ES2636902T3 - Métodos y composiciones para la modificación de ADN objetivo dirigida por ARN y para la modulación de la transcripción dirigida por ARN - Google Patents

Métodos y composiciones para la modificación de ADN objetivo dirigida por ARN y para la modulación de la transcripción dirigida por ARN Download PDF

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Abstract

Un metodo para modificar un ADN objetivo, comprendiendo el metodo poner en contacto el ADN objetivo con un complejo que comprende: (a) un polipeptido Cas9 y (b) un ARN dirigido a ADN de molecula simple que comprende: (i) un segmento dirigido a ADN que comprende una secuencia de nucleotidos que es complementaria a una secuencia en el ADN objetivo; y (ii) un segmento de union a proteina que interactua con dicho polipeptido Cas9, en donde el segmento de union a proteina comprende dos tramos complementarios de nucleotidos que hibridan para formar un duplex de ARN bicatenario (ARNbc), en el que dichos dos tramos complementarios de nucleotidos estan unidos covalentemente por nucleotidos intermedios, en el que dicho contacto es in vitro o en una celula ex vivo; y en el que dicha modificacion es escision del ADN objetivo.

Description

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DESCRIPCION
Metodos y composiciones para la modificacion de ADN objetivo dirigida por ARN y para la modulacion de la transcripcion dirigida por ARN
Antecedentes
Alrededor del 60 % de las bacterias y el 90 % de las arqueas poseen sistemas CRISPR (repeticiones palindromicas cortas agrupadas y regularmente espaciadas)/asociados con CRISPR (Cas) para otorgar resistencia a elementos externos al ADN. El sistema de tipo II de CRISPR de Streptococcus pyogenes involucra solo a un unico gen que codifica la proteina Cas9 y dos ARN - un ARN maduro de CRISPR de ArN (crRNA) y un regulador en trans de ARN parcialmente complementary (tracrRNA) - los cuales son necesarios y suficientes para el silenciamiento guiado por ARN de ADN foraneo. Deltcheva (Nature 471, 2011) se refiere a maduracion de ARN de CRISPR por ARN pequeno codificado en trans y RNasa III de factor hospedador.
En los ultimos anos, las enzimas nucleasa modificadas geneticamente para dirigirse a secuencias especificas de ADN han a^do gran atencion como herramientas poderosas para la manipulacion genetica de celulas y organismos completos, lo cual permite la eliminacion, reemplazo y reparacion dirigida de genes, asi como la insercion de secuencias exogenas (transgenes) en el genoma. Han surgido dos tecnologias principales para la manipulacion genetica de nucleasas de ADN de sitio especifico, ambas basadas en la construccion de enzimas endonucleasas quimericas en las cuales un dominio de secuencia no especifica de ADN endonucleasa se encuentra fusionado a un dominio de union de ADN manipulado geneticamente. Sin embargo, dirigirse a cada nuevo locus genomico requiere disenar una enzima nucleasa novedosa, lo cual hace que estos enfoques insuman tiempo y dinero. Ademas, ambas tecnologias poseen una precision limitada, lo que puede llevar a efectos impredecibles fuera del objetivo. El documento WO 2011/072246 se refiere a direccion genica con nucleasas efectoras de tipo activador de la transcripcion.
La interrogacion genomica sistematica y la reprogramacion genetica de celulas implican dirigir conjuntos de genes para expresion o represion. En la actualidad, el enfoque mas comun para el direccionamiento de genes arbitrarios para la regulacion es utilizar la ribointerferencia (RNAi). Este enfoque tiene limitaciones. Por ejemplo, la RNAi puede presentar efectos significativos fuera del objetivo y toxicidad.
Hay una necesidad en el campo de una tecnologia que permita dirigir de forma precisa la actividad de nucleasa (u otras actividades de proteina) hacia ubicaciones precisas dentro de un ADN objetivo, de forma tal que no requiera el diseno de una nueva proteina para cada secuencia objetivo nueva. Adicionalmente, hay una necesidad en la tecnica de metodos para controlar la expresion genica con minimos efectos fuera del objetivo.
Compendio
Cualquier referencia a la modificacion genetica de celulas no abarca la modificacion de la linea germinal de seres humanos.
Las composiciones de la invencion no comprenden celulas germinales humanas, embriones humanos o celulas germinales embrionarias humanas.
Los metodos de la invencion no comprenden el uso de embriones humanos o celulas germinales embrionarias humanas.
La presente invencion proporciona un metodo de modificacion de un ADN objetivo, comprendiendo el metodo poner en contacto el ADN objetivo con un complejo que comprende: (a) un polipeptido Cas9 y (b) ARN dirigido a aDn de molecula simple que comprende: (i) un segmento de direccion a ADN que comprende una secuencia de nucleotidos que es complementaria de una secuencia en el ADN objetivo y (ii) un segmento de union a proteinas que interacciona con dicho polipeptido Cas9, en el que el segmento de union a proteinas comprende dos tramos complementarios de nucleotidos que hibridan para formar una doble cadena de ARN bicatenario (ARNbc), en el que dichos dos tramos complementarios de nucleotidos estan unidos covalentemente por nucleotidos intermedios, en el que dicho contacto es in vitro o en una celula ex vivo; y en el que dicha modificacion es escision del ADN objetivo.
La invencion proporciona una composition que comprende: (a) un polipeptido Cas9 o un polinucleotido que codifica dicho polipeptido Cas9, y (b) ARN dirigido a ADN de molecula simple o un polinucleotido de ADN que codifica dicho ARN que se dirige a ADN, en el que dicha unica molecula de ARN que se dirige a ADN comprende: (i) un segmento de direccion a ADN que comprende una secuencia de nucleotidos que es complementaria de una secuencia en un ADN objetivo y (ii) un segmento de union a proteinas que interacciona con dicho polipeptido Cas9, en el que el segmento de union a proteinas comprende dos tramos complementarios de nucleotidos que hibridan para formar una doble cadena de ARN bicatenario (ARNbc), en el que dichos dos tramos complementarios de nucleotidos estan unidos covalentemente por nucleotidos intermedios.
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La invention proporciona ARN dirigido a ADN de molecula simple o un polinucleotido de ADN que codifica dicho ARN que se dirige a ADN, en el que dicha unica molecula de ARN que se dirige a ADN comprende: (a) un segmento de direction a ADN que comprende una secuencia de nucleotidos que es complementaria de una secuencia en un ADN objetivo y (b) un segmento de union a proteinas que interacciona con una proteina Cas9, en el que el segmento de union a proteinas comprende dos tramos complementarios de nucleotidos que hibridan para formar una doble cadena de ARN bicatenario (ARNbc), en el que dichos dos tramos complementarios de nucleotidos estan unidos covalentemente por nucleotidos intermedios.
La invencion proporciona uno o mas acidos nucleicos que comprenden: (a) una primera secuencia de nucleotidos que codifica ArN dirigido a ADN de molecula simple que comprende: (i) un segmento de direccion a ADN que comprende una secuencia de nucleotidos que es complementaria de una secuencia en un ADN objetivo y (ii) un segmento de union a proteinas que interacciona con dicho polipeptido Cas9, en el que el segmento de union a proteinas comprende dos tramos complementarios de nucleotidos que hibridan para formar una doble cadena de ARN bicatenario (ARNbc), en el que dichos dos tramos complementarios de nucleotidos estan unidos covalentemente por nucleotidos intermedios; en el que la primera secuencia de nucleotidos que codifica dicho ARN que se dirige a ADN esta unida operativamente con un promotor; y, opcionalmente, (b) una segunda secuencia de nucleotidos que codifica un polipeptido Cas9, en el que la secuencia de nucleotidos que codifica dicho polipeptido Cas9 esta unido operativamente a un promotor.
La invencion proporciona un kit que comprende (a) un polipeptido Cas9, o un acido nucleico que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica dicho polipeptido Cas9; y (b) ARN dirigido a ADN de molecula simple o un acido nucleico que codifica dicho ARN que se dirige a ADN, en el que la unica molecula de ARN que se dirige a ADN comprende: (i) un segmento de direccion a ADN que comprende una secuencia de nucleotidos que es complementaria de una secuencia en un ADN objetivo y (ii) un segmento de union a proteinas que interacciona con dicho polipeptido Cas9, en el que el segmento de union a proteinas comprende dos tramos complementarios de nucleotidos que hibridan para formar una doble cadena de ARN bicatenario (ARNbc), en el que dichos dos tramos complementarios de nucleotidos estan unidos covalentemente por nucleotidos intermedios, y en el que (a) y (b) estan en el mismo recipiente o recipientes separados.
La presente description proporciona un ARN dirigido a ADN que comprende una secuencia objetivo y, junto con un polipeptido modificador, proporciona una modification especifica del sitio de un ADN objetivo y/o un polipeptido asociado con el ADN objetivo. La presente descripcion proporciona ademas polipeptidos modificadores especificos del sitio. La presente descripcion proporciona ademas metodos para la modificacion especifica del sitio de un ADN objetivo y/o un polipeptido asociado con el ADN objetivo. La presente descripcion proporciona metodos para modular la transcription de un acido nucleico objetivo en una celula objetivo, que generalmente involucra poner en contacto el acido nucleico objetivo con un polipeptido Cas9 enzimaticamente inactivo y un ARN dirigido a ADN. Se proporcionan tambien kits y composiciones para llevar a cabo los metodos. La presente descripcion proporciona celulas modificadas geneticamente que producen Cas9; y organismos multicelulares no humanos Cas9 transgenicos.
Las caracteristicas de la presente descripcion incluyen un ARN dirigido a ADN que comprende: (i) un primer segmento que comprende una secuencia de nucleotidos que es complementaria a una secuencia en un ADN objetivo; y (ii) un segundo segmento que interactua con un polipeptido modificador dirigido al sitio. En algunos casos, el primer segmento comprende 8 nucleotidos que tienen 100 % de complementariedad con una secuencia en el ADN objetivo. En algunos casos, el segundo segmento comprende una secuencia de nucleotidos con al menos 60 % de identidad a lo largo de al menos 8 nucleotidos contiguos a cualquiera de las secuencias de nucleotidos establecidas en las SEQ ID NO: 431-682 (por ejemplo, 431-562). En algunos casos, el segundo segmento comprende una secuencia de nucleotidos con al menos 60 % de identidad a lo largo de al menos 8 nucleotidos contiguos a cualquiera de las secuencias de nucleotidos establecidas en las SEQ ID NO: 563-682. En algunos casos, el polipeptido modificador dirigido al sitio comprende una secuencia de aminoacidos con al menos alrededor de 75 % de identidad de secuencia de aminoacidos con los aminoacidos 7-166 o 731-1003 de la secuencia de aminoacidos Cas9/Csn1 ilustrada en la Figura 3 o a las partes correspondientes en cualquiera de las secuencias de aminoacidos establecidas como SEQ ID NO: 1-256 y 795-1346.
Las caracteristicas de la presente descripcion incluyen un polinucleotido de ADN que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica el ARN dirigido a ADN. En algunos casos, un vector de expresion recombinante comprende el polinucleotido de ADN. En algunos casos, la secuencia de nucleotidos que codifica el ARN dirigido a ADN esta unida operativamente a un promotor. En algunos casos, el promotor es un promotor inducible. En algunos casos, la secuencia de nucleotidos que codifica el ARN dirigido al ADN comprende ademas un sitio de donation multiple. Las caracteristicas de la presente descripcion incluyen una celula hospedadora in vitro modificada geneticamente que comprende el polinucleotido de ADN.
Las caracteristicas de la presente descripcion incluyen un vector de expresion recombinante que comprende: (i) una secuencia de nucleotidos que codifica un ARN dirigido a ADN, donde el ARN dirigido a aDn comprende: (a) un primer segmento que comprende una secuencia de nucleotidos que es complementaria a una secuencia en un ADN objetivo; y (b) un segundo segmento que interactua con un polipeptido modificador dirigido al sitio; y (ii) una
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secuencia de nucleotidos que codifica el polipeptido modificador dirigido al sitio que comprende: (a) una parte de union a ARN que interactua con el ARN dirigido a ADN; y (b) una parte de actividad que presenta una actividad enzimatica dirigida al sitio, donde el sitio de actividad enzimatica esta determinado por el ARN dirigido a ADN.
Las caracteristicas de la presente descripcion incluyen un vector de expresion recombinante que comprende: (i) una secuencia de nucleotidos que codifica un ARN dirigido a ADN, donde el ARN dirigido a aDn comprende: (a) un primer segmento que comprende una secuencia de nucleotidos que es complementaria a una secuencia en un ADN objetivo; y (b) un segundo segmento que interactua con un polipeptido modificador dirigido al sitio; y (ii) una secuencia de nucleotidos que codifica el polipeptido modificador dirigido al sitio, donde el polipeptido modificador dirigido al sitio comprende: (a) una parte de union a ARN que interactua con el ARN dirigido a ADN; y (b) una parte de actividad que modula la transcripcion dentro del ADN objetivo, donde el sitio de transcripcion modulada dentro del ADN objetivo esta determinado por el ARN dirigido a ADN.
Las caracteristicas de la presente descripcion incluyen una variante del polipeptido modificador dirigido al sitio que comprende: (i) una parte de union a ARN que interactua con un ARN dirigido a ADN, donde el ARN dirigido a ADN comprende una secuencia de nucleotidos que es complementaria a una secuencia en un ADN objetivo; y (ii) una parte de actividad que presenta actividad enzimatica dirigida al sitio reducida, donde el sitio de actividad enzimatica esta determinado por el ARN dirigido a ADN. En algunos casos, la variante de polipeptido modificador dirigido al sitio comprende una mutacion H840A de la secuencia S. pyogenes SEQ ID NO: 8 o la mutacion correspondiente en cualquiera de las secuencias de aminoacidos establecidas como las SEQ ID NO: 1-256 y 795-1346. En algunos casos, la variante de polipeptido modificador dirigido al sitio comprende una mutacion D10A de la secuencia S. pyogenes SEQ ID NO: 8 o la mutacion correspondiente en cualquiera de las secuencias de aminoacidos establecidas como las SEQ ID NO: 1-256 y 795-1346. En algunos casos, la variante del polipeptido modificador dirigido al sitio comprende (i) una mutacion D10A de la secuencia S. pyogenes SEQ ID NO: 8 o la mutacion correspondiente en cualquiera de las secuencias de aminoacidos establecidas como SEQ ID NO: 1-256 y 795-1346; y (ii) una mutacion H840A de la secuencia S. pyogenes SEQ ID NO: 8 o la mutacion correspondiente en cualquiera de las secuencias de aminoacidos establecidas como SEQ ID NO: 1-256 y 795-1346.
Las caracteristicas de la presente descripcion incluyen un polipeptido modificador quimerico dirigido al sitio que comprende: (i) una parte de union a ARN que interactua con un aRn dirigido a ADN, donde el ARN dirigido a ADN comprende una secuencia de nucleotidos que es complementaria a una secuencia en un ADN objetivo; y (ii) una parte de actividad que presenta actividad enzimatica dirigida al sitio, donde el sitio de actividad enzimatica esta determinado por el ARN dirigido a ADN. En algunos casos, el polipeptido modificador quimerico dirigido al sitio comprende una secuencia de aminoacidos con al menos alrededor de 75 % de identidad de secuencia de aminoacidos con los aminoacidos 7-166 o 731-1003 de la secuencia de aminoacidos Cas9/Csn1 ilustrada en la Figura 3 o con las partes correspondientes en cualquiera de las secuencias de aminoacidos establecidas como SEQ ID NO: 1-256 y 795-1346. En algunos casos, el ARN dirigido a ADN comprende ademas una secuencia de nucleotidos con al menos 60 % de identidad a lo largo de al menos 8 nucleotidos contiguos a cualquiera de las secuencias de nucleotidos establecidas en las SEQ ID NO: 431-682 (por ejemplo, SEQ ID NO: 563-682). En algunos casos, el ARN dirigido a ADN comprende ademas una secuencia de nucleotidos con al menos 60 % de identidad a lo largo de al menos 8 nucleotidos contiguos a cualquiera de las secuencias de nucleotidos establecidas en las SEQ ID NO: 431-562. En algunos casos, la actividad enzimatica del polipeptido modificador quimerico dirigido al sitio modifica el ADN objetivo. En algunos casos, la actividad enzimatica del polipeptido modificador quimerico dirigido al sitio es actividad de nucleasa, actividad de metiltransferasa, actividad de desmetilasa, actividad de reparacion del ADN, actividad de dano al ADN, actividad de desaminacion, actividad de dismutasa, actividad de alquilacion, actividad de depurinacion, actividad de oxidacion, actividad de formacion de dimeros de pirimidina, actividad de integrasa, actividad de transposasa, actividad de recombinasa, actividad de polimerasa, actividad de ligasa, actividad de helicasa, actividad de fotoliasa o actividad de glicosilasa. En algunos casos, la actividad enzimatica del polipeptido modificador quimerico dirigido al sitio es actividad de nucleasa. En algunos casos, la actividad de nucleasa introduce una rotura de cadena doble en el ADN objetivo. En algunos casos, la actividad enzimatica del polipeptido modificador quimerico dirigido al sitio modifica un polipeptido objetivo asociado al ADN objetivo. En algunos casos, la actividad enzimatica del polipeptido modificador quimerico dirigido al sitio es actividad de metiltransferasa, actividad de desmetilasa, actividad de acetiltransferasa, actividad de deacetilasa, actividad de cinasa, actividad de fosfatasa, actividad de ubiquitina ligasa, actividad desubiquitinante, actividad de adenilacion, actividad de desadenilacion, actividad de SUMOilacion, actividad de deSUMOilacion, actividad de ribosilacion, actividad de desribosilacion, actividad de miristoilacion o actividad de demiristoilacion.
Las caracteristicas de la presente descripcion incluyen un polinucleotido que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica a un polipeptido modificador quimerico dirigido al sitio. En algunos casos, el polinucleotido es un polinucleotido de ARN. En algunos casos, el polinucleotido es un polinucleotido de ADN. Las caracteristicas de la presente descripcion incluyen un vector de expresion recombinante que comprende el polinucleotido. En algunos casos, el polinucleotido se encuentra unido operativamente a un promotor. En algunos casos, el promotor es un promotor inducible. Las caracteristicas de la presente descripcion incluyen una celula hospedadora in vitro modificada geneticamente que comprende el polinucleotido.
Las caracteristicas de la presente descripcion incluyen un polipeptido modificador quimerico dirigido al sitio que
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comprende: (i) una parte de union a ARN que interactua con un ARN dirigido a ADN, donde el ARN dirigido a ADN comprende una secuencia de nucleotidos que es complementaria a una secuencia en un ADN objetivo; y (ii) una parte de actividad que modula la transcripcion dentro del ADN objetivo, donde el sitio de transcripcion modulada dentro el ADN objetivo esta determinado por el ARN dirigido a ADN. En algunos casos, la parte de actividad aumenta la transcripcion dentro del ADN objetivo. En algunos casos, la parte de actividad disminuye la transcripcion dentro del ADN objetivo.
Las caracteristicas de la presente descripcion incluyen una celula modificada geneticamente que comprende un polipeptido modificador recombinante dirigido al sitio que comprende una parte de union a ARN que interactua con un ARN dirigido a ADN; y una parte de actividad que presenta actividad enzimatica dirigida al sitio, donde el sitio de actividad enzimatica esta determinado por el ARN dirigido a ADN. En algunos casos, el polipeptido modificador dirigido al sitio comprende una secuencia de aminoacidos con al menos alrededor de 75 % de identidad de secuencia de aminoacidos con los aminoacidos 7-166 o 731-1003 de la secuencia de aminoacidos Cas9/Csn1 ilustrada en la Figura 3 o a las partes correspondientes en cualquiera de las secuencias de aminoacidos establecidas como SEQ ID NO: 1-256 y 795-1346. En algunos casos, la celula se selecciona del grupo que consiste en: una celula arqueal, una celula bacteriana, una celula eucariota, un organismo eucariota unicelular, una celula somatica, una celula germinal, una celula madre, una celula vegetal, una celula de algas, una celula de animal, una celula de invertebrado, una celula de vertebrado, una celula de pez, una celula de rana, una celula de ave, una celula de mamifero, una celula de cerdo, una celula de vaca, una celula de cabra, una celula de oveja, una celula de roedor, una celula de rata, una celula de raton, una celula de primate no humano y una celula de humano.
Las caracteristicas de la presente descripcion incluyen un organismo transgenico no humano cuyo genoma comprende un transgen que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica un polipeptido modificador recombinante dirigido al sitio que comprende: (i) una parte de union a ARN que interactua con el ARN dirigido a ADN; y (ii) una parte de actividad que presenta una actividad enzimatica dirigida al sitio, donde el sitio de actividad enzimatica esta determinado por el ARN dirigido a ADN. En algunos casos, el polipeptido modificador dirigido al sitio comprende una secuencia de aminoacidos con al menos alrededor de 75 % de identidad de secuencia de aminoacidos con los aminoacidos 7-166 o 731-1003 de la secuencia de aminoacidos Cas9/Csn1 ilustrada en la Figura 3 o a las partes correspondientes en cualquiera de las secuencias de aminoacidos establecidas como SEQ ID NO: 1-256 y 795-1346. En algunos casos, el organismo se selecciona del grupo que consiste en: una arquea, una bacteria, un organismo unicelular eucariota, un alga, una planta, un animal, un invertebrado, una mosca, un gusano, un cnidario, un vertebrado, un pez, una rana, un ave, un mamifero, un ungulado, un roedor, una rata, un raton y un primate no humano.
Las caracteristicas de la presente descripcion incluyen una composicion que comprende: (i) un ARN dirigido a ADN o un polinucleotido de aDn que codifica a este, donde el ARN dirigido a ADN comprende: (a) un primer segmento que comprende una secuencia de nucleotidos que es complementaria a una secuencia en un ADN objetivo; y (b) un segundo segmento que interactua con un polipeptido modificador dirigido al sitio; y (ii) el polipeptido modificador dirigido al sitio o un polinucleotido que lo codifica, donde el polipeptido modificador dirigido al sitio comprende: (a) una parte de union a ARN que interactua con el ARN dirigido a ADN; y (b) una parte de actividad que presenta una actividad enzimatica dirigida al sitio, donde el sitio de actividad enzimatica esta determinado por el ARN dirigido a ADN. En algunos casos, el primer segmento del ARN dirigido a ADN comprende 8 nucleotidos que tienen al menos 100 % de complementariedad con una secuencia en el ADN objetivo. En algunos casos, el segundo segmento del ARN dirigido a ADN comprende una secuencia de nucleotidos con al menos 60 % de identidad a lo largo de al menos 8 nucleotidos contiguos a cualquiera de las secuencias de nucleotidos establecidas en las SEQ ID NO: 431682 (por ejemplo, SEQ ID NO: 563-682). En algunos casos, el segundo segmento del ARN que dirige al ADN comprende una secuencia de nucleotidos con al menos 60 % de identidad a lo largo de al menos 8 nucleotidos contiguos a cualquiera de las secuencias de nucleotidos establecidas en las SEQ ID NO: 431-562. En algunos casos, el polipeptido modificador dirigido al sitio comprende una secuencia de aminoacidos con al menos alrededor de 75 % de identidad de secuencia de aminoacidos con los aminoacidos 7-166 o 731-1003 de la secuencia de aminoacidos Cas9/Csn1 ilustrada en la Figura 3 o a las partes correspondientes en cualquiera de las secuencias de aminoacidos establecidas como SEQ ID NO: 1-256 y 795-1346. En algunos casos, la actividad enzimatica modifica al ADN objetivo. En algunos casos, la actividad enzimatica es actividad de nucleasa, actividad de metiltransferasa, actividad de desmetilasa, actividad de reparacion del ADN, actividad de dano al ADN, actividad de desaminacion, actividad de dismutasa, actividad de alquilacion, actividad de depurinacion, actividad de oxidacion, actividad de formacion de dimeros de pirimidina, actividad de integrasa, actividad de transposasa, actividad de recombinasa, actividad de polimerasa, actividad de ligasa, actividad de helicasa, actividad de fotoliasa o actividad de glicosilasa. En algunos casos, la actividad enzimatica es actividad de nucleasa. En algunos casos, la actividad de nucleasa introduce una rotura de cadena doble en el ADN objetivo. En algunos casos, la actividad enzimatica modifica un polipeptido objetivo asociado con el ADN objetivo. En algunos casos, la actividad enzimatica es actividad de metiltransferasa, actividad de desmetilasa, actividad de acetiltransferasa, actividad de deacetilasa, actividad de cinasa, actividad de fosfatasa, actividad de ubiquitina ligasa, actividad desubiquitinante, actividad de adenilacion, actividad de desadenilacion, actividad de SUMOilacion, actividad de deSUMOilacion, actividad de ribosilacion, actividad de desribosilacion, actividad de miristoilacion o actividad de demiristoilacion. En algunos casos, el polipeptido objetivo es una histona y la actividad enzimatica es actividad de metiltransferasa, actividad de desmetilasa, actividad de acetiltransferasa, actividad de deacetilasa, actividad de cinasa, actividad de fosfatasa,
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actividad de ubiquitina ligasa o actividad desubiquitinante. En algunos casos, el ARN dirigido a ADN es un ARN dirigido a ADN de doble molecula y la composition comprende tanto un ARN identificador y un ARN activador, del cual los segmentos formadores de duplex son complementarios y se hibridan para formar el segundo segmento de ARN dirigido a ADN. En algunos casos, el segmento formador de duplex del ARN activador comprende una secuencia de nucleotidos con al menos 60 % de identidad a lo largo de al menos 8 nucleotidos contiguos a cualquiera de las secuencias de nucleotidos establecidas en las SEQ ID NO: 431-682.
Las caracteristicas de la presente description incluyen una composicion que comprende: (i) un ARN dirigido a ADN de la presente descripcion, o un polinucleotido de ADN que lo codifica; y (ii) un amortiguador para estabilizar acidos nucleicos. Las caracteristicas de la presente descripcion incluyen una composicion que comprende: (i) un polipeptido modificador dirigido al sitio de la presente descripcion, o un polinucleotido que lo codifica; y (ii) un amortiguador para estabilizar acidos nucleicos y/o proteinas. Las caracteristicas de la presente descripcion incluyen una composicion que comprende: (i) un ARN dirigido a ADN o un polinucleotido de aDn que codifica a este, donde el ARN dirigido a ADN comprende: (a) un primer segmento que comprende una secuencia de nucleotidos que es complementaria a una secuencia en un aDn objetivo; y (b) un segundo segmento que interactua con un polipeptido modificador dirigido al sitio; y (ii) el polipeptido modificador dirigido al sitio o un polinucleotido que lo codifica, donde el polipeptido modificador dirigido al sitio comprende: (a) una parte de union a aRn que interactua con el ARN dirigido a ADN; y (b) una parte de actividad que modula la transcription dentro del ADN objetivo, donde el sitio de transcription modulada dentro del ADN objetivo esta determinado por el ARN dirigido a ADN. En algunos casos, la parte de actividad aumenta la transcripcion dentro del ADN objetivo. En algunos casos, la parte de actividad disminuye la transcripcion dentro del ADN objetivo. Las caracteristicas de la presente descripcion incluyen una composicion que comprende: (i) un polipeptido modificador dirigido al sitio o un polinucleotido que lo codifica; y (ii) un amortiguador para estabilizar acidos nucleicos y/o proteinas.
Las caracteristicas de la presente descripcion incluyen un metodo de modification especifica al sitio de un ADN objetivo, donde el metodo comprende: poner en contacto el ADN objetivo con: (i) un ARN dirigido a ADN o un polinucleotido de ADN que codifica a este, donde el ARN dirigido a ADN comprende: (a) un primer segmento que comprende una secuencia de nucleotidos que es complementaria a una secuencia en el ADN objetivo; y (b) un segundo segmento que interactua con un polipeptido modificador dirigido al sitio; y (ii) un polipeptido modificador dirigido al sitio o un polinucleotido que lo codifica, donde el polipeptido modificador dirigido al sitio comprende: (a) una parte de union a ARN que interactua con el ARN dirigido a ADN; y (b) una parte de actividad que presenta actividad enzimatica dirigida al sitio. En algunos casos, el ADN objetivo es extracromosomico. En algunos casos, el ADN objetivo comprende una secuencia PAM de la cadena complementaria que es 5-CCY-3', donde Y es cualquier nucleotido de ADN e Y esta en una position inmediata respecto del extremo 5' de la secuencia objetivo de la cadena complementaria del ADN objetivo. En algunos casos, el aDn objetivo es parte de un cromosoma in vitro. En algunos casos, el ADN objetivo es parte de un cromosoma in vivo. En algunos casos, el ADN objetivo es parte de un cromosoma en una celula. En algunos casos, la celula se selecciona del grupo que consiste en: una celula arqueal, una celula bacteriana, una celula eucariota, un organismo eucariota unicelular, una celula somatica, una celula germinal, una celula madre, una celula vegetal, una celula de algas, una celula de animal, una celula de invertebrado, una celula de vertebrado, una celula de pez, una celula de rana, una celula de ave, una celula de mamifero, una celula de cerdo, una celula de vaca, una celula de cabra, una celula de oveja, una celula de roedor,
una celula de rata, una celula de raton, una celula de primate no humano y una celula de humano. En algunos
casos, el ARN dirigido a ADN comprende una secuencia de nucleotidos con al menos 60 % de identidad a lo largo de al menos 8 nucleotidos contiguos a cualquiera de las secuencias de nucleotidos establecidas en las SEQ ID NO: 431-682 (por ejemplo, SEQ ID NO: 563-682). En algunos casos, el ARN dirigido a ADN comprende ademas una secuencia de nucleotidos con al menos 60 % de identidad a lo largo de al menos 8 nucleotidos contiguos a
cualquiera de las secuencias de nucleotidos establecidas en las SEQ ID NO: 431-562. En algunos casos, el
polipeptido modificador de ADN comprende una secuencia de aminoacidos con al menos alrededor de 75 % de identidad de secuencia de aminoacidos con los aminoacidos 7-166 o 731-1003 de la secuencia de aminoacidos Cas9/Csn1 ilustrada en la Figura 3 o a las partes correspondientes en cualquiera de las secuencias de aminoacidos establecidas como SEQ ID NO: 1-256 y 795-1346. En algunos casos, la actividad enzimatica modifica al ADN objetivo. En algunos casos, la actividad enzimatica es actividad de nucleasa, actividad de metiltransferasa, actividad de desmetilasa, actividad de reparation del ADN, actividad de dano al ADN, actividad de desaminacion, actividad de dismutasa, actividad de alquilacion, actividad de depurinacion, actividad de oxidation, actividad de formation de dimeros de pirimidina, actividad de integrasa, actividad de transposasa, actividad de recombinasa, actividad de polimerasa, actividad de ligasa, actividad de helicasa, actividad de fotoliasa o actividad de glicosilasa. En algunos casos, la actividad enzimatica modificadora de ADN es actividad de nucleasa. En algunos casos, la actividad de nucleasa introduce una rotura de cadena doble en el ADN objetivo. En algunos casos, el contacto ocurre en condiciones que permiten reparacion dirigida por homologia o recombination no homologa. En algunos casos, el metodo comprende ademas poner en contacto el ADN objetivo con un polinucleotido donante, donde el polinucleotido donante, una parte del polinucleotido donante, una copia del polinucleotido donante o una parte de una copia del polinucleotido donante se integra al ADN objetivo. En algunos casos, el metodo no comprende poner en contacto la celula con el polinucleotido donante, donde el ADN objetivo se modifica de forma tal que los
nucleotidos dentro del ADN objetivo son eliminados. En algunos casos, la actividad enzimatica modifica un
polipeptido objetivo asociado con el ADN objetivo. En algunos casos, la actividad enzimatica es actividad de
metiltransferasa, actividad de desmetilasa, actividad de acetiltransferasa, actividad de deacetilasa, actividad de
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cinasa, actividad de fosfatasa, actividad de ubiquitina ligasa, actividad desubiquitinante, actividad de adenilacion, actividad de desadenilacion, actividad de SUMOilacion, actividad de deSUMOilacion, actividad de ribosilacion, actividad de desribosilacion, actividad de miristoilacion o actividad de demiristoilacion. En algunos casos, el polipeptido objetivo es una histona y la actividad enzimatica es actividad de metiltransferasa, actividad de desmetilasa, actividad de acetiltransferasa, actividad de deacetilasa, actividad de cinasa, actividad de fosfatasa, actividad de ubiquitina ligasa o actividad desubiquitinante. En algunos casos, el complejo comprende ademas un ARN activador. En algunos casos, el ARN activador comprende una secuencia de nucleotidos con al menos 60 % de identidad a lo largo de al menos 8 nucleotidos contiguos a cualquiera de las secuencias de nucleotidos establecidas en las SEQ ID NO: 431-682.
Las caracteristicas de la presente description incluyen un metodo de modulation de la transcription especifica al sitio de un ADN objetivo, donde el metodo comprende poner en contacto el ADN objetivo con: (i) un ARN dirigido a ADN o un polinucleotido de ADN que codifica a este, donde el ARN dirigido a ADN comprende: (a) un primer segmento que comprende una secuencia de nucleotidos que es complementaria a una secuencia en el ADN objetivo; y (b) un segundo segmento que interactua con un polipeptido modificador dirigido al sitio; y (ii) un polipeptido modificador dirigido al sitio o un polinucleotido que lo codifica, donde el polipeptido modificador dirigido al sitio comprende: (a) una parte de union a ARN que interactua con el ARN dirigido a ADN; y (b) una parte de actividad que modula la transcripcion, donde dichos dicho contacto da como resultado una modulacion de transcripcion dentro del ADN objetivo. En algunos casos, aumenta la transcripcion dentro del ADN objetivo. En algunos casos, disminuye la transcripcion dentro del ADN objetivo.
Las caracteristicas de la presente descripcion incluyen un metodo de modification especifica al sitio en ADN objetivo, donde el metodo comprende: poner en contacto el ADN objetivo con: (i) un ARN dirigido a ADN o un polinucleotido de ADN que codifica a este, donde el ARN dirigido a ADN comprende: (a) un primer segmento que comprende una secuencia de nucleotidos que es complementaria a una secuencia en el ADN objetivo; y (b) un segundo segmento que interactua con un polipeptido modificador dirigido al sitio; y (ii) un polipeptido modificador dirigido al sitio o un polinucleotido que lo codifica, donde el polipeptido modificador dirigido al sitio comprende: (a) una parte de union a ARN que interactua con el ARN dirigido a ADN; y (b) una parte de actividad que modula la transcripcion, dentro del ADN objetivo. En algunos casos, el polipeptido modificador dirigido al sitio aumenta la transcripcion dentro del ADN objetivo. En algunos casos, el polipeptido modificador dirigido al sitio disminuye la transcripcion dentro del ADN objetivo.
Las caracteristicas de la presente descripcion incluyen un metodo para promover la escision especifica del sitio y la modificacion de un ADN objetivo en una celula, donde el metodo comprende introducir en la celula: (i) un ARN dirigido a ADN o un polinucleotido de ADN que codifica a este, donde el ARN dirigido a ADN comprende: (a) un primer segmento que comprende una secuencia de nucleotidos que es complementaria a una secuencia en el ADN objetivo; y (b) un segundo segmento que interactua con un polipeptido modificador dirigido al sitio; y (ii) un polipeptido modificador dirigido al sitio o un polinucleotido que lo codifica, donde el polipeptido modificador dirigido al sitio comprende: (a) una parte de union a ARN que interactua con el ARN dirigido a ADN; y (b) una parte de actividad que presenta actividad de nucleasa que crea una rotura de cadena doble en el ADN objetivo; donde el sitio de la rotura de cadena doble esta determinado por el ARN dirigido a ADN, el contacto tiene lugar en condiciones que permiten la reparation dirigida por homologia o recombination no homologa, y el ADN objetivo esta escindido y se vuelve a unir para producir una secuencia modificada de ADN. En algunos casos, el metodo comprende ademas poner en contacto el ADN objetivo con un polinucleotido donante, donde el polinucleotido donante, una parte del polinucleotido donante, una copia del polinucleotido donante o una parte de una copia del polinucleotido donante se integra al ADN objetivo. En algunos casos, el metodo no comprende poner en contacto la celula con el polinucleotido donante, donde el ADN objetivo se modifica de forma tal que los nucleotidos dentro del ADN objetivo son eliminados. En algunos casos, la celula se selecciona del grupo que consiste en: una celula arqueal, una celula bacteriana, una celula eucariota, un organismo eucariota unicelular, una celula somatica, una celula germinal, una celula madre, una celula vegetal, una celula de algas, una celula de animal, una celula de invertebrado, una celula de vertebrado, una celula de pez, una celula de rana, una celula de ave, una celula de mamifero, una celula de cerdo, una celula de vaca, una celula de cabra, una celula de oveja, una celula de roedor, una celula de rata, una celula de raton, una celula de primate no humano y una celula de humano. En algunos casos, la celula es in vitro. En algunos casos, la celula es in vivo.
Las caracteristicas de la presente descripcion incluyen un metodo para producir una celula modificada geneticamente en un sujeto, donde el metodo comprende: (I) Introducir en una celula: (i) un ARN dirigido a ADN o un polinucleotido de ADN que codifica a este, donde el ARN dirigido a ADN comprende: (a) un primer segmento que comprende una secuencia de nucleotidos que es complementaria a una secuencia en el ADN objetivo; y (b) un segundo segmento que interactua con un polipeptido modificador dirigido al sitio; y (ii) un polipeptido modificador dirigido al sitio o un polinucleotido que lo codifica, donde el polipeptido modificador dirigido al sitio comprende: (a) una parte de union a ARN que interactua con el ARN dirigido a ADN; y (b) una parte de actividad que presenta actividad de nucleasa que crea una rotura de cadena doble en el ADN objetivo; donde el sitio de la rotura de cadena doble esta determinado por el ARN dirigido a ADN, el contacto tiene lugar en condiciones que permiten la reparacion dirigida por homologia o recombinacion no homologa, y el ADN objetivo esta escindido y se vuelve a unir para producir una secuencia modificada de ADN, produciendo asi la celula modificada geneticamente; y (II) trasplantar la
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celula modificada geneticamente al sujeto. En algunos casos, el metodo comprende ademas poner en contacto la celula con un polinucleotido donante, donde el polinucleotido donante, una parte del polinucleotido donante, una copia del polinucleotido donante o una parte de una copia del polinucleotido donante se integra al ADN objetivo. En algunos casos, el metodo no comprende poner en contacto la celula con el polinucleotido donante, donde el ADN objetivo se modifica de forma tal que los nucleotidos dentro del ADN objetivo son eliminados. En algunos casos, la celula se selecciona del grupo que consiste en: una celula arqueal, una celula bacteriana, una celula eucariota, un organismo eucariota unicelular, una celula somatica, una celula germinal, una celula madre, una celula vegetal, una celula de algas, una celula de animal, una celula de invertebrado, una celula de vertebrado, una celula de pez, una celula de anfibio, una celula de ave, una celula de mamifero, una celula de ungulado, una celula de roedor, una celula de primate no humano y una celula de humano.
Las caracteristicas de la presente descripcion incluyen un metodo para modificar el ADN objetivo en una celula modificada geneticamente que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica un polipeptido modificador exogeno dirigido al sitio, donde el metodo comprende introducir en la celula modificada geneticamente un ARN dirigido a ADN o un polinucleotido de ADN que lo codifica, donde: (i) el ARN dirigido a ADN comprende: (a) un primer segmento que comprende una secuencia de nucleotidos que es complementaria a una secuencia en el ADN objetivo; y (b) un segundo segmento que interactua con un polipeptido modificador dirigido al sitio; y (ii) el polipeptido modificador dirigido al sitio que comprende: (a) una parte de union a ARN que interactua con el ARN dirigido a ADN; y (b) una parte de actividad que presenta actividad de nucleasa. En algunos casos, el polipeptido modificador dirigido al sitio comprende una secuencia de aminoacidos con al menos alrededor de 75 % de identidad de secuencia de aminoacidos con los aminoacidos 7-166 o 731-1003 de la secuencia de aminoacidos Cas9/Csn1 ilustrada en la Figura 3 o a las partes correspondientes en cualquiera de las secuencias de aminoacidos establecidas como SEQ ID NO: 1-256 y 795-1346. En algunos casos, la celula se selecciona del grupo que consiste en: una celula arqueal, una celula bacteriana, una celula eucariota, un organismo eucariota unicelular, una celula somatica, una celula germinal, una celula madre, una celula vegetal, una celula de algas, una celula de animal, una celula de invertebrado, una celula de vertebrado, una celula de pez, una celula de anfibio, una celula de ave, una celula de mamifero, una celula de ungulado, una celula de roedor, una celula de primate no humano y una celula de humano. En algunos casos, la celula es in vivo. En algunos casos, la celula es in vitro. En algunos casos, la expresion del polipeptido modificador dirigido al sitio esta bajo el control de un promotor inducible. En algunos casos, la expresion del polipeptido modificador dirigido al sitio esta bajo el control de un promotor especifico de tipo celular.
Las caracteristicas de la presente descripcion incluyen un kit que comprende: el ARN dirigido a ADN o un polinucleotido de ADN que lo codifica; y un reactivo para reconstitucion y/o dilucion. En algunos casos, el kit comprende ademas un reactivo que se selecciona del grupo que consiste en: un amortiguador para introducir en celulas el ARN dirigido a ADN, un amortiguador de lavado, un reactivo de control, un polinucleotido de ARN o vector de expresion de control, un reactivo para transcribir el ARN dirigido a ADN a partir del ADN y combinaciones de estos.
Las caracteristicas de la presente descripcion incluyen un kit que comprende: un polipeptido modificador dirigido al sitio de la presente descripcion o un polinucleotido de ADN que lo codifica; y un reactivo para reconstitucion y/o dilucion. En algunos casos, el kit comprende ademas un reactivo que se selecciona del grupo que consiste en: un amortiguador para introducir en celulas el polipeptido modificador dirigido al sitio, un amortiguador de lavado, un reactivo de control, un vector de expresion de control o polinucleotido de ARN, un reactivo para la produccion in vitro del polipeptido modificador dirigido al sitio a partir de ADN y combinaciones de estos.
Las caracteristicas de la presente descripcion incluyen un kit que comprende: un polipeptido modificador dirigido al sitio de la presente descripcion o un polinucleotido de ADN que lo codifica; y un reactivo para reconstitucion y/o dilucion. Las caracteristicas de la presente descripcion incluyen un kit que comprende: un aRn dirigido a ADN o un polinucleotido de ADN que lo codifica, donde el ARN dirigido a ADN comprende: (a) un primer segmento que comprende una secuencia de nucleotidos que es complementaria a una secuencia en un ADN objetivo; y (b) un segundo segmento que interactua con un polipeptido modificador dirigido al sitio; y (ii) el polipeptido modificador dirigido al sitio o un polinucleotido que lo codifica, donde el polipeptido modificador dirigido al sitio comprende: (a) una parte de union a ARN que interactua con el ARN dirigido a ADN; y (b) una parte de actividad que presenta una actividad enzimatica dirigida al sitio, donde el sitio de actividad enzimatica esta determinado por el ARN dirigido a ADN.
Las caracteristicas de la presente descripcion incluyen un kit que comprende: (i) un ARN dirigido a ADN o un polinucleotido de ADN que codifica a este, que comprende: (a) un primer segmento que comprende una secuencia de nucleotidos que es complementaria a una secuencia en un ADN objetivo; y (b) un segundo segmento que interactua con un polipeptido modificador dirigido al sitio; y (ii) el polipeptido modificador dirigido al sitio o un polinucleotido que lo codifica, que comprende: (a) una parte de union a ARN que interactua con el ARN dirigido a ADN; y (b) una parte de actividad que modula la transcripcion dentro del ADN objetivo, donde el sitio de transcripcion modulada dentro del ADN objetivo esta determinado por el ARN dirigido a ADN.
Las caracteristicas de la presente descripcion incluyen un kit que comprende: (i) cualquiera de los vectores de expresion recombinantes mencionados anteriormente; y (ii) un reactivo para la reconstitucion y/o dilucion. Las
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caracteristicas de la presente descripcion incluyen un kit que comprende: (i) cualquiera de los vectores de expresion recombinantes mencionados anteriormente; y (ii) un vector de expresion recombinante que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica un polipeptido modificador dirigido al sitio, donde el polipeptido modificador dirigido al sitio comprende: (a) una parte de union a ARN que interactua con el ARN dirigido a ADN; y (b) una parte de actividad que presenta una actividad enzimatica dirigida al sitio, donde el sitio de actividad enzimatica esta determinado por el ARN dirigido a ADN. Las caracteristicas de la presente descripcion incluyen un kit que comprende: (i) cualquiera de los vectores de expresion recombinantes mencionados anteriormente; y (ii) un vector de expresion recombinante que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica un polipeptido modificador dirigido al sitio, donde el polipeptido modificador dirigido al sitio comprende: (a) una parte de union a ARN que interactua con el ARN dirigido a ADN; y (b) una parte de actividad que modula la transcripcion dentro del ADN objetivo, donde el sitio de transcripcion modulada dentro del ADN objetivo esta determinado por el ARN dirigido a ADN.
Las caracteristicas de la presente descripcion incluyen un kit para el direccionamiento del ADN objetivo que comprende: dos o mas ARN dirigidos a ADN o polinucleotidos de ADN que los codifican, donde el primer segmento de al menos uno de los dos o mas ARN dirigidos a ADN difiere en al menos un nucleotido del primer segmento de al menos otro de los dos o mas ARN dirigidos a ADN.
Breve descripcion de las figuras
Las Figuras 1A-B proporcionan un dibujo esquematico de dos ejemplos de ARN dirigido a ADN de la invencion, cada uno asociado con un polipeptido modificador dirigido al sitio y con un ADN objetivo.
La Figura 2 ilustra la edicion de ADN objetivo a traves de roturas de ADN de cadena doble introducidas con un polipeptido modificador dirigido al sitio Cas9/Csn1 y un ARN dirigido a ADN.
Las Figuras 3A-B ilustran la secuencia de aminoacidos de una proteina Cas9/Csn1 de Streptococcus pyogenes (SEQ ID NO: 8). Cas9 tiene dominios homologos a las endonucleasas HNH y RuvC. (A) Los motivos 1-4 estan sobrerrayados (B) Los dominios 1 y 2 estan sobrerrayados.
Las Figuras 4A-B ilustran la identidad porcentual entre las proteinas Cas9/Csn1 de multiples especies. (A) Identidad de secuencia relativa a Streptococcus pyogenes. Por ejemplo, el Dominio 1 son los aminoacidos 7-166 y el Dominio 2 son los aminoacidos 731-1003 de Cas9/Csn1 de Streptococcus pyogenes tal como se ilustra en la Figura 3B. (B) Identidad de secuencia relativa a Neisseria meningitidis. Por ejemplo, el Dominio 1 son los aminoacidos 13-139 y el Dominio 2 son los aminoacidos 475-750 de Cas9/Csn1 de Neisseria meningitidis (SEQ ID NO: 79).
La Figura 5 ilustra un alineamiento de multiples secuencias de los motivos 1-4 de proteinas Cas9/Csn1 de varias especies diversas seleccionadas de la tabla filogenetica de la Figura 32 (vease la Figura 32, la Figura 3A y la Tabla 1) (Streptococcus pyogenes (SEQ ID NO: 8), Legionella pneumophila (SEQ ID NO: 17), Gamma proteobacterium (SEQ ID NO: 107), Listeria innocua (SeQ ID NO: 3), Lactobacillus gasseri (SEQ ID NO: 152), Eubacterium rectale (SEQ ID NO: 99), Staphylococcus lugdunensis (SEQ ID NO: 185), Mycoplasma synoviae (SEQ ID NO: 22), Mycoplasma mobile (SEQ ID NO: 16), Wolinella succinogenes (SEQ ID NO: 10), Flavobacterium columnare (SEQ ID NO: 235), Fibrobacter succinogenes (SEQ ID NO: 121), Bacteroides fragilis (SEQ ID NO: 21), Acidothermus cellulolyticus (SEQ ID NO: 42) y Bifidobacterium dentium (SEQ ID NO: 131).
Las Figuras 6A-B proporcionan alineamientos de secuencias de tracrRNA de origen natural ("ARN activador") de varias especies (l. innocua (SEQ ID NO: 268); S. pyogenes (SEQ ID NO: 267); S. mutans (SeQ ID NO: 269); S. thermophilus1 (SEQ ID NO: 270); M. mobile (SEQ ID NO: 274); N. meningitides (SEQ ID NO: 272); P. multocida (SEQ ID NO: 273); S. thermophilus2 (SEQ ID NO: 271); y S. pyogenes (SEQ ID NO: 267). (A) alineamiento de multiples secuencias de ortologos seleccionados de tracrRNA (AlignX, VectorNTI package, Invitrogen) asociados con locus CRISPR/Cas de arquitectura similar y secuencias Cas9/Csn1 muy similares. Los recuadros negros representan nucleotidos compartidos (B) alineamiento de multiples secuencias de ortologos seleccionados de tracrRNA (AlignX, VectorNTI package, Invitrogen) asociados con locus CRISPR/Cas de arquitectura diferente y secuencias Cas9/Csn1 no relacionadas de forma cercana. Notese la similitud de la secuencia de los ortologos de tracrRNA de N. meningitidis y P. multocida. Los recuadros negros representan nucleotidos compartidos. Para mas ejemplos de secuencia de ARN activador, veanse las SEQ ID NO: 431-562. Las Figuras 7A-B proporcionan alineamientos de secuencias de segmentos formadores de duplex de crRNA ("ARN identificador") de origen natural de varias especies (L. innocua (SEQ ID NO://); S. pyogenes (SEQ ID NO://); S. mutans (SEQ ID NO://); S. thermophilus1 (SEQ ID NO://); C. jejuni (SEQ ID NO://); S. pyogenes (SEQ ID NO://); F. novicida (SEQ ID NO://); M. mobile (SEQ ID NO://); N. meningitides (SEQ ID NO://); P. multocida (SEQ ID NO://); y S. thermophilus2 (SEQ ID NO://). (A) multiples alineamientos de secuencias de ejemplos de secuencias de segmentos formadores de duplex de ARN identificador (AlignX, VectorNTI package, Invitrogen) asociadas con los locus de arquitectura similar y secuencias Cas9/Csn1 muy similares. (B) Multiples alineamientos de secuencias de ejemplos de secuencias de segmentos formadores de duplex de ARN identificador (AlignX, VectorNTI package, Invitrogen) asociadas con los locus de arquitectura diferente y diversas secuencias Cas9. Los recuadros negros representan nucleotidos compartidos. Para mas ejemplos de secuencias de segmentos formadores de duplex de ARN identificador, veanse las SEQ ID NO: 563-679.
La Figura 8 proporciona una vista esquematica de la hibridacion para segmentos formadores de duplex de origen natural del crRNA ("ARN identificador") con el segmento formador de duplex del ortologo correspondiente de tracrRNA ("ARN activador"). Secuencia superior, ARN identificador; secuencia inferior, segmento formador de
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duplex del ARN activador correspondiente. Los locus de CRISPR pertenecen al sistema CRISPR/Cas de Tipo II (Nmeni/CASS4). La nomenclatura es conforme a la base de datos de CRISPR (CRISPR DB). S. pyogenes (SeQ ID NO:// y //); S. mutans (SEQ ID NO:// y //); S. thermophilus1 (SEQ ID NO:// y //); S. thermophilus2 (SEQ ID NO:// y //); L. innocua (SEQ ID NO:// y //); T. denticola (SEQ ID NO:// y //); N. meningitides (SEQ ID NO:// y //); S. gordonii (SEQ ID NO:// y //); B. bifidum (SEQ ID NO:// y //); L salivarius (SEQ ID NO:// y //); F. tularensis (SEQ ID NO:// y //); y L. pneumophila (SEQ ID NO:// y //). Notese que algunas especies contienen cada una dos locus de CRISPR de Tipo II. Para mas ejemplos de secuencia de ARN activador, veanse las SEQ ID NO: 431-562. Para mas ejemplos de secuencias de segmentos formadores de duplex de ARN identificador, veanse las SEQ ID NO: 563-679.
La Figura 9 ilustra ejemplos de secuencias de tracrRNA (ARN activador) y crRNA (ARN identificador) de dos especies. Existe un grado de intercambiabilidad; por ejemplo, la proteina Cas9/Csn1 de S.pyogenes es funcional con tracrRNA y crRNA derivado de L. innocua. (|) denota un par de bases canonico Watson-Crick, mientras que (•) denota un par de bases Wobble G-U. "20 nt variables" o "20 nt" representa el segmento dirigido a ADN que es complementario a un ADN objetivo (esta region puede tener hasta alrededor de 100 nt de longitud). Tambien se muestra el diseno de ARN dirigido a ADN de molecula simple que incorpora caracteristicas del ARN identificador y del ARN activador. (Las secuencias de proteinas Cas9/Csn1 de una gran variedad de especies se ilustran en la Figura 3 y se establecen como SEQ ID NO: 1-256 y 795-1346) Streptococcus pyogenes: de arriba hacia abajo: (SEQ ID NO://, //, //); Listeria innocua: de arriba hacia abajo: (SEQ ID NO://, //, //). Las secuencias proporcionadas son ejemplos no taxativos y su proposito es ilustrar como pueden disenarse ARN dirigidos a ADN de molecula simple y de molecula doble con base en secuencias que existen naturalmente en una gran variedad de especies. Varios ejemplos de secuencias adecuadas de una gran variedad de especies se establecen de la siguiente manera (proteina Cas9: SEQ ID NO: 1-259; tracrRNA: SEQ ID NO: 431-562, o sus complementos; crRNA: SEQ ID NO: 563-679, o sus complementos; y ejemplos de ARN dirigidos a ADN de molecula simple: SEQ ID NO: 680-682).
Las Figuras 10A-E muestran que Cas9 es una endonucleasa de ADN guiada por dos moleculas de ARN. Figura E (de arriba hacia abajo, SEQ ID NO: 278-280, y //).
Las Figuras 11A-B demuestran que Cas9 usa dos dominios nucleasa para escindir las dos cadenas en el ADN objetivo.
Las Figuras 12A-E ilustran que la escision catalizada por Cas9 del ADN objetivo requiere un dominio activador en tracrRNA y esta regida por una secuencia semilla en el crRNA. Figura 12C (de arriba hacia abajo, SEQ ID NO: 278-280 y //); Figura 12D (de arriba hacia abajo, SEQ ID NO: 281-290; y Figura 12E (de arriba hacia abajo, SEQ ID NO: 291-292, 283, 293-298).
Las Figuras 13A-C muestran que se necesita un PAM para permitir la escision de ADN objetivo por el complejo Cas9-tracrRNA:crRNA.
Las Figuras 14A-C ilustran que Cas9 puede ser programada utilizando una unica molecula de ARN modificada que combina caracteristicas de tracrRNA y crRNA. Quimera A (SEQ ID NO: 299); Quimera B (SEQ ID NO: 300). La Figura 15 ilustra la via inmunitaria CRISPR/Cas mediada por ARN de Tipo II.
Las Figuras 16A-B ilustran la purificacion de nucleasas Cas9.
Las Figuras 17A-C muestran que la Cas9 guiada por tracrRNA:crRNA dual escinde el plasmido protoespaciador y ADN de oligonucleotidos. Figura 17B (de arriba hacia abajo, SEQ ID NO: 301-303 y //); y Figura 17C (de arriba hacia abajo, SEQ ID NO: 304-306 y //).
Las Figuras 18A-B muestran que Cas9 es una endonucleasa dependiente de Mg2+ con actividad exonucleasa 3'-5'.
Las Figuras 19A-C ilustran que la escision de Cas9 dirigida por tracrRNA:crRNA dual de ADN objetivo es especifica al sitio. Figura 19C (de arriba hacia abajo, SEQ ID NO: 307-309, //, 337-339 y //).
Las Figuras 20A-B ilustran que la escision de Cas9 dirigida por tracrRNA:crRNA dual de ADN objetivo es rapida y eficiente.
Las Figuras 21A-B muestran que el dominio similar a RuvC y HNH de Cas9 dirigen la escision de las cadenas de ADN complementarias y no complementarias, respectivamente.
La Figura 22 demuestra que se necesita tracrRNA para el reconocimiento de ADN objetivo.
Las Figuras 23A-B muestran que una region minima de tracrRNA es capaz de guiar la escision dirigida por tracrRNA:crRNA dual de ADN objetivo.
Las Figuras 24A-D demuestran que la escision de ADN objetivo guiada por tracrRNA:crRNA dual mediante Cas9 puede ser especifica para las especies.
Las Figuras 25A-C muestran que una secuencia semilla en el crRNA rige la escision dirigida al tracrRNA:crRNA dual de ADN objetivo mediante Cas9. Figura 25A: sonda 1 de ADN objetivo (SEQ ID NO: 310); espaciador 4 de crRNA (1-42) (SEQ ID NO: 311); tracrRNA (15-89) (SEQ ID NO: //). Figura 25B panel izquierdo (SEQ ID NO: 310).
Las Figuras 26A-C demuestran que la secuencia PAM es esencial para la escision de ADN de plasmido protoespaciador mediante Cas9-tracrRNA:crRNA y para la interferencia de plasmido de ADN mediada por Cas9 en celula bacterianas. Figura 26B (de arriba hacia abajo, SEQ ID NO: 312-314 y //); y Figura 26C (de arriba hacia abajo, SEQ ID NO: 315-320).
Las Figuras 27A-C muestran que la Cas9 dirigida por un unico ARN quimerico que imita al tracrRNA:crRNA dual escinde al ADN protoespaciador. Figura 27C (de arriba hacia abajo, sEq ID NO: 321-324).
Las Figuras 28A-D ilustran el diseno de novo de ARN quimericos dirigidos hacia la secuencia genica de la Proteina Verde Fluorescente (GFP, por sus siglas en ingles). Figura 28B (de arriba hacia abajo, SEQ ID NO:
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325-326). Figura 28C: Secuencia objetivo de GFP1 (SEQ ID NO: 327); secuencia objetivo de GFP2 (SEQ ID NO: 328); secuencia objetivo de GFP3 (SeQ ID NO: 329); secuencia objetivo de GFP4 (SeQ ID NO: 330); secuencia objetivo de GFP5 (SEQ ID NO: 331); ARN quimerico de GFP1 (SEQ ID NO: 332); ARN quimerico GFP2 (SEQ ID NO: 333); ARN quimerico de GFP3 (SEQ ID NO: 334); ARN quimerico de GFP4 (SEQ ID NO: 335); ARN quimerico de GFP5 (SEQ ID NO: 336).
Las Figuras 29A-E demuestran que la coexpresion de Cas9 y ARN guia en celulas humanas genera roturas de ADN de cadena doble en el locus objetivo. Figura 29C (de arriba hacia abajo, SEQ ID NO: 425-428).
Las Figuras 30A-B demuestran que los lisados celulares contienen Cas9:ARNsg y brindan soporte a la escision de ADN especifica del sitio.
Las Figuras 31A-B demuestran que la extension 3' de las construcciones ARNsg aumenta la mutagenesis especifica del sitio mediada por NHEJ. Figura 31A (de arriba hacia abajo, SEQ ID NO: 428-430).
Las Figuras 32A-B ilustran un arbol filogenico de secuencias representativas de Cas9 de varios organismos (A), asi como arquitecturas del locus del Cas9 para los grupos principales del arbol (B).
Las figuras 33A-E ilustran la arquitectura de CRISPR-Cas de tipo II de especies bacterianas seleccionadas.
Las Figuras 34A-B ilustran el coprocesamiento de tracrRNA y pre-crRNA en sistemas de tipo II de CRISPR Cas seleccionados. Figura 34A (de arriba hacia abajo, SEQ ID NO: //,//,//,//,//,//,//,//); Figura 34B (de arriba hacia abajo, SEQ ID NO: //,//,//,//).
La Figura 35 ilustra un alineamiento de secuencias de ortologos de tracrRNA que demuestra la diversidad de secuencias tracrRNA.
Las Figuras 36A-F muestran la expresion de ortologos de tracrRNA y crRNA bacterianos revelados mediante secuenciacion profunda de ARN.
Las Figuras 37A-O listan todos los ortologos de tracrRNA y crRNA maduros recuperados mediante secuenciacion para especies bacterianas estudiadas, incluyendo las coordenadas (region de interes) y secuencias de ADNc correspondientes (5' a 3').
Las Figuras 38 A-B presentan una tabla de especies bacterianas que contienen locus de CRISPR-Cas del tipo II caracterizados por la presencia del gen de firma cas9. Estas secuencias se usaron para analisis filogenetico.
Las Figuras 39 A-B muestran el diseno del sistema de interferencia de CRISPR (CRISPRi, por sus siglas en ingles).
Las Figuras 40 A-E demuestran que CRISPRi silencia eficazmente la elongacion e inicio de la transcripcion.
Las Figuras 41 A-B demuestran que CRISPRi funciona al bloquear la elongacion de la transcripcion.
Las Figuras 42 A-C demuestran la especificidad de direccionamiento del sistema CRISPRi.
Las Figuras 43 A-F muestran la caracterizacion de factores que afectan la eficacia de silenciamiento.
Las Figuras 44 A-C muestran el perfil funcional de una red reguladora de complejo usando la inactivacion genetica CRISPRi.
Las Figuras 45 A-B demuestran el silenciamiento genico usando CRISPRi en celulas de mamifero.
La Figura 46 muestra el mecanismo del sistema CRISPR tipo II a partir de S. pyogenes.
Las Figuras 47 A-B muestran las curvas de crecimiento de cultivos celulares de E. coli cotransformados con dCas9 y sgRNA.
La Figura 48 muestra que CRISPRi puede silenciar la expresion de un gen indicador en un plasmido de multiples copias.
Las Figuras 49 A-C muestran los datos de secuenciacion de ARN de celulas con ARNsg que se dirigen a diferentes genes.
Las Figuras 50 A-E muestran los efectos del silenciamiento de ARNsg con mal apareamientos dobles adyacentes.
Las Figuras 51 A-C muestran los efectos del silenciamiento combinatorio de usar dos ARNsg para regular un solo gen.
La Figura 52 muestra que la represion de ARNsg depende de los locus objetivo y la distancia relativa desde el inicio de la transcripcion.
Las Figuras 53 A-C muestran resultados experimentales que demuestran que una variante del polipeptido dirigido al sitio Cas9 (dCas9) funciona para los metodos de la presente cuando dCas9 tiene actividad reducida unicamente en el dominio RuvCI unicamente (por ejemplo, Dl0A), unicamente el dominio HNH (por ejemplo, H840A) o ambos dominios (por ejemplo, D10A y H840A).
Las Figuras 54 A-C enumeran ejemplos de companeros de fusion adecuados (o fragmentos de estos) para una variante del polipeptido dirigido al sitio Cas9 de la presente. Los ejemplos incluyen, de modo no taxativo, los enumerados.
Las Figuras 55 A-D demuestran que un polipeptido quimerico dirigido al sitio puede usarse para activar (aumentar) la transcripcion en celulas humanas.
La Figura 56 demuestra que un polipeptido quimerico dirigido al sitio puede usarse para reprimir (disminuir) la transcripcion en celulas humanas.
Las Figuras 57A-B demuestran que las secuencias artificiales que comparten aproximadamente 50 % de identidad con tracrRNA y crRNA de origen natural pueden funcionar con Cas9 para escindir ADN objetivo siempre que la estructura del dominio de union a proteinas del ARN dirigido a ADN se conserve.
Definiciones - parte i
Los terminos "polinucleotido" y "acido nucleico", que se utilizan de manera intercambiable en la presente, se refieren
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a una forma polimerica de nucleotidos de cualquier longitud, ya sean ribonucleotidos o desoxirribonucleotidos. Por lo tanto, este termino incluye, de modo no taxativo, ADN o ARN de cadena simple, doble o multiple, ADN genomico, ADNc, hibridos de ADN-ARN o un polimero que comprende bases de purina y pirimidina u otras bases de nucleotidos naturales, modificadas quimica o biologicamente, no naturales o derivados. "Oligonucleotido" se refiere generalmente a polinucleotidos de entre alrededor de 5 y alrededor de 100 nucleotidos de ADN de cadena simple o doble. Sin embargo, para los fines de esta descripcion, no hay un limite superior para la longitud de un oligonucleotido. Los oligonucleotidos se conocen tambien como "oligomeros" u "oligos" y pueden aislarse a partir de genes, o sintetizarse quimicamente mediante metodos conocidos en la tecnica. Los terminos "polinucleotido" y "acido nucleico" deberian entenderse como que incluyen, segun pueda ser aplicable a las modalidades descritas, polinucleotidos de cadena simple (tal como sentido o antisentido) y de cadena doble.
Una "estructura de tallo-bucle" se refiere a un acido nucleico que tiene una estructura secundaria que incluye una region de nucleotidos que se sabe o se predice que formaran una cadena doble (parte escalonada) que esta unida en un lado por una region de nucleotidos predominantemente de cadena simple (parte de bucle). Los terminos estructuras de "horquilla" y "pliegue" tambien se usan en la presente para referirse a estructuras de tallo-bucle. Dichas estructuras son conocidas en la tecnica y estos terminos se usan de manera consistente con sus significados conocidos en la tecnica. Como se conoce en la tecnica, una estructura de tallo-bucle no necesita pares de bases exactos. Por lo tanto, el tallo puede incluir uno o mas mal apareamientos de bases. De manera alternativa, la formacion de pares de bases puede ser exacta, es decir, no incluir ningun mal apareamiento.
Mediante el uso de los terminos "hibridable" o "complementario" se implica que un acido nucleico (por ejemplo, ARN) comprende una secuencia de nucleotidos que le permiten unirse de manera no covalente, es decir, formar pares de bases Watson-Crick y/o pares de bases G/U, "aparearse" o "hibridarse" con otro acido nucleico en una manera especifica de secuencia, antiparalela (es decir, un acido nucleico especificamente se una a un acido nucleico complementario) en condiciones in vitro y/o in vivo adecuadas de temperatura y potencia ionica de la solucion. Como se conoce en la tecnica, los pares de bases Watson-Crick estandares incluyen: adenina (A) formando un par con timidina (T), adenina (A) formando un par con uracilo (U) y guanina (G) formando un par con citosina (C) [ADN, ARN]. Ademas, se conoce en la tecnica que para la hibridacion entre dos moleculas de ARN (por ejemplo, ARNcd), guanina (G) forma pares de bases con uracilo (U). Por ejemplo, los pares de bases G/U son parcialmente responsables por la degeneracion (es decir, redundancia) del codigo genetico en el contexto de formacion de pares de bases anti-codon de ARNt con codones en ARNm. En el contexto de esta descripcion, una guanina (G) de un segmento de union a proteinas (duplex de ARNcd) de una molecula de ARN dirigido a ADN de la invencion se considera complementaria a un uracilo (U), y viceversa. Como tal, cuando puede realizarse un par de bases G/U en una posicion de nucleotido determinada, un segmento de union a proteinas (duplex de ARNcd) de una molecula de ARN dirigido a ADN de la invencion, la posicion no se considera no complementaria, sino que se considera complementaria.
Las condiciones de hibridacion y lavado son conocidas y se ejemplifican en Sambrook, J., Fritsch, E. F. y Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edicion, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (1989), particularmente el Capitulo 11 y la Tabla 11.1 de este; y Sambrook, J. y Russell, W., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Tercera Edicion, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (2001). Las condiciones de temperatura y potencia ionica determinan la "rigurosidad" de la hibridacion.
La hibridacion requiere que los dos acidos nucleicos contengan secuencias complementarias, aunque son posibles los mal apareamientos entre bases. Las condiciones adecuadas para la hibridacion entre los dos acidos nucleicos dependen de la longitud de los acidos nucleicos y del grado de complementacion, variables que son conocidas en la tecnica. Cuanto mayor el grado de complementacion entre los dos acidos nucleicos, mayor sera el valor de temperatura de fusion (Tf) para los hibridos de acidos nucleicos que tienen esas secuencias. Para las hibridaciones entre acidos nucleicos con extensiones cortas de complementariedad (por ejemplo, complementariedad de 35 nucleotidos o menos, 30 o menos, 25 o menos, 22 o menos, 20 o menos, o 18 o menos) la posicion de los mal apareamientos se vuelve importante (vease Sambrook et al., supra, 11.7-11.8). normalmente, la longitud de un acido nucleico hibridable es de al menos alrededor de 10 nucleotidos. Las longitudes minimas ilustrativas para un acido nucleico hibridable son: al menos alrededor de 15 nucleotidos; al menos alrededor de 20 nucleotidos; al menos alrededor de 22 nucleotidos; al menos alrededor de 25 nucleotidos; y al menos alrededor de 30 nucleotidos. Ademas, el experto en la tecnica reconocera que la temperatura y la concentracion de sal en solucion de lavado pueden ajustarse segun sea necesario de acuerdo con factores tal como longitud de la region de complementacion y el grado de complementacion.
Se entiende en la tecnica que la secuencia de polinucleotidos no necesita ser 100 % complementaria a la de su acido nucleico objetivo para ser especificamente hibridable o hibridable. Ademas, un polinucleotido puede hibridarse en uno o mas segmentos, de manera que los segmentos intervinientes o adyacentes no se vean implicados en el evento de hibridacion (por ejemplo, una estructura de bucle, o estructura de horquilla). Un polinucleotido puede comprender al menos 70 %, al menos 80 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 99 % o 100 % complementariedad de secuencia con una region objetivo dentro de la secuencia de acido nucleico objetivo a la cual se dirige. Por ejemplo, un acido nucleico antisentido en el que 18 de 20 nucleotidos del compuesto antisentido son complementarias a una region objetivo y que, por lo tanto, se hibridarian de manera especifica, representarian un 90
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por ciento de complementariedad. En este ejemplo, los nucleotidos no complementarios restantes pueden ser agrupados o intercalados con nucleotidos complementarios y no necesitan ser contiguos entre si o ser nucleotidos complementarios. El porcentaje de complementariedad entre extensiones particulares de secuencias de acido nucleico dentro de acidos nucleicos puede ser determinado de forma rutinaria utilizando programas BLAST (herramientas de busqueda de alineamiento local basica) y programas PowerBLAST conocidos en la tecnica (Altschul et al., J. Mol. Biol., 1990, 215, 403-410; Zhang and Madden, Genome Res., 1997, 7, 649-656) o mediante el programa Gap (paquete de analisis de secuencia de Wisconsin, Version 8 para Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison Wis.) con ajustes por defecto, que utiliza el algoritmo de Smith y Waterman (Adv. Appl. Math., 1981,2, 482-489).
Los terminos "peptido", "polipeptido" y "proteina", se usan de manera intercambiable en la presente y se refieren a una forma polimerica de aminoacidos de cualquier longitud, que puede incluir aminoacidos codificados y no codificados, aminoacidos modificados quimica o bioquimicamente o derivados y polipeptidos que tienen cadenas principales de peptido modificadas.
"Union", tal como se usa en la presente (por ejemplo, en referencia a un dominio de union de ARN de un polipeptido) se refiere a una interaccion no covalente entre macromoleculas (por ejemplo, entre una proteina y un acido nucleico). Mientras que estan en un estado de interaccion no covalente, se dice que las macromoleculas estan "asociadas" o que "interactuan" o estan "unidas" (por ejemplo, cuando una molecula X se dice que interactua con una molecula Y, quiere decir que la molecula X se une a la molecula Y en una manera no covalente). No todos los componentes de una interaccion de union necesitan ser especificos de secuencia (por ejemplo, contacto con residuos de fosfato en una estructura de ADN), pero algunas partes de una interaccion de union pueden ser especificas de la secuencia. Las interacciones de union estan caracterizadas en general mediante una constante de disociacion (Kd) de menos de 10-6 M, menos de 10-7 M, menos de 10-8 M, menos de 10-9 M, menos de 10-10 M, menos de 10-11 M, menos de 10-12 M, menos de 10-13 M, menos de 10-14 M o menos de 10-15 M. "Afinidad" se refiere a la potencia de union, una afinidad de union aumentada se correlaciona con una Kd menor.
"Dominio de union de union" significa un dominio de proteinas que es capaz de unirse de manera no covalente a otra molecula. Un dominio de union puede unirse a, por ejemplo, una molecula de ADN (una proteina de union a ADN), una molecula de ARN (una molecula de union a ARN) y/o una molecula de proteina (una proteina de union a proteina). En el caso de una proteina de union al dominio de proteinas, puede unirse a si misma (para formar homodimeros, homotrimeros, etc.) y/o puede unirse a una o mas moleculas de una proteina o proteinas diferentes.
El termino "sustituciones de aminoacidos conservadoras" se refiere al caracter intercambiable de las proteinas de residuos de aminoacidos que tienen cadenas laterales similares. Por ejemplo, un grupo de aminoacidos que tiene cadenas laterales alifaticas consiste en glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; un grupo de aminoacidos que tiene cadenas laterales hidroxialifaticas consiste en serina y treonina; un grupo de aminoacidos que tiene cadenas laterales que contienen amidas consiste en asparagina y glutamina; un grupo de aminoacidos que tiene cadenas laterales aromaticas consiste en fenilalanina, tirosina y triptofano; un grupo de aminoacidos que tiene cadenas laterales basicas consiste en lisina, arginina e histidina; un grupo de aminoacidos que tiene cadenas laterales acidas consiste en glutamato y aspartato; y un grupo de aminoacidos que tiene cadenas laterales que contienen azufre consiste en cisteina y metionina. Los ejemplos de grupos de sustitucion de aminoacidos conservadores son: valina- leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina y asparagina-glutamina.
Un polinucleotido o polipeptido tiene un determinado porcentaje de "identidad de secuencia" con respecto a otro polinucleotido o polipeptido, lo que significa que, cuando se encuentra alineado, ese porcentaje de bases o aminoacidos son los mismos y estan en las mismas posiciones relativas cuando se comparan las dos secuencias. La identidad de secuencia se puede determinar de una cantidad de maneras diferentes. Para determinar la identidad de secuencia, las secuencias pueden alinearse usando varios metodos y programas informaticos (por ejemplo, BLAST, T-COFFEE, MUSCLE, MAFFT, etc.), disponibles en la web en sitios que incluyen ncbi.nlm.nili.gov/BLAST, ebi.ac.uk/Tools/msa/tcoffee/, ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle/, mafft.cbrc.jp/alignment/software/. Vease, por ejemplo, Altschul et al. (1990), J. Mol. Bioi. 215:403-10.
Una secuencia de ADN que "codifica" un ARN particular es una secuencia de acido nucleico de ADN que se transcribe en ARN. Un polinucleotido de ADN puede codificar un ARN (ARNm) que se traduce en proteina, o un polinucleotido de ADN puede codificar un ARN que no se traduce en una proteina (por ejemplo, ARNt, ARNr o un ARN dirigido a ADN; tambien llamado ARN "no codificante" o "ncRNA" (por sus siglas en ingles)).
Una "secuencia codificante de proteinas" o una secuencia que codifica una proteina o polipeptido en particular, es una secuencia de acido nucleico que se transcribe en ARNm (en el caso de ADN) y se traduce (en el caso de ARNm) en un polipeptido in vitro o in vivo cuando se encuentra bajo el control de secuencias regulatorias apropiadas. Los limites de la secuencia codificante estan determinados por un codon de inicio en el extremo 5' (extremo N) y un codon de terminacion de la traduccion antisentido en el extremo 3' (extremo C). Una secuencia codificante puede incluir, de modo no taxativo, ADNc de ARNm procariota o eucariota, secuencias de ADN genomico de ADN procariota o eucariota, y acidos nucleicos sinteticos. Una secuencia de terminacion de transcripcion en general se encontrara usualmente situada en 3' con respecto a la secuencia de codificacion.
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Tal como se usa en la presente, una “secuencia promotora” es una region reguladora de ADN que puede unirse a la ARN polimerasa e iniciar la transcripcion de una secuencia codificante o no codificante posterior (direccion 3'). Con fines de definir la presente invencion, la secuencia promotora esta delimitada en su extremo 3' mediante el sitio de inicio de la transcripcion y se extiende hacia atras (direccion 5') para incluir la cantidad minima de bases o elementos necesarios para iniciar la transcripcion en niveles detectables por encima del valor registrado. Dentro de la secuencia promotora se encontrara un sitio de inicio de la transcripcion, asi como dominios de union a proteinas responsables por la union de ARN polimerasa. Los promotores eucariotas a menudo, pero no siempre, contendran "cajas TATA" y "cajas CAT". Varios promotores, incluidos los promotores inducibles, pueden usarse para impulsar varios vectores de la presente invencion.
Un promotor puede ser un promotor constitutivamente activo (es decir, un promotor que esta de manera constitutiva en un estado activo/"ENCENDIDO"), puede ser un promotor inducible (es decir, un promotor cuyo estado, activo/"ENCENDIDO" o inactivo/"APAGADO", es controlado mediante un estimulo externo, por ejemplo, la presencia de una temperatura, compuesto o proteina en particular), puede ser un promotor restringido espacialmente (es decir, elemento de control transcripcional, potenciador, etc.) (por ejemplo, potenciador especifico de tejido, potenciador especifico del tipo celular, etc.), y puede ser un promotor restringido temporalmente (es decir, el promotor esta en el estado "ENCENDIDO" o el estado "APAGADO" durante etapas especificas del desarrollo embrionario o durante etapas especificas de un proceso biologico, por ejemplo, ciclo de foliculo capilar en ratones).
Los promotores adecuados puede derivar de virus y pueden, por lo tanto, ser mencionados como promotores virales, o pueden derivar de cualquier organismo, incluidos organismos procariotas o eucariotas. Los promotores adecuados pueden usarse para impulsar la expresion mediante cualquier ARN polimerasa (por ejemplo, pol I, pol II, pol III). Los ejemplos de promotores incluyen, de modo no taxativo, el promotor temprano SV40, el promotor de repeticion terminal larga (LTR, por sus siglas en ingles) del virus de tumor mamario en ratones; el promotor tardio principal del adenovirus (Ad MLP); un promotor del virus del herpes simple (VHS), un promotor del citomegalovuris (CMV) tal como la region del promotor temprano inmediato de CMV (CMVIE, por sus siglas en ingles), un promotor del virus del sarcoma de rous (VSR), un promotor nuclear pequeno U6 humano (U6) (Miyagishi et al., Nature Biotechnology 20, 497 - 500 (2002)), un promotor de U6 mejorado (por ejemplo, Xia et al., Nucleic Acids Res. 2003 Sep 1 ;31 (17)), un promotor de H1 humano (HI), y similares.
Los ejemplos de promotores inducibles incluyen, de modo no taxativo, promotor de la ARN polimerasa T7, promotor de la ARN polimerasa T3, promotor regulado por isopropil-beta-D-tiogalactopiranosido (IPTG), promotor inducido por lactosa, promotor del choque termico, promotor regulado por tetraciclina, promotor regulado por esteroides, promotor regulado por metales, promotor regulado por el receptor de estrogenos, etc. Los promotores inducibles pueden, por lo tanto, regularse mediante moleculas que incluyen, de modo no taxativo, doxociclina; ARN polimerasa, por ejemplo, ARN polimerasa T7; un receptor de estrogeno; una fusion del receptor de estrogeno; etc.
En algunas modalidades, el promotor es un promotor restringido espacialmente (es decir, promotor especifico del tipo de celula, promotor especifico de tejido, etc.) de manera que en un organismo multicelular el promotor este activo (es decir, "ENCENDIDO") en un subconjunto de celulas especificas. Los promotores restringidos espacialmente tambien pueden mencionarse como potenciadores, elementos de control transcripcional, secuencias de control, etc. Cualquier promotor restringido espacialmente conveniente puede usarse y la eleccion del promotor adecuado (por ejemplo, un promotor especifico del cerebro, un promotor que impulsa la expresion en un subconjunto de neuronas, un promotor que impulsa la expresion en la linea germinal, un promotor que impulsa la expresion en los pulmones, un promotor que impulsa la expresion en los musculos, un promotor que impulsa la expresion en celulas del islote del pancreas, etc.) dependera del organismo. Por ejemplo, se conocen varios promotores restringidos espacialmente para plantas, moscas, gusanos, mamiferos, ratones, etc. Por lo tanto, un promotor restringido espacialmente puede usarse para regular la expresion de un acido nucleico que codifica un polipeptido modificador dirigido al sitio de la invencion en una amplia variedad de tejidos y tipos de celulas diferentes, dependiendo del organismo. Algunos promotores restringidos espacialmente tambien estan temporalmente restringidos de manera que el promotor este en el estado "ENCENDIDO" o el estado "APAGADO" durante etapas especificas del desarrollo embrionario o durante etapas especificas de un proceso biologico (por ejemplo, ciclo folicular capilar en ratones).
Con fines ilustrativos, los ejemplos de promotores restringidos espacialmente incluyen, de modo no taxativo, promotores especificos de neuronas, promotores especificos de adipocitos, promotores especificos de cardiomiocitos, promotores especificos del musculo liso, promotores especificos de fotorreceptores, etc. Los promotores restringidos espacialmente especificos de neuronas incluyen, de modo no taxativo, promotor de enolasa especifico de neuronas (nSe, por sus siglas en ingles) (veanse, por ejemplo, EMBL HSENO2, X51956); un promotor aminoacido aromatico descarboxilasa (AADC, por sus siglas en ingles); un promotor de neurofilamentos (vease, por ejemplo, GenBank HUMNFL, L04147); un promotor de sinapsina (vease, por ejemplo, GenBank HUMSYNIB, M55301); un promotor de thy-1 (vease, por ejemplo, Chen et al. (1987) Cell 51:7-19; y lewellyn, et al. (2010) Nat. Med. 16(10):1161-1166); un promotor del receptor de serotonina (vease, por ejemplo, GenBank S62283); un promotor de tirosina hidroxilasa (TH) (vease, por ejemplo, Oh et al. (2009) Gene Ther 16:437; Sasaoka et al. (1992) Mol. Brain Res. 16:274; Boundy et al. (1998) J. Neurosci. 18:9989; y Kaneda et al. (1991) Neuron 6:583-594); un promotor de GnRH (vease, por ejemplo, Radovick et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:3402-3406); un
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promotor de L7 (vease, por ejemplo, Oberdick et al. (1990) Science 248:223-226); un promotor de DNMT (vease, por ejemplo, Bartge et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:3648-3652); un promotor de encefalina (vease, por ejemplo, Comb et al. (1988) EMBO J. 17:3793-3805); un promotor de la proteina basica de mielina (PBM); un promotor de la proteina cinasa II-alfa dependiente de Ca2+-calmodulina (CamKIla) (vease, por ejemplo, Mayford et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:13250; y Casanova et al. (2001) Genesis 31:37); un promotor del factor de crecimiento p derivado de plaquetas/potenciador de CMV (vease, por ejemplo, Liu et al. (2004) terapia genica 11:5260); y similares.
