JP2022531347A - 新規のｏｍｎｉ－５０ｃｒｉｓｐｒヌクレアーゼ - Google Patents

Abstract

本発明は、配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有する配列を含むＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、またはＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列を含む核酸分子を含む、天然に存在しない組成物を提供する。

Description

本出願は、2020年3月18日出願の米国仮特許出願第62/991,285号、2020年1月10日出願の同第62/959,672号、2019年11月6日出願の同第62/931,630号、2019年9月9日出願の同第62/897,806号、および2019年4月30日出願の同第62/841,046号の利益を主張し、これらの内容は、参照により本明細書に組み込まれる。

本出願全体を通して、括弧内で参照されているものを含む様々な刊行物が参照される。本出願で言及されるすべての刊行物のそれらの全体における開示は、本発明が属する技術分野および本発明とともに用いることができる技術分野の特色の追加の説明を提供するために、参照により本出願に組み込まれる。

配列表への参照
本出願は、１８６キロバイトのサイズであり、本出願の一部として2020年4月30日出願のテキストファイルに含まれる、MS-Windowとのオペレーティングシステムの互換性を有するIBM-PCマシンフォーマットで2020年4月29日に作成された「200430_91116-A-PCT_SequenceListing_AWG.txt」という名称のファイルに存在するヌクレオチド配列を参照により組み込む。

本発明は、とりわけ、ゲノム編集のための組成物および方法を対象とする。

細菌および古細菌適応免疫のクラスター化された規則的な間隔の短い回文配列反復（ＣＲＩＳＰＲ）システムは、タンパク質組成およびゲノム遺伝子座アーキテクチャの極めて高い多様性を示す。ＣＲＩＳＰＲシステムは、研究およびゲノム操作のための重要なツールとなっている。それにもかかわらず、ＣＲＩＳＰＲシステムの多くの詳細は、決定されておらず、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの適用可能性は、配列特異性要件、発現、または送達における困難によって限定され得る。異なるＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、サイズ、ＰＡＭ部位、オンターゲット活性、特異性、切断パターン（例えば、ブラントエンド、付着末端）、および切断に続くインデル形成の卓越したパターンなどの多様な特徴を有する。異なる特徴の組は、異なる用途に有用であり得る。例えば、ＰＡＭ部位の限定に起因して他のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼが標的化することができない特定のゲノム遺伝子座に、いくつかのＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを標的化することが可能であり得る。加えて、現在使用されているいくつかのＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、インビボでの適用可能性を限定し得る前免疫を呈する。Charlesworth et al., Nature Medicine(2019)およびWagner et al., Nature Medicine(2019)を参照されたい。したがって、新規のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの発見、操作、および改善は、重要である。

本明細書で開示されるのは、ゲノム操作、エピゲノム操作、ゲノム標的化、細胞のゲノム編集、および／またはインビトロ診断のために利用することができる組成物および方法である。

本開示の組成物は、ゲノムＤＮＡ配列を改変するために利用することができる。本明細書で使用される場合、ゲノムＤＮＡは、目的の１つの細胞または複数の細胞に存在する線状および／もしくは染色体ＤＮＡ、ならびに／またはプラスミド、または他の染色体外ＤＮＡ配列を指す。いくつかの実施形態では、目的の細胞は、真核細胞である。いくつかの実施形態では、目的の細胞は、原核細胞である。いくつかの実施形態では、方法は、ゲノムＤＮＡ配列内の所定の標的部位で二重鎖分解（ＤＳＢ）を生じ、ゲノム内の標的部位におけるＤＮＡ配列の変異、挿入、および／または欠失を生じる。

したがって、いくつかの実施形態では、組成物は、クラスター化された規則的な間隔の短い回文配列反復（ＣＲＩＳＰＲ）ヌクレアーゼを含む。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質である。

いくつかの実施形態では、組成物は、Ezakiella peruensis株Ｍ６．Ｘ２に由来するＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと１００％、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８５％の同一性を有する、クラスター化された規則的な間隔の短い回文配列反復（ＣＲＩＳＰＲ）ヌクレアーゼを含む。各可能性は、別個の実施形態を表す。

ＯＭＮＩ－５０ヌクレアーゼ
本発明の実施形態は、表１に提供される「ＯＭＮＩ－５０」ヌクレアーゼとして指定されるＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを提供する。

本発明は、哺乳類細胞のゲノム内の標的部位におけるヌクレオチド配列を改変する方法であって、（ｉ）配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、または配列が配列番号１２もしくは１３の核酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列を含む核酸分子を含む組成物と、（ｉｉ）標的ＤＮＡ内の配列に相補的なヌクレオチド配列を含む、ＤＮＡ標的化ＲＮＡ分子、またはＤＮＡ標的化ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡポリヌクレオチドと、を細胞に導入することを含む、方法を提供する。

本発明はまた、ＣＲＩＳＰＲ関連システムを含む、天然に存在しない組成物であって、ＣＲＩＳＰＲ関連システムは、
ａ）直接反復配列に連結されたガイド配列部分を含む１つ以上のＲＮＡ分子であって、ガイド配列が、標的配列とハイブリダイゼーションすることが可能である、１つ以上のＲＮＡ分子、または１つ以上のＲＮＡ分子をコードする１つ以上のヌクレオチド配列と、
ｂ）配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、またはＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列を含む核酸分子と、を含み、
１つ以上のＲＮＡ分子が、標的配列にハイブリダイゼーションし、標的配列が、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の３’であり、１つ以上のＲＮＡ分子が、ＲＮＡガイドヌクレアーゼと複合体を形成する、組成物を提供する。

本発明はまた、天然に存在しない組成物であって、
ａ）配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有する配列を含むＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、またはＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列を含む核酸分子と、
ｂ）１つ以上のＲＮＡ分子、または１つ以上のＲＮＡ分子をコードする１つ以上のＤＮＡポリヌクレオチドであって、
ｉ）ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと相互作用／結合することが可能なヌクレアーゼ結合ＲＮＡヌクレオチド配列、および
ｉｉ）標的ＤＮＡ配列内の配列に相補的な配列を含む、ＤＮＡ標的化ＲＮＡヌクレオチド配列、のうちの少なくとも１つを含む、１つ以上のＲＮＡ分子、または１つ以上のＲＮＡ分子をコードする１つ以上のＤＮＡポリヌクレオチドと、を含み、
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼが、１つ以上のＲＮＡ分子と複合体化して、標的ＤＮＡ配列とハイブリダイゼーション可能な複合体を形成することが可能である、組成物を提供する。

図１Ａ：各ヌクレアーゼのｓｇＲＮＡの設計において可能な要素の同定に使用される、完全二重鎖ＲＮＡ要素（ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡキメラ）の予測される二次構造の例。上部ステムの異なる位置で二重鎖を短縮することによって、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡをテトラループ「ｇａａａ」を用いて接続して、ｓｇＲＮＡ足場を生成した。 図１Ｂ～図１Ｃ：単一ヌクレアーゼとともに使用するために設計された、２つの異なるｓｇＲＮＡ、Ｖ１（図１Ｂ）、およびＶ２（図１Ｃ）の領域間の構造の変動の例。上部ステムの異なる位置で二重鎖を短縮することによって、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡをテトラループ「ｇａａａ」を用いて接続して、ｓｇＲＮＡ足場を生成した。 図１Ｂ～図１Ｃ：単一ヌクレアーゼとともに使用するために設計された、２つの異なるｓｇＲＮＡ、Ｖ１（図１Ｂ）、およびＶ２（図１Ｃ）の領域間の構造の変動の例。上部ステムの異なる位置で二重鎖を短縮することによって、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡをテトラループ「ｇａａａ」を用いて接続して、ｓｇＲＮＡ足場を生成した。 図２Ａ：無細胞インビトロＴＸＴＬ系におけるＯＭＮＩ－５０ ｓｇＲＮＡ Ｖ１の８ｂｐ配列に沿った、すべての可能なＰＡＭ位置の縮合４Ｎウインドウライブラリ。枯渇アッセイ結果に基づいて生成された、ＰＡＭ部位の配列モチーフ。活性は、２つの最も枯渇した配列の平均に基づいて推定され、以下のように計算した：１－枯渇スコア。 図２Ｂ：ＯＭＮＩ－５０ ｓｇＲＮＡ Ｖ２の８ｂｐ配列に沿って生成された、すべての可能なＰＡＭ位置の配列モチーフ。 図３：哺乳類細胞におけるＯＭＮＩ－５０の発現。ＯＭＮＩ－５０またはＳｐＣａｓ９ヌクレアーゼを、Ｈｅｋ２９３Ｔ細胞に一過性にトランスフェクトした。細胞を採取し、７２時間で溶解させ、溶解物を使用して、ＨＡタグに対する抗体を使用するウエスタンブロットによって、哺乳類細胞におけるＯＭＮＩ－５０発現を試験した。ＳｐＣａｓ９－ＨＡは、陽性対照として機能させたのと同じ様式でトランスフェクトした。ＧＡＰＤＨを使用して、充填量を正規化した。 図４Ａ：ヒト細胞における本質的忠実性。ｓｇＲＮＡ発現プラスミドと一緒にＤＮＡトランスフェクションすることによって、ＯＭＮＩ－５０またはＳｐＣａｓ９ヌクレアーゼを哺乳類細胞系で発現させた。部位特異的ゲノムＤＮＡ増幅およびＮＧＳに、細胞溶解物を使用した。ＥＬＡＮＥｇ３５＿ＯＭＮＩ－５０またはＥＬＡＮＥｇ６２＿ＯＭＮＩ－５０を使用して、段落ｖｉｉのＨｅＬａ細胞株における標的対オフターゲット編集に記載されているように、インデルの割合を測定し、分析した。両方の場合のゲノムオンターゲット配列およびオフターゲット配列を、チャートの下に表記し、ＰＡＭ配列は下線で表記する。各実験は、３つの独立した反復を表す。 図４Ｂ：ＯＭＮＩ－５０またはＥＬＡＮＥｇ３５標的化ＳｐＣａｓ９のＲＮＰ導入に続いて、溶解、部位特異的ＤＮＡ増幅、およびＮＧＳを行った。オンターゲット配列およびオフターゲット配列の編集レベルを、第２のシステムで示す。 図５Ａ～図５Ｄ：ＲＮＰとしてのＯＭＮＩ－５０活性アッセイ。ＯＭＮＩ－５０ヌクレアーゼを過剰発現させ、精製した。精製したタンパク質を合成ｓｇＲＮＡと複合体化させて、ＲＮＰを形成した。インビトロアッセイ（図５Ａおよび図５Ｂ）では、ＲＮＰを、対応する標的およびＰＡＭ配列（表５に列挙）を含有する線状ＤＮＡテンプレートとともにインキュベートした。線状テンプレートの切断によって、活性を検証した。図５Ａ：ガイド３５の異なるスペーサー長（１７～２３ｂｐｓ）を有するＯＭＮＩ－５０ＲＮＰの活性アッセイ（表１０）。 図５Ａ～図５Ｄ：ＲＮＰとしてのＯＭＮＩ－５０活性アッセイ。ＯＭＮＩ－５０ヌクレアーゼを過剰発現させ、精製した。精製したタンパク質を合成ｓｇＲＮＡと複合体化させて、ＲＮＰを形成した。インビトロアッセイ（図５Ａおよび図５Ｂ）では、ＲＮＰを、対応する標的およびＰＡＭ配列（表５に列挙）を含有する線状ＤＮＡテンプレートとともにインキュベートした。線状テンプレートの切断によって、活性を検証した。図５Ｂ：２０～２３ｎｔｓのスペーサー長を有する、減少させた量（４ｐｍｏｌ、２ｐｍｏｌ、１．２ｐｍｏｌ、０．６ｐｍｏｌ、および０．２ｐｍｏｌ）のＲＮＰを、１００ｎｇのＤＮＡ標的テンプレートとともにインキュベートした。 図５Ａ～図５Ｄ：ＲＮＰとしてのＯＭＮＩ－５０活性アッセイ。ＯＭＮＩ－５０ヌクレアーゼを過剰発現させ、精製した。精製したタンパク質を合成ｓｇＲＮＡと複合体化させて、ＲＮＰを形成した。インビボアッセイ（図５Ｃおよび図５Ｄ）では、Ｕ２ＯＳ細胞を、ＲＮＰとともに電気穿孔し、ＮＧＳによるインデル頻度の測定によって活性を決定した。図５Ｃ：Ｕ２ＯＳ細胞におけるＲＮＰとしてのＯＭＮＩ－５０の活性アッセイ：１７～２３ｂｐｓのスペーサー長を有するＲＮＰをＵ２ＯＳ細胞株に電気穿孔し、編集レベル（インデル）をＮＧＳによって測定した。 図５Ａ～図５Ｄ：ＲＮＰとしてのＯＭＮＩ－５０活性アッセイ。ＯＭＮＩ－５０ヌクレアーゼを過剰発現させ、精製した。精製したタンパク質を合成ｓｇＲＮＡと複合体化させて、ＲＮＰを形成した。インビボアッセイ（図５Ｃおよび図５Ｄ）では、Ｕ２ＯＳ細胞を、ＲＮＰとともに電気穿孔し、ＮＧＳによるインデル頻度の測定によって活性を決定した。図５Ｄ：Ｕ２ＯＳ細胞におけるＲＮＰとしてのＯＭＮＩ－５０の活性アッセイ：ＥＬＡＮＥ ｇ３５ ｓｇＲＮＡ Ｖ１－Ｖ４を含むＲＮＰをＵ２ＯＳ細胞株に電気穿孔し、編集レベル（インデル）をＮＧＳによって測定した。 ｉＰＳＣにおけるＲＮＰとしてのＯＭＮＩ－５０の活性アッセイ。１７～２３ｎｔｓのスペーサー長を有するＲＮＰ（表１０）をｉＰＳＣ細胞株に電気穿孔し、編集レベル（インデル）をＮＧＳによって測定した。 内因性哺乳類細胞背景でのＯＭＮＩ－５０ヌクレアーゼ活性ｓｇＲＮＡ発現プラスミドと一緒にＤＮＡトランスフェクションすることによって、ＯＭＮＩ－５０ヌクレアーゼを哺乳類細胞系で発現させた。部位特異的ゲノムＤＮＡ増幅およびＮＧＳに、細胞溶解物を使用した。インデルの割合を測定し、分析して編集レベルを決定した。ガイドＲＮＡを含まないＯＭＮＩ－５０ヌクレアーゼでトランスフェクトした細胞を、比較および背景決定のための陰性対照として機能させた。異なるゲノム位置における編集レベルを示す。 ＯＭＮＩ－５０ヌクレアーゼの概略図。ＯＭＮＩ－５０ヌクレアーゼは、概略図ではドメインＡ～Ｆとして表される、いくつかの機能ドメインを含む。ドメインＡは、３つのサブドメイン、Ａ１、Ａ２、およびＡ３を含み、概略図では白枠として表される。ドメインＢは、水平なストライプで概略図に表される。ドメインＣは、３つのサブドメイン、Ｃ１、Ｃ２、およびＣ３を含み、概略図では薄い陰影の枠として表されている。ドメインＢは、概略図では斜めのストライプで表される。ドメインＥは、概略図では濃い陰影の枠として表される。ドメインＦは、概略図では点線の枠として表される。

本発明のいくつかの態様によれば、本開示の組成物は、クラスター化された規則的な間隔の短い回文配列反復（ＣＲＩＳＰＲ）ヌクレアーゼおよび／またはそれをコードする配列を含む核酸分子を含む。

いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、配列番号３に記載のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと少なくとも１００％、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、または８２％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列は、配列番号１１～１３からなる群から選択される核酸配列と少なくとも９５％の同一性を有する。

いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、Ezakiella peruensis株Ｍ６．Ｘ２に由来するＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと少なくとも１００％、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。各可能性は、別個の実施形態を表す。

本発明のいくつかの態様によれば、本開示の組成物は、ＤＮＡ構築物、またはＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼもしくはバリアントＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含むベクター系を含む。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼまたはバリアントＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列は、目的の細胞で操作可能であるプロモーターに操作可能に連結されている。いくつかの実施形態では、目的の細胞は、真核細胞である。いくつかの実施形態では、目的の細胞は、哺乳類細胞である。いくつかの実施形態では、操作されたＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする核酸配列は、特定の生物からの細胞で使用するためにコドン最適化されている。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼをコードする核酸配列は、E. Coliにコドン最適化されている。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼをコードする核酸配列は、真核細胞にコドン最適化されている。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼをコードする核酸配列は、哺乳類細胞にコドン最適化されている。

いくつかの実施形態では、組成物は、配列番号３と少なくとも１００％、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％の同一性を有するＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするポリヌクレオチドに操作可能に連結した異種プロモーターを含む、組換え核酸を含む。各可能性は、別個の実施形態を表す。

組成物の一実施形態では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、配列番号３に記載のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９７％の同一性を有するか、またはＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列は、配列番号１１、１２、および１３からなる群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９７％の配列同一性を有する。

いくつかの実施形態によれば、配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも１００％、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８５％、８０％の同一性を有する配列を含むＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、またはＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列を含む核酸分子を含む、操作されたかまたは天然に存在しない組成物が提供される。各可能性は、別個の実施形態を表す。

一実施形態では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、操作されているか、または天然に存在しない。ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼはまた、組換えであり得る。そのようなＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、実験室方法（分子クローニング）を使用して生成され、複数の源からの遺伝物質を結び付け、生物では見出されないであろう配列を作製する。

一実施形態では、本発明のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、１つ以上のＲＮＡ分子と複合体化すると、ＳｐＣａｓ９ヌクレアーゼと比較して、標的部位に対する増加した特異性を呈する。

一実施形態では、本発明のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと１つ以上のＲＮＡ分子との複合体は、ＳｐＣａｓ９ヌクレアーゼと比較して、少なくとも、標的部位のオンターゲット編集活性の維持およびオフターゲット活性の低減を呈する。

一実施形態では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、ＤＮＡ標的化ＲＮＡ分子（ｇＲＮＡ）と相互作用することが可能なＲＮＡ結合部分と、部位指向性酵素活性を呈する活性部分とをさらに含む。

一実施形態では、組成物は、ＤＮＡ標的化ＲＮＡ分子またはＤＮＡ標的化ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡポリヌクレオチドをさらに含み、ＤＮＡ標的化ＲＮＡ分子が、標的領域内の配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、ＤＮＡ標的化ＲＮＡ分子とＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼとが、一緒に天然に存在しない。

一実施形態では、ＤＮＡ標的化ＲＮＡ分子は、配列ＧＵＵＵＧＡＧＡＧを含むｃｒＲＮＡ反復配列を含む。

一実施形態では、ＤＮＡ標的化ＲＮＡ分子は、配列番号４１～４３および配列番号１４９～１５４から選択される１つ以上の配列を含むｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含む。

一実施形態では、ＤＮＡ標的化ＲＮＡ分子は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと複合体を形成することができるヌクレオチド配列をさらに含む。

