CN117178056A

CN117178056A - 用于生产无缝dna载体的方法

Info

Publication number: CN117178056A
Application number: CN202280020403.5A
Authority: CN
Inventors: 彼得·德罗吉; 萨布丽娜·多·彼得; 苏琪·罗伊
Original assignee: Nanyang Technological University
Current assignee: Nanyang Technological University
Priority date: 2021-03-12
Filing date: 2022-03-11
Publication date: 2023-12-05
Also published as: WO2022191779A1; WO2022191779A8; EP4305177A1

Abstract

本发明涉及在大肠杆菌体内生产无缝DNA载体的方法，所述无缝DNA载体包含感兴趣的DNA序列和噬菌体λ整合酶重组序列。该方法包括提供编码由诱导型表达控制序列严格控制的突变型噬菌体λ整合酶(lntC3)的大肠杆菌菌株；将包含感兴趣的DNA序列和两侧有两个正向重复λ整合酶重组序列的细菌骨架序列的细菌质粒转化至大肠杆菌菌株中，其中细菌骨架序列包含选择标志物；在对选择标志物进行选择的条件下培养经转化的大肠杆菌细胞；诱导lntC3的表达以促进重组，从而获得由携带细菌骨架的第一环状DNA分子以及携带感兴趣的DNA序列和噬菌体λ整合酶重组序列的第二环状DNA分子组成的二聚DNA连环体。

Description

用于生产无缝DNA载体的方法

相关申请的交叉引用

本申请要求于2021年3月12日提交的第10202102572X号新加坡专利申请的优先权，出于所有目的将其内容通过引用整体并入本文。

技术领域

本发明大体上涉及通过在大肠杆菌宿主细胞中重组表达进行DNA载体生产的领域，并且更具体地涉及通过在大肠杆菌中调控增强型噬菌体λ整合酶的表达来生产无缝DNA载体以及经改造并用于该方法的大肠杆菌菌株。

背景技术

无缝DNA载体也经常被称为“微环载体”，源自细菌质粒，并且缺乏细菌遗传元件(例如，对于游离质粒生长/维持重要的复制起点和抗性标志物)。无缝载体是环状共价闭合的负超螺旋DNA分子，并且对例如细胞系改造、生物制品生产、基因/细胞治疗和DNA疫苗接种的各种生物医学应用越来越有吸引力。这是因为与亲本细菌质粒相比，它们增强转基因表达，提高安全功能，减少基因沉默和提高基因转移效率[Chen ZY,Riu E,He C-Y等人(2008)Mol Ther16:548–5561；Kay MA(2011)Nat Rev Genet 12:316–328]。

生产无缝DNA载体的最常见方式是位点特异性DNA重组酶，其利用位于不需要的细菌遗传元件两侧的各自同源DNA序列。这些酶通过精确的DNA链切割和拼接反应从分子的其余部分中剪接出间插DNA。由此使用质粒作为底物的重组反应产生两种环状DNA分子：一种携带不需要的细菌元件，另一种作为所需的无缝载体。可利用各种方案，以便可以将后者分离并纯化以用于下游目的。

位点特异性重组反应可以在体外用纯化的酶进行小规模生产，也可以在体内(例如在细菌大肠杆菌中)进行以实现中等到大规模生产，目前后者已用于商业环境。已利用大量的重组酶在大肠杆菌体内生产无缝载体，包括例如野生型噬菌体λ整合酶[Darquet A,Cameron B,Wils P等人(1997)Gene Ther 4:1341–1349]，酵母重组酶Cre和FLP[BiggerBW,Tolmachov O,Collombet JM等人(2001)J Biol Chem 276:23018–23027；Nehlsen K,Broll S,Bode J等人(2006)Gene Ther Mol Biol 10:233–244]，野生型噬菌体ΦC31整合酶[Chen ZY,He CY,Ehrhardt A,Kay MA等人(2003)Mol Ther 8:495–500]和ParA解离酶[Jechlinger W,Azimpour Tabrizi C,Lubitz W等人(2004)J Mol Microb Biotech 8:222–231]。野生型λ整合酶及其体内应用也已经在US6143530A；WO1994/009127A2；US20130316449A1中描述。US2017/0362606 A1中已经描述了使用称为IntC3的突变型λ整合酶来小规模地体外生产无缝载体。

对于体内生产无缝载体，主要的技术挑战是严格控制重组酶的表达。细菌生长过程中的泄漏表达导致细菌中的无缝载体过早损失，从而严重损害载体产量。为了实现这一目标，已经采用了多种表达系统，包括温度敏感的λ阻遏物cI857/pR[Darquet A,CameronB,Wils P等人(1997)Gene Ther 4:1341–1349]和基于质粒的pBAD/araC阿拉伯糖系统[Chen ZY,He CY,Ehrhardt A,Kay MA等人(2003)Mol Ther 8:495–500]。然而，可重复地，特别是以更大规模使用这些系统在技术上仍然存在挑战性。

发明内容

本发明人改造了一种源自菌株MG1655的新型大肠杆菌菌株，通过突变型λ整合酶IntC3(WO 2016/022075A1中描述的突变型λ整合酶)催化的体内位点特异性重组，可以将该新型大肠杆菌菌株用于以多种规模且多种用途生产无缝载体。

因此，一方面，本申请涉及一种在大肠杆菌体内生产无缝DNA载体的方法，该无缝DNA载体包含感兴趣的DNA序列和噬菌体λ整合酶重组序列，该方法包括：

(i)提供包含编码突变型噬菌体λ整合酶(IntC3)的核苷酸序列的大肠杆菌菌株，该突变型噬菌体λ整合酶(IntC3)具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列或其功能变体或片段，其中所述核苷酸序列的表达由诱导型表达控制序列严格控制；

(ii)将包含感兴趣的DNA序列和两侧有两个正向重复λ整合酶重组序列的细菌骨架序列的细菌质粒转化至(i)中的大肠杆菌菌株中，所述两个正向重复λ整合酶重组序列是突变型噬菌体λ整合酶的重组底物，其中该细菌骨架序列包含选择标志物；

(iii)在对细菌质粒中包含的选择标志物进行选择的条件下培养经转化的大肠杆菌细胞；

(iv)诱导突变型噬菌体λ整合酶的表达，以促进细菌质粒中两个正向重复λ整合酶重组序列的重组，从而获得二聚DNA连环体(catenane)，所述二聚DNA连环体由携带细菌骨架的第一环状DNA分子以及携带感兴趣的DNA序列和噬菌体λ整合酶重组序列的第二环状DNA分子组成，所述噬菌体λ整合酶重组序列是两个正向重复λ整合酶重组序列的杂合体；以及

(v)将携带感兴趣的DNA序列和噬菌体λ整合酶重组序列的第二环状DNA分子分离出来。

在不同的实施方式中，步骤(iv)包括将两个连环的环状DNA分子分开。

步骤(v)可以包括使第一环状DNA分子(即包含质粒的细菌骨架的DNA分子)线性化。在此类实施方式中，步骤(v)中的分离可以包括消化线性化DNA以及任选任何带切口的环状DNA。该步骤还可以包括提取第二环状DNA分子和/或从任何其他不需要的细胞组分中纯化/分离第二环状DNA分子。

在不同的实施方式中，将编码具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列或其功能变体或片段的突变型噬菌体λ整合酶的核苷酸序列稳定地整合至大肠杆菌菌株的基因组中。

诱导型表达控制序列可以是大肠杆菌阿拉伯糖操纵子。在此类实施方式中，步骤(iv)中的诱导可以通过添加阿拉伯糖来触发。如果诱导型表达控制序列是大肠杆菌阿拉伯糖操纵子，则可以将编码突变型噬菌体λ整合酶(IntC3)的核苷酸序列插入至大肠杆菌的基因组阿拉伯糖操纵子中。插入可发生在紧邻阿拉伯糖启动子的下游，例如通过使用内源性araB基因的起始密码子作为编码突变型噬菌体λ整合酶的核苷酸序列的起始密码子。

在不同的实施方式中，(i)中的大肠杆菌菌株还包含编码单链整合宿主因子2(scIHF2)的核苷酸序列。scIHF2可以具有SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列或其功能变体或片段。

在不同的实施方式中，使IntC3和scIHF2包含在稳定整合至大肠杆菌菌株的基因组的表达盒中。在此类实施方式中，IntC3和scIHF2两者的表达可以由同一诱导型表达控制序列(例如，内源性阿拉伯糖操纵子)严格控制。表达盒可以包含另外的元件，例如选择标志物，其任选地两侧有随后被切除的重组位点。该重组位点可以不同于由表达盒编码的突变型λ整合酶。在不同的实施方式中，表达盒包含编码IntC3的核苷酸序列、编码scIHF2的核苷酸序列、编码选择标志物的核苷酸序列(例如，氯霉素抗性基因)、以及在选择标志物两侧的两个重组位点(例如，Flp重组酶重组位点)。在一些实施方式中，此类表达盒具有SEQ IDNO:1所示的核苷酸序列。