Los promotores restringidos espacialmente especificos de adipocitos incluyen, de modo no taxativo, promotor/potenciador del gen aP2, por ejemplo, una region de -5,4 kb a +21 pb del gen aP2 humano (vease, por ejemplo, Tozzo et al. (1997) Endocrinol. 138:1604; Ross et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:9590; y Pavjani et al. (2005) Nat. Med. 11:797); un promotor del transportador de glucosa 4 (GLUT4) (vease, por ejemplo, Knight et el. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:14725); un promotor de acidos grasos translocasa (FAT/CD36) (vease, por ejemplo, Kuriki et al. (2002) Biol. Pharm. Bull. 25:1476; y Sato et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:15703); un promotor de estearoilo-CoA desaturasa-1 (SCD1) (Tabor et al. (1999) J. Biol. Chem. 274:20603); un promotor de leptina (vease, por ejemplo, Mason et al. (1998) Endocrinol. 139:1013; y Chen et al. (1999) Biochem. Biophys. Res. Comm. 262:187); un promotor de adiponectina (vease, por ejemplo, Kita et al. (2005) Biochem. Biophys. Res. Comm. 331:484; y Chakrabarti (2010) Endocrinol. 151:2408); un promotor de adipsina (vease, por ejemplo, Platt et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:7490); un promotor de resistina (vease, por ejemplo, Seo et al. (2003) Molec. Endocrinol. 17:1522); y similares.
Los promotores restringidos espacialmente especificos de cardiomiocitos incluyen, de modo no taxativo, secuencias de control derivadas de los siguientes genes: cadena ligera de miosina 2, cadena pesada de miosina a, AE3, troponina cardiaca C, actina cardiaca y similares. Franz et al. (1997) Cardiovasc. Res. 35:560-566; Robbins et al. (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci. 752:492-505; Linn et al. (1995) Circ. Res. 76:584-591; Parmacek et al. (1994) Mol. Cell. Biol. 14:1870-1885; Hunter et al. (1993) Hypertension 22:608-617; y Sartorelli et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 89:4047-4051.
Los promotores restringidos espacialmente especificos de musculo liso incluyen, de modo no taxativo, un promotor de SM22a (vease, por ejemplo, Akyurek et al. (2000) Mol. Med. 6:983; y la patente estadounidense 7.169.874); un promotor de smoothelina (vease, por ejemplo, WO 2001/018048); un promotor de actina de musculo liso a; y similares. Por ejemplo, una region de 0,4 kb del promotor SM22a, dentro de la cual hay dos elementos de CArG, que se demostro que mediaba la expresion especifica de celulas de musculo liso vascular (vease, por ejemplo, Kim, et al. (1997) Mol. Cell. Biol. 17, 2266-2278; Li, et al., (1996) J. Cell Biol. 132, 849-859; y Moessler, et al. (1996) Development 122, 2415-2425).
Los promotores restringidos espacialmente especificos de fotorreceptores incluyen, de modo no taxativo, un promotor de rodopsina; un promotor de rodopsina cinasa (Young et al. (2003) Ophthalmol. Vis. Sci. 44:4076); un promotor del gen beta de la fosfodiesterasa (Nicoud et al. (2007) J. Gene Med. 9:1015); un promotor del gen de la retinitis pigmentaria (Nicoud et al. (2007) supra); un potenciador del gen de la proteina de union al retinoide interfotorreceptor (IRBP, por sus siglas en ingles) (Nicoud et al. (2007) supra); un promotor del gen IRBP (Yokoyama et al. (1992) Exp Eye Res. 55:225); y similares.
Los terminos "secuencias reguladoras de ADN", "elementos de control" y "elementos reguladores", utilizados de manera intercambiable, se refieren a secuencias de control transcripcional y traduccional, tal como promotores, potenciadores, senales de poliadenilacion, terminadores, senales de degradacion proteica, y similares, que proporcionan y/o regulan la transcripcion de una secuencia no codificante (por ejemplo, ARN dirigido a ADN) o una secuencia codificante (por ejemplo, polipeptido modificador dirigido al sitio, o polipeptido Cas9/Csn1) y/o regulan la traduccion de un polipeptido codificado.
El termino "de origen natural" o "no modificado", tal como se usa en la presente, aplicado a un acido nucleico, un polipeptido, una celula o un organismo, se refiere a un acido nucleico, polipeptido, celula u organismo que se encuentra en la naturaleza. Por ejemplo, una secuencia de polipeptidos o polinucleotidos presente en un organismo (incluyendo los virus) que puede aislarse de una fuente de la naturaleza y que no ha sido intencionalmente modificada por un ser humano en el laboratorio es de origen natural.
El termino "quimerico", tal como se usa en la presente cuando se aplica a un acido nucleico o polipeptido, se refiere a dos componentes que se definen mediante estructuras derivadas de fuentes diferentes. Por ejemplo, cuando "quimerico" se usa en el contexto de un polipeptido quimerico (por ejemplo, una proteina quimerica Cas9/Csn1), el polipeptido quimerico incluye secuencias de aminoacidos que derivan de diferentes polipeptidos. Un polipeptido quimerico puede comprender ya sea secuencias de polipeptidos modificadas o de origen natural (por ejemplo, una primera secuencia de aminoacidos de una proteina Cas9/Csn1 modificada o no modificada; y una segunda secuencia de aminoacidos diferente a la proteina Cas9/Csn1). De manera similar, "quimerico" en el contexto de un polinucleotido que codifica un polipeptido quimerico incluye secuencias de nucleotidos derivadas de diferentes regiones de codificacion (por ejemplo, una primera secuencia de nucleotidos que codifica una proteina Cas9/Csn1 modificada o no modificada; y una segunda secuencia de nucleotidos que codifica un polipeptido diferente a la
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protema Cas9/Csn1).
El termino "polipeptido quimerico" se refiere a un polipeptido que esta elaborado mediante la combinacion (es decir, "fusion") de dos segmentos de secuencia amino que de otra manera estan separados, usualmente mediante intervencion humana. Un polipeptido que comprende una secuencia de aminoacidos quimerica es un polipeptido quimerico. Algunos polipeptidos quimericos pueden mencionarse como "variantes de fusion".
"Heterologo", tal como se usa en la presente, significa una secuencia de nucleotidos o polipeptidos que no se encuentra en el acido nucleico o proteina natural, respectivamente. Por ejemplo, en una proteina Cas9/Csn1 quimerica, el dominio de union a ARN de un polipeptido Cas9/Csn1 bacteriano de origen natural (o una variante de este) puede fusionarse a una secuencia heterologa de polipeptidos (es decir, una secuencia de polipeptidos de una proteina diferente a Cas9/Csn1 o una secuencia de polipeptidos de otro organismo). La secuencia heterologa de polipeptidos puede presentar una actividad (por ejemplo, actividad enzimatica) que tambien presentara la proteina quimerica Cas9/Csn1 (por ejemplo, actividad de metiltransferasa, actividad de acetiltransferasa, actividad de cinasa, actividad de ubiquitinacion, etc.). Una secuencia de acido nucleico heterologa puede estar unida a una secuencia de acido nucleico de origen natural (o una variante de esta) (por ejemplo, mediante ingenieria genetica) para generar una secuencia de nucleotidos quimerica que codifica un polipeptido quimerico. Como otro ejemplo, en una variante de fusion del polipeptido dirigido al sitio Cas9, una variante de fusion del polipeptido dirigido al sitio Cas9 puede estar fusionado a un polipeptido heterologo (es decir, un polipeptido diferente a Cas9), que presenta una actividad que tambien presentara la variante de fusion del polipeptido dirigido al sitio Cas9. Una secuencia de acido nucleico heterologa puede estar unida a una variante del polipeptido dirigido al sitio Cas9 (por ejemplo, mediante ingenieria genetica) para generar una secuencia de nucleotidos que codifica una variante de fusion del polipeptido dirigido al sitio Cas9.
"Recombinante", tal como se usa en la presente, significa que un acido nucleico (ADN o ARN) en particular es el producto de varias combinaciones de clonacion, restriccion, reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) y/o etapas de ligacion que dan como resultado una construccion que tienen una secuencia estructural codificante o no codificante que puede distinguirse de los acidos nucleicos endogenos que se encuentran en sistemas naturales. Las secuencias de ADN que codifican polipeptidos pueden ensamblarse a partir de fragmentos de ADNc o a partir de una serie de oligonucleotidos sinteticos, para proporcionar un acido nucleico sintetico que es capaz de ser expresado a partir de una unidad transcripcional recombinante contenida en un sistema de transcripcion y traduccion celular o libre de celulas. El ADN genomico comprende las secuencias relevantes puede tambien usarse en la formacion de un gen o unidad transcripcional recombinante. Las secuencias de ADN no traducidas pueden estar presentes en 5' o 3' desde el marco de lectura abierto, donde dichas secuencias no interfieren con la manipulacion o expresion de las regiones codificantes, y puede ciertamente actuar para modular la produccion de un producto deseado mediante varios mecanismos (vease, "Secuencias reguladoras de ADN", mas adelante). De manera alternativa, las secuencias de ADN que codifican ARN (por ejemplo, ARN dirigido a ADN) que no se traducen tambien pueden considerarse recombinantes. Por lo tanto, por ejemplo, el termino acido nucleico "recombinante" se refiere a uno que no es de origen natural, por ejemplo, que fue elaborado mediante combinacion artificial de dos segmentos de secuencia que de otra mera estarian separados mediante intervencion humana. Esta combinacion artificial se logra frecuentemente ya sea por medios de sintesis quimica o mediante la manipulacion artificial de segmentos aislados de acidos nucleicos, por ejemplo, mediante tecnicas de manipulacion genetica. Esto usualmente se hace para reemplazar un codon con un codon que codifica el mismo aminoacido, un aminoacido conservador o un aminoacido no conservador. De manera alternativa, se realiza para unir segmentos de acido nucleico de funciones deseadas para generar una combinacion de funciones deseada. Esta combinacion artificial se logra frecuentemente ya sea por medios de sintesis quimica o mediante la manipulacion artificial de segmentos aislados de acidos nucleicos, por ejemplo, mediante tecnicas de manipulacion genetica. Cuando un polinucleotido recombinante codifica un polipeptido, la secuencia del polipeptido codificado puede ser de origen natural ("de tipo salvaje") o puede ser una variante (por ejemplo, un mutante) de la secuencia de origen natural. Por lo tanto, el termino polipeptido "recombinante" no necesariamente se refiere a un polipeptido cuya secuencia no es de origen natural. Por el contrario, un polipeptido "recombinante" es codificado por una secuencia de ADN recombinante, pero la secuencia del polipeptido puede ser de origen natural ("de tipo salvaje") o de origen no natural (es decir, una variante, un mutante, etc.). Por lo tanto, un polipeptido "recombinante" es el resultado de la intervencion humana, pero puede ser una secuencia de aminoacidos de origen natural.
Un "vector" o "vector de expresion" es un replicon, tal como un plasmido, fago, virus o cosmido, al que se puede unir otro segmento de ADN, es decir, un "inserto", para producir la replicacion del segmento unido en una celula.
Un "casete de expresion" comprende una secuencia de ADN codificante unida de manera operativa a un promotor. "Unido de manera operativa" se refiere a una yuxtaposicion donde los componentes descritos de esta manera estan en una relacion que les permite funcionar de la manera pretendida. Por ejemplo, un promotor esta unido de manera operativa a una secuencia codificante si el promotor afecta su transcription o expresion.
Los terminos "vector de expresion recombinante" o "construccion de ADN" se usan de manera intercambiable en la presente para referirse a una molecula de ADN que comprende un vector y al menos un inserto. Los vectores de expresion recombinante usualmente se generan con fines de expresar y/o propagar los insertos, o para la
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construccion de otras secuencias de nucleotidos recombinantes. Los insertos pueden o no estar unidos de manera operativa a una secuencia promotora y pueden o no estar unidos de manera operativa a secuencias reguladoras de ADN.
Una celula fue "modificada geneticamente" o "transformada" o "transfectada" con ADN exogeno, por ejemplo un vector de expresion recombinante, cuando dicho ADN ha sido introducido en la celula. La presencia del ADN exogeno da como resultado cambios geneticos permanentes o transitorios. El ADN transformante puede o no estar integrado (unido de manera covalente) en el genoma de la celula. En celulas procariotas, de levadura y de mamifero, por ejemplo, el ADN transformante puede mantenerse en un elemento episomal, tal como un plasmido. Con respecto a las celulas eucariotas, una celula transformada de manera estable es una en la cual el ADN transformante se ha integrado en el cromosoma de manera que este sea heredado por celulas hijas a traves de replicacion del cromosoma. Esta estabilidad es demostrada por la capacidad de la celula eucariota de establecer lineas celulares o clones que comprenden una poblacion de celulas hijas que contienen el ADN transformante. Un "clon" es una poblacion de celulas derivadas de una unica celula o progenitor comun mediante mitosis. Un "linea celular" es un clon de una celula primaria que es capaz de crecer de manera estable in vitro durante muchas generaciones.
Los metodos adecuados de modification genetica (tambien mencionadas como "transformation") incluyen, por ejemplo, infection viral o bacteriofagica, transfection, conjugation, fusion de protoplastos, lipofeccion, electroporation, precipitation de fosfato de calcio, transfeccion mediada por polietilenimina (PEI, por sus siglas en ingles), transfeccion mediada por DEAE-dextrano, transfeccion mediada por liposomas, tecnologia de canon de particulas, precipitacion de fosfato de calcio, microinyeccion directa, insertion de acido nucleico mediada por nanoparticulas (vease, por ejemplo, Panyam et al., Adv Drug Deliv Rev. 2012 Sep 13. pii: S0169-409X(12)00283-9. doi: 10.1016/j.addr.2012.09.023 ) y similares.
La election de metodo de modificacion genetica generalmente depende del tipo de celula que se esta transformando y las circunstancias en las cuales se lleva a cabo la transformacion (por ejemplo, in vitro, ex vivo o in vivo). Puede encontrarse una discusion general de estos metodos en Ausubel, et al., Short Protocols in Molecular Biology, 3a ed., Wiley & Sons, 1995.
Un "ADN objetivo", tal como se usa en un polinucleotido de ADN que comprende un "sitio objetivo" o una "secuencia objetivo". Los terminos "sitio objetivo" o "secuencia objetivo" o "ADN de protoespaciador objetivo" se usan de manera intercambiable en la presente para referirse a una secuencia de acido nucleico presente en un ADN objetivo al cual se unira un segmento de direccionamiento de ADN de un ARN de direccionamiento a ADN de la presente (vease la Figura 1 y la Figura 39), siempre que existan suficientes condiciones para la union. Por ejemplo, el sitio objetivo (o secuencia objetivo) 5-GAGCATATC-3' (SEQ ID NO://) dentro de un ADN objetivo es el objetivo de (o se une con, o se hibrida con, o es complementario a) la secuencia de ARN 5'-GAUAUGCUC-3' (SEQ ID NO://). Las condiciones de union de ADN/ARN adecuadas incluyen condiciones fisiologicas presentes normalmente en una celula. Otras condiciones de union a ADN/ARN adecuadas (por ejemplo, condiciones en un sistema libre de celulas) son conocidas en la tecnica; vease, por ejemplo, Sambrook, supra. La cadena del ADN objetivo que es complementaria y se hibrida con el ARN dirigido a aDn se menciona como "cadena complementaria" y la cadena del ADN objetivo que es complementaria a la "cadena complementaria" (y es, por lo tanto, no complementaria al ARN dirigido a ADN) se menciona como "cadena no complementaria" (vease la Figura 12).
"Polipeptido modificador dirigido al sitio" o "polipeptido dirigido al sitio de union al ARN" o "polipeptido modificador dirigido al sitio de union al ARN" o "polipeptido dirigido al sitio" significa un polipeptido que se une al ARN y se dirige a una secuencia de ADN especifica. Un polipeptido modificador dirigido al sitio, tal como se describe en la presente, se dirige a una secuencia de ADN especifica mediante la molecula de ARN a la cual se une. La molecula se ARN comprende una secuencia que es complementaria a una secuencia objetivo dentro del ADN objetivo, y de este modo dirige el polipeptido unido a una ubicacion especifica dentro del ADN objetivo (la secuencia objetivo).
"Escision" significa la rotura de la estructura covalente de una molecula de ADN. La escision puede iniciarse mediante varios metodos, incluyendo, de modo no taxativo, hidrolisis enzimatica o quimica de un enlace fosfodiester. Son posibles tanto la escision de cadena simple como la escision de cadena doble, y la escision de cadena doble puede ocurrir como resultado de dos eventos de escision de cadena doble distintos. La escision de ADN puede dar como resultado la production ya sea de extremos romos o de extremos escalonados. En determinadas modalidades, un complejo que comprende un ARN dirigido a ADN y un polipeptido modificador dirigido al sitio se usan para la escision dirigida de ADN de doble cadena.
"Nucleasa" y "endonucleasa" se usan de manera intercambiable en la presente para referirse a una enzima que posee actividad catalitica para la escision de ADN.
"Dominio de escision" o "dominio activo" o "dominio de nucleasa" de una nucleasa significa la secuencia de polipeptidos o dominio dentro de la nucleasa que posee la actividad catalitica para la escision de ADN. Un dominio de escision puede estar contenido en una unica cadena de polipeptidos o la actividad de escision puede ser el resultado de la asociacion de dos (o mas) polipeptidos. Un dominio de nucleasa individual puede consistir en mas de
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una extension aislada de aminoacidos dentro de un polipeptido dado.
La molecula de ARN que se une al polinucleotido modificador dirigido al sitio y dirige el polipeptido a una ubicacion espedfica dentro del ADN objetivo se menciona en la presente como "ARN dirigido a ADN" o "polinucleotido de ARN dirigido a ADN" (tambien mencionado en la presente como "ARN guia" o "ARNg"). Un ARN dirigido a ADN de la invention comprende dos segmentos, un "segmento dirigido a ADN" y un "segmento de union a proteina". "Segmento" significa un segmento/seccion/region de una molecula, por ejemplo, una extension contigua de nucleotidos en un ARN. Un segmento tambien puede significar una region/seccion de un complejo de manera que un segmento puede comprender regiones de mas de una molecula. Por ejemplo, en algunos casos, el segmento de union a proteina (descrito mas adelante) de un ARN dirigido a ADN es una molecula de ARN y el segmento de union a proteina, por lo tanto, comprende una region de esa molecula de ARN. En otros casos, el segmento de union a proteina (descrito mas adelante) de un ARN dirigido a ADN comprende dos moleculas separadas que estan hibridadas a lo largo de una region de complementariedad. Como ejemplo ilustrativo, no taxativo, un segmento de union a proteina de un ARN dirigido a ADN que comprende dos moleculas separadas puede comprender (i) los pares de bases 40-75 de una primera molecula de aRn que tiene una longitud de 100 pares de bases; y (ii) los pares de bases 10-25 de una segunda molecula de ARN que tiene una longitud de 50 pares de bases. La definition de "segmento", a menos que se defina especificamente de otra manera en un contexto particular, no se limita a una cantidad especifica de pares de bases totales de una molecula de ARN dada, no se limita a una cantidad especifica de pares de bases totales de una molecula de ARN dada, no se limita a una cantidad particular de moleculas separadas dentro de un complejo, y puede incluir regiones de moleculas de ARN que tienen cualquier longitud total y puede o no incluir regiones con complementariedad a otras moleculas.
El segmento de union al ADN (o "secuencia dirigida a ADN") comprende una secuencia de nucleotidos que es complementaria a una secuencia especifica dentro de un ADN objetivo (la cadena complementaria del ADN objetivo). El segmento de union a proteinas (o "secuencia de union a proteinas") interactua con un polipeptido modificador dirigido al sitio. Cuando el polipeptido modificador dirigido al sitio es un polipeptido Cas9 o relacionado con Cas9 (descrito en mas detalle mas adelante), la escision especifica del sitio del ADN objetivo ocurre en ubicaciones determinadas mediante ambas de (i) complementariedad de pares de bases entre el ARN dirigido a ADN y el ADN objetivo; y (ii) un motivo corto (mencionado como el motivo adyacente protoespaciador (PAM, por sus siglas en ingles)) en el ADN objetivo.
El segmento de union a proteinas de un ARN dirigido a ADN de la invencion comprende dos extensiones complementarias de nucleotidos que se hibridan entre si para formar un duplex de ARN de cadena doble (duplex de ARNcd).
En algunas modalidades, un acido nucleico de la invencion (por ejemplo, un ARN dirigido a ADN, un acido nucleico que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica un ARN dirigido a ADN; un acido nucleico que codifica un polipeptido dirigido al sitio; etc.) comprende una modification o secuencia que proporciona una caracteristica deseable adicional (por ejemplo, estabilidad modificada o regulada; direccionamiento subcelular; rastreo, por ejemplo, un marcado fluorescente; un sitio de union para una proteina o complejo de proteinas; etc.). Los ejemplos no taxativos incluyen: un casquete 5' (por ejemplo, un casquete 7-metilguanilato (m7G)); una cola poliadenilada 3' (es decir, una cola poli(A) 3'); una secuencia de ribointerruptor (por ejemplo, para permitir estabilidad regulada y/o accesibilidad regulada mediante proteinas y/o complejos de proteinas); una secuencia de control de estabilidad; una secuencia que forma un duplex de ARNcd (es decir, una horquilla)); una modificacion o secuencia que dirige el ARN a una ubicacion subcelular (por ejemplo, nucleo, mitocondria, cloroplastos y similares); una modificacion o secuencia que proporciona rastreo (por ejemplo, conjugation directa con una molecula fluorescente, conjugation con un resto que facilita la detection fluorescente, una secuencia que permite la detection fluorescente, etc.); una modificacion o secuencia que proporciona un sitio de union para proteinas (por ejemplo, proteinas que actuan en el ADN, incluidos los activadores transcripcionales, represores transcripcionales, ADN metiltransferasas, ADN desmetilasas, histona acetiltransferasas, histona deacetilasas y similares); y combinaciones de estos.
En algunas modalidades, un ARN dirigido a ADN comprende un segmento adicional ya sea en el extremo 5' o 3' que proporciona cualquiera de las caracteristicas descritas anteriormente. Por ejemplo, un tercer segmento aceptable puede comprender un casquete 5' (por ejemplo, un casquete 7-metilguanilato (m7G)); una cola poliadenilada 3' (es decir, una cola poli(A) 3'); una secuencia de ribointerruptor (por ejemplo, para permitir estabilidad regulada y/o accesibilidad regulada mediante proteinas y complejos de proteinas); una secuencia de control de estabilidad; una secuencia que forma un duplex de ARNcd (es decir, una horquilla)); una secuencia que dirige el ARN a una ubicacion subcelular (por ejemplo, nucleo, mitocondria, cloroplastos y similares); una modificacion o secuencia que proporciona rastreo (por ejemplo, conjugacion directa con una molecula fluorescente, conjugacion con un resto que facilita la deteccion fluorescente, una secuencia que permite la deteccion fluorescente, etc.); una modificacion o secuencia que proporciona un sitio de union para proteinas (por ejemplo, proteinas que actuan en el ADN, incluidos los activadores transcripcionales, represores transcripcionales, ADN metiltransferasas, ADN desmetilasas, histona acetiltransferasas, histona deacetilasas y similares); y combinaciones de estos.
Un ARN dirigido a ADN de la invencion y un polipeptido modificador dirigido al sitio de la invencion (es decir, polipeptido dirigido al sitio) forman un complejo (es decir, se unen por medio de interacciones no covalentes). El
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ARN dirigido a ADN proporciona especificidad de direccionamiento al complejo, ya que comprende una secuencia de nucleotidos que es complementaria a una secuencia de un ADN objetivo. El polipeptido modificador dirigido al sitio del complejo proporciona la actividad especifica del sitio. En otras palabras, el polipeptido modificador dirigido al sitio es guiado a una secuencia ADN objetivo (por ejemplo, una secuencia objetivo en un acido nucleico cromosomico; una secuencia objetivo en un acido nucleico extracromosomico, por ejemplo, un acido nucleico episomal, un minicirculo, etc.; una secuencia objetivo en un acido nucleico mitocondrial; una secuencia objetivo en un acido nucleico de cloroplasto; una secuencia objetivo en un plasmido; etc.) mediante su asociacion con el segmento de union a proteinas del ARN dirigido a ADN.
Tambien se describe un ARN dirigido a ADN de la invencion que comprende dos moleculas de ARN separadas (polinucleotidos de ARN; un "ARN activador" y un "ARN identificador", vease mas adelante) y se menciona en la presente como una "ARN dirigido a ADN de molecula doble" o un "ARN dirigido a ADN de dos moleculas". En la invencion, el ARN dirigido a ADN de la invencion es una molecula de ARN individual (polinucleotido de ARN individual) y se menciona en la presente como un "ARN dirigido a ADN de molecula simple", un "ARN simple guia " o un "ARNsg". El termino "ARN dirigido a ADN" o "ARNg" es inclusivo y hace referencia tanto a ARN dirigidos a ADN de molecula doble y a ARN dirigidos a ADN de molecula simple (es decir, ARNsg).
Un ejemplo de ARN dirigido a ADN de dos moleculas correspondiente una molecula similar a crRNA ("ARN CRISPR" o "ARN identificador" o "crRNA" o "repeticion de crRNA") y una molecula similar a tracrRNA ("ARN CRISPR regulador en trans" o "ARN activador" o "tracrRNA"). Una molecula similar a crRNA (ARN identificador) comprende tanto el segmento dirigido a ADN (cadena simple) del ARN dirigido a ADN y una extension ("segmento formador de duplex") de nucleotidos que forma una mitad del duplex de ARNcd del segmento de union a proteinas del ARN dirigido a ADN. Una molecula similar a tracrRNA correspondiente (ARN activador) comprende una extension de nucleotidos (segmento formador de duplex) que forma la otra mitad del duplex de ARNcd del segmento de union a proteinas del ARN dirigido a ADN. En otras palabras, una extension de nucleotidos de una molecula similar a crRNA es complementaria y se hibrida con una extension de nucleotidos de una molecula similar a tracrRNA para formar el duplex de ARNcd del dominio de union a proteinas del ARN dirigido a ADN. Como tal, cada molecula similar a crRNA puede decirse que tiene una molecula similar a tracrRNA correspondiente. La molecula similar a crRNA proporciona adicionalmente el segmento dirigido a ADN de cadena simple. Por lo tanto, una molecula similar a crRNA y similar a tracrRNA (como un par correspondiente) se hibridan para formar un ARN dirigido a ADN. La secuencia exacta de una molecula de crRNA o tracrRNA determinada es una caracteristica de la especia en la cual se encuentran las moleculas de ARN. Se representan varios crRNA y tracrRNA en pares complementarios correspondientes en la Figura 8. Un ARN dirigido a ADN de molecula doble de la invencion puede comprender cualquier par de crRNA y tracrRNA correspondiente. Un ARN dirigido a ADN de molecula doble de la invencion puede comprender cualquier par de crRNA y tracrRNA correspondiente.
El termino "ARN activador" se usa en la presente con el significado de una molecula similar a tracrRNA de un ARN dirigido a ADN de molecula doble. El termino "ARN identificador" se usa en la presente con el significado de una molecula similar a crRNA de un ARN dirigido a ADN de molecula doble. El termino "segmento formador de duplex" se usa en la presente con el significado de la extension de nucleotidos de un ARN activador o un ARN identificador que contribuye a la formacion del duplex de ARNcd mediante la hibridacion con una extension de nucleotidos de una molecula de ARN activador o ARN identificador correspondiente. En otras palabras, un ARN activador comprende un segmento formador de duplex que es complementario al segmento formador de duplex del ARN identificador correspondiente. Como tal, un ARN activador comprende un segmento formador de duplex mientras que un ARN identificador comprende tanto un segmento formador de duplex como el segmento dirigido a ADN del ARN dirigido a ADN. Por lo tanto, un ARN dirigido a ADN de molecula doble de la invencion puede comprender cualquier par de ARN activador y ARN identificador correspondiente.
Una "celula hospedadora", tal como se usa en la presente, indica una celula eucariota, una celula procariota (por ejemplo, celula bacteriana o de arquea), o una celula de un organismo multicelular (por ejemplo, linea celular) in vivo o in vitro cultivada como una entidad unicelular, cuyas celulas eucariotas o procariotas pueden ser, o haber sido, usadas como receptores para un acido nucleico, e incluyen la progenie de la celula original a partir de la cual fueron transformadas por medio del acido nucleico. Se entiende que la progenie de una celula individual puede no necesariamente ser completamente identica en morfologia o en el complemento de ADN total o genomico al progenitor original, debido a mutaciones naturales, accidentales o deliberadas. Una "celula hospedadora recombinante" (tambien mencionada como una "celula hospedadora modificada geneticamente") es una celula hospedadora en la cual se ha introducido un acido nucleico heterologo, por ejemplo, un vector de expresion. Por ejemplo, una celula hospedadora bacteriana de la invencion es una celula hospedadora bacteriana modificada geneticamente por medio de la introduccion en una celula hospedadora bacteriana adecuada de un acido nucleico exogeno (por ejemplo, un plasmido o vector de expresion recombinante) y una celula hospedadora eucariota de la invencion es una celula hospedadora eucariota modificada geneticamente (por ejemplo, una celula germinal de mamifero) por medio de la introduction en una celula hospedadora eucariota adecuada de un acido nucleico exogeno.
El termino "celula madre" se usa en la presente para referirse a una celula (por ejemplo, una celula madre vegetal, una celula madre de vertebrado) que tiene la capacidad tanto de auto renovarse como de generar un tipo de celula
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diferenciada (vease Morrison et al. (1997) Cell 88:287-298). En el contexto de ontogenia celular, el adjetivo "diferenciado" o "diferenciante" es un termino relativo. Una "celula diferenciada" es una celula que ha progresado mas en la v^a de desarrollo que la celula con la que se la esta comparando. Por lo tanto, las celulas madre pluripotentes (descritas mas adelante) pueden diferenciarse en celulas progenitoras especificas de la linea (por ejemplo, celula madre mesodermicas), que, a su vez, pueden diferenciarse en celulas que son adicionalmente especificas (por ejemplo, progenitores neuronales), que pueden diferenciarse en celulas de etapa final (es decir, celulas diferenciadas de manera terminal, por ejemplo, neuronas, cardiomiocitos, etc.), que tienen un papel caracteristico en un tipo de tejidos determinado, y pueden o no conservar la capacidad de proliferar adicionalmente. Las celulas madre pueden caracterizarse tanto por la presencia de marcadores especificos (por ejemplo, proteinas, ARN, etc.) como por la ausencia de marcadores especificos. Las celulas madre tambien pueden identificarse por medio de ensayos funcionales tanto in vitro como in vivo, particularmente ensayos relacionados con la capacidad de las celulas madre de producir multiple progenie diferenciada.
Las celulas madre de interes incluyen celulas madre pluripotentes (PSC, por sus siglas en ingles). La expresion "celula madre pluripotente" o "PSC" se utiliza en la presente para referirse a una celula madre capaz de producir todos los tipos de celula del organismo. Por lo tanto, una PSC puede dar origen a celulas de todas las capas germinales del organismo (por ejemplo, el endoderma, mesoderma y ectoderma de un vertebrado). Las celulas pluripotentes son capaces de formar teratomas y de contribuir a tejidos ectodermicos, mesodermicos o endodermicos en un organismo vivo. Las celulas madre pluripotentes de plantas son capaces de dar origen a todos los tipos de celula de la planta (por ejemplo, celulas de la raiz, tallo, hojas, etc.).
Pueden derivarse las PSC de animales en una cantidad de maneras diferentes. Por ejemplo, las celulas madre embrionicas (ESC, por sus siglas en ingles) se derivan de la masa celular interna de un embrion, mientras que las celulas madre pluripotentes inducidas (iPSC, por sus siglas en ingles) se derivan se celulas somaticas (Takahashi et. al., Cell. 30 de noviembre de 2007; 131(5):861-72; Takahashi et. al., Nat Protoc. 2007;2(12):3081-9; Yu et. al., Science. 21 de diciembre de 2007; 318(5858):1917-20. Pub ele. 20 nov 2007. Dado que el termino PSC se refiere a celulas madre pluripotentes sin importar su derivacion, el termino PSC abarca los terminos ESC e iPSC. Las PSC pueden encontrarse en forma de una linea celular establecida, pueden obtenerse directamente de tejido embrionario primario o pueden derivarse de una celula somatica. Las PSC pueden ser celulas objetivo de los metodos descritos en la presente.
Se entiende por "celula madre embrionaria" (ESC) una PSC que se aislo de un embrion, normalmente de la masa celular interna del blastocisto. Las celulas madre de interes tambien incluyen celulas madre embrionarias de otros primates, tales como celulas madre de Rhesus y celulas madre de titi. Las celulas madre pueden obtenerse de cualquier especie de mamiferos, por ejemplo, humanos, equinos, bovinos, porcinos, caninos, felinos, roedores, por ejemplo, ratones, ratas, hamsters, primates, etc. (Thomson et al. (1998) Science 282:1145; Thomson et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci EUA 92:7844; Thomson et al. (1996) Biol. Reprod. 55:254; Shamblott et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 95:13726, 1998). En el cultivo, las ESC normalmente crecen como colonias planas con amplios radios nucleo-citoplasmaticos, fronteras definidas y nucleolos prominentes. Ademas, las ESC expresan SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81 y fosfatasa alcalina, pero no SSEA-1. Los ejemplos de metodos para generar y caracterizar ESC pueden encontrarse en, por ejemplo, la patente estadounidense n.° 7.029.913, la patente estadounidense n.° 5.843.780 y la patente estadounidense n.° 6.200.806. Los metodos para la proliferacion de hESC en la forma no diferenciada se describen en WO 99/20741, WO 01/51616 y WO 03/020920.
Las celulas madre embrionarias germinales humanas o celulas embrionarias germinales humanas no son parte de la invencion. Por "celula madre embrionaria germinal" (EGSC), "celula madre germinal" o "celula EG" se entiende una PSC que se deriva de celulas germinales y/o progenitores de celulas germinales, por ejemplo, celulas germinales primordiales, es decir, aquellas que se convertirian en esperma y ovulos. Se piensa que las celulas germinales embrionarias (celulas EG) tienen propiedades similares a las celulas madre embrionarias descritas anteriormente. Los ejemplos de metodos para generar y caracterizar celulas EG pueden encontrarse en, por ejemplo, la patente estadounidense n.° 7.153.684; Matsui, Y., et al., (1992) Cell 70:841; Shamblott, M., et al. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 98: 113; Shamblott, M., et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA, 95:13726; y Koshimizu, U., et al. (1996) Development, 122:1235.
Por "celula madre pluripotente inducida" o "iPSC" se entiende una PSC derivada de una celula que no es una PSC (es decir, de una celula diferenciada relativa a una PSC). Las iPSC pueden derivarse de multiples tipos de celulas diferentes, inclusive celulas diferenciadas de forma terminal. Las iPSC tienen una morfologia similar a la de una celula ES, donde crecen como colonias planas con amplios radios nucleo-citoplasmaticos, fronteras definidas y nucleolos prominentes. Ademas, las iPSC expresan uno o mas marcadores de pluripotencia claves conocidos por un experto en la tecnica, inclusive, de modo no taxativo, fosfatasa alcalina, SSEA3, SSEA4, Sox2, Oct3/4, Nanog, TRA160, TRA181, TDGF 1, Dnmt3b, FoxD3, GDF3, Cyp26a1, TERT y zfp42. Los ejemplos de metodos para generar y caracterizar iPSC pueden encontrarse en, por ejemplo, las patentes estadounidense n.° US20090047263, US20090068742, US20090191159, US20090227032, US20090246875 y US20090304646. Generalmente, para generar iPSC, las celulas somaticas se proporcionan con factores de reprogramacion (por ejemplo, Oct4, SOX2, KLF4, MYC, Nanog, Lin28, etc.) conocidos en la tecnica para reprogramar las celulas somaticas para convertirse en celulas madre pluripotentes.
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Por "celula somatica" se entiende cualquier celula en un organismo que, ante la ausencia de manipulacion experimental, normalmente no da lugar a todos los tipos de celulas en un organismo. En otras palabras, las celulas somaticas son celulas que se han diferenciado lo suficiente, de forma que no generaran celulas de forma natural de las tres capas germinales del cuerpo, es decir, ectoderma, mesoderma y endoderma. Por ejemplo, las celulas somaticas incluirian tanto neuronas como progenitores neurales; estos ultimos pueden dar origen de forma natural a todos o algunos tipos de celulas de cada sistema nervioso central pero no pueden dar origen a celulas de los linajes mesodermicos o endodermicos.
Por "celula mitotica" se entiende una celula sometida a mitosis. La mitosis es el proceso por el cual una celula eucariota separa los cromosomas en su nucleo en dos conjuntos identicos en dos nucleos separados. Normalmente esta seguida inmediatamente por la citocinesis, la cual divide el nucleo, citoplasma, organelos y membrana celular en dos celulas que contienen aproximadamente partes iguales de estos componentes celulares.
Por "celula posmitotica" se entiende una celula que ha salido de la mitosis, es decir, es "quiescente", esto es, ya no esta experimentando divisiones. Este estado quiescente puede ser temporal, es decir, reversible, o puede ser permanente.
Por "celula meiotica" se entiende una celula sometida a meiosis. La meiosis es el proceso mediante el cual una celula divide su material nuclear con el proposito de producir gametos o esporas. A diferencia de la mitosis, en la meiosis los cromosomas experimentan una etapa de recombinacion, donde se transpone material genetico entre cromosomas. De manera adicional, el resultado de la meiosis es cuatro celulas haploides (geneticamente singulares), en comparacion con las dos celulas diploides (geneticamente identicas) producidas mediante mitosis.
Por "recombinacion" se entiende un proceso para intercambiar informacion genetica entre dos polinucleotidos. Tal como se usa en la presente, "reparacion dirigida por homologia (HDR, por sus siglas en ingles)" se refiere a la forma especializada de reparacion de ADN que se lleva a cabo, por ejemplo, durante la reparacion de roturas de cadena doble en las celulas. Este proceso requiere homologia de secuencia de nucleotidos, utiliza una molecula "donante" como plantilla de reparacion de una molecula "objetivo" (es decir, la que experimento la rotura de cadena doble), y lleva a la transferencia de la informacion genetica del donante al objetivo. La reparacion dirigida por homologia puede dar como resultado una alteracion de la secuencia de la molecula objetivo (por ejemplo, insertion, eliminacion, mutacion) si el polinucleotido donante difiere de la molecula objetivo y toda la secuencia o parte de la secuencia del polinucleotido donante se incorpora en el ADN objetivo. En algunas modalidades, el polinucleotido donante, una parte del polinucleotido donante, una copia del polinucleotido donante o una parte de una copia del polinucleotido donante se integra al ADN objetivo.
Por "recombinacion no homologa (NHEJ, por sus siglas en ingles)" se entiende la reparacion de las roturas de cadena doble en el ADN mediante ligation directa de los extremos rotos entre si sin necesidad de una plantilla homologa (en contraposition a la reparacion dirigida por homologia, la que requiere una secuencia homologa para dirigir la reparacion). La NHEJ a menudo da como resultado la perdida (elimination) de la secuencia de nucleotidos cerca del sitio de la rotura de cadena doble.
Los terminos "tratamiento", "tratar" y similares se utilizan en la presente generalmente para referirse a la obtencion de un efecto farmacologico y/o fisiologico deseado. El efecto puede ser profilactico en terminos de prevenir total o parcialmente una enfermedad o sintoma de esta y/o puede ser terapeutico en terminos de una cura parcial o total de una enfermedad y/o efecto adverso atribuible a la enfermedad. “Tratamiento", tal como se usa en la presente, abarca cualquier tratamiento de una enfermedad o sintoma en un mamifero e incluye: (a) prevenir la enfermedad o sintoma de en un sujeto que puede estar predispuesto a contraer la enfermedad o sintoma pero que no ha sido diagnosticado aun; (b) inhibir la enfermedad o sintoma, es decir, detener su desarrollo; o (c) aliviar la enfermedad, es decir, ocasionar el retroceso de la enfermedad. El agente terapeutico puede administrarse antes, durante o de forma posterior al comienzo de la enfermedad o lesion. Es de interes particular el tratamiento de la enfermedad en curso, donde el tratamiento estabiliza o reduce los sintomas clinicos no deseables del paciente. Dicho tratamiento se lleva a cabo, preferentemente, antes de la perdida completa de la funcion en los tejidos afectados. La terapia en cuestion se administrara, de preferencia, durante la etapa sintomatica de la enfermedad y, en algunos casos, luego de la etapa sintomatica de la enfermedad.
Los terminos "individuo", "sujeto", "hospedador" y "paciente" se utilizan de forma intercambiable en la presente y hacen referencia a cualquier sujeto mamifero para el cual se desea el diagnostico, tratamiento o terapia, particularmente humanos.
Los metodos generales sobre bioquimica molecular y celular se pueden encontrar en dichos libros de texto estandar tales como Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a Ed. (Sambrook et al., HaRBor Laboratory Press 2001); Short Protocols in Molecular Biology, 4a Ed. (Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons 1999); Protein Methods (Bollag et al., John Wiley & Sons 1996); Nonviral Vectors for Gene Therapy (Wagner et al. eds., Academic Press 1999); Viral Vectors (Kaplift & Loewy eds., Academic Press 1995); Immunology Methods Manual (I. Lefkovits ed., Academic Press 1997); y Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures in Biotechnology (Doyle & Griffiths, John Wiley & Sons 1998).
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Antes de describir la presente invencion en mayor detalle, se debera entender que esta invencion no se limita a las modalidades particulares descritas, ya que estas pueden evidentemente variar. Tambien debe entenderse que la terminolog^a utilizada en la presente tiene el fin de describir solamente modalidades particulares y no pretende ser taxativa, dado que el alcance de la presente invencion estara limitado solamente por las reivindicaciones adjuntas.
Mientras que se proporciona un intervalo de valores, se debera entender que cada valor involucrado, hasta la decima de la unidad del limite inferior salvo que el contexto claramente establezca lo contrario, entre el limite superior e inferior de ese intervalo y cualquier otro valor establecido o involucrado en ese intervalo establecido, estan comprendidos dentro de la invencion. Los limites superior e inferior de estos intervalos mas pequenos pueden estar incluidos independientemente en los intervalos mas pequenos y tambien estan comprendidos dentro de la invencion, sujeto a cualquier limite especificamente excluido en el intervalo establecido. Cuando el intervalo establecido incluye uno o ambos de los limites, los intervalos que excluyan cualesquiera o ambos limites incluidos tambien se incluyen en la invencion.
Se presentan en la presente determinados intervalos con valores numericos precedidos por el termino "alrededor de". El termino "alrededor de" se usa en la presente para proporcionar soporte literal al numero exacto que precede, asi como un numero cercano o aproximado al numero que el termino precede. Al determinar su un numero es cercano a o aproximado de un numero enumerado especificamente, el numero cercano o aproximado puede ser un numero que el contexto en el que se presente, proporciona el equivalente sustancial del numero enumerado especificamente.
A menos que se defina lo contrario, todos los terminos tecnicos y cientificos utilizados en la presente tienen el mismo significado comunmente entendido por un experto en la tecnica a la que pertenece la presente invencion. Si bien en la practica o prueba de la presente invencion tambien se puede utilizar cualquier metodo y material similar o equivalente a los descritos en la presente, a continuacion se describen los metodos y materiales preferidos.
La enumeration de cualquier publication es para su description previo a la fecha de presentation y no se entendera como una admision de que la presente invencion no tiene derecho a anteceder dicha publicacion en virtud de invencion previa. Ademas, las fechas de publicacion proporcionadas pueden ser distintas de las fechas de publicacion reales, las cuales puede ser necesario que se confirmen de manera independiente.
Se observa que, tal como se usan en la presente y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares “un", “una" y “el/la”, incluyen los referentes plurales, salvo que se exprese claramente lo contrario en el contexto. Por consiguiente, por ejemplo, la referencia a “un polinucleotido” incluye una pluralidad de dichos polinucleotidos y la referencia "al polipeptido" incluye la referencia a uno o mas polipeptidos y equivalentes de estos conocidos por los expertos en la tecnica, etc. Se observa ademas que las reivindicaciones pueden ser redactadas de forma que excluyan cualquier elemento opcional. Como tal, esto pretende ser una base antecedente para el uso de terminologia exclusiva tal como "solamente", "unicamente" y similares con relation a la enumeracion de los elementos de las reivindicaciones o el uso de una limitation "negativa".
Se entiende que algunas caracteristicas de la invencion que, a los efectos de la claridad, se describen en el contexto de modalidades separadas, tambien se pueden proporcionar en combination en una sola modalidad. De manera inversa, diversas caracteristicas de la invencion que, a efectos de brevedad, se describen en el contexto de una sola modalidad, tambien se pueden proporcionar por separado o en cualquier subcombinacion adecuada. Todas las combinaciones de las modalidades pertenecientes a la invencion se encuentran especificamente comprendidas dentro de la presente invencion y se describen en la presente como si cada combinacion estuviese individual y especificamente descrita. Ademas, todas las subcombinaciones de las varias modalidades y elementos de estas tambien se encuentran especificamente comprendidos dentro de la presente y se describen en la presente como si cada dicha subcombinacion estuviese individual y especificamente descrita en la presente.
Las publicaciones que se analizan en la presente se proporcionan unicamente para su divulgation antes de la fecha de presentacion de la presente solicitud. Ningun contenido de la presente debe interpretarse como una admision de que la presente invencion no tiene derecho a preceder a dicha publicacion en virtud de invencion anterior. Ademas, las fechas de publicacion proporcionadas pueden no coincidir con las fechas de publicacion reales, las que puede ser necesario confirmar independientemente.
Descripcion detallada - parte i
La presente descripcion proporciona un ARN dirigido a ADN que comprende una secuencia objetivo y, junto con un polipeptido modificador, proporciona una modification especifica del sitio de un ADN objetivo y/o un polipeptido asociado con el ADN objetivo. La presente descripcion proporciona ademas polipeptido modificadores especificos del sitio. La presente descripcion proporciona ademas metodos para la modificacion especifica del sitio de un ADN objetivo y/o un polipeptido asociado con el ADN objetivo. La presente descripcion proporciona metodos para modular la transcription de un acido nucleico objetivo en una celula objetivo, que generalmente involucra poner en contacto el acido nucleico objetivo con un polipeptido Cas9 enzimaticamente inactivo y un ARN dirigido a ADN. Se proporcionan tambien kits y composiciones para llevar a cabo los metodos. La presente descripcion proporciona
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celulas modificadas geneticamente que producen Cas9; y organismos multicelulares no humanos Cas9 transgenicos.
Acidos nucleicos
ARN dirigido a ADN
La presente description proporciona un ARN dirigido a ADN, que dirige las actividades de un polipeptido asociado (por ejemplo, un polipeptido modificador dirigido al sitio) hacia una secuencia objetivo espetifica dentro de un ADN objetivo. Un ARN dirigido a ADN de la invention comprende: un primer segmento (al que en la presente tambien se hace referencia como "segmento dirigido a ADN" o "secuencia dirigida a ADN") y un segundo segmento (al que tambien se hace referencia en la presente como "segmento de union a proteina" o una "secuencia de union a proteina").
Segmento dirigido a ADN de un ARN dirigido a ADN
El segmento dirigido a ADN de un ARN dirigido a ADN de la invencion comprende una secuencia de nucleotidos que es complementaria a una secuencia en un ADN objetivo. En otras palabras, el segmento dirigido a ADN de un ARN dirigido a ADN de la invencion interactua con un ADN objetivo de forma especifica a la secuencia mediante hibridacion (es decir, apareamiento de bases). Como tal, la secuencia de nucleotidos del segmento dirigido a ADN puede variar y determina la ubicacion dentro del ADN objetivo donde el ARN dirigido a ADN y el ADN objetivo interactuaran. El segmento dirigido a ADN de un ARN dirigido a ADN de la invencion puede modificarse (por ejemplo, mediante manipulation genetica) para hibridarse a cualquier secuencia deseada dentro de un ADN objetivo.
El segmento dirigido a ADN puede ser de una longitud de alrededor de 12 nucleotidos a alrededor de 100 nucleotidos. Por ejemplo, el segmento dirigido a ADN puede tener una longitud de alrededor de 12 nucleotidos (nt) a alrededor de 80 nt, de alrededor 12 nt a alrededor de 50 nt, de alrededor de 12 nt a alrededor de 40 nt, de alrededor de 12 nt a alrededor de 30 nt, de alrededor de 12 nt a alrededor de 25 nt, de alrededor de 12 nt a alrededor de 20 nt, de alrededor de 12 nt a alrededor de 19 nt. Por ejemplo, el segmento dirigido a ADN puede tener una longitud de alrededor de 19 nt a alrededor de 20 nt, de alrededor de 19 nt a alrededor de 25 nt, de alrededor de 19 nt a alrededor de 30 nt, de alrededor de 19 nt a alrededor de 35 nt, de alrededor de 19 nt a alrededor de 40 nt, de alrededor de 19 nt a alrededor de 45 nt, de alrededor de 19 nt a alrededor de 50 nt, de alrededor de 19 nt a alrededor de 60 nt, de alrededor de 19 nt a alrededor de 70 nt, de alrededor de 19 nt a alrededor de 80 nt, de alrededor de 19 nt a alrededor de 90 nt, de alrededor de 19 nt a alrededor de 100 nt, de alrededor de 20 nt a alrededor de 25 nt, de alrededor de 20 nt a alrededor de 30 nt, de alrededor de 20 nt a alrededor de 35 nt, de alrededor de 20 nt a alrededor de 30 nt, de alrededor de 20 nt a alrededor de 40 nt, de alrededor de 20 nt a alrededor de 45 nt, de alrededor de 20 nt a alrededor de 50 nt, de alrededor de 20 nt a alrededor de 60 nt, de alrededor de 20 nt a alrededor de 70 nt, de alrededor de 20 nt a alrededor de 80 nt, de alrededor de 20 nt a alrededor de 90 nt, de alrededor de 20 nt a alrededor de 100 nt. La secuencia de nucleotidos (la secuencia dirigida a ADN) del segmento dirigido a ADN que es complementario a una secuencia de nucleotidos (secuencia objetivo) del ADN objetivo puede tener una longitud de al menos alrededor de 12 nt. Por ejemplo, una secuencia dirigida a ADN del segmento dirigido a ADN que es complementario a una secuencia objetivo del ADN objetivo puede tener una longitud de al menos alrededor de 12 nt, al menos alrededor de 15 nt, al menos alrededor de 18 nt, al menos alrededor de 19 nt, al menos alrededor de 20 nt, al menos alrededor de 25 nt, al menos alrededor de 30 nt, al menos alrededor de 35 nt, al menos alrededor de 40 nt. Por ejemplo, la secuencia dirigida a ADN del segmento dirigido a ADN que es complementario a la secuencia objetivo del aDn objetivo puede tener una longitud de alrededor de 12 nucleotidos (nt) a alrededor de 80 nt, de alrededor de 12 nt a alrededor de 50 nt, de alrededor de 12 nt a alrededor de 45 nt, de alrededor de 12 nt a alrededor de 40 nt, de alrededor de 12 nt a alrededor de 35 nt, de alrededor de 12 nt a alrededor de 30 nt, de alrededor de 12 nt a alrededor de 25 nt, de alrededor de 12 nt a alrededor de 20 nt, de alrededor de 12 nt a alrededor de 19 nt, de alrededor de 19 nt a alrededor de 20 nt, de alrededor de 19 nt a alrededor de 25 nt, de alrededor de 19 nt a alrededor de 30 nt, de alrededor de 19 nt a alrededor de 35 nt, de alrededor de 19 nt a alrededor de 40 nt, de alrededor de 19 nt a alrededor de 45 nt, de alrededor de 19 nt a alrededor de 50 nt, de alrededor de 19 nt a alrededor de 60 nt, de alrededor de 20 nt a alrededor de 25 nt, de alrededor de 20 nt a alrededor de 30 nt, de alrededor de 20 nt a alrededor de 35 nt, de alrededor de 20 nt a alrededor de 40 nt, de alrededor de 20 nt a alrededor de 45 nt, de alrededor de 20 nt a alrededor de 50 nt, de alrededor de 20 nt a alrededor de 60 nt. La secuencia de nucleotidos (la secuencia dirigida a ADN) del segmento dirigido a ADN que es complementario a una secuencia de nucleotidos (secuencia objetivo) del ADN objetivo puede tener una longitud de al menos alrededor de 12 nt.
En algunos casos, la secuencia dirigida a ADN del segmento dirigido a ADN que es complementario a una secuencia objetivo del ADN objetivo tiene 20 nucleotidos de longitud. En algunos casos, la secuencia dirigida a ADN del segmento dirigido a ADN que es complementario a una secuencia objetivo del ADN objetivo tiene 19 nucleotidos de longitud.
El porcentaje de complementariedad entre la secuencia dirigida a ADN del segmento dirigido a ADN y la secuencia
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objetivo del ADN objetivo puede ser al menos de 60 % (por ejemplo, al menos 65 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 97%, al menos 98 %, al menos 99 % o 100 %). En algunos casos, el porcentaje de complementariedad entre la secuencia dirigida a ADN del segmento dirigido a ADN y la secuencia objetivo del ADN objetivo es 100 % dentro de los siete nucleotidos contiguos mas cercanos al extremo 5' de la secuencia objetivo de la cadena complementaria del ADN objetivo. En algunos casos, el porcentaje de complementariedad entre la secuencia dirigida a ADN del segmento dirigido a ADN y la secuencia objetivo del ADN objetivo es al menos 60 % dentro de alrededor de 20 nucleotidos continuos. En algunos casos, el porcentaje de complementariedad entre la secuencia dirigida a ADN del segmento dirigido a ADN y la secuencia objetivo del ADN objetivo es 100 % dentro de los catorce nucleotidos contiguos mas cercanos al extremo 5' de la secuencia objetivo de la cadena complementaria del ADN objetivo y tan bajo como 0 % dentro del resto. En dicho caso, puede considerarse que la secuencia dirigida a ADN tiene 14 nucleotidos de longitud (ver Figuras 12D-E). En algunos casos, el porcentaje de complementariedad entre la secuencia dirigida a ADN del segmento dirigido a ADN y la secuencia objetivo del ADN objetivo es 100 % dentro de los siete nucleotidos contiguos mas cercanos al extremo 5' de la secuencia objetivo de la cadena complementaria del ADN objetivo y tan bajo como 0 % dentro del resto. En dicho caso, puede considerarse que la secuencia dirigida a ADN tiene 7 nucleotidos de longitud.
Segmento de union a proteinas de un ARN dirigido a ADN
El segmento de union a proteinas de un ARN dirigido a ADN de la invencion interactua con un polipeptido modificador dirigido al sitio. El ARN dirigido a ADN de la invencion guia al polipeptido unido a una secuencia de nucleotidos especifica dentro del ADN objetivo a traves del segmento dirigido a ADN mencionado anteriormente. El segmento de union a proteinas de un ARN dirigido a ADN de la invencion comprende dos tramos de nucleotidos que son complementarios entre si. Los nucleotidos complementarios del segmento de union a proteinas se hibridan para formar un duplex de ARN de cadena doble (ARNcd) (ver Figuras 1A y 1B).
Un ARN dirigido a ADN de molecula doble de la invencion comprende dos moleculas separadas de ARN. Cada una de las dos moleculas de ARN de un ARN dirigido a ADN de molecula doble de la invencion comprende una extension de nucleotidos que son complementarios entre si, de forma que los nucleotidos complementarios de las dos moleculas de ARN se hibridan para formar el duplex de ARN de cadena doble del segmento de union a proteinas (Figura 1A).
En algunas modalidades, el segmento formador de duplex del ARN activador es al menos alrededor de 60 % identico a una de las moleculas de ARN activador (tracrRNA) establecidas en las SEQ ID NO: 431-562, o un complemento de estas, en una extension de al menos 8 nucleotidos contiguos. Por ejemplo, el segmento formador de duplex del ARN activador (o el ADN que codifica el segmento formador de duplex del ARN activador) es identico en al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 %, al menos un 99 % o 100 % identico a una de las secuencias de tracrRNA establecidas en SEQ ID NO: 431-562, o un complemento de estas, en una extension de al menos 8 nucleotidos contiguos.
En algunas modalidades, el segmento formador de duplex del ARN activador es al menos alrededor de 60 % identico a una de las secuencias de ARN identificador (crRNA) establecidas en las SEQ ID NO: 563-679, o un complemento de estas, en una extension de al menos 8 nucleotidos contiguos. Por ejemplo, el segmento formador de duplex del ARN identificador (o el ADN que codifica el segmento formador de duplex del ARN identificador) es identico en al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 %, al menos un 99 % o 100 % identico a una de las secuencias de crRNA establecidas en SEQ ID NO: 563-679, o un complemento de estas, en una extension de al menos 8 nucleotidos contiguos.
Un ARN dirigido a ADN de molecula doble como se desvela en el presente documento puede disenarse para permitir la union controlada (es decir, condicional) de un ARN identificador con un ARN activador. Dado que un ARN dirigido a ADN de molecula doble no es funcional a menos que el ARN activador y el ARN identificador esten unidos en un complejo funcional con dCas9, un ARN dirigido a ADN de molecula doble puede ser inducible (por ejemplo, inducible por farmacos) provocando que la union entre el ARN activador y el ARN identificador sea inducible. Como un ejemplo no taxativo, los aptameros de ARN pueden usarse para regular (es decir, controlar) la union del ARN activador con el ARN identificador. Por consiguiente, el ARN activador y/o el ARN identificador pueden comprender una secuencia de aptamero de ARN.
Los aptameros de ARN son conocidos en la tecnica y generalmente son una version sintetica de un ribointerruptor. Las expresiones "aptamero de ARN" y "ribointerruptor" se usan de manera intercambiable en la presente para abarcar secuencias de acido nucleico sinteticas y naturales que proporcionan regulacion inducible de la estructura (y por lo tanto la disponibilidad de las secuencias especificas) de la molecula de ARN de la que son parte. Los aptameros de ARN normalmente comprenden una secuencia que se pliega en una estructura en particular (por ejemplo, una horquilla), la cual une especificamente a un farmaco en particular (por ejemplo, a una molecula pequena). La union del farmaco provoca un cambio estructural en el pliegue del ARN, el cual cambia una caracteristica del acido nucleico del cual es parte el aptamero. Como ejemplos no taxativos: (i) un ARN activador con
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un aptamero puede no ser capaz de unirse al ARN identificador cognado a menos que el aptamero se una mediante el farmaco adecuado; (ii) un ARN identificador con un aptamero puede no ser capaz de unirse al ARN activador cognado a menos que el aptamero se una mediante el farmaco adecuado; y (iii) un ARN identificador y un ARN activador, cada uno de ellos con un aptamero diferente que se una a un farmaco diferente, pueden no ser capaces de unirse entre si a menos que esten presentes ambos farmacos. Tal como se ilustra en estos ejemplos, un ARN dirigido a ADN de molecula doble puede disenarse para ser inducible.
Pueden encontrarse ejemplos de aptameros y ribointerruptores, por ejemplo, en: Nakamura et al., Genes Cells. Mayo de 2012; 17(5):344-64; Vavalle et al., Future Cardiol. Mayo de 2012; 8(3):371-82; Citartan et al., Biosens Bioelectron. 15 de abril de 2012; 34(1 ):1-11; y Liberman et al., Wiley Interdiscip Rev RNA. 2012 May-Jun;3(3):369- 84.
Los ejemplos no taxativos de secuencias de nucleotidos que pueden incluirse en un ARN dirigido a ADN de molecula doble como se desvela en el presente documento incluyen cualquiera de las secuencias establecidas en las SEQ ID NO: 431-562, o complementos de estas, emparejadas con cualquiera de las secuencias establecidas en las SEQ ID NO: 563-679, o complementos de estas, que puedan hibridarse para formar un segmento de union a proteinas.
Un ARN dirigido a ADN de molecula simple de la invencion comprende dos extensiones de nucleotidos (un ARN identificador y un ARN activador) que son complementarios entre si, estan unidos de forma covalente mediante nucleotidos intermedios ("enlazadores" o "nucleotidos enlazadores") y se hibridan para formar el duplex de ARN de cadena doble (duplex de ARNcd) del segmento de union a proteinas, dando como resultado una estructura de tallo- bucle (Figura 1B). El ARN identificador y el ARN activador pueden estar unidos covalentemente mediante el extremo 3' del ARN identificador y el extremo 5' del ARN activador. De manera alternativa, el ARN identificador y el ARN activador pueden estar unidos covalentemente mediante el extremo 5' del ARN identificador y el extremo 3' del ARN activador.
El enlazador de un ARN dirigido a ADN de molecula simple puede tener una longitud de alrededor de 3 nucleotidos a alrededor de 100 nucleotidos. Por ejemplo, el enlazador puede tener una longitud de alrededor de 3 nucleotidos (nt) a alrededor de 90 nt, de alrededor de 3 nucleotidos (nt) a alrededor de 80 nt, de alrededor 3 nucleotidos (nt) a alrededor de 70 nt, de alrededor de 3 nucleotidos (nt) a alrededor de 60 nt, de alrededor de 3 nucleotidos (nt) a
alrededor de 50 nt, de alrededor de 3 nucleotidos (nt) a alrededor de 40 nt, de alrededor de 3 nucleotidos (nt) a
alrededor de 30 nt, de alrededor de 3 nucleotidos (nt) a alrededor de 20 nt, de alrededor de 3 nucleotidos (nt) a
alrededor de 10 nt. Por ejemplo, el enlazador puede tener una longitud de alrededor de 3 nt a alrededor de 5 nt, de
alrededor de 5 nt a alrededor de 10 nt, de alrededor de 10 nt a alrededor de 15 nt, de alrededor de 15 nt a alrededor de 20 nt, de alrededor de 20 nt a alrededor de 25 nt, de alrededor de 25 nt a alrededor de 30 nt, de alrededor de 30 nt a alrededor de 35 nt, de alrededor de 35 nt a alrededor de 40 nt, de alrededor de 40 nt a alrededor de 50 nt, de alrededor de 50 nt a alrededor de 60 nt, de alrededor de 60 nt a alrededor de 70 nt, de alrededor de 70 nt a alrededor de 80 nt, de alrededor de 80 nt a alrededor de 90 nt, de alrededor de 90 nt a alrededor de 100 nt. En algunas modalidades, el enlazador de un ARN dirigido a ADN de molecula simple tiene 4 nt.
Un ejemplo de ARN dirigido a ADN de molecula simple comprende dos extensiones complementarias de nucleotidos que se hibridan para formar un duplex de ARNcd. En algunas modalidades, una de las dos extensiones complementarias de nucleotidos del ARN dirigido a ADN de molecula simple (o el ADN que codifica la extension) es al menos alrededor de 60 % identica a una de las moleculas de ARN activador (tracrRNA) establecidas en las SEQ ID NO: 431-562, o un complemento de estas, en una extension de al menos 8 nucleotidos contiguos. Por ejemplo, una de las dos extensiones complementarias de nucleotidos de ARN dirigido a ADN de molecula simple (o el ADN que codifica la extension) es identico en al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 %, al menos un 99 % o 100 % identico a una de las secuencias de tracrRNA establecidas en las SEQ ID NO: 431-562, o un complemento de estas, en una extension de al menos 8 nucleotidos contiguos.
En algunas modalidades, una de las dos extensiones complementarias de nucleotidos del ARN dirigido a ADN de molecula simple (o el ADN que codifica la extension) es al menos alrededor de 60 % identica a una de las secuencias de ARN identificador (crRNA) establecidas en las SEQ ID NO: 563-679, o un complemento de estas, en una extension de al menos 8 nucleotidos contiguos. Por ejemplo, una de las dos extensiones complementarias de nucleotidos de ARN dirigido a ADN de molecula simple (o el ADN que codifica la extension) es identico en al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 %, al menos un 99 % o 100 % identico a una de las secuencias de crRNA establecidas en las SEQ ID NO: 563-679, o un complemento de estas, en una extension de al menos 8 nucleotidos contiguos.
Pares adecuados de crRNA y tracrRNA cognados de origen natural pueden determinarse de forma rutinaria para las SEQ ID NO: 431-679 tomando en cuenta el nombre y par de bases de la especie (para el duplex de ARNcd del dominio de union a proteinas) a la hora de determinar los pares adecuados de cognados (ver Figura 8 como un ejemplo no taxativo).
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Con relacion a un ARN dirigido a ADN de molecula simple de la invencion y a un ARN dirigido a ADN de molecula doble de la invencion, la Figura 57 demuestra que las secuencias artificiales que comparten muy poco (aproximadamente 50 % de identidad) con tracrRNA y crRNA de origen natural pueden funcionar con Cas9 para escindir ADN objetivo siempre que se conserve la estructura del dominio de union a proteinas del ARN dirigido a ADN. De esta forma, puede tomarse en cuenta la estructura plegada de ARN de un dominio de union a proteina de origen natural de un ARN dirigido a ADN para el diseno de dominios artificiales de union a proteinas (tanto versiones de moleculas dobles o de moleculas simples). Como un ejemplo no taxativo, el ARN dirigido a ADN funcional artificial de la Figura 57 se diseno con base en la estructura del segmento de union a proteinas del direccionamiento a ADN de origen natural (por ejemplo, que incluye la misma cantidad de pares de base a lo largo del duplex de ARN y que incluye la misma region "abultada" presente en el ARN de origen natural). De la misma forma que las estructuras pueden ser producidas por un experto en la tecnica para cualquier par crRNA:tracrRNA de origen natural de cualquier especie (ver SEQ ID NO: 431-679 para secuencias de crRNA y tracrRNA de una gran variedad de especies), puede disenarse un ARN dirigido a ADN artificial de forma que imite la estructura natural de una especie determinada al usar Cas9 (o un Cas9 relacionado, ver Figura 32A) para esa especie (ver figura 24 D y detalles relacionados en el Ejemplo 1). De esta forma, un ARN dirigido a ADN adecuado puede ser un ARN disenado de forma artificial (de origen no natural) que comprenda un dominio de union a proteinas disenado para imitar la estructura de un dominio de union a proteinas de un ARN dirigido a ADN de origen natural (ver las SEQ ID NO: 431679, tomando en cuenta el nombre de las especies al determinar pares adecuados de cognados).
El segmento de union a proteinas puede tener una longitud de alrededor de 10 nucleotidos a alrededor de 100 nucleotidos. Por ejemplo, el segmento de union a proteinas puede tener una longitud de alrededor de 15 nucleotidos (nt) a alrededor de 80 nt, de alrededor 15 nt a alrededor de 50 nt, de alrededor de 15 nt a alrededor de 40 nt, de alrededor de 15 nt a alrededor de 30 nt o de alrededor de 15 nt a alrededor de 25 nt.
Adicionalmente, con relacion a un ARN dirigido a ADN de molecula simple de la invencion y a un ARN dirigido a ADN de molecula doble desvelado, el duplex de ARNcd del segmento de union a proteinas puede tener una longitud de alrededor de 6 pares de base (pb) a alrededor de 50 pb. Por ejemplo, el duplex de ARNcd del segmento de union a proteinas puede tener una longitud de alrededor de 6 pb a alrededor de 40 pb, de alrededor de 6 pb a alrededor de 30 pb, de alrededor de 6 pb a alrededor de 25 pb, de alrededor de 6 pb a alrededor de 20 pb, de alrededor de 6 pb a alrededor de 15 pb, de alrededor de 8 pb a alrededor de 40 pb, de alrededor de 8 pb a alrededor de 30 pb, de alrededor de 8 pb a alrededor de 25 pb, de alrededor de 8 pb a alrededor de 20 pb, de alrededor de 8 pb a alrededor de 15 pb. Por ejemplo, el duplex de ARNcd del segmento de union a proteinas puede tener una longitud de alrededor de 8 pb a alrededor de 10 pb, de alrededor de 10 pb a alrededor de 15 pb, de alrededor de 15 pb a alrededor de 18 pb, de alrededor de 18 pb a alrededor de 20 pb, de alrededor de 20 pb a alrededor de 25 pb, de alrededor de 25 pb a alrededor de 30 pb, de alrededor de 30 pb a alrededor de 35 pb, de alrededor de 35 pb a alrededor de 40 pb, de alrededor de 40 pb a alrededor de 50 pb. En algunas modalidades, el duplex de ARNcd del segmento de union a proteinas tiene una longitud de 36 pares de base. El porcentaje de complementariedad entre las secuencias de nucleotidos que hibridan para formar el duplex de ARNcd del segmento de union a proteinas puede ser al menos alrededor de 60 %. Por ejemplo, el porcentaje de complementariedad entre las secuencias de nucleotidos que hibridan para formar el duplex de ARNcd del segmento de union a proteinas puede ser al menos alrededor de 65 %, al menos alrededor de 70 %, al menos alrededor de 75 %, al menos alrededor de 80 %, al menos alrededor de 85 %, al menos alrededor de 90 %, al menos alrededor de 95 %, al menos alrededor de 98 % o al menos alrededor de 99 %. En algunos casos, el porcentaje de complementariedad entre las secuencias de nucleotidos que hibridan para formar el duplex de ARNcd del segmento de union a proteinas es 100 %.
Polipeptido modificador dirigido al sitio
Un ARN dirigido a ADN de la invencion y un polipeptido modificador dirigido al sitio de la invencion forman un complejo. El ARN dirigido a ADN proporciona especificidad de direccionamiento al complejo, ya que comprende una secuencia de nucleotidos que es complementaria a una secuencia de un ADN objetivo (como se menciono anteriormente). El polipeptido modificador dirigido al sitio del complejo proporciona la actividad especifica del sitio. En otras palabras, el polipeptido modificador dirigido al sitio se dirige a una secuencia de ADN (por ejemplo, una secuencia cromosomica o una secuencia extracromosomica, por ejemplo, una secuencia episomal, una secuencia de minicirculos, una secuencia mitocondrial, una secuencia de cloroplasto, etc.) en virtud de su asociacion con al menos el segmento de union a proteinas del ARN dirigido a ADN (descrito anteriormente).
Un polipeptido modificador dirigido al sitio de la invencion modifica el ADN objetivo (por ejemplo, la escision o metilacion de ADN objetivo) y/o un polipeptido asociado con ADN objetivo (por ejemplo, metilacion o acetilacion de una cola de histona). En la presente, tambien se hace referencia a un polipeptido modificador dirigido al sitio como "polipeptido dirigido al sitio" o un "polipeptido modificador dirigido al sitio de union a ARN".
En algunos casos, el polipeptido modificador dirigido al sitio es un polipeptido modificador de origen natural. En otros casos, el polipeptido modificador dirigido al sitio no es un polipeptido de origen natural (por ejemplo, un polipeptido quimerico como se describe mas adelante o un polipeptido de origen natural que es modificado, por ejemplo, mutacion, eliminacion, insercion).
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Se establecen ejemplos de polipeptidos modificadores dirigidos al sitio de origen natural en las SEQ ID NO: 1-255 como una enumeracion no taxativa y no exhaustiva de endonucleasas Cas9/Csn1 de origen natural. Estos polipeptidos de origen natural, tal como se describe en la presente, se unen a un ARN dirigido a ADN, estan, de esta forma, dirigidos a una secuencia espedfica dentro de un ADN objetivo, y escinden el ADN objetivo para generar una rotura de cadena doble. Un polipeptido modificador dirigido al sitio de la invencion comprende dos partes: una parte de union a ARN y una parte de actividad. En algunas modalidades, un polipeptido modificador dirigido al sitio de la invencion comprende: (i) una parte de union a ARN que interactua con un ARN dirigido a ADN, donde el ARN dirigido a ADN comprende una secuencia de nucleotidos que es complementaria a una secuencia en un ADN objetivo; y (ii) una parte de actividad que presenta actividad enzimatica dirigida al sitio (por ejemplo, actividad para metilacion de ADN, actividad para la escision de ADN, actividad para la acetilacion de histona, etc.), donde el sitio de actividad enzimatica esta determinado por el ARN dirigido a ADN.
En otras modalidades, un polipeptido modificador dirigido al sitio de la invencion comprende: (i) una parte de union a ARN que interactua con un aRn dirigido a ADN, donde el ARN dirigido a ADN comprende una secuencia de nucleotidos que es complementaria a una secuencia en un ADN objetivo; y (ii) una parte de actividad que modula la transcripcion dentro del ADN objetivo (por ejemplo, para aumentar o disminuir la transcripcion), donde el sitio de transcripcion modulada dentro del ADN objetivo esta determinado por el ARN dirigido a ADN.
En algunos casos, un polipeptido modificador dirigido al sitio de la invencion tiene actividad enzimatica que modifica al ADN objetivo (por ejemplo, actividad de nucleasa, actividad de metiltransferasa, actividad de desmetilasa, actividad de reparacion del ADN, actividad de dano al ADN, actividad de desaminacion, actividad de dismutasa, actividad de alquilacion, actividad de depurinacion, actividad de oxidacion, actividad de formacion de dimeros de pirimidina, actividad de integrasa, actividad de transposasa, actividad de recombinasa, actividad de polimerasa, actividad de ligasa, actividad de helicasa, actividad de fotoliasa o actividad de glicosilasa).
En otros casos, un polipeptido modificador dirigido al sitio tiene actividad enzimatica que modifica al polipeptido (por ejemplo, una histona) asociado con ADN objetivo (por ejemplo, actividad de metiltransferasa, actividad de desmetilasa, actividad de acetiltransferasa, actividad deacetilasa, actividad de cinasa, actividad de fosfatasa, actividad de ubiquitina ligasa, actividad desubiquitinante, actividad de adenilacion, actividad de desadenilacion, actividad de SUMOilacion, actividad de deSUMOilacion, actividad de ribosilacion, actividad de desribosilacion, actividad de miristoilacion o actividad de demiristoilacion).
Ejemplos de polipeptidos modificadores dirigidos al sitio
En algunos casos, el polipeptido modificador dirigido al sitio comprende una secuencia de aminoacidos con al menos alrededor de 75 %, al menos alrededor de 80 %, al menos alrededor de 85 %, al menos alrededor de 90 %, al menos alrededor de 95 %, al menos alrededor de 99 %, o 100 % de identidad de secuencia de aminoacidos con los aminoacidos 7-166 o 731-1003 de la secuencia de aminoacidos Cas9/Csn1 ilustrada en la Figura 3 o a las partes correspondientes en cualquiera de las secuencias de aminoacidos establecidas como SEQ ID NO: 1-256 y 7951346.
Modification de acidos nucleicos
En algunas modalidades, un acido nucleico de la invencion (por ejemplo, un ARN dirigido a ADN) comprende una o mas modificaciones, por ejemplo, una modificacion de base, una modificacion de la estructura, etc., para proporcionarle al acido nucleico una caracteristica nueva o mejorada (por ejemplo, estabilidad mejorada). Tal como se conoce en la tecnica, un nucleosido es una combination base-azucar. La parte de base del nucleosido es comunmente una base heterociclica. Las dos clases mas comunes de tales bases heterociclicas son las purinas y las pirimidinas. Los nucleotidos son nucleosidos que incluyen ademas un grupo fosfato unido covalentemente a la parte de azucar del nucleosido. Para aquellos nucleosidos que incluyen un azucar pentofuranosilo, el grupo fosfato puede unirse al resto de hidroxilo 2', 3' o 5' del azucar. En la formacion de oligonucleotidos, los grupos fosfato unen covalentemente entre si a los nucleosidos adyacentes para formar un compuesto polimerico lineal. A su vez, los extremos respectivos de este compuesto polimerico lineal puede unirse ademas para formar un compuesto circular; no obstante, los compuestos lineales normalmente son adecuados. Adicionalmente, los compuestos lineales pueden tener una complementariedad interna de base de nucleotidos y puede, por lo tanto, plegarse de forma que produzca un compuesto total o parcialmente de cadena doble. Dentro de los oligonucleotidos, generalmente se hace referencia a los grupos de fosfato como formadores de la estructura de internucleosido del oligonucleotido. La union normal o estructura principal de ARN y ADN es un enlace de fosfodiester de 3' a 5'.
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Estructuras modificadas y enlaces intemucleosidos modificados.
Los ejemplos de acidos nucleicos adecuados que contienen modificaciones incluyen acidos nucleicos que contienen estructuras modificadas o enlaces intemucleosidos no naturales. Los acidos nucleicos (con estructuras modificadas) incluyen aquellos que retienen un atomo de fosforo en la estructura y aquellos que no tienen un atomo de fosforo en la estructura.
Las estructuras de oligonucleotidos modificadas adecuadas que contienen un atomo de fosforo en estas incluyen, por ejemplo, fosforotioatos, fosforotioatos quirales, fosforoditioates, fosfotriesteres, aminoalquilfosfotriesteres, metilo y otros fosfonatos de alquilo incluyendo fosfonatos de 3'-alquileno, fosfonatos de 5'-alquileno y fosfonatos quirales, fosfinatos, fosforamidatos incluyendo 3'-amino fosforamidato y aminoalquilfosforamidatos, tionofosforamidatos, tionoalquilfosfonatos, tionoalquilfosfotriesteres, selenofosfatos y boranofosfatos con enlaces 3'-5' normales, analogos unidos por 2'-5' de estos y aquellos con polaridad invertida donde uno o mas enlaces internucleotidos es un enlace 3' a 3', 5' a 5' o 2' a 2'. Los oligonucleotidos adecuados que tienen polaridad invertida comprenden un unico enlace 3' a 3' en el enlace internucleotido mas cercano a 3', es decir, un unico residuo nucleosido invertido que puede ser basico (le falta la nucleobase o tiene un grupo hidroxilo en su lugar). Tambien se incluyen varias sales (tales como, por ejemplo, de potasio o sodio), sales mixtas o formas acidas libres.
En algunas modalidades, un acido nucleico de la invencion comprende uno o mas enlaces intemucleosidos fosforotioato y/o de heteroatomo, en particular -CH2-NH-O-CH2-, -CH2-N(CH3)-O-CH2- (conocido como estructura de metileno (metilimino) o MMI), -CH2-O-N(CH3)-CH2-, -CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2- y -O-N(CH3)-CH2-CH2- (donde el enlace internucleotido natural fosfodiester se representa como -0-P(=O)(OH)-O-CH2-). Los tipos MMI de enlaces intemucleosidos se describen en la antes mencionada patente estadounidense n.° 5.489.677. Los enlaces intemucleosidos de amidas adecuados se describen en la patente estadounidense n.° 5.602.240.
Tambien son adecuados los acidos nucleicos que tienen estructuras de morfolino tal como las descritas en, por ejemplo, las patentes estadounidenses n.° 5.034.506. Por ejemplo, en algunas modalidades, un acido nucleico de la invencion comprende un anillo de morfolino de 6 miembros en el lugar de un anillo de ribosa. En algunas de estas modalidades, un enlace internucleosido de fosforodiamidato u otro no fosfodiester reemplaza a un enlace fosfodiester.
Las estructuras modificadas de polinucleotidos adecuadas que no incluyen un atomo de fosforo en ellas tienen estructuras formadas por enlaces intemucleosidos alquilo o cicloalquilo de cadena corta, enlaces intemucleosidos alquilo o cicloalquilo mixtos de heteroatomo o uno o mas enlaces intemucleosidos heteroatomicos o heterociclicos de cadena corta. Estos incluyen los que tienen enlaces de morfolina (formados en parte por la parte de azucar de un nucleosido); estructuras de siloxano; estructuras de sulfuro, sulfoxido y sulfona; estructuras de formacetilo y tioformacetilo; estructuras de metileno formacetilo y tioformacetilo; estructuras de riboacetilo; estructuras que convienen alqueno; estructuras de sulfamato; estructuras de metilenimino y metilenhidracino; estructuras de sulfonato y sulfonamida; estructuras de amida; y otras que tienen mezclas con partes de los componentes N, O, S and CH2.
Mimeticos
Un acido nucleico de la invencion puede ser un mimetico de acido nucleico. El termino "mimetico" como se aplica a los polinucleotidos se pretende que incluya polinucleotidos donde solamente el anillo de furanosa o tanto el anillo de furanosa y el enlace internucleotidos se reemplazan con grupos no furanosa, el reemplazo de solamente el anillo de furanosa tambien se menciona en la tecnica como un sustituto de azucar. El resto de base heterociclica o un resto de base heterociclica modificada se mantiene para la hibridacion con un acido nucleico objetivo adecuado. Tal compuesto de acido nucleico, un mimetico de polinucleotido que se ha demostrado que tiene excelentes propiedades de hibridacion, se menciona como un acido nucleico peptidico (PNA, por sus siglas en ingles). En el PNA, la estructura de azucar de un polinucleotido se reemplaza con una estructura que contiene amida, en particular una estructura de aminoetilglicina. Los nucleotidos se conservan y se unen directa o indirectamente a atomos de nitrogeno aza de la parte amida de la estructura.
Un mimetico de polinucleotido que se ha descrito como que tiene excelentes propiedades de hibridacion, se menciona como un acido nucleico peptidico (PNA). La estructura en compuestos de PNA es de dos o mas unidades de aminoetilglicina unidas que le proporciona a PNA una amida que contiene una estructura. Los restos de base heterociclica unen directa o indirectamente a atomos de nitrogeno aza de la parte amida de la estructura. Las patentes estadounidenses representativas que describen la preparacion de compuestos de PNA incluyen, de modo no taxativo: las patentes estadounidenses n.°. 5.539.082; 5.714.331; y 5.719.262.
Otra clase de mimetico de polinucleotido que ha sido estudiada se basa en unidades de morfolino unidas (acido nucleico de morfolino) que tienen bases heterociclicas acopladas al anillo de morfolino. Se ha descrito una cantidad de grupos de union que se unen a las unidades monomericas de morfolino en un acido nucleico de morfolino. Una clase de grupos de union se ha seleccionado para proporcionar un compuesto oligomerico no ionico. Es menos probable que los compuestos oligomericos a base de morfolino no ionicos tengan interacciones no deseadas con
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protemas celulares. Los polinucleotidos a base de morfolino son mimeticos no ionicos de oligonucleotidos que es menos probable que formen interacciones no deseadas con protemas celulares (Dwaine A. Braasch y David R. Corey, Biochemistry, 2002, 41(14), 4503-4510). Los polinucleotidos a base de morfolino se describen en la patente estadounidense n.° 5.034.506. Se ha preparado varios compuestos dentro de la clase de morfolino de polinucleotidos, los cuales tienen varios grupos de union diferentes que unen las subunidades monomericas.
Una clase adicional de mimeticos de polinucleotidos se denomina acidos nucleicos de ciclohexenilo (CeNA). El anillo de furanosa que esta presente normalmente en una molecula de ADN/ARN se reemplaza con un anillo de ciclohexenilo. Los monomeros de fosforamidita protegidos con DMT CeNA se prepararon y usaron para la sintesis de compuestos oligomericos siguiendo la quimica de fosforamidita clasica. Se han preparado y estudiado los compuestos oligomericos de CeNA modificados y oligonucleotidos que tienen posiciones especificas modificadas con CeNA (vease Wang et al., J. Am. Chem. Soc., 2000, 122, 8595-8602). En general, la incorporacion de monomeros de CeNA en una cadena de ADN aumenta su estabilidad de un hibrido de ADN/ARN. Los oligoadenilatos de CeNA formaron complejos con complementos de ARN y ADN con estabilidad similar a los complejos naturales. El estudio de la incorporacion de estructuras de CeNA en estructuras de acido nucleico natural se demostro mediante NMR y dicroismo circular para proceder con una adaptacion conformacional sencilla.
