JP6887479B2 - Ｒｎａ依存性標的ｄｎａ修飾およびｒｎａ依存性転写調節のための方法および組成物 - Google Patents

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Description

相互参照
本出願は、２０１２年５月２５日に出願された米国仮特許出願第６１／６５２，０８６
号、２０１２年１０月１９日に出願された同第６１／７１６，２５６号、２０１３年１月
２８日に出願された同第６１／７５７，６４０号、および２０１３年２月１５日に出願さ
れた同第６１／７６５，５７６号の利益を主張するものであり、それぞれの米国仮特許出
願はその全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
連邦政府による資金提供を受けた研究の記載
本発明は、アメリカ国立衛生研究所によって与えられた助成金番号ＧＭ０８１８７９を
基に、政府援助を得てなされたものである。米国政府は本発明において一定の権利を有す
る。
テキストファイルとして提供される配列表の参照による組み込み
配列表は、２０１３年３月１３日に作成され７６４５ＫＢのサイズを有するテキストフ
ァイル「ＢＥＲＫ−１８７ＷＯ−ＳｅｑＬｉｓｔ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」として、本明細書
に提供される。テキストファイルの内容は、それらの全体が参照によって本明細書に組み
込まれる。
細菌の約６０％および古細菌の９０％が、外来ＤＮＡエレメントに対し耐性を付与する
ためのＣＲＩＳＰＲ（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅ
ｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔｓ）／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａ
ｓ）系を有している。ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ
ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系は、ＲＮＡによって誘導される外来ＤＮ
Ａサイレンシングに必要充分な、Ｃａｓ９タンパク質をコードする単一の遺伝子のみと、
２種のＲＮＡ（成熟ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）および部分的に相補的なトラン
ス作動性ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ））を含む。
近年、特定のＤＮＡ配列を標的とするよう設計された改変ヌクレアーゼ酵素が、標的化
された遺伝子欠失、遺伝子置換および遺伝子修復、並びに外来性配列（導入遺伝子）のゲ
ノムへの挿入を可能にする、細胞および生物全体を遺伝子操作するための強力なツールと
して、かなりの関心を集めている。部位特異的ＤＮＡヌクレアーゼを改変するための２つ
の主な技術が登場しており、それらは共に、配列非特異的ＤＮＡエンドヌクレアーゼドメ
インが改変ＤＮＡ結合ドメインに融合されたキメラエンドヌクレアーゼ酵素の構築に基づ
いている。しかし、それぞれの新たなゲノム遺伝子座を標的とするには新規のヌクレアー
ゼ酵素の設計が必要であるが、このことから、これらのアプローチは多大な時間を要し且
つ高価なものとなっている。さらに、これら２つの技術は正確性が限定されているという
欠点を有しており、それにより予測不可能な非特異的作用がもたらされる可能性がある。
細胞のゲノムおよび遺伝子再プログラミングの系統的照合は、発現または抑制のために
一連の遺伝子を標的とすることを含む。近年の、任意遺伝子を調節のために標的とする最
も一般的なアプローチは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を使用することである。このアプロー
チには限界があり、例えば、ＲＮＡｉは有意な非特異的作用および毒性を示し得る。
それぞれの新たな標的配列のために新たなタンパク質を設計する必要がない形で、ヌク
レアーゼ活性（または他のタンパク質活性）を標的ＤＮＡ内の異なる場所へ正確にターゲ
ティングすることを可能にする技術が、この分野で必要とされている。さらに、非特異的
な作用を最小限にして遺伝子発現を調節する方法が、当該技術分野において必要とされて
いる。
本開示は、ターゲティング配列を含み、修飾ポリペプチドと共に、標的ＤＮＡおよび／
または標的ＤＮＡと結合したポリペプチドの部位特異的修飾を与える、ＤＮＡ標的化ＲＮ
Ａを提供する。本開示はさらに、部位特異的修飾ポリペプチドを提供する。本開示はさら
に、標的ＤＮＡおよび／または標的ＤＮＡと結合したポリペプチドの部位特異的修飾の方
法を提供する。本開示は、標的核酸を酵素的に不活性なＣａｓ９ポリペプチドおよびＤＮ
Ａ標的化ＲＮＡと接触させることを一般的に含む、標的細胞内の標的核酸の転写を調節す
る方法を提供する。該方法を実行するためのキットおよび組成物も提供される。本開示は
、Ｃａｓ９を産生する遺伝子改変細胞；およびＣａｓ９遺伝子導入非ヒト多細胞生物を提
供する。
特徴
本開示の特徴には、（ｉ）標的ＤＮＡ内の配列に対し相補的なヌクレオチド配列を含む
第一セグメント；および（ｉｉ）部位特異的修飾ポリペプチドと相互作用する第二セグメ
ントを含むＤＮＡ標的化ＲＮＡが含まれる。いくつかの例において、第一セグメントは、
標的ＤＮＡ内の配列に対して１００％の相補性を有する８個のヌクレオチドを含む。いく
つかの例において、第二セグメントは、配列番号４３１〜６８２（例えば、４３１〜５６
２）に記載のヌクレオチド配列のうちのいずれか１つに対して、一連の少なくとも８個の
連続ヌクレオチドにわたって少なくとも６０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む
。いくつかの例において、第二セグメントは、配列番号５６３〜６８２に記載のヌクレオ
チド配列のうちのいずれか１つに対して、一連の少なくとも８個の連続ヌクレオチドにわ
たって少なくとも６０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの例におい
て、部位特異的修飾ポリペプチドは、図３に示されるＣａｓ９／Ｃｓｎ１アミノ酸配列の
アミノ酸７〜１６６もしくは７３１〜１００３に対して、または配列番号１〜２５６およ
び７９５〜１３４６として記載されるアミノ酸配列のうちのいずれかにおける対応部分に
対して、少なくとも約７５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
本開示の特徴には、ＤＮＡ標的化ＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡポ
リヌクレオチドが含まれる。いくつかの例において、組み換え発現ベクターは、ＤＮＡポ
リヌクレオチドを含む。いくつかの例において、ＤＮＡ標的化ＲＮＡをコードするヌクレ
オチド配列は、プロモーターに作動可能に連結している。いくつかの例において、プロモ
ーターは、誘導性プロモーターである。いくつかの例において、ＤＮＡ標的化ＲＮＡをコ
ードするヌクレオチド配列は、複数のクローニング部位をさらに含む。本開示の特徴には
、ＤＮＡポリヌクレオチドを含むインビトロ遺伝子改変宿主細胞が含まれる。
本開示の特徴には、（ｉ）（ａ）標的ＤＮＡ内の配列に対し相補的なヌクレオチド配列
を含む第一セグメント；および（ｂ）部位特異的修飾ポリペプチドと相互作用する第二セ
グメントを含むＤＮＡ標的化ＲＮＡをコードするヌクレオチド配列；並びに（ｉｉ）（ａ
）ＤＮＡ標的化ＲＮＡと相互作用するＲＮＡ結合部位；および（ｂ）部位特異的酵素活性
を示す活性部位であって、酵素活性の部位がＤＮＡ標的化ＲＮＡによって決定される、活
性部位を含む部位特異的修飾ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、を含む組み換
え発現ベクターが含まれる。
本開示の特徴には、（ｉ）（ａ）標的ＤＮＡ内の配列に対し相補的なヌクレオチド配列
を含む第一セグメント；および（ｂ）部位特異的修飾ポリペプチドと相互作用する第二セ
グメントを含むＤＮＡ標的化ＲＮＡをコードするヌクレオチド配列；並びに（ｉｉ）（ａ
）ＤＮＡ標的化ＲＮＡと相互作用するＲＮＡ結合部位；および（ｂ）標的ＤＮＡ内の転写
を調節する活性部位であって、標的ＤＮＡ内の転写が調節される部位がＤＮＡ標的化ＲＮ
Ａによって決定される、活性部位を含む部位特異的修飾ポリペプチドをコードするヌクレ
オチド配列、を含む組み換え発現ベクターが含まれる。
本開示の特徴には、（ｉ）標的ＤＮＡ内の配列に対し相補的なヌクレオチド配列を含む
ＤＮＡ標的化ＲＮＡと相互作用するＲＮＡ結合部位；および（ｉｉ）低減された部位特異
的酵素活性を示す活性部位であって、酵素活性の部位がＤＮＡ標的化ＲＮＡによって決定
される、活性部位を含む変異型部位特異的修飾ポリペプチドが含まれる。いくつかの例に
おいて、変異型部位特異的修飾ポリペプチドは、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ． ｐｙｏｇｅｎｅ
ｓ）配列（配列番号８）のＨ８４０Ａ変異、または配列番号１〜２５６および７９５〜１
３４６として記載されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する変異を含む。いくつか
の例において、変異型部位特異的修飾ポリペプチドは、Ｓ．ピオゲネス配列（配列番号８
）のＤ１０Ａ変異、または配列番号１〜２５６および７９５〜１３４６として記載される
アミノ酸配列のいずれかにおける対応する変異を含む。いくつかの例において、変異型部
位特異的修飾ポリペプチドは、（ｉ）Ｓ．ピオゲネス配列（配列番号８）のＤ１０Ａ変異
、または配列番号１〜２５６および７９５〜１３４６として記載されるアミノ酸配列のい
ずれかにおける対応する変異；並びに（ｉｉ）Ｓ．ピオゲネス配列（配列番号８）のＨ８
４０Ａ変異、または配列番号１〜２５６および７９５〜１３４６として記載されるアミノ
酸配列のいずれかにおける対応する変異を両方含む。
本開示の特徴には、（ｉ）標的ＤＮＡ内の配列に対し相補的なヌクレオチド配列を含む
ＤＮＡ標的化ＲＮＡと相互作用するＲＮＡ結合部位；および（ｉｉ）部位特異的酵素活性
を示す活性部位であって、酵素活性の部位がＤＮＡ標的化ＲＮＡによって決定される、活
性部位を含むキメラ部位特異的修飾ポリペプチドが含まれる。いくつかの例において、キ
メラ部位特異的修飾ポリペプチドは、図３に示されるＣａｓ９／Ｃｓｎ１アミノ酸配列の
アミノ酸７〜１６６もしくは７３１〜１００３に対して、または配列番号１〜２５６およ
び７９５〜１３４６として記載されるアミノ酸配列のうちのいずれかにおける対応部分に
対して、少なくとも約７５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつ
かの例において、ＤＮＡ標的化ＲＮＡは、配列番号４３１〜６８２（例えば、配列番号５
６３〜６８２）に記載のヌクレオチド配列のうちのいずれか１つに対して、一連の少なく
とも８個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも６０％の同一性を有するヌクレオチド
配列をさらに含む。いくつかの例において、ＤＮＡ標的化ＲＮＡは、配列番号４３１〜５
６２に記載のヌクレオチド配列のうちのいずれか１つに対して、一連の少なくとも８個の
連続ヌクレオチドにわたって少なくとも６０％の同一性を有するヌクレオチド配列をさら
に含む。いくつかの例において、キメラ部位特異的修飾ポリペプチドの酵素活性は、標的
ＤＮＡを修飾する。いくつかの例において、キメラ部位特異的修飾ポリペプチドの酵素活
性は、ヌクレアーゼ活性、メチルトランスフェラーゼ活性、脱メチル化酵素活性、ＤＮＡ
修復活性、ＤＮＡ損傷活性、脱アミノ化活性、ジスムターゼ活性、アルキル化活性、脱プ
リン活性、酸化活性、ピリミジンダイマー形成活性、インテグラーゼ活性、トランスポサ
ーゼ活性、リコンビナーゼ活性、ポリメラーゼ活性、リガーゼ活性、ヘリカーゼ活性、光
回復酵素活性またはグリコシラーゼ活性である。いくつかの例において、キメラ部位特異
的修飾ポリペプチドの酵素活性は、ヌクレアーゼ活性である。いくつかの例において、ヌ
クレアーゼ活性は、標的ＤＮＡ内で二重鎖切断を引き起こす。いくつかの例において、キ
メラ部位特異的修飾ポリペプチドの酵素活性は、標的ＤＮＡと結合した標的ポリペプチド
を修飾する。いくつかの例において、キメラ部位特異的修飾ポリペプチドの酵素活性は、
メチルトランスフェラーゼ活性、脱メチル化酵素活性、アセチルトランスフェラーゼ活性
、脱アセチル化酵素活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、ユビキチンリガーゼ活性
、脱ユビキチン化活性、アデニル化活性、脱アデニル化活性、ＳＵＭＯ化活性、脱ＳＵＭ
Ｏ化活性、リボシル化活性、脱リボシル化活性、ミリストイル化活性または脱ミリストイ
ル化活性である。
本開示の特徴には、キメラ部位特異的修飾ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列
を含むポリヌクレオチドが含まれる。いくつかの例において、該ポリヌクレオチドは、Ｒ
ＮＡポリヌクレオチドである。いくつかの例において、該ポリヌクレオチドは、ＤＮＡポ
リヌクレオチドである。本開示の特徴には、該ポリヌクレオチドを含む組み換え発現ベク
ターが含まれる。いくつかの例において、該ポリヌクレオチドは、プロモーターに作動可
能に連結している。いくつかの例において、プロモーターは誘導性プロモーターである。
本開示の特徴には、該ポリヌクレオチドを含むインビトロ遺伝子改変宿主細胞が含まれる
。
本開示の特徴には、（ｉ）標的ＤＮＡ内の配列に対し相補的なヌクレオチド配列を含む
ＤＮＡ標的化ＲＮＡと相互作用するＲＮＡ結合部位；および（ｉｉ）標的ＤＮＡ内の転写
を調節する活性部位であって、標的ＤＮＡ内の転写が調節される部位がＤＮＡ標的化ＲＮ
Ａによって決定される、活性部位を含むキメラ部位特異的修飾ポリペプチドが含まれる。
いくつかの例において、活性部位は標的ＤＮＡ内の転写を増加させる。いくつかの例にお
いて、活性部位は標的ＤＮＡ内の転写を減少させる。
本開示の特徴には、ＤＮＡ標的化ＲＮＡと相互作用するＲＮＡ結合部位；および部位特
異的酵素活性を示す活性部位であって、酵素活性の部位がＤＮＡ標的化ＲＮＡによって決
定される、活性部位を含む組換え部位特異的修飾ポリペプチド、を含む遺伝子改変細胞が
含まれる。いくつかの例において、部位特異的修飾ポリペプチドは、図３に示されるＣａ
ｓ９／Ｃｓｎ１アミノ酸配列のアミノ酸７〜１６６もしくは７３１〜１００３に対して、
または配列番号１〜２５６および７９５〜１３４６として記載されるアミノ酸配列のうち
のいずれかにおける対応部分に対して、少なくとも約７５％のアミノ酸配列同一性を有す
るアミノ酸配列を含む。いくつかの例において、細胞は、古細菌細胞、細菌細胞、真核細
胞、真核単細胞生物、体細胞、生殖細胞、幹細胞、植物細胞、藻細胞、動物細胞、無脊椎
動物細胞、脊椎動物細胞、魚類細胞、カエル細胞、鳥類細胞、哺乳類細胞、ブタ細胞、雌
ウシ細胞、ヤギ細胞、ヒツジ細胞、げっ歯類細胞、ラット細胞、マウス細胞、非ヒト霊長
類細胞、およびヒト細胞からなる群から選択される。
本開示の特徴には、ゲノムが、（ｉ）ＤＮＡ標的化ＲＮＡと相互作用するＲＮＡ結合部
位；および（ｉｉ）部位特異的酵素活性を示す活性部位であって、酵素活性の部位がＤＮ
Ａ標的化ＲＮＡによって決定される、活性部位を含む、組換え部位特異的修飾ポリペプチ
ドをコードするヌクレオチド配列を含む、導入遺伝子を含む、遺伝子導入非ヒト生物が含
まれる。いくつかの例において、部位特異的修飾ポリペプチドは、図３に示されるＣａｓ
９／Ｃｓｎ１アミノ酸配列のアミノ酸７〜１６６もしくは７３１〜１００３に対して、ま
たは配列番号１〜２５６および７９５〜１３４６として記載されるアミノ酸配列のうちの
いずれかにおける対応部分に対して、少なくとも約７５％のアミノ酸配列同一性を有する
アミノ酸配列を含む。いくつかの例において、該生物は、古細菌、細菌、真核単細胞生物
、藻、植物、動物、無脊椎動物、ハエ、虫、刺胞動物、脊椎動物、魚、カエル、鳥、哺乳
動物、有蹄動物、げっ歯類動物、ラット、マウス、および非ヒト霊長類動物からなる群か
ら選択される。
本開示の特徴には、（ｉ）（ａ）標的ＤＮＡ内の配列に対し相補的なヌクレオチド配列
を含む第一セグメント；および（ｂ）部位特異的修飾ポリペプチドと相互作用する第二セ
グメントを含むＤＮＡ標的化ＲＮＡ、またはそれをコードするＤＮＡポリヌクレオチド；
並びに（ｉｉ）（ａ）ＤＮＡ標的化ＲＮＡと相互作用するＲＮＡ結合部位；および（ｂ）
部位特異的酵素活性を示す活性部位であって、酵素活性の部位がＤＮＡ標的化ＲＮＡによ
って決定される、活性部位を含む部位特異的修飾ポリペプチド、またはそれをコードする
ポリヌクレオチド、を含む組成物が含まれる。いくつかの例において、ＤＮＡ標的化ＲＮ
Ａの第一セグメントは、標的ＤＮＡ内の配列に対して少なくとも１００％の相補性を有す
る８個のヌクレオチドを含む。いくつかの例において、ＤＮＡ標的化ＲＮＡの第二セグメ
ントは、配列番号４３１〜６８２（例えば、配列番号５６３〜６８２）に記載のヌクレオ
チド配列のうちのいずれか１つに対して、一連の少なくとも８個の連続ヌクレオチドにわ
たって少なくとも６０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの例におい
て、ＤＮＡ標的化ＲＮＡの第二セグメントは、配列番号４３１〜５６２に記載のヌクレオ
チド配列のうちのいずれか１つに対して、一連の少なくとも８個の連続ヌクレオチドにわ
たって少なくとも６０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの例におい
て、部位特異的修飾ポリペプチドは、図３に示されるＣａｓ９／Ｃｓｎ１アミノ酸配列の
アミノ酸７〜１６６もしくは７３１〜１００３に対して、または配列番号１〜２５６およ
び７９５〜１３４６として記載されるアミノ酸配列のうちのいずれかにおける対応部分に
対して、少なくとも約７５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつ
かの例において、酵素活性は標的ＤＮＡを修飾する。いくつかの例において、酵素活性は
、ヌクレアーゼ活性、メチルトランスフェラーゼ活性、脱メチル化酵素活性、ＤＮＡ修復
活性、ＤＮＡ損傷活性、脱アミノ化活性、ジスムターゼ活性、アルキル化活性、脱プリン
活性、酸化活性、ピリミジンダイマー形成活性、インテグラーゼ活性、トランスポサーゼ
活性、リコンビナーゼ活性、ポリメラーゼ活性、リガーゼ活性、ヘリカーゼ活性、光回復
酵素活性またはグリコシラーゼ活性である。いくつかの例において、酵素活性はヌクレア
ーゼ活性である。いくつかの例において、ヌクレアーゼ活性は標的ＤＮＡ内で二重鎖切断
を引き起こす。いくつかの例において、酵素活性は標的ＤＮＡと結合した標的ポリペプチ
ドを修飾する。いくつかの例において、酵素活性は、メチルトランスフェラーゼ活性、脱
メチル化酵素活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、脱アセチル化酵素活性、キナーゼ
活性、ホスファターゼ活性、ユビキチンリガーゼ活性、脱ユビキチン化活性、アデニル化
活性、脱アデニル化活性、ＳＵＭＯ化活性、脱ＳＵＭＯ化活性、リボシル化活性、脱リボ
シル化活性、ミリストイル化活性または脱ミリストイル化活性である。いくつかの例にお
いて、標的ポリペプチドはヒストンであり、酵素活性はメチルトランスフェラーゼ活性、
脱メチル化酵素活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、脱アセチル化酵素活性、キナー
ゼ活性、ホスファターゼ活性、ユビキチンリガーゼ活性または脱ユビキチン化活性である
。いくつかの例において、ＤＮＡ標的化ＲＮＡは二重分子ＤＮＡ標的化ＲＮＡであり、組
成物は標的化ＲＮＡおよび活性化ＲＮＡの両方を含み、その二本鎖形成セグメントは相補
的でありハイブリダイズしてＤＮＡ標的化ＲＮＡの第二セグメントを形成する。いくつか
の例において、活性化ＲＮＡの二本鎖形成セグメントは、配列番号４３１〜６８２に記載
のヌクレオチド配列のうちのいずれか１つに対して、一連の少なくとも８個の連続ヌクレ
オチドにわたって少なくとも６０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
本開示の特徴には、（ｉ）本開示のＤＮＡ標的化ＲＮＡ、またはそれをコードするＤＮ
Ａポリヌクレオチド；および（ｉｉ）核酸を安定化させるための緩衝液を含む組成物が含
まれる。本開示の特徴には、（ｉ）本開示の部位特異的修飾ポリペプチド、またはそれを
コードするポリヌクレオチド；並びに（ｉｉ）核酸および／またはタンパク質を安定化さ
せるための緩衝液を含む組成物が含まれる。本開示の特徴には、（ｉ）（ａ）標的ＤＮＡ
内の配列に対し相補的なヌクレオチド配列を含む第一セグメント；および（ｂ）部位特異
的修飾ポリペプチドと相互作用する第二セグメントを含むＤＮＡ標的化ＲＮＡ、またはそ
れをコードするＤＮＡポリヌクレオチド；並びに（ｉｉ）（ａ）ＤＮＡ標的化ＲＮＡと相
互作用するＲＮＡ結合部位；および（ｂ）標的ＤＮＡ内の転写を調節する活性部位であっ
て、標的ＤＮＡ内の転写が調節される部位がＤＮＡ標的化ＲＮＡによって決定される、活
性部位を含む部位特異的修飾ポリペプチド、またはそれをコードするポリヌクレオチド、
を含む組成物が含まれる。いくつかの例において、活性部位は、標的ＤＮＡ内の転写を増
加させる。いくつかの例において、活性部位は、標的ＤＮＡ内の転写を減少させる。本開
示の特徴には、（ｉ）部位特異的修飾ポリペプチド、またはそれをコードするポリヌクレ
オチド；並びに（ｉｉ）核酸および／またはタンパク質を安定化させるための緩衝液、を
含む組成物が含まれる。
本開示の特徴には、標的ＤＮＡを部位特異的修飾する方法が含まれ、該方法は、標的Ｄ
ＮＡを、（ｉ）（ａ）標的ＤＮＡ内の配列に対し相補的なヌクレオチド配列を含む第一セ
グメント；および（ｂ）部位特異的修飾ポリペプチドと相互作用する第二セグメントを含
むＤＮＡ標的化ＲＮＡ、またはそれをコードするＤＮＡポリヌクレオチド；並びに（ｉｉ
）（ａ）ＤＮＡ標的化ＲＮＡと相互作用するＲＮＡ結合部位；および（ｂ）部位特異的酵
素活性を示す活性部位を含む部位特異的修飾ポリペプチド、またはそれをコードするポリ
ヌクレオチド、と接触させることを含む。いくつかの例において、標的ＤＮＡは染色体外
に存在する。いくつかの例において、標的ＤＮＡは、５’−ＣＣＹ−３’である相補鎖の
ＰＡＭ配列を含み、ここでＹはあらゆるＤＮＡヌクレオチドであり、Ｙは標的ＤＮＡの相
補鎖の標的配列のすぐ５’側である。いくつかの例において、標的ＤＮＡはインビトロに
おける染色体の一部である。いくつかの例において、標的ＤＮＡはインビボにおける染色
体の一部である。いくつかの例において、標的ＤＮＡは細胞内の染色体の一部である。い
くつかの例において、細胞は、古細菌細胞、細菌細胞、真核細胞、真核単細胞生物、体細
胞、生殖細胞、幹細胞、植物細胞、藻細胞、動物細胞、無脊椎動物細胞、脊椎動物細胞、
魚類細胞、カエル細胞、鳥類細胞、哺乳類細胞、ブタ細胞、雌ウシ細胞、ヤギ細胞、ヒツ
ジ細胞、げっ歯類細胞、ラット細胞、マウス細胞、非ヒト霊長類細胞、およびヒト細胞か
らなる群から選択される。いくつかの例において、ＤＮＡ標的化ＲＮＡは、配列番号４３
１〜６８２（例えば、配列番号５６３〜６８２）に記載のヌクレオチド配列のうちのいず
れか１つに対して、一連の少なくとも８個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも６０
％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの例において、ＤＮＡ標的化ＲＮ
Ａは、配列番号４３１〜５６２に記載のヌクレオチド配列のいずれかに対して、一連の少
なくとも８個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも６０％の同一性を有するヌクレオ
チド配列を含む。いくつかの例において、ＤＮＡ修飾ポリペプチドは、図３に示されるＣ
ａｓ９／Ｃｓｎ１アミノ酸配列のアミノ酸７〜１６６もしくは７３１〜１００３に対して
、または配列番号１〜２５６および７９５〜１３４６として記載されるアミノ酸配列のう
ちのいずれかにおける対応部分に対して、少なくとも約７５％のアミノ酸配列同一性を有
するアミノ酸配列を含む。いくつかの例において、酵素活性は標的ＤＮＡを修飾する。い
くつかの例において、酵素活性は、ヌクレアーゼ活性、メチルトランスフェラーゼ活性、
脱メチル化酵素活性、ＤＮＡ修復活性、ＤＮＡ損傷活性、脱アミノ化活性、ジスムターゼ
活性、アルキル化活性、脱プリン活性、酸化活性、ピリミジンダイマー形成活性、インテ
グラーゼ活性、トランスポサーゼ活性、リコンビナーゼ活性、ポリメラーゼ活性、リガー
ゼ活性、ヘリカーゼ活性、光回復酵素活性またはグリコシラーゼ活性である。いくつかの
例において、ＤＮＡ修飾酵素活性はヌクレアーゼ活性である。いくつかの例において、ヌ
クレアーゼ活性は標的ＤＮＡ内で二重鎖切断を引き起こす。いくつかの例において、接触
は、非相同末端結合または相同組換え修復に許容的な条件下で起こる。いくつかの例にお
いて、該方法は、標的ＤＮＡをドナーポリヌクレオチドと接触させることをさらに含み、
ドナーポリヌクレオチド、ドナーポリヌクレオチドの一部、ドナーポリヌクレオチドのコ
ピー、またはドナーポリヌクレオチドのコピーの一部は標的ＤＮＡに組み込まれる。いく
つかの例において、該方法は、細胞をドナーポリヌクレオチドと接触させることを含まず
、標的ＤＮＡ内のヌクレオチドが欠失されるように標的ＤＮＡが修飾される。いくつかの
例において、酵素活性は標的ＤＮＡと結合した標的ポリペプチドを修飾する。いくつかの
例において、酵素活性は、メチルトランスフェラーゼ活性、脱メチル化酵素活性、アセチ
ルトランスフェラーゼ活性、脱アセチル化酵素活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性
、ユビキチンリガーゼ活性、脱ユビキチン化活性、アデニル化活性、脱アデニル化活性、
ＳＵＭＯ化活性、脱ＳＵＭＯ化活性、リボシル化活性、脱リボシル化活性、ミリストイル
化活性または脱ミリストイル化活性である。いくつかの例において、標的ポリペプチドは
ヒストンであり、酵素活性はメチルトランスフェラーゼ活性、脱メチル化酵素活性、アセ
チルトランスフェラーゼ活性、脱アセチル化酵素活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活
性、ユビキチンリガーゼ活性または脱ユビキチン化活性である。いくつかの例において、
複合体は活性化ＲＮＡをさらに含む。いくつかの例において、活性化ＲＮＡは、配列番号
４３１〜６８２に記載のヌクレオチド配列のうちのいずれか１つに対して、一連の少なく
とも８個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも６０％の同一性を有するヌクレオチド
配列を含む。
本開示の特徴には、標的ＤＮＡ内の部位特異的転写を調節する方法が含まれ、該方法は
、標的ＤＮＡを、（ｉ）（ａ）標的ＤＮＡ内の配列に対し相補的なヌクレオチド配列を含
む第一セグメント；および（ｂ）部位特異的修飾ポリペプチドと相互作用する第二セグメ
ントを含むＤＮＡ標的化ＲＮＡ、またはそれをコードするＤＮＡポリヌクレオチド；並び
に（ｉｉ）（ａ）ＤＮＡ標的化ＲＮＡと相互作用するＲＮＡ結合部位；および（ｂ）転写
を調節する活性部位を含む部位特異的修飾ポリペプチド、またはそれをコードするポリヌ
クレオチドと接触させることを含み、該接触により標的ＤＮＡ内の転写の調節がもたらさ
れる。いくつかの例において、標的ＤＮＡ内の転写は増加される。いくつかの例において
、標的ＤＮＡ内の転写は減少される。
本開示の特徴には、標的ＤＮＡにおける部位特異的修飾の方法が含まれ、該方法は、標
的ＤＮＡを、（ｉ）（ａ）標的ＤＮＡ内の配列に対し相補的なヌクレオチド配列を含む第
一セグメント；および（ｂ）部位特異的修飾ポリペプチドと相互作用する第二セグメント
を含むＤＮＡ標的化ＲＮＡ、またはそれをコードするＤＮＡポリヌクレオチド；並びに（
ｉｉ）（ａ）ＤＮＡ標的化ＲＮＡと相互作用するＲＮＡ結合部位；および（ｂ）標的ＤＮ
Ａ内の転写を調節する活性部位を含む部位特異的修飾ポリペプチド、またはそれをコード
するポリヌクレオチドと接触させることを含む。いくつかの例において、部位特異的修飾
ポリペプチドは、標的ＤＮＡ内の転写を増加させる。いくつかの例において、部位特異的
修飾ポリペプチドは、標的ＤＮＡ内の転写を減少させる。
本開示の特徴には、細胞内の標的ＤＮＡの部位特異的切断および修飾を促進する方法が
含まれ、該方法は、細胞に、（ｉ）（ａ）標的ＤＮＡ内の配列に対し相補的なヌクレオチ
ド配列を含む第一セグメント；および（ｂ）部位特異的修飾ポリペプチドと相互作用する
第二セグメントを含むＤＮＡ標的化ＲＮＡ、またはそれをコードするＤＮＡポリヌクレオ
チド；並びに（ｉｉ）（ａ）ＤＮＡ標的化ＲＮＡと相互作用するＲＮＡ結合部位；および
（ｂ）標的ＤＮＡ内に二重鎖切断を生成するヌクレアーゼ活性を示す活性部位を含む部位
特異的修飾ポリペプチド、またはそれをコードするポリヌクレオチドを導入することを含
み；二重鎖切断の部位はＤＮＡ標的化ＲＮＡによって決定され、接触は非相同末端結合ま
たは相同組換え修復に許容的な条件下で起こり、標的ＤＮＡが切断および再結合されるこ
とで修飾されたＤＮＡ配列が生成される。いくつかの例において、該方法は標的ＤＮＡを
ドナーポリヌクレオチドと接触させることをさらに含み、ドナーポリヌクレオチド、ドナ
ーポリヌクレオチドの一部、ドナーポリヌクレオチドのコピー、またはドナーポリヌクレ
オチドのコピーの一部が標的ＤＮＡ内に組み込まれる。いくつかの例において、該方法は
、細胞をドナーポリヌクレオチドと接触させることを含まず、標的ＤＮＡ内のヌクレオチ
ドが欠失されるように標的ＤＮＡが修飾される。いくつかの例において、該細胞は、古細
菌細胞、細菌細胞、真核細胞、真核単細胞生物、体細胞、生殖細胞、幹細胞、植物細胞、
藻細胞、動物細胞、無脊椎動物細胞、脊椎動物細胞、魚類細胞、カエル細胞、鳥類細胞、
哺乳類細胞、ブタ細胞、雌ウシ細胞、ヤギ細胞、ヒツジ細胞、げっ歯類細胞、ラット細胞
、マウス細胞、非ヒト霊長類細胞、およびヒト細胞からなる群から選択される。いくつか
の例において、該細胞はインビトロに存在する。いくつかの例において、該細胞はインビ
ボに存在する。
本開示の特徴には、対象において遺伝子改変細胞を生産する方法が含まれ、該方法は、
（Ｉ）細胞に、（ｉ）（ａ）標的ＤＮＡ内の配列に対し相補的なヌクレオチド配列を含む
第一セグメント；および（ｂ）部位特異的修飾ポリペプチドと相互作用する第二セグメン
トを含むＤＮＡ標的化ＲＮＡ、またはそれをコードするＤＮＡポリヌクレオチド；並びに
（ｉｉ）（ａ）ＤＮＡ標的化ＲＮＡと相互作用するＲＮＡ結合部位；および（ｂ）標的Ｄ
ＮＡ内に二重鎖切断を生成するヌクレアーゼ活性を示す活性部位を含む部位特異的修飾ポ
リペプチド、またはそれをコードするポリヌクレオチドを導入すること（ここで、二重鎖
切断の部位はＤＮＡ標的化ＲＮＡによって決定され、接触は非相同末端結合または相同組
換え修復に許容的な条件下で起こり、標的ＤＮＡが切断および再結合されることで修飾さ
れたＤＮＡ配列が生成され；それによって遺伝子改変細胞が生産される）、並びに（ＩＩ
）遺伝子改変細胞を対象に移植することを含む。いくつかの例において、該方法は細胞を
ドナーポリヌクレオチドと接触させることをさらに含み、ドナーポリヌクレオチド、ドナ
ーポリヌクレオチドの一部、ドナーポリヌクレオチドのコピー、またはドナーポリヌクレ
オチドのコピーの一部が標的ＤＮＡに組み込まれる。いくつかの例において、該方法は、
細胞をドナーポリヌクレオチドと接触させることを含まず、標的ＤＮＡ内のヌクレオチド
が欠失されるように標的ＤＮＡが修飾される。いくつかの例において、該細胞は、古細菌
細胞、細菌細胞、真核細胞、真核単細胞生物、体細胞、生殖細胞、幹細胞、植物細胞、藻
細胞、動物細胞、無脊椎動物細胞、脊椎動物細胞、魚類細胞、両生類細胞、鳥類細胞、哺
乳類細胞、有蹄動物細胞、げっ歯類細胞、非ヒト霊長類細胞、およびヒト細胞からなる群
から選択される。
本開示の特徴には、外来性部位特異的修飾ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列
を含む遺伝子改変細胞内の標的ＤＮＡを修飾する方法が含まれ、該方法は、遺伝子改変細
胞にＤＮＡ標的化ＲＮＡ、またはそれをコードするＤＮＡポリヌクレオチドを導入するこ
とを含み、（ｉ）該ＤＮＡ標的化ＲＮＡは（ａ）標的ＤＮＡ内の配列に対し相補的なヌク
レオチド配列を含む第一セグメント；および（ｂ）部位特異的修飾ポリペプチドと相互作
用する第二セグメントを含み；（ｉｉ）該部位特異的修飾ポリペプチドは、（ａ）ＤＮＡ
標的化ＲＮＡと相互作用するＲＮＡ結合部位；および（ｂ）ヌクレアーゼ活性を示す活性
部位を含む。いくつかの例において、部位特異的修飾ポリペプチドは、図３に示されるＣ
ａｓ９／Ｃｓｎ１アミノ酸配列のアミノ酸７〜１６６もしくは７３１〜１００３に対して
、または配列番号１〜２５６および７９５〜１３４６として記載されるアミノ酸配列のう
ちのいずれかにおける対応部分に対して、少なくとも約７５％のアミノ酸配列同一性を有
するアミノ酸配列を含む。いくつかの例において、該細胞は、古細菌細胞、細菌細胞、真
核細胞、真核単細胞生物、体細胞、生殖細胞、幹細胞、植物細胞、藻細胞、動物細胞、無
脊椎動物細胞、脊椎動物細胞、魚類細胞、両生類細胞、鳥類細胞、哺乳類細胞、有蹄動物
細胞、げっ歯類細胞、非ヒト霊長類細胞、およびヒト細胞からなる群から選択される。い
くつかの例において、該細胞はインビボに存在する。いくつかの例において、該細胞はイ
ンビトロに存在する。いくつかの例において、部位特異的修飾ポリペプチドの発現は誘導
性プロモーターの制御下にある。いくつかの例において、部位特異的修飾ポリペプチドの
発現は細胞型特異的プロモーターの制御下にある。
本開示の特徴には、ＤＮＡ標的化ＲＮＡ、またはそれをコードするＤＮＡポリヌクレオ
チド；並びに再構成および／または希釈のための試薬を含むキットが含まれる。いくつか
の例において、キットは、細胞にＤＮＡ標的化ＲＮＡを導入するための緩衝液、洗浄緩衝
液、対照試薬、対照発現ベクターまたはＲＮＡポリヌクレオチド、ＤＮＡからＤＮＡ標的
化ＲＮＡを転写するための試薬、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される試
薬をさらに含む。
本開示の特徴には、本開示の部位特異的修飾ポリペプチド、またはそれをコードするポ
リヌクレオチド；並びに再構成および／または希釈のための試薬を含むキットが含まれる
。いくつかの例において、キットは、細胞に部位特異的修飾ポリペプチドを導入するため
の緩衝液、洗浄緩衝液、対照試薬、対照発現ベクターまたはＲＮＡポリヌクレオチド、Ｄ
ＮＡから部位特異的修飾ポリペプチドをインビトロ生成するための試薬、およびそれらの
組み合わせからなる群から選択される試薬をさらに含む。
本開示の特徴には、本開示の部位特異的修飾ポリペプチド、またはそれをコードするポ
リヌクレオチド；並びに再構成および／または希釈のための試薬を含むキットが含まれる
。本開示の特徴には、（ａ）標的ＤＮＡ内の配列に対し相補的なヌクレオチド配列を含む
第一セグメント；および（ｂ）部位特異的修飾ポリペプチドと相互作用する第二セグメン
トを含むＤＮＡ標的化ＲＮＡ、またはそれをコードするＤＮＡポリヌクレオチド；並びに
（ｉｉ）（ａ）ＤＮＡ標的化ＲＮＡと相互作用するＲＮＡ結合部位；および（ｂ）部位特
異的酵素活性を示す活性部位であって、酵素活性の部位がＤＮＡ標的化ＲＮＡによって決
定される、活性部位を含む部位特異的修飾ポリペプチド、またはそれをコードするポリヌ
クレオチドを含むキットが含まれる。
本開示の特徴には、（ｉ）（ａ）標的ＤＮＡ内の配列に対し相補的なヌクレオチド配列
を含む第一セグメント；および（ｂ）部位特異的修飾ポリペプチドと相互作用する第二セ
グメントを含むＤＮＡ標的化ＲＮＡ、またはそれをコードするＤＮＡポリヌクレオチド；
並びに（ｉｉ）（ａ）ＤＮＡ標的化ＲＮＡと相互作用するＲＮＡ結合部位；および（ｂ）
標的ＤＮＡ内の転写を調節する活性部位であって、標的ＤＮＡ内の転写が調節される部位
がＤＮＡ標的化ＲＮＡによって決定される、活性部位を含む部位特異的修飾ポリペプチド
、またはそれをコードするポリヌクレオチドを含むキットが含まれる。
本開示の特徴には、（ｉ）上記の組み換え発現ベクターのいずれか；並びに（ｉｉ）再
構成および／または希釈のための試薬を含むキットが含まれる。本開示の特徴には、（ｉ
）上記の組み換え発現ベクターのいずれか；並びに（ｉｉ）（ａ）ＤＮＡ標的化ＲＮＡと
相互作用するＲＮＡ結合部位；および（ｂ）部位特異的酵素活性を示す活性部位であって
、酵素活性の部位がＤＮＡ標的化ＲＮＡによって決定される、活性部位を含む部位特異的
修飾ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む組み換え発現ベクター、を含むキ
ットが含まれる。本開示の特徴には、（ｉ）上記の組み換え発現ベクターのいずれか；並
びに（ｉｉ）（ａ）ＤＮＡ標的化ＲＮＡと相互作用するＲＮＡ結合部位；および（ｂ）標
的ＤＮＡ内の転写を調節する活性部位であって、標的ＤＮＡ内の転写が調節される部位が
ＤＮＡ標的化ＲＮＡによって決定される、活性部位を含む部位特異的修飾ポリペプチドを
コードするヌクレオチド配列を含む組み換え発現ベクター、を含むキットが含まれる。
本開示の特徴には、２つ以上のＤＮＡ標的化ＲＮＡ、またはそれらをコードするＤＮＡ
ポリヌクレオチドを含む、標的ＤＮＡをターゲティングするためのキットが含まれ、２つ
以上のＤＮＡ標的化ＲＮＡのうちの少なくとも１つの第一セグメントは、２つ以上のＤＮ
Ａ標的化ＲＮＡのうちの少なくとも別の１つの第一セグメントと、少なくとも１つのヌク
レオチドだけ異なる。
図１Ａ〜Ｂは、二つの例示的な対象ＤＮＡ標的化ＲＮＡの略図を提供し、それぞれ、部位特異的修飾ポリペプチドおよび標的ＤＮＡに関連する。 Ｃａｓ９／Ｃｓｎ１部位特異的修飾ポリペプチドおよびＤＮＡターゲティングＲＮＡを使用して導入された二重鎖ＤＮＡ切断による標的ＤＮＡ編集を描写する。 ストレプトコッカス・ピオゲネス（配列番号８）のＣａｓ９／Ｃｓｎ１タンパク質のアミノ酸配列を示す。Ｃａｓ９は、ＨＮＨおよびＲｕｖＣエンドヌクレアーゼの双方と相同であるドメインを有する。モチーフ１〜４に上線が引かれる。 ストレプトコッカス・ピオゲネス（配列番号８）のＣａｓ９／Ｃｓｎ１タンパク質のアミノ酸配列を示す。Ｃａｓ９は、ＨＮＨおよびＲｕｖＣエンドヌクレアーゼの双方と相同であるドメインを有する。ドメイン１および２に上線が引かれる。 図４Ａ〜Ｂは、複数の種からのＣａｓ９／Ｃｓｎ１タンパク質間のパーセント同一性を示す。（Ａ）ストレプトコッカス・ピオゲネスに関する配列同一性。たとえば、図３Ｂで示される通り、ドメイン１はストレプトコッカス・ピオゲネスのＣａｓ９／Ｃｓｎ１のアミノ酸７〜１６６、ドメイン２はストレプトコッカス・ピオゲネスのＣａｓ９／Ｃｓｎ１のアミノ酸７３１〜１００３である。（Ｂ）ナイセリア・メニンギティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）に関する配列相同性である。たとえば、ドメイン１はナイセリア・メニンギティディス（配列番号７９）のＣａｓ９／Ｃｓｎ１のアミノ酸１３〜１３９、ドメイン２はナイセリア・メニンギティディス（配列番号７９）のＣａｓ９／Ｃｓｎ１のアミノ酸４７５〜７５０である。 図３２の系統表から選択された様々な多種多様の種からのＣａｓ９／Ｃｓｎ１タンパク質のモチーフ１〜４の多重配列アラインメントを示す。（図３２、図３Ａおよび表１を参照）（ストレプトコッカス・ピオゲネス（配列番号８）、レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）（配列番号１７）、ガンマ・プロテオバクテリウム（Ｇａｍｍａ ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）（配列番号１０７）、リステリア・イノキュア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ）（配列番号３）、ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）（配列番号１５２）、ユーバクテリウム・レクタレ（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｅｃｔａｌｅ）（配列番号９９）、スタフィロコッカス・ルグドゥネンシス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ）（配列番号１８５）、マイコプラズマ・シノビエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｓｙｎｏｖｉａｅ）（配列番号２２）、マイコプラズマ・モービレ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｍｏｂｉｌｅ）（配列番号１６）、ウォリネラ・サクシノゲネス（Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ）（配列番号１０）、フラボバクテリウム・コラムナレ（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃｏｌｕｍｎａｒｅ）（配列番号２３５）、フィブロバクター・サクシノゲネス（Ｆｉｂｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ）（配列番号１２１）、バクテロイデス・フラジリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ）（配列番号２１）、アシドサーマス・セルロリティカス（Ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）（配列番号４２）およびビフィドバクテリウム・デンティウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｅｎｔｉｕｍ）（配列番号１３１））。 図６Ａ〜Ｂは、様々な種からの天然ｔｒａｃｒＲＮＡ（「活性化ＲＮＡ」）配列のアラインメントを提供する（Ｌ．イノキュア（Ｌ． ｉｎｎｏｃｕａ）（配列番号２６８）；Ｓ．ピオゲネス（配列番号２６７）；Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）（配列番号２６９）；Ｓ．サーモフィラス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）１（配列番号２７０）；Ｍ．モービレ（Ｍ． ｍｏｂｉｌｅ）（配列番号２７４）；Ｎ．メニンギティデス（Ｎ． ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）（配列番号２７２）；Ｐ．マルトシダ（Ｐ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）（配列番号２７３）；Ｓ．サーモフィラス２（配列番号２７１）；およびＳ．ピオゲネス（配列番号２６７））。（Ａ）類似した構造および大変類似したＣａｓ９／Ｃｓｎ１配列のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ座位に関連する、選択されたｔｒａｃｒＲＮＡオルソログ（ＡｌｉｇｎＸ、ＶｅｃｔｏｒＮＴＩパッケージ、インビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））の多重配列アラインメントである。黒色の枠は共有されるヌクレオチドを示す。（Ｂ）異なる構造および非近縁種であるＣａｓ９／Ｃｓｎ１配列のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ座位に関連する、選択されたｔｒａｃｒＲＮＡオルソログ（ＡｌｉｇｎＸ、ＶｅｃｔｏｒＮＴＩパッケージ、インビトロジェン社）の多重配列アラインメントである。Ｎ．メニンギティディス（Ｎ． ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）およびＰ．マルトシダのｔｒａｃｒＲＮＡオルソログの配列類似性に留意されたい。黒色の枠は共有されるヌクレオチドを示す。より多くの例示的活性化ＲＮＡ配列に関しては、配列番号４３１〜５６２を参照されたい。 図７Ａ〜Ｂは、様々な種からのｃｒＲＮＡ（「標的化ＲＮＡ」）配列の天然二本鎖形成セグメントのアラインメントを提供する（Ｌ．イノキュア（配列番号／／）；Ｓ．ピオゲネス（配列番号／／）；Ｓ．ミュータンス（配列番号／／）；Ｓ．サーモフィラス１（配列番号／／）；Ｃ．ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）（配列番号／／）；Ｓ．ピオゲネス（配列番号／／）；Ｆ．ノビシダ（Ｆ．ｎｏｖｉｃｉｄａ）（配列番号／／）；Ｍ．モービレ（配列番号／／）；Ｎ．メニンギティデス（配列番号／／）；Ｐ．マルトシダ（配列番号／／）；およびＳ．サーモフィラス２（配列番号／／）。（Ａ）類似した構造および大変類似したＣａｓ９／Ｃｓｎ１配列の座位に関連する、標的化ＲＮＡ配列の例示的二本鎖形成セグメントの多重配列アラインメント（ＡｌｉｇｎＸ、ＶｅｃｔｏｒＮＴＩパッケージ、インビトロジェン社）である。（Ｂ）異なる構造および多種多様のＣａｓ９配列の座位に関連する、標的化ＲＮＡ配列の例示的二本鎖形成セグメントの多重配列アラインメント（ＡｌｉｇｎＸ、ＶｅｃｔｏｒＮＴＩパッケージ、インビトロジェン社）である。黒色の枠は共有されるヌクレオチドを示す。より多くの例示的二本鎖形成セグメント標的化ＲＮＡ配列に関しては、配列番号５６３〜６７９を参照されたい。 ｃｒＲＮＡ（「標的化ＲＮＡ」）の天然二本鎖形成セグメントと、対応するｔｒａｃｒＲＮＡオルソログ（「活性化ＲＮＡ」）の二本鎖形成セグメントとのハイブリダイゼーションの概略を提供する。上の配列が標的化ＲＮＡであり；下の配列が、対応する活性化ＲＮＡの二本鎖形成セグメントである。ＣＲＩＳＰＲ座位はＩＩ型（Ｎｍｅｎｉ／ＣＡＳＳ４）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムに属する。命名法は、ＣＲＩＳＰＲデータベース（ＣＲＩＳＰＲ ＤＢ）に従う。Ｓ．ピオゲネス（配列番号／／および／／）；Ｓ．ミュータンス（配列番号／／および／／）；Ｓ．サーモフィラス１（配列番号／／および／／）；Ｓ．サーモフィラス２（配列番号／／および／／）；Ｌ．イノキュア（配列番号／／および／／）；Ｔ．デンティコラ（Ｔ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａ）（配列番号／／および／／）；Ｎ．メニンギティデス（配列番号／／および／／）；Ｓ．ゴルドニ（Ｓ．ｇｏｒｄｏｎｉｉ）（配列番号／／および／／）；Ｂ．ビフィダム（Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍ）（配列番号／／および／／）；Ｌ．サリバリウス（Ｌ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）（配列番号／／および／／）；Ｆ．ツラレンシス（Ｆ．ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）（配列番号／／および／／）；およびＬ．ニューモフィラ（Ｌ． ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）（配列番号／／および／／）。いくつかの種にはそれぞれ二つのＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ座位が含まれていることに留意されたい。より多くの例示的活性化ＲＮＡ配列に関しては、配列番号４３１〜５６２を参照されたい。より多くの例示的二本鎖形成セグメント標的化ＲＮＡ配列に関しては、配列番号５６３〜６７９を参照されたい。 二つの種からの例示ｔｒａｃｒＲＮＡ（活性化ＲＮＡ）およびｃｒＲＮＡ（標的化ＲＮＡ）配列を示す。ある程度の互換性が存在する；たとえば、Ｓ．ピオゲネスＣａｓ９／Ｃｓｎ１タンパク質はＬ．イノキュア由来のｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡと機能する。「｜」は、標準的なワトソン−クリック塩基対を表し、一方で、「・」はＧ−Ｕゆらぎ塩基対を表す。「可変２０ｎｔ」または「２０ｎｔ」は標的ＤＮＡに相補的なＤＮＡ標的断片を意味する（この領域は長さが最大約１００ｎｔであり得る）。また、標的化ＲＮＡおよび活性化ＲＮＡの特色を組み込む単一分子ＤＮＡ標的化ＲＮＡの設計も示される（幅広い種類の種からのＣａｓ９／Ｃｓｎ１タンパク質配列が図３で示され、配列番号１〜２５６および７９５〜１３４６として示される）。ストレプトコッカス・ピオゲネス：上から下：（配列番号／／、／／、／／）；リステリア・イノキュア：上から下：（配列番号／／、／／、／／）。提供される配列は、非制限的な例であり、単一分子ＤＮＡ標的化ＲＮＡおよび二分子ＤＮＡ標的化ＲＮＡが、幅広い種類の種からの天然に存在する配列を基に、どのように設計され得るかを図示することを目的とする。幅広い種類の種からの適切な配列の様々な例が次のように示される（Ｃａｓ９タンパク質：配列番号１〜２５９；ｔｒａｃｒＲＮＡ：配列番号４３１〜５６２、またはそれらの補体；ｃｒＲＮＡ：配列番号５６３〜６７９、またはそれらの補体；および例示単一分子ＤＮＡ標的化ＲＮＡ：配列番号６８０〜６８２）。 Ｃａｓ９が、二つのＲＮＡ分子によって誘導されたＤＮＡエンドヌクレアーゼであることを示す。 同上。 同上。 同上。 Ｃａｓ９が、二つのＲＮＡ分子によって誘導されたＤＮＡエンドヌクレアーゼであることを示す。（上から下で、配列番号２７８〜２８０および／／）。 図１１Ａ〜Ｂは、Ｃａｓ９が二つのヌクレアーゼドメインを用いて標的ＤＮＡの二つの鎖を切断することを示す。 標的ＤＮＡのＣａｓ９触媒性切断が、ｔｒａｃｒＲＮＡの活性化ドメインを必要とし、ｃｒＲＮＡのシード配列によって支配されることを図示する。 同上。 標的ＤＮＡのＣａｓ９触媒性切断が、ｔｒａｃｒＲＮＡの活性化ドメインを必要とし、ｃｒＲＮＡのシード配列によって支配されることを図示する。（上から下で、配列番号２７８〜２８０および／／）。 標的ＤＮＡのＣａｓ９触媒性切断が、ｔｒａｃｒＲＮＡの活性化ドメインを必要とし、ｃｒＲＮＡのシード配列によって支配されることを図示する。（上から下で、配列番号２８１〜２９０）。 標的ＤＮＡのＣａｓ９触媒性切断が、ｔｒａｃｒＲＮＡの活性化ドメインを必要とし、ｃｒＲＮＡのシード配列によって支配されることを示す。（上から下で、配列番号２９１〜２９２、２８３、２９３〜２９８）。 ＰＡＭがＣａｓ９−ｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡ複合体による標的ＤＮＡ切断を認可するために必要であることを示す。 同上。 同上。 ｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡの特色を組み合わせる単一の操作ＲＮＡ分子を用いて、Ｃａｓ９をプログラムすることができることを図示する。キメラＡ（配列番号２９９）；キメラＢ（配列番号３００）。 同上。 同上。 ＩＩ型ＲＮＡ媒介性ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ免疫経路を示す。 図１６Ａ〜Ｂは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼの精製を示す。 二重ｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡに誘導されるＣａｓ９がプロトスペーサープラスミドおよびオリゴヌクレオチドＤＮＡを切断することを示す。 二重ｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡに誘導されるＣａｓ９がプロトスペーサープラスミドおよびオリゴヌクレオチドＤＮＡを切断することを示す。（上から下で、配列番号３０１〜３０３および／／）。 二重ｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡに誘導されるＣａｓ９がプロトスペーサープラスミドおよびオリゴヌクレオチドＤＮＡを切断することを示す。（上から下で、配列番号３０４〜３０６および／／）。 Ｃａｓ９が３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を伴うＭｇ２＋依存エンドヌクレアーゼであることを示す。 同上。 標的ＤＮＡの二重ｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡ指示性Ｃａｓ９切断は部位特異的であることを図示する。 同上。 標的ＤＮＡの二重ｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡ指示性Ｃａｓ９切断は部位特異的であることを図示する。（上から下で、配列番号３０７〜３０９、／／、３３７〜３３９および／／）。 標的ＤＮＡの二重ｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡ指示性Ｃａｓ９切断が速く効率的であることを示す。 同上。 図２１Ａ〜Ｂは、Ｃａｓ９のＨＮＨおよびＲｕｖＣ様ドメインがそれぞれ相補ＤＮＡおよび非相補ＤＮＡ鎖の切断を指示することを示す。 ｔｒａｃｒＲＮＡが標的ＤＮＡ認識のために必要であることを示す。 ｔｒａｃｒＲＮＡの最小領域が標的ＤＮＡの二重ｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡ指示性切断を誘導することが可能であることを示す。 同上。 Ｃａｓ９による二重ｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡ誘導標的ＤＮＡ切断が種特異的であることを示す。 同上。 同上。 同上。 ｃｒＲＮＡのシード配列がＣａｓ９による標的ＤＮＡの二重ｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡ指示性切断を支配することを示す。標的ＤＮＡプローブ１（配列番号３１０）；スペーサー４ ｃｒＲＮＡ（１〜４２）（配列番号３１１）；ｔｒａｃｒＲＮＡ（１５〜８９）（配列番号／／）。 ｃｒＲＮＡのシード配列がＣａｓ９による標的ＤＮＡの二重ｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡ指示性切断を支配することを示す。パネル左（配列番号３１０）。 ｃｒＲＮＡのシード配列がＣａｓ９による標的ＤＮＡの二重ｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡ指示性切断を支配することを示す。 ＰＡＭ配列がＣａｓ９−ｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡによるプロトスペーサープラスミドＤＮＡ切断および細菌細胞内でのＣａｓ９媒介性プラスミドＤＮＡ干渉に必要不可欠であることを示す。 ＰＡＭ配列がＣａｓ９−ｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡによるプロトスペーサープラスミドＤＮＡ切断および細菌細胞内でのＣａｓ９媒介性プラスミドＤＮＡ干渉に必要不可欠であることを示す。（上から下で、配列番号３１２〜３１４）。 ＰＡＭ配列がＣａｓ９−ｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡによるプロトスペーサープラスミドＤＮＡ切断および細菌細胞内でのＣａｓ９媒介性プラスミドＤＮＡ干渉に必要不可欠であることを示す。（上から下で、配列番号３１５〜３２０）。 二重ｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡを模倣する単一のキメラＲＮＡに誘導されるＣａｓ９がプロトスペーサーＤＮＡを切断することを示す。 同上。 二重ｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡを模倣する単一のキメラＲＮＡに誘導されるＣａｓ９がプロトスペーサーＤＮＡを切断することを示す。（上から下で、配列番号３２１〜３２４）。 緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子配列を標的とするキメラＲＮＡの新規の設計を示す。 緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子配列を標的とするキメラＲＮＡの新規の設計を示す。（上から下で、配列番号３２５〜３２６）。 緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子配列を標的とするキメラＲＮＡの新規の設計を示す。ＧＦＰ１標的配列（配列番号３２７）；ＧＦＰ２標的配列（配列番号３２８）；ＧＦＰ３標的配列（配列番号３２９）；ＧＦＰ４標的配列（配列番号３３０）；ＧＦＰ５標的配列（配列番号３３１）；ＧＦＰ１キメラＲＮＡ（配列番号３３２）；ＧＦＰ２キメラＲＮＡ（配列番号３３３）；ＧＦＰ３キメラＲＮＡ（配列番号３３４）；ＧＦＰ４キメラＲＮＡ（配列番号３３５）；ＧＦＰ５キメラＲＮＡ（配列番号３３６）。 緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子配列を標的とするキメラＲＮＡの新規の設計を示す。 ヒト細胞内のＣａｓ９および誘導ＲＮＡの同時発現が標的座位において二重鎖ＤＮＡの切断をもたらすことを示す。 同上。 ヒト細胞内のＣａｓ９および誘導ＲＮＡの同時発現が標的座位において二重鎖ＤＮＡの切断をもたらすことを示す。（上から下で、配列番号４２５〜４２８）。 ヒト細胞内のＣａｓ９および誘導ＲＮＡの同時発現が標的座位において二重鎖ＤＮＡの切断をもたらすことを示す。 同上。 図３０Ａ〜Ｂは、細胞可溶化物が活性Ｃａｓ９：ｓｇＲＮＡを含み、部位特異的ＤＮＡ切断を支援することを示す。 ｓｇＲＮＡ構築物の３’伸展が部位特異的ＮＨＥＪ媒介性変異誘発を強化することを示す。（上から下で、配列番号４２８〜４３０）。 ｓｇＲＮＡ構築物の３’伸展が部位特異的ＮＨＥＪ媒介性変異誘発を強化することを示す。 様々な有機体からの代表Ｃａｓ９配列の系統樹を示す。 様々な有機体からの代表Ｃａｓ９配列の系統樹の主要グループに関するＣａｓ９座位構造を示す。 選択された細菌種からのＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓの構造を示す。 同上。 同上。 同上。 同上。 選択されたＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ ＣａｓシステムのｔｒａｃｒＲＮＡおよびｐｒｅ−ｃｒＲＮＡの同時プロセシングを示す。（上から下で、配列番号／／、／／、／／、／／、／／、／／、／／、／／）。 選択されたＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ ＣａｓシステムのｔｒａｃｒＲＮＡおよびｐｒｅ−ｃｒＲＮＡの同時プロセシングを示す。（上から下で、配列番号／／、／／、／／、／／）。 ｔｒａｃｒＲＮＡ配列の多様性を示すｔｒａｃｒＲＮＡオルソログの配列アラインメントを示す。 ディープＲＮＡシークエンシングによって明らかになった細菌ｔｒａｃｒＲＮＡオルソログおよびｃｒＲＮＡの発現を示す。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 座標（対象の領域）および対応するｃＤＮＡ配列（５’から３’）を含む、研究される細菌種のシークエンシングによって回収されるｔｒａｃｒＲＮＡオルソログおよび成熟ｃｒＲＮＡを全て列挙する。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 シグネチャー遺伝子ｃａｓ９の存在を特徴とするＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ座位を含む細菌種の表を示す。これらの配列を系統発生分析のために使用した。 同上。 図３９Ａ〜Ｂは、ＣＲＩＳＰＲ干渉（ＣＲＩＳＰＲｉ）システムの設計を示す。 ＣＲＩＳＰＲｉが転写伸長および開始を効果的にサイレンシングすることを示す。 同上。 同上。 同上。 同上。 図４１Ａ〜Ｂは、ＣＲＩＳＰＲｉが転写伸長を遮断することで機能することを示す。 ＣＲＩＳＰＲｉシステムの標的特異性を示す。 同上。 同上。 サイレンシング効果に影響を及ぼす因子の特徴を示す。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 ＣＲＩＳＰＲｉ遺伝子ノックダウンを使用した複合体制御ネットワークの機能性プロファイリングを示す。 同上。 同上。 哺乳動物細胞でＣＲＩＳＰＲｉを用いた遺伝子サイレンシングを示す。 同上。 Ｓ．ピオゲネスのＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムのメカニズムを示す。 図４７Ａ〜Ｂは、ｄＣａｓ９およびｓｇＲＮＡで同時形質転換された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞培養の成長曲線を示す。 ＣＲＩＳＰＲｉが複数コピープラスミド上のレポーター遺伝子の発現をサイレンシングできることを示す。 異なる遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡを伴う細胞のＲＮＡ−ｓｅｑデータを示す。 同上。 同上。 近接する二重ミスマッチを伴うｓｇＲＮＡのサイレンシング効果を示す。 同上。 同上。 同上。 同上。 図５１Ａ〜Ｃは、二つのｓｇＲＮＡを用いて単一の遺伝子を制御することの組み合わせサイレンシング効果を示す。 ｓｇＲＮＡ抑制は標的座位および転写開始からの相対的な距離に依存することを示す。 図５３Ａ〜Ｃは、変異形Ｃａｓ９部位特異的ポリペプチド（ｄＣａｓ９）が、ｄＣａｓ９がＲｕｖＣ１ドメインのみ（たとえば、Ｄ１０Ａ）、ＨＮＨドメインのみ（たとえば、Ｈ８４０Ａ）、または双方のドメイン（たとえば、Ｄ１０ＡおよびＨ８４０Ａ）で活性を低下させる場合、対象方法のための機構であることを示す実験結果である。 対象変異形Ｃａｓ９部位特異的ポリペプチドのための適切な融合パートナー（またはそれらの断片）の例を列挙する。例には列挙されたものが含まれるが、これらに限定されない。 同上。 同上。 キメラ部位特異的ポリペプチドがヒト細胞の転写を活性化（増加）するために使用され得ることを示す。 同上。 同上。 同上。 キメラ部位特異的ポリペプチドがヒト細胞の転写を抑制（低下）するために使用され得ることを示す。 天然ｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡとおよそ５０％の同一性を共有する人工配列が、ＤＮＡ標的化ＲＮＡのタンパク質結合ドメインの構造が保存される限り、Ｃａｓ９と一緒に機能して標的ＤＮＡを切断し得ることを示す。 同上。
定義（第一部）
本明細書で同義的に使用される用語「ポリヌクレオチド」および「核酸」は、あらゆる
長さのヌクレオチドの重合体形態を指し、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオ
チドを指す。従って、この用語には、限定はされないが、一本鎖、二本鎖、または多鎖の
ＤＮＡまたはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、またはプ
リンおよびピリミジン塩基もしくは他の天然の、化学的もしくは生化学的に修飾された、
非天然の、もしくは誘導体化されたヌクレオチド塩基を含む重合体が含まれる。「オリゴ
ヌクレオチド」は、一般的には、約５〜約１００ヌクレオチドのポリヌクレオチドである
一本鎖または二本鎖ＤＮＡを指す。しかし、本開示の目的上、オリゴヌクレオチドの長さ
には上限は無い。オリゴヌクレオチドは、「オリゴマー」または「オリゴ」としても知ら
れており、当該技術分野において公知の方法によって、遺伝子から単離、または化学合成
することができる。用語「ポリヌクレオチド」および「核酸」は、記載されている実施形
態に適用可能な場合、一本鎖ポリヌクレオチド（センスまたはアンチセンス等）および二
本鎖ポリヌクレオチドを含むものと理解すべきである。
「ステムループ構造」とは、主に一本鎖のヌクレオチド（ループ部分）の領域によって
一方の端で連結されている二本鎖（ステップ部分（ｓｔｅｐ ｐｏｒｔｉｏｎ））を形成
することが知られている、または予想されるヌクレオチド領域を含む二次構造を有する核
酸を指す。用語「ヘアピン」および「フォールドバック」構造も、ステムループ構造を指
して、本明細書では使用される。そのような構造は、当該技術分野において周知であり、
これらの用語は当該技術分野において公知のそれらの意味と共に、一貫して使用される。
当該技術分野で知られているように、ステムループ構造は正確な塩基対形成を必要としな
い。従って、ステムは一つまたは複数の塩基ミスマッチを含む場合がある。あるいは、そ
の塩基対形成は正確である、すなわち、いかなるミスマッチも含まない場合がある。
「ハイブリッド可能な」または「相補的な」または「実質的に相補的な」とは、核酸（
例えばＲＮＡ）が、温度および溶液イオン強度が適切なインビトロおよび／またはインビ
ボ条件下で、配列特異的、逆平行的に、別の核酸に、非共有結合することを可能にする、
すなわち、ワトソン・クリック塩基対形成および／もしくはＧ／Ｕ塩基対形成、「アニー
ル」、または「ハイブリダイズ」することを可能にするヌクレオチド配列を含む（すなわ
ち、核酸が相補的核酸に特異的に結合する）ことを意味する。当該技術分野で知られてい
るように、標準的なワトソン・クリック塩基対形成には、アデニン（Ａ）とチミジン（Ｔ
）の対合、アデニン（Ａ）とウラシル（Ｕ）の対合、およびグアニン（Ｇ）とシトシン（
Ｃ）の対合［ＤＮＡ、ＲＮＡ］が含まれる。さらに、２つのＲＮＡ分子間の（例えば、ｄ
ｓＲＮＡ）ハイブリダイゼーションにおいては、グアニン（Ｇ）がウラシル（Ｕ）と塩基
対合することも当該技術分野において周知である。例えば、Ｇ／Ｕ塩基対形成は、ｍＲＮ
Ａ内のコドンとｔＲＮＡのアンチコドン塩基対形成との関係において、遺伝暗号の縮重（
すなわち、重複性）に部分的に関与している。本開示に照らして、主題のＤＮＡ標的化Ｒ
ＮＡ分子のタンパク質結合セグメント（ｄｓＲＮＡ二本鎖）のグアニン（Ｇ）は、ウラシ
ル（Ｕ）に対し相補的であるとみなされ、逆の場合も同じである。従って、Ｇ／Ｕ塩基対
が主題のＤＮＡ標的化ＲＮＡ分子のタンパク質結合セグメント（ｄｓＲＮＡ二本鎖）の所
与のヌクレオチド位置で形成可能である場合、その位置は非相補的であるとはみなさず、
代わりに、相補的であるとみなされる。
ハイブリダイゼーション条件および洗浄条件は周知であり、Sambrook, J., Fritsch, E
. F. and Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Co
ld Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (1989)、特にその第１１章お
よび表１１．１;およびSambrook, J. and Russell, W., Molecular Cloning: A Laborato
ry Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbo
r (2001)に例示されている。温度およびイオン強度の条件は、ハイブリダイゼーションの
「ストリンジェンシー」を決定する。
ハイブリダイゼーションは２本の核酸が相補的な配列を含有することを必要とするが、
塩基間のミスマッチは可能である。２本の核酸間のハイブリダイゼーションに適した条件
は、当該技術分野において周知の可変要素であるそれらの核酸の長さおよび相補性の程度
に依存する。２つのヌクレオチド配列間の相補性の程度が高い程、それらの配列を有する
核酸から成るハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）値はより高くなる。短い相補性（例えば、
３５以下、３０以下、２５以下、２２以下、２０以下、または１８以下のヌクレオチドに
わたる相補性）を有する核酸間のハイブリダイゼーションにおいては、ミスマッチの位置
が重要となる（Sambrook et al.、上記、11.7〜11.8を参照）。典型的に、ハイブリッド
可能な核酸の長さは、少なくとも約１０ヌクレオチドである。ハイブリッド可能な核酸の
最小の長さの例は、少なくとも約１５ヌクレオチド；少なくとも約２０ヌクレオチド；少
なくとも約２２ヌクレオチド；少なくとも約２５ヌクレオチド；および少なくとも約３０
ヌクレオチドである。さらに、温度および洗浄液の塩濃度が、相補的な領域の長さおよび
相補性の程度等の要素に応じ、必要に応じて調整されてもよいことは当業者に認識される
。
ポリヌクレオチド配列が、特異的にハイブリッド可能であるために、またはハイブリッ
ド可能であるために、その標的核酸のポリヌクレオチド配列に対し１００％相補的である
必要は無いことは、当該技術分野において理解される。さらに、ポリヌクレオチドは、介
在セグメントまたは隣接セグメントがハイブリダイゼーション事象に含まれないように（
例えば、ループ構造またはヘアピン構造）、一つまたは複数のセグメントにわたってハイ
ブリダイズし得る。ポリヌクレオチドは、標的とする標的核酸配列内の標的領域に対して
、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なく
とも９９％、または１００％の配列相補性を含み得る。例えば、アンチセンス化合物の２
０中１８のヌクレオチドが標的領域に対し相補的であり、従って特異的にハイブリダイズ
するアンチセンス核酸は、９０％の相補性を示すであろう。この例において、残りの非相
補的ヌクレオチドは、クラスター化しているか、または相補的ヌクレオチドと共に散在し
ている場合があり、互いに、または相補的ヌクレオチドに近接している必要は無い。核酸
内の特定の一続きの核酸配列間の相補性パーセントは、当該技術分野において公知のＢＬ
ＡＳＴプログラム（基本的な局所的アライメント検索ツール）およびＰｏｗｅｒＢＬＡＳ
Ｔプログラム(Altschul et al., J. Mol. Biol., 1990, 215, 403-410; Zhang and Madde
n, Genome Res., 1997, 7, 649-656）を用いて、またはＧａｐプログラム（Ｗｉｓｃｏｎ
ｓｉｎ配列解析パッケージ、Ｕｎｉｘ（登録商標）用バージョン８、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ
Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋ
， Ｍａｄｉｓｏｎ Ｗｉｓ．）を用いて、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ(Adv
. Appl. Math., 1981, 2, 482-489)のアルゴリズムを使用する初期設定を用いて、通常の
方法で決定することができる。
用語「ペプチド」、「ポリペプチド」、および「タンパク質」は、本明細書で同義的に
使用され、コードされたアミノ酸およびコードされていないアミノ酸、化学的または生化
学的に修飾または誘導体化されたアミノ酸、並びに修飾ペプチド骨格を有するポリペプチ
ドを含み得る、あらゆる長さのアミノ酸重合体形態を指す。
「結合」とは、本明細書で使用される場合（例えばポリペプチドのＲＮＡ結合ドメイン
に関連して）、高分子間（例えば、タンパク質および核酸間）の非共有結合性相互作用を
指す。非共有結合性相互作用の状態において、高分子は、「会合」または「相互作用」ま
たは「結合」していると言われる（例えば、分子Ｘが分子Ｙと相互作用すると言われる場
合、分子Ｘが非共有結合的に分子Ｙに結合することを意味する）。結合性相互作用の全て
の成分が配列特異的である必要は無いが（例えば、ＤＮＡ骨格内のリン酸塩残基との接触
）、結合性相互作用のいつくかの部分は配列特異的である場合がある。結合性相互作用は
、一般的には、１０−６Ｍ未満、１０−７Ｍ未満、１０−８Ｍ未満、１０−９Ｍ未満、１
０−１０Ｍ未満、１０−１１Ｍ未満、１０−１２Ｍ未満、１０−１３Ｍ未満、１０−１４
Ｍ未満、または１０−１５Ｍ未満の解離定数（Ｋｄ）を特徴とする。「親和性」は結合の
強さを指し、結合親和性の増加はより低いＫｄと相関する。
「結合ドメイン」とは、別の分子に非共有結合的に結合することが可能なタンパク質ド
メインを意味する。結合ドメインは、例えば、ＤＮＡ分子（ＤＮＡ結合タンパク質）、Ｒ
ＮＡ分子（ＲＮＡ結合タンパク質）および／またはタンパク質分子（タンパク質結合タン
パク質）に結合し得る。タンパク質ドメイン結合タンパク質の場合、それ自体に結合する
ことができ（ホモ二量体、ホモ三量体等を形成）、および／または一つもしくは複数の異
なるタンパク質から成る一つもしくは複数の分子に結合することができる。
用語「保存的アミノ酸置換」とは、類似の側鎖を有するアミノ酸残基のタンパク質にお
ける互換性を指す。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸群は、グリシン、アラニン、バ
リン、ロイシン、およびイソロイシンから成る；脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ
酸群はセリンおよびスレオニンから成る；アミド含有側鎖を有するアミノ酸群はアスパラ
ギンおよびグルタミンから成る；芳香族側鎖を有するアミノ酸群はフェニルアラニン、チ
ロシン、およびトリプトファンから成る；塩基性側鎖を有するアミノ酸群はリジン、アル
ギニン、およびヒスチジンから成る；酸性側鎖を有するアミノ酸群はグルタミン酸塩およ
びアスパラギン酸から成る；並びに硫黄含有側鎖を有するアミノ酸群はシステインおよび
メチオニンから成る。例示的な保存的アミノ酸置換基は、バリン−ロイシン−イソロイシ
ン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリン、およびアス
パラギン−グルタミンである。
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、別のポリヌクレオチドまたはポリペプチドに
対してある特定の「配列同一性」パーセントを有し、このことは、アライメントされた場
合にそのパーセンテージの塩基またはアミノ酸が同一であること、および、２つの配列を
比較する場合には同一の相対位置にあることを意味する。配列同一性は、いくつかの異な
る方法で決定することができる。配列同一性を決定するために、様々な方法およびｎｃｂ
ｉ．ｎｌｍ．ｎｉｌｉ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ、ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｍｓａ
／ｔｃｏｆｆｅｅ／、ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｍｓａ／ｍｕｓｃｌｅ／、ｍａ
ｆｆｔ．ｃｂｒｃ．ｊｐ／ａｌｉｇｎｍｅｎｔ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／を含むサイトにおい
てワールドワイドウェブ上で利用可能なコンピュータプログラム（例えば、ＢＬＡＳＴ、
Ｔ−ＣＯＦＦＥＥ、ＭＵＳＣＬＥ、ＭＡＦＦＴ等）を用いて、配列をアライメントするこ
とができる。例えば、Altschul et al. (1990), J. Mol. Bioi. 215:403-10を参照された
い。
特定のＲＮＡを「コードする」ＤＮＡ配列は、ＲＮＡに転写されるＤＮＡ核酸配列であ
る。ＤＮＡポリヌクレオチドは、タンパク質に翻訳されるＲＮＡ（ｍＲＮＡ）をコードす
る場合もあるし、あるいは、ＤＮＡポリヌクレオチドは、タンパク質に翻訳されないＲＮ
Ａ（例えばｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、またはＤＮＡ標的化ＲＮＡ；「非コード」ＲＮＡまたは
「ｎｃＲＮＡ」とも称される）をコードする場合もある。
「タンパク質コード配列」または特定のタンパク質もしくはポリペプチドをコードして
いる配列は、適切な制御配列の制御下に置かれた場合、インビトロまたはインビボにおい
て、（ＤＮＡの場合）ｍＲＮＡに転写され、（ｍＲＮＡの場合）ポリペプチドに翻訳され
る、核酸配列である。コード配列の境界は、５’末端（Ｎ末端）の開始コドンおよび３’
末端（Ｃ末端）の翻訳終止ナンセンスコドンによって決定される。コード配列には、限定
はされないが、原核生物または真核生物のｍＲＮＡから得られるｃＤＮＡ、原核生物また
は真核生物のＤＮＡから得られるゲノムＤＮＡ配列、および合成核酸が含まれ得る。転写
終結配列は通常、コード配列の３’側に位置している。
本明細書で使用される場合、「プロモーター配列」は、ＲＮＡポリメラーゼと結合する
ことができ、下流（３’方向）のコード配列または非コード配列の転写を開始することが
できるＤＮＡ調節領域である。本発明を定義する目的において、プロモーター配列は、転
写開始点によってその３’末端に結合しており、上流（５’方向）に伸びて、バックグラ
ウンドを超えた検出可能なレベルで転写を開始させるのに必要な最小数の塩基またはエレ
メントを含む。プロモーター配列内には、転写開始点、およびＲＮＡポリメラーゼの結合
に関与するタンパク質結合ドメインが存在する。真核生物のプロモーターはしばしば（常
にではないが）、「ＴＡＴＡ」ボックスおよび「ＣＡＴ」ボックスを含有する。誘導性プ
ロモーターを含む種々のプロモーターを使用して、本発明の種々のベクターを駆動させる
ことができる。
プロモーターは、恒常的活性型プロモーター（すなわち、恒常的に活性／「ＯＮ」状態
であるプロモーター）であってもよく、誘導性プロモーター（すなわち、活性／「ＯＮ」
または不活性／「ＯＦＦ」状態が、外部刺激、例えば、特定の温度、化合物、またはタン
パク質の存在によって制御されるプロモーター）であってもよく、空間限定的（ｓｐａｔ
ｉａｌｌｙ ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ）プロモーター（すなわち、転写調節領域、エンハン
サー等）（例えば、組織特異的プロモーター、細胞型特異的プロモーター等）であっても
よく、時間限定的（ｔｅｍｐｏｒａｌｌｙ ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ）プロモーター（すな
わち、プロモーターが、胚発生の特定の段階の間、または生物学的プロセス特定の段階、
例えば、マウスにおける毛包周期の間に、「ＯＮ」状態または「ＯＦＦ」状態にある）で
あってもよい。
適切なプロモーターはウイルス由来であってもよく、従ってウイルス性プロモーターと
称されてもよく、あるいは、適切なプロモーターは原核生物または真核生物を含むあらゆ
る生物に由来していてもよい。適切なプロモーターを用いることで、いかなるＲＮＡポリ
メラーゼ（例えば、ｐｏｌＩ、ｐｏｌＩＩ、ｐｏｌＩＩＩ）によっても発現を駆動するこ
とができる。プロモーターの例としては、限定はされないが、ＳＶ４０初期プロモーター
、マウス乳癌ウイルス末端反復配列（ＬＴＲ）プロモーター；アデノウイルス主要後期プ
ロモーター（ＡｄＭＬＰ）；単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）プロモーター、サイトメガロウ
イルス（ＣＭＶ）プロモーター、例えば、ＣＭＶ最初期プロモーター領域（ＣＭＶＩＥ）
、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ヒトＵ６核内低分子プロモーター（Ｕ６
）（Miyagishi et al. , Nature Biotechnology 20, 497 - 500 (2002)）、高感度Ｕ６プ
ロモーター（例えば、Xia et al., Nucleic Acids Res. 2003 Sep 1;31(17)）、ヒトＨ１
プロモーター（Ｈ１）等が挙げられる。
誘導性プロモーターの例としては、限定はされないが、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモ
ーター、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピ
ラノシド（ＩＰＴＧ）調節性プロモーター、ラクトース誘導性プロモーター、熱ショック
プロモーター、テトラサイクリン調節性プロモーター、ステロイド調節性プロモーター、
金属調節性プロモーター、エストロゲン受容体調節性プロモーター等が挙げられる。従っ
て誘導性プロモーターは、ドキシサイクリン；ＲＮＡポリメラーゼ、例えば、Ｔ７ＲＮＡ
ポリメラーゼ；エストロゲン受容体；エストロゲン受容体融合物；等を含むがこれらに限
定はされない分子によって調節され得る。
いくつかの実施形態において、プロモーターは、多細胞生物においてプロモーターが一
部の特定の細胞内で活性（すなわち、「ＯＮ」）であるような、空間限定的プロモーター
（すなわち、細胞型特異的プロモーター、組織特異的プロモーター等）である。空間限定
的プロモーターは、エンハンサー、転写調節領域、制御配列等とも称され得る。いかなる
好都合な空間限定的プロモーターも使用することができ、適切なプロモーター（例えば、
脳特異的プロモーター、一部のニューロンにおける発現を駆動するプロモーター、生殖細
胞系列における発現を駆動するプロモーター、肺における発現を駆動するプロモーター、
筋肉における発現を駆動するプロモーター、膵臓の島細胞における発現を駆動するプロモ
ーター等）の選択は、生物によって異なる。例えば、植物、ハエ、虫、哺乳動物、マウス
等において、種々の空間限定的プロモーターが知られている。従って、空間限定的プロモ
ーターを用いることで、生物に応じて、種々様々な異なる組織および細胞型において主題
の部位特異的修飾ポリペプチドをコードする核酸の発現を制御することがでる。また、い
くつかの空間限定的プロモーターは、プロモーターが、胚発生の特定の段階の間、または
生物学的プロセスの特定の段階（例えば、マウスにおける毛包周期）の間に、「ＯＮ」状
態または「ＯＦＦ」状態にあるように、時間限定的である。
例示を目的として、空間限定的プロモーターの例としては、限定はされないが、ニュー
ロン特異的プロモーター、脂肪細胞特異的プロモーター、心筋細胞特異的プロモーター、
平滑筋特異的プロモーター、光受容体特異的プロモーター等が挙げられる。ニューロン特
異的空間限定的プロモーターとしては、限定はされないが、ニューロン特異的エノラーゼ
（ＮＳＥ）プロモーター（例えば、ＥＭＢＬ ＨＳＥＮＯ２、Ｘ５１９５６を参照）；芳
香族アミノ酸脱炭酸酵素（ＡＡＤＣ）プロモーター；神経フィラメントプロモーター（例
えば、ＧｅｎＢａｎｋ ＨＵＭＮＦＬ、Ｌ０４１４７を参照）；シナプシンプロモーター
（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ ＨＵＭＳＹＮＩＢ、Ｍ５５３０１を参照）；ｔｈｙ−１プロ
モーター（例えば、Chen et al. (1987) Cell 51:7-19;およびLlewellyn, et al. (2010)
Nat. Med. 16(10):1161-1166を参照）；セロトニン受容体プロモーター（例えば、Ｇｅ
ｎＢａｎｋ Ｓ６２２８３を参照）；チロシン水酸化酵素プロモーター（ＴＨ）（例えば
、Oh et al. (2009) Gene Ther 16:437; Sasaoka et al. (1992) Mol. Brain Res. 16:27
4; Boundy et al. (1998) J. Neurosci. 18:9989;およびKaneda et al. (1991) Neuron 6
:583-594を参照）；ＧｎＲＨプロモーター（例えば、Radovick et al. (1991) Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA 88:3402-3406を参照）；Ｌ７プロモーター（例えば、Oberdick et al
. (1990) Science 248:223-226を参照）；ＤＮＭＴプロモーター（例えば、Bartge et al
. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:3648-3652を参照）；エンケファリンプロモー
ター（例えば、Comb et al. (1988) EMBO J. 17:3793-3805を参照）；ミエリン塩基性タ
ンパク質（ＭＢＰ）プロモーター；Ｃａ２＋−カルモジュリン依存性プロテインキナーゼ
ＩＩ−α（ＣａｍＫＩＩα）プロモーター（例えば、Mayford et al. (1996) Proc. Natl
. Acad. Sci. USA 93:13250;およびCasanova et al. (2001) Genesis 31:37を参照）；Ｃ
ＭＶエンハンサー／血小板由来増殖因子−βプロモーター（例えば、Liu et al. (2004)
Gene Therapy 11:52-60を参照）；等が挙げられる。
脂肪細胞特異的空間限定的プロモーターとしては、限定はされないが、ａＰ２遺伝子プ
ロモーター／エンハンサー、例えば、ヒトａＰ２遺伝子の−５．４ｋｂ〜＋２１ｂｐの領
域（例えば、Tozzo et al. (1997) Endocrinol. 138:1604; Ross et al. (1990) Proc. N
atl. Acad. Sci. USA 87:9590;およびPavjani et al. (2005) Nat. Med. 11:797を参照）
；グルコーストランスポーター−４（ＧＬＵＴ４）プロモーター（例えば、Knight et al
. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:14725を参照）；脂肪酸トランスロカーゼ（
ＦＡＴ／ＣＤ３６）プロモーター（例えば、Kuriki et al. (2002) Biol. Pharm. Bull.
25:1476;およびSato et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:15703を参照）；ステアロイル
ＣｏＡ不飽和酵素−１（ＳＣＤ１）プロモーター（Tabor et al. (1999) J. Biol. Chem.
274:20603）；レプチンプロモーター（例えば、Mason et al. (1998) Endocrinol. 139:
1013;およびChen et al. (1999) Biochem. Biophys. Res. Comm. 262:187を参照）；アデ
ィポネクチンプロモーター（例えば、Kita et al. (2005) Biochem. Biophys. Res. Comm
. 331:484;およびChakrabarti (2010) Endocrinol. 151:2408を参照）；アディプシンプ
ロモーター（例えば、Platt et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:7490を参照
）；レジスチンプロモーター（例えば、Seo et al. (2003) Molec. Endocrinol. 17:1522
を参照）；等が挙げられる。
心筋細胞特異的空間限定的プロモーターとしては、限定はされないが、以下の遺伝子に
由来する制御配列が挙げられる：ミオシン軽鎖−２、α−ミオシン重鎖、ＡＥ３、心筋ト
ロポニンＣ、心筋アクチン等が挙げられる。Franz et al. (1997) Cardiovasc. Res. 35:
560-566; Robbins et al. (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci. 752:492-505; Linn et al. (19
95) Circ. Res. 76:584-591; Parmacek et al. (1994) Mol. Cell. Biol. 14:1870-1885;
Hunter et al. (1993) Hypertension 22:608-617;およびSartorelli et al. (1992) Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA 89:4047-4051。
平滑筋特異的空間限定的プロモーターとしては、限定はされないが、ＳＭ２２αプロモ
ーター（例えば、Akyurek et al. (2000) Mol. Med. 6:983；および米国特許第７，１６
９，８７４号を参照）；スムーセリン（ｓｍｏｏｔｈｅｌｉｎ）プロモーター（例えば、
国際公開第２００１／０１８０４８号）；α−平滑筋アクチンプロモーター；等が挙げら
れる。例えば、ＳＭ２２αプロモーターの０．４ｋｂ領域は、その中に２つのＣＡｒＧエ
レメントが存在しており、血管平滑筋細胞特異的な発現を媒介することが示されている（
例えば、Kim, et al. (1997) Mol. Cell. Biol. 17, 2266-2278; Li, et al., (1996) J.
Cell Biol. 132, 849-859;およびMoessler, et al. (1996) Development 122, 2415-242
5を参照）。
光受容体特異的空間限定的プロモーターとしては、限定はされないが、ロドプシンプロ
モーター；ロドプシンキナーゼプロモーター（Young et al. (2003) Ophthalmol. Vis. S
ci. 44:4076）；βホスホジエステラーゼ遺伝子プロモーター（Nicoud et al. (2007) J.
