CN1312288C - 一种位点重组反向克隆基因方法及其应用 - Google Patents

一种位点重组反向克隆基因方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于分子生物学领域，与基因技术有关。利用生物的位点特异重组克隆，设计反向杂合特异引物，与带重组克隆的载体系统进行体外定向重组与交换，实现目的基因的反向克隆，获得特异的反义基因克隆载体。这样的载体系统用于基因功能鉴定分析和转基因生物的应用。相比现有技术，它不需对基因片段(或PCR产物)进行限制性的酶切、分离纯化和连接、插入片段的方向分析等操作，是一种快速、便捷、高效的基因克隆到载体系统的新方法。

Description

一种位点重组反向克隆基因方法及其应用
技术领域
本发明属于植物基因工程技术领域。具体涉及一种位点重组反向克隆基因方法及其应用。
背景技术
随着大规模的基因结构序列的分析、cDNA文库及EST序列的测序分析，人们获得了大量的编码序列(ORFs)，因此，需要对其功能进行鉴定分析，这在生物的功能基因组研究上尤为如此。对阐明了功能的基因通过克隆和遗传转化，获得的转基因生物具有其特定的商业利用价值。基因的功能分析方法和途径有多种，其中较为有效的途径是利用反向遗传学技术。目前应用较为成功的反向技术主要有antisense RNA(反义基因)及dsRNA(双链RNA)等。在反向技术中，通常是先要构建反义基因载体(或转化载体)，然后遗传转化生物体，导致生物内源靶基因的沉默(gene-silencing/suppression/knockout)，从而发生表现型或生理生化代谢途径的改变或丧失，使基因的功能得以鉴定。同时所获得转基因生物可商业性的应用。
对大量的单个基因分别进行克隆，是一项复杂费时的工作，涉及一系列的基因克隆、亚克隆等DNA重组操作及重组体的鉴定和基因方向测定工作。与之相关的专利有LifeTechnologies公司(1999，2001)的“利用工程重组位点的重组克隆”(US5888732/US6171861：Recombinational cloning using engineered recombination sites)。
本发明的目的在于克服现有技术存在的不足，利用成熟的λ噬菌体重组系统，发展了一套便捷、高效的基因克隆操作方法和程序，进行基因(或EST)的反向位点特异重组，形成新的转化载体，用于候选基因的功能鉴定。所获得的转基因生物体可用于商业性生产应用。
发明内容
本发明主要利用特殊PCR引物设计方法和和带有λ噬菌体和大肠杆菌的att位点重组元件的转化载体组成。具体操作过程包括：
一种构建反义基因克隆载体方法，适用于基因沉默研究的基因功能鉴定分析和转基因生物的创造，所指的生物包括植物、微生物和动物，所指的基因为DNA和cDNA的片段或全长，所指的位点特指一段可发生重组和交换的DNA碱基序列，所述的方法包括：
(1)引物设计：将12-30bp的重组位点attBl(Forward)的特异序列和目的基因序列的反义链，12-30 bp的重组位点attB2(Reverse)的特异序列和目的基因序列的正义链设计成一组PCR引物，然后利用带有λ噬菌体的重组位点(attP)元件的质粒载体，进行体外(in vitro)重组克隆；
(2)所述的重组克隆元件由attB、attP以及它们重组产生的attL和attR特异位点成对组成，将成对的重组克隆元件装在农杆菌的Ti或Ri质粒的T-DNA序列上，通过B×P和L×R位点之间的重组与交换，获得反向构建的位点特异重组转化载体，并用于遗传转化；
(3)通过将重组克隆元件连接在PVX(Potato Virus X)、TRV(Tobacco Rattle Virus)病毒的核酸载体上，获得反向构建的位点特异重组载体，用于人工接种感染植物；
(4)含PVX和T-DNA的重组克隆元件方法，将连接有重组元件的PVX或TRV一类的病毒载体再连接到转化载体(如Ti或Ri质粒)的T-DNA上，即可进行稳定的遗传转化，和\或进行感染(Agroinfection)；