在不同的实施方式中，感兴趣的DNA序列包含一种或多种基因。所述一种或多种基因中的至少一种可以与表达控制序列可操纵地连接。

在不同的实施方式中，包含感兴趣的DNA序列的第二环状DNA构建体，即无缝DNA载体，不包含除噬菌体λ整合酶重组序列之外的细菌序列。该噬菌体λ整合酶重组序列是由于细菌质粒中存在的两个重组位点重组而作为杂合体产生的单个重组序列。

在不同的实施方式中，为突变型噬菌体λ整合酶的重组底物的两个正向重复λ整合酶重组序列选自attP(SEQ ID NO:11)和attB(SEQ ID NO:12)、attL(SEQ ID NO:13)和attB(SEQ ID NO:12)、attL(SEQ ID NO:13)和attL(SEQ ID NO:13)以及其功能变体。这些功能变体具有重组能力。att位点的功能变体可以由attH4x(SEQ ID NO:14)和attP4x(SEQ IDNO:15)对、attL4x(SEQ ID NO:16)和attH4x(SEQ ID NO:14)对、attR4x(SEQ ID NO:17)和attH4x(SEQ ID NO:14)对以及attL4x(SEQ ID NO:16)和attR4x(SEQ ID NO:17)对组成，但不限于此。

大肠杆菌菌株可以是大肠杆菌菌株MG1655。未修饰的亲本大肠杆菌菌株MG1655是接近野生型K12菌株的衍生菌株，并且于1981年得到[Guyer,M.S.,R.E.Reed,T.Steitz,K.B.Low1981.Cold Spr.Harb.Symp.Quant.Biol.45:135-140]。然后，将该菌株改造以包含编码突变体噬菌体λ整合酶(IntC3)的核苷酸序列，该突变体噬菌体λ整合酶具有SEQ IDNO:2所示的氨基酸序列或其功能变体或片段，其中该核苷酸序列的表达由诱导型表达控制序列严格控制，以提供步骤(i)中的菌株。

另一方面，本发明涉及大肠杆菌细胞，其包含稳定整合至其基因组中的编码突变型噬菌体λ整合酶(IntC3)的核苷酸序列，该突变型噬菌体λ整合酶具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列或其功能变体或片段，其中该核苷酸序列的表达由基因组诱导型表达控制序列严格控制。

在此类细胞中，可以将编码突变型噬菌体λ整合酶(IntC3)的核苷酸序列插入至大肠杆菌的基因组阿拉伯糖操纵子中。可以紧邻阿拉伯糖启动子的下游整合，例如通过使用内源性araB基因的起始密码子作为编码突变型噬菌体λ整合酶的核苷酸序列的起始密码子。

本发明的大肠杆菌细胞还可以包含稳定整合至其基因组中的编码单链整合宿主因子2(scIHF2)的核苷酸序列。scIHF2可以具有SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列或其功能变体或片段。在一些实施方式中，使IntC3和scIHF2包含在稳定整合至大肠杆菌菌株基因组的表达盒中，并且其中任选地，IntC3和scIHF2两者的表达由同一诱导型表达控制序列严格控制。

大肠杆菌细胞可以源自大肠杆菌菌株MG1655。

在不同的实施方式中，该大肠杆菌细胞能够通过将编码突变型噬菌体λ整合酶(IntC3)的核苷酸序列稳定整合至大肠杆菌细胞(例如，大肠杆菌菌株MG1655细胞)的基因组中而获得，该突变型噬菌体λ整合酶具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列或其功能变体或片段，该核苷酸序列的这种表达由基因组诱导型表达控制序列严格控制。

附图说明

本发明在结合非限制性实施例和附图考虑时参考详细描述将得到更好地理解。

图1显示了大肠杆菌基因组中用于严格调控IntC3表达的靶向阿拉伯糖操纵子以及ISC表达盒的结构的示意图，该ISC表达盒的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。图下半部分显示的基因序列如SEQ ID NO:21和22所示。

INTC3：整合酶变体C3

IHF：单链整合宿主因子2

FRT：Flp重组酶的重组位点

CAT：氯霉素抗性盒

底部图中的箭头表示ISC盒通过同源重组插入起始密码子的位置。

图2显示了如实施例1所述的靶向后通过阿拉伯糖操纵子的琼脂糖凝胶电泳来分析连接处PCR产物和基因组PCR产物。

图3显示了用具有IntC3和scIHF2编码序列的表达盒(左曲线)或没有scIHF2编码序列的相同表达盒(右曲线)转化的大肠杆菌MG1655细胞的生长曲线。“CAT”是指作为选择标志物包含在内的氯霉素抗性基因。

图4示意性地显示了使用如本文所述的用IntC3和scIHF2转化的大肠杆菌MG1655菌株进行多种规模无缝载体生产的步骤。“att1”和“att2”是指重组酶位点，“at/t”是指重组事件产生的杂交重组位点。“有效负载”是指感兴趣的DNA序列。

图5显示了attPhae2(attL)的载体图谱。

图6显示了经分离且经受不同限制性酶处理的游离DNA的琼脂糖凝胶电泳分析结果(泳道：1–未消化的底物attLPhae2；2–未消化的诱导attPLPhae 2；NdeI消化的底物；4–ScaI消化的底物；5–诱导的纯化(NdeI+Exo)，100μl中的3μl；6–与5相同，除了100μl中的6μl；7–与5相同，除了仅ScaI消化(100μl中的6μl)；M–标志物泳道)。

图7显示了带有ClaI和EcoRV限制性位点的主质粒attP4x attH4x的载体图谱。

图8显示了经分离且经受不同限制性酶处理的游离DNA的琼脂糖凝胶电泳分析结果(泳道：1：1kb标志物；2：F8F1-Hygro原始300ng，用EcoRV消化；3：ISC-F8FL-Hygro非诱导300ng，用EcoRV消化；4：空；5：ISC-F8FL-Hygro诱导10μl，用EcoRV消化；6：ISC-F8Fl-Hygro诱导10μl，用Cla I消化；7：ISC-F8Fl-Hygro诱导10μl，用Cla I和1μl T5核酸外切酶消化；8：空泳道；9：100bp标志物3μl)。白色箭头指向无缝载体单体。

具体实施方式

以下详细描述通过说明的方式涉及可以实践本发明的具体细节和实施方式。这些实施方式被足够详细地描述以使本领域技术人员能够实践本发明。在不脱离本发明的范围的情况下，可以利用其他实施方式并且可以进行结构和逻辑的改变。各种实施方式不一定是相互排斥的，因为一些实施方式可以与一个或多个其他实施方式组合以形成新的实施方式。

除非另有定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的相同含义。单数术语“一个”、“一种”和“该”包括复数指示物，除非上下文另有明确指示。类似地，措辞“或”旨在包括“和”，除非上下文清楚地另有说明。术语“包含”是指“包括”。如有冲突，以本说明书(包括术语解释)为准。

本申请提供了一种用于以多种规模生产无缝DNA载体的通用新技术，该技术利用稳定整合至宿主细胞基因组的严格控制区域中的突变型噬菌体λ整合酶基因进行整合酶表达，随后使用合适底物质粒的位点特异性DNA重组。

一方面，本申请涉及在大肠杆菌体内生产无缝DNA载体的方法，该无缝DNA载体包含感兴趣的DNA序列和噬菌体λ整合酶重组序列。

如本文使用的术语“感兴趣的DNA序列”是指任何DNA序列，本领域普通技术人员出于任何原因对其的操作可以被认为是期望的(例如，赋予改善的质量和/或数量、宿主细胞中感兴趣蛋白质的表达、核酶的表达)。此类DNA序列包括但不限于结构基因的编码序列(例如，报告基因、选择标志物基因、癌基因、药物抗性基因、生长因子基因)和编码mRNA或蛋白质产物的非编码序列(例如，启动子序列、聚腺苷酸化序列、终止序列、增强子序列、小干扰RNA、短发夹RNA、反义RNA、微小RNA、长链非编码RNA)。

感兴趣的DNA序列可以包含一种或多种基因，其可以与或不与一种或多种表达控制序列(例如，启动子、增强子、操纵子、终止信号、3'-UTR或5'-UTR、隔离子)可操纵地连接。如本文使用的术语“可操纵地连接”是指在物理或功能上相互作用的两个或更多个核苷酸序列之间的关系。例如，如果启动子或调控核苷酸序列与编码RNA或蛋白质的核苷酸序列的位置使得该调控核苷酸序列将影响该编码或结构核苷酸的表达水平，则认为这两种序列可操纵地连接。

在某些实施方式中，感兴趣的DNA序列可以包括选择标志物基因。如本文使用的术语“选择标志物基因”是指仅允许携带该基因的细胞在相应选择因子的存在下特异性被选择或不被选择的基因。例如，通常用于真核细胞的选择性基因包括氨基糖苷磷酸转移酶(APH)、潮霉素磷酸转移酶(HYG)、二氢叶酸还原酶(DHFR)、胸苷激酶(TK)、谷氨酰胺合成酶、天冬酰胺合成酶的基因，以及编码新霉素(G418)、嘌呤霉素、组氨醇D、博来霉素和腐草霉素抗性的基因。下面将描述用于原核细胞的选择标志物，以选择已被成功转化的细胞。

