WO2004087916A1

WO2004087916A1 - ｃＤＮＡ合成方法

Info

Publication number: WO2004087916A1
Application number: PCT/JP2004/004458
Authority: WO
Inventors: Seishi Kato; Tomoko Kimura; Kuniyo Ohtoko
Original assignee: Japan As Represented By Director General Of National Rehabilitation Center For Persons With Disabilities; Hitachi Instruments Service Co., Ltd.
Priority date: 2003-03-28
Filing date: 2004-03-29
Publication date: 2004-10-14
Also published as: US20060246453A1; CA2520811C; EP1616947B1; EP1616947A1; CA2520811A1; JPWO2004087916A1; US8067205B2; JP4517114B2; EP1616947A4

Abstract

mRNAのキャップ構造に隣接するヌクレオチドからの連続配列を有するcDNAを合成する方法であって、(i)キャップ構造を有するmRNAを含むRNA混合物に、二本鎖DNAプライマーをアニールする工程、(ii)二本鎖DNAプライマーから逆転写酵素により第一鎖cDNAを合成してmRNA/cDNAヘテロデュプレックスと二本鎖DNA プライマーの連結体を調製する工程、および(iii)mRNA/cDNAヘテロデュプレックスと二本鎖DNAプライマーの連結体のcDNAを含むDNA鎖の3'端と5'端を、リガーゼを用いて連結し環状化する工程、を含む方法。微量のRNAから、少ない工程で、転写開始点ヌクレオチドからの連続配列を有する完全長cDNAを効率的に合成することを可能とする。

Description

明細書

cDNA合成方法

技術分野この出願の発明は、 cDNAの合成方法に関するものである。さらに詳しくは、この出願の発明は、 mRNA のキャップ構造に隣接するヌクレオチドからの連続配列を有する cDNA を、簡便かつ高効率で合成する新しい方法に関するものである。 .

背景技術ゲノムプロジェクトによって、ヒト、マウス、イネ、線虫、酵母など様々な生物の全遗伝子情報を網羅するゲノム DNA (染色体 DNA) の全長配列がほぼ決定された。これらのゲノムの全長配列から期待されることは、遺伝子がコードしている蛋白質の一次構造に関する情報と、遺伝子の発現を調節している発現制御領域（プロモーター、ェンハンサ一、サブレッサー等) に関する情報である。これら二つの情報をゲノム配列から抽出するためには、染色体 DNA の遺伝子領域から転写される mRNAの配列情報が必須であるが、この mRNAの配列情報を解析するためには、 mRNA に相補的な DNA ( complementary DNA： cDNA) が通常用いられている。特に、前記二つの情報を得るためには、遺伝子転写領域から正確に転写され、かつ、蛋白質コード領域の全てを含む mRNA から合成された cDNA (完全長 cDNA) を取得する必要がある。通常、完全長 cDNA に対しては、二つの条件が設定されている。一つは、ゲノム DNA の転写開始点から始まる配列を有することである。転写開始点から正しく転写された mRNAの 5'端には「キャップ構造」が付加される。このキヤップ構造は、 7 ? メチルグアノシン（m ⁷ G) が転写開始点ヌクレオチドに 5 '-5'三リン酸橋を介して結合したものであり、このキャップ構造を有する mRNA に対して相補的な cDNA は完全長 cDNA の一つの条件を満たすことになる。もう一つの指標は、 mRNA における「ポリ（A)テール」の存在である。このポリ（A)テ一ルは、ゲノム DNAから転写された mRNA の 3 '端に核内で付加される数十から 200 個のアデニン (A)連続配列である。従って、 5'側にキャップ構造を有し、 3' 側にポリ（A)テールを有する mRNAを铸型として正確に合成された cDNAは、完全長 cDNA の二つの条件（転写開始点から始まり、蛋白質コード領域の全てをカバーする）を満たすことになる。 cDNA は、 mRNA を錶型として逆転写反応により合成することができるが、染色体 DNA から転写された mRNA は細胞内で、あるいは細胞外への抽出および DNA鎖への合成過程で様々な分解反応に曝されるため、完全長 cDNAの合成は容易ではない。また、 mRNA を錡型とする逆転写反応は、 mRNA の 3 '側にプライマーオリゴヌクレオチドをァニールさせ、このプライマーから mRNA の 5' 方向へ DNA鎖 (第一鎖 cDNA) を合成する。従って、例えば、ポリ（A)テールにプライマー（オリゴ dT) をァニールすれば、ボリ（A)テールをカバ一する cDNA は比較的容易に得ることができる。しかしながら、この方法は、プライマーからキヤップ構造までの完全長 cDNA 合成を保証しない。 mRNA が分解していたり、 DNA 鎖の合成反応が途中で中断することが頻繁に生じるためである。事実、現在までに EST ( Expressed Sequence Tag) として膨大な数の配列情報が報告されているが、これらは分解した mRNA から生成した不完全 cDNA や、 DNA 合成反応が中断された不完全 cDNAに由来するものが大半である。そこで、 mRNA の 5'端に存在するキャップ構造までの配列を含む完全長 cDNAを合成する方法が数多く提案されている。これらの方法は、原理に基づき次の 4つに大きく分類することができる。 )テーリング法キャップ部位まで伸長した第一鎖 cDNA に、末端転移酵素によってホモオリゴマーテールを付加する方法であり、 okayama- Berg 法（非特許文献 1 ) や

Pruitt法（非特許文献 2) がこれに含まれる。付加したテールの数を厳密に制御することができないため、数が多すぎると塩基配列の解析が困難になる等の問題点を有している。

逆転写酵素の末端転移酵素活性によって第一鎖 cDNA の 3'端に付加した dC テールを利用する鍩型スィッチ法（特許文献 1 ) もこのテーリング法に含まれる。この際、付加される dCの数は、 3〜5個と記載されている（非特許文献 3) 。 (2)リンカ一ライゲーシヨン法

第一鎖 cDNAを合成後、アル力リ処理や RNaseH処理によって mRNAを分解除去した後、一本鎖 cDNA の 3 '端に、配列既知の一本鎖オリゴヌクレオチドリンカーを T4 RNAリガ一ゼを用いて連結する方法である（非特許文献 4) 。一本鎖 cDNAが二次構造を形成するため高品質の cDNA ライプラリーを作製するには向かない。

(3)オリゴキヤッビング法

キャップ構造をオリゴマーで置換する方法である。オリゴマーとして、 RNA オリゴマ一 (非特許文献 5) や DNA-RNAキメラオリゴマ一を用いる方法 (例えば、この出願の発明者らによる特許文献 1、非特許文献 6) が報告されている。原理的には、完全長 cDNAのみが合成されるはずであるが、約 5- 10 g という多量のポリ（A)+RNA を必要とし、 mRNA を処理する工程が多く、この段階で分解された mRNAから合成された cDNAが含まれる場合もある。 mRNAの分解を抑えるために、全 RNA を出発材料とすることにより、完全長率を 90 %以上とした例もあるが、工程数は変わらない（特許文献 2) 。

過ヨウ素酸酸化反応によってキャップ構造の糖を開裂した後、合成オリゴマーを付加する方法（特許文献 3) もこの方法に含まれる。

(4)キヤップトラッビング法

キャップ構造を有する mRNA を選別して铸型とする方法であり、抗キャップ抗体によって選別した mRNA を錡型にする方法（非特許文献 7) や、過ヨウ素酸酸化反応によってキャップ構造の糖を開裂した後、ピオチンを付加し、ァビジン固定化担体で選別した mRNA を鐯型として用いる方法（非特許文献 8) などがある。特許文献 1：米国特許第 5,962 ,272号

特許文献 2：特許 3337748号

特許文献 3：国際公開第 01 /04286号パンフレット

特許文献 4：米国特許第 6,022,715号

非特許文献 1： Okayama, H. and Berg, P. Mol. Cell. Biol. 2 : 161- 170, 1982. 非特許文献 2： Pruitt, S.C. , Gene 66 : 121 - 134, 1988.

