CN116848235A - 工程化t细胞 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及T细胞，所述T细胞被工程化以包含编码IFNG的内源核酸序列的修饰例如敲低、编码TNFA的内源核酸序列的修饰例如敲低和编码调节性T细胞促进分子的一个或多个序列的插入；及其组合物和用途。

Description

工程化T细胞
序列表
本申请包含以ASCII格式以电子方式提交，并且在此全文以引入的方式并入的序列表。所述ASCII副本创建于2021年12月28日，命名为12793_0030-00304_SL.txt，并且大小为120,061字节。
相关申请
本申请在此通过引用并入2020年12月30日提交的美国临时申请第63/131,987号，其全部内容以引用的方式明确地并入本文。
背景技术
适应性免疫是一种防御机制，通过这种机制，身体能够消除外来病原体。T细胞是能够介导这种免疫反应的免疫细胞。T细胞受体(TCR)是T细胞表面上能够识别抗原的蛋白质复合物。T细胞多样性来源于TCRα和β基因座的重排。
适应性免疫的一个特征是区分“自身”与“非自身”抗原的能力。自身免疫和自身炎症病症的特征在于针对“自身”抗原的致病性免疫反应。TCRα和β基因座的一些重排产生自身反应性T细胞。Owen等人,Regulatory T Cell Development i n the Thymus,J Immunol203(8)(2019)。许多自身反应性T细胞通过胸腺中的克隆缺失而被消除，但其他细胞可以逃避克隆缺失并引发有害的免疫反应。同上。被称为调节性T细胞(Treg)的特化T细胞对于“自身”耐受非常重要。同上。例如在移植物抗宿主疾病中，Treg能够抑制过度的免疫反应、自身免疫反应和不期望的免疫反应。同上。Treg的失调(例如，如果Treg的数量不足或如果Treg功能不正常)可能导致自身免疫反应。同上。
目前用于治疗自身免疫病症的疗法旨在抑制适应性免疫过程或免疫细胞的激活。虽然这些疗法可以抑制有害的免疫反应，例如自身免疫反应，但其也可以抑制有益的免疫反应。Treg疗法已用于抑制不同疾病中的抗原特异性免疫反应，包括移植物抗宿主疾病(GvHD)，其中供体细胞在造血干细胞移植后介导宿主组织的免疫攻击。Pierini等人,TCells Expressing Chimeric Antigen Receptor Promoter Immune Tolerance,JCIInsight 2(20)(2017)。然而，“基于Treg的疗法的临床实施仍然面临着重大挑战”。同上。因此，仍然需要有效的T细胞疗法，包括Treg疗法，以用于抑制免疫反应，包括炎症和自身免疫。
发明内容
本公开提供了T细胞或T细胞群体，其被工程化以包含在启动子序列的控制下的编码调节性T细胞促进分子的异源核酸；编码干扰素-γ(IFNG)的内源核酸序列的修饰，其中所述修饰敲低IFNG的表达；和编码肿瘤坏死因子α(TNFA)的内源核酸序列的修饰，其中所述修饰敲低TNFA的表达；及其组合物和用途，例如用于抑制免疫反应，包括炎症和自身免疫。在一些实施方案中，所述调节性T细胞促进分子选自白细胞介素-10(IL10)、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA4)、转化生长因子β1(TGFB1)、吲哚胺2,3-双加氧酶1(IDO1)、外切核苷三磷酸二磷酸水解酶1(ENTPD1)、外切5’-核苷酸酶(NT5E)、白细胞介素-22(IL-22)、双调蛋白(AREG)、白细胞介素-35(IL35)、GARP、CD274分子(CD274)、叉头盒P3(FOXP3)、IKAROS家族锌指2(IKZF2)、家族性嗜酸性粒细胞增多症(EOS)、干扰素调节因子4(IRF4)、淋巴增强因子结合因子1(LEF1)以及BTB结构域和CNC同源物2(BACH2)。
在一些实施方案中，T细胞或T细胞群体被工程化以包含在启动子序列的控制下的编码IL10的异源核酸；编码IFNG的内源核酸序列的修饰，其中所述修饰敲低IFNG的表达；和编码TNFA的内源核酸序列的修饰，其中所述修饰敲低TNFA的表达。
在一些实施方案中，T细胞或T细胞群体被工程化以包含在启动子序列的控制下的编码CTLA4的异源核酸；编码IFNG的内源核酸序列的修饰，其中所述修饰敲低IFNG的表达；和编码TNFA的内源核酸序列的修饰，其中所述修饰敲低TNFA的表达。
在一些实施方案中，T细胞或T细胞群体被工程化以包含各自在启动子序列的控制下的编码IL10和CTLA4的异源核酸序列；编码IFNG的内源核酸序列的修饰，其中所述修饰敲低IFNG的表达；和编码TNFA的内源核酸序列的修饰，其中所述修饰敲低TNFA的表达。
在一些实施方案中，T细胞或T细胞群体被进一步工程化以包含编码白细胞介素17A(IL17A)、白细胞介素-2(IL2)、白细胞介素6(IL6)、穿孔素1(PRF1)、颗粒酶A(GZMA)或颗粒酶B(GZMB)的内源核酸序列的修饰，例如敲低。
在一些实施方案中，T细胞或T细胞群体被进一步工程化以包含编码内源T细胞受体(TCR)的内源核酸序列的修饰，例如敲低。
在一些实施方案中，T细胞或T细胞群体被进一步工程化以包含在启动子序列的控制下的靶向受体的异源编码序列。在一些实施方案中，靶向受体包含嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)。在一些实施方案中，靶向受体靶向选自以下的配体：粘膜血管地址素细胞粘附分子1(MADCAM1)、肿瘤坏死因子α(TNFA)、CEA细胞粘附分子6(CEACAM6)、血管细胞粘附分子1(VCAM1)、瓜氨酸化波形蛋白、髓鞘碱性蛋白(MBP)、MOG(髓鞘少突胶质细胞糖蛋白)、蛋白脂质蛋白1(PLP1)、CD19分子(CD19)、CD20分子(CD20)、TNF受体超家族成员17(TNFRSF17)、二肽基肽酶样6(DPP6)、溶质载体家族2成员2(SCL2A2)、谷氨酸脱羧酶(GAD2)、桥粒芯糖蛋白3(DSG3)和MHC I类HLA-A(HLA-A*02)。
在一些实施方案中，至少30％、35％，优选至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的T细胞群体包含编码调节性T细胞促进分子的序列的插入，例如，如通过测序，例如NGS所评估。在一些实施方案中，至少50％、55％、60％、65％，优选至少70％、75％、80％、85％、90％或95％的T细胞群体包含IFNG序列中的修饰，例如敲低，例如，如通过测序，例如NGS所评估。在一些实施方案中，至少50％、55％、60％、65％，优选至少70％、75％、80％、85％、90％或95％的T细胞群体包含TNFA序列中的修饰，例如敲低，例如，如通过测序，例如NGS所评估。在一些实施方案中，至少50％、55％、60％、65％，优选至少70％、75％、80％、85％、90％或95％的T细胞群体包含TCR序列中的修饰，例如敲低，例如，如通过测序，例如NGS所评估。在一些实施方案中，至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的T细胞群体包含编码靶向受体(例如CAR)的序列的插入，例如，如通过测序，例如NGS所评估。
本文所述的用于敲低基因表达的修饰可以包括插入、缺失或取代中的一种或多种。可以将本文所述的异源序列并入表达构建体中。可以将多个异源序列并入单个表达构建体或分开的表达构建体中。可以将本文所述的异源序列并入游离表达构建体中。可以将本文所述的异源序列插入基因组中，例如非靶向插入或靶向插入。在一些实施方案中，所述靶向插入是在选自TCR基因座、TNF基因座、IFNG基因座、IL17A基因座、IL6基因座、IL2基因座、腺相关病毒整合位点1(AAVS1)基因座的位点中。
本文还提供了工程化T细胞的药物组合物和用途。在一些实施方案中，可以将工程化T细胞和其药物组合物施用于需要免疫抑制的受试者。在一些实施方案中，工程化T细胞和其药物组合物可以用于治疗免疫病症或自身免疫疾病，例如溃疡性结肠炎、克罗恩病(Crohn’s disease)、类风湿性关节炎、银屑病、多发性硬化、系统性红斑狼疮、1型糖尿病和移植物抗宿主疾病(GvHD)。
在一些实施方案中，本文所述的一个或多个序列的插入或一个或多个序列的修饰(例如敲低)可通过指导RNA与RNA指导的DNA结合剂(例如Cas核酸酶)的组合来介导。在一些实施方案中，本文所述的一个或多个序列的插入或一个或多个序列的敲低可通过另一种合适的基因编辑系统(例如，锌指核酸酶(ZFN)系统或转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)系统)来介导。
附图说明
图1A-1E是显示未经转导或经所指示编码序列的插入转导的CD3+CD4+细胞或在CD3+CD4+CD25+nTreg中的荧光染色强度的流式细胞术数据直方图。图1A是经转导的T细胞或所指示对照中的CTLA表达的荧光强度直方图。图1B是经转导的T细胞或所指示对照中的IL10表达的荧光强度直方图。图1C是经转导的T细胞或所指示对照中的Foxp3表达的荧光强度直方图。图1D是经转导的T细胞或所指示对照中的Helios表达的荧光强度直方图。图1E是经转导的T细胞或所指示对照中的Eos表达的荧光强度直方图。
图2A和2B是显示来自GvHD的小鼠模型的结果的图。图2A是显示注射经所指示编码序列的插入转导的CD3+CD4+细胞或所指示对照、注射CD4+CD25+Treg、PBMC或不注射细胞(仅辐射)后的存活天数的存活曲线。图2B是显示在注射经转导的CD3+CD4+细胞或如所指示的对照后处死时从小鼠脾脏分离的人淋巴细胞的定量的图。
图3A-3E是显示来自经所指示编码序列的插入转导的经刺激的CD3+CD4+细胞或所指示对照的体外细胞因子谱分析的结果的图。图3A显示了经转导的T细胞或所指示对照在细胞刺激后的体外IL6产生。图3B显示了经转导的T细胞或所指示对照在细胞刺激后的体外TNF-α产生。图3C显示了经转导的T细胞或所指示对照在细胞刺激后的体外IL10产生。图3D显示了经转导的T细胞或所指示对照在细胞刺激后的体外IL13产生。图3E显示了经转导的T细胞或所指示对照在细胞刺激后的体外IL2产生。图3F显示了经转导的T细胞或所指示对照在细胞刺激后的体外IFN-γ产生。
图4是显示如在混合淋巴细胞反应测定中通过CTV稀释所测量的经转导的T细胞对细胞增殖的抑制百分比的图，其中将CTV标记的T细胞和CD-3耗尽的PBMC与经所指示编码序列的插入转导的CD3+CD4+细胞或所指示对照以所指示比率混合。
图5A-5E是显示未经转导或经仅IL10和CTLA4的编码序列(未编辑)的插入或与IFNG和TNFA中的一者或两者的敲除(KO)组合转导的CD3+CD4+细胞或CD3+CD4+CD25+nTreg中的荧光染色强度的流式细胞术数据直方图。图5A是经转导的T细胞或所指示对照中的CTLA4表达的荧光强度直方图。图5B是经转导的T细胞或所指示对照中的IL10表达的荧光强度直方图。图5C是经转导的T细胞或所指示对照中的FOXP3表达的荧光强度直方图。图5D是经转导的T细胞或所指示对照中的Helios表达的荧光强度直方图。图5E是经转导的T细胞或所指示对照中的Eos表达的荧光强度直方图。
图6A和6B是显示来自GvHD的小鼠模型的结果的图。图6A是显示对小鼠注射PBMC、未经转导或经仅IL10和CTLA4的编码序列(未编辑)的插入或与IFNG和TNFA中的一者或两者的编辑(KO)组合转导的CD3+CD4+细胞、CD3+CD4+CD25+nTreg或不注射细胞(仅辐射)后的存活天数的存活曲线。图6B是显示在注射经转导的CD3+CD4+细胞或如所指示的对照细胞后处死时从小鼠脾脏分离的人淋巴细胞的定量的图。
图7A-7F是显示来自未经转导或经仅IL10和CTLA4的编码序列(未编辑)的插入或与IFNG和TNFA中的一者或两者的编辑(KO)组合转导的经刺激的CD3+CD4+细胞或CD4+CD25+nTreg中的体外细胞因子谱分析的结果的图。图7A显示了经转导的T细胞或所指示对照在细胞刺激后的体外IL6产生。图7B显示了经转导的T细胞或所指示对照在细胞刺激后的体外TNF-α产生。图7C显示了经转导的T细胞在细胞刺激后的体外IL10产生。图7D显示了经转导的T细胞在细胞刺激后的体外IL13产生。图7E显示了经转导的T细胞在细胞刺激后的体外IL2产生。图7F显示了工程化细胞在细胞刺激后的体外IFN-γ产生。
图8是显示如在混合淋巴细胞反应测定中通过CTV稀释所测量的工程化T细胞对细胞增殖的抑制百分比的图，其中将CTV标记的T细胞和CD-3耗尽的PBMC与经所指示编码序列的插入转导的CD3+CD4+细胞或所指示对照以所指示比率混合。
图9A和9B是显示来自GvHD的小鼠模型的结果的图。图9A是显示对小鼠注射PBMC、未经转导或经如所指示的野生型(wt)或高亲和力(HA)的IL10和CTLA4的编码序列的插入与IFNG和TNFA两者的编辑(KO)组合转导的CD3+CD4+细胞、CD3+CD4+CD25+nTreg或不注射细胞(媒介物)后的存活天数的存活曲线。图9B是显示在注射经转导的CD3+CD4+细胞或如所指示的对照细胞后处死时从小鼠脾脏分离的人淋巴细胞的定量的图。
图10A和10B是显示如在混合淋巴细胞测定中通过CTV稀释测量的增殖抑制百分比的图。图10A显示了在有或没有炎症预处理的情况下的增殖抑制。图10B显示了进一步在所指示炎症细胞因子的存在下，在有或没有炎症预处理的情况下的增殖抑制。所指示的各个p值为*p<0.05，**p<0.01和***p<0.001。
具体实施方式
现在将详细参考本发明的某些实施方案，其实例在附图中示出。虽然结合示出的实施方案来描述本发明，但是应理解，并不旨在将本发明限制于那些实施方案。相反，本发明旨在覆盖所有的替换、修改和等同物，这些替换、修改和等同物可以包括在由所附实施方案限定的本发明内。
本文使用的章节标题仅用于组织目的，并且不应被理解为以任何方式限制所需主题。如果通过引用并入的任何材料与本说明书中定义的任何术语或本说明书的任何其他明确内容相矛盾，则以本说明书为准。
I.定义
在详细描述本教导之前，应当理解，本公开不限于具体的组成或过程步骤，因为它们可以变化。应当注意，除非上下文另有明确指示，否则如在本说明书和所附实施方案中所使用的，单数形式“一个/种(a/an)”和“所述”包括复数个指代物。因此，例如，提及“一种缀合物”包括多种缀合物，提及“一种细胞”包括多种细胞或细胞群体等。如本文所使用的，术语“包括/包含(include)”及其语法变型旨在是非限制性的，使得列表中的条目的叙述不排除可以取代或添加到所列条目的其他类似条目。
数值范围包括定义所述范围的数值。考虑到有效数字和与测量相关的误差，测量值和可测量值应理解为近似值。此外，使用“包含/包括(comprise/comprises/comprising)”、“含有(contain/contains/containing)”、“包括/包含(include/includes/including)”并不旨在进行限制。应当理解，前面的一般描述和详细描述都仅仅是示例性和说明性的，而不是对教导的限制。
除非在说明书中特别指出，否则说明书中叙述“包含”各种组分的实施方案也被预期是“由”或“基本上由”所叙述的组分组成；说明书中叙述“由”各种组分组成的实施方案也被预期是“包含”所叙述的组分或“基本上由”其组成；并且说明书中叙述“基本上由”各种组分组成的实施方案也被预期是“由”所叙述的组分或“包含”所叙述的组分(这种互换性不适用于权利要求中这些术语的使用)。
除非上下文另有明确说明，否则术语“或”以包含的含义，即等同于“和/或”使用。
当用在列表或范围之前时，术语“约”修饰列表的每个成员或范围的每个端点。术语“约”或“大约”是指由本领域普通技术人员确定的特定值的可接受误差，这部分取决于如何测量或确定所述值。术语“约”在本文中用于指在本领域的典型公差范围内。例如，“约”可以理解为平均值的约2个标准偏差。在某些实施方案中，约是指+10％。在某些实施方案中，约是指+5％。
在一个数字或一系列数字之前的术语“至少”被理解为包括与术语“至少”相邻的数字，以及逻辑上可被包括的所有后续数字或整数，如从上下文中清楚可见的。例如，核酸分子中的核苷酸数量必须是整数。例如，“20个核苷酸的核酸分子的至少17个核苷酸”是指17个、18个、19个或20个核苷酸具有所指示特性。当至少出现在一系列数字或范围之前时，应理解“至少”可以修饰所述系列或范围中的每个数字。
如本文所使用的，“不大于”或“小于”被理解为与短语和逻辑低值或整数相邻的值，从上下文来看是逻辑上的零。例如，“不超过2个核苷酸碱基对”的双链体区域具有2个、1个或0个核苷酸碱基对。当“不大于”或“小于”出现在一系列数字或范围之前时，应理解为所述系列或范围中的每个数字都被修饰。
如本文所使用的，范围包括上限和下限。
如本文所使用的，应理解当一个值的最大量由100％(例如，100％抑制或100％包封)表示时，所述值受检测方法的限制。例如，100％抑制被理解为抑制到低于测定的检测水平的水平，并且100％包封被理解为在囊泡外不能检测到用于被包封的材料。
除非另有说明，否则本文中使用的以下术语和短语旨在具有以下含义。
如本文所使用的，“敲低”指通过基因编辑，例如在细胞、细胞群体、组织或器官中，特定基因产物(例如，全长或野生型mRNA、蛋白质或两者)的表达降低。在一些实施方案中，基因编辑可以通过序列，例如下一代测序(NGS)评估。与合适的对照(例如，其中基因序列未被修饰)相比，表达可降低至少70％、75％、80％、85％、90％、95％，或降低至低于测定的检测水平。蛋白质的敲低可以通过检测来自组织、细胞群体或所关注的流体的蛋白质的量来测量。测量mRNA敲低的方法是已知的，并且包括对从所关注的组织或细胞群体中分离的mRNA进行测序。流式细胞术分析是一种已知的用于测量蛋白质表达敲低的方法。对于分泌的蛋白质，可以在流体(例如组织培养基或血液，或来源于其的血清或血浆)中评估敲低。在一些实施方案中，“敲低”可指特定基因产物的表达的一些损失，例如转录或翻译成全长蛋白质的全长野生型mRNA的量减少，或由细胞群体表达的蛋白质的量减少。很好理解mRNA序列中的什么变化会导致野生型或全长蛋白质的表达降低。在一些实施方案中，“敲低”可以指特定基因产物(例如体液或组织培养基中的IFNG或TNFA基因产物)的表达的一些损失。内源核酸序列(例如编码IFNG或TNFA)的修饰可能导致敲低。
如本文所使用的，“T细胞受体”或“TCR”指T细胞中的受体。通常，TCR是一种异二聚体受体分子，其含有两条TCR多肽链，α和β。α和β链TCR多肽可以与各种CD3分子复合，并且在抗原结合后引发免疫反应，包括炎症和自身免疫。如本文所使用的，TCR的敲低指任何TCR基因的部分或全部敲低，例如TRBC1基因的部分缺失，单独或与其他TCR基因的部分或全部敲低相结合。
“TRAC”用于指T细胞受体α链。人野生型TRAC序列可在NCBI基因ID:28755处获得；Ensembl:ENSG00000277734。T细胞受体α常数、TCRA、IMD7、TRCA和TRA是TRAC的基因同义词。
“TRBC”用于指T细胞受体β链，例如TRBC1和TRBC2。“TRBC1”和“TRBC2”是指编码T细胞受体β链的两个同源基因，其是TRBC1或TRBC2基因的基因产物。
人野生型TRBC1序列可在NCBI基因ID:28639处获得；Ensembl:ENSG00000211751。T细胞受体β常数、V_区段翻译产物、BV05S1J2.2、TCRBC1和TCRB是TRBC1的基因同义词。
人野生型TRBC2序列可在NCBI基因ID:28638处获得；Ensembl:ENSG00000211772。T细胞受体β常数、V_区段翻译产物和TCRBC2是TRBC2的基因同义词。
如本文所使用的，“免疫反应”指一种或多种免疫系统反应，例如，与未刺激的对照免疫系统相比，免疫系统细胞的产量或活性增加，所述免疫系统细胞例如但不限于T细胞、B细胞、自然杀伤细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞、红细胞、树突细胞、抗原呈递细胞、巨噬细胞或吞噬细胞。免疫系统暴露于抗原可能会引起免疫反应，所述抗原例如外来或自身抗原，例如但不限于病原体(微生物、病毒、朊病毒、真菌等)、过敏原(灰尘、花粉、尘螨等)、毒素(化学物质、药物等)或生理变化(高胆固醇血症、肥胖、器官移植等)。免疫反应也可包括在GvHD中造血干细胞移植后供体细胞介导宿主组织免疫攻击的反应。免疫反应可能导致炎症。免疫反应可以靶向、攻击、去除或中和抗原，例如外来的或自身的抗原。免疫反应可能是需要的或可能不是需要的。免疫反应可以是急性的或慢性的。免疫反应可损害免疫反应所起始的细胞、组织或器官。
如本文所使用的，“自身免疫反应”是指对自身抗原的一种或多种免疫系统反应，例如由受试者自身的细胞、组织或器官产生的反应。与合适的对照(例如健康对照)相比，自身免疫反应可导致免疫系统细胞的产量或活性增加，所述免疫系统细胞例如但不限于T细胞、B细胞、自然杀伤细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞、红细胞、树突细胞、抗原呈递细胞、巨噬细胞或吞噬细胞。自身免疫反应可导致炎症，例如长期炎症，或导致自身免疫疾病。自身免疫反应可以靶向、攻击、去除或中和由受试者自身细胞、组织或器官产生的自身抗原，这可能导致自身免疫疾病。
如本文所使用的，“抑制”免疫反应是指降低或抑制一种或多种免疫系统反应的水平，例如与合适的对照(例如，未用本文所述的工程化T细胞处理或在用所述工程化T细胞处理之前)相比，免疫系统细胞的产量或活性。“抑制”免疫反应可指与合适的对照(例如，未用本文所述的工程化T细胞处理或在用所述工程化T细胞处理之前)相比，免疫系统细胞的产量或活性降低。“抑制”免疫反应可指增加免疫耐受性。例如，免疫系统细胞的产量或活性可以通过以下来测量：细胞计数，例如淋巴细胞计数或脾细胞计数；细胞活性，例如T细胞测定；或基因或蛋白质表达，例如生物标志物表达；其中与合适的对照(例如，未用本文所述的工程化T细胞处理或在用所述工程化T细胞处理之前)相比，产量或活性降低50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或低于测定的检测水平。
如本文所使用的，“自身免疫疾病”或“自身免疫病症”是指以对受试者自身抗原、细胞、组织或器官的病理性免疫反应为特征的疾患。自身免疫疾病和病症的实例包括但不限于：溃疡性结肠炎、克罗恩病、类风湿性关节炎、银屑病、多发性硬化、系统性红斑狼疮和1型糖尿病。在一些实施方案中，工程化T细胞具有自体或同种异体用途。
如本文所使用的，“免疫病症”被理解为受试者中以病理性或不期望的免疫反应为特征的疾病或疾患。在某些实施方案中，免疫病症是自身免疫疾病。在某些实施方案中，免疫病症是GvHD。在某些实施方案中，患有免疫病症的受试者需要抑制免疫反应。在某些实施方案中，患有免疫病症的受试者需要免疫耐受性的增加。
“T细胞”在暴露于抗原后的免疫反应中起着核心作用。T细胞可以是天然存在的，或例如，当T细胞通过工程化(例如，从干细胞)或通过转分化(例如，对体细胞重新编程)形成时，是非天然的。T细胞可以通过细胞表面上T细胞受体的存在而与其他淋巴细胞区分开。这个定义包括常规适应性T细胞，其包括辅助性C D4+ T细胞、细胞毒性CD8+ T细胞、记忆性T细胞和调节性CD4+ T细胞，以及先天样T细胞，包括自然杀伤T细胞、粘膜相关不变T细胞和γδT细胞。在一些实施方案中，T细胞是CD4+。在一些实施方案中，T细胞是CD3+/CD4+。