可以设计形成无缝载体一部分的感兴趣的DNA序列用于稳定整合至宿主细胞(例如真核细胞)的靶基因组序列中。如本文所用，术语“将感兴趣的DNA序列稳定整合至宿主细胞的靶基因组DNA序列中”是指通过与宿主DNA形成共价键而将感兴趣的DNA序列稳定整合至核基因组或感兴趣的细胞区室(例如线粒体)内的任何其他核外遗传物质中。因此，稳定整合的感兴趣的DNA序列将可遗传至如此修饰的宿主细胞的后代。该稳定整合可以在所有类型的细胞中体外、离体或体内进行。宿主细胞可以是真核细胞，优选哺乳动物细胞，更优选人细胞。例如，宿主细胞可以是细菌细胞、酵母细胞、植物细胞或人细胞；宿主细胞可以是癌细胞、卵母细胞、胚胎干细胞、造血干细胞或任何类型的分化细胞。

本文所述的方法包括提供包含编码突变型噬菌体λ整合酶(IntC3)的核苷酸序列的大肠杆菌菌株的步骤，该突变型噬菌体λ整合酶具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列或其功能变体或片段，其中该核苷酸序列的表达由诱导型表达控制序列严格控制。

如本文使用的术语“噬菌体λ整合酶”是指具有核酸内切酶和连接酶活性的任何源自λ噬菌体的整合酶。如本领域已知的，噬菌体λ整合酶如Cre和Flp属于序列特异性保守DNA重组酶的整合酶家族，并且催化两个不同重组att位点之间的整合重组。

本发明方法中使用的整合酶是本领域已知的噬菌体λ整合酶的特定突变体，即WO2016022075A1中公开的整合酶，其通过引用并入本文，并称为“IntC3”。该IntC3突变型整合酶具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。编码该突变型整合酶的DNA序列可以具有SEQ IDNO:10所示的核苷酸序列。

与整合酶有关的本文使用的术语“功能变体”涉及通过一个或多个氨基酸取代、添加或缺失而与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列不同但保留该参考序列的功能性的整合酶。在此类变体中，限定该参考整合酶C3的氨基酸位置(即位点43F、319G和336V)可以是不变的。该术语还涵盖包含SEQ ID NO:2所示序列但包含1个或多个氨基酸的N端和/或C端延伸的变体。通常，术语“变体”涵盖这样的整合酶，在其全长上与SEQ ID NO:2所示序列具有至少90％序列同一性，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。在这些变体中，位点43F、319G和336V仍然可以不变。核酸序列或氨基酸序列的同一性通常通过序列比较来确定。该序列比较是基于现有技术中建立且常用的BLAST算法(参见例如Altschul等人(1990)“Basic local alignment search tool”,J.Mol.Biol.215:403-410，和Altschul等人(1997):“Gapped BLAST and PSI-BLAST:a new generation ofprotein database search programs”；Nucleic Acids Res.,25,p.3389-3402)，并且原则上通过分别使核酸序列和氨基酸序列中相似连续的核苷酸或氨基酸相互关联来实现。将相关位点以表格形式的关联称为“比对”。序列比较(比对)，特别是多重序列比较，通常使用本领域技术人员可获得且已知的计算机程序来进行。

与整合酶有关的本文使用的术语“功能片段”或“片段”涉及通过其C端和/或N端缺失一个或多个氨基酸而与SEQ ID NO:2所示氨基酸序列不同的整合酶。该片段优选地保留全部功能性。在不同的实施方式中，此类片段不同于该参考序列，并且它们在N端和/或C端缺少1至20个氨基酸，例如1至15个氨基酸或1至10个氨基酸或1至5个氨基酸。

与野生型整合酶相比，本文公开的突变型整合酶能够在没有辅因子(例如IHF)的情况下进行重组反应。然而，如下所述，添加辅因子基因，特别是scIHF2(SEQ ID NO:9)，可具有的有益效果在于似乎大幅减少了培养中的滞后期，从而可以缩短达到所需细胞密度所需的孵育时间。

诱导型表达控制序列可以是大肠杆菌阿拉伯糖操纵子或存在于大肠杆菌基因组中的任何其他合适的严格受控的诱导型基因控制元件。在使用阿拉伯糖操纵子的实施方式中，步骤(iv)中的诱导可以通过添加阿拉伯糖或也可诱导操纵子的任何阿拉伯糖衍生物或模拟物来触发。在此类实施方式中，例如通过使用内源性araB基因的起始密码子作为编码IntC3的核苷酸序列的起始密码子，可以将编码突变型噬菌体λ整合酶(IntC3)的核苷酸序列插入至大肠杆菌阿拉伯糖启动子下游(例如紧邻启动子下游)的基因组阿拉伯糖操纵子中，该内源性araB基因是启动子序列下游的第一个内源性基因。如果使用表达盒，则可以相应地插入整个表达盒。

该方法还包括将包含感兴趣的DNA序列和两侧有两个正向重复λ整合酶重组序列的细菌骨架序列的细菌质粒转化至(i)所述的大肠杆菌菌株中的步骤，所述两个正向重复λ整合酶重组序列为突变型噬菌体λ整合酶的重组底物，其中该细菌骨架序列通常包含选择标志物。

如本文使用的术语“细菌质粒”是指能够在细菌宿主细胞中复制的环状DNA分子。细菌质粒可以包含适当的复制起点，该复制起点是足以使质粒能够在细菌宿主细胞中复制的DNA序列。细菌质粒还可以包含选择标志物序列，其编码赋予细胞抗生素(例如，氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素和四环素)抗性的选择标志物。在优选的实施方式中，细菌质粒是负(-)超螺旋的。

为突变型噬菌体λ整合酶的重组底物的λ整合酶重组序列是att位点衍生物对。att序列为由噬菌体λ整合酶及其任何相关辅助蛋白进行结合、切割和链交换的识别位点。这些att位点可选自以下：attP(SEQ ID NO:11)和attB(SEQ ID NO:12)对、attL(SEQ ID NO:13)和attB(SEQ ID NO:12)对、attL(SEQ ID NO:13)和attL(SEQ ID NO:13)对。此外，还可以选择由attH4x(SEQ ID NO:14)和attP4x(SEQ ID NO:15)对、attL4x(SEQ ID NO:16)和attH4x(SEQ ID NO:14)对、attR4x(SEQ ID NO:17)和attH4x(SEQ ID NO:14)对以及attL4x(SEQID NO:16)和attR4x(SEQ ID NO:17)对组成的att位点的功能变体。

如本文使用的术语“正向重复定向”表示一组重组发生的重组位点中的重组位点以相同方向排列(例如，5'至3')，使得这些位点之间的重组导致间插DNA序列切除而非倒置。如本文使用的术语“反向定向”表示一组重组发生的重组位点中的重组位点以相反方向排列，使得这些位点之间的重组导致间插DNA序列倒置而非切除。因此，为了成功实施本文所述步骤(ii)中的分子内重组，本文所述感兴趣的DNA序列两侧的两个识别位点以正向重复定向排列。

如果整合酶介导的重组发生在同一分子上的两个相容识别位点之间，则分子内重组导致两侧有两个识别位点的序列的缺失或倒置。更具体地，当同一DNA分子上的两个识别位点处于正向重复定向时，整合酶切除这两个位点之间的DNA，在DNA分子上留下单个识别位点；如果单个DNA分子上的两个识别位点处于反向定向，整合酶使这两个位点之间的DNA序列倒置而非去除该序列。

该方法还包括在对细菌质粒中包含的选择标志物进行选择的条件下培养经转化的大肠杆菌细胞的步骤。这确保了只有那些已被成功转化的细胞才能生长。更重要的是，在该培养步骤中，整合酶尚未得到表达，因为在此阶段整合酶的任何渗漏表达将导致细菌内无缝载体的过早损失，从而严重影响载体产量。由于该培养步骤对于生长细胞并因此增加细菌质粒的拷贝数是必需的，因此本发明的方法需要整合酶处于可诱导但严格控制表达的元件的控制下。

本发明人发现，如果大肠杆菌菌株还包含编码单链整合宿主因子2(scIHF2)的核苷酸序列，则可以显著缩短滞后期以及在诱导或无诱导的情况下达到稳定期的时间。即，达到所需细胞密度的时间显著缩短。因此，所使用的菌株还可以包含scIHF2编码序列，例如具有SEQ ID NO:9所示氨基酸序列或其功能变体或片段的菌株。该变体和片段被定义为上述整合酶的变体和片段(整合酶特异性的突变体除外)。在所使用的菌株中，甚至可以将IntC3和scIHF2包含在稳定整合至大肠杆菌菌株的基因组中的单个表达盒中。在此类实施方式中，IntC3和scIHF2两者的表达因而可以由同一诱导型表达控制序列(例如，内源性阿拉伯糖操纵子)严格控制。该表达盒可以包含另外的元件，例如选择标志物，任选其两侧有随后被切除的重组位点。该重组位点可以不同于表达盒编码的突变型λ整合酶。在不同的实施方式中，该表达盒包含编码IntC3的核苷酸序列(SEQ ID NO:10)、编码scIHF2的核苷酸序列(SEQ ID NO:18)、编码选择标志物的核苷酸序列(例如，氯霉素抗性基因SEQ ID NO:19)、以及位于选择标志物两侧的两个重组位点(例如，Flp重组酶重组位点，SEQ ID NO:20)。在一些实施方式中，此类表达盒具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。这些重组位点允许在该方法的后期阶段靶向切除基因组选择标志物。因此，重组位点优选为正向重复定向。

