MX2014014477A - Metodos y composiciones para la modificacion de adn objetivo dirigida por arn y para la modulacion de la transcripcion dirigida por arn. - Google Patents

Metodos y composiciones para la modificacion de adn objetivo dirigida por arn y para la modulacion de la transcripcion dirigida por arn.

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Abstract

La presente descripción proporciona un ARN dirigido a ADN que comprende una secuencia objetivo y, junto con un polipéptido modificador, proporciona una modificación específica del sitio de un ADN objetivo y/o un polipéptido asociado con el ADN objetivo. La presente descripción proporciona además polipéptidos modificadores específicos del sitio. La presente descripción proporciona además métodos para la modificación específica del sitio de un ADN objetivo y/o un polipéptido asociado con el ADN objetivo. La presente descripción proporciona métodos para modular la transcripción de un ácido nucleico objetivo en una célula objetivo, que generalmente involucra poner en contacto el ácido nucleico objetivo con un polipéptido Cas9 enzimáticamente inactivo y un ARN dirigido a ADN. Se proporcionan también kits y composiciones para llevar a cabo los métodos. La presente descripción proporciona células modificadas genéticamente que producen Cas9; y organismos multicelulares no humanos Cas9 transgénicos.

Description

METODOS Y COMPOSICIONES PARA LA MODIFICACION DE ADN OBJETIVO DIRIGIDA POR ARN Y PARA LA MODULACION DE LA TRANSCRIPCION DIRIGIDA POR ARN Referencia Cruzada Esta solicitud reivindica el beneficio de las solicitudes provisionales de patente estadounidense n.° 61/652,086, presentada el 25 de mayo de 2012, 61/716,256 presentada el 19 de octubre de 2012, 61/757,640, presentada el 28 de enero de 2013 y 61/765,576, presentada el 15 de febrero de 2013, cada una de las cuales se incorpora a la presente en su totalidad mediante esta referencia.
Campo de la Invención Alrededor del 60 % de las bacterias y el 90 % de las arqueas poseen sistemas CRISPR (repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y regularmente espaciadas)/asociados con CRISPR (Cas) para otorgar resistencia a elementos externos al ADN. El sistema de tipo II de CRISPR de Streptococcus pyogenes involucra sólo a un único gen que codifica la proteína Cas9 y dos ARN - un ARN maduro de CRISPR de ARN (crRNA) y un regulador en trans de ARN parcialmente complementario (tracrRNA) - los cuales son necesarios y suficientes para el silenciamiento guiado por ARN de ADN foráneo.
Antecedentes de la Invención En los últimos años, las enzimas nucleasa modificadas genéticamente para dirigirse a secuencias especificas de ADN han atraído gran atención como herramientas poderosas para la manipulación genética de células y organismos completos, lo cual permite la eliminación, reemplazo y reparación dirigida de genes, asi como la inserción de secuencias exógenas (transgenes) en el genoma. Han surgido dos teenologías principales para la manipulación genética de nucleasas de ADN de sitio específico, ambas basadas en la construcción de enzimas endonucleasas quiméricas en las puales un dominio de secuencia no específica de ADN endonucleasa se encuentra fusionado a un dominio de unión de ADN manipulado genéticamente. Sin embargo, dirigirse a cada nuevo locus genómico requiere diseñar una enzima nucleasa novedosa, lo cual hace que estos enfoques insuman tiempo y dinero. Además, ambas tecnologías poseen una precisión limitada, lo que puede llevar a efectos impredecibles fuera del objetivo.
La interrogación genómica sistemática y la reprogramación genética de células implican dirigir conjuntos de genes para expresión o represión. En la actualidad, el enfoque más común para el direccionamiento de genes arbitrarios para la regulación es utilizar la ribointerferencia (RNAi). Este enfoque tiene limitaciones. Por ejemplo, la RNAi puede presentar efectos significativos fuera del objetivo y toxicidad.
Hay una necesidad en el campo de una tecnología que permita dirigir de forma precisa la actividad de nucleasa (u otras actividades de proteína) hacia ubicaciones precisas dentro de un ADN objetivo, de forma tal que no requiera el diseño de una nucya proteína para cada secuencia objetivo nueva. Adicionalmente, hay una necesidad en la téenica de métodos para controlar la expresión génica con mínimos efectos fuera del objetivo.
Sumarlo de la Invención La presente descripción proporciona un ARN dirigido a ADN que comprende una secuencia objetivo y, junto con un polipéptido modificador, proporciona una modificación específica del sitio de un ADN objetivo y/o un polipéptido asociado con el ADN objetivo. La presente descripción proporciona además polipéptidos modificadores específicos del sitio. La presente descripción proporciona además métodos para la modificación especifica del sitio de un ADN objetivo y/o un polipéptido asociado con el ADN objetivo. La presente descripción proporciona métodos para modular la transcripción de un ácido nucleico objetivo en una célula objetivo, que generalmente involucra poner en contacto el ácido nucleico objetivo con un polipéptido Cas9 enzimáticamente inactivo y un ARN dirigido a ADN. Se proporcionan también kits y composiciones para llevar a cabo los métodos. La presente descripción proporciona células modificadas genéticamente que producen Cas9; y organismos multicelulares no humanos Cas9 transgénicos.
CARACTERÍSTICAS Las características de la presente descripción incluyen un ARN dirigido a ADN que comprende: (i) un primer segmento que comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia en un ADN objetivo; y (ii) un segundo segmento que interactúa con un polipéptido modificador dirigido al sitio. En algunos casos, el primer segmento comprende 8 nucleótidos que tienen 100 % de complementariedad con una secuencia en el ADN objetivo. En algunos casos, el segundo segmento comprende una secuencia de nugleótidos con al menos 60 % de identidad a lo largo de al menos 8 nucleótidos contiguos a cualquiera de las secuencias de nucleótidos establecidas en las SEQ ID NO: 431-682 (por ejemplo, 431-562). En algunos casos, el segundo segmento comprende una secuencia de nucleótidos con al menos 60 % de identidad a lo largo de al menos 8 nucleótidos contiguos a cualquiera de las secuencias de nucleótidos establecidas en las SEQ ID NO: 563-682. En algunos casos, el polipéptido modificador dirigido al sitio comprende una secuencia de aminoácidos con al menos alrededor de 75 % de identidad de secuencia de aminoácidos con los aminoácidos 7-166 o 731-1003 de la secuencia de aminoácidos Cas9/Csnl ilustrada en la Figura 3 o a las partes correspondientes en cualquiera de las secuencias de aminoácidos establecidas como SEQ ID NO: 1-256 y 795-1346.
Las características de la presente descripción incluyen un polinucleótido de ADN que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el ARN dirigido a ADN. En algunos casos, un vector de expresión recombinante comprende el polinucleótido de ADN. En algunos casos, la secuencia de nucleótidos que codifica el ARN dirigido a ADN está unida operativamente a un promotor. En algunos casos, el promotor es un promotor inducidle. En algunos casos, la secuencia de nucleótidos que codifica el ARN dirigido al ADN comprende además un sitio de clonación múltiple. Las características de la presente descripción incluyen una célula hospedadora in vitro modificada genéticamente que comprende el polinucleótido de ADN.
Las características de la presente descripción incluyen un vector de expresión recombinante que comprende: (i) una secuencia de nucleótidos que codifica un ARN dirigido a ADN, donde el ARN dirigido a ADN comprende: (a) un primer segmento que comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia en un ADN objetivo; y (b) un segundo segmento que interactúa con un polipéptido modificador dirigido al sitio; y (ii) una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido modificador dirigido al sitio que comprende: (a) una parte de unión a ARN que interactúa con el ARN dirigido a ADN; y (b) una parte de actividad que presenta una actividad enzimática dirigida al sitio, donde el sitio de actividad enzimática está determinado por el ARN dirigido a ADN.
Las características de la presente descripción incluyen un vector de expresión recombinante que comprende: (i) una secuencia de nucleótidos que codifica un ARN dirigido a ADN, donde el ARN dirigido a ADN comprende: (a) un prim’er segmento que comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia en un ADN objetivo; y (b) un segundo segmento que interactúa .con un polipéptido modificador dirigido al sitio; y (ii) una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido modificador dirigido al sitio> donde el polipéptido modificador dirigido al sitio comprende: (a) una parte de unión a ARN que interactúa con el ARN dirigido a ADN; y (b) una parte de actividad que modula la transcripción dentro del ADN objetivo, donde el sitio de transcripción modulada dentro del ADN objetivo está determinado por el ARN dirigido a ADN.
Las características de la presente descripción incluyen una variante del polipéptido modificador dirigido al sitio que comprende: (i) una parte de unión a ARN que interactúa con un ARN dirigido a ADN, donde el ARN dirigido a ADN comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia en un ADN objetivo; y (ii) una parte de actividad que presenta actividad enzimática dirigida al sitio reducida, donde el sitio de actividad enzimática está determinado por el ARN dirigido a ADN. En algunos casos, la variante de polipéptido modificador dirigido al sitio comprende una mutación H840A de la secuencia S. pyogenes SEQ ID NO: 8 o la mutación correspondiente en cualquiera de las secuencias de aminoácidos establecidas como las SEQ ID NO: 1-256 y 795-1346. En algunos casos, la variante de polipéptido modificador dirigido al sitio comprende una mutación D10A de la secuencia S. pyogenes SEQ ID NO: 8 o la mutación correspondiente en cualquiera de las secuencias de aminoácidos establecidas como las SEQ ID NO: 1-256 y 795-1346. En algunos casos, la variante del polipéptido modificador dirigido al sitio comprende (i) una mutación D10A de la secuencia S. pyogenes SEQ ID NO: 8 o la mutación correspondiente en cualquiera de las secuencias de aminoácidos establecidas como SEQ ID NO: 1-256 y 795-1346; y (ii) una mutación H840A de la secuencia S. pyogenes SEQ ID NO: 8 o la mutación correspondiente en cualquiera de las secuencias de aminoácidos establecidas como SEQ ID NO: 1-256 y 795-1346.
Las características de la presente descripción incluyen un polipéptido modificador quimérico dirigido al sitio que comprende: (i) una parte de unión a ARN que interactúa con un ARN dirigido a ADN, donde el ARN dirigido a ADN comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia en un ADN objetivo; y (ii) una parte de actividad que presenta actividad enzimática dirigida al sitio, donde el sitio de actividad enzimática está determinado por el ARN dirigido a ADN. En algunos casos, el polipéptido modificador quimérico dirigido al sitio comprende una secuencia de aminoácidos con al menos alrededor de 75 % de identidad de secuencia de aminoácidos con los aminoácidos 7-166 o 731-1003 de la secuencia de aminoácidos Cas9/Csnl ilustrada en la Figura 3 o con las partes correspondientes en cualquiera de las secuencias de aminoácidos establecidas como SEQ ID NO: 1-256 y 795-1346. En algunos casos, el ARN dirigido a ADN comprende además una secuencia de nucleótidos con al menos 60 % de identidad a lú largo de al menos 8 nucleótidos contiguos a cualquiera de las secuencias de nucleótidos establecidas en las SEQ ID NO: 431-682 (por ejemplo, SEQ ID NO: 563-682). En algunos casos, el ARN dirigido a ADN comprende además una secuencia de nucleótidos con al menos 60 % de identidad a lo largo de al menos 8 nucleótidos contiguos a cualquiera de las secuencias de nucleótidos establecidas en las SEQ ID NO: 431-562. En algunos casos, la actividad enzimática del polipéptido modificador quimérico dirigido al sitio modifica el ADN objetivo. En algunos casos, la actividad enzimática del polipéptido modificador quimérico dirigido al sitio es actividad de nucleasa, actividad de metiltransferasa, actividad de desmetilasa, actividad de reparación del ADN, actividad de daño al ADN, actividad de desaminación, actividad de dismutasa, actividad de alquilación, actividad de depurinación, actividad de oxidación, actividad de formación de dimeros de pirimidina, actividad de integrasa, actividad de transposasa, actividad de recombinasa, actividad de polimerasa, actividad de ligasa, actividad de helicasa, actividad de fotoliasa o actividad de glicosilasa. En algunos casos, la actividad enzimática del polipéptido modificador quimérico dirigido al sitio es actividad de nucleasa. En algunos casos, la actividad de nucleasa introduce una rotura de cadena doble en el ADN objetivo. En algunos casos, la actividad enzimática del polipéptido modificador quimérico dirigido al sitio modifica un polipéptido objetivo asociado al ADN objetivo. En algunos casos, la actividad enzimática del polipéptido modificador quimérico dirigido al sitio es actividad de metiltransferasa, actividad de desmetilasa, actividad de acetiltransferasa, actividad de deacetilasa, actividad de cinasa, actividad de foSfatasa, actividad de ubiquitina ligasa, actividad desubiquitinante, actividad de adenilación, actividad de desadenilación, actividad de SUMOilación, actividad de deSUMOilación, actividad de ribosilación, actividad de desribosilación, actividad de miristoilación o actividad de demiristoilación.
Las características de la presente descripción incluyen un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica a un polipéptido modificador quimérico dirigido al sitio. En algunos casos, el polinucleótido es un polinucleótido de ARN. En algunos casos, el polinucleótido es un polinucleótido de ADN. Las características de la presente descripción incluyen un vector de expresión recombinante que comprende el polinucleótido. En algunos casos, el polinucleótido. se encuentra unido operativamente a un promotor. En algunos casos, el promotor es un promotor inducible. Las características de la presente descripción incluyen una célula hospedadora in vitro modificada genéticamente que comprende el polinucleótido.
Las características de la presente descripción incluyen un polipéptido modificador quimérico dirigido al sitio que comprende: (i) una parte de unión a ARN que interactúa con un ARN dirigido a ADN, donde el ARN dirigido a ADN comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia en un ADN objetivo; y (ii) una parte de actividad que modula la transcripción dentro del ADN objetivo, donde el sitio de transcripción modulada dentro el ADN objetivo está determinado por el ARN dirigido a ADN. En algunos casos, la parte de actividad aumenta la transcripción dentro del ADN objetivo. En algunos casos, la parte de actividad disminuye la transcripción dentro del ADN objetivo.
Las características de la presente descripción incluyen una célula modificada genéticamente que comprende un polipéptido modificador recombinante dirigido al sitio que comprende una parte de unión a ARN que interactúa con un ARN dirigido a ADN; y una parte de actividad que presenta actividad enzimática dirigida al sitio, donde el sitio de actividad enzimática está determinado por el ARN dirigido a ADN. En algunos casos, el polipéptido modificador dirigido al sitio comprende una secuencia de aminoácidos con al menos alrededor de 75 % de identidad de secuencia de aminoácidos con los aminoácidos 7-166 o 731-1003 de la secuencia de aminoácidos Cas9/Csnl ilustrada en la Figura 3 o a las partes correspondientes en cualquiera de las secuencias de aminoácidos establecidas como SEQ ID NO: 1-256 y 795-1346. En algunos casos, la célula se selecciona del grupo que consiste en: una :célula arqueal, una célula bacteriana, una célula eucariota, un organismo eucariota unicelular, una célula somática, una célula germinal, una célula madre, una célula vegetal, una célula de algas, una célula de animal, una célula de invertebrado, una célula de vertebrado, una célula de pez, una célula de rana, una célula de ave, una célula de mamífero, una célula de cerdo, una célula de vaca, una célula de cabra, una célula de oveja, una célula de roedor, una célula de rata, una célula de ratón, una célula de primate no humano y una célula de humano.
Las características de la presente descripción incluyen un organismo transgénico no humano cuyo genoma comprende un transgén que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido modificador recombinante dirigido al sitio que comprende: (i) una parte de unión a ARN que interactúa con el ARN dirigido a ADN; y (ii) una parte de actividad que presenta una actividad enzimática dirigida al sitio, ddoonnddee eell ssiittiioo ddee aaccttiivviiddaadd eennzziimmááttiiccaa está determinado por el ARN dirigido a ADN. En algunos casos, el polipéptido modificador dirigido al sitio comprende una secuencia de aminoácidos con al menos alrededor de 75 % de identidad de secuencia de aminoácidos con los aminoácidos 7-166 o 731-1003 de la secuencia de aminoácidos Cas9/Csnl ilustrada en la Figura 3 o a las partes correspondientes en cualquiera de las secuencias de aminoácidos establecidas como SEQ ID NO: 1-256 y 795-1346. En algunos casos, el organismo se selecciona del grupo que consiste en: una arquea, una bacteria, un organismo unicelular eucariota, un alga, una planta, un animal, un invertebrado, una mosca, un gusano, un enidario, un vertebrado, un pez, una rana, un ave, un mamífero, un ungulado, un roedor, una rata, un ratón y un primate no humano.
Las características de la presente descripción incluyen una composición que comprende: (i) un ARN dirigido a ADN o un polinucleótido de ADN que codifica a este, donde el ARN dirigido a ADN comprende: (a) un primer segmento que comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia en un ADN objetivo; y (b) un segundo segmento que interactúa con un polipéptido modificador dirigido al sitio; y (ii) el polipéptido modificador dirigido al sitio o un polinucleótido que lo codifica, donde el polipéptido modificador dirigido al sitio comprende: (a) una parte de unión a ARN que interactúa con el ARN dirigido a ADN; y (b) una parte de actividad que presenta una actividad enzimática dirigida al sitio, donde el sitio de actividad enzimática está determinado por el ARN dirigido a ADN. En algunos casos, el primer segmento del ARN dirigido a ADN comprende 8 nucleótidos que tienen al menos 100 % de co plementariedad con una secuencia en el ADN objetivo. En algunos casos, el segundo segmento del ARN dirigido a ADN comprende una secuencia de nucleótidos con al menos 60 % de identidad a lo largo de al menos 8 nucleótidos contiguos a cualquiera de las secuencias de nucleótidos establecidas en las SEQ ID NO: 431-682 (por ejemplo, SEQ ID NO: 563-682). En algunos casos, el segundo segmento del ARN que dirige al ADN comprende una secuencia de nucleótidos con al menos 60 % de identidad a lo largo de al menos 8 nucleótidos contiguos a cualquiera de las secuencias de nucleótidos establecidas en las SEQ ID NO: 431-562. En algunos casos, el polipéptido modificador dirigido al sitio comprende una secuencia de aminoácidos con al menos alrededor de 75 % de identidad de secuencia de aminoácidos con los aminoácidos 7-166 o 731-1003 de la secuencia de aminoácidos Cas9/Csnl ilustrada en la Figura 3 o a las partes correspondientes en cualquiera de las secuencias de aminoácidos establecidas como SEQ ID NO: 1-256 y 795-1346. En algunos casos, la actividad enzimática modifica al ADN objetivo. En algunos casos, la actividad enzimática es actividad de nucleasa, actividad de metiltransferasa, actividad de desmetilasa, actividad de reparación del ADN, actividad de daño al ADN, actividad de desaminación, actividad de dismutasa, actividad de alquilación, actividad de depurinación, actividad de oxidación, actividad de formación de dimeros de pirimidina, actividad de integrasa, actividad de transposasa, actividad de recombinasa, actividad de polimerasa, actividad de ligasa, actividad de helicasa, actividad de fotoliasa o actividad de glicosilasa. En algunos casos, la actividad enzimática es actividad de nucleasa. En algunos casos, la actividad de nucleasa introduce una rotura de cadena doble en el ADN objetivo. En algunos casos, la actividad enzimática modifica un polipéptido objetivo asociado con el ADN objetivo. En algunos casos, la actividad enzimática es actividad de metiltransferasa, actividad de desmetilasa, actividad de acetiltransferasa, actividad de deacetilasa, actividad de cinasa, actividad de fosfatasa, actividad de ubiquitina ligasa, actividad desubiquitinante, actividad de adenilación, actividad de desadenilación, actividad de SUMOilación, actividad de deSUMOilación, actividad de ribosilación, actividad de desribosilación, actividad de miristoilación o actividad de demiristoilación. En algunos casos, el polipéptido objetivo es una histona y la actividad enzimática es actividad de metiltransferasa, actividad de desmetilasa, actividad de acetiltransferasa, actividad de deacetilasa, actividad de cinasa, actividad de fosfatasa, actividad de ubiquitina ligasa o actividad desubiquitinante. En algunos casos, el ARN dirigido a ADN es un ARN dirigido a ADN de doble molécula y la composición comprende tanto un ARN identificador y un ARN activador, del cual los segmentos formadores de dúplex son complementarios y se hibridan para formar el segundo segmento de ARN dirigido a ADN. En algunos casos, el segmento formador de dúplex del ARN activador comprende una secuencia de nucleótidos con al menos 60 % de identidad a lo largo de al menos 8 nucleótidos contiguos a cualquiera de las secuencias de nucleótidos establecidas en las SEQ ID NO: 431-682.
Las carajcteristicas de la presente descripción incluyen una composición que comprende: (i) un ARN dirigido a ADN de la presente descripción, o un polinucleótido de ADN que lo codifica; y (ii) un amortiguador para estabilizar ácidos nucleicos. Las características de la presente descripción incluyen una composición que comprende: (i) un polipéptido modificador dirigido al sitio de la presente descripción, o un polinucleótido que lo codifica; y (ii) un amortiguador para estabilizar ácidos nucleicos y/o proteínas. Las características de la presente descripción incluyen una composición que comprende: (i) un ARN dirigido a ADN o un polinucleótido de ADN que codifica a este, donde el ARN. dirigido a ADN comprende: (a) un primer segmento que comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia en un ADN objetivo; y (b) un segundo segmento que interactúa con un polipéptido modificador dirigido al sitio; y (ii) el polipéptido modificador dirigido al sitio o un polinucleótido que lo codifica, donde el polipéptido modificador dirigido al sitio comprende: (a) una parte de unión a ARN que interactúa con el ARN dirigido a ADN; y (b) una parte de actividad que modula la transcripción dentro del ADN objetivo, donde el sitio de transcripción modulada dentro del ADN objetivo está determinado por el ARN dirigido a ADN. En algunos casos, la parte de actividad aumenta la transcripción dentro del ADN objetivo. En algunos casos, la parte de actividad disminuye la transcripción dentro del ADN objetivo. Las características de la presente descripción incluyen una composición que comprende: (i) un polipéptido modificador dirigido al sitio o un polinucleótido que lo codifica; y (ii) un amortiguador para estabilizar ácidos nucleicos y/o proteínas.
Las características de la presente descripción incluyen un método de modificación específica al sitio de un ADN objetivo, donde el método comprende: poner en contacto el ADN objetivo con: (i) un ARN dirigido a ADN o un polinucleótido de ADN que codifica a este, donde el ARN dirigido a ADN comprende: (a) un primer segmento que comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia en el ADN objetivo; y (b) un segundo segmento que interactúa con un polipéptido modificador dirigido al sitio; y (ii) un polipéptido modificador dirigido al sitio o un polinucleótido que lo codifica, donde el polipéptido modificador dirigido al sitio comprende: (a) una parte de unión a ARN que interactúa con el ARN dirigido a ADN; y (b) una parte de actividad que presenta actividad enzimática dirigida al sitio. En algunos ca,sos, el ADN objetivo es extracromosómico. En algunos casos, el ADN objetivo comprende una secuencia PAM de la cadena complementaria que es 5'-CCY-3', donde Y es cualquier nucleótido de ADN e Y está en una posición inmediata respecto del extremo 5' de la secuencia objetivo de la cadena complementaria del ADN objetivo. En algunos casos, el ADN objetivo es parte de un cromosoma ín vitro. En algunos casos, el ADN objetivo es parte de un cromosoma in vivo. En algunos casos, el ADN objetivo es parte de un cromosoma en una célula. En algunos casos, la célula se selecciona del grupo que consiste en: una célula arqueal, una célula bacteriana, una célula eucariota, un organismo eucariota unicelular, una célula somática, una célula germinal, una célula madre, una célula vegetal, una célula de algas, una célula de animal, una célula de invertebrado, una célula de vertebrado, una célula de pez, una célula de rana, una célula de ave, una célula de mamífero, una célula de cerdo, una célula de vaca, una célula de cabra, una célula de oveja, una célula de roedor, una célula de rata, una célula de ratón, una célula de primate no humáno y una célula de humano. En algunos casos, el ARN dirigido a ADN comprende una secuencia de nucleótidos con al menos 60 % de identidad a lo largo de al menos 8 nucleótidos contiguos a cualquiera de las secuencias de nucleótidos establecidas en las SEQ ID NO: 431-682 (por ejemplo, SEQ ID NO: 563-682). En algunos casos, el ARN dirigido a ADN comprende además una secuencia de nucleótidos con al menos 60 % de identidad a lo largo de al menos 8 nucleótidos contiguos a cualquiera de las secuencias de nucleótidos establecidas en las SEQ ID NO: 431-562. En algunos casos, el polipéptido modificador de ADN comprende una secuencia de aminoácidos con al menos alrededor de 75 % de identidad de secuencia de aminoácidos con los aminoácidos 7-166 o 731-1003 de la secuencia de aminoácidos Cas9/Csnl ilustrada en la Figura 3 o a las partes correspondientes en cualquiera de las secuencias de aminoácidos establecidas como SEQ ID NO: 1-256 y 795-1346. En algunos casos, la actividad enzimática modifica al ADN objetivo. En algunos casos, la actividad enzimática es actividad de nucleasa, actividad de metiltransferasa, actividad de desmetilasa, actividad de reparación del ADN, actividad de daño al ADN, actividad de desaminación, actividad de dismutasa, actividad de alquilación, actividad de depurinación, actividad de oxidación, actividad de formación de dímeros de pirimidina, actividad de integrasa, actividad de transposasa, actividad de recombinasa, actividad de polimerasa, actividad de ligasa, actividad de helicasa, actividad de fotoliasa o actividad de glicosilasa. En algunos casos, la actividad enzimática modificadora de ADN es actividad de nucleasa. En algunos casos, la actividad de nucleasa introduce una rotura de cadena doble en el ADN objetivo. En algunos casos, el contacto ocurre en condiciones que permiten reparación dirigida por homología o recombinación no homologa. En algunos casos, el método comprende además poner en contacto el ADN objetivo con un polinucleótido donante, donde el polinucleótido donante, una parte del polinucleótido donante, una copia del polinucleótido donante o una parte de una copia del polinucleótido donante se integra al ADN objetivo. En algunos casos, el método no comprende poner en contacto la célula con el polinucleótido donante, donde el ADN objetivo se modifica de forma tal que los nucleótidos dentro del ADN objetivo son eliminados. En algunos casos, la actividad enzimática modifica un polipéptido objetivo asociado con el ADN objetivo. En algunos casos, la actividad enzimática es actividad de metil.transferasa, actividad de desmetilasa, actividad de acetiltransferasa, actividad de deacetilasa, actividad de cinasa, actividad de fosfatasa, actividad de ubiquitina ligasa, actividad desubiquitinante, actividad de adenilación, actividad de desadenilación, actividad de SUMOilación, actividad de deSUMOilación, actividad de ribosilación, actividad de desribosilación, actividad de miristoilación o actividad de demiristoilación. En algunos casos, el polipéptido objetivo es una histona y la actividad enzimática es actividad de metiltransferasa, actividad de desmetilasa, actividad de acetiltransferasa, actividad de deacetilasa, actividad de cinasa, actividad de fosfatasa, actividad de ubiquitina ligasa o actividad desubiquitinante. En algunos casos, el complejo Comprende además un ARN activador. En algunos casos, el ARN activador comprende una secuencia de nucleótidos con al menos 60 % de identidad a lo largo de al menos 8 nucleótidos contiguos a cualquiera de las secuencias de nucleótidos establecidas en las SEQ ID NO: 431-682.
Las' características de la presente descripción incluyen un método de modulación de la transcripción específica al sitio de un ADN objetivo, donde el método comprende poner en contacto el ADN objetivo con: (i) un ARN dirigido a ADN o un polinucleótido de ADN que codifica a este, donde el ARN dirigido a ADN comprende: (a) un primer segmento que comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia en el ADN objetivo; y (b) un segundo segmento que interactúa con un polipéptido modificador dirigido al sitio; y (ii) un polipéptido modificador dirigido al sitio o un polinucleótido que lo codifica, donde el polipéptido modificador dirigido al sitio comprende: (a) una parte de unión a ARN que interactúa con el ARN dirigido a ADN; y (b) una parte de actividad que modula la transcripción, donde dichos dicho contacto da como resultado una modulación de transcripción dentro del ADN objetivo. En algunos casos, aumenta la transcripción dentro del ADN objetivo. En algunos casos, disminuye la transcripción dentro del ADN objetivo.
Las características de la presente descripción incluyen un método de modificación específica al sitio en ADN objetivo, donde el!método comprende: poner en contacto el ADN objetivo con: (i) un ARN dirigido a ADN o un polinucleótido de ADN que codifica a este, donde el ARN dirigido a ADN comprende: (a) un primer segmento que comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia en el ADN objetivo; y (b) un segundo segmento que interactúa con un polipéptido modificador dirigido al sitio; y (ii) un polipéptido modificador dirigido al sitio o un polinucleótido que lo codifica, donde el polipéptido modificador dirigido al sitio comprende: (a) una parte de unión a ARN que interactúa con el ARN dirigido a ADN; y (b) una parte de actividad que modula la transcripción, dentro del ADN objetivo. En algunos casos, el polipéptido modificador dirigido al sitio aumenta la transcripción dentro del ADN objetivo. En algunos casos, el polipéptido modificador dirigido al sitio disminuye la transcripción dentro del ADN objetivo.
Las características de la presente descripción incluyen un método para promover la escisión específica del sitio y la modificación de un ADN objetivo ¾n una célula, donde el método comprende introducir en la célula: (i) un ARN dirigido a ADN o un polinucleótido de ADN que codifica a este, donde el ARN dirigido a ADN comprende: (a) un primer segmento que comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia en el ADN objetivo; y (b) un segundo segmento que interactúa con un polipéptido modificador dirigido al sitio; y (ii) un polipéptido modificador dirigido al sitio o un polinucleótido que lo codifica, donde el polipéptido modificador dirigido al sitio comprende: (a) una parte de unión a ARN que interactúa con el ARN dirigido a ADN; y (b) una parte de actividad que presenta actividad de nucleasa que crea una rotura de cadena doble en el ADN objetivo; donde el sitio de la rotura de cadena doble está determinado por el ARN dirigido a ADN, el contacto tiene lugar en condiciones que permiten la reparación dirigida por homología o recombinación no homologa, y el ADN objetivo está escindido y se vuelve a unir para producir una secuencia modificada de ADN. En algunos casos, el método comprende además poner en contacto el ADN objetivo con un polinucleótido donante, donde el polinucleótido donante, una parte del polinucleótido donante, una copia del.polinucleótido donante o una parte de una copia del polinucleótido donante se integra al ADN objetivo. En algunos casos, el método no comprende poner en contacto la célula con el polinucleótido donante, donde el ADN objetivo se modifica de forma tal que los nucleótidos dentro del ADN objetivo son eliminados. En algunos casos, la célula se selecciona del grupo que consiste en: una célula arqueal, una célula bacteriana, una célula eucariota, un organismo eucariota unicelular, una célula somática, una célula germinal, una célula madre, una célula vegetal, una célula de algas, una célula de animal, una célula de invertebrado, una célula de vertebrado, una.célula de pez, una célula de rana, una célula de ave, una célula de mamífero, una célula de cerdo, una célula de vaca, una célula de cabra, una célula de oveja, una célula de roedor, una célula de rata, una célula de ratón, una célula de primate no humano y una célula de humano. En algunos casos, la célula es in vitro. En algunos casos, la célula es in vivo.
Las características de la presente descripción incluyen un método para producir una célula modificada genéticamente en un sujeto, donde el método comprende: (I) Introducir en una célula: (i) un ARN dirigido a ADN o un polinucleótido de ADN que codifica a este, donde el ARN dirigido a ADN comprende: (a) un primer segmento que comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia en el ADN objetivo; y (b) un segundo segmento que interactúa con un polipéptido modificador dirigido al sitio; y (ii) un polipéptido modificador dirigido al sitio o un polinucleótido que lo codifica, donde el polipéptido modificador dirigido al sitio comprende: (a) una parte de unión a ARN que interactúa con el ARN dirigido a ADN; y (b) una parte de actividad que presenta actividad de nucleasa que crea una rotura de cadena doble en el ADN objetivo; donde el sitio de la rotura de cadena doble está determinado por el ARN dirigido a ADN, el contacto tiene lugar en condiciones que permiten la reparación dirigida por homología o recombinación no homologa, y el ADN objetivo está escindido y se vuelve a unir para producir una secuencia modificada de ADN, produciendo así la célula modificada genéticamente; y (II) trasplantar la célula modificada genéticamente al sujeto. En algunos casos, el método comprende además poner en contacto la célula con un polinucleótido donante, donde el polinucleótido donante, una parte del polinucleótido donante, una copia del polinucleótido donante o una parte de .una copia del polinucléótido donante se integra al ADN objetivo. En algunos casos, el método no comprende poner en contacto la célula con el polinucleótido donante, donde el ADN objetivo se modifica de forma tal que los nucleótidos dentro del ADN objetivo son eliminados. En algunos casos, la célula se selecciona del grupo que consiste en: una célula arqueal, una célula bacteriana, una célula eucariota, un organismo eucariota unicelular, una célula somática, una célula germinal, una célula madre, una célula vegetal, una célula de algas, una célula de animal, una célula de invertebrado, una célula de vertebrado, una célula de pez, una célula de anfibio, una célula de ave, una célula de mamífero, una célula de ungulado, una célula de roedor, una célula de primate no humano y una célula de humano.
Las características de la presente descripción incluyen un método para modificar el ADN objetivo en una célula modificada genéticamente que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido modificador exógeno dirigido al sitio, donde el método comprende introducir en la célula modificada genéticamente un ARN dirigido a ADN o un polinucleótido de ADN que.lo codifica, donde: (i) el ARN dirigido a ADN comprende: (a) un primer segmento que comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia en el ADN objetivo; y (b) un segundo segmento que interactúa con un polipéptido modificador dirigido al sitio; y (ii) el polipéptido modificador dirigido al sitio que comprende: (a) una parte de unión a ARN que interactúa con el ARN dirigido a ADN; y (b) una parte de actividad que presenta actividad de nucleasa. En algunos casos, el polipéptido modificador dirigido al sitio comprende una secuencia de aminoácidos con al menos alrededor de 75 % de identidad de secuencia de aminoácidos con los aminoácidos 7-166 o 731-1003 de la secuencia de aminoácidos Cas9/Csnl ilustrada en la Figura 3 o a las partes correspondientes en cualquiera de las secuencias de aminoácidos establecidas como SEQ ID NO: 1-256 y 795-1346. En algunos casos, la célula se selecciona del grupo que consiste en: una célula arqueal, una célula bacteriana, una célula eucariota, un organismo eucariota unicelular, una célula somática, una célula germinal, una célula madre, una célula vegetal, una célula de algas, una célula de animal, una célula de invertebrado, una célula de vertebrado, una célula de pez, una célula de anfibio, una célula de ave, una célula de mamífero, una célula de ungulado, una célula de roedor, una célula de primate no humano y una célula de humano. En algunos casos, la célula es in vivo. En algunos casos, la célula es in vitro. En algunos casos, la expresión del polipéptido modificador dirigido al sitio está bajo el control de un promotor inducible. En algunos casos, la expresión del polipéptido modificador dirigido al sitio está bajo el control de un promotor específico de tipo celular.
Las características de la presente descripción incluyen un kit que comprende: el ARN dirigido a ADN o un polinucleótido de ADN que lo codifica; y un reactivo para reconstitución y/o dilución. En algunos casos, el kit comprende además un reactivo que se selecciona del grupo que consiste en: un amortiguador para introducir en células el ARN dirigido a ADN, un amortiguador de lavado, un reactivo de control, un polinucleótido de ARN o vector de expresión de control, un reactivo para transcribir el ARN dirigido a ADN a partir del ADN y combinaciones de estos.
Las características de la presente descripción incluyen un kit que comprende: un polipéptido modificador dirigido al sitio de:la presente descripción o un polinucleótido de ADN que lo codifica; y un reactivo para reconstitución y/o dilución. En algunos casos, el kit comprende además un reactivo que se selecciona del grupo que consiste en: un amortiguador para introducir en células el polipéptido modificador dirigido al sitio, un amortiguador de lavado, un reactivo de control, un vector de expresión de control o polinucleótido de ARN, un reactivo para la producción in vitro del polipéptido modificador dirigido al sitio a partir de ADN y combinaciones de estos.
Las características de la presente descripción incluyen un kit que comprende: un polipéptido modificador dirigido al sitio de la presente descripción o un polinucleótido de ADN que lo codifica; y un reactivo para reconstitución y/o dilución. Las características de la presente descripción incluyen un kit que comprende: un ARN dirigido a ADN o un polinucleótido de ADN que lo codifica, donde el ARN dirigido a ADN comprende: (a) un primer segmento que comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia en un ADN objetivo; y (b) un segundo segmento que interactúa con un polipéptido modificador dirigido al sitio; y (ii) el polipéptido modificador dirigido al sitio o un polinucleótido que lo codifica, donde el polipéptido modificador dirigido al sitio comprende: (a) una parte de unión a ARN que interactúa con el ARN dirigido a ADN; y (b) una parte de actividad que presenta una actividad enzimática dirigida al sitio, donde el sitio de actividad enzimática está determinado por el ARN dirigido a ADN.
Las características de la presente descripción incluyen un kit que comprende: (i) un ARN dirigido a ADN o un polinucleótido de ADN que codifica a este, que comprende: (a) un primer segmento que comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia en un ADN objetivo; y (b) un segundo segmento que interactúa con un polipéptido modificador dirigido al sitio; y (ii) el polipéptido modificador dirigido al sitio o un polinucleótido que lo codifica, que comprende: (a) una parte de unión a ARN que interactúa con el ARN dirigido a ADN; y (b) una parte de actividad que modula la transcripción dentro del ADN objetivo, donde el sitio de transcripción modulada dentro del ADN objetivo está determinado por el ARN dirigido a ADN.
Las características de la presente descripción incluyen un kit que comprende: (i) cualquiera de los vectores de expresión recombinantes mencionados anteriormente; y (ii) un reactivo para la reconstitución y/o dilución. Las características de la presente descripción incluyen un kit que comprende: (i) cualquiera de los vectores de expresión recombinantes mencionados anteriormente; y (ii) un vector de expresión recombinante que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido modificador dirigido al sitio, donde el polipéptido modificador dirigido al sitio comprende: (a) una parte de unión a ARN que interactúa con el ARN dirigido a ADN; y (b) una parte de actividad que presenta una actividad enzimática dirigida al sitio, donde el sitio de actividad enzimática está determinado por el ARN dirigido a ADN. Las características de la presente descripción incluyen un kit que comprende: (i) cualquiera de los vectores de expresión recombinantes mencionados anteriormente; y (ii) un vector de expresión recombinante que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido modificador dirigido al sitio, donde el polipéptido modificador dirigido al sitio comprende: (a) una parte de unión a ARN que interactúa con el ARN dirigido a ADN; y (b) una parte de actividad que modula la transcripción dentro del ADN objetivo, donde el sitio de transcripción modulada dentro del ADN objetivo está determinado por el ARN dirigido a ADN.
Las características de la presente descripción incluyen un kit para el direccionamiento del ADN objetivo que comprende: dos o más ARN dirigidos a ADN o polinucleótidos de ADN que los codifican, donde el primer segmento de al menos uno de los dos o más ARN dirigidos a ADN difiere en al menos un nucleótido del primer segmento de al menos otro de los dos o más ARN dirigidos a ADN.
Descripción de las Figuras de la Invención Las Figuras 1A-B proporcionan un dibujo esquemático de dos ejemplos de ARN dirigido a ADN de la invención, cada uno asociado con un polipéptido modificador dirigido al sitio y con un ADN objetivo.
La Figura 2 ilustra la edición de ADN objetivo a través de roturas de ADN de cadena doble introducidas con un polipéptido modificador dirigido al sitio Cas9/Csnl y un ARN dirigido a ADN.
Las Figuras 3A-B ilustran la secuencia *de aminoácidos de una proteina Cas9/Csnl de Streptococcus pyogenes (SEQ ID NO: 8). Cas9 tiene dominios homólogos a las endonucleasas HNH y RuvC. (A) Los motivos 1-4 están sobrerrayados (B) Los dominios 1 y 2 están sobrerrayados.
Las Figuras 4A-B ilustran la identidad porcentual entre las proteínas Cas9/Csnl de múltiples especies. (A) Identidad de secuencia relativa a Streptococcus pyogenes . Por ejemplo, el Dominio 1 son los aminoácidos 7-166 y el Dominio 2 son los aminoácidos 731-1003 de Cas9/Csnl de Streptococcus pyogenes tal como se ilustra en la Figura 3B. (B) Identidad de secuencia relativa a Neisseria meningitidis . Por ejemplo, el Dominio 1 son los aminoácidos 13-139 y el Dominio 2 son los aminoácidos 475-750 de Cas9/Csnl de Neisseria meningitidis (SEQ ID NO: 79).
La Figura 5 ilustra un alineamiento de múltiples secuencias de los motivos 1-4 de proteínas Cas9/Csnl de varias especies diversas seleccionadas de la tabla filogenética de la Figura 32 (véase la Figura 32, la Figura 3A y la Tabla 1) ( Streptococcus pyogenes (SEQ ID NO: 8), Legionella pneumophila (SEQ ID NO: 17), Gamma proteobacterium (SEQ ID NO: 107), Listeria innocua (SEQ ID NO: 3), Lactobacillus gasseri (SEQ ID NO: 152), Eubacterium rectale (SEQ ID NO: 99), Staphylococcus lugdunensis (SEQ ID NO: 185), Mycoplasma synoviae (SEQ ID NO: 22), Mycoplasma mobile (SEQ ID NO: 16), Wolinella succinogenes (SEQ ID NO: 10), Flavobacterium columnare (SEQ ID NO: 235), Fibrobacter succinogenes (SEQ ID NO: 121), Bacteroides fragilis (SEQ ID NO: 21), Acidothermus cellulolyticus (SEQ ID NO: 42) y Bifidobacterium dentium (SEQ ID NO: 131).
Las Figuras 6A-B proporcionan alineamientos de secuencias de tracrRNA de origen natural ( "ARN activador") de varias especies (L. innocua (SEQ ID NO: 268); S. pyogenes (SEQ ID NO: 267); S. mutans (SEQ ID NO: 269); S. thermophilusl (SEQ ID NO: 270); M. mobile (SEQ ID NO: 274); N. meningitides (SEQ ID NO: 272); P. multocida (SEQ ID NO: 273); S. thermophilus2 (SEQ ID NO: 271); y S. pyogenes (SEQ ID NO: 267). (A) alineamiento de múltiples secuencias de ortólogos seleccionados de tracrRNA (AlignX, VectorNTI package, Invitrogen) asociados con locus CRISPR/Cas de arquitectura similar y secuencias Cas9/Csnl muy similares. Los recuadros negros representan nucleótidos compartidos (B) alineamiento de múltiples secuencias de ortólogos seleccionados de tracrRNA (AlignX, VectorNTI package, Invitrogen) asociados con locus CRISPR/Cas de arquitectura diferente y secuencias Cas9/Csnl no relacionadas de forma cercana. Nótese la similitud de la secuencia de los ortólogos de tracrRNA de N. meningitidis y P. multocida. Los recuadros negros representan nucleótidos compartidos. Para más ejemplos de secuencia de ARN activador, véanse las SEQ ID NO: 431-562.
Las Figuras 7A-B proporcionan alineamientos de secuencias de segmentos formadores de dúplex de crRNA ("ARN identificador") de origen natural de varias especies (L. innocua (SEQ ID NO://); S. pyogenes (SEQ ID NO://); S. mutans (SEQ ID NO://); S. thermophilusl (SEQ ID NO://); C. jejuni (SEQ ID NO://); S. pyogenesi (SEQ ID NO://); F. novicida (SEQ ID NO://); M. mobile (SEQ ID NO://); N. meningitides (SEQ ID NO://); P. multocida (SEQ ID NO://); y S. thermophilus2 (SEQ ID NO://). (A) múltiples alineamientos de secuencias de ejemplos de secuencias de segmentos formadores de dúplex de ARN identificador (AlignX, VectorNTI package, Invitrogen) asociadas con los locus de arquitectura similar y secuencias Cas9/Csnl muy similares. (B) Múltiples alineamientos de secuencias de ejemplos de secuencias de segmentos formadores de dúplex de ARN identificador (AlignX, VectorNTI package, Invitrogen) asociadas con los locus de arquitectura diferente y diversas secuencias Cas9. Los recuadros negros representan nucleótidos compartidos. Para más ejemplos de secuencias de segmentos formadores de dúplex de ARN identificador, véanse las SEQ ID NO: 563-679.
La Figura 8 proporciona una vista esquemática de la hibridación para segmentos formadores de dúplex de origen natural del crRNA ("ARN identificador") con el segmento formador de dúplex del ortólogo correspondiente de tracrRNA ("ARN activador"). Secuencia superior, ARN identificador; secuencia inferior, segmento formador de dúplex del ARN activador correspondiente. Los locus de CRISPR pertenecen al sistema CRISPR/Cas de Tipo II (Nmeni/CASS4). La nomenclatura es conforme a la base de datos de CRISPR (CRISPR DB). S. pyogenes (SEQ ID NO:// y //); S. mutans (SEQ ID NO:// y //); S. thermophilusl (SEQ ID NO:// y //); S. thermophilus2 (SEQ ID NO:// y //); L. innocua (SEQ ID NO:// y //); T. denticola (SEQ ID NO:// y //); N. meningitides (SEQ ID NO:// y //); S. gordonii (SEQ ID NO:// y //); B. bifidum (SEQ ID NO:// y //); L. salivarius (SEQ ID NO:// y //); F. tularensis (SEQ ID NO:// y //); y L. pneumophila (SEQ ID NO:// y //). Nótese que algunas especies contienen cada una dos locus de CRISPR de Tipo II. Para más ejemplos de secuencia de ARN activador, véanse las SEQ ID NO: 431-562. Para más ejemplos de secuencias de segmentos formadores de dúplex de ARN identificador, véanse las SEQ ID NO: 563-679.
La Figura 9 ilustra ejemplos de secuencias de tracrRNA (ARN activador) y crRNA (ARN identificador) de dos especies. Existe un grado de intercambiabilidad; por ejemplo, la proteína Cas9/Csnl de S .pyogenes es funcional con tracrRNA y crRNA derivado de L. innocua . (|) denota un par de bases canónico Watson-Crick, mientras que (·) denota un par de bases Wobb-le G-U. "20 nt variables" o "20 nt" representa el segmento dirigido a ADN que es complementario a un ADN objetivo (esta región puede tener hasta alrededor de 100 nt de longitud). También se muestra el diseño de ARN dirigido a ADN de molécula simple que incorpora características del ARN identificador y del ARN activador. (Las secuencias de proteínas Cas9/Csnl de una gran variedad de especies se ilustran en la Figura 3 y se establecen como SEQ ID NO: 1-256 y 795-1346) Streptococcus pyogenes: de arriba hacia abajo: (SEQ ID NO://, //, //); Listeria innocua : de arriba hacia abajo: (SEQ ID NO://, //, //). Las secuencias proporcionadas son ejemplos no taxativos y su propósito es ilustrar cómo pueden diseñarse ARN dirigidos a ADN de molécula simple y de molécula doble con base en secuencias que existen naturalmente en una gran variedad de especies. Varios ejemplos de secuencias adecuadas de una gran variedad de especies se establecen de la siguiente manera (proteína Cas9: SEQ ID NO: 1-259; tracrRNA: SEQ ID NO: 431-562, o sus complementos; crRNA: SEQ ID NO: 563-679, o sus complementos; y ejemplos de ARN dirigidos a ADN de molécula simple: SEQ ID NO: 680-682).
Las Figuras 10A-E muestran que Cas9 es una endonucleasa de ADN guiada por dos moléculas de ARN. Figura E (de arriba hacia abajo, SEQ ID NO: 278-280, y //).
Las Figuras 11A-B demuestran que Cas9 usa dos dominios nucleasa para escindir las dos cadenas en el ADN .objetivo.
Las Figuras 12A-E ilustran que la escisión catalizada por Cas9 del ADN objetivo requiere un dominio activador en tracrRNA y está regida por una secuencia semilla en el crRNA. Figura 12C (de arriba hacia abajo, SEQ ID NO: 278-280 y //); Figura 12D (de arriba hacia abajo, SEQ ID NO: 281-290; y Figura 12E (de arriba hacia abajo, SEQ ID NO: 291-292, 283, 293-298).
Las Figuras 13A-C muestran que se necesita un PAM para permitir la escisión de ADN objetivo por el complejo Cas9-tracrRNA:crRNA.
Las Figuras 14A-C ilustran que Cas9 puede ser programada utilizando una única molécula de ARN modificada que combina características de tracrRNA y crRNA. Quimera A (SEQ ID NO: 299); Quimera B (SEQ ID NO: 300).
La Figura 15 ilustra la vía inmunita'ria CRISPR/Cas mediada por ARN de Tipo II .
Las Figuras 16A-B ilustran la purificación de nucleasas Cas9.
Las Figuras 17A-C muestran que la Cas9 guiada por tracrRNA:crRNA dual escinde el plásmido protoespaciador y ADN de oligonucleótidos. Figura 17B (de arriba hacia abajo, SEQ ID NO: 301-303 y //); y Figura 17C (de arriba hacia abajo, SEQ ID NO: 304-306 y //).
Las Figuras 18A-B muestran que Cas9 es una endonucleasa dependiente de Mg2+ con actividad exonucleasa 3'-5'.
Las Figuras 19A-C ilustran que la escisión de Cas9 dirigida por tracrRNA:crRNA dual de ADN objetivo es especifica al sitio. Figura 19C (de arriba hacia abajo, SEQ ID NO: 307-309, //, 337-339 y //).
Las Figuras 20A-B ilustran que la escisión de Cas9 dirigida por tracrRNA:crRNA dual de ADN objetivo es rápida y eficiente.
Las Figuras 21A-B muestran que el dominio similar a RuvC y HNH de Cas9 dirigen la escisión de las cadenas de ADN complementarias y no complementarias, respectivamente.
La Figura 22 demuestra que se necesita tracrRNA para el reconocimiento de ADN objetivo.
Las Figujras 23A-B muestran que una región mínima de tracrRNA es capaz de guiar la escisión dirigida por tracrRNA:crRNA dual de ADN objetivo.
Las Figuras 24A-D demuestran que la escisión de ADN objetivo guiada por tracrRNA:crRNA dual mediante Cas9 puede ser especifica para las especies.
Las Figuras 25A-C muestran que una secuencia semilla en el crRNA rige la escisión dirigida al tracrRNA:crRNA dual de ADN objetivo mediante Cas9. Figura 25A: sonda 1 de ADN objetivo (SEQ ID NO: 310); espaciador 4 de crRNA (1-42) (SEQ ID NO: 311); tracrRNA (15-89) (SEQ ID NO: //). Figura 25B panel izquierdo (SEQ ID NO: 310).
Las Figuras 26A-C demuestran que la secuencia PAM es-esencial para la escisión de ADN de plásmido protoespaciador mediante Cas9-tracrRNA:crRNA .y para la interferencia de plásmido de ADN mediada por Cas9 en célula bacterianas. Figura 26B (de arriba hacia abajo, SEQ ID NO: 312-314 y //); y Figura 26C (de arriba hacia abajo, SEQ ID NO: 315-320).
Las Figuras 27A-C muestran que la Cas9 dirigida por un único ARN quimérico que imita al tracrRNA:crRNA dual escinde al ADN protoespaciador. Figura 27C (de arriba hacia abajo, SEQ ID NO: 321-324).
Las Figuras 28A-D ilustran el diseño de novo de ARN quiméricos dirigidos hacia la secuencia génica de la Proteina Verde Fluorescente (GFP, por sus siglas en inglés). Figura 28B (de arriba hacia abajo, SEQ ID NO: 325-326). Figura 28C: Secuencia objetivo de GFP1 (SEQ ID NO: 327); secuencia objetivo!de GFP2 (SEQ ID NO: 328); secuencia objetivo de GFP3 (SEQ ID NO: 329); secuencia objetivo de GFP4 (SEQ ID NO: 330); secuencia objetivo de GFP5 (SEQ ID NO: 331); ARN quimérico de GFP1 (SEQ ID NO: 332); ARN quimérico GFP2 (SEQ ID NO: 333); ARN quimérico de GFP3 (SEQ ID NO: 334); ARN quimérico de GFP4 (SEQ ID NO: 335); ARN quimérico de GFP5 (SEQ ID NO: 336).
Las Figuras 29A-E demuestran qué la coexpresión de Cas9 y ARN guia en células humanas genera roturas de ADN de cadena doble en el locus objetivo. Figura 29C (de arriba hacia abajo, SEQ ID NO: 425-428).
Las Figuras 30A-B demuestran que los U sados celulares contienen Cas9:ARNsg y brindan soporte a la escisión de ADN especifica del sitio.
Las Figuras 31A-B demuestran que la extensión 3' de las construcciones ARNsg aumenta la mutagénesis especifica del sitio mediada por NHEJ. Figura 31A (de arriba hacia abajo, SEQ ID NO: 428-430).
Las Figuras 32A-B ilustran un árbol filogénico de secuencias representativas de Cas9 de varios organismos (A), asi como arquitecturas del locus del Cas9 para los grupos principales del árbol (B).
Las figuras 33A-E ilustran la arquitectura de CRISPR-Cas de tipo II de especies bacterianas seleccionadas.
Las Figuras 34A-B ilustran el coprocesamiento de tracrRNA y pre-crRNA en sistemas de tipo II de CRISPR Cas seleccionados. Figura 34A (de arriba hacia abajo, SEQ ID NO: Figura 34B (de arriba hacia abajo, SEQ ID NO: //, 11, 11, //).
La Figura 35 ilustra un alineamiento de secuencias de ortólogos de tracrRNA que demuestra la diversidad de secuencias tracrRNA.
Las Figuras 36A-F muestran la expresión de ortólogos de tracrRNA y crRNA bacterianos revelados mediante secuenciación profunda de ARN.
Las Figuras 37A-0 listan todos los ortólogos de tracrRNA y crRNA maduros recuperados mediante secuenciación para especies bacterianas estudiadas, incluyendo las coordenadas (región de interés) y secuencias de ADNc correspondientes (5' a 3').
Las Figuras 38 A-B presentan una tabla de especies bacterianas que contienen locus de CRISPR-Cas del tipo II caracterizados por la presencia del gen de firma cas9. Estas secuencias se usaron para análisis filogenético.
Las Figuras 39 A-B muestran el diseño del sistema de interferencia de CRISPR (CRISPRi, por sus siglas en inglés).
Las Figuras 40 A-E demuestran que CRISPRi silencia eficazmente la elongación e inicio de la transcripción.
Las Figuras 41 A-B demuestran que CRISPRi funciona al bloquear la elongación de la transcripción.
Las Figuras 4? A-C demuestran la especificidad de direccionamiento del sistema CRISPRi.
Las Figuras 43 A-F muestran la caracterización de factores que afectan la eficacia de silenciamiento.
Las Figuras 44 A-C muestran el perfil funcional de una red reguladora de complejo usando la inactivación genética CRISPRi.
Las Figuras 45 A-B demuestran el silenciamiento génico usando CRISPRi en células de mamífero.
La Figura 46 muestra el mecanismo del sistema CRISPR tipo II a partir de S. pyogenes.
Las Figuras 47 A-B muestran las curvas de crecimiento de cultivos celulares de E. coli cotransformados con dCas9 y sgRNA.
La Figura 48 muestra que CRISPRi puede silenciar la expresión de un gen indicador en un plásmido de múltiples copias.
Las Figuras 49 A-C muestran los datos de secuenciación de ARN de células con ARNsg que se dirigen a diferentes genes.
Las Figuras 50 A-E muestran los efectos del silenciamiento de ARNsg con mal apareamientos dobles adyacentes.
Las Figuras 51 A-C muestran los efectos del silenciamiento combinatorio de usar dos ARNsg para regular un solo gen.
La Figura 52 muestra que la represión de ARNsg depende de los locus objetivo y la distancia relativa desde el inicio de la transcripción.
Las Figuras 53 A-C muestran resultados experimentales que demuestran que una variante del polipéptido dirigido al sitio Cas9 (dCas9) funciona para los métodos de la presente cuando dCas9 tiene actividad reducida únicamente en el dominio RuvCl únicamente (por ejemplo, D10A), únicamente el dominio HNH (por ejemplo, H840A) o ambos dominios (por ejemplo, D10A y H840A).
Las Figuras 54 A-C enumeran ejemplos de compañeros de fusión adecuados (o fragmentos de estos) para una variante del polipéptido dirigido al sitio Cas9 de la presente. Los ejemplos incluyen, de modo no taxativo, los enumerados.
Las Figuras 55 A-D demuestran que un polipéptido quimérico dirigido al sitio puede usarse para activar (aumentar) la transcripción en células humanas.
La Figura 56 demuestra que un polipéptido quimérico dirigido al sitio puede usarse para reprimir (disminuir) la transcripción en células humanas.
Las Figuras 57A-B demuestran que las secuencias artificiales que comparten aproximadamente 50 % de identidad con tracrRNA y crRNA de origen natural pueden funcionar con Cas9 para escindir ADN objetivo siempre que la estructura del dominio de unión a proteínas del ARN dirigido a ADN se conserve.
Descripción Detallada de la Invención DEFINICIONES - PARTE I Los términos "polinucleótido" y "ácido nucleico", que se utilizan de manera intercambiable en la presente, se refieren a una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, ya sean ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos. Por lo tanto, este término incluye, de modo no taxativo, ADN o ARN de cadena simple, doble o múltiple, ADN genómico, ADNc, híbridos de ADN-ARN o un polímero que comprende bases de purina y pirimidina u otras bases de nucleótidos naturales, modificadas química o biológicamente, no naturales o derivados. "Oligonucleótido" se refiere generalmente a polinucleótidos de entre alrededor de 5 y alrededor de 100 nucleótidos de ADN de cadena simple o doble. Sin embargo, para los fines de esta descripción, no hay un límite superior para la longitud de un oligonucleótido. Los oligonucleótidos se conocen también como "oligómeros" u "oligos" y pueden aislarse a partir de genes, o sintetizarse químicamente mediante métodos conocidos en la téenica. Los términos "polinucleótido" y "ácido nucleico" deberían entenderse como que incluyen, según pueda ser aplicable a las modalidades descritas, polinucleótidos de cadena simple (tal como sentido o antisentido) y de cadena doble.
Una "estructura de tallo-bucle" se refiere a un ácido nucleico que tiene una estructura secundaria que incluye una región de nucleótidos que se sabe o se predice que formarán una cadena doble (parte escalonada) que está unida en un lado por una región de nucleótidos predominantemente de cadena simple (parte de bucle). Los términos estructuras de "horquilla" y "pliegue" también se usan en la presente para referirse a estructuras de tallo-bucle. Dichas estructuras son conocidas en la téenica y estos términos se usan de manera consistente con sus significados conocidos en la técnica. Como se conoce en la técnica, una estructura de tallo-bucle no necesita pares de bases exactos. Por lo tanto, el tallo puede incluir uno o más mal apareamientos de bases. De manera alternativa, la formación de pares de bases puede ser exacta, es decir, no incluir ningún mal apareamiento.
Mediante el uso de los términos "hibridable" o "complementario" se implica que un ácido nucleico (por ejemplo, ARN) comprende una secuencia de nucleótidos que le permiten unirse de manera no covalente, es decir, formar pares de bases Watson-Crick y/o pares de bases G/U, "aparearse" o "hibridarse" con otro ácido nucleico en una manera especifica de secuencia, antiparalela (es decir, un ácido nucleico específicamente se una a un ácido nucleico complementario) en condiciones in vitro y/o in vivo adecuadas de temperatura y potencia iónica de la solución. Como se conoce en la téenica, los pares de bases Watson-Crick estándares incluyen: adenina (A) formando un par con timidina (T), adenina (A) formando un par con uracilo (U) y guanina (G) formando un par con citosina (C) [ADN, ARN]. Además, se conoce en la técnica que para la hibridación entre dos moléculas de ARN (por ejemplo, ARNcd), guanina (G) forma pares de bases con uracilo (U). Por ejemplo, los pares de bases G/U son parcialmente responsables por la degeneración (es decir, redundancia) del código genético en el contexto de formación de pares de bases anti-codón de ARNt con codones en ARNm. En el contexto de esta descripción, una guanina (G) de un segmento de unión a proteínas (dúplex de ARNcd) de una molécula de ARN dirigido a ADN de la invención se considera complementaria a un uracilo (U), y viceversa. Como tal, cuando puede realizarse un par de bases G/U en una posición de nucleótido determinada, un segmento de unión a proteínas (dúplex de ARNcd) de una molécula de ARN dirigido a ADN de la invención, la posición no se considera no complementaria, sino que se considera complementaria.
Las condiciones de hibridación y lavado son conocidas y se ejemplifican en Sambrook, J., Fritsch, E. F. y Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edición, Coid Spring Harbor Laboratory Press, Coid Spring Harbor (1989), particularmente el Capítulo 11 y la Tabla 11.1 de este; y Sambrook, J. y Russell, W., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Tercera Edición, Coid Spring Harbor Laboratory Press, Coid Spring Harbor (2001). Las condiciones de temperatura y potencia iónica determinan la "rigurosidad" de la hibridación.
La hibridación requiere que los dos ácidos nucleicos contengan secuencias complementarias, aunque son posibles los mal apareamientos entre bases. Las condiciones adecuadas para la hibridación entre los dos ácidos nucleicos dependen de la longitud de los ácidos nucleicos y del grado de co plementación, variables que son conocidas en la téenica. Cuanto mayor el grado de complementación entre los dos ácidos nucleicos, mayor será el valor de temperatura de fusión (Tf) para los híbridos de ácidos nucleicos que tienen esas secuencias. Para las hibridaciones entre ácidos nucleicos con extensiones cortas de complementariedad (por ejemplo, complementariedad de 35 nucleótidos o menos, 30 o menos, 25 o menos, 22 o menos, 20 o menos, o 18 o menos) la posición de los mal apareamientos se vuelve importante (véase Sambrook et ál., supra, 11.7-11.8). Típicamente, la longitud de un ácido nucleico hibridable es de al menos alrededor de 10 nucleótidos. Las longitudes mínimas ilustrativas para un ácido nucleico hibridable son: al menos alrededor de 15 nucleótidos; al menos alrededor de 20 nucleótidos; al menos alrededor de 22 nucleótidos; al menos alrededor de 25 nucleótidos; y al menos alrededor de 30 nucleótidos. Además, el experto en la técnica reconocerá que la temperatura y la concentración de sal en solución de lavado pueden ajustarse según sea necesario de acuerdo con factores tal como longitud de la región de complementación y el grado de complementación.
Se entiende en la técnica que la secuencia de polinucleótidos no necesita ser 100 % complementaria a la de su ácido nucleico objetivo para ser específicamente hibridable o hibridable. Además, un polinucleótido puede hibridarse en uno o más segmentos, de manera que los segmentos intervinientes o adyacentes no se vean implicados en el evento de hibridación (por ejemplo, una estructura de bucle, o estructura de horquilla). Un polinucleótido puede comprender al menos 70 %, al menos 80 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 99 % o 100 % complementariedad de secuencia con una región objetivo dentro de la secuencia de ácido nucleico objetivo a la cual se dirige. Por ejemplo, un ácido nucleico antisentido en el que 18 de 20 nucleótidos del compuesto antisentido son complementarias a una región objetivo y que, por lo tanto, se hibridarían de manera específica, representarían un 90 por ciento de complementariedad. En este ejemplo, los nucleótidos no complementarios restantes pueden ser agrupados o intercalados con nucleótidos complementarios y no necesitan ser contiguos entre sí o ser nucleótidos complementarios. El porcentaje de complementariedad entre extensiones particulares de secuencias de ácido nucleico dentro de ácidos nucleicos puede ser determinado de forma rutinaria utilizando programas BLAST (herramientas de búsqueda de alineamiento local básica) y programas PowerBLAST conocidos en la téenica (Altschul et ál., J. Mol. Biol., 1990, 215, 403-410; Zhang and Madden, Genome Res., 1997, 7, 649-656) o mediante el programa Gap (paquete de análisis de secuencia de Wisconsin, Versión 8 para Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison Wis.) con ajustes por defecto, que utiliza el algoritmo de Smith y Waterman (Adv. Appl. Math., 1981, 2, 482-489).
Los términos "péptido", "polipéptido" y "proteína", se usan de manera intercambiable en la presente y se refieren a una forma polimérica de aminoácidos de cualquier longitud, que puede incluir aminoácidos codificados y no codificados, aminoácidos modificados química o bioquímicamente o derivados y polipéptidos que tienen cadenas principales de péptido modificadas.
"Unión", tal como se usa en la presente (por ejemplo, én referencia a un dominio de unión de ARN de un polipéptido) se refiere a una interacción no covalente entre macromoléculas (por ejemplo, entre una proteína y un ácido nucleico). Mientras que están en un estado de interacción no covalente, se dice que las macromoléculas están "asociadas" o que "interactúan" o están "unidas" (por ejemplo, cuando una molécula X se dice que interactúa con una molécula Y, quiere decir que la molécula X se une a la molécula Y en una manera no covalente). No todos los componentes de una interacción de unión necesitan ser específicos de secuencia (por ejemplo, contacto con residuos de fosfato en una estructura de ADN), pero algunas partes de una interacción de unión pueden ser específicas de la secuencia. Las interacciones de unión están caracterizadas en general mediante una constante de disociación (Kd) de menos de 10~6 M, menos de 10-7 M, menos de 108 M, menos de 10~9 M, menos de 1010 M, menos de 10~n M, menos de 10~12 M, menos de 10~13 M, menos de 10~14 M o menos de 10-15 M. "Afinidad" se refiere a la potencia de unión, una afinidad de unión aumentada se correlaciona con una Kd menor.
"Dominio de unión de unión" significa un dominio de proteínas que es capaz de unirse· de manera no covalente a otra molécula. Un dominio de unión puede unirse a, por ejemplo, una molécula de ADN (una proteína de unión a ADN), una molécula de ARN (una molécula de unión a ARN) y/o una molécula de proteína (una proteína de unión a proteína). En el caso de una proteína de unión al dominio de proteínas, puede unirse a sí misma (para formar homodímeros, homotrímeros, etc.) y/o puede unirse a una o más moléculas de una proteína o proteínas diferentes.
El término "sustituciones de aminoácidos conservadoras" se refiere al carácter intercambiable de las proteínas de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares. Por ejemplo, un grupo de aminoácidos que tiene cadenas laterales alifáticas consiste en glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; un grupo de aminoácidos que tiene cadenas laterales hidroxialifáticas consiste en serina y treonina; un grupo de aminoácidos que tiene cadenas laterales que contienen amidas consiste en asparagina y glutamina; un grupo de aminoácidos que tiene cadenas laterales aromáticas consiste en fenilalanina, tirosina y triptófano; un grupo de aminoácidos que tiene cadenas laterales básicas consiste en lisina, arginina e histidina; un grupo de áminoácidos que tiene cadenas laterales ácidas consiste en glutamato y aspartato; y un grupo de aminoácidos que tiene cadenas laterales que contienen azufre consiste en cisteína y metionina. Los ejemplos de grupos de sustitución de aminoácidos conservadores son: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lliissiinnaa--aarrggiinniinnaa,, alanina-valina y asparagina-glutamina.
Un polinucleótido o polipéptido tiene un determinado porcentaje de "identidad de secuencia" con respecto a otro polinucleótido o polipéptido, lo que significa que, cuando se encuentra alineado, ese porcentaje de bases o aminoácidos son los mismos y están en las mismas posiciones relativas cuando se comparan las dos secuencias. La identidad de secuencia se puede determinar de una cantidad de maneras diferentes. Para determinar la identidad de secuencia, las secuencias pueden alinearse usando varios métodos y programas informáticos (por ejemplo, BLAST, T-COFFEE, MUSCLE, MAFFT, etc.), disponibles en la web en sitios que incluyen ncbi.nlm.nili.gov/BLAST, ebi.ac.uk/Tools/msa/tcoffee/, ebi.ac.uk/Tools/nasa/musele/, mafft.cbrc.jp/alignment/software/. Véase, por ejemplo, Altschul et ál. (1990), J. Mol. Bioi.215:403-10.
Una secuencia de ADN que "codifica" un ARN particular es una secuencia de ácido nucleico de ADN que se transcribe en ARN. Un polinucleótido de ADN puede codificar un ARN (ARNm) que se traduce en proteina, o un polinucleótido de ADN puede codificar un ARN que no se traduce en una proteina (por ejemplo, ARNt, ARNr o un ARN dirigido a ADN; también llamado ARN "no codificante" o "ncRNA" (por sus siglas en inglés)).
Una "secuencia codificante de proteínas" o una secuencia que codifica una proteína o polipéptido en particular, es una secuencia de ácido nucleico que se transcribe en ARNm (en el caso de ADN) y se traduce (en el caso de ARNm) en un polipéptido in vitro o in vivo cuando se encuentra bajo el control de secuencias regulatorias apropiadas. Los límites de la secuencia codificante están determinados por un codón de inicio en el extremo 5' (extremo N) y un codón de terminación de la traducción antisentido en el extremo 3' (extremo C). Una secuencia codificante puede incluir, de modo no taxativo, ADNc de ARNm procariota o eucariota, secuencias de ADN genómico de ADN procariota o eucariota, y ácidos nucleicos sintéticos. Una secuencia de terminación de transcripción en general se encontrará usualmente situada en 3' con respecto a la secuencia de codificación.
Tal como se usa en la presente, una "secuencia promotora" es una región reguladora de ADN que puede unirse a la ARN polimerasa e iniciar la transcripción de una secuencia codificante o no codificante posterior (dirección 3'). Con fines de definir la presente invención, la secuencia promotora está delimitada en su extremo 3' mediante el sitio de inicio de la transcripción y se extiende hacia atrás (dirección 5') para incluir la cantidad mínima de bases o elementos necesarios para iniciar la transcripción en niveles detectables por encima del valor registrado. Dentro de la secuencia promotora se encontrará un sitio de inicio de la transcripción, asi como dominios de unión a proteínas responsables por la unión de ARN polimerasa. Los promotores eucariotas a menudo, pero no siempre, contendrán "cajas TATA" y "cajas CAT". Varios promotores, incluidos los promotores inducibles, pueden usarse para impulsar varios vectores de la presente invención.
Un promotor puede ser un promotor constitutivamente activo | (es decir, un promotor que está de manera constitutiva en un estado activo/"ENCENDIDO"), puede ser un promotor inducible (es decir, un promotor cuyo estado, activo/"ENCENDIDO" o inactivo/"APAGADO", es controlado mediante un estimulo externo, por ejemplo, la presencia de una temperatura, compuesto o proteina en particular), puede ser un promotor restringido espacialmente (es decir, elemento de control transcripcional, potenciador, etc.) (por ejemplo, potenciador especifico de tejido, potenciador especifico del tipo celular, etc.), y puede ser un promotor restringido temporalmente (es decir, el promotor está en el estado "ENCENDIDO" o el estado "APAGADO" durante etapas especificas del desarrollo embrionario o durante etapas especificas de un proceso biológico, por ejemplo, ciclo de folículo capilar en ratones).
Los promotores adecuados puede derivar de virus y pueden, por lo tanto, ser mencionados como promotores virales, o pueden derivar de cualquier organismo, incluidos organismos procariotas o eucariotas. Los promotores adecuados pueden usarse para impulsar la expresión mediante cualquier ARN polimerasa (por ejemplo, pol I, pol II, pol III). Los ejemplos de promotores incluyen, de modo no taxativo, el promotor temprano SV40, el promotor de repetición terminal larga (LTR, por sus siglas en inglés) del virus de tumor mamario en ratones; el promotor tardío principal del adenovirus (Ad MLP); un promotor del virus del herpes simple (VHS), un promotor del citomegalovuris (CMV) tal como la región del promotor temprano inmediato de CMV (CMVIE, por sus siglas en inglés), un promotor del virus del sarcoma de rous (VSR), un promotor nuclear pequeño U6 humano (U6) (Miyagishi et ál., Nature Biotechnology 20, 497 - 500 (2002)) un promotor de U6 mejorado (por ejemplo, Xia et ál., Nucleic Acids Res.2003 Sep 1;31(17)), un promotor de H1 humano (Hl), y similares.
Los ejemplos de promotores inducibles incluyen, de modo no taxativo, promotor de la ARN polimerasa T7, promotor de la ARN polimerasa T3, promotor regulado por isopropil-beta-D-tiogalactopiranósido (IPTG), promotor inducido por lactosa, promotor del choque térmico, promotor regulado por tetracielina, promotor regulado por esteroides, promotor regulado por metales, promotor regulado por el receptor de estrógenos, etc. Los promotores inducibles pueden, por lo tanto, regularse mediante moléculas que incluyen, de modo no taxativo, doxociclina; ARN polimerasa, por ejemplo, ARN polimerasa T7; un receptor de estrógeno; una fusión del receptor de estrógeno; etc.
En algunas modalidades, el promotor es un promotor restringido espacialmente (es decir, promotor especifico del tipo de célula, promotor especifico de tejido, etc.) de manera que en un organismo multicelular el promotor esté activo (es decir, "ENCENDIDO") en un subconjunto de células especificas. Los promotores restringidos espacialmente también pueden mencionarse como potenciadores, elementos de control transcripcional, secuencias de control, etc. Cualquier promotor restringido espacialmente conveniente puede usarse y la elección del promotor adecuado (por ejemplo, ún promotor especifico del cerebro, un promotor que impulsa la expresión en un subconjunto de neuronas, un promotor que impulsa la expresión en la linea germinal, un promotor que impulsa la expresión en los pulmones, un promotor que impulsa la expresión en los músculos, un promotor que impulsa la expresión en células del islote del páncreas, etc.) dependerá del organismo. Por ejemplo, se conocen varios promotores restringidos espacialmente para plantas, moscas, gusanos, mamíferos, ratones, etc. Por lo tanto, un promotor restringido espacialmente puede usarse para regular la expresión de un ácido nucleico que codifica un polipéptido modificador dirigido al sitio de la invención en una amplia variedad de tejidos y tipos de células diferentes, dependiendo del organismo. Algunos promotores restringidos espacialmente también están temporalmente restringidos de manera que el promotor esté en el estado "ENCENDIDO" o el estado "APAGADO" durante etapas específicas del desarrollo embrionario o durante etapas específicas de un proceso biológico (por ejemplo, ciclo folicular capilar en ratones).
Con fines ilustrativos, los ejemplos de promotores restringidos espacialmente incluyen, de modo no taxativo, promotores específicos de neuronas, promotores específicos de adipocitos, promotores específicos de cardiomiocitos, promotores específicos del músculo liso, promotores específicos de fotorreceptores, etc. Los promotores restringidos espacialmente específicos de neuronas incluyen, de modo no taxativo, promotor de enolasa específico de neuronas (NSE, por sus siglas en inglés) (véanse, por ejemplo, EMBL HSEN02, X51956); un promotor aminoácido aromático descarboxilasa (AADC, por sus siglas en inglés); un promotoi de neurofilamentos (véase, por ejemplo, GenBank HUMNFL, i L04147); un promotor de sinapsina (véase, por ejemplo, GenBank HUMSYNIB, M55301); un promotor de thy-1 (véase, por ejemplo, Chen et ál. (1987) Cell 51:7-19; y 5 lewellyn, et ál. (2010) Nat. Med. 16(10):1161-1166); un promotor del receptor de serotonina (véase, por ejemplo, GenBank S62283); un promotor de tirosina hidroxilasa (TH) (véase, por ejemplo, Oh et ál. (2009) Gene Ther 16:437; Sasaoka et ál. (1992) Mol. Brain Res. 16:274; Boundy et ál. io (1998) J. Neurosci.18:9989; y Kaneda et ál. (1991) Neuron 6:583-594); un promotor de GnRH (véase, por ejemplo, Radovick et ál. (1991) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 88:3402-3406); un promotor de L7 (véase, por ejemplo, Oberdick et ál. (1990) Science 248:223-226); un promotor de DNMT (véase, por 15 ejemplo, Bartge et ál. (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85:3648-3652); un promotor de encefalina (véase, por ejemplo, Comb et ál. (1988) EMBO J.17:3793-3805); un promotor de la proteína básica de mielina (PBM); un promotor de la proteína cinasa II-alfa dependiente de Ca2+-calmodulina (CamKIIa) 20 (véase, por ejemplo, Mayford et ál. (1996) Proc. Nati. Acad.
Sci. USA 93:13250; y Casanova et ál. (2001) Génesis 31:37); un promotor del factor de crecimiento b derivado de plaquetas/potenciador de CMV (véase, por ejemplo, Liu et ál. (2004) terapia génica 11:52-60); y similares. 25 Los promotores restringidos espacialmente específicos de adipocitos incluyen, de modo no taxativo, promotor/potenciador del gen aP2, por ejemplo, una región de -5,4 kb a +21 bp del gen aP2 humano (véase, por ejemplo, 30 Tozzo et ál. (1997) Endocrinol.138:1604; Ross et ál. (1990) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 87:9590; y Pavjani et ál. (2005) Nat. Med.11:797); un promotor del transportador de glucosa 4 (GLUT4) (véase, por ejemplo, Knight et él. (2003) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 100:14725); un promotor de ácidos grasos translocasa (FAT/CD36) (véase, por ejemplo, Kuriki et ál. (2002) Biol. Pharm. Bull.25:1476; y Sato et ál. (2002) J. Biol. Chem. 277:15703); un promotor de estearoilo-CoA desaturasa-1 (SCD1) (Tabor et ál. (1999) J. Biol. Chem. 274:20603); un promotor de leptina (véase, por ejemplo, Masón et ál. (1998) Endocrinol. 139:1013; y Chen et ál. (1999) Biochem. Biophys. Res. Comm. 262:187); un promotor de adiponectina (véase, por ejemplo, Kita et ál. (2005) Biochem. Biophys. Res. Comm.331:484; y Chakrabarti (2010) Endocrinol. 151:2408); un promotor de adipsina (véase, por ejemplo, Platt et ál. (1989) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86:7490); un promotor de resistina (véase, por ejemplo, Seo et ál. (2003) Molec. Endocrinol.17:1522); y similares.
Los promotores restringidos espacialmente específicos de cardiomiocitos incluyen, de modo no taxativo, secuencias de control derivadas de los siguientes genes: cadena ligera de miosina 2, cadena pesada de miosina OÍ, AE3, troponina cardíaca C, actina cardíaca y similares. Franz et ál. (1997) Cardiovasc. Res.35:560-566; Robbins et ál. (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci.752:492-505; Linn et ál. (1995) Circ. Res.76:584-591; Parmacek et ál. (1994) Mol. Cell. Biol. 14:1870-1885; Hunter et ál. (1993) Hypertension 22:608-617; y Sartorelli et ál. (1992) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 89:4047-4051.
Los promotores restringidos espacialmente específicos de músculo liso incluyen, de modo no taxativo, un promotor de SM22a (véase, por ejemplo, Akyürek et ál. (2000) Mol. Med. 6:983; y la patente estadounidense 7,169,874); un promotor de smoothelina (véase, por ejemplo, WO 2001/018048); un promotor de actina de músculo liso a; y similares. Por ejemplo, una región de 0,4 kb del promotor SM22a, dentro de la cual hay dos elementos de CArG, que se demostró que mediaba la expresión especifica de células de músculo liso vascular (véase, por ejemplo, Kim, et ál. (1997) Mol. Cell. Biol.17, 2266-2278; Li, et ál., (1996) J. Cell Biol. 132, 849-859; y Moessler, et ál. (1996) Development 122, 2415-2425).
Los promotores restringidos espacialmente específicos de fotorreceptores incluyen, de modo no taxativo, un promotor de rodopsina; un promotor de rodopsina cinasa (Young et ál. (2003) Ophthalmol. Vis. Sci. 44:4076); un promotor del gen beta de la fosfodiesterasa (Nicoud et ál. (2007) J. Gene Med. 9:1015); un promotor del gen de la retinitis pigmentaria (Nicoud et ál. (2007) supra); un potenciador del gen de la proteína de unión al retinoide interfotorreceptor (IRBP,,por sus siglas en inglés) (Nicoud et ál. (2007) supra); un promotor del gen IRBP (Yokoyama et ál. (1992) Exp Eye Res. 55:225); y similares.
Los términos "secuencias reguladoras de ADN", "elementos de control" y "elementos reguladores", utilizados de manera intercambiable, se refieren a secuencias de control transcripcional y traduccional, tal como promotores, potenciadores, señales de poliadenilación, terminadores, señales de degradación proteica, y si'mi'l "ares, que proporcionan y/o regulan la transcripción de una secuencia no codificante (por ejemplo, ARN dirigido a ADN) o una secuencia codificante (por ejemplo, polipéptido modificador dirigido al sitio, o polipéptido Cas9/Csnl) y/o regulan la traducción de un polipéptido codificado.
El término "de origen natural" o "no modificado", tal como se usa en la presente, aplicado a un ácido nucleico, un polipéptido, una célula o un organismo, se refiere a un ácido nucleico, polipéptido, célula u organismo que se encuentra en la naturaleza. Por ejemplo, una secuencia de polipéptidos o polinucleótidos presente en un organismo (incluyendo los virus) que puede aislarse de una fuente de la naturaleza y que no ha sido intencionalmente modificada por un ser humano en el laboratorio es de origen natural.
El término "quimérico", tal como se usa en la presente cuando se aplica a un ácido nucleico o polipéptido, se refiere a dos componentes que se definen mediante estructuras derivadas de fuentes diferentes. Por ejemplo, cuando "quimérico" se usa en el contexto de un polipéptido quimérico (por ejemplo, una proteina quimérica Cas9/Csnl), el polipéptido quimérico incluye secuencias de aminoácidos que derivan de diferentes polipéptidos. Un polipéptido quimérico puede comprender ya sea secuencias de polipéptidos modificadas o de origen natural (por ejemplo, una primera secuencia de aminoácidos de una proteina Cas9/Csnl modificada o no modificada; y una segunda secuencia de aminoácidos diferente a la proteina Cas9/Csnl). De manera similar, "quimérico" en el contexto de un polinucleótido que codifica un polipéptido quimérico incluye secuencias de nucleótidos derivadas de diferentes regiones de codificación (por ejemplo, una primera secuencia de nucleótidos que codifica una proteina Cas9/Csnl modificada o no modificada; y una segunda secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido diferente a la proteina Cas9/Csnl).
El término "polipéptido quimérico" se refiere a un polipéptido que está elaborado mediante la combinación (es decir, "fusión") de dos segmentos de secuencia amino que de otra manera están separados, usualmente mediante intervención humana. Un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos quimérica es un polipéptido quimérico. Algunos polipéptidos quiméricos pueden mencionarse como "variantes de fusión".
"Heterólogo", tal como se usa en la presente, significa una secuencia de nucleótidos o polipéptidos que no se encuentra en el ácido nucleico o proteina natural, respectivamente. Por ejemplo, en una proteina Cas9/Csnl quimérica, el dominio de unión a ARN de un polipéptido Cas9/Csnl bacteriano de origen natural (o una variante de este) puede fusionarse a una secuencia heteróloga de polipéptidos (es decir, una secuencia de polipéptidos de una proteina diferente a Cas9/Csnl o una secuencia de polipéptidos de otro organismo). La secuencia heteróloga de polipéptidos puede presentar una actividad (por ejemplo, actividad enzimática) que también presentará la proteina quimérica Cas9/Csnl (por ejemplo, actividad de metiltransferasa, actividad de acetiltransferasa, actividad de cinasa, actividad de ubiquitinación, etc.). Una secuencia de ácido nucleico heteróloga puede estar unida a una secuencia de ácido nucleico de origen natural (o una variante de esta) (por ejemplo, mediante ingeniería genética) para generar una secuencia de nucleótidos quimérica que codifica un polipéptido quimérico. Como otro ejemplo, en una variante de fusión del polipéptido dirigido al sitio Cas9, una variante de fusión del polipéptido dirigido al sitio Cas9 puede estar fusionado a un polipéptido heterólogo (es decir, un polipéptido diferente a Cas9), que presenta una actividad que también presentará la variante de fusión del polipéptido dirigido al sitio Cas9. Una secuencia de ácido nucleico heteróloga puede estar unida a una variante del polipéptido dirigido al sitio Cas9 (por ejemplo, mediante ingeniería genética) para generar una secuencia de nucleótidos que codifica una variante de fusión del polipéptido dirigido al sitio Cas9.
