JP7473953B2 - 連結ｄｎａの製造方法及びそれに用いるためのベクターの組み合わせ - Google Patents

Description

本発明は、連結ＤＮＡの製造方法及びそれに用いるためのベクターの組み合わせに関する。

近年、医療、産業、生物学などの遺伝子合成が関わるあらゆる分野において、全ゲノム合成をはじめとする長鎖ＤＮＡ合成の需要が高まっている。一般的に、長鎖ＤＮＡは化学合成された２００ｂｐ程度の短鎖ＤＮＡ群を連結することによって作製される。しかしながら、このプロセスは完全ではなく、より長鎖のＤＮＡの合成を行う場合においては、多くの短鎖ＤＮＡの連結が必要となり、目的産物を得ることが困難になる。現在までに開発されたＤＮＡアセンブリ技術は、大きく二つに大別される。

＜タイプＩＩＳ制限酵素を用いたＤＮＡアセンブリ技術＞
一つは、Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅ法などに代表される制限酵素で処理された短鎖ＤＮＡをリガーゼによって連結する手法である（Ｅｎｇｌｅｒ Ｃ．，Ｋａｎｄｚｉａ Ｒ．，Ｍａｒｉｌｌｏｎｎｅｔ Ｓ．，Ａ ｏｎｅ ｐｏｔ，ｏｎｅ ｓｔｅｐ，ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ｃｌｏｎｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｃａｐａｂｉｌｉｔｙ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２００８；３（１１）：ｅ３６４７．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０００３６４７（非特許文献１）等）。この様な手法には他にＢｉｏＢｒｉｃｋ法（Ｋｎｉｇｈｔ Ｔ．，Ｉｄｅｍｐｏｔｅｎｔ Ｖｅｃｔｏｒ Ｄｅｓｉｇｎ ｆｏｒ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ Ｂｉｏｂｒｉｃｋｓ．ｈｄｌ：１７２１．１／２１１６８（非特許文献２）等）、ＯＧＡＢ法（Ｔｓｕｇｅ Ｋ．ら，Ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｐｒｅｐａｒｉｎｇ ａｎ ｅｑｕｉｍｏｌａｒ ＤＮＡ ｍｉｘｔｕｒｅ ｆｏｒ ｏｎｅ－ｓｔｅｐ ＤＮＡ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ｏｖｅｒ ５０ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ．Ｓｃｉ Ｒｅｐ．２０１５ Ｍａｙ ２０；５：１０６５５．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓｒｅｐ１０６５５．（非特許文献３）等）などが挙げられる。これらの手法の利点は、連結したい短鎖ＤＮＡを持つベクターを用意することで、ＰＣＲ等によるＤＮＡ断片の増幅を経ずにライゲーション反応によって短鎖ＤＮＡ群を一気に連結することにあり、また、実験の処理が簡便で処理時間が短いという特徴がある。Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅ法では、認識配列と離れた部位を切断することができるタイプＩＩＳの制限酵素をプラスミドベクターからのＤＮＡ断片の切り出しに用いる。このため、連結したいＤＮＡ断片の両端がそれらの外側に認識配列を持つタイプＩＩＳ制限酵素によって切断されると、認識配列を持たない任意の突出末端を持った短鎖ＤＮＡをベクターから切り出すことができる。したがってＧｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅ法を用いると、合成された目的産物に余計な認識配列が含まれないシームレスなアセンブリを行うことができる。

一方で、標準的に利用されるタイプＩＩＳ制限酵素がつくる突出末端の長さは４ｂｐであり、デザインできる突出末端の多様性には限りがある。そのため一度に連結できる断片数は１０断片程度までに限られている。また、目的配列によっては、特異的な突出末端をデザインすること自体が難しい場合もある。特に、リピート配列をアセンブリする場合には、同じ配列が何度も出現するため、連結されるＤＮＡ断片間での突出末端配列の特異性を担保するのが難しい。また、Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅ法で連結される短鎖ＤＮＡは、目的の配列のみに特化して突出末端が特異的になるように設計、合成されるため、あるアセンブリに利用した短鎖ＤＮＡを、他のアセンブリに利用できるとは限らず、資源としての再利用性が低い。さらに、連結するＤＮＡ断片の数が多いほど、非特異的なライゲーション等によって目的とは異なる産物が生成される確率が高くなり、ＰＣＲ法やサンガーシークエンシング法による品質検査に要する手間や時間が大きくなる。

＜組換配列を用いたＤＮＡアセンブリ技術＞
もう一つは、Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ法などに代表される、末端に数十ｂｐ程度の共通配列を有する短鎖ＤＮＡを連結する手法である（Ｇｉｂｓｏｎ Ｄ．Ｇ．ら，Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ＤＮＡ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｕｐ ｔｏ ｓｅｖｅｒａｌ ｈｕｎｄｒｅｄ ｋｉｌｏｂａｓｅｓ．Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００９ Ｍａｙ；６（５）：３４３－５．（非特許文献４）等）。こうした手法には、Ｉｎ Ｆｕｓｉｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ（Ｚｈｕ Ｂ．ら，Ｉｎ－ｆｕｓｉｏｎ ａｓｓｅｍｂｌｙ：ｓｅａｍｌｅｓｓ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ｍｕｌｔｉｄｏｍａｉｎ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ｍｏｄｕｌａｒ ｖｅｃｔｏｒｓ， ａｎｄ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．２００７ Ｓｅｐ；４３（３）：３５４－９．（非特許文献５）等）、オーバーラップＰＣＲ法等がある。これらは、制限酵素を用いる手法と異なり、アセンブリに制限酵素を利用するデザインを必要とせず両端に持つ共通配列を介した組換え反応によって連結することができる。そのため、配列設計における制約が極めて小さい。

一方で、一度に効率的な連結が可能なＤＮＡ断片の数は１０個以内程度である。したがって、長鎖のＤＮＡ合成を行う際には、数個のＤＮＡ断片によるアセンブリを繰り返す必要がある。このとき、アセンブリのたびに目的の産物が正しく合成されているかＰＣＲ法やサンガーシークエンシング法による品質検査に要する手間や時間が大きくなる。また、合成した短鎖ＤＮＡやアセンブリ過程で生成された中間産物は、隣に共通配列を有する断片としか連結できないため、これらを目的以外のアセンブリに利用したりすることは難しく、資源としての再利用性は非常に小さい。さらに、タイプＩＩＳ制限酵素を用いた手法以上に、リピート配列のアセンブリには適していない。リピート配列をアセンブリする場合、隣接するＤＮＡ断片同士ででしか結合しない特異的な数十ｂｐの共通配列を設計しようとしても、その配列が他のＤＮＡ断片配列にも現れてしまい、あらゆる断片間で部分的な結合が生じうる。したがって、リピート配列について、その繰り返し回数や順序を制御した合成を行うことはできない。

Ｅｎｇｌｅｒ Ｃ．，Ｋａｎｄｚｉａ Ｒ．，Ｍａｒｉｌｌｏｎｎｅｔ Ｓ．，Ａ ｏｎｅ ｐｏｔ，ｏｎｅ ｓｔｅｐ，ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ｃｌｏｎｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｃａｐａｂｉｌｉｔｙ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２００８；３（１１）：ｅ３６４７．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０００３６４７ Ｋｎｉｇｈｔ Ｔ．，Ｉｄｅｍｐｏｔｅｎｔ Ｖｅｃｔｏｒ Ｄｅｓｉｇｎ ｆｏｒ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ Ｂｉｏｂｒｉｃｋｓ．ｈｄｌ：１７２１．１／２１１６８ Ｔｓｕｇｅ Ｋ．ら，Ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｐｒｅｐａｒｉｎｇ ａｎ ｅｑｕｉｍｏｌａｒ ＤＮＡ ｍｉｘｔｕｒｅ ｆｏｒ ｏｎｅ－ｓｔｅｐ ＤＮＡ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ｏｖｅｒ ５０ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ．Ｓｃｉ Ｒｅｐ．２０１５ Ｍａｙ ２０；５：１０６５５．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓｒｅｐ１０６５５． Ｇｉｂｓｏｎ Ｄ．Ｇ．ら，Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ＤＮＡ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｕｐ ｔｏ ｓｅｖｅｒａｌ ｈｕｎｄｒｅｄ ｋｉｌｏｂａｓｅｓ．Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００９ Ｍａｙ；６（５）：３４３－５． Ｚｈｕ Ｂ．ら，Ｉｎ－ｆｕｓｉｏｎ ａｓｓｅｍｂｌｙ：ｓｅａｍｌｅｓｓ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ｍｕｌｔｉｄｏｍａｉｎ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ｍｏｄｕｌａｒ ｖｅｃｔｏｒｓ， ａｎｄ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．２００７ Ｓｅｐ；４３（３）：３５４－９．

本発明は、上記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、正確かつ効率的に容易に数十以上のＤＮＡ断片を連結することが可能な連結ＤＮＡの製造方法及びそれに用いるためのベクターの組み合わせを提供することを目的とする。

本発明者らは上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、互いに異なる選択マーカー遺伝子を有する特定の構造を含む二つのベクター（ツールキットベクター）を用い、これら２種類の異なる選択マーカーの切り換えを逐次的なＤＮＡ断片の連結プロセスに組み込むことで、正確、かつ、効率的に、短時間で容易に、リピート配列等の同じ配列が何度も出現する断片であっても、数十以上のＤＮＡ断片を連結して集積できることを見出し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は、以下の態様を包含する。

［１］
ＤＮＡ断片を連結した連結ＤＮＡを製造する方法であり、
（ａ１）下記（１）の構造を含む第一のベクター及び下記（２）の構造を含む第二のベクター：
（１）５’－Ｒ１－Ｄ（ｉ）－Ｒ２－Ｍ１－Ｒ２’－Ｄ（ｉｉ）－Ｒ１’－３’
（２）５’－Ｒ１－Ｄ（ｉｉｉ）－Ｒ２－Ｍ２－Ｒ２’－Ｄ（ｉｖ）－Ｒ１’－３’
［ここで、Ｒ１は、第一の制限酵素の認識配列を示し；Ｒ１’は、第二の制限酵素の認識配列を示し；Ｒ２は、第一の制限酵素及び第二の制限酵素とは異なる第三の制限酵素の認識配列を示し；Ｒ２’は、第一の制限酵素及び第二の制限酵素とは異なる第四の制限酵素の認識配列を示し；Ｍ１は、第一の選択マーカー遺伝子を示し；Ｍ２は、第一の選択マーカー遺伝子とは異なる第二の選択マーカー遺伝子を示し；Ｄ（ｉ）～Ｄ（ｉｖ）は、それぞれ独立に、任意の連結用ＤＮＡ断片を示し、Ｄ（ｉ）及びＤ（ｉｉ）はいずれか一方であってよく、Ｄ（ｉｉｉ）及びＤ（ｉｖ）はいずれか一方であってよい。第一の制限酵素はＲ１内又はＲ１の３’側を切断し、第二の制限酵素はＲ１’内又はＲ１’の５’側を切断し、第一の制限酵素と第二の制限酵素とは同一でも異なっていてもよく；第三の制限酵素はＲ２内又はＲ２の５’側を切断し、第四の制限酵素はＲ２’内又はＲ２’の３’側を切断し、第三の制限酵素と第四の制限酵素とは同一でも異なっていてもよい。］
を準備する工程ａ１と、
（ｂ１）第一のベクターを第一の制限酵素及び第二の制限酵素で処理して、次の構造：５’－Ｄ（ｉ）－Ｒ２－Ｍ１－Ｒ２’－Ｄ（ｉｉ）－３’からなる第一のベクター断片を得る工程ｂ１と、
（ｃ１）第二のベクターを第三の制限酵素及び第四の制限酵素で処理して、次の構造：５’－Ｒ２－Ｍ２－Ｒ２’－３’が除去された第二のベクター断片を得る工程ｃ１と、
（ｄ１）ライゲーション反応により、工程ｂ１で得られた第一のベクター断片と工程ｃ１で得られた第二のベクター断片とを連結し、下記（３）の構造を含む第三のベクター：
（３）５’－Ｒ１－Ｄ（ｉ）_１－Ｒ２－Ｍ１－Ｒ２’－Ｄ（ｉｉ）_１－Ｒ１’－３’
［ここで、Ｄ（ｉ）_１は、次の構造：５’－Ｄ（ｉｉｉ）－Ｄ（ｉ）－３’を含むＤＮＡ断片を示し、Ｄ（ｉｉ）_１は、次の構造：５’－Ｄ（ｉｉ）－Ｄ（ｉｖ）－３’を含むＤＮＡ断片を示す。］
を生成させる工程ｄ１と、
を含むことを特徴とする、連結ＤＮＡの製造方法。

［２］
工程ｄ１の後に、ライゲーション反応産物を宿主に形質転換する工程、及び、第一の選択マーカー遺伝子の発現を指標として第三のベクターが導入された宿主を選抜する工程をさらに含むことを特徴とする、［１］に記載の連結ＤＮＡの製造方法。

［３］
工程ｄ１の後に、第三のベクターを第三の制限酵素及び第四の制限酵素で処理して次の構造：５’－Ｒ２－Ｍ１－Ｒ２’－３’を除去し、次の構造：５’－Ｒ１－Ｄ（ｉ）_１－Ｄ（ｉｉ）_１－Ｒ１’－３’を含む第五のベクターを生成させる工程をさらに含むことを特徴とする、［１］又は［２］に記載の連結ＤＮＡの製造方法。

［４］
工程ｄ１で生成させた第三のベクターを、工程ａ１の第一のベクターとして用い、工程ａ１～ｄ１をさらにｎサイクル（合計１＋ｎサイクル）繰り返して、下記（３’）の構造を含む第三’のベクター：
（３’）５’－Ｒ１－Ｄ（ｉ）_１＋ｎ－Ｒ２－Ｍ１－Ｒ２’－Ｄ（ｉｉ）_１＋ｎ－Ｒ１’－３’
［ここで、Ｄ（ｉ）_１＋ｎは、１＋ｎサイクル目で得られる、次の構造：５’－Ｄ（ｉｉｉ）－Ｄ（ｉ）_ｎ－３’を含むＤＮＡ断片を示し；Ｄ（ｉｉ）_１＋ｎは、１＋ｎサイクル目で得られる、次の構造：５’－Ｄ（ｉｉ）_ｎ－Ｄ（ｉｖ）－３’を含むＤＮＡ断片を示し；ｎは自然数を示し；各サイクル間で、第二のベクターのＤ（ｉｉｉ）は、互いに同一であっても異なっていてもよく；各サイクル間で、第二のベクターのＤ（ｉｖ）は、互いに同一であっても異なっていてもよい。］
を生成させることを特徴とする、［１］～［３］のうちのいずれか一項に記載の連結ＤＮＡの製造方法。

［５］
ＤＮＡ断片を連結した連結ＤＮＡを製造する方法であり、
（ａ２）下記（１）の構造を含む第一のベクター及び下記（２）の構造を含む第二のベクター：
（１）５’－Ｒ１－Ｄ（ｉ）－Ｒ２－Ｍ１－Ｒ２’－Ｄ（ｉｉ）－Ｒ１’－３’
（２）５’－Ｒ１－Ｄ（ｉｉｉ）－Ｒ２－Ｍ２－Ｒ２’－Ｄ（ｉｖ）－Ｒ１’－３’
［ここで、Ｒ１は、第一の制限酵素の認識配列を示し；Ｒ１’は、第二の制限酵素の認識配列を示し；Ｒ２は、第一の制限酵素及び第二の制限酵素とは異なる第三の制限酵素の認識配列を示し；Ｒ２’は、第一の制限酵素及び第二の制限酵素とは異なる第四の制限酵素の認識配列を示し；Ｍ１は、第一の選択マーカー遺伝子を示し；Ｍ２は、第一の選択マーカー遺伝子とは異なる第二の選択マーカー遺伝子を示し；Ｄ（ｉ）～Ｄ（ｉｖ）は、それぞれ独立に、任意の連結用ＤＮＡ断片を示し、Ｄ（ｉ）及びＤ（ｉｉ）はいずれか一方であってよく、Ｄ（ｉｉｉ）及びＤ（ｉＶ）はいずれか一方であってよい。第一の制限酵素はＲ１内又はＲ１の３’側を切断し、第二の制限酵素はＲ１’内又はＲ１’の５’側を切断し、第一の制限酵素と第二の制限酵素とは同一でも異なっていてもよく；第三の制限酵素はＲ２内又はＲ２の５’側を切断し、第四の制限酵素はＲ２’内又はＲ２’の３’側を切断し、第三の制限酵素と第四の制限酵素とは同一でも異なっていてもよい。］
を準備する工程ａ２と、
（ｂ２）第二のベクターを第一の制限酵素及び第二の制限酵素で処理して、次の構造：５’－Ｄ（ｉｉｉ）－Ｒ２－Ｍ２－Ｒ２’－Ｄ（ｉｖ）－３’からなる第二のベクター断片を得る工程ｂ２と、
（ｃ２）第一のベクターを第三の制限酵素及び第四の制限酵素で処理して、次の構造：５’－Ｒ２－Ｍ１－Ｒ２’－３’が除去された第一のベクター断片を得る工程ｃ２と、
（ｄ２）ライゲーション反応により、工程ｂ２で得られた第二のベクター断片と工程ｃ２で得られた第一のベクター断片とを連結し、下記（４）の構造を含む第四のベクター：
（４）５’－Ｒ１－Ｄ（ｉｉｉ）_１－Ｒ２－Ｍ２－Ｒ２’－Ｄ（ｉｖ）_１－Ｒ１’－３’
［ここで、Ｄ（ｉｉｉ）_１は、次の構造：５’－Ｄ（ｉ）－Ｄ（ｉｉｉ）－３’を含むＤＮＡ断片を示し、Ｄ（ｉｖ）_１は、次の構造：５’－Ｄ（ｉｖ）－Ｄ（ｉｉ）－３’を含むＤＮＡ断片を示す。］
を生成させる工程ｄ２と、
を含むことを特徴とする、連結ＤＮＡの製造方法。

［６］
工程ｄ２の後に、ライゲーション反応産物を宿主に形質転換する工程、及び、第二の選択マーカー遺伝子の発現を指標として第四のベクターが導入された宿主を選抜する工程をさらに含むことを特徴とする、［５］に記載の連結ＤＮＡの製造方法。

［７］
工程ｄ２の後に、第四のベクターを第三の制限酵素及び第四の制限酵素で処理して次の構造：５’－Ｒ２－Ｍ２－Ｒ２’－３’を除去し、次の構造：５’－Ｒ１－Ｄ（ｉｉｉ）_１－Ｄ（ｉｖ）_１－Ｒ１’－３’を含む第六のベクターを生成させる工程をさらに含むことを特徴とする、［５］又は［６］に記載の連結ＤＮＡの製造方法。

［８］
工程ｄ２で生成させた第四のベクターを、工程ａ２の第二のベクターとして用い、工程ａ２～ｄ２をさらにｎサイクル（合計１＋ｎサイクル）繰り返して、下記（４’）の構造を含む第四’のベクター：
（４’）５’－Ｒ１－Ｄ（ｉｉｉ）_１＋ｎ－Ｒ２－Ｍ２－Ｒ２’－Ｄ（ｉｖ）_１＋ｎ－Ｒ１’－３’
［ここで、Ｄ（ｉｉｉ）_１＋ｎは、１＋ｎサイクル目で得られる、次の構造：５’－Ｄ（ｉ）－Ｄ（ｉｉｉ）_ｎ－３’を含むＤＮＡ断片を示し；Ｄ（ｉｖ）_１＋ｎは、１＋ｎサイクル目で得られる、次の構造：５’－Ｄ（ｉｖ）_ｎ－Ｄ（ｉｉ）－３’を含むＤＮＡ断片を示し；ｎは自然数を示し；各サイクル間で、第一のベクターのＤ（ｉ）は、互いに同一であっても異なっていてもよく；各サイクル間で、第一のベクターのＤ（ｉｉ）は、互いに同一であっても異なっていてもよい。］
を生成させることを特徴とする、［５］～［７］のうちのいずれか一項に記載の連結ＤＮＡの製造方法。

［９］
［５］の工程ｄ２で生成させた第四のベクター又は［８］で生成させた第四’のベクターを、工程ａ１の第二のベクターとして用いることを特徴とする、［１］～［４］のうちのいずれか一項に記載の連結ＤＮＡの製造方法。

［１０］
［１］の工程ｄ１で生成させた第三のベクター又は［４］で生成させた第三’のベクターを、工程ａ２の第一のベクターとして用いることを特徴とする、［５］～［８］のうちのいずれか一項に記載の連結ＤＮＡの製造方法。

［１１］
第一の制限酵素がＲ１の３’側を切断するタイプＩＩＳ制限酵素であり、かつ、第二の制限酵素がＲ１’の５’側を切断するタイプＩＩＳ制限酵素である、及び／又は、
第三の制限酵素がＲ２の５’側を切断するタイプＩＩＳ制限酵素であり、かつ、第四の制限酵素がＲ２’の３’側を切断するタイプＩＩＳ制限酵素である、
ことを特徴とする、［１］～［１０］のうちのいずれか一項に記載の連結ＤＮＡの製造方法。

［１２］
第一の選択マーカー遺伝子と逆の作用を有する選択マーカー遺伝子である第三の選択マーカー遺伝子が第一のベクターのＲ２とＲ２’との間にさらに挿入されている、及び／又は、
第二の選択マーカー遺伝子と逆の作用を有する選択マーカー遺伝子であり、第三の選択マーカー遺伝子と同一でも異なっていてもよい、第四の選択マーカー遺伝子が第二のベクターのＲ２とＲ２’との間にさらに挿入されている、
ことを特徴とする、［１］～［１１］のうちのいずれか一項に記載の連結ＤＮＡの製造方法。