Una modificacion adicional incluye acidos nucleicos bloqueados (LNA, por sus siglas en ingles) en los cuales el grupo 2'-hidroxilo esta unido al atomo de carbono de la posicion 4' del anillo de azucar, lo cual forma un enlace 2'- C,4'-C-oximetileno, lo cual forma un resto de azucar bidclico. El enlace puede ser un grupo metileno (-CH2-) puenteando el atomo de oxigeno en la posicion 2' y el atomo de carbono en la posicion 4', donde n es 1 o 2 (Singh et al., Chem. Commun., 1998, 4, 455-456). Los LNA y los analogos de LNA presentan estabilidades termicas de duplex altas con ADN y ARN complementarios (Tf=+3 a +10 °C), estabilidad hacia la degradacion exonucleolotica en la posicion 3' y propiedades de solubilidad adecuadas. Se han descrito oligonucleotidos antisentido potentes y no toxicos que contienen LNA (Wahlestedt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 2000, 97, 5633-5638).
Se ha descrito la sintesis y preparacion de los monomeros de LNA adenina, citosina, guanina, 5-metil-citosina, timina y uracilo, junto con su oligomerizacion y propiedades de reconocimiento de acidos nucleicos (Koshkin et al., Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630). Tambien se describieron los LNA y su preparacion en los documentos WO 98/39352 y WO 99/14226.
Restos con azucar modificado
Un acido nucleico de la invencion tambien puede incluir uno o mas restos de azucar sustituidos. Los polinucleotidos adecuados comprenden un grupo sustituyente de azucar que se selecciona de: OH; F; O-, S-, o N-alquilo; O-, S-, o N-alquenilo; O-, S-, o N-alquinilo; o O-alquilo-O-alquilo, donde el alquilo, alquenilo y alquinilo pueden ser alquilo C.sub.1 a C10 o alquenilo y alquinilo C2 a C10 sustituidos o no sustituidos. Tambien O((CH2)nO) mCH3, O(CH2)nOCH3, O(CH2)nNH2, O(CH2)nCH3, O(CH2)nONH2 y O(CH2)nON((CH2)nCH3)2 son particularmente adecuados, donde n y m son de 1 a alrededor de 10. Otros polinucleotidos adecuados comprenden un grupo sustituyente de azucar que se selecciona de: alquilo Ci a C10, alquilo inferior sustituido, alquenilo, alquinilo, alcarilo, aralquilo, O-alcarilo u O- aralquilo, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, heterocicloalquilo, heterocicloalcarilo, aminoalquilamino, polialquilamino, sililo sustituido, un grupo de escision de ARN, un grupo indicador, un intercalador, un grupo para mejorar las propiedades farmacocineticas de un oligonucleotido o un grupo para mejorar las propiedades farmacodinamicas de un oligonucleotido, y otros sustituyentes que tengan propiedades similares. Una modificacion adecuada incluye 2'-metoxietoxi (2-O-CH2 CH2OCH3, tambien conocido como 2'-O-(2- metoxietil) o 2'-MOE) (Martin et al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504) es decir, un grupo alcoxialcoxi. Una modificacion adecuada adicional incluye 2'-dimetilaminooxietoxi, es decir, un grupo O(CH2)2ON(CH3)2, tambien conocido como 2'-DMAOE, como se describe en los ejemplos de la presente mas adelante, y 2'- dimetilaminoetoxietoxi (tambien conocido en la tecnica como 2'-O-dimetil-amino-etoxi-etilo o 2'-DMAEOE), es decir, 2'-O-CH2-O-CH2-N(CH3)2.
Otros grupos sustituyentes de azucar incluyen metoxi (-O-CH3), aminopropoxy (--O CH2 CH2 CH2NH2), alilo (-CH2- CH=CH2), -O-alilo (--O-- CH2—CH=CH2) y fluoro (F). Los grupos sustituyentes de azucar en la posicion 2' pueden estar en la posicion arabino (superior) o la posicion ribo (inferior). Una modificacion adecuada de arabino en la posicion 2' es 2'-F. Pueden realizarse modificaciones similares en otras posiciones en el compuesto oligomerico, particularmente en la posicion 3' del azucar en el nucleosido del extremo 3' o en los oligonucleotidos unidos en la posicion 2'-5' y en la posicion 5' del nucleotido del extremo 5'. Los compuestos oligomericos tambien pueden tener mimeticos de azucar tal como restos de ciclobutilo en lugar del azucar pentofuranosilo.
Modificaciones y sustituciones de bases
Un acido nucleico de la invencion tambien puede incluir modificaciones o sustituciones de nucleobases (a veces mencionadas en la tecnica simplemente como "bases"). Tal como se usa en la presente, las nucleobases "no modificadas" o "naturales" incluyen las bases de purina adenina (A) y guanina (G) y las bases de pirimidina timina (T), citosina (C) y uracilo (U). Las nucleobases modificadas incluyen otras nucleobases sinteticas y naturales tales como 5-metilcitosina (5-me-C), 5-hidroximetil citosina, xantina, hipoxantina, 2-aminoadenina, 6-metilo y otros
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derivados de alquilo de adenina y guanina, 2-propilo y otros derivados de alquilo de adenina y guanina, 2-tiouracilo, 2-tiotimina y 2-tiocitosina, 5-halouracila y citosina, 5-propinilo (-C=C-CH3) uracilo y citosina y otros derivados de alquinilo de bases de pirimidina, 6-azo uracilo, citosina y timina, 5-uracilo (pseudouracilo), 4-tiouracilo, 8-halo, 8- amino, 8-tiol, 8-tioalquilo, 8-hidroxilo y otras adeninas y guaninas 8-sustituidas, 5-halo particularmente 5-bromo, 5- trifluorometilo y otros uracilos y citosinas 5-sustituidos, 7-metilguanina y 7-metiladenina, 2-F-adenina, 2-amino- adenina, 8-azaguanina y 8-azaadenina, 7-deazaguanina y 7-deazaadenina y 3-deazaguanina y 3-deazaadenina. Las nucleobases modificadas adicionales incluyen pirimidinas tridclicas, tal como fenoxazina citidina(1H-pirimido(5,4- b)(1,4)benzoxazin-2(3H)-ona), fenotiazina citidina (1H-pirimido(5,4-b)(1,4)benzotiazin-2(3H)-ona), abrazaderas en G tal como una fenoxazina citidina sustituida (por ejemplo, 9-(2-aminoetoxi)-H-pirimido(5,4-(b) (1,4)benzoxazin-2(3H)- ona), carbazol citidina (2H-pirimido(4,5-b)indol-2-ona), piridoindol citidina (H-pirido(3',2':4,5)pirrolo(2,3-d)pirimidin-2- ona).
Los restos de bases heterociclicas tambien pueden incluir aquellas en las cuales la base de purina o pirimidina es reemplazada con otros heterociclos, por ejemplo 7-deaza-adenina, 7-deazaguanosina, 2-aminopiridina y 2-piridona. Las nucleobases adicionales incluyen las descritas en la patente estadounidense n.° 3.687.808, las descritas en The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, paginas 858-859, Kroschwitz, J. I., ed. John Wiley & Sons, 1990, las descritas por Englisch et al., Angewandte Chemie, edicion internacional, 1991, 30, 613, y las descritas por Sanghvi, Y. S., Capitulo 15, Antisense Research and Applications, paginas 289-302, Crooke, S. T. y Lebleu, B., ed., CRC Press, 1993. Determinadas de estas nucleobases son utiles para aumentar la afinidad de union de un compuesto oligomerico. Estas incluyen pirimidinas 5-sustituidas, 6-azapirimidinas y purinas sustituidas con N- 2, N-6 y O-6, incluyendo 2-aminopropiladenina, 5-propiniluracilo y 5-propinilcitosina. Se ha demostrado que las sustituciones de 5-metilcitosina aumentan la estabilidad en duplex del acido nucleico por 0,6-1,2 °C (Sanghvi et al., eds., Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278) y son sustituciones de bases adecuadas, por ejemplo, cuando se combinan con modificaciones de azucar 2'-O-metoxietilo.
Conjugados
Otra modificacion posible de un acido nucleico de la invencion implica el enlace quimico a un polinucleotido de uno o mas restos o conjugados que mejoran la actividad, distribucion celular o absorcion celular del oligonucleotido. Estos restos o conjugados pueden incluir grupos conjugados unidos de manera covalente a grupos funcionales tal como grupos hidroxilo primarios o secundarios. Los grupos conjugados incluyen, de modo no taxativo, intercaladores, moleculas indicadoras, poliaminas, poliamidas, polietilenglicoles, polieteres, grupos que mejoran las propiedades farmacodinamicas de oligomeros, y grupos que mejoran las propiedades farmacocineticas de oligomeros. Los grupos de conjugados adecuados incluyen, de modo no taxativo, colesteroles, lipidos, fosfolipidos, biotina, fenazina, folato, fenantridina, antraquinona, acridina, fluoresceinas, rodaminas, cumarinas y tintes. Los grupos que mejoran las propiedades farmacodinamicas incluyen grupos que mejoran la absorcion, mejoran la resistencia a la degradation y/o refuerzan la hibridacion especifica de secuencia con el acido nucleico objetivo. Los grupos que mejoran las propiedades farmacocineticas incluyen grupos que mejoran la absorcion, distribucion, metabolismo o excretion de un acido nucleico de la invencion.
Los restos conjugados incluyen, de modo no taxativo, restos lipidos tales como un resto colesterol (Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86, 6553-6556), acido colico (Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1994, 4, 1053-1060), un tioeter, por ejemplo, hexil-S-tritiltiol (Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660, 306-309; Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3, 2765-2770), un tiocolesterol (Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20, 533-538), una cadena alifatica, por ejemplo, residuos de dodecandiol o undecilo (Saison-Behmoaras et al., EMBO J., 1991, 10, 1111-1118; Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259, 327-330; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75, 49-54), un fosfolipido, por ejemplo, 1,2-di-O-hexadecil-rac-glicero-3-H-fosfonato de di-hexadecil-rac- glicerol o trietilamonio (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654; Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18, 3777-3783), una cadena de poliamina o polietilenglicol (Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14, 969-973), o acido adamantano acetico (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654), un resto de palmitilo (Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264, 229-237), o un resto de octadecilamina o hexilamino-carbonil-oxicolesterol (Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277, 923-937.\
Un conjugado puede incluir un "dominio de transduction de proteinas" o PTD (por sus siglas en ingles) (tambien conocido como CPP, por sus siglas en ingles - peptido penetrante de celulas), que puede referirse a un polipeptido, polinucleotido, carbohidrato o compuesto organico o inorganico que facilita atravesar una bicapa lipidica, micela, membrana celular, membrana de organulo o membrana de vesicula. Un PTD unido a otra molecula, que puede variar entre una molecula polar pequena y una macromolecula grande y/o una nanoparticula, facilita que la molecula atraviese una membrana, por ejemplo, que vaya desde el espacio extracelular hacia el espacio intracelular, o citosol hacia el interior de un organulo. En algunas modalidades, una PTD esta unida de manera covalente al extremo amino de un polipeptido exogeno (por ejemplo, un polipeptido modificador dirigido al sitio). En algunas modalidades, una PTD esta unida de manera covalente al extremo carbonilo de un polipeptido exogeno (por ejemplo, un polipeptido modificador dirigido al sitio). En algunas modalidades, un PTD esta unido de manera covalente a un acido nucleico (por ejemplo, un ARN dirigido a ADN, un polinucleotido que codifica un ARN dirigido a ADN, un polinucleotido que codifica un polipeptido modificador dirigido al sitio, etc.). Los ejemplos de PTD incluyen, de modo no taxativo, un dominio de transduccion de proteinas de undecapeptido minimo (que corresponde a los residuos 47-
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57 de HIV-1 TAT que comprende YGRKKRRQRRR; SEQ ID NO:264); una secuencia de poliarginina que comprende una cantidad de argininas suficiente para dirigir la entrada en una celula (por ejemplo 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o 10-50 argininas); un dominio de VP22 (Zender et al. (2002) Cancer Gene Ther. 9(6):489-96); un dominio de transduccion de protema de Drosophila Antennapedia (Noguchi et al. (2003) Diabetes 52(7):1732-1737); un peptido de calcitonina humana truncada (Trehin et al. (2004) Pharm. Research 21:1248-1256); polilisina (Wender et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:13003-13008); RRQRRTSKLMKR (SEQ ID NO:265); Transportan GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL (SEQ ID NO:266); KALAWEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKCEA (SEQ ID NO:267); y RQIKIWFQNRRMKWKK (SEQ ID NO:268). Los ejemplos de PTD incluyen, de modo no taxativo, YGRKKRRQRRR (SEQ ID NO:264), RKKRRQRRR (SEQ ID NO:269); un homopoKmero de arginina de 3 residuos de arginina a 50 residuos de arginina; Las secuencias de aminoacidos del dominio PTD incluyen, de modo no taxativo, cualquiera de los siguientes: YGRKKRRQRRR (SEQ ID NO:264); RKKRRQRR (SEQ ID NO:270); YARAAARQARA (SEQ ID NO:271); THRLPRRRRRR (SEQ ID NO:272); y GGRRARRRRRR (SEQ ID NO:273). En algunas modalidades, el PTD es un CPP activable (ACPP, por sus siglas en ingles) (Aguilera et al. (2009) Integr Biol (Camb) June; 1(5-6): 371-381). Los ACPP comprenden CPP policationicos (por ejemplo, Arg9 o “R9”) conectados por medio de un enlazador escindible a un polianion coincidente (por ejemplo, Glu9 o “E9”), que reduce la carga neta a casi cero y, por lo tanto, inhiba la adhesion y absorcion en las celulas. Luego de la escision del enlazador, el polianion se libera, desenmascara localmente la poliarginina y su adhesividad inherente y, por lo tanto, "activa" el ACPP para atravesar la membrana.
Ejemplos de ARN dirigidos a ADN
Un tipo de ARN dirigido a ADN desvelado en el presente documento comprende dos moleculas de polinucleotidos de ARN separados. La primera de las dos moleculas de polinucleotidos de ARN (el ARN activador) comprende una secuencia de nucleotidos que tiene al menos alrededor 60 %, al menos alrededor 65 %, al menos alrededor 70 %, al menos alrededor 75 %, al menos alrededor 80 %, al menos alrededor 85 %, al menos alrededor 90%, al menos alrededor 95 %, al menos alrededor 98 %, al menos alrededor 99 % o 100 % de identidad de secuencia de nucleotidos sobre una extension de al menos 8 nucleotidos contiguos con respecto a cualquiera de las secuencias de nucleotidos establecidas en las SEQ ID NO:431-562, o complementos de estas. La segunda de las dos moleculas de polinucleotidos de ARN (el ARN identificador) comprende una secuencia de nucleotidos que tiene al menos alrededor 60 %, al menos alrededor 65 %, al menos alrededor 70 %, al menos alrededor 75 %, al menos alrededor 80 %, al menos alrededor 85%, al menos alrededor 90 %, al menos alrededor 95 %, al menos alrededor 98 %, al menos alrededor 99 % o 100 % de identidad de secuencia de nucleotidos sobre una extension de al menos 8 nucleotidos contiguos con respecto a cualquiera de las secuencias de nucleotidos establecidas en las SEQ ID NO:563-679, o complementos de estas.
En algunas modalidades, un ARN dirigido a ADN adecuado es un polinucleotido de ARN simple y comprende una primera secuencia de nucleotidos que tiene al menos alrededor 60 %, al menos alrededor 65 %, al menos alrededor 70 %, al menos alrededor 75 %, al menos alrededor 80 %, al menos alrededor 85 %, al menos alrededor 90 %, al menos alrededor 95 %, al menos alrededor 98 %, al menos alrededor 99 % o 100 % de identidad de secuencia de nucleotidos con respecto a una extension de al menos 8 nucleotidos contiguos con respecto a cualquiera de las secuencias de nucleotidos establecidas en la SEQ ID NOs:431-562 y una segunda secuencia de nucleotidos que tiene al menos alrededor 60 %, al menos alrededor 65 %, al menos alrededor 70 %, al menos alrededor 75 %, al menos alrededor 80 %, al menos alrededor 85 %, al menos alrededor 90 %, al menos alrededor 95 %, al menos alrededor 98 %, al menos alrededor 99 % o 100 % de identidad de secuencia de nucleotidos sobre una extension de al menos 8 nucleotidos contiguos respecto a cualquiera de las secuencias de nucleotidos establecidas en las SEQ ID NO: 463-679.
Algunos ARN dirigidos a ADN desvelados en el presente documento son ARN dirigido a ADN de molecula doble y el ARN identificador comprende la secuencia 5'gUuUUAGAGCUA-3' (SEQ ID NO:679) unida en su extremo 5' a una extension de nucleotidos que son complementarios a un ADN objetivo. Algunos ARN dirigidos a ADN desvelados en el presente documento son ARN dirigidos a ADN de molecula doble y el ARN activador comprende la secuencia 5' UAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCG-3' (SEQ ID NO://).
En algunas modalidades, el ARN dirigido a ADN es un ARN dirigido a ADN de molecula simple y comprende la secuencia 5'-GUUUUAGAGCUA-enlazador-UAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCG-3' unido en su extremo 5' a una extension de nucleotidos que son complementarios a un ADN objetivo (donde "enlazador" indica cualquier secuencia de nucleotidos enlazadora que puede comprender cualquier secuencia de nucleotidos) (SEQ ID NO://). Otros ejemplos de ARN dirigido a ADN de molecula simple incluyen los establecidos en las SEQ ID NO: 680-682.
Acidos nucleicos que codifican un ARN dirigido a ADN de la invencion y/o un polipeptido modificador dirigido al sitio de la invencion
La presente descripcion proporciona un acido nucleico que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica un ARN dirigido a ADN de la invencion y/o un polipeptido modificador dirigido al sitio. En algunas modalidades, un acido nucleico que codifica un ARN dirigido a aDn de la invencion es un vector de expresion, por ejemplo, un vector de expresion recombinante.
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En algunas modalidades, un metodo de la invencion implica poner en contacto un ADN objetivo o introducir en una celula (o una poblacion de celulas) uno o mas acidos nucleicos que comprenden secuencias de nucleotidos que codifican un ARN dirigido a ADN y/o un polipeptido modificador dirigido al sitio. En algunas modalidades una celula que comprende un ADN objetivo esta in vitro. En algunas modalidades una celula que comprende un ADN objetivo esta ex vivo. Los acidos nucleicos adecuados comprenden secuencias de nucleotidos que codifican un ARN dirigido a ADN y/o un polipeptido modificador dirigido al sitio incluyen vectores de expresion, donde un vector de expresion que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica un ARN dirigido a ADN y/o un polipeptido modificador dirigido al sitio es un "vector de expresion recombinante".
En algunas modalidades, el vector de expresion recombinante es una construccion viral, por ejemplo, una construccion viral adeno-asociada recombinante (vease, por ejemplo, la patente estadounidense n.° 7.078.387), una construccion adenoviral recombinante, una construccion lentiviral recombinante, una construccion retroviral recombinante, etc.
Los vectores de expresion adecuados incluyen, de modo no taxativo, vectores virales (por ejemplo, vectores virales basados en el virus vaccinia; poliovirus; adenovirus (vease, por ejemplo, Li et al., Invest Opthalmol Vis Sci 35:2543 2549, 1994; Borras et al., Gene Ther 6:515 524, 1999; Li y Davidson, PNAS 92:7700 7704, 1995; Sakamoto et al., H Gene Ther 5:1088 1097, 1999; WO 94/12649, WO 93/03769; WO 93/19191; WO 94/28938; WO 95/11984 and WO 95/00655); virus adeno-asociado (vease, por ejemplo, Ali et al., Hum Gene Ther 9:81 86, 1998, Flannery et al., PNAS 94:6916 6921, 1997; Bennett et al., Invest Opthalmol Vis Sci 38:2857 2863, 1997; Jomary et al., Gene Ther 4:683 690, 1997, Rolling et al., Hum Gene Ther 10:641 648, 1999; Ali et al., Hum Mol Genet 5:591 594, 1996; Srivastava en WO 93/09239, Samulski et al., J. Vir. (1989) 63:3822-3828; Mendelson et al., Virol. (1988) 166:154-165; y Flotte et al., PNAS (1993) 90:10613-10617); SV40; virus del herpes simple; virus de inmunodeficiencia humana (vease, por ejemplo, Miyoshi et al., PNAS 94:10319 23, 1997; Takahashi et al., J Virol 73:7812 7816, 1999); un vector retroviral (por ejemplo, virus de leucemia murina, virus de la necrosis del bazo y vectores derivados de retrovirus tal como el virus del sarcoma de Rous, virus del sarcoma de Harvey, virus de la leucosis aviar, un lentivirus, virus de inmunodeficiencia humana, virus del sarcoma mieloproliferativo y virus del tumor mamario); y similares.
Los expertos en la tecnica conocen numerosos vectores de expresion adecuados y muchos estan disponibles comercialmente. Se proporcionan los siguientes vectores a modo de ejemplo; para celulas hospedadoras eucariotas: pXT1, pSG5 (Stratagene), pSVK3, pBPV, pMSG, and pSVLSV40 (Pharmacia). Sin embargo, puede utilizarse cualquier otro vector siempre que sea compatible con la celula hospedadora.
Dependiendo del sistema de hospedador/vector utilizado, puede utilizarse cualquier cantidad de elementos de control de la transcripcion y traduccion adecuados, inclusive promotores constitutivos e inducibles, elementos mejoradores de la transcripcion, terminadores de la transcripcion, etc., en el vector de expresion (vease, por ejemplo, Bitter et al. (1987) Methods in Enzymology, 153:516-544).
En algunas modalidades, una secuencia de nucleotidos que codifica un ARN dirigido a ADN y/o un polipeptido modificador dirigido al sitio esta unida de manera operativa a un elemento de control, por ejemplo, un elemento de control transcripcional, tal como un promotor. El elemento de control transcripcional puede ser funcional ya sea en una celula eucariota, por ejemplo, una celula de mamifero; o una celula procariota (por ejemplo, una celula bacteriana o de arquea). En algunas modalidades, una secuencia de nucleotidos que codifica un ARN dirigido a ADN y/o un polipeptido modificador dirigido al sitio esta unido de manera operativa a multiples elementos de control que permiten la expresion de la secuencia de nucleotidos que codifica un ARN dirigido a ADN y/o un polipeptido modificador dirigido al sitio tanto en celulas procariotas como eucariotas.
Los ejemplos no limitativos de promotores eucariotas adecuados (promotores funcionales en una celula eucariota) incluyen los que derivan del inmediato temprano de citomegalovirus (CMV), timidina cinasa del virus del herpes simple (VHS), SV40 temprano y tardio, repetition terminal larga (LTR) de retrovirus y metalotioneina-I de raton. La selection del vector y promotor adecuado esta dentro del nivel de un experto en la tecnica. El vector de expresion tambien puede contener un sitio de union al ribosoma para el inicio de la traduccion y un terminador de la traduccion. El vector de expresion tambien puede incluir secuencias adecuadas para amplificar la expresion. El vector de expresion tambien puede incluir secuencias de nucleotidos que codifican etiquetas proteicas (por ejemplo, etiqueta de 6xHis, etiqueta de hemaglutinina, proteina verde fluorescente, etc.) que estan fusionadas al polipeptido modificador dirigido al sitio, lo cual da como resultado un polipeptido quimerico.
En algunas modalidades, una secuencia de nucleotidos que codifica un ARN dirigido a ADN y/o un polipeptido modificador dirigido al sitio esta unida de manera operativa a un promotor inducible. En algunas modalidades, una secuencia de nucleotidos que codifica un ARN dirigido a ADN y/o un polipeptido modificador dirigido al sitio esta unida de manera operativa a un promotor constitutivo.
Los metodos para introducir un acido nucleico en una celula hospedadora son conocidos en la tecnica, y puede utilizarse cualquier metodo conocido para introducir un acido nucleico (por ejemplo, una construccion de expresion)
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en una celula. Los metodos adecuados incluyen, por ejemplo, infeccion viral o bacteriofagica, transfeccion, conjugacion, fusion de protoplastos, lipofeccion, electroporacion, precipitacion de fosfato de calcio, transfeccion mediada por polietilenimina (PEI), transfeccion mediada por DEAE-dextrano, transfeccion mediada por liposomas, tecnolog^a de canon de particulas, precipitacion de fosfato de calcio, microinyeccion directa, insercion de acido nucleico mediada por nanoparticulas (vease, por ejemplo, Panyam et al., Adv Drug Deliv Rev. 2012 Sep 13. pii: 50169-409X(12)00283-9. doi: 10.1016/j.addr.2012.09.023 ) y similares.
POLIPEPTIDOS QUIMERICOS
Se describe en el presente documento un polipeptido modificador quimerico dirigido al sitio. Un polipeptido modificador quimerico dirigido al sitio interactua con (por ejemplo, se une a) un ARN dirigido a ADN de la invencion (descrito anteriormente). El ARN dirigido a ADN guia al polipeptido modificador quimerico dirigido al sitio a una secuencia objetivo dentro del ADN objetivo (por ejemplo, una secuencia cromosomica o una secuencia extracromosomica, por ejemplo, una secuencia episomal, una secuencia de minicirculo, una secuencia mitocondrial, una secuencia de cloroplastos, etc.). Un polipeptido modificador quimerico dirigido al sitio modifica el ADN objetivo (por ejemplo, la escision o metilacion de ADN objetivo) y/o un polipeptido asociado con ADN objetivo (por ejemplo, metilacion o acetilacion de una cola de histona).
Un polipeptido modificador quimerico dirigido al sitio modifica el ADN objetivo (por ejemplo, la escision o metilacion de ADN objetivo) y/o un polipeptido asociado con ADN objetivo (por ejemplo, metilacion o acetilacion de una cola de histona). En la presente, tambien se hace referencia a un polipeptido modificador quimerico dirigido al sitio como "polipeptido quimerico dirigido al sitio" o un "polipeptido modificador quimerico dirigido al sitio de union a ARN".
Un polipeptido modificador quimerico dirigido al sitio comprende dos partes: una parte de union a ARN y una parte de actividad. Un polipeptido modificador quimerico dirigido al sitio comprende secuencias de aminoacidos que derivan de al menos dos polipeptidos diferentes. Un polipeptido quimerico modificador dirigido al sitio puede comprender secuencias de polipeptidos modificadas y/o de origen natural (por ejemplo, una primera secuencia de aminoacidos de una proteina Cas9/Csn1 modificada o no modificada; y una segunda secuencia de aminoacidos diferente a la proteina Cas9/Csn1).
Parte de union al ARN
En algunos casos, la parte de union al ARN de un polipeptido modificador quimerico dirigido al sitio es un polipeptido de origen natural. En otros casos, la parte de union al ARN de un polipeptido modificador quimerico dirigido al sitio es una molecula de origen no natural (modificada, por ejemplo, mediante mutacion, elimination, insercion). Las partes de union al ARN de origen natural de interes derivan de polipeptidos modificadores dirigidos al sitio son conocidas en la tecnica. Por ejemplo, las SEQ ID NO:1-256 y 795-1346 proporcionan una lista no taxativa ni exhaustiva de endonucleasas Cas9/Csn1 de origen natural que pueden usarse como polipeptidos modificadores dirigidos al sitio. En algunos casos, la parte de union al ARN de un polipeptido modificador quimerico dirigido al sitio comprende una secuencia de aminoacidos con al menos alrededor de 75 %, al menos alrededor de 80 %, al menos alrededor de 85 %, al menos alrededor de 90 %, al menos alrededor de 95 %, al menos alrededor de 98 %, al menos alrededor de 99 % o al menos alrededor de 100 % de identidad de secuencia de aminoacidos a la parte de union al ARN de un polipeptido que tiene cualquiera de las secuencias de aminoacidos establecidas como SEQ ID NO: 1-256 y 795-1346.
En algunos casos, el polipeptido modificador dirigido al sitio comprende una secuencia de aminoacidos con al menos alrededor de 75 %, al menos alrededor de 80 %, al menos alrededor de 85 %, al menos alrededor de 90 %, al menos alrededor de 95 %, al menos alrededor de 99 %, o 100 % de identidad de secuencia de aminoacidos con los aminoacidos 7-166 o 731-1003 de la secuencia de aminoacidos Cas9/Csn1 ilustrada en la Figura 3 o a las partes correspondientes en cualquiera de las secuencias de aminoacidos establecidas como SEQ ID NO: 1-256 y 7951346.
Parte de actividad
Ademas de la parte de union al ARN, el polipeptido modificador quimerico dirigido al sitio comprende una "parte de actividad". En algunas modalidades, la parte de actividad de un polipeptido modificador quimerico dirigido al sitio comprende la parte de actividad de origen natural de un polipeptido modificador dirigido al sitio (por ejemplo, endonucleasa Cas9/Csn1). En otras modalidades, la parte de actividad de un polipeptido modificador quimerico dirigido al sitio comprende una secuencia de aminoacidos modificada (por ejemplo, sustitucion, eliminacion, insercion) de una parte de actividad de origen natural de un polipeptido modificador dirigido al sitio. Las partes de actividad de origen natural de interes derivan de polipeptidos modificadores dirigidos al sitio son conocidas en la tecnica. Por ejemplo, las SEQ ID NO:1-256 y 795-1346 proporcionan una lista no taxativa ni exhaustiva de endonucleasas Cas9/Csn1 de origen natural que pueden usarse como polipeptidos modificadores dirigidos al sitio. La parte de actividad de un polipeptido modificador quimerico dirigido al sitio es variable y puede comprender cualquier secuencia de polipeptido heterologo que pueda ser util en los metodos descritos en la presente.
En algunas modalidades, un polipeptido modificador quimerico dirigido al sitio comprende: (i) una parte de union a
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ARN que interactua con un ARN dirigido a ADN, donde el ARN dirigido a ADN comprende una secuencia de nucleotidos que es complementaria a una secuencia en un ADN objetivo; y (ii) una parte de actividad que presenta actividad enzimatica dirigida al sitio (por ejemplo, actividad para metilacion de ADN, actividad para la escision de ADN, actividad para la acetilacion de histona, actividad para la metilacion de histona, etc.), donde el sitio de actividad enzimatica esta determinado por el ARN dirigido a ADN.
En otras modalidades, un polipeptido modificador quimerico dirigido al sitio comprende: (i) una parte de union a ARN que interactua con un ARN dirigido a ADN, donde el ARN dirigido a ADN comprende una secuencia de nucleotidos que es complementaria a una secuencia en un ADN objetivo; y (ii) una parte de actividad que modula la transcripcion dentro del ADN objetivo (por ejemplo, para aumentar o disminuir la transcripcion), donde el sitio de transcripcion modulada dentro el ADN objetivo esta determinado por el ARN dirigido a ADN.
En algunos casos, la parte de actividad de un polipeptido modificador quimerico dirigido al sitio tiene actividad enzimatica que modifica al ADN objetico (por ejemplo, actividad nucleasa, actividad metiltransferasa, actividad desmetilasa, actividad de reparacion del ADN, actividad de dano al ADN, actividad de desaminacion, actividad de dismutasa, actividad de alquilacion, actividad de depurinacion, actividad de oxidacion, actividad de formacion de dimeros de pirimidina, actividad de integrasa, actividad de transposasa, actividad recombinasa, actividad polimerasa, actividad ligasa, actividad helicasa, actividad fotoliasa o actividad glicosilasa).
En otros casos, la parte de actividad del polipeptido modificador quimerico dirigido al sitio tiene una actividad enzimatica (por ejemplo, actividad de metiltransferasa, actividad de desmetilasa, actividad de acetiltransferasa, actividad de deacetilasa, actividad de cinasa, actividad de fosfatasa, actividad de ubiquitina de ligasa, actividad de desubiquitinante, actividad de adenilacion, actividad de desadenilacion, actividad de SUMOilacion, actividad de deSUMOilacion, actividad de ribosilacion, actividad de desribosilacion, actividad de miristoilacion o actividad de demiristoilacion) que modifica un polipeptido asociado con ADN objetivo (por ejemplo, una histona).
En algunos casos, la parte actividad de un polipeptido modificador quimerico dirigido al sitio presenta actividad enzimatica (descrita anteriormente). En otros casos, la parte actividad de un polipeptido modificador quimerico dirigido al sitio de la invencion modula la transcripcion del ADN objetivo (descrita anteriormente). La parte de actividad de un polipeptido modificador quimerico dirigido al sitio es variable y puede comprender cualquier secuencia de polipeptido heterologo que pueda ser util en los metodos descritos en la presente.
Ejemplos de polipeptidos modificadores quimericos dirigidos al sitio
En algunas modalidades, la parte de actividad del polipeptido modificador quimerico dirigido al sitio comprende una forma modificada de la proteina Cas9/Csn1. En algunas instancias, la forma modificada de la proteina Cas9/Csn1 comprende un cambio de aminoacidos (por ejemplo, eliminacion, insertion o sustitucion) que reduce la actividad de nucleasa de origen natural de la proteina Cas9/Csn1. Por ejemplo, en algunas instancias, la forma modificada de la proteina Cas9/Csn1 tiene menos de 50 %, menos de 40 %, menos de 30 %, menos de 20 %, menos de 10 %, menos de 5 % o menos de 1 % de la actividad de nucleasa del polipeptido Cas9/Csn1 de tipo salvaje correspondiente. En algunos casos, la forma modificada del polipeptido Cas9/Csn1 practicamente no tiene actividad de nucleasa.
En algunas modalidades, la forma modificada del polipeptido Cas9/Csn1 es una mutation D10A (aspartato a alanina en el aminoacido de la position 10 de la SEQ ID NO:8) (o la mutacion correspondiente de cualquiera de las proteinas presentadas en las SEQ ID NO:1-256 y 795-1346) que pueden escindir la cadena complementaria del ADN objetivo pero que tienen capacidad reducida de escindir la cadena no complementaria del ADN objetivo (vease la Figura 11). En algunas modalidades, la forma modificada del polipeptido Cas9/Csn1 es una mutacion H840A (histidina a alanina en el aminoacido de la posicion 840) (o la mutacion correspondiente de cualquiera de las proteinas establecidas como SEQ ID NO:1-256 y 795-1346) que pueden escindir la cadena no complementaria del ADN objetivo pero que tienen capacidad reducida de escindir la cadena complementaria del ADN objetivo (vease la Figura 11). En algunas modalidades, la forma modificada del polipeptido Cas9/Csn1 posee tanto mutaciones D10A como H840A (o las mutaciones correspondientes de cualquiera de las proteinas establecidas como SEQ ID NO:1- 256 y 795-1346) de manera que el polipeptido tiene una capacidad reducida de escindir tanto la cadena complementaria como la no complementaria del ADN objetivo. Pueden mutarse otros residuos para lograr los efectos antemencionados (es decir, inactivar una u otra parte de la nucleasa). Como ejemplos no taxativos, los residuos D10, G12, G17, E762, H840, N854, N863, H982, H983, A984, D986 y/o A987 (o las mutaciones correspondientes de cualquiera de las proteinas establecidas como SEQ ID NO:1-256 y 795-1346) pueden alterarse (es decir, sustituirse) (veanse la Figura 3, Figura 5, Figura 11A y la Tabla 1 por mas information respecto a la conservation de los residuos de aminoacidos de Cas9). Tambien son adecuadas mutaciones que no sean las sustituciones de alanina. Por mas informacion sobre importantes
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Tabla 1. La Tabla 1 enumera 4 motivos que estan presentes en las secuencias de Cas9 de varias especies (vease tambien la Figura 3 y la Figura 5). Los aminoacidos enumerados en la presente son de Cas9 de S. pyogenes (SEQ _____________________________________ID NO:8).______________________________________
N.° de Motivo
Motivo Aminoacidos (n.° de residuo) Altamente conservado
1.
Similar a RuvC I IGLDIGTNSVGWAVI (7-21) (SEQ ID NO:260) D10, G12, G17
2.
Similar a RuvC II IVIEMARE (759-766) (SEQ ID NO:261) E762
3.
Motivo HNH DVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKN (837863) (SEQ ID NO:262) H840, N854, N863
4.
Similar a RuvC II HHAHDAYL (982-989) (SEQ ID NO:263) H982, H983, A984, D986, A987
En algunos casos, el polipeptido modificador quimerico dirigido al sitio comprende una secuencia de aminoacidos con al menos alrededor de 75 %, al menos alrededor de 80 %, al menos alrededor de 85 %, al menos alrededor de 90 %, al menos alrededor de 95 %, al menos alrededor de 99 %, o 100 % de identidad de secuencia de aminoacidos con los aminoacidos 7-166 o 731-1003 de la secuencia de aminoacidos Cas9/Csn1 ilustrada en la Figura 3 o a las partes correspondientes en cualquiera de las secuencias de aminoacidos establecidas como SEQ ID NO: 1-256 y 795-1346. En algunos casos, el polipeptido modificador quimerico dirigido al sitio comprende 4 motivos (segun se enumera en la Tabla 4 y se representa en la Figura 3A y la Figura 5), cada uno con secuencias de aminoacidos que tienen al menos alrededor de 75 %, al menos alrededor de 80 %, al menos alrededor de 85 %, al menos alrededor de 90 %, al menos alrededor de 95 %, al menos alrededor de 99 % o 100 % de identidad de secuencia de aminoacidos a cada uno de los cuatro motivos enumerados en la Tabla 1 (SEQ ID NO:260-263), o a las partes correspondientes en cualquiera de las secuencias de aminoacidos establecidas como SEQ ID NOs:1-256 y 7951346. En algunos casos, el polipeptido modificador quimerico dirigido al sitio comprende secuencias de aminoacidos con al menos alrededor de 75 %, al menos alrededor de 80 %, al menos alrededor de 85 %, al menos alrededor de 90 %, al menos alrededor de 95 %, al menos alrededor de 99 %, o 100 % de identidad de secuencia de aminoacidos con los aminoacidos 7-166 o 731-1003 de la secuencia de aminoacidos Cas9/Csn1 ilustrada en la Figura 3 o a las partes correspondientes en cualquiera de las secuencias de aminoacidos establecidas como SEQ ID NO: 1-256 y 795-1346.
En algunas modalidades, la parte de actividad del polipeptido modificador dirigido al sitio comprende un polipeptido heterologo que tiene actividad modificadora de aDn y/o actividad de factor de transcripcion y/o actividad modificadora de polipeptido asociado con ADN. En algunos casos, un polipeptido heterologo reemplaza una parte del polipeptido Cas9/Csn1 que proporciona actividad de nucleasa. En otras modalidades, un polipeptido modificador dirigido al sitio comprende ambas partes del polipeptido Cas9/Csn1 que proporciona normalmente actividad de nucleasa (y la porcion puede ser totalmente activa o puede, en su lugar, estar modificada para tener menos del 100 % de la actividad de tipo salvaje correspondiente) y un polipeptido heterologo. En otras palabras, en algunos casos, un polipeptido modificador quimerico dirigido al sitio es un polipeptido de fusion que comprende tanto la parte del polipeptido Cas9/Csn1 que normalmente proporciona actividad de nucleasa y el polipeptido heterologo. En otros casos, un polipeptido modificador quimerico dirigido al sitio es un polipeptido de fusion que comprende una variante modificada de la parte de actividad del polipeptido Cas9/Csn1 (por ejemplo, cambio, eliminacion, insertion de aminoacido) y un polipeptido heterologo. En todavia otro casos, un polipeptido modificador quimerico dirigido al sitio es un polipeptido de fusion que comprende un polipeptido heterologo y la parte de union al ARN de un polipeptido modificador dirigido al sitio de origen natural o modificado.
Por ejemplo, en una proteina Cas9/Csn1 quimerica, un polipeptido Cas9/Csn1 bacteriano de origen natural (o modificado, por ejemplo, mutation, eliminacion, insercion) puede fusionarse a una secuencia heterologa de polipeptidos (es decir, una secuencia de polipeptidos de una proteina diferente a Cas9/Csn1 o una secuencia de polipeptidos de otro organismo). La secuencia heterologa de polipeptidos puede presentar una actividad (por ejemplo, actividad enzimatica) que tambien presentara la proteina quimerica Cas9/Csn1 (por ejemplo, actividad de metiltransferasa, actividad de acetiltransferasa, actividad de cinasa, actividad de ubiquitinacion, etc.). Una secuencia de acido nucleico heterologa puede estar unida a otra secuencia de acido nucleico (por ejemplo, mediante ingenieria genetica) para generar una secuencia de nucleotidos quimerica que codifica un polipeptido quimerico. En algunas modalidades, un polipeptido quimerico Cas9/Csn1 se genera mediante la fusion de un polipeptido Cas9/Csn1 (por ejemplo, Cas9 de tipo salvaje o una variante de Cas9, por ejemplo, un Cas9 con actividad de nucleasa reducida o inactivada) con una secuencia heterologa que proporciona localization subcelular (por ejemplo, una senal de localization nuclear (NLS, por sus siglas en ingles) para dirigirse al nucleo; una senal de localizacion mitocondrial para dirigirse a la mitocondria; una senal de localizacion de cloroplastos para dirigirse a un cloroplasto; una senal de retention de ER; y similares). En algunas modalidades, la secuencia heterologa puede proporcionar una etiqueta para facilitar el rastreo y la purification (por ejemplo, una proteina fluorescente, por ejemplo, proteina fluorescente verde (GFP, por sus siglas en ingles), YFP, RFP, CFP, mCherry, tdTomato y similares; una etiqueta HIS, por ejemplo, una etiqueta 6XHis; una etiqueta de hemaglutinina (HA); una etiqueta FLAG; una etiqueta Myc; y similares). En algunas modalidades, la secuencia heterologa puede proporcionar un aumento o descenso de la estabilidad. En
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algunas modalidades, la secuencia heterologa puede proporcionar un dominio de union (por ejemplo, proporcionarle la capacidad de un polipeptido Cas9 quimerico de unirse a otra proteina de interes, por ejemplo, una proteina modificadora de ADN o histona, una factor de transcripcion o represor de transcripcion, una protema reclutadora, etc.).
Los ejemplos de varios companeros de fusion adecuados adicionales (o fragmentos de estos) para una variante del polipeptido dirigido al sitio Cas9 de la invencion incluyen, de modo no taxativo, los enumerados en la Figura 54.
Acido nucleico que codifica un polipeptido modificador quimerico dirigido al sitio
La presente descripcion proporciona un acido nucleico que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica un polipeptido modificador quimerico dirigido al sitio de la invencion. En algunas modalidades, el acido nucleico que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica un polipeptido modificador quimerico dirigido al sitio es un vector de expresion, por ejemplo, un vector de expresion recombinante.
En algunas modalidades, un metodo implica poner en contacto un ADN objetivo o introducir en una celula (o una poblacion de celulas) uno o mas acidos nucleicos que comprenden un polipeptido modificador quimerico dirigido al sitio. Los acidos nucleicos adecuados comprenden secuencias de nucleotidos que codifican un polipeptido quimerico modificador dirigido al sitio incluyen vectores de expresion, donde un vector de expresion que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica un polipeptido quimerico modificador dirigido al sitio es un "vector de expresion recombinante".
En algunas modalidades, el vector de expresion recombinante es una construccion viral, por ejemplo, una construccion viral adeno-asociada recombinante (vease, por ejemplo, la patente estadounidense n.° 7.078.387), una construccion adenoviral recombinante, una construccion lentiviral recombinante, etc.
Los vectores de expresion adecuados incluyen, de modo no taxativo, vectores virales (por ejemplo, vectores virales basados en el virus vaccinia; poliovirus; adenovirus (vease, por ejemplo, Li et al., Invest Opthalmol Vis Sci 35:2543 2549, 1994; Borras et al., Gene Ther 6:515 524, 1999; Li y Davidson, PNAS 92:7700 7704, 1995; Sakamoto et al., H Gene Ther 5:1088 1097, 1999; WO 94/12649, WO 93/03769; WO 93/19191; WO 94/28938; WO 95/11984 and WO 95/00655); virus adeno-asociado (vease, por ejemplo, Ali et al., Hum Gene Ther 9:81 86, 1998, Flannery et al., PNAS 94:6916 6921, 1997; Bennett et al., Invest Opthalmol Vis Sci 38:2857 2863, 1997; Jomary et al., Gene Ther 4:683 690, 1997, Rolling et al., Hum Gene Ther 10:641 648, 1999; Ali et al., Hum Mol Genet 5:591 594, 1996; Srivastava en WO 93/09239, Samulski et al., J. Vir. (1989) 63:3822-3828; Mendelson et al., Virol. (1988) 166:154-165; y Flotte et al., PNAS (1993) 90:10613-10617); SV40; virus del herpes simple; virus de inmunodeficiencia humana (vease, por ejemplo, Miyoshi et al., PNAS 94:10319 23, 1997; Takahashi et al., J Virol 73:7812 7816, 1999); un vector retroviral (por ejemplo, virus de leucemia murina, virus de la necrosis del bazo y vectores derivados de retrovirus tal como el virus del sarcoma de Rous, virus del sarcoma de Harvey, virus de la leucosis aviar, un lentivirus, virus de inmunodeficiencia humana, virus del sarcoma mieloproliferativo y virus del tumor mamario); y similares.
Los expertos en la tecnica conocen numerosos vectores de expresion adecuados y muchos estan disponibles comercialmente. Se proporcionan los siguientes vectores a modo de ejemplo; para celulas hospedadoras eucariotas: pXT1, pSG5 (Stratagene), pSVK3, pBPV, pMSG, and pSVLSV40 (Pharmacia). Sin embargo, puede utilizarse cualquier otro vector siempre que sea compatible con la celula hospedadora.
Dependiendo del sistema de hospedador/vector utilizado, puede utilizarse cualquier cantidad de elementos de control de la transcripcion y traduccion adecuados, inclusive promotores constitutivos e inducibles, elementos mejoradores de la transcripcion, terminadores de la transcripcion, etc., en el vector de expresion (vease, por ejemplo, Bitter et al. (1987) Methods in Enzymology, 153:516-544).
En algunas modalidades, una secuencia de nucleotidos que codifica un polipeptido modificador quimerico dirigido al sitio esta unida de manera operativa a un elemento de control, por ejemplo, un elemento de control transcripcional, tal como un promotor. El elemento de control transcripcional puede ser funcional ya sea en una celula eucariota, por ejemplo, una celula de mamifero; o una celula procariota (por ejemplo, una celula bacteriana o de arquea). En algunas modalidades, una secuencia de nucleotidos que codifica un polipeptido modificador quimerico dirigido al sitio esta unida de manera operativa a multiples elementos de control que permiten la expresion de la secuencia de nucleotidos que codifica un polipeptido modificador quimerico dirigido al sitio tanto en celulas procariotas como eucariotas.
Los ejemplos no limitativos de promotores eucariotas adecuados (promotores funcionales en una celula eucariota) incluyen los que derivan del inmediato temprano de citomegalovirus (CMV), timidina cinasa del virus del herpes simple (VHS), SV40 temprano y tardio, repeticion terminal larga (LTR) de retrovirus y metalotioneina-I de raton. La selection del vector y promotor adecuado esta dentro del nivel de un experto en la tecnica. El vector de expresion tambien puede contener un sitio de union al ribosoma para el inicio de la traduccion y un terminador de la traduccion. El vector de expresion tambien puede incluir secuencias adecuadas para amplificar la expresion. El vector de
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expresion tambien incluye una secuencias de nucleotidos que codifica etiquetas proteicas (por ejemplo, etiqueta 6xHis, etiqueta de hemaglutinina (HA), una protema fluorescente (por ejemplo, una protema fluorescente verde; una protema fluorescente amarilla, etc.) que estan fusionadas al polipeptido modificador quimerico dirigido al sitio.
En algunas modalidades, una secuencia de nucleotidos que codifica un polipeptido modificador quimerico dirigido al sitio esta unido de manera operativa a un promotor inducible (por ejemplo, promotor de shock termico, promotor regulado por tetraciclina, promotor regulado por esteroides, promotor regulado por metales, promotor regulado por estrogenos, etc.). En algunas modalidades, una secuencia de nucleotidos que codifica un polipeptido modificador quimerico dirigido al sitio esta unida de manera operativa a un promotor restringido espacialmente y/o temporalmente (por ejemplo, un promotor especifico de tejido, un promotor especifico de un tipo de celula, etc.). En algunas modalidades, una secuencia de nucleotidos que codifica un polipeptido modificador quimerico dirigido al sitio esta unida operativamente a un promotor constitutivo.
Los metodos para introducir un acido nucleico en una celula hospedadora son conocidos en la tecnica, y puede utilizarse cualquier metodo para introducir un acido nucleico (por ejemplo, una construccion de expresion) en una celula madre o celula progenitora. Los metodos adecuados incluyen, por ejemplo, infeccion viral o bacteriofagica, transfeccion, conjugacion, fusion de protoplastos, lipofeccion, electroporacion, precipitacion de fosfato de calcio, transfeccion mediada por polietilenimina (PEI), transfeccion mediada por DEAE-dextrano, transfeccion mediada por liposomas, tecnologia de canon de particulas, precipitacion de fosfato de calcio, microinyeccion directa, insertion de acido nucleico mediada por nanoparticulas (vease, por ejemplo, Panyam et al., Adv Drug Deliv Rev. 2012 Sep 13. pii: S0169-409X(12)00283-9. doi: 10.1016/j.addr.2012.09.023 ) y similares.
METODOS
La presente description proporciona metodos para modificar un ADN objetivo y/o un polipeptido asociado a ADN objetivo. En general, un metodo de la invencion implica poner en contacto un ADN objetivo con un complejo (un "complejo de direccionamiento"), donde el complejo comprende un ARN dirigido a ADN y un polipeptido modificador dirigido al sitio.
Como se discutio anteriormente, un ARN dirigido a ADN de la invention y un polipeptido modificador dirigido al sitio de la invencion forman un complejo. El ARN dirigido a ADN proporciona especificidad de direccionamiento al complejo, ya que comprende una secuencia de nucleotidos que es complementaria a una secuencia de un ADN objetivo. El polipeptido modificador dirigido al sitio del complejo proporciona la actividad especifica del sitio. En algunas modalidades, un complejo de la invencion modifica un ADN objetivo, que lleva a, por ejemplo, la escision de ADN, metilacion de ADN, dano en el ADN, reparation del ADN, etc. En otras modalidades, un complejo de la invencion modifica un polipeptido objetivo asociado con ADN objetivo (por ejemplo, una histona, una proteina de union a ADN, etc.) que lleva a, por ejemplo, metilacion de histona, acetilacion de histona, ubiquitinacion de histona, y similares. El ADN objetivo puede, por ejemplo, ser ADN no conjugado in vitro, ADN cromosomico en celula in vitro, ADN cromosomico en celulas in vivo, etc.
En algunos casos, el polipeptido modificador dirigido al sitio presenta actividad de nucleasa que escinde ADN objetivo en una secuencia de ADN objetivo definida por la region de complementariedad entre el aRn dirigido a ADN y el ADN objetivo. En algunos casos, cuando el polipeptido modificador dirigido al sitio es un polipeptido Cas9 o relacionado con Cas9, la escision especifica del sitio del ADN objetivo ocurre en ubicaciones determinadas mediante ambas de (i) complementariedad de pares de bases entre el ARN dirigido a ADN y el ADN objetivo; y (ii) un motivo corto [mencionado como el motivo adyacente protoespaciador (PAM)] en el ADN objetivo. En algunas modalidades (por ejemplo, cuando se usa Cas9 de S. pyogenes, o un Cas9 relacionado estrechamente (veanse las SEQ ID NO:1- 256 y 795-1346)), la secuencia PAM de la cadena no complementaria es 5'-XGG-3', donde X es cualquier nucleotido de ADN y X esta en la position siguiente a 3' de la secuencia objetivo de la cadena no complementaria del ADN objetivo (vease la Figura 10). Como tal, la secuencia PAM de la cadena complementaria es 5'-CCY-3', donde Y es cualquier nucleotido de aDn e Y esta en la posicion siguiente a 5' de la secuencia objetivo de la cadena complementaria del ADN objetivo (vease la Figura 10 donde PAM de la secuencia no complementaria es 5'-GGG-3' y PAM de la cadena complementaria es 5'-CCC-3'). En algunas de dichas modalidades, X e Y pueden ser complementarios y el par de bases X-Y puede ser cualquier par de bases (por ejemplo, X=C y Y=G; X=G y Y=C; X=A y Y=T, X=T y Y=A).
En algunos casos, diferentes proteinas Cas9 (es decir, proteinas Cas9 de varias especies) pueden ser ventajosas para usarlas en los metodos proporcionados variados para capitalizar varias caracteristicas enzimaticas de las proteinas Cas9 diferentes (por ejemplo, para diferentes preferencias de secuencia PAM; para aumentar o disminuir la actividad enzimatica; para aumentar o disminuir el nivel de toxicidad celular; para cambiar en balance entre NHEJ, reparacion dirigida por homologia, roturas de cadena simple, roturas de cadena doble, etc.). Las proteinas Cas9 de varias especies (veanse las SEQ ID NO:1-256 y 795-1346) pueden requerir secuencias pAm diferentes en el ADN objetivo. Por lo tanto, para una proteina Cas9 en particular de election, el requisito de secuencia PAM puede ser diferente que la secuencia 5'-XGG-3' descrita anteriormente.
Se han identificado en la presente muchos ortologos de Cas9 de una variedad amplia de especies y las proteinas
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comparten unicamente unos pocos aminoacidos identicos. Todos los ortologos de Cas9 identificados tienen la misma arquitectura de dominio con un dominio de endonucleasa HNH central y un dominio RuvC/RNasaH de particion (veanse las Figuras 3A, 3B, la Figura 5 y la Tabla 1). Las proteinas Cas9 comparten 4 motivos clave con una arquitectura conservada. Los motivos 1, 2 y 4 son motivos similares a RuvC, mientras que el motivo 3 es un motivo de HNH. En algunos casos, un polipeptido modificador dirigido al sitio adecuado comprende una secuencia de aminoacidos que tiene 4 motivos, cada uno de los motivos 1-4 tiene al menos alrededor de 75 %, al menos alrededor de 80 %, al menos alrededor de 85 %, al menos alrededor de 90 %, al menos alrededor de 95 %, al menos alrededor de 99 %, o 100 % de identidad de secuencia de aminoacidos con los motivos 1-4 de la secuencia de aminoacidos Cas9/Csn1 ilustrada en la Figura 3A (SEQ ID NOs:260-263, respectivamente, como se muestra en la Tabla 1), o con las partes correspondientes en cualquiera de las secuencias de aminoacidos establecidas en la SEQ ID NO: 1-256 y 795-1346 (vease la Figura 5 para una alineamiento de motivos 1-4 de secuencias Cas9 divergentes). En algunos casos, un polipeptido modificador dirigido al sitio adecuado comprende una secuencia de aminoacidos con al menos alrededor de 75 %, al menos alrededor de 80 %, al menos alrededor de 85 %, al menos alrededor de 90 %, al menos alrededor de 95 %, al menos alrededor de 99 %, o 100 % de identidad de secuencia de aminoacidos con los aminoacidos 7-166 o 731-1003 de la secuencia de aminoacidos Cas9/Csn1 ilustrada en la Figura 3 o a las partes correspondientes en cualquiera de las secuencias de aminoacidos establecidas como SEQ ID NO: 1-256 y 795-1346. Cualquier proteina Cas9, como se describio anteriormente, puede usarse como polipeptido modificador dirigido al sitio o como parte de un polipeptido modificador quimerico dirigido al sitio de los metodos de la invencion.
La actividad nucleasa escinde ADN objetivo para producir roturas de cadena doble. Estas roturas luego son reparadas por la celula en una de dos maneras: recombinacion no homologa y reparacion dirigida por homologia (Figura 2). En la recombinacion no homologa (NHEJ), las roturas de cadena doble son reparadas por ligacion directa de los extremos rotos entre si. Como tal, no se inserta ningun material de acido nucleico en el sitio, aunque puede perderse algun material de acido nucleico, lo que resulta en una eliminacion. En la reparacion dirigida por homologia, se utiliza como plantilla un polinucleotido donante con homologia a la secuencia escindida de ADN objetivo para la reparacion de la secuencia escindida de ADN objetivo, lo cual da como resultado la transferencia de informacion genetica del polinucleotido donante al ADN objetivo. Como tal, el nuevo material de acido nucleico puede insertarse/copiarse en el sitio. En algunos casos, un ADN objetivo se pone en contacto con un polinucleotido donante de la invencion. En algunos casos, un polinucleotido donante de la invencion se introduce en una celula de la invencion. Las modificaciones del ADN objetivo debidas a NHEJ y/o reparacion dirigida por homologia llevan a, por ejemplo, la correccion genetica, reemplazo genetico, marcado genetico, insercion de transgenes, eliminacion de nucleotidos, alteracion genetica, mutacion genetica, etc.
Por consiguiente, puede utilizarse la escision de ADN mediante un polipeptido modificador dirigido al sitio para eliminar material de acido nucleico de una secuencia de ADN objetivo (por ejemplo, para alterar un gen que hace que las celulas sean susceptibles a infeccion (por ejemplo, el gen CCR5 o CXCR4, que ocasiona que los linfocitos T sean susceptibles a la infeccion por VIH), para crear mutaciones e inactivaciones geneticas como modelos de enfermedades en la investigation, etc.) al escindir la secuencia de ADN objetivo y permitirle a la celula la reparacion de la secuencia ante la ausencia de un polinucleotido donante proporcionado de forma exogena. Por lo tanto, los metodos de la invencion pueden utilizarse para inactivar un gen (lo cual da como resultado una total falta de transcription o transcription alterada) o activar material genetico en un locus elegido en el ADN objetivo.
De manera alternativa, si un ARN dirigido a ADN y un polipeptido modificador dirigido al sitio son coadministrados a celulas con una secuencia de polinucleotido donante que incluye al menos un segmento con homologia a la secuencia de ADN objetiva, los metodos de la invencion pueden utilizarse para agregar, es decir, insertar o reemplazar, material de acido nucleico a una secuencia de ADN objetiva (por ejemplo, para "activar" un acido nucleico que codifica para una proteina, un ARNip, un miARN, etc.), para agregar una etiqueta, (por ejemplo, 6xHis, una proteina fluorescente (por ejemplo, una proteina verde fluorescente; una proteina amarilla fluorescente, etc.), hemaglutinina (HA), FLAG, etc.), para agregar una secuencia reguladora a un gen (por ejemplo, promotor, senal de poliadenilacion, secuencia de entrada al ribosoma interno (IRES, por sus siglas en ingles), peptido 2A, codon de inicio, codon de parada, senal de corte y empalme, senal de localization, etc.), para modificar una secuencia de acido nucleico (por ejemplo, introducir una mutacion) y similares. Como tal, un complejo que comprende un ARN dirigido a ADN y un polipeptido modificador dirigido al sitio es util en cualquier aplicacion in vitro o in vivo en la que es deseable modificar ADN en una forma especifica del sitio, es decir, "dirigida", por ejemplo desactivacion genica, activation genica, edition genica, marcado genico, etc., segun se utiliza en, por ejemplo, terapia genica, por ejemplo, para tratar una enfermedad o como una terapia antiviral, antipatogenica o anticancer, la production de organismos modificados geneticamente en la agricultura, la produccion a gran escala de proteinas mediante celulas con propositos terapeuticos, diagnosticos o de investigacion, la induction de celulas iPS, investigacion biologica, el direccionamiento de genes de patogenos para la eliminacion o reemplazo, etc.
En algunas modalidades, el polipeptido modificador dirigido al sitio comprende una forma modificada de la proteina Cas9/Csn1. En algunas instancias, la forma modificada de la proteina Cas9/Csn1 comprende un cambio de aminoacidos (por ejemplo, eliminacion, insercion o sustitucion) que reduce la actividad de nucleasa de origen natural de la proteina Cas9/Csn1. Por ejemplo, en algunas instancias, la forma modificada de la proteina Cas9/Csn1 tiene menos de 50 %, menos de 40 %, menos de 30 %, menos de 20 %, menos de 10 %, menos de 5 % o menos de 1 %
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de la actividad de nucleasa del polipeptido Cas9/Csn1 de tipo salvaje correspondiente. En algunos casos, la forma modificada del polipeptido Cas9/Csn1 practicamente no tiene actividad de nucleasa. Cuando un polipeptido modificador dirigido al sitio de la invencion es una forma modificada del polipeptido Cas9/Csn1 que no tiene actividad de nucleasa sustancial, puede referirse a el como "dCas9".
En algunas modalidades, la forma modificada del polipeptido Cas9/Csn1 es una mutacion D10A (aspartato a alanina en la posicion del aminoacido 10 de la SEQ ID NO: 8) (o la mutacion correspondiente de cualquiera de las proteinas establecidas como SEQ ID NO: 1-256 y 795-1346) que puede escindir la cadena complementaria del ADN objetivo pero tiene una capacidad reducida de escindir la cadena no complementaria del ADN objetivo (dando como resultado una sola rotura de cadena (SSB, por sus siglas en ingles) en vez de una DSB; ver Figura 1l). En algunas modalidades, la forma modificada del polipeptido Cas9/Csn1 es una mutacion H840A (histidina a alanina en la posicion del aminoacido 840 de la SEQ ID NO: 8) (o la mutacion correspondiente de cualquiera de las proteinas establecidas como SEQ ID NO: 1-256 y 795-1346) que puede escindir la cadena no complementaria del ADN objetivo pero tiene una capacidad reducida de escindir la cadena complementaria del ADN objetivo (dando como resultado una sola rotura de cadena (SSB) en vez de una DSB; ver Figura 11). El uso de la variante D10A o H840A de Cas9 (o las mutaciones correspondientes en cualquiera de las proteinas establecidas como SEQ ID NO: 1-256 y 795-1346) puede alterar el resultado biologico esperado, dado que es mucho mas probable que suceda la recombinacion no homologa (NHEJ) cuando estan presentes las DSB, en contraposicion con las SSB. De esta forma, en algunos casos donde se desea reducir la probabilidad de DSB (y por ende, reducir la probabilidad de NHEJ), puede utilizarse una variante de Cas9 D10A o H840A. Pueden mutarse otros residuos para lograr el mismo efecto (es decir, inactivar una u otra parte de la nucleasa). Como ejemplos no taxativos, los residuos D10, G12, G17, E762, H840, N854, N863, H982, H983, A984, D986, y/o A987 (o las mutaciones correspondientes de cualquiera de las proteinas establecidas como SEQ ID NO:1-256 y 795-1346) pueden alterarse (es decir, sustituirse) (veanse la Figura 3, Figura 5, Figura 11A y la Tabla 1 por mas informacion respecto a la conservacion de los residuos de aminoacidos de Cas9). Tambien son adecuadas mutaciones que no sean las sustituciones de alanina. En algunas modalidades, cuando un polipeptido dirigido al sitio (por ejemplo, el polipeptido modificador dirigido al sitio) tiene una actividad catalitica reducida (por ejemplo, cuando una proteina Cas9 tiene una mutacion D10, G12, G17, E762, H840, N854, N863, H982, H983, A984, D986, y/o A987, por ejemplo, D10A, G12A, G17A, E762A, H840A, N854A, N863A, H982A, H983A, A984A, y/o D986A), el polipeptido todavia puede unirse a ADN objetivo de una forma especifica al sitio (dado que todavia esta guiado a una secuencia de ADN objetivo por un ARN dirigido a ADN), siempre y cuando retenga la capacidad de interactuar con el ARN dirigido a ADN.
En algunas modalidades, la forma modificada del polipeptido Cas9/Csn1 posee tanto las mutaciones D10A como H840A (o las mutaciones correspondientes de cualquiera de las proteinas establecidas como SEQ ID NO:1-256 y 795-1346) de manera que el polipeptido tiene una capacidad reducida de escindir tanto la cadena complementaria como la no complementaria del ADN objetivo (es decir, la variante no puede tener actividad de nucleasa sustancial). Pueden mutarse otros residuos para lograr el mismo efecto (es decir, inactivar una u otra parte de la nucleasa). Como ejemplos no taxativos, los residuos D10, G12, G17, E762, H840, N854, N863, H982, H983, A984, D986, y/o A987 (o las mutaciones correspondientes de cualquiera de las proteinas establecidas como SEQ ID NO:1-256 y 795-1346) pueden alterarse (es decir, sustituirse) (veanse la Figura 3, Figura 5, Figura 11A y la Tabla 1 por mas informacion respecto a la conservacion de los residuos de aminoacidos de Cas9). Tambien son adecuadas mutaciones que no sean las sustituciones de alanina.
En algunas modalidades, el polipeptido modificador dirigido al sitio comprende una secuencia heterologa (por ejemplo, una fusion). En algunas modalidades, una secuencia heterologa puede proporcionar localizacion subcelular del polipeptido modificador dirigido al sitio (por ejemplo, una senal de localizacion nuclear (NLS) para dirigirse al nucleo; una senal de localizacion mitocondrial para dirigirse a la mitocondria; una senal de localizacion en el cloroplasto para dirigirse a un cloroplasto; una senal de retencion en el ER y similares). En algunas modalidades, una secuencia heterologa puede proporcionar una etiqueta para facilitar el rastreo o purificacion (por ejemplo, una proteina fluorescente, por ejemplo, una proteina verde fluorescente (GFP), YFP, RFP, CFP, mCherry, tdTomato y similares; una etiqueta his, por ejemplo, una etiqueta 6XHis; una etiqueta de hemaglutinina (HA); una etiqueta FLAG; una etiqueta Myc y similares). En algunas modalidades, la secuencia heterologa puede proporcionar un aumento o disminucion de la estabilidad.
En algunas modalidades, un polipeptido modificador dirigido al sitio de la invencion puede optimizarse con codones. Este tipo de optimization es conocido en la tecnica e implica la mutacion de ADN derivado foraneo para imitar las preferencias de codon de la celula u organismo hospedador pretendidos mientras que se codifica la misma proteina. De esta forma, cambian los codones, pero la proteina codificada permanece sin modificaciones. Por ejemplo, si la celula objetivo pretendida era una celula humana, una Cas9 (o variante, por ejemplo, variante enzimaticamente inactiva) optimizada por codones seria un polipeptido modificador dirigido al sitio adecuado (ver SEQ ID NO: 256 para un ejemplo). Cualquier polipeptido modificador dirigido al sitio adecuado (por ejemplo, cualquier Cas9 tal como cualquiera de las secuencias establecidas en las SEQ ID NO: 1-256 y 795-1346) puede ser optimizado con codones. Como otro ejemplo no taxativo, si la celula hospedadora pretendida fuera una celula de raton, entonces una Cas9 (o variante, por ejemplo, una variante enzimaticamente inactiva) de raton optimizada con codones seria un polipeptido modificador dirigido al sitio adecuado. Mientras que no se requiere la optimizacion por codones, esta es aceptable y puede ser preferible en ciertos casos.
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En algunas modalidades, un ARN dirigido a ADN de la invencion y un polipeptido modificador dirigido al sitio de la invention se utilizan como un sistema inducible para desactivar la expresion genica en celulas bacterianas. En algunos casos, los acidos nucleicos que codifican un ARN dirigido a ADN apropiado y/o un polipeptido dirigido al sitio apropiado se incorporan al cromosoma de una celula objetivo y estan bajo el control de un promotor inducible. Cuando se inducen el ARN dirigido al ADN y/o el polipeptido dirigido al sitio, el ADN objetivo se escinde (o se modifica de otra manera) en la ubicacion de interes (por ejemplo, un gen objetivo en un plasmido separado), cuando tanto el ARN dirigido a ADN como el polipeptido modificador dirigido al sitio estan presentes y forman un complejo. Como tales, en algunos casos, las cepas de expresion bacteriana se modifican geneticamente para incluir secuencias de acido nucleico que codifican un polipeptido modificador dirigido al sitio adecuado en el genoma bacteriano y/o un ARN dirigido a ADN adecuado en un plasmido (por ejemplo, bajo el control de un promotor inducible), lo que permite experimentos en los cuales la expresion de cualquier gen etiquetado (expresado de un plasmido separado introducido en la cepa) pueda ser controlado mediante la induction de la expresion del ARN dirigido a ADN y el polipeptido dirigido al sitio.
Tambien se describen en el presente documento polipeptidos modificadores dirigidos al sitio que tienen actividad enzimatica que modifica ADN objetivo de formas distintas de la introduction de roturas de cadena doble. La actividad enzimatica de interes que puede usarse para modificar ADN objetivo (por ejemplo, mediante la fusion de un polipeptido heterologo con actividad enzimatica a un polipeptido modificador dirigido al sitio, generando asi un polipeptido modificador quimerico dirigido al sitio) incluye, de modo no taxativo, actividad de metiltransferasa, actividad de desmetilasa, actividad de reparation del ADN, actividad de dano al ADN, actividad de desaminacion, actividad de dismutasa, actividad de alquilacion, actividad de depurinacion, actividad de oxidation, actividad de formation de dimeros de pirimidina, actividad de integrasa, actividad de transposasa, actividad de recombinasa, actividad de polimerasa, actividad de ligasa, actividad de helicasa, actividad de fotoliasa o actividad de glicosilasa). La metilacion y la desmetilacion son reconocidas en la tecnica como una forma importante de regulation epigenica de genes, mientras que la actividad de dano y reparacion en el ADN es esencial para la supervivencia de las celulas y para el mantenimiento adecuado del genoma como respuesta a la tension ambiental.
Como tales, los metodos descritos en la presente pueden utilizarse en la modification epigenica de ADN objetivo y pueden emplearse para controlar la modificacion epigenica de ADN objetivo en cualquier ubicacion en un ADN objetivo mediante manipulation genetica de la secuencia de acido nucleico complementaria deseada en el segmento dirigido a ADN de un ARN dirigido a ADN. Los metodos de la presente tambien pueden usarse en el dano intencional y controlado del ADN en cualquier ubicacion deseada dentro del ADN objetivo. Los metodos de la presente tambien pueden usarse en la reparacion controlada y especifica a la secuencia del ADN en cualquier ubicacion deseada dentro del ADN objetivo. Los metodos para dirigir actividades enzimaticas modificadoras de ADN a ubicaciones especificas en ADN objetivo pueden usarse tanto en investigation como en aplicaciones clinicas.
En algunos casos descritos en el presente documento, el polipeptido modificador dirigido al sitio tiene actividad que modula la transcription de ADN objetivo (por ejemplo, en el caso de un polipeptido modificador quimerico dirigido al sitio, etc.). En algunos casos, un polipeptido modificador quimerico dirigido al sitio que comprende un polipeptido heterologo que presenta la capacidad de aumentar o disminuir la transcripcion (por ejemplo, polipeptidos activadores de la transcripcion o represores de la transcripcion) se utiliza para aumentar o disminuir la transcripcion de ADN objetivo en una ubicacion especifica en un ADN objetivo, la cual es guiada por el segmento dirigido a ADN del ARN dirigido a ADN. Los ejemplos de polipeptidos de origen para proporcionar un polipeptido modificador quimerico dirigido al sitio con actividad moduladora de la transcripcion incluyen, de modo no taxativo, reguladores de la transcripcion inducibles por la luz, reguladores de la transcripcion que responden a farmacos/de molecula pequena, factores de transcripcion, represores de transcripcion, etc. En algunos casos, el metodo de la invencion se usa para controlar la expresion de un ARN codificador dirigido (gen codificador de proteinas) y/o un ARN no codificador dirigido (por ejemplo, ARNt, ARNr, ARNnp, ARNip, miARN, ARNlnc, etc.).
En algunos casos, el polipeptido modificador dirigido al sitio descrito en el presente documento tiene actividad enzimatica que modifica un polipeptido asociado con ADN (por ejemplo, histona). En algunos casos, la actividad enzimatica es actividad de metiltransferasa, actividad de desmetilasa, actividad de acetiltransferasa, actividad de deacetilasa, actividad de cinasa, actividad de fosfatasa, actividad de ubiquitina ligasa (es decir, actividad de ubiquitinacion), actividad desubiquitinante, actividad de adenilacion, actividad de desadenilacion, actividad de SuMOilacion, actividad de deSUMOilacion, actividad de ribosilacion, actividad de desribosilacion, actividad de miristoilacion, actividad de demiristoilacion, actividad de glicosilacion (por ejemplo, de transferasa O-GlcNAc) o actividad de desglicosilacion. Las actividades enzimaticas enumeradas en la presente catalizan modificaciones covalentes a proteinas. Se sabe en la tecnica que dichas modificaciones alteran la estabilidad o actividad de la proteina objetivo (por ejemplo, la fosforilacion debida a la actividad cinasa puede estimular o silenciar la actividad de proteinas dependiendo de la proteina objetivo). Las histonas son de particular interes como proteinas objetivo. Se sabe en la tecnica que las proteinas de histona se unen a ADN y forman complejos conocidos como nucleosomas. Las histonas pueden modificarse (por ejemplo, mediante metilacion, acetilacion, ubiquitinacion, fosforilacion) para producir cambios estructurales en el aDn circundante, controlando asi la accesibilidad de partes potencialmente grandes de ADN a factores de interaction tales como los factores de transcripcion, polimerasas y similares. Una unica histona puede modificarse de muchas formas distintas y en muchas combinaciones diferentes (por ejemplo, la trimetilacion de la lisina 27 de la histona 3, H3K27, es asociada con regiones de ADN de transcripcion reprimida,
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mientras que la trimetilacion de la lisina 4 de la histona 3, H3K4, es asociada con regiones de ADN de transcripcion activa). De esta forma, un polipeptido modificador dirigido al sitio con actividad modificadora de histona se puede utilizar en el control especifico del sitio de estructuras de ADN y puede utilizarse para alterar el patron de modification de la histona en una region seleccionada de ADN objetivo. Dichos metodos pueden utilizarse tanto en la investigation como en aplicaciones clinicas.
En algunas modalidades, multiples ARN dirigidos a ADN se usan de manera simultanea para modificar, de manera simultanea, diferentes ubicaciones en el mismo ADN objetivo o en diferentes ADN objetivo. En algunas modalidades, dos o mas ARN dirigidos a ADN se dirigen al mismo gen, transcripcion o locus. En algunas modalidades, dos o mas ARN dirigidos a ADN se dirigen a distintos locus sin relation. En algunas modalidades, dos o mas ARN dirigidos a ADN se dirigen a locus distintos pero relacionados.
En algunos casos, el polipeptido modificador dirigido al sitio se proporciona directamente como una proteina. Como ejemplo no taxativo, los hongos (por ejemplo, levadura) pueden transformarse con proteina exogena y/o acido nucleico mediante transformation de esferoplastos (ver Kawai et al., Bioeng Bugs. 2010 nov-dic;1(6):395-403 : “Transformation of Saccharomyces cerevisiae and other fungi: methods and possible underlying mechanism"; y Tanka et al., Nature. 2004 mar 18;428(6980):323-8: “Conformational variations in an infectious protein determine prion strain differences"). Por lo tanto, un polipeptido modificador dirigido al sitio (por ejemplo, Cas9) puede incorporarse en un esferoplasto (con o sin acido nucleico codificando un ARN dirigido a ADN y con o sin un polinucleotido donante) y el esferoplasto puede utilizarse para introducir el contenido en una celula de levadura. Un polipeptido modificador dirigido al sitio puede introducirse en una celula (proporcionarse a la celula) mediante cualquier metodo conveniente; dichos metodos son conocidos por los expertos en la tecnica. Como otro ejemplo no taxativo, un polipeptido modificador dirigido al sitio puede inyectarse directamente en una celula (por ejemplo, con o sin acido nucleico codificando un ARN dirigido a ADN y con o sin un polinucleotido donante), por ejemplo, una celula de un embrion de pez cebra, el pronucleo de un ovocito de raton fertilizado, etc.
Celulas objetivo de interes
En algunas de las aplicaciones mencionadas anteriormente pueden emplearse los metodos de la invention para inducir la escision de ADN, modificacion de ADN y/o modulation transcripcional en celulas mitoticas o posmitoticas in vivo y/o ex vivo y/o in vitro (por ejemplo, para producir celulas modificadas geneticamente que pueden reintroducirse en un individuo). Dado que el ARN dirigido al ADN proporciona especificidad mediante la hibridacion a ADN objetivo, una celula mitotica o posmitotica de interes en los metodos descritos puede incluir una celula de cualquier organismo (por ejemplo, una celula bacteriana, una celula arqueal, una celula de un organismo eucariota unicelular, una celula vegetal, una celula de algas, por ejemplo, Botryococcus braunii, Chlamydomonas reinhardtii, Nannochloropsis gaditana, Chlorella pyrenoidosa, Sargassum patens C. Agardh y similares, una celula fungica (por ejemplo, una celula de levadura), una celula de animal, una celula de un animal invertebrado (por ejemplo, mosca de la fruta, cnidario, equinodermo, nematodo, etc.), una celula de un animal vertebrado (por ejemplo, pez, anfibio, reptil, ave, mamifero), una celula de un mamifero, una celula de un roedor, una celula de un humano, etc.).
Cualquier tipo de celula puede ser de interes (por ejemplo, una celula madre, por ejemplo, una celula madre embrionica (ES), una celula madre pluripotente inducida (iPS), una celula germinal; en la que las celulas germinales humanas no son parte de las composiciones de la invencion, una celula somatica, por ejemplo, un fibroblasto, una celula hematopoyetica, una neurona, una celula muscular, una celula osea, un hepatocito, una celula pancreatica; una celula embrionaria no humana in vitro o in vivo de un embrion no humano en cualquier etapa, por ejemplo, un embrion de pez cebra en la etapa de 1 celula, 2 celulas, 4 celulas, 8 celulas, etc.). Las celulas pueden ser de lineas celulares establecidas o pueden ser celulas primarias, donde "celulas primarias", “lineas celulares primarias" y "cultivos primarios" se usan en la presente de manera intercambiable para hacer referencia a celulas y cultivos celulares que se han derivado de un sujeto y se les permitio el cultivo in vitro para una cantidad limitada de pasajes, es decir, divisiones, del cultivo. Por ejemplo, los cultivos primarios son cultivos a los que se realizo un pasaje 0 veces, 1 vez, 2 veces, 4 veces, 5 veces, 10 veces o 15 veces, pero no la cantidad suficiente de veces como para atravesar la etapa de crisis. normalmente, las lineas celulares primarias de la presente invencion se mantienen durante menos de 10 pasajes in vitro. Las celulas objetivo, en muchas modalidades, son organismos unicelulares o cultivados.
Si las celulas son celulas primarias, pueden cosecharse de un individuo mediante cualquier metodo conveniente. Por ejemplo, los leucocitos pueden cosecharse de manera conveniente mediante aferesis, leucocitaferesis, separation de gradiente de densidad, etc., mientras que las celulas de tejidos tales como la piel, musculo, medula osea, bazo, higado, pancreas, pulmon, intestino, estomago, etc. se cosechan de forma mas conveniente mediante biopsia. Puede usarse una solution apropiada para la dispersion o suspension de las celulas cosechadas. Dicha solution generalmente sera una solucion salina equilibrada, por ejemplo, solucion salina normal, solucion salina amortiguada con fosfato (PBS, por sus siglas en ingles), solucion salina equilibrada de Hank, etc., complementada de manera conveniente con suero fetal bovino u otros factores de origen natural, junto con un amortiguador aceptable en una concentration baja, generalmente de 5-25 mM. Los amortiguadores convenientes incluyen HEPES, amortiguadores de fosfato, amortiguadores de lactato, etc. Las celulas pueden usarse de manera inmediata o pueden ser almacenadas, congeladas, durante largos periodos de tiempo, descongeladas y utiles para su reutilizacion. En
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dichos casos, las celulas se congelaran usualmente en DMSO al 10 %, suero al 50 %, medio amortiguado al 40 % u otra solucion como las usadas en la tecnica para preservar celulas en dichas temperaturas de congelamiento, y se descongelaran de una manera como las usadas comunmente en la tecnica para descongelar celulas cultivadas congeladas.
Acidos nucleicos que codifican un ARN dirigido a ADN de la invencion y/o un polipeptido modificador dirigido al sitio de la invencion
En algunas modalidades, un metodo de la invencion implica poner en contacto un ADN objetivo o introducir en una celula (o una poblacion de celulas) uno o mas acidos nucleicos que comprenden secuencias de nucleotidos que codifican un ARN dirigido a ADN y/o un polipeptido modificador dirigido al sitio y/o un polinucleotido donante. Los acidos nucleicos adecuados comprenden secuencias de nucleotidos que codifican un ARN dirigido a ADN y/o un polipeptido modificador dirigido al sitio incluyen vectores de expresion, donde un vector de expresion que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica un ARN dirigido a ADN y/o un polipeptido modificador dirigido al sitio es un "vector de expresion recombinante".
En algunas modalidades, el vector de expresion recombinante es una construccion viral, por ejemplo, una construccion viral adeno-asociada recombinante (vease, por ejemplo, la patente estadounidense n.° 7.078.387), una construccion adenoviral recombinante, una construccion lentiviral recombinante, etc.
Los vectores de expresion adecuados incluyen, de modo no taxativo, vectores virales (por ejemplo, vectores virales basados en el virus vaccinia; poliovirus; adenovirus (vease, por ejemplo, Li et al., Invest Opthalmol Vis Sci 35:2543 2549, 1994; Borras et al., Gene Ther 6:515 524, 1999; Li y Davidson, PNAS 92:7700 7704, 1995; Sakamoto et al., H Gene Ther 5:1088 1097, 1999; WO 94/12649, WO 93/03769; WO 93/19191; WO 94/28938; WO 95/11984 and WO 95/00655); virus adeno-asociado (vease, por ejemplo, Ali et al., Hum Gene Ther 9:81 86, 1998, Flannery et al., PNAS 94:6916 6921, 1997; Bennett et al., Invest Opthalmol Vis Sci 38:2857 2863, 1997; Jomary et al., Gene Ther 4:683 690, 1997, Rolling et al., Hum Gene Ther 10:641 648, 1999; Ali et al., Hum Mol Genet 5:591 594, 1996; Srivastava en WO 93/09239, Samulski et al., J. Vir. (1989) 63:3822-3828; Mendelson et al., Virol. (1988) 166:154-165; y Flotte et al., PNAS (1993) 90:10613-10617); SV40; virus del herpes simple; virus de inmunodeficiencia humana (vease, por ejemplo, Miyoshi et al., PNAS 94:10319 23, 1997; Takahashi et al., J Virol 73:7812 7816, 1999); un vector retroviral (por ejemplo, virus de leucemia murina, virus de la necrosis del bazo y vectores derivados de retrovirus tal como el virus del sarcoma de Rous, virus del sarcoma de Harvey, virus de la leucosis aviar, un lentivirus, virus de inmunodeficiencia humana, virus del sarcoma mieloproliferativo y virus del tumor mamario); y similares.