"Recombinante", tal como se usa en la presente, significa que un ácido nucleico (ADN o ARN) en particular es el producto de varias combinaciones de clonación, restricción, reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y/o etapas de ligación que dan como resultado una construcción que tienen una secuencia estructural codificante o no codificante que puede distinguirse de los ácidos nucleicos endógenos que se encuentran en sistemas naturales. Las secuencias de ADN que codifican polipéptidos pueden ensamblarse a partir de fragmentos de ADNc o a partir de una serie de oligonucleótidos sintéticos, para proporcionar un ácido nucleico sintético que es capaz de ser expresado a partir de una unidad transcripcional recombinante contenida en un sistema de transcripción y traducción celular o libre de células. El ADN genóraico comprende las secuencias relevantes puede también usarse en la formación de un gen o unidad transcripcional recombinante. Las secuencias de ADN no traducidas pueden estar presentes en 5' o 3' desde el marco de lectura abierto, donde dichas secuencias no interfieren con la manipulación o expresión de las regiones codificantes, y puede ciertamente actuar para modular la producción de un producto deseado mediante varios mecanismos (véase, "Secuencias reguladoras de ADN", más adelante). De manera alternativa, las secuencias de ADN que codifican ARN (por ejemplo, ARN dirigido a ADN) que no se traducen también pueden considerarse recombinantes. Por lo tanto, por ejemplo, el término ácido nucleico "recombinante" se refiere a uno que no es de origen natural, por ejemplo, que fue elaborado mediante combinación artificial de dos segmentos de secuencia que de otra mera estarían separados mediante intervención humana. Esta combinación artificial se logra frecuentemente ya sea por medios de síntesis química o mediante la manipulación artificial de segmentos aislados de ácidos nucleicos, por ejemplo, mediante téenicas de manipulación genética. Esto usualmente se hace para reemplazar un codón con un codón que codifica el mismo aminoácido, un aminoácido conservador o un aminoácido no conservador. De manera alternativa, se realiza para unir segmentos de ácido nucleico de funciones deseadas para generar una combinación de funciones deseada. Esta combinación artificial se logra frecuentemente ya sea por medios de síntesis química o mediante la manipulación artificial de segmentos aislados de ácidos nucleicos, por ejemplo, mediante técnicas de manipulación genética. Cuando un polinucleótido recombinante codifica un polipéptido, la secuencia del polipéptido codificado puede ser de origen natural ("de tipo salvaje") o puede ser una variante (por ejemplo, un mutante) de la secuencia de origen natural. Por lo tanto, el término polipéptido "recombinante" no necesariamente se refiere a un polipéptido cuya secuencia no es de origen natural. Por el contrario, un polipéptido "recombinante" es codificado por una secuencia de ADN recombinante, pero la secuencia del polipéptido puede ser de origen natural ("de tipo salvaje") o de origen no natural (es decir, una variante, un mutante, etc.). Por lo tanto, un polipéptido "recombinante" es el resultado de la intervención humana, pero puede ser una secuencia de aminoácidos de origen natural.
Un "vector" o "vector de expresión" es un replicón, tal como un plásmido, fago, virus o cósmido, al que se puede unir otro segmento de ADN, es decir, un "inserto", para producir la replicación del segmento unido en una célula.
Un "casete de expresión" comprende una secuencia de ADN codificante unida de manera operativa a un promotor. "Unido de manera operativa" se refiere a una yuxtaposición donde los componentes descritos de esta manera están en una relación que les permite funcionar de la manera pretendida. Por ejemplo, un promotor está unido de manera operativa a una secuencia codificante si el promotor afecta su transcripción o expresión.
Los términos "vector de expresión recombinante" o "construcción de ADN" se usan de manera intercambiable en la presente para referirse a una molécula de ADN que comprende un vector y al menos un inserto. Los vectores de expresión recombinante usualmente se generan con fines de expresar y/o propagar los insertos, o para la construcción de otras secuencias de nucleótidos recombinantes. Los insertos pueden o no estar unidos de manera operativa a una secuencia promotora y pueden o no estar unidos de manera operativa a secuencias reguladoras de ADN.
Una célula fue "modificada genéticamente" o "transformada" o "transfectada" con ADN exógeno, por ejemplo un vector de expresión recombinante, cuando dicho ADN ha sido introducido en la célula. La presencia del ADN exógeno da como resultado cambios genéticos permanentes o transitorios. El ADN transformante puede o no estar integrado (unido de manera covalente) en el genoma de la célula. En células procariotas, de levadura y de mamífero, por ejemplo, el ADN transformante puede mantenerse en un elemento episomal, tal como un plásmido. Con respecto a las células eucariotas, una célula transformada de manera estable es una en la cual el ADN transformante se ha integrado en el cromosoma de manera que este sea heredado por células hijas a través de replicación del cromosoma. Esta estabilidad es demostrada por la capacidad de la célula eucariota de establecer líneas celulares o clones que comprenden una población de células hijas que contienen el ADN transformante. Un "clon" es una población de células derivadas de una única célula o progenitor común mediante mitosis. Un "línea celular" es un clon de una célula primaria que es capaz de crecer de manera estable in vitro durante muchas generaciones.
Los métodos adecuados de modificación genética (también mencionadas como "transformación") incluyen, por ejemplo, infección viral o bacteriofágica, transíección, conjugación, fusión de protoplastos, lipofección, electroporación, precipitación de fosfato de calcio, transfección mediada por polietilenimina (PEI, por sus siglas en inglés), transfección mediada por DEAE-dextrano, transfección mediada por liposomas, teenología de cañón de partículas, precipitación de fosfato de calcio, microinyección directa, inserción de ácido nucleico mediada por nanopartículas (véase, por ejemplo, Panyam et al., Adv Drug Deliv Rev.2012 Sep 13. pii: S0169-409X(12)00283-9. doi: 10.1016/j.addr.2012.09.023 ) y similares.
La elección de método de modificación genética generalmente depende del tipo de célula que se está transformando y las circunstancias en las cuales se lleva a cabo la transformación (por ejemplo, in vitro, ex vivo o in vivo). Puede encontrarse una discusión general de estos métodos en Ausubel, et ál., Short Protocols in Molecular Biology, 3a ed., Wilcy & Sons, 1995.
Un "ADN objetivo", tal como se usa en un polinucleótido de ADN que comprende un "sitio objetivo" o una "secuencia objetivo". Los términos "sitio objetivo" o "secuencia objetivo" o "ADN de protoespaciador objetivo" se usan de manera intercambiable en la presente para referirse a una secuencia de ácido nucleico presente en un ADN objetivo al cual se unirá un segmento de direccionamiento de ADN de un ARN de direccionamiento a ADN de la presente (véase la Figura 1 y la Figura 39), siempre que existan suficientes condiciones para la unión. Por ejemplo, el sitio objetivo (o secuencia objetivo) 5'-GAGCATATC-3'.(SEQ ID NO://) dentro de un ADN objetivo es el objetivo de (o se une con, o se híbrida con, o es complementario a) la secuencia de ARN 5'-GAUAUGCUC-3' (SEQ ID NO://). Las condiciones de unión de ADN/ARN adecuadas incluyen condiciones fisiológicas presentes normalmente en una célula. Otras condiciones de unión a ADN/ARN adecuadas (por ejemplo, condiciones en un sistema libre de células) son conocidas en la téenica; véase, por ejemplo, Sabrook, supra. La cadena del ADN objetivo que es complementaria y se híbrida con el ARN dirigido a ADN se menciona como "cadena complementaria" y la cadena del ADN objetivo que es complementaria a la "cadena complementaria" (y es, por lo tanto, no complementaria al ARN dirigido a ADN) se menciona como "cadena no complementaria" (véase la Figura 12).
"Polipéptido modificador dirigido al sitio" o "polipéptido dirigido al sitio de unión al ARN" o "polipéptido modificador dirigido al sitio de unión al ARN" o "polipéptido dirigido al sitio" significa un polipéptido que se une al ARN y se dirige a una secuencia de ADN especifica. Un polipéptido modificador dirigido al sitio, tal como se describe en la presente, se dirige a una secuencia de ADN especifica mediante la molécula de ARN a la cual se une. La molécula se ARN comprende una secuencia que es complementaria a una secuencia objetivo dentro del ADN objetivo, y de este modo dirige el polipéptido unido a una ubicación especifica dentro del ADN objetivo (la secuenpia objetivo).
"Escisión" significa la rotura de la estructura covalente de una molécula de ADN. La escisión puede iniciarse mediante una variedad de métodos, incluyendo, de modo no taxativo, hidrólisis enzimática o química de un enlace fosfodiéster. Son posibles tanto la escisión de cadena simple como la escisión de cadena doble, y la escisión de cadena doble puede ocurrir como resultado de dos eventos de escisión de cadena doble distintos. La escisión de ADN puede dar como resultado la producción ya sea de extremos romos o de extremos escalonados. En determinadas modalidades, un complejo que comprende un ARN dirigido a ADN y un polipéptido modificador dirigido al sitio se usan para la escisión dirigida de ADN de doble cadena.
"Nucleasa" y "endonucleasa" se usan de manera intercambiable en la presente para referirse a una enzima que posee actividad catalítica para la escisión de ADN.
"Dominio de escisión" o "dominio activo" o "dominio de nucleasa" de una nucleasa significa la secuencia de polipéptidos o dominio dentro de la nucleasa que posee la actividad catalítica para la escisión de ADN. Un dominio de escisión puede estar contenido en una única cadena de polipéptidos o la actividad de escisión puede ser el resultado de la asociación de dos (o más) polipéptidos. Un dominio de nucleasa individual puede consistir en más de una extensión aislada de aminoácidos dentro de un polipéptido dado. i La molécula de ARN que se une al polinucleótido modificador dirigido al sitio y dirige el polipéptido a una ubicación especifica dentro del ADN objetivo se menciona en la presente como "ARN dirigido a ADN" o "polinucleótido de ARN dirigido a ADN" (también mencionado en la presente como "ARN guia" o "ARNg"). Un ARN dirigido a ADN de la invención comprende dos segmentos, un "segmento dirigido a ADN" y un "segmento de unión a proteína". "Segmento" significa un segmento/sección/región de una molécula, por ejemplo, una extensión contigua de nucleótidos en un ARN. Un segmento también puede significar una región/sección de un complejo de manera que un segmento puede comprender regiones de más de una molécula. Por ejemplo, en algunos casos, el segmento de unión a proteína (descrito más adelante) de un ARN dirigido a ADN es una molécula de ARN y el segmento de unión a proteína, por lo tanto, comprende una región de esa molécula de ARN. En otros casos, el segmento de unión a proteína (descrito más adelante) de un ARN dirigido a ADN comprende dos moléculas separadas que están hibridadas a lo largo de una región de complementariedad. Como ejemplo ilustrativo, no taxativo, un segmento de unión a proteína de un ARN dirigido a ADN que comprende dos moléculas separadas puede comprender (i) los pares de bases 40-75 de una primera molécula de ARN que tiene una longitud de 100 pares de bases; y (ii) los pares de bases 10-25 de una segunda molécula de ARN que tiene una longitud de 50 pares de bases. La definición de "segmento", a menos que se defina específicamente de otra manera en un contexto particular, no se limita a una cantidad específica de pares de bases totales de una molécula de ARN dada, no se limita a una cantidad especifica de pares de bases totales de una molécula de ARN dada, no se limita a una cantidad particular de moléculas separadas dentro de un complejo, y puede incluir regiones de moléculas de ARN que tienen cualquier longitud total y puede o no incluir regiones con complementariedad a otras moléculas.
El segmento de unión al ADN (o "secuencia dirigida a ADN") comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia específica dentro de un ADN objetivo (la cadena complementaria del ADN objetivo). El segmento de unión a proteínas (o "secuencia de unión a proteínas") interactúa con un polipéptido modificador dirigido al sitio. Cuando el polipéptido modificador dirigido al sitio es un polipéptido Cas9 o relacionado con Cas9 (descrito en más detalle más adelante), la escisión específica del sitio del ADN objetivo ocurre en ubicaciones determinadas mediante ambas de (i) complementariedad de pares de bases entre el ARN dirigido a ADN y el ADN objetivo; y (ii) un motivo corto (mencionado como el motivo adyacente protoespaciador (PAM, por sus siglas en inglés)) en el ADN objetivo.
El segmento de unión a proteínas de un ARN dirigido a ADN de la invención comprende dos extensiones complementarias de nucleótidos que se hibridan entre sí para formar un dúplex de ARN de cadena doble (dúplex de ARNcd).
En algunas modalidades, un ácido nucleico de la invención (por ejemplo, un ARN dirigido a ADN, un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un ARN dirigido a ADN; un ácido nucleico que codifica un polipéptido dirigido al sitio; etc.) comprende una modificación o secuencia que proporciona una característica deseable adicional (por ejemplo, estabilidad modificada o regulada; direccionamiento subcelular; rastreo, por ejemplo, un marcado fluorescente; un sitio de unión para una proteína o complejo de proteínas; etc.). Los ejemplos no taxativos incluyen: un casquete 5' (por ejemplo, un casquete 7-metilguanilato (m7G)); una cola poliadenilada 3' (es decir, una cola poli(A) 3'); una secuencia de ribointerruptor (por ejemplo, para permitir estabilidad regulada y/o accesibilidad regulada mediante proteínas y/o complejos de proteínas); una secuencia de control de estabilidad; una secuencia que forma un dúplex de ARNcd (es decir, una horquilla)); una modificación o secuencia que dirige el ARN a una ubicación subcelular (por ejemplo, núcleo, mitocondria, cloroplastos y similares); una modificación o secuencia que proporciona rastreo (por ejemplo, conjugación directa con una molécula fluorescente, conjugación con un resto que facilita la detección fluorescente, una secuencia que permite la detección fluorescente, etc.); una modificación o secuencia que proporciona un sitio de unión para proteínas (por ejemplo, proteínas que actúan en el ADN, incluidos los activadores transcripcionales, represores transcripcionales, ADN metiltransferasas, ADN desmetilasas, histona acetiltransferasas, histona deacetilasas y similares); y combinaciones de estos.
En algunas modalidades, un ARN dirigido a ADN comprende un segmento adicional ya sea en el extremo 5' o 3' que proporciona cualquiera de las características descritas anteriormente. Por ejemplo, un tercer segmento aceptable puede comprender un casquete 5' (por ejemplo, un casquete 7-metilguanilato (m7G)); una cola poliadenilada 3' (es decir, una cola poli(A) 3'); una secuencia de ribointerruptor (por ejemplo, para permitir estabilidad regulada y/o accesibilidad regulada mediante proteínas y complejos de proteínas); una secuencia de control de estabilidad; una secuencia que forma un dúplex de ARNcd (es decir, una horquilla)); una secuencia que dirige el ARN a una ubicación subcelular (por ejemplo, núcleo, mitocondria, cloroplastos y similares); una modificación o secuencia que proporciona rastreo (por ejemplo, conjugación directa con una molécula fluorescente, conjugación con un resto que facilita la detección fluorescente, una secuencia que permite la detección fluorescente, etc.); una modificación o secuencia que proporciona un sitio de unión para proteínas (por ejemplo, proteínas que actúan en el ADN, incluidos los activadores transcripcionales, represores transcripcionales, ADN metiltransferasas, ADN desmetilasas, histona acetiltransferasas, histona deacetilasas y similares); y combinaciones de estos.
Un ARN dirigido a ADN de la invención y un polipéptido modificador dirigido al sitio de la invención (es decir, polipéptido dirigido al sitio) forman un complejo (es decir, se unen por medio de interacciones no covalentes). El ARN dirigido a ADN proporciona especificidad de direccionamiento al complejo, ya que comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de un ADN objetivo. El polipéptido modificador dirigido al sitio del complejo proporciona la actividad especifica del sitio. En otras palabras, el polipéptido modificador dirigido al sitio es guiado a una secuencia ADN objetivo (por ejemplo, una secuencia objetivo en un ácido nucleico cromosómico; una secuencia objetivo en un ácido nucleico extracromosómico, por ejemplo, un ácido nucleico episomal, un minicírculo, etc.; una secuencia objetivo en un ácido nucleico mitocondrial; una secuencia objetivo en un ácido nucleico de cloroplasto; una secuencia objetivo en un plásmido; etc.) mediante su asociación con el segmento de unión a proteínas del ARN dirigido a ADN.
I I En algupas modalidades, un ARN dirigido a ADN de la invención I comprende dos moléculas de ARN separadas (polinucleótidos de ARN; un "ARN activador" y un "ARN identificador", véase más adelante) y se menciona en la presente como una "ARN dirigido á ADN de molécula doble" o un "ARN dirigido a ADN de dos moléculas". En otras modalidades, el ARN dirigido a ADN de la invención es una molécula de ARN individual (polinucleótido de ARN individual) y se menciona en la presente como un "ARN dirigido a ADN de molécula simple", un "ARN simple guia " o un "ARNsg". El término "ARN dirigido a ADN" o , "ARNg" es inclusivo y hace referencia tanto a ARN dirigidos a ADN de molécula doble y a ARN dirigidos a ADN de molécula simple (es decir, ARNsg).
Un ejemplo de ARN dirigido a ADN de dos moléculas correspondiente una molécula similar a crRNA ("ARN CRISPR" o "ARN identificador" o "crRNA" o "repetición de crRNA") y una molécula similar a tracrRNA ("ARN CRISPR regulador en trans" o "ARN activador" o "tracrRNA"). Una molécula similar a crRNA (ARN identificador) comprende tanto el segmento dirigido a ADN (cadena simple) del ARN dirigido a ADN y una extensión ("segmento formador de dúplex") de nucleótidos que forma una mitad del dúplex de ARNcd del segmento de unión a proteínas del ARN dirigido a ADN. Una molécula similar a tracrRNA correspondiente (ARN activador) comprende una extensión de nucleótidos (segmento formador de dúplex) que forma la otra mitad del dúplex de ARNcd del segmento de unión a proteínas del ARN dirigido a ADN. En otras palabras, una extensión de nucleótidos de una molécula similar a crRNA es complementaria y se híbrida con una extensión de nucleótidos de una molécula similar a tracrRNA para formar el dúplex de ARNcd del dominio de unión a proteínas del ARN dirigido a ADN. Como tal, cada molécula similar a crRNA puede decirse que tiene una molécula similar a tracrRNA correspondiente. La molécula similar a crRNA proporciona adicionalmente el segmento dirigido a ADN de cadena simple. Por lo tanto, una molécula similar a crRNA y similar a tracrRNA (como un par correspondiente) se hibridan para formar un ARN dirigido a ADN. La secuencia exacta de una molécula de crRNA o tracrRNA determinada es una característica de la especia en la cual se encuentran las moléculas de ARN. Se representan varios crRNA y tracrRNA en pares complementarios correspondientes en la Figura 8. Un ARN dirigido a ADN de molécula doble de la invención puede comprender cualquier par de crRNA y tracrRNA correspondiente. Un ARN dirigido a ADN de molécula doble de la invención puede comprender cualquier par de crRNA y tracrRNA correspondiente.
El término "ARN activador" se usa en la presente con el significado de una molécula similar a tracrRNA de un ARN dirigido a ADN de molécula doble. El término "ARN identificador" se usa en la presente con el significado de una molécula similar a crRNA de un ARN dirigido a ADN de molécula doble. El término "segmento formador de dúplex" se usa en la presente con el significado de la extensión de nucleótidos de un ARN activador o un ARN identificador que contribuye a la formación del dúplex de ARNcd mediante la hibridación con una extensión de nucleótidos de una molécula de ARN activador o ARN identificador correspondiente. En otras palabras, un ARN activador comprende un segmento formador de dúplex que es complementario al segmento formador de dúplex del ARN identificador correspondiente. Como tal, un ARN activador comprende un segmento formador de dúplex mientras que un ARN identificador comprende tanto un segmento formador de dúplex como el segmento dirigido a ADN del ARN dirigido a ADN. Por lo tanto, un ARN dirigido a ADN de molécula doble de la invención puede comprender cualquier par de ARN activador y ARN identificador correspondiente.
Una "célula hospedadora", tal como se usa en la presente, indica una célula eucariota, una célula procariota (por ejemplo, célula bacteriana o de arquea), o una célula de un organismo multicelular (por ejemplo, linea celular) in vivo o in vitro cultivada como una entidad unicelular, cuyas células eucariotas o procariotas pueden ser, o haber sido, usadas como receptores para un ácido nucleico, e incluyen la progenie de la célula original a partir de la cual fueron transformadas por medio del ácido nucleico. Se entiende que la progenie de una célula individual puede no necesariamente ser completamente idéntica en morfología o en el complemento de ADN total o genómico al progenitor original, debido a mutaciones naturales, accidentales o deliberadas. Una "célula hospedadora recombinante" (también mencionada como una "célula hospedadora modificada genéticamente") es una célula hospedadora en la cual se ha introducido un ácido nucleico heterólogo, por ejemplo, un vector de expresión. Por ejemplo, una célula hospedadora bacteriana de la invención es una célula hospedadora bacteriana modificada genéticamente por medio de la introducción en una célula hospedadora bacteriana adecuada de un ácido nucleico exógeno (por ejemplo, un plásmido o vector de expresión recombinante) y una célula hospedadora eucariota de la invención es una célula hospedadora eucariota modificada genéticamente (por ejemplo, una célula germinal de mamífero) por medio de la introducción en una célula hospedadora eucariota adecuada de un ácido nucleico exógeno.
El término "célula madre" se usa en la presente para referirse a una célula (por ejemplo, una célula madre vegetal, una célula madre de vertebrado) que tiene la capacidad tanto de auto renovarse como de generar un tipo de célula diferenciada (véase Morrison et ál. (1997) Cell 88:287-298). En el contexto de ontogenia celular, el adjetivo "diferenciado" o "diferenciante" es un término relativo. Una "célula diferenciada" es una célula que ha progresado más en la vía de desarrollo que la célula con la que se la está comparando. Por lo tanto, las células madre pluripotentes (descritas más adelante) pueden diferenciarse en células progenitores específicas de la línea (por ejemplo, célula madre mesodérmicas), que, a su vez, pueden diferenciarse en células que son adicionalmente específicas (por ejemplo, progenitores neuronales), que pueden diferenciarse en células de etapa final (es decir, células diferenciadas de manera terminal, por ejemplo, neuronas, cardiomiocitos, etc.), que tienen un papel característico en un tipo de tejidos determinado, y pueden o no conservar la capacidad de proliferar adicionalmente. Las células madre pueden caracterizarse tanto por la presencia de marcadores específicos (por ejemplo, proteínas, ARN, etc.) como por la ausencia de marcadores específicos. Las células madre también pueden identificarse por medio de ensayos funcionales tanto in vitro como in vivo, particularmente ensayos relacionados con la capacidad de las células madre de producir múltiple progenie diferenciada.
Las células madre de interés incluyen células madre pluripotentes (PSC, por sus siglas en inglés). La expresión "célula madre pluripotente" o "PSC" se utiliza en la presente para referirse a una célula madre capaz de producir todos los tipos de célula del organismo. Por lo tanto, una PSC puede dar origen a células de todas las capas germinales del organismo (por ejemplo, el endoderma, mesoderma y ectoderma de un vertebrado). Las células pluripotentes son capaces de formar teratomas y de contribuir a tejidos ectodérmicos, mesodérmicos o endodérmicos en un organismo vivo. Las células madre pluripotentes de plantas son capaces de dar origen a todos los tipos de célula de la planta (por ejemplo, células de la raíz, tallo, hojas, etc.).
Pueden derivarse las PSC de animales en una cantidad de maneras diferentes. Por ejemplo, las células madre embriónicas (ESC, por sus siglas en inglés) se derivan de la masa celular interna de un embrión (Thomson et. ál., Science. 1998 Nov 6;282(5391):1145-7), mientras que las células madre pluripotentes inducidas (iPSC, por sus siglas en inglés) se derivan se células somáticas (Takahashi et. ál., Cell.30 de noviembre de 2007; 131(5):861-72; Takahashi et. ál., Nat Protoc. 2007;2 (12):3081-9; Yu et. ál., Science. 21 de diciembre dé 2007; 318(5858):1917-20. Pub ele.20 nov 2007.
Dado que el término PSC se refiere a células madre pluripotentes sin importar su derivación, el término PSC abarca los términos ESC e iPSC, asi como la expresión células madre embrionarias germinales (EGSC, por sus siglas en inglés), las cuales son otro ejemplo de una PSC. Las PSC pueden encontrarse en forma de una linea celular establecida, pueden obtenerse directamente de tejido embrionario primario o pueden derivarse de una célula somática. Las PSC pueden ser células objetivo de los métodos descritos en la presente.
Se entiende por "célula madre embrionaria" (ESC) una PSC que se aisló de un embrión, típicamente de la masa celular interna del blastocisto. Las líneas ESC se enumeran en el Registro de Células Madre Embrionarias Humanas de los N1H, por ejemplo, hESBGN-01, hESBGN-02, hESBGN-03, hESBGN-04 (BresaGen, Inc.); HES-1, HES-2, HES-3, HES-4, HES-5, HES-6 (ES Cell International); Miz-hESl (MizMedi Hospital-Seoul National University); HSF-1, HSF-6 (Universidad de California en San Francisco); and Hl, H7, H9, H13, H14 (Wisconsin Alumni Research Foundation (WiCell Research Institute)). Las células madre de interés también incluyen células madre embrionarias de otros primates, tales como células madre de Rhesus y células madre de titi. Las células madre pueden obtenerse de cualquier especie de mamíferos, por ejemplo, humanos, equinos, bovinos, porcinos, caninos, felinos, roedores, por ejemplo, ratones, ratas, hámsters, primates, etc, (Thomson et ál. (1998) Science 282:1145; Thomson et ál. (1995) Proc. Nati. Acad. Sci EUA 92:7844; Thomson et ál. (1996) Biol. Reprod. 55:254; Shamblott et ál., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 95:13726, 1998). En el cultivo, las ESC típicamente crecen como colonias planas con amplios radios núcleo-citoplasmáticos, fronteras definidas y nucléolos prominentes. Además, las ESC expresan SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81 y fosfatasa alcalina, pero no SSEA-1. Los ejemplos de métodos para generar y caracterizar ESC pueden encontrarse en, por ejemplo, la patente estadounidense n.° 7,029,913, la patente estadounidense n.° 5,843,780 y la patente estadounidense n.° 6,200,806, las descripciones de las cuales se incorporan a la presente mediante referencia. Los métodos para la proliferación de hESC en la forma no diferenciada se describen en WO 99/20741, WO 01/51616 y WO 03/020920.
Por "célula madre embrionaria germinal" (EGSC), "célula madre germinal" o "célula EG" se entiende una PSC que se deriva de células germinales y/o progenitores de células germinales, por ejemplo, células germinales primordiales, es decir, aquellas que se convertirían en esperma y óvulos. Se piensa que las células germinales embrionarias (células EG) tienen propiedades similares a las células madre embrionarias descritas anteriormente. Los ejemplos de métodos para generar y caracterizar células EG pueden encontrarse en, por ejemplo, la patente estadounidense n.° 7,153,684; Matsui, Y., et ál., (1992) Cell 70:841; Shamblott, M., et ál. (2001) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 98: 113; Shamblott, M., et ál. (1998) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA, 95:13726; y Koshimizu, U., et ál. (1996) Development, 122:1235, que se incorporan ambos a la presente mediante esta referencia.
Por "célula madre pluripotente inducida" o "iPSC" se entiende una PSC derivada de una célula que no es una PSC (es decir, de una célula diferenciada relativa a una PSC). Las iPSC pueden derivarse de múltiples tipos de células diferentes, inclusive células diferenciadas de forma terminal. Las iPSC tienen una morfología similar a la de una célula ES, donde crecen como colonias planas con amplios radios núcleo-citoplasmáticos, fronteras definidas y nucléolos prominentes. Además, las iPSC expresan uno o más marcadores de pluripotencia claves conocidos por un experto en la téenica, inclusive, de modo no taxativo, fosfatasa alcalina, SSEA3, SSEA4, Sox2, Oct3/4, Nanog, TRA160, TRA181, TDGF 1, Dnmt3b, FoxD3, GDF3, Cyp26al, TERT y zfp42. Los ejemplos de métodos para generar y caracterizar iPSC pueden encontrarse en, por ejemplo, las patentes estadounidense n.° US20090047263, US20090068742, US20090191159, US20090227032, US20090246875 y US20090304646, las descripciones de las cuales se incorporan a la presente mediante referencia. Generalmente, para generar iPSC, las células somáticas se proporcionan con factores de reprogramación (por ejemplo, Oct4, SOX2, KLF4, MYC, Nanog, Lin28, etc.) conocidos en la técnica para reprogramar las células somáticas para convertirse en células madre pluripotentes.
Por "célula somática" se entiende cualquier célula en un organismo que, ante la ausencia de manipulación experimental, normalmente no da lugar a todos los tipos de células en un organismo. En otras palabras, las células somáticas son células que se han diferenciado lo suficiente, de forma que no generarán células de forma natural de las tres capas germinales del cuerpo, es decir, ectoderma, mesoderma y endoderma. Por ejemplo, las células somáticas incluirían tanto neuronas como progenitores neurales; estos últimos pueden dar origen de forma natural a todos o algunos tipos de células de cada sistema nervioso central pero no pueden dar origen a células de los linajes mesodérmicos o endodérmicos.
Por "célula mitótica" se entiende una célula sometida a mitosis. La mitosis es el proceso por el cual una célula eucariota separa los cromosomas en su núcleo en dos conjuntos idénticos en dos núcleos separados. Normalmente está seguida inmediatamente por la citocinesis, la cual divide el núcleo, citoplasma, organelos y membrana celular en dos células que contienen aproximadamente partes iguales de estos componentes celulares.
Por "célula posmitótica" se entiende una célula que ha salido de la mitosis, es decir, es "quiescente", esto es, ya no está experimentando divisiones. Este estado quiescente puede ser temporalees decir, reversible, o puede ser permanente.
Por "célula meiótica" se entiende una célula sometida a meiosis. La eiosis es el proceso mediante el cual una célula divide su material nuclear con el propósito de producir gametos o esporas. A diferencia de la mitosis, en la meiosis los cromosomas experimentan una etapa de recombinación, donde se transpone material genético entre cromosomas. De manera adicional, el resultado de la meiosis es cuatro células haploides (genéticamente singulares), en comparación con las dos células diploides (genéticamente idénticas) producidas mediante mitosis.
Por "recombinación" se entiende un proceso para intercambiar información genética entre dos polinucleótidos. Tal como se usa en la presente, "reparación dirigida por homología (HDR, por sus siglas en inglés) " se refiere a la forma especializada de reparación de ADN que se lleva a cabo, por ejemplo, durante la reparación de roturas de cadena doble en las células. Este proceso requiere homología de secuencia de nucleótidos, utiliza una molécula "donante" como plantilla de reparación de una molécula "objetivo" (es decir, la que experimentó la rotura de cadena doble), y lleva a la transferencia de la información genética del donante al objetivo..La reparación dirigida por homología puede dar como resultado una alteración de la secuencia de la molécula objetivo (por ejemplo, inserción, eliminación, mutación) si el polinucleótido donante difiere de la molécula objetivo y toda la secuencia o parte de la secuencia del polinucleótido donante se incorpora en el ADN objetivo. En algunas modalidades, el polinucleótido donante, una parte del polinucleótido donante, una copia del polinucleótido donante o una ¡parte de una copia del polinucleótido donante se integra!al ADN objetivo.
Por "recombinación no homologa (NHEJ, por sus siglas en inglés)" se entiende la reparación de las roturas de 'cadena doble en el ADN mediante ligación directa de los extremos rotos entre sí sin necesidad de una plantilla homologa (en contraposición a la reparación dirigida por homología, la que requiere una secuencia homologa para dirigir la reparación). La NHEJ a menudo da como resultado la pérdida (eliminación) de la secuencia de nucleótidos cerca del sitio de la rotura de cadena doble.
Los términos "tratamiento", "tratar" y similares se utilizan en la presente generalmente para referirse a la obtención de un efecto farmacológico y/o fisiológico deseado. El efecto puede ser profiláctico en términos de prevenir total o parcialmente una enfermedad o síntoma de esta y/o puede ser terapéutico en términos de una cura parcial o total de una enfermedad y/o efecto adverso atribuible a la enfermedad. "Tratamiento", tal como se usa en la presente, abarca cualquier tratamiento de una enfermedad o síntoma en un mamífero e incluye: (a) prevenir la enfermedad o síntoma de en un sujeto que puede estar predispuesto a contraer la enfermedad o síntoma pero que no ha sido diagnosticado aún; (b) inhibir la enfermedad o síntoma, es decir, detener su desarrollo; o (c) aliviar la enfermedad, es decir, ocasionar el retroceso de la enfermedad. El agente terapéutico puede administrarse antes, durante o de forma posterior al comienzo de la enfermedad o lesión. Es de interés particular el tratamiento de la enfermedad en curso, donde el tratamiento estabiliza o reduce los síntomas clínicos no deseables del ! paciente. Dicho tratamiento se lleva a cabo, preferentemente, antes de la pérdida completa de la función en los tejidos afectados. La terapia en cuestión se administrará, de preferencia, durante la etapa sintomática de la enfermedad y, en algunos casos, luego de la etapa sintomática de la enfermedad.
Los términos "individuo", "sujeto", "hospedador" y "paciente" se utilizan de forma intercambiable en la presente y hacen referencia a cualquier sujeto mamífero para el cual se desea el diagnóstico, tratamiento o terapia, particularmente humanos.
Los métodos generales sobre bioquímica molecular y celular se pueden encontrar en dichos libros de texto estándar tales como Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a Ed. (Sambrook et ál., HaRBor Laboratory Press 2001); Short Protocols in Molecular Biology, 4a Ed. (Ausubel et ál. eds., John Wilcy & Sons 1999); Protein Methods (Bollag et ál., John Wiley & Sons 1996); Nonviral Vectors for Gene Therapy (Wagner et ál. eds., Academic Press 1999); Viral Vectors (Kaplift & Loewy eds., Academic Press 1995); Immunology Methods Manual (I. Lefkovits ed., Academic Press 1997); y Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures in Biotechnology (Doyle & Griffiths, John Wiley & Sons 1998), cuyas descripciones se incorporan a la presente en su totalidad mediante referencia.
Antes de describir la presente invención en mayor detalle, se deberá entender que esta invención no se limita a las modalidades particulares descritas, ya que estas pueden evidentemente variar. También debe entenderse que la terminología utilizada en la presente tiene el fin de describir solamente modalidades particulares y no pretende ser taxativa, dado que el alcance de la presente invención estará limitado solamente por las reivindicaciones adjuntas.
Mientras que se proporciona un intervalo de valores, se deberá entender que cada valor involucrado, hasta la décima de la unidad del límite inferior salvo que el contexto claramente establezca lo contrario, entre el límite superior e inferior de ese intervalo y cualquier otro valor establecido o involucrado en ese intervalo establecido, están comprendidos dentro de la invención. Los límites superior e inferior de estos intervalos más pequeños pueden estar incluidos independientemente en los intervalos más pequeños y también están comprendidos dentro de la invención, sujeto a cualquier límite específicamente excluido en el intervalo establecido. Cuando el intervalo establecido incluye uno o ambos de los límites, los intervalos que excluyan cualesquiera o ambos limites incluidos también se incluyen en la invención.
Se presentan en la presente determinados intervalos con valores numéricos precedidos por el término "alrededor de". El término "alrededor de" se usa en la presente para proporcionar soporte literal al número exacto que precede, así como un número cercano o aproximado al número que el término precede. Al determinar su un número es cercano a o aproximado de un número enumerado específicamente, el número cercano o aproximado puede ser un número que el contexto en el que se presente, proporciona el equivalente sustancial del número enumerado específicamente.
A menos que se defina lo contrario, todos los términos téenicos y científicos utilizados en la presente tienen el mismo significado comúnmente entendido por un experto en la técnica a la que pertenece la presente invención. Si bien en la práctica o prueba de la presente invención también se puede utilizar cualquier método y material similar o equivalente a los descritos en la presente, a continuación se describen los métodos y materiales preferidos. Todas las publicaciones que se mencionan en la presente se incorporan a la misma mediante esta referencia para divulgar y describir los métodos y/o materiales en relación con los cuales se citan las publicaciones.
Todas las publicaciones y patentes enumeradas en esta memoria descriptiva se incorporan a la presente mediante esta referencia como si cada publicación o patente individual estuviera específica e individualmente indicada como incorporada mediante referencia, y se incorporan a la presente mediante esta referencia como descripciones de métodos y/o materiales a los cuales se refieren las publicaciones. La enumeración de cualquier publicación para su descripción previo a la fecha de presentación y no se entenderá como una admisión de que la presente invención no tiene derecho a anteceder dicha publicación en virtud de invención previa. Además, las fechas de publicación proporcionadas pueden ser distintas de las fechas de publicación reales, las cuales puede ser necesario que se confirmen de manera independiente.
Se observa que, tal como se usan en la presente y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una" y "el/la", incluyen los referentes plurales, salvo que se exprese claramente lo contrario en el contexto. Por consiguiente, por ejemplo, la referencia a "un polinucleótido" incluye una pluralidad de dichos polinucleótidos y la referencia "al polipéptido" incluye la referencia a uno o más polipéptidos y equivalentes de estos conocidos por los expertos en la téenica, etc. Se observa además que las reivindicaciones pueden ser redactadas de forma que excluyan cualquier elemento opcional. Como tal, esto pretende ser una base antecedente para el uso de terminología exclusiva tal como "solamente", "únicamente" y similares con relación a la enumeración de los elementos de las reivindicaciones o el uso de una limitación "negativa".
Se entiende que algunas características de la invención que, a los efectos de la claridad, se describen en el contexto de modalidades separadas, también se pueden proporcionar en combinación en una sola modalidad. De manera inversa, diversas características de la invención que, a efectos de brevedad, se describen en el contexto de una sola modalidad, también se pueden proporcionar por separado o en cualquier subcombinación adecuada. Todas las combinaciones de las modalidades pertenecientes a la invención se encuentran específicamente comprendidas dentro de la presente invención y se describen en la presente como si cada combinación estuviese individual y específicamente descrita. Además, todas las subcombinaciones de las varias modalidades y elementos de estas también se encuentran específicamente comprendidos dentro de la presente y se describen en la presente como si cada dicha subcombinación estuviese individual y específicamente descrita en la presente.
Las publicaciones que se analizan en la presente se proporcionan únicamente para su divulgación antes de la fecha de presentación de la presente solicitud. Ningún contenido de la presénte debe interpretarse como una admisión de que la presente invención no tiene derecho a preceder a dicha publicación en virtud de invención anterior. Además, las fechas de publicación proporcionadas pueden no coincidir con las fechas de publicación reales, las que puede ser necesario confirmar independientemente.
La presente descripción proporciona un ARN dirigido a ADN que comprende una secuencia objetivo y, junto con un polipéptido modificador, proporciona una modificación especifica del sitio de un ADN objetivo y/o un polipéptido asociado con el ADN objetivo. La presente descripción proporciona además polipéptido modificadores específicos del sitio. La presente descripción proporciona además métodos para la modificación específica del sitio de un ADN objetivo y/o un polipéptido asociado con el ADN objetivo. La presente descripción proporciona métodos para modular la transcripción de un ácido nucleico objetivo en una célula objetivo, que generalmente involucra poner en contacto el ácido nucleico objetivo con un polipéptido Cas9 enzimáticamente inactivo y un ARN dirigido a ADN. Se proporcionan también kits y composiciones para llevar a cabo los métodos. La presente descripción proporciona células modificadas genéticamente que producen Cas9; y organismos multicelulares no humanos Cas9 transgénicos. ÁCIDOS NUCLEICOS ARN dirigido a ADN La presente descripción proporciona un ARN dirigido a ADN, que dirige las actividades de un polipéptido asociado (por ejemplo, un polipéptido modificador dirigido al sitio) hacia una secuencia objetivo especifica dentro de un ADN objetivo. Un ARN dirigido a ADN de la invención comprende: un primer segmento (al que en la presente también se hace referencia como "segmento dirigido a ADN" o "secuencia dirigida a ADN") y un segundo segmento (al que también se hace referencia en la presente como "segmento de unión a proteína" o una "secuencia de unión a proteína").
Segmento dirigido a ADN de un ARN dirigido a ADN El segmento dirigido a ADN de un ARN dirigido a ADN de la invención comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia en un ADN objetivo. En otras palabras, el segmento dirigido a ADN de un ARN dirigido a ADN de la invención interactúa con un ADN objetivo de forma específica a la secuencia mediante hibridación (es decir, apareamiento de bases). Como tal, la secuencia de nucleótidos del segmento dirigido a ADN puede variar y determina la ubicación dentro del ADN objetivo donde el ARN dirigido a ADN y el ADN objetivo interactuarán. El segmento dirigido a ADN de un ARN dirigido a ADN de la invención puede modificarse (por ejemplo, mediante manipulación genética) para hibridarse a cualquier secuencia deseada dentro de un ADN objetivo.
El segmento dirigido a ADN puede ser de una longitud de alrededor de 12 nucleótidos a alrededor de 100 nucleótidos. Por ejemplo, el segmento dirigido a ADN puede tener una longitud de alrededor de 12 nucleótidos (nt) a alrededor de 80 nt, de alrededor 12 nt a alrededor de 50 nt, de alrededor de 12 nt a alrededor de 40 nt, de alrededor de 12 nt a alrededor de 30 nt, de alrededor de 12 nt a alrededor de 25 nt, de alrededor de 12 nt a alrededor de 20 nt, de alrededor de 12 nt a alrededor de 19 nt. Por ejemplo, el segmento dirigido a ADN puede tener una longitud de alrededor de 19 nt a alrededor de 20 nt, de alrededor de 19 nt a alrededor de 25 nt, de alrededor de 19 nt a alrededor de 30 nt, de alrededor de 19 nt a alrededor de 35 nt, de alrededor de 19 nt a alrededor de 40 nt, de alrededor de 19 nt a alrededor de 45 nt, de alrededor de 19 nt a alrededor de 50 nt, de alrededor de 19 nt a alrededor de 60 nt, de alrededor de 19 nt a alrededor de 70 nt, de alrededor de 19 nt a alrededor de 80 nt, de alrededor de 19 nt a alrededor de 90 nt, de alrededor de 19 nt a alrededor de 100 nt, de alrededor de 20 nt a alrededor de 25 nt, de alrededor de 20 nt a alrededor de 30 nt, de alrededor de 20 nt a alrededor de 35 nt, de alrededor de 20 nt a alrededor de 30 nt, de alrededor de 20 nt a alrededor de 40 nt, de alrededor de 20 nt a alrededor de 45 nt, de alrededor de 20 nt a alrededor de 50 nt, de alrededor de 20 nt a alrededor de 60 nt, de alrededor de 20 nt a alrededor de 70 nt, de alrededor de 20 nt a alrededor de 80 nt, de alrededor de 20 nt a alrededor de 90 nt, de alrededor de 20 nt a alrededor de 100 nt. La secuencia de nucleótidos (la secuencia dirigida a ADN) del segmento dirigido a ADN que es complementario a una secuencia de nucleótidos (secuencia objetivo) del ADN objetivo puede tener una longitud de al menos alrededor de 12 nt. Por ejemplo, una secuencia dirigida a ADN del segmento dirigido a ADN que es complementario a una secuencia objetivo del ADN objetivo puede tener una longitud de al menos alrededor de 12 nt, al menos alrededor de 15 nt, al menos alrededor de 18 nt, al menos alrededor de 19 nt, al menos alrededor de 20 nt, al menos alrededor de 25 nt, al menos alrededor de 30 nt, al menos alrededor de 35 nt, al menos alrededor de 40 nt. Por ejemplo, la secuencia dirigida a ADN del segmento dirigido a ADN que es complementario a la secuencia objetivo del ADN objetivo puede tener una longitud de alrededor de 12 nucleótidos (nt) a alrededor de 80 nt, de alrededor de 12 nt a alrededor de 50 nt, de alrededor de 12 nt a alrededor de 45 nt, de alrededor de 12 nt a alrededor de 40 nt, de alrededor de 12 nt a alrededor de 35 nt, de alrededor de 12 nt a alrededor de 30 nt, de alrededor de 12 nt a alrededor de 25 nt, de alrededor de 12 nt a alrededor de 20 nt, de alrededor de 12 nt a alrededor de 19 nt, de alrededor de 19 nt a alrededor de 20 nt, de alrededor de 19 nt a alrededor de 25 nt, de alrededor de 19 nt a alrededor de 30 nt, de alrededor de 19 nt a alrededor de 35 nt, de alrededor de 19 nt a alrededor de 40 nt, de alrededor de 19 nt a alrededor de 45 nt, de alrededor de 19 nt a alrededor de 50 nt, de alrededor de 19 nt a alrededor de 60 nt, de alrededor de 20 nt a alrededor de 25 nt, de alrededor de 20 nt a alrededor de 30 nt, de alrededor de 20 nt a alrededor de 35 nt, de alrededor de 20 nt a alrededor de 40 nt, de alrededor de 20 nt a alrededor de 45 nt, de alrededor de 20 nt a alrededor de 50 nt, de alrededor de 20 nt a alrededor de 60 nt. La secuencia de nucleótidos (la secuencia dirigida a ADN) del segmento dirigido a ADN que es complementario a una secuencia de nucleótidos (secuencia objetivo) del ADN objetivo puede tener una longitud de al menos alrededor de 12 nt.
En algunos casos, la secuencia dirigida a ADN del segmento dirigido a ADN que es complementario a una secuencia objetivo del ADN objetivo tiene 20 nucleótidos de longitud. En algunos casos, la secuencia dirigida a ADN del segmento dirigido a ADN que es complementario a una secuencia objetivo del ADN objetivo tiene 19 nucleótidos de longitud.
El porcentaje de complementariedad entre la secuencia dirigida a ADN del segmento dirigido a ADN y la secuencia objetivo del ADN objetivo puede ser al menos de 60 % (por ejemplo, al menos 65 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 97%, al menos 98 %, al menos 99 % o 100 %). En algunos casos, el porcentaje de complementariedad entre la secuencia dirigida a ADN del segmento dirigido a ADN y la secuencia objetivo del ADN objetivo es 100 % dentro de los siete nucleótidbs contiguos más cercanos al extremo 5' de la secuencia objetivo de la cadena complementaria del ADN objetivo. En algunos casos, el porcentaje de complementariedad entre la secuencia dirigida a ADN del segmento dirigido a ADN y la secuencia objetivo del ADN objetivo es al menos 60 % dentro de alrededor de 20 nucleótidos continuos. En algunos casos, el porcentaje de complementariedad entre la secuencia dirigida a ADN del segmento dirigido a ADN y la secuencia objetivo del ADN objetivo es 100 % dentro de los catorce nucleótidos contiguos más cercanos al extremo 5' de la secuencia objetivo de la cadena complementaria del ADN objetivo y tan bajo como 0 % dentro del resto. En dicho caso, puede considerarse que la secuencia dirigida a ADN tiene 14 nucleótidos de longitud (ver Figuras 12D-E). En algunos casos, el porcentaje ·de complementariedad .entre la secuencia dirigida a ADN del segmento dirigido a ADN y la secuencia objetivo del ADN objetivo es 100 % dentro de los siete nucleótidos contiguos más cercanos al extremo 5' de la secuencia objetivo de la cadena complementaria del ADN objetivo y tan bajo como 0 % dentro dél resto. En dicho caso, puede considerarse que la secuencia dirigida a ADN tiene 7 nucbeótidos de longitud.
Segmento de unión a proteínas de un ARN dirigido a ADN El segmento de unión a proteínas de un ARN dirigido a ADN de la invención interactúa con un polipéptido modificador dirigido al sitio. El ARN dirigido a ADN de la invención guía al polipéptido unido a una secuencia de nucleótidos específica dentro del ADN objetivo a través del segmento dirigido a ADN mencionado anteriormente. El segmento de unión a proteínas de un ARN dirigido a ADN de la invención comprende dos tramos de nucleótidos que son complementarios entre sí. Los nucleótidos complementarios del segmento de unión a proteínas se hibridan para formar un dúplex de ARN de cadena doble (ARNcd) (ver Figuras 1A y IB).
Un ARN dirigido a ADN de molécula doble de la invención comprende dos moléculas separadas de ARN. Cada una de las dos moléculas de ARN de un ARN dirigido a ADN de molécula doble de la invención comprende una extensión de nucleótidos que son complementarios entre sí, de forma que los nucleótidos complementarios de las dos moléculas de ARN se hibridan para formar el dúplex de ARN de cadena doble del segmento de unión a proteínas (Figura 1A).
En algunas modalidades, el segmento formador de dúplex del ARN activador es al menos alrededor de 60 % idéntico a una de las moléculas de ARN activador (tracrRNA) establecidas en las SEQ ID NO: 431-562, o un complemento de estas, en una extensión de al menos 8 nucleótidos contiguos. Por ejemplo, el segmento formador de dúplex del ARN activador (o el ADN que codifica el segmento formador de dúplex del ARN activador) es idéntico en al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 %, al menos un 99 % o 100 % idéntico a una de las secuencias de tracrRNA establecidas en SEQ ID NO: 431-562, o un complemento de estas, en una extensión de al menos 8 nucleótidos contiguos.
En algúnas modalidades, el segmento formador de dúplex del ARN activador es al menos alrededor de 60 % idéntico a una de las secuencias de ARN identificador (crRNA) establecidas en las SEQ ID NO: 563-679, o un complemento de estas, en una extensión de al menos 8 nucleótidos contiguos. Por ejemplo, el segmento formador de dúplex del ARN identificador (o el ADN gue codifica el segmento formador de dúplex del ARN identificador) es idéntico en al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 %, al menos un 99 % o 100 % idéntico a una de las secuencias de crRNA establecidas en SEQ ID NO: 563-679, o un complemento de estas, en una extensión de al menos 8 nucleótidos contiguos.
Un ARN dirigido a ADN de molécula doble puede diseñarse para permitir la unión controlada (es decir, condicional) de un ARN identificador con un ARN activador. Dado que un ARN dirigido a ADN de molécula doble no es funcional a menos que el ARN activador y el ARN identificador estén unidos en un complejo funcional con dCas9, un ARN dirigido a ADN de molécula doble puede ser inducible (por ejemplo, inducible por fármacos) provocando que la unión entre el ARN activador y el ARN identificador sea inducible. Como un ejemplo no taxativo, los aptámeros de ARN pueden usarse para regular (es decir, controlar) la unión del ARN activador con el ARN identificador. Por consiguiente, el ARN activador y/o el ARN identificador pueden comprender una secuencia de aptámero de ARN.
Los aptámeros de ARN son conocidos en la téenica y generalmente son una versión sintética de un ribointerruptor. Las expresiones "aptámero de ARN" y "ribointerruptor" se usan de manera intercambiable en la presente para abarcar secuencias de ácido nucleico sintéticas y naturales que proporcionan regulación inducible de la estructura (y por lo tanto la disponibilidad de las secuencias especificas) de la molécula de ARN de la que son parte. Los aptámeros de ARN normalmente comprenden una secuencia que se pliega en una estructura en particular (por ejemplo, una horquilla), la cual une específicamente a un fármaco en particular (por ejemplo, a una molécula pequeña). La unión del fármaco provoca un cambio estructural en el pliegue del ARN, el cual cambia una característica del ácido nucleico del cual es parte el aptámero. Como ejemplos no taxativos: (i) un ARN activador con un aptámero puede no ser capaz de unirse al ARN identificador cognado a menos que el aptámero se una mediante el fármaco adecuado; (ii) un ARN identificador con un aptámero puede no ser capaz de unirse al ARN activador cognado a menos que el aptámero se una mediante el fármaco adecuado; y (iii) un ARN identificador y un ARN activador, cada uno de ellos con un aptámero diferente que se una a un fármaco diferente, pueden no ser capaces de unirse entre si a menos que estén presentes ambos fármacos. Tal como se ilustra en estos ejemplos, un ARN dirigido a ADN de molécula doble puede diseñarse para ser inducible.
Pueden encontrarse ejemplos de aptáme-ros y ribointerruptores, por ejemplo, en: Nakamura et ál., Genes Cells. Mayo de 2012; 17 (5):344-64; Vavalle et ál., Future Cardiol. Mayo de 2012; 8(3):371-82; Citartan et ál., Biosens Bioelectron. 15 de abril !de 2012; 34(1):1-11; y Liberman. et ál., Wilcy Rev RNA. 2012 May-Jun;3(3):369-84; todas las cuales se incorporan a la presente en su totalidad mediante referencia.
Los ejemplos no taxativos de secuencias de nucleótidos que pueden incluirse en un ARN dirigido a ADN de molécula doble incluyen cualquiera de las secuencias establecidas en las SEQ ID NO: 431-562, o complementos de estas, emparejadas con cualquiera de las secuencias establecidas en las SEQ ID NO: 563-679, o complementos de estas, que puedan hibridarse para formar un segmento de unión a proteínas.
Un ARN dirigido a ADN de· molécula simple de la invención comprende dos extensiones de nucleótidos (un ARN identificador y un ARN activador) que son complementarios entre si, están unidos de forma covalente mediante nucleótidos intermedios ( "enlazadores" o "nucleótidos enlazadores") y se hibridan para formar el dúplex de ARN de cadena doble (dúplex de ARNcd) del segmento de unión a proteínas, dando como resultado una estructura de tallo-bucle (Figura IB). El ARN identificador y el ARN activador pueden estar unidos covalentemente mediante el extremo 3' del ARN identificador y el extremo 5' del ARN activador. De manera alternativa, el ARN identificador y el ARN activador pueden estar unidos covalentemente mediante el extremo 5' del ARN identificador y el extremo 3' del ARN activador.
El enlazador de un ARN dirigido a ADN de molécula simple puede tener una longitud de alrededor de 3 nucleótidos a alrededor de 100 nucleótidos. Por ejemplo, el enlazador puede tener una longitud de alrededor de 3 nucleótidos (nt) a alrededor de 90 nt, de alrededor de 3 nucleótidos (nt) alrededor de 80 nt, de alrededor 3 nucleótidos (nt) alrededor de 70 nt, de alrededor de 3 nucleótidos (nt) alrededor de 60 nt, de alrededor de 3 nucleótidos (nt) alrededor de 50 nt, de alrededor de 3 nucleótidos (nt) alrededor de 40 nt, de alrededor de 3 nucleótidos (nt) alrededor de 30 nt, de alrededor de 3 nucleótidos (nt) alrededor de 20 nt, de alrededor de 3 nucleótidos (nt) alrededor de 10 nt. Por ejemplo, el enlazador puede tener una longitud de alrededor de 3 nt a alrededor de 5 nt, de alrededor de 5 nt a alrededor de 10 nt, de alrededor de 10 nt a alrededor de 15 nt, de alrededor de 15 nt a alrededor de 20 nt, de alrededor de 20 nt a alrededor de 25 nt, de alrededor de 25 nt a alrededor de 30 nt, de alrededor de 30 nt a alrededor de 35 nt, de alrededor de 35 nt a alrededor de 40 nt, de alrededor de 40 nt a alrededor de 50 nt, de alrededor de 50 nt a alrededor de 60 nt, de alrededor de 60 nt a alrededor de 70 nt, de alrededor de 70 nt a alrededor de 80 nt, de alrededor de 80 nt a alrededor de 90 nt, de alrededor de 90 nt a alrededor de 100 nt. En algunas modalidades, el enlazador de un ARN dirigido a ADN de molécula simple tiene 4 nt.
Un ejemplo de ARN dirigido a ADN de molécula simple comprende dos extensiones complementarias de nucleótidos que se hibridan para formar un dúplex de ARNcd. En algunas modalidades, una de las dos extensiones complementarias de nucleótidos del ARN dirigido a ADN de molécula simple (o el ADN que codifica la extensión) es al menos alrededor de 60 % idéntica a una de las moléculas de ARN activador (tracrRNA) establecidas en las SEQ ID NO: 431-562, o un complemento de estas, en una extensión de al menos 8 nucleótidos contiguos. Por ejemplo, una de las dos extensiones complementarias de nucleótidos de ARN dirigido a ADN de molécula simple (o el ADN que codifica la extensión) es idéntico en al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 %, al menos un 99 % o 100 % idéntico a una de las secuencias de tracrRNA establecidas en las SEQ ID NO: 431-562, o un complemento de estas, en una extensión de al menos 8 nucleótidos contiguos.
En algunas modalidades, una de las dos extensiones complementarias de nucleótidos del ARN dirigido a ADN de molécula simple (o el ADN que codifica la extensión) es al menos alrededor de 60 % idéntica a una de las secuencias de ARN identificador (crRNA) establecidas en las SEQ ID NO: 563-679, o un complemento de estas, en una extensión de al menos 8 nucleótidos contiguos. Por ejemplo, una de las dos extensiones complementarias de nucleótidos de ARN dirigido a ADN de molécula simple (o el ADN que codifica la extensión) es idéntico en al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 %, al menos un 99 % o 100 % idéntico a una de las secuencias de crRNA establecidas en las SEQ ID NO: 563-679, o un complemento de estas, en una extensión de al menos 8 nucleótidos contiguos.
Pares adecuados de crRNA y tracrRNA cognados de origen natural pueden determinarse de forma rutinaria para las SEQ ID NO: 431-679 tomando en cuenta el nombre y par de bases de la especie (para el dúplex de ARNcd del dominio de unión a proteínas) a la hora de determinar los pares adecuados de cognados (ver Figura 8 como un ejemplo no taxativo).
Con relación a un ARN dirigido a ADN de molécula simple de la invención y a un ARN dirigido a ADN de molécula doble de la invención, la Figura 57 demuestra que las secuencias artificiales que comparten muy poco (aproximadamente 50 % de identidad) con tracrRNA y crRNA de origen natural pueden funcionar con Cas9 para escindir ADN objetivo siempre que. se conserve la estructura del dominio de unión a proteínas del ARN dirigido a ADN. De esta forma, puede tomarse en cuenta la estructura plegada de ARN de un dominio de unión a proteína de origen natural de un ARN dirigido a ADN para el diseño de dominios artificiales de unión a proteínas (tanto versiones de moléculas dobles o de moléculas simples). Como un ejemplo no taxativo, el ARN dirigido a ADN funcional artificial de la Figura 57 se diseñó con base en la estructura del segmento de unión a proteínas del direccionamiento a ADN de origen natural (por ejemplo, que incluye la misma cantidad de pares de base a lo largo del dúplex de ARN y que incluye la misma región "abultada" presente en el ARN de origen natural). De la misma forma que las estructuras pueden ser producidas por un experto en la téenica para cualquier par crRNA:tracrRNA de origen natural de cualquier especie (ver SEQ ID NO: 431-679 para secuencias de crRNA y tracrRNA de una gran variedad de especies), puede diseñarse un ARN dirigido a ADN artificial de ?ohhb que imite la estructura natural de una especie determinada al usar Cas9 (o un Cas9 relacionado, ver Figura 32A) para esa especie (ver figura 24 D y detalles relacionados en el Ejemplo 1). De esta forma, un ARN dirigido a ADN adecuado puede ser un ARN diseñado de forma artificial (de origen no natural) que comprenda un dominio de unión a proteínas diseñado para imitar la estructura de un dominio de unión a proteínas de un ARN dirigido a ADN de origen natural (ver las SEQ ID NO: 431-679, tomando en cuenta el nombre de las especies al determinar pares adecuados de cognados).
El segmento de unión a proteínas puede tener una longitud de alrededor de 10 nucleótidos a alrededor de 100 nucleótidos. Por ejemplo, el segmento de unión a proteínas puede tener una longitud de alrededor de 15 nucleótidos (nt) a alrededor de 80 nt, de alrededor 15 nt a alrededor de 50 nt, de alrededor de 15 nt a alrededor de 40 nt, de alrededor de 15 nt a alrededor de 30 nt o de alrededor de 15 nt a alrededor de 25 nt.
Adicionalmente, con relación a un ARN dirigido a ADN de molécula simple de la invención y a un ARN dirigido a ADN de molécula doble de la invención, el dúplex de ARNcd del segmento de unión a proteínas puede tener una longitud de alrededor de 6 pares de base (bp) a alrededor de 50 bp. Por ejemplo, el dúplex de ARNcd del segmento de unión a proteínas puede tener una longitud de alrededor de 6 bp a alrededor de 40 bp, de alrededor de 6 bp a alrededor de 30 bp, de alrededor de 6 bp a alrededor de 25 bp, de alrededor de 6 bp a alrededor de 20 bp, de alrededor de 6 bp a alrededor de 15 bp, de alrededor de 8 bp a alrededor de 40 bp, de alrededor de 8 bp a alrededor de 30 bp, de alrededor de 8 bp a alrededor de 25 bp, de alrededor de 8 bp a alrededor de 20 bp, de alrededor de 8 bp a alrededor de 15 bp. Por ejemplo, el dúplex de ARNcd del segmento de unión a proteínas puede tener una longitud de alrededor de 8 bp a alrededor de 10 bp, de alrededor de 10 bp a alrededor de 15 bp, de alrededor de 15 bp a alrededor de 18 bp, de alrededor de 18 bp a alrededor de 20 bp, de alrededor de 20 bp a alrededor de 25 bp, de alrededor de 25 bp a alrededor de 30 bp, de alrededor de 30 bp a alrededor de 35 bp, de alrededor de 35 bp a alrededor de 40 bp, de alrededor de 40 bp a alrededor de 50 bp. En algunas modalidades, el dúplex de ARNcd del segmento de unión a proteínas tiene una longitud de 36 pares de base. El porcentaje de complementariedad entre las secuencias de nucleótidos que hibridan para formar el dúplex de ARNcd del segmento de unión a proteínas puede ser al menos alrededor de 60 %. Por ejemplo, el porcentaje de complementariedad entre las secuencias de nucleótidos que hibridan para formar el dúplex de ARNcd del segmento de unión a proteínas puede ser al menos alrededor de 65 %, al menos alrededor de 70 %, al menos alrededor de 75 %, al menos alrededor de 80 %, al menos alrededor de 85 %, al menos alrededor de 90 %, al menos alrededor de 95 %, al menos alrededor de 98 % o al menos alrededor de 99 %. En algunos casos, el porcentaje de complementariedad entre las secuencias de nucleótidos que hibridan para formar el dúplex de ARNcd del segmento de unión a proteínas es 100 %.
Polipeptido modificador dirigido al sitio Un ARN dirigido a ADN de la invención y un polipéptido modificador dirigido al sitio de la invención forman un complejo. El ARN dirigido a ADN proporciona especificidad de direccionamiento al complejo, ya que comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de un ADN objetivo (como se mencionó anteriormente). El polipéptido modificador dirigido al sitio del complejo proporciona la actividad especifica del sitio. En otras palabras, el polipéptido modificador dirigido al sitio se dirige a una secuencia de ADN (por ejemplo, una secuencia cromosómica o una secuencia extracromosómica, por ejemplo, una secuencia episomal, una secuencia de minicírculos, una secuencia mitocondrial, una secuencia de cloroplasto, etc.) en virtud de su asociación con al menos el segmento de unión a proteínas del ARN dirigido a ADN (.descrito anteriormente).
Un polipéptido modificador dirigido al sitio de la invención modifica el ADN objetivo (por ejemplo, la escisión o metilación de ADN objetivo) y/o un polipéptido asociado con ADN objetivo (por ejemplo, metilación o acetilación de una cola de histona). En la presente, también se hace·referencia a un polipéptido modificador dirigido al sitio como "polipéptido dirigido al sitio" o un "polipéptido modificador dirigido al sitio de unión a ARN".
En algunos casos, el polipéptido modificador dirigido al sitio es un polipéptido modificador de origen natural. En otros casos, el polipéptido modificador dirigido al sitio no es un polipéptido de origen natural (por ejemplo, un t polipéptido quimérico como se describe más adelante o un polipéptido de origen natural que es modificado, por ejemplo, mutación, eliminación, inserción).
Se establecen ejemplos de polipéptidos modificadores dirigidos al sitio de origen natural en las SEQ ID NO: 1-255 como una enumeración no taxativa y no exhaustiva de endonucleasas Cas9/Csnl de origen natural. Estos polipéptidos de origen natural, tal como se describe en la presente, se unen a un ARN dirigido a ADN, están, de esta forma, dirigidos a una secuencia especifica dentro de un ADN objetivo, y escinden el ADN objetivo para generar una rotura de cadena doble. Un polipéptido modificador dirigido al sitio de la invención comprende dos partes: una parte de unión a ARN y una parte de actividad. En algunas modalidades, un polipéptido modificador dirigido al sitio de la invención comprende: (i) una parte de unión a ARN que interactúa con un ARN dirigido a ADN, donde el ARN dirigido a ADN comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia en un ADN objetivo; y (ii) una parte de actividad que presenta actividad enzimática dirigida al sitio (por e-jemplo, actividad para metilación de ADN, actividad para la escisión de ADN, actividad para la acetilación de histona, etc.), donde el sitio de actividad enzimática está determinado por el ARN dirigido a ADN.
En otras modalidades, un polipéptido modificador dirigido al sitio de la invención comprende: (i) una parte de unión a ARN que interactúa con un ARN dirigido a ADN, donde el ARN dirigido a ADN comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia en un ADN objetivo; y (ii) una parte de actividad que modula la transcripción dentro del ADN objetivo (por ejemplo, para aumentar o disminuir la transcripción), donde el sitio de transcripción modulada dentro del ADN objetivo está determinado por el ARN dirigido a ADN.
En algunos casos, un polipéptido modificador dirigido al sitio de la invención tiene actividad enzimática que modifica al ADN objetivo (por ejemplo, actividad de nucleasa, actividad de metiltransferasa, actividad de desmetilasa, actividad de reparación del ADN, actividad de daño al ADN, actividad de desaminación, actividad de dismutasa, actividad de alquilación, actividad de depurinación, actividad de oxidación, actividad de formación de dimeros de pirimidina, actividad de integrasa, actividad de transposasa, actividad de recombinasa, actividad de polimerasa, actividad de ligasa, actividad de helicasa, actividad de fotoliasa o actividad de glicosilasa).
En otros casos, un polipéptido modificador dirigido al sitio tiene actividad enzimática que modifica al polipéptido (por ejemplo, una histona) asociado con ADN objetivo (por ejemplo, actividad de metiltransferasa, actividad de desmetilasa, actividad de acetiltransferasa, actividad deacetilasa, actividad de cinasa, actividad de fosfatasa, actividad de ubiquitina ligasa, actividad desubiquitinante, actividad de adenilación, actividad de desadenilación, actividad de SUMOilación, actividad de deSUMOilación, actividad de ribosilación, actividad de desribosilación, actividad de miristoi lación o actividad de demiristoilación) .
Ejemplos de polipeptidos modificadores dirigidos al sitio En algunos casos, el polipéptido modificador dirigido al sitio comprende una secuencia de aminoácidos con al menos alrededor de 75 %, al menos alrededor de 80 %, al menos alrededor de 85 %, al menos alrededor de 90 %, al menos alrededor de 95 %, al menos alrededor de 99 %, o 100 % de identidad de secuencia de aminoácidos con los aminoácidos 7-166 o 731-100.3 de la secuencia de aminoácidos Cas9/Csnl ilustrada en la Figura 3 o a las partes correspondientes en cualquiera de las secuencias de aminoácidos establecidas como SEQ ID NO: 1-256 y 795-1346.
Modificación de ácidos nucleicos En algunas modalidades, un ácido nucleico de la invención (por ejemplo, un ARN dirigido a ADN) comprende una o más modificaciones, por ejemplo, una modificación de base, una modificación de la estructura, etc., para proporcionarle al ácido nucleico una característica nueva o mejorada (por ejemplo, estabilidad mejorada). Tal como se conoce en la téenica, un nucleósido es una combinación base-azúcar. La parte de base del nucleósido es comúnmente una base heterocíclica. Las dos clases más comunes de tales bases heterocíclicas son las purinas y las pirimidinas. Los nucleótidos son nucleósidos que incluyen además un grupo fosfato unido covalentemente a la parte de azúcar del nucleósido. Para aquellos nucleósidos que incluyen un azúcar pentofuranosilo, el grupo fosfato puede unirse al resto de hidroxilo 2', 3' o 5' del azúcar. En la formación de oligonucleótidos, los grupos fosfato unen covalentemente entre si a los nucleósidos adyacentes para formar un compuesto polimérico lineal. A su vez, los extremos respectivos de este compuesto polimérico lineal puede unirse además para formar un compuesto circular; no obstante, los compuestos lineales normalmente son adecuados. Adicionalmente, los compuestos lineales pueden tener una complementariedad interna de base de nucleótidos y puede, por lo tanto, plegarse de forma que produzca un compuesto total o parcialmente de cadena doble. Dentro de los oligonucleótidos, generalmente se hace referencia a los grupos de fosfato como formadores de la estructura de internucleósido del oligonucleótido. La unión normal o estructura principal de ARN y ADN es un enlace de fosfodiéster de 3' a 5'.
Estructuras modificadas y enlaces internucleósidos modificados.
Los ejemplos de ácidos nucleicos adecuados que contienen modificaciones incluyen ácidos nucleicos que contienen estructuras modificadas o enlaces internucleósidos no naturales. Los ácidos nucleicos (con estructuras modificadas) incluyen aquellos que retienen un átomo de fósforo en lá estructura y aquellos que no tienen un átomo de fósforo en la estructura.
Las estructuras de oligonucleótidos modificadas adecuadas que contienen un átomo de fósforo en estas incluyen, por ejemplo, fosforotioatos, fosforotioatos quirales, fosforoditioates, fosfotriésteres, aminoalquilfosfotriésteres, metilo y otros fosfonatos de alquilo incluyendo fosfonatos de 3'-alquileno, fosfonatos de 5'-alquileno y fosfonatos quirales, fosfinatos, fosforamidatos incluyendo 3'-amino fosforamidato y aminoalquilfosforamidatos, tionofosforamidatos, tionoalquilfosfonatos, tionoalquilfosfotriésteres, selenofosfatos y boranofosfatos con enlaces 3'-5' normales, análogos unidos por 2'-5' de estos y aquellos con polaridad invertida donde uno o más enlaces internucleótidos es un enlace 3' a 3', 5' a 5' o 2' a 2'. Los oligonucleótidos adecuados que tienen polaridad invertida comprenden un único enlace 3' a 3' en el enlace internucleótido más cercano a 3', es decir, un único residuo nucleósido invertido que puede ser básico (le falta la nucleobase o tiene un grupo hidroxilo en su lugar). También se incluyen varias sales (tales como, por ejemplo, de potasio o sodio), sales mixtas o formas ácidas libres.
En algunas modalidades, un ácido nucleico dé la invención comprende uno o más enlaces internucleósidos fosforotioato y/o de heteroátomo, en particular -CH2-NH-O-CH2-, -CH2-N(CH3)-O-CH2- (conocido como estructura de metileno (metilimino) o MMI), -CH2-O-N(CH3)-CH2-, -CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2- y -0-N(CH3)-CH2-CH2- (donde el enlace internucleótido natural fosfodiéster se representa como -O-P(=0)(OH)-O-CH2-). Los tipos MMI de enlaces internucleósidos se describen en la antes mencionada patente estadounidense n.° 5,489,677. Los enlaces internucleósidos de amidas adecuados se describen en la patente estadounidense n.° 5,602,240.
También son adecuados los ácidos nucleicos que tienen estructuras de morfolino tal como las descritas en, por ejemplo, las patentes estadounidenses n.° 5,034,506. Por ejemplo, en algunas modalidades, un ácido nucleico de la invención comprende un anillo de morfolino de 6 miembros en el lugar de un anillo de ribosa. En algunas de estas modalidades, un enlace internucleósido de fosforodiamidato u otro no fosfodiéster reemplaza a un enlace fosfodiéster.
Las estructuras modificadas de polinucleótidos adecuadas que no incluyen un átomo de fósforo en ellas tienen estructuras formadas por enlaces internucleósidos alquilo o cicloalquilp de cadena corta, enlaces internucleósidos alquilo o cicloalquilo mixtos de heteroátomo o uno o más enlaces internucleósidos heteroatómicos o heterociclicos de cadena corta. Estos incluyen los que tienen enlaces de morfolina (formados en parte por la parte de azúcar de un nucleósido); estructuras de siloxano; estructuras de sulfuro, sulfóxido y sulfona; estructuras de formacetilo y tioformacetilo; estructuras de metileno formacetilo y tioformacetilo; estructuras de. riboacetilo; estructuras que convienen alqueno; estructuras de sulfamato; estructuras de metilenimino y metilenhidracino; estructuras de sulfonato y sulfonamida; estructuras de amida; y otras que tienen mezclas con partes de los componentes N, 0, S and CH2.
Miméticos Un ácido nucleico de la invención puede ser un mimético de ácido nucleico. El término "mimético" como se aplica a los polinucleótidos se pretende que incluya polinucleótidos donde solamente el anillo de furanosa o tanto el anillo de furanosa y el enlace internucleótidos se reemplazan con grupos no furanosa, el reemplazo de solamente el anillo de furanosa también se menciona en la téenica como un sustituto de azúcar. El resto de base heterocielica o un resto de base heterociclica modificada se mantiene para la hibridación con un ácido nucleico objetivo adecuado. Tal compuesto de ácido nucleico, un mimético de polinucleótido que se ha demostrado que tiene excelentes propiedades de hibridación, se menciona como un ácido nucleico peptidico (PNA, por sus siglas en inglés). En el PNA, la estructura de azúcar de un polinucleótido se reemplaza con una estructura que contiene amida, en particular una estructura de aminoetilglicina. Los nucleótidos se conservan y se unen directa o indirectamente a átomos de nitrógeno aza de la parte amida de la estructura.
Un mimético de polinucleótido que se ha descrito como que tiene excelentes propiedades de hibridación, se menciona como un ácido nucleico peptidico (PNA). La estructura en compuestos de PNA es de dos o más unidades de aminoetilglicina unidas que le proporciona a PNA una amida que contiene una estructura. Los restos de base heterociclica unen directa o indirectamente a átomos de nitrógeno aza de la parte amida de la estructura. Las patentes estadounidenses representativas que describen la preparación de compuestos de PNA incluyen, de modo no taxativo: las patentes estadounidenses n.°.5,539,082; 5,714,331; y 5,719,262.
Otra clase de mimético de polinucleótido que ha sido estudiada se basa en unidades de morfolino unidas (ácido nucleico de morfolino) que tienen bases heterocielicas acopladas al anillo de morfolino. Se ha descrito una cantidad de grupos de unión que se unen a las unidades monoméricas de morfolino en un ácido nucleico de morfolino. Una clase de grupos de unión se ha seleccionado para proporcionar un compuesto oligomérico no iónico. Es menos probable que los compuestos oligoméricos a base de morfolino no iónicos tengan interacciones no deseadas con pro teínas celulares. Los polinucleótidos a base de morfolino son miméticos no iónicos de oligonucleótidos que es menos probable que formen interacciones no deseadas con proteínas celulares (Dwaine A. Braasch y David R. Corcy, Biochemistry, 2002, 41(14), 4503-4510). Los polinucleótidos a base de morfolino se describen en la patente estadounidense n.° 5,034,506. Se ha preparado una variedad de compuestos dentro de la clase de morfolino de polinucleótidos, los cuales tienen una variedad de grupos de unión diferentes que unen las subunidades monoméricas.
Una clase adicional de miméticos de polinucleótidos se denomina ácidos nucleicos de ciclohexenilo (CeNA). El anillo de furanosa que está presente normalmente en una molécula de ADN/ARN se reemplaza con un anillo de ciclohexenilo. Los monómeros de fosforamidita protegidos con DMT CeNA se prepararon y . usaron para la síntesis de compuestos oligoméricos siguiendo la química de fosforamidita clásica. Se han preparado y estudiado los compuestos oligoméricos de CeNA modificados y oligonucleótidos que tienen posiciones específicas modificadas con CeNA (véase Wang et ál., J. A .
Chem. Soc., 2000, 122, 8595-8602). En general, la incorpotación de monómeros de CeNA en una cadena de ADN aumenta su estabilidad de un híbrido de ADN/ARN. Los oligoadenilatos de CeNA formaron complejos con complementos de ARN y ADN con estabilidad similar a los complejos naturales. El estudio de la incorporación de estructuras de CeNA en estructuras de ácido nucleico natural se demostró mediante NMR y dicroismo circular para proceder con una adaptación conformacional sencilla.
Una modificación adicional incluye ácidos nucleicos bloqueados (LNA, por sus siglas en inglés) en los cuales el grupo 2'-hidroxilo está unido al átomo de carbono de la posición 4' del anillo de azúcar, lo cual forma un enlace 2'-C,4'-C-oximetileno, lo cual forma un resto de azúcar bicíclico. El enlace puede ser un grupo metileno (-CH2-) puenteando el átomo de oxígeno en la posición 2' y el átomo de carbono en la posición 4', donde n es 1 o 2 (Singh et ál., Chem. Commun., 1998, 4, 455-456). Los LNA y los análogos de LNA presentan estabilidades térmicas de dúplex altas con ADN y ARN complementarios (Tf=+3 a +10 °C), estabilidad hacia la degradación exonucleolótica en la posición 3' y propiedades de solubilidad adecuadas. Se han descrito oligonucleótidos antisentido potentes y no tóxicos que contienen LNA (Wahlestedt et ál., Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 2000, 97, 5633-5638).
Se ha descrito la síntesis y preparación de los monómeros de LNA adenina, citosina, guanina, 5-metil-citosina, timina y uracilo, junto con su oligomerización y propiedades de reconocimiento de ácidos nucleicos (Koshkin et ál., Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630). También se describieron los LNA y su preparación en los documentos WO 98/39352 y WO 99/14226.
Restos con azúcar modificado Un ácido nucleico de la invención también puede incluir uno o más restos de azúcar sustituidos. Los polinucleótidos adecuados comprenden un grupo sustituyente de azúcar que se selecciona de: OH; F; O-, S-, o N-alquilo; O-, S-, o N-alquenilo; 0-, S-, o N-alquinilo; o O-alquilo-O-alquilo, donde el alquilo, alquenilo y alquinilo pueden ser alquilo C.sub.l a Cío O alquenilo y alquinilo C2 a Cío sustituidos o no sustituidos. También 0((CH2)n0) mCH3, 0(CH2)n0CH3, 0(CH2)nNH2, 0(CH2)nCH3, 0(CH2)nONH2 y O(CH2)nON((CH2)nCH3)2 son particularmente adecuados, donde n y m son de 1 a alrededor de 10. Otros polinucleótidos adecuados comprenden un grupo sustituyente de azúcar que se selecciona de: alquilo Ci a Cío, alquilo inferior sustituido, alquenilo, alquinilo, alcarilo, aralquilo, O-alcarilo u O-aralquilo, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, heterocicloalquilo, heterocicloalcarilo, aminoalquilamino, polialquilamino, sililo sustituido, un grupo de escisión de ARN, un grupo indicador, un intercalador, un grupo para mejorar las propiedades farmacocinéticas de un oligonucleótido o un grupo para mejorar las propiedades farmacodinámicas de un oligonucleótido, y otros sustituyentes que tengan propiedades similares. Una modificación adecuada incluye 2'-metoxietoxi (2'-O-CH2 CH2OCH3, también conocido como 2'—O—(2-metoxietil) o 2'-MOE) (Martin et ál., Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504) es decir, un grupo alcoxialcoxi. Una modificación adecuada adicional incluye 2'-dimetilaminooxietoxi, es decir, un grupo 0 (CH2)2ON(CH3)2, también conocido como 2'-DMAOE, como se describe en los ejemplos de la presente más adelante, y 2'-dimetilaminoetoxietoxi (también conocido en la téenica como 2'-O-dimetil-amino-etoxi-etilo o 2'-DMAEOE), es decir, 2'-O-CH2-O-CH2-N(CH3)2.
Otros grupos sustituyentes de azúcar incluyen metoxi (-0-CH3), aminopropoxy (— 0 CH2 CH2 CH2NH2), alilo (-OH2-OH=OH2), -O-alilo (— O— CH2—CH=CH2) y fluoro (F). Los grupos sustituyentes de azúcar en la posición 2' pueden estar en la posición arabino (superior) o la posición ribo (inferior). Una modificación adecuada de arabino en la posición 2' es 2'-F. Pueden realizarse modificaciones similares en otras posiciones en el compuesto oligomérico, particularmente en la posición 3' del azúcar en el nucleósido del extremo 3' o en los oligonucleótidos unidos en la posición 2'-5' y en la posición 5' del nucleótido del extremo 5'. Los compuestos oligoméricos también pueden tener miméticos de azúcar tal como restos de ciclobutilo en lugar del azúcar pentofuranosilo.
Modificaciones y sustituciones de bases Un ácido nucleico de la invención también puede incluir modificaciones o sustituciones de nucleobases (a veces mencionadas en la técnica simplemente como "bases"). Tal como se usa ,en la presente, las nucleobases "no modificadas" o "naturales" incluyen las bases de purina adenina (A) y guanina (G) y las bases de pirimidina timina (T), citosina (C) y uracilo (U). Las nucleobases modificadas incluyen otras nucleobases sintéticas y naturales tales como 5-metilcitosina (5-me-C), 5-hidroximetil citosina, xantina, hipoxantina, 2-aminoadenina, 6-metilo y otros derivados de alquilo de adenina y guanina, 2-propilo y otros derivados de alquilo de adenina y guanina, 2-tiouracilo, 2-tiotimina y 2-tiocitosina, 5-halouracila y citosina, 5-propinilo (-C=C-CH3) uracilo y citosina y otros derivados de alquinilo de bases de pirimidina, 6-azo uracilo, citosina y timina, 5-uracilo (pseudouracilo), 4-tiouracilo, 8-halo, 8-amino, 8-tiol, 8-tioalquilo, 8-hidroxilo y otras adeninas y guaninas 8-sustituidas, 5-halo particularmente 5-bromo, 5-trifluorometilo y otros uracilos y citosinas 5-sustituidos, 7-metilguanina y 7-metiladenina, 2-F-adenina, 2-amino-adenina, 8-azaguanina y 8-azaadenina, 7-deazaguanina y 7-deazaadenina y 3-deazaguanina y 3-deazaadenina. Las nucleobases modificadas adicionales incluyen pirimidinas tricielicas, tal como fenoxazina citidina(1H-pirimido(5,4-b)(1,4)benzoxazin-2(3H)-ona), fenotiazina citidina (1H-pirimido(5,4-b)(1,4)benzotiazin-2(3H)-ona), abrazaderas en G tal como una fenoxazina citidina sustituida (por ejemplo, 9-(2-aminoetoxi)-H-pirimido(5,4-(b) (1,4)benzoxazin-2(3H)-ona), carbazol citidina (2H-pirimido(4,5-b)indol-2-ona), piridoindol citidina (H-pirido(3',2':4,5)pirrólo(2,3-d)pirimidin-2-ona).
Los restos de bases heterociclicas también pueden incluir aquellas en las cuales la base de purina o pirimidina es reemplazada con otros heterociclos, por ejemplo 7-deaza-adenina, 7-deazaguanosina, 2-aminopiridina y 2-piridona. Las nucleobases adicionales incluyen las descritas en la patente estadounidense n.° 3,687,808, las descritas en The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, páginas 858-859, Kroschwitz, J. I., ed. John Wilcy & Sons, 1990, las descritas por Englisch et ál., Angewandte Chemie, edición internacional, 1991, 30, 613, y las descritas por Sanghvi, Y. S., Capitulo 15, Antisense Research and Applications, páginas 289-302, Crooke, S. T. y Lebleu, B., ed., CRC Press, 1993. Determinadas de estas nucleobases son útiles para aumentar la afinidad de unión de un compuesto oligomérico. Estas incluyen pirimidinas 5-sustituidas, 6-azapirimidinas y purinas sustituidas con N-2, N-6 y 0-6, incluyendo 2-aminopropiladenina, 5-propiniluracilo y 5-propinilcitosina. Se ha demostrado que las sustituciones de 5-metilcitosina aumentan la estabilidad en dúplex del ácido nucleico por 0,6-1,2 °C (Sanghvi et ál., eds., Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Ratón, 1993, pp.276-278) y son sustituciones de bases adecuadas, por ejemplo, cuando se combinan con modificaciones de azúcar 2'-O-metoxietilo.
Conjugados Otra modificación posible de un ácido nucleico de la invención implica el enlace químico a un polinucleótido de uno o más restos o conjugados que mejoran la actividad, distribución celular o absorción celular del oligonucleótido. Estos restos o conjugados pueden incluir grupos conjugados - lio- unidos de manera covalente a grupos funcionales tal como grupos hidroxilo primarios o secundarios. Los grupos conjugados incluyen, de modo no taxativo, intercaladores, moléculas indicadoras, poliaminas, poliamidas, polietilenglicoles, poliéteres, grupos que mejoran las propiedades farmacodinámicas de oligómeros, y grupos que mejoran las propiedades farmacocinéticas de oligómeros. Los grupos de conjugados adecuados incluyen, de modo no taxativo, colesteroles, lipidos, fosfolipidos, biotina, fenazina, folato, fenantridina, antraquinona, acridina, fluoresceinas, rodaminas, cumarinas y tintes. Los grupos que mejoran las propiedades farmacodinámicas incluyen grupos que mejoran la absorción, mejoran la resistencia a la degradación y/o refuerzan la hibridación especifica de secuencia con el ácido nucleico objetivo. Los grupos que mejoran las propiedades farmacocinéticas incluyen grupos que mejoran la absorción, distribución, metabolismo o excreción de un ácido nucleico de la invención.