［１３］
Ｒ１、Ｒ１’、Ｒ２、及びＲ２’とは異なる第五の制限酵素の認識配列が第一のベクターにおける前記構造（１）以外の部位にさらに設定されている、並びに、
Ｒ１、Ｒ１’、Ｒ２、Ｒ２’及び第五の制限酵素の認識配列とは異なる第六の制限酵素の認識配列が第二のベクターにおける前記構造（２）以外の部位にさらに設定されている、
ことを特徴とする、［１］～［１２］のうちのいずれか一項に記載の連結ＤＮＡの製造方法。

［１４］
［１］～［１３］のうちのいずれか一項に記載の連結ＤＮＡの製造方法に用いるためのベクターの組み合わせであり、
下記（１）の構造を含む第一のベクター及び下記（２）の構造を含む第二のベクター：
（１）５’－Ｒ１－Ｄ（ｉ）－Ｒ２－Ｍ１－Ｒ２’－Ｄ（ｉｉ）－Ｒ１’－３’
（２）５’－Ｒ１－Ｄ（ｉｉｉ）－Ｒ２－Ｍ２－Ｒ２’－Ｄ（ｉｖ）－Ｒ１’－３’
［ここで、Ｒ１は、第一の制限酵素の認識配列を示し；Ｒ１’は、第二の制限酵素の認識配列を示し；Ｒ２は、第一の制限酵素及び第二の制限酵素とは異なる第三の制限酵素の認識配列を示し；Ｒ２’は、第一の制限酵素及び第二の制限酵素とは異なる第四の制限酵素の認識配列を示し；Ｍ１は、第一の選択マーカー遺伝子を示し；Ｍ２は、第一の選択マーカー遺伝子とは異なる第二の選択マーカー遺伝子を示し；Ｄ（ｉ）～Ｄ（ｉｖ）は、それぞれ独立に、任意の連結用ＤＮＡ断片を示し、Ｄ（ｉ）及びＤ（ｉｉ）はいずれか一方であってよく、Ｄ（ｉｉｉ）及びＤ（ｉｖ）はいずれか一方であってよい。第一の制限酵素はＲ１内又はＲ１の３’側を切断し、第二の制限酵素はＲ１’内又はＲ１’の５’側を切断し、第一の制限酵素と第二の制限酵素とは同一でも異なっていてもよく；第三の制限酵素はＲ２内又はＲ２の５’側を切断し、第四の制限酵素はＲ２’内又はＲ２’の３’側を切断し、第三の制限酵素と第四の制限酵素とは同一でも異なっていてもよい。］
を含む組み合わせ。

［１５］
［１］～［１３］のうちのいずれか一項に記載の連結ＤＮＡの製造方法に用いるためのベクターの組み合わせであり、
下記（１’）の構造を含む第一のベクター及び下記（２’）の構造を含む第二のベクター：
（１’）５’－Ｒ１－Ｅ１－Ｒ２－Ｍ１－Ｒ２’－Ｅ２－Ｒ１’－３’
（２’）５’－Ｒ１－Ｅ３－Ｒ２－Ｍ２－Ｒ２’－Ｅ４－Ｒ１’－３’
［ここで、Ｒ１は、第一の制限酵素の認識配列を示し；Ｒ１’は、第二の制限酵素の認識配列を示し；Ｒ２は、第一の制限酵素及び第二の制限酵素とは異なる第三の制限酵素の認識配列を示し；Ｒ２’は、第一の制限酵素及び第二の制限酵素とは異なる第四の制限酵素の認識配列を示し；Ｍ１は、第一の選択マーカー遺伝子を示し；Ｍ２は、第一の選択マーカー遺伝子とは異なる第二の選択マーカー遺伝子を示し；Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３、及びＥ４は、それぞれ独立に、任意の連結用ＤＮＡ断片の挿入用部位を示し、Ｅ１及びＥ２はいずれか一方であってよく、Ｅ３及びＥ４はいずれか一方であってよい。第一の制限酵素はＲ１内又はＲ１の３’側を切断し、第二の制限酵素はＲ１’内又はＲ１’の５’側を切断し、第一の制限酵素と第二の制限酵素とは同一でも異なっていてもよく；第三の制限酵素はＲ２内又はＲ２の５’側を切断し、第四の制限酵素はＲ２’内又はＲ２’の３’側を切断し、第三の制限酵素と第四の制限酵素とは同一でも異なっていてもよい。］
を含む組み合わせ。

本発明によれば、正確かつ効率的に容易に数十以上のＤＮＡ断片を連結することが可能な連結ＤＮＡの製造方法及びそれに用いるためのベクターの組み合わせを提供することが可能となる。

また、本発明によれば、リピート配列等の同じ配列が何度も出現する断片であっても、連続して連結することが可能であり、別のアセンブリにそのまま利用できるため、再利用性も高い。さらに、非特異的なライゲーション等によって目的とは異なる産物が生成される確率が低いため、品質検査に要する手間や時間を短縮することも可能である。このような本発明によれば、効率的な多重ゲノム編集のためのベクターライブリラリー、任意のクローンをＰＣＲ法によって単離することのできるプールライブラリの作製も可能となる。

Ｄ（ｉｉｉ）（３）とＤ（ｉ）（１）との連結、及び、Ｄ（ｉｖ）（４）とＤ（ｉｉ）（２）との連結の態様を示す模式図である。 Ｄ（ｉｉｉ）（３）とＤ（ｉｉ）（２）との連結の態様を示す模式図である。 選択マーカー遺伝子及び制限酵素による目的産物の選抜の態様を示す模式図である。 本発明の第一の方法の一態様を示す模式図である。 本発明の第二の方法の一態様を示す模式図である。 本発明の第一の方法と第二の方法との組み合わせの一態様を示す模式図である。 本発明の第一の方法及び第二の方法の各サイクルで得られる目的産物、中間産物の再利用の一態様を示す模式図である。 ＴＡＬＥリピートユニットアレイの作製の一態様を示す模式図である。 ＴＡＬＥリピートユニットアレイのライブラリープールの作製の一態様を示す模式図である。 ｇＲＮＡ－ＢＣベクターの作製で得られたツールキットベクター１（ｎ^１）を示す模式図である。 ｇＲＮＡ－ＢＣベクターの作製で得られたツールキットベクター２（ｎ^２）を示す模式図である。 ｇＲＮＡ－ＢＣベクターの作製の各工程で得られたツールキットベクターにおけるｇＲＮＡ－ＢＣユニットを示す模式図である。 ｇＲＮＡ－ＢＣベクターの作製の各工程で得られたツールキットベクターの断片の電気泳動写真である。 ｇＲＮＡ－ＢＣベクターの作製においてライゲーション産物を形質転換して得られたクローン１～６から単離されたベクター断片の電気泳動写真である。 Ａｒｒａｙ ｖｅｃｔｏｒ ｌｉｂ、Ｓｉｎｇｌｅ ｖｅｃｔｏｒ ｌｉｂ、及びＳｉｎｇｌｅ ｌｉｎｅｒ ＤＮＡ ｌｉｂをそれぞれトランスフェクションして塩基編集率の高かった上位２６箇所の編集効率を示すグラフである。

以下、本発明をその好適な実施形態に即して詳細に説明する。

本発明は、ＤＮＡ断片を連結した連結ＤＮＡを製造する方法として、先ず、下記の第一の方法及び第二の方法を提供する。

＜連結ＤＮＡを製造する第一の方法＞
本発明の連結ＤＮＡを製造する第一の方法は、
（ａ１）下記（１）の構造を含む第一のベクター及び下記（２）の構造を含む第二のベクター：
（１）５’－Ｒ１－Ｄ（ｉ）－Ｒ２－Ｍ１－Ｒ２’－Ｄ（ｉｉ）－Ｒ１’－３’
（２）５’－Ｒ１－Ｄ（ｉｉｉ）－Ｒ２－Ｍ２－Ｒ２’－Ｄ（ｉｖ）－Ｒ１’－３’
［ここで、Ｒ１は、第一の制限酵素の認識配列を示し；Ｒ１’は、第二の制限酵素の認識配列を示し；Ｒ２は、第一の制限酵素及び第二の制限酵素とは異なる第三の制限酵素の認識配列を示し；Ｒ２’は、第一の制限酵素及び第二の制限酵素とは異なる第四の制限酵素の認識配列を示し；Ｍ１は、第一の選択マーカー遺伝子を示し；Ｍ２は、第一の選択マーカー遺伝子とは異なる第二の選択マーカー遺伝子を示し；Ｄ（ｉ）～Ｄ（ｉｖ）は、それぞれ独立に、任意の連結用ＤＮＡ断片を示し、Ｄ（ｉ）及びＤ（ｉｉ）はいずれか一方であってよく、Ｄ（ｉｉｉ）及びＤ（ｉｖ）はいずれか一方であってよい。第一の制限酵素はＲ１内又はＲ１の３’側を切断し、第二の制限酵素はＲ１’内又はＲ１’の５’側を切断し、第一の制限酵素と第二の制限酵素とは同一でも異なっていてもよく；第三の制限酵素はＲ２内又はＲ２の５’側を切断し、第四の制限酵素はＲ２’内又はＲ２’の３’側を切断し、第三の制限酵素と第四の制限酵素とは同一でも異なっていてもよい。］
を準備する工程ａ１と、
（ｂ１）第一のベクターを第一の制限酵素及び第二の制限酵素で処理して、次の構造：５’－Ｄ（ｉ）－Ｒ２－Ｍ１－Ｒ２’－Ｄ（ｉｉ）－３’からなる第一のベクター断片を得る工程ｂ１と、
（ｃ１）第二のベクターを第三の制限酵素及び第四の制限酵素で処理して、次の構造：５’－Ｒ２－Ｍ２－Ｒ２’－３’が除去された第二のベクター断片を得る工程ｃ１と、
（ｄ１）ライゲーション反応により、工程ｂ１で得られた第一のベクター断片と工程ｃ１で得られた第二のベクター断片とを連結し、下記（３）の構造を含む第三のベクター：
（３）５’－Ｒ１－Ｄ（ｉ）_１－Ｒ２－Ｍ１－Ｒ２’－Ｄ（ｉｉ）_１－Ｒ１’－３’
［ここで、Ｄ（ｉ）_１は、次の構造：５’－Ｄ（ｉｉｉ）－Ｄ（ｉ）－３’を含むＤＮＡ断片を示し、Ｄ（ｉｉ）_１は、次の構造：５’－Ｄ（ｉｉ）－Ｄ（ｉｖ）－３’を含むＤＮＡ断片を示す。］
を生成させる工程ｄ１と、
を含む。

（工程ａ１）
本発明の第一の方法においては、先ず、下記（１）の構造：
（１）５’－Ｒ１－Ｄ（ｉ）－Ｒ２－Ｍ１－Ｒ２’－Ｄ（ｉｉ）－Ｒ１’－３’
を含む第一のベクター、及び、下記（２）の構造：
（２）５’－Ｒ１－Ｄ（ｉｉｉ）－Ｒ２－Ｍ２－Ｒ２’－Ｄ（ｉｖ）－Ｒ１’－３’
を含む第二のベクターを準備する（工程ａ１）。

－連結用ＤＮＡ断片－
本発明において、Ｄ（ｉ）～Ｄ（ｉｖ）は、それぞれ独立に、任意の連結用ＤＮＡ断片を示す。本発明の第一の方法は、後述の工程ｂ１～ｄ１を通じて、Ｄ（ｉｉｉ）の３’側にＤ（ｉ）が連結され、Ｄ（ｉｖ）の５’側にＤ（ｉｉ）が連結される。これにより、最終的に、第一の選択マーカー遺伝子の５’側において、Ｄ（ｉｉｉ）とＤ（ｉ）とが連結され、３’側において、Ｄ（ｉｖ）とＤ（ｉｉ）とが連結される（図１）。

本発明の方法において、Ｄ（ｉ）及びＤ（ｉｉ）はいずれか一方であってよく、Ｄ（ｉｉｉ）及びＤ（ｉｖ）はいずれか一方であってよい。この態様においては、例えば、Ｄ（ｉ）及びＤ（ｉｖ）が存在しない場合、最終的に、第一の選択マーカー遺伝子の５’側にＤ（ｉｉｉ）が配置され、３’側にＤ（ｉｉ）が配置されることになる（図２）。この場合、第三の制限酵素及び第四の制限酵素で処理することにより、最終的に、Ｄ（ｉｉｉ）とＤ（ｉｉ）とを連結することができる。

このようなＤ（ｉ）～Ｄ（ｉｖ）としては、本発明に係る制限酵素の認識配列や選択マーカー遺伝子を含んでいなければ何ら制限されず、任意のＤＮＡであってよく、互いに同一であっても異なっていても、互いに共通する配列を含む等の規則制を有するものであってもよい。Ｄ（ｉ）～Ｄ（ｉｖ）のサイズとしても特に制限されず、数ｂｐ～数十ｋｂｐまで連結可能である。

－制限酵素及びその認識配列－
本発明において、Ｒ１は、第一の制限酵素の認識配列を示し、Ｒ１’は第二の制限酵素の認識配列を示し、Ｒ２は第三の制限酵素の認識配列を示し、Ｒ２’は、第四の制限酵素の認識配列を示す。第一の制限酵素と第二の制限酵素とは、互いに同一であっても異なっていてもよく、第三の制限酵素と第四の制限酵素とは、互いに同一であっても異なっていてもよいが、第一の制限酵素及び第二の制限酵素と第三の制限酵素と、並びに、第一の制限酵素及び第二の制限酵素と第四の制限酵素と、では異なる制限酵素であり、かつ、認識配列も異なる制限酵素である必要がある。

後述の工程ｂ１においては、第一のベクターから「５’－Ｄ（ｉ）－Ｒ２－Ｍ１－Ｒ２’－Ｄ（ｉｉ）－３’」の構造のＤＮＡ断片を切り出すが、この工程において、第一の制限酵素又は第二の制限酵素がＲ２又はＲ２’を認識すると、Ｄ（ｉ）及びＤ（ｉｉ）が切除されてしまい、目的のＤＮＡ断片は得ることができなくなる。また、後述の工程ｃ１においては、第三の制限酵素及び第四の制限酵素の処理により、第２のベクターにおける「５’－Ｒ２－Ｍ２－Ｒ２’－３’」の構造を除去するが、これら制限酵素が第二のベクターに残されたＲ１又はＲ１’をも認識すると、第二のベクターからＤ（ｉｉｉ）及びＤ（ｉｖ）が切除されてしまい、第二のベクターから連結用ＤＮＡが消失してしまう。したがって、このような不適切な切断を回避する観点から、第一の制限酵素及び第二の制限酵素と、第三の制限酵素及び第四の制限酵素とは、異なる制限酵素である必要がある（すなわち、認識配列Ｒ１及びＲ１’は、Ｒ２及びＲ２’と異なる認識配列である必要がある）。

一方、第一の制限酵素と第二の制限酵素とが同一である場合（すなわち、認識配列Ｒ１とＲ１’とが同一の場合）には、単一の制限酵素の処理により、後述の工程ｂ１において、目的のＤＮＡ断片を得ることができ、操作が簡便である観点から好ましい。また、第三の制限酵素と第四の制限酵素とが同一である場合（すなわち、Ｒ２とＲ２’とが同一の場合）にも、単一の制限酵素の処理により、後述の工程ｃ１において、目的の構造を除去することができ、操作が簡便である観点から好ましい。

本発明の第一の方法において、第一の制限酵素は、Ｒ１内又はＲ１の３’側を切断し、第二の制限酵素はＲ１’内又はＲ１’の５’側を切断し、第一のベクター及び第二のベクター（並びに、下記の第三、第三’、第四、第四’のベクター）内の他の箇所は切断しない。また、第二の制限酵素はＲ１’内又はＲ１’の５’側を切断し、第三の制限酵素はＲ２内又はＲ２の５’側を切断し、第四の制限酵素はＲ２’内又はＲ２’の３’側を切断し、それぞれ、第一のベクター及び第二のベクター（並びに、下記の第三、第三’、第四、第四’のベクター）内の他の箇所は切断しない。

制限酵素により、その認識配列内に切断箇所がある場合には認識配列内（Ｒ１内、Ｒ１’内、Ｒ１’内、Ｒ２内、Ｒ２’内）で切断する。他方、認識配列と切断箇所とが離れている場合には、例えば、第一の制限酵素がＲ１の５’側で切断を行うと、後述の工程ｄ１で連結されたＤ（ｉｉｉ）とＤ（ｉ）との間にＲ１が存在することになり、また、Ｄ（ｉｉ）とＤ（ｉｖ）との間にＲ１’が存在することになる。この場合、第三のベクターを、さらなるＤＮＡ断片の連結に使用しようとしても、工程ｂ１における第一の制限酵素及び第二の制限酵素による処理で、Ｄ（ｉｉｉ）とＤ（ｉ）との間及びＤ（ｉｉ）とＤ（ｉｖ）との間が切断され、ＤＮＡの連結が解消されてしまう。したがってこの場合、第一の制限酵素は、Ｒ１の３’側を切断し、第二の制限酵素はＲ１’の５’側を切断する必要があり、第三の制限酵素はＲ２の５’側を切断し、第四の制限酵素はＲ２’の３’側を切断する必要がある。

本発明の第一の方法においては、第一の制限酵素で切断されたＲ１の突出末端と第三の制限酵素で切断されたＲ２の突出末端、及び第二の制限酵素で切断されたＲ１’の突出末端と第四の制限酵素で切断されたＲ２’の突出末端とが、工程ｄ１におけるライゲーション反応により連結可能である必要がある。この観点から、第一の制限酵素と第三の制限酵素、及び第二の制限酵素と第四の制限酵素としては、それぞれ２種のタイプＩＩＳ制限酵素、又はＤＮＡ切断により相同の突出末端を生じる２種の制限酵素を用いることが好ましい。

「タイプＩＩＳ制限酵素」は、認識配列と切断部位とが離れている制限酵素であり、切断部位の配列は通常任意である。本発明の第一の方法において、タイプＩＩＳ制限酵素を用いる場合には、一方のタイプＩＩＳ制限酵素がＲ１を認識してその３’側を切断するように、Ｒ１の塩基配列を設定し、他方のタイプＩＩＳ制限酵素がＲ２を認識してその５’側を切断するようにＲ２の塩基配列を設定する。同様に、一方のタイプＩＩＳ制限酵素がＲ１’を認識してその５’側を切断するように、Ｒ１’の塩基配列を設定し、他方のタイプＩＩＳ制限酵素がＲ２’を認識してその３’側を切断するように、Ｒ２’の塩基配列を設定する。さらに、２種のタイプＩＩＳ制限酵素の切断部位の突出末端が連結可能となるように、当該切断部位に相同の塩基配列を設定する。本発明の第一の方法に用いるタイプＩＩＳ制限酵素としては、第一の制限酵素と第三の制限酵素との組み合わせ、及び第二の制限酵素と第四の制限酵素との組み合わせにおいて、それぞれ、ＤＮＡ切断により突出末端のサイズが同じとなるものであれば特に制限されず、例えば、ＢｓａＩ、ＢｂｓＩ、ＢｓｍＢＩ、ＢｓｍＡＩ、が挙げられる。

本発明の第一の方法において、ＤＮＡ切断により相同の突出末端を生じる２種の制限酵素を用いる場合には、一方の制限酵素がＲ１を認識してその内部を切断し、他方の制限酵素がＲ２を認識してその内部を切断するが、Ｒ１及びＲ２の切断により生じる突出末端が相同であるため、互いに連結可能となる。本発明の第一の方法に用いる、ＤＮＡ切断により相同の突出末端を生じる２種の制限酵素としては、例えば、ＮｈｅＩとＳｐｅＩとの組み合わせ、ＡｇｅＩとＸｍａＩとの組み合わせ、ＳａｌＩとＸｈｏＩとの組み合わせが挙げられるが、本発明の目的に適合する限り、これらに制限されない。

－選択マーカー遺伝子－
本発明において、Ｍ１は、第一の選択マーカー遺伝子を示し、Ｍ２は、第二の選択マーカー遺伝子を示す。本発明の第一の方法において、第一の選択マーカー遺伝子は、工程ｄ１の後に、第二の選択マーカー遺伝子を持つ目的外のベクター（副産物）を排除して、第一の選択マーカー遺伝子を持つ目的のベクター（第三のベクター）を選抜する目的で使用される（図３）。この観点から、第一の選択マーカー遺伝子は、第二の選択マーカー遺伝子と異なる選択マーカー遺伝子である必要がある。

選択マーカー遺伝子としては、検出が可能である限り特に制限はなく、例えば、薬剤耐性遺伝子、レポーター遺伝子、逆選択マーカー遺伝子が挙げられるが、これらに制限されない。

前記薬剤耐性遺伝子としては、例えば、スペクチノマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子が挙げられる。また、前記レポーター遺伝子としては、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＤｓＲｅｄ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＢａｎａｎａ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ、ｍＰｌｕｍが挙げられる。前記逆選択マーカー遺伝子とは、形質転換体に当該遺伝子を持つベクターが存在すると当該形質転換体が死滅する作用をもたらす遺伝子であり、例えば、ｃｃｄＢ遺伝子（大腸菌ＤＮＡｇｙｒａｓｅ阻害タンパク質（ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ）遺伝子）などの毒素遺伝子が挙げられる。

このような第一の選択マーカー遺伝子と第二の選択マーカー遺伝子との組み合わせとしては、形質転換体の生存を指標として効率的に目的のベクターを選抜することが可能であるという観点から、第一の選択マーカー遺伝子及び第二の選択マーカー遺伝子が、前記薬剤耐性遺伝子であることが好ましい。