“调节性T细胞”或“Treg”是指通过抑制过度免疫反应(包括炎症和自身免疫)在自身耐受中发挥核心作用的特化T细胞。Treg可以是天然存在的，或例如当T reg通过工程化，例如通过编码IFNG和TNFA的内源核酸序列的修饰(例如敲低)和至少一个编码调节性T细胞促进分子的序列的插入形成时，是非天然的。天然存在的Treg或天然Treg或nTreg是一种特化T细胞，其通常在胸腺中发育并通过抑制过度免疫反应来促进自身耐受。在一些实施方案中，可通过修饰编码TNFA和IFNG的内源核酸序列，例如敲低编码TNFA和IFNG的核酸序列，并且将编码调节性T细胞促进分子的序列插入细胞中以表现调节性T细胞的表型特征和抑制功能来工程化细胞，例如常规T细胞或常规T细胞群体，例如不富集nTreg细胞的存在的T细胞群体，并且这些可被称为经转导的或“工程化的”T细胞。在一些实施方案中，工程化T细胞包含编码IFNG的内源核酸序列的修饰和编码TNFA的内源核酸序列的修饰，以及异源调节性T细胞促进分子(例如IL10或CTLA4)的插入。内源核酸序列的修饰(例如敲低内源基因表达的修饰)可以包含基因组序列中的一个或多个插入缺失或取代突变或由其组成。
如本文所使用的，“调节性T细胞促进分子”指促进常规T细胞转化为调节性T细胞的分子，包括免疫抑制分子和Treg转录因子。此外，调节性T细胞促进分子也指赋予常规T细胞调节活性的分子，包括Treg相关免疫抑制分子和转录因子。免疫抑制分子的实例可包括但不限于白细胞介素-10(IL10)、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA4)、转化生长因子β1(TGFB1)、吲哚胺2,3-双加氧酶1(IDO1)、外切核苷三磷酸二磷酸水解酶1(ENTPD1)、外切5’-核苷酸酶(NT5E)、白细胞介素-22(IL22)、双调蛋白(AREG)、白细胞介素-35(IL35)、含亮氨酸丰富重复蛋白32(GARP)、CD274分子(CD274)、叉头盒P3(FOXP3)、IKAROS家族锌指2(IKZF2)、家族性嗜酸性粒细胞增多症(EOS)、干扰素调节因子4(IRF4)、淋巴增强因子结合因子1(LEF1)以及BTB结构域和CNC同源物2(BACH2)。在一些实施方案中，调节性T细胞促进分子可以特定组合使用，例如IL10和CTLA4、ENTPD1和NT5E以及IL22和AREG。特别地，本文提供了IL10和CTLA4的组合。在一些实施方案中，免疫抑制分子的表达可通过转录因子(例如FoxP3、Helios、Eos、IRF4、Lef1或BACH2)的表达来促进。
在一些实施方案中，可以工程化常规T细胞以修饰、插入或缺失基因组中的序列，并且“工程化”T细胞表现出一种或多种天然调节性T细胞的表型特征和抑制功能。例如，如以下实施例2和3中提供的“工程化”T细胞在混合淋巴细胞反应测定中表现出抑制活性，或优选能够优选以统计学显著的方式抑制以下实施例2和3中所呈现的小鼠模型中的移植物抗宿主疾病(也参见，例如，Parmar等人,Ex vivo fucosylation of third-party humanregulatory T cells enhances anti–graft-versus-host disease potency in vivo,Blood 125(9)(2015))。在一些实施方案中，“工程化”T细胞是常规T细胞，其已经通过插入调节性T细胞促进分子的编码序列和通过修饰(例如敲低)促炎细胞因子(例如IFNG和TNFA)的表达而被修饰。在一些实施方案中，用于工程化的起始T细胞群体不富集天然Treg的存在，例如起始T细胞群体具有少于20％的天然Treg。
如本文所使用的，“促炎”分子(例如细胞因子)增加了本文所述的免疫反应，例如以剂量反应方式降低了Treg在实施例2和3中所呈现的移植物抗宿主疾病的小鼠模型中的功效。促炎分子的实例包括但不限于IFNG、TNFA、IL17A、IL6、IL2、穿孔素1(PRF1)、颗粒酶A(GZMA)、颗粒酶B(GZMB)。
如本文所使用的，“靶向受体”是指存在于细胞(例如T细胞)表面上的受体，以允许细胞与靶位点(例如生物体中的特定细胞或组织)结合。靶向受体包括但不限于嵌合抗原受体(CAR)、T细胞受体(TCR)和细胞表面分子的受体，所述细胞表面分子通过内部信号传导结构域中的至少一个跨膜结构域可操作地连接，所述内部信号传导结构域能够在结合蛋白质的胞外受体部分后激活T细胞，所述细胞表面分子例如粘膜地址素细胞粘附分子-1(MadCAM-1)、TNFA、CEA细胞粘附分子6(CEACAM6)、血管细胞粘附分子1(VCAM1)、瓜氨酸化波形蛋白、髓磷脂碱性蛋白(MBP)、MOG(髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白)、蛋白脂质蛋白1(PLP1)、CD19分子(CD19)、CD20分子(CD20)、TNF受体超家族成员17(TNFRSF17)、溶质载体家族2成员2(SCL2A2)、谷氨酸脱羧酶(GAD2)、桥粒芯蛋白3(DSG3)和MHC I类HLA-A(HLA-A*02)。
如本文所使用的，“嵌合抗原受体”指细胞外抗原识别结构域，例如，scFv、VHH、纳米抗体；其可操作地连接到细胞内信号传导结构域，当抗原结合时，其激活T细胞。CAR由四个区域组成：抗原识别结构域、细胞外铰链区、跨膜结构域和细胞内T细胞信号传导结构域。这种受体在本领域中是众所周知的(参见，例如，WO2020092057、WO2019191114、WO2019147805、WO2018208837，这些文献的相应内容部分通过引用并入本文)。还考虑了通过衔接分子促进免疫细胞与靶细胞结合的反向通用CAR(参见，例如，WO2019238722，其内容整体并入本文)。CAR可以被靶向可以产生抗体的任何抗原，并且通常针对展示在待靶向细胞或组织表面上的分子。在一些实施方案中，CAR能够将工程化T细胞靶向胃肠道，例如CAR靶向MAdCAM-1。在一些实施方案中，CAR能够将工程化T细胞靶向包含内皮细胞的组织，例如CAR靶向VCAM-1，例如用于抑制例如克罗恩病和多发性硬化的病症中的免疫反应。在一些实施方案中，CAR能够将工程化T细胞靶向内皮细胞，例如CAR靶向CEACAM6，例如用于抑制例如克罗恩病的病症中的免疫反应。在一些实施方案中，CAR能够将工程化T细胞靶向前B细胞，例如CAR靶向CD19，例如用于抑制例如多发性硬化和系统性红斑狼疮的病症中的免疫反应。在一些实施方案中，CAR能够将工程化T细胞靶向B淋巴细胞，例如CAR靶向CD20，例如用于抑制例如多发性硬化和系统性红斑狼疮的病症中的免疫反应。在一些实施方案中，CAR能够将工程化T细胞靶向炎症组织，例如CAR靶向TNFA，例如用于抑制例如类风湿性关节炎、炎性肠病、溃疡性结肠炎或克罗恩病的病症中的免疫反应。在一些实施方案中，CAR能够将工程化T细胞靶向炎症组织，例如CAR靶向TGF-b1，例如用于抑制例如炎性肠病、溃疡性结肠炎或克罗恩病的病症中的免疫反应。在一些实施方案中，CAR能够将工程化T细胞靶向神经组织，例如CAR靶向MBP、MOG或PLP1，例如用于抑制例如多发性硬化的病症中的免疫反应。在一些实施方案中，CAR能够将工程化T细胞靶向包含成熟B淋巴细胞的组织，例如CAR靶向TNFRSF17，例如用于抑制例如系统性红斑狼疮的病症中的免疫反应。在一些实施方案中，CAR能够将工程化T细胞靶向滑膜组织，例如CAR靶向瓜氨酸化波形蛋白，例如用于抑制例如类风湿性关节炎的病症中的免疫反应。在一些实施方案中，CAR靶向二肽基肽酶样6(DPP6)、溶质载体家族2成员2(SCL2A2)、谷氨酸脱羧酶(GAD2)、桥粒芯蛋白3(DSG3)或MHC I类HLA-A(HLA-A*02)。另外的CAR靶标(例如炎性抗原)是本领域已知的。参见例如WO2020092057A1，其内容全部并入本文。
如本文所使用的，“治疗”是指对受试者的疾病或病症进行治疗的任何施用或应用，并且包括抑制疾病、阻止其发展、减轻疾病的一种或多种症状、治愈疾病、预防疾病的一种或多种症状或预防疾病的一种或多种症状的复发。治疗自身免疫或炎性反应或病症可以包括减轻与特定病症相关的炎症，从而减轻疾病特异性症状。用本文所述的工程化T细胞进行的治疗可在另外的治疗剂(例如，抗炎剂、免疫抑制剂或用于治疗自身免疫病症的生物制剂，例如Remicade、Humira)之前、之后或与其组合使用。
“启动子”指控制基因表达的调控区，所述调控区与所述基因相连。
“多核苷酸”和“核酸”在本文中用于指包含核苷或核苷类似物的多聚体化合物，所述核苷或核苷类似物具有沿主链连接在一起的含氮杂环碱基或碱基类似物，包括常规RNA、DNA、混合RNA-DNA及其类似物的聚合物。核酸“主链”可由多种键组成，包括一个或多个糖-磷酸二酯键、肽-核酸键(“肽核酸”或PNA；PCT第WO 95/32305号)、硫代磷酸酯键、甲基膦酸酯键或它们的组合。核酸的糖部分可以是核糖、脱氧核糖或具有取代的类似化合物，例如2’甲氧基或2’卤化物取代。含氮碱基可以是常规碱基(A、G、C、T、U)，其类似物(例如，修饰的尿苷，例如5-甲氧基尿苷，假尿苷或N1-甲基假尿苷或其他物)；肌苷；嘌呤或嘧啶的衍生物(例如，N4-甲基脱氧鸟苷、脱氮-嘌呤或氮杂-嘌呤、脱氮-嘧啶或氮杂-嘧啶，在5位或6位具有取代基的嘧啶碱基(例如，5-甲基胞嘧啶)，在2位、6位或8位具有取代基的嘌呤碱基，2-氨基-6-甲基氨基嘌呤，O6-甲基鸟嘌呤、4-硫代-嘧啶、4-氨基-嘧啶、4-二甲基肼-嘧啶和O4-烷基-嘧啶；美国专利第5,378,825号和PCT第WO 93/13121号)。一般讨论参见The Biochemistryof the Nucleic Acids 5-36,Adams等人编,第11版,1992)。核酸可以包括一个或多个“脱碱基”残基，其中主链不包括聚合物位置的含氮碱基(美国专利第5,585,481号)。核酸可以仅包含常规RNA或DNA糖、碱基和键，或者可以包含常规组分和取代物(例如，具有2’甲氧基键的常规碱基，或者含有常规碱基和一个或多个碱基类似物的聚合物)。核酸包括“锁定核酸”(LNA)(含有一个或多个具有锁定在模拟糖构象的RNA中的双环呋喃糖单元的LNA核苷酸单体的类似物)，其增强对互补RNA和DNA序列的杂交亲和力(Vester和Wengel,2004,Biochemistry 43(42):13233-41)。RNA和DNA可以具有不同的糖部分，并且可以因RNA中尿嘧啶或其类似物和DNA中胸腺嘧啶或其类似物的存在而不同。
“指导RNA”、“gRNA”和简称“指导”在本文中可互换使用，以指包含指导序列的指导，例如crRNA(也称为CRISPR RNA)，或crRNA和trRNA的组合(也称为tracrRNA)。crRNA和trRNA可以作为单个RNA分子(单指导RNA，sgRNA)或例如两个分开的RNA分子(双指导RNA，dgRNA)结合。“指导RNA”或“gRNA”是指每一种类型。trRNA可以是天然存在的序列，或与天然存在的序列相比具有修饰或变异的trRNA序列。指导RNA(如sgRNA或dgRNA)可包括本文所述的修饰的RNA。
如本文所使用的，“指导序列”指指导RNA内的序列，其与靶序列互补并具有通过RNA指导的DNA结合剂将指导RNA导向靶序列以进行结合或修饰(例如，裂解)的功能。“指导序列”也可称为“靶向序列”或“间隔序列”。例如在化脓性链球菌(Streptococcuspyogenes)(即，Spy Cas9)和相关的Cas9同源物/直系同源物的情况下，指导序列的长度可以是20个碱基对。更短或更长的序列也可以用作指导，例如长度为15个、16个、17个、18个、19个、21个、22个、23个、24个或25个核苷酸。例如，在一些实施方案中，指导序列包含与靶标互补的序列的至少15个、16个、17个、18个、19个或20个连续核苷酸。在一些实施方案中，例如，靶序列在基因中或染色体上，并且与指导序列互补。在一些实施方案中，指导序列和其相应的靶序列之间的互补性或同一性程度可以是约75％、80％、85％、90％、95％或100％。例如，在一些实施方案中，指导序列包括与序列的至少15个、16个、17个、18个、19个或20个连续核苷酸具有约75％、80％、85％、90％、95％或100％同一性的序列。在一些实施方案中，指导序列和靶区域可以是100％互补或相同的。在其他实施方案中，指导序列和靶区域可以含有至少一个错配。例如，指导序列和靶序列可以含有1个、2个、3个或4个错配，其中靶序列的总长度至少为17个、18个、19个、20个或更多个碱基对。在一些实施方案中，指导序列和靶区域可以含有1-4个错配，或者其可以是完全互补的，其中指导序列包含至少17个、18个、19个、20个或更多个核苷酸。在一些实施方案中，指导序列和靶区域可以含有1个、2个、3个或4个错配，其中指导序列包含20个核苷酸。
RNA指导的DNA结合剂的靶序列包括基因组DNA的正链和负链(即，给定的序列和所述序列的反向互补序列)，因为RNA指导的DNA结合剂的核酸底物是双链核酸。因此，当指导序列被称为“与靶序列互补”时，应理解为指导序列可以引导指导RNA结合于靶序列的反向互补序列。因此，在一些实施方案中，当指导序列结合靶序列的反向互补序列时，指导序列与靶序列的某些核苷酸相同(例如，靶序列不包括PAM)，除了指导序列中的T被U取代外。
如本文所使用的，“RNA指导的DNA结合剂”指具有RNA和DNA结合活性的多肽或多肽复合物，或这种复合物的DNA结合亚基，其中DNA结合活性是序列特异性的并取决于RNA的序列。术语RNA指导的DNA结合剂也包括编码这种多肽的核酸。示例性的RNA指导的DNA结合剂包括Cas裂解酶/切口酶。示例性RNA指导的DNA结合剂可包括其灭活形式(“dCas DNA结合剂”)，例如，如果这些剂例如通过与FokI裂解酶结构域融合而被修饰以允许DNA裂解的情况。如本文所使用的，“Cas核酸酶”包括Cas裂解酶和Cas切口酶。Cas裂解酶和Cas切口酶包括III型CRISPR系统的Csm或Cmr复合物、其Cas10、Csm1或Cmr2亚基、I型CRISPR系统的级联复合物、其Cas3亚基和2类Cas核酸酶。如本文所使用的，“2类Cas核酸酶”是具有RNA指导的DNA结合活性的单链多肽。2类Cas核酸酶包括2类Cas裂解酶/切口酶(例如，H840A、D10A或N863A变体)，其进一步具有RNA指导的DNA裂解酶或切口酶活性，以及2类dCas DNA结合剂，其中裂解酶/切口酶活性被失活)，例如，如果那些剂被修饰以允许DNA裂解，或者具有C至T脱氨酶或A至G脱氨酶活性的情况。在一些实施方案中，RNA指导的DNA结合剂包含脱氨酶区域和RNA指导的DNA切口酶，例如Cas9切口酶。2类Cas核酸酶包括例如Cas9、Cpf1、C2c1、C2c2、C2c3、HF Cas9(例如，N497A、R661A、Q695A、Q926A变体)、HypaCas9(例如，N692A、M694A、Q695A、H698A变体)、eSPCas9(1.0)(例如，K810A、K1003A、R1060A变体)和eSPCas9(1.1)(例如，K848A、K1003A、R1060A变体)蛋白和其修饰。Cpf1蛋白(Zetsche等人,Cell,163:1-13(2015))也含有RuvC样核酸酶结构域。Zetsche的Cpf1序列通过引用整体并入本文。参见例如，Zetsche,表S1和S3。参见例如,Makarova等人,Nat Rev Microbiol,13(11):722-36(2015)；Shmakov等人,Molecular Cell,60:385-397(2015)。如本文所使用的，RNA指导的DNA结合剂(例如，Cas核酸酶、Cas9核酸酶或化脓性链球菌Cas9核酸酶)的递送包括多肽或mRNA的递送。
下面提供了Cas9分子的示例性核苷酸和多肽序列。用于鉴定编码Cas9多肽序列的替代核苷酸序列(包括替代的天然存在的变体)的方法是本领域已知的。还考虑与本文提供的任何Cas9核酸序列、氨基酸序列或编码氨基酸序列的核酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。
Cas9的示例性开放阅读框
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Cas9的示例性氨基酸序列
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Cas9的示例性开放阅读框
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具有Hibit标签的Cas9的示例性开放阅读框
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具有Hibit标签的Cas9的示例性氨基酸序列
如本文所使用的，“核糖核蛋白”(RNP)或“RNP复合物”是指指导RNA和RNA指导的DNA结合剂，例如Cas核酸酶，例如Cas裂解酶、Cas切口酶或dCas DNA结合剂(例如，Cas9)。在一些实施方案中，指导RNA将RNA指导的DNA结合剂(例如Cas9)引导至靶序列，并且指导RNA与靶序列杂交并且剂与靶序列结合；在剂是裂解酶或切口酶的情况下，结合之后可以是双链DNA裂解或单链DNA裂解。
如本文所使用的，如果第一序列与第二序列的比对显示第二序列的X％或更多的位置整体上与第一序列匹配，那么认为第一序列“包含与第二序列具有至少X％同一性的序列”。例如，序列AAGA包含与序列AAG具有100％同一性的序列，因为比对会给出100％同一性，因为与第二序列的所有三个位置都匹配。只要相关核苷酸(例如胸苷、尿苷或修饰的尿苷)具有相同的互补序列(例如，所有胸苷、尿苷或修饰的尿苷的腺苷，另一个实例是胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶，两者都具有鸟苷或修饰的鸟苷作为互补序列)，RNA与DNA之间的差异(通常是尿苷交换为胸苷，或反之亦然)和核苷类似物(如经修饰的尿苷)的存在不会导致多核苷酸之间的同一性或互补性的差异。因此，例如，序列5’-AXG(其中X是任何经修饰的尿苷，例如假尿苷、N1-甲基假尿苷或5-甲氧基尿苷)被认为与AUG 100％相同，因为两者都与同一序列(5’-CAU)完全互补。示例性的比对算法是Smith-Waterman和Needleman-Wunsch算法，它们是本领域众所周知的。本领域技术人员将理解对于给定的待比对序列对，选择什么样的算法和参数设置是合适的；对于长度大致相似且氨基酸的预期同一性>50％或核苷酸的预期同一性>75％的序列，具有由EBI在www.ebi.ac.uk网络服务器上提供的Needleman-Wunsch算法界面的默认设置的Needleman-Wunsch算法通常是合适的。
如本文所使用的，如果第一序列的X％碱基与第二序列配对，那么认为第一序列与第二序列“X％互补”。例如，第一序列5’AAGA3’与第二序列3’TTCT5’100％互补，并且第二序列与第一序列100％互补。在一些实施方案中，第一序列5’AAGA3’与第二序列3’TTCTGTGA5’100％互补，而第二序列与第一序列50％互补。
如本文所使用的，“mRNA”在本文中指完全或主要是RNA或经修饰的RNA的多核苷酸，并且包含可翻译成多肽的开放阅读框(即，可作为核糖体和氨基酰化tRNA翻译的底物)。mRNA可以包含磷酸-糖主链，包括核糖残基或其类似物，例如2’-甲氧基核糖残基。在一些实施方案中，mRNA磷酸-糖主链的糖基本上由核糖残基、2’-甲氧基核糖残基或其组合组成。
如本文所使用的，“插入缺失(indel)”指由在靶核酸的双链断裂(DSB)位点处插入或缺失的许多核苷酸组成的插入/缺失突变。
如本文所使用的，“靶序列”指靶基因中与gRNA的指导序列互补的核酸序列。靶序列和指导序列的相互作用引导RNA指导的DNA结合剂在靶序列内结合，并且可能在其中切割或裂解(取决于试剂的活性)。
如本文所使用的，“多肽”指野生型或变体蛋白质(例如，突变体、片段、融合体或它们的组合)。变体多肽可具有野生型多肽的至少或约5％、10％、15％、20％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％的功能活性。在一些实施方案中，变体与野生型多肽的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。在一些实施方案中，变体多肽可以是高活性变体。在某些情况下，变体具有野生型多肽的约80％至约120％、140％、160％、180％、200％、300％、400％、500％或更多的功能活性。
如本文所使用的，“异源基因”是指已经作为外源引入细胞内的基因(例如，在基因组基因座，例如包括TCR基因座的安全港基因座处插入)。也就是说，引入的基因就其插入位点而言是异源的。由这种异源基因表达的多肽被称为“异源多肽”。异源基因可以是天然存在的或工程化的，并且可以是野生型或变体。异源基因可以包括不同于编码异源多肽的序列的核苷酸序列(例如，内部核糖体进入位点)。异源基因可以是基因组中天然存在的基因，野生型或变体形式(例如，突变体)。例如，尽管细胞含有所关注的基因(野生型或变体形式)，但是相同的基因或其变体可以作为外源被引入，以用于例如在高表达的基因座处表达。异源基因也可以是非基因组中天然存在的基因，或者表达非基因组中天然存在的异源多肽的基因。“异源基因”、“外源基因”和“转基因”可互换使用。在一些实施方案中，异源基因或转基因包括外源核酸序列，例如，核酸序列对于接受细胞不是内源的。在一些实施方案中，异源基因或转基因包括外源核酸序列，例如，在接受细胞中不天然存在的核酸序列。例如，异源基因就其插入位点和其接受细胞而言可以是异源的。
“安全港”基因座是基因组内的基因座，其中可以插入基因而不会对细胞产生明显的有害影响。由本文所使用的核酸酶靶向的安全港基因座的非限制性实例包括AAVS1(PPP1R12C)、TCR、B2M和本文所述的靶向敲低的任何基因座，例如TNFA、IFNG、IL17A和IL6基因组基因座。在一些实施方案中，在靶向敲低的一个或多个基因座(例如TRC基因，例如TRAC基因)处的插入对于同种异体细胞是有利的。其他合适的安全港基因座是本领域已知的。
II.组合物
A.工程化T细胞
本文提供了T细胞和T细胞群体，其被工程化以包含编码IFNG的内源核酸序列的修饰(例如敲低)、编码TNFA的内源核酸序列的修饰(例如敲低)和向在启动子序列的控制下的编码调节性T细胞促进分子的异源序列的细胞中的插入；以及其组合物和用途。在一些实施方案中，调节性T细胞促进分子选自IL10、CTLA4、TGFB1、IDO1、ENTPD1、NT5E、IL22、AREG、IL35、GARP、CD274、FOXP3、IKZF2、EOS、IRF4、LEF1和BACH2。
在一些实施方案中，T细胞或T细胞群体被工程化以包含编码IFNG的内源核酸序列的修饰(例如敲低)、编码TNFA的内源核酸序列的修饰(例如敲低)和向各自在启动子序列的控制下的编码两种或更多种调节性T细胞促进分子的异源序列的细胞中的插入。例如，工程化T细胞包含在第一启动子的控制下的编码第一调节性T细胞促进分子的第一异源序列和在第二启动子的控制下的编码第二调节性T细胞促进分子的第二异源序列。第一启动子和第二启动子可以是相同的启动子或不同的启动子。
在一些实施方案中，T细胞或T细胞群体被工程化以包含编码IFNG的内源核酸序列的修饰(例如敲低)、编码TNFA的内源核酸序列的修饰(例如敲低)和向在启动子的控制下的编码IL10的异源序列的细胞中的插入。在一些实施方案中，T细胞被工程化以包含编码IFNG的内源核酸序列的修饰(例如敲低)、编码TNFA的内源核酸序列的修饰(例如敲低)和向在启动子的控制下的编码CTLA4的异源序列的细胞中的插入。在一些实施方案中，T细胞被工程化以包含编码IFNG的内源核酸序列的修饰(例如敲低)、编码TNFA的内源核酸序列的修饰(例如敲低)、向在启动子的控制下的编码IL10的异源序列的细胞中的插入以及向在启动子的控制下的编码CTLA4的异源序列的细胞中的插入。
