CN114401743A

CN114401743A - 中和颗粒酶b用于向经历过心肌梗塞的受试者提供心脏保护

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Publication number: CN114401743A
Application number: CN202080055751.7A
Authority: CN
Inventors: 阿菲德·艾特-乌尔费拉; 尼古拉斯·丹希; I·桑托斯扎斯; 塔巴索姆·西蒙
Original assignee: Assistance Publique Hopitaux de Paris APHP; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Sorbonne Universite; Universite de Paris
Current assignee: Assistance Publique Hopitaux de Paris APHP; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Sorbonne Universite; Universite de Paris
Priority date: 2019-08-02
Filing date: 2020-07-31
Publication date: 2022-04-26
Also published as: WO2021023644A1; US20220275105A1; EP4007584A1

Abstract

本发明涉及一种向经历过心肌梗塞的受试者提供心脏保护的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的颗粒酶B抑制剂。在此，发明人证明，在小鼠发生急性MI后，CD8+T淋巴细胞在缺血性心脏组织中迅速募集和激活，并释放颗粒酶B，导致心肌细胞凋亡和心肌功能恶化。抗体介导(CD8特异性抗体)的CD8+T淋巴细胞的耗减降低了心肌内颗粒酶B的含量和细胞凋亡以及炎性反应。mAb介导的CD8耗减会限制心肌损伤并改善心脏功能。这些作用重现在具有CD8+T细胞选择性颗粒酶B缺陷的小鼠中。颗粒酶B也由其他细胞类型如NK细胞产生。整体颗粒酶B缺失(GzmB^‑/‑小鼠)会减少心肌内的细胞凋亡，减少局部促炎标志并最终限制MI后的梗塞面积。发明人还证明，急性MI患者中颗粒酶B的循环水平升高预示了1年随访时死亡风险增加。这项工作揭示了颗粒酶B在急性缺血后的先前未曾预料到的致病作用，并确定了针对这种破坏性病况的新治疗靶点。

Description

中和颗粒酶B用于向经历过心肌梗塞的受试者提供心脏保护

技术领域

本发明属于医学领域，尤其是心脏病学领域。

背景技术

直接PCI(primary PCI)后的急性心肌缺血和再灌注是导致有害的心肌重塑(myocardial remodeling)和心脏衰竭(heart failure)的心脏组织损伤的原因。急性冠状动脉血栓性阻塞的早期管理已经取得了许多进展，包括冠状动脉血流的快速机械修复和抗血小板治疗[1]。对于心肌梗塞(myocardial infarction，MI)来说，在美国[2]和欧洲[3]已观察到早期死亡率随时间逐步下降。然而，缺血相关心脏损伤的长期影响仍然是一个临床和社会问题，包括心律不齐(arrhythmia)、心脏衰竭和反复住院的风险增加[4]。因此，目前所做努力是靶向参与缺血后心脏重塑的病理生理学途径[5,6]。

大量人类和实验证据表明，冠状动脉闭塞(coronary occlusion)的长期心脏并发症中涉及免疫应答[7]。在人类和实验性心肌梗塞(MI)中，血液供应中断导致缺血性心脏中的心肌细胞迅速死亡。随后，炎性信号允许募集炎性细胞，通过其对细胞外基质降解/沉积以及对死亡心肌细胞及其碎片的清除的影响，这构成了左心室(LV)重塑(remodelling)的主要决定因素。在小鼠中，中性粒细胞在最初的24小时内大量浸润心肌，随后是两个单核细胞亚群(Ly6-C^高和Ly6C^低)的双相浸润(biphasic infiltration)。Ly6-C^高单核细胞在前4天的损伤急性期占优，并导致不利的组织重塑，而Ly6C^低单核细胞在随后变得普遍，并被认为在组织愈合和新血管形成(neovascularization)中发挥保护作用[8]。CD4⁺T细胞在急性心肌缺血后的第一周内浸润心脏组织[9]。再补充实验(resupplementation experiment)表明，CD4⁺T细胞促进涉及IFN-γ表达的心肌缺血再灌注损伤。另一方面，天然调节性T细胞(Treg)可保护免受心肌缺血后有害的炎性重塑，因为使用抗CD25抗体的Treg耗减损害了左心室舒张和存活，而体内扩增的Treg则减弱心肌促炎细胞因子的表达和白细胞募集[10,11]。在心肌缺血再灌注后，已经在CD4⁺T细胞亚群的激活中确定了TCR非依赖性[12]和依赖性机制[13]。我们小组已经证明，在MI急性期由B细胞产生的CCL-7协调单核细胞动员(mobilization)并募集至缺血性心脏，对LV重塑和功能具有重大影响[14]。最近有人提出，CD8+T细胞的耗减将适用于心肌梗塞的治疗(WO2017/064034)。然而，CD8介导的心脏细胞毒性的机制仍然未知。

发明内容

如权利要求书所定义，本发明涉及向经历过心肌梗塞的受试者提供心脏保护的方法。

具体实施方式

急性心肌梗塞(MI)是导致心脏衰竭和猝死的常见病况。在此，发明人证明，在小鼠发生急性MI后，CD8+T淋巴细胞在缺血性心脏组织中迅速募集和激活，并释放颗粒酶B，导致心肌细胞凋亡和心肌功能恶化。抗体介导(CD8特异性抗体)的CD8+T淋巴细胞的耗减降低了心肌内颗粒酶B的含量和细胞凋亡以及炎性反应。最后，CD8耗减限制了心肌损伤并改善了心脏功能。这些作用在具有CD8+T细胞选择性颗粒酶B缺陷的小鼠中得到了重现。颗粒酶B还由其他细胞类型如NK细胞产生。有趣的是，整体(global)颗粒酶B缺失(GzmB^-/-小鼠)降低了心肌内的细胞凋亡，减少了局部促炎标志(pro-inflammatory signature)并最终限制了MI后的梗塞面积(infarct size)。发明人还证明，急性MI患者中颗粒酶B的循环水平升高预示了1年随访时死亡风险增加。这项工作揭示了颗粒酶B在急性缺血后的先前未曾预料到的致病作用，并确定了针对这种破坏性病况的新治疗靶点。

因此，本发明的第一个目的涉及向经历过心肌梗塞的受试者提供心脏保护的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的颗粒酶B抑制剂。

如本文所用，术语“受试者”、“个体”或“患者”可互换使用，并且是指需要对其进行诊断、治疗或疗法的任何受试者，尤其是人类。其他受试者可以包括牛、狗、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、马等。在一些优选的实施方案中，受试者是人类。