（工程ｂ１、工程ｃ１）
本発明の第一の方法においては、次いで、第一のベクターを第一の制限酵素及び第二の制限酵素で処理して、次の構造：５’－Ｄ（ｉ）－Ｒ２－Ｍ１－Ｒ２’－Ｄ（ｉｉ）－３’からなる第一のベクター断片を得る（工程ｂ１）。一方、第二のベクターを第三の制限酵素及び第四の制限酵素で処理して、次の構造：５’－Ｒ２－Ｍ２－Ｒ２’－３’が除去された第二のベクター断片を得る（工程ｃ１）。工程ｂ１と工程ｃ１とは、いずれを先に行っても、同時並行で行ってもよい。

工程ｂ１における制限酵素処理は、緩衝液中で、制限酵素（第一の制限酵素及び第二の制限酵素）を第一のベクターに作用させることにより行うことができる。工程ｂ１における第一の制限酵素と第二の制限酵素とが異なる場合には、いずれの制限酵素の処理を先に行っても、反応系に両制限酵素をいずれも添加して同時に処理を行ってもよい。

同様に、工程ｃ１における制限酵素処理は、緩衝液中で、制限酵素（第三の制限酵素及び第四の制限酵素）を第二のベクターに作用させることにより行うことができる。工程ｃ１における第三の制限酵素と第四の制限酵素とが異なる場合には、いずれの制限酵素の処理を先に行っても、反応系に両制限酵素をいずれも添加して同時に処理を行ってもよい。

工程ｂ１及びｃ１の反応系に用いる緩衝液としては、従来制限酵素の反応溶媒として公知のものを適宜用いてよく、ＣｕｔＳｍａｒｔ Ｂｕｆｆｅｒ（ＮＥＢ）等の市販のものを適宜用いてもよい。また、前記反応系としては、制限酵素の種類等に応じて適宜条件を調整することができるが、例えば、５～１０μｇ／５０μＬのベクターに対して、反応系に添加する各制限酵素の濃度としては、０．１～０．２ｕｎｉｔｓ／μＬであることが好ましく、各ベクターの濃度としては、１００～２００ｎｇ／μＬであることが好ましい。さらに、前記反応系の反応温度としては、３７℃程度であることが好ましく、反応時間としては、１～２時間であることが好ましい。

工程ｂ１においては、制限酵素処理の後に、セルフライゲーションを防ぐために、アルカリホスファターゼ（ＣＩＰ等）による脱リン酸化処理を行ってもよい。

また、工程ｂ１においては、反応産物から、生成された第一のベクター断片を回収する操作を含むことができ、また、工程ｃ１においては、反応産物から、生成された第二のベクター断片を回収する操作を含むことができる。このようなベクター断片の回収は、例えば、アガロースゲル電気泳動などの電気泳動によるサイズ分画により行うことができる。

（工程ｄ１）
本発明の第一の方法においては、次いで、ライゲーション反応により、工程ｂ１で得られた第一のベクター断片と工程ｃ１で得られた第二のベクター断片とを連結し、下記（３）の構造：
（３）５’－Ｒ１－Ｄ（ｉ）_１－Ｒ２－Ｍ１－Ｒ２’－Ｄ（ｉｉ）_１－Ｒ１’－３’
を含む第三のベクターを生成させる（工程ｄ１）。

ここで、Ｄ（ｉ）_１は、次の構造：５’－Ｄ（ｉｉｉ）－Ｄ（ｉ）－３’を含むＤＮＡ断片を示し、Ｄ（ｉｉ）_１は、次の構造：５’－Ｄ（ｉｉ）－Ｄ（ｉｖ）－３’を含むＤＮＡ断片を示す。以下、特にことわりのない場合、Ｄ（ｉ）～Ｄ（ｉｖ）に付す下付き文字は、ＤＮＡ断片が連結された回数を示す。

工程ｄ１におけるライゲーション反応は、第一のベクター断片と第二のベクター断片とを連結させる反応であり、緩衝液中で、ＤＮＡリガーゼを作用させることにより行うことができる。工程ｄ１の反応系に用いる緩衝液としては、上記と同様のものが挙げられる。前記反応系に添加するＤＮＡリガーゼとしては、例えば、Ｔ４リガーゼを用いることができるが、これらに制限されない。また、前記反応系としては、ＤＮＡリガーゼの種類等に応じて適宜条件を調整することができるが、例えば、反応系に添加するＤＮＡリガーゼの濃度としては、２０～４０ｕｎｉｔｓ／μＬであることが好ましく、各ベクター断片の濃度としては、１００～２００ｎｇ／μＬであることが好ましい。さらに、前記反応系の反応温度としては、１６～２５℃であることが好ましく、反応時間としては、１～１２時間であることが好ましい。

＜連結ＤＮＡを製造する第二の方法＞
本発明の連結ＤＮＡを製造する第二の方法は、
（ａ２）下記（１）の構造を含む第一のベクター及び下記（２）の構造を含む第二のベクター：
（１）５’－Ｒ１－Ｄ（ｉ）－Ｒ２－Ｍ１－Ｒ２’－Ｄ（ｉｉ）－Ｒ１’－３’
（２）５’－Ｒ１－Ｄ（ｉｉｉ）－Ｒ２－Ｍ２－Ｒ２’－Ｄ（ｉｖ）－Ｒ１’－３’
［ここで、Ｒ１は、第一の制限酵素の認識配列を示し；Ｒ１’は、第二の制限酵素の認識配列を示し；Ｒ２は、第一の制限酵素及び第二の制限酵素とは異なる第三の制限酵素の認識配列を示し；Ｒ２’は、第一の制限酵素及び第二の制限酵素とは異なる第四の制限酵素の認識配列を示し；Ｍ１は、第一の選択マーカー遺伝子を示し；Ｍ２は、第一の選択マーカー遺伝子とは異なる第二の選択マーカー遺伝子を示し；Ｄ（ｉ）～Ｄ（ｉｖ）は、それぞれ独立に、任意の連結用ＤＮＡ断片を示し、Ｄ（ｉ）及びＤ（ｉｉ）はいずれか一方であってよく、Ｄ（ｉｉｉ）及びＤ（ｉＶ）はいずれか一方であってよい。第一の制限酵素はＲ１内又はＲ１の３’側を切断し、第二の制限酵素はＲ１’内又はＲ１’の５’側を切断し、第一の制限酵素と第二の制限酵素とは同一でも異なっていてもよく；第三の制限酵素はＲ２内又はＲ２の５’側を切断し、第四の制限酵素はＲ２’内又はＲ２’の３’側を切断し、第三の制限酵素と第四の制限酵素とは同一でも異なっていてもよい。］
を準備する工程ａ２と、
（ｂ２）第二のベクターを第一の制限酵素及び第二の制限酵素で処理して、次の構造：５’－Ｄ（ｉｉｉ）－Ｒ２－Ｍ２－Ｒ２’－Ｄ（ｉｖ）－３’からなる第二のベクター断片を得る工程ｂ２と、
（ｃ２）第一のベクターを第三の制限酵素及び第四の制限酵素で処理して、次の構造：５’－Ｒ２－Ｍ１－Ｒ２’－３’が除去された第一のベクター断片を得る工程ｃ２と、
（ｄ２）ライゲーション反応により、工程ｂ２で得られた第二のベクター断片と工程ｃ２で得られた第一のベクター断片とを連結し、下記（４）の構造を含む第四のベクター：
（４）５’－Ｒ１－Ｄ（ｉｉｉ）_１－Ｒ２－Ｍ２－Ｒ２’－Ｄ（ｉｖ）_１－Ｒ１’－３’
［ここで、Ｄ（ｉｉｉ）_１は、次の構造：５’－Ｄ（ｉ）－Ｄ（ｉｉｉ）－３’を含むＤＮＡ断片を示し、Ｄ（ｉｖ）_１は、次の構造：５’－Ｄ（ｉｖ）－Ｄ（ｉｉ）－３’を含むＤＮＡ断片を示す。］
を生成させる工程ｄ２と、
を含む。

上記の本発明の第一の方法においては、上述のとおり、第一のベクターを第一の制限酵素及び第二の制限酵素で処理することにより、得られたＤＮＡ断片「５’－Ｄ（ｉ）－Ｒ２－Ｍ１－Ｒ２’－Ｄ（ｉｉ）－３’」を、第二のベクターにおける「５’－Ｒ２－Ｍ２－Ｒ２’－３’」と入れ替える工程を含むが、同様の原理で、本発明の第二の方法においては、第二のベクターを第一の制限酵素及び第二の制限酵素で処理することにより、得られたＤＮＡ断片「５’－Ｄ（ｉｉｉ）－Ｒ２－Ｍ２－Ｒ２’－Ｄ（ｉｖ）－３’」を、第一のベクターにおける「５’－Ｒ２－Ｍ１－Ｒ２’－３’」と入れ替える。よって、本発明の第二の方法では、本発明の第一の方法と異なり、第二の選択マーカー遺伝子を含むベクターが生成される。

（工程ａ２）
本発明の第二の方法における工程ａ２は、第一の方法における工程ａ１と同様である。また、連結用ＤＮＡ断片、制限酵素及びその認識配列、選択マーカー遺伝子、及びこれらの好ましい態様も、第一の方法における工程ａ１において述べたとおりである。

（工程ｂ２、工程ｃ２）
本発明の第二の方法においては、次いで、第一の方法とは逆に、第二のベクターを第一の制限酵素及び第二の制限酵素で処理して、次の構造：５’－Ｄ（ｉｉｉ）－Ｒ２－Ｍ２－Ｒ２’－Ｄ（ｉｖ）－３’からなる第二のベクター断片を得る（工程ｂ２）。一方、第一のベクターを第三の制限酵素及び第四の制限酵素で処理して、次の構造：５’－Ｒ２－Ｍ１－Ｒ２’－３’が除去された第一のベクター断片を得る（工程ｃ２）。工程ｂ２と工程ｃ２とは、いずれを先に行っても、同時並行で行ってもよい。

工程ｂ２における制限酵素処理及び工程ｃ２における制限酵素処理としては、その好ましい態様も含めて、それぞれ、工程ｂ１における制限酵素処理及び工程ｃ１における制限酵素処理と同様である。また、前記アルカリホスファターゼ処理やベクター断片を回収する工程をさらに含んでいてもよい。

（工程ｄ２）
本発明の第二の方法においては、次いで、ライゲーション反応により、工程ｂ２で得られた第二のベクター断片と工程ｃ２で得られた第一のベクター断片とを連結し、下記（４）の構造：
（４）５’－Ｒ１－Ｄ（ｉｉｉ）_１－Ｒ２－Ｍ２－Ｒ２’－Ｄ（ｉｖ）_１－Ｒ１’－３’
を含む第四のベクターを生成させる（工程ｄ２）。

ここで、Ｄ（ｉｉｉ）_１は、次の構造：５’－Ｄ（ｉ）－Ｄ（ｉｉｉ）－３’を含むＤＮＡ断片を示し、Ｄ（ｉｖ）_１は、次の構造：５’－Ｄ（ｉｖ）－Ｄ（ｉｉ）－３’を含むＤＮＡ断片を示す。工程ｄ２におけるライゲーション反応としては、その好ましい態様も含めて、それぞれ、工程ｄ１におけるライゲーション反応と同様である。

（形質転換）
本発明の第一の方法においては、工程ｄ１の後に、ライゲーション反応産物を宿主に形質転換する工程、及び、第一の選択マーカー遺伝子の発現を指標として第三のベクターが導入された宿主を選抜する工程をさらに含むことができる。同様に、本発明の第二の方法においては、工程ｄ２の後に、ライゲーション反応産物を宿主に形質転換する工程、及び、第二の選択マーカー遺伝子の発現を指標として第四のベクターが導入された宿主を選抜する工程をさらに含むことができる。

ライゲーション反応産物の宿主への形質転換は、当業者に公知の方法、例えば、ヒートショック法、エレクトロポレーション法により行うことができる。第三のベクター又は第四のベクターが導入された宿主の選抜の方法は、それぞれ第一の選択マーカー遺伝子又は第二の選択マーカー遺伝子の種類に応じて異なるが、例えば、当該選択マーカー遺伝子が薬剤耐性遺伝子である場合には、その薬剤を含む環境下での生存を指標に選抜することができ、当該選択マーカー遺伝子がレポーター遺伝子である場合には、レポーター活性（例えば、蛍光など）を指標に選抜することができる。

（第五の制限酵素、第六の制限酵素）
本発明の第一の方法及び第二の方法においては、Ｒ１、Ｒ１’、Ｒ２、及びＲ２’のいずれとも異なる第五の制限酵素の認識配列（図３では、その認識配列を「Ｒ５」で示した）を、第一のベクターにおける前記構造（１）以外の部位にさらに設定することができ、また、Ｒ１、Ｒ１’、Ｒ２、Ｒ２’及び第五の制限酵素の認識配列のいずれとも異なる第六の制限酵素の認識配列（図３では、その認識配列を「Ｒ６」で示した）を、第二のベクターにおける前記構造（２）以外の部位にさらに設定することができる。

このような第五の制限酵素及び第六の制限酵素としては、特に制限はないが、例えば、認識配列が長く非特異的な切断が生じにくい、Ｉ－ＣｅｕＩ、Ｉ－ＳｃｅＩが好ましい。

この場合、本発明の第一の方法における工程ｂ１において、反応産物から、生成された第一のベクター断片を回収する操作を省略することができ、また、工程ｃ１において、反応産物から、生成された第二のベクター断片を回収する操作を省略することができる。すなわち、工程ｂ１の反応産物及び工程ｃ１の反応産物に対して、そのままライゲーション反応を行うと、制限酵素処理で切り出された断片が元のベクターに戻るセルフライゲーションが副反応として生じ、元のベクターが副産物として生じてしまう（図３）。この場合でも、本発明の第一の方法における工程ｂ１と同時若しくは工程ｂ１の後、或いは工程ｄ１の後に、第五の制限酵素で処理を行うことにより、元の第一のベクターは切断して除去することができ、一方、元の第二のベクターは、第一の選択マーカー遺伝子を持たないため、当該第一の選択マーカーによる選抜処理により、除去することができる。

同様に、本発明の第二の方法における工程ｂ２と同時若しくは工程ｂ２の後、或いは工程ｄ２の後に、第六の制限酵素で処理を行うことにより、元の第二のベクターは切断して除去することができ、元の第一のベクターは、第二の選択マーカー遺伝子を持たないため、当該第二の選択マーカーによる選抜処理により、除去することができる。

（選択マーカー遺伝子の除去）
また、本発明の第一の方法においては、工程ｄ１の後に、第三のベクターを第三の制限酵素及び第四の制限酵素で処理して、次の構造：５’－Ｒ２－Ｍ１－Ｒ２’－３’を除去し、セルフライゲーション反応を行うことにより、次の構造：５’－Ｒ１－Ｄ（ｉ）_１－Ｄ（ｉｉ）_１－Ｒ１’－３’を含む第五のベクターを生成させる工程をさらに含むことができる。これにより、第一の選択マーカー遺伝子の両側にある連結用ＤＮＡ断片を連結することができる。この場合、第三の制限酵素と第四の制限酵素とは同じ制限酵素であるか、相同の突出末端を生じる制限酵素であることが必要である。

同様に、本発明の第二の方法においては、工程ｄ２の後に、第四のベクターを第三の制限酵素及び第四の制限酵素で処理して、次の構造：５’－Ｒ２－Ｍ２－Ｒ２’－３’を除去し、セルフライゲーション反応を行うことにより、次の構造：５’－Ｒ１－Ｄ（ｉｉｉ）_１－Ｄ（ｉｖ）_１－Ｒ１’－３’を含む第六のベクターを生成させる工程をさらに含むことができる。これにより、第二の選択マーカー遺伝子の両側にある連結用ＤＮＡ断片を連結することができる。この場合にも、第三の制限酵素と第四の制限酵素とは同じ制限酵素であるか、相同の突出末端を生じる制限酵素であることが必要である。

本工程における制限酵素による処理及びライゲーション反応（セルフライゲーション反応）の方法及び条件は、上記と同様である。

（第三の選択マーカー遺伝子、第四の選択マーカー遺伝子）
また、本発明の第一の方法においては、第一の選択マーカー遺伝子の除去とセルフライゲーションにより生成された第五のベクターの選抜とを容易にするために、第一の選択マーカー遺伝子とは逆の作用を有する選択マーカー遺伝子である第三の選択マーカー遺伝子が第一のベクターのＲ２とＲ２’との間にさらに挿入されていることが好ましい。同様に、本発明の第二の方法においては、第二の選択マーカー遺伝子の除去とセルフライゲーションにより生成された第六のベクターの選抜とを容易にするために、第二の選択マーカー遺伝子とは逆の作用を有する選択マーカー遺伝子である第四の選択マーカー遺伝子が第二のベクターのＲ２とＲ２’との間にさらに挿入されていることが好ましい。第三の選択マーカー遺伝子及び第四の選択マーカー遺伝子をいずれも用いる場合、第三の選択マーカー遺伝子と第四の選択マーカー遺伝子とは、同一であっても異なっていてもよい。

これにより、上記の選択マーカー遺伝子の除去をした場合に、前記セルフライゲーションの反応産物で形質転換体を作製すると、第三の選択マーカー遺伝子又は第四の選択マーカー遺伝子も除去されるため、第三の選択マーカー遺伝子又は第四の選択マーカー遺伝子の発現を指標として、第五のベクター又は第六のベクターを選択することができる。

ここで、ある選択マーカーとは逆の作用を有する選択マーカー遺伝子とは、例えば、ある選択マーカー遺伝子の発現によって形質転換体の生存が可能となる場合、その発現によって形質転換体が生存できなくなる遺伝子のことをいう。例えば、第一の選択マーカー遺伝子が前記薬剤耐性遺伝子である場合、第三の選択マーカー遺伝子としては、前記逆選択マーカー遺伝子を選択することができる。この場合、例えば、本発明の第一の方法における工程ａ１～ｄ１、及び／又は、本発明の第二の方法における工程ａ２～ｄ２において、形質転換体を利用する際に、当該形質転換体が死滅しないよう、前記逆選択マーカー耐性の宿主を用いる。

＜連結の繰り返し＞
本発明の第一の方法によれば、上記工程ａ１～ｄ１のサイクルを繰り返すことにより、連結用ＤＮＡ断片を順次連結することができる。すなわち、本発明は、本発明の第一の方法を１サイクル行った後に、工程ｄ１で生成させた第三のベクターを、工程ａ１の第一のベクターとして用い、工程ａ１～ｄ１をさらにｎサイクル（合計１＋ｎサイクル）繰り返して、下記（３’）の構造：
（３’）５’－Ｒ１－Ｄ（ｉ）_１＋ｎ－Ｒ２－Ｍ１－Ｒ２’－Ｄ（ｉｉ）_１＋ｎ－Ｒ１’－３’
を含む第三’のベクターを生成させる、連結ＤＮＡの製造方法を提供する。

ここで、Ｄ（ｉ）_１＋ｎは、１＋ｎサイクル目で得られる、第一の選択マーカー遺伝子の５’側の連結されたＤＮＡ断片である。当該連結されたＤＮＡ断片においては、サイクルを繰り返す毎に、５’側に第二のベクター由来のＤ（ｉｉｉ）が連結されることになる。したがって、Ｄ（ｉ）_１＋ｎは、次の構造：５’－Ｄ（ｉｉｉ）－Ｄ（ｉ）_ｎ－３’を含むＤＮＡ断片となる。Ｄ（ｉ）_ｎは、ｎサイクル目で得られた、次の構造：５’－Ｄ（ｉｉｉ）－Ｄ（ｉ）_ｎ－１－３’を含むＤＮＡ断片であり、以降同様に続く。

同様に、Ｄ（ｉｉ）_１＋ｎは、１＋ｎサイクル目で得られる、第一の選択マーカー遺伝子の３’側の連結されたＤＮＡ断片である。当該連結されたＤＮＡ断片においては、サイクルを繰り返す毎に、３’側に第二のベクター由来のＤ（ｉｖ）が連結されることになる。したがって、Ｄ（ｉｉ）_１＋ｎは、次の構造：５’－Ｄ（ｉｉ）_ｎ－Ｄ（ｉｖ）－３’を含むＤＮＡ断片となる。Ｄ（ｉｉ）_ｎは、ｎサイクル目で得られた、次の構造：５’－Ｄ（ｉｉ）_ｎ－１－Ｄ（ｉｖ）－３’を含むＤＮＡ断片であり、以降同様に続く。

なお、上述したように、Ｄ（ｉ）～Ｄ（ｉｖ）に付す下付き文字は、ＤＮＡ断片が連結された回数（サイクル数）を示し、例えば、いずれか又は全てのサイクルにおいて、Ｄ（ｉ）及びＤ（ｉｉ）がいずれか一方である場合、及び／又は、Ｄ（ｉｉｉ）及びＤ（ｉｖ）がいずれか一方である場合、当該下付き文字で示される数字は、連結されたＤＮＡ断片の個数に一致しない。

また、各サイクル間で、第二のベクターのＤ（ｉｉｉ）は、互いに同一であっても異なっていてもよく、また、各サイクル間で、第二のベクターのＤ（ｉｖ）は、互いに同一であっても異なっていてもよい。したがって、サイクルを繰り返す毎に、第一の選択マーカー遺伝子の両側に、新たなＤＮＡ断片Ｄ（ｉｉｉ）及びＤ（ｉｖ）を連結することが可能である。

同様に、本発明の第二の方法によれば、上記工程ａ２～ｄ２のサイクルを繰り返すことにより、連結用ＤＮＡ断片を順次連結することができる。すなわち、本発明は、本発明の第二の方法を１サイクル行った後に、工程ｄ２で生成させた第四のベクターを、工程ａ２の第二のベクターとして用い、工程ａ２～ｄ２をさらにｎサイクル（合計１＋ｎサイクル）繰り返して、下記（４’）の構造：
（４’）５’－Ｒ１－Ｄ（ｉｉｉ）_１＋ｎ－Ｒ２－Ｍ２－Ｒ２’－Ｄ（ｉｖ）_１＋ｎ－Ｒ１’－３’
を含む第四’のベクターを生成させる、連結ＤＮＡの製造方法を提供する。