Los expertos en la tecnica conocen numerosos vectores de expresion adecuados y muchos estan disponibles comercialmente. Se proporcionan los siguientes vectores a modo de ejemplo; para celulas hospedadoras eucariotas: pXT1, pSG5 (Stratagene), pSVK3, pBPV, pMSG y pSVLSV40 (Pharmacia). Sin embargo, puede utilizarse cualquier otro vector siempre que sea compatible con la celula hospedadora.
En algunas modalidades, una secuencia de nucleotidos que codifica un ARN dirigido a ADN y/o un polipeptido modificador dirigido al sitio esta unida de manera operativa a un elemento de control, por ejemplo, un elemento de control transcripcional, tal como un promotor. El elemento de control transcripcional puede ser funcional ya sea en una celula eucariota, por ejemplo, una celula de mamifero o una celula procariota (por ejemplo, una celula bacteriana o de arquea). En algunas modalidades, una secuencia de nucleotidos que codifica un ARN dirigido a ADN y/o un polipeptido modificador dirigido al sitio esta unido de manera operativa a multiples elementos de control que permiten la expresion de la secuencia de nucleotidos que codifica un ARN dirigido a ADN y/o un polipeptido modificador dirigido al sitio tanto en celulas procariotas como eucariotas.
Dependiendo del sistema de hospedador/vector utilizado, puede utilizarse cualquier cantidad de elementos de control de la transcripcion y traduccion adecuados, incluyendo promotores constitutivos e inducibles, elementos mejoradores de la transcripcion, terminadores de la transcripcion, etc., en el vector de expresion (por ejemplo, promotor U6, promotor H1, etc.; vease lo que antecede) (vease, por ejemplo, Bitter et al. (1987) Methods in Enzymology, 153:516-544).
En algunas modalidades, un ARN dirigido a ADN y/o un polipeptido modificador dirigido al sitio pueden proporcionarse como ARN. En dichos casos, el ARN dirigido a ADN y/o el ARN que codifica el polipeptido modificador dirigido al sitio pueden producirse mediante sintesis quimica directa o pueden transcribirse in vitro de un ADN que codifica el ARN dirigido al ADN. Los metodos para sintetizar ARN de un modelo de ADN son bien conocidos en la tecnica. En algunos casos, el ARN dirigido a ADN y/o el ARN que codifica el polipeptido modificador dirigido al sitio seran sintetizados in vitro utilizando una enzima ARN polimerasa (por ejemplo, polimerasa T7, polimerasa T3, polimerasa SP6, etc.). Una vez sintetizado, el ARN puede ponerse en contacto de forma directa con un ARN objetivo o puede introducirse en una celula mediante cualquiera de las tecnicas reconocidas para la introduccion de acidos nucleicos en celulas (por ejemplo, microinyeccion, electroporacion, transfeccion, etc.).
Los nucleotidos que codifican a un ARN dirigido a ADN (que se introducen como ADN o ARN) y/o un polipeptido
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modificador dirigido al sitio (que se introduce como ADN o ARN) y/o un polinucleotido donante pueden proporcionarse a las celulas utilizando tecnicas de transfeccion bien desarrolladas; vease, por ejemplo, Angel y Yanik (2010) PLoS ONE 5(7): e11756, y los reactivos TransMessenger® a la venta de Qiagen, Stemfect™ RnA Transfection Kit de Stemgent, y TransIT®-mRNA Transfection Kit de Mirus Bio LLC. Vease tambien Beumer et al. (2008) Efficient gene targeting in Drosophila by direct embryo injection with zinc-finger nucleases. PNAS 105(50):19821-19826. De manera alternativa, los acidos nucleicos que codifican un ARN dirigido a ADN, un polipeptido modificador dirigido al sitio, un polipeptido modificador quimerico dirigido al sitio y/o un polinucleotido donante pueden proporcionarse sobre vectores de ADN. Estan disponibles muchos vectores, por ejemplo, plasmidos, cosmidos, minicirculos, fagos, virus, etc., utiles para transferir acidos nucleicos a celulas objetivo. Los vectores que comprenden el o los acidos nucleicos pueden mantenerse de manera episomal, por ejemplo, como plasmidos, ADN de minicirculos, virus tales como citomegalovirus, adenovirus, etc., o pueden integrarse en el genoma de la celula objetivo, mediante recombinacion homologa o integracion aleatoria, por ejemplo, vectores derivados de retrovirus, tales como MMLV, VIH-1, ALV, etc.
Los vectores pueden ser proporcionados directamente a las celulas de la invencion. En otras palabras, las celulas se ponen en contacto con vectores que comprenden el acido nucleico que codifica un ARN dirigido al ADN, un polipeptido modificador dirigido al sitio, un polipeptido modificador quimerico dirigido al sitio y/o un polinucleotido donante, de forma que los vectores son absorbidos por las celulas. Son bien conocidos en la tecnica los metodos para poner en contacto a las celulas con vectores de acido nucleico que son plasmidos, inclusive electroporacion, transfeccion de cloruro de calcio, microinyeccion y lipofeccion. Para la administracion de vectores virales, las celulas se ponen en contacto con particulas virales que comprenden el acido nucleico que codifica un ARN dirigido a ADN, un polipeptido modificador dirigido al sitio, un polipeptido modificador quimerico dirigido al sitio y/o un polinucleotido donante. Los retrovirus, por ejemplo, lentivirus, son particularmente adecuados para el metodo de la invencion. Los vectores virales comunmente utilizados son "defectuosos", es decir, no son capaces de producir proteinas virales requeridas para la infeccion productiva. En cambio, la replicacion del vector requiere el cultivo en una linea celular empaquetadora. Para generar particulas virales que comprendan acidos nucleicos de interes, los acidos nucleicos retrovirales que comprenden el acido nucleico se empacan en capsides virales mediante una linea celular empaquetadora. Las distintas lineas celulares empaquetadoras proporcionan una proteina de envoltura diferente (ecotropica, anfotropica o xenotropica) para incorporarla en la capside, donde esta proteina de envoltura determina la especificidad de la particula viral para las celulas (ecotropica para murino y rata; anfotropica para la mayoria de los tipos celulares de mamiferos, inclusive de ser humano, de perro y raton; y xenotropica para la mayoria de los tipos de celulas de mamifero salvo las celulas de murino). La linea celular de envoltura apropiada puede utilizarse para garantizar que las celulas sean dirigidas por las particulas virales empaquetadoras. Son bien conocidos en la tecnica los metodos para la introduccion de vectores retrovirales que comprenden el acido nucleico que codifica los factores de reprogramacion en lineas celulares empaquetadora, y para la recoleccion de particulas virales generadas por las lineas empaquetadoras. Los acidos nucleicos pueden introducirse tambien mediante microinyeccion directa (por ejemplo, la inyeccion de ARN en un embrion de pez cebra).
Los vectores utilizados para proporcionar los acidos nucleicos que codifican un ARN dirigido a ADN, un polipeptido modificador dirigido al sitio, un polipeptido modificador quimerico dirigido al sitio y/o un polinucleotido donante a las celulas de la invencion normalmente comprenderan promotores adecuados para dirigir la expresion, es decir, la activacion transcripcional, del acido nucleico de interes. En otras palabras, el acido nucleico de interes estara unido de manera operativa a un promotor. Esto puede incluir promotores que actuan de manera general, por ejemplo, el promotor de CMV-p-actina o promotores inducibles, tales como promotores que estan activos en poblaciones celulares en particular o que responden ante la presencia de farmacos como la tetraciclina. Se entiende por activacion transcripcional que la transcripcion se aumentara por encima de los niveles basales en la celula objetivo, al menos alrededor de 10 veces, al menos alrededor de 100 veces, mas usualmente al menos alrededor de 1000 veces. Ademas, los vectores utilizados para proporcionar un ARN dirigido a ADN, un polipeptido modificador dirigido al sitio, un polipeptido modificador quimerico dirigido al sitio y/o un polinucleotido donante a las celulas de la invencion pueden incluir secuencias de acido nucleico que codifican marcadores seleccionables en las celulas objetivo, para identificar celulas que han absorbido el ARN dirigido a ADN, un polipeptido modificador dirigido al sitio, un polipeptido modificador quimerico dirigido al sitio y/o un polinucleotido donante.
Un ARN dirigido a ADN, un polipeptido modificador dirigido al sitio y/o un polipeptido modificador quimerico dirigido al sitio de la invencion pueden, en vez, utilizarse para poner en contacto AdN o pueden introducirse en las celulas como ARN. Los metodos para introducir ARN en celulas son conocidos en la tecnica y pueden incluir, por ejemplo, inyeccion directa, transfeccion o cualquier otro metodo utilizado para la introduccion de ADN.
Un polipeptido modificador dirigido al sitio puede, en cambio, ser proporcionado a las celulas como un polipeptido. Dicho polipeptido puede, opcionalmente, estar fusionado a un dominio de polipeptido que aumenta la solubilidad del producto. El dominio puede estar unido al polipeptido mediante un sitio definido de escision de proteasa, por ejemplo, una secuencia TEV, la cual es escindida mediante una proteasa TEV. El enlazador puede incluir tambien una o mas secuencias flexibles, por ejemplo, de 1 a 10 residuos de glicina. En algunas modalidades, la escision de la proteina de fusion es realizada en un amortiguador que mantiene la solubilidad del producto, por ejemplo, ante la presencia de 0,5 a 2 M de urea, ante la presencia de polipeptidos y/o polinucleotidos que aumentan la solubilidad, y similares. Los dominios de interes incluyen dominios endosomoliticos, por ejemplo, dominio HA de la influenza y
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otros polipeptidos que colaboran en la produccion, por ejemplo, dominio IF2, dominio GST, dominio GRPE y similares. El polipeptido puede estar formulado para una estabilidad mejorada. Por ejemplo, los peptidos pueden ser PEGilados, donde el grupo polietilenoxi proporciona un ciclo de vida mejorado en el torrente sanguineo.
De manera adicional o alternativa, el polipeptido modificador dirigido al sitio de la invencion puede estar fusionado a un dominio de permeabilidad de polipeptidos para promover la absorcion de la celula. Son conocidos en la tecnica una cantidad de dominios de permeabilidad, y pueden ser utilizados en los polipeptidos no integrados de la presente invencion, inclusive peptidos, peptidomimeticos y portadores no peptidos. Por ejemplo, un peptido permeante puede derivarse de la tercera helice alfa del factor de transcripcion de Drosophila melanogaster Antennapaedia, al que se hace referencia como penetratina, que comprende la secuencia de aminoacidos RQIKIWFQNRRMKWKK (SEQ ID NO://). Como otro ejemplo, el peptido permeante comprende la secuencia de aminoacidos de la region basica de tat de VIH-1, que puede incluir, por ejemplo, los aminoacidos 49-57 de la proteina tat de origen natural. Otros dominios de permeabilidad incluyen motivos de poliarginina, por ejemplo, la region de los aminoacidos 34-56 de la proteina rev de VIH-1, nonaarginina, octaarginina y similares. (Vease, por ejemplo, Futaki et al. (2003) Curr Protein Pept Sci. abr de 2003; 4(2): 87-9 and 446; y Wender et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 21 de noviembre de 2000; 97(24):13003-8; solicitudes publicadas de patente estadounidense 20030220334; 20030083256; 20030032593; y 20030022831). La secuencia de nonaarginina (R9) es uno de los PTD mas eficientes que se han caracterizado (Wender et al. 2000; Uemura et al. 2002). El sitio en el que se realiza la fusion puede seleccionarse para optimizar las caracteristicas de union, secrecion o actividad biologica del polipeptido. El sitio optimo sera determinado mediante experimentacion de rutina.
Un polipeptido modificador dirigido al sitio puede producirse in vitro, mediante celulas eucariotas o mediante celulas procariotas, y puede procesarse adicionalmente mediante desdoblamiento, por ejemplo, desnaturalizacion termica, reduccion de DTT, etc. y puede replegarse utilizando metodos conocidos en la tecnica.
Las modificaciones de interes que no alteran la secuencia primaria incluyen la derivacion quimica de polipeptidos, por ejemplo, acilacion, acetilacion, carboxilacion, amidacion, etc. Tambien se incluyen las modificaciones de glicosilacion, por ejemplo, aquellas realizadas mediante la modificacion de los patrones de glicosilacion de un polipeptido durante su sintesis y procesamiento o en etapas posteriores de procesamiento; por ejemplo, mediante la exposicion del polipeptido a enzimas que afectan la glicosilacion, tales como enzimas glicosilantes o desglicosilantes de mamifero. Tambien se comprenden secuencias que tienen residuos de aminoacidos fosforilados, por ejemplo, fosfotirosina, fosfoserina o fosfotreonina.
Tambien se incluyen en la presente invencion ARN dirigidos a ADN y polipeptidos modificadores dirigidos al sitio que se han modificado utilizando tecnicas biologicas moleculares y quimica sintetica con la finalidad de mejorar su resistencia a la degradacion proteolitica, cambiar la especificidad de la secuencia objetivo, optimizar las propiedades de solubilidad, alterar la actividad de las proteinas (por ejemplo, la actividad moduladora de la transcripcion, actividad enzimatica, etc.) o tornarlas mas adecuadas como agente terapeutico. Los analogos de dichos polipeptidos incluyen aquellos que contienen residuos que no sean L-aminoacidos de origen natural, por ejemplo, D-aminoacidos o aminoacidos sinteticos de origen no natural. Algunos o todos los residuos de aminoacidos pueden ser sustituidos por D-aminoacidos.
Los polipeptidos modificadores dirigidos al sitio pueden prepararse mediante sintesis in vitro, utilizando metodos convencionales conocidos en la tecnica. Se encuentran disponibles varios aparatos sinteticos comerciales, por ejemplo, sintetizadores automatizados de Applied Biosystems, Inc., Beckman, etc. Al utilizar sintetizadores, los aminoacidos de origen natural pueden sustituirse con aminoacidos no naturales. La secuencia en particular y la forma de preparacion se determinaran por la conveniencia, factores economicos, pureza requerida y similares.
De desearse, podran introducirse en el peptido varios grupos durante la sintesis o durante la expresion, lo cual permite la union a otras moleculas o a una superficie. Por lo tanto, pueden utilizarse las cisteinas para hacer tioeteres, las histidinas para el enlace a un complejo de ion metalico, los grupos carboxilo para formar amidas o esteres, los grupos amino para formar amidas, etc.
Los polipeptidos modificadores dirigidos al sitio tambien pueden aislarse y purificarse de acuerdo con metodos convencionales de sintesis recombinante. Puede prepararse un lisado del hospedador de expresion y el lisado puede purificarse mediante HPLC, cromatografia de exclusion, electroforesis en gel, cromatografia de afinidad u otra tecnica de purification. En general, las composiciones utilizadas comprenderan al menos 20 % en peso del producto deseado, de forma mas usual al menos alrededor de 75 % en peso, preferentemente al menos alrededor de 95 % en peso y, con fines terapeuticos, usualmente al menos alrededor de 99,5 % en peso, en relation con contaminantes relacionados con el metodo de preparacion del producto y su purificacion. Usualmente, el porcentaje se basara en proteinas totales.
Para inducir la recombination y escision de ADN, cualquier modificacion deseada a un ADN objetivo o cualquier modificacion deseada a un polipeptido asociado con ADN objetivo, el ARN dirigido a ADN, el polipeptido modificador dirigido al sitio, el polinucleotido donante, esten introducidos como acidos nucleicos o polipeptidos, se proporcionan a las celulas durante alrededor de 30 minutos a alrededor de 24 horas, por ejemplo, 1 hora, 1,5 horas, 2 horas, 2,5
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horas, 3 horas, 3,5 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 8 horas, 12 horas, 16 horas, 18 horas, 20 horas o cualquier otro periodo en el intervalo de alrededor de 30 minutos a alrededor de 24 horas, lo que se puede repetir con una frecuencia de aproximadamente todos los d^as a aproximadamente cada 4 d^as, por ejemplo, cada 1,5 d^as, cada 2 d^as, cada 3 dias o cualquier otra frecuencia de aproximadamente cada dia a aproximadamente cada 4 dias. El o los agentes pueden proporcionarse a las celulas de la invencion una o mas veces, por ejemplo, una vez, dos veces, tres veces o mas de tres veces, y permitirle a las celulas la incubacion con el o los agentes durante una cantidad de tiempo luego de cada evento de contacto, por ejemplo, 16-24 horas; luego de este tiempo, el medio se reemplaza con medio fresco y las celulas se continuan cultivando.
En los casos en que se proporcionan a la celula dos o mas complejos de direccionamiento distintos (por ejemplo, dos ARN dirigidos a ADN que son complementarios a diferentes secuencias dentro del mismo ADN objetivo o uno distinto), los complejos pueden proporcionarse de forma simultanea (por ejemplo, como dos polipeptidos y/o acidos nucleicos) o administrarse de forma simultanea. De manera alternativa, pueden proporcionarse de manera consecutiva, por ejemplo, proporcionando primero el complejo de direccionamiento, seguido por el segundo complejo de direccionamiento, etc., o viceversa.
Normalmente, se proporciona una cantidad eficaz del ARN dirigido a ADN, polipeptido modificador dirigido al sitio y/o polinucleotido donante al ADN o celulas objetivo para inducir la escision. Una cantidad eficaz o dosis eficaz del ARN dirigido a ADN y/o polipeptido modificador dirigido al sitio y/o polinucleotido donante es la cantidad para inducir un aumento de 2 veces o mas en la cantidad de modification del objetivo observada entre dos secuencias homologas en relation a un control negativo, por ejemplo, una celula que se puso en contacto con un vector vacio o polipeptido irrelevante. Es decir, una dosis o cantidad eficaz del ARN dirigido a ADN y/o polipeptido modificador dirigido al sitio y/o polinucleotido donante inducira un aumento de 2 veces, un aumento de 3 veces, un aumento de 4 veces o mas en la cantidad de modificacion del objetivo observada en una region de ADN objetivo, en algunas instancias un aumento de 5 veces, un aumento de 6 veces o mas, a veces un aumento de 7 u 8 veces o mas en la cantidad de recombination observada, por ejemplo, un aumento de 10 veces, 50 veces o 100 veces o mas, en algunas instancias, un aumento de 200 veces, 500 veces, 700 veces o 1000 veces o mas, por ejemplo, un aumento de 5000 veces o 10000 veces en la cantidad de recombinacion observada. La cantidad de modificacion del objetivo puede medirse mediante cualquier metodo conveniente. Por ejemplo, puede cotransfectarse a las celulas una construction indicadora silenciosa que comprende una secuencia complementaria al segmento de direccionamiento (secuencia de direccionamiento) del ARN dirigido a ADN flanqueado por secuencias de repetition que, cuando se recombinan, reconstituyen un acido nucleico que codifica un indicador activo, y puede evaluarse la cantidad de proteina indicadora luego del contacto con el ARN dirigido a ADN y/o el polipeptido modificador dirigido al sitio y/o el polinucleotido donante, por ejemplo, 2 horas, 4 horas, 8 horas, 12 horas, 24 horas, 36 horas, 48 horas, 72 horas o mas luego de ponerse en contacto con el ARN dirigido a ADN y/o el polipeptido modificador dirigido al sitio y/o el polinucleotido donante. Como otro ensayo mas sensible, por ejemplo, la extension de la recombinacion en una region de ADN genomico de interes que comprende secuencias de ADN objetivo puede evaluarse mediante PCR o hibridacion Southern de la region luego de ponerla en contacto con un ARN dirigido a ADN y/o polipeptido modificador dirigido al sitio y/o polinucleotido donante, por ejemplo, 2 horas, 4 horas, 8 horas, 12 horas, 24 horas, 36 horas, 48 horas, 72 horas o mas luego del contacto con el ARN dirigido a ADN y/o polipeptido modificador dirigido al sitio y/o polinucleotido donante.
El contacto de las celulas con ARN dirigido a ADN y/o polipeptido modificador dirigido al sitio y/o polinucleotido donante puede ocurrir en cualquier medio de cultivo y en cualquier condition que promueva la supervivencia de las celulas. Por ejemplo, las celulas pueden suspenderse en cualquier medio de nutriente adecuado, tal como DMEM modificado de Iscove o RPMI 1640, complementado con suero fetal bovino o suero de cabra inactivado por calor (alrededor de 5-10 %), L-glutamina, un tiol, particularmente 2-mercaptoetanol y antibioticos, por ejemplo, penicilina y estreptomicina. El cultivo puede contener factores de crecimiento a los cuales responden las celulas. Los factores de crecimiento, tal como se definen en la presente, son moleculas capaces de promover la supervivencia, crecimiento y/o diferenciacion de celulas, ya sea en cultivo o en el tejido intacto, a traves de efectos especificos en una receptor transmembrana. Los factores de crecimiento incluyen factores polipeptidicos y no polipeptidicos. Las condiciones que promueven la supervivencia de celulas normalmente permiten la recombinacion no homologa y la reparation dirigida por homologia.
En aplicaciones en las que es deseable insertar una secuencia de polinucleotidos en una secuencia de ADN objetivo, se proporciona tambien a la celula un polinucleotido que comprende una secuencia donante para ser insertada. Por "secuencia donante" o "polinucleotido donante" se entiende una secuencia de acido nucleico para insertar en el sitio de escision inducido por un polipeptido modificador dirigido al sitio. El polinucleotido donante contendra una homologia suficiente con respecto a una secuencia genomica en el sitio de escision, por ejemplo, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o 100 % de homologia con las secuencias de nucleotidos que flanquean el sitio de escision, por ejemplo, dentro de alrededor de 50 bases o menos del sitio de escision, dentro de alrededor de 30 bases, dentro de alrededor de 15 bases, dentro de alrededor de 10 bases, dentro de alrededor de 5 bases o que flanquean inmediatamente el sitio de escision, para sostener la reparacion dirigida por homologia entre este y la secuencia genomica con la cual posee homologia. Aproximadamente 20, 50, 100 o 200 nucleotidos, o mas de 200 nucleotidos, de homologia de secuencia entre un donante y una secuencia genomica (o cualquier valor integral entre 10 y 200 nucleotidos o mas) sostendra la reparacion dirigida por homologia. Las secuencias donantes pueden tener cualquier
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longitud, por ejemplo, 10 nucleotidos o mas, 50 nucleotidos o mas, 100 nucleotidos o mas, 250 nucleotidos o mas, 500 nucleotidos o mas, 1000 nucleotidos o mas, 5000 nucleotidos o mas, etc.
La secuencia donante no es normalmente identica a la secuencia genomica que reemplaza. En cambio, la secuencia donante puede contener al menos uno o mas cambios, inserciones, eliminaciones, inversiones o reajustes de base simple con respecto a la secuencia genomica, siempre y cuando haya suficiente homologia para brindar soporte a la reparacion dirigida por homologia. En algunas modalidades, la secuencia donante comprende una secuencia no homologa flanqueada por dos regiones de homologia, de forma tal que la reparacion dirigida por homologia entre la region de ADN objetivo y las dos secuencias flanqueantes da como resultado la insercion de la secuencia no homologa en la region objetivo. Las secuencias donantes tambien pueden comprender una estructura de vector que contiene secuencias que no son homologas con respecto a la region de ADN de interes y que no estan destinadas para la insercion en la region de ADN de interes. Generalmente, la o las regiones homologas de una secuencia donante tendran al menos 50 % de identidad de secuencia con una secuencia genomica con la cual se desea la recombinacion. En determinadas modalidades, esta presente una identidad de secuencia del 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o 99,9 %. Puede estar presente cualquier valor entre 1 % y 100 % de identidad de secuencia, dependiendo de la longitud del polinucleotido donante.
La secuencia donante puede comprender ciertas diferencias de secuencia en comparacion con la secuencia genomica, por ejemplo, sitios de restriccion, polimorfismos de nucleotido, marcadores seleccionables (por ejemplo, genes de resistencia a farmacos, proteinas fluorescentes, enzimas, etc.), etc., que pueden utilizarse para evaluar la insercion exitosa de la secuencia donante en el sitio de escision, o en algunos casos pueden utilizarse con otros fines (por ejemplo, para indicar la expresion en el locus genomico objetivo). En algunos casos, si se encuentran en la region de codificacion, dichas diferencias en la secuencia de nucleotidos no cambiaran la secuencia de aminoacidos o haran que los cambios de los aminoacidos sean silenciosos (es decir, los cambios que no afectan la estructura o funcion de la proteina). De manera alternativa, estas diferencia de secuencias pueden incluir secuencias de recombinacion flanqueantes tales como FLP, secuencias loxP o similares, que pueden activarse en un momento posterior para la remocion de la secuencia marcadora.
Puede proporcionarse a la celula la secuencia donante como ADN de cadena simple, ARN de cadena simple, ADN de cadena doble o ARN de cadena doble. Puede introducirse a una celula de forma lineal o circular. De introducirse de forma lineal, los extremos de la secuencia donante pueden protegerse (por ejemplo, de degradation exonucleolitica) mediante metodos conocidos para el experto en la tecnica. Por ejemplo, se agregan uno o mas residuos de didesoxinucleotido al extremo 3' de una molecula lineal y/o se ligan los oligonucleotido autocomplementarios a uno o ambos extremos. Vease, por ejemplo, Chang et al. (1987) Proc. Natl. Acad Sci EUA 84:4959-4963; Nehls et al. (1996) Science 272:886-889. Metodos adicionales para proteger polinucleotidos exogenos de degradacion incluyen, de modo no taxativo, la adicion de grupos amino del extremo y el uso de enlaces internucleotidos modificados, tales como, por ejemplo, fosforotioatos, fosforamidatos y residuos de O-metil ribosa o desoxirribosa. Como una alternativa a la protection del extremo de una secuencia donante lineal, pueden incluirse longitudes adicionales de secuencia fuera de las regiones de homologia que pueden degradarse sin impactar la recombinacion. Una secuencia donante puede introducirse en una celula como parte de una molecula de vector que tiene secuencias adicionales tales como, por ejemplo, origenes de replication, promotores y genes que codifican la resistencia antibiotica. Mas aun, las secuencias donantes pueden introducirse como acido nucleico no conjugado, como acido nucleico en complejo con un agente tal como liposoma o poloxamero, o puede administrarse mediante virus (por ejemplo, adenovirus, AAV), segun se describio anteriormente en cuanto a los acidos nucleicos que codifican un ARN dirigido a ADN y/o polipeptido modificador dirigido al sitio y/o polinucleotido donante.
Siguiendo los metodos descritos anteriormente, puede escindirse y modificarse una region de ADN de interes, es decir, "modificarse geneticamente", ex vivo. En algunas modalidades, como cuando se inserto un marcador seleccionable en la region de ADN de interes, la poblacion de celulas puede estar enriquecida para las que comprenden la modification genetica mediante la separation de las celulas modificadas geneticamente de la poblacion restante. Antes del enriquecimiento, las celulas "modificadas geneticamente" pueden comprender solamente alrededor de 1 % o mas (por ejemplo, 2 % o mas, 3 % o mas, 4 % o mas, 5 % o mas, 6 % o mas, 7 % o mas, 8 % o mas, 9 % o mas, 10 % o mas, 15 % o mas, o 20 % o mas) de la poblacion de celulas. La separacion de celulas "modificadas geneticamente" puede lograrse mediante cualquier tecnica de separacion conveniente adecuada para el marcador seleccionable utilizado. Por ejemplo, si se ha insertado un marcador fluorescente, las celulas pueden separarse mediante clasificacion de celulas activadas por fluorescencia, mientras que si se ha insertado un marcador de superficie celular, las celulas pueden separarse de la poblacion heterogenea mediante tecnicas de separacion por afinidad, por ejemplo, separacion magnetica, cromatografia por afinidad, "cribado" con un reactivo de afinidad acoplado a una matriz solida, u otra tecnica conveniente. Las tecnicas que proporcionan una separacion correcta incluyen clasificadores de celulas activadas por fluorescencia, que pueden tener varios grados de sofisticacion, tal como multiples canales de color, canales de detection de dispersion de luz de angulo bajo y obtuso, canales de impedancia, etc. Las celulas pueden seleccionarse contra celulas muertas mediante el uso de tintes asociados con celulas muertas (por ejemplo, yoduro de propidio). Puede emplearse cualquier tecnica que no sea indebidamente perjudicial para la viabilidad de las celulas modificadas geneticamente. Las composiciones celulares que estan altamente enriquecidas para celulas que comprenden ADN modificado se obtienen de esta manera. "Altamente enriquecida" significa que las celulas modificadas geneticamente seran el 70 % o mas, 75 % o
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mas, 80 % o mas, 85 % o mas, 90 % o mas de la composition celular, por ejemplo, alrededor de 95 % o mas, o 98 % o mas de la composicion celular. En otras palabras, la composicion puede ser una composicion sustancialmente pura de celulas modificadas geneticamente.
Las celulas modificadas geneticamente producidas mediante los metodos descritos en la presente pueden usarse inmediatamente. De manera alternativa, las celulas pueden congelarse a temperaturas de nitrogeno liquido y almacenarse durante periodos de tiempo prolongados, y luego pueden descongelarse y puede reutilizarse. En dichos casos, las celulas se congelaran usualmente en dimetilsulfoxido (DMSO) al 10 %, suero al 50 %, medio amortiguado al 40 % u otra solution como las usadas en la tecnica para preservar celulas en dichas temperaturas de congelamiento, y se descongelaran de una manera como las usadas comunmente en la tecnica para descongelar celulas cultivadas congeladas.
Las celulas modificadas geneticamente pueden cultivarse in vitro en varias condiciones de cultivo. Las celulas pueden expandirse en el cultivo, es decir, crecer en condiciones que promueven su proliferation. El medio de cultivo puede ser liquido o semisolido, por ejemplo, puede contener agar, metilcelulosa, etc. La poblacion de celulas puede suspenderse en un medio de nutriente adecuado, tal como DMEM modificado de Iscove o RPMI 1640, complementado normalmente con suero fetal bovino (alrededor de 5-10 %), L-glutamina, un tiol, particularmente 2- mercaptoetanol, y antibioticos, por ejemplo, penicilina y estreptomicina. El cultivo puede contener factores de crecimiento a los cuales responden los linfocitos T reguladores. Los factores de crecimiento, tal como se definen en la presente, son moleculas capaces de promover la supervivencia, crecimiento y/o diferenciacion de celulas, ya sea en cultivo o en el tejido intacto, a traves de efectos especificos en un receptor transmembrana. Los factores de crecimiento incluyen factores polipeptidicos y no polipeptidicos.
Las celulas que han sido modificadas geneticamente de esta manera pueden trasplantarse a un sujeto con fines tales como terapia genica, por ejemplo, para tratar una enfermedad o como un agente terapeutico antiviral, antipatogenico o anticanceroso, para la produccion de organismos modificados geneticamente en la agricultura o para la investigation biologica. El sujeto puede ser un neonato, un joven o un adulto. Los sujetos mamiferos son de particular interes. Las especies de los mamiferos que pueden tratarse con los metodos incluyen caninos y felinos; equinos; bovinos; ovinos; etc., y primates, particularmente seres humanos. Pueden usarse modelos animales, particularmente de mamiferos pequenos (por ejemplo, ratones, ratas, cobayos, hamsteres, lagomorfos (por ejemplo, conejos), etc.) para investigaciones experimentales.
Pueden proporcionarse celulas al sujeto solas o con un sustrato o matriz adecuados, por ejemplo, para respaldar su crecimiento y/u organization en el tejido al cual se trasplantan. Usualmente, se administraran al menos 1x103 celulas, por ejemplo 5x103 celulas, 1x104 celulas, 5x104 celulas, 1x105 celulas, 1 x 106 celulas o mas. Las celulas pueden introducirse en el sujeto por medio de cualquiera de las siguientes vias: parenteral, subcutanea, intravenosa, intracraneana, intraespinal, intraocular o en el liquido cefalorraquideo. Las celulas pueden introducirse por medio de inyeccion, cateter o similares. Los ejemplos de metodos para la administration local, es decir, administration al sitio de la lesion, incluyen, por ejemplo, a traves de un deposito de Ommaya, por ejemplo, para la administracion intratecal (veanse, por ejemplo, las patentes estadounidenses n.° 5.222.982 y 5385582); mediante inyeccion en bolo, por ejemplo, con una jeringa, por ejemplo, en una articulation; mediante infusion continua, por ejemplo, mediante canulacion, por ejemplo, con convection (vease, por ejemplo, la solicitud estadounidense n.° 20070254842); o por implante de un dispositivo en el cual se fijaron de manera reversible las celulas (veanse, por ejemplo, las solicitudes estadounidenses n.° 20080081064 y 20090196903). Las celulas no humanas tambien pueden introducirse en un embrion no humano (por ejemplo, un blastocisto) con el fin de generar un animal transgenico no humano (por ejemplo, un raton transgenico).
La cantidad de administraciones de tratamiento a un sujeto puede variar. La introduction de celulas modificadas geneticamente en un sujeto puede ser un evento de una sola vez; en determinadas situaciones, dicho tratamiento puede producir la mejora durante un periodo de tiempo limitado y necesitar una serie continua de tratamientos repetidos. En otras situaciones, pueden necesitarse multiples administraciones de las celulas modificadas geneticamente antes de observar un efecto. Los protocolos exactos dependen de la enfermedad o afeccion, la etapa de la enfermedad y los parametros del sujeto individual que se esta tratando.
En otros aspectos de la invention, el ARN dirigido a ADN y/o polipeptido modificador dirigido al sitio y/o polinucleotido donante se emplean para modificar el ADN celular in vivo, nuevamente con fines tales como la terapia genica, por ejemplo, para tratar una enfermedad o como un agente terapeutico antiviral, antipatogenico o anticanceroso, para la production de organismos modificados geneticamente en la agricultura o para la investigacion biologica. En estas modalidades in vivo, un ARN dirigido a ADN y/o polipeptido modificador dirigido al sitio y/o polinucleotido donante se administran directamente al individuo. Un ARN dirigido a ADN y/o polipeptido modificador dirigido al sitio y/o polinucleotido donante puede administrarse mediante cualquier cantidad de metodos conocidos en la tecnica para la administracion de peptidos, moleculas pequenas y acidos nucleicos a un sujeto. Un ARN dirigido a ADN y/o polipeptido modificador dirigido al sitio y/o polinucleotido donante puede incorporarse en variedad formulaciones. Mas particularmente, un ARN dirigido a ADN y/o polipeptido modificador dirigido al sitio y/o polinucleotido donante de la presente invencion puede formularse en composiciones farmaceuticas mediante la combination con portadores o diluyentes farmaceuticamente aceptables.
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Las preparaciones farmaceuticas son composiciones que incluyen uno o mas ARN dirigidos a ADN y/o polipeptidos modificadores dirigidos al sitio y/o polipeptido donante presentes en un vehiculo farmaceuticamente aceptable. Los “vehnculos farmaceuticamente aceptables” pueden ser vehnculos aprobados por una agencia reguladora del gobierno federal o estatal o enumerado en la Farmacopea de Estados Unidos u otra farmacopea reconocida en general para usar en mamiferos, tal como seres humanos. El termino "vetnculo" se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente o portador con el cual un compuesto de la invencion se formula para su administration a un mamifero. Dichos vehiculos farmaceuticos pueden ser lipidos, por ejemplo, liposomas, por ejemplo, dendrimeros de liposoma; Kquidos, tal como agua y aceites, inclusive los de origen petrolifero, animal, vegetal o sintetico, tal como aceite de mani, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sesamo y similares, solution salina; goma acacia, gelatina, pasta de almidon, talco, queratina, silice coloidal, urea y similares. Ademas, se pueden utilizar agentes auxiliares, estabilizantes, espesantes, lubricantes y colorantes. Las composiciones farmaceuticas pueden formularse en preparaciones en formas solida, semisolida, liquida o gaseosa, tal como comprimidos, capsulas, polvos, granulos, unguentos, soluciones, supositorios, inyecciones, inhaladores, geles, microesferas y aerosoles. Como tal, la administracion del ARN dirigido al ADN y/o polipeptido modificador dirigido al sitio y/o polinucleotido donante puede lograrse de varias maneras, incluyendo administracion oral, bucal, rectal, parenteral, intraperitoneal, intradermica, transdermica, intratraqueal, intraocular, etc. El agente activo puede ser sistemico luego de la administracion o puede localizarse mediante el uso de administracion regional, administracion intramural o el uso de un implante que actua para retener la dosis activa en el sitio de implante. El agente activo puede formularse para su actividad inmediata o puede formularse para liberation sostenida.
Para algunas afecciones, particularmente las afecciones del sistema nervioso central, puede ser necesario formular los agentes para que crucen la barrera hematoencefalica (BBB, por sus siglas en ingles). Una estrategia para la administracion del farmaco a traves de la barrera hematoencefalica (BBB) implica la alteration de la BBB, ya sea mediante medios osmoticos como manitol o leucotrienos, o bioquimicamente mediante el uso de sustancias vasoactivas tal como bradiquinina. El potencial para abrir la BBB para dirigir agentes especificos a tumores cerebrales tambien es una option. Un agente de alteracion de la BBB puede coadministrarse con las composiciones terapeuticas de la invencion cuando las composiciones se administran mediante inyeccion intravascular. Otras estrategias para atravesar la BBB pueden implicar el uso de sistemas de transporte endogeno, inclusive tanscitosis mediada por caveolina-1, transportadores mediados por portador tal como portadores de glucosa o aminoacidos, transcitosis mediada por receptor para insulina o transferrina, y transportadores de eflujo activo tal como p- glicoproteina. Los restos de transporte activos pueden tambien conjugarse con los compuestos terapeuticos para su uso en la invencion para facilitar el transporte a traves de la pared entodelial de los vasos sanguineos. De manera alternativa, la administracion de farmacos de agentes terapeuticos mas alla de la BBB pueden ser mediante administracion local, por ejemplo, mediante administracion intratecal, por ejemplo, a traves de un deposito de Ommaya (veanse, por ejemplo, las patentes estadounidenses n.° 5.222.982 y 5385582); mediante inyeccion en bolo, por ejemplo, con una jeringa, por ejemplo, por via intravitrea o intracraneana; mediante infusion continua, por ejemplo, mediante canulacion, por ejemplo, con convection (vease, por ejemplo, la solicitud estadounidense n.° 20070254842); o por implante de un dispositivo en el cual se fijo de manera reversible el agente (veanse, por ejemplo, las solicitudes estadounidenses n.° 20080081064 y 20090196903).
Normalmente, se proporciona una cantidad eficaz de un ARN dirigido a ADN y/o polipeptido modificador dirigido al sitio y/o polinucleotido donante. Tal como se describe anteriormente respecto a los metodos ex vivo, una cantidad eficaz o dosis eficaz de un ARN dirigido a ADN y/o polipeptido modificador dirigido al sitio y/o polinucleotido donante in vivo es la cantidad para inducir un aumento de 2 veces o mas en la cantidad de recombination observada entre dos secuencias homologas en relation a un control negativo, por ejemplo, se pone en contacto una celula con un vector vacio o polipeptido irrelevante. La cantidad de recombinacion puede medirse mediante cualquier metodo conveniente, por ejemplo, como se describe anteriormente y se conoce en la tecnica. El calculo de la cantidad eficaz o dosis eficaz de un ARN dirigido a ADN y/o polipeptido modificador dirigido al sitio y/o polinucleotido donante que sera administrada esta dentro de la capacidad de un experto en la tecnica, y sera de rutina para los expertos en la tecnica. La cantidad final que sera administrada dependera de la via de administracion y de la naturaleza del trastorno o afeccion que sera tratada.
La cantidad eficaz dada a un paciente en particular dependera de varios factores, varios de los cuales difieren de paciente a paciente. Un medico competente sera capaz de determinar una cantidad eficaz de un agente terapeutico para administrarlo a un paciente para detener o revertir la evolution de la condition de la enfermedad, segun sea necesario. Con la utilization de datos animales LD50, y otra information disponible para el agente, un medico puede determinar la dosis segura maxima para un individuo, dependiendo de la via de administracion. Por ejemplo, una dosis administrada por via intravenosa puede ser mas que una dosis administrada por via intratecal, dado que la composition terapeutica se administra en un cuerpo de fluido mayor. De manera similar, las composiciones que se depuran rapidamente del cuerpo pueden administrarse en dosis mayores, o en dosis repetidas, para mantener una concentration terapeutica. Mediante la utilizacion de capacidades estandares, el medico competente podra optimizar la dosificacion de un agente terapeutico particular en el transcurso de ensayos clinicos de rutina.
Para su inclusion en un medicamento, un ARN dirigido a ADN y/o polipeptido modificador dirigido al sitio y/o polinucleotido donante puede obtenerse de una fuente comercial adecuada. Como una propuesta general, la cantidad farmaceuticamente eficaz total del ARN dirigido a ADN y/o polipeptido modificador dirigido al sitio y/o
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polinucleotido donante administrada por v^a parenteral por dosis, estara en un intervalo que puede medirse mediante una curva de respuesta a la dosis.
Las terapias basadas en ARN dirigido a ADN y/o polipeptido modificador dirigido al sitio y/o polinucleotidos donantes, es decir, las preparaciones de ARN dirigido a ADN y/o polipeptido modificador dirigido al sitio y/o polinucleotido donante que se usaran para la administracion terapeutica deben ser esteriles. La esterilidad se logra facilmente mediante filtrado a traves de membranas de filtracion (por ejemplo, membranas de 0,2 |jm). Las composiciones terapeuticas generalmente se colocan en un recipiente que tiene un puerto de acceso esteril, por ejemplo, una bolsa o vial de solucion intravenosa con un tapon perforable con una aguja de inyeccion hipodermica. Las terapias basadas en ARN dirigido a ADN y/o polipeptido modificador dirigido al sitio y/o polinucleotido donante pueden almacenarse en recipientes unitarios o de dosis multiples, por ejemplo, ampollas o viales sellados, como una solucion acuosa o como una formulacion liofilizada para su reconstitucion. Como ejemplo de formulacion liofilizada, se llenan viales de 10 mL con 5 ml de solucion acuosa filtrada esteril al 1 % (p/v) del compuesto, y la mezcla resultante se liofiliza. La solucion de infusion se prepara mediante la reconstitucion del compuesto liofilizado usando agua bacteriostatica para inyecciones.
Las composiciones farmaceuticas pueden incluir, dependiendo de la formulacion deseada, portadores de diluyentes farmaceuticamente aceptables, no toxicos, que se definen como vehiculos comunmente utilizados para formular composiciones farmaceuticas para administracion a animales o seres humanos. El diluyente se selecciona a fin de no afectar la actividad biologica de la combinacion. Los ejemplos de dichos diluyentes son agua destilada, agua con amortiguador, solucion salina fisiologica, PBS, solucion de Ringer, solucion de dextrosa y solucion de Hank. Ademas, la composition o formulacion farmaceutica puede incluir otros portadores, adyuvantes o estabilizadores no toxicos, no terapeuticos, no inmunogenos, excipientes y similares. Las composiciones tambien pueden incluir sustancias adicionales para aproximarse a condiciones fisiologicas, tales como agentes de ajuste de pH y amortiguacion, agentes de ajuste de toxicidad, agentes humectantes y detergentes.
La composicion tambien puede incluir cualquiera de varios agentes estabilizadores, tales como un antioxidante, por ejemplo. Cuando la composicion farmaceutica incluye un polipeptido, el polipeptido puede formar complejos con varios compuestos conocidos para potenciar la estabilidad in vivo del polipeptido o potenciar de otra forma sus propiedades farmacologicas (por ejemplo, aumentar la semivida del polipeptido, reducir su toxicidad, potenciar la solubilidad o absorcion). Los ejemplos de dichas modificaciones o agentes para formation de complejos incluyen sulfato, gluconato, citrato y fosfato. Los acidos nucleicos o polipeptidos de una composicion tambien pueden formar complejos con moleculas que potencian sus atributos in vivo. Dichas moleculas incluyen, por ejemplo, carbohidratos, poliaminas, aminoacidos, otros peptidos, iones (por ejemplo, sodio, potasio, calcio, magnesio, manganeso) y lipidos.
Se pueden obtener mayores instrucciones sobre las formulaciones que son adecuadas para varios tipos de administracion en Remington's Pharmaceutical Sciences, Mace Publishing Company, Philadelphia, Pa., 17a edition (1985). Por una breve resena respecto a los metodos para la administracion de farmacos vease Langer, Science 249:1527-1533 (1990).
Las composiciones farmaceuticas pueden administrarse para tratamientos profilacticos y/o terapeuticos. La toxicidad y la eficacia terapeutica del ingrediente activo pueden determinarse de acuerdo con procedimientos farmaceuticos estandares en cultivos celulares y/o animales para experimentos, inclusive, por ejemplo, la determination de la LD50 (la dosis letal para el 50 % de la poblacion) y de la ED50 (la dosis terapeuticamente efectiva en el 50 % de la poblacion). La proportion de la dosis entre los efectos toxicos y terapeuticos es el indice terapeutico y puede expresarse como la proporcion LD50/ED50. Se prefieren las terapias que presentan indices terapeuticos mayores.
Los datos obtenidos del cultivo celular y/o los estudios con animales pueden utilizarse para formular un rango de dosificaciones para humanos. La dosificacion del ingrediente activo normalmente esta dentro de un intervalo de concentraciones en circulation que incluyen la ED50 con toxicidad baja. La dosificacion puede variar dentro de este intervalo dependiendo de la forma de dosificacion empleada y la via de administracion utilizada.
Los componentes utilizados para formular las composiciones farmaceuticas son preferentemente de pureza alta y estan sustancialmente libres de contaminantes potencialmente daninos (por ejemplo, al menos de grado del Instituto Nacional de Alimentos (NF), generalmente al menos de grado analitico, y mas normalmente al menos de grado farmaceutico). Ademas, las composiciones destinadas al uso in vivo son usualmente esteriles. En la medida que un compuesto dado debe sintetizarse antes de su uso, el producto resultante esta normalmente sustancialmente libre de cualquier agente potencialmente toxico, particularmente cualquier endotoxina, que pueden estar presentes durante el proceso de sintesis o purification. Las composiciones para administracion parenteral tambien son esteriles, sustancialmente isotonicas y elaboradas en condiciones GMP (buenas practicas de fabrication).
La cantidad eficaz de una composicion terapeutica administrada a un paciente en particular dependera de varios factores, varios de los cuales difieren de paciente a paciente. Un medico competente sera capaz de determinar una cantidad eficaz de un agente terapeutico para administrarlo a un paciente para detener o revertir la evolution de la condition de la enfermedad, segun sea necesario. Con la utilization de datos de LD50 de animales, y otra information disponible para el agente, un medico puede determinar la dosis segura maxima para un individuo,
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dependiendo de la via de administracion. Por ejemplo, una dosis administrada por via intravenosa puede ser mas que una dosis administrada por via intratecal, dado que la composicion terapeutica se administra en un cuerpo de fluido mayor. De manera similar, las composiciones que se depura rapidamente del cuerpo pueden administrate en dosis mayores, o en dosis repetidas, para mantener una concentracion terapeutica. Mediante la utilizacion de capacidades estandares, el medico competente podra optimizar la dosificacion de un agente terapeutico particular en el transcurso de ensayos clinicos de rutina.
CELULAS HOSPEDADORAS MODIFICADAS GENETICAMENTE
La presente description proporciona celulas hospedadoras modificadas geneticamente, inclusive celulas hospedadoras modificadas geneticamente, donde una celula hospedadora modificada geneticamente de la invention comprende (ha sido modificada geneticamente con: 1) un ARN dirigido a ADN exogeno; 2) un acido nucleico exogeno que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica un ARN dirigido a ADN; 3) un polipeptido modificador exogeno dirigido al sitio (por ejemplo, una Cas9 de origen natural; una Cas9 modificada, es decir, mutada o variante; una Cas9 quimerica; etc.); 4) un acido nucleico exogeno que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica un polipeptido modificador dirigido al sitio; o 5) cualquier combination de los anteriores. Una celula modificada geneticamente de la invencion se genera mediante la modification genetica de una celula hospedadora con, por ejemplo: 1) un ARN dirigido a ADN exogeno; 2) un acido nucleico exogeno que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica un ARN dirigido a ADN; 3) un polipeptido modificador exogeno dirigido al sitio; 4) un acido nucleico exogeno que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica un polipeptido modificador dirigido al sitio; o 5) cualquier combinacion de los anteriores).
Todas las celulas adecuadas para ser celula objetivo tambien son adecuadas para ser una celula hospedadora modificada geneticamente. Por ejemplo, las celulas hospedadoras modificadas geneticamente de interes pueden ser una celula de cualquier organismo (por ejemplo, una celula bacteriana, una celula arqueal, una celula de un organismo eucariota unicelular, una celula vegetal, una celula de algas, por ejemplo, Botryococcus braunii, Chlamydomonas reinhardtii, Nannochloropsis gaditana, Chlorella pyrenoidosa, Sargassum patens C. Agardh y similares, una celula fungica (por ejemplo, una celula de levadura), una celula animal, una celula de un animal invertebrado (por ejemplo, mosca de la fruta, cnidario, equinodermo, nematodo, etc.), una celula de un animal vertebrado (por ejemplo, pez, anfibio, reptil, ave, mamifero), una celula de un mamifero (por ejemplo, un cerdo, una vaca, una cabra, una oveja, un roedor, una rata, un raton, un primate no humano, un ser humano, etc.), etc.
En algunas modalidades, una celula hospedadora modificada geneticamente se ha modificado geneticamente con un acido nucleico exogeno que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica un polipeptido modificador dirigido al sitio (por ejemplo, una Cas9 de origen natural; una Cas9 modificada, es decir, mutada o variante; una Cas9 quimerica; etc.). El ADN de una celula hospedadora modificada geneticamente puede ser objetivo para la modificacion mediante la introduction de un ARN dirigido a ADN (o un ARN que codifica un ARN dirigido a ADN, que determina la ubicacion/secuencia genomica que sera modificada) y opcionalmente un acido nucleico donante en la celula. En algunas modalidades, la secuencia de nucleotidos que codifica un polipeptido modificador dirigido al sitio esta unida de manera operativa a un promotor inducible (por ejemplo, promotor de shock termico, promotor regulado por tetraciclina, promotor regulado por esteroides, promotor regulado por metales, promotor regulado por estrogenos, etc.). En algunas modalidades, la secuencia de nucleotidos que codifica un polipeptido modificador dirigido al sitio esta unida de manera operativa a un promotor restringido espacialmente y/o temporalmente (por ejemplo, un promotor especifico de tejido, un promotor especifico de un tipo de celula, etc.). En algunas modalidades, la secuencia de nucleotidos que codifica un polipeptido modificador dirigido al sitio esta unida operativamente a un promotor constitutivo.
En algunas modalidades, una celula hospedadora modificada geneticamente esta in vitro. En algunas modalidades, una celula hospedadora modificada geneticamente esta in vivo. En algunas modalidades, una celula hospedadora modificada geneticamente de la invencion es una celula procariota o deriva de una celula procariota. En algunas modalidades, una celula hospedadora modificada geneticamente de la invencion es una celula bacteriana o deriva de una celula bacteriana. En algunas modalidades, una celula hospedadora modificada geneticamente de la invencion es una celula de arquea o deriva de una celula de arquea. En algunas modalidades, una celula hospedadora modificada geneticamente de la invencion es una celula eucariota o deriva de una celula eucariota. En algunas modalidades, una celula hospedadora modificada geneticamente de la invencion es una celula vegetal o deriva de una celula vegetal. En algunas modalidades, una celula hospedadora modificada geneticamente de la invencion es una celula animal o deriva de una celula de animal. En algunas modalidades, una celula hospedadora modificada geneticamente de la invencion es una celula de invertebrado o deriva de una celula de invertebrado. En algunas modalidades, una celula hospedadora modificada geneticamente de la invencion es una celula de vertebrado o deriva de una celula de vertebrado. En algunas modalidades, una celula hospedadora modificada geneticamente de la invencion es una celula de mamifero o deriva de una celula de mamifero. En algunas modalidades, una celula hospedadora modificada geneticamente de la invencion es una celula de roedor o deriva de una celula de roedor. En algunas modalidades, una celula hospedadora modificada geneticamente de la invencion es una celula humana o deriva de una celula humana.
La presente descripcion proporciona adicionalmente progenie de una celula hospedadora modificada geneticamente, donde la progenie puede comprender el mismo acido nucleico o polipeptido exogeno que la celula modificada
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geneticamente de la invencion de la cual deriva. La presente descripcion proporciona adicionalmente una composition que comprende una celula hospedadora modificada geneticamente de la invencion.
Celulas madre modificadas geneticamente y celulas progenitoras modificadas geneticamente
En algunas modalidades, una celula hospedadora modificada geneticamente de la invencion es una celula madre o una celula progenitora modificada geneticamente. Las celulas hospedadoras adecuadas incluyen, por ejemplo, celulas madre (celula madre adultas, celulas madre embrionarias, celulas iPS, etc.) y las celulas progenitoras (por ejemplo, celulas progenitoras cardiacas, celulas progenitoras neuronales, etc.). Las celulas hospedadoras adecuadas incluyen celulas madre y progenitoras de mamifero, incluyendo, por ejemplo, celulas madre de roedor, celulas progenitoras de roedor, celulas madre humanas, celulas progenitoras humanas, etc. Las celulas hospedadoras adecuadas incluyen celulas hospedadoras in vitro, por ejemplo, celulas hospedadoras aisladas.
En algunas modalidades, una celula hospedadora modificada geneticamente de la invencion comprende un acido nucleico de ARN dirigido a ADN exogeno. En algunas modalidades, una celula hospedadora modificada geneticamente de la invencion comprende un acido nucleico exogeno que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica un ARN dirigido a ADN. En algunas modalidades, una celula hospedadora modificada geneticamente de la invencion comprende un polipeptido modificador exogeno dirigido al sitio (por ejemplo, una Cas9 de origen natural; una Cas9 modificada, es decir, mutada o variante; una Cas9 quimerica; etc.). En algunas modalidades, una celula hospedadora modificada geneticamente de la invencion comprende un acido nucleico exogeno que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica un polipeptido modificador dirigido al sitio. En algunas modalidades, una celula hospedadora modificada geneticamente de la invencion comprende un acido nucleico exogeno que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica 1) un ARN dirigido a ADN y 2) un polipeptido modificador dirigido al sitio.
En algunos casos, el polipeptido modificador dirigido al sitio comprende una secuencia de aminoacidos con al menos alrededor de 75 %, al menos alrededor de 80 %, al menos alrededor de 85 %, al menos alrededor de 90 %, al menos alrededor de 95 %, al menos alrededor de 99 % o 100 % de identidad de secuencia de aminoacidos con los aminoacidos 7-166 o 731-1003 de la secuencia de aminoacidos Cas9/Csn1 ilustrada en la Figura 3 o a las partes correspondientes en cualquiera de las secuencias de aminoacidos establecidas como SEQ ID NO: 1-256 y 7951346.
COMPOSICIONES
La presente invencion proporciona una composicion que comprende un ARN dirigido a ADN de la invencion y/o un polipeptido modificador dirigido al sitio. En algunos casos, el polipeptido modificador dirigido al sitio es un polipeptido quimerico de la invencion. Una composicion de la invencion es util para llevar a cabo un metodo de la presente descripcion, por ejemplo, un metodo para la modification especifica del sitio de un ADN objetivo; un metodo para la modification especifica del sitio de un polipeptido asociado con un ADN objetivo; etc.
Composiciones que comprenden un ARN dirigido a ADN
La presente invencion proporciona una composicion que comprende un ARN dirigido a ADN de la invencion. La composicion puede comprender, ademas del ARN dirigido a ADN uno o mas de: una sal, por ejemplo, NaCl, MgCh, KCl, MgSO4, etc.; un agente amortiguador, por ejemplo, un amortiguador Tris, acido N-(2-hidroxietil)piperazin-N'-(2- etanosulfonico) (HEPES), acido 2-(N-morfolino)etanosulfonico (MES), sal sodica de MES, acido 3-(N- morfolino)propanosulfonico (MOPS), acido N-tris[Hidroximetil]metil-3-aminopropanosulfonico (TAPS), etc.; un agente solubilizante; un detergente, por ejemplo, un detergente no ionico tal como Tween-20, etc.; un inhibidor de nucleasa; y similares. Por ejemplo, en algunos casos, una composicion de la invencion comprende un ARN dirigido a ADN de la invencion y un amortiguador para estabilizar acidos nucleicos.
En algunas modalidades, un ARN dirigido a ADN presente en una composicion de la invencion es puro, por ejemplo, al menos alrededor de 75 %, al menos alrededor de 80 %, al menos alrededor de 85 %, al menos alrededor de 90 %, al menos alrededor de 95 %, al menos alrededor de 98 %, al menos alrededor de 99 % o mas de 99 % puro, donde "% de pureza" significa que el ARN dirigido a ADN esta libre en el porcentaje mencionado de otras macromoleculas o contaminantes que pueden estar presentes durante la production del ARN dirigido a ADN.
Composiciones que comprenden un polipeptido quimerico de la invencion
Se describe en el presente documento una composicion que comprende un polipeptido quimerico como se ha descrito anteriormente. La composicion puede comprender, ademas del ARN dirigido a ADN uno o mas de: una sal, por ejemplo, NaCl, MgCl2, KCl, MgSO4, etc.; un agente amortiguador, por ejemplo, un amortiguador Tris, HEPES, MES, sal sodica de MES, MOPS, TAPS, etc.; un agente solubilizante; un detergente, por ejemplo, un detergente no ionico tal como Tween-20, etc.; un inhibidor de proteasa; un agente reductor (por ejemplo, ditiotreitol); y similares.
En algunas modalidades, un polipeptido quimerico presente en una composicion es puro, por ejemplo, al menos alrededor de 75 %, al menos alrededor de 80 %, al menos alrededor de 85 %, al menos alrededor de 90 %, al
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menos alrededor de 95 %, al menos alrededor de 98 %, al menos alrededor de 99 %, o mas de 99 % puro, donde "% de pureza" significa que el polipeptido modificador dirigido al sitio esta libre en el porcentaje mencionado de otras proteinas, otras macromoleculas o contaminantes que pueden estar presentes durante la produccion del polipeptido quimerico.
Composiciones que comprenden un ARN dirigido a ADN y un polipeptido modificador dirigido al sitio
La presente invencion proporciona una composition que comprende: (i) un ARN dirigido a ADN o un polinucleotido de ADN que lo codifica; y ii) un polipeptido modificador dirigido al sitio o un polinucleotido que lo codifica. En algunos casos, el polipeptido modificador dirigido al sitio es un polipeptido quimerico modificador dirigido al sitio de la invencion. En otros casos, el polipeptido modificador dirigido al sitio es un polipeptido modificador dirigido al sitio de origen natural. En algunas instancias, el polipeptido modificador dirigido al sitio presenta actividad enzimatica que modifica un ADN objetivo. En otros casos, el polipeptido modificador dirigido al sitio presenta actividad enzimatica que modifica un polipeptido que esta asociado con un ADN objetivo. En aun otros casos, el polipeptido modificador dirigido al sitio modula la transcription del ADN objetivo.
La presente invencion proporciona una composicion que comprende: (i) un ARN dirigido a ADN, como se describio anteriormente, o un polinucleotido de ADN que codifica a este, donde el ARN dirigido a ADN comprende: (a) un primer segmento que comprende una secuencia de nucleotidos que es complementaria a una secuencia en un ADN objetivo; y (b) un segundo segmento que interactua con un polipeptido modificador dirigido al sitio; y (ii) el polipeptido modificador dirigido al sitio o un polinucleotido que lo codifica, donde el polipeptido modificador dirigido al sitio comprende: (a) una parte de union a ARN que interactua con el ARN dirigido a ADN; y (b) una parte de actividad que presenta una actividad enzimatica dirigida al sitio, donde el sitio de actividad enzimatica esta determinado por el ARN dirigido a ADN.
En algunas instancias, una composicion de la invencion comprende: una composicion que comprende: (i) un ARN dirigido a ADN de la invencion, donde el ARN dirigido a ADN comprende: (a) un primer segmento que comprende una secuencia de nucleotidos que es complementaria a una secuencia en un ADN objetivo; y (b) un segundo segmento que interactua con un polipeptido modificador dirigido al sitio; y (ii) el polipeptido modificador dirigido al sitio, donde el polipeptido modificador dirigido al sitio que comprende: (a) una parte de union a ARN que interactua con el ARN dirigido a ADN; y (b) una parte de actividad que presenta una actividad enzimatica dirigida al sitio, donde el sitio de actividad enzimatica esta determinado por el ARN dirigido a ADN.
En otras modalidades, una composicion de la invencion comprende: (i) un polinucleotido que codifica un ARN dirigido a ADN, donde el ARN dirigido a ADN comprende: (a) un primer segmento que comprende una secuencia de nucleotidos que es complementaria a una secuencia en un ADN objetivo; y (b) un segundo segmento que interactua con un polipeptido modificador dirigido al sitio; y (ii) un polinucleotido que codifica el polipeptido modificador dirigido al sitio, donde el polipeptido modificador dirigido al sitio que comprende: (a) una parte de union a ARN que interactua con el ARN dirigido a ADN; y (b) una parte de actividad que presenta una actividad enzimatica dirigida al sitio, donde el sitio de actividad enzimatica esta determinado por el ARN dirigido a ADN.
Se desvela en el presente documento una composicion que incluye ambas moleculas de ARN de un ARN dirigido a ADN de molecula doble. Dicha composicion puede incluir un ARN activador que comprende un segmento formador de duplex que es complementario al segmento formador de duplex de un ARN identificador (vease la Figura 1A). Los segmentos formadores de duplex del ARN activador y el ARN identificador se hibridan para formar el duplex de ARNcd del segmento de union a proteinas del ARN dirigido a ADN. El ARN identificador proporciona adicionalmente el segmento dirigido a ADN (cadena simple) del ARN dirigido a ADN y, por lo tanto, dirige el ARN dirigido a ADN a una secuencia especifica dentro del ADN objetivo. Como ejemplo no taxativo, el segmento formador de duplex del ARN activador comprende una secuencia de nucleotidos que tiene al menos alrededor de 70 %, al menos alrededor de 80 %, al menos alrededor de 90 %, al menos alrededor de 95 %, al menos alrededor de 98 % o 100% de identidad con la secuencia 5'-UAGCAAGUUAAAAU-3' (SEQ ID NO:562). Como otro ejemplo no taxativo, el segmento formador de duplex del ARN identificador comprende una secuencia de nucleotidos que tiene al menos alrededor de 70 %, al menos alrededor de 80 %, al menos alrededor de 90 %, al menos alrededor de 95 %, al menos alrededor de 98 % o 100% de identidad con la secuencia 5'-GUUUUAGAGCUA-3' (SEQ ID NO:679).
La presente description proporciona una composicion que comprende: (i) un ARN dirigido a ADN o un polinucleotido de ADN que codifica a este, donde el ARN dirigido a ADN comprende: (a) un primer segmento que comprende una secuencia de nucleotidos que es complementaria a una secuencia en un ADN objetivo; y (b) un segundo segmento que interactua con un polipeptido modificador dirigido al sitio; y (ii) el polipeptido modificador dirigido al sitio o un polinucleotido que lo codifica, donde el polipeptido modificador dirigido al sitio comprende: (a) una parte de union a ARN que interactua con el ARN dirigido a ADN; y (b) una parte de actividad que modula la transcripcion dentro del ADN objetivo, donde el sitio de transcripcion modulada dentro del ADN objetivo esta determinado por el ARN dirigido a ADN.
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Por ejemplo, en algunos casos, una composicion de la invencion comprende: (i) un ARN dirigido a ADN, donde el ARN dirigido a ADN comprende: (a) un primer segmento que comprende una secuencia de nucleotidos que es complementaria a una secuencia en un ADN objetivo; y (b) un segundo segmento que interactua con un polipeptido modificador dirigido al sitio; y (ii) el polipeptido modificador dirigido al sitio, donde el polipeptido modificador dirigido al sitio que comprende: (a) una parte de union a ARN que interactua con el ARN dirigido a ADN; y (b) una parte de actividad que modula la transcripcion dentro del ADN objetivo, donde el sitio de transcripcion modulada dentro del ADN objetivo esta determinado por el ARN dirigido a ADN.
Como otro ejemplo, en algunos casos, una composicion de la invencion comprende: (i) un polinucleotido de ADN que codifica un ARN dirigido a ADN, donde el ARN dirigido a ADN comprende: (a) un primer segmento que comprende una secuencia de nucleotidos que es complementaria a una secuencia en un ADN objetivo; y (b) un segundo segmento que interactua con un polipeptido modificador dirigido al sitio; y (ii) un polinucleotido que codifica el polipeptido modificador dirigido al sitio, donde el polipeptido modificador dirigido al sitio que comprende: (a) una parte de union a ARN que interactua con el ARN dirigido a ADN; y (b) una parte de actividad que modula la transcripcion dentro del ADN objetivo, donde el sitio de transcripcion modulada dentro del ADN objetivo esta determinado por el ARN dirigido a ADN.
Una composicion puede comprender, ademas de i) un ARN dirigido a ADN o un polinucleotido de ADN que lo codifica; y ii) un polipeptido modificador dirigido al sitio, o un polinucleotido que lo codifica, uno o mas de: una sal, por ejemplo, NaCl, MgCl2, KCl, MgSO4, etc.; un agente amortiguador, por ejemplo, un amortiguador Tris, HEPES, MES, sal sodica de MES, MOPS, TAPS, etc.; un agente solubilizante; un detergente, por ejemplo, un detergente no ionico tal como Tween-20, etc.; un inhibidor de proteasa; un agente reductor (por ejemplo, ditiotreitol); y similares.
En algunos casos, los componentes de la composicion son individualmente puros, por ejemplo, cada uno de los componentes es al menos alrededor de 75%, al menos alrededor de 80%, al menos alrededor de 90%, al menos alrededor de 95%, al menos alrededor de 98%, al menos alrededor de 99%, o al menos alrededor de 99 % puro. En algunos casos, los componentes individuales de una composicion de la invencion son puros antes de ser agregados a la composicion.
Por ejemplo, en algunas modalidades, un polipeptido modificador dirigido al sitio presente en una composicion de la invencion es puro, por ejemplo, al menos alrededor de 75 %, al menos alrededor de 80 %, al menos alrededor de 85 %, al menos alrededor de 90 %, al menos alrededor de 95 %, al menos alrededor de 98 %, al menos alrededor de 99 %, o mas de 99 % puro, donde "% de pureza" significa que el polipeptido modificador dirigido al sitio esta libre en el porcentaje mencionado de otras proteinas (por ejemplo, proteinas diferentes del polipeptido modificador dirigido al sitio), otras macromoleculas o contaminantes que pueden estar presentes durante la produccion del polipeptido quimerico.
KITS
La presente descripcion proporciona kits para llevar a cabo un metodo de la invencion. Un kit de la invencion puede incluir uno o mas de: un polipeptido modificador dirigido al sitio; un acido nucleico que comprende un nucleotido que codifica un polipeptido modificador dirigido al sitio; un ARN dirigido a ADN; un acido nucleico que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica un ARN dirigido a ADN; un ARN activador; un acido nucleico que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica un ARN activador; un ARN identificador; y un acido nucleico que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica un ARN identificador. Un polipeptido modificador dirigido al sitio; un acido nucleico que comprende un nucleotido que codifica un polipeptido modificador dirigido al sitio; un ARN dirigido a ADN; un acido nucleico que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica un ARN dirigido a ADN; un ARN activador; un acido nucleico que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica un ARN activador; un ARN identificador; y un acido nucleico que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica un ARN identificador, se describieron anteriormente en detalle. Un kit puede comprender un complejo que comprende dos o mas de: un polipeptido modificador dirigido al sitio; un acido nucleico que comprende un nucleotido que codifica un polipeptido modificador dirigido al sitio; un ARN dirigido a ADN; un acido nucleico que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica un ARN dirigido a ADN; un ARN activador; un acido nucleico que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica un ARN activador; un ARN identificador; y un acido nucleico que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica un ARN identificador.
En algunas modalidades, un kit de la invencion comprende un polipeptido modificador dirigido al sitio, o un polinucleotido que lo codifica. Ciertos polipeptidos modificadores dirigidos al sitio descritos en el presente documento comprenden: (a) una parte de union a aRn que interactua con el ARN dirigido a ADN; y (b) una parte de actividad que modula la transcripcion dentro del ADN objetivo, donde el sitio de transcripcion modulada dentro del ADN objetivo esta determinado por el ARN dirigido a ADN. En algunos casos, la parte de actividad de un polipeptido modificador dirigido al sitio descrito en el presente documento presenta actividad de nucleasa reducida o inactivada. En algunos casos, un polipeptido modificador dirigido al sitio es un polipeptido quimerico modificador dirigido al sitio descrito en el presente documento.
En algunas modalidades, un kit de la invencion comprende: un polipeptido modificador dirigido al sitio o un
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polinucleotido que lo codifica, y un reactivo para reconstituir y/o diluir el polipeptido modificador dirigido al sitio. En otras modalidades, un kit de la invention comprende un acido nucleico (por ejemplo, ADN, ARN) que comprende un nucleotido que codifica un polipeptido modificador dirigido al sitio. En algunas modalidades, un kit de la invencion comprende: un acido nucleico (por ejemplo, ADN, ARN) que comprende un nucleotido que codifica un polipeptido modificador dirigido al sitio; y un reactivo para reconstituir y/o diluir el polipeptido modificador dirigido al sitio
Un kit de la invencion que comprende un polipeptido modificador dirigido al sitio o un polinucleotido que lo codifica, puede incluir adicionalmente uno o mas reactivos adicionales, donde dichos reactivos adicionales se seleccionan de: un amortiguador para introducir el polipeptido modificador dirigido al sitio en una celula; un amortiguador de lavado; un reactivo de control; un vector de expresion o polinucleotido de ARN de control; un reactivo para la production in vitro del polipeptido modificador dirigido al sitio a partir de ADN, y similares. En algunos casos, el polipeptido modificador dirigido al sitio incluido en un kit es un polipeptido modificador quimerico dirigido al sitio, como se describio anteriormente.
En algunas modalidades, un kit de la invencion un ARN dirigido a ADN o un polinucleotido de ADN que lo codifica, donde el ARN dirigido a ADN comprende: (a) un primer segmento que comprende una secuencia de nucleotidos que es complementaria a una secuencia en un aDn objetivo; y (b) un segundo segmento que interactua con un polipeptido modificador dirigido al sitio. En algunas modalidades, el ARN dirigido a ADN comprende ademas un tercer segmento (como se describio anteriormente). En algunas modalidades, un kit de la invencion comprende: (i) un ARN dirigido a ADN o un polinucleotido de ADN que codifica a este, donde el ARN dirigido a ADN comprende: (a) un primer segmento que comprende una secuencia de nucleotidos que es complementaria a una secuencia en un ADN objetivo; y (b) un segundo segmento que interactua con un polipeptido modificador dirigido al sitio; y (ii) un polipeptido modificador dirigido al sitio o un polinucleotido que lo codifica, donde el polipeptido modificador dirigido al sitio comprende: (a) una parte de union a ARN que interactua con el ARN dirigido a ADN; y (b) una parte de actividad que presenta una actividad enzimatica dirigida al sitio, donde el sitio de actividad enzimatica esta determinado por el ARN dirigido a ADN. En algunas modalidades, la parte de actividad del polipeptido modificador dirigido al sitio no presenta actividad enzimatica (comprende una nucleasa inactivada, por ejemplo, por medio de mutation). En algunos casos, el kit comprende un ARN dirigido a ADN y un polipeptido modificador dirigido al sitio. En otros casos, el kit comprende: (i) un acido nucleico que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica un ARN dirigido a ADN; y (ii) un acido nucleico que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica un polipeptido modificador dirigido al sitio.
Como otro ejemplo, un kit de la invencion puede incluir: (i) un ARN dirigido a ADN o un polinucleotido de ADN que codifica a este, que comprende: (a) un primer segmento que comprende una secuencia de nucleotidos que es complementaria a una secuencia en un ADN objetivo; y (b) un segundo segmento que interactua con un polipeptido modificador dirigido al sitio; y (ii) el polipeptido modificador dirigido al sitio o un polinucleotido que lo codifica, que comprende: (a) una parte de union a ARN que interactua con el ARN dirigido a ADN; y (b) una parte de actividad que modula la transcription dentro del ADN objetivo, donde el sitio de transcription modulada dentro del ADN objetivo esta determinado por el ARN dirigido a ADN. En algunos casos, el kit comprende: (i) un ARN dirigido a ADN; y un polipeptido modificador dirigido al sitio. En algunos casos, el kit comprende: (i) un acido nucleico que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica un ARN dirigido a ADN; y (ii) un acido nucleico que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica un polipeptido modificador dirigido al sitio.
La presente description proporciona un kit que comprende: (1) un vector de expresion recombinante que comprende (i) una secuencia de nucleotidos que codifica un aRn dirigido a ADN, donde el ARN dirigido a ADN comprende: (a) un primer segmento que comprende una secuencia de nucleotidos que es complementaria a una secuencia en un ADN objetivo; y (b) un segundo segmento que interactua con un polipeptido modificador dirigido al sitio; y (ii) una secuencia de nucleotidos que codifica el polipeptido modificador dirigido al sitio, donde el polipeptido modificador dirigido al sitio comprende: (a) una parte de union a ARN que interactua con el ARN dirigido a ADN; y (b) una parte de actividad que presenta una actividad enzimatica dirigida al sitio, donde el sitio de actividad enzimatica esta determinado por el ARN dirigido a ADN; y (2) un reactivo para la reconstituir y/o diluir el vector de expresion.
La presente descripcion proporciona un kit que comprende: (1) un vector de expresion recombinante que comprende: (i) una secuencia de nucleotidos que codifica un ARN dirigido a ADN, donde el ARN dirigido a ADN comprende: (a) un primer segmento que comprende una secuencia de nucleotidos que es complementaria a una secuencia en un ADN objetivo; y (b) un segundo segmento que interactua con un polipeptido modificador dirigido al sitio; y (ii) una secuencia de nucleotidos que codifica el polipeptido modificador dirigido al sitio, donde el polipeptido modificador dirigido al sitio comprende: (a) una parte de union a ARN que interactua con el ARN dirigido a ADN; y (b) una parte de actividad que modula la transcripcion dentro del ADN objetivo, donde el sitio de transcripcion modulada dentro del ADN objetivo se determina mediante el ARN dirigido a ADN; y (2) un reactivo para reconstituir y/o diluir el vector de expresion recombinante.
La presente descripcion proporciona un kit que comprende: (1) un vector de expresion recombinante que comprende un acido nucleico que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica un ARN dirigido a ADN que comprende: (i) un primer segmento que comprende una secuencia de nucleotidos que es complementaria a una secuencia en un aDn objetivo; y (ii) un segundo segmento que interactua con un polipeptido modificador dirigido al
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sitio; y (2) un reactivo para reconstituir y/o diluir el vector de expresion recombinante. En algunas modalidades de este kit, el kit comprende: un vector de expresion recombinante que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica un polipeptido modificador dirigido al sitio, donde el polipeptido modificador dirigido al sitio comprende: (a) una parte de union a ARN que interactua con el ARN dirigido a ADN; y (b) una parte de actividad que presenta una actividad enzimatica dirigida al sitio, donde el sitio de actividad enzimatica esta determinado por el ARN dirigido a ADN. En otras modalidades de este kit, el kit comprende: un vector de expresion recombinante que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica un polipeptido modificador dirigido al sitio, donde el polipeptido modificador dirigido al sitio comprende: (a) una parte de union a ARN que interactua con el ARN dirigido a ADN; y (b) una parte de actividad que modula la transcripcion dentro del ADN objetivo, donde el sitio de transcripcion modulada dentro del ADN objetivo esta determinado por el ARN dirigido a ADN.
En algunas modalidades de cualquiera de los kits antemencionados, el kit comprende un ARN activador o un ARN identificador. En algunas modalidades de cualquiera de los kits antemencionados, el kit comprende un ARN dirigido a ADN de molecula simple. En algunas modalidades de cualquiera de los kits antemencionados, el kit comprende dos o mas ARN dirigidos a ADN de molecula simple o molecula doble. En algunas modalidades de cualquiera de los kits antemencionados, un ARN dirigido a ADN (por ejemplo, incluidos dos o mas ARN dirigidos a ADN) pueden proporcionarse como un conjunto (por ejemplo, un conjunto de moleculas de ARN, un conjunto de moleculas de ADN que codifican el ARN dirigido a ADN, etc.). Dichos kits pueden ser utiles, por ejemplo, para usarse en conjunto con las celulas hospedadoras modificadas geneticamente descritas anteriormente que comprenden un polipeptido modificador dirigido al sitio de la invencion. En algunas modalidades de cualquiera de los kits antemencionados, el kit comprende ademas un polinucleotido donante para producir la modificacion genetica deseada. Los componentes de un kit de la invencion pueden separarse en recipientes; o pueden combinarse en un solo recipiente.
Cualquiera de los kits descritos anteriormente puede incluir adicionalmente uno o mas reactivos adicionales, donde dichos reactivos adicionales se seleccionan de: un amortiguador de dilucion; un amortiguador de reconstitucion; un amortiguador de lavado; un reactivo de control; un vector de expresion o polinucleotido de ARN de control; un reactivo para la produccion in vitro del polipeptido modificador dirigido al sitio a partir de ADN, y similares.
Ademas de los componentes mencionados anteriormente, un kit de la presente puede incluir adicionalmente instrucciones para usar los componentes del kit para practicar los metodos de la presente. Las instrucciones para practicar los metodos de la presente estan generalmente registradas en un medio de registro adecuado. Por ejemplo, las instrucciones pueden estar impresas en un sustrato, tal como papel o plastico, etc. Como tales, las instrucciones pueden estar presentes en los kits como un prospecto, en el etiquetado del recipiente del kit o componentes del mismo (es decir, asociado al embalaje o subembalaje), etc. En otras modalidades, las instrucciones estan presentes como un archivo de almacenamiento de datos electronico, presente en un medio de almacenamiento adecuado leido por computadora, por ejemplo, CD-ROM, disquete, memoria flash, etc. En aun otras modalidades, las instrucciones reales no estan presentes en el kit, pero se proporcionan medios para obtener las instrucciones desde una fuente remota, por ejemplo, por medio de Internet. Un ejemplo de esta modalidad es un kit que incluye una direccion web donde se pueden ver las instrucciones y/o desde donde pueden descargarse. Como con las instrucciones, este medio para obtener las instrucciones se registra en un sustrato adecuado.
ORGANISMOS NO HUMANOS MODIFICADOS GENETICAMENTE
En algunas modalidades, una celula hospedadora modificada geneticamente se ha modificado geneticamente con un acido nucleico exogeno que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica un polipeptido modificador dirigido al sitio (por ejemplo, una Cas9 de origen natural; una Cas9 modificada, es decir, mutada o variante; una Cas9 quimerica; etc.). Si dicha celula es un organismo unicelular eucariota, entonces la celula modificada puede considerarse un organismo modificado geneticamente. En algunas modalidades, el organismo no humano modificado geneticamente de la invencion es un organismo multicelular transgenico Cas9.
En algunas modalidades, una celula hospedadora no humana modificada geneticamente de la invencion (por ejemplo, una celula que se ha modificado geneticamente con un acido nucleico exogeno que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica un polipeptido modificador dirigido al sitio, por ejemplo, una Cas9 de origen natural; una Cas9 modificada, es decir, mutada o variante; una Cas9 quimerica; etc.) puede generar un organismo no humano modificado geneticamente de la invencion (por ejemplo, un raton, un pez, una rana, una mosca, un gusano, etc.). Por ejemplo, si la celula hospedadora modificada geneticamente es una celula madre pluripotente (es decir, PSC) o una celula germinal (por ejemplo, esperma, ovocito, etc.), un organismo entero geneticamente modificado puede derivarse de la celula hospedadora geneticamente modificada. En algunas modalidades, la celula hospedadora geneticamente modificada es una celula madre pluripotente (por ejemplo, ESC, iPSC, celula madre pluripotente vegetal, etc.) o una celula germinal (por ejemplo, celula de esperma, ovocito, etc.), ya sea in vivo o in vitro, que puede dar origen a un organismo modificado geneticamente. En algunas modalidades, la celula hospedadora geneticamente modificada es una PSC de vertebrado (por ejemplo, ESC, iPSC, etc.) y se utiliza para generar un organismo modificado geneticamente (por ejemplo, inyectando una PSC en un blastocisto para producir un animal quimerico/mosaico, que luego se aparearian para generar organismos no quimericos/no mosaicos modificados geneticamente; injertos, en el caso de las plantas; etc.). Cualquier metodo/protocolo conveniente para producir un organismo modificado geneticamente, inclusive los metodos descritos en la presente, son adecuados
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para producir una celula hospedadora modificada geneticamente que comprende un acido nucleico exogeno que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica un polipeptido modificador dirigido al sitio (por ejemplo, una Cas9 de origen natural; una Cas9 modificada, es decir, mutada o variante; una Cas9 quimerica; etc.). Son conocidos en la tecnica los metodos para producir organismos modificados geneticamente. Por ejemplo, ver Cho et al., Curr Protoc Cell Biol. Marzo 2009; Capitulo 19:Unidad 19.11: Generation of transgenic mice; Gama et al., Brain Struct Funct. Marzo 2010; 214(2-3):91-109. Pub. ele. 2009 Nov 25: Animal transgenesis: an overview; Husaini et al., GM Crops. Jun-dic 2011;2(3):150-62. Pub. ele. 2011 Jun 1: Approaches for gene targeting and targeted gene expression in plants.
En algunas modalidades, un organismo modificado geneticamente comprende una celula objetivo para metodos de la invencion y puede, por lo tanto, considerarse una fuente de celulas objetivo. Por ejemplo, si se utiliza una celula modificada geneticamente que comprende un acido nucleico exogeno que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica un polipeptido modificador dirigido al sitio (por ejemplo, una Cas9 de origen natural; una Cas9 modificada, es decir, mutada o variante; una Cas9 quimerica; etc.) para generar un organismo modificado geneticamente, entonces las celulas del organismo modificado geneticamente comprenden el acido nucleico exogeno que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica un polipeptido modificador dirigido al sitio (por ejemplo, una Cas9 de origen natural; una Cas9 modificada, es decir, mutada o variante; una Cas9 quimerica; etc.). En algunas de estas modalidades, el ADN de una celula o celulas del organismo modificado geneticamente pueden dirigirse para la modificacion mediante la introduccion en la celula o celulas de un ARN dirigido a ADN (o un ADN que codifica un ARN dirigido a ADN) y opcionalmente un acido nucleico donante. Por ejemplo, la introduccion de un ARN dirigido a ADN (o un ADN que codifica a un ARN dirigido a ADN) en un subconjunto de celulas (por ejemplo, celulas cerebrales, celulas intestinales, celulas de rinon, celulas pulmonares, celulas sanguineas, etc.) del organismo modificado geneticamente puede dirigirse al ADN de dichas celulas para la modificacion, donde la ubicacion genomica de estas dependera de la secuencia dirigida a ADN del ARN dirigido a ADN.