在该方法的下一个步骤中，一旦达到所需的细胞密度(例如，OD600＝0.5)，就诱导突变型噬菌体λ整合酶的表达。所述诱导可以通过添加诱导整合酶编码序列的表达控制序列的因子或化合物来完成。

整合酶的表达导致细菌宿主细胞中整合酶和细菌质粒两者的存在。两者的接触促进细菌质粒中两个正向重复λ整合酶重组序列的分子内重组。所述切除和重组事件产生二聚DNA连环体，该二聚DNA连环体由携带细菌骨架的第一环状DNA分子和携带感兴趣的DNA序列和噬菌体λ整合酶重组序列的第二环状DNA分子组成，所述噬菌体λ整合酶重组序列是两个正向重复λ整合酶重组序列的杂合体。Spengler等人("The stereostructure of knotsand catenanes produced by phage lambda integrative recombination:implicationsfor mechanism and DNA structure",Cell,vol.42,No.1,Aug.1985,325-334)总体描述了此类连环体。

通过位于细菌骨架序列(和感兴趣的DNA序列)两侧的两个λ整合酶识别位点之间的“分子内重组”，例如通过整合酶介导的，获得包含质粒的细菌骨架或基本上由质粒的细菌骨架组成的第一环状DNA构建体(该质粒的细菌骨架包含基本上所有的细菌DNA元件，例如用于在细菌宿主细胞中增殖的上述那些元件)，以及包含感兴趣的DNA序列和核苷酸序列或基本上由感兴趣的DNA序列和核苷酸序列组成的第二环状DNA构建体，该核苷酸序列由重组事件产生并且是两个正向重复λ整合酶重组序列的杂合体。

在该上下文中如本文使用的术语“基本上由……组成”是部分开放式术语，其不排除另外的、未列举的要素、步骤或成分，只要这些另外的一个或多个要素、一个或多个步骤或一个或多个成分不会实质上影响本发明的基本特性和新颖的特性。所述术语是指第二环状DNA构建体由感兴趣的DNA序列、由重组事件产生并且是两个正向重复λ整合酶重组序列的杂合体的核苷酸序列、和感兴趣的DNA序列和两个侧翼序列之间初始存在的核苷酸延伸段组成。在优选的实施方式中，感兴趣的DNA序列每一侧的所述核苷酸延伸段的长度最多为1,000nt，优选最多为500nt，更优选最多为100nt。优选的是，所述核苷酸延伸段不构成整个构建体的重要部分(例如，小于1％、5％或10％)。在一些实施方式中，细菌质粒中感兴趣的DNA序列的两侧紧邻两个正向重复λ整合酶重组序列，在这种情况下这样的核苷酸延伸段不存在，并且所得到的第二环状DNA构建体不包含细菌序列，但是包含由两个重组位点的重组事件产生的核苷酸序列。在一些实施方式中，本申请的细菌质粒被设计为在感兴趣的DNA序列两侧具有最小化的核苷酸延伸段，只要感兴趣的DNA序列的后续分子内重组和基因组整合不受到显著不利的影响。

不希望受任何特定理论的束缚，认为分子内重组在热力学上比分子间重组更有利；因此，在标准反应条件下，分子间重组是少量的副产物，即使发生分子间重组，也可以由于分子大小差异而与分子内重组清楚地区分开来。然而，细菌质粒和整合酶的相对浓度以及反应条件的各种参数仍然可以通过常规实验进行优化，以有利于分子内重组而不是两个不同细菌质粒之间的分子间重组。

该反应的结果是，构成无缝DNA载体的第二环状DNA分子可以是不含或基本上不含细菌序列的微型环状质粒，除了为用于切除的两个重组位点的杂合体的核苷酸序列。这种微型环状质粒提供了优于传统质粒的替代物。与传统质粒相比，由于其尺寸较小，它们表现出更好的生物利用度，并且由于减少或消除了不需要的细菌序列而提高了免疫相容性。此外，它们较小的尺寸也可以带来更高的递送效率和更低的毒性。可替代地，该方法可以类似地用于生产较长的环状质粒，因为质粒的长度不受限制。本文包括的实施例表明所描述的方法可以有效地用于生产小型质粒载体和大型质粒载体。

由于产物是连环体，因此该步骤可以包括将两个连环的环状DNA分子分开。在一些实施方式中，可以通过核酸内切酶活性，优选通过限制酶将包含细菌序列的第一环状DNA构建体线性化，同时保持第二环状DNA构建体完整。这样的消化步骤还可以用于消化受损的分子，例如带切口的环状分子。然后进一步将第二环状DNA构建体分离出来。核酸内切酶和分离方法的选择在本领域普通技术人员的知识范围内。

无缝DNA载体的分离可以通过任何合适的方法进行。通常，这涉及通过合适的方式(例如，超声、均质化、弗氏压碎器等)裂解细胞或破坏细胞壁，以及随后例如通过离心和/或过滤使所有不需要的细胞碎片分离。然后可以通过溶剂提取或层析技术分离出DNA载体，所有这些技术都是本领域技术人员已知的。

本发明方法中使用的大肠杆菌菌株可以是大肠杆菌菌株MG1655。未修饰的亲本大肠杆菌菌株MG1655已经在本领域中描述[Guyer,M.S.,R.E.Reed,T.Steitz,K.B.Low1981.Cold Spr.Harb.Symp.Quant.Biol.45:135-140]并且已经在该领域中广泛使用。根据本发明，将所述菌株改造以包含在内源性表达控制元件的严格控制下编码本文所述的突变型噬菌体λ整合酶(IntC3)的核苷酸序列。

可以将经分离后的包含感兴趣的DNA序列的无缝DNA载体用于引入至另一宿主细胞中，通过本领域可用的任何方法进行，包括但不限于DNA转染、生物弹道技术、超声、纳米颗粒或显微注射。在该宿主细胞中，可以通过适当的手段和技术，例如US2017/0362606A1中描述的那些手段和技术，将感兴趣的DNA序列整合至宿主细胞的基因组中。

本发明还涉及本文所述的大肠杆菌细胞。这些细胞已经被修饰使得它们包含稳定整合至其基因组中的编码突变型噬菌体λ整合酶(IntC3)的核苷酸序列，所述突变型噬菌体λ整合酶具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列或其功能变体或片段，其中该核苷酸序列的表达由基因组诱导型表达控制序列严格控制。

上面公开的与本发明的方法相关的所有实施方式类似地适用于本发明的细胞，反之亦然。

这些细胞然后可以用于所描述的方法中，或者通常可以用于由本文所述的细菌质粒生产无缝DNA载体。因此，这样的用途也构成本发明的一部分。

通过以下实施例进一步说明本发明。然而，应当理解，本发明不限于示例性的实施方式。

实施例

实施例1：携带诱导型λ整合酶C3表达盒的大肠杆菌(E.coli)菌株MG1655的改造

选择大肠杆菌菌株MG1655作为生成通用无缝载体细菌生产菌株的基础，因为它接近K12野生型细胞，具有最小的预先遗传变化[Blattner FR,等人(1997)Science.277(5331):1453-62]。推测这一特征会提供更高成功机会以通过内源性阿拉伯糖操纵子严格地调控增强型噬菌体λ整合酶变体IntC3的表达，这是体内生产无缝载体的先决条件。大肠杆菌基因组计划(https://www.genome.wisc.edu/resources/strains.htm)关于MG1655指出，该菌株接近野生型大肠杆菌，并且作为具有最小程度基因操作的实验室菌株维持，即仅分别通过紫外光和吖啶橙处理温和噬菌体λ和F质粒。MG1655菌株最初由Mark Guyer从菌株W1485获得，而该W1485菌株获得自原始K-12分离株的穿刺培养后代[Guyer,M.S.,R.E.Reed,T.Steitz,K.B.Low 1981.Cold Spr.Harb.Symp.Quant.Biol.45:135-140]。最初的大肠杆菌菌株K-12于1922年从加利福尼亚州帕洛阿尔托的一名白喉患者的粪便样本中获得[Bachmann,B.,pp.2460-2488in Neidhardt等人(1996),Escherichia coli andSalmonella:Cellular and Molecular Biology,ASM Press’]。

SEQ ID NO:1所示的多转基因脱氧核糖核苷酸(DNA)序列，称为ISC，由GeneScript公司商业合成：IntC3_scIHF2_FRT_CAT_FRT_LexA(2725bp)(参见图1；IntC3：整合酶变体C3(SEQ ID NO:2)；IHF：单链整合宿主因子2；FRT：Flp重组酶的重组位点；CAT：氯霉素抗性盒)。

MG1655改造所选择的策略包括使用内源性araB基因的起始密码子作为IntC3的起始密码子，将ISC表达盒精确地插入至MG1655紧邻阿拉伯糖启动子下游的基因组阿拉伯糖操纵子中(图1)。设计两个引物以使用MG1655细胞内lambda Red介导的同源重组反应的常规方案将构建体插入该基因座[Thomason,L.,D.L.Court,M.Bubunenko,N.Costantino,H.Wilson等人,2007Curr.Protoc.Mol.Biol.78:1.16.1–1.16.24]。将IntC3基因的ATG起始密码子重新引入至正向引物中。使用以下引物对ISC构建体进行PCR扩增，用于电穿孔至电穿孔感受态MG1655细胞中：