在一些实施方案中，T细胞或T细胞群体被工程化以包含编码IFNG的内源核酸序列的修饰(例如敲低)、编码TNFA的内源核酸序列的修饰(例如敲低)和向在启动子的控制下的编码调节性T细胞促进分子的异源序列的细胞中的插入，并且表现出天然存在的调节性T细胞(nTreg)的至少一种抑制活性，例如在体外或体内测定(例如GvHD的动物模型)中免疫反应或生物标志物的抑制。
在一些实施方案中，编码调节性T细胞促进分子的异源序列被并入表达构建体中。在一些实施方案中，可将编码两种或更多种调节性T细胞促进分子的异源序列并入两种或更多种分开的表达构建体中。例如，编码第一调节性T细胞促进分子的第一异源序列提供于第一表达构建体中，并且编码第二调节性T细胞促进分子的第二异源序列提供于第二个分开的表达构建体中。在一些实施方案中，表达构建体是游离表达构建体。在一些实施方案中，将编码调节性T细胞促进分子的异源序列插入基因组中，例如靶向或非靶向插入。
在一些实施方案中，可将编码调节性T细胞促进分子的序列插入选自以下的位点：TCR基因座，例如TRAC基因座；TNF基因座、IFNG基因座、IL17A基因座、IL6基因座、IL2基因座或腺相关病毒整合位点1(AAVS1)基因座。
在一些实施方案中，工程化T细胞群体包含通过基因编辑进行的TNFA序列中的修饰(例如敲低)，例如，如通过测序(例如NGS)所评估，其中至少50％、55％、60％、65％，优选至少70％、75％、80％、85％、90％或95％的细胞包含在内源TNFA序列中的插入、缺失或取代。在一些实施方案中，与合适的对照相比，TNFA(全长、野生型蛋白质或mRNA)的表达降低至少50％、55％、60％、65％，优选至少70％、75％、80％、85％、90％、95％，或降低至低于测定的检测限，例如，其中TNFA基因未被修饰，如通过例如ELISA或流式细胞术所测定。对例如T细胞群体中的TNFA蛋白和mRNA表达的测定是本领域已知的并在本文中提供(参见实施例2和3)。在某些实施方案中，通过实施例2和3中提供的方法，敲低TNFA导致2500pg/ml或更低的TNFA水平。
在一些实施方案中，工程化T细胞群体包含通过基因编辑进行的IFNG序列中的修饰(例如敲低)，例如，如通过测序(例如NGS)所评估，其中至少50％、55％、60％、65％，优选至少70％、75％、80％、85％、90％或95％的细胞包含内源IFNG序列中的插入、缺失或取代。在一些实施方案中，与合适的对照相比，IFNG(全长、野生型蛋白质或mRNA)的表达降低至少50％、55％、60％、65％，优选至少70％、75％、80％、85％、90％、95％，或降低至低于测定的检测限，例如，其中IFNG基因未被修饰，如通过例如ELISA或流式细胞术所测定。对例如T细胞群体中的IFNG蛋白和mRNA表达的测定是本领域已知的并在本文中提供(参见实施例2和3)。在某些实施方案中，通过实施例2和3中提供的方法敲低IFNG导致300,000pg/ml或更低的IFNG水平。
在一些实施方案中，敲低基因(例如TNFA或IFNG)的表达的修饰是插入、缺失或取代中的一种或多种。
在一些实施方案中，工程化T细胞或T细胞群体包含例如通过基因编辑进行的编码调节性T细胞促进分子的序列的插入，例如，如通过测序(例如NGS)所评估，其中至少30％、35％，优选至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的细胞包含编码调节性T细胞促进分子的序列的插入。在一些实施方案中，与合适的对照相比，插入的调节性T细胞促进分子(例如IL10)导致蛋白质或mRNA的表达在统计学上显著增加，例如，其中调节性T细胞促进分子基因没有被插入，如通过例如ELISA或流式细胞术所测定。在一些实施方案中，工程化T细胞包含通过基因编辑进行的编码IL10的序列的插入，例如，如通过测序(例如NGS)所评估，其中至少30％、35％，优选至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的细胞包含编码IL10的插入或序列。在一些实施方案中，与合适的对照相比，编码IL10的插入的序列导致蛋白质或mRNA的表达在统计学上显著增加，例如，其中调节性T细胞促进分子。本文描述对例如T细胞群体中的IL10蛋白和mRNA表达的测定，并且是本领域已知的，例如ELISA和流式细胞术。在某些实施方案中，如通过实施例2和3中的方法所测定，IL10的水平为至少300pg/ml。
在一些实施方案中，工程化T细胞或T细胞群体包含例如通过基因编辑进行的编码CTLA4的序列的插入，例如，如通过测序(例如NGS)所评估，其中至少30％、35％，优选至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的细胞包含编码CTLA4的插入或序列。在一些实施方案中，与合适的对照相比，编码CTLA4的插入的序列导致蛋白质或mRNA的表达在统计学上显著增加，例如，其中调节性T细胞促进分子。本文描述对例如T细胞群体中的CTLA4蛋白和mRNA表达的测定，并且是本领域已知的，例如ELISA和流式细胞术。
在一些实施方案中，T细胞群体包含的T细胞被工程化以包含编码IFNG的内源核酸序列的修饰(例如敲低)、编码TNFA的内源核酸序列的修饰(例如敲低)和编码调节性T细胞促进分子的序列的插入。在一些实施方案中，T细胞群体中至少40％、45％，优选至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％(例如，在所使用测定的检测限内)的T细胞被工程化以包含异源调节性T细胞促进分子，例如，如通过测序(例如NGS)所评估。在一些实施方案中，T细胞群体中至少50％、55％、60％、65％，优选至少70％、75％，优选至少80％、85％、90％、95％或100％的T细胞被工程化以包含编码TNFA的序列的修饰(例如敲低)，例如，如通过测序(例如NGS)所评估。在一些实施方案中，T细胞群体中至少50％、55％、60％、65％，优选至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％的T细胞被工程化以包含编码IFNG的序列的修饰(例如敲低)，例如，如通过测序(例如NGS)所评估。在一些实施方案中，T细胞群体中至少40％、45％，优选至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％的T细胞被工程化以包含编码调节性T细胞促进分子的序列的插入，例如，如通过测序(例如NGS)所评估。在一些实施方案中，T细胞群体中至少30％、35％，优选至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％的T细胞被工程化以包含编码IL10的序列的插入，例如，如通过测序(例如NGS)所评估。在一些实施方案中，T细胞群体中至少30％、35％，优选至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％的T细胞被工程化以包含编码CTLA4的序列的插入，例如，如通过测序(例如NGS)所评估。
在一些实施方案中，包含编码IFNG的内源核酸序列的修饰(例如敲低)、编码TNFA的内源核酸序列的修饰(例如敲低)和在启动子序列的控制下的编码调节性T细胞促进分子的异源序列的插入的工程化T细胞或T细胞群体还包含编码白细胞介素17A(IL17A)、白细胞介素6(IL6)、白细胞介素2(IL2)、穿孔素1(PRF1)、颗粒酶A(GZMA)或颗粒酶B(GZMB)的内源核酸序列的修饰，其中所述修饰分别敲低IL17A、IL6、IL2、PRF1、GZMA或GZMB的表达。
在一些实施方案中，使用基因编辑系统，例如使用RNA指导的DNA结合剂工程化T细胞或T细胞群体。在一些实施方案中，使用CRISPR/Cas基因编辑系统工程化T细胞。在一些实施方案中，使用CRISPR/Cas II型基因编辑系统，例如使用Cpf1工程化T细胞。在一些实施方案中，使用CRISPR/Cas9基因编辑系统，例如使用SpyCas9工程化T细胞。本文提供了示例性Cas9序列。
在一些实施方案中，使用特异性靶向IFNG和TNFA基因内的位点的指导RNA来工程化T细胞或T细胞群体，以提供对IFNG和TNFA基因的敲低。表1和表2中提供了示例性序列，以及每个列出的指导序列的靶标的基因组坐标。
在一些实施方案中，工程化T细胞或T细胞群体包含使用本文公开的指导RNA与RNA指导的DNA结合剂敲低的IFNG和TNFA基因。在一些实施方案中，本文公开了通过例如使用本文公开的指导RNA与RNA指导的DNA结合剂(例如，CRISPR/Cas系统)在T细胞的IFNG和TNFA基因内诱导断裂(例如，双链断裂(DSB)或单链断裂(切口))工程化的T细胞。所述方法可体外或离体用于例如制造抑制免疫反应(包括炎症和自身免疫)的细胞产物。在一些实施方案中，本文公开的指导RNA通过RNA指导的DNA结合剂(例如，Cas核酸酶)在IFNG基因内的本文描述的位点处介导靶特异性切割。在一些实施方案中，本文公开的指导RNA通过RNA指导的DNA结合剂(例如，Cas核酸酶)在TNFA基因内的本文描述的位点处介导靶特异性切割。应当理解，在一些实施方案中，指导RNA包含结合或能够结合所述区域的指导序列。
提供了包含在选自表1中所列的基因组坐标处的基因修饰的工程化T细胞或T细胞群体，例如，包含在IFNG内的任何所列基因组范围内的插入缺失或取代突变的细胞。还提供了包含在选自表2中所列的基因组坐标处的基因修饰的工程化T细胞，例如，包含在TNFA内的任何所列基因组范围内的插入缺失或取代突变的细胞。在一些实施方案中，工程化T细胞将包含选自表1的基因组坐标区域内的修饰和选自表2的基因组坐标区域内的修饰。
在一些实施方案中，本文公开的指导RNA包含与选自表1或表2中的序列组的序列具有95％、90％、85％、80％或75％同一性的指导序列。在一些实施方案中，本文公开的指导RNA包含与选自表1或表2中的序列组的序列具有95％、90％、85％、80％或75％同一性的指导序列。
在一些实施方案中，本文公开的指导RNA包含具有某一序列的至少15个、16个、17个、18个、19个或20个连续核苷酸的指导序列，所述序列选自由以下组成的组：与选自表1中的序列组的序列具有95％、90％、85％、80％或75％同一性的序列。在一些实施方案中，本文公开的指导RNA包含为选自表1中的序列组的序列的至少17个、18个、19个或20个连续核苷酸的指导序列。在一些实施方案中，本文公开的指导RNA包含与选自表1中的序列组的序列具有95％、90％、85％、80％或75％同一性的指导序列。在一些实施方案中，本文公开的指导RNA包含为选自表1中的序列组的序列的17个、18个、19个或20个连续核苷酸的指导序列。在一些实施方案中，本文公开的指导RNA包含选自表1中的序列组的指导序列。
在一些实施方案中，本文公开的指导RNA包含具有某一序列的至少15个、16个、17个、18个、19个或20个连续核苷酸的指导序列，所述序列选自由以下组成的组：与选自表2中的序列组的序列具有95％、90％、85％、80％或75％同一性的序列。在一些实施方案中，本文公开的指导RNA包含为选自表2中的序列组的序列的至少17个、18个、19个或20个连续核苷酸的指导序列。在一些实施方案中，本文公开的指导RNA包含与选自表2中的序列组的序列具有95％、90％、85％、80％或75％同一性的指导序列。在一些实施方案中，本文公开的指导RNA包含为选自表2中的序列组的序列的17个、18个、19个或20个连续核苷酸的指导序列。在一些实施方案中，本文公开的指导RNA包含选自表2中的序列组的指导序列。
除非另有说明，否则基因组坐标始终根据人参考基因组hg38。
在某些实施方案中，包括包含靶向IFNG的指导序列的指导RNA和包含靶向TNFA的指导序列的指导RNA。
表1：敲低IFNG的人指导序列和染色体坐标
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表2：敲低TNFA的人指导序列和染色体坐标
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用于敲低TNFA的非限制性修饰的指导序列如下所示(hg38坐标chr12:68158001-68158021)：
mC*mC*mA*GAGCAUCCAAAAGAGUGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU(SEQ ID NO:119)，其中m是2’-OMe修饰的核苷酸/核苷残基，*指示残基之间的硫代磷酸酯键，大写字母指示残基，优选包含核糖。
用于敲低IFNG的非限制性修饰的指导序列如下所示(hg38坐标chr6:31576805-31576825)：
mA*mG*mA*GCUCUUACCUACAACAUGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU(SEQ ID NO:120)。
如下示出示例性的修饰的模拟指导(hg38坐标chr1:0-20)：
mG*mA*mU*CACGUCGGCCGUUGGCGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU(SEQ ID NO:121)。
在一些实施方案中，本文公开了通过以下方式而工程化的T细胞：使用指导RNA与RNA指导的DNA结合剂和包含异源IL10核酸的构建体(例如，供体构建体或模板)，将异源IL10核酸引入或插入T细胞或T细胞群体的基因组基因座中例如以制造工程化T细胞。在一些实施方案中，本文公开了通过以下方式而工程化的T细胞：例如使用指导RNA与RNA指导的DNA结合剂和包含异源IL10核酸的构建体(例如，供体)，从T细胞或T细胞群体的基因组基因座表达异源IL10。在一些实施方案中，本文公开了通过以下方式而工程化的T细胞：例如使用指导RNA与RNA指导的DNA结合剂(例如，CRISPR/Cas系统)，在T细胞或T细胞群体的基因组内诱导断裂(例如，双链断裂(DSB)或单链断裂(切口))以插入IL10基因。还提供了通过所述方法制备的细胞和细胞群体。
在一些实施方案中，本文公开了通过以下方式而工程化的T细胞：使用指导RNA与RNA指导的DNA结合剂和包含异源CTLA4核酸的构建体(例如，供体构建体或模板)，将异源CTLA4核酸引入或插入T细胞或T细胞群体的基因组基因座中例如以制造工程化T细胞。在一些实施方案中，本文公开了通过以下方式而工程化的T细胞：例如使用指导RNA与RNA指导的DNA结合剂和包含异源CTLA4核酸的构建体(例如，供体)，从T细胞或T细胞群体的基因组基因座表达异源CTLA4。在一些实施方案中，本文公开了通过以下方式而工程化的T细胞：例如使用指导RNA与RNA指导的DNA结合剂(例如，CRISPR/Cas系统)，在T细胞或T细胞群体的基因组内诱导断裂(例如，双链断裂(DSB)或单链断裂(切口))以插入CTLA4基因。还提供了通过所述方法制备的细胞和细胞群体。
在一些实施方案中，本文公开了通过以下方式而工程化的T细胞：使用指导RNA与RNA指导的DNA结合剂和一种或多种包含异源CTLA4核酸和异源IL10核酸的构建体(例如，供体构建体或模板)，将异源CTLA4核酸和异源IL10核酸引入或插入T细胞或T细胞群体的基因组基因座中例如以制造工程化T细胞。在一些实施方案中，本文公开了通过以下方式而工程化的T细胞：例如使用指导RNA与RNA指导的DNA结合剂和一种或多种包含异源CTLA4核酸和异源IL10核酸的构建体(例如，供体构建体或模板)，从T细胞或T细胞群体的基因组基因座表达异源CTLA4和异源IL10。在一些实施方案中，本文公开了通过以下方式而工程化的T细胞：例如使用指导RNA与RNA指导的DNA结合剂(例如，CRISPR/Cas系统)，在T细胞或T细胞群体的基因组内诱导断裂(例如，双链断裂(DSB)或单链断裂(切口))以插入CTLA4基因和IL10基因。在一些实施方案中，指导RNA通过RNA指导的DNA结合剂(例如，Cas核酸酶)在本文所述的位点处介导靶特异性切割，以用于插入编码两种或更多种调节性T细胞促进分子(例如IL10和CTLA4)的序列。应当理解，在一些实施方案中，指导RNA包含结合或能够结合所述区域的指导序列。还提供了通过所述方法制备的细胞和细胞群体。
下文提供了调节性T细胞促进分子的示例性核苷酸和多肽序列。用于鉴定编码多肽序列的替代核苷酸序列(包括替代的天然存在的变体和非人同源物)的方法是本领域已知的。下文提供了编码IL10和CTLA4的示例性核酸序列。其他合适的IL10和CTLA4序列是本领域已知的。参见例如，Gorby等人,Engineered IL-10variants elicit potent immuno-modulatory activities at therapeutic low ligand doses,BioRxiv(2020)和Xu等人,Affinity and cross-reactivity engineering of CTLA4-Ig to modulate T cellcostimulation,J Immunol(2012)，其内容和序列通过引用并入本文。用于鉴定替代IL10和CTLA4序列的方法也是本领域已知的。参见例如，同上。还预期例如由于突变或截短而与本文所述的任何核酸序列、氨基酸序列或编码氨基酸序列的核酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。在一些实施方案中，还提供了编码本文提供的任何氨基酸序列的核酸序列。
提供了编码IL10的非限制性示例性核酸序列：
野生型IL10：
高亲和力IL10(N36I、N110I、K117N、F129L)：
提供了IL10的非限制性示例性氨基酸序列：
野生型IL10：
高亲和力IL10(N36I、N110I、K117N、F129L)：
提供了编码CTLA4的非限制性示例性核酸序列：
野生型CTLA4：
高亲和力CTLA4(贝拉西普(belatacept)；结合结构域：A29Y、L104E)：
高亲和力CTLA4(结合结构域：A29H)：
高亲和力CTLA4(结合结构域：K28H、A29H)：
提供了CTLA4的非限制性示例性氨基酸序列：野生型CTLA4：
高亲和力CTLA4(贝拉西普；结合结构域：A29Y、L104E)：
高亲和力CTLA4(结合结构域：A29H)：
高亲和力CTLA4(结合结构域：K28H、A29H)：
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在一些实施方案中，包含编码IFNG的内源核酸序列的修饰(例如敲低)、编码TNFA的内源核酸序列的修饰(例如敲低)和向在启动子序列的控制下的编码调节性T细胞促进分子的异源序列的细胞中的插入的工程化T细胞或T细胞群体表现出天然存在的调节性T细胞(nTreg)的至少一种抑制活性，例如在体外或体内测定(例如GvHD的动物模型)中免疫反应或生物标志物的抑制。在一些实施方案中，与nTreg相比，包含编码IFNG的内源核酸序列的修饰(例如敲低)、编码TN FA的内源核酸序列的修饰(例如敲低)和向在启动子序列的控制下的编码调节性T细胞促进分子的异源序列的细胞中的插入的工程化T细胞或T细胞群体表现出改善的抑制活性，例如在体外或体内测定(例如GvHD的动物模型)中免疫反应或生物标志物的抑制增加。例如，在GvHD的小鼠模型中，与对照(例如接受PBMC的小鼠)相比，接受包含编码IFNG的内源核酸序列的修饰(例如敲低)、编码TNF A的内源核酸序列的修饰(例如敲低)和向在启动子序列的控制下的编码调节性T细胞促进分子的异源序列的细胞中的插入的工程化T细胞的小鼠表现出提高的存活率。
B.靶向受体
在一些实施方案中，包含编码IFNG的内源核酸序列的修饰(例如敲低)、编码TNFA的内源核酸序列的修饰(例如敲低)和向在启动子序列的控制下的编码调节性T细胞促进分子的异源序列的细胞中的插入的工程化T细胞还包含向编码靶向受体的异源序列的细胞中的插入。编码靶向受体的序列在启动子序列(例如内源启动子或异源启动子)的控制下。
在一些实施方案中，靶向受体是嵌合抗原受体(CAR)、T细胞受体(TCR)或细胞表面分子的受体，其通过内部信号传导结构域中的至少一个跨膜结构域可操作地连接，所述内部信号传导结构域能够在结合胞外受体部分时激活T细胞。在一些实施方案中，靶向受体可以是存在于细胞(例如T细胞)表面上的受体，以允许细胞与靶位点(例如生物体中的特定细胞或组织)结合。靶向受体不需要是抗原受体，例如，靶向受体可以是能够靶向整联蛋白的RGD肽。在一些实施方案中，靶向受体靶向选自由以下组成的组的分子：MAdCAM-1、TNFA、CEACAM6、VCAM-1、瓜氨酸化波形蛋白、髓鞘碱性蛋白(MBP)、MOG(髓鞘少突胶质细胞糖蛋白)、蛋白脂质蛋白1(PLP1)、CD19分子(CD19)、CD20分子(CD20)、TNF RSF17、二肽基肽酶样6(DPP6)、溶质载体家族2成员2(SCL2A2)、谷氨酸脱羧酶(GAD2)、桥粒芯蛋白3(DSG3)和MHC I类HLA-A(HLA-A*02)。
在一些实施方案中，工程化T细胞包含编码IFNG的内源核酸序列的修饰(例如敲低)；编码TNFA的内源核酸序列的修饰(例如敲低)；编码调节性T细胞促进分子的序列的插入，所述调节性T细胞促进分子选自IL10、CTLA4、TGFB1、I DO1、ENTPD1、NT5E、IL22、AREG、IL35、GARP、CD274、FOXP3、IKZF2、EOS、IRF4、LEF1和BACH2；以及编码靶向受体(例如CAR，例如靶向MAdC AM-1的CAR)的序列的插入。
在一些实施方案中，工程化T细胞包含编码IFNG的内源核酸序列的修饰(例如敲低)、编码TNFA的内源核酸序列的修饰(例如敲低)、编码IL10的序列的插入以及编码靶向受体(例如CAR，例如靶向MAdCAM-1的CAR)的序列的插入。
在一些实施方案中，工程化T细胞包含编码IFNG的内源核酸序列的修饰(例如敲低)、编码TNFA的内源核酸序列的修饰(例如敲低)、编码CTLA4的序列的插入以及编码靶向受体(例如CAR，例如靶向MAdCAM-1的CAR)的序列的插入。
在一些实施方案中，工程化T细胞包含编码IFNG的内源核酸序列的修饰(例如敲低)、编码TNFA的内源核酸序列的修饰(例如敲低)、编码IL10的序列的插入、编码CTLA4的序列的插入以及编码靶向受体(例如CAR，例如靶向MAdCAM-1的CAR)的序列的插入。
在一些实施方案中，编码靶向受体的序列被并入表达构建体中。在一些实施方案中，包含编码靶向受体的序列的表达构建体还包含编码调节性T细胞促进分子的序列，例如，编码靶向受体的序列和编码调节性T细胞促进分子的序列被并入同一表达构建体中。在一些实施方案中，包含编码靶向受体的序列的表达构建体不进一步包含编码调节性T细胞促进分子的序列，例如，编码调节性T细胞促进分子的序列被并入分开的表达构建体中。在一些实施方案中，包含编码靶向受体的序列的表达构建体是游离表达构建体。在一些实施方案中，将编码靶向受体的序列插入基因组中，例如靶向或非靶向插入。
在一些实施方案中，可将编码靶向受体的序列插入选自TCR基因座，例如TRAC基因座、TNF基因座、IFNG基因座、IL17A基因座、IL6基因座、IL2基因座或腺相关病毒整合位点1(AAVS1)基因座的位点。