本発明はまた、ＣＲＩＳＰＲ関連システムを含む、天然に存在しない組成物であって、ＣＲＩＳＰＲ関連システムは、
ａ）直接反復配列に連結されたガイド配列部分を含む１つ以上のＲＮＡ分子であって、ガイド配列が、標的配列とハイブリダイゼーションすることが可能である、１つ以上のＲＮＡ分子、または１つ以上のＲＮＡ分子をコードする１つ以上のヌクレオチド配列と、
ｂ）配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、またはＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列を含む核酸分子と、を含み、
１つ以上のＲＮＡ分子が、標的配列にハイブリダイゼーションし、標的配列が、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の３’であり、１つ以上のＲＮＡ分子が、ＲＮＡガイドヌクレアーゼと複合体を形成する、組成物を提供する。

一実施形態では、組成物は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと複合体を形成することができるヌクレオチド配列を含むＲＮＡ分子（ｔｒａｃｒＲＮＡ）、またはＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと複合体を形成することができるＲＮＡ分子をコードする配列を含むＤＮＡポリヌクレオチドをさらに含む。

一実施形態では、組成物は、相同性指向修復（ＨＤＲ）のためのドナーテンプレートをさらに含む。

一実施形態では、組成物は、細胞のゲノム内の標的領域を編集することが可能である。

組成物の一実施形態では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、配列番号３と少なくとも１００％、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８５％、８０％の同一性を有し、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと複合体を形成することができる、ＤＮＡ標的化ＲＮＡ分子内のヌクレオチド配列は、配列番号３７～４５、８７～８８、１４９～１５４、およびＧＵＵＵＧＡＧＡＧから選択される配列を含む。

いくつかの実施形態によれば、天然に存在しない組成物であって、
（ａ）ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、またはＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドであって、
ＲＮＡ結合部分、および
部位指向性酵素活性を呈する活性部分を含み、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼが、配列番号３と少なくとも１００％、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８５％、８０％の同一性を有する、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、またはＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドと、
（ｂ）１つ以上のＲＮＡ分子、または１つ以上のＲＮＡ分子をコードするＤＮＡポリヌクレオチドであって、
ｉ）標的ＤＮＡ配列内の配列に相補的なヌクレオチド配列を含む、ＤＮＡ標的化ＲＮＡ配列、および
ｉｉ）ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼのＲＮＡ結合部分と相互作用することが可能なタンパク質結合ＲＮＡ配列を含む、１つ以上のＲＮＡ分子、または１つ以上のＲＮＡ分子をコードするＤＮＡポリヌクレオチドと、を含み、
ＤＮＡ標的化ＲＮＡ配列とＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼとが、一緒に天然に存在しない、組成物が提供される。各可能性は、別個の実施形態を表す。

いくつかの実施形態では、ＤＮＡ標的化ＲＮＡ配列およびタンパク質結合ＲＮＡ配列を含む単一ＲＮＡ分子が提供され、ＲＮＡ分子が、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと複合体を形成し、ＤＮＡ標的化モジュールとして機能することができる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ分子は、最大１０００塩基長、９００塩基長、８００塩基長、７００塩基長、６００塩基長、５００塩基長、４００塩基長、３００塩基長、２００塩基長、１００塩基長、５０塩基長を有する。各可能性は、別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ標的化ＲＮＡ配列を含む第１のＲＮＡ分子、およびタンパク質結合ＲＮＡ配列を含む第２のＲＮＡ分子は、塩基対合によって相互作用するか、または代替的に一緒に融合して、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと複合体を形成し、ＤＮＡ標的化モジュールとして機能する１つ以上のＲＮＡ分子を形成する。

いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、配列番号３と少なくとも１００％、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８５％、８０％の同一性を有し、ＲＮＡ分子は、配列番号３７～４５、８７～８８、１４９～１５４、およびＧＵＵＵＧＡＧＡＧから選択される配列を含む。

本発明はまた、天然に存在しない組成物であって、
ａ）配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有する配列を含むＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、またはＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列を含む核酸分子と、
ｂ）１つ以上のＲＮＡ分子、または１つ以上のＲＮＡ分子をコードする１つ以上のＤＮＡポリヌクレオチドであって、
ｉ）ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと相互作用／結合することが可能なヌクレアーゼ結合ＲＮＡヌクレオチド配列、および
ｉｉ）標的ＤＮＡ配列内の配列に相補的な配列を含む、ＤＮＡ標的化ＲＮＡヌクレオチド配列、のうちの少なくとも１つを含む、１つ以上のＲＮＡ分子、または１つ以上のＲＮＡ分子をコードする１つ以上のＤＮＡポリヌクレオチドと、を含み、
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼが、１つ以上のＲＮＡ分子と複合体化して、標的ＤＮＡ配列とハイブリダイゼーション可能な複合体を形成することが可能である、組成物を提供する。

一実施形態では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼおよび１つ以上のＲＮＡ分子は、標的ＤＮＡ配列に結合して標的ＤＮＡ配列の切断をもたらすことが可能なＣＲＩＳＰＲ複合体を形成する。

一実施形態では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼおよび１つ以上のＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、一緒に天然に存在しない。

一実施形態では、
ａ）ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、ＲＮＡ結合部分と、部位指向性酵素活性を呈する活性部分とを含み、
ｂ）ＤＮＡ標的化ＲＮＡヌクレオチド配列は、標的ＤＮＡ配列内の配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、
ｃ）ヌクレアーゼ結合ＲＮＡヌクレオチド配列は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼのＲＮＡ結合部分と相互作用する配列を含む。

一実施形態では、ヌクレアーゼ結合ＲＮＡヌクレオチド配列およびＤＮＡ標的化ＲＮＡヌクレオチド配列は、単一ガイドＲＮＡ分子（ｓｇＲＮＡ）上にあり、ｓｇＲＮＡ分子が、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと複合体を形成し、ＤＮＡ標的化モジュールとして機能することができる。

一実施形態では、ヌクレアーゼ結合ＲＮＡヌクレオチド配列は、第１のＲＮＡ分子上にあり、ＤＮＡ標的化ＲＮＡヌクレオチド配列は、単一ガイドＲＮＡ分子上にあり、第１および第２のＲＮＡ配列は、塩基対合によって相互作用するか、または一緒に融合して、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと複合体を形成し、標的化モジュールとして機能する１つ以上のＲＮＡ分子またはｓｇＲＮＡを形成する。

一実施形態では、ｓｇＲＮＡは、最大１０００塩基長、９００塩基長、８００塩基長、７００塩基長、６００塩基長、５００塩基長、４００塩基長、３００塩基長、２００塩基長、１００塩基長、５０塩基長を有する。

一実施形態では、組成物は、相同性指向修復（ＨＤＲ）のためのドナーテンプレートをさらに含む。

いくつかの実施形態では、（ａ）ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、配列番号３と少なくとも１００％、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８５％、８０％の同一性を有するか、または（ｂ）ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列を含む核酸分子は、配列番号１１、１２、もしくは１３に記載の核酸配列と少なくとも９５％の配列同一性の配列を含み、ＰＡＭは、ＮＧＧである。好適なＰＡＭ配列の非限定的な例としては、ＧＧＧ、ＡＧＧ、およびＴＧＧが挙げられる。この実施形態では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと複合体を形成することができる、ＤＮＡ標的化ＲＮＡ分子内のヌクレオチド配列は、配列番号３７～４５、８７～８８、１４９～１５４、およびＧＵＵＵＧＡＧＡＧから選択される配列を含む。

いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、ＮＡＧまたはＮＧＡの配列を有するＰＡＭを利用する。

一実施形態では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの野生型のアミノ酸配列と比較して、１～１０、１０～２０、２０～３０、３０～４０、４０～５０、５０～６０、６０～７０、７０～８０、８０～９０、９０～１００、１００～１１０、１１０～１２０、１２０～１３０、１３０～１４０、または１４０～１５０個のアミノ酸置換、欠失、および／または挿入を含む。

一実施形態では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの野生型と比較して、少なくとも２％、５％、７％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、または３５％増加した特異性を呈する。

一実施形態では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの野生型と比較して、少なくとも２％、５％、７％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、または３５％増加した活性を呈する。

一実施形態では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの野生型と比較して、ＰＡＭ特異性が変化している。

一実施形態では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、天然に存在しない。

一実施形態では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、操作され、非天然または合成アミノ酸を含む。

一実施形態では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、操作され、核局在化配列（ＮＬＳ）、細胞透過性ペプチド配列、および／または親和性タグのうちの１つ以上を含む。

一実施形態では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、真核細胞の核において検出可能な量でのＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを含むＣＲＩＳＰＲ複合体の蓄積を推進するのに十分な強度の１つ以上の核局在化配列を含む。

本発明はまた、無細胞系または細胞のゲノム内の標的部位におけるヌクレオチド配列を改変する方法であって、本発明の組成物のうちのいずれかを細胞に導入することを含む、方法を提供する。

一実施形態では、細胞は、真核細胞である。

別の実施形態では、細胞は、原核細胞である。

いくつかの実施形態では、１つ以上のＲＮＡ分子は、ＲＮＡヌクレアーゼと複合体を形成することができるヌクレオチド分子を含むＲＮＡ配列（ｔｒａｃｒＲＮＡ）、またはＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと複合体を形成することができるヌクレオチド配列を含むＲＮＡ分子をコードするＤＮＡポリヌクレオチドをさらに含む。

一実施形態では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、アミノ末端もしくはその付近に１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上のＮＬＳを含むか、カルボキシ末端もしくはその付近に１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上のＮＬＳを含むか、またはアミノ末端もしくはその付近に１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上のＮＬＳとカルボキシ末端もしくはその付近に１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上のＮＬＳとの組み合わせを含む。一実施形態では、１～４個のＮＬＳを、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと融合させる。一実施形態では、ＮＬＳは、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）内に位置する。

ＮＬＳをアミノ末端もしくはその付近、カルボキシ末端もしくはその付近、または発現したタンパク質のＯＲＦ内で融合させる方法は、当該技術分野において周知である。一例として、ＮＬＳをＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼのアミノ末端に融合させるためには、ＮＬＳ融合ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする核酸上のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの開始コドンの直後にＮＬＳの核酸配列が配置される。逆に、ＮＬＳをＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼのカルボキシ末端に融合させるためには、ＮＬＳの核酸配列は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの最後のアミノ酸をコードするコドンの後、および終止コドンの前に配置される。

ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼのＯＲＦに沿った任意の位置に、ＮＬＳ、細胞透過性ペプチド配列、および／または親和性タグの任意の組み合わせが、本発明では企図される。

本明細書で提供されるＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼのアミノ酸配列および核酸配列は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの連続アミノ酸配列または核酸配列を中断するように挿入されたＮＬＳおよび／またはＴＡＧを含み得る。

一実施形態では、１つ以上のＮＬＳは、タンデム反復である。

一実施形態では、１つ以上のＮＬＳは、ＮＬＳの最も近いアミノ酸が、ポリペプチド鎖に沿ってＮ末端またはＣ末端から約１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０個以上のアミノ酸内にあると、Ｎ末端またはＣ末端に近接しているとみなされる。

考察されたように、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、核局在化配列（ＮＬＳ）、細胞透過性ペプチド配列、および／または親和性タグのうちの１つ以上を含むように操作され得る。

一実施形態では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、１つ以上のＲＮＡ分子と複合体化すると、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの野生型と比較して、標的部位に対する特異性の増加を呈する。

一実施形態では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと１つ以上のＲＮＡ分子との複合体は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの野生型と比較して、少なくとも、標的部位のオンターゲット編集活性の維持およびオフターゲット活性の低減を呈する。

一実施形態では、組成物は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列を含むヌクレオチド酸分子に操作可能に連結した異種プロモーターを含む組換え核酸分子をさらに含む。

一実施形態では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼまたはＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列を含む核酸分子は、天然に存在しないか、または操作されている。

本発明はまた、本発明のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼのうちのいずれかをコードする配列を含む核酸分子を含むベクター系を含む、天然に存在しないか、または操作された組成物を提供する。

本発明はまた、対象のゲノム内の標的部位におけるヌクレオチド配列を改変することを含む、ゲノム変異関連疾患に罹患している対象を治療するための、本発明の組成物のうちのいずれかの使用を提供する。

本発明は、哺乳類細胞のゲノム内の標的部位におけるヌクレオチド配列を改変する方法であって、（ｉ）配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、または配列が配列番号１２もしくは１３からなる群から選択される核酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列を含む核酸分子を含む組成物と、（ｉｉ）標的ＤＮＡ内の配列に相補的なヌクレオチド配列を含む、ＤＮＡ標的化ＲＮＡ分子、またはＤＮＡ標的化ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡポリヌクレオチドとを、細胞に導入することを含む、方法を提供する。

いくつかの実施形態では、方法は、エクスビボで実施される。いくつかの実施形態では、方法は、インビボで実施される。いくつかの実施形態では、方法のいくつかのステップは、エクスビボで実施され、いくつかのステップは、インビボで実施される。いくつかの実施形態では、哺乳類細胞は、ヒト細胞である。

一実施形態では、方法は、（ｉｉｉ）ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと相互作用する、ヌクレアーゼ結合ＲＮＡ配列を含むＲＮＡ分子、またはヌクレアーゼ結合ＲＮＡを含むＲＮＡ分子をコードするＤＮＡポリヌクレオチドを、細胞に導入することをさらに含む。

一実施形態では、ＤＮＡ標的化ＲＮＡ分子は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと活性複合体を形成するのに好適なｃｒＲＮＡ分子である。

一実施形態では、ヌクレアーゼ結合ＲＮＡ配列を含むＲＮＡ分子は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと活性複合体を形成するのに好適なｔｒａｃｒＲＮＡ分子である。

一実施形態では、ＤＮＡ標的化ＲＮＡ分子とヌクレアーゼ結合ＲＮＡ配列を含むＲＮＡ分子とは、単一ガイドＲＮＡ分子の形態で融合される。

一実施形態では、方法は、（ｉｖ）プロトスペーサー配列に相補的な配列を含むＲＮＡ分子を、細胞に導入することをさらに含む。

一実施形態では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、１つ以上のＲＮＡ分子と複合体を形成し、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の３’に二重鎖分解をもたらす。

一実施形態では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、１つ以上のＲＮＡ分子と複合体を形成し、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の５’に二重鎖分解をもたらす。

いくつかの実施形態では、（ａ）ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、配列番号３と少なくとも１００％、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８５％、８０％の同一性を有するか、または（ｂ）ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列を含む核酸分子は、配列番号１１、１２、もしくは１３に記載の核酸配列と少なくとも９５％の配列同一性の配列を含み、ＰＡＭは、ＮＧＧである。好適なＰＡＭ配列の非限定的な例としては、ＧＧＧ、ＡＧＧ、およびＴＧＧが挙げられる。この実施形態では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと複合体を形成することができる、ＤＮＡ標的化ＲＮＡ分子内のヌクレオチド配列は、配列番号３７～４５、８７～８８、１４９～１５４、およびＧＵＵＵＧＡＧＡＧから選択される配列を含む。

いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、ＮＡＧまたはＮＧＡの配列を有するＰＡＭを利用する。

本明細書に記載の方法のうちのいずれかの一実施形態では、方法は、ゲノム変異関連疾患に罹患している対象を治療するためのものであり、対象のゲノム内の標的部位におけるヌクレオチド配列を改変することを含む。

一実施形態では、方法は、まず、ゲノム変異関連疾患に罹患している対象を選択し、対象から細胞を得ることを含む。

本発明はまた、本明細書に記載の方法のうちのいずれかによって得られる改変された１つの細胞または複数の細胞を提供する。一実施形態では、これらの改変された１つの細胞または複数の細胞は、子孫細胞を生じさせることが可能である。一実施形態では、これらの改変された１つの細胞または複数の細胞は、生着後に子孫細胞を生じさせることが可能である。

本発明はまた、これらの改変された細胞および薬学的に許容可能な担体を含む組成物を提供する。提供されるのはまた、細胞を薬学的に許容可能な担体と混合することを含む、組成物を調製するインビトロまたはエクスビボ方法である。

ＤＮＡ標的化ＲＮＡ分子
本発明の実施形態では、ＤＮＡ標的化ＲＮＡ配列は、ガイド配列部分を含む。ＲＮＡ分子の「ガイド配列部分」は、特定の標的ＤＮＡ配列にハイブリダイゼーション可能なヌクレオチド配列を指し、例えば、ガイド配列部分は、ガイド配列部分の長さに沿って標的ＤＮＡ配列に完全に相補的であるヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、ガイド配列部分は、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４ヌクレオチド長、またはおよそ１７～２４、１８～２２、１９～２２、１８～２０、１７～２０、または２１～２２ヌクレオチド長である。ガイド配列部分の全長は、ガイド配列部分の長さに沿って標的ＤＮＡ配列に完全に相補的である。ガイド配列部分は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと複合体を形成することができるＲＮＡ分子の一部であり得、ガイド配列部分がＣＲＩＳＰＲ複合体のＤＮＡ標的化部分として機能する。ガイド配列部分を有するＲＮＡ分子がＣＲＩＳＰＲ分子と同時に存在すると、ＲＮＡ分子は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを特異的標的ＤＮＡ配列に標的化させることが可能である。各可能性は、別個の実施形態を表す。任意の所望の配列に標的化するように、ＲＮＡ分子をカスタム設計することができる。

本発明の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、２０個以下のヌクレオチド、および／または２４個以上のヌクレオチドを有するガイド配列部分を含むＲＮＡ分子とともに使用したときのＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの切断活性と比較して、２１～２３個のヌクレオチドを有するガイド配列部分を含むＲＮＡ分子とともに使用すると、より高い切断活性を有する。本発明の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、２０個以下のヌクレオチド、および／または２３個以上のヌクレオチドを有するガイド配列部分を含むＲＮＡ分子とともに使用したときのＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの切断活性と比較して、２１～２２個のヌクレオチドを有するガイド配列部分を含むＲＮＡ分子とともに使用すると、より高い切断活性を有する。一実施形態では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、２２個のヌクレオチドを有するガイド配列部分を含むＲＮＡ分子とともに使用すると、最も高い切断活性を有する。

一実施形態では、そのようなＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、配列番号３に記載のアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するか、またはＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列は、配列番号１１～１３のうちのいずれかと少なくとも９５％の配列同一性を有する。一実施形態では、そのようなＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、配列番号３に記載のアミノ酸配列と少なくとも１００％、９９．５％、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、もしくは８２％の同一性を有するか、またはＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列は、配列番号１１～１３のうちのいずれかと少なくとも１００％、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、もしくは８２％の配列同一性を有する。

ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの特徴的な標的化ヌクレアーゼ活性は、その特異的ドメインの様々な機能によって付与される。本出願では、ＯＭＮＩ－５０ドメインは、図８のＯＭＮＩ－５０概略図に提示されるように、ドメインＡ、ドメインＢ、ドメインＣ、ドメインＤ、ドメインＥ、およびドメインＦとして定義される。