IntC3_ARAB_FWD_HR:

ACTCTCTACTGTTTCTCCATACCCGTTTTTTTGGATGGAGTGAAACGATGGGAAGAAGGCGAAGTCATGAGC(SEQ ID NO:3)

FRT_ARAB_REV_HR:

GCCAAAGCTCGCACAGAATCACTGCCAAAATCGAGGCCAATTGCAATCGCTTATACAGTCGAAGTTCCTATA(SEQ ID NO:4)

PCR反应条件：

/>

PCR参数	Q5高保真DNA聚合酶(NEB)
		初始变性	98℃持续30秒
变性	98℃持续10秒
		退火	65℃持续30秒
延伸	72℃持续30秒/1kb
		最终延伸	72℃持续2分钟
保持	4℃

所得到的PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分析，凝胶纯化并储存用于后续电穿孔至MG1655/pKD46电穿孔感受态细胞中。

MG1655细胞在琼脂平板上生长，并且将单菌落接种进行过夜培养。使用标准方案使细胞具有质粒转化能力。转化质粒pKD46[Datsenko,KA,BL Wanner(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.97(12):6640-5]，细胞在选择培养基上铺板，并在30℃下生长过夜。

将一个携带pKD46的MG1655菌落在DYT培养基AMP⁺²⁰⁰中于30℃并以180rpm摇动过夜培养。将稳定培养物在200ml新鲜DYT培养基中按1:200稀释，并在30℃下以180rpm摇动孵育。在600nm处测定OD，当其达到0.4时，用1.2％L-阿拉伯糖(16ml 15％阿拉伯糖原液)诱导培养物，并在37℃下以180rpm孵育1小时。然后立即将烧瓶放入冰水浴中。将培养物置于冰上20分钟，伴随偶尔搅拌；从这一时刻起，细胞始终保持冷藏。将细胞分配到冰上的4×50mlFalcon管中并保存在冰上。在4℃下以1000g离心10分钟至20分钟；上清液必须澄清并且沉淀物必须可见。如果上清液混浊，必须延长离心时间。一旦上清液变澄清，弃去上清液并将沉淀物悬浮于25ml双去离子冰水中。将2×50ml Falcon管中的内容物合并，并且在相同条件下再次离心。旋转后，如果上清液澄清，则将沉淀物各自悬浮于50ml的冰水中并重复离心。弃去上清液，将沉淀物悬浮于50ml冰冷的10％甘油(用DD水稀释)中。重复离心并弃去上清液。将沉淀物重新悬浮于0.5ml 10％甘油中。将两个重新悬浮的沉淀物合并在2ml预冷的Eppendorf管中并混合。1:100稀释溶液(10μl悬浮细胞+990μl 10％甘油)的OD 600应为0.4至0.6。以每管70μl至100μl的等分试样将感受态细胞保存在干冰中。用液氮快速冷冻并储存在-80℃下。

使用Gene Pulser(BioRad)将ISC构建体电穿孔至感受态MG1655/pKD46细胞中，如下所示：将1ng至10ng ISC PCR产物添加至100μl感受态大肠杆菌中，并且在预设条件下进行电穿孔(设置1或2)。细胞在37℃下在不含抗生素的DYT中恢复1小时。将转化的细胞涂布于DYT培养基+0.1％葡萄糖+15μg/ml氯霉素的琼脂平板上并在30℃下生长。在37℃下生长随后将导致pKD46质粒丢失，因为该pKD46质粒携带温度敏感的复制起点。

通过菌落PCR测试所得到的菌落，以验证插入基因组的转基因盒的左连接处和右连接处以及通过基因组PCR验证整个盒的存在。

PCR所用引物：

左连接处：PCR产物＝291bp

ARAC_FWD:GTCTATAATCACGGCAGAAAAGTCC(SEQ ID NO:5)

IntC3_REV:TCGCCTGTCTCTGCCTAATCC(SEQ ID NO:6)

右连接处：PCR产物＝397bp

CAT_FWD:CGCAAGGCGACAAGGTGCT(SEQ ID NO:7)

ARAB_REV:CCGCTTCCATTGACTCAATGTAGTC(SEQ ID NO:8)

基因组PCR(2.85kb)：

ARAC_FWD+ARAB REV

菌落PCR：

将1个菌落在50μl DYT培养基+0.1％葡萄糖+15μg/ml氯霉素培养基中稀释，2μl用作菌落PCR模板。

PCR反应：

PCR程序：

PCR参数	GoTaq Flexi DNA聚合酶(Promega)
		初始变性	95℃持续5分钟
变性	95℃持续1分钟
		退火	56℃持续30秒
延伸	72℃持续1分钟/1kb
		最终延伸	72℃持续5分钟
保持	4℃

通过琼脂糖凝胶电泳分析了连接处PCR产物和基因组PCR产物，如图2所示。分析的克隆对于转基因连接和全长基因组插入均呈阳性。通过测序验证PCR产物，显示与预测的基因组/构建体序列完全匹配。将改造的新菌株命名为MG1655-ISC。此时，保留了CAT基因作为转基因盒的一部分。通过在构建体中包含酵母Flp重组酶的FRT序列(图1)，在后期仍然可以选择通过瞬时Flp重组酶表达载体来去除CAT表达盒。

实施例2：使用改造的大肠杆菌菌株MG1655-ISC进行无缝载体生产

任何用于生产无缝载体的经改造的大肠杆菌菌株的关键参数是细胞倍增时间。通过测量600nm处的光密度来分析MG1655-ISC的生长速率，并且将该生长速率与变体MG1655菌株的生长速率进行比较，该变体MG1655菌株在阿拉伯糖基因座上携带相同的转基因表达盒，但不含有编码scIHF2的基因。后一种菌株被称为MG1655-IC，除了使用不同的转基因靶向PCR构建体，按照相同的方案与MG1655-ISC平行生成。

图3显示了生长速率分析的示例，并且表明基因组中存在scIHF2基因序列导致达到所需细胞密度的时间大幅缩短。这表现了大规模生产无缝载体的优势，因为它缩短了达到用于由阿拉伯糖诱导IntC3表达所需的细胞密度的孵育时间。

使用菌株MG1655-ISC进行无缝载体生产的一般工作流程如图4所示。简言之，通过常规细菌转化和选择，将具有标准细菌骨架并携带用于无缝载体生产的所需DNA有效负载的质粒转化至MG1655-ISC中，该标准细菌骨架的两侧有两个正向重复λ整合酶重组序列(称为att1和att2)。经转化的细胞在含有抗生素的液体LB培养基中生长，直到OD₍₆₀₀₎达到约1.0的值。在该时间点，通过向培养基中添加阿拉伯糖来诱导IntC3和scIHF2表达，并且将细胞在37℃下孵育额外的70至90分钟。MG1655-ISC中IntC3的诱导导致att1和att2之间的重组，从而生成二聚DNA连环体，该二聚DNA连环体由携带细菌骨架的第一DNA环以及携带DNA有效负载加上一个杂交att拷贝的第二DNA环组成(图4)。该连环的DNA环在大肠杆菌中被内源性2型拓扑异构酶分开，从而形成两个单独的DNA环(图4中未示出)。

通过阿拉伯糖诱导IntC3和scIHF2转基因表达后，通过标准程序从裂解的MG1655-ISC细胞中纯化游离DNA，并且通过使用合适的商业上可获得的限制性酶(其仅水解细菌骨架中的DNA)进行限制性消化来使细菌DNA环线性化。随后，通过与商业上可获得的噬菌体T5核酸外切酶一起孵育来消化线性化DNA和被污染的带切口的DNA分子(图4，下半部分)。剩余的完整共价闭合超螺旋无缝DNA载体可以通过例如苯酚/氯仿提取、醇沉淀并溶解在合适溶剂中来纯化。

实施例3：在MG1655-ISC中使用attL和attB重组位点变体进行微型无缝载体生产

为了证明MG1655-ISC在无缝载体生产中的广泛效用，使用标准方案对底物质粒pattPhae2(attL)(图5)进行转化。该重组底物携带在正向上相距约500bp的21bp的attB同源序列和121bp的attL同源序列。IntC3重组将产生两个DNA环：500bp的较小超螺旋微型无缝载体加上杂合attB序列，以及5.8kb的携带细菌骨架和其他序列的超螺旋DNA。

用pattPhae2(attL)转化的MG1655-ISC细胞用阿拉伯糖诱导70分钟并收获。分离游离DNA并且通过琼脂糖凝胶电泳分析重组产物。图6所示的结果表明，与底物DNA(泳道1)相比，IntC3表达的诱导产生大于90％的重组产物，这些重组产物在体内被内源性拓扑异构酶有效地解开，即两个重组产物DNA环不再是拓扑学连接的(泳道2)。释放的500bp超螺旋微型无缝载体(泳道2，图6)因其小尺寸而远离所分离DNA的其余部分迁移。Sca I(图5中的箭头)对底物DNA和重组产物的限制性消化证实，在阿拉伯糖诱导后，大于90％的底物已经在MG1655-ISC细胞内重组(泳道4和7，图6)。在核酸外切酶T5(Exo)存在的情况下，通过NdeI(仅在细菌骨架片段中进行切割)对从诱导细胞中分离出的DNA进行限制性消化，产生纯的超螺旋无缝载体DNA(泳道5和6，图6)。泳道3显示了在不进行Exo处理下用NdeI消化底物DNA作为对照。经测定，从100ml培养物中可以容易地生产约3μg的纯超螺旋微型无缝载体。