非特許文献 3： CLONTECHniques, July 1997， p.26.

特 §午文献 4： Edwards, J.， Delort, J. , and Mallet, J. Nucleic Acids Res.

19 :5227-5232, 1991.

非特許文献 5： Maruyama, K and Sugano, S. Gene 138: 171- 174， 1994. 非特許文献 6： Kato et al.， Gene 150:243-250 , 1994.

非特許文献 7： Edery, I， Chu, L.L. , Sonenberg, Ν·， and Pelletier, J. Mol.

Cell. Biol. 15 :3363-3371， 1995.

非特許文献 8： Carninci et al.， Genomics 37:327-336 , 1996.

発明の開示前記のいずれの従来方法によっても完全長 cDNA の合成は可能である。しかしながら、合成された cDNA のうち、完全長 cDNAが占める割合がどれだけ多くとも、分解した mRNA に由来する不完全 cDNAや、 DNA 合成が途中で中断して生成した不完全 cDNA も必ず含まれる。このため、合成された cDNAがキヤップ構造を有する完全長 mRNA に由来するものであるか否かを判定する必要がある。一般的には、同じ 5'端配列を有するクローンが複数個存在すれば、それらは完全長 mRNA に由来するものである可能性は高いが、断定はできない。とりわけ、複数の転写開始点を有する遺伝子の場合には、完全長 mRNA に由来する cDNA クローンであるか、 5'端が欠失した分解産物由来のクローンであるかを決定することは極めて困難である。従って、完全長 cDNA を高い割合で合成し、かつ転写開始点から始まる配列を有していることを識別することのできる cDNA合成方法が求められている。また、前記のいずれの従来方法も、多くの工程を必要とするという問題点を有している。例えば、特許文献 1のオリゴキヤッピング法は、確実にキャップ部位からの塩基配列を含む cDNA を合成可能であるという点において優れた方法ではあるが、 cDNAの合成までに 8工程を要する。工程の増大は、 cDNAの合成収率の低下や、時間や労力、コストの増加といった問題を引き起こす。さらに、従来法のいくつかは PCR による増幅工程を含んでいる (非特許文献 4、 5) 。しかしながら、 PCR に用いる DNA ポリメラーゼはポリメラ一ゼ反応時に铸型と異なるヌクレオチドを取り込む頻度が高いため、 cDNA配列中に人工的な変異を生成するという問題点を有していた。従って、微量の RNAから、 PCRを使用せずに少ない工程で完全長 cDNAの合成を可能とする方法が求められていた。この出願の発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであり、以下の条件：

( 1) l gオーダーの全 RNAを出発材料とすること；

(2) PCRを使用しないこと；

(3) できるだけ少ない工程であること；

(4) 転写開始点ヌクレオチドからの連続配列を有することが保証された完全長 cDNAを 90%以上の高収率で合成すること、

を満たす方法を提供することを課題としている。従来方法の中には、これらの要件をすベて満たすものはない。前記の課題を解決するための第 1 の発明は、 mRNA のキャップ構造に隣接するヌクレオチドからの連続配列を有する cDNAを合成する方法であって、

(i) キャップ構造を有する mRNAを含む RNA混合物に、二本鎖 DNAプライマーをァニールする工程、

(ii) 二本鎖 DNA プライマーから逆転写酵素により第一鎖 cDNA を合成して mRNA/cDNA ヘテロデュプレックスと二本鎖 DNA プライマーの連結体を調製する工程、および

(iii) mRNA/cDNA ヘテロデュプレックスと二本鎖 DNA プライマ一の連結体の cDNAを含む DNA鎖の 3'端と 5'端を、リガーゼを用いて連結し環状化する工程、

を含むことを特徵とする方法である。この第 1発明の方法においては、キヤップ構造を有する mRNA が細胞抽出物中に含まれていること、またはキヤップ構造を有する mRNA がインビトロ転写によって合成されたものであることをそれぞれ好ましい態様としている。またこの第 1発明の方法においては、二本鎖 DNAプライマーのプライマ一配列が、キャップ構造を有する mRNA の部分配列に相補的な配列を含むこと、またはキャップ構造を有する mRNAのポリ（A)配列に相補的なオリゴ dTを含むことをそれぞれ好ましい態様としている。さらにこの第 1 発明の方法においては、リガーゼが T4 RNA リガーゼであることを別の好ましい態様としている。この第 1 発明の方法においては、工程 (ii)と工程 (iii)の間に、 mRNA/cDNA へテロデュプレックスと二本鎖 DNA プライマーの連結体を制限酵素で切断することにより、二本鎖 DNAプライマ一の端部に 5'突出末端あるいは平滑末端を生成する工程 (ii')を含むことを別の好ましい形態としている。第 2発明は、前記第 1発明の方法に加え、さらに以下の工程：

(iv) mRNA/cDNAヘテロデュプレックスと二本鎖 DNAプライマ一の連結体の RNA鎖を DNA鎖に置換して第二鎖 cDNAを合成する工程、

を含むことを特徴とする cDNA合成方法である。この第 2発明の方法においては、二本鎖 DNAプライマーが複製オリジン、または複製オリジンと cDNA 発現用プロモーターを含んでいることを好ましい態様としている。この第 2 発明の方法によって、合成された二本鎖 cDNA を含むクローンが得られる。この第 2発明の方法は、さらには以下の工程：

(v) 第一鎖 cDNAと第二鎖 cDNAとからなる二本鎖 cDNAをべクタ一 DNAの一部とする工程、

を含むことを別の好ましい態様としている。これによつて、合成された二本鎖 cDNAがべク夕一にクローニングされる。第 3発明は、前記第 2発明の方法によって合成された二本鎖 cDNAを含むクローンの集団であって、 5'端にヌクレオチド (dT)n dG (n = 0~ 5) を有し、これに連続して mRNA のキャップ構造に隣接するヌクレオチドからの連続配列を有する cDNAのクローンを 60%以上含むことを特徴とする cDNAライブラリーである。第 4発明は、前記第 3発明の cDNAライブラリーのクローンから、 mRNAのキャップ構造に隣接するヌクレオチドからの連続配列を有する cDNA のクロ一ンを選択する方法であって、 5'端ヌクレオチドが（dT)n dG (n= 0〜5) である cDNAを含むクロ一ンを目的クローンとする方法である。 -. 第 5 発明は、プライマ一部分がオリゴ（dT) n (n= 15〜100) からなり、プライマ一側の末端部分に 8塩基認識制限酵素切断部位 RE 1 を有し、もう一方の末端部に 8塩基認識制限酵素切断部位 RE2 と 5'突出末端あるいは平滑末端を生成する制限酵素部位 RE3を有する二本鎖 DNAプライマーである。第 5発明の二本鎖 DNAプライマ一は、複製オリジン、または複製オリジンと cDNA発現用プロモー夕一を含んでいることを好ましい態様としている。そして、この第 5発明の二本鎖 DNAプライマーの具体例は、配列番号 2の塩基配列を有する pGCAP I O由来のベクタープライマ一である。第 6発明は、二本鎖 DNAプライマー、逆転写酵素と反応緩衝液、 T4 RNA リガ —ゼと反応緩衝液'、キャップ付加モデル mRNAを含む cDNA合成用試薬キットである。前記のとおりの発明は、少なくとも