ここで、Ｄ（ｉｉｉ）_１＋ｎは、１＋ｎサイクル目で得られる、第二の選択マーカー遺伝子の５’側の連結されたＤＮＡ断片である。当該連結されたＤＮＡ断片においては、サイクルを繰り返す毎に、５’側に第一のベクター由来のＤ（ｉ）が連結されることになる。したがって、Ｄ（ｉｉｉ）_１＋ｎは、次の構造：５’－Ｄ（ｉ）－Ｄ（ｉｉｉ）_ｎ－３’を含むＤＮＡ断片となる。Ｄ（ｉｉｉ）_ｎは、ｎサイクル目で得られた、次の構造：５’－Ｄ（ｉ）－Ｄ（ｉｉｉ）_ｎ－１－３’を含むＤＮＡ断片であり、以降同様に続く。

同様に、Ｄ（ｉｖ）_１＋ｎは、１＋ｎサイクル目で得られる、第二の選択マーカー遺伝子の３’側の連結されたＤＮＡ断片である。当該連結されたＤＮＡ断片においては、サイクルを繰り返す毎に、３’側に第一のベクター由来のＤ（ｉｉ）が連結されることになる。したがって、Ｄ（ｉｖ）_１＋ｎは、次の構造：５’－Ｄ（ｉｖ）_ｎ－Ｄ（ｉｉ）－３’を含むＤＮＡ断片となる。Ｄ（ｉｖ）_ｎは、ｎサイクル目で得られた、次の構造：５’－Ｄ（ｉｖ）_ｎ－１－Ｄ（ｉｉ）－３’を含むＤＮＡ断片であり、以降同様に続く。

また、各サイクル間で、第一のベクターのＤ（ｉ）は、互いに同一であっても異なっていてもよく、また、各サイクル間で、第一のベクターのＤ（ｉｉ）は、互いに同一であっても異なっていてもよい。したがって、このサイクルを繰り返す毎に、第二の選択マーカー遺伝子の両側に、新たなＤＮＡ断片Ｄ（ｉ）及びＤ（ｉｉ）を連結することが可能である。第一の方法及び第二の方法において、ｎは自然数であって１以上の数であり、上限としては、連結ＤＮＡのサイズがベクターや宿主細胞に許容される限り特に制限されない。

以下、図４を参照して、本発明の第一の方法の一態様を具体的に説明する。本発明の第一の方法では、選択マーカー遺伝子が異なる二つのベクターを用いる（工程ａ１）。図４の例では、第一の選択マーカー遺伝子は、スペクチノマイシン耐性遺伝子（Ｓｐｅｃ^Ｒ）であり、第二の選択マーカー遺伝子は、クロラムフェニコール耐性遺伝子（Ｃｍ^Ｒ）であり、第三の選択マーカー遺伝子は、ｃｃｄＢ遺伝子（逆選択マーカー遺伝子）である。また、第一の制限酵素及び第二の制限酵素としてＢｓａＩを、第三の制限酵素及び第四の制限酵素としてＢｂｓＩを、それぞれ使用している。第一のベクター及び第二のベクターにおいては、第一の制限酵素としてのＢｓａＩが、その認識配列Ｒ１の３’側を、第二の制限酵素としてのＢｓａＩが、その認識配列Ｒ１’の５’側を、それぞれ切断するように各認識配列が配置されており、第三の制限酵素としてのＢｂｓＩが、その認識配列Ｒ２の５’側を、第四の制限酵素としてのＢｂｓＩが、その認識配列Ｒ２’の３’側を、それぞれ切断するように各認識配列が配置されている。

本例では、第一のベクターの第一の選択マーカー遺伝子Ｓｐｅｃ^ＲをＢｓａＩによって連結用ＤＮＡ１及び連結用ＤＮＡ２と共に切り出し（工程ｂ１）、一方、第二のベクターにおいて第二の選択マーカー遺伝子（及び第三の選択マーカー遺伝子）ｃｃｄＢ＋Ｃｍ^ＲをＢｂｓＩによって切り出し除去し（工程ｃ１）、第一のベクターから切り出されたＤＮＡ断片（第一の選択マーカー遺伝子カセット）が、第二のベクターから切り出されたＤＮＡ断片（第二の選択マーカー遺伝子カセット）と入れ替わるように、ライゲーション反応を行う（工程ｄ１）。こうして、第一の選択マーカー遺伝子の５’側に、連結されたＤＮＡ断片（連結用ＤＮＡ３＋連結用ＤＮＡ１）が形成され、３’側に、連結されたＤＮＡ断片（連結用ＤＮＡ２＋連結用ＤＮＡ４）が形成される。

このとき、第一のベクターにおいて切断に利用したＢｓａＩの認識配列Ｒ１及びＲ１’並びに第二のベクターにおいて切断に利用したＢｂｓＩの認識配列Ｒ２及びＲ２’は、連結されたＤＮＡ断片（連結用ＤＮＡ３と連結用ＤＮＡ１の間、及び連結用ＤＮＡ２と連結用ＤＮＡ４の間）には残らない。こうして、次のサイクルにおける制限酵素処理でＤＮＡ断片の連結を解消してしまうことになる余計な認識配列を残さずに、ＤＮＡ断片同士を連結することができる。一方、切断に利用しなかった第二のベクター由来のＢｓａＩの認識配列及び第一のベクター由来のＢｂｓＩの認識配列は残されているため、ライゲーション反応により生成される第三のベクターにおいて、第一の選択マーカー遺伝子Ｓｐｅｃ^Ｒの両端に、ＢｂｓＩの認識配列Ｒ２及びＢｓａＩの認識配列Ｒ２’が元の第一のベクターと同様の位置で復元される。したがって、このサイクル（工程ａ１～ｄ１）は、何度も繰り返し行うことが可能である。

第二の方法においても、同様の原理で、サイクル（工程ａ２～ｄ２）は、何度も繰り返し行うことが可能である（図５）。

＜第一の方法と第二の方法との組み合わせ＞
本発明においては、第一の方法で生成された第三のベクター又は第三’のベクターと、第二の方法で生成された第四のベクター又は第四’のベクターとを組み合わせて、同様のＤＮＡ断片の連結サイクルを行うことができる。

したがって、本発明は、第一の方法における工程ｄ１で生成させた第三のベクター又は第三’のベクターを、第二の方法における工程ａ２の第一のベクターとして用いることを特徴とする、連結ＤＮＡの製造方法を提供する。また、本発明は、第二の方法における工程ｄ２で生成させた第四のベクター又は第四’のベクターを、第一の方法における工程ａ１の第二のベクターとして用いることを特徴とする、連結ＤＮＡの製造方法を提供する。

以下、図６を参照して、本発明の組み合わせの一態様を説明する。すなわち、図６では、先ず、連結用ＤＮＡ断片を１つずつ含む第一のベクター（Ｓｐｅｃ^Ｒを含むベクター）及び第二のベクター（Ｃｍ^Ｒを含むベクター）から、本発明の第一の方法を１サイクル行って（１段階目）、連結用ＤＮＡ断片を２つ含む第三のベクター（Ｓｐｅｃ^Ｒを含むベクター）を生成させる。また、同様に、連結用ＤＮＡ断片を１つずつ含む第一のベクター（Ｓｐｅｃ^Ｒを含むベクター）及び第二のベクター（Ｃｍ^Ｒを含むベクター）から、本発明の第二の方法を１サイクル行って（１段階目）、連結用ＤＮＡ断片を２つ含む第四のベクター（Ｃｍ^Ｒを含むベクター）を生成させる。これらを、それぞれ、第二の方法の工程ａ２の第一のベクター及び第二のベクターとして用いる（２段階目）。これを繰り返すことにより、繰り返しのたびに集積されるＤＮＡ断片の数は、１、２、４、８、１６、３２と、指数関数的に増やすことができる。また、ＤＮＡ断片の連結時には、選択マーカー遺伝子を、Ｓｐｅｃ^Ｒ（第一の選択マーカー遺伝子）→Ｃｍ^Ｒ（第二の選択マーカー遺伝子）→Ｓｐｅｃ^Ｒ→Ｃｍ^Ｒ→・・・と切り替えることができるため、サイクル毎に、薬剤（スペクチノマイシン又はクロラムフェニコール）による選択を行うだけで、生成されたＤＮＡ産物の品質検査を経ずとも、高確率で目的の連結ＤＮＡが挿入されたベクターを保持する形質転換体のみを効率的に選択することができる。

目的の連結ＤＮＡを保持するベクター（目的産物）としては、第三の選択マーカー遺伝子又は第四の選択マーカー遺伝子を含むベクターであることが好ましい。図６では、第二のベクターの第四の選択マーカー遺伝子として、逆選択マーカー遺伝子であるｃｃｄＢ遺伝子を有している。ＮＥＢ５α等の一般的に形質転換に用いられる大腸菌株は、ｃｃｄＢ遺伝子を保有していると生育できずに死滅する。したがって、第三の制限酵素及び第四の制限酵素による切断後、セルフライゲーション反応を行い、ｃｃｄＢ耐性ではない宿主に形質転換すれば、第二のベクターにおいてｃｃｄＢ遺伝子を持たないＤＮＡ産物、すなわち、選択マーカー遺伝子が除去されて、１つに連結されたＤＮＡ産物を選択することができる。なお、ｃｃｄＢ遺伝子を逆選択マーカー遺伝子として利用する場合には、ｃｃｄＢ耐性株を繰り返しサイクルに用いる。

さらに、第五の制限酵素の認識配列（例えば、Ｉ－ＣｅｕＩ）を第一のベクターにおける前記構造（１）以外の部位にさらに設定し、かつ、第五の制限酵素の認識配列とは異なる第六の制限酵素の認識配列（例えば、Ｉ－ＳｃｅＩ）を第二のベクターにおける前記構造（２）以外の部位にさらに設定した場合には、各サイクルで、生成されるベクターにおける選択マーカー遺伝子が、Ｓｐｅｃ^Ｒ（第一の選択マーカー遺伝子）→Ｃｍ^Ｒ（第二の選択マーカー遺伝子）→Ｓｐｅｃ^Ｒ→Ｃｍ^Ｒ→・・・と切り替わるのに応じて、目的のベクターに含まれる制限酵素の認識配列が、Ｉ－ＣｅｕＩ→Ｉ－ＳｅｕＩ→Ｉ－ＣｅｕＩ→Ｉ－ＳｃｅＩ→・・・と切り替わる。したがって、この場合、生成物を、Ｉ－ＳｅｕＩ→Ｉ－ＣｅｕＩ→Ｉ－ＳｃｅＩ→Ｉ－ＣｅｕＩ→・・・という順に制限酵素（ホーミングヌクレアーゼ）で処理することにより、目的外のベクター（セルフライゲーションした副産物）を切断して、除去することができる（図３を参照のこと）。

また、本発明の第一の方法及び第二の方法の各サイクルで得られる目的産物や中間産物としての各ベクターは、別の組み合せの目的産物や中間産物としての各ベクターと組み合わせて、さらに様々な連結ＤＮＡの製造に再利用することができる。このように再利用可能な様々な産物のストックが増加すれば、新たな目的産物の製造に必要な工程数が減少するため、製造時間を短縮したり、製造工程を効率化したりすることができる（図７）。

＜ベクターの組み合わせ＞
本発明は、上記本発明の第一の方法及び／又は第二の方法に用いるための、以下のベクターの組み合わせ（ベクターの第一の組み合わせ）、すなわち、
下記（１）の構造を含む第一のベクター及び下記（２）の構造を含む第二のベクター：
（１）５’－Ｒ１－Ｄ（ｉ）－Ｒ２－Ｍ１－Ｒ２’－Ｄ（ｉｉ）－Ｒ１’－３’
（２）５’－Ｒ１－Ｄ（ｉｉｉ）－Ｒ２－Ｍ２－Ｒ２’－Ｄ（ｉｖ）－Ｒ１’－３’
を提供する。ここで、Ｄ（ｉ）～Ｄ（ｉｖ）、Ｒ１、Ｒ１’、Ｒ２、Ｒ２’、Ｍ１、Ｍ２は、それぞれ、その好ましい態様も含めて、上記の本発明に係る第一ベクター及び第二のベクターとして述べたとおりである。

また、本発明は、第一のベクターの組み合わせを調製するために、連結用ＤＮＡの挿入部位を有する、以下のベクターの組み合わせ（ベクターの第二の組み合わせ）、すなわち、
下記（１’）の構造を含む第一のベクター及び下記（２’）の構造を含む第二のベクター：
（１’）５’－Ｒ１－Ｅ１－Ｒ２－Ｍ１－Ｒ２’－Ｅ２－Ｒ１’－３’
（２’）５’－Ｒ１－Ｅ３－Ｒ２－Ｍ２－Ｒ２’－Ｅ４－Ｒ１’－３’
も提供する。ここで、Ｒ１、Ｒ１’、Ｒ２、Ｒ２’、Ｍ１、Ｍ２は、それぞれ、その好ましい態様も含めて、上記の本発明に係る第一ベクター及び第二のベクターにおいて述べたとおりである。Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３、及びＥ４は、それぞれ独立に、任意の連結用ＤＮＡ断片の挿入用部位を示し、Ｅ１及びＥ２はいずれか一方であってよく、Ｅ３及びＥ４はいずれか一方であってよい。前記挿入用部位としては、例えば、マルチクローニングサイトが挙げられるが、これに限られるものではない。

これらベクターの組み合わせは、それぞれ、ベクターの組み合わせ物としても、前記ベクターの組み合わせを含むキットとしてもよい。キットとする場合には、各制限酵素反応やライゲーション反応に必要な酵素、緩衝液、希釈緩衝液等をさらに含んでいてもよいが、これらに制限されない。

＜応用例（ゲノム編集系の調製）＞
本発明の方法は、第一の方法と第二の方法との組み合わせ、さらに各繰り返しのパターンやサイクル数をランダムに組み合わせることにより、いくつもの組み合わせパターンでＤＮＡ断片を連結することができる方法（ＦＲＡＣＴＡＬアセンブリ法）である。そのため、ＤＮＡ断片の種類や数によらず、様々な技術に用いることができる。

例えば、本発明をゲノム編集系の調製に用いる場合、連結用ＤＮＡ断片Ｄ（ｉ）～Ｄ（ｉｉｉ）としては、それぞれ例えば、ＺＦ（Ｚｉｎｃ Ｆｉｎｇｅｒ）、ＴＡＬＥ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｃｔｉｖａｔｏｒ Ｌｉｋｅ Ｅｆｆｅｃｔｏｒｓ）、ＰＰＲ（Ｐｅｎｔａｔｒｉｃｏｐｅｐｔｉｄｅ Ｒｅｐｅａｔ）などのゲノム編集酵素の繰り返しユニットをコードするＤＮＡ；ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ ＣＲＩＳＰＲ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）のガイドＲＮＡをコードするＤＮＡを採用することができる。また、例えば、Ｄ（ｉ）及びＤ（ｉｉｉ）として、ゲノム編集酵素の繰り返しユニット、又はガイドＲＮＡをコードするＤＮＡを採用し、Ｄ（ｉｉ）及びＤ（ｉｖ）として、それぞれＤ（ｉ）及びＤ（ｉｉｉ）に特異的な短いバーコード配列（識別用配列）を採用すれば、各繰り返しユニットや各ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡがどのような順序で連結されたのかを、これらの配列を全て確認しなくとも、連結されたバーコード配列を指標に判別することができる。以下、具体的な態様を例に挙げて説明する。

－ｇＲＮＡの連結－
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムを用いたゲノム編集技術は、その簡便さと編集効率の高さから急速に利用が広まり、今や遺伝子工学における標準的な技術の１つとなっている。数塩基のＰＡＭ認識配列に隣接する２０塩基程度の任意の標的配列と相補的なガイドＲＮＡさえ合成すれば、ガイドＲＮＡがＣａｓ９を標的配列まで誘導する役割を果たし、Ｃａｓ９によるＤＮＡ二重鎖切断によって標的配列を含む遺伝子の機能を破壊することができる。これまでに、ヒトをはじめとする哺乳細胞や酵母等を対象に、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９を利用した様々な遺伝子ノックアウトライブラリが作製されてきたが、数十以上の遺伝子を同時に欠損した多重遺伝子欠損細胞を作製するような技術はこれまで存在しなかった。これは複数のガイドＲＮＡをコードする配列（ｇＲＮＡ）を単一のベクターに搭載するのが難しいことに起因する。これまでにもＧｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅ法等を用いて複数のｇＲＮＡをシングルベクターに集積する手法はあったが、集積できる数は最大で１０個程度であった。一方、本発明の連結ＤＮＡの製造方法によれば、数十以上のｇＲＮＡを連結することが可能である。ただし、単に数十個のｇＲＮＡが一つのアレイとして連結されたベクターライブラリを作製しても、単一のガイドＮＡ発現ユニットの長さはプロモータ配列も含めると３５０ｂｐ程度であるため、ｇＲＮＡがタンデムに連結されたアレイ領域をＤＮＡシークエンシングによって直接同定することは難しい。

そこで、本例では、本発明の連結ＤＮＡの製造方法を用いて、選択マーカー遺伝子の一端にｇＲＮＡを、もう一端にはそのｇＲＮＡに対応するバーコード配列（ＢＣ）を、それぞれ連結したベクターライブラリ（ｇＲＮＡ－ＢＣベクター）を作製した（実施例の１）。作製したベクターライブラリをヒト細胞にトランスフェクションすれば、多様な多重遺伝子欠損細胞を得ることができる。さらに、同一のＤＮＡ分子上にｇＲＮＡのアレイとそれに対応する短いＤＮＡバーコードのアレイとが対応して集積することになるため、このＤＮＡバーコードアレイの塩基配列を読むことでｇＲＮＡの組合せを同定することができる。本例では、選択マーカー遺伝子の一端がＢｂｓＩ、ＢｓａＩではなく、ＮｈｅＩ、ＳｐｅＩの制限酵素サイトであるツールキットベクターを用いた。この場合、ＮｈｅＩ、ＳｐｅＩで処理されたＤＮＡ断片の突出末端が相同になるため、ライゲーションによって連結可能である。連結後には、いずれの制限酵素も認識できない配列が形成される。

実際に、本発明の連結ＤＮＡの製造方法を用いて、３２個のｇＲＮＡ及び、それぞれのｇＲＮＡに対応する３２個のバーコード配列を単一のベクターに集積できることが示された（図１３～１４）。さらに、本発明の方法によって複数のｇＲＮＡが一つに集積されたベクター、個別のｇＲＮＡを含むベクターを混合したプール、個別のｇＲＮＡ配列を持つ二本鎖ＤＮＡの混合プールをそれぞれヒト培養細胞にトランスフェクションによって導入した場合、ｇＲＮＡが集積されたベクターが最も高いゲノム編集効率を持つことが示された（図１５）。また、本ツールキットベクターのように、選択マーカー遺伝子の３’側にあるＢｓａＩ認識配列の外側にＰｏｌｙ－Ａ配列を挿入することにより、ｇＲＮＡ及びバーコード配列を集積後、ｃｃｄＢ＋Ｃｍ^Ｒの領域を転写プロモータ配列と置き換えて細胞に導入すると、ＤＮＡバーコードアレイがｐｏｌｙ－Ａ配列が付加されたＲＮＡとして転写される。したがって、１細胞ＲＮＡトランスクリプトーム技術を用いて、各細胞の状態とそれらが持つｇＲＮＡの組合せ情報を同時に読みとることが可能である。

これにより、複数のｇＲＮＡを発現できるベクターが得られれば、Ｃａｓタンパク質と組み合わせてＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを構築することにより、同時に、ゲノム上の複数の領域のＤＮＡを編集することが可能となる。組み合わせるＣａｓタンパク質は、完全なヌクレアーゼ活性を持つＣａｓタンパク質であっても、Ｃａｓタンパク質のヌクレアーゼ活性の一部又は全部を消失させたＣａｓタンパク質（ｎＣａｓ、ｄＣａｓ）であっても、これらＣａｓタンパク質と他の酵素との融合タンパク質であってもよい。融合する他の酵素の活性としては、例えば、デアミナーゼ活性（例えば、シスチジンデアミナーゼ活性、アデノシンデアミナーゼ活性）、メチルトランスフェラーゼ活性、脱メチル化酵素活性、ＤＮＡ修復活性、ＤＮＡ損傷活性、ジスムターゼ活性、アルキル化活性、脱プリン活性、酸化活性、ピリミジンダイマー形成活性、インテグラーゼ活性、トランスポサーゼ活性、リコンビナーゼ活性、ポリメラーゼ活性、リガーゼ活性、ヘリカーゼ活性、光回復酵素活性、又はグリコシラーゼ活性が含まれるが、これらに制限されない。Ｃａｓタンパク質は転写調節タンパク質との融合タンパク質であってもよい。転写調節タンパク質としては、例えば、光誘導性転写制御因子、小分子／薬剤反応性転写制御因子、転写因子、転写抑制因子などが挙げられるが、これらに制限されない。融合タンパク質を調製する場合には、必要に応じて、リンカー配列を介在させてもよい。

－ＴＡＬＥリピートユニットの連結－
ＴＡＬＥ、Ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒなどのゲノム編集に利用されているタンパク質配列は、部分的に異なる配列を含む数種のリピートユニット配列がタンデムに繰り返した構造を持つ。例えば、ＴＡＬＥでは部分的にアミノ酸残基が異なる４～５種類のリピートユニット配列それぞれが特異的に塩基を認識する。これまで、ＴＡＬＥのリピートユニットアレイの合成には、Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅ法を用いた方法が一般的な手法として用いられてきた。しかし、目的のＴＡＬＥリピートユニットアレイに応じて異なる断片配列を用意する必要があった。一方で、本発明の方法によれば、あらゆる組み合わせのＴＡＬＥリピートユニットアレイを製造することができ、特に、ＴＡＬＥリピートユニットを分割し、アミノ酸残基の可変領域（ＲＶＤ：Ｒｅｐｅａｔ Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｄｉｒｅｓｉｄｕｒｅ）を含む断片のみにバリエーションを持たせることで、他の断片は数種類さえ準備すれば、様々なＴＡＬＥリピートユニットが含まれたプールライブラリ（ＴＡＬＥリピートユニットアレイ）を作製することもできる（図８）。