Gene Med. 9:1015）；網膜色素変性症遺伝子プロモーター（Nicoud et al. (2007)、上
記）；光受容体間レチノイド結合タンパク質（ＩＲＢＰ）遺伝子エンハンサー（Nicoud e
t al. (2007)、上記）；ＩＲＢＰ遺伝子プロモーター（Yokoyama et al. (1992) Exp Eye
Res. 55:225）；等が挙げられる。
本明細書で同義的に使用される用語「ＤＮＡ制御配列」、「調節領域」、および「調節
エレメント」は、非コード配列（例えば、ＤＮＡ標的化ＲＮＡ）もしくはコード配列（例
えば、部位特異的修飾ポリペプチド、またはＣａｓ９／Ｃｓｎ１ポリペプチド）の転写を
もたらすおよび／もしくは調節する、並びに／またはコードされるポリペプチドの翻訳を
調節する、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、ターミネーター、タ
ンパク質分解シグナル等の、転写および翻訳の調節配列を指す。
核酸、ポリペプチド、細胞、または生物に適用されて本明細書で使用される用語「自然
発生的な」または「無修飾の」は、天然に存在する核酸、ポリペプチド、細胞、または生
物を指す。例えば、天然源から単離することができ、実験室でヒトによって意図的に修飾
されていない、生物（ウイルスを含む）内に存在するポリペプチドまたはポリヌクレオチ
ド配列は、自然発生的である。
核酸またはポリペプチドに適用されて本明細書で使用される用語「キメラ」とは、異な
る供給源に由来する構造によって定義される２つの成分を指す。例えば、「キメラ」がキ
メラポリペプチド（例えば、キメラＣａｓ９／Ｃｓｎ１タンパク質）に関連して使用され
る場合、そのキメラポリペプチドは、異なるポリペプチドに由来するアミノ酸配列を含む
。キメラポリペプチドは、修飾された、または自然発生的なポリペプチド配列のいずれか
を含んでいてもよい（例えば、修飾または無修飾Ｃａｓ９／Ｃｓｎ１タンパク質由来の第
一アミノ酸配列；およびＣａｓ９／Ｃｓｎ１タンパク質以外の第二アミノ酸配列）。同様
に、キメラポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関連した「キメラ」は、異なる
コード領域に由来するヌクレオチド配列を含む（例えば、修飾または無修飾Ｃａｓ９／Ｃ
ｓｎ１タンパク質をコードする第一ヌクレオチド配列；およびＣａｓ９／Ｃｓｎ１タンパ
ク質以外のポリペプチドをコードする第二ヌクレオチド配列）。
用語「キメラポリペプチド」は、アミノ配列の２つの組み合わされていなければ離れて
いるセグメントの組み合わせ（すなわち、「融合」）によって、通常は人の介在によって
作製される、ポリペプチドを指す。キメラアミノ酸配列を含むポリペプチドはキメラポリ
ペプチドである。いくつかのキメラポリペプチドは「融合変異体」と称され得る。
「異種」とは、本明細書で使用される場合、天然の核酸またはタンパク質にそれぞれ存
在していないヌクレオチド配列またはポリペプチド配列を意味する。例えば、キメラＣａ
ｓ９／Ｃｓｎ１タンパク質では、自然発生的な細菌性Ｃａｓ９／Ｃｓｎ１ポリペプチド（
またはその変異体）のＲＮＡ結合ドメインは、異種ポリペプチド配列（すなわち、Ｃａｓ
９／Ｃｓｎ１以外のタンパク質に由来するポリペプチド配列または別の生物由来のポリペ
プチド配列）に融合されている場合がある。異種ポリペプチド配列は、キメラＣａｓ９／
Ｃｓｎ１タンパク質によっても示される活性（例えば、酵素活性）を示し得る（例えば、
メチルトランスフェラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、キナーゼ活性、ユビ
キチン化活性等）。異種核酸配列が自然発生的な核酸配列（またはその変異体）に（例え
ば、遺伝子操作によって）連結されることで、キメラポリペプチドをコードするキメラヌ
クレオチド配列が作製され得る。別の例として、融合変異型Ｃａｓ９部位特異的ポリペプ
チドでは、変異型Ｃａｓ９部位特異的ポリペプチドは、異種ポリペプチド（すなわち、Ｃ
ａｓ９以外のポリペプチド）に融合されている場合があり、融合変異型Ｃａｓ９部位特異
的ポリペプチドによっても示される活性を示す。異種核酸配列が変異型Ｃａｓ９部位特異
的ポリペプチドに（例えば、遺伝子操作）によって連結されることで、融合変異型Ｃａｓ
９部位特異的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が作製され得る。
「組換え型」とは、本明細書で使用される場合、特定の核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）が
、天然系に存在する内在性核酸と区別可能な構造コード配列または構造非コード配列を有
する構築物をもたらす、クローニング、制限処理（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ）、ポリメラ
ーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）および／またはライゲーションステップの種々の組換えの産物で
あることを意味する。ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列をｃＤＮＡ断片から、または
一連の合成オリゴヌクレオチドから構築することで、細胞内または無細胞の転写系および
翻訳系内に含有される組換え型転写単位からの発現が可能な合成核酸を作製することがで
きる。関連配列を含むゲノムＤＮＡは、組換え型の遺伝子または転写単位の形成にも使用
することができる。非翻訳ＤＮＡの配列はオープンリーディングフレームの５’側または
３’側に存在し得、そこで、係る配列は、コード領域の操作または発現に干渉せず、実際
には、種々の機構による所望の生成物の産生を調節するように作用し得る（下記の「ＤＮ
Ａ制御配列」を参照）。あるいは、翻訳されないＲＮＡ（例えば、ＤＮＡ標的化ＲＮＡ）
をコードするＤＮＡ配列も、組換え型と見なされ得る。従って、例えば、用語「組換え型
」核酸は、自然発生的でない、例えば、通常は人の介在により、配列の２つの組み合わさ
れていなければ離れているセグメントの人為的な組み合わせによって作製される、核酸を
指す。この人工的な組み合わせは、多くの場合、化学合成手段によって、または核酸の単
離セグメントの人為的操作、例えば、遺伝子工学技術によって達成される。そのような人
工的組み合わせは、通常は、コドンを、同一のアミノ酸、保存的アミノ酸、または非保存
的アミノ酸をコードするコドンと置換するために行われる。あるいは、所望の機能を有す
る核酸セグメントを結合して、所望の機能的組み合わせを生み出すために行われる。この
人工的な組み合わせは、多くの場合、化学合成手段によって、または核酸の単離セグメン
トの人為的操作、例えば、遺伝子工学技術によって達成される。組換え型ポリヌクレオチ
ドがポリペプチドをコードする場合、コードされるポリペプチドの配列は、自然発生的（
「野生型」）であってもよいし、あるいは自然発生的配列の異型（例えば、変異体）であ
ってもよい。従って、用語「組換え型」ポリペプチドは、必ずしも、配列が自然発生的で
ないポリペプチドを指すわけではない。実際には、「組換え型」ポリペプチドは組換えＤ
ＮＡ配列によってコードされているが、該ポリペプチド配列は、自然発生的（「野生型」
）であってもよいし、あるいは非自然発生的（例えば、異型、変異体等）であってもよい
。従って、「組換え型」ポリペプチドは人の介在の産物であるが、自然発生的なアミノ酸
配列であり得る。
「ベクター」または「発現ベクター」は、別のＤＮＡセグメント、すなわち「インサー
ト」が結合されるていることで、細胞内で結合されたセグメントの複製を引き起こすこと
ができる、プラスミド、ファージ、ウイルス、またはコスミド等のレプリコンである。
「発現カセット」は、プロモーターに作動可能に連結しているＤＮＡコード配列を含む
。「作動可能に連結された」とは、そのように記載された成分が、それらの意図される様
式で機能することを可能とする関係にある並列を指す。例えば、プロモーターがコード配
列の転写または発現に影響を与えている場合、プロモーターはコード配列に作動可能に連
結している。
用語「組み換え発現ベクター」、または「ＤＮＡ構築物」は、本明細書で同義的に使用
されて、ベクターおよび少なくとも１つのインサートを含むＤＮＡ分子を指す。組み換え
発現ベクターは通常、インサート（複数可）を発現および／もしくは増幅（ｐｒｏｐａｇ
ａｔｅ）させるため、または他の組換えヌクレオチド配列の構築のために、作製される。
インサート（複数可）は、プロモーター配列に作動可能に連結していてもしていなくても
よく、ＤＮＡ制御配列に作動可能に連結していてもしていなくてもよい。
細胞は、外来性ＤＮＡ（例えば、組み換え発現ベクター）が細胞内に導入されている場
合、係るＤＮＡによって「遺伝子改変」または「形質転換」または「形質移入」されてい
る。外来性ＤＮＡの存在は、永続的または一過性の遺伝的変化をもたらす。形質転換ＤＮ
Ａは、細胞のゲノムに組み込まれても組み込まれなくてもよい（共有結合的に連結してい
てもしていなくてもよい）。例えば、原核生物、酵母、および哺乳類細胞では、形質転換
ＤＮＡはプラスミド等のエピソームエレメント上に維持されている場合がある。真核細胞
について、安定に形質転換された細胞は、染色体複製を通じて娘細胞に遺伝されるように
形質転換ＤＮＡが染色体内に組み込まれた細胞である。この安定性は、真核細胞が、形質
転換ＤＮＡを含有する娘細胞集団を含む細胞株またはクローンを樹立する能力によって説
明される。「クローン」とは、有糸分裂によって単一細胞または共通の祖先に由来する細
胞集団である。「細胞株」とは、何世代にもわたってインビトロにおいて安定な増殖が可
能な初代細胞のクローンである。
遺伝子改変（「形質転換」とも称される）の適切な方法としては、例えば、ウイルス感
染またはバクテリオファージ感染、トランスフェクション、接合（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏ
ｎ）、原形質融合、リポフェクション、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿
、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）介在性トランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン
介在性トランスフェクション、リポソーム介在性トランスフェクション、パーティクルガ
ン法、リン酸カルシウム沈殿、直接微量注入、ナノ粒子介在性核酸送達（例えば、Panyam
et., al Adv Drug Deliv Rev. 2012 Sep 13. pii: S0169-409X(12)00283-9. doi: 10.10
16/j.addr.2012.09.023を参照）等が挙げられる。
遺伝子改変の方法の選択は、一般的には形質転換される細胞の種類および形質転換が起
こる環境（例えば、インビトロ、エキソビボ、またはインビボ）に依存する。これらの方
法の総括的な考察は、Ausubel, et al., Short Protocols in Molecular Biology, 3rd e
d., Wiley & Sons, 1995に見出すことができる。
本明細書で使用される「標的ＤＮＡ」は、「標的部位」または「標的配列」を含むＤＮ
Ａポリヌクレオチドである。用語「標的部位」または「標的配列」または「標的プロトス
ペーサー（ｐｒｏｔｏｓｐａｃｅｒ）ＤＮＡ」は、本明細書では同義的に使用され、結合
に十分な条件が存在する場合に主題のＤＮＡ標的化ＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントが結
合する（図１および図３９を参照）標的ＤＮＡ内に存在する核酸配列を指す。例えば、標
的ＤＮＡ内の標的部位（または標的配列）５’−ＧＡＧＣＡＴＡＴＣ−３’（配列番号／
／）は、ＲＮＡ配列５’−ＧＡＵＡＵＧＣＵＣ−３’（配列番号／／）の標的とされる（
またはそれと結合する、またはそれにハイブリダイズする、またはそれに対し相補的であ
る）。適切なＤＮＡ／ＲＮＡ結合条件には、細胞内に通常存在する生理的条件が含まれる
。他の適切なＤＮＡ／ＲＮＡ結合条件（例えば、無細胞系における条件）は、当該技術分
野において公知である（例えば、Sambrook、上記参照）。ＤＮＡ標的化ＲＮＡに対し相補
的でそれとハイブリダイズする標的ＤＮＡ鎖は「相補鎖」と称され、「相補鎖」に対し相
補的な（従ってＤＮＡ標的化ＲＮＡに対し相補的でない）標的ＤＮＡ鎖は「非相補鎖（ｎ
ｏｎｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｓｔｒａｎｄ）」または「非相補鎖（ｎｏｎ−ｃｏｍ
ｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｓｔｒａｎｄ）」と称される（図１２を参照）。
「部位特異的修飾ポリペプチド」または「ＲＮＡ結合部位特異的ポリペプチド」または
「ＲＮＡ結合部位特異的修飾ポリペプチド」または「部位特異的ポリペプチド」とは、Ｒ
ＮＡと結合し特定のＤＮＡ配列に標的化されるポリペプチドを意味する。本明細書に記載
される部位特異的修飾ポリペプチドは、それが結合しているＲＮＡ分子によって特定のＤ
ＮＡ配列に標的化される。ＲＮＡ分子は、標的ＤＮＡ内の標的配列に対し相補的であるこ
とから、結合したポリペプチドを標的ＤＮＡ（標的配列）内の特定の位置に標的化する配
列を含む。
「切断（ｃｌｅａｖａｇｅ）」とは、ＤＮＡ分子の共有結合性骨格の切断（ｂｒｅａｋ
ａｇｅ）を意味する。切断は、ホスホジエステル結合の酵素的または化学的な加水分解を
含むがこれらに限定はされない種々の方法によって開始され得る。一本鎖切断および二本
鎖切断は共に可能であり、二本鎖切断は２つの別々の一本鎖切断事象の結果として起こる
可能性がある。ＤＮＡ切断は平滑末端または付着末端の生成をもたらす可能性がある。あ
る特定の実施形態では、ＤＮＡ標的化ＲＮＡおよび部位特異的修飾ポリペプチドを含む複
合体が標的二本鎖ＤＮＡの切断のために使用される。
「ヌクレアーゼ」および「エンドヌクレアーゼ」は、本明細書で同義的に使用され、Ｄ
ＮＡ切断の触媒活性を有する酵素を意味する。
ヌクレアーゼの「切断ドメイン」または「活性ドメイン」または「ヌクレアーゼドメイ
ン」とは、ＤＮＡ切断の触媒活性を有するヌクレアーゼ内のポリペプチド配列またはポリ
ペプチドドメインを意味する。切断ドメインが１本鎖ポリペプチド内に含まれている場合
もあるし、あるいは、切断活性が２つの（またはそれ以上の）ポリペプチドの結合によっ
てもたらされる場合もある。単一のヌクレアーゼドメインは、所与のポリペプチド内の２
つ以上の単離されたアミノ酸鎖から成り得る。
部位特異的修飾ポリペプチドに結合し該ポリペプチドを標的ＤＮＡ内の特定の位置に標
的化するＲＮＡ分子は、「ＤＮＡ標的化ＲＮＡ」または「ＤＮＡ標的化ＲＮＡポリヌクレ
オチド」と称される（「誘導ＲＮＡ」または「ｇＲＮＡ」とも称される）。主題のＤＮＡ
標的化ＲＮＡは、「ＤＮＡ標的化セグメント」および「タンパク質結合セグメント」の２
つのセグメントを含む。「セグメント」とは、分子のセグメント／セクション／領域（例
えば、ＲＮＡ内の連続するヌクレオチド鎖）を意味する。セグメントは、セグメントが２
つ以上の分子の領域を含み得るような、複合体の領域／セクションを意味する場合もある
。例えば、いくつかの例においては、ＤＮＡ標的化ＲＮＡのタンパク質結合セグメント（
下記）は１つのＲＮＡ分子であり、そのため、タンパク質結合セグメントは、そのＲＮＡ
分子の領域を含む。他の場合においては、ＤＮＡ標的化ＲＮＡのタンパク質結合セグメン
ト（下記）は、相補的領域に沿ってハイブリダイズしている２つの別々の分子を含む。例
としては、限定はされないが、２つの別々の分子を含むＤＮＡ標的化ＲＮＡのタンパク質
結合セグメントは、（ｉ）１００塩基対長の第一ＲＮＡ分子の塩基対４０〜７５；および
（ｉｉ）５０塩基対長の第二ＲＮＡ分子の塩基対１０〜２５を含み得る。「セグメント」
の定義は、特定の文脈において特に定義されていない限り、特定の全塩基対数に限定され
ず、いかなる特定の、所与のＲＮＡ分子由来の任意の特定の塩基対数にも限定されず、複
合体内の特定の数の別々の分子に限定されず、任意の全長であるＲＮＡ分子の領域を含ん
でいてもよく、他の分子に対し相補性を有する領域を含んでいても含んでいなくてもよい
。
ＤＮＡ標的化セグメント（または「ＤＮＡ標的化配列」）は、標的ＤＮＡ内の特定の配
列に対し相補的なヌクレオチド配列（標的ＤＮＡの相補鎖）を含む。タンパク質結合セグ
メント（または「タンパク質結合配列」）は、部位特異的修飾ポリペプチドと相互作用す
る。部位特異的修飾ポリペプチドがＣａｓ９またはＣａｓ９関連ポリペプチド（以下によ
り詳細に記載）である場合、標的ＤＮＡの部位特異的切断は、（ｉ）ＤＮＡ標的化ＲＮＡ
と標的ＤＮＡの間の塩基対形成の相補性；および（ｉｉ）標的ＤＮＡ内のショートモチー
フ（ｓｈｏｒｔ ｍｏｔｉｆ）（プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）と称される）
の両方によって決定される位置で起こる。
主題のＤＮＡ標的化ＲＮＡのタンパク質結合セグメントは、互いにハイブリダイズして
二本鎖ＲＮＡ二本鎖（ｄｏｕｂｌｅ ｓｔｒａｎｄｅｄ ＲＮＡ ｄｕｐｌｅｘ）（ｄｓ
ＲＮＡ二本鎖）を形成する、２本の相補的なヌクレオチド鎖を含む。
いくつかの実施形態において、主題の核酸（例えば、ＤＮＡ標的化ＲＮＡ、ＤＮＡ標的
化ＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む核酸；部位特異的ポリペプチドをコードす
る核酸；等）は、追加の所望の特徴（例えば、修飾または調節された安定性；細胞内標的
化；追跡（例えば、蛍光標識）；タンパク質またはタンパク質複合体に対する結合部位；
等）を与える修飾または配列を含む。例としては、限定はされないが、５’キャップ（例
えば、７−メチルグアニル酸キャップ（ｍ７Ｇ））；３’ポリアデニル化尾部（すなわち
、３’ポリ（Ａ）尾部）；リボスイッチ配列（例えば、安定性の調節、並びに／またはタ
ンパク質および／もしくはタンパク質複合体による接触のし易さの調節を可能にする）；
安定性制御配列；ｄｓＲＮＡ二本鎖を形成する配列（すなわち、ヘアピン））；ＲＮＡを
細胞内位置（例えば、核、ミトコンドリア、葉緑体等）に標的化する修飾または配列；追
跡（例えば、蛍光分子への直接結合、蛍光検出を促進する部分、蛍光検出を可能にする配
列への結合等）をもたらす修飾または配列；タンパク質（例えば、転写活性化因子、転写
抑制因子、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ＤＮＡ脱メチル化酵素、ヒストンアセチル
トランスフェラーゼ、ヒストン脱アセチル化酵素等を含むＤＮＡに作用するタンパク質）
に対する結合部位を与える修飾または配列；並びにそれらの組み合わせが挙げられる。
いくつかの実施形態において、ＤＮＡ標的化ＲＮＡは、上記の特徴のうちのいずれかを
与える追加のセグメントを５’末端または３’末端のいずれかに含む。例えば、適切な第
三セグメントは、５’キャップ（例えば、７−メチルグアニル酸キャップ（ｍ７Ｇ））；
３’ポリアデニル化尾部（すなわち、３’ポリ（Ａ）尾部）；リボスイッチ配列（例えば
、安定性の調節、並びに／またはタンパク質およびタンパク質複合体による接触のし易さ
の調節を可能にする）；安定性制御配列；ｄｓＲＮＡ二本鎖を形成する配列（すなわち、
ヘアピン））；ＲＮＡを細胞内位置（例えば、核、ミトコンドリア、葉緑体等）に標的化
する配列；追跡（例えば、蛍光分子への直接結合、蛍光検出を促進する部分、蛍光検出を
可能にする配列への結合等）をもたらす修飾または配列；タンパク質（例えば、転写活性
化因子、転写抑制因子、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ＤＮＡ脱メチル化酵素、ヒス
トンアセチルトランスフェラーゼ、ヒストン脱アセチル化酵素等を含むＤＮＡに作用する
タンパク質）に対する結合部位を与える修飾または配列；並びにそれらの組み合わせを含
み得る。
主題のＤＮＡ標的化ＲＮＡおよび主題の部位特異的修飾ポリペプチド（すなわち、部位
特異的ポリペプチド）は、複合体を形成する（すなわち、非共有結合性相互作用によって
結合する）。ＤＮＡ標的化ＲＮＡは、標的ＤＮＡの配列に対し相補的なヌクレオチド配列
を含むことによって、標的特異性を複合体に与える。複合体の部位特異的修飾ポリペプチ
ドは部位特異的活性を与える。言い換えれば、部位特異的修飾ポリペプチドは、それ自体
がＤＮＡ標的化ＲＮＡのタンパク質結合セグメントと結合することによって、標的ＤＮＡ
配列（例えば、染色体核酸内の標的配列；染色体外核酸（例えば、エピソーム核酸、ミニ
サークル等）内の標的配列；ミトコンドリア核酸内の標的配列；葉緑体核酸内の標的配列
；プラスミド内の標的配列；等）に誘導される。
いくつかの実施形態において、主題のＤＮＡ標的化ＲＮＡは、２つの別々のＲＮＡ分子
（ＲＮＡポリヌクレオチド：「活性化ＲＮＡ」および「標的化ＲＮＡ」、以下を参照）を
含み、「二重分子ＤＮＡ標的化ＲＮＡ」または「二分子ＤＮＡ標的化ＲＮＡ」と称される
。他の実施形態では、主題のＤＮＡ標的化ＲＮＡは単一ＲＮＡ分子（単一ＲＮＡポリヌク
レオチド）であり、「単一分子ＤＮＡ標的化ＲＮＡ」、「単一誘導ＲＮＡ」、または「ｓ
ｇＲＮＡ」と称される。用語「ＤＮＡ標的化ＲＮＡ」または「ｇＲＮＡ」は、二重分子Ｄ
ＮＡ標的化ＲＮＡおよび単一分子ＤＮＡ標的化ＲＮＡ（すなわち、ｓｇＲＮＡ）の両方を
包括的に指す。
例示的な二分子ＤＮＡ標的化ＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ様（「ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ」また
は「標的化ＲＮＡ」または「ｃｒＲＮＡ」または「ｃｒＲＮＡリピート」）分子および対
応するｔｒａｃｒＲＮＡ様（「トランス作動性ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ」または「活性化Ｒ
ＮＡ」または「ｔｒａｃｒＲＮＡ」）分子を含む。ｃｒＲＮＡ様分子（標的化ＲＮＡ）は
、ＤＮＡ標的化ＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメント（一本鎖）およびＤＮＡ標的化ＲＮＡの
タンパク質結合セグメントのｄｓＲＮＡ二本鎖の半分を形成するヌクレオチド鎖（「二本
鎖形成セグメント」）の両方を含む。対応するｔｒａｃｒＲＮＡ様分子（活性化ＲＮＡ）
は、ＤＮＡ標的化ＲＮＡのタンパク質結合セグメントのｄｓＲＮＡ二本鎖のもう半分を形
成するヌクレオチド鎖（二本鎖形成セグメント）を含む。言い換えれば、ｃｒＲＮＡ様分
子のヌクレオチド鎖は、ｔｒａｃｒＲＮＡ様分子のヌクレオチド鎖に対し相補的でそれと
ハイブリダイズして、ＤＮＡ標的化ＲＮＡのタンパク質結合ドメインのｄｓＲＮＡ二本鎖
を形成する。従って、それぞれのｃｒＲＮＡ様分子は、対応するｔｒａｃｒＲＮＡ様分子
を有すると言うことができる。ｃｒＲＮＡ様分子はさらに、一本鎖ＤＮＡ標的化セグメン
トを与える。従って、ｃｒＲＮＡ様分子およびｔｒａｃｒＲＮＡ様分子は（対応する対と
して）ハイブリダイズしてＤＮＡ標的化ＲＮＡを形成する。所与のｃｒＲＮＡ分子または
ｔｒａｃｒＲＮＡ分子の正確な配列は、ＲＮＡ分子が存在する種類に特有である。様々な
ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡが図８の対応する相補的対合に示されている。主題の
二重分子ＤＮＡ標的化ＲＮＡは、いかなる対応するｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ対
を含んでいてもよい。主題の二重分子ＤＮＡ標的化ＲＮＡは、いかなる対応するｃｒＲＮ
ＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ対を含んでいてもよい。
用語「活性化ＲＮＡ」は、二重分子ＤＮＡ標的化ＲＮＡのｔｒａｃｒＲＮＡ様分子を意
味して、本明細書では使用される。用語「標的化ＲＮＡ」は、二重分子ＤＮＡ標的化ＲＮ
ＡのｃｒＲＮＡ様分子を意味して、本明細書では使用される。用語「二本鎖形成セグメン
ト」は、対応する活性化ＲＮＡ分子または標的化ＲＮＡ分子のヌクレオチド鎖にハイブリ
ダイズすることでｄｓＲＮＡ二本鎖の形成に寄与する、活性化ＲＮＡまたは標的化ＲＮＡ
のヌクレオチド鎖を意味して、本明細書では使用される。言い換えれば、活性化ＲＮＡは
、対応する標的化ＲＮＡの二本鎖形成セグメントに対し相補的な二本鎖形成セグメントを
含む。従って、活性化ＲＮＡは二本鎖形成セグメントを含み、一方、標的化ＲＮＡは二本
鎖形成セグメントおよびＤＮＡ標的化ＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントの両方を含む。従
って、主題の二重分子ＤＮＡ標的化ＲＮＡは、いかなる対応する活性化ＲＮＡおよび標的
化ＲＮＡ対から成っていてもよい。
「宿主細胞」は、本明細書で使用される場合、インビボまたはインビトロにおける真核
細胞、原核細胞（例えば、細菌細胞または古細菌細胞）、または単細胞の独立体として培
養される多細胞生物由来の細胞（例えば、細胞株）を示し、真核細胞または原核細胞は核
酸のレシピエントとして使用され得る、もしくは使用されており、核酸によって形質転換
された原細胞の子孫が含まれる。単一細胞の子孫は、自然変異、偶発的変異、または意図
的な変異があるために、形態において、またはゲノムもしくは全ＤＮＡの相補体（ｃｏｍ
ｐｌｅｍｅｎｔ）において、元の親と必ずしも完全に同一でなくてもよいことが理解され
る。「組換え宿主細胞」（「遺伝子改変宿主細胞」とも称される）は、異種核酸（例えば
、発現ベクター）を導入された宿主細胞である。例えば、主題の細菌宿主細胞は、適切な
細菌宿主細胞への外来性核酸（例えば、プラスミドまたは組み換え発現ベクター）の導入
による遺伝子改変された細菌性宿主細胞であり、主題の真核生物宿主細胞は、適切な真核
生物性宿主細胞への外来性核酸の導入による遺伝子改変された真核生物性宿主細胞（例え
ば、哺乳類生殖細胞）である。
用語「幹細胞」は、自己複製し、且つ分化細胞型を生み出す能力を有する細胞（例えば
、植物幹細胞、脊椎動物幹細胞）を指して本明細書で使用される（Morrison et al. (199
7) Cell 88:287-298を参照）。細胞の個体発生に関連して、形容詞「分化型の」、または
「分化中の」は、相対語である。「分化細胞」は、比較されている細胞よりも発生経路を
さらに進行した細胞である。従って、多能性幹細胞（下記）は、系統が限定された前駆細
胞（例えば、中胚葉幹細胞）に分化可能であり、系統が限定された前駆細胞はその後、さ
らに限定された細胞（例えば、ニューロン前駆細胞）に分化可能であり、さらに限定され
た細胞は最終段階の細胞（すなわち、高分化型細胞、例えば、ニューロン、心筋細胞等）
に分化可能であり、最終段階の細胞はある特定の組織型において特徴的な役割を果たし、
さらに増殖する能力は保持していても保持していなくてもよい。幹細胞は、特定のマーカ
ー（例えば、タンパク質、ＲＮＡ等）の存在および特定のマーカーの非存在の両方を特徴
とし得る。また幹細胞は、インビトロおよびインビボの両方における機能分析、特に、幹
細胞が複数の分化した子孫を生じさせる能力に関したアッセイによって同定され得る。
目的とする幹細胞には多能性幹細胞（ＰＳＣ）が含まれる。用語「多能性幹細胞」また
は「ＰＳＣ」は、その生物の全ての細胞型を生み出すことが可能な幹細胞を意味して、本
明細書では使用される。従って、ＰＳＣは、その生物の全ての胚葉（例えば、脊椎動物の
内胚葉、中胚葉、および外胚葉）の細胞を生じることができる。多能性細胞は、生体にお
いて、奇形腫を形成することができ、外胚葉、中胚葉、または内胚葉組織に寄与すること
が可能である。植物の多能性幹細胞は、その植物の全ての細胞型（例えば、根、茎、葉等
の細胞）を生じることができる。
動物のＰＳＣはいくつかの異なる方法で得ることができる。例えば、胚性幹細胞（ＥＳ
Ｃ）は胚の内部細胞塊から得られ（Thomson et. al, Science. 1998 Nov 6;282(5391):11
45-7）、一方、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）は体細胞から得られる（Takahashi et. al
, Cell. 2007 Nov 30;131(5):861-72; Takahashi et. al, Nat Protoc. 2007;2(12):3081
-9; Yu et. al, Science. 2007 Dec 21;318(5858):1917-20. Epub 2007 Nov 20）。用語
ＰＳＣは多能性幹細胞をそれらの由来にかかわらず指すため、用語ＰＳＣは用語ＥＳＣお
よび用語ｉＰＳＣ、並びにＰＳＣの別の例である用語胚性生殖幹細胞（ＥＧＳＣ）を包含
する。ＰＳＣは株化細胞系形態であってもよいし、一次胚組織から直接得てもよいし、あ
るいは、体細胞に由来していてもよい。ＰＳＣは本明細書に記載の方法の標的細胞であり
得る。
「胚性幹細胞」（ＥＳＣ）とは、胚から、典型的には胚盤胞の内部細胞塊から単離され
たＰＳＣを意味する。ＥＳＣ系はＮＩＨ Ｈｕｍａｎ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ
Ｃｅｌｌ Ｒｅｇｉｓｔｒｙに記載されており、例えば、ｈＥＳＢＧＮ−０１、ｈＥＳＢ
ＧＮ−０２、ｈＥＳＢＧＮ−０３、ｈＥＳＢＧＮ−０４（ブレサジェン社（ＢｒｅｓａＧ
ｅｎ， Ｉｎｃ．）；ＨＥＳ−１、ＨＥＳ−２、ＨＥＳ−３、ＨＥＳ−４、ＨＥＳ−５、
ＨＥＳ−６（ＥＣセル・インターナショナル社（ＥＳ Ｃｅｌｌ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏ
ｎａｌ））；Ｍｉｚ−ｈＥＳ１（ミズメディ病院−ソウル大学校（ＭｉｚＭｅｄｉ Ｈｏ
ｓｐｉｔａｌ−Ｓｅｏｕｌ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ））；ＨＳＦ−１
、ＨＳＦ−６（カリフォルニア大学サンフランシスコ校（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ
Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ａｔ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ））；およびＨ１、Ｈ７、Ｈ
９、Ｈ１３、Ｈ１４（ウイスコンシン同窓研究基金（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ａｌｕｍｎｉ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）（ウィセル・リサーチ・インスティテュー
ト社（ＷｉＣｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）））等である。目的とす
る幹細胞には、アカゲザル幹細胞およびマーモセット幹細胞等の他の霊長類由来の胚性幹
細胞も含まれる。該幹細胞は、あらゆる哺乳類種、例えば、ヒト、ウマ、ウシ、ブタ、イ
ヌ、ネコ、げっ歯類（例えば、マウス、ラット、ハムスター）、霊長類等から得られてい
てもよい（Thomson et al. (1998) Science 282:1145; Thomson et al. (1995) Proc. Na
tl. Acad. Sci USA 92:7844; Thomson et al. (1996) Biol. Reprod. 55:254; Shamblott
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:13726, 1998）。培養において、ＥＳＣは典型
的に、大きな核−細胞質比、明確な境界および顕著な核小体を有する平坦なコロニーとし
て増殖する。さらに、ＥＳＣは、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲ
Ａ−１−８１、およびアルカリホスファターゼを発現するが、ＳＳＥＡ−１は発現しない
。ＥＳＣを作製および特徴付けする方法の例は、例えば、米国特許第７，０２９，９１３
号、同第５，８４３，７８０号、および同第６，２００，８０６号に見出すことができ、
これらの開示は参照によって本明細書に組み込まれる。未分化型のｈＥＳＣを増殖させる
ための方法は、国際公開第９９／２０７４１号、同第０１／５１６１６号、および同第０
３／０２０９２０号に記載される。
「胚性生殖幹細胞」（ＥＧＳＣ）または「胚性生殖細胞」または「ＥＧ細胞」とは、生
殖細胞および／または生殖細胞前駆細胞、例えば始原生殖細胞（すなわち精子および卵子
になるであろう細胞）に由来するＰＳＣを意味する。胚性生殖細胞（ＥＧ細胞）は、上記
の胚性幹細胞と類似した特性を有すると考えられている。ＥＧ細胞を作製および特徴付け
する方法の例は、例えば、米国特許第７，１５３，６８４号;Matsui, Y., et al., (1992
) Cell 70:841; Shamblott, M., et al. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 113;
Shamblott, M., et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:13726;およびKoshimiz
u, U., et al. (1996) Development, 122:1235に見出すことができ、これらの開示は参照
によって本明細書に組み込まれる。
「誘導多能性幹細胞」または「ｉＰＳＣ」とは、ＰＳＣではない細胞（すなわち、ＰＳ
Ｃよりも分化した細胞）に由来するＰＳＣを意味する。ｉＰＳＣは、複数の異なる細胞型
（例えば、高分化型細胞）から得ることができる。ｉＰＳＣはＥＳ細胞様形態を有し、大
きな核−細胞質比、明確な境界および顕著な核を有する平坦なコロニーとして増殖する。
さらに、ｉＰＳＣは、当業者に公知の、一つまたは複数の重要な多能性マーカーを発現し
、例えば、限定はされないが、アルカリホスファターゼ、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、Ｓｏ
ｘ２、Ｏｃｔ３／４、Ｎａｎｏｇ、ＴＲＡ１６０、ＴＲＡ１８１、ＴＤＧＦ１、Ｄｎｍｔ
３ｂ、ＦｏｘＤ３、ＧＤＦ３、Ｃｙｐ２６ａ１、ＴＥＲＴ、およびｚｆｐ４２等である。
ｉＰＳＣを作製および特徴付けする方法の例は、例えば、米国特許出願公開第ＵＳ２００
９００４７２６３号、同第ＵＳ２００９００６８７４２号、同第ＵＳ２００９０１９１１
５９号、同第ＵＳ２００９０２２７０３２号、同第ＵＳ２００９０２４６８７５号、およ
び同第ＵＳ２００９０３０４６４６号に見出すことができ、これらの開示は参照によって
本明細書に組み込まれる。一般的に、ｉＰＳＣを作製するために、多能性幹細胞になるよ
うに体細胞を再プログラムするための、当該技術分野において公知の再プログラム因子（
例えば、Ｏｃｔ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ＭＹＣ、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８等）が体細胞
に与えられる。
「体細胞」とは、実験的操作の非存在下では、生物における全細胞型を通常生じない、
生物におけるあらゆる細胞を意味する。言い換えれば、体細胞は、生体の３種の全胚葉（
すなわち、外胚葉、中胚葉および内胚葉）の細胞を自然には生じない程十分に分化した細
胞である。例えば、体細胞にはニューロンおよび神経前駆細胞の両方が含まれ、その後者
は、中枢神経系の全てまたはいくつかの細胞型を自然に生じることができ得るが、中胚葉
または内胚葉系統の細胞を生じることはできない。
「有糸分裂細胞」とは、有糸分裂を行っている細胞を意味する。有糸分裂は、真核細胞
がその核に含まれる染色体を２つの別々の核の２つの同一のセットに分離するプロセスで
ある。通常、その直後に細胞質分裂が起こり、核、細胞質、細胞小器官および細胞膜が、
これらの細胞成分をおおよそ等しい割合で含有する２つの細胞に分割される。
「分裂終了細胞」とは、有糸分裂から脱出した、すなわち、「静止状態」にある、すな
わち、それ以上分裂を行わない細胞を意味する。この静止状態は一時的、すなわち可逆的
な場合もあるし、あるいは永続的な場合もある。
「減数分裂細胞」とは、減数分裂を行っている細胞を意味する。減数分裂は、細胞が配
偶子または胞子をつくることを目的としてその核内物質を分割するプロセスである。有糸
分裂と異なり、減数分裂では、染色体は染色体間で遺伝物質を組み換える組換えステップ
を行う。さらに、有糸分裂から生み出される２つの（遺伝的に同一の）二倍体細胞に対し
て、減数分裂は４つの（遺伝的に特有の）一倍体細胞をもたらす。
「組換え」とは、２つのポリヌクレオチド間の遺伝情報の交換のプロセスを意味する。
本明細書で使用される場合、「相同組換え修復（ＨＤＲ）」は、例えば、細胞における二
重鎖切断の修復中に起こる、特殊な形態のＤＮＡ修復を指す。このプロセスはヌクレオチ
ド配列相同性を必要とし、「ドナー」分子を「標的」分子（すなわち、二重鎖切断を受け
た分子）の鋳型修復に用い、ドナーから標的への遺伝情報の移動をもたらす。相同組換え
修復は、ドナーポリヌクレオチドが標的分子と異なり、ドナーポリヌクレオチド配列の一
部または全てが標的ＤＮＡ内に組み込まれた場合に、標的分子配列の変化（例えば、挿入
、欠失、変異）をもたらし得る。いくつかの実施形態において、ドナーポリヌクレオチド
、ドナーポリヌクレオチドの一部、ドナーポリヌクレオチドのコピー、またはドナーポリ
ヌクレオチドのコピーの一部は、標的ＤＮＡに組み込まれる。
「非相同末端結合（ＮＨＥＪ）」とは、相同的鋳型を必要とせずに（修復を導くために
相同配列を必要とする相同組換え修復とは対照的）、切断末端を互いに直接ライゲーショ
ンすることによる、ＤＮＡ内の二重鎖切断の修復を意味する。ＮＨＥＪは多くの場合、二
重鎖切断部位の近くのヌクレオチド配列の損失（欠失）をもたらす。
用語「処置」、「処置すること」等は、所望の薬理学的および／または生理学的効果を
得ることを通常意味して、本明細書では使用される。効果は、疾患もしくはその症状を完
全にまたは部分的に予防するという点から予防的なものであってもよいし、および／また
は、疾患および／もしくはその疾患に起因する有害作用の部分的もしくは完全な治癒とい
う点から治療的なものであってもよい。本明細書で使用される「処置」は、哺乳動物にお
ける疾患または症状のあらゆる処置を包含し、（ａ）疾患または症状にかかる傾向がある
が、まだそれを有しているとは診断されていない対象において、疾患または症状が発症す
ることを予防すること；（ｂ）疾患または症状を抑制すること、すなわち、その発達を止
めること；あるいは（ｃ）疾患を軽減すること、すなわち、疾患の後退を引き起こすこと
、を含む。治療薬は、病気または傷害の発生の前に投与されてもよいし、発生中に投与さ
れてもよいし、発生後に投与されてもよい。進行中の疾患の処置であって、患者の望まし
くない臨床症状を安定化または低減する処置は、特に重要である。そのような処置は、患
部組織における完全な機能喪失の前に行われることが望ましい。主題の治療は、疾患の対
症段階の間、および場合によっては疾患の対症段階の後に、投与されることが望ましい。
用語「個体」、「対象」、「宿主」、および「患者」は、本明細書で同義的に使用され
、診断、処置、または治療が望ましいあらゆる哺乳類対象、特にヒトを指す。
分子生化学および細胞生化学における一般的な方法は、Molecular Cloning: A Laborat
ory Manual, 3rd Ed. (Sambrook et al., HaRBor Laboratory Press 2001); Short Proto
cols in Molecular Biology, 4th Ed. (Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons 1999)
; Protein Methods (Bollag et al., John Wiley & Sons 1996); Nonviral Vectors for
Gene Therapy (Wagner et al. eds., Academic Press 1999); Viral Vectors (Kaplift &
Loewy eds., Academic Press 1995); Immunology Methods Manual (I. Lefkovits ed.,
Academic Press 1997);およびCell and Tissue Culture: Laboratory Procedures in Bio
technology (Doyle & Griffiths, John Wiley & Sons 1998)等の標準的な教科書に見出す
ことができ、これらの開示は参照によって本明細書に組み込まれる。
本発明をさらに説明する前に、本発明が記載される特定の実施形態に限定されず、従っ
て、当然のことながら、変更され得ることを理解されたい。本明細書で使用される専門用
語は特定の実施形態を説明することのみを目的としており、本発明の範囲は添付の特許請
求の範囲によってのみ限定されるため、限定を意図するものではないことも理解されたい
。
数値の範囲が与えられた場合、その範囲の上限値と下限値の間の、文脈によって特に明
示されない限りは下限値の単位の１０分の１までの、間に挟まれた各値、およびその記載
の範囲内のあらゆる他の記載された、または間に挟まれた数値は、本発明に包含されるこ
とを理解されたい。これらのより小さな範囲の上限値および下限値は、そのより小さな範
囲内に独立して含まれてもよく、これもまた本発明に包含されるが、記載範囲の具体的に
除外される境界値が適用される。記載範囲が一方または両方の境界値を含む場合、それら
の含まれる境界値の一方または両方を除外した範囲もまた、本発明に含まれる。
ある特定の範囲は、「約」という用語に先行された数値を用いて、本明細書で提供され
る。本明細書において「約」という用語は、それに続くまさにその数値、およびその用語
に続く数値に近いまたは近似した数値のための字義通りのサポートを提供するのに使用さ
れる。ある数値が具体的に記載された数値に近いまたは近似しているかどうかを決定する
際、近いまたは近似している未記載の数値は、それが提示された文脈において、具体的に
記載された数値の実質的な等価物を提供する数値であり得る。
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての専門用語および科学用語は、本発
明が属する技術分野において当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。
本明細書に記載されるものと同様または等価であるいかなる方法および材料も本発明の実
施または試験に使用可能ではあるが、ここで、好ましい方法および材料が記載される。本
明細書で言及される全ての刊行物は、引用された刊行物と関連した方法および／または材
料を開示および説明するために、参照によって本明細書に組み込まれる。
本明細書において引用した全ての刊行物および特許は、あたかも個々の刊行物または特
許がそれぞれ、具体的かつ個々に、本明細書に参照によって組み込まれることが示される
ように、本明細書に参照によって組み込まれており、関連して刊行物が引用される方法お
よび／または材料を開示および説明するために、本明細書に参照によって組み込まれる。
いかなる出版物の引用も、出願日よりも前のその開示に対するものであり、先願発明によ
りそのような刊行物に先行する権利がないという承認として解釈されるべきではない。さ
らに、提供される刊行物の日付は、実際の刊行日とは異なる場合があり、別に確認される
必要があり得る。
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、お
よび「ｔｈｅ」は、文脈によって特に明示されない限り、複数の指示対象を含むことに注
意されたい。従って、例えば、「ポリヌクレオチド」への言及には、複数のそのようなポ
リヌクレオチドが含まれ、「ポリペプチド」への言及には、一つまたは複数のポリペプチ
ドおよび当業者に公知のその等価物への言及が含まれる、等である。さらに、特許請求の
範囲は、いかなる任意の要素も除外するように起案することができることを注意されたい
。従って、この記載は、請求項の要素の列挙に関連して、「単に（ｓｏｌｅｌｙ）」、「
のみ（ｏｎｌｙ）」等の排他的な用語の使用、または「否定的な」制限の使用に先立つ基
準としての役割を果たすことが意図される。
明確化のために別々の実施形態に関して記載される本発明のある特定の特徴は、単一の
実施形態において組み合わされて提供されてもよいことが理解される。逆に、簡潔さのた
めに単一の実施形態に関して記載される本発明の種々の特徴は、別々に提供されてもよい
し、あるいは任意の適切な副組合せで提供されてもよい。本発明に関連する全ての実施形
態の組み合わせは、それぞれおよび全ての組み合わせがあたかも個々に且つ明示的に開示
されたかの如く、本発明に具体的に包含され、本明細書で開示される。さらに、種々の実
施形態およびその要素の全ての副組合せも、それぞれおよび全てのそのような副組み合わ
せがあたかも個々に且つ明示的に本明細書で開示されたかの如く、本発明に具体的に包含
され、本明細書で開示される。
本明細書で考察される刊行物は、本出願の出願日よりも前のその開示のみに対して提供
される。本明細書に記載のものはいずれも、本発明が、先願発明によりそのような刊行物
に先行する権利がないという承認として解釈されるべきではない。さらに、提供される刊
行物の日付は、実際の刊行日とは異なる場合があり、別に確認される必要があり得る。
発明を実施するための形態（第一部）
本開示は、ターゲティング配列を含み、修飾ポリペプチドと共に、標的ＤＮＡおよび／
または標的ＤＮＡと結合したポリペプチドの部位特異的修飾を与える、ＤＮＡ標的化ＲＮ
Ａを提供する。本開示はさらに、部位特異的修飾ポリペプチドを提供する。本開示はさら
に、標的ＤＮＡおよび／または標的ＤＮＡと結合したポリペプチドの部位特異的修飾の方
法を提供する。本開示は、標的核酸を酵素的に不活性なＣａｓ９ポリペプチドおよびＤＮ
Ａ標的化ＲＮＡと接触させることを一般的に含む、標的細胞内の標的核酸の転写を調節す
る方法を提供する。該方法を実行するためのキットおよび組成物も提供される。本開示は
、Ｃａｓ９を産生する遺伝子改変細胞；およびＣａｓ９遺伝子導入非ヒト多細胞生物を提
供する。
核酸
ＤＮＡ標的化ＲＮＡ
本開示は、標的ＤＮＡ内の特定の標的配列に対し、結合したポリペプチド（例えば、部
位特異的修飾ポリペプチド）の活性を向ける、ＤＮＡ標的化ＲＮＡを提供する。主題のＤ
ＮＡ標的化ＲＮＡは、第一セグメント（本明細書では「ＤＮＡ標的化セグメント」または
「ＤＮＡ標的化配列」とも称される）および第二セグメント（本明細書では「タンパク質
結合セグメント」または「タンパク質結合配列」とも称される）を含む。
ＤＮＡ標的化ＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメント
主題のＤＮＡ標的化ＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントは、標的ＤＮＡ内の配列に対し相
補的なヌクレオチド配列を含む。言い換えれば、主題のＤＮＡ標的化ＲＮＡのＤＮＡ標的
化セグメントは、ハイブリダイゼーション（すなわち、塩基対形成）を介して配列特異的
に標的ＤＮＡと相互作用する。従って、ＤＮＡ標的化セグメントのヌクレオチド配列は変
動してもよく、ＤＮＡ標的化ＲＮＡおよび標的ＤＮＡが相互作用する標的ＤＮＡ内の位置
を決定する。主題のＤＮＡ標的化ＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントは、標的ＤＮＡ内のい
かなる所望の配列にもハイブリダイズするように、（例えば、遺伝子操作によって）修飾
することができる。
ＤＮＡ標的化セグメントは、約１２ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチドの長さを有し
得る。例えば、ＤＮＡ標的化セグメントは、約１２ヌクレオチド（ｎｔ）〜約８０ｎｔ、
約１２ｎｔ〜約５０ｎｔ、約１２ｎｔ〜約４０ｎｔ、約１２ｎｔ〜約３０ｎｔ、約１２ｎ
ｔ〜約２５ｎｔ、約１２ｎｔ〜約２０ｎｔ、または約１２ｎｔ〜約１９ｎｔの長さを有し
得る。例えば、ＤＮＡ標的化セグメントは、約１９ｎｔ〜約２０ｎｔ、約１９ｎｔ〜約２
５ｎｔ、約１９ｎｔ〜約３０ｎｔ、約１９ｎｔ〜約３５ｎｔ、約１９ｎｔ〜約４０ｎｔ、
約１９ｎｔ〜約４５ｎｔ、約１９ｎｔ〜約５０ｎｔ、約１９ｎｔ〜約６０ｎｔ、約１９ｎ
ｔ〜約７０ｎｔ、約１９ｎｔ〜約８０ｎｔ、約１９ｎｔ〜約９０ｎｔ、約１９ｎｔ〜約１
００ｎｔ、約２０ｎｔ〜約２５ｎｔ、約２０ｎｔ〜約３０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約３５ｎｔ
、約２０ｎｔ〜約４０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約４５ｎｔ、約２０ｎｔ〜約５０ｎｔ、約２０
ｎｔ〜約６０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約７０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約８０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約
９０ｎｔ、または約２０ｎｔ〜約１００ｎｔの長さを有し得る。標的ＤＮＡのヌクレオチ
ド配列（標的配列）に対し相補的なＤＮＡ標的化セグメントのヌクレオチド配列（ＤＮＡ
標的化配列）は、少なくとも約１２ｎｔの長さを有し得る。例えば、標的ＤＮＡの標的配
列に対し相補的なＤＮＡ標的化セグメントのＤＮＡ標的化配列は、少なくとも約１２ｎｔ
、少なくとも約１５ｎｔ、少なくとも約１８ｎｔ、少なくとも約１９ｎｔ、少なくとも約
２０ｎｔ、少なくとも約２５ｎｔ、少なくとも約３０ｎｔ、少なくとも約３５ｎｔまたは
少なくとも約４０ｎｔの長さを有し得る。例えば、標的ＤＮＡの標的配列に対し相補的な
ＤＮＡ標的化セグメントのＤＮＡ標的化配列は、約１２ヌクレオチド（ｎｔ）〜約８０ｎ
ｔ、約１２ｎｔ〜約５０ｎｔ、約１２ｎｔ〜約４５ｎｔ、約１２ｎｔ〜約４０ｎｔ、約１
２ｎｔ〜約３５ｎｔ、約１２ｎｔ〜約３０ｎｔ、約１２ｎｔ〜約２５ｎｔ、約１２ｎｔ〜
約２０ｎｔ、約１２ｎｔ〜約１９ｎｔ、約１９ｎｔ〜約２０ｎｔ、約１９ｎｔ〜約２５ｎ
ｔ、約１９ｎｔ〜約３０ｎｔ、約１９ｎｔ〜約３５ｎｔ、約１９ｎｔ〜約４０ｎｔ、約１
９ｎｔ〜約４５ｎｔ、約１９ｎｔ〜約５０ｎｔ、約１９ｎｔ〜約６０ｎｔ、約２０ｎｔ〜
約２５ｎｔ、約２０ｎｔ〜約３０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約３５ｎｔ、約２０ｎｔ〜約４０ｎ
ｔ、約２０ｎｔ〜約４５ｎｔ、約２０ｎｔ〜約５０ｎｔ、または約２０ｎｔ〜約６０ｎｔ
の長さを有し得る。標的ＤＮＡのヌクレオチド配列（標的配列）に対し相補的なＤＮＡ標
的化セグメントのヌクレオチド配列（ＤＮＡ標的化配列）は、少なくとも約１２ｎｔの長
さを有し得る。
いくつかの例において、標的ＤＮＡの標的配列に対し相補的なＤＮＡ標的化セグメント
のＤＮＡ標的化配列は、２０ヌクレオチド長である。いくつかの例において、標的ＤＮＡ
の標的配列に対し相補的なＤＮＡ標的化セグメントのＤＮＡ標的化配列は、１９ヌクレオ
チド長である。
ＤＮＡ標的化セグメントのＤＮＡ標的化配列および標的ＤＮＡの標的配列の間の相補性
パーセントは、少なくとも６０％（例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少な
くとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９
５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）であ
り得る。いくつかの例において、ＤＮＡ標的化セグメントのＤＮＡ標的化配列および標的
ＤＮＡの標的配列の間の相補性パーセントは、標的ＤＮＡの相補鎖の標的配列の７個の連
続する５’末端ヌクレオチドにわたって１００％である。いくつかの例において、ＤＮＡ
標的化セグメントのＤＮＡ標的化配列および標的ＤＮＡの標的配列の間の相補性パーセン
トは、約２０個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも６０％である。いくつかの例に
おいて、ＤＮＡ標的化セグメントのＤＮＡ標的化配列および標的ＤＮＡの標的配列の間の
相補性パーセントは、標的ＤＮＡの相補鎖の標的配列の１４個の連続する５’末端ヌクレ
オチドにわたって１００％であり、残りの配列にわたっては０％という低さである。その
ような場合、ＤＮＡ標的化配列は、１４ヌクレオチド長であるとみなすことができる（図
１２Ｄ〜Ｅを参照）。いくつかの例において、ＤＮＡ標的化セグメントのＤＮＡ標的化配
列および標的ＤＮＡの標的配列の間の相補性パーセントは、標的ＤＮＡの相補鎖の標的配
列の７個の連続する５’末端ヌクレオチドにわたって１００％であり、残りの配列にわた
っては０％という低さである。そのような場合、ＤＮＡ標的化配列は７ヌクレオチド長で
あるとみなすことができる。
ＤＮＡ標的化ＲＮＡのタンパク質結合セグメント
主題のＤＮＡ標的化ＲＮＡのタンパク質結合セグメントは、部位特異的修飾ポリペプチ
ドと相互作用する。主題のＤＮＡ標的化ＲＮＡは、結合したポリペプチドを上記のＤＮＡ
標的化セグメントを介して標的ＤＮＡ内の特定のヌクレオチド配列に導く。主題のＤＮＡ
標的化ＲＮＡのタンパク質結合セグメントは、互いに相補的な２本のヌクレオチド鎖を含
む。タンパク質結合セグメントの相補的ヌクレオチドは、ハイブリダイズして二本鎖ＲＮ
Ａ二本鎖（ｄｓＲＮＡ）を形成する（図１Ａおよび図１Ｂを参照）。
主題の二重分子ＤＮＡ標的化ＲＮＡは、２つの別々のＲＮＡ分子を含む。主題の二重分
子ＤＮＡ標的化ＲＮＡの２つの各ＲＮＡ分子は、それら２つのＲＮＡ分子の相補的なヌク
レオチドがハイブリダイズしてタンパク質結合セグメントの二本鎖ＲＮＡ二本鎖を形成す
るような、互いに相補的なヌクレオチド鎖を含む（図１Ａ）。
いくつかの実施形態において、活性化ＲＮＡの二本鎖形成セグメントは、配列番号４３
１〜５６２に記載の活性化ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）分子の１つ、またはその相補体に
対して、一連の少なくとも８個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも約６０％同一で
ある。例えば、活性化ＲＮＡの二本鎖形成セグメント（または活性化ＲＮＡの二本鎖形成
セグメントをコードするＤＮＡ）は、配列番号４３１〜５６２に記載のｔｒａｃｒＲＮＡ
配列の１つ、またはその相補体に対して、一連の少なくとも８個の連続ヌクレオチドにわ
たって、少なくとも約６０％同一、少なくとも約６５％同一、少なくとも約７０％同一、
少なくとも約７５％同一、少なくとも約８０％同一、少なくとも約８５％同一、少なくと
も約９０％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９８％同一、少なくとも約９９
％同一、または１００％同一である。
いくつかの実施形態において、標的化ＲＮＡの二本鎖形成セグメントは、配列番号５６
３〜６７９に記載の標的化ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）配列の１つ、またはその相補体に対して
、一連の少なくとも８個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも約６０％同一である。
例えば、標的化ＲＮＡの二本鎖形成セグメント（または標的化ＲＮＡの二本鎖形成セグメ
ントをコードするＤＮＡ）は、配列番号５６３〜６７９に記載のｃｒＲＮＡ配列の１つ、
またはその相補体に対して、一連の少なくとも８個の連続ヌクレオチドにわたって、少な
くとも約６５％同一、少なくとも約７０％同一、少なくとも約７５％同一、少なくとも約
８０％同一、少なくとも約８５％同一、少なくとも約９０％同一、少なくとも約９５％同
一、少なくとも約９８％同一、少なくとも約９９％同一、または１００％同一である。
二分子ＤＮＡ標的化ＲＮＡは、標的化ＲＮＡの活性化ＲＮＡとの調節された（すなわち
、条件的な）結合を可能にするように設計することができる。二分子ＤＮＡ標的化ＲＮＡ
は活性化ＲＮＡおよび標的化ＲＮＡの両方が機能的な複合体の形態でｄＣａｓ９と結合し
ない限り機能的にならないため、活性化ＲＮＡおよび標的化ＲＮＡの結合を誘導性とする
ことによって、二分子ＤＮＡ標的化ＲＮＡを、誘導性（例えば、薬剤誘導性）にすること
ができる。１つの非限定例として、ＲＮＡアプタマーを用いることで、活性化ＲＮＡの標
的化ＲＮＡとの結合を制御（すなわち、調節）することができる。従って、活性化ＲＮＡ
および／または標的化ＲＮＡは、ＲＮＡアプタマー配列を含み得る。
ＲＮＡアプタマーは当該技術分野において公知であり、一般的にリボスイッチの合成バ
ージョンである。用語「ＲＮＡアプタマー」および「リボスイッチ」は本明細書で同義的
に使用されて、合成核酸配列および天然核酸配列であって、それらが一部として含まれる
ＲＮＡ分子の構造（および、従って、特定の配列の利用能）の誘導性調節を与える合成核
酸配列および天然核酸配列の両方を包含する。ＲＮＡアプタマーは通常、特定の構造（例
えば、ヘアピン）に折り畳まれる配列を含み、その配列が特定の薬剤（例えば、小分子）
と特異的に結合する。薬剤の結合はＲＮＡの折り畳みにおける構造変化をもらたし、それ
によって、アプタマーが一部として含まれる核酸の特徴が変化される。非限定例として、
（ｉ）アプタマーを有する活性化ＲＮＡは、アプタマーが適切な薬剤と結合しない限り、
同種の（ｃｏｇｎａｔｅ）標的化ＲＮＡに結合することができず；（ｉｉ）アプタマーを
有する標的化ＲＮＡは、アプタマーが適切な薬剤と結合しない限り、同種の活性化ＲＮＡ
に結合することができず；（ｉｉｉ）異なる薬剤と結合する異なるアプタマーをそれぞれ
含む標的化ＲＮＡおよび活性化ＲＮＡは、両方の薬剤が存在しない限り、互いに結合する
ことができない。これらの例によって説明される通り、二分子ＤＮＡ標的化ＲＮＡは誘導
性となるように設計することができる。
アプタマーおよびリボスイッチの例は、例えば、Nakamura et al., Genes Cells. 2012
May;17(5):344-64; Vavalle et al., Future Cardiol. 2012 May;8(3):371-82; Citarta
n et al., Biosens Bioelectron. 2012 Apr 15;34(1):1-11;およびLiberman et al., Wil
ey Interdiscip Rev RNA. 2012 May-Jun;3(3):369-84に見出すことができ、これらは全て
それらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
二分子ＤＮＡ標的化ＲＮＡに含まれ得るヌクレオチド配列の非限定例としては、配列番
号４３１〜５６２に記載される配列のいずれか、またはその相補体が、ハイブリダイズし
てタンパク質結合セグメントを形成することができる、配列番号５６３〜６７９に記載さ
れるいずれかの配列、またはその相補体と対合して、挙げられる。
主題の単一分子ＤＮＡ標的化ＲＮＡは、互いに相補的であり、介在ヌクレオチド（「リ
ンカー」または「リンカーヌクレオチド」）によって共有結合的に連結しており、ハイブ
リダイズしてタンパク質結合セグメントの二本鎖ＲＮＡ二本鎖（ｄｓＲＮＡ二本鎖）を形
成し、それによってステムループ構造をもたらす、２本のヌクレオチド鎖（標的化ＲＮＡ
および活性化ＲＮＡ）を含む（図１Ｂ）。標的化ＲＮＡおよび活性化ＲＮＡは、標的化Ｒ
ＮＡの３’末端および活性化ＲＮＡの５’末端を介して共有結合的に連結し得る。あるい
は、標的化ＲＮＡおよび活性化ＲＮＡは、標的化ＲＮＡの５’末端および活性化ＲＮＡの
３’末端を介して共有結合的に連結し得る。
単一分子ＤＮＡ標的化ＲＮＡのリンカーは、約３ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチド
の長さを有し得る。例えば、リンカーは、約３ヌクレオチド（ｎｔ）〜約９０ｎｔ、約３
ヌクレオチド（ｎｔ）〜約８０ｎｔ、約３ヌクレオチド（ｎｔ）〜約７０ｎｔ、約３ヌク
レオチド（ｎｔ）〜約６０ｎｔ、約３ヌクレオチド（ｎｔ）〜約５０ｎｔ、約３ヌクレオ
チド（ｎｔ）〜約４０ｎｔ、約３ヌクレオチド（ｎｔ）〜約３０ｎｔ、約３ヌクレオチド
（ｎｔ）〜約２０ｎｔまたは約３ヌクレオチド（ｎｔ）〜約１０ｎｔの長さを有し得る。
例えば、リンカーは、約３ｎｔ〜約５ｎｔ、約５ｎｔ〜約１０ｎｔ、約１０ｎｔ〜約１５
ｎｔ、約１５ｎｔ〜約２０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約２５ｎｔ、約２５ｎｔ〜約３０ｎｔ、約
３０ｎｔ〜約３５ｎｔ、約３５ｎｔ〜約４０ｎｔ、約４０ｎｔ〜約５０ｎｔ、約５０ｎｔ
〜約６０ｎｔ、約６０ｎｔ〜約７０ｎｔ、約７０ｎｔ〜約８０ｎｔ、約８０ｎｔ〜約９０
ｎｔ、または約９０ｎｔ〜約１００ｎｔの長さを有し得る。いくつかの実施形態において
、単一分子ＤＮＡ標的化ＲＮＡのリンカーは４ｎｔである。
例示的な単一分子ＤＮＡ標的化ＲＮＡは、ハイブリダイズしてｄｓＲＮＡ二本鎖を形成
する２本の相補的なヌクレオチド鎖を含む。いくつかの実施形態において、単一分子ＤＮ
Ａ標的化ＲＮＡの２本の相補的なヌクレオチド鎖の一方（またはその配列をコードするＤ
ＮＡ）は、配列番号４３１〜５６２に記載される活性化ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）分子
のうちの１つ、またはその相補体に対して、一連の少なくとも８個の連続ヌクレオチドに
わたって少なくとも約６０％同一である。例えば、単一分子ＤＮＡ標的化ＲＮＡの２本の
相補的なヌクレオチド鎖の一方（またはその配列をコードするＤＮＡ）は、配列番号４３
１〜５６２に記載されるｔｒａｃｒＲＮＡ配列のうちの１つ、またはその相補体に対して
、一連の少なくとも８個の連続ヌクレオチドにわたって、少なくとも約６５％同一、少な
くとも約７０％同一、少なくとも約７５％同一、少なくとも約８０％同一、少なくとも約
８５％同一、少なくとも約９０％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９８％同
一、少なくとも約９９％同一または１００％同一である。
いくつかの実施形態において、単一分子ＤＮＡ標的化ＲＮＡの２本の相補的なヌクレオ
チド鎖の一方（またはその配列をコードするＤＮＡ）は、配列番号５６３〜６７９に記載
される標的化ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）配列のうちの１つ、またはその相補体に対して、一連
の少なくとも８個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも約６０％同一である。例えば
、単一分子ＤＮＡ標的化ＲＮＡの２本の相補的なヌクレオチド鎖の一方（またはその配列
をコードするＤＮＡ）は、配列番号５６３〜６７９に記載されるｃｒＲＮＡ配列のうちの
１つ、またはその相補体に対して、一連の少なくとも８個の連続ヌクレオチドにわたって
、少なくとも約６５％同一、少なくとも約７０％同一、少なくとも約７５％同一、少なく
とも約８０％同一、少なくとも約８５％同一、少なくとも約９０％同一、少なくとも約９
５％同一、少なくとも約９８％同一、少なくとも約９９％同一または１００％同一である
。
ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの適切な自然発生的な同種対は、適切な同種対を決
定する場合に、種の名前および塩基対形成（タンパク質結合ドメインのｄｓＲＮＡ二本鎖
のための）を考慮することにより、配列番号４３１〜６７９について通常の方法によって
決定することができる（非限定例として図８を参照）。
主題の単一分子ＤＮＡ標的化ＲＮＡおよび主題の二重分子ＤＮＡ標的化ＲＮＡについて
、図５７は、自然発生的なｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡとほとんど共通していない
（およそ５０％の同一性）人工配列であっても、ＤＮＡ標的化ＲＮＡのタンパク質結合ド
メインの構造が保存されていさえすれば、Ｃａｓ９と一緒に機能して標的ＤＮＡを切断す
ることができることを示す。従って、ＤＮＡ標的化ＲＮＡの自然発生的なタンパク質結合
ドメインのＲＮＡ折り畳み構造が、人工タンパク質結合ドメイン（二分子または単一分子
バージョンのいずれか）を設計するために、考慮され得る。非限定例として、図５７の機
能的人工ＤＮＡ標的化ＲＮＡは、自然発生的なＤＮＡ標的のタンパク質結合セグメントの
構造に基づいて設計された（例えば、ＲＮＡ二本鎖に沿った同じ数の塩基対を含み、自然
発生的なＲＮＡ内に存在するものと同じ「バルジ（ｂｕｌｄｇｅ）」領域を含む）。構造
は、当業者によって、いかなる種からもいかなる自然発生的なｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲ
ＮＡ対について容易に生み出すことができるため（種々様々な種由来のｃｒＲＮＡ配列お
よびｔｒａｃｒＲＮＡ配列については配列番号４３１〜６７９を参照）、人工的ＤＮＡ標
的化ＲＮＡは、所与の種に由来するＣａｓ９（または関連Ｃａｓ９、図３２Ａを参照）を
用いた場合その種の天然構造を模倣するように設計することができる。（図２４Ｄおよび
実施例１における関連の詳細を参照）。従って、適切なＤＮＡ標的化ＲＮＡは、自然発生
的なＤＮＡ標的化ＲＮＡのタンパク質結合ドメインの構造を模倣するように設計されたタ
ンパク質結合ドメインを含む、人工的に設計されたＲＮＡ（非自然発生的な）であっても
よい。（配列番号４３１〜６７９を参照、適切な同種対を決定する場合は種の名称を考慮
）。
タンパク質結合セグメントは、約１０ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチドの長さを有
し得る。例えば、タンパク質結合セグメントは、約１５ヌクレオチド（ｎｔ）〜約８０ｎ
ｔ、約１５ｎｔ〜約５０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約４０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約３０ｎｔまたは
約１５ｎｔ〜約２５ｎｔの長さを有し得る。
また、主題の単一分子ＤＮＡ標的化ＲＮＡおよび主題の二重分子ＤＮＡ標的化ＲＮＡに
関して、タンパク質結合セグメントのｄｓＲＮＡ二本鎖は、約６塩基対（ｂｐ）〜約５０
ｂｐの長さを有し得る。例えば、タンパク質結合セグメントのｄｓＲＮＡ二本鎖は、約６
ｂｐ〜約４０ｂｐ、約６ｂｐ〜約３０ｂｐ、約６ｂｐ〜約２５ｂｐ、約６ｂｐ〜約２０ｂ
ｐ、約６ｂｐ〜約１５ｂｐ、約８ｂｐ〜約４０ｂｐ、約８ｂｐ〜約３０ｂｐ、約８ｂｐ〜
約２５ｂｐ、約８ｂｐ〜約２０ｂｐまたは約８ｂｐ〜約１５ｂｐの長さを有し得る。例え
ば、タンパク質結合セグメントのｄｓＲＮＡ二本鎖は、約８ｂｐ〜約１０ｂｐ、約１０ｂ
ｐ〜約１５ｂｐ、約１５ｂｐ〜約１８ｂｐ、約１８ｂｐ〜約２０ｂｐ、約２０ｂｐ〜約２
５ｂｐ、約２５ｂｐ〜約３０ｂｐ、約３０ｂｐ〜約３５ｂｐ、約３５ｂｐ〜約４０ｂｐ、
または約４０ｂｐ〜約５０ｂｐの長さを有し得る。いくつかの実施形態において、タンパ
ク質結合セグメントのｄｓＲＮＡ二本鎖は、３６塩基対の長さを有する。ハイブリダイズ
してタンパク質結合セグメントのｄｓＲＮＡ二本鎖を形成するヌクレオチド配列間の相補
性パーセントは少なくとも約６０％であり得る。例えば、ハイブリダイズしてタンパク質
結合セグメントのｄｓＲＮＡ二本鎖を形成するヌクレオチド配列間の相補性パーセントは
、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％
、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％
、または少なくとも約９９％であり得る。いくつかの例において、ハイブリダイズしてタ
ンパク質結合セグメントのｄｓＲＮＡ二本鎖を形成するヌクレオチド配列間の相補性パー
セントは１００％である。
部位特異的修飾ポリペプチド
主題のＤＮＡ標的化ＲＮＡおよび主題の部位特異的修飾ポリペプチドは複合体を形成す
る。ＤＮＡ標的化ＲＮＡは、（上記で言及したように）標的ＤＮＡの配列に対し相補的な
ヌクレオチド配列を含むことにより複合体に標的特異性を与える。複合体の部位特異的修
飾ポリペプチドは部位特異的活性を与える。言い換えれば、部位特異的修飾ポリペプチド
は、それがＤＮＡ標的化ＲＮＡの少なくともタンパク質結合セグメントと結合することに
より、ＤＮＡ配列（例えば、染色体配列または染色体外配列、例えば、エピソーム配列、
ミニサークル配列、ミトコンドリア配列、葉緑体配列等）に誘導される（上記）。
主題の部位特異的修飾ポリペプチドは、標的ＤＮＡを修飾し（例えば、標的ＤＮＡの切
断またはメチル化）、および／または標的ＤＮＡと結合したポリペプチドを修飾する（例
えば、ヒストン尾部のメチル化またはアセチル化）。部位特異的修飾ポリペプチドは、本
明細書において「部位特異的ポリペプチド」または「ＲＮＡ結合部位特異的修飾ポリペプ
チド」とも称される。
いくつかの例において、部位特異的修飾ポリペプチドは、自然発生的な修飾ポリペプチ
ドである。他の場合においては、部位特異的修飾ポリペプチドは自然発生的なポリペプチ
ドではない（例えば、下記のキメラポリペプチドまたは改変（例えば、変異、欠失、挿入
）された自然発生的ポリペプチド）。
例示的な自然発生的な部位特異的修飾ポリペプチドは、自然発生的なＣａｓ９／Ｃｓｎ
１エンドヌクレアーゼの非限定的且つ非網羅的な列挙として配列番号１〜２５５に記載さ
れる。本明細書に記載されるこれらの自然発生的なポリペプチドは、ＤＮＡ標的化ＲＮＡ
と結合し、それによって標的ＤＮＡ内の特定の配列に向けられ、標的ＤＮＡを切断して二
重鎖切断を起こす。主題の部位特異的修飾ポリペプチドは、２つの部分、ＲＮＡ結合部位
および活性部位を含む。いくつかの実施形態において、主題の部位特異的修飾ポリペプチ
ドは、（ｉ）標的ＤＮＡ内の配列に対し相補的なヌクレオチド配列を含むＤＮＡ標的化Ｒ
ＮＡと相互作用するＲＮＡ結合部位；および（ｉｉ）部位特異的酵素活性を示す活性部位
（例えば、ＤＮＡメチル化活性、ＤＮＡ切断活性、ヒストンアセチル化活性、ヒストンメ
チル化活性等）を含み、酵素活性の部位はＤＮＡ標的化ＲＮＡによって決定される。
他の実施形態では、主題の部位特異的修飾ポリペプチドは、（ｉ）標的ＤＮＡ内の配列
に対し相補的なヌクレオチド配列を含むＤＮＡ標的化ＲＮＡと相互作用するＲＮＡ結合部
位；および（ｉｉ）標的ＤＮＡ内の転写を調節する活性部位（例えば、転写を増加または
減少させるための）を含み、標的ＤＮＡ内の調節される転写の部位はＤＮＡ標的化ＲＮＡ
によって決定される。
いくつかの例において、主題の部位特異的修飾ポリペプチドは、標的ＤＮＡを修飾する
酵素活性を有する（例えば、ヌクレアーゼ活性、メチルトランスフェラーゼ活性、脱メチ
ル化酵素活性、ＤＮＡ修復活性、ＤＮＡ損傷活性、脱アミノ化活性、ジスムターゼ活性、
アルキル化活性、脱プリン活性、酸化活性、ピリミジンダイマー形成活性、インテグラー
ゼ活性、トランスポサーゼ活性、リコンビナーゼ活性、ポリメラーゼ活性、リガーゼ活性
、ヘリカーゼ活性、光回復酵素活性またはグリコシラーゼ活性）。
他の場合においては、主題の部位特異的修飾ポリペプチドは、標的ＤＮＡと結合したポ
リペプチド（例えば、ヒストン）を修飾する酵素活性を有する（例えば、メチルトランス
フェラーゼ活性、脱メチル化酵素活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、脱アセチル化
酵素活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、ユビキチンリガーゼ活性、脱ユビキチン
化活性、アデニル化活性、脱アデニル化活性、ＳＵＭＯ化活性、脱ＳＵＭＯ化活性、リボ
シル化活性、脱リボシル化活性、ミリストイル化活性または脱ミリストイル化活性）。
例示的な部位特異的修飾ポリペプチド
いくつかの例において、部位特異的修飾ポリペプチドは、図３に示されるＣａｓ９／Ｃ
ｓｎ１アミノ酸配列のアミノ酸７〜１６６または７３１〜１００３に対して、または配列
番号１〜２５６および７９５〜１３４６として記載されるアミノ酸配列のうちのいずれか
における対応部分に対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８
５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または１００％
のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
核酸修飾
いくつかの実施形態において、主題の核酸（例えば、ＤＮＡ標的化ＲＮＡ）は、新規の
または増強された特徴（例えば、向上された安定性）を有する核酸を与えるための、一つ
または複数の修飾（例えば、塩基修飾、骨格修飾等）を含む。当該技術分野で知られてい
るように、ヌクレオシドは、塩基−糖の組み合わせである。ヌクレオシドの塩基部分は通
常、ヘテロ環式塩基である。そのようなヘテロ環式塩基の２つの最も一般的なクラスは、
プリンおよびピリミジンである。ヌクレオチドは、ヌクレオシドの糖部分に共有結合的に
連結されたリン酸基をさらに含むヌクレオシドである。ペントフラノシル糖を含むそれら
のヌクレオシドにおいて、リン酸基は、糖の２’、３’、または５’ヒドロキシル部分に
連結している可能性がある。オリゴヌクレオチド形成において、リン酸基は隣接するヌク
レオシドを互いに共有結合的に連結させて、直鎖状の高分子化合物を形成する。次に、こ
の直鎖状高分子化合物のそれぞれの末端がさらに連結して環状化合物を形成し得るが、直
鎖状化合物が一般的には適切である。さらに、直鎖状化合物は内部のヌクレオチド塩基相
補性を有する場合があり、従って完全または部分的に二本鎖の化合物を形成するように折
り畳まれる場合がある。オリゴヌクレオチド内で、リン酸基は、オリゴヌクレオチドのヌ
クレオシド間骨格を形成するものと一般的に称される。ＲＮＡおよびＤＮＡの通常の連結
または骨格は、３’から５’のホスホジエステル結合である。
修飾された骨格および修飾されたヌクレオシド間連結
修飾を含む適切な核酸の例としては、修飾された骨格または非天然ヌクレオシド間連結
を含有する核酸が挙げられる。修飾された骨格を有する核酸には、骨格内にリン原子を保
持している核酸および骨格内にリン原子を有していない核酸が含まれる。
内部にリン原子を含有する適切な修飾されたオリゴヌクレオチド骨格としては、例えば
、通常の３’−５’連結を有する、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホ
スホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチル
および他のアルキルのホスホン酸エステル、例えば、３’−アルキレンホスホネート、５
’−アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネート、ホスフィネート、ホスホルアミ
ダート、例えば、３’−アミノホスホルアミダートおよびアミノアルキルホスホルアミダ
ート、ホスホロジアミダート、チオノホスホルアミダート、チオノアルキルホスホネート
、チオノアルキルホスホトリエステル、セレノホスフェートおよびボラノホスフェート、
これらの２’−５’連結類似体、並びに一つまたは複数のヌクレオチド間連結が３’から
３’、５’から５’または２’から２’連結である逆の極性を有するものが挙げられる。
逆の極性を有する適切なオリゴヌクレオチドは、３’末端ヌクレオチド間連結における単
一の３’から３’の連結、すなわち、単一の逆のヌクレオシド残基を含み、当該ヌクレオ
シド残基は脱塩基性（核酸塩基が失われているか、その位置にヒドロキシル基を有する）
であってもよい。種々の塩（例えば、カリウムまたはナトリウム等）、混合塩および遊離
酸形態も含まれる。
いくつかの実施形態において、主題の核酸は、一つまたは複数のホスホロチオエートお
よび／またはヘテロ原子ヌクレオシド間連結、具体的には、−ＣＨ２−ＮＨ−Ｏ−ＣＨ２
−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｏ−ＣＨ２−（メチレン（メチルイミノ）またはＭＭＩ骨
格として知られている）、−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ
３）−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−および−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２−（ここで、
元のリン酸ジエステルヌクレオチド間連結は−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−ＣＨ２−と
して表される）を含む。ＭＭＩ型ヌクレオシド間連結は、上記で参照した米国特許第５，
４８９，６７７号に開示される。適切なアミドヌクレオシド間連結は、米国特許第５，６
０２，２４０号に開示される。
例えば、米国特許第５，０３４，５０６号に記載されるモルホリノ骨格構造を有する核
酸も適切である。例えば、いくつかの実施形態において、主題の核酸は、リボース環の位
置に６員モルホリノ環を含む。これらの実施形態のうちのいくつかにおいて、ホスホロジ
アミダートまたは他の非リン酸ジエステルヌクレオシド間連結は、ホスホジエステル結合
を置換する。
内部にリン原子を含まない適切な修飾ポリヌクレオチド骨格は、短鎖アルキルもしくは
シクロアルキルヌクレオシド間連結、混合ヘテロ原子およびアルキルもしくはシクロアル
キルヌクレオシド間連結、または一つもしくは複数の短鎖ヘテロ原子もしくはヘテロ環式
ヌクレオシド間連結によって形成された骨格を有する。これらには、モルホリノ連結（ヌ
クレオシドの糖部分から部分的に形成）；シロキサン骨格；スルフィド、スルホキシドお
よびスルホン骨格；ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセ
チルおよびチオホルムアセチル骨格；リボアセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファメ
ート骨格；メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ骨格；スルホネートおよびスルホン
アミド骨格；アミド骨格；並びに混合されたＮ、Ｏ、ＳおよびＣＨ２成分部分を有する他
の骨格を有するものが含まれる。
模倣体
主題の核酸は核酸模倣体であり得る。用語「模倣体」には、ポリヌクレオチドに適用さ
れる場合、フラノース環のみまたはフラノース環およびヌクレオチド間連結の両方が非フ
ラノース基で置換されているポリヌクレオチドが含まれることが意図され、フラノース環
のみの置換も当該技術分野においては糖代替物であるとされる。ヘテロ環式塩基部分また
は修飾されたヘテロ環式塩基部分は、適切な標的核酸とのハイブリダイゼーションのため
に維持される。１つのそのような核酸、優れたハイブリダイゼーション特性を有すること
が示されているポリヌクレオチド模倣体は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と称される。ＰＮＡ
において、ポリヌクレオチドの糖骨格は、アミド含有骨格、具体的にはアミノエチルグリ
シン骨格で置換されている。ヌクレオチドは保持されており、骨格のアミド部分のアザ窒
素原子に直接または間接的に結合している。
優れたハイブリダイゼーション特性を有することが報告されている１つのポリヌクレオ
チド模倣体はペプチド核酸（ＰＮＡ）である。ＰＮＡ化合物内の骨格は、ＰＮＡにアミド
含有骨格を与える、２つ以上の連結されたアミノエチルグリシン単位である。ヘテロ環式
塩基部分は、骨格のアミド部分のアザ窒素原子に直接または間接的に結合している。ＰＮ
Ａ化合物の調製を記載している代表的な米国特許としては、限定はされないが：米国特許
第５，５３９，０８２号；同第５，７１４，３３１号；および同第５，７１９，２６２号
が挙げられる。
研究されているポリヌクレオチド模倣体の別のクラスは、モルホリノ環に結合したヘテ
ロ環式塩基を有する連結したモルホリノ単位（モルホリノ核酸）に基づいている。モルホ
リノ核酸内のモルホリノ単量体単位を連結するいくつかの連結基が報告されている。連結
基の１つのクラスが、非イオン性オリゴマー化合物を得るために選択されている。非イオ
ン性モルホリノ系オリゴマー化合物は、細胞タンパク質との望ましくない相互作用を有す
る可能性が小さい。モルホリノ系ポリヌクレオチドは、細胞タンパク質との望ましくない
相互作用を形成する可能性が小さいオリゴヌクレオチドの非イオン性模倣体である（Dwai
ne A. Braasch and David R. Corey, Biochemistry, 2002, 41(14), 4503-4510）。モル
ホリノ系ポリヌクレオチドは、米国特許第５，０３４，５０６号で開示される。ポリヌク
レオチドのモルホリノクラス内で、単量体サブユニットを連結する種々の異なる連結基を
有する種々の化合物が調製されている。
ポリヌクレオチド模倣体のさらなるクラスは、シクロヘキセニル核酸（ＣｅＮＡ）と称
される。ＤＮＡ／ＲＮＡ分子内に通常存在するフラノース環がシクロヘキセニル環と置換
されている。ＣｅＮＡ ＤＭＴ保護ホスホラミダイト単量体が調製され、古典的なホスホ
ラミダイト化学作用に従うオリゴマー化合物合成に使用されている。完全に修飾されたＣ
ｅＮＡオリゴマー化合物およびＣｅＮＡで修飾された特定の部分を有するオリゴヌクレオ
チドが調製され研究されている（Wang et al., J. Am. Chem. Soc., 2000, 122, 8595-86
02を参照）。一般的に、ＤＮＡ鎖へのＣｅＮＡ単量体の組込みは、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブ
リッドのその安定性を増加させる。ＣｅＮＡオリゴアデニル酸は、元の複合体に類似した
安定性を有する、ＲＮＡおよびＤＮＡ相補体との複合体を形成した。天然の核酸構造にＣ
ｅＮＡ構造を組み込む研究は、容易な高次構造適合を開始するようＮＭＲおよび円二色性
によって示された。
さらなる修飾には、２’−ヒドロキシル基が糖環の４’炭素原子に連結されることによ
り２’−Ｃ，４’−Ｃ−オキシメチレン結合を形成して二環式糖部分を形成しているＬｏ
ｃｋｅｄ核酸（ＬＮＡ）が含まれる。該連結は、ｎが１または２である、２’酸素原子お
よび４’炭素原子を架橋する基であるメチレン（−ＣＨ２−）であり得る（Singh et al.
, Chem. Commun., 1998, 4, 455-456）。ＬＮＡおよびＬＮＡ類似体は、相補ＤＮＡおよ
びＲＮＡとの非常に高い二本鎖熱安定性（Ｔｍ＝＋３〜＋１０℃）、３’−エキソヌクレ
アーゼ分解に対する安定性および良好な溶解性特性を示す。ＬＮＡを含有する強力且つ無
毒性のアンチセンスオリゴヌクレオチドが記載されている（Wahlestedt et al., Proc. N
atl. Acad. Sci. U.S.A., 2000, 97, 5633-5638）。
ＬＮＡ単量体アデニン、シトシン、グアニン、５−メチル−シトシン、チミンおよびウ
ラシルの合成および調製は、それらのオリゴマー化、並びに核酸認識特性と共に記載され
ている（Koshkin et al., Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630）。ＬＮＡおよびその調製
は、国際公開第９８／３９３５２号および同第９９／１４２２６号にも記載される。
修飾された糖部分
主題の核酸は、一つまたは複数の置換された糖部分も含み得る。適切なポリヌクレオチ
ドは、アルキル、アルケニルおよびアルキニルが置換または非置換のＣ１〜Ｃ１０アルキ
ルまたはＣ２〜Ｃ１０アルケニルおよびアルキニルであってもよい、ＯＨ；Ｆ；Ｏ−、Ｓ
−、もしくはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルケニル；Ｏ−、Ｓ−もしくは
Ｎ−アルキニル；またはＯ−アルキル−Ｏ−アルキルから選択される糖置換基を含む。ｎ
およびｍが１〜約１０であるＯ（（ＣＨ２）ｎＯ）ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、
Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２、およびＯ（Ｃ
Ｈ２）ｎＯＮ（（ＣＨ２）ｎＣＨ３）２は、特に適切である。他の適切なポリヌクレオチ
ドは、Ｃ１〜Ｃ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカ
リル、アラルキル、Ｏ−アルカリルもしくはＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、
Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、
Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ
、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、干渉物質、オリゴヌ
クレオチドの薬物動態特性を向上させるための基、またはオリゴヌクレオチドの薬力学的
特性を向上させるための基、および類似の特性を有する他の置換基から選択される糖置換
基を含む。適切な修飾には、２’−メトキシエトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３
、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）または２’−ＭＯＥとしても知られている）（Mart
in et al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504）、すなわち、アルコキシアルコキシ
基が含まれる。さらなる適切な修飾には、下記の実施例に記載される、２’−ＤＭＡＯＥ
としても知られている、２’−ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわち、Ｏ（ＣＨ２）
２ＯＮ（ＣＨ３）２基、および２’−ジメチルアミノエトキシエトキシ（当該技術分野に
おいて２’−Ｏ−ジメチル−アミノ−エトキシ−エチルまたは２’−ＤＭＡＥＯＥとして
も知られている）、すなわち、２’−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）２が含まれ
る。
他の適切な糖置換基には、メトキシ（−Ｏ−ＣＨ３）、アミノプロポキシ（−−ＯＣＨ
２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）、アリル（−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２）、−Ｏ−アリル（−−Ｏ−
−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２）およびフルオロ（Ｆ）が含まれる。２’−糖置換基は、アラビ
ノ（ａｒａｂｉｎｏ）（上）位置であってもリボ（ｒｉｂｏ）（下）位置であってもよい
。適切な２’−アラビノ修飾は２’−Ｆである。類似の修飾は、オリゴマー化合物上の他
の位置、特に３’末端ヌクレオシド上または２’−５’連結オリゴヌクレオチド内の糖の
３’位置、および５’末端ヌクレオチドの５’位置にも起こり得る。オリゴマー化合物は
、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部分等の糖模倣体も有し得る。
塩基の修飾および置換
主題の核酸は、核酸塩基（しばしば、当該技術分野において単に「塩基」と称される）
の修飾または置換を含んでいてもよい。本明細書で使用される場合、「無修飾の」または
「天然の」核酸塩基には、プリン塩基のアデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）、並びにピ
リミジン塩基のチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）が含まれる。修飾さ
れた核酸塩基には、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒロドキシメチルシトシ
ン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、６−メチル並びにアデニンおよ
びグアニンの他のアルキル誘導体、２−プロピル並びにアデニンおよびグアニンの他のア
ルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミンおよび２−チオシトシン、５−ハロウ
ラシルおよびシトシン、５−プロピニル（−Ｃ＝Ｃ−ＣＨ３）ウラシルおよびシトシン並
びにピリミジン塩基の他のアルキニル誘導体、６−アゾウラシル、シトシンおよびチミン
、５−ウラシル（偽ウラシル（ｐｓｅｕｄｏｕｒａｃｉｌ）、４−チオウラシル、８−ハ
ロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシル並びに他の８−置
換アデニンおよびグアニン、５−ハロ、特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチル並びに
他の５−置換ウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン、
２−Ｆ−アデニン、２−アミノ−アデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、
７−デアザグアニンおよび７−デアザアデニンおよび３−デアザグアニンおよび３−デア
ザアデニン等の、他の合成核酸塩基および天然核酸塩基が含まれる。さらなる修飾された
核酸塩基には、フェノキサジンシチジン（１Ｈ−ピリミド（５，４−ｂ）（１，４）ベン
ゾキサジン−２（３Ｈ）−オン）、フェノチアジンシチジン（１Ｈ−ピリミド（５，４−
ｂ）（１，４）ベンゾチアジン−２（３Ｈ）−オン）、Ｇ形クランプ、例えば、置換フェ
ノキサジンシチジン（例えば、９−（２−アミノエトキシ）−Ｈ−ピリミド（５，４−（
ｂ）（１，４）ベンゾキサジン−２（３Ｈ）−オン）、カルバゾールシチジン（２Ｈ−ピ
リミド（４，５−ｂ）インドール−２−オン）、ピリドインドールシチジン（Ｈ−ピリド
（３’，２’：４，５）ピロロ（２，３−ｄ）ピリミジン−２−オン）等の三環式ピリミ
ジンが含まれる。
ヘテロ環式塩基部分は、プリンまたはピリミジン塩基が他の複素環、例えば、７−デア
ザ−アデニン、７−デアザグアノシン、２−アミノピリジンおよび２−ピリドンで置換さ
れているものを含んでいてもよい。さらなる核酸塩基には、米国特許第３，６８７，８０
８号に記載される核酸塩基、The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engine
ering, pages 858-859, Kroschwitz, J. I., ed. John Wiley & Sons, 1990に開示される
核酸塩基、Englisch et al., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 6
13により開示される核酸塩基、およびSanghvi, Y. S., Chapter 15, Antisense Research
and Applications, pages 289-302, Crooke, S. T. and Lebleu, B., ed., CRC Press,
1993に開示される核酸塩基が含まれる。ある特定のこれらの核酸塩基は、オリゴマー化合
物の結合親和性を増加させるのに有用である。これらには、５−置換ピリミジン、６−ア
ザピリミジン並びにＮ−２、Ｎ−６およびＯ−６置換プリン、例えば、２−アミノプロピ
ルアデニン、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシンが含まれる。５−メ
チルシトシン置換は、核酸の二本鎖安定性を０．６〜１．２℃増加させ（Sanghvi et al.
, eds., Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 27
6-278）、例えば、２’−Ｏ−メトキシエチル糖修飾を組み合わせる場合に、適切な塩基
置換であることが示されている。
結合体
主題の核酸の別の可能な修飾には、オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布または細胞取
り込みを増強する、ポリヌクレオチドへの一つまたは複数の部分または結合体の化学的連
結が含まれる。これらの部分または結合体は、一級または二級ヒドロキシル基等の官能基
に共有結合した結合基が含まれる。結合基としては、限定はされないが、干渉物質、レポ
ーター分子、ポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール、ポリエーテル、オリゴ
マーの薬力学的特性を増強する基、およびオリゴマーの薬物動態特性を増強する基が挙げ
られる。適切な結合基としては、限定はされないが、コレステロール、脂質、リン脂質、
ビオチン、フェナジン、葉酸、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオ
レセイン、ローダミン、クマリン、および色素が挙げられる。薬力学的特性を増強する基
には、取り込みを増強する基、分解への耐性を増強する基、および／または標的核酸との
配列特異的なハイブリダイゼーションを強化する基が含まれる。薬物動態特性を増強する
基には、主題の核酸の取り込み、分布、代謝または排出を向上させる基が含まれる。
結合部分としては、限定はされないが、コレステロール部分等の脂質部分（Letsinger
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86, 6553-6556）、コール酸（Manoharan e
t al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1994, 4, 1053-1060）、チオエーテル、例えば、ヘキ
シル−Ｓ−トリチルチオール（Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660, 3
06-309; Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3, 2765-2770）、チオコ
レステロール（Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20, 533-538）、脂肪族鎖
、例えば、ドデカンジオールもしくはウンデシル残基（Saison-Behmoaras et al., EMBO
J., 1991, 10, 1111-1118; Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259, 327-330; Svinarc
huk et al., Biochimie, 1993, 75, 49-54）、リン脂質、例えば、ジ−ヘキサデシル−ｒ
ａｃ−グリセロールもしくはトリエチルアンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒ
ａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホン酸（Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 3
6, 3651-3654; Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18, 3777-3783）、ポリアミンも
しくはポリエチレングリコール鎖（Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 199
5, 14, 969-973）、またはアダマンタン酢酸（Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1
995, 36, 3651-3654）、パルミチル部分（Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 199
5, 1264, 229-237）、またはオクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノ−カルボニル−
オキシコレステロール部分（Crooke et al., J. Pharmacol. Exp.Ther., 1996, 277, 923
-937）が挙げられる。
結合体は「タンパク質形質導入ドメイン」またはＰＴＤ（ＣＰＰ：細胞浸透性ペプチド
としても知られている）を含んでいてもよく、これは、脂質二重層、ミセル、細胞膜、細
胞小器官膜、またはベシクル膜の横断を促進するポリペプチド、ポリヌクレオチド、炭水
化物、または有機もしくは無機化合物を指し得る。低分子極性分子から巨大な高分子およ
び／またはナノ粒子まで及び得る別の分子に結合したＰＴＤは、その分子が膜を横切るこ
と、例えば細胞外間隙から細胞内空間、または細胞基質から細胞小器官内への移行を促進
する。いくつかの実施形態において、ＰＴＤは、外来性ポリペプチド（例えば、部位特異
的修飾ポリペプチド）のアミノ末端に共有結合的に連結される。いくつかの実施形態にお
いて、ＰＴＤは、外来性ポリペプチド（例えば、部位特異的修飾ポリペプチド）のカルボ
キシル末端に共有結合的に連結される。いくつかの実施形態において、ＰＴＤは、核酸（
例えば、ＤＮＡ標的化ＲＮＡ、ＤＮＡ標的化ＲＮＡをコードするポリヌクレオチド、部位
特異的修飾ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド等）に共有結合的に連結される。
ＰＴＤの例としては、限定はされないが、最小ウンデカペプチドタンパク質形質導入ドメ
イン（ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号２６４）を含むＨＩＶ−１ ＴＡＴの残基４７
〜５７に対応）；細胞への侵入を方向付けるのに充分ないくつかのアルギニン（例えば、
３、４、５、６、７、８、９、１０、または１０〜５０個のアルギニン）を含むポリアル
ギニン配列；ＶＰ２２ドメイン（Zender et al. (2002) Cancer Gene Ther. 9(6):489-96
）；ドロソフィラ・アンテナペディア（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉ
ａ）タンパク質形質導入ドメイン（Noguchi et al. (2003) Diabetes 52(7):1732-1737）
；切断型ヒトカルシトニンペプチド（Trehin et al. (2004) Pharm. Research 21:1248-1
256）；ポリリジン（Wender et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:13003-1300
8）；ＲＲＱＲＲＴＳＫＬＭＫＲ（配列番号２６５）；トランスポータン（Ｔｒａｎｓｐ
ｏｒｔａｎ）ＧＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ（配列番号２６
６）；ＫＡＬＡＷＥＡＫＬＡＫＡＬＡＫＡＬＡＫＨＬＡＫＡＬＡＫＡＬＫＣＥＡ（配列番
号２６７）；およびＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号２６８）が挙げられる
。ＰＴＤの例としては、限定はされないが、ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号２６４）
、ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号２６９）；３個のアルギニン残基〜５０個のアルギニン
残基のアルギニンホモポリマーが挙げられ；ＰＴＤドメインアミノ酸配列の例としては、
、限定はされないが、以下：ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号２６４）；ＲＫＫＲＲＱ
ＲＲ（配列番号２７０）；ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡ（配列番号２７１）；ＴＨＲＬＰＲＲ
ＲＲＲＲ（配列番号２７２）；およびＧＧＲＲＡＲＲＲＲＲＲ（配列番号２７３）のいず
れかが挙げられる。いくつかの実施形態において、ＰＴＤは、活性化可能ＣＰＰ（ＡＣＰ
Ｐ）である（Aguilera et al. (2009) Integr Biol (Camb) June; 1(5-6): 371-381）。
ＡＣＰＰは、切断可能なリンカーを介して適合するポリアニオン（例えば、Ｇｌｕ９また
は「Ｅ９」）に連結されたポリカチオンＣＰＰ（例えば、Ａｒｇ９または「Ｒ９」）を含
み、これは、実効電荷をほぼゼロに減少させることで、細胞への接着および取り込みを阻
害する。リンカーを切断すると、ポリアニオンが放出され、ポリアルギニンおよびその固
有の接着性が局所的に暴露され、それによってＡＣＰＰの膜横断が「活性化」される。
例示的なＤＮＡ標的化ＲＮＡ
いくつかの実施形態において、適切なＤＮＡ標的化ＲＮＡは、２つの別々のＲＮＡポリ
ヌクレオチド分子を含む。２つの別々のＲＮＡポリヌクレオチド分子の１つ目（活性化Ｒ
ＮＡ）は、配列番号４３１〜５６２に記載されるヌクレオチド配列のうちのいずれか一つ
、またはその相補体に対して、一連の少なくとも８個の連続ヌクレオチドにわたって、少
なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少
なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少
なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のヌクレオチド配列同一性を有
するヌクレオチド配列を含む。２つの別々のＲＮＡポリヌクレオチド分子の２つ目（標的
化ＲＮＡ）は、配列番号５６３〜６７９に記載されるヌクレオチド配列のうちのいずれか
一つ、またはその相補体に対して、一連の少なくとも８個の連続ヌクレオチドにわたって
、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％
、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％
、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のヌクレオチド配列同一性
を有するヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態において、適切なＤＮＡ標的化ＲＮＡは、単一のＲＮＡポリヌクレ
オチドであり、配列番号４３１〜５６２に記載されるヌクレオチド配列のうちのいずれか
１つに対して、一連の少なくとも８個の連続ヌクレオチドにわたって、少なくとも約６０
％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０
％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８
％、少なくとも約９９％、または１００％のヌクレオチド配列同一性を有する第一ヌクレ
オチド配列、および配列番号４６３〜６７９に記載されるヌクレオチド配列のいずれか１
つに対して、一連の少なくとも８個の連続ヌクレオチドにわたって、少なくとも約６０％
、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％
、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％
、少なくとも約９９％、または１００％のヌクレオチド配列同一性を有する第二ヌクレオ
チド配列を含む。
いくつかの実施形態において、ＤＮＡ標的化ＲＮＡは二重分子ＤＮＡ標的化ＲＮＡであ
り、標的化ＲＮＡは、標的ＤＮＡに対し相補的なヌクレオチド鎖にその５’末端で連結さ
れた配列５’ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡ−３’（配列番号６７９）を含む。いくつかの実
施形態において、ＤＮＡ標的化ＲＮＡは二重分子ＤＮＡ標的化ＲＮＡであり、活性化ＲＮ
Ａは、配列５’ＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧ−３’（配列番
号／／）を含む。
いくつかの実施形態において、ＤＮＡ標的化ＲＮＡは単一分子ＤＮＡ標的化ＲＮＡであ
り、標的ＤＮＡに対し相補的なヌクレオチド鎖にその５’末端で連結された配列５’−Ｇ
ＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡ−リンカー−ＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵ
ＣＣＧ−３’を含む（ここで、「リンカー」は、いかなるヌクレオチド配列も含み得るい
かなるリンカーヌクレオチド配列をも表す）（配列番号／／）。他の例示的な単一分子Ｄ
ＮＡ標的化ＲＮＡには、配列番号６８０〜６８２に記載されるものが含まれる。
主題のＤＮＡ標的化ＲＮＡおよび／または主題の部位特異的修飾ポリペプチドをコードす
る核酸
本開示は、主題のＤＮＡ標的化ＲＮＡおよび／または主題の部位特異的修飾ポリペプチ
ドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。いくつかの実施形態において、
主題のＤＮＡ標的化ＲＮＡをコードする核酸は、発現ベクター、例えば、組み換え発現ベ
クターである。
いくつかの実施形態において、主題の方法には、標的ＤＮＡをＤＮＡ標的化ＲＮＡおよ
び／もしくは部位特異的修飾ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つもし
くは複数の核酸と接触させること、または細胞（または細胞集団）にＤＮＡ標的化ＲＮＡ
および／もしくは部位特異的修飾ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つ
もしくは複数の核酸を導入すること、が含まれる。いくつかの実施形態において、標的Ｄ
ＮＡを含む細胞はインビトロに存在する。いくつかの実施形態において、標的ＤＮＡを含
む細胞はインビボに存在する。ＤＮＡ標的化ＲＮＡおよび／または部位特異的修飾ポリペ
プチドをコードするヌクレオチド配列を含む適切な核酸には発現ベクターが含まれ、ここ
で、ＤＮＡ標的化ＲＮＡおよび／または部位特異的修飾ポリペプチドをコードするヌクレ
オチド配列を含む発現ベクターは「組み換え発現ベクター」である。
いくつかの実施形態において、組み換え発現ベクターは、ウイルス性構築物、例えば、
組換えアデノ随伴ウイルス構築物（例えば、米国特許第７，０７８，３８７号を参照）、
組換えアデノウイルス構築物、組換えレンチウイルス構築物、組換えレトロウイルス構築
物等である。
適切な発現ベクターとしては、限定はされないが、ウイルスベクター（例えば、ワクシ
ニアウイルスに基づくウイルスベクター；ポリオウイルス；アデノウイルス（例えば、Li
et al., Invest Opthalmol Vis Sci 35:2543 2549, 1994; Borras et al., Gene Ther 6
:515 524, 1999; Li and Davidson, PNAS 92:7700 7704, 1995; Sakamoto et al., H Gen
e Ther 5:1088 1097, 1999；国際公開第９４／１２６４９号、同第９３／０３７６９号；
同第９３／１９１９１号；同第９４／２８９３８号；同第９５／１１９８４号および同第
９５／００６５５号を参照）；アデノ随伴ウイルス（例えば、Ali et al., Hum Gene The
r 9:81 86, 1998, Flannery et al., PNAS 94:6916 6921, 1997; Bennett et al., Inves
t Opthalmol Vis Sci 38:2857 2863, 1997; Jomary et al., Gene Ther 4:683 690, 1997
, Rolling et al., Hum Gene Ther 10:641 648, 1999; Ali et al., Hum Mol Genet 5:59
1 594, 1996；国際公開第９３／０９２３９号のSrivastava, Samulski et al., J. Vir.
(1989) 63:3822−3828; Mendelson et al., Virol. (1988) 166:154−165;およびFlotte
et al., PNAS (1993) 90:10613−10617を参照）；ＳＶ４０；単純疱疹ウイルス；ヒト免
疫不全ウイルス（例えば、Miyoshi et al., PNAS 94:10319 23, 1997; Takahashi et al.