实施例4：在MG1655-ISC中使用attP和attB重组位点变体进行大型无缝载体生产

在证明菌株MG1655-ISC在无缝载体生产中的广泛效用的另一个实施例中，对底物质粒pEF1a-FLF8-Ires-Hygro进行转化(图7)。该重组底物携带在正向上相距约3kb的21bpattB同源序列(SEQ ID NO:14)和241bp attP同源序列(SEQ ID NO:15)。IntC3重组将产生较大的10.4kb超螺旋无缝载体，该无缝载体携带人凝血因子8-Ires-潮霉素表达盒(图7中的图谱)加上杂合attL序列。第二产物是3kb的携带细菌遗传元件的超螺旋DNA加上杂合attR序列。

用阿拉伯糖诱导经转化的MG1655-ISC细胞并收获。通过标准程序分离出游离质粒DNA并且通过琼脂糖凝胶电泳分析重组产物。用EcoRV消化的DNA获得的结果(图8)显示，与底物DNA(泳道2)相比，在体内诱导IntC3表达之前，几乎100％的质粒保持未重组(泳道3)，因此证明了经改造的阿拉伯糖操纵子中IntC3基因的超严格调控。阿拉伯糖诱导IntC3表达产生了大于70％的预测为10.4kb和3kb的重组产物(EcoRV消化，泳道5)。与ClaI(其仅在细菌DNA骨架中进行切割，参见图7中的图谱)一起孵育后，对回收的DNA进行限制性消化，产生了10.4kb的超螺旋无缝载体、线性化未重组底物(13.4kb)和线性化细菌骨架(3kb)(泳道6)。此外，10.4kb无缝载体是添加核酸外切酶T5至ClaI消化的DNA中后唯一剩余的产物(泳道7)。在这个实施例中，还观察到了一小部分无缝载体二聚体，其大小约为21kb。经测定，100ml培养物中可以生产60μg至90μg的纯超螺旋大型无缝载体。

本文对本发明进行了广泛且一般性地描述。落入一般性公开范围内的每个狭义种类和亚属分类同样构成本发明的一部分。这包括本发明的一般性描述，具有从该范围去除任何主题的附带条件或否定限制，无论本文是否具体描述了所删除的材料。其他实施方式在所附权利要求范围内。

本领域技术人员将容易理解，本发明非常适合于实现这些目的并获得所提到的目的和优点以及其中固有的那些。此外，对于本领域技术人员来说显而易见的是，在不脱离本发明的范围和精神的情况下，可以对本文公开的发明进行各种替换和修改。本文描述的组合物、方法、程序、处理、分子和具体化合物目前表示优选的实施方式，它们是示例性的并且不打算限制本发明的范围。本领域技术人员将意识到其中的变化和其他用途，这些变化和其他用途包含在由权利要求的范围限定的本发明的精神内。不应当将本说明书中先前公开文献的列表或讨论视为承认该文献是现有技术的一部分或者是公知常识。

本文示例性描述的本发明可以在本文未具体公开的任何一个或多个要素、一个或多个限制缺失的情况下适当地实践。因此，应当理解，虽然已经通过示例性实施方式和可选特征具体公开了本发明，但是本领域技术人员可以实施对本文公开的本发明实施的修改和变化，并且认为这样的修改和变化在本发明的范围内。