実際に、本発明の連結ＤＮＡの製造方法を用いて、３断片に分割したＴＡＬＥリピートユニットを連結していき、最終的に４８断片１６リピートからなるＴＡＬＥリピートユニットアレイを合成した（実施例の２）。本手法は、ＴＡＬＥだけではなく、Ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒやＰＰＲ（Ｐｅｎｔａｔｒｉｃｏｐｅｐｔｉｄｅ Ｒｅｐｅａｔ）タンパク質等、部分的に異なる数種のリピートユニットから構成されるリピートタンパク質に汎用的に適用することができる。

また、上記のｇＲＮＡとｇＲＮＡに対応するバーコード配列とを同時に集積していくというアイデアは、効率的にタンパク質リピートを得たいときに適用することができる。例えば、ＴＡＬＥリピートユニットの連結であれば、はじめに、ツールキットベクターの選択マーカー遺伝子の一端にＴＡＬＥリピートユニットが１つ、もう一端に対応するバーコード配列が挿入されたベクターを、各ＴＡＬＥリピートユニットのそれぞれについて準備する。その後、これらのベクターの混合物を本発明の方法で連結していくと、対応するＤＮＡバーコードアレイを持つ様々なＴＡＬＥリピートユニットアレイのライブラリープールができる（図９）。

その後、バーコードアレイの３’末端側に３０塩基程度のランダムＤＮＡ配列を挿入すると、各バーコードアレイを持つそれぞれのＤＮＡ １分子に特異的な３０塩基のＤＮＡ配列が付加されることになる。バーコードアレイの３’末端から、ランダムバーコードの５’末端までを含む短い領域はＰＣＲ法で増幅し、超並列ＤＮＡシークエンサーによって一斉に読み出すことができるため、ライブラリープール内で、目的のＴＡＬＥリピートユニットアレイを、対応するＤＮＡバーコードアレイを指標に同定するとともに、それに紐付いたランダムバーコード配列も同定することができる。したがって、特定のＴＡＬＥリピートユニットアレイをライブラリープールから取り出す際に、ＴＡＬＥリピートユニットアレイに対応するランダムバーコード配列に特異的に結合するＰＣＲプライマーを用いることで、目的のＴＡＬＥリピートユニットアレイのみをライブラリープールから増幅して抽出することが可能になる。ＴＡＬＥを用いたゲノム編集は、目的のＴＡＬＥリピートユニットを生成することがｇＲＮＡを生成することに比べて、煩雑であることが欠点であったが、このように予め準備したライブラリープールから特定のプライマーを利用するだけで、目的の産物を取り出すことが可能になる。

以下に本発明の実施例を説明するが、本発明はこれら実施例により何ら制限されるものではない。以下において、各プラスミドは、それぞれ下記のものを用いた。

＜プラスミドｐＮＭ１０８８（Ｓｐｅｃ^Ｒ）＞
ｐＵＣ１９（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｊａｐａｎ（ＮＥＢ））を鋳型として、フォワードプライマーＤＧ０１２（配列番号：１）及びリバースプライマーＤＧ０１１（配列番号：２）で増幅したＰＣＲ産物；ｐＵＣ１９（ＮＥＢ）を鋳型として、フォワードプライマーＤＧ００９（配列番号：３）及びリバースプライマーＤＧ０１０（配列番号：４）で増幅したＰＣＲ産物；ｐＬＶＳＩＮ－ＣＭＶ Ｐｕｒ Ｖｅｃｔｏｒ（Ｔａｋａｒａ）を鋳型として、フォワードプライマーＤＧ００７（配列番号：５）及びリバースプライマーＤＧ００８（配列番号：６）で増幅したＰＣＲ産物；ｐＵＣ１９（ＮＥＢ）を鋳型として、フォワードプライマーＤＧ００１（配列番号：７）及びリバースプライマーＤＧ００２（配列番号：８）で増幅したＰＣＲ産物；並びに、ｐＩＮＤＵＣＥＲ２０（ａｄｄｇｅｎｅ）を鋳型として、フォワードプライマーＤＧ００３（配列番号：９）及びリバースプライマーＤＧ００４（配列番号：１０）で増幅したＰＣＲ産物を、Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙによって連結することで作製した。プラスミドｐＮＭ１０８８（Ｓｐｅｃ^Ｒ）は、スペクチノマイシン耐性遺伝子（Ｓｐｅｃ^Ｒ）を有する。

＜プラスミドｐＮＭ１０８９（ｃｃｄＢ＋Ｃｍ^Ｒ）＞
ｐＵＣ１９（ＮＥＢ）を鋳型として、フォワードプライマーＤＧ０１２及びリバースプライマーＤＧ０１１で増幅したＰＣＲ産物；ｐＵＣ１９（ＮＥＢ）を鋳型として、フォワードプライマーＤＧ００９及びリバースプライマーＤＧ０１０で増幅したＰＣＲ産物；ｐＬＶＳＩＮ－ＣＭＶ Ｐｕｒ Ｖｅｃｔｏｒ（Ｔａｋａｒａ）を鋳型として、フォワードプライマーＤＧ００７及びリバースプライマーＤＧ００８で増幅したＰＣＲ産物；ｐＵＣ１９（ＮＥＢ）を鋳型として、フォワードプライマーＤＧ００１及びリバースプライマーＤＧ００２で増幅したＰＣＲ産物；並びに、ｐＤＯＮＲ２２３（ａｄｄｇｅｎｅ）を鋳型として、フォワードプライマーＤＧ０１３（配列番号：１１）及びリバースプライマーＤＧ０１５（配列番号：１２）で増幅したＰＣＲ産物を、Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙによって連結することで作製した。プラスミドｐＮＭ１０８９（ｃｃｄＢ＋Ｃｍ^Ｒ）は、クロラムフェニコール耐性遺伝子（Ｃｍ^Ｒ）と大腸菌ＤＮＡｇｙｒａｓｅ阻害タンパク質（ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ）遺伝子（ｃｃｄＢ）との組み合わせ（ｃｃｄＢ＋Ｃｍ^Ｒ）を有する。

＜プラスミドｐＫＫ１０１０（Ａｍｐ^Ｒ）＞
ｐＤＯＮＲ２２３（ａｄｄｇｅｎｅ）を鋳型として、フォワードプライマーＤＧ０２１（配列番号：１３）及びリバースプライマーＤＧ０１５で増幅したＰＣＲ産物；並びに、ｐＮＭ１０８８を鋳型として、フォワードプライマーＭ１３－Ｆｗ（配列番号：１４）及びリバースプライマーＤＧ００８で増幅したＰＣＲ産物を、Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙによって連結することで作製した。プラスミドｐＫＫ１０１０（Ａｍｐ^Ｒ）は、アンピシリン耐性遺伝子（Ａｍｐ^Ｒ）を有する。

＜プラスミドｐＫＫ１００９（Ａｍｐ^Ｒ）＞
ｐＤＯＮＲ２２３（ａｄｄｇｅｎｅ）を鋳型として、フォワードプライマーＤＧ０２０（配列番号：１５）及びリバースプライマーＤＧ００６（配列番号：１６）で増幅したＰＣＲ産物；並びに、ｐＮＭ１０８９を鋳型として、フォワードプライマーＤＧ０１２及びリバースプライマーＤＧ００９で増幅したＰＣＲ産物を、Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙによって連結することで作製した。プラスミドｐＫＫ１００９（Ａｍｐ^Ｒ）は、アンピシリン耐性遺伝子（Ａｍｐ^Ｒ）を有する。

１． ｇＲＮＡ－ＢＣベクターの作製（ＦＲＡＣＴＡＬアセンブリ法）
ガイドＲＮＡをコードする配列（ｇＲＮＡ）とそれに対応するバーコードをコードする配列（ＢＣ）とを、本発明の連結ＤＮＡの製造方法（ＦＲＡＣＴＡＬアセンブリ法）により、１つのベクターに集積したｇＲＮＡ－ＢＣベクターを作製した。

１．１ ｇＲＮＡ、ＢＣ、及び選択マーカー遺伝子を含むＤＮＡ断片（ｇＲＮＡ－ＢＣユニット）の増幅
ヒトＡＢＣトランスポーターの９６個の遺伝子領域を標的とするガイドＲＮＡ１～９６をそれぞれコードする配列（ｇＲＮＡ１～９６）をそれぞれ含むフォワードプライマー１～９６（ガイドＲＮＡ１をコードする配列（ｇＲＮＡ１）を含むフォワードプライマーＮＭ＿ＡＢＣ００１Ｆｗの配列を例として配列番号：１７に示す）と、各ｇＲＮＡに対応するバーコードをそれぞれコードする配列（ＢＣ１～９６）をそれぞれ含むリバースプライマ―（ｇＲＮＡ１に対応するバーコードをコードする配列（ＢＣ１）を含むリバースプライマ―ＮＭ＿ＡＢＣ００１Ｒｖの配列を例として配列番号：１８に示す）と、をそれぞれ用いて、プラスミドｐＮＭ１０８８（Ｓｐｅｃ^Ｒ）及びプラスミドｐＮＭ１０８９（ｃｃｄＢ＋Ｃｍ^Ｒ）をそれぞれ鋳型として、ＰＣＲ法で増幅した。これにより、「５’－ｇＲＮＡ１－Ｓｐｅｃ^Ｒ－ＢＣ１－３’」～「５’－ｇＲＮＡ９６－Ｓｐｅｃ^Ｒ－ＢＣ９６－３’」をそれぞれ含むＤＮＡ断片（計９６種）、及び、「５’－ｇＲＮＡ１－ｃｃｄＢ＋Ｃｍ^Ｒ－ＢＣ１－３’」～「５’－ｇＲＮＡ９６－ｃｃｄＢ＋Ｃｍ^Ｒ－ＢＣ９６－３’」をそれぞれ含むＤＮＡ断片（計９６種）（以下、場合によりこれら１９２種のＤＮＡ断片を「ｇＲＮＡ－ＢＣユニット」と総称する）をそれぞれ得た。各ＤＮＡ断片の５’側にはＮｈｅＩ認識配列を、３’側にはＢｓａＩ認識配列を、上記プライマーによりそれぞれ挿入し、また、ｇＲＮＡと各マーカー遺伝子との間にはＳｐｅＩ認識配列を、ＢＣと各マーカー遺伝子との間にはＢｂｓＩ認識配列を、上記プライマーによりそれぞれ挿入した。ＰＣＲ条件を下記に示す。

［ＰＣＲ条件］
・反応溶液（Ｔｏｔａｌ：２０μＬ）：
５×ＧＣ ｂｕｆｆｅｒ ４．０μＬ
２．５μＭ ｄＮＴＰｓ ０．４μＬ
Ｐｈｕｓｉｏｎ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ０．４μＬ
２μＭ フォワードプライマー ５．０μＬ
２μＭ リバースプライマー ５．０μＬ
ＤＭＳＯ １．０μＬ
５０ｐｇ／μＬ 鋳型プラスミド １．０μＬ
ｄｄＨ_２Ｏ ３．２μＬ
・反応条件：
１． ９５℃ ３０秒
２～５． ９５℃ １０秒、５３℃ １０秒、７２℃ １分：３０サイクル
６． ７２℃ ５分
７． ４℃ ∞。

１．２ ツールキットベクターの作製（ｇＲＮＡ－ＢＣユニットのベクターへの挿入）
上記１．１のＰＣＲ産物（ｇＲＮＡ－ＢＣユニット）を制限酵素ＮｈｅＩ（ＮｈｅＩ－ＨＦ、ＮＥＢ）及びＢｓａＩ（ＢｓａＩ－ＨＦ ｖ２、ＮＥＢ）で切断処理してＤｏｎｏｒ ＤＮＡとした。また、Ｈｏｓｔ ＤＮＡとして、プラスミドｐＫＫ１０１０（Ａｍｐ^Ｒ）及びプラスミドｐＫＫ１００９（Ａｍｐ^Ｒ）を、それぞれ、制限酵素ＳｐｅＩ（ＳｐｅＩ－ＨＦ、ＮＥＢ）及びＢｂｓＩ（ＢｂｓＩ－ＨＦ、ＮＥＢ）で切断処理した。なお、ＢｓａｌＩの切断末端には、上記プライマーにより、ＢｂｓＩの切断末端に連結可能な相同配列を挿入しておいた。「５’－ｇＲＮＡ１－Ｓｐｅｃ^Ｒ－ＢＣ１－３’」～「５’－ｇＲＮＡ９６－Ｓｐｅｃ^Ｒ－ＢＣ９６－３’」をそれぞれ含むＤＮＡ断片をプラスミドｐＫＫ１０１０（Ａｍｐ^Ｒ）にライゲーションにより連結して、各ＤＮＡ断片を１つずつ含むツールキットベクター１（ｎ）（ｎ：１～９６）を作製した。また、「５’－ｇＲＮＡ１－ｃｃｄＢ＋Ｃｍ^Ｒ－ＢＣ１－３’」～「５’－ｇＲＮＡ９６－ｃｃｄＢ＋Ｃｍ^Ｒ－ＢＣ９６－３’」をそれぞれ含むＤＮＡ断片をプラスミドｐＫＫ１００９（Ａｍｐ^Ｒ）にライゲーションにより連結して、各ＤＮＡ断片を１つずつ含むツールキットベクター２（ｎ）（ｎ：１～９６）を作製した。制限酵素処理条件及びライゲーション条件をそれぞれ下記に示す。

［制限酵素処理条件］
〔ＮｈｅＩ／ＢｓａＩ ｆｏｒ Ｄｏｎｏｒ ＤＮＡ〕
・反応溶液（Ｔｏｔａｌ：５０μＬ）：
１０×ＣｕｔＳｍａｒｔ Ｂｕｆｆｅｒ ５μＬ
ＮｈｅＩ（２０，０００ｕｎｉｔｓ／ｍＬ） １μＬ
ＢｓａＩ（２０，０００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ） １μＬ
ＰＣＲ産物（１．４以降ではドナーベクター） ５μｇ
ｄｄＨ_２Ｏ 残部
・反応条件
１． ３７℃ ２時間
２． １μＬ ＣＩＰを反応溶液５０μＬに添加
３． ３７℃ ３０分
〔ＳｐｅＩ／ＢｂｓＩ ｆｏｒ Ｈｏｓｔ ＤＮＡ〕
・反応溶液（Ｔｏｔａｌ：５０μＬ）：
１０×ＣｕｔＳｍａｒｔ Ｂｕｆｆｅｒ ５μＬ
ＳｐｅＩ（２０，０００ｕｎｉｔｓ／ｍＬ） １μＬ
ＢｂｓＩ（２０，０００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ） １μＬ
プラスミド（１．４以降ではホストベクター） ５μｇ
ｄｄＨ_２Ｏ 残部
・反応条件
１． ３７℃ ２時間。

［ライゲーション条件］
・反応溶液（Ｔｏｔａｌ：２０μＬ）：
１０×ｌｉｇａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ ２μＬ
Ｄｏｎｏｒ ＤＮＡ １００ｎｇ
Ｈｏｓｔ ＤＮＡ １００ｎｇ
Ｔ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ（３５０Ｕ／μＬ） １μＬ
ｄｄＨ_２Ｏ 残部
・反応条件
１． １６℃ ２時間
２． ４℃ ∞。

１．３ ツールキットベクターの形質転換
上記１．２のライゲーション産物を大腸菌に形質転換し、Ｄｏｎｏｒ ＤＮＡのｇＲＮＡ－ＢＣユニットに含まれる各選択マーカー遺伝子に対応した抗生物質を含む薬剤選択培地を用いて、目的のツールキットベクターを含む大腸菌を選択した。先ず、選択マーカー遺伝子がＳｐｅｃ^Ｒの場合、２．５μＬライゲーション産物を３０μＬ ＮＥＢ ５－ａｌｐｈａ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ．ｃｏｌｉ（ＮＥＢ）に加えた。また、選択マーカー遺伝子がｃｃｄＢ＋Ｃｍ^Ｒの場合、２．５μＬライゲーション反応液を３０μＬ Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ^ＴＭ ｃｃｄＢ Ｓｕｒｖｉｖａｌ^ＴＭ ２ Ｔ１^Ｒ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｃｅｌｌｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｎ）に加えた。次いで、これらを氷上で３０分間静置し、その後、４２℃ウォーターバスで３０秒間インキュベーション（ヒートショック）した後、氷上で２分間静置した。次いで、これらにそれぞれ２５０μＬ Ｓｏｃ培地を添加し、３７℃で２時間インキュベーションした後、インキュベートした培養液全てを前記選択マーカー遺伝子に対応した抗生物質を含むＬＢ寒天培地に播種した。前記ｇＲＮＡ－ＢＣユニットに含まれる選択マーカー遺伝子がＳｐｅｃ^Ｒの場合、抗生物質はアンピシリン（Ａｍｐ）及びスペクチノマイシン（Ｓｐｅｃ）であり、前記ｇＲＮＡ－ＢＣユニットに含まれる選択マーカー遺伝子がｃｃｄＢ＋Ｃｍ^Ｒの場合、抗生物質はアンピシリン（Ａｍｐ）及びクロラムフェニコール（Ｃｍ）である。次いで、１６℃で３～４日間インキュベーションをし、生育が確認された大腸菌から目的のツールキットベクター、すなわち、前記ツールキットベクター１（ｎ）と前記ツールキットベクター２（ｎ）とをそれぞれ単離した。これらのツールキットベクターは、それぞれ、ｇＲＮＡ－ＢＣユニットを１セット含むｇＲＮＡ－ＢＣベクターである。

得られたツールキットベクター１（ｎ）及びツールキットベクター１（ｎ）のうち、ｎが任意のｎ^１であるｇＲＮＡｎ^１－ＢＣｎ^１ユニットを含むツールキットベクター１（ｎ^１）の模式図を図１０に、ｎが任意のｎ^２であるｇＲＮＡｎ^２－ＢＣｎ^２ユニットを含むツールキットベクター２（ｎ^２）の模式図を図１１に、それぞれ示す。各ＤＮＡ断片に挿入した５’側のＮｈｅＩ認識配列は上記ライゲーションにより消滅するが、ツールキットベクター１（ｎ）及びツールキットベクター２（ｎ）は、それぞれ、Ｈｏｓｔ ＤＮＡ由来のＮｈｅＩ認識配列及びＵ６プロモーター配列をｇＲＮＡの５’側に含み、ポリＡ配列をＢｓａＩ認識配列の３’側に含む。なお、各ＤＮＡ断片に挿入した３’側のＢｓａＩ認識配列は上記ライゲーションでは消滅しない（Ｈｏｓｔ ＤＮＡ由来のＢｂｓＩ認識配列は上記ライゲーションで除去される）。

１．４．１ ツールキットベクターの切断処理１
追加するｇＲＮＡ－ＢＣユニットを含むドナーベクターとして、９６種類のツールキットベクター２（１～９６）（「ｇＲＮＡ１－ｃｃｄＢ＋Ｃｍ^Ｒ－ＢＣ１」を含むベクター～「ｇＲＮＡ９６－ｃｃｄＢ＋Ｃｍ^Ｒ－ＢＣ９６」を含むベクター）を混合し、これを制限酵素ＮｈｅＩ及びＢｓａＩで切断した。他方、前記セットを受け取るホストベクターとして、９６種類のツールキットベクター１（１～９６）（「ｇＲＮＡ１－Ｓｐｅｃ^Ｒ－ＢＣ１」を含むベクター～「ｇＲＮＡ９６－Ｓｐｅｃ^Ｒ－ＢＣ９６」を含むベクター）を混合し、これを制限酵素ＳｐｅＩ及びＢｂｓＩで切断した。制限酵素処理条件は上記の１．２に示したとおりである。

１．４．２ ライゲーションによるＤＮＡ断片の連結１（ｇＲＮＡｎ^１－ｇＲＮＡｎ^２、ＢＣｎ^２－ＢＣｎ^１）
上記の１．４．１でドナーベクターから切り出された、ｇＲＮＡ－ＢＣユニットを１セット含む断片（「５’－ｇＲＮＡｎ^２－ｃｃｄＢ＋Ｃｍ^Ｒ－ＢＣｎ^２－３’」、ｎ^２：１～９６のうちのいずれか）の混合物と、ホストベクターから選択マーカー遺伝子（Ｓｐｅｃ^Ｒ）を除去した、ｇＲＮＡ－ＢＣユニットを１セット含む断片（「ｇＲＮＡｎ^１－３’／５’－ＢＣｎ^１」、ｎ^１：１～９６のうちのいずれか）の混合物と、をそれぞれ回収し、ライゲーションによって連結した。ライゲーション条件は上記の１．２に示したとおりである。

１．４．３ 目的ベクターの形質転換１
上記１．４．２のライゲーション産物２．５μＬを、Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ^ＴＭ ｃｃｄＢ Ｓｕｒｖｉｖａｌ^ＴＭ ２ Ｔ１^Ｒ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｃｅｌｌｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｎ）３０μＬに加えた。次いで、これを氷上で３０分間静置し、その後、４２℃ウォーターバスで３０秒間インキュベーション（ヒートショック）した後、氷上で２分間静置した。次いで、２５０μＬ Ｓｏｃ培地を添加し、３７℃で２時間インキュベーションした後、インキュベートした培養液全てをアンピシリン（Ａｍｐ）及びクロラムフェニコール（Ｃｍ）を含むＬＢ寒天培地に播種した。１６℃で３～４日間インキュベーションをし、生育が確認された大腸菌から目的ベクター、すなわち、「５’－ｇＲＮＡｎ^１－ｇＲＮＡｎ^２－ｃｃｄＢ＋Ｃｍ^Ｒ－ＢＣｎ^２－ＢＣｎ^１－３’、ｎ^１、ｎ^２：互いに独立にそれぞれ１～９６のうちのいずれか」を含むベクター（ツールキットベクター２（ｎ^１、ｎ^２））を単離した。得られたツールキットベクター２（ｎ^１、ｎ^２）のｇＲＮＡ－ＢＣユニットの模式図を図１２の（ａ）に示す。