本明細書で使用される場合、ドメインＡは、３つのサブドメイン：サブドメインＡ１、サブドメインＡ２、およびサブドメインＡ３を含む。本明細書で使用される場合、サブドメインＡ１は、配列番号３の１～１０内のアミノ酸位置で開始し、４５～５５内のアミノ酸位置で終了し、サブドメインＡ２は、配列番号３の７３６～７４６内のアミノ酸位置で開始し、７８４～７９４内のアミノ酸位置で終了し、サブドメインＡ３は、配列番号３の９５７～９６７内のアミノ酸位置で開始し、１０９１～１１０１内のアミノ酸位置で終了する。Smith-Watermanアルゴリズムを使用して生成された局所アラインメントの好ましい分析に基づいて、一実施形態では、サブドメインＡ１は、配列番号３のアミノ酸１～５０として同定され、サブドメインＡ２は、配列番号３のアミノ酸７４１～７８９として同定され、サブドメインＡ３は、配列番号３のアミノ酸９６２～１０９６として同定されている。

本明細書で使用される場合、ドメインＢは、配列番号３の４６～５６内のアミノ酸位置で開始し、７８～８８内のアミノ酸位置で終了する。Smith-Watermanアルゴリズムを使用して生成された局所アラインメントの好ましい分析に基づいて、一実施形態では、ドメインＢは、配列番号３のアミノ酸５１～８３として同定されている。

本明細書で使用される場合、ドメインＣは、３つのサブドメイン：サブドメインＣ１、サブドメインＣ２、およびサブドメインＣ３、または代替的に２つのサブドメイン：サブドメインＣａおよびサブドメインＣｂを含む。本明細書で使用される場合、サブドメインＣ１は、配列番号３の７９～８９内のアミノ酸位置で開始し、１５５～１６５内のアミノ酸位置で終了し、サブドメインＣ２は、配列番号３の１５６～１６６内のアミノ酸位置で開始し、２９４～３０４内のアミノ酸位置で終了し、サブドメインＣ３は、配列番号３の２９５～３０５内のアミノ酸位置で開始し、７３２～７４２内のアミノ酸位置で終了する。Smith-Watermanアルゴリズムを使用して生成された局所アラインメントの好ましい分析に基づいて、一実施形態では、サブドメインＣ１は、配列番号３のアミノ酸８４～１６０として同定され、サブドメインＣ２は、配列番号３のアミノ酸１６１～２９９として同定され、サブドメインＣ３は、配列番号３のアミノ酸３００～７３７として同定されている。本明細書で使用される場合、サブドメインＣａは、配列番号３の７９～８９内のアミノ酸位置で開始し、４７３～４８３内のアミノ酸位置で終了し、サブドメインＣｂは、配列番号３の４７４～４８４内のアミノ酸位置で開始し、７３２～７４２内のアミノ酸位置で終了する。Smith-Watermanアルゴリズムを使用して生成された局所アラインメントの分析に基づいて、一実施形態では、サブドメインＣａは、配列番号３のアミノ酸８４～４７８として同定され、サブドメインＣｂは、配列番号３のアミノ酸４７９～７３７として同定されている。

本明細書で使用される場合、ドメインＤは、配列番号３の７８５～７９５内のアミノ酸位置で開始し、９５６～９６６内のアミノ酸位置で終了する。Smith-Watermanアルゴリズムを使用して生成された局所アラインメントの好ましい分析に基づいて、一実施形態では、ドメインＤは、配列番号３のアミノ酸７９０～９６１として同定されている。

本明細書で使用される場合、ドメインＥは、配列番号３の１０９２～１１０２内のアミノ酸位置で開始し、１１９１～１２０１内のアミノ酸位置で終了する。Smith-Watermanアルゴリズムを使用して生成された局所アラインメントの好ましい分析に基づいて、一実施形態では、ドメインＥは、配列番号３のアミノ酸１０９７～１１９６として同定されている。

本明細書で使用される場合、ドメインＦは、配列番号３の１１９２～１２０２内のアミノ酸位置で開始し、１３６０～１３７０内のアミノ酸位置で終了する。Smith-Watermanアルゴリズムを使用して生成された局所アラインメントの好ましい分析に基づいて、一実施形態では、ドメインＦは、配列番号３のアミノ酸１１９７～１３７０として同定されている。

各ＯＭＮＩ－５０ヌクレアーゼドメインの活性は、本明細書に記載されており、各ドメイン活性は、ヌクレアーゼの有利な特色の態様を提供する。

具体的には、ＯＭＮＩ－５０ドメインＡおよびは、ＤＮＡ鎖切断に関与するヌクレアーゼ活性部位を含有する。ドメインＡは、標的化ＲＮＡ分子がＤＮＡ標的部位に結合しているＤＮＡ鎖を切断する。

ドメインＢは、ＯＭＮＩ－５０がＤＮＡ部位の標的に結合すると、ＤＮＡ切断活性を開始することに関与する。

ドメインＣは、標的化ＲＮＡ分子に結合し、標的部位認識のための特異性の提供に関与する。ドメインＣは、各々がドメインＣ活性の特定の機能的態様に関与するサブドメインＣ１、サブドメインＣ２、およびサブドメインＣ３を含む。例えば、Ｃ３は、ＤＮＡ標的部位の感知に関与し、Ｃ２は、ヌクレアーゼドメイン（例えば、ドメインＤ）の活性化の調節に関与し、Ｃ１は、標的部位におけるヌクレアーゼドメインのロックに関与する。したがって、ドメインＣは、オフターゲット配列の切断の制御に関与する。

ドメインＤは、ＤＮＡ鎖切断に関与するヌクレアーゼ活性部位を含有する。ドメインＤは、ＤＮＡ標的部位に結合している標的化ＲＮＡ分子によって置き換えられるＤＮＡ鎖を切断する。

ドメインＥは、構造的にトポイソメラーゼドメインと同様である。

ドメインＦは、ＰＡＭ部位の照合および認識の態様を含む、ＰＡＭ部位特異性の提供に関与する。

他のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼドメインおよびそれらの一般機能のさらなる説明は、とりわけ、参照により本明細に組み込まれる、Mir et al., ACS Chem. Biol. (2019)、Palermo et al., Quarterly Reviews of Biophysics (2018)、Jiang and Doudna, Annual Review of Biophysics (2017),、Nishimasu et al., Cell (2014)およびNishimasu et al., Cell (2015)に見出すことができる。

本発明の一態様では、ＯＭＮＩ－５０ドメインまたはサブドメインと類似性を有するアミノ酸配列は、ペプチドが、ＯＭＮＩ－５０ドメインまたはサブドメイン活性の有利な特色を表示するように、天然に存在しないペプチド、例えば、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの設計および製造に利用することができる。

一実施形態では、そのようなペプチド、例えば、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、ＯＭＮＩ－５０ヌクレアーゼのドメインＡもしくはその３つのサブドメインのうちのいずれか１つ、ドメインＢ、ドメインＣもしくはその３つのサブドメインのうちのいずれか１つ、ドメインＤ、ドメインＥ、またはドメインＦのうちの少なくとも１つのアミノ酸配列と少なくとも１００％、９９．５％、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、または８２％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ペプチドは、ＯＭＮＩ－５０ヌクレアーゼのドメインＡもしくはその３つのサブドメインのうちのいずれか１つ、ドメインＢ、ドメインＣもしくはその３つのサブドメインのうちのいずれか１つ、ドメインＤ、ドメインＥ、またはドメインＦのうちの少なくとも１つのアミノ酸配列と少なくとも１００％、９９．５％、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、または８２％の同一性を有するペプチドアミノ酸配列を別として、完全長ＯＭＮＩ－５０アミノ酸配列（配列番号３）と比較して広範なアミノ酸変動性を呈する。一実施形態では、ペプチドは、２つのドメイン配列間に介在するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、介在するアミノ酸配列は、１～１０、１０～２０、２０～４０、４０～５０、または最大１００個のアミノ酸長である。一実施形態では、介在する配列は、リンカー配列である。

本発明の一態様では、ペプチド内の本明細書に記載のＯＭＮＩ－５０ヌクレアーゼのドメインのうちのいずれか１つをコードするアミノ酸配列は、元のＯＭＮＩ－５０ドメイン配列と比較して、１つ以上のアミノ酸置換を含み得る。アミノ酸置換は、保存的置換、すなわち、元のアミノ酸と同様の化学的特性を有するアミノ酸との置換であり得る。例えば、正に荷電したアミノ酸は、交互に正に荷電したアミノ酸と置換され得、例えば、アルギニン残基が、リジン残基と置換され得るか、または極性アミノ酸が、異なる極性アミノ酸と置換され得る。保存的置換は、より許容性が高く、ＯＭＮＩ－５０ヌクレアーゼのドメインのうちのいずれか１つをコードするアミノ酸配列は、１０％ほどのそのような置換を含有し得る。アミノ酸置換は、ラジカル置換、すなわち、元のアミノ酸とは異なる化学的特性を有するアミノ酸との置換であり得る。例えば、正に荷電したアミノ酸は、負に荷電したアミノ酸と置換され得、例えば、アルギニン残基が、グルタミン酸残基と置換され得るか、または極性アミノ酸が、非極性アミノ酸と置換され得る。アミノ酸置換は、半保存的置換であり得るか、またはアミノ酸置換は、任意の他のアミノ酸に対してであり得る。置換は、元のＯＭＮＩ－５０ドメイン機能と比較して活性を変化させ得、例えば、触媒ヌクレアーゼ活性を低減し得る。

本発明のいくつかの態様によれば、本開示の組成物は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを含む天然に存在しない組成物を含み、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼが、ＯＭＮＩ－５０ヌクレアーゼのドメインＡ、ドメインＢ、ドメインＣ、ドメインＤ、ドメインＥ、またはドメインＦのうちの少なくとも１つのアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を含む。本発明のいくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、または少なくとも５つのアミノ酸配列を含み、各アミノ酸配列が、ＯＭＮＩ－５０ヌクレアーゼのドメインＡ、ドメインＢ、ドメインＣ、ドメインＤ、ドメインＥ、またはドメインＦのアミノ酸配列のうちのいずれか１つに対応する。したがって、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、ＯＭＮＩ－５０ヌクレアーゼのドメインＡ、ドメインＢ、ドメインＣ、ドメインＤ、ドメインＥ、またはドメインＦのうちのいずれかに対応するアミノ酸配列の任意の組み合わせを含み得る。

いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、
ａ）配列番号３のアミノ酸１～５０と少なくとも９７％の配列同一性を有するサブドメインＡ１、
ｂ）配列番号３のアミノ酸７４１～７８９と少なくとも９７％の配列同一性を有するサブドメインＡ２、または
ｃ）配列番号３のアミノ酸９６２～１０９６と少なくとも９７％の配列同一性を有するサブドメインＡ３、
のうちの少なくとも１つを含む、ドメインＡを含む。

いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、配列番号３のアミノ酸５１～８３と少なくとも９７％の配列同一性を有するドメインＢを含む。

いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、
ａ）配列番号３のアミノ酸８４～１６０と少なくとも９７％の配列同一性を有するサブドメインＣ１、
ｂ）配列番号３のアミノ酸１６１～２９９と少なくとも９７％の配列同一性を有するサブドメインＣ２、または
ｃ）配列番号３のアミノ酸３００～７３７と少なくとも９７％の配列同一性を有するサブドメインＣ３、
のうちの少なくとも１つを含む、ドメインＣを含む。

いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、
ａ）配列番号３のアミノ酸８４～４７８と少なくとも９７％の配列同一性を有するサブドメインＣａ、および
ｂ）配列番号３のアミノ酸４７９～７３７と少なくとも９７％の配列同一性を有するサブドメインＣｂ
のうちの少なくとも１つを含む、ドメインＣを含む。

いくつかの実施形態では、ドメインＣは、配列番号３のアミノ酸８４～７３７と少なくとも９７％の配列同一性を有する。

いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、配列番号３のアミノ酸７９０～９６１と少なくとも９７％の配列同一性を有するドメインＤを含む。

いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、配列番号３のアミノ酸１０９７～１１９６と少なくとも９７％の配列同一性を有するドメインＥを含む。

いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、配列番号３のアミノ酸１１９７～１３７０と少なくとも９７％の配列同一性を有するドメインＦを含む。

いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、ドメインＡ、ドメインＢ、ドメインＣ、ドメインＤ、ドメインＥ、およびドメインＦを含み、
ａ）ドメインＡが、
ｉ．配列番号３のアミノ酸１～５０と少なくとも９７％の配列同一性を有するサブドメインＡ１、
ｉｉ．配列番号３のアミノ酸７４１～７８９と少なくとも９７％の配列同一性を有するサブドメインＡ２、および
ｉｉｉ．配列番号３のアミノ酸９６２～１０９６と少なくとも９７％の配列同一性を有するサブドメインＡ３、を含み、
ｂ）ドメインＢが、配列番号３のアミノ酸５１～８３と少なくとも９７％の配列同一性を有し、
ｃ）ドメインＣが、配列番号３のアミノ酸８４～７３７と少なくとも９７％の配列同一性を有し、
ｄ）ドメインＤが、配列番号３のアミノ酸７９０～９６１と少なくとも９７％の配列同一性を有し、
ｅ）ドメインＥが、配列番号３のアミノ酸１０９７～１１９６と少なくとも９７％の配列同一性を有し、
ｆ）ドメインＦが、配列番号３のアミノ酸１１９７～１３７０と少なくとも９７％の配列同一性を有する。

いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ配列は、少なくとも１００～２５０、２５０～５００、５００～１０００、または１０００～２０００アミノ酸長である。

本発明のいくつかの態様によれば、本開示の組成物は、ペプチドを含む天然に存在しない組成物を含み、ペプチドが、ＯＭＮＩ－５０ヌクレアーゼのドメインＡ、ドメインＢ、ドメインＣ、ドメインＤ、ドメインＥ、またはドメインＦのうちの少なくとも１つのアミノ酸配列と少なくとも９７％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、ドメインＡのアミノ酸配列は、
ａ）配列番号３のアミノ酸１～５０と少なくとも９７％の配列同一性を有するサブドメインＡ１、
ｂ）配列番号３のアミノ酸７４１～７８９と少なくとも９７％の配列同一性を有するサブドメインＡ２、または
ｃ）配列番号３のアミノ酸９６２～１０９６と少なくとも９７％の配列同一性を有するサブドメインＡ３、
のうちの少なくとも１つのアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、ドメインＢのアミノ酸配列は、配列番号３のアミノ酸５１～８３と少なくとも９７％の配列同一性を有する。

いくつかの実施形態では、ドメインＣのアミノ酸配列は、
ａ）配列番号３のアミノ酸８４～１６０と少なくとも９７％の配列同一性を有するサブドメインＣ１、
ｂ）配列番号３のアミノ酸１６１～２９９と少なくとも９７％の配列同一性を有するサブドメインＣ２、または
ｃ）配列番号３のアミノ酸３００～７３７と少なくとも９７％の配列同一性を有するサブドメインＣ３、
のうちの少なくとも１つのアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、ドメインＣのアミノ酸配列は、
ａ）配列番号３のアミノ酸８４～４７８と少なくとも９７％の配列同一性を有するサブドメインＣａ、および
ｂ）配列番号３のアミノ酸４７９～７３７と少なくとも９７％の配列同一性を有するサブドメインＣｂ
のうちの少なくとも１つのアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、ドメインＣのアミノ酸配列は、配列番号３のアミノ酸８４～７３７と少なくとも９７％の配列同一性を有する。

いくつかの実施形態では、ドメインＤのアミノ酸配列は、配列番号３のアミノ酸７９０～９６１と少なくとも９７％の配列同一性を有する。

いくつかの実施形態では、ドメインＥのアミノ酸配列は、配列番号３のアミノ酸１０９７～１１９６と少なくとも９７％の配列同一性を有する。

いくつかの実施形態では、ドメインＦのアミノ酸配列は、配列番号３のアミノ酸１１９７～１３７０と少なくとも９７％の配列同一性を有する。

いくつかの実施形態では、アミノ酸配列は、少なくとも１００～２５０、２５０～５００、５００～１０００、または１０００～２０００アミノ酸長である。

本発明のいくつかの態様によれば、本開示の組成物は、ＯＭＮＩ－５０ヌクレアーゼのドメインＡ、ドメインＢ、ドメインＣ、ドメインＤ、ドメインＥ、またはドメインＦのうちの少なくとも１つのアミノ酸配列と少なくとも９７％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド含む、天然に存在しない組成物を含む。

本発明のいくつかの態様によれば、本開示の組成物は、ＯＭＮＩ－５０ヌクレアーゼのドメインＡ、ドメインＢ、ドメインＣ、ドメインＤ、ドメインＥ、またはドメインＦのうちの少なくとも１つのアミノ酸配列と少なくとも９７％の配列同一性を有する天然に存在しないアミノ酸配列を含む。

本発明のいくつかの態様によれば、本開示の方法は、無細胞系または細胞のゲノム内の標的部位におけるヌクレオチド配列を改変する方法であって、本明細書に記載の実施形態のうちのいずれか１つの組成物を細胞に導入することを含む、方法を含む。

いくつかの実施形態では、細胞は、真核細胞、好ましくは、哺乳類細胞または植物細胞である。

本発明のいくつかの態様によれば、本開示の方法は、ゲノム変異関連疾患に罹患している対象を治療するための、本明細書に記載の組成物のうちのいずれか１つの使用であって、対象のゲノム内の標的部位におけるヌクレオチド配列を改変することを含む、使用を含む。

本発明のいくつかの態様によれば、本開示の方法は、変異障害を有する対象を治療する方法であって、本明細書に記載の組成物のうちのいずれか１つを、変異障害と関連する対立遺伝子に標的化することを含む、方法を含む。

いくつかの実施形態では、変異障害は、新生物、加齢関連黄斑変性、統合失調症、神経学的、神経変性、または運動障害、脆弱Ｘ症候群、分泌酵素関連障害、プリオン関連障害、ＡＬＳ、中毒、自閉症、アルツハイマー病、好中球減少症、炎症関連障害、パーキンソン病、血液および凝固疾患および障害、細胞調節不全および腫瘍疾患および障害、炎症および免疫関連疾患および障害、代謝性、肝臓、腎臓、およびタンパク質疾患および障害、筋肉および骨格疾患および障害、皮膚疾患および障害、神経学的および神経疾患および障害、ならびに眼疾患および眼障害のうちのいずれかから選択される疾患または障害に関連する。