本文引用的所有文献和专利文献的内容通过引用以其整体并入。

序列表

<110> 南洋理工大学

<120> 用于生产无缝DNA载体的方法

<130> P122248

<150> SG10202102572X

<151> 2021-03-12

<160> 22

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2713

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 多转基因DNA序列ISC

<400> 1

ggaagaaggc gaagtcatga gcgccgggat ttacccccta acctttatat aagaaacaat 60

ggatattact gctacaggga cccaaggacg ggtaaagagt ttggattagg cagagacagg 120

cgattcgcaa tcactgaagc tatacaggcc aacattgagt tattttcagg acacaaacac 180

aagcctctga cagcgagaat caacagtgat aattccgtta cgttacattc atggcttgat 240

cgctacgaaa aaatcctggc cagcagagga atcaagcaga agacactcat aaattacatg 300

agcaaaatta aagcaataag gaggggtctg cctgatgctc cacttgaaga catcaccaca 360

aaagaaattg cggcaatgct caatggatac atagacgagg gcaaggcggc gtcagccaag 420

ttaatcagat caacgctgag cgatgcattc cgagaggcaa tagctgaagg ccatataaca 480

acaaaccatg tcgctgccac tcgcgcggca aagtcaaagg taaggagatc aagacttacg 540

gctgacgaat acctgaaaat ttatcaagca gcagaatcat caccatgttg gctcagactt 600

gcaatggaac tggctgttgt taccgggcaa cgagttggtg acttgtgcaa aatgaagtgg 660

tctgatatcg tagatggata tctttatgtc gagcaaagca aaacaggcgt aaaaattgcc 720

atcccaacag cattgcatat tgatgctctc ggaatatcaa tgaaggaaac acttgataaa 780

tgcaaagaga ttcttggcgg agaaaccata attgcatcta ctcgtcgcga accgctctca 840

tccggcacag tatcaaggta ttttatgcgc gcacgaaaag catcaggtct ttccttcgaa 900

ggggatccgc ctacctttca cgagttgcgc agtttgtctg caagactcta tgggaagcag 960

ataagcgata agtttgctca acatcttctc gggcataagt cggtcaccat ggcatcacag 1020

tatcgtgatg acagaggcag ggagtgggac aaaattgaaa tcaaatgaaa aacgaatggc 1080

tagcaccaag tcagaattga tagaaagact tgccacccag caatcgcaca ttcccgccaa 1140

gacggttgaa gatgcagtaa aagagatgct ggagcatatg gcctcgactc ttgcgcaggg 1200

tggaagcggc ggtcttacaa aagctgaaat gtcagaatat ctgtttgata agcttgggct 1260

tagcaagcgg gatgccaaag aactggttga actgtttttc gaagagatcc gtcgcgctct 1320

ggaaaacggc gaacaggtga aactctctgg ttttggtaac ttcgatctgc gtgataagaa 1380

tcaacgcccg ggacgtaacc cgaaaacggg cgaggatatt cccattacag cacggcgcgt 1440

ggtgaccttc agacccgggc agaagttaaa aagccgggtc gaaaacgctg gtgggggcga 1500

gcgtattgaa atccgcggtt tcggcagttt ctctttgcac taccgcgcac cacgtaccgg 1560

acgtaatccg aagactggcg ataaagtaga actggaagga aaatacgttc ctcactttaa 1620

acctggtaaa gaactgcgcg atcgcgccaa tatctacggt ggatcaggct gataaataaa 1680

acgaaaggct cagtcgaaag actgggcctt tcgttttatc ctattccgaa gttcctattc 1740

tctagaaagt ataggaactt cggcgcgcct acctgtgacg gaagatcact tcgcagaata 1800

aataaatcct ggtgtccctg ttgataccgg gaagccctgg gccaactttt ggcgaaaatg 1860

agacgttgat cggcacgtaa gaggttccaa ctttcaccat aatgaaataa gatcactacc 1920

gggcgtattt tttgagttgt cgagattttc aggagctaag gaagctaaaa tggagaaaaa 1980

aatcactgga tataccaccg ttgatatatc ccaatggcat cgtaaagaac attttgaggc 2040

atttcagtca gttgctcaat gtacctataa ccagaccgtt cagctggata ttacggcctt 2100

tttaaagacc gtaaagaaaa ataagcacaa gttttatccg gcctttattc acattcttgc 2160

ccgcctgatg aatgctcatc cggaattacg tatggcaatg aaagacggtg agctggtgat 2220

atgggatagt gttcaccctt gttacaccgt tttccatgag caaactgaaa cgttttcatc 2280

gctctggagt gaataccacg acgatttccg gcagtttcta cacatatatt cgcaagatgt 2340

ggcgtgttac ggtgaaaacc tggcctattt ccctaaaggg tttattgaga atatgttttt 2400

cgtctcagcc aatccctggg tgagtttcac cagttttgat ttaaacgtgg ccaatatgga 2460

caacttcttc gcccccgttt tcaccatggg caaatattat acgcaaggcg acaaggtgct 2520

gatgccgctg gcgattcagg ttcatcatgc cgtttgtgat ggcttccatg tcggcagaat 2580

gcttaatgaa ttacaacagt actgcgatga gtggcagggc ggggcgtaag gcgcgccatt 2640

taaatgaagt tcctattccg aagttcctat tctctagaaa gtataggaac ttcgactgta 2700

taaaaccaca gcc 2713

<210> 2

<211> 356

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 突变型 IntC3 重组酶

<400> 2

Met Gly Arg Arg Arg Ser His Glu Arg Arg Asp Leu Pro Pro Asn Leu

1 5 10 15

Tyr Ile Arg Asn Asn Gly Tyr Tyr Cys Tyr Arg Asp Pro Arg Thr Gly

20 25 30

Lys Glu Phe Gly Leu Gly Arg Asp Arg Arg Phe Ala Ile Thr Glu Ala

35 40 45

Ile Gln Ala Asn Ile Glu Leu Phe Ser Gly His Lys His Lys Pro Leu

50 55 60

Thr Ala Arg Ile Asn Ser Asp Asn Ser Val Thr Leu His Ser Trp Leu

65 70 75 80

Asp Arg Tyr Glu Lys Ile Leu Ala Ser Arg Gly Ile Lys Gln Lys Thr

85 90 95

Leu Ile Asn Tyr Met Ser Lys Ile Lys Ala Ile Arg Arg Gly Leu Pro

100 105 110

Asp Ala Pro Leu Glu Asp Ile Thr Thr Lys Glu Ile Ala Ala Met Leu

115 120 125

Asn Gly Tyr Ile Asp Glu Gly Lys Ala Ala Ser Ala Lys Leu Ile Arg

130 135 140

Ser Thr Leu Ser Asp Ala Phe Arg Glu Ala Ile Ala Glu Gly His Ile

145 150 155 160

Thr Thr Asn His Val Ala Ala Thr Arg Ala Ala Lys Ser Lys Val Arg

165 170 175

Arg Ser Arg Leu Thr Ala Asp Glu Tyr Leu Lys Ile Tyr Gln Ala Ala

180 185 190

Glu Ser Ser Pro Cys Trp Leu Arg Leu Ala Met Glu Leu Ala Val Val

195 200 205

Thr Gly Gln Arg Val Gly Asp Leu Cys Lys Met Lys Trp Ser Asp Ile

210 215 220

Val Asp Gly Tyr Leu Tyr Val Glu Gln Ser Lys Thr Gly Val Lys Ile

225 230 235 240

Ala Ile Pro Thr Ala Leu His Ile Asp Ala Leu Gly Ile Ser Met Lys

245 250 255

Glu Thr Leu Asp Lys Cys Lys Glu Ile Leu Gly Gly Glu Thr Ile Ile

260 265 270

Ala Ser Thr Arg Arg Glu Pro Leu Ser Ser Gly Thr Val Ser Arg Tyr

275 280 285

Phe Met Arg Ala Arg Lys Ala Ser Gly Leu Ser Phe Glu Gly Asp Pro

290 295 300

Pro Thr Phe His Glu Leu Arg Ser Leu Ser Ala Arg Leu Tyr Gly Lys

305 310 315 320

Gln Ile Ser Asp Lys Phe Ala Gln His Leu Leu Gly His Lys Ser Val

325 330 335

Thr Met Ala Ser Gln Tyr Arg Asp Asp Arg Gly Arg Glu Trp Asp Lys

340 345 350

Ile Glu Ile Lys

355

<210> 3

<211> 72

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物序列

<400> 3

actctctact gtttctccat acccgttttt ttggatggag tgaaacgatg ggaagaaggc 60

gaagtcatga gc 72

<210> 4

<211> 72

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物序列

<400> 4

gccaaagctc gcacagaatc actgccaaaa tcgaggccaa ttgcaatcgc ttatacagtc 60

gaagttccta ta 72

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> PCR引物

<400> 5

gtctataatc acggcagaaa agtcc 25

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> PCR引物

<400> 6

tcgcctgtct ctgcctaatc c 21

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> PCR引物

<400> 7

cgcaaggcga caaggtgct 19

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> PCR引物

<400> 8

ccgcttccat tgactcaatg tagtc 25

<210> 9

<211> 198

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> scIHF2

<400> 9

Met Ala Ser Thr Lys Ser Glu Leu Ile Glu Arg Leu Ala Thr Gln Gln

1 5 10 15

Ser His Ile Pro Ala Lys Thr Val Glu Asp Ala Val Lys Glu Met Leu

20 25 30

Glu His Met Ala Ser Thr Leu Ala Gln Gly Gly Ser Gly Gly Leu Thr

35 40 45

Lys Ala Glu Met Ser Glu Tyr Leu Phe Asp Lys Leu Gly Leu Ser Lys

50 55 60

Arg Asp Ala Lys Glu Leu Val Glu Leu Phe Phe Glu Glu Ile Arg Arg

65 70 75 80

Ala Leu Glu Asn Gly Glu Gln Val Lys Leu Ser Gly Phe Gly Asn Phe

85 90 95

Asp Leu Arg Asp Lys Asn Gln Arg Pro Gly Arg Asn Pro Lys Thr Gly

100 105 110

Glu Asp Ile Pro Ile Thr Ala Arg Arg Val Val Thr Phe Arg Pro Gly

115 120 125

Gln Lys Leu Lys Ser Arg Val Glu Asn Ala Gly Gly Gly Glu Arg Ile

130 135 140

Glu Ile Arg Gly Phe Gly Ser Phe Ser Leu His Tyr Arg Ala Pro Arg

145 150 155 160

Thr Gly Arg Asn Pro Lys Thr Gly Asp Lys Val Glu Leu Glu Gly Lys

165 170 175

Tyr Val Pro His Phe Lys Pro Gly Lys Glu Leu Arg Asp Arg Ala Asn

180 185 190

Ile Tyr Gly Gly Ser Gly

195

<210> 10

<211> 1071

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> IntC3编码序列

<400> 10

atgggaagaa ggcgaagtca tgagcgccgg gatttacccc ctaaccttta tataagaaac 60

aatggatatt actgctacag ggacccaagg acgggtaaag agtttggatt aggcagagac 120

aggcgattcg caatcactga agctatacag gccaacattg agttattttc aggacacaaa 180

cacaagcctc tgacagcgag aatcaacagt gataattccg ttacgttaca ttcatggctt 240

gatcgctacg aaaaaatcct ggccagcaga ggaatcaagc agaagacact cataaattac 300

atgagcaaaa ttaaagcaat aaggaggggt ctgcctgatg ctccacttga agacatcacc 360

acaaaagaaa ttgcggcaat gctcaatgga tacatagacg agggcaaggc ggcgtcagcc 420

aagttaatca gatcaacgct gagcgatgca ttccgagagg caatagctga aggccatata 480