Los restos conjugados incluyen, de modo no taxativo, restos lipidos tales como un resto colesterol (Letsinger et ál., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 1989, 86, 6553-6556), ácido cólico (Manoharan et ál., B100rg. Med. Chem. Let., 1994, 4, 1053-1060), un tioéter, por ejemplo, hexil-S-tritiltiol (Manoharan et ál., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660, 306-309; Manoharan et ál., Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3, 2765-2770), un tiocolesterol (Oberhauser et ál., Nucí. Acids Res., 1992, 20, 533-538), una cadena alifática, por ejemplo, residuos de dodecandiol o undecilo (Saison-Behmoaras et ál., EMBO J., 1991, 10, 1111-1118; Kabanov et ál., FEBS Lett., 1990, 259, 327-330; Svinarchuk et ál., Biochimie, 1993, 75, 49-54), un fosfolipido, por ejemplo, 1,2-di-O-hexadecil-rac-glicero-3-H-fosfonato de di-hexadecil-rac-glicerol o trietilamonio (Manoharan et ál., Tetrahedron Lett., 19.95, 36, 3651-3654; Shea et ál., Nucí. Acids Res., 1990, 18, 3777-3783), una cadena de poliamina o polietilenglicol (Manoharan et ál., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14, 969-973), o ácido adamantano acético (Manoharan et ál., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654), un resto de palmitilo (Mishra et ál., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264, 229-237), o un resto de octadecilamina o hexilamino-carbonil-oxicolesterol (Grooke et ál., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277, 923-937.\ Un conjugado puede incluir un "dominio de transducción de proteínas" o PTD (por sus siglas en inglés) (también conocido como CPP, por sus siglas en inglés - péptido penetrante de células), que puede referirse a un polipéptido, polinucleótido, carbohidrato o compuesto orgánico o inorgánico que facilita atravesar una bicapa lipídica, micela, membrana celular, membrana de orgánulo o membrana de vesícula. Un PTD unido a otra molécula, que puede variar entre una molécula polar pequeña y una macromolécula grande y/o una nanopartícula, facilita que la molécula atraviese una membrana, por ejemplo, que vaya desde el espacio extracelular hacia el espacio intracelular, o citosol hacia el interior de un orgánulo. En algunas modalidades, una PTD está unida de manera covalente al extremo amino de un polipéptido exógeno (por ejemplo, un polipéptido modificador dirigido al sitio). En algunas modalidades, una PTD está unida de manera covalente al extremo carbonilo de un polipéptido exógeno (por ejemplo, un polipéptido modificador dirigido al sitio). En algunas modalidades, un PTD está unido de manera covalente a un ácido nucleico (por ejemplo, un ARN dirigido a ADN, un polinucleótido que codifica un ARN dirigido a ADN, un polinucleótido que codifica un polipéptido modificador dirigido al sitio, etc.)· Los ejemplos de PTD incluyen, de modo no taxativo, un dominio de transducción de proteínas de undecapéptido mínimo (que corresponde a los residuos 47-57 de HIV-1 TAT que comprende YGRKKRRQRRR; SEQ ID NO:264); una secuencia de poliarginína que comprende una cantidad de argininas suficiente para dirigir la entrada en una célula (por ejemplo 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o 10-50 argininas); un dominio de VP22 (Zender et ál. (2002) Cáncer Gene Ther. 9 (6):489^96); un dominio de transducción de proteína de Drosophila Antennapedia (Noguchi et ál. (2003) Diabetes 52 (7):1732-1737); un péptido de calcitonina humana truncada (Trehin et ál. (2004) Pharm. Research 21:1248-1256); polilisina (Wender et ál. (2000) Proc. Nati . Acad. Sci . USA 97:13003-13008); RRQRRTSKLMKR (SEQ ID NO:265); Transportan GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL (SEQ ID NO:266); KALAWEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKCEA (SEQ ID NO:267); y RQIKIWFQNRRMKWKK (SEQ ID NO:268). Los ejemplos de PTD incluyen, de modo no taxativo, YGRKKRRQRRR (SEQ ID NO:264), RKKRRQRRR (SEQ ID NO:269); un homopolímero de arginina de 3 residuos de arginina a 50 residuos de arginina; Las secuencias de aminoácidos del dominio PTD incluyen, de modo no taxativo, cualquiera de los siguientes: YGRKKRRQRRR (SEQ ID NO:264); RKKRRQRR (SEQ ID NO:270); YARAAARQARA (SEQ ID NO:271); THRLPRRRRRR (SEQ ID NO:272); y GGRRARRRRRR (SEQ ID NO:273). En algunas modalidades, el PTD es un CPP activable (ACPP, jj>or sus siglas en inglés) (Aguilera et ál. (2009) Integr Biol (Camb) June; 1(5-6): 371-381). Los ACPP comprenden CPP policatiónicos (por ejemplo, Arg9 o "R9") conectados por medio de un enlazador escindible a un polianión coincidente (por ejemplo, Glu9 o "E9"), que reduce la carga neta a casi cero y, por lo tanto, inhiba la adhesión y absorción en las células. Luego de la escisión del enlazador, el polianión se libera, desenmascara localmente la poliarginina y su adhesividad inherente y, por lo tanto, "activa" el ACPP para atravesar la membrana.
Ejemplos de ARN dirigidos a ADN En algunas modalidades, un ARN dirigido a ADN adecuado comprende dos moléculas de polinucleótidos de ARN separados. La primera de las dos moléculas de polinucleótidos de ARN (el ARN activador) comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos alrededor 60 %, al menos alrededor 65 %, al menos alrededor 70 %, al menos alrededor 75 %, al menos alrededor 80 %, al menos alrededor 85 %, al menos alrededor 90%, al menos alrededor 95 %, al menos alrededor 98 %, al menos alrededor 99 % o 100 % de identidad de secuencia de nucleótidos sobre una extensión de al menos 8 nucleótidos contiguos con respecto a cualquiera de las secuencias de nucleótidos establecidas en las SEQ ID NO:431-562, o complementos de estas. La segunda de las dos moléculas de polinucleótidos de ARN (el ARN identificador) comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos alrededor 60 %, al menos alrededor 65 %, al menos alrededor 70 %, al menos alrededor 75 %, al menos alrededor 80 %, al menos alrededor 85%, al menos alrededor 90 %, al menos alrededor 95 %, al menos alrededor 98 %, al menos alrededor 99 % o 100 % de identidad de secuencia de nucleótidos sobre una extensión de al menos 8 nucleótidos contiguos con respecto a cualquiera de las secuencias de nucleótidos establecidas en las SEQ ID NO:563-679, o complementos de estas.
En algunas modalidades, un ARN dirigido a ADN adecuado es un polinucleótido de ARN simple y comprende una primera secuencia de nucleótidos que tiene al menos alrededor 60 %, al menos alrededor 65 %, al menos alrededor 70 %, al menos alrededor 75 %, al menos alrededor 80 %, al menos alrededor 85 %, al menos alrededor 90 %, al menos alrededor 95 %, al menos alrededor 98 %, al menos alrededor 99 % o 100 % de identidad de secuencia de nucleótidos con respecto a una extensión de al menos 8 nucleótidos contiguos con respecto a cualquiera de las secuencias de nucleótidos establecidas en la SEQ ID NOs:431-562 y una segunda secuencia de nucleótidos que tiene al menos alrededor 60 %, al menos alrededor 65 %, al menos alrededor 70 %, al menos alrededor 75 %, al menos alrededor 80 %, al menos alrededor 85 %, al menos alrededor 90 %, al menos alrededor 95 %, al menos alrededor 98 %, al menos alrededor 99 % o 100 % de identidad de secuencia de nucleótidos sobre una extensión de al menos 8 nucleótidos contiguos respecto a cualquiera de las secuencias de nucleótidos establecidas en las SEQ ID NO: 463-679.
En algunas modalidades, el ARN dirigido a ADN es un ARN dirigido a ADN de molécula doble y el ARN identificador comprende la secuencia 5'GUUUUAGAGCUA-3' (SEQ ID NO:679) unida en su extremo 5' a una extensión de nucleótidos que son complementarios a un ADN objetivo. En algunas modalidades, el ARN dirigido a ADN es un ARN dirigido a ADN de molécula doble y el ARN activador comprende la secuencia 5' UAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCG-3' (SEQ ID NO://).
En algunas modalidades, el ARN dirigido a ADN es un ARN dirigido a ADN de molécula simple y comprende la secuencia 5'-GUUUUAGAGCUA-enlazador-UAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCG-3' unido en su extremo 5' a una extensión de nucleótidos que son complementarios a un ADN objetivo (donde "enlazador" indica cualquier secuencia de nucleótidos enlazadora que puede comprender cualquier secuencia de nucleótidos) (SEQ ID NO://). Otros ejemplos de ARN dirigido a ADN de molécula simple incluyen los establecidos en las SEQ ID NO: 680-682. Ácidos nucleicos que codifican un ARN dirigido a ADN de la invención y/o un polipéptido modificador dirigido al sitio de la invención La presente descripción proporciona un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un ARN dirigido a ADN de la invención y/o un polipéptido modificador dirigido al sitio. En algunas modalidades, un ácido nucleico que codifica un ARN dirigido a ADN de la invención es un vector de expresión, por ejemplo, un vector de expresión recombinante.
En algunas modalidades, un método de la invención implica poner en contacto un ADN objetivo o introducir en una célula (o una población de células) uno o más ácidos nucleicos que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican un ARN dirigido a ADN y/o un polipéptido modificador dirigido al sitio. En algunas modalidades una célula que comprende un ADN objetivo está in vitro. En algunas modalidades una célula que comprende un ADN objetivo está in vivo. Los ácidos nucleicos adecuados comprenden secuencias de nucleótidos que codifican un ARN dirigido a ADN y/o un polipéptido modificador dirigido al sitio incluyen vectores de expresión, donde un vector de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un ARN dirigido a ADN y/o un polipéptido modificador dirigido al sitio es un "vector de expresión recombinante".
En algunas modalidades, el vector de expresión recombinante es una construcción viral, por ejemplo, una construcción viral adeno-asociada recombinánte (véase, por ejemplo, la patente estadounidense n.° 7,078,387), una construcción adenoviral recombinante, una construcción lentiviral recombinante, una construcción retroviral recombinante, etc.
Los vectores de expresión adecuados incluyen, de modo no taxativo, vectores virales (por ejemplo, vectores virales basados en el virus vaccinia; poliovirus; adenovirus (véase, por ejemplo, Li et ál., Invest Opthalmol Vis Sci 35:2543 2549, 1994; Borras et ál., Gene Ther 6:515 524, 1999; Li y Davidson, PNAS 92:7700 7704, 1995; Sakamoto et ál., H Gene Ther 5:1088 1097, 1999; WO 94/12649, WO 93/03769; WO 93/19191; WO 94/28938; WO 95/11984 and WO 95/00655); virus adeno-asociado (véase, por ejemplo, Ali et ál., Hum Gene Ther 9:81 86, 1998, Flannery et ál., PNAS 94:6916 6921, 1997; Bennett et ál., Invest Opthalmol Vis Sci 38:28572863, 1997; Jomary et ál., Gene Ther 4:683690, 1997, Rolling et ál., Hum Gene Ther 10:641648, 1999; Ali et ál., Hum Mol Genet 5:591 594, 1996; Srivastava en WO 93/09239, Samulski et ál., J. Vir. (1989) 63:3822-3828; Mendelson et ál., Virol. (1988) 166:154-165; y Flotte et ál., PNAS (1993) 90:10613-10617); SV40; virus del herpes simple; virus de inmunodeficiencia humana (véase, por ejemplo, Miyoshi et ál., PNAS 94:1031923, 1997; Takahashi et ál., J Virol 73:7812 7816, 1999); un vector retroviral (por ejemplo, virus dé leucemia murina, virus de la necrosis del bazo y vectores derivados de retrovirus tal como el virus del sarcoma de Rous, virus del sarcoma de Harvey, virus de la leucosis aviar, un lentivirus, virus de inmunodeficiencia humana, virus del sarcoma mieloproliferativo y virus del tumor mamario); y similares.
Los expertos en la téenica conocen numerosos vectores de expresión adecuados y muchos están disponibles comercialmente. Se proporcionan los siguientes vectores a modo de ejemplo; para células hospedadoras eucariotas: pXTl, pSG5 (Stratagene), pSVK3, pBPV, pMSG, and pSVLSV40 (Pharmacia). Sin embargo, puede utilizarse cualquier otro vector siempre que sea compatible con la célula hospedadora.
Dependiendo del sistema de hospedador/vector utilizado, puede utilizarse cualquier cantidad de elementos de control de la .transcripción y traducción adecuados, inclusive promotores constitutivos e inducibles, elementos mejoradores de la transcripción, terminadores de la transcripción, etc., en el vector de expresión (véase, por ejemplo, Bitter et ál. (1987) Methods in Enzymology, 153:516-544).
En algunas modalidades, una secuencia de nucleótidos que codifica un ARN dirigido a ADN y/o un polipéptido modificador dirigido al sitio está unida de manera operativa a un elemento de control, por ejemplo, un elemento de control transcripcional, tal como un promotor. El elemento de control transcripcional puede ser funcional ya sea en una célula eucariota, por ejemplo, una célula de mamífero; o una célula procariota (por ejemplo, una célula bacteriana o de arquea). En algunas modalidades, una secuencia de nucleótidos que codifica un ARN dirigido a ADN y/o un polipéptido modificador dirigido al sitio está unido de manera operativa a múltiples elementos de control que permiten la expresión de la secuencia de nucleótidos que codifica un ARN dirigido a ADN y/o un polipéptido modificador dirigido al sitio tanto en células procariotas como eucariotas.
Los ejemplos no limitativos de promotores eucariotas adecuados (promotores funcionales en una célula eucariota) incluyen los que derivan del inmediato temprano de citomegalovirus (CMV), timidina cinasa del virus del herpes simple (VHS), SV40 temprano y tardío, repetición terminal larga (LTR) de retrovirus y metalotioneina-I de ratón. La selección del vector y promotor adecuado está dentro del nivel de un experto en la téenica. El vector de expresión también puede contener un sitio de unión al ribosoma para el inicio de la traducción y un terminador de la traducción. El vector de expresión también puede incluir secuencias adecuadas para amplificar la expresión. El vector de expresión también puede incluir secuencias de nucleótidos que codifican etiquetas proteicas (por ejemplo, etiqueta de 6xHis, etiqueta de hemaglutinina, proteina verde fluorescente, etc.) que están fusionadas al polipéptido modificador dirigido al sitio, lo cual da como resultado un polipéptido quimérico.
En algunas modalidades, una secuencia de nucleótidos que codifica un ARN dirigido a ADN y/o un polipéptido modificador dirigido al sitio está unida de manera operativa a un promotor inducible. En algunas modalidades, una secuencia de nucleótidos que codifica un ARN dirigido a ADN y/o un polipéptido modificador dirigido al sitio está unida de manera operativa a un promotor constitutivo.
Los métodos para introducir un ácido nucleico en una célula hospedadora son conocidos en la téenica, y puede utilizarse cualquier método conocido para introducir un ácido nucleico (por ejemplo, una construcción de expresión) en una célula. Los métodos adecuados incluyen, por ejemplo, infección viral o bacteriofágica, transíección, conjugación, fusión de protoplastos, lipofección, electroporación, precipitación de fosfato de calcio, transfección mediada por polietilenimina (PEI), transfección mediada por DEAE-dextrano, transfección mediada por liposomas, tecnología de cañón de partículas, precipitación de fosfato de calcio, microinyección directa, inserción de ácido nucleico mediada por nanopartículas (véase, por ejemplo, Panyam et ál., Adv Drug Deliv Rev.2012 Sep 13. pii: S0169-409X (12)00283-9. doi: 10.1016/j.addr.2012.09.023 ) y similares.
POLIPÉPTIDOS QUIMÉRICOS La presente descripción proporciona un polipéptido modificador quimérico dirigido al sitio. Un polipéptido modificador quimérico dirigido al sitio interactúa con (por ejemplo, se une a) un ARN dirigido a ADN de la invención (descrito anteriormente). El ARN dirigido a ADN guia al polipéptido modificador quimérico dirigido al sitio a una secuencia objetivo dentro del ADN objetivo (por ejemplo, una secuencia cromosómica o una secuencia extracromosómica, por ejemplo, una secuencia episomal, una secuencia de minicirculo, una secuencia mitocondrial, una secuencia de cloroplastos, etc.). Un polipéptido modificador quimérico dirigido al sitio de la invención modifica el ADN objetivo (por ejemplo, la escisión o metilación de ADN objetivo) y/o un polipéptido asociado con ADN objetivo (por ejemplo, metilación o acetilación de una cola de histona).
Un polipéptido modificador quimérico dirigido al sitio de la invención modifica el ADN objetivo (por ejemplo, la escisión o metilación de ADN objetivo) y/o un polipéptido asociado con ADN objetivo (por ejemplo, metilación o acetilación de una cola de histona). En la presente, también se hace referencia a un polipéptido modificador quimérico dirigido al sitio como "polipéptido quimérico dirigido al sitio" o un "polipéptido modificador quimérico dirigido al sitio de unión a ARN".
Un polipéptido modificador quimérico dirigido al sitio de la invención comprende dos partes: una parte de unión a ARN y una parte de actividad. Un polipéptido modificador quimérico dirigido al sitio de la invención comprende secuencias de aminoácidos que derivan de al menos dos’ polipéptidos diferentes. Un polipéptido quimérico modificador dirigido al sitio de la invención puede comprender secuencias de polipéptidos modificadas y/o de origen natural (por ejemplo, una primera secuencia de aminoácidos de una proteina Cas9/Csnl modificada o no modificada; y una segunda secuencia de aminoácidos diferente a la proteina Cas9/Csnl).
Parte de unión al ARN En algunos casos, la parte de unión al ARN de un polipéptido modificador quimérico dirigido al sitio de la invención es un polipéptido de origen natural. En otros casos, la parte de unión al ARN de un polipéptido modificador quimérico dirigido al sitio de la invención es una molécula de origen no natural (modificada, por ejemplo, mediante mutación, eliminación, inserción). Las partes de unión al ARN de origen natural de interés derivan de polipéptidos modificadores dirigidos al sitio son conocidas en la téenica. Por ejemplo, las SEQ ID NO:1-256 y 795-1346 proporcionan una lista no taxativa ni exhaustiva de endonucleasas Cas9/Csnl de origen natural que pueden usarse como polipéptidos modificadores dirigidos al sitio. En algunos casos, la parte de unión al ARN de un polipéptido modificador quimérico dirigido al sitio comprende una secuencia de aminoácidos con al menos alrededor de 75 %, al menos alrededor de 80 %, al menos alrededor de 85 %, al menos alrededor de 90 %, al menos alrededor de 95 %, al menos alrededor de 98 %, al menos alrededor de 99 % o al menos alrededqr de 100 % de identidad de secuencia de aminoácidos a la parte de unión al ARN de un polipéptido que tiene cualquiera de las secuencias de aminoácidos establecidas como SEQ ID NO: 1-256 y 795-1346.
En algunos casos, el polipéptido modificador dirigido al sitio comprende una secuencia de aminoácidos con al menos alrededor de 75 %, al menos alrededor de 80 %, al menos alrededor de 85 %, al menos alrededor de 90 %, al menos alrededor de 95 %, al menos alrededor de 99 %, o 100 % de identidad de secuencia de aminoácidos con los aminoácidos 7-166 o 731-1003 de la secuencia de aminoácidos Cas9/Csnl ilustrada en la Figura 3 o a las partes correspondientes en cualquiera de las secuencias de aminoácidos establecidas como SEQ ID NO: 1-256 y 795-1346.
Parte de actividad Además de la parte de unión al ARN, el polipéptido modificador quimérico dirigido al sitio comprende una "parte de actividad". En algunas modalidades, la parte de actividad de un polipéptido modificador quimérico dirigido al sitio de la invención comprende la parte de actividad de origen natural de un polipéptido modificador dirigido al sitio (por ejemplo, endonucleasa Cas9/Csnl). En otras modalidades, la parte de actividad de un polipéptido modificador quimérico dirigido al sitio comprende una secuencia de aminoácidos modificada (por ejemplo, sustitución, eliminación, inserción) de una parte de actividad de origen natural de un polipéptido modificador dirigido al sitio. Las partes de actividad de origen natural de interés derivan de polipéptidos modificadores dirigidos al sitio son conocidas en la téenica. Por ejemplo, las SEQ ID NO:1-256 y 795-1346 proporcionan una lista no taxativa ni exhaustiva de endonucleasas Cas9/Csnl de origen natural que pueden usarse como polipéptidos modificadores dirigidos al sitio. La parte de actividad de un polipéptido modificador quimérico dirigido al sitio de la invención es variable y puede comprender cualquier secuencia de polipéptido heterólogo que pueda ser útil en los métodos descritos en la presente.
En algunas modalidades, un polipéptido modificador quimérico dirigido al sitio de la invención comprende: (i) una parte de unión a ARN que interactúa con un ARN dirigido a ADN, donde el ARN dirigido a ADN comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia en un ADN objetivo; y (ii) una parte de actividad que presenta actividad enzimática dirigida al sitio (por ejemplo, actividad para metilación de ADN, actividad para la escisión de ADN, actividad para la acetilación de histona, actividad para la metilación de histona, etc.), donde el sitio de actividad enzimática está determinado por el ARN dirigido a ADN.
En otras modalidades, un polipéptido modificador quimérico dirigido al sitio de la invención comprende: (i) una parte de unión a ARN que interactúa con un ARN dirigido a ADN, donde el ARN dirigido a ADN comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia en un ADN objetivo; y (ii) una parte de actividad que modula la transcripción dentro del ADN objetivo (por ejemplo, para aumentar o disminuir la transcripción), donde el sitio de transcripción modulada,dentro el ADN objetivo está determinado por el ARN dirigido a ADN.
En algunos casos, la parte de actividad de un polipéptido modificador quimérico dirigido al sitio de la invención tiene actividad enzimática que modifica al ADN objetico (por ejemplo, actividad nucleasa, actividad metiltransferasa, actividad desmetilasa, actividad de reparación del ADN, actividad de daño al ADN, actividad de desaminación, actividad de dismutasa, actividad de alquilación, actividad de depurinación, actividad de oxidación, actividad de formación de dímeros de pirimidina, actividad de integrasa, actividad de transposasa, actividad recombinasa, actividad polimerasa, actividad ligasa, actividad helicasa, actividad fotoliasa o actividad glicosilasa).
En otros casos, la parte de actividad del polipéptido modificador quimérico dirigido al sitio tiene una actividad enzimática (por ejemplo, actividad de metiltransferasa, actividad de desmetilasa, actividad de acetiltransferasa, actividad de deacetilasa, actividad de cinasa, actividad de fosfatasa, actividad de ubiquitina de ligasa, actividad de desubiquitinante, actividad de adenilación, actividad de desadenilación, actividad de SUMOilación, actividad de deSUMOilación, actividad de ribosilación, actividad de desribosilación, actividad de miristoilación o actividad de demiristoilación) que modifica un polipéptido asociado con ADN objetivo (por ejemplo, una histona).
En algunos casos, la parte actividad de un polipéptido modificador quimérico dirigido al sitio de la invección presenta actividad enzimática (descrita anteriormente). En otros casos, la parte actividad de un polipéptido modificador quimérico dirigido al sitio de la invención modula la transcripción del ADN objetivo (descrita anteriormente). La parte de actividad de un polipéptido modificador quimérico dirigido al sitio de la invención es variable y puede comprender cualquier secuencia de polipéptido heterólogo que pueda ser útil en los métodos descritos en la presente.
Ejemplos de polipéptidos modificadores quiméricos dirigidos al sitio En algunas modalidades, la parte de actividad del polipéptido modificador quimérico dirigido al sitio comprende una forma modificada de la proteina Cas9/Csnl. En algunas instancias, la forma modificada de la proteina Cas9/Csnl comprende un cambio de aminoácidos (por ejemplo, eliminación, inserción o sustitución) que reduce la actividad de nucleasa de origen natural de la proteina Cas9/Csnl. Por ejemplo, en algunas instancias, la forma modificada de la proteina Cas9/Csnl tiene menos de 50 %, menos de 40 %, menos de 30 %, menos de 20 %, menos de 10 %, menos de 5 % o menos de 1 % de la actividad de nucleasa del polipéptido Cas9/Csnl de tipo salvaje correspondiente. En algunos casos, la forma modificada del polipéptido Cas9/Csnl prácticamente no tiene actividad de nucleasa.
En algunas modalidades, la forma modificada del polipéptido Cas9/Csrjil es una mutación D10A (aspartato a alanina en el aminoácido de la posición 10 de la SEQ ID NO:8) (o la mutación correspondiente de cualquiera de las proteínas presentadas en las SEQ ID NO:1-256 y 795-1346) que pueden escindir la cadena complementaria del ADN objetivo pero que tienen capacidad reducida de escindir la cadena no complementaria del ADN objetivo (véase la Figura 11). En algunas modalidades, la forma modificada del polipéptido Cas9/Csnl es una mutación H840A (histidina a alanina en el aminoácido de la posición 840) (o la mutación correspondiente de cualquiera de las proteínas establecidas como SEQ ID N0:1-256 y 795-1346) que pueden escindir la cadena no complementaria del ADN objetivo pero que tienen capacidad reducida de escindir la cadena complementaria del ADN objetivo (véase la Figura 11). En algunas modalidades, la forma modificada del polipéptido Cas9/Csnl posee tanto mutaciones D10A como H840A (o las mutaciones correspondientes de cualquiera de las proteínas establecidas como SEQ ID NO:l-256 y 795-1346) de manera que el polipéptido tiene una capacidad reducida de escindir tanto la cadena complementaria como la no complementaria del ADN objetivo. Pueden mutarse otros residuos para lograr los efectos antemencionados (es decir, inactivar una u otra parte de la nucleasa). Como ejemplos no taxativos, los residuos DIO, G12, G17, E762, H840, N854, N863, H982, H983, A984, D986 y/o A987 (o las mutaciones correspondientes de cualquiera de las proteínas establecidas como SEQ ID NO:1-256 y 795-1346) pueden alterarse (es decir, sustituirse) (véanse la Figura 3, Figura 5, Figura 11A y la Tabla 1 por más información respecto a la conservación de los residuos de aminoácidos de Cas9). También son adecuadas mutaciones que no sean las sustituciones de alanina. Por más información sobre importantes Tabla 1. La Tabla 1 enumera 4 motivos que están presentes en las secuencias de Cas9 de varias especies (véase también la Figura 3 y la Figura 5). Los aminoácidos enumerados en la presente son de Cas9 de S. pyogenes (SEQ ID NO:8).
En algunos casos, el polipéptido modificador quimérico dirigido al sitio comprende una secuencia de aminoácidos con al menos alrededor de 75 %, al menos alrededor de 80 %, al menos alrededor de 85 %, al menos alrededor de 90 %, al menos alrededor de 95 %, al menos alrededor de 99 %, o 100 % de identidad de secuencia de aminoácidos con los aminoácidos 7-166 o 731-1003 de la secuencia de aminoácidos Cas9/Csnl ilustrada en la Figura 3 o a las partes correspondientes en cualquiera de las secuencias de aminoácidos establecidas como SEQ ID NO: 1-256 y 795-1346. En algunos casos, el polipéptido modificador quimérico dirigido al sitio comprende 4 motivos (según se enumera en la Tabla 4 y se representa en la Figura 3A y la Figura 5), cada uno con secuencias de aminoácidos que tienen al menos alrededor de 75 %, al menos alrededor de 80 %, al menos alrededor de 85 %, al menos alrededor de 90 %, al menos alrededor de 95 %, al menos alrededor de 99 % o 100 % de identidad de secuencia de aminoácidos a cada uno de los cuatro motivos enumerados en la Tabla 1 (SEQ ID NO:260-263), o a las partes correspondientes en cualquiera de las secuencias de aminoácidos establecidas como SEQ ID NOs:1-256 y 795-1346. En algunos casos, el polipéptido modificador quimérico dirigido al sitio comprende secuencias de aminoácidos con al menos alrededor de 75 %, al menos alrededor de 80 %, al menos alrededor de 85 %, al menos alrededor de 90 %, al menos alrededor de 95 %, al menos alrededor de 99 %, o 100 % de identidad de secuencia de aminoácidos con los aminoácidos 7-166 o 731-1003 de la secuencia de aminoácidos Cas9/Csnl ilustrada en la Figura 3 o a las partes correspondientes en cualquiera de las secuencias de aminoácidos establecidas como SEQ ID NO: 1-256 y 795-1346.
En algunas modalidades, la parte de actividad del polipéptido modificador dirigido al sitio comprende un polipéptido heterólogo que tiene actividad modificadora de ADN y/o actividad de factor de transcripción y/o actividad modificadora de polipéptido asociado con ADN. En algunos casos, un polipéptido heterólogo reemplaza una parte del polipéptido Cas9/Csnl que proporciona actividad de nucleasa. En otras modalidades, un polipéptido modificador dirigido al sitio de la invención comprende ambas partes del polipéptido Cas9/Csnl que proporciona normalmente actividad de nucleasa (y la porción puede ser totalmente activa o puede, en su lugar, estar modificada para tener menos del 100 % de la actividad de tipo salvaje correspondiente) y un polipéptido heterólogo. En otras palabras, en algunos casos, un polipéptido modificador quimérico dirigido al sitio de la invención es un polipéptido de fusión que comprende tanto la parte del polipéptido Cas9/Csnl que normalmente proporciona actividad de nucleasa y el polipéptido heterólogo. En otros casos, un polipéptido modificador quimérico dirigido al sitio es un polipéptido de fusión que comprende una variante modificada de la parte de actividad del polipéptido Cas9/Csnl (por ejemplo, cambio, eliminación, inserción de aminoácido) y un polipéptido heterólogo. En todavía otro casos,· un polipéptido modificador quimérico dirigido al sitio de la invención es un polipéptido de fusión que comprende un polipéptido heterólogo y la parte de unión al ARN de un polipéptido modificador dirigido al sitio de origen natural o modificado.
Por ejemplo, en una proteína Cas9/Csnl quimérica, un polipéptido Cas9/Csnl bacteriano de origen natural (o modificado, por ejemplo, mutación, eliminación, inserción) puede fusionarse a una secuencia heteróloga de polipéptidos (es decir, una secuencia de polipéptidos de una proteina diferente a Cas9/Csnl o una secuencia de polipéptidos de otro organismo). La secuencia heteróloga de polipéptidos puede presentar una actividad (por ejemplo, actividad enzimática) que también presentará la proteina quimérica Cas9/Csnl (por ejemplo, actividad de metiltransferasa, actividad de acetiltransferasa, actividad de cinasa, actividad de ubiquitinación, etc.)· Una secuencia de ácido nucleico heteróloga puede estar unida a otra secuencia de ácido nucleico (por ejemplo, mediante ingeniería genética) para generar una secuencia de nucleótidos quimérica que codifica un polipéptido quimérico. En algunas modalidades, un polipéptido quimérico Cas9/Csnl se genera mediante la fusión de un polipéptido Cas9/Csnl (por ejemplo, Cas9 de tipo salvaje o una variante de Cas9, por ejemplo, un Cas9 con actividad de nucleasa reducida o inactivada) con una secuencia heteróloga que proporciona localización subcelular (por ejemplo, una señal de localización nuclear (NLS, por sus siglas en inglés) para dirigirse al núcleo; una señal de localización mitocondrial para dirigirse a la mitocondria; una señal de localización de cloroplastos para dirigirse a un cloroplasto; una señal de retención de ER; y similares). En algunas modalidades, la secuencia heteróloga puede proporcionar una etiqueta para facilitar el rastreo y la purificación (por ejemplo, una proteína fluorescente, por ejemplo, proteína fluorescente verde (GFP, por sus siglas en inglés), YFP, RFP, CFP, mCherry, tdTomato y similares; una etiqueta HIS, por ejemplo, una etiqueta 6XHis; una etiqueta de hemaglutinina (HA); una etiqueta FLAG; una etiqueta Myc; y similares). En algunas modalidades, la secuencia heteróloga puede proporcionar un aumento o descenso de la estabilidad. En algunas modalidades, la secuencia heteróloga puede proporcionar un dominio de unión (por ejemplo, proporcionarle la capacidad de un polipéptido Cas9 quimérico de unirse a otra proteina de interés, por ejemplo, una proteina modificadora de·ADN o histona, una factor de transcripción o represor de transcripción, una proteina reclutadora, etc.).
Los ejemplos de varios compañeros de fusión adecuados adicionales (o fragmentos de estos) para una variante del polipéptido dirigido al sitio Cas9 de la invención incluyen, de modo no taxativo, los enumerados en la Figura 54. Ácido nucleico que codifica un polipéptido modificador quimérico dirigido al sitio La presente descripción proporciona un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido modificador quimérico dirigido al sitio de la invención. En algunas modalidades, el ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido modificador quimérico dirigido al sitio de la invención es un vector de expresión, por ejemplo, un vector de expresión recombinante.
En algunas modalidades, un método de la invención implica poner en contacto un ADN objetivo o introducir en una célula (o una población de células) uno o más ácidos nucleicos que comprenden un polipéptido modificador quimérico dirigido al sitio. Los ácidos nucleicos adecuados comprenden secuencias de nucleótidos que codifican un polipéptido quimérico modificador dirigido al sitio incluyen vectores de expresión, donde un vector de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido quimérico modificador dirigido al sitio es un "vector de expresión recombinante".
En algunas modalidades, el vector de expresión recombinante es una construcción viral, por ejemplo, una construcción viral adeno-asociada recombinante (véase, por ejemplo, la patente estadounidense n.° 7,078,387), una construcción adenoviral recombinante, una construcción lentiviral recombinante, etc.
Los vectores de expresión adecuados incluyen, de modo no taxativo, vectores virales (por ejemplo, vectores virales basados en el virus vaccinia; poliovirus; adenovirus (véase, por ejemplo, Li et ál., Invest Opthalmol Vis Sci 35:2543 2549, 1994; Borras et ál., Gene Ther 6:515 524, 1999; Li y Davidson, PNAS 92:7700 7704, 1995; Sakamoto et ál., H Gene Ther 5:1088 1097, 1999; WO 94/12649, WO 93/03769; WO 93/19191; WO 94/28938; WO 95/11984 and WO 95/00655); virus adeno-asociado (véase, por ejemplo, Ali et ál., Hum Gene Ther 9:81 86, 1998, Flannery et ál., PNAS 94:6916 6921, 1997; Bennett et ál., Invest Opthalmol Vis Sci 38:28572863, 1997; Jomary et ál., Gene Ther 4:683690, 1997, Rolling et ál., Hum Gene Ther 10:641 648, 1999; Ali et ál., Hum Mol Genet 5:591 594, 1996; Srivastava en WO 93/09239, Samulski et ál., J.
Vir. (1989) 63:3822-3828; Mendelson et ál., Virol. (1988) 166:154-165; y Flotte et ál., PNAS (1993) 90:10613-10617); SV40; virus del herpes simple; virus de inmunodeficiencia humana (¡véase, por ejemplo, Miyoshi et ál., PNAS 94:1031923, 1997; Tákahashi et ál., J Virol 73:7812 7816, 1999); un vector retroviral (por ejemplo, virus de leucemia murina, virus de la necrosis del bazo y vectores derivados de retrovirus tal como el virus del sarcoma de Rous, virus del sarcoma de Harvey, virus de la leucosis aviar, un lentivirus, virus de inmunodeficiencia humana, virus del sarcoma mieloproliferativo y virus del tumor mamario); y similares.
Los expertos en la téenica conocen numerosos vectores de expresión adecuados y muchos están disponibles comercialmente. Se proporcionan los siguientes vectores a modo de ejemplo; para células hospedadoras eucariotas: pXTl, pSG5 (Stratagene), pSVK3, pBPV, pMSG, and pSVLSV40 (Pharmacia). Sin embargo, puede utilizarse cualquier otro vector siempre que sea compatible con la célula hospedadora.
Dependiendo del sistema de hospedador/vector utilizado, puede utilizarse cualquier cantidad de elementos de control de la transcripción y traducción adecuados, inclusive promotores constitutivos e inducibles, elementos mejoradores de la transcripción, terminadores de la transcripción, etc., en el vector de expresión (véase, por ejemplo, Bitter et ál. (1987) Methods in Enzymology, 153:516-544).
En algunas modalidades, una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido modificador quimérico dirigido al sitio está unida de manera operativa a un elemento de control, por ejemplo, un elemento de control transcripcional, tal como un promotor. El elemento de control transcripcional puede ¿er funcional ya sea en una célula eucariota, por ejemplo, una célula de mamífero; o una célula procariota (por ejemplo, una célula bacteriana o de arquea). En algunas modalidades, una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido modificador quimérico dirigido al sitio está unida de manera operativa a múltiples elementos de control que permiten la expresión de la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido modificador quimérico dirigido al sitio tanto en células procariotas como eucariotas.
Los ejemplos no limitativos de promotores eucariotas adecuados (promotores funcionales en una célula eucariota) incluyen los que derivan del inmediato temprano de citomegalovirus (CMV), timidina cinasa del virus del herpes simple (VHS), SV40 temprano y tardío, repetición terminal larga (LTR) de retrovirus y metalotioneina-I de ratón. La selección del vector y promotor adecuado está dentro del nivel de un experto en la téenica. El vector de expresión también puede contener un sitio de unión al ribosoma para el inicio de la traducción y un terminador de la traducción. El vector de expresión también puede incluir secuencias adecuadas para amplificar la expresión. El vector de expresión también incluye una secuencias de nucleótidos que codifica etiquetas proteicas (por ejemplo, etiqueta 6xHis, etiqueta de hemaglutinina (HA), una proteína fluorescente (por ejemplo, una proteína fluorescente verde; una proteína fluorescente amarilla, etc.) que están fusionadas al polipéptido modificador quimérico dirigido al sitio.
En algunas modalidades, una secuencia de nucleótidos que I -135- I codifica un polipéptido modificador quimérico dirigido al sitio está unido de manera operativa a un promotor inducible (por ejemplo, promotor de shock térmico, promotor regulado por tetracielina, promotor regulado por esteroides, promotor regulado por metales, promotor regulado por estrógenos, etc.). En algunas modalidades, una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido modificador quimérico dirigido al sitio está unida de manera operativa a un promotor restringido espacialmente y/o temporalmente (por ejemplo, un promotor específico de tejido, un promotor específico de un. tipo de célula, etc.). En algunas modalidades, una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido modificador quimérico dirigido al sitio está unida operativamente a un promotor constitutivo.
Los métodos para introducir un ácido nucleico en una célula hospedadora son conocidos en la téenica, y puede utilizarse cualquier método para introducir un ácido nucleico (por ejemplo, una construcción de expresión) en una célula madre o célula progenitora. Los métodos adecuados incluyen, por ejemplo, infección viral o bacteriofágica, transfección, conjugación, fusión de protoplastos, lipofección, electroporación, precipitación de fosfato de calcio, transfección mediada por polietilenimina (PEI), transfección mediada por DEAE-dextrano, transfección mediada por liposomas, tecnología de cañón de partículas, precipitación de fosfato de calcio, microinyección directa, inserción de ácido nucleico mediada por nanopartículas (véase, por ejemplo, Panyam et ál., Adv Drug Deliv Rev.2012 Sep 13. pii: S0169-409X(12)00283-9. doi: 10.1016/j.addr.2012.09.023 ) y similarps.
METODOS La presente descripción proporciona métodos para modificar un ADN objetivo y/o un polipéptido asociado a ADN objetivo. En general, un método de la invención implica poner en contacto un ADN objetivo con un complejo (un "complejo de direccionamiento"), donde el complejo comprende un ARN dirigido a ADN y un polipéptido modificador dirigido al sitio.
Como se discutió anteriormente, un ARN dirigido a ADN de la invención y un polipéptido modificador dirigido al sitio de la invención forman un complejo. El ARN dirigido a ADN proporciona especificidad de direccionamiento al complejo, ya que comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de un ADN objetivo. El polipéptido modificador dirigido al sitio del complejo proporciona la actividad especifica del sitio. En algunas modalidades, un complejo de la invención modifica un ADN objetivo, que lleva a, por ejemplo, la escisión de ADN, metilación de ADN, daño en el ADN, reparación del ADN, etc. En otras modalidades, un complejo de la invención modifica un polipéptido objetivo asociado con ADN objetivo (por ejemplo, una histona, una proteina de unión a ADN, etc.) que lleva a, por ejemplo, metilación de histona, acetilación de histona, ubiquitinación de histona, y similares. El ADN objetivo puede, por ejemplo, ser ADN no conjugado in vitro, ADN cromosómico en célula in vitro, ADN cromosómico en células in vivo, etc.
En algunos casos, el polipéptido modificador dirigido al sitio presenta actividad de nucleasa que escinde ADN objetivo en una secuencia de ADN objetivo definida por la región de complementariedad entre el ARN dirigido a ADN y el ADN objetivo. En algunos casos, cuando el polipéptido modificador dirigido al sitio es un polipéptido Cas9 o relacionado con Cas9, la escisión especifica del sitio del ADN objetivo ocurre en ubicaciones determinadas mediante ambas de (i) complementariedad de pares de bases entre el ARN dirigido a ADN y el ADN objetivo; y (ii) un motivo corto [mencionado como el motivo adyacente protoespaciador (PAM)] en el ADN objetivo. En algunas modalidades (por ejemplo, cuando se usa Cas9 deiS. pyogenes, o un Cas9 relacionado estrechamente (véanse Ías SEQ ID NO:l-256 y 795-1346)), la secuencia PAM de la cadena no complementaria es 5'-XGG-3', donde X es cualquier nucleótido de ADN y X está en la posición siguiente a 3' de la secuencia objetivo de la cadena no complementaria del ADN objetivo (véase la Figura 10). Como tal, la secuencia PAM de la cadena complementaria es 5'-CCY-3', donde Y es cualquier nucleótido de ADN e Y está en la posición siguiente a 5' de la secuencia objetivo de la cadena complementaria del ADN objetivo (véase la Figura 10 donde PAM de la secuencia no complementaria es 5'-GGG-3' y PAM de la cadena complementaria es 5'-CCC-3')· En algunas de dichas modalidades, X e Y pueden ser complementarios y el par de bases X-Y puede ser cualquier par de bases (por ejemplo, X=C y Y=G; X=G y Y=C; X=A y Y=T, X=T y Y=Aj.
En algunos casos, diferentes proteínas Cas9 (es decir, proteínas Cas9 de varias especies) pueden ser ventajosas para usarlas en los métodos proporcionados variados para capitalizar varias características enzimáticas de las proteínas Cas9 diferentes (por ejemplo, para diferentes preferencias de secuencia RDM; para aumentar o disminuir la actividad enzimática; para aumentar o disminuir el nivel de toxicidad celular; para cambiar en balance entre NHEJ, reparación dirigida por homología, roturas de cadena simple, roturas de cadena doble, etc.)· Las proteínas Cas9 de varias especies (véanse las SEQ ID NO:1-256 y 795-1346) pueden requerir secuencias PAM diferentes en el ADN objetivo. Por lo tanto, para una proteína Cas9 en particular de elección, el requisito de secuencia PAM puede ser diferente que la secuencia 5'-XGG-3' descrita anteriormente.
Se han identificado en la presente muchos ortólogos de Cas9 de una variedad amplia de especies y las proteínas comparten únicamente unos pocos aminoácidos idénticos. Todos los ortólogos de Cas9 identificados tienen la misma arquitectura de dominio con un dominio de endonucleasa HNH central y un dominio RuvC/RNasaH de partición (véanse las Figuras 3A, 3B, la Figura 5 y la Tabla 1). Las proteínas Cas9 comparten 4 motivos clave con una arquitectura conservada. Los motivos 1, 2 y 4 son motivos similares a RuvC, mientras que el motivo 3 es un motivo de HNH. En algunos casos, un polipéptido modificador dirigido al sitio adecuado comprende una secuencia de aminoácidos que tiene 4 motivos, cada uno de los motivos 1-4 tiene al menos alrededor de 75 %, al menos alrededor de 80 %, al menos alrededor de 85 %, al menos alrededor de 90 %, al menos alrededor de 95 %, al menos alrededor de 99 %, o 100 % de identidad de secuencia de aminoácidos con los motivos 1-4 de la secuencia de aminoácidos Cas9/Csnl ilustrada en la Figura 3A (SEQ ID NOs:260-263, respectivamente, como se muestra en la Tabla 1), o con las partes correspondientes en cualquiera de las secuencias de aminoácidos establecidas en la SEQ ID NO: 1-256 y 795-1346 (véase la Figura 5 para una alineamiento de motivos 1-4 de secuencias Cas9 divergentes). En algunos casos, un polipéptido modificador dirigido al sitio adecuado comprende una secuencia de aminoácidos con al menos alrededor de 75 %, al menos alrededor de 80 %, al menos alrededor de 85 %, al menos alrededor de 90 %, al menos alrededor de 95 %, al menos alrededor de 99 %, o 100 % de identidad de secuencia de aminoácidos con los aminoácidos 7-166 o 731-1003 de la secuencia de aminoácidos Cas9/Csnl ilustrada en la Figura 3 o a las partes correspondientes en cualquiera de las secuencias de aminoácidos establecidas como SEQ ID NO: 1-256 y 795-1346. Cualquier proteína·Cas9, como se describió anteriormente, puede usarse como polipéptido modificador dirigido al sitio-o como parte de un polipéptido modificador quimérico dirigido al sitio de los métodos de la invención.
La actividad nucleasa escinde ADN objetivo para producir roturas de cadena doble. Estas roturas luego son reparadas por la célula en una de dos maneras: recombinación no homologa y reparación dirigida por homología (Figura 2). En la recombinación no homologa (NHEJ), las roturas de cadena doble son reparadas por ligación directa de los extremos rotos entre sí. Como tal, no se inserta ningún material de ácido nucleico en el sitio, aunque puede perderse algún material de ácido nucleico, lo que resulta en una eliminación. En la reparación dirigida por homología, se utiliza como plantilla un polinucleótido donante con homología a la secuencia escindida de ADN objetivo para la reparación de la secuencia escindida de ADN objetivo, lo cual da como resultado la transferencia de información genética del polinucleótido donante al ADN objetivo. Como tal, el nuevo material de ácido nucleico puede insertarse/copiarse en el sitio. En algunos casos, un ADN objetivo se pone en contacto con un polinucleótido donante de la invención. En algunos casos, un polinucleótido donante de la invención se introduce en una célula de la invención. Las modificaciones del ADN objetivo debidas a NHEJ y/o reparación dirigida por homología llevan a, por ejemplo, la corrección genética, reemplazo genético, marcado genético, inserción de transgenes, eliminación de nucleótidos, alteración genética, mutación genética, etc.
Por consiguiente, puede utilizarse la escisión de ADN mediante un polipéptido modificador dirigido al sitio para eliminar material de ácido nucleico de una secuencia de ADN objetivo (por ejemplo, para alterar un gen que hace que las células sean susceptibles a infección (por ejemplo, el gen CCR5 o CXCR4, que ocasiona que los linfocitos T sean susceptibles a la infección por V1H), para crear mutaciones e inactivaciones genéticas como modelos de enfermedades en la investigación, etc.) al escindir la secuencia de ADN objetivo y permitirle a la célula la reparación de la secuencia ante la ausencia de un polinucleótido donante proporcionado de forma exógena. Por lo tanto, los métodos de la invención pueden utilizarse para inactivar un gen (lo cual da como resultado una total falta de transcripción o transcripción alterada) o activar material genético en un locus elegido en el ADN objetivo.
De manera alternativa, si un ARN dirigido a ADN y un polipéptido modificador dirigido al sitio son coadministrados a células con una secuencia de polinucleótido donante que incluye al menos un segmento con homología a la secuencia de ADN objetiva, los métodos de la invención pueden utilizarse para agregar, es decir, insertar o reemplazar, material de ácido nucleico a una secuencia de ADN objetiva (por ejemplo, para "activar" un ácido nucleico que codifica para una proteína, un ARNip, un miARN, etc.), para agregar una etiqueta, (por ejemplo, 6xHis, una proteína fluorescente (por ejemplo, una proteína verde fluorescente; una proteína amarilla fluorescente, etc.), hemaglutinina (HA), FLAG, etc.), para agregar una secuencia reguladora a un gen (por ejemplo, promotor, señal de poliadenilación, secuencia de entrada al ribosoma interno (IRES, por sus siglas en inglés), péptido 2A, codón de inicio, codón de parada, señal de corte y empalme, señal de localización, etc.), para modificar una secuencia de ácido nucleico (por ejemplo, introducir una mutación) y similares. Como tal, un complejo que comprende un ARN dirigido a ADN y un polipéptido modificador dirigido al sitio es útil en cualquier aplicación in vitro o in vivo en la que es deseable modificar ADN en una forma específica del sitio, es decir, "dirigida", por ejemplo desactivación génica, activación génica, edición génica, marcado génico, etc., s^gún se utiliza en, por ejemplo, terapia génica, por ejemplo, para tratar una enfermedad o como una terapia antiviral, antipatogénica o anticáncer, la producción de organismos modificados genéticamente en la agricultura, la producción a gran escala de proteínas mediante células con propósitos terapéuticos, diagnósticos o de investigación, la inducción de células iPS, investigación biológica, el direccionamiento de genes de patógenos para la eliminación o reemplazo, etc.
En algunas modalidades, el polipéptido modificador dirigido al sitio comprende una forma modificada de la proteína Cas9/Csftl. En algunas instancias, la forma modificada de la proteína Cas9/Csnl comprende un cambio de aminoácidos (por ejemplo, eliminación, inserción o sustitución) que reduce la actividad de nucleasa de origen natural de la proteína Cas9/Csnl. Por ejemplo, en algunas instancias, la forma modificada de la proteína Cas9/Csnl tiene menos de 50 %, menos de 40 %, menos de 30 %, menos de 20 %, menos de 10 %, menos de 5 % o menos de 1 % de la actividad de nucleasa del polipéptido Cas9/Csnl de tipo salvaje correspondiente. En algunos casos, la forma modificada del polipéptido Cas9/Csnl prácticamente no tiene actividad de nucleasa. Cuando un polipéptido modificador dirigido al sitio de la invención es una forma modificada del polipéptido Cas9/Csnl que no tiene actividad de nucleasa sustancial, puede referirse a él como "dCas9".
En algunas modalidades, la forma modificada del polipéptido Cas9/Csnl es una mutación D10A (aspartato a alanina en la posición del aminoácido 10 de la SEQ ID NO: 8) (o la mutación correspondiente de cualqui'era de las proteínas establecidas como SEQ ID NO: 1-256 y 795-1346) que puede escindir la cadena complementaria del ADN objetivo pero tiene una capacidad reducida de escindir la cadena no complementaria del ADN objetivo (dando como resultado una sola rotura de cadena (SSB, por sus siglas en inglés) en vez de una DSB; ver Figura 11). En algunas modalidades, la forma modificada del polipéptido Cas9/Csnl es una mutación H840A (histidina a alanina en la posición del aminoácido 840 de la SEQ ID NO: 8) (o la mutación correspondiente de cualquiera de las proteínas establecidas como SEQ ID NO: 1-256 y 795-1346) que puede escindir la cadena no complementaria del ADN objetivo pero tiene una capacidad reducida de escindir la cadena complementaria del ADN objetivo (dando como resultado una sola rotura de cadena (SSB) en vez de una DSB; ver Figura 11). El uso de la variante D10A o H840A de Cas9 (o las mutaciones correspondientes en cualquiera de las proteínas establecidas como SEQ ID NO: 1-256 y 795-1346) puede alterar el resultado biológico esperado, dado que es mucho más probable que suceda la recombinación no homologa (NHEJ) cuando están presentes las DSB, en contraposición con las SSB. De esta forma, en algunos casos donde se desea reducir la probabilidad de DSB (y por ende, reducir la probabilidad de NHEJ), puede utilizarse una variante de Cas9 D10A o H840A. Pueden mutarse otros residuos para lograr el mismo efecto (es decir, inactivar una u otra parte de la nucleasa). Como ejemplos no taxativos, los residuos DIO, G12, G17, E762, H840, N854, N863, H982, H983, A984, D986, y/o A987 (o las mutaciones correspondientes de cualquiera de las proteínas estableci ¡ das como SEQ ID NO: 1-256 y 795-1346) pueden alterarse (es decir, sustituirse) (véanse la Figura 3, Figura 5, Figura 11A y la Tabla 1 por más información respecto a la conservación de los residuos de aminoácidos de Cas9). También son adecuadas mutaciones que no sean las sustituciones de alanina. En algunas modalidades, cuando un polipéptido dirigido al sitio (por ejemplo, el polipéptido modificador dirigido al sitio) tiene una actividad catalítica reducida (por ejemplo, cuando una proteína Cas9 tiene una mutación DIO, G12, G17, E762, H840, N854, N863, H982, H983, A984, D986, y/o A987, por ejemplo, D10A, G12A, G17A, E762A, H840A, N854A, N863A, H982A, H983A, A984A, y/o D986A), el polipéptido todavía puede unirse a ADN objetivo de una forma específica al sitio (dado que todavía está guiado a una secuencia de ADN objetivo por un ARN dirigido a ADN), siempre y cuando retenga la capacidad de interactuar con el ARN dirigido a ADN.
En algunas modalidades, la forma modificada del polipéptido Cas9/Csnl posee tanto las mutaciones D10A como H840A (o las mutaciones correspondientes de cualquiera de las proteínas establecidas como SEQ ID NO:1-256 y 795-1346) de manera que el polipéptido tiene una capacidad reducida de escindir tanto la cadena complementaria como la no complementaria del ADN objetivo (es decir, la variante no puede tener actividad de nucleasa sustancial). Pueden mutarse otros residuos para lograr el mismo efecto (es decir, inactivar una u otra parte de la nucleasa). Como ejemplos no taxativos, los residuos DIO, G12, G17, E762, H840, N854, N863, H982, H983, A984, D986, y/o A987 (o las mutaciones correspondientes de cualquiera de las proteínas establecidas como SEQ ID NO:1-256 y 795-1346) pueden alterarse (es decir, sustituirse) (véanse la Figura 3, Figura 5, Figura 11A y la Tabla 1 por más información respecto a la conservación de los residuos de aminoácidos de Cas9). También son adecuadas mutaciones que no sean las sustituciones de alanina.
En algunas modalidades, el polipéptido modificador dirigido al sitio comprende una secuencia heteróloga (por ejemplo, una fusión). En algunas modalidades, una secuencia heteróloga puede proporcionar localización subcelular del polipéptido modificador dirigido al sitio (por ejemplo, una señal de localización nuclear (NLS) para dirigirse al núcleo; una señal de localización mitocondrial para dirigirse a la mitocondria; una señal de localización en el cloroplasto para dirigirse a un cloroplasto; una señal de retención en el ER y similares). En algunas modalidades, una secuencia heteróloga puede proporcionar una etiqueta para facilitar el rastreo o purificación (por ejemplo, una proteina fluorescente, por ejemplo, una proteina verde fluorescente (GFP), YFP, RFP, CFP, mCherry, tdTomato y similares; una etiqueta his, por ejemplo, una etiqueta 6XHis; una etiqueta de hemaglutinina (HA); una etiqueta FLAG; una etiqueta Myc y similares). En algunas modalidades, la secuencia heteróloga puede proporcionar un aumento o .disminución de la estabilidad.
En algunas modalidades, un polipéptido modificador dirigido al sitio de la invención puede optimizarse con codones. Este tipo de optimización es conocido en la téenica e implica la mutación de ADN derivado foráneo para imitar las preferencias de codón de la célula u organismo hospedador pretendidos mientras que se codifica la misma proteina. De esta forma, cambian los codones, pero la proteina codificada permanece sin modificaciones. Por ejemplo, si la célula objetivo pretendida era una célula humana, una Cas9 (o variante, por ejemplo, variante enzimáticamente inactiva) optimizada por codones seria un polipéptido modificador dirigido al sitio adecuado (ver SEQ ID NO: 256 para un ejemplo). Cualquier polipéptido modificador dirigido al sitio adecuado (por ejemplo, cualquier Cas9 tal como cualquiera de las secuencias establecidas en las SEQ ID NO: 1-256 y 795-1346) puede ser optimizado con codones. Como otro ejemplo no taxativo, si la célula hospedadora pretendida fuera una célula de ratón, entonces una Cas9 (o variante, por ejemplo, una variante enzimáticamente inactiva) de ratón optimizada con codones seria un polipéptido modificador dirigido al sitio adecuado. Mientras que no se requiere la optimización por codones, esta es aceptable y puede ser preferible en ciertos casos.
En algunas modalidades, un ARN dirigido a ADN de la invención y un polipéptido modificador dirigido al sitio de la invención se utilizan como un sistema inducible para desactivar la expresión génica en células bacterianas. En algunos casos, los ácidos nucleicos que codifican un ARN dirigido a ADN apropiado y/o un polipéptido dirigido al sitio apropiado se incorporan al cromosoma de una célula objetivo y están bajo el control de un promotor inducible. Cuando se inducen el ARN dirigido al ADN y/o el polipéptido dirigido al sitio, el ADN objetivo se escinde (o se modifica de otra manera) en la ubicación de interés (por ejemplo, un gen objetivo en un plásmido separado), cuando tanto el ARN dirigido a ADN como el polipéptido modificador dirigido al sitio están presentes y forman un complejo. Como tales, en algunos casos, las cepas de expresión bacteriana se modifican genéticamente para incluir secuencias de ácido nucleico que codifican un polipéptido modificador dirigido al sitio adecuado en el genoma bacteriano y/o un ARN dirigido a ADN adecuado en un plásmido (por ejemplo, bajo el control de un promotor inducible), lo que permite experimentos en los cuales la expresión de cualquier gen etiquetado (expresado de un plásmido separado introducido en la cepa) pueda ser controlado mediante la inducción de la expresión del ARN dirigido a ADN y el polipéptido dirigido al sitio.
En algunos casos, el polipéptido modificador dirigido al sitio tiene actividad enzimática que modifica ADN objetivo de formas distintas de la introducción de roturas de cadena doble. La actividad enzimática de interés que puede usarse para modificar ADN objetivo (por ejemplo, mediante la fusión de un polipéptido heterólogo con actividad enzimática a un polipéptido modificador dirigido al sitio, generando asi un polipéptido modificador quimérico dirigido al sitio) incluye, de modo no taxativo, actividad de metiltransferasa, actividad de desmetilasa, actividad de reparación del ADN, actividad de daño al ADN, actividad de desaminación, actividad de dismutasa, actividad de alquilación, actividad de depurinación, actividad de oxidación, actividad de formación de dimeros de pirimidina, actividad de integrasa, actividad de transposasa, actividad de recombinasa, actividad de polimerasa, actividad de ligasa, actividad de helicasa, actividad de fotoliasa o actividad de glicosilasa). La metilación y la desmetilación son reconocidas en la téenica como una forma importante de regulación epigénica de genes, mientras que la actividad de daño y reparación en el ADN es esencial para la supervivencia de las células y para el mantenimiento adecuado del genoma como respuesta a la tensión ambiental.
Como tales, los métodos de la presente pueden utilizarse en la modificación epigénica de ADN objetivo y pueden emplearse para controlar la modificación epigénica de ADN objetivo en cualquier ubicación en un ADN objetivo mediante manipulación genética de la secuencia de ácido nucleico complementaria deseada en el segmento dirigido a ADN de un ARN dirigido a ADN. Los métodos de la presente también pueden usarse en el daño intencional y controlado del ADN en cualquier ubicación deseada dentro del ADN objetivo. Los métodos de la presente también pueden usarse en la reparación controlada y especifica a la secuencia del ADN en cualquier ubicación deseada dentro del ADN objetivo. Los métodos para dirigir actividades enzimáticas modificadoras de ADN a ubicaciones especificas en ADN objetivo pueden usarse tanto en investigación como en aplicaciones clínicas.
En algunos casos, el polipéptido modificador dirigido al sitio tiene actividad que modula la transcripción de ADN objetivo (por ejemplo, en el caso de un polipéptido modificador quimérico dirigido al sitio, etc.). En algunos casos, un polipéptido modificador quimérico dirigido al sitio que comprende un polipéptido heterólogo que presenta la capacidad de aumentar o disminuir la transcripción (por ejemplo, polipéptidos activadores de la transcripción o represores de la transcripción) se utiliza para aumentar o disminuir la transcripción de ADN objetivo en una ubicación especifica en un ADN objetivo, la cual es guiada por el segmento dirigido a ADN del ARN dirigido a ADN. Los ejemplos de polipéptidos de origen para proporcionar un polipéptido modificador quimérico dirigido al sitio con actividad moduladora de la transcripción incluyen, de modo no taxativo, reguladores de la transcripción inducibles por la luz, reguladores de la transcripción que responden a fármacos/de molécula pequeña, factores de transcripción, represores de transcripción, etc. En algunos casos, el método de la invención se usa para controlar la expresión de un ARN codificador dirigido (gen codificador de proteínas) y/o un ARN no codificador dirigido (por ejemplo, ARNt, ARNr, ARNnp, ARNip, miARN, ARNlnc, etc.).
En algunos casos, el polipéptido modificador dirigido al sitio tiene actividad enzimática que modifica un polipéptido asociado con ADN (por ejemplo, histona). En algunas modalidades, la actividad enzimática es actividad de metiltransferasa, actividad de desmetilasa, actividad de acetiltransferasa, actividad de deacetilasa, actividad de cinasa, actividad de fosfatasa, actividad de ubiquitina ligasa (es decir, actividad de ubiquitinación), actividad desubiquitinante, actividad de adenilación, actividad de desadenilación, actividad de SUMOilación, actividad de deSUMOilación, actividad de ribosilación, actividad de desribosilación, actividad de miristoilación, actividad de demiristoilación, actividad de glicosilación (por ejemplo, de transferksa O-GlcNAc) o actividad de desglicosilación, Las actividades enzimáticas enumeradas en la presente catalizan modificaciones covalentes a proteínas. Se sabe en la téenica que dichas modificaciones alteran la estabilidad o actividad de la proteina objetivo (por ejemplo, la fosforilación debida a la actividad cinasa puede estimular o silenciar la actividad de proteínas dependiendo de la proteína objetivo). Las histonas son de particular interés como proteínas objetivo. Se sabe en la técnica que las proteínas de histona se unen a ADN y forman complejos conocidos como nucleosomas. Las histonas pueden modificarse (por ejemplo, mediante metilación, acetilación, ubiquitinación, fosforilación) para producir cambios estructurales en el ADN circundante, controlando así la accesibilidad de partes potencialmente grandes de ADN a factores de interacción tales como los factores de transcripción, polimerasas y similares. Una única histona puede modificarse de muchas formas distintas y en muchas combinaciones diferentes (por ejemplo, la trimetilación de la lisina 27 de la histona 3, H3K27, es asociada con regiones de ADN de transcripción reprimida, mientras que la trimetilación de la lisina 4 de la histona 3, H3K4, es asociada con regiones de ADN de transcripción activa). De esta forma, un polipéptido modificador dirigido al sitio con actividad modificadora de histona se puede utilizar en el control específico del sitio de estructuras de ADN y puede utilizarse para alterar el patrón de modificación de la histona en una región seleccionada de ADN objetivo. Dichos métodos pueden utilizarse tanto en la investigación como en aplicaciones clínicas.
En algunas modalidades, múltiples ARN dirigidos a ADN se usan de manera simultánea para modificar, de manera simultánea, diferentes ubicaciones en el mismo ADN objetivo o en diferentes ADN objetivo. En algunas modalidades, dos o más ARN dirigidos a ADN se dirigen al mismo gen, transcripción o locus. En algunas modalidades, dos o más ARN dirigidos a ADN se dirigen a distintos locus sin relación. En algunas modalidades, dos o más ARN dirigidos a ADN se dirigen a locus distintos pero relacionados.
En algunos casos, el polipéptido modificador dirigido al sitio se proporciona directamente como una proteina. Como ejemplo no taxativo, los hongos (por ejemplo, levadura) pueden transformarse con proteina exógena y/o ácido nucleico mediante transformación de esferoplastos (ver Kawai et ál., Bioeng Bugs. 2010 nov-dic;1(6):395-403 : "Transformation of Saccharomyces cerevisiae and other fungí: methods and possible underlying mechanism"; y Tanka et ál., Nature.2004 mar 18;428(6980):323-8: "Conformational variations in an infectious protein determine prion strain differences"; los cuales se incorporan a la presente en su totalidad mediante referencia). Por lo tanto, un polipéptido modificador dirigido al sitio (por ejemplo, Cas9) puede incorporarse en un esferoplasto (con o sin ácido nucleico codificando un ARN dirigido a ADN y con o sin un polinucleótido donante) y el esferoplasto puede utilizarse para introducir el contenido en una célula de levadura. Un polipéptido modificador dirigido al sitio puede introducirse en una célula (proporcionarse a la célula) mediante cualquier método conveniente; dichos métodos son conocidos por los expertos en la téenica. Como otro ejemplo no taxativo, un polipéptido modificador dirigido al sitio puede inyectarse directamente en una célula (por ejemplo, con o sin ácido nucleico codificando un ARN dirigido a ADN y con o sin un polinucleótido donante), por ejemplo, una célula de un embrión de pez cebra, el pronúcleo de un ovocito de ratón fertilizado, etc.
Células objetivo de interés En algunas de las aplicaciones mencionadas anteriormente pueden emplearse los métodos de la invención para inducir la escisión de ADN, modificación de ADN y/o modulación transcripcional en células mitóticas o posmitóticas in vivo y/o ex vivo y/o in vitro (por ejemplo, para producir células modificadas genéticamente que pueden reintroducirse en un individuo). Dado que el ARN dirigido al ADN proporciona especificidad mediante la hibridación a ADN objetivo, una célula mitótica o posmitótica de interés en los métodos descritos puede incluir una célula de cualquier organismo (por ejemplo, una célula bacteriana, una célula arqueal, una célula de un organismo eucariota unicelular, una célula vegetal, una célula de algas, por ejemplo, Botryococcus braunii, Chlamydomonas reínhardtíi, Nannochloropsis gaditana , Chlorella pyrenoidosa, Sargassum patens C. Agardh y similares, una célula fúngica (por ejemplo, una célula de levadura), una célúla de animal, una célula de un animal invertebrado (por ejemplo, mosca de la fruta, enidario, equinodermo, nemátodo, etc.), una célula de un animal vertebrado (por ejemplo, pez, anfibio, reptil, ave, mamífero), una célula de un mamífero, una célula de un roedor, una célula de un humano, etc.) Cualquier tipo de célula puede ser de interés (por ejemplo, una célula madre, por ejemplo, una célula madre embriónica (ES), una célula madre pluripotente inducida (iPS), una célula germinal; una célula somática, por ejemplo, un fibroblasto, una célula hematopoyética, una neurona, una célula muscular, una célula ósea, un hepatocito, una célula pancreática; una célula embrionaria in vitro o in vivo de un embrión en cualquier etapa, por ejemplo, un embrión de pez cebra en la etapa de 1 célula, 2 células, 4 células, 8 células, etc.). Las células pueden ser de lineas celulares establecidas o pueden ser células primarias, donde "células primarias", "lineas celulares primarias" y "cultivos primarios" se usan en la presente de manera intercambiable para hacer referencia a células y cultivos celulares que se han derivado de un sujeto y se les permitió el cultivo in vitro para una cantidad limitada de pasajes, es decir, divisiones, del cultivo. Por ejemplo, los cultivos primarios son cultivos a los que se realizó un pasaje 0 veces, 1 vez, 2 veces, 4 veces, 5 veces, 10 veces o 15 veces, pero no la cantidad suficiente de veces como para atravesar la etapa de crisis. Típicamente, las líneas celulares primarias de la presente invención se mantienen durante menos de 10 pasajes in vitro. Las células objetivo, en muchas modalidades, son organismos unicelulares o cultivados.
Si las células son células primarias, pueden cosecharse de un individuo mediante cualquier método conveniente. Por ejemplo, los leucocitos pueden cosecharse de manera conveniente mediante aféresis, leucocitaféresis, separación de gradiente de densidad, etc., mientras que las células de tejidos tales como la piel, músculo, médula ósea, bazo, hígado, páncreas, pulmón, intestino, estómago, etc. se cosechan de forma más conveniente mediante biopsia. Puede usarse una solución apropiada para la dispersión o suspensión de las células cosechadas. Dicha solución generalmente será una solución salina equilibrada, por ejemplo, solución salina normal, solución salina amortiguada con fosfato (PBS, por sus siglas en inglés), solución salina equilibrada de Hank, etc., complementada de manerá conveniente con suero fetal bovino u otros factores de origen natural, junto con un amortiguador aceptable en una concentración baja, generalmente de 5-25 mM. Los amortiguadores convenientes incluyen HEPES, amortiguadores de fosfato, amortiguadores de lactato, etc. Las células pueden usarse de manera inmediata o pueden ser almacenadas, congeladas, durante largos períodos de tiempo, descongeladas y útiles para su reutilización. En dichos casos, las células se congelarán usualmente en DMSO al 10 %, suero al 50 %, medio amortiguado al 40 % u otra solución como las usadas en la téenica para preservar células en dichas temperaturas de congelamiento, y se descongelarán de una manera como las usadas comúnmente en la técnica para descongelar células cultivadas congeladas. Ácidos nucleicos que codifican un ARN dirigido a ADN de la invención y/o un polipéptido modificador dirigido al sitio de la invención En algunas modalidades, un método de la invención implica poner en contacto un ADN objetivo o introducir en una célula (o una población de células) uno o más ácidos nucleicos que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican un ARN dirigido a ADN y/o un polipéptido modificador dirigido al sitio y/o un polinucleótido donante. Los ácidos nucleicos adecuados comprenden secuencias de nucleótidos que codifican un ARN dirigido a ADN y/o un polipéptido modificador dirigido al sitio incluyen vectores de expresión, donde un vector de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un ARN dirigido a ADN y/o un polipéptido modificador dirigido al sitio es un "vector de expresión recombinante".
En algunas modalidades, el vector de expresión recombinante es una construcción viral, por ejemplo, una construcción viral adeno-asociada recombinante (véase, por ejemplo, la patente estadounidense n.° 7,078,387), una construcción adenoviral recombinante, una construcción lentiviral recombinante, etc.
Los vectores de expresión adecuados incluyen, de modo no taxativo, vectores virales (por ejemplo, vectores virales basados en el virus vaccinia; poliovirus; adenovirus (véase, por ejemplo, Li et ál., Invest Opthalmol Vis Sci 35:2543 2549, 1994; Borras et ál., Gene Ther 6:515 524, 1999; Li y Davidson, PNAS 92:7700 7704, 1995; Sakamoto et ál., H Gene Ther 5:1088 1097, 1999; WO 94/12649, WO 93/03769; WO 93/19191; WO 94/28938; WO 95/11984 and WO 95/00655);·virus adeno-asociado (véase, por ejemplo, Ali et ál., Hum Gene Ther 9:81 86, 1998, Flannery et ál., PNAS 94:6916 6921, 1997; Bennett et ál., Invest Opthalmol Vis Sci 38:28572863, 1997; Jomary et ál., Gene Ther 4:683690, 1997, Rolling et ál., Hum Gene Ther 10:641648, 1999; Ali et ál., Hum Mol Genet 5:591 594, 1996; Srivastava en WO 93/09239, Samulski et ál., J. Vir. (1989) 63:3822-3828; Mendelson et ál., Virol. (1988) 166:154-165; y Flotte et ál., PNAS (1993) 90:10613-10617); SV40; virus del herpes simple; virus de inmunodeficiencia humana (véase, por ejemplo, Miyoshi et ál., PNAS 94:1031923, 1997; Takahashi et ál·., J Virol 73:7812 7816, 1999); un vector retroviral (por ejemplo, virus de leucemia murina, virus de la necrosis del bazo y vectores derivados de retrovirus tal como el virus del sarcoma de Rous, virus del sarcoma de Harvey, virus de la leucosis aviar, un lentivirus, virus de inmunodeficiencia humana, virus del sarcoma mieloproliferativo y virus del tumor mamario); y similares.
Los expertos en la téenica conocen numerosos vectores de expresión adecuados y muchos están disponibles comercialmente. Se proporcionan los siguientes vectores a modo de ejemplo; para células hospedadoras eucariotas: pXTl, pSG5 (Stratagene), pSVK3, pBPV, pMSG, and pSVLSV40 (Pharmacia). Sin embargo, puede utilizarse cualquier otro vector siempre que sea compatible con la célula hospedadora.
En algunas modalidades, una secuencia de nucleótidos que codifica un ARN dirigido a ADN y/o un polipéptido modificador dirigido al sitio está unida de manera operativa a un elemento de control, por ejemplo, un elemento de control transcripcional, tal como un promotor. El elemento de control transcripcional puede ser funcional ya sea en una célula eucariota, por ejemplo, una célula de mamífero o una célula procariota (por ejemplo, una célula bacteriana o de arquea). En algunas modalidades, una secuencia de nucleótidos que codifica un ARN dirigido a ADN y/o un polipéptido modificador dirigido al sitio está unido de manera operativa a múltiples elementos de control que permiten la expresión de la secuencia de nucleótidos que codifica un ARN dirigido a ADN y/o un polipéptido modificador dirigido al sitio tanto en células procariotas como eucariotas.
Dependiendo del sistema de hospedador/vector utilizado, puede utilizarse cualquier cantidad de elementos de control de la transcripción y traducción adecuados, incluyendo promotores constitutivos e inducibles, elementos mejoradores de la transcripción, terminadores de la transcripción, etc., en el vector de expresión (por ejemplo, promotor U6, promotor Hl, etc.; véase lo que antecede) (véase, por ejemplo, Bitter et ál. (1987) Methods in Enzymology, 153:516-544).
En algunas modalidades, un ARN dirigido a ADN y/o un polipéptido modificador dirigido al sitio pueden proporcionarse como ARN. En dichos casos, el ARN dirigido a ADN y/o el ARN que codifica el polipéptido modificador dirigido al sitio pueden producirse mediante síntesis química directa o pueden transcribirse in vitro de un ADN que codifica el ARN dirigido al ADN. Los métodos para sintetizar ARN de un modelo de ADN son bien conocidos en la téenica. En algunos casos, el ARN dirigido a ADN y/o el ARN que codifica el polipéptido modificador dirigido al sitio serán sintetizados in vitro utilizando una enzima ARN polimerasa (por ejemplo, polimerasa T7, polimerasa T3,· polimerasa SP6, etc.)· pna vez sintetizado, el ARN puede ponerse en contacto de forma directa con un ARN objetivo o puede introducirse en una célula mediante cualquiera de las téenicas reconocidas para la introducción de ácidos nucleicos en células (por ejemplo, microinyección, electroporación, transfección, etc.).
Los nucleótidos que codifican a un ARN dirigido a ADN (que se introducen como ADN o ARN) y/o un polipéptido modificador dirigido al sitio (que se introduce como ADN o ARN) y/o un polinucleótido donante pueden proporcionarse a las células utilizando técnicas de transfección bien desarrolladas; véase, por ejemplo, Angel y Yanik (2010) PLoS ONE 5(7): ell756, y los reactivos TransMessenger® a la venta de Qiagen, Stemfect™ RNA Transíection Kit de Stemgent, y TransIT®-mRNA Transfection Kit de Mirus Bio LLC. Véase también Beumer et ál. (2008) Efficient gene targeting in Drosophila by direct embryo injection with zinc-finger nucleases. PNAS 105(50):19821-19826. De manera alternativa, los ácidos nucleicos que codifican un ARN dirigido a ADN, un polipéptido modificador dirigido al sitio, un polipéptido modificador quimérico dirigido al sitio y/o un polinucleótido donante pueden proporcionarse sobre vectores de ADN. Están disponibles muchos vectores, por ejemplo, plásmidos, cósmidos, minicírculos, fagos, virus, etc., útiles para transferir ácidos nucleicos a células objetivo. Los vectores que comprenden el o los ácidos nucleicos pueden mantenerse de manera episomal, por ejemplo, como plásmidos, ADN de minicírculos, virus tales como citomegalovirus, adenovirus, etc., o pueden integrarse en el genoma de la célula objetivo, mediante recombinación homologa o integración aleatoria, por ejemplo, vectores derivados de retrovirus, tales como MMLV, V1H-1, ALV, etc.
Los vectores pueden ser proporcionados directamente a las células de la invención. En otras palabras, las células se ponen en contacto con vectores que comprenden el ácido nucleico que codifica un ARN dirigido al ADN, un polipéptido modificador dirigido al sitio, un polipéptido modificador quimérico dirigido al sitio y/o un polinucleótido donante, de forma que los vectores son absorbidos por las células. Son bien conocidos en la téenica los métodos para poner en contacto a las células con vectores de ácido nucleico que son plásmidos, inclusive electroporación, transfección de cloruro de calcio, microinyección y lipofección. Para la administración de vectores virales, las células se ponen en contacto con partículas virales que comprenden el ácido nucleico que codifica un ARN dirigido a ADN, un polipéptido modificador dirigido al sitio, un polipéptido modificador quimérico dirigido al sitio y/o un polinucleótido donante. Los retrovirus, por ejemplo, lentivirus, son particularmente adecuados para el método de la invención. Los vectores virales comúnmente utilizados son "defectuosos", es decir, no son capaces de producir proteínas virales requeridas para la infección productiva. En cambio, la replicación del vector requiere el cultivo en una línea celular empaquetadora. Para generar partículas virales que comprendan ácidos nucleicos de interés, los ácidos nucleicos retrovirales que comprenden el ácido nucleico se empacan en cápsides virales mediante una línea celular empaquetadora. Las distintas líneas celulares empaquetadoras proporcionan una proteína de envoltura diferente (ecotrópica, anfotrópica o xenotrópica) para incorporarla en la cápside, donde esta proteína de envoltura determina la especificidad de la partícula viral para las células (ecotrópica para murino y rata; anfotrópica para la mayoría de los tipos celulares de mamíferos, inclusive de ser humano, de perro y ratón; y xenotrópica para la mayoría de los tipos de células de mamífero salvo las células de murino). La línea celular de envoltura apropiada puede utilizarse para garantizar que las células sean dirigidas por las partículas virales empaquetadoras. Son bien conocidos en la téenica los métodos para la introducción de vectores retrovirales que comprenden el ácido nucleico que codifica los factores de reprogramación en líneas celulares empaquetadora, y para la recolección de partículas virales generadas por las líneas empaquetadoras. Los ácidos nucleicos pueden introducirse también mediante microinyección directa (por ejemplo, la inyección de ARN en un embrión de pez cebra).
Los vectores utilizados para proporcionar los ácidos nucleicos que codifican un ARN dirigido a ADN, un polipéptido modificador dirigido al sitio, un polipéptido modificador quimérico dirigido al sitio y/o un polinucleótido donante a las células de la invención típicamente comprenderán promotores adecuados para dirigir la expresión, es decir, la activación transcripcional, del ácido nucleico de interés. En otras palabras, el ácido nucleico de interés estará unido de manera operativa a un promotor. Esto puede incluir promotores que actúan de manera general, por ejemplo, el promotor de CMV- -actina o promotores inducibles, tales como promotores que están activos en poblaciones celulares en particular o que responden ante la presencia de fármacos como la tetracielina. Se entiende por activación transcripcional que la transcripción se aumentará por encima de los niveles básales en la célula objetivo, al menos alrededor de 10 veces, al menos alrededor de 100 veces, más usualmente al menos alrededor de 1000 veces. Además, los vectores utilizados para proporcionar un ARN dirigido a ADN, un polipéptido modificador dirigido al sitio, un polipéptido modificador quimérico dirigido al sitio y/o un polinucleótido donante a las células de la invención pueden incluir secuencias de ácido nucleico que codifican marcadores seleccionables en las células objetivo, para identificar células que han absorbido el ARN dirigido a ADN, un polipéptido modificador dirigido al sitio, un polipéptido modificador quimérico dirigido al sitio y/o un polinucleótido donante.
Un ARN dirigido a ADN, un polipéptido modificador dirigido al sitio y/o un polipéptido modificador quimérico dirigido al sitio de la invención pueden, en vez, utilizarse para poner en contacto ADN o pueden introducirse en las células como ARN. Los métodos para introducir ARN en células son conocidos en la téenica y pueden incluir, por ejemplo, inyección directa, transfección o cualquier otro método utilizado para la introducción de ADN.
Un polipéptido modificador dirigido al sitio puede, en cambio, ser proporpionado a las células como un polipéptido.
Dicho polipéptido puede, opcionalmente, estar fusionado a un dominio! de polipéptido que aumenta la solubilidad del producto. El dominio puede estar unido al polipéptido mediante un sitio definido de escisión de proteasa, por ejemplo, una secuencia TEV, la cual es escindida mediante una proteasa TEV. El enlazador puede incluir también una o más secuencias flexibles, por ejemplo, de 1 a 10 residuos de glicina. En algunas modalidades, la escisión de la proteina de fusión es realizada en un amortiguador que mantiene la solubilidad del producto, por ejemplo, ante la presencia de 0,5 a 2 M de urea, ante la presencia de polipéptidos y/o polinucleótidos que aumentan la solubilidad, y similares. Los dominios de interés incluyen dominios endosomoliticos, por ejemplo, dominio HA de la influenza y otros polipéptidos que colaboran en la producción, por ejemplo, dominio IF2, dominio GST, dominio GRPE y similares. El polipéptido puede estar formulado para una estabilidad mejorada. Por ejemplo, los péptidos pueden ser PEGilados, donde el grupo polietilenoxi proporciona un ciclo de vida mejorado en el torrente sanguíneo.
De manera adicional o alternativa, el polipéptido modificador dirigido al sitio de la invención puede estar fusionado a un dominio de permeabilidad de polipéptidos para promover la absorción de la célula. Son conocidos en la téenica una cantidad de dominios de permeabilidad, y pueden ser utilizados en los polipéptidos no integrados de la presente invención, inclusive péptidos, peptidomiméticos y portadores no péptidos. Por ejemplo, un péptido permeante puede derivarsé de la tercera hélice alfa del factor de I transcripción de Drosophila melanogaster Antennapaedia, al que se !hace referencia como penetratina, que comprende la secuencia de aminoácidos RQIKIWFQNRRMKWKK (SEQ ID NO://). Como otro ejemplo, el péptido permeante comprende la secuencia de aminoácidos de la región básica de tat de V1H-1, que puede incluir, por ejemplo, los aminoácidos 49-57 de la proteina tat de origen natural. Otros dominios de permeabilidad incluyen motivos de poliarginina, por ejemplo, la región de los aminoácidos 34-56 de la proteina rev de V1H-1, nonaarginina, octaarginina y similares. (Véase, por ejemplo, Futaki et ál. (2003) Curr Protein Pept Sci. abr de 2003; 4(2): 87-9 and 446; y Wender et ál. (2000) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 21 de noviembre de 2000; 97(24):13003-8; solicitudes publicadas de patente estadounidense 20030220334; 20030083256; 20030032593; y 20030022831, incorporadas específicamente a la presente debido a las enseñanzas de péptidos y peptoides de translocación). La secuencia de nonaarginina (R9) es uno de los PTD más eficientes que se han caracterizado (Wender et ál.2Q00; Uemura et ál. 2002). El sitio en el que se realiza la fusión puede seleccionarse para optimizar las características de unión, secreción o actividad biológica del polipéptido. El sitio óptimo será determinado mediante experimentación de rutina.
Un polipéptido modificador dirigido al sitio puede producirse ín vitro, mediante células eucariotas o mediante células procariotas, y puede procesarse adicionalmente mediante desdoblamiento, por ejemplo, desnaturalización térmica, reducción de DTT, etc. y puede replegarse utilizando métodos conocidos en la téenica.
Las modificaciones de interés que no alteran la secuencia primaria incluyen la derivación química de polipéptidos, por ejemplo, acilación, acetilación, carboxilación, amidación, etc. También se incluyen las modificaciones de glicosilación, por ejemplo, aquellas realizadas mediante la modificación de los patrones de glicosilación de un polipéptido durante su síntesis y procesamiento o en etapas posteriores de procesamiento; por ejemplo, mediante la exposición del polipéptido a enzimas que afectan la glicosilación, tales como enzimas glicosilantes o desglicosilantes de mamífero. También se comprenden secuencias que tienen residuos de aminoácidos fosforilados, por ejemplo, fosfotirosina, fosfoserina o fosfotreonina.
También se incluyen en la presente invención ARN dirigidos a ADN y polipéptidos modificadores dirigidos al sitio que se han modificado utilizando téenicas biológicas moleculares y química sintética con la finalidad de mejorar su resistencia a la degradación proteolítica, cambiar la especificidad de la secuencia objetivo, optimizar las propiedades de solubilidad, alterar la actividad de las proteínas (por ejemplo, la actividad moduladora de la transcripción, actividad enzimática, etc.) o tornarlas más adecuadas como agente terapéutico. Los análogos de dichos polipéptidos incluyen aquellos que contienen residuos que no sean L-aminoácidos de origen natural, por ejemplo, D-aminoácidos o aminoácidos sintéticos de origen no natural. Algunos o todos los residuos de aminoácidos pueden ser sustituidos por D-aminoácidos: Los polipéptidos modificadores dirigidos al sitio pueden prepararse mediante sintesis in vitro, utilizando métodos convencionales conocidos en la téenica. Se encuentran disponibles varios aparatos sintéticos comerciales, por ejemplo, sintetizadores automatizados de Applied Biosystems, Inc., Beckman, etc. Al utilizar sintetizadores, los aminoácidos de origen natural pueden sustituirse con aminoácidos no naturales. La secuencia en particular y la forma de preparación se determinarán por la conveniencia, factores económicos, pureza requerida y similares.
De desearse, podrán introducirse en el péptido varios grupos durante la síntesis o durante la expresión, lo cual permite la unión a otras moléculas o a una superficie. Por lo tanto, pueden utilizarse las cisteínas para hacer tioéteres, las histidinas para el enlace a un complejo de ion metálico, los grupos carboxilo para formar-amidas o ésteres, los grupos amino para formar amidas, etc.
Los polipéptidos modificadores dirigidos al sitio también pueden aislarse y purificarse de acuerdo con métodos convencionales de síntesis recombinante. Puede prepararse un lisado del hospedador de expresión y el U sado puede purificarse mediante HPLC, cromatografía de exclusión, electroforesis en gel, cromatografía de afinidad u otra técnica de purificación. En general, las composiciones utilizadas comprenderán al menos 20 % en peso del producto deseado, de forma más usual al menos alrededor de 75 % en peso, preferentemente al menos alrededor de 95 % en peso y, con fines terapéuticos, usualmente al menos alrededor de 99,5 % en peso, en relación con contaminantes relacionados con el método de preparación del producto y su purificación. Usualmente, el porcentaje se basará en proteínas totales.