いくつかの実施形態では、変異障害は、ベータサラセミアまたは鎌状赤血球貧血である。

いくつかの実施形態では、疾患と関連する対立遺伝子は、ＢＣＬ１１Ａである。

疾患および療法
本発明のある特定の実施形態は、遺伝子編集の形態、治療する方法、または療法として、ヌクレアーゼを、疾患または障害と関連する特定の遺伝子座に標的化する。例えば、遺伝子の編集またはノックアウトを誘導するために、カスタム設計されたガイドＲＮＡ分子を使用して、本明細書に開示の新規のヌクレアーゼを遺伝子の病原性変異対立遺伝子に特異的に標的化することができる。ガイドＲＮＡ分子は、好ましくは、まず、本明細書に示されるように、遺伝子編集が実施されている系にも依存する、ヌクレアーゼのＰＡＭ要件を考慮することによって設計される。例えば、ＯＭＮＩ－５０ヌクレアーゼを標的部位に標的化するように設計されたガイドＲＮＡ分子は、ＯＭＮＩ－５０ＰＡＭ配列「ＮＧＧ」に隣接する領域に相補的なスペーサー領域を含有するように設計される。ガイドＲＮＡ分子は、さらに、好ましくは、ヌクレアーゼの特異的活性を増加させ、オフターゲット効果を低減するために、十分であり、好ましくは最適な長さのスペーサー領域（すなわち、標的対立遺伝子に相補性を有するガイドＲＮＡ分子の領域）を含有するように設計される。例えば、ＯＭＮＩ－５０ヌクレアーゼを標的化するように設計されたガイドＲＮＡ分子は、高オンターゲット切断活性のための２２ｎｔのスペーサーを含有するように設計され得る。

非限定的な例として、ヌクレアーゼによって引き起こされるＤＮＡ損傷の際に、非相同末端接合（ＮＨＥＪ）経路が誘導され、フレームシフト変異の導入による変異対立遺伝子のサイレンシングをもたらすように、ガイドＲＮＡ分子は、ヌクレアーゼが変異対立遺伝子の特定領域に標的化するように設計され得る。ガイドＲＮＡ分子設計に対するこのアプローチは、ドミナントネガティブ変異の効果を変化させ、それによって対象を治療するために特に有用である。別個の非限定的な例として、ヌクレアーゼによって引き起こされるＤＮＡ損傷の際に、相同性指向修復（ＨＤＲ）経路が誘導され、変異対立遺伝子のテンプレート媒介性補正をもたらすように、ガイドＲＮＡ分子は、変異対立遺伝子の特定の病原性変異に標的化するように設計され得る。ガイドＲＮＡ分子に対するこのアプローチは、変異対立遺伝子のハプロ不全効果を変化させ、それによって対象を治療するために特に有用である。

疾患または障害を治療するための変化のために標的化され得る特定の遺伝子の非限定的な例を本明細書で以下に提示する。変異障害を誘導する特定の疾患関連遺伝子および変異は、文献に記載されている。そのような変異は、ＣＲＩＳＰＲ組成物を疾患関連遺伝子の対立遺伝子に標的化するようにＤＮＡ標的化ＲＮＡ分子を設計するために使用することができ、ＣＲＩＳＰＲ組成物が、ＤＮＡ損傷を引き起こし、ＤＮＡ修復経路を誘導して対立遺伝子を変化させ、それによって変異障害を治療する。

ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異は、好中球減少症と関連している。したがって、限定されないが、ＥＬＡＮＥに標的化する本発明の実施形態は、好中球減少症に罹患している対象を治療する方法で使用され得る。

ＣＸＣＲ４は、ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ－１）感染症の共受容体である。したがって、限定されないが、ＣＸＣＲ４に標的化する本発明の実施形態は、ＨＩＶ－１に罹患している対象を治療する方法、またはＨＩＶ－１感染に対する耐性を対象に付与する方法で使用され得る。

プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１）破壊は、腫瘍細胞のＣＡＲ－Ｔ細胞媒介性殺傷を向上させ、ＰＤ－１は、他のがん療法における標的であり得る。したがって、限定されないが、ＰＤ－１に標的化する本発明の実施形態は、がんに罹患している対象を治療する方法で使用され得る。一実施形態では、治療は、ＰＤ－１欠損となるように本発明に従って改変されているＴ細胞を用いるＣＡＲ－Ｔ細胞療法である。

加えて、ＢＣＬ１１Ａは、ヘモグロビン産生の抑制において役割を果たす遺伝子である。グロビン産生は、ＢＣＬ１１Ａを阻害することによって、サラセミアまたは鎌状赤血球貧血などの疾患を治療するために増加され得る。例えば、ＰＣＴ国際公開第2017/077394 A2号、米国公開第2011/0182867 A1号、Humbert et al. Sci. Transl. Med. (2019)およびCanver et al. Nature (2015)を参照されたい。したがって、限定されないが、ＢＣＬ１１Ａのエンハンサーに標的化する本発明の実施形態は、ベータサラセミアまたは鎌状赤血球貧血に罹患している対象を治療する方法で使用され得る。

本発明の実施形態はまた、任意の疾患関連遺伝子に標的化するために、以下の表Ａまたは表Ｂに列挙される疾患または障害のうちのいずれかを研究、変化、または治療するために使用され得る。実際、遺伝子座と関連する任意の疾患は、本明細書に開示のヌクレアーゼを、適切な疾患関連遺伝子、例えば、米国公開第2018/0282762 A1号および欧州特許第3079726 B1号に列挙されているものに標的化することによって、研究、変化、または治療することができる。

別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および／または科学用語は、本発明が関連する技術分野の当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと同様または同等の方法および材料を、本発明の実施形態の実施または試験で使用することができるが、例示的な方法および／または材料を以下に記載する。矛盾する場合、定義を含む本特許明細書が優先されるであろう。加えて、材料、方法、および実施例は、単なる例示であり、必ずしも限定することを意図しない。

別途記載されない限り、考察における本発明の実施形態の１つの特色または複数の特色の条件または関係特徴を修正する「実質的に」および「約」などの形容詞は、条件または特徴が、それが意図される用途のための実施形態の操作に対して許容可能な許容範囲内に定義されることを意味すると理解される。別途示されない限り、本明細書および特許請求の範囲における「または」という単語は、排他的なまたはではなく、包括的な「または」であるとみなされ、それが結合する項目のうちの少なくとも１つおよび任意の組み合わせを示す。

上および本明細書の他の箇所で使用される「ａ」および「ａｎ」という用語は、列挙された構成要素のうちの「１つ以上」を指すことが理解されるべきである。別途特別に記載されない限り、単数形の使用が複数形を含むことは当業者には明らかであろう。したがって、「ａ」、「ａｎ」、および「少なくとも１つ」という用語は、本出願において同義に使用される。

本教示のより良好な理解、および本教示の範囲を決して限定しないことを目的とするために、別途示されない限り、本明細書および特許請求の範囲で使用される量、割合、または比率、および他の数値を表すすべての数は、「約」という用語によってすべての事例で修正されるものと理解されるものである。したがって、別途逆の意味が示されない限り、以下の明細書および添付の特許請求の範囲に記載の数値パラメータは、得ることが求められる所望の特性に応じて変動し得る近似値である。最低限でも、各数値パラメータは、少なくとも、報告された有効数字の数に照らして、および通常の丸め技法を適用することによって解釈されるべきである。

本明細書で数値範囲が列挙される場合、本発明は、別途記載されない限り、上限と下限との間の各整数、ならびに上限および下限を含む各整数を企図することが理解される。

本明細書および本出願の特許請求の範囲では、動詞「含む（comprise）」、「含む（include）」、および「有する」、およびそれらの活用形の各々は、必ずしも動詞の１つの目的語または複数の目的語が、構成要素、要素、または動詞の１つの対象または複数の対象の一部の完全な列挙ではないことを示すために使用される。本明細書で使用される他の用語は、当該技術分野において周知の意味によって定義されることを意図される。

「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、「ヌクレオチド配列」、「核酸」、および「オリゴヌクレオチド」という用語は、同義に使用される。これらは、任意の長さのヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドのいずれか、またはそれらの類似体のポリマー形態を指す。ポリヌクレオチドは、任意の三次元構造を有し得、既知または未知の任意の機能を実施し得る。以下は、ポリヌクレオチドの非限定的な例である：遺伝子または遺伝子断片のコード領域または非コード領域、連結分析から定義される複数の遺伝子座（１つの遺伝子座）、鉄におけるエクソン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、転写ＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離ＤＮＡ、任意の配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブ、およびプライマーである、ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体などの１つ以上の改変ヌクレオチドを含み得る。存在する場合、ヌクレオチド構造への改変は、ポリマーの組み立て前または組み立て後に付与され得る。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド構成要素によって中断され得る。ポリヌクレオチドは、標識構成要素とのコンジュゲーションによってなどの重合後に、さらに改変され得る。

「ヌクレオチド類似体」または「改変ヌクレオチド」という用語は、ヌクレオシドの窒素塩基（例えば、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、またはウラシル（Ｕ）、アデニン（Ａ）、またはグアニン（Ｇ））の中もしくは上に、ヌクレオシドの糖部分（例えば、リボース、デオキシリボース、改変リボース、改変デオキシリボース、６員糖類似体、または開鎖糖類似体）、またはリン酸塩の中もしくは上に、１つ以上の化学的改変（例えば、置換）を含有するヌクレオチドを指す。本明細書に記載のＲＮＡ配列の各々は、１つ以上のヌクレオチド類似体を含み得る。

本明細書で使用される場合、以下のヌクレオチド識別子は、参照されるヌクレオチド塩基を表すために使用される。

本明細書で使用される場合、「標的化配列」または「標的化分子」という用語は、特定の標的配列にハイブリダイズすることが可能なヌクレオチド配列またはヌクレオチド配列を含む分子を指し、例えば、標的化配列は、標的化配列の長さに沿って標的配列に少なくとも部分的に相補的であるヌクレオチド配列を有する。標的化配列または標的化分子は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと複合体を形成することができる、標的化ＲＮＡ分子の一部であり得、標的化配列がＣＲＩＳＰＲ複合体の標的化部分として機能する。標的化配列を有する分子がＣＲＩＳＰＲ分子と同時に存在すると、ＲＮＡ分子は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを特異的標的配列に標的化させることが可能である。各可能性は、別個の実施形態を表す。任意の所望の配列に標的化するように、標的化ＲＮＡ分子をカスタム設計することができる。

本明細書で使用される場合、「標的化する」という用語は、標的化配列または標的化分子を、標的ヌクレオチド配列を有する核酸に優先的にハイブリダイゼーションすることを指す。「標的化する」という用語は、標的ヌクレオチド配列を有する核酸を優先的に標的化するが、オンターゲットハイブリダイゼーションに加えて、意図しないオフターゲットハイブリダイゼーションも生じ得るように、可変的なハイブリダイゼーション効率を包含することが理解される。ＲＮＡ分子を配列に標的化する場合、ＲＮＡ分子とＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ分子との複合体は、ヌクレアーゼ活性によりその配列に標的化することが理解される。

複数の細胞に存在するＤＮＡ配列に標的化する背景では、標的化は、ＲＮＡ分子のガイド配列部分と、細胞のうちの１つ以上の配列とのハイブリダイゼーションを包含し、また、ＲＮＡ分子と、複数の細胞においてすべての細胞よりも少ない標的配列とのハイブリダイゼーションを包含することが理解される。したがって、ＲＮＡ分子を複数の細胞の配列に標的化する場合、ＲＮＡ分子とＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼとの複合体は、細胞のうちの１つ以上の標的配列とハイブリダイズすることが理解され、また、すべての細胞よりも少ない標的配列とハイブリダイズし得ることが理解される。したがって、ＲＮＡ分子とＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼとの複合体は、１つ以上の細胞の標的配列とのハイブリダイゼーションと関連して二重鎖分解を導入し、また、すべての細胞よりも少ない標的配列とのハイブリダイゼーションと関連して二重鎖分解を導入し得ることが理解される。本明細書で使用される「改変された細胞」という用語は、二重鎖分解が、標的配列とのハイブリダイゼーション、すなわち、オンターゲットハイブリダイゼーションの結果として、ＲＮＡ分子とＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼとの複合体によって影響を受ける細胞を指す。

本明細書で使用される場合、「野生型」という用語は、当業者によって理解される当該技術分野の用語であり、変異形態またはバリアント形態とは区別される、天然に存在する生物、株、遺伝子、または特徴の典型的な形態を意味する。したがって、本明細書で使用される場合、アミノ酸またはヌクレオチドの配列が野生型配列を指す場合、バリアントは、例えば、置換、欠失、挿入を含む、その配列のバリアントを指す。本発明の実施形態では、操作されたＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、表１に示されるＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼのうちのいずれかのＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと比較して、少なくとも１つのアミノ酸改変（例えば、置換、欠失、および／または挿入）を含むバリアントＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼである。

「天然に存在しない」または「操作された」という用語は、同義に使用され、ヒトの操作を示す。核酸分子またはポリペプチドを指す場合、これらの用語は、核酸分子またはポリペプチドが、それらが天然で自然に関連し、天然で見出される少なくとも１つの他の構成要素を少なくとも実質的に含まないことを意味し得る。

本明細書で使用される場合、「アミノ酸」という用語は、グリシン、およびＤまたはＩの両方、光学異性体、およびアミノ酸類似体、およびペプチド模倣体を含む、天然および／または非天然または合成アミノ酸を含む。

本明細書で使用される場合、「ゲノムＤＮＡ」は、目的の１つの細胞または複数の細胞に存在する線状および／もしくは染色体ＤＮＡ、ならびに／またはプラスミド、または他の染色体外ＤＮＡ配列を指す。いくつかの実施形態では、目的の細胞は、真核細胞である。いくつかの実施形態では、目的の細胞は、原核細胞である。いくつかの実施形態では、方法は、ゲノムＤＮＡ配列内の所定の標的部位で二重鎖分解（ＤＳＢ）を生じ、ゲノム内の標的部位におけるＤＮＡ配列の変異、挿入、および／または欠失を生じる。

「真核生物」細胞としては、限定されないが、真菌細胞（酵母など）、植物細胞、動物細胞、哺乳類細胞、およびヒト細胞が挙げられる。

本明細書で使用される場合、「ヌクレアーゼ」という用語は、核酸のヌクレオチドサブユニット間のホスホジエステル結合を切断することが可能な酵素を指す。ヌクレアーゼは、天然源から単離されていても、または天然源に由来してもよい。天然源は、任意の生物であり得る。あるいは、ヌクレアーゼは、ホスホジエステル結合切断活性を保持する改変タンパク質または合成タンパク質であり得る。

本明細書で使用される場合、「ＰＡＭ」という用語は、標的ＤＮＡ配列に近接して位置し、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼによって認識される標的ＤＮＡのヌクレオチド配列を指す。ＰＡＭ配列は、ヌクレアーゼの同一性に応じて異なり得る。

本明細書で使用される場合、「変異障害」または「変異疾患」という用語は、変異によって引き起こされる遺伝子の機能不全に関連する任意の障害または疾患を指す。変異障害として現れる機能不全遺伝子は、その対立遺伝子のうちの少なくとも１つに変異を含有し、「疾患関連遺伝子」と称される。変異は、疾患関連遺伝子の任意の部分、例えば、調節部分、コード部分、または非コード部分にあり得る。変異は、置換、挿入、または欠失などの任意のクラスの変異であり得る。疾患関連遺伝子の変異は、劣性、ドミナントネガティブ、機能獲得、機能喪失、または遺伝子産物のハプロ不全をもたらす変異などの任意のタイプの変異のメカニズムによる障害または疾患として現れ得る。

本発明の実施形態が、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に隣接する目的の標的ゲノムＤＮＡ配列と会合するためなどの、ヌクレアーゼ、例えばＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと複合体化することが可能なＲＮＡ分子を開示していることを当業者は理解するであろう。次いで、ヌクレアーゼは標的ＤＮＡの切断を媒介して、プロトスペーサー内に二重鎖分解を作り出す。

本発明の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼおよび標的化分子は、標的ＤＮＡ配列に結合して標的ＤＮＡ配列の切断をもたらすＣＲＩＳＰＲ複合体を形成する。ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、さらなる別個のｔｒａｃｒＲＮＡ分子なしで、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼおよびＲＮＡ分子を含むＣＲＩＳＰＲ複合体を形成し得る。あるいは、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、ＲＮＡ分子、およびｔｒａｃｒＲＮＡ分子の間でＣＲＩＳＰＲ複合体を形成し得る。

「タンパク質結合配列」または「ヌクレアーゼ結合配列」という用語は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと結合してＣＲＩＳＰＲ複合体を形成することが可能な配列を指す。当業者は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと結合してＣＲＩＳＰＲ複合体を形成することが可能なｔｒａｃｒＲＮＡが、タンパク質またはヌクレアーゼ結合配列を含むことを理解するであろう。

ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの「ＲＮＡ結合部分」は、ＲＮＡ分子に結合してＣＲＩＳＰＲ複合体、例えばｔｒａｃｒＲＮＡ分子のヌクレアーゼ結合配列を形成し得るＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの部分を指す。ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの「活性部分（activity portion）」または「活性部分（active portion）」は、例えばＤＮＡ標的化ＲＮＡ分子と複合体を形成すると、ＤＮＡ分子内の二重鎖分解をもたらすＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの部分を指す。

ＲＮＡ分子は、塩基対形成を介してｔｒａｃｒＲＮＡにハイブリダイゼーションし、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進するように、ｔｒａｃｒＲＮＡ分子に十分に相補的な配列を含み得る。（米国特許第8,906,616号を参照されたい）。本発明の実施形態では、ＲＮＡ分子は、ｔｒａｃｒメイト配列を有する部分をさらに含み得る。

本発明の実施形態では、標的化分子は、ｔｒａｃｒＲＮＡ分子の配列をさらに含み得る。そのような実施形態は、ＲＮＡ分子のガイド部分（ｇＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ）と、トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）との合成融合として設計され得、一緒に単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を形成する。（Jinek et al., Science (2012)を参照されたい）。本発明の実施形態はまた、別個のｔｒａｃｒＲＮＡ分子およびガイド配列部分を含む別個のＲＮＡ分子を利用して、ＣＲＩＳＰＲ複合体を形成し得る。そのような実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡ分子は、塩基対合を介してＲＮＡ分子とハイブリダイゼーションし得、本明細書に記載された本発明のある特定の用途において有利であり得る。

本発明の実施形態では、ＲＮＡ分子は、ＲＮＡ分子の構造をさらに定義し得る「ネクサス」領域および／または「ヘアピン」領域を含み得る。（Briner et al., Molecular Cell (2014)を参照されたい）。

本明細書で使用される場合、「直接反復配列」という用語は、ヌクレオチド配列の特定のアミノ酸配列の２つ以上の反復を指す。

本明細書で使用される場合、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと「相互作用する」または「結合する」ことが可能なＲＮＡ配列または分子は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼとＣＲＩＳＰＲ複合体を形成するＲＮＡ配列または分子の能力を指す。

本明細書で使用される場合、「操作可能に連結した」という用語は、２つの配列間または分子間の関係（すなわち、融合、ハイブリダイゼーション）が、それらが意図された様式で機能することを可能にする関係を指す。本発明の実施形態では、ＲＮＡ分子がプロモーターに操作可能に連結されていると、ＲＮＡ分子とプロモーターとの両方が、意図された様式で機能することが可能になる。

本明細書で使用される場合、「異種プロモーター」という用語は、促進されている分子または経路が一緒に天然に存在しないプロモーターを指す。

本明細書で使用される場合、分子の配列間の塩基またはアミノ酸のＸ％が同じであり、かつ同じ相対位置にある場合、配列または分子は、別の配列または分子とＸ％の「配列同一性」を有する。例えば、第２のヌクレオチド配列と少なくとも９５％の配列同一性を有する第１のヌクレオチド配列は、他の配列と同じ相対位置において少なくとも９５％同一の塩基を有するであろう。