, J Virol 73:7812 7816, 1999を参照）；レトロウイルスベクター（例えば、マウス白血
病ウイルス、脾壊死ウイルス、およびラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、トリ
白血病ウイルス、レンチウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス（ｍ
ｙｅｌｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ｓａｒｃｏｍａ ｖｉｒｕｓ）、および乳癌ウイ
ルス等のレトロウイルス由来のベクター）；等が挙げられる。
多数の適切な発現ベクターが当業者に知られており、多くは市販されている。例として
以下のベクターを記載する；真核生物宿主細胞：ｐＸＴ１、ｐＳＧ５（ストラタジーン社
（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、およびｐＳＶＬＳＶ４
０（ファルマシア社（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））。しかし、宿主細胞に適合している限り、
いかなる他のベクターを使用してもよい。
使用される宿主／ベクター系に応じて、いくつかの適切な転写調節領域および翻訳調節
領域のいずれか、例えば、構成的プロモーターおよび誘導性プロモーター、転写エンハン
サーエレメント、転写ターミネーター等を発現ベクターに用いてもよい（例えば、Bitter
et al. (1987) Methods in Enzymology, 153:516-544を参照）。
いくつかの実施形態において、ＤＮＡ標的化ＲＮＡおよび／または部位特異的修飾ポリ
ペプチドをコードするヌクレオチド配列は、調節領域、例えば、プロモーター等の転写調
節領域に作動可能に連結している。転写調節領域は、真核細胞、例えば、哺乳類細胞；ま
たは原核細胞（例えば、細菌細胞または古細菌細胞）において機能的であり得る。いくつ
かの実施形態において、ＤＮＡ標的化ＲＮＡおよび／または部位特異的修飾ポリペプチド
をコードするヌクレオチド配列は、原核細胞および真核細胞の両方におけるＤＮＡ標的化
ＲＮＡおよび／または部位特異的修飾ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現
を可能にする複数の調節領域に作動可能に連結している。
適切な真核生物プロモーター（真核細胞において機能的なプロモーター）の例としては
、限定はされないが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期、単純疱疹ウイルス（ＨＳ
Ｖ）チミジンキナーゼ、初期および後期ＳＶ４０、レトロウイルス由来の末端反復配列（
ＬＴＲ）、並びにマウスメタロチオネイン−Ｉに由来する真核生物プロモーターが挙げら
れる。適切なベクターおよびプロモーターの選択は、当該技術分野において十分に通常の
技術の範囲内である。また発現ベクターは、翻訳開始のためのリボソーム結合部位および
転写ターミネーターを含有していてもよい。また発現ベクターは、発現を増幅するための
適切な配列を含んでいてもよい。また発現ベクターは、部位特異的修飾ポリペプチドに融
合したタンパク質タグ（例えば、６ｘＨｉｓタグ、赤血球凝集素タグ、緑色蛍光タンパク
質等）をコードし、それ故キメラポリペプチドをもたらす、ヌクレオチド配列を含んでい
てもよい。
いくつかの実施形態において、ＤＮＡ標的化ＲＮＡおよび／または部位特異的修飾ポリ
ペプチドをコードするヌクレオチド配列は、誘導性プロモーターに作動可能に連結してい
る。いくつかの実施形態において、ＤＮＡ標的化ＲＮＡおよび／または部位特異的修飾ポ
リペプチドをコードするヌクレオチド配列は、構成的プロモーターに作動可能に連結して
いる。
核酸を宿主細胞に導入する方法は当該技術分野において公知であり、いかなる公知の方
法を使用しても核酸（例えば、発現構築物）を細胞に導入することができる。適切な方法
としては、例えば、ウイルス感染またはバクテリオファージ感染、トランスフェクション
、接合（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）、原形質融合、リポフェクション、エレクトロポレー
ション、リン酸カルシウム沈殿、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）介在性トランスフェクシ
ョン、ＤＥＡＥ−デキストラン介在性トランスフェクション、リポソーム介在性トランス
フェクション、パーティクルガン法、リン酸カルシウム沈殿、直接微量注入、ナノ粒子介
在性核酸送達（例えば、Panyam et., al Adv Drug Deliv Rev. 2012 Sep 13. pii: S0169
-409X(12)00283-9. doi: 10.1016/j.addr.2012.09.023を参照）等が挙げられる。
キメラポリペプチド
本開示はキメラ部位特異的修飾ポリペプチドを提供する。主題のキメラ部位特異的修飾
ポリペプチドは、主題のＤＮＡ標的化ＲＮＡ（上記）と相互作用（例えば、結合）する。
ＤＮＡ標的化ＲＮＡは、キメラ部位特異的修飾ポリペプチドを、標的ＤＮＡ（例えば、染
色体配列または染色体外配列、例えば、エピソーム配列、ミニサークル配列、ミトコンド
リア配列、葉緑体配列等）内の標的配列に誘導する。主題のキメラ部位特異的修飾ポリペ
プチドは、標的ＤＮＡを修飾し（例えば、標的ＤＮＡの切断またはメチル化）、および／
または標的ＤＮＡと結合したポリペプチドを修飾する（例えば、ヒストン尾部のメチル化
またはアセチル化）。
主題のキメラ部位特異的修飾ポリペプチド 標的ＤＮＡを修飾し（例えば、標的ＤＮＡ
の切断またはメチル化）、および／または標的ＤＮＡと結合したポリペプチドを修飾する
（例えば、ヒストン尾部のメチル化またはアセチル化）。キメラ部位特異的修飾ポリペプ
チドは、「キメラ部位特異的ポリペプチド」または「キメラＲＮＡ結合部位特異的修飾ポ
リペプチド」とも称される。
主題のキメラ部位特異的修飾ポリペプチドは、２つの部分、ＲＮＡ結合部位および活性
部位を含む。主題のキメラ部位特異的修飾ポリペプチドは、少なくとも２つの異なるポリ
ペプチドに由来するアミノ酸配列を含む。主題のキメラ部位特異的修飾ポリペプチドは、
修飾されたおよび／または自然発生的なポリペプチド配列（例えば、修飾されたまたは無
修飾のＣａｓ９／Ｃｓｎ１タンパク質由来の第一アミノ酸配列；およびＣａｓ９／Ｃｓｎ
１タンパク質以外の第二アミノ酸配列）を含み得る。
ＲＮＡ結合部位
いくつかの例において、主題のキメラ部位特異的修飾ポリペプチドのＲＮＡ結合部位は
、自然発生的なポリペプチドである。他の例においては、主題のキメラ部位特異的修飾ポ
リペプチドのＲＮＡ結合部位は、自然発生的な分子ではない（修飾されている、例えば、
変異、欠失、挿入）。目的の自然発生的なＲＮＡ結合部位は、当該技術分野において公知
の部位特異的修飾ポリペプチドに由来する。例えば、配列番号１〜２５６および７９５〜
１３４６は、部位特異的修飾ポリペプチドとして用いることができる自然発生的なＣａｓ
９／Ｃｓｎ１エンドヌクレアーゼの非限定的且つ非網羅的な列挙を提供する。いくつかの
例において、主題のキメラ部位特異的修飾ポリペプチドのＲＮＡ結合部位は、配列番号１
〜２５６および７９５〜１３４６として記載されるアミノ酸配列のいずれかを有するポリ
ペプチドのＲＮＡ結合部位に対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なく
とも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なく
とも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの例において、部位特異的修飾ポリペプチドは、図３に示されるＣａｓ９／Ｃ
ｓｎ１アミノ酸配列のアミノ酸７〜１６６または７３１〜１００３に対して、または配列
番号１〜２５６および７９５〜１３４６として記載されるアミノ酸配列のうちのいずれか
における対応部分に対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８
５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または１００％
のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
活性部位
ＲＮＡ結合部位に加えて、キメラ部位特異的修飾ポリペプチドは「活性部位」を含む。
いくつかの実施形態において、主題のキメラ部位特異的修飾ポリペプチドの活性部位は、
部位特異的修飾ポリペプチド（例えば、Ｃａｓ９／Ｃｓｎ１エンドヌクレアーゼ）の自然
発生的な活性部位を含む。他の実施形態では、主題のキメラ部位特異的修飾ポリペプチド
の活性部位は、部位特異的修飾ポリペプチドの自然発生的な活性部位の修飾されたアミノ
酸配列（例えば、置換、欠失、挿入）を含む。目的の自然発生的な活性部位は、当該技術
分野において公知の部位特異的修飾ポリペプチドに由来する。例えば、配列番号１〜２５
６および７９５〜１３４６は、部位特異的修飾ポリペプチドとして用いることができる自
然発生的なＣａｓ９／Ｃｓｎ１エンドヌクレアーゼの非限定的且つ非網羅的な列挙を提供
する。主題のキメラ部位特異的修飾ポリペプチドの活性部位は可変であり、本明細書で開
示される方法に有用であり得るいずれの異種ポリペプチド配列を含んでいてもよい。
いくつかの実施形態において、主題のキメラ部位特異的修飾ポリペプチドは、（ｉ）標
的ＤＮＡ内の配列に対し相補的なヌクレオチド配列を含むＤＮＡ標的化ＲＮＡと相互作用
するＲＮＡ結合部位；および（ｉｉ）部位特異的酵素活性を示す活性部位（例えば、ＤＮ
Ａメチル化活性、ＤＮＡ切断活性、ヒストンアセチル化活性、ヒストンメチル化活性等）
を含み、酵素活性の部位はＤＮＡ標的化ＲＮＡによって決定される。
他の実施形態では、主題のキメラ部位特異的修飾ポリペプチドは、（ｉ）標的ＤＮＡ内
の配列に対し相補的なヌクレオチド配列を含むＤＮＡ標的化ＲＮＡと相互作用するＲＮＡ
結合部位；および（ｉｉ）標的ＤＮＡ内の転写を調節する活性部位（例えば、転写を増加
または減少させるための）を含み、標的ＤＮＡ内の調節される転写の部位はＤＮＡ標的化
ＲＮＡによって決定される。
いくつかの例において、主題のキメラ部位特異的修飾ポリペプチドの活性部位は、標的
ＤＮＡを修飾する酵素活性（例えば、ヌクレアーゼ活性、メチルトランスフェラーゼ活性
、脱メチル化酵素活性、ＤＮＡ修復活性、ＤＮＡ損傷活性、脱アミノ化活性、ジスムター
ゼ活性、アルキル化活性、脱プリン活性、酸化活性、ピリミジンダイマー形成活性、イン
テグラーゼ活性、トランスポサーゼ活性、リコンビナーゼ活性、ポリメラーゼ活性、リガ
ーゼ活性、ヘリカーゼ活性、光回復酵素活性またはグリコシラーゼ活性）を有する。
他の例において、主題のキメラ部位特異的修飾ポリペプチドの活性部位は、標的ＤＮＡ
と結合したポリペプチド（例えば、ヒストン）を修飾する酵素活性（例えば、メチルトラ
ンスフェラーゼ活性、脱メチル化酵素活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、脱アセチ
ル化酵素活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、ユビキチンリガーゼ活性、脱ユビキ
チン化活性、アデニル化活性、脱アデニル化活性、ＳＵＭＯ化活性、脱ＳＵＭＯ化活性、
リボシル化活性、脱リボシル化活性、ミリストイル化活性または脱ミリストイル化活性）
を有する。
いくつかの例において、主題のキメラ部位特異的修飾ポリペプチドの活性部位は、酵素
活性を示す（上記）。他の例において、主題のキメラ部位特異的修飾ポリペプチドの活性
部位は、標的ＤＮＡの転写を調節する（上記）。主題のキメラ部位特異的修飾ポリペプチ
ドの活性部位は可変であり、本明細書で開示される方法に有用であり得るいずれの異種ポ
リペプチド配列を含んでいてもよい。
例示的なキメラ部位特異的修飾ポリペプチド
いくつかの実施形態において、キメラ部位特異的修飾ポリペプチドの活性部位は、Ｃａ
ｓ９／Ｃｓｎ１タンパク質の修飾形態を含む。いくつかの例において、Ｃａｓ９／Ｃｓｎ
１タンパク質の修飾形態は、Ｃａｓ９／Ｃｓｎ１タンパク質の自然発生的なヌクレアーゼ
活性を低減させるアミノ酸変化（例えば、欠失、挿入、または置換）を含む。例えば、い
くつかの例において、Ｃａｓ９／Ｃｓｎ１タンパク質の修飾形態は、対応する野生型Ｃａ
ｓ９／Ｃｓｎ１ポリペプチドの５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０
％未満、５％未満、または１％未満のヌクレアーゼ活性を有する。いくつかの例において
、Ｃａｓ９／Ｃｓｎ１ポリペプチドの修飾形態は、実質的なヌクレアーゼ活性を有さない
。
いくつかの実施例において、Ｃａｓ９／Ｃｓｎ１ポリペプチドの修飾形態は、標的ＤＮ
Ａの相補鎖を切断することができるが、標的ＤＮＡの非相補鎖を切断する能力が低減して
いる、Ｄ１０Ａ（配列番号８のアミノ酸位置１０におけるアスパラギン酸からアラニン）
変異（または配列番号１〜２５６および７９５〜１３４６に示されるタンパク質のうちの
いずれかの対応する変異）である（図１１を参照）。いくつかの実施例において、Ｃａｓ
９／Ｃｓｎ１ポリペプチドの修飾形態は、標的ＤＮＡの非相補鎖を切断することができる
が、標的ＤＮＡの相補鎖を切断する能力が低減している、Ｈ８４０Ａ（アミノ酸位置８４
０におけるヒスチジンからアラニン）変異（または配列番号１〜２５６および７９５〜１
３４６として記載されるタンパク質のうちのいずれかの対応する変異）である（図１１を
参照）。いくつかの実施例において、Ｃａｓ９／Ｃｓｎ１ポリペプチドの修飾形態は、ポ
リペプチドが標的ＤＮＡの相補鎖および非相補鎖の両方を切断する能力が低減しているよ
うな、Ｄ１０ＡおよびＨ８４０Ａ変異（または配列番号１〜２５６および７９５〜１３４
６として記載されるタンパク質のうちのいずれかの対応する変異）の両方を有する。他の
残基を変異させることで、上記の効果（すなわち、１つまたはその他のヌクレアーゼ部分
を失活させる）を得ることができる。非限定例として、残基Ｄ１０、Ｇ１２、Ｇ１７、Ｅ
７６２、Ｈ８４０、Ｎ８５４、Ｎ８６３、Ｈ９８２、Ｈ９８３、Ａ９８４、Ｄ９８６、お
よび／またはＡ９８７（または配列番号１〜２５６および７９５〜１３４６として記載さ
れるタンパク質のうちのいずれかの対応する変異）を、変化（すなわち、置換）させるこ
とができる（Ｃａｓ９アミノ酸残基の保存に関するさらなる情報については図３、図５、
図１１Ａ、および表１を参照）。また、アラニン置換以外の変異も適切である。
目的のさらなる情報について
表１． 表１は種々の種に由来するＣａｓ９配列内に存在する４つのモチーフを列挙し
ている（図３および図５も参照）。表に列挙されるアミノ酸は、Ｓ．ピオゲネス由来のＣ
ａｓ９のものである（配列番号８）。
Figure 0006887479
いくつかの例において、キメラ部位特異的修飾ポリペプチドは、図３に示されるＣａｓ
９／Ｃｓｎ１アミノ酸配列のアミノ酸７〜１６６または７３１〜１００３に対して、また
は配列番号１〜２５６および７９５〜１３４６として記載されるアミノ酸配列のうちのい
ずれかにおける対応部分に対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくと
も約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％または１０
０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの例において、キメラ
部位特異的修飾ポリペプチドは、４つのモチーフ（表４に列挙され、図３Ａおよび図５に
示される）を含み、それぞれは、表１に列挙される４つのモチーフ（配列番号２６０〜２
６３）のそれぞれに対して、または、配列番号１〜２５６および７９５〜１３４６として
記載されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応部分に対して、少なくとも約７５％、少
なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少
なくとも約９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。
いくつかの例において、キメラ部位特異的修飾ポリペプチドは、図３に示されるＣａｓ９
／Ｃｓｎ１アミノ酸配列のアミノ酸７〜１６６または７３１〜１００３に対して、または
配列番号１〜２５６および７９５〜１３４６として記載されるアミノ酸配列のうちのいず
れかにおける対応部分に対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも
約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％または１００
％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、部位特異的修飾ポリペプチドの活性部位は、ＤＮＡ修飾
活性および／または転写因子活性および／またはＤＮＡ結合ポリペプチド修飾活性を有す
る異種ポリペプチドを含む。いくつかの例において、異種ポリペプチドは、ヌクレアーゼ
活性を与えるＣａｓ９／Ｃｓｎ１ポリペプチドの位置と置換されている。他の実施形態で
は、主題の部位特異的修飾ポリペプチドは、ヌクレアーゼ活性を正常に与えるＣａｓ９／
Ｃｓｎ１ポリペプチドの部分（および十分に活性な、または代わりに、対応する野生型活
性の１００％未満を有するよう修飾されていてもよいＣａｓ９／Ｃｓｎ１ポリペプチドの
部分）、および異種ポリペプチドの両方を含む。言い換えれば、いくつかの例において、
主題のキメラ部位特異的修飾ポリペプチドは、ヌクレアーゼ活性を正常に与えるＣａｓ９
／Ｃｓｎ１ポリペプチドの部分および異種ポリペプチドの両方を含む融合ポリペプチドで
ある。他の例において、主題のキメラ部位特異的修飾ポリペプチドは、Ｃａｓ９／Ｃｓｎ
１ポリペプチドの活性部位の修飾変異体（例えば、アミノ酸変化、欠失、挿入）および異
種ポリペプチドを含む融合ポリペプチドである。さらに別の例では、主題のキメラ部位特
異的修飾ポリペプチドは、異種ポリペプチドおよび自然発生的なまたは修飾された部位特
異的修飾ポリペプチドのＲＮＡ結合部位を含む融合ポリペプチドである。
例えば、キメラＣａｓ９／Ｃｓｎ１タンパク質において、自然発生的な（または修飾（
例えば、変異、欠失、挿入）された）細菌Ｃａｓ９／Ｃｓｎ１ポリペプチドは、異種ポリ
ペプチド配列（すなわち、Ｃａｓ９／Ｃｓｎ１以外のタンパク質由来のポリペプチド配列
または別の生物由来のポリペプチド配列）に融合されていてもよい。異種ポリペプチド配
列は、キメラＣａｓ９／Ｃｓｎ１タンパク質によっても示される活性（例えば、酵素活性
）を示し得る（例えば、メチルトランスフェラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活
性、キナーゼ活性、ユビキチン化活性等）。異種核酸配列を別の核酸配列に連結して（例
えば、遺伝子操作によって）、キメラポリペプチドをコードするキメラヌクレオチド配列
を作製してもよい。いくつかの実施形態において、キメラＣａｓ９／Ｃｓｎ１ポリペプチ
ドは、Ｃａｓ９／Ｃｓｎ１ポリペプチド（例えば、野生型Ｃａｓ９またはＣａｓ９変異型
、例えば、ヌクレアーゼ活性が低減または不活性化されたＣａｓ９）を、細胞内局在を与
える異種配列（例えば、核に標的化するための核局在化シグナル（ＮＬＳ）；ミトコンド
リアに標的化するためのミトコンドリア局在化シグナル；葉緑体に標的化するための葉緑
体局在化シグナル；ＥＲ保留シグナル；等）と融合することにより作製される。いくつか
の実施形態において、異種配列は、追跡または精製を容易にするためのタグを与え得る（
例えば、蛍光タンパク質、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＹＦＰ、ＲＦＰ、Ｃ
ＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｔｄＴｏｍａｔｏ等；Ｈｉｓタグ、例えば、６ＸＨｉｓタグ；赤
血球凝集素（ＨＡ）タグ；ＦＬＡＧタグ；Ｍｙｃタグ；等）。いくつかの実施形態におい
て、異種配列は、安定性の増加または減少を与え得る。いくつかの実施形態において、異
種配列は、（例えば、キメラＣａｓ９ポリペプチドが別の目的タンパク質、例えば、ＤＮ
Ａまたはヒストン修飾タンパク質、転写因子または転写抑制因子、動員（ｒｅｃｒｕｉｔ
ｉｎｇ）タンパク質等に結合する能力を与えるための）結合ドメインを与え得る。
主題の変異型Ｃａｓ９部位特異的ポリペプチドの、種々のさらなる適切な融合パートナ
ー（またはその断片）の例には、限定はされないが、図５４に列挙されるものが含まれる
。
主題のキメラ部位特異的修飾ポリペプチドをコードする核酸
本開示は、主題のキメラ部位特異的修飾ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を
含む核酸を提供する。いくつかの実施形態において、主題のキメラ部位特異的修飾ポリペ
プチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸は、発現ベクター、例えば、組み換え発
現ベクターである。
いくつかの実施形態において、主題の方法は、標的ＤＮＡをキメラ部位特異的修飾ポリ
ペプチドを含む一つまたは複数の核酸と接触させること、または細胞（または細胞集団）
にキメラ部位特異的修飾ポリペプチドを含む一つまたは複数の核酸を導入すること、を含
む。キメラ部位特異的修飾ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む適切な核酸
には発現ベクターが含まれ、ここで、キメラ部位特異的修飾ポリペプチドをコードするヌ
クレオチド配列を含む発現ベクターは「組み換え発現ベクター」である。
いくつかの実施形態において、組み換え発現ベクターは、ウイルス性構築物、例えば、
組換え型アデノ随伴ウイルス構築物（例えば、米国特許第７，０７８，３８７号を参照）
、組換え型アデノウイルス構築物、組換え型レンチウイルス構築物等である。
適切な発現ベクターとしては、限定はされないが、ウイルスベクター（例えば、ワクシ
ニアウイルスに基づくウイルスベクター；ポリオウイルス；アデノウイルス（例えば、Li
et al., Invest Opthalmol Vis Sci 35:2543 2549, 1994; Borras et al., Gene Ther 6
:515 524, 1999; Li and Davidson, PNAS 92:7700 7704, 1995; Sakamoto et al., H Gen
e Ther 5:1088 1097, 1999；国際公開第９４／１２６４９号、同第９３／０３７６９号；
同第９３／１９１９１号；同第９４／２８９３８号；同第９５／１１９８４号および同第
９５／００６５５号を参照）；アデノ随伴ウイルス（例えば、Ali et al., Hum Gene The
r 9:81 86, 1998, Flannery et al., PNAS 94:6916 6921, 1997; Bennett et al., Inves
t Opthalmol Vis Sci 38:2857 2863, 1997; Jomary et al., Gene Ther 4:683 690, 1997
, Rolling et al., Hum Gene Ther 10:641 648, 1999; Ali et al., Hum Mol Genet 5:59
1 594, 1996；国際公開第９３／０９２３９号のSrivastava, Samulski et al., J. Vir.
(1989) 63:3822−3828; Mendelson et al., Virol. (1988) 166:154−165;およびFlotte
et al., PNAS (1993) 90:10613−10617を参照）；ＳＶ４０；単純疱疹ウイルス；ヒト免
疫不全ウイルス（例えば、Miyoshi et al., PNAS 94:10319 23, 1997; Takahashi et al.
, J Virol 73:7812 7816, 1999を参照）；レトロウイルスベクター（例えば、マウス白血
病ウイルス、脾壊死ウイルス、およびラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、トリ
白血病ウイルス、レンチウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス（ｍ
ｙｅｌｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ｓａｒｃｏｍａ ｖｉｒｕｓ）、および乳癌ウイ
ルス等のレトロウイルス由来のベクター）；等が挙げられる。
多数の適切な発現ベクターが当業者に知られており、多くは市販されている。例として
以下のベクターを記載する；真核生物宿主細胞：ｐＸＴ１、ｐＳＧ５（ストラタジーン社
）、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、およびｐＳＶＬＳＶ４０（ファルマシア社）。し
かし、宿主細胞に適合している限り、いかなる他のベクターを使用してもよい。
使用される宿主／ベクター系に応じて、いくつかの適切な転写調節領域および翻訳調節
領域のいずれか、例えば、構成的プロモーターおよび誘導性プロモーター、転写エンハン
サーエレメント、転写ターミネーター等を発現ベクターに用いてもよい（例えば、Bitter
et al. (1987) Methods in Enzymology, 153:516-544を参照）。
いくつかの実施形態において、キメラ部位特異的修飾ポリペプチドをコードするヌクレ
オチド配列は、調節領域、例えば、プロモーター等の転写調節領域に作動可能に連結して
いる。転写調節領域は、真核細胞、例えば、哺乳類細胞；または原核細胞（例えば、細菌
細胞または古細菌細胞）において機能的であり得る。いくつかの実施形態において、キメ
ラ部位特異的修飾ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、原核細胞および真核細
胞の両方におけるキメラ部位特異的修飾ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の発
現を可能にする複数の調節領域に作動可能に連結している。
適切な真核生物プロモーター（真核細胞において機能的なプロモーター）の例としては
、限定はされないが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期、単純疱疹ウイルス（ＨＳ
Ｖ）チミジンキナーゼ、初期および後期ＳＶ４０、レトロウイルス由来の末端反復配列（
ＬＴＲ）、並びにマウスメタロチオネイン−Ｉに由来する真核生物プロモーターが挙げら
れる。適切なベクターおよびプロモーターの選択は、当該技術分野において十分に通常の
技術の範囲内である。また発現ベクターは、翻訳開始のためのリボソーム結合部位および
転写ターミネーターを含有していてもよい。また発現ベクターは、発現を増幅するための
適切な配列を含んでいてもよい。また発現ベクターは、キメラ部位特異的修飾ポリペプチ
ドに融合したタンパク質タグ（例えば、６ｘＨｉｓタグ、赤血球凝集素(ＨＡ)タグ、蛍光
タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質；黄色蛍光タンパク質等）等）をコードするヌ
クレオチド配列を含んでいてもよい。
いくつかの実施形態において、キメラ部位特異的修飾ポリペプチドをコードするヌクレ
オチド配列は、誘導性プロモーター（例えば、熱ショックプロモーター、テトラサイクリ
ン調節プロモーター、ステロイド調節プロモーター、金属調節プロモーター、エストロゲ
ン受容体調節プロモーター等）に作動可能に連結している。いくつかの実施形態において
、キメラ部位特異的修飾ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、空間限定的およ
び／または時間限定的プロモーター（例えば、組織特異的プロモーター、細胞型特異的プ
ロモーター等）に作動可能に連結している。いくつかの実施形態において、キメラ部位特
異的修飾ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、構成的プロモーターに作動可能
に連結している。
核酸を宿主細胞に導入する方法は当該技術分野において公知であり、いかなる公知の方
法も、核酸（例えば、発現構築物）を幹細胞または前駆細胞に導入するために使用するこ
とができる。適切な方法としては、例えば、ウイルス感染またはバクテリオファージ感染
、トランスフェクション、接合（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）、原形質融合、リポフェクシ
ョン、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）
介在性トランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン介在性トランスフェクション、リ
ポソーム介在性トランスフェクション、パーティクルガン法、リン酸カルシウム沈殿、直
接微量注入、ナノ粒子介在性核酸送達（例えば、Panyam et., al Adv Drug Deliv Rev. 2
012 Sep 13. pii: S0169-409X(12)00283-9. doi: 10.1016/j.addr.2012.09.023を参照）
等が挙げられる。
方法
本開示は、標的ＤＮＡおよび／または標的ＤＮＡ結合ポリペプチドを修飾する方法を提
供する。一般的に、主題の方法は、標的ＤＮＡを、ＤＮＡ標的化ＲＮＡおよび部位特異的
修飾ポリペプチドを含む複合体（「ターゲティング複合体」）と接触させることを含む。
前述の通り、主題のＤＮＡ標的化ＲＮＡおよび主題の部位特異的修飾ポリペプチドは、
複合体を形成する。ＤＮＡ標的化ＲＮＡは、標的ＤＮＡの配列に対し相補的なヌクレオチ
ド配列を含むことにより、複合体に標的特異性を与える。複合体の部位特異的修飾ポリペ
プチドは、部位特異的活性を与える。いくつかの実施形態において、主題の複合体は標的
ＤＮＡを修飾し、例えば、ＤＮＡ切断、ＤＮＡメチル化、ＤＮＡ損傷、ＤＮＡ修復等をも
たらす。他の実施形態では、主題の複合体は標的ＤＮＡと結合した標的ポリペプチド（例
えば、ヒストン、ＤＮＡ結合タンパク質等）を修飾し、例えば、ヒストンメチル化、ヒス
トンアセチル化、ヒストンユビキチン化等をもたらす。標的ＤＮＡは、例えば、インビト
ロにおける裸のＤＮＡ、インビトロにおける細胞内の染色体ＤＮＡ、インビボにおける細
胞内の染色体ＤＮＡ等であり得る。
いくつかの例において、部位特異的修飾ポリペプチドは、ＤＮＡ標的化ＲＮＡおよび標
的ＤＮＡの間の相補的領域によって決定される標的ＤＮＡ配列において標的ＤＮＡを切断
するヌクレアーゼ活性を示す。いくつかの例において、部位特異的修飾ポリペプチドがＣ
ａｓ９またはＣａｓ９関連ポリペプチドである場合、標的ＤＮＡの部位特異的切断は、（
ｉ）ＤＮＡ標的化ＲＮＡおよび標的ＤＮＡ間の塩基対形成相補性；並びに（ｉｉ）標的Ｄ
ＮＡ内のショートモチーフ（プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）と称される）の両
方によって決定される位置で起こる。いくつかの実施形態において（例えば、Ｓ．ピオゲ
ネス由来のＣａｓ９、または近縁Ｃａｓ９が用いられる場合（配列番号１〜２５６および
７９５〜１３４６を参照））、非相補鎖のＰＡＭ配列は５’−ＸＧＧ−３’であり、ここ
で、ＸはあらゆるＤＮＡヌクレオチドであり、Ｘは標的ＤＮＡの非相補鎖の標的配列のす
ぐ３’側である（図１０を参照）。従って、相補鎖のＰＡＭ配列は５’−ＣＣＹ−３’で
あり、ここでＹはあらゆるＤＮＡヌクレオチドであり、Ｙは標的ＤＮＡの相補鎖の標的配
列のすぐ５’側である（非相補鎖のＰＡＭが５’−ＧＧＧ−３’であり相補鎖のＰＡＭが
５’−ＣＣＣ−３’である、図１０を参照）。いくつかのそのような実施形態において、
ＸおよびＹは相補的であり得、Ｘ−Ｙ塩基対はいかなる塩基対でもあり得る（例えば、Ｘ
＝ＣおよびＹ＝Ｇ；Ｘ＝ＧおよびＹ＝Ｃ；Ｘ＝ＡおよびＹ＝Ｔ、Ｘ＝ＴおよびＹ＝Ａ）。
いくつかの例において、異なるＣａｓ９タンパク質（すなわち、様々な種に由来するＣ
ａｓ９タンパク質）は、異なるＣａｓ９タンパク質の種々の酵素的特徴を十分に利用する
ために、種々の提供される方法において使用するのに有利であり得る（例えば、異なるＰ
ＡＭ配列優先度のため；酵素活性の増加または減少のため；細胞毒性レベルの増加または
減少のため；ＮＨＥＪ、相同組換え修復、一本鎖切断、二本鎖切断等の間のバランスを変
化させるため）。様々な種に由来するＣａｓ９タンパク質（配列番号１〜２５６および７
９５〜１３４６を参照）は、標的ＤＮＡ内に異なるＰＡＭ配列を必要とし得る。従って、
特定の最適なＣａｓ９タンパク質において、ＰＡＭ配列の要求は上記の５’−ＸＧＧ−３
’配列とは異なり得る。
種々様々な種に由来する多くのＣａｓ９オルソログが本明細書において特定されたが、
それらのタンパク質は同一のアミノ酸をわずかしか共有していない。特定された全てのＣ
ａｓ９オルソログは、中心のＨＮＨエンドヌクレアーゼドメインおよび分割されたＲｕｖ
Ｃ／ＲＮａｓｅＨドメインを有する同一のドメイン構造を有する（図３Ａ、３Ｂ、図５、
および表１を参照）。Ｃａｓ９タンパク質は保存された構造と４つの重要なモチーフを共
有している。モチーフ１、２、および４はＲｕｖＣ様モチーフであり、一方、モチーフ３
はＨＮＨモチーフである。いくつかの例において、適切な部位特異的修飾ポリペプチドは
４つのモチーフを有するアミノ酸配列を含み、モチーフ１〜４のそれぞれは、図３Ａに示
されるＣａｓ９／Ｃｓｎ１アミノ酸配列のモチーフ１〜４（それぞれ、配列番号２６０〜
２６３、表１に示される）に対して、または、配列番号１〜２５６および７９５〜１３４
６に記載のアミノ酸配列のうちのいずれかにおける対応部分（多岐にわたるＣａｓ９配列
由来のモチーフ１〜４のアライメントについては図５を参照）に対して、少なくとも約７
５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９
５％、少なくとも約９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有している。いくつか
の例において、適切な部位特異的修飾ポリペプチドは、図３に示されるＣａｓ９／Ｃｓｎ
１アミノ酸配列のアミノ酸７〜１６６または７３１〜１００３に対して、または配列番号
１〜２５６および７９５〜１３４６として記載されるアミノ酸配列のうちのいずれかにお
ける対応部分に対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％
、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％または１００％のアミ
ノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。上記のいかなるＣａｓ９タンパク質も、部
位特異的修飾ポリペプチドとして、または主題の方法のキメラ部位特異的修飾ポリペプチ
ドの一部として、使用することができる。
ヌクレアーゼ活性は標的ＤＮＡを切断して二重鎖切断を生成する。これらの切断は次に
、非相同末端結合および相同組換え修復という２つの方法のうちの１つで、細胞によって
修復される（図２）。非相同末端結合（ＮＨＥＪ）において、二重鎖切断は切断末端の互
いへの直接的ライゲーションによって修復される。従って、新規の核酸物質はその部位に
挿入されないが、ただし、いくらかの核酸物質が失われて欠失をもたらし得る。相同組換
え修復においては、切断された標的ＤＮＡ配列に対し相同性を有するドナーポリヌクレオ
チドが切断された標的ＤＮＡ配列を修復するための鋳型として使用され、ドナーポリヌク
レオチドから標的ＤＮＡへの遺伝情報の移動をもたらす。従って、新規の核酸物質がその
部位に挿入／複製され得る。いくつかの例において、標的ＤＮＡは主題のドナーポリヌク
レオチドと接触される。いくつかの例において、主題のドナーポリヌクレオチドは主題の
細胞に導入される。ＮＨＥＪおよび／または相同組換え修復による標的ＤＮＡの修飾は、
例えば、遺伝子修正、遺伝子置換、遺伝子標識、導入遺伝子挿入、ヌクレオチド欠失、遺
伝子破壊、遺伝子変異等をもたらす。
従って、部位特異的修飾ポリペプチドによるＤＮＡの切断を用いることで、標的ＤＮＡ
配列を切断し、外因的に供給したドナーポリヌクレオチドの非存在下において細胞にその
配列を修復させることにより、標的ＤＮＡ配列から核酸物質を除去（例えば、細胞を感染
し易くする遺伝子（例えば、Ｔ細胞をＨＩＶに感染し易くさせるＣＣＲ５またはＣＸＣＲ
４遺伝子）を破壊するように、ニューロンにおける疾患を引き起こす三塩基反復配列を除
去するように、研究において疾病モデルとして遺伝子ノックアウトおよび遺伝子変異を起
こすように、等）することができる。従って、主題の方法を用いることで、遺伝子をノッ
クアウト（転写の完全な欠如または改変された転写をもたらす）、または標的ＤＮＡ内の
最適な遺伝子座に遺伝物質をノックインすることができる。
あるいは、ＤＮＡ標的化ＲＮＡおよび部位特異的修飾ポリペプチドが、標的ＤＮＡ配列
に対し相同性を有する少なくとも１つのセグメントを含むドナーポリヌクレオチド配列と
共に細胞に同時投与される場合、主題の方法を用いることで、標的ＤＮＡ配列に核酸物質
を付加（すなわち挿入または置換）（例えば、タンパク質、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ等を
コードする核酸を「ノックイン」）、タグ（例えば、６ｘＨｉｓ、蛍光タンパク質（例え
ば、緑色蛍光タンパク質；黄色蛍光タンパク質等）、赤血球凝集素（ＨＡ）、ＦＬＡＧ等
）を付加、遺伝子に制御配列を付加（例えば、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、
内部リボソーム侵入配列（ＩＲＥＳ）、２Ａペプチド、開始コドン、終止コドン、スプラ
イスシグナル、局在化シグナル等）、核酸配列を修飾（例えば、変異を導入）する等が可
能となる。従って、ＤＮＡ標的化ＲＮＡおよび部位特異的修飾ポリペプチドを含む複合体
は、例えば、遺伝子治療（例えば、疾患を治療するために、または抗ウイルス治療、抗病
原治療、もしくは抗がん治療として）、農業における遺伝子改変生物の作製、治療、診断
、または研究を目的とした細胞によるタンパク質の大規模生産、ｉＰＳ細胞の誘導、生物
学的研究、病原体の遺伝子の欠失または置換の標的化等において用いられる、部位特異的
、すなわち「標的化された」方法（例えば、遺伝子ノックアウト、遺伝子ノックイン、遺
伝子編集、遺伝子標識等）でＤＮＡを修飾することが望ましい、いかなるインビトロまた
はインビボ適用においても有用である。
いくつかの実施形態において、部位特異的修飾ポリペプチドは、Ｃａｓ９／Ｃｓｎ１タ
ンパク質の修飾形態を含む。いくつかの例において、Ｃａｓ９／Ｃｓｎ１タンパク質の修
飾形態は、Ｃａｓ９／Ｃｓｎ１タンパク質の自然発生的なヌクレアーゼ活性を低減させる
アミノ酸変化（例えば、欠失、挿入、または置換）を含む。例えば、いくつかの例におい
て、Ｃａｓ９／Ｃｓｎ１タンパク質の修飾形態は、対応する野生型Ｃａｓ９／Ｃｓｎ１ポ
リペプチドの５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満
、または１％未満のヌクレアーゼ活性を有する。いくつかの例において、Ｃａｓ９／Ｃｓ
ｎ１ポリペプチドの修飾形態は、実質的なヌクレアーゼ活性を有さない。主題の部位特異
的修飾ポリペプチドは、実質的なヌクレアーゼ活性を有さないＣａｓ９／Ｃｓｎ１ポリペ
プチドの修飾形態である場合、「ｄＣａｓ９」と称され得る。
いくつかの実施形態において、Ｃａｓ９／Ｃｓｎ１ポリペプチドの修飾形態は、標的Ｄ
ＮＡの相補鎖を切断することができるが、標的ＤＮＡの非相補鎖を切断する能力が低減し
ている（従って、ＤＳＢではなく一本鎖切断（ＳＳＢ）をもたらす；図１１を参照）、Ｄ
１０Ａ（配列番号８のアミノ酸位置１０におけるアスパラギン酸からアラニン）変異（ま
たは配列番号１〜２５６および７９５〜１３４６として記載されるタンパク質のうちのい
ずれかの対応する変異）である。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ９／Ｃｓｎ１ポリ
ペプチドの修飾形態は、標的ＤＮＡの非相補鎖を切断することができるが、標的ＤＮＡの
相補鎖を切断する能力が低減している（従って、ＤＳＢではなく一本鎖切断（ＳＳＢ）を
もたらす；図１１を参照）、Ｈ８４０Ａ（配列番号８のアミノ酸位置８４０におけるヒス
チジンからアラニン）変異（または配列番号１〜２５６および７９５〜１３４６として記
載されるタンパク質のうちのいずれかの対応する変異）である。Ｃａｓ９のＤ１０Ａまた
はＨ８４０Ａ変異体（または配列番号１〜２５６および７９５〜１３４６として記載され
るタンパク質のいずれかにおける対応する変異）を用いることで、ＳＳＢとは対照的に、
ＤＳＢが存在する場合、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）が起こる可能性がさらにより大きい
ために、期待される生物学的結果を変化させることができる。従って、ＤＳＢの可能性を
減少させる（および、従って、ＮＨＥＪの可能性を減少させる）ことが望ましいいくつか
の例においては、Ｃａｓ９のＤ１０ＡまたはＨ８４０Ａ変異体を用いることができる。他
の残基を変異させて、同一の効果を得る（すなわち、１つまたはその他のヌクレアーゼ部
分を失活させる）ことができる。非限定例として、残基Ｄ１０、Ｇ１２、Ｇ１７、Ｅ７６
２、Ｈ８４０、Ｎ８５４、Ｎ８６３、Ｈ９８２、Ｈ９８３、Ａ９８４、Ｄ９８６、および
／またはＡ９８７（または配列番号１〜２５６および７９５〜１３４６として記載される
タンパク質のうちのいずれかの対応する変異）を、変化（すなわち、置換）させることが
できる（Ｃａｓ９アミノ酸残基の保存に関するさらなる情報については図３、図５、図１
１Ａ、および表１を参照）。また、アラニン置換以外の変異も適切である。部位特異的ポ
リペプチド（例えば、部位特異的修飾ポリペプチド）が低減された触媒活性を有する場合
（例えば、Ｃａｓ９タンパク質がＤ１０、Ｇ１２、Ｇ１７、Ｅ７６２、Ｈ８４０、Ｎ８５
４、Ｎ８６３、Ｈ９８２、Ｈ９８３、Ａ９８４、Ｄ９８６、および／またはＡ９８７変異
、例えば、Ｄ１０Ａ、Ｇ１２Ａ、Ｇ１７Ａ、Ｅ７６２Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、Ｎ８
６３Ａ、Ｈ９８２Ａ、Ｈ９８３Ａ、Ａ９８４Ａ、および／またはＤ９８６Ａを有する場合
）のいくつかの実施形態において、該ポリペプチドは、該ポリペプチドがＤＮＡ標的化Ｒ
ＮＡと相互作用する能力を保持している限り、部位特異的に標的ＤＮＡになお結合するこ
とができる（該ポリペプチドはＤＮＡ標的化ＲＮＡによって標的ＤＮＡ配列になお誘導さ
れるため）。
いくつかの実施形態において、Ｃａｓ９／Ｃｓｎ１ポリペプチドの修飾形態は、該ポリ
ペプチドが標的ＤＮＡの相補鎖および非相補鎖の両方を切断する能力が低減しているよう
な（すなわち、該変異体が実質的なヌクレアーゼ活性を有さない可能性がある）、Ｄ１０
Ａ変異およびＨ８４０Ａ変異の両方（または配列番号１〜２５６および７９５〜１３４６
として記載されるタンパク質のうちのいずれかの対応する変異）を有する。他の残基を変
異させて、同一の効果を得る（すなわち、１つまたはその他のヌクレアーゼ部分を失活さ
せる）ことができる。非限定例として、残基Ｄ１０、Ｇ１２、Ｇ１７、Ｅ７６２、Ｈ８４
０、Ｎ８５４、Ｎ８６３、Ｈ９８２、Ｈ９８３、Ａ９８４、Ｄ９８６、および／またはＡ
９８７（または配列番号１〜２５６および７９５〜１３４６として記載されるタンパク質
のうちのいずれかの対応する変異）を、変化（すなわち、置換）させることができる（Ｃ
ａｓ９アミノ酸残基の保存に関するさらなる情報については図３、図５、図１１Ａ、およ
び表１を参照）。また、アラニン置換以外の変異も適切である。
いくつかの実施形態において、部位特異的修飾ポリペプチドは、異種配列を含む（例え
ば、融合）。いくつかの実施形態において、異種配列は部位特異的修飾ポリペプチドの細
胞内局在化を与え得る（例えば、核に標的化するための核局在化シグナル（ＮＬＳ）；ミ
トコンドリアに標的化するためのミトコンドリア局在化シグナル；葉緑体に標的化するた
めの葉緑体局在化シグナル；ＥＲ保留シグナル；等）。いくつかの実施形態において、異
種配列は、追跡または精製を容易にするためのタグを与え得る（例えば、蛍光タンパク質
、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＹＦＰ、ＲＦＰ、ＣＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、
ｔｄＴｏｍａｔｏ等；Ｈｉｓタグ、例えば、６ＸＨｉｓタグ；赤血球凝集素（ＨＡ）タグ
；ＦＬＡＧタグ；Ｍｙｃタグ；等）。いくつかの実施形態において、異種配列は、安定性
の増加または減少を与え得る。
いくつかの実施形態において、主題の部位特異的修飾ポリペプチドはコドン最適化され
得る。この種の最適化は当該技術分野において公知であり、同一のタンパク質をコードし
たまま目的の宿主生物または細胞のコドン選択を模倣するために、外来性ＤＮＡの変異を
必要とする。従って、コドンは変化されるが、コードされるタンパク質は変化されないま
まである。例えば、目的の標的細胞がヒト細胞である場合、ヒトコドン最適化Ｃａｓ９（
または変異体、例えば、酵素的に不活性な変異体）が適切な部位特異的修飾ポリペプチド
であるだろう（例として配列番号２５６を参照）。いかなる適切な部位特異的修飾ポリペ
プチドも（例えば、配列番号１〜２５６および７９５〜１３４６に記載される配列のいず
れか等のいかなるＣａｓ９も）、コドン最適化することができる。別の非限定例として、
目的の宿主細胞がマウス細胞である場合、マウスコドン最適化Ｃａｓ９（または変異体、
例えば、酵素的に不活性な変異体）が適切な部位特異的修飾ポリペプチドであるだろう。
コドン最適化は必要なものではないが、ある特定の場合においては受け入れられるもので
あり、好ましい場合がある。
いくつかの実施形態において、主題のＤＮＡ標的化ＲＮＡおよび主題の部位特異的修飾
ポリペプチドは、細菌細胞における遺伝子発現を停止させるための誘導可能な系として用
いられる。いくつかの例において、適切なＤＮＡ標的化ＲＮＡおよび／または適切な部位
特異的ポリペプチドをコードする核酸は、標的細胞の染色体に組み込まれ、誘導性プロモ
ーターの制御下にある。ＤＮＡ標的化ＲＮＡおよび／または部位特異的ポリペプチドが誘
導された場合、標的ＤＮＡは、ＤＮＡ標的化ＲＮＡおよび部位特異的修飾ポリペプチドの
両方が存在し複合体を形成した場合に、目的の位置（例えば、別々のプラスミド上の標的
遺伝子）において切断（または修飾）される。従って、いくつかの例において、細菌発現
株は、細菌ゲノム内の適切な部位特異的修飾ポリペプチドをコードする核酸配列、および
／またはプラスミド上の（例えば、誘導性プロモーターの制御下にある）適切なＤＮＡ標
的化ＲＮＡを含むように、操作され、（その株に導入された別々のプラスミドから発現さ
れる）いかなる標的化された遺伝子の発現もＤＮＡ標的化ＲＮＡおよび部位特異的ポリペ
プチドの発現を誘導することにより制御することができる実験を可能にする。
いくつかの例において、部位特異的修飾ポリペプチドは、二重鎖切断を導入する以外の
方法で標的ＤＮＡを修飾する酵素活性を有する。標的ＤＮＡを（例えば、酵素活性を有す
る異種ポリペプチドを部位特異的修飾ポリペプチドに融合することにより、キメラ部位特
異的修飾ポリペプチドを作製することによって）修飾するのに用いられ得る目的の酵素活
性には、限定はされないが、メチルトランスフェラーゼ活性、脱メチル化酵素活性、ＤＮ
Ａ修復活性、ＤＮＡ損傷活性、脱アミノ化活性、ジスムターゼ活性、アルキル化活性、脱
プリン活性、酸化活性、ピリミジンダイマー形成活性、インテグラーゼ活性、トランスポ
サーゼ活性、リコンビナーゼ活性、ポリメラーゼ活性、リガーゼ活性、ヘリカーゼ活性、
光回復酵素活性またはグリコシラーゼ活性）が含まれる。ＤＮＡの損傷および修復の活性
が環境ストレスに応答した細胞生存および適切なゲノム維持のために必須である一方で、
メチル化および脱メチル化は、当該技術分野において、後成的遺伝子制御の重要な方法と
して認識されている。
従って、本明細書における方法は、標的ＤＮＡの後成的修飾において有用であり、ＤＮ
Ａ標的化ＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントに所望の相補的核酸配列を遺伝子導入すること
によって、標的ＤＮＡ内のあらゆる位置における標的ＤＮＡの後成的修飾を制御するため
に用いることができる。本明細書における方法はまた、標的ＤＮＡ内のあらゆる所望の位
置における、ＤＮＡの意図的および制御された損傷において有用である。本明細書におけ
る方法はまた、標的ＤＮＡ内のあらゆる所望の位置における、ＤＮＡの配列特異的および
制御された修復において有用である。ＤＮＡ修飾酵素活性を標的ＤＮＡ内の特定の位置に
標的化する方法は、研究および臨床応用の両方で有用である。
いくつかの例において、部位特異的修飾ポリペプチドは、（例えば、キメラ部位特異的
修飾ポリペプチド等の場合）標的ＤＮＡの転写を調節する活性を有する。いくつかの例に
おいて、転写を増加または減少させる能力を示す異種ポリペプチド（例えば、転写活性化
因子または転写抑制因子ポリペプチド）を含むキメラ部位特異的修飾ポリペプチドは、Ｄ
ＮＡ標的化ＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントによって誘導される、標的ＤＮＡ内の特定の
位置において標的ＤＮＡの転写を増加または減少させるために用いられる。キメラ部位特
異的修飾ポリペプチドに転写調節活性を与える、供給源ポリペプチドの例としては、限定
はされないが、光誘導性転写制御因子、小分子／薬剤反応性転写制御因子、転写因子、転
写抑制因子等が挙げられる。いくつかの例において、主題の方法は、標的化されたコード
ＲＮＡ（タンパク質コード遺伝子）および／または標的化された非コードＲＮＡ（例えば
、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、長鎖ｎｃＲＮＡ等）の
発現を制御するために用いられる。
いくつかの例において、部位特異的修飾ポリペプチドは、ＤＮＡに結合したポリペプチ
ド（例えば、ヒストン）を修飾する酵素活性を有する。いくつかの実施形態において、該
酵素活性は、メチルトランスフェラーゼ活性、脱メチル化酵素活性、アセチルトランスフ
ェラーゼ活性、脱アセチル化酵素活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、ユビキチン
リガーゼ活性（すなわち、ユビキチン化活性）、脱ユビキチン化活性、アデニル化活性、
脱アデニル化活性、ＳＵＭＯ化活性、脱ＳＵＭＯ化活性、リボシル化活性、脱リボシル化
活性、ミリストイル化活性、脱ミリストイル化活性、グリコシル化活性（例えば、Ｏ−Ｇ
ｌｃＮＡｃトランスフェラーゼから）または脱グリコシル化活性である。本明細書に列挙
される酵素活性はタンパク質に対する共有結合的修飾を触媒する。そのような修飾は、標
的タンパク質の安定性または活性を変化させることが、当該技術分野において公知である
（例えば、キナーゼ活性によるリン酸化は、標的タンパク質に応じてタンパク質活性を刺
激または抑制し得る）。ヒストンはタンパク質標的として特に重要である。ヒストンタン
パク質は、ＤＮＡと結合しヌクレオソームとして知られる複合体を形成することが、当該
技術分野において知られている。ヒストンを修飾（例えば、メチル化、アセチル化、ユビ
キチン化、リン酸化）することで、周囲のＤＮＡに構造変化を誘発し、それにより、転写
因子、ポリメラーゼ等の相互作用因子に対する、ＤＮＡの潜在的に大きな部分の接触性を
制御することができる。単一のヒストンは、多くの異なる方法で、および多くの異なる組
み合わせで、修飾することができる（例えば、ヒストン３のリジン２７（Ｈ３Ｋ２７）の
トリメチル化は、転写抑制されたＤＮＡ領域と関連しており、一方、ヒストン３のリジン
４（Ｈ３Ｋ４）のトリメチル化は、転写活性型のＤＮＡ領域と関連している）。従って、
ヒストン修飾活性を有する部位特異的修飾ポリペプチドは、ＤＮＡ構造の部位特異的制御
において有用であり、標的ＤＮＡの選択された領域においてヒストン修飾パターンを変化
させるために用いることができる。そのような方法は研究および臨床応用の両方において
有用である。
いくつかの実施形態において、複数のＤＮＡ標的化ＲＮＡが、同一の標的ＤＮＡまたは
異なる標的ＤＮＡ上の異なる位置を同時に修飾するために、同時に用いられる。いくつか
の実施形態において、２つ以上のＤＮＡ標的化ＲＮＡが、同一の遺伝子または転写物また
は遺伝子座を標的とする。いくつかの実施形態において、２つ以上のＤＮＡ標的化ＲＮＡ
が、異なる無関連の遺伝子座を標的とする。いくつかの実施形態において、２つ以上のＤ
ＮＡ標的化ＲＮＡが、異なるが関連した遺伝子座を標的とする。
いくつかの例において、部位特異的修飾ポリペプチドはタンパク質として直接的に提供
される。１つの非限定例として、真菌（例えば、酵母）は、スフェロプラスト形質転換を
用いて、外来性タンパク質および／または核酸によって形質転換され得る（Kawai et al.
, Bioeng Bugs. 2010 Nov-Dec;1(6):395-403 : “Transformation of Saccharomyces cer
evisiae and other fungi: methods and possible underlying mechanism”；およびTank
a et al., Nature. 2004 Mar 18;428(6980):323-8: “Conformational variations in an
infectious protein determine prion strain differences”を参照されたい（これらは
共に、それらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる））。従って、部位特異的修
飾ポリペプチド（例えば、Ｃａｓ９）は、スフェロプラストに組み入れることができ（Ｄ
ＮＡ標的化ＲＮＡをコードする核酸の有無、およびドナーポリヌクレオチドの有無にかか
わらず）、スフェロプラストを用いることで、内容物を酵母細胞に導入することができる
。部位特異的修飾ポリペプチドは、いかなる好都合な方法によっても細胞に導入すること
ができ（細胞に与えることができ）；そのような方法は当業者に公知である。別の非限定
例として、部位特異的修飾ポリペプチドは、細胞（例えば、ゼブラフィッシュ胚の細胞、
受精したマウス卵母細胞の前核等）に直接的に注入することができる（例えば、ＤＮＡ標
的化ＲＮＡをコードする核酸の有無、およびドナーポリヌクレオチドの有無にかかわらず
）。
目的の標的細胞
上記応用のいくつかにおいて、主題の方法を用いることで、インビボおよび／またはエ
キソビボおよび／またはインビトロにおいて、有糸分裂細胞または分裂終了細胞における
ＤＮＡ切断、ＤＮＡ修飾、および／または転写調節を誘導することができる（例えば、個
体に再導入することができる遺伝子改変細胞を作製することができる）。ＤＮＡ標的化Ｒ
ＮＡは標的ＤＮＡにハイブリダイズすることにより特異性を与えるため、本開示の方法に
おける目的の有糸分裂細胞および／または分裂終了細胞には、いかなる生物由来の細胞も
含まれ得る（例えば、細菌細胞、古細菌細胞、単細胞真核生物の細胞、植物細胞、藻細胞
、例えば、ボツリオコッカス・ブラウニー（Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ ｂｒａｕｎｉｉ
）、コナミドリムシ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）、ナンノ
クロロプシス・ガディタナ（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ ｇａｄｉｔａｎａ）、ク
ロレラ・ピレノイドサ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｐｙｒｅｎｏｉｄｏｓａ）、ヤツマタモク
（Ｓａｒｇａｓｓｕｍ ｐａｔｅｎｓ）、Ｃ．アガルド（Ｃ． Ａｇａｒｄｈ）等、真菌
細胞（例えば、酵母細胞）、動物細胞、無脊椎動物（例えばショウジョウバエ、刺胞動物
、棘皮動物、線虫等）由来の細胞、脊椎動物（例えば、魚類、両生類、爬虫類、鳥類、哺
乳動物）由来の細胞、哺乳動物由来の細胞、げっ歯類動物由来の細胞、ヒト由来の細胞等
）。
いかなる種類の細胞も対象になり得る（例えば、幹細胞、例えば、胚性幹（ＥＳ）細胞
、誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞、生殖細胞；体細胞、例えば、線維芽細胞、造血細胞、ニ
ューロン、筋細胞、骨細胞、肝細胞、膵臓細胞；インビトロまたはインビボにおける、あ
らゆる段階の胚の胚細胞、例えば、１細胞、２細胞、４細胞、８細胞等の段階のゼブラフ
ィッシュ胚；等）。細胞は株化細胞系から得てもよいし、あるいは初代細胞であってもよ
く、ここで、「初代細胞」、「初代細胞系」、および「初代培養物」は、本明細書で同義
的に使用されて、対象から得られ、培養物の、限定された回数の継代（すなわち、分裂）
だけインビトロにおいて増殖した、細胞および細胞培養物を指す。例えば、初代培養物は
、０回、１回、２回、４回、５回、１０回、または１５回継代されている場合があるが、
危機期（ｃｒｉｓｉｓ ｓｔａｇｅ）を起こすには十分な回数継代されていない、培養物
である。典型的に、本発明の初代細胞系はインビトロにおいて１０継代未満維持される。
標的細胞は、多くの実施形態では、単細胞生物であるか、または培養下で増殖する。
細胞は、初代細胞である場合、あらゆる好都合な方法によって個体から採取することが
できる。例えば、白血球は、アフェレーシス、白血球アフェレーシス、密度勾配分離等に
よって採取することが好都合であり得、一方、皮膚、筋肉、骨髄、脾臓、肝臓、膵臓、肺
、腸、胃等の組織由来の細胞は、生検によって採取することが最も好都合である。適切な
溶液を、採取した細胞を分散または懸濁させるために用いてもよい。そのような溶液は、
一般的には、低濃度の、一般的には５〜２５ｍＭの許容可能な緩衝液と共に、ウシ胎仔血
清または他の自然発生的な因子を添加されていることが好都合である、平衡塩類溶液、例
えば、生理食塩水、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、ハンクス平衡塩類溶液等である。好都
合な緩衝液には、ＨＥＰＥＳ、リン酸緩衝液、乳酸緩衝液等が含まれる。細胞は直ちに使
用してもよいし、あるいは、長期間保存、凍結して、解凍および再使用可能にしてもよい
。そのような場合、細胞は通常、１０％ＤＭＳＯ、５０％血清、４０％緩衝培地、または
、細胞をそのような凍結温度において保存するために当該技術分野において一般的に用い
られるいくつかの他の溶液中で凍結され、凍結培養細胞を解凍するための当該技術分野に
おいて周知の方法で解凍される。
主題のＤＮＡ標的化ＲＮＡおよび／または主題の部位特異的修飾ポリペプチドをコードす
る核酸
いくつかの実施形態において、主題の方法には、標的ＤＮＡをＤＮＡ標的化ＲＮＡおよ
び／もしくは部位特異的修飾ポリペプチドおよび／またはドナーポリヌクレオチドをコー
ドするヌクレオチド配列を含む一つもしくは複数の核酸と接触させること、または細胞（
または細胞集団）にＤＮＡ標的化ＲＮＡおよび／もしくは部位特異的修飾ポリペプチドお
よび／またはドナーポリヌクレオチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つもしくは
複数の核酸を導入すること、が含まれる。ＤＮＡ標的化ＲＮＡおよび／または部位特異的
修飾ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む適切な核酸には発現ベクターが含
まれ、ここで、ＤＮＡ標的化ＲＮＡおよび／または部位特異的修飾ポリペプチドをコード
するヌクレオチド配列を含む発現ベクターは「組み換え発現ベクター」である。
いくつかの実施形態において、組み換え発現ベクターは、ウイルス性構築物、例えば、
組換え型アデノ随伴ウイルス構築物（例えば、米国特許第７，０７８，３８７号を参照）
、組換え型アデノウイルス構築物、組換え型レンチウイルス構築物等である。
適切な発現ベクターとしては、限定はされないが、ウイルスベクター（例えば、ワクシ
ニアウイルスに基づくウイルスベクター；ポリオウイルス；アデノウイルス（例えば、Li
et al., Invest Opthalmol Vis Sci 35:2543 2549, 1994; Borras et al., Gene Ther 6
:515 524, 1999; Li and Davidson, PNAS 92:7700 7704, 1995; Sakamoto et al., H Gen
e Ther 5:1088 1097, 1999；国際公開第９４／１２６４９号、同第９３／０３７６９号；
同第９３／１９１９１号；同第９４／２８９３８号；同第９５／１１９８４号および同第
９５／００６５５号を参照）；アデノ随伴ウイルス（例えば、Ali et al., Hum Gene The
r 9:81 86, 1998, Flannery et al., PNAS 94:6916 6921, 1997; Bennett et al., Inves
t Opthalmol Vis Sci 38:2857 2863, 1997; Jomary et al., Gene Ther 4:683 690, 1997
, Rolling et al., Hum Gene Ther 10:641 648, 1999; Ali et al., Hum Mol Genet 5:59
1 594, 1996；国際公開第９３／０９２３９号のSrivastava, Samulski et al., J. Vir.
(1989) 63:3822−3828; Mendelson et al., Virol. (1988) 166:154−165;およびFlotte
et al., PNAS (1993) 90:10613−10617を参照）；ＳＶ４０；単純疱疹ウイルス；ヒト免
疫不全ウイルス（例えば、Miyoshi et al., PNAS 94:10319 23, 1997; Takahashi et al.
, J Virol 73:7812 7816, 1999を参照）；レトロウイルスベクター（例えば、マウス白血
病ウイルス、脾壊死ウイルス、およびラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、トリ
白血病ウイルス、レンチウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス（ｍ
ｙｅｌｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ｓａｒｃｏｍａ ｖｉｒｕｓ）、および乳癌ウイ
ルス等のレトロウイルス由来のベクター）；等が挙げられる。
多数の適切な発現ベクターが当業者に知られており、多くは市販されている。例として
以下のベクターを記載する；真核生物宿主細胞：ｐＸＴ１、ｐＳＧ５（ストラタジーン社
）、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、およびｐＳＶＬＳＶ４０（ファルマシア社）。し
かし、宿主細胞に適合している限り、いかなる他のベクターを使用してもよい。
いくつかの実施形態において、ＤＮＡ標的化ＲＮＡおよび／または部位特異的修飾ポリ
ペプチドをコードするヌクレオチド配列は、調節領域、例えば、プロモーター等の転写調
節領域に作動可能に連結している。転写調節領域は、真核細胞（例えば、哺乳類細胞）、
または原核細胞（例えば、細菌細胞または古細菌細胞）において機能的であり得る。いく
つかの実施形態において、ＤＮＡ標的化ＲＮＡおよび／または部位特異的修飾ポリペプチ
ドをコードするヌクレオチド配列は、原核細胞および真核細胞の両方においてＤＮＡ標的
化ＲＮＡおよび／または部位特異的修飾ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の発
現を可能にする複数の調節領域に作動可能に連結している。
使用される宿主／ベクター系に応じて、いくつかの適切な転写調節領域および翻訳調節
領域のいずれか、例えば、構成的プロモーターおよび誘導性プロモーター、転写エンハン
サーエレメント、転写ターミネーター等を発現ベクターに用いてもよい（例えば、Ｕ６プ
ロモーター、Ｈ１プロモーター等；上記参照）（例えば、Bitter et al. (1987) Methods
in Enzymology, 153:516-544を参照）。
いくつかの実施形態において、ＤＮＡ標的化ＲＮＡおよび／または部位特異的修飾ポリ
ペプチドはＲＮＡとして提供され得る。そのような例において、ＤＮＡ標的化ＲＮＡおよ
び／または部位特異的修飾ポリペプチドをコードするＲＮＡは、直接的な化学合成によっ
て生成することができ、またはＤＮＡ標的化ＲＮＡをコードするＤＮＡからインビトロで
転写されてもよい。鋳型ＤＮＡからＲＮＡを合成する方法は、当該技術分野において周知
である。いくつかの例において、ＤＮＡ標的化ＲＮＡおよび／または部位特異的修飾ポリ
ペプチドをコードするＲＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼ酵素（例えば、Ｔ７ポリメラーゼ、
Ｔ３ポリメラーゼ、ＳＰ６ポリメラーゼ等）を用いてインビトロで合成される。合成され
た後、ＲＮＡは標的ＤＮＡに直接的に接触させてもよいし、あるいは核酸を細胞に導入す
るための周知の技術（例えば、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、ト
ランスフェクション等）のいずれかによって、細胞に導入してもよい。
ＤＮＡ標的化ＲＮＡ（ＤＮＡまたはＲＮＡとして導入）および／または部位特異的修飾
ポリペプチド（ＤＮＡまたはＲＮＡとして導入）および／またはドナーポリヌクレオチド
をコードするヌクレオチドは、充分に開発されたトランスフェクション技術（例えば、An
gel and Yanik (2010) PLoS ONE 5(7): e11756を参照）、並びにキアゲン社（Ｑｉａｇｅ
ｎ）から販売されるＴｒａｎｓＭｅｓｓｅｎｇｅｒ（登録商標）試薬、ステムジェント社
（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）から販売されるＳｔｅｍｆｅｃｔ（商標）ＲＮＡトランスフェクシ
ョンキット、およびミルス・バイオＬＬＣ社（Ｍｉｒｕｓ Ｂｉｏ ＬＬＣ）から販売さ
れるＴｒａｎｓＩＴ（登録商標）−ｍＲＮＡトランスフェクションキットを用いて、細胞
に与えることができる。Beumer et al. (2008) Efficient gene targeting in Drosophil
a by direct embryo injection with zinc-finger nucleases. PNAS 105(50):19821-1982
6も参照されたい。あるいは、ＤＮＡ標的化ＲＮＡおよび／または部位特異的修飾ポリペ
プチドおよび／またはキメラ部位特異的修飾ポリペプチドおよび／またはドナーポリヌク
レオチドをコードする核酸は、ＤＮＡベクター上で提供されてもよい。核酸を標的細胞に
導入するのに有用な多くのベクター、例えばプラスミド、コスミド、ミニサークル、ファ
ージ、ウイルス等が利用可能である。核酸（複数可）を含むベクターは、例えば、プラス
ミド、ミニサークルＤＮＡ、ウイルス、例えば、サイトメガロウイルス、アデノウイルス
等としてエピソームに保持されていてもよいし、あるいは、相同組換えまたはランダムイ
ンテグレーション、例えば、ＭＭＬＶ、ＨＩＶ−１、ＡＬＶ等のレトロウイルス由来ベク
ターによって、標的細胞ゲノム内に組み込まれてもよい。
ベクターは、主題の細胞に直接的に与えてもよい。言い換えれば、細胞は、ベクターが
細胞に取り込まれるように、ＤＮＡ標的化ＲＮＡおよび／または部位特異的修飾ポリペプ
チドおよび／またはキメラ部位特異的修飾ポリペプチドおよび／またはドナーポリヌクレ
オチドをコードする核酸を含むベクターと接触される。細胞をプラスミドである核酸ベク
ターと接触させるための方法、例えば、エレクトロポレーション、塩化カルシウムトラン
スフェクション（ｃａｌｃｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）、マ
イクロインジェクション、およびリポフェクションは、当該技術分野において周知である
。ウイルスベクター送達において、細胞は、ＤＮＡ標的化ＲＮＡおよび／または部位特異
的修飾ポリペプチドおよび／またはキメラ部位特異的修飾ポリペプチドおよび／またはド
ナーポリヌクレオチドをコードする核酸を含むウイルス粒子と接触される。レトロウイル
ス（例えば、レンチウイルス）は、本発明の方法に特に適している。一般的に用いられる
レトロウイルスベクターは、「欠陥」を有する、すなわち、増殖性感染に必要なウイルス
タンパク質を産生することができない。むしろ、ベクターの複製は、パッケージング細胞
系内での増殖を必要とする。目的の核酸を含むウイルス粒子を生成するために、該核酸を
含むレトロウイルス核酸は、パッケージング細胞系によってウイルスカプシド内にパッケ
ージングされる。異なるパッケージング細胞系は、カプシド内に取り込まれる異なるエン
ベロープタンパク質（同種志向性、両種指向性または異種指向性）を与え、このエンベロ
ープタンパク質が、細胞に対するウイルス粒子の特異性を決定する（マウスおよびラット
に対する同種志向性；ヒト、イヌおよびマウスを含むほとんどの哺乳類細胞種に対する両
種指向性；並びにマウス細胞以外のほとんどの哺乳類細胞種に対する異種指向性）。適切
なパッケージング細胞系を用いることで、細胞がパッケージングされたウイルス粒子の標
的となることを確実にすることができる。再プログラム因子をコードする核酸を含むレト
ロウイルスベクターをパッケージング細胞系に導入する方法、およびパッケージング系に
よって生成されたウイルス粒子を収集する方法は、当該技術分野において周知である。核
酸は、直接的微量注入によって導入することもできる（例えば、ＲＮＡのゼブラフィッシ
ュ胚への注入）。
ＤＮＡ標的化ＲＮＡおよび／または部位特異的修飾ポリペプチドおよび／またはキメラ
部位特異的修飾ポリペプチドおよび／またはドナーポリヌクレオチドをコードする核酸を
主題の細胞に与えるために用いられるベクターは、典型的に、目的の核酸の発現（すなわ
ち、転写活性化）を駆動するのに適したプロモーターを含む。言い換えれば、目的の核酸
は、プロモーターに作動可能に連結している。これには、偏在的作用性（ｕｂｉｑｕｉｔ
ｏｕｓｌｙ ａｃｔｉｎｇ）プロモーター（例えば、ＣＭＶ−β−アクチンプロモーター
）、または誘導性プロモーター（例えば、特定の細胞集団において活性がある、またはテ
トラサイクリン等の薬剤の存在に応答するプロモーター）が含まれ得る。転写活性化によ
り、転写は少なくとも約１０倍、少なくとも約１００倍、より一般的には少なくとも約１
０００倍、標的細胞における基底レベルを超えて増加することが意図される。さらに、Ｄ
ＮＡ標的化ＲＮＡおよび／または部位特異的修飾ポリペプチドおよび／またはキメラ部位
特異的修飾ポリペプチドおよび／またはドナーポリヌクレオチドを主題の細胞に与えるた
めに用いられるベクターは、ＤＮＡ標的化ＲＮＡおよび／または部位特異的修飾ポリペプ
チドおよび／またはキメラ部位特異的修飾ポリペプチドおよび／またはドナーポリヌクレ
オチドを取り込んだ細胞を特定するために、標的細胞内の選択マーカーをコードする核酸
配列を含んでいてもよい。
主題のＤＮＡ標的化ＲＮＡおよび／または部位特異的修飾ポリペプチドおよび／または
キメラ部位特異的修飾ポリペプチドを、代わりに、ＤＮＡと接触させるのに使用、または
ＲＮＡとして細胞に導入してもよい。細胞にＲＮＡを導入する方法は当該技術分野におい
て公知であり、例えば、直接注入、トランスフェクション、またはＤＮＡの導入に用いら
れる他のあらゆる方法が含まれ得る。
主題の部位特異的修飾ポリペプチドを、代わりに、ポリペプチドとして細胞に与えても
よい。そのようなポリペプチドを、所望により、産物の溶解性を増加させるポリペプチド
ドメインに融合してもよい。該ドメインは、ＴＥＶプロテアーゼによって切断される、規
定のプロテアーゼ切断部位（例えば、ＴＥＶ配列）を介してポリペプチドに連結されてい
てもよい。リンカーは、一つまたは複数の可動性配列、例えば１〜１０個のグリシン残基
を含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、融合タンパク質の切断は、産物の溶
解性を維持する緩衝液中、例えば、０．５〜２Ｍ尿素の存在下、溶解性を増加させるポリ
ペプチドおよび／またはポリヌクレオチドの存在下等で、行われる。目的のドメインには
、エンドソーム溶解性（ｅｎｄｏｓｏｍｏｌｙｔｉｃ）ドメイン、例えば、インフルエン
ザＨＡドメイン；および生成を助ける他のポリペプチド、例えば、ＩＦ２ドメイン、ＧＳ
Ｔドメイン、ＧＲＰＥドメイン等が含まれる。本ポリペプチドは、安定性を向上させるた
めに製剤化されてもよい。例えば、本ペプチドは、ＰＥＧ化されていてもよく、ポリエチ
レンオキシ基によって血流中の寿命が延長される。
さらに、または、あるいは、主題の部位特異的修飾ポリペプチドは、細胞による取り込
みを促進するために、ポリペプチド浸透性ドメインに融合されていてもよい。いくつかの
浸透性ドメインが当該技術分野において公知であり、本発明の非組込み（ｎｏｎ−ｉｎｔ
ｅｇｒａｔｉｎｇ）ポリペプチドに用いられてもよく、これにはペプチド、ペプチド模倣
薬、および非ペプチド担体が含まれる。例えば、浸透性ペプチドは、アミノ酸配列ＲＱＩ
ＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号／／）を含む、ペネトラチンと称される、キイロ
ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）転写因子アンテ
ナペディア（Ａｎｔｅｎｎａｐａｅｄｉａ）の第三αヘリックスに由来し得る。別の例と
して、浸透性ペプチドは、例えば、自然発生的なｔａｔタンパク質のアミノ酸４９〜５７
を含み得る、ＨＩＶ−１ ｔａｔ基本領域アミノ酸配列を含む。他の浸透性ドメインには
、ポリ−アルギニンモチーフ、例えば、ＨＩＶ−１ ｒｅｖタンパク質のアミノ酸３４〜
５６の領域、ノナ−アルギニン、オクタ−アルギニン等が含まれる。（例えば、Futaki e
t al. (2003) Curr Protein Pept Sci. 2003 Apr; 4(2): 87-9 and 446;およびWender et
al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 2000 Nov. 21; 97(24):13003-8；米国特許
出願公開第２００３０２２０３３４号；同第２００３００８３２５６号；同第２００３０
０３２５９３号；および同第２００３００２２８３１号（これらは、移行ペプチドおよび
移行ペプトイドの教示のために参照によって本明細書に明確に組み込まれる）を参照され
たい）。ノナ−アルギニン（Ｒ９）配列は、特徴付けされたより効率的なＰＴＤの１つで
ある（Wender et al. 2000; Uemura et al. 2002）。融合が起こる該部位は、本ポリペプ
チドの生物活性、分泌または結合の特徴を最適化するために、選択されてもよい。最適な
部位は通例の実験法により決定される。
主題の部位特異的修飾ポリペプチドは、インビトロで、または真核細胞によって、また
は原核細胞によって生成され得、アンフォールディング、例えば、熱変性、ＤＴＴ還元等
によってさらに処理されてもよく、当該技術分野において公知の方法を用いてリフォール
ディングをさらに受けてもよい。
一次配列を変化させない目的の修飾には、ポリペプチドの化学誘導体化、例えば、アシ
ル化、アセチル化、カルボキシル化、アミド化等が含まれる。グリコシル化の修飾、例え
ば、ポリペプチドの合成中およびプロセシング中またはさらなるプロセシング段階中に、
例えば、ポリペプチドを哺乳類グリコシル化酵素または脱グリコシル化酵素等のグリコシ
ル化に影響を与える酵素に暴露することにより、ポリペプチドのグリコシル化パターンを
改変することにより成されるもの、も含まれる。リン酸化したアミノ酸残基、例えば、ホ
スホチロシン、ホスホセリン、またはホスホトレオニンを有する配列も含まれる。
通常の分子生物学的手法および合成化学を用いて修飾されたＤＮＡ標的化ＲＮＡおよび
部位特異的修飾ポリペプチドも、タンパク質分解に対するそれらの耐性を向上させるため
、標的配列特異性を変化させるため、溶解特性を最適化するため、タンパク質活性（例え
ば、転写調節活性、酵素活性等）を変化させるため、またはそれらを治療薬としてより適
切にするために、主題の発明に含まれる。そのようなポリペプチドの類似体としては、自
然発生的なＬ−アミノ酸以外の残基、例えば、Ｄ−アミノ酸または非自然発生的な合成ア
ミノ酸を含有するものが含まれる。アミノ酸残基のいくつかまたは全てがＤ−アミノ酸で
置換されていてもよい。
部位特異的修飾ポリペプチドは、当該技術分野において公知の常法を用いるインビトロ
合成によって、作製することができる。種々の市販の装置が利用可能であり、例えば、ア
プライドバイオシステムズ社（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｉｎｃ．）製
、ベックマン社（Ｂｅｃｋｍａｎ）製等の自動合成装置である。合成装置を用いることに
より、自然発生的なアミノ酸は、非天然アミノ酸と置換することができる。特定の配列お
よび作製法は、利便性、経済性、要求される純度等によって決定される。
所望であれば、他の分子または表面への連結を可能にする種々の基を合成中または発現
中にペプチドに導入してもよい。従って、システインを、金属イオン錯体に連結するため
のチオエーテル、ヒスチジン、アミドまたはエステルを形成するためのカルボキシル基、
アミドを形成するためのアミノ基等をつくるために用いてもよい。
部位特異的修飾ポリペプチドは、組み換え合成の常法に従って単離および精製してもよ
い。発現宿主の可溶化液を作製して、ＨＰＬＣ、排除クロマトグラフィ、ゲル電気泳動、
アフィニティークロマトグラフィー、または他の精製法を用いて、その可溶化液を精製し
てもよい。通例、用いられる組成物は、生成物の調製法およびその精製に関連した混入物
との関連で、少なくとも２０重量％の所望の生成物、より一般的には少なくとも約７５重
量％、好ましくは少なくとも約９５重量％の所望の生成物を含み、治療目的には、一般的
には少なくとも約９９．５重量％の所望の生成物を含む。一般的には、該パーセンテージ
は総タンパク質量に依存する。
ＤＮＡの切断および組換えを誘導するために、または標的ＤＮＡへの任意の所望の修飾
のために、または標的ＤＮＡと結合したポリペプチドへの任意の所望の修飾のために、Ｄ
ＮＡ標的化ＲＮＡおよび／または部位特異的修飾ポリペプチドおよび／またはドナーポリ
ヌクレオチドは、核酸として導入されるかまたはポリペプチドとして導入されるかにかか
わらず、約３０分間〜約２４時間、例えば、１時間、１．５時間、２時間、２．５時間、
３時間、３．５時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、１２時間、１６時間、
１８時間、２０時間、または約３０分間〜約２４時間の任意の他の期間、細胞に与えられ
、それをおよそ毎日〜およそ４日毎、例えば、１．５日毎、２日毎、３日毎の頻度、また
はおよそ毎日〜およそ４日毎の任意の他の頻度で繰り返される。該作用剤（複数可）は、
１回または複数回、例えば１回、２回、３回、または３回より多い回数、主題の細胞に与
えられてもよく、細胞は、それぞれの接触事象後にいくらかの時間（例えば、１６〜２４
時間）該作用剤（複数可）と一緒にインキュベートされ、その時間の後、培地は新鮮な培
地と交換され、細胞はさらに培養される。
２つ以上の異なるターゲティング複合体（例えば、同一または異なる標的ＤＮＡ内の異
なる配列に対し相補的な２つの異なるＤＮＡ標的化ＲＮＡ）が細胞に与えられる場合、そ
れらの複合体は、同時に（例えば２つのポリペプチドおよび／または核酸として）与えら
れてもよいし、あるいは同時に送達されてもよい。あるいは、２つ以上の異なるターゲテ
ィング複合体は連続的に与えられてもよい（例えば、最初にターゲティング複合体が与え
られ、その後、第二のターゲティング複合体が与えられる等またはその逆）。
典型的に、有効量のＤＮＡ標的化ＲＮＡおよび／または部位特異的修飾ポリペプチドお
よび／またはドナーポリヌクレオチドは、切断を誘導するために標的ＤＮＡまたは細胞に
与えられる。ＤＮＡ標的化ＲＮＡおよび／または部位特異的修飾ポリペプチドおよび／ま
たはドナーポリヌクレオチドの有効量は、２つの相同配列間で観察される標的修飾の量に
おいて、負の対照（例えば、空ベクターまたは無関係なポリペプチドと接触された細胞）
と比較して２倍以上の増加を誘導するための量である。すなわち、ＤＮＡ標的化ＲＮＡお
よび／または部位特異的修飾ポリペプチドおよび／またはドナーポリヌクレオチドの有効
量または有効用量は、標的ＤＮＡ領域において観察される標的修飾の量において、２倍の
増加、３倍の増加、４倍の増加またはそれ以上の増加を誘導し、いくつかの例においては
、観察される組換えの量において５倍の増加、６倍の増加またはそれ以上の増加、時に、
７倍または８倍の増加またはそれ以上の増加、例えば、１０倍、５０倍、または１００倍
以上の増加を誘導し、いくつかの例においては、観察される組換えの量において２００倍
、５００倍、７００倍、または１０００倍以上、例えば、５０００倍、または１０，００
０倍の増加を誘導する。標的修飾の量は、いかなる従来の方法によっても測定することが
できる。例えば、組み換えられた場合に活性レポーターをコードする核酸を再構築する、
反復配列に隣接したＤＮＡ標的化ＲＮＡのターゲティングセグメント（ターゲティング配
列）に相補的な配列を含むサイレントなレポーター構築物を、細胞に同時トランスフェク
トしてもよく、レポータータンパク質の量は、ＤＮＡ標的化ＲＮＡおよび／または部位特
異的修飾ポリペプチドおよび／またはドナーポリヌクレオチドとの接触の後に、例えば、
ＤＮＡ標的化ＲＮＡおよび／または部位特異的修飾ポリペプチドおよび／またはドナーポ
リヌクレオチドとの接触から２時間、４時間、８時間、１２時間、２４時間、３６時間、
４８時間、７２時間またはそれ以上の時間の後に、評価される。別の、さらなる感度アッ
セイとして、例えば、標的ＤＮＡ配列を含む目的のゲノムＤＮＡ領域における組換えの程
度は、ＤＮＡ標的化ＲＮＡおよび／または部位特異的修飾ポリペプチドおよび／またはド
ナーポリヌクレオチドとの接触の後に、例えば、ＤＮＡ標的化ＲＮＡおよび／または部位
特異的修飾ポリペプチドおよび／またはドナーポリヌクレオチドとの接触から２時間、４
時間、８時間、１２時間、２４時間、３６時間、４８時間、７２時間またはそれ以上の時
間の後に、該領域のＰＣＲまたはサザンハイブリダイゼーションによって、評価すること
ができる。
細胞とＤＮＡ標的化ＲＮＡおよび／または部位特異的修飾ポリペプチドおよび／または
ドナーポリヌクレオチドの接触は、細胞の生存を促進する、いかなる培地中でも、および
いかなる培養条件下でも、起こすことができる。例えば、細胞は、ウシ胎仔血清または熱
不活化したヤギ血清（約５〜１０％）、Ｌ−グルタミン、チオール、特に、２−メルカプ
トエタノール、および抗生物質、例えば、ペニシリンおよびストレプトマイシンを添加し
たイスコフ改変ＤＭＥＭまたはＲＰＭＩ１６４０等の、いかなる好都合な適切な栄養培地
中にも懸濁することができる。培地は、細胞が応答性である増殖因子を含有していてもよ
い。本明細書で定義される増殖因子は、膜貫通受容体に対する特異的な効果を介して、培
地中で、または無傷組織内で、細胞の生存、増殖および／または分化を促進することがで
きる分子である。増殖因子には、ポリペプチド因子および非ポリペプチド因子が含まれる
。細胞の生存を促進する条件は、典型的には、非相同末端結合および相同組換え修復を許
容する。
ポリヌクレオチド配列を標的ＤＮＡ配列に挿入することが望ましい適用において、挿入
されるドナー配列を含むポリヌクレオチドも細胞に与えられる。「ドナー配列」または「
ドナーポリヌクレオチド」とは、部位特異的修飾ポリペプチドによって誘導された切断部
位に挿入される核酸配列を意味する。ドナーポリヌクレオチドは、ドナーポリヌクレオチ
ドおよびそれが相同性を有するゲノム配列の間の相同組換え修復を支援するために、切断
部位におけるゲノム配列に対して充分な相同性を有し、例えば、切断部位に隣接した、例
えば、切断部位の約５０塩基以内の、例えば、約３０塩基以内、約１５塩基以内、約１０
塩基以内、約５塩基以内の、または切断部位に直接隣接した、ヌクレオチド配列と７０％
、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の相同性を有する。ドナー配列およ
びゲノム配列の間で配列相同性を有するおよそ２５、５０、１００、または２００個のヌ
クレオチド、または２００個より多いヌクレオチド（または１０〜２００のあらゆる整数
値のヌクレオチド、またはそれ以上のヌクレオチド）が、相同組換え修復を支援する。ド
ナー配列は、いかなる長さであってもよく、例えば、１０ヌクレオチド以上、５０ヌクレ
オチド以上、１００ヌクレオチド以上、２５０ヌクレオチド以上、５００ヌクレオチド以
上、１０００ヌクレオチド以上、５０００ヌクレオチド以上等の長さであってもよい。
ドナー配列は、典型的には、置換されるゲノム配列と同一ではない。それどころか、ド
ナー配列は、相同組換え修復を支援するのに充分な相同性が存在してさえいれば、ゲノム
配列に対して少なくとも一つまたは複数の一塩基変化、挿入、欠失、逆位または再編成を
含有していてもよい。いくつかの実施形態において、ドナー配列は、標的ＤＮＡ領域およ
び２つの隣接配列の間の相同組換え修復が標的領域における非相同配列の挿入をもたらす
ように、２つの相同領域に挟まれた非相同配列を含む。ドナー配列は、目的のＤＮＡ領域
に対し相同でなく、目的のＤＮＡ領域への挿入が意図されていない配列を含有するベクタ
ー骨格を含んでいてもよい。一般的に、ドナー配列の相同領域（複数可）は、組換えが望
まれるゲノム配列に対し少なくとも５０％の配列同一性を有する。ある特定の実施形態で
は、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、または９９．９％の配
列同一性が存在する。ドナーポリヌクレオチドの長さに応じて、１％〜１００％の間のい
かなる数値の配列同一性も存在し得る。
ドナー配列は、ゲノム配列と比較してある特定の配列差異を含んでいてもよく、例えば
、切断部位におけるドナー配列の挿入の成功を評価するために用いられ得る、または、い
くつかの例においては、他の目的のために（例えば、標的ゲノム遺伝子座における発現を
示すために）用いられ得る、制限酵素認識部位、ヌクレオチド多型、選択マーカー（例え
ば、薬剤耐性遺伝子、蛍光タンパク質、酵素等）等を含んでいてもよい。いくつかの例に
おいて、コード領域内に位置する場合、そのようなヌクレオチド配列差異はアミノ酸配列
を変化させないか、またはサイレントなアミノ酸変化を起こす（すなわち、タンパク質の
構造または機能に影響を与えない変化）。あるいは、これらの配列差異は、マーカー配列
の除去のために後に活性化され得る、ＦＬＰ、ｌｏｘＰ配列等の隣接組換え配列を含んで
いてもよい。
ドナー配列は、一本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、または二本鎖ＲＮＡとし
て細胞に与えられてもよい。ドナー配列は、直鎖状または環状の形態で細胞に導入されて
もよい。直鎖状で導入される場合、ドナー配列の末端は、当業者に既知の方法によって（
例えば、エキソヌクレアーゼ分解によって）保護されてもよい。例えば、一つまたは複数
のジデオキシヌクレオチド残基が、直鎖状分子の３’末端に付加され、および／または、
自己相補的オリゴヌクレオチドが一方または両方の末端に連結される。例えば、Chang et
al. (1987) Proc. Natl. Acad Sci USA 84:4959-4963; Nehls et al. (1996) Science 2
72:886-889を参照されたい。外来性ポリヌクレオチドを分解から保護するためのさらなる
方法としては、限定はされないが、末端アミノ基（複数可）の付加、並びに修飾されたヌ
クレオチド間連結（例えば、ホスホロチオエート、ホスホルアミダートおよびＯ−メチル
リボース残基またはデオキシリボース残基等）、の使用が挙げられる。直鎖状ドナー配列
の末端を保護するための代替物として、組換えに影響を与えることなく分解可能な追加の
配列長を相同領域の外側に含んでいてもよい。ドナー配列は、例えば、複製開始点、プロ
モーターおよび抗生物質耐性をコードする遺伝子等の追加の配列を有するベクター分子の
一部として、細胞に導入することができる。さらに、ドナー配列は、ＤＮＡ標的化ＲＮＡ
および／または部位特異的修飾ポリペプチドおよび／またはドナーポリヌクレオチドをコ
ードする核酸についての上記のように、裸の核酸として、リポソームまたはポロキサマー
等の作用剤と複合体化した核酸として、導入することができ、あるいは、ウイルス（例え
ば、アデノウイルス、ＡＡＶ）によって送達することができる。
上記の方法に従って、目的のＤＮＡ領域をエキソビボで切断および改変、すなわち「遺
伝子改変」してもよい。選択マーカーが目的のＤＮＡ領域内に挿入された場合のいくつか
の実施形態において、細胞集団は、遺伝子改変細胞を残りの集団から分離することにより
、遺伝子改変を含む細胞について富化することができる。富化に先立ち、「遺伝子改変」
細胞は、細胞集団の約１％以上（例えば、２％以上、３％以上、４％以上、５％以上、６
％以上、７％以上、８％以上、９％以上、１０％以上、１５％以上、または２０％以上）
のみを構成し得る。「遺伝子改変」細胞の分離は、使用される選択マーカーに適したいか
なる好都合の分離技術によっても達成することができる。例えば、蛍光性マーカーが挿入
された場合、細胞は蛍光標識細胞分取により分離することができ、一方、細胞表面マーカ
ーが挿入された場合、細胞は、アフィニティー分離技術、例えば、磁気分離、アフィニテ
ィークロマトグラフィー、固体マトリクスに付着した親和性試薬での「パニング」、また
は他の好都合な技術によって、異種集団から分離することができる。正確な分離を提供す
る技術には蛍光標示式細胞分取器が含まれ、蛍光標示式細胞分取器は、複数のカラーチャ
ネル、低角度および鈍角光散乱検出チャネル、インピーダンスチャネル等の様々な精巧度
を有し得る。細胞は、死細胞に結合した色素（例えば、ヨウ化プロピジウム）を利用する
ことにより、死細胞から選び分けてもよい。遺伝子改変細胞の生存率に対して過度に有害
でない、いかなる技術も利用することができる。改変ＤＮＡを含む細胞について高度に富
化された細胞組成物は、このようにして達成される。「高度に富化された」とは、細胞組
成物の遺伝子改変細胞が７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上
であること、例えば、細胞組成物の約９５％以上、または９８％以上であること、を意味
する。言い換えれば、組成は、実質的に純粋な遺伝子改変細胞組成物であり得る。
本明細書に記載の方法によって作製される遺伝子改変細胞は、即時に用いることができ
る。あるいは、該細胞は、液体窒素温度で凍結し長期間保存してもよく、解凍し再使用す
ることができる。そのような場合、細胞は通常、１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ
）、５０％血清、４０％緩衝培地、または、細胞をそのような凍結温度において保存する
ために当該技術分野において一般的に用いられるいくつかの他の溶液中で凍結され、凍結
培養細胞を解凍するための当該技術分野において周知の方法で解凍される。
本遺伝子改変細胞は、種々の培養条件下でインビトロで培養することができる。本遺伝
子改変細胞は、培地中で増殖、すなわち、それらの増殖を促進する条件下で増殖させるこ
とができる。培地は、例えば寒天、メチルセルロース等を含有する液体であっても半固体
であってもよい。細胞集団は、ウシ胎仔血清（約５〜１０％）、Ｌ−グルタミン、チオー
ル、特に、２−メルカプトエタノール、および抗生物質、例えば、ペニシリンおよびスト
レプトマイシンを通常は添加したイスコフ改変ＤＭＥＭまたはＲＰＭＩ１６４０等の、適
切な栄養培地中に懸濁することができる。培地は、調節性Ｔ細胞が応答性である増殖因子
を含有していてもよい。本明細書で定義される増殖因子は、膜貫通受容体に対する特異的
な効果を介して、培地中で、または無傷組織内で、細胞の生存、増殖および／または分化
を促進することができる分子である。増殖因子には、ポリペプチド因子および非ポリペプ
チド因子が含まれる。
このように遺伝子改変された細胞を、例えば、疾患を治療するための、または抗ウイル
ス治療剤、抗病原体治療剤、もしくは抗がん治療剤としての、遺伝子治療等の目的のため
に、農業における遺伝子改変生物の生産のために、または生物学的研究のために、対象に
移植してもよい。対象は、新生児、若年、または成人であってもよい。哺乳類対象が特に
重要である。本発明の方法を用いて治療され得る哺乳類種には、イヌおよびネコ；ウマ；
ウシ；ヒツジ；等、並びに霊長類、特にヒトが含まれる。動物モデル、特に小型哺乳動物
（例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ目（例えば、ウサギ）等）
を、実験的調査に用いてもよい。
細胞は、単独で、または、例えば、移植される組織におけるそれらの増殖および／もし
くは組織化を支援するための適切な基質もしくはマトリクスと一緒に、対象に与えること
ができる。通常、少なくとも１×１０３個の細胞、例えば、５×１０３個の細胞、１×１
０４個の細胞、５×１０４個の細胞、１×１０５個の細胞、１×１０６個の細胞またはそ
れ以上の細胞が投与される。細胞は、以下の経路のいずれかを介して対象に導入すること
ができる：非経口、皮下、静脈内、頭蓋内、脊髄内、眼内、または髄液内。細胞は、注射
、カテーテル等によって導入することができる。局所送達、すなわち、損傷部位への送達
のための方法の例としては、例えば、例えばくも膜下腔内送達用のオマヤレザバー（例え
ば、米国特許第５，２２２，９８２号および同第５３８５５８２号参照（参照によって本
明細書に組み込まれる））；例えば注射器による、例えば間節へのボーラス投与；例えば
カニューレ挿入による、例えば対流を用いた、持続点滴（例えば、米国特許出願公開第２
００７０２５４８４２号（参照によって本明細書に組み込まれる））；または細胞が可逆
的に付着された装置の埋め込み（例えば、米国特許出願公開第２００８００８１０６４号
および同第２００９０１９６９０３号参照（参照によって本明細書に組み込まれる））が
挙げられる。細胞は、遺伝子導入動物（例えば、トランスジェニックマウス）を作製する
目的で、胚（例えば、胚盤胞）に導入することもできる。
対象に対する治療的投与の回数は変動し得る。対象への遺伝子改変細胞の導入は、１回
の事象であり得るが；ある特定の状況においては、そのような治療は、限定された期間だ
けの改善をもたらし、継続的な一連の反復的治療を必要とし得る。他の状況において、効
果が観察されるまでに、遺伝子改変細胞の複数回投与が必要となり得る。正確なプロトコ
ルは、疾患または状態、疾患の段階および治療される個々の対象のパラメーターによって
異なる。
本発明の他の態様では、ＤＮＡ標的化ＲＮＡおよび／または部位特異的修飾ポリペプチ
ドおよび／またはドナーポリヌクレオチドは、繰り返しになるが、例えば、遺伝子治療（
例えば、疾患を治療するために、または抗ウイルス治療、抗病原治療、もしくは抗がん治
療として）、農業における遺伝子改変生物の作製、または生物学的研究のために、インビ
ボで細胞ＤＮＡを改変するのに使用される。これらのインビボでの実施形態において、Ｄ
ＮＡ標的化ＲＮＡおよび／または部位特異的修飾ポリペプチドおよび／またはドナーポリ
ヌクレオチドは、個体に直接投与される。ＤＮＡ標的化ＲＮＡおよび／または部位特異的
修飾ポリペプチドおよび／またはドナーポリヌクレオチドは、対象へのペプチド、小分子
および核酸の投与のための、当該技術分野におけるいくつかの周知の方法のいずれかによ
って投与されてもよい。ＤＮＡ標的化ＲＮＡおよび／または部位特異的修飾ポリペプチド
および／またはドナーポリヌクレオチドは、種々の製剤に組み入れることができる。より