(i) mRNAへの二本鎖 DNAプライマ一のァニール、

(ii) 第一鎖 cDNA の合成による mRNA/cDNA ヘテロデュプレックスと二本鎖 DNAプライマ一の連結体の調製、および

(iii) mRNA/cDNA ヘテロデュプレックスと二本鎖 DNA プライマ一の連結体の cDNAを含む DNA鎖の 3 '端と 5'端の連結、

という三段階の工程によって、 mRNA のキャップ構造に連続する塩基配列を有する cDNAを高効率で合成する方法である。すなわちこの発明は、キャップ構造を有する mRNA が铸型となる場合には、前記工程 (ii)によって、キャップ構造の塩基が「G」の場合には「dC」 [または 5'-dC(dA)n-3 '(n= l -5)] が第一鎖 cDNA の 3，端に付加されることを見いだして完成された。キャップ構造の塩基が「A」の場合には「dT」 [または 5'- dT(dA)n-3'(n= l-5) ] が第一鎖 cDNAの 3'端に付加されることから、付加されるヌクレオチドはキャップ構造の塩基に相補的な塩基を有するものであることが示された。また、キャップ構造を有さない RNA を铸型にした場合には、第一鎖 cDNA の 3 '端に余分なヌクレオチドの付加は認められなかった。したがって、 cDNA の 5'端に余分な「dG」 [または 5'- (dT)n dG -3'(n= l-5)] が存在する場合には、この cDNAはキヤップ構造を有する mRNAに由来する完全長 cDNAであると判定できる。逆転写酵素の反応条件によっては、余分な「dG」が 2個以上付加する場合もあるので（非特許文献 3) 、一般的には cDNAの 5'端に (dN)n dG (dNは dTまたは dG、 n= 0〜5) が存在する場合には、この cDNAはキヤップ構造を有する mRNAに由来する完全長 cDNAであると判定できる。ただし、余分な「dG」が 2個以上付加する場合、どれが余分な「dG」なのか判定が困難なので、実施例のように余分な「dG」が 1個付加する条件で行なうのが好ましい。なお、铸型スィッチ法では 3〜5 個の dC が付加されると記載されているが (非特許文献 3) 、この発明の実施例の条件下においては、そのような複数個の dC 付加は認められなかった。また、逆転写酵素の末端転移酵素様活性により、第一鎖 cDNA の 3'端に優先的に dC がー個付加されるという報告があるが ( Schmidt, W.M. and Mueller, M.W. ' Nucleic Acids Res. 27:e31 , 1999) 、その機構に関する報告はない。さらに、 RNA/DNA ヘテロデュプレックス（この発明におけるキヤップ構造を有さない RNA/cDNAヘテロデュプレックスに相当する）に逆転写酵素を作用させると、 DNAの 3'端の 90%に一 j面のヌクレオチド ( 「dA」あるいは「dG」あるいは「dC」あるいは「dT」 ) が付加するという幸艮告カあるが ( Chen, D. and Patton, J.T. , BioTechniques 30:574-582， 2001 ) 、この発明の実施例の条件下においては、そのような付加はほとんど認められなかった。なお、この発明において、「ヌクレオチド」とは、プリンまたはピリミジンが糖に /3 -N-グリコシド結合したヌクレオシドのリン酸エステル（ATP、 GTP、 CTP、 UTP；または dATP、 dGTP、 dCTP、 dTTP) を言う。以下の説明において、前記のヌクレオチドはそれぞれ単に「A」、「G」、「C」、「U」、または「dA」、「dG」、「dC」、「dT」と記載することがある。また「相補的」とは、前記ヌクレオチドの「A」または「dA」と「U」または「dT」、「G」または「dG」と「C」または「dC」との水素結合による対合を意味する。また、「二本鎖 DNAプライマ一」とは、二本鎖 DNAの片方の DNA鎖の 3，端が突出しており、この突出した部分の塩基配列が铸型 mRNA 配列に相補的な塩基配列を有するものを言う。この突出した部分は、铸型 mRNA にハイブリダィズし、逆転写酵素による第一鎖 cDNA 合成時のプライマ一として働く。二本鎖 DNAが複製オリジンを有するものを、特に「ベクタ一プライマー」と言う。またさらに、この発明において「キャップ構造を有する mRNA」は、ゲノム DNAからの転写産物 mRNAの 5'端に、メチル化されたグァニン（G)を有するグァノシンが 5，-5'三リン酸結合 (mG_P5'-5'pp) した分子であり、例えば G の第 7位がメチル化されたキャップ構造の場合には以下の構造：

5'-m7GNiN₂N₃N₄N₅—— N_m- 3'： (a)

(なお、 Nは A、 G、 Cまたは U、 mは 50以上の正数)

を有している。この発明における「mRNA のキャップ構造に隣接するヌクレオチドからの連続配列を有する cDNA」とは、前記の mRNA構造 (a)における N Nm配列に相補的な cDNA の 3，端に 5'-dC(dA)n-3' ( n=0-5 ) (より一般的には、 5'- dC(dN)n-3' ( dN は dA または dC、 n = 0 ~ 5) ) が付加した cDNA (第一鎖 cDNA) ：

3'-(dA)ndCdNidN₂dN₃dN₄dN5 dN_m-5'： (b)

(なお、 dNは dA、 dG、 dCまたは dT)

と、この cDNA(b)に対してさらに相補的な cDNA (第二鎖 cDNA) ：

5'-(dT)ndGdNidN₂dN₃dN₄dN₅—— dN_m- 3，：（c)、

および cDNA(b) / (c)のデュプレックス（二本鎖 cDNA) を全て意味する。ただし、単に「cDNA」と言う場合には二本鎖 cDNAを言い、その塩基配列について言及する場合には、前記構造 (c)の第二鎖 cDNAのものを言う。また、前記の mRNA構造 (a)におけるは、転写開始点のヌクレオチドであことから、「mRNA のキャップ構造に隣接するヌクレオチドからの連続配列を有する cDNA」とは、「転写開始点ヌクレオチドからの連続配列を有する cDNA」と定義することもできる。以下の説明においては、「mRNA のキャップ構造に隣接するヌクレオチド (転写開始点ヌクレオチド）からの連続配列を有する cDNAj を、「キャップ連続 cDNA」と記載することがある。また、このキャップ連続 cDNA のうち、特に mRNAのポリ（A)配列までを含むものを「完全長 cDNA」と記載することがある。さらに、キャップ構造に隣接するヌクレオチド（前記の構造 (b)または (c)における少なくとも dN を含まない cDNA を「キャップ非連続 cDNA」と記載することがある。またさらに、「キャップ構造を有する mRNA」を「キャップ (+)mRNAJ 、「キャップ構造を持たない mRNA」を「キャップ (-) mRNA」、キヤップ (+)mRNAからキャップ構造を除去したものを「脱キャップ mRNA」と記載することがある。この発明におけるその他の用語や概念は、発明の実施形態の説明や実施例において詳しく規定する。またこの発明を実施するために使用する様々な技術は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。例えば、この発明の造伝子工学および分子生物学的技術は Sambrook and Maniatis, in Molecular Cloning- A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989 ; Ausubel, F. M. et al. , Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y, 1995等に記載されている。

図面の簡単な説明図 1は、この発明の基本工程を示した模式図である。図 2 は、この発明のベクタープライマーの一般的な構造を例示した模式図である。図 3 は、この発明の pGCAPl 並びに pGCAP l ベクタ一プライマ一の構造を例示した模式図である。図 4は、この発明の pGCAP IO並びに pGCAPI Oベクタープライマーの構造を例示した模式図である。

発明を実施するための最良の形態第 1の発明は、キャップ連続 cDNA (第一鎖 cDNA) を合成する方法であって、以下の工程 (i)、 (ii)および (iii)を必須として含むことを特徴としている (図 1 参