Para inducir la recombinación y escisión de ADN, cualquier modificación deseada a un ADN objetivo o cualquier modificación deseada a un polipéptido asociado con ADN objetivo, el ARN dirigido a ADN, el polipéptido modificador dirigido al sitio, el polinucleótido donante, estén introducidos como ácidos nucleicos o polipéptidos, se proporcionan a las células durante alrededor de 30 minutos a alrededor de 24 horas, por ejemplo, 1 hora, 1,5 horas, 2 horas, 2,5 horas, 3 horas, 3,5 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 8 horas, 12 horas, 16 horas, 18 horas, 20 horas o cualquier otro período en el intervalo de alrededor de 30 minutos a alrededor de 24 horas, lo que se puede repetir con una frecuencia de aproximadamente todos los días a aproximadamente cada 4 días, por ejemplo, cada 1,5 días, cada 2 días, cada 3 días o cualquier otra frecuencia de aproximadamente cada día a aproximadamente cada 4 días. El o los agentes pueden proporcionarse a las células de la invención una o más veces, por ejemplo, una vez, dos veces, tres veces o más de tres veces, y permitirle a las células la incubación con el o los agentes durante una cantidad de tiempo luego de cada evento de contacto, por ejemplo, 16-24 horas; luego de este tiempo, el medio se reemplaza con medio fresco y las células se continúan cultivando.
En los casos en que se proporcionan a la célula dos o más complejos de direccionamiento distintos (por ejemplo, dos ARN dirigidos a ADN que son complementarios a diferentes secuencias dentro del mismo ADN objetivo o uno distinto), los complejos pueden proporcionarse de forma simultánea (por ejemplo, como dos polipéptidos y/o ácidos nucleicos) -o administrarse de forma simultánea. De manera alternativa, pueden proporcionarse de manera consecutiva, por ejemplo, proporcionando primero el complejo de direccionamiento, seguido por el segundo complejo de direccionamiento, etc., o viceversa.
Típicamente, se proporciona una cantidad eficaz del ARN dirigido a ADN, polipéptido modificador dirigido al sitio y/o polinucleótido donante al ADN o células objetivo para inducir la escisión. Una cantidad eficaz o dosis eficaz del ARN dirigido a ADN y/o polipéptido modificador dirigido al sitio y/o polinucleótido donante es la cantidad para inducir un aumento de 2 veces o más en la cantidad de modificación del objetivo observada entre dos secuencias homologas en relación a un control negativo, por ejemplo, una célula que se puso en contacto con un vector vacío o polipéptido irrelevante. Es decir, una dosis o cantidad eficaz del ARN dirigido a ADN y/o polipéptido modificador dirigido al sitio y/o polinucleótido donante inducirá un aumento de 2 veces, un aumento de 3 veces, un aumento de 4 veces o más en la cantidad de modificación del objetivo observada en una región de ADN objetivo, en algunas instancias un aumento de 5 veces, un aumento de 6 veces o más, a veces un aumento de 7 u 8 veces o más en la cantidad de recombinación observada, por ejemplo, un aumento de 10 veces, 50 veces o 100 veces o más, en algunas instancias, un aumento de 200 veces, 500 veces, 700 veces o 1000 veces o más, por ejemplo, un aumento de 5000 veces o 10000 veces en la cantidad de recombinación observada. La cantidad de modificación del objetivo puede medirse mediante cualquier método conveniente. Por ejemplo, puede cotransfectarse a las células una construcción indicadora silenciosa que comprende una secuencia complementaria al segmento de direccionamiento (secuencia de direccionamiento) del ARN dirigido a ADN flanqueado por secuencias de repetición que, cuando se recombinan,-reconstituyen un ácido nucleico que codifica un indicador activo, y puede evaluarse la cantidad de proteina indicadora luego del contacto con el ARN dirigido a ADN y/o el polipéptido modificador dirigido al sitio y/o el polinucleótido donante, por ejemplo, 2 horas, 4 horas, 8 horas, 12 horas, 24 horas, 36 horas, 48 horas, 72 horas o más luego de ponerse en contacto con el ARN dirigido a ADN y/o el polipéptido modificador dirigido al sitio y/o el polinucleótido donante. Como otro ensayo más sensible, por ejemplo, la extensión de la recombinación en una región de ADN genómico de interés que comprende secuencias de ADN objetivo puede evaluarse mediante PCR o hibridación Southern de la región luego de ponerla en contacto con un ARN dirigido a ADN y/o polipéptido modificador dirigido al sitio y/o polinucleótido donante, por ejemplo, 2 horas, 4 horas, 8 horas, 12 horas, 24 horas, 36 horas, 48 horas, 72 horas o más luego del contacto con el ARN dirigido a ADN y/o polipéptido modificador dirigido al sitio y/o polinucleótido donante.
El contacto de las células con ARN dirigido a ADN y/o polipéptido modificador dirigido al sitio y/o polinucleótido donante puede ocurrir en cualquier medio de cultivo y en cualquier condición que promueva la supervivencia de las células. Por ejemplo, las células pueden suspenderse en cualquier medio de nutriente adecuado, tal como DMEM modificado de Iscove o RPMI 1640, complementado con suero fetal bovino o suero de cabra inactivado por calor (alrededor de 5-10 %), L-glutamina, un tiol, particularmente 2-mercaptoetanol y antibióticos, por ejemplo, penicilina y estreptomicina. El cultivo puede contener factores de crecimiento a los cuales responden las células. Los factores de crecimiento, tal como se definen en la presente, son moléculas capaces de promover la supervivencia, crecimiento y/o diferenciación de células, ya sea en cultivo o en el tejido intacto, a través de efectos específicos en una receptor transmembrana. Los factores de crecimiento incluyen factores polipeptídicos y no polipeptídicos. Las condiciones que promueven la supervivencia de células normalmente permiten la recombinación no homologa y la reparación dirigida por homología.
En aplicaciones en las que es deseable insertar una secuencia de polinucleótidos en una secuencia de ADN objetivo, se proporciona también a la célula un polinucleótido que comprende una secuencia donante para ser insertada. Por "secuencia donante" o "polinucleótido donante" se entiende una secuencia de ácido nucleico para insertar en el sitio de escisión inducido por un polipéptido modificador dirigido al sitio. El polinucleótido donante contendrá una homología suficiente con respecto a una secuencia genómica en el sitio de escisión, por ejemplo, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o 100 % de homología con las secuencias de nucleótidos que flanquean el sitio de escisión, por ejemplo, dentro de alrededor de 50 bases o menos del sitio de escisión, dentro de alrededor de 30 bases, dentro de alrededor de 15 bases, dentro de alrededor de 10 bases, dentro de alrededor de 5 bases o que flanquean inmediatamente el sitio de escisión, para sostener la reparación dirigida por homología entre este y la secuencia genómica con la cual posee homología. Aproximadamente 20, 50, 100 o 200 nucleótidos, o más de 200 nucleótidos, de homología de secuencia entre un donante y una secuencia genómica (o cualquier valor integral entre 10 y 200 nucleótidos o más) sostendrá la reparación dirigida por homología. Las secuencias donantes pueden tener cualquier longitud, por ejemplo, 10 nucleótidos o más, 50 nucleótidos o más, 100 nucleótidos o más, 250 nucleótidos o más, 500 nucleótidos o más, 1000 nucleótidos o más, 5000 nucleótidos o más, etc.
La secuencia donante no es típicamente idéntica a la secuencia genómica que reemplaza. En cambio, la secuencia donante puede contener al menos uno o más cambios, inserciones, eliminaciones, inversiones o reajustes de base simple con respecto a la secuencia genómica, siempre y cuando haya suficiente homología para brindar soporte a la reparación dirigida por homología. En algunas modalidades, la secuencia dpnante comprende una secuencia no homologa flanqueada por dos regiones -de homología, de forma tal que la reparación dirigida por homología entre la región de ADN objetivo y las dos secuencias flanqueantes da como resultado la inserción de la secuencia no homologa en la región objetivo. Las secuencias donantes también pueden comprender una estructura de vector que contiene secuencias que no son homologas con respecto a la región de ADN de interés y que no están destinadas para la inserción en la región de ADN de interés. Generalmente, la o las regiones homologas de una secuencia donante tendrán al menos 50 % de identidad de secuencia con una secuencia genómica con la cual se desea la recombinación. En determinadas modalidades, está presente una identidad de secuencia del 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o 99,9 %. Puede estar presente cualquier valor entre 1 % y 100 % de identidad de secuencia, dependiendo de la longitud del polinucleótido donante.
La secuencia donante puede comprender ciertas diferencias de secuencia en comparación con la secuencia genómica, por ejemplo, sitios de restricción, polimorfismos de nucleótido, marcadores seleccionables (por ejemplo, genes de resistencia a fármacos, proteínas fluorescentes, enzimas, etc.), etc., que pueden utilizarse para evaluar la inserción exitosa de la secuencia donante en el sitio de escisión, o en algunos casos pueden utilizarse con otros fines (por ejemplo, para indicar la expresión en el locus genómico objetivo). En algunos casos, si se encuentran en la región de codificación, dichas diferencias en la secuencia de nucleótidos no cambiarán la secuencia de aminoácidos o harán que los cambios de los aminoácidos sean silenciosos (es decir, los cambios que no afectan la estructura o función de la proteína). De manera alternativa, estas diferencia de secuencias pueden incluir secuencias de recombinación flanqueantes tales como FLP, secuencias loxP o similares, que pueden activarse en un momento1posterior para la remoción de la secuencia marcadora.
Puede proporcionarse a la célula la secuencia donante como ADN de cadena simple, ARN de cadena simple, ADN de cadena doble o ARN de cadena doble. Puede introducirse a una célula de forma lineal o circular. De introducirse de forma lineal, los extremos de la secuencia donante pueden protegerse (por ejemplo, de degradación exonucleolitica) mediante métodos conocidos para el experto en la téenica. Por ejemplo, se agregan uno o más residuos de didesoxinucleótido al extremo 3' de una molécula lineal y/o se ligan los oligonucleótido autocomplementarios a uno o ambos extremos. Véase, por ejemplo, Chang et ál. (1987) Proc. Nati. Acad Sci EUA 84:4959-4963; Nehls et ál. (1996) Science 272:886-889. Métodos adicionales para proteger polinucleótidos exógenos de degradación incluyen, de modo no taxativo, la adición de grupos amino del extremo y el uso de enlaces internucleótidos modificados, tales como, por ejemplo, fosforotioatos, fosforamidatos y residuos de O-metil ribosa o desoxirribosa. Como una alternativa a la protección del extremo de una secuencia donante lineal, pueden incluirse longitudes adicionales de secuencia fuera de las regiones de homología que pueden degradarse sin impactar la recombinación. Una secuencia donante puede introducirse en una célula como parte de una molécula de vector que tiene secuencias adicionales tales como, por ejemplo, orígenes de replicación, promotores y genes que codifican la resistencia antibiótica. Más aun, las secuencias donantes pueden introducirse como ácido nucleico no conjugado, como ácido nucleico en complejo con un agente tal como liposoma o poloxámero, o puede administrarse mediante virus (por ejemplo, adenovirus, AAV), según se describió anteriormente en cuanto a los ácidos nucleicos que codifican un ARN dirigido a ADN y/o polipéptido modificador dirigido al sitio y/o polinucleótido donante.
Siguiendo los métodos descritos anteriormente, puede escindirse y modificarse una región de ADN de interés, es decir, "modificarse genéticamente", ex vivo. En algunas modalidades, como cuando se insertó un marcador seleccionable en la región de ADN de interés, la población de células puede estar enriquecida para las que comprenden la modificación genética mediante la separación de las células modificadas genéticamente de la población restante. Antes del enriquecimiento, las células "modificadas genéticamente" pueden comprender solamente alrededor de 1 % o más (por ejemplo, 2 % o más, 3 % o más, 4 % o más, 5 % o más, 6 % o más, 7 % o más, 8 % o más, 9 % o más, 10 % o más, 15 % o más, o 20 % o más) de la población de células. La separación de células "modificadas genéticamente" puede lograrse mediante cualquier téenica de separación conveniente adecuada para el marcador seleccionable utilizado. Por ejemplo, si se ha insertado un marcador fluorescente, las células pueden separarse mediante clasificación de células activadas por fluorescencia, mientras que si se ha insertado un marcador de superficie celular, las células pueden separarse de la población heterogénea mediante técnicas de separación por afinidad, por ejemplo, separación magnética, cromatografía por afinidad, "cribado" con un reactivo de afinidad acoplado a una matriz sólida, u otra técnica conveniente. Las técnicas que proporcionan una separación correcta incluyen clasificadores de células activadas por fluorescencia, que pueden 'tener varios grados de sofisticación, tal como múltiples canales de color, canales de detección de dispersión de luz de ángulo bajo y obtuso, canales de impedancia, etc. Las células pueden seleccionarse contra células muertas mediante el uso de tintes asociados con células muertas (por ejemplo, yoduro de propidio). Puede emplearse cualquier téenica que no sea indebidamente perjudicial para la viabilidad de las células modificadas genéticamente. Las composiciones celulares que están altamente enriquecidas para células que comprenden ADN modificado se obtienen de esta manera. "Altamente enriquecida" significa que las células modificadas genéticamente serán el 70 % o más, 75 % o más, 80 % o más, 85 % o más, 90 % o más de la composición celular, por ejemplo, alrededor de 95 % o más, o 98 % o más de la composición celular. En otras palabras, la composición puede ser una composición sustancialmente pura de células modificadas genéticamente.
Las células modificadas genéticamente producidas mediante los métodos descritos en la presente pueden usarse inmediatamente. De manera alternativa, las células pueden congelarse a temperaturas de nitrógeno liquido y almacenarse durante periodos de tiempo prolongados, y luego pueden descongelarse y puede reutilizarse. En dichos casos, las * células se congelarán usualmente en dimetilsulfóxido (DMSO) al 10 %, suero al 50 %, medio amortiguado al 40 % u otra solución como las usadas en la técnica para preservar células en dichas temperaturas de congelamiento, y se descongelarán de una manera como las.usadas comúnmente en la téenica para descongelar células cultivadas congeladas.
Las células modificadas genéticamente pueden cultivarse in vitro en varias condiciones de cultivo. Las células pueden expandirse en el cultivo, es decir, crecer en condiciones que promueven su proliferación. El medio de cultivo puede ser liquido o semisólido, por ejemplo, puede contener agar, metilcelulosa, etc. La población de células puede suspenderse en un medio de nutriente adecuado, tal como DMEM modificado de Iscove o RPMI 1640, complementado normalmente con suero fetal bovino (alrededor de 5-10 %), L-glutamina, un tiol, particularmente 2-mercaptoetanol, y antibióticos, por ejemplo, penicilina y estreptomicina. El cultivo puede contener factores de crecimiento a los cuales responden.los linfocitos T reguladores. Los factores de crecimiento, tal como se definen en la presente, son moléculas capaces de promover la supervivencia, crecimiento y/o diferenciación de células, ya sea en cultivo o en el tejido intacto, a través de efectos específicos en un receptor transmembrana. Los factores de crecimiento incluyen factores polipeptídicos y no polipeptídicos.
Las células que han sido modificadas genéticamente de esta manera pueden trasplantarse a un sujeto con fines tales como terapia génica, por ejemplo, para tratar una enfermedad o como un agente terapéutico antiviral, antipatogénico o anticanceroso, para la producción de organismos modificados genéticamente en la agricultura o para la investigación biológica. El sujeto puede ser un neonato, un joven o un adulto. Los sujetos mamíferos son de particular interés. Las especies de los mamíferos que pueden tratarse con los métodos incluyen caninos y felinos; equinos; bovinos; ovinos; etc., y primates, particularmente seres humanos. Pueden usarse modelos animales, particularmente de mamíferos pequeños (por ejemplo, ratones, ratas, cobayos, hámsteres, lagomorfos (por ejemplo, conejos), etc.) para investigaciones experimentales.
Pueden proporcionarse células al sujeto solas o con un sustrato o matriz adecuados, por ejemplo, para respaldar su crecimiento y/u organización en el tejido al cual se trasplantan. Usualmente, se administrarán al menos 1x103 células, por ejemplo 5x103 células, 1x104 células, 5x104 células, 1x105 células, 1 x 106 células o más. Las células pueden introducirse en el sujeto por medio de cualquiera de las siguientes vías: parenteral, subcutánea, intravenosa, intracraneana, intraespinal, intraocular o en el líquido cefalorraquídeo. Las células pueden introducirse por medio de inyección, catéter o similares. Los ejemplos de métodos para la administración local, es decir, administración al sitio de la lesión, incluyen, por ejemplo, a través de un depósito de Ommaya, por ejemplo, para la administración intratecal (véanse, por ejemplo, las patentes estadounidenses n.° 5,222,982 y 5385582, que se incorporan a la presente mediante esta referencia); mediante inyección en bolo, por ejemplo, con una jeringa, por ejemplo, en una articulación; mediante infusión continua, por ejemplo, mediante canulación, por ejemplo, con convección (véase, por ejemplo, la solicitud estadounidense n.° 20070254842, la cual se incorpora a la presente mediante esta referencia); o por implante de un dispositivo en el cual se fijaron de manera reversible las células (véanse, por ejemplo, las solicitudes estadounidenses n.° 20080081064 y 20090196903, las cuales se incorporan a la presente mediante esta referencia). Las células también pueden introducirse en un embrión (por ejemplo, un blastocisto) con el fin de generar un animal transgénico (por ejemplo, un ratón transgénico).
La cantidad de administraciones de tratamiento a un sujeto puede variar. La introducción de células modificadas genéticamente en un sujeto puede ser un evento de una sola vez; en determinadas situaciones, dicho tratamiento puede producir la mejora durante un periodo de tiempo limitado y necesitar una serie continua de tratamientos repetidos. En otras situaciones, pueden necesitarse múltiples administraciones de las células modificadas genéticamente antes de observar un efecto. Los protocolos exactos dependen de la enfermedad o afección, la etapa de la enfermedad y los parámetros del sujeto individual que se está tratando.
En otros aspectos de la invención, el ARN dirigido a ADN y/o polipéptido modificador dirigido al sitio y/o polinucleótido donante se emplean para modificar el ADN celular in vivo, nuevamente con fines tales como la terapia génica, por ejemplo, para tratar una enfermedad o como un agente terapéutico antiviral, antipatogénico o anticanceroso, para la producción de organismos modificados genéticamente en la agricultura o para la investigación biológica. En estas modalidades in vivo, un ARN dirigido a ADN y/o polipéptido modificador dirigido al sitio y/o polinucleótido donante se | administran directamente al individuo. Un ARN dirigido a ADN y/o polipéptido modificador dirigido al sitio y/o polinucleótido donante puede administrarse mediante cualquier cantidad de métodos conocidos en la téenica para la administración de péptidos, moléculas pequeñas y ácidos nucleicos a un sujeto. Un ARN dirigido a ADN y/o polipéptido modificador dirigido al sitio y/o polinucleótido donante puede incorporarse en una variedad de formulaciones. Más particularmente, un ARN dirigido a ADN y/o polipéptido modificador dirigido al sitio y/o polinucleótido donante de la presente invención puede formularse en composiciones farmacéuticas mediante la combinación con portadores o diluyentes farmacéuticamente aceptables.
Las preparaciones farmacéuticas son composiciones que incluyen uno o más ARN dirigidos a ADN y/o polipéptidos modificadores dirigidos al sitio y/o polipéptido donante presentes en un vehículo farmacéuticamente aceptable. Los "vehículos farmacéuticamente aceptables" pueden ser vehículos aprobados por una agencia reguladora del gobierno federal o estatal o enumerado en la Farmacopea de Estados Unidos u otra farmacopea reconocida en general para usar en mamíferos, tal como seres humanos. El término "vehículo" se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente o portador con el cual un compuesto de la invención se formula para su administración a un mamífero. Dichos vehículos farmacéuticos pueden ser lípidos, por ejemplo, liposomas, por ejemplo, dendrímeros de liposoma; líquidos, tal como agua y aceites, inclusive los de origen petrolífero, animal, vegetal o sintético, tal como aceite de maní, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo y similares, solución salina; goma acacia, gelatina, pasta de almidón, talco, queratina, sílice coloidal, urea y similares. Además, se pueden utilizar agentes auxiliares, estabilizantes, espesantes, lubricantes y colorantes. Las composiciones farmacéuticas pueden formularse en preparaciones en formas sólida, semisólida, liquida o gaseosa, tal como comprimidos, cápsulas, polvos, gránulos, ungüentos, soluciones, supositorios, inyecciones, inhaladores, geles, microesferas y aerosoles. Como tal, la administración del ARN dirigido al ADN y/o polipéptido modificador dirigido al sitio y/o polinucleótido donante puede lograrse de varias maneras, incluyendo administración oral, bucal, rectal, parenteral, intraperitoneal, intradérmica, transdérmica, intratraqueal, intraocular, etc. El agente activo puede ser sistémico luego de la administración o puede localizarse mediante el uso de administración regional, administración intramural o el.uso de un implante que actúa para retener la dosis activa en el sitio de implante. El agente activo puede formularse para su actividad inmediata o puede formularse para liberación sostenida.
Para algunas afecciones, particularmente ·las afecciones del sistema nervioso central, puede ser necesario formular los agentes para que crucen la barrera hematoencefálica (BBB, por sus siglas en inglés). Una estrategia para la administración del fármaco a través de la barrera hematoencefálica (BBB) implica la alteración de la BBB, ya sea mediante medios osmóticos como manitol o leucotrienos, o bioquímicamente mediante el uso de sustancias vasoactivas tal como | bradiquinina. El potencial para abrir la BBB para dirigir agentes específicos a tumores cerebrales también es una opción. Un agente de alteración de la BBB puede coadministrarse con las composiciones terapéuticas de la invención cuando las composiciones se administran mediante inyección intravascular. Otras estrategias para atravesar la BBB pueden implicar el uso de sistemas de transporte endógeno, inclusive tanscitosis mediada por caveolina-1, transportadores mediados por portador tal como portadores de glucosa o aminoácidos, transcitosis mediada por receptor para insulina o transferrina, y transportadores de eflujo activo tal como p-glicoproteína. Los restos de transporte activos pueden también conjugarse con los compuestos terapéuticos para su uso en la invención para facilitar el transporte a través de la pared entodelial de los vasos sanguíneos. De manera alternativa, la administración de fármacos de agentes terapéuticos más allá de la BBB pueden ser mediante administración local, por ejemplo, mediante administración intratecal, por ejemplo, a través de un depósito de Om aya (véanse, por ejemplo, las patentes estadounidenses n.° 5,222,982 y 5385582, que se incorporan a la presente mediante esta referencia); mediante inyección en bolo, por ejemplo, con una jeringa, por ejemplo, por vía intravítrea o intracraneana; mediante infusión continua, por ejemplo, mediante canulación, por ejemplo, con convección (véase, por ejemplo, la solicitud estadounidense n.° 20070254842, la cual se incorpora a la presente mediante esta referencia); o por implante de un dispositivo en el cual se fijó de manera reversible el agente (véanse, por ejemplo, las solicitudes estadounidenses n.° 20080081064 y 20090196903, las cuales se incorporan a la presente mediante esta referencia).
Típicamente, se proporciona una cantidad eficaz de un ARN dirigido a ADN y/o polipéptido modificador dirigido al sitio y/o polinucleótido donante. Tal como se describe anteriormente respecto a los métodos ex vivo, una cantidad eficaz o dosis eficaz de un ARN dirigido a ADN y/o polipéptido modificador dirigido al sitio y/o polinucleótido donante in vivo es la cantidad para inducir un aumento de 2 veces o más en la cantidad de recombinación observada entre dos secuencias homologas en relación a un control negativo, por ejemplo, se pone en contacto una célula con un vector vacio o polipéptido irrelevante. La cantidad de recombinación puede medirse mediante cualquier método conveniente, por ejemplo, como se describe anteriormente y se conoce en la téenica. El cálculo de la cantidad eficaz o dosis eficaz de un ARN dirigido a ADN y/o polipéptido modificador dirigido al sitio y/o polinucleótido donante que será administrada está dentro de la capacidad de un experto en la técnica, y será de rutina para los expertos en la técnica. La cantidad final que será administrada dependerá de la vía de administración y de la naturaleza del trastorno o afección que será tratada.
La cantidad eficaz dada a un paciente en particular dependerá de una variedad de factores, varios de los cuales difieren de paciente a paciente. Un médico competente será capaz de determinar una cantidad eficaz de un agente terapéutico para administrarlo a un paciente para detener o revertir la evolución de la condición de la enfermedad, según sea necesario. Con la utilización de datos animales LD50, y otra información disponible para el agente, un médico puede determinar la dosis segura máxima para un individuo, dependiendo de la via de administración. Por ejemplo, una dosis administrada por via intravenosa puede ser más que una dosis administrada por via intratecal, dado que la composición terapéutica se administra en un cuerpo de fluido mayor. De manera similar, las composiciones que se depuran rápidamente del cuerpo pueden administrarse en dosis mayores, o en dosis repetidas, para mantener una concentración terapéutica. Mediante la utilización de capacidades estándares, el médico competente podrá optimizar la dosificación de un agente terapéutico particular en el transcurso de ensayos clínicos de rutina.
Para su inclusión en un medicamento, un ARN dirigido a ADN y/o polipéptido modificador dirigido al sitio y/o polinucleótido donante puede obtenerse de una fuente comercial adecuada. Como una propuesta general, la cantidad farmacéuticamente eficaz total del ARN dirigido a ADN y/o polipéptido modificador dirigido al sitio y/o polinucleótido donante administrada por vía parenteral por dosis, estará en un intervalo que puede medirse mediante una curva de respuesta a la dosis.
Las terapias basadas en ARN dirigido a ADN y/o polipéptido modificador dirigido al sitio y/o polinucleótidos donantes, es decir, las preparaciones de ARN dirigido a ADN y/o polipéptido modificador dirigido al sitio y/o polinucleótido donante que se usarán para la administración terapéutica deben ser estériles. La esterilidad se logra fácilmente mediante filtrado a través de membranas de filtración (por ejemplo, membranas de 0,2 mm). Las composiciones terapéuticas generalmente se colocan en un recipiente que tiene un puerto de acceso estéril, por ejemplo, una bolsa o vial de solución intravenosa con un tapón perforable con una aguja de inyección hipodérmica. Las terapias basadas en ARN dirigido a ADN y/o polipéptido modificador dirigido al sitio y/o polinucleótido donante pueden almacenarse en recipientes unitarios o de dosis múltiples, por ejemplo, ampollas o viales sellados, como una solución acuosa o como una formulación liofilizada para su reconstitución. Como ejemplo de formulación liofilizada, se llenan viales de 10 mL con 5 mi de solución acuosa filtrada estéril al 1 % (p/v) del compuesto, y la mezcla resultante se liofiliza. La solución de infusión se prepara mediante la reconstitución del compuesto liofilizado usando agua bacteriostática para inyecciones.
Las composiciones farmacéuticas pueden incluir, dependiendo de la formulación deseada, portadores de diluyentes farmacéuticamente aceptables, no tóxicos, que se definen como vehículos comúnmente utilizados para formular composiciones farmacéuticas para administración a animales o seres humanos. El diluyente se selecciona a fin de no afectar la actividad biológica de la combinación. Los ejemplos de dichos diluyentes son agua destilada, agua con amortiguador, solución salina fisiológica, PBS, solución de Ringer, solución de dextrosa y solución de Hank. Además, la composición o formulación farmacéutica puede incluir otros portadores, adyuvantes o estabilizadores no tóxicos, no terapéuticos, no inmunógenos, excipientes y similares. Las composiciones también pueden incluir sustancias adicionales para aproximarse a condiciones fisiológicas, tales como agentes de ajuste de pH y amortiguación, agentes de ajuste de toxicidad, agentes humectantes y detergentes.
La composición también puede incluir cualquiera de una variedad de agentes estabilizadores, tales como un antioxidante, por ejemplo. Cuando la composición farmacéutica incluye un polipéptido, el polipéptido puede formar complejos con varios compuestos conocidos para potenciar la estabilidad in vivo del polipéptido o potenciar de otra forma sus propiedades farmacológicas (por ejemplo, aumentar la semivida del polipéptido, reducir su toxicidad, potenciar la solubilidad o absorción) . Los ejemplos de dichas modificaciones o agentes para formación de complejos incluyen sulfato, gluconato, citrato y fosfato. Los ácidos nucleicos o polipéptidos de una composición también pueden formar complejos con moléculas que potencian sus atributos in vivo. Dichas moléculas incluyen, por ejemplo, carbohidratos, poliaminas, aminoácidos, otros péptidos, iones (por ejemplo, sodio, potasio, calcio, magnesio, manganeso) y lipidos.
Se pueden obtener mayores instrucciones sobre las formulaciones que son adecuadas para varios tipos de administración en Remington's Pharmaceutical Sciences, Mace Publishing Company, Philadelphia, Pa., 17a edición (1985). Por una breve reseña respecto a los métodos para la administración de fármacos véase Langer, Science 249:1527-1533 (1990).
Las composiciones farmacéuticas pueden administrarse para tratamientos profilácticos y/o terapéuticos. La toxicidad y la eficacia terapéutica del ingrediente activo pueden determinarse de acuerdo con procedimientos farmacéuticos estándares en cultivos celulares y/o animales para experimentos, inclusive, por ejemplo, la determinación de la LD50 (la dosis letal para el 50 % de la población) y de la ED50 (la dosis terapéuticamente efectiva en el 50 % de la población). La proporción de la dosis entre los efectos tóxicos y terapéuticos es el indice terapéutico y puede expresarse como la proporción LD50/ED50. Se prefieren las terapias que presentan índices terapéuticos mayores.
Los datos obtenidos del cultivo celular y/o los estudios con animales pueden utilizarse para formular un rango de dosificaciones para humanos. La dosificación del ingrediente activo típicamente está dentro de un intervalo de concentraciones en circulación que incluyen la ED50 con toxicidad baja. La dosificación puede variar dentro de este intervalo dependiendo de la forma de dosificación empleada y la vía de administración utilizada.
Los componentes utilizados para formular las composiciones farmacéuticas son preferentemente de pureza alta y están sustancialmente libres de contaminantes potencialmente dañinos (por ejemplo, al menos de grado del Instituto Nacional de Alimentos (NF), generalmente al menos de grado analítico, y más típicamente al menos de grado farmacéutico). Además, las composiciones destinadas al uso in vivo son usualmente estériles. En la medida que un compuesto dado debe sintetizarse antes de su uso, el producto resultante está típicamente sustancialmente libre de cualquier agente potencialmente tóxico, particularmente cualquier endotoxina, que pueden estar presentes durante el proceso de síntesis o purificación. Las composiciones para administración parenteral también son estériles, sustancialmente isotónicas y elaboradas en condiciones GMP (buenas prácticas de fabricación).
La cantidad eficaz de una composición terapéutica administrada a un paciente en particular dependerá de una variedad de factores, varios de los cuales difieren de paciente a paciente. Un médico competente será capaz de determinar una cantidad eficaz de un agente terapéutico para administrarlo a un paciente para detener o revertir la evolución de la condición de la enfermedad, según sea necesario. Con la utilización de datos de LD50 de animales, y otra información disponible para el agente, un médico puede determinar la dosis segura máxima para un individuo, expendiendo de la vía de administración. Por ejemplo, una dosis administrada por vía intravenosa puede ser más que una dosis administrada por vía intratecal, dado que la composición terapéutica se administra en un cuerpo de fluido mayor. De manera similar, las composiciones que se depura rápidamente del cuerpo pueden administrarse en dosis mayores, o en dosis repetidas, para mantener una concentración terapéutica. Mediante la utilización de capacidades estándares, el médico competente podrá optimizar la dosificación de un agente terapéutico particular en el transcurso de ensayos clínicos de rutina.
CÉLULAS HOSPEDADORAS MODIFICADAS GENÉTICAMENTE La presente descripción proporciona células hospedadoras modificadas genéticamente, inclusive células hospedadoras modificadas genéticamente, donde una célula hospedadora modificada genéticamente de la invención comprende (ha sido modificada genéticamente con: 1) un ARN dirigido a ADN exógeno; 2) un ácido nucleico exógeno que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un ARN dirigido a ADN; 3) un polipéptido modificador exógeno dirigido al sitio (por ejemplo, una Cas9 de origen natural; una Cas9 modificada, es decir, mutada o variante; una Cas9 quimérica; etc.); 4) un ácido nucleico exógeno que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido modificador dirigido al sitio; o 5) cualquier combinación de los anteriores. Una célula modificada genéticamente de la invención se genera mediante la modificación genética de una célula hospedadora con, por ejemplo: 1) un ARN dirigido a ADN exógeno; 2) un ácido nucleico exógeno que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un ARN dirigido a ADN; 3) un polipéptido modificador exógeno dirigido al sitio; 4) un ácido nucleico exógeno que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido .modificador dirigido al sitio; o 5) cualquier combinación de los anteriores).
Todas las células adecuadas para ser célula objetivo también son adecuadas para ser una célula hospedadora modificada genéticamente. Por ejemplo, las células hospedadoras modific',adas genéticamente de interés pueden ser una célula de cualquier organismo (por ejemplo, una célula bacteriana, una célula arqueal, una célula de un organismo eucariota unicelular, una célula vegetal, una célula de algas, por ejemplo, Botryococcus braunii , Chlamydomonas reinhardtii , Nannochloropsis gaditana , Chlorella pyrenoidosa, Sargassum patens C. Agardh y similares, una célula fúngica (por ejemplo, una célula de levadura), una célula animal, una célula de un animal invertebrado (por ejemplo, mosca de la fruta, enidario, equinodermo, nemátodo, etc.), una célula de un animal vertebrado (por ejemplo, pez, anfibio, reptil, ave, mamífero), una célula de un mamífero (por ejemplo, un cerdo, una vaca, una cabra, una oveja, un roedor, una rata, un ratón, un primate no humano, un ser humano, etc.), etc.
En algunas modalidades, una célula hospedadora modificada genéticamente se ha modificado genéticamente con un ácido nucleico exógeno que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido modificador dirigido al sitio (por ejemplo, una Cas9 de origen natural; una Cas9 modificada, es decir, mutada o variante; una Cas9 quimérica; etc.). El ADN de una célula hospedadora modificada genéticamente puede ser objetivo para la modificación mediante la introducción de un ARN dirigido a ADN (o un ARN que codifica un ARN dirigido a ADN, que determina la ubicación/secuencia genómica que será modificada) y opcionalmente un ácido nucleico donante en la célula. En algunas modalidades, la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido modificador dirigido al sitio está unida de manera operativa a un promotor inducible (por ejemplo, promotor de shock térmico, promotor regulado por tetracielina, promotor regulado por esteroides, promotor regulado por metales, promotor regulado por estrógenos, etc.). En algunas modalidades, la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido modificador dirigido al sitio está unida de manera operativa a un promotor restringido espacialmente y/o temporalmente (por ejemplo, un promotor especifico de tejido, un promotor especifico de un tipo de célula, etc.). En algunas modalidades, la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido modificador dirigido al sitio está unida operativamente a un promotor constitutivo.
En algunas modalidades, una célula hospedadora modificada genéticamente está in vitro. En algunas modalidades, una célula hospedadora modificada genéticamente.está in vivo. En algunas modalidades, una célula hospedadora modificada genéticamente de la invención es una célula procariota o deriva de una célula procariota. En algunas modalidades, una célula hospedadora modificada genéticamente de la invención es una célula bacteriana o deriva de una célula bacteriana. En algunas modalidades, una célula hospedadora modificada genéticamente de la invención es una célula de arquea o deriva de una célula de arquea. En algunas modalidades, una célula hospedadora modificada genéticamente de la invención es una célula eucariota o deriva de una célula eucariota. En algunas modalidades, una célula hospedadora modificada genéticamente de la invención es una célula vegetal o deriva de una célula vegetal. En algunas modalidades, una célula hospedadora modificada genéticamente de la invención es una célula animal o deriva de una célula de animal. En algunas modalidades, una célula hospedadora modificada genéticamente de la invención es una célula de invertebrado o deriva de una célula de invertebrado. En algunas modalidades, una célula hospedadora modificada genéticamente de la invención es una célula de vertebrado o deriva de una célula de vertebrado. En algunas modalidades, una célula hospedadora modificada genéticamente de la invención es una célula de mamífero o deriva de una célula de mamífero. En algunas modalidades, una célula hospedadora modificada genéticamente de la invención es una célula de roedor o deriva de una célula de roedor. En algunas modalidades, una célula hospedadora modificada genéticamente de la invención es una célula humana o deriva de una célula humana.
La presente descripción proporciona adicionalmente progenie de una célula hospedadora modificada genéticamente, donde la progenie puede comprender el mismo ácido nucleico o polipéptido exógeno que la célula modificada genéticamente de la invención de la cual deriva. La presente descripción proporciona adicionalmente una composición que comprende una célula hospedadora modificada genéticamente de la invención.
Células madre modificadas genéticamente y células progenitoras modificadas genéticamente En algunas modalidades, una célula hospedadora modificada genéticamente de la invención es una célula madre o una célula progenitora modificada genéticamente. Las células hospedadoras adecuadas incluyen, por ejemplo, células madre (célula madre adultas, células madre embrionarias, células iPS, etc.) y las células progenitoras (por ejemplo, células progenitoras cardiacas, células progenitoras neuronales, etc.). Las células hospedadoras adecuadas incluyen células madre .y progenitoras de mamífero, incluyendo, por ejemplo, células madre de roedor, células progenitoras de roedor, células madre humanas, células progenitoras humanas, etc. Las células hospedadoras adecuadas incluyen células hospedadoras in vitro, por ejemplo, células hospedadoras aisladas.
En algunas modalidades, una célula hospedadora modificada genéticamente de la invención comprende un ácido nucleico de ARN dirigido a ADN exógeno. En algunas modalidades, una célula hospedadora modificada genéticamente de la invención comprende un ácido nucleico- exógeno que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un ARN dirigido a ADN. En algunas modalidades, una célula hospedadora modificada genéticamente de la invención comprende un polipéptido modificador exógeno dirigido al sitio (por ejemplo, una Cas9 de origen natural; una Cas9 modificada, es decir, mutada o variante; una Cas9 quimérica; etc.). En algunas modalidades, una célula hospedadora modificada genéticamente de la invención comprende un ácido nucleico exógeno que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido modificador dirigido al sitio. En algunas modalidades, una célula hospedadora modificada genéticamente de la invención comprende un ácido nucleico exógeno que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica 1) un ARN dirigido a ADN y 2) un polipéptido modificador dirigido al sitio.
En algúnos casos, el polipéptido modificador dirigido al sitio comprende una secuencia de aminoácidos con al menos alrededor de 75 %, al menos alrededor de 80 %, al menos alrededor de 85 %, al menos alrededor de 90 %, al menos alrededor de 95 %, al menos alrededor de 99 % o 100 % de identidad de secuencia de aminoácidos con los aminoácidos 7-166 o 731-1003 de la secuencia de aminoácidos Cas9/Csnl ilustrada en la Figura 3 o a las partes correspondientes en cualquiera de las secuencias de aminoácidos establecidas como SEQ ID NO: 1-256 y 795-1346.
COMPOSICIONES La presente invención proporciona una composición que comprende un ARN dirigido a ADN- de la invención y/o un polipéptido modificador dirigido al sitio. En algunos casos, el polipéptido modificador dirigido al sitio es un polipéptido quimérico de la invención. Una composición de la invención es útil para llevar a cabo un método de la presente descripción, por ejemplo, un método para la modificación especifica del sitio de un ADN objetivo; un método para la modificación especifica del sitio de un polipéptido asociado con un ADN objetivo; etc.
Composiciones que comprenden un ARN dirigido a ADN La presente invención proporciona una composición que comprende un ARN dirigido a ADN de la invención. La composición puede comprender, además del ARN dirigido a ADN uno o más de: una sal, por ejemplo, NaCl, MgCl2, KC1, MgSO4, etc.; un agente amortiguador, por ejemplo, un amortiguador Tris, ácido N-(2-hidroxietil)piperazin-N'-(2-etanosulfónico) (HEPES), ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico (MES), sal sódica de MES, ácido 3-(N-morfolino)propanosulfónico (MOPS), ácido N-tris [Hidroximetil]metil-3-aminopropanosulfónico (TAPS), etc.; un agente solubilizante; un detergente, por ejemplo, un detergente no iónico tal como Tween-20, etc.; un inhibidor de nucleasa; y similares. Por ejemplo, en algunos casos, una composición de la invención comprende un ARN dirigido a ADN de la invención y un amortiguador para estabilizar ácidos nucleicos.
En algunas modalidades, un ARN dirigido a ADN presente en una composición de la invención es puro, por ejemplo, al menos alrededor de 75 %, al menos alrededor de 80 %, al menos alrededor de 85 %, al menos alrededor de 90 %, al menos alrededor de 95 %, al menos alrededor de 98 %, al menos alrededor de 99 % o más de 99 % puro, donde "% de pureza" significa que el ARN dirigido a ADN está libre en el porcentaje mencionado de otras macromoléculas o contaminantes que pueden estar presentes durante la producción del ARN dirigido a ADN.
Composiciones que comprenden un polipéptido quimérico de la invención La presente invención proporciona una composición que comprende un polipéptido quimérico de la invención. La composición puede comprender, además del ARN dirigido a ADN uno o más de: una sal, por ejemplo, NaCl, MgCl2, KC1, MgSO4, etc.; i|m agente amortiguador, por ejemplo, un amortiguador Tris, HEPES, MES, sal sódica de MES, MOPS, TAPS, etc.; un agente solubilizante; un detergente, por ejemplo, un detergente no iónico tal como Tween-20, etc.; un inhibidor de proteasa; un agente reductor (por ejemplo, ditiotreitol); y similares.
En algunas modalidades, un polipéptido quimérico de la invención presente en una composición de la invención es puro, por ejemplo, al menos alrededor de 75 %, al menos alrededor de 80 %, al menos alrededor de 85 %, al menos alrededor de 90 %, al menos alrededor de 95 %, al menos alrededor de 98 %, al menos alrededor de 99 %, o más de 99 % puro, donde "% de pureza" significa que el polipéptido modificador dirigido al sitio está libre en el porcentaje mencionado de otras proteínas, qtras· macromoléculas o contaminantes que pueden estar presentes durante la producción del polipéptido quimérico.
Composiciones que comprenden un ARN dirigido a ADN y un polipéptido modificador dirigido al sitio La presente invención proporciona una composición que comprende: (i) un ARN dirigido a ADN o un polinucleótido de ADN que lo codifica; y ii) un polipéptido modificador dirigido al sitio o un polinucleótido que lo codifica. En algunos casos, el polipéptido modificador dirigido al sitio es un polipéptido quimérico modificador dirigido al sitio de la invención. En otros casos, el polipéptido modificador dirigido al sitio es un polipéptido modificador dirigido al sitio de origen natural. En algunas instancias, el polipéptido modificador dirigido al sitio presenta actividad enzi ática que modifica un ADN objetivo. En otros casos, el polipéptido modificador dirigido al sitio presenta actividad enzimática que modifica un polipéptido que está asociado con un ADN objetivo. En aún otros casos, el polipéptido modificador dirigido al sitio modula la transcripción del ADN objetivo.
La presente invención proporciona una composición que comprende: (i) un ARN dirigido a ADN, como se describió anteriormente, o un polinucleótido de ADN que codifica a este, donde el ARN dirigido a ADN comprende: (a) un primer segmento que comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia en un ADN objetivo; y (b) un segundo segmento que interactúa con un polipéptido modificador dirigido al sitio; y (ii) el polipéptido modificador dirigido al sitio o un polinucleótido que lo codifica, donde el polipéptido modificador dirigido al sitio comprende: (a) una parte de unión a ARN que interactúa con el ARN dirigido a ADN; y (b) una parte de actividad que presenta una actividad enzimática dirigida al sitio, donde el sitio de actividad enzimática está determinado por el ARN dirigido a ADN.
En algunas instancias, una composición de la invención comprende: una composición gue comprende: (i) un ARN dirigido a ADN de la invención, donde el ARN dirigido a ADN comprende: (a) un primer segmento que comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia en un ADN objetivo; y (b) un segundo segmento que interactúa con un polipéptido modificador dirigido al sitio; y (ii) el polipéptido modificador dirigido al sitio, donde el polipéptido modificador dirigido al sitio que comprende: (a) una parte de unión á ARN que interactúa con el ARN dirigido a ADN; y (b) una parte de actividad que presenta una actividad enzimática dirigida al sitio, donde el sitio de actividad enzimática está determinado por el ARN dirigido a ADN.
En otras modalidades, una composición de la invención comprende: (i) un polinucleótido que codifica un ARN dirigido a ADN, donde el ARN dirigido a ADN comprende: (a) un primer segmento que comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia en un ADN objetivo; y (b) un segundo segmento que interactúa con un polipéptido modificador dirigido al sitio; y (ii) un polinucleótido que codifica el polipéptido modificador dirigido al sitio, donde el polipéptido modificador dirigido al sitio que comprende: (a) una parte de unión a ARN que interactúa con el ARN dirigido a ADN; y (b) una parte de actividad que presenta una actividad enzimática dirigida al sitio, donde el sitio de actividad enzimática está determinado por el ARN dirigido a ADN.
En algunas modalidades, una composición de la invención incluye ambas moléculas de ARN de un ARN dirigido a ADN de molécula doble. Como tal, en algunas modalidades, una composición de la invención incluye un ARN activador que comprende un segmento formador de dúplex que es complementario al segmento formador de dúplex de un ARN identificador (véase la Figura 1A). Los segmentos formadores de dúplex del ARN activador y el ARN identificador se hibridan para formar el dúplex de ARNcd del segmento de unión a proteínas del ARN dirigido a ADN. El ARN identificador proporciona adicionalmente el segmento dirigido a ADN (cadena simple) del ARN dirigido a ADN y, por lo tanto, dirige el ARN dirigido a ADN a una secuencia específica dentro del ADN objetivo. Como ejemplo no taxativo, el segmento formador de dúplex del ARN activador comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos alrededor de 70 %, al menos alrededor de 80 %, al menos alrededor de 90 %, al menos alrededor de 95 %, al menos alrededor de 98 % o 100% de identidad con la secuencia 5'-UAGCAAGUUAAAAU-3' (SEQ ID NO:562). Como otro ejemplo no taxativo, el segmento formador de dúplex del ARN identificador comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos alrededor de 70 %, al menos alrededor de 80 %, al menos alrededor de 90 %, al menos alrededor de 95 %, al menos alrededor de 98 % o 100% de identidad con la secuencia 5'-GUUUUAGAGCUA-3' (SEQ ID NO:679).
La presente descripción proporciona una composición que comprende: (i) un ARN dirigido a ADN o un polinucleótido de ADN que codifica a este, donde el ARN dirigido a ADN comprende: (a) un primer segmento que comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia en un ADN objetivo; y (b) un segundo segmento que interactúa con un polipéptido modificador dirigido al sitio; y (ii) el polipéptido modificador dirigido al sitio o un polinucleótido que lo codifica, donde el polipéptido modificador dirigido al sitio comprende: (a) una parte de unión a ARN que interactúa con el ARN dirigido a ADN; y (b) una parte de actividad que modula la transcripción dentro del ADN objetivo, donde el sitio de transcripción modulada dentro del ADN objetivo está determinado por el ARN dirigido a ADN.
Por ejemplo, en algunos casos, una composición de la invención comprende: (i) un ARN dirigido a ADN, donde el ARN dirigido a ADN comprende: (a) -un primer segmento que comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia en un ADN objetivo; y (b) un segundo segmento que interactúa con un polipéptido modificador dirigido al sitio; y (ii) el polipéptido modificador dirigido al sitio, donde el polipéptido modificador dirigido al sitio que comprende: (a) una parte de unión a ARN que interactúa con el ARN dirigido a ADN; y (b) una parte de actividad que modula la transcripción dentro del ADN objetivo, donde el sitio de transcripción modulada dentro del ADN objetivo está determinado por el ARN dirigido a ADN.
Como otro ejemplo, en algunos casos, una composición de la invención comprende: (i) un polinucleótido de ADN que codifica un ARN dirigido a ADN, donde el ARN dirigido a ADN comprende: (a) un primer segmento que comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia en un ADN objetivo; y (b) un segundo segmento que interactúa con un polipéptido modificador dirigido al sitio; y (ii) un polinucleótido que codifica el polipéptido modificador dirigido al sitio, donde el polipéptido modificador dirigido al sitio que comprende: (a) una parte de unión a ARN que interactúa con el ARN dirigido a ADN; y (b) una parte de actividad que modula la transcripción dentro del ADN objetivo, donde el sitio de transcripción modulada dentro del ADN objetivo está determinado por el ARN dirigido a ADN.
Una composición puede comprender, además de i) un ARN dirigido a ADN o un polinucleótido de ADN que lo codifica; y ii) un polipéptido modificador dirigido al sitio, o un polinucleótido que lo codifica, uno o más de: una sal, por ejemplo, NaCl, MgCl2, KC1, MgSO4, etc.; un agente amortiguador, por ejemplo, un amortiguador Tris, HEPES, MES, sal sódica de MES, MOPS, TAPS, etc.; un agente solubilizante; un detergente, por ejemplo, un detergente no iónico tal como Tween-20, etc.; un inhibidor de proteasa; un agente reductor (por ejemplo, ditiotreitol); y similares.
En algunos casos, los componentes de la composición son individualmente puros, por ejemplo, cada uno de los componentes es al menos alrededor de 75%, al menos alrededor de 80%, al menos alrededor de 90%, al menos alrededor de 95%, al menos alrededor de 98%, al menos alrededor de 99%, o al menos alrededor de 99 % puro. En algunos casos, los componentes individuales de una composición de la invención son puros antes de ser agregados a la composición.
Por ejemplo, en algunas modalidades, un polipéptido modificador dirigido al sitio presente en una composición de la invención es puro, por ejemplo, al menos alrededor de 75 %, al menos alrededor de 80 %, al menos alrededor de 85 %, al menos alrededor de 90 %, al menos alrededor de 95 %, al menos alrededor de 98 %, al menos alrededor de 99 %, o más de 99 % puro, donde "% de pureza" significa que el polipéptido modificador dirigido al sitio está libre en el porcentaje mencionado de otras proteínas (por ejemplo, proteínas diferentes del polipéptido modificador dirigido al sitio), otras macromoléculas o contaminantes que pueden estar presentes durante la producción del polipéptido quimérico.
KITS La presente descripción proporciona kits para llevar a cabo un método de la invención. Un kit de la invención puede incluir uno o más de: un polipéptido modificador dirigido al sitio; un ácido nucleico que comprende un nucleótido que codifica un polipéptido modificador dirigido al sitio; un ARN dirigido a ADN; un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un ARN dirigido a ADN; un ARN activador; un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un ARN activador; un ARN identificador; y un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un ARN identificador. Un polipéptido modificador dirigido al sitio; un ácido nucleico que comprende un nucleótido que codifica un polipéptido modificador dirigido al sitio; un ARN dirigido a ADN; un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un ARN dirigido a ADN; un ARN activador; un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un ARN activador; un ARN identificador; y un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un ARN identificador, se describieron anteriormente en detalle. Un kit puede comprender un complejo que comprende dos o más de: un polipéptido modificador dirigido al sitio; un ácido nucleico que comprende un nucleótido que codifica un polipéptido modificador dirigido al sitio; un ARN dirigido a ADN; un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un ARN dirigido a ADN; un ARN activador; un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un ARN activador; un ARN identificador; y un ácido nucleico que ·comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un ARN identificador.
En algunas modalidades, un kit de la invención comprende un polipéptido modificador dirigido al sitio, o un polinucleótido que lo codifica. En algunas modalidades, el polipéptido modificador dirigido al sitio comprende: (a) una parte de unión a ARN que interactúa con el ARN dirigido a ADN; y (b) una parte de actividad que modula la transcripción dentro del ADN objetivo, donde el sitio de transcripción modulada dentro del ADN objetivo está determinado por el ARN dirigido a ADN. En algunos casos, la parte de actividad del polipéptido modificador dirigido al sitio presenta actividad de nucleasa reducida o inactivada. En algunos casos, el polipéptido modificador dirigido al sitio es un polipéptido quimérico modificador dirigido al sitio.
En algunas modalidades, un kit de la invención comprende: un polipéptido modificador dirigido al sitio o un polinucleótido que lo codifica, y un reactivo para reconstituir y/o diluir el polipéptido modificador dirigido al sitio. En otras modalidades, un kit de la invención comprende un ácido nucleico (por ejemplo, ADN, ARN) que comprende un nucleótido que codifica un polipéptido modificador dirigido al sitio. En algunas modalidades, un kit de la invención comprende: un ácido nucleico ·(por ejemplo, ADN, ARN) que comprende un nucleótido que codifica un polipéptido modificador dirigido al sitio; y un reactivo para reconstituir y/o diluir el polipéptido modificador dirigido al sitio Un kit de la invención que comprende un polipéptido modificador dirigido al sitio o un polinucleótido que lo codifica, puede incluir adicionalmente uno o más reactivos adicionales, donde dichos reactivos adicionales se seleccionan de: un amortiguador para introducir el polipéptido modificador dirigido al sitio en una célula; un amortiguador de lavado; un reactivo de control; un vector de expresión o polinucleótido de ARN de control; un reactivo para la producción in vitro del polipéptido modificador dirigido al sitio a partir de ADN, y similares. En algunos casos, el polipéptido modificador dirigido al sitio incluido en un kit de la invención es un polipéptido modificador quimérico dirigido al sitio, como se describió anteriormente.
En algunas modalidades, un kit de la invención un ARN dirigido a ADN o un polinucleótido de ADN que lo codifica, donde el ARN dirigido a ADN comprende: (a) un primer segmento que comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia en un ADN objetivo; y (b) un segundo segmento que interactúa con un polipéptido modificador dirigido al sitió. En algunas modalidades, el ARN dirigido a ADN comprende además un tercer segmento (como se describió anteriormente). En algunas modalidades, un kit de la invención comprende: (i) un ARN dirigido a ADN o un polinucleótido de ADN que codifica a este, donde el ARN dirigido a ADN comprende: (a) un primer segmento que comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia en un ADN objetivo; y (b) un segundo segmento que interactúa con un polipéptido modificador dirigido al sitio; y (ii) un polipéptido modificador dirigido al sitio o un polinucleótido que lo codifica, donde el polipéptido modificador dirigido al sitio comprende: (a) una parte de unión a ARN que interactúa con el ARN dirigido a ADN; y (b) una parte de actividad que presenta una actividad enzimática dirigida al sitio, donde el sitio de actividad enzimática está determinado por el ARN dirigido a ADN. En algunas modalidades, la parte de actividad del polipéptido modificador dirigido al sitio no presenta actividad enzimática (comprende una nucleasa inactivada, por ejemplo, por medio de mutación). En algunos casos, el kit comprende un ARN dirigido a ADN y un polipéptido modificador dirigido al sitio. En otros casos, el kit comprende: (i) un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un ARN dirigido a ADN; y (ii) un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido modificador dirigido al sitio.
Como otro ejemplo, un kit de la invención puede incluir: (i) un ARN dirigido a ADN o un polinucleótido de ADN que codifica a este, que comprende: (a) un primer segmento que comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia en·un ADN objetivo; y (b) un segundo segmento que interactúa con un polipéptido modificador dirigido al sitio; y (ii) el polipéptido modificador dirigido al sitio o un polinucleótido que lo codifica, que comprende: (a) una parte de unión a ARN que interactúa con el ARN dirigido a ADN; y (b) una parte de actividad que modula la transcripción dentro del ADN objetivo, donde el sitio de transcripción modulada dentro del ADN objetivo está determinado por el ARN dirigido a ADN. En algunos casos, el kit comprende: (i) un ARN dirigido a ADN; y un polipéptido modificador dirigido al sitio. En algunos casos, el kit comprende: (i) un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un ARN dirigido a ADN; y (ii) un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido modificador dirigido al sitio.
La presente descripción proporciona un kit que cortiprende: (1) un vector de expresión recombinante que comprende (i) una secuencia de nucleótidos que codifica un ARN dirigido a ADN, donde el ARN dirigido a ADN comprende: (a) un primer segmento que comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia en un ADN objetivo; y (b) un segundo segmento que interactúa con un polipéptido modificador dirigido al sitio; y (ii) una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido modificador dirigido al sitio, donde el polipéptido modificador dirigido al sitio comprende: (a) una parte de unión a ARN que interactúa con el ARN dirigido a ADN; y (b) una parte de actividad que presenta una actividad enzimática dirigida al sitio, donde el sitio de actividad :enzimática está determinado por el ARN dirigido a ADN; y (2) un reactivo para la reconstituir y/o diluir el vector de expresión.
La presente descripción proporciona un kit que comprende: (1) un vector de expresión recombinante que comprende: (i) una secuencia de nucleótidos que codifica un ARN dirigido a ADN, donde el ARN dirigido a ADN comprende: (a) un primer segmento que comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia en un ADN objetivo; y (b) un segundo segmento que interactúa con un polipéptido modificador dirigido al sitio; y (ii) una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido modificador dirigido al sitio, donde el polipéptido modificador dirigido al sitio comprende: (a) una parte de unión a ARN que interactúa con el ARN dirigido a ADN; y (b) una parte de actividad que modula a transcripción dentro del ADN objetivo, donde el sitio de transcripción modulada dentro del ADN objetivo se determina mediante el ARN dirigido a ADN; y (2) un reactivo para la reconstituir y/o diluir el vector de expresión recombinante.
La presente descripción proporciona un kit que comprende: (1) un vector de expresión recombinante que comprende un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un ARN dirigido a ADN que comprende: (i) un primer segmento que comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia en un ADN objetivo; y (ii) un segundo segmento que interactúa con un polipéptido modificador dirigido al sitio; y (2) un reactivo para reconstituir y/o diluir el vector de expresión recombinante. En algunas modalidades de este kit, el kit cpmprende: un vector de expresión recombinante que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido modificador dirigido al sitio, donde el polipéptido modificador dirigido al sitio comprende: (a) una parte de unión a ARN que interactúa con el ARN dirigido a ADN; y (b) una parte de actividad que presenta una actividad enzimática dirigida al sitio, donde el sitio de actividad enzimática está determinado por el ARN dirigido a ADN. En otras modalidades de este kit, el kit comprende: un vector de expresión recombinante que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido modificador dirigido al sitio, donde el polipéptido modificador dirigido al sitio comprende: (a) una parte de unión a ARN que interactúa con el ARN dirigido a ADN; y (b) una parte de actividad que modula la transcripción dentro del ADN objetivo, donde el sitio de transcripción modulada dentro del ADN objetivo está determinado por el ARN dirigido a ADN.
En algunas modalidades de cualquiera de los kits antemencionados, el kit comprende un ARN activador o un ARN identificador. En algunas modalidades de cualquiera de los kits antemencionados, el kit comprende un ARN dirigido a ADN de molécula simple. En algunas modalidades de cualquiera de los kits antemencionados, el kit comprende dos o más ARN dirigidos a ADN de molécula simple o molécula doble. En algunas modalidades de cualquiera de los kits antemencionados, un ARN dirigido a ADN (por ejemplo, incluidos dos o más ARN dirigidos a ADN) pueden proporcionarse como un conjunto (por ejemplo, un conjunto de moléculas de ARN, un conjunto de moléculas de ADN que codifican el ARN dirigido a ADN, etc.)· Dichos kits pueden ser útiles, por ejemplo, para usarse en conjunto con las células hospedadoras modificadas genéticamente descritas anteriormente que comprenden un polipéptido modificador dirigido al sitio de la invención. En algunas modalidades de cualquiera de los kits antemencionados, el kit comprende además un polinucleótido donante para producir la modificación genética deseada. Los componentes de un kit de la invención pueden separarse en recipientes; o pueden combinarse en un solo recipiente.
Cualquiera de los kits descritos anteriormente puede incluir adicionalmente uno o más reactivos adicionales, donde dichos reactivos adicionales se seleccionan de: un amortiguador de dilución; un amortiguador de reconstitución; un amortiguador de lavado; un reactivo de control; un vector de expresión o polinucleótido de ARN de control; un reactivo para la producción in vitro del polipéptido modificador dirigido al sitio a partir de ADN, y similares.
Además de los componentes mencionados anteriormente, un kit de la presente puede incluir adicionalmente instrucciones para usar los componentes del kit para practicar los métodos de la presente. Las instrucciones para practicar los métodos de la presente están generalmente registradas en un medio de registro adecuado. Por ejemplo, las instrucciones pueden estar impresas en un sustrato, tal como papel o plástico, etc. Como tales, las instrucciones pueden estar presentes en los kits como un prospecto, en el etiquetado del recipiente del kit o componentes del mismo (es decir, asociado al embalajé o subembalaje), etc. En otras modalidades, las instrucciones están presentes como un archivo de almacenamiento de datos electrónico, presente en un medio de almacenamiento adecuado leído por computadora, por ejemplo, CD-ROM, disquete, memoria flash, etc. En aun otras modalidades, las instrucciones reales no están presentes en el kit, pero se proporcionan medios para obtener las instrucciones desde una fuente remota, por ejemplo, por medio de Internet. Un ejemplo de esta modalidad es un kit que incluye una dirección web donde se pueden ver las instrucciones y/o desde donde pueden descargarse. Como con las instrucciones, este medio para obtener las instrucciones se registra en un sustrato adecuado.
ORGANISMOS NO HUMANOS MODIFICADOS GENÉTICAMENTE En algunas modalidades, una célula hospedadora modificada genéticamente se ha modificado genéticamente con un ácido nucleico exógeno que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido modificador dirigido al sitio (por ejemplo, una Cas9 de origen natural; una Cas9 modificada, es decir, mutada o variante; una Cas9 quimérica; etc.). Si dicha célula es un organismo unicelular eucariota, entonces la célula modificada puede considerarse un organismo modificado genéticamente. En algunas modalidades, el organismo no humano modificado genéticamente de la invención es un organismo multicelular transgénico Cas9.
En algunas modalidades, una célula hospedadora no humana modificada genéticamente de la invención (por ejemplo, una célula que se ha modificado genéticamente con un ácido nucleico exógeno que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido modificador dirigido al sitio, por ejemplo, una Cas9 de origen natural; una Cas9 modificada, es decir, mutada o variante; una Cas9 quimérica; etc.) puede generar un organismo no humano modificado genéticamente de la invención (por ejemplo, un ratón, un pez, una rana, una mosca, un gusano, etc.). Por ejemplo, si la célula hospedadora modificada genéticamente es una célula madre pluripotente (es decir, PSC) o una célula germinal (por ejemplo, esperma, ovocito, etc.), un organismo entero genéticamente modificado puede derivarse de la célula hospedadora genéticamente modificada. En algunas modalidades, la célula hospedadora genéticamente modificada es una célula madre pluripotente (por ejemplo, ESC, iPSC, célula madre pluripotente vegetal, etc.) o una célula germinal (por ejemplo, célula de esperma, ovocito, etc.), ya sea in vivo o in vitro, que puede dar origen a un organismo modificado genéticamente. En algunas modalidades, la célula hospedadora genéticamente modificada es una PSC de vertebrado (por ejemplo, ESC, iPSC, etc.) y se utiliza para generar un organismo modificado genéticamente (por ejemplo, inyectando una PSC en un blastocisto para producir un animal quimérico/mosaico, que luego se aparearían para generar organismos no quiméricos/no mosaicos modificados genéticamente; injertos, en el caso de las plantas; etc.). Cualquier método/protocolo conveniente para producir un organismo modificado genéticamente, inclusive los métodos descritos en la presente, son adecuados para producir una célula hospedadora modificada genéticamente que comprende un ácido nucleico exógeno que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido modificador dirigido al sitio (por ejemplo, una Cas9 de origen natural; una Cas9 modificada, es decir, mutada o variante; una Cas9 quimérica; etc.). Son conocidos en la téenica los métodos para producir organismos modificados genéticamente. Por ejemplo, ver Cho et ál., Curr Protoc Cell Biol. Marzo 2009; Capitulo 19:Unidad 19.11: Generation of transgenic mice; Gama et ál., Brain Struct Funct. Marzo 2010; 214(2-3):91-109. Pub. ele.2009 Nov 25: Animal transgenesis: an overview; Husaini et ál., GM Crops. Jun-dic 2011;2(3):150-62. Pub. ele. 2011 Jun 1: Approaches for gene targeting and targeted gene expression in plants.
En algunas modalidades, un organismo modificado genéticamente comprende una célula objetivo para métodos de la invención y puede, por lo tanto, considerarse una fuente de células objetivo. Por ejemplo, si se utiliza una célula modificada genéticamente que comprende un ácido nucleico exógeno que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido modificador dirigido al sitio (por ejemplo, una Cas9 de origen natural; una Cas9 modificada, es decir, mutada o variante; una Cas9 quimérica; etc.) para generar un organismo modificado genéticamente, entonces las células del organismo modificado genéticamente comprenden el ácido nucleico exógeno que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido modificador dirigido al sitio (por ejemplo, una Cas9 de origen natural; una Cas9 modificada, es decir, mutada o variante; una Cas9 quimérica; etc.). En algunas de estas modalidades, el ADN de una célula o células del organismo modificado genéticamente pueden dirigirse para la modificación mediante la introducción en la célula o células de un ARN dirigido a ADN (o un ADN que codifica un ARN dirigido a ADN) .y opcionalmente un ácido nucleico donante. Por ejemplo, la introducción de un ARN dirigido a ADN (o un ADN que codifica a un ARN dirigido a ADN) en un subconjunto de células (por ejemplo, células cerebrales, células intestinales, células de riñón, células pulmonares, células sanguíneas, etc.) del organismo modificado genéticamente puede dirigirse al ADN de dichas células para la modificación, donde la ubicación genómica de estas dependerá de la secuencia dirigida a ADN del ARN dirigido a ADN.
En algunas modalidades, un organismo modificado genéticamente es una fuente de células objetivo para los métodos de la invención. Por ejemplo, un organismo modificado genéticamente que comprende células que están modificadas genéticamente con un ácido nucleico exógeno que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido modificador dirigido al sitio (por ejemplo, una Cas9 de origen natural; una Cas9 modificada, es decir, mutada o variante; una Cas9 quimérica; etc.) puede proporcionar una fuente de células modificadas genéticamente, por ejemplo, PSC (por ejemplo, ESC, iPSC, esperma, ovocitos, etc.), neuronas, células progenitoras, cardiomiocitos, etc.
En algunas modalidades, una célula modificada genéticamente es una PSC que comprende un ácido nucleico exógeno que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido modificador dirigido al sitio (por ejemplo, una Cas9 de origen natural; una Cas9 modificada, es decir, mutada o variante; una Cas9 quimérica; etc.)· Como tal, la PSC puede ser una célula objetivo tal que el ADN de la PSC puede ser dirigida para la modificación, mediante la introducción de ARN dirigido a ADN (o un ADN que codifica un ARN dirigido a ADN) en la PSC y, opcionalmente, un ácido nucleico donante, y la ubicación genómica de la modificación dependerá de la secuencia dirigida a ADN del ARN dirigido a ADN introducido. Por lo tanto, en algunas modalidades, los métodos descritos en la presente pueden utilizarse para modificar el ADN (por ejemplo, eliminar y/o reemplazar cualquier ubicación genómica) de las PSC derivadas de un organismo modificado genéticamente de la invención. Dichas PSC modificadas pueden utilizarse entonces para generar organismos que tengan (i) un ácido nucleico exógeno que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido modificador dirigido al sitio (por ejemplo, una Cas9 de origen natural; una Cas9 modificada, es decir, mutada o variante; una Cas9 quimérica; etc.) y (ii) una modificación de ADN que se introdujo en la PSC.
Un ácido nucleico exógeno que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido modificador dirigido al sitio (por ejemplo, una Cas9 de origen natural; una Cas9 modificada, es decir, mutada o variante; una Cas9 quimérica; etc.) puede estar bajo el control de (es decir, enlazado operativamente a) un promotor desconocido (por ejemplo, cuando el ácido nucleico se integra aleatoriamente en el genoma de una célula hospedadora) puede estar bajo el control de (es decir, enlazado operativamente a) un promotor conocido. Los promotores adecuados conocidos pueden ser cualquier promotor conocido e incluir promotores constitutivamente activos (por ejemplo, promotor CMV), promotores inducibles (por ejemplo, promotor de shock térmico, promotor regulado por tetracielina, promotor regulado por esteroides, promotor regulado por metales, promotor regulado por estrógenos, etc.), promotores restringidos espacialmente y/o restringidos temporalmente (por ejemplo, un promotor especifico al tejido, un promotor especifico al tipo de célula, etc.), etc.
Un organismo modificado genéticamente de la invención (por ejemplo, un organismo cuyas células comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido modificador dirigido al sitio, por ejemplo, una Cas9 de origen natural; una Cas9 modificada, es decir, mutada o variante; una Cas9 quimérica; etc.) puede ser cualquier organismo que incluye, por ejemplo, una planta; alga; un invertebrado (por ejemplo, un enidario, un equinodermo, un gusano, una mosca, etc.); un I vertebrado (por ejemplo, un pez (por ejemplo, pez cebra, pez globo, carpín dorado, etc.) un anfibio (por ejemplo, salamandra, rana, etc.), un reptil, un ave, un mamífero, etc.); un ungulado (por ejemplo, una cabra, un cerdo, una oveja, una vaca, etc.); un roedor (por ejemplo, un ratón, una rata, un hámster, un cobayo), un lagomorfo (por ejemplo, un conejo); etc.
En algunos casos, el polipéptido modificador dirigido al sitio coiriprende una secuencia de aminoácidos con al menos alrededor de 75 %, al menos alrededor de 80 %, al menos alrededor de 85 %, al menos alrededor de 90 %, al menos alrededor de 95 %, al menos alrededor de 99 %, o 100 % de identidad de secuencia de aminoácidos con los aminoácidos 7-166 o 731-1003 de la secuencia de aminoácidos Cas9/Csnl ilustrada en la Figura 3 o a las partes correspondientes en cualquiera de las secuencias de aminoácidos establecidas como SEQ ID NO: 1-256 y .795-1346.
Animales no humanos transgénicos Tal como se describe anteriormente, en algunas modalidades, un ácido nucleico de la invención (por ejemplo, una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido modificador dirigido al sitio, por ejemplo, una Cas9 de origen natural; una Cas9 modificada, es decir, mutada o variante; una Cas9 quimérica; etc.) o un vector de expresión recombinante de la invención se utilizan como un transgén para generar un animal transgénico que produce un polipéptido modificador dirigido al sitio. Por lo tanto, la presente invención proporciona además un animal no humano transgénico, donde dicho animal comprende un transgén que comprende un ácido nucleico de la invención que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido modificador dirigido al sitio, por ejemplo, una Cas9 de origen natural; una Cas9 modificada, es decir, mutada o variante; una Cas9 quimérica; etc., según se describe anteriormente. En algunas modalidades, el genoma del animal no humano transgénico comprende una secuencia de nucleótidos de la invención que codifica un polipéptido modificador dirigido al sitio. En algunas modalidades, el animal no humano transgénico es homocigoto para la modificación genética. En algunas modalidades, el animal no humano transgénico es heterocigoto para la modificación genética. En algunas modalidades, el animal no humano transgénico es un vertebrado, por ejemplo, un pez (pez cebra, carpin dorado, pez globo, pez de cueva, etc.), un anfibio (rana, salamandra, etc.), un ave (por ejemplo, pollo, pavo, etc.), un reptil (por ejemplo, serpiente, lagartija, etc.), un mamífero (por ejemplo, un ungulado, por ejemplo, un cerdo, una vaca, una cabra, una oveja, etc.; un lagomorfo (por ejemplo, un conejo); un roedor (por ejemplo, una rata, un ratón); un primate no humano; etc.), etc.
Un ácido nucleico exógeno que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido modificador dirigido al sitio (por ejemplo, una Cas9 de origen natural; una Cas9 modificada, es decir, mutada o variante; una Cas9 quimérica; etc.) puede estar bajo el control de (es decir, enlazado operativamente a) un promotor desconocido (por ejemplo, cuando el ácido nucleico se integra aleatoriamente en ·el genoma de una célula hospedadora) puede estar bajo el control de (es decir, enlazado operativamente a) un promotor conocido. Los promotores adecuados conocidos pueden ser cualquier promotor conocido e incluir promotores constitutivamente activos (por ejemplo, promotor CMVj, promotores inducibles (por ejemplo, promotor de shock térmico, promotor regulado por tetracielina, promotor regulado por esteroides, promotor regulado por metales, promotor regulado por estrógenos, etc.), promotores restringidos espacialmente y/o restringidos temporalmente (por ejémplo, un promotor específico al tejido, un promotor específico al tipo de célula, etc.), etc.
En algunos casos, el polipéptido modificador dirigido al sitio comprende una secuencia de aminoácidos con al menos alrededor de 75 %, al menos alrededor de 80 %, al menos alrededor de 85 %, al menos alrededor de 90 %, al menos alrededor de 95 %, al menos alrededor de 99 %, o 100 % de identidad de secuencia de aminoácidos con los aminoácidos 7-166 o 731-1003 de la secuencia de aminoácidos Cas9/Csnl ilustrada en la Figura 3 o a las partes correspondientes en cualquiera de las secuencias de aminoácidos establecidas como SEQ ID NO: 1-256 y 795-1346.
Plantas transgénicas Tal comp se describe anteriormente, en algunas modalidades, un ácido nucleico de la invención (por ejemplo, una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido modificador dirigido al sitio, por ejemplo, una Cas9 de origen natural; una Cas9 modificada, es decir, mutada o variante; una Cas9 quimérica; etc.) o un vector de expresión recombinante de la invención se utilizan como un transgén para generar una planta transgénica que produce un polipéptido modificador dirigido al sitio. Por lo tanto, la presente invención proporciona además una planta transgénica, donde dicha planta comprende un transgén que comprende un ácido nucleico de la invención que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido modificador dirigido al sitio, por ejemplo, una Cas9 de origen natural; una Cas9 modificada, es decir, mutada o variante; una Cas9 quimérica; etc., según se describe anteriormente. En algunas modalidades, el genoma de la planta transgénica comprende un ácido nucleico de la invención. En algunas modalidades, la planta transgénica es homocigota para la modificación genética. En algunas modalidades, la planta transgénica es heterocigota para la modificación genética.
Son conocidos en la téenica los métodos para introducir ácidos nucleicos exógenos en células vegetales. Dichas células vegetales se consideran "transformadas", según se definió anteriormente. Los métodos adecuados incluyen infección viral (tales como virus de ADN de cadena doble), transfección, conjugación, fusión de protoplastos, electroporación, tecnología de cañón de partículas, precipitación de fosfato de calcio, microinyección directa, tecnología de agitación de carburo de silicio, transformación mediada por Agrobacterium y similares. La elección del método generalmente depende del tipo de célula que se está transformando y las circunstancias en las cuales se lleva a cabo la transformación (es decir, in vitro, ex vivo o in vivo).
Los métodos de transformación que se basan en la bacteria de suelo Agrobacterium tumefaciens son particularmente útiles para introducir una molécula de ácido nucleico exógeno en una planta vascular. La forma de tipo salvaje de Agrobacterium contiene un plásmido Ti (que induce tumores) que direcciona la producción del crecimiento de agalla de corona tumorigénica en plantas hospedadoras. La transferencia de la región de ADN-T que induce tumores del plásmido Ti a genoma vegetal requiere los genes de virulencia codificados por plásmidos, asi como las fronteras de ADN-T, las cuales son un conjunto de repeticiones de ADN que delinean la región que será transferida. Un vector basado en Agrobacterium es una forma modificada de un plásmido Ti, donde las funciones que inducen tumores son reemplazadas por la secuencia de ácido nucleico de interés que será introducida en el hospedador vegetal.
La transformación mediada por Agrobacterium generalmente emplea vectores cointegrado o sistemas de vectores binarios, donde los componentes del plásmido Ti se dividen entre un vector auxiliar, el cual reside permanentemente en el hospedador de Agrobacterium y porta los genes de virulencia y un vector transportador, el cual contiene el gen de interés delimitado por secuencias de ADN-T. Son conocidos en la téenica una variedad de vectores binarios y están comercialmente disponibles, por ejemplo en Clontech (Palo Alto, Calif.). También son conocidos en la técnica los métodos de cocultivo de Agrobacterium con células vegetales cultivadas o tejido lesionado tal como tejido de hoja, explantes de raíz, hipocotiledóneas, piezas de tallo o tubérculos, por ejemplo. Ver, por ejemplo, Glick and Thompson, (eds.), Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Boca Ratón, Fia.: CRC Press (1993).
La transformación mediada por microproyectiles también puede usarse para producir una planta transgénica de la invención. Este método, descrito por primera vez por Klein et ál.
( Nature 327:70-73 (1987)), se basa en microproyectiles tales como oro o tungsteno que se recubren con la molécula de ácido nucleico deseada mediante precipitación con cloruro de calcio, espermidina o polietilenglicol, Las partículas de microproyectil se aceleran a alta velocidad en un tejido de angiospermas utilizando un dispositivo como el BIOLISTIC PD-1000 (Biorad; Hercules Calif.)· Un ácido nucleico de la invención puede introducirse en una planta de forma tal que el ácido nucleico pueda ingresar en una o más células vegetales, por ejemplo, a través de un protocolo in vivo o ex vivo. Por "in vivo” se entiende que el ácido nucleico se administra a un cuerpo vivo de una planta, por ejemplo, infiltración. Por "ex vivo" se entiende que las células o explantes se modifican fuera de la planta y luego dichas células u órganos se regeneran a una planta. Una cantidad de vectores adecuados para transformación estable de células vegetales o para el establecimiento de plantas transgénicas se han descrito, inclusive aquellos descritos en Weissbach and Weissbach, (1989) Methods for Plant Molecular Biology Academic Press, y Gelvin et ál., (1990) Plant Molecular Biology Manual, Kluwer Academic Publishers. Los ejemplos específicos incluyen aquellos derivados de un plásmido Ti de Agrobacterium tumefaciens, así como aquellos descritos por Herrera-Estrella et ál. (1983) Nature 303: 209, Bevan (1984) Nucí Acid Res. 12: 8711-8721, Klee (1985) Bio/Technolo 3: 637-642. De manera alternativa, los vectores que no son de Ti pueden utilizarse para transferir el ADN a las plantas y células mediante téenicas de administración libre de ADN. Mediante la utilización de estos métodos, pueden producirse plantas transgénicas tales como trigo, arroz (Christou (1991) Bio/Technology 9:957-9 y 4462) y maíz (Gordon-Kamm (1990) Plant Cell 2: 603-618). Un embrión inmaduro también puede ser un buen tejido objetivo para monocotileidóneas para téenicas de administración directa de ADN utilizando el cañón de partículas (Weeks et ál. (1993) Plant Physiol 102: 1077-1084; Vasil (1993) Bio/Technolo 10: 667-674; Wan and Lemeaux (1994) Plant Physiol 104: 37-48 y para la transferencia de ADN mediada por Agrobacterium (Ishida et ál. (1996) Nature Biotech 14: 745-750). Los ejemplos de métodos para la introducción de ADN en cloroplastos son el bombardeo biolístico, transformación de polietilenglicol de cloroplastos y microinyección (Danieli et ál Nat. Biotechnol 16:345-348, 1998; Staub et ál Nat. Biotechnol 18: 333-338, 2000; O'Neill et ál Plant J.3:729-738, 1993; Knoblauch et ál Nat. Biotechnol 17: 906-909; n.° de patente estadounidense 5,451,513, 5,545,817, 5,545,818, y 5,576,198; en la solicitud internacional n.° WO 95/16783; y en Boynton et ál., Methods in Enzymology 217: 510-536 (1993), Svab et ál., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90: 913-917 (1993), y McBride et ál., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91: 7301-7305 (1994)). Cualguier vector adecuado para los métodos de bombardeo biolístico, transformación de polietilenglicol de protoplastos y microinyección será adecuado como un vector de direccionamiento para la transformación de cloroplastos. Cualguier vector de ADN de cadena doble puede utilizarse como un vector de transformación, especialmente cuando el método de introducción no utiliza Agrobacterium.
Las plantas que pueden ser modificadas genéticamente incluyen granos, cosechas de forraje, frutas, vegetales, cosechas de semillas oleaginosas, palmas, bosques y vides. Ejemplos específicos de plantas que pueden modificarse se enumeran a continuación: maíz, banana, maní, guisante forrajero, girasol, tomate, cañóla, tabaco, trigo, cebada, avena, papa, soja, algodón, claveles, sorgo, lupino y arroz.
También se proporcionan en la invención células vegetales transformadas, tejidos, plantas y productos que contienen las células vegetales transformadas. Una característica de las células transformadas de la invención, y de tejidos y productos que incluyen a estas es la presencia de un ácido nucleico de la invención integrado en el genoma, y la producción mediante células vegetales de un polipéptido modificador dirigido al sitio, por ejemplo, una Cas9 de origen natural; una Cas9 modificada, es decir, mutada o variante; una Cas9 quimérica, etc. Las células vegetales recombinantes de la presente invención son útiles como poblaciones de células recombinantes o como un tejido, semilla, planta entera, tallo, fruto, hoja, raíz, flor, tallo, tubérculo, grano, pienso, un campo de plantas y similares.
Un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido modificador dirigido al sitio (por ejemplo, una Cas9 de origen natural; una Cas9 modificada, es decir, mutada o variante; una Cas9 quimérica; etc.) puede estar bajo el control de (es decir, enlazado operativamente a) un promotor desconocido (por ejemplo, cuando el ácido nucleico se integra aleatoriamente en el genoma de una célula hospedadora) puede estar bajo el control de (es decir, enlazado operativamente a) un promotor conocido. Los promotores adecuados conocidos pueden ser cualquier promotor conocido e incluyen promotores constitutivamente activos, promotores inducibles, promotores restringidos espacialmente y/o restringidos temporalmente, etc.
En algunos casos, el polipéptido modificador dirigido al sitio comprende una secuencia de aminoácidos con al menos alrededor de 75 %, al menos alrededor de 80 %,.al menos alrededor de 85 %, al menos alrededor de 90 %, al menos alrededor de 95 %, al menos alrededor de 99 %, o 100 % de identidad de secuencia de aminoácidos con los aminoácidos 7-166 o 731-1003 de la secuencia de aminoácidos Cas9/Csnl ilustrada en la Figura 3 o a las partes correspondientes en cualquiera de las secuencias de aminoácidos establecidas como SEQ ID NO: 1-256 y 795-1346.
A través de la invención se proporciona también material reproductivo de una planta transgénica de la invención, donde el material reproductivo incluye semillas, plantas de progenie y material de clonación.
DEFINICIONES - PARTE II El término "de origen natural" o "no modificado", tal como se usa en la presente, aplicado a un ácido nucleico, un polipéptido, una célula o un organismo, se refiere a un ácido nucleico, polipéptido, célula u organismo que se encuentra en I -223- 1 la naturaleza. Por ejemplo, una secuencia de polipéptidos o polinucleótidos presente en un organismo (incluyendo los virus) que puede aislarse de una fuente de la naturaléza y que no ha sido intencionalmente modificada por un ser humano en el laboratorio es de origen natural.
"Heterólogo", tal como se usa en la presente, significa una secuencia de nucleótidos o polipéptidos que no se encuentra en el ácido nucleico o proteina natural, respectivamente. Por ejemplo, en una variante del polipéptido dirigido al sitio Cas9 de fusión, una variante del polipéptido dirigido al sitio Cas9 puede estar fusionada a un polipéptido heterólogo (es decir, un polipéptido que no sea Cas9). El polipéptido heterólogo puede presentar una actividad (por ejemplo, actividad enzimática) que también la presentará la variante del polipéptido dirigido al sitio Cas9. Una secuencia de ácido nucleico heteróloga puede estar unida a una variante del polipéptido dirigido al sitio Cas9 (por ejemplo, mediante ingeniería genética) para generar una secuencia de nucleótidos que codifica una variante de fusión del polipéptido dirigido al sitio Cas9.
La expresión "polipéptido quimérico" se refiere a un polipéptido que no es de origen natural, por ejemplo, que fue elaborado mediante combinación artificial de dos segmentos de secuencia mediante intervención humana que de otra mera estarían separados. Por lo tanto, un polipéptido quimérico es también el resultado de la intervención humana. De esta forma, un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos quimérica es un polipéptido quimérico.
Por "polipéptido dirigido al sitio", "polipéptido dirigido al sitio de unión al ARN" o "polipéptido dirigido al sitio de unión al ARN" se entiende un polipéptido que se une al ARN y se dirige a una secuencia de ADN especifica. Un polipéptido dirigido al sitio, tal como se describe en la presente, se dirige a una secuencia de ADN especifica mediante la molécula de ARN a la cual se une. La molécula se ARN comprende una secuencia que es complementaria a una secuencia objetivo dentro del ADN objetivo, y de este modo dirige el polipéptido unido a una ubicación especifica dentro del ADN objetivo (la secuencia objetivo).
En algunas modalidades, un ácido nucleico de la invención (por ejemplo, un ARN dirigido a ADN, un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un ARN dirigido a ADN; un ácido nucleico que codifica un polipéptido dirigido al sitio; etc.) comprende una modificación o secuencia que proporciona una característica deseable adicional (por ejemplo, estabilidad modificada o regulada; direccionamiento subcelular; rastreo, por marcado fluorescente; un sitio de unión para una proteína o complejo de proteínas; etc.). Los ejemplos no taxativos incluyen: un casquete 5' (por ejemplo, un casquete 7-metilguanilato (m7G)); una cola poliadenilada 3' (es decir, una cola poli(A) 3'); una secuencia de ribointerruptor (por ejemplo, para permitir estabilidad regulada y/o accesibilidad regulada mediante proteínas y/o complejos de proteínas); una modificación o secuencia que dirige el ARN a una ubicación subcelular (por ejemplo, núcleo, mitocondria, cloroplastos y similares); una modificación o secuencia que proporciona rastreo (por ejemplo, conjugación directa con una molécula fluorescente, conjugación con un resto que facilita la detección fluorescente, una secuencia que permite la detección fluorescente, etc.); una modificación o secuencia que proporciona un sitio de unión para proteínas (por ejemplo, proteínas que actúan en el ADN, incluidos los activadores transcripcionales, represores transcripcionales, ADN metiltransferasas, ADN desmetilasas, histona acetiltransferasas, histona deacetilasas y similares); y combinaciones de estos.