如本文所用，术语“心脏保护(cardioprotection)”意指在心肌梗塞之后、在缺血再灌注之后、期间或之前保护免受心肌损害或减少对心肌的损害。具体地，心脏保护包括减少梗塞面积、减少缺血再灌注损伤、减少缺氧诱导的细胞凋亡/坏死和防止心肌细胞死亡。因此，本发明的方法尤其适用于治疗有此需要的受试者中的心肌梗塞损伤。更具体地，本发明的方法尤其适用于减少缺血后左心室重塑。更具体地，本发明的方法适用于增加左心室射血分数(left ventricle ejection fraction，LVEF)，和/或适用于抑制左心室扩大，和/或适用于减少左心室收缩末期容积(left ventricle end systolic volume)，和/或适用于减少左心室舒张末期容积(left ventricle end diastolic volume)，和/或适适用于改善左心室功能障碍，和/或适用于改善心肌收缩性(myocardial contractibility)。

本发明的方法适用于降低心脏衰竭的风险或发展。如本文所用，术语“心脏衰竭(heart failure)”或““““具有本领域中的一般含义并且包括充血性心脏衰竭(congestiveheart failure)和/或慢性心脏衰竭(chronic heart failure)。心脏衰竭的功能分类通常由纽约心脏协会功能分类(New York Heart Association Functional Classification)完成(Criteria Committee,New York Heart Association.Diseases of the heart andblood vessels.Nomenclature and criteria for diagnosis,6th ed.Boston:Little,Brown and co,1964；114)。这一分类将心脏衰竭的严重程度分为4级(I-IV)。这些等级(I-IV)是：I级：在任何活动中均不受限，日常活动未出现症状；II级：略有轻度活动受限，患者在静息或轻度运动时感到舒适；III级：在任何活动中均明显受限，患者仅在静息时感到舒适；Ⅳ级：任何体力活动均会引起不适，并且在静息时出现症状。

如本文所用，术语“治疗(treatment或treat)”是指预防性治疗(prophylactictreatment)或防止性(preventive treatment)治疗以及治愈性治疗(curativetreatment)或疾病改善(disease modifying treatment)治疗，包括对处于患上疾病的风险中或怀疑患有疾病的患者以及生病或已被诊断为患有疾病或医学病况的患者的治疗，并且包括抑制临床复发。治疗可以施用给患有医学病症或最终可能患上病症的受试者，以对病症或复发病症的一种或多种症状进行预防、治愈、延迟其发作、降低其严重程度或改善，或延长受试者的存活时间超出没有此类治疗时的预期寿命。“治疗方案(therapeuticregimen)”意指疾病的治疗模式，例如治疗期间使用的给药模式。治疗方案可以包括诱导方案和维持方案。短语“诱导方案(induction regimen)”或“诱导期(induction period)”是指用于疾病初始治疗的治疗方案(或治疗方案的一部分)。诱导方案的总体目标是在治疗方案的初始阶段为患者提供高水平的药物。诱导方案可以(部分或全部)采用“负荷给药方案(loading regimen)”，其可包括施用剂量高于医师在维持方案期间所采剂量的药物，频率高于医师在维持方案期间采用的频率，或两者。短语“维持方案(maintenance regimen)”或“维持期(maintenance period)”是指用于在疾病治疗期间维持患者的治疗方案(或治疗方案的一部分)，例如，以使患者长期(数月或数年)处于缓解状态。维持方案可以采用连续治疗(例如，定期施用药物，例如每周、每月、每年等)或间歇治疗(例如，间断治疗(interrupted treatment)、间歇治疗(intermittent treatment)、复发治疗(treatmentat relapse)或达到特定的预定标准[例如，疾病表现等]的治疗)。

在一些实施方案中，将本发明的抑制剂施用给具有一种或多种急性心肌梗塞损伤的体征(sign)或症状(symptom)的受试者。在一些实施方案中，受试者具有一种或多种心肌梗塞的体征或症状，例如胸痛，描述为胸中部的压力感(pressure sensation)、饱胀感(fullness)或挤压感(squeezing)；胸痛放射至下巴或牙齿、肩部、手臂和/或背部；呼吸困难(dyspnea)或呼吸短促；上腹不适，伴有或不伴有恶心和呕吐；以及发汗(diaphoresis)或出汗(sweating)。

在一些实施方案中，本发明的抑制剂与对受试者进行的血管重建(revascularization)术同时或顺序(即，在之前或之后)施用。在一些实施方案中，在血管重建术之前、期间和之后向受试者施用本发明的抑制剂。在一些实施方案中，在血管重建术紧前以浓注剂量(bolus dose)向受试者施用本发明的抑制剂。在一些实施方案中，在血管重建术期间和之后连续向受试者施用本发明的抑制剂。在一些实施方案中，在选自由以下组成的组的时间段向受试者施用本发明的抑制剂：血管重建术后至少3小时；血管重建术后至少5小时；血管重建术后至少8小时；血管重建术后至少12小时；血管重建术后至少24小时。在一些实施方案中，在选自由以下组成的组的时间段向受试者施用本发明的抑制剂：在血管重建术前至少8小时开始；在血管重建术前至少4小时开始；在血管重建术前至少2小时开始；在血管重建术前至少1小时开始；在血管重建术前至少30分钟开始。在一些实施方案中，血管重建术选自由以下组成的组：经皮冠状动脉介入术(percutaneous coronaryintervention)；球囊血管成形术(balloon angioplasty)；插入旁路移植物(insertion ofbypass graft)；插入支架；定向冠状动脉斑块切除术(directional coronaryatherectomy)；用一种或多种溶栓剂(thrombolytic agent)治疗；和去除闭塞。

如本文所用，术语“颗粒酶B(Granzyme B)”具有本领域中的一般含义，并且是指细胞介导的免疫应答中靶细胞裂解所必需的酶。例如，颗粒酶B切割半胱天冬酶(caspase)-3、-7、-9和10以产生活性酶介导的细胞凋亡。颗粒酶B的示例性氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

SEQ ID NO:1>sp|P10144|GRAB_HUMAN Granzyme B OS＝Homo sapiens OX＝9606

GN＝GZMB PE＝1SV＝2

MQPILLLLAFLLLPRADAGEIIGGHEAKPHSRPYMAYLMIWDQKSLKRCGGFLIRDDFVL

TAAHCWGSSINVTLGAHNIKEQEPTQQFIPVKRPIPHPAYNPKNFSNDIMLLQLERKAKR

TRAVQPLRLPSNKAQVKPGQTCSVAGWGQTAPLGKHSHTLQEVKMTVQEDRKCESDLRHY

YDSTIELCVGDPEIKKTSFKGDSGGPLVCNKVAQGIVSYGRNNGMPPRACTKVSSFVHWI

KKTMKRY

如本文所用，“颗粒酶B抑制剂”是指能够抑制颗粒酶B的活性或表达的任何天然或非天然化合物。该术语涵盖本领域中目前已知或将在未来鉴定出的任何颗粒酶B抑制剂，并且包括对患者施用后会导致颗粒酶B生物学活性或表达受到抑制或下调的任何化学实体。