作为PCR产物的特例，利用限制性内切酶对所述的DNA片段进行酶切，并反向连接到重组克隆元件中。
本发明的所述的方法可用于dsRNA(双链RNA)的“反义—正义”构建体置于重组克隆元件上。
作为本发明的拓展，利用已带有重组克隆元件的转基因生物进行细胞活体(in vivo)重组交换。
附图说明
以下结合说明书附图对本发明作进一步描述。
图1.、是本发明的引物设计及重组克隆的原理及流程图；
图2、是本发明的位点重组元件与植物转化载体T-DNA连接图；
.图3、是本发明的位点重组元件与马铃薯X病毒(PVX)载体连接图；
图4.、是本发明的位点重组元件与烟草Rattle病毒(TRV)载体连接图；
图5.、是本发明的位点重组元件和植物病毒(PVX)载体与植物转化载体连接图；
图6.、是本发明的attB重组位点的碱基序列。
本发明的特殊PCR引物是根据位点重组序列加上反义基因序列设计而成。
具体的引物设计方法如下：在进行基因PCR扩增引物设计时，将某一基因的反义链(Antisense-Strand/Non-template-strand)核酸序列连接在位点重组attBl的正向延伸引物(Forward Primer)之后，而将其正义链(Sense-strand/Template-strand)核酸序列连接在attB2反向延伸引物(Reverse primer)之后，构成一组引物；对需要克隆的基因进行PCR扩增，扩增的产物通过简单的纯化，即可与所称的载体质粒混合，在一定的重组蛋白酶作用下，其特异重组位点就可自主地与带有特异重组位点序列的载体质粒进行体外(Invitro)DNA片段的重组与交换，形成各种新的(反义)基因重组克隆载体。
引物序列的设计：
正向延伸引物：attB1(12-30 bp)-反义链(Antisense Strand)DNA(15-50 bp)
反向延伸引物：attB2(12-30 bp)-正义链(Sense strand)DNA(15-50 bp)
其中，正义或反义核酸序列可以是某一基因的、某一载体的、或载体与基因的核酸序列。
特殊反向引物设计思路有别于常规的正义链序列连接在attB1(Forward Primer)之后，反义链序列连接在attB2(Reverse primer)之后的情形。
位点重组转化载体系统是由带有位点重组元件的各类植物转化载体，重组元件分别由两个同类的重组位点序列组成，插入在一定的转化载体之中。
具体的重组位点叙述如下：λ噬菌体具有将其特异重组位点(attP)的整合进入宿主细菌(大肠杆菌)的染色体的重组位点(attB)上或从大肠杆菌的染色体重组位点上切割下来的功能。细菌的attB位点有21 bp序列(其中7 bp核心区)，通过碱基修饰突变可产生功能不变，但碱基序列不同的一组重组位点。类似地，λ噬菌体染色体也有这样的位点(attP)，通过同样的修饰方法，也相应形成了一组重组位点。attP位点可与attB位点发生定向重组和准确地交换，形成新的attL和attR位点(见附图1)。同样地，attL位点可与attR位点发生重组和交换，形成新的attP位点和attB位点(见附图1)。而一组内的重组位点之间相互不发生重组，即attB1和attB2、attP1和attP2、attL1和attL2、attR1和attR2位点之间不能发生重组，attP只与attB位点发生重组，不会与attL或attR位点发生重组。其它亦如此。这种重组与交换机制保证了所克隆的基因具有方向性和交换的准确性，从而使反向基因克隆程序大为简化。
本发明在已有的技术和专利基础上，将位点重组元件插入到植物转化载体进行了设计和构建，获得了位点重组转化载体系统，进行目的基因反向克隆和载体构建。本发明所创造的这种基因反向克隆的方法，已在番茄的基因(EST)的反义克隆和遗传转化上成功地进行验证和应用(见实施例1、2)。本发明所称的位点重组转化载体系统主要是指用于植物转化的带有位点重组克隆元件的各类Ti或Ri质粒转化载体或病毒转化载体(见附图2、3、4、5)，也可是带有位点重组克隆元件的各类动物或微生物等转化载体。