En algunas modalidades, un ARN dirigido a ADN comprende un segmento adicional ya sea en el extremo 5' o 3' que proporciona cualquiera de las características descritas anteriormente. Por ejemplo, un tercer segmento adecuado puede comprender un casquete 5' (por ejemplo, un casquete 7-metilguanilato (m7G)); una cola poliadenilada 3' (es decir, una cola poli(A) 3'); una secuencia de ribointerruptor (por ejemplo, para permitir estabilidad regulada y/o accesibilidad regulada mediante proteínas y complejos de proteínas); una secuencia que dirige el ARN a una ubicación subcelular (por ejemplo, núcleo, mitocondria, cloroplastos y similares); una modificación o secuencia que proporciona rastreo (por ejemplo, conjugación directa con una molécula fluorescente, conjugación con un resto que facilita la detección fluorescente, una secuencia que permite la detección fluorescente, etc.); una modificación o secuencia que proporciona un sitio de unión para proteínas (por ejemplo, proteínas que actúan en el ADN, incluidos los activadores transcripcionales, represores transcripcionales, ADN metiltransferasas, ADN desmetilasas, histona acetiltransferasas, histona deacetilasas y similares); y combinaciones de estos.
Un ARN dirigido a ADN de la invención y un polipéptido polipéptido dirigido al sitio forman un complejo (es decir, se unen por medio de interacciones no covalentes). El ARN dirigido a ADN proporciona especificidad de direccionamiento al complejo, ya que comprende .una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de un ADN objetivo. El polipéptido dirigido al sitio del complejo proporciona la actividad específica del sitio. En otras palabras, el polipéptido dirigido al sitio es guiado a una secuencia ADN objetivo (por ejemplo, una secuencia objetivo en un ácido nucleico cromosómico; una secuencia objetivo en un ácido nucleico extracromosómico, por ejemplo, un ácido nucleico episomal, un minicírculo, etc.; una secuencia objetivo en un ácido nucleico mitocondrial; una secuencia objetivo en un ácido nucleico de cloroplasto; una secuencia objetivo en un plásmido; etc.) mediante su asociación con el segmento de unión a proteínas del ARN dirigido a ADN.
En algunas modalidades, un ARN dirigido a ADN de la invención comprende dos moléculas de ARN separadas (polinucleótidos de ARN) y se menciona en la presente como una "ARN dirigido a ADN de molécula doble" o un "ARN dirigido a ADN de dos moléculas". En otras modalidades, un ARN dirigido a ADN de la invención es una molécula de ARN simple (polinucleótido de ARN simple) y se menciona en la presente como un "ARN dirigido a ADN de molécula simple". De no especificarse lo contrario, la expresión "ARN dirigido a ADN" es inclusiva, refiriéndose tanto a ARN dirigido a ADN de molécula simple como a ARN dirigido a ADN de molécula doble.
Un ARN dirigido a ADN de molécula doble comprende dos moléculas de ARN separadas (un "ARN identificador" y un "ARN activador"). Cada una de las dos moléculas de ARN de un ARN dirigido a ADN de molécula doble de la invención comprende una extensión de nucleótidos que son complementarios entre si, de forma que los nucleótidos complementarios de las dos moléculas de ARN se hibridan para formar el dúplex de ARN de cadena doble del segmento de unión a proteínas.
* Un ARN dirigido a ADN de molécula simple de la invención comprende dos extensiones de nucleótidos (un ARN identificador y un ARN activador) que son complementarios entre sí, están unidos de forma covalente mediante nucleótidos intermedios ("enlazadores" o "nucleótidos enlazadores") y se hibridan para formar el dúplex de ARN de cadena doble (dúplex de ARNcd) del segmento de unión a proteínas, dando como resultado una estructura de tallo-bucle. El ARN identificador y el ARN activador pueden estar unidos covalentemente mediante el extremo 3' del ARN identificador y el extremo 5' del ARN activador. De manera alternativa, el ARN identificador y el ARN activador pueden estar unidos covalentemente mediante el extremo 5' del ARN identificador y el extremo 3' del ARN activador.
Un ejemplo de ARN dirigido a ADN de dos moléculas correspondiente una molécula similar a crRNA ( "ARN CRISPR" o "ARN identificador" o "crRNA" o "repetición de crRNA") y una molécula correspondiente similar a tracrRNA ("ARN CRISPR regulador en trans" o "ARN activador" o "tracrRNA"). Una molécula similar a crRNA (ARN identificador) comprende tanto el segmento dirigido a ADN (cadena simple) del ARN dirigido a ADN y una extensión ("segmento formador de dúplex") de nucleótidos que forma una mitad del dúplex de ARNcd del segmento de unión·a proteínas del ARN dirigido a ADN. Una molécula similar a tracrRNA correspondiente (ARN activador) comprende una extensión de nucleótidos (segmento formador de dúplex) que forma la otra mitad del dúplex de ARNcd del segmento de unión a proteínas del ARN dirigido a ADN. En otras palabras, una extensión de nucleótidos de una molécula similar a crRNA es complementaria y se híbrida con una extensión de nucleótidos de una molécula similar a tracrRNA para formar el dúplex de ARNcd del dominio de unión a proteínas del ARN dirigido a ADN. Como tal, cada molécula similar a crRNA puede decirse que tiene una molécula similar a tracrRNA correspondiente. La molécula similar a crRNA proporciona adicionalmente el segmento dirigido a ADN de cadena simple. Por lo tanto, una molécula similar a crRNA y similar a tracrRNA (como un par correspondiente) se hibridan para formar un ARN dirigido a ADN. La secuencia exacta de una molécula de crRNA o tracrRNA dada es una característica de la especia en la cual se encuentran las moléculas de ARN.
El término "ARN activador" se usa en la presente con el significado de una molécula similar a tracrRNA de un ARN dirigido a ADN de molécula doble. El término "ARN identificador" se usa en la presente con el significado de una molécula similar a crRNA de un ARN dirigido a ADN de molécula doble. El término "segmento formador de dúplex" se usa en la presente con el significado de la extensión de nucleótidos de uti ARN activador o un ARN identificador que contribuye a la formación del dúplex de ARNcd mediante la hibridación con una extensión de nucleótidos de una molécula de ARN activador o ARN identificador correspondiente. En otras palabras, un ARN activador comprende un segmento formador de dúplex que es complementario al segmento formador de dúplex del ARN identificador correspondiente. Como tal, un ARN activador comprende un segmento formador de dúplex mientras que un ARN identificador comprende tanto un segmento formador de dúplex como el segmento dirigido a ADN del ARN dirigido a ADN. Por lo tanto, un ARN dirigido a ADN de molécula doble de la invención puede comprender cualquier par de ARN activador y ARN identificador correspondiente.
Un ARN dirigido a ADN de molécula doble puede diseñarse para permitir la unión controlada (es decir, condicional) de un ARN identificador con un ARN activador. Dado que un ARN dirigido a ADN de molécula doble no es funcional a menos que el ARN activador y el ARN identificador estén unidos en un complejo funcional con dCas9, un ARN dirigido a ADN de molécula doble puede ser inducible (por ejemplo, inducible por fármacos) provocando que la unión entre el ARN activador y el ARN identificador sea inducible. Como un ejemplo no taxativo, los aptámeros de ARN pueden usarse para regular (es decir,. controlar) la unión del ARN activador con el ARN identificador. Por consiguiente, el ARN activador y/o el ARN identificador pueden comprender una secuencia de aptámero de ARN.
Los aptámeros de ARN son conocidos en la téenica y generalmente son una versión sintética de un ribointerruptor. Las expresiones "aptámero de ARN" y "ribointerruptor" se usan de manera intercambiable en la presente para abarcar secuencias de ácido nucleico sintéticas y naturales que proporcionan regulación inducible de la estructura (y por lo tanto la disponibilidad de las secuencias especificas) de la molécula de ARN de la que son parte. Los aptámeros normalmente comprenden una secuencia que se pliega en una estructura en particular (por ejemplo, una horquilla), la cual une específicamente a un fármaco en particular (por ejemplo, a una molécula pequeña). La unión del fármaco provoca un cambio estructural en el pliegue del ARN, el cual cambia una característica del ácido nucleico del cual es parte el aptámero. Como ejemplos no taxativos: (i) un ARN activador con un aptámero puede no ser capaz de unirse al ARN identificador cognado a menos que el aptámero se una.mediante el fármaco adecuado; (ii) un ARN identificador con un aptámero puede no ser capaz de unirse al ARN activador cognado a menos que el aptámero se una mediante el fármaco adecuado; y (iii) un ARN identificador y un ARN activador, cada uno de ellos con un aptámero diferente que se una a un fármaco diferente, pueden no ser capaces de unirse entre sí a menos que estén presentes ambos fármacos. Tal como se ilustra en estos ejemplos, un ARN dirigido a ADN de molécula doble puede diseñarse para ser inducible.
Pueden encontrarse ejemplos de aptámeros y ribointerruptores, por ejemplo, en: Nakamura et ál., Genes Cells. Mayo de 2012; 17 (5):344-6 ; Vavalle et ál., Future Cardiol. Mayo de 2012; 8(3):371-82; Citartan et ál., Biosens Bioelectron. 15 de abril de 2012; 34(1):1-11; y Liberman et ál., Wilcy Interdiscip Rev RNA. 2012 May-Jun;3(3):369-84; todas las cuales se incorporan a la presente en su totalidad mediante referencia.
Los ejemplos no taxativos de secuencias de nucleótidos que pueden incluirse en un ARN dirigido a ADN de molécula doble incluyen ARN identificadores (por ejemplo, las SEQ ID NO: 566-567) que pueden emparejarse con el segmento formador de dúplex de cualquiera de los ARN activadores establecidos en las SEQ ID NO: 671-678.
Un ejemplo de ARN dirigido a ADN de molécula simple comprende dos extensiones complementarias de nucleótidos que se hibridan para formar un dúplex de ARNcd. En algunas modalidades, una de las dos extensiones complementarias de nucleótidos del ARN dirigido a ADN de molécula simple (o el ADN que codifica la extensión) es al menos alrededor de 60 % idéntica a una de las secuencias de ARN activador (tracrRNA) establecidas en las SEQ ID NO: 431-562 en una extensión de al menos 8 nucleótidos contiguos. Por ejemplo, una de las dos extensiones complementarias de nucleótidos de ARN dirigido a ADN de molécula simple (o el ADN que codifica la extensión) es idéntico en al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 %, al menos un 99 % o 100 % idéntico a una de las secuencias de tracrRNA establecidas en las SEQ ID NO: 431-562 en una extensión de al menos 8 nucleótidos contiguos.
En algunas modalidades, una de las dos extensiones complementarias de nucleótidos del ARN dirigido a ADN de molécula simple (o el ADN que codifica la extensión) es al menos alrededor de 60 % idéntica a una de las secuencias de ARN identificador (crRNA) establecidas en las SEQ ID NO: 563-679 en una extensión de al menos 8 nucleótidos contiguos. Por ejemplo, una de las dos extensiones complementarias de nucleótidos de ARN dirigido a ADN de molécula simple (o el ADN que codifica la extensión) es idéntico en al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 %, al menos un 99 % o 100 % idéntico a una de las secuencias de crRNA establecidas en las SEQ ID NO: 563-679 en » una extensión de al menos 8 nucleótidos contiguos.
De la misma forma que se definió anteriormente, una "célula hospedadora", tal como se usa en la presente, indica una célula eucariota, una célula procariota (por ejemplo, célula bacteriana o de arquea), o una célula de un organismo multicelular (por ejemplo, linea celular) in vivo o in vitro cultivada como una entidad unicelular, cuyas células eucariotas o procariotas pueden ser, o haber sido, usadas como receptores para un ácido nucleico, e incluyen la progenie de la célula original a partir de la cual fueron transformadas por medio del ácido nucleico. Se entiende que -la progenie de una célula individual puede no necesariamente ser completamente idéntica en morfología o en la genómica o complemento de ADN total al progenitor original, debido a mutaciones naturales, accidentales o deliberadas. Una "célula hospedadora recombinante" (también mencionada como una "célula hospedadora modificada genéticamente") es una célula hospedadora en la cual se ha introducido un ácido nucleico heterólogo, por ejemplo, un vector de expresión. Por ejemplo, una célula hospedadora bacteriana de la invención es una célula hospedadora bacteriana modificada genéticamente por medio de la introducción en una célula hospedadora bacteriana adecuada de un ácido nucleico exógeno (por ejemplo, un plásmido o vector de expresión recombinante) y una célula ! hospedadora eucariota de la invención es una célula hospedadora eucariota modificada genéticamente (por ejemplo, una célula germinal de mamífero) por medio de la introducción en una célula hospedadora eucariota adecuada de un ácido nucleico exógeno.
Las definiciones proporcionadas en "Definiciones - Parte I" también se aplican en la presente sección; véase "Definiciones - Parte I" para una clarificación adicional de los términos.
Antes de describir la presente invención en más detalle, se deberá entender que esta invención no está limitada a las modalidades particulares descritas, ya que estas pueden evidentemente variar. También debe entenderse que la terminología usada en la presente tiene el fin de describir solamente modalidades particulares y no pretende ser limitativa ya que el alcance de la presente invención estará limitadb solamente por las reivindicaciones adjuntas.
Mientras que se proporciona un intervalo de valores, se deberá entender que cada valor involucrado, hasta la décima de la unidad del limite inferior salvo que el contexto claramente establezca lo contrario, entre el limite superior e inferior de ese intervalo y cualquier otro valor establecido o involucrado en ese intervalo establecido, están comprendidos dentro de la invención. Los limites superior e inferior de estos intervalos más pequeños pueden estar incluidos independientemente en los intervalos más pequeños y también están comprendidos dentro de la invención, sujeto a cualquier limite específicamente excluido en el intervalo establecido. Cuando el intervalo establecido incluye uno o ambos de los límites, los intervalos que excluyan cualesquiera o ambos límites incluidos también se incluyen en la invención.
A menos que se indique de otro modo, todos los términos téenicos y científicos utilizados en la presente tienen el mismo significado según lo entiende comúnmente un experto en la técnica a la que pertenece la presente invención. Si bien en la práctica o prueba de la presente invención también se puede utilizar cualquier método y material similar o equivalente a los descritos en la presente, a continuación se describen los métodos y materiales preferidos. Todas las publicaciones que se mencionan en la ptesente se incorporan a la misma mediante esta referencia para divulgar y describir los métodos y/o materiales en relación con los cuales se citan las publicaciones.
Debe observarse que tal como se usa aquí y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una" y "el/la", incluyen los referentes plurales salvo que se exprese claramente lo contrario en el contexto. Por lo tanto, por ejemplo, la referencia a "un polipéptido Cas9 enzi áticamente inactivo" incluye una pluralidad de dichos polipéptidos y la referencia "al ácido nucleico objetivo" incluye la referencia a uno o más ácidos nucleicos objetivo y equivalentes de estos conocidos por los expertos en la téenica, etc. Se observa además que las reivindicaciones pueden ser redactadas de forma que excluyan cualquier elemento opcional. Como tal, esto pretende ser una base antecedente para el uso de dicha terminología exclusiva tal como "solamente", "únicamente" y similares con relación a la enumeración de los elementos de las reivindicaciones o el uso de una limitación "negativa".
Se entiende que algunas características de la invención que, a los efectos de la claridad, se describen en el contexto de modalidades separadas, también se pueden proporcionar en combinación en una sola modalidad. De manera inversa, diversas características de la invención que, a efectos de brevedad, se describen en el contexto de una sola modalidad, también se pueden proporcionar por separado o en cualquier subcombinación adecuada. Todas las combinaciones de las modalidades pertenecientes a la invención se encuentran específicamente comprendidas dentro de la presente invención y se describen en la presente como si cada combinación estuviese individual y específicamente descrita. Además, todas las subcombinaciones de las varias modalidades y elementos de estas también se encuentran específicamente comprendidas dentro de la presente y se describen en la presente como si cada dicha subcombinación estuviese individual y específicamente descrita en la presente.
Las publicaciones que se analizan en la presente se proporcionan únicamente para su divulgación antes de la fecha de presentación de la presente solicitud. Ningún contenido de la presente debe interpretarse como una admisión de que la presente invención no tiene derecho a preceder a dicha publicación en virtud de invención anterior. Además, las fechas de publicación proporcionadas pueden no coincidir con las fechas de publicación reales, las que puede ser necesario confirmar independientemente.
DESCRIPCIÓN DETALLADA - PARTE II La presente descripción proporciona métodos para regular la transcripción de un ácido nucleico objetivo en una célula hospedadora. Los métodos generalmente involucran poner en contacto el ácido nucleico objetivo con un polipéptido Cas9 enzimáticamente inactivo y un ARN simple guia. Los métodos son útiles en una variedad de aplicaciones, que también se proporcionan.
Un método de modulación transcripcional de la presente descripción supera algunas de las desventajas de métodos que involucran ribointerferencia. Un método de modulación transcripcional de la presente descripción puede utilizarse en una gran variedad de aplicaciones, inclusive solicitudes de investigación, descubrimiento de fármacos (por ejemplo, análisis de alto rendimiento), validación de objetivos, aplicaciones industriales (por ejemplo, modificación genética de cultivos; modificación genética de bacterias, etc.), aplicaciones de diagnóstico, aplicaciones terapéuticas y téenica de imaginologia.
METODOS PARA MODULAR LA TRANSCRIPCION La presente descripción proporciona un método para modular la transcripción de forma selectiva de un ADN objetivo en una célula hospedadora. El método generalmente involucra: a) introducir en la célula hospedadora: i) un ARN dirigido a ADN o un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica al ARN dirigido a ADN; y ii) un variante del polipéptido dirigido al sitio Cas9 ( "polipéptido Cas9 variante") o un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido Cas9 variante, donde el polipéptido Cas9 variante presenta actividad de endodesoxirribonucleasa reducida.
El ARN dirigido a ADN (al que también se hace referencia en la presente como "crRNA", "ARN guia" o "ARNg") comprende: i) un primer segmento que comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia objetivo en un ADN objetivo; ii) un segundo segmento que interactúa con un polipéptido dirigido al sitio; y iii) un terminador transcripcional. Se hace referencia en la presente al primer segmento, que comprende una secuencia de nucleótidos que es compleméntaria a la secuencia objetivo en un ADN objetivo, como "segmento direccionador". Se hace referencia en la presente al segundo segmento, el cual interactúa con un polipéptido dirigido al sitio, como "secuencia de unión a proteínas", "horquilla de unión a dCas9" o "asa de dCas9". "Segmento" significa un segmento/sección/región de una molécula, por ejemplo, una extensión continua de nucleótidos en un ARN. La definición de "segmento", a menos que se defina lo contrario en un contexto específico, no se limita a una cantidad específica de pares de base totales, y puede incluir regiones de moléculas de ARN que tiene cualquier longitud total y pueden o no incluir regiones con complementariedad a otras moléculas. Un ARN dirigido a ADN de acuerdo con la presente descripción puede ser una molécula de ARN simple (polinucleótido de ARN simple) al que se puede hacer referencia como un "ARN dirigido a ADN de molécula simple", un "ARN simple guía" o un "ARNsg". Un ARN dirigido a ADN de acuerdo con la presente descripción puede comprender dos moléculas de ARN. La expresión "ARN dirigido a ADN" o "ARNg" es inclusiva y hace referencia tanto a ARN dirigidos a ADN de molécula doble y a ARN dirigidos a ADN de molécula simple (es decir, ARNsg).
La variante del polipéptido dirigido al sitio Cas9 comprende: i) una parte de unión a ARN que interactúa con el ARN dirigido a ADN; y ii) una parte de actividad que presenta actividad de endodesoxirribonucleasa reducida.
El ARN dirigido a ADN y el polipéptido Cas9 variante forman un complejo en la célula hospedadora; el complejo modula selectivamente la transcripción de un ADN objetivo en la célula hospedadora.
En algunos casos, un método de modulación de la transcripción de la presente descripción proporciona modulación selectiva (por ejemplo, reducción o aumento) de un ácido nucleico objetivo en una célula hospedadora. Por ejemplo, la reducción "selectiva" de la transcripción de un ácido nucleico objetivo reduce la transcripción del ácido nucleico objetivo en al menos alrededor de 10 %, al menos alrededor de 20 %, al menos alrededor de 30 %, al menos alrededor de 40 %, al menos alrededor de 50 %, al menos alrededor de 60 %, al menos alrededor de 70 %, al menos alrededor de 80 %, al menos alrededor de 90 % o más de 90 %, en comparación con el nivel de transcripción del ácido nucleico objetivo ante la ausencia de un complejo de ARN dirigido a ADN/polipéptido Cas9 variante. La reducción selectiva de la transcripción de un ácido nucleico objetivo reduce la transcripción del ácido nucleico objetivo, pero no reduce sustancialmente la transcripción de un ácido nucleico no objetivo, por ejemplo, la transcripción de un ácido nucleico no objetivo se reduce, de reducirse, en menos de 10 % en comparación con el nivel de transcripción del ácido nucleico no objetivo ante la ausencia del complejo de ARN dirigido a ADN/polipéptido Cas9 variante.
Aumento de la transcripción E1 aumento "selectivo" de la transcripción de un ADN objetivo puede aumentar la transcripción del ADN objetivo en al menos alrededor de 1,1 veces (por ejemplo, al menos alrededor de 1,2 veces, al menos alrededor de 1,3 veces, al menos alrededor de 1,4 veces, al menos alrededor de 1,5 veces, al menos alrededor de 1,6 veces, al menos alrededor de 1,7 veces, al menos alrededor de 1,8 veces, al menos alrededor de 1,9 veces, al menos alrededor de 2 veces, al menos alrededor de 2,5 veces, al menos alrededor de 3 veces, al menos alrededor de 3,5 veces, al menos alrededor de 4 veces, al menos alrededor de 4,5 veces, al menos alrededor de 5 veces, al menos alrededor de 6 veces, al menos alrededor de 7 veces, al menos alrededor de 8 veces, al menos alrededor de 9 veces, al menos alrededor de 10 veces, al menos alrededor de 12 veces, al menos alrededor de 15 veces, al menos alrededor de 20 veces) en comparación con el nivel de transcripción del ADN objetivo ante la ausencia de un complejo de ARN dirigido a ADN/polipéptido Cas9 variante. El aumento selectivo de la transcripción de un ADN objetivo aumenta la transcripción del ADN objetivo, pero no aumenta la transcripción de manera sustancial de un ADN no objetivo, por ejemplo, la transcripción de un ADN no objetivo aumenta, de aumentar, menos de alrededor de 5 veces (por ejemplo, menos de alrededor de 4 veces, menos de alrededor de 3 veces, menos de alrededor de 2 veces, menos de alrededor de 1,8 veces, menos de alrededor de 1,6 veces, menos de alrededor de 1,4 veces, menós de alrededor de 1,2 veces, menos de alrededor de 1,1 veces) en comparación con el nivel de transcripción del ADN no objetivo ante la ausencia del complejo ADN dirigido a ARN/polipéptido Cas9 variante.
Como un ejemplo no taxativo, el aumento puede alcanzarse mediante la fusión de dCas9 a una secuencia heteróloga. Los compañeros de fusión adecuados incluyen, de modo no taxativo, un polipéptido que proporciona una actividad que aumenta la transcripción de manera indirecta al actuar de manera directa sobre el ADN objetivo o sobre un polipéptido (por ejemplo, una histona u otra proteina de unión a ADN) asociado con el ADN objetivo. Los compañeros de fusión adecuados incluyen, de modo no taxativo, un polipéptido que proporciona actividad de metiltransferasa, actividad de desmetilasa, actividad de acetiltransferasa, actividad de deacetilasa, actividad de cinasa, actividad de fosfatasa, actividad de ubiquitina ligasa, actividad desubiquitinante, actividad de adenilación, actividad de desadenilación, actividad de SUMOilación, actividad de deSUMOilación, actividad de ribosilación, actividad de desribosilación, actividad de miristoilación o actividad de demiristoilación.
Los compañeros de fusión adicionales adecuados incluyen, de modo no taxativo, un polipéptido que proporciona, de manera indirecta, el aumento de la transcripción del ácido nucleico objetivo (por ejemplo, un activador de la transcripción o un fragmento de este, una proteina o fragmento de este que recluta un activador de la transcripción, un regulador de la transcripción que responde a fármacos/de molécula pequeña, etc.).
Un ejemplo no taxativo de un método de la invención que utiliza una proteina de fusión dCas9 para aumentar la transcripción en una procariota incluye una modificación del sistema bacteriano de un híbrido (B1H) o de doble híbrido (B2H). En el sistema B1H, un dominio de unión (BD, por sus siglas en inglés) a ADN se fusiona a un dominio de activación de la transcripción bacteriana (AD, por sus siglas en inglés, por ejemplo, la subunidad alfa de la ARN polimerasa de Escherichia coli (RNAPa)). Por lo tanto, un dCas9 de la invención puede fusionarse a una secuencia heteróloga que comprende un AD. Cuando la proteina de fusión dCas9 de la invención llega a la región anterior de un promotor (dirigido allí por el ARN dirigido a ADN), el AD (por ejemplo, RNAPa) de una proteina de fusión dCas9 recluta a la holoenzima de RNAP, lo que lleva a la activación de la transcripción. En el sistema B2H, el BD no está fusionado directamente al AD; en cambio, su interacción está mediada por una interacción proteina-proteina (por ejemplo, interacción GAL11P - GAL4). Para modificar dicho sistema para su uso en los métodos de la invención, dCas9 puede fusionarse a una primera secuencia de proteínas que proporciona interacción proteina-proteina (por ejemplo, la proteína de levadura GAL11P y/o GAL4) y el RNAa puede fusionarse a una segunda secuencia de proteínas que completa la interacción proteina-proteina (por ejemplo, GAL4 si GAL11P se fusiona a dCas9, GAL11P Si GAL4 se fusiona a dCas9, etc.). La afinidad de unión entre GAL11P y GAL4 aumenta la eficacia de la tasa de activación de transcripción y unión.
Un ejemplo no taxativo de un método de la invención que utiliza una proteína de fusión dCas9 para aumentar la transcripción en una eucariota incluye la fusión de dCas9 a un dominio de activación (AD) (por ejemplo, GAL4, la proteína de activación de herpesvirus VP16 o VP64, subunidad de factor humano nuclear NF-kB p65, etc.). Para que el sistema se torne l inducidle, la expresión de la proteína de fusión dCas9 puede ser controlada por un promotor inducibie (por ejemplo, Tet-ON, Tet-OFF, etc.)· El ARN dirigido a ADN puede diseñarse para dirigir elementos conocidos de respuesta a la transcripción (por ejemplo, promotores, potenciadores, etc.), secuencias conocidas de activación anterior (UAS, por sus siglas .en inglés), secuencias de función conocida o desconocida que se sospecha que pueden controlar la expresión del ADN objetivo, etc.
Compañeros de fusión adicionales Los ejemplos no taxativos de compañeros de fusión para lograr un aumento o disminución de la transcripción se enumeran en la Figura 54 e incluyen dominios activadores de la transcripción y represores de la transcripción (por ejemplo, la caja asociada con Krüppel (KRAB o SKD); el dominio de interacción de Mad mSIN3 (SID); el dominio represor de ERF (ERD, por sus siglas en inglés), etc.). En algunos de dichos casos, la proteína de fusión dCas9 es el objetivo del ARN dirigido a ADN en una ubicación específica (es decir, secuencia) en el ADN objetivo y produce la regulación especifica del locus, tal como el bloqueo de la unión de ARN polimerasa a un promotor (que inhibe de manera selectiva la función del activador de transcripción), y/o la modificación del estado de cromatina local (por ejemplo, cuando se usa una secuencia de fusión que modifica el ADN objetivo o modifica un polipéptido asociado con el ADN objetivo). En algunos casos, los cambios son transitorios (por ejemplo, represión o activación de la transcripción). En algunos casos, los cambios1 pueden heredarse (por ejemplo, cuando se realizan modificaciones epigenéticas al ADN objetivo o a proteínas asociadas con el ADN objetivo, por ejemplo, histonas nucleosomales).
En algunas modalidades, la secuencia heteróloga puede fusionarse al extremo C del polipéptido dCas9. En algunas modalidades, la secuencia heteróloga puede fusionarse al extremo N del polipéptido dCas9. En algunas modalidades, la secuencia heteróloga-puede fusionarse a una parte interna (es decir, una parte diferente al extremo N o extremo C) del polipéptido dCas9.
Los efectos biológicos de un método que usa una proteína de fusión dCas9 pueden detectarse mediante cualquier método conveniente (por ejemplo, ensayos de expresión génica; ensayos basados en cromatina, por ejemplo, inmunoprecipitación de cromatina (ChiP), ensayo in vivo de cromatina (CiA), etc.; y similares).
En algunos casos, un método de la invención implica el uso de dos o más ARN dirigidos a ADN diferentes. Por ejemplo, pueden utilizarse dos ARN dirigidos a ADN diferentes en una única célula hospedadora, donde los dos ARN dirigidos a ADN diferentes se dirigen a dos secuencias objetivo diferentes en el mismo ácido nucleico objetivo.
Por lo tanto, por ejemplo, un método de modulación transcripcional de la invención puede comprender adicionalmente la introducción en la célula hospedadora de un ARN dirigido a ADN, o un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el segundo ARN dirigido a ADN, donde el segundo ARN dirigido a ADN comprende: (i) un primer segmento que comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una segunda secuencia objetivo en el ADN objetivo; (ii) un segundo segmento que interactúa con un polipéptido dirigido al sitio; y (iii) un terminador transcripcional. En algunos casos, el uso de dos ARN dirigidos a ADN diferentes que se dirigen a dos secuencias objetivo diferentes en el mismo ácido nucleico objetivo proporciona un aumento de la modulación (por ejemplo, reducción o aumento) en la transcripción del ácido nucleico objetivo.
Como ejemplo adicional, pueden utilizarse dos ARN dirigidos a ADN diferentes en una única célula hospedadora, donde los dos ARN dirigidos a ADN diferentes se dirigen a dos ácidos nucleicos objetivo diferentes. Por lo tanto, por ejemplo, un método de modulación transcripcional de la invención puede comprender adicionalmente la introducción en la célula hospedadora de un segundo ARN dirigido a ADN, o un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el segundo ARN dirigido a ADN, donde el segundo ARN dirigido a ADN comprende: (i) un primer segmento que comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia objetivo en al menos un segundo ADN objetivo; (ii) un segundo segmento que interactúa con un polipéptido dirigido al sitio; y (iii) un terminador transcripcional.
En algunas modalidades, un ácido nucleico de la invención (por ejemplo, un ARN dirigido a ADN, por ejemplo, un ARN dirigido a ADN de molécula simple, un ARN activador, un ARN identificador, etc.; un polinucleótido donante; un ácido nucleico que codifica un polipéptido modificador dirigido al sitio; etc.) comprende una modificación o secuencia que proporciona una característica deseable adicional (por ejemplo, estabilidad modificada o regulada; direccionamiento subcelular; rastreo, por ejemplo, marcado fluorescente; un sitio de unión para una proteína o complejo de proteínas; etc.). Los ejemplos no taxativos incluyen: un casquete 5' (por ejemplo, un casquete 7-metilguanilato (m7G)); una cola poliadenilada 3' (es decir, una cola poli(A) 3'); una secuencia de ribointerruptor o una secuencia de aptámero (por ejemplo, para permitir estabilidad regulada y/o accesibilidad regulada mediante proteínas y/o complejos de proteínas); una secuencia de terminación; una secuencia que forma un dúplex de ARNcd (es decir, una horquilla)); una modificación o secuencia que dirige el ARN a una ubicación subcelular (por ejemplo, núcleo, mitocondria, cloroplastos y similares); una modificación o secuencia que proporciona rastreo (por ejemplo, conjugación directa con una molécula fluorescente, conjugación con un resto que facilita la detección fluorescente, una secuencia que permite la detección fluorescente, etc.); una modificación o secuencia que proporciona un sitio de unión para proteínas (por ejemplo, proteínas que actúan en el ADN, incluidos los activadores transcripcionales, represores transcripcionales, ADN metiltránsferasas, ADN desmetilasas, histona acetiltransferasas, histona deacetilasas y similares); y combinaciones de estos.
Segmento dirigido a ADN El segmento dirigido al ADN (o "secuencia dirigida al ADN") de un ARN dirigido a ADN ("crRNA") comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia especifica dentro de un ADN objetivo (la cadena complementaria del ADN objetivo).
En otras palabras, el segmento dirigido a ADN de un ARN dirigido a ADN de la invención interactúa con un ADN objetivo de forma especifica a la secuencia mediante hibridación (es decir, apareamiento de bases). Como tal, la secuencia de nucleótidos del segmento dirigido a ADN puede variar y determina la ubicación dentro del ADN objetivo donde el ARN dirigido a ADN y el ADN objetivo interactuarán. El segmento dirigido a ADN de un ARN dirigido a ADN de la invención puede modificarse (por ejemplo, mediante manipulación genética) para hibridarse a cualquier secuencia deseada dentro de un ADN objetivo.
El segmento dirigido a ADN puede ser de una longitud de alrededor de 12 nucleótidos a alrededor de 100 nucleótidos. Por ejemplo, el segmento dirigido a ADN puede tener una longitud de alrededor de 12 nucleótidos (nt) a alrededor de 80 nt, de alrededor 12 nt a alrededor de 50 nt, de alrededor de 12 nt a alrededor de 40 nt, de alrededor de 12 nt a alrededor de 30 nt, de alrededor de 12 nt a alrededor de 25 nt, de alrededor de 12 nt a alrededor de 20 nt, de alrededor de 12 nt a alrededor de 19 nt. Por ejemplo, el segmento dirigido a ADN puede tener una longitud de alrededor de 19 nt a alrededor de 20 nt, de alrededor de 19 nt a alrededor de 25 nt, de alrededor de 19 nt a alrededor de 30 nt, de alrededor de 19 nt a alrededor de 35 nt, de alrededor de 19 nt a alrededor de 40 nt, de alrededor de 19 nt a alrededor de 45 nt, de alrededor de 19 nt a alrededor de 50 nt, de alrededor de 19 nt a alrededor de 60 nt, de alrededor de 19 nt a alrededor de 70 nt, de alrededor de 19 nt a alrededor de 80 nt, de alrededor de 19 nt a alrededor de 90 nt, de alrededor de 19 nt a alrededor de 100 nt, , de alrededor de 20 nt a alrededor de 25 nt de alrededor de 20 nt a alrededor de 30 nt, de alrededor de 20 nt a alrededor de 35 nt, de alrededor de 20 nt a alrededor de 40 nt, de alrededor de 20 nt a alrededor de 45 nt, de alrededor de 20 nt a alrededor de 50 nt, de alrededor de 20 nt a alrededor de 60 nt, de alrededor de 20 nt a alrededor de 70 nt, de alrededor de 20 nt a alrededor de 80 nt, de alrededor de 20 nt a alrededor de 90 nt o de alrededor de 20 nt a alrededor de 100 nt.
La secuencia de nucleótidos (la secuencia dirigida a ADN) del segmento dirigido a ADN que es complementario a una secuencia de nucleótidos (secuencia objetivo) del ADN objetivo puede tener una longitud de al menos alrededor de 12 nt. Por ejemplo, una secuencia dirigida a ADN del segmento dirigido a ADN que es complementario a una secuencia objetivo del ADN objetivo puede tener una longitud de al menos alrededor de 12 nt, al menos alrededor de 15 nt, al menos alrededor de 18 nt, al menos alrededor de 19 nt, al menos alrededor de 20 nt, al menos alrededor de 25 nt, al menos alrededor de 30 nt, al menos alrededor de 35 nt o al menos alrededor de 40 nt. Por ejemplo, la secuencia dirigida a ADN del segmento dirigido a ADN que ·es complementario a la secuencia objetivo del ADN objetivo puede tener una longitud de alrededor de 12 nucleótidos (nt) a alrededor de 80 nt, de alrededor de 12 nt a alrededor de 50 nt, de alrededor de 12 nt a alrededor de 45 nt, de alrededor de 12 nt a alrededor de 40 nt, de alrededor de 12 nt a alrededor de 35 nt, de alrededor de 12 nt a alrededor de 30 nt, de alrededor de 12 nt a alrededor de 25 nt, de alrededor de 12 nt a alrededor de 20 nt, de alrededor de 12 nt a alrededor de 19 nt, de alrededor de 19 nt a alrededor de 20 nt, de alrededor de 19 nt a alrededor de 25 nt, de alrededor de 19 nt a alrededor de 30 nt, de alrededor de 19 nt a alrededor de 35 nt, de. alrededor de 19 nt a alrededor de 40 nt, de alrededor de 19 nt a alrededor de 45 nt, de alrededor de 19 nt a alrededor de 50 nt, de alrededor de 19 nt a alrededor de 60 nt, de alrededor de 20 nt a alrededor de 25 nt, de alrededor de 20 nt a alrededor de 30 nt, de alrededor de 20 nt a alrededor de 35 nt, de alrededor de 20 nt a alrededor de 40 nt, de alrededor de 20 nt a alrededor de 45 nt, de alrededor de 20 nt a alrededor de 50 nt o de alrededor de 20 nt a alrededor de 60 nt. La secuencia de nucleótidos (la secuencia dirigida a ADN) del segmento dirigido a ADN que es complementario a una secuencia de nucleótidos (secuencia objetivo) del ADN objetivo puede tener una longitud de al menos alrededor de 12 nt.
En algunos casos, la secuencia dirigida a ADN del segmento dirigido a ADN que es complementario a una secuencia objetivo del ADN objetivo tiene 20 nucleótidos de longitud. En algunos casos, la secuencia dirigida a ADN del segmento dirigido a ADN que es complementario a una secuencia objetivo del ADN objetivo tiene 19 nucleótidos de longitud.
El porcentaje de complementariedad entre la secuencia dirigida a ADN del segmento dirigido a ADN y la secuencia objetivo del ADN objetivo puede ser al menos de 60 % (por ejemplo, al menos 65 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % o 100 %). En algunos casos, el porcentaje de complementariedad entre la secuencia dirigida a ADN del segmento dirigido a ADN y la secuencia objetivo del ADN objetivo es 100 % dentro de los siete nucleótidos contiguos más cercanos al extremo 5' de la secuencia objetivo de la cadena complementaria del ADN objetivo. En algunos casos, el porcentaje de complementariedad entre la secuencia dirigida a ADN del segmento dirigido a ADN y la secuencia objetivo del ADN objetivo es al menos 60 % dentro de alrededor de 20 nucleótidos continuos. En algunos casos, el porcentaje de complementariedad entre la secuencia dirigida a ADN del segmento dirigido a ADN y la secuencia objetivo del ADN objetivo es 100 % dentro de los catorce nucleótidos contiguos más cercanos al extremo 5' de la secuencia objetivo de la cadena complementaria del ADN objetivo y tan bajo como 0 % dentro del resto. En dicho caso, puede considerarse que la secuencia dirigida a ADN tiene 14 nucleótidos de longitud. En algunos casos, el porcentaje de complementariedad entre la secuencia dirigida a ADN del segmento dirigido a ADN y la secuencia objetivo del ADN objetivo es 100 % dentro de los siete nucleótidos contiguos más cercanos al extremo 5' de la secuencia objetivo de la cadena complementaria del ADN objetivo y tan bajo como 0 % dentro del resto. En dicho caso, puede considerarse que la secuencia dirigida a ADN tiene 7 nucleótidos de longitud.
Segmento de unión a proteínas El segmento de unión a proteínas (es decir, "secuencia de unión a proteínas") de un ARN dirigido a ADN interactúa con una polipéptido dirigido al sitio variante. Cuando, la variante del polipéptido dirigido al sitio Cas9, junto con el ARN dirigido a ADN, se une a un ADN objetivo, se reduce la transcripción del ADN objetivo.
El segmento de unión a proteínas de un ARN dirigido a ADN comprende dos extensiones complementarias de nucleótidos que se hibridan entre sí para formar un dúplex de ARN de cadena doble (dúplex de ARNcd).
El segmento de unión a proteínas de un ARN dirigido a ADN de la presente descripción comprende dos extensiones de nucleótidos (un ARN identificador y un ARN activador) que son complementarios entre sí, están unidos de forma covalente mediante nucleótidos intermedios (por ejemplo, en el caso de ARN dirigido a ADN de molécula simple) ( "^nlazadores" o "nucleótidos enlazadores") y se hibridan para formar el dúplex de ARN de cadena doble (dúplex de ARNcd, u "horquilla de unión a dCas9") del segmento de unión a proteínas, dando como resultado una estructura de tallo-bucle. Esta estructura de tallo-bucle se muestra de manera esquemática en la Figura 39A. El ARN identificador y el ARN activador pueden estar unidos 1covalentemente mediante el extremo 3' del ARN identificador y el extremo 5' del ARN activador. De manera alternativa, el ARN identificador y el ARN activador pueden estar unidos covalentemente mediante el extremo 5' del ARN identificador y el extremo 3' del ARN activador.
El segmento de unión a proteínas puede tener una longitud de alrededor de 10 nucleótidos a alrededor de 100 nucleótidos, por ejemplo, de alrededor de 10 nucleótidos (nt) a alrededor de 20 nt, de alrededor de 20 nt a alrededor de 30 nt, de alrededor de 30 nt a alrededor de 40 nt, de alrededor de 40 nt a alrededor de 50 nt, de alrededor de 50 nt a alrededor de 60 nt, de alrededor de -60 nt a alrededor de 70 nt, de alrededor de 70 nt a alrededor de 80 nt, de alrededor de 80 nt a alrededor de 90 nt o de alrededor de 90 nt a alrededor de 100 nt. Por ejemplo, el segmento de unión a proteínas puede tener una longitud de alrededor de 15 nucleótidos (nt) a alrededor de 80 nt, de alrededor 15 nt a alrededor de 50 nt, de alrededor de 15 nt a alrededor de 40 nt, de alrededor de 15 nt a alrededor de 30 nt o de alrededor de 15 nt a alrededor de 25 nt.
El dúplex de ARNcd del segmento de unión a proteínas puede tener una longitud de alrededor de 6 pares de bases (bp, por v sus siglas en inglés) a alrededor de 50 bp. Por ejemplo, el dúplex de ARNcd del segmento de unión a proteínas puede tener una longitud de alrededor de 6 bp a alrededor de 40 bp, de alrededor de 6 bp a alrededor de 30 bp, de alrededor de 6 bp a alrededor de 25 bp, de alrededor de 6 bp a alrededor de 20 bp, de 'alrededor de 6 bp a alrededor de 15 bp, de alrededor de 8 bp a alrededor de 40 bp, de alrededor de 8 bp a alrededor de 30 bp, de alrededor de 8 bp a alrededor de 25 bp, de alrededor de 8 bp a alrededor de 20 bp o de alrededor de 8 bp a alrededor de 15 bp. Por ejemplo, el dúplex de ARNcd del segmento de unión a proteínas puede tener una longitud de alrededor de 8 bp a alrededor de 10 bp, de alrededor de 10 bp a alrededor de 15 bp, de alrededor de 15 bp a alrededor de 18 bp, de alrededor de 18 bp a alrededor de 20 bp, de alrededor de 20 bp a alrededor de 25 bp, de alrededor de 25 bp a alrededor de 30 bp, de alrededor de 30 bp a alrededor de 35 bp, de alrededor de 35 bp a alrededor de 40 bp o de alrededor de 40 bp a alrededor de 50 bp. En algunas modalidades, el dúplex de ARNcd del segmento de unión a proteínas tiene una longitud de 36 pares de base. El porcentaje de complementariedad entre las secuencias de nucleótidos que hibridan para formar el dúplex de ARNcd del segmento de unión a proteínas puede ser al menos alrededor de 60 %. Por ejemplo, el porcentaje de complementariedad entre las secuencias de nucleótidos que hibridan para formar el dúplex de ARNcd del segmento de unión a proteínas puede ser al menos alrededor de 65 %, al menos alrededor de 70 %, al menos alrededor de 75 %, al menos alrededor de 80 %, al menos alrededor de 85 %, al menos alrededor de 90 %, al menos alrededor de 95 %, al menos alrededor de 98 % o al menos alrededor de 99 %. En algunos casos, el porcentaje de complementariedad entre las secuencias de nucleótidos que hibridan para formar el dúplex de ARNcd del segmento de unión a proteínas es 100 %.
E1 enlazador puede tener una longitud de alrededor de 3 nucleótidos a alrededor de 100 nucleótidos. Por ejemplo, el enlazador puede tener una longitud de alrededor de 3 nucleótidos (nt) a alrededor de 90 nt, de alrededor de nucleótidos (nt) a alrededor de 80 nt, de alrededor nucleótidos (nt) a alrededor de 70 nt, de alrededor de nucleótidos (nt) a alrededor de 60 nt, de alrededor de nucleótidos (nt) a alrededor de 50 nt, de alrededor de nucleótidos (nt) a alrededor de 40 nt, de alrededor de nucleótidos (nt) a alrededor de 30 nt, de alrededor de nucleótidos (nt) a alrededor de 20 nt, de alrededor de nucleótidos (nt) a alrededor de 10 nt. Por ejemplo, el enlazador puede tener una longitud de alrededor de 3 nt a alrededor de 5 nt, de alrededor de 5 nt a alrededor de 10 nt, de alrededor de 10 nt a alrededor de 15 nt, de alrededor de 15 nt a alrededor de 20 nt, de alrededor de 20 nt a alrededor de 25 nt, de alrededor de 25 nt a alrededor de 30 nt, de alrededor de 30 nt a alrededor de 35 nt, de alrededor de 35 nt a alrededor de 40 nt, de alrededor de 40 nt a alrededor de 50 nt, de alrededor de 50 nt a alrededor de 60 nt, de alrededor de 60 nt a alrededor de 70 nt, de alrededor de 70 nt a alrededor de 80 nt, de alrededor de 80 nt a alrededor de 90 nt o de alrededor de 90 nt a alrededor de 100 nt. En algunas modalidades, el enlazador de un ARN dirigido a ADN tiene 4 nt.
Los ejemplos no taxativos de secuencias de nucleótidos que pueden incluirse en un segmento de unión a proteínas adecuado (es decir, asa de dCas9) se establecen en las SEQ ID NO:563-682 (por ejemplos, véanse la Figura 8 y la Figura 9).
En algunos casos, un segmento de unión a proteínas adecuado comprende una secuencia de nucleótidos que difiere en 1, 2, 3, 4, o 5 nucleótidos con cualquiera de las secuencias enumeradas anteriormente.
Secuencia de control de estabilidad (por ejemplo, segmento terminador transcripcional) Uña secuencia de control de estabilidad influye en la estabilidad de un ARN (por ejemplo, un ARN dirigido a ADN, un ARN identificador, un ARN activador, etc.). Un ejemplo de una secuencia de control de estabilidad adecuada es un segmento terminador transcripcional (es decir, una secuencia de terminación de la transcripción). Un segmento terminador de la transcripción de un ARN dirigido a ADN puede tener una longitud total de alrededor de 10 nucleótidos a alrededor de 100 nucleótidos, por ejemplo, de alrededor de 10 nucleótidos (nt) a alrededor de 20 nt, de alrededor de 20 nt a alrededor de 30 nt, de alrededor de 30 nt a alrededor de 40 nt, de alrededor de 40 nt a alrededor de 50 nt, de alrededor de 50 nt a alrededor de 60 nt, de alrededor de 60 nt a alrededor de 70 nt, de alrededor de 70 nt a alrededor de 80 nt, de alrededor de 80 nt a alrededor de 90 nt o de alrededor de 90 nt a alrededor de 100 nt. Por ejemplo, el segmento terminador transcripcional puede tener una longitud de alrededor de 15 nucleótidos (nt) a alrededor de 80 nt, de alrededor 15 nt a alrededor de 50 nt, de alrededor de 15 nt a alrededor de 40 nt, de alrededor de 15 nt a alrededor de 30 nt o de alrededor de 15 nt a alrededor de 25 nt.
En algunos casos, la secuencia de terminación de la transcripción es funcional en una célula eucariota. En algunos casos, la secuencia de terminación de la transcripción es funcional en una célula procariota.
Los ejemplos no taxativos de secuencias de nucleótidos que pueden incluirse en una secuencia de control de estabilidad (por ejemplo, segmento de terminación transcripcional, o en cualquier segmento del ARN dirigido a ADN para proporcionar una estabilidad aumentada) incluyen secuencias establecidas en las SEQ ID NO:683-696 y, por ejemplo, 5'-UAAUCCCACAGCCGCCAGUUCCGCUGGCGGCAUUUU-5' (SEQ ID NO:795) (un sitio de terminación de trp independiente de Rho).
Secuencias adicionales En algunas modalidades, un ARN dirigido a ADN comprende al menos un segmento adicional ya sea en el extremo 5' o 3'. Por ejemplo, un segmento adicional aceptable puede comprender un casquete 5' (por ejemplo, un casquete 7-metilguanilato (m7G)); una cola poliadenilada 3' (es decir, una cola poli(A) 3'); una secuencia de ribointerruptor (por ejemplo, para permitir estabilidad regulada y/o accesibilidad regulada mediante proteínas y complejos de proteínas); una secuencia que forma un dúplex de ARNcd (es decir, una horquilla)); una secuencia que dirige el ARN a una ubicación subcelular (por ejemplo, núcleo, mitocondria, cloroplastos y similares); una modificación o secuencia que proporciona rastreo (por ejemplo, conjugación directa con una molécula fluorescente, conjugación con un resto que facilita la detección fluorescente, una secuencia que permite la detección fluorescente, etc.); una modificación o secuencia que proporciona un sitio de unión para proteínas (por ejemplo, proteínas que actúan en el ADN, incluidos los activadores transcripeionales, represores transcripcionales, ADN metiltransferasas, ADN desmetilasas, histona acetiltransferasas, histona deacetilasas y similares), una modificación o secuencia que proporciona una estabilidad aumentada, disminuida y/o controlable; y combinaciones de estos.
ARN dirigido a ADN simultáneos y múltiples En algunas modalidades, múltiples ARN dirigidos a ADN se usan de manera simultánea en la misma célula para modular de manera simultánea diferentes ubicaciones en el mismo ADN objetivo o en diferentes ADN objetivo. En algunas modalidades, dos o más ARN dirigidos a ADN se dirigen al mismo gen, transcripción o locus. En algunas modalidades, dos o más ARN dirigidos a ADN se dirigen a distintos locus sin relación. En algunas modalidades, dos o más ARN dirigidos a ADN se dirigen a locus distintos pero relacionados.
Debido a que los ARN dirigidos a ADN son pequeños y potentes pueden estar presentes de manera simultánea en el mismo vector de expresión y pueden incluso estar bajo el mismo control transcipcional, si asi se desea. En algunas modalidades, dos o más (por ejemplo, 3 o más, 4 o más, 5 o más, 10 o más, 15 o más, 20 o más, 25 o más, 30 o más, 35 o más, 40 o más, 45 o más o 50 o más) ARN dirigidos a ADN se expresan simultáneamente en una célula objetivo (del mismo vector o de vectores diferentes). Los ARN dirigidos a ADN pueden ser reconocidos de manera diferente mediante proteínas dCas9 de diferentes bacterias, tal como S. pyogenes , S. thermophilus , L. innocua y N. meningitidis .
Para expresar múltiples ARN dirigidos a ADN, puede utilizarse un sistema de procesamiento de ARN artificial mediado por Csy4 endorribonucleasa. Pueden concatenarse múltiples ARN dirigidos a ADN en una configuración de tándem en un transcripto precursor (por ejemplo, expresado a partir de un promotor U6) y separarse mediante secuencia de ARN específica de Csy4. La proteína Csy4 coexpresada escinde el transcripto precursor en múltiples ARN dirigidos a ADN. Las ventajas de usar un sistema de procesamiento de ARN incluyen: primero, no es necesario usar promotores múltiples; segundo, dado que todos los ARN dirigidos a ADN se procesan a partir de un transcripto precursor, sus concentraciones se normalizan para unión a dCas9 similar.
La Csy4 es una proteína de endorribonucleasa (RNasa) pequeña derivada de la bacteria Pseudomonas aeruginosa . La Csy4 reconoce específicamente una horquilla de ARN mínima de 17 bp y presenta escisión de ARN rápida (<1 min) y altamente eficiente (>99,9 %). A diferencia de la mayoría de RNasas, el fragmento de ARN escindido permanece estable y funcionalmente activo. La escisión de ARN basada en Csy4 puede adaptarse como un sistema de procesamiento de ARN artificial. En este sistema, las horquillas de ARN de 17 bp se insertan entre múltiplas fragmentos de ARN que se transcriben como un transcripto precursor a partir de un promotor individual. La coexpresión de Csy4 es eficaz para generar fragmentos de ARN individuales.
Polipeptido dirigido al sitio Como se mencionó anteriormente, un ARN dirigido a ADN de la invención y una variante del polipéptido dirigido al sitio Cas9 de la invención forman un complejo. El ARN dirigido a ADN proporciona especificidad de direccionamiento al complejo, ya que comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de un ADN objetivo.
La variante del polipéptido dirigido al sitio Cas9 tiene actividad de endodesoxiorribonucleasa reducida. Por ejemplo, una variante del polipéptido dirigido al sitio Cas9 adecuada para su uso en un método de modulación de transcripción de la presente descripción presenta menos que alrededor de 20 %, menos que alrededor de 15 %, menos que alrededor de 10 %, menos que alrededor de 5 %, menos que alrededor de 1 %, menos que alrededor de 0,1 %, de la actividad de endpdesoxirribonucleasa de un polipéptido de Cas9 de tipo salvaje, por ejemplo, un polipéptido de Cas9 de tipo salvaje que comprende una secuencia de aminoácidos como se representa en la Figura 3 (SEQ ID NO:8). En algunas modalidades, la variante del polipéptido dirigido al sitio Cas9 tiene actividad de endodesoxirribonucleasa sustancialmente no detectable. En algunas modalidades, cuando un polipéptido dirigido al sitio tiene una actividad catalítica reducida (por ejemplo, cuando una proteína Cas9 tiene una mutación DIO, G12, G17, E762, H840, N854, N863, H982, H983, A984, D986, y/o A987, por ejemplo, D10A, G12A, G17A, E762A, H840A, N854A, N863A, H982A, H983A, A984A y/o D986A), el polipéptido todavía puede unirse a ADN objetivo de una forma específica al sitio (dado que todavía está guiado a una secuencia de ADN objetivo por un ARN dirigido a ADN), siempre y cuando retenga la capacidad de interactuar con el ARN dirigido a ADN.
En algunos casos, una variante del polipéptido dirigido al sitio Cas9 adecuada comprende una secuencia de aminoácidos con al menos alrededor de 75 %, al menos alrededor de 80 %, al menos alrededor de 85 %, al menos alrededor de 90 %, al menos alrededor de 95 %, al menos alrededor de 99 % o 100 % de identidad de secuencia de aminoácidos con los aminoácidos 7-166 o 731-1003 de la secuencia de aminoácidos Cas9/Csnl ilustrada en la Figura 3 (SEQ ID NO:8), o a las partes correspondientes en cualquiera de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 1-256 y 795-1346.
En algunos casos, la variante del polipéptido dirigido al sitio Cas9 puede escindir la cadena complementaria del ADN objetivo pero tiene capacidad reducida de escindir la cadena no complementaria del ADN objetivo. Por ejemplo, la variante del polipéptido dirigido al sitio Cas9 puede tener una mutación (sustitución de aminoácidos) que reduce la función del dominio de RuvC (por ejemplo, "dominio 1" de la Figura 3). Como ejemplo no taxativo, en algunos casos, la variante del polipéptido dirigido al sitio Cas9 comprende es una mutación D10A (aspartato a alanina) de la secuencia de aminoácidos representada en la Figura 3 (o la mutación correspondiente de cualquiera de las secuencias de aminoácidos establecidas en las SEQ ID NO: 1-256 y 795-1346).
En algunos casos, la variante del polipéptido dirigido al sitio Cas9 puede escindir la cadena no complementaria del ADN objetivo pero tiene capacidad reducida de escindir la cadena no complementaria del ADN objetivo. Por ejemplo, la variante del polipéptido dirigido al sitio Cas9 puede tener una mutación (sustitución de aminoácidos) que reduce la función del dominio de HNH (motivos del dominio RuvC/HNH/RuvC, "dominio 2" de la Figura 3). Como ejemplo no taxativo, en algunos casos, la variante del polipéptido dirigido al sitio Cas9 comprende es una mutación H840A (histidina a alanina en la posición del aminoácido 840 de la SEQ ID NO:8) o la mutación correspondiente de cualquiera de las secuencias de aminoácidos establecidas en las SEQ ID NO: 1-256 y 795-1346).
En algunos casos, la variante del polipéptido dirigido al sitio Cas9 tiene una capacidad reducida de escindir tanto la cadena complementaria como la no complementaria del ADN objetivo. Como ejemplo no taxativo, en algunos casos, la variante del polipéptido dirigido al sitio Cas9 comprende tanto una mutación D10A como H840A de la secuencia de aminoácidos representada en la Figura 3 (o las mutaciones correspondientes de cualquiera de las secuencias de aminoácidos establecidas en las SEQ ID NO: 1-256 y 795-1346).
Pueden mutarse otros residuos para lograr el mismo efecto (es decir, inactivar una u otra parte de la nucleasa). Como ejemplos- no taxativos, los residuos DIO, G12, G17, E762, H840, N854, N863, H982, H983, A984, D986 y/o A987 (o las mutaciones correspondientes de cualquiera de las proteínas establecidas como SEQ ID NO:1-256 y 795-1346) pueden alterarse (es decir, sustituirse) (véanse la Figura 3, Figura 5, Figura 11A y la Tabla 1 por más información respecto a la conservación de los residuos de aminoácidos de Cas9). También son adecuadas mutaciones que no sean las sustituciones de alanina.
En algunos casos, la variante del polipéptido dirigido al sitio Cas9 es un polipéptido de fusión (un "polipéptido de fusión Cas9 variante"), es decir, un polipéptido de fusión que comprende: i) una variante del polipéptido dirigido al sitio Cas9; y bj un polipéptido heterólogo unido de manera covalente (también mencionado como un "compañero de fusión").
El polipéptido heterólogo puede presentar una actividad (por ejemplo, actividad enzimática) que también presentará la variante del polipéptido de fusión Cas9 (por ejemplo, actividad de metiltransferasa, actividad de acetiltransferasa, actividad de cinasa, actividad de ubiquitinación, etc.). Una secuencia de ácido- nucleico heteróloga puede estar unida a otra secuencia de ácido nucleico (por ejemplo, mediante ingeniería genética) para generar una secuencia de nucleótidos quimérica que codifica un polipéptido quimérico. En algunas modalidades, una variante de polipéptido de fusión Cas9 se genera mediante la variante de fusión de un polipéptido Cas9 con una secuencia heteróloga que proporciona localización subcelular (es decir, la secuencia heteróloga es una secuencia de localización subcelular, por ejemplo, una señal de localización nuclear (NLS) para dirigirse al núcleo; una señal de localización mitocondrial para dirigirse a la mitocondria; una señal de localización de cloroplastos para dirigirse a un cloroplasto; una señal de retención de ER; y similares). En algunas modalidades, la secuencia heteróloga puede proporcionar una etiqueta (es decir, la secuencia heteróloga es una etiqueta detectable) para facilitar el rastreo y/o la purificación (por ejemplo, una proteina fluorescente, por ejemplo, proteina fluorescente verde (GFP), YFP, RFP, CFP, mCherry, tdTomato y similares; una etiqueta histidina, por ejemplo, una etiqueta 6XHis; una etiqueta de hemaglutinina (HA); una etiqueta FLAG; una etiqueta yc; y similares). En algunas modalidades, la secuencia heteróloga puede proporcionar un aumento o disminución de estabilidad (es decir, la secuencia heteróloga es un péptido de control de estabilidad, por ejemplo, un degrón, que en algunos casos es controlable (por ejemplo, una secuencia degrón sensible a la temperatura o controlable por fármacos, ver más adelante). En algunas modalidades, la secuencia heteróloga puede proporcionar un aumento o disminución de la transcripción a partir del ADN objetivo (es decir, la secuencia heteróloga es una secuencia de modulación de la transcripción, por ejemplo, un factor/activador de la transcripción o un fragmento de este, una proteina o fragmento de esta que recluta un factor/activador de la transcripción, un represor de la transcripción o un fragmento de este, una proteina o fragmento de esta que recluta un represor de la transcripción, un regulador de la transcripción de molécula pequeña/que responde a fármacos, etc.)· En algunas modalidades, la secuencia heteróloga puede proporcionar un dominio de unión (es decir, la secuencia heteróloga es una secuencia de unión a proteínas, por ejemplo, proporcionarle la capacidad de un polipéptido dCas9 quimérico de unirse a otra proteína de interés, por ejemplo, una proteína modificadora de ADN o histona, una factor de transcripción o represor de transcripción, una proteína reclutadora, etc.)· Los compañeros de fusión adecuados que proporcionan aumento o disminución de la estabilidad incluyen, de modo no taxativo, secuencias de degrón. Los expertos en la téenica comprenderán fácilmente que los degrones son secuencias de aminoácidos que controlan la estabilidad de la proteína de la cual son parte. Por ejemplo, la estabilidad de una proteína que comprende una secuencia de degrones se controla al menos en parte mediante la secuencia de degrones. En algunos casos, un degrón adecuado es constitutivo, de manera que el degrón ejerce su influencia en la estabilidad de proteínas de manera independiente al control experimental (es decir, el degrón no es inducible por fármacos, inducible por temperatura, etc.). En algunos casos, el degrón le proporciona al polipéptido Cas9 variante estabilidad controlable de manera que el polipéptido Cas9 variante puede estar "encendido" (es decir, estable) o "apagado" (es decir, inestable, degradado) dependiendo de las condiciones deseadas. Por ejemplo, si el degrón es un degrón sensible a la temperatura, el polipéptido Cas9 variante puede ser funcional (es decir, "encendido", estable) por debajo de una temperatura umbral (por ejemplo, 42 °C, 41 °C, 40 °C, 39 °C, 38 °C, 37 °C, 36 °C, 35 °C, 34 °C, 33 °C, 32 °C, 31 °C, 30 °C, etc.) pero no ser funcional (es decir, "apagado", degradado) por encima de la temperatura umbral. Como ejemplo adicional, si el degrón es un degrón inducible por fármacos, la presencia o ausencia de fármaco puede hacer cambiar la proteína de un estado "apagado" (es decir, inestable) a un estado "encendido" (es decir, estable) o viceversa. Un ejemplo de degrón inducible por fármacos se deriva de la proteína FKBP12. La estabilidad del degrón se controla mediante la presencia o ausencia de una molécula pequeña que se une al degrón.
Los ejemplos de degrones adecuados incluyen, de modo no taxativo, degrones controlados mediante Shield-1, DHFR, auxinas y/o temperatura. Los ejemplos no taxativos de degrones adecuados son conocidos en la téenica (por ejemplo, Dohmen et ál., Science, 1994.263(5151): p.1273-1276: Heat-inducible degrón: a method for constructing temperature-sensitive mutants; Schoeber et ál., Am J Physiol Renal Physiol. 2009 Ene;296(1):F204-11 : Conditional fast expression and function of multimeric TRPV5 channels using Shield-1 ; Chu et ál., B100rg Med Chem Lett. 2008 Nov 15;18(22):5941-4: Recent progress with FKBP-derived destabilizing domains ; Kanemaki, Pflugers Arch.2012 Dic 28. Frontiers of protein expression control with conditional degrons; Yang et ál., Mol Cell. 2012 Nov 30;48(4):487-8: Titivated for destruction: the methyl degrón; Barbour et ál., Biosci Rep. 2013 Ene 18;33{1).: Characterization of the bipartite degrón that regulates ubiquitin-independent degradation of thymidylate synthase; and Greussing et ál., J Vis Exp.2012 Nov 10;(69): Monitoring of ubiquitin-proteasome activity in living cells using a Degron (dgn)-destabilized green fluorescent protein (GFP)-based repórter protein; todas las cuales se incorporan a la presente en su totalidad mediante esta referencia).
Los ejemplos de secuencias degrones se han caracterizado y evaluado correctamente tanto en células como animales. Por lo tanto, fusionar dCas9 a una secuencia degrones produce un polipéptido dCas9 "ajustable" e "inducible". Cualguiera de los compañeros de fusión descritos en la presente puede usarse en cualquier combinación deseable. Como ejemplo no taxativo para ilustrar este punto, una proteina de fusión dCas9 puede comprender una secuencia YFP para detector, una secuencia de degrones para la estabilidad y una secuencia de activador de la transcripción para aumentar la transcripción del ADN objetivo. Además, la cantidad de compañeros de fusión que puede usarse en una proteina de fusión dCas9 es ilimitada. En algunos casos, una proteina de fusión dCas9 comprende uno o más (por ejemplo, dos o más, tres o más, cuatro o más, o cinco o más) secuencias heterólogas.
Los compañeros de fusión incluyen, de modo no taxativo, un polipéptido que proporciona actividad de metiltransferasa,. actividad de desmetilasa, actividad de acetiltransferasa, actividad de deacetilasa, actividad de cinasa, actividad de fosfatasa, actividad de ubiquitina ligasa, actividad de deubiquitinación, actividad de adenilación, actividad de desadenilación, actividad de SUMOilación, actividad de deSUMOilación, actividad de ribosilación, actividad de desribosilación, actividad de miristoilación o actividad de desamiristoilación, cualquiera de las cuales puede estar dirigida a la modificación del ADN directamente (por ejemplo, metilación de ADN) o para modificar un polipéptido asociado con ADN (por ejemplo, una proteina de unión a ADN o histona). Los compañeros de fusión adecuados adicionales incluyen, de modo no taxativo, elementos de frontera (por ejemplo, CTCF), proteínas y fragmentos de estos que proporcionan reclutamiento periférico (por ejemplo, Lamina A, Lamina B, etc.) y elementos de anclaje a proteínas (por .ejemplo FKBP/FRB, Pill/Abyl, etc.).
Los ejemplos de varios compañeros de fusión adecuados adicionales (o fragmentos de estos) para una variante del polipéptido dirigido al sitio Cas9 de la invención incluyen, de modo no taxativo, los enumerados en la Figura 54.
En algunas modalidades, un polipéptido modificador dirigido al sitio de la invención puede optimizarse con codones. Este tipo de optimización es conocido en la téenica e implica la mutación de ADN derivado foráneo para imitar las preferencias de codón de la célula u organismo hospedador pretendidos mientras que se codifica la misma proteína. De esta forma, cambian los codones, pero la proteína codificada permanece sin modificaciones. Por ejemplo, si la célula objetivo pretendida era una célula humana, una dCas9 (o variante de dCas9) optimizada por codones sería un polipéptido modificador dirigido al sitio adecuado. Como otro ejemplo no taxativo, si la célula hospedadora pretendida fuera gna célula de ratón, entonces una Cas9 (o variante, por ejemplo, una variante enzimáticamente inactiva) de ratón optimizada con codones sería un polipéptido dirigido al sitio Cas9. Mientras que no se requiere la optimización por codones, esta es aceptable y puede ser preferible en ciertos casos.
Células hospedadoras Un método de la presente descripción para modular la transcripción puede emplearse para inducir modulación transcripcional en células mitóticas o post-mitóticas in vivo y/o ex vivo y/o in vitro. Dado que el ARN dirigido a ADN proporciona especificidad mediante la hibridación a un ADN objetivo, una célula mitótica y/o post-mitótica puede ser cualquiera de una variedad de células hospedadoras, donde las células hospedadoras adecuadas incluyen, de modo no taxativo, una célula bacteriana; una célula de arquea; un organismo eucariota unicelular; una célula vegetal; una célula de alga, por ejemplo, Botryococcus braunii, Chlamydomonas reínhardtii, Nannochloropsis gaditana , Chlorella pyrenoidosa , Sargassum patens , C. agardh, y similares; una célula fúngica; una célula animal; una célula de un animal invertebrado (por ejemplo, un insecto, un enidario, un equinodermo, un nemátodo, etc.); un parásito eucariota (por ejemplo, un parásito de la malaria, por ejemplo, Plasmodium falciparum; un helminto; etc.); una célula de un animal vertebrado (por ejemplo, pez, anfibio, reptil, ave, mamífero); una célula de mamífero, por ejemplo, una célula de roedor, una célula humana, una célula de primate no humano, etc. Las células hospedadoras adecuadas incluyen células de origen natural; células modificadas genéticamente (por ejemplo, células modificadas genéticamente en el laboratorio, por ejemplo, mediante la "mano de un ser humano"); y células manipuladas in vítro de cualquier manera. En algunos casos, una célula hospedadora está aislada.
Cualquier tipo de célula puede ser de interés (por ejemplo, una célula madre, por ejemplo, una célula madre embriónica (ES), una célula madre pluripotente inducida (iPS), una célula germinal; una célula somática, por ejemplo, un fibroblasto, una célula hematopoyética, una neurona, una célula muscular, una célula ósea, un hepatocito, una célula pancreática; una célula embrionaria in vitro o in vivo de un embrión en cualquier etapa, por ejemplo, un embrión de pez cebra en la etapa de 1 célula, 2 células, 4 células, 8 células, etc.). Las células pueden ser de lineas celulares establecidas o pueden ser células primarias, donde "células primarias", lineas celulares primarias" y "cultivos primarios" se usan en la presente de manera intercambiable para hacer referencia a células y cultivos celulares que se han derivado de un sujeto y se les permitió el cultivo in vitro para una cantidad limitada de pasajes, es decir, divisiones, del cultivo. Por ejemplo, los cultivos primarios incluyen cultivos a los que se realizó un pasaje 0 veces, 1 vez, 2 veces, 4 veces, 5 veces-, 10 veces o 15 veces, pero no la cantidad suficiente de veces como para atravesar la etapa de crisis. Las lineas celulares primarias pueden se mantenerse durante menos de 10 pasajes in vitro. Las células objetivo, en muchas modalidades, son organismos unicelulares o cultivados.
Si las células son células primarias, dichas células pueden recogerse de un individuo mediante cualquier método conveniente. Por ejemplo, los leucocitos pueden cosecharse de manera conveniente mediante aféresis, leucocitaféresis, separación de gradiente de densidad, etc., mientras que las células de tejidos tales como la piel, músculo, médula ósea, bazo, hígado, páncreas, pulmón, intestino, estómago, etc. se cosechan de forma más conveniente mediante biopsia. Puede usarse una solución apropiada para la dispersión o suspensión de las células cosechadas. Dicha solución generalmente será una solución salina equilibrada, por ejemplo, solución salina normal, solución salina amortiguada con fosfato (PBS), solución salina equilibrada de Hank, etc., complementada de manera conveniente con suero fetal bovino u otros factores de origen natural, junto con un amortiguador aceptable en una concentración baja, por ejemplo, de 5-25 mM. Los amortiguadores convenientes incluyen HEPES, amortiguadores de fosfato, amortiguadores de lactato, etc. Las células pueden usarse de manera inmediata o pueden ser almacenadas, congeladas, durante largos períodos de tiempo, descongeladas y útiles para su reutilización. En dichos casos, las células se congelarán usualmente en dimetilsulfóxido (DMSO) al 10 %, suero al 50 %, medio amortiguado al 40 % u otra solución como las usadas en la téenica para preservar células en dichas temperaturas de congelamiento, y se descongelarán de una manera como las usadas comúnmente en la técnica para descongelar células cultivadas congeladas.
Introducción de ácido nucleico en una célula hospedadora Un ARN dirigido a ADN, o ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que lo codifica, puede introducirse en una célula hospedadora mediante una variedad de métodos conocidos. De manera similar, cuando un. método de la invención implica la introducción en una célula hospedadora de un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una variante del polipéptido dirigido al sitio Cas9, dicho ácido nucleico puede introducirse en una célula hospedadora mediante cualquiera de una variedad de métodos conocidos.
Los métodos para introducir un ácido nucleico en una célula hospedadora son conocidos en la téenica, y puede utilizarse cualquier método conocido para introducir un ácido nucleico (por ejemplo, una construcción de expresión) en una célula madre o célula progenitora. Los métodos adecuados incluyen, por ejemplo, infección viral o bacteriofágica, transíección, conjugación, fusión de protoplastos, lipofección, electroporación, precipitación de fosfato de calcio, transfección·mediada por polietilenimina (PEI), transfección mediada por DEAE-dextrano, transfección mediada por liposomas, tecnología de cañón de partículas, precipitación de fosfato de calcio, microinyección directa, inserción de ácido nucleico mediada por nanopartículas (véase, por ejemplo, Panyam et ál., Adv Drug Deliv Rev.2012 Sep 13. pii: S0169-409X (12)00283-9. doi: 10.1016/j.addr.2012.09.023 ) y similares. ÁCIDOS NUCLEICOS La presente descripción proporciona un ácido nucleico aislado que colnprende una secuencia de nucleótidos que codifica un ARN dirigido a ADN de la invención. En algunos casos, un ácido nucleico de la presente comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una variante del polipéptido dirigido al sitio Cas9.
En algunas modalidades, un método de la invención implica introducir en una célula hospedadora (o una población de células hospedadoras) uno o más ácidos nucleicos que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican un ARN dirigido a ADN y/o una variante del polipéptido dirigido al sitio Cas9. En algunas modalidades una célula que comprende un ADN objetivo está in vitro. En algunas modalidades una célula que comprende un ADN objetivo está in vivo. Los ácidos nucleicos adecuados comprenden secuencias de nucleótidos que codifican un ARN dirigido a ADN y/o un polipéptido dirigido al sitio incluyen vectores de expresión, donde un vector de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un ARN dirigido a ADN y/o un polipéptido dirigido al sitio es un "vector de expresión recombinante".
En algunas modalidades, el vector de expresión recombinante es una construcción viral, por ejemplo, una construcción viral adeno-asociada recombinante (véase, por ejemplo, la patente estadounidense n.° 7,078,387), una construcción adenoviral recombinante, una construcción lentiviral recombinante, una construcción retroviral recombinante, etc.
Los vectores de expresión adecuados incluyen, de modo no taxativo, vectores virales (por ejemplo, vectores virales basados en el virus vaccinia; poliovirus; adenovirus (véase, por ejemplo, Li et ál., Invest Opthal ol Vis Sci 35:2543 2549, 1994; Borras et ál., Gene Ther 6:515 524, 1999; Li y Davidson, PNAS 92:7700 7704, 1995; Sakamoto et ál., H Gene Ther 5:1088 1097, 1999; WO 94/12649, WO 93/03769; WO 93/19191; WO 94/28938; WO 95/11984 and WO 95/00655); virus adeno-asociado (véase, por ejemplo, Ali et ál·., Hu Gene Ther 9:81 86, 1998, Flannery et ál., PNAS 94:6916 6921, 1997; Bennett et ál., Invest Opthalmol Vis Sci 38:28572863, 1997; Jomary et ál., Gene Ther 4:683690, 1997, Rolling et ál., Hum Gene Ther 10:641648, 1999; Ali et ál., Hum Mol Genet 5:591 594, 1996; Srivastava en WO 93/09239, Samulski et ál., J. Vir. (1989) 63:3822-3828; Mendelson et ál., Virol. (1988) 166:154-165; y Flotte et ál·., PNAS (1993) 90:10613-10617); SV40; virus del herpes simple; virus de inmunodeficiencia humana (véase, por ejemplo, Miyoshi et ál., PNAS 94:1031923, 1997; Takahashi et ál., J Virol 73:7812 7816, 1999); un vector retroviral (por ejemplo, virus de leucemia murina, virus de la necrosis del bazo y vectores derivados de retrovirus tal como el virus del sarcoma de Rous, virus del sarcoma de Harvey, virus de la leucosis aviar, un lentivirus, virus de inmunodeficiencia humana, virus del sarcoma mieloproliferativo y virus del tumor mamario); y similares.
Los expertos en la téenica conocen numerosos vectores de expresión adecuados y muchos están disponibles comercialmente. Se proporcionan los siguientes vectores a modo de ejemplo; para células hospedadoras eucariotas: pXTl, pSG5 (Stratagene), pSVK3, pBPV, pMSG, and pSVLSV40 (Pharmacia). Sin embargo, puede utilizarse cualquier otro vector siempre que sea compatible con la célula hospedadora.
Dependiendo del sistema de hospedador/vector utilizado, puede utilizarse cualquier cantidad de elementos de control de la transcripción y traducción adecuados, inclusive promotores constitutivos e inducibles, elementos mejoradores de la transcripción, terminadores de la transcripción, etc., en el vector de expresión (véase, por ejemplo, Bitter et ál. (1987) Methods in Enzymology, 153:516-544).
En algunas modalidades, una secuencia de nucleótidos que codifica un ARN dirigido a ADN y/o una variante del polipéptido dirigido al sitio Cas9 está unida de manera operativa a un elemento de control, por ejemplo, un elemento de control transcripcional, tal como un promotor. El elemento de control transcripcional puede ser funcional ya sea en una célula eucariota-, por ejemplo, una célula de mamífero; o una célula procariota (por ejemplo, una célula bacteriana o de arquea). En algunas modalidades, una secuencia de nucleótidos que codifica un ARN dirigido a ADN y/o una variante del polipéptido dirigido al sitio Cas9 está unido de manera operativa a múltiples elementos de control que permiten la expresión de la secuencia de nucleótidos que codifica un ARN dirigido a ADN y/o una variante del polipéptido dirigido al sitio Cas9 tanto en células procariotas como eucariotas.
Un promotor puede ser un promotor constitutivamente activo (es decir, un promotor que está de manera constitutiva en un estado activo/"ENCENDIDO"), puede ser un promotor inducible (es decir, un promotor cuyo estado, activo/"ENCENDIDO" o inactivo/"APAGADO", es controlado mediante un estímulo externo, por ejemplo, la presencia de una temperatura, compuesto o proteina en particular), puede ser un promotor restringido espacialmente (es decir, elemento de control transcripcional, potenciador, etc.) (por ejemplo, potenciador específico de tejido, potenciador específico del tipo celular, etc.), y puede ser un promotor restringido temporalmente (es decir, el promotor está en el estado "ENCENDIDO" o el estado "APAGADO" durante etapas específicas del desarrollo embrionario o durante etapas específicas de un proceso biológico, por ejemplo, ciclo de folículo capilar en ratones).
Los promotores adecuados puede derivar de virus y pueden, por lo tanto, ser mencionados como promotores virales, o pueden derivar de cualquier organismo, incluidos organismos procariotas o eucariot-as. Los promotores adecuados pueden usarse para impulsar la expresión mediante cualquier ARN polimerasa (por ejemplo, pol I, pol II, pol III). Los ejemplos de promotores incluyen, de modo no taxativo, el promotor temprano SV40, el promotor de repetición terminal larga (LTR) del virus de tumor mamario en ratones; el promotor tardío principal del adenovirus (Ad MLP); un promotor del virus del herpes simple (VHS), un promotor del citomegalovuris (CMVj tal como la región del promotor temprano inmediato de CMV (CMVIE), un promotor del virus del sarcoma de rous (RSV), un promotor nuclear pequeño U6 humano (U6) (Miyagishi et ál., Nature Biotechnology 20, 497 - 500 (2002)), un promotor de U6 mejorado (por ejemplo, Xia et ál., Nucleic Acids Res. 2003 Sep 1;31(17)), un promotor de H1 humano (Hl ) , y similares .
Los ejemplos de promotores inducibles incluyen, de modo no taxativo, promotor de la ARN polimerasa T7, promotor de la ARN polimerasa T3, promotor regulado por isopropil-beta-D-tiogalactopiranósido (IPTG), promotor inducido por lactosa, promotor del choque térmico, promotor regulado por tetracielina (por ejemplo, Tet-ON, Tet-OFF, etc.), promotor regulado por esteroides, promotor regulado por metales, promotor regulado por el receptor de estrógenos, etc. Los promotores inducibles pueden, por lo tanto, regularse mediante moléculas que incluyen, de modo no taxativo, doxociclina; ARN polimerasa, por ejemplo, ARN polimerasa T7; un receptor de estrógeno; una fusión del receptor de estrógeno; etc.
En algunas modalidades, el promotor es un promotor restringido espacialmente (es decir, promotor especifico del tipo de célula, promotor especifico de tejido, etc.) de manera que en un organismo multicelular el promotor esté activo (es decir, "ENCENDIDO") en un subconjunto de células especificas. Puede hacerse referencia a los promotores restringidos espacialmente como potenciadores, elementos de control transcripcional, secuencias de control, etc. Cualquier promotor restringido espacialmente conveniente puede usarse y la elección del promotor adecuado (por ejemplo, un promotor especifico del cerebro, un promotor que impulsa la expresión en un subconjunto de neuronas, un promotor que impulsa la expresión en la linea germinal, un promotor que impulsa la expresión en los pulmones, un promotor que impulsa la expresión en los músculos, un promotor que impulsa la expresión en células del islote del páncreas, etc.) dependerá del organismo. Por ejemplo, se conocen varios promotores restringidos espacialmente para plantas, moscas, gusanos, mamíferos, ratones, etc. De esta manera, un promotor restringido espacialmente puede usarse para regular la expresión de un ácido nucleico que codifica un polipéptido dirigido al sitio de la invención en una amplia variedad de tejidos y tipos de células diferentes, dependiendo del organismo. Algunos promotores restringidos espacialmente también están temporalmente restringidos de manera que el promotor esté en el estado "ENCENDIDO" o el estado "APAGADO" durante etapas específicas del desarrollo embrionario o durante etapas específicas de un proceso biológico (por ejemplo, ciclo folicular capilar en ratones).
Con el propósito de ilustrar, los ejemplos de promotores restringidos espacialmente incluyen, de modo no taxativo, promotores específicos de neuronas, promotores específicos de adipocitos, promotores específicos de cardiomiocitos, promotores específicos de músculo liso, promotores específicos de fotorreceptores, etc. Los promotores restringidos espacialmente específicos de neuronas incluyen, de modo no taxativo, un promotor de enolasa específico de neuronas (NSE) (véanse, por ejemplo, EMBL HSEN02, X51956); un promotor aminoácido aromático descarboxilasa (AADC); un promotor de neurofilamentos (véase, por ejemplo, GenBank HUMNFL, L04147); un promotor de sinapsina (véase, por ejemplo, GenBank HU SYNIB, M55301); un promotor de thy-1 (véase, por ejemplo, Chen et ál. (1987) Cell 51:7-19; y Llewellyn, et ál. (2010) Na t . Med. 16(10):1161-1166); un promotor receptor de serotonina (véase, por ejemplo, GenBank S62283); un promotor de tirosina hidroxilasa (TH) (véase, por ejemplo, Oh el ál. (2009) Gene Ther 16:437; Sasaoka et ál. (1992) Mol . Brain Res. 16:274; Boundy et ál. (1998) J. Neurosci . 18:9989; y Kaneda et ál. (1991) Neuron 6:583-594); un promotor de GnRH (véase, por ejemplo, Radovick et ál. (1991) Proc. Nati . Acad. Sci . USA 88:3402-3406); un promotor L7 (véase, por ejemplo, Oberdick et ál. (1990) Science 248:223-226); un promotor de DNMT (véase, por ejemplo, Bartge et ál. (1988) Proc. Nati . Acad. Sci . USA 85:3648-3652); un promotor de encefalina (véase, por ejemplo, Comb et ál. (1988) EMBO J. 17:3793-3805); un promotor de la proteina básica de mielina (PBM); un promotor de la proteína cinasa II-alfa dependiente de Ca2+-calmodulina (CamKIIa) (véase, por ejemplo, Mayford et ál. (1996) Proc. Nati . Acad. Sci . EUA 93:13250; y Casanova et ál. (2001) Génesis 31:37); un promotor del factor de crecimiento b derivado de plaquetas/potenciador del CMV (véase, por ejemplo, Liu et ál. (2004) Gene Therapy 11:52-60) y similares.
Los promotores restringidos espacialmente específicos de adipocitos incluyen, de modo no taxativo, promotor/potenciador del gen aP2, por ejemplo, una región de -5,4 kb a +21 bp del gen aP2 humano (véase, por ejemplo, Tozzo et ál. (1997) Endocrinol . 138:1604; Ross et ál. (1990) Proc. Nati . Acad. Sci . USA 87:9590; y Pavjani et ál. (2005) Nat . Med. 11:797); un promotor del transportador de glucosa 4 (GLUT4) (véase, por ejemplo, Knight et él. (2003) Proc. Nati . Acad. Sci . USA 100:14725); un promotor de ácidos grasos translocasa (FAT/CD36) (véase, por ejemplo, Kuriki et ál. (2002) Biol . Pharm. Bull . 25:1476; y Sato et ál. (2002) J. Biol . Chem. 277:15703); un promotor de estearoilo-CoA desaturasa-1 (SCD1) (Tabor et ál. (1999) J. Biol . Chem. 274:20603); un promotor de leptina (véase, por ejemplo, Masón et ál. (1998) Endocrinol . 139:1013; y Chen et ál. (1999) Biochem. Biophys. Res. Comm. 262:187); un promotor de adiponectina (véase, por ejemplo, Kita et ál. (2005) Biochem. Biophys. Res. Comm. 331:484; y Chakrabarti (2010) Endocrinol . 151:2408); un promotor de adipsina (véase, por ejemplo, Platt et ál. (1989) Proc. Nati . Acad. Sci . EUA 86:7490); un promotor de resistina (véase, por ejemplo, Seo et ál. (2003) Molec. Endocrinol . 17:1522); y similares.