在一些实施方案中，本发明的抑制剂是抗颗粒酶B中和抗体。

如本文所用，术语“抗体”因此用于指具有抗原结合区的任何抗体样分子，并且该术语包括包含抗原结合结构域的抗体片段，例如Fab'、Fab、F(ab')2、单域抗体(singledomain antibodiy，DAB)、TandAb二聚体、Fv、scFv(单链Fv)、dsFv、ds-scFv、Fd、线性抗体、微抗体(minibody)、双抗体(diabody)、双特异性抗体片段、bibody、tribody(scFv-Fab融合体，分别为双特异性或三特异性)；sc-双抗体；kappa(lamda)体(scFv-CL融合体)；BiTE(双特异性T细胞接合体(Bispecific T-cell Engager)，scFv-scFv串联以吸引T细胞)；DVD-Ig(双可变域抗体，双特异性形式)；SIP(小免疫蛋白，一种微抗体)；SMIP(“小型模块化免疫药物(small modular immunopharmaceutical)””all mo二聚体；DART(ds-稳定化双抗体“双亲和重靶向(Dual Affinity ReTargeting)”)；包含一个或多个CDR的小抗体模拟物等。制备和使用各种基于抗体的构建体和片段的技术是本领域公知的(参见Kabat et al.,1991，其具体通过引用并入本文)。具体地，双抗体进一步描述在EP 404,097和WO 93/1 1 161中；而线性抗体进一步描述在Zapata et al.(1995)中。可以使用常规技术将抗体片段化。例如，可以通过用胃蛋白酶处理抗体来产生F(ab')2片段。可以对所得F(ab')2片段进行处理以减少二硫键从而产生Fab'片段。木瓜蛋白酶(papain)消化可导致形成Fab片段。Fab、Fab'和F(ab')2、scFv、Fv、dsFv、Fd、dAb、TandAb、ds-scFv、二聚体、微抗体、双抗体、双特异性抗体片段以及其他片段也可以通过重组技术合成或可以化学合成。用于产生抗体片段的技术是本领域公知的，并有描述。例如，Beckman et al.,2006；Holliger&Hudson,2005；Le Gallet al.,2004；Reff&Heard,2001；Reiter et al.,1996；和Young et al.,1995均进一步描述并实现了有效抗体片段的产生。在一些实施方案中，本发明的抗体是单链抗体。如本文所用，术语“单域抗体(single domain antibody)”具有本领域的一般含义，并且是指可以在天然缺乏轻链的骆驼科(Camelid)哺乳动物中发现的抗体类型的单重链可变域。此类单域抗体也是“是“域抗体也是““体。对于(单)域抗体的一般描述，还参考了上文引用的现有技术，以及EP 0 368 684、Ward et al.(Nature 1989Oct 12；341(6242):544-6)、Holt etal.,Trends Biotechnol.,2003,21(11):484-490；和WO 06/030220、WO 06/003388。

如本文所用，术语“中和抗体(neutralizing antibody)”是指能够降低或抑制(阻断)配体的活性或信号传导的抗体，如通过体内或体外测定法所测得。通常，本发明的抗体能够减少和/或抑制由颗粒酶B诱导的心肌细胞的凋亡。

在一些实施方案中，本发明的抗体是单域抗体。如本文所用，术语“单域抗体”具有本领域的一般含义，并且是指可以在天然缺乏轻链的骆驼科哺乳动物中发现的抗体类型的单重链可变域。此类单域抗体也是“是“域抗体也是““的。

在一些实施方案中，本发明的抑制剂是抗颗粒酶B单克隆抗体。

可以使用通过培养中的连续细胞系提供抗体分子产生的任何技术来制备和分离单克隆抗体。生产和分离技术包括但不限于杂交瘤技术、人B细胞杂交瘤技术和EBV杂交瘤技术。

在一些实施方案中，本发明的抗体是完全人抗体(fully human antibody)。如本文所用，术语“完全人的(fully human)”是指免疫球蛋白，例如抗体或抗体片段，其中整个分子来源于人类或由与人类形式的抗体或免疫球蛋白相同的氨基酸序列组成。还可以通过对转基因了大部分人免疫球蛋白重链和轻链基因座的小鼠进行免疫，来制备完全人单克隆抗体。参见，例如，美国专利号5,591,669、5,598,369、5,545,806、5,545,807、6,150,584和其中引用的参考文献，其内容通过引用并入本文。

在一些实施方案中，本发明的抗体是人源化抗体。如本文所用，“人源化(humanized)”描述其中CDR区以外的一些、大部分或全部氨基酸被源自人免疫球蛋白分子的相应氨基酸替代的抗体。人源化方法包括但不限于在以下描述的那些：美国专利号4,816,567、5,225,539、5,585,089、5,693,761、5,693,762和5,859,205，其在此通过引用并入。

在一些实施方案中，本发明的抑制剂是适体(aptamer)。适体是代表抗体在分子识别方面的替代物的一类分子。适体是具有以高亲和力和特异性识别几乎任何类型的靶分子的能力的寡核苷酸序列。此类配体可通过随机序列文库的指数富集的配体系统进化(Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment，SELEX)来分离。随机序列文库可通过DNA的组合化学合成获得。在这个文库中，每个成员都是最终化学修饰的具有独特序列的线性寡聚体。肽适体由平台蛋白(platform protein)展示的构象受限的抗体可变区组成，所述平台蛋白例如通过两种杂交方法从组合文库中选择的大肠杆菌硫氧还蛋白A(E.coli Thioredoxin A)(Colas et al.,1996)。