核局在化配列
「核局在化配列」および「ＮＬＳ」という用語は、核エンベロープバリアを越えて細胞の細胞質からのタンパク質と会合するタンパク質の輸送を指示するアミノ酸配列／ペプチドを示すために同義に使用される。「ＮＬＳ」という用語は、特定のペプチドの核局在化配列だけでなく、核エンベロープバリアを越えて細胞質ポリペプチドのトランスロケーションを指示することが可能なその誘導体も包含することが意図される。ＮＬＳは、ポリペプチドのＮ末端、Ｃ末端、またはＮ末端とＣ末端との両方に結合すると、ポリペプチドの核トランスロケーションを指示することが可能である。加えて、そのＮ末端またはＣ末端によってポリペプチドのアミノ酸配列に沿ってランダムに位置するアミノ酸側鎖に結合したＮＬＳを有するポリペプチドは、トランスロケーションされるであろう。典型的には、ＮＬＳは、タンパク質表面上に露出した正に荷電したリジンまたはアルギニンの１つ以上の短配列からなるが、他のタイプのＮＬＳが知られている。ＮＬＳの非限定的な例としては、ＳＶ４０ウイルス大型Ｔ抗原、ヌクレオプラズミン、ｃ－ｍｙｃ、ｈＲＮＰＡｌ Ｍ９ ＮＬＳ、インポーチン－アルファからのＩＢＢドメイン、筋腫Ｔタンパク質、ヒトｐ５３、マウスｃ－ａｂｌ ＩＶ、インフルエンザｖｉｍｓ ＮＳ１、肝炎ウイルスデルタ抗原、マウスＭｘ１タンパク質、ヒトポリ（ＡＤＰ－リボース）ポリメラーゼ、およびステロイドホルモン受容体（ヒト）グルココルチコイドに由来するＮＬＳ配列が挙げられる。そのようなＮＬＳ配列は、配列番号６９～８４として列挙される。

送達
本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼまたはＣＲＩＳＰＲ組成物は、タンパク質、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）、核酸ベクター、またはそれらの任意の組み合わせとして送達され得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ分子は、化学的改変を含む。好適な化学的改変の非限定的な例としては、2’-O-メチル（Ｍ）、2’-O-メチル、3’ホスホロチオエート（ＭＳ）または2’-O-メチル、3’ thioＰＡＣＥ（ＭＳＰ）、シュードウリジン、および1-メチルシュード-ウリジンが挙げられる。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。

本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼおよび／もしくはそれをコードするポリヌクレオチド、ならびに任意選択的に追加のタンパク質（例えば、ＺＦＰ、ＴＡＬＥＮ、転写因子、制限酵素）、ならびに／またはガイドＲＮＡなどのヌクレオチド分子は、任意の好適な手段によって標的細胞に送達され得る。標的細胞は、任意の環境の、例えば、単離されたもしくは単離されていない、培養中の、インビトロ、エクスビボ、インビボ、または植物体内で維持されている、任意のタイプの細胞、例えば、真核細胞または原核細胞であり得る。

いくつかの実施形態では、送達される組成物は、ヌクレアーゼのｍＲＮＡおよびガイドのＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、送達される組成物は、ヌクレアーゼのｍＲＮＡ、ガイドのＲＮＡ、およびドナーテンプレートを含む。いくつかの実施形態では、送達される組成物は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼおよびガイドＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、送達される組成物は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、ガイドＲＮＡ、および例えば、相同性指向修復を介した遺伝子編集のためのドナーテンプレートを含む。いくつかの実施形態では、送達される組成物は、ヌクレアーゼのｍＲＮＡ、ＤＮＡ標的化ＲＮＡ、およびｔｒａｃｒＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、送達される組成物は、ヌクレアーゼのｍＲＮＡ、ＤＮＡ標的化ＲＮＡ、およびｔｒａｃｒＲＮＡ、およびドナーテンプレートを含む。いくつかの実施形態では、送達される組成物は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼＤＮＡ標的化ＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、送達される組成物は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、ＤＮＡ標的化ＲＮＡ、およびｔｒａｃｒＲＮＡ、および例えば、相同性指向修復を介した遺伝子編集のためのドナーテンプレートを含む。

任意の好適なウイルスベクター系を使用して、ＲＮＡ組成物を送達することができる。従来のウイルスおよび非ウイルスに基づく遺伝子転写方法を使用して、細胞（例えば、哺乳類細胞、植物細胞など）および標的組織に核酸および／またはＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを導入することができる。そのような方法はまた、インビトロで細胞に、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼタンパク質をコードする核酸および／またはＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼタンパク質を投与するために使用され得る。ある特定の実施形態では、核酸および／またはＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、インビボまたはエクスビボ遺伝子療法を使用するために投与される。非ウイルスベクター送達系は、裸の核酸、およびリポソームまたはポロキサマーなどの送達ビヒクルと複合体化された核酸を含む。遺伝子療法手順の概説については、Anderson, Science (1992)；Nabel and Felgner, TIBTECH (1993)；Mitani and Caskey, TIBTECH (1993)；Dillon, TIBTECH (1993)；Miller, Nature (1992)；Van Brunt, Biotechnology (1988)；Vigne et al., Restorative Neurology and Neuroscience 8:35-36 (1995)；Kremer and Perricaudet, British Medical Bulletin (1995)；Haddada et al., Current Topics in Microbiology and Immunology (1995)およびYu et al., Gene Therapy 1:13-26 (1994)を参照されたい。

核酸および／またはタンパク質の非ウイルス送達の方法としては、電気穿孔、リポフェクション、マイクロインジェクション、バイオリスティック法、パーティクルガン法（particle gun acceleration）、ビロソーム、リポソーム、免疫リポソーム、ポリカチオンもしくは脂質：核酸コンジュゲート、人工ビリオン、および薬剤で向上された核酸取り込みが挙げられるか、または細菌もしくはウイルス（例えば、Agrobacterium、Rhizobium sp. NGR234、Sinorhizoboiummeliloti、Mesorhizobium loti、タバコモザイクウイルス、ジャガイモＸウイルス、カリフラワーモザイクウイルス、およびキャッサバ静脈モザイクウイルスによって植物細胞に送達され得る。例えば、Chung et al. Trends Plant Sci. (2006)を参照されたい。例えば、Sonitron 2000系（Rich-Mar）を使用するソノポレーションも、核酸の送達に使用され得る。タンパク質および／または核酸のカチオン性脂質媒介送達は、インビボまたはインビトロ送達方法としても企図される。Zuris et al., Nat. Biotechnol. (2015)、Coelho et al., N. Engl. J. Med. (2013)；Judge et al., Mol. Ther. (2006)およびBasha et al., Mol. Ther. (2011)を参照されたい。

追加の例示的な核酸送達系としては、Amaxa（登録商標）Biosystems（Cologne, Germany）、Maxcyte, Inc.（Rockville, Md.）、BTX Molecular Delivery Systems（Holliston, Mass.）、およびCopernicus Therapeutics Inc.、（例えば、米国特許第6,008,336号を参照されたい）によって提供されるものが挙げられる。リポフェクションは、例えば、米国特許第5,049,386号、米国特許第4,946,787号、および米国特許第4,897,355号に記載されており、リポフェクション試薬は、市販されている（例えば、Transfectam.（商標）、Lipofectin.（商標）、およびLipofectamine.（商標）RNAiMAX）。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識リポフェクションに好適なカチオン性および中性脂質としては、ＰＣＴ国際公開第1991/017424号および同第1991/016024号に開示のものが挙げられる。送達は、細胞（エクスビボ投与）または標的組織（インビボ投与）へであり得る。

免疫脂質複合体などの標的リポソームを含む脂質：核酸複合体の調製は、当業者に周知である（例えば、Crystal, Science (1995)；Blaese et al., Cancer Gene Ther. (1995)；Behr et al., Bioconjugate Chem. (1994)；Remy et al., Bioconjugate Chem. (1994)；Gao and Huang, Gene Therapy (1995)；Ahmad and Allen, Cancer Res., (1992)、米国特許第4,186,183号、同第4,217,344号、同第4,235,871号、同第4,261,975号、同第4,485,054号、同第4,501,728号、同第4,774,085号、同第4,837,028号、および同第4,946,787号を参照されたい）。

追加の送達の方法としては、EnGeneIC送達ビヒクル（ＥＤＶ）に送達される核酸のパッケージングの使用が挙げられる。これらのＥＤＶは、抗体の一方のアームが標的組織に対する特異性を有し、他方がＥＤＶに対する特異性を有する二重特異性抗体を使用して標的組織に特異的に送達される。抗体は、ＥＤＶを標的細胞表面に運び、次いでＥＤＶは、エンドサイトーシスによって細胞内に運び込まれる。細胞内に入ると、内容物が放出される（MacDiamid et al., Nature Biotechnology (2009)を参照されたい）。

核酸の送達のためのＲＮＡまたはＤＮＡウイルスに基づく系の使用は、ウイルスを体内の特定の細胞に標的化し、ウイルスペイロードを核に輸送するための高度に進化したプロセスを利用する。ウイルスベクターは、患者に直接投与され得る（インビボ）か、または細胞をインビトロで治療するために使用され得、改変された細胞は、患者に投与される（エクスビボ）。核酸を送達するための従来のウイルスに基づくシステムとしては、限定されないが、遺伝子転写のための組換えレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴、ワクシニア、および単純ヘルペスウイルスベクターが挙げられる。しかしながら、ＲＮＡウイルスが、本明細書に記載のＲＮＡ組成物の送達に好ましい。加えて、多くの異なる細胞型および標的組織での高い形質導入効率が観察されている。本発明の核酸は、非統合レンチウイルスによって送達され得る。任意選択的に、レンチウイルスを用いるＲＮＡ送達が利用される。任意選択的に、レンチウイルスは、ヌクレアーゼのｍＲＮＡ、ガイドのＲＮＡを含む。任意選択的に、レンチウイルスは、ヌクレアーゼのｍＲＮＡ、ガイドのＲＮＡ、およびドナーテンプレートを含む。任意選択的に、レンチウイルスは、ヌクレアーゼタンパク質、ガイドＲＮＡを含む。任意選択的に、レンチウイルスは、ヌクレアーゼタンパク質、ガイドＲＮＡ、および／または例えば、相同性指向修復を介した遺伝子編集のためのドナーテンプレートを含む。任意選択的に、レンチウイルスは、ヌクレアーゼのｍＲＮＡ、ＤＮＡ標的化ＲＮＡ、およびｔｒａｃｒＲＮＡを含む。任意選択的に、レンチウイルスは、ヌクレアーゼのｍＲＮＡ、ＤＮＡ標的化ＲＮＡ、およびｔｒａｃｒＲＮＡ、およびドナーテンプレートを含む。任意選択的に、レンチウイルスは、ヌクレアーゼタンパク質、ＤＮＡ標的化ＲＮＡ、およびｔｒａｃｒＲＮＡを含む。任意選択的に、レンチウイルスは、ヌクレアーゼタンパク質、ＤＮＡ標的化ＲＮＡ、およびｔｒａｃｒＲＮＡ、および例えば、相同性指向修復を介した遺伝子編集のためのドナーテンプレートを含む。

上に言及した本明細書に記載の組成物は、非統合レンチウイルス粒子方法、例えば、LentiFlash（登録商標）システムを使用して、標的細胞に送達され得る。標的細胞へのＲＮＡの送達が標的細胞内部で本明細書に記載の組成物の組み立てを生じるようにそのような方法を使用して、ｍＲＮＡまたは他のタイプのＲＮＡを標的細胞内に送達することができる。また、ＰＣＴ国際公開第2013/014537号、同第2014/016690号、同第2016/185125号、同第2017/194902号、および同第2017/194903号を参照されたい。

外来のエンベロープタンパク質を組み込んで、レトロウイルスのトロピズムを変化させて、標的細胞の潜在的な標的集団を拡大することができる。レンチウイルスベクターは、非分裂細胞を形質導入または感染させることが可能なレトロウイルスベクターであり、典型的には、高いウイルス力価を生成する。レトロウイルス遺伝子転写系の選択は、標的組織に依存する。レトロウイルスベクターは、最大６～１０ｋｂの外来配列のパッケージング能力を有するシス作用の長い末端反復で構成される。最小のシス作用ＬＴＲは、ベクターの複製およびパッケージングに十分であり、次いで、療法的遺伝子を標的細胞に統合して永続的な導入遺伝子発現を提供するために使用される。広く使用されているレトロウイルスベクターとしては、マウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、およびそれらの組み合わせに基づくものが挙げられる（例えば、Buchscher Panganiban, J. Virol. (1992)；Johann et al., J. Virol. (1992)；Sommerfelt et al., Virol. (1990)；Wilson et al., J. Virol. (1989)；Miller et al., J. Virol. (1991)；ＰＣＴ国際公開第1994/026877 A1号を参照されたい）。

現在、ヘルパー細胞株に挿入された遺伝子による欠陥ベクターの相補性を伴うアプローチを利用して、形質導入物質を生成する臨床試験における遺伝子転写には、少なくとも６つのウイルスベクターアプローチが利用可能である。

ｐＬＡＳＮおよびＭＦＧ－Ｓは、臨床試験で使用されているレトロウイルスの例である（Dunbar et al., Blood (1995)；Kohn et al., Nat. Med. (1995)；Malech et al., PNAS (1997)）。ＰＡ３１７／ｐＬＡＳＮは、遺伝子療法試験で使用された最初の療法的ベクターであった。（Blaese et al., Science (1995)）。ＭＦＧ－Ｓをパッケージングしたベクターでは、５０％以上の形質導入効率が観察されている（Ellem et al., Immunol Immunother. (1997)；Dranoff et al., Hum. Gene Ther. (1997)）。

パッケージング細胞は、宿主細胞に感染することが可能なウイルス粒子を形成するために使用される。そのような細胞としては、アデノウイルス、ＡＡＶ、およびｐｓｉ．２細胞をパッケージングする２９３細胞、またはレトロウイルスをパッケージングするＰＡ３１７細胞が挙げられる。遺伝子療法に使用されるウイルスベクターは、通常、核酸ベクターをウイルス粒子内にパッケージングするプロデューサー細胞株によって生成される。ベクターは、典型的には、パッケージングおよびその後の宿主への統合に必要な最小限のウイルス配列を含有し（該当する場合）、他のウイルス配列は、発現されるタンパク質をコードする発現カセットによって置き換えられる。欠損したウイルス機能は、パッケージング細胞株によってトランスで供給される。例えば、遺伝子療法に使用されるＡＡＶベクターは、典型的には、パッケージングおよび宿主ゲノムへの統合に必要な、ＡＡＶゲノムからの反転末端反復（ＩＴＲ）配列のみを有する。ウイルスＤＮＡは、他のＡＡＶ遺伝子、すなわちｒｅｐおよびｃａｐをコードするが、ＩＴＲ配列を欠くヘルパープラスミドを含有する細胞株にパッケージングされる。細胞株はまた、ヘルパーとしてのアデノウイルスで感染される。ヘルパーウイルスは、ＡＡＶベクターの複製およびヘルパープラスミドからのＡＡＶ遺伝子の発現を促進する。ヘルパープラスミドは、ＩＴＲ配列を欠くことに起因して、有意な量でパッケージングされない。アデノウイルスによる汚染は、例えば、アデノウイルスがＡＡＶよりも感受性が高い熱処理によって低減することができる。加えて、ＡＡＶは、バキュロウイルス系を使用して臨床規模で産生することができる（米国特許第7,479,554号を参照されたい）。

多くの遺伝子療法用途において、遺伝子療法ベクターは、特定の組織タイプに対して高度の特異性で送達されることが望ましい。したがって、ウイルスベクターは、ウイルスの外面上にウイルスコートタンパク質を有する融合タンパク質としてリガンドを発現させることによって、所与の細胞型に対する特異性を有するように改変されることができる。リガンドは、目的の細胞型上に存在することが知られている受容体に対して親和性を有するように選択される。例えば、Han et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995)は、Moloneyマウス白血病ウイルスが、ｇｐ７０に融合したヒトヘレグリンを発現するように改変することができ、組換えウイルスは、ヒト表皮増殖因子受容体を発現するある特定のヒト乳がん細胞に感染することを報告した。この原理は、標的細胞が受容体を発現し、ウイルスが細胞表面受容体のリガンドを含む融合タンパク質を発現する、他のウイルス標的細胞対に拡大することができる。例えば、糸状ファージは、事実上任意の選択された細胞受容体に対する特異的結合親和性を有する抗体断片（例えば、ＦＡＢまたはＦｖ）を表示するように操作することができる。上の説明は、主にウイルスベクターに適用されるが、同じ原理を非ウイルスベクターに適用することができる。そのようなベクターは、特異的標的細胞による取り込みに有利な特異的取り込み配列を含有するように操作され得る。

遺伝子療法ベクターは、以下に記載されるように、個々の患者への投与によって、典型的には、全身投与（例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、または頭蓋内注入）、または局所適用によって、インビボで送達され得る。あるいは、ベクターは、個々の患者から摘出された細胞（例えば、リンパ球、骨髄穿刺液、組織生検）、またはユニバーサルドナー造血幹細胞などの細胞にエクスビボで送達され、続いて、通常、ベクターを組み込んだ細胞の選択後に、患者への細胞の再移植が行われ得る。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡのインビボおよびエクスビボでの送達、ならびにＲＮＰの送達が利用され得る。

診断、研究、または遺伝子療法のための（例えば、宿主生物へのトランスフェクト細胞の再注入を介した）エクスビボ細胞トランスフェクションは、当業者に周知である。好ましい実施形態では、細胞は、対象生物から単離され、ＲＮＡ組成物でトランスフェクトされ、対象生物（例えば、患者）に再注入される。エクスビボトランスフェクションに好適な様々な細胞型は、当業者に周知である（例えば、患者から細胞を単離および培養する方法の考察については、Freshney, “Culture of Animal Cells, A Manual of Basic Technique and Specialized Applications (6th edition, 2010)）、およびこれに列挙されている参考文献を参照されたい）。