在一些实施方案中，工程化T细胞包含通过基因编辑进行的编码靶向受体的序列的插入，例如，如通过测序(例如NGS)所评估。在一些实施方案中，T细胞群体包含T细胞，所述T细胞被工程化以包含编码IFNG的内源核酸序列的修饰(例如敲低)、编码TNFA的内源核酸序列的修饰(例如敲低)、编码调节性T细胞促进分子的序列的插入以及编码靶向受体(例如CAR)的序列的插入。在一些实施方案中，T细胞群体中至少40％、45％，优选至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％的T细胞被工程化以包含编码靶向受体的序列的插入，例如，如通过测序(例如NGS)所评估。应当理解，可以使用本领域已知的选择方法从具有靶向受体的细胞群体中富集T细胞群体。
在一些实施方案中，本文公开了通过以下方式而工程化的T细胞：使用指导RNA与RNA指导的DNA结合剂和包含靶向受体(例如CAR核酸)的构建体(例如，供体构建体或模板)，在T细胞内(例如在T细胞或T细胞群体的基因组基因座内)引入或插入靶向受体(例如CAR核酸)，例如以制造工程化T细胞。在一些实施方案中，本文公开了通过以下方式而工程化的T细胞：例如使用指导RNA与RNA指导的DNA结合剂和包含靶向受体(例如CAR核酸)的构建体(例如，供体)，从T细胞或T细胞群体的基因组基因座表达靶向受体(例如CAR)。在一些实施方案中，本文公开了通过以下方式而工程化的T细胞：例如使用指导RNA与RNA指导的DNA结合剂(例如，CRISPR/Cas系统)，在T细胞或T细胞群体的基因组内诱导断裂(例如，双链断裂(DSB)或单链断裂(切口))以插入靶向受体(例如CAR)。还提供了通过所述方法制备的细胞和细胞群体。
在一些实施方案中，靶向受体(例如CAR)能够将靶标特异性赋予包含靶向受体(例如，CAR)的工程化T细胞，例如特定细胞、组织或器官。
在一些实施方案中，靶向受体(例如CAR)能够将工程化T细胞靶向胃肠系统，例如，靶向受体是靶向MAdCAM-1的CAR，例如用于抑制例如炎性肠病、溃疡性结肠炎或克罗恩病的病症中的免疫反应。
在一些实施方案中，靶向受体(例如CAR)能够将工程化T细胞靶向炎性组织，例如，靶向受体是靶向TNFA的CAR，例如用于抑制例如炎性肠病、溃疡性结肠炎或克罗恩病的病症中的免疫反应。
在一些实施方案中，靶向受体(例如CAR)能够将工程化T细胞靶向内皮细胞，例如，靶向受体是靶向CEACAM6的CAR，例如用于抑制例如克罗恩病的病症中的免疫反应，包括炎症。
在一些实施方案中，靶向受体(例如CAR)能够将工程化T细胞靶向包含内皮细胞的组织，例如，靶向受体是靶向VCAM-1的CAR，例如用于抑制例如克罗恩病和多发性硬化症的病症中的免疫反应。
在一些实施方案中，CAR能够将工程化T细胞靶向滑膜组织，例如，靶向受体是靶向瓜氨酸化波形蛋白的CAR，例如用于抑制例如类风湿性关节炎的病症中的免疫反应。
在一些实施方案中，靶向受体(例如CAR)能够将工程化T细胞靶向神经组织，例如，靶向受体是靶向MBP、MOG或PLP1的CAR，例如用于抑制例如多发性硬化的病症中的免疫反应。
在一些实施方案中，靶向受体(例如CAR)能够将工程化T细胞靶向B细胞，例如，靶向受体是靶向CD19的CAR，例如用于抑制例如多发性硬化和系统性红斑狼疮的病症中的免疫反应。
在一些实施方案中，靶向受体(例如CAR)能够将工程化T细胞靶向B细胞，例如，靶向受体是靶向CD20的CAR，例如用于抑制例如多发性硬化和系统性红斑狼疮的病症中的免疫反应。
在一些实施方案中，靶向受体(例如CAR)能够将工程化T细胞靶向包含成熟B淋巴细胞的组织，例如，靶向受体是靶向TNFRSF17的CAR，例如用于抑制例如系统性红斑狼疮的病症中的免疫反应。
在一些实施方案中，靶向受体(例如，CAR)靶向SCL2A2。在一些实施方案中，靶向受体(例如，CAR)靶向DPP6。在一些实施方案中，靶向受体(例如，CAR)靶向GAD2。在一些实施方案中，靶向受体(例如，CAR)靶向DSG3。在一些实施方案中，靶向受体(例如，CAR)靶向MHC I类HLA-A(HLA-A*02)。
另外的CAR靶标(例如炎性抗原)是本领域已知的。参见例如WO2020092057A1，其内容全部并入本文。在一些实施方案中，可通过检测工程化T细胞、工程化T细胞群体、组织、所关注体液或包含工程化T细胞的组织培养基中的蛋白质或mRNA的量来评估插入。在一些实施方案中，通过基因编辑进行的插入可以通过序列，例如下一代测序(NGS)来评估。本文描述对靶向受体(例如CAR)的蛋白质和mRNA表达的测定，并且是本领域已知的。
在一些实施方案中，工程化T细胞或T细胞群体不包括异源靶向受体。
C.T细胞受体(TCR)
一些实施方案中，包含编码IFNG的内源核酸序列的修饰(例如敲低)、编码TNFA的内源核酸序列的修饰(例如敲低)和向在启动子序列的控制下的编码调节性T细胞促进分子的异源序列的细胞中的插入的工程化T细胞或T细胞群体还包含编码TCR基因序列的内源核酸序列的修饰(例如敲低)。
在一些实施方案中，包含编码IFNG的内源核酸序列的修饰(例如敲低)、编码TNFA的内源核酸序列的修饰(例如敲低)、向在启动子序列的控制下的编码调节性T细胞促进分子的异源序列的细胞中的插入、向编码靶向受体的异源序列的细胞中的插入的工程化T细胞或T细胞群体还包含编码TCR基因序列的内源核酸序列的修饰(例如敲低)。
通常，TCR是异二聚体受体分子，其含有两条TCR多肽链α和β。用于靶向敲低的合适的α和β基因组序列或基因座是本领域已知的。在一些实施方案中，工程化T细胞包含TCRα链基因序列(例如TRAC)的修饰(例如敲低)。参见例如，NCBI基因ID：28755；Ensembl：ENSG00000277734(T细胞受体α常数)，US2018/0362975和WO2020081613。
在一些实施方案中，工程化T细胞或T细胞群体包含编码IFNG的内源核酸序列的修饰(例如敲低)；编码TNFA的内源核酸序列的修饰(例如敲低)；编码调节性T细胞促进分子的序列的插入，所述调节性T细胞促进分子选自IL10、CTLA4、TGFB1、IDO1、ENTPD1、NT5E、IL22、AREG、IL35、GARP、CD274、FOXP3、IKZF2、EOS、IRF4、LEF1和BACH2；以及编码TCR基因序列的内源核酸序列的修饰(例如敲低)。
在一些实施方案中，工程化T细胞或T细胞群体包含编码IFNG的内源核酸序列的修饰(例如敲低)、编码TNFA的内源核酸序列的修饰(例如敲低)、编码IL10或CTLA4的序列的插入以及编码TCR基因序列的内源核酸序列的修饰(例如敲低)。
在一些实施方案中，工程化T细胞或T细胞群体包含编码IFNG的内源核酸序列的修饰(例如敲低)、编码TNFA的内源核酸序列的修饰(例如敲低)、编码调节性T细胞促进分子的序列的插入以及内源TCR基因序列(例如TRAC基因序列)的修饰(例如敲低)。
在一些实施方案中，工程化T细胞或T细胞群体包含编码IFNG的内源核酸序列的修饰(例如敲低)；编码TNFA的内源核酸序列的修饰(例如敲低)；
编码调节性T细胞促进分子的序列的插入，所述调节性T细胞促进分子选自
IL10、CTLA4、TGFB1、IDO1、ENTPD1、NT5E、IL22、AREG、IL35、GARP、CD274、FOXP3、IKZF2、EOS、IRF4、LEF1和BACH2；以及内源TCR基因(例如TRAC基因序列)的修饰(例如敲低)。
在一些实施方案中，工程化T细胞或T细胞群体包含编码IFNG的内源核酸序列的修饰(例如敲低)、编码TNFA的内源核酸序列的修饰(例如敲低)、编码IL10或CTLA4的序列的插入以及TCR基因(例如TRAC基因序列)的修饰(例如敲低)。
在一些实施方案中，工程化T细胞或T细胞群体包含编码IFNG的内源核酸序列的修饰(例如敲低)、编码TNFA的内源核酸序列的修饰(例如敲低)、编码调节性T细胞促进分子的序列的插入以及内源TCR基因(例如TRAC基因序列)的修饰(例如敲低)。
在任何这些实施方案中，工程化T细胞或T细胞群体可进一步包含编码如本文所述的靶向受体(例如CAR，例如靶向MAdCAM-1的CAR)的序列的插入。
在一些实施方案中，工程化T细胞或T细胞群体包含通过基因编辑进行的TRC基因序列的修饰(例如敲低)，例如，如通过测序(例如NGS)所评估，其中至少50％、55％、60％、65％，优选至少70％、75％、80％、85％、90％或95％的细胞包含内源TRC基因序列中的插入、缺失或取代。在一些实施方案中，与合适的对照相比，TRC降低至少50％、55％、60％、65％，优选至少70％、75％、80％、85％、90％、95％，或降低至低于测定的检测限，例如，其中TRC基因未被修饰。对TRC蛋白和mRNA表达的测定是本领域中已知的。
在一些实施方案中，工程化T细胞或T细胞群体包含通过基因编辑进行的编码靶向受体的序列的插入，例如，如通过测序(例如NGS)所评估。
在一些实施方案中，T细胞群体包含T细胞，所述T细胞被工程化以包含编码IFNG的内源核酸序列的修饰(例如敲低)、编码TNFA的内源核酸序列的修饰(例如敲低)、编码调节性T细胞促进分子的序列的插入以及至少一种TCR基因序列的修饰(例如敲低)。在一些实施方案中，T细胞群体中至少50％、55％、60％、65％，优选至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％的T细胞被工程化以包含至少一种TCR基因序列的修饰(例如敲低)，例如，如通过测序(例如NGS)所评估。
在一些实施方案中，特异性靶向TCR基因(例如TRAC基因)内的位点的指导RNA用于提供TCR基因的修饰(例如敲低)。
在一些实施方案中，在T细胞中使用指导RNA与RNA指导的DNA结合剂来修饰(例如敲低)TCR基因。在一些实施方案中，本文公开了通过以下方式而工程化的T细胞：例如使用指导RNA与RNA指导的DNA结合剂(例如，CRIS PR/Cas系统)，在T细胞的TCR基因内诱导断裂(例如，双链断裂(DSB)或单链断裂(切口))。所述方法可体外或离体用于例如制造抑制免疫反应的细胞产物。
在一些实施方案中，指导RNA通过RNA指导的DNA结合剂(例如，Cas核酸酶)在TCR基因内的本文所述的位点处介导靶特异性切割。应当理解，在一些实施方案中，指导RNA包含结合或能够结合所述区域的指导序列。
D.指导RNA
在本文的任何实施方案中，指导RNA可以进一步包含trRNA。在本文所述的每种组合物和方法实施方案中，crRNA和trRNA可以作为单个RNA(sgRNA)缔合，或者可以在分开的RNA(dgRNA)上。在sgRNA的情况下，crRNA和trRNA组分可例如通过磷酸二酯键或其他共价键共价连接。在一些实施方案中，sgRNA包含核苷酸之间的一个或多个不是磷酸二酯键的键。
在本文描述的组合物、用途和方法实施方案中的每一个中，指导RNA可以包含两个RNA分子作为“双指导RNA”或“dgRNA”dgRNA包含第一RNA分子和第二RNA分子，第一RNA分子包含crRNA，crRNA包含例如本文所示的指导序列，第二RNA分子包含trRNA。第一和第二RNA分子可以不共价连接，但是可以通过crRNA和trRNA部分之间的碱基配对形成RNA双链体。
在本文描述的组合物、用途和方法实施方案中的每一个中，指导RNA可以包含单个RNA分子作为“单指导RNA”或“sgRNA”。sgRNA可包含crRNA(或其一部分),crRNA包含本文所示的与trRNA共价连接的指导序列。sgRNA可包含本文所示的指导序列的15个、16个、17个、18个、19个或20个连续核苷酸。在一些实施方案中，crRNA和trRNA通过接头共价连接。在一些实施方案中，sgRNA通过crRNA和trRNA部分之间的碱基配对形成茎环结构(stem-loopstructure)。在一些实施方案中，crRNA和trRNA通过一个或多个不是磷酸二酯键的键共价连接。
在一些实施方案中，trRNA可以包含来自天然存在的CRISPR/Cas系统的trRNA序列的全部或一部分。在一些实施方案中，trRNA包含截短的或修饰的野生型trRNA。trRNA的长度取决于所用的CRISPR/Cas系统。在一些实施方案中，trRNA包含5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、25个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个或超过100个核苷酸或由其组成。在一些实施方案中，trRNA可包含某些二级结构，例如一个或多个发夹或茎环结构，或一个或多个凸起结构。
在一些实施方案中，靶序列或区域可以与指导RNA的指导序列互补。在一些实施方案中，指导RNA的指导序列与其相应的靶序列之间的互补性或同一性程度可以是75％、80％、85％、90％、95％或100％。在一些实施方案中，gRNA的靶序列和指导序列可以是100％互补或相同的。在其他实施方案中，gRNA的靶序列和指导序列可以含有一个错配。例如，gRNA的靶序列和指导序列可以含有1个、2个、3个、4个或5个错配，其中指定序列的总长度为约20或为20。在一些实施方案中，gRNA的靶序列和指导序列可以含有1-4个错配，其中指导序列为约20或为20个核苷酸。
在本文的任何实施方案中，本文的每个指导序列可进一步包含另外的核苷酸以形成crRNA或指导RNA，例如，在其3’末端的指导序列之后的以下示例性核苷酸序列：呈5’至3’取向的GUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG(SEQ ID NO:134)。在sgRNA的情况下，上述指导序列可进一步包含另外的核苷酸以形成sgRNA，例如，在其3’末端指导序列之后的以下示例性核苷酸序列：
GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU(SEQ ID NO:135)或GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(SEQ ID NO:136)。
在任何实施方案中，本文公开的指导RNA结合于原型间隔区邻近基序(PAM)的上游区域。如本领域技术人员所理解的，PAM序列出现在与含有靶序列的链相对的链上，并且随着CRISPR/Cas系统而变化。也就是说，PAM序列在靶链(含有指导RNA所结合的靶序列的链)的互补链上。在一些实施方案中，PAM选自由以下组成的组：NGG、NNGRRT、NNGRR(N)、NNAGAAW、NNNNG(A/C)TT和NNNNRYAC。
在一些实施方案中，本文提供的指导RNA序列与邻近PAM序列的序列互补。
在一些实施方案中，指导RNA序列包含与根据人参考基因组hg38中的坐标选自本文表格的基因组区域内的序列互补的序列。在一些实施方案中，指导RNA序列包含与包含来自本文表格的基因组区域内的5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个或25个连续核苷酸的序列互补的序列。在一些实施方案中，指导RNA序列包含与包含跨越选自本文表格的基因组区域的5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个或25个连续核苷酸的序列互补的序列。
本文公开的指导RNA介导靶特异性切割，从而导致双链断裂(DSB)。本文公开的指导RNA介导靶特异性切割，从而导致单链断裂(SSB或切口)。
E.经化学修饰的gRNA
在本文的任何实施方案中，gRNA可以被化学修饰。包含一个或多个经修饰的核苷或核苷酸的gRNA被称为“经修饰的”gRNA或“经化学修饰的”gRNA，以描述一个或多个非天然或天然存在的组分或构型的存在，这些组分或构型被用来代替或补充常规的A、G、C和U残基。在一些实施方案中，用非常规核苷或核苷酸合成经修饰的gRNA，这里称为“经修饰的”。经修饰的核苷和核苷酸可包括以下一种或多种：(i)磷酸二酯主链键中一个或两个非连接磷酸氧或一个或多个连接磷酸氧的更改，例如，替换(示例性主链修饰)；(ii)核糖糖，例如核糖糖上2’羟基的成分的更改，例如替换(示例性的糖修饰)；(iii)用“脱磷酸”接头大规模替换磷酸部分(示例性主链修饰)；(iv)天然存在的核碱基的修饰或替换，包括用非常规核碱基(示例性碱基修饰)；(v)核糖-磷酸主链的替换或修饰(示例性的主链修饰)；(vi)寡核苷酸的3’末端或5’末端的修饰，例如末端磷酸基团的去除、修饰或替换，或部分、帽或接头的缀合(这种3’或5’帽修饰可包括糖或主链修饰)；和(vii)糖的修饰或替换(示例性的糖修饰)。
化学修饰(如上面列出的那些)可以组合以提供包含核苷和核苷酸(统称为“残基”)的修饰的gRNA，其可以具有两个、三个、四个或更多个修饰。经例如，经修饰的残基可以具有经修饰的糖和经修饰的核碱基。在一些实施方案中，gRNA的每个碱基都被修饰，例如，所有碱基都具有经修饰的磷酸基团，例如硫代磷酸酯基团。在某些实施方案中，gRNA分子的全部或基本上全部磷酸基团被硫代磷酸酯基团替换。在一些实施方案中，经修饰的gRNA包含在RNA的5’末端处或其附近的至少一个经修饰的残基。在一些实施方案中，经修饰的gRNA包含在RNA的3’末端处或其附近的至少一个经修饰的残基。某些gRNA包含在RNA的5’末端和3’末端处或其附近的至少一个经修饰的残基。
在一些实施方案中，本文公开的指导RNA包含WO2018/107028中公开的修饰模式中的一种，该文献的内容通过引用并入本文相关部分。在一些实施方案中，本文公开的指导RNA包含US20170114334中公开的结构/修饰模式中的一种，该文献通过引用并入本文。在一些实施方案中，本文公开的指导RNA包含WO2017/136794、WO2017004279、US2018187186、US2019048338中公开的结构/修饰模式中的一种，这些文献通过引用并入本文。
F.编码RNA指导的DNA结合剂的mRNA
在一些实施方案中，细胞或方法包含mRNA，所述mRNA包含编码RNA指导的DNA结合剂的开放阅读框(ORF)，如本文所述的Cas核酸酶。本文提供了Cas9 ORF，并且是本领域已知的。作为一个实例，Cas9 ORF可以是密码子优化的，使得编码序列包括一个或多个氨基酸的一个或多个替代密码子。如本文所使用的“替代密码子”是指给定氨基酸的密码子使用的变化，并且对于给定的表达系统，可以是或不是优选的或优化的密码子(密码子优化的)。优选的密码子使用或给定表达系统中耐受性良好的密码子是本领域已知的。WO2013/176772、WO2014/065596、WO2016/106121和WO2019/067910的Cas9编码序列、Cas9 mRNA和Cas9蛋白序列通过引用并入本文。特别地，WO2019/067910第[0449]段的表格中的ORF和Cas9氨基酸序列以及WO2019/067910第[0214]-[0234]段的Cas9mRNA和ORF通过引用并入本文。
在一些实施方案中，经修饰的ORF可以包含在至少一个、多个或所有尿苷位置处的经修饰的尿苷。在一些实施方案中，经修饰的尿苷是在5位处例如用卤素、甲基或乙基修饰的尿苷。在一些实施方案中，经修饰的尿苷是在1位处例如用卤素、甲基或乙基修饰的假尿苷。经修饰的尿苷可以是例如假尿苷、N1-甲基-假尿苷、5-甲氧基尿苷、5-碘尿苷或它们的组合。在一些实施方案中，经修饰的尿苷是5-甲氧基尿苷。在一些实施方案中，经修饰的尿苷是5-碘尿苷。在一些实施方案中，经修饰的尿苷是假尿苷。在一些实施方案中，经修饰的尿苷是N1-甲基-假尿苷。在一些实施方案中，经修饰的尿苷是假尿苷和N1-甲基-假尿苷的组合。在一些实施方案中，经修饰的尿苷是假尿苷和5-甲氧基尿苷的组合。在一些实施方案中，经修饰的尿苷是N1-甲基假尿苷和5-甲氧基尿苷的组合。在一些实施方案中，经修饰的尿苷是5-碘尿苷和N1-甲基-假尿苷的组合。在一些实施方案中，经修饰的尿苷是假尿苷和5-碘尿苷的组合。在一些实施方案中，经修饰的尿苷是5-碘尿苷和5-甲氧基尿苷的组合。
在一些实施方案中，本文公开的mRNA包含5’帽，例如Cap0、Cap1或Cap2。5’帽通常是通过5’-三磷酸连接至mRNA的5’-至-3’链的第一个核苷酸的5’位(即第一个近帽核苷酸)的7-甲基鸟嘌呤核糖核苷酸(其可以进一步被修饰，例如，ARCA(抗反向帽类似物；ThermoFisher Scientific目录号AM8045)是一种帽类似物，其包含与鸟嘌呤核糖核苷酸的5’位连接的7-甲基鸟嘌呤3’-甲氧基-5’-三磷酸)。在Cap0中，mRNA的第一个和第二个近帽核苷酸的核糖都包含2’-羟基。在Cap1中，mRNA的第一和第二转录核苷酸的核糖分别包含2’-甲氧基和2’-羟基。参见例如CleanCapTM AG(m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)pG；TriLinkBiotechnologies目录号N-7113)或CleanCapTM GG(m7G(5')ppp(5')(2'OMeG)pG；TriLinkBiotechnologies目录号N-7133)。在Cap2中，mRNA的第一个和第二个近帽核苷酸的核糖都包含2’-甲氧基。参见例如，Katibah等人(2014)Proc Natl Acad Sci USA 111(33):12025-30；Abbas等人(2017)Proc Natl Acad Sci USA 114(11):E2106-E2115。
在一些实施方案中，mRNA还包含聚腺苷酸化(poly-A)尾。在一些实施方案中，poly-A尾包含20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个或100个腺嘌呤(SEQ ID NO:147)，任选多达300个腺嘌呤(SEQ ID NO:148)。在一些实施方案中，poly-A尾包含95个、96个、97个、98个、99个或100个腺嘌呤核苷酸(SEQ ID NO:149)。
G.用于工程化的T细胞
本文提供的工程化细胞是由富含CD4+ T细胞的细胞群体制备的。这种细胞可以容易地从新鲜的白细胞采集物(leukopak)样品中获得，这些样品可以从各种来源(包括例如StemCell Technologies)商业获得。CD4+ T细胞可以使用常规方法，例如通过使用人CD4+T细胞分离试剂盒的阴性选择，使用市售试剂盒来分离。然而，由其他来源制备CD4+ T细胞的方法也是本领域已知的。例如，例如造血干细胞(HSC，例如从骨髓或脐带血中分离的那些)、造血祖细胞(例如淋巴祖细胞)或间充质干细胞(MSC)的多能细胞可用于获得CD4+ T细胞。多能细胞能够发育成一种以上的细胞类型，但在分化的广度上比多能细胞更有限。多能细胞可以来源于已建立的细胞系或从人骨髓或脐带中分离。例如，可以在G-CSF诱导的动员、普乐沙福(plerixafor)诱导的动员或其组合后，从患者或健康供体中分离HSC。为了从血液或骨髓中分离HSC，可以用结合不需要的细胞的抗体淘选血液或骨髓中的细胞，例如针对CD4和CD8(T细胞)、CD45(B细胞)、GR-I(粒细胞)和Iad(分化的抗原呈递细胞)的抗体(参见例如，Inaba等人(1992)J Exp Med.176:1693-1702)。促进分化成CD4+ T细胞的方法是本领域已知的。
III.递送方法
本文公开的指导RNA、RNA指导的DNA结合剂(例如，Cas核酸酶)和核酸序列可体外或离体递送至细胞或细胞群体，以用于产生工程化T细胞，所述工程化T细胞包含编码IFNG的内源核酸序列的修饰(例如敲低)、编码TNFA的内源核酸序列的修饰(例如敲低)、编码调节性T细胞促进分子(例如IL10、CTLA4)的序列的插入；并且任选地还包含编码靶向受体(例如CAR)的序列的插入，并且任选地还包含使用本领域可用的各种已知和合适的方法对TCR序列的修饰(例如敲低)。指导RNA、RNA指导的DNA结合剂和核酸构建体可以单独或以任何组合一起递送，适当时使用相同或不同的递送方法。