在一些实施方案中，颗粒酶B抑制剂是颗粒酶B表达的抑制剂。“表达抑制剂(inhibitor of expression)”是指具有抑制基因表达的生物学效应的天然或合成化合物。在本发明的一个优选实施方案中，所述基因表达的抑制剂是siRNA、反义寡核苷酸或核酶。例如，反义寡核苷酸，包括反义RNA分子和反义DNA分子，将通过与颗粒酶B mRNA结合直接阻断其翻译，并从而阻止蛋白翻译或增加mRNA降解，从而降低细胞中颗粒酶B的水平和活性。例如，可以合成至少约15个碱基并与编码颗粒酶B的mRNA转录序列的独特区域互补的反义寡核苷酸，例如，通过常规的磷酸二酯技术。使用反义技术特异性抑制序列已知的基因的基因表达的方法是本领域公知的(例如，参见，美国专利号6,566,135；6,566,131；6,365,354；6,410,323；6,107,091；6,046,321；和5,981,732)。小的抑制性RNA(siRNA)也可用作本发明中使用的表达抑制剂。颗粒酶B基因表达可以通过使患者或细胞与小双链RNA(dsRNA)或导致产生小双链RNA的载体或构建体接触来降低，从而特异性抑制颗粒酶B基因表达(即，RNA干扰或RNAi)。本发明的反义寡核苷酸、siRNA、shRNA和核酶可以单独或与载体一起递送在体内。在其最广泛的意义上，“载体(vector)”是能够促进反义寡核苷酸、siRNA、shRNA或核酶核酸转移至细胞(通常是表达颗粒酶B的细胞)的任何媒介物(vehicle)。通常，载体将核酸转运至细胞，由此的降解相对于载体不存在时导致的降解程度降低。一般而言，可用于本发明的载体包括但不限于质粒、噬菌粒(phagemid)、病毒、衍生自病毒或细菌来源的其他媒介物，其已通过插入或并入反义寡核苷酸、siRNA、shRNA或核酶核酸序列而进行了操作。病毒载体是优选的载体类型，并且包括但不限于来自以下病毒的核酸序列：逆转录病毒，例如莫洛尼鼠白血病病毒(moloney murine leukemia virus)、哈维鼠肉瘤病毒(harveymurine sarcoma virus)、鼠乳腺肿瘤病毒和劳斯肉瘤病毒；腺病毒、腺相关病毒；SV40型病毒；多瘤病毒(polyoma virus)；爱泼斯坦-巴尔病毒(Epstein-Barr virus)；乳头状瘤病毒(papilloma virus)；疱疹病毒；痘苗病毒(vaccinia virus)；脊髓灰质炎病毒(poliovirus)；和RNA病毒，例如逆转录病毒。可以容易地使用其他未命名但本领域已知的载体。在一些实施方案中，表达抑制剂是核酸内切酶。术语“核酸内切酶(endonuclease)”是指切割多核苷酸链内的磷酸二酯键的酶。一些，例如脱氧核糖核酸酶I，相对非特异性地切割DNA(不考虑序列)，而许多，通常称为限制性核酸内切酶或限制性酶，仅在非常特异的核苷酸序列处切割。基于核酸内切酶的基因组失活背后的机制通常需要第一步的DNA单链或双链断裂，然后可以触发两种不同的细胞DNA修复机制，其可用于DNA失活：易错非同源末端连接(errorprone nonhomologous end-joining，NHEJ)和高保真同源定向修复(high-fidelityhomology-directed repair，HDR)。在一个具体的实施方案中，核酸内切酶是CRISPR-cas。如本文所用，术语“如本文所用，术语“方案具有本领域中的一般含义并且是指相关的成簇的规则间隔的短回文重复(clustered regularly interspaced short palindromicrepeat)，其是含有碱基序列的短重复的原核DNA区段。在一些实施方案中，核酸内切酶是来自酿脓链球菌(Streptococcus pyogene)的CRISPR-cas9。CRISPR/Cas9系统已描述在US8697359 B1和US 2014/0068797中。在一些实施方案中，核酸内切酶是CRISPR-Cpf1，其是Zetsche et al.(“etsche et al.切酶是gene脓链球菌(paced short palindromicrepeatd核酸内切酶(富集的配体系统进化(＝2＝2PE＝1 SV＝2剂：等)或间歇治疗()最近表征的来自Provotella和Francisella 1(Cpf1)的CRISPR。

“治疗有效量”意指以适用于任何医学治疗的合理效益/风险比来治疗或减轻症状的足够量的活性成分。应当理解，本发明的化合物和组合物的总每日用量将由主治医师在合理的医学判断范围内决定。对任何特定受试者的具体治疗有效剂量水平将取决于多种因素，包括所治疗的病症和病症的严重程度；所用特定化合物的活性；所用的具体组合物，受试者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；所用特定化合物的施用时间、施用途径和排泄速率；治疗的持续时间；与活性成分组合使用的药物；以及医学领域中公知的类似因素。例如，在低于达到目标治疗效果所需的水平开始化合物的剂量并逐渐增加剂量直至达到所需效果，这完全在本领域的技术范围内。然而，产品的每日剂量可以在每位成人每天0.01至1,000mg的宽范围内变化。通常，组合物含有0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、15.0、25.0、50.0、100、250和500mg的活性成分，用于对要治疗的受试者的剂量进行症状性调整。药物通常含有约0.01mg至约500mg的活性成分，通常为1mg至约100mg的活性成分。药物的有效量通常以每天0.0002mg/kg体重至约20mg/kg体重，尤其是每天约0.001mg/kg体重至7mg/kg体重的剂量水平提供。

在一些实施方案中，本发明的抑制剂与另外的活性剂组合施用。在一些实施方案中，另外的活性剂是选自由以下组成的组的心血管药物：透明质酸酶(hyaluronidase)、皮质类固醇(corticosteroid)、重组超氧化物歧化酶(recombinant superoxidedismutase)、前列环素(prostacyclin)、氟路索(fluosol)、镁、泊洛沙姆188(poloxamer188)、曲美他嗪(trimetazidine)、eniporidine、cariporidine、硝酸盐、抗-P选择素、抗CD18抗体、腺苷和葡萄糖-胰岛素-钾。在一些实施方案中，心血管药物选自由以下组成的组：抗心律不齐剂、血管舒张剂(vasodilator)、抗心绞痛剂、皮质类固醇、cardioglycoside、利尿剂(diuretic)、镇静剂(sedative)、血管紧张素转化酶(angiotensin converting enzyme，ACE)抑制剂、血管紧张素II拮抗剂、溶栓剂、钙通道阻滞剂、血栓烷受体拮抗剂(throboxane receptor antagonist)、自由基清除剂(radicalscavenger)、抗血小板药物、β-肾上腺素受体阻滞剂、受体阻滞剂(oreceptor blockingdrug)、交感神经抑制剂、洋地黄制剂(digitalis formulation)、inotrope和抗高血脂药(antihyperlipidemic drug)。在一些实施方案中，活性剂是inotrope。正性肌力药(positive inotropic agent)增加心肌收缩力，并用于在疾病中支持心脏功能，所述疾病例如失代偿性充血性心脏衰竭(decompensated congestive heart failure)、心源性休克、败血性休克、心肌梗塞、心肌病等。正性肌力药的示例包括但不限于小檗碱(Berberine)、二吡啶衍生物、氨力农(Inamrinone)、米力农(Milrinone)、钙、钙敏化剂、左西孟旦(Levosimendan)、强心苷(Cardiac glycoside)、地高辛(Digoxin)、儿茶酚胺(Catecholamine)、多巴胺、多巴酚丁胺(Dobutamine)、多培沙明(Dopexamine)、肾上腺素(Epinephrine(adrenaline))、异丙肾上腺素(Isoprenaline(isoproterenol))、去甲肾上腺素(Norepinephrine(noradrenaline))、类花生酸(Eicosanoid)、前列腺素(Prostaglandin)、磷酸二酯酶抑制剂、依诺昔酮(Enoximone)、米力农、茶碱(Theophylline)和胰高血糖素(Glucagon)。负性肌力药(negative inotropic agent)会降低心肌收缩力，并用于减少心绞痛(angina)等病况中的心脏负荷。尽管负性肌力(negativeinotropism)可能加速或加剧心脏衰竭，但某些β阻滞剂(例如，卡维地洛(carvedilol)、比索洛尔(bisoprolol)和美托洛尔(metoprolol))已被证明可以降低充血性心脏衰竭的发病率和死亡率。负性肌力药的示例包括但不限于β阻滞剂、钙通道阻滞剂、地尔硫卓(Diltiazem)、维拉帕米(Verapamil)、氯维地平(Clevidipine)、奎尼丁(Quinidine)、普鲁卡因胺(Procainamide)、丙吡胺(disopyramide)和氟卡尼(Flecainide)。在一些实施方案中，心血管药物是环孢菌素。如本文所用，术语“环孢菌素(cyclosporine)”是指环孢菌素A、环孢菌素G及其功能性衍生物或类似物，例如NIM81 1。环孢菌素A是指天然弯颈霉膨胀环状非核糖体肽(natural Tolypocladium inflation cyclic non-ribosomal peptide)。环孢菌素G与环孢菌素A的区别在氨基酸2位置，在此L-正缬氨酸取代了a-氨基丁酸。(通常参见，Wenger,R.M.1986.Synthesis of Ciclosporin and analogues:structural andconformational requirements for immunosuppressive activity.Progress inAllergy,38:46-64)。