acaacaaacc atgtcgctgc cactcgcgcg gcaaagtcaa aggtaaggag atcaagactt 540

acggctgacg aatacctgaa aatttatcaa gcagcagaat catcaccatg ttggctcaga 600

cttgcaatgg aactggctgt tgttaccggg caacgagttg gtgacttgtg caaaatgaag 660

tggtctgata tcgtagatgg atatctttat gtcgagcaaa gcaaaacagg cgtaaaaatt 720

gccatcccaa cagcattgca tattgatgct ctcggaatat caatgaagga aacacttgat 780

aaatgcaaag agattcttgg cggagaaacc ataattgcat ctactcgtcg cgaaccgctc 840

tcatccggca cagtatcaag gtattttatg cgcgcacgaa aagcatcagg tctttccttc 900

gaaggggatc cgcctacctt tcacgagttg cgcagtttgt ctgcaagact ctatgggaag 960

cagataagcg ataagtttgc tcaacatctt ctcgggcata agtcggtcac catggcatca 1020

cagtatcgtg atgacagagg cagggagtgg gacaaaattg aaatcaaata a 1071

<210> 11

<211> 261

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> attP重组位点

<400> 11

tctgttacag gtcactaata ccatctaagt agttgattca tagtgactgc atatcttgtg 60

ttttacagta ttaattagtc tgttttttat ccaaaatcta atttaatata ttgatattta 120

tatcatttta cgtttctcgt tcagcttttt tatactaagt tggcattata aaaaagcatt 180

gcttatcaat ttgttgcaac gaacaggtca ctatcagtca aaatacaatc attatttgat 240

ttcaattttg tcccactccc t 261

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> attB重组位点

<400> 12

ctgctttttt atactaactt g 21

<210> 13

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> attL重组位点

<400> 13

ctgctttttt atactaagtt ggcattataa aaaagcattg cttatcaatt tgttgcaacg 60

aacaggtcac tatcagtcaa aatacaatca ttatttgatt tcaattttgt cccactccct 120

<210> 14

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> attH4x重组位点

<400> 14

ctttatttca ttaagttg 18

<210> 15

<211> 271

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> attP4x重组位点

<400> 15

aattcctctg taacaggtca ctaataccat ctaagtagtt gattcatagt gactgcatat 60

gttgtgtttt acagtattat gtagtctgtt ttttatgcaa aatctaattt aatatattga 120

tatttatatc attttacgtt tctcgttcag ctttatttca ttaagttggc attataaaaa 180

agcattgctt atcaatttgt tgcaacgaac aggtcactat cagtcaaaat acaatcatta 240

tttgatttca attttgtccc actccctccc g 271

<210> 16

<211> 121

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> attL4x重组位点

<400> 16

ctttatttca ttaagttggc attataaaaa agcattgctt atcaatttgt tgcaacgaac 60

aggtcactat cagtcaaaat acaatcatta tttgatttca attttgtccc actccctccc 120

g 121

<210> 17

<211> 168

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> attR4x重组位点

<400> 17

aattcctctg taacaggtca ctaataccat ctaagtagtt gattcatagt gactgcatat 60

gttgtgtttt acagtattat gtagtctgtt ttttatgcaa aatctaattt aatatattga 120

tatttatatc attttacgtt tctcgttcag ctttatttca ttaagttg 168

<210> 18

<211> 595

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> scIHF2

<400> 18

atggctagca ccaagtcaga attgatagaa agacttgcca cccagcaatc gcacattccc 60

gccaagacgg ttgaagatgc agtaaaagag atgctggagc atatggcctc gactcttgcg 120

cagggtggaa gcggcggtct tacaaaagct gaaatgtcag aatatctgtt tgataagctt 180

gggcttagca agcgggatgc caaagaactg gttgaactgt ttttcgaaga gatccgtcgc 240

gctctggaaa acggcgaaca ggtgaaactc tctggttttg gtaacttcga tctgcgtgat 300

aagaatcaac gcccgggacg taacccgaaa acgggcgagg atattcccat tacagcacgg 360

cgcgtggtga ccttcagacc cgggcagaag ttaaaaagcc gggtcgaaaa cgctggtggg 420

ggcgagcgta ttgaaatccg cggtttcggc agtttctctt tgcactaccg cgcaccacgt 480

accggacgta atccgaagac tggcgataaa gtagaactgg aaggaaaata cgttcctcac 540

tttaaacctg gtaaagaact gcgcgatcgc gccaatatct acggtggatc aggct 595

<210> 19

<211> 647

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 氯霉素抗性基因

<400> 19

atggagaaaa aaatcactgg atataccacc gttgatatat cccaatggca tcgtaaagaa 60

cattttgagg catttcagtc agttgctcaa tgtacctata accagaccgt tcagctggat 120

attacggcct ttttaaagac cgtaaagaaa aataagcaca agttttatcc ggcctttatt 180

cacattcttg cccgcctgat gaatgctcat ccggaattac gtatggcaat gaaagacggt 240

gagctggtga tatgggatag tgttcaccct tgttacaccg ttttccatga gcaaactgaa 300

acgttttcat cgctctggag tgaataccac gacgatttcc ggcagtttct acacatatat 360

tcgcaagatg tggcgtgtta cggtgaaaac ctggcctatt tccctaaagg gtttattgag 420

aatatgtttt tcgtctcagc caatccctgg gtgagtttca ccagttttga tttaaacgtg 480

gccaatatgg acaacttctt cgcccccgtt ttcaccatgg gcaaatatta tacgcaaggc 540

gacaaggtgc tgatgccgct ggcgattcag gttcatcatg ccgtttgtga tggcttccat 600

gtcggcagaa tgcttaatga attacaacag tactgcgatg agtggca 647

<210> 20

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> FLP-FRT重组位点

<400> 20

gaagttccta ttctctagaa agtataggaa cttc 34

<210> 21

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 部分基因组序列

<400> 21

tcactgccaa aatcgaggcc aattgcaatc gccatcgttt cactccatcc aaaaaaacgg 60

gta 63

<210> 22

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 部分基因组序列

<400> 22

tacccgtttt tttggatgga gtgaaacgat ggcgattgca attggcctcg attttggcag 60

tga 63

Claims

1.一种在大肠杆菌体内生产无缝DNA载体的方法，所述无缝DNA载体包含感兴趣的DNA序列和噬菌体λ整合酶重组序列，所述方法包括：

(i)提供包含编码突变型噬菌体λ整合酶(IntC3)的核苷酸序列的大肠杆菌菌株，所述突变型噬菌体λ整合酶(IntC3)具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列或其功能变体或片段，其中所述核苷酸序列的表达由诱导型表达控制序列严格控制；

(ii)将包含感兴趣的DNA序列和两侧有两个正向重复λ整合酶重组序列的细菌骨架序列的细菌质粒转化至(i)中所述大肠杆菌菌株中，所述两个正向重复λ整合酶重组序列为所述突变型噬菌体λ整合酶的重组底物，其中所述细菌骨架序列包含选择标志物；

(iii)在对所述细菌质粒中包含的选择标志物进行选择的条件下培养经转化的大肠杆菌细胞；

(iv)诱导所述突变型噬菌体λ整合酶表达，以促进所述细菌质粒中两个正向重复λ整合酶重组序列的重组，从而获得二聚DNA连环体，所述二聚DNA连环体由携带所述细菌骨架的第一环状DNA分子以及携带所述感兴趣的DNA序列和噬菌体λ整合酶重组序列的第二环状DNA分子组成，所述噬菌体λ整合酶重组序列是所述两个正向重复λ整合酶重组序列的杂合体；以及

(v)将携带所述感兴趣的DNA序列和噬菌体λ整合酶重组序列的第二环状DNA分子分离出来。

2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(iv)包括将两个连环的环状DNA分子分开。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中步骤(v)包括使所述第一环状DNA分子线性化。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中将编码具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列或其功能变体或片段的突变型噬菌体λ整合酶的核苷酸序列稳定地整合至所述大肠杆菌菌株基因组中。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述诱导型表达控制序列是大肠杆菌阿拉伯糖操纵子，并且其中任选地，步骤(iv)中的诱导通过添加阿拉伯糖来触发。

6.根据权利要求5所述的方法，其中通过使用内源性araB基因的起始密码子作为编码突变型噬菌体λ整合酶的核苷酸序列的起始密码子，将编码具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列或其功能变体或片段的突变型噬菌体λ整合酶(IntC3)的核苷酸序列插入至大肠杆菌紧邻阿拉伯糖启动子下游的基因组阿拉伯糖操纵子中。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中(i)中所述大肠杆菌菌株还包含编码单链整合宿主因子2(scIHF2)的核苷酸序列。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述scIHF2具有SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列或其功能变体或片段。

9.根据权利要求7或8所述的方法，其中使所述IntC3和scIHF2包含在稳定整合至所述大肠杆菌菌株的基因组中的表达盒中，并且其中优选地，所述IntC3和scIHF2两者的表达由同一诱导型表达控制序列严格控制。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述表达盒还包含选择标志物，任选地两侧有随后被切除的重组位点。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述表达盒具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中步骤(v)中的分离包括消化线性化且带切口的DNA并且提取所述第二环状DNA分子。

13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述感兴趣的DNA序列包含一种或多种基因。

14.根据权利要求13所述的方法，其中所述一种或多种基因中的至少一种与表达控制序列可操纵地连接。

15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中包含所述感兴趣的DNA序列的第二环状DNA构建体不包含除所述噬菌体λ整合酶重组序列之外的细菌序列。

16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中为所述突变型噬菌体λ整合酶的重组底物的两个正向重复λ整合酶重组序列选自attP和attB、attL和attB、attL和attL或其功能变体。

17.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其中所述大肠杆菌菌株是包含编码突变型噬菌体λ整合酶(IntC3)的核苷酸序列的大肠杆菌菌株MG1655，所述突变型噬菌体λ整合酶(IntC3)具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列或其功能变体或其片段，其中所述核苷酸序列的表达由诱导型表达控制序列严格控制。

18.大肠杆菌细胞，其包含稳定整合至其基因组中的编码突变型噬菌体λ整合酶(IntC3)的核苷酸序列，所述突变型噬菌体λ整合酶(IntC3)具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列或其功能变体或片段，其中所述核苷酸序列的表达由基因组诱导型表达控制序列严格控制。

19.根据权利要求18所述的大肠杆菌细胞，其中将所述编码突变型噬菌体λ整合酶(IntC3)的核苷酸序列插入至大肠杆菌的基因组阿拉伯糖操纵子中。

20.根据权利要求19所述的大肠杆菌细胞，其中通过使用内源性araB基因的起始密码子作为编码突变型噬菌体λ整合酶的核苷酸序列的起始密码子，紧邻所述阿拉伯糖启动子的下游进行整合。

21.根据权利要求18至20中任一项所述的大肠杆菌细胞，其中所述大肠杆菌细胞还包含稳定整合至其基因组中的编码单链整合宿主因子2(scIHF2)的核苷酸序列。

22.根据权利要求21所述的大肠杆菌细胞，其中所述scIHF2具有SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列或其功能变体或片段。

23.根据权利要求21或22所述的大肠杆菌细胞，其中使所述IntC3和scIHF2包含在稳定整合至所述大肠杆菌菌株的基因组的表达盒中，并且其中优选地，所述IntC3和scIHF2两者的表达由同一诱导型表达控制序列严格控制。

24.根据权利要求18至23中任一项所述的大肠杆菌细胞，其中所述大肠杆菌细胞源自大肠杆菌菌株MG1655。

25.根据权利要求18至24中任一项所述的大肠杆菌细胞，其能够通过将编码突变型噬菌体λ整合酶(IntC3)的核苷酸序列稳定整合至大肠杆菌细胞，优选大肠杆菌菌株MG1655细胞的基因组中而获得，所述突变型噬菌体λ整合酶(IntC3)具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列或其功能变体或片段，所述核苷酸序列的这种表达由基因组诱导型表达控制序列严格控制。