具体的には、本発明のＤＮＡ標的化ＲＮＡおよび／または部位特異的修飾ポリペプチドお
よび／またはドナーポリヌクレオチドは、適切な薬剤的に許容できる担体または希釈剤と
組み合わせることにより、医薬組成物に製剤化することができる。
医薬品は、薬剤的に許容できるビヒクル中に存在する一つまたは複数のＤＮＡ標的化Ｒ
ＮＡおよび／または部位特異的修飾ポリペプチドおよび／またはドナーポリヌクレオチド
を含む組成物である。「薬剤的に許容できるビヒクル」は、連邦政府または州政府の規制
当局に承認された、またはヒト等の哺乳動物における使用のための米国薬局方もしくは他
の一般的に認知された薬局方に記載された、ビヒクルであり得る。用語「ビヒクル」は、
本発明の化合物が哺乳動物への投与用にそれを用いて製剤化される、希釈剤、アジュバン
ト、賦形剤、または担体を指す。そのような医薬品ビヒクルは、脂質、例えばリポソーム
、例えばリポソームデンドリマー；水および油等の液体、例えば、石油、動物、野菜また
は合成起源のもの、例えば、落花生油、ダイズ油、ミネラルオイル、ゴマ油等、食塩水；
アラビアゴム、ゼラチン、デンプンのり、滑石、ケラチン、コロイドシリカ、尿素等であ
り得る。さらに、助剤、安定化剤、増粘剤、潤滑剤および着色料を用いてもよい。医薬組
成物は、錠剤、カプセル剤、散剤、粒剤、軟膏剤、液剤、坐剤、注射剤、吸入剤、ゲル剤
、ミクロスフェア、およびエアロゾル等の固体、半固体、液体またはガス状形態の調製物
に製剤化されてもよい。従って、ＤＮＡ標的化ＲＮＡおよび／または部位特異的修飾ポリ
ペプチドおよび／またはドナーポリヌクレオチドの投与は、経口的、頬側、直腸、非経口
、腹腔内、皮内、経皮、気管内、眼内投与等を含む種々の方法で、達成することができる
。本活性薬剤は、投与後に全身性であってもよいし、あるいは、領域投与（ｒｅｇｉｏｎ
ａｌ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）、壁内投与の使用、または植え込み部位において
活性用量を保持するように作用する植込錠の使用によって、局在化されてもよい。本活性
薬剤は、速効的な活性のために製剤化されてもよいし、あるいは、徐放用に製剤化されて
もよい。
いくつかの条件、特に、中枢神経系条件において、血液脳関門（ＢＢＢ）を通過するよ
うに作用剤を製剤化することが必要となり得る。血液脳関門（ＢＢＢ）を通過する薬物送
達のための１つの戦略は、マンニトールもしくはロイコトリエン等の浸透圧的手段による
、または、生化学的な、ブラジキニン等の血管作動性物質の使用による、ＢＢＢの混乱を
必要とする。特定の薬剤を脳腫瘍に標的化するためにＢＢＢ開口を利用する可能性も、１
つの選択肢である。ＢＢＢ崩壊剤は、本発明の治療用組成物が血管内注射によって投与さ
れる際に、本組成物と同時に投与することができる。ＢＢＢを通過するための他の戦略は
、カベオリン１を介したトランスサイトーシス、グルコース担体およびアミノ酸担体等の
担体による輸送体、インスリンまたはトランスフェリンのための受容体を介したトランス
サイトーシス、並びにｐ−糖タンパク質等の能動拡散輸送体を含む、内在性輸送系の利用
を伴い得る。能動輸送部分は、血管の内皮壁を通過する輸送を促進するために、本発明に
おける使用のために治療化合物に結合されてもよい。あるいは、ＢＢＢの向こう側への治
療剤の薬物送達は、局所送達によるものであり得、例えば、例えばオマヤレザバーによる
、くも膜下腔内送達によるもの（例えば、米国特許第５，２２２，９８２号および同第５
３８５５８２号参照（参照によって本明細書に組み込まれる））；例えば硝子体内へのま
たは頭蓋内への、例えば注射器による、ボーラス投与によるもの；例えば対流による、例
えばカニューレ挿入による、持続点滴によるもの（例えば、米国特許出願公開第２００７
０２５４８４２号参照（参照によって本明細書に組み込まれる））；または作用剤が可逆
的に付着された装置の埋め込みによるもの（例えば、米国特許出願公開第２００８００８
１０６４号および同第２００９０１９６９０３号参照（参照によって本明細書に組み込ま
れる））である。
典型的に、有効量のＤＮＡ標的化ＲＮＡおよび／または部位特異的修飾ポリペプチドお
よび／またはドナーポリヌクレオチドが与えられる。エキソビボでの方法に関しての前述
の通り、インビボにおけるＤＮＡ標的化ＲＮＡおよび／または部位特異的修飾ポリペプチ
ドおよび／またはドナーポリヌクレオチドの有効量または有効用量は、２つの相同配列間
で観察される組換えの量において、負の対照（例えば、空ベクターまたは無関係なポリペ
プチドと接触された細胞）と比較して２倍以上の増加を誘導するための量である。組換え
の量は、いかなる好都合な方法によっても、例えば、上記の方法および当該技術分野にお
いて公知の方法によって、測定することができる。投与されるＤＮＡ標的化ＲＮＡおよび
／または部位特異的修飾ポリペプチドおよび／またはドナーポリヌクレオチドの有効量ま
たは有効用量の算出は、当業者の技術の範囲内であり、これらの当業者にとっては通例の
ものである。投与される最終的な量は、投与経路および治療される障害または状態の性質
によって異なる。
特定の患者に与えられる有効量は、種々の要因によって異なり、そのいくつかは患者間
で異なる。適任である臨床医は、患者に投与して必要に応じて病状の進行を止めるまたは
逆行させるための治療薬の有効量を決定することができる。ＬＤ５０動物データ、および
臨床医が使用可能である薬剤についての他の情報を利用して、臨床医は、投与経路に応じ
て、個人に対する最大安全用量を決定することができる。例えば、静脈内に投与される用
量は、治療用組成物が投与されている流体がより大きいことを鑑みて、くも膜下腔内に投
与される用量よりも多い場合がある。同様に、身体から迅速にクリアランスされる組成物
は、治療的濃度を維持するために、より高用量で、または反復投与で投与されてもよい。
通常の技術を用いて、適任である臨床医は、通例の臨床試験の間に、特定の治療剤の投与
量を最適化することができる。
薬剤に含ませるために、ＤＮＡ標的化ＲＮＡおよび／または部位特異的修飾ポリペプチ
ドおよび／またはドナーポリヌクレオチドを、適切な商業的供給源から得てもよい。一般
的な規則として、投与毎の非経口的に投与されるＤＮＡ標的化ＲＮＡおよび／または部位
特異的修飾ポリペプチドおよび／またはドナーポリヌクレオチドの薬剤的有効量の総量は
、用量反応曲線によって測定することができる範囲内である。
ＤＮＡ標的化ＲＮＡおよび／または部位特異的修飾ポリペプチドおよび／またはドナー
ポリヌクレオチドに基づく治療剤、すなわち、治療的投与に用いられるＤＮＡ標的化ＲＮ
Ａおよび／または部位特異的修飾ポリペプチドおよび／またはドナーポリヌクレオチドの
調製物は、無菌でなければならない。無菌性は、無菌ろ過膜（例えば、０．２μｍ膜）を
通す濾過によって容易に達成される。治療用組成物は、一般的には、無菌のアクセスポー
トを有する容器、例えば、皮下注射針によって突き刺し可能なストッパーを有する静脈注
射用溶液バッグまたはバイアル中に入れられる。ＤＮＡ標的化ＲＮＡおよび／または部位
特異的修飾ポリペプチドおよび／またはドナーポリヌクレオチドに基づく治療剤は、単回
または多回投与用容器（例えば、密閉したアンプルまたはバイアル）内に、水溶液として
、または再構成用の凍結乾燥製剤として、保存され得る。凍結乾燥製剤の一例として、１
０ｍＬバイアルは５ｍｌの滅菌濾過された１％（ｗ／ｖ）化合物水溶液を充填され、得ら
れた混合物は凍結乾燥される。輸液は、静菌的注射用蒸留水を用い凍結乾燥化合物を再構
成することによって調製される。
医薬組成物は、所望の製剤に応じて、動物またはヒトへの投与用の医薬組成物を製剤化
するために一般的に用いられるビヒクルとして定義される、薬剤的に許容できる、無毒の
希釈剤の担体（ｃａｒｒｉｅｒｓ ｏｆ ｄｉｌｕｅｎｔｓ）を含むことができる。希釈
剤は、その組み合わせの生物活性に影響を与えないように選択される。そのような希釈剤
の例は、蒸留水、緩衝化水、生理食塩水、ＰＢＳ、リンゲル液、デキストロース溶液、お
よびハンクス液である。さらに、医薬組成物または製剤は、他の担体、アジュバント、ま
たは無毒の、非治療的な、非免疫原性の安定剤、賦形剤等を含むことができる。本組成物
は、ｐＨ調整剤および緩衝剤、毒性調整剤、湿潤剤および界面活性剤等の生理的条件に近
づくための追加の物質も含むことができる。
本組成物は、例えば抗酸化剤等の、種々の安定化剤のいずれも含むことができる。本医
薬組成物がポリペプチドを含む場合、ポリペプチドは、ポリペプチドのインビボ安定性を
増強する、あるいはそれ以外にその薬理学的特性を増強する（例えば、ポリペプチドの半
減期を延長する、その毒性を減少させる、溶解性または取り込みを増強する）種々の周知
の化合物と複合体化することができる。そのような修飾剤または錯化剤の例としては、硫
酸塩、グルコン酸塩、クエン酸塩およびリン酸塩が挙げられる。組成物の核酸またはポリ
ペプチドは、インビボにおけるその特性を増強する分子と複合体化することもできる。そ
のような分子としては、例えば、炭水化物、ポリアミン、アミノ酸、他のペプチド、イオ
ン（例えば、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、マンガン）、および脂
質が挙げられる。
様々なタイプの投与に適した製剤についてのさらなる手引きは、Remington's Pharmace
utical Sciences, Mace Publishing Company, Philadelphia, Pa., 17th ed. (1985)に見
出すことができる。薬物送達法の簡潔な概略については、Langer, Science 249:1527-153
3 (1990)を参照されたい。
本医薬組成物は、予防的および／または治療的な処置のために投与することができる。
本活性成分の毒性および治療効果は、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に致死的な用量）
およびＥＤ５０（集団の５０％において治療効果のある用量）を決定することを含む、細
胞培養液および／または実験動物における、標準的な薬学的手法に従って決定することが
できる。毒性効果および治療効果間の用量比は治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０比と
して表すことができる。大きな治療指数を示す治療が好ましい。
細胞培養および／または動物試験から得られたデータは、ヒトに対するある範囲の投与
量を処方する際に用いることができる。本活性成分の投与量は、典型的には、毒性が低い
ＥＤ５０を含む血中濃度の範囲内に並ぶ。投与量は、使用される剤形および利用される投
与経路に応じて、この範囲内で変動し得る。
本医薬組成物を製剤化するのに使用される成分は、高純度であることが好ましく、潜在
的に有害な混入物を実質的に含まない（例えば、少なくとも、米国食品（Ｎａｔｉｏｎａ
ｌ Ｆｏｏｄ）（ＮＦ）グレード、一般的には、少なくとも分析用グレード、より典型的
には、少なくとも医薬品グレード）。さらに、インビボでの使用を意図される組成物は、
通常、無菌である。所与の化合物が使用前に合成されなければならない限りにおいて、得
られる産物は、典型的に、合成または精製の過程の間に存在し得る、いかなる潜在的に有
毒な作用剤も、特にいかなる内毒素も、実質的に含まない。非経口的（ｐａｒｅｎｔａｌ
）投与用の組成物も、無菌で、実質的に等張性であり、ＧＭＰ条件下で作製される。
特定の患者に与えられる治療用組成物の有効量は、種々の要因によって異なり、そのい
くつかは患者間で異なる。適任である臨床医は、患者に投与して必要に応じて病状の進行
を止めるまたは逆行させるための治療薬の有効量を決定することができる。ＬＤ５０動物
データ、および臨床医が使用可能である薬剤についての他の情報を利用して、臨床医は、
投与経路に応じて、個人に対する最大安全用量を決定することができる。例えば、静脈内
に投与される用量は、治療用組成物が投与されている流体がより大きいことを鑑みて、く
も膜下腔内に投与される用量よりも多い場合がある。同様に、身体から迅速にクリアラン
スされる組成物は、治療的濃度を維持するために、より高用量で、または反復投与で投与
されてもよい。通常の技術を用いて、適任である臨床医は、通例の臨床試験の間に、特定
の治療剤の投与量を最適化することができる。
遺伝子改変宿主細胞
本開示は、単離された遺伝子改変宿主細胞を含む、遺伝子改変宿主細胞を提供し、主題
の遺伝子改変宿主細胞は、１）外来性ＤＮＡ標的化ＲＮＡ；２）ＤＮＡ標的化ＲＮＡをコ
ードするヌクレオチド配列を含む外来性核酸；３）外来性部位特異的修飾ポリペプチド（
例えば、自然発生的Ｃａｓ９；修飾された、すなわち、変異型もしくは異型のＣａｓ９；
キメラＣａｓ９；等）；４）部位特異的修飾ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列
を含む外来性核酸；または５）上記のあらゆる組み合わせ、を含む（それで遺伝子改変さ
れている）。主題の遺伝子改変細胞は、宿主細胞を、例えば：１）外来性ＤＮＡ標的化Ｒ
ＮＡ；２）ＤＮＡ標的化ＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む外来性核酸；３）外
来性部位特異的修飾ポリペプチド；４）部位特異的修飾ポリペプチドをコードするヌクレ
オチド配列を含む外来性核酸；または５）上記のあらゆる組み合わせ、で遺伝子改変する
ことによって、作製される。
標的細胞となるのに適した細胞は全て、遺伝子改変宿主細胞となるのにも適している。
例えば、目的の遺伝子改変宿主細胞は、あらゆる細胞由来の細胞であり得る（例えば、細
菌細胞、古細菌細胞、単細胞真核生物の細胞、植物細胞、藻細胞、例えば、ボツリオコッ
カス・ブラウニー、コナミドリムシ、ナンノクロロプシス・ガディタナ、クロレラ・ピレ
ノイドサ、ヤツマタモク、Ｃ．アガルド等、真菌細胞（例えば、酵母細胞）、動物細胞、
無脊椎動物（例えばショウジョウバエ、刺胞動物、棘皮動物、線虫等）由来の細胞、脊椎
動物（例えば、魚類、両生類、爬虫類、鳥類、哺乳動物）由来の細胞、哺乳動物（例えば
、ブタ、雌ウシ、ヤギ、ヒツジ、げっ歯類動物、ラット、マウス、非ヒト霊長類動物、ヒ
ト等）由来の細胞等）。
いくつかの実施形態において、遺伝子改変宿主細胞は、部位特異的修飾ポリペプチド（
例えば、自然発生的なＣａｓ９；修飾された、すなわち、変異型もしくは異型のＣａｓ９
；キメラＣａｓ９；等）をコードするヌクレオチド配列を含む外来性核酸で遺伝子改変さ
れている。遺伝子改変宿主細胞のＤＮＡは、細胞に、ＤＮＡ標的化ＲＮＡ（または修飾さ
れる遺伝子位置／配列を決定する、ＤＮＡ標的化ＲＮＡをコードするＤＮＡ）および所望
によりドナー核酸を導入することにより、修飾の標的とすることができる。いくつかの実
施形態において、部位特異的修飾ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、誘導性
プロモーター（例えば、熱ショックプロモーター、テトラサイクリン調節プロモーター、
ステロイド調節プロモーター、金属調節プロモーター、エストロゲン受容体調節プロモー
ター等）に作動可能に連結している。いくつかの実施形態において、部位特異的修飾ポリ
ペプチドをコードするヌクレオチド配列は、空間限定的および／または時間限定的プロモ
ーター（例えば、組織特異的プロモーター、細胞型特異的プロモーター等）に作動可能に
連結している。いくつかの実施形態において、部位特異的修飾ポリペプチドをコードする
ヌクレオチド配列は、構成的プロモーターに作動可能に連結している。
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子改変宿主細胞はインビトロに存在する。い
くつかの実施形態において、主題の遺伝子改変宿主細胞はインビボに存在する。いくつか
の実施形態において、主題の遺伝子改変宿主細胞は、原核細胞であるか、または原核細胞
由来である。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子改変宿主細胞は、細菌細胞であ
るか、または細菌細胞由来である。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子改変宿主
細胞は、古細菌細胞であるか、または古細菌細胞由来である。いくつかの実施形態におい
て、主題の遺伝子改変宿主細胞は、真核細胞であるか、または真核細胞由来である。いく
つかの実施形態において、主題の遺伝子改変宿主細胞は、植物細胞であるか、または植物
細胞由来である。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子改変宿主細胞は、動物細胞
であるか、または動物細胞由来である。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子改変
宿主細胞は、無脊椎動物細胞であるか、または無脊椎動物細胞由来である。いくつかの実
施形態において、主題の遺伝子改変宿主細胞は、脊椎動物細胞であるか、または脊椎動物
細胞由来である。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子改変宿主細胞は、哺乳類細
胞であるか、または哺乳類細胞由来である。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子
改変宿主細胞は、げっ歯類細胞であるか、またはげっ歯類細胞由来である。いくつかの実
施形態において、主題の遺伝子改変宿主細胞は、ヒト細胞であるか、またはヒト細胞由来
である。
本開示はさらに、主題の遺伝子改変細胞の子孫を提供し、子孫はそれが由来する主題の
遺伝子改変細胞と同じ外来性核酸またはポリペプチドを含み得る。本開示はさらに、主題
の遺伝子改変宿主細胞を含む組成物を提供する。
遺伝子改変幹細胞および遺伝子改変前駆細胞
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子改変宿主細胞は遺伝子改変幹細胞または前
駆細胞である。適切な宿主細胞には、例えば、幹細胞（成体幹細胞、胚性幹細胞、ｉＰＳ
細胞等）および前駆細胞（例えば、心筋前駆細胞、神経前駆細胞等）が含まれる。適切な
宿主細胞には、例えば、げっ歯類幹細胞、げっ歯類前駆細胞、ヒト幹細胞、ヒト前駆細胞
等を含む、哺乳類の幹細胞および前駆細胞が含まれる。適切な宿主細胞には、インビトロ
の宿主細胞、例えば、単離された宿主細胞が含まれる。
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子改変宿主細胞は、外来性ＤＮＡ標的化ＲＮ
ＡＤＮＡ標的化ＲＮＡ核酸を含む。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子改変宿主
細胞は、ＤＮＡ標的化ＲＮＡＤＮＡ標的化ＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む外
来性核酸を含む。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子改変宿主細胞は、外来性部
位特異的修飾ポリペプチド（例えば、自然発生的なＣａｓ９；修飾された、すなわち、変
異型もしくは異型のＣａｓ９；キメラＣａｓ９；等）を含む。いくつかの実施形態におい
て、主題の遺伝子改変宿主細胞は、部位特異的修飾ポリペプチドをコードするヌクレオチ
ド配列を含む外来性核酸を含む。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子改変宿主細
胞は、１）ＤＮＡ標的化ＲＮＡおよび２）部位特異的修飾ポリペプチドをコードするヌク
レオチド配列を含む外来性核酸を含む。
いくつかの例において、部位特異的修飾ポリペプチドは、図３に示されるＣａｓ９／Ｃ
ｓｎ１アミノ酸配列のアミノ酸７〜１６６または７３１〜１００３に対して、または配列
番号１〜２５６および７９５〜１３４６として記載されるアミノ酸配列のうちのいずれか
における対応部分に対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８
５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または１００％
のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
組成物
本発明は、主題のＤＮＡ標的化ＲＮＡおよび／または部位特異的修飾ポリペプチドを含
む組成物を提供する。いくつかの例において、部位特異的修飾ポリペプチドは、主題のキ
メラポリペプチドである。主題の組成物は、本開示の方法、例えば、標的ＤＮＡの部位特
異的修飾の方法；標的ＤＮＡと結合したポリペプチドの部位特異的修飾の方法；等を実行
するのに有用である。
ＤＮＡ標的化ＲＮＡを含む組成物
本発明は、主題のＤＮＡ標的化ＲＮＡを含む組成物を提供する。本組成物は、ＤＮＡ標
的化ＲＮＡに加えて、塩、例えば、ＮａＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＫＣｌ、ＭｇＳＯ４等；緩衝
剤、例えば、トリス緩衝液、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（２−エ
タンスルホン酸）（ＨＥＰＥＳ）、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）
、ＭＥＳナトリウム塩、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、Ｎ−
トリス［ヒロドキシメチル］メチル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）等；可
溶化剤；界面活性剤、例えば、非イオン性界面活性剤、例えばトウィーン−２０等；ヌク
レアーゼ阻害剤；等のうちの一つまたは複数を含み得る。例えば、いくつかの例において
、主題の組成物は、主題のＤＮＡ標的化ＲＮＡおよび核酸を安定化させるための緩衝液を
含む。
いくつかの実施形態において、主題の組成物中に存在するＤＮＡ標的化ＲＮＡは、純粋
であり、例えば、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少な
くとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、また
は９９％超純粋であり、ここで、「％純粋」とは、ＤＮＡ標的化ＲＮＡが、他の高分子、
またはＤＮＡ標的化ＲＮＡを製造する間に存在し得る混入物を記載されたパーセントだけ
含まないことを意味する。
主題のキメラポリペプチドを含む組成物
本発明は、主題のキメラポリペプチド組成物を提供する。本組成物は、ＤＮＡ標的化Ｒ
ＮＡに加えて、塩、例えば、ＮａＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＫＣｌ、ＭｇＳＯ４等．；緩衝剤、
例えば、トリス緩衝液、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳ、ＭＥＳナトリウム塩、ＭＯＰＳ、ＴＡＰＳ
等；可溶化剤；界面活性剤、例えば、非イオン性界面活性剤、例えば、トウィーン−２０
等；プロテアーゼ阻害剤；還元剤（例えば、ジチオスレイトール）；等のうちの一つまた
は複数を含み得る。
いくつかの実施形態において、主題の組成物中に存在する主題のキメラポリペプチドは
、純粋であり、例えば、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％
、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％
、または９９％超純粋であり、ここで、「％純粋」とは、部位特異的修飾ポリペプチドが
、他のタンパク質、他の高分子、またはキメラポリペプチドを製造する間に存在し得る混
入物を記載されたパーセントだけ含まないことを意味する。
ＤＮＡ標的化ＲＮＡおよび部位特異的修飾ポリペプチドを含む組成物
本発明は、（ｉ）ＤＮＡ標的化ＲＮＡまたはそれをコードするＤＮＡポリヌクレオチド
；およびｉｉ）部位特異的修飾ポリペプチド、またはそれをコードするポリヌクレオチド
を含む組成物を提供する。いくつかの例において、部位特異的修飾ポリペプチドは、主題
のキメラ部位特異的修飾ポリペプチドである。他の例において、部位特異的修飾ポリペプ
チドは、自然発生的な部位特異的修飾ポリペプチドである。いくつかの例において、部位
特異的修飾ポリペプチドは、標的ＤＮＡを修飾する酵素活性を示す。他の例において、部
位特異的修飾ポリペプチドは、標的ＤＮＡと結合したポリペプチドを修飾する酵素活性を
示す。さらに他の例において、部位特異的修飾ポリペプチドは、標的ＤＮＡの転写を調節
する。
本発明は、（ｉ）（ａ）標的ＤＮＡ内の配列に対し相補的なヌクレオチド配列を含む第
一セグメント；および（ｂ）部位特異的修飾ポリペプチドと相互作用する第二セグメント
を含む上記のＤＮＡ標的化ＲＮＡ、またはそれをコードするＤＮＡポリヌクレオチド；並
びに（ｉｉ）（ａ）ＤＮＡ標的化ＲＮＡと相互作用するＲＮＡ結合部位；および（ｂ）部
位特異的酵素活性を示す活性部位であって、酵素活性の部位がＤＮＡ標的化ＲＮＡによっ
て決定される、活性部位を含む部位特異的修飾ポリペプチド、またはそれをコードするポ
リヌクレオチド、を含む、組成物を提供する。
いくつかの例において、主題の組成物は、（ｉ）（ａ）標的ＤＮＡ内の配列に対し相補
的なヌクレオチド配列を含む第一セグメント；および（ｂ）部位特異的修飾ポリペプチド
と相互作用する第二セグメントを含む主題のＤＮＡ標的化ＲＮＡ；並びに（ｉｉ）（ａ）
ＤＮＡ標的化ＲＮＡと相互作用するＲＮＡ結合部位；および（ｂ）部位特異的酵素活性を
示す活性部位であって、酵素活性の部位がＤＮＡ標的化ＲＮＡによって決定される、活性
部位を含む部位特異的修飾ポリペプチド、を含む、組成物を提供する。
他の実施形態では、主題の組成物は、（ｉ）（ａ）標的ＤＮＡ内の配列に対し相補的な
ヌクレオチド配列を含む第一セグメント；および（ｂ）部位特異的修飾ポリペプチドと相
互作用する第二セグメントを含む主題のＤＮＡ標的化ＲＮＡをコードするポリヌクレオチ
ド；並びに（ｉｉ）（ａ）ＤＮＡ標的化ＲＮＡと相互作用するＲＮＡ結合部位；および（
ｂ）部位特異的酵素活性を示す活性部位であって、酵素活性の部位がＤＮＡ標的化ＲＮＡ
によって決定される、活性部位を含む部位特異的修飾ポリペプチドをコードするポリヌク
レオチド、を含む。
いくつかの実施形態において、主題の組成物は、二重分子ＤＮＡ標的化ＲＮＡのＲＮＡ
分子の両方を含む。従って、いくつかの実施形態において、主題の組成物は、標的化ＲＮ
Ａの二本鎖形成セグメントに対し相補的な二本鎖形成セグメントを含む活性化ＲＮＡを含
む（図１Ａを参照）。活性化ＲＮＡおよび標的化ＲＮＡの二本鎖形成セグメントは、ハイ
ブリダイズしてＤＮＡ標的化ＲＮＡのタンパク質結合セグメントのｄｓＲＮＡ二本鎖を形
成する。標的化ＲＮＡはさらに、ＤＮＡ標的化ＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメント（一本鎖
）を与えることで、標的ＤＮＡ内の特定の配列に対してＤＮＡ標的化ＲＮＡを標的化する
。１つの非限定例として、活性化ＲＮＡの二本鎖形成セグメントは、配列５’−ＵＡＧＣ
ＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵ−３’（配列番号５６２）と少なくとも約７０％、少なくとも約８
０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または１００％
の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。別の非限定例として、標的化ＲＮＡの二本鎖
形成セグメントは、配列５’−ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡ−３’（配列番号６７９）と少
なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少
なくとも約９８％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
本開示は、（ｉ）（ａ）標的ＤＮＡ内の配列に対し相補的なヌクレオチド配列を含む第
一セグメント；および（ｂ）部位特異的修飾ポリペプチドと相互作用する第二セグメント
を含むＤＮＡ標的化ＲＮＡ、またはそれをコードするＤＮＡポリヌクレオチド；並びに（
ｉｉ）（ａ）ＤＮＡ標的化ＲＮＡと相互作用するＲＮＡ結合部位；および（ｂ）標的ＤＮ
Ａ内の転写を調節する活性部位であって、標的ＤＮＡ内の転写が調節される部位がＤＮＡ
標的化ＲＮＡによって決定される、活性部位を含む部位特異的修飾ポリペプチド、または
それをコードするポリヌクレオチド、を含む組成物を提供する。
例えば、いくつかの例において、主題の組成物は、（ｉ）（ａ）標的ＤＮＡ内の配列に
対し相補的なヌクレオチド配列を含む第一セグメント；および（ｂ）部位特異的修飾ポリ
ペプチドと相互作用する第二セグメントを含むＤＮＡ標的化ＲＮＡ；並びに（ｉｉ）（ａ
）ＤＮＡ標的化ＲＮＡと相互作用するＲＮＡ結合部位；および（ｂ）標的ＤＮＡ内の転写
を調節する活性部位であって、標的ＤＮＡ内の転写が調節される部位がＤＮＡ標的化ＲＮ
Ａによって決定される、活性部位を含む部位特異的修飾ポリペプチド、を含む。
別の例として、いくつかの例において、主題の組成物は、（ｉ）（ａ）標的ＤＮＡ内の
配列に対し相補的なヌクレオチド配列を含む第一セグメント；および（ｂ）部位特異的修
飾ポリペプチドと相互作用する第二セグメントを含むＤＮＡ標的化ＲＮＡをコードするＤ
ＮＡポリヌクレオチド；並びに（ｉｉ）（ａ）ＤＮＡ標的化ＲＮＡと相互作用するＲＮＡ
結合部位；および（ｂ）標的ＤＮＡ内の転写を調節する活性部位であって、標的ＤＮＡ内
の転写が調節される部位がＤＮＡ標的化ＲＮＡによって決定される、活性部位を含む部位
特異的修飾ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
主題の組成物は、ｉ）主題のＤＮＡ標的化ＲＮＡ、またはそれをコードするＤＮＡポリ
ヌクレオチド；およびｉｉ）部位特異的修飾ポリペプチド、またはそれをコードするポリ
ヌクレオチドに加えて、塩、例えば、ＮａＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＫＣｌ、ＭｇＳＯ４等；緩
衝剤、例えば、トリス緩衝液、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳ、ＭＥＳナトリウム塩、ＭＯＰＳ、Ｔ
ＡＰＳ等；可溶化剤；界面活性剤、例えば、非イオン性界面活性剤、例えば、トウィーン
−２０等；プロテアーゼ阻害剤；還元剤（例えば、ジチオスレイトール）；等のうちの一
つまたは複数を含み得る。
いくつかの例において、本組成物の成分は、それぞれ純粋であり、例えば、各成分は、
少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、
少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または少なくとも９９％純粋である。いくつ
かの例において、主題の組成物のそれぞれの成分は、該組成物に加えられる前に、純粋で
ある。
例えば、いくつかの実施形態において、主題の組成物中に存在する部位特異的修飾ポリ
ペプチドは、純粋であり、例えば、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくと
も約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくと
も約９９％、または９９％超純粋であり、ここで、「％純粋」とは、部位特異的修飾ポリ
ペプチドが、他のタンパク質（例えば、部位特異的修飾ポリペプチド以外のタンパク質）
、他の高分子、または部位特異的修飾ポリペプチドを製造する間に存在し得る混入物を記
載のパーセントだけ含まないことを意味する。
キット
本開示は主題の方法を実行するためのキットを提供する。主題のキットは、部位特異的
修飾ポリペプチド；部位特異的修飾ポリペプチドをコードするヌクレオチドを含む核酸；
ＤＮＡ標的化ＲＮＡ；ＤＮＡ標的化ＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む核酸；活
性化ＲＮＡ；活性化ＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む核酸；標的化ＲＮＡ；お
よび標的化ＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む核酸のうちの一つまたは複数を含
み得る。部位特異的修飾ポリペプチド；部位特異的修飾ポリペプチドをコードするヌクレ
オチドを含む核酸；ＤＮＡ標的化ＲＮＡ；ＤＮＡ標的化ＲＮＡをコードするヌクレオチド
配列を含む核酸；活性化ＲＮＡ；活性化ＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む核酸
；標的化ＲＮＡ；および標的化ＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む核酸は、上記
において詳細に説明されている。キットは、部位特異的修飾ポリペプチド；部位特異的修
飾ポリペプチドをコードするヌクレオチドを含む核酸；ＤＮＡ標的化ＲＮＡ；ＤＮＡ標的
化ＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む核酸；活性化ＲＮＡ；活性化ＲＮＡをコー
ドするヌクレオチド配列を含む核酸；標的化ＲＮＡ；および標的化ＲＮＡをコードするヌ
クレオチド配列を含む核酸のうちの２つ以上を含む複合体を含み得る。
いくつかの実施形態において、主題のキットは、部位特異的修飾ポリペプチド、または
それをコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、部位特異的修
飾ポリペプチドは、（ａ）ＤＮＡ標的化ＲＮＡと相互作用するＲＮＡ結合部位；および（
ｂ）標的ＤＮＡ内の転写を調節する活性部位であって、標的ＤＮＡ内の転写が調節される
部位がＤＮＡ標的化ＲＮＡによって決定される、活性部位を含む。いくつかの例において
、部位特異的修飾ポリペプチドの活性部位は、低減された、または不活性化されたヌクレ
アーゼ活性を示す。いくつかの例において、部位特異的修飾ポリペプチドは、キメラ部位
特異的修飾ポリペプチドである。
いくつかの実施形態において、主題のキットは、部位特異的修飾ポリペプチド、または
それをコードするポリヌクレオチド、並びに部位特異的修飾ポリペプチドを再構成および
／または希釈するための試薬を含む。他の実施形態では、主題のキットは、部位特異的修
飾ポリペプチドをコードするヌクレオチドを含む核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ）を含む
。いくつかの実施形態において、主題のキットは、部位特異的修飾ポリペプチドをコード
するヌクレオチドを含む核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ）；並びに部位特異的修飾ポリペ
プチドを再構成および／または希釈するための試薬を含む。
部位特異的修飾ポリペプチド、またはそれをコードするポリヌクレオチドを含む主題の
キットはさらに、一つまたは複数の追加の試薬を含む場合があり、そのような追加の試薬
は、細胞に部位特異的修飾ポリペプチドを導入させるための緩衝液；洗浄緩衝液；対照試
薬；対照発現ベクターまたはＲＮＡポリヌクレオチド；ＤＮＡから部位特異的修飾ポリペ
プチドをインビトロ生成するための試薬等から選択され得る。いくつかの例において、主
題のキットに含まれる部位特異的修飾ポリペプチドは、上記のキメラ部位特異的修飾ポリ
ペプチドである。
いくつかの実施形態において、主題のキットは、（ａ）標的ＤＮＡ内の配列に対し相補
的なヌクレオチド配列を含む第一セグメント；および（ｂ）部位特異的修飾ポリペプチド
と相互作用する第二セグメントを含むＤＮＡ標的化ＲＮＡ、またはそれをコードするＤＮ
Ａポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、ＤＮＡ標的化ＲＮＡはさらに
、第三のセグメント（上記）を含む。いくつかの実施形態において、主題のキットは、（
ｉ）（ａ）標的ＤＮＡ内の配列に対し相補的なヌクレオチド配列を含む第一セグメント；
および（ｂ）部位特異的修飾ポリペプチドと相互作用する第二セグメントを含むＤＮＡ標
的化ＲＮＡ、またはそれをコードするＤＮＡポリヌクレオチド；並びに（ｉｉ）（ａ）Ｄ
ＮＡ標的化ＲＮＡと相互作用するＲＮＡ結合部位；および（ｂ）部位特異的酵素活性を示
す活性部位であって、酵素活性の部位がＤＮＡ標的化ＲＮＡによって決定される、活性部
位を含む部位特異的修飾ポリペプチド、またはそれをコードするポリヌクレオチド、を含
む。いくつかの実施形態において、部位特異的修飾ポリペプチドの活性部位は、酵素活性
を示さない（例えば変異により、不活性化されたヌクレアーゼを含む）。いくつかの例に
おいて、本キットは、ＤＮＡ標的化ＲＮＡおよび部位特異的修飾ポリペプチドを含む。他
の例において、本キットは、（ｉ）ＤＮＡ標的化ＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を
含む核酸；および（ｉｉ）部位特異的修飾ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を
含む核酸を含む。
別の例として、主題のキットは、（ｉ）（ａ）標的ＤＮＡ内の配列に対し相補的なヌク
レオチド配列を含む第一セグメント；および（ｂ）部位特異的修飾ポリペプチドと相互作
用する第二セグメントを含むＤＮＡ標的化ＲＮＡ、またはそれをコードするＤＮＡポリヌ
クレオチド；並びに（ｉｉ）（ａ）ＤＮＡ標的化ＲＮＡと相互作用するＲＮＡ結合部位；
および（ｂ）標的ＤＮＡ内の転写を調節する活性部位であって、標的ＤＮＡ内の転写が調
節される部位がＤＮＡ標的化ＲＮＡによって決定される、活性部位を含む部位特異的修飾
ポリペプチド、またはそれをコードするポリヌクレオチドを含み得る。いくつかの例にお
いて、本キットは、（ｉ）ＤＮＡ標的化ＲＮＡ；および部位特異的修飾ポリペプチドを含
む。他の例において、本キットは、（ｉ）ＤＮＡ標的化ＲＮＡをコードするヌクレオチド
配列を含む核酸；および（ｉｉ）部位特異的修飾ポリペプチドをコードするヌクレオチド
配列を含む核酸を含む。
本開示は、（１）（ｉ）（ａ）標的ＤＮＡ内の配列に対し相補的なヌクレオチド配列を
含む第一セグメント；および（ｂ）部位特異的修飾ポリペプチドと相互作用する第二セグ
メントを含むＤＮＡ標的化ＲＮＡをコードするヌクレオチド配列；並びに（ｉｉ）（ａ）
ＤＮＡ標的化ＲＮＡと相互作用するＲＮＡ結合部位；および（ｂ）部位特異的酵素活性を
示す活性部位であって、酵素活性の部位がＤＮＡ標的化ＲＮＡによって決定される、活性
部位を含む部位特異的修飾ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、を含む組み換え
発現ベクター；並びに（２）発現ベクターの再構成および／または希釈のための試薬、を
含むキットを提供する。
本開示は、（１）（ｉ）（ａ）標的ＤＮＡ内の配列に対し相補的なヌクレオチド配列を
含む第一セグメント；および（ｂ）部位特異的修飾ポリペプチドと相互作用する第二セグ
メントを含むＤＮＡ標的化ＲＮＡをコードするヌクレオチド配列；並びに（ｉｉ）（ａ）
ＤＮＡ標的化ＲＮＡと相互作用するＲＮＡ結合部位；および（ｂ）標的ＤＮＡ内の転写を
調節する活性部位であって、標的ＤＮＡ内の転写が調節される部位がＤＮＡ標的化ＲＮＡ
によって決定される、活性部位を含む部位特異的修飾ポリペプチドをコードするヌクレオ
チド配列、を含む組み換え発現ベクター；並びに（２）組み換え発現ベクターの再構成お
よび／または希釈のための試薬、を含むキットを提供する。
本開示は、（１）（ｉ）標的ＤＮＡ内の配列に対し相補的なヌクレオチド配列を含む第
一セグメント；および（ｉｉ）部位特異的修飾ポリペプチドと相互作用する第二セグメン
ト、を含むＤＮＡ標的化ＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む組み換え
発現ベクター；並びに（２）組み換え発現ベクターの再構成および／または希釈のための
試薬、を含むキットを提供する。本キットのいくつかの実施形態において、本キットは、
（ａ）ＤＮＡ標的化ＲＮＡと相互作用するＲＮＡ結合部位；および（ｂ）部位特異的酵素
活性を示す活性部位であって、酵素活性の部位がＤＮＡ標的化ＲＮＡによって決定される
、活性部位を含む部位特異的修飾ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む組み
換え発現ベクターを含む。本キットの他の実施形態では、本キットは、（ａ）ＤＮＡ標的
化ＲＮＡと相互作用するＲＮＡ結合部位；および（ｂ）標的ＤＮＡ内の転写を調節する活
性部位であって、標的ＤＮＡ内の転写が調節される部位がＤＮＡ標的化ＲＮＡによって決
定される、活性部位を含む部位特異的修飾ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を
含む組み換え発現ベクターを含む。
上記のキットのいずれかのいくつかの実施形態において、本キットは、活性化ＲＮＡま
たは標的化ＲＮＡを含む。上記のキットのいずれかのいくつかの実施形態において、本キ
ットは、単一分子ＤＮＡ標的化ＲＮＡを含む。上記のキットのいずれかのいくつかの実施
形態において、本キットは、２つ以上の二重分子または単一分子ＤＮＡ標的化ＲＮＡを含
む。上記のキットのいずれかのいくつかの実施形態において、（例えば、２つ以上のＤＮ
Ａ標的化ＲＮＡを含む）ＤＮＡ標的化ＲＮＡは、アレイ（例えば、ＲＮＡ分子のアレイ、
ＤＮＡ標的化ＲＮＡ（複数可）をコードするＤＮＡ分子のアレイ等）として提供され得る
。そのようなキットは、例えば、主題の部位特異的修飾ポリペプチドを含む上記の遺伝子
改変宿主細胞と併せた使用において有用であり得る。上記のキットのいずれかのいくつか
の実施形態において、本キットはさらに、所望の遺伝子改変をもたらすドナーポリヌクレ
オチドを含む。主題のキットの構成要素は、別々の容器中に存在していてもよいし；ある
いは単一の容器中で混合されていてもよい。
前述のキットのいずれかは、一つまたは複数の追加の試薬をさらに含む場合があり、そ
のような追加の試薬は、希釈緩衝液；再構成溶液；洗浄緩衝液；対照試薬；対照発現ベク
ターまたはＲＮＡポリヌクレオチド；ＤＮＡから部位特異的修飾ポリペプチドをインビト
ロ生成するための試薬等から選択され得る。
上記構成要素に加えて、主題のキットは、キットの構成要素を用いて主題の方法を実施
するための説明書をさらに含み得る。主題の方法を実施するための説明書は、一般的には
、適切な記録媒体上に記録される。例えば、説明書は、紙またはプラスチック等の基体上
に印刷されていてもよい。従って、説明書は、添付文書としてキット内に、キットまたは
その構成要素の容器の標識中（すなわち、パッケージまたはサブパッケージに付随して）
等、存在していてもよい。他の実施形態では、説明書は、適切なコンピューター可読の記
憶媒体、例えばＣＤ−ＲＯＭ、ディスケット、フラッシュドライブ等上に存在する電子記
憶データファイルとして存在する。さらに他の実施形態においては、実際の説明書がキッ
ト内に存在しないが、例えばインターネットを介して、遠隔の供給源から説明書を得るた
めの手段が提供される。この実施形態の一例は、説明書を閲覧することができる、および
／または説明書をダウンロードすることができる、ウェブアドレスを含むキットである。
説明書と同様、説明書を得るためのこの手段は、適切な基体上に記録される。
非ヒト遺伝子改変生物
いくつかの実施形態において、遺伝子改変宿主細胞は、部位特異的修飾ポリペプチド（
例えば、自然発生的なＣａｓ９；修飾された、すなわち、変異型もしくは異型のＣａｓ９
；キメラＣａｓ９；等）をコードするヌクレオチド配列を含む外来性核酸で遺伝子改変さ
れている。そのような細胞が真核単細胞生物である場合、修飾された細胞は遺伝子改変生
物とみなすことができる。いくつかの実施形態において、主題の非ヒト遺伝子改変生物は
、Ｃａｓ９遺伝子導入多細胞生物である。
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子改変非ヒト宿主細胞（例えば、部位特異的
修飾ポリペプチド、例えば、自然発生的なＣａｓ９；修飾された、すなわち、変異型もし
くは異型のＣａｓ９；キメラＣａｓ９；等をコードするヌクレオチド配列を含む外来性核
酸で遺伝子改変された細胞）は、主題の遺伝子改変非ヒト生物（例えば、マウス、魚、カ
エル、ハエ、虫等）を作製することができる。例えば、遺伝子改変宿主細胞が多能性幹細
胞（すなわち、ＰＳＣ）または生殖細胞（例えば、精子、卵子等）である場合、遺伝子改
変生物の全体は、その遺伝子改変宿主細胞に由来し得る。いくつかの実施形態において、
遺伝子改変宿主細胞は、遺伝子改変生物を生じることができる、インビボまたはインビト
ロのいずれかの、多能性幹細胞（例えば、ＥＳＣ、ｉＰＳＣ、多能性植物幹細胞等）また
は生殖細胞（例えば、精子細胞、卵子等）である。いくつかの実施形態において、遺伝子
改変宿主細胞は、脊椎動物ＰＳＣ（例えば、ＥＳＣ、ｉＰＳＣ等）であり、（例えば、Ｐ
ＳＣを胚盤胞に注入してキメラ／モザイク動物を作製し、次に交配させて非キメラ／非モ
ザイク遺伝子改変生物を作製することによって；植物の場合は接木することによって；等
）遺伝子改変生物を作製するのに用いられる。本明細書に記載の方法を含む、遺伝子改変
生物を作製するためのいかなる好都合な方法／プロトコルも、部位特異的修飾ポリペプチ
ド（例えば、自然発生的なＣａｓ９；修飾された、すなわち、変異型もしくは異型のＣａ
ｓ９；キメラＣａｓ９；等）をコードするヌクレオチド配列を含む外来性核酸を含む遺伝
子改変宿主細胞を作製するのに適している。遺伝子改変生物を作製する方法は、当該技術
分野において公知である。例えば、Cho et al., Curr Protoc Cell Biol. 2009 Mar;Chap
ter 19:Unit 19.11: Generation of transgenic mice; Gama et al., Brain Struct Func
t. 2010 Mar;214(2-3):91-109. Epub 2009 Nov 25: Animal transgenesis: an overview;
Husaini et al., GM Crops. 2011 Jun-Dec;2(3):150-62. Epub 2011 Jun 1: Approaches
for gene targeting and targeted gene expression in plantsを参照されたい。
いくつかの実施形態において、遺伝子改変生物は、本発明の方法のための標的細胞を含
み、従って、標的細胞の供給源とみなすことができる。例えば、部位特異的修飾ポリペプ
チド（例えば、自然発生的なＣａｓ９；修飾された、すなわち、変異型もしくは異型のＣ
ａｓ９；キメラＣａｓ９；等）をコードするヌクレオチド配列を含む外来性核酸を含む遺
伝子改変細胞が遺伝子改変生物を作製するために用いられる場合、遺伝子改変生物の細胞
は、部位特異的修飾ポリペプチド（例えば、自然発生的なＣａｓ９；修飾された、すなわ
ち、変異型もしくは異型のＣａｓ９；キメラＣａｓ９；等）をコードするヌクレオチド配
列を含む外来性核酸を含む。いくつかのそのような実施形態において、遺伝子改変生物の
１つまたは複数の細胞のＤＮＡは、１つまたは複数の細胞に、ＤＮＡ標的化ＲＮＡ（また
はＤＮＡ標的化ＲＮＡをコードするＤＮＡ）および所望によりドナー核酸を導入すること
により、修飾の標的とすることができる。例えば、ＤＮＡ標的化ＲＮＡ（またはＤＮＡ標
的化ＲＮＡをコードするＤＮＡ）の、遺伝子改変生物の一部の細胞（例えば、脳細胞、腸
細胞、腎細胞、肺細胞、血液細胞等）への導入は、そのような細胞のＤＮＡを修飾の標的
にすることができ、修飾の遺伝子位置は導入されたＤＮＡ標的化ＲＮＡのＤＮＡ標的配列
に依存する。
いくつかの実施形態において、遺伝子改変生物は、本発明の方法のための標的細胞の供
給源である。例えば、部位特異的修飾ポリペプチド（例えば、自然発生的なＣａｓ９；修
飾された、すなわち、変異型もしくは異型のＣａｓ９；キメラＣａｓ９；等）をコードす
るヌクレオチド配列を含む外来性核酸で遺伝子改変された細胞を含む遺伝子改変生物は、
遺伝子改変細胞、例えばＰＳＣ（例えば、ＥＳＣ、ｉＰＳＣ、精子、卵子、等）、ニュー
ロン、前駆細胞、心筋細胞等の供給源を提供し得る。
いくつかの実施形態において、遺伝子改変細胞は、部位特異的修飾ポリペプチド（例え
ば、自然発生的なＣａｓ９；修飾された、すなわち、変異型もしくは異型のＣａｓ９；キ
メラＣａｓ９；等）をコードするヌクレオチド配列を含む外来性核酸を含むＰＳＣである
。従って、ＰＳＣは、ＰＳＣのＤＮＡが、ＰＳＣにＤＮＡ標的化ＲＮＡ（またはＤＮＡ標
的化ＲＮＡをコードするＤＮＡ）および所望によりドナー核酸を導入することにより、修
飾の標的となることができ、修飾の遺伝子位置が、導入されたＤＮＡ標的化ＲＮＡのＤＮ
Ａ標的配列に依存するような、標的細胞であり得る。従って、いくつかの実施形態におい
て、本明細書に記載の方法を用いることで、主題の遺伝子改変生物に由来するＰＳＣのＤ
ＮＡを修飾（例えば、あらゆる所望の遺伝子位置を欠失および／または置換）することが
できる。そのような修飾されたＰＳＣは、次に、（ｉ）部位特異的修飾ポリペプチド（例
えば、自然発生的なＣａｓ９；修飾された、すなわち、変異型もしくは異型のＣａｓ９；
キメラＣａｓ９；等）をコードするヌクレオチド配列を含む外来性核酸および（ｉｉ）Ｐ
ＳＣに導入されたＤＮＡ修飾の両方を有する生物を作製するために用いることができる。
部位特異的修飾ポリペプチド（例えば、自然発生的なＣａｓ９；修飾された、すなわち
、変異型もしくは異型のＣａｓ９；キメラＣａｓ９；等）をコードするヌクレオチド配列
を含む外来性核酸は、未知のプロモーターの制御下にあり得（すなわち、それに作動可能
に連結している）（例えば、核酸が宿主細胞ゲノムに無作為に組み込まれた場合）、また
は、公知のプロモーターの制御下にあり得る（すなわち、それに作動可能に連結している
）。適切な公知のプロモーターは、いかなる公知のプロモーターであってもよく、恒常的
活性型プロモーター（例えば、ＣＭＶプロモーター）、誘導性プロモーター（例えば、熱
ショックプロモーター、テトラサイクリン調節プロモーター、ステロイド調節プロモータ
ー、金属調節プロモーター、エストロゲン受容体調節プロモーター等）、空間限定的およ
び／または時間限定的プロモーター（例えば、組織特異的プロモーター、細胞型特異的プ
ロモーター等）等が含まれる。
主題の遺伝子改変生物（例えば、細胞が、部位特異的修飾ポリペプチド、例えば、自然
発生的なＣａｓ９；修飾された、すなわち、変異型もしくは異型のＣａｓ９；キメラＣａ
ｓ９；等をコードするヌクレオチド配列を含む生物）は、いかなる生物であってもよく、
例えば、植物；藻類；無脊椎動物（例えば、刺胞動物、棘皮動物、虫、ハエ等）；脊椎動
物（例えば、魚（例えば、ゼブラフィッシュ、フグ、キンギョ等）、両生類動物（例えば
、サンショウウオ、カエル等）、爬虫類動物、鳥、哺乳動物等）；有蹄動物（例えば、ヤ
ギ、ブタ、ヒツジ、雌ウシ等）；げっ歯類動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、
モルモット）；ウサギ目（例えば、ウサギ）；等が含まれる。
いくつかの例において、部位特異的修飾ポリペプチドは、図３に示されるＣａｓ９／Ｃ
ｓｎ１アミノ酸配列のアミノ酸７〜１６６または７３１〜１００３に対して、または配列
番号１〜２５６および７９５〜１３４６として記載されるアミノ酸配列のうちのいずれか
における対応部分に対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８
５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または１００％
のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
遺伝子導入非ヒト動物
上記のように、いくつかの実施形態において、主題の核酸（例えば、部位特異的修飾ポ
リペプチド、例えば、自然発生的なＣａｓ９；修飾された、すなわち、変異型もしくは異
型のＣａｓ９；キメラＣａｓ９；等をコードするヌクレオチド配列）または主題の組み換
え発現ベクターは、部位特異的修飾ポリペプチドを産生する遺伝子導入動物を作製するた
めの導入遺伝子として用いられる。従って、本発明はさらに、上記の、部位特異的修飾ポ
リペプチド、例えば、自然発生的なＣａｓ９；修飾された、すなわち、変異型もしくは異
型のＣａｓ９；キメラＣａｓ９；等をコードするヌクレオチド配列を含む主題の核酸を含
む導入遺伝子を含む、遺伝子導入非ヒト動物を提供する。いくつかの実施形態において、
遺伝子導入非ヒト動物のゲノムは、部位特異的修飾ポリペプチドをコードする主題のヌク
レオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、遺伝子導入非ヒト動物は、遺伝子改
変にとってホモ接合性である。いくつかの実施形態において、遺伝子導入非ヒト動物は、
遺伝子改変にとってヘテロ接合性である。いくつかの実施形態において、遺伝子導入非ヒ
ト動物は、脊椎動物、例えば、魚（例えば、ゼブラフィッシュ、キンギョ、フグ、洞窟魚
等）、両生類動物（カエル、サンショウウオ等）、鳥（例えば、ニワトリ、シチメンチョ
ウ等）、爬虫類動物（例えば、ヘビ、トカゲ等）、哺乳動物（例えば、有蹄動物、例えば
、ブタ、雌ウシ、ヤギ、ヒツジ等；ウサギ（例えば、ウサギ）；げっ歯類動物（例えば、
ラット、マウス）；非ヒト霊長類；等）等である。
部位特異的修飾ポリペプチド（例えば、自然発生的なＣａｓ９；修飾された、すなわち
、変異型もしくは異型のＣａｓ９；キメラＣａｓ９；等）をコードするヌクレオチド配列
を含む外来性核酸は、未知のプロモーターの制御下にあり得（すなわち、それに作動可能
に連結している）（例えば、核酸が宿主細胞ゲノムに無作為に組み込まれた場合）、また
は、公知のプロモーターの制御下にあり得る（すなわち、それに作動可能に連結している
）。適切な公知のプロモーターは、いかなる公知のプロモーターであってもよく、恒常的
活性型プロモーター（例えば、ＣＭＶプロモーター）、誘導性プロモーター（例えば、熱
ショックプロモーター、テトラサイクリン調節プロモーター、ステロイド調節プロモータ
ー、金属調節プロモーター、エストロゲン受容体調節プロモーター等）、空間限定的およ
び／または時間限定的プロモーター（例えば、組織特異的プロモーター、細胞型特異的プ
ロモーター等）等が含まれる。
いくつかの例において、部位特異的修飾ポリペプチドは、図３に示されるＣａｓ９／Ｃ
ｓｎ１アミノ酸配列のアミノ酸７〜１６６または７３１〜１００３に対して、または配列
番号１〜２５６および７９５〜１３４６として記載されるアミノ酸配列のうちのいずれか
における対応部分に対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８
５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または１００％
のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
遺伝子導入植物
上記のように、いくつかの実施形態において、主題の核酸（例えば、部位特異的修飾ポ
リペプチド、例えば、自然発生的なＣａｓ９；修飾された、すなわち、変異型もしくは異
型のＣａｓ９；キメラＣａｓ９；等をコードするヌクレオチド配列）または主題の組み換
え発現ベクターは、部位特異的修飾ポリペプチドを産生する遺伝子導入植物を作製するた
めの導入遺伝子として用いられる。従って、本発明はさらに、上記の、部位特異的修飾ポ
リペプチド、例えば、自然発生的なＣａｓ９；修飾された、すなわち、変異型もしくは異
型のＣａｓ９；キメラＣａｓ９；等をコードするヌクレオチド配列を含む主題の核酸を含
む導入遺伝子を含む、遺伝子導入植物を提供する。いくつかの実施形態において、遺伝子
導入植物のゲノムは主題の核酸を含む。いくつかの実施形態において、遺伝子導入植物は
、遺伝子改変にとってホモ接合性である。いくつかの実施形態において、遺伝子導入植物
は、遺伝子改変にとってヘテロ接合性である。
外来性核酸を植物細胞に導入する方法は当該技術分野において周知である。そのような
植物細胞は、上記で定義されたように、「形質転換されている」とみなされる。適切な方
法には、ウイルス感染（二本鎖ＤＮＡウイルス等）、トランスフェクション、接合（ｃｏ
ｎｊｕｇａｔｉｏｎ）、原形質融合、エレクトロポレーション、パーティクルガン技術、
リン酸カルシウム沈殿、直接マイクロインジェクション、シリコンカーバイドウィスカー
技術、アグロバクテリウム属介在性形質転換等が含まれる。方法の選択は、一般的には、
形質転換される細胞の種類および形質転換が起こる環境（すなわち、インビトロ、エキソ
ビボ、またはインビボ）に依存する。
土壌細菌アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕ
ｍｅｆａｃｉｅｎｓ）に基づく形質転換法は、外来性核酸分子を維管束植物に導入するの
に特に有用である。アグロバクテリウム属の野生型は、宿主植物における腫瘍形成性クラ
ウンゴール成長の生成を指示するＴｉ（腫瘍誘導性）プラスミドを含有する。植物ゲノム
へのＴｉプラスミドの腫瘍誘導性Ｔ−ＤＮＡ領域の導入は、Ｔｉプラスミドにコードされ
た病原性遺伝子および導入される領域を表す一連の直接ＤＮＡ反復であるＴ−ＤＮＡボー
ダーを必要とする。アグロバクテリウム属に基づくベクターは、腫瘍誘導性機能が植物宿
主に導入される目的の核酸配列によって置換されている、Ｔｉプラスミドの修飾形態であ
る。
アグロバクテリウム属介在性形質転換は、一般的に、Ｔｉプラスミドの成分が、アグロ
バクテリウム属宿主内に恒久的に存在し病原性遺伝子を保有するヘルパーベクター、およ
びＴ−ＤＮＡ配列が結合した目的の遺伝子を含有するシャトルベクターの間で分割されて
いる、共統合ベクターまたは二成分ベクター系を用いる。種々の二成分ベクターは当該技
術分野において周知であり、例えば、クロンテック社（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）（カリフォル
ニア州パロアルト）から市販されている。例えば、アグロバクテリウム属を、培養植物細
胞または葉組織、根外植片、子葉下部（ｈｙｐｏｃｏｔｙｌｅｄｏｎ）、茎断片もしくは
塊茎等の損傷組織と共に共培養する方法も、当該技術分野において周知である。例えば、
Glick and Thompson, (eds.), Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology
, Boca Raton, Fla.: CRC Press (1993)を参照されたい。
マイクロ射出（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ）による形質転換も、主題の遺伝子導
入植物を作製するために用いることができる。Klein et al. (Nature 327:70-73 (1987))
に最初に報告されたこの方法は、塩化カルシウム、スペルミジンまたはポリエチレングリ
コールを用いた沈殿により所望の核酸分子で被膜された金またはタングステン等のマイク
ロ射出に依存している。マイクロ射出粒子は、ＢＩＯＬＩＳＴＩＣ ＰＤ−１０００（バ
イオラド社（Ｂｉｏｒａｄ）；カリフォルニア州ハーキュリーズ）等の装置を用いて、被
子植物組織内に高速で加速される。
主題の核酸は、核酸が植物細胞（複数可）に侵入できるような方法、例えば、インビボ
またはエキソビボのプロトコルで、植物に導入することができる。「インビボ」とは、核
酸が、生きている状態の植物に、例えば浸透によって導入されることを意味する。「エキ
ソビボ」とは、細胞または外植片が植物の外側で改変され、係る細胞または生物が植物に
再生することを意味する。植物細胞の安定な形質転換または遺伝子導入植物の確立に適し
たいくつかのベクターが記載されており、例えば、Weissbach and Weissbach, (1989) Me
thods for Plant Molecular Biology Academic Press、およびGelvin et al., (1990) Pl
ant Molecular Biology Manual, Kluwer Academic Publishersに記載されるものである。
具体例としては、アグロバクテリウム・ツメファシエンスのＴｉプラスミドに由来するベ
クター、およびHerrera-Estrella et al. (1983) Nature 303: 209, Bevan (1984) Nucl
Acid Res. 12: 8711-8721, Klee (1985) Bio/Technolo 3: 637-642に開示されるベクター
が挙げられる。あるいは、非Ｔｉベクターを用いて、遊離ＤＮＡ送達法（free DNA deliv
ery technique）で、ＤＮＡを植物および細胞に導入することができる。これらの方法を
用いることによって、コムギ、イネ（Christou (1991) Bio/Technology 9:957-9 and 446
2）およびトウモロコシ（Gordon-Kamm (1990) Plant Cell 2: 603-618）等の遺伝子導入
植物を作製することができる。未成熟の胚は、単子葉植物に対する、パーティクルガン（
Weeks et al. (1993) Plant Physiol 102: 1077-1084; Vasil (1993) Bio/Technolo 10:
667-674; Wan and Lemeaux (1994) Plant Physiol 104: 37-48）を使用する直接ＤＮＡ送
達法に、およびアグロバクテリウムによるＤＮＡ輸送（Ishida et al. (1996) Nature Bi
otech 14: 745-750）に良好な標的組織にもなり得る。葉緑体にＤＮＡを導入するための
例示的な方法は、遺伝子銃法（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）、ポリエ
チレングリコールによるプロトプラストの形質転換、およびマイクロインジェクションで
ある（Danieli et al Nat. Biotechnol 16:345-348, 1998; Staub et al Nat. Biotechno
l 18: 333-338, 2000; O’Neill et al Plant J. 3:729-738, 1993; Knoblauch et al Na
t. Biotechnol 17: 906-909；米国特許第５，４５１，５１３号、同第５，５４５，８１
７号、同第５，５４５，８１８号、および同第５，５７６，１９８号；国際公開第９５／
１６７８３号；並びにBoynton et al., Methods in Enzymology 217: 510-536 (1993), S
vab et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 913-917 (1993)、およびMcBride et al.,
Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91: 7301-7305 (1994)）。遺伝子銃法、ポリエチレングリ
コールによるプロトプラストの形質転換、およびマイクロインジェクションの方法に適し
たいかなるベクターも、葉緑体の形質転換のためのターゲッティングベクターとして適切
である。いかなる２本鎖ＤＮＡベクターも、特に導入法がアグロバクテリウムを使用しな
い場合は、形質転換用ベクターとして使用することができる。
遺伝子改変可能な植物には、穀物類、飼料作物、果物、野菜類、油料種子作物、パーム
ヤシ、樹木（ｆｏｒｅｓｔｒｙ）、およびツル植物が含まれる。改変可能な植物の具体例
を以下に挙げる：トウモロコシ、バナナ、ピーナツ、フィールドピー、ヒマワリ、トマト
、アブラナ、タバコ、コムギ、オオムギ、カラスムギ、ジャガイモ、ダイズ、ワタ、カー
ネーション、モロコシ、ルピナス、およびイネ。
本発明は、形質転換された植物細胞、組織、植物体、および形質転換された植物細胞を
含有する製品も提供する。これらを含む、主題の形質転換細胞およびそれを含む組織なら
びに製品の特徴は、ゲノムに組み混まれた主題の核酸の存在、ならびに部位特異的修飾ポ
リペプチド、例えば、自然発生的なＣａｓ９；修飾された、すなわち、変異型もしくは異
型Ｃａｓ９；キメラＣａｓ９；等の、植物細胞による産生である。本発明の組換え植物細
胞は、組換え細胞の集団として、または組織、種子、全植物体、茎、果実、葉、根、花、
茎、塊茎、穀粒、動物飼料、植物の畑(ｆｉｅｌｄ ｏｆ ｐｌａｎｔｓ)などとして有用
である。
部位特異的修飾ポリペプチド（例えば、自然発生的なＣａｓ９；修飾された、すなわち
、変異型もしくは異型のＣａｓ９；キメラＣａｓ９；等）をコードするヌクレオチド配列
を含む核酸は、未知のプロモーターの制御下にあり得（すなわち、それに作動可能に連結
している）（例えば、核酸が宿主細胞ゲノムに無作為に組み込まれた場合）、または、公
知のプロモーターの制御下にあり得る（すなわち、それに作動可能に連結している）。適
切な公知のプロモーターは、いかなる公知のプロモーターであってもよく、恒常的活性型
プロモーター、誘導性プロモーター、空間限定的および／または時間限定的プロモーター
等が含まれる。
いくつかの例において、部位特異的修飾ポリペプチドは、図３に示されるＣａｓ９／Ｃ
ｓｎ１アミノ酸配列のアミノ酸７〜１６６または７３１〜１００３に対して、または配列
番号１〜２５６および７９５〜１３４６として記載されるアミノ酸配列のうちのいずれか
における対応部分に対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８
５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または１００％
のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
種子、子孫植物およびクローン物質を含む、主題の遺伝子導入植物の生殖物質も、主題
の発明によって提供される。
定義（第ＩＩ部）
核酸、ポリペプチド、細胞、または生物に適用されて本明細書で使用される用語「自然
発生的な」または「無修飾の」は、天然に存在する核酸、ポリペプチド、細胞、または生
物を指す。例えば、天然源から単離することができ、実験室でヒトによって意図的に改変
されていない、生物（ウイルスを含む）内に存在するポリペプチドまたはポリヌクレオチ
ド配列は、自然発生的である。
「異種」とは、本明細書で使用される場合、天然の核酸またはタンパク質にそれぞれ存
在していないヌクレオチド配列またはポリペプチド配列を意味する。例えば、融合変異型
Ｃａｓ９部位特異的ポリペプチドにおいて、変異型Ｃａｓ９部位特異的ポリペプチドは、
異種ポリペプチド（すなわちＣａｓ９以外のポリペプチド）に融合され得る。異種ポリペ
プチドは、融合変異型Ｃａｓ９部位特異的ポリペプチドによっても示される活性（例えば
、酵素活性）を示し得る。異種核酸配列を、（例えば、遺伝子操作によって）変異型Ｃａ
ｓ９部位特異的ポリペプチドに連結して、融合変異型Ｃａｓ９部位特異的ポリペプチドを
コードするヌクレオチド配列を作製してもよい。
用語「キメラポリペプチド」は、自然発生的でない、例えば、人の介在によって、アミ
ノ配列の２つの組み合わされていなければ離れているセグメントの人為的な組み合わせに
よって作製される、ポリペプチドを指す。従って、キメラポリペプチドは人の介在の産物
でもある。従って、キメラアミノ酸配列を含むポリペプチドはキメラポリペプチドである
。
「部位特異的ポリペプチド」または「ＲＮＡ結合部位特異的ポリペプチド」または「Ｒ
ＮＡ結合部位特異的ポリペプチド」とは、ＲＮＡと結合し特定のＤＮＡ配列に標的化され
るポリペプチドを意味する。本明細書に記載される部位特異的ポリペプチドは、それが結
合しているＲＮＡ分子によって特定のＤＮＡ配列に標的化される。ＲＮＡ分子は、標的Ｄ
ＮＡ内の標的配列に対し相補的であることから結合したポリペプチドを標的ＤＮＡ（標的
配列）内の特定の位置に標的化する配列を含む。
いくつかの実施形態において、主題の核酸（例えば、ＤＮＡ標的化ＲＮＡ、ＤＮＡ標的
化ＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む核酸；部位特異的ポリペプチドをコードす
る核酸；等）は、追加の所望の特徴（例えば、改変または調節された安定性；細胞内標的
化；追跡（例えば、蛍光標識）；タンパク質またはタンパク質複合体に対する結合部位；
等）を与える修飾または配列を含む。例としては、限定はされないが、５’キャップ（例
えば、７−メチルグアニル酸キャップ（ｍ７Ｇ））；３’ポリアデニル化尾部（すなわち
、３’ポリ（Ａ）尾部）；リボスイッチ配列（例えば、安定性の調節、並びに／またはタ
ンパク質および／もしくはタンパク質複合体による接触のし易さの調節を可能にする）；
ＲＮＡを細胞内位置（例えば、核、ミトコンドリア、葉緑体等）に標的化する修飾または
配列；追跡（例えば、蛍光分子への直接結合、蛍光検出を促進する部分、蛍光検出を可能
にする配列への結合等）をもたらす修飾または配列；タンパク質（例えば、転写活性化因
子、転写抑制因子、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ＤＮＡ脱メチル化酵素、ヒストン
アセチルトランスフェラーゼ、ヒストン脱アセチル化酵素等を含むＤＮＡに作用するタン
パク質）に対する結合部位を与える修飾または配列；並びにそれらの組み合わせが挙げら
れる。
いくつかの実施形態において、ＤＮＡ標的化ＲＮＡは、上記の特徴のうちのいずれかを
与える追加のセグメントを５’末端または３’末端のいずれかに含む。例えば、適切な第
三セグメントは、５’キャップ（例えば、７−メチルグアニル酸キャップ（ｍ７Ｇ））；
３’ポリアデニル化尾部（すなわち、３’ポリ（Ａ）尾部）；リボスイッチ配列（例えば
、安定性の調節、並びに／またはタンパク質およびタンパク質複合体による接触のし易さ
の調節を可能にする）；ＲＮＡを細胞内位置（例えば、核、ミトコンドリア、葉緑体等）
に標的化する配列；追跡（例えば、蛍光分子への直接結合、蛍光検出を促進する部分、蛍
光検出を可能にする配列への結合等）をもたらす修飾または配列；タンパク質（例えば、
転写活性化因子、転写抑制因子、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ＤＮＡ脱メチル化酵
素、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、ヒストン脱アセチル化酵素等を含むＤＮＡに
作用するタンパク質）に対する結合部位を与える修飾または配列；並びにそれらの組み合
わせを含み得る。
主題のＤＮＡ標的化ＲＮＡおよび主題の部位特異的ポリペプチドは、複合体を形成する
（すなわち、非共有結合性相互作用によって結合する）。ＤＮＡ標的化ＲＮＡは、標的Ｄ
ＮＡの配列に対し相補的なヌクレオチド配列を含むことによって、標的特異性を複合体に
与える。複合体の部位特異的ポリペプチドは部位特異的活性を与える。言い換えれば、部
位特異的ポリペプチドは、それ自体がＤＮＡ標的化ＲＮＡのタンパク質結合セグメントと
結合することによって、標的ＤＮＡ配列（例えば、染色体核酸内の標的配列；染色体外核
酸（例えば、エピソーム核酸、ミニサークル等）内の標的配列；ミトコンドリア核酸内の
標的配列；葉緑体核酸内の標的配列；プラスミド内の標的配列；等）に誘導される。
いくつかの実施形態において、主題のＤＮＡ標的化ＲＮＡは、２つの別々のＲＮＡ分子
（ＲＮＡポリヌクレオチド）を含み、「二重分子ＤＮＡ標的化ＲＮＡ」または「二分子Ｄ
ＮＡ標的化ＲＮＡ」と称される。他の実施形態では、主題のＤＮＡ標的化ＲＮＡは単一Ｒ
ＮＡ分子（単一ＲＮＡポリヌクレオチド）であり、本明細書では「単一分子ＤＮＡ標的化
ＲＮＡ」と称される。特に断りがなければ、用語「ＤＮＡ標的化ＲＮＡ」は、単一分子Ｄ
ＮＡ標的化ＲＮＡおよび二重分子ＤＮＡ標的化ＲＮＡの両方を包括的に指す。
主題の二分子ＤＮＡ標的化ＲＮＡは、２つの別々のＲＮＡ分子（「標的化ＲＮＡ」およ
び「活性化ＲＮＡ」）を含む。主題の二分子ＤＮＡ標的化ＲＮＡの２つのＲＮＡ分子はそ
れぞれ、互いに対し相補的なヌクレオチド鎖を含み、その結果、２つのＲＮＡ分子の相補
的ヌクレオチドはハイブリダイズしてタンパク質結合セグメントの二本鎖ＲＮＡ二本鎖を
形成する。
主題の単一分子ＤＮＡ標的化ＲＮＡは、互いに対し相補的であり、介在ヌクレオチド（
「リンカー」または「リンカーヌクレオチド」）によって共有結合的に連結し、ハイブリ
ダイズしてタンパク質結合セグメントの二本鎖ＲＮＡ二本鎖（ｄｓＲＮＡ二本鎖）を形成
し、それによりステムループ構造をもたらす、２本のヌクレオチド鎖（標的化ＲＮＡおよ
び活性化ＲＮＡ）を含む。標的化ＲＮＡおよび活性化ＲＮＡは、標的化ＲＮＡの３’末端
および活性化ＲＮＡの５’末端を介して共有結合的に連結し得る。あるいは、標的化ＲＮ
Ａおよび活性化ＲＮＡは、標的化ＲＮＡの５’末端および活性化ＲＮＡの３’末端を介し
て共有結合的に連結し得る。
例示的な二分子ＤＮＡ標的化ＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ様（「ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ」また
は「標的化ＲＮＡ」または「ｃｒＲＮＡ」または「ｃｒＲＮＡリピート」）分子および対
応するｔｒａｃｒＲＮＡ様（「トランス作動性ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ」または「活性化Ｒ
ＮＡ」または「ｔｒａｃｒＲＮＡ」）分子を含む。ｃｒＲＮＡ様分子（標的化ＲＮＡ）は
、ＤＮＡ標的化ＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメント（一本鎖）およびＤＮＡ標的化ＲＮＡの
タンパク質結合セグメントのｄｓＲＮＡ二本鎖の半分を形成するヌクレオチド鎖（「二本
鎖形成セグメント」）の両方を含む。対応するｔｒａｃｒＲＮＡ様分子（活性化ＲＮＡ）
は、ＤＮＡ標的化ＲＮＡのタンパク質結合セグメントのｄｓＲＮＡ二本鎖のもう半分を形
成するヌクレオチド鎖（二本鎖形成セグメント）を含む。言い換えれば、ｃｒＲＮＡ様分
子のヌクレオチド鎖は、ｔｒａｃｒＲＮＡ様分子のヌクレオチド鎖に対し相補的でそれと
ハイブリダイズして、ＤＮＡ標的化ＲＮＡのタンパク質結合ドメインのｄｓＲＮＡ二本鎖
を形成する。従って、それぞれのｃｒＲＮＡ様分子は、対応するｔｒａｃｒＲＮＡ様分子
を有すると言うことができる。ｃｒＲＮＡ様分子はさらに、一本鎖ＤＮＡ標的化セグメン
トを与える。従って、ｃｒＲＮＡ様分子およびｔｒａｃｒＲＮＡ様分子は（対応する対と
して）ハイブリダイズしてＤＮＡ標的化ＲＮＡを形成する。所与のｃｒＲＮＡ分子または
ｔｒａｃｒＲＮＡ分子の正確な配列は、ＲＮＡ分子が存在する種類に特有である。
用語「活性化ＲＮＡ」は、二重分子ＤＮＡ標的化ＲＮＡのｔｒａｃｒＲＮＡ様分子を意
味して、本明細書では使用される。用語「標的化ＲＮＡ」は、二重分子ＤＮＡ標的化ＲＮ
ＡのｃｒＲＮＡ様分子を意味して、本明細書では使用される。用語「二本鎖形成セグメン
ト」は、対応する活性化ＲＮＡ分子または標的化ＲＮＡ分子のヌクレオチド鎖にハイブリ
ダイズすることでｄｓＲＮＡ二本鎖の形成に寄与する、活性化ＲＮＡまたは標的化ＲＮＡ
のヌクレオチド鎖を意味して、本明細書では使用される。言い換えれば、活性化ＲＮＡは
、対応する標的化ＲＮＡの二本鎖形成セグメントに対し相補的な二本鎖形成セグメントを
含む。従って、活性化ＲＮＡは二本鎖形成セグメントを含み、一方、標的化ＲＮＡは二本
鎖形成セグメントおよびＤＮＡ標的化ＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントの両方を含む。従
って、主題の二重分子ＤＮＡ標的化ＲＮＡは、いかなる対応する活性化ＲＮＡおよび標的
化ＲＮＡ対から成っていてもよい。
二分子ＤＮＡ標的化ＲＮＡは、標的化ＲＮＡの活性化ＲＮＡとの調節された（すなわち
、条件的な）結合を可能にするように設計することができる。二分子ＤＮＡ標的化ＲＮＡ
は活性化ＲＮＡおよび標的化ＲＮＡの両方が機能的な複合体の形態でｄＣａｓ９と結合し
ない限り機能的にならないため、活性化ＲＮＡおよび標的化ＲＮＡの結合を誘導性とする
ことによって、二分子ＤＮＡ標的化ＲＮＡを、誘導性（例えば、薬剤誘導性）にすること
ができる。１つの非限定例として、ＲＮＡアプタマーを用いることで、活性化ＲＮＡの標
的化ＲＮＡとの結合を制御（すなわち、調節）することができる。従って、活性化ＲＮＡ
および／または標的化ＲＮＡは、ＲＮＡアプタマー配列を含み得る。
ＲＮＡアプタマーは当該技術分野において公知であり、一般的にリボスイッチの合成バ
ージョンである。用語「ＲＮＡアプタマー」および「リボスイッチ」は本明細書で同義的
に使用されて、合成核酸配列および天然核酸配列であって、それらが一部として含まれる
ＲＮＡ分子の構造（および、従って、特定の配列の利用能）の誘導性調節を与える合成核
酸配列および天然核酸配列の両方を包含する。ＲＮＡアプタマーは通常、特定の構造（例
えば、ヘアピン）に折り畳まれる配列を含み、その配列が特定の薬剤（例えば、小分子）
と特異的に結合する。薬剤の結合はＲＮＡの折り畳みにおける構造変化をもらたし、それ
によって、アプタマーが一部として含まれる核酸の特徴が変化される。非限定例として、
（ｉ）アプタマーを有する活性化ＲＮＡは、アプタマーが適切な薬剤と結合しない限り、
同種の（ｃｏｇｎａｔｅ）標的化ＲＮＡに結合することができず；（ｉｉ）アプタマーを
有する標的化ＲＮＡは、アプタマーが適切な薬剤と結合しない限り、同種の活性化ＲＮＡ
に結合することができず；（ｉｉｉ）異なる薬剤と結合する異なるアプタマーをそれぞれ
含む標的化ＲＮＡおよび活性化ＲＮＡは、両方の薬剤が存在しない限り、互いに結合する
ことができない。これらの例によって説明される通り、二分子ＤＮＡ標的化ＲＮＡは誘導
性となるように設計することができる。
アプタマーおよびリボスイッチの例は、例えば、Nakamura et al., Genes Cells. 2012
May;17(5):344-64; Vavalle et al., Future Cardiol. 2012 May;8(3):371-82; Citarta
n et al., Biosens Bioelectron. 2012 Apr 15;34(1):1-11、およびLiberman et al., Wi
ley Interdiscip Rev RNA. 2012 May-Jun;3(3):369-84に見出すことができ、これらは全
てそれらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
二分子ＤＮＡ標的化ＲＮＡに含まれ得るヌクレオチド配列の非限定例としては、配列番
号６７１〜６７８に記載の活性化ＲＮＡのいずれか１つの二本鎖形成セグメント（ｓｅｑ
ｍｅｎｔ）と対合することができる標的化ＲＮＡ（例えば、配列番号５６６〜５６７）が
挙げられる。
例示的な単一分子ＤＮＡ標的化ＲＮＡは、ハイブリダイズしてｄｓＲＮＡ二本鎖を形成
する２本の相補的ヌクレオチド鎖を含む。いくつかの実施形態において、単一分子ＤＮＡ
標的化ＲＮＡ（またはその鎖をコードするＤＮＡ）の２本の相補的ヌクレオチド鎖の一方
は、配列番号４３１〜５６２に記載される活性化ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）配列の１つ
に対して、一連の少なくとも８個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも約６０％同一
である。例えば、単一分子ＤＮＡ標的化ＲＮＡ（またはその鎖をコードするＤＮＡ）の２
本の相補的ヌクレオチド鎖の一方は、配列番号４３１〜５６２に記載されるｔｒａｃｒＲ
ＮＡ配列の１つに対して、一連の少なくとも８個の連続ヌクレオチドにわたって、少なく
とも約６５％同一、少なくとも約７０％同一、少なくとも約７５％同一、少なくとも約８
０％同一、少なくとも約８５％同一、少なくとも約９０％同一、少なくとも約９５％同一
、少なくとも約９８％同一、少なくとも約９９％同一または１００％同一である。
いくつかの実施形態において、単一分子ＤＮＡ標的化ＲＮＡ（またはその鎖をコードす
るＤＮＡ）の２本の相補的ヌクレオチド鎖の一方は、配列番号５６３〜６７９に記載され
る標的化ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）配列の１つに対して、一連の少なくとも８個の連続ヌクレ
オチドにわたって少なくとも約６０％同一である。例えば、単一分子ＤＮＡ標的化ＲＮＡ
（またはその鎖をコードするＤＮＡ）の２本の相補的ヌクレオチド鎖の一方は、配列番号
５６３〜６７９に記載されるｃｒＲＮＡ配列の１つに対して、一連の少なくとも８個の連
続ヌクレオチドにわたって、少なくとも約６５％同一、少なくとも約７０％同一、少なく
とも約７５％同一、少なくとも約８０％同一、少なくとも約８５％同一、少なくとも約９
０％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９８％同一、少なくとも約９９％同一
または１００％同一である。
上記のように、「宿主細胞」は、本明細書で使用される場合、インビボまたはインビト
ロにおける真核細胞、原核細胞（例えば、細菌細胞または古細菌細胞）、または単細胞の
独立体として培養される多細胞生物由来の細胞（例えば、細胞株）を示し、真核細胞また
は原核細胞は核酸のレシピエントとして使用され得る、もしくは使用されており、核酸に
よって形質転換された原細胞の子孫も含まれる。単一細胞の子孫は、自然変異、偶発的変
異、または意図的な変異があるために、形態において、またはゲノムもしくは全ＤＮＡの
相補体（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）において、元の親と必ずしも完全に同一でなくてもよい
ことが理解される。「組換え宿主細胞」（「遺伝子改変宿主細胞」とも称される）は、異
種核酸（例えば、発現ベクター）を導入された宿主細胞である。例えば、主題の細菌宿主
細胞は、適切な細菌宿主細胞への外来性核酸（例えば、プラスミドまたは組み換え発現ベ
クター）の導入による遺伝子改変された細菌性宿主細胞であり、主題の真核生物宿主細胞
は、適切な真核生物性宿主細胞への外来性核酸の導入による遺伝子改変された真核生物性
宿主細胞（例えば、哺乳類生殖細胞）である。
「定義（第一部）」に記載された定義は、本セクションにも適用可能である；さらなる
用語説明は、「定義（第一部）」を参照されたい。
本発明をさらに説明する前に、本発明が記載される特定の実施形態に限定されず、従っ
て、当然のことながら、変更され得ることを理解されたい。本明細書で使用される専門用
語は特定の実施形態を説明することのみを目的としており、本発明の範囲は添付の特許請
求の範囲によってのみ限定されるため、限定を意図するものではないことも理解されたい
。
数値の範囲が与えられた場合、その範囲の上限値と下限値の間の、文脈によって特に明
示されない限りは下限値の単位の１０分の１までの、間に挟まれた各値、およびその記載
の範囲内のあらゆる他の記載された、または間に挟まれた数値は、本発明に包含されるこ
とを理解されたい。これらのより小さな範囲の上限値および下限値は、そのより小さな範
囲内に独立して含まれてもよく、これもまた本発明に包含されるが、記載範囲の具体的に
除外される境界値が適用される。記載範囲が一方または両方の境界値を含む場合、それら
の含まれる境界値の一方または両方を除外した範囲もまた、本発明に含まれる。
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての専門用語および科学用語は、本発
明が属する技術分野において当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。
本明細書に記載されるものと同様または等価であるいかなる方法および材料も本発明の実
施または試験に使用可能ではあるが、ここで、本明細書には、好ましい方法および材料が
記載される。本明細書で言及される全ての刊行物は、引用された刊行物と関連した方法お
よび／または材料を開示および説明するために、参照によって本明細書に組み込まれる。
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、お
よび「ｔｈｅ」は、文脈によって特に明示されない限り、複数の指示対象を含むことに注
意されたい。従って、例えば、「酵素的に不活性なＣａｓ９ポリペプチド」への言及には
、複数のそのようなポリペプチドが含まれ、「標的核酸」への言及には、一つまたは複数
の標的核酸および当業者に公知のその等価物への言及が含まれる、等である。さらに、特
許請求の範囲は、いかなる任意の要素も除外するように起案することができることを注意
されたい。従って、この記載は、請求項の要素の列挙に関連して、「単に（ｓｏｌｅｌｙ
）」、「のみ（ｏｎｌｙ）」等の排他的な用語の使用、または「否定的な」制限の使用に
先立つ基準としての役割を果たすことが意図される。
明確化のために別々の実施形態に関して記載される本発明のある特定の特徴は、単一の
実施形態において組み合わされて提供されてもよいことが理解される。逆に、簡潔さのた
めに単一の実施形態に関して記載される本発明の種々の特徴は、別々に提供されてもよい
し、あるいは任意の適切な副組合せで提供されてもよい。本発明に関連する全ての実施形
態の組み合わせは、それぞれおよび全ての組み合わせがあたかも個々に且つ明示的に開示
されたかの如く、本発明に具体的に包含され、本明細書で開示される。さらに、種々の実
施形態およびその要素の全ての副組合せも、それぞれおよび全てのそのような副組み合わ
せがあたかも個々に且つ明示的に本明細書で開示されたかの如く、本発明に具体的に包含
され、本明細書で開示される。
本明細書で考察される刊行物は、本出願の出願日よりも前のその開示のみに対して提供
される。本明細書に記載のものはいずれも、本発明が、先願発明によりそのような刊行物
に先行する権利がないという承認として解釈されるべきではない。さらに、提供される刊
行物の日付は、実際の刊行日とは異なる場合があり、別に確認される必要があり得る。
発明を実施するための形態（第二部）
本開示は、宿主細胞内の標的核酸の転写を調節する方法を提供する。本方法は、概して
、標的核酸を、酵素的に不活性なＣａｓ９ポリペプチドおよび単一誘導ＲＮＡと接触させ
ることを含む。本方法は、種々の用途において有用であり、それもまた提供される。
本開示の転写調節法により、ＲＮＡｉが関与する方法の欠点のいくつかが克服される。
本開示の転写調節法は、研究用途、創薬（例えば、ハイスループットスクリーニング）、
ターゲットバリデーション、工業的用途（例えば、作物操作；微生物操作等）、診断用途
、治療用途、および画像処理技術を含む、種々様々な適用において有用である。
転写を調節する方法
本開示は、宿主細胞内の標的ＤＮＡの転写を選択的に調節する方法を提供する。本方法
は、概して、ａ）宿主細胞に、ｉ）ＤＮＡ標的化ＲＮＡ、またはＤＮＡ標的化ＲＮＡをコ
ードするヌクレオチド配列を含む核酸；およびｉｉ）低減されたエンドデオキシリボヌク
レアーゼ活性を示す異型Ｃａｓ９部位特異的ポリペプチド（「異型Ｃａｓ９ポリペプチド
」）、または該異型Ｃａｓ９ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を導
入することを含む。
ＤＮＡ標的化ＲＮＡ（「ｃｒＲＮＡ」；または「誘導ＲＮＡ」；または「ｇＲＮＡ」と
も称される）は、ｉ）標的ＤＮＡ内の標的配列に対し相補的なヌクレオチド配列を含む第
一セグメント；ｉｉ）部位特異的ポリペプチドと相互作用する第二セグメント；およびｉ
ｉｉ）転写ターミネーターを含む。標的ＤＮＡ内の標的配列に対し相補的なヌクレオチド
配列を含む第一セグメントは、本明細書において「ターゲティングセグメント」と称され
る。部位特異的ポリペプチドと相互作用する第二セグメントは、本明細書において「タン
パク質結合配列」または「ｄＣａｓ９結合ヘアピン」、または「ｄＣａｓ９ハンドル」と
も称される。「セグメント」とは、分子のセグメント／セクション／領域（例えば、ＲＮ
Ａ内の連続するヌクレオチド鎖）を意味する。「セグメント」の定義は、特定の文脈にお
いて特に定義されていない限り、特定の全塩基対数に限定されず、任意の全長であるＲＮ
Ａ分子の領域を含んでいてもよく、他の分子に対し相補性を有する領域を含んでいても含
んでいなくてもよい。本開示によるＤＮＡ標的化ＲＮＡは、「単一分子ＤＮＡ標的化ＲＮ
Ａ」、「単一誘導ＲＮＡ」、または「ｓｇＲＮＡ」と本明細書において称され得る、単一
ＲＮＡ分子（単一ＲＮＡポリヌクレオチド）であり得る。本開示によるＤＮＡ標的化ＲＮ
Ａは、２つのＲＮＡ分子を含み得る。用語「ＤＮＡ標的化ＲＮＡ」または「ｇＲＮＡ」は
、二分子ＤＮＡ標的化ＲＮＡおよび単一分子ＤＮＡ標的化ＲＮＡ（すなわち、ｓｇＲＮＡ
）の両方を包括的に指す。
異型Ｃａｓ９部位特異的ポリペプチドは、ｉ）ＤＮＡ標的化ＲＮＡと相互作用するＲＮ
Ａ結合部位；およびｉｉ）低減されたエンドデオキシリボヌクレアーゼ活性を示す活性部
位を含む。
ＤＮＡ標的化ＲＮＡおよび異型Ｃａｓ９ポリペプチドは宿主細胞内で複合体を形成し；
その複合体は宿主細胞内の標的ＤＮＡの転写を選択的に調節する。
いくつかの例において、本開示の転写調節法は、宿主細胞内の標的核酸の選択的調節（
例えば、低減または増加）を与える。例えば、標的核酸の転写の「選択的」低減によって
、標的核酸の転写は、ＤＮＡ標的化ＲＮＡ／異型Ｃａｓ９ポリペプチド複合体の非存在下
における標的核酸の転写レベルと比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、
少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、
少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または９０％超、低減
される。標的核酸の転写の選択的低減は標的核酸の転写を低減させるが、非標的核酸の転
写を実質的に低減させず、例えば、非標的核酸の転写は、仮に低減されたとしても、ＤＮ
Ａ標的化ＲＮＡ／異型Ｃａｓ９ポリペプチド複合体の非存在下における非標的核酸の転写
レベルと比較して、１０％未満低減される。
転写の増加
標的ＤＮＡの「選択的」に増加された転写は、ＤＮＡ標的化ＲＮＡ／異型Ｃａｓ９ポリ
ペプチド複合体の非存在下における標的ＤＮＡの転写レベルと比較して、少なくとも約１
．１倍（例えば、少なくとも約１．２倍、少なくとも約１．３倍、少なくとも約１．４倍
、少なくとも約１．５倍、少なくとも約１．６倍、少なくとも約１．７倍、少なくとも約
１．８倍、少なくとも約１．９倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくと
も約３倍、少なくとも約３．５倍、少なくとも約４倍、少なくとも約４．５倍、少なくと
も約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍
、少なくとも約１０倍、少なくとも約１２倍、少なくとも約１５倍、または少なくとも約
２０倍）、標的ＤＮＡの転写を増加し得る。標的ＤＮＡの転写の選択的増加は、標的ＤＮ
Ａの転写を増加させるが、非標的ＤＮＡの転写は実質的に増加させず、例えば、非標的Ｄ
ＮＡの転写は、仮に増加されたとしても、ＤＮＡ標的化ＲＮＡ／異型Ｃａｓ９ポリペプチ
ド複合体の非存在下における非標的ＤＮＡの転写レベルと比較して、約５倍未満（例えば
、約４倍未満、約３倍未満、約２倍未満、約１．８倍未満、約１．６倍未満、約１．４倍
未満、約１．２倍未満、または約１．１倍未満）、増加される。
非限定例として、増加（ｉｎｃｒｅａｓｅｄ）は、ｄＣａｓ９を異種配列に融合するこ
とにより達成され得る。適切な融合パートナーとしては、限定はされないが、標的ＤＮＡ
に直接作用することにより、または標的ＤＮＡと結合したポリペプチド（例えば、ヒスト
ンまたは他のＤＮＡ結合タンパク質）に作用することにより、転写を間接的に増加させる
活性を提供するポリペプチドが挙げられる。適切な融合パートナーとしては、限定はされ
ないが、メチルトランスフェラーゼ活性、脱メチル化酵素活性、アセチルトランスフェラ
ーゼ活性、脱アセチル化酵素活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、ユビキチンリガ
ーゼ活性、脱ユビキチン化活性、アデニル化活性、脱アデニル化活性、ＳＵＭＯ化活性、
脱ＳＵＭＯ化活性、リボシル化活性、脱リボシル化活性、ミリストイル化活性または脱ミ
リストイル化活性を与えるポリペプチドが挙げられる。
追加の適切な融合パートナーとしては、限定はされないが、標的核酸の転写の増加を直
接与えるポリペプチド（例えば、転写活性化因子またはその断片、転写活性化因子をリク
ルートするタンパク質またはその断片、小分子／薬剤応答性転写制御因子等）が挙げられ
る。
ｄＣａｓ９融合タンパク質を用いて原核生物における転写を増加させる主題の方法の非
限定例には、細菌のワンハイブリッド（Ｂ１Ｈ）系またはツーハイブリッド（Ｂ２Ｈ）系
の改変が含まれる。Ｂ１Ｈ系において、ＤＮＡ結合ドメイン（ＢＤ）は、細菌性転写活性
化ドメイン（ＡＤ、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＲＮＡポリメ
ラーゼのαサブユニット（ＲＮＡＰα））に融合される。従って、主題のｄＣａｓ９は、
ＡＤを含む異種配列に融合され得る。主題のｄＣａｓ９融合タンパク質がプロモーターの
上流領域に到着すると（ＤＮＡ標的化ＲＮＡによってそこに標的化されている）、ｄＣａ
ｓ９融合タンパク質のＡＤ（例えば、ＲＮＡＰα）は、ＲＮＡＰホロ酵素をリクルートし
、転写活性化をもたらす。Ｂ２Ｈ系において、ＢＤはＡＤに直接融合されず；代わりに、
それらの相互作用はタンパク質間相互作用（例えば、ＧＡＬ１１Ｐ−ＧＡＬ４相互作用）
によって仲介される。主題の方法で使用するのにそのような系を改変するために、ｄＣａ
ｓ９は、タンパク質間相互作用を与える第一のタンパク質配列（例えば、酵母ＧＡＬ１１
Ｐおよび／またはＧＡＬ４タンパク質）に融合され得、ＲＮＡαは、タンパク質間相互作
用を完成させる第二のタンパク質配列に融合され得る（例えば、ＧＡＬ１１ＰがｄＣａｓ
９に融合される場合はＧＡＬ４、ＧＡＬ４がｄＣａｓ９に融合される場合はＧＡＬ１１Ｐ
、等）。ＧＡＬ１１ＰおよびＧＡＬ４の間の結合親和性は、結合および転写発生速度の効
率を増加させる。
ｄＣａｓ９融合タンパク質を用いて真核生物における転写を増加させる主題の方法の非
限定例には、ｄＣａｓ９の、活性化ドメイン（ＡＤ）（例えば、ＧＡＬ４、ヘルペスウイ
ルス活性化タンパク質ＶＰ１６またはＶＰ６４、ヒト核内因子ＮＦ−κＢ ｐ６５サブユ
ニット等）への融合が含まれる。系を誘導可能にするために、ｄＣａｓ９融合タンパク質
の発現は、誘導性プロモーター（例えば、Ｔｅｔ−ＯＮ、Ｔｅｔ−ＯＦＦ等）によって制
御され得る。ＤＮＡ標的化ＲＮＡは、既知の転写応答エレメント（例えば、プロモーター
、エンハンサー等）、既知の上流活性化配列（ＵＡＳ）、標的ＤＮＡの発現を調節可能で
あると推測される未知または既知の機能の配列等を標的とするように設計され得る。
追加の融合パートナー
転写の増加または減少を達成するための融合パートナーの非限定例は、図５４に列挙さ
れており、転写活性化因子ドメインおよび転写抑制因子ドメイン（例えば、クルッペル結
合ボックス（Ｋｒｕｐｐｅｌ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｂｏｘ）（ＫＲＡＢまたはＳＫＤ
）；Ｍａｄ ｍＳＩＮ３相互作用ドメイン（ＳＩＤ）；ＥＲＦ抑制因子ドメイン（ＥＲＤ
）等）が含まれる。いくつかのそのような例において、ｄＣａｓ９融合タンパク質は、Ｄ
ＮＡ標的化ＲＮＡによって、標的ＤＮＡ内の特定の位置（すなわち、配列）に標的化され
、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターへの結合の阻止（転写活性化因子機能を選択的に阻
害）、および／または局所的なクロマチン状態の修飾（例えば、標的ＤＮＡを修飾するま
たは標的ＤＮＡと結合したポリペプチドを修飾する融合配列が用いられた場合）等の遺伝
子座特異的調節を及ぼす。いくつかの例において、変化は一過性である（例えば、転写の
抑制または活性化）。いくつかの例において、変化は遺伝性である（例えば、後成的修飾
が標的ＤＮＡまたは標的ＤＮＡと結合したタンパク質（例えば、ヌクレオソームヒストン
）に起こった場合）。
いくつかの実施形態において、異種配列はｄＣａｓ９ポリペプチドのＣ末端に融合され
得る。いくつかの実施形態において、異種配列はｄＣａｓ９ポリペプチドのＮ末端に融合