通常，本发明的活性成分(例如，颗粒酶B抑制剂)与药学上可接受的赋形剂以及任选的缓释基质(例如，可生物降解的聚合物)组合以形成药物组合物。术语“药学上的”或“药学上可接受的”是指当酌情施用给哺乳动物，尤其是人类时不产生不利的、过敏的或其他不良反应的分子实体和组合物。药学上可接受的载体或赋形剂是指任何类型的无毒固体、半固体或液体填充剂、稀释剂、包封材料或制剂助剂。载体也可以是溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、其合适混合物和植物油。适当的流动性可以例如通过使用包衣例如卵磷脂、通过在分散体的情况下保持所需粒径和通过使用表面活性剂来保持。可以通过各种抗细菌剂和抗真菌剂来防止微生物的作用，例如对羟基苯甲酸酯(parabens)、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等。在许多情况下，优选包括等渗剂，例如糖或氯化钠。可通过在组合物中使用延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸铝和明胶来延长可注射组合物的吸收。在本发明的药物组合物中，本发明的活性成分可以以单位施用形式施用，作为与常规药物支持物的混合物。合适的单位施用形式包括口服途径形式，例如片剂、凝胶胶囊、粉末、颗粒剂和口服悬浮液或溶液、舌下和口腔施用形式、气雾剂、植入物、皮下(subcutaneous)、透皮(transdermal)、局部(topical)、腹膜内、肌内、静脉内、真皮下(subdermal)、透皮、鞘内和鼻内施用形式和直肠施用形式。

本发明的另一个目的涉及一种筛选适用于向经历过心肌梗塞的受试者提供心脏保护的药物的方法，所述方法包括i)提供测试化合物和ii)确定所述测试化合物抑制颗粒酶B表达或活性的能力。

本领域公知的任何生物测定法均可适用于测定测试化合物抑制颗粒酶B活性或表达的能力。在一些实施方案中，所述测定首先包括测定测试化合物结合颗粒酶B的能力。在一些实施方案中，然后使心肌细胞群体进行接触并激活以确定测试化合物抑制颗粒酶B活性或表达的能力。具体地，由测试化合物触发的效果相对于在不存在测试化合物或存在对照剂的情况下(其中任何一种都类似于阴性对照条件)平行孵育的免疫细胞群体的效果来确定。如本文所用，术语“对照物质(control substance)”、“对照剂(control agent)”或“对照化合物(control compound)”是指惰性的或不具有与调节生物活性或表达的能力有关的活性的分子。应当理解，如使用本文所述的体外方法所测定地，能够抑制颗粒酶B活性或表达的测试化合物在体内应用中可能表现出类似的调节能力。体内测定是本领域公知的，并且通常包括实施例中描述的那些。通常，测试化合物选自由肽、肽模拟物、有机小分子、抗体(例如intraantibody)、适体或核酸组成的组。例如，本发明的测试化合物可以选自先前合成的化合物库或其中在数据库中确定其结构的化合物库，或选自已从头合成的化合物库。在一些实施方案中，测试化合物可以选自有机小分子。

本发明将通过以下附图和实施例进一步说明。然而，这些实施例和附图不应以任何方式解释为限制本发明的范围。

附图说明

图1：细胞毒性CD8+T淋巴细胞在心肌梗塞后被激活并募集到缺血组织。冠状动脉结扎或假手术(sham)后第1天、第3天和第7天受损心肌内颗粒酶B的mRNA水平(每组/时间点n＝8只小鼠)。与假手术相比的*P<0.05。

图2：整体颗粒酶B缺陷限制了急性MI后的心脏损伤。

(A)在C57bl6野生型(WT)小鼠或颗粒酶B缺陷(GzmB^-/-)小鼠上诱导急性MI。(B)在MI后第3天对WT C57BL/6J或GzmB^-/-小鼠的梗塞周围区域中的TUNEL+细胞的定量分析(左)(每组n＝8-9只小鼠)；***P<0.001。(C)在MI后第3天，通过qPCR在梗塞心脏中测量的Il-1β、Il-6、Tnf-α、IL-10和Mmp9mRNA水平，**P<0.01，***P<0.001。(D)在2组小鼠中，通过Masson三色染色(Masson trichrome staining)评估的梗塞面积评估的代表性显微照片(左)和定量分析(右)。(每组n＝7只小鼠)，*P<0.05。

图3：CD8⁺T淋巴细胞通过产生颗粒酶B触发了有害的心室重塑并改变了心脏功能。(A)在MI前3周，向Rag1^-/-小鼠注射CD8耗减的脾细胞或CD8细胞耗减的脾细胞并再补充有野生型或GzmB^-/-CD8+T细胞。(B)MI后的存活曲线(合并3次实验，n＝10-18/组)，*P<0.05，**P<0.01和***P<0.001。(C，D)4组小鼠中梗塞面积(C)、纤维化和胶原蛋白含量(D)的代表性显微照片和定量分析，比例尺100μm。结果来自三个独立实验的合并，每组7至9只小鼠。(E)4组小鼠中，MI 21天后的超声心动图(echocardiography)分析和LV缩短分数(shorteningfraction，SF)评估。(F)第21天脾脏中CD8+T细胞数与LV缩短分数之间的相关性。包括来自以下2个组的数据：CD8耗减的脾细胞或CD8细胞耗减的脾细胞并再补充有野生型CD8⁺T细胞的脾细胞。

图4：根据急性MI患者中基线循环颗粒酶B水平(<或>中值)的生存率。急性MI入院时的高颗粒酶B水平多次调整后可独立预测在一年随访后的死亡(参见方法)。HR(Hazardratio)＝风险比。