Los promotores restringidos espacialmente específicos de cardiomiocitos incluyen, de modo no taxativo, secuencias de control derivadas de los siguientes genes: cadena ligera de miosina 2, cadena pesada de miosina OÍ, AE3, troponina cardíaca C, actina cardíaca y similares. Franz et ál. (1997) Cardiovasc. Res.35:560-566; Robbins et ál. (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci.752:492-505; Linn et ál. (1995) Circ. Res.76:584-591; Parmacek et ál. (1994) Mol. Cell. Biol.14:1870-1885; Hunter et ál. (1993) Hypertension 22:608-617; y Sartorelli et ál. (1992) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 89:4047-4051.
Los promotores restringidos espacialmente específicos de músculo liso incluyen, de modo no taxativo, un promotor de SM22a (véase, por ejemplo, Akyürek et ál. (2000) Mol . Med. 6:983; y la patente estadounidense 7,169,874); un promotor de smoothelina (véase, por ejemplo, WO 2001/018048); un promotor de actina de músculo liso a; y similares. Por ejemplo, una región de 0,4 kb del promotor SM22a, dentro de la cual hay dos elementos de CArG, que se demostró que mediaba la expresión especifica de células de músculo liso vascular (véase, por ejemplo, Kim, et ál. (1997) Mol. Cell. Biol.17, 2266-2278; Li, et ál., (1996) J. Cell Biol. 132, 849-859; y Moessler, et ál. (1996) Development 122, 2415-2425).
Los promotores restringidos espacialmente específicos de fotorreceptores incluyen, de modo no taxativo, un promotor de rodopsina; un promotor de rodopsina cinasa (Young et ál. (2003) Ophthalmol . Vis. Sci . 44:4076); un promotor del gen beta de la fosfodiesterasa (Nicoud et ál. (2007) J. Gene Med. 9:1015); un promotor del gen de la retinitis pigmentaria (Nicoud et ál. (2007) supra) ; un potenciador del gen de la proteína de unión al retinoide interfotorreceptor (IRBP) (Nicoud et ál. (2007) supra) ; un promotor del gen IRBP (Yokoyama et ál. (1992) Exp Eye Res. 55:225); y similares.
BIBLIOTECAS La presente descripción proporciona una biblioteca en ARN dirigido a ADN. La presente descripción proporciona una biblioteca de ácidos nucleicos que comprenden nucleótidos que codifican ARN dirigido a ADN. Una biblioteca de ácidos nucleicos de la descripción que comprende nucleótidos que codifican ARN dirigido a ADN puede comprender una biblioteca de vectores de expresión recombinantes que comprenden nucleótidos que codifican los ARN dirigidos a ADN.
Una biblioteca de la invención puede comprender de alrededor de 10 miembros individuales a alrededor de 1012 miembros individuales; por ejemplo, una biblioteca de la invención puede comprender de alrededor de 10 miembros individuales a alrededor de 102 miembros individuales, de alrededor de 102 miembros individuales a alrededor de 103 miembros individuales, de alrededor de 103 miembros individuales a alrededor de 105 miembros individuales, de alrededor de 105 miembros individuales a alrededor de 107 miembros individuales, de alrededor de 107 miembros individuales a alrededor de 109 miembros individuales, de alrededor de 109 miembros individuales a alrededor de 1012 miembros individuales.
Un "miembro individual" de una biblioteca de la invención difiere de otros miembros de la biblioteca en la secuencia de nucleótidos del segmento dirigido a ADN del ARN dirigido a ADN. Por lo tanto, por ejemplo, cada miembro individual de una biblioteca de la invención puede comprender la misma secuencia de nucleótidos del segmento de unión a proteínas, o sustancialmente la misma, que la de todos los otros miembros de la biblioteca; y puede comprender la misma secuencia de nucleótidos, o sustancialmente la misma, del segmento de terminación transcripcional que todo los otros miembros de la biblioteca; pero difiere de otros miembros de la biblioteca en la secuencia de nucleótidos del segmento dirigido a ADN del ARN dirigido a ADN. De esta forma, la biblioteca puede comprender miembros que se unen a diferentes ácidos nucleicos objetivo.
UTILIDAD Un método para modular la transcripción de acuerdo con la presente descripción se puede utilizar en una variedad de aplicaciones, las cuales también se proporcionan. Las aplicaciones incluyen aplicaciones para investigación; aplicaciones para diagnóstico; aplicaciones industriales y aplicaciones para tratamiento.
Las aplicaciones para investigación incluyen, por ejemplo, determinar el efecto de la reducción o el aumento de la transcripción de un ácido nucleico objetivo en, por ejemplo, el desarrollo, metabolismo, expresión de un gen posterior y similares.
El análisis genómico de alto rendimiento puede llevarse a cabo utilizando un método de modulación de la transcripción de la invención, en el cual únicamente el segmento dirigido a ADN del ARN dirigido a ADN precisa variar, mientras que el segmento de unión a proteínas y el segmento de terminación de la transcripción puede (en algunos casos) mantenerse constante. Una biblioteca (por ejemplo, una biblioteca de la invención) que comprende una pluralidad de ácidos nucleicos utilizados en el análisis genómico incluiría: un promotor unido de manera operativa a una secuencia de nucleótidos codificadora de ARN dirigido a ADN, donde cada ácido nucleico incluiría un segmento diferente dirigido a ADN, un segmento común de unión a proteínas y un segmento común de terminación de la transcripción. Un Chip contendría más de 5 x 104 ARN dirigidos a ADN únicos. Las aplicaciones incluirían fenotipado a gran escala, mapeo gen-función y análisis metagenómico.
Los métodos descritos en la presente pueden utilizarse en el campo de la ingeniería metabólica. Dado que los niveles de transcripción pueden ser controlados de manera eficiente y predecible mediante el diseño de un ARN dirigido a ADN apropiado, según se describe en la presente, la actividad de las vías metabólicas (por ejemplo, vías biosintéticas) pueden afinarse y controlarse de manera precisa controlando el nivel de enzimas especificas (por ejemplo, mediante aumento o disminución de la transcripción) dentro de una vía metabólica de interés. Las vías metabólicas de interés incluyen aquellas utilizadas para la producción de fármacos y/o químicos (químicos finos, combustible, antibióticos, toxinas, agonistas, antagonistas, etc.).
Las vías biosintéticas de interés incluyen, de modo no taxativo, (1) la vía de mevalonato (por ejemplo, la vía de HMG-CoA reductasa) (convierte acetil-CoA en pirofosfato de dimetilalilo (DMAPP) y pirofosfato de isopentenilo (IPP), los cuales se utilizan para la biosíntesis de una gran cantidad de biomoléculas, inclusive terpenoides/isoprenoides), (2) la vía de no mevalonato (es decir, "la vía 2-C-metil-D-eritritol 4-fosfato/l-desoxi-D-xilulosa 5-fosfato", "vía MEP/DOXP" o "vía DXP") (también produce DMAPP e IPP, convirtiendo, en cambio, piruvato y gliceraldehído 3-fosfato en DMAPP-e IPP mediante una vía alternativa a la vía de mevalonato), (3) la vía de síntesis de policétido (produce una variedad de policétidos mediante una variedad de enzimas de policétido sintasa. Los policétidos incluyen moléculas pequeñas de origen natural utilizadas para la quimioterapia (por ejemplo, tetracielina y macrólidos) y los policétidos importantes en la industria incluyen rapamicina (inmunosupresor), eritromicina (antibiótico), lovastatina (fármaco anticolesterol) y epotilona B (un fármaco anticáncer)), (4) vías de síntesis de ácidos grasos, (5) la vía de síntesis de DAHP (3-desoxi-D-arabino-heptulosonato 7-fosfato), (6) vías que producen potenciales biocombustibles (tales como alcoholes de cadena corta y alcano, ésteres metílicos de ácidos grasos y alcoholes grasos, isoprenoides, etc.), etc.
Redes y cascadas Los métodos descritos en la presente pueden utilizarse para diseñar redes integradas (es decir, una cascada o cascadas) de control. Por ejemplo, un ARN dirigido a ADN / variante del polipéptido dirigido al sitio Cas9 de la invención puede utilizarse para controlar (es decir, modular, por ejemplo, aumentar, disminuir) la expresión de otro ARN dirigido por ADN u otra variante del polipéptido dirigido al sitio Cas9 de la invención. Por ejemplo, un primer ARN dirigido a ADN puede diseñarse para dirigir la modulación de la transcripción de un segundo polipéptido quimérico dCas9 con una función distinta de la primera variante del polipéptido dirigido al sitio Cas9 (por ejemplo, actividad de metiltransferasa, actividad de desmetilasa, actividad de acetiltransferasa, actividad de deacetilasa, etc.). Adicionalmente, dado que distintas proteínas dCas9 (por ejemplo, derivadas de especies diferentes) pueden requerir un asa de Cas9 distinta (es decir, segmento de unión a proteínas), el segundo polipéptido quimérico dCas9 puede derivarse de una especie diferente que el primer polipéptido dCas9 mencionado anteriormente. Por lo tanto, en algunos casos, el segundo polipéptido quimérico dCas9 puede seleccionarse de forma tal que pueda no interactuar con el primer ARN dirigido a ADN. En otros casos, el segundo polipéptido quimérico dCas9 puede seleccionarse de forma tal que interactúe con el primer ARN dirigido a ADN. En algunos de estos casos, las actividades de las dos (o más) proteínas dCas9 pueden competir (por ejemplo, si los polipéptidos tienen actividades opuestas) o pueden sinergizar (por ejemplo, si los polipéptidos tienen actividades sinérgicas o similares). Del mismo modo, tal como se mencionó anteriormente, cualquiera de los complejos (es decir, ARN dirigido a ADN / polipéptido dCas9) de la red puede diseñarse para controlar otros ARN dirigidos a ADN o polipéptidos dCas9. Dado que un ARN dirigido a ADN de la invención y una variante del polipéptido dirigido al sitio Cas9 de la invención puede dirigirse a cualquier secuencia deseada de ADN, los métodos descritos en la presente pueden usarse para controlar y regular la expresión de cualquier objetivo deseado. Las redes integradas (es decir, cascadas de interacciones) que pueden diseñarse se encuentran en un intervalo de muy simples a muy complejas y no tienen límites.
En una red donde dos o más componentes (por ejemplo, ARN dirigidos a ADN, ARN activadores, ARN identificadores o polipéptidos dCas9) se encuentran cada uno bajo el control regulador de otro complejo de ARN dirigido a ADN / polipéptido dCas9, el nivel de expresión de un componente de la red puede afectar el nivel de expresión (por ejemplo, puede aumentar o disminuir la expresión) de otro componente de la red. Mediante este mecanismo, la expresión de un componente puede afectar la expresión de un componente distinto en la misma red, y la red puede incluir una mezcla de componentes que aumente la expresión de otros componentes, asi como componentes que disminuyan la expresión de otros componentes. Como comprenderá fácilmente un experto en la téenica, los ejemplos que anteceden, mediante los que el nivel de expresión de un componente puede afectar el nivel de expresión de uno o más componentes diferentes, se proporcionan con fines ilustrativos y no son taxativos. Una capa adicional de complejidad puede introducirse, de manera opcional, en una red donde uno o más componentes se modifican (como se describió anteriormente) para ser manipulable (es decir, bajo control experimental, por ejemplo, control de temperatura; control de fármacos, es decir, control inducible por fármacos; control ligero; etc.).
Como un ejemplo no taxativo, un primer ARN dirigido a ADN puede unirse al promotor de un segundo ARN dirigido a ADN, el cual controla la expresión de un gen objetivo terapéutico/metabólico. En dicho caso, la expresión condicional del primer ARN dirigido a ADN activa indirectamente el gen terapéutico/metabólico. Las cascadas de ARN de este tipo son útiles, por ejemplo, para convertir de manera fácil un represor en un activador, y puede utilizarse para controlar la lógica o la dinámica de expresión de un gen objetivo.
Un método de modulación de la transcripción de la invención también puede usarse para el descubrimiento de fármacos y la validación de objetivos.
KITS La presente descripción proporciona un kit para llevar a cabo un método de la invención. Un kit de la invención comprende: a) un ARN dirigido a ADN de la presente descripción, o un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el ARN dirigido a ADN, donde el ARN dirigido a ADN comprende: i)) un primer segmento que comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia objetivo en el ADN objetivo; ii)) un segundo segmento que interactúa con un polipéptido dirigido al sitio; y iii)) un terminador transcripcional; y b) un amortiguador. En algunos casos, el ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el ARN dirigido a ADN comprende además una secuencia de nucleótidos que codifica una variante del polipéptido dirigido al sitio Cas9 que presenta actividad de endodesoxirribonucleasa reducida con relación a Cas9 de tipo salvaje.
En algunos casos, un kit de la invención comprende además una variante del polipéptido dirigido al sitio Cas9 que presenta actividad endodesoxirribonucleasa reducida con relación a Cas9 de tipo salvaje.
En algunos casos, un kit de la invención comprende además un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una variante del polipéptido dirigido al·sitio Cas9 que presenta actividad endodesoxirribonucleasa reducida con relación a Cas9 de tipo salvaje.
Un sujeto puede incluir adicionalmente uno o más reactivos adicionales, donde dichos reactivos adicionales pueden seleccionarse de: un amortiguador; un amortiguador de lavado; un reactivo de control; un vector de expresión o polinucleótido de ARN de control; un reactivo para la producción in vitro de la variante del polipéptido dirigido al sitio Cas9 a partir de ADN; y similares. En algunos casos, la variante del polipéptido dirigido al sitio Cas9 incluida en un kit de la invención es una variante del polipéptido dirigido al sitio Cas9 de fusión, como se describió anteriormente.
Los componentes de un kit de la invención pueden separarse en recipientes; o pueden combinarse en un solo recipiente.
Además de los componentes mencionados anteriormente, un kit de la presente puede incluir adicionalmente instrucciones para usar los componentes del kit para practicar los métodos de la presente. Las instrucciones para practicar los métodos de la presente están generalmente registradas en un medio de registro adecuado. Por ejemplo, las instrucciones pueden estar impresas en un sustrato, tal como papel o plástico, etc. Como tales, las instrucciones pueden estar presentes en los kits como un prospecto, en el etiquetado del recipiente del kit o componentes del mismo (es decir, asociado al embalaje o subembalaje), etc. En otras modalidades, las instrucciones están presentes como un archivo de almacenamiento de datos electrónico, presente en un medio de almacenamiento adecuado leído por computadora, por ejemplo, CD-ROM, disquete, memoria flash, etc. En aun otras modalidades, las instrucciones reales no están presentes en el kit, pero se proporcionan medios para obtener las instrucciones desde una fuente remota, por ejemplo, por medio de Internet. Un ejemplo de esta modalidad es un kit que incluye una dirección web donde se pueden ver las instrucciones y/o desde donde pueden descargarse. Como con las instrucciones, este medio para obtener las instrucciones se registra en un sustrato adecuado.
EJEMPLOS Los siguientes ejemplos se proponen para proporcionarles a los expertos en la téenica una divulgación y descripción completa sobre cómo realizar y usar la presente invención y no pretenden limitar el alcance de lo que los inventores consideran como su invención, ni pretenden describir que los experimentos a continuación son todos ? los únicos experimentos que se llevaron a cabo. Se han realizado esfuerzos para asegurar la exactitud con respecto a los números usados (por ejemplo, cantidades, temperatura, etc.), pero se deben tener en cuenta algunos errores y desviaciones experimentales. A menos que se indique lo contrario, las partes son partes en peso, el peso molecular es peso molecular promedio, la temperatura se expresa en grados Celsius y la presión es la atmosférica o cercana a esta. Se pueden utilizar abreviaturas estándar, por ejemplo, bp, pares de bases; kb, kilobases; ml, picolitros; s o seg, segundos; min, minutos; h o hr, horas; aa, aminoácidos; kb, kilobases; bp, pares de bases; nt, nucleótidos; i.m., intramuscular o intramuscularmente; i.p., intraperitoneal o intraperitonealmente; s.c, subcutánea o subcutáneamente; y similares.
Ejemplo 1: Uso de Cas9 para generar modificaciones en ADN objetivo.
MATERIALES Y MÉTODOS Cepas bacterianas y condiciones de cultivo Streptococcus pyogenes, cultivado en medio THY (caldo Todd Hewitt (THB, por sus siglas en inglés, Bacto, Becton Dickinson) complementado con extracto de levadura al 0,2 % (Oxoid)) o en TSA (agar tripticasa de soja,_ BBL, Becton, Dickinson), complementado con sangre de oveja al 3 %, se incubó a 37 °C en una atmósfera complementada con CO2 al 5 % sin agitar. Escherichia coli, cultivado en medio Luria-Bertani (LB) y agar, se incubó a 37 °C con agitación. Cuando se requirió, se agregaron antibióticos adecuados al medio en las siguientes concentraciones finales: ampicilina, 100 mg/ml para E. coli; cloranfenicol, 33 pg/ml para E, coli; kanamicina, 25 pg/ml para E. coli y 300 pg/ml para S. pyogenes. El crecimiento celular bacteriano se monitoreó de manera periódica mediante la medición de la densidad óptica de 620 nm de alícuotas de cultivo utilizando un lector de microplacas (SLT Spectra Reader).
Transformación de células bacterianas La transformación de ADN de plásmido en células de E. coli se realizó de acuerdo con un protocolo estándar se shock térmico. La transformación de S. pyogenes se llevó a cabo según se describió en algunas modificaciones. El ensayo de transformación realizado para monitorear la actividad CRISPR/Cas in vivo en mantenimiento de plásmidos se llevó a cabo esencialmente según lo descrito anteriormente. En síntesis, las células electrocompetentes de S. pyogenes se ecualizaron a la misma densidad celular y se electroporaron con 500 ng de ADN de plásmido. Cada transformación se colocó en placas dos a tres veces y el experimento se llevó a cabo tres veces de manera independiente con diferentes lotes de células competentes para análisis estadístico. Las eficiencias de transformación se calcularon como CFU (unidades formadoras de colonias) por mg de ADN. Las transformaciones de control se llevaron a cabo con agua estéril y vector de estructura pEC85.
Manipulaciones de ADN Las manipulaciones de ADN que incluyen preparación, amplificación, digestión, ligación, purificación, electroforesis en gel de agarosa de ADN, se llevaron a cabo de acuerdo con téenicas estándar con modificaciones menores. Los plásmidos protoespaciadores para la escisión in vitro y los ensayos de transformación de S. pyogenes se construyeron según se describió anteriormente (4). Los plásmidos protoespaciadores adicionales basados en pUC19 para los ensayos de escisión in vitro se generaron ligando oligonucleótidos hibridados entre sitios EcoRI y BamHI en pUC19. El plásmido que contenía el gen GFP se describió anteriormente (41). Los kits (Qiagen) se utilizaron para la purificación de ADN y la preparación de plásmidos. La mutagénesis de plásmidos se llevó a cabo usando el kit QuikChange® II XL kit (Stratagene) o el kit de mutagénesis dirigida al sitio QuickChange (Agilent). Los oligonucleótidos y ARN fueron proporcionados por VBC-Biotech Services, Sigma-Aldrich e Integrated DNA Technologies.
Oligonucleótidos para plantillas de transcripción in vitro Plantillas para tracrRNA de CRISPR Tipo II transcrito in vitro y crRNA de S . pyogenes (para tracrRNA - PCR en cr. ADN SF370; para crRNA - hibridación de dos oligonucleótidos) T7-tracrRNA (75 nt) OLEC1521 (F 5' tracrRNA): SEQ ID NO:340 OLEC1522 (R 3' tracrRNA): SEQ ID NO:341 T7-crRNA (plantilla) OLEC2176 (F crRNA-spl): SEQ ID NO:342 OLEC2178 (R crRNA-spl): SEQ ID NOÍ343 OLEC2177 (F crRNA-sp2): SEQ ID NO:344 OLEC2179 (R crRNA-sp2): SEQ ID NO:345 Plantillas para tracrRNA de N. meningitidis transcrito in vitro y crRNA-sp2 modificado genéticamente (para tracrRNA - PCR en cr. ADN Z2491; paca crRNA hibridación de dos oligonucleótidos) T7-tracrRNA OLEC2205 (F previsto 5'): SEQ ID NO:346 OLEC2206 (R previsto 3'): SEQ ID NO:347 T7-crRNA (plantilla) OLEC2209 (F sp2 {speM) + N.m. repetición): SEQ ID NO:348 OLEC2214 (R sp2 (speM) + N.m. repetición): SEQ ID NO:349 Plantillas para tracrRNA de L. innocua transcrito in vitro y crRNA-sp2 modificado genéticamente (para tracrRNA - PCR en cr. ADN Clipll262; para crRNA - hibridación de dos oligonucleótidos) T7-tracrRNA OLEC2203 (F previsto 5'): SEQ ID NO:350 OLEC2204 (R previsto 3'): SEQ ID NO:351 T7-crRNA (plantilla) OLEC2207 (F sp2 (speM) + L. in . repetición): SEQ ID NO:352 OLEC2212 (R sp2 { speM) + L. in . repetición): SEQ ID NO:353 Oligonucleótidos para la construcción de plásmidos con protoespaciador para estudios in vitro e in vivo Plásmidos para speM (espaciador 2 (CRISPR Tipo II-A, SF370; profago protoespaciador 08232.3.de MGAS8232) análisis in vitro y en S. pyogenes (plantilla: cr. ADN MGAS8232 o plásmidos que contengan fragmentos de speM) pEC287 OLEC1555 (F speM).: SEQ ID NO:354 OLEC1556 (R speM) : SEQ ID NO:355 pEG488 OLEC2145 (F speM) : SEQ ID NO:356 OLEC2146 (R speM) : SEQ ID NO:357 PEC370 OLEC1593 (F pEC488 protoespaciador 2 A22G): SEQ ID NO:358 OLEC1594 (R pEC488 protoespaciador 2 A22G): SEQ ID NO:359 PEC371 OLEC1595 (F pEC488 protoespaciador 2 T10C): SEQ ID NO:360 OLEC1596 (R pEC488 protoespaciador 2 T10C): SEQ ID NO:361 pEC372 OLEC2185 (F pEC488 protoespaciador 2 T7A): SEQ ID NO:362 OLEC2186 (R pEC488 protoespaciador 2 T7A): SEQ ID NO:363 PEC373 OLEC2187 (F pEC488 protoespaciador 2 A6T): SEQ ID NO:364 OLEC2188 (R pEC488 protoespaciador 2 A6T): SEQ ID NO:365 pEC374 OLEC2235 (F pEC488 protoespaciador 2 A5T): SEQ ID NO:366 OLEC2236 (R pEC488 protoespaciador 2 A5T): SEQ ID NO:367 PEC375 OLEC2233 (F pEC488 protoespaciador 2 A4T): SEQ ID NO:368 OLEC2234 (R pEC488 protoespaciador 2 A4T): SEQ ID NO:369 pEC376 OLEC2189 (F pEC488 protoespaciador 2 A3T): SEQ ID NO:370 OLEC2190 (R pEC488 protoespaciador 2 A3T): SEQ ID NO:371 pEC377 OLEC2191 (F pEC488 protoespaciador 2 PAM G1C): SEQ ID NO:372 OLEC2192 (R pEC488 protoespaciador 2 PAM G1C): SEQ ID NO:373 pEC378 OLEC2237 I pEC488 protoespaciador 2 PAM GG1, 2CC): SEQ ID NO:374 OLEC2238 I (R pEC488 protoespaciador 2 PAM GG1, 2CC): SEQ ID NO:375 Plásmidos para SPy_0700 (espaciador 1 (CRISPR Tipo II-A, SF370; profago protoespaciador 0370.1 de SF370) análisis in vitro y en S. pyogenes (plantilla: cr. ADN SF370 o plásmidos que contengan fragmentos de SPy_0700) pEC489 OLEC2106 (F Spy_0700): SEQ ID NO:376 OLEC2107 (R Spy_0700): SEQ ID NO:377 pEC573 OLEC29 1 (F PAM TG1, 2GG): SEQ ID NO:378 OLEC2942 (R PAM TG1, 2GG): SEQ ID NO:379 Oligonucleótidos para la verificación de construcciones de plásmidos y sitios de corte mediante análisis de secuenciación ColEl (pEC85) OÜ RN228 (secuenciación R): SEQ ID NO:380 speM (pEC287) OLEC1557 (secuenciación F): SEQ ID NO:381 OLEC1556 (secuenciación R): SEQ ID NO:382 repDEG-pAMbetal (pEC85) OLEC787 (secuenciación F): SEQ ID NO:383 Oligonuoleótidos para engayos de escisión in vi tro crRNA crRNA espaciador 1 (1-42): SEQ ID NO:384 crRNA espaciador 2 (1-42): SEQ ID NO:385 crRNA espaciador 4 (1-42): SEQ ID NO:386 crRNA espaciador 2 (1-36): SEQ ID NO:387 crRNA espaciador 2 (1-32): SEQ ID NO:388 crRNA espaciador 2 (11-42): SEQ ID NO:389 tracrRNA (4-89): SEQ ID NO:390 (15-89): SEQ ID NO:391 (23-89): SEQ ID NO:392 (15-53): SEQ ID NO:393 (15-44): SEQ ID NO:394 (15-36): SEQ ID NO:395 (23-53): SEQ ID NO:396 (23-48): SEQ ID NO:397 (23-44): SEQ ID NO:398 (1-26): SEQ ID NO:399 ARN quiméricos Espaciador 1 - quimera A SEQ ID NO:400 Espaciador 1 - quimera B SEQ ID NO:401 Espaciador 2 - quimera A SEQ ID NO:402 Espaciador 2 - quimera B SEQ ID NO:403 Espaciador 4 - quimera A SEQ ID NO:04 Espaciador 4 - quimera B: SEQ ID NO:405 GFP1: SEQ ID NO:406 GFP2: SEQ ID NO:407 GFP3: SEQ ID NO:408 GFP4: SEQ ID NQ:409 GFP5: SEQ ID NO:410 Oligonucleótidos de ADN como sustratos para ensayos de escisión (protoespaciador en negrita, PAM subrayado) protoespaciador 1 - complementario - tipo salvaje: SEQ ID NO:411 protoespaciador 1 - no complementario - tipo salvaje: SEQ ID NO:412 protoespaciador 2 - complementario - tipo salvaje: SEQ ID NO:413 protoespaciador 2 - no complementario - tipo salvaje: SEQ ID NO:414 protoespaciador 4 - complementario - tipo salvaje: SEQ ID NO:415 protoespaciador 4 - no complementario - tipo salvaje: SEQ ID NO:416 protoespaciador 2 - complementario - PAM1: SEQ ID NO:417 protoespaciador 2 - no complementario - PAM1: SEQ ID NO:418 protoespaciador 2 - complementario - PAM2: SEQ ID NO:419 protoespaciador 2 - no complementario - PAM2: SEQ ID NO:420 protoespaciador 4 - complementario - PAM1: SEQ ID NO:421 protoespaciador 4 - no complementario - PAM1: SEQ ID NO:422 protoespaciador 4 - complementario - PAM2: SEQ ID NO:423 protoespaciador 4 - no complementario - PAM2: SEQ ID NO:424 Transcripción y purificación de ARN in vitro El ARN se transcribió in vitro utilizando el kit de transcripción in vitro T7 Flash (Epicentre, Illumina company) y modelos de ADN generados por PCR con una secuencia promotora de T7. El ARN se purificó en gel y se comprobó su calidad antes del uso. Los cebadores utilizados para la preparación de modelos de ARN de S. pyogenes SF370, Listeria innocua Clip 11262 y Neisseria meningitidis A Z2491 se describieron anteriormente.
Purificación de proteínas La secuencia codificadora de Cas9 (residuos 1-1368) se amplificó mediante PCR del ADN genómico de S. pyogenes SF370 y se insertó en un vector de expresión personalizado con base en PET mediante clonación independiente de ligación (LIC, por sus siglas en inglés). La construcción de fusión resultante contenia una etiqueta de proteina de unión hexahistidina-maltosa del extremo N (His6- MBP), seguida por una secuencia de péptidos que contenia un sitio de escisión de proteasa del virus del grabado del tabaco (VGT). La proteina se expresó en la cepa de E. coli BL21 Rosetta 2 (DE3) (EMD Biosciences), cultivada en medio 2xTY a 18 °C durante 16 horas luego de la inducción con IPTG 0,2 mM. La proteina se purificó mediante una combinación de afinidad, intercambio iónico y etapas de cromatografía de exclusión por tamaño. En síntesis, las células se U saron en Tris 20 mM con pH 8,0, NaCl 500 mM, TCEP 1 mM (complementado con cóctel inhibidor de proteasa (Roche)) en un homogenizador (Avestln). El U sado aclarado se unió en lote a agarosa Ni-NTA (Quiagen). La resina se lavó de manera extensiva con Tris 20 mM con pH 8,0, NaCl 500 mM y la proteina unida se eluyó en Tris 20 mM con pH 8,0, NaCl 250 mM, glicerol al 10 %. La etiqueta de afinidad His6-MBP se quitó mediante escisión con proteasa TEV, mientras que la proteina se dializó durante la noche contra HEPES 20 mM con pH 7,5, KC1150 mM, TCEP 1 mM, glicerol al 10 %. La proteina escindida Cas9 se separó de la etiqueta de fusión mediante purificación en una columna de Sefarosa SP HiTrap de 5 mi (GE Life Sciences), eluyéndola con un gradiente lineal de 100 mM - KC1 1 M. La proteina se purificó posteriormente mediante cromatografía de exclusión por tamaño en una columna Superdex 200 16/60 en HEPES 20 mM con pH 7,5, KC1150 mM y TCEP 1 mM. La proteína eluida se concentró a ~8 mg/ml, se ultracongeló en nitrógeno líquido y se almacenó a -80 °C. Los mutantes puntuales de Cas9 D10A, H840A y D10A/H480A se generaron con el kit de mutagénesis dirigida al sitio de QuickChange (Agilent) y se confirmaron mediante secuenciación de ADN. Las proteínas se purificaron utilizando el mismo procedimiento que para la proteína Cas9 de tipo salvaje.
Los ortólogos de Cas9 de Streptococcus thermophilus (LMD-9,YP_820832.1), L. innocua (Clipll262, NP_472073.1), Campylobacter jejuni (subesp. jejuni NCTC 11168, YP_002344900.1) y N. meningitidis (Z2491, YP_002342100.1) se expresaron en células BL21 Rosetta (DE3) pLysS (Novagen) como proteínas de fusión His6-MBP (N. meningitidis y C. jejuni), His6-Thioredoxin (L. innocua) y His6-GST (S. thermophilus), y se purificaron esencialmente como Cas9 de S. pyogenes con las siguientes modificaciones. Debido a grandes cantidades de ácidos nucleicos copurificantes, las cuatro proteínas Cas9 se purificaron mediante una etapa adicional de heparina sefarosa previa a la filtración en gel, eluyendo la proteína unida con un gradiente lineal de KC1 100 mM - 2 M. Esto quitó exitosamente la contaminación de ácido nucleico de las proteínas C. jejuni, N. meningitidis y L. innocua, pero no pudo quitar los ácidos nucleicos copurificadores de la preparación de Cas9 de S. thermophilus. Todas las proteínas se concentraron a 1-8 mg/ml en HEPES 20 M con pH 7,5, KC1 150 mM y TCEP 1 M, se ultracongelaron en N2 líquido y se almacenaron a -80 °C.
Ensayo de escisión de ADN de plásmido Se pre-hibridaron tracrRNA y crRNA sintéticos o transcritos in vitro previo a la reacción calentando a 95 °C y enfriando lentamente a temperatura ambiente. El ADN de plásmido natural o linealizado mediante digestión de restricción (300 ng (~8 nM)) se incubó durante 60 minutos a 37 °C con proteína Cas9 purificada (50-500 nM) y dúplex tracrRNA:crRNA (50-500 nM, 1:1) en un amortiguador de escisión de plásmido Cas9 (HEPES 20 mM con pH 7,5, KC1 150 mM, DTT 0,5 mM, EDTA 0,1 mM) con o sin MgCl2 10 mM. Las reacciones se detuvieron con 5X amortiguador de carga de ADN que contenía EDTA 250 mM, se resolvieron mediante electroforesis en gel de agarosa ál 0,8 o 1 % y se visualizaron mediante tinción con bromuro de etidio. Para los ensayos de escisión de Cas9 mutante, las reacciones se detuvieron con 5X amortiguador de carga SDS (glicerol al 30 %, SDS al 1,2 %, EDTA 250 mM) previo a la carga en el gel de agarosa.
Ensayo de escisión dependiente de metal El ADN de plásmido protoespaciador 2 (5 nM) se incubó durante 1 hora·a 37 °C con Cas9 (50 nM) preincubado con 50 nM de tracrRNA:crRNA^sp2 en amortiguador de escisión (HEPES 20 mM con pH 7,5, KC1 150 mM, DTT 0,5 mM, EDTA 0,1 mM) complementado con MgCl21, 5 o 10 mM, MnCl2, CaCl2, ZnCl2, CoCl2, NiSO4 o CuS04 1 o 10 mM. La reacción se detuvo agregando 5X amortiguador de carga SDS (glicerol al 30 %, SDS al 1,2 %, EDTA 250 mM), se resolvió por electroforesis en gel de agarosa al 1 % y se visualizó mediante tinción con bromuro de etidio.
Ensayo de reemplazo simple La Cas9 (25 nM) se preincubó durante 15 minutos a 37 °C en amortiguador de escisión (HEPES 20 mM con pH 7,5, KC1150 mM, MgCl2 10 mM, DTT 0,5 mM, EDTA 0,1 mM) con tracrRNA:crRNA-sp2 en dúplex (25 nM, 1:1) o ambos ARN (25 nM) sin prehibridar y la reacción se inició agregando ADN de plásmido protoespaciador 2 (5 nM). La mezcla de reacción se incubó a 37 °C. En intervalos definidos de tiempo, se retiraron muestras de la reacción, se agregó 5X amortiguador de carga SDS (glicerol al 30 %, ADA al 1,2 %, EDTA 250 mM) para detener la reacción y la escisión se monitoreó mediante electroforesis en gel de agarosa al 1 % y tinción de bromuro de etidio. Lo mismo se hizo para la cinética de reemplazo simple sin preincubación de Cas9 ,y ARN, donde el ADN de plásmido protoespaciador 2 (5 nM) se mezcló en amortiguador de escisión con dúplex tracrRNA:crRNA-sp2 (25 nM) o ambos ARN (25 nM) sin prehibridar y la reacción se inició agregando Cas9 (25 nM) Se analizó el porcentaje de escisión mediante densitometría y el promedio de tres experimentos independientes se gráfico en función del tiempo. Se ajustaron los datos mediante análisis de regresión no lineal y se calcularon las tasas de escisión (k0bs [min-1]).
Ensayo de reemplazo múltiple Se preincubó Cas9 (1 nM) durante 15 minutos a 37 °C en amortiguador de escisión (HEPES 20 mM con pH 7,5, KC1150 mM, MgCl2 10 mM, DTT 0,5 mM, EDTA 0,1 mM) con tracrRNA:crRNA-sp2 pre-hibridado (1 nM, 1:1). Se inició la reacción mediante la adición de ADN de plásmido protoespaciador 2 (5 nM). En intervalos definidos de tiempo, se retiraron muestras y se detuvo la reacción agregando 5X amortiguador de carga SDS (glicerol al 30 %, SDS al 1,2 %, EDTA 250 mM). La reacción de escisión se resolvió mediante electroforesis en gel de agarosa al 1 %, teñida con bromuro de etidio y el porcentaje de escisión se analizó mediante densitometria. Se graficaron los resultados de cuatro experimentos independientes en función del tiempo (minutos).
Ensayo de escisión de ADN de oligonucleótido Los oligonucleótidos de ADN (10 pmol) se radiomarcaron mediante incubación con 5 unidades de polinucleótido cinasa T4 (New England Biolabs) y -3-6 pmol (-20-40 mCi) [g-32R]-ATR (Promega) en IX amortiguador de reacción de polinucleótido cinasa T4 a 37 °C durante 30 minutos, en una reacción de 50 pL. Luego de la inactivación por calor (65 °C durante 20 minutos), las reacciones se purificaron mediante una columna Illustra MicroSpin G-25 (GE Healthcare) para quitar las etiquetas no incorporadas. Los sustratos de dúplex (100 nM) se generaron mediante la hibridación de oligonucleótidos marcados con cantidades equimolares de oligonucleótido complementario sin marcar a 95 °C durante 3 minutos, luego enfriando lentamente a temperatura ambiente. Para ensayos de escisión, se hibridaron tracrRNA y crRNA mediante calentamiento a 95 °C durante 30 segundos, seguido de enfriamiento lento a temperatura ambiente. Se preincubó Cas9 (concentración final 500 nM) con el dúplex hibridado tracrRNA:crRNA (500 nM) en el amortiguador de ensayo de escisión (HEPES 20 mM con pH 7,5, KC1100 mM, MgCl25 mM, DTT 1 mM, glicerol al 5 %) en un volumen total de 9 ml. Se iniciaron las reacciones añadiendo 1 ml de ADN objetivo (10 nM) y se incubaron durante 1 hora a 37 °C. Las reacciones se inactivaron añadiendo 20 m? de tinte de carga (EDTA 5 nM, SDS al 0,025 %, glicerol al 5 % en formamida) y se calentaron a 95 °C durante 5 minutos. Los productos de escisión se resolvieron en geles de poliacrilamida desnaturalizada al 12 % que contenían urea 7 M y se visualizaron mediante imaginología de fósforo. Se llevaron a cabo los ensayos que examinaban los requisitos de PAM (Figura 13B) utilizando sustratos de dúplex que se habían prehibridado y purificado en un gel de acrilamida natural al 8 % y posteriormente se marcaron en ambos extremos 5'. Las reacciones se establecieron y analizaron de la misma forma que lo descrito anteriormente.
Ensayos de cambio de movilidad electroforética Los dúplex de ADN objetivo se formaron mezclando cada cadena (10 nmol) en agua desionizada, calentando a 95 °C durante 3 minutos y enfriando lentamente a temperatura ambiente. Todos los ADN se purificaron en geles naturales al 8 % que contenían IX TBE. Las bandas de ADN se visualizaron mediante análisis de absorbancia UV se extirparon y se eluyeron sumergiendo piezas de gel en H2O tratada con DEPC. El ADN eluido era etanol precipitado y disuelto en H20 tratada con DEPC. Las muestras de ADN eran extremos 5' marcados con [g-32P]-ATP usando polinucleótido cinasa T4 (New England Biolabs) durante 30 minutos a 37 °C. PNK se desnaturalizó mediante calor a 65 °C durante 20 minutos, y se quitaron las etiquetas no incorporadas con una columna Illustra MicroSpin G-25 (GE Healthcare). Los ensayos de unión se realizaron en amortiguador que contenía HEPES 20 mM con pH 7,5, KC1100 mM, MgCl2 5 mM, DTT 1 M y glicerol al 10 % en un volumen total de 10 ml. El mutante doble de Cas9 D10A/H840A se programó con cantidades equimolares del dúplex tracrRNA:crRNA prehibridado y se tituló de 100 pM a 1 mM. Se agregó péptido el ADN radiomarcado a una concentración final de 20 pM. Las muestras se incubaron durante 1 hora a 37 °C y se resolvieron a 4 °C en un gel de poliacrilamida natural al 8 % que contenía IX TBE y MgCl25 mM. Los geles se secaron y el ADN se visualizó mediante imaginología de fósforo.
Análisis simulado de secuencias de ADN y proteínas Se utilizó el paquete Vector NTI (Invitrogen) para el análisis de secuencias de ADN (Vector NTI) y el análisis comparativo de secuencias de proteínas (AlignX), Modelación simulada de estructuras de ARN y coplegado Las predicciones simuladas se realizaron utilizando los algoritmos de paquete de ARN Vienna (42, 43). Las estructuras secundarias de ARN y modelos de coplegado se predijeron con RNAfold y RNAcofold, respectivamente, y se visualizaron con VARNA (44).
RESULTADOS Las bacterias y las arqueas tienen sistemas adaptativos de defensas mediados por ARN evolucionados llamados repeticiones .palindrómicas cortas agrupadas y regularmente espaciadas (CRISPR)/asociados con CRISPR (Cas) que protegen a los organismos de virus y plásmidos invasores (1-3). Se demuestra que en un subconjunto de estos sistemas, el crRNA maduro que forma pares de base con crRNA transactivador (tracrRNA) forma una estructura de dos ARN que direcciona la proteína Cas9 asociada con CRISPR para introducir roturas de cadena doble (cd) en ADN objetivo. En sitios complementarios a la secuencia guia de crRNA, el dominio de nucleasa HNH de Cas9 escinde la cadena complementaria, donde el dominio de Cas9 similar a RuvC escinde la cadena no complementaria. El tracrRNA:crRNA dual, cuando se modifica genéticamente como una única quimera de ARN, también dirige la escisión de ADNdc de Cas9 específica a la secuencia. Estos estudios revelan una familia de endonucleasas que utilizan ARN dual para la escisión de ADN específica al sitio y resaltan la capacidad de explotar el sistema para la edición genómica programable por ARN.
Los sistemas de defensa CRISPR/Cas se basan en ARN pequeño para la detección específica a la secuencia y el silenciamiento de ácidos nucleicos externos. Los sistemas CRISPR/Cas están compuestos de genes cas dispuestos en uno o más operones y una o más configuraciones de CRISPR que consisten en secuencias dirigidas a genomas (llamadas espaciadores) intercaladas con repeticiones idénticas (1-3). La inmunidad mediada por CRISPR/Cas se da en tres pasos. En la fase adaptativa, las bacterias y arqueas que contienen uno o más locus de CRISPR responden a exposición a virus o plásmidos integrando fragmentos cortos de secuencia externa (protoespaciadores) en el cromosoma hospedador en el extremo proximal de la configuración de CRISPR (1-3). En las fases de expresión e interferencia, la transcripción del elemento espaciador de repetición en las moléculas de ARN CRISPR precursor (pre-crRNA), seguida de escisión enzimática, da como resultado los crRNA cortos que pueden aparearse con secuencias complementarias de protoespaciador de objetivos invasores virales o plásmidos (4-11). El reconocimiento de crRNA de los objetivos dirige el silenciamiento de las secuencias externas mediante las proteínas Cas que funcionan formando complejos con los crRNA (10, 12-20).
Hay tres tipos de sistemas CRISPR/Cas (21-23). Los sistemas de tipo I y III comparten algunas características generales: las endonucleasas Cas especializadas procesan los pre-crRNA y, ya-maduro, cada crRNA se une en un gran complejo de proteínas multi-Cas capaz de reconocer y escindir ácidos nucleicos complementarios al crRNA. Por el contrario, los sistemas de tipo II procesan los precrRNA mediante un mecanismo distinto, en el cual un crRNA transactivador (tracrRNA) complementario a las secuencias de repetición en pre-crRNA dispara el procesamiento realizado por la ribonucleasa específica a ARN de doble cadena (de) RNasa III ante la presencia de la proteína Cas9 (anteriormente Csnl) (Figura 15) (4, 24). Se piensa que Cas9 es la única proteína responsable por el silenciamiento guiado por crRNA de ADN foráneo (25-27).
Se demuestra que en los sistemas de tipo II, las proteínas Cas9 constituyen una familia de enzimas que requieren una estructura de pares de bases formada entre el tracrRNA activador y el crRNA identificador para escindir ADNcd objetivo. La escisión específica del sitio ocurre en ubicaciones determinadas por ambas complementariedades de pares de base entre el crRNA y el ADN protoespaciador objetivo y un motivo corto [al cual se hace referencia como el motivo adyacente protoespaciador (PAM)] yuxtapuestos a la región complementaria en el ADN objetivo. El presente estudio demuestra además que la familia de endonucleasas de Cas9 puede programarse con moléculas simples de ARN para escindir sitios específicos de ADN, facilitando así el desarrollo de un sistema dirigido a ARN simple y versátil para generar roturas de ADNcd para la dirección y edición genómicas.
Cas9 es una endonucleasa de ADN guiada por dos ARN Surge la hipótesis de que Cas9, la proteina distintiva de los sistemas de tipo II, está involucrada tanto en la maduración de crRNA y en la interferencia de ADN guiada por crRNA (Figura 15) (4, 25-27). Cas9 está involucrada en la maduración de crRNA (4), pero no se ha investigado su participación directa en la destrucción de ADN objetivo. Para probar si Cas9 es capaz de dirigir la escisión de ADN, y cómo, se utilizó un,sistema de sobreexpresión para purificar la proteina Cas9 derivada del patógeno Streptococcus pyogenes (Figura 16, ver materiales y métodos complementarios) y se probó su capacidad de escindir un ADN de plásmido o un dúplex de oligonucleótido con una secuencia de protoespaciador complementaria a un crRNA maduro, y un PAM bona fide. Se descubrió que el crRNA maduro en si mismo no era capaz de dirigir la escisión de ADN de plásmido catalizada por Cas9-(Figura 10A y Figura 17A). No obstante, la adición de tracrRNA, el cual puede emparejarse con la secuencia de repetición de crRNA y es esencial para la maduración de crRNA en este sistema, disparó que Cas9 escindiera ADN de plásmido (Figura 10A y Figura 17A). La reacción de escisión requirió tanto magnesio como la presencia de una secuencia de crRNA complementaria al ADN; un crRNA capaz de crear pares de bases de tracrRNA pero que contenia una secuencia de unión a ADN objetivo no cognado no brindó soporte a la escisión de plásmido catalizado por Cas9 (Figura 10A; Figura 17A, comparar crRNA-sp2 con crRNA-spl; y Figura 18A). Se obtuvieron resultados similares con un sustrato de ADNcd corto linear (Figura 10B y Figura 17, B y C). De esta forma, el tracrRNA transactivador es un ARN pequeño no codificante con dos funciones cruciales: disparar el procesamiento de pre-crRNA mediante la enzima RNasa III (4) y posteriormente activar la escisión de ADN guiada por crRNA mediante Cas9.
La escisión de tanto plásmido como ADNcd corto linear mediante Cas9 dirigido por tracrRNa:crRNA es especifica al sitio (Figura 10, C a E-y Figura 19, A y B). La escisión de ADN de plásmido produjo extremos romos en una posición anterior en tres pares de base de la secuencia PAM (Figura 10, C y E y Figura 19, A y C) (26). De manera similar, dentro de dúplex con ADNcd corto, la cadena de ADN que es complementaria a la secuencia de unión al objetivo en el crRNA (la cadena complementaria) se escinde en el sitio que se encuentra en posición anterior en tres pares de base del PAM (Figura 10, D y ,E, y Figura 19, B y C). La cadena de ADN no complementaria se escinde en uno o más sitios dentro de tres a ocho pares de base ubicados anteriores al PAM. Una investigación posterior reveló que la cadena no complementaria se escinde primero de manera endonucleótica y se recorta posteriormente mediante una actividad de 3'-5' exonucleasa (18B). Las tasas de escisión mediante Cas9 en condiciones de reemplazo simple en un intervalo de 0,3 a 1 min-1, en comparación con aquellas de las endonucleasas de restricción (Figura 20A), mientras que la incubación del complejo Cas9-tracrRNA:crRNA de tipo salvaje (TS) con un exceso molar de cinco veces de ADN de sustrato proporcionó pruebas de que la Cas9 guiada por ADN dual es una enzima de reemplazo simple (Figura 20B). En comparación con el complejo de cascada de CRISPR de tipo I (18), Cas9 escinde tanto plásmidos linealizados como superenrrollados (Figuras 10A y 11A). Por lo tanto, un plásmido invasor puede, en principio, ser escindido múltiples veces por proteínas Cas9 programadas con crRNA diferentes.
Figura 10 (A) Cas9 programada con un crRNA-sp2 de 42 nucleótidos (crRNA que contiene una secuencia de espaciador 2) en presencia o ausencia de tracrRNA de 75 nucleótidos. El complejo se agregó a ADN de plásmido circular o linealizado por Xhol que contenía una secuencia complementaria al espaciador 2 y un PAM funcional. crRNA-spl, control de especificidad; M, marcador de ADN; kbp, pares de kilobases. Véase la Figura 17A. (B) La Cas9 se programó con crRNa-sp2 y tracrRNA (nucleótidos 4 a 89). El complejo se incubó con ADN de cadena doble o simple que contenía una secuencia complementaria al espaciador 2 y un PAM funcional (4). Las cadenas complementarias o no complementarias de ADN se radiomarcaron en la posición 5' y se hibridaron con una cadena compañera, nt, nucleótidos. Véase la Figura 17, B y C. (C) Análisis de secuenciación de productos de escisión de la Figura 10A. La terminación de la primera extensión en la reacción de secuenciación indica la posición del sitio de escisión. El excedente A (asteriscos) del extremo 3' es un artefacto de la reacción de secuenciación. Véase la Figura 19, A y C. (D) Los productos de escisión de la Figura 10B se analizaron junto con marcadores de tamaño marcados en el extremo 5' derivados de las cadenas complementarias y no complementarias del dúplex de ADN objetivo. M, marcador; P, producto de escisión. Véase la Figura 19, B y C. (E) Representación esquemática de secuencias de ADN de tracrRNA, crRNA-sp2 y protoespaciador 2. Se representan regiones de complementariedad de crRNA a tracrRNA (sobrerrayado) y el ADN de protoespaciador (subrayado). Se marca la secuencia PAM; los sitios de escisión mapeados en (C) y (D) se representan mediante flechas con relleno blanco (C), una flecha con relleno negro [(D) cadena complementaria)] y una barra negra [(D) cadena no complementaria].
La Figura 15 ilustra la vía inmunitaria CRISPR/Cas mediada por ARN de Tipo II. Se representan en la figura las etapas de expresión e interferencia. Los locus de CRISPR/Cas de tipo II están compuestos por un operón de cuatro genes que codifica las proteínas Cas9, Casi, Cas2 y Csn2, una configuración de CRISPR que consiste en una secuencia líder seguida por repeticiones idénticas (rectángulos negros) intercaladas con espaciadores únicos dirigidos a genomas (rombos) y una secuencia que codifica el tracrRNA transactivador. Se representa aquí el locus de CRISPR/Cas de tipo II de S. pyogenes SF370 (número de accesión NC_002737) (4). Se indican los promotores y el terminador transcripcional confirmados de manera experimental en este locus (4). La configuración de CRISPR se transcribe como una molécula precursora de ARN de CRISPR (pre-crRNA) que sufre un proceso de maduración específico de los sistemas de tipo II (4). En S. pyogenes SF370, se transcribe el tracrRNA como dos transcripciones primarias con una longitud de 171 y 89 nt que tienen complementariedad a cada repetición de pre-crRNA. El primer evento de procesamiento implica el apareamiento de tracrRNA con pre-crRNA, que forma un ARN dúplex que es reconocido y escindido por la endorribonucleasa constitutiva RNasa III en presencia de la proteina Cas9. La escisión mediada por RNasa III del ARN dúplex genera un tracrRNA procesado de 75 nt y un crRNA intermedio de 66 nt que consiste en una región central que contiene una secuencia de un espaciador, flanqueada por partes de la secuencia de repetición. Un segundo evento de procesamiento, mediado por una o más ribonucleasas desconocidas, lleva a la formación de crRNA maduros con una longitud de 39 a 42 nt, que consisten en una secuencia guia derivada por espaciador en el extremo 5' y una secuencia derivada por repetición en el extremo 3'. Luego del primer y segundo eventos de procesamiento, el tracrRNA maduro permanece apareado a los crRNA maduros y unido a la proteina Cas9. En este complejo ternario, la estructura dual tracrRNA:crRNA actúa como ARN guia que dirige la endonucleasa Cas9 al ADN objetivo cognado. El reconocimiento de objetivo realizado por el complejo Cas9-tracrRNA:crRNA se inicia escaneando la molécula invasora de ADN en búsqueda de homología entre la secuencia de protoespaciador en el ADN objetivo y la secuencia derivada por espaciador en el crRNA. Además de la complementariedad de protoespaciador de ADN-espaciador de crRNA, el direccionamiento de ADN requiere la presencia de un motivo corto (NGG, donde N puede ser cualquier nucleótido) adyacente al protoespaciador (motivo adyacente protoespaciador - PAM). Luego del apareamiento entre el ARN dual y la secuencia de protoespaciador, se forma un bucle R y la Cas9 introduce, posteriormente, una rotura de cadena doble (DSB) en el ADN. La escisión de ADN objetivo mediante Cas9 requiere dos dominios catalíticos en la proteína. En un sitio específico relacionado con el PAM, el dominio HNH escinde la cadena complementaria del ADN mientras que el dominio similar a RuvC escinde la cadena no complementaria.
Figura 16 (A) Cas9 de S. pyogenes se expresó en E. coli como una proteina de fusión que contenia una etiqueta His6-PBM en el extremo N y se purificó mediante una combinación de etapas de afinidad, intercambio iónico y cromatografía de exclusión por tamaño. La etiqueta de afinidad se retiró mediante escisión de proteasa TEV luego de la etapa de purificación por afinidad. Se muestra un cromatograma de la etapa de cromatografía de exclusión por tamaño en una columna Superdex 200 (16/60). Cas9 se eluye como un único pico monomérico sin ácidos nucleicos contaminantes, según se juzga por la proporción de absorbancias a 280 y 260 nm. Recuadro; las fracciones eluidas se resolvieron mediante SDS-PAGE en un gel de poliacrilamida al 10 % y se tiñeron con SimplyBlue Safe Stain (Invitrogen). (B) Análisis SDS-PAGE de ortólogos de Cas9 purificados. Los ortólogos de Cas9 se purificaron como se describe en Materiales y Métodos Complementarios. .Se analizaron 2,5 mg de cada Cas9 purificada en un gel de poliacrilamida de gradiente de 4-20 ¾ y se tiñeron con SimplyBlue Safe Stain.
Figura 17 (ver también la Figura 10). La secuencia de protoespaciador 1 se origina a partir de S. pyogenes SF370 (MI) SPy_0700, objetivo de S. pyogenes SF370 crRNAspl ( 4) . En este caso, la secuencia de protoespaciador 1 se manipuló mediante el cambio de PAM de una secuencia no funcional (TTG) a una secuencia funcional (TGG). La secuencia de protoespaciador 4 se origina a partir de S. pyogenes MGAS10750 (M4) MGAS10750_Spyl285, objetivo de S. pyogenes SF370 crRNA-sp4 ( 4) . (A) Escisión de ADN de plásmido de protoespaciador 1 guiada mediante dúplex de tracrRNA:crRNA cognados. Los productos de escisión se resolvieron mediante electroforesis en gel de agarosa y se visualizaron mediante tinción con bromuro de etidio. M, marcador de ADN; se indican los tamaños de fragmentos en pares de bases. (B) Escisión de ADN de oligonucleótido de protoespaciador 1 guiada mediante dúplex de tracrRNA:crRNA-spl cognados. Los productos de escisión se resolvieron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida desnaturalizada y se visualizaron mediante imaginologia de fósforo. Se indican los tamaños de fragmentos en nucleótidos. (C) Escisión de ADN de oligonucleótido de protoespaciador 4 guiada mediante dúplex de tracrRNA:crRNA-sp4 cognados. Los productos de escisión se resolvieron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida desnaturalizada y se visualizaron mediante imaginologia de fósforo. Se indican los tamaños de fragmentos en nucleótidos. (A, B, C) Los experimentos en (A) se llevaron a cabo como se describe en la Figura 10A; en (B) y en (C) como en la Figura 10B. (B, C) Un esquema de la interacción de ADN objetivo de tracrRNA:crRNA se muestra más adelante. Las regiones de complementariedad de crRNA con tracrRNA y el ADN protoespaciador están sobrerrayadas y subrayadas, respectivamente. La secuencia PAM está marcada.
Figura 18 (ver también la Figura 10). (A) ADN de plásmido de protoespaciador 2 se incubó con Cas9 en complejo con tracrRNA:crRNA-sp2 en presencia de diferentes concentraciones de Mg2+, Mn2+, Ca2+, Zn2+, Co2+, Ni2+ o ·Cu2+. Los productos de escisión se resolvieron mediante electroforesis en gel de agarosa y se visualizaron mediante tinción con bromuro de etidio. Se indican las formas de plásmido. (B) Un dúplex de ADN de oligonucleótido de protoespaciador 4 que contenia un motivo de PAM se híbrido y purificó con gel antes de radiomarcarlo en ambos extremos 5'. Se incubó el dúplex (concentración final de 10 mM) con Cas9 programada con tracrRNA (nucleótidos 23-89) y crRNAsp4 (concentración final de 500 nM, 1:1). En los momentos indicados (min), se inactivaron alícuotas de 10 ml de reacción de escisión con amortiguador de formamida que contenía SDS al 0,025 % y EDTA 5 mM, y se analizaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida desnaturalizada como en la Figura 10B. Se indican los tamaños en nucleótidos.
Figura 19 (A) Mapeo de escisión de ADN de plásmido protoespaciador 1. Los productos de escisión de la Figura 17A se analizaron mediante secuenciación como en la Figura 10C. Cabe destacar que el excedente A (asterisco) del extremo 3' es un artefacto de la reacción de secuenciación. (B) Mapeo de escisión de ADN de oligonucleótido protoespaciador 4. Los productos de escisión de la Figura 17C se analizaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida desnaturalizada junto con marcadores de tamaño de oligonucleótido marcados en el extremo 5' derivados de las cadenas complementaria y no complementaria del ADN de dúplex protoespaciador 4. M, marcador; P, producto de escisión. Líneas 1-2: cadena complementaria. Líneas 3-4: cadena no complementaria. Se indican los tamaños de fragmentos en nucleótidos. (C) Representaciones esquemáticas de secuencias de tracrRNA, crRNA-spl y ADN protoespaciador 1 (parte superior) y secuencias de tracrRNA, crRNAsp4 y ADN protoespaciador 4 (parte inferior). tracrRNA:crRNA forma una estructura de A doble dirigida al ADN de protoespaciador complementario a través del apareamiento con ADN protoespaciador-crRNA. Las regiones complementarias a crRNA con tracrRNA y el ADN protoespaciador están sobrerrayadas y subrayadas, respectivamente. Los sitios de escisión en las cadenas de ADN complementaria y no complementaria mapeadas en (A) (parte superior) y (B) (parte inferior) se representan con flechas (A y B, cadena complementaria) y una barra negra (B, cadena no complementaria) sobre las secuencias, respectivamente.
Figura 20 (A) Cinética de reemplazo simple de Cas9 bajo diferentes condiciones de prehibridación de ARN y preincubación de ARN de proteina. Se incubó ADN de plásmido protoespaciador 2 ya sea con Cas9 preincubada con tracrRNA:crRNA-sp2 prehibridado (o), Cas9 no preincubada con tracrRNA:crRNA-sp2 prehibridado (·), Cas9 preincubada con tracrRNA y crRNA-sp2 no prehibridado (?) o Cas9 no preincubado con ARN no prehibridado (¦). Se monitoreó la actividad de escisión de una manera que dependía del tiempo y se analizó mediante electroforesis en gel de agarosa, seguida de tinción con bromuro de etidio. El porcentaje promedio de escisión de tres experimentos diferentes se gráfico en función del tiempo (min) y se ajustó con una regresión no lineal. Las tasas de escisión calculadas ( kobs ) se muestran en la tabla. Los resultados sugieren que la unión de Cas9 a los ARN no limitan la tasa en las condiciones evaluadas. Se indican las formas de plásmido. Los valores de kobs obtenidos son similares a las endonucleasas de restricción que están típicamente en el orden de 1-10 por minuto [45-47) . (B) Cas9 es una endonucleasa de reemplazo múltiple. Se incubó Cas9 cargada con dúplex de tracrRNA:crRNA-sp2 (1 nM, 1:1:1 -indicado con una línea gris en la gráfica) con un exceso de 5 veces de ADN de plásmido protoespaciador 2 natural. Se monitoreó la escisión mediante el retiro de muestras de la reacción en los intervalos de tiempo definidos (0 a 120 min) seguido de análisis de electroforesis en gel de agarosa (parte superior) y determinación de la cantidad de producto de escisión (nM) (parte inferior). Se indican las desviaciones estándar de tres experimentos independientes. En el intervalo de tiempo investigado, Cas9 1 nM fue capaz de escindir ADN de plásmido ~2,5.
Cada dominio de nucleasa Cas9 escinde una cadena de ADN Cas9 contiene dominios homólogos a ambas endonucleasas HNH y RuvC (Figura 11A y .Figura 3) (21-23, 27, 28). Se diseñaron y purificaron variantes de Cas9 que contenían mutación puntuales inactivadoras en los residuos catalíticos de los dominios similares a RuvC o HNH (Figura 11A y Figura 3) (23, 27). La incubación de estas variantes de proteínas Cas9 con ADN de plásmido natural mostró que las proteínas Cas9 mutantes guiadas por ARN dual proporcionaron plásmidos circulares abiertos mellados, mientras que el complejo de proteína Cas9 de tipo salvaje-tracrRNA:crRNA produjo un producto de ADN lineal (Figuras 10A y 11A y Figuras 17A y 25A). Este resultado indica que los dominios similares a RuvC y HNH de Cas9, cada uno escinde una cadena de ADN de plásmido. Para determinar qué cadena del ADN objetivo se escinde mediante cada dominio catalítico de Cas9, se incubaron los complejos de Cas9 mutante-tracrRNA:crRNA con sustratos de ADNcd cortos en los cuales se radiomarcó ya sea la cadena complementara o la cadena no complementaria en su extremo 5'. Los productos de escisión resultantes indicaron que el dominio de HNH de Cas9 escinde la cadena de ADN complementaria, donde el dominio similar a RuvC de Cas9 escinde la cadena de ADN no complementaria (Figura 11B y Figura 21B).
Figura 11(A) (Parte superior) Representación esquemática de la estructura del dominio de Cas9 que muestra las posiciones de las mutaciones de dominio. D10A, AsplOAlalO; H840A; His840Ala840 . Los complejos de proteínas Cas9 de tipo salvaje o mutante de nucleasa con tracrRNA:crRNA-sp2 se analizaron para verificar la actividad de endonucleasa como en la Figura 10A. (B) Los complejos de Cas9 de tipo salvaje o mutantes de dominio de nucleasa con tracrRNA y crRNA-sp2 se analizaron para verificar la actividad como en la Figura 10B.
Figura 3 Se representa la secuencia de aminoácidos de Cas9 a partir de S. pyogenes (SEQ ID NO:8). Las proteínas Cas9/Csnl de varias especies diferentes tienen 2 dominios que incluyen motivos homólogos a las endonucleasas de RuvC y HNH. (A) Se muestran los motivos 1-4 (los números de motivos están marcados en el lado izquierdo de la secuencia) para Cas9/Csnl de S. pyogenes. Los tres motivos similares a RuvC predichos (1, 2, 4) y el motivo de HNH predicho (3) están subrayados.
Los residuos AsplO y His840, que fueron sustituidos por Ala en este estudio se destacan por medio de un asterisco encima de la secuencia. Los residuos subrayados están altamente conservados entre las proteínas Cas9 de especies diferentes. Es probable que las mutaciones en residuos subrayados tengan consecuencias funcionales en la actividad de Cas9. Cabe destacar que en el presente estudio el acoplamiento de las dos actividades similares a nuclease se demostró de manera experimental (Figura 11 y Figura.21). (B) Se representan los dominios 1 (aminoácidos 7-166) y 2 (aminoácidos 731-1003), que incluyen los motivos 1-4, para S. pyogenes Cas9/Csnl. Referirse a la Tabla 1 y la Figura 5 por información adicional.
Figura 21 Escisión de ADN protoespaciador mediante mutantes Cas9 dirigidos a tracrRNA:crRNA cognados que contienen mutaciones en el dominio similar a RuvC o HNH. (A) Escisión de ADN de plásmido protoespaciador 1. El experimento se llevó a cabo como en la Figura 11A. Se indican las conformaciones y tamaños de ADN de plásmido en pares de bases. (B) Escisión de ADN de oligonucleótido protoespaciador 4. El experimento se llevó a cabo como en la Figura 11B. Se indican los tamaños en nucleótidos.
Requisitos de ARN dual para dirigir la unión y escisión de ADN Puede ser necesario el tracrRNA para la unión a ADN objetivo y/o estimular la actividad de nucleasa de Cas9 en una posición posterior al reconocimiento objetivo. Para distinguir entre estas posibilidades, se usó un ensayo de cambio de movilidad electroforética para monitorear la unión a ADN objetivo mediante Cas9 inactiva catalíticamente en presencia o ausencia de crRNA y/o tracrRNA. El agregado de tracrRNA mejoró sustancialmente la unión a ADN objetivo por Cas9, donde se observó poca unión a ADN específica con Cas9 sola o Cas9-crRNA (Figura 22). Esto indica que tracrRNA es necesario para el reconocimiento de ADN objetivo, posiblemente mediante la orientación adecuada de crRNA para su interacción con la cadena complementaria del ADN objetivo. La estructura secundaria de tracrRNA:crRNA predicha incluye pares de bases entre los 22 nucleótidos del extremo 3' del crRNA y un segmento cercano al extremo 5' del tracrRNA maduro (Figura 10E). Esta interacción crea una estructura en la cual los 20 nucleótidos del extremo 5' de crRNA, que varían en secuencia en crRNA diferentes, están disponibles para la unión a ADN objetivo. La mayor parte del tracrRNA en la posición posterior a la región del par de bases de crRNA está libre para formar estructuras adicionales de ARN y/o para interactuar con Cas9 o con el sitio del ADN objetivo. Para determinar si la longitud completa del tracrRNA es necesaria para la escisión de ADN catalizada por Cas9 específica del sitio, se evaluaron complejos de Cas9-tracrRNA:crRNA reconstituidos usando crRNA maduro de longitud completa (42 nucleótidos) y varias formas truncadas de tracrRNA que carecen de secuencias en sus extremos 5' o 3'. Estos complejos se evaluaron para verificar la escisión usando un ADNcd objetivo corto. Una versión sustancialmente truncada del tracrRNA que conserva los nucleótidos 23 a 48 de la secuencia natural fue capaz de permitir una escisión potente de ADN catalizada por Cas9 guiada por ARN dual (Figura 12, A y C, y Figura 23, A y B). El truncado del crRNA de cualquiera de los extremos mostró que la escisión catalizada por Cas9 en presencia de tracrRNA puede iniciarse con crRNA que carezcan de los 10 nucleótidos del extremo 3' (Figura 12, B y C). Por el contrario, una eliminación de 10 nucleótidos del extremo 5' de crRNA suprimió la escisión de ADN por Cas9 (Figura 12B). También se analizaron los ortólogos de Cas9 de varias especies bacterianas para verificar su capacidad de permitir la escisión de ADN guiada por tracrRNA:crRNA de S. pyogenes. Al contrario de los ortólogos de Cas9 de S. pyogenes relacionados estrechamente, los ortólogos con relaciones más lejanas no fueron funcionales para la reacción de escisión (Figura 24). De manera similar, Cas9 de S. pyogenes Cas9 guiada por dúplex de tracrRNA:crRNA producidos a partir de sistemas más distantes fue incapaz de,escindir ADN de manera eficiente (Figura 24). La especificidad de especie de la escisión guiada por ARN dual de ADN indica una evolución conjunta de Cas9, tracrRNA y la repetición de crRNA, asi como la existencia de una estructura y/o secuencias desconocidas en el ARN dual cruciales para la formación del complejo ternario con ortólogos de Cas9 específicos.
Para investigar los requisitos de la secuencia de protoespaciador para la inmunidad tipo II de CRISPR/Cas en células bacterianas, se analizó una serie de ADN de plásmido que contienen protoespaciadores que portan mutaciones de nucleótido simple para su mantenimiento, seguido de transformación en S. pyogenes y su capacidad de ser escindidos por Cas9 in vitro. Al contrario de las mutaciones puntuales introducidas en el extremo 5' del protoespaciador, las mutaciones en la región cercana al PAM y los sitios de escisión de Cas9 no fueron tolerados in vitro, y dieron como resultado una disminución de la eficiencia de escisión de plásmidos in vitro (Figura 12D). Los resultados concuerdan con el informe previo de mutantes de escape de protoespaciador seleccionados en el sistema de CRISPR de tipo II de S. thermophilus in vivo (27, 29). Además, los resultados de mantenimiento y escisión de plásmidos apuntan a la existencia de una región de "semilla" ubicada en el extremo 3' de la secuencia de protoespaciador que es crucial para la interacción con crRNA y la subsiguiente escisión mediante Cas9. Como apoyo de este concepto, Cas9 mejoró la hibridación de la cadena de ADN complementaria al crRNA; esta mejora fue la más potente en la región del extremo 3' de la secuencia dirigida a crRNA (Figura 25A-C). Para corroborar este descubrimiento, una extensión contigua de al menos 13 pares de bases entre el crRNA y el sitio de ADN objetivo más cercano a PAM es necesaria para una escisión objetivo eficaz, mientras que hasta seis mal apareamientos contiguos en la región del extremo 5' del protoespaciador son tolerables (Figura 12E). Estos descubrimientos son reminiscentes de los requisitos de secuencia semilla observados para el reconocimiento de ácido nucleico objetivo en proteínas Argonauta (30, 31) y los complejos de Csy CRISPR y Casacade (13, 14).
Figura 12 (A) los complejos de Cas9-tracrRNA:crRNA se reconstituyeron usando construcciones de crRNA-sp2 de 42 nucleótidos y tracrRNA truncado y se analizaron para verificar la actividad de escisión como en la Figura 10B. (B) Se analizó la Cas9 programada con truncaciones de crRNA-sp2 y tracrRNA de longitud completa para verificar su actividad en (A). (CJ) Regiones minimas de tracrRNA y crRNA capaces de guiar la escisión de ADN mediada por Cas9 (región sombreada). (D) Los plásmidos que contienen secuencias de protoespaciador 2 de tipo salvaje o mutantes con mutaciones puntuales indicadas se escindieron in vitro mediante Cas9 programada como en la Figura 10A y se usaron para ensayos de transformación de S. pyogenes con deficiencia de pre-crRNA o de tipo salvaje. La eficiencia de transformación se calculó como unidades formadoras de colonias (CFU) por microgramo de ADN de plásmido. Las barras de error representan la desviación estándar para tres replicados biológicos. (E) Los plásmidos que contienen insertos de protoespaciador 2 mutante y de tipo salvaje con una extensión variada de mal apareamientos de ADN objetivo y crRNA (parte inferior) se escindieron in vitro mediante Cas9 programada (parte superior). Las reacciones de escisión se digirieron adicionalmente con Xmnl. Los fragmentos de 1880 y 800 bp son productos de escisión generada con Cas9. M, marcador de ADN.
Figura 22 Se llevaron a cabo ensayos de cambio de movilidad usando dúplex de ADN objetivo protoespaciador 4 y Cas9 (que contenía mutaciones inactivadoras de dominio de nucleasa D10A y H840) solos o en presencia de crRNA-sp4, tracrRNA (75 nt) o ambos. El dúplex de ADN objetivo se radiomarcó en ambos extremos 5'. Cas9 (D10/H840A) y los complejos se titularon de 1 nM a 1 mM. La unión se analizó mediante-electroforesis en gel de poliacrilamida natural al 8 % y se visualizó mediante imaginoiogia de fósforo. Cabe destacar que Cas9 sola se une al ADN objetivo con afinidad moderada. Esta unión no se ve afectada por la adición de crRNA, lo cual sugiere que esto representa la interacción no especifica de secuencia con el ADNcd. Además, esta interacción puede ser superada por tracrRNA solo en ausencia de crRNA. En presencia tanto de crRNA como de tracrRNA, la unión a ADN objetivo mejora sustancialmente y produce una especie con movilidad electroforética distintiva, lo cual indica un reconocimiento del ADN objetivo especifico.
Figura 23 Un fragmento de tracrRNA que comprende una parte de la región apareada de crRNA y una parte de la región posterior es suficiente para dirigir la escisión de ADN de oligonucleótido protoespaciador mediante Cas9. (A) La escisión de ADN de oligonucleótido protoespaciador 1 y (B) la escisión de ADN de oligonucleótido protoespaciador 4 mediante Cas9 guiada con un crRNA cognado maduro y varios fragmentos de tracrRNA. (A, B) Se indican los tamaños en nucleótidos.
Figura 24 Al igual que Cas9 de S. pyogenes, los ortólogos de Cas9 estrechamente relacionados de las bacterias gram-positivas L. innocua y S. thermophilus escinden el ADN protoespaciador cuando son el objetivo de tracrRNA:crRNA de S. pyogenes. Sin embargo, en las mismas condiciones, no se observó escisión de ADN mediante los ortólogos de Cas9 relacionados de manera más lejana a partir de las bacterias gram-negativas C. jejuni y N. meningitidis. Spy, S. pyogenes SF370 (número de acceso NC_002737); Sth, S. thermophilus LMD-9 (ortólogo de Cas9 STER 1477; número de acceso NC 008532); Lin, L. innocua Clipll262 (número de acceso NC_003212); Cje, C. jejuní NCTC 11168 (número de acceso NC_002163); Nme, N. meningitidis A Z2491 (número de acceso NC_003116). (A) Escisión de ADN de plásmido protoespaciador. ADN de plásmido protoespaciador 2 (300 ng) se sometió a escisión mediante diferentes ortólogos de Cas9 (500 nM) guiada por dúplex híbridos de tracrRNA:crRNA-sp2 (500 nM, 1:1) de diferentes especies. Para diseñar los dúplex de ARN, se predijeron las secuencias de tracrRNA de L. innocua y N. meningitidis basándose en datos de ensayo de transferencia Northern previamente publicados (4) . Los dúplex de ARN híbridos duales consisten en tracrRNA específico de especie y un crRNA heterólogo. La secuencia de crRNA heterólogo se modificó genéticamente para contener una secuencia de sp2 dirigida a ADN de S. pyogenes en el extremo 5' fusionada a una secuencia de repetición de unión a tracrRNA de L. innocua o N. meningitidis en el extremo 3'. Los ortólogos de Cas9 de S. thermophilus y L. innocua, pero no los de N. meningitidis o C. jejuni, pueden ser guiados mediante tracrRNA:crRNA-sp2 de S. pyogenes para escindir ADN de plásmido protoespaciador 2, aunque con una eficacia ligeramente disminuida. De manera similar, el híbrido tracrRNA:crRNA-sp2 de L. innocua puede guiar Cas9 de S. pyogenes para escindir el ADN objetivo con eficiencia elevada, mientras que el híbrido de tracrRNA:crRNA-sp2 de N. meningitidis activa solamente una actividad de escisión ligera mediante S. pyogenes Cas9. Como controles, los ortólogos de Cas9 de N. meningitidis y L. innocua escinden el ADN de plásmido protoespaciador 2 cuando son guiados por tracrRNA:crRNA-sp2 híbrido cognado. Cabe destacar como se mencionó anteriormente que la secuencia de tracrRNA de N. meningitidis fue únicamente predicha y no se ha confirmado aún mediante secuenciación de ARN. Por lo tanto, la baja eficacia de escisión podría ser el resultado de ya sea una baja actividad de los ortólogos de Cas9 o al uso de una secuencia de tracrRNA no diseñada de manera óptima. (B) Escisión de ADN de oligonucleótido protoespaciador. Un oligonucleótido de cadena complementaria marcado por radiactividad en el extremo 5' (10 nM) prehibridado con un oligonucleótido no marcado de cadena no complementaria (protoespaciador 1) (10 nM) (izquierda) o un oligonucleótido de cadena no complementaria marcado por radiactividad en el extremo 5' (10 nM) prehibridado con un oligonucleótido de cadena complementaria sin marcar (10 nM) (derecha) (protoespaciador 1) se sometió a escisión mediante varios ortólogos de Cas9 (500 nM) guiada por dúplex de tracrRNA:crRNA-spl de S. pyogenes (500 nM, 1:1). Los ortólogos de Cas9 de S. thermophilus y L. innocua , pero no los de N. meningitidis o C. jejuni, pueden ser guiados mediante ARN dual cognado de S. pyogenes para escindir el ADN de oligonucleótido protoespaciador, aunque con una eficacia disminuida. Cabe destacar que el sitio de escisión en la cadena de ADN complementaria es idéntico para los tres ortólogos. La escisión de la cadena no complementaria ocurre en posiciones distintivas. (C) Identidad de secuencia de aminoácidos de ortólogos de Cas9. Los ortólogos de Cas9de S. pyogenes, S. thermophilus y L. innocua Cas9 comparten un alto porcentaje de identidad de aminoácidos. Por el contrario, las proteínas Cas9 de C. jejuni y N. meningitidis difieren en secuencia y longitud (~300-400 aminoácidos más cortas). (D) Coplegado de secuencias de crRNA heterólogo específico de especie modificado genéticamente con los ortólogos de tracrRNA correspondientes de S. pyogenes (confirmado experimentalmente, ( 4) ) , L. innocua (predicho) o N. meningitídis (predicho). Se rastrean y marcan los tracrRNA; fragmentos de espaciador 2 de crRNA; y fragmentos de repetición de crRNA. Los dúplex de tracrRNA:crRNA-sp2 híbrido de L. innocua and S. pyogenes comparten características estructurales muy similares, aunque distintas del tracrRNA:crRNA híbrido de N. meningitídis. Junto con los datos de escisión descritos anteriormente en (A) y (B), las predicciones de coplegado indicarían que la escisión específica de especie del ADN objetivo mediante Cas9-tracrRNA:crRNA está dictada por una característica estructural aún desconocida en el dúplex tracrRNA:crRNA que es reconocido específicamente por un ortólogo de Cas9 cognado. Se predijo que la especificidad de especie de la escisión observada en (A) y (B) ocurre a nivel de la unión de Cas9 a tracrRNA:crRNA dual. El ARN dual guió la escisión de Cas9 del ADN objetivo puede ser específico de especie. Dependiendo del grado de diversidad/evolución entre las proteínas Cas9 y los dúplex de tracrRNA:crRNA, los ortólogos de Cas9 y ARN duales son parcialmente intercambiables.
Figura 25 Se analizó una serie de sondas de ADN de 8 nucleótidos complementarias a las regiones en el crRNA que comprenden la región dirigida a ADN y la región de unión a tracrRNA para verificar su capacidad de hibridarse al CrRNA en el contexto de un dúplex de tracrRNA:crRNA y del complejo ternario de Cas9-tracrRNA:crRNA. (A) Representación esquemática de las secuencias de sondas de ADN usadas en el ensayo y sus sitios de unión en crRNA-sp4. (B-C) Ensayos de cambio de movilidad electroforética de sondas de ADN objetivo con tracrRNA:crRNA-sp4 o Cas9-tracrRNA:crRNA-sp4. La construcción de tracrRNA (15-89) se usó en el experimento. La unión de los dúplex o complejos a ADN de oligonucleótido objetivo se analizó en un gel de poliacrilamida natural al 16 % y se visualizó mediante imaginologia de fósforo.
Un motivo de secuencia corta dicta la formación de bucle R En múltiples sistemas CRISPR/Cas, se ha demostrado que el reconocimiento propio respecto al ajeno implica un motivo de secuencia corta que se preserva en el genoma foráneo, mencionado como PAM(27, 29, 32-34). Los motivos de PAM tienen únicamente unos pocos pares de bases de longitud y su secuencia y posición precisas varia de acuerdo con el tipo de sistema CRISPR/Cas (32). En el sistema tipo II de S. pyogenes, PAM se conforma a una secuencia de consenso de NGG, que contiene dos pares de bases G:C que se producen un par de bases más adelante de la secuencia de unión a crRNA, dentro del ADN objetivo (4). Los ensayos de transformación demostraron que el motivo GG es esencial para la eliminación del ADN de plásmido protoespaciador mediante CRISPR/Cas en células bacterianas (Figura 26A), lo cual es consistente con las observaciones previas en S. thermophilus (27). El motivo también es esencial para la escisión de plásmido protoespaciador in vitro mediante Cas9 guiada por tracrRNA:crRNA (Figura 26B). Para determinar el rol de PAM en la escisión de ADN objetivo mediante el complejo Cas9-tracrRNA: crRNA, se evaluó una serie de dúplex de ADNcd que contenía mutaciones en la secuencia PAM en las cadenas complementaria y no complementaria, o ambas (Figura 13A). Los ensayos de escisión con estos sustratos mostraron que la escisión de ADN catalizada por Cas9 fue particularmente sensible a mutaciones en la secuencia PAM en la cadena no complementaria del ADN, en contraste con el reconocimiento de PAM de cadena complementaria mediante los sistemas de CRISPR/Cas de tipo I (18, 34). La escisión de ADN de cadena simple objetivo no se vio afectada por mutaciones en el motivo PAM. Esta observación sugiere que el motivo PAM es necesario únicamente en el contexto de ADNcd objetivo y puede, por lo tanto, ser necesario para permitir el despliegue del dúplex, la invasión de cadena y la formación de una estructura en bucle R. Cuando se usó un par diferente de ADN dirigido a crRNA (crRNA-sp4 y ADN protoespaciador 4), seleccionado debido a la presencia de PAM canónico no presente en el ADN objetivo protoespaciador 2, se descubrió que ambos nucleótidos G de PAM eran necesarios para la escisión de ADN catalizada por Cas9 eficiente (Figura 13B y Figura 26C). Para determinar si PAM tiene un papel principal para reclutar el complejo Cas9-tracrRNA:crRNA con el sitio de ADN objetivo correcto, se analizaron afinidades de unión del complejo para secuencias de ADN objetivo mediante ensayos de cambio de movilidad en gel natural (Figura 13C). La mutación de cualquier G en la secuencia PAM redujo sustancialmente la afinidad de Cas9-tracrRNA: crRNA por el ADN objetivo. Este descubrimiento ilustra un rol para la secuencia PAM en la unión a ADN objetivo mediante Cas9.
Figura 13 (A) Se evaluó Cas9 programada por ARN dual para verificar su actividad como en la Figura 10B. Las secuencias PAM de tipo salvaje y imitante en los ADN objetivo se indican con lineas. (B) Los dúplex de ADN objetivo protoespaciador 4 (marcados en ambos extremos 5') que contienen motivos PAM de tipo salvaje y mutante se incubaron con Cas9 programada con tracrRNA:crRNA-sp4 (nucleótidos 23 a 89). En los momentos indicados (en minutos), se tomaron alícuotas de la reacción de escisión y se analizaron como en la Figura 10B. (C) Se llevaron a cabo ensayos de cambio de movilidad electroforética usando Cas9 programada con ARN (D10A/H840A) y dúplex de ADN objetivo protoespaciador 4 [igual que en (B)] que contenía motivos PAM de tipo salvaje y mutados. El complejo de Cas9 (D10A/H840A)-ARN se tituló desde 100 pM hasta 1 mM.
Figura 26 (A) Las mutaciones de la secuencia PAM en el ADN de plásmido protoespaciador 2 impiden la interferencia del mantenimiento de plásmido mediante el sistema CRISPR/Cas del tipo II en células bacterianas. Los plásmidos protoespaciador 2 de tipo salvaje con un PAM funcional o mutado se transformó en tipo salvaje (cepa SF370, también llamada EC904) y mutante con deficiencia de pre-crRNA (EC1479) S. pyogenes como en la Figura 12D. Las mutaciones de PAM no son toleradas por el sistema CRISPR/Cas de tipo II in vivo. Se muestran los valores promedio y las desviaciones estándar de tres replicados biológicos. (B) Las mutaciones de la secuencia PAM en ADN de plásmido protoespaciador impide la escisión mediante Cas9-tracrRNA:crRNA. El plásmido protoespaciador 2 con un PAM funcional o mutado se sometió a escisión de Cas9 como en la Figura 10A. Los plásmidos mutantes de PAM no son escindidos por el complejo Cas9-tracrRNA:crRNA. (C) Las mutaciones de la secuencia de PAM canónica impiden la interferencia del mantenimiento de plásmido mediante el sistema CRISPR/Cas del tipo II en células bacterianas. Los plásmidos protoespaciadores 4 de tipo salvaje con PAM funcional o mutado se escindieron con Cas9 programada con tracrRNA y crRNA-sp2. Las reacciones de escisión se llevaron a cabo en presencia de la endonucleasa de restricción Xmnl para visualizar los productos de escisión de Cas9 como dos fragmentos (~1880 y ~800 bp). Se indican los tamaños de fragmentos en pares de bases.
Cas9 puede programarse con un único ARN quimérico El examen de la estructura secundaria posible del dúplex de tracrRNA:crRNA (Figuras 10E y 12C) sugiere la posibilidad de que las características necesarias para la escisión de ADN catalizada por Cas9 específica del sitio pueden ser capturadas en un único ARN quimérico. Aunque el mecanismo de selección de objetivo de tracrRNA:crRNA funciona de manera eficiente en la naturaleza, la posibilidad de una Cas9 guiada por ARN simple es atractiva, debido a su utilidad posible para la escisión de ADN programado y la edición del genoma (Figura 1A-B). Se diseñaron dos versiones de un ARN quimérico que contenía una secuencia de reconocimiento de objetivo en el extremo 5' seguida de una estructura de horquilla que conservaba las interacciones de pares de base que ocurren entre el tracrRNA y el crRNA (Figura 14A). Este transcripto simple fusiona eficazmente al extremo 3' de crRNA al extremo 5' de tracrRNA, lo cual imita la estructura de ARN dual necesaria para guiar la escisión de ADN especifica del sitio mediante Cas9. En ensayos de escisión con ADN de plásmido se observó que cuanto más largo era el ARN quimérico era capaz de guiar la escisión de ADN catalizada por Cas9 de una manera similar a la observada para el dúplex de tracrRNA:crRNA truncado (Figura 14A y Figura 27, A y C). El ARN quimérico más corto no funcionó eficazmente en este ensayo, lo cual confirma que los nucleótidos que están 5 a 12 posiciones más allá de la interacción del par de bases tracrRNA:crRNA son importantes para una unión eficaz a Cas9 y/o para el reconocimiento del objetivo. Se obtuvieron resultados similares en los ensayos de escisión usando ADNcd corto como un sustrato, lo cual indica adicionalmente que la posición del sitio de escisión en el ADN objetivo es idéntica a la observada usando el tracrRNA:crRNA dual como guia (Figura 14B y Figura 27, B y C). Finalmente, para establecer si el diseño del ARN quimérico puede aplicarse universalmente, se modificaron genéticamente cinco ARN guia quiméricos diferentes para dirigirse a una parte del gen que codifica la proteina verde fluorescente (GFP) (Figura 28, A a C) y se evaluaron para verificar su eficacia contra un plásmido que porta la secuencia codificante de GFP in vitro. En los cinco casos, Cas9 programada con estos ARN quiméricos escindió eficazmente el plásmido en el sitio objetivo correcto (Figura 14C y Figura 28D), lo cual indica que el diseño racional de ARN quimérico es potente y podría, en principio, permitir el direccionamiento a cualquier secuencia de ADN de interés con pocos obstáculos más allá de la presencia de un dinucleótido GG adyacente a la secuencia objetivo.