され得る。いくつかの実施形態において、異種配列はｄＣａｓ９ポリペプチドの内部部分
（すなわち、Ｎ末端またはＣ末端以外の部分）に融合され得る。
主題のｄＣａｓ９融合タンパク質を用いる方法の生物学的効果は、いかなる従来の方法
（例えば、遺伝子発現アッセイ；クロマチンに基づくアッセイ、例えば、クロマチン免疫
沈降（ＣｈｉＰ）、クロマチンインビボアッセイ（ＣｉＡ）等；等）によっても検出する
ことができる。
いくつかの例において、主題の方法は、２つ以上の異なるＤＮＡ標的化ＲＮＡの使用を
含む。例えば、同一の標的核酸内の２つの異なる標的配列を標的にする、２つの異なるＤ
ＮＡ標的化ＲＮＡを単一の宿主細胞に用いることができる。
従って、例えば、主題の転写調節法は、宿主細胞に、ｉ）標的ＤＮＡ内の第二の標的配
列に対し相補的なヌクレオチド配列を含む第一セグメント；ｉｉ）部位特異的ポリペプチ
ドと相互作用する第二セグメント；およびｉｉｉ）転写ターミネーターを含む第二のＤＮ
Ａ標的化ＲＮＡ、または該第二のＤＮＡ標的化ＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含
む核酸を導入することをさらに含み得る。いくつかの例において、同一の標的核酸内の２
つの異なるターゲティング配列を標的とする２つの異なるＤＮＡ標的化ＲＮＡの使用は、
標的核酸の転写における調節（例えば、減少または増加）の増加を与える。
別の例として、２つの異なる標的配列を標的にする、２つの異なるＤＮＡ標的化ＲＮＡ
を単一の宿主細胞に用いることができる。従って、例えば、主題の転写調節法は、宿主細
胞に、ｉ）少なくとも第二の標的ＤＮＡ内の標的配列に対し相補的なヌクレオチド配列を
含む第一セグメント；ｉｉ）部位特異的ポリペプチドと相互作用する第二セグメント；お
よびｉｉｉ）転写ターミネーターを含む第二のＤＮＡ標的化ＲＮＡ、または該第二のＤＮ
Ａ標的化ＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を導入することをさらに含み得
る。
いくつかの実施形態において、主題の核酸（例えば、ＤＮＡ標的化ＲＮＡ、例えば、単
一分子ＤＮＡ標的化ＲＮＡ、活性化ＲＮＡ、標的化ＲＮＡ等；ドナーポリヌクレオチド；
部位特異的修飾ポリペプチドをコードする核酸；等）は、追加の所望の特徴（例えば、改
変または調節された安定性；細胞内標的化；追跡（例えば、蛍光標識）；タンパク質また
はタンパク質複合体に対する結合部位；等）を与える修飾または配列を含む。例としては
、限定はされないが、５’キャップ（例えば、７−メチルグアニル酸キャップ（ｍ７Ｇ）
）；３’ポリアデニル化尾部（すなわち、３’ポリ（Ａ）尾部）；リボスイッチ配列また
はアプタマー配列（例えば、安定性の調節、並びに／またはタンパク質および／もしくは
タンパク質複合体による接触のし易さの調節を可能にする）；ターミネーター配列；ｄｓ
ＲＮＡ二本鎖を形成する配列（すなわち、ヘアピン））；ＲＮＡを細胞内位置（例えば、
核、ミトコンドリア、葉緑体等）に標的化する修飾または配列；追跡（例えば、蛍光分子
への直接結合、蛍光検出を促進する部分、蛍光検出を可能にする配列への結合等）をもた
らす修飾または配列；タンパク質（例えば、転写活性化因子、転写抑制因子、ＤＮＡメチ
ルトランスフェラーゼ、ＤＮＡ脱メチル化酵素、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、
ヒストン脱アセチル化酵素等を含むＤＮＡに作用するタンパク質）に対する結合部位を与
える修飾または配列；並びにそれらの組み合わせが挙げられる。
ＤＮＡ標的化セグメント
ＤＮＡ標的化ＲＮＡ（「ｃｒＲＮＡ」）のＤＮＡ標的化セグメント（または「ＤＮＡ標
的化配列」）は、標的ＤＮＡ内の特定の配列に対し相補的なヌクレオチド配列（標的ＤＮ
Ａの相補鎖）を含む。
言い換えれば、主題のＤＮＡ標的化ＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントは、ハイブリダイゼ
ーション（すなわち、塩基対形成）を介して配列特異的に標的ＤＮＡと相互作用する。従
って、ＤＮＡ標的化セグメントのヌクレオチド配列は変動してもよく、ＤＮＡ標的化ＲＮ
Ａおよび標的ＤＮＡが相互作用する標的ＤＮＡ内の位置を決定する。主題のＤＮＡ標的化
ＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントは、標的ＤＮＡ内のいかなる所望の配列にもハイブリダ
イズするように、（例えば、遺伝子操作によって）改変することができる。
ＤＮＡ標的化セグメントは、約１２ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチドの長さを有し
得る。例えば、ＤＮＡ標的化セグメントは、約１２ヌクレオチド（ｎｔ）〜約８０ｎｔ、
約１２ｎｔ〜約５０ｎｔ、約１２ｎｔ〜約４０ｎｔ、約１２ｎｔ〜約３０ｎｔ、約１２ｎ
ｔ〜約２５ｎｔ、約１２ｎｔ〜約２０ｎｔ、または約１２ｎｔ〜約１９ｎｔの長さを有し
得る。例えば、ＤＮＡ標的化セグメントは、約１９ｎｔ〜約２０ｎｔ、約１９ｎｔ〜約２
５ｎｔ、約１９ｎｔ〜約３０ｎｔ、約１９ｎｔ〜約３５ｎｔ、約１９ｎｔ〜約４０ｎｔ、
約１９ｎｔ〜約４５ｎｔ、約１９ｎｔ〜約５０ｎｔ、約１９ｎｔ〜約６０ｎｔ、約１９ｎ
ｔ〜約７０ｎｔ、約１９ｎｔ〜約８０ｎｔ、約１９ｎｔ〜約９０ｎｔ、約１９ｎｔ〜約１
００ｎｔ、約２０ｎｔ〜約２５ｎｔ、約２０ｎｔ〜約３０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約３５ｎｔ
、約２０ｎｔ〜約４０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約４５ｎｔ、約２０ｎｔ〜約５０ｎｔ、約２０
ｎｔ〜約６０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約７０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約８０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約
９０ｎｔ、または約２０ｎｔ〜約１００ｎｔの長さを有し得る。
標的ＤＮＡのヌクレオチド配列（標的配列）に対し相補的なＤＮＡ標的化セグメントの
ヌクレオチド配列（ＤＮＡ標的化配列）は、少なくとも約１２ｎｔの長さを有し得る。例
えば、標的ＤＮＡの標的配列に対し相補的なＤＮＡ標的化セグメントのＤＮＡ標的化配列
は、少なくとも約１２ｎｔ、少なくとも約１５ｎｔ、少なくとも約１８ｎｔ、少なくとも
約１９ｎｔ、少なくとも約２０ｎｔ、少なくとも約２５ｎｔ、少なくとも約３０ｎｔ、少
なくとも約３５ｎｔまたは少なくとも約４０ｎｔの長さを有し得る。例えば、標的ＤＮＡ
の標的配列に対し相補的なＤＮＡ標的化セグメントのＤＮＡ標的化配列は、約１２ヌクレ
オチド（ｎｔ）〜約８０ｎｔ、約１２ｎｔ〜約５０ｎｔ、約１２ｎｔ〜約４５ｎｔ、約１
２ｎｔ〜約４０ｎｔ、約１２ｎｔ〜約３５ｎｔ、約１２ｎｔ〜約３０ｎｔ、約１２ｎｔ〜
約２５ｎｔ、約１２ｎｔ〜約２０ｎｔ、約１２ｎｔ〜約１９ｎｔ、約１９ｎｔ〜約２０ｎ
ｔ、約１９ｎｔ〜約２５ｎｔ、約１９ｎｔ〜約３０ｎｔ、約１９ｎｔ〜約３５ｎｔ、約１
９ｎｔ〜約４０ｎｔ、約１９ｎｔ〜約４５ｎｔ、約１９ｎｔ〜約５０ｎｔ、約１９ｎｔ〜
約６０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約２５ｎｔ、約２０ｎｔ〜約３０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約３５ｎ
ｔ、約２０ｎｔ〜約４０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約４５ｎｔ、約２０ｎｔ〜約５０ｎｔ、また
は約２０ｎｔ〜約６０ｎｔの長さを有し得る。標的ＤＮＡのヌクレオチド配列（標的配列
）に対し相補的なＤＮＡ標的化セグメントのヌクレオチド配列（ＤＮＡ標的化配列）は、
少なくとも約１２ｎｔの長さを有し得る。
いくつかの例において、標的ＤＮＡの標的配列に対し相補的なＤＮＡ標的化セグメント
のＤＮＡ標的化配列は、２０ヌクレオチド長である。いくつかの例において、標的ＤＮＡ
の標的配列に対し相補的なＤＮＡ標的化セグメントのＤＮＡ標的化配列は、１９ヌクレオ
チド長である。
ＤＮＡ標的化セグメントのＤＮＡ標的化配列および標的ＤＮＡの標的配列の間の相補性
パーセントは、少なくとも６０％（例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少な
くとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９
５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）であ
り得る。いくつかの例において、ＤＮＡ標的化セグメントのＤＮＡ標的化配列および標的
ＤＮＡの標的配列の間の相補性パーセントは、標的ＤＮＡの相補鎖の標的配列の７個の連
続する５’末端ヌクレオチドにわたって１００％である。いくつかの例において、ＤＮＡ
標的化セグメントのＤＮＡ標的化配列および標的ＤＮＡの標的配列の間の相補性パーセン
トは、約２０個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも６０％である。いくつかの例に
おいて、ＤＮＡ標的化セグメントのＤＮＡ標的化配列および標的ＤＮＡの標的配列の間の
相補性パーセントは、標的ＤＮＡの相補鎖の標的配列の１４個の連続する５’末端ヌクレ
オチドにわたって１００％であり、残りの配列にわたっては０％という低さである。その
ような場合、ＤＮＡ標的化配列は、１４ヌクレオチド長であるとみなすことができる。い
くつかの例において、ＤＮＡ標的化セグメントのＤＮＡ標的化配列および標的ＤＮＡの標
的配列の間の相補性パーセントは、標的ＤＮＡの相補鎖の標的配列の７個の連続する５’
末端ヌクレオチドにわたって１００％であり、残りの配列にわたっては０％という低さで
ある。そのような場合、ＤＮＡ標的化配列は７ヌクレオチド長であるとみなすことができ
る。
タンパク質結合セグメント
ＤＮＡ標的化ＲＮＡのタンパク質結合セグメント（すなわち、「タンパク質結合配列」
）は、変異型部位特異的ポリペプチドと相互作用する。異型Ｃａｓ９部位特異的ポリペプ
チドが、ＤＮＡ標的化ＲＮＡと一緒に、標的ＤＮＡに結合した場合、標的ＤＮＡの転写は
低減される。
ＤＮＡ標的化ＲＮＡのタンパク質結合セグメントは、互いにハイブリダイズして二本鎖
ＲＮＡ二本鎖（ｄｓＲＮＡ二本鎖）を形成する２本の相補的ヌクレオチド鎖を含む。
本開示のＤＮＡ標的化ＲＮＡのタンパク質結合セグメントは、互いに相補的であり、介
在ヌクレオチド（例えば、単一分子ＤＮＡ標的化ＲＮＡの場合）（「リンカー」または「
リンカーヌクレオチド」）によって共有結合的に連結しており、ハイブリダイズしてタン
パク質結合セグメントの二本鎖ＲＮＡ二本鎖（ｄｓＲＮＡ二本鎖または「ｄＣａｓ９結合
ヘアピン」）を形成し、それによってステムループ構造をもたらす、２本のヌクレオチド
鎖（標的化ＲＮＡおよび活性化ＲＮＡ）を含む。このステムループ構造は、図３９Ａに模
式的に示される。標的化ＲＮＡおよび活性化ＲＮＡは、標的化ＲＮＡの３’末端および活
性化ＲＮＡの５’末端を介して共有結合的に連結し得る。あるいは、標的化ＲＮＡおよび
活性化ＲＮＡは、標的化ＲＮＡの５’末端および活性化ＲＮＡの３’末端を介して共有結
合的に連結し得る。
タンパク質結合セグメントは、約１０ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチド、例えば、
約１０ヌクレオチド（ｎｔ）〜約２０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約３０ｎｔ、約３０ｎｔ〜約４
０ｎｔ、約４０ｎｔ〜約５０ｎｔ、約５０ｎｔ〜約６０ｎｔ、約６０ｎｔ〜約７０ｎｔ、
約７０ｎｔ〜約８０ｎｔ、約８０ｎｔ〜約９０ｎｔ、または約９０ｎｔ〜約１００ｎｔの
長さを有し得る。例えば、タンパク質結合セグメントは、約１５ヌクレオチド（ｎｔ）〜
約８０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約５０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約４０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約３０ｎ
ｔまたは約１５ｎｔ〜約２５ｎｔの長さを有し得る。
タンパク質結合セグメントのｄｓＲＮＡ二本鎖は、約６塩基対（ｂｐ）〜約５０ｂｐの
長さを有し得る。例えば、タンパク質結合セグメントのｄｓＲＮＡ二本鎖は、約６ｂｐ〜
約４０ｂｐ、約６ｂｐ〜約３０ｂｐ、約６ｂｐ〜約２５ｂｐ、約６ｂｐ〜約２０ｂｐ、約
６ｂｐ〜約１５ｂｐ、約８ｂｐ〜約４０ｂｐ、約８ｂｐ〜約３０ｂｐ、約８ｂｐ〜約２５
ｂｐ、約８ｂｐ〜約２０ｂｐまたは約８ｂｐ〜約１５ｂｐの長さを有し得る。例えば、タ
ンパク質結合セグメントのｄｓＲＮＡ二本鎖は、約８ｂｐ〜約１０ｂｐ、約１０ｂｐ〜約
１５ｂｐ、約１５ｂｐ〜約１８ｂｐ、約１８ｂｐ〜約２０ｂｐ、約２０ｂｐ〜約２５ｂｐ
、約２５ｂｐ〜約３０ｂｐ、約３０ｂｐ〜約３５ｂｐ、約３５ｂｐ〜約４０ｂｐ、または
約４０ｂｐ〜約５０ｂｐの長さを有し得る。いくつかの実施形態において、タンパク質結
合セグメントのｄｓＲＮＡ二本鎖は３６塩基対の長さを有する。ハイブリダイズしてタン
パク質結合セグメントのｄｓＲＮＡ二本鎖を形成するヌクレオチド配列間の相補性パーセ
ントは、少なくとも約６０％であり得る。例えば、ハイブリダイズしてタンパク質結合セ
グメントのｄｓＲＮＡ二本鎖を形成するヌクレオチド配列間の相補性パーセントは、少な
くとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少な
くとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、また
は少なくとも約９９％であり得る。いくつかの例において、ハイブリダイズしてタンパク
質結合セグメントのｄｓＲＮＡ二本鎖を形成するヌクレオチド配列間の相補性パーセント
は、１００％である。
リンカーは、約３ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチドの長さを有し得る。例えば、リ
ンカーは、約３ヌクレオチド（ｎｔ）〜約９０ｎｔ、約３ヌクレオチド（ｎｔ）〜約８０
ｎｔ、約３ヌクレオチド（ｎｔ）〜約７０ｎｔ、約３ヌクレオチド（ｎｔ）〜約６０ｎｔ
、約３ヌクレオチド（ｎｔ）〜約５０ｎｔ、約３ヌクレオチド（ｎｔ）〜約４０ｎｔ、約
３ヌクレオチド（ｎｔ）〜約３０ｎｔ、約３ヌクレオチド（ｎｔ）〜約２０ｎｔまたは約
３ヌクレオチド（ｎｔ）〜約１０ｎｔの長さを有し得る。例えば、リンカーは、約３ｎｔ
〜約５ｎｔ、約５ｎｔ〜約１０ｎｔ、約１０ｎｔ〜約１５ｎｔ、約１５ｎｔ〜約２０ｎｔ
、約２０ｎｔ〜約２５ｎｔ、約２５ｎｔ〜約３０ｎｔ、約３０ｎｔ〜約３５ｎｔ、約３５
ｎｔ〜約４０ｎｔ、約４０ｎｔ〜約５０ｎｔ、約５０ｎｔ〜約６０ｎｔ、約６０ｎｔ〜約
７０ｎｔ、約７０ｎｔ〜約８０ｎｔ、約８０ｎｔ〜約９０ｎｔ、または約９０ｎｔ〜約１
００ｎｔの長さを有し得る。いくつかの実施形態において、ＤＮＡ標的化ＲＮＡのリンカ
ーは４ｎｔである。
適切なタンパク質結合セグメント（すなわち、ｄＣａｓ９ハンドル）内に含まれ得るヌ
クレオチド配列の非限定例は、配列番号５６３〜６８２に記載される（例えば、図８およ
び図９を参照）。
いくつかの例において、適切なタンパク質結合セグメントは、上記配列のいずれか１つ
と１、２、３、４、または５ヌクレオチド異なるヌクレオチド配列を含む。
安定性制御配列（例えば、転写ターミネーターセグメント）
安定性制御配列は、ＲＮＡ（例えば、ＤＮＡ標的化ＲＮＡ、標的化ＲＮＡ、活性化ＲＮ
Ａ等）の安定性に影響を与える。適切な安定性制御配列の一例は、転写ターミネーターセ
グメント（すなわち、転写終結配列）である。主題のＤＮＡ標的化ＲＮＡの転写ターミネ
ーターセグメントは、約１０ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチド、例えば、約１０ヌク
レオチド（ｎｔ）〜約２０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約３０ｎｔ、約３０ｎｔ〜約４０ｎｔ、約
４０ｎｔ〜約５０ｎｔ、約５０ｎｔ〜約６０ｎｔ、約６０ｎｔ〜約７０ｎｔ、約７０ｎｔ
〜約８０ｎｔ、約８０ｎｔ〜約９０ｎｔ、または約９０ｎｔ〜約１００ｎｔの全長を有し
得る。例えば、転写ターミネーターセグメントは、約１５ヌクレオチド（ｎｔ）〜約８０
ｎｔ、約１５ｎｔ〜約５０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約４０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約３０ｎｔまた
は約１５ｎｔ〜約２５ｎｔの長さを有し得る。
いくつかの例において、転写終結配列は、真核細胞内で機能的なものである。いくつか
の例において、転写終結配列は、原核細胞内で機能的なものである。
安定性制御配列（例えば、転写終結セグメント、または安定性の増加を与えるためのＤ
ＮＡ標的化ＲＮＡの任意のセグメント）内に含まれ得るヌクレオチド配列の非限定例は、
配列番号６８３〜６９６に記載される配列を含み、例えば、５’−ＵＡＡＵＣＣＣＡＣＡ
ＧＣＣＧＣＣＡＧＵＵＣＣＧＣＵＧＧＣＧＧＣＡＵＵＵＵ−５’（配列番号７９５）（Ｒ
ｈｏ非依存的ｔｒｐ終結部位）である。
追加の配列
いくつかの実施形態において、ＤＮＡ標的化ＲＮＡは、５’末端または３’末端に少な
くとも１つの追加のセグメントを含む。例えば、適切な追加のセグメントは、５’キャッ
プ（例えば、７−メチルグアニル酸キャップ（ｍ７Ｇ））；３’ポリアデニル化尾部（す
なわち、３’ポリ（Ａ）尾部）；リボスイッチ配列（例えば、安定性の調節、並びに／ま
たはタンパク質およびタンパク質複合体による接触のし易さの調節を可能にする）；ｄｓ
ＲＮＡ二本鎖を形成する配列（すなわち、ヘアピン））；ＲＮＡを細胞内位置（例えば、
核、ミトコンドリア、葉緑体等）に標的化する配列；追跡（例えば、蛍光分子への直接結
合、蛍光検出を促進する部分、蛍光検出を可能にする配列への結合等）をもたらす修飾ま
たは配列；タンパク質（例えば、転写活性化因子、転写抑制因子、ＤＮＡメチルトランス
フェラーゼ、ＤＮＡ脱メチル化酵素、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、ヒストン脱
アセチル化酵素等を含むＤＮＡに作用するタンパク質）に対する結合部位を与える修飾ま
たは配列；増加した、低減した、および／または制御可能な安定性を与える修飾または配
列；並びにそれらの組み合わせを含み得る。
同時に存在する複数のＤＮＡ標的化ＲＮＡ
いくつかの実施形態において、複数のＤＮＡ標的化ＲＮＡが、同一の標的ＤＮＡまたは
異なる標的ＤＮＡ上の異なる位置における転写を同時に調節するために、同一の細胞にお
いて同時に用いられる。いくつかの実施形態において、２つ以上のＤＮＡ標的化ＲＮＡは
、同一の遺伝子または転写物または遺伝子座を標的とする。いくつかの実施形態において
、２つ以上のＤＮＡ標的化ＲＮＡは、異なる無関係の遺伝子座を標的とする。いくつかの
実施形態において、２つ以上のＤＮＡ標的化ＲＮＡは、異なるが関連している遺伝子座を
標的とする。
ＤＮＡ標的化ＲＮＡは、小さく頑強（ｒｏｂｕｓｔ）であるため、同一の発現ベクター
上に同時に存在することができ、同一の転写調節下にあることさえ、そのように所望され
る場合は、できる。いくつかの実施形態において、２つ以上（例えば、３以上、４以上、
５以上、１０以上、１５以上、２０以上、２５以上、３０以上、３５以上、４０以上、４
５以上、または５０以上）のＤＮＡ標的化ＲＮＡは、（同一または異なるベクターから）
標的細胞内で同時に発現される。発現したＤＮＡ標的化ＲＮＡは、Ｓ．ピオゲネス、スト
レプトコッカス・サーモフィラス、Ｌ．イノキュア、およびＮ．メニンギティディス等の
異なる細菌に由来するｄＣａｓ９タンパク質によって別々に認識され得る。
複数のＤＮＡ標的化ＲＮＡを発現するために、Ｃｓｙ４エンドリボヌクレアーゼに仲介
される人工的なＲＮＡプロセシング系を用いることができる。複数のＤＮＡ標的化ＲＮＡ
は、（例えば、Ｕ６プロモーターから発現された）前駆転写物上で直列の並びに連鎖され
、Ｃｓｙ４特異的ＲＮＡ配列によって分離され得る。共発現したＣｓｙ４タンパク質は、
前駆転写物を複数のＤＮＡ標的化ＲＮＡに切断する。ＲＮＡプロセシング系を用いる利点
には、第一に、複数のプロモーターを用いる必要がないこと；第二に、全てのＤＮＡ標的
化ＲＮＡが前駆転写物からプロセシングされるため、それらの濃度が同様のｄＣａｓ９結
合に対して正規化されること、が含まれる。
Ｃｓｙ４は、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）細菌に由来す
る小分子エンドリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）タンパク質である。Ｃｓｙ４は最小の１
７ｂｐＲＮＡヘアピンを特異的に認識し、迅速（１分未満）且つ高い効果（９９．９％超
）のＲＮＡ切断を示す。大部分のＲＮａｓｅと異なり、切断されたＲＮＡ断片は安定で機
能的に活性のままである。Ｃｓｙ４に基づくＲＮＡ切断は、人工的ＲＮＡプロセシング系
に再利用され得る。この系において、１７ｂｐＲＮＡヘアピンは、単一のプロモーターか
ら前駆転写物として転写される複数のＲＮＡ断片の間に挿入される。Ｃｓｙ４の共発現は
個々のＲＮＡ断片を作製するのに効果的である。
部位特異的ポリペプチド
上記で言及したように、主題のＤＮＡ標的化ＲＮＡおよび異型Ｃａｓ９部位特異的ポリ
ペプチドは複合体を形成する。ＤＮＡ標的化ＲＮＡは、標的ＤＮＡの配列に対し相補的な
ヌクレオチド配列を含むことにより、複合体に対する標的特異性を与える。
異型Ｃａｓ９部位特異的ポリペプチドは、低減されたエンドデオキシリボヌクレアーゼ
活性を有する。例えば、本開示の転写調節法で用いるのに適した異型Ｃａｓ９部位特異的
ポリペプチドは、野生型Ｃａｓ９ポリペプチド、例えば、図３に示されるアミノ酸配列（
配列番号８）を含む野生型Ｃａｓ９ポリペプチドのエンドデオキシリボヌクレアーゼ活性
の約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、約５％未満、約１％未満、または約０．
１％未満を示す。いくつかの実施形態において、異型Ｃａｓ９部位特異的ポリペプチドは
、検出可能なエンドデオキシリボヌクレアーゼ活性を実質的に有さない。部位特異的ポリ
ペプチドが低減された触媒活性を有する場合（例えば、Ｃａｓ９タンパク質がＤ１０、Ｇ
１２、Ｇ１７、Ｅ７６２、Ｈ８４０、Ｎ８５４、Ｎ８６３、Ｈ９８２、Ｈ９８３、Ａ９８
４、Ｄ９８６、および／またはＡ９８７変異、例えば、Ｄ１０Ａ、Ｇ１２Ａ、Ｇ１７Ａ、
Ｅ７６２Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、Ｎ８６３Ａ、Ｈ９８２Ａ、Ｈ９８３Ａ、Ａ９８４
Ａ、および／またはＤ９８６Ａを有する場合）のいくつかの実施形態において、該ポリペ
プチドは、該ポリペプチドがＤＮＡ標的化ＲＮＡと相互作用する能力を保持している限り
、部位特異的に標的ＤＮＡになお結合することができる（該ポリペプチドはＤＮＡ標的化
ＲＮＡによって標的ＤＮＡ配列になお誘導されるため）。
いくつかの例において、適切な異型Ｃａｓ９部位特異的ポリペプチドは、図３に示され
るＣａｓ９／Ｃｓｎ１アミノ酸配列（配列番号８）のアミノ酸７〜１６６または７３１〜
１００３に対して、または配列番号１〜２５６および７９５〜１３４６のアミノ酸配列の
いずれか１つにおける対応部分に対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少
なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％また
は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの例において、異型Ｃａｓ９部位特異的ポリペプチドは、標的ＤＮＡの相補鎖
を切断することができるが、標的ＤＮＡの非相補鎖を切断する能力が低下している。例え
ば、異型Ｃａｓ９部位特異的ポリペプチドは、ＲｕｖＣドメイン（例えば、図３の「ドメ
イン１」）の機能を低減する変異（アミノ酸置換）を有し得る。非限定例として、いくつ
かの例において、異型Ｃａｓ９部位特異的ポリペプチドは、図３に示されるアミノ酸配列
のＤ１０Ａ（アスパラギン酸からアラニン）変異（または、配列番号１〜２５６および７
９５〜１３４６に記載されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異）である。
いくつかの例において、異型Ｃａｓ９部位特異的ポリペプチドは、標的ＤＮＡの非相補
鎖を切断することができるが、標的ＤＮＡの相補鎖を切断する能力が低下している。例え
ば、異型Ｃａｓ９部位特異的ポリペプチドは、ＨＮＨドメイン（ＲｕｖＣ／ＨＮＨ／Ｒｕ
ｖＣドメインモチーフ、図３の「ドメイン２」）の機能を低減する変異（アミノ酸置換）
を有し得る。非限定例として、いくつかの例において、異型Ｃａｓ９部位特異的ポリペプ
チドは、Ｈ８４０Ａ（配列番号８のアミノ酸位置８４０におけるヒスチジンからアラニン
）または配列番号１〜２５６および７９５〜１３４６に記載されるアミノ酸配列のいずれ
かの対応する変異である。
いくつかの例において、異型Ｃａｓ９部位特異的ポリペプチドは、標的ＤＮＡの相補鎖
および非相補鎖の両方を切断する能力が低下している。非限定例として、いくつかの例に
おいて、異型Ｃａｓ９部位特異的ポリペプチドは、図３に示されるアミノ酸配列のＤ１０
Ａ変異およびＨ８４０Ａ変異の両方（または、配列番号１〜２５６および７９５〜１３４
６に記載されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異）を有する。
他の残基を変異させて、同一の効果を得る（すなわち、１つまたはその他のヌクレアー
ゼ部分を失活させる）ことができる。非限定例として、残基Ｄ１０、Ｇ１２、Ｇ１７、Ｅ
７６２、Ｈ８４０、Ｎ８５４、Ｎ８６３、Ｈ９８２、Ｈ９８３、Ａ９８４、Ｄ９８６、お
よび／またはＡ９８７（または配列番号１〜２５６および７９５〜１３４６として記載さ
れるタンパク質のうちのいずれかの対応する変異）を、変化（すなわち、置換）させるこ
とができる（Ｃａｓ９アミノ酸残基の保存に関するさらなる情報については図３、図５、
図１１Ａ、および表１を参照）。また、アラニン置換以外の変異も適切である。
いくつかの例において、異型Ｃａｓ９部位特異的ポリペプチドは、融合ポリペプチド（
「異型Ｃａｓ９融合ポリペプチド」）、すなわち、ｉ）異型Ｃａｓ９部位特異的ポリペプ
チド；およびｂ）共有結合的に連結された異種ポリペプチド（「融合パートナー」とも称
される）を含む融合ポリペプチドである。
異種ポリペプチドは、異型Ｃａｓ９融合ポリペプチドによっても示される活性（例えば
、酵素活性）（例えば、メチルトランスフェラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活
性、キナーゼ活性、ユビキチン化活性等）を示し得る。異種核酸配列を別の核酸配列に連
結して（例えば、遺伝子操作によって）、キメラポリペプチドをコードするキメラヌクレ
オチド配列を作製してもよい。いくつかの実施形態において、異型Ｃａｓ９融合ポリペプ
チドは、異型Ｃａｓ９ポリペプチドを細胞内局在を与える異種配列（すなわち、異種配列
は細胞内局在配列、例えば、核に標的化するための核局在化シグナル（ＮＬＳ）；ミトコ
ンドリアに標的化するためのミトコンドリア局在化シグナル；葉緑体に標的化するための
葉緑体局在化シグナル；ＥＲ保留シグナル；等である）と融合することによって作製され
る。いくつかの実施形態において、異種配列は、追跡および/または精製を容易にするた
めのタグ（すなわち、異種配列は検出可能な標識である）を与え得る（例えば、蛍光タン
パク質、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＹＦＰ、ＲＦＰ、ＣＦＰ、ｍＣｈｅｒ
ｒｙ、ｔｄＴｏｍａｔｏ等；ヒスチジンタグ、例えば、６ＸＨｉｓタグ；赤血球凝集素（
ＨＡ）タグ；ＦＬＡＧタグ；Ｍｙｃタグ；等）。いくつかの実施形態において、異種配列
は、安定性の増加または低減を与え得る（すなわち、異種配列は安定性制御ペプチド、例
えば、いくつかの例において制御可能なデグロン（例えば、温度感受性または薬剤により
制御可能なデグロン配列、下記参照）である）。いくつかの実施形態において、異種配列
は、標的ＤＮＡからの転写の増加または減少を与え得る（すなわち、異種配列は、転写調
節配列、例えば、転写因子／活性化因子またはその断片、転写因子／活性化因子をリクル
ートするタンパク質またはその断片、転写抑制因子またはその断片、転写抑制因子をリク
ルートするタンパク質またはその断片、小分子／薬剤応答性転写制御因子等である）。い
くつかの実施形態において、異種配列は、結合ドメインを与え得る（すなわち、異種配列
は、例えば、キメラｄＣａｓ９ポリペプチドを目的の別のタンパク質（例えば、ＤＮＡま
たはヒストン修飾タンパク質、転写因子または転写抑制因子、リクルートタンパク質等）
に結合する能力を与えるタンパク質結合配列である）。
安定性の増加または低減を与える適切な融合パートナーには、限定はされないが、デグ
ロン配列が含まれる。デグロンは、それらが一部となるタンパク質の安定性を制御するア
ミノ酸配列となることが、当業者に容易に理解される。例えば、デグロン配列を含むタン
パク質の安定性は、デグロン配列によって少なくとも部分的に制御される。いくつかの例
において、適切なデグロンは、デグロンが実験的制御に関係なくタンパク質安定性にその
影響を及ぼすように、恒常的である（すなわち、デグロンは薬剤誘導性、温度誘導性等で
はない）。いくつかの例において、デグロンは、異型Ｃａｓ９ポリペプチドが所望の条件
に依存して「オン」（すなわち、安定な）または「オフ」（すなわち、不安定な、分解さ
れた）を切り替えることができるように、異型Ｃａｓ９ポリペプチドに制御可能な安定性
を与える。例えば、デグロンが温度感受性デグロンである場合、異型Ｃａｓ９ポリペプチ
ドは、閾値温度（例えば、４２℃、４１℃、４０℃、３９℃、３８℃、３７℃、３６℃、
３５℃、３４℃、３３℃、３２℃、３１℃、３０℃等）未満において機能的（すなわち、
「オン」、安定）であるが、閾値温度を超えた温度では非機能的（すなわち、「オフ」、
分解された）であり得る。別の例として、デグロンが薬剤誘導性デグロンである場合、薬
剤の存在または非存在は、該タンパク質を「オフ」（すなわち、不安定な）状態から「オ
ン」（すなわち、安定な）状態、またはその逆に切り替えることができる。例示的な薬剤
誘導性デグロンはＦＫＢＰ１２タンパク質に由来する。デグロンの安定性はデグロンに結
合する小分子の存在または非存在によって制御される。
適切なデグロンの例としては、限定はされないが、Ｓｈｉｅｌｄ−１、ＤＨＦＲ、オー
キシン、および／または温度によって制御されるデグロンが挙げられる。適切なデグロン
の非限定例は当該技術分野において公知である（例えば、Dohmen et al., Science, 1994
. 263(5151): p. 1273-1276: Heat-inducible degron: a method for constructing temp
erature-sensitive mutants; Schoeber et al., Am J Physiol Renal Physiol. 2009 Jan
;296(1):F204-11 : Conditional fast expression and function of multimeric TRPV5 c
hannels using Shield-1 ; Chu et al., Bioorg Med Chem Lett. 2008 Nov 15;18(22):59
41-4: Recent progress with FKBP-derived destabilizing domains ; Kanemaki, Pfluge
rs Arch. 2012 Dec 28: Frontiers of protein expression control with conditional d
egrons; Yang et al., Mol Cell. 2012 Nov 30;48(4):487-8: Titivated for destructio
n: the methyl degron; Barbour et al., Biosci Rep. 2013 Jan 18;33(1).: Characteri
zation of the bipartite degron that regulates ubiquitin-independent degradation
of thymidylate synthase;およびGreussing et al., J Vis Exp. 2012 Nov 10;(69): Mon
itoring of ubiquitin-proteasome activity in living cells using a Degr
on (dgn)-destabilized green fluorescent protein (GFP)-based reporter protein（こ
れらは全て、これらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる））。
例示的なデグロン配列は、細胞および動物の両方において十分に特徴付けされ、試験さ
れている。従って、ｄＣａｓ９をデグロン配列に融合することにより、「調節可能」且つ
「誘導性」のｄＣａｓ９ポリペプチドが作製される。本明細書に記載の融合パートナーの
いずれも、あらゆる望ましい組み合わせで用いることができる。この点を説明するための
１つの非限定例として、ｄＣａｓ９融合タンパク質は、検出のためのＹＦＰ配列、安定性
のためのデグロン配列、および標的ＤＮＡの転写を増加させるための転写活性化因子配列
を含み得る。さらに、ｄＣａｓ９融合タンパク質内に用いることができる融合パートナー
の数は限定されている。いくつかの例において、ｄＣａｓ９融合タンパク質は、一つまた
は複数（例えば、２つ以上、３つ以上、４つ以上、または５つ以上）の異種配列を含む。
適切な融合パートナーとしては、限定はされないが、メチルトランスフェラーゼ活性、
脱メチル化酵素活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、脱アセチル化酵素活性、キナー
ゼ活性、ホスファターゼ活性、ユビキチンリガーゼ活性、脱ユビキチン化活性、アデニル
化活性、脱アデニル化活性、ＳＵＭＯ化活性、脱ＳＵＭＯ化活性、リボシル化活性、脱リ
ボシル化活性、ミリストイル化活性または脱ミリストイル化活性を与えるポリペプチドが
挙げられ、これらの活性はいずれも、ＤＮＡの直接修飾（例えば、ＤＮＡのメチル化）に
、またはＤＮＡ結合ポリペプチドの修飾（例えば、ヒストンまたはＤＮＡ結合タンパク質
）に向けられることができる。さらに、適切な融合パートナーとしては、限定はされない
が、境界エレメント（例えば、ＣＴＣＦ）、末梢動員（ｐｅｒｉｐｈｅｒｙ ｒｅｃｒｕ
ｉｔｍｅｎｔ）を与えるタンパク質およびその断片（例えば、ラミンＡ、ラミンＢ等）、
並びにタンパク質ドッキングエレメント（例えば、ＦＫＢＰ／ＦＲＢ、Ｐｉｌ１／Ａｂｙ
１等）が挙げられる。
主題の異型Ｃａｓ９部位特異的ポリペプチドの、種々の追加の適切な融合パートナー（
またはその断片）の例としては、限定はされないが、図５４に列挙されるものが挙げられ
る。
いくつかの実施形態において、主題の部位特異的修飾ポリペプチドはコドン最適化され
得る。この種の最適化は当該技術分野において公知であり、同一のタンパク質をコードし
たまま目的の宿主生物または細胞のコドン選択を模倣するために、外来性ＤＮＡの変異を
必要とする。従って、コドンは変化されるが、コードされるタンパク質は変化されないま
まである。例えば、目的の標的細胞がヒト細胞である場合、ヒトコドン最適化ｄＣａｓ９
（またはｄＣａｓ９変異体）が適切な部位特異的修飾ポリペプチドであるだろう。別の非
限定例として、目的の宿主細胞がマウス細胞である場合、マウスコドン最適化Ｃａｓ９（
または変異体、例えば、酵素的に不活性な変異体）が適切なＣａｓ９部位特異的ポリペプ
チドであるだろう。コドン最適化は必要なものではないが、ある特定の場合においては受
け入れられるものであり、好ましい場合がある。
宿主細胞
転写を調節するための本開示の方法は、インビボおよび／またはエキソビボおよび／ま
たはインビトロにおいて有糸分裂または分裂終了細胞内の転写調節を誘導するために用い
ることができる。ＤＮＡ標的化ＲＮＡは標的ＤＮＡにハイブリダイズすることにより特異
性を与えるため、有糸分裂細胞および／または分裂終了細胞は、種々の宿主細胞のいずれ
であってもよく、適切な宿主細胞としては、限定はされないが、細菌細胞；古細菌細胞；
単細胞真核生物；植物細胞；藻細胞、例えば、ボツリオコッカス・ブラウニー、コナミド
リムシ、ナンノクロロプシス・ガディタナ、クロレラ・ピレノイドサ、ヤツマタモク、Ｃ
．アガルド等；真菌細胞；動物細胞；無脊椎動物（例えば、昆虫、刺胞動物、棘皮動物、
線虫等）由来の細胞；真核生物の原虫（例えば、マラリア原虫、例えば、熱帯熱マラリア
原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）；蠕虫；等）；脊椎動物（例えば
、魚、両生類、爬虫類動物、鳥、哺乳動物）由来の細胞；哺乳類細胞、例えば、げっ歯類
細胞、ヒト細胞、非ヒト霊長類細胞等が挙げられる。適切な宿主細胞としては、自然発生
的な細胞；遺伝子改変細胞（例えば、実験室で、例えば、「ヒトの手」によって遺伝子改
変された細胞）；および任意の方法でインビトロで操作された細胞が挙げられる。いくつ
かの例において、宿主細胞は単離されている。
いかなる種類の細胞も対象になり得る（例えば、幹細胞、例えば、胚性幹（ＥＳ）細胞
、誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞、生殖細胞；体細胞、例えば、線維芽細胞、造血細胞、ニ
ューロン、筋細胞、骨細胞、肝細胞、膵臓細胞；インビトロまたはインビボにおける、あ
らゆる段階の胚の胚細胞、例えば、１細胞、２細胞、４細胞、８細胞等の段階のゼブラフ
ィッシュ胚；等）。細胞は株化細胞系から得てもよいし、あるいは初代細胞であってもよ
く、ここで、「初代細胞」、「初代細胞系」、および「初代培養物」は、本明細書で同義
的に使用されて、対象から得られ、培養物の、限定された回数の継代（すなわち、分裂）
だけインビトロにおいて増殖した、細胞および細胞培養物を指す。例えば、初代培養物に
は、０回、１回、２回、４回、５回、１０回、または１５回継代されている場合があるが
、危機期（ｃｒｉｓｉｓ ｓｔａｇｅ）を起こすには十分な回数継代されていない、培養
物が含まれる。初代細胞系はインビトロにおいて１０継代未満維持することができる。標
的細胞は、多くの実施形態では、単細胞生物であるか、または培養下で増殖する。
細胞は、初代細胞である場合、あらゆる好都合な方法によって個体から採取することが
できる。例えば、白血球は、アフェレーシス、白血球アフェレーシス、密度勾配分離等に
よって採取することが好都合であり得、一方、皮膚、筋肉、骨髄、脾臓、肝臓、膵臓、肺
、腸、胃等の組織由来の細胞は、生検によって採取することが最も好都合である。適切な
溶液を、採取した細胞を分散または懸濁させるために用いてもよい。そのような溶液は、
一般的には、低濃度（例えば、５〜２５ｍＭ）の許容可能な緩衝液と共に、ウシ胎仔血清
または他の自然発生的な因子を添加されていることが好都合である、平衡塩類溶液、例え
ば、生理食塩水、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、ハンクス平衡塩類溶液等である。好都合
な緩衝液には、ＨＥＰＥＳ、リン酸緩衝液、乳酸緩衝液等が含まれる。細胞は直ちに使用
してもよいし、あるいは、長期間保存、凍結して、解凍および再使用可能にしてもよい。
そのような場合、細胞は通常、１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、５０％血清、
４０％緩衝培地、または、細胞をそのような凍結温度において保存するために当該技術分
野において一般的に用いられるいくつかの他の溶液中で凍結され、凍結培養細胞を解凍す
るための当該技術分野において周知の方法で解凍される。
宿主細胞への核酸の導入
ＤＮＡ標的化ＲＮＡ、またはそれをコードするヌクレオチド配列を含む核酸は、種々の
周知の方法のいずれによっても宿主細胞に導入することができる。同様に、主題の方法が
、異型Ｃａｓ９部位特異的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を宿主
細胞に導入することを含む場合、そのような核酸は、種々の周知の方法のいずれによって
も宿主細胞に導入することができる。
核酸を宿主細胞に導入する方法は当該技術分野において公知であり、いかなる公知の方
法を用いても、核酸（例えば、発現構築物）を幹細胞または前駆細胞に導入することがで
きる。適切な方法としては、例えば、ウイルス感染またはバクテリオファージ感染、トラ
ンスフェクション、接合（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）、原形質融合、リポフェクション、
エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）介在性
トランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン介在性トランスフェクション、リポソー
ム介在性トランスフェクション、パーティクルガン法、リン酸カルシウム沈殿、直接微量
注入、ナノ粒子介在性核酸送達（例えば、Panyam et., al Adv Drug Deliv Rev. 2012 Se
p 13. pii: S0169-409X(12)00283-9. doi: 10.1016/j.addr.2012.09.023を参照）等が挙
げられる。
核酸
本開示は、主題のＤＮＡ標的化ＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸を
提供する。いくつかの例において、主題の核酸は、異型Ｃａｓ９部位特異的ポリペプチド
をコードするヌクレオチド配列も含む。
いくつかの実施形態において、主題の方法は、宿主細胞（または宿主細胞集団）に、Ｄ
ＮＡ標的化ＲＮＡおよび／または異型Ｃａｓ９部位特異的ポリペプチドをコードするヌク
レオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を導入することを含む。いくつかの実施形態に
おいて、標的ＤＮＡを含む細胞はインビトロに存在する。いくつかの実施形態において、
標的ＤＮＡを含む細胞はインビボに存在する。ＤＮＡ標的化ＲＮＡおよび／または部位特
異的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む適切な核酸には発現ベクターが含
まれ、ここで、ＤＮＡ標的化ＲＮＡおよび／または部位特異的ポリペプチドをコードする
ヌクレオチド配列を含む発現ベクターは「組み換え発現ベクター」である。
いくつかの実施形態において、組み換え発現ベクターは、ウイルス性構築物、例えば、
組換え型アデノ随伴ウイルス構築物（例えば、米国特許第７，０７８，３８７号を参照）
、組換え型アデノウイルス構築物、組換え型レンチウイルス構築物、組換え型レトロウイ
ルス構築物等である。
適切な発現ベクターとしては、限定はされないが、ウイルスベクター（例えば、ワクシ
ニアウイルスに基づくウイルスベクター；ポリオウイルス；アデノウイルス（例えば、Li
et al., Invest Opthalmol Vis Sci 35:2543 2549, 1994; Borras et al., Gene Ther 6
:515 524, 1999; Li and Davidson, PNAS 92:7700 7704, 1995; Sakamoto et al., H Gen
e Ther 5:1088 1097, 1999；国際公開第９４／１２６４９号、同第９３／０３７６９号；
同第９３／１９１９１号；同第９４／２８９３８号；同第９５／１１９８４号および同第
９５／００６５５号を参照）；アデノ随伴ウイルス（例えば、Ali et al., Hum Gene The
r 9:81 86, 1998, Flannery et al., PNAS 94:6916 6921, 1997; Bennett et al., Inves
t Opthalmol Vis Sci 38:2857 2863, 1997; Jomary et al., Gene Ther 4:683 690, 1997
, Rolling et al., Hum Gene Ther 10:641 648, 1999; Ali et al., Hum Mol Genet 5:59
1 594, 1996；国際公開第９３／０９２３９号のSrivastava, Samulski et al., J. Vir.
(1989) 63:3822−3828; Mendelson et al., Virol. (1988) 166:154−165;およびFlotte
et al., PNAS (1993) 90:10613−10617を参照）；ＳＶ４０；単純疱疹ウイルス；ヒト免
疫不全ウイルス（例えば、Miyoshi et al., PNAS 94:10319 23, 1997; Takahashi et al.
, J Virol 73:7812 7816, 1999を参照）；レトロウイルスベクター（例えば、マウス白血
病ウイルス、脾壊死ウイルス、およびラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、トリ
白血病ウイルス、レンチウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス（ｍ
ｙｅｌｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ｓａｒｃｏｍａ ｖｉｒｕｓ）、および乳癌ウイ
ルス等のレトロウイルス由来のベクター）；等が挙げられる。
多数の適切な発現ベクターが当業者に知られており、多くは市販されている。例として
以下のベクターを記載する；真核生物宿主細胞：ｐＸＴ１、ｐＳＧ５（ストラタジーン社
）、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、およびｐＳＶＬＳＶ４０（ファルマシア社）。し
かし、宿主細胞に適合している限り、いかなる他のベクターを使用してもよい。
使用される宿主／ベクター系に応じて、構成的プロモーターおよび誘導性プロモーター
、転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーター等を含む、いくつかの適切な転写調
節領域および翻訳調節領域のいずれかを、発現ベクター内に用いてもよい（例えば、Bitt
er et al. (1987) Methods in Enzymology, 153:516-544を参照）。
いくつかの実施形態において、ＤＮＡ標的化ＲＮＡおよび／または異型Ｃａｓ９部位特
異的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、調節領域、例えば、プロモーター等
の転写調節領域に作動可能に連結している。転写調節領域は、真核細胞、例えば、哺乳類
細胞；または原核細胞（例えば、細菌細胞または古細菌細胞）において機能的であり得る
。いくつかの実施形態において、ＤＮＡ標的化ＲＮＡおよび／または異型Ｃａｓ９部位特
異的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、原核細胞および真核細胞の両方にお
いてＤＮＡ標的化ＲＮＡおよび／または異型Ｃａｓ９部位特異的ポリペプチドをコードす
るヌクレオチド配列の発現を可能にする、複数の調節領域に作動可能に連結している。
プロモーターは、恒常的活性型プロモーター（すなわち、恒常的に活性／「ＯＮ」状態
であるプロモーター）であってもよく、誘導性プロモーター（すなわち、活性／「ＯＮ」
または不活性／「ＯＦＦ」状態が、外部刺激、例えば、特定の温度、化合物、またはタン
パク質の存在によって制御されるプロモーター）であってもよく、空間限定的（ｓｐａｔ
ｉａｌｌｙ ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ）プロモーター（すなわち、転写調節領域、エンハン
サー等）（例えば、組織特異的プロモーター、細胞型特異的プロモーター等）であっても
よく、時間限定的（ｔｅｍｐｏｒａｌｌｙ ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ）プロモーター（すな
わち、プロモーターが、胚発生の特定の段階の間、または生物学的プロセスの特定の段階
、例えば、マウスにおける毛包周期の間に、「ＯＮ」状態または「ＯＦＦ」状態にある）
であってもよい。
適切なプロモーターはウイルス由来であってもよく、従ってウイルス性プロモーターと
称されてもよく、あるいは、適切なプロモーターは原核生物または真核生物を含むあらゆ
る生物に由来していてもよい。適切なプロモーターを用いることで、いかなるＲＮＡポリ
メラーゼ（例えば、ｐｏｌＩ、ｐｏｌＩＩ、ｐｏｌＩＩＩ）によっても発現を駆動するこ
とができる。プロモーターの例としては、限定はされないが、ＳＶ４０初期プロモーター
、マウス乳癌ウイルス末端反復配列（ＬＴＲ）プロモーター；アデノウイルス主要後期プ
ロモーター（ＡｄＭＬＰ）；単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）プロモーター、サイトメガロウ
イルス（ＣＭＶ）プロモーター、例えば、ＣＭＶ最初期プロモーター領域（ＣＭＶＩＥ）
、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ヒトＵ６核内低分子プロモーター（Ｕ６
）（Miyagishi et al. , Nature Biotechnology 20, 497 - 500 (2002)）、高感度Ｕ６プ
ロモーター（例えば、Xia et al., Nucleic Acids Res. 2003 Sep 1;31(17)）、ヒトＨ１
プロモーター（Ｈ１）等が挙げられる。
誘導性プロモーターの例としては、限定はされないが、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモ
ーター、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピ
ラノシド（ＩＰＴＧ）調節性プロモーター、ラクトース誘導性プロモーター、熱ショック
プロモーター、テトラサイクリン調節性プロモーター（例えば、Ｔｅｔ−ＯＮ、Ｔｅｔ−
ＯＦＦ等）、ステロイド調節性プロモーター、金属調節性プロモーター、エストロゲン受
容体調節性プロモーター等が挙げられる。従って誘導性プロモーターは、ドキシサイクリ
ン；ＲＮＡポリメラーゼ、例えば、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ；エストロゲン受容体；エス
トロゲン受容体融合物；等を含むがこれらに限定はされない分子によって調節され得る。
いくつかの実施形態において、プロモーターは、多細胞生物においてプロモーターが一
部の特定の細胞内で活性（すなわち、「ＯＮ」）であるような、空間限定的プロモーター
（すなわち、細胞型特異的プロモーター、組織特異的プロモーター等）である。空間限定
的プロモーターは、エンハンサー、転写調節領域、制御配列等とも称され得る。いかなる
好都合な空間限定的プロモーターも使用することができ、適切なプロモーター（例えば、
脳特異的プロモーター、一部のニューロンにおける発現を駆動するプロモーター、生殖細
胞系列における発現を駆動するプロモーター、肺における発現を駆動するプロモーター、
筋肉における発現を駆動するプロモーター、膵臓の島細胞における発現を駆動するプロモ
ーター等）の選択は、生物によって異なる。例えば、植物、ハエ、虫、哺乳動物、マウス
等において、種々の空間限定的プロモーターが知られている。従って、空間限定的プロモ
ーターを用いることで、生物に応じて、種々様々な異なる組織および細胞型において主題
の部位特異的ポリペプチドをコードする核酸の発現を制御することがでる。また、いくつ
かの空間限定的プロモーターは、プロモーターが、胚発生の特定の段階の間、または生物
学的プロセスの特定の段階（例えば、マウスにおける毛包周期）の間に、「ＯＮ」状態ま
たは「ＯＦＦ」状態にあるように、時間限定的である。
例示を目的として、空間限定的プロモーターの例としては、限定はされないが、ニュー
ロン特異的プロモーター、脂肪細胞特異的プロモーター、心筋細胞特異的プロモーター、
平滑筋特異的プロモーター、光受容体特異的プロモーター等が挙げられる。ニューロン特
異的空間限定的プロモーターとしては、限定はされないが、ニューロン特異的エノラーゼ
（ＮＳＥ）プロモーター（例えば、ＥＭＢＬ ＨＳＥＮＯ２、Ｘ５１９５６を参照）；芳
香族アミノ酸脱炭酸酵素（ＡＡＤＣ）プロモーター；神経フィラメントプロモーター（例
えば、ＧｅｎＢａｎｋ ＨＵＭＮＦＬ、Ｌ０４１４７を参照）；シナプシンプロモーター
（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ ＨＵＭＳＹＮＩＢ、Ｍ５５３０１を参照）；ｔｈｙ−１プロ
モーター（例えば、Chen et al. (1987) Cell 51:7-19;およびLlewellyn, et al. (2010)
Nat. Med. 16(10):1161-1166を参照）；セロトニン受容体プロモーター（例えば、Ｇｅ
ｎＢａｎｋ Ｓ６２２８３を参照）；チロシン水酸化酵素プロモーター（ＴＨ）（例えば
、Oh et al. (2009) Gene Ther 16:437; Sasaoka et al. (1992) Mol. Brain Res. 16:27
4; Boundy et al. (1998) J. Neurosci. 18:9989;およびKaneda et al. (1991) Neuron 6
:583-594を参照）；ＧｎＲＨプロモーター（例えば、Radovick et al. (1991) Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA 88:3402-3406を参照）；Ｌ７プロモーター（例えば、Oberdick et al
. (1990) Science 248:223-226を参照）；ＤＮＭＴプロモーター（例えば、Bartge et al
. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:3648-3652を参照）；エンケファリンプロモー
ター（例えば、Comb et al. (1988) EMBO J. 17:3793-3805を参照）；ミエリン塩基性タ
ンパク質（ＭＢＰ）プロモーター；Ｃａ２＋−カルモジュリン依存性プロテインキナーゼ
ＩＩ−α（ＣａｍＫＩＩα）プロモーター（例えば、Mayford et al. (1996) Proc. Natl
. Acad. Sci. USA 93:13250;およびCasanova et al. (2001) Genesis 31:37を参照）；Ｃ
ＭＶエンハンサー／血小板由来増殖因子−βプロモーター（例えば、Liu et al. (2004)
Gene Therapy 11:52-60を参照）；等が挙げられる。
脂肪細胞特異的空間限定的プロモーターとしては、限定はされないが、ａＰ２遺伝子プ
ロモーター／エンハンサー、例えば、ヒトａＰ２遺伝子の−５．４ｋｂ〜＋２１ｂｐの領
域（例えば、Tozzo et al. (1997) Endocrinol. 138:1604; Ross et al. (1990) Proc. N
atl. Acad. Sci. USA 87:9590;およびPavjani et al. (2005) Nat. Med. 11:797を参照）
；グルコーストランスポーター−４（ＧＬＵＴ４）プロモーター（例えば、Knight et al
. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:14725を参照）；脂肪酸トランスロカーゼ（
ＦＡＴ／ＣＤ３６）プロモーター（例えば、Kuriki et al. (2002) Biol. Pharm. Bull.
25:1476;およびSato et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:15703を参照）；ステアロイル
ＣｏＡ不飽和酵素−１（ＳＣＤ１）プロモーター（Tabor et al. (1999) J. Biol. Chem.
274:20603）；レプチンプロモーター（例えば、Mason et al. (1998) Endocrinol. 139:
1013;およびChen et al. (1999) Biochem. Biophys. Res. Comm. 262:187を参照）；アデ
ィポネクチンプロモーター（例えば、Kita et al. (2005) Biochem. Biophys. Res. Comm
. 331:484;およびChakrabarti (2010) Endocrinol. 151:2408を参照）；アディプシンプ
ロモーター（例えば、Platt et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:7490を参照
）；レジスチンプロモーター（例えば、Seo et al. (2003) Molec. Endocrinol. 17:1522
を参照）；等が挙げられる。
心筋細胞特異的空間限定的プロモーターとしては、限定はされないが、以下の遺伝子に
由来する制御配列が挙げられる：ミオシン軽鎖−２、α−ミオシン重鎖、ＡＥ３、心筋ト
ロポニンＣ、心筋アクチン等が挙げられる。Franz et al. (1997) Cardiovasc. Res. 35:
560-566; Robbins et al. (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci. 752:492-505; Linn et al. (19
95) Circ. Res. 76:584-591; Parmacek et al. (1994) Mol. Cell. Biol. 14:1870-1885;
Hunter et al. (1993) Hypertension 22:608-617;およびSartorelli et al. (1992) Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA 89:4047-4051。
平滑筋特異的空間限定的プロモーターとしては、限定はされないが、ＳＭ２２αプロモ
ーター（例えば、Akyurek et al. (2000) Mol. Med. 6:983；および米国特許第７，１６
９，８７４号を参照）；スムーセリン（ｓｍｏｏｔｈｅｌｉｎ）プロモーター（例えば、
国際公開第２００１／０１８０４８号）；α−平滑筋アクチンプロモーター；等が挙げら
れる。例えば、ＳＭ２２αプロモーターの０．４ｋｂ領域は、その中に２つのＣＡｒＧエ
レメントが存在しており、血管平滑筋細胞特異的な発現を媒介することが示されている（
例えば、Kim, et al. (1997) Mol. Cell. Biol. 17, 2266-2278; Li, et al., (1996) J.
Cell Biol. 132, 849-859、およびMoessler, et al. (1996) Development 122, 2415-24
25を参照）。
光受容体特異的空間限定的プロモーターとしては、限定はされないが、ロドプシンプロ
モーター；ロドプシンキナーゼプロモーター（Young et al. (2003) Ophthalmol. Vis. S
ci. 44:4076）；βホスホジエステラーゼ遺伝子プロモーター（Nicoud et al. (2007) J.
Gene Med. 9:1015）；網膜色素変性症遺伝子プロモーター（Nicoud et al. (2007)、上
記）；光受容体間レチノイド結合タンパク質（ＩＲＢＰ）遺伝子エンハンサー（Nicoud e
t al. (2007)、上記）；ＩＲＢＰ遺伝子プロモーター（Yokoyama et al. (1992) Exp Eye
Res. 55:225）；等が挙げられる。
ライブラリー
本開示はＤＮＡ標的化ＲＮＡのライブラリーを提供する。本開示は、ＤＮＡ標的化ＲＮ
Ａをコードするヌクレオチドを含む核酸のライブラリーを提供する。主題の、ＤＮＡ標的
化ＲＮＡをコードするヌクレオチドを含む核酸のライブラリーは、ＤＮＡ標的化ＲＮＡを
コードするヌクレオチドを含む組み換え発現ベクターのライブラリーを含み得る。
主題のライブラリーは、約１０個の個々の構成要素〜約１０１２個の個々の構成要素を
含み得；例えば、主題のライブラリーは、約１０個の個々の構成要素〜約１０２個の個々
の構成要素、約１０２個の個々の構成要素〜約１０３個の個々の構成要素、約１０３個の
個々の構成要素〜約１０５個の個々の構成要素、約１０５個の個々の構成要素〜約１０７
個の個々の構成要素、約１０７個の個々の構成要素〜約１０９個の個々の構成要素、また
は約１０９個の個々の構成要素〜約１０１２個の個々の構成要素を含み得る。
主題のライブラリーの「個々の構成要素」は、ＤＮＡ標的化ＲＮＡのＤＮＡターゲティ
ングセグメントのヌクレオチド配列において、ライブラリーの他の構成要素と異なる。従
って、例えば、主題のライブラリーの個々の構成要素のそれぞれは、ライブラリーの他の
全ての構成要素と同一または実質的に同一のタンパク質結合セグメントのヌクレオチド配
列を含み得；ライブラリーの他の全ての構成要素と同一または実質的に同一の転写終結セ
グメントのヌクレオチド配列を含み得るが；ＤＮＡ標的化ＲＮＡのＤＮＡターゲティング
セグメントのヌクレオチド配列においてライブラリーの他の構成要素と異なる。このよう
に、本ライブラリーは、異なる標的核酸に結合する構成要素を含み得る。
有用性
本開示による転写を調節するための方法は、種々の用途において有用であり、それもま
た提供される。用途には、研究用途；診断用途；産業的用途；および治療用途が含まれる
。
研究用途には、例えば、例えば、発達、代謝、下流遺伝子の発現等に対する、標的核酸
の転写を低減または増加することの影響の決定が含まれる。
ハイスループットゲノム解析は、ＤＮＡ標的化ＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントのみが
変化される必要があるが、タンパク質結合セグメントおよび転写終結セグメントは（いく
つかの例において）一定に保たれ得る、主題の転写調節法を用いて、実行することができ
る。ゲノム解析に用いられる複数の核酸を含むライブラリー（例えば、主題のライブラリ
ー）は、ＤＮＡ標的化ＲＮＡをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結しているプ
ロモーターを含み、ここで、それぞれの核酸は異なるＤＮＡ標的化セグメント、共通のタ
ンパク質結合セグメント、および共通の転写終結セグメントを含む。チップは５×１０４
個超の独特なＤＮＡ標的化ＲＮＡを含有し得る。応用には、大規模表現型検査、遺伝子−
機能マッピング、およびメタゲノム解析が含まれる。
本明細書で開示される主題の方法は、代謝工学の分野において有用である。転写レベル
は、本明細書に記載されるような、適切なＤＮＡ標的化ＲＮＡを設計することによって効
率的且つ予想通りに制御することができるため、代謝経路（例えば、生合成経路）の活性
は、目的の代謝経路内の特定の酵素のレベルを（例えば、転写の増加または減少によって
）制御することによって、正確に制御および調節することができる。目的の代謝経路には
、化学製品製造（精製化学製品、燃料、抗生物質、毒素、作動薬、拮抗薬等）および／ま
たは薬剤製造に用いられる経路が含まれる。
目的の生合成経路には、限定はされないが、（１）メバロン酸経路（例えば、ＨＭＧ−
ＣｏＡ還元酵素経路）（アセチル−ＣｏＡがジメチルアリルピロリン酸（ＤＭＡＰＰ）お
よびイソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）に変換され、それらがテルペノイド／イソプレ
ノイドを含む種々様々な生体分子の生合成に用いられる）、（２）非メバロン酸経路（す
なわち、「２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール４−リン酸／１−デオキシ−Ｄ−キシル
ロース５−リン酸経路」または「ＭＥＰ／ＤＯＸＰ経路」または「ＤＸＰ経路」）（これ
も、メバロン酸経路の代替経路によって、ピルビン酸およびグリセルアルデヒド３−リン
酸がＤＭＡＰＰおよびＩＰＰに変換されることにより、ＤＭＡＰＰおよびＩＰＰが生成さ
れる）、（３）ポリケチド合成経路（種々のポリケチド合成酵素により種々のポリケチド
が生成される）（ポリケチドには、化学療法に用いられる自然発生的な小分子（例えば、
テトラサイクリン、およびマクロライド系抗生物質）が含まれ、産業上重要なポリケチド
としては、ラパマイシン（免疫抑制剤）、エリスロマイシン（抗生物質）、ロバスタチン
（抗コレステロール剤）、およびエポシロンＢ（抗がん剤）が挙げられる）、（４）脂肪
酸合成経路、（５）ＤＡＨＰ（３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロン酸７−リン酸）
合成経路、（６）有望なバイオ燃料（例えば、短鎖アルコールおよびアルカン、脂肪酸メ
チルエステルおよび脂肪アルコール、イソプレノイド等）を生成する経路等が含まれる。
ネットワークおよびカスケード
本明細書で開示される方法は、制御の統合ネットワーク（すなわち、１つまたは複数の
カスケード）を設計するために用いることができる。例えば、主題のＤＮＡ標的化ＲＮＡ
／異型Ｃａｓ９部位特異的ポリペプチドは、別のＤＮＡ標的化ＲＮＡまたは別の主題の異
型Ｃａｓ９部位特異的ポリペプチドの発現を制御（すなわち、調節、例えば、増加、低減
）するために用いることができる。例えば、第一のＤＮＡ標的化ＲＮＡは、第一の異型Ｃ
ａｓ９部位特異的ポリペプチドと異なる機能（例えば、メチルトランスフェラーゼ活性、
脱メチル化酵素活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、脱アセチル化酵素活性等）を有
する第二のキメラｄＣａｓ９ポリペプチドの転写の調節を標的とするように設計すること
ができる。さらに、異なるｄＣａｓ９タンパク質（例えば、異なる種に由来する）は異な
るＣａｓ９ハンドル（すなわち、タンパク質結合セグメント）を必要とし得るため、第二
のキメラｄＣａｓ９ポリペプチドは、上記の第一のｄＣａｓ９ポリペプチドとは異なる種
に由来し得る。従って、いくつかの例において、第二のキメラｄＣａｓ９ポリペプチドは
、第一のＤＮＡ標的化ＲＮＡと相互作用できないように、選択され得る。他の例において
、第二のキメラｄＣａｓ９ポリペプチドは、第一のＤＮＡ標的化ＲＮＡと相互作用するよ
うに、選択され得る。いくつかのそのような例において、２つ（またはそれ以上の）ｄＣ
ａｓ９タンパク質の活性は、競合し得る（例えば、それらのポリペプチドが逆の活性を有
する場合）か、または相乗的に作用し得る（例えば、それらのポリペプチドが類似の、ま
たは相乗的な活性を有する場合）。同様に、上記で言及したように、ネットワーク内の複
合体（すなわち、ＤＮＡ標的化ＲＮＡ／ｄＣａｓ９ポリペプチド）のいずれも、他のＤＮ
Ａ標的化ＲＮＡまたはｄＣａｓ９ポリペプチドを制御するように設計することができる。
主題のＤＮＡ標的化ＲＮＡおよび主題の異型Ｃａｓ９部位特異的ポリペプチドはいかなる
所望のＤＮＡ配列にも標的化することができるため、本明細書に記載の方法は、いかなる
所望の標的の発現をも調節および制御するために用いることができる。設計することがで
きる統合ネットワーク（すなわち、相互作用のカスケード）は、非常に単純なものから非
常に複雑なものまで幅があり、限定されない。
２つ以上の構成要素（例えば、ＤＮＡ標的化ＲＮＡ、活性化ＲＮＡ、標的化ＲＮＡ、ま
たはｄＣａｓ９ポリペプチド）がそれぞれ別のＤＮＡ標的化ＲＮＡ／ｄＣａｓ９ポリペプ
チド複合体の調節管理下にあるネットワークにおいて、ネットワークの１つの構成要素の
発現レベルは、ネットワークの別の構成要素の発現レベルに影響を与え得る（例えば、発
現を増加または減少させ得る）。この機構によって、１つの構成要素の発現は、同一ネッ
トワーク内の異なる構成要素の発現に影響を与える場合があり、そのネットワークは、他
の構成要素の発現を増加させる構成要素および他の構成要素の発現を減少させる構成要素
の混成物を含み得る。当業者には容易に理解されることであるが、１つの構成要素の発現
レベルが一つまたは複数の異なる構成要素の発現レベルに影響を与え得ることによる上記
の例は、説明を目的としたものであって、限定するものではない。一つまたは複数の構成
要素が操作可能となるように（すなわち、実験制御下で、例えば、温度制御下；薬剤制御
下、すなわち、薬剤誘導性制御下；光制御下；等で）、（上記のように）改変される場合
、さらなる複雑さの層を所望によりネットワークに導入することができる。
１つの非限定例として、第一のＤＮＡ標的化ＲＮＡは、標的の治療／代謝関連遺伝子の
発現を制御する、第二のＤＮＡ標的化ＲＮＡのプロモーターに結合することができる。そ
のような例において、第一のＤＮＡ標的化ＲＮＡの条件的発現は、治療／代謝関連遺伝子
を間接的に活性化する。このタイプのＲＮＡカスケードは、例えば、抑制因子を活性化因
子に容易に変換する上で有用であり、標的遺伝子の発現の論理または動態（ｌｏｇｉｃｓ
ｏｒ ｄｙｎａｍｉｃｓ）を制御するために用いることができる。
主題の転写調節法は、創薬およびターゲットバリデーションに用いることもできる。
キット
本開示は主題の方法を実行するためのキットを提供する。主題のキットは、ａ）ｉ））
標的ＤＮＡ内の標的配列に対し相補的なヌクレオチド配列を含む第一セグメント；ｉｉ）
）部位特異的ポリペプチドと相互作用する第二セグメント；およびｉｉｉ）転写ターミネ
ーターを含む本開示のＤＮＡ標的化ＲＮＡ、またはＤＮＡ標的化ＲＮＡをコードするヌク
レオチド配列を含む核酸；並びにｂ）緩衝液を含む。いくつかの例において、ＤＮＡ標的
化ＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む核酸は、野生型Ｃａｓ９と比較して低減さ
れたエンドデオキシリボヌクレアーゼ活性を示す異型Ｃａｓ９部位特異的ポリペプチドを
コードするヌクレオチド配列をさらに含む。
いくつかの例において、主題のキットは、野生型Ｃａｓ９と比較して低減されたエンド
デオキシリボヌクレアーゼ活性を示す異型Ｃａｓ９部位特異的ポリペプチドをさらに含む
。
いくつかの例において、主題のキットは、野生型Ｃａｓ９と比較して低減されたエンド
デオキシリボヌクレアーゼ活性を示す異型Ｃａｓ９部位特異的ポリペプチドをコードする
ヌクレオチド配列を含む核酸をさらに含む。
主題はさらに、一つまたは複数の追加の試薬を含む場合があり、そのような追加の試薬
は、緩衝液；洗浄緩衝液；対照試薬；対照発現ベクターまたはＲＮＡポリヌクレオチド；
ＤＮＡから異型Ｃａｓ９部位特異的ポリペプチドをインビトロ生成するための試薬；等か
ら選択され得る。いくつかの例において、主題のキットに含まれる異型Ｃａｓ９部位特異
的ポリペプチドは、上記の融合異型Ｃａｓ９部位特異的ポリペプチドである。
主題のキットの構成要素は別々の容器内に存在していてもよいし；あるいは単一の容器
内で混合されていてもよい。
上記構成要素に加えて、主題のキットは、キットの構成要素を用いて主題の方法を実施
するための説明書をさらに含み得る。主題の方法を実施するための説明書は、一般的には
、適切な記録媒体上に記録される。例えば、説明書は、紙またはプラスチック等の基体上
に印刷されていてもよい。従って、説明書は、添付文書としてキット内に、キットまたは
その構成要素の容器の標識中（すなわち、パッケージまたはサブパッケージに付随して）
等、存在していてもよい。他の実施形態では、説明書は、適切なコンピューター可読の記
憶媒体、例えばＣＤ−ＲＯＭ、ディスケット、フラッシュドライブ等上に存在する電子記
憶データファイルとして存在する。さらに他の実施形態においては、実際の説明書がキッ
ト内に存在しないが、例えばインターネットを介して、遠隔の供給源から説明書を得るた
めの手段が提供される。この実施形態の一例は、説明書を閲覧することができる、および
／または説明書をダウンロードすることができる、ウェブアドレスを含むキットである。
説明書と同様、説明書を得るためのこの手段は、適切な基体上に記録される。
次の実施例は、当業者に本発明の作成および使用方法の完全な開示および説明を提供す
るために記載され、発明者らが自身の発明と見なすものの範囲を限定する意図はなく、下
記の実験が実行される全てまたは唯一の実験であると示すようにも意図されていない。使
用される数（たとえば、量、温度など）に関して正確性を確実にするよう尽力したが、実
験の誤差および偏差は多少考慮されるべきである。別で指示されない限り、部は重量部で
あり、分子量は平均的な分子量の重量であり、温度は摂氏の温度であり、圧力は大気圧ま
たは大気圧付近である。標準的な省略が使用され得、たとえば、ｂｐ、塩基対（複数可）
；ｋｂ、キロベース（複数可）；ｐｌ、ピコリットル（複数可）；ｓまたはｓｅｃ、秒（
複数可）；ｍｉｎ、分（複数可）；ｈまたはｈｒ、時間（複数可）；ａａ、アミノ酸（複
数可）；ｋｂ、キロベース（複数可）；ｂｐ、塩基対（複数可）；ｎｔ、ヌクレオチド（
複数可）；ｉ．ｍ．、筋肉内の（に）；ｉ．ｐ．、腹腔内の（に）；ｓ．ｃ．、皮下の（
に）；などである。
実施例１：標的ＤＮＡに修飾を作成するためのＣａｓ９の使用
材料および方法
菌株および培養条件
０．２％酵母エキス（オキソイド社（Ｏｘｏｉｄ））を添加したＴＨＹ培地（トッド・
ヒューイット培地（ＴＨＢ、Ｂａｃｔｏ、ベクトンディッキンソン社（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄ
ｉｃｋｉｎｓｏｎ））内で、または、３％羊血液を添加したＴＳＡ（トリプチケースソイ
寒天、ＢＢＬ、ベクトンディッキンソン社）上で培養されたストレプトコッカス・ピオゲ
ネスを、５％ＣＯ２が添加された３７℃の大気中で振ることなくインキュベートした。ル
リア−ベルターニ（ＬＢ）培地および寒天内で培養された大腸菌を振りながら３７℃でイ
ンキュベートした。必要な際は、適切な抗生物質を次の最終濃度で培地に添加した：アン
ピシリン、大腸菌に１００μｇ／ｍｌ；クロラムフェニコール、大腸菌に３３μｇ／ｍｌ
；カナマイシン、大腸菌に２５μｇ／ｍｌおよびＳ．ピオゲネスに３００μｇ／ｍｌ。マ
イクロプレートリーダー（ＳＬＴ Ｓｐｅｃｔｒａ Ｒｅａｄｅｒ）を使用して６２０ｎ
ｍの培養一定分量の光学濃度を観測することで、細菌細胞の成長を定期的にモニターした
。
細菌細胞の形質転換
大腸菌へのプラスミドＤＮＡの形質転換を、標準的な熱ショックプロトコルに従って実
施した。Ｓ．ピオゲネスの形質転換を、いくつかの修正を伴い、前述したとおりに実施し
た。プラスミド維持に対するインビボＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ活性をモニターするべく実施
された形質転換アッセイを、以前に記載された通り基本的に実行した。手短に、Ｓ．ピオ
ゲネスのエレクトロコンピテンスセルを同じ細胞密度に均一にし、５００ｎｇのプラスミ
ドＤＮＡで電気穿孔した。全ての形質転換を２〜３回プレート化し、統計分析のために異
なるバッチのコンピテントセルでそれぞれ独立して３回実験を行った。形質転換効率をＤ
ＮＡのμｇあたりのＣＦＵ（コロニー形成単位）として算出した。対照形質転換を、減菌
水および主鎖ベクターｐＥＣ８５で実施した。
ＤＮＡ操作
ＤＮＡ調製、増幅、消化、ライゲーション、精製、アガロースゲル電気泳動を含むＤＮ
Ａ操作を小さな修正を伴って標準的な技術に従って実施した。インビトロ切断のためのプ
ロトスペーサープラスミドおよびＳ．ピオゲネス形質転換アッセイを以前に記載されたと
おりに作成した（４）。インビトロ切断アッセイのための追加のｐＵＣ１９ベースプロト
スペーサープラスミドを、アニールしたオリゴヌクレオチドをｐＵＣ１９の消化されたＥ
ｃｏＲＩとＢａｍＨＩ部位との間でライゲーションすることで、作成した。ＧＦＰ遺伝子
含有プラスミドは以前に記載されている（４１）。ＤＮＡ精製およびプラスミド調製のた
めにキット（キアゲン社）を使用した。ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）ＩＩ ＸＬキ
ット（ストラタジーン社）またはＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ部位特異的変異誘発キット（アジ
レント社（Ａｇｉｌｅｎｔ））を使用して、プラスミド変異誘発を実施した。ＶＢＣ−バ
イオテックサービス社（ＶＢＣ−Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）、シグマ・アルド
リッチ社（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）およびインテグレーテッドＤＮＡテクノロジー
社（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）が合成オリゴヌクレオ
チドおよびＲＮＡを供給した。
インビトロ転写鋳型のためのオリゴヌクレオチド
インビトロで転写されたＳ．ピオゲネスのＣＲＩＳＰＲ ＩＩ−Ａ型ｔｒａｃｒＲＮＡお
よびｃｒＲＮＡのための鋳型（ｔｒａｃｒＲＮＡに関してはｃｈｒ．ＤＮＡ ＳＦ３７０
上でのＰＣＲ；ｃｒＲＮＡに関しては二つのオリゴヌクレオチドをアニール）
Ｔ７−ｔｒａｃｒＲＮＡ（７５ｎｔ）
ＯＬＥＣ１５２１（Ｆ５’ｔｒａｃｒＲＮＡ）：配列番号３４０
ＯＬＥＣ１５２２（Ｒ３’ｔｒａｃｒＲＮＡ）：配列番号３４１
Ｔ７−ｃｒＲＮＡ（鋳型）
ＯＬＥＣ２１７６（Ｆ ｃｒＲＮＡ−ｓｐ１）：配列番号３４２
ＯＬＥＣ２１７８（Ｒ ｃｒＲＮＡ−ｓｐ１）：配列番号３４３
ＯＬＥＣ２１７７（Ｆ ｃｒＲＮＡ−ｓｐ２）：配列番号３４４
ＯＬＥＣ２１７９（Ｒ ｃｒＲＮＡ−ｓｐ２）：配列番号３４５
インビトロで転写されたＮ．メニンギティディスのｔｒａｃｒＲＮＡおよび操作されたｃ
ｒＲＮＡ−ｓｐ２のための鋳型（ｔｒａｃｒＲＮＡに関してはｃｈｒ．ＤＮＡ Ｚ２４９
１上でのＰＣＲ；ｃｒＲＮＡに関しては二つのオリゴヌクレオチドをアニール）
Ｔ７−ｔｒａｃｒＲＮＡ
ＯＬＥＣ２２０５（Ｆ 予想５’）：配列番号３４６
ＯＬＥＣ２２０６（Ｒ 予想３’）：配列番号３４７
Ｔ７−ｃｒＲＮＡ（鋳型）
ＯＬＥＣ２２０９（Ｆ ｓｐ２（ｓｐｅＭ）＋Ｎ．ｍ．リピート）：配列番号３４８
ＯＬＥＣ２２１４（Ｒ ｓｐ２（ｓｐｅＭ）＋Ｎ．ｍ．リピート）：配列番号３４９
インビトロで転写されたＬ．イノキュアのｔｒａｃｒＲＮＡおよび操作されたｃｒＲＮＡ
−ｓｐ２のための鋳型（ｔｒａｃｒＲＮＡに関してはｃｈｒ．ＤＮＡ Ｃｌｉｐ１１２６
２上でのＰＣＲ；ｃｒＲＮＡに関しては二つのオリゴヌクレオチドをアニール）
Ｔ７−ｔｒａｃｒＲＮＡ
ＯＬＥＣ２２０３（Ｆ 予想５’）：配列番号３５０
ＯＬＥＣ２２０４（Ｒ 予想３’）：配列番号３５１
Ｔ７−ｃｒＲＮＡ（鋳型）
ＯＬＥＣ２２０７（Ｆ ｓｐ２（ｓｐｅＭ）＋Ｌ．ｉｎ．リピート）：配列番号３５２
ＯＬＥＣ２２１２（Ｒ ｓｐ２（ｓｐｅＭ）＋Ｌ．ｉｎ．リピート）：配列番号３５３
インビトロおよびインビボでの実験のためのプロトスペーサーを伴うプラスミドを作成す
るためのオリゴヌクレオチド
インビトロおよびＳ．ピオゲネスでのｓｐｅＭ（スペーサー２（ＣＲＩＳＰＲ ＩＩ−Ａ
型、ＳＦ３７０；ＭＧＡＳ８２３２のプロトスペーサープロファージφ８２３２．３）分
析のためのプラスミド（鋳型：ｃｈｒ．ＤＮＡ ＭＧＡＳ８２３２またはｓｐｅＭ断片を
含有するプラスミド）
ｐＥＣ２８７
ＯＬＥＣ１５５５（Ｆ ｓｐｅＭ）：配列番号３５４
ＯＬＥＣ１５５６（Ｒ ｓｐｅＭ）：配列番号３５５
ｐＥＣ４８８
ＯＬＥＣ２１４５（Ｆ ｓｐｅＭ）：配列番号３５６
ＯＬＥＣ２１４６（Ｒ ｓｐｅＭ）：配列番号３５７
ｐＥＣ３７０
ＯＬＥＣ１５９３（Ｆ ｐＥＣ４８８プロトスペーサー２ Ａ２２Ｇ）：配列番号３５８
ＯＬＥＣ１５９４（Ｒ ｐＥＣ４８８プロトスペーサー２ Ａ２２Ｇ）：配列番号３５９
ｐＥＣ３７１
ＯＬＥＣ１５９５（Ｆ ｐＥＣ４８８プロトスペーサー２ Ｔ１０Ｃ）：配列番号３６０
ＯＬＥＣ１５９６（Ｒ ｐＥＣ４８８プロトスペーサー２ Ｔ１０Ｃ）：配列番号３６１
ｐＥＣ３７２
ＯＬＥＣ２１８５（Ｆ ｐＥＣ４８８プロトスペーサー２ Ｔ７Ａ）：配列番号３６２
ＯＬＥＣ２１８６（Ｒ ｐＥＣ４８８プロトスペーサー２ Ｔ７Ａ）：配列番号３６３
ｐＥＣ３７３
ＯＬＥＣ２１８７（Ｆ ｐＥＣ４８８プロトスペーサー２ Ａ６Ｔ）：配列番号３６４
ＯＬＥＣ２１８８（Ｒ ｐＥＣ４８８プロトスペーサー２ Ａ６Ｔ）：配列番号３６５
ｐＥＣ３７４
ＯＬＥＣ２２３５（Ｆ ｐＥＣ４８８プロトスペーサー２ Ａ５Ｔ）：配列番号３６６
ＯＬＥＣ２２３６（Ｒ ｐＥＣ４８８プロトスペーサー２ Ａ５Ｔ）：配列番号３６７
ｐＥＣ３７５
ＯＬＥＣ２２３３（Ｆ ｐＥＣ４８８プロトスペーサー２ Ａ４Ｔ）：配列番号３６８
ＯＬＥＣ２２３４（Ｒ ｐＥＣ４８８プロトスペーサー２ Ａ４Ｔ）：配列番号３６９
ｐＥＣ３７６
ＯＬＥＣ２１８９（Ｆ ｐＥＣ４８８プロトスペーサー２ Ａ３Ｔ）：配列番号３７０
ＯＬＥＣ２１９０（Ｒ ｐＥＣ４８８プロトスペーサー２ Ａ３Ｔ）：配列番号３７１
ｐＥＣ３７７
ＯＬＥＣ２１９１（Ｆ ｐＥＣ４８８プロトスペーサー２ ＰＡＭ Ｇ１Ｃ）：配列番号
３７２
ＯＬＥＣ２１９２（Ｒ ｐＥＣ４８８プロトスペーサー２ ＰＡＭ Ｇ１Ｃ）：配列番号
３７３
ｐＥＣ３７８
ＯＬＥＣ２２３７（Ｆ ｐＥＣ４８８プロトスペーサー２ ＰＡＭ ＧＧ１，２ＣＣ）：
配列番号３７４
ＯＬＥＣ２２３８（Ｒ ｐＥＣ４８８プロトスペーサー２ ＰＡＭ ＧＧ１，２ＣＣ）：
配列番号３７５
インビトロおよびＳ．ピオゲネスでのＳＰｙ＿０７００（スペーサー１（ＣＲＩＳＰＲ
ＩＩ−Ａ型、ＳＦ３７０；ＳＦ３７０のプロトスペーサープロファージφ３７０．１）分
析のためのプラスミド（鋳型：ｃｈｒ．ＤＮＡ ＳＦ３７０またはＳＰｙ＿０７００断片
を含有するプラスミド）
ｐＥＣ４８９
ＯＬＥＣ２１０６（Ｆ Ｓｐｙ＿０７００）：配列番号３７６
ＯＬＥＣ２１０７（Ｒ Ｓｐｙ＿０７００）：配列番号３７７
ｐＥＣ５７３
ＯＬＥＣ２９４１（Ｆ ＰＡＭ ＴＧ１、２ＧＧ）：配列番号３７８
ＯＬＥＣ２９４２（Ｒ ＰＡＭ ＴＧ１、２ＧＧ）：配列番号３７９
シークエンシング解析によるプラスミド構築物および切断部位の検証のためのオリゴヌク
レオチド
ＣｏｌＥ１（ｐＥＣ８５）
ｏｌｉＲＮ２２８（Ｒ シークエンシング）：配列番号３８０
ｓｐｅＭ（ｐＥＣ２８７）
ＯＬＥＣ１５５７（Ｆ シークエンシング）：配列番号３８１
ＯＬＥＣ１５５６（Ｒ シークエンシング）：配列番号３８２
ｒｅｐＤＥＧ−ｐＡＭベータ１（ｐＥＣ８５）
ＯＬＥＣ７８７（Ｆ シークエンシング）：配列番号３８３
インビトロ切断アッセイのためのオリゴヌクレオチド
ｃｒＲＮＡ
スペーサー１ ｃｒＲＮＡ（１−４２）：配列番号３８４
スペーサー２ ｃｒＲＮＡ（１−４２）：配列番号３８５
スペーサー４ ｃｒＲＮＡ（１−４２）：配列番号３８６
スペーサー２ ｃｒＲＮＡ（１−３６）：配列番号３８７
スペーサー２ ｃｒＲＮＡ（１−３２）：配列番号３８８
スペーサー２ ｃｒＲＮＡ（１１−４２）：配列番号３８９
ｔｒａｃｒＲＮＡ
（４−８９）：配列番号３９０
（１５−８９）：配列番号３９１
（２３−８９）：配列番号３９２
（１５−５３）：配列番号３９３
（１５−４４）：配列番号３９４
（１５−３６）：配列番号３９５
（２３−５３）：配列番号３９６
（２３−４８）：配列番号３９７
（２３−４４）：配列番号３９８
（１−２６）：配列番号３９９
キメラＲＮＡ
スペーサー１−キメラＡ：配列番号４００
スペーサー１−キメラＢ：配列番号４０１
スペーサー２−キメラＡ：配列番号４０２
スペーサー２−キメラＢ：配列番号４０３
スペーサー４−キメラＡ：配列番号４０４
スペーサー４−キメラＢ：配列番号４０５
ＧＦＰ１：配列番号４０６
ＧＦＰ２：配列番号４０７
ＧＦＰ３：配列番号４０８
ＧＦＰ４：配列番号４０９
ＧＦＰ５：配列番号４１０
切断アッセイのための基質としてのＤＮＡオリゴヌクレオチド（プロトスペーサーは太文
字、ＰＡＭは下線が引かれてある。）
プロトスペーサー１−相補性−ＷＴ：配列番号４１１
プロトスペーサー１−非相補性−ＷＴ：配列番号４１２
プロトスペーサー２−相補性−ＷＴ：配列番号４１３
プロトスペーサー２−非相補性−ＷＴ：配列番号４１４
プロトスペーサー４−相補性−ＷＴ：配列番号４１５
プロトスペーサー４−非相補性−ＷＴ：配列番号４１６
プロトスペーサー２−相補性−ＰＡＭ１：配列番号４１７
プロトスペーサー２−非相補性−ＰＡＭ１：配列番号４１８
プロトスペーサー２−相補性−ＰＡＭ２：配列番号４１９
プロトスペーサー２−非相補性−ＰＡＭ２：配列番号４２０
プロトスペーサー４−相補性−ＰＡＭ１：配列番号４２１
プロトスペーサー４−非相補性−ＰＡＭ１：配列番号４２２
プロトスペーサー４−相補性−ＰＡＭ２：配列番号４２３
プロトスペーサー４−非相補性−ＰＡＭ２：配列番号４２４
ＲＮＡのインビトロ転写および精製
インビトロ転写キットのＴ７ Ｆｌａｓｈ（エピセンター社（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）、
イルミナ社（Ｉｌｌｕｍｉｎａ））およびＴ７プロモーター配列を保有するＰＣＲで作成
したＤＮＡ鋳型を使用してインビトロでＲＮＡを転写した。使用前に、ＲＮＡをゲルで精
製し、品質を確認した。Ｓ．ピオゲネスＳＦ３７０、リステリア・イノキュア Ｃｌｉｐ
１１２６２およびナイセリア・メニンギティディスＡ Ｚ２４９１のＲＮＡ鋳型の調製の
ために使用されたプライマーは上に記載される。
タンパク質精製
Ｓ．ピオゲネスＳＦ３７０のゲノムＤＮＡからのＣａｓ９（残基１〜１３６８）をコー
ドする配列をＰＣＲで増幅し、ライゲーション独立クローニング（ＬＩＣ）を使用してカ
スタムｐＥＴベース発現ベクター内に挿入した。得られた融合構築物はＮ末端ヘキサヒス
チジン−マルトース結合タンパク質（Ｈｉｓ６−ＭＢＰ）タグを有し、該タグにタバコエ
ッチ病ウィルス（ＴＥＶ）プロテアーゼ切断部位を含有するペプチド配列が続く。タンパ
ク質を大腸菌株ＢＬ２１ロゼッタ２（ＤＥ３）（ＥＭＤバイオサイエンス社（ＥＭＤ Ｂ
ｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））内で発現させ、１８℃の２倍ＴＹ培地内で１６時間成長させ、
続いて０．２ｍＭのＩＰＴＧで誘導を行った。アフィニティー、イオン交換およびサイズ
排除クロマトグラフィー工程の組み合わせによってタンパク質を精製した。手短に、ホモ
ジナイザー（アベスチン社（Ａｖｅｓｔｉｎ））で、細胞を２０ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ８
．０、５００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＴＣＥＰ（プロテアーゼ阻害カクテル（ロシュ社
（Ｒｏｃｈｅ））が添加されている）に溶解した。透明にした可溶化物をバッチ内でＮｉ
−ＮＴＡアガロース（キアゲン社）に結合させた。この樹脂を２０ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ
８．０、５００ｍＭのＮａＣｌでさらに洗浄し、結合したタンパク質を２０ｍＭのＴｒｉ
ｓ ｐＨ８．０、２５０ｍＭのＮａＣｌ、１０％グリセロール内で溶離した。Ｈｉｓ６−
ＭＢＰアフィニティータグをＴＥＶプロテアーゼとの切断によって取り除き、一方で、タ
ンパク質を２０ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＴＣＥＰ
、１０％グリセロールに対して一晩透析した。１００ｍＭ〜１ＭのＫＣｌの直線勾配で溶
離し、５ｍｌのＳＰセファロースＨｉＴｒａｐカラム（ＧＥライフサイエンス社（ＧＥ
Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ））上での精製によって、切断Ｃａｓ９タンパク質を融合タ
グから分離した。２０ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＫＣｌおよび１ｍＭ
のＴＣＥＰ内Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １６／６０カラム上でのサイズ排除クロマトグ
ラフィーによってタンパク質をさらに精製した。溶離したタンパク質を約８ｍｇ／ｍｌま
で濃縮し、液体窒素内で急速冷凍し、−８０℃で保管した。ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ部位特
異的変異誘発キット（アジレント社）を用いて、Ｃａｓ９ Ｄ１０Ａ、Ｈ８４０Ａおよび
Ｄ１０Ａ／Ｈ８４０Ａの点変異体を作成し、ＤＮＡシークエンシングによって確認した。
野生型Ｃａｓ９タンパク質に関する同じ手法に従ってタンパク質を精製した。
ストレプトコッカス・サーモフィラス（ＬＭＤ−９、ＹＰ＿８２０８３２．１）、Ｌ．イ
ノキュア（Ｃｌｉｐ１１２６２、ＮＰ＿４７２０７３．１）、カンピロバクター・ジェジ
ュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）（亜種ジェジュニＮＣＴＣ １１１
６８、ＹＰ＿００２３４４９００．１）およびＮ．メニンギティディス（Ｚ２４９１、Ｙ
Ｐ＿００２３４２１００．１）のＣａｓ９オルソログを、ＢＬ２１ロゼッタ（ＤＥ３）ｐ
ＬｙｓＳ細胞（ノバジェン（Ｎｏｖａｇｅｎ））内で、Ｈｉｓ６−ＭＢＰ（Ｎ．メニンギ
ティディスおよびＣ．ジェジュニ）、Ｈｉｓ６−チオレドキシン（Ｌ．イノキュア）およ
びＨｉｓ６−ＧＳＴ（Ｓ．サーモフィラス）融合タンパク質として発現させ、Ｓ．ピオゲ
ネスのＣａｓ９に関するように次の修正を伴って実質的に精製した。同時精製核酸の量が
多大であるため、四つのＣａｓ９タンパク質を全て、ゲル濾過の前に、結合したタンパク
質を１００ｍＭ〜２ＭのＫＣｌの直線勾配で溶離し、追加のヘパリンセファロース工程に
よって精製した。これによってＣ．ジェジュニ、Ｎ．メニンギティディスおよびＬ．イノ
キュアタンパク質からの核酸混入が無事に取り除かれたが、Ｓ．サーモフィラスのＣａｓ
９調製からの同時精製核酸は取り除けなかった。タンパク質を全て、２０ｍＭのＨＥＰＥ
Ｓ ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＫＣｌおよび１ｍＭのＴＣＥＰ中１〜８ｍｇ／ｍｌまで濃
縮し、液体Ｎ２内で急速冷凍し、−８０℃で保管した。
プラスミドＤＮＡ切断アッセイ
合成またはインビトロ転写ｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡを、反応前に、９５℃ま
で加熱し、ゆっくり室温まで下げることで、プレアニールした。天然または制限消化直線
化プラスミドＤＮＡ（３００ｎｇ（約８ｎＭ））を、３７℃で６０分間、１０ｍＭのＭｇ
Ｃｌ２有りまたは無しのＣａｓ９プラスミド切断緩衝液（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７
．５、１５０ｍＭのＫＣｌ、０．５ｍＭのＤＴＴ、０．１ｍＭのＥＤＴＡ）内で、精製Ｃ
ａｓ９タンパク質（５０〜５００ｎＭ）およびｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡ二重鎖（５
０〜５００ｎＭ、１：１）でインキュベートした。反応を２５０ｍＭのＥＤＴＡを含む５
倍ＤＮＡ添加緩衝液で停止し、０．８または１％アガロースゲル電気泳動で分離し、エチ
ジウムブロマイド染色で可視化した。Ｃａｓ９変異体切断アッセイのために、アガロース
ゲルに添加する前に、反応を５倍ＳＤＳ添加緩衝液（３０％グリセロール、１．２％ＳＤ
Ｓ、２５０ｍＭのＥＤＴＡ）で停止した。
金属依存切断アッセイ
プロトスペーサー２プラスミドＤＮＡ（５ｎＭ）を、１、５または１０ｍＭのＭｇＣｌ
２、１または１０ｍＭのＭｎＣｌ２、ＣａＣｌ２、ＺｎＣｌ２、ＣｏＣｌ２、ＮｉＳＯ４
またはＣｕＳＯ４が添加された切断緩衝液（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、１５０
ｍＭのＫＣｌ、０．５ｍＭのＤＴＴ、０．１ｍＭのＥＤＴＡ）内で、５０ｎＭのｔｒａｃ
ｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡ−ｓｐ２でプレインキュベートしたＣａｓ９（５０ｎＭ）で、３７
℃にて１時間、インキュベートした。５倍ＳＤＳ添加緩衝液（３０％グリセロール、１．
２％ＳＤＳ、２５０ｍＭのＥＤＴＡ）を添加することで反応を停止し、１％アガロースゲ
ル電気泳動で分離し、エチジウムブロマイド染色で可視化した。
シングルターンオーバーアッセイ
切断緩衝液（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＭ
ｇＣｌ２、０．５ｍＭのＤＴＴ、０．１ｍＭのＥＤＴＡ）内で、二重鎖ｔｒａｃｒＲＮＡ
：ｃｒＲＮＡ−ｓｐ２（２５ｎＭ、１：１）、または、プレアニールされていない双方の
ＲＮＡ（２５ｎＭ）でＣａｓ９（２５ｎＭ）を３７℃で１５分間プレインキュベートし、
プロトスペーサー２プラスミドＤＮＡ（５ｎＭ）を添加することで反応を開始した。反応
混合物を３７℃でインキュベートした。決められた時間間隔で、試料を反応から取り出し
、５倍ＳＤＳ添加緩衝液（３０％グリセロール、１．２％ＳＤＳ、２５０ｍＭのＥＤＴＡ
）を添加して反応を停止し、切断を１％アガロースゲル電気泳動およびエチジウムブロマ
イド染色でモニターした。シングルターンオーバー動態のために、同じことをＣａｓ９お
よびＲＮＡのプレインキュベーション無しで行い、ここで、プロトスペーサー２プラスミ
ドＤＮＡ（５ｎＭ）を二重鎖ｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡ−ｓｐ２（２５ｎＭ）または
プレアニールされていない双方のＲＮＡ（２５ｎＭ）を伴う切断緩衝液内で混合し、Ｃａ
ｓ９（２５ｎＭ）を添加することで反応を開始した。切断のパーセンテージをデンシトメ
トリーで分析し、三つの独立した実験の平均を時間に対してプロットした。データは、非
線形回帰分析によってあてはめを行い、切断速度（ｋｏｂｓ［毎分−１］）を算出した。
複数ターンオーバーアッセイ
切断緩衝液（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＭ
ｇＣｌ２、０．５ｍＭのＤＴＴ、０．１ｍＭのＥＤＴＡ）内で、３７℃にて１５分間、Ｃ
ａｓ９（１ｎＭ）をプレアニールしたｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡ−ｓｐ２（１ｎＭ、
１：１）でプレインキュベートした。プロトスペーサー２プラスミドＤＮＡ（５ｎＭ）を
添加することで、反応を開始した。決められた時間間隔で試料を取り出し、５倍ＳＤＳ添
加緩衝液（３０％グリセロール、１．２％ＳＤＳ、２５０ｍＭのＥＤＴＡ）を添加するこ
とで反応を停止した。切断反応を１％アガロースゲル電気泳動で分離し、エチジウムブロ
マイドで染色し、切断のパーセンテージをデンシトメトリーで分析した。四つの独立した
実験の結果を時間（分）に対してプロットした。
オリゴヌクレオチドＤＮＡ切断アッセイ
ＤＮＡオリゴヌクレオチド（１０ｐｍｏｌ）を、５０μＬ反応内で、１倍Ｔ４ポリヌク
レオチドキナーゼ反応緩衝液中５単位のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ニュー・イング
ランド・バイオラボ社（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ））および約３〜６ｐ
ｍｏｌ（約２０〜４０ｍＣｉ）［γ−３２Ｐ］−ＡＴＰ（プロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ）
）で３７℃にて３０分間インキュベートすることで、放射標識した。熱失活（６５℃で２
０分間）後、反応をＩｌｌｕｓｔｒａ ＭｉｃｒｏＳｐｉｎ Ｇ−２５カラム（ＧＥヘル
スケア社（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ））を通して精製し、組み込まれていない標識を取
り除いた。標識オリゴヌクレオチドを等モル量の未標識相補オリゴヌクレオチドと一緒に
９５℃にて３分間アニールすることで二重鎖基質（１００ｎＭ）を作成し、続いて、室温