实施例：

方法

心肌梗塞。所有小鼠均处于完全C57Bl/6J背景。C57BL/6(Janvier,法国)、Gzm-B^-/-、Rag1^-/-(Jackson,美国)。心肌梗塞通过左前降支冠状动脉结扎(left anteriordescending coronary artery ligation)来诱导[14]。使用克他命(ketamine)(100mg/kg)和甲苯噻嗪(10mg/kg)通过腹膜内(i.p.)注射对小鼠进行麻醉，然后使用小型动物呼吸器进行插管和通气。将胸壁剃毛，并在左第四肋间进行开胸术。观察左心室，然后取出心包囊，然后使用7/0不可吸收的单丝缝合线(monofilament suture)(Peters Surgery，法国)在左心房下方其出现的部位对左前降支冠状动脉进行永久结扎。认为缺血区域的显著颜色变化表明了成功的冠状动脉闭塞。使用6/0不可吸收的单丝缝合线(Peters Surgery，法国)结束开胸术。对进行假手术的对照动物进行相同的程序，除了不进行结扎。一旦恢复自主呼吸，就移除气管内导管，并将动物置于保持在37℃的温暖垫上直至小鼠完全醒来。Rag1^-/-小鼠在心肌梗塞诱导前21天接受以下之一：4x10⁶个CD8+T细胞耗减的脾细胞(使用抗CD8珠子的阴性部分)、CD8+T细胞耗减并再补充有6x10⁶个野生型CD8+T淋巴细胞的脾细胞或6x10⁶个Gzm-B^-/-CD8+T淋巴细胞。然后让小鼠恢复3周。实验是根据法国兽医指南和欧洲共同体为实验动物使用而制定的指南进行的，并得到了国立卫生与研究研究所(Institut Nationalde la Santéet de la Recherche Médicale)的批准。

超声心动图测量。在手术后第9、21和28天，使用配备有14-MHz线性传感器(1415SP)的超声心动图机(ACUSON S3000TM超声，Siemens AG,Erlangen德国)进行经胸超声心动图检查。相对研究者进行盲化分组。动物通过吸入异氟醚进行麻醉。获得了左心室的二维胸骨旁长轴视图，用于引导M模式测量舒张末期(LVDD)和收缩末期(LVDS)的LV内直径，以及相同点处的心室间隔壁厚度(interventricular septal wall thickness)和后壁厚度(posterior wall thickness)。分数缩短百分比(％FS)通过以下公式计算：％FS＝[(LVDD-LVDS)/LVDD]X 100。

CD8+T细胞纯化和移植。根据制造商的方案，从C57BL/6J、Gzm-B^-/-脾脏中分离出CD8+T细胞，并使用CD8+T细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec；Paris，France)进行纯化。简言之，使用抗体包被的磁珠的混合物(CD4、CD11b、CD11c、CD19、CD45R(B220)、CD49b(DX5)、CD105、抗MHC II类、Ter-119和TCRγ/δ)对CD8+T细胞进行负筛选，然后使用LS磁柱(Miltenyi Biotec；Paris，France)进行细胞分离，产生纯度>95％的CD8+T细胞(数据未显示)。然后心肌梗塞前21天向Rag1^-/-小鼠静脉内注射细胞。

组织病理学和免疫荧光分析。在第21天评估心肌梗塞后的心脏愈合情况。切除心脏，在PBS中冲洗并在液氮中冷冻。用低温恒温器(cryostat)(CM 3050S，Leica)将心脏切成7μm厚的切片。进行Masson三色染色和天狼星红(Sirius Red)染色以评估梗塞面积和心肌纤维化。梗塞面积计算为梗塞面积占LV总周长的百分比。胶原体积分数(collagen volumefraction)计算为间质纤维化总面积与切片整个视野中肌细胞面积的比值。

将用于免疫荧光分析的心脏切片用4％多聚甲醛固定，使用含0.2％Triton X100的磷酸盐缓冲溶液(PBS)在室温下渗透30分钟，用PBS-T(含0.2％Triton X100、10％山羊血清、0.2％BSA的PBS)封闭1小时，并与稀释于PBS-T中的一抗在4抗在下孵育过夜。为了评估细胞凋亡(MI后第3天)，根据制造商的说明，使用TUNEL测定试剂盒(Roche Diagnostis，Meylan，法国)进行免疫荧光分析。使用Zeiss Axioimager Z2 Apotome获得免疫荧光的数字图像。并使用ImageJ64进行检查。

定量实时PCR。在Step-one Plus(Applied Biosystems)qPCR机器上进行定量实时PCR。GAPDH用于标准化基因表达。使用以下引物序列：GAPDH：正向5′-CGTCCCGTAGACAAAATGGTGAA-3′(SEQ ID NO:2)，反向5′-GCCGTGAGTGGAGTCATACTGGAA-CA-3′(SEQ ID NO:3)；GRZB：正向5′-GTGCGGGGGACCCAAAGACCAAAC-3′(SEQ ID NO:4)，反向：5′-GCACGTGGAGGTGAACCATCCTTATAT-3′(SEQ ID NO:5)；IL1β：正向5’-GAAGAGCCCATCCTCTGTGA-3’(SEQ ID NO:6)，反向5’-GGGTGTGCCGTCTTTCATTA-3’(SEQ ID NO:7)；IL6：正向5′-TGACAACCACGGCCTTCCCTA-3′(SEQ ID NO:8)，反向：5′-TCAGAATTGCCATTGCACAACTCTT-3′(SEQ ID NO:9)；IL10：正向5′-ACTTCCCAGTCGGCCAGAGCCACAT-3′(SEQ ID NO:10)，反向：5′-GATGACAGCGCCTCAGCCGCATCCT-3(SEQ ID NO:11)；IL15：正向5′-CCGGTGCCAAGATCTGTGTCTCT-3′(SEQ ID NO:12)；反向：5′-GTTGCACAGGGGAGTCTGGTCTT-3′((SEQ ID NO:13)；TNF-α：正向5’-GATGGGGGGCTTCCAGAACT-3’(SEQ ID NO:14)，反向5’-GATGGGGGGCTTCCAGAACT-3’(SEQ ID NO:15)；MMP9：正向5’-GCGTCATTCGCGTGGATAAGGAGT-3’(SEQ ID NO:16)，反向5’-GTAGCCCACGTCGTCCACCTGGTT-3(SEQ ID NO:17)。

急性MI患者群体。法国急性ST抬高和非ST抬高心肌梗塞登记处(French registryof Acute ST-elevation and non–ST-elevation Myocardial Infarction，FAST-MI)的群体选择方法已在先前的出版物中详细描述[15]。简言之，将符合以下条件的所有≥简言岁的患者登记在案：他们具有升高的心肌坏死血清标志物，高于肌酸激酶、肌酸激酶-MB正常上限两倍，或升高的肌钙蛋白，以及与急性MI相符的任何一种症状和/或至少两条相邻导联(leads)的心电图改变，伴有病理性Q波(≥(≥电图sec)和/或持续的ST抬高或压低>0或压低改变。从症状出现到入住重症监护病房的时间必须<48小时。按照惯常操作对患者进行管理；治疗不受参与登记的影响。当时在法国治疗急性MI患者的374个中心中，有223个(60％)参与了登记。其中，100个中心招募了1029名为血清库做出贡献的患者。对于本研究，1046个样品可用于颗粒酶B测量。向每位患者提供书面知情同意书。他们的基线特征与登记的总群体相当。超过99％的患者是白种人。通过联系患者的医师、患者本人或他们的家人以及他们出生地的登记处，收集随访数据。从一年随访获得的数据已完成>99％。该研究由圣安托万大学医院生物医学研究中的人类受试者保护委员会(Committee for the Protection ofHuman Subjects in Biomedical Research of Saint Antoine University Hospital)审查，并且数据文件已向国家信息与自由委员会(Commission Nationale Informatique etLiberté)申报。根据制造商的说明，使用颗粒酶B人ELISA试剂盒(Invitrogen，ThermoFisher)进行人颗粒酶B分析。