常规的基于病毒和非病毒的基因递送方法可用于在细胞(例如，哺乳动物细胞)和靶组织中引入指导RNA以及RNA指导的DNA结合剂和供体构建体。如本文进一步所提供，非病毒载体递送系统核酸，例如非病毒载体、质粒载体和例如裸核酸，以及与递送媒介物，例如脂质体、脂质纳米颗粒(LNP)或泊洛沙姆(poloxamer)复合的核酸。病毒载体传递系统包括DNA和RNA病毒。
用于核酸的非病毒递送的方法和组合物包括电穿孔、脂转染、显微注射、生物射弹(biolistics)、病毒体、脂质体、免疫脂质体、LNP、聚阳离子或脂质:核酸缀合物、裸核酸(例如，裸DNA/RNA)、人工病毒体和剂增强的DNA摄取。使用例如的Sonitron 2000系统(Rich-Mar)的声穿孔也可用于递送核酸。
还可以将含有指导RNA、RNA指导的DNA结合剂和供体构建体的各种递送系统(例如，载体、脂质体、LNP)单独或组合离体施用至细胞或细胞培养物。施用是通过通常用于将分子引入与血液、流体或细胞最终接触的任何途径进行，包括但不限于注射、输注、局部施用和电穿孔。施用这种核酸的合适方法是可获得的，并且是本领域技术人员熟知的。
在某些实施方案中，本公开提供了编码本文公开的任何组合物的DNA或RNA载体，例如包含本文描述的任何一种或多种指导序列的指导RNA，例如以用于修饰(例如敲低)IFNG和TNFA，或包含编码调节性T细胞促进分子(例如IL10)或靶向受体(例如CAR，例如MAdCAM-1 CAR)的序列的供体构建体。在一些实施方案中，载体还包含编码RNA指导的DNA结合剂的序列。在某些实施方案中，本发明包含编码本文所述的组合物中的任何一种或多种或其任意组合的DNA或RNA载体。在一些实施方案中，载体还包含例如启动子、增强子和调控序列。在一些实施方案中，包含含有本文所述的任何一种或多种指导序列的指导RNA的载体也包含一种或多种编码crRNA、trRNA或crRNA和trRNA的核苷酸序列，如本文所公开。
在某些实施方案中，本发明提供了编码调节性T细胞促进分子和靶向受体的DNA或RNA载体。这种载体允许基于细胞受体的存在来选择细胞，所述细胞受体也含有调节性T细胞促进分子的编码序列。基于细胞表面分子存在的阳性和阴性选择方法是本领域已知的。
在一些实施方案中，载体包含编码本文所述的指导RNA的核苷酸序列。在一些实施方案中，载体包含指导RNA的一个拷贝。在其他实施方案中，载体包含指导RNA的一个以上拷贝。在具有一种以上指导RNA的实施方案中，指导RNA可以是不相同的，使得其靶向不同的靶序列，或者可以是相同的，因为其靶向相同的靶序列。在载体包含一种以上指导RNA的实施方案中，每种指导RNA可以具有其他不同的特性，例如在具有RNA指导的DNA核酸酶的复合物(例如Cas RNP复合物)中的活性或稳定性。在一些实施方案中，编码指导RNA的核苷酸序列可以可操作地连接到至少一个转录或翻译控制序列，例如启动子、3’UTR或5’UTR。在一个实施方案中，启动子可以是tRNA启动子，例如tRNALys3，或tRNA嵌合体。参见Mefferd等人,RNA.2015 21:1683-9；Scherer等人,Nucleic Acids Res.2007 35:2620–2628。在一些实施方案中，启动子可以被RNA聚合酶III(Pol III)识别。Pol III启动子的非限制性实例包括U6和H1启动子。在一些实施方案中，编码指导RNA的核苷酸序列可以可操作地连接到小鼠或人U6启动子。在其他实施方案中，编码指导RNA的核苷酸序列可以可操作地连接到小鼠或人H1启动子。在具有一种以上指导RNA的实施方案中，用于驱动表达的启动子可以相同或不同。在一些实施方案中，编码指导RNA的crRNA的核苷酸和编码指导RNA的trRNA的核苷酸可以在同一载体上提供。在一些实施方案中，编码crRNA的核苷酸和编码trRNA的核苷酸可以由相同的启动子驱动。在一些实施方案中，crRNA和trRNA可以被转录成单个转录物。例如，crRNA和trRNA可以从单个转录物加工形成双分子指导RNA。或者，crRNA和trRNA可以转录成单分子指导RNA(sgRNA)。在其他实施方案中，crRNA和trRNA可以由其在同一载体上的相应启动子驱动。在其他实施方案中，crRNA和trRNA可以由不同的载体编码。
在一些实施方案中，编码指导RNA的核苷酸序列可以位于包含编码RNA指导的DNA结合剂(例如Cas蛋白)的核苷酸序列的同一载体上。在一些实施方案中，指导RNA和RNA指导的DNA结合剂(例如Cas蛋白)的表达可由其自身相应的启动子驱动。在一些实施方案中，指导RNA的表达可以由驱动RNA指导的DNA结合剂(例如Cas蛋白)的表达的相同启动子驱动。在一些实施方案中，指导RNA和RNA指导的DNA结合剂(例如Cas蛋白)转录物可以包含在单一转录物中。例如，指导RNA可以在RNA指导的DNA结合剂(例如Cas蛋白)转录物的非翻译区(UTR)内。在一些实施方案中，指导RNA可以在转录物的5’UTR内。在其他实施方案中，指导RNA可以在转录物的3’UTR内。在一些实施方案中，转录物的细胞内半衰期可以通过在其3’UTR中含有指导RNA从而缩短其3’UTR的长度来缩短。在另外的实施方案中，指导RNA可以在转录物的内含子内。在一些实施方案中，可以在内含子处添加合适的剪接位点，指导RNA位于内含子内，使得指导RNA被正确地从转录物中剪接出来。在一些实施方案中，来自同一载体的RNA指导的DNA结合剂(例如Cas蛋白)和指导RNA在时间上非常接近的表达可以促进更有效地形成CRISPR RNP复合物。
在一些实施方案中，编码指导RNA或RNA指导的DNA结合剂的核苷酸序列可以位于包含构建体的同一载体上，所述构建体包含编码调节性T细胞促进分子(例如IL10、CTLA4)或靶向受体(例如CAR，例如MAdCAM-1 CAR)的序列。在一些实施方案中，包含编码调节性T细胞促进分子(例如IL10、CTLA4)或靶向受体(例如CAR，例如MAdCAM-1 CAR)的序列的构建体的邻近性；和同一载体上的指导RNA(或RNA指导的DNA结合剂)可以促进构建体更有效地插入由指导RNA/RNA指导的DNA结合剂产生的插入位点中。
在某些实施方案中，DNA和RNA载体可以包括在存在于载体中或基因组插入位点处的单一启动子下表达的一个以上开放阅读框。在这样的实施方案中，自裂解肽的编码序列可以包含在开放阅读框之间。自裂解肽可以是例如2A肽，例如P2A肽、E2A肽、F2A肽或T2A肽。
在一些实施方案中，载体包含一个或多个编码sgRNA的核苷酸序列和编码RNA指导的DNA结合剂的mRNA，所述结合剂可以是Cas蛋白，例如Cas9或Cpf1。在一些实施方案中，载体包含一个或多个编码crRNA、trRNA和mRNA的核苷酸序列，所述mRNA编码RNA指导的DNA结合剂，其可以是Cas蛋白，例如Cas9或Cpf1。在一个实施方案中，Cas9来自化脓性链球菌(即，Spy Cas9)。在一些实施方案中，编码crRNA、trRNA或crRNA和trRNA(其可以是sgRNA)的核苷酸序列包含侧翼为来自天然存在的CRISPR/Cas系统的重复序列的全部或部分的指导序列或由其组成。包含crRNA、trRNA或crRNA和trRNA或由其组成的核酸可以进一步包含载体序列，其中载体序列包含不与crRNA、trRNA或crRNA和trRNA一起天然发现的核酸或由其组成。
在一些实施方案中，crRNA和trRNA由一个载体内的不连续核酸编码。在其他实施方案中，crRNA和trRNA可以由连续的核酸编码。在一些实施方案中，crRNA和trRNA由单个核酸的相反链编码。在其他实施方案中，crRNA和trRNA由单个核酸的相同链编码。
在一些实施方案中，载体包含供体构建体，其包含编码调节性T细胞促进分子(例如IL10)或靶向受体(例如CAR，例如MAdCAM-1)的序列，如本文所公开。在一些实施方案中，除了本文公开的供体构建体之外，载体还可以包含编码本文描述的指导RNA的核酸或编码RNA指导的DNA结合剂的核酸(例如Cas核酸酶，例如Cas9)。在一些实施方案中，编码RNA指导的DNA结合剂的核酸各自或两者位于与包含本文公开的供体构建体的载体不同的载体上。在任一实施方案中，载体可包括其他序列，包括但不限于启动子、增强子、调控序列，如本文所述。在一些实施方案中，启动子不驱动供体构建体的调节性T细胞促进分子(例如IL10)或靶向受体(例如CAR，例如MAdCAM-1)的表达。在一些实施方案中，载体包含一个或多个编码crRNA、trRNA或crRNA和trRNA的核苷酸序列。在一些实施方案中，载体包含一个或多个编码sgRNA的核苷酸序列和编码RNA指导的DNA核酸酶的mRNA，所述核酸酶可以是Cas核酸酶(例如，Cas9)。在一些实施方案中，载体包含一个或多个编码crRNA、trRNA和mRNA的核苷酸序列，所述mRNA编码RNA指导的DNA核酸酶，其可以是Cas核酸酶，例如Cas9。在一些实施方案中，Cas9来自化脓性链球菌(即，Spy Cas9)。在一些实施方案中，编码crRNA、trRNA或crRNA和trRNA(其可以是sgRNA)的核苷酸序列包含侧翼为来自天然存在的CRISPR/Cas系统的重复序列的全部或部分的指导序列或由其组成。包含crRNA、trRNA或crRNA和trRNA或由其组成的核酸可以进一步包含载体序列，其中载体序列包含不与crRNA、trRNA或crRNA和trRNA一起天然发现的核酸或由其组成。
在一些实施方案中，载体可以是环状的。在其他实施方案中，载体可以是线性的。在一些实施方案中，载体可以被包封在脂质纳米颗粒、脂质体、非脂质纳米颗粒或病毒衣壳中。非限制性的示例性载体包括质粒、噬菌粒、粘粒、人工染色体、微小染色体、转座子、病毒载体和表达载体。
在一些实施方案中，载体可以是病毒载体。在一些实施方案中，病毒载体可以从其野生型对应物进行遗传修饰。例如，病毒载体可包含一个或多个核苷酸的插入、缺失或取代，以促进克隆或改变载体的一种或多种特性。这些特性可以包括包装能力、转导效率、免疫原性、基因组整合、复制、转录和翻译。在一些实施方案中，可以缺失病毒基因组的一部分，使得病毒能够包装具有更大尺寸的外源序列。在一些实施方案中，病毒载体可以具有增强的转导效率。在一些实施方案中，由a中的病毒诱导的免疫反应可能降低。在一些实施方案中，促进病毒序列整合到基因组中的病毒基因(如例如整合酶)可以被突变，使得病毒变得非整合。在一些实施方案中，病毒载体可能是复制缺陷型的。在一些实施方案中，病毒载体可以包含外源转录或翻译控制序列，以驱动编码序列在载体上的表达。在一些实施方案中，病毒可能是辅助病毒依赖型的。例如，病毒可能需要一种或多种辅助病毒来提供扩增和包装载体进入病毒颗粒所需要的病毒组分(如例如病毒蛋白)。在这种情况下，可将一种或多种辅助组分(包括一种或多种编码病毒组分的载体)与本文所述的载体系统一起引入细胞或细胞群体中。在其他实施方案中，病毒可以是无辅助病毒的。例如，病毒可能能够在没有辅助病毒的情况下扩增和包装载体。在一些实施方案中，本文所述的载体系统也可以编码病毒扩增和包装所需的病毒组分。
非限制性示例性病毒载体包括腺相关病毒(AAV)载体、慢病毒载体、腺病毒载体、辅助病毒依赖性腺病毒载体(HDAd)、单纯疱疹病毒(HSV-1)载体、噬菌体T4、杆状病毒载体和逆转录病毒载体。在一些实施方案中，病毒载体可以是AAV载体。在其他实施方案中，病毒载体可以是慢病毒载体。
在一些实施方案中，“AAV”指所有血清型、亚型和天然存在的AAV以及重组AAV。“AAV”可用于指病毒本身或其衍生物。术语“AAV”包括AAV1、AAV2、AAV3、AAV3B、AAV4、AAV5、AAV6、AAV6.2、AAV7、AAVrh.64R1、AAVhu.37、AAVrh.8、AAVrh.32.33、AAV8、AAV9、AAV-DJ、AAV2/8、AAVrh10、AAVLK03、AV10、AAV11、AAV12、rh10及其杂交体、禽AAV、牛AAV、犬AAV、马AAV、灵长类AAV、非灵长类AAV和羊AAV。AAV的各种血清型的基因组序列以及天然末端重复序列(TR)、Rep蛋白和衣壳亚基的序列是本领域已知的。这些序列可以在文献或公共数据库(如GenBank)中找到。本文所用的“AAV载体”是指包含非AAV来源的异源序列(即，与AAV异源的核酸序列)的AAV载体，通常包含编码所关注异源多肽的序列。构建体可以包含AAV1、AAV2、AAV3、AAV3B、AAV4、AAV5、AAV6、AAV6.2、AAV7、AAVrh.64R1、AAVhu.37、AAVrh.8、AAVrh.32.33、AAV8、AAV9、AAV-DJ、AAV2/8、AAVrh10、AAVLK03、AV10、AAV11、AAV12、rh10及其杂交体、禽AAV、牛AAV、犬AAV、马AAV、灵长类AAV、非灵长类AAV和羊AAV衣壳序列。通常，异源核酸序列(转基因)的侧翼是至少一个，通常两个AAV反向末端重复序列(ITR)。AAV载体可以是单链的(ssAAV)或自身互补的(scAAV)。
在一些实施方案中，慢病毒可以是整合型的。在一些实施方案中，慢病毒可以是非整合型的。在一些实施方案中，病毒载体可以是腺病毒载体。在一些实施方案中，腺病毒可以是高克隆能力或“无病毒基因的(gutless)”腺病毒，其中除了5’和3’反向末端重复序列(ITR)和包装信号(‘I’)之外的所有编码病毒区域都从病毒中缺失，以增加其包装能力。在其他实施方案中，病毒载体可以是HSV-1载体。在一些实施方案中，基于HSV-1的载体是辅助病毒依赖型的，而在其他实施方案中，其是辅助病毒非依赖型的。例如，仅保留包装序列的扩增子载体需要具有包装结构组分的辅助病毒，而去除非必需病毒功能的30kb缺失的HSV-1载体不需要辅助病毒。在另外的实施方案中，病毒载体可以是噬菌体T4。在一些实施方案中，当病毒的头部被清空时，噬菌体T4可能能够包装任何线性或环状DNA或RNA分子。在其他的实施方案中，病毒载体可以是杆状病毒载体。在又其他实施方案中，病毒载体可以是逆转录病毒载体。在使用具有较小克隆能力的AAV或其他载体的实施方案中，可能需要使用一种以上的载体来递送本文公开的载体系统的所有组分。例如，一个AAV载体可以包含编码RNA指导的DNA结合剂(例如Cas蛋白(例如，Cas9))的序列，而第二个AAV载体可以包含一个或多个指导序列。
在一些实施方案中，载体系统能够驱动细胞中一种或多种核酸酶组分的表达。在一些实施方案中，载体不包含一旦整合到细胞中就驱动一个或多个编码序列的表达的启动子(例如，使用细胞的内源启动子，例如当插入到细胞的特定基因组基因座时，如本文所举例说明的)。驱动不同类型细胞(例如CD4+ T细胞)中的表达的合适启动子是本领域已知的。在一些实施方案中，启动子可以是野生型的。在其他实施方案中，启动子可以被修饰以获得更高效或更有效的表达。在其他实施方案中，启动子可以被截短，但仍保留其功能。例如，启动子可以具有适于将载体正确包装到病毒中的正常尺寸或减小的尺寸。
在一些实施方案中，载体可以包含编码RNA指导的DNA结合剂(例如本文所述的Cas蛋白(例如，Cas9))的核苷酸序列。在一些实施方案中，由载体编码的核酸酶可以是Cas蛋白。在一些实施方案中，载体系统可以包含编码核酸酶的核苷酸序列的一个拷贝。在其他实施方案中，载体系统可以包含编码核酸酶的核苷酸序列的一个以上拷贝。在一些实施方案中，编码核酸酶的核苷酸序列可以可操作地连接到至少一个转录或翻译控制序列。在一些实施方案中，编码核酸酶的核苷酸序列可以可操作地连接到至少一个启动子。
在一些实施方案中，载体可以包含任何一种或多种构建体，所述构建体包含编码调节性T细胞促进分子(例如IL10、CTLA4)或靶向受体(例如CAR，例如MAdCAM-1 CAR)的序列，如本文所述。在一些实施方案中，调节性T细胞促进分子(例如IL10、CTLA4)或靶向受体(例如CAR，例如MAdCAM-1 CAR)的序列可以可操作地连接到至少一个转录或翻译控制序列。在一些实施方案中，调节性T细胞促进分子(例如IL10、CTLA4)或靶向受体(例如CAR，例如MAdCAM-1 CAR)的序列可以可操作地连接到至少一个启动子。在一些实施方案中，调节性T细胞促进分子(例如IL10、CTLA4)或靶向受体(例如CAR，例如MAdCAM-1 CAR)的序列不连接到驱动异源基因的表达的启动子。
在一些实施方案中，启动子可以是组成型、诱导型或组织特异性的。在一些实施方案中，启动子可以是组成型启动子。非限制性的示例性组成型启动子包括巨细胞病毒立即早期启动子(CMV)、猿猴病毒(SV40)启动子、腺病毒主要晚期(MLP)启动子、劳斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus；RSV)启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子、磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子、延伸因子-α(EF1a)启动子、泛素启动子、肌动蛋白启动子、微管蛋白启动子、免疫球蛋白启动子、其功能性片段或前述的任意组合。在一些实施方案中，启动子可以是CMV启动子。在一些实施方案中，启动子可以是截短的CMV启动子。在其他实施方案中，启动子可以是EF1a启动子。在一些实施方案中，启动子可以是诱导型启动子。非限制性的示例性诱导型启动子包括可被热休克、光、化学物质、肽、金属、类固醇、抗生素或醇诱导的启动子。在一些实施方案中，诱导型启动子可以是具有低基础(非诱导)表达水平的启动子，如例如启动子(Clontech)。
在一些实施方案中，启动子可以是组织特异性启动子，例如对T细胞中的表达具有特异性的启动子。
在一些实施方案中，组合物包含载体系统。在一些实施方案中，载体系统可以包含一个单一载体。在其他实施方案中，载体系统可以包含两种载体。在另外的实施方案中，载体系统可以包含三种载体。当不同的指导RNA用于多路复用(multiplexing)时，或者当使用指导RNA的多个拷贝时，载体系统可以包含三个以上的载体。
在一些实施方案中，载体系统可以包含诱导型启动子，以仅在其被递送至靶细胞后开始表达。非限制性的示例性诱导型启动子包括可被热休克、光、化学物质、肽、金属、类固醇、抗生素或醇诱导的启动子。在一些实施方案中，诱导型启动子可以是具有低基础(非诱导)表达水平的启动子，如例如启动子(Clontech)。
在另外的实施方案中，载体系统可以包含组织特异性启动子。
下文提供了非限制性的示例性病毒载体序列：
CTLA4慢病毒插入物(核苷酸序列)
CTLA4慢病毒插入物(氨基酸序列)
IL10慢病毒插入物(核苷酸序列)
IL10慢病毒插入物(氨基酸序列)
FOXP3慢病毒插入物(核苷酸序列)
FOXP3慢病毒插入物(氨基酸序列)
空慢病毒载体
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空慢病毒载体
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包含指导RNA、RNA结合DNA结合剂或包含编码调节性T细胞促进分子(例如IL10、CTLA4)或靶向受体(例如CAR)的序列的供体构建体的载体可以通过脂质体、纳米颗粒、外来体或微泡单独或以任何组合形式递送。载体也可以由脂质纳米颗粒(LNP)递送。一种或多种指导RNA、RNA结合DNA结合剂(例如mRN A)或包含编码异源蛋白质的序列的供体构建体可以通过LNP、脂质体、纳米颗粒、外来体或微泡单独或以任何组合形式递送。一种或多种指导RNA、RNA结合DNA结合剂(例如mRNA)或包含编码异源蛋白质的序列的供体构建体可以通过LNP单独或以任何组合形式递送。在一些实施方案中，一种或多种指导RNA和RNA指导的DNA结合剂(例如，mRNA)通过LNP递送。供体构建体可以通过病毒载体递送。
脂质纳米颗粒(LNP)是用于递送核苷酸和蛋白质货物的众所周知的手段，并且可以用于递送本文公开的任何指导RNA、RNA指导的DNA结合剂或供体构建体。
如本文所使用的，脂质纳米颗粒(LNP)是指包含多个(即一个以上)脂质分子的颗粒，所述脂质分子通过分子间力彼此物理缔合。LNP可以是例如微球体(包括单层和多层囊泡，例如“脂质体”——层状相脂质双层，其在一些实施方案中基本上是球形的，并且在更具体的实施方案中，可以包含水性核心，例如包含RNA分子的主要部分)、乳液中的分散相、胶束或悬浮液中的内相(参见例如WO2017173054，其内容通过引用整体并入本文)。可以使用本领域技术人员已知的能够向受试者递送核苷酸的任何LNP。
在一些实施方案中，本文提供了用于将本文描述的任何指导RNA或本文公开的供体构建体单独或组合递送至细胞或细胞群体或受试者的方法，其中任何一种或多种组分与LNP缔合。在一些实施方案中，所述方法还包括RNA指导的DNA结合剂(例如，Cas9或编码Cas9的序列)。
在一些实施方案中，本文提供了一种组合物，其包含本文所述的任何指导RNA或本文所公开的供体构建体，单独或与LNP组合。在一些实施方案中，组合物还包含RNA指导的DNA结合剂(例如，Cas9或编码Cas9的序列)。
在一些实施方案中，LNP包含阳离子脂质。在一些实施方案中，LNP包含十八碳-9,12-二烯酸(9Z,12Z)-3-((4,4-双(辛氧基)丁酰基)氧基)-2-((((3-(二乙氨基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙酯，也称为(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯酸3-((4,4-双(辛氧基)丁酰基)氧基)-2-((((3-(二乙氨基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙酯或另一种可电离的脂质。参见例如WO2019/067992、WO2017/173054、WO2015/095340和WO2014/136086的脂质，以及其中提供的参考文献。在一些实施方案中，LNP包含约4.5、5.0、5.5、6.0或6.5的阳离子脂质胺与RNA磷酸(N:P)的摩尔比。在一些实施方案中，术语阳离子和可电离的在LNP脂质的情形中是可互换的，例如，其中可电离的脂质是阳离子的，这取决于pH。
在一些实施方案中，与本文公开的构建体缔合的LNP用于制备用于抑制免疫反应的基于细胞的药物。用于制备基于细胞的治疗剂和用于基于细胞的治疗剂的试剂的方法是本领域已知的。
在一些实施方案中，本文描述的任何指导RNA、RNA指导的DNA结合剂或本文公开的供体构建体(单独或组合)(无论是裸的还是作为载体的一部分)在脂质纳米颗粒中配制或通过脂质纳米颗粒施用；参见例如WO2019/067992或WO2017/173054，其内容在此通过引用整体并入。
在一些实施方案中，预期LNP组合物，其包含：RNA组分和脂质组分，其中脂质组分包括胺脂质，例如可生物降解的、可电离的脂质。在一些情况下，脂质组分包括可生物降解的、可电离的脂质、胆固醇、DSPC和PEG-DMG。在某些实施方案中，脂质核酸装配体含有可电离的脂质A十八碳-9,12-二烯酸((9Z,12Z)-3-((4,4-双(辛氧基)丁酰基)氧基)-2-((((3-(二乙氨基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙酯，也称为(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯酸3-((4,4-双(辛氧基)丁酰基)氧基)-2-((((3-(二乙氨基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙酯)、胆固醇、DSPC和PEG2k-DMG。在某些实施方案中，各组分分别以50:38:9:3的摩尔比存在。脂质核酸装配体可以配制成脂胺与RNA磷酸(N∶P)摩尔比为约为6，gRNA与mRNA的重量比为2:1、1:1或1:2。