Figura 1 Un ARN dirigido a ADN comprende un "segmento dirigido a ADN" y "un segmento de unión a proteínas" de cadena simple, que comprende una extensión de ARN de cadena doble. (A) Un ARN dirigido a ADN puede comprender dos moléculas de ARN separadas (mencionadas como un ARN dirigido a ADN de "molécula doble" o de "dos moléculas"). Un ARN dirigido a ADN de molécula doble comprende un "ARN identificador" y un "ARN activador". (B) Un ARN dirigido a ADN puede comprender una única molécula de ARN (mencionada como un ARN dirigido a ADN de "molécula simple"). Un ARN dirigido a ADN de molécula simple comprende "nucleótidos enlazadores".
Figura 14 (A) Un plásmido que poseía una secuencia objetivo de protoespaciador 4 y una PAM de tipo salvaje se sometió a escisión mediante Cas9 programada con dúplex de tracrRNA (4-89):crRNA-sp4 o ARN quimérico transcripto in vitro construidos mediante la unión del extremo 3' del crRNA al extremo 5' de tracrRNA con un tetrabucle GAAA. Las reacciones de escisión se analizaron mediante mapeo de restricción con XmnI. Las secuencias de ARN quimérico A y B se muestran con secuencias dirigidas a ADN (subrayado), secuencias derivadas de repetición de crRNA (sobrerrayado) y secuencias derivadas de tracrRNA (subrayado punteado). (B) Las reacciones de escisión del dúplex de ADN protoespaciador 4 se llevaron a cabo como en la Figura 10B. (C) Se usaron cinco ARN quiméricos diseñados para dirigirse al gen GFP para programar Cas9 para escindir un plásmido que contenía un gen GFP. Las reacciones de escisión de plásmido se llevaron a cabo como en la Figura 12E, excepto que el ADN de plásmido se mapeó por restricción con Avrll luego de la escisión con Cas9.
Figura 27 (A) Un único ARN quimérico guia la escisión catalizada por Cas9 del ADN de plásmido protoespaciador cognado (protoespaciador 1 y protoespaciador 2). Las reacciones de escisión se llevaron a cabo en presencia de la endonucleasa de restricción Xmnl para visualizar los productos de escisión de Cas9 como dos fragmentos (~1880 y ~800 bp). Se indican los tamaños de fragmentos en pares de bases. (B) Un único ARN quimérico guia la escisión catalizada por Cas9 del ADN de oligonucleótido protoespaciador cognado (protoespaciador 1 y protoespaciador 2). Se indican los tamaños de fragmentos en nucleótidos. (C) Representaciones esquemáticas de los ARN quiméricos usados en el experimento. Las secuencias de ARN quimérico A y B se muestran con la secuencia dirigida a ADN de protoespaciador 5' de crRNA (subrayado), la secuencia de unión a tracrRNA de crRNA (sobrerrayado) y la secuencia derivada de tracrRNA (subrayado punteado).
Figura 28 (A) Representación esquemática del plásmido de expresión de GFP pCFJ127. La parte objetivo del marco de lectura abierto de GFP se indica con una punta de flecha negra. (B) Acercamiento de la secuencia de la región objetivo. Las secuencias objetivo de los ARN quiméricos se muestran con barras grises. Los dinucleótidos de PAM tienen un recuadro. Un sitio de restricción de Salí único se ubica 60 bp antes del locus objetivo. (C) Izquierda: Las secuencias de ADN objetivo se muestran junto con sus motivos PAM adyacentes. Derecha: Secuencias de ARN guia quiméricos..(D) pCFJ127 se escindió mediante Cas9 programada con ARN quiméricos GFP1-5, según se indica. El plásmido fue digerido adicionalmente con Salí y las reacciones se analizaron mediante electroforesis en un gel de agarosa al 3 % y se visualizaron mediante tinción con SYBR Safe.
Conclusiones Un mecanismo de interferencia de ADN se identificó, el cual implica una estructura de ARN dual que dirige una endonucleasa de Cas9 para introducir roturas de cadena doble específicas del sitio en ADN objetivo. La proteína Cas9 guiada por tracrRNA:crRNA utiliza dominios de endonucleasa distintos (dominios similares a RuvC y HNH) para escindir las dos cadenas en el ADN objetivo. El reconocimiento del objetivo mediante Cas9 necesita tanto una secuencia semilla en el crRNA y una secuencia PAM que contiene el dinucleótido GG adyacente a la región de unión a crRNA en el ADN objetivo. Se demostró adicionalmente que la endonucleasa de Cas9 puede programarse con ARN guía modificado genéticamente como una transcripción individual para dirigir y escindir cualquier secuencia de ADNcd de interés. El sistema es eficaz, versátil y programable mediante el cambio de la secuencia de unión a ADN objetivo en el ARN quimérico guía. Las nucleasas de dedos de cinc y nucleasas efectoras similares al activador de transcripción han generado un interés considerable como enzimas artificiales modificadas genéticamente para manipular genomas (35-38). Esto representa una metodología alternativa basada en Cas9 programada por ARN que facilita las aplicaciones de direccionamiento genético y edición del genoma.
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Los datos proporcionados más adelante demuestran que Cas9 puede expresarse y localizarse en el núcleo de células humanas, y que este se ensambla con ARN simple guía ("ARNsg"); que abarca las características necesarias tanto para la unión a Cas9 y el reconocimiento del sitio objetivo del ADN) en una célula humana. Estos complejos pueden generar roturas de doble cadena y estimular la reparación de unión de extremos no homólogos (NHEJ) en ADN genómico en un sitio complementario a la secuencia de ARNsg, una actividad que requiere tanto Cas9 y el ARNsg. La extensión de la secuencia de ARN en su extremo 3' mejora la actividad de direccionamiento de ADN en células vivas. Además, los experimentos que utilizan extractos de células transfectadas muestran que el ensamblaje de ARNsg en Cas9 es el factor limitante de la escisión de ADN mediada por Cas9. Estos resultados demuestran que la edición de genoma programada por ARN funciona en células vivas e in vivo.
MATERIALES Y MÉTODOS Diseño y construcción de plásmidos La secuencia que codifica Cas9 de Streptococcus pyogenes (residuos 1-1368) fusionada a un epítopo de HA (secuencia de aminoácidos DAYPYDVPDYASL (SEQ ID NO:274)), una señal de localización nuclear (secuencia de aminoácidos PKKKRKVEDPKKKRKVD (SEQ ID NO:275)) se optimizó mediante codones para la expresión humana y se sintetizó por GeneArt. La secuencia de ADN es SEQ ID NO:276 y la secuencia de proteínas es SEQ ID NO:277. Se usó clonación independiente de ligación (LIC,.por sus siglas en inglés) para insertar esta s.ecuencia en GFP derivado de pcDNA3.1 y vectores LIC mCherry (vectores 6D y 6B, respectivamente, obtenidas de UC Berkelcy MacroLab), lo cual dio como resultado fusiones Cas9-HA-NLS-GFP y Cas9-HA-NLS-mCherry expresadas bajo el control del promotor CMV. Los ARNsg guia se expresaron usando el vector de expresión pSilencer 2.1-U6 puro (Life Technologies) y pSuper (Oligoengine). Las construcciones de expresión de ARN se generaron mediante hibridación de oligonucleótidos complementarios para formar la secuencia de ADN que codifica ARN y la ligación del fragmento de ADN hibridado entre los sitios BamHI y HindIII en pSilencer 2.1-U6 puro y los sitios BglII y HindIII en pSUper.
Condiciones de cultivo celular y transfecciones de ADN Las células HEK293T se mantuvieron en medio eagle modificado de Dulbecco (DMEM, por sus siglas en inglés) complementado con suero fetal bovino (FBS, por sus siglas en inglés) al 10 % en un incubador humidificado a 37 °C con CO2al 5 %. Las células se transfectaron transitoriamente con ADN de plásmido con el Reactivo de Transfección de ADN X-tremeGENE (Roche) o el Reactivo de Transfección Turbofect (Thermo Scientific) con los protocolos recomendados. A grandes rasgos, las células HEK293T se transfectaron con una confluencia del 60-80 % en placas de 6 pocilios usando 0,5 mg de plásmido de expresión de Cas9 y 2,0 pg del plásmido de expresión de ARN. Las eficacias de transfección se estimaron en 30-50 % para Tubofect (Figuras 29E y 37A-B) y en 80-90 % para X-tremegene (Figura 31B), basándose en la fracción de células GFP positivas observadas mediante microscopía fluorescente. 48 horas luego de la transfección, las células se lavaron con solución salina amortiguada con fosfato (PBS) y se lisaron mediante la aplicación de 250 ml de amortiguador de lisis (Hepes 20 mM con pH 7,5, cloruro de potasio 100 mM (KC1), cloruro de magnesio 5 mM (MgCl2), ditiotreitol 1 mM (DTT), glicerol al 5 %, Tritón X-100 al 0,1 %, complementado con cóctel inhibidor de proteasa de Roche) y luego se mecieron durante 10 minutos a 4 °C. El lisado celular resultante se dividió en alícuotas para su análisis adicional. El ADN genómico se aisló a partir de 200 ml de lisado celular usando el Kit de Sangre y Tejido DNeasy (Qiagen) de acuerdo con el protocolo del fabricante.
Análisis de transferencia Western de la expresión de Cas9 HEK293T, transíectadas con plásmido de expresión Cas9-HA-NLS-GFP, se recogieron y se lisaron durante 48 horas luego de transfección como la anterior.5 ul de lisado se sometieron a electroforesis en gel de poliacrilamida SDS al 10 %, se realizó inmunotransferencia en una membrana de PVDF y se sondó con anticuerpo anti-HA conjugado con HRP (Sigma, 1:1000 dilución en lx PBS).
Ensayó Surveyor Se llevó a cabo el ensayo Surveyor como se describió previamente [10,12,13]. A grandes rasgos, el locus de cadena ligera ce clatrina humana A (CLTA) se amplificó mediante PCR a partir de 200 ng de ADN genómico usando polimerasa de alta fidelidad, ADN polimerasa de Fusión de Herculasa II (Agilent Technologies) y cebador directo ·5'-GCAGCAGAAGAAGCCTTTGT-3' (SEQ ID NO://) y cebador inverso 5'-TTCCTCCTCTCCCTCCTCTC-3' (SEQ ID NO://).300 ng del amplicón de 360 bp amplicón se desnaturalizó entonces mediante calentamiento a 95 °C y se rehibridó lentamente usando un bloque de calor para rehibridar aleatoriamente las cadenas de ADN mutantes y de tipo salvaje. Las muestras entonces se incubaron con nucleasa Cel-1 (Surveyor Kit, Transgenomic) durante 1 hora a 42 °C. Cel-1 reconoce y escinde hélices de ADN que contienen mal apareamientos (hibridación tipo salvaje:mutante). Los productos de digestión de nucleasa Cel-1 se separaron en un gel de acrilamida al 10 % y se visualizaron mediante tinción con SYBR Safe (Life Technologies). La cuantificación de las bandas de escisión se llevó a cabo usando el software ImageLab (Bio-Rad). El porcentaje de escisión se determinó mediante la división de la intensidad promedio de los productos de escisión (160-200 bp) entre la suma de las intensidades del producto de PCR sin escindir (360 bp) y el producto de escisión.
Transcripción in vi tro El ARN guia se transcribió in vitro usando ARN polimerasa T7 y una plantilla de ADN generada mediante la hibridación de oligonucleótidos sintéticos complementarios como se describió previamente [14]. Los ARN se purificaron mediante electroforesis en gel de acrilamida desnaturalizado con urea 7 M, precipitación en etanol y disolución en agua tratada con DEPC.
Análisis de transferencia Northern El ARN se purificó a partir de células HEK293T usando el kit de aislamiento de ARN pequeño mirVana (Ambion). Para cada muestra, 800 ng de ARN se separaron en un gel de PAGE-urea al 10 % luego de desnaturalización durante 10 min a 70°C en amortiguador de carga de ARN (0,5X TBE (pH 7,5), 0,5 mg/ml de azul bromofenol, 0,5 mg de xileno cianol y formamida al 47 %). Luego de la electroforesis a 10 W en 0,5X de amortiguador TBE hasta que la tinta azul bromofenol alcanzara el fondo del gel, las muestras se sometieron a electrotransferencia en una membrana Nytran a 20 volts durante 1,5 horas en 0,5X TBE. Los ARN transferidos se reticularon en membrana Nytran en reticulador UV (Strategene) y se prehibridaron a 45 °C durante 3 horas en amortiguador que contenía formamida al 40 %, 5X SSC, 3X Dernhardt (ficol, polivinilpirolidona y BSA, todos al 0,1 %) y 200 mg/ml de ADN de esperma de salmón. Las membranas prehibridadas se incubaron durante la noche en el amortiguador de prehibridación complementado con sonda oligo antisentido marcado con 32P en el extremo 5' a 1 millón de cpm/ml. Luego de varios lavados con amortiguador SSC (lavado final en 0,2X SCC), las membranas se sometieron a imaginología de fósforo.
Ensayo de escisión in vi tro Los U sados celulares se prepararon como se describió anteriormente y se incubaron con plásmido donante CLTA-RFP [10]. Las reacciones de escisión se llevaron a cabo en un volumen total de 20 ml y contenían 10 ml de lisado, 2 m? de 5x amortiguador de escisión (HEPES 100 mM con pH 7,5, KC1500 mM, MgCl2 25 mM, DTT 5 mM, glicerol al 25 %) y 300 ng de plásmido. Cuando se indica, las reacciones se complementaron con 10 pmol de ARNsg CLTA1 transcrito in vitro. Las reacciones se incubaron a 37 °C durante una hora y luego se digirieron con 10 U de Xhol (NEB) durante 30 min adicionales a 37 °C. Las reacciones se detuvieron mediante la adición de Proteinasa K (Thermo Scientific) y se incubaron a 37 °C durante 15 min. Los productos de escisión se analizaron mediante electroforesis en un gel de agarosa al 1 % teñidos con SYBR Safe. La presencia de fragmentos de ~2230 y ~3100 bp es un indicador de la escisión mediada por Cas9.
RESULTADOS Para evaluar si Cas9 puede ser programada para escindir ADN genómico en células vivas, Cas9 se coexpresó junto con ARNsg diseñado para dirigirse al gen de cadena ligera de clatrina humana (CLTA). El locus genómico de CLTA ha sido previamente el objetivo de y se editó usando ZFN [10]. Primero se evaluó la expresión de una versión optimizada por codón humano de la proteina Cas9 de Streptococcus pyogenes y ARNsg en células HEK293T humanas. La proteina Cas9 de 160 kDa se expresó como proteína de fusión que portaba un epítopo de HA, una señal de localización nuclear (NLS) y una proteina fluorescente verde (GFP) unida al extremo C de Cas9 (Figura 29A). El análisis de células transfectadas con un vector que codifica la Cas9 fusionada a GFP reveló una expresión de Cas9 y localización nuclear abundantes (Figura 29B). La transferencia·Western confirmó que la proteína Cas9 se expresó ampliamente intacta en extractos de esas células (Figura 29A). Para programar Cas9, se expresó ARNsg que portaba una secuencia de 20 nucleótidos en el extremo 5' complementaria a la secuencia de ADN objetivo, y una estructura de tallo bucle del extremo 3' de 42 nucleótidos necesaria para la unión a Cas9 (Figura 29C). Esta secuencia del extremo 3' corresponde a la estructura de tallo-bucle mínima que ha sido usada previamente para programar Cas9 in vitro [8]. La expresión de este ARNsg fue impulsada mediante el promotor U6 humano (polimerasa III de ARN) [11]. El análisis de transferencia Northern de ARN extraído de células transíectadas con vector de expresión de plásmido de ARNsg impulsado por promotor U6 mostró que el ARNsg se expresa realmente y su estabilidad se mejora mediante la presencia de Cas9 (Figura 29D).
La Figura 29 demuestra que la coexpresión de Cas9 y ARN guía en células humanas genera roturas de ADN de cadena doble en el locus objetivo. (A) Parte superior; diagrama esquemático de la construcción de expresión Cas9-HA-NLS-GFP. Parte inferior; el lisado de células HEK293T transfectadas con el plásmido de expresión Cas9 se analizó mediante transferencia Western usando un anticuerpo anti-HA. (B) Microscopía fluorescente de células HEK293T que expresan Cas9-HA-NLS-GFP. (C) Diseño de un ARN simple guía (ARNsg, es decir, un ARN dirigido a ADN de molécula simple) que se dirige al locus de CLTA humana. Parte superior; diagrama esquemático del sitio objetivo de ARNsg en el exón 7 del gen de CLTA humana. La secuencia objetivo que se híbrida al segmento guía de ARNsg de CLTA1 se indica como "ARNsg CLTA1". El motivo adyacente de protoespaciador (PAM) de dinucleótido GG está marcado con una flecha. Las lineas negras indican las regiones de unión a ADN de la proteina ZFN de control. El codón de termninación de traducción del marco de lectura abierto de CLTA está marcado con una linea punteada como referencia. Parte central; diagrama esquemático de la construcción de expresión de ARNsg. El ARN se expresa bajo el control del promotor Pol III U6 y un tracto poli(T) que sirve como señal de terminación transcripcional Pol III. Parte inferior; escisión guiada por ARNsg del ADN objetivo mediante Cas9. El ARNsg consiste en un segmento guia del extremo 5' de 20 nt seguido por una estructura de tallo-bucle de 42 nt necesarios para la unión a Cas9. La escisión mediada por Cas9 de las dos cadenas de ADN objetivo ocurre luego del despliegue del ADN objetivo y la formación de un dúplex entre el segmento guia del ARNsg y del ADN objetivo. Esto depende de la presencia de un motivo PAM (adecuado para la Cas9 usada, por ejemplo, dinucleótido GG, ver el Ejemplo 1 anterior) en una posición posterior a la secuencia objetivo en el ADN objetivo. Cabe destacar que la secuencia objetivo está invertida en relación al diagrama superior. (D) Análisis de transferencia Northern de la expresión de ARNsg en células HEK239T. (E) Ensayo de nucleasa Surveyor de ADN genómico aislado de células HEK293T que expresan Cas9 y/o ARNsg de CLTA. Una construcción de ZFN previamente usada para dirigirse al locus de CLTA [10] se usó como control positivo para detectar la reparación del ADN inducida por DSB mediante la unión de extremos no homólogos.
Posteriormente se investigó si las DSB especificas del sitio se generan en células HEK293T transfectadas con Cas9-HA-NLS-mCherry y el ARNsg CLTA1. Para hacer eso, se sondeó en búsqueda de inserciones y eliminaciones menores en el locus resultantes de reparación imperfecta de NHEJ inducida por DSB utilizando el ensayo de nucleasa [12] Surveyor. La región de ADN genómico direccionado por Cas9:ARNsg se amplifica mediante PCR y los productos resultantes se desnaturalizan y rehibridan. Los productos de PCR rehibridados se incuban con la endonucleasa de reconocimiento de mal apareamiento Cel-1 y se resuelven en un gel de acrilamida para identificar la banda de escisión Cel-1. Dado que la reparación de ADN mediante NHEJ se induce típicamente mediante una DSB, una señal positiva en el ensayo Surveyor indica que ha ocurrido una escisión de ADN genómico. Mediante este ensayo, se detectó escisión del locus CLTA en una posición dirigida por el ARNsg CLTA1 (Figura 29E). Un par de ZFN que direccionan un sitio vecino en el locus CLTA proporcionó un control positivo en estos experimentos [10].
Para determinar si la expresión de Cas9 o de ARNsg es un factor limitante en las reacciones observadas de edición de genomas, los lisados preparados a partir de las células transfectadas se incubaron con ADN de plásmidos que contenían un fragmento del gen CLTA direccionado por el ARNsg CLTAl. No se observó escisión de ADN de plásmidos tras la incubación con lisado preparado a partir de células transfectadas con el vector de expresión Cas9-HA-NLS-GFP por sí solo, en conformidad con los resultados del ensayo Surveyor. No obstante, se detectó una escisión potente de plásmidos cuando el lisado se complementó con ARNsg CLTAl transcrito in vitro (Figura 30A). Adicionalmente, el lisado preparado a partir de células transfectadas con los vectores de expresión de Cas9 y ARNsg brindó soporte a la escisión de plásmidos, mientras que los U sados de células transfectadas con el vector que codifica el ARNsg no lo hicieron (Figura 30A). Estos resultados sugieren que un factor limitante para la función de Cas9 en células humanas podría ser la unión con el ARNsg. Se probó esta posibilidad directamente mediante el análisis de la escisión de plásmidos en U sados de células transfectadas, como antes, en presencia y ausencia de ARNsg exógeno agregado. Cabe destacar que cuando se agregó ARNsg exógeno al U sado de células transfectadas con los vectores de expresión de Cas9 y ARNsg, se observó un aumento sustancial en la actividad de escisión de ADN (Figura 30B). Este resultado indica que el factor limitante de la función de Cas9 en células HEK293T es la expresión del ARNsg o su carga en Cas9.
La Figura 30 demuestra que los lisados celulares contienen Cas9:ARNsg y brindan soporte a la escisión de ADN específica del sitio. (A) Los lisados de células transfectadas con el o los plásmidos que se indican a la izquierda se incubaron con ADN de plásmido que contenía un PAM y la secuencia objetivo complementaria al ARNsg CLTA1; donde se indica, la reacción se complementó con 10 pmol de ARNsg CLTA1 transcrito in vitro; la escisión secundaria con Xhol generó fragmentos de ~2230 y ~3100 bp que indicaron escisión mediada por Cas9. Una reacción de control con lisado de células transfectadas con una construcción de expresión ZFN muestra fragmentos de tamaño ligeramente diferente que reflejan el desplazamiento del sitio objetivo de ZFN en relación con el sitio objetivo de CLTA1. (B) Los lisados de células transfectadas con el plásmido de expresión Cas9-GFP y, donde se indica, el plásmido de expresión de ARNsg CLTA1, se incubaron con ADN de plásmido objetivo tal como en (A) en ausencia o presencia de ARNsg CLTA1 transcrito in vitro.
Como un medio para potenciar la unión de Cas9:ARNsg en celulas vivas, a continuación se probó el efecto de la extensión de la región de unión a Cas9 presumida dél ARN guia. Se diseñaron dos versiones nuevas del ARNsg CLTA1 para incluir seis a doce pares de bases adicionales en la hélice que imita las interacciones de pares de bases entre crRNA y tracrRNA (Figura 31A). De manera adicional, el extremo 3' del ARN guia se extendió en cinco nucleótidos con base en la secuencia natural del tracrRNA [9] de S. pyogenes . Los vectores que codifican estos ARNsg extendidos en el extremo 3' bajo el control de los promotores Pol III H1 o U6 se transfectaron en células junto con el vector de expresión Cas9-HA-NLS-GFP y se evaluó la escisión del genoma específica del sitio mediante el ensayo Surveyor (Figura 31B). Los resultados confirmaron que la escisión requería Cas9 y el ARNsg CLTA1, pero no ocurría cuando Cas9 o el ARNsg se expresaban solos. Además, se observaron frecuencias sustancialmente aumentadas de NHEJ, según se detectó mediante la escisión de la nucleasa Cel-1, mientras que la frecuencia de la mutagénesis de NHEJ obtenida con el par de ZFN de control permaneció sin cambios.
La Figura 31 demuestra que la extensión 3' de las construcciones de ARNsg aumenta la mutagénesis específica del sitio mediada por NHEJ. (A) La construcción para la expresión de ARNsg CLTAl (parte superior) se diseñó para generar transcriptos que contuvieran la secuencia original de unión a Cas9 (vl.O) o dúplex de ARNcd extendidos en 4 pares de base (v2.1) o 10 pares de base (v2.2). (B) El ensayo de nucleasa Surveyor de ADN genómico aislado de células HEK293T que expresan Cas9 y/o ARNsg CLTA vl.O, v2.1 o v2.2. Una construcción de ZFN utilizada previamente para el direccionamiento del locus de CLTA [10] se utilizó como control positivo para detectar la reparación de ADN inducida· por DSB mediante recómbinación no homologa.
Los resultados proporcionan entonces el marco para la implementación de Cas9 como una herramienta molecular fácil para diversas aplicaciones de edición genómica. Una característica importante de este sistema es el potencial para programar Cas9 con múltiples ARNsg en la misma célula, ya sea para aumentar la eficiencia del direccionamiento en un solo locus o como un medio para el direccionamiento de varios locus de manera simultánea. Dichas estrategias encontrarían una amplia aplicación en experimentos a lo largo del genoma y esfuerzos de investigación a gran escala, tales como el desarrollo de modelos de enfermedades multigénicas.
Ejemplo 3: Familias de tracrRNA y Cas9 de sistemas inmunitarios de CRISPR-Cas de tipo II Se buscaron todos los locus putativos de CRISPR-Cas de tipo II existentes en la actualidad en genomas bacterianos de dominio público mediante la búsqueda de secuencias homologas a Cas9, la proteína distintiva del sistema de tipo II. Se construyó un árbol filogénico de un alineamiento de múltiples secuencias de los ortólogos de Cas9 identificados. La longitud de repetición de CRISPR y la organización génica de los operones cas de los sistemas asociados de tipo II se analizaron en los diferentes subconjuntos de Cas9. Se propuso una subclasificación de locus de tipo II y luego se dividió en subgrupos con base en la selección de 75 ortólogos representativos de Cas9. Luego se predijeron secuencias de tracrRNA, principalmente extrayendo secuencias de repetición de CRISPR y buscando antirrepeticiones dentro o alrededor de los genes de cas y configuraciones de CRISPR del locus de tipo II seleccionado. Se realizó un análisis comparativo de secuencias y estructuras previstas de ortólogos de tracrRNA seleccionados. Finalmente, se determinó la expresión y los perfiles de procesamiento de tracrRNA y crRNA de cinco especies bacterianas.
MATERIALES Y MÉTODOS Cepas bacterianas y condiciones de cultivo Se utilizaron los siguientes medios para cultivar bacterias en placas: TSA (agar tripticasa de soja, Trypticase™ Soy Agar (TSA II) BD BBL, Becton Dickinson) complementada con sangre de oveja al 3 % para S. mutans (UA159) y agar BHI (infusión de cerebro y corazón, BD Bacto™ Brain Heart Infusión, Becton Dickinson) para L. innocua (Clipll262). Cuando se cultivó en cultivos liguidos, se utilizó el medio THY (caldo Todd Hewitt (THB, Bacto, Becton Dickinson) complementado con extracto de levadura al 0,2 % (Servabacter®) para S. mutans, caldo BHI para L. innocua, medio liquido BHI que contiene Vitamin-mix VX (Difeo, Becton Dickinson) al 1 % para N. meningitidis (A Z2491), caldo MH (caldo Mueller Hinton, Oxoid) que incluye vitamin-mix VX ¿1 1 % para C. jejuni (NCTC 11168; ATCC 700819) y TSB (caldo tripticasa-soja, caldo de soja BD BBL™ Trypticase™) para F. novicida (U112). Se incubó S. mutans a 37 °C, C02 al 5 % sin agitar. Las cepas de L. innocua, N. meningitidis y F. novicida se cultivaron de manera aeróbica a 37 °C sin agitar. C. jejuni se cultivó a 37 °C en condiciones microaerofilicas utilizando atmósfera camygen (Oxoid). Al crecimiento celular bacteriano le siguió la medición de la densidad óptica de los cultivos a 620 nm (OD620 nm) en intervalos regulares de tiempo haciendo uso de un lector de microplacas (BioTek PowerWave™).
Secuenciación de bibliotecas de ?BN bacteriano pequeño.
Se cultivaron C. jejuni NCTC 11168 (ATCC 700819), F. novicida U112, L. innocua Clipll262, N. meningitidis A Z2491 y S. mutans UA159 hasta la fase de crecimiento semilogaritmica y se extrajo el ARN total con TRIzol (Sigma-Aldrich).10 mg de ARN total de cada cepa se trataron con TURBO™ DNasa (Ambion) para quitar todo ADN genómico residual. Los ARN ribosomales se quitaron con Ribo-Zero™ rRNA Removal Kits® para bacterias gram-positivas o gram-negativas (Epicentre) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Luego de la purificación con el kit de ARN Clean & Concentrator™-5 (Zymo Research), las bibliotecas se prepararon con el kit de preparación de bibliotecas de ARN pequeño ScriptMiner™ (Multiplex, compatible con Illumina®) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los ARN se trataron con pirofosfatasa ácida de tabaco (TAP , por sus siglas en inglés) (Epicentre). Se utilizaron columnas de RNA Clean & Concentrator™-5 (Zymo Research} para la purificación posterior de ARN y se utilizó la ADN polimerasa Phusion® High-Fidelity (New England Biolabs) para la amplificación por PCR. Se agregaron a cada biblioteca códigos de barra específicos definidos por el usuario (cebadores de código de barras de secuenciación de ARN (compatible con Illumina®) Epicentre) y las muestras se secuenciaron en las instalaciones de Next Generation Sequencing (CSF NGS Unit; en la web "csf." seguido por "ac.at") en el biocentro de Viena, Viena, Austria (Illumina single end sequencing).
Análisis de datos de secuenciación de tracrRNA y crRNA Las lecturas de secuenciación de ARN se dividieron con la herramienta illumina2bam mediante (i) eliminación de las secuencias de adaptador Illumina (cutadapt 1.0) y (ii) eliminación de 15 nt en el extremo 3' para mejorar la calidad de las lecturas. Luego de la eliminación de las lecturas menores que 15 nt, las lecturas de ADNc se alinearon con su genoma respectivo con Bowtie, permitiéndole dos mal apareamientos: C. jejuni (GenBank: NC_002163), F. novicida (GenBank: NC_008601), N. meningitidis (GenBank: NC_003116), L. innocua (GenBank: NC_003212) y S. utans (GenBank: NC_004350). La cobertura de las lecturas se calculó para cada posición de nucleótido de manera separada para ambas cadenas de ADN utilizando BEDTools-Versión-2.15.0. Se creó un archivo wiggle normalizado que contenía cobertura en lectura por millón (rpm, por sus siglas en inglés) y se visualizó con la herramienta Integrative Genomics Viewer (IGV) ("www." seguido de "broadinstitute.org/igv/") (Figura 36). Se calculó la proporción de lecturas mapeadas con SAMTools flagstat80 en un total de 9914184 lecturas mapeadas para C. jejuni, 48205 lecturas para F. novicida, 13110087 lecturas para N. meningitidis, 161865 lecturas para L. innocua y 1542239 lecturas para S. mutans. Se creó un archivo que contenía la cantidad de lecturas que comenzaban (5') y terminaban (3') en cada posición de nucleótido, y se visualizó en IGV. Para cada ortólogo de tracrRNA y crRNA, la cantidad total de lecturas obtenidas se calculó utilizando SAMtools.
Construcción de árbol guia, alineamiento de múltiples secuencias y análisis de secuencias de Cas9 Se utilizó el programa de búsqueda de iteración en posición específica (PSI)-BLAST para obtener homólogos de la familia Cas9 en la base de datos no redundante NCBI. Se descartaron las secuencias con menos de 800 aminoácidos. El programa BLASTClust configurado con un corte de cobertura de longitud de 0,8 y se usó un umbral de cobertura de puntaje (puntuación dividida entre la longitud de alineamiento) de 0,8 para agrupar las secuencias restantes (Figura 38). Este procedimiento produjo 78 grupos (48 de los cuales estaban representados únicamente por una secuencia). Se seleccionó uno (o rara vez pocos representativos) de cada grupo y se construyó un alineamiento múltiple para estas secuencias mediante el programa MUSCLE con parámetros predefinidos, seguido por una corrección manual sobre la base de alineamientos locales obtenida mediante los programas PSI-BLAST y HHpred. Algunas secuencias más eran no alineables y también se excluyeron de los alineamientos finales. Los bloques alineados de manera confiable con 272 posiciones informativas se utilizaron para la reconstrucción de árboles con máxima similitud mediante el programa FastTree con los parámetros predefinidos: modelo evolucionarlo JTT, modelo gamma discreto con 20 categorías de puntaje. El mismo programa se utilizó para calcular los valores bootstrap.
La Figura 38 ilustra secuencias que se agruparon de acuerdo con el programa de agrupación BLASTclust. Únicamente se seleccionaron para el análisis BLASTclust las secuencias mayores que 800 aminoácidos (véase Materiales y Métodos). Se utilizaron cepas representativas que contenían genes ortólogos de cas9. Algunas secuencias que no se agruparon, pero se verificaron como secuencias de Cas9 debido a la presencia de motivos conservados y/u otros genes de cas en su cercanía inmediata.
Análisis de locus de CRISPR-Cas Las secuencias de repetición de CRISPR se obtuvieron de la base de datos de CRISPRdb o se predijeron con la herramienta CRISPRFinder (Grissa I et ál., BMC Bioinformatics 2007; 8:172; Grissa I et ál., Nucleic Acids Res 2007). Los genes cas se identificaron con el algoritmo BLASTp y/o se verificaron con la base de datos KEGG (en internet "www." seguido por kegg.jp/).
Predicción y análisis simulados de ortólogos de tracrRNA Las antirrepeticiones putativas se identificaron con el software de Vector NTI® (Invitrogen) mediante la búsqueda de secuencias de repetición adicionales y redundantes que no pertenecían a la configuración de repetición-espaciador en ambas cadenas de los genomas respectivos, lo cual permitió hasta 15 mal apareamientos. Los promotores transcripcionales y los terminadores independientes de rho se predijeron con el programa BDGP Neural Network Promoter Prediction ("www." seguido por fruitfly.org/seq_tools/promoter.html) y el software TransTermHP, respectivamente. Los múltiples alineamientos de secuencias se realizaron con el programa MUSCLE con parámetros predefinidos. Se analizaron los alineamientos en búsqueda de la presencia de motivos de estructura conservada con el algoritmo RANalifold del paquete de Vienna RNA 2.0.
RESULTADOS Los sistemas de CRISPR-Cas de tipo II son generalizados en las bacterias.
Además del ADN codificador de tracrRNA y la configuración de repetición-espaciador, los locus de CRISPR-Cas de tipo II están compuestos típicamente de tres a cuatro genes de cas organizados en un operón (Figura 32A-B). Cas9 es la proteína distintiva característica de tipo II y está involucrada en los pasos de expresión e interferencia. Casi y Cas2 son proteínas nucleares compartidas por todos los sistemas CRISPR-Cas y están implicadas en la adquisición de. espaciadores. Csn2 y Cas4 están presentes únicamente en un subconjunto de sistemas de tipo II y se sugiere que desempeñaban un rol en la adaptación. Para extraer una cantidad máxima de locus de CRISPR-Cas de tipo II que contuvieran tracrRNA, primero se filtraron genomas del dominio público en búsqueda de secuencias homologas a proteínas Cas9 ya comentadas. Se identificaron 235 ortólogos de Cas9 en 203 especies bacterianas. Se seleccionó un conjunto de 75 secuencias representativas de todos los ortólogos de Cas9 extraídos para un análisis posterior (Figura 32, Figura 38 y Materiales y Métodos) La Figura 32 ilustra (A) un árbol filogénico de secuencias representativas de Cas9 de varios organismos, así como (B) arquitectura representativa del locus de Cas9. Se indican los valores bootstrap calculados para cada nodo. Las ramas del mismo color representan subgrupos seleccionados de ortólogos similares de Cas9. Se muestran para cada subgrupo la longitud de repetición de CRISPR en nucleótidos, el tamaño promedio de la proteína Cas9 en aminoácidos (aa) y la arquitectura de consenso del locus. *- gi|116628213 **- gi|116627542 †-gi134557790 F- gi134557932. El tipo II-A está caracterizado por cas9- csxl2, casi, cas2, cas4. El tipo II-B está caracterizado por cas9, casi, cas2 seguido por una variante de csn2. El tipo II-C está caracterizado por un operón conservador de cas9, casi, cas2 (véase también la Figura 38).
A continuación, se realizó un alineamiento de múltiples secuencias de los ortólogos de Cas9 seleccionados. El análisis comparativo reveló grandes diversidades en la composición de los aminoácidos y el tamaño de las proteínas. Los ortólogos de Cas9 comparten únicamente unos cuantos aminoácidos idénticos y todas las secuencias extraídas tienen la misma arquitectura de dominio con un dominio central de endonucleasa HNH y dominio partido de RuvC/RNasaH. La longitud de las proteínas Cas9 se encuentra en el intervalo de 984 (Campylobacter jejuni) a 1629 (Francisella novicida) aminoácidos con tamaños típicos de ~1100 o ~1400 aminoácidos. Debido a la gran diversidad de secuencias Cas9, especialmente en la longitud de las regiones entre dominios, se seleccionaron únicamente posiciones informativas bien alineadas del alineamiento preparado para reconstruir un árbol filogénico de las secuencias analizadas (Figura 32 y Materiales y métodos). Los ortólogos de Cas9 se agruparon en tres grupos monofH éticos principales con secuencias atípicas. La topología observada del árbol de Cas9 se encuentra en consonancia con la clasificación actual de locus de tipo II, donde los tipos II-A y II-B definidos anteriormente formaban grupos separados y monofiléticos. Para caracterizar adicionalmente los grupos, se examinaron en detalle las composiciones de operones de cas y las secuencias de repetición de CRISPR de todas las cepas enumeradas.
La subagrupación de Cas9 refleja la diversidad de la arquitectura de locus de CRISPR-Cas de tipo II Un análisis más profundo de los locus de tipo II seleccionados reveló que la subagrupación de secuencias de ortólogos de Cas9 se correlaciona con la diversidad de la longitud de repeticiones de CRISPR. Para la mayoría de los sistemas de CRISPR-Cas de tipo II, la longitud de repetición es de 36 nucleótidos (nt), con algunas variaciones en dos de los subgrupos de árbol Cas9. En el grupo de tipo II-A (Figura 32) que comprende locus que codifica el ortólogo -de Cas9 largo, anteriormente llamado Csxl2, las repeticiones de CRISPR tienen 37 nt de longitud. El pequeño subgrupo compuesto por secuencias de bacterias que pertenecían al phylum Bacteroidetes (Figura 32) está caracterizado por repeticiones de CRISPR inusualmente largas, con un tamaño de 48 nt. Además, se notó que la subagrupación de secuencias de Cas9 se correlaciona con distintas arquitecturas de operones de cas, según se ilustra en la Figura 32. El tercer subgrupo mayor (Figura 32) y el locus atípico (Figura 32) consisten principalmente en el operón mínimo compuesto de los genes cas9, casi y cas2, con una excepción de algún locus incompleto que se analiza más adelante. Todos los otros locus de los dos primeros grupos mayores están asociados con un cuarto gen, principalmente cas4, específico al tipo II-A o similar al csn2, específico al tipo II-B (Figura 32). Se identificaron los genes que codificaban variantes más cortas de la proteina Csn2, Csn2a, dentro de locus similares a CRISPR01 de S. pyogenes y CRISPR3 de S. thermophilus de tipo II-B (Figura 32). Se halló que la variante más larga de Csn2, Csn2b, estaba asociada con locus similares al CRISPRl de S. thermophilus de tipo II-B (Figura 32). Curiosamente, se identificaron genes putativos de cas adicionales que codificaban proteínas sin similitud de secuencia aparente a variantes de Csn2 descritas anteriormente. Una de esas proteínas sin caracterizar estaba asociada de manera exclusiva a locus de tipo II-B de especies de Mycoplasma (Figura 32 y Figura 33). Se encontró que otras dos estaban codificadas en locus de tipo II-B de especies de Staphylococcus (Figura 33). En todos los casos, la diversidad de la arquitectura del operón cas es, entonces, consistente con la subagrupación de secuencias de Cas9. Estas características, junto con la topología general del árbol de Cas9 dividido en tres grupos monofH éticos mayores y distintivos, llevaron a proponer una nueva y posterior división del sistema CRISPR-Cas de tipo II en tres subtipos. El tipo II-A está asociado con Cas9 y Cas4 similares a Csxl2, el tipo II-B está asociado con similar a Csn2 y el tipo II-C únicamente contiene el conjunto mínimo de los genes de cas9, casi y cas2, según se muestra en la Figura 32.
La figura 33 ilustra la arquitectura de CRISPR-Cas de tipo II de especies bacterianas seleccionadas. Las barras verticales agrupan los locus que codifican los ortólogos de Cas9 que pertenecen al mismo subgrupo de árbol (comparar con la Figura 32). Barra negra horizontal, secuencia líder; rectángulos y rombos negros, configuración de repetición-espaciador. Las antirrepeticiones previstas están representadas por flechas que indican la dirección de la transcripción del ortólogo de tracrRNA putativo. Nótese que para los locus que no se verificaron de manera experimental, se considera aquí que la configuración de repetición-espaciador de CRISPR está transcrita de la misma cadena que el operón cas. La dirección de la transcripción del ortólogo de tracrRNA putativo se indica de manera acorde.
Predicciones simuladas de ortó logos novedosos de tracrRNA Los locus de tipo II seleccionados anteriormente con base en los 75 ortólogos representativos de Cas9 se estudiaron en búsqueda de ortólogos de tracrRNA putativos. El análisis previo realizado sobre una cantidad restringida de secuencias de tracrRNA reveló que ni las secuencias de tracrRNA ni su ubicación dentro del locus de CRISPR-Cas parecían estar conservadas. No obstante, según se mencionó anteriormente, los tracrRNA también están caracterizados por una secuencia de antirrepetición capaz de formar pares de bases con cada una de las repeticiones de pre-crRNA para formar dúplex de repetición tracrRNArprecrRNA que son escindidos por RNasa III en presencia de Cas9. Para predecir tracrRNA novedosos, se sacó ventaja de esta característica y se utilizó el siguiente flujo de trabajo: (i) analizar en búsqueda de antirrepeticiones potenciales (formación de pares de bases de secuencias con repeticiones de CRISPR) dentro del locus de CRISPR-Cas, (ii) seleccionar antirrepeticiones ubicadas en las regiones intergénicas, (iii) validar los pares de bases antirrepetición:repetición de CRISPR y (iv) predecir promotores y terminadores transcripcionales independientes de rho asociados con los tracrRNA identificados.
Para analizar en búsqueda de antirrepeticiones putativas, se extrajeron secuencias de repetición de la base de datos de CRISPRdb o, cuando la información no estaba disponible, se predijeron las secuencias de repetición con el software CRISPRfinder. En el estudio previo, se demostró de manera experimental que la dirección de la transcripción de la configuración de repetición-espaciador variaba entre locus, en comparación con la del operón cas. Aquí, el análisis de secuenciación de ARN confirmó esta observación. En algunos de los locus analizados, a saber en F. novicida, N. meningitidis y C. jejuni, la configuración de repetición-espaciador está transcrita en la dirección opuesta al operón cas (ver la sección "La secuenciación profunda de ARN valida la expresión de ortólogos novedosos de tracrRNA" y Figuras 33 y 34), mientras que en S pyogenes, S. mutans, S. thermophilus y L. innocua, la configuración y el operón cas se transcriben en la misma dirección. Estos son los únicos datos de expresión de la configuración de repetición-espaciador de tipo II disponibles a la fecha. Para predecir la dirección de la transcripción de otras configuraciones de repetición-espaciador, se consideró la observación anterior de acuerdo con cuáles de las últimas repeticiones de las configuraciones se mutan de manera usual. Este comentario está de acuerdo con el modelo actual de adquisición de espaciadores, en el cual típicamente la primera repetición de la configuración está duplicada tras la inserción de la secuencia de espaciador durante la fase de adaptación. Para 37 configuraciones espaciadores de repetición, se pudo identificar la repetición mutada en el extremo putativo de las configuraciones. Se observó que la orientación prevista de la transcripción para la configuración de repetición-espaciador de N. meningitidis y C. jejuni sería opuesta a la orientación determinada de manera experimental (secuenciación de ARN y análisis de transferencia Northern). Dado que la orientación prevista no es coherente dentro de los grupos, y dado que en la mayoría de los casos se pudo detectar promotores potenciales en ambos extremos de las configuraciones, se consideró que las transcripciones de las configuraciones de repetición-espaciador estaban en la misma dirección que la transcripción del operón cas, si no se validaba lo contrario.
La Figura 34 ilustra el coprocesamiento de tracrRNA y pre-crRNA en sistemas de tipo II de CRISPR Cas seleccionados. Se muestran arquitecturas de locus de CRISPR con direcciones y posiciones verificadas de transcripción de tracrRNA y pre-crRNA. Secuencias superiores, repeticiones de pre-crRNA; secuencias inferiores, secuencias de tracrRNA con pares de base con repeticiones de crRNA. Se indican con cabezas de flecha los sitios de procesamiento de ARN putativos según se revelaron mediante secuenciación de ARN. Para cada locus, los tamaños de las cabezas de flecha representan las cantidades relativas de los extremos 5' y 3' extraídos (ver también la Figura 37).
La Figura 37 enumera todos los ortólogos de tracrRNA y los crRNA maduros extraídos mediante secuenciación de las especies bacterianas estudiadas, inclusive coordenadas (región de interés) y secuencias de ADNc correspondientes (5' a 3'). Las flechas representan la dirección transcripcional (cadena). Se indica la cantidad de lecturas de ADNc (calculadas con SA tools), números de cobertura (porcentaje de lecturas mapeadas) y extremos predominantes asociados con cada transcripto. Se presenta la cantidad de lecturas que comienzan o terminan en cada posición de nucleótido alrededor de los extremos 5' y 3' de cada transcripto. Se indican los tamaños de cada forma madura de crRNA. El número designado a cada especie de crRNA corresponde a la posición de la secuencia espad adora en el pre-crRNA, de acuerdo con la CRISPRdb. El número designado a cada especie de tracrRNA corresponde a formas diferentes de la misma transcripción.
Luego se analizaron los locus seleccionados de,CRISPR-Cas, inclusive las secuencias ubicadas 1 kb anterior y posterior en ambas cadenas, en búsqueda de posibles secuencias de repetición que no pertenecieran a la configuración de repetición-espaciador, permitiendo hasta 15 mal apareamientos. En promedio, se encontraron una a tres secuencias de repetición redundantes por locus que corresponderían a antirrepeticiones de ortólogos de tracrRNA y se seleccionaron las secuencias ubicadas dentro de las regiones intergénicas. Las antirrepeticiones putativas se encontraron en cuatro ubicaciones típicas: anteriores al gen cas9, en la región entre cas9 y casi, y anteriores o posteriores a la configuración de repetición-espaciador (Figura 33). Para cada secuencia extraída se validó la extensión de pares de base formados entre la repetición y la antirrepetición (Figura 44) mediante la predicción de la posible interacción ARN-.ARN y enfocándose en especial en candidatos con regiones complementarias largas y perfectas que formaran una estructura bicatenaria para el procesamiento de la RNasa III. Para predecir promotores y terminadores transcripcionales que flanquearan la antirrepetición, se estableció que los sitios de inicio y terminación de la transcripción putativa estuvieran incluidos dentro de una región ubicada, como máximo, 200 nt en dirección anterior y 100 nt en dirección posterior a la secuencia de antirrepetición, respectivamente, con base en observaciones anteriores26. Según se mencionó anteriormente, falta información experimental sobre la dirección de transcripción de la mayoría de las configuraciones de repetición-espaciador de los sistemas de tipo II. Los algoritmos de predicción simulada de promotores a menudo arroja resultados falsos positivos y apunta a promotores putativos que llevarían a la transcripción de configuraciones de repetición-espaciador de ambas cadenas. En algunos casos no se pudieron predecir terminadores transcripcionales, aunque la expresión del ortólogo de tracrRNA se pudiera validad experimentalmente, según lo ejemplifica el locus de C. jejuni (ver la sección "La secuenciación profunda de ARN valida la expresión de ortólogos novedosos de tracrRNA"). Se sugiere considerar las predicciones de promotor y terminador transcripcional únicamente como una etapa de apoyo, mas no esencial, de la guía descrita anteriormente.
La Figura 44 ilustra los pares de bases de antirrepetición previstos repetición:tracrRNA de pre-crRNA en especies bacterianas seleccionadas. bLos locus de CRISPR que pertenecen al sistema CRISPR-Cas de tipo II (Nmeni/CASS4). La nomenclatura es conforme a la base de datos de CRISPR (CRISPRdb). Nótese que S. thermophilus LMD-9 y W. succinogenes contienen dos locus de tipo II. cSecuencia superior, secuencia de consenso de repetición de pre-crRNA (5' a 3'); secuencia inferior, secuencia homologa de tracrRNA hibridada a la repetición (antirrepetición; 3' a 5')· Nótese que se otorga la secuencia de repetición con base en la presunción de que la configuración de repetición-espaciador de CRISPR se transcribe de la misma cadena que el operón cas. Para las secuencias que se validaron de manera experimental en este estudio, los datos de secupnciación de ARN se tomaron en cuenta para determinar .los par^s de base. Véase la Figura 33. dSe identificaron dos antirrépeticiones posibles en el locus de tipo II-A de F. tularensis subsp. novicida, W. succinogenes y gamma proteobacterium HTCC5015. Apareamiento de secuencias superior, antirrepetición dentro de la secuencia líder putativa; apareamiento de secuencias inferior, antirrepetición posterior de la configuración de repetición-espaciador. Véase la Figura 33. eSe identificaron dos antirrepeticiones posibles en el locus de tipo II-A de S. wadsworthensis. Apareamiento secuencias superior, antirrepetición; apareamiento de secuencias, antirrepetición dentro de la secuencia líder putativa. Ver Figura 33. fSe identificaron dos antirrepeticiones posibles en el locus de tipo II-B de L. gasseri. Apareamiento de secuencias superior, antirrepetición anterior a cas9; apareamiento de secuencias inferior, antirrepetición entre los genes cas9 y casi. Ver la Figura 33. 9Se identificaron dos antirrepeticiones posibles en el locus de tipo II-C de C jejuni. Apareamiento de secuencias superior, antirrepetición anterior cas9; apareamiento de secuencias j[nferior, antirrepetición posterior de la configuración de repetición-espaciador. Ver la Figura 33. hSe identificaran dos antirrepeticiones posibles en el locus de tipo II-C de R. rubrum. Apareamiento de secuencias superior, antirrepetición anterior a la configuración de repetición-espáciador; apareamiento de secuencias inferior, antirrepetición anterior a casi. Véase la Figura 33.
Una plétora de ortólogos de tracrPNk Se predijeron los ortólogos putativos de tracrRNA de 56 de los 75 locus seleccionados anteriormente. Los resultados de las predicciones se muestran en jla Figura 33. Según se mencionó, la dirección de la transcripción de tracrRNA indicada en esta figura es hipotética y basada en la dirección indicada en la transcripción de la configuración de repetición-espaciador. Tal como se mencionó anteriormente, las secuencias que codifican ortólogos putativos de tracrRNA se identificaron en posición antejrior, interna y posterior del operón cas, asi como en una posición posterior a las configuraciones de repetición-espaciador, inclusive las secuencias lideres putativas que sp encuentran comúnmente en los locus de tipo II-A (Figura 33). No obstante, se observó que las antirrepeticiones de ubicación similar dentro de locus de CRISPR-Cas pueden transcribirse en direcciones ¡ diferentes (según se observó alj comparar, por ejemplo, Lactobacillus rhamnosus y Eubacterium rectale o Mycoplas a mobile y S. pyogenes o N. meningfLtidis) (Figura 33). Cabe destacar que los locus agrupados dentro de un mismo subgrupo del árbol guia de Cas9 comparten úna arquitectura común con ¡ respecto a la posición del gen codificador de tracrRNA. Se ¡ identificaron antirrepeticiones alrededor de la configuración de repetición-espaciador en locus ^le tipo II-A, y mayormente anterior al gen cas9 en los tipos II-B y II-C con varias excepciones notables para el tracrRNA putativo ubicado entre cas9 y casi en tres subgrupos distintos de tipo II-B.
Algunos locus de CRISPR-Cas de tipo II tienen ortólogos de tracrRNA y/o configuraciones de repetición-espaciador defectuosas Para seis locus de tipo II (Fusobacterium nucleatum, Aminomonas paucivorans, Helicobacter mustelae, Azospirillum sp., Prevotella ruminicola y Akkermansia muciniphila), se identificaron antirrepeticiones potenciales con pares de bases débiles a la secuencia de repetición o ubicadas dentro de los marcos de lectura abiertos. Cabe destacar que en estos locus, se identificaron: una antirrepetición débil dentro del marco de lectura abierto del gen que codifica una ATPasa putativa en A. paucivorans, una antirrepetición fuerte dentro de los primeros 100 nt del gen cas9 en Azospirillum sp. B510 y una antirrepetición fuerte superpuesta tanto con cas9 como con casi en A. muciniphila (Figura 33). No se pudo detectar ninguna antirrepetición putativa para doce locus adicionales (Peptoniphilus duerdenii, Coprococcus catus, Acidaminococcus intestini, Catenibacterium mitsuokai, Staphylococcus pseudintermedius, Ilyobacter polytropus, Elusimicrobium minutum, Bacteroides fragilis, Acidothermus cellulolyticus, Corynebacterium diphteriae, Bifidobacterium longum y Bifidobacterium dentium). No hay información disponible sobre la expresión y el procesamiento de pre-crRNA en estos locus de CRISPR-Cas. Por lo tanto, queda por abordar la funcionalidad de los sistemas de tipo II ante la ausencia de un ortólogo de tracrRNA claramente definido. En siete locus analizados no se pudo identificar ninguna configuración de repetición-espaciador (Parasutterella excrementihominis, Bacillus cereus, Ruminococcus albus, Rhodopseudomonas palustris, Nitrobacter hamburgensis, Bradyrhizobium sp. y Prevotella micans) (Figura 33) y en tres de ellos (Bradyrhizobium sp. BTAil, N. hamburgensis y B. cereus) se detectó cas9 como ungen único sin otros genes cas en su proximidad. Para tres locus, no se pudo predecir ninguna secuencia de ARN pegueño anterior o posterior al gen cas9. En el caso de R. albus y P. excrementihominis, el contigo genómico que contiene cas9 es demasiado corto para permitir la predicción de la configuración de repetición-espaciador.
La secuenciación profunda de ARN valida la expresión de ortólogos novedosos de tracrRNA Para verificar las predicciones simuladas de tracrRNA y determinar los patrones de coprocesamiento de tracrRNA:pre-crRNA, se analizaron mediante secuenciación profunda los ARN de bacterias gram-positivas (S. mutans y L. innocua) y gram-negativas (N. meningitidis, C. jejuni y F. novicida) seleccionadas. Se extrajeron las secuencias de ortólogos de tracrRNA y los crRNA procesados (Figura 36 y Figura 37). De acuerdo con datos de secuenciación de tracrRNA de S. pyogenes26 diferenciales publicados anteriormente, los ortólogos de tracrRNA estaban representados en gran medida en las bibliotecas, en el intervalo de 0,08 a 6,2 % del total de las lecturas mapeadas. Los tracrRNA procesados también eran más abundantes que las transcripciones principales, en un intervalo de 66 % a más de 95 % de la cantidad total de lecturas de tracrRNA (Figura 36 y Figura 37).
La Figura 36 muestra la expresión de ortólogos bacterianos de tracrRNA y crRNA revelados mediante secuenciación profunda de ARN. Los perfiles de expresión de los ortólogos de tracrRNA y crRNA de cepas bacterianas seleccionadas se representan a lo largo de los genomas correspondientes mediante diagramas de barras (las imágenes se capturaron de la herramienta de Integrative Genomics Viewer (IGV)). Campylobacter jejuni (GenBank: NC_002163), Francisella novicida (GenBank: NC_008601), Neisseria meningitidis (GeñBank: NC_003116), Listeria innocua (GenBank: NC_003212) y Streptococcus mutans (GenBank: NC_004350). Se proporcionan coordenadas genómicas. aLa cobertura de secuencia se calculó con BEDTools-Versión-2.15.0 (escala dada en lecturas por millón). bSe indica la distribución de lecturas que comienza (5') y finaliza (3') en cada posición de nucleótido (escala dada en cantidad de lecturas). Los paneles superiores corresponden a transcriptos de la cadena positiva y los paneles inferiores corresponden a transcriptos de la cadena negativa. Los picos y valores de cobertura negativos que se presentan bajo los ejes indican la transcripción de la cadena negativa del genoma. Se graficaron los extremos 5' y 3' predominantes de las lecturas para todos los ARN. Nótese que, dada la baja calidad de la biblioteca de ADNc de L. innocua, las lecturas se acotaron para crRNA y se observa una acumulación de las lecturas en el extremo 3' de tracrRNA, según se presume, debido a la degradación de ARN.
Para evaluar los extremos 5' de las transcripciones principales de tracrRNA, se analizó la abundancia de todas las lecturas de los extremos 5' de tracrRNA y se extrajeron las lecturas más prominentes anteriores o cerca del extremo 5 ' de la secuencia de antirrepetición prevista. Los extremos 5' de ortólogos de tracrRNA se confirmaron posteriormente con el algoritmo de predicción de promotores. Los extremos 5' identificados de tracrRNA de S. mutans, L. innocua y N. meningitidis se correlacionaron con predicciones simuladas y análisis de transferencia Northern de expresión de tracrRNA26. El extremo 5' más prominente de tracrRNA de C. jejuni se identificó en el medio de la secuencia de antirrepetición. Cinco nucleótidos en la dirección anterior, se detectó un extremo 5' adicional putativo con la predicción simulada y que proporcionaba mayor secuencia de interacción con la secuencia de repetición de CRISPR. Se extrajo una cantidad relativamente baja de lecturas de la biblioteca de F. novicida que corresponden casi exclusivamente a transcriptos procesados. Los análisis de la pequeña cantidad de lecturas de transcriptos principales proporcionaron un extremo 5' que correspondía a las fuertes predicciones simuladas de promotor. El sondeo de la transferencia Northern de tracrRNA de F. novicida confirmó además la validez de las predicciones que mostraban la baja abundancia de transcriptos de alrededor de 90 nt de longitud. Los resultados se enumeran en la Tabla 2. Para todas las especies analizadas, salvo N meningitidis, los transcriptos principales de tracrRNA se identificaron como especies únicas de ARN pequeño de 75 a 100 nt de longitud. En el caso de N. meningitidis, se encontró una forma primaria predominante de tracrRNA de ~110 nt y un transcripto putativo más largo de ~170 nt representadas por una cantidad muy baja de lecturas y detectadas previamente como una banda débil mediante análisis de transferencia Northern.
Tabla 2. Ortólogos de tracrRNA seleccionados aLos ortólogos de S. termophilus , P.multocida y M. mobile se predijeron de manera simulada. bSecuenciación se ARN, revelado mediante secuenciación de ARN (Tabla S3); primera lectura, primera posición del extremo 5' extraída mediante secuenciación; más predominante hacia el extremo 5' según los datos de secuenciación de ARN; previsto, predicción simulada del sitio de inicio de transcripción; subrayado, extremo 5' elegido para alinear el tracrRNA primario. cExtremo 3' estimado de acuerdo con datos de secuenciación de ARN y predicción de terminador transcripcional.
Los sitios de coprocesamiento de tracrRNA y pre-crRNA se encuentran en la región de antirrepetición:repetición Se examinaron las transcripciones de tracrRNA procesadas mediante análisis de extremos 5' de tracrRNA abundantes dentro de la secuencia de antirrepetición prevista y de extremos 3' de crRNA maduros abundantes (Figuras 34 y 35). En todas las especies, se identificaron los extremos 5' prominentes de ortólogos de tracrRNA que podrían resultar del coprocesamiento de los dúplex de repetición de tracrRNA:pre-crRNA mediante RNasa III. También se identificaron los extremos 5' procesados de crRNA que probablemente resultan de un segundo evento de maduración a través de reducción putativa, consistente con observaciones anteriores. Cabe destacar, en los pares de ARN estrechamente relacionados de S. pyogenes, S. mutans y L. innocua, se observó el mismo sitio de procesamiento alrededor del par de bases G:C en el medio de la secuencia de antirrepetición. Tanto en S. mutans como en L. innocua, se detectaron extremos 5' de tracrRNA adicionales prominentes y extremos 3' de crRNA que podría sugerir una reducción adicional del dúplex tracrRNA:crRNA, donde el extremo 3' de crRNA se acorta adicionalmente a la reducción del extremo 5' ya mencionada, luego del primer evento de procesamiento catalizado por RNasa III. De manera similar, en C. jejuni se encontró solo una pequeña cantidad de extremos 3' de crRNA que se amoldarían a los patrones de procesamiento de la RNasa III y se extrajeron los extremos 5' correspondientes de tracrRNA procesado. De esta forma, la reducción putativa de dúplex tracrRNA:crRNA luego de la escisión inicial mediante RNasa III daría como resultado una parte más corta derivada por repetición en crRNA maduros, lo que produciría dúplex más cortos de tracrRNA:crRNA estabilizados por un triple par de bases G:C para la interacción con la endonucleasa Cas9 y posterior escisión de ADN objetivo. El dúplex de ARN de N. meningitidis parece estar procesado en dos sitios principales más hacia el extremo 3' de la repetición de CRISPR, lo que da como resultado una parte más larga derivada por repetición en crRNA maduro y una interacción estable de ARN:ARN a pesar de la protuberancia central dentro del dúplex. Curiosamente, el dúplex de tracrRNA:pre-crRNA de F. novicida parece estar escindido dentro de la región de baja complementariedad y parte de los extremos 5' abundantes de tracrRNA sugiere su reducción adicional sin reducción concomitante de crRNA. Las diferencias de tamaños de transcriptos principales y de la ubicación de sitios de procesamiento dan como resultado longitudes varias de tracrRNA procesados en un intervalo de ~65 a 85 nt. Las coordenadas y tamaño de los transcriptos de tracrRNA procesados prominentes se muestran en la Tabla 2 y en la Figura 37. Los patrones de procesamiento de tracrRNA y crRNA observados se encuentran en consonancia con el modelo propuesto anteriormente de dos eventos de maduración. La reducción adicional putativa de parte de los extremos 5' de tracrRNA y extremos 3' de crRNA podría resultar del segundo evento de maduración o, de manera alternativa, ser un artefacto de la preparación de la biblioteca de ADNc o secuenciación de ARN. La naturaleza de estos procesamientos aún debe investigarse más a fondo.
Las secuencias de ortólogos de tracrRNA son muy diversas También se determinaron las similitudes de secuencias de ortólogos seleccionados de tracrRNA. Se realizaron múltiples alineamientos de secuencia de transcripciones principales de tracrRNA de S. pyogenes (sólo la forma de 89 nt), S. mutans, L. innocua y N. meningitidis (sólo la forma de 110 nt), S. thermophilus, P. multocida y M. mobile (Tabla 2, Figura 35). Se observó gran diversidad en secuencias de tracrRNA pero una conservación significativa de secuencias de locus altamente relacionados de CRISPR-Cas. Los tracrRNA de L. innocua, S. pyogenes, S. mutans y S. thermophiles comparten un promedio de 77 % de identidad y los tracrRNA de N. meningitidis y P. multocida comparten 82 % de identidad de acuerdo con alineamientos en pares. La identidad promedio de las secuencias analizadas de tracrRNA es de 56 %, comparable a la identidad de secuencias aleatorias de ARN. Esta observación confirma además que la predicción de ortólogos de tracrRNA con base en la similitud de secuencias puede realizarse únicamente en el caso de locus altamente relacionados.
También .se buscó una posible conservación de estructura de tracrRNA pero no se pudo encontrar ninguna similitud significativa, salvo una covariación y estructura de terminador transcripcional conservada (Figura 35).
La Figura 35 ilustra la diversidad de secuencia de los ortólogos de tracrRNA. Múltiples alineamientos de secuencia de tracrRNA. S. thermophilus y S. thermophilus2, tracrRNA asociado con ortólogos de Cas9 de la SEQ ID NO:41 y la SEQ ID NO:40, según corresponda. Negro, altamente conservada; gris oscuro, conservada; gris claro, no muy conservada. La estructura de consenso prevista se representa en la parte superior del alineamiento. Las flechas indican las covariaciones de nucleótidos. Los tracrRNA de S. pyogenes SF370, S. mutans UA159, L. innocua Clipll262, C. jejuni NCTC 11168, F. novicida U112 y N. meningitidis A Z2491 se validaron mediante secuenciación de ARN y análisis de transferencia Northern. El tracrRNA LMD-9 de S. thermophiles se validó mediante análisis de transferencia Northern. El tracrRNA de P. multocida Pm70 se previo a partir de una alta similitud del locus de CRISPR-Cas con el de N. meningitidis A Z2491. El tracrRNA de M. mobile 163K se previo en simulación a partir de fuertes predicciones de terminador y promotor transcripcional.
Ejemplo 4: Adaptación de GRISPR como una plataforma guiada por ARN para el control especifico de la secuencia de expresión génica La regulación direccionada en una escala genómica es una estrategia poderosa para el cuestionamiento, la perturbación y la modificación genética de sistemas celulares. Los inventores han desarrollado un nuevo método para controlar la expresión génica, con base en Cas9, una endonucleasa de ADN guiada por ARN de un sistema de CRISPR de tipo II. Este ejemplo demuestra que una Cas9 catalíticamente muerta, sin actividad de endonucleasa, al coexpresarse con un ARN guía, genera un complejo de reconocimiento de ADN que. puede interferir de manera específica con la elongación transcripcional, la unión de ARN polimerasa o la unión del factor de transcripción. Este sistema, llamado interferencia CRISPR (CRISPRi), puede reprimir eficientemente la expresión de genes direccionados en Escherichia coli sin efectos detectables fuera del objetivo. La CRISPRi puede utilizarse para reprimir múltiples genes objetivo de manera simultánea, y sus efectos son reversibles. Además, el sistema puede adaptarse para la represión génica en células de mamífero. Esta plataforma de reconocimiento de ADN guiada por ARN proporciona un enfoque simple para perturbar de manera simple la expresión génica a escala genómica.
MATERIALES Y MÉTODOS Cepas y medios La cepa MG1655 de Escherichia coli K-12 se utilizó como la cepa huésped para medidas de fluorescencia in vivo. Se utilizó una cepa derivada de MG1655 de E. coli que expresa de manera endógena una variante de RNAP con una etiqueta de epítopo 3x-FLAG unida al extremo C de la subunidad RpoC para todos los experimentos de secuenciación. Se utilizó el medio definido EZ Rich (EZ-RDM, Teknoka) como medio de cultivo para ensayos de fluorescencia in vivo. La transformación y la verificación de transformación genética se realizaron mediante protocolos estándar, con genes AmpR, CmR o KanR como marcadores seleccionables.
Construcción de plásmidos y clonación del genoma de E. coli Los genes Cas9 y dCas9 se clonaron de los vectores descritos anteriormente pMJ806 y pMJ841, respectivamente. Los genes se amplificaron por PCR y se insertaron en un vector que contenia un promotor inducible por anhidrotetracielina (aTc) PLtetO-1, un marcador seleccionable de cloranfenicol y un origen de replicación pl5A. La plantilla de ARNsg se clonó en un vector que contenia un promotor mínimo sintético (J23119) con un sitio de inicio de la transcripción comentado, un marcador seleccionable de ampicilina y un origen de replicación de ColEl. Se utilizó PCR inversa para generar casetes de ARNsg con regiones complementarias de 20 bp nuevas. Para insertar genes indicadores fluorescentes en genomas de E. coli, el gen de fluorescencia se clonó primero en un vector de entrada, el cual se amplificó después por PCR para generar fragmentos de ADN linealizados que contenían secuencias UTR 5'/3' nsfA, el gen fluorescente y un marcador seleccionable de KanR. La cepa MG1655 de E. coli se transformó con un plásmido sensible a la temperatura pKD46 que contenía proteínas de recombinación l-Red (Exo, Beta y Gamma) . Los cultivos celulares se cultivaron a 30 °C a una OD (600 nm) de ~ 0,5 y se agregó arabinosa al 0,2 % para inducir la expresión de las proteínas de recombinación l-Red durante 1 hora. Las células se cosecharon a 4 °C y se utilizaron para la transformación de fragmentos de ADN linealizados mediante electroporación. Las células que contienen inserciones genómicas correctas se seleccionaron con 50 mg/mL de kanamicina.
Citometría de flujo y análisis Las cepas se cultivaron en EZ-RDM con 100 pg/mL de carbencilina y 34 pg/mL de cloranfenicol en placas profundas de 96 pocilios de 2 mL (Costar 3960) durante la noche a 37 °C y 1200 r.p.m. Se agregó entonces un mL de este cultivo durante la noche a 249 pL de EZ-RDM fresco con las mismas concentraciones antibióticas con 2 pM de aTc complementado para inducir la producción de la proteína dCas9. Tras el cultivo de las células hasta la fase logarítmica (~4h), se determinaron los niveles de proteína fluorescente con el citómetro de flujo LSRII (BD Biosciences) equipado con un muestrario de alto rendimiento. Las células se muestrearon con una velocidad de flujo baja hasta que se hubieran recolectado al menos 20.000 células. Los datos se analizaron con FSC Express (De Novo Software) mediante el control de canales en una región poligonal que contenía una población de células del 60 % en el lado de aspersión delantera de la gráfica de dispersión. Para cada experimento, se midieron los cultivos triplicados y luego se indicó la desviación estándar como la barra de error.
Ensayo de B-galactosidasa Para realizar el ensayo de b-galactosidasa, se agregó 1 pL del.cultivo durante la noche preparado según antecede a 249 pL de EZ-RDM fresco con las mismas concentraciones antibióticas con 2 mM de aTc, con o sin isopropil b-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) 1 M. Las células se cultivaron hasta la fase logarítmica. Se midió la actividad de LacZ de 100 uL de este cultivo con el kit de ensayo de b-galactosidasa de levadura (Pierce), siguiendo las instrucciones.
Extracción y purificación de ARN total Para cada muestra, se cultivó un cultivo monoclonal de E. coli a 37 °C desde una OD (600 nm) de 0,1 en 500 mL de EZ-RDM hasta la fase logarítmica temprana (OD 0,45 ± 0,05), punto en que las células se cosecharon mediante filtración sobre filtros de nitrocelulosa de 0,22 mm (GE) y se congelaron en nitrógeno líquido para detener, de manera simultánea, todo progreso transcripcional. Las células congeladas (10.0 pg) se pulverizaron en un molino mezclador Qiagen TissueLyser II 6 veces a 15 Hz durante 3 minutos en presencia de 500 mL de amortiguador de lisís congelado (Tris 20 mM con pH 8, Tritón X-100 al 0,4 %, NP-40 al 0,1 %, NH4CI 100 mM, 50 U/mL de SUPERase*In (Ambion) y lx cóctel inhibidor de proteasa (Complete, EDTA-free, Roche), complementado con MnCl210 mM e inhibidor de transcripción Tagetin 15 pM (Epicentre).
El lisado se volvió a suspender en hielo mediante pipeteado. Se agregó RQ1 DNasa I (110 U en total, Promega) y se incubó durante 20 minutos en hielo. La reacción se inactivó con EDTA (25 mM final) y el U sado se aclaró a 4 °C mediante centrifugado a 20.000 g durante 10 minutos. El lisado se cargó en una columna PD MiniTrap G-25 (GE Healthcare) y se eluyó con amortiguador de lisis complementado con EDTA 1 mM.
Purificación -total de ARNm.
El ARN total se purificó del lisado aclarado con el kit miRNeasy (Qiagen). Se mezcló 1 mg de ARN en 20 mL de Tris 10 mM con pH 7 con un volumen igual de solución de fragmentación alcalina 2x (EDTA 2 mM, Na2CO310 mM,·NaHC0390 mM, pH 9,3) y se incubó durante ~25 minutos a 95 °C para generar fragmentos en un intervalo de 30-100 nt. La reacción de fragmentación se detuvo añadiendo 0,56 mL de solución de precipitación helada (NaOAc 300 mM con pH 5,5 más GlycoBlue (A bion)) y el ARN se purificó mediante una precipitación de isopropanol estándar. El ARNm fragmentado luego se desfosforiló en una reacción de 50 pL con 25 U T4 PNK (NEB) en lx amortiguador PNK (sin ATP) más 0,5 U de SUPERase»In y se precipitó con GlycoBlue mediante métodos estándar de precipitación de isopropanol.
Purificación de ARN naciente Para la purificación de ARN naciente, se agregó el lisado aclarado a 0,5 mL de gel de afinidad anti-FLAG M2 (Sigma Aldrich) según se describió anteriormente. El gel de afinidad se lavó dos veces con amortiguador de lisis y se complementó con EDTA 1 mM previo a la incubación con el lisado aclarado a 4 °C durante 2,5 horas con nutación. Se lavó la inmunoprecipitación a 4 x 10 mi con amortiguador de lisis complementado con KC1 300 mM, y se eluyó el RNAP unido dos veces con amortiguador de lisis complementado con EDTA 1 mM y 2 mg/mL de péptido 3x-FLAG (Sigma Aldrich). El ARN naciente se purificó del eluido con el kit miRNeasy (Qiagen) y se convirtió en ADN con un protocolo preestablecido de generación de bibliotecas.
Preparación de bibliotecas de ADN y secuenciación de ADN La biblioteca de ADN se secuenció en Illumina HiSeq 2000. Se procesaron las lecturas con el paquete HTSeq Python y otro software personalizado escrito en Python. El extremo 3' de la transcripción secuenciada se alineó con el genoma de referencia con Bowtie ( "bowtie-bio" antes de ".sourceforge.net") y los perfiles de RNAP generados en MochiView ("johnsonlab.ucsf " antes de ".edu/mochi.html").
Diseño de plásmidos y construcción para CRISPRi en células humanas La secuencia que codifica Cas9 optimizada por codón de mamífero de Streptococcus pyogenes (ADN 2.0) se fusionó con tres secuencias de localización nuclear (NLS) SV40 del extremo C o a tagBFP flanqueado por dos NLS. Usando clonación independiente de ligación estándar se clonaron estas dos proteínas de fusión en MSCV-Puro (Clontech). Los ARNsg guía se expresaron usando un vector de expresión basado en U6 lentiviral derivado de pSico que coexpresa mCherry a partir de un promotor.CMV. Los plásmidos de expresión de ARNsg se clonaron mediante la inserción de cebadores hibridados en el vector de expresión basado en U6 lentiviral que se digirió mediante BstXI y Xhol.
Cultivo celular, transfecciones de ADN y mediciones de fluorescencia para CRISPRi en celulas humanas Se mantuvieron células HEK293 en medio eagle modificado de • Dulbecco (DMEM) en FBS al 10 %, glutamina 2mM, 100 unidades/mL de estreptomicina y 100 mg/mL de penicilina. Las células HEK293 se infectaron con un GFP que expresaba un retrovirus MSCV usando los protocolos estándar y se clasificaron mediante citometria de flujo usando BD FACS Aria2 para la expresión de GFP estable. Las células HEK293 que expresaban GFP se transíectaron transitoriamente usando reactivo de transfección TransIT-LTl (Mirus) con el protocolo recomendado por el fabricante en placas de 24 pocilios usando 0,5 mg del plásmido de expresión de dCas9 y 0,5 pg del plásmido de expresión de ARN (con 0,25 pg de plásmido indicador de GFP para la Figura 45B).72 horas luego de la transfección, las células se tripsinizaron a una suspensión celular individual. El vector U6 contiene un promotor CMV constitutivo que impulsa un gen mCherry. La expresión de GFP se analizó usando una máquina BD LSRII FACS mediante el control de canales en las poblaciones positivas a mCherry (mCherry >10 veces más brillante en comparación con células de control negativo).
ARN diseñados Diseños de ARNsg usados en las figuras: solamente se enumera la región coincidente de 20 nucleótidos (segmento dirigido a ADN) (a menos que se especifique lo contrario): Los ARNsg dirigidos a mRFP usados en la Figura 40C (SEQ ID NO:741-746); Los ARNsg dirigidos al promotor usados en la Figura 40D (SEQ ID NOs:747-751); Secuencia de promotor objetivo en la Figura 40D (SEQ ID NO:752); Los ARNsg dirigidos a mRFP usados en la Figura 43B (SEQ ID NOs :753-760); Los ARNsg dirigidos a sfGFP (gfp) usados en la Figura 42B (SEQ ID NO:761); Los ARNsg dirigidos a sfGFP usados en la Figura 43B (SEQ ID NO:762-769); Los experimentos de direccionamiento de ARNsg dobles en la Figura 43F y la Figura 51 (SEQ ID NOs:770-778); Los ARNs'g dirigidos al operón lac usados en la Figura 44B (SEQ ID NO:779-787); Los ARNsg dirigidos a EGFP usados en la Figura 45 (SEQ ID NO:788-794); Tabla 3. Secuencias usadas en las figuras del Ejemplo 4 (enumeradas anteriormente) RESULTADOS El sistema CRISPR (repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y regularmente espaciadas) proporciona una nueva plataforma potencial para la regulación genética objetivo. Alrededor del 40 % de las bacterias y el 90 % de las arqueas poseen sistemas CRISPR/asociados con CRISPR (Cas) para otorgar resistencia a elementos externos al ADN. Los sistemas CRISPR usan ARN de pares de bases pequeños para dirigirse y escindir elementos de ADN extraños de una manera especifica de secuencia. Hay diferentes sistemas CRISPR en diferentes organismos, y uno de los más simples es el sistema CRISPR tipo II de Streptococcus pyogenes: un único gen que codifica la proteina Cas9 y dos ARN, un ARN de CRISPR maduro (crRNA) y un ARN regulador en trans (tracrRNA) complementario, son necesarios y suficientes para el silenciamiento guiado por ARN de ADN extraño (Figura 46). La maduración de crRNA necesita tracrRNA y RNasa III. Sin embargo, este requerimiento puede superarse mediante el uso de un ARN guia pequeño (ARNsg) modificado genéticamente que contiene una horquilla diseñada que imita el complejo tracrRNA-crRNA. La formación de pares de bases entre el ARNsg y el ADN objetivo produce roturas de cadena doble (DSB) debido a la actividad de endonucleasa de Cas9. La especificidad de unión se determina mediante la formación de pares de bases de ARNsg-ADN y un motivo de ADN corto (motivo adyacente a protoespaciador, o PAM, secuencia: NGG) yuxtapuesto a la región de complementariedad del ADN. Por lo tanto, el sistema CRISPR solo necesita un conjunto mínimo de dos moléculas-la proteína Cas9 y el ARNsg, y, por lo tanto, mantiene el potencial de ser usado como una plataforma de direccionamiento genético independiente del hospedador. Se ha demostrado que Cas9/CRISPR puede aprovecharse para la edición del genoma guiada por ARN selectiva del sitio (Figura 39A).
La Figura 46 muestra el mecanismo del sistema CRISPR tipo II a partir de S. pyogenes. El sistema consiste en un conjunto de proteínas asociadas a CRISPR (Cas) y un locus de CRISPR que contiene una matriz de secuencias espad adoras de repetición. Todas las repeticiones son iguales y todos los espaciadores son diferentes y complementarios a las secuencias de ADN objetivo. Cuando la célula se infecta mediante elementos de ADN extraños, el locus de CRISPR se transcribirá en un transcripto de precursor largo, el cual se escindirá en fragmentos más pequeños. La escisión está mediada por un ARN antisentido regulador en trans (tracrRNAj y la RNasa III hospedadora. Luego de la escisión, una única proteina, Cas9, reconoce y se une a la forma escindida del crRNA. Cas9 guia el crRNA al ADN y escanea la molécula de ADN. El complejo se estabiliza mediante la formación de pares de bases entre el crRNA y el ADN objetivo. En este caso, Cas9 produce la rotura del ADN de cadena doble debido a su actividad de nucleasa. Esto usualmente elimina las moléculas de ADN cognado y las células confieren inmunidad a ciertas poblaciones de ADN.
La Figura 39 muestra el diseño del sistema de interferencia de CRISPR (CRISPRi). (A) El sistema de interferencia mínima consiste en una única proteína y una quimera diseñada de ARNsg . El ARNsg quimérico consiste en tres dominios (región recuadrada): una región complementaria de 20 nucleótidos (nt) para la unión específica al ADN, una horquilla de 42 nt para la unión a Cas9 (asa de Cas9) y un terminador de la transcripción de 40 nt derivado de S. pyogenes. La proteína Cas9 de tipo salvaje contiene la actividad de nucleasa. La proteína dCas9 posee actividad de nucleasa deficiente. (B) La proteína Cas9 de tipo salvaje se une al ARNsg y forma un complejo de ARN y proteína. El complejo se une a objetivos de ADN específicos mediante formación de pares de bases de Watson-Crick entre el ARNsg y el objetivo de ADN. En el caso de Cas9 de tipo salvaje, el ADN se escindirá debido a la actividad de nucleasa de la proteina Cas9. En el caso de nucleasa deficiente en Cas9, el complejo impide la transcripción adecuada.
Un sistema CRISPRi mínimo consiste en una única proteina y ARN y puede silenciar eficazmente la elongación y el inicio de la transcripción Para implementar dicha plataforma CRISPRi en E. coli, el gen Cas9 de S. pyogenes de tipo salvaje y un ARNsg se expresaron a partir de vectores bacterianos para determinar si el sistema podría interrumpir la expresión génica en un locus objetivo (Figura 40A). El sistema CRISPR de S. pyogenes es ortogonal al sistema de E. coli natural. La proteina Cas9 se i expresa a partir de un promotor inducible por anhidrotetracielina (aTc) en un plásmido gue contiene un origen de replicación pl5A, y el ARNsg se expresa a partir de un promotor consitutivo mínimo en un plásmido que contiene un origen de replicación ColEl. Como estrategia alternativa, un mutante Cas9 catalíticamente muerto (dCas9), que es deficiente en escisión de ADN, se usó y se demostró que esta forma de Cas9 todavía actúa como un complejo de unión a ADN guiado por ARN simple.
La Figura 40 demuestra que CRISPRi silencia eficazmente la elongación e inicio de la transcripción. (A) El sistema CRISPRi consiste en una proteína Cas9 inducida y una quimera diseñada de ARNsg. La dCas9 contiene mutaciones de los dominios de nucleasa HNH y RuvCl. La quimera diseñada de ARNsg contiene tres dominios funcionales como se describe en la Figura 1. (B) Secuencia de ARNsg diseñada (NT1) y el objetivo de ADN. NT1 se dirige a la cadena de ADN que no es la plantilla de la región codificante de mRFP. Solo se muestra la región que rodea el motivo de pares de bases (20 nt). Los nucleótidos en pares de bases están numerados y la horquilla de unión a dCas9 está sobrerrayada. La secuencia PAM está subrayada. (C) CRISPRi bloqueó la elongación de transcripción de una manera especifica de la cadena. Un sistema indicador basado en fluorescencia sintética que contiene un gen codificante de mRFP se insertó en el genoma de MG1655 de E. coli (el locus de nsfA) . Seis ARNsg que se unen ya sea a la cadena de ADN plantilla o la cadena de ADN que no es plantilla se coexpresaron con la proteína dCas9, con sus efectos en el mRFP objetivo medido por ensayo de fluorescencia in vivo. Solamente los ARNsg que se unen a la cadena de ADN no plantilla mostraron el silenciamiento (10~300 veces). El control muestra fluorescencia de las células con proteína dCas9 pero sin el ARNsg. (D) CRISPRi bloqueó el inicio de la transcripción. Se diseñaron cinco ARNsg para unirse a diferentes regiones alrededor de un promotor de E. coli (J23119). El sitio de inicio de la transcripción se marcó como +1. El óvalo punteado muestra el complejo RNAP inicial que cubre una región de 75 bp desde -55 hasta +20. Solamente los ARNsg que se dirigen a regiones dentro del complejo RNAP inicial mostraron represión (P1-P4). A diferencia del bloqueo de elongación de la transcripción, el silenciamiento fue independiente de la cadena de ADN objetivo. (E) La regulación de CRISPRi era reversible. Tanto dCas9 como ARNsg (NT1) estaban bajo el control de un promotor inducible por aTc. El cultivo celular se mantuvo durante la fase exponencial. En el momento T = 0, 1 mM de aTc se agregó a células con una OD = 0,001. La represión del mRFP objetivo comenzó dentro de un periodo de 10 min. La señal de fluorescencia decreció de una manera consistente con el crecimiento celular, lo cual sugiere que la disminución se debía a la división celular. En 240 min, la fluorescencia alcanzó el nivel completamente reprimido. En T = 370 min, aTc se lavó del medio de cultivo y las células se diluyeron de nuevo a OD = 0,001. La fluorescencia comenzó a aumentar luego de 50 min, y le llevó alrededor de 300 min aumentar al mismo nivel que el control positivo. Control positivo: siempre sin el inductor; control negativo: siempre con un inductor aTc 1 mM. Los ·resultados de fluorescencia en 2C, 2D y 2E representan el promedio y EEM de al menos tres replicados biológicos. Véanse también la Figura 47 y la Figura 48.
Cada molécula de ARNsg coexpresadas con Cas9 consiste en tres segmentos: una región complementaria específica del objetivo de 20 nucleótidos (nt), una horquilla de unión a Cas9 de 42 nt (asa de Cas9) y un terminador de la transcripción de 40 nt derivado de S. pyogenes (Figura 40B). Un sistema de gen indicador basado en proteína fluorescente roja (mRFP) se insertó en el genoma MG1655 de E. Coli.