好適な細胞としては、限定されないが、真核細胞および原核細胞、ならびに／または細胞株が挙げられる。そのような細胞またはそのような細胞から生成される細胞株の非限定的な例としては、ＣＯＳ、ＣＨＯ（例えば、ＣＨＯ－Ｓ、ＣＨＯ－Ｋ１、ＣＨＯ－ＤＧ４４、ＣＨＯ－ＤＵＸＢ１１、ＣＨＯ－ＤＵＫＸ、ＣＨＯＫ１ＳＶ）、ＶＥＲＯ、ＭＤＣＫ、ＷＩ３８、Ｖ７９、Ｂ１４ＡＦ２８－Ｇ３、ＢＨＫ、ＨａＫ、ＮＳＯ、ＳＰ２／０－Ａｇ１４、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３（例えば、ＨＥＫ２９３－Ｆ、ＨＥＫ２９３－Ｈ、ＨＥＫ２９３－Ｔ）、およびＰｅｒＣ６細胞、任意の植物細胞（分化または未分化）、ならびにSpodopterafugiperda（Ｓｆ）などの昆虫細胞、またはSaccharomyces、Pichia、およびSchizosaccharomycesなどの真菌細胞が挙げられる。ある特定の実施形態では、細胞株は、ＣＨＯ－Ｋ１、ＭＤＣＫ、またはＨＥＫ２９３細胞株である。加えて、初代細胞は、単離され、ヌクレアーゼ（例えば、ＺＦＮまたはＴＡＬＥＮ）、またはヌクレアーゼ系（例えば、ＣＲＩＳＰＲ）での処理に続いて、治療される対象への再導入のためにエクスビボで使用され得る。好適な初代細胞としては、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、ならびに限定されないが、ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞などの他の血液細胞サブセットが挙げられる。また、好適な細胞としては、例としては、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、造血幹細胞（ＣＤ３４＋）、神経幹細胞、および間葉系幹細胞などの幹細胞が挙げられる。

一実施形態では、幹細胞は、細胞トランスフェクションおよび遺伝子療法のためのエクスビボ手順で使用される。幹細胞を使用する利点は、それらがインビトロで他の細胞型に分化することができるか、またはそれらが骨髄に移植される場合、哺乳類（細胞のドナーなど）に導入することができることである。ＣＤ３４＋細胞をインビトロでＧＭ－ＣＳＦ、ＩＦＮ－ガンマ、およびＴＮＦ－アルファのサイトカインを使用して臨床的に重要な免疫細胞型に分化させるための方法が知られている（非限定的な例として、Inaba et al., J. Exp. Med. (1992)を参照されたい）。

幹細胞は、既知の方法を使用して形質導入および分化のために単離される。例えば、幹細胞は、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋（Ｔ細胞）、ＣＤ４５＋（ｐａｎＢ細胞）、ＧＲ－１（顆粒球）、ならびにＩａｄ（分化抗原提示細胞）などの不要な細胞に結合する抗体で骨髄細胞を選別することによって、骨髄細胞から単離される（非限定的な例として、Inaba et al., J. Exp. Med. (1992)を参照されたい）。いくつかの実施形態では、改変されている幹細胞も使用され得る。

とりわけ、本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、有糸分裂後の細胞または活動的に分裂していない任意の細胞、例えば、休止細胞におけるゲノム編集に好適であり得る。本発明のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを使用して編集され得る有糸分裂後の細胞の例としては、限定されないが、筋細胞、心筋細胞、肝細胞、骨細胞、およびニューロンが挙げられる。

療法的ＲＮＡ組成物を含有するベクター（例えば、レトロウイルス、リポソームなど）はまた、インビボでの細胞の形質導入のために生物に直接投与され得る。あるいは、裸のＲＮＡまたはｍＲＮＡが投与され得る。投与は、限定されないが、注射、注入、局所適用、および電気穿孔を含む、血液または組織細胞との根本的な接触に分子を導入するために通常使用される経路のうちのいずれかによる。そのような核酸を投与する好適な方法は、利用可能かつ当業者に周知であり、２つ以上の経路を使用して特定の組成物を投与することができるが、特定の経路は、多くの場合、別の経路よりも即時的かつ効果的な反応を提供し得る。

免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）への導入遺伝子の導入に好適なベクターとしては、非統合レンチウイルスベクターが挙げられる。例えば、米国特許公開第2009/0117617号を参照されたい。

薬学的に許容可能な担体は、投与される特定の組成物によって、ならびに組成物を投与するために使用される特定の方法によって部分的に決定される。したがって、以下に記載されるように、利用可能な薬学的組成物の多様な好適な製剤が存在する（例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., 1989を参照されたい）。

相同組換えによるＤＮＡ修復
「相同性指向修復」または「ＨＤＲ」という用語は、例えば、ＤＮＡにおける二重鎖および一本鎖分解の修復中に、細胞におけるＤＮＡ損傷を修復するためのメカニズムを指す。ＨＤＲは、ヌクレオチド配列相同性を必要とし、「核酸テンプレート」（本明細書で同義に使用される核酸テンプレートまたはドナーテンプレート）を使用して、二重鎖または一本鎖分解が生じた配列（例えば、ＤＮＡ標的配列）を修復する。これにより、例えば、核酸テンプレートからＤＮＡ標的配列への遺伝子情報の転写が生じる。核酸テンプレート配列がＤＮＡ標的配列と異なり、核酸テンプレートポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの一部またはすべてがＤＮＡ標的配列に組み込まれる場合、ＨＤＲは、ＤＮＡ標的配列の変化（例えば、挿入、欠失、変異）を生じ得る。いくつかの実施形態では、核酸テンプレートポリヌクレオチド全体、核酸テンプレートポリヌクレオチドの一部分、または核酸テンプレートのコピーは、ＤＮＡ標的配列の部位に統合される。

「核酸テンプレート」および「ドナー」という用語は、ゲノムに挿入またはコピーされるヌクレオチド配列を指す。核酸テンプレートは、標的核酸に付加されるか、または標的核酸の変化をテンプレートするか、または標的配列を改変するために使用され得るであろう、例えば、１つ以上のヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む。核酸テンプレート配列は、任意の長さ、例えば２～１０，０００ヌクレオチド長（またはそれらの間もしくはそれらの上の任意の整数値）、好ましくは約１００～１，０００ヌクレオチド長（またはそれらの間の任意の整数値）、より好ましくは約２００～５００ヌクレオチド長であり得る。核酸テンプレートは、一本鎖核酸、二重鎖核酸であり得る。いくつかの実施形態では、核酸テンプレートは、例えば、標的位置の標的核酸の野生型配列に対応する、例えば１つ以上のヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸テンプレートは、例えば、標的位置の標的核酸の野生型配列に対応する、例えば１つ以上のリボヌクレオチドのリボヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸テンプレートは、改変されたリボヌクレオチドを含む。

外因性配列（「ドナー配列」、「ドナーテンプレート」、または「ドナー」とも呼ばれる）の、例えば、変異遺伝子の補正のための、または野生型遺伝子の発現増加のための挿入も行うことができる。ドナー配列は、典型的には、それが配置されるゲノム配列と同一ではないことが容易に明らかであろう。ドナー配列は、目的の位置で効率的なＨＤＲを可能にするために、相同性の２つの領域に隣接する非相同配列を含有し得る。加えて、ドナー配列は、細胞クロマチンにおける目的の領域に相同ではない配列を含有するベクター分子を含み得る。ドナー分子は、細胞クロマチンと相同性のいくつかの非連続的な領域を含有し得る。例えば、目的の領域に通常存在しない配列を標的に挿入するための当該配列は、ドナー核酸分子内に存在し、目的の領域内の配列と相同性の領域に隣接し得る。

ドナーポリヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡ、一本鎖および／または二重鎖であり得、線状または環状形態で細胞に導入され得る。例えば、米国特許公開第2010/0047805号、同第2011/0281361号、同第2011/0207221号、および同第2019/0330620号を参照されたい。線状形態で導入される場合、ドナー配列の末端は、当業者に既知の方法によって（例えば、エキソヌクレアーゼによる分解から）保護され得る。例えば、１つ以上のジデオキシヌクレオチド残基が線状分子の３’末端に付加され、および／または自己相補性オリゴヌクレオチドが１つまたは両方の末端にライゲーションされる。例えば、Chang and Wilson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1987)；Nehls et al., Science (1996)を参照されたい。外因性ポリヌクレオチドを分解から保護するための追加の方法としては、限定されないが、末端アミノ基の付加、ならびに改変されたヌクレオチド間連結、例えば、ホスホロチオエート、ホスホロアミダート、およびO-メチルリボース、またはデオキシリボース残基などの使用が挙げられる。

したがって、修復のためにドナーテンプレートを使用する本発明の実施形態は、線状または環状形態で細胞に導入され得るＤＮＡまたはＲＮＡ、一本鎖および／または二重鎖ドナーテンプレートが使用され得る。本発明の実施形態では、遺伝子編集組成物は、（１）修復前の遺伝子内の二重鎖分解に影響を及ぼすためのガイド配列を含むＲＮＡ分子、および（２）修復のためのドナーＲＮＡテンプレートを含み、ガイド配列を含むＲＮＡ分子が、第１のＲＮＡ分子であり、ドナーＲＮＡテンプレートが、第２のＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡ分子およびテンプレートＲＮＡ分子は、単一分子の一部として接続されている。

ドナー配列はまた、オリゴヌクレオチドであり得、内因性配列の遺伝子補正または標的遺伝子の変化のために使用され得る。オリゴヌクレオチドは、ベクター上で細胞に導入され得るか、細胞内に電気穿孔され得るか、または当該技術分野において既知の他の方法を介して導入され得る。オリゴヌクレオチドは、内因性遺伝子の変異配列（例えば、ベータグロビンの鎌状変異）を「補正」するために使用することができるか、または所望の目的を有する配列を内因性遺伝子座に挿入するために使用することができる。

ポリヌクレオチドは、例えば、複製起点、プロモーター、および抗生物質耐性をコードする遺伝子などの追加の配列を有するベクター分子の一部として細胞に導入され得る。さらに、ドナーポリヌクレオチドは、裸の核酸として、リポソームもしくはポロキサマーなどの物質と複合体化された核酸として導入され得るか、または組換えウイルス（例えば、アデノウイルス、ＡＡＶ、ヘルペスウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、およびインテグラーゼ欠損レンチウイルス（ＩＤＬＶ））によって送達され得る。

ドナーは、一般に、その発現が、統合部位の内因性プロモーター、すなわち、ドナーが挿入される内因性遺伝子の発現を推進するプロモーターによって推進されるように挿入される。しかしながら、ドナーは、プロモーターおよび／またはエンハンサー、例えば、構成的プロモーター、または誘導性もしくは組織特異的プロモーターを含み得ることが明らかであろう。

ドナー分子は、内因性遺伝子のすべて、一部を発現するか、または全く発現しないように、内因性遺伝子に挿入され得る。例えば、本明細書に記載の導入遺伝子は、例えば、導入遺伝子との融合体として、内因性配列の一部（導入遺伝子に対するＮ末端および／またはＣ末端）を発現するか、または内因性配列のいずれも発現しないように、内因性遺伝子座に挿入され得る。他の実施形態では、（例えば、内因性遺伝子などための追加のコード配列を有するかまたは有さない）導入遺伝子は、任意の内因性遺伝子座、例えば、セーフハーバー遺伝子座、例えば、ＣＣＲ５遺伝子、ＣＸＣＲ４遺伝子、ＰＰＰ１Ｒ１２ｃ（ＡＡＶＳ１としても知られている）遺伝子、アルブミン遺伝子、またはＲｏｓａ遺伝子に統合される。例えば、米国特許第7,951,925号、および同第8,110,379号、米国公開第2008/0159996号、同第2010/0218264号、同第2010/0291048号、同第2012/0017290号、同第2011/0265198号、同第2013/0137104号、同第2013/0122591号、同第2013/0177983号、および同第2013/0177960号、ならびに米国仮特許出願第61/823,689号を参照されたい）。

内因性配列（内因性または導入遺伝子の一部）が導入遺伝子を伴って発現される場合、内因性配列は、完全長配列（野生型または変異型）または部分配列であり得る。好ましくは、内因性配列は、機能的である。これらの全長配列または部分配列の機能の非限定的な例としては、導入遺伝子によって発現されるポリペプチドの血清半減期を増加させること（例えば、療法的遺伝子）、および／または担体として作用することが挙げられる。

さらに、発現には必要ではないが、外因性配列としてはまた、転写または翻訳調節配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、インシュレーター、内部リボソーム進入部位、２Ａペプチドをコードする配列、および／またはポリアデニル化シグナルを挙げることができる。

ある特定の実施形態では、ドナー分子は、タンパク質をコードする遺伝子（例えば、細胞内もしくは個体に欠けているタンパク質をコードするコード配列、またはタンパク質をコードする遺伝子の代替バージョン）、調節配列、および／またはマイクロＲＮＡもしくはｓｉＲＮＡなどの構造的核酸をコードする配列からなる群から選択される配列を含む。

前述の実施形態では、本明細書に開示の各実施形態は、他の開示された実施形態の各々に適用可能であることが企図される。例えば、本発明のＲＮＡ分子または組成物のうちのいずれかを、本発明の方法のうちのいずれかに利用することができることが理解される。

本明細書で使用される場合、すべての見出しは単に組織についての見出しであり、いかなる様式でも開示を限定することを意図しない。任意の個々の段落の内容は、すべての段落に同等に適用可能であり得る。

本発明の追加の目的、利点、および新規の特色は、限定することを意図しない以下の実施例を吟味する際、当業者に明らかになるであろう。加えて、本明細書に上記され、以下の特許請求の範囲の段落で特許請求される本発明の様々な実施形態および態様の各々により、以下の実施例において実験的裏付けが見出される。

明確にするために、別個の実施形態の背景で記載される本発明のある特定の特色はまた、単一の実施形態で組み合わせて提供され得ることが理解される。むしろ、簡潔にするために、単一の実施形態の背景で記載される本発明の様々な特色はまた、別個に、または任意の好適な部分的な組み合わせで、または本発明の任意の他の記載の実施形態で好適なものとして提供され得る。様々な実施形態の背景で記載されるある特定の特色は、実施形態がそれらの要素を用いずに操作不能でない限り、それらの実施形態の本質的な特色とみなされるものではない。

一般に、本明細書で使用される命名法、および本発明で利用される実験手順は、分子、生化学、微生物学、および組換えＤＮＡ技法を含む。そのような技法は、文献において丁寧に説明されている。例えば、Sambrook et al., "Molecular Cloning: A laboratory Manual" (1989)；Ausubel, R. M. (Ed.), "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes I-III (1994)；Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989)；Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, New York (1988)；Watson et al., "Recombinant DNA", Scientific American Books, New York; Birren et al. (Eds.), "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998)；米国特許第4,666,828号、同第4,683,202号、同第4,801,531号、同第5,192,659号、および同第5,272,057号に記載の方法論、Cellis, J. E. (Ed.), "Cell Biology: A Laboratory Handbook", Volumes I-III (1994)；Freshney, "Culture of Animal Cells - A Manual of Basic Technique" Third Edition, Wiley-Liss, N. Y. (1994)；Coligan J. E. (Ed.), "Current Protocols in Immunology" Volumes I-III (1994)；Stites et al. (Eds.), "Basic and Clinical Immunology" (8th Edition), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994)；Mishell and Shiigi (Eds.), "Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996)；Clokie and Kropinski (Eds.), "Bacteriophage Methods and Protocols", Volume 1: Isolation, Characterization, and Interactions (2009)を参照されたい。他の一般的な参考文献は、本文書全体を通して提供される。

本発明のより完全な理解を容易にするために、実施例を以下に提供する。以下の実施例は、本発明の作製および実施の例示的なモードを示している。しかしながら、本発明の範囲は、これらの実施例で開示された特定の実施形態に限定されず、例示のみを目的とするものである。

実験の詳細
本発明のより完全な理解を容易にするために、実施例を以下に提供する。以下の実施例は、本発明の作製および実施の例示的なモードを示している。しかしながら、本発明の範囲は、これらの実施例で開示された特定の実施形態に限定されず、例示のみを目的とするものである。

環境試料の配列の異なるメタゲノムデータベースから、ＣＲＩＳＰＲ反復（ｃｒＲＮＡ）、トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）、ヌクレアーゼポリペプチド、およびＰＡＭ配列を予測した。ＣＲＩＳＰＲ反復、ｔｒａｃＲＮＡ配列、およびヌクレアーゼポリペプチド配列を予測した細菌種／株を表１に提供する。

ＯＭＮＩ－５０ヌクレアーゼポリペプチドの構築
ＯＭＮＩ－５０ヌクレアーゼポリペプチドを構築するために、ＯＭＮＩ－５０ヌクレアーゼのオープンリーディングフレームを、ヒト細胞株発現のためにコドン最適化した。最適化したＯＲＦを、細菌プラスミドｐｂ－ＮＮＣおよび哺乳類プラスミドｐｍＯＭＮＩにクローニングした（表４）。

ＳｇＲＮＡの予測および構築
ヌクレアーゼが同定された細菌ゲノムにおけるＣＲＩＳＰＲ反復アレイ配列（ｃｒＲＮＡ）およびトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）の検出によって、ＯＭＮＩ－５０ヌクレアーゼのｓｇＲＮＡを予測した。成熟前のナイーブｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ配列を、テトラループ「ｇａａａ」を用いてインシリコ接続し、ＲＮＡ二次構造予測ツールを使用することによって二重鎖の二次構造要素を予測した。

ＯＭＮＩ－５０ヌクレアーゼの様々なバージョンを有するｓｇＲＮＡの設計のために、完全二重鎖ＲＮＡ要素（すなわち、ｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡキメラ）の予測される二次構造を、可能性のあるｔｒａｃｒ配列の同定に使用した（例えば、図１Ａを参照されたい）。上部ステムの異なる位置で二重鎖を短縮することによって、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡをテトラループ「ｇａａａ」を用いて接続し、それによって可能性のあるｓｇＲＮＡ足場を生成した（例えば、図１Ｂを参照されたい、ＯＭＮＩ－５０ｓｇＲＮＡ設計は表２に列挙する）。ＯＭＮＩ－５０のために設計した、可能性のある足場のうちの少なくとも２つのバージョンを合成し、２２ｎｔのユニバーサルユニークスペーサー配列（Ｔ２、配列番号５６）の下流に接続し、構成的プロモーター下で細菌発現プラスミドおよびＵ６プロモーター下で哺乳類発現プラスミドにクローニングした（それぞれ、ｐｂガイドおよびｐｍガイド、表４）。

潜在的な転写および構造的制約を克服し、ヒト細胞環境背景でのｓｇＲＮＡ足場の可塑性を評価するために、ｓｇＲＮＡのいくつかのバージョンを試験した。各場合の改変は、可能性のあるｓｇＲＮＡのヌクレオチド配列の小さな変動を表す（図１Ｃ、表２）。
Ｔ１－ＧＧＴＧＣＧＧＴＴＣＡＣＣＡＧＧＧＴＧＴＣＧ（配列番号５５）
Ｔ２－ＧＧＡＡＧＡＧＣＡＧＡＧＣＣＴＴＧＧＴＣＴＣ（配列番号５６）