までゆっくり冷やした。切断アッセイのために、ｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡを３
０秒間９５℃まで加熱し、続いて、室温までゆっくり冷やすことでアニールした。合計体
積が９μｌの切断アッセイ緩衝液（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、１００ｍＭのＫ
Ｃｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＤＴＴ、５％グリセロール）内で、アニールされた
ｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡ二重鎖（５００ｎＭ）でＣａｓ９（５００ｎＭ最終濃度）
をプレインキュベートした。１μｌの標的ＤＮＡ（１０ｎＭ）の添加によって反応を開始
し、３７℃にて１時間インキュベートした。２０μｌの添加色素（ホルムアミド中５ｍＭ
のＥＤＴＡ、０．０２５％ＳＤＳ、５％グリセロール）の添加によって反応をクエンチし
、５分間９５℃まで加熱した。切断産物を７Ｍウレア含有の１２％変性ポリアクリルアミ
ドゲル上で分離し、ホスフォイメージャー（Ｓｔｏｒｍ、ＧＥライフサイエンス社）によ
って可視化した。プレアニールし、８％天然アクリルアミドゲル上で精製し、続いて双方
の５’末端で放射標識しておいたＤＮＡ二重鎖基質を用いて、ＰＡＭ必要条件を試験する
切断アッセイ（図１３Ｂ）を実行した。反応を上記の通り準備し、分析した。
電気泳動移動度シフトアッセイ
各鎖（１０ｎｍｏｌ）をイオン除去水内で混合し、９５℃まで３分間加熱して、室温ま
で冷やすことで、標的ＤＮＡ二重鎖を形成した。ＤＮＡを全て１倍ＴＢＥ含有８％天然ゲ
ル上で精製した。ＤＮＡバンドをＵＶシャドーイングによって可視化し、切断し、ゲル小
片をＤＥＰＣで処理したＨ２Ｏ内に浸漬することによって溶離した。溶離したＤＮＡをエ
タノールで沈殿させ、ＤＥＰＣで処理したＨ２Ｏに溶解した。Ｔ４ポリヌクレオチドキナ
ーゼ（ニュー・イングランド・バイオラボ社）を３０分間３７℃にて使用して、ＤＮＡ試
料を［γ−３２Ｐ］−ＡＴＰで５’末端を標識した。ＰＮＫを６５℃で２０分間熱変性し
、組み込まれていない放射標識を、Ｉｌｌｕｓｔｒａ ＭｉｃｒｏＳｐｉｎ Ｇ−２５カ
ラム（ＧＥヘルスケア社）を使用して除去した。合計体積が１０μｌである、２０ｍＭの
ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、１００ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＤＴＴお
よび１０％グリセロールを含む緩衝液内で結合アッセイを実施した。Ｃａｓ９ Ｄ１０Ａ
／Ｈ８４０Ａの二重変異体を等モル量のプレアニールしたｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡ
二重鎖でプログラムし、１００ｐＭから１μＭに滴定した。放射標識ＤＮＡを２０ｐＭの
最終濃度に添加した。試料を１時間３７℃でインキュベートし、１倍ＴＢＥおよび５ｍＭ
のＭｇＣｌ２を含む８％天然ポリアクリルアミドゲル上で、４℃で分離した。ゲルを乾燥
させ、ＤＮＡをホスフォイメージャーによって可視化した。
ＤＮＡおよびタンパク質配列のインシリコ分析
Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩパッケージ（インビトロジェン社）を、ＤＮＡ配列分析（Ｖｅｃ
ｔｏｒ ＮＴＩ）およびタンパク質の比較配列分析（ＡｌｉｇｎＸ）のために使用した。
ＲＮＡ構造および同時折り畳みのインシリコモデリング
Ｖｉｅｎｎａ ＲＮＡパッケージアルゴリズム（４２、４３）を使用して、インシリコ
予想を実施した。ＲＮＡの二次構造および同時折り畳みモデルをそれぞれＲＮＡｆｏｌｄ
およびＲＮＡｃｏｆｏｌｄで予想し、ＶＡＲＮＡ（４４）で可視化した。
結果
細菌および古細菌は、クラスター化され、等間隔にスペーサーが入った、短回文型リピ
ート配列（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）と呼ばれる、ＲＮＡ媒介性適応
防御システムを発達させ、該システムは、侵入するウィルスおよびプラスミドから有機体
を保護する（１〜３）。これらシステムの一部で、トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃ
ｒＲＮＡ）と塩基対である成熟ｃｒＲＮＡが、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質Ｃａｓ９に標
的ＤＮＡの二重鎖（ｄｓ）切断を引き起こすように指示する、二つのＲＮＡからなる構造
を形成することを示す。ｃｒＲＮＡ誘導配列に相補的である部位では、Ｃａｓ９ ＨＮＨ
ヌクレアーゼドメインは相補鎖を切断する一方で、Ｃａｓ９ ＲｕｖＣ様ドメインは非相
補鎖を切断する。二重ｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡは、単一のＲＮＡキメラとして設計
される場合、配列特異性Ｃａｓ９ ｄｓＤＮＡ切断も指示する。これらの研究は、二重Ｒ
ＮＡを部位特異的ＤＮＡ切断のために使用するエンドヌクレアーゼのファミリーを明らか
にし、ＲＮＡプログラム可能ゲノム編集のためにそのシステムを利用する能力を強調する
。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ防御システムは、外来性の核酸の配列特異性検知およびサイレン
シングのために、小さいＲＮＡに依存している。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、オペ
ロン（複数可）に組織化されるｃａｓ遺伝子、および、同一のリピートが散在するゲノム
標的配列（スペーサーと呼ばれる）から成るＣＲＩＳＰＲアレイ（複数可）から構成され
る（１〜３）。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ媒介性免疫は三つの工程で生じる。適応段階では、
一つまたは複数のＣＲＩＳＰＲ座位を保有する細菌および古細菌は、外来性配列の短断片
（プロトスペーサー）を宿主染色体内のＣＲＩＳＰＲ配列の近位末端に組み込むことで、
ウィルス性またはプラスミド攻撃に応答する（１〜３）。発現および干渉段階では、リピ
ートスペーサー要素の前駆体ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ）分子への転写
、続いて酵素的な切断が、侵入ウィルス性またはプラスミド標的の相補プロトスペーサー
配列と対になることができる短いｃｒＲＮＡをもたらす（４〜１１）。ｃｒＲＮＡによる
標的認識は、ｃｒＲＮＡと複合して機能するＣａｓタンパク質を利用して外来性配列のサ
イレンシングを指示する（１０、１２〜２０）。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムには三つの種類がある（２１〜２３）。Ｉ型およびＩＩ
Ｉ型システムはいくつかの包括的な特色を共有する：特定Ｃａｓエンドヌクレアーゼがｐ
ｒｅ−ｃｒＲＮＡをプロセシングし、一度成熟すると、各ｃｒＲＮＡは、ｃｒＲＮＡに相
補的である核酸を認識および切断できる大型の多Ｃａｓタンパク質複合体を形成する。対
照的に、ＩＩ型システムは、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡのリピート配列に相補的であるトランス
活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）が、Ｃａｓ９（かつてのＣｓｎ１）タンパク質存
在下での二重鎖（ｄｓ）ＲＮＡ特異的リボヌクレアーゼＲＮａｓｅ ＩＩＩによってプロ
セシングを誘発するという異なるメカニズムでｐｒｅｃｒＲＮＡを処理する（図１５）（
４、２４）。Ｃａｓ９は外来性ＤＮＡのｃｒＲＮＡ誘導サイレンシングに関与する唯一の
タンパク質であると考えられている（２５〜２７）。
ＩＩ型システムでは、Ｃａｓ９タンパク質は、標的ｄｓＤＮＡを切断するために活性化
ｔｒａｃｒＲＮＡと標的ｃｒＲＮＡとの間に形成される塩基対構造を必要とする酵素のフ
ァミリーを構成する。部位特異的切断は、ｃｒＲＮＡと標的プロトスペーサーＤＮＡとの
間の塩基対形成相補性および標的ＤＮＡ内の相補領域に隣接する短いモチーフ（プロトス
ペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）と呼ばれる）の双方によって決定される位置で起こる。
我々の実験は、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼファミリーは単一のＲＮＡ分子とプログラム
されて特定のＤＮＡ部位を切断できることを更に実証し、それによって、ゲノム標的およ
び編集のためにｄｓＤＮＡ切断を引き起こす単純かつ融通の利くＲＮＡ依存性システムの
発達を助長する。
Ｃａｓ９は二つのＲＮＡに誘導されるＤＮＡエンドヌクレアーゼである
ＩＩ型システムの特徴タンパク質でありＣａｓ９は、ｃｒＲＮＡ成熟およびｃｒＲＮＡ
誘導ＤＮＡ干渉の双方に関与していると仮定されてきた（図１５）（４、２５〜２７）。
Ｃａｓ９はｃｒＲＮＡ成熟に関与するが（４）、その標的ＤＮＡ破壊への直接的関与は調
査されていない。Ｃａｓ９が標的ＤＮＡを切断し得るかどうか、および、どのように標的
ＤＮＡを切断し得るのかを試験するために、我々は、過剰発現システムを使用して病原菌
ストレプトコッカス・ピオゲネス由来のＣａｓ９タンパク質を精製（図１６、補足の材料
および方法を参照）し、成熟ｃｒＲＮＡと相補的であるプロトスペーサー配列および本物
のＰＡＭを保有するプラスミドＤＮＡまたはオリゴヌクレオチド二重鎖を切断するその能
力を試験した。我々は、成熟ｃｒＲＮＡ単独ではＣａｓ９触媒性プラスミドＤＮＡ切断を
指示することはできないことを発見した（図１０Ａおよび図１７Ａ）。しかし、ｃｒＲＮ
Ａのリピート配列と対をなし得、このシステム内でｃｒＲＮＡ成熟に必要不可欠であるｔ
ｒａｃｒＲＮＡの添加が、Ｃａｓ９がプラスミドＤＮＡを切断するように誘発した（図１
０Ａおよび図１７Ａ）。切断反応は、マグネシウムおよびＤＮＡに相補的であるｃｒＲＮ
Ａ配列の存在の双方が必要であった；ｔｒａｃｒＲＮＡ塩基対形成が可能ではあるが、非
同種標的ＤＮＡ結合配列を有するｃｒＲＮＡはＣａｓ９触媒性プラスミド切断を支援しな
かった（図１０Ａ；図１７Ａ、ｃｒＲＮＡ−ｓｐ２とｃｒＲＮＡ−ｓｐ１を比較；および
図１８Ａ）。短い線状ｄｓＤＮＡ基質でも同様の結果を得た（図１０Ｂおよび図１７、Ｂ
およびＣ）。このように、トランス活性化ｔｒａｃｒＲＮＡは二つの重要な機能を伴う小
さな非コードＲＮＡである：酵素ＲＮａｓｅ ＩＩＩ（４）によってｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ
プロセシングを誘発すること、および、引き続きＣａｓ９によるｃｒＲＮＡ誘導ＤＮＡ切
断を活性化させること。
ｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡに誘導されたＣａｓ９によるプラスミドおよび短い線状
ｄｓＤＮＡの双方の切断は部位特異的である（図１０、Ｃ〜Ｅ、および図１９、Ａおよび
Ｂ）。プラスミドＤＮＡ切断は、ＰＡＭ配列の塩基対三つ上流の位置で、平滑末端をもた
らした（図１０、ＣおよびＥ、並びに図１９、ＡおよびＣ）（２６）。同様に、短いｄｓ
ＤＮＡ二重鎖内で、ｃｒＲＮＡの標的結合配列に相補的であるＤＮＡ鎖（相補鎖）は、Ｐ
ＡＭの塩基対三つ上流の位置で切断される（図１０、ＤおよびＥ、並びに図１９、Ｂおよ
びＣ）。非相補ＤＮＡ鎖は、ＰＡＭの塩基対３〜８個上流内の一つまたは複数部位で切断
される。さらなる調査によって、非相補鎖はまず始めにヌクレオチド鎖切断的に切断され
、その後、３′−５′エキソヌクレアーゼ活性によって調節されることが明らかになった
（図１８Ｂ）。シングルターンオーバー条件下でのＣａｓ９による切断速度は制限エンド
ヌクレアーゼに匹敵する毎分０．３〜１の範囲に及び（図２０Ａ）、一方で、５倍モル過
剰である基質ＤＮＡを伴う野生型（ＷＴ）Ｃａｓ９−ｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡ複合
体のインキュベーションは、二重ＲＮＡ誘導Ｃａｓ９は複数ターンオーバー酵素である証
拠を提供した（図２０Ｂ）。ＣＲＩＳＰＲ Ｉ型カスケード複合体とは対照的に（１８）
、Ｃａｓ９は直線化およびスーパーコイルプラスミドの双方を切断する（図１０Ａおよび
１１Ａ）。従って、侵入プラスミドは、基本的に、異なるｃｒＲＮＡでプログラムされた
Ｃａｓ９タンパク質によって複数回切断され得る。
図１０（Ａ） Ｃａｓ９を、７５−ヌクレオチドｔｒａｃｒＲＮＡの存在または不在下
で、４２−ヌクレオチドｃｒＲＮＡ−ｓｐ２（スペーサー２配列を含むｃｒＲＮＡ）でプ
ログラムした。複合体を、スペーサー２および機能性ＰＡＭに相補的である配列を保有す
る環状またはＸｈｏＩ直線化プラスミドＤＮＡに添加した。ｃｒＲＮＡ−ｓｐ１、特異性
制御；Ｍ、ＤＮＡマーカー；ｋｂｐ、キロ塩基対。図１７Ａを参照。（Ｂ）Ｃａｓ９をｃ
ｒＲＮＡ−ｓｐ２およびｔｒａｃｒＲＮＡ（ヌクレオチド４〜８９）でプログラムした。
複合体を、スペーサー２および機能性ＰＡＭに相補的である配列を保有する二重または単
鎖ＤＮＡでインキュベートした（４）。ＤＮＡの相補または非相補鎖の５’を放射標識し
、非標識パートナー鎖でアニールした。ｎｔ、ヌクレオチド。図１７、ＢおよびＣを参照
。（Ｃ）図１０Ａの切断産物のシークエンシング分析。シークエンシング反応のプライマ
ー伸長の終結は、切断部位の位置を示す。３’末端Ａオーバーハング（アスタリスク）は
、シークエンシング反応の人為産物である。図１９、ＡおよびＣを参照。（Ｄ）図１０Ｂ
の切断産物を、標識ＤＮＡ二重鎖の相補および非相補鎖由来の５’が標識されたサイズマ
ーカーと一緒に分析した。Ｍ、マーカー；Ｐ、切断産物。図１９、ＢおよびＣを参照。（
Ｅ）ｔｒａｃｒＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ−ｓｐ２およびプロトスペーサー２ＤＮＡ配列の概略
図である。ｃｒＲＮＡ（上線）およびプロトスペーサーＤＮＡ（下線）と相補性を有する
ｔｒａｃｒＲＮＡの領域を示す。ＰＡＭ配列は標識される；（Ｃ）および（Ｄ）にマッピ
ングされる切断部位は白色矢印（Ｃ）、黒色矢印［（Ｄ）、相補鎖］、および黒色棒線［
（Ｄ）、非相補鎖］で表される。
図１５はＩＩ型ＲＮＡ媒介性ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ免疫経路を示す。発現および干渉工
程が図に示される。ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ座位はタンパク質Ｃａｓ９、Ｃａｓ１、
Ｃａｓ２およびＣｓｎ２をコードする四つの遺伝子のオペロン、および、特有のゲノム標
的スペーサー（菱形）が散在した同一のリピート（黒色長方形）が続くリーダー配列から
成るＣＲＩＳＰＲアレイ、およびトランス活性化ｔｒａｃｒＲＮＡをコードする配列から
構成される。ここに示されるのは、Ｓ．ピオゲネスＳＦ３７０（受託番号ＮＣ＿００２７
３７）のＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ座位である（４）。この座位で実験的に確認された
プロモーターおよび転写ターミネーターが示される（４）。ＣＲＩＳＰＲアレイは、ＩＩ
型システムに特異的な成熟プロセスを行う前駆体ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｐｒｅ−ｃｒＲ
ＮＡ）分子として転写される（４）。Ｓ．ピオゲネスＳＦ３７０では、ｔｒａｃｒＲＮＡ
は、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡの各リピートと相補性を有する、長さ１７１および８９ｎｔであ
る二つの一次転写物として転写される。第１のプロセシング現象はｔｒａｃｒＲＮＡとｐ
ｒｅ−ｃｒＲＮＡの対形成に関わり、Ｃａｓ９タンパク質の存在下でハウスキーピングエ
ンドリボヌクレアーゼＲＮａｓｅ ＩＩＩによって認識および切断される二重鎖ＲＮＡを
形成する。二重鎖ＲＮＡのＲＮａｓｅ ＩＩＩ媒介性切断は、７５ｎｔのプロセシングさ
れたｔｒａｃｒＲＮＡ、および、リピート配列の一部が隣接する一つのスペーサーの配列
を含む中央領域から成る６６ｎｔの中間体ｃｒＲＮＡを作成する。第２のプロセシング現
象は、未知のリボヌクレアーゼ（複数可）によって媒介され、５’末端スペーサー由来の
誘導配列およびリピート由来の３’末端配列から成る長さ３９〜４２ｎｔの成熟ｃｒＲＮ
Ａの形成につながる。第１および第２のプロセシング現象に続いて、成熟ｔｒａｃｒＲＮ
Ａは成熟ｃｒＲＮＡと対形成し、Ｃａｓ９タンパク質と結合した状態を維持する。この３
元複合体では、二重ｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡ構造は、エンドヌクレアーゼＣａｓ９
を同種標的ＤＮＡに誘導する誘導ＲＮＡとして作用する。Ｃａｓ９−ｔｒａｃｒＲＮＡ：
ｃｒＲＮＡ複合体による標的認識は、標的ＤＮＡのプロトスペーサー配列とｃｒＲＮＡの
スペーサー由来配列との間の相同性に関して侵入ＤＮＡ分子を走査することで開始される
。ＤＮＡプロトスペーサー−ｃｒＲＮＡスペーサーの相補性に加え、ＤＮＡ標的はプロト
スペーサーに隣接する短いモチーフ（ＮＧＧ、ここで、Ｎは任意のヌクレオチドであり得
る）（プロトスペーサー隣接モチーフ−ＰＡＭ）の存在を必要とする。二重ＲＮＡとプロ
トスペーサー配列との間の対形成に続いて、Ｒループが形成され、Ｃａｓ９は続いてＤＮ
Ａ内に二重鎖切断（ＤＳＢ）をもたらす。Ｃａｓ９による標的ＤＮＡの切断は、タンパク
質内に二つの触媒性ドメインを必要とする。ＰＡＭに対する特定の部位では、ＨＮＨドメ
インはＤＮＡの相補鎖を切断する一方で、ＲｕｖＣ様ドメインは非相補鎖を切断する。
図１６（Ａ）Ｓ．ピオゲネスＣａｓ９を大腸菌内にＮ末端Ｈｉｓ６−ＭＢＰタグを含む
融合タンパク質として発現させ、アフィニティー、イオン交換およびサイズ排除クロマト
グラフィー工程の組み合わせによって精製した。アフィニティー精製工程に続くＴＥＶプ
ロテアーゼ切断によって、アフィニティータグを除去した。示されるのは、Ｓｕｐｅｒｄ
ｅｘ ２００（１６／６０）カラム上の最終サイズ排除クロマトグラフィー工程のクロマ
トグラムである。２８０および２６０ｎｍの吸着率で判別される通り、混入核酸のない単
一の単量体ピークとしてＣａｓ９を溶離する。挿入図；溶離した画分を１０％ポリアクリ
ルアミドゲル上のＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ Ｓａｆｅ Ｓｔａ
ｉｎ（インビトロジェン社）で染色した。（Ｂ）精製Ｃａｓ９オルソログのＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥ分析。Ｃａｓ９オルソログを、補足の材料および方法で記載した通り精製した。２．
５μｇの各精製Ｃａｓ９を、４〜２０％勾配ポリアクリルアミドゲル上で分析し、Ｓｉｍ
ｐｌｙＢｌｕｅ Ｓａｆｅ Ｓｔａｉｎで染色した。
図１７（図１０も参照）。プロトスペーサー１配列は、Ｓ．ピオゲネスＳＦ３７０ｃｒ
ＲＮＡｓｐ１の標的である、Ｓ．ピオゲネスＳＦ３７０（Ｍ１）ＳＰｙ＿０７００由来で
ある（４）。ここで、プロトスペーサー１配列を、ＰＡＭを非機能性配列（ＴＴＧ）から
機能性配列（ＴＧＧ）に変えることで、操作した。プロトスペーサー４配列は、Ｓ．ピオ
ゲネスＳＦ３７０ｃｒＲＮＡ−ｓｐ４の標的である、Ｓ．ピオゲネスＭＧＡＳ１０７５０
（Ｍ４）ＭＧＡＳ１０７５０＿Ｓｐｙ１２８５由来である（４）。（Ａ）同種ｔｒａｃｒ
ＲＮＡ：ｃｒＲＮＡ二重鎖によって誘導されるプロトスペーサー１プラスミドＤＮＡ切断
。切断産物をアガロースゲル電気泳動で分離し、エチジウムブロマイド染色で可視化した
。Ｍ、ＤＮＡマーカー；塩基対数で断片サイズが示される。（Ｂ）同種ｔｒａｃｒＲＮＡ
：ｃｒＲＮＡ−ｓｐ１二重鎖によって誘導されるプロトスペーサー１オリゴヌクレオチド
ＤＮＡ切断。切断産物を変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離し、ホスフォ
イメージャーによって可視化した。ヌクレオチド数で断片サイズが示される。（Ｃ）同種
ｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡ−ｓｐ４二重鎖によって誘導されるプロトスペーサー４オ
リゴヌクレオチドＤＮＡ切断。切断産物を変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって
分離し、ホスフォイメージャーによって可視化した。ヌクレオチド数で断片サイズが示さ
れる。（Ａ、Ｂ、Ｃ）（Ａ）の実験は図１０Ａの通り実行され；（Ｂ）および（Ｃ）の実
験は図１０Ｂの通りである。（Ｂ、Ｃ）ｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡ標的ＤＮＡ相互作
用の概略が下に示される。ｔｒａｃｒＲＮＡとのｃｒＲＮＡ相補性およびプロトスペーサ
ーＤＮＡの領域にそれぞれ上線および下線が引かれている。ＰＡＭ配列は標識される。
図１８（図１０も参照）。（Ａ）プロトスペーサー２プラスミドＤＮＡを、異なる濃度
のＭｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃａ２＋、Ｚｎ２＋、Ｃｏ２＋、Ｎｉ２＋またはＣｕ２＋の存在
下でｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡ−ｓｐ２と複合体化したＣａｓ９でインキュベートし
た。切断産物をアガロースゲル電気泳動で分離し、エチジウムブロマイド染色で可視化し
た。プラスミド形態が示される。（Ｂ）ＰＡＭモチーフを含むプロトスペーサー４オリゴ
ヌクレオチドＤＮＡ二重鎖をアニールし、双方の５’末端を放射標識する前にゲルで精製
した。二重鎖（１０ｎＭ最終濃度）を、ｔｒａｃｒＲＮＡ（ヌクレオチド２３〜８９）お
よびｃｒＲＮＡｓｐ４（５００ｎＭ最終濃度、１：１）でプログラムしたＣａｓ９でイン
キュベートした。指定された時間点（分）で、１０μｌの一定分量の切断反応物を０．０
２５％ＳＤＳおよび５ｍＭのＥＤＴＡを含むホルムアミド緩衝液でクエンチし、変性ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動で図１０Ｂの通り分析した。ヌクレオチド数でサイズが示さ
れる。
図１９（Ａ）プロトスペーサー１プラスミドＤＮＡ切断のマッピング。図１７Ａの切断
産物を図１０Ｃの通りシークエンシングによって分析した。３’末端Ａオーバーハング（
アスタリスク）はシークエンシング反応の人為産物であることに留意する。（Ｂ）プロト
スペーサー４オリゴヌクレオチドＤＮＡ切断のマッピング。図１７Ｃの切断産物を、変性
ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって、プロトスペーサー４二重鎖ＤＮＡの相補およ
び非相補鎖由来の５’末端標識オリゴヌクレオチドサイズマーカーと一緒に分析した。Ｍ
、マーカー；Ｐ、切断産物。レーン１〜２：相補鎖。レーン３〜４：非相補鎖。ヌクレオ
チド数で断片サイズが示される。（Ｃ）ｔｒａｃｒＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ−ｓｐ１およびプ
ロトスペーサー１ＤＮＡ配列（上）並びにｔｒａｃｒＲＮＡ、ｃｒＲＮＡｓｐ４およびプ
ロトスペーサー４ＤＮＡ配列（下）の模式図である。ｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡは、
ｃｒＲＮＡ−プロトスペーサーＤＮＡ対形成を通して相補プロトスペーサーＤＮＡに誘導
される二重ＲＮＡ構造を形成する。ｔｒａｃｒＲＮＡに相補的であるｃｒＲＮＡおよびプ
ロトスペーサーＤＮＡの領域はそれぞれ下線および上線が引かれている。（Ａ）（上）お
よび（Ｂ）（下）にマッピングされる相補および非相補ＤＮＡ鎖における切断部位は、そ
れぞれ配列の上で、矢印（ＡおよびＢ、相補鎖）および黒色棒線（Ｂ、非相補鎖）によっ
て表される。
図２０（Ａ） 異なるＲＮＡプレアニールおよびタンパク質−ＲＮＡプレインキュベー
ション条件下でのＣａｓ９のシングルターンオーバー動態。プロトスペーサー２プラスミ
ドＤＮＡを、プレアニールしたｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡ−ｓｐ２でプレインキュベ
ートしたＣａｓ９（○）、プレアニールしたｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡ−ｓｐ２でプ
レインキュベートしていないＣａｓ９（●）、プレアニールしていないｔｒａｃｒＲＮＡ
およびｃｒＲＮＡ−ｓｐ２でプレインキュベートしたＣａｓ９（□）またはプレアニール
していないＲＮＡでプレインキュベートしていないＣａｓ９（■）のいずれかでインキュ
ベートした。切断活性を時間に依存した方法でモニターし、アガロースゲル電気泳動、続
いてエチジウムブロマイド染色で分析した。三つの独立した実験からの切断の平均パーセ
ンテージを時間（分）に対してプロットし、非線形回帰分析であてはめを行った。算出し
た切断速度（ｋｏｂｓ）を表に示す。結果は、Ｃａｓ９のＲＮＡへの結合は、試験した条
件下では速度を制限しないことを示す。プラスミド形態を示す。得られたｋｏｂｓ値は、
一般的に１分あたり１〜１０とほぼ同程度の制限エンドヌクレアーゼの値に匹敵する（４
５〜４７）。（Ｂ）Ｃａｓ９は複数ターンオーバーエンドヌクレアーゼである。二重鎖ｔ
ｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡ−ｓｐ２を添加したＣａｓ９（１ｎＭ、１：１：１−グラフ
上では灰色の線で示される）を、５倍過剰の天然プロトスペーサー２プラスミドＤＮＡで
インキュベートした。決められた時間間隔（０〜１２０分）で反応から試料を取り出すこ
とで、切断をモニターし、続いてアガロースゲル電気泳動分析（上）および切断産物量（
ｎＭ）の決定（下）を行った。三つの独立した実験の標準偏差を示す。調査した時間間隔
では、１ｎＭのＣａｓ９は約２．５ｎＭプラスミドＤＮＡを切断できた。
各Ｃａｓ９ヌクレアーゼドメインは一つのＤＮＡ鎖を切断する
Ｃａｓ９は、ＨＮＨおよびＲｕｖＣエンドヌクレアーゼの双方に相似のドメインを含む
（図１１Ａおよび図３）（２１〜２３、２７、２８）。我々は、ＨＮＨまたはＲｕｖＣ様
ドメインのいずれかの触媒残基で不活性化点変異を含むＣａｓ９変異形を設計および精製
した（図１１Ａおよび図３）（２３、２７）。天然プラスミドＤＮＡとのこれら変異形Ｃ
ａｓ９タンパク質のインキュベーションは、二重ＲＮＡ誘導変異体Ｃａｓ９タンパク質は
ニックの入った開環状のプラスミドをもたらし、一方で、ＷＴ Ｃａｓ９タンパク質−ｔ
ｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡ複合体は線状ＤＮＡ産物（図１０Ａおよび１１Ａ並びに図１
７Ａおよび２５Ａ）を生成した。この結果は、Ｃａｓ９ＨＮＨおよびＲｕｖＣ様ドメイン
はそれぞれ一つのプラスミドＤＮＡ鎖を切断することを示す。標的ＤＮＡのどの鎖が各Ｃ
ａｓ９触媒ドメインによって切断されるかを決定するために、相補または非相補鎖のいず
れかがその５’末端で放射標識された短いｄｓＤＮＡ基質で変異体Ｃａｓ９−ｔｒａｃｒ
ＲＮＡ：ｃｒＲＮＡ複合体をインキュベートした。得られた切断産物は、Ｃａｓ９ＨＮＨ
ドメインが相補ＤＮＡ鎖を切断する一方で、Ｃａｓ９ＲｕｖＣ様ドメインは非相補ＤＮＡ
鎖を切断することを示した（図１１Ｂおよび図２１Ｂ）。
図１１（Ａ）（上）ドメイン変異の位置を示す、Ｃａｓ９ドメイン構造の模式図。Ｄ１
０Ａ、Ａｓｐ１０→Ａｌａ１０；Ｈ８４０Ａ；Ｈｉｓ８４０→Ａｌａ８４０。ｔｒａｃｒ
ＲＮＡ：ｃｒＲＮＡ−ｓｐ２とのＷＴまたはヌクレアーゼ変異体Ｃａｓ９タンパク質の複
合体を、図１０Ａの通り、エンドヌクレアーゼ活性に関してアッセイを行った。（Ｂ）ｔ
ｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡ−ｓｐ２とのＷＴ Ｃａｓ９またはヌクレアーゼドメイ
ン変異体の複合体を、図１０Ｂの通り、活性に関して試験した。
図３ Ｓ．ピオゲネス（配列番号８）由来のＣａｓ９のアミノ酸配列を表す。様々な多
種多様の種由来のＣａｓ９／Ｃｓｎ１タンパク質は、ＨＮＨおよびＲｕｖＣエンドヌクレ
アーゼの双方に類似するモチーフを含む二つのドメインを含む。（Ａ）Ｓ．ピオゲネスＣ
ａｓ９／Ｃｓｎ１に関して、モチーフ１〜４（モチーフ番号を配列の左側にマークしてい
る）が示される。三つの予想ＲｕｖＣ様モチーフ（１、２、４）および予想ＨＮＨモチー
フ（３）に上線が引かれている。本実験においてＡｌａで置換された残基Ａｓｐ１０およ
びＨｉｓ８４０は、配列上部のアスタリスクによって強調される。下線が引かれた残基は
、異なる種由来のＣａｓ９タンパク質の中で高度に保存されている。下線付き残基におけ
る変異はＣａｓ９活性に機能的な影響をもたらす可能性が高い。本実験では、二つのヌク
レアーゼ様活性の共役が実験的に示されることを留意されたい（図１１および図２１）。
（Ｂ）Ｓ．ピオゲネスＣａｓ９／Ｃｓｎ１に関して、モチーフ１〜４を含む、ドメイン１
（アミノ酸７〜１６６）および２（アミノ酸７３１〜１００３）が示される。さらなる情
報のために表１および図５を参照されたい。
図２１ ＨＮＨまたはＲｕｖＣ様ドメインに変異を含む同種ｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲ
ＮＡ指示性Ｃａｓ９変異体によるプロトスペーサーＤＮＡ切断。（Ａ）プロトスペーサー
１プラスミドＤＮＡ切断。実験を図１１Ａの通り実施した。塩基対数でプラスミドＤＮＡ
立体構造およびサイズが示される。（Ｂ）プロトスペーサー４オリゴヌクレオチドＤＮＡ
切断。実験を図１１Ｂの通り実施した。ヌクレオチド数でサイズが示される。
標的ＤＮＡ結合および切断のための二重ＲＮＡの必要性
ｔｒａｃｒＲＮＡは、標的認識の下流において、Ｃａｓ９のヌクレアーゼ活性および／
または標的ＤＮＡ結合を刺激するために必要であり得る。これらの可能性をそれぞれ識別
するために、電気泳動移動度シフトアッセイを用いて、ｃｒＲＮＡおよび／またはｔｒａ
ｃｒＲＮＡの存在または不在下で触媒的に不活性であるＣａｓ９による標的ＤＮＡ結合を
モニターした。ｔｒａｃｒＲＮＡの添加がＣａｓ９による標的ＤＮＡ結合を実質的に強化
する一方で、Ｃａｓ９単独またはＣａｓ９−ｃｒＲＮＡでの特異的ＤＮＡ結合はほとんど
観察されなかった（図２２）。これは、ｔｒａｃｒＲＮＡが標的ＤＮＡ認識のために必要
であることを示し、標的ＤＮＡの相補鎖との相互作用のためにｃｒＲＮＡを適切に方向付
けることによる可能性がある。予想ｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡ二次構造は、ｃｒＲＮ
Ａの３’末端における２２個のヌクレオチドと成熟ｔｒａｃｒＲＮＡの５’末端付近での
断片との間での塩基対形成を含む（図１０Ｅ）。この相互作用は、異なるｃｒＲＮＡで配
列が様々である、ｃｒＲＮＡの５’末端の２０個のヌクレオチドが標的ＤＮＡ結合に利用
可能である構造を形成する。ｃｒＲＮＡ塩基対形成領域の下流の大部分のｔｒａｃｒＲＮ
Ａは自由にＲＮＡ構造（複数可）をさらに形成し、および／または、Ｃａｓ９もしくは標
的ＤＮＡ部位と相互作用する。ｔｒａｃｒＲＮＡの全長が部位特異的Ｃａｓ９触媒性ＤＮ
Ａ切断に必要かどうかを決定するために、全長成熟（４２ヌクレオチド）ｃｒＲＮＡおよ
び５’および３’末端で配列が欠如したｔｒａｃｒＲＮＡの様々な切断形態を使用して再
構成したＣａｓ９−ｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡ複合体を試験した。これらの複合体を
、短い標的ｄｓＤＮＡを用いて切断に関して試験した。天然配列のヌクレオチド２３〜４
８を維持する実質的に切断されたバージョンのｔｒａｃｒＲＮＡは、頑強な二重ＲＮＡ誘
導Ｃａｓ９触媒性ＤＮＡ切断を支援することができた（図１２、ＡおよびＣ、および図２
３、ＡおよびＢ）。いずれかの末端からのｃｒＲＮＡの切断は、ｔｒａｃｒＲＮＡ存在下
でのＣａｓ９触媒性切断は３′末端で１０個のヌクレオチドを欠如したｃｒＲＮＡで引き
起こされ得ることを示した（図１２、ＢおよびＣ）。対照的に、ｃｒＲＮＡの５’末端か
らの１０−ヌクレオチド欠失はＣａｓ９によるＤＮＡ切断を無効にする（図１２Ｂ）。ま
た、様々な細菌種からのＣａｓ９オルソログを、Ｓ．ピオゲネスｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒ
ＲＮＡ誘導ＤＮＡ切断を支援するそれらの能力に関して分析した。近縁種Ｓ．ピオゲネス
Ｃａｓ９オルソログとは対照的に、さらに遠縁種であるオルソログは切断反応では機能的
ではなかった（図２４）。同様に、さらに遠縁システム由来である、ｔｒａｃｒＲＮＡ：
ｃｒＲＮＡ二重鎖によって誘導されるＳ．ピオゲネスＣａｓ９は、ＤＮＡを効率的に切断
できなかった（図２４）。ＤＮＡの二重ＲＮＡ誘導切断の種特異性は、Ｃａｓ９、ｔｒａ
ｃｒＲＮＡ、およびｃｒＲＮＡリピートの共進化、並びに、二重ＲＮＡ内に特定のＣａｓ
９オルソログとの三元複合体の形成のために不可欠な未知の構造および／または配列の存
在を示す。
細菌細胞内のＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ免疫のためのプロトスペーサー配列必要条件
を調査するために、Ｓ．ピオゲネスにおける形質転換に続きその維持のために単一ヌクレ
オチド変異を保有する、一連のプロトスペーサー含有プラスミドＤＮＡを分析し、および
Ｃａｓ９によって切断される能力を分析した。プロトスペーサーの５’末端で導入される
点変異とは対照的に、ＰＡＭおよびＣａｓ９切断部位に近い領域における変異はインビボ
では許容されず、およびインビトロでのプラスミド切断効率の低下につながった（図１２
Ｄ）。我々の結果は、インビボでＳ．サーモフィラスのＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムで選
択されたプロトスペーサーエスケープ変異体の以前の報告と合致している（２７、２９）
。さらに、プラスミド維持および切断の結果は、プロトスペーサー配列の３’末端に位置
される、ｃｒＲＮＡとの相互作用およびそれに続くＣａｓ９による切断のために必要不可
欠な「シード」領域の存在をほのめかす。この考えを支持するように、Ｃａｓ９はｃｒＲ
ＮＡとの相補ＤＮＡ鎖ハイブリダイゼーションを強化し；この強化はｃｒＲＮＡ標的配列
の３’末端領域で最も強かった（図２５Ａ〜Ｃ）。この発見を実証するように、ｃｒＲＮ
ＡとＰＡＭに近接する標的ＤＮＡ部位との間の少なくとも一連の１３の連続した塩基対が
効率的な標的切断のために必要である一方で、プロトスペーサーの５’末端領域において
最大六つの隣接ミスマッチが許容される（図１２Ｅ）。これらの発見は、アルゴノートタ
ンパク質（３０、３１）並びにカスケードおよびＣｓｙ ＣＲＩＳＰＲ複合体（１３、１
４）における標的核酸認識のための以前観察されたシード配列必要条件を連想させる。
図１２（Ａ）Ｃａｓ９−ｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡ複合体を、４２ヌクレオチドｃ
ｒＲＮＡ−ｓｐ２および切断ｔｒａｃｒＲＮＡ構築物を用いて再構成し、図１０Ｂの通り
、切断活性に関してアッセイを行った。（Ｂ）全長ｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡ−
ｓｐ２切断でプログラムされたＣａｓ９を（Ａ）の通り活性に関してアッセイを行った。
（Ｃ）Ｃａｓ９媒介性ＤＮＡ切断を誘導できるｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡの最小
領域（影領域）。（Ｄ）ＷＴまたは変異体プロトスペーサー２配列を指定された点変異で
含むプラスミドを、図１０Ａの通りプログラムされたＣａｓ９で、インビトロで切断し、
ＷＴまたはｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ欠損Ｓ．ピオゲネスの形質転換アッセイのために使用した
。プラスミドＤＮＡ１マイクログラムあたりのコロニー形成単位（ＣＦＵ）として形質転
換効率を算出した。エラーバーは三つの生物学的複製物に関するＳＤを示す。（Ｅ）異な
る範囲のｃｒＲＮＡ標的ＤＮＡミスマッチを伴ってＷＴおよび変異体プロトスペーサー２
挿入を含むプラスミド（下）を、インビトロでプログラムされたＣａｓ９（上）で切断し
た。切断反応をさらにＸｍｎＩで消化した。１８８０および８００ｂｐ断片はＣａｓ９作
成切断産物である。Ｍ、ＤＮＡマーカー。
図２２ プロトスペーサー４標的ＤＮＡ二重鎖およびＣａｓ９（変異Ｄ１０ＡおよびＨ
８４０を不活性化するヌクレアーゼドメインを含む）を単独、または、ｃｒＲＮＡ−ｓｐ
４、ｔｒａｃｒＲＮＡ（７５ｎｔ）もしくは双方の存在下で用いて、電気泳動移動度シフ
トアッセイを実施した。標的ＤＮＡ二重鎖を双方の５’末端で放射標識した。Ｃａｓ９（
Ｄ１０／Ｈ８４０Ａ）および複合体を１ｎＭから１μＭに滴定した。結合を８％天然ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動で分析し、ホスフォイメージャーで可視化した。Ｃａｓ９単
独で標的ＤＮＡと適度の親和性で結合することに留意されたい。この結合はｃｒＲＮＡの
添加に影響されず、これはｄｓＤＮＡとの配列非特異的相互作用を表すことを暗示する。
さらに、この相互作用はｃｒＲＮＡの不在下でｔｒａｃｒＲＮＡ単独で打ち負かされ得る
。ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ双方の存在下では、標的ＤＮＡ結合は実質的に強化
され、特定の標的ＤＮＡ認識を表す、異なる電気泳動移動度を伴う種をもたらす。
図２３Ａ ｃｒＲＮＡ結合領域の一部分および下流領域の一部分を含むｔｒａｃｒＲＮ
Ａの断片は、Ｃａｓ９によるプロトスペーサーオリゴヌクレオチドＤＮＡの切断を指示す
るのに十分である。（Ａ）プロトスペーサー１オリゴヌクレオチドＤＮＡ切断および（Ｂ
）成熟同種ｃｒＲＮＡおよび様々なｔｒａｃｒＲＮＡ断片で誘導された、Ｃａｓ９による
プロトスペーサー４オリゴヌクレオチドＤＮＡ切断。（Ａ、Ｂ）ヌクレオチド数でサイズ
が示される。
図２４ Ｓ．ピオゲネスのＣａｓ９のように、グラム陽性の細菌Ｌ．イノキュアおよび
Ｓ．サーモフィラスの近縁Ｃａｓ９オルソログは、Ｓ．ピオゲネスのｔｒａｃｒＲＮＡ：
ｃｒＲＮＡに標的された際、プロトスペーサーＤＮＡを切断する。しかし、同じ条件下で
、より近縁ではない、グラム陰性細菌Ｃ．ジェジュニおよびＮ．メニンギティディスのＣ
ａｓ９オルソログによるＤＮＡ切断は観察されない。Ｓｐｙ、Ｓ．ピオゲネスＳＦ３７０
（受託番号ＮＣ＿００２７３７）；Ｓｔｈ、Ｓ．サーモフィラスＬＭＤ−９（ＳＴＥＲ＿
１４７７Ｃａｓ９オルソログ；受託番号ＮＣ＿００８５３２）；Ｌｉｎ、Ｌ．イノキュア
Ｃｌｉｐ１１２６２（受託番号ＮＣ＿００３２１２）；Ｃｊｅ、Ｃ．ジェジュニＮＣＴＣ
１１１６８（受託番号ＮＣ＿００２１６３）；Ｎｍｅ、Ｎ．メニンギティディスＡ Ｚ２
４９１（受託番号ＮＣ＿００３１１６）。（Ａ）プロトスペーサープラスミドＤＮＡの切
断。プロトスペーサー２プラスミドＤＮＡ（３００ｎｇ）を、異なる種のハイブリッドｔ
ｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡ−ｓｐ２二重鎖（５００ｎＭ、１：１）によって誘導された
異なるＣａｓ９オルソログ（５００ｎＭ）による切断に供した。ＲＮＡ二重鎖を設計する
ために、以前公開されたノーザンブロットデータに基づいて、Ｌ．イノキュアおよびＮ．
メニンギティディスからのｔｒａｃｒＲＮＡ配列を予想した（４）。二重ハイブリッドＲ
ＮＡ二重鎖は種特異性ｔｒａｃｒＲＮＡおよび異種ｃｒＲＮＡから成る。異種ｃｒＲＮＡ
配列を、３’末端のＬ．イノキュアまたはＮ．メニンギティディスｔｒａｃｒＲＮＡ結合
リピート配列と融合するＳ．ピオゲネスＤＮＡ標的ｓｐ２配列を５’末端に含むように設
計した。Ｎ．メニンギティディスまたはＣ．ジェジュニ由来ではなく、Ｓ．サーモフィラ
スおよびＬ．イノキュア由来のＣａｓ９オルソログは、少し低下した効率を伴ったが、Ｓ
．ピオゲネスｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡ−ｓｐ２に誘導されてプロトスペーサー２プ
ラスミドＤＮＡを切断し得る。同様にハイブリッドＬ．イノキュアｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃ
ｒＲＮＡ−ｓｐ２はＳ．ピオゲネスＣａｓ９を誘導して、高い効率を伴って標的ＤＮＡを
切断し得る一方で、ハイブリッドＮ．メニンギティディスｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡ
−ｓｐ２はＳ．ピオゲネスＣａｓ９によるＤＮＡ切断活性をほんの少ししか引き起こさな
い。対照として、Ｎ．メニンギティディスおよびＬ．イノキュアＣａｓ９オルソログは、
同種ハイブリッドｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡ−ｓｐ２に誘導される際、プロトスペー
サー２プラスミドＤＮＡを切断する。上述した通り、Ｎ．メニンギティディスのｔｒａｃ
ｒＲＮＡ配列は予想されるだけであり、ＲＮＡシークエンシングではまだ確証されていな
いことに留意されたい。従って、切断の低効率は、Ｃａｓ９オルソログの低活性または非
最適に設計されたｔｒａｃｒＲＮＡ配列の使用のいずれかの結果であり得る。（Ｂ）プロ
トスペーサーオリゴヌクレオチドＤＮＡの切断。未標識非相補鎖リゴヌクレオチド（プロ
トスペーサー１）（１０ｎＭ）（左）でプレアニールした５’末端が放射活性的に標識さ
れた相補鎖リゴヌクレオチド（１０ｎＭ）または未標識非相補鎖リゴヌクレオチド（１０
ｎＭ）（右）（プロトスペーサー１）でプレアニールした５’末端放射活性的に標識され
た非相補鎖リゴヌクレオチド（１０ｎＭ）を、Ｓ．ピオゲネスのｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒ
ＲＮＡ−ｓｐ１二重鎖（５００ｎＭ、１：１）で誘導された、様々なＣａｓ９オルソログ
（５００ｎＭ）による切断に供した。Ｎ．メニンギティディスまたはＣ．ジェジュニ由来
ではなく、Ｓ．サーモフィラスおよびＬ．イノキュア由来のＣａｓ９オルソログは、Ｓ．
ピオゲネス同種二重ＲＮＡによって誘導され、効率は低下するが、プロトスペーサーオリ
ゴヌクレオチドＤＮＡを切断し得る。相補ＤＮＡ鎖上の切断部位が全三つのオルソログに
関して同一であることに留意されたい。非相補鎖の切断は別個の場所で生じる。（Ｃ）Ｃ
ａｓ９オルソログのアミノ酸配列同一性。Ｓ．ピオゲネス、Ｓ．サーモフィラスおよびＬ
．イノキュアＣａｓ９オルソログは高パーセンテージのアミノ酸同一性を共有する。対照
的に、Ｃ．ジェジュニおよびＮ．メニンギティディスＣａｓ９タンパク質は配列および長
さにおいて異なる（約３００〜４００のアミノ酸だけ、より短い）。（Ｄ）Ｓ．ピオゲネ
ス（実験で確証された（４））、Ｌ．イノキュア（予想）またはＮ．メニンギティディス
（予想）の対応ｔｒａｃｒＲＮＡオルソログとの、操作された種特異的異種ｃｒＲＮＡ配
列の同時折り畳み。ｔｒａｃｒＲＮＡ；ｃｒＲＮＡスペーサー２断片；およびｃｒＲＮＡ
リピート断片をトレースおよび標識した。Ｌ．イノキュアおよびＳ．ピオゲネスハイブリ
ッドｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡ−ｓｐ２二重鎖は、Ｎ．メニンギティディスハイブリ
ッドｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡとは異なるが、非常に類似した構造的な特徴を共有す
る。（Ａ）および（Ｂ）で上述した切断データと一緒に、同時折り畳み予想は、Ｃａｓ９
−ｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡによる標的ＤＮＡの種特異的切断が、同種Ｃａｓ９オル
ソログによって特異的に認識されるｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡ二重鎖の未知の構造的
特色によって指示されることを示すであろう。（Ａ）および（Ｂ）で観察される切断の種
特異性はＣａｓ９と二重ｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡの結合の段階で生じることが予想
された。二重ＲＮＡ誘導である標的ＤＮＡのＣａｓ９切断は、種特異的であり得る。Ｃａ
ｓ９タンパク質およびｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡ二重鎖間の多様性／進化の度合いに
よって、Ｃａｓ９および二重ＲＮＡオルソログは部分的に互換可能である。
図２５Ａ ＤＮＡ標的化領域およびｔｒａｃｒＲＮＡ結合領域を含むｃｒＲＮＡの領域
に相補的である、一連の８ヌクレオチドＤＮＡプローブを、ｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮ
Ａ二重鎖およびＣａｓ９−ｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡ三次複合体と関連して、ｃｒＲ
ＮＡとハイブリダイズする能力に関して分析した。（Ａ）アッセイで使用されたＤＮＡプ
ローブの配列およびそれらのｃｒＲＮＡ−ｓｐ４での結合部位の模式図。（Ｂ〜Ｃ）ｔｒ
ａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡ−ｓｐ４またはＣａｓ９−ｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡ−ｓ
ｐ４を伴う標的ＤＮＡプローブの電気泳動移動シフトアッセイ。ｔｒａｃｒＲＮＡ（１５
〜８９）構築物を実験で使用した。二重鎖または複合体の標的オリゴヌクレオチドＤＮＡ
への結合を１６％天然ポリアクリルアミドゲル上で分析し、ホスフォイメージャーで可視
化した。
短い配列モチーフがＲループ形成を支配する
複数のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムで、自己対非自己の認識が、ＰＡＭ（２７、２９
、３２〜３４）として称される、外来性ゲノムに保存される短い配列モチーフを含むこと
が示されている。ＰＡＭモチーフはほんの数個の塩基対の長さであり、それらの正確な配
列および位置はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの種類によって異なる（３２）。Ｓ．ピオ
ゲネスＩＩ型システムでは、ＰＡＭはＮＧＧコンセンサス配列に適合し、標的ＤＮＡ内で
、ｃｒＲＮＡ結合配列の塩基対一つ下流で生じる二つのＧ：Ｃ塩基対を含む（４）。形質
転換アッセイは、ＧＧモチーフが、細菌細胞内におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓによるプロ
トスペーサープラスミドＤＮＡ除去に必要不可欠であることを示し（図２６Ａ）、Ｓ．サ
ーモフィラスでの前の観察と一貫している（２７）。モチーフはまた、ｔｒａｃｒＲＮＡ
：ｃｒＲＮＡ誘導Ｃａｓ９によるインビトロプロトスペーサープラスミド切断にも必要不
可欠である（図２６Ｂ）。Ｃａｓ９−ｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡ複合体による標的Ｄ
ＮＡの切断におけるＰＡＭの役割を決定するために、相補もしくは非相補鎖または双方上
のＰＡＭ配列で変異を含む一連のｄｓＤＮＡ二重鎖を試験した（図１３Ａ）。これらの基
質を用いた切断アッセイは、Ｃａｓ９触媒性ＤＮＡ切断が、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシ
ステムによる相補鎖ＰＡＭ認識とは対照的に、ＤＮＡの非相補鎖上のＰＡＭ配列の変異に
特に感度が高いことを示した（１８、３４）。標的単鎖ＤＮＡの切断はＰＡＭモチーフの
変異によって影響されなかった。この観察は、ＰＡＭモチーフは標的ｄｓＤＮＡに関して
のみ必要であり、従って、二重鎖巻き戻し、鎖侵入、およびＲループ構造の形成を許可す
るために必要であり得ることを示唆する。プロトスペーサー２標的ＤＮＡに存在しない基
準ＰＡＭの存在のために選択された、異なるｃｒＲＮＡ標的ＤＮＡ対（ｃｒＲＮＡ−ｓｐ
４およびプロトスペーサー４ＤＮＡ）を使用した場合、ＰＡＭの双方のＧヌクレオチドが
効率的なＣａｓ９触媒性ＤＮＡ切断のために必要であることを発見した（図１３Ｂおよび
図２６Ｃ）。Ｃａｓ９−ｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡ複合体を正しい標的ＤＮＡ部位に
動員する際にＰＡＭが直接的な役割を果たすかどうかを決定するために、天然ゲル移動度
シフトアッセイによって、標的ＤＮＡ配列に関する複合体の結合親和性を分析した（図１
３Ｃ）。ＰＡＭ配列のいずれかのＧの変異は標的ＤＮＡのためのＣａｓ９−ｔｒａｃｒＲ
ＮＡ：ｃｒＲＮＡの親和性を実質的に低下させた。この発見は、Ｃａｓ９による標的ＤＮ
Ａ結合のＰＡＭ配列に関する役割を説明する。
図１３（Ａ）二重ＲＮＡプログラムＣａｓ９を、図１０Ｂの通り、その活性に関して試
験した。標的ＤＮＡにおけるＷＴおよび変異体ＰＡＭ配列は線で示される。（Ｂ）ＷＴお
よび変異体ＰＡＭモチーフを含むプロトスペーサー４標的ＤＮＡ二重鎖（双方の５’末端
で標識される）を、ｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡ−ｓｐ４（ヌクレオチド２３〜８９）
でプログラムされたＣａｓ９でインキュベートした。指定した時間点（分）で、一定分量
の切断反応を取り出し、図１０Ｂの通り、分析した。（Ｃ）電気泳動移動度シフトアッセ
イを、ＷＴおよび変異させたＰＡＭモチーフを含む、ＲＮＡプログラムＣａｓ９（Ｄ１０
Ａ／Ｈ８４０Ａ）およびプロトスペーサー４標的ＤＮＡ二重鎖［（Ｂ）のものと同一］を
使って実施した。Ｃａｓ９（Ｄ１０Ａ／Ｈ８４０Ａ）−ＲＮＡ複合体を１００ｐＭから１
ｍＭに滴定した。
図２６（Ａ）プロトスペーサー２プラスミドＤＮＡにおけるＰＡＭ配列の変異は細菌細
胞内ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムによるプラスミド維持の干渉を無効にする。機
能性または変異させたＰＡＭを伴う野生型プロトスペーサー２プラスミドを、図１２Ｄの
通り、野生型（株ＳＦ３７０、ＥＣ９０４とも呼ばれる）およびｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ−欠
陥変異体（ＥＣ１４７９）Ｓ．ピオゲネスに形質転換した。ＰＡＭ変異はインビボのＩＩ
型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムには許容されない。三つの生物学的複製物の平均値およ
び標準偏差が示される。（Ｂ）プロトスペーサープラスミドＤＮＡのＰＡＭ配列の変異は
、Ｃａｓ９−ｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡによる切断を無効にする。機能性または変異
させたＰＡＭを伴う野生型プロトスペーサー２プラスミドを図１０Ａの通り、Ｃａｓ９切
断に供した。ＰＡＭ変異体プラスミドはＣａｓ９−ｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡ複合体
に切断されない。（Ｃ）標準ＰＡＭ配列の変異は細菌細胞内ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ
システムによるプラスミド維持の干渉を無効にする。機能性または変異させたＰＡＭを伴
う野生型プロトスペーサー４プラスミドを、ｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡ−ｓｐ２
でプログラムされたＣａｓ９で切断した。切断反応を、ＸｍｎＩ制限エンドヌクレアーゼ
の存在下で実行し、Ｃａｓ９切断産物を二つの断片として可視化した（約１８８０および
約８００ｂｐ）。塩基対数で断片サイズが示される。
Ｃａｓ９は単一キメラＲＮＡでプログラムされ得る
ｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡ二重鎖（図１０Ｅおよび１２Ｃ）の可能性のある二次構
造の試験は、部位特異的Ｃａｓ９触媒性ＤＮＡ切断に必要な特色が単一キメラＲＮＡ内に
獲得され得ることを示した。ｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡ標的選択メカニズムは自然の
中で効率よく作用するが、単一ＲＮＡ誘導Ｃａｓ９の可能性は、プログラムＤＮＡ切断お
よびゲノム編集（図１Ａ〜Ｂ）のための可能性のある利用性のために、魅力的である。５
′末端に標的認識配列を含み、ｔｒａｃｒＲＮＡとｔｈｅｃｒＲＮＡとの間に生じる塩基
対形成相互作用を保持するヘアピン構造が続く、キメラＲＮＡの二つのバージョンを設計
した（図１４Ａ）。この単一転写は効率的にｃｒＲＮＡの３’末端をｔｒａｃｒＲＮＡの
５’末端に融合させ、それによって、Ｃａｓ９による部位特異的ＤＮＡ切断に誘導するの
に必要である二重ＲＮＡ構造を模倣する。プラスミドＤＮＡを用いる切断アッセイでは、
さらに長いキメラＲＮＡは切断ｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡ二重鎖に関して観察された
ものと類似した方法でＣａｓ９触媒性ＤＮＡ切断を誘導できたことを観察した（図１４Ａ
および図２７、ＡおよびＣ）。さらに短いキメラＲＮＡはこのアッセイでは効率的に作用
せず、ｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡ塩基対相互作用から５〜１２位置先にあるヌクレオ
チドが効率的なＣａｓ９結合および／または標的認識に重要であることを確証する。短い
ｄｓＤＮＡを基質として用いる切断アッセイでも同様の結果を得、標的ＤＮＡでの切断部
位が二重ｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡを誘導として用いて観察されたものに同一である
ことを更に示す（図１４Ｂおよび図２７、ＢおよびＣ）。最終的に、キメラＲＮＡの設計
が普遍的に適用可能かどうかを確立するために、五つの異なるキメラ誘導ＲＮＡを、緑色
蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする遺伝子の一部分を標的とするように操作し（図２
８、Ａ〜Ｃ）、インビトロでＧＦＰコード配列を保有するプラスミドに対するそれらの有
効性を試験した。五つの全ての件で、三つのキメラＲＮＡでプログラムされたＣａｓ９は
正しい標的部位でプラスミドを効率よく切断し（図１４Ｃおよび図２８Ｄ）、キメラＲＮ
Ａの合理的な設計が頑強で、原則的に、標的配列に隣接したＧＧジヌクレオチドの存在を
超えた制約をほとんど持たない任意の対象ＤＮＡ配列の標的を可能にし得ることを示す。
図１ ＤＮＡ標的化ＲＮＡは、単鎖の「ＤＮＡ標的化断片」および一連の二重鎖ＲＮＡ
を含む「タンパク質結合断片」を含む。（Ａ）ＤＮＡ標的化ＲＮＡは二つの異なるＲＮＡ
分子（「二重分子」または「２分子」ＤＮＡ標的化ＲＮＡと称される）を含み得る。二重
分子ＤＮＡ標的化ＲＮＡは「標的化ＲＮＡ」および「活性化ＲＮＡ」を含む。（Ｂ）ＤＮ
Ａ標的化ＲＮＡは単一ＲＮＡ分子（「単一分子」ＤＮＡ標的化ＲＮＡと称される）を含み
得る。単一分子ＤＮＡ標的化ＲＮＡは「リンカーヌクレオチド」を含む。
図１４（Ａ）プロトスペーサー４標的配列およびＷＴ ＰＡＭを保有するプラスミドを
ｔｒａｃｒＲＮＡ（４〜８９）：ｃｒＲＮＡ−ｓｐ４二重鎖またはＧＡＡＡテトラループ
でｃｒＲＮＡの３’末端をｔｒａｃｒＲＮＡの５’末端に結合することで構築されたイン
ビトロ転写キメラＲＮＡでプログラムされたＣａｓ９による切断に供した。切断反応をＸ
ｍｎＩでの制限マッピングによって分析した。キメラＲＮＡ ＡおよびＢの配列を、ＤＮ
Ａ標的（下線）、ｃｒＲＮＡリピート由来配列（上線）、およびｔｒａｃｒＲＮＡ由来（
下部に点線）配列で示す。（Ｂ）プロトスペーサー４ＤＮＡ二重鎖切断反応を図１０Ｂの
通り実施した。（Ｃ）ＧＦＰ遺伝子を標的とするように設計された五つのキメラＲＮＡを
用いて、Ｃａｓ９がＧＦＰ遺伝子含有プラスミドを切断するようにプログラムした。プラ
スミド切断反応を、プラスミドＤＮＡがＣａｓ９切断後にＡｖｒＩＩで制限マッピングさ
れたという点を除いて、図１２Ｅの通り実施した。
図２７（Ａ）単一のキメラＲＮＡは、同種プロトスペーサープラスミドＤＮＡ（プロト
スペーサー１およびプロトスペーサー２）のＣａｓ９触媒性切断を誘導する。切断反応を
ＸｍｎＩ制限エンドヌクレアーゼの存在下で実行し、Ｃａｓ９切断産物を二つの断片（約
１８８０および約８００ｂｐ）として可視化した。塩基対数で断片サイズを示す。（Ｂ）
単一のキメラＲＮＡは、同種プロトスペーサープラスミドＤＮＡ（プロトスペーサー１お
よびプロトスペーサー２）のＣａｓ９触媒性切断を誘導する。ヌクレオチド数で断片サイ
ズを示す。（Ｃ）実験で使用したキメラＲＮＡの模式図である。キメラＲＮＡ Ａおよび
Ｂの配列が、ｃｒＲＮＡの５’プロトスペーサーＤＮＡ標的配列（下線）、ｃｒＲＮＡの
ｔｒａｃｒＲＮＡ結合配列（上線）およびｔｒａｃｒＲＮＡ由来配列（下部に点線）と一
緒に示されている。
図２８（Ａ）ＧＦＰ発現プラスミドｐＣＦＪ１２７の模式図である。ＧＦＰオープンリ
ーディングフレームの標的部分を黒色の矢頭で示す。（Ｂ）標的領域の配列の詳細である
。キメラＲＮＡによって標的された配列は灰色傍線で示される。ＰＡＭジヌクレオチドは
枠で囲まれている。特有のＳａｌＩ制限部位は標的座位の６０ｂｐ上流に位置する。（Ｃ
）左：標的ＤＮＡ配列がそれらの隣接ＰＡＭモチーフと一緒に示される。右：キメラ誘導
ＲＮＡの配列。（Ｄ）ｐＣＦＪ１２７は、示される通り、キメラＲＮＡ ＧＦＰ１〜５で
プログラムされたＣａｓ９によって切断された。プラスミドをさらにＳａｌＩで消化し、
反応を３％アガロースゲル上の電気泳動で分析し、ＳＹＢＲ Ｓａｆｅで染色することで
可視化した。
結論
Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼが標的ＤＮＡ内で部位特異的二重鎖切断を導入するように
指示する二重ＲＮＡ構造を含むＤＮＡ干渉メカニズムが確認された。ｔｒａｃｒＲＮＡ：
ｃｒＲＮＡ誘導Ｃａｓ９タンパク質は、異なるエンドヌクレアーゼドメイン（ＨＮＨおよ
びＲｕｖＣ様ドメイン）を利用して標的ＤＮＡの二つの鎖を切断する。Ｃａｓ９による標
的認識は、ｃｒＲＮＡにおけるシード配列およびＤＮＡ標的のｃｒＲＮＡ結合領域に隣接
したＧＧジヌクレオチド含有ＰＡＭ配列の双方を必要とする。Ｃａｓ９エンドヌクレアー
ゼは、任意の対象ｄｓＤＮＡ配列を標的および切断する単一の転写物として設計された誘
導ＲＮＡでプログラムされ得ることをさらに示す。本システムは、効率的で、融通が利き
、および誘導キメラＲＮＡにおけるＤＮＡ標的化結合配列を変えることでプログラム可能
である。亜鉛フィンガーヌクレアーゼおよび転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ
はゲノム（３５〜３８）を操作するよう設計される人工酵素として著しい興味を引き付け
ている。これは、遺伝子標的およびゲノム編集適用を促すＲＮＡプログラムＣａｓ９に基
づいた代替方法論を意味する。
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実施例２：ヒト細胞でのＲＮＡプログラムゲノム編集
下で提供されるデータは、Ｃａｓ９がヒト細胞の核に発現および局在し得るここと、お
よびＣａｓ９がヒト細胞内で単一誘導ＲＮＡ（「ｓｇＲＮＡ」；Ｃａｓ９結合およびＤＮ
Ａ標的化部位認識の双方に必要な特色を含む）と集合することを示す。これら複合体は、
二重鎖切断を形成し得、Ｃａｓ９およびｓｇＲＮＡの双方を必要とする活性である、ｓｇ
ＲＮＡ配列に相補的な部位におけるゲノムＤＮＡにおける非相同性末端結合（ＮＨＥＪ）
修復を刺激し得る。ＲＮＡ配列の３’末端における伸展は、生細胞のＤＮＡ標的活性を強
化する。さらに、形質移入した細胞の抽出物を用いた実験は、ｓｇＲＮＡのＣａｓ９への
集合はＣａｓ９媒介性ＤＮＡ切断に関して制限因子であることを示す。これらの結果は、
ＲＮＡプログラムゲノム編集が生細胞およびインビボで作用することを示す。
材料および方法
プラスミド設計および構築
ＨＡエピトープ（アミノ酸配列ＤＡＹＰＹＤＶＰＤＹＡＳＬ（配列番号２７４））、核
局在シグナル（アミノ酸配列ＰＫＫＫＲＫＶＥＤＰＫＫＫＲＫＶＤ（配列番号２７５））
と融合した、ストレプトコッカス・ピオゲネスＣａｓ９（残基１〜１３６８）をコードす
る配列をヒト発現のためにコドン最適化し、ＧｅｎｅＡｒｔで合成した。ＤＮＡ配列は配
列番号２７６で、タンパク質配列は配列番号２７７である。ライゲーション独立クローニ
ング（ＬＩＣ）を使用してこの配列をｐｃＤＮＡ３．１由来ＧＦＰおよびｍＣｈｅｒｒｙ
ＬＩＣベクター（ベクター６Ｄおよび６ＢはそれぞれＵＣバークレー・マクロラボ（ＵＣ
Ｂｅｒｋｅｌｅｙ ＭａｃｒｏＬａｂ）から取得）に挿入し、ＣＭＶプロモーターの制
御下で発現されるＣａｓ９−ＨＡ−ＮＬＳ−ＧＦＰおよびＣａｓ９−ＨＡ−ＮＬＳ−ｍＣ
ｈｅｒｒｙ融合をもたらした。誘導ｓｇＲＮＡを、発現ベクターｐＳｉｌｅｎｃｅｒ２．
１−Ｕ６ｐｕｒｏ（ライフ・テクノロジー社（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））
およびｐＳｕｐｅｒ（オリゴエンジン社（Ｏｌｉｇｏｅｎｇｉｎｅ））を用いて発現させ
た。相補オリゴヌクレオチドをアニールしてＲＮＡコードＤＮＡ配列を形成し、ｐＳｉｌ
ｅｎｃｅｒ２．１−Ｕ６ｐｕｒｏのＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位とｐＳｕｐｅｒ
のＢｇｌＩＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位との間でアニールしたＤＮＡ断片をライゲーショ
ンすることで、ＲＮＡ発現構築物を作成した。
細胞培養条件およびＤＮＡ形質移入
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、５％ＣＯ２を伴う３７℃の加湿インキュベーター内で１０％ウ
シ胎仔血清（ＦＢＳ）を添加したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）で維持した。
推奨プロトコルで、Ｘ−ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ ＤＮＡ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅ
ａｇｅｎｔ（ロシュ社）またはＴｕｒｂｏｆｅｃｔ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａ
ｇｅｎｔ（サーモ・サイエンティフィック社（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））の
いずれかを用いて、細胞を一過性的にプラスミドＤＮＡで形質移入した。手短に、０．５
μｇのＣａｓ９発現プラスミドおよび２．０μｇのＲＮＡ発現プラスミドを用いて、６ウ
ェルプレート内で、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を６０〜８０％培養密度で形質移入した。形質移
入効率は、蛍光顕微鏡で観察されたＧＦＰ陽性細胞の割合をもとに、Ｔｕｂｏｆｅｃｔに
関しては３０〜５０％（図２９Ｅおよび３７Ａ〜Ｂ）、Ｘ−ｔｒｅｍｅｇｅｎｅに関して
は８０〜９０％（図３１Ｂ）であると予想された。形質移入から４８時間後、細胞をリン
酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、２５０μｌの溶解緩衝液（２０ｍＭのＨｅｐｅｓ ｐ
Ｈ７．５、１００ｍＭの塩化カリウム（ＫＣｌ）、５ｍＭの塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ
２）、１ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）、５％グリセロール、０．１％Ｔｒｉｔｏ
ｎ Ｘ−１００、ロシュプロテアーゼインヒビターカクテルが添加されている）を適用す
ることで溶解し、次いで、４℃で１０分間振動させた。得られた細胞可溶化物をさらなる
分析のために一定分量に分割した。製造業者のプロトコルに従ってＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏ
ｏｄおよびＴｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（キアゲン社）を使用してゲノムＤＮＡを２００μｌの
細胞可溶化物から単離した。
Ｃａｓ９発現のウェスターンブロット分析
Ｃａｓ９−ＨＡ−ＮＬＳ−ＧＦＰ発現プラスミドで形質移入したＨＥＫ２９３Ｔを、上
述の通り形質移入の４８時間後に回収および溶解した。５ｕｌの可溶化物を１０％ＳＤＳ
ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動、ＰＶＤＦ膜上にブロットし、ＨＲＰ結合抗ＨＡ抗
体（シグマ社（Ｓｉｇｍａ））、１倍ＰＢＳ中１：１０００希釈）でプローブした。
Ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイ
Ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイを以前に記載された通り実施した［１０、１２、１３］。手
短に、ヒトクラスリン軽鎖Ａ（ＣＬＴＡ）座位を、高忠実度ポリメラーゼ、Ｈｅｒｃｕｌ
ａｓｅ ＩＩ Ｆｕｓｉｏｎ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（アジレントテクノロジー
社（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））並びにフォワードプライマー５’−
ＧＣＡＧＣＡＧＡＡＧＡＡＧＣＣＴＴＴＧＴ−３’（配列番号／／）およびリバースプラ
イマー５’−ＴＴＣＣＴＣＣＴＣＴＣＣＣＴＣＣＴＣＴＣ−３’（配列番号／／）を用い
て、２００ｎｇのゲノムＤＮＡからＰＣＲで増幅した。３００ｎｇの３６０ｂｐ単位複製
配列を次いで、９５℃まで加熱することで変性し、ヒートブロックを用いてゆっくりプレ
アニールし、無作為に野生型および変異体ＤＮＡ鎖を再びハイブリダズした。試料を次い
でＣｅｌ−１ヌクレアーゼ（Ｓｕｒｖｅｙｏｒ Ｋｉｔ、トランスジェノミック社（Ｔｒ
ａｎｓｇｅｎｏｍｉｃ））で４２℃にて１時間インキュベートした。Ｃｅｌ−１は、ミス
マッチを含むＤＮＡらせん体（野生型：変異体ハイブリダイゼーション）を認識および切
断する。Ｃｅｌ−１ヌクレアーゼ分解産物を１０％アクリルアミドゲル上で分離し、ＳＹ
ＢＲ Ｓａｆｅ（ライフ・テクノロジー社）で染色することで可視化した。ＩｍａｇｅＬ
ａｂソフトウェア（バイオラド社）を用いて切断バンドの定量化を実施した。切断産物の
平均強度（１６０〜２００ｂｐ）を非切断ＰＣＲ産物の強度（３６０ｂｐ）および切断産
物の合計で割ることで、切断パーセントを決定した。
インビトロ転写
組み換えＴ７ ＲＮＡポリメラーゼおよび相補的な合成オリゴヌクレオチドを以前に記
載された通りアニールすることで作成したＤＮＡ鋳型を用いて、誘導ＲＮＡをインビトロ
で転写した［１４］。７Ｍのウレア変性アクリルアミドゲル上での電気泳動によってＲＮ
Ａを精製し、エタノール沈殿し、ＤＥＰＣ処理水に溶解した。
ノーザンブロット分析
ｍｉｒＶａｎａ小ＲＮＡ単離キット（アンビオン社（Ａｍｂｉｏｎ））を用いて、ＲＮ
ＡをＨＥＫ２９３Ｔ細胞から精製した。各試料のために、ＲＮＡ添加緩衝液（０．５倍Ｔ
ＢＥ（ｐＨ７．５）、０．５ｍｇ／ｍｌブロモフェノールブルー、０．５ｍｇキシレンシ
アノールおよび４７％ホルムアミド）中７０℃にて１０分間の変性後、８００ｎｇのＲＮ
Ａを１０％ウレア−ＰＡＧＥゲル上で分離した。ブロモフェノールブルー染料がゲルの底
に到達するまで０．５倍ＴＢＥ緩衝液中１０Ｗで電気泳動した後、試料を、０．５倍ＴＢ
Ｅ中で１．５時間、２０ボルトでＮｙｔｒａｎ膜上にエレクトロブロットした。移動した
ＲＮＡをＵＶ−Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｒ（ストラテジーン社（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ））
中Ｎｙｔｒａｎ膜上で架橋結合させ、４０％ホルムアミド、５倍ＳＳＣ、３倍Ｄｅｒｎｈ
ａｒｄｔ’ｓ（フィコール、ポリビニルプロリドンおよびＢＳＡをそれぞれ０．１％）お
よび２００μｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡを含む緩衝液中で４５℃にて３時間、プレハイブ
リダイズした。プレハイブリダイズした膜を、５’−３２Ｐ標識アンチセンスＤＮＡオリ
ゴプローブが１００万ｃｐｍ／ｍｌで添加されたプレハイブリダイゼーション緩衝液中で
一晩インキュベートした。ＳＳＣ緩衝液中での複数回の洗浄後（最終洗浄は０．２倍ＳＣ
Ｃ中）、膜をホスフォイメージャーで撮像した。
インビトロ切断アッセイ
細胞可溶化物を上述した通りに調製し、ＣＬＴＡ−ＲＦＰドナープラスミドでインキュ
ベートした［１０］。切断反応は２０μｌの合計体積で実行され、１０μｌ可溶化物、２
μｌの５倍切断緩衝液（１００ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、５００ｍＭのＫＣｌ、２
５ｍＭのＭｇＣｌ２、５ｍＭのＤＴＴ、２５％グリセロール）および３００ｎｇのプラス
ミドを含んでいた。指定された箇所で、反応に１０ｐｍｏｌのインビトロで転写されたＣ
ＬＴＡ１ ｓｇＲＮＡを添加した。反応を３７℃で１時間インキュベートし、続いて１０
ＵのＸｈｏＩ（ＮＥＢ）でさらに３０分間３７℃で消化した。反応をＰｒｏｔｅｉｎａｓ
ｅＫ（サーモ・サイエンティフィック社）によって停止し、３７℃で１５分間インキュベ
ートした。切断産物を１％アガロースゲル上の電気泳動によって分析し、ＳＹＢＲ Ｓａ
ｆｅで染色した。約２２３０および約３１００ｂｐの断片の存在がＣａｓ９媒介性切断を
示す。
結果
Ｃａｓ９がゲノムＤＮＡを生細胞内で切断するようにプログラムされ得るのかどうかを
試験するために、Ｃａｓ９を、ヒトクラスリン軽鎖（ＣＬＴＡ）遺伝子を標的とするよう
設計されたｓｇＲＮＡと一緒に同時発現させた。ＣＬＴＡゲノム座位は以前からＺＦＮを
用いて標的および編集されてきた［１０］。我々はまずヒトＨＥＫ２９３Ｔ細胞内のスト
レプトコッカス・ピオゲネスＣａｓ９タンパク質およびｓｇＲＮＡのヒトコドン最適化バ
ージョンの発現を試験した。１６０ｋＤａのＣａｓ９タンパク質を、Ｃａｓ９のＣ末端に
接合されたＨＡエピトープ、核局在シグナル（ＮＬＳ）および緑色蛍光タンパク質（ＧＦ
Ｐ）を有する融合タンパク質として発現した（図２９Ａ）。ＧＦＰ融合Ｃａｓ９をコード
するベクターで形質移入した細胞の分析は、豊富なＣａｓ９発現および核局在を示した（
図２９Ｂ）。Ｃａｓ９タンパク質はこれらの細胞の抽出物内でほぼ完全に発現されること
がウェスターンブロットで確認された（図２９Ａ）。Ｃａｓ９をプログラムするために、
標的ＤＮＡ配列に相補的である５’末端２０ヌクレオチド配列およびＣａｓ９結合に必要
な４２ヌクレオチドの３’末端ステムループ構造を有するｓｇＲＮＡを発現した（図２９
Ｃ）。この３’末端配列はインビトロでＣａｓ９をプログラムするために以前から使用さ
れる最小ステムループ構造に対応する［８］。このｓｇＲＮＡ発現は、ヒトＵ６（ＲＮＡ
ポリメラーゼＩＩＩ）プロモーターによって助長された［１１］。Ｕ６プロモーター助長
ｓｇＲＮＡプラスミド発現ベクターで形質移入した細胞から抽出したＲＮＡのノーザンブ
ロット分析によって、ｓｇＲＮＡは確実に発現されること、および、それらの安定性はＣ
ａｓ９の存在によって強化されることが示された（図２９Ｄ）。
図２９は、ヒト細胞のＣａｓ９および誘導ＲＮＡが標的座位で二重鎖ＤＮＡ切断をもた
らすことを示す。（Ａ）上；Ｃａｓ９−ＨＡ−ＮＬＳ−ＧＦＰ発現構築物の模式図。下；
Ｃａｓ９発現プラスミドで形質移入したＨＥＫ２９３Ｔ細胞の可溶化物を、抗ＨＡ抗体を
用いてウェスターンブロットによって分析した。（Ｂ）Ｃａｓ９−ＨＡ−ＮＬＳ−ＧＦＰ
を発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞の蛍光顕微鏡観察。（Ｃ）ヒトＣＬＴＡ座位を標的とする
単一誘導ＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ、すなわち、単一分子ＤＮＡ標的化ＲＮＡ）の設計。上；ヒ
トＣＬＴＡ遺伝子のエキソン７におけるｓｇＲＮＡ標的部位の模式図。ＣＬＴＡ１ ｓｇ
ＲＮＡの誘導断片にハイブリダイズする標的配列は「ＣＬＴＡ１ ｓｇＲＮＡ」として示
される。ＧＧジヌクレオチドプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）は矢印で示される
。黒色の線は対照ＺＦＮタンパク質のＤＮＡ結合領域を意味する。ＣＬＴＡオープンリー
ディングフレームの翻訳終結コドンは参照のために点線で示される。中央：ｓｇＲＮＡ発
現構築物の模式図。ＲＮＡを、Ｕ６ＰｏｌＩＩＩプロモーターおよびＰｏｌ ＩＩＩ転写
ターミネーターシグナルとして作用するポリ（Ｔ）トラクトの制御下で発現する。下：Ｃ
ａｓ９による標的ＤＮＡのｓｇＲＮＡ誘導切断。ｓｇＲＮＡは、２０ｎｔの５’末端誘導
断片、続いて、Ｃａｓ９結合に必要な４２ｎｔのステムループ構造から成る。二つの標的
ＤＮＡ鎖のＣａｓ９媒介性切断は、標的ＤＮＡの巻き戻し、および、ｓｇＲＮＡの誘導断
片と標的ＤＮＡとの間の二重鎖形成の際に生じる。これは標的ＤＮＡの標的配列下流のＰ
ＡＭモチーフ（使用されているＣａｓ９に対して適切、例えば、ＧＧジヌクレオチド、上
記実施例１を参照）の存在に依存する。標的配列が上の模式図に対して上下逆であること
に留意されたい。（Ｄ）ＨＥＫ２３９Ｔ細胞におけるｓｇＲＮＡ発現のノーザンブロット
分析。（Ｅ）Ｃａｓ９および／またはＣＬＴＡ ｓｇＲＮＡを発現するＨＥＫ２９３Ｔ細
胞から単離したゲノムＤＮＡのＳｕｒｖｅｙｏｒヌクレアーゼアッセイ。ＣＬＴＡ座位を
標的とするために以前使用されたＺＦＮ構築物［１０］を、非相同性末端結合によるＤＳ
Ｂ誘導性ＤＮＡ修復を検知するための陽性対照として使用した。
次に部位特異的ＤＳＢがＣａｓ９−ＨＡ−ＮＬＳ−ｍＣｈｅｒｒｙおよびＣＬＴＡ１
ｓｇＲＮＡで形質移入されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞内で生成するのかどうかを調査した。こ
れを行うために、Ｓｕｒｖｅｙｏｒヌクレアーゼアッセイを用いて、ＤＳＢ誘導性ＮＨＥ
Ｊによる不完全修復に起因する座位における小さな挿入および欠失を調べた［１２］。Ｃ
ａｓ９：ｓｇＲＮＡに標的されたゲノムＤＮＡの領域をＰＣＲで増幅し、得られる産物を
変性および再度アニールする。再度ハイブリダイズしたＰＣＲ産物をミスマッチ認識エン
ドヌクレアーゼＣｅｌ−１でインキュベートし、アクリルアミドゲル上で分離し、Ｃｅｌ
−１切断バンドを識別する。ＮＨＥＪによるＤＮＡ修復が一般的にＤＳＢによって誘導さ
れる通り、Ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイにおける陽性シグナルは、ゲノムＤＮＡ切断が生じ
たことを示す。このアッセイを用いて、ＣＬＴＡ１ ｓｇＲＮＡによって標的された位置
のＣＬＴＡ座位の切断を検知した（図２９Ｅ）。ＣＬＴＡ座位での隣接部位を標的とする
１対のＺＦＮはこれらの実験にて陽性対照を提供した［１０］。
Ｃａｓ９またはｓｇＲＮＡ発現のいずれかが観察したゲノム編集反応において制限因子
かどうかを決定するために、形質移入した細胞から調製した可溶化物を、ＣＬＴＡ１ ｓ
ｇＲＮＡに標的されたＣＬＴＡ遺伝子の断片を保有するプラスミドＤＮＡでインキュベー
トした。Ｃａｓ９−ＨＡ−ＮＬＳ−ＧＦＰ発現ベクターのみで形質移入した細胞から調製
した可溶化物とのインキュベーションの際には、プラスミドＤＮＡ切断は観察されず、Ｓ
ｕｒｖｅｙｏｒアッセイ結果と一貫していた。しかし、可溶化物にインビトロ転写ＣＬＴ
Ａ１ ｓｇＲＮＡが添加された際は、強固なプラスミド切断が検知された（図３０Ａ）。
さらに、Ｃａｓ９およびｓｇＲＮＡ発現ベクターの双方で形質移入した細胞から調製され
た可溶化物はプラスミド切断を支援する一方で、ｓｇＲＮＡをコードするベクターのみで
形質移入した細胞からの可溶化物はそうでなかった（図３０Ａ）。これらの結果は、ヒト
細胞におけるＣａｓ９の機能のための制限因子はｓｇＲＮＡとの集合であり得ることを暗
示する。添加外来性ｓｇＲＮＡの存在下および不在下で、前述同様に形質移入した細胞か
らの可溶化物におけるプラスミド切断を分析することで、この可能性を直接試験した。特
に、外来性ｓｇＲＮＡをＣａｓ９およびｓｇＲＮＡ発現ベクターの双方で形質移入した細
胞からの可溶化物に添加した場合、ＤＮＡ切断活性において実質的な増加が観察された（
図３０Ｂ）。この結果は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＣａｓ９機能のための制限因子は
ｓｇＲＮＡの発現またはそのＣａｓ９への添加であることを示す。
図３０は、細胞可溶化物が、活性Ｃａｓ９：ｓｇＲＮＡを含み、部位特異的ＤＮＡ切断
を支援することを示す。（Ａ）左に示される、プラスミド（複数可）で形質移入した細胞
からの細胞可溶化物を、ＰＡＭおよびＣＬＴＡ１ ｓｇＲＮＡに相補的である標的配列を
含むプラスミドＤＮＡでインキュベートした；指定された場合、反応に１０ｐｍｏｌのイ
ンビトロ転写ＣＬＴＡ１ ｓｇＲＮＡを添加した；ＸｈｏＩとの第２切断は、Ｃａｓ９媒
介性切断を示す約２２３０および約３１００ｂｐ断片の断片を生成した。ＺＦＮ発現構築
物で形質移入された細胞からの可溶化物を用いた対照反応は、かすかに異なるサイズの断
片を示し、ＣＬＴＡ１標的部位に対するＺＦＮ標的部位のオフセットを反映する。（Ｂ）
Ｃａｓ９−ＧＦＰ発現プラスミド、および、指定された場合、ＣＬＴＡ１ ｓｇＲＮＡ発
現プラスミドで形質移入した細胞からの可溶化物を、インビトロで転写されたＣＬＴＡ１
ｓｇＲＮＡの不在または存在下で、（Ａ）の通りに標的プラスミドＤＮＡでインキュベ
ートした。
生細胞内でのＣａｓ９：ｓｇＲＮＡ集合を強化する手段として、次に、誘導ＲＮＡの推
定Ｃａｓ９結合領域を伸展する効果を試験した。ＣＬＴＡ１ ｓｇＲＮＡの二つの新しい
バージョンを、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとの間の塩基対形成相互作用を模倣する６
または１２の塩基対をらせん体にさらに含むように設計した（図３１Ａ）。さらに、Ｓ．
ピオゲネスｔｒａｃｒＲＮＡの天然配列を基に、誘導ＲＮＡの３’末端を五つのヌクレオ
チドで伸展した［９］。Ｕ６またはＨ１ Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターのいずれかの制御
下でこれらの３’伸長ｓｇＲＮＡをコードするベクターを、Ｃａｓ９−ＨＡ−ＮＬＳ−Ｇ
ＦＰ発現ベクターと一緒に細胞に形質移入し、部位特異的ゲノム切断を、Ｓｕｒｖｅｙｏ
ｒアッセイを用いて試験した（図３１Ｂ）。結果によって、切断は、Ｃａｓ９およびＣＬ
ＴＡ１ ｓｇＲＮＡの双方を必要とするが、Ｃａｓ９またはｓｇＲＮＡのいずれかが単独
で発現された場合には起こらなかったことが確認された。さらに、Ｃｅｌ−１ヌクレアー
ゼ切断によって検知された通り、ＮＨＥＪの実質的に増大した頻度を観察し、一方で、対
照ＺＦＮ対で得られたＮＨＥＪ変異誘発の頻度は大きく変わらなかった。
図３１は、ｓｇＲＮＡ構築物の３’伸展が部位特異的ＮＨＥＪ媒介性変異誘発を強化す
ることを示す。（Ａ）ＣＬＴＡ１ ｓｇＲＮＡ発現のための構築物（上）を、本来のＣａ
ｓ９結合配列（ｖ１．０）または４個の塩基対で伸展されたｄｓＲＮＡ二重鎖（ｖ２．１
）もしくは１０個の塩基対で伸展されたｄｓＲＮＡ二重鎖（ｖ２．２）を含む転写物を生
成するように設計した。（Ｂ）Ｃａｓ９および／またはＣＬＴＡ ｓｇＲＮＡ ｖ１．０
、ｖ２．１またはｖ２．２を発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞から単離されたゲノムＤＮＡの
Ｓｕｒｖｅｙｏｒヌクレアーゼアッセイ。ＣＬＴＡ座位を標的とするために以前使用され
たＺＦＮ構築物［１０］を、非相同性末端結合によるＤＳＢ誘導性ＤＮＡ修復を検知する
ための陽性対照として使用した。
こうして、多種多様のゲノム編集適用のための容易な分子ツールとしてＣａｓ９を利用
するためのフレームワークが結果によって提供される。このシステムの強力な特色は、単
一座位を標的とする効率を増大すること、または複数の座位を同時に標的とする手段とし
てのいずれかのために、同一細胞内でＣａｓ９を複数のｓｇＲＮＡでプログラムする可能
性である。このような戦略は、ゲノム全体での実験、および、多重遺伝子性疾患モデルの
発達といった大規模な研究への尽力において、幅広い適用を見出す。
実施例３：ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ免疫システムのｔｒａｃｒＲＮＡおよびＣａｓ９
ファミリー
ＩＩ型システムの特徴的なタンパク質であるＣａｓ９と相似である配列をスクリーニン
グすることで、一般で入手可能な細菌ゲノムに現在存在する全ての推定ＩＩ型ＣＲＩＳＰ
Ｒ−Ｃａｓ座位を調査した。識別されるＣａｓ９オルソログの多重配列アラインメントか
ら、系統樹を作成した。ＣＲＩＳＰＲリピート長および関連ＩＩ型システムのｃａｓオペ
ロンの遺伝子構成を、異なるＣａｓ９サブクラスター内で分析した。ＩＩ型座位の細分類
を提唱し、７５個の代表的なＣａｓ９オルソログの選択に基づいて、さらに亜群に分割し
た。次いで、主に、ＣＲＩＳＰＲリピート配列を取り出し、選択したＩＩ型座位のｃａｓ
遺伝子およびＣＲＩＳＰＲアレイ内または近辺の抗リピートをスクリーニングすることで
、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列を予想した。選ばれたｔｒａｃｒＲＮＡオルソログの配列および
予想構造の比較分析を実施した。最後に、五つの細菌種からのｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃ
ｒＲＮＡの発現およびプロセシングプロファイルを決定した。
材料および方法
細菌株および培養条件
次にあげる培養地を使用してプレートで細菌を成長させた：Ｓ．ミュータンス（ＵＡ１
５９）に関しては３％羊血液を添加したＴＳＡ（トリプチケースソイ寒天、Ｔｒｙｐｔｉ
ｃａｓｅ（商標）ＳｏｙＡｇａｒ（ＴＳＡ ＩＩ）ＢＤ ＢＢＬ、ベクトンディッキンソ
ン社）、および、Ｌ．イノキュア（Ｃｌｉｐ１１２６２）に関してはＢＨＩ（脳心臓浸出
物、ＢＤ Ｂａｃｔｏ（商標）Ｂｒａｉｎ Ｈｅａｒｔ Ｉｎｆｕｓｉｏｎ、ベクトンデ
ィッキンソン社）寒天。液体培養で培養した場合、Ｓ．ミュータンスに関してはＴＨＹ培
地（０．２％酵母エキス（Ｓｅｒｖａｂａｃｔｅｒ（登録商標））が添加されたトッド・
ヒューイット培地（ＴＨＢ、Ｂａｃｔｏ、ベクトンディッキンソン社））、Ｌ．イノキュ
アに関してはＢＨＩブロス、Ｎ．メニンギティディス（Ａ Ｚ２４９１）に関しては１％
ビタミン混合ＶＸを含むＢＨＩ液体培地（Ｄｉｆｃｏ、ベクトンディッキンソン社）、Ｃ
．ジェジュニ（ＮＣＴＣ１１１６８；ＡＴＣＣ７００８１９）に関しては１％ビタミン混
合ＶＸを含むＭＨ（Ｍｕｅｌｌｅｒ Ｈｉｎｔｏｎ Ｂｒｏｔｈ、オキソイド社）ブロス
、および、Ｆ．ｎｏｖｉｃｉｄａ（Ｕ１１２）に関してはＴＳＢ（Ｔｒｙｐｔｉｃ Ｓｏ
ｙ Ｂｒｏｔｈ、ＢＤ ＢＢＬ（商標）Ｔｒｙｐｔｉｃａｓｅ（商標）Ｓｏｙ Ｂｒｏｔ
ｈ）を使用した。Ｓ．ミュータンスを３７℃、５％ＣＯ２で振動無しでインキュベートし
た。Ｌ．イノキュア、Ｎ．メニンギティディスおよびＦ．ノビシダの株を、振動を伴って
好気的に３７℃で成長させた。キャンピゲン（ｃａｍｐｙｇｅｎ）（オキソイド社）雰囲
気を用いて、３７℃の微好気性菌条件でＣ．ジェジュニを成長させた。細菌成長に続いて
、マイクロプレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ ＰｏｗｅｒＷａｖｅ（商標））を用いて定
期的な時間間隔で６２０ｎｍ（ＯＤ６２０ｎｍ）の培養の光学濃度を観測した。
細菌の小さいＲＮＡライブラリーのシークエンシング
Ｃ．ジェジュニＮＣＴＣ１１１６８（ＡＴＣＣ７００８１９）、Ｆ．ノビシダＵ１１２
、Ｌ．イノキュアＣｌｉｐ１１２６２、Ｎ．メニンギティディスＡ Ｚ２４９１およびＳ
．ミュータンスＵＡ１５９を、半対数成長期まで培養し、全ＲＮＡをＴＲＩｚｏｌ（シグ
マ・アルドリッチ社）で抽出した。各株からの１０μｇの全ＲＮＡをＴＵＲＢＯ（商標）
ＤＮａｓｅ（アンビオン社）で処理して、いかなる残基ゲノムＤＮＡも除去した。グラム
陽性またはグラム陰性細菌（エピセンター社）のために、製造業者の説明に従い、Ｒｉｂ
ｏ−Ｚｅｒｏ（商標）ｒＲＮＡ Ｒｅｍｏｖａｌ Ｋｉｔｓ（登録商標）を使用すること
で、リボソームＲＮＡを除去した。ＲＮＡ Ｃｌｅａｎ＆Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（商
標）５キット（ザイモ・リサーチ社（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ））での精製に続いて
、製造業者の説明に従ってＳｃｒｉｐｔＭｉｎｅｒ（商標）Ｓｍａｌｌ ＲＮＡ−Ｓｅｑ
Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ、Ｉｌｌｕｍ
ｉｎａ（登録商標）適合性）を使用してライブラリーを調製した。ＲＮＡをＴｏｂａｃｃ
ｏ Ａｃｉｄ Ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＴＡＰ）（エピセンター社）でプロセ
シングした。引き続きＲＮＡ精製のためにＲＮＡ Ｃｌｅａｎ＆Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏ
ｒ（商標）５（ザイモ・リサーチ社）のカラムを使用し、ＰＣＲ増幅のためにＰｈｕｓｉ
ｏｎ（登録商標）Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ニュー
・イングランド・バイオラボ社）を使用した。特定のユーザー定義バーコードを各ライブ
ラリーに付け加え（ＲＮＡ−Ｓｅｑ Ｂａｒｃｏｄｅ Ｐｒｉｍｅｒｓ（Ｉｌｌｕｍｉｎ
ａ（登録商標）適合性）エピセンター社）、オーストリア、ウィーン、ウィーンバイオセ
ンター（ＶｉｅｎｎａＢｉｏｃｅｎｔｅｒ）のＮｅｘｔ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｓｅｑ
ｕｅｎｃｉｎｇ（ＣＳＦ ＮＧＳユニット；「ａｃ．ａｔ」が続く、ウェブ「ｃｓｆ．」
上）設備で試料をシークエンシングした（イルミナ単一末端シークエンシング（ｓｉｎｇ
ｌｅ ｅｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）。
ｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡシークエンスデータの分析
イルミナ２ｂａｍツールを使用してＲＮＡシークエンスリードを分割し、（ｉ）イルミ
ナアダプター配列（カットアダプト（ｃｕｔａｄａｐｔ）１．０）の除去および（ｉｉ）
３末端の１５ｎｔの除去によって調節してリードの質を向上させた。１５ｎｔよりも短い
リードを除去した後、Ｂｏｗｔｉｅを使用して、二つのミスマッチを許容することでｃＤ
ＮＡリードをそれぞれのゲノムと配列した：Ｃ．ジェジュニ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＮＣ＿０
０２１６３）、Ｆ．ノビシダ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＮＣ＿００８６０１）、Ｎ．メニンギテ
ィディス（ＧｅｎＢａｎｋ：ＮＣ＿００３１１６）、Ｌ．イノキュア（ＧｅｎＢａｎｋ：
ＮＣ＿００３２１２）およびＳ．ミュータンス（ＧｅｎＢａｎｋ：ＮＣ＿００４３５０）
。ＢＥＤＴｏｏｌｓ−バージョン２．１５．０を使用して、双方のＤＮＡ鎖に関して別々
に各ヌクレオチド位置でリードの被覆度を算出した。１００万あたりのリード（ｒｐｍ）
の被覆度を含む標準化されたウィグル（ｗｉｇｇｌｅ）ファイルを作成し、Ｉｎｔｅｇｒ
ａｔｉｖｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｖｉｅｗｅｒ（ＩＧＶ）ツール（“ｗｗｗ．”続いて、
“ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｏｒｇ／ｉｇｖ／”）（図３６）を用いて可視化した
。ＳＡＭＴｏｏｌｓ ｆｌａｇｓｔａｔ８０を用いて、マッピングされたリードの割合を
、Ｃ．ジェジュニに関しては９９１４１８４リード、Ｆ．ノビシダに関しては４８２０５
リード、Ｎ．メニンギティディスに関しては１３１１００８７リード、Ｌ．イノキュアに
関しては１６１８６５リードおよびＳ．ミュータンスに関しては１５４２２３９リードの
マッピングされた合計を元に算出した。各単一ヌクレオチド位置に始まり（５’）、終わ
る（３’）リードを複数含むファイルを作成し、ＩＧＶで可視化した。各ｔｒａｃｒＲＮ
ＡオルソログおよびｃｒＲＮＡに関しては、取り出されたリードの合計を、ＳＡＭツール
を用いて算出した。
Ｃａｓ９配列分析、多重配列アラインメントおよび誘導ツリー作成
位置特異的反復（Ｐｏｓｉｔｉｏｎ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｉｔｅｒａｔｅｄ（ＰＳＩ）
−ＢＬＡＳＴプログラムを用いて、ＮＣＢＩ非重複データベースにおけるＣａｓ９ファミ
リーのホモログを取り出した。８００個のアミノ酸よりも短い配列は廃棄した。０．８の
長さ範囲カットオフおよび０．８のスコア範囲閾値（アラインメントの長さで割られるビ
ットスコア）でセットアップしたＢＬＡＳＴＣｌｕｓｔプログラムを使用して、残った配
列をクラスター化した（図３８）。この手順で、７８個のクラスター（そのうち４８個は
１個の配列でしか表されない）を作成した。１個（または、めったにないが数個の代表例
）を各クラスターから選択し、これらの配列のための多重アラインメントを、デフォルト
パラメーターのＭＵＳＣＬＥプログラムを用いて作成し、続いてＰＳＩ−ＢＬＡＳＴおよ
びＨＨｐｒｅｄプログラムを用いて取得された局所アラインメントを基準に手動で校正を
行った。さらに数個の配列はアラインメント不可能であり、また、最終アラインメントか
ら除外された。最大の可能性を持つツリー復元のために、デフォルトパラメーターのＦａ
ｓｔＴｒｅｅプログラムを使用して、２７２個の有益な位置を伴う、確信的に並べられた
ブロックを使用した：ＪＴＴ進化型モデル、２０個の速度分類を伴う分離ガンマモデル。
同一のプログラムを使用してブートストラップ値を算出した。
図３８は、ＢＬＡＳＴｃｌｕｓｔクラスター化プログラムに従って分類された配列を示
す。８００個のアミノ酸よりも長い配列のみがＢＬＡＳＴｃｌｕｓｔ分析のために選択さ
れた（材料および方法を参照）。ｃａｓ９オルソログ遺伝子を保有する代表的な株を使用
した。いくつかの配列はクラスター化しなかったが、それらのすぐ付近にある保存された
モチーフおよび／または他のｃａｓ遺伝子の存在によりＣａｓ９オルソログ配列として確
認された。
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ座位の分析
ＣＲＩＳＰＲリピート配列をＣＲＩＳＰＲｄｂデータベースから取り出し、または、Ｃ
ＲＩＳＰＲＦｉｎｄｅｒツール（Grissa Iet al., BMC Bioinformatics 2007; 8: 172; G
rissa I et al., Nucleic Acids Res 2007）を用いて予想した。ｃａｓ遺伝子を、ＢＬＡ
ＳＴｐアルゴリズムを用いて識別し、および／または、ＫＥＧＧデータベース（「ｗｗｗ
．」、続いてｋｅｇｇ．ｊｐ／であるウェブ上）で確認した。
ｔｒａｃｒＲＮＡオルソログのインシリコ予想および分析
Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ（登録商標）ソフトウェア（インビトロジェン社）を用いて、最
大１５個のミスマッチを許容するそれぞれのゲノムの双方の鎖上のリピートスペーサーア
レイに属さない、追加の変性リピート配列をスクリーニングすることで、推定抗リピート
を識別した。転写プロモーターおよびｒｈｏ独立ターミネーターを、ＢＤＧＰ Ｎｅｕｒ
ａｌ Ｎｅｔｗｏｒｋ Ｐｒｏｍｏｔｏｒ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎプログラム（「ｗｗｗ
．」、続いてｆｒｕｉｔｆｌｙ．ｏｒｇ／ｓｅｑ＿ｔｏｏｌｓ／ｐｒｏｍｏｔｅｒ．ｈｔ
ｍｌ）およびＴｒａｎｓＴｅｒｍＨＰソフトウェアをそれぞれ用いて予想した。デフォル
トパラメーターのＭＵＳＣＬＥプログラムを用いて、多重配列アラインメントを実施した
。ウィーンＲＮＡパッケージ２．０のＲＮＡａｌｉｆｏｌｄアルゴリズムを用いて、保さ
れた構造モチーフの存在に関してアラインメントを分析した。
結果
ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは細菌内で広範囲にわたる。
ｔｒａｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡおよびリピートスペーサーアレイに加え、ＩＩ型
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ座位は一般的に、オペロンで組織化される３〜４個のｃａｓ遺伝子
から構成される（図３２Ａ〜Ｂ）。Ｃａｓ９はＩＩ型に特徴的なシグネチャータンパク質
であり、発現および干渉の工程に関わる。Ｃａｓ１およびＣａｓ２は、全てのＣＲＩＳＰ
Ｒ−Ｃａｓシステムによって共有され、スペーサー獲得に関係するコアタンパク質である
。Ｃｓｎ２およびＣａｓ４は、ＩＩ型システムのサブセットのみに存在し、適応で役割を
果たすことが提唱された。最大数のｔｒａｃｒＲＮＡ含有ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ座
位を取り出すために、既に注釈されたＣａｓ９タンパク質に相似である配列に関する、一
般で入手可能なゲノムをまず始めにスクリーニングした。２３５個のＣａｓ９オルソログ
を２０３個の細菌種で識別した。全ての取り出されたＣａｓ９オルソログを代表する７５
個の多種多様の配列のセットをさらなる分析のために選択した（図３２、図３８、並びに
材料および方法）。
図３２は、（Ａ）様々な有機体の代表的なＣａｓ９配列の系統樹、並びに、（Ｂ）代表
的なＣａｓ９座位構造を示す。各節に対して算出されたブーストラップ値が示されている
。同一色の枝は類似Ｃａｓ９オルソログの選択されたサブクラスターを表す。ヌクレオチ
ド数でＣＲＩＳＰＲリピート長、アミノ酸（ａａ）の平均Ｃａｓ９タンパク質サイズおよ
びコンセンサス座位構造が、各サブクラスターに関して示されている。＊−ｇｉ｜１１６
６２８２１３＊＊−ｇｉ｜１１６６２７５４２†−ｇｉ｜３４５５７７９０‡−ｇｉ｜３
４５５７９３２。ＩＩ−Ａ型はｃａｓ９−ｃｓｘ１２、ｃａｓ１、ｃａｓ２、ｃａｓ４を
特徴とする。ＩＩ−Ｂ型はｃａｓ９、ｃａｓ１、ｃａｓ２、続いてｃｓｎ２変異形を特徴
とする。ＩＩ−Ｃ型は、保存されたｃａｓ９、ｃａｓ１、ｃａｓ２オペロンを特徴とする
（図３８も参照）。
次に、選択されたＣａｓ９オルソログの多重配列アラインメントを実施した。比較分析
によって、アミノ酸構成およびタンパク質サイズにおいて高い多様性が明らかになった。
Ｃａｓ９オルソログは数個の同一アミノ酸のみを共有し、取り出された配列は全て中央Ｈ
ＮＨエンドヌクレアーゼドメインおよび分割ＲｕｖＣ／ＲＮａｓｅＨドメインと同じドメ
イン構造を有する。Ｃａｓ９タンパク質の長さは、約１１００または約１４００個のアミ
ノ酸の一般的なサイズを伴って、９８４（カンピロバクター・ジェジュニ）から１６２９
（フランシセラ・ノビシダ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ））個のアミノ
酸に及ぶ。Ｃａｓ９配列の高い多様性のために、特にドメイン間領域の長さにおいて、調
製したアラインメントの、良く配置された有益な位置のみを選択し、分析した配列の系統
樹を復元した（図３２および材料および方法）。Ｃａｓ９オルソログを、外れ配列をいく
つか伴う、三つの主要な単系統制クラスターに分類した。Ｃａｓ９ツリーの観察されたト