En algunas modalidades, un organismo modificado geneticamente es una fuente de celulas objetivo para los metodos de la invencion. Por ejemplo, un organismo modificado geneticamente que comprende celulas que estan modificadas geneticamente con un acido nucleico exogeno que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica un polipeptido modificador dirigido al sitio (por ejemplo, una Cas9 de origen natural; una Cas9 modificada, es decir, mutada o variante; una Cas9 quimerica; etc.) puede proporcionar una fuente de celulas modificadas geneticamente, por ejemplo, PSC (por ejemplo, ESC, iPSC, esperma, ovocitos, etc.), neuronas, celulas progenitoras, cardiomiocitos, etc.
En algunas modalidades, una celula modificada geneticamente es una PSC que comprende un acido nucleico exogeno que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica un polipeptido modificador dirigido al sitio (por ejemplo, una Cas9 de origen natural; una Cas9 modificada, es decir, mutada o variante; una Cas9 quimerica; etc.). Como tal, la PSC puede ser una celula objetivo tal que el ADN de la PSC puede ser dirigida para la modificacion, mediante la introduccion de ARN dirigido a ADN (o un ADN que codifica un ARN dirigido a ADN) en la PSC y, opcionalmente, un acido nucleico donante, y la ubicacion genomica de la modificacion dependera de la secuencia dirigida a ADN del ARN dirigido a ADN introducido. Por lo tanto, en algunas modalidades, los metodos descritos en la presente pueden utilizarse para modificar el ADN (por ejemplo, eliminar y/o reemplazar cualquier ubicacion genomica) de las PSC derivadas de un organismo modificado geneticamente de la invencion. Dichas PSC modificadas pueden utilizarse entonces para generar organismos que tengan (i) un acido nucleico exogeno que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica un polipeptido modificador dirigido al sitio (por ejemplo, una Cas9 de origen natural; una Cas9 modificada, es decir, mutada o variante; una Cas9 quimerica; etc.) y (ii) una modificacion de ADN que se introdujo en la PSC.
Un acido nucleico exogeno que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica un polipeptido modificador dirigido al sitio (por ejemplo, una Cas9 de origen natural; una Cas9 modificada, es decir, mutada o variante; una Cas9 quimerica; etc.) puede estar bajo el control de (es decir, enlazado operativamente a) un promotor desconocido (por ejemplo, cuando el acido nucleico se integra aleatoriamente en el genoma de una celula hospedadora) puede estar bajo el control de (es decir, enlazado operativamente a) un promotor conocido. Los promotores adecuados conocidos pueden ser cualquier promotor conocido e incluir promotores constitutivamente activos (por ejemplo, promotor CMV), promotores inducibles (por ejemplo, promotor de shock termico, promotor regulado por tetraciclina, promotor regulado por esteroides, promotor regulado por metales, promotor regulado por estrogenos, etc.), promotores restringidos espacialmente y/o restringidos temporalmente (por ejemplo, un promotor especifico al tejido, un promotor especifico al tipo de celula, etc.), etc.
Un organismo modificado geneticamente de la invencion (por ejemplo, un organismo cuyas celulas comprenden una secuencia de nucleotidos que codifica un polipeptido modificador dirigido al sitio, por ejemplo, una Cas9 de origen natural; una Cas9 modificada, es decir, mutada o variante; una Cas9 quimerica; etc.) puede ser cualquier organismo que incluye, por ejemplo, una planta; alga; un invertebrado (por ejemplo, un cnidario, un equinodermo, un gusano, una mosca, etc.); un vertebrado (por ejemplo, un pez (por ejemplo, pez cebra, pez globo, carpin dorado, etc.) un anfibio (por ejemplo, salamandra, rana, etc.), un reptil, un ave, un mamifero, etc.); un ungulado (por ejemplo, una cabra, un cerdo, una oveja, una vaca, etc.); un roedor (por ejemplo, un raton, una rata, un hamster, un cobayo), un lagomorfo (por ejemplo, un conejo); etc.
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En algunos casos, el polipeptido modificador dirigido al sitio comprende una secuencia de aminoacidos con al menos alrededor de 75 %, al menos alrededor de 80 %, al menos alrededor de 85 %, al menos alrededor de 90 %, al menos alrededor de 95 %, al menos alrededor de 99 %, o 100 % de identidad de secuencia de aminoacidos con los aminoacidos 7-166 o 731-1003 de la secuencia de aminoacidos Cas9/Csn1 ilustrada en la Figura 3 o a las partes correspondientes en cualquiera de las secuencias de aminoacidos establecidas como SEQ ID NO: 1-256 y 7951346.
Animales no humanos transgenicos
Tal como se describe anteriormente, en algunas modalidades, un acido nucleico de la invencion (por ejemplo, una secuencia de nucleotidos que codifica un polipeptido modificador dirigido al sitio, por ejemplo, una Cas9 de origen natural; una Cas9 modificada, es decir, mutada o variante; una Cas9 quimerica; etc.) o un vector de expresion
recombinante de la invencion se utilizan como un transgen para generar un animal transgenico que produce un
polipeptido modificador dirigido al sitio. Por lo tanto, la presente invencion proporciona ademas un animal no humano transgenico, donde dicho animal comprende un transgen que comprende un acido nucleico de la invencion que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica un polipeptido modificador dirigido al sitio, por ejemplo, una Cas9 de origen natural; una Cas9 modificada, es decir, mutada o variante; una Cas9 quimerica; etc., segun se describe anteriormente. En algunas modalidades, el genoma del animal no humano transgenico comprende una secuencia de nucleotidos de la invencion que codifica un polipeptido modificador dirigido al sitio. En algunas modalidades, el animal no humano transgenico es homocigoto para la modificacion genetica. En algunas
modalidades, el animal no humano transgenico es heterocigoto para la modificacion genetica. En algunas
modalidades, el animal no humano transgenico es un vertebrado, por ejemplo, un pez (pez cebra, carpin dorado, pez globo, pez de cueva, etc.), un anfibio (rana, salamandra, etc.), un ave (por ejemplo, pollo, pavo, etc.), un reptil (por ejemplo, serpiente, lagartija, etc.), un mamifero (por ejemplo, un ungulado, por ejemplo, un cerdo, una vaca, una cabra, una oveja, etc.; un lagomorfo (por ejemplo, un conejo); un roedor (por ejemplo, una rata, un raton); un primate no humano; etc.), etc.
Un acido nucleico exogeno que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica un polipeptido modificador dirigido al sitio (por ejemplo, una Cas9 de origen natural; una Cas9 modificada, es decir, mutada o variante; una Cas9 quimerica; etc.) puede estar bajo el control de (es decir, enlazado operativamente a) un promotor desconocido (por ejemplo, cuando el acido nucleico se integra aleatoriamente en el genoma de una celula hospedadora) puede estar bajo el control de (es decir, enlazado operativamente a) un promotor conocido. Los promotores adecuados conocidos pueden ser cualquier promotor conocido e incluir promotores constitutivamente activos (por ejemplo, promotor CMV), promotores inducibles (por ejemplo, promotor de shock termico, promotor regulado por tetraciclina, promotor regulado por esteroides, promotor regulado por metales, promotor regulado por estrogenos, etc.), promotores restringidos espacialmente y/o restringidos temporalmente (por ejemplo, un promotor especifico al tejido, un promotor especifico al tipo de celula, etc.), etc.
En algunos casos, el polipeptido modificador dirigido al sitio comprende una secuencia de aminoacidos con al menos alrededor de 75 %, al menos alrededor de 80 %, al menos alrededor de 85 %, al menos alrededor de 90 %, al menos alrededor de 95 %, al menos alrededor de 99 %, o 100 % de identidad de secuencia de aminoacidos con los aminoacidos 7-166 o 731-1003 de la secuencia de aminoacidos Cas9/Csn1 ilustrada en la Figura 3 o a las partes correspondientes en cualquiera de las secuencias de aminoacidos establecidas como SEQ ID NO: 1-256 y 7951346.
Plantas transgenicas
Tal como se describe anteriormente, en algunas modalidades, un acido nucleico de la invencion (por ejemplo, una secuencia de nucleotidos que codifica un polipeptido modificador dirigido al sitio, por ejemplo, una Cas9 de origen natural; una Cas9 modificada, es decir, mutada o variante; una Cas9 quimerica; etc.) o un vector de expresion recombinante de la invencion se utilizan como un transgen para generar una planta transgenica que produce un polipeptido modificador dirigido al sitio. Por lo tanto, la presente invencion proporciona ademas una planta transgenica, donde dicha planta comprende un transgen que comprende un acido nucleico de la invencion que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica un polipeptido modificador dirigido al sitio, por ejemplo, una Cas9 de origen natural; una Cas9 modificada, es decir, mutada o variante; una Cas9 quimerica; etc., segun se describe anteriormente. En algunas modalidades, el genoma de la planta transgenica comprende un acido nucleico de la invencion. En algunas modalidades, la planta transgenica es homocigota para la modificacion genetica. En algunas modalidades, la planta transgenica es heterocigota para la modificacion genetica.
Son conocidos en la tecnica los metodos para introducir acidos nucleicos exogenos en celulas vegetales. Dichas celulas vegetales se consideran "transformadas", segun se definio anteriormente. Los metodos adecuados incluyen infeccion viral (tales como virus de ADN de cadena doble), transfeccion, conjugacion, fusion de protoplastos, electroporacion, tecnologia de canon de particulas, precipitacion de fosfato de calcio, microinyeccion directa, tecnologia de agitacion de carburo de silicio, transformacion mediada por Agrobacterium y similares. La eleccion del metodo generalmente depende del tipo de celula que se esta transformando y las circunstancias en las cuales se lleva a cabo la transformacion (es decir, in vitro, ex vivo o in vivo).
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Los metodos de transformacion que se basan en la bacteria de suelo Agrobacterium tumefaciens son particularmente utiles para introducir una molecula de acido nucleico exogeno en una planta vascular. La forma de tipo salvaje de Agrobacterium contiene un plasmido Ti (que induce tumores) que direcciona la produccion del crecimiento de agalla de corona tumorigenica en plantas hospedadoras. La transferencia de la region de ADN-T que induce tumores del plasmido Ti a genoma vegetal requiere los genes de virulencia codificados por plasmidos, asi como las fronteras de ADN-T, las cuales son un conjunto de repeticiones de ADN que delinean la region que sera transferida. Un vector basado en Agrobacterium es una forma modificada de un plasmido Ti, donde las funciones que inducen tumores son reemplazadas por la secuencia de acido nucleico de interes que sera introducida en el hospedador vegetal.
La transformacion mediada por Agrobacterium generalmente emplea vectores cointegrado o sistemas de vectores binarios, donde los componentes del plasmido Ti se dividen entre un vector auxiliar, el cual reside permanentemente en el hospedador de Agrobacterium y porta los genes de virulencia y un vector transportador, el cual contiene el gen de interes delimitado por secuencias de ADN-T. Son conocidos en la tecnica varios vectores binarios y estan comercialmente disponibles, por ejemplo en Clontech (Palo Alto, Calif.). Tambien son conocidos en la tecnica los metodos de cocultivo de Agrobacterium con celulas vegetales cultivadas o tejido lesionado tal como tejido de hoja, explantes de raiz, hipocotiledoneas, piezas de tallo o tuberculos, por ejemplo. Ver, por ejemplo, Glick and Thompson, (eds.), Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Boca Raton, Fla.: CRC Press (1993).
La transformacion mediada por microproyectiles tambien puede usarse para producir una planta transgenica de la invention. Este metodo, descrito por primera vez por Klein et al. (Nature 327:70-73 (1987)), se basa en microproyectiles tales como oro o tungsteno que se recubren con la molecula de acido nucleico deseada mediante precipitation con cloruro de calcio, espermidina o polietilenglicol. Las particulas de microproyectil se aceleran a alta velocidad en un tejido de angiospermas utilizando un dispositivo como el BIOLISTIC PD-1000 (Biorad; Hercules Calif.).
Un acido nucleico de la invencion puede introducirse en una planta de forma tal que el acido nucleico pueda ingresar en una o mas celulas vegetales, por ejemplo, a traves de un protocolo in vivo o ex vivo. Por "in vivo" se entiende que el acido nucleico se administra a un cuerpo vivo de una planta, por ejemplo, infiltration. Por "ex vivo" se entiende que las celulas o explantes se modifican fuera de la planta y luego dichas celulas u organos se regeneran a una planta. Una cantidad de vectores adecuados para transformacion estable de celulas vegetales o para el establecimiento de plantas transgenicas se han descrito, inclusive aquellos descritos en Weissbach and Weissbach, (1989) Methods for Plant Molecular Biology Academic Press, y Gelvin et al., (1990) Plant Molecular Biology Manual, Kluwer Academic Publishers. Los ejemplos especificos incluyen aquellos derivados de un plasmido Ti de Agrobacterium tumefaciens, asi como aquellos descritos por Herrera-Estrella et al. (1983) Nature 303: 209, Bevan (1984) Nucl Acid Res. 12: 8711-8721, Klee (1985) Bio/Technolo 3: 637-642. De manera alternativa, los vectores que no son de Ti pueden utilizarse para transferir el ADN a las plantas y celulas mediante tecnicas de administracion libre de ADN. Mediante la utilization de estos metodos, pueden producirse plantas transgenicas tales como trigo, arroz (Christou (1991) Bio/Technology 9:957-9 y 4462) y maiz (Gordon-Kamm (1990) Plant Cell 2: 603-618). Un embrion inmaduro tambien puede ser un buen tejido objetivo para monocotileidoneas para tecnicas de administration directa de ADN utilizando el canon de particulas (Weeks et al. (1993) Plant Physiol 102: 1077-1084; Vasil (1993) Bio/Technolo 10: 667-674; Wan and Lemeaux (1994) Plant Physiol 104: 37-48 y para la transferencia de ADN mediada por Agrobacterium (Ishida et al. (1996) Nature Biotech 14: 745-750). Los ejemplos de metodos para la introduction de ADN en cloroplastos son el bombardeo biolistico, transformacion de polietilenglicol de cloroplastos y microinyeccion (Danieli et al Nat. Biotechnol 16:345-348, 1998; Staub et al Nat. Biotechnol 18: 333-338, 2000; O'Neill et al Plant J. 3:729-738, 1993; Knoblauch et al Nat. Biotechnol 17: 906-909; n.° de patente estadounidense 5.451.513, 5.545.817, 5.545.818, y 5.576.198; en la solicitud internacional n.° WO 95/16783; y en Boynton et al., Methods in Enzymology 217: 510-536 (1993), Svab et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 913-917 (1993), y McBride et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 7301-7305 (1994)). Cualquier vector adecuado para los metodos de bombardeo biolistico, transformacion de polietilenglicol de protoplastos y microinyeccion sera adecuado como un vector de direccionamiento para la transformacion de cloroplastos. Cualquier vector de ADN de cadena doble puede utilizarse como un vector de transformacion, especialmente cuando el metodo de introduccion no utiliza Agrobacterium.
Las plantas que pueden ser modificadas geneticamente incluyen granos, cosechas de forraje, frutas, vegetales, cosechas de semillas oleaginosas, palmas, bosques y vides. Ejemplos especificos de plantas que pueden modificarse se enumeran a continuation: maiz, banana, mani, guisante forrajero, girasol, tomate, canola, tabaco, trigo, cebada, avena, papa, soja, algodon, claveles, sorgo, lupino y arroz.
Tambien se proporcionan en la invencion celulas vegetales transformadas, tejidos, plantas y productos que contienen las celulas vegetales transformadas. Una caracteristica de las celulas transformadas de la invencion, y de tejidos y productos que incluyen a estas es la presencia de un acido nucleico de la invencion integrado en el genoma, y la produccion mediante celulas vegetales de un polipeptido modificador dirigido al sitio, por ejemplo, una Cas9 de origen natural; una Cas9 modificada, es decir, mutada o variante; una Cas9 quimerica, etc. Las celulas vegetales recombinantes de la presente invencion son utiles como poblaciones de celulas recombinantes o como un tejido, semilla, planta entera, tallo, fruto, hoja, raiz, flor, tallo, tuberculo, grano, pienso, un campo de plantas y similares.
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Un acido nucleico que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica un polipeptido modificador dirigido al sitio (por ejemplo, una Cas9 de origen natural; una Cas9 modificada, es decir, mutada o variante; una Cas9 quimerica; etc.) puede estar bajo el control de (es decir, enlazado operativamente a) un promotor desconocido (por ejemplo, cuando el acido nucleico se integra aleatoriamente en el genoma de una celula hospedadora) puede estar bajo el control de (es decir, enlazado operativamente a) un promotor conocido. Los promotores adecuados conocidos pueden ser cualquier promotor conocido e incluyen promotores constitutivamente activos, promotores inducibles, promotores restringidos espacialmente y/o restringidos temporalmente, etc.
En algunos casos, el polipeptido modificador dirigido al sitio comprende una secuencia de aminoacidos con al menos alrededor de 75 %, al menos alrededor de 80 %, al menos alrededor de 85 %, al menos alrededor de 90 %, al menos alrededor de 95 %, al menos alrededor de 99 %, o 100 % de identidad de secuencia de aminoacidos con los aminoacidos 7-166 o 731-1003 de la secuencia de aminoacidos Cas9/Csn1 ilustrada en la Figura 3 o a las partes correspondientes en cualquiera de las secuencias de aminoacidos establecidas como SEQ ID NO: 1-256 y 7951346.
A traves de la invencion se proporciona tambien material reproductivo de una planta transgenica de la invencion, donde el material reproductivo incluye semillas, plantas de progenie y material de clonacion.
Definiciones - parte ii
El termino "de origen natural" o "no modificado", tal como se usa en la presente, aplicado a un acido nucleico, un polipeptido, una celula o un organismo, se refiere a un acido nucleico, polipeptido, celula u organismo que se encuentra en la naturaleza. Por ejemplo, una secuencia de polipeptidos o polinucleotidos presente en un organismo (incluyendo los virus) que puede aislarse de una fuente de la naturaleza y que no ha sido intencionalmente modificada por un ser humano en el laboratorio es de origen natural.
"Heterologo", tal como se usa en la presente, significa una secuencia de nucleotidos o polipeptidos que no se encuentra en el acido nucleico o proteina natural, respectivamente. Por ejemplo, en una variante del polipeptido dirigido al sitio Cas9 de fusion, una variante del polipeptido dirigido al sitio Cas9 puede estar fusionada a un polipeptido heterologo (es decir, un polipeptido que no sea Cas9). El polipeptido heterologo puede presentar una actividad (por ejemplo, actividad enzimatica) que tambien la presentara la variante del polipeptido dirigido al sitio Cas9. Una secuencia de acido nucleico heterologa puede estar unida a una variante del polipeptido dirigido al sitio Cas9 (por ejemplo, mediante ingenieria genetica) para generar una secuencia de nucleotidos que codifica una variante de fusion del polipeptido dirigido al sitio Cas9.
La expresion "polipeptido quimerico" se refiere a un polipeptido que no es de origen natural, por ejemplo, que fue elaborado mediante combinacion artificial de dos segmentos de secuencia mediante intervencion humana que de otra mera estarian separados. Por lo tanto, un polipeptido quimerico es tambien el resultado de la intervencion humana. De esta forma, un polipeptido que comprende una secuencia de aminoacidos quimerica es un polipeptido quimerico.
Por "polipeptido dirigido al sitio", "polipeptido dirigido al sitio de union al ARN" o "polipeptido dirigido al sitio de union al aRn" se entiende un polipeptido que se une al ARN y se dirige a una secuencia de ADN especifica. Un polipeptido dirigido al sitio, tal como se describe en la presente, se dirige a una secuencia de ADN especifica mediante la molecula de ARN a la cual se une. La molecula se ARN comprende una secuencia que es complementaria a una secuencia objetivo dentro del ADN objetivo, y de este modo dirige el polipeptido unido a una ubicacion especifica dentro del ADN objetivo (la secuencia objetivo).
En algunas modalidades, un acido nucleico de la invencion (por ejemplo, un ARN dirigido a ADN, un acido nucleico que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica un ARN dirigido a ADN; un acido nucleico que codifica un polipeptido dirigido al sitio; etc.) comprende una modificacion o secuencia que proporciona una caracteristica deseable adicional (por ejemplo, estabilidad modificada o regulada; direccionamiento subcelular; rastreo, por marcado fluorescente; un sitio de union para una proteina o complejo de proteinas; etc.). Los ejemplos no taxativos incluyen: un casquete 5' (por ejemplo, un casquete 7-metilguanilato (m7G)); una cola poliadenilada 3' (es decir, una cola poli(A) 3'); una secuencia de ribointerruptor (por ejemplo, para permitir estabilidad regulada y/o accesibilidad regulada mediante proteinas y/o complejos de proteinas); una modificacion o secuencia que dirige el ARN a una ubicacion subcelular (por ejemplo, nucleo, mitocondria, cloroplastos y similares); una modificacion o secuencia que proporciona rastreo (por ejemplo, conjugacion directa con una molecula fluorescente, conjugacion con un resto que facilita la deteccion fluorescente, una secuencia que permite la deteccion fluorescente, etc.); una modificacion o secuencia que proporciona un sitio de union para proteinas (por ejemplo, proteinas que actuan en el ADN, incluidos los activadores transcripcionales, represores transcripcionales, ADN metiltransferasas, ADN desmetilasas, histona acetiltransferasas, histona deacetilasas y similares); y combinaciones de estos.
En algunas modalidades, un ARN dirigido a ADN comprende un segmento adicional ya sea en el extremo 5' o 3' que proporciona cualquiera de las caracteristicas descritas anteriormente. Por ejemplo, un tercer segmento adecuado puede comprender un casquete 5' (por ejemplo, un casquete 7-metilguanilato (m7G)); una cola poliadenilada 3' (es
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dedr, una cola poli(A) 3'); una secuencia de ribointerruptor (por ejemplo, para permitir estabilidad regulada y/o accesibilidad regulada mediante protemas y complejos de protemas); una secuencia que dirige el ARN a una ubicacion subcelular (por ejemplo, nucleo, mitocondria, cloroplastos y similares); una modification o secuencia que proporciona rastreo (por ejemplo, conjugation directa con una molecula fluorescente, conjugation con un resto que facilita la detection fluorescente, una secuencia que permite la detection fluorescente, etc.); una modificacion o secuencia que proporciona un sitio de union para proteinas (por ejemplo, proteinas que actuan en el ADN, incluidos los activadores transcripcionales, represores transcripcionales, ADN metiltransferasas, ADN desmetilasas, histona acetiltransferasas, histona deacetilasas y similares); y combinaciones de estos.
Un ARN dirigido a ADN de la invention y un polipeptido polipeptido dirigido al sitio forman un complejo (es decir, se unen por medio de interacciones no covalentes). El ARN dirigido a ADN proporciona especificidad de direccionamiento al complejo, ya que comprende una secuencia de nucleotidos que es complementaria a una secuencia de un ADN objetivo. El polipeptido dirigido al sitio del complejo proporciona la actividad especifica del sitio. En otras palabras, el polipeptido dirigido al sitio es guiado a una secuencia ADN objetivo (por ejemplo, una secuencia objetivo en un acido nucleico cromosomico; una secuencia objetivo en un acido nucleico extracromosomico, por ejemplo, un acido nucleico episomal, un minicirculo, etc.; una secuencia objetivo en un acido nucleico mitocondrial; una secuencia objetivo en un acido nucleico de cloroplasto; una secuencia objetivo en un plasmido; etc.) mediante su asociacion con el segmento de union a proteinas del ARN dirigido a ADN.
Se describe en el presente documento un ARN dirigido a ADN que comprende dos moleculas de ARN separadas (polinucleotidos de ARN) y se menciona en la presente como una "ARN dirigido a ADN de molecula doble" o un "ARN dirigido a ADN de dos moleculas". En otras modalidades, un ARN dirigido a ADN de la invencion es una molecula de ARN simple (polinucleotido de ARN simple) y se menciona en la presente como un "ARN dirigido a ADN de molecula simple". De no especificarse lo contrario, en la presente description la expresion "ARN dirigido a ADN" es inclusiva, refiriendose tanto a ARN dirigido a ADN de molecula simple como a ARN dirigido a ADN de molecula doble.
Un ARN dirigido a ADN de molecula doble descrito en el presente documento comprende dos moleculas de ARN separadas (un "ARN identificador" y un "ARN activador"). Cada una de las dos moleculas de ARN de un ARN dirigido a ADN de molecula doble de la invencion comprende una extension de nucleotidos que son complementarios entre si, de forma que los nucleotidos complementarios de las dos moleculas de ARN se hibridan para formar el duplex de ARN de cadena doble del segmento de union a proteinas.
Un ARN dirigido a ADN de molecula simple de la invencion comprende dos extensiones de nucleotidos (un ARN identificador y un ARN activador) que son complementarios entre si, estan unidos de forma covalente mediante nucleotidos intermedios ("enlazadores" o "nucleotidos enlazadores") y se hibridan para formar el duplex de ARN de cadena doble (duplex de ARNcd) del segmento de union a proteinas, dando como resultado una estructura de tallo- bucle. El ARN identificador y el ARN activador pueden estar unidos covalentemente mediante el extremo 3' del ARN identificador y el extremo 5' del ARN activador. De manera alternativa, el ARN identificador y el ARN activador pueden estar unidos covalentemente mediante el extremo 5' del ARN identificador y el extremo 3' del ARN activador.
Un ejemplo de ARN dirigido a ADN de dos moleculas descrito en el presente documento correspondiente una molecula similar a crRNA ("ARN CRISPR" o "ARN identificador" o "crRNA" o "repetition de crRNA") y una molecula correspondiente similar a tracrRNA ("ARN CRISPR regulador en trans" o "ARN activador" o "tracrRNA"). Una molecula similar a crRNA (ARN identificador) comprende tanto el segmento dirigido a ADN (cadena simple) del ARN dirigido a ADN y una extension ("segmento formador de duplex") de nucleotidos que forma una mitad del duplex de ARNcd del segmento de union a proteinas del ARN dirigido a ADN. Una molecula similar a tracrRNA correspondiente (ARN activador) comprende una extension de nucleotidos (segmento formador de duplex) que forma la otra mitad del duplex de ARNcd del segmento de union a proteinas del ARN dirigido a ADN. En otras palabras, una extension de nucleotidos de una molecula similar a crRNA es complementaria y se hibrida con una extension de nucleotidos de una molecula similar a tracrRNA para formar el duplex de ARNcd del dominio de union a proteinas del ARN dirigido a ADN. Como tal, cada molecula similar a crRNA puede decirse que tiene una molecula similar a tracrRNA correspondiente. La molecula similar a crRNA proporciona adicionalmente el segmento dirigido a ADN de cadena simple. Por lo tanto, una molecula similar a crRNA y similar a tracrRNA (como un par correspondiente) se hibridan para formar un ARN dirigido a ADN. La secuencia exacta de una molecula de crRNA o tracrRNA dada es una caracteristica de la especia en la cual se encuentran las moleculas de ARN.
El termino "ARN activador" se usa en la presente con el significado de una molecula similar a tracrRNA de un ARN dirigido a ADN de molecula doble. El termino "ARN identificador" se usa en la presente con el significado de una molecula similar a crRNA de un ARN dirigido a ADN de molecula doble. El termino "segmento formador de duplex" se usa en la presente con el significado de la extension de nucleotidos de un ARN activador o un ARN identificador que contribuye a la formation del duplex de ARNcd mediante la hibridacion con una extension de nucleotidos de una molecula de ARN activador o ARN identificador correspondiente. En otras palabras, un ARN activador comprende un segmento formador de duplex que es complementario al segmento formador de duplex del ARN identificador correspondiente. Como tal, un ARN activador comprende un segmento formador de duplex mientras que un ARN identificador comprende tanto un segmento formador de duplex como el segmento dirigido a ADN del ARN dirigido a
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ADN. Por lo tanto, un ARN dirigido a ADN de molecula doble de la invencion puede comprender cualquier par de ARN activador y ARN identificador correspondiente.
Un ARN dirigido a ADN de molecula doble descrito puede disenarse para permitir la union controlada (es decir, condicional) de un ARN identificador con un ARN activador. Dado que un ARN dirigido a ADN de molecula doble no es funcional a menos que el ARN activador y el ARN identificador esten unidos en un complejo funcional con dCas9, un ARN dirigido a ADN de molecula doble puede ser inducible (por ejemplo, inducible por farmacos) provocando que la union entre el ARN activador y el ARN identificador sea inducible. Como un ejemplo no taxativo, los aptameros de ARN pueden usarse para regular (es decir, controlar) la union del ARN activador con el ARN identificador. Por consiguiente, el ARN activador y/o el ARN identificador pueden comprender una secuencia de aptamero de ARN.
Los aptameros de ARN son conocidos en la tecnica y generalmente son una version sintetica de un ribointerruptor. Las expresiones "aptamero de ARN" y "ribointerruptor" se usan de manera intercambiable en la presente para abarcar secuencias de acido nucleico sinteticas y naturales que proporcionan regulacion inducible de la estructura (y por lo tanto la disponibilidad de las secuencias especificas) de la molecula de ARN de la que son parte. Los aptameros normalmente comprenden una secuencia que se pliega en una estructura en particular (por ejemplo, una horquilla), la cual une especificamente a un farmaco en particular (por ejemplo, a una molecula pequena). La union del farmaco provoca un cambio estructural en el pliegue del aRn, el cual cambia una caracteristica del acido nucleico del cual es parte el aptamero. Como ejemplos no taxativos: (i) un ARN activador con un aptamero puede no ser capaz de unirse al ARN identificador cognado a menos que el aptamero se una mediante el farmaco adecuado; (ii) un ARN identificador con un aptamero puede no ser capaz de unirse al ARN activador cognado a menos que el aptamero se una mediante el farmaco adecuado; y (iii) un ARN identificador y un ARN activador, cada uno de ellos con un aptamero diferente que se una a un farmaco diferente, pueden no ser capaces de unirse entre si a menos que esten presentes ambos farmacos. Tal como se ilustra en estos ejemplos, un ARN dirigido a ADN de molecula doble puede disenarse para ser inducible.
Pueden encontrarse ejemplos de aptameros y ribointerruptores, por ejemplo, en: Nakamura et al., Genes Cells. Mayo de 2012; 17(5):344-64; Vavalle et al., Future Cardiol. Mayo de 2012; 8(3):371-82; Citartan et al., Biosens Bioelectron. 15 de abril de 2012; 34(1 ):1-11; y Liberman et al., Wiley Interdiscip Rev RNA. 2012 May-Jun;3(3):369- 84.
Los ejemplos no taxativos de secuencias de nucleotidos que pueden incluirse en un ARN dirigido a ADN de molecula doble incluyen ARN identificadores (por ejemplo, las SEQ ID NO: 566-567) que pueden emparejarse con el segmento formador de duplex de cualquiera de los ARN activadores establecidos en las SEQ ID NO: 671-678.
Un ejemplo de ARN dirigido a ADN de molecula simple comprende dos extensiones complementarias de nucleotidos que se hibridan para formar un duplex de ARNcd. En algunas modalidades, una de las dos extensiones complementarias de nucleotidos del aRn dirigido a ADN de molecula simple (o el ADN que codifica la extension) es al menos alrededor de 60 % identica a una de las secuencias de ARN activador (tracrRNA) establecidas en las SEQ ID NO: 431-562 en una extension de al menos 8 nucleotidos contiguos. Por ejemplo, una de las dos extensiones complementarias de nucleotidos de ARN dirigido a ADN de molecula simple (o el ADN que codifica la extension) es identico en al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 %, al menos un 99 % o 100 % identico a una de las secuencias de tracrRNA establecidas en las SEQ ID NO: 431-562 en una extension de al menos 8 nucleotidos contiguos.
En algunas modalidades, una de las dos extensiones complementarias de nucleotidos del ARN dirigido a ADN de molecula simple (o el ADN que codifica la extension) es al menos alrededor de 60 % identica a una de las secuencias de ARN identificador (crRNA) establecidas en las SEQ ID NO: 563-679 en una extension de al menos 8 nucleotidos contiguos. Por ejemplo, una de las dos extensiones complementarias de nucleotidos de ARN dirigido a ADN de molecula simple (o el aDn que codifica la extension) es identico en al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 %, al menos un 99 % o 100 % identico a una de las secuencias de crRNA establecidas en las SEQ ID NO: 563-679 en una extension de al menos 8 nucleotidos contiguos.
De la misma forma que se definio anteriormente, una "celula hospedadora", tal como se usa en la presente, indica una celula eucariota, una celula procariota (por ejemplo, celula bacteriana o de arquea), o una celula de un organismo multicelular (por ejemplo, linea celular) in vivo o in vitro cultivada como una entidad unicelular, cuyas celulas eucariotas o procariotas pueden ser, o haber sido, usadas como receptores para un acido nucleico, e incluyen la progenie de la celula original a partir de la cual fueron transformadas por medio del acido nucleico. Se entiende que la progenie de una celula individual puede no necesariamente ser completamente identica en morfologia o en la genomica o complemento de ADN total al progenitor original, debido a mutaciones naturales, accidentales o deliberadas. Una "celula hospedadora recombinante" (tambien mencionada como una "celula hospedadora modificada geneticamente") es una celula hospedadora en la cual se ha introducido un acido nucleico heterologo, por ejemplo, un vector de expresion. Por ejemplo, una celula hospedadora bacteriana de la invencion es una celula hospedadora bacteriana modificada geneticamente por medio de la introduccion en una celula hospedadora bacteriana adecuada de un acido nucleico exogeno (por ejemplo, un plasmido o vector de expresion
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recombinante) y una celula hospedadora eucariota de la invencion es una celula hospedadora eucariota modificada geneticamente (por ejemplo, una celula germinal de mamifero) por medio de la introduccion en una celula hospedadora eucariota adecuada de un acido nucleico exogeno.
Las definiciones proporcionadas en "Definiciones - Parte I" tambien se aplican en la presente seccion; vease "Definiciones - Parte I" para una clarificacion adicional de los terminos.
Antes de describir la presente invencion en mas detalle, se debera entender que esta invencion no esta limitada a las modalidades particulares descritas, ya que estas pueden evidentemente variar. Tambien debe entenderse que la terminologia usada en la presente tiene el fin de describir solamente modalidades particulares y no pretende ser limitativa ya que el alcance de la presente invencion estara limitado solamente por las reivindicaciones adjuntas.
Mientras que se proporciona un intervalo de valores, se debera entender que cada valor involucrado, hasta la decima de la unidad del limite inferior salvo que el contexto claramente establezca lo contrario, entre el limite superior e inferior de ese intervalo y cualquier otro valor establecido o involucrado en ese intervalo establecido, estan comprendidos dentro de la invencion. Los limites superior e inferior de estos intervalos mas pequenos pueden estar incluidos independientemente en los intervalos mas pequenos y tambien estan comprendidos dentro de la invencion, sujeto a cualquier limite especificamente excluido en el intervalo establecido. Cuando el intervalo establecido incluye uno o ambos de los limites, los intervalos que excluyan cualesquiera o ambos limites incluidos tambien se incluyen en la invencion.
A menos que se indique de otro modo, todos los terminos tecnicos y cientificos utilizados en la presente tienen el mismo significado segun lo entiende comunmente un experto en la tecnica a la que pertenece la presente invencion. Si bien en la practica o prueba de la presente invencion tambien se puede utilizar cualquier metodo y material similar o equivalente a los descritos en la presente, a continuacion se describen los metodos y materiales preferidos.
Debe observarse que tal como se usa aqui y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares “un", “una" y “el/la”, incluyen los referentes plurales salvo que se exprese claramente lo contrario en el contexto. Por lo tanto, por ejemplo, la referencia a “un polipeptido Cas9 enzimaticamente inactivo” incluye una pluralidad de dichos polipeptidos y la referencia "al acido nucleico objetivo" incluye la referencia a uno o mas acidos nucleicos objetivo y equivalentes de estos conocidos por los expertos en la tecnica, etc. Se observa ademas que las reivindicaciones pueden ser redactadas de forma que excluyan cualquier elemento opcional. Como tal, esto pretende ser una base antecedente para el uso de dicha terminologia exclusiva tal como "solamente", "unicamente" y similares con relacion a la enumeracion de los elementos de las reivindicaciones o el uso de una limitacion "negativa".
Se entiende que algunas caracteristicas de la invencion que, a los efectos de la claridad, se describen en el contexto de modalidades separadas, tambien se pueden proporcionar en combinacion en una sola modalidad. De manera inversa, diversas caracteristicas de la invencion que, a efectos de brevedad, se describen en el contexto de una sola modalidad, tambien se pueden proporcionar por separado o en cualquier subcombinacion adecuada. Todas las combinaciones de las modalidades pertenecientes a la invencion se encuentran especificamente comprendidas dentro de la presente invencion y se describen en la presente como si cada combinacion estuviese individual y especificamente descrita. Ademas, todas las subcombinaciones de las varias modalidades y elementos de estas tambien se encuentran especificamente comprendidas dentro de la presente y se describen en la presente como si cada dicha subcombinacion estuviese individual y especificamente descrita en la presente.
Las publicaciones que se analizan en la presente se proporcionan unicamente para su divulgacion antes de la fecha de presentation de la presente solicitud. Ningun contenido de la presente debe interpretarse como una admision de que la presente invencion no tiene derecho a preceder a dicha publication en virtud de invencion anterior. Ademas, las fechas de publicacion proporcionadas pueden no coincidir con las fechas de publicacion reales, las que puede ser necesario confirmar independientemente.
Descripcion detallada - parte ii
Se exponen en la presente descripcion metodos para regular la transcription de un acido nucleico objetivo en una celula hospedadora. Los metodos generalmente involucran poner en contacto el acido nucleico objetivo con un polipeptido Cas9 enzimaticamente inactivo y un ARN simple guia. Los metodos son utiles en variedad aplicaciones, que tambien se proporcionan en esta descripcion.
Un metodo de modulation transcripcional descrita por la presente descripcion supera algunas de las desventajas de metodos que involucran ribointerferencia. Un metodo de modulacion transcripcional de la presente descripcion puede utilizarse en una gran variedad de aplicaciones, inclusive solicitudes de investigation, descubrimiento de farmacos (por ejemplo, analisis de alto rendimiento), validation de objetivos, aplicaciones industriales (por ejemplo, modification genetica de cultivos; modification genetica de bacterias, etc.), aplicaciones de diagnostico, aplicaciones terapeuticas y tecnica de imaginologia.
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METODOS PARA MODULAR LA TRANSCRIPCION
La presente descripcion presenta un metodo para modular la transcripcion de forma selectiva de un ADN objetivo en una celula hospedadora. El metodo generalmente involucra: a) introducir en la celula hospedadora: i) un ARN dirigido a ADN o un acido nucleico que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica al ARN dirigido a ADN; y ii) un variante del polipeptido dirigido al sitio Cas9 ("polipeptido Cas9 variante") o un acido nucleico que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica el polipeptido Cas9 variante, donde el polipeptido Cas9 variante presenta actividad de endodesoxirribonucleasa reducida.
El ARN dirigido a ADN (al que tambien se hace referencia en la presente como "crRNA", "ARN guia" o "ARNg") comprende: i) un primer segmento que comprende una secuencia de nucleotidos que es complementaria a una secuencia objetivo en un ADN objetivo; ii) un segundo segmento que interactua con un polipeptido dirigido al sitio; y iii) un terminador transcripcional. Se hace referencia en la presente al primer segmento, que comprende una secuencia de nucleotidos que es complementaria a la secuencia objetivo en un ADN objetivo, como "segmento direccionador". Se hace referencia en la presente al segundo segmento, el cual interactua con un polipeptido dirigido al sitio, como "secuencia de union a proteinas", "horquilla de union a dCas9" o "asa de dCas9". "Segmento" significa un segmento/seccion/region de una molecula, por ejemplo, una extension continua de nucleotidos en un ARN. La definition de "segmento", a menos que se defina lo contrario en un contexto especifico, no se limita a una cantidad especifica de pares de base totales, y puede incluir regiones de moleculas de ARN que tiene cualquier longitud total y pueden o no incluir regiones con complementariedad a otras moleculas. Un ARN dirigido a ADN de acuerdo con la presente descripcion es una molecula de ARN simple (polinucleotido de ARN simple) al que se puede hacer referencia como un "ARN dirigido a ADN de molecula simple", un "ARN simple guia" o un "ARNsg". Otro ARN dirigido a ADN descrito en el presente documento puede comprender dos moleculas de ARN. En la presente descripcion la expresion "ARN dirigido a ADN" o "ARNg" es inclusiva y hace referencia tanto a ARN dirigidos a ADN de molecula doble y a ARN dirigidos a ADN de molecula simple (es decir, ARNsg).
La variante del polipeptido dirigido al sitio Cas9 presentado en el presente documento comprende: i) una parte de union a ARN que interactua con el ARN dirigido a ADN; y ii) una parte de actividad que presenta actividad de endodesoxirribonucleasa reducida.
El ARN dirigido a ADN y el polipeptido Cas9 variante forman un complejo en la celula hospedadora; el complejo modula selectivamente la transcripcion de un ADN objetivo en la celula hospedadora.
En algunos casos, un metodo de modulation de la transcripcion de la presente descripcion proporciona modulation selectiva (por ejemplo, reduction o aumento) de un acido nucleico objetivo en una celula hospedadora. Por ejemplo, la reduccion "selectiva" de la transcripcion de un acido nucleico objetivo reduce la transcripcion del acido nucleico objetivo en al menos alrededor de 10 %, al menos alrededor de 20 %, al menos alrededor de 30 %, al menos alrededor de 40 %, al menos alrededor de 50 %, al menos alrededor de 60 %, al menos alrededor de 70 %, al menos alrededor de 80 %, al menos alrededor de 90 % o mas de 90 %, en comparacion con el nivel de transcripcion del acido nucleico objetivo ante la ausencia de un complejo de ARN dirigido a ADN/polipeptido Cas9 variante. La reduccion selectiva de la transcripcion de un acido nucleico objetivo reduce la transcripcion del acido nucleico objetivo, pero no reduce sustancialmente la transcripcion de un acido nucleico no objetivo, por ejemplo, la transcripcion de un acido nucleico no objetivo se reduce, de reducirse, en menos de 10 % en comparacion con el nivel de transcripcion del acido nucleico no objetivo ante la ausencia del complejo de ARN dirigido a ADN/polipeptido Cas9 variante.
Aumento de la transcripcion
El aumento "selectivo" de la transcripcion de un ADN objetivo puede aumentar la transcripcion del ADN objetivo en al menos alrededor de 1,1 veces (por ejemplo, al menos alrededor de 1,2 veces, al menos alrededor de 1,3 veces, al menos alrededor de 1,4 veces, al menos alrededor de 1,5 veces, al menos alrededor de 1,6 veces, al menos alrededor de 1,7 veces, al menos alrededor de 1,8 veces, al menos alrededor de 1,9 veces, al menos alrededor de 2 veces, al menos alrededor de 2,5 veces, al menos alrededor de 3 veces, al menos alrededor de 3,5 veces, al menos alrededor de 4 veces, al menos alrededor de 4,5 veces, al menos alrededor de 5 veces, al menos alrededor de 6 veces, al menos alrededor de 7 veces, al menos alrededor de 8 veces, al menos alrededor de 9 veces, al menos alrededor de 10 veces, al menos alrededor de 12 veces, al menos alrededor de 15 veces, al menos alrededor de 20 veces) en comparacion con el nivel de transcripcion del ADN objetivo ante la ausencia de un complejo de ARN dirigido a ADN/polipeptido Cas9 variante. El aumento selectivo de la transcripcion de un ADN objetivo aumenta la transcripcion del ADN objetivo, pero no aumenta la transcripcion de manera sustancial de un ADN no objetivo, por ejemplo, la transcripcion de un ADN no objetivo aumenta, de aumentar, menos de alrededor de 5 veces (por ejemplo, menos de alrededor de 4 veces, menos de alrededor de 3 veces, menos de alrededor de 2 veces, menos de alrededor de 1,8 veces, menos de alrededor de 1,6 veces, menos de alrededor de 1,4 veces, menos de alrededor de 1,2 veces, menos de alrededor de 1,1 veces) en comparacion con el nivel de transcripcion del ADN no objetivo ante la ausencia del complejo ADN dirigido a ARN/polipeptido Cas9 variante.
Como un ejemplo no taxativo, el aumento puede alcanzarse mediante la fusion de dCas9 a una secuencia
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heterologa. Los companeros de fusion adecuados incluyen, de modo no taxativo, un polipeptido que proporciona una actividad que aumenta la transcripcion de manera indirecta al actuar de manera directa sobre el ADN objetivo o sobre un polipeptido (por ejemplo, una histona u otra proteina de union a ADN) asociado con el ADN objetivo. Los companeros de fusion adecuados incluyen, de modo no taxativo, un polipeptido que proporciona actividad de metiltransferasa, actividad de desmetilasa, actividad de acetiltransferasa, actividad de deacetilasa, actividad de cinasa, actividad de fosfatasa, actividad de ubiquitina ligasa, actividad desubiquitinante, actividad de adenilacion, actividad de desadenilacion, actividad de SUMOilacion, actividad de deSUMOilacion, actividad de ribosilacion, actividad de desribosilacion, actividad de miristoilacion o actividad de demiristoilacion.
Los companeros de fusion adicionales adecuados incluyen, de modo no taxativo, un polipeptido que proporciona, de manera indirecta, el aumento de la transcripcion del acido nucleico objetivo (por ejemplo, un activador de la transcripcion o un fragmento de este, una proteina o fragmento de este que recluta un activador de la transcripcion, un regulador de la transcripcion que responde a farmacos/de molecula pequena, etc.).
Un ejemplo no taxativo de un metodo que utiliza una proteina de fusion dCas9 para aumentar la transcripcion en una procariota incluye una modificacion del sistema bacteriano de un hibrido (B1H) o de doble hibrido (B2H). En el sistema B1H, un dominio de union (BD, por sus siglas en ingles) a ADN se fusiona a un dominio de activacion de la transcripcion bacteriana (AD, por sus siglas en ingles, por ejemplo, la subunidad alfa de la ARN polimerasa de Escherichia coli (RNAPa)). Por lo tanto, un dCas9 puede fusionarse a una secuencia heterologa que comprende un AD. Cuando la proteina de fusion dCas9 llega a la region anterior de un promotor (dirigido alli por el ARN dirigido a ADN), el AD (por ejemplo, RNAPa) de una proteina de fusion dCas9 recluta a la holoenzima de RNAP, lo que lleva a la activacion de la transcripcion. En el sistema B2H, el BD no esta fusionado directamente al AD; en cambio, su interaction esta mediada por una interaction proteina-proteina (por ejemplo, interaction GAL11P - GAL4). Para modificar dicho sistema para su uso en los metodos, dCas9 puede fusionarse a una primera secuencia de proteinas que proporciona interaccion proteina-proteina (por ejemplo, la proteina de levadura GAL11P y/o GAL4) y el RNAa puede fusionarse a una segunda secuencia de proteinas que completa la interaccion proteina-proteina (por ejemplo, GAL4 si GAL11P se fusiona a dCas9, GALlIP si GAL4 se fusiona a dCas9, etc.). La afinidad de union entre GAL11P y GAL4 aumenta la eficacia de la tasa de activacion de transcripcion y union.
Un ejemplo no taxativo de un metodo que utiliza una proteina de fusion dCas9 para aumentar la transcripcion en una eucariota incluye la fusion de dCas9 a un dominio de activacion (AD) (por ejemplo, GAL4, la proteina de activacion de herpesvirus VP16 o VP64, subunidad de factor humano nuclear NF-kB p65, etc.). Para que el sistema se torne inducible, la expresion de la proteina de fusion dCas9 puede ser controlada por un promotor inducible (por ejemplo, Tet-ON, Tet-OFF, etc.). El aRn dirigido a ADN puede disenarse para dirigir elementos conocidos de respuesta a la transcripcion (por ejemplo, promotores, potenciadores, etc.), secuencias conocidas de activacion anterior (UAS, por sus siglas en ingles), secuencias de funcion conocida o desconocida que se sospecha que pueden controlar la expresion del ADN objetivo, etc.
Companeros de fusion adicionales
Los ejemplos no taxativos de companeros de fusion para lograr un aumento o disminucion de la transcripcion se enumeran en la Figura 54 e incluyen dominios activadores de la transcripcion y represores de la transcripcion (por ejemplo, la caja asociada con Kruppel (KRAB o SKD); el dominio de interaccion de Mad mSIN3 (SID); el dominio represor de eRf (ERD, por sus siglas en ingles), etc.). En algunos de dichos casos, la proteina de fusion dCas9 es el objetivo del ARN dirigido a ADN en una ubicacion especifica (es decir, secuencia) en el ADN objetivo y produce la regulation especifica del locus, tal como el bloqueo de la union de ARN polimerasa a un promotor (que inhibe de manera selectiva la funcion del activador de transcripcion), y/o la modificacion del estado de cromatina local (por ejemplo, cuando se usa una secuencia de fusion que modifica el ADN objetivo o modifica un polipeptido asociado con el ADN objetivo). En algunos casos, los cambios son transitorios (por ejemplo, represion o activacion de la transcripcion). En algunos casos, los cambios pueden heredarse (por ejemplo, cuando se realizan modificaciones epigeneticas al ADN objetivo o a proteinas asociadas con el ADN objetivo, por ejemplo, histonas nucleosomales).
En algunas modalidades, la secuencia heterologa puede fusionarse al extremo C del polipeptido dCas9. En algunas modalidades, la secuencia heterologa puede fusionarse al extremo N del polipeptido dCas9. En algunas modalidades, la secuencia heterologa puede fusionarse a una parte interna (es decir, una parte diferente al extremo N o extremo C) del polipeptido dCas9.
Los efectos biologicos de un metodo que usa una proteina de fusion dCas9 pueden detectarse mediante cualquier metodo conveniente (por ejemplo, ensayos de expresion genica; ensayos basados en cromatina, por ejemplo, inmunoprecipitacion de cromatina (ChiP), ensayo in vivo de cromatina (CiA), etc.; y similares).
En algunos casos, un metodo descrito en el presente documento implica el uso de dos o mas ARN dirigidos a ADN diferentes. Por ejemplo, pueden utilizarse dos ARN dirigidos a ADN diferentes en una unica celula hospedadora, donde los dos ARN dirigidos a ADN diferentes se dirigen a dos secuencias objetivo diferentes en el mismo acido nucleico objetivo.
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Por lo tanto, por ejemplo, un metodo de modulacion transcripcional puede comprender adicionalmente la introduccion en la celula hospedadora de un ARN dirigido a ADN, o un acido nucleico que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica el segundo ARN dirigido a ADN, donde el segundo ARN dirigido a ADN comprende: (i) un primer segmento que comprende una secuencia de nucleotidos que es complementaria a una segunda secuencia objetivo en el ADN objetivo; (ii) un segundo segmento que interactua con un polipeptido dirigido al sitio; y (iii) un terminador transcripcional. En algunos casos, el uso de dos ARN dirigidos a ADN diferentes que se dirigen a dos secuencias objetivo diferentes en el mismo acido nucleico objetivo proporciona un aumento de la modulacion (por ejemplo, reduccion o aumento) en la transcripcion del acido nucleico objetivo.
Como ejemplo adicional, pueden utilizarse dos ARN dirigidos a ADN diferentes en una unica celula hospedadora, donde los dos ARN dirigidos a ADN diferentes se dirigen a dos acidos nucleicos objetivo diferentes. Por lo tanto, por ejemplo, un metodo de modulacion transcripcional de la invencion puede comprender adicionalmente la introduccion en la celula hospedadora de un segundo ARN dirigido a ADN, o un acido nucleico que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica el segundo ARN dirigido a ADN, donde el segundo ARN dirigido a ADN comprende: (i) un primer segmento que comprende una secuencia de nucleotidos que es complementaria a una secuencia objetivo en al menos un segundo ADN objetivo; (ii) un segundo segmento que interactua con un polipeptido dirigido al sitio; y (iii) un terminador transcripcional.
En algunas modalidades, un acido nucleico de la invencion (por ejemplo, un ARN dirigido a ADN, por ejemplo, un ARN dirigido a ADN de molecula simple, un ARN activador, un ARN identificador, etc.; un polinucleotido donante; un acido nucleico que codifica un polipeptido modificador dirigido al sitio; etc.) comprende una modificacion o secuencia que proporciona una caracteristica deseable adicional (por ejemplo, estabilidad modificada o regulada; direccionamiento subcelular; rastreo, por ejemplo, marcado fluorescente; un sitio de union para una proteina o complejo de proteinas; etc.). Los ejemplos no taxativos incluyen: un casquete 5' (por ejemplo, un casquete 7- metilguanilato (m7G)); una cola poliadenilada 3' (es decir, una cola poli(A) 3'); una secuencia de ribointerruptor o una secuencia de aptamero (por ejemplo, para permitir estabilidad regulada y/o accesibilidad regulada mediante proteinas y/o complejos de proteinas); una secuencia de terminacion; una secuencia que forma un duplex de ARNcd (es decir, una horquilla)); una modificacion o secuencia que dirige el ARN a una ubicacion subcelular (por ejemplo, nucleo, mitocondria, cloroplastos y similares); una modificacion o secuencia que proporciona rastreo (por ejemplo, conjugacion directa con una molecula fluorescente, conjugacion con un resto que facilita la deteccion fluorescente, una secuencia que permite la deteccion fluorescente, etc.); una modificacion o secuencia que proporciona un sitio de union para proteinas (por ejemplo, proteinas que actuan en el ADN, incluidos los activadores transcripcionales, represores transcripcionales, ADN metiltransferasas, ADN desmetilasas, histona acetiltransferasas, histona deacetilasas y similares); y combinaciones de estos.
Segmento dirigido a ADN
El segmento dirigido al ADN (o "secuencia dirigida al ADN") de un ARN dirigido a ADN ("crRNA") comprende una secuencia de nucleotidos que es complementaria a una secuencia especifica dentro de un ADN objetivo (la cadena complementaria del ADN objetivo).
En otras palabras, el segmento dirigido a ADN de un ARN dirigido a ADN de la invencion interactua con un ADN objetivo de forma especifica a la secuencia mediante hibridacion (es decir, apareamiento de bases). Como tal, la secuencia de nucleotidos del segmento dirigido a ADN puede variar y determina la ubicacion dentro del ADN objetivo donde el ARN dirigido a ADN y el ADN objetivo interactuaran. El segmento dirigido a ADN de un ARN dirigido a ADN de la invencion puede modificarse (por ejemplo, mediante manipulacion genetica) para hibridarse a cualquier secuencia deseada dentro de un ADN objetivo.
El segmento dirigido a ADN puede ser de una longitud de alrededor de 12 nucleotidos a alrededor de 100 nucleotidos. Por ejemplo, el segmento dirigido a ADN puede tener una longitud de alrededor de 12 nucleotidos (nt) a alrededor de 80 nt, de alrededor 12 nt a alrededor de 50 nt, de alrededor de 12 nt a alrededor de 40 nt, de alrededor de 12 nt a alrededor de 30 nt, de alrededor de 12 nt a alrededor de 25 nt, de alrededor de 12 nt a alrededor de 20 nt, de alrededor de 12 nt a alrededor de 19 nt. Por ejemplo, el segmento dirigido a ADN puede tener una longitud de
alrededor de 19 nt a alrededor de 20 nt, de alrededor de 19 nt a alrededor de 25 nt, de alrededor de 19 nt a
alrededor de 30 nt, de alrededor de 19 nt a alrededor de 35 nt, de alrededor de 19 nt a alrededor de 40 nt, de
alrededor de 19 nt a alrededor de 45 nt, de alrededor de 19 nt a alrededor de 50 nt, de alrededor de 19 nt a
alrededor de 60 nt, de alrededor de 19 nt a alrededor de 70 nt, de alrededor de 19 nt a alrededor de 80 nt, de
alrededor de 19 nt a alrededor de 90 nt, de alrededor de 19 nt a alrededor de 100 nt, , de alrededor de 20 nt a
alrededor de 25 nt de alrededor de 20 nt a alrededor de 30 nt, de alrededor de 20 nt a alrededor de 35 nt, de
alrededor de 20 nt a alrededor de 40 nt, de alrededor de 20 nt a alrededor de 45 nt, de alrededor de 20 nt a
alrededor de 50 nt, de alrededor de 20 nt a alrededor de 60 nt, de alrededor de 20 nt a alrededor de 70 nt, de alrededor de 20 nt a alrededor de 80 nt, de alrededor de 20 nt a alrededor de 90 nt o de alrededor de 20 nt a alrededor de 100 nt.
La secuencia de nucleotidos (la secuencia dirigida a ADN) del segmento dirigido a ADN que es complementario a una secuencia de nucleotidos (secuencia objetivo) del ADN objetivo puede tener una longitud de al menos alrededor
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de 12 nt. Por ejemplo, una secuencia dirigida a ADN del segmento dirigido a ADN que es complementary a una secuencia objetivo del ADN objetivo puede tener una longitud de al menos alrededor de 12 nt, al menos alrededor de 15 nt, al menos alrededor de 18 nt, al menos alrededor de 19 nt, al menos alrededor de 20 nt, al menos alrededor de 25 nt, al menos alrededor de 30 nt, al menos alrededor de 35 nt o al menos alrededor de 40 nt. Por ejemplo, la secuencia dirigida a ADN del segmento dirigido a ADN que es complementario a la secuencia objetivo del ADN objetivo puede tener una longitud de alrededor de 12 nucleotidos (nt) a alrededor de 80 nt, de alrededor de 12 nt a alrededor de 50 nt, de alrededor de 12 nt a alrededor de 45 nt, de alrededor de 12 nt a alrededor de 40 nt, de alrededor de 12 nt a alrededor de 35 nt, de alrededor de 12 nt a alrededor de 30 nt, de alrededor de 12 nt a alrededor de 25 nt, de alrededor de 12 nt a alrededor de 20 nt, de alrededor de 12 nt a alrededor de 19 nt, de alrededor de 19 nt a alrededor de 20 nt, de alrededor de 19 nt a alrededor de 25 nt, de alrededor de 19 nt a alrededor de 30 nt, de alrededor de 19 nt a alrededor de 35 nt, de alrededor de 19 nt a alrededor de 40 nt, de alrededor de 19 nt a alrededor de 45 nt, de alrededor de 19 nt a alrededor de 50 nt, de alrededor de 19 nt a alrededor de 60 nt, de alrededor de 20 nt a alrededor de 25 nt, de alrededor de 20 nt a alrededor de 30 nt, de alrededor de 20 nt a alrededor de 35 nt, de alrededor de 20 nt a alrededor de 40 nt, de alrededor de 20 nt a alrededor de 45 nt, de alrededor de 20 nt a alrededor de 50 nt o de alrededor de 20 nt a alrededor de 60 nt. La secuencia de nucleotidos (la secuencia dirigida a ADN) del segmento dirigido a ADN que es complementario a una secuencia de nucleotidos (secuencia objetivo) del ADN objetivo puede tener una longitud de al menos alrededor de 12 nt.
En algunos casos, la secuencia dirigida a ADN del segmento dirigido a ADN que es complementario a una secuencia objetivo del ADN objetivo tiene 20 nucleotidos de longitud. En algunos casos, la secuencia dirigida a ADN del segmento dirigido a ADN que es complementario a una secuencia objetivo del ADN objetivo tiene 19 nucleotidos de longitud.
El porcentaje de complementariedad entre la secuencia dirigida a ADN del segmento dirigido a ADN y la secuencia objetivo del ADN objetivo puede ser al menos de 60 % (por ejemplo, al menos 65 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % o 100 %). En algunos casos, el porcentaje de complementariedad entre la secuencia dirigida a ADN del segmento dirigido a ADN y la secuencia objetivo del ADN objetivo es 100 % dentro de los siete nucleotidos contiguos mas cercanos al extremo 5' de la secuencia objetivo de la cadena complementaria del ADN objetivo. En algunos casos, el porcentaje de complementariedad entre la secuencia dirigida a ADN del segmento dirigido a ADN y la secuencia objetivo del ADN objetivo es al menos 60 % dentro de alrededor de 20 nucleotidos continuos. En algunos casos, el porcentaje de complementariedad entre la secuencia dirigida a ADN del segmento dirigido a ADN y la secuencia objetivo del ADN objetivo es 100 % dentro de los catorce nucleotidos contiguos mas cercanos al extremo 5' de la secuencia objetivo de la cadena complementaria del ADN objetivo y tan bajo como 0 % dentro del resto. En dicho caso, puede considerarse que la secuencia dirigida a ADN tiene 14 nucleotidos de longitud. En algunos casos, el porcentaje de complementariedad entre la secuencia dirigida a ADN del segmento dirigido a ADN y la secuencia objetivo del ADN objetivo es 100 % dentro de los siete nucleotidos contiguos mas cercanos al extremo 5' de la secuencia objetivo de la cadena complementaria del ADN objetivo y tan bajo como 0 % dentro del resto. En dicho caso, puede considerarse que la secuencia dirigida a ADN tiene 7 nucleotidos de longitud.
Segmento de union a proteinas
El segmento de union a proteinas (es decir, "secuencia de union a proteinas") de un ARN dirigido a ADN interactua con una polipeptido dirigido al sitio variante. Cuando la variante del polipeptido dirigido al sitio Cas9, junto con el ARN dirigido a ADN, se une a un ADN objetivo, se reduce la transcripcion del ADN objetivo.
El segmento de union a proteinas de un ARN dirigido a ADN comprende dos extensiones complementarias de nucleotidos que se hibridan entre si para formar un duplex de ARN de cadena doble (duplex de ARNcd).
El segmento de union a proteinas de un ARN dirigido a ADN de la presente description comprende dos extensiones de nucleotidos (un ARN identificador y un ARN activador) que son complementarios entre si, estan unidos de forma covalente mediante nucleotidos intermedios (por ejemplo, en el caso de ARN dirigido a ADN de molecula simple) ("enlazadores" o "nucleotidos enlazadores") y se hibridan para formar el duplex de ARN de cadena doble (duplex de ARNcd, u "horquilla de union a dCas9") del segmento de union a proteinas, dando como resultado una estructura de tallo-bucle. Esta estructura de tallo-bucle se muestra de manera esquematica en la Figura 39A. El ARN identificador y el ARN activador pueden estar unidos covalentemente mediante el extremo 3' del ARN identificador y el extremo 5' del ARN activador. De manera alternativa, el ARN identificador y el ARN activador pueden estar unidos covalentemente mediante el extremo 5' del ARN identificador y el extremo 3' del ARN activador.
El segmento de union a proteinas puede tener una longitud de alrededor de 10 nucleotidos a alrededor de 100 nucleotidos, por ejemplo, de alrededor de 10 nucleotidos (nt) a alrededor de 20 nt, de alrededor de 20 nt a alrededor de 30 nt, de alrededor de 30 nt a alrededor de 40 nt, de alrededor de 40 nt a alrededor de 50 nt, de alrededor de 50 nt a alrededor de 60 nt, de alrededor de 60 nt a alrededor de 70 nt, de alrededor de 70 nt a alrededor de 80 nt, de alrededor de 80 nt a alrededor de 90 nt o de alrededor de 90 nt a alrededor de 100 nt. Por ejemplo, el segmento de union a proteinas puede tener una longitud de alrededor de 15 nucleotidos (nt) a alrededor de 80 nt, de alrededor 15
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nt a alrededor de 50 nt, de alrededor de 15 nt a alrededor de 40 nt, de alrededor de 15 nt a alrededor de 30 nt o de alrededor de 15 nt a alrededor de 25 nt.
El duplex de ARNcd del segmento de union a proteinas puede tener una longitud de alrededor de 6 pares de bases (pb, por sus siglas en ingles) a alrededor de 50 pb. Por ejemplo, el duplex de ARNcd del segmento de union a proteinas puede tener una longitud de alrededor de 6 pb a alrededor de 40 pb, de alrededor de 6 pb a alrededor de 30 pb, de alrededor de 6 pb a alrededor de 25 pb, de alrededor de 6 pb a alrededor de 20 pb, de alrededor de 6 pb a alrededor de 15 pb, de alrededor de 8 pb a alrededor de 40 pb, de alrededor de 8 pb a alrededor de 30 pb, de alrededor de 8 pb a alrededor de 25 pb, de alrededor de 8 pb a alrededor de 20 pb o de alrededor de 8 pb a alrededor de 15 pb. Por ejemplo, el duplex de ARNcd del segmento de union a proteinas puede tener una longitud de alrededor de 8 pb a alrededor de 10 pb, de alrededor de 10 pb a alrededor de 15 pb, de alrededor de 15 pb a alrededor de 18 pb, de alrededor de 18 pb a alrededor de 20 pb, de alrededor de 20 pb a alrededor de 25 pb, de alrededor de 25 pb a alrededor de 30 pb, de alrededor de 30 pb a alrededor de 35 pb, de alrededor de 35 pb a alrededor de 40 pb o de alrededor de 40 pb a alrededor de 50 pb. En algunas modalidades, el duplex de ARNcd del segmento de union a proteinas tiene una longitud de 36 pares de base. El porcentaje de complementariedad entre las secuencias de nucleotidos que hibridan para formar el duplex de ARNcd del segmento de union a proteinas puede ser al menos alrededor de 60 %. Por ejemplo, el porcentaje de complementariedad entre las secuencias de nucleotidos que hibridan para formar el duplex de ARNcd del segmento de union a proteinas puede ser al menos alrededor de 65 %, al menos alrededor de 70 %, al menos alrededor de 75 %, al menos alrededor de 80 %, al menos alrededor de 85 %, al menos alrededor de 90 %, al menos alrededor de 95 %, al menos alrededor de 98 % o al menos alrededor de 99 %. En algunos casos, el porcentaje de complementariedad entre las secuencias de nucleotidos que hibridan para formar el duplex de ARNcd del segmento de union a proteinas es 100 %.
El enlazador puede tener una longitud de alrededor de 3 nucleotidos a alrededor de 100 nucleotidos. Por ejemplo, el enlazador puede tener una longitud de alrededor de 3 nucleotidos (nt) a alrededor de 90 nt, de alrededor de 3 nucleotidos (nt) a alrededor de 80 nt, de alrededor 3 nucleotidos (nt) a alrededor de 70 nt, de alrededor de 3 nucleotidos (nt) a alrededor de 60 nt, de alrededor de 3 nucleotidos (nt) a alrededor de 50 nt, de alrededor de 3
nucleotidos (nt) a alrededor de 40 nt, de alrededor de 3 nucleotidos (nt) a alrededor de 30 nt, de alrededor de 3
nucleotidos (nt) a alrededor de 20 nt, de alrededor de 3 nucleotidos (nt) a alrededor de 10 nt. Por ejemplo, el enlazador puede tener una longitud de alrededor de 3 nt a alrededor de 5 nt, de alrededor de 5 nt a alrededor de 10 nt, de alrededor de 10 nt a alrededor de 15 nt, de alrededor de 15 nt a alrededor de 20 nt, de alrededor de 20 nt a alrededor de 25 nt, de alrededor de 25 nt a alrededor de 30 nt, de alrededor de 30 nt a alrededor de 35 nt, de
alrededor de 35 nt a alrededor de 40 nt, de alrededor de 40 nt a alrededor de 50 nt, de alrededor de 50 nt a
alrededor de 60 nt, de alrededor de 60 nt a alrededor de 70 nt, de alrededor de 70 nt a alrededor de 80 nt, de alrededor de 80 nt a alrededor de 90 nt o de alrededor de 90 nt a alrededor de 100 nt. En algunas modalidades, el enlazador de un ARN dirigido a ADN tiene 4 nt.
Los ejemplos no taxativos de secuencias de nucleotidos que pueden incluirse en un segmento de union a proteinas adecuado (es decir, asa de dCas9) se establecen en las SEQ ID NO:563-682 (por ejemplos, veanse la Figura 8 y la Figura 9).
En algunos casos, un segmento de union a proteinas adecuado comprende una secuencia de nucleotidos que difiere en 1,2, 3, 4, o 5 nucleotidos con cualquiera de las secuencias enumeradas anteriormente.
Secuencia de control de estabilidad (por ejemplo. segmento terminador transcripcional)
Una secuencia de control de estabilidad influye en la estabilidad de un ARN (por ejemplo, un ARN dirigido a ADN, un ARN identificador, un ARN activador, etc.). Un ejemplo de una secuencia de control de estabilidad adecuada es un segmento terminador transcripcional (es decir, una secuencia de terminacion de la transcripcion). Un segmento terminador de la transcripcion de un ARN dirigido a ADN puede tener una longitud total de alrededor de 10 nucleotidos a alrededor de 100 nucleotidos, por ejemplo, de alrededor de 10 nucleotidos (nt) a alrededor de 20 nt, de alrededor de 20 nt a alrededor de 30 nt, de alrededor de 30 nt a alrededor de 40 nt, de alrededor de 40 nt a alrededor de 50 nt, de alrededor de 50 nt a alrededor de 60 nt, de alrededor de 60 nt a alrededor de 70 nt, de alrededor de 70 nt a alrededor de 80 nt, de alrededor de 80 nt a alrededor de 90 nt o de alrededor de 90 nt a alrededor de 100 nt. Por ejemplo, el segmento terminador transcripcional puede tener una longitud de alrededor de 15 nucleotidos (nt) a alrededor de 80 nt, de alrededor 15 nt a alrededor de 50 nt, de alrededor de 15 nt a alrededor de 40 nt, de alrededor de 15 nt a alrededor de 30 nt o de alrededor de 15 nt a alrededor de 25 nt.
En algunos casos, la secuencia de terminacion de la transcripcion es funcional en una celula eucariota. En algunos casos, la secuencia de terminacion de la transcripcion es funcional en una celula procariota.
Los ejemplos no taxativos de secuencias de nucleotidos que pueden incluirse en una secuencia de control de estabilidad (por ejemplo, segmento de terminacion transcripcional, o en cualquier segmento del ARN dirigido a ADN para proporcionar una estabilidad aumentada) incluyen secuencias establecidas en las SEQ ID NO:683-696 y, por ejemplo, 5'-UAAUCCCACAGCCGCCAGUUCCGCUGGCGGCAUUUU-5' (SEQ ID NO:795) (un sitio de terminacion de trp independiente de Rho).
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Secuencias adicionales
En algunas modalidades, un ARN dirigido a ADN comprende al menos un segmento adicional ya sea en el extremo 5' o 3'. Por ejemplo, un segmento adicional aceptable puede comprender un casquete 5' (por ejemplo, un casquete 7-metilguanilato (m7G)); una cola poliadenilada 3' (es decir, una cola poli(A) 3'); una secuencia de ribointerruptor (por ejemplo, para permitir estabilidad regulada y/o accesibilidad regulada mediante proteinas y complejos de proteinas); una secuencia que forma un duplex de ARNcd (es decir, una horquilla)); una secuencia que dirige el ARN a una ubicacion subcelular (por ejemplo, nucleo, mitocondria, cloroplastos y similares); una modification o secuencia que proporciona rastreo (por ejemplo, conjugation directa con una molecula fluorescente, conjugation con un resto que facilita la detection fluorescente, una secuencia que permite la detection fluorescente, etc.); una modificacion o secuencia que proporciona un sitio de union para proteinas (por ejemplo, proteinas que actuan en el ADN, incluidos los activadores transcripcionales, represores transcripcionales, ADN metiltransferasas, ADN desmetilasas, histona acetiltransferasas, histona deacetilasas y similares), una modificacion o secuencia que proporciona una estabilidad aumentada, disminuida y/o controlable; y combinaciones de estos.
ARN dirigido a ADN simultaneos y multiples
En algunas modalidades, multiples ARN dirigidos a ADN se usan de manera simultanea en la misma celula para modular de manera simultanea diferentes ubicaciones en el mismo ADN objetivo o en diferentes ADN objetivo. En algunas modalidades, dos o mas ARN dirigidos a ADN se dirigen al mismo gen, transcription o locus. En algunas modalidades, dos o mas ARN dirigidos a ADN se dirigen a distintos locus sin relation. En algunas modalidades, dos o mas ARN dirigidos a ADN se dirigen a locus distintos pero relacionados.
Debido a que los ARN dirigidos a ADN son pequenos y potentes pueden estar presentes de manera simultanea en el mismo vector de expresion y pueden incluso estar bajo el mismo control transcipcional, si asi se desea. En algunas modalidades, dos o mas (por ejemplo, 3 o mas, 4 o mas, 5 o mas, 10 o mas, 15 o mas, 20 o mas, 25 o mas, 30 o mas, 35 o mas, 40 o mas, 45 o mas o 50 o mas) ARN dirigidos a ADN se expresan simultaneamente en una celula objetivo (del mismo vector o de vectores diferentes). Los ARN dirigidos a ADN pueden ser reconocidos de manera diferente mediante proteinas dCas9 de diferentes bacterias, tal como S. pyogenes, S. thermophilus, L. innocua y N. meningitidis.
Para expresar multiples ARN dirigidos a ADN, puede utilizarse un sistema de procesamiento de ARN artificial mediado por Csy4 endorribonucleasa. Pueden concatenarse multiples ARN dirigidos a ADN en una configuration de tandem en un transcripto precursor (por ejemplo, expresado a partir de un promotor U6) y separarse mediante secuencia de ARN especifica de Csy4. La proteina Csy4 coexpresada escinde el transcripto precursor en multiples ARN dirigidos a ADN. Las ventajas de usar un sistema de procesamiento de ARN incluyen: primero, no es necesario usar promotores multiples; segundo, dado que todos los ARN dirigidos a ADN se procesan a partir de un transcripto precursor, sus concentraciones se normalizan para union a dCas9 similar.
La Csy4 es una proteina de endorribonucleasa (RNasa) pequena derivada de la bacteria Pseudomonas aeruginosa. La Csy4 reconoce especificamente una horquilla de ARN minima de 17 pb y presenta escision de ARN rapida (<1 min) y altamente eficiente (>99,9 %). A diferencia de la mayoria de RNasas, el fragmento de ARN escindido permanece estable y funcionalmente activo. La escision de ARN basada en Csy4 puede adaptarse como un sistema de procesamiento de ARN artificial. En este sistema, las horquillas de ARN de 17 pb se insertan entre multiples fragmentos de ARN que se transcriben como un transcripto precursor a partir de un promotor individual. La coexpresion de Csy4 es eficaz para generar fragmentos de ARN individuales.
Polipeptido dirigido al sitio
Como se menciono anteriormente, un ARN dirigido a ADN de la invention y una variante del polipeptido dirigido al sitio Cas9 de la invencion forman un complejo. El ARN dirigido a ADN proporciona especificidad de direccionamiento al complejo, ya que comprende una secuencia de nucleotidos que es complementaria a una secuencia de un ADN objetivo.
La variante del polipeptido dirigido al sitio Cas9 tiene actividad de endodesoxiorribonucleasa reducida. Por ejemplo, una variante del polipeptido dirigido al sitio Cas9 adecuada para su uso en un metodo de modulation de transcripcion de la presente descripcion presenta menos que alrededor de 20 %, menos que alrededor de 15 %, menos que alrededor de 10 %, menos que alrededor de 5 %, menos que alrededor de 1 %, menos que alrededor de 0,1 %, de la actividad de endodesoxirribonucleasa de un polipeptido de Cas9 de tipo salvaje, por ejemplo, un polipeptido de Cas9 de tipo salvaje que comprende una secuencia de aminoacidos como se representa en la Figura 3 (SEQ ID NO:8). En algunas modalidades, la variante del polipeptido dirigido al sitio Cas9 tiene actividad de endodesoxirribonucleasa sustancialmente no detectable. En algunas modalidades, cuando un polipeptido dirigido al sitio tiene una actividad catalitica reducida (por ejemplo, cuando una proteina Cas9 tiene una mutation D10, G12, G17, E762, H840, N854, N863, H982, H983, A984, D986, y/o A987, por ejemplo, D10A, G12A, G17A, E762A, H840A, N854A, N863A, H982A, H983A, A984A y/o D986A), el polipeptido todavia puede unirse a ADN objetivo de una forma especifica al sitio (dado que todavia esta guiado a una secuencia de ADN objetivo por un ARN dirigido a
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ADN), siempre y cuando retenga la capacidad de interactuar con el ARN dirigido a ADN.
En algunos casos, una variante del polipeptido dirigido al sitio Cas9 adecuada comprende una secuencia de aminoacidos con al menos alrededor de 75 %, al menos alrededor de 80 %, al menos alrededor de 85 %, al menos alrededor de 90 %, al menos alrededor de 95 %, al menos alrededor de 99 % o 100 % de identidad de secuencia de aminoacidos con los aminoacidos 7-166 o 731-1003 de la secuencia de aminoacidos Cas9/Csn1 ilustrada en la Figura 3 (SEQ ID NO:8), o a las partes correspondientes en cualquiera de las secuencias de aminoacidos de las SEQ ID NO: 1-256 y 795-1346.
En algunos casos, la variante del polipeptido dirigido al sitio Cas9 puede escindir la cadena complementaria del ADN objetivo pero tiene capacidad reducida de escindir la cadena no complementaria del ADN objetivo. Por ejemplo, la variante del polipeptido dirigido al sitio Cas9 puede tener una mutacion (sustitucion de aminoacidos) que reduce la funcion del dominio de RuvC (por ejemplo, "dominio 1" de la Figura 3). Como ejemplo no taxativo, en algunos casos, la variante del polipeptido dirigido al sitio Cas9 comprende es una mutacion D10A (aspartato a alanina) de la secuencia de aminoacidos representada en la Figura 3 (o la mutacion correspondiente de cualquiera de las secuencias de aminoacidos establecidas en las SEQ ID NO: 1-256 y 795-1346).
En algunos casos, la variante del polipeptido dirigido al sitio Cas9 puede escindir la cadena no complementaria del ADN objetivo pero tiene capacidad reducida de escindir la cadena no complementaria del ADN objetivo. Por ejemplo, la variante del polipeptido dirigido al sitio Cas9 puede tener una mutacion (sustitucion de aminoacidos) que reduce la funcion del dominio de HNH (motivos del dominio RuvC/HNH/RuvC, "dominio 2" de la Figura 3). Como ejemplo no taxativo, en algunos casos, la variante del polipeptido dirigido al sitio Cas9 comprende es una mutacion H840A (histidina a alanina en la posicion del aminoacido 840 de la SEQ ID NO:8) o la mutacion correspondiente de cualquiera de las secuencias de aminoacidos establecidas en las SEQ ID NO: 1-256 y 795-1346).
En algunos casos, la variante del polipeptido dirigido al sitio Cas9 tiene una capacidad reducida de escindir tanto la cadena complementaria como la no complementaria del ADN objetivo. Como ejemplo no taxativo, en algunos casos, la variante del polipeptido dirigido al sitio Cas9 comprende tanto una mutacion D10A como H840A de la secuencia de aminoacidos representada en la Figura 3 (o las mutaciones correspondientes de cualquiera de las secuencias de aminoacidos establecidas en las SEQ ID NO: 1-256 y 795-1346).
Pueden mutarse otros residuos para lograr el mismo efecto (es decir, inactivar una u otra parte de la nucleasa). Como ejemplos no taxativos, los residuos D10, G12, G17, E762, H840, N854, N863, H982, H983, A984, D986 y/o A987 (o las mutaciones correspondientes de cualquiera de las proteinas establecidas como SEQ ID NO:1-256 y 795-1346) pueden alterarse (es decir, sustituirse) (veanse la Figura 3, Figura 5, Figura 11A y la Tabla 1 por mas informacion respecto a la conservacion de los residuos de aminoacidos de Cas9). Tambien son adecuadas mutaciones que no sean las sustituciones de alanina.
En algunos casos, la variante del polipeptido dirigido al sitio Cas9 es un polipeptido de fusion (un "polipeptido de fusion Cas9 variante"), es decir, un polipeptido de fusion que comprende: i) una variante del polipeptido dirigido al sitio Cas9; y b) un polipeptido heterologo unido de manera covalente (tambien mencionado como un "companero de fusion").
El polipeptido heterologo puede presentar una actividad (por ejemplo, actividad enzimatica) que tambien presentara la variante del polipeptido de fusion Cas9 (por ejemplo, actividad de metiltransferasa, actividad de acetiltransferasa, actividad de cinasa, actividad de ubiquitinacion, etc.). Una secuencia de acido nucleico heterologa puede estar unida a otra secuencia de acido nucleico (por ejemplo, mediante ingenieria genetica) para generar una secuencia de nucleotidos quimerica que codifica un polipeptido quimerico. En algunas modalidades, una variante de polipeptido de fusion Cas9 se genera mediante la variante de fusion de un polipeptido Cas9 con una secuencia heterologa que proporciona localizacion subcelular (es decir, la secuencia heterologa es una secuencia de localizacion subcelular, por ejemplo, una senal de localizacion nuclear (NLS) para dirigirse al nucleo; una senal de localizacion mitocondrial para dirigirse a la mitocondria; una senal de localizacion de cloroplastos para dirigirse a un cloroplasto; una senal de retencion de ER; y similares). En algunas modalidades, la secuencia heterologa puede proporcionar una etiqueta (es decir, la secuencia heterologa es una etiqueta detectable) para facilitar el rastreo y/o la purificacion (por ejemplo, una proteina fluorescente, por ejemplo, proteina fluorescente verde (GFP), YFP, RFP, CFP, mCherry, tdTomato y similares; una etiqueta histidina, por ejemplo, una etiqueta 6XHis; una etiqueta de hemaglutinina (HA); una etiqueta FLAG; una etiqueta Myc; y similares). En algunas modalidades, la secuencia heterologa puede proporcionar un aumento o disminucion de estabilidad (es decir, la secuencia heterologa es un peptido de control de estabilidad, por ejemplo, un degron, que en algunos casos es controlable (por ejemplo, una secuencia degron sensible a la temperatura o controlable por farmacos, ver mas adelante). En algunas modalidades, la secuencia heterologa puede proporcionar un aumento o disminucion de la transcripcion a partir del ADN objetivo (es decir, la secuencia heterologa es una secuencia de modulation de la transcripcion, por ejemplo, un factor/activador de la transcripcion o un fragmento de este, una proteina o fragmento de esta que recluta un factor/activador de la transcripcion, un represor de la transcripcion o un fragmento de este, una proteina o fragmento de esta que recluta un represor de la transcripcion, un regulador de la transcripcion de molecula pequena/que responde a farmacos, etc.). En algunas modalidades, la secuencia heterologa puede proporcionar un dominio de union (es decir, la secuencia heterologa es
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una secuencia de union a protemas, por ejemplo, proporcionarle la capacidad de un polipeptido dCas9 quimerico de unirse a otra proteina de interes, por ejemplo, una proteina modificadora de ADN o histona, una factor de transcripcion o represor de transcripcion, una protema reclutadora, etc.).