工程 (i)：キヤップ構造を有する mRNAを含む RNA混合物に、二本鎖 DNAプライマ一をァニールする。工程）：二本鎖 DNAプライマ一から逆転写酵素により第一鎖 cDNAを合成して mRNA/cDNAヘテロデュプレックスと二本鎖 DNA プライマーの連結体を調製する。工程（iii)： mRNA/ cDNA ヘテロデュプレックスと二本鎖 DNA プライマーの連結体の cDNA を含む DNA鎖の 3 '端と 5'端を、 ύガーゼを用いて連結し環状化する。工程 (i)において、「キャップ付加 mRNAを含む RNA混合物」は、実質的にキヤップ付加 mRNA のみからなるものであってもよく、その他に、例えば「キヤップ (- )mRNA」および/または「他の RNA 分子（例えば rRNA、 tRNA 等）」を含んでいてもよい。このような RNA 混合物は、単細胞真核生物由来のものであってもよく、多細胞真核細胞由来のものであってもよい。またこの RNA混合物は、 DNA を铸型としてインビトロ転写により合成されたものでもよく、あるいは細胞抽出物としての全 RNAであってもよい。この工程 (i)において、 RNA混合物は、例えば全 RNAの場合は 1 /i g以下でも cDNAの合成は可能であるが、好ましくは I n 以上を使用する。細胞から抽出される全 RNA の場合、 mRNA は 2- 3%であり、この発明の方法ではこのような少量の mRNAを含む全 RNAからキヤップ連続 cDNAや完全長 cDNAを合成することが可能である。工程 (i)で使用する「二本鎖 DNAプライマー」は、その 3'突出末端として「プライマ一配列」を備えている。この場合のプライマー配列は、例えば、対象となるキャップ付加 mRNA の部分配列情報が公知の場合は、この公知配列に基づいて公知の化学合成法（例えば、 Carruthers, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 47:41 1-418， 1982; Adams, J. Am. Chem. Soc. 105:661 , 1983; Belousov, Nucleic Acid Res. 25:3440-3444, 1997; Frenkel, Free Radic. Biol. Med. 19:373-380, 1995; Blommers, Biochemistry 33:7886- 7896, 1994; Narang, Meth. Enzymol. 68:90, 1979 ; Brown, Meth. Enzymol. 68: 109, 1979; Beaucage, Tetra. Lett. 22 : 1859, 1981 ; 米国特許第 4,458,066 号に記載されているような方法など）により作製することができる。例えば公知の EST (Expressed Sequence Tag) 配列は cDNAの 3，側部分配列がほとんどであるが、これらの配列に基づいて作製したプライマ一配列 ¾用いることによって、その EST配列より 5，側のキャップ連続 cDNAを取得することができる。また、 mRNAのポリ（A) 配列に相補的なオリゴ dTを含むプライマーを使用することもできる。オリゴ dT を構成する連続した dT の数は、 30〜70 個程度が好ましく用いられる。このようなオリゴ dTプライマ一の使用によって、ポリ (A)部位までを含むキャップ連続 cDNA (完全長 cDNA) を取得することができる。一方、このような二本鎖 DNA プライマーのプライマー配列の他端部は、特に制限はなく、任意の二本鎖 DNA とすることができるが、後の工程においてベクター DNAへの挿入連結を容易とするように、ベクター DNAのクロ一ニングサイトへの連結末端を端部に備えるようにすることが好ましい。工程 (ii)においては、 mRNA にァニールした二本鎖 DNA プライマ一に逆転写酵素を作用させ、二本鎖 DNAプライマーの 3'端から mRNA の 5'方向に相補的な cDNA '鎖を合成する。この工程により、 mRNA/cDNAヘテロデュプレックスと二本鎖 DNA プライマ一の連結体が形成される。この連結体では、 mRNA/cDNAヘテロデュプレックスの cDNA鎖の一端と二本鎖 DNAプライマ一の片側鎖の一端が連結している。またこの工程 (ii)で生成される mRNA/cDNA ヘテロデュプレックスの cDNAは、キャップ (+)mRNAに相補的で、かつ 3'端に dC または 5'- dC(dA)n-3'を付加したキャップ連続 cDNA、またはキャップ（- )mRNAに由来するキヤップ非連続 cDNAである。逆転写酵素としては、 M- MLV (Moloney murine leukemia virus)や AMV (avian myeloblastosis virus)由来の逆転写酵素が利用できるが、内在性の RNaseH活性を無くしたものが好ましい。この工程 (iii)におけるリガーゼとしては、各種の DNAリガ一ゼまたは RNAリガーゼを適宜に選択して使用できるが、好ましくは T4 RNA リガ一ゼを使用する。なお、 T4 RNA リガーゼによって、 RNA にハイブリダィズさせた 2本のォリゴデォキシヌクレオチド同士を連結する方法 (米国特許第 6,368,801 号）が報告されているが、 mRNA/cDNA ヘテロデュプレックスに二本鎖 DNA を連結した例はない。また、ライゲ一ションは、 mRNA/ cDNA ヘテロデュプレックスと二本鎖 DNA プライマーの連結体を制限酵素で切断することにより、二本鎖 DNA プライマーの端部に 5'突出末端あるいは平滑末端を生成させる工程 (ii')を行なった後、行なうことも好ましい。工程は一つ増えるが、 cDNAインサートの入っていないべクタ一だけのバックグラウンドが減少することと、ライゲーション効率が上がるといった利点がある。また、 mRNA/cDNA ヘテロデュプレックスのキャップ構造を、例えばタバコ酸性ピロホスファタ一ゼを用いて除去してから行っても良いが、そのキャップ構造を残存させたまま行ってもよい。さらに、 mRNA/cDNA ヘテロデュプレックスの mRNA を分解したり、あるいは mRNA 鎖を DNA鎖に置換してから.ライゲ一シヨンを行なってもよい。ただし、このェ程で生成する mRNA分解産物が、 cDNAの 3'端に付加する場合があるので、注意を要する。以上の方法によって、

3'-(dA)ndCdNidN₂dN₃dN4dN₅——氣 -5'： (b)