１．５．１ ツールキットベクターの切断処理２
追加するｇＲＮＡ－ＢＣユニットを含むドナーベクターとして、ツールキットベクター１（１～９６）（「ｇＲＮＡ１－Ｓｐｅｃ^Ｒ－ＢＣ１」を含むベクター～「ｇＲＮＡ９６－Ｓｐｅｃ^Ｒ－ＢＣ９６」を含むベクター）を混合し、これを制限酵素ＮｈｅＩ及びＢｓａＩで切断した。他方、前記セットを受け取るホストベクターとして、ツールキットベクター２（１～９６）（「ｇＲＮＡ１－ｃｃｄＢ＋Ｃｍ^Ｒ－ＢＣ１」を含むベクター～「ｇＲＮＡ９６－ｃｃｄＢ＋Ｃｍ^Ｒ－ＢＣ９６」を含むベクター）を混合し、これを制限酵素ＳｐｅＩ及びＢｂｓＩで切断した。制限酵素処理条件は上記の１．２に示したとおりである。

１．５．２ ライゲーションによるＤＮＡ断片の連結２（ｇＲＮＡｎ^３－ｇＲＮＡｎ^４、ＢＣｎ^４－ＢＣｎ^３）
上記の１．５．１でドナーベクターから切り出された、ｇＲＮＡ－ＢＣユニットを含む断片（「５’－ｇＲＮＡｎ^４－Ｓｐｅｃ^Ｒ－ＢＣｎ^４－３’」、ｎ^４：１～９６のうちのいずれか）の混合物と、ホストベクターから選択マーカー遺伝子（ｃｃｄＢ＋Ｃｍ^Ｒ）を除去した、ｇＲＮＡ－ＢＣユニットを１セット含む断片（「ｇＲＮＡｎ^３－３’／５’－ＢＣｎ^３」、ｎ^３：１～９６のうちのいずれか）の混合物と、をそれぞれ回収し、ライゲーションによって連結した。ライゲーション条件は上記の１．２に示したとおりである。

１．５．３ 目的ベクターの形質転換２
上記１．５．２のライゲーション産物２．５μＬを、ＮＥＢ ５－ａｌｐｈａ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ．ｃｏｌｉ（ＮＥＢ）３０μＬに加えた。次いで、これを氷上で３０分間静置し、その後、４２℃ウォーターバスで３０秒間インキュベーション（ヒートショック）した後、氷上で２分間静置した。次いで、２５０μＬ Ｓｏｃ培地を添加し、３７℃で２時間インキュベーションした後、インキュベートした培養液全てをアンピシリン（Ａｍｐ）及びスペクチノマイシン（Ｓｐｅｃ）を含むＬＢ寒天培地に播種した。１６℃で３～４日間インキュベーションをし、生育が確認された大腸菌から目的ベクター、すなわち、「５’－ｇＲＮＡｎ^３－ｇＲＮＡｎ^４－Ｓｐｅｃ^Ｒ－ＢＣｎ^４－ＢＣｎ^３－３’」（ｎ^３、ｎ^４：互いに独立にそれぞれ１～９６のうちのいずれか）を含むベクター（ツールキットベクター１（ｎ^３、ｎ^４））を単離した。得られたツールキットベクター１（ｎ^３、ｎ^４）のｇＲＮＡ－ＢＣユニットの模式図を図１２の（ｂ）に示す。得られたツールキットベクターは、ｇＲＮＡ－ＢＣユニットを２セット含むｇＲＮＡ－ＢＣベクターである。

１．６ ＤＮＡ断片の連結３（ｇＲＮＡｎ^１～ｎ^４、ＢＣｎ^１～ｎ^４）
追加するｇＲＮＡ－ＢＣユニットを含むドナーベクターとして、ツールキットベクター１（１～９６）の混合物に代えて、１．５．３で得られた、ｇＲＮＡ－ＢＣユニットを２セット含むツールキットベクター１（ｎ^３、ｎ^４）の混合物（ｎ^３、ｎ^４：互いに及びベクター間でそれぞれ独立に、１～９６のいずれか）を用い、前記セットを受け取るホストベクターとして、ツールキットベクター２（１～９６）の混合物に代えて、上記の１．４．３で得られた、ｇＲＮＡ－ＢＣユニットを２セット含むツールキットベクター２（ｎ^１、ｎ^２）の混合物（ｎ^１、ｎ^２：互いに及びベクター間でそれぞれ独立に、１～９６のいずれか）を用いたこと以外は１．５．１～１．５．３と同様にして、目的ベクター、すなわち、「５’－ｇＲＮＡｎ^１－ｇＲＮＡｎ^２－ｇＲＮＡｎ^３－ｇＲＮＡｎ^４－Ｓｐｅｃ^Ｒ－ＢＣｎ^４－ＢＣｎ^３－ＢＣｎ^２－ＢＣｎ^１－３’」を含むベクター（ツールキットベクター１（ｎ^１～ｎ^４））を得た。得られたツールキットベクター１（ｎ^１～ｎ^４）のｇＲＮＡ－ＢＣユニットの模式図を図１２の（ｄ）に示す。得られたツールキットベクターは、ｇＲＮＡ－ＢＣユニットを４セット含むｇＲＮＡ－ＢＣベクターである。

１．７ ＤＮＡ断片の連結４（ｇＲＮＡｎ^５～ｎ^８、ＢＣｎ^１～ｎ^８）
追加するｇＲＮＡ－ＢＣユニットを含むドナーベクターとして、ツールキットベクター２（１～９６）の混合物に代えて、１．４．３で得られた、ｇＲＮＡ－ＢＣユニットを２セット含むツールキットベクター２（ｎ^１、ｎ^２）の混合物（ｎ^１、ｎ^２：互いに及びベクター間でそれぞれ独立に、１～９６のいずれか）をツールキットベクター２（ｎ^７、ｎ^８）の混合物として用い、前記セットを受け取るホストベクターとして、ツールキットベクター１（１～９６）の混合物に代えて、１．５．３で得られたツールキットベクター１（ｎ^３、ｎ^４）の混合物（ｎ^３、ｎ^４：互いに及びベクター間でそれぞれ独立に、１～９６のいずれか）をツールキットベクター１（ｎ^５、ｎ^６）の混合物として用いたこと以外は１．４．１～１．４．３と同様にして、目的ベクター、すなわち、「５’－ｇＲＮＡｎ^５－ｇＲＮＡｎ^６－ｇＲＮＡｎ^７－ｇＲＮＡｎ^８－ｃｃｄＢ＋Ｃｍ^Ｒ－ＢＣｎ^８－ＢＣｎ^７－ＢＣｎ^６－ＢＣｎ^５－３’」を含むベクター（ツールキットベクター２（ｎ^５～ｎ^８））を得た。得られたツールキットベクター２（ｎ^５～ｎ^８）のｇＲＮＡ－ＢＣユニットの模式図を図１２の（ｃ）に示す。得られたツールキットベクターは、ｇＲＮＡ－ＢＣユニットを４セット含むｇＲＮＡ－ＢＣベクターである。

１．８ ＤＮＡ断片の連結５（ｇＲＮＡｎ^１～ｎ^８、ＢＣｎ^１～ｎ^８、及びそれ以降）
上記１．６及び１．７で得られたツールキットベクターを用いて１．４．１～１．４．３を繰り返し、ｇＲＮＡ－ＢＣユニットを８セット含むツールキットベクター（ｇＲＮＡ－ＢＣベクター）、すなわち、「５’－ｇＲＮＡｎ^１－ｇＲＮＡｎ^２－ｇＲＮＡｎ^３－ｇＲＮＡｎ^４－ｇＲＮＡｎ^５－ｇＲＮＡｎ^６－ｇＲＮＡｎ^７－ｇＲＮＡｎ^８－ｃｃｄＢ＋Ｃｍ^Ｒ－ＢＣｎ^８－ＢＣｎ^７－ＢＣｎ^６－ＢＣｎ^５－ＢＣｎ^４－ＢＣｎ^３－ＢＣｎ^２－ＢＣｎ^１－３’」を含むベクター（ツールキットベクター２（ｎ^１～ｎ^８））を得た。得られたツールキットベクター２（ｎ^１～ｎ^８）のｇＲＮＡ－ＢＣユニットの模式図を図１２の（ｅ）に示す。また、上記１．６及び１．７で得られたツールキットベクターを用いて１．５．１～１．５．３を繰り返し、ｇＲＮＡ－ＢＣユニットに含まれる選択マーカー遺伝子がＳｐｅｃ^Ｒのものも同様に作製した。

さらに、同様に、上記１．４．１以降を繰り返して、ｇＲＮＡ－ＢＣユニットを１６セット含む各ツールキットベクター１（ｎ^１～ｎ^１６）及びツールキットベクター２（ｎ^１～ｎ^１６）（ｇＲＮＡ－ＢＣベクター）、並びに、ｇＲＮＡ－ＢＣユニットを３２セット含む各ツールキットベクター１（ｎ^１～ｎ^３２）及びツールキットベクター２（ｎ^１～ｎ^３２）（ｇＲＮＡ－ＢＣベクター）もそれぞれ作製した。

上記の１．２で用いたプラスミドｐＫＫ１００９（ｌａｎｅ １）、１．３で得られたｇＲＮＡ－ＢＣユニットを１セット含むツールキットベクター２（ｎ）（ｌａｎｅ ２）、１．４．３で得られたｇＲＮＡ－ＢＣユニットを２セット含むツールキットベクター２（ｎ^１、ｎ^２）（ｌａｎｅ ３）、１．７で得られたｇＲＮＡ－ＢＣユニットを４セット含むツールキットベクター２（ｎ^５～ｎ^８）（ｌａｎｅ ４）、１．８で得られたｇＲＮＡ－ＢＣユニットを８セット含むツールキットベクター２（ｎ^１～ｎ^８）（ｌａｎｅ ５）、ｇＲＮＡ－ＢＣユニットを１６セット含むツールキットベクター２（ｎ^１～ｎ^１６）（ｌａｎｅ ６）、ｇＲＮＡ－ＢＣユニットを３２セット含むツールキットベクター２（ｎ^１～ｎ^３２）（ｌａｎｅ ７）を、それぞれ制限酵素ＳｐｅＩで切断した断片の電気泳動写真を図１３に示す。図１３に示したように、上記連結を繰り返す毎に分子量が大きくなり、ｇＲＮＡ及びＢＣがいずれも段階的に（０、１、２、４、８、１６、３２個）集積されていることが確認された。

また、含まれるｇＲＮＡ－ＢＣユニットが３２セットとなるように上記１．４．１～１．８を繰り返して得られたライゲーション産物を大腸菌に形質転換して得られたクローン１～６から単離されたベクターを、それぞれ制限酵素ＳｐｅＩで切断した断片の電気泳動写真を図１４に示す。図１４に示したように、上記の本発明の連結ＤＮＡの製造方法（ＦＲＡＣＴＡＬアセンブリ法）により、３２個のｇＲＮＡと３２個のＢＣとを単一のベクターに集積できたことが確認された（クローン２、６）。

１．９． ｇＲＮＡ－ＢＣベクターのＨＥＫ２９３Ｔａ細胞へのトランスフェクション
本発明の連結ＤＮＡの製造方法によって得られた、ｇＲＮＡ－ＢＣユニットを含むｇＲＮＡ－ＢＣベクターを用いて、ゲノム編集アッセイの評価を行った。

すなわち、先ず、ｐＬＶＳＩＮ－ＣＭＶ Ｐｕｒ Ｖｅｃｔｏｒ（Ｔａｋａｒａ）から、ピューロマイシン耐性遺伝子を含むＤＮＡ断片をＰＣＲで増幅し、増幅したＰＣＲ産物と、上記の１．８で得られたｇＲＮＡ－ＢＣユニットを３２セット含むツールキットベクター２（ｎ^１～ｎ^３２）の混合物（ｎ^１～ｎ^３２：互いに及びベクター間でそれぞれ独立に、１～９６のいずれか）とを、それぞれ制限酵素ＳｐｅＩ（ＳｐｅＩ－ＨＦ、ＮＥＢ）及びＢａｍＨＩ（ＢａｍＨＩ－ＨＦ、ＮＥＢ）で切断して互いにライゲーションし、ｇＲＮＡ－ＢＣユニットに含まれる選択マーカー遺伝子をｃｃｄＢ＋Ｃｍ^Ｒからピューロマイシン耐性遺伝子に置き換えたベクター（Ａｒｒａｙ ｖｅｃｔｏｒ）の混合物を作製した。また、１．３で得られたｇＲＮＡ－ＢＣユニットを１セット含む９６種類のツールキットベクター２についてもそれぞれ同様にして、選択マーカー遺伝子をｃｃｄＢ＋Ｃｍ^Ｒからピューロマイシン耐性遺伝子に置き換えたベクター（Ｓｉｎｇｌｅ ｖｅｃｔｏｒ）を作製した。制限酵素処理条件及びライゲーション条件をそれぞれ下記に示す。

［制限酵素処理条件］
〔ＳｐｅＩ／ＢａｍＨＩ〕
・反応溶液（Ｔｏｔａｌ：５０μＬ）：
１０×ＣｕｔＳｍａｒｔ Ｂｕｆｆｅｒ ５μＬ
ＳｐｅＩ（２０，０００ｕｎｉｔｓ／ｍＬ） １μＬ
ＢａｍＨＩ（２０，０００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ） １μＬ
ＰＣＲ産物又はツールキットベクター ５μｇ
ｄｄＨ_２Ｏ 残部
・反応条件 ｆｏｒ ＰＣＲ産物
１． ３７℃ ２時間
２． １μＬ ＣＩＰを反応溶液５０μＬに添加
３． ３７℃ ３０分
・反応条件 ｆｏｒ ツールキットベクター
１． ３７℃ ２時間。

［ライゲーション条件］
・反応溶液（Ｔｏｔａｌ：２０μＬ）：
１０×ｌｉｇａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ ２μＬ
ＰＣＲ産物 １００ｎｇ
ツールキットベクター １００ｎｇ
Ｔ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ（３５０Ｕ／μＬ） １μＬ
ｄｄＨ_２Ｏ 残部
・反応条件
１． １６℃ ２時間
２． ４℃ ∞。

得られた各ライゲーション産物をそれぞれ大腸菌（ＮＥＢ ５－ａｌｐｈａ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ．ｃｏｌｉ（ＮＥＢ））に形質転換し、抗生物質をピューロマイシンにしたこと以外は上記の１．３と同様にして、各ベクターを含む大腸菌を選択し、Ａｒｒａｙ ｖｅｃｔｏｒ又はＳｉｎｇｌｅ ｖｅｃｔｏｒのそれぞれを単離した。以下のＨＥＫ２９３Ｔａ細胞へのトランスフェクションにおいては、Ａｒｒａｙ ｖｅｃｔｏｒ ｌｉｂとして、複数の大腸菌から単離されたＡｒｒａｙ ｖｅｃｔｏｒの混合物を用い、Ｓｉｎｇｌｅ ｖｅｃｔｏｒ ｌｉｂとしては、９６種類のツールキットベクター２（ｎ）から作製した９６種類のＳｉｎｇｌｅ ｖｅｃｔｏｒの混合物を用いた。また、対照として、９６種類のツールキットベクター２（ｎ）をそれぞれ制限酵素ＮｈｅＩ及びＢｓａＩによって処理した、各ｇＲＮＡ－ＢＣユニットのみを含む９６種類のＤＮＡ断片の混合物をＳｉｎｇｌｅ ｌｉｎｅｒ ＤＮＡ ｌｉｂとして用いた。

トランスフェクション前日にＨＥＫ２９３Ｔａ細胞を０．１×１０^６個／ｗｅｌｌずつ１２－ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに継代した。また、１ｗｅｌｌあたり０．２５μｇ（２．５μＬ）のＡｒｒａｙ ｖｅｃｔｏｒ ｌｉｂ、Ｓｉｎｇｌｅ ｖｅｃｔｏｒ ｌｉｂ、又はＳｉｎｇｌｅ ｌｉｎｅｒ ＤＮＡ ｌｉｂ、０．２５μｇ（２．５μＬ）のＴａｒｇｅｔ－ＡＩＤベクター（Ａｄｄｇｅｎｅ社製）、１．５μＬのＰＥＩを、９３．５μＬのＰＢＳと混合し、２０分室温に放置した。Ｔａｒｇｅｔ－ＡＩＤでは、ガイドＲＮＡによってＤＮＡが１本鎖に解離されると、シトシンデアミナーゼが解離状態の１本鎖ＤＮＡの塩基を、シトシン（Ｃ）からチミン（Ｔ）に、化学的に置換することでゲノムが編集される。継代から２４時間後に培地を交換した細胞に、前記放置後の各混合物をそれぞれ添加し、トランスフェクションを行った。トランスフェクションから１８時間後に培地を交換し、さらに４８時間後に２μｇ／ｍＬのピューロマイシンを培地中に添加し、細胞の選択を行った。その後、４８時間おきに培地を交換し、トランスフェクションから１０日後にゲノムＤＮＡを抽出した。

次いで、各ゲノムＤＮＡを鋳型として、９６種類のガイドＲＮＡそれぞれの標的領域（９６箇所）を、それぞれＰＣＲ法で増幅した。ＰＣＲに用いたフォワードプライマーのうち、ガイドＲＮＡ１の標的配列に対するフォワードプライマーＮＭ＿ＡＢＣ＿ｇｔ＿１＿Ｆｗの配列を例として配列番号：１９に示し、ガイドＲＮＡ１の標的配列に対するリバースプライマーＮＭ＿ＡＢＣ＿ｇｔ＿１＿Ｒｖの配列を例として配列番号：２０に示す。また、ＰＣＲ条件を下記に示す。

［ＰＣＲ条件］
・反応溶液（Ｔｏｔａｌ：３０μＬ）：
５×ＨＦ ｂｕｆｆｅｒ ６．０μＬ
２５μＭ ｄＮＴＰｓ ２．４μＬ
Ｐｈｕｓｉｏｎ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ０．３μＬ
１０μＭ フォワードプライマー ３．０μＬ
１０μＭ リバースプライマー ３．０μＬ
２５０ｎｇ／μＬ ゲノムＤＮＡ １．０μＬ
ｄｄＨ_２Ｏ １４．３μＬ
・反応条件：
１． ９８℃ １０分
２～５． ９８℃ １０秒、５８．４℃ １０秒、７２℃ １５秒：２５サイクル
６． ７２℃ ５分
７． ４℃ ∞。

次いで、Ｉｌｌｕｍｉｎａライブラリーの準備のために、ＰＣＲ産物を鋳型として、フォワードプライマーＢＣ＿００７４（配列番号：２１）と、リバースプライマ―ＢＣ＿００７５（配列番号：２２）と、を用いて以下のＰＣＲを行った。

［ＰＣＲ条件］
・反応溶液（Ｔｏｔａｌ：３０μＬ）：
５×ＧＣ ｂｕｆｆｅｒ ６．０μＬ
２５μＭ ｄＮＴＰｓ ０．６μＬ
Ｐｈｕｓｉｏｎ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ０．６μＬ
１０μＭ フォワードプライマー １．５μＬ
１０μＭ リバースプライマー １．５μＬ
ＤＭＳＯ ０．９μＬ
２０ｎｇ／μＬ ＰＣＲ産物 １．０μＬ
ｄｄＨ_２Ｏ １７．９μＬ
・反応条件：
１． ９８℃ １０分
２～５． ９８℃ １０秒、５８．４℃ １０秒、７２℃ １５秒：１９サイクル
６． ７２℃ ５分
７． ４℃ ∞。

次いで、ＰＣＲ産物（Ｉｌｌｕｍｉｎａライブラリー）について、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）でペアエンドシーケンスを行うことで、ガイドＲＮＡによるゲノム編集の有無を確認した。Ａｒｒａｙ ｖｅｃｔｏｒ ｌｉｂ及びＳｉｎｇｌｅ ｖｅｃｔｏｒ ｌｉｂをトランスフェクションしたＨＥＫ２９３Ｔａ細胞において、９６箇所のガイドＲＮＡの標的領域の塩基配列中のシトシン（Ｃ）がチミン（Ｔ）に置換されていることが確認された。

また、各シークエンス結果より、９６箇所のガイドＲＮＡの標的領域の塩基配列中のシトシン（Ｃ）がチミン（Ｔ）に置換されている確率を塩基編集率（Ｂａｓｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｒａｔｅ）とした。Ａｒｒａｙ ｖｅｃｔｏｒ ｌｉｂ、Ｓｉｎｇｌｅ ｖｅｃｔｏｒ ｌｉｂ、及びＳｉｎｇｌｅ ｌｉｎｅｒ ＤＮＡ ｌｉｂをそれぞれトランスフェクションしたものについて、９６箇所のガイドＲＮＡの標的領域のうち、塩基編集率の高かった上位２６箇所の編集効率をソートして図１５に示す。

図１５に示したように、複数のｇＲＮＡがアレイとして挿入されているベクター（Ａｒｒａｙ ｖｅｃｔｏｒ）を用いてトランスフェクションした方が、個別のｇＲＮＡを含むベクター又は個別のｇＲＮＡを含む断片を混合して用いてトランスフェクションするよりも高い編集効率を示した。本発明の連結ＤＮＡの製造方法（ＦＲＡＣＴＡＬアセンブリ法）によれば、このように編集効率の高いベクター、及びかかるベクターの作製に用いることができるベクターを容易に作製することもできる。