统计学分析。将结果事件定义为1年随访期间的全因死亡(all-cause death)。将主要终点(primary endpoint)定义为全因死亡，并由一个成员不知道患者的药物和血液测量结果的委员会裁定。连续变量描述为平均值±s.d.或中数、Q1、Q3，分类变量描述为频率或百分比。比较低于或高于颗粒酶B中值水平(8.9pg/mL)的患者之间的基线人口学和临床特征、治疗因素和住院期间的治疗管理，对离散变量使用卡方(chi-square)或费舍尔精确检验(Fisher’s exact test)，对连续变量使用非配对t检验或威尔科克森符号秩检验(Wilcoxon sign-rank test)。使用卡普兰-梅尔(Kaplan-Meier)估计法来预估根据颗粒酶B中值水平的存活曲线。我们使用多变量Cox比例风险模型(multivariable Coxproportional-hazards model)来评估1年随访期间具有主要终点的变量的独立预后值。多变量模型包含性别、年龄、体重指数、当前吸烟、冠心病家族史、高血压史、高胆固醇血症、既往心肌梗塞、既往中风或短暂性脑缺血发作(transient ischemic attack，TIA)、心脏衰竭、肾衰竭、糖尿病、Killip分级、左心室射血分数、STEMI或再灌注、医院管理(包括再灌注治疗、冠状动脉搭桥手术、他汀类药物、β阻滞剂、氯吡格雷(clopidogrel)、利尿剂、低分子量肝素、GPIIb/IIIa抑制剂)。结果表示为Cox模型的风险比，95％置信区间(confidenceinterval，CI)。所有统计学检验都是双侧的，并使用SAS软件9.4版本进行。

结果：

整体颗粒酶B缺陷限制了急性MI后的心脏损伤。

我们之前证明，CD8+T细胞的耗减适于治疗MI(WO2017/064034)。我们接下来评估了CD8+T细胞介导的对心脏重塑和功能的影响的潜在机制。具体地，这些发现促使我们研究颗粒酶B在缺血后心脏重塑中的直接细胞毒性作用。在MI的情况下，缺血性心肌中的颗粒酶B含量在冠状动脉闭塞后第一周内增加(图1)。

在C57bl6野生型和颗粒酶B缺陷型(Gzm-B^-/-)成年小鼠中诱导MI(图2A)。通过Gzm-B^-/-小鼠脾脏(数据未显示)和心脏(数据未显示)的免疫染色证实了颗粒酶B缺陷。在急性MI后，我们观察到与WT对照组相比，Gzm-B^-/-小鼠梗塞周围心脏(peri-infarct heart)中受损心肌内的TUNEL+凋亡细胞显著减少(P<0.001)(图2B，数据未显示)，以及Il-1β、Il-6、Tnf-α和Mmp9 mRNA水平的局部降低(P<0.01)(图2C)。最后，在MI后，颗粒酶B缺陷动物的21天存活趋于更高(88％相比于64％，P＝0.12)(数据未显示)，伴随梗塞面积的显著减少(-55％，P<0.05)(图2D)。这些实验表明，颗粒酶B自身可以对心肌细胞具有直接的细胞毒活性。为了证实这一假设，将小鼠心肌细胞与纯化的脾CD8⁺T细胞在体外共培养24小时。接下来，去除T细胞并使用半胱天冬酶-3荧光染料在额外48小时内监测心肌细胞凋亡(数据未显示)。与活化CD8+T细胞预孵育(数据未显示)诱导了心肌细胞凋亡，而非活化CD8⁺T细胞没有致病作用。活化CD8+T细胞的促凋亡活性是剂量依赖的，并且在颗粒酶B缺失的情况下显著降低(数据未显示)。

颗粒酶B缺陷型CD8+T淋巴细胞不会影响急性MI后的心脏重塑和功能

为了进一步证实CD8细胞衍生的颗粒酶B在这种情况下的作用，我们向Rag1^-/-小鼠注射了CD8⁺T细胞耗减的脾细胞、CD8⁺T耗减的脾细胞并再补充有野生型或Gzm-B^-/-CD8⁺T淋巴细胞(图3A)。我们首次证实，与仅注射CD8⁺T细胞耗减的脾细胞的小鼠相比，再补充野生型或Gzm-B^-/-CD8⁺T淋巴细胞显著增加了Rag1^-/-小鼠脾脏和心脏中的CD8⁺T细胞数量(数据未显示)。有趣的是，我们发现与仅接受CD8+T细胞耗减的脾细胞相比，再补充野生型CD8⁺T淋巴细胞与受损心肌内Cd11b⁺Ly6G^-Ly6C^hi单核细胞和CD3^-Ly6G^-F4/80⁺巨噬细胞数量的增加有关(数据未显示)，这种表型在再补充有Gzm-B^-/-CD8⁺T淋巴细胞的小鼠中被消除(数据未显示)。因此，在这种免疫缺陷小鼠的再补充模型中，CD8⁺T细胞来源的颗粒酶B可能参与急性MI后经典单核细胞和巨噬细胞的选择性组织募集。

然后，我们检查了CD8⁺T淋巴细胞中的颗粒酶B缺陷对缺血后心脏重塑的影响。我们发现，与转移CD8耗减的脾细胞相比，将野生型CD8⁺T细胞转移到Rag1^-/-小鼠中降低了MI后的21天存活率(图3B)和左心室缩短分数(图3C)(p<0.05)。CD8重迁入(repopulation)越高，LV收缩功能障碍越严重(图3F)。这种对死亡率和LV收缩功能的致病作用在再补充Gzm-B^-/-CD8⁺T淋巴细胞后被消除(图3B-3C)。CD8⁺T细胞补充还增加了梗塞面积(p＝0.04；图3C)和胶原蛋白含量(图3D)，这被Gzm-B^-/-CD8+T淋巴细胞的再补充所拮抗(图3E-3F)。

人类MI环境中的颗粒酶B和CD8⁺T细胞

在从急性MI患者获得的人类心脏活检中，我们在MI后第3天和第8天检测到缺血性心脏组织中的CD8⁺T细胞浸润(数据未显示)。颗粒酶B在MI的第一周内主要在梗塞区域中检测到，但在第7天后主要在梗塞周围区域中检测到(数据未显示)。