からなるキャップ連続 cDNA (第一鎖 cDNA) を一部とする環状 DNA鎖が合成される。このようにして得られたキャップ連続 cDNA は、例えばその配列解析とゲノム配列との比較によって、遺伝子の転写開始点やその上流の発現制御領域を特定するために情報を提供する。以上の方法により得られたキャップ連続 cDNA (第一鎖 cDNA) は、第 2発明の工程（iv)によって二本鎖 cDNA へと合成される。この工程（iv)は、例えば、 RNaseH、大腸菌 DNA ポリメラーゼ I、大腸菌 DNA リガ一ゼ等を作用させて RNA鎖を DNA鎖に置換する方法によって行うことができる。この工程はかならずしも試験管内で行なう必要はなく、例えば、二本鎖 DNA プライマ一として「ベクタープライマー」を用いれば、ライゲ一シヨン後、大腸菌などに導入し、細胞内で RNA鎖を DNA鎖に置換してもよい。また第 2発明の方法では、二本鎖 cDNA を、工程 (V)によってベクタ一にクロ —ニングすることもできる。例えば、二本鎖 DNA部分に備えられた制限酵素部位で切断後、プラスミドベクタ一やファージベクターなどに挿入するなどして、配列解析やその発現産物の産生等に使用することができる。なお、この第.2発明の方法では、二本鎖 DNAプライマーとして「ベクタ一プライマー」を用いれば、他のベクターへの挿入工程を省略することができるので好ましい。ベクタ一プライマーは、例えば、環状ベクター DNA を適当なクロ一ニングサイトで制限切断し、その 3'端に mRNAの一部配列に相補的なプライマ —配列を連結して 3'突出末端とすることによって作製することができる。また、完全長 cDNA を合成するためには、 3'端にオリゴ dT (好ましくは、 30 ~ 70 個）を連結すればよい。 3 '突出末端としてオリゴ dT を有する二本鎖 DNA ブライマ一は、例えば完全長 cDNA ライブラリーを効率良く作製するなどの目的には特に好ましい。また、 cDNAを切り出して他のベクターに組み換えることを容易にするために、二本鎖 DNA部分に 8塩基認識の制限酵素部位を備えることも好ましい。さらにまた、二本鎖 DNA部分に複製オリジンを備えるようにすることも好ましい。複製オリジンとしては、大腸菌などの原核細胞や、酵母、昆虫細胞、哺乳動物細胞、植物細胞などの真核細胞内で機能するものが用いられる。これによって、最終的に得られた cDNA ベクターをこれらの細胞に導入して、複製することが可能となる。さらに、 cDNAをインビトロ転写 ·翻訳により試験管内で発現させたり、真核細胞内に導入して発現させたりできるように、二本鎖 DNA 部分にプロモータ一、スプライシング領域、ポリ（A)付加部位などを備えることも好ましい。このような二本鎖 DNA プライマ一（第 5発明）は、適当なベクタ一 DNA を出発材料として適宜にデザインしてもよく、あるいは公知のもの（例えば、 pKA l ベクタ一プライマー (一端に約 60個の 3 '突出末端 dTテールを有し、もう一端が EcoRV平滑末端 [Kato et al.， Gene 150 : 243-250 , 1994] ) 等を使用することもできる。この発明の二本鎖 DNA プライマーの一般的な構造を図 2 に示した。プライマー配列として 60 ± 10個の dTを有している。もう一方の末端部は、平滑末端、突出末端いずれでも良い。プライマー配列を含む末端部に 8 塩基認識制限酵素部位 RE 1 を有し、もう一方の末端部に 8塩基認識制限酵素部位 RE 2と 5 '突出末端あるいは平滑末端を生成する制限酵素部 ·位 RE3 を有することが好ましい。 8塩基認識制限酵素部位としては、 ΝοΛ、 Sse8387I、 Pad , Swal、 Sfil、 SgrAL Ascl、 Fsel , Pmel , Srfi などが利用できる。この発明において作製した pGCAP l ベクタープライマ一は、 RE3 として部位 (CTTAAG)を設けてあるが、この Α ΠΙ 5 '突出末端（... CTTAA)に第一鎖 cDNA の 3 '端が連結すると、「キャップ連続 cDNA」の場合、 5'突出末端に「dG」が付加して、 ... CTTAAG...となり、 A/ l の切断認識配列が復活する。したがって、「キャップ連続 cDNA」クローンは、 Α ΠΙ によって切断可能となる。このことを利用すれば、 4/7II 消化によってキャップ連続 cDNA クローンかどうかを判定することもできる。他にも「dG」付加によって切断認識配列が復活する unl(CTTAAG) , XhoI(CTCGAG)等も利用できる。さらに、この発明において作製した pGCAP I O ベクタープライマーは、 RE 1 として Notl、 RE2 として SwaL RE3として £coRIを有する。この出願の第 3 発明は、前記第 2 発明の方法によって最終的に作製された cDNAベクターの集団からなる「cDNAライブラリー」である。この cDNAライブラリーは、後記実施例にも示したように、キャップ連続 cDNA を含むクロ一ンを 60%以上、好ましくは 75%以上、さらに好ましくは 90%以上、最も好ましくは 95%以上という極めて高い確率で保有することを特徴としている。従って、この第 3 発明の cDNA ライブラリ一は、そのほとんどのクローンがキャップ連続 cDNAであるため、キャップ連続 cDNA を特に選択しない場合であっても、高い確率でキャップ連続 cDNA を単離して解析することができる。ただし、正確を期すためには、この出願の第 4 発明の方法によって、キャップ連続 cDNA を正しく選択することができる。すなわち、前記第 1 発明および第 2 発明の方法によって合成されたキヤップ連続 cDNA は、その 5，端に「(dT)ndG」を有することを特徴としているため、全塩基配列を調べる必要はなく、この「（dT)ndG」の存否を指標としてキャップ連続 cDNA を特定することができる。「(dT)ndG」の存在は、公知の塩基配列決定法等により簡便に行うことができる。なお、キャップ連続 cDNAの 90 %以上は「dG」から始まるので、実際的には「dG」の存否を指標とすればよい。この出願の第 6発明は、この発明の方法で cDNA を合成するために最低限必要とする試薬類、すなわち二本鎖 DNA プライマ一、逆転写酵素と反応緩衝液、 T4 RNAリガーゼと反応緩衝液、キヤップ付加モデル mRNAを含む cDNA合成用試薬キットである。このキットを用いれば、任意のキャップ付加 mRNA を含む RNA混合物から、キャップ連続 cDNAを含む cDNAライブラリーを容易に作製することができる。

実施例次に実施例により発明を具体的に説明するが、この発明はこれらの例に限定されるものではない。なお DNA の組換えに関する基本的な操作および酵素反応は、文 ( Sambrook and Maniatis, in Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989) に従った。制限酵素および各種修飾酵素は特に記載の無い場合には宝酒造社製のものを用いた。各酵素反応の緩衝液組成、並びに反応条件は付属の説明書に従った。

実施例 1

キャップアナログ付加 RNAを用いた cDNA合成

( 1) キャップアナログ付加 RNAの調製ヒト延長因子- 1 (EF- 1 α ) の完全長 cDNA クローン pHPOO 155(非特許文献 6 )を Noil消化により直鎖状にした後、これを铸型にしてインビトロ転写キット（Ambion 社製）を用いて mRNA を調製した。反応液にキャップアナログとして、 m7G(5 ')pppG(5)あるいは A(5 ')pppG(5) (いずれも Ambion社製）を添加することにより、「m⁷G」あるいは「A」をキャップ構造とするモデル mRNA を得た。また、キャップアナログ無添加によって、キャップ構造を持たないモデル mRNA を得た。インビトロ転写産物の 5'端の塩基配列は、ベクター由来の配列 ( 5 '-GGGAATTCGAGGA-3 ' ) の下流に EF- 1 a の 5'端配列 ( 5 CTTTTTCGCAA ... .. ) が続いている。

(2) 第一鎖 cDNA合成

上記で調製したモデル mRNA 0.3 gと pKA lベクタープライマー（一端に約 60個の 3'突出末端 dTテールを有し、もう一端が £coRV平滑末端）（非特許文献 6) 0.3 g を反応液（50mM Tris-HCl, pH8.3， 75mM KCl, 3mM MgCb, 5mM DTT, 1.25mM dNTP) に混合し、モデル mRNAとベクタープライマ一とをァニールさせたのち、逆転写酵素 SuperScriptTM π (インビトロジェン社 ·製） ·200υ とリポヌクレアーゼインヒビ夕一 40U (宝酒造社製）を添加して、 42で1時間反応させ、モデル mRNAに相補的な第一鎖 cDNAを合成した。反応液をフエノール抽出した後、エタノール沈澱により、キャップ (+)mRNA/cDNA ヘテロデュプレックスとベクタ一プライマーの連結体を回収し、水に溶解した。

(3) 脱キャップ反応

キヤップ (+)mRNA/cDNAヘテロデュプレツクス溶液 20 1を反応液（50mM 酢酸ナトリウム， pH5.5， 5mM EDTA, 10mM 2-メルカプトエタノール）に混合し、 10U のタバコ酸性ピロホスファターゼ（日本ジーン社製）を添加し、 37°C 30 分間反応させ、 mRNAのキャップ構造を除去した。反応液をフエノール抽出した後、エタノール沈澱により、脱キャップ mRNA/cDNAヘテロデュプレックスとベクタ一プライマ一の連結体を回収し、水 20 lに溶解した。

(4) セルフライゲ一シ aン .