显而易见的是，指导RNA、RNA指导的DNA结合剂(例如，Cas核酸酶或编码Cas核酸酶的核酸)和包含编码调节性T细胞促进分子(例如IL10)或靶向受体(例如CAR)的序列的供体构建体可以使用相同或不同的系统递送。例如，指导RNA、Cas核酸酶和构建体可以由相同载体(例如，AAV)携带。或者，Cas核酸酶(作为蛋白质或mRNA)或gRNA可由质粒或LNP携带，而供体构建体可由载体(例如AAV)携带。
不同的递送系统可以同时递送或以任何顺序递送。在一些实施方案中，可以例如在一个载体、两个载体、单独的载体、一个LNP、两个LNP、单独的LNP或其组合中同时递送供体构建体、指导RNA和Cas核酸酶。在一些实施方案中，供体构建体可以作为载体或与LNP缔合，在递送指导RNA或Cas核酸酶之前(例如，约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天或更多天)作为载体或与LNP单独或一起缔合或作为核糖核蛋白(RNP)递送。作为另一实例，指导RNA和Cas核酸酶(作为载体或与LNP单独或一起缔合或作为核糖核蛋白(RNP))可以在递送构建体之前(例如，约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天或更多天)作为载体或与LNP缔合来递送。
IV.工程化T细胞的方法
本公开提供了工程化T细胞的方法，以包含编码IFNG的内源核酸序列的修饰(例如敲低)、编码TNFA的内源核酸序列的修饰(例如敲低)以及向在启动子序列的控制下的编码调节性T细胞促进分子的异源序列的细胞中的插入。本公开提供了工程化T细胞的方法，以包含编码IFNG的内源核酸序列的修饰(例如敲低)、编码TNFA的内源核酸序列的修饰(例如敲低)以及向在启动子序列的控制下的编码IL10的异源序列的细胞中的插入。本公开提供了工程化T细胞的方法，以包含编码IFNG的内源核酸序列的修饰(例如敲低)、编码TNFA的内源核酸序列的修饰(例如敲低)以及向在启动子序列的控制下的编码CTLA4的异源序列的细胞中的插入。本公开提供了工程化T细胞的方法，以包含编码IFNG的内源核酸序列的修饰(例如敲低)、编码TNFA的内源核酸序列的修饰(例如敲低)以及向各自在启动子序列的控制下的编码IL10和CTLA4的异源序列的细胞中的插入。
在一些实施方案中，所述方法包括工程化T细胞以包含编码IFNG的内源核酸序列的修饰(例如敲低)、编码TNFA的内源核酸序列的修饰(例如敲低)、向编码调节性T细胞促进分子(例如IL10或CTLA4)的异源序列的细胞中的插入，并且还包含TCR序列的修饰(例如敲低)。
在一些实施方案中，所述方法包括工程化T细胞以包含编码IFNG的内源核酸序列的修饰(例如敲低)、编码TNFA的内源核酸序列的修饰(例如敲低)、向编码调节性T细胞促进分子(例如IL10或CTLA4)的异源序列的细胞中的插入，并且还包括向编码靶向受体(例如CAR)的异源序列的细胞中的插入。
在一些实施方案中，所述方法包括工程化T细胞以包含编码IFNG的内源核酸序列的修饰(例如敲低)、编码TNFA的内源核酸序列的修饰(例如敲低)、向编码调节性T细胞促进分子(例如IL10或CTLA4)的异源序列的细胞中的插入、TCR序列的修饰(例如敲低)以及向编码靶向受体(例如CAR)的异源序列的细胞中的插入。
在一些实施方案中，使用CRISPR/Cas系统和本文公开的指导RNA工程化编码IFNG的内源核酸序列的修饰(例如敲低)、编码TNFA的内源核酸序列的修饰(例如敲低)、向编码调节性T细胞促进分子的异源序列的细胞中的插入、TCR基因的任选敲低以及向靶向受体(例如CAR)的细胞中的任选插入。
在这些实施方案中，待插入的调节性T细胞促进分子可通过供体构建体提供。通过供体构建体提供的调节性T细胞促进分子可选自IL10、CTLA4、TGFB1、IDO1、ENTPD1、NT5E、IL22、AREG、IL35、GARP、CD274、FOXP3、IKZF2、EOS、IRF4、LEF1和BACH2，以及TCR基因序列的修饰(例如敲低)。
在这些实施方案中，待插入的靶向受体可通过供体构建体提供。在一些实施方案中，靶向受体可以是嵌合抗原受体(CAR)、T细胞受体(TCR)或细胞表面分子的受体，所述受体通过内部信号传导结构域中的至少一个跨膜结构域可操作地连接，所述内部信号传导结构域能够在结合胞外受体部分后激活T细胞。在一些实施方案中，靶向受体可以是存在于细胞(例如T细胞)表面上的受体，以允许细胞与靶位点(例如生物体中的特定细胞或组织)结合。在这些实施方案中，靶向受体是能够靶向MAdCAM-1的CAR。
本文公开并且本领域已知用于工程化T细胞以包含插入和修饰(例如敲低)的合适的基因编辑系统。在一些实施方案中，基因编辑系统包括但不限于CRISPR/Cas系统；锌指核酸酶(ZFN)系统；转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)系统。通常，基因编辑系统涉及使用工程化裂解系统在靶DNA序列中诱导双链断裂(DSB)或切口(例如，单链断裂或SSB)。裂解或切口可通过使用特定的核酸酶(例如工程化ZFN、TALEN)或使用CRISPR/Cas系统与工程化指导RNA来指导靶DNA序列的特异性裂解或切口，例如CRISPR/Cas9系统。此外，正在基于Argonaute系统开发靶向核酸酶(例如，来自嗜热链球菌(T.thermophilus)，称为“TtAgo”，参见Swarts等人(2014)Nature 507(7491):258-261)，其也可能具有用于基因组编辑和基因疗法的潜力。
转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)是可以被工程化来切割特定的DNA序列的限制性酶。它们通过将TAL效应物DNA结合结构域与DNA裂解结构域(一种切割DNA链的核酸酶)融合而制成。转录激活因子样效应物(TALE)可被工程化以结合所需的DNA序列，从而促进特定位置处的DNA裂解(参见例如，Boch,TALEs of genome targeting NatureBiotech.29:135–136(2011))。可以将限制性酶引入细胞中，以用于基因编辑或原位基因组编辑，这种技术被称为用工程化核酸酶进行的基因组编辑。用于其中的这种方法和组合物是本领域已知的。参见例如WO2019147805、WO2014040370、WO2018073393，其内容在此全文引入。
锌指核酸酶(ZFN)是通过将锌指DNA结合结构域与DNA裂解结构域融合而产生的人工限制性酶。锌指结构域可以被工程化以靶向特定的所需DNA序列，从而使锌指核酸酶能够靶向复杂基因组中的独特序列。II型限制性内切核酸酶FokI的非特异性裂解结构域通常用作ZFN中的裂解结构域。裂解由内源性DNA修复机制修复，从而允许ZFN精确地更改高等生物的的基因组。这种方法和其中使用的组合物是本领域已知的。参见例如WO2011091324，其内容在此全部并入。
RNA干扰(RNAi)是一种生物过程，其中RNA分子通过中和靶mRNA分子来抑制基因表达或翻译。小干扰RNA(SiRNA)是RNA干扰的核心。RNA是基因的直接产物，并且这些小RNA(通常每条链长19-23个核苷酸，形成19-21个核苷酸的双链体)可以引导RNA诱导的沉默(RISC)复合物降解信使RNA(mRNA)分子，并且因此通过转录后基因沉默阻止翻译来降低其活性。短发夹RNA(shRNA)是作为单链RNA的siRNA，其中形成双链体区的链具有发夹结构，通常通过从表达载体转录产生。RNAi也可以通过称为Dicer底物分子的更长RNA双链体结构来完成，其在装载到RISC中以促进靶mRNA裂解之前被酶Dicer裂解。供使用的这种方法和组合物是本领域已知的。在本文提供的组合物和方法中，优选提供促进RNA干扰的RNA分子作为持久性表达载体，参见例如WO2018208837，其内容在此全文引入。在一些实施方案中，RNAi与表达载体一起使用。
应当理解，本公开考虑了在有或没有本文公开的指导RNA的情况下进行的插入的方法(例如，使用ZFN系统引起靶DNA序列的断裂，从而产生用于插入构建体的位点)。对于使用本文公开的指导RNA的方法，所述方法包括使用CRISPR/Cas系统来修饰(例如敲低)编码TNFA、IFNG或TCR的核酸序列。还应当理解，本公开考虑了修饰(例如敲低)TNFA、IFNG或TCR的方法，其可以在没有本文公开的指导RNA的情况下进行(例如，使用ZFN系统引起靶DNA序列的断裂，从而产生用于插入构建体的位点)。
在一些实施方案中，将包含用于插入的序列(例如，编码IL10或CTLA4的序列)的供体构建体插入被靶向用于修饰(例如，敲低)的序列(例如，TCR基因)的基因组基因座。
在一些实施方案中，CRISPR/Cas系统(例如，指导RNA和RNA指导的DNA结合剂)可用于在基因组内的所需基因座处产生插入位点，在所述位点处可插入包含编码IL10、CTLA4或靶向受体(例如本文公开的CAR，例如MAdCAM-1 CAR)的序列的供体构建体，以表达IL10、CTLA4或CAR(例如MAdCAM-1 CAR)。靶向受体(例如CAR，例如MAdCAM-1 CAR)、IL10或CTLA4在其插入位点或基因座方面可以是异源的，例如IL10、CTLA4或靶向受体(例如CAR，例如MAdCAM-1 CAR)不正常表达的安全港基因座或TCR基因座，如本文所述。在一些实施方案中，本文所述的指导RNA可根据本发明方法与RNA指导的DNA结合剂(例如，Cas核酸酶)一起使用，以产生插入位点，在所述位点处可插入包含编码IL10、CTLA4或靶向受体(例如CAR，例如MAdCAM-1 CAR)的序列的供体构建体，以表达IL10、CTLA4或CAR(例如MAdCAM-1 CAR)。本文举例说明并描述了用于将IL10、CTLA4或靶向受体(例如CAR，例如MAdCAM-1 CAR)插入特定基因组基因座中的指导RNA。
在一些实施方案中，通过用gRNA(例如，靶向IFNG、TNFA的gRNA，或用于敲低的TCR)、RNA指导的DNA结合剂(例如，Cas核酸酶)、供体构建体转导(例如，使用病毒或非病毒递送)来工程化CD4+ T细胞。在一些实施方案中，工程化T细胞是：1)用靶向编码促炎细胞因子(例如IFNG或TNFA)的核酸序列的gRNA、RNA指导的DNA结合剂(例如，Cas核酸酶)转导，和2)用包含编码调节性T细胞促进分子(例如IL10或CTLA4)和靶向受体(例如CAR，例如MAdCAM-1 CAR)的核酸序列的供体构建体转导。在某些实施方案中，针对靶向受体的表达选择工程化细胞。
在一些实施方案中，CD4+ T细胞通过用gRNA(例如，靶向IFNG、TNFA的gRNA，或用于敲低的TCR)、RNA指导的DNA结合剂(例如，Cas核酸酶)和供体构建体转导而被工程化。在一些实施方案中，工程化T细胞：1)用包含编码调节性T细胞促进分子(例如IL10或CTLA4)和靶向受体(例如CAR，例如MAd CAM-1 CAR)的核酸序列的供体构建体转导，和2)用靶向编码促炎细胞因子(例如IFNG或TNFA)的核酸序列的gRNA、RNA指导的DNA结合剂(例如Cas核酸酶)转导。在某些实施方案中，针对靶向受体的表达选择工程化细胞。
在一些实施方案中，CD4+ T细胞通过用gRNA(例如，靶向IFNG、TNFA的gRNA或用于敲低的TCR)、RNA指导的DNA结合剂(例如，Cas核酸酶)、供体构建体转导而被工程化。在一些实施方案中，工程化T细胞：1)用包含编码调节性T细胞促进分子(例如IL10或CTLA4)和靶向受体(例如CAR，例如MAdCA M-1 CAR)的核酸序列的供体构建体转导，和2)用靶向编码促炎细胞因子(例如IFNG或TNFA)的核酸序列的gRNA、RNA指导的DNA结合剂(例如Cas核酸酶)转导。
如本文所述，可使用本领域已知的任何合适的递送系统和方法来递送包含编码IL10、CTLA4或靶向受体(例如CAR)的序列、指导RNA(例如，靶向IFNG、TNFA的gRNA，或用于敲低的TCR)和RNA指导的DNA结合剂的供体构建体。在一些实施方案中，指导RNA和Cas核酸酶与LNP缔合并在递送包含编码IL10、CTLA4或靶向受体(例如CAR)的序列的供体构建体之前递送至细胞或细胞群体。在一些实施方案中，指导RNA和Cas核酸酶与LNP缔合并在递送包含编码IL10、CTLA4或靶向受体(例如CAR)的序列的供体构建体之后递送至细胞或细胞群体。
在一些实施方案中，将本文所述的gRNA、供体构建体和RNA指导的DNA结合剂施用至天然存在的T细胞能够将天然存在的T细胞(例如CD4+ T细胞)转化为表现出调节性T细胞的特征(例如免疫反应抑制特征)的细胞。
可将用于修饰(例如敲低)IFNG、TNFA或TCR基因表达或插入编码IL10、CTLA4或靶向受体(例如CAR，例如MAdCAM-1 CAR)的序列的gRNA、供体构建体和RNA指导的DNA结合剂引入常规T细胞或常规T细胞群体，以产生本文所述的工程化T细胞或T细胞群体。
使用各种RNA指导的DNA结合剂(例如核酸酶，例如Cas核酸酶，例如Cas9)的方法也是本领域众所周知的。虽然本文举例说明了CRISPR/Cas系统的使用，但是应当理解，也可以使用所述系统的适当变型。应当理解，根据上下文，RNA指导的DNA结合剂可以作为核酸(例如，DNA或mRNA)提供，例如上面提供的编码RNA指导的DNA结合剂的mRNA，或者作为蛋白质提供。在一些实施方案中，本发明方法可以在已经包含或表达RNA指导的DNA结合剂的细胞中实施。
在一些实施方案中，RNA指导的DNA结合剂(例如Cas9核酸酶)具有裂解酶活性，其也可被称为双链核酸内切酶活性。在一些实施方案中，RNA指导的DNA结合剂(例如Cas9核酸酶)具有切口酶活性，其也可被称为单链核酸内切酶活性。在一些实施方案中，RNA指导的DNA结合剂包括Cas核酸酶。Cas核酸酶的实例包括化脓性链球菌、金黄色葡萄球菌(S.aureus)和其他原核生物的II型CRISPR系统(参见例如，下一个段落中的列表)，及其变体或突变体(例如，工程化的、非天然存在的、天然存在的或其他变体)型式的那些。参见例如，US2016/0312198A1；US2016/0312199A1。
Cas核酸酶可源自的非限制性示例性物种包括化脓性链球菌、嗜热链球菌、链球菌属种(Streptococcus sp.)、金黄色葡萄球菌、英诺克李斯特菌(Listeria innocua)、加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)、新凶手弗朗西丝菌(Francisella novicida)、产琥珀酸沃林氏菌(Wolinella succinogenes)、华德萨特菌(Sutterella wadsworthens is)、伽马变形杆菌(Gammaproteobacterium)、脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitides)、空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)、多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)、产琥珀酸丝状杆菌(Fibrobacter succinogene)、深红红螺菌(Rhodospirillum rubrum)、达氏拟诺卡氏菌(Nocardiopsis dassonvillei)、始旋链霉菌(Streptomyces pristinaespiralis)、绿色产色链霉菌(Streptomyces viridochromogenes)、绿色产色链霉菌、玫瑰链孢囊菌(Streptosporangium roseum)、玫瑰链孢囊菌、酸热脂环酸杆菌(Alicyclobacillusacidocaldarius)、假蕈状芽孢杆菌(Bacillus pseudomycoides)、硒还原芽孢杆菌(Bacillus selenitireducens)、西伯利亚微小杆菌(Exiguobacterium sibiricum)、德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)、布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)、齿垢密螺旋体(Treponema denticola)、海洋微颤菌(Microscilla marina)、伯克霍尔德氏菌(Burkholderiales bacterium)、食萘极地单胞菌(Polaromonas naphthalenivorans)、极地单胞菌属种(Polaromonas sp.)、瓦氏鳄球藻(Crocosphaera watsonii)、蓝丝菌属种(Cyanothece sp.)、铜绿微囊藻(Microcystisaeruginosa)、聚球藻属种(Synechococcus sp.)、阿拉伯糖醋盐杆菌(Acetohalobiumarabaticum)、根制氨菌(Ammonifex degensii)、热解纤维素菌(Caldicel ulosiruptorbecscii)、金矿菌(Candidatus Desulforudis)、肉毒杆菌(Clostridium botulinum)、艰难梭菌(Clostridium difficile)、大芬戈尔德菌(Finegoldia magna)、嗜热盐碱厌氧菌(Natranaerobius thermophiles)、喜温发酵菌(Pelotomaculum thermopropionicum)、喜温硫杆菌(Acidithiobacillus caldus)、氧化亚铁硫杆菌(Acidithiobacillusferrooxidans)、酒色异着色菌(Allochromatium vinosum)、海杆菌属种(Marinobactersp.)、嗜盐亚硝化球菌(Nitrosococcus halophilus)、瓦氏亚硝化球菌(Nitrosococcuswatsoni)、河豚毒素假交替单胞菌(Pseudoalteromonas haloplanktis)、消旋纤线杆菌(Ktedonobacter racemifer)、爱维斯特甲烷盐菌(Methanohalobium evestigatum)、多变鱼腥藻(Anabaena variabilis)、泡沫节球藻(Nodularia spumigena)、念珠藻属(Nostocsp.)、极大节旋藻(Arthrospira maxima)、钝顶节旋藻(Arthrospira platensis)、螺旋菌属种(Arthrospira sp.)、鞘丝藻属种(Lyngbya sp.)、原型微鞘藻(Microcoleuschthonoplastes)、、颤藻属种(Oscillatoria sp.)、运动石袍菌(Petrotoga mobilis)、非洲栖热腔菌(Thermosipho africanus)、巴氏链球菌(Streptococcuspasteurianus)、灰色奈瑟氏球菌(Neisseria cinerea)、红嘴鸥弯曲杆菌(Campylobacter lari)、食清洁剂细小棒菌(Parvibaculum lavamentivorans)、白喉棒状杆菌(Cory nebacterium diphtheria)、氨基酸球菌属种(Acidaminococcus sp.)、毛螺菌科细菌(Lachnospiraceae bacterium)ND2006和深海单细胞蓝藻(Acaryochloris marina)。
在一些实施方案中，Cas核酸酶是来自化脓性链球菌的Cas9核酸酶。在一些实施方案中，Cas核酸酶是来自嗜热链球菌的Cas9核酸酶。在一些实施方案中，Cas核酸酶是来自脑膜炎奈瑟氏球菌的Cas9核酸酶。在一些实施方案中，Cas核酸酶是来自金黄色葡萄球菌的Cas9核酸酶。在一些实施方案中，Cas核酸酶是来自新凶手弗朗西丝菌的Cpf1核酸酶。在一些实施方案中，Cas核酸酶是来自氨基酸球菌属种的Cpf1核酸酶。在一些实施方案中，Cas核酸酶是来自毛螺科菌ND2006的Cpf1核酸酶。在其他的实施方案中，Cas核酸酶是来自土拉热弗朗西斯菌(Francisella tularensis)、毛螺科菌、解蛋白丁酸弧菌(Butyrivibrioproteoclasticus)、异域菌门细菌(Peregrinibacteria bacterium)、俭菌总门细菌(Parcubacteria bacterium)、密斯氏菌属(Smithella)、氨基酸球菌(Acidaminococcus)、白蚁甲烷支原体暂定种(Candidatus Methanoplasma termitum)、挑剔真杆菌(Eubacterium eligen s)、牛眼莫拉氏菌(Moraxella bovoculi)、稻田氏钩端螺旋体(Leptospira inadai)、狗齿龈卟啉单胞菌(Porphyromonas crevioricanis)、解糖胨普雷沃菌(Prevotella disiens)或猕猴卟啉单胞菌(Porphyromonas macacae)的Cpf1核酸酶。在某些实施方案中，Cas核酸酶是来自氨基酸球菌或毛螺菌科的Cpf1核酸酶。
在一些实施方案中，gRNA与RNA指导的DNA结合剂一起被称为核糖核蛋白复合物(RNP)。在一些实施方案中，RNA指导的DNA结合剂是Cas核酸酶。在一些实施方案中，gRNA与Cas核酸酶一起被称为Cas RNP。在一些实施方案中，RNP包括I型、II型或III型组分。在一些实施方案中，Cas核酸酶是来自II型CRISPR/Cas系统的Cas9蛋白。在一些实施方案中，gRNA与Cas9一起被称为Cas9RNP。
野生型Cas9具有两个核酸酶结构域：RuvC和HNH。RuvC结构域裂解非靶DNA链，并且HNH结构域裂解靶DNA链。在一些实施方案中，Cas9蛋白包含一个以上的RuvC结构域或一个以上的HNH结构域。在一些实施方案中，Cas9蛋白是野生型Cas9。在组合物、用途和方法实施方案中的每一个中，Cas诱导靶DNA中的双链断裂。
在一些实施方案中，使用嵌合Cas核酸酶，其中蛋白质的一个结构域或区域被不同蛋白质的一部分替换。在一些实施方案中，Cas核酸酶结构域可以被来自不同核酸酶(例如Fok1)的结构域替换。在一些实施方案中，Cas核酸酶可以是经修饰的核酸酶。
在其他实施方案中，Cas核酸酶可以来自I型CRISPR/Cas系统。在一些实施方案中，Cas核酸酶可以是I型CRISPR/Cas系统的级联复合物的组分。在一些实施方案中，Cas核酸酶可以是Cas3蛋白。在一些实施方案中，Cas核酸酶可以来自III型CRISPR/Cas系统。在一些实施方案中，Cas核酸酶可以具有RNA裂解活性。
在一些实施方案中，RNA指导的DNA结合剂具有单链切口酶活性，即，可以切割一条DNA链以产生单链断裂，也称为“切口”。在一些实施方案中，RNA指导的DNA结合剂包括Cas切口酶。切口酶是在dsDNA中产生切口的酶，即，切割DNA双螺旋的一条链而不切割另一条链。在一些实施方案中，Cas切口酶是Cas核酸酶的一种形式(例如，上述Cas核酸酶)，其中核酸内切活性位点例如通过催化结构域中的一个或多个更改(例如，点突变)而失活。关于Cas切口酶和示例性催化结构域更改的讨论，参见例如美国专利第8,889,356号。在一些实施方案中，Cas切口酶(如Cas9切口酶)具有失活的RuvC或HNH结构域。