La coexpresión de proteína Cas9 de tipo salvaje y un ARNsg (NT1) dirigido a la secuencia codificante de mRFP disminuyó dramáticamente la eficacia de transformación, probablemente debido a las roturas de cadena doble inducidas por Cas9 en el genoma (Figura 47A). La secuenciación de unas pocas colonias sobrevivientes mostró que todas tenían los mismos reagrupamientos alrededor del sitio de mRFP objetivo en el genoma, lo cual sugiere que hubo una selección fuerte contra la expresión de Cas9 de tipo salvaje y un ARNsg dirigido a una secuencia hospedadora. El gen mutante dCas9 (no escindido), que contenia dos mutaciones de silenciamiento de los dominios de nucleasa HNH y RuvCl (D10A y H841A), alivió este carácter letal, como se verificó mediante las tasas de eficacia de transformación y de crecimiento de E. coli (Figura 47A y B).
La Figura 47 se relaciona con la Figura 40 y muestra las curvas de crecimiento de cultivos celulares de E. coli cotransformados con dCas9 y ARNsg. (A) Eficacia de transformación para transformar células de E. coli con dos plásmidos. Un plásmido contiene un ARNsg que se dirige a una copia genómica de mRFP y el otro plásmido contiene la Cas9 de tipo salvaje o dCas9. La cotransformación de Cas9 de tipo salvaje y ARNsg es altamente tóxica, lo cual puede aliviarse usando dCas9. (B) El ARNsg (NT1) se diseñó para dirigirse a la secuencia codificante de mRFP. La coexpresión de dCas9 y ARNsg casi no presenta efectos en las tasas de crecimiento celular, lo cual sugiere que la interacción entre dCas9-ARNsg y ADN es lo suficientemente fuerte como para bloquear la ARN polimerasa pero no la ADN polimerasa o la replicación celular. Los resultados representan el promedio y EEM de al menos tres experimentos independientes.
Para evaluar si el complejo de dCas9:ARNsg puede producir una represión altamente eficiente de la expresión génica, los ARNsg complementarios a diferentes regiones de la secuencia codificante de mRFP se diseñaron, unidos ya sea a la cadena de ADN plantilla o a la cadena de ADN que no es plantilla. Los resultados indicaron que los ARNsg que se dirigen a la cadena de ADN que no es plantilla presentaron silenciamiento génico eficaz (10 a 300 veces la represión), mientras que los que se dirigen a la cadena plantilla mostraron un efecto muy inferior (Figura 40C). El sistema presentó efectos de represión similares para los genes que estaban dentro del genoma de E. coli o en un plásmido con alto número de copias (Figura 48). Además, el direccionamiento hacia la región del promotor también lleva a un silenciamiento génico eficaz (Figura 40D). El direccionamiento del ARNsg a la caja -35 inactivó significativamente la expresión génica (Pl, ~100 veces de represión), mientras que el direccionamiento a otras regiones adyacentes mostró un efecto disminuido (P2-P4). El direccionamiento hacia las secuencias alrededor de 100 bp en una posición anterior a la del promotor no mostró efectos (P5). A diferencia de la secuencia codificante, cuando se produce el direccionamiento al promotor, la eficacia de silenciamiento es independiente de la cadena de ADN; el direccionamiento de las cadenas de plantilla y las que no son plantilla es igualmente eficaz (P2 y P3).
La Figura 48 está relacionada con la Figura 40C y muestra que CRISPRi puede silenciar la expresión de un gen indicador en un plásmido de múltiples copias. El gen de mRFP se clonó en un plásmido pl5A. La presencia de dCas9 y un ARNsg específico de mRFP (NT1) reprime de manera potente mRFP (~300 veces). El efecto de represión es similar al observado usando la mRFP en el genoma (Figura 40C). El silenciamiento es solamente eficaz cuando el ARNsg actúa en la cadena de ADN que no es plantilla pero no en la cadena de ADN plantilla (Ti). También, el silenciamiento es altamente especifico, dado que un ARNsg especifico de GFP 3 (gfp) no muestra efectos en la expresión de mRFP. Los resultados de fluorescencia representan el promedio y EEM de al menos tres replicados biológicos.
La inactivación de genes mediante CRISPRi es inducible y reversible A diferencia de los métodos de inactivación genética, una ventaja de usar la inactivación basada en CRISPRi de la expresión génica es el hecho de que esta perturbación deberla ser reversible. Para evaluar si la regulación de CRISPRi podría inducirse y revertirse subsiguientemente, tanto dCas9 como ARNsg específico de mRFP (NT1) se colocaron bajo el control del promotor inducible por aTc, y se llevaron a cabo mediciones de transcurso de tiempo de la regulación mediada por CRISPRi de mRFP en respuesta a inductores (Figura 40E). En el momento cero, el cultivo celular que creció hasta la fase exponencial temprana sin inductores se complementó con 1 mM de aTc. Los datos indican que el sistema podría responder rápidamente a la presencia de inductores - la señal de la proteína indicadora fluorescente comenzó a disminuir dentro de un período de 10 min desde la adición de la molécula inductora. Dado que la proteína de mRFP es estable, la tasa de la disminución de la señal de fluorescencia es limitada por la disolución de la proteína debido al crecimiento celular, como se observa mediante un tiempo de duplicación celular similar y la pérdida de la semivida de fluorescencia (ambos ~36 min). A los 240 min, todas las células se reprimieron uniformemente al mismo nivel que el control negativo. A los 420 min, el inductor se lavó del medio de cultivo y las células se diluyeron de nuevo a una OD inferior. Luego de un retraso de 50 min, la fluorescencia de mRFP comenzó a aumentar. Tomó un total de 300 min para que la fluorescencia de una célula simple aumentara al mismo nivel que el control positivo. Es muy probable que el retraso de 50 min esté determinado por la desviación de la tasa de reemplazo de dCas9/ARNsg mediante la disolución por crecimiento y división celular. En resumen, estos resultados demuestran que los efectos de silenciamiento de dCas9/ARNsg pueden ser inducidos y reversibles.
La secuenciación del transcripto de elongación natural (NET-Seq) confirma que CRISPRi funciona mediante el bloqueo de la transcripción dCas9 parecía funcionar como un complejo de unión de ADN guiado por ARN que podría bloquear la unión de ARN polimerasa (RNAP) durante la elongación de transcripción. Dado que la cadena de ADN que no es plantilla comparte la misma identidad de secuencia que el ARNm transcripto y solamente los ARNsg que se unen . al ADN que no es plantilla presentan silenciamiento, es todavía una posibilidad que el complejo dCas9:ARNsg interactúa con ARNm y altera su traducción o estabilidad. Para distinguir estas posibilidades, un abordaje descrito recientemente de secuenciación del transcripto de elongación natural (NET-seq) se aplicó a E. coli, lo cual podría usarse para perfilar de manera global las posiciones de las polimerasas de ARNsg elongadas y se monitores el efecto del complejo dCas9:sgRNA en la transcripción. En este método NET-Seq, el sistema CRISPRi se transformó en una cepa derivada de MG1655 de E. coli que .contenia una RNAP marcada con FLAG. El CRISPRi contenia un ARNsg (NT1) que se une a la región codificante de mRFP. La inmunopurificación in vitro de la RNAP marcada seguida por secuenciación de los transcriptos nacientes asociados con RNAP elongadas permitió distinguir los sitios de pausa de RNAP.
Estos experimentos demostraron que el ARNsg indujo una pausa transcripcionaí fuerte en una posición anterior al locus objetivo de ARNsg (Figura 41A). La distancia entre el sitio de pausa y el sitio objetivo es de 19 bp, que está en perfecta concordancia con la distancia previamente descrita de ~18 bp entre la incorporación de nucleótidos de RNAP y su borde frontal. Este descubrimiento es consistente con un mecanismo de CRISPRi en el cual el bloque de la transcripción se debe a la colisión física entre la RNAP elongada y el complejo dCas9:ARNsg (Figura 41B). La unión del complejo dCas9:ARNsg a la cadena plantilla tuvo un efecto represor bajo, lo cual sugiere que RNAP fue capaz de leer a través del complejo en esta orientación particular. En este caso el ARNsg está enfrentado a RNAP, el cual podría estar desplegado por medio de la actividad de helicasa de RNAP. Estos experimentos han demostrado que CRISPRi utiliza ARN que bloquean directamente la transcripción. Este mecanismo difiere del de ribointereferencia, para el cual la inactivación de la expresión génica requiere de la destrucción de ARN mensajeros ya transcriptos, antes de su traducción.
La Figura 41 demuestra que CRISPRi funciona al bloquear la elongación de la transcripción. (A) Las moléculas de RNAP marcadas con FLAG se inmunoprecipitaron y los transcriptos de ARNm nacientes asociados se secuenciaron. El panel superior muestra los resultados de secuenciación del transcripto de mRFP naciente en células sin ARNsg y el panel inferior muestra resultados en células con ARNsg. En presencia de ARNsg, se observó una pausa transcripcional fuerte en la posición de 19 bp anterior al sitio objetivo, luego de la cual la cantidad de lecturas de secuenciación cayó precipitadamente. (B) Un mecanismo de CRISPRi basado en la colisión física entre RNAP y dCas9-ARNsg. La distancia desde el centro de RNAP hasta el borde frontal es de 19 bp, lo cual coincide con la distancia medida entre el sitio de pausa de la transcripción y 3' de la región de los pares de bases de ARNsg. La RNAP pausada aborta la elongación de transcripción al encontrar el obstáculo de dCas9-ARNsg.
El silenciamiento génico guiado por ARNsg de CRISPRi es altamente especifico Para evaluar la especificidad de CRISPRi en una escala genómica, se llevó a cabo la secuenciación completa de transcriptoma (secuenciación de ARN) de células transformadas por dCas9 con y sin coexpresión de ARNsg (Figura 42A). En presencia de ARNsg dirigido a mRFP (NT1), el transcripto de mRFP fue el único gen que presentaba una disminución de abundancia. Ningún otro gen mostró un cambio significativo en la expresión luego de la adición del ARNsg, dentro de los errores de secuenciación. También se llevó a cabo la secuenciación de ARN en células con diferentes ARNsg que se dirigen a genes diferentes. Ninguno de los experimentos mostró cambios significativos de genes aparte del gen objetivo (Figura 49). Por lo tanto el direccionamiento y la regulación genética guiados por ARNsg son altamente específicos y no tiene efectos significativos fuera del objetivo.
La Figura 42 demuestra la especificidad de direccionamiento del sistema CRISPRi. (A) La secuenciación de ARNm a escala genómica (secuenciación de ARN) confirmó que el direccionamiento por CRISPRi no tiene efectos fuera del objetivo. Se usó el ARNsg NT1 que se une a la región codificante de mRFP. Los genes dCas9, mRFP y sfGFP están resaltados. (B) Múltiples ARNsg pueden silenciar independientemente dos informantes de proteína fluorescente en la misma célula. Cada ARNsg reprimió específicamente su gen cognado pero no el otro gen. Cuando ambos ARNsg estaban presentes, ambos genes fueron silenciados. Las barras de error representan el EEM de al menos tres replicados biológicos. (C) Imágenes microscópicas para usar dos ARNsg para controlar dos proteínas fluorescentes. El panel superior muestra las imágenes de campo claro de las células de E. coli, el panel central muestra el canal de RFP y la parte inferior muestra el panel de GFP. La coexpresión de un ARNsg y dCas9 solamente silencia la proteína fluorescente cognada pero no la otra. El efecto de inactivación fue fuerte, ya que prácticamente no se observó fluorescencia a partir de las células con determinada proteína fluorescente silenciada. Barra de escala, 10 pm. El control muestra células sin ningún informante de proteína fluorescente. Los resultados de fluorescencia representan el promedio y EEM de al menos tres replicados biológicos. Véase también la Figura 49.
La Figura 49 se relaciona con la Figura 42A y muestra los datos de secuenciación de ARN de células con ARNsg que se dirigen a diferentes genes. (A) (+/-) ARNsg que se dirige al promotor del gen lacl endógeno en E. coli. El mismo ARNsg dirigido a lacl se usó en la Figura 44A. (B) (+/-) 1 mM de IPTG para células sin ARNsg autoinhibido (ARNsg reprimió su propio promotor. (C) (+/-) ARNsg que se dirige al gen lacZ endógeno en E. coli. El mismo ARNsg dirigido a lacZ se usó en la Figura 44A. IPTG 1 mM también se agregó a células con el ARNsg dirigido a lacZ.
CRISPRi puede usarse para regular simultáneamente múltiples genes El sistema CRISPRi puede pemitir el control de múltiples genes independientemente sin interferencia. Se ideó un sistema de informante de fluorescencia de color dual asado en mRFP y sfGFP. Se diseñaron dos ARNsg con regiones complementarias diferentes para cada gen. La expresión de cada ARNsg solamente silenció el gen cognado y no tuvo efecto en el otro. La coexpresión de dos ARNsg inactivó ambos genes (Figura 42B y C) . Estos resultados sugieren que el direccionamiento guiado por ARNsg es específico, con la especificidad dictada por su identidad de secuencia y no afectada por la presencia de otros ARNsg. Este comportamiento debería permitir el control múltiple de múltiples genes de manera simultánea mediante CRISPRi.
Factores que determinan la eficacia de silenciamiento de CRISPRi Para encontrar determinantes de la eficacia de direccionamiento de CRISPRi, se investigó el rol de la longitud, complementariedad de secuencia y posición en la eficacia de silenciamiento (Figura 43A). Como sugiere la Figura 40C, la ubicación de la secuencia objetivo de ARNsg a lo largo del gen era importante para la eficacia. Se diseñaron adiciónalmente ARNsg para cubrir la longitud total de las regiones codificantes tanto para mRFP como para sfGFP (Datos Complementarios para secuencias de ARNsg). En todos los casos, la represión se relacionó inversamente a la distancia objetivo desde el sitio de inicio de la transcripción (Figura 43B). Se observó una correlación lineal fuerte para mRFP. Se observó una correlación similar pero más débil cuando se usó sfGFP como objetivo, lo cual quizás indica cinética variada de la ARN polimerasa durante diferentes puntos en la elongación de este gen.
El ARNsg contiene una región complementaria al objetivo de 20 bp. Para identificar la importancia de esta región de pares de bases, se modificó la longitud de ARNsg NT1 (Figura 43C). Mientras que la extensión de la región desde el extremo 5' no afectó el silenciamiento, el truncamiento de la región disminuyó drásticamente la represión. La longitud mínima de la región de pares de bases necesaria para el silenciamiento génico era de 12 bp, con truncamiento adicional que llevó a la pérdida completa de la función. Se introdujeron mutaciones individuales en la región de pares de bases de ARNsg NT1 y se evaluó el efecto general en el silenciamiento. A partir de los resultados, pudieron discernirse tres subregiones, cada una con una contribución diferente a la unión y silenciamiento en general (Figura 43D). Cualquier mutación individual de los primeros 7 nucleótidos disminuyó dramáticamente la represión, lo cual sugiere que esta secuencia constituye una "región semilla" para la unión, como se notó previamente para ambos sistemas CRISPR de tipo I y de tipo II. Los nucleótidos adyacentes también se mutaron en pares (Figura 43E y Figura 50). En la mayoría de los casos, la actividad de represión relativa debida a la mutación doble fue multiplicativa, en relación con los efectos de los mutantes individuales, lo cual sugiere una relación independiente entre los mal apareamientos. Además, coherente con resultados previos en la importancia de la secuencia de PAM, un PAM incorrecto eliminó completamente el silenciamiento incluso con una región de unión perfecta de 20 bp (Figura 43E). Por lo tanto, la especificidad del sistema CRISPRi está determinada en conjunto mediante el PAM (2 bp) y al menos una extensión de ARNsg-ADN de 12 bp, donde dicho espacio es lo suficientemente grande para cubrir la mayoría de los genomas bacterianos para sitios objetivo únicos.
Se analizaron dos ARNsg que se dirigen al mismo gen (Figura 43F y Figura 51). Dependiendo del posicionamiento relativo de múltiples ARNsg, se observaron efectos combinatorios diferentes. Combinar dos ARNsg, cada uno con una represión de alrededor de 300 veces, permitió un aumento del silenciamiento general de hasta doscientas veces. Combinar dos ARNsg más débiles (~5 veces) mostró efectos multiplicativos cuando se usan juntos. Se observaron efectos combinatorios supresores al usar dos ARNsg cuyos objetivos se superponían. Esto se debió probablemente a la competencia entre ambos ARNsg para unirse a la misma región.
La Figura 43 muestra la caracterización de factores que afectan la eficacia de silenciamiento. (A) Se midieron los efectos de silenciamiento de ARNsg con diferentes locus objetivo en el mismo gen (Distancia desde el codón de inicio de la traducción) y ARNsg con diferentes longitudes de la región de pares de base al mismo locus objetivo (basado en NT1). (B) La eficacia de silenciamiento se correlacionó inversamente con la distancia objetivo desde el codón de inicio de la traducción (naranja - mRFP y verde - sfGFP). La actividad de represión relativa se calculó mediante la normalización de la represión de cada ARNsg a la del ARNsg con el cambio de múltiplo de represión más alto. Las barras de error representan el EEM de tres replicados biológicos. (C) La longitud de la región de pares de bases de Watson-Crick entre el ARNsg y el ADN objetivo afecta la eficacia de represión. Todas las extensiones de la región de pares de bases presentaron un efecto de silenciamiento fuerte y los truncamientos disminuyeron dramáticamente la represión. La longitud mínima de la región de pares de bases para la represión detectable es de 12 bp. Las barras de error representan el EEM de tres replicados biológicos. (D) Se introdujeron mal apareamientos individuales en cada nucleótido en el ARNsg (NT1, Figura 40B) y se midió cómo estos mal apareamientos individuales afectaban la eficacia de represión. Pueden discernirse tres subregiones con importancia diferente para el silenciamiento general. Presentan una función escalonada. La región de los primeros 7 nucleótidos fue crucial para el silenciamiento y probablemente constituye una región "semilla" para sondar la unión de ARNsg al ADN objetivo. La secuencia de PAM (NGG) fue indispensable para el silenciamiento. Las barras de error representan el EEM de tres replicados biológicos. (E) Efectos del silenciamiento de ARNsg con mal apareamientos dobles adyacentes. La actividad de represión relativa de ARNsg mal apareados simples se muestra con la posición de mal apareamiento marcada en la parte inferior. Se muestra la actividad medida experimentalmente de ARNsg mal apareados dobles. La actividad calculada mediante la multiplicación de los efectos de dos ARNsg mal apareados simples se muestra en blanco y marcada con "Com". En la mayoría de los casos, la actividad de silenciamiento de un ARNsg mal apareado doble fue simplemente una multiplicación de las actividades de ARNsg mal apareados simples (excepto la Figura 50B), lo cual sugiere una relación independíente entre los mal apareamientos simples. Las barras de error representan el EEM de tres replicados biológicos. (P) Efectos de silenciamiento combinatorios del uso de ARNsg dobles para dirigirse a un gen de mRFP simple. Usando dos ARNsg que se dirigen al mismo gen puede mejorar el efecto general de inactivación hasta casi 1.000 veces. Cuando dos ARNsg se unen a secuencias no superpuestas del mismo gen, la represión aumenta. Cuando dos ARNsg se dirigen a regiones superpuestas, la represión se suprime. Las barras de error representan el EEM de tres replicados biológicos.
La Figura 50 está relacionada con la Figura 43E y muestra los efectos de silenciamiento de ARNsg con mal apareamientos dobles adyacentes. La actividad de represión relativa de ARNsg mal apareados simples se muestra con la posición de mal apareamiento marcada en la parte inferior. También se muestra la actividad medida experimentalmente de ARNsg mal apareados dobles. La actividad calculada mediante la multiplicación de los efectos de dos ARNsg mal apareados simples se muestra en blanco y marcada con "Com". Los resultados de fluorescencia representan el promedio y EEM de tres replicados biológicos.
La Figura 51 está relacionada con la Figura 43F y muestra los efectos combinatorios de silenciamiento al usar dos ARNsg para regular un único gen. En todos los casos, los ARNsg no superpuestos mostraron efectos de silenciamiento aumentativos, y los ARNsg superpuestos mostraron efectos supresores. El efecto combinatorio era independiente de si el ARNsg. tenia como objetivo la cadena de ADN plantilla o no plantilla. Los resultados de fluorescencia representan el promedio y EEM de tres replicados biológicos.
Cuestionamiento de una red reguladora endógena usando inactivación génica de CRISPRi El sistema CRISPRi se usó a continuación como una plataforma de inactivación de genes para cuestionar redes genéticas endógenas. Los métodos anteriores para cuestionar redes genéticas microbianas dependían en su mayoría de procedimientos de ingeniería genómica e inactivación que eran laboriosos y costosos. En contraste, la inactivación genética con CRISPRi requiere solamente el diseño y síntesis de un ARNsg pequeño que tiene una región complementaria de 20 bp respecto a los genes deseados. Para demostrar esto, se usó CRISPRi para crear cepas de inactivación de E. coli mediante el diseño de ARNsg para perturbar sistemáticamente los genes que eran parte de la vía reguladora de lactosa de E. coli bien caracterizada (Figura 44A). Se llevaron a cabo ensayos de b-galactosidasa para medir la expresión de LacZ a partir de las cepas inactivadas, con y sin isopropil b-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG), un químico que inhibe el represor lac (LacI). En las células de tipo salvaje, la adición de IPTG indujo la expresión de LacZ. Los resultados mostraron que un ARNsg especifico de lacZ podría reprimir de manera potente la expresión de LacZ (Figura 44B). Por el contrario, un ARNsg que se dirige al gen lacl llevó a la activación de expresión de LacZ, incluso en la ausencia de IPTG, como se esperaría para el silenciamiento de un represor directo de la expresión de LacZ.
Se sabe que cA P-CRP es un activador esencial de la expresión de LacZ mediante la unión a un sitio regulador cis anterior al promotor (sitio A). De manera consistente, el ARNsg que se dirigía al gen crp o al sitio A en el promotor LacZ llevó a la represión, lo cual demuestra un medio para unir un regulador a su secuencia reguladora en cis usando experimentos CRISPRi. El direccionamiento al gen de adenilato cilasa (cya), que es necesario para producir el cAMP que hace CRP más eficaz en el promotor de LacZ, solo llevó a una represión parcial. La adición de cAMP 1 mM al medio de cultivo complementó los efectos para la inactivación de cya pero no para la inactivación crp, lo que sugiere que cya es un regulador indirecto de LacZ. Además, dirigirse al sitio regulador cis de LacI (sitio 0) con un ARNsg llevó a la inhibición, presumiblemente debido a la unión del complejo de Cas9 en este sitio bloque estéricamente la ARN polimerasa, imitando el comportamiento del represor de transcripción de LacI. Dirigirse al sitio de unión de RNAP conocido (sitio P) también bloqueó la expresión. En resumen, estos estudios demuestran que el método de inactivación genética basado en CRISPRi proporciona un abordaje rápido y eficaz para el cuestionamiento de funciones reguladoras (activación y represión) de genes y elementos cis en una red reguladora compleja (Figura 44C).
La Figura 44 muestra el perfil funcional de una red reguladora de complejo usando la inactivación genética CRISPRi. (A) Se diseñaron ARNsg y se usaron para inactivar genes (cya, crp, lacl, lacZ, lacY, lacA) en la via reguladora de lac o para bloquear sitios transcripcionales (A/P/O). LacI es un represor del operón de lacZYA mediante la unión de un sitio operador de la transcripción (sitio 0). El gen lacZ codifica una enzima que cataliza lactosa en glucosa. Unos pocos genes hospedadores reguladores en trans tal como cya y crp están implicados en la activación del sistema de lacZYA. El complejo cAMP-CRP se une a un sitio operador de la transcripción (sitio A) y recluta la ARN polimerasa que se une al sitio P, lo cual inicia la transcripción de lacZYA. IPTG, un químico que inhibe la función de LacI, induce la expresión de LacZ. (B) Ensayo de b-galactosidasa de las cepas de inactivación sin (blanco) y con (gris) IPTG. El control muestra que las células de tipo salvaje sin perturbación de CRISPRi podrían ser inducidas por la adición de IPTG. El ARNsg que se dirige a LacZ reprimió de manera potente la expresión de LacZ, incluso en la presencia de IPTG. Cuando LacI era el objetivo, la expresión de LacZ era alta, incluso sin IPTG. El direccionamiento a los genes cya y crp llevó a una disminución del nivel de expresión de LacZ en presencia de IPTG. La presencia de cAMP 1 M recuperó la inactivación de cya pero no la inactivación .de crp. El bloqueo de los sitios operadores de la transcripción dio como resultado la represión de LacZ, lo cual sugiere que estos son sitios reguladores en cis importantes para LacZ. Luego de la perturbación, se indica la disminución (flechas hacia abajo) y el aumento (flechas hacia arriba) de la expresión de LacZ. Las barras de error representan el EEM de tres replicados biológicos. (C) Los experimentos de inactivación permitieron perfilar los roles de los reguladores en el circuito regulador de lac. Los datos se muestran en una gráfica en 2 dimensiones, donde el eje x muestra la actividad de LacZ sin IPTG y el eje y muestra su actividad con IPTG. La extensión de ovales a lo largo de cada eje muestra las desviaciones estándar. Los resultados del ensayo de b-galactosidasa representan el promedio y EEM de tres replicados biológicos. Para los datos de secuenciación de ARN en el direccionamiento de LacI y LacZ, véase también la Figura 49.
CRISPRi puede inactivar la expresión génica objetivo en células humanas Para evaluar la generalidad del abordaje de CRISPRi para usar el complejo de dCas9-ARNsg para reprimir la transcripción, el sistema se evaluó en células de mamífero HEK293. La proteina dCas9 se optimizó por codón, se fusionó a tres copias de una secuencia de localización nuclear (NLS) y se expresó a partir de un vector retroviral de virus de célula madre murina (MSCV, por sus siglas en inglés). El mismo diseño del ARNsg que se muestra en la Figura 40B se usó para expresar a partir del promotor U6 de ARN polimerasa III. Una linea celular HEK293 informante que expresa EGFP bajo el promotor SV40 se creó mediante infección viral. Usando un ARNsg (eNT2) que se dirigía a la cadena de ADN no plantilla de la región codificante de EGFP se observó una inactivación de la expresión génica moderada pero reproducible (46 % de represión, Figura 45A). La represión dependía tanto de la proteína dCas9 como del ARNsg, lo cual implica que la represión se debía al complejo de dCas9-ARNsg y al direccionamiento guiado por ARN. El mismo ARNsg presentó una mejor represión en el mismo gen cuando se expresó transitoriamente a partir de un plásmido (63 % de represión, Figura 52). De manera consistente con el sistema bacteriano, solamente los ARNsg dirigidos a la cadena no plantilla presentaron represión. Los factores, tales como la distancia desde el inicio de la transcripción y el estado de cromatina local pueden ser parámetros cruciales para determinar la eficacia de represión (Figura 52). La optimización de la expresión, estabilidad, localización nuclear y la interacción de Cas9 y ARNsg permitirá la mejora adicional de la eficacia de CRISPRi en células de mamífero.
La Figura 45 demuestra que CRISPRi puede reprimir la expresión génica en células humanas. (A) Un sistema de CRISPRi en células HEK293. El casete de expresión SV40-EGFP se insertó en el genoma por medio de infección retroviral. La proteína dCas9 se optimizó por codón y se fusionó con tres copias de la secuencia NLS. El ARNsg se expresó a partir de un vector U6 de ARN polimerasa III. La cotransfección de dCas9 y un ARNsg (eNT2) que se dirige a la cadena no plantilla de EGFP disminuyó la fluorescencia (~46 %) mientras que la expresión de, ya sea dCas9 o ARNsg solo no mostró efecto. (B) La represión mediada por dCas9:ARNsg fue dependiente de los locus objetivo. Se diseñaron siete ARNsg para dirigirse a diferentes regiones de la secuencia codificante de EGFP en la cadena plantilla y no plantilla. Solamente eNT2 y eNT5 mostraron una represión moderada. Los resultados de fluorescencia de 7A y 7B representan un promedio y error de dos replicados biológicos.
La Figura 52 está relacionada con la Figura 45 y muestra que * la represión de ARNsg depende de los locus objetivo y la distancia relativa desde el inicio de la transcripción. Se usó el mismo ARNsg para reprimir el mismo gen EGFP con diferentes promotores. Los complejos de Cas9/ARNsg reprimieron la transcripción a partir de ADN de plásmido transfectado transitoriamente. El nivel de represión transcripcional fue ligeramente mejor (63 %) que el observado para genes genómicos, y el porcentaje de células GFP negativas aumentó en presencia de ARNsg. El locus objetivo tiene diferente distancia desde el inicio de la transcripción. Mientras que SV40-EGFP mostró represión, LTR-EGFP no tuvo efecto. Los resultados de fluorescencia representan el promedio y error de dos replicados biológicos.
CRISPRi reprimió eficaz y selectivamente la transcripción de los genes objetivo El sistema CRISPRi es una plataforma relativamente simple para la regulación genética objetivo. CRISPRi no se basa en la presencia de factores hospedadores complejos, sino que requiere únicamente de la proteina dCas9 y ARN guias y, por lo tanto, es flexible y altamente diseñable. El sistema puede silenciar eficazmente genes en bacterias. El silenciamiento es muy eficaz, ya que no se detectaron efectos fuera del objetivo. Además, la eficacia de la inactivación puede ajustarse mediante el cambio de los locus objetivo y del grado de formación de pares de bases entre el ARNsg y el gen objetivo. Esto hará posible la creación de series alélicas de hipomorfos -- una característica que es especialmente útil para el estudio de genes esenciales. El sistema funciona mediante el bloqueo directo de la transcripción, de una manera que puede programarse fácilmente mediante el diseño de ARNsg. Mecánicamente esto difiere del silenciamiento basado en ribointereferencia, la cual requiere de la destrucción de los ARNm ya transcriptos.
Además, estos complejos de dCas9:ARNsg también pueden modular la transcripción mediante el direccionamiento de motivos reguladores en cis clave dentro de cualquier promotor, lo cual bloquea estéricamente la asociación de sus factores de transcripción reguladores en trans cognados. Por lo tanto, además de su uso como una herramienta de inactivación genética, CRISPRi podría ser usado por su mapeo funcional de promotores y otros módulos reguladores genómicos.
CRISPRI se adapta al análisis y regulación en escala genómica El método de CRISPRi se basa en el uso de ARN dirigidos a ADN, y solamente el segmento dirigido a ADN necesita ser diseñado para objetivos genéticos específicos. Con los avances en la teenología de síntesis de oligonucleótidos de ADN a gran escala, generar conjuntos grandes de oligonucleótidos que contienen regiones de 20 bp únicas para el direccionamiento genómico es rápido y económico. Estas bibliotecas de oligonucleótidos podrían permitir el direccionamiento de grandes cantidades de genes individuales para inferir la función genética para dirigir pares de genes para apear interacciones genéticas. Además, CRISPRi podría usarse para modular simultáneamente la expresión de grandes conjuntos de genes, mientras que el ARNsg de pequeño tamaño permite concatenar múltiples elementos en el mismo vector de expresión.
CRISPRi proporciona nuevas herramientas para manipular genomas microbianos Dado que la plataforma de CRISPRi es compacta y autocontenida, puede adaptarse para diferentes organismos.
CRISPRi es una herramienta poderosa para estudiar organismos no modelo para los cuales los métodos de ingeniería genética no están bien desarrollados, inclusive patógenos u organismos útiles industrialmente. A diferencia de las eucariotas, la mayoría de las bacterias carecen de mecanismo de ribointerefencía. Como consecuencia, la regulación de genes endógenos usando ARN diseñados de manera sintética está actualmente limitada. CISRPRi podría proporcionar un método similar a la ribointereferencia para la perturbación genética en microbios.
CRISPRi como plataforma para modificar genéticamente redes reguladoras transcripcionales CRISPRi puede utilizarse como un marco flexible para modificar genéticamente redes reguladoras transcripcionales. La plataforma de CRISPRi, debido a que es esencialmente un complejo de unión al ADN guiado por ARN, también proporciona una estructura flexible para dirigir diversos mecanismos reguladores a sitios específicos en el genoma. Más allá de simplemente bloquear la transcripción de genes objetivo, es posible acoplar la proteína Cas9 a numerosos dominios reguladores para modular diferentes procesos biológicos y generar diferentes resultados funcionales (por ejemplo, activación transcripcional, modificaciones de la cromatina).
En el sistema de CRISPRi, es posible unir múltiples ARNsg en circuitos transcripcionales en los cuales un ARNsg en una posición anterior controla la expresión de un ARNsg diferente en una posición posterior. Mientras las moléculas de ARN en microorganismos tienden a tener vidas cortas, se sospecha que los programas genéticos regulados mediante ARNsg pueden presentar cinéticas rápidas diferentes de los circuitos que implican procesos lentos, tal como la expresión y degradación de proteínas. En resumen, el sistema CRISPRi es una plataforma de programación genética general adecuada para una variedad de aplicaciones clínicas e investigación biomédica, incluyendo perfilado funcional de escala genómica, modificación genética metabólica microbiana y reprogramación celular.
Ejemplo 5: Un polipéptido quimérico dirigido al sitio puede usarse para modular (activar o reprimir) la transcripción en células humanas.
Se demostró que en células humanas, una proteína de fusión que comprende una Cas9 catalíticamente inactiva y un dominio activador o un dominio represor puede aumentar o disminuir la transcripción a partir de un ADN objetivo, respectivamente.
Figura 55. Se fusionaron Cas9 catalíticamente inactivas humanizadas con un dominio activador de la transcripción VP64. (A) Para evaluar la eficacia para la activación genética usando este sistema, se insertó un promotor inducible GAL4 UAS que controla un GFP en el genoma de HEK293 (células de cultivo de tejido humano). (B) El promotor GAL4 UAS puede ser inducido en presencia de una proteína derivada de levadura GAL4. La fusión de dCas9-VP64 puede activar eficazmente GAL4 UAS 20 veces mayor en presencia de un ARN guía cognado que se une a la región de GAL4 UAS. (C) Imágenes microscópicas para la activación de dCas9-VP64. (D) Citometria de flujo para la activación de dCas9-VP64.
Figura 56 Se fusionaron Cas9 catalíticamente inactivas humanizadas con un dominio represor de la transcripción KRAB. (Parte superior) Se diseñaron 10 ARN guía que se dirigen a un promotor bien caracterizado, el promotor temprano SV40, y un ARN guía que se dirige a la región codificante de EGFP. (Parte inferior) Usando una dCas9 no quimérica, se observó una represión 2~3 mayor para los ARNg de P9 y NT2. Esta eficacia mejoró ampliamente usando la fusión de dCas9-KRAB. Por ejemplo, con la fusión de dCas9-KRAB, P9 y NT2 mostraron una represión 20 veces y 15 veces mayor, respectivamente. Además P1-P6 mostró una reducción significativa de la expresión cuando se usó la proteína de fusión, pero una represión limitada cuando se usó una proteína dCas9 no quimérica.
Ejemplo 6: Cas9 puede usarse con ARN guía artificiales, que no existen en la naturaleza, para llevar a cabo la escisión del ADN objetivo.
Se diseñaron un crRNA artificial y un tracrRNA artificial, basados en el segmento de unión a proteínas del transcripto de origen natural de crRNA y tracrRNA de S. pyogenes, modificados para imitar la protuberancia asimétrica dentro del dúplex de crRNA:tracrRNA de S. pyogenes (véase la protuberancia en el dominio de unión a proteínas de moléculas de ARN tanto artificiales (parte superior) como naturales (parte inferior) que se muestran en la Figura 57A). La secuencia de tracrRNA artificial comparte menos del 50 % de identidad con el tracrRNA natural. La estructura secundaria predicha del dúplex de unión a proteínas de crRNA:tracrRNA es la misma para ambos pares de ARN, pero la estructura predicha para el resto de los ARN es muy diferente.
La Figura 57 demuestra que las secuencias artificiales que comparte muy poca identidad de secuencia (aproximadamente el 50 %) con tracrRNA y crRNA de origen natural pueden funcionar con Cas9 para escindir ADN objetivo siempre que la estructura del dominio de unión a proteínas del ARN dirigido a ADN se conserve. (A) Coplegado de tracrRNA y crRNA de S. pyogenes y tracrRNA y crRNA artificiales. (B) Se usaron combinaciones de Cas9 de S. pyogenes y ortólogos de tracrRNA:crRNA para llevar a cabo ensayos de escisión de ADN de plásmido. Spy - S. pyogenes, Lin - L. innocua, Nme - N. meningitidis, Pmu - P. multocida. La Cas 9 de S. pyogenes puede ser guiada por alguno, pero no todos los ortólogos de tracrRNA:crRNA de origen natural en especies bacterianas seleccionadas. Cabe destacar que la Cas9 de S. pyogenes puede ser guiada por el par de tracrRNA:crRNA artificial, que fue diseñado basándose en la estructura del segmento de unión a proteínas de origen natural de ARN dirigido a ADN usando una secuencia no relacionada en absoluto con sistema CRISPRi.
El "tracrRNA" artificial (ARN activador) usado fue 5'-GUUUUCCCUUUUCAAAGAAAUCUCCUGGGCACCUAUCUUCUUAGGUGCCCUCCCUUGUUUA AACCUGACCAGUUAACCGGCUGGUUAGGUUUUU-3' (SEQ ID NO:1347). El "crRNA" artificial (ARN identificador) usado fue: 5'-GAGAUUUAUGAAAAGGGAAAAC-3 ' (SEQ ID NO:1348).
Ejemplo 7: Generación de organismos transgénicos no humanos Se generó un ratón transgénico que expresaba Cas9 (ya sea sin modificar, modificada para tener actividad enzimática reducida, modificada como una proteina de fusión para cualquiera de los fines descritos anteriormente) usando un método conveniente conocido por un experto en la téenica (por ejemplo, (i) inactivación genética en un locus objetivo (por ejemplo, ROSA 26) de una célula madre embrionaria de ratón (célula ES) seguida de inyección de blastocistos y la generación de ratones quiméricos; (ii) inyección de un transgén integrador aleatorio en el pronúcleo de un ovocito de ratón fertilizado, seguida por la implantación del óvulo en una hembra pseudopreñada; etc.)· La proteina Cas9 está bajo el control de un promotor que se expresa al menos en células madre embrionarias, y puede estar adicionalmente bajo el control temporal o especifico de tejidos (por ejemplo, inducible por fármacos, controlado por sistema promotor basado en Cre/Lox, etc.). Una vez que una linea de ratón que expresa Cas9 transgénica es generada, se aíslan células madre embrionarias y se cultivan, y en algunos casos se congelan células ES para uso futuro. Debido a que las células ES aisladas expresan Cas9 (y en algunos casos la expresión está bajo el control temporal (por ejemplo, inducible por fármacos), se generan rápidamente nuevas células inactivadas o activadas (y por lo tanto ratones) en cualquier locus deseado en el genoma mediante la introducción de un ARN dirigido a ADN diseñado que dirige la Cas9 a un locus particular de elección. Dicho sistema, y muchas variaciones de este, se usan para generar nuevos organismos modificados genéticamente en cualquier.locus de elección. Cuando se usa Cas9 modificada para modular la transcripción y/o modificar ADN y/o modificar polipéptidos asociados con ADN, las células ES en si (o cualesquiera células diferenciadas derivadas de las células ES (por ejemplo, un ratón entero, una linea celular diferenciada, etc.) se usaron para estudiar las propiedades de cualquier gen de elección (o cualquier producto de expresión de elección, o cualquier locus genómico de elección) simplemente mediante la introducción de,un ARN dirigido a ADN adecuado en una célula que expresa Cas9 deseada.
Si bien la presente invención fue descrita con referencia a las modalidades especificas de esta, los expertos en la téenica deberán entender que pueden realizarse varios cambios y que pueden sustituirse los equivalentes sin apartarse del verdadero espíritu y alcance de la invención. Además, se pueden realizar varias modificaciones para adaptar una situación, material, composición de materia, proceso, paso o pasos del proceso particular al objetivo, espíritu y alcance de la presente invención. Se pretende que dichas modificaciones se encuentren dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Claims (155)

REIVINDICACIONES
1. Un ARN dirigido a ADN que comprende: (i) un primer segmento que comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia en un ADN objetivo; y (ii) un segundo segmento que interactúa con un polipéptido modificador dirigido al sitio.
2. El ARN dirigido a ADN de la reivindicación 1, donde el primer segmento comprende 8 nucleótidos que tienen 100 % de complementariedad con una secuencia en el ADN objetivo.
3. El ARN dirigido a ADN de la reivindicación 1, donde el segundo segmento comprende una secuencia de nucleótidos con al menos 60 % de identidad a lo largo de al menos 8 nucleótidos contiguos a cualquiera de las secuencias de nucleótidos establecidas en las SEQ ID NO: 563-682 o un complemento de estas.
4. El ARN dirigido a ADN de la reivindicación 1, donde el segundo segmento comprende una secuencia de nucleótidos con al menos 60 % de identidad a lo largo de al menos 8 nucleótidos contiguos a cualquiera de las secuencias de nucleótidos establecidas en las SEQ ID NO: 431-562 o un complemento de estas.
5. El ARN dirigido a ADN de la reivindicación 1, donde el polipéptido modificador dirigido al sitio comprende una secuencia de aminoácidos con al menos alrededor de 75 % de identidad de secuencia de aminoácidos con los aminoácidos 7-166 o 731-1003 de la secuencia de aminoácidos Cas9/Csnl ilustrada en la Figura 3 o a las partes correspondientes en cualquiera de las secuencias de aminoácidos establecidas como SEQ ID NO: 1-256 y 795-1346.
6. Un polinucleótido de ADN que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el ARN dirigido a ADN de la reivindicación 1.
7. Un vector de expresión recombinante que comprende el polinucleótido de ADN de la Reivindicación 6.
8. El vector de expresión recombinante de la reivindicación 7, donde la secuencia de nucleótidos que codifica el ARN dirigido a ADN está unido de forma operativa a un promotor.
9. El vector de expresión recombinante de la reivindicación 8, donde el promotor es un promotor inducible.
10. El vector de expresión recombinante de la reivindicación 7, donde la secuencia de nucleótidos que codifica el ARN dirigido a ADN de la Reivindicación 1 comprende además un sitio de clonación múltiple.
11. Una célula hospedadora modificada genéticamente in vitro que comprende el polinucleótido de ADN de la reivindicación 6.
12. Un vector de expresión recombinante que comprende: (i) una secuencia de nucleótidos que codifica un ARN dirigido a ADN, donde el ARN dirigido a ADN comprende: (a) un primer segmento .que comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia en un ADN objetivo; y (b) un segundo segmento que interactúa con un polipeptido modificador dirigido al sitio; y (ii) una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido modificador dirigido al -sitio que comprende: (a) una parte de unión a ARN que interactúa con el ARN dirigido a ADN; y (b) una parte de actividad que presenta una actividad enzimática dirigida al sitio, donde el sitio de actividad enzimática está determinado por el ARN dirigido a ADN.
13. Un vector de expresión recombinante que comprende: (i) una secuencia de nucleótidos que codifica un ARN dirigido a ADN, donde el ARN dirigido a ADN comprende: (a) un primer segmento que comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia en un ADN objetivo; y (b) un segundo segmento que interactúa con un polipéptido modificador dirigido al sitio; y (ii) una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido modificador dirigido al sitio, donde el polipéptido modificador dirigido al sitio comprende: (a) una parte de unión a ARN que interactúa con el ARN dirigido a ADN; y (b) una parte de actividad que modula la transcripción dentro del ADN objetivo, donde el sitio de transcripción modulada dentro del ADN objetivo está determinado por el ARN dirigido a ADN.
14. Una variante del polipéptido modificador dirigido al sitio que comprende: (i) una parte de unión al ARN que interactúa con un ARN dirigido a ADN, donde el ARN dirigido a ADN comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia en un ADN objetivo; y (ii) una parte de actividad que presenta una actividad enzimática dirigida al sitio reducida, donde el sitio de actividad enzimática está determinado por el ARN dirigido a ADN.
15. La variante del polipéptido modificador dirigido al sitio de la reivindicación 14, que comprende una mutación H840A de la secuencia S. pyogenes SEQ ID NO: 8 o la mutación correspondiente en cualquiera de las secuencias de aminoácidos establecidas como las SEQ ID NO: 1-256 y 795- 1346.
16. La variante del polipéptido modificador dirigido al sitio de la reivindicación 14, que comprende una mutación D10A de la secuencia S. pyogenes SEQ ID NO: 8 o la mutación correspondiente en cualquiera de las secuencias de aminoácidos establecidas como las SEQ ID NO: 1-256 y 795- 1346.
17. La variante del polipéptido modificador dirigido al sitio de la reivindicación 14, que comprende (i) una mutación D10A de la secuencia S. pyogenes SEQ ID NO: 8 o la mutación correspondiente en cualquiera de las secuencias de aminoácidos establecidas como SEQ ID NO: 1-256 y 795-1346; y (ii) una mutación H840A de la secuencia S. pyogenes SEQ ID NO: 8 o la mutación correspondiente en cualquiera de las secuencias de aminoácidos establecidas como SEQ ID NO:· 1-256 y 795-1346.
18. Un polipéptido modificador quimérico dirigido al sitio que comprende: (i) una parte de unión al ARN que interactúa con un ARN dirigido a ADN, donde el ARN dirigido a ADN comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia en un ADN objetivo; y (ii) una parte de actividad que presenta una actividad enzimática dirigida al sitio, donde el sitio de actividad enzimática está determinado por el ARN dirigido a ADN.
19. El polipéptido modificador quimérico dirigido al sitio de la reivindicación 18 que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos alrededor de 75 % de identidad de secuencia de aminoácidos con los aminoácidos 7-166 o 731-1003 de la secuencia de aminoácidos Cas9/Csnl ilustrada en la Figura 3 o con las partes correspondientes en cualquiera de las secuencias de aminoácidos establecidas como SEQ ID NO: 1-256 y 795-1346.
20. El polipéptido modificador quimérico dirigido al sitio de la reivindicación 18, donde el ARN dirigido a ADN comprende además una secuencia de nucleótidos con al menos 60 % de identidad a lo largo de al menos 8 nucleótidos contiguos a cualquiera de las secuencias de nucleótidos establecidas en las SEQ ID NO: 563-682.
21. El polipéptido modificador quimérico dirigido al sitio de la reivindicación 18, donde el ARN dirigido a ADN comprende además una secuencia de nucleótidos con al menos 60 % de identidad a lo largo de al menos 8 nucleótidos contiguos a cualquiera de las secuencias de nucleótidos establecidas en las SEQ ID NO: 431-562.
22. El polipéptido modificador quimérico dirigido al sitio de la reivindicación 18, donde la actividad enzimática modifica el ADN objetivo.
23. El polipéptido modificador quimérico dirigido al sitio de la reivindicación 22, donde la actividad enzimática es actividad de nucleasa, actividad de metiltransferasa, actividad de desmetilasa, actividad de reparación del ADN, actividad de daño al ADN, actividad de desaminación, actividad de dismutasa, actividad de alquilación, actividad de depurinación, actividad de oxidación, actividad de formación de dimeros de pirimidina, actividad de integrasa, actividad de transposasa, actividad de recombinasa, actividad de polimerasa, actividad de ligasa, actividad de helicasa, actividad de fotoliasa o actividad de glicosilasa.
24. El polipéptido modificador quimérico dirigido al sitio de la reivindicación 23, donde la actividad enzimática es actividad de nucleasa.
25. El polipéptido modificador quimérico dirigido al sitio de la reivindicación 24, donde la actividad de nucleasa introduce una rotura de cadena doble en el ADN objetivo.
26. El polipéptido modificador quimérico dirigido al sitio de la reivindicación 18, donde la actividad enzimática modifica un polipéptido objetivo asociado con el ADN objetivo.
27. El polipéptido modificador quimérico dirigido al sitio de la reivindicación 26, donde la actividad enzimática es actividad de metiltransferasa, actividad de desmetilasa, actividad de acetiltransferasa, actividad de deacetilasa, actividad de cinasa, actividad de fosfatasa, actividad de ubiquitina ligasa, actividad desubiquitinante, actividad de adenilación, actividad de desadenilación, actividad de SUMOilación, actividad de deSUMOilación, actividad de ribosilación, actividad de desribosilación, actividad de miristoilación o actividad de demiristoilación.
28. El polipéptido.modificador quimérico dirigido al sitio de la reivindicación 26, donde el polipéptido objetivo es una histona y la actividad enzimática es actividad de metiltransferasa, actividad de desmetilasa, actividad de acetiltransferasa, actividad de deacetilasa, actividad de cinasa, actividad de fosfatasa, actividad de ubiquitina ligasa o actividad desubiquitinante.
29. Un polinucleótido de ARN que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido modificador quimérico dirigido al sitio de la reivindicación 18.
30. Un polinucleótido de ADN que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido modificador quimérico dirigido al sitio de la reivindicación 18.
31. Un vector de expresión recombinante que comprende el polinucleótido de la Reivindicación 30.
32. El vector de expresión recombinante de la reivindicación 31, donde el polinucleótido está unido de forma operativa a un promotor.
33. El vector de expresión recombinante de la reivindicación 32, donde el promotor es un promotor inducible.
34. Una célula hospedadora modificada genéticamente in vitro que comprende el polinucleótido de la reivindicación 30.
35. Un polipéptido modificador quimérico dirigido al sitio que comprende: (i) una parte de unión al ARN que interactúa con un ARN dirigido a ADN, donde el ARN dirigido a ADN comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia en un ADN objetivo; y (ii) una parte de actividad que modula la transcripción dentro del ADN objetivo, donde el sitio de transcripción modulada dentro del ADN objetivo está determinado por el ARN dirigido a ADN.
36. El polipéptido modificador quimérico dirigido al sitio de la reivindicación 35, donde la parte de actividad aumenta la transcripción dentro del ADN objetivo.
37. El polipéptido modificador quimérico dirigido al sitio de la reivindicación 35, donde la parte de actividad disminuye la transcripción dentro del ADN objetivo.
38. Una célula modificada genéticamente que comprende un polipéptido modificador recombinante dirigido al sitio que comprende una parte de unión a ARN que interactúa con un ARN dirigido a ADN; y una parte de actividad que presenta actividad enzimática dirigida al sitio, donde el sitio de actividad enzimática está determinado por el ARN dirigido a ADN.
39. La célula modificada genéticamente de la reivindicación 38, donde el polipéptido modificador dirigido al sitio comprende una secuencia de aminoácidos con al menos alrededor de 75 % de identidad de secuencia de aminoácidos con los aminoácidos 7-166 o 731-1003 de la secuencia de aminoácidos Cas9/Csnl ilustrada en la Figura 3 o a las partes correspondientes en cualquiera de las secuencias de aminoácidos establecidas como SEQ ID NO: 1-256 y 795-1346.
40. La célula modificada genéticamente de la reivindicación 38, donde la célula se selecciona del grupo que consiste en: una célula arqueal, una célula bacteriana, una célula eucariota, un organismo eucariota unicelular, una célula somática, una célula germinal, una célula madre, una célula vegetal, una célula de algas, una célula de animal, una célula de invertebrado, una célula de vertebrado, una célula de pez, una célula de rana, una célula de ave, una célula de mamífero, una célula de cerdo, una célula de vaca, una célula de cabra, una célula de oveja, una célula de roedor, una célula de rata, una célula de ratón, una célula de primate no humano y una célula de humano.
41. Un organismo transgénico no humano cuyo genoma comprende un transgén que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido modificador recombinante dirigido al sitio que comprende: (i) una parte de unión a ARN que interactúa con el ARN dirigido a ADN; y (ii) una parte de actividad que presenta una actividad enzimática dirigida al sitio, donde el sitio de actividad enzimática está determinado por el ARN dirigido a ADN.
42. El organismo transgénico de la reivindicación 41, donde el polipéptido modificador dirigido al sitio comprende una secuencia de aminoácidos con al menos alrededor de 75 % de identidad de secuencia de aminoácidos con los aminoácidos 7-166 o 731-1003 de la secuencia de aminoácidos Cas9/Csnl ilustrada en la Figura 3 o a las partes correspondientes en cualquiera de las secuencias de aminoácidos establecidas como SEQ ID NO: 1-256 y 795-1346.
43. El organismo transgénico de la reivindicación 41, donde el organismo se selecciona del grupo que consiste en: una arqueobacteria, una bacteria, .un organismo unicelular eucariota, un alga, una planta, un animal, un invertebrado, una mosca, un gusano, un enidario, un vertebrado, un pez, una rana, un ave, un mamífero, un ungulado, un roedor, una rata, un ratón y un primate no humano.
44. Una composición que comprende: (i) un ARN dirigido a ADN o un polinucleótido de ADN que lo codifica, donde el ARN dirigido a ADN comprende: (a) un primer segmento que comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia en un ADN objetivo; y (b) un segundo segmento que interactúa con un polipéptido modificador dirigido al sitio; y (ii) el polinucleótido modificador dirigido al sitio, o un polipéptido que lo codifica, donde el polipéptido modificador dirigido al sitio comprende: (a) una parte de unión a ARN que interactúa con el ARN dirigido a ADN; y (b) una parte de actividad que presenta una actividad enzimática dirigida al sitio, donde el sitio de actividad enzimática está determinado por el ARN dirigido a ADN.
45. La composición de la reivindicación 44, donde el primer segmento del ARN dirigido a ADN comprende 8 nucleótidos que tienen al menos 100 % de complementariedad con una secuencia en el ADN objetivo.
46. La composición de la reivindicación 44, donde el segundo segmento del ARN dirigido a ADN comprende una secuencia de nucleótidos con al menos 60 % de identidad a lo largo de al menos 8 nucleótidos contiguos a cualquiera de las secuencias de nucleótidos establecidas en las SEQ ID NO: 563-682.
47. La composición de la reivindicación 44, donde el segundo segmento del ARN dirigido a ADN comprende una secuencia de nucleótidos con al menos 60 % de identidad a lo largo de al menos 8 nucleótidos contiguos a cualquiera de las secuencias de nucleótidos establecidas en las SEQ ID NO: 431-562.
48. La composición de la reivindicación 44, donde el polipéptido modificador dirigido al sitio comprende una secuencia de aminoácidos con al menos alrededor de 75 % de identidad de secuencia de aminoácidos con los aminoácidos 7-166 o 731-1003 de la secuencia de aminoácidos Cas9/Csnl ilustrada en la Figura 3 o a las partes correspondientes en cualquiera de las secuencias de aminoácidos establecidas como SEQ ID NO: 1-256 y 795-1346.
49. La composición de la reivindicación 44, donde la actividad enzimática modifica el ADN objetivo.
50. La composición de la reivindicación 49, donde la actividad enzimática es actividad de nucleasa, actividad de metiltransferasa, actividad de desmetilasa, actividad de reparación del ADN, actividad de daño al ADN, actividad de desaminación, actividad de dismutasa, actividad de alquilación, actividad de depurinación, actividad de oxidación, actividad de formación de dimeros de pirimidina, actividad de integrasa, actividad de transposasa, actividad de recombinasa, actividad de polimerasa, actividad de ligasa, actividad de helicasa, actividad de fotoliasa o actividad de glicosilasa.
51. La composición de la reivindicación 50, donde la actividad enzimática es actividad de nucleasa.
52. La composición de la reivindicación 51, donde la actividad de nucleasa introduce una rotura de cadena doble en el ADN objetivo.
53. La composición de la reivindicación 44, donde la actividad enzimática modifica un polipéptido objetivo asociado con el ADN objetivo.
54. La composición de la reivindicación 53, donde la actividad enzimática ,es actividad de metiltransferasa, actividad de desmetilasa, actividad de acetiltransferasa, actividad de deacetilasa, actividad de cinasa, actividad de fosfatasa, actividad de ubiquitina ligasa, actividad desubiquitinante, actividad de adenilación, actividad de desadenilación, actividad de SUMOilación, actividad de deSUMOilación, actividad de ribosilación, actividad de desribosilación, actividad de miristoilación o actividad de demiristoilación.
55. La composición de la reivindicación 53, donde el polipéptido objetivo es una histona y la actividad enzimática es actividad de metiltransferasa, actividad de desmetilasa, actividad de acetiltransferasa, actividad de deacetilasa, j actividad de cinasa, actividad de fosfatasa, actividad de ubiquitina ligasa o actividad desubiquitinante.
56. La composición de la reivindicación 44, donde el ARN dirigido a ADN es un ARN dirigido a ADN de doble molécula y la composición comprende tanto un ARN identificador y un ARN activador, del cual los segmentos formadores de dúplex son complementarios y se hibridan para formar el segundo segmento de ARN dirigido a ADN.
57. La composición de la reivindicación 56, donde el segundo formador de dúplex del ARN activador comprende una secuencia de nucleótidos con al menos 60 % de identidad a lo largo de al menos 8 nucleótidos contiguos a cualquiera de las secuencias de nucleótidos establecidas en las SEQ ID NO: 431-682.
58. Una composición que comprende: (i) el ARN dirigido a ADN de la reivindicación 44, o un polinucleótido de ADN que lo codifica; y (ii) un amortiguador para estabilizar ácidos nucleicos.
59. Una composición que comprende: (i) el polipéptido modificador dirigido al sitio de la reivindicación 44, o un polinucleótido que lo codifica; y (ii) un amortiguador para estabilizar ácidos nucleicos y/o proteínas.
60. Una composición que comprende: (i) un ARN dirigido a ADN o un polinucleótido de ADN que codifica a este, donde el ARN dirigido a ADN comprende: (a) un primer segmento que comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia en un ADN objetivo; y (b) un segundo segmento que interactúa con un polipéptido modificador dirigido al sitio; y (ii) el polinucleótido modificador dirigido al sitio, o un polipéptido que lo codifica, donde el polipéptido modificador dirigido al sitio comprende: (a) una parte de unión a ARN que interactúa con el ARN dirigido a ADN; y (b) una parte de actividad que modula la transcripción dentro del ADN objetivo, donde el sitio de transcripción modulada dentro del ADN objetivo está determinado por el ARN dirigido a ADN.
61. La composición de la reivindicación 60, donde la parte de actividad aumenta la transcripción dentro del ADN objetivo.
62. La composición de la reivindicación 60, donde la parte de actividad disminuye la transcripción dentro del ADN objetivo.
63. Una composición que comprende: (i) el polipéptido modificador dirigido al sitio de la reivindicación 60, o un polinucleótido que lo codifica; y (ii) un amortiguador para estabilizar ácidos nucleicos y/o proteínas.
64. Un método de modificación específica del sitio de un ADN objetivo, el método que comprende: poner en contacto el ADN objetivo con: (i) un ARN dirigido a ADN o un polinucleótido de ADN que codifica a este, donde el ARN dirigido a ADN comprende: (a) un primer segmento que comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia en el ADN objetivo; y (b) un segundo segmento que interactúa con un polipéptido modificador dirigido al sitio; y (ii) un polinucleótido modificador dirigido al sitio, o un polipéptido que lo codifica, donde el polipéptido modificador dirigido al sitio comprende: (a) una parte de unión a ARN que interactúa con el ARN dirigido a ADN; y (b) una parte de actividad que presenta actividad enzimática dirigida al sitio.
65. El método de la reivindicación 64, donde el ADN objetivo es extracromosómico.
66. El método de la reivindicación 64, donde el ADN objetivo comprende una secuencia PAM de la cadena complementaria que es 5'-CCY-3', donde Y es cualquier nucleótido de ADN e Y está en una posición inmediata respecto del extremo 5' de la secuencia objetivo de la cadena complementaria del ADN objetivo.
67. El método de la reivindicación 64, donde el ADN objetivo es parte de un cromosoma in vitro.
68. El método de la reivindicación 64, donde el ADN objetivo es parte de un cromosoma in vivo.
69. E‘l método de la reivindicación 64, donde el ADN objetivo es parte de un cromosoma en una célula.
70. El método de la reivindicación 69, donde la célula se selecciona del grupo que consiste en: una célula arqueal, una célula bacteriana, una célula eucariota, un organismo eucariota unicelular, una célula somática, una célula germinal, una célula madre, una célula vegetal, una célula de algas, una célula de animal, una célula de invertebrado, una célula de vertebrado, una célula de pez, una célula de rana, una célula de ave, una célula de mamífero, una célula de cerdo, una célula de vaca, una célula de cabra, una célula de oveja, una célula de roedor, una célula dé rata, una célula de ratón, una célula de primate no humano y una célula de humano.
71. El método de la reivindicación 64, donde el ARN dirigido a ADN comprende una secuencia de nucleótidos con al menos 60 % de identidad a lo largo de al menos 8 nucleótidos contiguos a cualquiera de las secuencias de nucleótidos establecidas en las SEQ ID NO: 563-682.
72. El método de la reivindicación 64, donde el ARN dirigido a ADN comprende una secuencia de nucleótidos con al menos 60 % de identidad a lo largo de al menos 8 nucleótidos contiguos a cualquiera de las secuencias de nucleótidos establecidas en las SEQ ID NO: 431-562.
73. El método de la reivindicación 64, donde el polipéptido modificador del ADN comprende una secuencia de aminoácidos con al menos alrededor de 75 % de identidad de secuencia de aminoácidos con los aminoácidos 7-166 o 731-1003 de la secuencia de aminoácidos Cas9/Csnl ilustrada en la Figura 3 o a las partes correspondientes en cualquiera de las secuencias de aminoácidos establecidas como SEQ ID NO: 1-256 y 795-1346.
74. El método de la reivindicación 64, donde la actividad enzimática modifica el ADN objetivo.
73. El método de la reivindicación 74, donde la actividad enzimática es actividad de nucleasa, actividad de metiltransferasa, actividad de desmetilasa, actividad de reparación del ADN, actividad de daño al ADN, actividad de desaminación, actividad de dismutasa, actividad de alquílación actividad de depurinación, actividad de oxidación, actividad de formación de dimeros de pirimidina, actividad de integrasa, actividad de transposasa, actividad de recombinasa, actividad de polimerasa, actividad de ligasa, actividad de helicasa, actividad de fotoliasa o actividad de glicosilasa.
76. El método de la reivindicación 75, donde la actividad enzimática modificadora del ADN es actividad de nucleasa.
77. El método de la reivindicación 76, donde la actividad de nucleasa introduce una rotura de cadena doble en el ADN objetivo.
78. El método de la reivindicación 77, donde el contacto ocurre en condiciones que permiten reparación dirigida por homología o recombinación no homologa.
79. El método de la reivindicación 78, donde el método comprende además poner en contacto el ADN objetivo con un polinucleótido donante, donde el polinucleótido donante, una parte del polinucleótido donante, una copia del polinucleótido donante o una parte de una copia del polinucleótido donante se integra al ADN objetivo.
80. El método de la reivindicación 78, donde el método no comprende poner en contacto la célula con el polinucleótido donante, donde el ADN objetivo se modifica de forma tal que los nucleótidos dentro del ADN objetivo son eliminados.
81. El método de la reivindicación 64, donde la actividad enzimática modifica un polipéptido objetivo asociado con el ADN objetivo.
82. El método de la reivindicación 81, donde la actividad enzimática es actividad de metiltransferasa, actividad de desmetilasa, actividad de acetiltransferasa, actividad de deacetilasa, actividad de cinasa, actividad de fosfatasa, actividad de ubiquitina ligasa, actividad desubiquitinante, actividad de adenilación, actividad de desadenilación, actividad de . SUMOilación, actividad de deSUMOilación, actividad de ribosilación, actividad de desribosilación, actividad de miristoilación o actividad de demiristoilación.
83. El método de la reivindicación 81, donde el polipéptido objetivo es una histona y la actividad enzimática es actividad de metiltransferasa, actividad de desmetilasa, actividad de acétiltransferasa, actividad de deacetilasa, actividad de cinasa, actividad de fosfatasa, actividad de ubiquitina ligasa o actividad desubiquitinante.
84. El método de la reivindicación 64, donde el complejo comprende además un ARN activador.
85. El método de la reivindicación 84, donde el ARN activador comprende una secuencia de nucleótidos con al menos 60 % de identidad a lo largo de al menos 8 nucleótidos contiguos a cualquiera de las secuencias de nucleótidos establecidas en las SEQ ID NO: 431-682.
86. Un método de modulación de la transcripción especifica al sitio de un ADN objetivo, donde el método comprende poner en contacto el ADN objetivo con: (i) un ARN dirigido a ADN o un polinucleótido de ADN que codifica a este, donde el ARN dirigido a ADN comprende: (a) un primer segmento que comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia en el ADN objetivo; y (b) un segundo segmento que interactúa con un polipéptido modificador dirigido al.sitio; y (ii) un polinucleótido modificador dirigido al sitio, o un polipéptido que lo codifica, donde el polipéptido modificador dirigido al sitio comprende: (a) una parte de unión a ARN que interactúa con el ARN dirigido a ADN; y (b) una parte de actividad que modula la transcripción, donde dicho contacto da como resultado la modulación de la transcripción dentro del ADN objetivo.
87. El método de la reivindicación 86, donde la transcripción dentro del ADN objetivo aumenta.
88. El método de la reivindicación 86, donde la transcripción dentro del ADN objetivo disminuye.
89. Un método de modificación especifica del sitio en un ADN objetivo, el método que comprende: poner en contacto el ADN-objetivo con: (i) un ARN dirigido a ADN o un polinucleótido de ADN que codifica a este, donde el ARN dirigido a ADN comprende: (a) un primer segmento que comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia en el ADN objetivo; y (b) un segundo segmento que interactúa con un polipéptido modificador dirigido al sitio; y (ii) un polinucleótido modificador dirigido al sitio, o un polipéptido que lo codifica, donde el polipéptido modificador dirigido al sitio comprende: (a) una parte de unión a ARN que interactúa con el ARN dirigido a ADN; y (b) una parte de actividad que modula la transcripción dentro del ADN objetivo.
90. El método de la reivindicación 86, donde la polipéptido modificador dirigido al sitio aumenta la transcripción dentro del ADN objetivo.
91. El método de la reivindicación 86, donde la polipéptido modificador dirigido al sitio disminuye la transcripción dentro del ADN objetivo.
92. Un método para promover la escisión especifica del sitio y la modificación de un ADN objetivo en una célula, donde el método comprende introducir en la célula: (i) un ARN dirigido a ADN o un polinucleótido de ADN que codifica a este, donde el ARN dirigido a ADN comprende: (a) un primer segmento que comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia en el ADN objetivo; y (b) un segundo segmento que interactúa con un polipéptido modificador dirigido al sitio; y (ii) un polinucleótido modificador dirigido al sitio, o un polipéptido que lo codifica, donde el polipéptido modificador dirigido al sitio comprende: (a) una parte de unión a ARN que interactúa con el ARN dirigido a ADN; y (b) una parte de actividad que presenta actividad de nucleasa que crea una rotura de enlace doble en el ADN objetivo; donde el sitio de la rotura de enlace doble es determinado por el ARN dirigido a ADN, donde el contacto ocurre bajo condiciones que permiten la unión de extremos no homólogos o la reparación dirigida por homología, y el ADN objetivo se escinde y vuelve a unir para producir una secuencia de ADN modificada.
93. El método de la reivindicación 92, donde el método comprende además poner en contacto el ADN objetivo con un polinucleótido donante, donde el polinucleótido donante, una parte del polinucleótido donante, una copia del polinucleótido donante o una parte de una copia del polinucleótido donante se integra al ADN objetivo.
94. El método de la reivindicación 92, donde el método no comprende poner en contacto la célula con el polinucleótido donante, donde el ADN objetivo se modifica de forma tal que los nucleótidos dentro del ADN objetivo son .eliminados.
95. El método de la reivindicación 92, donde la célula se selecciona del grupo que consiste en: una célula arqueal, una célula bacteriana, una célula eucariota, un organismo eucariota unicelular, una célula somática, una célula germinal, una célula madre, una célula vegetal, una célula de algas, una célula de animal, una célula de invertebrado, una célula de vertebrado, una célula de pez, una célula de rana, una célula de ave, una célula de mamífero, una célula de cerdo, una célula de vaca, una célula de cabra, una célula de oveja, una célula de roedor, una célula de rata, una célula de ratón, una célula de primate no humano y una célula de humano.
96. El método de la reivindicación 92, donde la célula está in vi tro.
97. El método de la reivindicación 92, donde la célula está in vivo.
98. Un método para producir una célula modificada genéticamente en un sujeto, donde el método comprende: (I) Introducir en una célula: (i) un ARN dirigido a ADN o un polinucleótido de ADN que codifica a este, donde el ARN dirigido a ADN comprende: (a) un primer segmento que comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia en el ADN objetivo; y (b) un segundo segmento que interactúa .con un polipéptido modificador dirigido al sitio; y (ii) un polinucleótido modificador dirigido al sitio,·o un polipéptido que lo codifica, donde el polipéptido modificador dirigido al sitio comprende: (a) una parte de unión a ARN que interactúa con el ARN dirigido a ADN; y (b) una parte de actividad que presenta actividad de nucleasa que crea una rotura de enlace doble en el ADN objetivo; donde el sitio de la rotura de enlace doble es determinado por el ARN dirigido a ADN, donde el contacto ocurre bajo condiciones que permiten la unión de extremos no homólogos o la reparación dirigida por homología, y el ADN objetivo se escinde y vuelve a unir para producir una secuencia de ADN modificada; lo cual produce de esta manera la célula modificada genéticamente; y (II) trasplantar la célula modificada genéticamente al sujeto.
99. El método de la reivindicación 98, donde el método comprende además poner en contacto la célula con un polinucleótido donante, donde el polinucleótido donante, una parte del polinucleótido donante, una copia del polinucleótido donante o una parte de una copia del polinucleótido donante se integra al ADN objetivo.
100. El método de la reivindicación 98, donde el método no comprende poner en contacto la célula con el polinucleótido donante, donde el ADN objetivo se modifica de forma tal que los nucleótidos dentro del ADN objetivo son eliminados.
101. El método de la reivindicación 98, donde la célula se selecciona del grupo que consiste en: una célula arqueal, una célula bacteriana, una célula eucariota, un organismo eucariota unicelular, una célula somática, una célula germinal, una célula madre, una célula vegetal, una célula de algas, una célula de animal, una célula de invertebrado, una célula de vertebrado, una célula de pez, una célula de anfibio, una célula de ave, una célula de mamífero, una célula de ungulado, una célula de roedor, una célula de primate no humano y una célula de humano.
102. Un método para modificar el ADN objetivo en una célula modificada genéticamente que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido modificador exógeno dirigido al sitio, donde el método comprende introducir en la célula modificada genéticamente un ARN dirigido a ADN o un polinucleótido de ADN que lo codifica, donde: (i) el ARN dirigido a ADN comprende: (a) un primer segmento que comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia en el ADN objetivo; y (b) un segundo segmento que interactúa con un polipéptido modificador dirigido al sitio; y (ii) un polipéptido modificador quimérico dirigido al sitio que comprende: (a) una parte de unión a ARN que interactúa con el ARN dirigido a ADN; y (b) una parte de actividad que presenta actividad de nucleasa.
103. El método de la reivindicación 102, donde el polipéptido modificador dirigido al sitio comprende una secuencia de aminoácidos con al menos alrededor de 75 % de identidad de secuencia de aminoácidos con los aminoácidos 7-166 o 731-1003 de la secuencia de aminoácidos Cas9/Csnl ilustrada en la Figura 3 o a las partes correspondientes en cualquiera de las secuencias de aminoácidos establecidas como SEQ ID NO: 1-256 y 795-1346.
104. El método de la reivindicación 102, donde la célula se selecciona del grupo que consiste en: una célula arqueal, una célula bacteriana, una célula eucariota, un organismo eucariota unicelular, una célula somática, una célula germinal, una célula madre, una célula vegetal, una célula de algas, una célula de animal, una célula de invertebrado, una célula de vertebrado, una célula de pez, una célula de anfibio, una célula de ave, una célula de mamífero, una célula de ungulado, una célula de roedor, una célula de primate no humano y una célula de humano.
105. El método de la reivindicación 102, donde la célula está in vivo.
106. El método de la reivindicación 102, donde la célula está in vi tro.
107. El método de la reivindicación 102, donde la expresión del polipéptido modificador dirigido al sitio está bajo el control de un promotor inducible.
108. El método de la reivindicación 102, donde la expresión del polipéptido modificador dirigido al sitio está bajo el control de un promotor específico del tipo celular.
109. Un kit que comprende: (i) el ARN dirigido a ADN de la reivindicación 1, o un polinucleótido de ADN que lo codifica; y (ii) un reactivo para la reconstitución y/o dilución.
110. El kit de la reivindicación 109, que comprende además un reactivo que se selecciona del grupo que consiste en: un amortiguador para introducir en células el ARN dirigido a ADN, un amortiguador de lavado, un reactivo de control, un polinucleótido de ARN o vector de expresión de control, un reactivo para transcribir el ARN dirigido a ADN a partir del ADN y combinaciones de estos.
111. Un kit que comprende: (i) el polipéptido modificador dirigido al sitio de la reivindicación 44, o un polinucleótido que lo codifica; y (ii) un reactivo para la reconstitución y/o dilución.
112. El kit de la reivindicación 111, que comprende además un reactivo que se selecciona del grupo que consiste en: un amortiguador para introducir en células el polipéptido modificador dirigido al sitio, un amortiguador de lavado, un reactivo de control, un vector de expresión de control o polinucleótido de ARN, un reactivo para la producción in vitro del polipéptido modificador dirigido al sitio a partir de ADN y combinaciones de estos.
113. Un kit que comprende: (i) el polipéptido modificador dirigido al sitio de la reivindicación 60, o un polinucleótido que lo codifica; y (ii) un reactivo para la reconstitución y/o dilución.
114. Un kit que comprende: (i) un ARN dirigido a ADN o un polinucleótido de ADN que codifica a este, donde el ARN dirigido a ADN comprende: (a) un primer segmento que comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia en un ADN objetivo; y (b) un-segundo segmento que interactúa con un polipéptido modificador dirigido al sitio; y (ii) el polinucleótido modificador dirigido al sitio, o un polipéptido que lo codifica, donde el polipéptido modificador dirigido al sitio comprende: (a) una parte de unión a ARN que interactúa con el ARN dirigido a ADN; y (b) una parte de actividad que presenta una actividad enzimática dirigida al sitio, donde el sitio de actividad enzimática está determinado por el ARN dirigido a ADN.
115. Un kit que comprende: (i) un ARN dirigido a ADN o un polinucleótido de ADN que codifica a este, que comprende: (a) un primer segmento que comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia en un ADN objetivo; y (b) un segundo segmento que interactúa con un polipéptido modificador dirigido al sitio; y (ii) el polinucleótido modificador dirigido al sitio, o un polipéptido que lo codifica, que comprende: (a) una parte de unión a ARN que interactúa con el ARN dirigido a ADN; y (b) una parte de actividad que modula la transcripción dentro del ADN objetivo, donde el sitio de transcripción modulada dentro del ADN objetivo está determinado por el ARN dirigido a ADN.
116. Un kit que comprende: (i) el vector de expresión recombinante de la reivindicación 12; y (ii) un reactivo para reconstitución y/o dilución.
117. Un kit que comprende : (i) el vector de expresión reco binante de la reivindicación 13; y (ii) un reactivo para reconstitución y/o dilución.
118. Un kit que comprende: (i) el vector de expresión recombinante de la reivindicación 7; y (ii) un reactivo para reconstitución y/o dilución.
119. Un kit que comprende: (i) el vector de expresión recombinante de la reivindicación 7; y (ii) un vector de expresión recombinante que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido modificador dirigido al sitio, donde el polipéptido modificador dirigido al sitio comprende: (a) una parte de unión a ARN que interactúa con el ARN dirigido a ADN; y (b) una parte de actividad que presenta una actividad enzimática dirigida al sitio, donde el sitio de actividad enzimática está determinado por el ARN dirigido a ADN.
120. Un kit que comprende: (i) el vector de expresión recombinante de la reivindicación 7; y (ii) un vector de expresión recombinante que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido modificador dirigido al sitio, donde el polipéptido modificador dirigido al sitio comprende: (a) una parte de unión a ARN que interactúa con el ARN dirigido a ADN; y (b) una parte de actividad que modula la transcripción dentro del ADN objetivo, donde el sitio de transcripción modulada dentro del ADN objetivo está determinado por el ARN dirigido a ADN.
121. Un kit para el direccionamiento del ADN objetivo que comprende: dos o más ARN dirigidos a ADN de acuerdo con la reivindicación 1, o polinucleótidos de ADN que los codifican, donde el primer segmento de al menos uno de los dos o más ARN dirigidos a ADN difiere en al menos un nucleótido del primer segmento de al menos otro de los dos o más ARN dirigidos a ADN.
122. Un método para modular selectivamente la transcripción de un ADN objetivo en una célula hospedadora, donde el método comprende introducir en la célula hospedadora: a) un ARN dirigido a ADN, o un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el ARN dirigido a ADN, donde el ARN dirigido a AON que comprende: i) un primer segmento que comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia objetivo en el ADN objetivo; ii) un segundo segmento que interactúa con un polipéptido dirigido al sitio; y iii) una secuencia de control de la estabilidad; y b) una variante del polipéptido dirigido al sitio Cas9, o un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la variante del polipéptido dirigido al sitio Cas9, donde la variante del polipéptido dirigido al sitio Cas9 comprende: i) una parte de unión a ARN que interactúa con el ARN dirigido a ADN; y ii) una parte de actividad que presenta actividad de endodesoxirribonucleasa reducida. Donde dicho ARN dirigido a ADN y dicha variante de polipéptido Cas9 forman un complejo en la célula y donde dicho complejo modula selectivamente la transcripción de un ADN objetivo en la célula.
123. Un método de la reivindicación 122, donde la variante del polipéptido dirigido al sitio Cas9 puede escindir la cadena no complementaria del ADN objetivo pero tiene capacidad reducida de escindir la cadena complementaria del ADN objetivo.
124. El método de la reivindicación 123, donde la variante del polipéptido dirigido al sitio comprende una mutación H840A de la secuencia de aminoácidos representada en la Figura 39A o la mutación correspondiente en cualquiera de las secuencias de aminoácidos establecidas en las SEQ ID NO:1-256 y 795-1346.
125. El método de la reivindicación 122, donde la variante del polipéptido dirigido al sitio puede escindir la cadena complementaria del ADN objetivo pero tiene capacidad reducida de escindir la cadena no complementaria del ADN objetivo.
126. El método de la reivindicación 125, donde el polipéptido dirigido al sitio variante comprende una mutación D10A de la secuencia de aminoácidos representada en la Figura 39A o la mutación correspondiente en cualquiera de las secuencias de aminoácidos establecidas en las SEQ ID NO:1-256 y 795-1346.
127. El método de la reivindicación 122, donde la variante del polipéptido dirigido al sitio tiene capacidad reducida para escindir la cadena complementaria del ADN objetivo y tiene capacidad reducida de escindir la cadena no complementaria del ADN objetivo.
128. El método de la reivindicación 127, donde la variante del polipéptido dirigido al sitio comprende ambas, (i) una mutación D10A de la secuencia de aminoácidos representada en la Figura 41 o la mutación correspondiente en cualquiera de las secuencias de aminoácidos establecidas en la SEQ ID NO: 1-256 y 795-1346; y (ii) una mutación H840A de la SEQ ID NO: 8 o la mutación correspondiente en cualquiera de las secuencias de aminoácidos establecidas en la SEQ ID NO: 1-256 y 795-1346.
129. El método de la reivindicación 122, donde la célula hospedadora es una célula procariota.
130. El método de la reivindicación 122, donde la célula hospedadora es una célula eucariota.
131. El método de la reivindicación 130, donde la célula eucariota es una célula de mamífero.
132. El método de la reivindicación 122, donde la transcripción del ADN objetivo se inhibe por lo menos un 10 % en comparación con la transcripción del ADN objetivo en ausencia del complejo.
133. El método de reivindicación 122, donde la variante del polipéptido dirigido al sitio Cas9 comprende un polipéptido heterólogo.
134. El método de la reivindicación 133, donde el polipéptido heterólogo comprende una secuencia de localización subcelular, una etiqueta detectable, un péptido de control de la estabilidad, una secuencia de modulación de la transcripción, una secuencia de unión a proteínas o una combinación de estas.
135. El método de reivindicación 134, en donde el polipéptido heterólogo comprende un péptido de control de la estabilidad.
136. El método de la reivindicación 135, donde el péptido de control de la estabilidad comprende una secuencia de degrones.
137. El método de la reivindicación 133, donde el polipéptido heterólogo se selecciona del grupo que consiste en: un activador transcripcional, una represor transcripcional, una histona lisina metiltransferasa, una histona lisina desmetilasa, una histona lisina acetiltransferasa, una histona lisina deacetilasa, una metilasa de ADN, una desmetilasa de ADN, un elemento de frontera, un elemento de reclutamiento periférico, un elemento de anclaje de proteínas y combinaciones de estos.
138. El método de la reivindicación 133, donde la transcripción del ADN objetivo aumenta por lo menos alrededor de 1,2 veces en comparación con la transcripción del ADN objetivo en ausencia del complejo.
139. El método de la reivindicación 138, donde el polipéptido heterólogo se selecciona del grupo que consiste en: un activador . transcripcional, una histona lisina metiltransferasa, una histona lisina desmetilasa, una histona lisina acetiltransferasa, una desmetilasa de ADN, un elemento de anclaje de proteínas y combinaciones de estos.
140. El método de la reivindicación 122, donde el ARN dirigido a ADN es un ARN dirigido a ADN de molécula simple.
141. El método de la reivindicación 122, donde el ARN dirigido a ADN es un ARN dirigido a ADN de dos moléculas.
142. El método de la reivindicación 122, que comprende adicionalmente la introducción en la célula hospedadora de un segundo ARN dirigido a ADN, o un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el segundo ARN dirigido a ADN, donde el segundo ARN dirigido a ADN comprende: un primer segmento que comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una segunda secuencia objetivo en el ADN objetivo; un segundo segmento que interactúa con el polipéptido dirigido al sitio; y una secuencia de control de la estabilidad.
143. El método de la reivindicación 122, donde el segundo segmento tiene una longitud desde alrededor de 30 nucleótidos a alrededor de 60 nucleótidos, y comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos alrededor de 95 % de identidad de secuencia de nucleótidos con una secuencia de nucleótidos seleccionada de: 1) 5'-GUUUUAGAGCUA-(enlazador)-UAGCAAGUUAAAA-3'; 2) 5'-GUUUAGAGCUG-(enlazador)-CAGCAAGUUAAA-3'; 3) 5'-GUUUUAGAGCUG-(enlazador)-CAGCGAGUUAAA-3'; 4) 5'-GUUUUUGUACUCU-(enlazador)-AGAAGCUACAAAGAU-3'; 5) 5'-GUUGUAGCUCC-(enlazador)-GUUGCUACAAU-3'; y 6) 5'-GUÜUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCG-3'.
144. Un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un ARN dirigido a ADN que comprende: a) un primer segmento que comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia objetivo en el ADN objetivo; b) un segundo segmento que interactúa con un polipéptido dirigido al sitio; y c) una secuencia de control de la estabilidad.
145. El ácido nucleico aislado de la reivindicación 144, donde la secuencia de nucleótidos que codifica el ARN dirigido a ADN está unido de forma operativa a un promotor.
146. El ácido nucleico aislado de la reivindicación 144, donde el ácido nucleico comprende además una secuencia de nucleótidos que codifica una variante del polipéptido dirigido al sitio Cas9 que presenta actividad endodesoxirribonucleasa reducida con relación a Cas9 de tipo salvaje.
147. El ácido nucleico aislado de la reivindicación 146, donde la secuencia de nucleótidos que codifica la variante del polipéptido dirigido al sitio Cas9 está unido de forma operativa a un promotor.
148. Un vector de expresión recombinante que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 24.
149. Una célula hospedadora modificada genéticamente que comprende el ácido nucleico aislado de la reivindicación 24 o el vector de expresión recombinante de la reivindicación 28.
150. Una biblioteca de ácidos nucleicos que comprende una pluralidad de miembros, donde cada ácido nucleico miembro comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un ARN dirigido a ADN que comprende: a) un primer segmento que comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia objetivo en el ADN objetivo; b) un segundo segmento que interactúa con un polipéptido dirigido al sitio; y c) una secuencia de control de la estabilidad, donde cada miembro difiere de otros miembros de la biblioteca en la secuencia de nucleótidos del primer segmento.
151. Una biblioteca de la reivindicación 150, donde la secuencia de nucleótidos que codifica un ÁRN dirigido a ADN está unido de forma operativa a un promotor.
152. Un kit que comprende: a) un ARN dirigido a ADN, o un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el ARN dirigido a ADN, donde el ARN dirigido a ADN que comprende: i)) un primer segmento que comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia objetivo en el ADN objetivo; ii)) un segundo segmento que interactúa con un polipéptido dirigido al sitio; y iii)) una secuencia de control de la estabilidad; y b) un amortiguador.
153. El kit de la reivindicación 152, que comprende además una variante del polipéptido dirigido al sitio Cas9 que presenta actividad endodesoxirribonucleasa reducida con relación a Cas9 de tipo salvaje.
154. El kit de la reivindicación 152, donde el ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el ARN dirigido a ADN comprende además una secuencia de nucleótidos que codifica una variante del polipéptido dirigido al sitio Cas9 que presenta actividad de endodesoxirribonucleasa reducida con relación a Cas9 de tipo salvaje.
155. El kit de la reivindicación 152, que comprende además un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una variante del polipéptido dirigido al sitio Cas9 que presenta actividad endodesoxirribonucleasa reducida con relación a Cas9 de tipo salvaje.
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