Los companeros de fusion adecuados que proporcionan aumento o disminucion de la estabilidad incluyen, de modo no taxativo, secuencias de degron. Los expertos en la tecnica comprenderan facilmente que los degrones son secuencias de aminoacidos que controlan la estabilidad de la proteina de la cual son parte. Por ejemplo, la estabilidad de una proteina que comprende una secuencia de degrones se controla al menos en parte mediante la secuencia de degrones. En algunos casos, un degron adecuado es constitutivo, de manera que el degron ejerce su influencia en la estabilidad de protemas de manera independiente al control experimental (es decir, el degron no es inducible por farmacos, inducible por temperatura, etc.). En algunos casos, el degron le proporciona al polipeptido Cas9 variante estabilidad controlable de manera que el polipeptido Cas9 variante puede estar "encendido" (es decir, estable) o "apagado" (es decir, inestable, degradado) dependiendo de las condiciones deseadas. Por ejemplo, si el degron es un degron sensible a la temperatura, el polipeptido Cas9 variante puede ser funcional (es decir, "encendido", estable) por debajo de una temperatura umbral (por ejemplo, 42 °C, 41 °C, 40 °C, 39 °C, 38 °C, 37 °C, 36 °C, 35 °C, 34 °C, 33 °C, 32 °C, 31 °C, 30 °C, etc.) pero no ser funcional (es decir, "apagado", degradado) por encima de la temperatura umbral. Como ejemplo adicional, si el degron es un degron inducible por farmacos, la presencia o ausencia de farmaco puede hacer cambiar la proteina de un estado "apagado" (es decir, inestable) a un estado "encendido" (es decir, estable) o viceversa. Un ejemplo de degron inducible por farmacos se deriva de la proteina FKBP12. La estabilidad del degron se controla mediante la presencia o ausencia de una molecula pequena que se une al degron.
Los ejemplos de degrones adecuados incluyen, de modo no taxativo, degrones controlados mediante Shield-1, DHFR, auxinas y/o temperatura. Los ejemplos no taxativos de degrones adecuados son conocidos en la tecnica (por ejemplo, Dohmen et al., Science, 1994. 263(5151): p. 1273-1276: Heat-inducible degron: a method for constructing temperature-sensitive mutants; Schoeber et al., Am J Physiol Renal Physiol. 2009 Ene;296(1):F204-11 : Conditional fast expression and function of multimeric TRPV5 channels using Shield-1 ; Chu et al., Bioorg Med Chem Lett. 2008 Nov 15;18(22):5941-4: Recent progress with FKBP-derived destabilizing domains ; Kanemaki, Pflugers Arch. 2012 Dic 28. Frontiers of protein expression control with conditional degrons; Yang et al., Mol Cell. 2012 Nov 30;48(4):487- 8: Titivated for destruction: the methyl degron; Barbour et al., Biosci Rep. 2013 Ene 18;33(1).: Characterization of the bipartite degron that regulates ubiquitin-independent degradation of thymidylate synthase; and Greussing et al., J Vis Exp. 2012 Nov 10;(69): Monitoring of ubiquitin-proteasome activity in living cells using a Degron (dgn)-destabilized green fluorescent protein (GFP)-based reporter protein).
Los ejemplos de secuencias degrones se han caracterizado y evaluado correctamente tanto en celulas como animales. Por lo tanto, fusionar dCas9 a una secuencia degrones produce un polipeptido dCas9 "ajustable" e "inducible". Cualquiera de los companeros de fusion descritos en la presente puede usarse en cualquier combinacion deseable. Como ejemplo no taxativo para ilustrar este punto, una proteina de fusion dCas9 puede comprender una secuencia YFP para detector, una secuencia de degrones para la estabilidad y una secuencia de activador de la transcripcion para aumentar la transcripcion del ADN objetivo. Ademas, la cantidad de companeros de fusion que puede usarse en una proteina de fusion dCas9 es ilimitada. En algunos casos, una proteina de fusion dCas9 comprende uno o mas (por ejemplo, dos o mas, tres o mas, cuatro o mas, o cinco o mas) secuencias heterologas.
Los companeros de fusion incluyen, de modo no taxativo, un polipeptido que proporciona actividad de metiltransferasa, actividad de desmetilasa, actividad de acetiltransferasa, actividad de deacetilasa, actividad de cinasa, actividad de fosfatasa, actividad de ubiquitina ligasa, actividad de deubiquitinacion, actividad de adenilacion, actividad de desadenilacion, actividad de SUMOilacion, actividad de deSUMOilacion, actividad de ribosilacion, actividad de desribosilacion, actividad de miristoilacion o actividad de desamiristoilacion, cualquiera de las cuales puede estar dirigida a la modificacion del ADN directamente (por ejemplo, metilacion de ADN) o para modificar un polipeptido asociado con ADN (por ejemplo, una proteina de union a ADN o histona). Los companeros de fusion adecuados adicionales incluyen, de modo no taxativo, elementos de frontera (por ejemplo, CTCF), protemas y fragmentos de estos que proporcionan reclutamiento periferico (por ejemplo, Lamina A, Lamina B, etc.) y elementos de anclaje a protemas (por ejemplo FKBP/FRB, Pil1/Aby1, etc.).
Los ejemplos de varios companeros de fusion adecuados adicionales (o fragmentos de estos) para una variante del polipeptido dirigido al sitio Cas9 de la invencion incluyen, de modo no taxativo, los enumerados en la Figura 54.
En algunas modalidades, un polipeptido modificador dirigido al sitio puede optimizarse con codones. Este tipo de optimization es conocido en la tecnica e implica la mutation de ADN derivado foraneo para imitar las preferencias de codon de la celula u organismo hospedador pretendidos mientras que se codifica la misma proteina. De esta forma, cambian los codones, pero la proteina codificada permanece sin modificaciones. Por ejemplo, si la celula objetivo pretendida era una celula humana, una dCas9 (o variante de dCas9) optimizada por codones seria un polipeptido modificador dirigido al sitio adecuado. Como otro ejemplo no taxativo, si la celula hospedadora pretendida fuera una celula de raton, entonces una Cas9 (o variante, por ejemplo, una variante enzimaticamente inactiva) de raton optimizada con codones seria un polipeptido dirigido al sitio Cas9. Mientras que no se requiere la optimizacion por codones, esta es aceptable y puede ser preferible en ciertos casos.
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Celulas hospedadoras
Se describe en el presente documento un metodo para modular la transcripcion que puede emplearse para inducir modulacion transcripcional en celulas mitoticas o post-mitoticas in vivo y/o ex vivo y/o in vitro. Dado que el ARN dirigido a ADN proporciona especificidad mediante la hibridacion a un ADN objetivo, una celula mitotica y/o post- mitotica puede ser cualquiera de variedad celulas hospedadoras, donde las celulas hospedadoras adecuadas incluyen, de modo no taxativo, una celula bacteriana; una celula de arquea; un organismo eucariota unicelular; una celula vegetal; una celula de alga, por ejemplo, Botryococcus braunii, Chlamydomonas reinhardtii, Nannochloropsis gaditana, Chlorella pyrenoidosa, Sargassum patens, C. agardh, y similares; una celula fungica; una celula animal; una celula de un animal invertebrado (por ejemplo, un insecto, un cnidario, un equinodermo, un nematodo, etc.); un parasito eucariota (por ejemplo, un parasito de la malaria, por ejemplo, Plasmodium falciparum; un helminto; etc.); una celula de un animal vertebrado (por ejemplo, pez, anfibio, reptil, ave, mamifero); una celula de mamifero, por ejemplo, una celula de roedor, una celula humana, una celula de primate no humano, etc. Las celulas hospedadoras adecuadas incluyen celulas de origen natural; celulas modificadas geneticamente (por ejemplo, celulas modificadas geneticamente en el laboratorio, por ejemplo, mediante la "mano de un ser humano"); y celulas manipuladas in vitro de cualquier manera. En algunos casos, una celula hospedadora esta aislada.
Cualquier tipo de celula puede ser de interes (por ejemplo, una celula madre, por ejemplo, una celula madre embrionica (ES), una celula madre pluripotente inducida (iPS), en las que celulas germinales humanas no son parte de las composiciones de la invencion, una celula somatica, por ejemplo, un fibroblasto, una celula hematopoyetica, una neurona, una celula muscular, una celula osea, un hepatocito, una celula pancreatica; una celula embrionaria no humana in vitro o in vivo de un embrion no humano en cualquier etapa, por ejemplo, un embrion de pez cebra en la etapa de 1 celula, 2 celulas, 4 celulas, 8 celulas, etc.). Las celulas pueden ser de lineas celulares establecidas o pueden ser celulas primarias, donde "celulas primarias", lineas celulares primarias" y "cultivos primarios" se usan en la presente de manera intercambiable para hacer referencia a celulas y cultivos celulares que se han derivado de un sujeto y se les permitio el cultivo in vitro para una cantidad limitada de pasajes, es decir, divisiones, del cultivo. Por ejemplo, los cultivos primarios incluyen cultivos a los que se realizo un pasaje 0 veces, 1 vez, 2 veces, 4 veces, 5 veces, 10 veces o 15 veces, pero no la cantidad suficiente de veces como para atravesar la etapa de crisis. Las lineas celulares primarias pueden se mantenerse durante menos de 10 pasajes in vitro. Las celulas objetivo, en muchas modalidades, son organismos unicelulares o cultivados.
Si las celulas son celulas primarias, dichas celulas pueden recogerse de un individuo mediante cualquier metodo conveniente. Por ejemplo, los leucocitos pueden cosecharse de manera conveniente mediante aferesis, leucocitaferesis, separacion de gradiente de densidad, etc., mientras que las celulas de tejidos tales como la piel, musculo, medula osea, bazo, higado, pancreas, pulmon, intestino, estomago, etc. se cosechan de forma mas conveniente mediante biopsia. Puede usarse una solucion apropiada para la dispersion o suspension de las celulas cosechadas. Dicha solucion generalmente sera una solucion salina equilibrada, por ejemplo, solucion salina normal, solucion salina amortiguada con fosfato (PBS), solucion salina equilibrada de Hank, etc., complementada de manera conveniente con suero fetal bovino u otros factores de origen natural, junto con un amortiguador aceptable en una concentracion baja, por ejemplo, de 5-25 mM. Los amortiguadores convenientes incluyen HEPES, amortiguadores de fosfato, amortiguadores de lactato, etc. Las celulas pueden usarse de manera inmediata o pueden ser almacenadas, congeladas, durante largos periodos de tiempo, descongeladas y utiles para su reutilizacion. En dichos casos, las celulas se congelaran usualmente en dimetilsulfoxido (DMSO) al 10 %, suero al 50 %, medio amortiguado al 40 % u otra solucion como las usadas en la tecnica para preservar celulas en dichas temperaturas de congelamiento, y se descongelaran de una manera como las usadas comunmente en la tecnica para descongelar celulas cultivadas congeladas.
Introduction de acido nucleico en una celula hospedadora
Un ARN dirigido a ADN, o acido nucleico que comprende una secuencia de nucleotidos que lo codifica, puede introducirse en una celula hospedadora mediante varios metodos conocidos. De manera similar, cuando un metodo implica la introduccion en una celula hospedadora de un acido nucleico que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica una variante del polipeptido dirigido al sitio Cas9, dicho acido nucleico puede introducirse en una celula hospedadora mediante cualquiera de varios metodos conocidos.
Los metodos para introducir un acido nucleico en una celula hospedadora son conocidos en la tecnica, y puede utilizarse cualquier metodo conocido para introducir un acido nucleico (por ejemplo, una construction de expresion) en una celula madre o celula progenitora. Los metodos adecuados incluyen, por ejemplo, infection viral o bacteriofagica, transfection, conjugation, fusion de protoplastos, lipofeccion, electroporation, precipitation de fosfato de calcio, transfeccion mediada por polietilenimina (PEI), transfeccion mediada por DEAE-dextrano, transfeccion mediada por liposomas, tecnologia de canon de particulas, precipitacion de fosfato de calcio, microinyeccion directa, insertion de acido nucleico mediada por nanoparticulas (vease, por ejemplo, Panyam et al., Adv Drug Deliv Rev. 2012 Sep 13. pii: S0169-409X(12)00283-9. doi: 10.1016/j.addr.2012.09.023 ) y similares.
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Acidos nucleicos
La presente description proporciona un acido nucleico aislado que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica un ARN dirigido a ADN de la invention. En algunos casos, un acido nucleico de la presente comprende una secuencia de nucleotidos que codifica una variante del polipeptido dirigido al sitio Cas9.
En algunas modalidades, un metodo de la invencion implica introducir en una celula hospedadora (o una poblacion de celulas hospedadoras) uno o mas acidos nucleicos que comprenden secuencias de nucleotidos que codifican un ARN dirigido a ADN y/o una variante del polipeptido dirigido al sitio Cas9. En algunas modalidades una celula que comprende un ADN objetivo esta in vitro. En algunas modalidades una celula que comprende un ADN objetivo esta in vivo. Los acidos nucleicos adecuados comprenden secuencias de nucleotidos que codifican un ARN dirigido a ADN y/o un polipeptido dirigido al sitio incluyen vectores de expresion, donde un vector de expresion que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica un ARN dirigido a ADN y/o un polipeptido dirigido al sitio es un "vector de expresion recombinante".
En algunas modalidades, el vector de expresion recombinante es una construction viral, por ejemplo, una construction viral adeno-asociada recombinante (vease, por ejemplo, la patente estadounidense n.° 7.078.387), una construccion adenoviral recombinante, una construccion lentiviral recombinante, una construccion retroviral recombinante, etc.
Los vectores de expresion adecuados incluyen, de modo no taxativo, vectores virales (por ejemplo, vectores virales basados en el virus vaccinia; poliovirus; adenovirus (vease, por ejemplo, Li et al., Invest Opthalmol Vis Sci 35:2543 2549, 1994; Borras et al., Gene Ther 6:515 524, 1999; Li y Davidson, PNAS 92:7700 7704, 1995; Sakamoto et al., H Gene Ther 5:1088 1097, 1999; WO 94/12649, WO 93/03769; WO 93/19191; WO 94/28938; WO 95/11984 and WO 95/00655); virus adeno-asociado (vease, por ejemplo, Ali et al., Hum Gene Ther 9:81 86, 1998, Flannery et al., PNAS 94:6916 6921, 1997; Bennett et al., Invest Opthalmol Vis Sci 38:2857 2863, 1997; Jomary et al., Gene Ther 4:683 690, 1997, Rolling et al., Hum Gene Ther 10:641 648, 1999; Ali et al., Hum Mol Genet 5:591 594, 1996; Srivastava en WO 93/09239, Samulski et al., J. Vir. (1989) 63:3822-3828; Mendelson et al., Virol. (1988) 166:154-165; y Flotte et al., PNAS (1993) 90:10613-10617); SV40; virus del herpes simple; virus de inmunodeficiencia humana (vease, por ejemplo, Miyoshi et al., PNAS 94:10319 23, 1997; Takahashi et al., J Virol 73:7812 7816, 1999); un vector retroviral (por ejemplo, virus de leucemia murina, virus de la necrosis del bazo y vectores derivados de retrovirus tal como el virus del sarcoma de Rous, virus del sarcoma de Harvey, virus de la leucosis aviar, un lentivirus, virus de inmunodeficiencia humana, virus del sarcoma mieloproliferativo y virus del tumor mamario); y similares.
Los expertos en la tecnica conocen numerosos vectores de expresion adecuados y muchos estan disponibles comercialmente. Se proporcionan los siguientes vectores a modo de ejemplo; para celulas hospedadoras eucariotas: pXT1, pSG5 (Stratagene), pSVK3, pBPV, pMSG, and pSVLSV40 (Pharmacia). Sin embargo, puede utilizarse cualquier otro vector siempre que sea compatible con la celula hospedadora.
Dependiendo del sistema de hospedador/vector utilizado, puede utilizarse cualquier cantidad de elementos de control de la transcription y traduction adecuados, inclusive promotores constitutivos e inducibles, elementos mejoradores de la transcripcion, terminadores de la transcripcion, etc., en el vector de expresion (vease, por ejemplo, Bitter et al. (1987) Methods in Enzymology, 153:516-544).
En algunas modalidades, una secuencia de nucleotidos que codifica un ARN dirigido a ADN y/o una variante del polipeptido dirigido al sitio Cas9 esta unida de manera operativa a un elemento de control, por ejemplo, un elemento de control transcripcional, tal como un promotor. El elemento de control transcripcional puede ser funcional ya sea en una celula eucariota, por ejemplo, una celula de mamifero; o una celula procariota (por ejemplo, una celula bacteriana o de arquea). En algunas modalidades, una secuencia de nucleotidos que codifica un ARN dirigido a ADN y/o una variante del polipeptido dirigido al sitio Cas9 esta unido de manera operativa a multiples elementos de control que permiten la expresion de la secuencia de nucleotidos que codifica un ARN dirigido a ADN y/o una variante del polipeptido dirigido al sitio Cas9 tanto en celulas procariotas como eucariotas.
Un promotor puede ser un promotor constitutivamente activo (es decir, un promotor que esta de manera constitutiva en un estado activo/"ENCENDIDO"), puede ser un promotor inducible (es decir, un promotor cuyo estado, activo/"ENCENDIDO" o inactivo/"APAGADO", es controlado mediante un estimulo externo, por ejemplo, la presencia de una temperatura, compuesto o proteina en particular), puede ser un promotor restringido espacialmente (es decir, elemento de control transcripcional, potenciador, etc.) (por ejemplo, potenciador especifico de tejido, potenciador especifico del tipo celular, etc.), y puede ser un promotor restringido temporalmente (es decir, el promotor esta en el estado "ENCENDIDO" o el estado "APAGADO" durante etapas especificas del desarrollo embrionario o durante etapas especificas de un proceso biologico, por ejemplo, ciclo de foliculo capilar en ratones).
Los promotores adecuados puede derivar de virus y pueden, por lo tanto, ser mencionados como promotores virales, o pueden derivar de cualquier organismo, incluidos organismos procariotas o eucariotas. Los promotores adecuados pueden usarse para impulsar la expresion mediante cualquier ARN polimerasa (por ejemplo, pol I, pol II, pol III). Los
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ejemplos de promotores incluyen, de modo no taxativo, el promotor temprano SV40, el promotor de repeticion terminal larga (LTR) del virus de tumor mamario en ratones; el promotor tardio principal del adenovirus (Ad MLP); un promotor del virus del herpes simple (VHS), un promotor del citomegalovuris (CMV) tal como la region del promotor temprano inmediato de CMV (CMVIE), un promotor del virus del sarcoma de rous (RSV), un promotor nuclear pequeno U6 humano (U6) (Miyagishi et al., Nature Biotechnology 20, 497 - 500 (2002)), un promotor de U6 mejorado (por ejemplo, Xia et al., Nucleic Acids Res. 2003 Sep 1 ;31 (17)), un promotor de Hi humano (H1), y similares.
Los ejemplos de promotores inducibles incluyen, de modo no taxativo, promotor de la ARN polimerasa T7, promotor de la ARN polimerasa T3, promotor regulado por isopropil-beta-D-tiogalactopiranosido (IPTG), promotor inducido por lactosa, promotor del choque termico, promotor regulado por tetraciclina (por ejemplo, Tet-ON, Tet-OFF, etc.), promotor regulado por esteroides, promotor regulado por metales, promotor regulado por el receptor de estrogenos, etc. Los promotores inducibles pueden, por lo tanto, regularse mediante moleculas que incluyen, de modo no taxativo, doxociclina; ARN polimerasa, por ejemplo, ARN polimerasa T7; un receptor de estrogeno; una fusion del receptor de estrogeno; etc.
En algunas modalidades, el promotor es un promotor restringido espacialmente (es decir, promotor especifico del tipo de celula, promotor especifico de tejido, etc.) de manera que en un organismo multicelular el promotor este activo (es decir, "ENCENDlDO") en un subconjunto de celulas especificas. Puede hacerse referencia a los promotores restringidos espacialmente como potenciadores, elementos de control transcripcional, secuencias de control, etc. Cualquier promotor restringido espacialmente conveniente puede usarse y la eleccion del promotor adecuado (por ejemplo, un promotor especifico del cerebro, un promotor que impulsa la expresion en un subconjunto de neuronas, un promotor que impulsa la expresion en la linea germinal, un promotor que impulsa la expresion en los pulmones, un promotor que impulsa la expresion en los musculos, un promotor que impulsa la expresion en celulas del islote del pancreas, etc.) dependera del organismo. Por ejemplo, se conocen varios promotores restringidos espacialmente para plantas, moscas, gusanos, mamiferos, ratones, etc. De esta manera, un promotor restringido espacialmente puede usarse para regular la expresion de un acido nucleico que codifica un polipeptido dirigido al sitio de la invencion en una amplia variedad de tejidos y tipos de celulas diferentes, dependiendo del organismo. Algunos promotores restringidos espacialmente tambien estan temporalmente restringidos de manera que el promotor este en el estado "ENCENDlDO" o el estado "APAGADO" durante etapas especificas del desarrollo embrionario o durante etapas especificas de un proceso biologico (por ejemplo, ciclo folicular capilar en ratones).
Con el proposito de ilustrar, los ejemplos de promotores restringidos espacialmente incluyen, de modo no taxativo, promotores especificos de neuronas, promotores especificos de adipocitos, promotores especificos de cardiomiocitos, promotores especificos de musculo liso, promotores especificos de fotorreceptores, etc. Los promotores restringidos espacialmente especificos de neuronas incluyen, de modo no taxativo, un promotor de enolasa especifico de neuronas (NSE) (veanse, por ejemplo, EMBL HSENO2, X51956); un promotor aminoacido aromatico descarboxilasa (AADC); un promotor de neurofilamentos (vease, por ejemplo, GenBank HUMNFL, L04147); un promotor de sinapsina (vease, por ejemplo, GenBank HUMSYNlB, M55301); un promotor de thy-1 (vease, por ejemplo, Chen et al. (1987) Cell 51:7-19; y Llewellyn, et al. (2010) Nat. Med. 16(10): 1161-1166); un promotor receptor de serotonina (vease, por ejemplo, GenBank S62283); un promotor de tirosina hidroxilasa (TH) (vease, por ejemplo, Oh et al. (2009) Gene Ther 16:437; Sasaoka et al. (1992) Mol. Brain Res. 16:274; Boundy et al. (1998) J. Neurosci. 18:9989; y Kaneda et al. (1991) Neuron 6:583-594); un promotor de GnRH (vease, por ejemplo, Radovick et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:3402-3406); un promotor L7 (vease, por ejemplo, Oberdick et al. (1990) Science 248:223-226); un promotor de DNMT (vease, por ejemplo, Bartge et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:3648-3652); un promotor de encefalina (vease, por ejemplo, Comb et al. (1988) EMBO J. 17:37933805); un promotor de la proteina basica de mielina (pBm); un promotor de la proteina cinasa ll-alfa dependiente de Ca2+-calmodulina (CamKIla) (vease, por ejemplo, Mayford et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 93:13250; y Casanova et al. (2001) Genesis 31:37); un promotor del factor de crecimiento p derivado de plaquetas/potenciador del CMV (vease, por ejemplo, Liu et al. (2004) Gene Therapy 11:52-60) y similares.
Los promotores restringidos espacialmente especificos de adipocitos incluyen, de modo no taxativo, promotor/potenciador del gen aP2, por ejemplo, una region de -5,4 kb a +21 pb del gen aP2 humano (vease, por ejemplo, Tozzo et al. (1997) Endocrinol. 138:1604; Ross et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:9590; y Pavjani et al. (2005) Nat. Med. 11:797); un promotor del transportador de glucosa 4 (GLUT4) (vease, por ejemplo, Knight et el. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:14725); un promotor de acidos grasos translocasa (FAT/CD36) (vease, por ejemplo, Kuriki et al. (2002) Biol. Pharm. Bull. 25:1476; y Sato et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:15703); un promotor de estearoilo-CoA desaturasa-1 (SCD1) (Tabor et al. (1999) J. Biol. Chem. 274:20603); un promotor de leptina (vease, por ejemplo, Mason et al. (1998) Endocrinol. 139:1013; y Chen et al. (1999) Biochem. Biophys. Res. Comm. 262:187); un promotor de adiponectina (vease, por ejemplo, Kita et al. (2005) Biochem. Biophys. Res. Comm. 331:484; y Chakrabarti (2010) Endocrinol. 151:2408); un promotor de adipsina (vease, por ejemplo, Platt et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 86:7490); un promotor de resistina (vease, por ejemplo, Seo et al. (2003) Molec. Endocrinol. 17:1522); y similares.
Los promotores restringidos espacialmente especificos de cardiomiocitos incluyen, de modo no taxativo, secuencias de control derivadas de los siguientes genes: cadena ligera de miosina 2, cadena pesada de miosina a, AE3,
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troponina cardiaca C, actina cardiaca y similares. Franz et al. (1997) Cardiovasc. Res. 35:560-566; Robbins et al. (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci. 752:492-505; Linn et al. (1995) Circ. Res. 76:584-591; Parmacek et al. (1994) Mol. Cell. Biol. 14:1870-1885; Hunter et al. (1993) Hypertension 22:608-617; y Sartorelli et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 89:4047-4051.
Los promotores restringidos espacialmente espedficos de musculo liso incluyen, de modo no taxativo, un promotor de SM22a (vease, por ejemplo, Akyurek et al. (2000) Mol. Med. 6:983; y la patente estadounidense 7.169.874); un promotor de smoothelina (vease, por ejemplo, WO 2001/018048); un promotor de actina de musculo liso a; y similares. Por ejemplo, una region de 0,4 kb del promotor SM22a, dentro de la cual hay dos elementos de CArG, que se demostro que mediaba la expresion especifica de celulas de musculo liso vascular (vease, por ejemplo, Kim, et al. (1997) Mol. Cell. Biol. 17, 2266-2278; Li, et al., (1996) J. Cell Biol. 132, 849-859; y Moessler, et al. (1996) Development 122, 2415-2425).
Los promotores restringidos espacialmente especificos de fotorreceptores incluyen, de modo no taxativo, un promotor de rodopsina; un promotor de rodopsina cinasa (Young et al. (2003) Ophthalmol. Vis. Sci. 44:4076); un promotor del gen beta de la fosfodiesterasa (Nicoud et al. (2007) J. Gene Med. 9:1015); un promotor del gen de la retinitis pigmentaria (Nicoud et al. (2007) supra); un potenciador del gen de la proteina de union al retinoide interfotorreceptor (IRBp) (Nicoud et al. (2007) supra); un promotor del gen IRBP (Yokoyama et al. (1992) Exp Eye Res. 55:225); y similares.
BIBLIOTECAS
La presente descripcion proporciona una biblioteca en ARN dirigido a ADN. La presente description proporciona una biblioteca de acidos nucleicos que comprenden nucleotidos que codifican ARN dirigido a aDn. Una biblioteca de acidos nucleicos de la descripcion que comprende nucleotidos que codifican ARN dirigido a ADN puede comprender una biblioteca de vectores de expresion recombinantes que comprenden nucleotidos que codifican los ARN dirigidos a ADN.
Una biblioteca de la invention puede comprender de alrededor de 10 miembros individuales a alrededor de 1012 miembros individuales; por ejemplo, una biblioteca de la invencion puede comprender de alrededor de 10 miembros individuales a alrededor de 102 miembros individuales, de alrededor de 102 miembros individuales a alrededor de 103 miembros individuales, de alrededor de 103 miembros individuales a alrededor de 105 miembros individuales, de alrededor de 105 miembros individuales a alrededor de 107 miembros individuales, de alrededor de 107 miembros individuales a alrededor de 109 miembros individuales, de alrededor de 109 miembros individuales a alrededor de 1012 miembros individuales.
Un "miembro individual" de una biblioteca de la invencion difiere de otros miembros de la biblioteca en la secuencia de nucleotidos del segmento dirigido a ADN del ARN dirigido a ADN. Por lo tanto, por ejemplo, cada miembro individual de una biblioteca de la invencion puede comprender la misma secuencia de nucleotidos del segmento de union a proteinas, o sustancialmente la misma, que la de todos los otros miembros de la biblioteca; y puede comprender la misma secuencia de nucleotidos, o sustancialmente la misma, del segmento de termination transcripcional que todo los otros miembros de la biblioteca; pero difiere de otros miembros de la biblioteca en la secuencia de nucleotidos del segmento dirigido a ADN del ARN dirigido a ADN. De esta forma, la biblioteca puede comprender miembros que se unen a diferentes acidos nucleicos objetivo.
UTILIDAD
Un metodo para modular la transcription como se presenta en la presente descripcion se puede utilizar en variedad aplicaciones, las cuales tambien se proporcionan. Las aplicaciones incluyen aplicaciones para investigation; aplicaciones para diagnostico; aplicaciones industriales y aplicaciones para tratamiento.
Las aplicaciones para investigacion incluyen, por ejemplo, determinar el efecto de la reduction o el aumento de la transcripcion de un acido nucleico objetivo en, por ejemplo, el desarrollo, metabolismo, expresion de un gen posterior y similares.
El analisis genomico de alto rendimiento puede llevarse a cabo utilizando un metodo de modulation de la transcripcion de la invencion, en el cual unicamente el segmento dirigido a ADN del ARN dirigido a ADN precisa variar, mientras que el segmento de union a proteinas y el segmento de terminacion de la transcripcion puede (en algunos casos) mantenerse constante. Una biblioteca (por ejemplo, una biblioteca de la invencion) que comprende una pluralidad de acidos nucleicos utilizados en el analisis genomico incluiria: un promotor unido de manera operativa a una secuencia de nucleotidos codificadora de ARN dirigido a ADN, donde cada acido nucleico incluiria un segmento diferente dirigido a ADN, un segmento comun de union a proteinas y un segmento comun de terminacion de la transcripcion. Un Chip contendria mas de 5 x 104 ARN dirigidos a ADN unicos. Las aplicaciones incluirian fenotipado a gran escala, mapeo gen-funcion y analisis metagenomico.
Los metodos descritos en la presente pueden utilizarse en el campo de la ingenieria metabolica. Dado que los
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niveles de transcripcion pueden ser controlados de manera eficiente y predecible mediante el diseno de un ARN dirigido a ADN apropiado, segun se describe en la presente, la actividad de las vias metabolicas (por ejemplo, v^as biosinteticas) pueden afinarse y controlarse de manera precisa controlando el nivel de enzimas espedficas (por ejemplo, mediante aumento o disminucion de la transcripcion) dentro de una via metabolica de interes. Las v^as metabolicas de interes incluyen aquellas utilizadas para la produccion de farmacos y/o quimicos (qmmicos finos, combustible, antibioticos, toxinas, agonistas, antagonistas, etc.).
Las vias biosinteticas de interes incluyen, de modo no taxativo, (1) la via de mevalonato (por ejemplo, la via de HMG-CoA reductasa) (convierte acetil-CoA en pirofosfato de dimetilalilo (DMAPP) y pirofosfato de isopentenilo (IPP), los cuales se utilizan para la biosintesis de una gran cantidad de biomoleculas, inclusive terpenoides/isoprenoides), (2) la via de no mevalonato (es decir, "la via 2-C-metil-D-eritritol 4-fosfato/1-desoxi-D-xilulosa 5-fosfato", "via MEP/DOXP" o "via DXP") (tambien produce DMAPP e IPP, convirtiendo, en cambio, piruvato y gliceraldehido 3- fosfato en DMAPP e IPP mediante una via alternativa a la via de mevalonato), (3) la via de sintesis de policetido (produce varios policetidos mediante variedad enzimas de policetido sintasa. Los policetidos incluyen moleculas pequenas de origen natural utilizadas para la quimioterapia (por ejemplo, tetraciclina y macrolidos) y los policetidos importantes en la industria incluyen rapamicina (inmunosupresor), eritromicina (antibiotico), lovastatina (farmaco anticolesterol) y epotilona B (un farmaco anticancer)), (4) vias de sintesis de acidos grasos, (5) la via de sintesis de DAHP (3-desoxi-D-arabino-heptulosonato 7-fosfato), (6) vias que producen potenciales biocombustibles (tales como alcoholes de cadena corta y alcano, esteres metilicos de acidos grasos y alcoholes grasos, isoprenoides, etc.), etc.
Redes y cascadas
Los metodos descritos en la presente pueden utilizarse para disenar redes integradas (es decir, una cascada o cascadas) de control. Por ejemplo, un ARN dirigido a ADN / variante del polipeptido dirigido al sitio Cas9 de la invention puede utilizarse para controlar (es decir, modular, por ejemplo, aumentar, disminuir) la expresion de otro ARN dirigido por ADN u otra variante del polipeptido dirigido al sitio Cas9 de la invencion. Por ejemplo, un primer ARN dirigido a ADN puede disenarse para dirigir la modulation de la transcripcion de un segundo polipeptido quimerico dCas9 con una funcion distinta de la primera variante del polipeptido dirigido al sitio Cas9 (por ejemplo, actividad de metiltransferasa, actividad de desmetilasa, actividad de acetiltransferasa, actividad de deacetilasa, etc.). Adicionalmente, dado que distintas proteinas dCas9 (por ejemplo, derivadas de especies diferentes) pueden requerir un asa de Cas9 distinta (es decir, segmento de union a proteinas), el segundo polipeptido quimerico dCas9 puede derivarse de una especie diferente que el primer polipeptido dCas9 mencionado anteriormente. Por lo tanto, en algunos casos, el segundo polipeptido quimerico dCas9 puede seleccionarse de forma tal que pueda no interactuar con el primer ARN dirigido a aDn. En otros casos, el segundo polipeptido quimerico dCas9 puede seleccionarse de forma tal que interactue con el primer ARN dirigido a ADN. En algunos de estos casos, las actividades de las dos (o mas) proteinas dCas9 pueden competir (por ejemplo, si los polipeptidos tienen actividades opuestas) o pueden sinergizar (por ejemplo, si los polipeptidos tienen actividades sinergicas o similares). Del mismo modo, tal como se menciono anteriormente, cualquiera de los complejos (es decir, ARN dirigido a ADN / polipeptido dCas9) de la red puede disenarse para controlar otros ARN dirigidos a ADN o polipeptidos dCas9. Dado que un ARN dirigido a ADN de la invencion y una variante del polipeptido dirigido al sitio Cas9 de la invencion puede dirigirse a cualquier secuencia deseada de ADN, los metodos descritos en la presente pueden usarse para controlar y regular la expresion de cualquier objetivo deseado. Las redes integradas (es decir, cascadas de interacciones) que pueden disenarse se encuentran en un intervalo de muy simples a muy complejas y no tienen limites.
En una red donde dos o mas componentes (por ejemplo, ARN dirigidos a ADN, ARN activadores, ARN identificadores o polipeptidos dCas9) se encuentran cada uno bajo el control regulador de otro complejo de ARN dirigido a ADN / polipeptido dCas9, el nivel de expresion de un componente de la red puede afectar el nivel de expresion (por ejemplo, puede aumentar o disminuir la expresion) de otro componente de la red. Mediante este mecanismo, la expresion de un componente puede afectar la expresion de un componente distinto en la misma red, y la red puede incluir una mezcla de componentes que aumente la expresion de otros componentes, asi como componentes que disminuyan la expresion de otros componentes. Como comprendera facilmente un experto en la tecnica, los ejemplos que anteceden, mediante los que el nivel de expresion de un componente puede afectar el nivel de expresion de uno o mas componentes diferentes, se proporcionan con fines ilustrativos y no son taxativos. Una capa adicional de complejidad puede introducirse, de manera opcional, en una red donde uno o mas componentes se modifican (como se describio anteriormente) para ser manipulable (es decir, bajo control experimental, por ejemplo, control de temperatura; control de farmacos, es decir, control inducible por farmacos; control ligero; etc.).
Como un ejemplo no taxativo, un primer ARN dirigido a ADN puede unirse al promotor de un segundo ARN dirigido a ADN, el cual controla la expresion de un gen objetivo terapeutico/metabolico. En dicho caso, la expresion condicional del primer ARN dirigido a ADN activa indirectamente el gen terapeutico/metabolico. Las cascadas de ARN de este tipo son utiles, por ejemplo, para convertir de manera facil un represor en un activador, y puede utilizarse para controlar la logica o la dinamica de expresion de un gen objetivo.
Un metodo de modulacion de la transcripcion de la invencion tambien puede usarse para el descubrimiento de farmacos y la validation de objetivos.
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KITS
La presente descripcion presenta un kit para llevar a cabo metodos descritos en el presente documento. Un kit comprende: a) un ARN dirigido a ADN de la presente descripcion, o un acido nucleico que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica el ARN dirigido a ADN, donde el ARN dirigido a ADN comprende: i)) un primer segmento que comprende una secuencia de nucleotidos que es complementaria a una secuencia objetivo en el ADN objetivo; ii)) un segundo segmento que interactua con un polipeptido dirigido al sitio; y iii)) un terminador transcripcional; y b) un amortiguador. En algunos casos, el acido nucleico que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica el ARN dirigido a ADN comprende ademas una secuencia de nucleotidos que codifica una variante del polipeptido dirigido al sitio Cas9 que presenta actividad de endodesoxirribonucleasa reducida con relacion a Cas9 de tipo salvaje.
En algunos casos, un kit comprende ademas una variante del polipeptido dirigido al sitio Cas9 que presenta actividad endodesoxirribonucleasa reducida con relacion a Cas9 de tipo salvaje.
En algunos casos, un kit comprende ademas un acido nucleico que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica una variante del polipeptido dirigido al sitio Cas9 que presenta actividad endodesoxirribonucleasa reducida con relacion a Cas9 de tipo salvaje.
Un kit puede incluir adicionalmente uno o mas reactivos adicionales, donde dichos reactivos adicionales pueden seleccionarse de: un amortiguador; un amortiguador de lavado; un reactivo de control; un vector de expresion o polinucleotido de ARN de control; un reactivo para la produccion in vitro de la variante del polipeptido dirigido al sitio Cas9 a partir de ADN; y similares. En algunos casos, la variante del polipeptido dirigido al sitio Cas9 incluida en un kit de la invencion es una variante del polipeptido dirigido al sitio Cas9 de fusion, como se describio anteriormente.
Los componentes de un kit pueden separarse en recipientes; o pueden combinarse en un solo recipiente.
Ademas de los componentes mencionados anteriormente, un kit puede incluir adicionalmente instrucciones para usar los componentes del kit para practicar los metodos de la presente. Las instrucciones para practicar los metodos de la presente estan generalmente registradas en un medio de registro adecuado. Por ejemplo, las instrucciones pueden estar impresas en un sustrato, tal como papel o plastico, etc. Como tales, las instrucciones pueden estar presentes en los kits como un prospecto, en el etiquetado del recipiente del kit o componentes del mismo (es decir, asociado al embalaje o subembalaje), etc. En otras modalidades, las instrucciones estan presentes como un archivo de almacenamiento de datos electronico, presente en un medio de almacenamiento adecuado leido por computadora, por ejemplo, CD-ROM, disquete, memoria flash, etc. En aun otras modalidades, las instrucciones reales no estan presentes en el kit, pero se proporcionan medios para obtener las instrucciones desde una fuente remota, por ejemplo, por medio de Internet. Un ejemplo de esta modalidad es un kit que incluye una direccion web donde se pueden ver las instrucciones y/o desde donde pueden descargarse. Como con las instrucciones, este medio para obtener las instrucciones se registra en un sustrato adecuado.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos se proponen para proporcionarles a los expertos en la tecnica una divulgacion y descripcion completa sobre como realizar y usar la presente invencion y no pretenden limitar el alcance de lo que los inventores consideran como su invencion, ni pretenden describir que los experimentos a continuacion son todos o los unicos experimentos que se llevaron a cabo. Se han realizado esfuerzos para asegurar la exactitud con respecto a los numeros usados (por ejemplo, cantidades, temperatura, etc.), pero se deben tener en cuenta algunos errores y desviaciones experimentales. A menos que se indique lo contrario, las partes son partes en peso, el peso molecular es peso molecular promedio, la temperatura se expresa en grados Celsius y la presion es la atmosferica o cercana a esta. Se pueden utilizar abreviaturas estandar, por ejemplo, pb, pares de bases; kb, kilobases; pl, picolitros; s o seg, segundos; min, minutos; h o hr, horas; aa, aminoacidos; kb, kilobases; pb, pares de bases; nt, nucleotidos; i.m., intramuscular o intramuscularmente; i.p., intraperitoneal o intraperitonealmente; s.c, subcutanea o subcutaneamente; y similares.
Ejemplo 1: Uso de Cas9 para generar modificaciones en ADN objetivo.
MATERIALES Y METODOS
Cepas bacterianas y condiciones de cultivo
Streptococcus pyogenes, cultivado en medio THY (caldo Todd Hewitt (THB, por sus siglas en ingles, Bacto, Becton Dickinson) complementado con extracto de levadura al 0,2 % (Oxoid)) o en TSA (agar tripticasa de soja, BBL, Becton, Dickinson), complementado con sangre de oveja al 3 %, se incubo a 37 °C en una atmosfera complementada con CO2 al 5 % sin agitar. Escherichia coli, cultivado en medio Luria-Bertani (LB) y agar, se incubo a 37 °C con agitacion. Cuando se requirio, se agregaron antibioticos adecuados al medio en las siguientes
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concentraciones finales: ampicilina, 100 |jg/ml para E. coli; cloranfenicol, 33 |jg/ml para E. coli; kanamicina, 25 jg/ml para E. coli y 300 jg/ml para S. pyogenes. El crecimiento celular bacteriano se monitoreo de manera periodica mediante la medicion de la densidad optica de 620 nm de alicuotas de cultivo utilizando un lector de microplacas (SLT Spectra Reader).
Transformacion de celulas bacterianas
La transformacion de ADN de plasmido en celulas de E. coli se realizo de acuerdo con un protocolo estandar se shock termico. La transformacion de S. pyogenes se llevo a cabo segun se describio en algunas modificaciones. El ensayo de transformacion realizado para monitorear la actividad CRISPR/Cas in vivo en mantenimiento de plasmidos se llevo a cabo esencialmente segun lo descrito anteriormente. En sintesis, las celulas electrocompetentes de S. pyogenes se ecualizaron a la misma densidad celular y se electroporaron con 500 ng de ADN de plasmido. Cada transformacion se coloco en placas dos a tres veces y el experimento se llevo a cabo tres veces de manera independiente con diferentes lotes de celulas competentes para analisis estadistico. Las eficiencias de transformacion se calcularon como UFC (unidades formadoras de colonias) por jg de ADN. Las transformaciones de control se llevaron a cabo con agua esteril y vector de estructura pEC85.
Manipulaciones de ADN
Las manipulaciones de ADN que incluyen preparacion, amplificacion, digestion, ligacion, purificacion, electroforesis en gel de agarosa de ADN, se llevaron a cabo de acuerdo con tecnicas estandar con modificaciones menores. Los plasmidos protoespaciadores para la escision in vitro y los ensayos de transformacion de S. pyogenes se construyeron segun se describio anteriormente (4). Los plasmidos protoespaciadores adicionales basados en pUC19 para los ensayos de escision in vitro se generaron ligando oligonucleotidos hibridados entre sitios EcoRI y BamHI en pUC19. El plasmido que contenia el gen GFP se describio anteriormente (41). Los kits (Qiagen) se utilizaron para la purificacion de ADN y la preparacion de plasmidos. La mutagenesis de plasmidos se llevo a cabo usando el kit QuikChange® II XL kit (Stratagene) o el kit de mutagenesis dirigida al sitio QuickChange (Agilent). Los oligonucleotidos y ARN fueron proporcionados por VBC-Biotech Services, Sigma-Aldrich e Integrated DNA Technologies.
Oligonucleotidos para plantillas de transcripcion in vitro
Plantillas para tracrRNA de CRISPR Tipo II transcrito in vitro y crRNA de S. pyogenes (para tracrRNA - PCR en cr. ADN SF370; para crRNA - hibridacion de dos oligonucleotidos)
T7-tracrRNA (75 nt)
OLEC1521 (F 5' tracrRNA): SEQ ID NO:340 OLEC1522 (R 3' tracrRNA): SEQ ID NO:341
T7-crRNA (plantilla)
OLEC2176 (F crRNA-sp1): SEQ ID NO:342 OLEC2178 (R crRNA-sp1): SEQ ID NO:343 OLEC2177 (F crRNA-sp2): SEQ ID NO:344 OLEC2179 (R crRNA-sp2): SEQ ID NO:345
Plantillas para tracrRNA de N. meningitidis transcrito in vitro y crRNA-sp2 modificado geneticamente (para tracrRNA - PCR en cr. ADN Z2491; para crRNA - hibridacion de dos oligonucleotidos)
T7-tracrRNA
OLEC2205 (F previsto 5'): SEQ ID NO:346 OLEC2206 (R previsto 3'): SEQ ID NO:347
T7-crRNA (plantilla)
OLEC2209 (F sp2(speM) + N.m. repeticion): SEQ ID NO:348 OLEC2214 (r sp2(speM) + N.m. repeticion): SEQ ID NO:349
Plantillas para tracrRNA de L. innocua transcrito in vitro y crRNA-sp2 modificado geneticamente (para tracrRNA - PCR en cr. ADN Clipl 1262; para crRNA - hibridacion de dos oligonucleotidos)
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T7-tracrRNA
OLEC2203 (F previsto 5'): SEQ ID NO:350 OLEC2204 (R previsto 3'): SEQ ID NO:351
T7-crRNA (plantilla)
OLEC2207 (F sp2(speM) + L.in. repeticion): SEQ ID NO:352 OLEC2212 (r sp2(speM) + L.in. repeticion): SEQ ID NO:353
Oligonucleotidos para la construccion de plasmidos con protoespaciador para estudios in vitro e in vivo
Plasmidos para speM (espaciador 2 (CRISPR Tipo II-A, SF370; profago protoespaciador 08232.3 de MGAS8232) analisis in vitro y en S. pyogenes (plantilla: cr. ADN MGAS8232 o plasmidos que contengan fragmentos de speM)
pEC287
OLEC1555 (F speM): SEQ ID NO:354 OLEC1556 (R speM): SEQ ID NO:355
pEC488
OLEC2145 (F speM): SEQ ID NO:356 OLEC2146 (R speM): SEQ ID NO:357
pEC370
OLEC1593 (F pEC488 protoespaciador 2 A22G): SEQ ID NO:358 OLEC1594 (r pEC488 protoespaciador 2 A22G): SEQ ID NO:359
pEC371
OLEC1595 (F pEC488 protoespaciador 2 T10C): SEQ ID NO:360 OLEC1596 (R pEC488 protoespaciador 2 T10C): SEQ ID NO:361
pEC372
OLEC2185 (F pEC488 protoespaciador 2 T7A): SEQ ID NO:362 OLEC2186 (r pEC488 protoespaciador 2 T7A): SEQ ID NO:363
pEC373
OLEC2187 (F pEC488 protoespaciador 2 A6T): SEQ ID NO:364 OLEC2188 (r pEC488 protoespaciador 2 A6T): SEQ ID NO:365
pEC374
OLEC2235 (F pEC488 protoespaciador 2 A5T): SEQ ID NO:366 OLEC2236 (r pEC488 protoespaciador 2 A5T): SEQ ID NO:367
pEC375
OLEC2233 (F pEC488 protoespaciador 2 A4T): SEQ ID NO:368 OLEC2234 (r pEC488 protoespaciador 2 A4T): SEQ ID NO:369
pEC376
OLEC2189 (F pEC488 protoespaciador 2 A3T): SEQ ID NO:370 OLEC2190 (R pEC488 protoespaciador 2 A3T): SEQ ID NO:371
pEC377
OLEC2191 (F pEC488 protoespaciador 2 PAM G1C): SEQ ID NO:372 OLEC2192 (R pEC488 protoespaciador 2 PAM G1C): SEQ ID NO:373
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pEC378
OLEC2237 (F pEC488 protoespaciador 2 PAM GG1,2CC): SEQ ID NO:374 OLEC2238 (R pEC488 protoespaciador 2 PAM GG1,2CC): SEQ ID NO:375
Plasmidos para SPy_0700 (espaciador 1 (CRISPR Tipo II-A, SF370; profago protoespaciador 0370.1 de SF370) analisis in vitro y en S. pyogenes (plantilla: cr. ADN SF370 o plasmidos que contengan fragmentos de SPy_0700)
pEC489
OLEC2106 (F Spy_0700): SEQ ID NO:376 OLEC2107 (R Spy_0700): SEQ ID NO:377
pEC573
OLEC2941 (F PAM TG1,2GG): SEQ ID NO:378 OLEC2942 (R PAM TG1,2GG): SEQ ID NO:379
Oligonucleotidos para la verificacion de construcciones de plasmidos y sitios de corte mediante analisis de secuenciacion
ColE1 (pEC85)
oliRN228 (secuenciacion R): SEQ ID NO:380 speM (pEC287)
OLEC1557 (secuenciacion F): SEQ ID NO:381 OLEC1556 (secuenciacion R): SEQ ID NO:382
repDEG-pAMbetal (pEC85)
OLEC787 (secuenciacion F): SEQ ID NO:383
Oligonucleotidos para ensayos de escision in vitro
CrRNA
crRNA espaciador 1 (1-42): SEQ ID NO:384 crRNA espaciador 2 (1-42): SEQ ID NO:385 crRNA espaciador 4 (1-42): SEQ ID NO:386 crRNA espaciador 2 (1-36): SEQ ID NO:387 crRNA espaciador 2 (1-32): SEQ ID NO:388 crRNA espaciador 2 (11-42): SEQ ID NO:389
tracrRNA
(4-89): SEQ ID NO:390 (15-89): SEQ ID NO:391 (23-89): SEQ ID NO:392 (15-53): SEQ ID NO:393 (15-44): SEQ ID NO:394 (15-36): SEQ ID NO:395 (23-53): SEQ ID NO:396 (23-48): SEQ ID NO:397 (23-44): SEQ ID NO:398 (1-26): SEQ ID NO:399
ARN quimericos
Espaciador 1 - quimera A: SEQ ID NO:400 Espaciador 1 - quimera B: SEQ ID NO:401 Espaciador 2 - quimera A: SEQ ID NO:402 Espaciador 2 - quimera B: SEQ ID NO:403 Espaciador 4 - quimera A: SEQ ID NO:404
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Espaciador 4 - quimera B: SEQ ID NO:405
GFP1: SEQ ID NO:406
GFP2: SEQ ID NO:407
GFP3: SEQ ID NO:408
GFP4: SEQ ID NO:409
GFP5: SEQ ID NO:410
Oligonucleotidos de ADN como sustratos para ensayos de escision (protoespaciador en negrita, PAM subrayado)
protoespaciador 1 - complementary - tipo salvaje: SEQ ID NO:411 protoespaciador 1 - no complementary - tipo salvaje: SEQ ID NO:412 protoespaciador 2 - complementary - tipo salvaje: SEQ ID NO:413 protoespaciador 2 - no complementary - tipo salvaje: SEQ ID NO:414 protoespaciador 4 - complementary - tipo salvaje: SEQ ID NO:415 protoespaciador 4 - no complementario - tipo salvaje: SEQ ID NO:416 protoespaciador 2 - complementario - PAM1: SEQ ID NO:417 protoespaciador 2 - no complementario - PAM1: SEQ ID NO:418 protoespaciador 2 - complementario - PAM2: SEQ ID NO:419 protoespaciador 2 - no complementario - PAM2: SEQ ID NO:420 protoespaciador 4 - complementario - PAM1: SEQ ID NO:421 protoespaciador 4 - no complementario - PAM1: SEQ ID NO:422 protoespaciador 4 - complementario - PAM2: SEQ ID NO:423 protoespaciador 4 - no complementario - PAM2: SEQ ID NO:424
Transcripcion y purificacion de ARN in vitro
El ARN se transcribio in vitro utilizando el kit de transcripcion in vitro T7 Flash (Epicentre, Illumina company) y modelos de ADN generados por PCR con una secuencia promotora de T7. El ARN se purifico en gel y se comprobo su calidad antes del uso. Los cebadores utilizados para la preparacion de modelos de ARN de S. pyogenes SF370, Listeria innocua Clip 11262 y Neisseria meningitidis A Z2491 se describieron anteriormente.
Purificacion de proternas
La secuencia codificadora de Cas9 (residuos 1-1368) se amplifico mediante PCR del ADN genomico de S. pyogenes SF370 y se inserto en un vector de expresion personalizado con base en PET mediante clonacion independiente de ligacion (LIC, por sus siglas en ingles). La construccion de fusion resultante contenia una etiqueta de proteina de union hexahistidina-maltosa del extremo N (His6- MBP), seguida por una secuencia de peptidos que contenia un sitio de escision de proteasa del virus del grabado del tabaco (VGT). La proteina se expreso en la cepa de E. coli BL21 Rosetta 2 (DE3) (EMD Biosciences), cultivada en medio 2xTY a 18 °C durante 16 horas luego de la induccion con IPTG 0,2 mM. La proteina se purifico mediante una combinacion de afinidad, intercambio ionico y etapas de cromatografia de exclusion por tamano. En sintesis, las celulas se lisaron en Tris 20 mM con pH 8,0, NaCl 500 mM, TCEP 1 mM (complementado con coctel inhibidor de proteasa (Roche)) en un homogenizador (Avestin). El lisado aclarado se unio en lote a agarosa Ni-NTA (Quiagen). La resina se lavo de manera extensiva con Tris 20 mM con pH 8,0, NaCl 500 mM y la proteina unida se eluyo en Tris 20 mM con pH 8,0, NaCl 250 mM, glicerol al 10 %. La etiqueta de afinidad His6-MBP se quito mediante escision con proteasa TEV, mientras que la proteina se dializo durante la noche contra HEPES 20 mM con pH 7,5, KCl 150 mM, TCEP 1 mM, glicerol al 10 %. La proteina escindida Cas9 se separo de la etiqueta de fusion mediante purificacion en una columna de Sefarosa SP HiTrap de 5 ml (GE Life Sciences), eluyendola con un gradiente lineal de 100 mM - KCl 1 M. La proteina se purifico posteriormente mediante cromatografia de exclusion por tamano en una columna Superdex 200 16/60 en HEPES 20 mM con pH 7,5, KCl 150 mM y TCEP 1 mM. La proteina eluida se concentro a ~8 mg/ml, se ultracongelo en nitrogeno liquido y se almaceno a -80 °C. Los mutantes puntuales de Cas9 D10A, H840A y D10A/H480A se generaron con el kit de mutagenesis dirigida al sitio de QuickChange (Agilent) y se confirmaron mediante secuenciacion de ADN. Las proteinas se purificaron utilizando el mismo procedimiento que para la proteina Cas9 de tipo salvaje.
Los ortologos de Cas9 de Streptococcus thermophilus (LMD-9,YP_820832.1), L. innocua (Clip11262, NP_472073.1), Campylobacter jejuni (subesp. jejuni NCTC 11168, YP_002344900.1) y N. meningitidis (z2491, YP_002342100.1) se expresaron en celulas BL21 Rosetta (DE3) pLysS (Novagen) como proteinas de fusion His6-MBP (N. meningitidis y C. jejuni), His6-Thioredoxin (L. innocua) y His6-GST (S. thermophilus), y se purificaron esencialmente como Cas9 de S. pyogenes con las siguientes modificaciones. Debido a grandes cantidades de acidos nucleicos copurificantes, las cuatro proteinas Cas9 se purificaron mediante una etapa adicional de heparina sefarosa previa a la filtracion en gel, eluyendo la proteina unida con un gradiente lineal de KCl 100 mM - 2 M. Esto quito exitosamente la contaminacion de acido nucleico de las proteinas C. jejuni, N. meningitidis y L. innocua, pero no pudo quitar los acidos nucleicos copurificadores de la preparacion de Cas9 de S. thermophilus. Todas las proteinas se concentraron a 1-8 mg/ml en hEpES 20 mM con pH 7,5, KCl 150 mM y TCEP 1 mM, se ultracongelaron en N2 liquido y se almacenaron a -80 °C.
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Se pre-hibridaron tracrRNA y crRNA sinteticos o transcritos in vitro previo a la reaccion calentando a 95 °C y enfriando lentamente a temperatura ambiente. El ADN de plasmido natural o linealizado mediante digestion de restriction (300 ng (~8 nM)) se incubo durante 60 minutos a 37 °C con protema Cas9 purificada (50-500 nM) y duplex tracrRNA:crRNA (50-500 nM, 1:1) en un amortiguador de escision de plasmido Cas9 (HEPES 20 mM con pH 7,5, KCl 150 mM, DTT 0,5 mM, EDTA 0,1 mM) con o sin MgCh 10 mM. Las reacciones se detuvieron con 5X amortiguador de carga de ADN que contenia EDTA 250 mM, se resolvieron mediante electroforesis en gel de agarosa al 0,8 o 1 % y se visualizaron mediante tincion con bromuro de etidio. Para los ensayos de escision de Cas9 mutante, las reacciones se detuvieron con 5X amortiguador de carga SDS (glicerol al 30 %, SDS al 1,2 %, EDTA 250 mM) previo a la carga en el gel de agarosa.
Ensayo de escision dependiente de metal
El ADN de plasmido protoespaciador 2 (5 nM) se incubo durante 1 hora a 37 °C con Cas9 (50 nM) preincubado con 50 nM de tracrRNA:crRNA-sp2 en amortiguador de escision (HEPES 20 mM con pH 7,5, KCl 150 mM, DTT 0,5 mM, EDTA 0,1 mM) complementado con MgCl2 1,5 o 10 mM, MnCh, CaCh, ZnCl2, CoCh, NiSO4 o CuSO4 1 o 10 mM. La reaccion se detuvo agregando 5X amortiguador de carga SDS (glicerol al 30 %, SDS al 1,2 %, EDTA 250 mM), se resolvio por electroforesis en gel de agarosa al 1 % y se visualizo mediante tincion con bromuro de etidio.
Ensayo de reemplazo simple
La Cas9 (25 nM) se preincubo durante 15 minutos a 37 °C en amortiguador de escision (HEPES 20 mM con pH 7,5, KCl 150 mM, MgCl2 10 mM, DTT 0,5 mM, EDTA 0,1 mM) con tracrRNA:crRNA-sp2 en duplex (25 nM, 1:1) o ambos ARN (25 nM) sin prehibridar y la reaccion se inicio agregando ADN de plasmido protoespaciador 2 (5 nM). La mezcla de reaccion se incubo a 37 °C. En intervalos definidos de tiempo, se retiraron muestras de la reaccion, se agrego 5X amortiguador de carga SDS (glicerol al 30 %, ADA al 1,2 %, EDTA 250 mM) para detener la reaccion y la escision se monitoreo mediante electroforesis en gel de agarosa al 1 % y tincion de bromuro de etidio. Lo mismo se hizo para la cinetica de reemplazo simple sin preincubacion de Cas9 y ARN, donde el ADN de plasmido protoespaciador 2 (5 nM) se mezclo en amortiguador de escision con duplex tracrRNA:crRNA-sp2 (25 nM) o ambos ARN (25 nM) sin prehibridar y la reaccion se inicio agregando Cas9 (25 nM) Se analizo el porcentaje de escision mediante densitometria y el promedio de tres experimentos independientes se grafico en funcion del tiempo. Se ajustaron los datos mediante analisis de regresion no lineal y se calcularon las tasas de escision (kobs [min-1]).
Ensayo de reemplazo multiple
Se preincubo Cas9 (1 nM) durante 15 minutos a 37 °C en amortiguador de escision (HEPES 20 mM con pH 7,5, KCl 150 mM, MgCl2 10 mM, DTT 0,5 mM, EDTA 0,1 mM) con tracrRNA:crRNA-sp2 pre-hibridado (1 nM, 1:1). Se inicio la reaccion mediante la adicion de ADN de plasmido protoespaciador 2 (5 nM). En intervalos definidos de tiempo, se retiraron muestras y se detuvo la reaccion agregando 5X amortiguador de carga SDS (glicerol al 30 %, SDS al 1,2 %, EDTA 250 mM). La reaccion de escision se resolvio mediante electroforesis en gel de agarosa al 1 %, tenida con bromuro de etidio y el porcentaje de escision se analizo mediante densitometria. Se graficaron los resultados de cuatro experimentos independientes en funcion del tiempo (minutos).
Ensayo de escision de ADN de oligonucleotido
Los oligonucleotidos de ADN (10 pmol) se radiomarcaron mediante incubation con 5 unidades de polinucleotido cinasa T4 (New England Biolabs) y ~3-6 pmol (~20-40 mCi) [y-32P]-ATP (Promega) en 1X amortiguador de reaccion de polinucleotido cinasa T4 a 37 °C durante 30 minutos, en una reaccion de 50 |jL. Luego de la inactivation por calor (65 °C durante 20 minutos), las reacciones se purificaron mediante una columna Illustra MicroSpin G-25 (GE Healthcare) para quitar las etiquetas no incorporadas. Los sustratos de duplex (100 nM) se generaron mediante la hibridacion de oligonucleotidos marcados con cantidades equimolares de oligonucleotido complementario sin marcar a 95 °C durante 3 minutos, luego enfriando lentamente a temperatura ambiente. Para ensayos de escision, se hibridaron tracrRNA y crRNA mediante calentamiento a 95 °C durante 30 segundos, seguido de enfriamiento lento a temperatura ambiente. Se preincubo Cas9 (concentration final 500 nM) con el duplex hibridado tracrRNA:crRNA (500 nM) en el amortiguador de ensayo de escision (HEPES 20 mM con pH 7,5, KCl 100 mM, MgCl2 5 mM, DTT 1 mM, glicerol al 5 %) en un volumen total de 9 jl. Se iniciaron las reacciones anadiendo 1 jl de ADN objetivo (10 nM) y se incubaron durante 1 hora a 37 °C. Las reacciones se inactivaron anadiendo 20 jl de tinte de carga (EDTA 5 nM, SDS al 0,025 %, glicerol al 5 % en formamida) y se calentaron a 95 °C durante 5 minutos. Los productos de escision se resolvieron en geles de poliacrilamida desnaturalizada al 12 % que contenian urea 7 M y se visualizaron mediante imaginologia de fosforo. Se llevaron a cabo los ensayos que examinaban los requisitos de PAM (Figura 13B) utilizando sustratos de duplex que se habian prehibridado y purificado en un gel de acrilamida natural al 8 % y posteriormente se marcaron en ambos extremos 5'. Las reacciones se establecieron y analizaron de la misma forma que lo descrito anteriormente.
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Los duplex de ADN objetivo se formaron mezclando cada cadena (10 nmol) en agua desionizada, calentando a 95 °C durante 3 minutos y enfriando lentamente a temperatura ambiente. Todos los ADN se purificaron en geles naturales al 8 % que contenian 1X TBE. Las bandas de ADN se visualizaron mediante analisis de absorbancia UV se extirparon y se eluyeron sumergiendo piezas de gel en H2O tratada con DEPC. El ADN eluido era etanol precipitado y disuelto en H2O tratada con DEPC. Las muestras de ADN eran extremos 5' marcados con [y-32P]-ATP usando polinucleotido cinasa T4 (New England Biolabs) durante 30 minutos a 37 °C. PNK se desnaturalizo mediante calor a 65 °C durante 20 minutos, y se quitaron las etiquetas no incorporadas con una columna Illustra MicroSpin G- 25 (GE Healthcare). Los ensayos de union se realizaron en amortiguador que contenia HEPES 20 mM con pH 7,5, KCl 100 mM, MgCl2 5 mM, dTt 1 mM y glicerol al 10 % en un volumen total de 10 |jl. El mutante doble de Cas9 D10A/H840A se programo con cantidades equimolares del duplex tracrRNA:crRNA prehibridado y se titulo de 100 pM a 1 jM. Se agrego peptido el ADN radiomarcado a una concentracion final de 20 pM. Las muestras se incubaron durante 1 hora a 37 °C y se resolvieron a 4 °C en un gel de poliacrilamida natural al 8 % que contenia 1X TBE y MgCl2 5 mM. Los geles se secaron y el ADN se visualizo mediante imaginologia de fosforo.
Analisis simulado de secuencias de ADN y proteinas
Se utilizo el paquete Vector NTI (Invitrogen) para el analisis de secuencias de ADN (Vector NTI) y el analisis comparativo de secuencias de proteinas (AlignX).
Modelacion simulada de estructuras de ARN y coplegado
Las predicciones simuladas se realizaron utilizando los algoritmos de paquete de ARN Vienna (42, 43). Las estructuras secundarias de ARN y modelos de coplegado se predijeron con RNAfold y RNAcofold, respectivamente, y se visualizaron con VARNA (44).
RESULTADOS
Las bacterias y las arqueas tienen sistemas adaptativos de defensas mediados por ARN evolucionados llamados repeticiones palindromicas cortas agrupadas y regularmente espaciadas (CRISPR)/asociados con CRISPR (Cas) que protegen a los organismos de virus y plasmidos invasores (1-3). Se demuestra que en un subconjunto de estos sistemas, el crRNA maduro que forma pares de base con crRNA transactivador (tracrRNA) forma una estructura de dos ARN que direcciona la proteina Cas9 asociada con CRISPR para introducir roturas de cadena doble (cd) en ADN objetivo. En sitios complementarios a la secuencia guia de crRNA, el dominio de nucleasa HNH de Cas9 escinde la cadena complementaria, donde el dominio de Cas9 similar a RuvC escinde la cadena no complementaria. El tracrRNA:crRNA dual, cuando se modifica geneticamente como una unica quimera de ARN, tambien dirige la escision de ADNdc de Cas9 especifica a la secuencia. Estos estudios revelan una familia de endonucleasas que utilizan ARN dual para la escision de ADN especifica al sitio y resaltan la capacidad de explotar el sistema para la edicion genomica programable por ARN.
Los sistemas de defensa CRISPR/Cas se basan en ARN pequeno para la deteccion especifica a la secuencia y el silenciamiento de acidos nucleicos externos. Los sistemas CRISPR/Cas estan compuestos de genes cas dispuestos en uno o mas operones y una o mas configuraciones de CRISPR que consisten en secuencias dirigidas a genomas (llamadas espaciadores) intercaladas con repeticiones identicas (1-3). La inmunidad mediada por CRISPR/Cas se da en tres pasos. En la fase adaptativa, las bacterias y arqueas que contienen uno o mas locus de CRISPR responden a exposicion a virus o plasmidos integrando fragmentos cortos de secuencia externa (protoespaciadores) en el cromosoma hospedador en el extremo proximal de la configuracion de CRISPR (1-3). En las fases de expresion e interferencia, la transcripcion del elemento espaciador de repeticion en las moleculas de ARN CRISPR precursor (pre-crRNA), seguida de escision enzimatica, da como resultado los crRNA cortos que pueden aparearse con secuencias complementarias de protoespaciador de objetivos invasores virales o plasmidos (4-11). El reconocimiento de crRNA de los objetivos dirige el silenciamiento de las secuencias externas mediante las proteinas Cas que funcionan formando complejos con los crRNA (10, 12-20).
Hay tres tipos de sistemas CRISPR/Cas (21-23). Los sistemas de tipo I y III comparten algunas caracteristicas generales: las endonucleasas Cas especializadas procesan los pre-crRNA y, ya maduro, cada crRNA se une en un gran complejo de proteinas multi-Cas capaz de reconocer y escindir acidos nucleicos complementarios al crRNA. Por el contrario, los sistemas de tipo II procesan los precrRNA mediante un mecanismo distinto, en el cual un crRNA transactivador (tracrRNA) complementario a las secuencias de repeticion en pre-crRNA dispara el procesamiento realizado por la ribonucleasa especifica a ARN de doble cadena (dc) RNasa III ante la presencia de la proteina Cas9 (anteriormente Csn1) (Figura 15) (4, 24). Se piensa que Cas9 es la unica proteina responsable por el silenciamiento guiado por crRNA de AdN foraneo (25-27).
Se demuestra que en los sistemas de tipo II, las proteinas Cas9 constituyen una familia de enzimas que requieren una estructura de pares de bases formada entre el tracrRNA activador y el crRNA identificador para escindir ADNcd objetivo. La escision especifica del sitio ocurre en ubicaciones determinadas por ambas complementariedades de
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pares de base entre el crRNA y el ADN protoespaciador objetivo y un motivo corto [al cual se hace referencia como el motivo adyacente protoespaciador (PAM)] yuxtapuestos a la region complementaria en el ADN objetivo. El presente estudio demuestra ademas que la familia de endonucleasas de Cas9 puede programarse con moleculas simples de ARN para escindir sitios especificos de ADN, facilitando asi el desarrollo de un sistema dirigido a ARN simple y versatil para generar roturas de ADNcd para la direccion y edicion genomicas.
Cas9 es una endonucleasa de ADN guiada por dos ARN
Surge la hipotesis de que Cas9, la proteina distintiva de los sistemas de tipo II, esta involucrada tanto en la maduracion de crRNA y en la interferencia de ADN guiada por crRNA (Figura 15) (4, 25-27). Cas9 esta involucrada en la maduracion de crRNA (4), pero no se ha investigado su participation directa en la destruction de ADN objetivo. Para probar si Cas9 es capaz de dirigir la escision de ADN, y como, se utilizo un sistema de sobreexpresion para purificar la proteina Cas9 derivada del patogeno Streptococcus pyogenes (Figura 16, ver materiales y metodos complementarios) y se probo su capacidad de escindir un ADN de plasmido o un duplex de oligonucleotido con una secuencia de protoespaciador complementaria a un crRNA maduro, y un PAM bona fide. Se descubrio que el crRNA maduro en si mismo no era capaz de dirigir la escision de ADN de plasmido catalizada por Cas9 (Figura 10A y Figura 17A). No obstante, la adicion de tracrRNA, el cual puede emparejarse con la secuencia de repetition de crRNA y es esencial para la maduracion de crRNA en este sistema, disparo que Cas9 escindiera ADN de plasmido (Figura 10A y Figura 17A). La reaction de escision requirio tanto magnesio como la presencia de una secuencia de crRNA complementaria al ADN; un crRNA capaz de crear pares de bases de tracrRNA pero que contenia una secuencia de union a ADN objetivo no cognado no brindo soporte a la escision de plasmido catalizado por Cas9 (Figura 10A; Figura 17A, comparar crRNA-sp2 con crRNA-sp1; y Figura 18A). Se obtuvieron resultados similares con un sustrato de ADNcd corto linear (Figura 10B y Figura 17, B y C). De esta forma, el tracrRNA transactivador es un ARN pequeno no codificante con dos funciones cruciales: disparar el procesamiento de pre-crRNA mediante la enzima RNasa III (4) y posteriormente activar la escision de ADN guiada por crRNA mediante Cas9.
La escision de tanto plasmido como ADNcd corto linear mediante Cas9 dirigido por tracrRNa:crRNA es especifica al sitio (Figura 10, C a E y Figura 19, A y B). La escision de ADN de plasmido produjo extremos romos en una position anterior en tres pares de base de la secuencia PAM (Figura 10, C y E y Figura 19, A y C) (26). De manera similar, dentro de duplex con ADNcd corto, la cadena de ADN que es complementaria a la secuencia de union al objetivo en el crRNA (la cadena complementaria) se escinde en el sitio que se encuentra en posicion anterior en tres pares de base del PAM (Figura 10, D y E, y Figura 19, B y C). La cadena de ADN no complementaria se escinde en uno o mas sitios dentro de tres a ocho pares de base ubicados anteriores al PAM. Una investigation posterior revelo que la cadena no complementaria se escinde primero de manera endonucleotica y se recorta posteriormente mediante una actividad de 3'-5' exonucleasa (18B). Las tasas de escision mediante Cas9 en condiciones de reemplazo simple en un intervalo de 0,3 a 1 min-1, en comparacion con aquellas de las endonucleasas de restriction (Figura 20A), mientras que la incubation del complejo Cas9-tracrRNA:crRNA de tipo salvaje (TS) con un exceso molar de cinco veces de ADN de sustrato proporciono pruebas de que la Cas9 guiada por ADN dual es una enzima de reemplazo simple (Figura 20B). En comparacion con el complejo de cascada de CRISPR de tipo I (18), Cas9 escinde tanto plasmidos linealizados como superenrrollados (Figuras 10A y 11A). Por lo tanto, un plasmido invasor puede, en principio, ser escindido multiples veces por proteinas Cas9 programadas con crRNA diferentes.
Figura 10 (A) Cas9 programada con un crRNA-sp2 de 42 nucleotidos (crRNA que contiene una secuencia de espaciador 2) en presencia o ausencia de tracrRNA de 75 nucleotidos. El complejo se agrego a ADN de plasmido circular o linealizado por XhoI que contenia una secuencia complementaria al espaciador 2 y un PAM funcional. crRNA-sp1, control de especificidad; M, marcador de ADN; kpb, pares de kilobases. Vease la Figura 17A. (B) La Cas9 se programo con crRNa-sp2 y tracrRNA (nucleotidos 4 a 89). El complejo se incubo con ADN de cadena doble o simple que contenia una secuencia complementaria al espaciador 2 y un PAM funcional (4). Las cadenas complementarias o no complementarias de ADN se radiomarcaron en la posicion 5' y se hibridaron con una cadena companera. nt, nucleotidos. Vease la Figura 17, B y C. (C) Analisis de secuenciacion de productos de escision de la Figura 10A. La termination de la primera extension en la reaccion de secuenciacion indica la posicion del sitio de escision. El excedente A (asteriscos) del extremo 3' es un artefacto de la reaccion de secuenciacion. Vease la Figura 19, A y C. (D) Los productos de escision de la Figura 10B se analizaron junto con marcadores de tamano marcados en el extremo 5' derivados de las cadenas complementarias y no complementarias del duplex de ADN objetivo. M, marcador; P, producto de escision. Vease la Figura 19, B y C. (E) Representation esquematica de secuencias de ADN de tracrRNA, crRNA-sp2 y protoespaciador 2. Se representan regiones de complementariedad de crRNA a tracrRNA (sobrerrayado) y el ADN de protoespaciador (subrayado). Se marca la secuencia PAM; los sitios de escision mapeados en (C) y (D) se representan mediante flechas con relleno blanco (C), una flecha con relleno negro [(D) cadena complementaria)] y una barra negra [(D) cadena no complementaria].
La Figura 15 ilustra la via inmunitaria CRISPR/Cas mediada por ARN de Tipo II. Se representan en la figura las etapas de expresion e interferencia. Los locus de CRISPR/Cas de tipo II estan compuestos por un operon de cuatro genes que codifica las proteinas Cas9, Cas1, Cas2 y Csn2, una configuration de CRISPR que consiste en una secuencia lider seguida por repeticiones identicas (rectangulos negros) intercaladas con espaciadores unicos dirigidos a genomas (rombos) y una secuencia que codifica el tracrRNA transactivador. Se representa aqui el locus de CRISPR/Cas de tipo II de S. pyogenes SF370 (numero de accesion NC_002737) (4). Se indican los promotores y
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el terminador transcripcional confirmados de manera experimental en este locus (4). La configuracion de CRISPR se transcribe como una molecula precursora de ARN de CRISPR (pre-crRNA) que sufre un proceso de maduracion espedfico de los sistemas de tipo II (4). En S. pyogenes SF370, se transcribe el tracrRNA como dos transcripciones primarias con una longitud de 171 y 89 nt que tienen complementariedad a cada repeticion de pre-crRNA. El primer evento de procesamiento implica el apareamiento de tracrRNA con pre-crRNA, que forma un ARN duplex que es reconocido y escindido por la endorribonucleasa constitutiva RNasa III en presencia de la proteina Cas9. La escision mediada por RNasa III del ARN duplex genera un tracrRNA procesado de 75 nt y un crRNA intermedio de 66 nt que consiste en una region central que contiene una secuencia de un espaciador, flanqueada por partes de la secuencia de repeticion. Un segundo evento de procesamiento, mediado por una o mas ribonucleasas desconocidas, lleva a la formacion de crRNA maduros con una longitud de 39 a 42 nt, que consisten en una secuencia guia derivada por espaciador en el extremo 5' y una secuencia derivada por repeticion en el extremo 3'. Luego del primer y segundo eventos de procesamiento, el tracrRNA maduro permanece apareado a los crRNA maduros y unido a la proteina Cas9. En este complejo ternario, la estructura dual tracrRNA:crRNA actua como ARN guia que dirige la endonucleasa Cas9 al ADN objetivo cognado. El reconocimiento de objetivo realizado por el complejo Cas9- tracrRNA:crRNA se inicia escaneando la molecula invasora de ADN en busqueda de homologia entre la secuencia de protoespaciador en el ADN objetivo y la secuencia derivada por espaciador en el crRNA. Ademas de la complementariedad de protoespaciador de ADN-espaciador de crRNA, el direccionamiento de ADN requiere la presencia de un motivo corto (NGG, donde N puede ser cualquier nucleotido) adyacente al protoespaciador (motivo adyacente protoespaciador - PAM). Luego del apareamiento entre el ARN dual y la secuencia de protoespaciador, se forma un bucle R y la Cas9 introduce, posteriormente, una rotura de cadena doble (DSB) en el ADN. La escision de ADN objetivo mediante Cas9 requiere dos dominios cataliticos en la proteina. En un sitio espedfico relacionado con el PAM, el dominio HNH escinde la cadena complementaria del ADN mientras que el dominio similar a RuvC escinde la cadena no complementaria.
Figura 16 (A) Cas9 de S. pyogenes se expreso en E. coli como una proteina de fusion que contenia una etiqueta His6-PBM en el extremo N y se purifico mediante una combination de etapas de afinidad, intercambio ionico y cromatografia de exclusion por tamano. La etiqueta de afinidad se retiro mediante escision de proteasa TEV luego de la etapa de purification por afinidad. Se muestra un cromatograma de la etapa de cromatografia de exclusion por tamano en una columna Superdex 200 (16/60). Cas9 se eluye como un unico pico monomerico sin acidos nucleicos contaminantes, segun se juzga por la proportion de absorbancias a 280 y 260 nm. Recuadro; las fracciones eluidas se resolvieron mediante SDS-PAGE en un gel de poliacrilamida al 10 % y se tineron con SimplyBlue Safe Stain (Invitrogen). (B) Analisis SDS-PAGE de ortologos de Cas9 purificados. Los ortologos de Cas9 se purificaron como se describe en Materiales y Metodos Complementarios. Se analizaron 2,5 |jg de cada Cas9 purificada en un gel de poliacrilamida de gradiente de 4-20 % y se tineron con SimplyBlue Safe Stain.
Figura 17 (ver tambien la Figura 10). La secuencia de protoespaciador 1 se origina a partir de S. pyogenes SF370 (M1) SPy_0700, objetivo de S. pyogenes SF370 crRNAsp1 (4). En este caso, la secuencia de protoespaciador 1 se manipulo mediante el cambio de PAM de una secuencia no funcional (TTG) a una secuencia funcional (TGG). La secuencia de protoespaciador 4 se origina a partir de S. pyogenes MGAS10750 (M4) MGAS10750_Spy1285, objetivo de S. pyogenes SF370 crRNA-sp4 (4). (A) Escision de ADN de plasmido de protoespaciador 1 guiada mediante duplex de tracrRNA:crRNA cognados. Los productos de escision se resolvieron mediante elect roforesis en gel de agarosa y se visualizaron mediante tincion con bromuro de etidio. M, marcador de ADN; se indican los tamanos de fragmentos en pares de bases. (B) Escision de ADN de oligonucleotido de protoespaciador 1 guiada mediante duplex de tracrRNA:crRNA-sp1 cognados. Los productos de escision se resolvieron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida desnaturalizada y se visualizaron mediante imaginologia de fosforo. Se indican los tamanos de fragmentos en nucleotidos. (C) Escision de ADN de oligonucleotido de protoespaciador 4 guiada mediante duplex de tracrRNA:crRNA-sp4 cognados. Los productos de escision se resolvieron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida desnaturalizada y se visualizaron mediante imaginologia de fosforo. Se indican los tamanos de fragmentos en nucleotidos. (A, B, C) Los experimentos en (A) se llevaron a cabo como se describe en la Figura 10A; en (B) y en (C) como en la Figura 10B. (B, C) Un esquema de la interaction de ADN objetivo de tracrRNA:crRNA se muestra mas adelante. Las regiones de complementariedad de crRNA con tracrRNA y el ADN protoespaciador estan sobrerrayadas y subrayadas, respectivamente. La secuencia PAM esta marcada.
Figura 18 (ver tambien la Figura 10). (A) ADN de plasmido de protoespaciador 2 se incubo con Cas9 en complejo con tracrRNA:crRNA-sp2 en presencia de diferentes concentraciones de Mg2+, Mn2+, Ca2+, Zn2+, Co2+, Ni2+ o Cu2+. Los productos de escision se resolvieron mediante electroforesis en gel de agarosa y se visualizaron mediante tincion con bromuro de etidio. Se indican las formas de plasmido. (B) Un duplex de ADN de oligonucleotido de protoespaciador 4 que contenia un motivo de PAM se hibrido y purifico con gel antes de radiomarcarlo en ambos extremos 5'. Se incubo el duplex (concentration final de 10 mM) con Cas9 programada con tracrRNA (nucleotidos 23-89) y crRNAsp4 (concentracion final de 500 nM, 1:1). En los momentos indicados (min), se inactivaron alicuotas de 10 jl de reaction de escision con amortiguador de formamida que contenia SDS al 0,025 % y EDTA 5 mM, y se analizaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida desnaturalizada como en la Figura 10B. Se indican los tamanos en nucleotidos.
Figura 19 (A) Mapeo de escision de ADN de plasmido protoespaciador 1. Los productos de escision de la Figura 17A se analizaron mediante secuenciacion como en la Figura 10C. Cabe destacar que el excedente A (asterisco) del
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extremo 3' es un artefacto de la reaccion de secuenciacion. (B) Mapeo de escision de ADN de oligonucleotido protoespaciador 4. Los productos de escision de la Figura 17C se analizaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida desnaturalizada junto con marcadores de tamano de oligonucleotido marcados en el extremo 5' derivados de las cadenas complementaria y no complementaria del ADN de duplex protoespaciador 4. M, marcador; P, producto de escision. Lineas 1-2: cadena complementaria. Lineas 3-4: cadena no complementaria. Se indican los tamanos de fragmentos en nucleotidos. (C) Representaciones esquematicas de secuencias de tracrRNA, crRNA-sp1 y ADN protoespaciador 1 (parte superior) y secuencias de tracrRNA, crRNAsp4 y ADN protoespaciador 4 (parte inferior). tracrRNA:crRNA forma una estructura de A doble dirigida al ADN de protoespaciador complementario a traves del apareamiento con ADN protoespaciador-crRNA. Las regiones complementarias a crRNA con tracrRNA y el ADN protoespaciador estan sobrerrayadas y subrayadas, respectivamente. Los sitios de escision en las cadenas de ADN complementaria y no complementaria mapeadas en (A) (parte superior) y (B) (parte inferior) se representan con flechas (A y B, cadena complementaria) y una barra negra (B, cadena no complementaria) sobre las secuencias, respectivamente.