２． ＴＡＬＥリピートユニットアレイベクターの作製（ＦＲＡＣＴＡＬアセンブリ法）
ＴＡＬＥリピートユニットをコードする配列を３つの断片ａ、ｂ、及びｃに分け、本発明の連結ＤＮＡの製造方法（ＦＲＡＣＴＡＬアセンブリ法）により、複数のＴＡＬＥリピートユニット１つのベクターに集積したＴＡＬＥリピートユニットアレイベクターを作製した。下記の例において、断片ａ、ｂ、ｃはそれぞれ１種ずつであるが、例えば、断片ａとしてアミノ酸が部分的に異なる複数種の断片を混合することで、多様なＴＡＬＥリピートユニットをコードする配列を集積することが可能となる。

２．１ ＴＡＬＥリピートユニット断片及び選択マーカー配列を含むＤＮＡ断片の増幅
制限酵素ＳａｃＩ、ＢｓａＩ、ＢｂｓＩ、ＡｇｅＩの認識配列（ＳａｃＩ、ＢｓａＩ、ＢｂｓＩ、ＡｇｅＩ）とＴＡＬＥリピートユニット断片ａ、ｂ、ｃのそれぞれとを含むフォワードプライマー（ＴＡＬＥ＿ｒｐｔｕｉｎｉｔ１Ｌ（配列番号：２３、ＴＡＬＥ リピートユニット断片ａを含む）；ＴＡＬＥ＿ｒｐｔｕｉｎｉｔ２Ｌ（配列番号：２４、ＴＡＬＥ リピートユニット断片ｂを含む）；ＴＡＬＥ＿ｒｐｔｕｉｎｉｔ３Ｌ（配列番号：２５、ＴＡＬＥ リピートユニット断片ｃを含む））と、制限酵素ＳａｌＩ、ＢｓａＩ、ＢｂｓＩ、ＮｈｅＩの認識サイト（ＳａｌＩ、ＢｓａＩ、ＢｂｓＩ、ＮｈｅＩ）を含むリバースプライマーＳｐｅｃＲ＿ＣｍＲ＿ｃｏｍｍｏｎ＿ＲＶ（配列番号：２６）と、をそれぞれ用いて、プラスミドｐＮＭ１０８８（Ｓｐｅｃ^Ｒ）を鋳型として、ＰＣＲ法で増幅した。これにより、「５’－ＳａｃＩ－ＢｓａＩ－ＴＡＬＥリピートユニット断片（ａ又はｂ又はｃ）－ＢｂｓＩ－ＡｇｅＩ－Ｓｐｅｃ^Ｒ－ＮｈｅＩ－ＢｂｓＩ－ＢｓａＩ－ＳａｌＩ－３’」を含む第一のＤＮＡ断片を得た。

また、制限酵素ＳａｃＩ、ＢｓａＩ、ＢｂｓＩ、ＡｇｅＩの認識配列（ＳａｃＩ、ＢｓａＩ、ＢｂｓＩ、ＡｇｅＩ）を含むフォワードプライマーｃｃｄＢＣｍＲ＿Ｆｗ（配列番号：２７）と、制限酵素ＳａｌＩ、ＢｓａＩ、ＢｂｓＩ、ＮｈｅＩの認識サイト（ＳａｌＩ、ＢｓａＩ、ＢｂｓＩ、ＮｈｅＩ）とＴＡＬＥリピートユニット断片ａ、ｂ、ｃのそれぞれとを含むリバースプライマー（ＴＡＬＥ＿ｒｐｔｕｉｎｉｔ１Ｒ（配列番号：２８、ＴＡＬＥ リピートユニット断片ａを含む）；ＴＡＬＥ＿ｒｐｔｕｉｎｉｔ２Ｒ（配列番号：２９、ＴＡＬＥ リピートユニット断片ｂを含む；ＴＡＬＥ＿ｒｐｔｕｉｎｉｔ３Ｒ（配列番号：３０、ＴＡＬＥ リピートユニット断片ｃを含む）と、をそれぞれ用いて、プラスミドｐＮＭ１０８９（ｃｃｄＢ＋Ｃｍ^Ｒ）を鋳型として、ＰＣＲ法で増幅した。これにより、「５’－ＳａｃＩ－ＢｓａＩ－ＢｂｓＩ－ＡｇｅＩ－ｃｃｄＢ＋Ｃｍ^Ｒ－ＮｈｅＩ－ＢｂｓＩ－ＴＡＬＥリピートユニット断片（ａ又はｂ又はｃ）－ＢｓａＩ－ＳａｌＩ－３’」を含む第二のＤＮＡ断片をそれぞれ得た。なお、ＴＡＬＥリピートユニット断片ａの３’側と断片ｂの５’側；ＴＡＬＥリピートユニット断片ｂの５’側と断片ｃの３’側は、それぞれ、制限酵素ＢｓａＩ又はＢｂｓＩの切断による突出末端が相同となる配列にしている（図８）。ＰＣＲ条件を下記に示す。

［ＰＣＲ条件］
・反応溶液（Ｔｏｔａｌ：２０μＬ）：
５×ＧＣ ｂｕｆｆｅｒ ４．０μＬ
２．５μＭ ｄＮＴＰｓ ０．４μＬ
Ｐｈｕｓｉｏｎ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ０．４μＬ
１０μＭ フォワードプライマー １．０μＬ
１０μＭ リバースプライマー １．０μＬ
１００ｐｇ／μＬ プラスミド １．０μＬ
ｄｄＨ_２Ｏ １２．２μＬ
・反応条件：
１． ９５℃ ３０秒
２～５． ９５℃ １０秒、５８℃ １５秒、７２℃ １．５分：３０サイクル
６． ７２℃ １０分
７． ４℃ ∞。

２．２ ツールキットベクターの作製
＜ツールキットベクター１、２＞
（制限酵素処理及びライゲーション）
上記２．１のＰＣＲ産物を制限酵素ＳａｃＩ（ＳａｃＩ－ＨＦ、ＮＥＢ）及びＳａｌＩ（ＳａｌＩ－ＨＦ、ＮＥＢ）でそれぞれ切断処理してＤｏｎｏｒ ＤＮＡとした。また、Ｈｏｓｔ ＤＮＡとして、ｐＵＣ１９を制限酵素ＳａｃＩ及びＳａｌＩで切断処理した。第一のＤＮＡ断片をｐＵＣ１９にライゲーションにより連結して、ツールキットベクター１とした。また、第二のＤＮＡ断片をｐＵＣ１９にライゲーションにより連結して、ツールキットベクター２とした。制限酵素処理条件及びライゲーション条件をそれぞれ下記に示す。

［制限酵素処理条件］
〔ＳａｃＩ／ＳａｌＩ〕
・反応溶液（Ｔｏｔａｌ：５０μＬ）：
１０×ＣｕｔＳｍａｒｔ Ｂｕｆｆｅｒ ５μＬ
ＳａｃＩ（２０，０００ｕｎｉｔｓ／ｍＬ） １μＬ
ＳａｌＩ（２０，０００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ） １μＬ
ＰＣＲ産物又はｐＵＣ１９ ５μｇ
ｄｄＨ_２Ｏ 残部
・反応条件 ｆｏｒ Ｄｏｎｏｒ ＤＮＡ
１． ３７℃ ２時間
２． １μＬ ＣＩＰを反応溶液５０μＬに添加
３． ３７℃ ３０分
・反応条件 ｆｏｒ Ｈｏｓｔ ＤＮＡ
１． ３７℃ ２時間。

［ライゲーション条件］
・反応溶液（Ｔｏｔａｌ：２０μＬ）：
Ｄｏｎｏｒ ＤＮＡに含まれる選択マーカー遺伝子がＳｐｅｃ^Ｒの場合
１０×ｌｉｇａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ １μＬ
Ｄｏｎｏｒ ＤＮＡ ５００ｎｇ
Ｈｏｓｔ ＤＮＡ ５０ｎｇ
Ｔ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ（５００Ｕ／μＬ） １μＬ
ｄｄＨ_２Ｏ 残部
Ｄｏｎｏｒ ＤＮＡに含まれる選択マーカー遺伝子がｃｃｄＢ＋Ｃｍ^Ｒの場合
１０×ｌｉｇａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ １μＬ
Ｄｏｎｏｒ ＤＮＡ ２５０ｎｇ
Ｈｏｓｔ ＤＮＡ ５０ｎｇ
Ｔ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ（５００Ｕ／μＬ） ０．１μＬ
ｄｄＨ_２Ｏ 残部
・反応条件
１． １６℃ １時間
２． ４℃ ∞。

（形質転換）
上記のライゲーション産物を大腸菌に形質転換し、Ｄｏｎｏｒ ＤＮＡに含まれる各選択マーカー遺伝子に対応した抗生物質を含む薬剤選択培地を用いて、目的のツールキットベクターを含む大腸菌を選択した。先ず、選択マーカー遺伝子がＳｐｅｃ^Ｒの場合、１．５μＬライゲーション産物を２０μＬ ＮＥＢ ５－ａｌｐｈａ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ．ｃｏｌｉ（ＮＥＢ）に加えた。また、選択マーカー遺伝子がｃｃｄＢ＋Ｃｍ^Ｒの場合、１．５μＬライゲーション反応液を２０μＬ Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ^ＴＭ ｃｃｄＢ Ｓｕｒｖｉｖａｌ^ＴＭ ２ Ｔ１^Ｒ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｃｅｌｌｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｎ）に加えた。次いで、これらを氷上で３０分間静置し、その後、４２℃ウォーターバスで３０秒間インキュベーション（ヒートショック）した後、氷上で２分間静置した。次いで、これらにそれぞれ２５０μＬ Ｓｏｃ培地を添加し、３７℃で２時間インキュベーションした後、インキュベートした培養液全てを前記選択マーカー遺伝子に対応した抗生物質を含むＬＢ寒天培地に播種した。前記Ｄｏｎｏｒ ＤＮＡに含まれる選択マーカー遺伝子がＳｐｅｃ^Ｒの場合、抗生物質はアンピシリン（Ａｍｐ）及びスペクチノマイシン（Ｓｐｅｃ）であり、前記Ｄｏｎｏｒ ＤＮＡに含まれる選択マーカー遺伝子がｃｃｄＢ＋Ｃｍ^Ｒの場合、抗生物質はアンピシリン（Ａｍｐ）及びクロラムフェニコール（Ｃｍ）である。次いで、３７℃で一晩インキュベーションをし、生育が確認された大腸菌から目的のツールキットベクター、すなわち、前記ツールキットベクター１と前記ツールキットベクター２とをそれぞれ単離した。

＜ツールキットベクター３、４＞
上記ツールキットベクター１を制限酵素ＳａｃＩ（ＳａｃＩ－ＨＦ、ＮＥＢ）及びＮｈｅＩ（ＮｈｅＩ－ＨＦ、ＮＥＢ）で切断処理してＤｏｎｏｒ ＤＮＡとし、上記ツールキットベクター２から制限酵素ＳａｃＩ及びＮｈｅＩで切断処理によりｃｃｄＢ＋Ｃｍ^Ｒを除去してＨｏｓｔ ＤＮＡとし、これらをライゲーションにより連結して、「５’－ＢｓａＩ－ＴＡＬＥリピートユニット断片（ａ又はｂ又はｃ）－ＢｂｓＩ－Ｓｐｅｃ^Ｒ－ＢｂｓＩ－ＴＡＬＥリピートユニット断片（ａ又はｂ又はｃ）－ＢｓａＩ－３’」を含むツールキットベクター３とした（ＳａｃＩ、ＡｇｅＩ、ＮｈｅＩ、ＳａｌＩは以降使用しないので記載せず）。

また、上記ツールキットベクター２を制限酵素ＡｇｅＩ（ＡｇｅＩ－ＨＦ、ＮＥＢ）及びＳａｌＩ（ＳａｌＩ－ＨＦ、ＮＥＢ）で切断処理してＤｏｎｏｒ ＤＮＡとし、上記ツールキットベクター１から制限酵素ＡｇｅＩ及びＳａｌＩで切断処理によりＳｐｅｃ^Ｒを除去してＨｏｓｔ ＤＮＡとし、これらをライゲーションにより連結して、「５’－ＢｓａＩ－ＴＡＬＥリピートユニット断片（ａ又はｂ又はｃ）－ＢｂｓＩ－ｃｃｄＢ＋Ｃｍ^Ｒ－ＢｂｓＩ－ＴＡＬＥリピートユニット断片（ａ又はｂ又はｃ）－ＢｓａＩ－３’」を含むツールキットベクター４とした（ＳａｃＩ、ＡｇｅＩ、ＮｈｅＩ、ＳａｌＩは以降使用しないので記載せず）。

各ツールキットベクターにおいて、連結後の選択マーカー遺伝子（Ｓｐｅｃ^Ｒ、ｃｃｄＢ＋Ｃｍ^Ｒ）の３’側のＴＡＬＥリピートユニット断片と５’側のＴＡＬＥリピートユニット断片との組み合わせが、ａ－ｃ、ｂ－ｂ、又はｃ－ａになるようにした（１段階目の連結）。限酵素処理条件をそれぞれ下記に示す。制限酵素処理の反応条件及びライゲーション条件は＜ツールキットベクター１、２＞に示したとおりである。

［制限酵素処理条件］
・反応溶液（Ｔｏｔａｌ：５０μＬ）：
〔ＳａｃＩ／ＮｈｅＩ〕
１０×ＣｕｔＳｍａｒｔ Ｂｕｆｆｅｒ ５μＬ
ＳａｃＩ（２０，０００ｕｎｉｔｓ／ｍＬ） １μＬ
ＮｈｅＩ（２０，０００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ） １μＬ
ツールキットベクター１、２ 各５μｇ
ｄｄＨ_２Ｏ 残部
〔ＡｇｅＩ／ＳａｌＩ〕
１０×ＣｕｔＳｍａｒｔ Ｂｕｆｆｅｒ ５μＬ
ＡｇｅＩ（２０，０００ｕｎｉｔｓ／ｍＬ） １μＬ
ＳａｌＩ（２０，０００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ） １μＬ
ツールキットベクター１、２ 各５μｇ
ｄｄＨ_２Ｏ 残部
また、上記のライゲーション産物を大腸菌に形質転換し、Ｄｏｎｏｒ ＤＮＡに含まれる各選択マーカー遺伝子に対応した抗生物質を含む薬剤選択培地を用いて、目的のツールキットベクターを含む大腸菌を選択した。形質転換の条件は＜ツールキットベクター１、２＞と同様である。

２．３ ツールキットベクターの切断処理
追加するＴＡＬＥリピートユニット断片を含むドナーベクターとして、ツールキットベクター４を制限酵素ＢｓａＩ（ＢｓａＩ－ＨＦ ｖ２、ＮＥＢ）で、前記ＴＡＬＥリピートユニット断片を受け取るホストベクターとして、ツールキットベクター３を制限酵素ＢｂｓＩ（ＢｂｓＩ－ＨＦ、ＮＥＢ）で、それぞれ切断した。制限酵素処理条件をそれぞれ下記に示す。

［制限酵素処理条件］
〔ＢｓａＩ ｆｏｒ Ｄｏｎｏｒ ＤＮＡ〕
・反応溶液（Ｔｏｔａｌ：５０μＬ）：
１０×ＣｕｔＳｍａｒｔ Ｂｕｆｆｅｒ ５μＬ
ＢｓａＩ（２０，０００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ） １μＬ
ドナーベクター ５μｇ
ｄｄＨ_２Ｏ 残部
・反応条件
１． ３７℃ ２時間
２． １μＬ ＣＩＰを反応溶液５０μＬに添加
３． ３７℃ ３０分
〔ＢｂｓＩ ｆｏｒ Ｈｏｓｔ ＤＮＡ〕
・反応溶液（Ｔｏｔａｌ：５０μＬ）：
１０×ＣｕｔＳｍａｒｔ Ｂｕｆｆｅｒ ５μＬ
ＢｂｓＩ（２０，０００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ） １μＬ
ホストベクター ５μｇ
ｄｄＨ_２Ｏ 残部
・反応条件
１． ３７℃ ２時間。

２．４ ライゲーションによるＴＡＬＥリピートユニット断片の連結
上記の２．３でドナーベクターから切り出された、ＴＡＬＥリピートユニット断片を２つ有する断片（「５’－ＴＡＬＥリピートユニット断片（ａ又はｂ又はｃ）－ＢｂｓＩ－ｃｃｄＢ＋Ｃｍ^Ｒ－ＢｂｓＩ－ＴＡＬＥリピートユニット断片（ａ又はｂ又はｃ）－３’」）と、ホストベクターから選択マーカー遺伝子（Ｓｐｅｃ^Ｒ）を除去した断片（「ＴＡＬＥリピートユニット断片（ａ又はｂ又はｃ）－３’／５’－ＴＡＬＥリピートユニット断片（ａ又はｂ又はｃ）」）と、をそれぞれ回収し、ライゲーションにより、連結後のｃｃｄＢ＋Ｃｍ^Ｒの３’側のＴＡＬＥリピートユニット断片と５’側のＴＡＬＥリピートユニット断片との組み合わせが、ａｂ－ｂｃとなるように連結し、目的のベクターを得た（２段階目の連結）。ライゲーション条件は上記の２．２に示したとおりである。ライゲーション産物を大腸菌へ形質転換し、適切な薬剤選択培地を用いて、目的産物を含む大腸菌を選択し、目的のベクターを得た。形質転換方法は２．２と同様である。

２．５ ライゲーションによるＴＡＬＥリピートユニット断片の連結の連続
上記の２．２～２．４を繰り返し、連結後のｃｃｄＢ＋Ｃｍ^Ｒの３’側のＴＡＬＥリピートユニット断片と５’側のＴＡＬＥリピートユニット断片との組み合わせが、ａｂｃ－ａｂｃとなるように連結し、目的のベクターを得た（３段階目の連結）。さらに上記を繰り返し、連結後のｃｃｄＢ＋Ｃｍ^Ｒの３’側のＴＡＬＥリピートユニット断片ａｂｃと５’側のＴＡＬＥリピートユニット断片ａｂｃとが、それぞれ順に繋がるように連結し、ｃｃｄＢ＋Ｃｍ^Ｒの５’側及び３’側に、それぞれ２４断片（ａｂｃの繰り返し８回）ずつ、合計４８のＴＡＬＥリピートユニット断片が連結されたベクターを得た。

２．６ サンガーシークエンシング法による配列の確認
上記２．５で得られたｃｃｄＢ＋Ｃｍ^Ｒの５’側及び３’側にそれぞれ２４断片（ａｂｃの繰り返し８回）ずつ、合計４８のＴＡＬＥリピートユニット断片が連結されたベクターについて、ｃｃｄＢ＋Ｃｍ^Ｒの５’側の２４断片（ａｂｃの繰り返し８回）、及び、３’側の２４断片（ａｂｃの繰り返し８回）の配列を、それぞれサンガーシークエンシング法によって確認し、確かに目的のＴＡＬＥリピートユニット断片が連結されたベクター（「５’－ＢｓａＩ－ＴＡＬＥリピートユニット断片×２４（ａｂｃ－ａｂｃ－ａｂｃ－ａｂｃ－ａｂｃ－ａｂｃ－ａｂｃ－ａｂｃ）－ＢｂｓＩ－ｃｃｄＢ＋Ｃｍ^Ｒ－ＢｂｓＩ－ＴＡＬＥリピートユニット断片×２４（ａｂｃ－ａｂｃ－ａｂｃ－ａｂｃ－ａｂｃ－ａｂｃ－ａｂｃ－ａｂｃ）－ＢｓａＩ－３’」を含むベクター）が得られたことを確認した。

２．７ ｃｃｄＢ＋Ｃｍ^Ｒの除去
上記２．６で配列が確認されたベクターを制限酵素ＢｂｓＩで切断処理し、セルフライゲーションさせることで、ｃｃｄＢ＋Ｃｍ^Ｒを除去し、４８のＴＡＬＥリピートユニット断片がひとつなぎ（ａｂｃが１６連続で連結）になったＴＡＬＥリピートユニットアレイベクターを得た。制限酵素処理条件は上記の２．３に示したとおりである。本発明の連結ＤＮＡの製造方法（ＦＲＡＣＴＡＬアセンブリ法）によれば、このようにＴＡＬＥリピートユニットが連続して連結されたＴＡＬＥリピートユニットアレイも容易に作製することができる。

以上説明したように、本発明によれば、正確かつ効率的に容易に数十以上のＤＮＡ断片を連結することが可能な連結ＤＮＡの製造方法及びそれに用いるためのベクターの組み合わせを提供することが可能となる。
また、本発明によれば、リピート配列等の同じ配列が何度も出現する断片であっても、連続して連結することが可能であり、別のアセンブリにそのまま利用できるため、再利用性も高い。さらに、非特異的なライゲーション等によって目的とは異なる産物が生成される確率が低いため、品質検査に要する手間や時間を短縮することも可能である。このような本発明によれば、効率的な多重ゲノム編集のためのベクターライブリラリー、任意のクローンをＰＣＲ法によって単離することのできるプールライブラリの作製も可能となる。