在一些实施方案中，RNA指导的DNA结合剂被修饰为仅含有一个功能性核酸酶结构域。例如，可以修饰剂蛋白，使得核酸酶结构域中的一种被突变或完全或部分缺失，以降低其核酸裂解活性。在一些实施方案中，使用具有活性降低的RuvC结构域的切口酶。在一些实施方案中，使用具有非活性RuvC结构域的切口酶。在一些实施方案中，使用具有活性降低的HNH结构域的切口酶。在一些实施方案中，使用具有非活性HNH结构域的切口酶。
在一些实施方案中，Cas蛋白核酸酶结构域内的保守氨基酸被取代以降低或改变核酸酶活性。在一些实施方案中，Cas核酸酶可以包含在RuvC或RuvC样核酸酶结构域中的氨基酸取代。RuvC或RuvC样核酸酶结构域中的示例性氨基酸取代包括D10A(基于化脓性链球菌Cas9蛋白)。参见例如，Zetsche等人(2015)Cell Oct 22:163(3):759-771。在一些实施方案中，Cas核酸酶可以包含在HNH或HNH样核酸酶结构域中的氨基酸取代。HNH或HNH样核酸酶结构域中的示例性氨基酸取代包括E762A、H840A、N863A、H983A和D986A(基于化脓性链球菌Cas9蛋白)。参见例如，Zetsche等人(2015)。其他示例性氨基酸取代包括D917A、E1006A和D1255A(基于新凶手弗朗西丝菌U112 Cpf1(FnCpf1)序列(Uni ProtKB-A0Q7Q2(CPF1_FRATN))。
在一些实施方案中，提供了与一对分别与靶序列的有义链和反义链互补的指导RNA组合的切口酶。在这个实施方案中，指导RNA将切口酶导向靶序列，并且通过在靶序列的相对链上产生切口(即，双切口)来引入DSB。在一些实施方案中，切口酶与靶向DNA相对链的两个分开的指导RNA一起使用，以在靶DNA中产生双切口。在一些实施方案中，切口酶与被选择为非常接近的两个分开的指导RNA一起使用，以在靶DNA中产生双切口。
在一些实施方案中，RNA指导的DNA结合剂包含一个或多个异源功能结构域(例如，是或包含融合多肽)。
在一些实施方案中，异源功能结构域可以促进RNA指导的DNA结合剂转运到细胞核中。例如，异源功能结构域可以是核定位信号(NLS)。在一些实施方案中，RNA指导的DNA结合剂可以与1-10个NLS融合。在一些实施方案中，RNA指导的DNA结合剂可以与1-5个NLS融合。在一些实施方案中，RNA指导的DNA结合剂可以与一个NLS融合。当使用一个NLS时，NLS可以连接在RNA指导的DNA结合剂序列的N末端或C末端处。其也可以插入RNA指导的DNA结合剂序列中。在其他实施方案中，RNA指导的DNA结合剂可以与一个以上的NLS融合。在一些实施方案中，RNA指导的DNA结合剂可以与2个、3个、4个或5个NLS融合。在一些实施方案中，RNA指导的DNA结合剂可以与两个NLS融合。在某些情况下，两个NLS可能相同(例如，两个SV40NLS)或不同。在一些实施方案中，RNA指导的DNA结合剂与羧基末端处连接的两个SV40 NLS序列融合。在一些实施方案中，RNA指导的DNA结合剂可以与两个NLS融合，一个连接在N末端处，并且另一个连接在C末端处。在一些实施方案中，RNA指导的DNA结合剂可以与3个NLS融合。在一些实施方案中，RNA指导的DNA结合剂可以不与NLS融合。在一些实施方案中，NLS可以是单部分序列，如例如SV40NLS、PKKKRKV(SEQ ID NO:143)或PKKKRRV(SEQ ID NO:144)。在一些实施方案中，NLS可以是二部分序列，例如核质蛋白的NLS，KRPAATKKAGQAKKKK(SEQ ID NO:145)。在一个具体的实施方案中，单个PKKKRKV(SEQ ID NO:143)NLS可以连接在RNA指导的DNA结合剂的C末端处。融合位点任选地包括一个或多个接头。
V.治疗方法
本公开提供了用于抑制受试者中的免疫反应的方法，其包括施用工程化T细胞，所述工程化T细胞包含编码IFNG的内源核酸序列的修饰(例如敲低)、编码TNFA的内源核酸序列的修饰(例如敲低)以及向在启动子序列的控制下的编码调节性T细胞促进分子的异源序列的细胞中的插入。本公开提供了用于抑制受试者中的免疫反应的方法，其包括施用工程化T细胞，所述工程化T细胞包含编码IFNG的内源核酸序列的修饰(例如敲低)、编码TNFA的内源核酸序列的修饰(例如敲低)以及向在启动子序列的控制下的编码IL10的异源序列的细胞中的插入。本公开提供了用于抑制受试者中的免疫反应的方法，其包括施用工程化T细胞，所述工程化T细胞包含编码IFNG的内源核酸序列的修饰(例如敲低)、编码TNFA的内源核酸序列的修饰(例如敲低)以及向在启动子序列的控制下的编码CTLA4的异源序列的细胞中的插入。本公开提供了用于抑制受试者中的免疫反应的方法，其包括施用工程化T细胞，所述工程化T细胞包含编码IFNG的内源核酸序列的修饰(例如敲低)、编码TNFA的内源核酸序列的修饰(例如敲低)以及向编码IL10和CTLA4的异源序列的细胞中的插入。
本发明提供了用于治疗受试者的自身免疫病症的方法，其包括施用工程化T细胞，所述工程化T细胞包含编码IFNG的内源核酸序列的修饰(例如敲低)、编码TNFA的内源核酸序列的修饰(例如敲低)以及向在启动子序列的控制下的编码调节性T细胞促进分子的异源序列的细胞中的插入。本发明提供了用于治疗受试者的自身免疫病症的方法，其包括施用工程化T细胞，所述工程化T细胞包含编码IFNG的内源核酸序列的修饰(例如敲低)、编码TNFA的内源核酸序列的修饰(例如敲低)以及向在启动子序列的控制下的编码IL10的异源序列的细胞中的插入。本发明提供了用于治疗受试者的自身免疫病症的方法，其包括施用工程化T细胞，所述工程化T细胞包含编码IFNG的内源核酸序列的修饰(例如敲低)、编码TNFA的内源核酸序列的修饰(例如敲低)以及向在启动子序列的控制下的编码CTLA4的异源序列的细胞中的插入。本发明提供了用于治疗受试者的自身免疫病症的方法，其包括施用工程化T细胞，所述工程化T细胞包含编码IFNG的内源核酸序列的修饰(例如敲低)、编码TNFA的内源核酸序列的修饰(例如敲低)以及向各自在启动子序列的控制下的编码IL10和CTLA4的异源序列的细胞中的插入。
本发明提供了用于治疗受试者的GvHD的方法，其包括施用工程化T细胞，所述工程化T细胞包含编码IFNG的内源核酸序列的修饰(例如敲低)、编码TNFA的内源核酸序列的修饰(例如敲低)以及向在启动子序列的控制下的编码调节性T细胞促进分子的异源序列的细胞中的插入。本发明提供了用于治疗受试者的GvHD的方法，其包括施用工程化T细胞，所述工程化T细胞包含编码IFNG的内源核酸序列的修饰(例如敲低)、编码TNFA的内源核酸序列的修饰(例如敲低)以及向在启动子序列的控制下的编码IL10的异源序列的细胞中的插入。本发明提供了用于治疗受试者的GvHD的方法，其包括施用工程化T细胞，所述工程化T细胞包含编码IFNG的内源核酸序列的修饰(例如敲低)、编码TNFA的内源核酸序列的修饰(例如敲低)以及向在启动子序列的控制下的编码CTLA4的异源序列的细胞中的插入。本公开提供了用于治疗受试者的GvHD的方法，其包括施用工程化T细胞，所述工程化T细胞包含编码IFNG的内源核酸序列的修饰(例如敲低)、编码TNFA的内源核酸序列的修饰(例如敲低)以及向各自在启动子序列的控制下的编码IL10和CTLA4的异源序列的细胞中的插入。
在一些实施方案中，所述方法包括施用工程化T细胞，所述工程化T细胞包含编码IFNG的内源核酸序列的修饰(例如敲低)、编码TNFA的内源核酸序列的修饰(例如敲低)、编码调节性T细胞促进分子的序列的插入，并且还包含TCR序列的修饰(例如敲低)。
在一些实施方案中，所述方法包括施用工程化T细胞，所述工程化T细胞包含编码IFNG的内源核酸序列的修饰(例如敲低)、编码TNFA的内源核酸序列的修饰(例如敲低)、编码调节性T细胞促进分子的序列的插入，并且还包含编码靶向受体(例如CAR)的序列的插入。
在一些实施方案中，靶向受体(例如CAR)能够将工程化T细胞靶向至胃肠系统，例如，靶向受体是靶向MAdCAM-1的CAR，例如用于抑制例如炎性肠病、溃疡性结肠炎或克罗恩病的病症中的免疫反应，包括炎症。在一些实施方案中，靶向受体(例如CAR)能够将工程化T细胞靶向包含内皮细胞的组织，例如，靶向受体是靶向VCAM-1的CAR，例如用于在例如克罗恩病和多发性硬化的病症中抑制免疫反应，包括炎症。在一些实施方案中，靶向受体(例如CAR)能够将工程化T细胞靶向内皮细胞，例如，靶向受体是靶向CEACAM6的CAR，例如用于抑制例如克罗恩病的病症中的免疫反应。在一些实施方案中，靶向受体(例如CAR)能够将工程化T细胞靶向B细胞，例如，靶向受体是靶向CD19的CAR，例如用于抑制例如多发性硬化和系统性红斑狼疮的病症中的免疫反应。在一些实施方案中，靶向受体(例如CAR)能够将工程化T细胞靶向B细胞，例如，靶向受体是靶向CD20的CAR，例如用于抑制例如多发性硬化和系统性红斑狼疮的病症中的免疫反应。在一些实施方案中，靶向受体(例如CAR)能够将工程化T细胞靶向炎性组织，例如，靶向受体是靶向TNFA的CAR，例如用于抑制例如炎性肠病、溃疡性结肠炎或克罗恩病的病症中的免疫反应。在一些实施方案中，靶向受体(例如CAR)能够将工程化T细胞靶向神经组织，例如，靶向受体是靶向MBP、MOG或PLP的CAR，例如用于抑制例如多发性硬化的病症中的免疫反应。在一些实施方案中，靶向受体(例如CAR)能够将工程化T细胞靶向包含成熟B淋巴细胞的组织，例如，靶向受体是靶向TNFRSF17的CAR，例如用于抑制例如系统性红斑狼疮的病症中的免疫反应。在一些实施方案中，靶向受体(例如CAR)能够将工程化T细胞靶向滑膜组织，例如，靶向受体是靶向瓜氨酸化波形蛋白的CAR，例如用于抑制例如类风湿性关节炎的病症中的免疫反应。
在一些实施方案中，靶向受体是靶向DPP6、SCL2A2、谷氨酸脱羧酶(GAD2)、桥粒芯蛋白3(DSG3)和MHC I类HLA-A(HLA-A*02)的CAR。
在一些实施方案中，所述方法包括施用工程化T细胞，所述工程化T细胞包含编码IFNG的内源核酸序列的修饰(例如敲低)、编码TNFA的内源核酸序列的修饰(例如敲低)、编码调节性T细胞促进分子的序列的插入、编码靶向受体(例如CAR)的序列的插入，并且还包含TCR序列的修饰(例如敲低)。
在一些实施方案中，将待插入的序列插入待修饰(例如敲低)的序列中，例如，将CAR序列插入TNFA基因组序列中，从而修饰(例如敲低)TNFA序列。
在一些实施方案中，所述方法包括施用包含如上所述工程化的T细胞的T细胞群体。在一些实施方案中，T细胞群体中至少40％、45％，优选至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％的T细胞被工程化，例如，如通过测序(例如NGS)所评估。
在一些实施方案中，自身免疫病症选自溃疡性结肠炎、克罗恩病、类风湿性关节炎、银屑病、多发性硬化、系统性红斑狼疮、1型糖尿病和移植物抗宿主疾病(GvHD)。在一些实施方案中，工程化T细胞具有自体或同种异体用途。
在一些实施方案中，可在移植物抗宿主疾病的动物模型(例如，小鼠模型)中，通过在施用工程化T细胞后测量动物的体重或存活率(其中，在体重的相当大部分(例如，初始体重的20％)减轻后，处死动物)来评估使用上述工程化T细胞的治疗有效性。在一些实施方案中，与合适的对照(例如用PBMC治疗的动物)相比，有效的治疗导致存活率在统计学上显著增加。
实施例
提供以下实施例来说明某些公开的实施方案，并且不应解释为以任何方式限制本公开的范围。
实施例1.一般方法
1.1.脂质纳米颗粒的制备
通常，将脂质组分以不同的摩尔比溶解在100％乙醇中。将RNA货物(例如，Cas9mRNA和sgRNA)溶解在25mM柠檬酸盐缓冲液、100mM NaCl(pH 5.0)中，导致RNA货物的浓度为约0.45mg/mL。
除非另有说明，否则脂质核酸装配体分别以50:38.5:10:1.5摩尔比含有可电离的脂质A十八碳-9,12-二烯酸(9Z,12Z)-3-((4,4-双(辛氧基)丁酰基)氧基)-2-((((3-(二乙氨基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙酯，也称为((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯酸3-((4,4-双(辛氧基)丁酰基)氧基)-2-((((3-(二乙氨基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙酯)、胆固醇、DSPC和PEG2k-DMG。除非另有说明，否则以约6的脂质胺与RNA磷酸(N:P)的摩尔比和1:1的gRNA与mRNA的重量比配制脂质核酸装配体。
使用交叉流动技术制备LNP，所述技术利用含脂质的乙醇与两个体积的RNA溶液和一个体积的水的撞击喷射混合。将含脂质的乙醇通过十字混合器与两个体积的RNA溶液混合。将第四股水流通过内联三通与十字管的出口水流混合(参见WO2016010840图2)。将LNP在室温下保持1小时，并且进一步用水稀释(约1:1v/v)。在平板滤筒(Sartorius，100kDMWCO)上使用切向流过滤浓缩LNP，并且使用PD-10脱盐柱(GE)将缓冲液交换到50mM Tris、45mM NaCl、5％(w/v)蔗糖，pH 7.5(TSS)中。或者，任选使用100kDa Amicon旋转过滤器浓缩LNP，并且使用PD-10脱盐柱(GE)将缓冲液交换到TSS中。然后使用0.2μm无菌过滤器过滤所得混合物。将最终的LNP储存在4℃或-80℃下直到进一步使用。
1.2.mRNA的体外转录(“IVT”)
使用线性化的质粒DNA模板和T7RNA聚合酶，通过体外转录产生含有N1-甲基假U的加帽和聚腺苷酸化的mRNA。将包含T7启动子、转录序列和聚腺苷酸化区的质粒DNA通过在37℃下使用以下条件与XbaI一起孵育2小时而线性化：200ng/μL质粒、2U/μL XbaI(NEB)和1x反应缓冲液。通过在65℃下加热反应20分钟使XbaI失活。从酶和缓冲盐中纯化线性化的质粒。产生经修饰的mRNA的IVT反应通过在以下条件下在37℃下孵育1.5-4小时来进行：50ng/μL线性化质粒；GTP、ATP、CTP和N1-甲基假UTP(Trilink)各2-5mM；10-25mM ARCA(Trilink)；5U/μL T7RNA聚合酶(NEB)；1U/μL鼠RNA酶抑制剂(NEB)；0.004U/μL无机大肠杆菌焦磷酸酶(NEB)；和1x反应缓冲液。将TURBO DNA酶(ThermoFisher)添加至0.01U/μL的终浓度，并且将反应物再孵育30分钟以除去DNA模板。按照制造商的方案，使用MegaClear转录清除试剂盒(ThermoFisher)或RNeasy Maxi试剂盒(Qiagen)纯化mRNA。或者，通过沉淀方案纯化mRNA，在某些情况下，随后是基于HPLC的纯化。简言之，在DNA酶消化后，使用LiCl沉淀、乙酸铵沉淀和乙酸钠沉淀纯化mRNA。对于HPLC纯化的mRNA，在LiCl沉淀和重构后，通过RP-IP HPLC纯化mRNA(参见例如，Kariko等人Nucleic Acids Research,2011,第39卷,第21e142期)。将选择用于合并的级分组合，并且通过如上所述的乙酸钠/乙醇沉淀脱盐。在其他替代方法中，用LiCl沉淀法纯化mRNA，然后通过切向流过滤进一步纯化。RNA浓度通过测量260nm处的吸光度(Nanodrop)来确定，并且将转录物通过毛细管电泳由Bioanlayzer(Agilent)来分析。
根据本文所述的核酸序列由编码开放阅读框的质粒DNA产生化脓性链球菌(“Spy”)Cas9 mRNA。对于下面的mRNA核酸序列，应理解T应被U(如上所述的N1-甲基假尿苷)替换。实施例中使用的信使RNA包括5’帽和3’poly-A尾，例如长达100个nt(SEQ ID NO:146)。
1.3.下一代测序(“NGS”)和针对在靶编辑效率的分析
根据制造商的协议，使用QuickExtractTM DNA提取溶液提取基因组DNA(Lucigen，目录号QE09050)。
为了定量确定基因组中靶位置的编辑效率，利用深度测序来鉴定由基因编辑引入的插入和缺失的存在。围绕所关注基因(例如，TRAC)内的靶位点设计PCR引物，并且扩增所关注的基因组区域。按照本领域的标准进行引物序列设计。
根据制造商的方案(Illumina)进行另外的PCR，以添加用于测序的化学物质。将扩增子在Illumina MiSeq仪器上进行测序。在消除那些具有低质量分数的读段后，将读段与人参考基因组(例如，hg38)进行比对。将得到的含有读段的文件绘制到参考基因组(BAM文件)上，其中选择与所关注的靶区域重叠的读段，并且计算野生型读段的数量与包含插入缺失的读段的数量。编辑百分比(例如，“编辑效率”或“编辑百分比”或“插入缺失百分比”)被定义为具有插入缺失的序列读段总数与序列读段总数之比，包括野生型。
实施例2.-过表达Treg相关因子的T细胞的抑制能力
转导CD3+CD4+ T细胞以过表达Treg相关转录因子Foxp3、Foxp3与IL10、IL10、CTLA4和IL10与CTLA4，并且测定其抑制炎症免疫反应的能力。
2.1 T细胞制备
人CD3+CD4+ T细胞由新鲜白细胞采集物(StemCell Technologies，供体RG1953)内部制备。对于内部制备，遵循制造商的协议，使用人CD4+ T细胞分离试剂盒(Miltenyi；目录号130-096-533)，通过阴性选择分离CD3+CD4+ T细胞。将分离的CD3+CD4+ T细胞冷冻在Cryostor CS10冷冻培养基(目录号07930)中，直到进一步使用。在激活当天，使用37℃水浴解冻冷冻的CD3+CD4+ T细胞。将解冻的CD3+CD4+ T细胞以1x106个细胞/毫升的密度铺板在总共5ml由含有10％(v/v)胎牛血清(Gibco；目录号A31605-01)，1x谷氨酰胺(Gibco；目录号35050-061)、50μM 2-巯基乙醇(Gibco；31350-010)、1x非必需氨基酸(Corning；目录号25-0250-CI)、1mM丙酮酸钠(Corning；目录号25-000-CI)、10mM HEPE S缓冲液(Gibco；目录号15630-080)、1x青霉素-链霉素(Gibco；目录号15140-122)与所添加的细胞因子100U/mL重组人白细胞介素-2(StemCell Technologies；目录号78036.1)、5ng/ml重组人白细胞介素7(StemCell technologies，目录号78053.1)和5ng/ml重组人白细胞介素15(StemCelltechnologies，目录号78031.1)的RPMI 1640(Corning；目录号10-040-CV)构成的T细胞RPMI培养基中。通过添加25uL/mL ImmunoCult人CD3/CD28/CD2 T细胞激活剂(StemcellTechno logies，目录号10990)并在慢病毒转导前在37℃下培养48小时来激活细胞。
2.2 T细胞转导和细胞分选
为了过表达IL10、CTLA4和FOX3P，用慢病毒构建体单独或一起转导激活的CD3+CD4+ T细胞。激活后四十八小时，收获CD3+CD4+ T细胞，洗涤并以1x106个细胞/100uL T细胞RPMI培养基的密度重悬。将100uL浓缩的病毒上清液添加到CD3+CD4+ T细胞中并在37℃下以1000xg离心60分钟。转导后，将CD3+CD4+ T细胞重悬于细胞/病毒上清液混合物中并转移至含有补充有500U/mL IL-2、5ng/mL IL-7和5ng/mL IL-17的20mL T细胞RPMI培养基的6孔G-rex(Wilson Wolf；目录号80240M)中。将转导的CD3+CD4+ T细胞培养4至6天并使用BDFACSAriaTM融合细胞分选仪(BD Biosciences)分选，以分离表达所关注靶标的细胞。分选后，将CD3+CD4+ T细胞在6孔Grex板中与含有2.1中所提到的组分并进一步补充有500U/mLIL-2、5ng/mL IL7和5ng/mL IL17的20mL T细胞RPMI培养基一起培养，直至第25天。
使用本领域已知的方法制备天然调节性T细胞(nTreg)。简言之，根据制造商的说明，使用CD4+ T细胞阴性选择试剂盒(Miltenyi，目录号130-096-533)将自体PBMC解冻并处理以分离CD4+ T细胞。将CD3+CD4+ T细胞以1x107个细胞/毫升重悬于FACS缓冲液中并在4℃下用BV421抗CD4(Biolegend，目录号300532)，APC抗CD25(Biolegend，目录号302610)和PE-Cy7抗CD127(Biolegend，目录号351320)染色30分钟。通过FACS将来自CD4+CD127-群体的最高表达CD25+细胞的前3-5％分选到含有50％胎牛血清的T细胞RPMI培养基培养物中。将分选的CD3+CD4+CD25+CD127-nTreg铺板在含有20mL T细胞RPMI培养基的6孔Grex中，所述培养基补充有如实施例2.1中所提到的组分，还补充有500U/mL IL-2(stem cellTechnologies，目录号78036.1)、100nM雷帕霉素(Millipore Sigma，目录号553211)和25μl/mL抗CD3/28/2免疫细胞T细胞激活剂(Stemcell Technologies，目录号10990)。每隔一天添加IL-2(Stemcell Technologies，目录号78036.1)和雷帕霉素(Millipore Sigma，目录号553211)，持续7天，此时每隔一天仅添加500U/ml IL-2(Stemcell Technologies，目录号78036.1)。在第12天，收获nTreg，洗涤并在6孔Grex板中铺板在补充有A.1中所提到的组分、500U/mL IL-2(Stemcell Technologies，目录号78036.1)的T细胞RPMI培养基中，直到注射当天。
2.3验证靶标表达
通过流式细胞术验证靶标表达。根据制造商的说明，用FoxP3/转录因子染色缓冲液组(eBioscience，目录号00-5523-00)透化五十万转导的CD3+CD4+ T细胞。透化后，将转导的CD3+CD4+ T细胞与一组抗体一起孵育，所述抗体由以下组成：(1)PerCP/Cy 5.5抗FoxP3(BD Biosciences，目录号561493)、eFluor660抗Eos(Invitrogen，目录号50-5758-80)、Pacific blue抗Helios(Biolegend，目录号137220)或(2)BV421抗IL-10(Biolegend，目录号501422)和APC抗CTLA4(Biolegend，目录号369612)。将染色的转导CD3+CD4+ T细胞在Cytoflex流式细胞仪(Beckman Coulter)上进行处理，并且使用FlowJo软件包进行分析。将转导的CD3+CD4+ T细胞基于大小、形状进行设门，然后对抗体组中的靶标进行定量。相对于转导对照来表征靶标的过表达。给定靶标的期望表达水平等于或大于nTreg(表4和图1A-E)。nTreg样品表达了高水平的Foxp3、Helios和Eos，这与高纯度和抑制性表型相关。
表4-慢病毒转导后CD3+CD4+ T细胞中蛋白质表达的平均荧光强度
样品 CTLA4 IL10 Foxp3 Helios Eos n
转导对照 2203 1285 3948 1521 877 1
IL10 2291 2448 3945 1396 871 1
CTLA4 47928 1296 3936 1334 939 1
IL10+CTLA4 49948 1802 4372 1304 803 1