前記（2)で得たキャップ (+)niRNA/cDNAヘテロデュプレックス溶液、および前記（3)で得た脱キャップ mRNA/cPNA ヘテロデュプレックス溶液のそれぞれ 20 Hiを反応液 (50mM Tris-HCl, pH7.5, 5mM MgCl₂, lOmM 2 -メルカプトエタノール， 0.5mM ATP, 2mM DTT) に混合し、 120Uの T4 RNAリガーゼ（宝酒造社製）を添加し、 20°C 16 時間反応させ、 mRNA/cDNA ヘテロデュプレックスの末端とベクタープライマーの EcoRV 末端とをライゲーションさせて環状とした (セルフライゲーシヨン反応) 。反応液をフエノール抽出した後、エタノール沈澱により、セルフライゲ一ション産物を回収し、水 20 lに溶解した。

(5) RNA鎖から DNA鎖への置換

セルフライゲ一シヨン産物溶液 20 1 を反応液（20mM Tris-HCl, ρΗ7·5, 4mM MgCl₂, lOmM (NH₄)₂S0_4; lOOmM KC1, 50 g/ml BSA， O.lmM dNTP) に混合し、 0.3U の RNaseH (宝酒造社製）、 4U の E.coli DNAポリメラ一ゼ I (宝酒造社製）、 60U の E.coli DNA リガーゼ（宝酒造社製）を添加し、 12°C5 時間反応させ、 RNA 鎖を DNA 鎖で置換して第二鎖 C DNA を合成し、 cDNA/cDNA デュプレックスをインサートとするベクタ一（cDNA ベクタ一'）を得た。反応液をフエノール抽出した後、エタノール沈澱により、 cDNAベクタ —を回収し、 TE 40 lに溶解した。

(6) 大腸菌の形質転換

cDNAベクター溶液 l l を DH 12S コンビテント細胞（インビトロジェン社製） 20 1 と混合し、エレクトロボレ一シヨン法により形質転換を行なった。ェレクト口ポレーシヨンは、 MicroPulser (バイオラッド社製）を用いて行なった。得られた形質転換体を SOC 培地に懸濁したのち、 100 g/ml アンピシリン含有寒天培地上に'蒔いて、 37°C—晩培養した。その結果、形質転換大腸菌約 10⁵ ~ 10⁶個のライブラリ一が得られた。

(7) cDNAクローンの 5'端塩基配列解析

寒天培地上に生成したコロニーを拾い、 100 g/ml アンピシリン含有 LB 培地に懸濁し、 37°C—晩培養した。培養液から菌体を遠心分離した後、アルカリ /SDS法によりプラスミド DNAを単離 ·精製した。このプラスミドを踌型にして、キット（BigDye Terminator v3.0、 ABI社製）を用いてサイクルシーケンシング反応を行ない、蛍光 DNAシーケンサー (ABI社製) により cDNAの 5'端塩基配列を決定した。

キャップアナログとして m⁷G(5')pppG(5)を用いて作製したモデル mRNA を铸型にした場合、 cDNA インサートを有する 2 0クローン中、キャップ連続 cDNA を含むものは 1 5個であった。その中の 1 2クローンは、モデル mRNA には無い「dG」が、また 1クローンは「dTdG」が、転写開始点の dGの前に余分に付加していた。他に、余分な「dG」を含まないものが 2個、 mRNA の途中から始まるキャップ非連続 cDNA が 5個含まれていた。なお、脱キャップ反応を行なわなくとも、生成する形質転換体の数、キャップ部位から始まる cDNA の割合、余分な「dG」の付加等は変わらなかった。

一方、キャップアナログとして A(5 ')pppG(5)を用いて作製したモデル mRNA を铸型にした場合、 cDNA インサートを有する 2 4 クローン中、キヤップ連続 cDNA を含むものは 1 8個であった。その中の 1 5 クローンは、モデル mRNA には無い「dA」が、また 1クローンは「dTdA」が、転写開始点の G の前に余分に付加していた。他に、余分な「dA」を含まないものが 2個、 mRNA の途中から始まるキャップ非連続 cDNAが 6個含まれていた。

またいずれの場合にも、キャップ非連続 cDNA を有するクローンでは、モデル mRNA には本来無い余分な「dG」や「dA」が付加した物は見出せなかった。さらに、キャップ構造を持たないモデル mRNA を铸型として用いた場合には、 cDNAインサートを有する 19 クローン中、転写開始点からの配列を含むものは 16個であった。その中の 14クローンは、転写開始点の Gの前に余分な配列を' 持たなかった。しかし、 2 クロ一ンはモデル mRNA には無い「dT」が余分に転写開始点の G の前に付加していた。他に、 mRNAの途中から始まるキャップ非連続 cDNAが 3個含まれていた。

以上の結果から、この発明の方法によって、第一鎖 cDNA 合成の際にその铸型となる mRNA のキャップ構造塩基「G」に相補的なヌクレオチド「dC」が付加され、第二鎖 cDNA合成の際に第一鎖 cDNA3 '端の「dC」に相補的な「dG」が付加されることが示された。さらに、相補的な「dG」の後に、 dTが付加される場合も認められた。従って、 cDNAの 5'端に「dG」あるいは「dTdG」が付加している場合には、キヤップ連続 cDNAであることが示唆された。

(8) 突出末端ベクタープライマ一を用いた cDNA合成

第一鎖 cDNA を合成後、 EcoRI でべクタ一プライマーを切断し、 5'突出末端を生成した後、セルフライゲーション反応を行なったところ、平滑末端 EcoRV を有するベクタープライマーを用いた場合と同様に 5，端に「dG」が付加したキャップ連続 cDNAクローンが得られた。従って、 pKA lベクタ一プライマ一の制限酵素切断末端は、平滑末端だけでなく、 5'突出末端でも良いことが示された。また、平滑末端の場合に比べライゲーシヨンの効率が高くなり cDNA ライブラリーに含まれるクローンの数が多くなつた。

実施例 2

培養細胞 HT-1080由来の mRNAを用いた cDNAライブラリー作製ヒトフイブ口サルコ一マ細胞株 HT- 1080 (大日本製薬から購入）から AGPC 法（二ツボンジーン社製キット）を用いて、全 RNA を調製した。これをビォチン化オリゴ（dT)プライマ一（プロメガ社製）に結合させ、 Streptavidin MagneSphere Particles を加えた後マグネットにかけて、ポリ（A)+RNA を精製した。ポリ（A)+RNA 0.3 gと pKA lベクタ一プライマー 0.3 gを用いて、実施例 1と同じ条件で cDNA を合成し、大腸菌の形質転換を行ない、 cDNA ライブラリーを作製した。その結果、約 10 ⁵から 10 ⁶の形質転換体を含むライブラリ一が得られた。脱キャップ反応を行なった場合と、行なわなかった場合の両方でライブラリーを作製したが、両者のライブラリーの解析結果に大きな差異は無かつたので、以下に脱キャップ反応無しの結果についてのみ記載する。