Figura 20 (A) Cinetica de reemplazo simple de Cas9 bajo diferentes condiciones de prehibridacion de ARN y preincubacion de ARN de proteina. Se incubo ADN de plasmido protoespaciador 2 ya sea con Cas9 preincubada con tracrRNA:crRNA-sp2 prehibridado (o), Cas9 no preincubada con tracrRNA:crRNA-sp2 prehibridado (•), Cas9 preincubada con tracrRNA y crRNA-sp2 no prehibridado (□) o Cas9 no preincubado con aRn no prehibridado (■). Se monitoreo la actividad de escision de una manera que dependia del tiempo y se analizo mediante electroforesis en gel de agarosa, seguida de tincion con bromuro de etidio. El porcentaje promedio de escision de tres experimentos diferentes se grafico en funcion del tiempo (min) y se ajusto con una regresion no lineal. Las tasas de escision calculadas (kobs) se muestran en la tabla. Los resultados sugieren que la union de Cas9 a los ARN no limitan la tasa en las condiciones evaluadas. Se indican las formas de plasmido. Los valores de kobs obtenidos son similares a las endonucleasas de restriccion que estan normalmente en el orden de 1-10 por minuto (45-47). (B) Cas9 es una endonucleasa de reemplazo multiple. Se incubo Cas9 cargada con duplex de tracrRNA:crRNA-sp2 (1 nM, 1:1:1 - indicado con una linea gris en la grafica) con un exceso de 5 veces de ADN de plasmido protoespaciador 2 natural. Se monitoreo la escision mediante el retiro de muestras de la reaccion en los intervalos de tiempo definidos (0 a 120 min) seguido de analisis de electroforesis en gel de agarosa (parte superior) y determination de la cantidad de producto de escision (nM) (parte inferior). Se indican las desviaciones estandar de tres experimentos independientes. En el intervalo de tiempo investigado, Cas9 1 nM fue capaz de escindir ADN de plasmido ~2,5.
Cada dominio de nucleasa Cas9 escinde una cadena de ADN
Cas9 contiene dominios homologos a ambas endonucleasas HNH y RuvC (Figura 11A y Figura 3) (21-23, 27, 28). Se disenaron y purificaron variantes de Cas9 que contenian mutation puntuales inactivadoras en los residuos cataliticos de los dominios similares a RuvC o HNH (Figura 11A y Figura 3) (23, 27). La incubation de estas variantes de proteinas Cas9 con ADN de plasmido natural mostro que las proteinas Cas9 mutantes guiadas por ARN dual proporcionaron plasmidos circulares abiertos mellados, mientras que el complejo de proteina Cas9 de tipo salvaje-tracrRNA:crRNA produjo un producto de ADN lineal (Figuras 10A y 11A y Figuras 17A y 25A). Este resultado indica que los dominios similares a RuvC y HNH de Cas9, cada uno escinde una cadena de ADN de plasmido. Para determinar que cadena del ADN objetivo se escinde mediante cada dominio catalitico de Cas9, se incubaron los complejos de Cas9 mutante-tracrRNA:crRNA con sustratos de ADNcd cortos en los cuales se radiomarco ya sea la cadena complementara o la cadena no complementaria en su extremo 5'. Los productos de escision resultantes indicaron que el dominio de HNH de Cas9 escinde la cadena de ADN complementaria, donde el dominio similar a RuvC de Cas9 escinde la cadena de ADN no complementaria (Figura 11B y Figura 21B).
Figura 11(A) (Parte superior) Representation esquematica de la estructura del dominio de Cas9 que muestra las posiciones de las mutaciones de dominio. D10A, Asp10^Ala10; H840A; His840^Ala840. Los complejos de proteinas Cas9 de tipo salvaje o mutante de nucleasa con tracrRNA:crRNA-sp2 se analizaron para verificar la actividad de endonucleasa como en la Figura 10A. (B) Los complejos de Cas9 de tipo salvaje o mutantes de dominio de nucleasa con tracrRNA y crRNA-sp2 se analizaron para verificar la actividad como en la Figura 10B.
Figura 3 Se representa la secuencia de aminoacidos de Cas9 a partir de S. pyogenes (SEQ ID NO:8). Las proteinas Cas9/Csn1 de varias especies diferentes tienen 2 dominios que incluyen motivos homologos a las endonucleasas de RuvC y HNH. (A) Se muestran los motivos 1-4 (los numeros de motivos estan marcados en el lado izquierdo de la secuencia) para Cas9/Csn1 de S. pyogenes. Los tres motivos similares a RuvC predichos (1, 2, 4) y el motivo de HNH predicho (3) estan subrayados. Los residuos Asp10 y His840, que fueron sustituidos por Ala en este estudio se destacan por medio de un asterisco encima de la secuencia. Los residuos subrayados estan altamente conservados entre las proteinas Cas9 de especies diferentes. Es probable que las mutaciones en residuos subrayados tengan consecuencias funcionales en la actividad de Cas9. Cabe destacar que en el presente estudio el acoplamiento de las dos actividades similares a nuclease se demostro de manera experimental (Figura 11 y Figura 21). (B) Se representan los dominios 1 (aminoacidos 7-166) y 2 (aminoacidos 731-1003), que incluyen los motivos 1-4, para S. pyogenes Cas9/Csn1. Referirse a la Tabla 1 y la Figura 5 por information adicional.
Figura 21 Escision de ADN protoespaciador mediante mutantes Cas9 dirigidos a tracrRNA:crRNA cognados que contienen mutaciones en el dominio similar a RuvC o HNH. (A) Escision de ADN de plasmido protoespaciador 1. El
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experimento se llevo a cabo como en la Figura 11A. Se indican las conformaciones y tamanos de ADN de plasmido en pares de bases. (B) Escision de ADN de oligonucleotido protoespaciador 4. El experimento se llevo a cabo como en la Figura 11B. Se indican los tamanos en nucleotidos.
Requisitos de ARN dual para dirigir la union y escision de ADN
Puede ser necesario el tracrRNA para la union a ADN objetivo y/o estimular la actividad de nucleasa de Cas9 en una posicion posterior al reconocimiento objetivo. Para distinguir entre estas posibilidades, se uso un ensayo de cambio de movilidad electroforetica para monitorear la union a ADN objetivo mediante Cas9 inactiva cataliticamente en presencia o ausencia de crRNA y/o tracrRNA. El agregado de tracrRNA mejoro sustancialmente la union a ADN objetivo por Cas9, donde se observo poca union a ADN especifica con Cas9 sola o Cas9-crRNA (Figura 22). Esto indica que tracrRNA es necesario para el reconocimiento de ADN objetivo, posiblemente mediante la orientacion adecuada de crRNA para su interaccion con la cadena complementaria del ADN objetivo. La estructura secundaria de tracrRNA:crRNA predicha incluye pares de bases entre los 22 nucleotidos del extremo 3' del crRNA y un segmento cercano al extremo 5' del tracrRNA maduro (Figura 10E). Esta interaccion crea una estructura en la cual los 20 nucleotidos del extremo 5' de crRNA, que varian en secuencia en crRNA diferentes, estan disponibles para la union a ADN objetivo. La mayor parte del tracrRNA en la posicion posterior a la region del par de bases de crRNA esta libre para formar estructuras adicionales de ARN y/o para interactuar con Cas9 o con el sitio del ADN objetivo. Para determinar si la longitud completa del tracrRNA es necesaria para la escision de ADN catalizada por Cas9 especifica del sitio, se evaluaron complejos de Cas9-tracrRNA:crRNA reconstituidos usando crRNA maduro de longitud completa (42 nucleotidos) y varias formas truncadas de tracrRNA que carecen de secuencias en sus extremos 5' o 3'. Estos complejos se evaluaron para verificar la escision usando un ADNcd objetivo corto. Una version sustancialmente truncada del tracrRNA que conserva los nucleotidos 23 a 48 de la secuencia natural fue capaz de permitir una escision potente de ADN catalizada por Cas9 guiada por ARN dual (Figura 12, A y C, y Figura 23, A y B). El truncado del crRNA de cualquiera de los extremos mostro que la escision catalizada por Cas9 en presencia de tracrRNA puede iniciarse con crRNA que carezcan de los 10 nucleotidos del extremo 3' (Figura 12, B y C). Por el contrario, una eliminacion de 10 nucleotidos del extremo 5' de crRNA suprimio la escision de ADN por Cas9 (Figura 12B). Tambien se analizaron los ortologos de Cas9 de varias especies bacterianas para verificar su capacidad de permitir la escision de ADN guiada por tracrRNA:crRNA de S. pyogenes. Al contrario de los ortologos de Cas9 de S. pyogenes relacionados estrechamente, los ortologos con relaciones mas lejanas no fueron funcionales para la reaccion de escision (Figura 24). De manera similar, Cas9 de S. pyogenes Cas9 guiada por duplex de tracrRNA:crRNA producidos a partir de sistemas mas distantes fue incapaz de escindir ADN de manera eficiente (Figura 24). La especificidad de especie de la escision guiada por ARN dual de ADN indica una evolucion conjunta de Cas9, tracrRNA y la repeticion de crRNA, asi como la existencia de una estructura y/o secuencias desconocidas en el ARN dual cruciales para la formacion del complejo ternario con ortologos de Cas9 especificos.
Para investigar los requisitos de la secuencia de protoespaciador para la inmunidad tipo II de CRISPR/Cas en celulas bacterianas, se analizo una serie de ADN de plasmido que contienen protoespaciadores que portan mutaciones de nucleotido simple para su mantenimiento, seguido de transformacion en S. pyogenes y su capacidad de ser escindidos por Cas9 in vitro. Al contrario de las mutaciones puntuales introducidas en el extremo 5' del protoespaciador, las mutaciones en la region cercana al PAM y los sitios de escision de Cas9 no fueron tolerados in vitro, y dieron como resultado una disminucion de la eficiencia de escision de plasmidos in vitro (Figura 12D). Los resultados concuerdan con el informe previo de mutantes de escape de protoespaciador seleccionados en el sistema de CRISPR de tipo II de S. thermophilus in vivo (27, 29). Ademas, los resultados de mantenimiento y escision de plasmidos apuntan a la existencia de una region de "semilla" ubicada en el extremo 3' de la secuencia de protoespaciador que es crucial para la interaccion con crRNA y la subsiguiente escision mediante Cas9. Como apoyo de este concepto, Cas9 mejoro la hibridacion de la cadena de ADN complementaria al crRNA; esta mejora fue la mas potente en la region del extremo 3' de la secuencia dirigida a crRNA (Figura 25A-C). Para corroborar este descubrimiento, una extension contigua de al menos 13 pares de bases entre el crRNA y el sitio de ADN objetivo mas cercano a PAM es necesaria para una escision objetivo eficaz, mientras que hasta seis mal apareamientos contiguos en la region del extremo 5' del protoespaciador son tolerables (Figura 12E). Estos descubrimientos son reminiscentes de los requisitos de secuencia semilla observados para el reconocimiento de acido nucleico objetivo en proteinas Argonauta (30, 31) y los complejos de Csy CRISPR y Casacade (13, 14).
Figura 12 (A) los complejos de Cas9-tracrRNA:crRNA se reconstituyeron usando construcciones de crRNA-sp2 de 42 nucleotidos y tracrRNA truncado y se analizaron para verificar la actividad de escision como en la Figura 10B. (B) Se analizo la Cas9 programada con truncaciones de crRNA-sp2 y tracrRNA de longitud completa para verificar su actividad en (A). (C) Regiones minimas de tracrRNA y crRNA capaces de guiar la escision de aDn mediada por Cas9 (region sombreada). (D) Los plasmidos que contienen secuencias de protoespaciador 2 de tipo salvaje o mutantes con mutaciones puntuales indicadas se escindieron in vitro mediante Cas9 programada como en la Figura 10A y se usaron para ensayos de transformacion de S. pyogenes con deficiencia de pre-crRNA o de tipo salvaje. La eficiencia de transformacion se calculo como unidades formadoras de colonias (UFC) por microgramo de aDn de plasmido. Las barras de error representan la desviacion estandar para tres replicados biologicos. (E) Los plasmidos que contienen insertos de protoespaciador 2 mutante y de tipo salvaje con una extension variada de mal apareamientos de ADN objetivo y crRNA (parte inferior) se escindieron in vitro mediante Cas9 programada (parte superior). Las reacciones de escision se digirieron adicionalmente con XmnI. Los fragmentos de 1880 y 800 pb son
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productos de escision generada con Cas9. M, marcador de ADN.
Figura 22 Se llevaron a cabo ensayos de cambio de movilidad usando duplex de ADN objetivo protoespaciador 4 y Cas9 (que contema mutaciones inactivadoras de dominio de nucleasa D10A y H840) solos o en presencia de crRNA-sp4, tracrRNA (75 nt) o ambos. El duplex de ADN objetivo se radiomarco en ambos extremos 5'. Cas9 (D10/H840A) y los complejos se titularon de 1 nM a 1 |jM. La union se analizo mediante electroforesis en gel de poliacrilamida natural al 8 % y se visualizo mediante imaginologia de fosforo. Cabe destacar que Cas9 sola se une al ADN objetivo con afinidad moderada. Esta union no se ve afectada por la adicion de crRNA, lo cual sugiere que esto representa la interaction no especifica de secuencia con el ADNcd. Ademas, esta interaction puede ser superada por tracrRNA solo en ausencia de crRNA. En presencia tanto de crRNA como de tracrRNA, la union a ADN objetivo mejora sustancialmente y produce una especie con movilidad electroforetica distintiva, lo cual indica un reconocimiento del ADN objetivo especifico.
Figura 23 Un fragmento de tracrRNA que comprende una parte de la region apareada de crRNA y una parte de la region posterior es suficiente para dirigir la escision de ADN de oligonucleotido protoespaciador mediante Cas9. (A) La escision de ADN de oligonucleotido protoespaciador 1 y (B) la escision de ADN de oligonucleotido protoespaciador 4 mediante Cas9 guiada con un crRNA cognado maduro y varios fragmentos de tracrRNA. (A, B) Se indican los tamanos en nucleotidos.
Figura 24 Al igual que Cas9 de S. pyogenes, los ortologos de Cas9 estrechamente relacionados de las bacterias gram-positivas L. innocua y S. thermophilus escinden el ADN protoespaciador cuando son el objetivo de tracrRNA:crRNA de S. pyogenes. Sin embargo, en las mismas condiciones, no se observo escision de ADN mediante los ortologos de Cas9 relacionados de manera mas lejana a partir de las bacterias gram-negativas C. jejuni y N. meningitidis. Spy, S. pyogenes SF370 (numero de acceso NC_002737); Sth, S. thermophilus LMD-9 (ortologo de Cas9 STER_1477; numero de acceso nC_008532); Lin, L. innocua Clipl 1262 (numero de acceso NC_0o3212); Cje, C. jejuni NCTC 11168 (numero de acceso NC_002163); Nme, N. meningitidis A Z2491 (numero de acceso NC_003116). (A) Escision de ADN de plasmido protoespaciador. ADN de plasmido protoespaciador 2 (300 ng) se sometio a escision mediante diferentes ortologos de Cas9 (500 nM) guiada por duplex hibridos de tracrRNA:crRNA- sp2 (500 nM, 1:1) de diferentes especies. Para disenar los duplex de ARN, se predijeron las secuencias de tracrRNA de L. innocua y N. meningitidis basandose en datos de ensayo de transferencia Northern previamente publicados (4). Los duplex de ARN hibridos duales consisten en tracrRNA especifico de especie y un crRNA heterologo. La secuencia de crRNA heterologo se modifico geneticamente para contener una secuencia de sp2 dirigida a ADN de
S. pyogenes en el extremo 5' fusionada a una secuencia de repetition de union a tracrRNA de L. innocua o N. meningitidis en el extremo 3'. Los ortologos de Cas9 de S. thermophilus y L. innocua, pero no los de N. meningitidis o C. jejuni, pueden ser guiados mediante tracrRNA:crRNA-sp2 de S. pyogenes para escindir ADN de plasmido protoespaciador 2, aunque con una eficacia ligeramente disminuida. De manera similar, el hibrido tracrRNA:crRNA- sp2 de L. innocua puede guiar Cas9 de S. pyogenes para escindir el ADN objetivo con eficiencia elevada, mientras que el hibrido de tracrRNA:crRNA-sp2 de N. meningitidis activa solamente una actividad de escision ligera mediante S. pyogenes Cas9. Como controles, los ortologos de Cas9 de N. meningitidis y L. innocua escinden el ADN de plasmido protoespaciador 2 cuando son guiados por tracrRNA:crRNA-sp2 hibrido cognado. Cabe destacar como se menciono anteriormente que la secuencia de tracrRNA de N. meningitidis fue unicamente predicha y no se ha confirmado aun mediante secuenciacion de ARN. Por lo tanto, la baja eficacia de escision podria ser el resultado de ya sea una baja actividad de los ortologos de Cas9 o al uso de una secuencia de tracrRNA no disenada de manera optima. (B) Escision de ADN de oligonucleotido protoespaciador. Un oligonucleotido de cadena complementaria marcado por radiactividad en el extremo 5' (10 nM) prehibridado con un oligonucleotido no marcado de cadena no complementaria (protoespaciador 1) (10 nM) (izquierda) o un oligonucleotido de cadena no complementaria marcado por radiactividad en el extremo 5' (10 nM) prehibridado con un oligonucleotido de cadena complementaria sin marcar (10 nM) (derecha) (protoespaciador 1) se sometio a escision mediante varios ortologos de Cas9 (500 nM) guiada por duplex de tracrRNA:crRNA-sp1 de S. pyogenes (500 nM, 1:1). Los ortologos de Cas9 de S. thermophilus y L. innocua, pero no los de N. meningitidis o C. jejuni, pueden ser guiados mediante ARN dual cognado de S. pyogenes para escindir el ADN de oligonucleotido protoespaciador, aunque con una eficacia disminuida. Cabe destacar que el sitio de escision en la cadena de ADN complementaria es identico para los tres ortologos. La escision de la cadena no complementaria ocurre en posiciones distintivas. (C) Identidad de secuencia de aminoacidos de ortologos de Cas9. Los ortologos de Cas9 de S. pyogenes, S. thermophilus y L. innocua Cas9 comparten un alto porcentaje de identidad de aminoacidos. Por el contrario, las proteinas Cas9 de C. jejuni y N. meningitidis difieren en secuencia y longitud (~300-400 aminoacidos mas cortas). (D) Coplegado de secuencias de crRNA heterologo especifico de especie modificado geneticamente con los ortologos de tracrRNA correspondientes de S. pyogenes (confirmado experimentalmente, (4)), L. innocua (predicho) o N. meningitidis (predicho). Se rastrean y marcan los tracrRNA; fragmentos de espaciador 2 de crRNA; y fragmentos de repeticion de crRNA. Los duplex de tracrRNA:crRNA-sp2 hibrido de L. innocua and S. pyogenes comparten caracteristicas estructurales muy similares, aunque distintas del tracrRNA:crRNA hibrido de N. meningitidis. Junto con los datos de escision descritos anteriormente en (A) y (B), las predicciones de coplegado indicarian que la escision especifica de especie del ADN objetivo mediante Cas9- tracrRNA:crRNA esta dictada por una caracteristica estructural aun desconocida en el duplex tracrRNA:crRNA que es reconocido especificamente por un ortologo de Cas9 cognado. Se predijo que la especificidad de especie de la escision observada en (A) y (B) ocurre a nivel de la union de Cas9 a tracrRNA:crRNA dual. El ARN dual guio la escision de Cas9 del ADN objetivo puede ser especifico de especie. Dependiendo del grado de diversidad/evolucion
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entre las protemas Cas9 y los duplex de tracrRNA:crRNA, los ortologos de Cas9 y ARN duales son parcialmente intercambiables.
Figura 25 Se analizo una serie de sondas de ADN de 8 nucleotidos complementarias a las regiones en el crRNA que comprenden la region dirigida a ADN y la region de union a tracrRNA para verificar su capacidad de hibridarse al crRNA en el contexto de un duplex de tracrRNA:crRNA y del complejo ternario de Cas9-tracrRNA:crRNA. (A) Representacion esquematica de las secuencias de sondas de ADN usadas en el ensayo y sus sitios de union en crRNA-sp4. (B-C) Ensayos de cambio de movilidad electroforetica de sondas de ADN objetivo con tracrRNA:crRNA- sp4 o Cas9-tracrRNA:crRNA-sp4. La construccion de tracrRNA(15-89) se uso en el experimento. La union de los duplex o complejos a ADN de oligonucleotido objetivo se analizo en un gel de poliacrilamida natural al 16 % y se visualizo mediante imaginologia de fosforo.
Un motivo de secuencia corta dicta la formacion de bucle R
En multiples sistemas CRISPR/Cas, se ha demostrado que el reconocimiento propio respecto al ajeno implica un motivo de secuencia corta que se preserva en el genoma foraneo, mencionado como PAM(27, 29, 32-34). Los motivos de PAM tienen unicamente unos pocos pares de bases de longitud y su secuencia y posicion precisas varia de acuerdo con el tipo de sistema CRISPR/Cas (32). En el sistema tipo II de S. pyogenes, PAM se conforma a una secuencia de consenso de NGG, que contiene dos pares de bases G:C que se producen un par de bases mas adelante de la secuencia de union a crRNA, dentro del ADN objetivo (4). Los ensayos de transformacion demostraron que el motivo GG es esencial para la eliminacion del ADN de plasmido protoespaciador mediante CRISPR/Cas en celulas bacterianas (Figura 26A), lo cual es consistente con las observaciones previas en S. thermophilus (27). El motivo tambien es esencial para la escision de plasmido protoespaciador in vitro mediante Cas9 guiada por tracrRNA:crRNA (Figura 26B). Para determinar el rol de PAM en la escision de ADN objetivo mediante el complejo Cas9-tracrRNA: crRNA, se evaluo una serie de duplex de ADNcd que contenia mutaciones en la secuencia PAM en las cadenas complementaria y no complementaria, o ambas (Figura 13A). Los ensayos de escision con estos sustratos mostraron que la escision de ADN catalizada por Cas9 fue particularmente sensible a mutaciones en la secuencia PAM en la cadena no complementaria del ADN, en contraste con el reconocimiento de PAM de cadena complementaria mediante los sistemas de CRISPR/Cas de tipo I (18, 34). La escision de ADN de cadena simple objetivo no se vio afectada por mutaciones en el motivo PAM. Esta observacion sugiere que el motivo PAM es necesario unicamente en el contexto de ADNcd objetivo y puede, por lo tanto, ser necesario para permitir el despliegue del duplex, la invasion de cadena y la formacion de una estructura en bucle R. Cuando se uso un par diferente de ADN dirigido a crRNA (crRNA-sp4 y ADN protoespaciador 4), seleccionado debido a la presencia de PAM canonico no presente en el ADN objetivo protoespaciador 2, se descubrio que ambos nucleotidos G de PAM eran necesarios para la escision de ADN catalizada por Cas9 eficiente (Figura 13B y Figura 26C). Para determinar si PAM tiene un papel principal para reclutar el complejo Cas9-tracrRNA:crRNA con el sitio de aDn objetivo correcto, se analizaron afinidades de union del complejo para secuencias de ADN objetivo mediante ensayos de cambio de movilidad en gel natural (Figura 13C). La mutacion de cualquier G en la secuencia PAM redujo sustancialmente la afinidad de Cas9-tracrRNA: crRNA por el ADN objetivo. Este descubrimiento ilustra un rol para la secuencia PAM en la union a ADN objetivo mediante Cas9.
Figura 13 (A) Se evaluo Cas9 programada por ARN dual para verificar su actividad como en la Figura 10B. Las secuencias PAM de tipo salvaje y mutante en los ADN objetivo se indican con lineas. (B) Los duplex de ADN objetivo protoespaciador 4 (marcados en ambos extremos 51) que contienen motivos PAM de tipo salvaje y mutante se incubaron con Cas9 programada con tracrRNA:crRNA-sp4 (nucleotidos 23 a 89). En los momentos indicados (en minutos), se tomaron alicuotas de la reaccion de escision y se analizaron como en la Figura 10B. (C) Se llevaron a cabo ensayos de cambio de movilidad electroforetica usando Cas9 programada con ARN (D10A/H840A) y duplex de ADN objetivo protoespaciador 4 [igual que en (B)] que contenia motivos PAM de tipo salvaje y mutados. El complejo de Cas9 (D10A/H840A)-ARN se titulo desde 1o0 pM hasta 1 mM.
Figura 26 (A) Las mutaciones de la secuencia PAM en el ADN de plasmido protoespaciador 2 impiden la interferencia del mantenimiento de plasmido mediante el sistema CRISPR/Cas del tipo II en celulas bacterianas. Los plasmidos protoespaciador 2 de tipo salvaje con un PAM funcional o mutado se transformo en tipo salvaje (cepa SF370, tambien llamada EC904) y mutante con deficiencia de pre-crRNA (EC1479) S. pyogenes como en la Figura 12D. Las mutaciones de PAM no son toleradas por el sistema CRISPR/Cas de tipo II in vivo. Se muestran los valores promedio y las desviaciones estandar de tres replicados biologicos. (B) Las mutaciones de la secuencia PAM en ADN de plasmido protoespaciador impide la escision mediante Cas9-tracrRNA:crRNA. El plasmido protoespaciador 2 con un PAM funcional o mutado se sometio a escision de Cas9 como en la Figura 10A. Los plasmidos mutantes de PAM no son escindidos por el complejo Cas9-tracrRNA:crRNA. (C) Las mutaciones de la secuencia de PAM canonica impiden la interferencia del mantenimiento de plasmido mediante el sistema CRISPR/Cas del tipo II en celulas bacterianas. Los plasmidos protoespaciadores 4 de tipo salvaje con PAM funcional o mutado se escindieron con Cas9 programada con tracrRNA y crRNA-sp2. Las reacciones de escision se llevaron a cabo en presencia de la endonucleasa de restriccion XmnI para visualizar los productos de escision de Cas9 como dos fragmentos (~1880 y ~800 pb). Se indican los tamanos de fragmentos en pares de bases.
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Cas9 puede programarse con un unico ARN quimerico
El examen de la estructura secundaria posible del duplex de tracrRNA:crRNA (Figuras 10E y 12C) sugiere la posibilidad de que las caracteristicas necesarias para la escision de ADN catalizada por Cas9 espedfica del sitio pueden ser capturadas en un unico ARN quimerico. Aunque el mecanismo de seleccion de objetivo de tracrRNA:crRNA funciona de manera eficiente en la naturaleza, la posibilidad de una Cas9 guiada por ARN simple es atractiva, debido a su utilidad posible para la escision de ADN programado y la edicion del genoma (Figura 1A-B). Se disenaron dos versiones de un ARN quimerico que contenia una secuencia de reconocimiento de objetivo en el extremo 5' seguida de una estructura de horquilla que conservaba las interacciones de pares de base que ocurren entre el tracrRNA y el crRNA (Figura 14A). Este transcripto simple fusiona eficazmente al extremo 3' de crRNA al extremo 5' de tracrRNA, lo cual imita la estructura de ARN dual necesaria para guiar la escision de ADN especifica del sitio mediante Cas9. En ensayos de escision con ADN de plasmido se observo que cuanto mas largo era el ARN quimerico era capaz de guiar la escision de ADN catalizada por Cas9 de una manera similar a la observada para el duplex de tracrRNA:crRNA truncado (Figura 14A y Figura 27, A y C). El ARN quimerico mas corto no funciono eficazmente en este ensayo, lo cual confirma que los nucleotidos que estan 5 a 12 posiciones mas alla de la interaction del par de bases tracrRNA:crRNA son importantes para una union eficaz a Cas9 y/o para el reconocimiento del objetivo. Se obtuvieron resultados similares en los ensayos de escision usando ADNcd corto como un sustrato, lo cual indica adicionalmente que la position del sitio de escision en el ADN objetivo es identica a la observada usando el tracrRNA:crRNA dual como guia (Figura 14B y Figura 27, B y C). Finalmente, para establecer si el diseno del ARN quimerico puede aplicarse universalmente, se modificaron geneticamente cinco ARN guia quimericos diferentes para dirigirse a una parte del gen que codifica la proteina verde fluorescente (GFP) (Figura 28, A a C) y se evaluaron para verificar su eficacia contra un plasmido que porta la secuencia codificante de GFP in vitro. En los cinco casos, Cas9 programada con estos ARN quimericos escindio eficazmente el plasmido en el sitio objetivo correcto (Figura 14C y Figura 28D), lo cual indica que el diseno racional de ARN quimerico es potente y podria, en principio, permitir el direccionamiento a cualquier secuencia de ADN de interes con pocos obstaculos mas alla de la presencia de un dinucleotido GG adyacente a la secuencia objetivo.
Figura 1 Un ARN dirigido a ADN comprende un "segmento dirigido a ADN" y "un segmento de union a proteinas" de cadena simple, que comprende una extension de ARN de cadena doble. (A) Un ARN dirigido a ADN puede comprender dos moleculas de ARN separadas (mencionadas como un ARN dirigido a ADN de "molecula doble" o de "dos moleculas"). Un ARN dirigido a ADN de molecula doble comprende un "ARN identificador" y un "ARN activador". (B) Un ARN dirigido a ADN puede comprender una unica molecula de ARN (mencionada como un ARN dirigido a ADn de "molecula simple"). Un ARN dirigido a ADN de molecula simple comprende "nucleotidos enlazadores".
Figura 14 (A) Un plasmido que poseia una secuencia objetivo de protoespaciador 4 y una PAM de tipo salvaje se sometio a escision mediante Cas9 programada con duplex de tracrRNA(4-89):crRNA-sp4 o ARN quimerico transcripto in vitro construidos mediante la union del extremo 3' del crRNA al extremo 5' de tracrRNA con un tetrabucle GAAA. Las reacciones de escision se analizaron mediante mapeo de restriction con Xmnl. Las secuencias de ARN quimerico A y B se muestran con secuencias dirigidas a ADN (subrayado), secuencias derivadas de repetition de crRNA (sobrerrayado) y secuencias derivadas de tracrRNA (subrayado punteado). (B) Las reacciones de escision del duplex de ADN protoespaciador 4 se llevaron a cabo como en la Figura 10B. (C) Se usaron cinco ARN quimericos disenados para dirigirse al gen GFP para programar Cas9 para escindir un plasmido que contenia un gen GFP. Las reacciones de escision de plasmido se llevaron a cabo como en la Figura 12E, excepto que el ADN de plasmido se mapeo por restriccion con AvrII luego de la escision con Cas9.
Figura 27 (A) Un unico ARN quimerico guia la escision catalizada por Cas9 del ADN de plasmido protoespaciador cognado (protoespaciador 1 y protoespaciador 2). Las reacciones de escision se llevaron a cabo en presencia de la endonucleasa de restriccion XmnI para visualizar los productos de escision de Cas9 como dos fragmentos (~1880 y ~800 pb). Se indican los tamanos de fragmentos en pares de bases. (B) Un unico ARN quimerico guia la escision catalizada por Cas9 del ADN de oligonucleotido protoespaciador cognado (protoespaciador 1 y protoespaciador 2). Se indican los tamanos de fragmentos en nucleotidos. (C) Representaciones esquematicas de los ARN quimericos usados en el experimento. Las secuencias de ARN quimerico A y B se muestran con la secuencia dirigida a ADN de protoespaciador 5' de crRNA (subrayado), la secuencia de union a tracrRNA de crRNA (sobrerrayado) y la secuencia derivada de tracrRNA (subrayado punteado).
Figura 28 (A) Representation esquematica del plasmido de expresion de GFP pCFJ127. La parte objetivo del marco de lectura abierto de GFP se indica con una punta de flecha negra. (B) Acercamiento de la secuencia de la region objetivo. Las secuencias objetivo de los ARN quimericos se muestran con barras grises. Los dinucleotidos de PAM tienen un recuadro. Un sitio de restriccion de Sall unico se ubica 60 pb antes del locus objetivo. (C) Izquierda: Las secuencias de ADN objetivo se muestran junto con sus motivos PAM adyacentes. Derecha: Secuencias de ARN guia quimericos. (D) pCFJ127 se escindio mediante Cas9 programada con ARN quimericos GFP1-5, segun se indica. El plasmido fue digerido adicionalmente con Sall y las reacciones se analizaron mediante electroforesis en un gel de agarosa al 3 % y se visualizaron mediante tincion con SYBR Safe.
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Conclusiones
Un mecanismo de interferencia de ADN se identifico, el cual implica una estructura de ARN dual que dirige una endonucleasa de Cas9 para introducir roturas de cadena doble espedficas del sitio en ADN objetivo. La protema Cas9 guiada por tracrRNA:crRNA utiliza dominios de endonucleasa distintos (dominios similares a RuvC y HNH) para escindir las dos cadenas en el ADN objetivo. El reconocimiento del objetivo mediante Cas9 necesita tanto una secuencia semilla en el crRNA y una secuencia PAM que contiene el dinucleotido GG adyacente a la region de union a crRNA en el ADN objetivo. Se demostro adicionalmente que la endonucleasa de Cas9 puede programarse con ARN guia modificado geneticamente como una transcripcion individual para dirigir y escindir cualquier secuencia de ADNcd de interes. El sistema es eficaz, versatil y programable mediante el cambio de la secuencia de union a ADN objetivo en el ARN quimerico guia. Las nucleasas de dedos de cinc y nucleasas efectoras similares al activador de transcripcion han generado un interes considerable como enzimas artificiales modificadas geneticamente para manipular genomas (35-38). Esto representa una metodologia alternativa basada en Cas9 programada por ARN que facilita las aplicaciones de direccionamiento genetico y edicion del genoma.
Referencias citadas
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Ejemplo 2: Edicion del genoma programada por ARN en celulas humanas.
Los datos proporcionados mas adelante demuestran que Cas9 puede expresarse y localizarse en el nucleo de celulas humanas, y que este se ensambla con ARN simple guia ("ARNsg"); que abarca las caracteristicas necesarias tanto para la union a Cas9 y el reconocimiento del sitio objetivo del ADN) en una celula humana. Estos complejos pueden generar roturas de doble cadena y estimular la reparacion de union de extremos no homologos (NHEJ) en ADN genomico en un sitio complementario a la secuencia de ARNsg, una actividad que requiere tanto Cas9 y el ARNsg. La extension de la secuencia de ARN en su extremo 3' mejora la actividad de direccionamiento de ADN en celulas vivas. Ademas, los experimentos que utilizan extractos de celulas transfectadas muestran que el ensamblaje de ARNsg en Cas9 es el factor limitante de la escision de ADN mediada por Cas9. Estos resultados demuestran que la edicion de genoma programada por ARN funciona en celulas vivas e in vivo.
MATERIALES Y METODOS
Diseno y construccion de plasmidos
La secuencia que codifica Cas9 de Streptococcus pyogenes (residuos 1-1368) fusionada a un epitopo de HA (secuencia de aminoacidos DAYPYDVPDYASL (SEQ ID NO:274)), una senal de localizacion nuclear (secuencia de aminoacidos PKKKRKVEDPKKKRKVD (SEQ ID NO:275)) se optimizo mediante codones para la expresion humana y se sintetizo por GeneArt. La secuencia de ADN es SEQ ID NO:276 y la secuencia de proteinas es SEQ ID NO:277. Se uso clonacion independiente de ligacion (LIC, por sus siglas en ingles) para insertar esta secuencia en GFP derivado de pcDNA3.1 y vectores LIC mCherry (vectores 6D y 6B, respectivamente, obtenidas de UC Berkeley MacroLab), lo cual dio como resultado fusiones Cas9-HA-NLS-GFP y Cas9-HA-NLS-mCherry expresadas bajo el control del promotor CMV. Los ARNsg guia se expresaron usando el vector de expresion pSilencer 2.1-U6 puro (Life Technologies) y pSuper (Oligoengine). Las construcciones de expresion de ARN se generaron mediante hibridacion de oligonucleotidos complementarios para formar la secuencia de ADN que codifica ARN y la ligacion del fragmento de ADN hibridado entre los sitios BamHI y HindIII en pSilencer 2.1-U6 puro y los sitios BglII y HindIII en pSUper.
Condiciones de cultivo celular y transfecciones de ADN
Las celulas HEK293T se mantuvieron en medio eagle modificado de Dulbecco (DMEM, por sus siglas en ingles) complementado con suero fetal bovino (FBS, por sus siglas en ingles) al 10 % en un incubador humidificado a 37 °C con CO2 al 5 %. Las celulas se transfectaron transitoriamente con ADN de plasmido con el Reactivo de Transfeccion de ADN X-tremeGENE (Roche) o el Reactivo de Transfeccion Turbofect (Thermo Scientific) con los protocolos recomendados. A grandes rasgos, las celulas HEK293T se transfectaron con una confluencia del 60-80 % en placas de 6 pocillos usando 0,5 |jg de plasmido de expresion de Cas9 y 2,0 |jg del plasmido de expresion de ARN. Las eficacias de transfeccion se estimaron en 30-50 % para Tubofect (Figuras 29E y 37A-B) y en 80-90 % para X- tremegene (Figura 31B), basandose en la fraccion de celulas GFP positivas observadas mediante microscopia fluorescente. 48 horas luego de la transfeccion, las celulas se lavaron con solucion salina amortiguada con fosfato (PBS) y se lisaron mediante la aplicacion de 250 jl de amortiguador de lisis (Hepes 20 mM con pH 7,5, cloruro de potasio 100 mM (KCl), cloruro de magnesio 5 mM (MgCh), ditiotreitol 1 mM (DTT), glicerol al 5 %, Triton X-100 al 0,1 %, complementado con coctel inhibidor de proteasa de Roche) y luego se mecieron durante 10 minutos a 4 °C. El lisado celular resultante se dividio en alicuotas para su analisis adicional. El ADN genomico se aislo a partir de 200 jl de lisado celular usando el Kit de Sangre y Tejido DNeasy (Qiagen) de acuerdo con el protocolo del fabricante.
Analisis de transferencia Western de la expresion de Cas9
HEK293T, transfectadas con plasmido de expresion Cas9-HA-NLS-GFP, se recogieron y se lisaron durante 48 horas luego de transfeccion como la anterior. 5 ul de lisado se sometieron a electroforesis en gel de poliacrilamida SDS al 10 %, se realizo inmunotransferencia en una membrana de PVDF y se sondo con anticuerpo anti-HA conjugado con HRP (Sigma, 1:1000 dilucion en 1x PBS).
Ensayo Surveyor
Se llevo a cabo el ensayo Surveyor como se describio previamente [10,12,13]. A grandes rasgos, el locus de cadena ligera ce clatrina humana A (CLTA) se amplifico mediante PCR a partir de 200 ng de ADN genomico usando polimerasa de alta fidelidad, ADN polimerasa de Fusion de Herculasa II (Agilent Technologies) y cebador directo 5'- GCAGCAGAAGAAGCCTTTGT-3' (SEQ ID NO://) y cebador inverso 5'-TTCCTCCTCTCCCTCCTCTC-3' (SEQ ID NO://). 300 ng del amplicon de 360 pb amplicon se desnaturalizo entonces mediante calentamiento a 95 °C y se rehibrido lentamente usando un bloque de calor para rehibridar aleatoriamente las cadenas de ADN mutantes y de tipo salvaje. Las muestras entonces se incubaron con nucleasa Cel-1 (Surveyor Kit, Transgenomic) durante 1 hora a 42 °C. Cel-1 reconoce y escinde helices de ADN que contienen mal apareamientos (hibridacion tipo
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Transcripcion in vitro
El ARN guia se transcribio in vitro usando ARN polimerasa T7 y una plantilla de ADN generada mediante la hibridacion de oligonucleotidos sinteticos complementarios como se describio previamente [14]. Los ARN se purificaron mediante electroforesis en gel de acrilamida desnaturalizado con urea 7 M, precipitacion en etanol y disolucion en agua tratada con DEPC.
Analisis de transferencia Northern
El ARN se purifico a partir de celulas HEK293T usando el kit de aislamiento de ARN pequeno mirVana (Ambion). Para cada muestra, 800 ng de ARN se separaron en un gel de PAGE-urea al 10 % luego de desnaturalizacion durante 10 min a 70°C en amortiguador de carga de ARN (0,5X TBE (pH 7,5), 0,5 mg/ml de azul bromofenol, 0,5 mg de xileno cianol y formamida al 47 %). Luego de la electroforesis a 10 W en 0,5X de amortiguador TBE hasta que la tinta azul bromofenol alcanzara el fondo del gel, las muestras se sometieron a electrotransferencia en una membrana Nytran a 20 volts durante 1,5 horas en 0,5X TBE. Los ARN transferidos se reticularon en membrana Nytran en reticulador UV (Strategene) y se prehibridaron a 45 °C durante 3 horas en amortiguador que contenia formamida al 40 %, 5X SSC, 3X Dernhardt (ficol, polivinilpirolidona y BSA, todos al 0,1 %) y 200 |jg/ml de ADN de esperma de salmon. Las membranas prehibridadas se incubaron durante la noche en el amortiguador de prehibridacion complementado con sonda oligo antisentido marcado con 32P en el extremo 5' a 1 millon de cpm/ml. Luego de varios lavados con amortiguador SSC (lavado final en 0,2X SCC), las membranas se sometieron a imaginologia de fosforo.
Ensayo de escision in vitro
Los lisados celulares se prepararon como se describio anteriormente y se incubaron con plasmido donante CLTA- RFP [10]. Las reacciones de escision se llevaron a cabo en un volumen total de 20 |jl y contenian 10 |jl de lisado, 2 |jl de 5x amortiguador de escision (HEPES 100 mM con pH 7,5, KCl 500 mM, MgCh 25 mM, DTT 5 mM, glicerol al 25 %) y 300 ng de plasmido. Cuando se indica, las reacciones se complementaron con 10 pmol de ARNsg CLTA1 transcrito in vitro. Las reacciones se incubaron a 37 °C durante una hora y luego se digirieron con 10 U de Xhol (NEB) durante 30 min adicionales a 37 °C. Las reacciones se detuvieron mediante la adicion de Proteinasa K (Thermo Scientific) y se incubaron a 37 °C durante 15 min. Los productos de escision se analizaron mediante electroforesis en un gel de agarosa al 1 % tenidos con SYBR Safe. La presencia de fragmentos de ~2230 y ~3100 pb es un indicador de la escision mediada por Cas9.
RESULTADOS
Para evaluar si Cas9 puede ser programada para escindir ADN genomico en celulas vivas, Cas9 se coexpreso junto con ARNsg disenado para dirigirse al gen de cadena ligera de clatrina humana (CLTA). El locus genomico de CLTA ha sido previamente el objetivo de y se edito usando ZFN [10]. Primero se evaluo la expresion de una version optimizada por codon humano de la proteina Cas9 de Streptococcus pyogenes y ARNsg en celulas HEK293T humanas. La proteina Cas9 de 160 kDa se expreso como proteina de fusion que portaba un epitopo de HA, una senal de localizacion nuclear (NLS) y una proteina fluorescente verde (GFP) unida al extremo C de Cas9 (Figura 29A). El analisis de celulas transfectadas con un vector que codifica la Cas9 fusionada a GFP revelo una expresion de Cas9 y localizacion nuclear abundantes (Figura 29B). La transferencia Western confirmo que la proteina Cas9 se expreso ampliamente intacta en extractos de esas celulas (Figura 29A). Para programar Cas9, se expreso ARNsg que portaba una secuencia de 20 nucleotidos en el extremo 5' complementaria a la secuencia de ADN objetivo, y una estructura de tallo bucle del extremo 3' de 42 nucleotidos necesaria para la union a Cas9 (Figura 29C). Esta secuencia del extremo 3' corresponde a la estructura de tallo-bucle minima que ha sido usada previamente para programar Cas9 in vitro [8]. La expresion de este ARNsg fue impulsada mediante el promotor U6 humano (polimerasa III de ARN) [11]. El analisis de transferencia Northern de ARN extraido de celulas transfectadas con vector de expresion de plasmido de ARNsg impulsado por promotor U6 mostro que el ARNsg se expresa realmente y su estabilidad se mejora mediante la presencia de Cas9 (Figura 29D).
La Figura 29 demuestra que la coexpresion de Cas9 y ARN guia en celulas humanas genera roturas de ADN de cadena doble en el locus objetivo. (A) Parte superior; diagrama esquematico de la construccion de expresion Cas9- HA-NLS-GFP. Parte inferior; el lisado de celulas HEK293T transfectadas con el plasmido de expresion Cas9 se analizo mediante transferencia Western usando un anticuerpo anti-HA. (B) Microscopia fluorescente de celulas HEK293T que expresan Cas9-HA-NLS-GFP. (C) Diseno de un ARN simple guia (ARNsg, es decir, un ARN dirigido a ADN de molecula simple) que se dirige al locus de CLTA humana. Parte superior; diagrama esquematico del sitio objetivo de ARNsg en el exon 7 del gen de CLTA humana. La secuencia objetivo que se hibrida al segmento guia de
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ARNsg de CLTA1 se indica como "ARNsg CLTA1". El motivo adyacente de protoespaciador (PAM) de dinucleotido GG esta marcado con una flecha. Las lmeas negras indican las regiones de union a ADN de la proteina ZFN de control. El codon de termninacion de traduccion del marco de lectura abierto de CLTA esta marcado con una linea punteada como referencia. Parte central; diagrama esquematico de la construccion de expresion de ARNsg. El ARN se expresa bajo el control del promotor Pol III U6 y un tracto poli(T) que sirve como senal de terminacion transcripcional Pol III. Parte inferior; escision guiada por ARNsg del ADN objetivo mediante Cas9. El ARNsg consiste en un segmento guia del extremo 5' de 20 nt seguido por una estructura de tallo-bucle de 42 nt necesarios para la union a Cas9. La escision mediada por Cas9 de las dos cadenas de ADN objetivo ocurre luego del despliegue del ADN objetivo y la formation de un duplex entre el segmento guia del ARNsg y del ADN objetivo. Esto depende de la presencia de un motivo PAM (adecuado para la Cas9 usada, por ejemplo, dinucleotido GG, ver el Ejemplo 1 anterior) en una position posterior a la secuencia objetivo en el ADN objetivo. Cabe destacar que la secuencia objetivo esta invertida en relation al diagrama superior. (D) Analisis de transferencia Northern de la expresion de ARNsg en celulas HEK239T. (E) Ensayo de nucleasa Surveyor de ADN genomico aislado de celulas HEK293T que expresan Cas9 y/o ARNsg de CLTA. Una construccion de ZFN previamente usada para dirigirse al locus de CLTA [10] se uso como control positivo para detectar la reparation del ADN inducida por DSB mediante la union de extremos no homologos.
Posteriormente se investigo si las DSB especificas del sitio se generan en celulas HEK293T transfectadas con Cas9-HA-NLS-mCherry y el ARNsg CLTA1. Para hacer eso, se sondeo en busqueda de inserciones y eliminaciones menores en el locus resultantes de reparacion imperfecta de NHEJ inducida por DSB utilizando el ensayo de nucleasa [12] Surveyor. La region de ADN genomico direccionado por Cas9:ARNsg se amplifica mediante PCR y los productos resultantes se desnaturalizan y rehibridan. Los productos de PCR rehibridados se incuban con la endonucleasa de reconocimiento de mal apareamiento Cel-1 y se resuelven en un gel de acrilamida para identificar la banda de escision Cel-1. Dado que la reparacion de ADN mediante NHEJ se induce normalmente mediante una DSB, una senal positiva en el ensayo Surveyor indica que ha ocurrido una escision de ADN genomico. Mediante este ensayo, se detecto escision del locus CLTA en una posicion dirigida por el ARNsg CLTA1 (Figura 29E). Un par de ZFN que direccionan un sitio vecino en el locus CLTA proporciono un control positivo en estos experimentos [10].
Para determinar si la expresion de Cas9 o de ARNsg es un factor limitante en las reacciones observadas de edition de genomas, los lisados preparados a partir de las celulas transfectadas se incubaron con ADN de plasmidos que contenian un fragmento del gen CLTA direccionado por el ARNsg CLTA1. No se observo escision de ADN de plasmidos tras la incubation con lisado preparado a partir de celulas transfectadas con el vector de expresion Cas9- HA-NLS-GFP por si solo, en conformidad con los resultados del ensayo Surveyor. No obstante, se detecto una escision potente de plasmidos cuando el lisado se complemento con ARNsg CLTA1 transcrito in vitro (Figura 30A). Adicionalmente, el lisado preparado a partir de celulas transfectadas con los vectores de expresion de Cas9 y ARNsg brindo soporte a la escision de plasmidos, mientras que los lisados de celulas transfectadas con el vector que codifica el ARNsg no lo hicieron (Figura 30A). Estos resultados sugieren que un factor limitante para la funcion de Cas9 en celulas humanas podria ser la union con el ARNsg. Se probo esta posibilidad directamente mediante el analisis de la escision de plasmidos en lisados de celulas transfectadas, como antes, en presencia y ausencia de ARNsg exogeno agregado. Cabe destacar que cuando se agrego ARNsg exogeno al lisado de celulas transfectadas con los vectores de expresion de Cas9 y ARNsg, se observo un aumento sustancial en la actividad de escision de ADN (Figura 30B). Este resultado indica que el factor limitante de la funcion de Cas9 en celulas HEK293T es la expresion del ARNsg o su carga en Cas9.
La Figura 30 demuestra que los lisados celulares contienen Cas9:ARNsg y brindan soporte a la escision de ADN especifica del sitio. (A) Los lisados de celulas transfectadas con el o los plasmidos que se indican a la izquierda se incubaron con ADN de plasmido que contenia un PAM y la secuencia objetivo complementaria al ARNsg CLTA1; donde se indica, la reaction se complemento con 10 pmol de ARNsg CLTA1 transcrito in vitro; la escision secundaria con Xhol genero fragmentos de ~2230 y ~3100 pb que indicaron escision mediada por Cas9. Una reaccion de control con lisado de celulas transfectadas con una construccion de expresion ZFN muestra fragmentos de tamano ligeramente diferente que reflejan el desplazamiento del sitio objetivo de ZFN en relacion con el sitio objetivo de CLTA1. (B) Los lisados de celulas transfectadas con el plasmido de expresion Cas9-GFP y, donde se indica, el plasmido de expresion de ARNsg CLTA1, se incubaron con ADN de plasmido objetivo tal como en (A) en ausencia o presencia de ARNsg CLTA1 transcrito in vitro.
Como un medio para potenciar la union de Cas9:ARNsg en celulas vivas, a continuation se probo el efecto de la extension de la region de union a Cas9 presumida del ARN guia. Se disenaron dos versiones nuevas del ARNsg CLTA1 para incluir seis a doce pares de bases adicionales en la helice que imita las interacciones de pares de bases entre crRNA y tracrRNA (Figura 31A). De manera adicional, el extremo 3' del ARN guia se extendio en cinco nucleotidos con base en la secuencia natural del tracrRNA [9] de S. pyogenes. Los vectores que codifican estos ARNsg extendidos en el extremo 3' bajo el control de los promotores Pol III H1 o U6 se transfectaron en celulas junto con el vector de expresion Cas9-HA-NLS-GFP y se evaluo la escision del genoma especifica del sitio mediante el ensayo Surveyor (Figura 31B). Los resultados confirmaron que la escision requeria Cas9 y el ARNsg CLTA1, pero no ocurria cuando Cas9 o el ARNsg se expresaban solos. Ademas, se observaron frecuencias sustancialmente aumentadas de NHEJ, segun se detecto mediante la escision de la nucleasa Cel-1, mientras que la frecuencia de la mutagenesis de NHEJ obtenida con el par de ZFN de control permanecio sin cambios.
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La Figura 31 demuestra que la extension 3' de las construcciones de ARNsg aumenta la mutagenesis espedfica del sitio mediada por NHEJ. (A) La construccion para la expresion de ARNsg CLTA1 (parte superior) se diseno para generar transcriptos que contuvieran la secuencia original de union a Cas9 (v1.0) o duplex de ARNcd extendidos en 4 pares de base (v2.1) o 10 pares de base (v2.2). (B) El ensayo de nucleasa Surveyor de ADN genomico aislado de celulas HEK293T que expresan Cas9 y/o ARNsg CLTA v1.0, v2.1 o v2.2. Una construccion de ZFN utilizada previamente para el direccionamiento del locus de CLTA [10] se utilizo como control positivo para detectar la reparacion de ADN inducida por DSB mediante recombination no homologa.
Los resultados proporcionan entonces el marco para la implementation de Cas9 como una herramienta molecular facil para diversas aplicaciones de edition genomica. Una caracteristica importante de este sistema es el potencial para programar Cas9 con multiples ARNsg en la misma celula, ya sea para aumentar la eficiencia del direccionamiento en un solo locus o como un medio para el direccionamiento de varios locus de manera simultanea. Dichas estrategias encontrarian una amplia aplicacion en experimentos a lo largo del genoma y esfuerzos de investigation a gran escala, tales como el desarrollo de modelos de enfermedades multigenicas.
Ejemplo 3: Familias de tracrRNA y Cas9 de sistemas inmunitarios de CRISPR-Cas de tipo II
Se buscaron todos los locus putativos de CRISPR-Cas de tipo II existentes en la actualidad en genomas bacterianos de dominio publico mediante la busqueda de secuencias homologas a Cas9, la proteina distintiva del sistema de tipo II. Se construyo un arbol filogenico de un alineamiento de multiples secuencias de los ortologos de Cas9 identificados. La longitud de repetition de CRISPR y la organization genica de los operones cas de los sistemas asociados de tipo II se analizaron en los diferentes subconjuntos de Cas9. Se propuso una subclasificacion de locus de tipo II y luego se dividio en subgrupos con base en la selection de 75 ortologos representativos de Cas9. Luego se predijeron secuencias de tracrRNA, principalmente extrayendo secuencias de repeticion de CRISPR y buscando antirrepeticiones dentro o alrededor de los genes de cas y configuraciones de CRISPR del locus de tipo II seleccionado. Se realizo un analisis comparativo de secuencias y estructuras previstas de ortologos de tracrRNA seleccionados. Finalmente, se determino la expresion y los perfiles de procesamiento de tracrRNA y crRNA de cinco especies bacterianas.
MATERIALES Y METODOS
Cepas bacterianas y condiciones de cultivo
Se utilizaron los siguientes medios para cultivar bacterias en placas: TSA (agar tripticasa de soja, Trypticase™ Soy Agar (TSA II) BD BBL, Becton Dickinson) complementada con sangre de oveja al 3 % para S. mutans (UA159) y agar BHI (infusion de cerebro y corazon, BD Bacto™ Brain Heart Infusion, Becton Dickinson) para L. innocua (Clipl 1262). Cuando se cultivo en cultivos liquidos, se utilizo el medio THY (caldo Todd Hewitt (THB, Bacto, Becton Dickinson) complementado con extracto de levadura al 0,2 % (Servabacter®) para S. mutans, caldo BHI para L. innocua, medio liquido BHI que contiene Vitamin-mix VX (Difco, Becton Dickinson) al 1 % para N. meningitidis (A Z2491), caldo MH (caldo Mueller Hinton, Oxoid) que incluye vitamin-mix VX al 1 % para C. jejuni (NCTC 11168; ATCC 700819) y TSB (caldo tripticasa-soja, caldo de soja BD BBL™ Trypticase™) para F. novicida (U112). Se incubo S. mutans a 37 °C, CO2 al 5 % sin agitar. Las cepas de L. innocua, N. meningitidis y F. novicida se cultivaron de manera aerobica a 37 °C sin agitar. C. jejuni se cultivo a 37 °C en condiciones microaerofilicas utilizando atmosfera camygen (Oxoid). Al crecimiento celular bacteriano le siguio la medicion de la densidad optica de los cultivos a 620 nm (DO620 nm) en intervalos regulares de tiempo haciendo uso de un lector de microplacas (BioTek PowerWave™).
Secuenciacion de bibliotecas de ARN bacteriano pequeno.
Se cultivaron C. jejuni NCTC 11168 (ATCC 700819), F. novicida U112, L. innocua Clip11262, N. meningitidis A Z2491 y S. mutans UA159 hasta la fase de crecimiento semilogaritmica y se extrajo el ARN total con TRIzol (Sigma- Aldrich). 10 |jg de ARN total de cada cepa se trataron con TURBO™ DNasa (Ambion) para quitar todo ADN genomico residual. Los ARN ribosomales se quitaron con Ribo-Zero™ rRNA Removal Kits® para bacterias gram- positivas o gram-negativas (Epicentre) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Luego de la purification con el kit de ARN Clean & Concentrator™-5 (Zymo Research), las bibliotecas se prepararon con el kit de preparation de bibliotecas de ARN pequeno ScriptMiner™ (Multiplex, compatible con Illumina®) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los ARN se trataron con pirofosfatasa acida de tabaco (TAP , por sus siglas en ingles) (Epicentre). Se utilizaron columnas de RNA Clean & Concentrator™-5 (Zymo Research) para la purificacion posterior de ARN y se utilizo la ADN polimerasa Phusion® High-Fidelity (New England Biolabs) para la amplification por PCR. Se agregaron a cada biblioteca codigos de barra especificos definidos por el usuario (cebadores de codigo de barras de secuenciacion de ARN (compatible con Illumina®) Epicentre) y las muestras se secuenciaron en las instalaciones de Next Generation Sequencing (CSF NGS Unit; en la web “csf.” seguido por “ac.at”) en el biocentro de Viena, Viena, Austria (Illumina single end sequencing).
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Las lecturas de secuenciacion de ARN se dividieron con la herramienta illumina2bam mediante (i) eliminacion de las secuencias de adaptador Illumina (cutadapt 1.0) y (ii) eliminacion de 15 nt en el extremo 3' para mejorar la calidad de las lecturas. Luego de la eliminacion de las lecturas menores que 15 nt, las lecturas de ADNc se alinearon con su genoma respectivo con Bowtie, permitiendole dos mal apareamientos: C. jejuni (GenBank: NC_002163), F. novicida (GenBank: Nc_008601), N. meningitidis (GenBank: NC_003116), L. innocua (GenBank: NC_003212) y S. mutans (GenBank: NC_004350). La cobertura de las lecturas se calculo para cada posicion de nucleotido de manera separada para ambas cadenas de ADN utilizando BEDTools-Version-2.15.0. Se creo un archivo wiggle normalizado que contenia cobertura en lectura por millon (rpm, por sus siglas en ingles) y se visualizo con la herramienta Integrative Genomics Viewer (IGV) ("www." seguido de "broadinstitute.org/igv/") (Figura 36). Se calculo la proporcion de lecturas mapeadas con SAMTools flagstat80 en un total de 9914184 lecturas mapeadas para C. jejuni, 48205 lecturas para F. novicida, 13110087 lecturas para N. meningitidis, 161865 lecturas para L. innocua y 1542239 lecturas para S. mutans. Se creo un archivo que contenia la cantidad de lecturas que comenzaban (5') y terminaban (3') en cada posicion de nucleotido, y se visualizo en IGV. Para cada ortologo de tracrRNA y crRNA, la cantidad total de lecturas obtenidas se calculo utilizando SAMtools.
Construccion de arbol guia, alineamiento de multiples secuencias y analisis de secuencias de Cas9
Se utilizo el programa de busqueda de iteracion en posicion especifica (PSI)-BLAST para obtener homologos de la familia Cas9 en la base de datos no redundante NCBI. Se descartaron las secuencias con menos de 800 aminoacidos. El programa BLASTClust configurado con un corte de cobertura de longitud de 0,8 y se uso un umbral de cobertura de puntaje (puntuacion dividida entre la longitud de alineamiento) de 0,8 para agrupar las secuencias restantes (Figura 38). Este procedimiento produjo 78 grupos (48 de los cuales estaban representados unicamente por una secuencia). Se selecciono uno (o rara vez pocos representativos) de cada grupo y se construyo un alineamiento multiple para estas secuencias mediante el programa MUSCLE con parametros predefinidos, seguido por una correccion manual sobre la base de alineamientos locales obtenida mediante los programas PSI-BLAST y HHpred. Algunas secuencias mas eran no alineables y tambien se excluyeron de los alineamientos finales. Los bloques alineados de manera confiable con 272 posiciones informativas se utilizaron para la reconstruccion de arboles con maxima similitud mediante el programa FastTree con los parametros predefinidos: modelo evolucionario JTT, modelo gamma discreto con 20 categorias de puntaje. El mismo programa se utilizo para calcular los valores bootstrap.
La Figura 38 ilustra secuencias que se agruparon de acuerdo con el programa de agrupacion BLASTclust. Unicamente se seleccionaron para el analisis BLASTclust las secuencias mayores que 800 aminoacidos (vease Materiales y Metodos). Se utilizaron cepas representativas que contenian genes ortologos de cas9. Algunas secuencias que no se agruparon, pero se verificaron como secuencias de Cas9 debido a la presencia de motivos conservados y/u otros genes de cas en su cercania inmediata.
Analisis de locus de CRISPR-Cas
Las secuencias de repeticion de CRISPR se obtuvieron de la base de datos de CRISPRdb o se predijeron con la herramienta CRISPRFinder (Grissa I et al., BMC Bioinformatics 2007; 8:172; Grissa I et al., Nucleic Acids Res 2007). Los genes cas se identificaron con el algoritmo BLASTp y/o se verificaron con la base de datos KEGG (en internet "www." seguido por kegg.jp/).
Prediccion y analisis simulados de ortologos de tracrRNA
Las antirrepeticiones putativas se identificaron con el software de Vector NTI® (Invitrogen) mediante la busqueda de secuencias de repeticion adicionales y redundantes que no pertenecian a la configuracion de repeticion-espaciador en ambas cadenas de los genomas respectivos, lo cual permitio hasta 15 mal apareamientos. Los promotores transcripcionales y los terminadores independientes de rho se predijeron con el programa BDGP Neural Network Promoter Prediction ("www." seguido por fruitfly.org/seq_tools/promoter.html) y el software TransTermHP, respectivamente. Los multiples alineamientos de secuencias se realizaron con el programa MUSCLE con parametros predefinidos. Se analizaron los alineamientos en busqueda de la presencia de motivos de estructura conservada con el algoritmo RANalifold del paquete de Vienna RNA 2.0.
RESULTADOS
Los sistemas de CRISPR-Cas de tipo II son generalizados en las bacterias.
Ademas del ADN codificador de tracrRNA y la configuracion de repeticion-espaciador, los locus de CRISPR-Cas de tipo II estan compuestos normalmente de tres a cuatro genes de cas organizados en un operon (Figura 32A-B). Cas9 es la proteina distintiva caracteristica de tipo II y esta involucrada en los pasos de expresion e interferencia. Cas1 y Cas2 son proteinas nucleares compartidas por todos los sistemas CRISPR-Cas y estan implicadas en la adquisicion de espaciadores. Csn2 y Cas4 estan presentes unicamente en un subconjunto de sistemas de tipo II y
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se sugiere que desempenaban un rol en la adaptacion. Para extraer una cantidad maxima de locus de CRISPR-Cas de tipo II que contuvieran tracrRNA, primero se filtraron genomas del dominio publico en busqueda de secuencias homologas a proteinas Cas9 ya comentadas. Se identificaron 235 ortologos de Cas9 en 203 especies bacterianas. Se selecciono un conjunto de 75 secuencias representativas de todos los ortologos de Cas9 extraidos para un analisis posterior (Figura 32, Figura 38 y Materiales y Metodos)
La Figura 32 ilustra (A) un arbol filogenico de secuencias representativas de Cas9 de varios organismos, asi como (B) arquitectura representativa del locus de Cas9. Se indican los valores bootstrap calculados para cada nodo. Las ramas del mismo color representan subgrupos seleccionados de ortologos similares de Cas9. Se muestran para cada subgrupo la longitud de repeticion de CRISPR en nucleotidos, el tamano promedio de la proteina Cas9 en aminoacidos (aa) y la arquitectura de consenso del locus. *- gi|116628213 **- gi|116627542 f- gi|34557790 f- gi|34557932. El tipo II-A esta caracterizado por cas9- csx12, casl, cas2, cas4. El tipo II-B esta caracterizado por cas9, casl, cas2 seguido por una variante de csn2. El tipo II-C esta caracterizado por un operon conservador de cas9, casl, cas2 (vease tambien la Figura 38).
A continuation, se realizo un alineamiento de multiples secuencias de los ortologos de Cas9 seleccionados. El analisis comparativo revelo grandes diversidades en la composition de los aminoacidos y el tamano de las proteinas. Los ortologos de Cas9 comparten unicamente unos cuantos aminoacidos identicos y todas las secuencias extraidas tienen la misma arquitectura de dominio con un dominio central de endonucleasa HNH y dominio partido de RuvC/RNasaH. La longitud de las proteinas Cas9 se encuentra en el intervalo de 984 (Campylobacter jejuni) a 1629 (Francisella novicida) aminoacidos con tamanos tipicos de ~1100 o ~1400 aminoacidos. Debido a la gran diversidad de secuencias Cas9, especialmente en la longitud de las regiones entre dominios, se seleccionaron unicamente posiciones informativas bien alineadas del alineamiento preparado para reconstruir un arbol filogenico de las secuencias analizadas (Figura 32 y Materiales y metodos). Los ortologos de Cas9 se agruparon en tres grupos monofileticos principales con secuencias atipicas. La topologia observada del arbol de Cas9 se encuentra en consonancia con la clasificacion actual de locus de tipo II, donde los tipos II-A y II-B definidos anteriormente formaban grupos separados y monofileticos. Para caracterizar adicionalmente los grupos, se examinaron en detalle las composiciones de operones de cas y las secuencias de repeticion de CRISPR de todas las cepas enumeradas.
La subagrupacion de Cas9 refleja la diversidad de la arquitectura de locus de CRISPR-Cas de tipo II
Un analisis mas profundo de los locus de tipo II seleccionados revelo que la subagrupacion de secuencias de ortologos de Cas9 se correlaciona con la diversidad de la longitud de repeticiones de CRISPR. Para la mayoria de los sistemas de CRISPR-Cas de tipo II, la longitud de repeticion es de 36 nucleotidos (nt), con algunas variaciones en dos de los subgrupos de arbol Cas9. En el grupo de tipo II-A (Figura 32) que comprende locus que codifica el ortologo de Cas9 largo, anteriormente llamado Csx12, las repeticiones de CRISPR tienen 37 nt de longitud. El pequeno subgrupo compuesto por secuencias de bacterias que pertenecian al phylum Bacteroidetes (Figura 32) esta caracterizado por repeticiones de CRISPR inusualmente largas, con un tamano de 48 nt. Ademas, se noto que la subagrupacion de secuencias de Cas9 se correlaciona con distintas arquitecturas de operones de cas, segun se ilustra en la Figura 32. El tercer subgrupo mayor (Figura 32) y el locus atipico (Figura 32) consisten principalmente en el operon minimo compuesto de los genes cas9, cas1 y cas2, con una exception de algun locus incompleto que se analiza mas adelante. Todos los otros locus de los dos primeros grupos mayores estan asociados con un cuarto gen, principalmente cas4, especifico al tipo II-A o similar al csn2, especifico al tipo II-B (Figura 32). Se identificaron los genes que codificaban variantes mas cortas de la proteina Csn2, Csn2a, dentro de locus similares a CRISPR01 de S. pyogenes y CRISPR3 de S. thermophilus de tipo II-B (Figura 32). Se hallo que la variante mas larga de Csn2, Csn2b, estaba asociada con locus similares al CRISPR1 de S. thermophilus de tipo II-B (Figura 32). Curiosamente, se identificaron genes putativos de cas adicionales que codificaban proteinas sin similitud de secuencia aparente a variantes de Csn2 descritas anteriormente. Una de esas proteinas sin caracterizar estaba asociada de manera exclusiva a locus de tipo II-B de especies de Mycoplasma (Figura 32 y Figura 33). Se encontro que otras dos estaban codificadas en locus de tipo II-B de especies de Staphylococcus (Figura 33). En todos los casos, la diversidad de la arquitectura del operon cas es, entonces, consistente con la subagrupacion de secuencias de Cas9. Estas caracteristicas, junto con la topologia general del arbol de Cas9 dividido en tres grupos monofileticos mayores y distintivos, llevaron a proponer una nueva y posterior division del sistema CRISPR-Cas de tipo II en tres subtipos. El tipo II-A esta asociado con Cas9 y Cas4 similares a Csx12, el tipo II-B esta asociado con similar a Csn2 y el tipo II-C unicamente contiene el conjunto minimo de los genes de cas9, cas1 y cas2, segun se muestra en la Figura 32.
La figura 33 ilustra la arquitectura de CRISPR-Cas de tipo II de especies bacterianas seleccionadas. Las barras verticales agrupan los locus que codifican los ortologos de Cas9 que pertenecen al mismo subgrupo de arbol (comparar con la Figura 32). Barra negra horizontal, secuencia lider; rectangulos y rombos negros, configuration de repeticion-espaciador. Las antirrepeticiones previstas estan representadas por flechas que indican la direction de la transcription del ortologo de tracrRNA putativo. Notese que para los locus que no se verificaron de manera experimental, se considera aqui que la configuracion de repeticion-espaciador de CRISPR esta transcrita de la misma cadena que el operon cas. La direccion de la transcripcion del ortologo de tracrRNA putativo se indica de manera acorde.
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Los locus de tipo II seleccionados anteriormente con base en los 75 ortologos representativos de Cas9 se estudiaron en busqueda de ortologos de tracrRNA putativos. El analisis previo realizado sobre una cantidad restringida de secuencias de tracrRNA revelo que ni las secuencias de tracrRNA ni su ubicacion dentro del locus de CRISPR-Cas paredan estar conservadas. No obstante, segun se menciono anteriormente, los tracrRNA tambien estan caracterizados por una secuencia de antirrepeticion capaz de formar pares de bases con cada una de las repeticiones de pre-crRNA para formar duplex de repeticion tracrRNA:precrRNA que son escindidos por RNasa III en presencia de Cas9. Para predecir tracrRNA novedosos, se saco ventaja de esta caracteristica y se utilizo el siguiente flujo de trabajo: (i) analizar en busqueda de antirrepeticiones potenciales (formacion de pares de bases de secuencias con repeticiones de CRISPR) dentro del locus de CRISPR-Cas, (ii) seleccionar antirrepeticiones ubicadas en las regiones intergenicas, (iii) validar los pares de bases antirrepeticion:repeticion de CRISPR y (iv) predecir promotores y terminadores transcripcionales independientes de rho asociados con los tracrRNA identificados.
Para analizar en busqueda de antirrepeticiones putativas, se extrajeron secuencias de repeticion de la base de datos de CRISPRdb o, cuando la informacion no estaba disponible, se predijeron las secuencias de repeticion con el software CRISPRfinder. En el estudio previo, se demostro de manera experimental que la direccion de la transcripcion de la configuration de repeticion-espaciador variaba entre locus, en comparacion con la del operon cas. Aqui, el analisis de secuenciacion de ARN confirmo esta observation. En algunos de los locus analizados, a saber en F. novicida, N. meningitidis y C. jejuni, la configuracion de repeticion-espaciador esta transcrita en la direccion opuesta al operon cas (ver la section "La secuenciacion profunda de ARN valida la expresion de ortologos novedosos de tracrRNA" y Figuras 33 y 34), mientras que en S. pyogenes, S. mutans, S. thermophilus y L. innocua, la configuracion y el operon cas se transcriben en la misma direccion. Estos son los unicos datos de expresion de la configuracion de repeticion-espaciador de tipo II disponibles a la fecha. Para predecir la direccion de la transcripcion de otras configuraciones de repeticion-espaciador, se considero la observacion anterior de acuerdo con cuales de las ultimas repeticiones de las configuraciones se mutan de manera usual. Este comentario esta de acuerdo con el modelo actual de adquisicion de espaciadores, en el cual normalmente la primera repeticion de la configuracion esta duplicada tras la insertion de la secuencia de espaciador durante la fase de adaptation. Para 37 configuraciones espaciadoras de repeticion, se pudo identificar la repeticion mutada en el extremo putativo de las configuraciones. Se observo que la orientation prevista de la transcripcion para la configuracion de repeticion-espaciador de N. meningitidis y C. jejuni seria opuesta a la orientacion determinada de manera experimental (secuenciacion de ARN y analisis de transferencia Northern). Dado que la orientacion prevista no es coherente dentro de los grupos, y dado que en la mayoria de los casos se pudo detectar promotores potenciales en ambos extremos de las configuraciones, se considero que las transcripciones de las configuraciones de repeticion-espaciador estaban en la misma direccion que la transcripcion del operon cas, si no se validaba lo contrario.
La Figura 34 ilustra el coprocesamiento de tracrRNA y pre-crRNA en sistemas de tipo II de CRISPR Cas seleccionados. Se muestran arquitecturas de locus de CRISPR con direcciones y posiciones verificadas de transcripcion de tracrRNA y pre-crRNA. Secuencias superiores, repeticiones de pre-crRNA; secuencias inferiores, secuencias de tracrRNA con pares de base con repeticiones de crRNA. Se indican con cabezas de flecha los sitios de procesamiento de ARN putativos segun se revelaron mediante secuenciacion de ARN. Para cada locus, los tamanos de las cabezas de flecha representan las cantidades relativas de los extremos 5' y 3' extraidos (ver tambien la Figura 37).
La Figura 37 enumera todos los ortologos de tracrRNA y los crRNA maduros extraidos mediante secuenciacion de las especies bacterianas estudiadas, inclusive coordenadas (region de interes) y secuencias de ADNc correspondientes (5' a 3'). Las flechas representan la direccion transcripcional (cadena). Se indica la cantidad de lecturas de ADNc (calculadas con SAMtools), numeros de cobertura (porcentaje de lecturas mapeadas) y extremos predominantes asociados con cada transcripto. Se presenta la cantidad de lecturas que comienzan o terminan en cada position de nucleotido alrededor de los extremos 5' y 3' de cada transcripto. Se indican los tamanos de cada forma madura de crRNA. El numero designado a cada especie de crRNA corresponde a la posicion de la secuencia espaciadora en el pre-crRNA, de acuerdo con la CRISPRdb. El numero designado a cada especie de tracrRNA corresponde a formas diferentes de la misma transcripcion.
Luego se analizaron los locus seleccionados de CRISPR-Cas, inclusive las secuencias ubicadas 1 kb anterior y posterior en ambas cadenas, en busqueda de posibles secuencias de repeticion que no pertenecieran a la configuracion de repeticion-espaciador, permitiendo hasta 15 mal apareamientos. En promedio, se encontraron una a tres secuencias de repeticion redundantes por locus que corresponderian a antirrepeticiones de ortologos de tracrRNA y se seleccionaron las secuencias ubicadas dentro de las regiones intergenicas. Las antirrepeticiones putativas se encontraron en cuatro ubicaciones tipicas: anteriores al gen cas9, en la region entre cas9 y casl, y anteriores o posteriores a la configuracion de repeticion-espaciador (Figura 33). Para cada secuencia extraida se valido la extension de pares de base formados entre la repeticion y la antirrepeticion (Figura 44) mediante la prediction de la posible interaction ARN:ARN y enfocandose en especial en candidatos con regiones complementarias largas y perfectas que formaran una estructura bicatenaria para el procesamiento de la RNasa III. Para predecir promotores y terminadores transcripcionales que flanquearan la antirrepeticion, se establecio que los
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sitios de inicio y terminacion de la transcripcion putativa estuvieran incluidos dentro de una region ubicada, como maximo, 200 nt en direccion anterior y 100 nt en direccion posterior a la secuencia de antirrepeticion, respectivamente, con base en observaciones anteriores26. Segun se menciono anteriormente, falta informacion experimental sobre la direccion de transcripcion de la mayoria de las configuraciones de repeticion-espaciador de los sistemas de tipo II. Los algoritmos de prediction simulada de promotores a menudo arroja resultados falsos positivos y apunta a promotores putativos que llevarian a la transcripcion de configuraciones de repeticion-espaciador de ambas cadenas. En algunos casos no se pudieron predecir terminadores transcripcionales, aunque la expresion del ortologo de tracrRNA se pudiera validad experimentalmente, segun lo ejemplifica el locus de C. jejuni (ver la section "La secuenciacion profunda de ARN valida la expresion de ortologos novedosos de tracrRNA"). Se sugiere considerar las predicciones de promotor y terminador transcripcional unicamente como una etapa de apoyo, mas no esencial, de la guia descrita anteriormente.
La Figura 44 ilustra los pares de bases de antirrepeticion previstos repeticion:tracrRNA de pre-crRNA en especies bacterianas seleccionadas. bLos locus de CRISPR que pertenecen al sistema CRISPR-Cas de tipo II (Nmeni/CASS4). La nomenclatura es conforme a la base de datos de CRISPR (CRISPRdb). Notese que S. thermophilus LMD-9 y W. succinogenes contienen dos locus de tipo II. cSecuencia superior, secuencia de consenso de repetition de pre-crRNA (5' a 3'); secuencia inferior, secuencia homologa de tracrRNA hibridada a la repetition (antirrepeticion; 3' a 5'). Notese que se otorga la secuencia de repeticion con base en la presuncion de que la configuration de repeticion-espaciador de CRISPR se transcribe de la misma cadena que el operon cas. Para las secuencias que se validaron de manera experimental en este estudio, los datos de secuenciacion de ARN se tomaron en cuenta para determinar los pares de base. Vease la Figura 33. dSe identificaron dos antirrepeticiones posibles en el locus de tipo II-A de F. tularensis subsp. novicida, W. succinogenes y gamma proteobacterium HTCC5015. Apareamiento de secuencias superior, antirrepeticion dentro de la secuencia lider putativa; apareamiento de secuencias inferior, antirrepeticion posterior de la configuracion de repeticion-espaciador. Vease la Figura 33. eSe identificaron dos antirrepeticiones posibles en el locus de tipo II-A de S. wadsworthensis. Apareamiento de secuencias superior, antirrepeticion; apareamiento de secuencias, antirrepeticion dentro de la secuencia lider putativa. Ver Figura 33. fSe identificaron dos antirrepeticiones posibles en el locus de tipo II-B de L. gasseri. Apareamiento de secuencias superior, antirrepeticion anterior a cas9; apareamiento de secuencias inferior, antirrepeticion entre los genes cas9 y casl. Ver la Figura 33. gSe identificaron dos antirrepeticiones posibles en el locus de tipo II-C de C. jejuni. Apareamiento de secuencias superior, antirrepeticion anterior a cas9; apareamiento de secuencias inferior, antirrepeticion posterior de la configuracion de repeticion-espaciador. Ver la Figura 33. hSe identificaron dos antirrepeticiones posibles en el locus de tipo II-C de R. rubrum. Apareamiento de secuencias superior, antirrepeticion anterior a la configuracion de repeticion-espaciador; apareamiento de secuencias inferior, antirrepeticion anterior a casl. Vease la Figura 33.
Una pletora de ortologos de tracrRNA
Se predijeron los ortologos putativos de tracrRNA de 56 de los 75 locus seleccionados anteriormente. Los resultados de las predicciones se muestran en la Figura 33. Segun se menciono, la direccion de la transcripcion de tracrRNA indicada en esta figura es hipotetica y basada en la direccion indicada en la transcripcion de la configuracion de repeticion-espaciador. Tal como se menciono anteriormente, las secuencias que codifican ortologos putativos de tracrRNA se identificaron en position anterior, interna y posterior del operon cas, asi como en una position posterior a las configuraciones de repeticion-espaciador, inclusive las secuencias lideres putativas que se encuentran comunmente en los locus de tipo II-A (Figura 33). No obstante, se observo que las antirrepeticiones de ubicacion similar dentro de locus de CRISPR-Cas pueden transcribirse en direcciones diferentes (segun se observo al comparar, por ejemplo, Lactobacillus rhamnosus y Eubacterium rectale o Mycoplasma mobile y S. pyogenes o N. meningitidis) (Figura 33). Cabe destacar que los locus agrupados dentro de un mismo subgrupo del arbol guia de Cas9 comparten una arquitectura comun con respecto a la posicion del gen codificador de tracrRNA. Se identificaron antirrepeticiones alrededor de la configuracion de repeticion-espaciador en locus de tipo II-A, y mayormente anterior al gen cas9 en los tipos II-B y II-C con varias excepciones notables para el tracrRNA putativo ubicado entre cas9 y casl en tres subgrupos distintos de tipo II-B.
Algunos locus de CRISPR-Cas de tipo II tienen ortologos de tracrRNA y/o configuraciones de repeticion- espaciador defectuosas
Para seis locus de tipo II (Fusobacterium nucleatum, Aminomonas paucivorans, Helicobacter mustelae, Azospirillum sp., Prevotella ruminicola y Akkermansia muciniphila), se identificaron antirrepeticiones potenciales con pares de bases debiles a la secuencia de repeticion o ubicadas dentro de los marcos de lectura abiertos. Cabe destacar que en estos locus, se identificaron: una antirrepeticion debil dentro del marco de lectura abierto del gen que codifica una ATPasa putativa en A. paucivorans, una antirrepeticion fuerte dentro de los primeros 100 nt del gen cas9 en Azospirillum sp. B510 y una antirrepeticion fuerte superpuesta tanto con cas9 como con casl en A. muciniphila (Figura 33). No se pudo detectar ninguna antirrepeticion putativa para doce locus adicionales (Peptoniphilus duerdenii, Coprococcus catus, Acidaminococcus intestini, Catenibacterium mitsuokai, Staphylococcus pseudintermedius, Ilyobacter polytropus, Elusimicrobium minutum, Bacteroides fragilis, Acidothermus cellulolyticus, Corynebacterium diphteriae, Bifidobacterium longum y Bifidobacterium dentium). No hay informacion disponible sobre la expresion y el procesamiento de pre-crRNA en estos locus de CRISPR-Cas. Por lo tanto, queda por abordar
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la funcionalidad de los sistemas de tipo II ante la ausencia de un ortologo de tracrRNA claramente definido. En siete locus analizados no se pudo identificar ninguna configuracion de repeticion-espaciador (Parasutterella excrementihominis, Bacillus cereus, Ruminococcus albus, Rhodopseudomonas palustris, Nitrobacter hamburgensis, Bradyrhizobium sp. y Prevotella micans) (Figura 33) y en tres de ellos (Bradyrhizobium sp. BTAi1, N. hamburgensis y B. cereus) se detecto cas9 como ungen unico sin otros genes cas en su proximidad. Para tres locus, no se pudo predecir ninguna secuencia de ARN pequeno anterior o posterior al gen cas9. En el caso de R. albus y P. excrementihominis, el contigo genomico que contiene cas9 es demasiado corto para permitir la prediction de la configuracion de repeticion-espaciador.
La secuenciacion profunda de ARN valida la expresion de ortologos novedosos de tracrRNA
Para verificar las predicciones simuladas de tracrRNA y determinar los patrones de coprocesamiento de tracrRNA:pre-crRNA, se analizaron mediante secuenciacion profunda los ARN de bacterias gram-positivas (S. mutans y L. innocua) y gram-negativas (N. meningitidis, C. jejuni y F. novicida) seleccionadas. Se extrajeron las secuencias de ortologos de tracrRNA y los crRNA procesados (Figura 36 y Figura 37). De acuerdo con datos de secuenciacion de tracrRNA de S. pyogenes26 diferenciales publicados anteriormente, los ortologos de tracrRNA estaban representados en gran medida en las bibliotecas, en el intervalo de 0,08 a 6,2 % del total de las lecturas mapeadas. Los tracrRNA procesados tambien eran mas abundantes que las transcripciones principales, en un intervalo de 66 % a mas de 95 % de la cantidad total de lecturas de tracrRNA (Figura 36 y Figura 37).