ポロジーは、現在のＩＩ型座位分類、別個の単系統クラスターを形成する、以前に定義さ
れたＩＩ−Ａ型およびＩＩ−Ｂ型と良く一貫している。クラスターをさらに特徴づけるた
めに、列挙された株全てのｃａｓオペロン組成およびＣＲＩＳＰＲリピート配列を詳細に
検査した。
Ｃａｓ９サブクラスター化は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ座位構造の多様性を反映する
選択されたＩＩ型座位のより深い分析により、Ｃａｓ９オルソログ配列のクラスター化
はＣＲＩＳＰＲリピート長の多様性と相関していることが明らかになった。ほとんどのＩ
Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムに関して、二つのＣａｓ９ツリーサブクラスターに関
してはばらつきを多少伴って、リピート長は３６個のヌクレオチド（ｎｔ）である。Ｃｓ
ｘ１２と以前は呼ばれた、長いＣａｓ９オルソログをコードする座位を含むＩＩ−Ａ型ク
ラスター（図３２）において、ＣＲＩＳＰＲリピートは３７ｎｔの長さである。バクテロ
イデス門（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ ｐｈｙｌｕｍ）に属する細菌の配列から成る小
さいサブクラスター（図３２）は、サイズで最大４８ｎｔである、異常に長いＣＲＩＳＰ
Ｒリピートを特徴とする。さらに、我々は、図３２で示される通り、Ｃａｓ９配列のサブ
クラスター化が別個のｃａｓオペロン構造と互いに関連していることに気が付いた。３番
目に主要であるクラスター（図３２）および外れ座位（図３２）は、後述されるいくつか
の不完全な座位の例外を伴って、ｃａｓ９、ｃａｓ１およびｃａｓ２遺伝子から構成され
る、最小オペロンから主に成る。二つの一番主要なクラスターの他の座位は全て、ＩＩ−
Ａ型またはｃｓｎ２様に特異的、ＩＩ−Ｂ型に特異的である、第４の遺伝子、主にｃａｓ
４に関連する（図３２）。我々は、ＩＩ−Ｂ型Ｓ．ピオゲネスＣＲＩＳＰＲ０１およびＳ
．サーモフィラスＣＲＩＳＰＲ３に類似する座位内で、Ｃｓｎ２タンパク質、Ｃｓｎ２ａ
のより短い変異形をコードする遺伝子を識別した（図３２）。Ｃｓｎ２、Ｃｓｎ２ｂのよ
り長い変異形は、ＩＩ−Ｂ型Ｓ．サーモフィラスＣＲＩＳＰＲ１に類似する座位と関連す
ることが発見された（図３２）。興味深いことに、前述したＣｓｎ２変異形とは明らかな
配列相同性を有さないタンパク質をコードする推定ｃａｓ遺伝子をさらに識別した。これ
ら特徴づけされていないタンパク質の一つは、マイコプラズマ種のＩＩ−Ｂ型座位と排他
的に関連する（図３２および図３３）。他の二つは、スタフィロコッカス種のＩＩ−Ｂ型
座位にコードされていることが発見された（図３３）。全ての例において、ｃａｓオペロ
ン構造の多様性は、このように、Ｃａｓ９配列のサブクラスター化に一貫している。三つ
の主要な別個の単系統性クラスターに分割されたＣａｓ９ツリーの一般的なトポロジーと
一緒に、これらの特徴によって、我々は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムを三つの
サブタイプへさらに新しく分類することを提唱した。図３２で示される通り、ＩＩ−Ａ型
はＣｓｘ１２様Ｃａｓ９およびＣａｓ４に関連し、ＩＩ−Ｂ型はＣｓｎ２様に関連し、お
よび、ＩＩ−Ｃ型のみが最小セットのｃａｓ９、ｃａｓ１およびｃａｓ２遺伝子を有する
。
図３３は、選択した細菌種のＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓの構造を示す。縦線は、同じ
ツリーのサブクラスターに属するＣａｓ９オルソログをコードする座位を分類する（図３
２と比較されたい）。黒色横線、リーダー配列；黒色長方形および菱形、リピートスペー
サーアレイ。予想される抗リピートは推定ｔｒａｃｒＲＮＡオルソログ転写の方向を示す
矢印によって表される。実験で確認されなかった座位に関して、ＣＲＩＳＰＲリピートス
ペーサーアレイはここではｃａｓオペロンと同一鎖から転写されると見なされることに留
意されたい。推定ｔｒａｃｒＲＮＡオルソログの転写方向も同様に示される。
新規のｔｒａｃｒＲＮＡオルソログのインシリコ予想
７５個の代表的なＣａｓ９オルソログに基づいてすでに選択されたＩＩ型座位を、推定
ｔｒａｃｒＲＮＡオルソログの存在のためにスクリーニングした。制限された数のｔｒａ
ｃｒＲＮＡ配列で実施された我々の以前の分析によると、ｔｒａｃｒＲＮＡの配列および
それらのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ座位内の局在性はいずれも保存されていない様子であるこ
とが明らかになった。しかし、前述した通り、ｔｒａｃｒＲＮＡは、各ｐｒｅ−ｃｒＲＮ
Ａリピートと塩基対を形成して、Ｃａｓ９の存在下でＲＮａｓｅＩＩＩによって切断され
るｔｒａｃｒＲＮＡ：ｐｒｅｃｒＲＮＡリピート二重鎖を形成することが可能な抗リピー
ト配列も特徴とする。新規ｔｒａｃｒＲＮＡを予想するために、この特徴を利用し、次に
挙げる作業の流れを行った：（ｉ）ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ座位内で、可能性のある抗リピ
ート（ＣＲＩＳＰＲリピートと塩基対形成する配列）をスクリーニングする、（ｉｉ）遺
伝子間領域に位置する抗リピートを選択する、（ｉｉｉ）ＣＲＩＳＰＲ抗リピート：リピ
ート塩基対形成を確認する、および（ｉｖ）識別されたｔｒａｃｒＲＮＡに関連するプロ
モーターおよびＲｈｏ独立転写ターミネーターを予想する。
推定抗リピートをスクリーニングするために、ＣＲＩＳＰＲｄｂデータベースからリピ
ート配列を取り出し、または、その情報が利用可能でなかった場合は、ＣＲＩＳＰＲｆｉ
ｎｄｅｒソフトウェアを用いて、リピート配列を予想した。我々の前回の実験で、リピー
トスペーサーアレイの転写方向はｃａｓオペロンの転写方向と比較して座位の中で異なる
ことを、我々は実験的に示した。ここで、ＲＮＡシークエンシング分析がこの観察を確実
なものとした。分析した座位のいくつかで、すなわち、Ｆ．ノビシダ、Ｎ．メニンギティ
ディスおよびＣ．ジェジュニにおいて、リピートスペーサーアレイはｃａｓオペロンとは
反対方向に転写される（パラグラフ「ディープＲＮＡシークエンシングで新規ｔｒａｃｒ
ＲＮＡオルソログの発現を確証する」並びに図３３および３４を参照）一方で、Ｓ．ピオ
ゲネス、Ｓ．ミュータンス、Ｓ．サーモフィラスおよびＬ．イノキュアにおいては、その
アレイおよびｃａｓオペロンは同一方向に転写される。これらが、今までで入手可能な唯
一のＩＩ型リピートスペーサーアレイ発現データである。他のリピートスペーサーアレイ
の転写方向を予想するために、アレイの最後のリピートは通常どちらに変異するかに従っ
て、前回の観察を考慮した。この所見は、通常アレイの最初のリピートは適応段階の間ス
ペーサー配列の挿入後に複製されるという現在のスペーサー獲得モデルと一致する。３７
個のリピートスペーサーアレイに関して、アレイの推定末端で変異したリピートを識別す
ることができた。Ｎ．メニンギティディスおよびＣ．ジェジュニリピートスペーサーアレ
イの予想された転写方向は実験的に決定された方向（ＲＮＡシークエンシングおよびノー
ザンブロット分析）とは反対になるだろうと観察した。予想された方向はクラスター内で
一貫せず、ほとんどの例においてアレイの双方の末端上で可能性のあるプロモーターを検
知できたため、我々は、リピートスペーサーアレイの転写は、そうでないと確証されない
限り、ｃａｓオペロンの転写と同一の方向であると見なした。
図３４は、選択したＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ ＣａｓシステムにおけるｔｒａｃｒＲＮＡお
よびｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ同時プロセシングを示す。ｔｒａｃｒＲＮＡおよびｐｒｅ−ｃｒ
ＲＮＡ転写の確認された位置および方向と一緒に、ＣＲＩＳＰＲ座位構造を示す。上部配
列、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡリピート；下部配列、ｃｒＲＮＡリピートと塩基対を形成するｔ
ｒａｃｒＲＮＡ配列。ＲＮＡシークエンシングで明らかになった推定ＲＮＡプロセシング
部位を矢頭で表す。各座位に関して、矢頭サイズは取り出された５’および３’末端の相
対量を示す（図３７も参照されたい）。
図３７は、座標（ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ）（対象領域）および対応するｃＤＮＡ配列
（５’〜３’）を含む、実験された細菌種をシークエンシングすることで取り出した全て
のｔｒａｃｒＲＮＡオルソログおよび成熟ｃｒＲＮＡを列挙する。矢印は転写方向（鎖）
を示す。ｃＤＮＡリードの数（ＳＡＭツールを利用して算出）、被覆度（マッピングされ
たリードのパーセンテージ）および各転写に関連する優勢な末端が示される。各転写物の
５’および３’末端周辺の各ヌクレオチド位置で始まる、または停止するリードの数が表
示される。各ｃｒＲＮＡ成熟形態のサイズが示される。各ｃｒＲＮＡ種に割り当てられる
数は、ＣＲＩＳＰＲｄｂに従って、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ内のスペーサー配列位置に対応す
る。各ｔｒａｃｒＲＮＡ種に割り当てられる数は、同じ転写物の異なる形態に対応する。
次いで、双方の鎖状の１ｋｂ上流および下流に位置する配列を含む選択されたＣＲＩＳ
ＰＲ−Ｃａｓ座位を、最大１５個のミスマッチを許容して、リピートスペーサーアレイに
属さない、可能性のあるリピート配列のためにスクリーニングした。平均して、ｔｒａｃ
ｒＲＮＡオルソログの抗リピートに対応するであろう変性リピート配列を、座位１個あた
り１〜３個発見し、遺伝子間領域内に位置するその配列を選択した。推定抗リピートを四
つの典型的な局在で発見した：ｃａｓ９遺伝子の上流、ｃａｓ９とｃａｓ１との間の領域
、およびリピートスペーサーアレイの上流または下流（図３３）。取り出した各配列に関
して、可能性のあるＲＮＡ：ＲＮＡ相互作用を予想し、ＲＮａｓｅ ＩＩＩプロセシング
のために最適な二重鎖構造を形成するより長く完璧な相補領域を伴う候補に特に焦点を当
てることで、リピートと抗リピートとの間に形成された塩基対形成の範囲（図４４）を確
認した。抗リピートに隣接するプロモーターおよび転写ターミネーターを予想するために
、我々の以前の観察２６に基づいて、抗リピート配列の最大２００ｎｔ上流および１００
ｎｔ下流にそれぞれ位置する領域内に含まれる推定転写開始および終結部位を設定した。
上述した通り、ＩＩ型システムの多くのリピートスペーサーアレイの転写方向に関する実
験的な情報は不足している。インシリコプロモーター予想アルゴリズムは、しばしば間違
った陽性結果を提供し、双方の鎖からのリピートスペーサーアレイの転写につながり得る
推定プロモーターを指摘する。いくつかの例において、Ｃ．ジェジュニ座位（パラグラフ
「ディープＲＮＡシークエンシングで新規ｔｒａｃｒＲＮＡオルソログの発現を確証する
」を参照）で例証される、ｔｒａｃｒＲＮＡオルソログ発現を実験的に確証できても、転
写ターミネーターを予想はできなかった。プロモーターおよび転写ターミネーター予想は
、上述の誘導ラインの必須ではなく支持的なだけである工程として見なされるべきだと我
々は提唱する。
図４４は、選択された細菌種内における予想ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡリピート：ｔｒａｃｒ
ＲＮＡ抗リピートの塩基対形成を示す。ｂＣＲＩＳＰＲ座位はＩＩ型（Ｎｍｅｎｉ／ＣＡ
ＳＳ４）ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムに所属する。命名法はＣＲＩＳＰＲデータベース
（ＣＲＩＳＰＲｄｂ）に従う。Ｓ．サーモフィラスＬＭＤ−９およびＷ．サクシノゲネス
は二つのＩＩ型座位を含む。ｃ上部配列、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡリピートコンセンサス配列
（５’から３’）；下部配列、リピートにアニールしているｔｒａｃｒＲＮＡホモログ配
列（抗リピート；３’から５’）。所与のリピート配列は、ＣＲＩＳＰＲリピートスペー
サーアレイがｃａｓオペロンと同一の鎖から転写されるという仮定に基づいていることに
留意されたい。本実験で実験的に確認した配列に関して、ＲＮＡシークエンシングデータ
を考慮して塩基対決定を決定した。図３３を参照されたい。ｄ二つの可能な抗リピートを
Ｆ．ツラレンシス亜種ノビシダ、Ｗ．サクシノゲネスおよびガンマ・プロテオバクテリウ
ムＨＴＣＣ５０１５ ＩＩ−Ａ型座位で識別した。上部配列対形成、推定リーダー配列内
の抗リピート；下部配列対形成、リピートスペーサーアレイ下流の抗リピート。図３３を
参照されたい。ｅ二つの可能な抗リピートをＳ．ワドスヲルテンシスＩＩ−Ａ型座位で識
別した。上部配列対形成、抗リピート；下部配列対形成、推定リーダー配列内の抗リピー
ト。図３３を参照されたい。ｆ二つの可能な抗リピートをＬ．ガセリＩＩ−Ｂ型座位で識
別した。上部配列対形成、ｃａｓ９上流の抗リピート；下部配列対形成、ｃａｓ９とｃａ
ｓ１遺伝子との間の抗リピート。図３３を参照されたい。ｇ二つの可能な抗リピートをＣ
．ジェジュニＩＩ−Ｃ型座位で識別した。上部配列対形成、ｃａｓ９上流の抗リピート；
下部配列対形成、リピートスペーサーアレイ下流の抗リピート。図３３を参照されたい。
ｈ二つの可能な抗リピートをＲ．ラブラムＩＩ−Ｃ型座位で識別した。上部配列対形成、
リピートスペーサーアレイ下流の抗リピート；下部配列対形成、ｃａｓ１上流の抗リピー
ト。図３３を参照されたい。
ｔｒａｃｒＲＮＡオルソログの過多
すでに選択した７５個の座位のうち５６個に関して推定ｔｒａｃｒＲＮＡオルソログを
予想した。予想の結果が図３３に示される。すでに述べた通り、この図で示されるｔｒａ
ｃｒＲＮＡ転写の方向は仮定であり、リピートスペーサーアレイ転写の指定された方向に
基づいている。前述の通り、推定ｔｒａｃｒＲＮＡオルソログをコードする配列はｃａｓ
オペロンの上流、内および下流、並びに、推定リーダー配列を含む、通常ＩＩ−Ａ型座位
で見つかるリピートスペーサーアレイの下流で識別された（図３３）。しかし、ＣＲＩＳ
ＰＲ−Ｃａｓ座位内の類似した局在の抗リピートは異なる方向で転写され得ることを我々
は観察した（たとえば、ラクトバチルス・ラムノサスおよびユーバクテリウム・レクタレ
またはマイコプラズマ・モービレおよびＳ．ピオゲネスまたはＮ．メニンギティディスと
比較する際に観察される通り）（図３３）。特に、Ｃａｓ９誘導ツリーの同一サブクラス
ター内に分類される座位は、ｔｒａｃｒＲＮＡをコードする遺伝子に関して、共通の構造
を共有する。ＩＩ−Ｂ型の三つの異なるサブクラスターのｃａｓ９とｃａｓ１との間に位
置する推定ｔｒａｃｒＲＮＡの顕著な例外を複数伴うが、我々は、ＩＩ−Ａ型座位のリピ
ートスペーサーアレイ周辺に、並びに、ほとんどはＩＩ−Ｂ型およびＩＩ−Ｃ型のｃａｓ
９遺伝子上流で、抗リピートを識別した。
いくつかのＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ座位は欠陥リピートスペーサーアレイおよび／ま
たはｔｒａｃｒＲＮＡオルソログを有する
六つのＩＩ型座位（フソバクテリウム・ヌクレアタム、アミノモナス・パウシボラン、
ヘリコバクター・ムステラエ、アゾスピリルム種、プレボテラ・ルミニコラおよびアッカ
ーマンシア・ムシニフィラ）に関して、リピート配列と弱い塩基対形成を有し、または、
オープンリーディングフレーム内に位置する、可能性のある抗リピートを我々は識別した
。特に、これらの座位では、Ａ．パウシボランの推定ＡＴＰａｓｅをコードする遺伝子の
オープンリーディングフレーム内の弱い抗リピート、アゾスピリルム種Ｂ５１０のｃａｓ
９遺伝子の最初の１００ｎｔ内の強い抗リピート、および、Ａ．ムシニフィラの双方のｃ
ａｓ９およびｃａｓ１と重複する強い抗リピートが識別された（図３３）。１２個の追加
座位（ペプトニフィルス・ドゥエルデニイ、コプロコッカス・カタス、アシダミノコッカ
ス・インテスティニ、カテニバクテリウム・ミツオカイ、スタフィロコッカス・シュード
インターメディウス、イリオバクター・ポリトロプス、エルシミクロビウム・ミヌツム、
バクテロイデス・フラジリス、アシドサーマス・セルロリティカス、コリネバクテリウム
・ジフセリエ、ビフィドバクテリウム・ロンガムおよびビフィドバクテリウム・デンティ
ウム）に関しては、推定抗リピートを検知できなかった。これらのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ
座位におけるｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ発現およびプロセシングに関する利用可能な情報は一切
ない。従って、はっきり定義されたｔｒａｃｒＲＮＡオルソログの不在下では、ＩＩ型シ
ステムの機能性を取り上げる必要が引き続きある。７個の分析した座位に関して、リピー
トスペーサーアレイを一切識別できず（パラステレラ・エクスクレメンティホミニス、バ
チルス・セレウス、ルミノコッカス・アルバス、ロドシュードモナス・パルストリス、ニ
トロバクター・ハンブルゲンシス、ブラディリゾビウム種およびプレボテラ・ミカンス）
（図３３）、また、これらのうち三つにおいては（ブラディリゾビウム種ＢＴＡｉ１、Ｎ
．ハンブルゲンシスおよびＢ．セレウス）、我々は、周辺に他のｃａｓ遺伝子を一切持た
ない単一遺伝子としてｃａｓ９を検知した。これら三つの座位に関しては、ｃａｓ９遺伝
子の上流または下流の小さいＲＮＡ配列を一切予想できなかった。Ｒ．アルバスおよびＰ
．エクスクレメンティホミニスの例では、ｃａｓ９含有ゲノムコンティグが短すぎてリピ
ートスペーサーアレイの予想は可能ではない。
ディープＲＮＡシークエンシングで新規ｔｒａｃｒＲＮＡオルソログの発現を確証する
インシリコｔｒａｃｒＲＮＡ予想を確証し、ｔｒａｃｒＲＮＡ：ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡの
同時プロセシングパターンを決定するために、選択したグラム陽性（Ｓ．ミュータンスお
よびＬ．イノキュア）およびグラム陰性（Ｎ．メニンギティディス、Ｃ．ジェジュニおよ
びＦ．ノビシダ）細菌のＲＮＡを、ディープシークエンシングによって分析した。ｔｒａ
ｃｒＲＮＡオルソログおよびプロセスされたｃｒＲＮＡの配列を取り出した（図３６およ
び図３７）。Ｓ．ピオゲネスの以前公開された差次的なｔｒａｃｒＲＮＡシークエンシン
グデータに一貫して２６、ｔｒａｃｒＲＮＡオルソログは、０．０８から６．２％のマッ
ピングされた合計リードの被覆度で、ライブラリーで非常に良く示された。プロセシング
されたｔｒａｃｒＲＮＡも、６６％から９５％超のｔｒａｃｒＲＮＡリードの合計量の被
覆度で、一次転写物よりもさらに豊富であった（図３６および図３７）。
図３６は、ディープＲＮＡシークエンスによって明らかになった細菌ｔｒａｃｒＲＮＡ
オルソログおよびｃｒＲＮＡの発現を示す。選択された細菌株のｔｒａｃｒＲＮＡオルソ
ログおよびｃｒＲＮＡの発現プロファイルを、対応するゲノムと一緒に棒グラフで表す（
Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｖｉｅｗｅｒ（ＩＧＶ）ツールでキャプチ
ャーした画像）。カンピロバクター・ジェジュニ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＮＣ＿００２１６３
）、フランシセラ・ノビシダ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＮＣ＿００８６０１）、ナイセリア・メ
ニンギティディス（ＧｅｎＢａｎｋ：ＮＣ＿００３１１６）、リステリア・イノキュア（
ＧｅｎＢａｎｋ：ＮＣ＿００３２１２）およびストレプトコッカス・ミュータンス（Ｇｅ
ｎＢａｎｋ：ＮＣ＿００４３５０）。ゲノム座標が提供される。ａＢＥＤＴｏｏｌｓ−バ
ージョン−２．１５．０（規模は１００万あたりのリードで提供される）を用いて算出さ
れた配列被覆度。ｂ各ヌクレオチド位置で開始（５’）および終結（３’）するリードの
分布が示される（規模はリードの数で提供される）。上部パネルは陽性鎖の転写物に対応
し、下部パネルは陰性鎖の転写物に対応する。軸の下に示される陰性被覆度値およびピー
クは、ゲノムの陰性鎖の転写を示す。リードの優勢である５’および３’末端が全ＲＮＡ
に関してプロットされる。Ｌ．イノキュアｃＤＮＡライブラリーの低品質を踏まえると、
おそらくＲＮＡ変性のために、リードがｃｒＲＮＡに関しては短くなっており、ｔｒａｃ
ｒＲＮＡの３’末端でのリードの蓄積が観察されることに留意されたい。
ｔｒａｃｒＲＮＡ一次転写物の５’末端を評価するために、ｔｒａｃｒＲＮＡの全ての
５’末端リードの存在量を分析し、予想される抗リピート配列の５’末端の上流または周
辺の最も突出したリードを取り出した。プロモーター予想アルゴリズムを用いてｔｒａｃ
ｒＲＮＡオルソログの５’末端をさらに確認した。Ｓ．ミュータンス、Ｌ．イノキュアお
よびＮ．メニンギティディスのｔｒａｃｒＲＮＡの識別された５’末端はｔｒａｃｒＲＮ
Ａ発現のインシリコ予想およびノーザンブロット分析の双方と互いに関連していた２６。
最も突出したＣ．ジェジュニｔｒａｃｒＲＮＡの５’末端は、抗リピート配列の真ん中で
識別された。５個のヌクレオチド上流で、インシリコ予想と互いに関連し、ＣＲＩＳＰＲ
リピート配列との相互作用のより長い配列を提供する追加の推定５’末端を検知した。我
々は、Ｆ．ノビシダライブラリーから、ほぼ排他的にプロセシングされた転写物に対応し
たリードを比較的少ない量で取り出した。一次転写物のごく少量のリードの分析は、強い
インシリコプロモーター予想に対応する５’末端を提供した。Ｆ．ノビシダｔｒａｃｒＲ
ＮＡのノーザンブロットプローブは、長さ約９０ｎｔの転写物の低存在量を示す予想の有
効性を確証した。結果が表２に列挙される。Ｎ．メニンギティディスを除いたすべての検
査された種、一次ｔｒａｃｒＲＮＡ転写物は長さ７５〜１００ｎｔの単一の小さいＲＮＡ
種として識別された。Ｎ．メニンギティディスの例では、約１１０ｎｔの優勢な一次ｔｒ
ａｃｒＲＮＡ形態およびごく少量のリードで表され、ノーザンブロット分析によって弱い
バンドとして以前検知された約１７０ｎｔの推定のより長い転写物を発見した。
Figure 0006887479
Figure 0006887479
ａＳ．サーモフィラス、Ｐ．マルトシダ、Ｍ．モービレのｔｒａｃｒＲＮＡオルソログを
インシリコで予想した。
ｂＲＮＡシークエンシングによって明らかになったＲＮＡ−ｓｅｑ（表Ｓ３）：第１のリ
ード、シークエンシングによって取り出された第１の５’末端位置；最も突出している、
ＲＮＡ−ｓｅｑデータによる豊富な５’末端；予想、転写開始部位のインシリコ予想；下
線、アライメントされる一次ｔｒａｃｒＲＮＡについて選ばれた５’末端。
ｃＲＮＡ−ｓｅｑデータおよび転写ターミネーター予想による推定３’末端。
ｔｒａｃｒＲＮＡおよびｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ同時プロセシング部位は、抗リピート：リピ
ート領域に存在する。
予想抗リピート配列内の豊富なｔｒａｃｒＲＮＡ５’末端および豊富な成熟ｃｒＲＮＡ
３’末端を分析することで、プロセシングされたｔｒａｃｒＲＮＡ転写物を検査した（図
３４および４５）。全ての種において、ＲＮａｓｅＩＩＩによるｔｒａｃｒＲＮＡ：ｐｒ
ｅ−ｃｒＲＮＡリピート二重鎖の同時プロセシングに起因し得るｔｒａｃｒＲＮＡオルソ
ログの突出した５’末端を識別した。以前の観察に一貫して、推定トリミングによる第２
成熟現象からおそらく生じるｃｒＲＮＡのプロセシングされた５’末端も識別した。注目
すべきことは、Ｓ．ピオゲネス、Ｓ．ミュータンスおよびＬ．イノキュアの近縁ＲＮＡの
対において、抗リピート配列の真ん中のＧ：Ｃ塩基対周辺で同一のプロセシング部位を観
察した。双方のＳ．ミュータンスおよびＬ．イノキュアで、突出したｔｒａｃｒＲＮＡ５
’末端およびｃｒＲＮＡ３’末端をさらに検知し、これらは、ｃｒＲＮＡの３’末端が、
すでに言及された５’末端トリミングまでさらに短くなった状態である、ｔｒａｃｒＲＮ
Ａ：ｃｒＲＮＡ二重鎖のさらなるトリミングを暗示し得、続いてＲＮａｓｅＩＩＩ触媒性
第１プロセシング現象を暗示し得る。同様に、Ｃ．ジェジュニにおいて、ＲＮａｓｅ Ｉ
ＩＩプロセシングパターンに適合する、少量のみのｃｒＲＮＡ３’末端を発見し、プロセ
シングされたｔｒａｃｒＲＮＡの対応する５’末端を取り出した。このように、ＲＮａｓ
ｅ ＩＩＩによる最初の切断後のｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡ二重鎖の推定トリミング
は、成熟ｃｒＲＮＡにより短いリピート由来部分をもたらし、エンドヌクレアーゼＣａｓ
９との相互作用およびそれに続く標的ＤＮＡの切断のために、三つのＧ：Ｃ塩基対によっ
て安定化したより短いｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡ二重鎖を生成する。Ｎ．メニンギテ
ィディスＲＮＡ二重鎖は、二つの一次部位からさらにＣＲＩＳＰＲリピートの３’末端で
プロセシングされるようであり、二重鎖内の中央バルジにも関わらず、成熟ｃｒＲＮＡ内
の長いリピート由来部分および安定したＲＮＡ：ＲＮＡ相互作用につながる。興味深いこ
とに、Ｆ．ノビシダのｔｒａｃｒＲＮＡ：ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ二重鎖は、低い相補性の領
域内で切断されるようであり、取り出された豊富なｔｒａｃｒＲＮＡの５’末端のいくつ
かは、付随するｃｒＲＮＡのトリミングを伴わない、そのさらなるトリミングを示唆する
。一次転写物サイズおよびプロセシング部位の位置における違いは、様々な長さのプロセ
シングされたｔｒａｃｒＲＮＡをもたらし、約６５〜８５ｎｔの範囲に及ぶ。突出した、
プロセシングされたｔｒａｃｒＲＮＡ転写物の座標およびサイズが表２および図３７に示
される。ｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡの観察されるプロセシングパターンは、従来
提唱された二つの成熟現象のモデルと良く一致している。ｔｒａｃｒＲＮＡ５’末端およ
びｃｒＲＮＡ３’末端のいくつかのさらなる推定トリミングは第２成熟現象から生じ得、
または、ｃＤＮＡライブラリー調製またはＲＮＡシークエンシングの人為産物であり得る
。これらプロセシングの性質は、これ以上はまだ調査されていない。
ｔｒａｃｒＲＮＡオルソログの配列は非常に多様である
選択されたｔｒａｃｒＲＮＡオルソログの配列相同性も決定した。Ｓ．ピオゲネス（８
９ｎｔ形態のみ）、Ｓ．ミュータンス、Ｌ．イノキュアおよびＮ．メニンギティディス（
１１０ｎｔ形態のみ）、Ｓ．サーモフィラス、Ｐ．マルトシダおよびＭ．モービレの一次
ｔｒａｃｒＲＮＡ転写物の多重配列アラインメントを行った（表２、図３５）。ｔｒａｃ
ｒＲＮＡ配列に高い多様性を観察したが、近縁ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ座位の配列の著しい
保存を観察した。対配列によると、Ｌ．イノキュア、Ｓ．ピオゲネス、Ｓ．ミュータンス
およびＳ．サーモフィラスのｔｒａｃｒＲＮＡは平均７７％の同一性を共有し、Ｎ．メニ
ンギティディスおよびＰ．マルトシダのｔｒａｃｒＲＮＡは、８２％の同一性を共有する
。分析したｔｒａｃｒＲＮＡ配列の平均同一性は５６％で、無作為のＲＮＡ配列の同一性
に匹敵する。この観察によって、配列相同性に基づいたｔｒａｃｒＲＮＡオルソログの予
想は近縁座位の例のみで実施可能であることがさらに確認される。可能なｔｒａｃｒＲＮ
Ａ構造の保存も試みたが、一つの共変動および保存された転写ターミネーター構造を除い
て、著しい相同性は一切見つけられなかった（図３５）。
図３５は、ｔｒａｃｒＲＮＡオルソログの配列多様性を示す。ｔｒａｃｒＲＮＡ配列多
重アラインメント。Ｓ．サーモフィラスおよびＳ．サーモフィラス２、相応に配列番号４
１および配列番号４０のＣａｓ９オルソログに関連するｔｒａｃｒＲＮＡ。黒色、高度に
保存されている；濃灰色、保存されている；淡灰色、不十分に保存されている。予想され
るコンセンサス構造を、アラインメントの上部に示す。矢印はヌクレオチド共変動を示す
。Ｓ．ピオゲネスＳＦ３７０、Ｓ．ミュータンスＵＡ１５９、Ｌ．イノキュアＣｌｉｐ１
１２６２、Ｃ．ジェジュニＮＣＴＣ １１１６８、Ｆ．ノビシダＵ１１２およびＮ．メニ
ンギティディスＡ Ｚ２４９１のｔｒａｃｒＲＮＡをＲＮＡシークエンシングおよびノー
ザンブロット分析によって確認した。Ｓ．サーモフィラスＬＭＤ−９のｔｒａｃｒＲＮＡ
をノーザンブロット分析によって確認した。Ｐ．マルトシダＰｍ７０のｔｒａｃｒＲＮＡ
を、Ｎ．メニンギティディスＡ Ｚ２４９１のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ座位とそのＣＲＩＳ
ＰＲ−Ｃａｓ座位の高い相同性から予想した。Ｍ．モービレ１６３ＫのｔｒａｃｒＲＮＡ
を転写プロモーターおよびターミネーターの強予想からインシリコで予想した。
実施例４：ＲＮＡ誘導プラットフォームとしてのＣＲＩＳＰＲを、遺伝子発現の配列特異
的制御用に転用
ゲノム全体規模での標的遺伝子調節は、細胞システムを調べる、乱す、および操作する
のに強力な戦略である。発明者らは、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムからのＲＮＡ誘導ＤＮ
ＡエンドヌクレアーゼであるＣａｓ９に基づいて、遺伝子発現を制御するための新しい方
法を開発した。この実施例は、エンドヌクレアーゼ活性に欠けた、触媒的に死んだＣａｓ
９が、誘導ＲＮＡと共に同時発現されると、転写伸長、ＲＮＡポリメラーゼ結合または転
写因子結合に特異的に干渉し得るＤＮＡ認識複合体を生成するということを示す。ＣＲＩ
ＳＰＲ干渉（ＣＲＩＳＰＲｉ）と呼ばれるこのシステムは、大腸菌の標的遺伝子の発現を
、検知可能なオフターゲット効果を一切もたらさないで、効果的に抑制し得る。ＣＲＩＳ
ＰＲｉは複数の標的遺伝子を同時に抑制するために使用され得、その効果は可逆性である
。さらに、システムを哺乳動物細胞の遺伝子抑制のために適応することもできる。このＲ
ＮＡ誘導ＤＮＡ認識プラットフォームは、ゲノム全体規模で遺伝子発現を選択的に乱すた
めの単純なアプローチを提供する。
材料および方法
株および培地
大腸菌Ｋ−１２株ＭＧ１６５５を、インビボ蛍光測定のために宿主株として使用した。
３ｘ−ＦＬＡＧエピトープタグがＲｐｏＣサブユニットのＣ末端に付着した、ＲＮＡＰの
変異形を内因的に発現する大腸菌ＭＧ１６５５由来株を、全てのシークエンシング実験の
ために使用した。ＥＺが豊富な定義された培地（ＥＺ−ＲＤＭ、テクノカ社（Ｔｅｋｎｏ
ｋａ））を、インビボ蛍光アッセイのために、成長培地として使用した。標準的なプロト
コルを用いて、ＡｍｐＲ、ＣｍＲ、またはＫａｎＲ遺伝子を選択マーカーとして使用して
、遺伝子形質転換および形質転換の確認を行った。
プラスミド構築および大腸菌ゲノムクローニング
Ｃａｓ９およびｄＣａｓ９遺伝子を、前述したベクターｐＭＪ８０６およびｐＭＪ８４
１からそれぞれクローニングした。遺伝子をＰＣＲ増幅し、アンヒドロテトラサイクリン
（ａＴｃ）誘導性プロモーターＰＬｔｅｔＯ−１、クロラムフェニコール選択マーカーお
よびｐ１５Ａ複製開始点を含むベクターに挿入した。注釈つき転写開始部位、アンピシリ
ン選択マーカーおよびＣｏｌＥ１複製開始点と一緒に最小合成プロモーター（Ｊ２３１１
９）を含むベクターに、ｓｇＲＮＡ鋳型をクローニングした。逆ＰＣＲを使用して、新し
い２０−ｂｐ相補領域を伴うｓｇＲＮＡカセットを作成した。蛍光レポーター遺伝子を大
腸菌ゲノムに挿入するために、蛍光遺伝子をはじめにエントリーベクターにクローニング
し、これを次いでＰＣＲ増幅して、ｎｓｆＡ５’／３’ＵＴＲ配列、蛍光遺伝子およびＫ
ａｎＲ選択マーカーを含む直線化ＤＮＡ断片を作成した。大腸菌ＭＧ１６５５株を、λ−
レッド（Ｒｅｄ）組み換えタンパク質（エキソ、ベータおよびガンマ）を含む温度感受性
プラスミドｐＫＤ４６で形質転換した。細胞培養を３０℃で約０．５のＯＤ（６００ｎｍ
）まで成長させ、０．２％アラビノースを添加して、１時間、λ−レッド組み換えタンパ
ク質を誘導した。細胞を４℃で回収し、エレクトロポレーションによる直線化ＤＮＡ断片
の形質転換のために使用した。正しいゲノム挿入を含む細胞を、５０μｇ／ｍＬカナマイ
シンを用いて選択した。
フローサイコメトリーおよび分析
２ｍＬの９６ウェルのディープウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ３９６０）中１００μｇ
／ｍＬカルベニシリンおよび３４μｇ／ｍＬクロラムフェニコール含有ＥＺ−ＲＤＭで、
３７℃にて一晩１２００ｒ．ｐ．ｍで株を培養した。次いで、この一晩培養のうち１μＬ
を、同じ抗生濃度を伴い、２μＭのａＴｃが添加された２４９μＬの新しいＥＺ−ＲＤＭ
に添加し、ｄＣａｓ９タンパク質の生成を誘導した。細胞が半対数期まで成長した際に（
約４時間）、蛍光タンパク質の量を、高処理サンプラーが設備されたＬＳＲＩＩフローサ
イトメーター（ＢＤバイオサイエンス社（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））を用いて決
定した。少なくとも２０、０００個の細胞が回収されるまで、低フロー速度で細胞をサン
プリングした。前方分散側分散図にて６０％の細胞密度を含む多角形領域をゲートする（
ｇａｔｉｎｇ）ことで、ＦＣＳ Ｅｘｐｒｅｓｓ（デ・ノボ・ソフトウェア社（Ｄｅ Ｎ
ｏｖｏ Ｓｏｆｔｗａｒｅ））を用いてデータを分析した。各実験に関して、三重で培養
物を測定し、それらの標準偏差をエラーバーとして示した。
Β−ガラクトシダーゼアッセイ
β−ガラクトシダーゼアッセイを実行するために、上記の通り調製した１μＬの一晩培
養物を、同じ抗生濃度で、２μＭのａＴｃを伴い、１ｍＭのイソプロピルβ−Ｄ−１−チ
オガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を伴う、または伴わない２４９μＬの新しいＥＺ−Ｒ
ＤＭに添加した。細胞が半対数期まで成長させた。この培養の１００ｕＬのＬａｃＺ活性
を、説明に従って酵母β−ガラクトシダーゼアッセイキット（ピアス社（Ｐｉｅｒｃｅ）
）を使って測定した。
合計ＲＮＡの抽出および精製
各試料に関して、大腸菌のモノクローン培養物を、３７℃で５００ｍＬのＥＺ−ＲＤＭ
中ＯＤ（６００ｎｍ）０．１から初期の対数期（ＯＤ０．４５±０．０５）まで成長させ
、この時点で細胞を０．２２μｍのニトロセルロース膜（ＧＥ）上での濾過によって回収
し、液体窒素で凍結させて同時に全ての転写進行を止めた。１０ｍＭのＭｎＣｌ２および
１５μＭのＴａｇｅｔｉｎ転写インヒビター（エピセンター社）を添加した５００μＬの
凍結溶解緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ８、０．４％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０
．１％ＮＰ−４０、１００ｍＭのＮＨ４Ｃｌ、５０Ｕ／ｍＬＳＵＰＥＲａｓｅ・Ｉｎ（ア
ンビオン社）および１倍プロテアーゼインヒビターカクテル（完全、ＥＤＴＡフリー、ロ
シュ社）の存在下で、凍結細胞（１００μｇ）を、Ｑｉａｇｅｎ ＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅ
ｒ ＩＩミキサーミル上で、１５Ｈｚで３分間、６回粉々にした。
可溶化物を、ピペッティングすることで、氷の上に再懸濁した。ＲＱ１ ＤＮａｓｅ
Ｉ（１１０Ｕ合計、プロメガ社）を添加し、氷上で２０分間インキュベートした。反応を
ＥＤＴＡ（２５ｍＭ最終）でクエンチし、１０分間の２０、０００ｇの遠心分離によって
、可溶化物を４℃で透明にした。可溶化物をＰＤ ＭｉｎｉＴｒａｐＧ−２５カラム（Ｇ
Ｅヘルスケア社）上に載せ、１ｍＭのＥＤＴＡを添加した溶解緩衝液で溶離した。
全ｍＲＮＡの精製
ｍｉＲＮｅａｓｙキット（キアゲン社）を用いて、全ＲＮＡを透明にした可溶化物から
精製した。２０μＬの１０ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ７中の１μｇのＲＮＡを同じ容積の２倍
アルカリ性断片化溶液（２ｍＭのＥＤＴＡ、１０ｍＭのＮａ２ＣＯ３、９０ｍＭのＮａＨ
ＣＯ３、ｐＨ９．３）と混合し、約２５分間９５℃にてインキュベートし、３０〜１００
ｎｔの範囲である断片を作成した。０．５６ｍＬの氷冷沈殿溶液（３００ｍＭのＮａＯＡ
ｃ ｐＨ５．５およびＧｌｙｃｏＢｌｕｅ（アンビオン社））を添加することで断片化反
応を停止し、標準イソプロパノール沈殿によって、ＲＮＡを精製した。次いで、１倍ＰＮ
Ｋ緩衝液（ＡＴＰ無し）および０．５Ｕ ＳＵＰＥＲａｓｅ・Ｉｎ中２５Ｕ Ｔ４ ＰＮ
Ｋ（ＮＥＢ）を伴う５０μＬの反応内で断片化ｍＲＮＡを脱リン酸化し、標準イソプロパ
ノール沈殿方法によってＧｌｙｃｏＢｌｕｅで沈殿させた。
新生ＲＮＡ精製
新生ＲＮＡ精製のために、透明にした可溶化物を前述の通り０．５ｍＬ抗ＦＬＡＧ Ｍ
２アフィニティーゲル（シグマ・アルドリッチ社）に添加した。４℃で２．５時間回転を
伴う、透明にした可溶化物とのインキュベーション前に、アフィニティーゲルを、１ｍＭ
のＥＤＴＡを添加した溶解緩衝液で２回洗浄した。３００ｍＭのＫＣｌを添加した溶解緩
衝液で、免疫沈澱を４×１０ｍｌ洗浄し、結合したＲＮＡＰを１ｍＭのＥＤＴＡおよび２
ｍｇ／ｍＬの３ｘ−ＦＬＡＧペプチド（シグマ・アルドリッチ社）を添加した溶解緩衝液
で２回溶離した。新生ＲＮＡを、ｍｉＲＮｅａｓｙキット（キアゲン社）を用いて溶離液
から精製し、以前に確立されたライブラリー作成プロトコルを用いてＤＮＡに転換した。
ＤＮＡライブラリー調製およびＤＮＡシークエンシング
ＤＮＡライブリーはＩｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ２０００上でのシークエンシングで
ある。ＨＴＳｅｑ ＰｙｔｈｏｎパッケージおよびＰｙｔｈｏｎに書かれる他の従来のソ
フトウェアを用いて、リードを処理した。シークエンシングされた転写物の３’末端を、
Ｂｏｗｔｉｅ（「．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔ」の前（ｐｒｅｃｅｅｄｉｎｇ）に
「ｂｏｗｔｉｅ−ｂｉｏ」）およびＭｏｃｈｉＶｉｅｗ（「．ｅｄｕ／ｍｏｃｈｉ．ｈｔ
ｍｌ」の前に「ｊｏｈｎｓｏｎｌａｂ．ｕｃｓｆ」）で作成されるＲＮＡＰプロファイル
を用いて、参照ゲノムと配列した。
ヒト細胞におけるＣＲＩＳＰＲｉのためのプラスミド設計および作成
哺乳動物コドン最適化ストレプトコッカス・ピオゲネスＣａｓ９（ＤＮＡ２．０）をコ
ードする配列を三つのＣ末端ＳＶ４０核局在配列（ＮＬＳ）と、または、二つのＮＬＳが
隣接するｔａｇＢＦＰに融合させた。標準ライゲーション独立クローニングを用いて、こ
れら二つの融合タンパク質をＭＳＣＶ−Ｐｕｒｏ（クロンテック社）にクローニングした
。ＣＭＶプロモーターからｍＣｈｅｒｒｙを同時発現するｐＳｉｃｏ由来であるレンチウ
ィルスＵ６ベース発現ベクターを用いて、誘導ｓｇＲＮＡを発現させた。ｓｇＲＮＡ発現
プラスミドを、アニールしたプライマーを、ＢｓｔＸＩおよびＸｈｏＩで消化したレンチ
ウィルスＵ６ベース発現ベクターに挿入することでクローニングした。
ヒト細胞におけるＣＲＩＳＰＲｉのための細胞培養、ＤＮＡ形質移入および蛍光測定
ＨＥＫ２９３細胞を、１０％ＦＢＳ、２ｍＭのグルタミン、１００単位／ｍＬストレプ
トマイシンおよび１００μｇ／ｍＬペニシリン中ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ
）で維持した。標準的なプロトコルを用いて、ＨＥＫ２９３をＧＦＰ発現ＭＳＣＶレトロ
ウィルスで感染させ、安定したＧＦＰ発現のためにＢＤ ＦＡＣＳ Ａｒｉａ２を用いて
フローサイコメトリーによって分類した。０．５μｇのｄＣａｓ９発現プラスミドおよび
０．５μｇのＲＮＡ発現プラスミド（図４５Ｂに関しては０．２５μｇのＧＦＰリポータ
ープラスミドを伴う）を用いて、２４ウェルプレート内で、製造業者の推奨プロトコルで
ＴｒａｎｓＩＴ−ＬＴ１形質移入試薬（ミラス社（Ｍｉｒｕｓ））を使用し、ＧＦＰ発現
ＨＥＫ２９３細胞を一過性的に形質移入した。形質移入から７２時間後、細胞を単個細胞
浮遊液にトリプシン処理した。Ｕ６ベクターは、ｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子を誘導する構成的
ＣＭＶプロモーターを含む。ｍＣｈｅｒｒｙ陽性群（陰性対照細胞に比べて１０倍超さら
に明るいｍＣｈｅｒｒｙ）をゲートすることで、ＢＤ ＬＳＲＩＩ ＦＡＣＳ機を用いて
ＧＦＰ発現を分析した。
設計されたＲＮＡ
図で使用されたｓｇＲＮＡ設計：２０個のヌクレオチドが適合する領域のみ（ＤＮＡ標
的化断片）が列挙される（別で指示されない限り）：

図４０Ｃで使用されたｍＲＦＰ標的ｓｇＲＮＡ（配列番号７４１〜７４６）；
図４０Ｄで使用されたプロモーター標的ｓｇＲＮＡ（配列番号７４７〜７５１）；
図４０Ｄの標的プロモーター配列（配列番号７５２）；
図４３Ｂで使用されたｍＲＦＰ標的ｓｇＲＮＡ（配列番号７５３〜７６０）；
図４２Ｂで使用されたｓｆＧＦＰ標的ｓｇＲＮＡ（ｇｆｐ）（配列番号７６１）；
図４３Ｂで使用されたｓｆＧＦＰ標的ｓｇＲＮＡ（配列番号７６２〜７６９）；
図４３Ｆおよび図５１の二重ｓｇＲＮＡ標的実験（配列番号７７０〜７７８）；
図４４Ｂで使用されたｌａｃオペロン標的ｓｇＲＮＡ（配列番号７７９〜７８７）；およ
び
図４５で使用されたＥＧＦＰ標的ｓｇＲＮＡ（配列番号７８８〜７９４）。
Figure 0006887479
結果
ＣＲＩＳＰＲ（規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列）システム
は、標的遺伝子調節のための新しい可能性のあるプラットフォームを提供する。４０％の
細菌のおよび９０％の古細菌が、外来性ＤＮＡ要素に対する耐性を与えるＣＲＩＳＰＲ／
ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）システムを有する。ＣＲＩＳＰＲシステムは、小さな塩基対
形成ＲＮＡを用いて配列特異的な方法で外来性ＤＮＡ要素を標的および切断する。異なる
有機体に多種多様のＣＲＩＳＰＲシステムが存在し、最も単純なものがストレプトコッカ
ス・ピオゲネスのＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムである：Ｃａｓ９タンパク質および二つの
ＲＮＡをコードする単一遺伝子、成熟ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）および部分的
に相補的であるｔｒａｎｓ作動性ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）のみが外来性ＤＮＡのＲＮ
Ａ誘導サイレンシングには必要および十分である（図４６）。ｃｒＲＮＡの成熟にはｔｒ
ａｃｒＲＮＡおよびＲＮａｓｅＩＩＩが必要である。しかし、この必要条件を、ｔｒａｃ
ｒＲＮＡ−ｃｒＲＮＡ複合体を模倣するよう設計されたヘアピンを含む、操作した小さな
誘導ＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を用いることで避けることができる。ｓｇＲＮＡと標的ＤＮＡ
との間の塩基対形成は、Ｃａｓ９のエンドヌクレアーゼ活性のために、二重鎖切断（ＤＳ
Ｂ）を引き起こす。結合特異性はｓｇＲＮＡ−ＤＮＡ塩基対形成、および、ＤＮＡ相補領
域に隣接する短いＤＮＡモチーフ（プロトスペーサー隣接モチーフ、つまりＰＡＭ、配列
：ＮＧＧ）の双方によって決定される。このように、ＣＲＩＳＰＲシステムは二分子、Ｃ
ａｓ９タンパク質およびｓｇＲＮＡの最小セットを必要とするだけであり、従って、宿主
独立遺伝子標的プラットフォームとして使用される可能性を秘める。Ｃａｓ９／ＣＲＩＳ
ＰＲは部位選択的ＲＮＡ誘導ゲノム編集のために活用され得ることが示されている（図３
９Ａ）。
図４６は、Ｓ．ピオゲネスのＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムのメカニズムを示す。システ
ムは、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質およびリピートスペーサー配列のアレイを
含むＣＲＩＳＰＲ座位から成る。全てのリピートは同じであり、全てのスペーサーは異な
り、標的ＤＮＡ配列に相補的である。細胞が外来性ＤＮＡ要素に感染された場合、ＣＲＩ
ＳＰＲ座位は、より小さな断片に切断される長い前駆転写物に転写する。切断はトランス
作動性アンチセンスＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）および宿主ＲＮａｓｅ ＩＩＩによって
媒介される。切断後、一つの単一タンパク質、Ｃａｓ９、がｃｒＲＮＡの切断された形態
を認識し、結合する。Ｃａｓ９はｃｒＲＮＡをＤＮＡに誘導し、ＤＮＡ分子を走査する。
複合体は、ｃｒＲＮＡとＤＮＡ標的との間で塩基対形成することで安定化される。この場
合、Ｃａｓ９は、そのヌクレアーゼ活性のために、二重鎖ＤＮＡ切断を引き起こす。これ
は通常同種ＤＮＡ分子を取り除き、細胞がある特定のＤＮＡ群に免疫を与える。
図３９は、ＣＲＩＳＰＲ干渉（ＣＲＩＳＰＲｉ）システムの設計を示す。（Ａ）最小干
渉システムは、単一タンパク質および設計ｓｇＲＮＡキメラから成る。ｓｇＲＮＡキメラ
は三つのドメイン（枠で囲まれた領域）から成る：特異的ＤＮＡ結合のための２０ヌクレ
オチド（ｎｔ）相補領域、Ｃａｓ９結合のための４２ｎｔヘアピン（Ｃａｓ９ハンドル）
、およびＳ．ピオゲネス由来の４０ｎｔ転写ターミネーター。野生型Ｃａｓ９タンパク質
はヌクレアーゼ活性を含む。ｄＣａｓ９タンパク質はヌクレアーゼ活性おいて欠陥がある
。（Ｂ）野生型Ｃａｓ９タンパク質はｓｇＲＮＡに結合し、タンパク質−ＲＮＡ複合体を
形成する。複合体は、ｓｇＲＮＡとＤＮＡ標的との間のワトソン−クリック塩基対形成に
よって特定のＤＮＡ標的に結合する。野生型Ｃａｓ９の場合、ＤＮＡはＣａｓ９タンパク
質のヌクレアーゼ活性のために切断される。ヌクレアーゼ欠陥Ｃａｓ９の場合、複合体が
適切な転写を破壊する。
最小ＣＲＩＳＰＲｉシステムは、単一タンパク質およびＲＮＡから成り、効果的に転写開
始および伸長をサイレンシングできる。
そのようなＣＲＩＳＰＲｉプラットフォームを大腸菌で実施するため、野生型Ｓ．ピオ
ゲネスＣａｓ９遺伝子およびｓｇＲＮＡを細菌ベクターから発現させ、システムが標的座
位で遺伝子発現を乱し得るかどうかを決定した（図４０Ａ）。Ｓ．ピオゲネスＣＲＩＳＰ
Ｒシステムは天然大腸菌システムに対して直交性である。Ｃａｓ９タンパク質はｐ１５Ａ
複製起点を含むプラスミド上のアンヒドロテトラサイクリン（ａＴｃ）誘導性プロモータ
ーから発現され、ｓｇＲＮＡはＣｏｌＥ１複製起点を含むプラスミド上の最小構成的プロ
モーターから発現される。代替戦略として、ＤＮＡ切断において欠陥がある、触媒的に死
んだＣａｓ９変異体（ｄＣａｓ９）を使用して、Ｃａｓ９のこの形態が単一のＲＮＡ誘導
ＤＮＡ結合複合体として依然作用することを示した。
図４０は、ＣＲＩＳＰＲｉが効果的に転写伸長および開始をサイレンシングするのを示
す。（Ａ）ＣＲＩＳＰＲｉシステムは誘導性Ｃａｓ９タンパク質および設計ｓｇＲＮＡキ
メラから成る。ｄＣａｓ９はＲｕｖＣ１およびＨＮＨヌクレアーゼドメインの変異を含む
。ｓｇＲＮＡキメラは、図１に記載される通り、三つの機能性ドメインを含む。（Ｂ）設
計ｓｇＲＮＡ（ＮＴ１）およびＤＮＡ標的の配列。ＮＴ１は、ｍＲＦＰコード領域の非鋳
型ＤＮＡ鎖を標的とする。塩基対形成モチーフを囲む領域（２０ｎｔ）のみが示される。
塩基対形成ヌクレオチドには数が振り分けられ、ｄＣａｓ９結合ヘアピンに上線が引かれ
ている。ＰＡＭ配列は下線が引かれている。（Ｃ）ＣＲＩＳＰＲｉは鎖特異的な方法で転
写伸長を遮断する。ｍＲＦＰをコードする遺伝子を含む合成蛍光ベースリポーターシステ
ムを大腸菌ＭＧ１６５５ゲノム（ｎｓｆＡ座位）に挿入した。鋳型ＤＮＡ鎖または非鋳型
ＤＮＡ鎖のいずれかに結合する６個のｓｇＲＮＡを、ｄＣａｓ９タンパク質で同時発現さ
せ、インビボ蛍光アッセイによって測定される、標的ｍＲＦＰに対するそれらの効果を伴
った。非鋳型ＤＮＡ鎖に結合するｓｇＲＮＡのみがサイレンシングを示した（１０〜３０
０倍）。対照はｄＣａｓ９タンパク質を伴うがｓｇＲＮＡは伴わない細胞の蛍光を示す。
（Ｄ）ＣＲＩＳＰＲｉは転写開始を遮断した。五つのｓｇＲＮＡを、大腸菌プロモーター
（Ｊ２３１１９）周辺の異なる領域に結合するよう設計した。転写開始部位を＋１として
標識した。点線の楕円は−５５から＋２０の７５−ｂｐ領域を包含する初期ＲＮＡＰ複合
体を示す。初期ＲＮＡＰ複合体内のｓｇＲＮＡ標的領域のみが抑制（Ｐ１〜Ｐ４）を示し
た。転写伸長遮断とは違い、サイレンシングは標的ＤＮＡ鎖と無関係であった。（Ｅ）Ｃ
ＲＩＳＰＲｉ調節は可逆性であった。ｄＣａｓ９およびｓｇＲＮＡ（ＮＴ１）の双方がａ
Ｔｃ誘導性プロモーターの制御下にあった。細胞培養を指数関数期の間維持した。時間Ｔ
＝０の際、１μＭのａＴｃを細胞にＯＤ＝０．００１で添加した。標的ｍＲＦＰの抑制が
１０分内に開始された。蛍光シグナルは細胞成長に一貫した方法で崩壊し、その崩壊は細
胞分割のためであったことを示唆した。２４０分後には、蛍光は完全に抑制されたレベル
に到達した。Ｔ＝３７０分では、ａＴｃは成長培地から洗浄され、細胞をＯＤ＝０．００
１まで希釈し直した。蛍光は５０分後に増加し始め、陽性対照と同じレベルに上がるまで
３００分かかった。陽性対照：常にインデューサー無し；陰性対照：常に１μＭのａＴｃ
インデューサー有り。２Ｃ、２Ｄ、および２Ｅにおける蛍光結果は、平均および少なくと
も三つの生物学的複製物のＳＥＭを示す。図４７および図４８も参照されたい。
Ｃａｓ９で同時発現したｓｇＲＮＡはそれぞれ三つの断片から成る：２０ヌクレオチド
（ｎｔ）標的特異的相補領域、４２ｎｔのＣａｓ９結合ヘアピン（Ｃａｓ９ハンドル）お
よびＳ．ピオゲネス由来の４０ｎｔ転写ターミネーター（図４０Ｂ）。赤色蛍光タンパク
質（ｍＲＦＰ）ベースレポーターシステムを大腸菌ＭＧ１６５５ゲノムに挿入した。
野生型Ｃａｓ９タンパク質およびｍＲＦＰコード配列に標的されたｓｇＲＮＡ（ＮＴ１
）の同時発現は、形質転換効率を劇的に減少させ、これは、おそらくゲノム上のＣａｓ９
誘導性二重鎖切断のためである（図４７Ａ）。数個の生存コロニーのシークエンシングは
、それらはすべてゲノム上の標的ｍＲＦＰ部位周辺で配列再編成を有し、野生型Ｃａｓ９
および宿主配列に標的されたｓｇＲＮＡの発現に対して強い選択性があることを示唆した
。ＲｕｖＣ１およびＨＮＨヌクレアーゼドメインの二つのサイレンシング変異を含む（Ｄ
１０ＡおよびＨ８４１Ａ）ｄＣａｓ９変異体遺伝子（非切断）は、形質転換能率および大
腸菌成長速度によって確認される通り、この致死率を緩和した（図４７Ａ＆Ｂ）。
図４７は図４０に関連し、ｄＣａｓ９およびｓｇＲＮＡで同時形質転換した大腸菌細胞
培養の成長曲線を示す。（Ａ）大腸菌細胞を二つのプラスミドで形質転換するための低湿
転換効率。一つのプラスミドは、ｍＲＦＰのゲノムコピーを標的とするｓｇＲＮＡを含み
、もう一方のプラスミドは、野生型Ｃａｓ９またはｄＣａｓ９を含む。野生型Ｃａｓ９お
よびｓｇＲＮＡの同時形質転換は非常に有毒であり、これは、ｄＣａｓ９を使用して緩和
され得る。（Ｂ）ｓｇＲＮＡ（ＮＴ１）を、ｍＲＦＰのコード配列を標的とするように設
計する。ｄＣａｓ９およびｓｇＲＮＡの同時発現は、細胞成長速度にはほぼ一切効果を示
さず、これは、ＤＮＡとのｄＣａｓ９−ｓｇＲＮＡ相互作用は、ＲＮＡポリメラーゼを遮
断するには十分強いが、ＤＮＡポリメラーゼまたは細胞複製を遮断するほどではないこと
を示唆する。結果は平均および少なくとも三つの独立した実験のＳＥＭを示す。
ｄＣａｓ９：ｓｇＲＮＡ複合体が遺伝子発現の非常に効率的な抑制を提供し得るかどう
かを試験するために、ｍＲＦＰコード配列の異なる領域に相補的なｓｇＲＮＡを設計し、
これらは、鋳型ＤＮＡ鎖または非鋳型ＤＮＡ鎖のいずれかに結合する。結果は、非鋳型Ｄ
ＮＡ鎖を標的とするｓｇＲＮＡは、効果的な遺伝子サイレンシングを示す（１０から３０
０倍の抑制）一方で、鋳型鎖を標的とするものはほとんど効果を示さなかったことを明か
した（図４０Ｃ）。システムは、大腸菌ゲノム内または高コピープラスミド上にある遺伝
子に関しても同様の抑制効果を示した（図４８）。さらに、プロモーター領域への標的も
効果的な遺伝子サイレンシングをもたらした（図４０Ｄ）。ｓｇＲＮＡの−３５枠への標
的は、遺伝子発現を著しくノックダウンした（Ｐ１、約１００倍の抑制）一方で、他の隣
接領域への標的は弱化した効果を示した（Ｐ２〜Ｐ４）。プロモーターの１００ｂｐ上流
周辺の配列の標的は一切効果を示さなかった（Ｐ５）。コード配列の標的とは違って、プ
ロモーターを標的とする場合、サイレンシングの効率はＤＮＡ鎖とは無関係である；鋳型
または非鋳型鎖の標的は同じくらい効果的である（Ｐ２およびＰ３）。
図４８は、図４０Ｃと関連しており、ＣＲＩＳＰＲｉが複数コピープラスミド上のレポ
ーター遺伝子の発現をサイレンシングし得ることを示す。ｍＲＦＰ遺伝子をａｐ１５Ａプ
ラスミドにクローニングした。ｄＣａｓ９およびｍＲＦＰ特異的ｓｇＲＮＡ（ＮＴ１）の
存在はｍＲＦＰを強く抑制する（約３００倍）。抑制効果は、ゲノム内でｍＲＦＰを用い
て観察されるものに類似している（図４０Ｃ）。サイレンシングは、ｓｇＲＮＡが鋳型Ｄ
ＮＡ鎖ではなく非鋳型ＤＮＡ鎖上で作用する時のみ効果的である（Ｔ１）。また、ＧＦＰ
特異的３ｓｇＲＮＡ（ｇｆｐ）がｍＲＦＰ発現に一切効果を示さない通り、サイレンシン
グは非常に特異的である。蛍光結果は、平均および少なくとも三つの生物学的複製物のＳ
ＥＭを示す。
ＣＲＩＳＰＲｉ遺伝子ノックダウンは誘導性および可逆性である
遺伝子ノックダウン方法と違って、ＣＲＩＳＰＲｉベースの遺伝子発現ノックダウンを
使用することの一つの利点に、この乱れは可逆性であるはずであるという事実である。Ｃ
ＲＩＳＰＲｉ調節が誘導され、続いて逆転され得るかどうかを試験するために、ｄＣａｓ
９およびｍＲＦＰ特異的ｓｇＲＮＡ（ＮＴ１）の双方をａＴｃ誘導性プロモーターの制御
下に置き、インデューサーに反応するｍＲＦＰのＣＲＩＳＰＲｉ媒介性調節の時間経過測
定を実施した（図４０Ｅ）。時間０で、インデューサー無しで初期対数期まで成長した細
胞培養物に１μＭのａＴｃを添加した。データは、システムはインデューサーの存在に素
早く反応し得ることを示し、蛍光レポータータンパク質シグナルはインデューサー分子の
添加後１０分内に減少し始めた。ｍＲＦＰタンパク質は安定しているため、同様の細胞増
倍時間および蛍光半減時間の損失（双方とも約３６分）によって見られるように、蛍光シ
グナル減少速度は細胞成長によるタンパク質希釈によって制限される。２４０分では、全
ての細胞が陰性対照と同じレベルまで均一に抑制された。４２０分で、インデューサーを
成長培地から洗浄し、細胞をより低いＯＤまで希釈し直した。５０分の遅れの後、ｍＲＦ
Ｐ蛍光は上昇し始めた。単一細胞蛍光が陽性対照と同じレベルまで上昇するのに合計３０
０分かかった。５０分の遅れは、細胞成長および分割による希釈によってオフセットされ
るｄＣａｓ９／ｓｇＲＮＡターンオーバー速度によって決定される可能性が一番高い。つ
まり、これらの結果は、ｄＣａｓ９−ｓｇＲＮＡのサイレンシング効果は誘導され、逆転
され得ることを示す。
天然伸長転写物シークエンシング（ＮＥＴ−Ｓｅｑ）は、ＣＲＩＳＰＲｉが、転写を遮断
することで機能することを確証する
ｄＣａｓ９は転写伸長の間ＲＮＡポリメラーゼ（ＲＮＡＰ）結合を遮断し得るＲＮＡ誘
導ＤＮＡ結合複合体として機能しているように見えた。非鋳型ＤＮＡ鎖は転写ｍＲＮＡと
同一の配列同一性を共有し、非鋳型ＤＮＡ鎖に結合するｓｇＲＮＡのみがサイレンシング
を示しため、ｄＣａｓ９：ｓｇＲＮＡ複合体はｍＲＮＡと相互に作用し、その翻訳または
安定性を変えるという可能性にとどまった。これらの可能性を区別するため、直近に転写
した天然伸長転写物シークエンシング（ＮＥＴ−ｓｅｑ）アプローチを、伸長ＲＮＡポリ
メラーゼの位置のプロファイルを全体的に作り、転写物に対するｄＣａｓ９：ｓｇＲＮＡ
複合体の効果をモニターするために使用され得る大腸菌に適用した。このＮＥＴ−ｓｅｑ
方法で、ＣＲＩＳＰＲｉシステムをＦＬＡＧでタグしたＲＮＡＰを含む大腸菌ＭＧ１６５
５由来株に形質転換した。ＣＲＩＳＰＲｉはｍＲＦＰコード領域に結合するｓｇＲＮＡ（
ＮＴ１）を含んだ。タグされたＲＮＡＰのインビトロ免疫精製、続いて伸長ＲＮＡＰに関
連する新生転写物のシークエンシングによって、ＲＮＡＰの休止部位の区別を可能にした
。
これらの実験は、ｓｇＲＮＡが、ｓｇＲＮＡ標的座位の上流に強力な転写休止を誘導し
たことを示した（図４１Ａ）。休止部位と標的部位との間の距離は１９ｂｐであり、これ
は、従来報告された、ＲＮＡＰのヌクレオチド取り込みとその先端との間の約１８ｂｐの
距離に完璧に一致している。この発見は転写遮断が伸長ＲＮＡＰとｄＣａｓ９：ｓｇＲＮ
Ａ複合体との間の物理的な衝突のためであるというＣＲＩＳＰＲｉのメカニズムに一致し
ている（図４１Ｂ）。ｄＣａｓ９：ｓｇＲＮＡ複合体の鋳型鎖との結合はほとんど抑制効
果を有さず、ＲＮＡＰはこの特定の配向では複合体をリードスルーできることを示唆した
。この場合、ｓｇＲＮＡはＲＮＡＰのヘリカーゼ活性によって開かれ得るＲＮＡＰに向く
。これらの実験は、ＣＲＩＳＰＲｉがＲＮＡを使用して転写を直接遮断することを示す。
このメカニズムは、遺伝子発現のノックダウンが翻訳前にすでに転写されたメッセンジャ
ーＲＮＡの破壊を必要とするＲＮＡｉのメカニズムとは違う。
図４１は、ＣＲＩＳＰＲｉが転写伸長を遮断することで機能することを示す。（Ａ）Ｆ
ＬＡＧでタグしたＲＮＡＰ分子を免疫沈澱し、関連新生ｍＲＮＡ転写物をシークエンシン
グした。上部パネルはｓｇＲＮＡ無しの細胞内の新生ｍＲＦＰ転写物のシークエンシング
結果を示し、下部パネルはｓｇＲＮＡ有りの細胞での結果を示す。ｓｇＲＮＡの存在下で
は、強力な転写休止が標的部位の１９ｂｐ上流で観察され、その後、シークエンシングリ
ードの数は急激に落ちる。（Ｂ）ＲＮＡＰとｄＣａｓ９−ｓｇＲＮＡとの間の物理的衝突
に基づく、提唱ＣＲＩＳＰＲｉメカニズムである。ＲＮＡＰの中央から先端までの距離は
約１９ｂｐであり、これは、我々が測定した転写休止部位とｓｇＲＮＡ塩基対形成領域の
３’との距離に良く適合する。休止されたＲＮＡＰはｄＣａｓ９−ｓｇＲＮＡ障害物に遭
遇した際に転写伸長に失敗する。
ＣＲＩＳＰＲｉ ｓｇＲＮＡ誘導遺伝子サイレンシングは非常に特異的である
ゲノム全体規模でのＣＲＩＳＰＲｉの特異性を評価するために、ｓｇＲＮＡ同時発現を
伴う、および、伴わない、ｄＣａｓ９で形質転換された細胞の全トランスクリプトームシ
ョットガンシークエンシング（ＲＮＡ−ｓｅｑ）を実施した（図４２Ａ）。ｍＲＦＰ（Ｎ
Ｔ１）に標的されたｓｇＲＮＡの存在下では、ｍＲＦＰ転写物は存在量の低下を示す唯一
の遺伝子であった。他のどの遺伝子も、シークエンシングエラー内で、ｓｇＲＮＡの添加
後に発現に顕著な変化を示さなかった。異なる遺伝子を標的とする異なるｓｇＲＮＡを伴
う細胞にＲＮＡ−ｓｅｑも実施した。これらの実験はどれも、標的遺伝子の他に遺伝子の
顕著な変化を示さなかった（図４９）。このように、ｓｇＲＮＡ誘導遺伝子標的および調
節は、非常に特異的であり、顕著なオフターゲット効果を有さない。
図４２は、ＣＲＩＳＰＲｉシステムの標的特異性を示す。（Ａ）ゲノム規模のｍＲＮＡ
シークエンシング（ＲＮＡ−ｓｅｑ）により、ＣＲＩＳＰＲｉ標的はオフターゲット効果
を一切有さないことが確認された。ｍＲＦＰコード領域に結合するｓｇＲＮＡ ＮＴ１を
使用した。ｄＣａｓ９、ｍＲＦＰ、およびｓｆＧＦＰ遺伝子はハイライトされている。（
Ｂ）複数のｓｇＲＮＡが独立して二つの蛍光タンパク質レポーターを同一細胞内でサイレ
ンシングできる。各ｓｇＲＮＡは特にその同種遺伝子を抑制したが、他の遺伝子は抑制し
なかった。双方のｓｇＲＮＡが存在した場合、双方の遺伝子がサイレンシングされた。エ
ラーバーは示す少なくとも三つの生物学的複製物のＳＥＭを示す。（Ｃ）二つのｓｇＲＮ
Ａを使用して二つの蛍光タンパク質を制御するための顕微鏡画像。上部パネルは大腸菌細
胞の明視野画像を示し、真ん中のパネルはＲＦＰチャネルを示し、下部パネルはＧＦＰパ
ネルを示す。一つのｓｇＲＮＡおよびｄＣａｓ９の同時発現は、同種蛍光タンパク質をサ
イレンシングするだけであり、他はサイレンシングしない。ある特定の蛍光タンパク質が
サイレンシングされた細胞からほぼ一切蛍光が観察されなかった通り、ノックダウン効果
は強力であった。スケールバー、１０μｍ。対照は任意の蛍光タンパク質レポーターを伴
わない細胞を示す。蛍光結果は平均および少なくとも三つの生物学的複製物のＳＥＭを示
す。図４９も参照されたい。
図４９は図４２Ａに関連しており、異なる遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡを伴う細胞の
ＲＮＡ−ｓｅｑデータを示す。（Ａ）（＋／−）大腸菌の内在性ｌａｃＩ遺伝子のプロモ
ーターを標的とするｓｇＲＮＡ。同じｌａｃＩ標的ｓｇＲＮＡを図４４Ａの通り使用した
。（Ｂ）（＋／−）自己抑制ｓｇＲＮＡ（ｓｇＲＮＡはその自身のプロモーターを抑制し
た）を伴わない細胞のための１ｍＭのＩＰＴＧ。（Ｃ）（＋／−）大腸菌の内在性ｌａｃ
Ｚ遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡ。同じｌａｃＺ標的ｓｇＲＮＡを図４４Ａの通り使用し
た。１ｍＭのＩＰＴＧもｌａｃＺ標的ｓｇＲＮＡを伴う細胞に添加した。
ＣＲＩＳＰＲｉを使用して同時に複数の遺伝子を調節できる
ＣＲＩＳＰＲｉシステムは、クロストーク無しで独立して複数の遺伝子の制御を可能に
し得る。ｍＲＦＰおよびｓｆＧＦＰに基づいた二色蛍光レポーターシステムを作成した。
各遺伝子に相補的である別個の領域を有する二つのｓｇＲＮＡを設計した。各ｓｇＲＮＡ
の発現は、同種遺伝子のみをサイレンシングし、他方には一切効果を有さなかった。二つ
のｓｇＲＮＡの同時発現は、双方の遺伝子をノックダウンした（図４２Ｂ＆Ｃ）。これら
の結果は、ｓｇＲＮＡ誘導標的は、特異的であり、その配列同一性によって表される特異
性を伴い、他のｓｇＲＮＡの存在による影響を受けないことを示す。この挙動は、ＣＲＩ
ＳＰＲｉによって複数遺伝子の多重制御を同時に可能にするはずである。
ＣＲＩＳＰＲｉサイレンシング効率を決定する因子
ＣＲＩＳＰＲｉ標的効率の決定因子を発見するために、長さ、配列相補性および位置の
サイレンシング効率に対する役割を調査した（図４３Ａ）。図４０Ｃで示される通り、遺
伝子に沿ったｓｇＲＮＡ標的配列の位置が効率に重要である。ｓｇＲＮＡをさらに、ｍＲ
ＦＰおよびｓｆＧＦＰの双方のためのコード領域の全長を包含するように設計した（補足
のｓｇＲＮＡ配列のためのデータ）。全ての例において、抑制は転写開始部位からの標的
距離と逆相関した（図４３Ｂ）。強力な直線相関がｍＲＦＰに関して観察された。類似し
た、だがかすかに弱い相関が、ｓｆＧＦＰを標的として使用した際に観察され、もしかす
ると、この遺伝子の伸長において異なる時点のＲＮＡポリメラーゼの様々な動態を示す。
ｓｇＲＮＡは、標的に相補的である２０ｂｐ領域を含む。この塩基対形成領域の重要性
を識別するために、ｓｇＲＮＡ ＮＴ１の長さを変えた（図４３Ｃ）。５’末端からの領
域の伸展がサイレンシングに影響を与えなかった一方で、領域の切断は抑制を大きく減少
させた。遺伝子サイレンシングに必要な塩基対形成領域の最小の長さは１２ｂｐであり、
さらなる切断は機能の完全な喪失につながる。単一の変異をｓｇＲＮＡ ＮＴ１の塩基対
形成領域内に導入し、サイレンシングへの全体的な効果を試験した。結果から、三つのサ
ブ領域が認識され得、それぞれ全体的な結合およびサイレンシングに別個に寄与する（図
４３Ｄ）。初めの７個のヌクレオチドの任意の単一変異は抑制を劇的に減少させ、Ｉ型お
よびＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムの双方に関して前述された通り、この配列は結合のため
の「シード領域」を構成することを示唆する。隣接ヌクレオチドも対で変異させた（図４
３Ｅおよび図５０）。ほとんどの場合で、二重変異による相対的な抑制活性は、単一変異
の効果と比べて乗法的であり、ミスマッチ間の独立した関係を示唆する。さらに、ＰＡＭ
配列の重要性に関する以前の結果と一致して、間違ったＰＡＭは２０ｂｐの完璧な結合領
域を伴ってもサイレンシングに完全に失敗した（図４３Ｅ）。このように、ＣＲＩＳＰＲ
ｉシステムの特異性はＰＡＭ（２ｂｐ）および少なくとも１２ｂｐのｓｇＲＮＡ−ＤＮＡ
の一続きによって共同で決定され、その間隔は特有の標的部位に関するほとんどの細菌ゲ
ノムを含有するのに十分な大きさである。
双方とも同一の遺伝子を標的とする二つのｓｇＲＮＡを試験した（図４３Ｆおよび図５
１）。複数のｓｇＲＮＡの相対的な位置づけ次第で、別個の組み合わせ効果が観察された
。それぞれが約３００倍の抑制を伴う、二つのｓｇＲＮＡを組み合わせると、全体のサイ
レンシングの最大１０００倍の増加が可能になった。二つのさらに弱いｓｇＲＮＡ（約５
倍）を組み合わせると、一緒に使用された場合は乗法効果が示された。その標的が重なっ
ている二つのｓｇＲＮＡを使用した場合、抑圧的な組み合わせ効果が観察された。これは
おそらく同一領域への結合のためのｓｇＲＮＡ双方の競合に起因するものであった。
図４３は、サイレンシング効率に影響を与える因子の特徴を示す。（Ａ）異なる標的座
位を同一遺伝子上に伴うｓｇＲＮＡ（翻訳開始コドンからの距離）および同一標的座位に
対する塩基対形成領域の異なる距離を伴うｓｇＲＮＡ（ＮＴ１に基づいて）のサイレンシ
ング効果を測定した。（Ｂ）サイレンシング効率は、翻訳開始コドン（オレンジ色−ｍＲ
ＦＰ＆緑色−ｓｆＧＦＰ）からの標的距離に逆相関した。各ｓｇＲＮＡの抑制を、最も高
い抑制の倍変化を伴うｓｇＲＮＡの抑制に対して標準化することで、相対抑制活性を算出
した。エラーバーは三つの生物学的複製物のＳＥＭを示す。（Ｃ）ｓｇＲＮＡと標的ＤＮ
Ａとの間のワトソン−クリック塩基対形成領域の長さは、抑制効率に影響を与える。塩基
対形成領域の伸展は全て強力なサイレンシング効率効果を示し、切断は抑制を劇的に減少
させた。検知可能な抑制のための塩基対形成領域の最小の長さは１２ｂｐである。エラー
バーは三つの生物学的複製物のＳＥＭを示す。（Ｄ）単一ミスマッチをｓｇＲＮＡ上の各
ヌクレオチドに導入（ＮＴ１、図４０Ｂ）し、これらの単一ミスマッチがどのように抑制
効率に影響を及ぼすのかを測定した。全体的なサイレンシングに異なる重要性を有する三
つのサブ領域が認識される。それらは段階関数を示す。最初の７ヌクレオチド領域はサイ
レンシングには必要不可欠であり、ＤＮＡ標的に結合するｓｇＲＮＡをプローブするため
の「シード」領域を構成する可能性が高い。ＰＡＭ配列（ＮＧＧ）はサイレンシングのた
めに必須である。エラーバーは三つの生物学的複製物のＳＥＭを示す。（Ｅ）隣接二重ミ
スマッチを伴うｓｇＲＮＡのサイレンシング効果。ミスマッチの位置が下部に示された状
態で、単一ミスマッチのｓｇＲＮＡの相対抑制活性を示す。実験的に測定された、二重ミ
スマッチｓｇＲＮＡの活性を示す。二つの単一ミスマッチｓｇＲＮＡの効果をかけること
で算出された活性は白色で表され「Ｃｏｍ」と名付ける。ほとんどの場合で、二重ミスマ
ッチｓｇＲＮＡのサイレンシング活性は単純に、単一ミスマッチｓｇＲＮＡの活性の掛け
算であり（図５０Ｂを除いて）、単一ミスマッチ間の独立関係を示唆した。エラーバーは
三つの生物学的複製物のＳＥＭを示す。（Ｆ）二重ｓｇＲＮＡを用いて単一ｍＲＦＰ遺伝
子を標的とする組み合わせサイレンシング効果。同一の遺伝子を標的とする二つのｓｇＲ
ＮＡを用いて、全体的なノックダウン効果をほぼ１０００倍まで向上し得る。二つのｓｇ
ＲＮＡが同一遺伝子の重なっていない配列に結合する際、抑制は増大した。二つのｓｇＲ
ＮＡが重なった領域を標的とする場合、抑制は抑制された。エラーバーは三つの生物学的
複製物のＳＥＭを示す。
図５０は図４３Ｅに関連し、隣接二重ミスマッチを伴うｓｇＲＮＡのサイレンシング効
果を示す。単一ミスマッチｓｇＲＮＡの相対抑制活性が、ミスマッチの位置が下部に示さ
れた状態で提示される。実験的に測定された、二重ミスマッチｓｇＲＮＡの活性も示す。
二つの単一ミスマッチｓｇＲＮＡの効果をかけることで算出された活性は白色で表され「
Ｃｏｍ」と名付ける。蛍光結果は平均および三つの生物学的複製物のＳＥＭを示す。
図５１は図４３Ｆに関連し、二つのｓｇＲＮＡを使って単一遺伝子を調節する組み合わ
せサイレンシング効果を示す。全ての場合で、重なっていないｓｇＲＮＡは増大したサイ
レンシング効果を示し、重なっているｓｇＲＮＡは抑圧的な効果を示した。組み合わせ効
果はｓｇＲＮＡが鋳型または非鋳型ＤＮＡ鎖を標的していたかどうかに無関係であった。
蛍光結果は平均および三つの生物学的複製物のＳＥＭを示す。
ＣＲＩＳＰＲｉ遺伝子ノックダウンを用いた内在性制御ネットワークの調査
次に、ＣＲＩＳＰＲｉシステムを遺伝子ノックダウンプラットフォームとして用い、内在
性遺伝子ネットワークを調査した。微生物遺伝子ネットワークを調査する従来の方法は、
コストがかかり、骨の折れるゲノム工学およびノックダウン手順にほとんど依存していた
。対照的に、ＣＲＩＳＰＲｉでの遺伝子ノックダウンは、所望する遺伝子に相補的である
２０ｂｐ領域を保有する小さなｓｇＲＮＡの設計および合成しか必要としない。これを実
証するために、良く特徴づけられた大腸菌ラクトース制御経路の一部分である遺伝子を組
織的に乱すようにｓｇＲＮＡを設計することで、ＣＲＩＳＰＲｉを用いて大腸菌ノックダ
ウン株を作成した（図４４Ａ）。ｌａｃ抑制因子（ＬａｃＩ）を阻害する化学物質である
イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を伴う、および伴わない
状態で、β−ガラクトシダーゼアッセイを実施してノックダウン株からのＬａｃＺ発現を
測定した。野生型細胞で、ＩＰＴＧの添加がＬａｃＺ発現を誘導した。結果は、ｌａｃＺ
特異的ｓｇＲＮＡはＬａｃＺ発現を強力に抑制し得ることを示した（図４４Ｂ）。逆に、
ｌａｃＩ遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡは、ＬａｃＺ発現の直接的な抑制因子をサイレン
シングすることに関して予想される通り、ＩＰＴＧが不在下の時でもＬａｃＺ発現の活性
化をもたらした。
ｃＡＭＰ−ＣＲＰは、プロモーター上流のｃｉｓ制御部位（Ａ部位）に結合することで
、ＬａｃＺ発現の必要不可欠な活性化因子であることが知られている。従って、ＬａｃＺ
プロモーターのｃｒｐ遺伝子またはＡ部位に標的されるｓｇＲＮＡは抑制につながり、Ｃ
ＲＩＳＰＲｉ実験を用いて、制御因子をそのｃｉｓ−制御配列に結合させる手段を実証し
た。ＬａｃＺプロモーターでＣＲＰをもっと効果的にするｃＡＭＰを生成するのに必要で
あるアデニル酸シクラーゼ遺伝子（ｃｙａ）を標的とすることは、部分的な抑制にしかつ
ながらなかった。１ｍＭのｃＡＭＰの成長培地への追加は、ｃｒｐノックダウンのためで
はなくｃｙａノックダウンのための効果を補い、ｃｙａがＬａｃＺの間接的な制御因子で
あることを示唆した。さらに、ＬａｃＩ ｃｉｓ制御部位（Ｏ部位）をｓｇＲＮＡで標的
とすることは阻害につながり、というのも、おそらく、この部位でのＣａｓ９複合体結合
がＬａｃＩ転写抑制因子の挙動を模倣し、ＲＮＡポリメラーゼを立体的に遮断するからで
ある。公知のＲＮＡＰ結合部位（Ｐ部位）を標的とすることも発現を遮断した。要するに
、ＣＲＩＳＰＲｉベースの遺伝子ノックダウン方法が、複合体制御ネットワークの遺伝子
およびｃｉｓ要素の制御機能（活性化または抑制すること）を調査するための迅速かつ効
果的なアプローチを提供することを、これらの実験は実証する（図４４Ｃ）。
図４４はＣＲＩＳＰＲｉ遺伝子ノックダウンを用いた複合体制御ネットワークの機能性
プロファイリングを示す。（Ａ）ｓｇＲＮＡを設計および使用してｌａｃ制御経路の遺伝
子（ｃｙａ、ｃｒｐ、ｌａｃＩ、ｌａｃＺ、ｌａｃＹ、ｌａｃＡ）をノックダウンまたは
転写オペレーター部位（Ａ／Ｐ／Ｏ）を遮断した。ＬａｃＩは転写オペレーター部位（Ｏ
部位）に結合することで、ｌａｃＺＹＡオペロンの抑制因子である。ｌａｃＺ遺伝子はラ
クトースをグルコースに触媒する酵素をコードする。ｃｙａおよびｃｒｐといった数個の
トランス作動性宿主遺伝子がｌａｃＺＹＡシステムの活性化に関連する。ｃＡＭＰ−ＣＲ
Ｐ複合体は転写オペレーター部位（Ａ部位）に結合し、Ｐ部位に結合するＲＮＡポリメラ
ーゼを動員し、これは、ｌａｃＺＹＡの転写を開始する。ＬａｃＩ機能を阻害する化学物
質であるＩＰＴＧは、ＬａｃＺ発現を誘導する。（Ｂ）ＩＰＴＧ無し（白色）および有り
（灰色）のノックダウン株のβ−ガラクトシダーゼアッセイ。対照はＣＲＩＳＰＲｉによ
る乱れがない野生型細胞は、ＩＰＴＧの添加によって誘導され得ることを示す。ＬａｃＺ
を標的とするｓｇＲＮＡは、ＩＰＴＧの存在下でもＬａｃＺ発現を強力に抑制した。Ｌａ
ｃＩが標的される場合、ＬａｃＺ発現はＩＰＴＧ無しでも高かった。ｃｙａおよびｃｒｐ
遺伝子を標的とすることは、ＩＰＴＧの存在下でＬａｃＺ発現レベルの低下につながった
。１ｍＭのｃＡＭＰの存在はｃｙａノックダウンを救出したが、ｃｒｐノックダウンは救
出されなかった。転写オペレーター部位の遮断はＬａｃＺ抑制につながり、これらがＬａ
ｃＺのために重要なｃｉｓ作動性制御部位であることを示唆した。乱れの際には、Ｌａｃ
Ｚの減少した（下矢印）および増加した（上矢印）発現が示される。エラーバーは三つの
生物学的複製物のＳＥＭを示す。（Ｃ）ノックダウン実験によって、ｌａｃ制御回路での
制御因子の役割のプロファイリングが可能になった。データは２Ｄグラフで示され、ｘ軸
はＩＰＴＧ無しのＬａｃＺ活性、ｙ軸はＩＰＴＧ有りの活性を示している。各軸に沿った
楕円形の拡散は、標準偏差を示す。β−ガラクトシダーゼアッセイ結果は平均および三つ
の生物学的複製物のＳＥＭを示す。ＬａｃＩおよびＬａｃＺ標的に関するＲＮＡ−ｓｅｑ
データは、図４９も参照されたい。
ＣＲＩＳＰＲｉはヒト細胞の標的遺伝子発現をノックダウンし得る。
ｄＣａｓ９−ｓｇＲＮＡ複合体を使用して転写を抑制するＣＲＩＳＰＲｉアプローチの
一般性を試験するために、システムをＨＥＫ２９３哺乳動物細胞内で試験した。ｄＣａｓ
９タンパク質をコドン最適化し、核局在配列（ＮＬＳ）の三つのコピーに融合させ、マウ
ス胚性幹細胞ウィルス（ＭＳＣＶ）レトロウィルスベクターから発現させた。図４０Ｂで
示された同一であるｓｇＲＮＡ設計を用いてＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ Ｕ６プロモータ
ーから発現させた。ＳＶ４０プロモーター下でＥＧＦＰを発現するレポーターＨＥＫ２９
３細胞株をウィルス感染によって作成した。ＥＧＦＰコード領域の非鋳型ＤＮＡ鎖を標的
したｓｇＲＮＡ（ｅＮＴ２）を用いると、わずかだが再現可能な遺伝子発現のノックダウ
ンが観察された（４６％抑制、図４５Ａ）。抑制はｄＣａｓ９タンパク質およびｓｇＲＮ
Ａの双方に依存しており、抑制がｄＣａｓ９−ｓｇＲＮＡ複合体およびＲＮＡ誘導標的の
ためであることを暗示している。同一のｓｇＲＮＡは、プラスミドから一過性的に発現さ
れた場合、同一遺伝子上により良い抑制を示した（６３％抑制、図５２）。細菌システム
に一貫して、非鋳型鎖に標的されたｓｇＲＮＡのみが抑制を示した。転写開始からの距離
および局所のクロマチン状態といった因子も抑制効率を決定する重要なパラメーターであ
り得る（図５２）。ｄＣａｓ９およびｓｇＲＮＡ発現の最適化、安定性、核局在および相
互作用は、哺乳動物細胞におけるＣＲＩＳＰＲｉ効率のさらなる改善を可能にするだろう
。
図４５は、ＣＲＩＳＰＲｉがヒト細胞で遺伝子発現を抑制できることを実証する。（Ａ
）ＨＥＫ２９３細胞のＣＲＩＳＰＲｉシステム。ＳＶ４０−ＥＧＦＰ発現カセットをレト
ロウィルス感染経路でゲノムに挿入した。ｄＣａｓ９タンパク質をコドン最適化し、ＮＬ
Ｓ配列の三つのコピーと融合した。ｓｇＲＮＡをＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ Ｕ６ベクタ
ーから発現した。ｄＣａｓ９およびＥＧＦＰの非鋳型鎖を標的とするｓｇＲＮＡ（ｅＮＴ
２）の同時形質移入は蛍光を減少させる一方で（約４６％）、ｄＣａｓ９またはｓｇＲＮ
Ａ単独のいずれかの発現は一切効果を示さなかった。（Ｂ）ｄＣａｓ９：ｓｇＲＮＡ媒介
性抑制は、標的座位に依存していた。七つのｓｇＲＮＡを、鋳型または非鋳型鎖のＥＧＦ
Ｐコード配列の異なる領域を標的とするように設計した。ｅＮＴ２およびｅＮＴ５のみが
わずかな抑制を示した。７Ａおよび７Ｂからの蛍光結果は平均および二つの生物学的複製
物のエラーを示す。
図５２は図４５に関連しており、ｓｇＲＮＡ抑制が標的座位に依存し、および転写開始
からの距離に比較的依存することを示す。同一のｓｇＲＮＡを用いて異なるプロモーター
を伴う同一のＥＧＦＰ遺伝子を抑制した。Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡ複合体は、一過性的に形
質移入したプラスミドＤＮＡからの転写を抑制した。転写抑制の量はゲノム遺伝子に関し
て観察されたものより少しだけ良く（６３％）、ＧＦＰ陰性細胞のパーセンテージはｓｇ
ＲＮＡの存在下で上昇した。標的座位は転写開始から異なる距離を有する。ＳＶ４０−Ｅ
ＧＦＰが抑制を示す一方で、ＬＴＲ−ＥＧＦＰは効果を一切有さなかった。蛍光結果は平
均および二つの生物学的複製物のエラーを示す。
ＣＲＩＳＰＲｉは効率的かつ選択的に標的遺伝子の転写を抑制する
ＣＲＩＳＰＲｉシステムは標的遺伝子調節のために比較的単純なプラットフォームである
。ＣＲＩＳＰＲｉは複雑な宿主因子の存在に依存せず、その代わりにｄＣａｓ９タンパク
質および誘導ＲＮＡを必要とするだけであり、従って、融通性があり非常に設計しやすい
。システムは細菌内の遺伝子を効果的にサイレンシングできる。サイレンシングは、オフ
ターゲット効果が一切検知されなかった通り、大変効率的である。さらに、標的座位およ
びｓｇＲＮＡと標的遺伝子との間の塩基対形成の度合いを変えることで、ノックダウンの
効率を調節することができる。これによって、必須遺伝子の研究に特に有益である特色で
ある、対立遺伝子の一連のハイポモルフを作成することが可能になるであろう。システム
は、ｓｇＲＮＡを設計することで簡単にプログラムできる方法で転写を直接遮断すること
で、機能する。メカニズム的には、これは、すでに転写されたｓｇＲＮＡの破壊を要する
ＲＮＡｉベースのサイレンシングとは異なる。
さらに、これらｄＣａｓ９：ｓｇＲＮＡ複合体は、それらの同種ｔｒａｎｓ作動性転写
因子の会合を立体的に遮断し、任意のプロモーター内の重要なｃｉｓ作動性モチーフを標
的とすることで、転写の調節もできる。このように、遺伝子ノックダウンツールとしての
それの利用に加え、ＣＲＩＳＰＲｉはプロモーターの機能性マッピングおよび他のゲノム
制御モジュールのために使用され得る。
ＣＲＩＳＰＲｉはゲノム規模の分析および調節に適している。
ＣＲＩＳＰＲｉ方法はＤＮＡ標的化ＲＮＡの使用に基づいており、ＤＮＡ標的化断片の
みが特異的遺伝子標的のために設計される必要がある。大規模ＤＮＡオリゴヌクレオチド
合成技術の発達に伴い、ゲノム標的のために特有の２０ｂｐ領域を含むオリゴヌクレオチ
ドの大きなセットを作成することは、迅速かつ費用がかからない。これらオリゴヌクレオ
チドライブラリーによって、大量の個々の遺伝子を標的して遺伝子機能を推測し、または
、遺伝子対を標的して遺伝子相互作用をマッピングすることが可能になり得る。さらに、
小さなサイズのｓｇＲＮＡによって複数の要素を同一発現ベクターに連結することを可能
にするように、ＣＲＩＳＰＲｉを用いて、遺伝子の大きなセットを同時に調節し得る。
ＣＲＩＳＰＲｉは微生物ゲノムを操作するための新しいツールを提供する
ＣＲＩＳＰＲｉプラットフォームはコンパクトかつ自給自足型であるため、異なる有機
体に適応させることができる。ＣＲＩＳＰＲｉは、病原菌または産業上有益な有機体を含
む、遺伝子工学方法があまり発達していない非モデル有機体を研究するために強力なツー
ルである。ほとんどの真核生物と違い、多くの細菌はＲＮＡｉ機構に欠ける。その結果、
設計合成配列ＲＮＡを用いた内在性遺伝子の調節は現在限られている。ＣＲＩＳＰＲｉは
、微生物内の遺伝子の乱れのためのＲＮＡｉ様方法を提供し得る。
転写制御ネットワークを操作するためのプラットフォームとしてのＣＲＩＳＰＲｉ
ＣＲＩＳＰＲｉを、転写制御ネットワークを操作するための柔軟なフレームワークとし
て利用することができる。ＣＲＩＳＰＲｉプラットフォームは、実質的にＲＮＡ誘導ＤＮ
Ａ結合複合体であるため、多種多様な制御機構をゲノム内の特定の部位に誘導するための
柔軟な足場配列も提供する。標的遺伝子の転写を単に遮断することを超え、ｄＣａｓ９タ
ンパク質を多くの制御ドメインに結合させて異なる生物学的プロセスを調節する、および
、異なる機能上の結果（たとえば、転写活性化、クロマチン修飾）を引き起こすことが可
能である。
ＣＲＩＳＰＲｉシステムにおいて、複数のｓｇＲＮＡを、一つの上流ｓｇＲＮＡが別の
下流ｓｇＲＮＡの発現を制御する転写回路内に結びつけることも可能である。微生物内の
ＲＮＡ分子は短命である傾向にあるため、ｓｇＲＮＡによって調節される遺伝子プログラ
ムは、タンパク質発現および分解といった遅いプロセスを含む回路とは異なる、素早い動
態を示し得ると我々は考える。つまり、ＣＲＩＳＰＲｉシステムはゲノム規模の機能性プ
ロファイリング、微生物代謝工学および細胞リプログラミングを含む、様々な生物学医療
研究および臨床応用に適した一般的な遺伝子プログラミングプラットフォームである。
実施例５：キメラ部位特異的ポリペプチドを使ってヒト細胞の転写を調節（活性化または
抑制）し得る。
ヒト細胞で、触媒的に不活性なＣａｓ９および活性化因子ドメインまたは抑制因子ドメ
インを含む融合タンパク質が、標的ＤＮＡからの転写をそれぞれ増大または減少させ得る
ことを我々は実証した。
図５５。ヒト化した触媒的に不活性なＣａｓ９を転写活性化因子ドメインＶＰ６４と融
合した。（Ａ）このシステムを用いた遺伝子活性化の効率を試験するため、ＧＦＰを制御
するＧＡＬ４ ＵＡＳ誘導性プロモーターをＨＥＫ２９３（ヒト組織培養細胞）ゲノムに
挿入した。（Ｂ）ＧＡＬ４ ＵＡＳプロモーターは酵母菌由来のタンパク質ＧＡＬ４の存
在下で誘導され得る。ｄＣａｓ９−ＶＰ６４融合は、ＧＡＬ４ ＵＡＳ領域に結合する同
種誘導ＲＮＡの存在下ではＧＡＬ４ ＵＡＳを２０倍効率的に活性化し得る。（Ｃ）ｄＣ
ａｓ９−ＶＰ６４活性化の顕微鏡画像である。（Ｄ）ｄＣａｓ９−ＶＰ６４活性化のため
のフローサイコメトリーデータである。
図５６ ヒト化した触媒的に不活性なＣａｓ９を転写抑制因子ドメインＫＲＡＢと融合
した。（上部）良く特徴づけされたプロモーターであるＳＶ４０初期プロモーターを標的
とする１０個の誘導ＲＮＡおよびＥＧＦＰコード領域を標的とする１個の誘導ＲＮＡを設
計した。（下部）非キメラｄＣａｓ９を用いて、Ｐ９およびＮＴ２のｇＲＮＡに関して２
〜３倍の抑制を観察した。この効率を、ｄＣａｓ９−ＫＲＡＢ融合を用いて大いに向上さ
せた。たとえば、ｄＣａｓ９−ＫＲＡＢ融合で、Ｐ９およびＮＴ２はそれぞれ２０倍およ
び１５倍の抑制を示した。さらに、Ｐ１〜Ｐ６は、融合タンパク質が使用された際、発現
において著しい減少を示したが、非キメラｄＣａｓ９が使用された際は、限られた抑制を
示した。
実施例６：Ｃａｓ９は、天然に存在しない人工誘導ＲＮＡを使って標的ＤＮＡの切断を実
施し得る
人工ｃｒＲＮＡおよび人工ｔｒａｃｒＲＮＡを、Ｓ．ピオゲネスｃｒＲＮＡおよびｔｒ
ａｃｒＲＮＡの天然に存在する転写物のタンパク質結合断片に基づいて設計し、Ｓ．ピオ
ゲネスｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ二重鎖の非対称バルジを模倣するように修飾した（
図５７Ａに示される人工（上部）および天然（下部）ＲＮＡ分子双方のタンパク質結合ド
メインのバルジを参照されたい）。人工ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は天然ｔｒａｃｒＲＮＡと
５０％未満の同一性を共有する。ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡタンパク質結合二重鎖の
予想される二次構造は、双方のＲＮＡ対に関しては同じであるが、残りのＲＮＡの予想さ
れた構造はかなり異なる。
図５７は、天然に存在するｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡとほんの少ししか共有し
ない（だいたい５０％の同一性）人工配列は、Ｃａｓ９と機能してＤＮＡ標的化ＲＮＡの
タンパク質結合ドメインの構造が保存される限り、標的ＤＮＡを切断し得ることを実証す
る。（Ａ）Ｓ．ピオゲネスｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡ並びに人工ｔｒａｃｒＲＮ
ＡおよびｃｒＲＮＡの同時折り畳み。（Ｂ）Ｓ．ピオゲネスＣａｓ９およびｔｒａｃｒＲ
ＮＡ：ｃｒＲＮＡオルソログの組み合わせを用いてプラスミドＤＮＡ切断アッセイを実施
した。Ｓｐｙ−Ｓ．ピオゲネス、Ｌｉｎ−Ｌ．イノキュア、Ｎｍｅ−Ｎ．メニンギティデ
ィス、Ｐｍｕ−Ｐ．マルトシダ。Ｓ．ピオゲネスＣａｓ９はいくつかによっては誘導され
得るが、選択される細胞種に天然に存在する全てのｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡオルソ
ログによってではない。特に、Ｓ．ピオゲネスＣａｓ９は、ＣＲＩＳＰＲシステムに完全
に関連していない配列を用いて、天然に存在するＤＮＡ標的化ＲＮＡのタンパク質結合断
片の構造に基づいて設計された人工ｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡ対によって誘導され得
る。
使用された人工“ｔｒａｃｒＲＮＡ”（活性化ＲＮＡ）は、５’−ＧＵＵＵＵＣＣＣＵ
ＵＵＵＣＡＡＡＧＡＡＡＵＣＵＣＣＵＧＧＧＣＡＣＣＵＡＵＣＵＵＣＵＵＡＧＧＵＧＣＣ
ＣＵＣＣＣＵＵＧＵＵＵＡＡＡＣＣＵＧＡＣＣＡＧＵＵＡＡＣＣＧＧＣＵＧＧＵＵＡＧＧ
ＵＵＵＵＵ−３’（配列番号１３４７）であった。使用された人工“ｃｒＲＮＡ”（標的
化ＲＮＡ）は、：５’−ＧＡＧＡＵＵＵＡＵＧＡＡＡＡＧＧＧＡＡＡＡＣ−３’（配列番
号１３４８）であった。
実施例７：非ヒト遺伝子組み換え体の作成
Ｃａｓ９を発現する遺伝子組み換えマウス（非改変、減少した酵素活性を有するように
改変された、上記のいずれかの目的のために融合タンパク質として改変された、のいずれ
か）を、当該技術分野の当業者には公知の従来の方法を用いて作成する（たとえば、（ｉ
）マウス胚幹細胞（ＥＳ細胞）の標的座位（たとえばＲＯＳＡ２６）での遺伝子ノックイ
ンに続く胚盤胞注入およびキメラマウスの作成；（ｉｉ）無作為に組み込む導入遺伝子の
受精したマウス卵母細胞の前核への注入に続く偽妊娠雌への卵細胞着床；など）。Ｃａｓ
９タンパク質は、少なくとも胚幹細胞で発現するプロモーターの制御下にあり、さらに、
一時的または組織特異的な制御下にあり得る（たとえば、薬剤誘導性、Ｃｒｅ／Ｌｏｘベ
ースプロモーターシステムによって制御される、など）。一度導入遺伝子Ｃａｓ９を発現
するマウスの株を作成すると、胚幹細胞を単離、培養し、いくつかの場合では、ＥＳ細胞
を今後の使用のために凍結する。単離されたＥＳ細胞はＣａｓ９を発現するため（また、
いくつかの場合でその発現は一時的な制御下（たとえば薬剤誘導性）であるため、新しい
ノックアウトまたはノックイン細胞（および、従って、マウス）は、特定の選択座位にｃ
ａｓ９を標的とする適切に設計されたＤＮＡ標的化ＲＮＡを導入することで、ゲノム内の
いずれかの所望する座位で急速に作成される。そのようなシステム、およびその多くの変
化形を用いて、任意の選択座位において新たな遺伝子組み換え生物を作成する。修飾Ｃａ
ｓ９を使用して転写を調節、および／またはＤＮＡを修飾、および／またはＤＮＡに関連
したポリペプチドを修飾する場合、単純に、適切なＤＮＡ標的化ＲＮＡを所望するＣａｓ
９発現細胞に導入することで、任意の選択遺伝子（または、任意の選択発現産物、または
、任意の選択ゲノム座位）の性質を研究するためにＥＳ細胞そのもの（または、ＥＳ細胞
由来のいずれかの分化細胞（たとえば、マウス全体、分化細胞株など）が使用される。
本発明は、その具体的な実施形態への参照と共に説明されてきたが、一方で、本発明の真の趣旨および範囲から逸脱することなく様々な変更がなされ得、同等物が置き換えられ得ることを当業者は理解するべきである。さらに、特定の状況、材料、物質の組成、プロセス、プロセス工程（単数）または工程（複数）を本発明の目的、主旨および範囲に適応させるために、多くの修正がなされ得る。そのような修正は全てここに付属される特許請求の範囲内に含まれることが意図される。
本発明は一態様において、以下を提供する。
[項目１]
（ｉ）標的ＤＮＡ内の配列に対し相補的なヌクレオチド配列を含む第一セグメント；および
（ｉｉ）部位特異的修飾ポリペプチドと相互作用する第二セグメント
を含む、ＤＮＡ標的化ＲＮＡ。
[項目２]
前記第一セグメントが標的ＤＮＡ内の配列に対し１００％の相補性を有する８個のヌクレオチドを含む、項目１に記載のＤＮＡ標的化ＲＮＡ。
[項目３]
前記第二セグメントが、配列番号５６３〜６８２に記載のヌクレオチド配列のうちのいずれか１つに対して、一連の少なくとも８個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも６０％の同一性を有するヌクレオチド配列、またはその相補体を含む、項目１に記載のＤＮＡ標的化ＲＮＡ。
[項目４]
前記第二セグメントが、配列番号４３１〜５６２に記載のヌクレオチド配列のうちのいずれか１つに対して、一連の少なくとも８個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも６０％の同一性を有するヌクレオチド配列、またはその相補体を含む、項目１に記載のＤＮＡ標的化ＲＮＡ。
[項目５]
前記部位特異的修飾ポリペプチドが、図３に示されるＣａｓ９／Ｃｓｎ１アミノ酸配列のアミノ酸７〜１６６または７３１〜１００３に対して、または配列番号１〜２５６および７９５〜１３４６として記載されるアミノ酸配列のうちのいずれかにおける対応部分に対して、少なくとも約７５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、項目１に記載のＤＮＡ標的化ＲＮＡ。
[項目６]
項目１に記載のＤＮＡ標的化ＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む、ＤＮＡポリヌクレオチド。
[項目７]
項目６に記載のＤＮＡポリヌクレオチドを含む、組み換え発現ベクター。
[項目８]
前記ＤＮＡ標的化ＲＮＡをコードする前記ヌクレオチド配列がプロモーターに作動可能に連結している、項目７に記載の組み換え発現ベクター。
[項目９]
前記プロモーターが誘導性プロモーターである、項目８に記載の組み換え発現ベクター。
[項目１０]
項目１に記載のＤＮＡ標的化ＲＮＡをコードするヌクレオチド配列が複数のクローニング部位をさらに含む、項目７に記載の組み換え発現ベクター。
[項目１１]
項目６に記載のＤＮＡポリヌクレオチドを含む、インビトロ遺伝子改変宿主細胞。
[項目１２]
（ｉ）
（ａ）標的ＤＮＡ内の配列に対し相補的なヌクレオチド配列を含む第一セグメント；および
（ｂ）部位特異的修飾ポリペプチドと相互作用する第二セグメント
を含むＤＮＡ標的化ＲＮＡをコードするヌクレオチド配列；並びに
（ｉｉ）
（ａ）前記ＤＮＡ標的化ＲＮＡと相互作用するＲＮＡ結合部位；および
（ｂ）部位特異的酵素活性を示す活性部位であって、酵素活性の部位が前記ＤＮＡ標的化ＲＮＡによって決定される、活性部位
を含む前記部位特異的修飾ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列
を含む、組み換え発現ベクター。
[項目１３]
（ｉ）
（ａ）標的ＤＮＡ内の配列に対し相補的なヌクレオチド配列を含む第一セグメント；および
（ｂ）部位特異的修飾ポリペプチドと相互作用する第二セグメント
を含むＤＮＡ標的化ＲＮＡをコードするヌクレオチド配列；並びに
（ｉｉ）
（ａ）前記ＤＮＡ標的化ＲＮＡと相互作用するＲＮＡ結合部位；および
（ｂ）前記標的ＤＮＡ内の転写を調節する活性部位であって、前記標的ＤＮＡ内の転写が調節される部位が前記ＤＮＡ標的化ＲＮＡによって決定される、活性部位
を含む、前記部位特異的修飾ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列
を含む、組み換え発現ベクター。
[項目１４]
（ｉ）標的ＤＮＡ内の配列に対し相補的なヌクレオチド配列を含むＤＮＡ標的化ＲＮＡと相互作用するＲＮＡ結合部位；および
（ｉｉ）低減された部位特異的酵素活性を示す活性部位であって、酵素活性の部位が前記ＤＮＡ標的化ＲＮＡによって決定される、活性部位
を含む、変異型部位特異的修飾ポリペプチド。
[項目１５]
Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）配列（配列番号８）のＨ８４０Ａ変異、または配列番号１〜２５６および７９５〜１３４６として記載されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する変異を含む、項目１４に記載の変異型部位特異的修飾ポリペプチド。
[項目１６]
Ｓ．ピオゲネス配列（配列番号８）のＤ１０Ａ変異、または配列番号１〜２５６および７９５〜１３４６として記載されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する変異を含む、項目１４に記載の変異型部位特異的修飾ポリペプチド。
[項目１７]
（ｉ）Ｓ．ピオゲネス配列（配列番号８）のＤ１０Ａ変異、または配列番号１〜２５６および７９５〜１３４６として記載されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する変異；並びに（ｉｉ）Ｓ．ピオゲネス配列（配列番号８）のＨ８４０Ａ変異、または配列番号１〜２５６および７９５〜１３４６として記載されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する変異を両方含む、項目１４に記載の変異型部位特異的修飾ポリペプチド。
[項目１８]
（ｉ）標的ＤＮＡ内の配列に対し相補的なヌクレオチド配列を含むＤＮＡ標的化ＲＮＡと相互作用するＲＮＡ結合部位；および
（ｉｉ）部位特異的酵素活性を示す活性部位であって、酵素活性の部位が前記ＤＮＡ標的化ＲＮＡによって決定される、活性部位
を含む、キメラ部位特異的修飾ポリペプチド。
[項目１９]
図３に示されるＣａｓ９／Ｃｓｎ１アミノ酸配列のアミノ酸７〜１６６もしくは７３１〜１００３に対して、または配列番号１〜２５６および７９５〜１３４６として記載されるアミノ酸配列のうちのいずれかにおける対応部分に対して、少なくとも約７５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、項目１８に記載のキメラ部位特異的修飾ポリペプチド
[項目２０]
前記ＤＮＡ標的化ＲＮＡが、配列番号５６３〜６８２に記載のヌクレオチド配列のうちのいずれか１つに対して、一連の少なくとも８個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも６０％の同一性を有するヌクレオチド配列をさらに含む、項目１８に記載のキメラ部位特異的修飾ポリペプチド。
[項目２１]
前記ＤＮＡ標的化ＲＮＡが、配列番号４３１〜５６２に記載のヌクレオチド配列のうちのいずれか１つに対して、一連の少なくとも８個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも６０％の同一性を有するヌクレオチド配列をさらに含む、項目１８に記載のキメラ部位特異的修飾ポリペプチド。
[項目２２]
前記酵素活性が前記標的ＤＮＡを修飾する、項目１８に記載のキメラ部位特異的修飾ポリペプチド。
[項目２３]
前記酵素活性が、ヌクレアーゼ活性、メチルトランスフェラーゼ活性、脱メチル化酵素活性、ＤＮＡ修復活性、ＤＮＡ損傷活性、脱アミノ化活性、ジスムターゼ活性、アルキル化活性、脱プリン活性、酸化活性、ピリミジンダイマー形成活性、インテグラーゼ活性、トランスポサーゼ活性、リコンビナーゼ活性、ポリメラーゼ活性、リガーゼ活性、ヘリカーゼ活性、光回復酵素活性またはグリコシラーゼ活性である、項目２２に記載のキメラ部位特異的修飾ポリペプチド。
[項目２４]
前記酵素活性がヌクレアーゼ活性である、項目２３に記載のキメラ部位特異的修飾ポリペプチド。
[項目２５]
前記ヌクレアーゼ活性が前記標的ＤＮＡ内で二重鎖切断を引き起こす、項目２４に記載のキメラ部位特異的修飾ポリペプチド。
[項目２６]
前記酵素活性が前記標的ＤＮＡと結合した標的ポリペプチドを修飾する、項目１８に記載のキメラ部位特異的修飾ポリペプチド。
[項目２７]