上記ライブラリ一から無作為にコロニ一を選択し、プラスミドを単離した後、 cDNAの 5'端の塩基配列を決定した。 cDNAインサートを有するもので、その配列が決定できたもの 19 1 クローンについて、 GenBank の核酸デ一夕ベースを用いて BLAST検索を行なったところ、 189 クローンが mRNA 由来の遺伝子として登録されていた。全体の 94 %に当たる 178クロ一ンは、すべて翻訳領域を含んでいた。含量がもっとも多いのが、リボソーム蛋白質 P1 と延長因子 l- αであり、それぞれ 5クロ一ンづっ含まれていた。 5'端の塩基配列は、 5クローンすベてが、リボソーム蛋白質 P 1 は 5 '-GCCCTTTCCTCAGCTGCCGC...、延長因子 1 - αは 5，-GCTTTTTCGCAACGGGTTTG…であり、いずれも 5，端の「dG」以外は、従来方法 (DNA-RNAキメラオリゴキヤッビング法) で作製されたライブラリーから得られたもの (非特許文献 6) と同じ配列を有していた。ゲノム配列と比較してみると、 5'端にあるいずれの「dG」も、ゲノム配列には存在しておらず、 cDNA合成の過程で付加したものであることが確認された。このことを裏付けるものとして、翻訳領域を含んでいる 178 クローン中、 168 クローンが「dG」から始まるものであった。他に、（dT)ndG (n= l- 5 )から始まるものが 6 個あった。これらは、「dG」が付加した後、さらに「dT」が複数個付加したものと考えられる。

mRNA 由来の遺伝子として未登録のものも 2 クローン含まれていたが、ゲノム配列の一部と完全に一致し、かつ EST デ一夕ベースの中に同じ配列を有するものが少数存在していた。いずれもゲノムの配列には存在しない「dG:i が付加した配列であった。したがって、この 2クローンはまだ遺伝子として未同定の新規完全長 cDNAである可能性が高い。

niRNAの途中から始まるもの（キャップ非連続 cDNA) が、 1 1 クロ一ン含まれていた。これらの cDNAクローンの 5'端配列が「dG」から始まるものも 3ク口一含まれていたが、いずれも本来の mRNA の配列に由来するものであり、新たに付加した「dG」を有するものは無かった。

以上の結果から、全体としてみると、 cDNA インサートを有する 191 クローンの中で、完全長（キャップ連続. cDNA) であると思われるものが 180 クローン含まれていることから、完全長率は 94 %という値になる。また、 5'端配列が「dG」から始まる 171クローンの中で、キヤップ非連続 cDNAは 3クローンであったことから、この cDNA ライブラリーの場合、 5'端配列が「dG」で始まるものでかつ翻訳領域を含んでいるものは、完全長 cDNAであることが 98 %の確率で保証されていると言える。特に、ゲノムの配列には存在しない「dG」から始まるものは、ほぼ間違いなく完全長 cDNAであることが保証される。

実施例 3

培養細胞由来の全を用いた elDHilライプラリ一作製ヒトフイブ口サルコ一マ細胞株 HT- 1080 から実施例 2 で調製した全 RNA 5 H g と pKAl ベクタープライマー 0.3 ^i g を用いて、実施例 1と同じ条件（ただし、脱キャップ反応は省略）で cDNA を合成し、大腸菌の形質転換を行ない、 cDNAライブラリ一を作製した。その結果、約 10⁵の形質転換体を含むライブラリーが得られた。

このライブラリーに含まれる cDNAクローンについて、実施例 2 と同様に 5' 端の部分塩基配列解析を行なった。 cDNAインサートを有するもので、その配列が決定できたもの 222 クローンについて、 GenBank の核酸デ一夕ベースを用いて BLAST検索を行なったと έろ、 217 クローンが mRNA 由来の遺伝子として登録されていた。全体の 96 %に当たる 209クローンは、すべて翻訳領域を含んでいた。これらの中で、 189 クローンは「dG」から始まるクローンであった。ここで特筆すべき点は、このライブラリ一は、精製したポリ（A)+RNA からではなく、全 RNAから作製したという点である。しかも、その量は 5 g という微量である。したがって、この方法を用いることにより、ポリ（A)+RNA の精製プ口セスを省くことができ、かつ数^ g オーダーの全 RNA から高品質の完全長 cDNAライブラリ一を作製できることが示された。

実施例 4

培養細胞 ARPE-19完全長 cDNAライブラリ一の大規模配列解析ヒト網膜色素上皮細胞株 ARPE- 19 ( ATCC から分譲）から調製したポリ (A)+RNA 2.5 i gと pKA lベクタ一プライマー 0.7 a gを用いて、実施例 1と同じ条件で cDNA を合成し、大腸菌の形質転換を行ない、 cDNA ライブラリーを作製した。このライブラリーに含まれる cDNA クローンについて、実施例 2 と同様に 5 '端の部分塩基配列解析を行なった。 cDNA ィンサー卜を有するもので、その配列が決定できたもの 3，683クローンについて、 GenBankの核酸データべ —スを用いて BLAST検索を行なったところ、 3，662 クローンが mRNA 由来の遺伝子として登録されていた。全体の 94 %に当たる 3，474 クローンは、完全長 cDNA クローンであった。これらの中で、 3,069 クローンは「dG」あるいは「（dT)ndG」から始まるクロ一ンであった。

実施例 5

pGCAPlベクタ一プライマーの作製多機能クロ一ニングベクター pKAl (非特許文献 6 ) を出発材料にして、 pGCAPlを作製した。図 3Aにその構造の模式図を、配列表の配列番号 1にその全塩基配列を示す。 pKAl との相違点は、（1 )複製オリジンを pUC 19由来に変えたこと、（2)ρΚΑ1 の制限酵素部位 Hindm の上流に Pad を追加したこと、 (3)ρΚΑ 1 の £coRI- HsiXI-£coRV-i¾mI部位を EcoRI-A ni-Swal- に置換したことである。配列番号 1の 1番目ヌクレオチド「A」は Hindlll 部位に、また 568番目が EcoRI部位に対応する。

pGCAP l l OO gを 200U の Kpnl で完全消化後、 0.8%ァガロース電気泳動にかけ、切断片を単離精製した。得られた切断片を 20 w M dTTP存在下、 375Uの末端転移酵素（宝酒造社製）を添加し、 37°C 30分間反応させ、消化によって生成した 3 '突出末端に約 60個の dTテールを付加した。次いで反応生成物を Su al で消化し、 0.8%ァガロース電気泳動にかけ、長い方の切断片を単離精製した。これを pGCAPlベクタープライマー（図 3B) として用いた。

実施例 6

pGCAPlベクタープライマ一を用いた cDNAライブラリー作製ヒトフィブロサルコ一マ細胞株 HT- 1080の全 RNA 5 gと実施例 5で調製した pGCAPlベクタープライマ一 0.3 gを用いて、実施例 3 と同じ条件で cDNA を合成し、大腸菌の形質転換を行ない、 cDNAライブラリ一を作製した。その結果、約 2 X 10⁵の形質転換体を含むライブラリ一が得られた。このライブラリ一に含まれる cDNA クローンについて、 5'端の部分塩基配列解析を行なったところ、 5，端に「dG」が付加した完全長 cDNAが得られ、実施例 3 と同様に完全長率は 95%であった。

pKA l ベクタープライマ一を用いた場合、 £coRV切断末端（... GAT) に Gが一個付加すると… GATG...となり開始コドン ATG が新たに生成する。このことは、キャップ連続 cDNA の配列を知ることが目的の場合は問題にならないが、このベクターを発現ベクターとして用いようとする場合は、余分な ATG の存在は cDNA の正確な転写 ·翻訳に悪影響を及ぼす可能性がある。 pGCAP l ベクタ一プライマ一を用いると、 Su al 切断末端（...ATTT) に G がー個付加すると ...ATTTG...となり開始コドンは生成しないので、この問題は生じない。

さらに、第一鎖 cDNA を合成後、でベクタープライマーを切断し、 5'突出末端を生成した後、セルフライゲーシヨン反応を行なったところ、平滑末端 Swal を有するベクタープライマ一を用いた場合と同様に 5'端に「dG」が付加したキャップ連続 cDNAクローンが得られた。 4/ΠΙ切断末端（...CTTAA) に G が一個付加すると… CTTAAG...となり、切断部位の再形成が起こる。したがって、キャップ連続 cDNA クローンは、 4 ΠΙ によって切断可能となる。このことを利用すれば、消化によってキャップ連続 cDNA クローンかどうかを判定することもできる。