与已有技术相比，本发明不需对要对克隆的基因进行一系列的限制性内切酶切割、片段分离纯化回收、连接酶连接，以及连接产物(插入子)整合方向鉴定(酶切或测序)等基因操作步骤，是一种快速、便捷、高效的基因反义克隆及转化载体构建方法。
具体实施方式
实施例1：番茄ACC氧化酶的位点特异重组反向克隆应用
引物设计：
attB1+ACO：5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT-( GGAGATGAGAGAGCCAACACC)-3’
attB2+ACO：5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT-( CCAAGATGACAAAGTGAGTGGCC)-3’
再进行PCR扩增，得到带有attB重组位点的某一特定基因反义链的PCR扩增产物，经PEG法纯化后，即可用于过渡载体的位点特异重组，获得转化过渡载体；将重组载体转化E.coli，在含特定抗生素的平皿上筛选到阳性克隆菌落。再培养阳性菌落细菌，提取过渡载体，再与目标载体混合，在重组酶的作用下，获得转化载体，用于植物遗传转化，得到转基因植株，进行表现型的鉴定和分析，获得该克隆的基因功能信息。通过该方法转化的反义转基因耐贮藏番茄表现出对乙烯释放量有明显的抑制效果，且耐贮藏性大大提高。1996年通过农业部农业生物工程安全委员会安全性评价，国家批准可以进行商品化生产。利用本发明的方法已经成功地培育出转基因耐贮藏番茄新品种“华番1号”。
实施例2：番茄EST通用的位点特异重组反向克隆应用
引物设计：利用了原载体pBluescript序列(T3和T7)进行不同基因(eDNA)的克隆。
attB1+T3：5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT-( GTAATACGACTCACTATAGGGC)-3’
attB2+T7：5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT-( AATTAACCCTCACTAAAGGG)-3’
再进行PCR扩增，得到带有attB重组位点的某一特定基因反义链的PCR扩增产物，经PEG法纯化后，即可用于过渡载体的位点特异重组，获得转化过渡载体；将重组载体转化E.coli，在含特定抗生素的平皿上筛选到阳性克隆菌落。再培养阳性菌落细菌，提取过渡载体，再与目标载体混合，在重组酶的作用下，获得转化载体，用于植物遗传转化，得到转基因植株，进行表现型的鉴定和分析，获得该克隆的基因功能信息。
本发明的积极效果是：
λ噬菌体系统与其它位点特异重组系统(细菌噬菌体P1的Cre/loxP系统，酵母质粒Flp/FRT系统)相比具有如下优点：
1、attB位点的序列段较短，且不产生干扰基因表达的次级结构，也便于碱基修饰。
2、λ噬菌体系统能很好的控制重组事件的发生。在实验控制条件下attP和attB位点只重组产生attR和attL位点；同样，attR和attL位点只产生attP和attB位点。而loxP位点则是一个平衡反应体系，loxP位点间产生复杂的重组事件，如二聚体、三聚体及重排现象，不可控制进行定向重组。

Claims (1)

1、一种构建植物反义基因克隆载体的方法，其步骤在于：
(1)将重组位点attB1的特异序列与12-30bp的目的基因序列的反义链、重组位点attB2的特异序列与12-30bp的目的基因序列的正义链设计成一组PCR引物，进行PCR扩增，得到PCR产物；
(2)将步骤(1)得到的PCR产物通过体外重组克隆到带有λ噬菌体attP1和attP2元件的载体中，这些载体包括Ti质粒或Ri质粒以及病毒转化载体；
(3)将步骤(2)得到的载体用于植物遗传转化得到转基因植株。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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