最后，我们通过评估一组1046名因急性MI入院的患者的循环颗粒酶B水平与临床结果之间的关系，探讨了这些发现与人类疾病的相关性。患者的特征在表1中给出。有趣的是，我们发现，因急性MI入院时具有高循环颗粒酶B水平(>中值8.9pg/mL)的患者与低水平的患者相比在随访一年后的死亡风险显著增加，即使是在调整了多个多变量风险因素后(风险比，HR＝2.2，95％CI＝1.2-4.0，p＝0.009)(图4)。

讨论：

我们在此聚焦颗粒酶B的作用，因为它在冠状动脉闭塞后的早期时间点在梗塞周围区域检测到，并且主要与浸润CD8⁺T细胞和TUNEL+细胞共定位。此外，颗粒酶B先前已被鉴定为自身免疫疾病如糖尿病[16]以及炎性疾病包括卒中[17]的主要毒性蛋白。我们发现整体颗粒酶B缺陷(GzmB^-/-小鼠)在小鼠急性MI的情况下具有保护作用，限制了心脏细胞凋亡、促炎局部特征和梗塞面积。为了证实颗粒酶B介导的CD8⁺T细胞在急性心肌缺血情况下的细胞毒作用，我们进行了额外的实验。在体外，我们显示，当CD8⁺T细胞分离自GzmB^-/-小鼠时，活化的纯化CD8⁺T细胞诱导心肌细胞凋亡，并且细胞死亡被消除。此外，当用GzmB^-/-CD8⁺T细胞重迁入动物时，Rag1^-/-小鼠中CD8⁺T细胞重建(reconstitution)对心脏的有害影响被消除。在MI患者的人心脏组织中检测到表达颗粒酶B的T细胞，其在MI后第一周内主要位于梗塞区域，但在第7天后在边界区积累。最后，我们发现，一组MI患者入院48小时内的颗粒酶B血浆水平与显著更高的1年死亡率相关。因此，这些结果促使我们认为酶B的中和将适用于治疗MI。

表1：根据基线血浆颗粒酶B水平纳入的患者的特征。CAD(Coronary ArteryDisease)，冠状动脉疾病；PCI(Percutaneous coronary intervention)，经皮冠状动脉介入治疗；CABG(Coronary By-Pass Graft)，冠状动脉旁路移植术；TIA(Transient ischemicattack)，短暂性缺血发作；STEMI(ST Elevation Myocardial Infarction)，ST抬高心肌梗塞。

在整个本申请中，各种参考文献描述了本发明所属的现有技术。这些参考文献的公开内容在此通过引用并入本公开中。

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<210> 1

<211> 247

<212> PRT

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 1

Met Gln Pro Ile Leu Leu Leu Leu Ala Phe Leu Leu Leu Pro Arg Ala

1 5 10 15

Asp Ala Gly Glu Ile Ile Gly Gly His Glu Ala Lys Pro His Ser Arg

20 25 30

Pro Tyr Met Ala Tyr Leu Met Ile Trp Asp Gln Lys Ser Leu Lys Arg

35 40 45

Cys Gly Gly Phe Leu Ile Arg Asp Asp Phe Val Leu Thr Ala Ala His

50 55 60

Cys Trp Gly Ser Ser Ile Asn Val Thr Leu Gly Ala His Asn Ile Lys

65 70 75 80

Glu Gln Glu Pro Thr Gln Gln Phe Ile Pro Val Lys Arg Pro Ile Pro

85 90 95

His Pro Ala Tyr Asn Pro Lys Asn Phe Ser Asn Asp Ile Met Leu Leu

100 105 110

Gln Leu Glu Arg Lys Ala Lys Arg Thr Arg Ala Val Gln Pro Leu Arg

115 120 125

Leu Pro Ser Asn Lys Ala Gln Val Lys Pro Gly Gln Thr Cys Ser Val

130 135 140

Ala Gly Trp Gly Gln Thr Ala Pro Leu Gly Lys His Ser His Thr Leu

145 150 155 160

Gln Glu Val Lys Met Thr Val Gln Glu Asp Arg Lys Cys Glu Ser Asp

165 170 175

Leu Arg His Tyr Tyr Asp Ser Thr Ile Glu Leu Cys Val Gly Asp Pro

180 185 190

Glu Ile Lys Lys Thr Ser Phe Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val

195 200 205

Cys Asn Lys Val Ala Gln Gly Ile Val Ser Tyr Gly Arg Asn Asn Gly

210 215 220

Met Pro Pro Arg Ala Cys Thr Lys Val Ser Ser Phe Val His Trp Ile

225 230 235 240

Lys Lys Thr Met Lys Arg Tyr

245

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> GAPDH正向

<400> 2

cgtcccgtag acaaaatggt gaa 23

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> GAPDH反向

<400> 3

gccgtgagtg gagtcatact ggaaca 26

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> GRZB正向

<400> 4

gtgcggggga cccaaagacc aaac 24

<210> 5

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> GRZB反向

<400> 5

gcacgtggag gtgaaccatc cttatat 27

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> IL1beta正向

<400> 6

gaagagccca tcctctgtga 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> IL1 beta反向

<400> 7

gggtgtgccg tctttcatta 20

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> IL6 正向

<400> 8

tgacaaccac ggccttccct a 21

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> IL6反向

<400> 9

tcagaattgc cattgcacaa ctctt 25

<210> 10

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> IL10 正向

<400> 10

acttcccagt cggccagagc cacat 25

<210> 11

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> IL10反向

<400> 11

gatgacagcg cctcagccgc atcct 25

<210> 12

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> IL15正向

<400> 12

ccggtgccaa gatctgtgtc tct 23

<210> 13

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> IL15反向

<400> 13

gttgcacagg ggagtctggt ctt 23

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> TNF-alpha正向

<400> 14

gatggggggc ttccagaact 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> TNF-alpha反向

<400> 15

gatggggggc ttccagaact 20

<210> 16

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> MMP9正向

<400> 16

gcgtcattcg cgtggataag gagt 24

<210> 17

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> MMP9反向

<400> 17

gtagcccacg tcgtccacct ggtt 24

Claims

1.一种向经历过心肌梗塞的受试者提供心脏保护的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的颗粒酶B抑制剂。

2.如权利要求1所述的方法，其适于降低心脏衰竭的风险或发展。

3.如权利要求1至2所述的方法，其中，所述颗粒酶B抑制剂是中和抗体。

4.如权利要求1至2所述的方法，其中，所述颗粒酶B抑制剂是单克隆抗体。

5.如权利要求1至2所述的方法，其中，所述颗粒酶B抑制剂是颗粒酶B表达的抑制剂。

6.如权利要求5所述的方法，其中，所述颗粒酶B表达的抑制剂是siRNA、反义寡核苷酸或核酶。

7.一种筛选适于向经历过心肌梗塞的受试者提供心脏保护的药物的方法，所述方法包括i)提供测试化合物和ii)确定所述测试化合物抑制颗粒酶B的表达或活性的能力。

8.药物组合物，其包含颗粒酶B抑制剂。