前記酵素活性が、メチルトランスフェラーゼ活性、脱メチル化酵素活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、脱アセチル化酵素活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、ユビキチンリガーゼ活性、脱ユビキチン化活性、アデニル化活性、脱アデニル化活性、ＳＵＭＯ化活性、脱ＳＵＭＯ化活性、リボシル化活性、脱リボシル化活性、ミリストイル化活性または脱ミリストイル化活性である、項目２６に記載のキメラ部位特異的修飾ポリペプチド。
[項目２８]
前記標的ポリペプチドがヒストンであり、前記酵素活性がメチルトランスフェラーゼ活性、脱メチル化酵素活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、脱アセチル化酵素活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、ユビキチンリガーゼ活性または脱ユビキチン化活性である、項目２６に記載のキメラ部位特異的修飾ポリペプチド。
[項目２９]
項目１８に記載のキメラ部位特異的修飾ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、ＲＮＡポリヌクレオチド。
[項目３０]
項目１８に記載のキメラ部位特異的修飾ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、ＤＮＡポリヌクレオチド。
[項目３１]
項目３０に記載のポリヌクレオチドを含む、組み換え発現ベクター。
[項目３２]
前記ポリヌクレオチドがプロモーターに作動可能に連結している、項目３１に記載の組み換え発現ベクター。
[項目３３]
前記プロモーターが誘導性プロモーターである、項目３２に記載の組み換え発現ベクター。
[項目３４]
項目３０に記載のポリヌクレオチドを含む、インビトロ遺伝子改変宿主細胞。
[項目３５]
（ｉ）標的ＤＮＡ内の配列に対し相補的なヌクレオチド配列を含むＤＮＡ標的化ＲＮＡと相互作用するＲＮＡ結合部位；および
（ｉｉ）前記標的ＤＮＡ内の転写を調節する活性部位であって、前記標的ＤＮＡ内の転写が調節される部位が前記ＤＮＡ標的化ＲＮＡによって決定される、活性部位
を含む、キメラ部位特異的修飾ポリペプチド。
[項目３６]
前記活性部位が前記標的ＤＮＡ内の転写を増加させる、項目３５に記載のキメラ部位特異的修飾ポリペプチド。
[項目３７]
前記活性部位が前記標的ＤＮＡ内の転写を減少させる、項目３５に記載のキメラ部位特異的修飾ポリペプチド。
[項目３８]
ＤＮＡ標的化ＲＮＡと相互作用するＲＮＡ結合部位；および部位特異的酵素活性を示す活性部位であって、酵素活性の部位が前記ＤＮＡ標的化ＲＮＡによって決定される、活性部位を含む組換え部位特異的修飾ポリペプチドを含む、遺伝子改変細胞。
[項目３９]
前記部位特異的修飾ポリペプチドが、図３に示されるＣａｓ９／Ｃｓｎ１アミノ酸配列のアミノ酸７〜１６６もしくは７３１〜１００３に対して、または配列番号１〜２５６および７９５〜１３４６として記載されるアミノ酸配列のうちのいずれかにおける対応部分に対して、少なくとも約７５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、項目３８に記載の遺伝子改変細胞。
[項目４０]
前記細胞が、古細菌細胞、細菌細胞、真核細胞、真核単細胞生物、体細胞、生殖細胞、幹細胞、植物細胞、藻細胞、動物細胞、無脊椎動物細胞、脊椎動物細胞、魚類細胞、カエル細胞、鳥類細胞、哺乳類細胞、ブタ細胞、雌ウシ細胞、ヤギ細胞、ヒツジ細胞、げっ歯類細胞、ラット細胞、マウス細胞、非ヒト霊長類細胞、およびヒト細胞からなる群から選択される、項目３８に記載の遺伝子改変細胞。
[項目４１]
ゲノムが、（ｉ）ＤＮＡ標的化ＲＮＡと相互作用するＲＮＡ結合部位；および（ｉｉ）部位特異的酵素活性を示す活性部位であって、酵素活性の部位が前記ＤＮＡ標的化ＲＮＡによって決定される、活性部位を含む組換え部位特異的修飾ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子を含んでいる、遺伝子導入非ヒト生物
[項目４２]
前記部位特異的修飾ポリペプチドが、図３に示されるＣａｓ９／Ｃｓｎ１アミノ酸配列のアミノ酸７〜１６６もしくは７３１〜１００３に対して、または配列番号１〜２５６および７９５〜１３４６として記載されるアミノ酸配列のうちのいずれかにおける対応部分に対して、少なくとも約７５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、項目４１に記載の遺伝子導入生物。
[項目４３]
前記生物が、古細菌、細菌、真核単細胞生物、藻、植物、動物、無脊椎動物、ハエ、虫、刺胞動物、脊椎動物、魚、カエル、鳥、哺乳動物、有蹄動物、げっ歯類動物、ラット、マウス、および非ヒト霊長類動物からなる群から選択される、項目４１に記載の遺伝子導入生物。
[項目４４]
（ｉ）
（ａ）標的ＤＮＡ内の配列に対し相補的なヌクレオチド配列を含む第一セグメント；および
（ｂ）部位特異的修飾ポリペプチドと相互作用する第二セグメント
を含むＤＮＡ標的化ＲＮＡ、またはそれをコードするＤＮＡポリヌクレオチド；並びに
（ｉｉ）
（ａ）ＤＮＡ標的化ＲＮＡと相互作用するＲＮＡ結合部位；および
（ｂ）部位特異的酵素活性を示す活性部位であって、酵素活性の部位が前記ＤＮＡ標的化ＲＮＡによって決定される、活性部位
を含む前記部位特異的修飾ポリペプチド、またはそれをコードするポリヌクレオチド
を含む、組成物。
[項目４５]
前記ＤＮＡ標的化ＲＮＡの前記第一セグメントが、前記標的ＤＮＡ内の配列に対して少なくとも１００％の相補性を有する８個のヌクレオチドを含む、項目４４に記載の組成物。
[項目４６]
前記ＤＮＡ標的化ＲＮＡの前記第二セグメントが、配列番号５６３〜６８２に記載のヌクレオチド配列のうちのいずれか１つに対して、一連の少なくとも８個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも６０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、項目４４に記載の組成物。
[項目４７]
前記ＤＮＡ標的化ＲＮＡの前記第二セグメントが、配列番号４３１〜５６２に記載のヌクレオチド配列のうちのいずれか１つに対して、一連の少なくとも８個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも６０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、項目４４に記載の組成物。
[項目４８]
前記部位特異的修飾ポリペプチドが、図３に示されるＣａｓ９／Ｃｓｎ１アミノ酸配列のアミノ酸７〜１６６もしくは７３１〜１００３に対して、または配列番号１〜２５６および７９５〜１３４６として記載されるアミノ酸配列のうちのいずれかにおける対応部分に対して、少なくとも約７５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、項目４４に記載の組成物。
[項目４９]
前記酵素活性が前記標的ＤＮＡを修飾する、項目４４に記載の組成物。
[項目５０]
前記酵素活性が、ヌクレアーゼ活性、メチルトランスフェラーゼ活性、脱メチル化酵素活性、ＤＮＡ修復活性、ＤＮＡ損傷活性、脱アミノ化活性、ジスムターゼ活性、アルキル化活性、脱プリン活性、酸化活性、ピリミジンダイマー形成活性、インテグラーゼ活性、トランスポサーゼ活性、リコンビナーゼ活性、ポリメラーゼ活性、リガーゼ活性、ヘリカーゼ活性、光回復酵素活性またはグリコシラーゼ活性である、項目４９に記載の組成物。
[項目５１]
前記酵素活性がヌクレアーゼ活性である、項目５０に記載の組成物。
[項目５２]
前記ヌクレアーゼ活性が前記標的ＤＮＡ内で二重鎖切断を引き起こす、項目５１に記載の組成物。
[項目５３]
前記酵素活性が前記標的ＤＮＡと結合した標的ポリペプチドを修飾する、項目４４に記載の組成物。
[項目５４]
前記酵素活性が、メチルトランスフェラーゼ活性、脱メチル化酵素活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、脱アセチル化酵素活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、ユビキチンリガーゼ活性、脱ユビキチン化活性、アデニル化活性、脱アデニル化活性、ＳＵＭＯ化活性、脱ＳＵＭＯ化活性、リボシル化活性、脱リボシル化活性、ミリストイル化活性または脱ミリストイル化活性である、項目５３に記載の組成物。
[項目５５]
前記標的ポリペプチドがヒストンであり、前記酵素活性がメチルトランスフェラーゼ活性、脱メチル化酵素活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、脱アセチル化酵素活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、ユビキチンリガーゼ活性または脱ユビキチン化活性である、項目５３に記載の組成物。
[項目５６]
前記ＤＮＡ標的化ＲＮＡが二重分子ＤＮＡ標的化ＲＮＡであり、前記組成物が標的化ＲＮＡおよび活性化ＲＮＡの両方を含み、その二本鎖形成セグメントは相補的であり、ハイブリダイズして前記ＤＮＡ標的化ＲＮＡの前記第二セグメントを形成する、項目４４に記載の組成物。
[項目５７]
前記活性化ＲＮＡの前記二本鎖形成セグメントが、配列番号４３１〜６８２に記載のヌクレオチド配列のうちのいずれか１つに対して、一連の少なくとも８個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも６０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、項目５６に記載の組成物。
[項目５８]
（ｉ）項目４４に記載のＤＮＡ標的化ＲＮＡ、またはそれをコードするＤＮＡポリヌクレオチド；および
（ｉｉ）核酸を安定化させるための緩衝液
を含む、組成物。
[項目５９]
（ｉ）項目４４に記載の部位特異的修飾ポリペプチド、またはそれをコードするポリヌクレオチド；並びに
（ｉｉ）核酸および／またはタンパク質を安定化させるための緩衝液
を含む、組成物。
[項目６０]
（ｉ）
（ａ）標的ＤＮＡ内の配列に対し相補的なヌクレオチド配列を含む第一セグメント；および
（ｂ）部位特異的修飾ポリペプチドと相互作用する第二セグメント
を含むＤＮＡ標的化ＲＮＡ、またはそれをコードするＤＮＡポリヌクレオチド；並びに
（ｉｉ）
（ａ）前記ＤＮＡ標的化ＲＮＡと相互作用するＲＮＡ結合部位；および
（ｂ）前記標的ＤＮＡ内の転写を調節する活性部位であって、前記標的ＤＮＡ内の転写が調節される部位が前記ＤＮＡ標的化ＲＮＡによって決定される、活性部位
を含む前記部位特異的修飾ポリペプチド、またはそれをコードするポリヌクレオチド
を含む、組成物。
[項目６１]
前記活性部位が前記標的ＤＮＡ内の転写を増加させる、項目６０に記載の組成物。
[項目６２]
前記活性部位が前記標的ＤＮＡ内の転写を減少させる、項目６０に記載の組成物。
[項目６３]
（ｉ）項目６０に記載の部位特異的修飾ポリペプチド、またはそれをコードするポリヌクレオチド；並びに
（ｉｉ）核酸および／またはタンパク質を安定化させるための緩衝液
を含む、組成物。
[項目６４]
標的ＤＮＡの部位特異的修飾の方法であって、
前記標的ＤＮＡを、
（ｉ）
（ａ）前記標的ＤＮＡ内の配列に対し相補的なヌクレオチド配列を含む第一セグメント；および
（ｂ）部位特異的修飾ポリペプチドと相互作用する第二セグメント
を含むＤＮＡ標的化ＲＮＡ、またはそれをコードするＤＮＡポリヌクレオチド；並びに
（ｉｉ）
（ａ）前記ＤＮＡ標的化ＲＮＡと相互作用するＲＮＡ結合部位；および
（ｂ）部位特異的酵素活性を示す活性部位
を含む部位特異的修飾ポリペプチド、またはそれをコードするポリヌクレオチド
と接触させることを含む、上記方法。
[項目６５]
前記標的ＤＮＡが染色体外に存在する、項目６４に記載の方法。
[項目６６]
前記標的ＤＮＡが５’−ＣＣＹ−３’である相補鎖のＰＡＭ配列を含み、ここでＹはあ
らゆるＤＮＡヌクレオチドであり、Ｙは前記標的ＤＮＡの相補鎖の標的配列のすぐ５’側
である、項目６４に記載の方法。
[項目６７]
前記標的ＤＮＡがインビトロにおける染色体の一部である、項目６４に記載の方法。[項目６８]
前記標的ＤＮＡがインビボにおける染色体の一部である、項目６４に記載の方法。
[項目６９]
前記標的ＤＮＡが細胞内の染色体の一部である、項目６４に記載の方法。
[項目７０]
前記細胞が、古細菌細胞、細菌細胞、真核細胞、真核単細胞生物、体細胞、生殖細胞、幹細胞、植物細胞、藻細胞、動物細胞、無脊椎動物細胞、脊椎動物細胞、魚類細胞、カエル細胞、鳥類細胞、哺乳類細胞、ブタ細胞、雌ウシ細胞、ヤギ細胞、ヒツジ細胞、げっ歯類細胞、ラット細胞、マウス細胞、非ヒト霊長類細胞、およびヒト細胞からなる群から選択される、項目６９に記載の方法。
[項目７１]
前記ＤＮＡ標的化ＲＮＡが、配列番号５６３〜６８２に記載のヌクレオチド配列のうちのいずれか１つに対して、一連の少なくとも８個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも６０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、項目６４に記載の方法。
[項目７２]
前記ＤＮＡ標的化ＲＮＡが、配列番号４３１〜５６２に記載のヌクレオチド配列のうちのいずれか１つに対して、一連の少なくとも８個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも６０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、項目６４に記載の方法。
[項目７３]
前記ＤＮＡ修飾ポリペプチドが、図３に示されるＣａｓ９／Ｃｓｎ１アミノ酸配列のアミノ酸７〜１６６もしくは７３１〜１００３に対して、または配列番号１〜２５６および７９５〜１３４６として記載されるアミノ酸配列のうちのいずれかにおける対応部分に対して、少なくとも約７５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、項目６４に記載の方法。
[項目７４]
前記酵素活性が前記標的ＤＮＡを修飾する、項目６４に記載の方法。
[項目７５]
前記酵素活性がヌクレアーゼ活性、メチルトランスフェラーゼ活性、脱メチル化酵素活性、ＤＮＡ修復活性、ＤＮＡ損傷活性、脱アミノ化活性、ジスムターゼ活性、アルキル化活性、脱プリン活性、酸化活性、ピリミジンダイマー形成活性、インテグラーゼ活性、トランスポサーゼ活性、リコンビナーゼ活性、ポリメラーゼ活性、リガーゼ活性、ヘリカーゼ活性、光回復酵素活性またはグリコシラーゼ活性である、項目７４に記載の方法。
[項目７６]
前記ＤＮＡ修飾酵素活性がヌクレアーゼ活性である、項目７５に記載の方法。
[項目７７]
前記ヌクレアーゼ活性が前記標的ＤＮＡ内で二重鎖切断を引き起こす、項目７６に記載の方法。
[項目７８]
前記接触が非相同末端結合または相同組換え修復に許容的な条件下で起こる、項目７７に記載の方法。
[項目７９]
前記標的ＤＮＡをドナーポリヌクレオチドと接触させることをさらに含み、前記ドナーポリヌクレオチド、前記ドナーポリヌクレオチドの一部、前記ドナーポリヌクレオチドのコピー、または前記ドナーポリヌクレオチドのコピーの一部が前記標的ＤＮＡに組み込まれる、項目７８に記載の方法。
[項目８０]
細胞をドナーポリヌクレオチドと接触させることを含まず、前記標的ＤＮＡ内のヌクレオチドが欠失されるように前記標的ＤＮＡが修飾される、項目７８に記載の方法。
[項目８１]
前記酵素活性が前記標的ＤＮＡと結合した標的ポリペプチドを修飾する、項目６４に記載の方法。
[項目８２]
前記酵素活性が、メチルトランスフェラーゼ活性、脱メチル化酵素活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、脱アセチル化酵素活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、ユビキチンリガーゼ活性、脱ユビキチン化活性、アデニル化活性、脱アデニル化活性、ＳＵＭＯ化活性、脱ＳＵＭＯ化活性、リボシル化活性、脱リボシル化活性、ミリストイル化活性または脱ミリストイル化活性である、項目８１に記載の方法。
[項目８３]
前記標的ポリペプチドがヒストンであり、前記酵素活性がメチルトランスフェラーゼ活性、脱メチル化酵素活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、脱アセチル化酵素活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、ユビキチンリガーゼ活性または脱ユビキチン化活性である、項目８１に記載の方法。
[項目８４]
複合体が活性化ＲＮＡをさらに含む、項目６４に記載の方法。
[項目８５]
前記活性化ＲＮＡが、配列番号４３１〜６８２に記載のヌクレオチド配列のうちのいずれか１つに対して、一連の少なくとも８個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも６０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、項目８４に記載の方法。
[項目８６]
標的ＤＮＡ内の部位特異的転写を調節する方法であって、前記標的ＤＮＡを、
（ｉ）
（ａ）前記標的ＤＮＡ内の配列に対し相補的なヌクレオチド配列を含む第一セグメント；および
（ｂ）部位特異的修飾ポリペプチドと相互作用する第二セグメント
を含むＤＮＡ標的化ＲＮＡ、またはそれをコードするＤＮＡポリヌクレオチド；並びに
（ｉｉ）
（ａ）前記ＤＮＡ標的化ＲＮＡと相互作用するＲＮＡ結合部位；および
（ｂ）転写を調節する活性部位
を含む部位特異的修飾ポリペプチド、またはそれをコードするポリヌクレオチド
と接触させることを含み、前記接触により前記標的ＤＮＡ内の転写の調節がもたらされる、上記方法。
[項目８７]
前記標的ＤＮＡ内の転写が増加する、項目８６に記載の方法。
[項目８８]
前記標的ＤＮＡ内の転写が減少する、項目８６に記載の方法。
[項目８９]
標的ＤＮＡにおける部位特異的修飾の方法であって、
前記標的ＤＮＡを、
（ｉ）
（ａ）前記標的ＤＮＡ内の配列に対し相補的なヌクレオチド配列を含む第一セグメント；および
（ｂ）部位特異的修飾ポリペプチドと相互作用する第二セグメント
を含むＤＮＡ標的化ＲＮＡ、またはそれをコードするＤＮＡポリヌクレオチド；並びに
（ｉｉ）
（ａ）前記ＤＮＡ標的化ＲＮＡと相互作用するＲＮＡ結合部位；および
（ｂ）前記標的ＤＮＡ内の転写を調節する活性部位
を含む部位特異的修飾ポリペプチド、またはそれをコードするポリヌクレオチド
と接触させることを含む、上記方法。
[項目９０]
前記部位特異的修飾ポリペプチドが前記標的ＤＮＡ内の転写を増加させる、項目８６に記載の方法。
[項目９１]
前記部位特異的修飾ポリペプチドが前記標的ＤＮＡ内の転写を減少させる、項目８６に記載の方法。
[項目９２]
細胞内の標的ＤＮＡの部位特異的切断および修飾を促進する方法であって、
前記細胞に、
（ｉ）
（ａ）前記標的ＤＮＡ内の配列に対し相補的なヌクレオチド配列を含む第一セグメント；および
（ｂ）部位特異的修飾ポリペプチドと相互作用する第二セグメント
を含むＤＮＡ標的化ＲＮＡ、またはそれをコードするＤＮＡポリヌクレオチド；並びに
（ｉｉ）
（ａ）前記ＤＮＡ標的化ＲＮＡと相互作用するＲＮＡ結合部位；および
（ｂ）前記標的ＤＮＡ内に二重鎖切断を生成するヌクレアーゼ活性を示す活性部位
を含む部位特異的修飾ポリペプチド、またはそれをコードするポリヌクレオチド；
を導入することを含み、
前記二重鎖切断の部位は前記ＤＮＡ標的化ＲＮＡによって決定され、前記接触は非相同末端結合または相同組換え修復に許容的な条件下で起こり、前記標的ＤＮＡが切断および再結合されることで修飾されたＤＮＡ配列が生成される、
上記方法。
[項目９３]
前記標的ＤＮＡをドナーポリヌクレオチドと接触させることをさらに含み、前記ドナーポリヌクレオチド、前記ドナーポリヌクレオチドの一部、前記ドナーポリヌクレオチドのコピー、または前記ドナーポリヌクレオチドのコピーの一部が標的ＤＮＡに組み込まれる、項目９２に記載の方法。
[項目９４]
前記細胞をドナーポリヌクレオチドと接触させることを含まず、前記標的ＤＮＡ内のヌクレオチドが欠失されるように前記標的ＤＮＡが修飾される、項目９２に記載の方法。[項目９５]
前記細胞が、古細菌細胞、細菌細胞、真核細胞、真核単細胞生物、体細胞、生殖細胞、幹細胞、植物細胞、藻細胞、動物細胞、無脊椎動物細胞、脊椎動物細胞、魚類細胞、カエル細胞、鳥類細胞、哺乳類細胞、ブタ細胞、雌ウシ細胞、ヤギ細胞、ヒツジ細胞、げっ歯類細胞、ラット細胞、マウス細胞、非ヒト霊長類細胞、およびヒト細胞からなる群から選択される、項目９２に記載の方法。
[項目９６]
前記細胞がインビトロに存在する、項目９２に記載の方法。
[項目９７]
前記細胞がインビボに存在する、項目９２に記載の方法。
[項目９８]
対象において遺伝子改変細胞を生産する方法であって、
（Ｉ）細胞に、
（ｉ）
（ａ）標的ＤＮＡ内の配列に対し相補的なヌクレオチド配列を含む第一セグメント；および
（ｂ）部位特異的修飾ポリペプチドと相互作用する第二セグメント
を含むＤＮＡ標的化ＲＮＡ、またはそれをコードするＤＮＡポリヌクレオチド；並びに
（ｉｉ）
（ａ）前記ＤＮＡ標的化ＲＮＡと相互作用するＲＮＡ結合部位；および
（ｂ）前記標的ＤＮＡ内に二重鎖切断を生成するヌクレアーゼ活性を示す活性部位
を含む部位特異的修飾ポリペプチド、またはそれをコードするポリヌクレオチドを導入し；
ここで、前記二重鎖切断の部位は前記ＤＮＡ標的化ＲＮＡによって決定され、前記接触は非相同末端結合または相同組換え修復に許容的な条件下で起こり、前記標的ＤＮＡが切断および再結合されることで修飾されたＤＮＡ配列が生成され；
これにより前記遺伝子改変細胞を生産すること；並びに
（ＩＩ）前記遺伝子改変細胞を前記対象に移植すること
を含む、上記方法。
[項目９９]
前記細胞をドナーポリヌクレオチドと接触させることをさらに含み、前記ドナーポリヌクレオチド、前記ドナーポリヌクレオチドの一部、前記ドナーポリヌクレオチドのコピー、または前記ドナーポリヌクレオチドのコピーの一部が前記標的ＤＮＡに組み込まれる、項目９８に記載の方法。
[項目１００]
前記細胞をドナーポリヌクレオチドと接触させることを含まず、前記標的ＤＮＡ内のヌクレオチドが欠失されるように前記標的ＤＮＡが修飾される、項目９８に記載の方法。[項目１０１]
前記細胞が、古細菌細胞、細菌細胞、真核細胞、真核単細胞生物、体細胞、生殖細胞、幹細胞、植物細胞、藻細胞、動物細胞、無脊椎動物細胞、脊椎動物細胞、魚類細胞、両生類細胞、鳥類細胞、哺乳類細胞、有蹄動物細胞、げっ歯類細胞、非ヒト霊長類細胞、およびヒト細胞からなる群から選択される、項目９８に記載の方法。
[項目１０２]
外来性部位特異的修飾ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子改変細胞内の標的ＤＮＡを修飾する方法であって、
前記遺伝子改変細胞に、ＤＮＡ標的化ＲＮＡ、またはそれをコードするＤＮＡポリヌクレオチドを導入することを含み、
（ｉ）前記ＤＮＡ標的化ＲＮＡが、
（ａ）前記標的ＤＮＡ内の配列に対し相補的なヌクレオチド配列を含む第一セグメント；および
（ｂ）部位特異的修飾ポリペプチドと相互作用する第二セグメントを含み；
（ｉｉ）前記部位特異的修飾ポリペプチドが、
（ａ）前記ＤＮＡ標的化ＲＮＡと相互作用するＲＮＡ結合部位；および
（ｂ）ヌクレアーゼ活性を示す活性部位を含む、
上記方法。
[項目１０３]
前記部位特異的修飾ポリペプチドが、図３に示されるＣａｓ９／Ｃｓｎ１アミノ酸配列のアミノ酸７〜１６６もしくは７３１〜１００３に対して、または配列番号１〜２５６および７９５〜１３４６として記載されるアミノ酸配列のうちのいずれかにおける対応部分に対して、少なくとも約７５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、項目１０２に記載の方法。
[項目１０４]
前記細胞が、古細菌細胞、細菌細胞、真核細胞、真核単細胞生物、体細胞、生殖細胞、幹細胞、植物細胞、藻細胞、動物細胞、無脊椎動物細胞、脊椎動物細胞、魚類細胞、両生類細胞、鳥類細胞、哺乳類細胞、有蹄動物細胞、げっ歯類細胞、非ヒト霊長類細胞、およびヒト細胞からなる群から選択される、項目１０２に記載の方法。
[項目１０５]
前記細胞がインビボに存在する、項目１０２に記載の方法。
[項目１０６]
前記細胞がインビトロに存在する、項目１０２に記載の方法。
[項目１０７]
前記部位特異的修飾ポリペプチドの発現が誘導性プロモーターの制御下にある、項目１０２に記載の方法。
[項目１０８]
前記部位特異的修飾ポリペプチドの発現が細胞型特異的プロモーターの制御下にある、項目１０２に記載の方法。
[項目１０９]
（ｉ）項目１に記載のＤＮＡ標的化ＲＮＡ、またはそれをコードするＤＮＡポリヌクレオチド；並びに
（ｉｉ）再構成および／または希釈のための試薬
を含む、キット。
[項目１１０]
細胞に前記ＤＮＡ標的化ＲＮＡを導入するための緩衝液、洗浄緩衝液、対照試薬、対照発現ベクターまたはＲＮＡポリヌクレオチド、ＤＮＡからＤＮＡ標的化ＲＮＡを転写するための試薬、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される試薬をさらに含む、項目１０９に記載のキット。
[項目１１１]
（ｉ）項目４４に記載の部位特異的修飾ポリペプチド、またはそれをコードするポリヌクレオチド；並びに
（ｉｉ）再構成および／または希釈のための試薬
を含む、キット。
[項目１１２]
細胞に前記部位特異的修飾ポリペプチドを導入するための緩衝液、洗浄緩衝液、対照試薬、対照発現ベクターまたはＲＮＡポリヌクレオチド、ＤＮＡから前記部位特異的修飾ポリペプチドをインビトロ生成するための試薬、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される試薬をさらに含む、項目１１１に記載のキット。
[項目１１３]
（ｉ）項目６０に記載の部位特異的修飾ポリペプチド、またはそれをコードするポリヌクレオチド；並びに
（ｉｉ）再構成および／または希釈のための試薬
を含む、キット。
[項目１１４]
（ｉ）
（ａ）標的ＤＮＡ内の配列に対し相補的なヌクレオチド配列を含む第一セグメント；および
（ｂ）部位特異的修飾ポリペプチドと相互作用する第二セグメント
を含むＤＮＡ標的化ＲＮＡ、またはそれをコードするＤＮＡポリヌクレオチド；並びに
（ｉｉ）
（ａ）前記ＤＮＡ標的化ＲＮＡと相互作用するＲＮＡ結合部位；および
（ｂ）部位特異的酵素活性を示す活性部位であって、酵素活性の部位が前記ＤＮＡ標的化ＲＮＡによって決定される、活性部位
を含む前記部位特異的修飾ポリペプチド、またはそれをコードするポリヌクレオチド
を含む、キット。
[項目１１５]
（ｉ）
（ａ）標的ＤＮＡ内の配列に対し相補的なヌクレオチド配列を含む第一セグメント；および
（ｂ）部位特異的修飾ポリペプチドと相互作用する第二セグメント
を含むＤＮＡ標的化ＲＮＡ、またはそれをコードするＤＮＡポリヌクレオチド；並びに
（ｉｉ）
（ａ）前記ＤＮＡ標的化ＲＮＡと相互作用するＲＮＡ結合部位；および
（ｂ）前記標的ＤＮＡ内の転写を調節する活性部位であって、前記標的ＤＮＡ内の転写が調節される部位が前記ＤＮＡ標的化ＲＮＡによって決定される、活性部位
を含む前記部位特異的修飾ポリペプチド、またはそれをコードするポリヌクレオチド
を含む、キット。
[項目１１６]
（ｉ）項目１２に記載の組み換え発現ベクター；および
（ｉｉ）再構成および／または希釈のための試薬
を含む、キット。
[項目１１７]
（ｉ）項目１３に記載の組み換え発現ベクター；および
（ｉｉ）再構成および／または希釈のための試薬
を含む、キット。
[項目１１８]
（ｉ）項目７に記載の組み換え発現ベクター；および
（ｉｉ）再構成および／または希釈のための試薬
を含む、キット。
[項目１１９]
（ｉ）項目７に記載の組み換え発現ベクター；並びに
（ｉｉ）
（ａ）ＤＮＡ標的化ＲＮＡと相互作用するＲＮＡ結合部位；および
（ｂ）部位特異的酵素活性を示す活性部位であって、酵素活性の部位が前記ＤＮＡ標的化ＲＮＡによって決定される、活性部位
を含む部位特異的修飾ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む組み換え発現ベクター
を含む、キット。
[項目１２０]
（ｉ）項目７に記載の組み換え発現ベクター；並びに
（ｉｉ）
（ａ）ＤＮＡ標的化ＲＮＡと相互作用するＲＮＡ結合部位；および
（ｂ）標的ＤＮＡ内の転写を調節する活性部位であって、前記標的ＤＮＡ内の転写が調節される部位が前記ＤＮＡ標的化ＲＮＡによって決定される、活性部位
を含む部位特異的修飾ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む組み換え発現ベクター
を含む、キット。
[項目１２１]
項目１に記載の２つ以上のＤＮＡ標的化ＲＮＡ、またはそれらをコードするＤＮＡポリヌクレオチドを含む標的ＤＮＡを標的とするためのキットであって、前記２つ以上のＤＮＡ標的化ＲＮＡのうちの少なくとも１つの第一セグメントが、前記２つ以上のＤＮＡ標的化ＲＮＡのうちの少なくとも別の１つの第一セグメントと、少なくとも１つのヌクレオチドだけ異なる、上記キット。
[項目１２２]
宿主細胞において標的ＤＮＡの転写を選択的に調節する方法であって、前記宿主細胞に、
ａ）
ｉ）前記標的ＤＮＡ内の標的配列に対し相補的なヌクレオチド配列を含む第一セグメント；
ｉｉ）部位特異的ポリペプチドと相互作用する第二セグメント；および
ｉｉｉ）安定性制御配列
を含むＤＮＡ標的化ＲＮＡ、または前記ＤＮＡ標的化ＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む核酸；並びに
ｂ）
ｉ）前記ＤＮＡ標的化ＲＮＡと相互作用するＲＮＡ結合部位；および
ｉｉ）低減されたエンドデオキシリボヌクレアーゼ活性を示す活性部位
を含む変異型Ｃａｓ９部位特異的ポリペプチド、または前記変異型Ｃａｓ９部位特異的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸
を導入することを含み、
前記ＤＮＡ標的化ＲＮＡおよび前記変異型Ｃａｓ９ポリペプチドが前記細胞内で複合体を形成し、前記複合体が前記細胞内の標的ＤＮＡの転写を選択的に調節する、上記方法。
[項目１２３]
前記変異型Ｃａｓ９部位特異的ポリペプチドが、前記標的ＤＮＡの非相補鎖を切断することはできるが、前記標的ＤＮＡの相補鎖を切断する低減された能力を有する、項目１２２に記載の方法。
[項目１２４]
前記変異型部位特異的ポリペプチドが、図３９Ａに示されるアミノ酸配列のＨ８４０Ａ変異、または配列番号１〜２５６および７９５〜１３４６に記載されるアミノ酸配列のうちのいずれかにおける対応する変異を含む、項目１２３に記載の方法。
[項目１２５]
前記変異型部位特異的ポリペプチドが、前記標的ＤＮＡの相補鎖を切断することはできるが、前記標的ＤＮＡの非相補鎖を切断する低減された能力を有する、項目１２２に記載の方法。
[項目１２６]
前記変異型部位特異的ポリペプチドが、図３９Ａに示されるアミノ酸配列のＤ１０Ａ変異、または配列番号１〜２５６および７９５〜１３４６に記載されるアミノ酸配列のうちのいずれかにおける対応する変異を含む、項目１２５に記載の方法。
[項目１２７]
前記変異型部位特異的ポリペプチドが、前記標的ＤＮＡの相補鎖を切断する低減された能力、および前記標的ＤＮＡの非相補鎖を切断する低減された能力を有する、項目１２２に記載の方法。
[項目１２８]
前記変異型部位特異的ポリペプチドが、（ｉ）図４１に示されるアミノ酸配列のＤ１０Ａ変異、または配列番号１〜２５６および７９５〜１３４６に記載されるアミノ酸配列のうちのいずれかにおける対応する変異；並びに（ｉｉ）配列番号８のＨ８４０Ａ変異、または配列番号１〜２５６および７９５〜１３４６に記載されるアミノ酸配列のうちのいずれかにおける対応する変異、の両方を含む、項目１２７に記載の方法
[項目１２９]
前記宿主細胞が原核細胞である、項目１２２に記載の方法。
[項目１３０]
前記宿主細胞が真核細胞である、項目１２２に記載の方法。
[項目１３１]
前記真核細胞が哺乳類細胞である、項目１３０に記載の方法。
[項目１３２]
前記標的ＤＮＡの転写が前記複合体非存在下における前記標的ＤＮＡの転写と比較して少なくとも約１０％だけ阻害される、項目１２２に記載の方法。
[項目１３３]
前記変異型Ｃａｓ９部位特異的ポリペプチドが異種ポリペプチドを含む、項目１２２に記載の方法。
[項目１３４]
前記異種ポリペプチドが、細胞内局在配列、検出可能な標識、安定性制御ペプチド、転写調節配列、タンパク質結合配列、またはそれらの組み合わせを含む、項目１３３に記載の方法。
[項目１３５]
前記異種ポリペプチドが安定性制御ペプチドを含む、項目１３４に記載の方法。
[項目１３６]
前記安定性制御ペプチドがデグロン配列を含む、項目１３５に記載の方法。
[項目１３７]
前記異種ポリペプチドが、転写活性化因子、転写抑制因子、ヒストンリジンメチルトランスフェラーゼ、ヒストンリジン脱メチル化酵素、ヒストンリジンアセチルトランスフェラーゼ、ヒストンリジン脱アセチル化酵素、ＤＮＡメチラーゼ、ＤＮＡ脱メチル化酵素、境界エレメント、周辺リクルートメントエレメント、タンパク質ドッキングエレメント、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、項目１３３に記載の方法。
[項目１３８]
前記標的ＤＮＡの転写が、前記複合体非存在下における前記標的ＤＮＡの転写と比較して少なくとも約１．２倍だけ増加される、項目１３３に記載の方法。
[項目１３９]
前記異種ポリペプチドが、転写活性化因子、ヒストンリジンメチルトランスフェラーゼ、ヒストンリジン脱メチル化酵素、ヒストンリジンアセチルトランスフェラーゼ、ＤＮＡ脱メチル化酵素、タンパク質ドッキングエレメント、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、項目１３８に記載の方法。
[項目１４０]
前記ＤＮＡ標的化ＲＮＡが単一分子ＤＮＡ標的化ＲＮＡである、項目１２２に記載の方法。
[項目１４１]
前記ＤＮＡ標的化ＲＮＡが二分子ＤＮＡ標的化ＲＮＡである、項目１２２に記載の方法。
[項目１４２]
項目１２２に記載の方法であって、前記宿主細胞に、第二のＤＮＡ標的化ＲＮＡ、または前記第二のＤＮＡ標的化ＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を導入することをさらに含み、前記第二のＤＮＡ標的化ＲＮＡが、
前記標的ＤＮＡ内の第二の標的配列に対し相補的なヌクレオチド配列を含む第一セグメント；
部位特異的ポリペプチドと相互作用する第二セグメント；および
安定性制御配列
を含む、上記方法。
[項目１４３]
前記第二セグメントが、約３０ヌクレオチド〜約６０ヌクレオチドの長さを有し、
１）５’−ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡ−（リンカー）−ＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡ−３
’；
２）５’−ＧＵＵＵＡＧＡＧＣＵＧ−（リンカー）−ＣＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡ−３’；
３）５’−ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＧ−（リンカー）−ＣＡＧＣＧＡＧＵＵＡＡＡ−３’
；
４）５’−ＧＵＵＵＵＵＧＵＡＣＵＣＵ−（リンカー）−ＡＧＡＡＧＣＵＡＣＡＡＡＧＡ
Ｕ−３’；
５）５’−ＧＵＵＧＵＡＧＣＵＣＣ−（リンカー）−ＧＵＵＧＣＵＡＣＡＡＵ−３’；お
よび
６）５’−ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣ
ＵＡＧＵＣＣＧ−３’
から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも約９５％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、項目１２２に記載の方法。
[項目１４４]
ａ）標的ＤＮＡ内の標的配列に対し相補的なヌクレオチド配列を含む第一セグメント；
ｂ）部位特異的ポリペプチドと相互作用する第二セグメント；および
ｃ）安定性制御配列
を含むＤＮＡ標的化ＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸。
[項目１４５]
前記ＤＮＡ標的化ＲＮＡをコードする前記ヌクレオチド配列がプロモーターに作動可能に連結している、項目１４４に記載の単離核酸。
[項目１４６]
前記核酸が、野生型Ｃａｓ９と比較して低減されたエンドデオキシリボヌクレアーゼ活性を示す変異型Ｃａｓ９部位特異的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列をさらに含む、項目１４４に記載の単離核酸。
[項目１４７]
前記変異型Ｃａｓ９部位特異的ポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列がプロモーターに作動可能に連結している、項目１４６に記載の単離核酸。
[項目１４８]
項目２４に記載の核酸を含む、組み換え発現ベクター。
[項目１４９]
項目２４に記載の単離核酸、または項目２８に記載の組み換え発現ベクターを含む、遺伝子改変宿主細胞。
[項目１５０]
複数のメンバーを含む核酸のライブラリーであって、各核酸メンバーが、
ａ）標的ＤＮＡ内の標的配列に対し相補的なヌクレオチド配列を含む第一セグメント；
ｂ）部位特異的ポリペプチドと相互作用する第二セグメント；および
ｃ）安定性制御配列
を含むＤＮＡ標的化ＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含み、
各メンバーが前記第一セグメントの前記ヌクレオチド配列においてライブラリーの他のメンバーと異なる、上記ライブラリー。
[項目１５１]
前記ＤＮＡ標的化ＲＮＡをコードする前記ヌクレオチド配列がプロモーターに作動可能に連結している、項目１５０に記載のライブラリー。
[項目１５２]
ａ）
ｉ）標的ＤＮＡ内の標的配列に対し相補的なヌクレオチド配列を含む第一セグメント； ｉｉ）部位特異的ポリペプチドと相互作用する第二セグメント；および
ｉｉｉ）安定性制御配列
を含むＤＮＡ標的化ＲＮＡ、または前記ＤＮＡ標的化ＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む核酸；並びに
ｂ）緩衝液
を含む、キット。
[項目１５３]
野生型Ｃａｓ９と比較して低減されたエンドデオキシリボヌクレアーゼ活性を示す変異型Ｃａｓ９部位特異的ポリペプチドをさらに含む、項目１５２に記載のキット。
[項目１５４]
前記ＤＮＡ標的化ＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む前記核酸が、野生型Ｃａｓ９と比較して低減されたエンドデオキシリボヌクレアーゼ活性を示す変異型Ｃａｓ９部位特異的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列をさらに含む、項目１５２に記載のキット。
[項目１５５]
野生型Ｃａｓ９と比較して低減されたエンドデオキシリボヌクレアーゼ活性を示す変異型Ｃａｓ９部位特異的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸をさらに含む、項目１５２に記載のキット。

Claims (147)

  1. （ａ）キメラＣａｓ９タンパク質に活性を与える異種ポリペプチドと融合したＣａｓ９ポリペプチドを含む、キメラＣａｓ９タンパク質、または該キメラＣａｓ９タンパク質をコードするポリヌクレオチド、並びに
    （ｂ）以下（ｉ）および（ｉｉ）を含むＤＮＡ標的化ＲＮＡ、または該ＤＮＡ標的化ＲＮＡをコードする、１つまたはそれ以上のＤＮＡポリヌクレオチド
    （ｉ）標的ＤＮＡ内の配列に対して相補的な標的化配列を含むＤＮＡ標的化セグメント；および
    （ｉｉ）前記キメラＣａｓ９タンパク質と相互作用するタンパク質結合セグメントであって、ハイブリダイズして二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を形成する二つの相補的な連続ヌクレオチドを含み、前記ｄｓＲＮＡがｔｒａｃｒＲＮＡおよびＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）の相補的なヌクレオチドを含む、タンパク質結合セグメント；
    を含む組成物。
  2. 前記相補的な連続ヌクレオチドが、ハイブリダイズして８塩基対（ｂｐ）〜１５ｂｐを形成する、請求項１に記載の組成物。
  3. 前記相補的な連続ヌクレオチドが、ハイブリダイズして１５塩基対（ｂｐ）〜１８ｂｐを形成する、請求項１に記載の組成物。
  4. 前記相補的な連続ヌクレオチド間の相補性％が７０％超である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
  5. 前記ＤＮＡ標的化ＲＮＡが２分子のＤＮＡ標的化ＲＮＡであり、２つの別々のＲＮＡ分子を含み、そのそれぞれが、前記ハイブリダイズしてｄｓＲＮＡを形成する２つの連続ヌクレオチドの一方を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
  6. 前記ＤＮＡ標的化ＲＮＡが１分子のＤＮＡ標的化ＲＮＡであり、１つのＲＮＡ分子を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
  7. 前記ＤＮＡ標的化ＲＮＡをコードする１つまたはそれ以上のＤＮＡポリヌクレオチドが、１つまたはそれ以上の組み換え発現ベクターである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
  8. 前記１つまたはそれ以上の組み換え発現ベクターが、１つまたはそれ以上のウイルスベクターである、請求項７に記載の組成物。
  9. 前記１つまたはそれ以上のウイルスベクターが、ワクシニアウイルスベクター、ポリオウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターおよび単純疱疹ウイルスベクターから選択される、請求項８に記載の組成物。
  10. 前記１つまたはそれ以上の組み換え発現ベクターが、プラスミド、コスミド、ミニサークル、ファージおよびウイルスベクターから選択される、請求項７に記載の組成物。
  11. 前記ＤＮＡ標的化ＲＮＡが、修飾された核酸塩基、修飾された骨格または非天然ヌクレオシド間連結、修飾された糖部分、Ｌｏｃｋｅｄ核酸およびペプチド核酸の１つまたはそれ以上を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
  12. 前記ＤＮＡ標的化ＲＮＡが、
    （１）ホスホロチオエート、ホスホロアミデート、非ホスホジエステル、ヘテロ原子、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、３’−アルキレンホスホネート、５’−アルキレンホスホネート、キラルホスホネート、ホスフィネート、３’−アミノホスホルアミダート、アミノアルキルホスホルアミダート、ホスホロジアミダート、チオノホスホルアミダート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、セレノホスフェートおよびボラノホスフェートの１つまたはそれ以上を含む非天然ヌクレオシド間連結を含む；
    （２）以下、（ａ）〜（ｃ）の１つまたはそれ以上を含む、
    （ａ）ホスホロチオエート、逆極性連結および脱塩基性ヌクレオシド間連結から選択される非天然ヌクレオシド間連結、
    （ｂ）Ｌｏｃｋｅｄ核酸（ＬＮＡ）、および
    （ｃ）２’−Ｏ−メトキシエチル、２’−Ｏ−メチルおよび２’−フルオロから選択される修飾された糖部分；
    （３）２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）、２’−ジメチルアミノオキシエトキシ、２’−ジメチルアミノエトキシエトキシ、２’−Ｏ−メチルおよび２’−フルオロから選択される１つまたはそれ以上の修飾された糖部分を含む；または
    （４）５−メチルシトシン、５−ヒロドキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニンの６−メチル誘導体、グアニンの６−メチル誘導体、アデニンの２−プロピル誘導体、グアニンの２−プロピル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミン、２−チオシトシン、５−プロピニルウラシル、５−プロピニルシトシン、６−アゾウラシル、６−アゾシトシン、６−アゾチミン、偽ウラシル（ｐｓｅｕｄｏｕｒａｃｉｌ）、４−チオウラシル、８−ハロアデニン、８−アミノアデニン、８−チオールアデニン、８−チオアルキルアデニン、８−ヒドロキシルアデニン、８−ハログアニン、８−アミノグアニン、８−チオールグアニン、８−チオアルキルグアニン、８−ヒドロキシルグアニン、５−ハロウラシル、５−ブロモウラシル、５−トリフルオロメチルウラシル、５−ハロシトシン、５−ブロモシトシン、５−トリフルオロメチルシトシン、５−置換ウラシル、５−置換シトシン、７−メチルグアニン、７−メチルアデニン、２−Ｆ−アデニン、２−アミノ−アデニン、８−アザグアニン、８−アザアデニン、７−デアザグアニン、７−デアザアデニン、３−デアザグアニン、３−デアザアデニン、三環式ピリミジン、フェノキサジンシチジン、フェノチアジンシチジン、置換フェノキサジンシチジン、カルバゾールシチジン、ピリドインドールシチジン、７−デアザグアノシン、２−アミノピリジン、２−ピリドン、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン、Ｎ−２、Ｎ−６またはＯ−６置換プリン、２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシンの１つまたはそれ以上を含む核酸塩基を含む；
    請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
  13. 前記ＤＮＡ標的化ＲＮＡが、
    ポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール、ポリエーテル、コレステロール部分、コール酸、チオエーテル、チオコレステロール、脂肪族鎖、リン脂質、アダマンタン酢酸、パルミチル部分、オクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分、ビオチン、フェナジン、葉酸、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、色素、クマリン、取り込みを増強する部分、分解への耐性を増強する部分および／または配列特異的なハイブリダイゼーションを強化する部分、並びに取り込み、分布、代謝、または排出を向上させる部分から選択される部分に結合されている、
    請求項１〜６または１１〜１２のいずれか一項に記載の組成物。
  14. 前記標的配列が１８〜２５ヌクレオチド長である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の組成物。
  15. 前記ＤＮＡ標的化ＲＮＡが、
    （１）６７ヌクレオチドのｔｒａｃｒＲＮＡ配列：ＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵＵＵＵ（配列番号４３２）；または
    （２）２６ヌクレオチドのｔｒａｃｒＲＮＡ配列：ＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧ（配列番号３９７）
    を含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の組成物。
  16. 前記ＤＮＡ標的化ＲＮＡが、前記標的化配列の下流（３´）に、５´から３´方向の順番で、
    １２ヌクレオチドのｃｒＲＮＡ配列：ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡ（配列番号６７９）；
    ４ヌクレオチドのリンカー配列：ＧＡＡＡ；および
    ２６ヌクレオチドのｔｒａｃｒＲＮＡ配列：ＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧ（配列番号３９７）
    を含む１分子ＤＮＡ標的化ＲＮＡである、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の組成物。
  17. 前記標的ＤＮＡが、細菌細胞、古細菌細胞、単細胞真核生物、植物細胞、無脊椎動物からの細胞または脊椎動物からの細胞内に存在する、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の組成物。
  18. 前記標的ＤＮＡが、単細胞真核生物、植物細胞、無脊椎動物からの細胞または脊椎動物からの細胞内に存在する、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の組成物。
  19. 前記標的ＤＮＡが染色体ＤＮＡである、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の組成物。
  20. 前記Ｃａｓ９ポリペプチドが、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のＣａｓ９である、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の組成物。
  21. 前記Ｃａｓ９ポリペプチドが、対応する野生型Ｃａｓ９に比して、低いヌクレアーゼ活性を有する修飾されたＣａｓ９タンパク質である、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の組成物。
  22. 前記Ｃａｓ９ポリペプチドが、実質的にヌクレアーゼ活性を有しない修飾されたＣａｓ９タンパク質である、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の組成物。
  23. 前記Ｃａｓ９ポリペプチドが、ＲｕｖＣドメインおよび／またはＨＮＨドメインに１つまたはそれ以上の変異を含む修飾されたＣａｓ９タンパク質である、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の組成物。
  24. 前記異種ポリペプチドが、
    （１）ＤＮＡ修飾活性を有し；または
    （２）前記標的ＤＮＡからの転写を増加または減少させる能力を示す；または
    （３）前記標的ＤＮＡに結合するポリペプチドを修飾する酵素活性を有する；
    請求項１〜２３のいずれか一項に記載の組成物。
  25. 前記異種ポリペプチドが前記ＤＮＡ修飾活性を有し、前記活性がメチルトランスフェラーゼ活性、脱メチル化酵素活性、ＤＮＡ修復活性、ＤＮＡ損傷活性、脱アミノ化活性、ジスムターゼ活性、アルキル化活性、脱プリン活性、酸化活性、ピリミジンダイマー形成活性、インテグラーゼ活性、トランスポサーゼ活性、リコンビナーゼ活性、ポリメラーゼ活性、リガーゼ活性、ヘリカーゼ活性、光回復酵素活性およびグリコシラーゼ活性から選択される、請求項２４に記載の組成物。
  26. 前記異種ポリペプチドが脱アミノ化活性を有する、請求項２５に記載の組成物。
  27. 前記異種ポリペプチドがポリメラーゼ活性を有する、請求項２５に記載の組成物。
  28. 前記異種ポリペプチドが転写活性化因子ポリペプチドまたは転写抑制化因子ポリペプチドである、請求項２４に記載の組成物。
  29. 前記異種ポリペプチドが前記酵素活性を有し、前記酵素活性がヒストン修飾活性である、請求項２４に記載の組成物。
  30. 前記異種ポリペプチドが前記酵素活性を有し、前記酵素活性が、メチルトランスフェラーゼ活性、脱メチル化酵素活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、脱アセチル化酵素活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、ユビキチンリガーゼ活性、脱ユビキチン化活性、アデニル化活性、脱アデニル化活性、ＳＵＭＯ化活性、脱ＳＵＭＯ化活性、リボシル化活性、脱リボシル化活性、ミリストイル化活性、脱ミリストイル化活性、グリコシル化活性および脱グリコシル化活性から選択される、請求項２４に記載の組成物。
  31. 前記キメラＣａｓ９タンパク質のアミノ末端に、キメラＣａｓ９タンパク質の細胞基質から細胞小器官内への移行を促進するタンパク質形質導入ドメインが共有結合的に連結されている、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の組成物。
  32. 前記キメラＣａｓ９タンパク質のカルボキシル末端に、キメラＣａｓ９タンパク質の細胞基質から細胞小器官内への移行を促進するタンパク質形質導入ドメインが共有結合的に連結されている、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の組成物。
  33. キメラＣａｓ９タンパク質を標的ＤＮＡの標的配列に導く方法であって、
    前記標的ＤＮＡを下記（ａ）および（ｂ）を含む複合体と接触させることを含み、
    （ａ）キメラＣａｓ９タンパク質に活性を与える異種ポリペプチドと融合したＣａｓ９ポリペプチドを含む、キメラＣａｓ９タンパク質；
    （ｂ）以下（ｉ）および（ｉｉ）を含むＤＮＡ標的化ＲＮＡ
    （ｉ）前記標的ＤＮＡ内の前記標的配列に対して相補的な標的化配列を含むＤＮＡ標的化セグメント；および
    （ｉｉ）前記キメラＣａｓ９タンパク質と相互作用するタンパク質結合セグメントであって、ハイブリダイズして二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を形成する二つの相補的な連続ヌクレオチドを含み、前記ｄｓＲＮＡがｔｒａｃｒＲＮＡおよびＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）の相補的なヌクレオチドを含む、タンパク質結合セグメント；
    前記ＤＮＡ標的化ＲＮＡは前記キメラＣａｓ９タンパク質と複合体を形成し、これにより前記キメラＣａｓ９タンパク質を前記標的配列に導き、
    前記接触は、インビボのヒト細胞、ヒト生殖細胞およびヒト胚細胞で行われるものではない、前記方法。
  34. 前記異種ペプチドがＤＮＡ修飾活性を有し、前記接触が前記標的ＤＮＡの修飾をもたらす、請求項３３に記載の方法。
  35. 前記ＤＮＡ修飾活性がメチルトランスフェラーゼ活性、脱メチル化酵素活性、ＤＮＡ修復活性、ＤＮＡ損傷活性、脱アミノ化活性、ジスムターゼ活性、アルキル化活性、脱プリン活性、酸化活性、ピリミジンダイマー形成活性、インテグラーゼ活性、トランスポサーゼ活性、リコンビナーゼ活性、ポリメラーゼ活性、リガーゼ活性、ヘリカーゼ活性、光回復酵素活性およびグリコシラーゼ活性から選択される、請求項３４に記載の方法。
  36. 前記異種ポリペプチドが脱アミノ化活性を有する、請求項３５に記載の方法。
  37. 前記異種ポリペプチドがポリメラーゼ活性を有する、請求項３５に記載の方法。
  38. 前記異種ポリペプチドが転写活性化因子ポリペプチドまたは転写抑制化因子ポリペプチドであり、したがって前記接触が前記標的ＤＮＡからの部位特異的転写の調節をもたらす、請求項３３に記載の方法。
  39. 前記異種ポリペプチドが前記標的ＤＮＡに結合するポリペプチドを修飾する酵素活性を有し、したがって前記接触が前記ポリペプチドの修飾をもたらす、請求項３３に記載の方法。
  40. 前記酵素活性がヒストン修飾活性である、請求項３９に記載の方法。
  41. 前記酵素活性が、メチルトランスフェラーゼ活性、脱メチル化酵素活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、脱アセチル化酵素活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、ユビキチンリガーゼ活性、脱ユビキチン化活性、アデニル化活性、脱アデニル化活性、ＳＵＭＯ化活性、脱ＳＵＭＯ化活性、リボシル化活性、脱リボシル化活性、ミリストイル化活性、脱ミリストイル化活性、グリコシル化活性および脱グリコシル化活性から選択される、請求項３９に記載の方法。
  42. 前記相補的な連続ヌクレオチドが、ハイブリダイズして８塩基対（ｂｐ）〜１５ｂｐを形成する、請求項３３〜４１のいずれか一項に記載の方法。
  43. 前記相補的な連続ヌクレオチドが、ハイブリダイズして１５塩基対（ｂｐ）〜１８ｂｐを形成する、請求項３３〜４１のいずれか一項に記載の方法。
  44. 前記相補的な連続ヌクレオチド間の相補性％が７０％超である、請求項３３〜４３のいずれか一項に記載の方法。
  45. 前記ＤＮＡ標的化ＲＮＡが２分子のＤＮＡ標的化ＲＮＡであり、２つの別々のＲＮＡ分子を含み、そのそれぞれが、前記ハイブリダイズしてｄｓＲＮＡを形成する二つの相補的な連続ヌクレオチドの一方を含む、請求項３３〜４４のいずれか一項に記載の方法。
  46. 前記ＤＮＡ標的化ＲＮＡが１分子のＤＮＡ標的化ＲＮＡであり、１つのＲＮＡ分子を含む、請求項３３〜４４のいずれか一項に記載の方法。
  47. 前記ＤＮＡ標的化ＲＮＡが、
    （１）修飾された核酸塩基、修飾された骨格または非天然ヌクレオシド間連結、修飾された糖部分、Ｌｏｃｋｅｄ核酸およびペプチド核酸の１つまたはそれ以上を含む；
    （２）ホスホロチオエート、ホスホロアミデート、非ホスホジエステル、ヘテロ原子、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、３’−アルキレンホスホネート、５’−アルキレンホスホネート、キラルホスホネート、ホスフィネート、３’−アミノホスホルアミダート、アミノアルキルホスホルアミダート、ホスホロジアミダート、チオノホスホルアミダート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、セレノホスフェートおよびボラノホスフェートの１つまたはそれ以上を含む非天然ヌクレオシド間連結を含む；
    （３）以下、（ａ）〜（ｃ）の１つまたはそれ以上を含む；
    （ａ）ホスホロチオエート、逆極性連結および脱塩基性ヌクレオシド間連結から選択される非天然ヌクレオシド間連結、
    （ｂ）Ｌｏｃｋｅｄ核酸（ＬＮＡ）、および
    （ｃ）２’−Ｏ−メトキシエチル、２’−Ｏ−メチルおよび２’−フルオロから選択される修飾された糖部分；
    （４）２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）、２’−ジメチルアミノオキシエトキシ、２’−ジメチルアミノエトキシエトキシ、２’−Ｏ−メチルおよび２’−フルオロから選択される１つまたはそれ以上の修飾された糖部分を含む；または
    （５）５−メチルシトシン、５−ヒロドキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニンの６−メチル誘導体、グアニンの６−メチル誘導体、アデニンの２−プロピル誘導体、グアニンの２−プロピル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミン、２−チオシトシン、５−プロピニルウラシル、５−プロピニルシトシン、６−アゾウラシル、６−アゾシトシン、６−アゾチミン、偽ウラシル（ｐｓｅｕｄｏｕｒａｃｉｌ）、４−チオウラシル、８−ハロアデニン、８−アミノアデニン、８−チオールアデニン、８−チオアルキルアデニン、８−ヒドロキシルアデニン、８−ハログアニン、８−アミノグアニン、８−チオールグアニン、８−チオアルキルグアニン、８−ヒドロキシルグアニン、５−ハロウラシル、５−ブロモウラシル、５−トリフルオロメチルウラシル、５−ハロシトシン、５−ブロモシトシン、５−トリフルオロメチルシトシン、５−置換ウラシル、５−置換シトシン、７−メチルグアニン、７−メチルアデニン、２−Ｆ−アデニン、２−アミノ−アデニン、８−アザグアニン、８−アザアデニン、７−デアザグアニン、７−デアザアデニン、３−デアザグアニン、３−デアザアデニン、三環式ピリミジン、フェノキサジンシチジン、フェノチアジンシチジン、置換フェノキサジンシチジン、カルバゾールシチジン、ピリドインドールシチジン、７−デアザグアノシン、２−アミノピリジン、２−ピリドン、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン、Ｎ−２、Ｎ−６またはＯ−６置換プリン、２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシンの１つまたはそれ以上を含む核酸塩基を含む；
    請求項３３〜４６のいずれか一項に記載の方法。
  48. 前記ＤＮＡ標的化ＲＮＡが、
    ポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール、ポリエーテル、コレステロール部分、コール酸、チオエーテル、チオコレステロール、脂肪族鎖、リン脂質、アダマンタン酢酸、パルミチル部分、オクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分、ビオチン、フェナジン、葉酸、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、色素、クマリン、取り込みを増強する部分、分解への耐性を増強する部分および／または配列特異的なハイブリダイゼーションを強化する部分、並びに取り込み、分布、代謝、または排出を向上させる部分から選択される部分に結合されている、
    請求項３３〜４７のいずれか一項に記載の方法。
  49. 前記標的配列が１８〜２５ヌクレオチド長である、請求項３３〜４８のいずれか一項に記載の方法。
  50. 前記ＤＮＡ標的化ＲＮＡが、
    （１）６７ヌクレオチドのｔｒａｃｒＲＮＡ配列：ＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵＵＵＵ（配列番号４３２）；または
    （２）２６ヌクレオチドのｔｒａｃｒＲＮＡ配列：ＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧ（配列番号３９７）
    を含む、請求項３３〜４９のいずれか一項に記載の方法。
  51. 前記ＤＮＡ標的化ＲＮＡが、前記標的化配列の下流（３´）に、５´から３´方向の順番で、
    １２ヌクレオチドのｃｒＲＮＡ配列：ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡ（配列番号６７９）；
    ４ヌクレオチドのリンカー配列：ＧＡＡＡ；および
    ２６ヌクレオチドのｔｒａｃｒＲＮＡ配列：ＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧ（配列番号３９７）
    を含む１分子ＤＮＡ標的化ＲＮＡである、請求項３３〜４９のいずれか一項に記載の方法。
  52. 前記標的ＤＮＡが、細菌細胞、古細菌細胞、単細胞真核生物、植物細胞、無脊椎動物からの細胞または脊椎動物からの細胞内に存在する、請求項３３〜５１のいずれか一項に記載の方法。
  53. 前記標的ＤＮＡが、単細胞真核生物、植物細胞、無脊椎動物からの細胞または脊椎動物からの細胞内に存在する、請求項３３〜５１のいずれか一項に記載の方法。
  54. 前記標的ＤＮＡが染色体ＤＮＡである、請求項３３〜５３のいずれか一項に記載の方法。
  55. 前記接触が、
    （ａ）前記キメラＣａｓ９タンパク質または前記キメラＣａｓ９タンパク質をコードするポリヌクレオチド；および
    （ｂ）前記ＤＮＡ標的化ＲＮＡまたは前記ＤＮＡ標的化ＲＮＡをコードする１つまたはそれ以上のＤＮＡポリヌクレオチド；
    の少なくとも一つを、細胞内に形質導入することを含む、請求項３３〜５４のいずれか一項に記載の方法。
  56. 前記キメラＣａｓ９タンパク質をコードするポリヌクレオチドおよび／または前記ＤＮＡ標的化ＲＮＡをコードする１つもしくはそれ以上のＤＮＡポリヌクレオチドは、１つまたはそれ以上の組み換え発現ベクターである、請求項５５に記載の方法。
  57. 前記１つまたはそれ以上の組み換え発現ベクターは、１つまたはそれ以上のウイルスベクターである、請求項５６に記載の方法。
  58. 前記１つまたはそれ以上のウイルスベクターが、ワクシニアウイルスベクター、ポリオウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターおよび単純疱疹ウイルスベクターから選択される、請求項５７に記載の方法。
  59. 前記１つまたはそれ以上の組み換え発現ベクターが、プラスミド、コスミド、ミニサークル、ファージおよびウイルスベクターから選択される、請求項５６に記載の方法。
  60. ドナーポリヌクレオチドを細胞に形質導入することを含む、請求項３３〜５９のいずれか一項に記載の方法。
  61. 前記標的ＤＮＡ分子の切断された鎖への、ドナーポリヌクレオチドの１つの配列の挿入により前記標的ＤＮＡ分子が編集される、請求項３３〜６０のいずれか一項に記載の方法。
  62. 前記Ｃａｓ９ポリペプチドが、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のＣａｓ９である、請求項３３〜６１のいずれか一項に記載の方法。
  63. 前記Ｃａｓ９ポリペプチドが、対応する野生型Ｃａｓ９に比して、低いヌクレアーゼ活性を有する修飾されたＣａｓ９タンパク質である、請求項３３〜６２のいずれか一項に記載の方法。
  64. 前記Ｃａｓ９ポリペプチドが、実質的にヌクレアーゼ活性を有しない修飾されたＣａｓ９タンパク質である、請求項３３〜６２のいずれか一項に記載の方法。
  65. 前記Ｃａｓ９ポリペプチドが、ＲｕｖＣドメインおよび／またはＨＮＨドメインに１つまたはそれ以上の変異を含む修飾されたＣａｓ９タンパク質である、請求項３３〜６２のいずれか一項に記載の方法。
  66. キメラＣａｓ９タンパク質の細胞基質から細胞小器官内への移行を促進するタンパク質形質導入ドメインが、キメラＣａｓ９タンパク質のアミノ末端に共有結合的に連結されている、請求項３３〜６５のいずれか一項に記載の方法。
  67. キメラＣａｓ９タンパク質の細胞基質から細胞小器官内への移行を促進するタンパク質形質導入ドメインが、キメラＣａｓ９タンパク質のカルボキシル末端に共有結合的に連結されている、請求項３３〜６５のいずれか一項に記載の方法。
  68. 前記接触がインビボのヒト細胞内で行われるものではない、請求項３３〜６７のいずれか一項に記載の方法。
  69. 前記接触が体細胞内で行われる、請求項３３〜６７のいずれか一項に記載の方法。
  70. （ａ）キメラＣａｓ９タンパク質に活性を与える異種ポリペプチドと融合したＣａｓ９ポリペプチドを含む、キメラＣａｓ９タンパク質または前記キメラＣａｓ９タンパク質をコードするポリヌクレオチド；および
    （ｂ）以下（ｉ）および（ｉｉ）を含むＤＮＡ標的化ＲＮＡまたは前記ＤＮＡ標的化ＲＮＡをコードする１つまたはそれ以上のＤＮＡポリヌクレオチド；
    （ｉ）標的ＤＮＡ内の標的配列に対して相補的な標的化配列を含むＤＮＡ標的化セグメント；および
    （ｉｉ）前記キメラＣａｓ９タンパク質と相互作用するタンパク質結合セグメントであって、ハイブリダイズして二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を形成する二つの相補的な連続ヌクレオチドを含み、前記ｄｓＲＮＡがｔｒａｃｒＲＮＡおよびＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）の相補的なヌクレオチドを含む、タンパク質結合セグメント；
    を含み、（ａ）および（ｂ）が同一のまたは別々の容器中に存在するキット。
  71. 前記Ｃａｓ９ポリペプチドが、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のＣａｓ９である、請求項７０に記載のキット。
  72. 前記Ｃａｓ９ポリペプチドが、対応する野生型Ｃａｓ９に比して、低いヌクレアーゼ活性を有する修飾されたＣａｓ９タンパク質である、請求項７０または７１に記載のキット。
  73. 前記修飾されたＣａｓ９タンパク質が、実質的にヌクレアーゼ活性を有しない、請求項７０または７１に記載のキット。
  74. 前記Ｃａｓ９ポリペプチドが、ＲｕｖＣドメインおよび／またはＨＮＨドメインに１つまたはそれ以上の変異を含む修飾されたＣａｓ９タンパク質である、請求項７０または７１に記載のキット。
  75. 前記異種ポリペプチドが、
    （１）ＤＮＡ修飾活性を有し；または
    （２）前記標的ＤＮＡからの転写を増加または減少させる能力を示す；または
    （３）前記標的ＤＮＡに結合するポリペプチドを修飾する酵素活性を有する；
    請求項７０〜７４のいずれか一項に記載のキット。
  76. 前記異種ポリペプチドが前記ＤＮＡ修飾活性を有し、前記活性がメチルトランスフェラーゼ活性、脱メチル化酵素活性、ＤＮＡ修復活性、ＤＮＡ損傷活性、脱アミノ化活性、ジスムターゼ活性、アルキル化活性、脱プリン活性、酸化活性、ピリミジンダイマー形成活性、インテグラーゼ活性、トランスポサーゼ活性、リコンビナーゼ活性、ポリメラーゼ活性、リガーゼ活性、ヘリカーゼ活性、光回復酵素活性およびグリコシラーゼ活性から選択される、請求項７５に記載のキット。
  77. 前記異種ポリペプチドが脱アミノ化活性を有する、請求項７６に記載のキット。
  78. 前記異種ポリペプチドがポリメラーゼ活性を有する、請求項７６に記載のキット。
  79. 前記異種ポリペプチドが転写を増加または抑制する能力を示し、前記異種ポリペプチドが転写活性化因子ポリペプチドまたは転写抑制化因子ポリペプチドである、請求項７５に記載のキット。
  80. 前記異種ポリペプチドが前記酵素活性を有し、前記酵素活性がヒストン修飾活性である、請求項７５に記載のキット。
  81. 前記異種ポリペプチドが前記酵素活性を有し、前記酵素活性が、メチルトランスフェラーゼ活性、脱メチル化酵素活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、脱アセチル化酵素活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、ユビキチンリガーゼ活性、脱ユビキチン化活性、アデニル化活性、脱アデニル化活性、ＳＵＭＯ化活性、脱ＳＵＭＯ化活性、リボシル化活性、脱リボシル化活性、ミリストイル化活性または脱ミリストイル化活性、グリコシル化活性および脱グリコシル化活性から選択される、請求項７５に記載のキット。
  82. 前記相補的な連続ヌクレオチドが、ハイブリダイズして８塩基対（ｂｐ）〜１５ｂｐを形成する、請求項７０〜８１のいずれか一項に記載のキット。
  83. 前記相補的な連続ヌクレオチドが、ハイブリダイズして１５塩基対（ｂｐ）〜１８ｂｐを形成する、請求項７０〜８１のいずれか一項に記載のキット。
  84. 前記相補的な連続ヌクレオチド間の相補性％が７０％超である、請求項７０〜８３のいずれか一項に記載のキット。
  85. 前記ＤＮＡ標的化ＲＮＡが２分子のＤＮＡ標的化ＲＮＡであり、２つの別々のＲＮＡ分子を含み、そのそれぞれが、前記ハイブリダイズしてｄｓＲＮＡを形成する二つの相補的な連続ヌクレオチドの一方を含む、請求項７０〜８４のいずれか一項に記載のキット。
  86. 前記ＤＮＡ標的化ＲＮＡが１分子のＤＮＡ標的化ＲＮＡであり、１つのＲＮＡ分子を含む、請求項７０〜８４のいずれか一項に記載のキット。
  87. 前記キメラＣａｓ９タンパク質をコードするポリヌクレオチドおよび／または前記ＤＮＡ標的化ＲＮＡをコードする１つもしくはそれ以上のＤＮＡポリヌクレオチドは、１つまたはそれ以上の組み換え発現ベクターである、請求項７０〜８６のいずれか一項に記載のキット。
  88. 前記１つまたはそれ以上の組み換え発現ベクターは、１つまたはそれ以上のウイルスベクターである、請求項８７に記載のキット。
  89. 前記１つまたはそれ以上のウイルスベクターが、ワクシニアウイルスベクター、ポリオウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターおよび単純疱疹ウイルスベクターから選択される、請求項８８に記載のキット。
  90. 前記１つまたはそれ以上の組み換え発現ベクターが、プラスミド、コスミド、ミニサークル、ファージおよびウイルスベクターから選択される、請求項８７に記載のキット。
  91. 前記ＤＮＡ標的化ＲＮＡが、
    （１）修飾された核酸塩基、修飾された骨格または非天然ヌクレオシド間連結、修飾された糖部分、Ｌｏｃｋｅｄ核酸およびペプチド核酸の１つまたはそれ以上を含む；
    （２）ホスホロチオエート、ホスホロアミデート、非ホスホジエステル、ヘテロ原子、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、３’−アルキレンホスホネート、５’−アルキレンホスホネート、キラルホスホネート、ホスフィネート、３’−アミノホスホルアミダート、アミノアルキルホスホルアミダート、ホスホロジアミダート、チオノホスホルアミダート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、セレノホスフェートおよびボラノホスフェートの１つまたはそれ以上を含む非天然ヌクレオシド間連結を含む；
    （３）以下、（ａ）〜（ｃ）の１つまたはそれ以上を含む；
    （ａ）ホスホロチオエート、逆極性連結および脱塩基性ヌクレオシド間連結から選択される非天然ヌクレオシド間連結、
    （ｂ）Ｌｏｃｋｅｄ核酸（ＬＮＡ）、および
    （ｃ）２’−Ｏ−メトキシエチル、２’−Ｏ−メチルおよび２’−フルオロから選択される修飾された糖部分；
    （４）２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）、２’−ジメチルアミノオキシエトキシ、２’−ジメチルアミノエトキシエトキシ、２’−Ｏ−メチルおよび２’−フルオロから選択される１つまたはそれ以上の修飾された糖部分を含む；または
    （５）５−メチルシトシン、５−ヒロドキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニンの６−メチル誘導体、グアニンの６−メチル誘導体、アデニンの２−プロピル誘導体、グアニンの２−プロピル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミン、２−チオシトシン、５−プロピニルウラシル、５−プロピニルシトシン、６−アゾウラシル、６−アゾシトシン、６−アゾチミン、偽ウラシル（ｐｓｅｕｄｏｕｒａｃｉｌ）、４−チオウラシル、８−ハロアデニン、８−アミノアデニン、８−チオールアデニン、８−チオアルキルアデニン、８−ヒドロキシルアデニン、８−ハログアニン、８−アミノグアニン、８−チオールグアニン、８−チオアルキルグアニン、８−ヒドロキシルグアニン、５−ハロウラシル、５−ブロモウラシル、５−トリフルオロメチルウラシル、５−ハロシトシン、５−ブロモシトシン、５−トリフルオロメチルシトシン、５−置換ウラシル、５−置換シトシン、７−メチルグアニン、７−メチルアデニン、２−Ｆ−アデニン、２−アミノ−アデニン、８−アザグアニン、８−アザアデニン、７−デアザグアニン、７−デアザアデニン、３−デアザグアニン、３−デアザアデニン、三環式ピリミジン、フェノキサジンシチジン、フェノチアジンシチジン、置換フェノキサジンシチジン、カルバゾールシチジン、ピリドインドールシチジン、７−デアザグアノシン、２−アミノピリジン、２−ピリドン、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン、Ｎ−２、Ｎ−６またはＯ−６置換プリン、２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシンの１つまたはそれ以上を含む核酸塩基を含む；
    請求項７０〜９０のいずれか一項に記載のキット。
  92. 前記ＤＮＡ標的化ＲＮＡが、
    ポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール、ポリエーテル、コレステロール部分、コール酸、チオエーテル、チオコレステロール、脂肪族鎖、リン脂質、アダマンタン酢酸、パルミチル部分、オクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分、ビオチン、フェナジン、葉酸、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、色素、クマリン、取り込みを増強する部分、分解への耐性を増強する部分および／または配列特異的なハイブリダイゼーションを強化する部分、並びに取り込み、分布、代謝、または排出を向上させる部分から選択される部分に結合されている、
    請求項７０〜９１のいずれか一項に記載のキット。
  93. 前記標的配列が１８〜２５ヌクレオチド長である、請求項７０〜９２のいずれか一項に記載のキット。
  94. 前記ＤＮＡ標的化ＲＮＡが、
    （１）６７ヌクレオチドのｔｒａｃｒＲＮＡ配列：ＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵＵＵＵ（配列番号４３２）；または
    （２）２６ヌクレオチドのｔｒａｃｒＲＮＡ配列：ＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧ（配列番号３９７）
    を含む、請求項７０〜９３のいずれか一項に記載のキット。
  95. 前記ＤＮＡ標的化ＲＮＡが、前記標的化配列の下流（３´）に、５´から３´方向の順番で、
    １２ヌクレオチドのｃｒＲＮＡ配列：ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡ（配列番号６７９）；
    ４ヌクレオチドのリンカー配列：ＧＡＡＡ；および
    ２６ヌクレオチドのｔｒａｃｒＲＮＡ配列：ＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧ（配列番号３９７）
    を含む１分子ＤＮＡ標的化ＲＮＡである、請求項７０〜９３のいずれか一項に記載のキット。
  96. 前記標的ＤＮＡが、細菌細胞、古細菌細胞、単細胞真核生物、植物細胞、無脊椎動物からの細胞または脊椎動物からの細胞内に存在する、請求項７０〜９５のいずれか一項に記載のキット。
  97. 前記標的ＤＮＡが、単細胞真核生物、植物細胞、無脊椎動物からの細胞または脊椎動物からの細胞内に存在する、請求項７０〜９６のいずれか一項に記載のキット。
  98. 前記標的ＤＮＡが染色体ＤＮＡである、請求項７０〜９７のいずれか一項に記載のキット。
  99. キメラＣａｓ９タンパク質の細胞基質から細胞小器官内への移行を促進するタンパク質形質導入ドメインが、キメラＣａｓ９タンパク質のアミノ末端に共有結合的に連結されている、請求項７０〜９８のいずれか一項に記載のキット。
  100. キメラＣａｓ９タンパク質の細胞基質から細胞小器官内への移行を促進するタンパク質形質導入ドメインが、キメラＣａｓ９タンパク質のカルボキシル末端に共有結合的に連結されている、請求項７０〜９８のいずれか一項に記載のキット。
  101. （ａ）キメラＣａｓ９タンパク質をコードするヌクレオチド配列であって、前記キメラＣａｓ９タンパク質は、該キメラＣａｓ９タンパク質に活性を与える異種ポリペプチドと融合したＣａｓ９ポリペプチドを含む、前記ヌクレオチド配列；並びに
    （ｂ）以下（ｉ）および（ｉｉ）を含むＤＮＡ標的化ＲＮＡをコードするヌクレオチド配列：
    （ｉ）標的ＤＮＡ内の標的配列に対して相補的な標的化配列を含むＤＮＡ標的化セグメント；および
    （ｉｉ）前記キメラＣａｓ９タンパク質と相互作用するタンパク質結合セグメントであって、ハイブリダイズして二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を形成する二つの相補的な連続ヌクレオチドを含み、前記ｄｓＲＮＡがｔｒａｃｒＲＮＡおよびＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）の相補的なヌクレオチドを含む、タンパク質結合セグメント；
    を含む１つまたはそれ以上の核酸。
  102. 前記核酸が、１つまたはそれ以上の組み換え発現ベクターである、請求項１０１に記載の１つまたはそれ以上の核酸。
  103. 前記１つまたはそれ以上の組み換え発現ベクターが、１つまたはそれ以上のウイルスベクターである、請求項１０２に記載の１つまたはそれ以上の核酸。
  104. 前記１つまたはそれ以上のウイルスベクターが、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターおよび単純疱疹ウイルスベクターから選択される、請求項１０３に記載の１つまたはそれ以上の核酸。
  105. 前記１つまたはそれ以上の組み換え発現ベクターが、プラスミド、コスミド、ミニサークル、ファージおよびウイルスベクターから選択される、請求項１０２に記載の１つまたはそれ以上の核酸。
  106. 前記キメラＣａｓ９タンパク質が、そのカルボキシル末端またはアミノ末端に共有結合されたタンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）を含み、前記ＰＴＤは、前記キメラＣａｓ９タンパク質の細胞基質から細胞小器官内への移行を促進させる、請求項１０１〜１０５のいずれか一項に記載の１つまたはそれ以上の核酸。
  107. 前記相補的な連続ヌクレオチドが、ハイブリダイズして８塩基対（ｂｐ）〜１５ｂｐを形成する、請求項１０１〜１０６のいずれか一項に記載の１つまたはそれ以上の核酸。
  108. 前記相補的な連続ヌクレオチドが、ハイブリダイズして１５塩基対（ｂｐ）〜１８ｂｐを形成する、請求項１０１〜１０６のいずれか一項に記載の１つまたはそれ以上の核酸。
  109. 前記相補的な連続ヌクレオチド間の相補性％が７０％超である、請求項１０１〜１０８のいずれか一項に記載の１つまたはそれ以上の核酸。
  110. 前記標的ＤＮＡが、細菌細胞、古細菌細胞、単細胞真核生物、植物細胞、無脊椎動物からの細胞または脊椎動物からの細胞内に存在する、請求項１０１〜１０９のいずれか一項に記載の１つまたはそれ以上の核酸。
  111. 前記標的ＤＮＡが染色体ＤＮＡである、請求項１０１〜１１０のいずれか一項に記載の１つまたはそれ以上の核酸。
  112. 前記Ｃａｓ９ポリペプチドがＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のＣａｓ９である、請求項１０１〜１１１のいずれか一項に記載の１つまたはそれ以上の核酸。
  113. 前記Ｃａｓ９ポリペプチドが、対応する野生型Ｃａｓ９に比して、低いヌクレアーゼ活性を有する修飾されたＣａｓ９タンパク質である、請求項１０１〜１１２のいずれか一項に記載の１つまたはそれ以上の核酸。
  114. 前記修飾されたＣａｓ９タンパク質が、実質的にヌクレアーゼ活性を有しない、請求項１０１〜１１２のいずれか一項に記載の１つまたはそれ以上の核酸。
  115. 前記Ｃａｓ９タンパク質が、ＲｕｖＣドメインおよび／またはＨＮＨドメインに１つまたはそれ以上の変異を含む、請求項１０１〜１１２のいずれか一項に記載の１つまたはそれ以上の核酸。
  116. 前記ＤＮＡ標的化ＲＮＡが２分子のＤＮＡ標的化ＲＮＡであり、２つの別々のＲＮＡ分子を含み、そのそれぞれが、前記ハイブリダイズしてｄｓＲＮＡを形成する二つの相補的な連続ヌクレオチドの一方を含む、請求項１０１〜１１５のいずれか一項に記載の１つまたはそれ以上の核酸。
  117. 前記ＤＮＡ標的化ＲＮＡが１分子のＤＮＡ標的化ＲＮＡであり、１つのＲＮＡ分子を含む、請求項１０１〜１１５のいずれか一項に記載の１つまたはそれ以上の核酸。
  118. 前記ＤＮＡ標的化ＲＮＡが、
    （１）６７ヌクレオチドのｔｒａｃｒＲＮＡ配列：ＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵＵＵＵ（配列番号４３２）；または
    （２）２６ヌクレオチドのｔｒａｃｒＲＮＡ配列：ＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧ（配列番号３９７）
    を含む、請求項１０１〜１１７のいずれか一項に記載の１つまたはそれ以上の核酸。
  119. 前記異種ポリペプチドが、
    （１）ＤＮＡ修飾活性を有し；または
    （２）前記標的ＤＮＡからの転写を増加または減少させる能力を示す；または
    （３）前記標的ＤＮＡに結合するポリペプチドを修飾する酵素活性を有する；
    請求項１０１〜１１８のいずれか一項に記載の１つまたはそれ以上の核酸。
  120. 前記異種ポリペプチドが前記ＤＮＡ修飾活性を有し、前記活性がメチルトランスフェラーゼ活性、脱メチル化酵素活性、ＤＮＡ修復活性、ＤＮＡ損傷活性、脱アミノ化活性、ジスムターゼ活性、アルキル化活性、脱プリン活性、酸化活性、ピリミジンダイマー形成活性、インテグラーゼ活性、トランスポサーゼ活性、リコンビナーゼ活性、ポリメラーゼ活性、リガーゼ活性、ヘリカーゼ活性、光回復酵素活性およびグリコシラーゼ活性から選択される、請求項１１９に記載の１つまたはそれ以上の核酸。
  121. 前記異種ポリペプチドが脱アミノ化活性を有する、請求項１２０に記載の１つまたはそれ以上の核酸。
  122. 前記異種ポリペプチドがポリメラーゼ活性を有する、請求項１２０に記載の１つまたはそれ以上の核酸。
  123. 異種ポリペプチドと融合したＣａｓ９ポリペプチドを含むキメラＣａｓ９タンパク質、または該キメラＣａｓ９タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子改変細胞であって、ヒト生殖細胞又はヒト胚細胞ではない、前記遺伝子改変細胞。
  124. 真核生物細胞である、請求項１２３に記載の遺伝子改変細胞。
  125. 細菌細胞である、請求項１２３に記載の遺伝子改変細胞。
  126. タンパク質形質導入ドメインが前記キメラＣａｓ９タンパク質のカルボキシル末端に共有結合的に連結されており、前記タンパク質形質導入ドメインが、キメラＣａｓ９タンパク質の真核生物細胞基質から細胞小器官内への移行を促進する、請求項１２４に記載の遺伝子改変細胞。
  127. タンパク質形質導入ドメインがキメラＣａｓ９タンパク質のアミノ末端に共有結合的に連結されており、前記タンパク質形質導入ドメインが、キメラＣａｓ９タンパク質の真核生物細胞基質から細胞小器官内への移行を促進する、請求項１２４に記載の遺伝子改変細胞。
  128. 前記Ｃａｓ９ポリペプチドが、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のＣａｓ９である、請求項１２３〜１２７のいずれか一項に記載の遺伝子改変細胞。
  129. 前記Ｃａｓ９ポリペプチドが、対応する野生型Ｃａｓ９に比して、低いヌクレアーゼ活性を有する修飾されたＣａｓ９タンパク質である、請求項１２３〜１２８のいずれか一項に記載の遺伝子改変細胞。
  130. 前記修飾されたＣａｓ９タンパク質が、実質的にヌクレアーゼ活性を有しない、請求項１２３〜１２８のいずれか一項に記載の遺伝子改変細胞。
  131. 前記修飾されたＣａｓ９タンパク質が、ＲｕｖＣドメインおよび／またはＨＮＨドメインに１つまたはそれ以上の変異を含む、請求項１２３〜１２８のいずれか一項に記載の遺伝子改変細胞。
  132. 前記異種ポリペプチドがタンパク質タグである、請求項１２３〜１３１のいずれか一項に記載の遺伝子改変細胞。
  133. 前記タンパク質タグが６ｘＨｉｓタグ、赤血球凝集素タグおよび緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）から選択される、請求項１３２に記載の遺伝子改変細胞。
  134. 前記異種ポリペプチドがＤＮＡ修飾活性を有し、前記活性がメチルトランスフェラーゼ活性、脱メチル化酵素活性、ＤＮＡ修復活性、ＤＮＡ損傷活性、脱アミノ化活性、ジスムターゼ活性、アルキル化活性、脱プリン活性、酸化活性、ピリミジンダイマー形成活性、インテグラーゼ活性、トランスポサーゼ活性、リコンビナーゼ活性、ポリメラーゼ活性、リガーゼ活性、ヘリカーゼ活性、光回復酵素活性およびグリコシラーゼ活性から選択される、請求項１２３〜１３１のいずれか一項に記載の遺伝子改変細胞。
  135. 前記異種ポリペプチドが脱アミノ化活性を有する、請求項１３４に記載の遺伝子改変細胞。
  136. 前記異種ポリペプチドがポリメラーゼ活性を有する、請求項１３４に記載の遺伝子改変細胞。
  137. 前記異種ポリペプチドが転写を増加または抑制する能力を示し、前記異種ポリペプチドが転写活性化因子ポリペプチドまたは転写抑制化因子ポリペプチドである、請求項１２３〜１３１のいずれか一項に記載の遺伝子改変細胞。
  138. 前記異種ポリペプチドが、ＤＮＡに結合するポリペプチドを修飾する酵素活性を有し、前記酵素活性がヒストン修飾活性である、請求項１２３〜１３１のいずれか一項に記載の遺伝子改変細胞。
  139. 前記異種ポリペプチドがＤＮＡに結合するポリペプチドを修飾する酵素活性を有し、前記酵素活性が、メチルトランスフェラーゼ活性、脱メチル化酵素活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、脱アセチル化酵素活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、ユビキチンリガーゼ活性、脱ユビキチン化活性、アデニル化活性、脱アデニル化活性、ＳＵＭＯ化活性、脱ＳＵＭＯ化活性、リボシル化活性、脱リボシル化活性、ミリストイル化活性または脱ミリストイル化活性、グリコシル化活性および脱グリコシル化活性から選択される、請求項１２３〜１３１のいずれか一項に記載の遺伝子改変細胞。
  140. 以下（ｉ）および（ｉｉ）を含むＤＮＡ標的化ＲＮＡ、または該ＤＮＡ標的化ＲＮＡをコードする１つまたはそれ以上のＤＮＡポリヌクレオチド：
    （ｉ）標的ＤＮＡ内の配列に対して相補的な標的化配列を含むＤＮＡ標的化セグメント；および
    （ｉｉ）前記キメラＣａｓ９タンパク質と相互作用するタンパク質結合セグメントであって、ハイブリダイズして二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を形成する二つの相補的な連続ヌクレオチドを含み、前記ｄｓＲＮＡがｔｒａｃｒＲＮＡおよびＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）の相補的なヌクレオチドを含む、タンパク質結合セグメント；
    をさらに含む、請求項１２３〜１３９のいずれか一項に記載の遺伝子改変細胞。
  141. 前記ＤＮＡ標的化ＲＮＡが、
    （１）修飾された核酸塩基、修飾された骨格または非天然ヌクレオシド間連結、修飾された糖部分、Ｌｏｃｋｅｄ核酸およびペプチド核酸の１つまたはそれ以上を含む；
    （２）ホスホロチオエート、ホスホロアミデート、非ホスホジエステル、ヘテロ原子、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、３’−アルキレンホスホネート、５’−アルキレンホスホネート、キラルホスホネート、ホスフィネート、３’−アミノホスホルアミダート、アミノアルキルホスホルアミダート、ホスホロジアミダート、チオノホスホルアミダート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、セレノホスフェートおよびボラノホスフェートの１つまたはそれ以上を含む非天然ヌクレオシド間連結を含む；
    （３）以下、（ａ）〜（ｃ）の１つまたはそれ以上を含む；
    （ａ）ホスホロチオエート、逆極性連結および脱塩基性ヌクレオシド間連結から選択される非天然ヌクレオシド間連結、
    （ｂ）Ｌｏｃｋｅｄ核酸（ＬＮＡ）、および
    （ｃ）２’−Ｏ−メトキシエチル、２’−Ｏ−メチルおよび２’−フルオロから選択される修飾された糖部分；
    （４）２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）、２’−ジメチルアミノオキシエトキシ、２’−ジメチルアミノエトキシエトキシ、２’−Ｏ−メチルおよび２’−フルオロから選択される１つまたはそれ以上の修飾された糖部分を含む；または
    （５）５−メチルシトシン、５−ヒロドキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニンの６−メチル誘導体、グアニンの６−メチル誘導体、アデニンの２−プロピル誘導体、グアニンの２−プロピル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミン、２−チオシトシン、５−プロピニルウラシル、５−プロピニルシトシン、６−アゾウラシル、６−アゾシトシン、６−アゾチミン、偽ウラシル（ｐｓｅｕｄｏｕｒａｃｉｌ）、４−チオウラシル、８−ハロアデニン、８−アミノアデニン、８−チオールアデニン、８−チオアルキルアデニン、８−ヒドロキシルアデニン、８−ハログアニン、８−アミノグアニン、８−チオールグアニン、８−チオアルキルグアニン、８−ヒドロキシルグアニン、５−ハロウラシル、５−ブロモウラシル、５−トリフルオロメチルウラシル、５−ハロシトシン、５−ブロモシトシン、５−トリフルオロメチルシトシン、５−置換ウラシル、５−置換シトシン、７−メチルグアニン、７−メチルアデニン、２−Ｆ−アデニン、２−アミノ−アデニン、８−アザグアニン、８−アザアデニン、７−デアザグアニン、７−デアザアデニン、３−デアザグアニン、３−デアザアデニン、三環式ピリミジン、フェノキサジンシチジン、フェノチアジンシチジン、置換フェノキサジンシチジン、カルバゾールシチジン、ピリドインドールシチジン、７−デアザグアノシン、２−アミノピリジン、２−ピリドン、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン、Ｎ−２、Ｎ−６またはＯ−６置換プリン、２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシンの１つまたはそれ以上を含む核酸塩基を含む；
    請求項１４０に記載の遺伝子改変細胞。
  142. 前記ＤＮＡ標的化ＲＮＡが、
    ポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール、ポリエーテル、コレステロール部分、コール酸、チオエーテル、チオコレステロール、脂肪族鎖、リン脂質、アダマンタン酢酸、パルミチル部分、オクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分、ビオチン、フェナジン、葉酸、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、色素、クマリン、取り込みを増強する部分、分解への耐性を増強する部分および／または配列特異的なハイブリダイゼーションを強化する部分、並びに取り込み、分布、代謝、または排出を向上させる部分から選択される部分に結合されている、
    請求項１４０または１４１に記載の遺伝子改変細胞。
  143. 前記ＤＮＡ標的化ＲＮＡが２分子のＤＮＡ標的化ＲＮＡであり、２つの別々のＲＮＡ分子を含み、そのそれぞれが、前記ハイブリダイズしてｄｓＲＮＡを形成する二つの相補的な連続ヌクレオチドの一方を含む、請求項１４０〜１４２のいずれか一項に記載の遺伝子改変細胞。
  144. 前記ＤＮＡ標的化ＲＮＡが１分子のＤＮＡ標的化ＲＮＡであり、１つのＲＮＡ分子を含む、請求項１４０〜１４２のいずれか一項に記載の遺伝子改変細胞。
  145. 前記ＤＮＡ標的化ＲＮＡが、
    （１）６７ヌクレオチドのｔｒａｃｒＲＮＡ配列：ＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵＵＵＵ（配列番号４３２）；または
    （２）２６ヌクレオチドのｔｒａｃｒＲＮＡ配列：ＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧ（配列番号３９７）
    を含む、請求項１４０〜１４４のいずれか一項に記載の遺伝子改変細胞。
  146. 前記標的ＤＮＡが染色体ＤＮＡである、請求項１４０〜１４５のいずれか一項に記載の遺伝子改変細胞。
  147. 患者の疾患を治療する方法において使用するための、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の組成物、請求項７０〜１００のいずれか一項に記載のキット、請求項１０１〜１２２のいずれか一項に記載の１つまたはそれ以上の核酸、または請求項１２３〜１４６のいずれか一項に記載の遺伝子改変細胞。
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