La Figura 36 muestra la expresion de ortologos bacterianos de tracrRNA y crRNA revelados mediante secuenciacion profunda de ARN. Los perfiles de expresion de los ortologos de tracrRNA y crRNA de cepas bacterianas seleccionadas se representan a lo largo de los genomas correspondientes mediante diagramas de barras (las imagenes se capturaron de la herramienta de Integrative Genomics Viewer (IGV)). Campylobacter jejuni (GenBank: NC_002163), Francisella novicida (GenBank: NC_008601), Neisseria meningitidis (GenBank: NC_003116), Listeria innocua (GenBank: NC_003212) y Streptococcus mutans (GenBank: NC_004350). Se proporcionan coordenadas genomicas. aLa cobertura de secuencia se calculo con BEDTools-Version-2.15.0 (escala dada en lecturas por millon). bSe indica la distribution de lecturas que comienza (5') y finaliza (3') en cada position de nucleotido (escala dada en cantidad de lecturas). Los paneles superiores corresponden a transcriptos de la cadena positiva y los paneles inferiores corresponden a transcriptos de la cadena negativa. Los picos y valores de cobertura negativos que se presentan bajo los ejes indican la transcription de la cadena negativa del genoma. Se graficaron los extremos 5' y 3' predominantes de las lecturas para todos los ARN. Notese que, dada la baja calidad de la biblioteca de ADNc de L. innocua, las lecturas se acotaron para crRNA y se observa una acumulacion de las lecturas en el extremo 3' de tracrRNA, segun se presume, debido a la degradation de ARN.
Para evaluar los extremos 5' de las transcripciones principales de tracrRNA, se analizo la abundancia de todas las lecturas de los extremos 5' de tracrRNA y se extrajeron las lecturas mas prominentes anteriores o cerca del extremo 5' de la secuencia de antirrepeticion prevista. Los extremos 5' de ortologos de tracrRNA se confirmaron posteriormente con el algoritmo de prediccion de promotores. Los extremos 5' identificados de tracrRNA de S. mutans, L. innocua y N. meningitidis se correlacionaron con predicciones simuladas y analisis de transferencia Northern de expresion de tracrRNA26. El extremo 5' mas prominente de tracrRNA de C. jejuni se identifico en el medio de la secuencia de antirrepeticion. Cinco nucleotidos en la direction anterior, se detecto un extremo 5' adicional putativo con la prediccion simulada y que proporcionaba mayor secuencia de interaccion con la secuencia de repetition de CRISPR. Se extrajo una cantidad relativamente baja de lecturas de la biblioteca de F. novicida que corresponden casi exclusivamente a transcriptos procesados. Los analisis de la pequena cantidad de lecturas de transcriptos principales proporcionaron un extremo 5' que correspondia a las fuertes predicciones simuladas de promotor. El sondeo de la transferencia Northern de tracrRNA de F. novicida confirmo ademas la validez de las predicciones que mostraban la baja abundancia de transcriptos de alrededor de 90 nt de longitud. Los resultados se enumeran en la Tabla 2. Para todas las especies analizadas, salvo N. meningitidis, los transcriptos principales de tracrRNA se identificaron como especies unicas de ARN pequeno de 75 a 100 nt de longitud. En el caso de N. meningitidis, se encontro una forma primaria predominante de tracrRNA de ~110 nt y un transcripto putativo mas largo de ~170 nt representadas por una cantidad muy baja de lecturas y detectadas previamente como una banda debil mediante analisis de transferencia Northern.
Tabla 2. Ortologos de tracrRNA seleccionados
Cepasa
Transcrip Extremo 5’b Extremo 3’c Longitud (nt)
Secuenciacion de ARN
Previsto
Primera Lectura
Mas Prominente
S. pyogenes SF370
primaria - 854 546 - 854 376 171
primaria
- 854 464 - 89
procesada
- 854 450 - ~75
C. jejuni
primaria 1 455 497 1 455 502 1 455 497 1 455 570 ~75
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NCTC 11168
procesada - 1 455 509 - ~80
L. innocua Clip11262
primaria 2 774 774 2 774 774 2 774 773 2 774 863 ~90
procesada
- 2 774 788 - ~75
S. mutans UA159
primaria 1 335 040 1 335 040 1 355 039 1 335 141 ~100
procesada
- 1 335 054 1 335 062 - ~85 ~80
N. meningitidis A Z2491
primaria 614 158 614 162 614 154 614 333 ~175
primaria
614 223 614 225 614 223 ~110
procesada
- 614 240 - ~90
F. novicida U112
primaria 817 144 - 817145 817154 817 065 ~80
procesada
- 817 138 817 128 - ~75 ~65
S. thermophilus LMD-9
primaria - - 1 384 330 1 384 425 ~95
primaria
- - 646 654 646 762 ~110
P. multocida Pm70
primaria - - 1 327 287 1 327 396 ~110
M. mobile 163K
primaria - - 49 470 49 361 ~110
aLos ortologos de S. termophilus, P.multocida y M. mobile se predijeron de manera simulada.
bSecuenciacion se ARN, revelado mediante secuenciacion de ARN (Tabla S3); primera lectura, primera posicion del extremo 5' ex^da mediante secuenciacion; mas predominante hacia el extremo 5' segun los datos de secuenciacion de ARN; previsto, prediction simulada del sitio de inicio de transcription; subrayado, extremo 5' elegido para alinear el tracrRNA primario.
cExtremo 3' estimado de acuerdo con datos de secuenciacion de ARN y prediccion de terminador transcripcional.
Los sitios de coprocesamiento de tracrRNA y pre-crRNA se encuentran en la region de antirrepeticion:repeticion
Se examinaron las transcripciones de tracrRNA procesadas mediante analisis de extremos 5' de tracrRNA abundantes dentro de la secuencia de antirrepeticion prevista y de extremos 3' de crRNA maduros abundantes (Figuras 34 y 35). En todas las especies, se identificaron los extremos 5' prominentes de ortologos de tracrRNA que podrian resultar del coprocesamiento de los duplex de repetition de tracrRNA:pre-crRNA mediante RNasa III. Tambien se identificaron los extremos 5' procesados de crRNA que probablemente resultan de un segundo evento de maduracion a traves de reduction putativa, consistente con observaciones anteriores. Cabe destacar, en los pares de ARN estrechamente relacionados de S. pyogenes, S. mutans y L. innocua, se observo el mismo sitio de procesamiento alrededor del par de bases G:C en el medio de la secuencia de antirrepeticion. Tanto en S. mutans como en L. innocua, se detectaron extremos 5' de tracrRNA adicionales prominentes y extremos 3' de crRNA que podria sugerir una reduccion adicional del duplex tracrRNA:crRNA, donde el extremo 3' de crRNA se acorta adicionalmente a la reduccion del extremo 5' ya mencionada, luego del primer evento de procesamiento catalizado por RNasa III. De manera similar, en C. jejuni se encontro solo una pequena cantidad de extremos 3' de crRNA que se amoldarian a los patrones de procesamiento de la RNasa III y se extrajeron los extremos 5' correspondientes de tracrRNA procesado. De esta forma, la reduccion putativa de duplex tracrRNA:crRNA luego de la escision inicial mediante RNasa III daria como resultado una parte mas corta derivada por repeticion en crRNA maduros, lo que produciria duplex mas cortos de tracrRNA:crRNA estabilizados por un triple par de bases G:C para la interaction con la endonucleasa Cas9 y posterior escision de ADN objetivo. El duplex de ARN de N. meningitidis parece estar procesado en dos sitios principales mas hacia el extremo 3' de la repeticion de CRISPR, lo que da como resultado una parte mas larga derivada por repeticion en crRNA maduro y una interaccion estable de ARN:ARN a pesar de la protuberancia central dentro del duplex. Curiosamente, el duplex de tracrRNA:pre-crRNA de F. novicida parece estar escindido dentro de la region de baja complementariedad y parte de los extremos 5' abundantes de tracrRNA sugiere su reduccion adicional sin reduccion concomitante de crRNA. Las diferencias de tamanos de transcriptos principales y de la ubicacion de sitios de procesamiento dan como resultado longitudes varias de tracrRNA
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procesados en un intervalo de ~65 a 85 nt. Las coordenadas y tamano de los transcriptos de tracrRNA procesados prominentes se muestran en la Tabla 2 y en la Figura 37. Los patrones de procesamiento de tracrRNA y crRNA observados se encuentran en consonancia con el modelo propuesto anteriormente de dos eventos de maduracion. La reduccion adicional putativa de parte de los extremos 5' de tracrRNA y extremos 3' de crRNA podria resultar del segundo evento de maduracion o, de manera alternativa, ser un artefacto de la preparation de la biblioteca de ADNc o secuenciacion de ARN. La naturaleza de estos procesamientos aun debe investigarse mas a fondo.
Las secuencias de ortologos de tracrRNA son muy diversas
Tambien se determinaron las similitudes de secuencias de ortologos seleccionados de tracrRNA. Se realizaron multiples alineamientos de secuencia de transcripciones principales de tracrRNA de S. pyogenes (solo la forma de 89 nt), S. mutans, L. innocua y N. meningitidis (solo la forma de 110 nt), S. thermophilus, P. multocida y M. mobile (Tabla 2, Figura 35). Se observo gran diversidad en secuencias de tracrRNA pero una conservation significativa de secuencias de locus altamente relacionados de CRISPR-Cas. Los tracrRNA de L. innocua, S. pyogenes, S. mutans y S. thermophiles comparten un promedio de 77 % de identidad y los tracrRNA de N. meningitidis y P. multocida comparten 82 % de identidad de acuerdo con alineamientos en pares. La identidad promedio de las secuencias analizadas de tracrRNA es de 56 %, comparable a la identidad de secuencias aleatorias de ARN. Esta observation confirma ademas que la prediction de ortologos de tracrRNA con base en la similitud de secuencias puede realizarse unicamente en el caso de locus altamente relacionados. Tambien se busco una posible conservacion de estructura de tracrRNA pero no se pudo encontrar ninguna similitud significativa, salvo una covariation y estructura de terminador transcripcional conservada (Figura 35).
La Figura 35 ilustra la diversidad de secuencia de los ortologos de tracrRNA. Multiples alineamientos de secuencia de tracrRNA. S. thermophilus y S. thermophilus2, tracrRNA asociado con ortologos de Cas9 de la SEQ ID NO:41 y la SEQ ID NO:40, segun corresponda. Negro, altamente conservada; gris oscuro, conservada; gris claro, no muy conservada. La estructura de consenso prevista se representa en la parte superior del alineamiento. Las flechas indican las covariaciones de nucleotidos. Los tracrRNA de S. pyogenes SF370, S. mutans UA159, L. innocua Clipl 1262, C. jejuni NCTC 11168, F. novicida U112 y N. meningitidis A Z2491 se validaron mediante secuenciacion de ARN y analisis de transferencia Northern. El tracrRNA LMD-9 de S. thermophiles se valido mediante analisis de transferencia Northern. El tracrRNA de P. multocida Pm70 se previo a partir de una alta similitud del locus de CRISPR-Cas con el de N. meningitidis A Z2491. El tracrRNA de M. mobile 163K se previo en simulation a partir de fuertes predicciones de terminador y promotor transcripcional.
Ejemplo 4: Adaptation de CRISPR como una plataforma guiada por ARN para el control especifico de la secuencia de expresion genica
La regulation direccionada en una escala genomica es una estrategia poderosa para el cuestionamiento, la perturbation y la modification genetica de sistemas celulares. Los inventores han desarrollado un nuevo metodo para controlar la expresion genica, con base en Cas9, una endonucleasa de ADN guiada por ARN de un sistema de CRISPR de tipo II. Este ejemplo demuestra que una Cas9 cataliticamente muerta, sin actividad de endonucleasa, al coexpresarse con un ARN guia, genera un complejo de reconocimiento de ADN que puede interferir de manera especifica con la elongation transcripcional, la union de ARN polimerasa o la union del factor de transcription. Este sistema, llamado interferencia CRISPR (CRISPRi), puede reprimir eficientemente la expresion de genes direccionados en Escherichia coli sin efectos detectables fuera del objetivo. La CRISPRi puede utilizarse para reprimir multiples genes objetivo de manera simultanea, y sus efectos son reversibles. Ademas, el sistema puede adaptarse para la represion genica en celulas de mamifero. Esta plataforma de reconocimiento de ADN guiada por ARN proporciona un enfoque simple para perturbar de manera simple la expresion genica a escala genomica.
MATERIALES Y METODOS
Cepas y medios
La cepa MG1655 de Escherichia coli K-12 se utilizo como la cepa huesped para medidas de fluorescencia in vivo. Se utilizo una cepa derivada de MG1655 de E. coli que expresa de manera endogena una variante de RNAP con una etiqueta de epitopo 3x-FLAG unida al extremo C de la subunidad RpoC para todos los experimentos de secuenciacion. Se utilizo el medio definido EZ Rich (EZ-RDM, Teknoka) como medio de cultivo para ensayos de fluorescencia in vivo. La transformation y la verification de transformation genetica se realizaron mediante protocolos estandar, con genes AmpR, CmR o KanR como marcadores seleccionables.
Construccion de plasmidos y clonacion del genoma de E. coli
Los genes Cas9 y dCas9 se clonaron de los vectores descritos anteriormente pMJ806 y pMJ841, respectivamente. Los genes se amplificaron por PCR y se insertaron en un vector que contenia un promotor inducible por anhidrotetraciclina (aTc) PLtetO-1, un marcador seleccionable de cloranfenicol y un origen de replication p15A. La plantilla de ARNsg se clono en un vector que contenia un promotor minimo sintetico (J23119) con un sitio de inicio de la transcripcion comentado, un marcador seleccionable de ampicilina y un origen de replicacion de ColE1. Se
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utilizo PCR inversa para generar casetes de ARNsg con regiones complementarias de 20 pb nuevas. Para insertar genes indicadores fluorescentes en genomas de E. coli, el gen de fluorescencia se clono primero en un vector de entrada, el cual se amplifico despues por PCR para generar fragmentos de ADN linealizados que contenian secuencias UTR 5'/3' nsfA, el gen fluorescente y un marcador seleccionable de KanR. La cepa MG1655 de E. coli se transformo con un plasmido sensible a la temperatura pKD46 que contenia protemas de recombinacion A-Red (Exo, Beta y Gamma). Los cultivos celulares se cultivaron a 30 °C a una DO (600 nm) de ~ 0,5 y se agrego arabinosa al 0,2 % para inducir la expresion de las proteinas de recombinacion A-Red durante 1 hora. Las celulas se cosecharon a 4 °C y se utilizaron para la transformacion de fragmentos de ADN linealizados mediante electroporacion. Las celulas que contienen inserciones genomicas correctas se seleccionaron con 50 |jg/mL de kanamicina.
Citometria de flujo y analisis
Las cepas se cultivaron en EZ-RDM con 100 jg/mL de carbencilina y 34 jg/mL de cloranfenicol en placas profundas de 96 pocillos de 2 mL (Costar 3960) durante la noche a 37 °C y 1200 r.p.m. Se agrego entonces un |jL de este cultivo durante la noche a 249 jL de EZ-RDM fresco con las mismas concentraciones antibioticas con 2 jM de aTc complementado para inducir la produccion de la proteina dCas9. Tras el cultivo de las celulas hasta la fase logaritmica (~4h), se determinaron los niveles de proteina fluorescente con el citometro de flujo LSRII (BD Biosciences) equipado con un muestrario de alto rendimiento. Las celulas se muestrearon con una velocidad de flujo baja hasta que se hubieran recolectado al menos 20.000 celulas. Los datos se analizaron con FSC Express (De Novo Software) mediante el control de canales en una region poligonal que contenia una poblacion de celulas del 60 % en el lado de aspersion delantera de la grafica de dispersion. Para cada experimento, se midieron los cultivos triplicados y luego se indico la desviacion estandar como la barra de error.
Ensayo de B-galactosidasa
Para realizar el ensayo de p-galactosidasa, se agrego 1 jL del cultivo durante la noche preparado segun antecede a 249 jL de EZ-RDM fresco con las mismas concentraciones antibioticas con 2 jM de aTc, con o sin isopropil p-D-1- tiogalactopiranosido (IPTG) 1 mM. Las celulas se cultivaron hasta la fase logaritmica. Se midio la actividad de LacZ de 100 uL de este cultivo con el kit de ensayo de p-galactosidasa de levadura (Pierce), siguiendo las instrucciones.
Extraccion y purificacion de ARN total
Para cada muestra, se cultivo un cultivo monoclonal de E. coli a 37 °C desde una DO (600 nm) de 0,1 en 500 mL de EZ-RDM hasta la fase logaritmica temprana (DO 0,45 ± 0,05), punto en que las celulas se cosecharon mediante filtracion sobre filtros de nitrocelulosa de 0,22 jm (GE) y se congelaron en nitrogeno liquido para detener, de manera simultanea, todo progreso transcripcional. Las celulas congeladas (100 jg) se pulverizaron en un molino mezclador Qiagen TissueLyser II 6 veces a 15 Hz durante 3 minutos en presencia de 500 jL de amortiguador de lisis congelado (Tris 20 mM con pH 8, Triton X-100 al 0,4 %, NP-40 al 0,1 %, NH4Cl 100 mM, 50 U/mL de SUPERase4n (Ambion) y 1x coctel inhibidor de proteasa (Complete, EDTA-free, Roche), complementado con MnCh 10 mM e inhibidor de transcripcion Tagetin 15 jM (Epicentre).
El lisado se volvio a suspender en hielo mediante pipeteado. Se agrego RQ1 DNasa I (110 U en total, Promega) y se incubo durante 20 minutos en hielo. La reaccion se inactivo con EDTA (25 mM final) y el lisado se aclaro a 4 °C mediante centrifugado a 20.000 g durante 10 minutos. El lisado se cargo en una columna PD MiniTrap G-25 (GE Healthcare) y se eluyo con amortiguador de lisis complementado con EDTA 1 mM.
Purificacion total de ARNm
El ARN total se purifico del lisado aclarado con el kit miRNeasy (Qiagen). Se mezclo 1 jg de ARN en 20 jL de Tris 10 mM con pH 7 con un volumen igual de solucion de fragmentacion alcalina 2x (EDTA 2 mM, Na2CO3 10 mM, NaHCO3 90 mM, pH 9,3) y se incubo durante ~25 minutos a 95 °C para generar fragmentos en un intervalo de 30100 nt. La reaccion de fragmentacion se detuvo anadiendo 0,56 mL de solucion de precipitacion helada (NaOAc 300 mM con pH 5,5 mas GlycoBlue (Ambion)) y el ARN se purifico mediante una precipitacion de isopropanol estandar. El ARNm fragmentado luego se desfosforilo en una reaccion de 50 jL con 25 U T4 PNK (NEB) en 1x amortiguador PNK (sin ATP) mas 0,5 U de SUPERase4n y se precipito con GlycoBlue mediante metodos estandar de precipitacion de isopropanol.
Purificacion de ARN naciente
Para la purificacion de ARN naciente, se agrego el lisado aclarado a 0,5 mL de gel de afinidad anti-FLAG M2 (Sigma Aldrich) segun se describio anteriormente. El gel de afinidad se lavo dos veces con amortiguador de lisis y se complemento con EDTA 1 mM previo a la incubacion con el lisado aclarado a 4 °C durante 2,5 horas con nutacion. Se lavo la inmunoprecipitacion a 4 x 10 ml con amortiguador de lisis complementado con KCl 300 mM, y se eluyo el RNAP unido dos veces con amortiguador de lisis complementado con EDTA 1 mM y 2 mg/mL de peptido 3x-FLAG (Sigma Aldrich). El ARN naciente se purifico del eluido con el kit miRNeasy (Qiagen) y se convirtio en ADN con un protocolo preestablecido de generacion de bibliotecas.
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Preparacion de bibliotecas de ADN y secuenciacion de ADN
La biblioteca de ADN se secuencio en Illumina HiSeq 2000. Se procesaron las lecturas con el paquete HTSeq Python y otro software personalizado escrito en Python. El extremo 3' de la transcripcion secuenciada se alineo con el genoma de referencia con Bowtie (“bowtie-bio” antes de “.sourceforge.net") y los perfiles de RNAP generados en MochiView (“johnsonlab.ucsf” antes de “.edu/mochi.html”).
Diseno de plasmidos y construccion para CRISPRi en celulas humanas
La secuencia que codifica Cas9 optimizada por codon de mamifero de Streptococcus pyogenes (ADN 2.0) se fusiono con tres secuencias de localizacion nuclear (NLS) SV40 del extremo C o a tagBFP flanqueado por dos NLS. Usando clonacion independiente de ligacion estandar se clonaron estas dos proteinas de fusion en MSCV-Puro (Clontech). Los ARNsg gma se expresaron usando un vector de expresion basado en U6 lentiviral derivado de pSico que coexpresa mCherry a partir de un promotor CMV. Los plasmidos de expresion de ARNsg se clonaron mediante la insercion de cebadores hibridados en el vector de expresion basado en U6 lentiviral que se digirio mediante BstXI y Xhol.
Cultivo celular, transfecciones de ADN y mediciones de fluorescencia para CRISPRi en celulas humanas
Se mantuvieron celulas HEK293 en medio eagle modificado de Dulbecco (DMEM) en FBS al 10 %, glutamina 2mM, 100 unidades/mL de estreptomicina y 100 |jg/mL de penicilina. Las celulas HEK293 se infectaron con un GFP que expresaba un retrovirus MSCV usando los protocolos estandar y se clasificaron mediante citometria de flujo usando bD FACS Aria2 para la expresion de GFP estable. Las celulas HEK293 que expresaban GFP se transfectaron transitoriamente usando reactivo de transfeccion T ransIT-LT 1 (Mirus) con el protocolo recomendado por el fabricante en placas de 24 pocillos usando 0,5 jg del plasmido de expresion de dCas9 y 0,5 jg del plasmido de expresion de ARN (con 0,25 jg de plasmido indicador de GFP para la Figura 45B). 72 horas luego de la transfeccion, las celulas se tripsinizaron a una suspension celular individual. El vector U6 contiene un promotor CMV constitutivo que impulsa un gen mCherry. La expresion de GFP se analizo usando una maquina BD LSRII FACS mediante el control de canales en las poblaciones positivas a mCherry (mCherry >10 veces mas brillante en comparacion con celulas de control negativo).
ARN disenados
Disenos de ARNsg usados en las figuras: solamente se enumera la region coincidente de 20 nucleotidos (segmento dirigido a ADN) (a menos que se especifique lo contrario):
Los ARNsg dirigidos a mRFP usados en la Figura 40C (SEQ ID NO:741-746);
Los ARNsg dirigidos al promotor usados en la Figura 40d (SEQ ID NOs:747-751);
Secuencia de promotor objetivo en la Figura 40D (SEQ ID NO:752);
Los ARNsg dirigidos a mRFP usados en la Figura 43B (SEQ ID nOs:753-760);
Los ARNsg dirigidos a sfGFP (gfp) usados en la Figura 42B (SEQ ID NO:761);
Los ARNsg dirigidos a sfGFP usados en la Figura 43B (SEQ ID NO:762-769);
Los experimentos de direccionamiento de ARNsg dobles en la Figura 43F y la Figura 51 (SEQ ID NOs:770-778); Los ARNsg dirigidos al operon lac usados en la Figura 44B (SEQ ID NO:779-787); y Los ARNsg dirigidos a EGFP usados en la Figura 45 (SEQ ID NO:788-794).
Tabla 3. Secuencias usadas en las figuras^ del Ejemplo 4 (enumeradas anteriormente)
Secuencia
SEQ ID N.°: Secuencia SEQ ID N.°: Secuencia SEQ ID N.°:
T1
741 R2 771 crp 783
T2
742 R3 772 cya 784
T3
743 R4 773 Sitio A 785
NT1
744 R5 774 Sitio O 786
NT2
745 R6 775 Sitio P 787
NT3
746 R7 776 eT1 788
P1
747 R8 777 eT2 789
P2
748 R9 778 eNT1 790
P3
749 lacZ 779 eNT2 791
P4
750 lacI 780 eNT3 792
P5
751 lacY 781 eNT4 793
R1
770 lacA 782 eNT5 794
RESULTADOS
El sistema CRISPR (repeticiones palindromicas cortas agrupadas y regularmente espaciadas) proporciona una nueva plataforma potencial para la regulacion genetica objetivo. Alrededor del 40 % de las bacterias y el 90 % de las
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arqueas poseen sistemas CRISPR/asociados con CRISPR (Cas) para otorgar resistencia a elementos externos al ADN. Los sistemas CRISPR usan ARN de pares de bases pequenos para dirigirse y escindir elementos de ADN extranos de una manera espedfica de secuencia. Hay diferentes sistemas CRISPR en diferentes organismos, y uno de los mas simples es el sistema CRISPR tipo II de Streptococcus pyogenes: un unico gen que codifica la proteina Cas9 y dos ARN, un ARN de CRISPR maduro (crRNA) y un ARN regulador en trans (tracrRNA) complementario, son necesarios y suficientes para el silenciamiento guiado por ARN de ADN extrano (Figura 46). La maduracion de crRNA necesita tracrRNA y RNasa III. Sin embargo, este requerimiento puede superarse mediante el uso de un ARN guia pequeno (ARNsg) modificado geneticamente que contiene una horquilla disenada que imita el complejo tracrRNA-crRNA. La formacion de pares de bases entre el ARNsg y el ADN objetivo produce roturas de cadena doble (DSB) debido a la actividad de endonucleasa de Cas9. La especificidad de union se determina mediante la formacion de pares de bases de ARNsg-ADN y un motivo de ADN corto (motivo adyacente a protoespaciador, o PAM, secuencia: NGG) yuxtapuesto a la region de complementariedad del ADN. Por lo tanto, el sistema CRISPR solo necesita un conjunto minirno de dos moleculas-la proteina Cas9 y el ARNsg, y, por lo tanto, mantiene el potencial de ser usado como una plataforma de direccionamiento genetico independiente del hospedador. Se ha demostrado que Cas9/CRISPR puede aprovecharse para la edicion del genoma guiada por ARN selectiva del sitio (Figura 39A).
La Figura 46 muestra el mecanismo del sistema CRISPR tipo II a partir de S. pyogenes. El sistema consiste en un conjunto de proteinas asociadas a CRISPR (Cas) y un locus de CRISPR que contiene una matriz de secuencias espaciadoras de repeticion. Todas las repeticiones son iguales y todos los espaciadores son diferentes y complementarios a las secuencias de ADN objetivo. Cuando la celula se infecta mediante elementos de ADN extranos, el locus de CRISPR se transcribira en un transcripto de precursor largo, el cual se escindira en fragmentos mas pequenos. La escision esta mediada por un ARN antisentido regulador en trans (tracrRNA) y la RNasa III hospedadora. Luego de la escision, una unica proteina, Cas9, reconoce y se une a la forma escindida del crRNA. Cas9 guia el crRNA al ADN y escanea la molecula de ADN. El complejo se estabiliza mediante la formacion de pares de bases entre el crRNA y el ADN objetivo. En este caso, Cas9 produce la rotura del ADN de cadena doble debido a su actividad de nucleasa. Esto usualmente elimina las moleculas de ADN cognado y las celulas confieren inmunidad a ciertas poblaciones de ADN.
La Figura 39 muestra el diseno del sistema de interferencia de CRISPR (CRISPRi). (A) El sistema de interferencia minima consiste en una unica proteina y una quimera disenada de ARNsg . El ARNsg quimerico consiste en tres dominios (region recuadrada): una region complementaria de 20 nucleotidos (nt) para la union especifica al ADN, una horquilla de 42 nt para la union a Cas9 (asa de Cas9) y un terminador de la transcripcion de 40 nt derivado de S. pyogenes. La proteina Cas9 de tipo salvaje contiene la actividad de nucleasa. La proteina dCas9 posee actividad de nucleasa deficiente. (B) La proteina Cas9 de tipo salvaje se une al ARNsg y forma un complejo de ARN y proteina. El complejo se une a objetivos de ADN especificos mediante formacion de pares de bases de Watson-Crick entre el ARNsg y el objetivo de ADN. En el caso de Cas9 de tipo salvaje, el ADN se escindira debido a la actividad de nucleasa de la proteina Cas9. En el caso de nucleasa deficiente en Cas9, el complejo impide la transcripcion adecuada.
Un sistema CRISPRi mmimo consiste en una unica proteina y ARN y puede silenciar eficazmente la elongacion y el inicio de la transcripcion
Para implementar dicha plataforma CRISPRi en E. coli, el gen Cas9 de S. pyogenes de tipo salvaje y un ARNsg se expresaron a partir de vectores bacterianos para determinar si el sistema podria interrumpir la expresion genica en un locus objetivo (Figura 40A). El sistema CRISPR de S. pyogenes es ortogonal al sistema de E. coli natural. La proteina Cas9 se expresa a partir de un promotor inducible por anhidrotetraciclina (aTc) en un plasmido que contiene un origen de replicacion p15A, y el ARNsg se expresa a partir de un promotor consitutivo minimo en un plasmido que contiene un origen de replicacion ColEI. Como estrategia alternativa, un mutante Cas9 cataliticamente muerto (dCas9), que es deficiente en escision de ADN, se uso y se demostro que esta forma de Cas9 todavia actua como un complejo de union a ADN guiado por ARN simple.
La Figura 40 demuestra que CRISPRi silencia eficazmente la elongacion e inicio de la transcripcion. (A) El sistema CRISPRi consiste en una proteina Cas9 inducida y una quimera disenada de ARNsg. La dCas9 contiene mutaciones de los dominios de nucleasa HNH y RuvCI. La quimera disenada de ARNsg contiene tres dominios funcionales como se describe en la Figura 1. (B) Secuencia de ARNsg disenada (NT1) y el objetivo de ADN. NT1 se dirige a la cadena de ADN que no es la plantilla de la region codificante de mRFP. Solo se muestra la region que rodea el motivo de pares de bases (20 nt). Los nucleotidos en pares de bases estan numerados y la horquilla de union a dCas9 esta sobrerrayada. La secuencia PAM esta subrayada. (C) CRISPRi bloqueo la elongacion de transcripcion de una manera especifica de la cadena. Un sistema indicador basado en fluorescencia sintetica que contiene un gen codificante de mRFP se inserto en el genoma de MG1655 de E. coli (el locus de nsfA). Seis ARNsg que se unen ya sea a la cadena de ADN plantilla o la cadena de ADN que no es plantilla se coexpresaron con la proteina dCas9, con sus efectos en el mRFP objetivo medido por ensayo de fluorescencia in vivo. Solamente los ARNsg que se unen a la cadena de ADN no plantilla mostraron el silenciamiento (10~300 veces). El control muestra fluorescencia de las celulas con proteina dCas9 pero sin el ARNsg. (D) CRISPRi bloqueo el inicio de la transcripcion. Se disenaron cinco ARNsg para unirse a diferentes regiones alrededor de un promotor de E. coli (J23119). El sitio de inicio de la
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transcripcion se marco como +1. El ovalo punteado muestra el complejo RNAP inicial que cubre una region de 75 pb desde -55 hasta +20. Solamente los ARNsg que se dirigen a regiones dentro del complejo RNAP inicial mostraron represion (P1-P4). A diferencia del bloqueo de elongacion de la transcripcion, el silenciamiento fue independiente de la cadena de ADN objetivo. (E) La regulacion de CRISPRi era reversible. Tanto dCas9 como ARNsg (NT1) estaban bajo el control de un promotor inducible por aTc. El cultivo celular se mantuvo durante la fase exponencial. En el momento T = 0, 1 |jM de aTc se agrego a celulas con una DO = 0,001. La represion del mRFP objetivo comenzo dentro de un periodo de 10 min. La senal de fluorescencia decrecio de una manera consistente con el crecimiento celular, lo cual sugiere que la disminucion se debia a la division celular. En 240 min, la fluorescencia alcanzo el nivel completamente reprimido. En T = 370 min, aTc se lavo del medio de cultivo y las celulas se diluyeron de nuevo a DO = 0,001. La fluorescencia comenzo a aumentar luego de 50 min, y le llevo alrededor de 300 min aumentar al mismo nivel que el control positivo. Control positivo: siempre sin el inductor; control negativo: siempre con un inductor aTc 1 jM. Los resultados de fluorescencia en 2C, 2D y 2E representan el promedio y EEM de al menos tres replicados biologicos. Veanse tambien la Figura 47 y la Figura 48.
Cada molecula de ARNsg coexpresadas con Cas9 consiste en tres segmentos: una region complementaria especifica del objetivo de 20 nucleotidos (nt), una horquilla de union a Cas9 de 42 nt (asa de Cas9) y un terminador de la transcripcion de 40 nt derivado de S. pyogenes (Figura 40B). Un sistema de gen indicador basado en proteina fluorescente roja (mRFP) se inserto en el genoma MG1655 de E. Coli.
La coexpresion de proteina Cas9 de tipo salvaje y un ARNsg (NT1) dirigido a la secuencia codificante de mRFP disminuyo dramaticamente la eficacia de transformacion, probablemente debido a las roturas de cadena doble inducidas por Cas9 en el genoma (Figura 47A). La secuenciacion de unas pocas colonias sobrevivientes mostro que todas tenian los mismos reagrupamientos alrededor del sitio de mRFP objetivo en el genoma, lo cual sugiere que hubo una seleccion fuerte contra la expresion de Cas9 de tipo salvaje y un ARNsg dirigido a una secuencia hospedadora. El gen mutante dCas9 (no escindido), que contenia dos mutaciones de silenciamiento de los dominios de nucleasa HNH y RuvC1 (D10A y H841A), alivio este caracter letal, como se verifico mediante las tasas de eficacia de transformacion y de crecimiento de E. coli (Figura 47A y B).
La Figura 47 se relaciona con la Figura 40 y muestra las curvas de crecimiento de cultivos celulares de E. coli cotransformados con dCas9 y ARNsg. (A) Eficacia de transformacion para transformar celulas de E. coli con dos plasmidos. Un plasmido contiene un ARNsg que se dirige a una copia genomica de mRFP y el otro plasmido contiene la Cas9 de tipo salvaje o dCas9. La cotransformacion de Cas9 de tipo salvaje y ARNsg es altamente toxica, lo cual puede aliviarse usando dCas9. (B) El ARNsg (NT1) se diseno para dirigirse a la secuencia codificante de mRFP. La coexpresion de dCas9 y ARNsg casi no presenta efectos en las tasas de crecimiento celular, lo cual sugiere que la interaccion entre dCas9-ARNsg y ADN es lo suficientemente fuerte como para bloquear la ARN polimerasa pero no la ADN polimerasa o la replicacion celular. Los resultados representan el promedio y EEM de al menos tres experimentos independientes.
Para evaluar si el complejo de dCas9:ARNsg puede producir una represion altamente eficiente de la expresion genica, los ARNsg complementarios a diferentes regiones de la secuencia codificante de mRFP se disenaron, unidos ya sea a la cadena de ADN plantilla o a la cadena de ADN que no es plantilla. Los resultados indicaron que los ARNsg que se dirigen a la cadena de ADN que no es plantilla presentaron silenciamiento genico eficaz (10 a 300 veces la represion), mientras que los que se dirigen a la cadena plantilla mostraron un efecto muy inferior (Figura 40C). El sistema presento efectos de represion similares para los genes que estaban dentro del genoma de E. coli o en un plasmido con alto numero de copias (Figura 48). Ademas, el direccionamiento hacia la region del promotor tambien lleva a un silenciamiento genico eficaz (Figura 40D). El direccionamiento del ARNsg a la caja -35 inactivo significativamente la expresion genica (P1, ~100 veces de represion), mientras que el direccionamiento a otras regiones adyacentes mostro un efecto disminuido (P2-P4). El direccionamiento hacia las secuencias alrededor de 100 pb en una posicion anterior a la del promotor no mostro efectos (P5). A diferencia de la secuencia codificante, cuando se produce el direccionamiento al promotor, la eficacia de silenciamiento es independiente de la cadena de ADN; el direccionamiento de las cadenas de plantilla y las que no son plantilla es igualmente eficaz (P2 y P3).
La Figura 48 esta relacionada con la Figura 40C y muestra que CRISPRi puede silenciar la expresion de un gen indicador en un plasmido de multiples copias. El gen de mRFP se clono en un plasmido p15A. La presencia de dCas9 y un ARNsg especifico de mRFP (NT1) reprime de manera potente mRFP (~300 veces). El efecto de represion es similar al observado usando la mRFP en el genoma (Figura 40C). El silenciamiento es solamente eficaz cuando el ARNsg actua en la cadena de ADN que no es plantilla pero no en la cadena de ADN plantilla (T1). Tambien, el silenciamiento es altamente especifico, dado que un ARNsg especifico de GFP 3 (gfp) no muestra efectos en la expresion de mRFP. Los resultados de fluorescencia representan el promedio y EEM de al menos tres replicados biologicos.
La inactivacion de genes mediante CRISPRi es inducible y reversible
A diferencia de los metodos de inactivacion genetica, una ventaja de usar la inactivacion basada en CRISPRi de la expresion genica es el hecho de que esta perturbacion deberia ser reversible. Para evaluar si la regulacion de CRlSPRi podria inducirse y revertirse subsiguientemente, tanto dCas9 como ARNsg especifico de mRFP (NT1) se
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colocaron bajo el control del promotor inducible por aTc, y se llevaron a cabo mediciones de transcurso de tiempo de la regulacion mediada por cRlSPRi de mRFP en respuesta a inductores (Figura 40E). En el momento cero, el cultivo celular que crecio hasta la fase exponencial temprana sin inductores se complemento con 1 |jM de aTc. Los datos indican que el sistema podria responder rapidamente a la presencia de inductores - la senal de la proteina indicadora fluorescente comenzo a disminuir dentro de un periodo de 10 min desde la adicion de la molecula inductora. Dado que la proteina de mRFP es estable, la tasa de la disminucion de la senal de fluorescencia es limitada por la disolucion de la proteina debido al crecimiento celular, como se observa mediante un tiempo de duplicacion celular similar y la perdida de la semivida de fluorescencia (ambos ~36 min). A los 240 min, todas las celulas se reprimieron uniformemente al mismo nivel que el control negativo. A los 420 min, el inductor se lavo del medio de cultivo y las celulas se diluyeron de nuevo a una DO inferior. Luego de un retraso de 50 min, la fluorescencia de mRFP comenzo a aumentar. Tomo un total de 300 min para que la fluorescencia de una celula simple aumentara al mismo nivel que el control positivo. Es muy probable que el retraso de 50 min este determinado por la desviacion de la tasa de reemplazo de dCas9/ARNsg mediante la disolucion por crecimiento y division celular. En resumen, estos resultados demuestran que los efectos de silenciamiento de dCas9/ARNsg pueden ser inducidos y reversibles.
La secuenciacion del transcripto de elongacion natural (NET-Seq) confirma que CRISPRi funciona mediante el bloqueo de la transcripcion
dCas9 parecia funcionar como un complejo de union de ADN guiado por ARN que podria bloquear la union de ARN polimerasa (RNAP) durante la elongacion de transcripcion. Dado que la cadena de ADN que no es plantilla comparte la misma identidad de secuencia que el ARNm transcripto y solamente los ARNsg que se unen al ADN que no es plantilla presentan silenciamiento, es todavia una posibilidad que el complejo dCas9:ARNsg interactua con ARNm y altera su traduccion o estabilidad. Para distinguir estas posibilidades, un abordaje descrito recientemente de secuenciacion del transcripto de elongacion natural (NET-seq) se aplico a E. coli, lo cual podria usarse para perfilar de manera global las posiciones de las polimerasas de ARNsg elongadas y se monitorea el efecto del complejo dCas9:sgRNA en la transcripcion. En este metodo NET-Seq, el sistema CRISPRi se transformo en una cepa derivada de MG1655 de E. coli que contenia una RNAP marcada con FLAG. El CRISPRi contenia un ARNsg (NT1) que se une a la region codificante de mRFP. La inmunopurificacion in vitro de la RNAP marcada seguida por secuenciacion de los transcriptos nacientes asociados con RNAP elongadas permitio distinguir los sitios de pausa de RNAP.
Estos experimentos demostraron que el ARNsg indujo una pausa transcripcional fuerte en una posicion anterior al locus objetivo de ARNsg (Figura 41A). La distancia entre el sitio de pausa y el sitio objetivo es de 19 pb, que esta en perfecta concordancia con la distancia previamente descrita de ~18 pb entre la incorporacion de nucleotidos de RNAP y su borde frontal. Este descubrimiento es consistente con un mecanismo de CRlSPRi en el cual el bloque de la transcripcion se debe a la colision fisica entre la RNAP elongada y el complejo dCas9:ARNsg (Figura 41B). La union del complejo dCas9:ARNsg a la cadena plantilla tuvo un efecto represor bajo, lo cual sugiere que RNAP fue capaz de leer a traves del complejo en esta orientacion particular. En este caso el ARNsg esta enfrentado a RNAP, el cual podria estar desplegado por medio de la actividad de helicasa de RNAP. Estos experimentos han demostrado que CRISPRi utiliza aRn que bloquean directamente la transcripcion. Este mecanismo difiere del de ribointereferencia, para el cual la inactivacion de la expresion genica requiere de la destruccion de ARN mensajeros ya transcriptos, antes de su traduccion.
La Figura 41 demuestra que CRISPRi funciona al bloquear la elongacion de la transcripcion. (A) Las moleculas de RNAP marcadas con FLAG se inmunoprecipitaron y los transcriptos de ARNm nacientes asociados se secuenciaron. El panel superior muestra los resultados de secuenciacion del transcripto de mRFP naciente en celulas sin ARNsg y el panel inferior muestra resultados en celulas con ARNsg. En presencia de ARNsg, se observo una pausa transcripcional fuerte en la posicion de 19 pb anterior al sitio objetivo, luego de la cual la cantidad de lecturas de secuenciacion cayo precipitadamente. (B) Un mecanismo de CRISPRi basado en la colision fisica entre RNAP y dCas9-ARNsg. La distancia desde el centro de RNAP hasta el borde frontal es de 19 pb, lo cual coincide con la distancia medida entre el sitio de pausa de la transcripcion y 3' de la region de los pares de bases de ARNsg. La RNAP pausada aborta la elongacion de transcripcion al encontrar el obstaculo de dCas9-ARNsg.
El silenciamiento genico guiado por ARNsg de CRISPRi es altamente especifico
Para evaluar la especificidad de CRISPRi en una escala genomica, se llevo a cabo la secuenciacion completa de transcriptoma (secuenciacion de ARN) de celulas transformadas por dCas9 con y sin coexpresion de ARNsg (Figura 42A). En presencia de ARNsg dirigido a mRFP (NT1), el transcripto de mRFP fue el unico gen que presentaba una disminucion de abundancia. Ningun otro gen mostro un cambio significativo en la expresion luego de la adicion del ARNsg, dentro de los errores de secuenciacion. Tambien se llevo a cabo la secuenciacion de ARN en celulas con diferentes ARNsg que se dirigen a genes diferentes. Ninguno de los experimentos mostro cambios significativos de genes aparte del gen objetivo (Figura 49). Por lo tanto el direccionamiento y la regulacion genetica guiados por ARNsg son altamente especificos y no tiene efectos significativos fuera del objetivo.
La Figura 42 demuestra la especificidad de direccionamiento del sistema CRISPRi. (A) La secuenciacion de ARNm
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a escala genomica (secuenciacion de ARN) confirmo que el direccionamiento por CRISPRi no tiene efectos fuera del objetivo. Se uso el ARNsg NT1 que se une a la region codificante de mRFP. Los genes dCas9, mRFP y sfGFP estan resaltados. (B) Multiples ARNsg pueden silenciar independientemente dos informantes de proteina fluorescente en la misma celula. Cada ARNsg reprimio especificamente su gen cognado pero no el otro gen. Cuando ambos ARNsg estaban presentes, ambos genes fueron silenciados. Las barras de error representan el EEM de al menos tres replicados biologicos. (C) Imagenes microscopicas para usar dos ARNsg para controlar dos proteinas fluorescentes. El panel superior muestra las imagenes de campo claro de las celulas de E. coli, el panel central muestra el canal de RFP y la parte inferior muestra el panel de GFP. La coexpresion de un ARNsg y dCas9 solamente silencia la proteina fluorescente cognada pero no la otra. El efecto de inactivacion fue fuerte, ya que practicamente no se observo fluorescencia a partir de las celulas con determinada proteina fluorescente silenciada. Barra de escala, 10 |jm. El control muestra celulas sin ningun informante de proteina fluorescente. Los resultados de fluorescencia representan el promedio y EEM de al menos tres replicados biologicos. Vease tambien la Figura 49.
La Figura 49 se relaciona con la Figura 42A y muestra los datos de secuenciacion de ARN de celulas con ARNsg que se dirigen a diferentes genes. (A) (+/-) ARNsg que se dirige al promotor del gen lacl endogeno en E. coli. El mismo ARNsg dirigido a lacl se uso en la Figura 44A. (B) (+/-) 1 mM de IPTG para celulas sin ARNsg autoinhibido (ARNsg reprimio su propio promotor. (C) (+/-) ARNsg que se dirige al gen lacZ endogeno en E. coli. El mismo ARNsg dirigido a lacZ se uso en la Figura 44A. IPTG 1 mM tambien se agrego a celulas con el ARNsg dirigido a lacZ.
CRISPRi puede usarse para regular simultaneamente multiples genes
El sistema CRISPRi puede pemitir el control de multiples genes independientemente sin interferencia. Se ideo un sistema de informante de fluorescencia de color dual asado en mRFP y sfGFP. Se disenaron dos ARNsg con regiones complementarias diferentes para cada gen. La expresion de cada ARNsg solamente silencio el gen cognado y no tuvo efecto en el otro. La coexpresion de dos ARNsg inactivo ambos genes (Figura 42B y C). Estos resultados sugieren que el direccionamiento guiado por ARNsg es especifico, con la especificidad dictada por su identidad de secuencia y no afectada por la presencia de otros ARNsg. Este comportamiento deberia permitir el control multiple de multiples genes de manera simultanea mediante CRISPRi.
Factores que determinan la eficacia de silenciamiento de CRISPRi
Para encontrar determinantes de la eficacia de direccionamiento de CRISPRi, se investigo el rol de la longitud, complementariedad de secuencia y posicion en la eficacia de silenciamiento (Figura 43A). Como sugiere la Figura 40C, la ubicacion de la secuencia objetivo de ARNsg a lo largo del gen era importante para la eficacia. Se disenaron adicionalmente ARNsg para cubrir la longitud total de las regiones codificantes tanto para mRFP como para sfGFP (Datos Complementarios para secuencias de ARNsg). En todos los casos, la represion se relaciono inversamente a la distancia objetivo desde el sitio de inicio de la transcripcion (Figura 43B). Se observo una correlacion lineal fuerte para mRFP. Se observo una correlacion similar pero mas debil cuando se uso sfGFP como objetivo, lo cual quizas indica cinetica variada de la ARN polimerasa durante diferentes puntos en la elongacion de este gen.
El ARNsg contiene una region complementaria al objetivo de 20 pb. Para identificar la importancia de esta region de pares de bases, se modifico la longitud de ARNsg NTl (Figura 43c). Mientras que la extension de la region desde el extremo 5' no afecto el silenciamiento, el truncamiento de la region disminuyo drasticamente la represion. La longitud minima de la region de pares de bases necesaria para el silenciamiento genico era de 12 pb, con truncamiento adicional que llevo a la perdida completa de la funcion. Se introdujeron mutaciones individuales en la region de pares de bases de ARNsg NT1 y se evaluo el efecto general en el silenciamiento. A partir de los resultados, pudieron discernirse tres subregiones, cada una con una contribution diferente a la union y silenciamiento en general (Figura 43D). Cualquier mutation individual de los primeros 7 nucleotidos disminuyo dramaticamente la represion, lo cual sugiere que esta secuencia constituye una "region semilla" para la union, como se noto previamente para ambos sistemas CRISPR de tipo I y de tipo II. Los nucleotidos adyacentes tambien se mutaron en pares (Figura 43E y Figura 50). En la mayoria de los casos, la actividad de represion relativa debida a la mutacion doble fue multiplicativa, en relation con los efectos de los mutantes individuales, lo cual sugiere una relation independiente entre los mal apareamientos. Ademas, coherente con resultados previos en la importancia de la secuencia de PAM, un PAM incorrecto elimino completamente el silenciamiento incluso con una region de union perfecta de 20 pb (Figura 43E). Por lo tanto, la especificidad del sistema CRISPRi esta determinada en conjunto mediante el PAM (2 pb) y al menos una extension de ARNsg-ADN de 12 pb, donde dicho espacio es lo suficientemente grande para cubrir la mayoria de los genomas bacterianos para sitios objetivo unicos.
Se analizaron dos ARNsg que se dirigen al mismo gen (Figura 43F y Figura 51). Dependiendo del posicionamiento relativo de multiples ARNsg, se observaron efectos combinatorios diferentes. Combinar dos ARNsg, cada uno con una represion de alrededor de 300 veces, permitio un aumento del silenciamiento general de hasta doscientas veces. Combinar dos ARNsg mas debiles (~5 veces) mostro efectos multiplicativos cuando se usan juntos. Se observaron efectos combinatorios supresores al usar dos ARNsg cuyos objetivos se superponian. Esto se debio probablemente a la competencia entre ambos ARNsg para unirse a la misma region.
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La Figura 43 muestra la caracterizacion de factores que afectan la eficacia de silenciamiento. (A) Se midieron los efectos de silenciamiento de ARNsg con diferentes locus objetivo en el mismo gen (Distancia desde el codon de inicio de la traduccion) y ARNsg con diferentes longitudes de la region de pares de base al mismo locus objetivo (basado en NT1). (B) La eficacia de silenciamiento se correlaciono inversamente con la distancia objetivo desde el codon de inicio de la traduccion (naranja - mRFP y verde - sfGFP). La actividad de represion relativa se calculo mediante la normalizacion de la represion de cada ARNsg a la del ARNsg con el cambio de multiplo de represion mas alto. Las barras de error representan el EEM de tres replicados biologicos. (C) La longitud de la region de pares de bases de Watson-Crick entre el ARNsg y el ADN objetivo afecta la eficacia de represion. Todas las extensiones de la region de pares de bases presentaron un efecto de silenciamiento fuerte y los truncamientos disminuyeron dramaticamente la represion. La longitud minima de la region de pares de bases para la represion detectable es de 12 pb. Las barras de error representan el EEM de tres replicados biologicos. (D) Se introdujeron mal apareamientos individuales en cada nucleotido en el ARNsg (NT1, Figura 40B) y se midio como estos mal apareamientos individuales afectaban la eficacia de represion. Pueden discernirse tres subregiones con importancia diferente para el silenciamiento general. Presentan una funcion escalonada. La region de los primeros 7 nucleotidos fue crucial para el silenciamiento y probablemente constituye una region "semilla" para sondar la union de ARNsg al ADN objetivo. La secuencia de PAM (NGG) fue indispensable para el silenciamiento. Las barras de error representan el EEM de tres replicados biologicos. (E) Efectos del silenciamiento de ARNsg con mal apareamientos dobles adyacentes. La actividad de represion relativa de ARNsg mal apareados simples se muestra con la posicion de mal apareamiento marcada en la parte inferior. Se muestra la actividad medida experimentalmente de ARNsg mal apareados dobles. La actividad calculada mediante la multiplicacion de los efectos de dos ARNsg mal apareados simples se muestra en blanco y marcada con "Com". En la mayoria de los casos, la actividad de silenciamiento de un ARNsg mal apareado doble fue simplemente una multiplicacion de las actividades de ARNsg mal apareados simples (excepto la Figura 50B), lo cual sugiere una relacion independiente entre los mal apareamientos simples. Las barras de error representan el EEM de tres replicados biologicos. (F) Efectos de silenciamiento combinatorios del uso de ARNsg dobles para dirigirse a un gen de mRFP simple. Usando dos ARNsg que se dirigen al mismo gen puede mejorar el efecto general de inactivacion hasta casi I.0O0 veces. Cuando dos ARNsg se unen a secuencias no superpuestas del mismo gen, la represion aumenta. Cuando dos ARNsg se dirigen a regiones superpuestas, la represion se suprime. Las barras de error representan el EEM de tres replicados biologicos.
La Figura 50 esta relacionada con la Figura 43E y muestra los efectos de silenciamiento de ARNsg con mal apareamientos dobles adyacentes. La actividad de represion relativa de ARNsg mal apareados simples se muestra con la posicion de mal apareamiento marcada en la parte inferior. Tambien se muestra la actividad medida experimentalmente de ARNsg mal apareados dobles. La actividad calculada mediante la multiplicacion de los efectos de dos ARNsg mal apareados simples se muestra en blanco y marcada con "Com". Los resultados de fluorescencia representan el promedio y EEM de tres replicados biologicos.
La Figura 51 esta relacionada con la Figura 43F y muestra los efectos combinatorios de silenciamiento al usar dos ARNsg para regular un unico gen. En todos los casos, los ARNsg no superpuestos mostraron efectos de silenciamiento aumentativos, y los ARNsg superpuestos mostraron efectos supresores. El efecto combinatorio era independiente de si el ARNsg tenia como objetivo la cadena de ADN plantilla o no plantilla. Los resultados de fluorescencia representan el promedio y EEM de tres replicados biologicos.
Cuestionamiento de una red reguladora endogena usando inactivacion genica de CRISPRi
El sistema CRISPRi se uso a continuacion como una plataforma de inactivacion de genes para cuestionar redes geneticas endogenas. Los metodos anteriores para cuestionar redes geneticas microbianas dependian en su mayoria de procedimientos de ingenieria genomica e inactivacion que eran laboriosos y costosos. En contraste, la inactivacion genetica con CRISPRi requiere solamente el diseno y sintesis de un ARNsg pequeno que tiene una region complementaria de 20 pb respecto a los genes deseados. Para demostrar esto, se uso CRISPRi para crear cepas de inactivacion de E. coli mediante el diseno de ARNsg para perturbar sistematicamente los genes que eran parte de la via reguladora de lactosa de E. coli bien caracterizada (Figura 44A). Se llevaron a cabo ensayos de p- galactosidasa para medir la expresion de LacZ a partir de las cepas inactivadas, con y sin isopropil p-D-1- tiogalactopiranosido (IPTG), un quimico que inhibe el represor lac (LacI). En las celulas de tipo salvaje, la adicion de IPTG indujo la expresion de LacZ. Los resultados mostraron que un ARNsg especifico de lacZ podria reprimir de manera potente la expresion de LacZ (Figura 44B). Por el contrario, un ARNsg que se dirige al gen lacl llevo a la activacion de expresion de LacZ, incluso en la ausencia de IPTG, como se esperaria para el silenciamiento de un represor directo de la expresion de LacZ.
Se sabe que cAMP-CRP es un activador esencial de la expresion de LacZ mediante la union a un sitio regulador cis anterior al promotor (sitio A). De manera consistente, el ARNsg que se dirigia al gen crp o al sitio A en el promotor LacZ llevo a la represion, lo cual demuestra un medio para unir un regulador a su secuencia reguladora en cis usando experimentos CRISPRi. El direccionamiento al gen de adenilato cilasa (cya), que es necesario para producir el cAMP que hace CRP mas eficaz en el promotor de LacZ, solo llevo a una represion parcial. La adicion de cAMP 1 mM al medio de cultivo complemento los efectos para la inactivacion de cya pero no para la inactivacion crp, lo que sugiere que cya es un regulador indirecto de LacZ. Ademas, dirigirse al sitio regulador cis de LacI (sitio O) con un ARNsg llevo a la inhibicion, presumiblemente debido a la union del complejo de Cas9 en este sitio bloque
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estericamente la ARN polimerasa, imitando el comportamiento del represor de transcripcion de LacI. Dirigirse al sitio de union de RNAP conocido (sitio P) tambien bloqueo la expresion. En resumen, estos estudios demuestran que el metodo de inactivacion genetica basado en CRISPRi proporciona un abordaje rapido y eficaz para el cuestionamiento de funciones reguladoras (activacion y represion) de genes y elementos cis en una red reguladora compleja (Figura 44C).
La Figura 44 muestra el perfil funcional de una red reguladora de complejo usando la inactivacion genetica CRISPRi. (A) Se disenaron ARNsg y se usaron para inactivar genes (cya, crp, lacl, lacZ, lacY, lacA) en la via reguladora de lac o para bloquear sitios transcripcionales (A/P/O). LacI es un represor del operon de lacZYA mediante la union de un sitio operador de la transcripcion (sitio O). El gen lacZ codifica una enzima que cataliza lactosa en glucosa. Unos pocos genes hospedadores reguladores en trans tal como cya y crp estan implicados en la activacion del sistema de lacZYA. El complejo cAMP-CRP se une a un sitio operador de la transcripcion (sitio A) y recluta la ARN polimerasa que se une al sitio P, lo cual inicia la transcripcion de lacZYA. IPTG, un quimico que inhibe la funcion de LacI, induce la expresion de LacZ. (B) Ensayo de p-galactosidasa de las cepas de inactivacion sin (blanco) y con (gris) IPTG. El control muestra que las celulas de tipo salvaje sin perturbacion de CRISPRi podrian ser inducidas por la adicion de IPTG. El ARNsg que se dirige a LacZ reprimio de manera potente la expresion de LacZ, incluso en la presencia de IPTG. Cuando LacI era el objetivo, la expresion de LacZ era alta, incluso sin IPTG. El direccionamiento a los genes cya y crp llevo a una disminucion del nivel de expresion de LacZ en presencia de IPTG. La presencia de cAMP 1 mM recupero la inactivacion de cya pero no la inactivacion de crp. El bloqueo de los sitios operadores de la transcripcion dio como resultado la represion de LacZ, lo cual sugiere que estos son sitios reguladores en cis importantes para LacZ. Luego de la perturbacion, se indica la disminucion (flechas hacia abajo) y el aumento (flechas hacia arriba) de la expresion de LacZ. Las barras de error representan el EEM de tres replicados biologicos. (C) Los experimentos de inactivacion permitieron perfilar los roles de los reguladores en el circuito regulador de lac. Los datos se muestran en una grafica en 2 dimensiones, donde el eje x muestra la actividad de LacZ sin IPTG y el eje y muestra su actividad con IPTG. La extension de ovales a lo largo de cada eje muestra las desviaciones estandar. Los resultados del ensayo de p-galactosidasa representan el promedio y EEM de tres replicados biologicos. Para los datos de secuenciacion de ARN en el direccionamiento de LacI y LacZ, vease tambien la Figura 49.
CRISPRi puede inactivar la expresion genica objetivo en celulas humanas
Para evaluar la generalidad del abordaje de CRISPRi para usar el complejo de dCas9-ARNsg para reprimir la transcripcion, el sistema se evaluo en celulas de mamifero HEK293. La proteina dCas9 se optimizo por codon, se fusiono a tres copias de una secuencia de localizacion nuclear (NLS) y se expreso a partir de un vector retroviral de virus de celula madre murina (MSCV, por sus siglas en ingles). El mismo diseno del ARNsg que se muestra en la Figura 40B se uso para expresar a partir del promotor U6 de ARN polimerasa III. Una linea celular HEK293 informante que expresa EGFP bajo el promotor SV40 se creo mediante infeccion viral. Usando un ARNsg (eNT2) que se dirigia a la cadena de ADN no plantilla de la region codificante de EGFP se observo una inactivacion de la expresion genica moderada pero reproducible (46 % de represion, Figura 45A). La represion dependia tanto de la proteina dCas9 como del ARNsg, lo cual implica que la represion se debia al complejo de dCas9-ARNsg y al direccionamiento guiado por ARN. El mismo ARNsg presento una mejor represion en el mismo gen cuando se expreso transitoriamente a partir de un plasmido (63 % de represion, Figura 52). De manera consistente con el sistema bacteriano, solamente los ARNsg dirigidos a la cadena no plantilla presentaron represion. Los factores, tales como la distancia desde el inicio de la transcripcion y el estado de cromatina local pueden ser parametros cruciales para determinar la eficacia de represion (Figura 52). La optimizacion de la expresion, estabilidad, localizacion nuclear y la interaccion de Cas9 y ARNsg permitira la mejora adicional de la eficacia de CRISPRi en celulas de mamifero.
La Figura 45 demuestra que CRISPRi puede reprimir la expresion genica en celulas humanas. (A) Un sistema de CRISPRi en celulas HEK293. El casete de expresion SV40-EGFP se inserto en el genoma por medio de infeccion retroviral. La proteina dCas9 se optimizo por codon y se fusiono con tres copias de la secuencia NLS. El ARNsg se expreso a partir de un vector U6 de ARN polimerasa III. La cotransfeccion de dCas9 y un ARNsg (eNT2) que se dirige a la cadena no plantilla de EGFP disminuyo la fluorescencia (~46 %) mientras que la expresion de, ya sea dCas9 o ARNsg solo no mostro efecto. (B) La represion mediada por dCas9:ARNsg fue dependiente de los locus objetivo. Se disenaron siete ARNsg para dirigirse a diferentes regiones de la secuencia codificante de EGFP en la cadena plantilla y no plantilla. Solamente eNT2 y eNT5 mostraron una represion moderada. Los resultados de fluorescencia de 7A y 7B representan un promedio y error de dos replicados biologicos.
La Figura 52 esta relacionada con la Figura 45 y muestra que la represion de ARNsg depende de los locus objetivo y la distancia relativa desde el inicio de la transcripcion. Se uso el mismo ARNsg para reprimir el mismo gen EGFP con diferentes promotores. Los complejos de Cas9/ARNsg reprimieron la transcripcion a partir de ADN de plasmido transfectado transitoriamente. El nivel de represion transcripcional fue ligeramente mejor (63 %) que el observado para genes genomicos, y el porcentaje de celulas GFP negativas aumento en presencia de ARNsg. El locus objetivo tiene diferente distancia desde el inicio de la transcripcion. Mientras que SV40-EGFP mostro represion, LTR-EGFP no tuvo efecto. Los resultados de fluorescencia representan el promedio y error de dos replicados biologicos.
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CRISPRi reprimio eficaz y selectivamente la transcripcion de los genes objetivo
El sistema CRISPRi es una plataforma relativamente simple para la regulacion genetica objetivo. CRISPRi no se basa en la presencia de factores hospedadores complejos, sino que requiere unicamente de la proteina dCas9 y ARN guias y, por lo tanto, es flexible y altamente disenable. El sistema puede silenciar eficazmente genes en bacterias. El silenciamiento es muy eficaz, ya que no se detectaron efectos fuera del objetivo. Ademas, la eficacia de la inactivacion puede ajustarse mediante el cambio de los locus objetivo y del grado de formacion de pares de bases entre el ARNsg y el gen objetivo. Esto hara posible la creacion de series alelicas de hipomorfos -- una caracteristica que es especialmente util para el estudio de genes esenciales. El sistema funciona mediante el bloqueo directo de la transcripcion, de una manera que puede programarse facilmente mediante el diseno de ARNsg. Mecanicamente esto difiere del silenciamiento basado en ribointereferencia, la cual requiere de la destruccion de los ARNm ya transcriptos.
Ademas, estos complejos de dCas9:ARNsg tambien pueden modular la transcripcion mediante el direccionamiento de motivos reguladores en cis clave dentro de cualquier promotor, lo cual bloquea estericamente la asociacion de sus factores de transcripcion reguladores en trans cognados. Por lo tanto, ademas de su uso como una herramienta de inactivacion genetica, CRISPRi podria ser usado por su mapeo funcional de promotores y otros modulos reguladores genomicos.
CRISPRi se adapta al analisis y regulacion en escala genomica
El metodo de CRISPRi se basa en el uso de ARN dirigidos a ADN, y solamente el segmento dirigido a ADN necesita ser disenado para objetivos geneticos especificos. Con los avances en la tecnologia de sintesis de oligonucleotidos de ADN a gran escala, generar conjuntos grandes de oligonucleotidos que contienen regiones de 20 pb unicas para el direccionamiento genomico es rapido y economico. Estas bibliotecas de oligonucleotidos podrian permitir el direccionamiento de grandes cantidades de genes individuales para inferir la funcion genetica para dirigir pares de genes para mapear interacciones geneticas. Ademas, CRISPRi podria usarse para modular simultaneamente la expresion de grandes conjuntos de genes, mientras que el ARNsg de pequeno tamano permite concatenar multiples elementos en el mismo vector de expresion.
CRISPRi proporciona nuevas herramientas para manipular genomas microbianos
Dado que la plataforma de CRISPRi es compacta y autocontenida, puede adaptarse para diferentes organismos. CRISPRi es una herramienta poderosa para estudiar organismos no modelo para los cuales los metodos de ingenieria genetica no estan bien desarrollados, inclusive patogenos u organismos utiles industrialmente. A diferencia de las eucariotas, la mayoria de las bacterias carecen de mecanismo de ribointerefencia. Como consecuencia, la regulacion de genes endogenos usando ARN disenados de manera sintetica esta actualmente limitada. CISRPRi podria proporcionar un metodo similar a la ribointereferencia para la perturbacion genetica en microbios.
CRISPRi como plataforma para modificar geneticamente redes reguladoras transcripcionales
CRISPRi puede utilizarse como un marco flexible para modificar geneticamente redes reguladoras transcripcionales. La plataforma de CRISPRi, debido a que es esencialmente un complejo de union al ADN guiado por ARN, tambien proporciona una estructura flexible para dirigir diversos mecanismos reguladores a sitios especificos en el genoma. Mas alla de simplemente bloquear la transcripcion de genes objetivo, es posible acoplar la proteina Cas9 a numerosos dominios reguladores para modular diferentes procesos biologicos y generar diferentes resultados funcionales (por ejemplo, activacion transcripcional, modificaciones de la cromatina).
En el sistema de CRISPRi, es posible unir multiples ARNsg en circuitos transcripcionales en los cuales un ARNsg en una posicion anterior controla la expresion de un ARNsg diferente en una posicion posterior. Mientras las moleculas de ARN en microorganismos tienden a tener vidas cortas, se sospecha que los programas geneticos regulados mediante ARNsg pueden presentar cineticas rapidas diferentes de los circuitos que implican procesos lentos, tal como la expresion y degradation de proteinas. En resumen, el sistema CRISPRi es una plataforma de programacion genetica general adecuada para variedad aplicaciones clinicas e investigation biomedica, incluyendo perfilado funcional de escala genomica, modification genetica metabolica microbiana y reprogramacion celular.
Ejemplo 5: Un polipeptido quimerico dirigido al sitio puede usarse para modular (activar o reprimir) la transcripcion en celulas humanas.
Se demostro que en celulas humanas, una proteina de fusion que comprende una Cas9 cataliticamente inactiva y un dominio activador o un dominio represor puede aumentar o disminuir la transcripcion a partir de un ADN objetivo, respectivamente.
Figura 55. Se fusionaron Cas9 cataliticamente inactivas humanizadas con un dominio activador de la transcripcion VP64. (A) Para evaluar la eficacia para la activacion genetica usando este sistema, se inserto un promotor inducible
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GAL4 UAS que controla un GFP en el genoma de HEK293 (celulas de cultivo de tejido humano). (B) El promotor GAL4 UAS puede ser inducido en presencia de una proteina derivada de levadura GAL4. La fusion de dCas9-VP64 puede activar eficazmente GAL4 UAS 20 veces mayor en presencia de un ARN guia cognado que se une a la region de GAL4 UAS. (C) Imagenes microscopicas para la activacion de dCas9-VP64. (D) Citometria de flujo para la activacion de dCas9-VP64.
Figura 56 Se fusionaron Cas9 cataliticamente inactivas humanizadas con un dominio represor de la transcripcion KRAB. (Parte superior) Se disenaron 10 ARN guia que se dirigen a un promotor bien caracterizado, el promotor temprano SV40, y un ARN guia que se dirige a la region codificante de eGfP. (Parte inferior) Usando una dCas9 no quimerica, se observo una represion 2~3 mayor para los ARNg de P9 y NT2. Esta eficacia mejoro ampliamente usando la fusion de dCas9-KRAB. Por ejemplo, con la fusion de dCas9-KRAB, P9 y NT2 mostraron una represion 20 veces y 15 veces mayor, respectivamente. Ademas P1-P6 mostro una reduccion significativa de la expresion cuando se uso la proteina de fusion, pero una represion limitada cuando se uso una proteina dCas9 no quimerica.
Ejemplo 6: Cas9 puede usarse con ARN guia artificiales, que no existen en la naturaleza, para llevar a cabo la escision del ADN objetivo.
Se disenaron un crRNA artificial y un tracrRNA artificial, basados en el segmento de union a proteinas del transcripto de origen natural de crRNA y tracrRNA de S. pyogenes, modificados para imitar la protuberancia asimetrica dentro del duplex de crRNA:tracrRNA de S. pyogenes (vease la protuberancia en el dominio de union a proteinas de moleculas de ARN tanto artificiales (parte superior) como naturales (parte inferior) que se muestran en la Figura 57A). La secuencia de tracrRNA artificial comparte menos del 50 % de identidad con el tracrRNA natural. La estructura secundaria predicha del duplex de union a proteinas de crRNA:tracrRNA es la misma para ambos pares de ARN, pero la estructura predicha para el resto de los ARN es muy diferente.
La Figura 57 demuestra que las secuencias artificiales que comparte muy poca identidad de secuencia (aproximadamente el 50 %) con tracrRNA y crRNA de origen natural pueden funcionar con Cas9 para escindir ADN objetivo siempre que la estructura del dominio de union a proteinas del ARN dirigido a ADN se conserve. (A) Coplegado de tracrRNA y crRNA de S. pyogenes y tracrRNA y crRNA artificiales. (B) Se usaron combinaciones de Cas9 de S. pyogenes y ortologos de tracrRNA:crRNA para llevar a cabo ensayos de escision de ADN de plasmido. Spy - S. pyogenes, Lin - L. innocua, Nme - N. meningitidis, Pmu - P. multocida. La Cas 9 de S. pyogenes puede ser guiada por alguno, pero no todos los ortologos de tracrRNA:crRNA de origen natural en especies bacterianas seleccionadas. Cabe destacar que la Cas9 de S. pyogenes puede ser guiada por el par de tracrRNA:crRNA artificial, que fue disenado basandose en la estructura del segmento de union a proteinas de origen natural de ARN dirigido a ADN usando una secuencia no relacionada en absoluto con sistema CRISPRi.
El “tracrRNA" artificial (ARN activador) usado fue 5'-
GUUUUCCCUUUUCAAAGAAAUCUCCUGGGCACCUAUCUUCUUAGGUGCCCUCCCUUGUUUAAACCUGACCAG UUAACCGGCUGGUUAGGUUUUU-3' (SEQ ID NO:1347). El “crRNA" artificial (ARN identificador) usado fue: 5'- GAGAUUUAUGAAAAGGGAAAAC-3' (SEQ ID NO:1348).
Ejemplo 7: Generacion de organismos transgenicos no humanos
Se genero un raton transgenico que expresaba Cas9 (ya sea sin modificar, modificada para tener actividad enzimatica reducida, modificada como una proteina de fusion para cualquiera de los fines descritos anteriormente) usando un metodo conveniente conocido por un experto en la tecnica (por ejemplo, (i) inactivacion genetica en un locus objetivo (por ejemplo, ROSA 26) de una celula madre embrionaria de raton (celula ES) seguida de inyeccion de blastocistos y la generacion de ratones quimericos; (ii) inyeccion de un transgen integrador aleatorio en el pronucleo de un ovocito de raton fertilizado, seguida por la implantacion del ovulo en una hembra pseudoprenada; etc.). La proteina Cas9 esta bajo el control de un promotor que se expresa al menos en celulas madre embrionarias, y puede estar adicionalmente bajo el control temporal o especifico de tejidos (por ejemplo, inducible por farmacos, controlado por sistema promotor basado en Cre/Lox, etc.). Una vez que una linea de raton que expresa Cas9 transgenica es generada, se aislan celulas madre embrionarias y se cultivan, y en algunos casos se congelan celulas ES para uso futuro. Debido a que las celulas ES aisladas expresan Cas9 (y en algunos casos la expresion esta bajo el control temporal (por ejemplo, inducible por farmacos), se generan rapidamente nuevas celulas inactivadas o activadas (y por lo tanto ratones) en cualquier locus deseado en el genoma mediante la introduccion de un ARN dirigido a ADN disenado que dirige la Cas9 a un locus particular de eleccion. Dicho sistema, y muchas variaciones de este, se usan para generar nuevos organismos modificados geneticamente en cualquier locus de eleccion. Cuando se usa Cas9 modificada para modular la transcripcion y/o modificar ADN y/o modificar polipeptidos asociados con ADN, las celulas ES en si (o cualesquiera celulas diferenciadas derivadas de las celulas ES (por ejemplo, un raton entero, una linea celular diferenciada, etc.) se usaron para estudiar las propiedades de cualquier gen de eleccion (o cualquier producto de expresion de eleccion, o cualquier locus genomico de eleccion) simplemente mediante la introduccion de un ARN dirigido a ADN adecuado en una celula que expresa Cas9 deseada.

Claims (22)

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    REIVINDICACIONES
    1. Un metodo para modificar un ADN objetivo, comprendiendo el metodo poner en contacto el ADN objetivo con un complejo que comprende:
    (a) un polipeptido Cas9 y
    (b) un ARN dirigido a aDn de molecula simple que comprende:
    (i) un segmento dirigido a ADN que comprende una secuencia de nucleotidos que es complementaria a una secuencia en el ADN objetivo; y
    (ii) un segmento de union a proteina que interactua con dicho polipeptido Cas9, en donde el segmento de union a proteina comprende dos tramos complementarios de nucleotidos que hibridan para formar un duplex de ARN bicatenario (ARNbc),
    en el que dichos dos tramos complementarios de nucleotidos estan unidos covalentemente por nucleotidos intermedios,
    en el que dicho contacto es in vitro o en una celula ex vivo; y en el que dicha modificacion es escision del ADN objetivo.
  2. 2. El metodo de la reivindicacion 1, en el que dicho duplex de ARNbc tiene una longitud de 8 pares de bases (pb) a 30 pb.
  3. 3. El metodo de las reivindicaciones 1 o 2, en el que el porcentaje de complementariedad entre los nucleotidos que hibridan para formar el duplex de ARNbc del segmento de union a proteina es mayor del 70 %.
  4. 4. El metodo de las reivindicaciones 1, 2 o 3, en el que el ADN objetivo esta presente en una celula bacteriana, una celula de arquea, un organismo eucariota unicelular, una celula vegetal, una celula de un animal invertebrado o una celula de un animal vertebrado.
  5. 5. El metodo de las reivindicaciones 1,2 o 3, en el que el ADN objetivo es ADN cromosomico
  6. 6. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que el contacto comprende introducir en una celula (a) dicho polipeptido Cas9, o un polinucleotido que codifica dicho polipeptido Cas9, y (b) dicho ARN dirigido a ADN, o un polinucleotido de ADN que codifica dicho aRn dirigido a ADN.
  7. 7. El metodo de la reivindicacion 6 en donde el metodo comprende ademas introducir en la celula un polinucleotido donante.
  8. 8. El metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que un dominio de transduccion de proteinas se une covalentemente al extremo amino del polipeptido Cas9, en donde dicho dominio de transduccion de proteinas facilita la travesia del polipeptido Cas9 del citosol al interior de un organulo de una celula.
  9. 9. El metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-7 en el que un dominio de transduccion de proteinas se une covalentemente al extremo carboxilo del polipeptido Cas9, en donde dicho dominio de transduccion de proteinas facilita la travesia del polipeptido Cas9 del citosol al interior de un organulo de una celula.
  10. 10. Una composicion que comprende:
    (a) un polipeptido Cas9, o un polinucleotido que codifica dicho polipeptido Cas9, y
    (b) un ARN dirigido a ADN de molecula simple, o un polinucleotido de ADN que codifica dicho ARN dirigido a ADn, en donde dicho ARN dirigido a ADN de molecula simple comprende:
    (i) un segmento dirigido a ADN que comprende una secuencia de nucleotidos que es complementaria de una secuencia en un ADN objetivo, y
    (ii) un segmento de union a proteina que interacciona con dicho polipeptido Cas9, en donde el segmento de union a proteina comprende dos tramos complementarios de nucleotidos que hibridan para formar un duplex de ARN bicatenario (ARNbc), y
    en la que dichos dos tramos complementarios de nucleotidos estan unidos covalentemente por nucleotidos intermedios.
  11. 11. La composicion de la reivindicacion 10, en la que un dominio de transduccion de proteinas esta unido covalentemente al extremo amino del polipeptido Cas9, en donde dicho dominio de transduccion de proteinas facilita la travesia del polipeptido Cas9 del citosol a dentro de un organulo de una celula.
    5
    10
    15
    20
    25
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    35
    40
    45
    50
    55
    60
    65
  12. 12. La composition de la reivindicacion 10, en la que un dominio de transduction de protemas esta unido covalentemente al extremo carboxilo terminal del polipeptido Cas9, en donde dicho dominio de transduccion de proteinas facilita la traves^a del polipeptido Cas9 del citosol a dentro de un organulo de una celula.
  13. 13. La composicion de una cualquiera de las reivindicaciones 10-12, en la que (a) el polipeptido Cas9, o el polinucleotido que codifica dicho polipeptido Cas9, y (b) el ARN dirigido a ADN de molecula simple, o el polinucleotido de ADN que codifica dicho ARN dirigido a ADN, estan en una celula in vivo o ex vivo, en donde la celula no es una celula germinal humana.
  14. 14. Un ARN dirigido a ADN de molecula simple, o un polinucleotido de ADN que codifica dicho ARN dirigido a ADN, en donde el ARN dirigido a ADN de molecula simple comprende:
    (a) un segmento dirigido a ADN que comprende una secuencia de nucleotidos que es complementaria de una secuencia objetivo en un ADN objetivo y
    (b) un segmento de union a proteinas que interacciona con una proteina Cas9, en donde el segmento de union a proteinas comprende dos tramos complementarios de nucleotidos que hibridan para formar un duplex de ARN bicatenario (ARNbc), y en donde dichos dos tramos complementarios de nucleotidos estan unidos covalentemente por nucleotidos intermedios.
  15. 15. Uno o mas acidos nucleicos que comprenden:
    (a) una primera secuencia de nucleotidos que codifica un ARN dirigido a ADN de molecula simple que comprende:
    (i) un segmento dirigido a ADN que comprende una secuencia de nucleotidos que es complementaria de una secuencia objetivo en un ADN objetivo y
    (ii) un segmento de union a proteinas que interacciona con un polipeptido Cas9, en donde el segmento de union a proteinas comprende dos tramos complementarios de nucleotidos que hibridan para formar un duplex de ARN bicatenario (ARNbc), y en donde dichos dos tramos complementarios de nucleotidos estan unidos covalentemente por nucleotidos intermedios;
    en donde la primera secuencia de nucleotidos que codifica dicho ARN dirigido a ADN esta unida operativamente a un promotor; y, opcionalmente,
    (b) una segunda secuencia de nucleotidos que codifica un polipeptido Cas9, en donde la secuencia de nucleotidos que codifica dicho polipeptido Cas9 esta unida operativamente a un promotor.
  16. 16. El uno o mas acidos nucleicos de la reivindicacion 15, en donde dichos acidos nucleicos son uno o mas vectores de expresion recombinantes.
  17. 17. El uno o mas acidos nucleicos de la reivindicacion 15, en donde el uno o mas vectores de expresion recombinante son uno o mas vectores viricos.
  18. 18. Un kit que comprende
    (a) un polipeptido Cas9, o un acido nucleico que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica dicho polipeptido Cas9; y
    (b) un ARN dirigido a ADN de molecula simple, o un acido nucleico que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica dicho ARN dirigido a ADN de molecula simple, en donde el ARN dirigido a ADN de molecula simple comprende:
    (i) un segmento dirigido a ARN que comprende una secuencia de nucleotidos que es complementaria de una secuencia en un ADN objetivo y
    (ii) un segmento de union a proteinas que interacciona con dicho polipeptido Cas9, en donde el segmento de union a proteina comprende dos tramos complementarios de nucleotidos que hibridan para formar un duplex de ARN bicatenario (ARNbc), y en donde dichos dos tramos complementarios de nucleotidos estan unidos covalentemente por nucleotidos intermedios y
    en el que (a) y (b) estan en el mismo recipiente o en recipientes separados.
  19. 19. La composicion de una cualquiera de las reivindicaciones 10-13, el ARN dirigido a ADN de molecula simple o polinucleotido que codifica dicho ARN dirigido a ADN de molecula simple de la reivindicacion 14, el uno o mas acidos nucleicos de cualquiera de las reivindicaciones 15-17 o el kit de la reivindicacion 18, en donde dicho duplex de ARNbc tiene una longitud de 8 pares de bases (pb) a 30 pb.
  20. 20. La composicion de una cualquiera de las reivindicaciones 10-13 o 19, el ARN dirigido a ADN de molecula simple o polinucleotido que codifica dicho ARN dirigido a ADN de molecula simple de las reivindicaciones 14 o 19, el uno o
    mas acidos nucleicos de cualquiera de las reivindicaciones 15-17 o 19, o el kit de las reivindicaciones 18 o 19, en donde el porcentaje de complementariedad entre los nucleotidos que se hibridan para formar el duplex de ARNbc del segmento de union a proteinas es mayor del 70 %.
    5 21. La composicion de una cualquiera de las reivindicaciones 10-13, 19 o 20, el ARN dirigido a ADN de molecula
    simple o polinucleotido que codifica dicho ARN dirigido a ADN de molecula simple de cualquiera de las reivindicaciones 14, 19 o 20, el uno o mas acidos nucleicos de una cualquiera de las reivindicaciones 15-17, 19 o 20, o el kit de una cualquiera de las reivindicaciones 18, 19 o 20, en donde el ADN objetivo esta presente en una celula bacteriana, un celula de arquea, un organismo eucariota unicelular, una celula vegetal, una celula de un animal 10 invertebrado o una celula de un animal vertebrado.
  21. 22. La composicion de una cualquiera de las reivindicaciones 10-13 o 19-21, el ARN dirigido a ADN de molecula simple o polinucleotido que codifica dicho ARN dirigido a ADN de molecula simple de una cualquiera de las reivindicaciones 14 o 19-21, el uno o mas acidos nucleicos de una cualquiera de las reivindicaciones 15-17 o 19-21,
    15 o el kit de una cualquiera de las reivindicaciones 18-21, en donde el ADN objetivo es ADN cromosomico.
  22. 23. La composicion de una cualquiera de las reivindicaciones 10-13 o 19-22, o el ARN dirigido a ADN de molecula
    simple o polinucleotido que codifica dicho ARN dirigido a ADN de molecula simple de una cualquiera de las reivindicaciones 14 o 19-22, o el uno o mas acidos nucleicos de una cualquiera de las reivindicaciones 15-17 o 1920 22, para uso en un metodo de tratamiento terapeutico de un paciente.
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