配列番号：１
＜２２３＞ プライマー 「ＤＧ０１２」
配列番号：２
＜２２３＞ プライマー 「ＤＧ０１１」
配列番号：３
＜２２３＞ プライマー 「ＤＧ００９」
配列番号：４
＜２２３＞ プライマー 「ＤＧ０１０」
配列番号：５
＜２２３＞ プライマー 「ＤＧ００７」
配列番号：６
＜２２３＞ プライマー 「ＤＧ００８」
配列番号：７
＜２２３＞ プライマー 「ＤＧ００１」
配列番号：８
＜２２３＞ プライマー 「ＤＧ００２」
配列番号：９
＜２２３＞ プライマー 「ＤＧ００３」
配列番号：１０
＜２２３＞ プライマー 「ＤＧ００４」
配列番号：１１
＜２２３＞ プライマー 「ＤＧ０１３」
配列番号：１２
＜２２３＞ プライマー 「ＤＧ０１５」
配列番号：１３
＜２２３＞ プライマー 「ＤＧ０２１」
配列番号：１４
＜２２３＞ プライマー 「Ｍ１３－Ｆｗ」
配列番号：１５
＜２２３＞ プライマー 「ＤＧ０２０」
配列番号：１６
＜２２３＞ プライマー 「ＤＧ００６」
配列番号：１７
＜２２３＞ プライマー 「ＮＭ＿ＡＢＣ００１Ｆｗ」
配列番号：１８
＜２２３＞ プライマー 「ＮＭ＿ＡＢＣ００１Ｒｖ」
配列番号：１９
＜２２３＞ プライマー 「ＮＭ＿ＡＢＣ＿ｇｔ＿１＿Ｆｗ」
配列番号：２０
＜２２３＞ プライマー 「ＮＭ＿ＡＢＣ＿ｇｔ＿１＿Ｒｖ」
配列番号：２１
＜２２３＞ プライマー 「ＢＣ＿００７４」
＜２２３＞ ｎはａ、ｃ、ｇ、又はｔ
配列番号：２２
＜２２３＞ プライマー 「ＢＣ＿００７５」
＜２２３＞ ｎはａ、ｃ、ｇ、又はｔ
配列番号：２３
＜２２３＞ プライマー 「ＴＡＬＥ＿ｒｐｔｕｉｎｉｔ１Ｌ」
配列番号：２４
＜２２３＞ プライマー 「ＴＡＬＥ＿ｒｐｔｕｉｎｉｔ２Ｌ」
配列番号：２５
＜２２３＞ プライマー 「ＴＡＬＥ＿ｒｐｔｕｉｎｉｔ３Ｌ」
配列番号：２６
＜２２３＞ プライマー 「ＳｐｅｃＲ＿ＣｍＲ＿ｃｏｍｍｏｎ＿ＲＶ」
配列番号：２７
＜２２３＞ プライマー 「ｃｃｄＢＣｍＲ＿Ｆｗ」
配列番号：２８
＜２２３＞ プライマー 「ＴＡＬＥ＿ｒｐｔｕｉｎｉｔ１Ｒ」
配列番号：２９
＜２２３＞ プライマー 「ＴＡＬＥ＿ｒｐｔｕｉｎｉｔ２Ｒ」
配列番号：３０
＜２２３＞ プライマー 「ＴＡＬＥ＿ｒｐｔｕｉｎｉｔ３Ｒ」

Claims (13)

1. ＤＮＡ断片を連結した連結ＤＮＡを製造する方法であり、
   （ａ１）下記（１）の構造を含む第一のベクター及び下記（２）の構造を含む第二のベクター：
   （１）５’－Ｒ１－Ｄ（ｉ）－Ｒ２－Ｍ１－Ｒ２’－Ｄ（ｉｉ）－Ｒ１’－３’
   （２）５’－Ｒ１－Ｄ（ｉｉｉ）－Ｒ２－Ｍ２－Ｒ２’－Ｄ（ｉｖ）－Ｒ１’－３’
   ［ここで、Ｒ１は、第一の制限酵素の認識配列を示し；Ｒ１’は、第二の制限酵素の認識配列を示し；Ｒ２は、第一の制限酵素及び第二の制限酵素とは異なる第三の制限酵素の認識配列を示し；Ｒ２’は、第一の制限酵素及び第二の制限酵素とは異なる第四の制限酵素の認識配列を示し；Ｍ１は、第一の選択マーカー遺伝子を示し；Ｍ２は、第一の選択マーカー遺伝子とは異なる第二の選択マーカー遺伝子を示し；Ｄ（ｉ）～Ｄ（ｉｖ）は、それぞれ独立に、任意の連結用ＤＮＡ断片を示し、Ｄ（ｉ）及びＤ（ｉｉ）はいずれか一方であってよく、Ｄ（ｉｉｉ）及びＤ（ｉｖ）はいずれか一方であってよい。第一の制限酵素はＲ１内又はＲ１の３’側を切断し、第二の制限酵素はＲ１’内又はＲ１’の５’側を切断し、第一の制限酵素と第二の制限酵素とは同一でも異なっていてもよく；第三の制限酵素はＲ２内又はＲ２の５’側を切断し、第四の制限酵素はＲ２’内又はＲ２’の３’側を切断し、第三の制限酵素と第四の制限酵素とは同一でも異なっていてもよい。］
   を準備する工程ａ１と、
   （ｂ１）第一のベクターを第一の制限酵素及び第二の制限酵素で処理して、次の構造：５’－Ｄ（ｉ）－Ｒ２－Ｍ１－Ｒ２’－Ｄ（ｉｉ）－３’からなる第一のベクター断片を得る工程ｂ１と、
   （ｃ１）第二のベクターを第三の制限酵素及び第四の制限酵素で処理して、次の構造：５’－Ｒ２－Ｍ２－Ｒ２’－３’が除去された第二のベクター断片を得る工程ｃ１と、
   （ｄ１）ライゲーション反応により、工程ｂ１で得られた第一のベクター断片と工程ｃ１で得られた第二のベクター断片とを連結し、下記（３）の構造を含む第三のベクター：
   （３）５’－Ｒ１－Ｄ（ｉ）_１－Ｒ２－Ｍ１－Ｒ２’－Ｄ（ｉｉ）_１－Ｒ１’－３’
   ［ここで、Ｄ（ｉ）_１は、次の構造：５’－Ｄ（ｉｉｉ）－Ｄ（ｉ）－３’を含むＤＮＡ断片を示し、Ｄ（ｉｉ）_１は、次の構造：５’－Ｄ（ｉｉ）－Ｄ（ｉｖ）－３’を含むＤＮＡ断片を示す。］
   を生成させる工程ｄ１と、
   を含み、
   工程ｄ１で生成させた第三のベクターを、工程ａ１の第一のベクターとして用い、工程ａ１～ｄ１をさらにｎサイクル（合計１＋ｎサイクル）繰り返して、下記（３’）の構造を含む第三’のベクター：
   （３’）５’－Ｒ１－Ｄ（ｉ） _１＋ｎ －Ｒ２－Ｍ１－Ｒ２’－Ｄ（ｉｉ） _１＋ｎ －Ｒ１’－３’
   ［ここで、Ｄ（ｉ） _１＋ｎ は、１＋ｎサイクル目で得られる、次の構造：５’－Ｄ（ｉｉｉ）－Ｄ（ｉ） _ｎ －３’を含むＤＮＡ断片を示し；Ｄ（ｉｉ） _１＋ｎ は、１＋ｎサイクル目で得られる、次の構造：５’－Ｄ（ｉｉ） _ｎ －Ｄ（ｉｖ）－３’を含むＤＮＡ断片を示し；ｎは自然数を示し；各サイクル間で、第二のベクターのＤ（ｉｉｉ）は、互いに同一であっても異なっていてもよく；各サイクル間で、第二のベクターのＤ（ｉｖ）は、互いに同一であっても異なっていてもよい。］
   を生成させることを特徴とする、連結ＤＮＡの製造方法。
2. 工程ｄ１の後に、ライゲーション反応産物を宿主に形質転換する工程、及び、第一の選択マーカー遺伝子の発現を指標として第三’のベクターが導入された宿主を選抜する工程をさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載の連結ＤＮＡの製造方法。
3. 工程ｄ１の後に、第三’のベクターを第三の制限酵素及び第四の制限酵素で処理して次の構造：５’－Ｒ２－Ｍ１－Ｒ２’－３’を除去し、次の構造：５’－Ｒ１－Ｄ（ｉ）_１＋ｎ －Ｄ（ｉｉ）_１＋ｎ －Ｒ１’－３’を含む第五のベクターを生成させる工程をさらに含むことを特徴とする、請求項１又は２に記載の連結ＤＮＡの製造方法。
4. ＤＮＡ断片を連結した連結ＤＮＡを製造する方法であり、
   （ａ２）下記（１）の構造を含む第一のベクター及び下記（２）の構造を含む第二のベクター：
   （１）５’－Ｒ１－Ｄ（ｉ）－Ｒ２－Ｍ１－Ｒ２’－Ｄ（ｉｉ）－Ｒ１’－３’
   （２）５’－Ｒ１－Ｄ（ｉｉｉ）－Ｒ２－Ｍ２－Ｒ２’－Ｄ（ｉｖ）－Ｒ１’－３’
   ［ここで、Ｒ１は、第一の制限酵素の認識配列を示し；Ｒ１’は、第二の制限酵素の認識配列を示し；Ｒ２は、第一の制限酵素及び第二の制限酵素とは異なる第三の制限酵素の認識配列を示し；Ｒ２’は、第一の制限酵素及び第二の制限酵素とは異なる第四の制限酵素の認識配列を示し；Ｍ１は、第一の選択マーカー遺伝子を示し；Ｍ２は、第一の選択マーカー遺伝子とは異なる第二の選択マーカー遺伝子を示し；Ｄ（ｉ）～Ｄ（ｉｖ）は、それぞれ独立に、任意の連結用ＤＮＡ断片を示し、Ｄ（ｉ）及びＤ（ｉｉ）はいずれか一方であってよく、Ｄ（ｉｉｉ）及びＤ（ｉＶ）はいずれか一方であってよい。第一の制限酵素はＲ１内又はＲ１の３’側を切断し、第二の制限酵素はＲ１’内又はＲ１’の５’側を切断し、第一の制限酵素と第二の制限酵素とは同一でも異なっていてもよく；第三の制限酵素はＲ２内又はＲ２の５’側を切断し、第四の制限酵素はＲ２’内又はＲ２’の３’側を切断し、第三の制限酵素と第四の制限酵素とは同一でも異なっていてもよい。］
   を準備する工程ａ２と、
   （ｂ２）第二のベクターを第一の制限酵素及び第二の制限酵素で処理して、次の構造：５’－Ｄ（ｉｉｉ）－Ｒ２－Ｍ２－Ｒ２’－Ｄ（ｉｖ）－３’からなる第二のベクター断片を得る工程ｂ２と、
   （ｃ２）第一のベクターを第三の制限酵素及び第四の制限酵素で処理して、次の構造：５’－Ｒ２－Ｍ１－Ｒ２’－３’が除去された第一のベクター断片を得る工程ｃ２と、
   （ｄ２）ライゲーション反応により、工程ｂ２で得られた第二のベクター断片と工程ｃ２で得られた第一のベクター断片とを連結し、下記（４）の構造を含む第四のベクター：
   （４）５’－Ｒ１－Ｄ（ｉｉｉ）_１－Ｒ２－Ｍ２－Ｒ２’－Ｄ（ｉｖ）_１－Ｒ１’－３’
   ［ここで、Ｄ（ｉｉｉ）_１は、次の構造：５’－Ｄ（ｉ）－Ｄ（ｉｉｉ）－３’を含むＤＮＡ断片を示し、Ｄ（ｉｖ）_１は、次の構造：５’－Ｄ（ｉｖ）－Ｄ（ｉｉ）－３’を含むＤＮＡ断片を示す。］
   を生成させる工程ｄ２と、
   を含み、
   工程ｄ２で生成させた第四のベクターを、工程ａ２の第二のベクターとして用い、工程ａ２～ｄ２をさらにｎサイクル（合計１＋ｎサイクル）繰り返して、下記（４’）の構造を含む第四’のベクター：
   （４’）５’－Ｒ１－Ｄ（ｉｉｉ） _１＋ｎ －Ｒ２－Ｍ２－Ｒ２’－Ｄ（ｉｖ） _１＋ｎ －Ｒ１’－３’
   ［ここで、Ｄ（ｉｉｉ） _１＋ｎ は、１＋ｎサイクル目で得られる、次の構造：５’－Ｄ（ｉ）－Ｄ（ｉｉｉ） _ｎ －３’を含むＤＮＡ断片を示し；Ｄ（ｉｖ） _１＋ｎ は、１＋ｎサイクル目で得られる、次の構造：５’－Ｄ（ｉｖ） _ｎ －Ｄ（ｉｉ）－３’を含むＤＮＡ断片を示し；ｎは自然数を示し；各サイクル間で、第一のベクターのＤ（ｉ）は、互いに同一であっても異なっていてもよく；各サイクル間で、第一のベクターのＤ（ｉｉ）は、互いに同一であっても異なっていてもよい。］
   を生成させることを特徴とする、連結ＤＮＡの製造方法。
5. 工程ｄ２の後に、ライゲーション反応産物を宿主に形質転換する工程、及び、第二の選択マーカー遺伝子の発現を指標として第四’のベクターが導入された宿主を選抜する工程をさらに含むことを特徴とする、請求項４に記載の連結ＤＮＡの製造方法。
6. 工程ｄ２の後に、第四’のベクターを第三の制限酵素及び第四の制限酵素で処理して次の構造：５’－Ｒ２－Ｍ２－Ｒ２’－３’を除去し、次の構造：５’－Ｒ１－Ｄ（ｉｉｉ）_１＋ｎ －Ｄ（ｉｖ）_１＋ｎ －Ｒ１’－３’を含む第六のベクターを生成させる工程をさらに含むことを特徴とする、請求項４又は５に記載の連結ＤＮＡの製造方法。
7. （ｂ２）第二のベクターを第一の制限酵素及び第二の制限酵素で処理して、次の構造：５’－Ｄ（ｉｉｉ）－Ｒ２－Ｍ２－Ｒ２’－Ｄ（ｉｖ）－３’からなる第二のベクター断片を得る工程ｂ２と、
   （ｃ２）第一のベクターを第三の制限酵素及び第四の制限酵素で処理して、次の構造：５’－Ｒ２－Ｍ１－Ｒ２’－３’が除去された第一のベクター断片を得る工程ｃ２と、
   （ｄ２）ライゲーション反応により、工程ｂ２で得られた第二のベクター断片と工程ｃ２で得られた第一のベクター断片とを連結し、下記（４）の構造を含む第四のベクター：
   （４）５’－Ｒ１－Ｄ（ｉｉｉ） _１ －Ｒ２－Ｍ２－Ｒ２’－Ｄ（ｉｖ） _１ －Ｒ１’－３’
   ［ここで、Ｄ（ｉｉｉ） _１ は、次の構造：５’－Ｄ（ｉ）－Ｄ（ｉｉｉ）－３’を含むＤＮＡ断片を示し、Ｄ（ｉｖ） _１ は、次の構造：５’－Ｄ（ｉｖ）－Ｄ（ｉｉ）－３’を含むＤＮＡ断片を示す。］
   を生成させる工程ｄ２と、を含む方法で生成させた第四のベクター又は請求項４で生成させた第四’のベクターを、工程ａ１の第二のベクターとして用いることを特徴とする、請求項１～３のうちのいずれか一項に記載の連結ＤＮＡの製造方法。
8. （ｂ１）第一のベクターを第一の制限酵素及び第二の制限酵素で処理して、次の構造：５’－Ｄ（ｉ）－Ｒ２－Ｍ１－Ｒ２’－Ｄ（ｉｉ）－３’からなる第一のベクター断片を得る工程ｂ１と、
   （ｃ１）第二のベクターを第三の制限酵素及び第四の制限酵素で処理して、次の構造：５’－Ｒ２－Ｍ２－Ｒ２’－３’が除去された第二のベクター断片を得る工程ｃ１と、
   （ｄ１）ライゲーション反応により、工程ｂ１で得られた第一のベクター断片と工程ｃ１で得られた第二のベクター断片とを連結し、下記（３）の構造を含む第三のベクター：
   （３）５’－Ｒ１－Ｄ（ｉ） _１ －Ｒ２－Ｍ１－Ｒ２’－Ｄ（ｉｉ） _１ －Ｒ１’－３’
   ［ここで、Ｄ（ｉ） _１ は、次の構造：５’－Ｄ（ｉｉｉ）－Ｄ（ｉ）－３’を含むＤＮＡ断片を示し、Ｄ（ｉｉ） _１ は、次の構造：５’－Ｄ（ｉｉ）－Ｄ（ｉｖ）－３’を含むＤＮＡ断片を示す。］
   を生成させる工程ｄ１と、を含む方法で生成させた第三のベクター又は請求項１で生成させた第三’のベクターを、工程ａ２の第一のベクターとして用いることを特徴とする、請求項４～６のうちのいずれか一項に記載の連結ＤＮＡの製造方法。
9. 第一の制限酵素がＲ１の３’側を切断するタイプＩＩＳ制限酵素であり、かつ、第二の制限酵素がＲ１’の５’側を切断するタイプＩＩＳ制限酵素である、及び／又は、
   第三の制限酵素がＲ２の５’側を切断するタイプＩＩＳ制限酵素であり、かつ、第四の制限酵素がＲ２’の３’側を切断するタイプＩＩＳ制限酵素である、
   ことを特徴とする、請求項１～８のうちのいずれか一項に記載の連結ＤＮＡの製造方法。
10. 第一の選択マーカー遺伝子と逆の作用を有する選択マーカー遺伝子である第三の選択マーカー遺伝子が第一のベクターのＲ２とＲ２’との間にさらに挿入されている、及び／又は、
    第二の選択マーカー遺伝子と逆の作用を有する選択マーカー遺伝子であり、第三の選択マーカー遺伝子と同一でも異なっていてもよい、第四の選択マーカー遺伝子が第二のベクターのＲ２とＲ２’との間にさらに挿入されている、
    ことを特徴とする、請求項１～９のうちのいずれか一項に記載の連結ＤＮＡの製造方法。
11. Ｒ１、Ｒ１’、Ｒ２、及びＲ２’とは異なる第五の制限酵素の認識配列が第一のベクターにおける前記構造（１）以外の部位にさらに設定されている、並びに、
    Ｒ１、Ｒ１’、Ｒ２、Ｒ２’及び第五の制限酵素の認識配列とは異なる第六の制限酵素の認識配列が第二のベクターにおける前記構造（２）以外の部位にさらに設定されている、
    ことを特徴とする、請求項１～１０のうちのいずれか一項に記載の連結ＤＮＡの製造方法。
12. 請求項１～１１のうちのいずれか一項に記載の連結ＤＮＡの製造方法に用いるためのベクターの組み合わせであり、
    下記（１）の構造を含む第一のベクター及び下記（２）の構造を含む第二のベクター：
    （１）５’－Ｒ１－Ｄ（ｉ）－Ｒ２－Ｍ１－Ｒ２’－Ｄ（ｉｉ）－Ｒ１’－３’
    （２）５’－Ｒ１－Ｄ（ｉｉｉ）－Ｒ２－Ｍ２－Ｒ２’－Ｄ（ｉｖ）－Ｒ１’－３’
    ［ここで、Ｒ１は、第一の制限酵素の認識配列を示し；Ｒ１’は、第二の制限酵素の認識配列を示し；Ｒ２は、第一の制限酵素及び第二の制限酵素とは異なる第三の制限酵素の認識配列を示し；Ｒ２’は、第一の制限酵素及び第二の制限酵素とは異なる第四の制限酵素の認識配列を示し；Ｍ１は、第一の選択マーカー遺伝子を示し；Ｍ２は、第一の選択マーカー遺伝子とは異なる第二の選択マーカー遺伝子を示し；Ｄ（ｉ）～Ｄ（ｉｖ）は、それぞれ独立に、任意の連結用ＤＮＡ断片を示し、Ｄ（ｉ）及びＤ（ｉｉ）はいずれか一方であってよく、Ｄ（ｉｉｉ）及びＤ（ｉｖ）はいずれか一方であってよい。第一の制限酵素はＲ１内又はＲ１の３’側を切断し、第二の制限酵素はＲ１’内又はＲ１’の５’側を切断し、第一の制限酵素と第二の制限酵素とは同一でも異なっていてもよく；第三の制限酵素はＲ２内又はＲ２の５’側を切断し、第四の制限酵素はＲ２’内又はＲ２’の３’側を切断し、第三の制限酵素と第四の制限酵素とは同一でも異なっていてもよい。］
    を含む組み合わせ。
13. 請求項１～１１のうちのいずれか一項に記載の連結ＤＮＡの製造方法に用いるためのベクターの組み合わせであり、
    下記（１’）の構造を含む第一のベクター及び下記（２’）の構造を含む第二のベクター：
    （１’）５’－Ｒ１－Ｅ１－Ｒ２－Ｍ１－Ｒ２’－Ｅ２－Ｒ１’－３’
    （２’）５’－Ｒ１－Ｅ３－Ｒ２－Ｍ２－Ｒ２’－Ｅ４－Ｒ１’－３’
    ［ここで、Ｒ１は、第一の制限酵素の認識配列を示し；Ｒ１’は、第二の制限酵素の認識配列を示し；Ｒ２は、第一の制限酵素及び第二の制限酵素とは異なる第三の制限酵素の認識配列を示し；Ｒ２’は、第一の制限酵素及び第二の制限酵素とは異なる第四の制限酵素の認識配列を示し；Ｍ１は、第一の選択マーカー遺伝子を示し；Ｍ２は、第一の選択マーカー遺伝子とは異なる第二の選択マーカー遺伝子を示し；Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３、及びＥ４は、それぞれ独立に、任意の連結用ＤＮＡ断片の挿入用部位を示し、Ｅ１及びＥ２はいずれか一方であってよく、Ｅ３及びＥ４はいずれか一方であってよい。第一の制限酵素はＲ１内又はＲ１の３’側を切断し、第二の制限酵素はＲ１’内又はＲ１’の５’側を切断し、第一の制限酵素と第二の制限酵素とは同一でも異なっていてもよく；第三の制限酵素はＲ２内又はＲ２の５’側を切断し、第四の制限酵素はＲ２’内又はＲ２’の３’側を切断し、第三の制限酵素と第四の制限酵素とは同一でも異なっていてもよい。］
    を含む組み合わせ。