実施例 7

培養細胞 ARPE-19完全長 cDNAライブラリ一の発現プロフィ一ル解析ヒト網膜色素上皮細胞株 ARPE- 19の全 RNA5 /z g力ゝら、実施例 4 と同様にして cDNAライブラリーを作製し、 5'端の部分塩基配列解析を行なった。 cDNAィンサートを有するもので、その配列が決定できたもの 3,204 クローンについて、 GenBank の核酸データベースを用いて BLAST検索を行なったところ、全体の. 95 %に当たる 3,038クローンは、完全長 cDNAクローンであった。

これらの完全長 cDNA クローンのインサートのサイズ分布を調べてみたところ、最も短いものは 0.1kbp、最も長いものは lOkbp と広範囲の長さのインサ ―トを有しており、平均鎖長は 1.94kbp であった。 3kbp 以上の長鎖クロ一ンも 16%を占めていた。

これらのクローンを分類したところ、 1 ,408 種類の遗伝子からなることが示された。最も多く含まれているのはグリセルアルデヒドー 3—リン酸デヒドロゲナ一ゼ cDNAであり、 44 クローン（全クロ一ンの 1.4%) 含まれていた。 3 ク口一ン以上、.すなわち 0. 1%以上の発現量を示すものは 235 種類の cDNA に留まり、 971 種類（全遺伝子の 69%) の cDNA は 1クロ一ンづつしかとれず、 0.03%以下の低い発現量の遺伝子であることが示された。また、ゲノム配列には一致するが、データベースにまだ遺伝子として登録されていない非常に発現量の少ないと思われる新規遺伝子クローンも含まれていた。このように、得られた cDNAライブラリ一は、発現量の低い遺伝子をも数多く含み、冗長度の低い高品質のライブラリーであることが確認された。

以上の解析の結果、この発明の方法で作製した cDNA ライブラリ一は、完全長 cDNA クローンの含有率が高いだけでなく、遺伝子の鎖長や発現量によるバィァスがかからずに、細胞内で発現している mRNA の発現量を忠実に反映していることが示唆された。したがって、この方法は完全長 cDNA クローンを取得する目的だけでなく、細胞内で発現している遺伝子の発現プロフィールを解析するためにも有効である。

実施例 8

pGCAPlOベクタ一プライマ一の作製とこれを用いた cDNAライブラリ一作製 pGCAPl を出発材料にして、 pGCAP l Oを作製した。図 4Aにその構造の模式図を、配列表の配列番号 2にその全塩基配列を示す。 pGCAPl との相違点は、 EcoRl-Aflll- Swal-Kpnl部位を Swal-EcoRl-Fsel-EcoRV-Kpnl に置換したことである。実施例 5と同様にして pGCAP lO の Κρ ί 3'突出末端に約 60個の d'T テールを付加した。次いで反応生成物を EcoRV で消化し、長い方の切断片を pGCAP l O ベクタープライマー (図 4B) として用いた。このべクタ一プライマ一 0.3 g とヒトフィブロサルコ一マ細胞株 HT- 1080 の全 RNA a g を用いて、実施例 3 と同じ条件で第一鎖 cDNA を合成したのち、 EcoRI消化によってべク夕一側の末端を 5'突出末端とした。セルフライゲーションを行なった後、 mRNA鎖を DNA鎖に置換する工程を省いて大腸菌の形質転換を行ない、 ' cDNA ライブラリーを作製したところ、約 106の形質転換体を含むライブラリ一が得られた。このライブラリーに含まれる cDNA クローンについて、 5'端の部分塩基配列解析を行なつたところ、 5 '端に「dG」が付加した完全長 cDNA が得られ、実施例 3と同様に完全長率は 95%であった。

産業上の利用可能性以上詳しく説明したとおり、この出願の発明によって、 l ^ g オーダ一の全 RNAから、 PCR を使用せずに、少ない工程で、転写開始点ヌクレオチドからの連続配列を有することが保証された完全長 cDNA を、 90%以上の高収率で合成することが可能となる。これによつて遺伝子がコードしている蛋白質の一次構造に関する情報と、遺伝子の発現を調節している発現制御領域に関する情報を確実に得ることが可能となり、ゲノム情報を有効に活用できるばかりか、医療分野等における有用蛋白質の遺伝子工学的製造にも大きく貢献する。

Claims

請求の範囲

1 . mRNA のキャップ構造に隣接するヌクレオチドからの連続配列を有する cDNAを合成する方法であって、

(iii) mRNA/cDNA ヘテロデュプレックスとニ本鎖 DNA プライマーの連結体の cDNAを含む DNA鎖の 3，端と 5'端を、リガーゼを用いて連結し環状化する工程、

を含むことを特徵とする方法。

2. キャップ構造を有する mRNA が細胞抽出物中に含まれている請求項 1の方法。

3. キヤップ構造を有する mRNA がインビトロ転写によって合成されたものである請求項 1の方法。

4. 二本鎖 DNA プライマーのプライマ一配列が、キヤップ構造を有する mRNAの部分配列に相補的な配列を含む請求項 1の方法。

5 . 二本鎖 DNA プライマーのプライマ一配列が、キャップ構造を有する mRNAのポリ（A)配列に相補的なオリゴ dTを含む請求項 1の方法。

6. リガーゼが T4 RNAリガーゼである請求項 1の方法。

7. 工程 (ii)と工程 (iii)の間に、以下の工程：

(ii') mRNA/cDNAヘテロデュプレックスと二本鎖 DNAプライマーの連結体を制限酵素で切断することにより、二本鎖 DNA プライマーの端部に 5 '突出末端あるいは平滑末端を生成する工程、

を含む請求項 1から 6のいずれかの方法。

8. さらに以下の工程：

(iv) mRNA/cDNAヘテロデュプレツクスと二本鎖 DNAプライマーの連結体の RNA鎖を DNA鎖に置換して第二鎖 cDNAを合成する工程、

を含む請求項 1から 7のいずれかの方法。

9. 二本鎖 DNA プライマ一が複製オリジン、または複製オリジンと cDNA発現用プロモーターを含んでいる請求項 8の方法。

10. さらに以下の工程：

(v) 第一鎖 cDNAと第二鎖 cDNA とからなる二本鎖 cDNAをべクタ一 DNAの一部とする工程、

を含む請求項 8の方法。

1 1. 請求項 8 または請求項 10 の方法によって合成された二本鎖 cDNA を含むクローンの集団であって、 5'端にヌクレオチド（dT)n dG (n= 0~ 5) を有し、これに連続して mRNA のキヤップ構造に隣接するヌクレオチドからの連続配列を有する cDNAのクローンを 60%以上含むことを特徵とする cDNAライブラリ

12. 請求項 1 1 の cDNA ライブラリ—のクローンから、 mRNA のキヤップ構造に隣接するヌクレオチドからの連続配列を有する cDNA のクロ一ンを選択する方法であって、 5'端ヌクレオチドが（dT)n dG (n = 0〜5) である cDNA を含むクローンを目的クローンとする方法。

13. プライマー部分がオリゴ（dT) n (n= 15~ 100) からなり、プライマ一側の末端部分に 8塩基認識制限酵素切断部位 RE 1 を有し、もう一方の末端部に 3

8塩基認識制限酵素切断部位 RE2 と 5'突出末端あるいは平滑末端を生成する制限酵素部位 RE3を有する二本鎖 DNAプライマ一。

14. 複製オリジン、または複製オリジンと cDNA 発現用プロモーターを含んでいる請求項 13の二本鎖 DNAプライマー。

15. 配列番号 2 の塩基配列を有する pGCAPlO 由来のベクタ一プライマーである請求項 14の二本鎖 DNAプライマ一。

16. 請求項 14 あるいは請求項 15 の二本鎖 DNAプライマー、逆転写酵素と反応緩衝液、 T4 RNA リガ一ゼと反応緩衝液、キャップ付加モデル mRNA を含む cDNA合成用試薬キッ卜。