ＴＸＴＬによるインビトロ枯渇アッセイ
インビトロでのＰＡＭ配列の枯渇は、Maxwell et al., Methods (2018)によって記述された。簡単に述べると、ＯＭＮＩ－５０ヌクレアーゼを発現する線状ＤＮＡおよびＴ７プロモーター下のｓｇＲＮＡを、ＴＸＴＬミックス（Arbor Bioscience）に、Ｔ７ポリメラーゼを発現する線状構築物と一緒に付加した。ＴＸＴＬミックスによるＲＮＡ発現およびタンパク質翻訳は、ＲＮＰ複合体の形成を生じる。線状ＤＮＡを使用したので、ＲｅｃＢＣＤ阻害物質であるＣｈｉ６配列を付加して、ＤＮＡを分解から保護した。ＳｇＲＮＡスペーサーは、８Ｎのランダムな組の潜在的なＰＡＭ配列に隣接する、標的化プロトスペーサー（ｐｂＰＯＳ Ｔ２ライブラリ、表４）を含有するプラスミドのライブラリに標的化するように設計されている。必要なアダプターおよびインデックスを、切断されたライブラリと非標的化ｇＲＮＡを発現する対照ライブラリ（Ｔ１）との両方に、ＰＣＲを使用して付加した際の、ライブラリからのＰＡＭ配列の枯渇を高スループット配列決定によって測定した。ディープシーケンシングに続いて、インビトロシステムによって、機能的ＤＮＡ切断を示すＯＭＮＩヌクレアーゼによる対照での発生と比較して、同じＰＡＭ配列を有する枯渇した配列の画分によるインビトロ活性を確認した（図２、表３）。２つのｓｇＲＮＡバージョン（Ｖ１およびＶ２）でＯＭＮＩ－５０を試験した。いずれの場合も、分析からＮＧＧの明確なＰＡＭを推論した（図２）。いくつかの活性が、ＮＡＧおよびＮＧＡ ＰＡＭ配列でも観察された。

哺乳類系におけるＰＡＭライブラリ
ＰＡＭ配列の優先性は、ヌクレアーゼの固有の特性とみなされるが、細胞環境、ゲノム組成、およびゲノムサイズによって、ある程度影響を受け得る。ヒト細胞環境は、これらの特性の各々に関して細菌環境と有意に異なるので、ヒト細胞の背景ではＰＡＭの優先性の潜在的な差に対処するために、「微調整」ステップが導入されている。この目的を達成するために、ＰＡＭライブラリをヒト細胞株内に構築した。このアッセイでは、ＰＡＭライブラリを、定常標的配列としてウイルスベクター（表４を参照されたい）を使用して細胞に導入し、続いて６Ｎの伸長を行った。ＯＭＮＩ－５０およびライブラリ定常標的部位標的化ｓｇＲＮＡの導入の際に、ＮＧＳ分析を使用して、編集された配列およびそれらと関連するＰＡＭを同定した。次いで、濃縮された編集された配列を使用して、ＰＡＭコンセンサスを定義した。この方法論を適用して、哺乳類細胞におけるＯＭＮＩ－５０ヌクレアーゼの最適化されたＰＡＭ要件を決定する（表３、「哺乳類純化」）。ＯＭＮＩ－５０ＰＡＭは、インビトロＴＸＴＬで見出されたものと同一であることが見出された。

哺乳類細胞における最適化されたＤＮＡ配列によってコードされるＯＭＮＩ－５０ヌクレアーゼの発現
まず、哺乳類細胞におけるＯＭＮＩ－５０をコードする最適化されたＤＮＡ配列の各々の発現を検証した。この目的を達成するために、Ｐ２Ａペプチド（ｐｍＯＭＮＩ、表４）によってｍＣｈｅｒｒｙに連結されたＨＡタグ付きＯＭＮＩ－５０ヌクレアーゼまたはStreptococcus Pyogenes Cas9（ＳｐＣａｓ９）をコードする発現ベクターを、Jet-optimus（商標）トランスフェクション試薬（polyplus-transfection）を使用してＨｅｋ２９３Ｔ細胞に導入した。Ｐ２Ａペプチドは、発現の際にＯＭＮＩヌクレアーゼとｍＣｈｅｒｒｙとが分離されるように、細胞内の組換えタンパク質の切断を誘導することができる自己切断ペプチドである。ＭＣｈｅｒｒｙは、発現ベクターからのＯＭＮＩの転写効率の指標として機能する。抗ＨＡ抗体を使用するウエスタンブロットアッセイによって、ＯＭＮＩ－５０タンパク質の発現を確認した（図３）。

ヒト細胞内の内因性ゲノム標的における活性
ヒト細胞内の特定のゲノム位置における編集を促進する能力についても、ＯＭＮＩ－５０をアッセイした。この目的を達成するために、ヒトゲノムの特定の位置に標的化するように設計されたｓｇＲＮＡ（ｐｍガイド、表４）と一緒に、ＯＭＮＩ－Ｐ２Ａ－ｍＣｈｅｒｒｙ発現ベクター（ｐｍＯＭＮＩ、表４）をＨｅＬａ細胞にトランスフェクトした。７２時間で、細胞を採取した。ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光をマーカーとして使用するＦＡＣＳによるトランスフェクション効率の定量化に、細胞のうちの半分を使用した。細胞のうちの残り半分を溶解させ、それらのゲノムＤＮＡを使用して、対応する推定ゲノム標的をＰＣＲ増幅した。アンプリコンにＮＧＳを施し、生じた配列を使用して、各標的部位における編集イベントの割合を計算した。切断部位の周囲の短い挿入または欠失（インデル）は、ヌクレアーゼ誘導ＤＮＡ切断に続くＤＮＡ末端の修復の典型的な結果である。編集パーセントの計算は、各アンプリコン内のインデル含有配列の画分から推論した。すべての編集値を、各実験で得られたトランスフェクションおよび翻訳有効性に正規化し、ｍＣｈｅｒｒｙ発現細胞の割合から推論した。正規化した値は、ヌクレアーゼを発現した細胞集団内の有効な編集レベルを表す。

ＯＭＮＩ－５０のゲノム活性は、異なるゲノム位置に標的化するように各々設計された１１個の固有のｓｇＲＮＡのパネルを使用して評価した。これらの実験結果を表６に要約する。表（列６、「編集％」）に見ることができるように、ＯＭＮＩ－５０は、試験したすべての標的部位において、陰性対照（列９、「陰性対照での編集％」）と比較して、高く有意な編集レベルを呈している。ＯＭＮＩ－５０は、試験した１１／１１の部位において、高く有意な編集レベルを呈している。

ヒト細胞における本質的忠実性
ヌクレアーゼの本質的忠実性は、その切断特異性の尺度である。高い忠実性のヌクレアーゼは、意図しない標的（「オフターゲット」）の切断が最小限であるかまたは全くなく、意図された標的（「オンターゲット」）の切断を促進するヌクレアーゼである。ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼでは、標的は、ガイドＲＮＡのスペーサーエレメントに対する配列相補性に基づいて取得される。オフターゲティングは、スペーサー配列と意図しない標的との間の類似性から生じる。オンターゲット領域および事前に検証されたオフターゲット領域の両方について、ＰＣＲ増幅、ＮＧＳ、およびインデル分析に続いて、上の段落に記載の活性アッセイを行うことによって、ヒト細胞におけるゲノムレベルでのＯＭＮＩ－５０の本質的忠実性を測定した。ＯＭＮＩ－５０の本質的忠実性の測定を、図４Ａに提供する。この実施例では、２つのガイドＲＮＡを独立して使用してＯＭＮＩ－５０の忠実性を測定し、参照のために、各場合でのＳｐＣａｓ９の並行測定を提供する。ｃｈｒ１９上のＥＬＡＮＥ遺伝子の上流に定義されたオンターゲット部位、およびｃｈｒ１５上のオフターゲット部位を有するＥＬＡＮＥ ｇ３５ ｇＲＮＡ（表６）を使用して、第１の部位に標的化した。図４Ａに見ることができるように、ＯＭＮＩ－５０によって得られたオン／オフターゲット編集効率比は４１：０である一方で、ＳｐＣａｓ９オン／オフ比は６．８：１であった（それぞれ４０．９％／０％、１８．６％／２．７％）。ＥＬＡＮＥ ｇ６２ ｇＲＮＡを、第２の部位に標的化した（表６）。このｇＲＮＡスペーサー配列は、ｃｈｒ１９上のＥＬＡＮＥ遺伝子に定義されたオンターゲット部位およびｃｈｒ１上のオフターゲット部位を有する。この場合、ＳｐＣａｓ９で得られた比１．７：１と比較して、ＯＭＮＩ－５０によって得られたオン／オフ比は、７２：１であった（それぞれ３８．９％／０．６％、４３．１％／２５．８％）。これらの結果は、これらの特異的ｇＲＮＡを使用するＳｐＣａｓ９と比較して、ＯＭＮＩ－５０が著しく高い本質的忠実性を有することを実証している。後にＵ２ＯＳ細胞株へのＲＮＰ電気穿孔によって、本質的忠実性を第２の系で試験した（図４Ｂ）。ＥＬＡＮＥ ｇ３５では、ＯＭＮＩ－５０によって得られたオン／オフターゲット編集効率比は９：１である一方で、ＳｐＣａｓ９オン／オフ比は１：１であった（それぞれ９１％／１０％、９３％／９１％）。２つの別個の系では、ＯＭＮＩ－５０の忠実性は、ＳｐＣａｓ９よりも優れていた。

ガイドシーケンス不偏分析方法を使用したオフターゲットの評価
ＯＭＮＩ－５０の特異性をさらに評価するために、ガイド配列を使用して、いくつかの部位にわたってオフターゲットの数を試験した。ＳｐＣａｓ９のオフターゲット数は、数個～数百個の部位にわたって変動した一方で、ＯＭＮＩ－５０オフターゲット数は、試験したすべての部位において２０未満であった。ＳｐＣａｓ９またはＯＭＮＩ－５０のいずれかを使用して、１０個超の読み取り値を有する部位で見出されたオフターゲットの数を比較すると、ＯＭＮＩ－５０は高い特異性を示している。試験した６つの部位のうち５つでは、ＳｐＣａｓ９オフターゲットの数は、ＯＭＮＩ－５０と比較してかなり高く（２倍～２０倍）、６つの部位のうちの１つのみにおいて、オフターゲット数は、２つのヌクレアーゼ間で同等であった（表９）。

ＯＭＮＩ－５０タンパク質の精製
ＯＭＮＩ－５０オープンリーディングフレームを細菌発現プラスミド（Ｔ７－ＮＬＳ－ＯＭＮＩ－ＮＬＳ－ＨＡ－Ｈｉｓタグ、ｐＥＴ９ａ、表４）にクローニングし、Ｃ４３細胞（Lucigen）内で発現させた。細胞をTerrific Broth中で対数増殖中期まで増殖させ、次いで温度を１８℃まで下げた。１ｍＭのＩＰＴＧで１６～２０時間、０．６ＯＤで発現を誘導し、その後細胞を採取し、－８０℃で冷凍した。ＥＤＴＡを含まない完全プロテアーゼ阻害剤カクテルセットＩＩＩ（Calbiochem）を補充した溶解緩衝液（５０ｍＭのＮａＨ_２ＰＯ_４、３００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのイミダゾールｐＨ８．０、１ｍＭのＴＣＥＰ）中に、細胞ペーストを再懸濁させた。超音波処理を使用して細胞を溶解させ、清浄した溶解物をＮｉ－ＮＴＡ樹脂でインキュベートした。樹脂を重力カラムに充填し、洗浄緩衝液（５０ｍＭのＮａＨ_２ＰＯ_４、３００ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのイミダゾールｐＨ８．０、１ｍＭのＴＣＥＰ）で洗浄し、１００～５００ｍＭのイミダゾールを補充した洗浄緩衝液でＯＭＮＩ－５０タンパク質を溶出させた。ＯＭＮＩ－５０タンパク質を含有する画分をプールし、濃縮し、centricone（Amicon Ultra 15ml 100K, Merck）に充填し、緩衝液をＧＦ緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．５、５００ｍＭのＮａＣｌ、１０％のグリセロール、０．４Ｍのアルギニン）に交換した。５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．５、５００ｍＭのＮａＣｌ、１０％のグリセロール、０．４Ｍのアルギニンを用いるHiLoad 16/600 Superdex 200 pg-SEC, AKTA Pure（GE Healthcare Life Sciences）のＳＥＣによって、濃縮したＯＭＮＩ－５０タンパク質をさらに精製した。ＯＭＮＩ－５０タンパク質を含有する画分をプールし、濃縮し、１０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０％のグリセロール、および１ｍＭのＴＣＥＰの最終貯蔵緩衝液を含むcentricone（Amicon Ultra 15ml 100K, Merck）上に充填した。精製したＯＭＮＩ－５０タンパク質を１０ｍｇ／ｍｌのストックに濃縮し、液体窒素中で瞬間冷凍し、－８０℃で保管した。

ＲＮＰ活性アッセイによるガイド最適化
３’および５’末端の３つの2’-O-メチル3’-ホスホロチオエート（Agilent）を用いて、ＯＭＮＩ－５０の合成ｓｇＲＮＡを合成した。ガイド３５の異なるスペーサー長（１７～２３ｎｔ）を有するＯＭＮＩ－５０ＲＮＰの活性アッセイを、本明細書に記載する（表５、図５Ａ）。簡単に述べると、４ｐｍｏｌのＯＭＮＩ－５０ヌクレアーゼを、６ｐｍｏｌの合成ガイドと混合した。室温で１０分間インキュベーションした後、ＲＮＰ複合体を、１００ｎｇのオンターゲットテンプレートと反応させた。２２ｎｔｓ以上のスペーサーのみが、オンターゲットテンプレートのほぼ完全な切断を示す。２０～２３ｎｔｓのスペーサー長を有する、減少させた量（４、２、１．２、０．６、および０．２ｐｍｏｌ）のＲＮＰを、１００ｎｇのＤＮＡ標的テンプレートと反応させた（図５Ｂ）。２２ｎｔ以上の長さのスペーサーは、より低いＲＮＰ濃度でも、より良好な切断活性を示す。

哺乳類細胞の背景でも、スペーサー長の最適化を実施した。１００ｕＭのヌクレアーゼを、異なるスペーサー長（１７～２３ｎｔ、表５）を有する１２０ｕＭの合成ガイドおよび１００ｕＭのＣａｓ９電気穿孔エンハンサー（ＩＤＴ）と混合することによって、ＲＮＰを組み立てた。室温での１０分間のインキュベーションの後、ＲＮＰ複合体を、２００，０００の予め洗浄したＵ２ＯＳ、ｉＰＳＣ、またはＨＳＣ細胞と混合し、製造業者のプロトコルに従って、Lonza SEまたはP3 Cell Line 4D-Nucleofector（商標）X KitをそれぞれＤＮ１００またはＣＡ１３７プログラムを用いて使用して、電気穿孔した。７２時間で、細胞を溶解させ、それらのゲノムＤＮＡをＰＣＲ反応に使用して、対応する推定ゲノム標的を増幅した。アンプリコンにＮＧＳを施し、次いで生じた配列を使用して、編集イベントの割合を計算した。図５Ｃ、図６、および表１０に見ることができるように、１７～１９ｎｔのスペーサーは、低い編集レベルを示し、２０ｎｔのスペーサーは、中程度の編集レベルを示し、２１～２３ｎｔのスペーサーは、最も高い編集レベルを示している。

Ｕ２ＯＳ細胞株を使用して、異なるトレーサーＲＮＡ配列の変動を試験した（表２）。２０ｎｔのスペーサーで、異なるｓｇＲＮＡバージョンを試験した。図５Ｄに見ることができるように、ｓｇＲＮＡ Ｖ１、Ｖ２、またはＶ３のいずれかを使用したＲＮＰアセンブリは、同様の編集レベルを生じる。しかしながら、ｓｇＲＮＡ Ｖ４を使用したＲＮＰアセンブリは、有意に高い編集レベルを生じる。

５つのゲノム部位にわたって２１ｎｔおよび２２ｎｔのスペーサーを使用してＨＳＣで得られた結果を比較すると、効率的な編集には２２ｎｔのスペーサーがわずかに好ましいことが示唆される（図６および表１０）。

ＲＮＰとしてのＯＭＮＩ－５０の活性
哺乳類細胞におけるＲＮＰとしてのＯＭＮＩ－５０タンパク質の活性を、Ｕ２ＯＳ細胞株でまず試験し、その後３つの初代細胞系：ｉＰＳＣ、ＨＳＣ、およびＴ細胞で試験した。表７に見ることができるように、編集は、すべての系で観察された。

２つの遺伝子上のＴ細胞での編集活性について、ＯＭＮＩ－５０を試験した（付録表７）。ＴＲＡＣに標的化した３４個のガイドおよびＢ２Ｍに標的化した２６個のガイドで、ＯＭＮＩ－５０を試験した。試験したＴＲＡＣガイドのうちの６４％（２２／３４）が活性であり、５％～８４％の範囲の編集レベルを有することが見出された。同様に、Ｂ２Ｍガイドのうちの５７％が活性であり、５％～６１％の範囲の編集レベルを有した。これらの結果を付録表７に要約する。

ＴＲＡＣ遺伝子とＢ２Ｍ遺伝子との両方において、各１９個のガイドのレパートリーで、高い編集が観察された。マルチプレックスおよびさらなる最適化の潜在性を考慮すると、適切な戦略を用いて、ＯＭＮＩ－５０による両方の遺伝子の完全なノックアウトが可能である。

ＯＭＮＩ－５０を用いて、Ｕ２ＯＳ細胞、ｉＰＳＣ、およびＨＳＣでＥＬＡＮＥ遺伝子標的化ガイドを試験した。試験した５つのガイドはすべて、Ｕ２ＯＳ細胞とＨＳＣとの両方で２２％超の編集を示した。ｉＰＳＣでは、ＥＬＡＮＥ ｇ３５のみを試験し、５３％の編集レベルを有した。この結果は、他の系で得られた結果と比較して低い。

マルチプレックス
２つのＲＮＰ集団を混合し、混合物を初代Ｔ細胞に電気穿孔することによって、マルチプレックス編集についてもＯＭＮＩ－５０を試験した。ｇＲＮＡ＃３２をＴＲＡＣに使用し、ｇＲＮＡ＃１５をＢ２Ｍに使用した（スペーサー配列は表８に列挙する）。７２時間で細胞を採取し、ＮＧＳによる編集について試験した。ＴＲＡＣ遺伝子は、５０％の編集を測定し、Ｂ２Ｍ遺伝子は、２５％の編集を測定した。これらの結果は、マルチプレックス試験と並行して実施した単一ＲＮＰを用いた編集レベルと同様であった（表８）。

表１．ＯＭＮＩ－５０ヌクレアーゼ配列：表１は、ＯＭＮＩ－５０ヌクレアーゼが同定された生物、そのタンパク質配列、そのＤＮＡ配列、およびそのヒト最適化ＤＮＡ配列を列挙している。

表６．哺乳類細胞における内因性の背景でのヌクレアーゼ活性：ｓｇＲＮＡ発現プラスミドと一緒にＤＮＡトランスフェクションすることによって、ＯＭＮＩ－５０ヌクレアーゼを哺乳類細胞系（ＨｅＬａ）で発現させた。部位特異的ゲノムＤＮＡ増幅およびＮＧＳに、細胞溶解物を使用した。インデルの割合を測定し、分析して編集レベルを決定した。各ｓｇＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡ（表２を参照されたい）および本明細書に詳述したスペーサーで構成されている。３’ゲノムスペーサー配列は、ＯＭＮＩ－５０ヌクレアーゼに関連するＰＡＭを含有する。トランスフェクション効率（トランスフェクション％）は、上述のｍＣｈｅｒｒｙシグナルのフローサイトメトリー定量化によって測定した。トランスフェクション効率を使用して、編集レベルを正規化した（インデル基準％）。すべての試験は、３回実施された。ＯＭＮＩヌクレアーゼのみ（すなわち、ガイドなし）のトランスフェクトした細胞を、陰性対照として機能させた。

表７．ＲＮＰとしてのＯＭＮＩ－５０活性：ＯＭＮＩ－５０ＲＮＰを合成ｓｇＲＮＡ（Agilent）で組み立て、細胞に電気穿孔した。いくつかの細胞型を様々なｓｇＲＮＡで試験した。細胞系、遺伝子名称、およびスペーサー配列は、ＮＧＳによって測定した編集レベルの横に示す。

表８．初代Ｔ細胞におけるＯＭＮＩ－５０マルチプレックス：ＴＲＡＣまたはＢ２Ｍ遺伝子のいずれかに標的化、または標的を組み合わせた活性化した初代Ｔ細胞への電気穿孔によって、ＯＭＮＩ－５０のマルチプレックスを実施した。最初の２行は、５つのドナーバンクからランダムに選択された２つのドナー上の各遺伝子を別個に示す。最後の２行は、電気穿孔をマルチプレックスとして実施したときの各遺伝子についての同じ分析を示す。編集活性は、アンプリコンに基づくＮＧＳの後のインデル数によって決定された。２回の標準偏差も示される。ＴＲＡＣ ｇＲＮＡのみを使用すると、Ｂ２Ｍ遺伝子に効果はなく、逆も同様であった（図示せず）。

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Claims (59)

1. 配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有する配列を含むＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、または前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列を含む核酸分子を含む、天然に存在しない組成物。
2. ＤＮＡ標的化ＲＮＡ分子またはＤＮＡ標的化ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡポリヌクレオチドをさらに含み、前記ＤＮＡ標的化ＲＮＡ分子が、標的領域内の配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、前記ＤＮＡ標的化ＲＮＡ分子と前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼとが、一緒に天然に存在しない、請求項１に記載の組成物。
3. 前記ＤＮＡ標的化ＲＮＡ分子が、配列ＧＵＵＵＧＡＧＡＧを含むｃｒＲＮＡ反復配列を含む、請求項２に記載の組成物。
4. 前記ＤＮＡ標的化ＲＮＡ分子が、配列番号４１～４３および配列番号１４９～１５４から選択される１つ以上の配列を含むｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含む、請求項２または３に記載の組成物。
5. 前記ＤＮＡ標的化ＲＮＡ分子が、前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと複合体を形成することができるヌクレオチド配列を含む、請求項２～４のいずれか一項に記載の組成物。
6. 操作された天然に存在しない組成物であって、
   直接反復配列に連結されたガイド配列部分を含む１つ以上のＲＮＡ分子であって、前記ガイド配列が、標的配列とハイブリダイゼーションすることが可能である１つ以上のＲＮＡ分子、または前記１つ以上のＲＮＡ分子をコードする１つ以上のヌクレオチド配列と、
   配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、または前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列を含む核酸分子と、を含み、
   前記１つ以上のＲＮＡ分子が、前記標的配列にハイブリダイゼーションし、前記標的配列が、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の３’であり、前記１つ以上のＲＮＡ分子が、ＲＮＡガイドヌクレアーゼと複合体を形成する、組成物。
7. ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと複合体を形成することができるヌクレオチド配列を含むＲＮＡ分子（ｔｒａｃｒＲＮＡ）、または前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと複合体を形成することができるＲＮＡ分子をコードする配列を含むＤＮＡポリヌクレオチド、をさらに含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の組成物。
8. 相同性指向修復（ＨＤＲ）のためのドナーテンプレートをさらに含む、請求項２～７のいずれか一項に記載の組成物。
9. 前記組成物が、細胞のゲノム内の前記標的領域を編集することが可能である、請求項２～８のいずれか一項に記載の組成物。
10. 前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼが、配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有する配列を含み、前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと複合体を形成することができる、前記ＤＮＡ標的化ＲＮＡ分子内の前記ヌクレオチド配列が、配列番号４４～５２から選択される配列を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の組成物。
11. 天然に存在しない組成物であって、
    配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有する配列を含むＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、または前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列を含む核酸分子と、
    １つ以上のＲＮＡ分子、または前記１つ以上のＲＮＡ分子をコードする１つ以上のＤＮＡポリヌクレオチドであって、
    （ｉ）前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと相互作用／結合することが可能なヌクレアーゼ結合ＲＮＡヌクレオチド配列、および
    （ｉｉ）標的ＤＮＡ配列内の配列に相補的な配列を含む、ＤＮＡ標的化ＲＮＡヌクレオチド配列、のうちの少なくとも１つを含む、１つ以上のＲＮＡ分子、または前記１つ以上のＲＮＡ分子をコードする１つ以上のＤＮＡポリヌクレオチドと、を含み、
    前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼが、前記１つ以上のＲＮＡ分子と複合体化して、前記標的ＤＮＡ配列とハイブリダイゼーション可能な複合体を形成することが可能である、組成物。
12. 前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼおよび前記１つ以上のＲＮＡ分子が、前記標的ＤＮＡ配列に結合して前記標的ＤＮＡ配列の切断をもたらすことが可能なＣＲＩＳＰＲ複合体を形成する、請求項１１に記載の組成物。
13. 前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと、前記１つ以上のＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つとが、一緒に天然に存在しない、請求項１１または１２に記載の組成物。
14. 前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼが、ＲＮＡ結合部分と、部位指向性酵素活性を呈する活性部分とを含み、
    ＤＮＡ標的化ＲＮＡヌクレオチド配列が、標的ＤＮＡ配列内の配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、
    前記ヌクレアーゼ結合ＲＮＡヌクレオチド配列が、前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの前記ＲＮＡ結合部分と相互作用する配列を含む、請求項１１～１３のいずれか一項に記載の組成物。
15. 前記ヌクレアーゼ結合ＲＮＡヌクレオチド配列および前記ＤＮＡ標的化ＲＮＡヌクレオチド配列が、単一ＲＮＡ分子（ｓｇＲＮＡ）上にあり、前記ｓｇＲＮＡ分子が、前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと複合体を形成し、ＤＮＡ標的化モジュールとして機能することができる、請求項１１～１４のいずれか一項に記載の組成物。
16. 前記ｓｇＲＮＡが、最大１０００塩基長、９００塩基長、８００塩基長、７００塩基長、６００塩基長、５００塩基長、４００塩基長、３００塩基長、２００塩基長、１００塩基長、５０塩基長を有する、請求項１５に記載の天然に存在しない組成物。
17. 相同性指向修復（ＨＤＲ）のためのドナーテンプレートをさらに含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載の組成物。
18. 前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼが、配列番号３に記載のアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するか、または前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列を含む前記核酸分子が、配列番号１１～１３に記載の核酸配列と少なくとも９５％の配列同一性の配列を含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載の組成物。
19. 前記組成物が、配列番号３と少なくとも９５％の同一性を有するＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと、ヌクレアーゼ結合ＲＮＡヌクレオチド配列を含むＲＮＡ分子と、を含み、前記ヌクレオチド結合ＲＮＡ配列が、配列番号３７～４５、８７～８８、１４９～１５４、およびＧＵＵＵＧＡＧＡＧからなる群から選択され、前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと活性複合体を形成するのに好適である、請求項１８に記載の組成物。
20. 前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼが、ＮＧＧ、ＮＡＧ、およびＮＧＡから選択されるＰＡＭ部位を使用する、請求項１９に記載の組成物。
21. 前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼが、前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの野生型のアミノ酸配列と比較して、少なくとも１～１０、１０～２０、２０～３０、３０～４０、４０～５０、５０～６０、６０～７０、７０～８０、８０～９０、９０～１００、１００～１１０、１１０～１２０、１２０～１３０、１３０～１４０、または１４０～１５０個のアミノ酸置換、欠失、および／または挿入を含む、請求項１～２０のいずれか一項に記載の組成物。
22. 前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼが、前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの野生型と比較して、少なくとも２％、５％、７％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、もしくは３５％の特異性の増加もしくは活性の増加を呈するか、または前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの野生型と比較して、ＰＡＭ特異性が変化している、請求項２１に記載の組成物。
23. 前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼが、操作されているか、または天然に存在しない、請求項１～２２のいずれか一項に記載の組成物。
24. 前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼが、操作され、非天然または合成アミノ酸を含む、請求項２３に記載の組成物。
25. 前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼが操作され、核局在化配列（ＮＬＳ）、細胞透過性ペプチド配列、および／または親和性タグのうちの１つ以上を含む、請求項２３または２４に記載の組成物。
26. 無細胞系または細胞のゲノム内の標的部位におけるヌクレオチド配列を改変する方法であって、請求項１～２５のいずれか一項に記載の組成物を前記細胞に導入することを含む、方法。
27. 前記細胞が、真核細胞または原核細胞である、請求項２６に記載の方法。
28. 哺乳類細胞のゲノム内の標的部位におけるヌクレオチド配列を改変する方法であって、（ｉ）配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを含む組成物であって、または前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列を含む核酸分子が、配列番号１１～１３からなる群から選択される少なくとも９５％の核酸配列を有する、組成物と、（ｉｉ）標的ＤＮＡ内の配列に相補的なヌクレオチド配列を含む、ＤＮＡ標的化ＲＮＡ分子、またはＤＮＡ標的化ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡポリヌクレオチドと、を前記細胞に導入することを含む、方法。
29. （ｉｉｉ）前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと相互作用する、ヌクレアーゼ結合ＲＮＡ配列を含むＲＮＡ分子、またはヌクレアーゼ結合ＲＮＡを含むＲＮＡ分子をコードするＤＮＡポリヌクレオチドを、前記細胞に導入することをさらに含む、請求項２８に記載の方法。
30. 前記ＤＮＡ標的化ＲＮＡ分子が、前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと活性複合体を形成するのに好適なｃｒＲＮＡ分子である、請求項２８または２９に記載の方法。
31. ヌクレアーゼ結合ＲＮＡ配列を含む前記ＲＮＡ分子が、前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと活性複合体を形成するのに好適なｔｒａｃｒＲＮＡ分子である、請求項２８～３０のいずれか一項に記載の方法。
32. 前記ＤＮＡ標的化ＲＮＡ分子とヌクレアーゼ結合ＲＮＡ配列を含む前記ＲＮＡ分子とが、単一ガイドＲＮＡ分子の形態で融合される、請求項３８～３１のいずれか一項に記載の方法。
33. （ｉｖ）プロトスペーサー配列に相補的な配列を含むＲＮＡ分子を、前記細胞に導入することを含む、請求項２８～３２のいずれか一項に記載の方法。
34. 前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼが、前記１つ以上のＲＮＡ分子と複合体を形成し、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の３’に二重鎖分解をもたらす、請求項２８～３３のいずれか一項に記載の方法。
35. 前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼが、配列番号３と少なくとも９５％の同一性を有する配列と、ヌクレアーゼ結合ＲＮＡヌクレオチド配列を含むＲＮＡ分子と、を含み、前記ヌクレオチド結合ＲＮＡ配列が、配列番号３７～４５、８７～８８、１４９～１５４、およびＧＵＵＵＧＡＧＡＧからなる群から選択され、前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと活性複合体を形成するのに好適である、請求項２８～３４のいずれか一項に記載の方法。
36. 前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼが、ＮＧＧ、ＮＡＧ、およびＮＧＡから選択されるＰＡＭ部位を使用する、請求項３５に記載の方法。
37. 前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼが、配列番号３と少なくとも９５％の同一性を有する配列を含み、ＮＧＧ、ＮＡＧ、およびＮＧＡから選択されるＰＡＭ部位を使用する、請求項２８～３６のいずれか一項に記載の方法。
38. 前記ＤＮＡ標的化ＲＮＡ分子が、２１～２２個のヌクレオチドを有するガイド配列部分を含む、請求項２～２７のいずれか一項に記載の組成物、または請求項２８～３７のいずれか一項に記載の方法。
39. ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを含む天然に存在しない組成物であって、前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼが、ＯＭＮＩ－５０ヌクレアーゼのドメインＡ、ドメインＢ、ドメインＣ、ドメインＤ、ドメインＥ、またはドメインＦのうちの少なくとも１つのアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を含む、組成物。
40. 前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼが、
    ａ）配列番号３のアミノ酸１～５０と少なくとも９７％の配列同一性を有するサブドメインＡ１、
    ｂ）配列番号３のアミノ酸７４１～７８９と少なくとも９７％の配列同一性を有するサブドメインＡ２、または
    ｃ）配列番号３のアミノ酸９６２～１０９６と少なくとも９７％の配列同一性を有するサブドメインＡ３、
    のうちの少なくとも１つを含む、ドメインＡを含む、請求項３９に記載の組成物。
41. 前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼが、配列番号３のアミノ酸５１～８３と少なくとも９７％の配列同一性を有するドメインＢを含む、請求項３９または４０に記載の組成物。
42. 前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼが、
    ａ）配列番号３のアミノ酸８４～１６０と少なくとも９７％の配列同一性を有するサブドメインＣ１、
    ｂ）配列番号３のアミノ酸１６１～２９９と少なくとも９７％の配列同一性を有するサブドメインＣ２、または
    ｃ）配列番号３のアミノ酸３００～７３７と少なくとも９７％の配列同一性を有するサブドメインＣ３
    のうちの少なくとも１つを含む、ドメインＣを含む、請求項３９～４１のいずれか一項に記載の組成物。
43. 前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼが、
    ａ）配列番号３のアミノ酸８４～４７８と少なくとも９７％の配列同一性を有するサブドメインＣａ、および
    ｂ）配列番号３のアミノ酸４７９～７３７と少なくとも９７％の配列同一性を有するサブドメインＣｂ
    のうちの少なくとも１つを含む、ドメインＣを含む、請求項３９～４１のいずれか一項に記載の組成物。
44. ドメインＣが、配列番号３のアミノ酸８４～７３７と少なくとも９７％の配列同一性を有する、請求項３９～４３のいずれか一項に記載の組成物。
45. 前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼが、配列番号３のアミノ酸７９０～９６１と少なくとも９７％の配列同一性を有するドメインＤを含む、請求項３９～４４のいずれか一項に記載の組成物。
46. 前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼが、配列番号３のアミノ酸１０９７～１１９６と少なくとも９７％の配列同一性を有するドメインＥを含む、請求項３９～４５のいずれか一項に記載の組成物。
47. 前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼが、配列番号３のアミノ酸１１９７～１３７０と少なくとも９７％の配列同一性を有するドメインＦを含む、請求項３９～４７のいずれか一項に記載の組成物。
48. 前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼが、ドメインＡ、ドメインＢ、ドメインＣ、ドメインＤ、ドメインＥ、およびドメインＦを含み、
    ａ）ドメインＡが、
    ｉ．配列番号３のアミノ酸１～５０と少なくとも９７％の配列同一性を有するサブドメインＡ１、
    ｉｉ．配列番号３のアミノ酸７４１～７８９と少なくとも９７％の配列同一性を有するサブドメインＡ２、および
    ｉｉｉ．配列番号３のアミノ酸９６２～１０９６と少なくとも９７％の配列同一性を有するサブドメインＡ３、を含み、
    ｂ）ドメインＢが、配列番号３のアミノ酸５１～８３と少なくとも９７％の配列同一性を有し、
    ｃ）ドメインＣが、配列番号３のアミノ酸８４～７３７と少なくとも９７％の配列同一性を有し、
    ｄ）ドメインＤが、配列番号３のアミノ酸７９０～９６１と少なくとも９７％の配列同一性を有し、
    ｅ）ドメインＥが、配列番号３のアミノ酸１０９７～１１９６と少なくとも９７％の配列同一性を有し、
    ｆ）ドメインＦが、配列番号３のアミノ酸１１９７～１３７０と少なくとも９７％の配列同一性を有する、
    請求項３９に記載の組成物。
49. 前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ配列が、少なくとも１００～２５０、２５０～５００、５００～１０００、または１０００～２０００アミノ酸長である、請求項３９～４８のいずれか一項に記載の組成物。
50. ペプチドを含む天然に存在しない組成物であって、前記ペプチドが、ＯＭＮＩ－５０ヌクレアーゼのドメインＡ、ドメインＢ、ドメインＣ、ドメインＤ、ドメインＥ、またはドメインＦのうちの少なくとも１つのアミノ酸配列と少なくとも９７％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、組成物。
51. ＯＭＮＩ－５０ヌクレアーゼのドメインＡ、ドメインＢ、ドメインＣ、ドメインＤ、ドメインＥ、またはドメインＦのうちの少なくとも１つのアミノ酸配列と少なくとも９７％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド含む、天然に存在しない組成物。
52. ＯＭＮＩ－５０ヌクレアーゼのドメインＡ、ドメインＢ、ドメインＣ、ドメインＤ、ドメインＥ、またはドメインＦのうちの少なくとも１つのアミノ酸配列と少なくとも９７％の配列同一性を有する、天然に存在しないアミノ酸配列。
53. 無細胞系または細胞のゲノム内の標的部位におけるヌクレオチド配列を改変する方法であって、請求項３９～５１のいずれか一項に記載の組成物を前記細胞に導入することを含む、方法。
54. 前記細胞が、真核細胞、好ましくは哺乳類細胞または植物細胞である、請求項５３に記載の方法。
55. ゲノム変異関連疾患に罹患している対象を治療するための、請求項３９～５１のいずれか一項に記載の組成物の使用であって、前記対象のゲノム内の標的部位におけるヌクレオチド配列を改変することを含む、使用。
56. 変異障害を有する対象を治療する方法であって、請求項３９～５１のいずれか一項に記載の組成物を、前記変異障害に関連する対立遺伝子に標的化することを含む、方法。
57. 前記変異障害が、新生物、加齢関連黄斑変性、統合失調症、神経学的、神経変性、または運動障害、脆弱Ｘ症候群、分泌酵素関連障害、プリオン関連障害、ＡＬＳ、中毒、自閉症、アルツハイマー病、好中球減少症、炎症関連障害、パーキンソン病、血液および凝固疾患および障害、細胞調節不全および腫瘍疾患および障害、炎症および免疫関連疾患および障害、代謝性、肝臓、腎臓、およびタンパク質疾患および障害、筋肉および骨格疾患および障害、皮膚疾患および障害、神経学的および神経疾患および障害、ならびに眼疾患および眼障害のうちのいずれかから選択される疾患または障害に関連する、請求項５６に記載の方法。
58. 前記変異障害が、ベータサラセミアまたは鎌状赤血球貧血である、請求項５６または５７に記載の方法。
59. 前記疾患に関連する前記対立遺伝子が、ＢＣＬ１１Ａである、請求項５８に記載の方法。

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