FOXP3 3551 1347 10127 1670 1704 1
FOXP3+IL10 3952 2050 7339 1525 2796 1
nTreg 9324 1282 10047 5018 2016 1
2.4 GvHD模型中免疫抑制的体内评估
使用移植物抗宿主疾病小鼠模型评估分选的转导CD3+CD4+ T细胞的体内抑制功能。
收集用于体内注射的分选的CD3+CD4+ T细胞，并且根据制造商的说明用死细胞去除试剂盒(Miltenyi，目录号130-090-101)处理。如以上实施例中所述解冻自体PBMC。将PBMC以1:1的比率添加至每个测定群体中，并且将细胞重悬于PBS中至6x106/150μL。仅PBMC组以3x106/150μL重悬。
对雌性NOG小鼠(NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Sug/JicTac；Taconic，目录号NOG-F)在注射前一天通过使用X射线(RS-2000辐射器；Rad Source Technologies)的亚致死辐射(200rads)处理以进行细胞移植。对受辐射的NOG小鼠群组静脉注射150μL每种试验细胞群体。五只受辐射的小鼠不注射，并且用作仅受辐射的对照。每天监测体重。体重减轻20％后，处死小鼠，并且评估其脾脏的细胞组成。绘制存活图，以了解每个测试组中小鼠的存活率。如表5和图2A中所示，只有用IL-10和CTLA4转导的T细胞延长存活至与nTreg相似的水平。
表5-注射慢病毒转导的CD3+CD4+细胞后的存活天数百分比
为了证实人白细胞的植入，评估了脾的组成。在安乐死时，将每只动物的脾脏收集在含有PBS的gentleMACS C管(Miltenyi，目录号130-096-334)中。使用gentleMACS Octo解离仪(Miltenyi，130-095-937，程序mSpleen01_01)分离脾脏。使细胞悬浮液通过70微米细胞过滤器(Corning，目录号08-771-2)过滤，并且使用Vi-CELL XR细胞活力分析仪(BeckmanCoulter)对细胞进行计数。将大约一百万活脾细胞重悬于FACS缓冲液中，并且在4℃下用由抗人CD3(Alexa Fluor 488(Biolegend，目录号317310或PerCP/花青5.5(Biolegend，目录号300327)))、BV650抗人CD19(Biolegend，目录号302238)、APC抗人CD45(BD Pharmigen，目录号561864)、APC-Fire 750抗人CD4(Biolegend，目录号300560)和BV421抗鼠Ter119(Biolegend，目录号116234)组成的一组抗体染色30min。用FACS缓冲液洗涤脾细胞，在Cytoflex流式细胞仪(Beckman Coulter)上处理，并且使用FlowJo软件包进行分析。将CD4T细胞定义为Ter119-CD45+CD19-CD3+CD4+。将CD8T细胞定义为Ter119-CD45+CD19-CD3+CD4-。将B细胞定义为Ter119-CD45+CD19+CD3-。为了确定单个群体的细胞数，将每个群体的百分比应用于回收的脾细胞总数。用慢病毒载体转导的T细胞处理以诱导IL10和CTLA4以及nTreg过表达的小鼠比未处理的PBMC小鼠具有更低的B细胞百分比和数量。数据显示于表6和图2B中。
表6-小鼠脾脏中人淋巴细胞的定量
2.5转导的CD3+CD4+ T细胞的细胞因子谱分析
刺激分选的转导的CD3+CD4+ T细胞以评估其的细胞因子谱。将分选的转导的CD3+CD4+ T细胞以1x10^5个T细胞/孔在U形底培养板中铺板于有或没有25uL/mL ImmunoCult人CD3/CD28/CD2 T细胞激活剂(Stemcell Technologies，目录号10990)的总共200μL T细胞RPMI培养基中，并且在37℃培养48小时。培养48小时后，将培养板离心，收集上清液并冷冻，用于随后根据制造商的说明，使用定制的U-PLEX生物标志物试剂盒(Meso ScaleDiagnostics，目录号K15067L-2)进行细胞因子定量。具体来说，U-PLEX生物标志物试剂盒用于定量下列人细胞因子：IFNG、TNFA、IL6、IL2、IL13和IL10。使用Meso Quickplex SQ120仪器(Meso Scale Discovery)读取U-PLEX生物标志物板，并且使用Discovery Workbench4.0软件包(Meso Scale Discovery)分析数据。结果显示于表7和图3A-3F中。用具有编码IL10的序列的慢病毒表达载体转导的CD3+CD4+ T细胞在TCR刺激时分泌大量IL10。IL10的过表达也增加了IL6、IFNG和TNFA的分泌。相反，用具有编码FoxP3的序列的慢病毒表达载体转导的T细胞显示所有定量细胞因子的表达减少。天然Treg也显示出定量细胞因子分泌减少，这是高纯度和抑制性nTreg的特征。
表7-细胞刺激后转导细胞的体外细胞因子产生(pg/ml)
2.6抑制功能的混合淋巴细胞反应测定
混合淋巴细胞反应(MLR)用于测定分选的转导的CD3+CD4+ T细胞的抑制功能。MLR是由T细胞将另一个供体的同种异体白细胞识别为外来物而引起的炎症反应。Treg能够抑制这种炎症反应。因此，MLR是评估Treg(包括工程化Treg)的抑制能力的标准测定。如果Treg是抑制性的，那么应答炎性T细胞的增殖和炎性细胞因子的产生就会减少。
使用T细胞RPMI培养基在96孔U形底板中进行MLR。根据制造商的说明，用CellTrace Violet(CTV)(Thermofisher Scientific；目录号C34557)标记未转导的CD3+CD4+ T细胞并用作应答细胞。根据制造商的说明，使用死细胞去除试剂盒(Miltenyi；目录号130-090-101)处理来自同种异体供体而不是用于转导的T细胞的CD3耗尽的PBMC。通过将每孔50,000个CTV标记的T细胞、50,000个CD3耗尽的PBMC以及大约50,000个(1比1)、16,666个(4比1)、5,555个(16比1)、1,851个(64比1)或617个(256比1)分选的转导的CD3+CD4+ T细胞组合来制备培养物。在37℃下培养5天后，将培养板离心，并且收获培养上清液以用于细胞因子定量。将细胞沉淀重悬于含有APC/Fire 750抗CD4的FACS缓冲液中，并且在4℃下放置30分钟。随后洗涤细胞，在CytoFlex流式细胞仪(Beckman Coulter)上处理，并且使用FlowJo软件包进行分析。将细胞首先通过阳性CD4表达进行设门，然后是CTV表达，最后是未稀释的CTV群体。使用以下公式计算CTV稀释的抑制：
(CTV T细胞的log2(y)-具有Treg的CTV T细胞的log2(y)))/CTV T细胞的log2(y)*100
其中y＝整个CTV标记群体的平均荧光强度/CTV标记群体的未稀释部分的平均荧光强度。数据显示于表8和图4中。
表8-通过CTV稀释测量的转导T细胞对细胞增殖的抑制百分比
实施例3.工程化T细胞的抑制能力
由于用慢病毒载体转导的促进IL-10和CTLA-4的过表达的CD3+CD4+ T细胞显示了IFNG和TNFA产生的增加，这些细胞被进一步工程化以破坏编码IFNG和TNFA的基因。在体外和体内评估这些细胞的抑制能力。
3.1 T细胞工程化
如实施例2.2所述，从白细胞采集物中分离人CD3+CD4+ T细胞，并且将其激活并用慢病毒构建体转导，以促进IL10和CTLA4的过表达。转导后一天，使用Cas9工程化转导的细胞以破坏TNFA和IFNG基因。如实施例1所述配制含有Cas9 mRNA和靶向IFNG(G019753；IFNG指导序列CCAGAGCAUCCAAAAGAGUG(SEQ ID NO:14))或TNFA(G019757；TNFA指导序列AGAGCUCUUACCUACAACAU(SEQ ID NO:58))的sgRNA的LNP。
G019753:
mC*mC*mA*GAGCAUCCAAAAGAGUGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU(SEQ ID NO:119)
G019757:
mA*mG*mA*GCUCUUACCUACAACAUGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU(SEQ ID NO:120)
将每种LNP制剂在37℃下在补充有10ug/ml重组人ApoE3(Peprotech，目录号350-02)的包含CTS OpTmizer T细胞扩增SFM(Gibco，目录号A3705001)、1％青霉素-链霉素、1X谷氨酰胺、10mM HEPES、2.5％人AB血清(Gemini，目录号100-512)、200U/mL重组人白细胞介素-2、5ng/ml重组人白细胞介素7和5ng/ml重组人白细胞介素-15的OpTmizer基础培养基中孵育15分钟。激活后四十八小时，洗涤转导的T细胞，并且悬浮于具有200U/mL重组人白细胞介素-2、5ng/ml重组人白细胞介素7和5ng/ml重组人白细胞介素-15以及2.5％人AB血清(Gemini，目录号100-512)的OpTmizer基础培养基中。将预孵育的LNP混合物添加到每个15mL试管中，以产生5ug/ml总RNA的最终浓度，在双敲除组中，总RNA的最终浓度为10ug/ml。补充有ApoE3的培养基用作媒介物对照。24小时后，收集、洗涤T细胞，并且如实施例2所述在具有细胞因子的T细胞RPMI培养基中培养以用于扩增，直至注射日(激活后第15天)。
3.2工程化CD3+CD4+ T细胞中蛋白质表达的流式细胞术分析
如实施例2中一样，通过流式细胞术验证靶标表达。数据显示于表9和图5A-5E中。
表9-T细胞工程化后CD3+CD4+细胞的平均荧光强度
3.3 GvHD模型中炎症反应的体内评估
使用如实施例2中的移植物抗宿主疾病小鼠模型评估单独过表达IL10和CTLA4或与编辑以敲低IFNG、TNFA表达或双重敲低IFNG和TNFA组合的工程化CD3+CD4+ T细胞(模拟KO)的体内抑制功能。存活数据显示于表10和图6A中。如实施例2中一样，通过脾组合物评估人白细胞移植。数据显示于表11和图6B中。
表10--注射工程化CD3+CD4+细胞后的存活天数百分比
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表11-小鼠脾脏中人淋巴细胞的定量
3.4 CD3+CD4+工程化细胞的细胞因子谱
如实施例2中一样，刺激分选的经转导CD3+CD4+ T细胞，以一式三份评估其的细胞因子谱。结果显示于表12和图7A-7F中。
表12-细胞刺激后工程化T细胞的体外细胞因子产生(pg/ml)
/>
3.5抑制功能的混合淋巴细胞反应测定
混合淋巴细胞反应用于测定如实施例2中的转导细胞的抑制功能，其中CTV标记的T细胞与工程化T细胞的比率描述于表13中。数据显示于表13和图8中。
表13-通过CTV稀释测量的工程化T细胞对细胞增殖的抑制百分比
实施例4.GvHD模型中炎症反应的体内评估
除了注射5x10^6个PBMC和Treg之外，使用如实施例2中的移植物抗宿主疾病小鼠模型评估过表达野生型或高亲和力形式的IL10和CTLA4并编辑以敲低IFNG、TNFA表达的工程化CD3+CD4+T细胞的体内抑制功能。存活数据显示于表14和图9A中。如实施例2中一样，通过脾组合物评估人白细胞移植。数据显示于表15和图9B中。
表14--注射工程化CD3+CD4+细胞后的存活天数百分比
表15-小鼠脾脏中人淋巴细胞的定量
实施例5.暴露于炎性细胞因子后工程化T细胞的抑制能力
Treg抑制表型在炎症环境中的稳定性是Treg治疗的关键考虑因素。因此，我们将sTreg暴露于炎性细胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β，并且在体外评估其的抑制功能。
5.1 T细胞工程化
如实施例2.2所述，从白细胞采集物中分离人CD3+CD4+ T细胞，并且将其激活并用慢病毒构建体转导，以促进IL10和CTLA4的过表达。转导一天后，如实施例3.1所述，使用gRNA G019754(INFG)和G019760(TNFA)用Cas9工程化转导的细胞以破坏TNFA和IFNG基因。
在各自100ng/mL TNF-α(Miltenyi；130-094-014)、IL-1β(Miltenyi；130-093-898)和IL-6(Miltenyi；130-095-365)的炎性细胞因子混合物存在下培养一部分分选的工程化CD3+CD4+ T细胞。每两天补充TNF-α、IL-1β和IL-6，持续八天，此时使用MLR抑制测定评估其的功能。
如实施例2中一样，通过流式细胞术验证靶标表达。数据显示于表16中。
表16--T细胞工程化后CD3+CD4+细胞的平均荧光强度
样品 CTLA4(平均值)
未转导的 3866
未编辑 114290
IFNG KO 114271
TNFA KO 112277
IFNG/TNFA KO 116005
未编辑，预处理 78579
IFNG KO，预处理 93574
TNFA KO，预处理 82986
IFNG/TNFA KO，预处理 85807
如实施例2中一样，刺激分选的转导CD3+CD4+T细胞，以一式三份评估其细胞因子谱。数据显示于表17和表18中。
表17-细胞刺激后工程化T细胞的体外细胞因子产生(pg/ml)
表18-在细胞刺激时暴露于炎性细胞因子的工程化T细胞的体外细胞因子产生(pg/ml)
5.2抑制功能的混合淋巴细胞反应测定
在添加或不添加各自100ng/mL的TNF-α、IL-1β和IL-6的情况下，以1:1的CTV标记的T细胞与工程化T细胞的比率使用混合淋巴细胞反应来测定如实施例2中的转导细胞的抑制功能。数据显示于表19和20以及图10A-B中。
表19-在不具有炎性细胞因子的抑制测定中通过CTV稀释测量的工程化T细胞对细胞增殖的抑制百分比
表20-在具有和不具有炎性细胞因子的抑制测定中通过CTV稀释测量的工程化T细胞对细胞增殖的抑制百分比
实施例6.炎性肠病模型中工程化T细胞的抑制能力
已知Treg在临床前模型中抑制结肠炎的诱导。此外，已知IL-10的突变是人结肠炎发展的危险因素。重要的是，已知炎症的结肠表达高水平的MAdCAM-1(淋巴细胞的一种粘附分子)。被编辑以破坏编码IFNG和TNFA的基因并被进一步工程化以表达抗MAdCAM CAR的过表达IL10和CTLA4的T细胞用于治疗炎性肠病(IBD)的人源化小鼠模型(参见，例如，Gottel等人,Low-Dose Interleukin-2 Ameliorates Colitis in a Preclinical HumanizedMouse Model.Cell Mol Gastroenterol Hepatol.2019；8(2):193-195)或IBD的CD45RBhi转移模型(参见，例如，Asseman等人,An Essential Role for Interleukin 10in theFunction of Regulatory T Cells That Inhibit Intestinal Inflammation.J ExptMed.190(7):995-1003)。
简言之，通过在第0天给NOG小鼠注射20x106个PBMC并施用具有悬浮于50％乙醇水溶液中(X w/v)中的50μL 2,4-二硝基苯磺酸(DNBS)的灌肠剂(Sigma-Aldrich，目录号556971)来诱导人源化小鼠IBD模型。为了在预防环境中评估工程化T细胞，将本文提供的20x10^6个工程化T细胞在第0天与来自相同供体的PBMC共转移。在人源化模型的治疗环境中，在DNBS灌肠的当天注射PBMC，并且在随后的不同天转移来自与PBMC相同的供体的20x10^6个工程化T细胞。在体重减少20％之后，或者对于体重没有减少至少20％的小鼠，在预定的时间对小鼠实施安乐死并收集其的结肠。使用已知方法分析小鼠的结肠炎程度。例如，结肠炎的程度由结肠的总长度以及结肠长度与重量的比率决定。将结肠固定在福尔马林中，并通过组织学分析结肠上皮的增厚。用具有CTLA4和IL10的插入与IFNG和TNFA的敲除组合的工程化T细胞对小鼠进行预防性和治疗性治疗显著减少了上皮的增厚。在一些实施方案中，预防性和治疗性治疗包括施用具有CTLA4的插入和IFNG和TNFA的敲除的工程化T细胞，并且显著减少了上皮的增厚。在一些实施方案中，预防性和治疗性治疗包括施用具有IL10的插入和IFNG和TNFA的敲除的工程化T细胞，并且显著减少了上皮的增厚。
通过将来自BALB/c(Taconic；BALB)的CD45RBhi CD3+CD4+CD25- T细胞转移至免疫缺陷型SCID小鼠(Taconic；CB17SC)中来诱导IBD的T辅助细胞1型介导的/CD45RBhi转移模型。结肠炎源于Th1反应的发展，因为肠道病变中存在极化的Th1细胞。相互的CD45RB低CD4+T细胞亚群与正常致病性CD45RB高细胞的共转移防止了结肠炎的发展，从而指示来自正常小鼠的CD45RB低CD4+亚群含有能够控制肠内炎症反应的调节性T细胞群体(Powrid等人,Phenotypically distinct subsets of CD4+ T cells induce or protect fromchronic intestinal inflammation in C.B-17 scid mice.Int.Immunol.5:1461–1471)。使用已知方法分离细胞群体，并且制备用于腹膜内注射。如以上实施例2中所述制备工程化Treg和nTreg。在体重减少20％后，或者对于体重没有减少至少20％的小鼠，在预定时间对小鼠实施安乐死，并收集其的结肠。使用已知方法，例如在IBD的人源化小鼠模型中提供的方法分析小鼠的结肠炎程度。用具有CTLA4和IL10的插入和IFNG和TNFA的敲除的工程化T细胞治疗小鼠显著降低了上皮细胞的增厚达50％以上。在一些实施方案中，预防性和治疗性处理包括施用具有CTLA4的插入和IFNG和TNFA的敲除的工程化T细胞，并且显著降低上皮细胞的增厚达50％以上。在一些实施方案中，预防性和治疗性处理包括施用具有IL10的插入和IFNG和TNFA的敲除的工程化T细胞，并且显著降低上皮细胞的增厚达50％以上。治疗还可以减少体重减轻，延长生存期。
序列表
<110> 易达利治疗公司(INTELLIA THERAPEUTICS, INC.)
<120> 工程化T细胞
<130> 12793.0030-00304
<140>
<141>
<150> 63/131,987
<151> 2020-12-30
<160> 149
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成
寡核苷酸”
<400> 1
gcaggcagga caaccauuac 20
<210> 2
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成
寡核苷酸”
<400> 2
caggcaggac aaccauuacu 20
<210> 3
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成
寡核苷酸”
<400> 3
aggagucaga ugcuguuucg 20
<210> 4
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成
寡核苷酸”
<400> 4
cuaaaacagg gaagcgaaaa 20
<210> 5
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成
寡核苷酸”
<400> 5
cgcuucccug uuuuagcugc 20
<210> 6
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成
寡核苷酸”
<400> 6
ugucgccagc agcuaaaaca 20
<210> 7
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成
寡核苷酸”
<400> 7
cugucgccag cagcuaaaac 20
<210> 8
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成
寡核苷酸”
<400> 8
gcgacaguuc agccaucacu 20
<210> 9
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成
寡核苷酸”
<400> 9
acaugaacuc auccaaguga 20
<210> 10
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成
寡核苷酸”
<400> 10
guucauguau ugcuuugcgu 20
<210> 11
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成
寡核苷酸”
<400> 11
gacauucaug ucuuccuuga 20
<210> 12
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成
寡核苷酸”
<400> 12
ugauggucuc cacacucuuu 20
<210> 13
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成
寡核苷酸”
<400> 13
aaagagugug gagaccauca 20
<210> 14
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成
寡核苷酸”
<400> 14
ccagagcauc caaaagagug 20
<210> 15
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成
寡核苷酸”
<400> 15
gauaauggaa cucuuuucuu 20
<210> 16
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成
寡核苷酸”
<400> 16
cauucagaug uagcggauaa 20
<210> 17
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成
寡核苷酸”
<400> 17
ugcaggucau ucagauguag 20
<210> 18
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成
寡核苷酸”
<400> 18
cuucuuuuac auaugggucc 20
<210> 19
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成
寡核苷酸”
<400> 19
ugcaucguuu uggguucucu 20
<210> 20
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成
寡核苷酸”
<400> 20
uuucagcucu gcaucguuuu 20
<210> 21
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成
寡核苷酸”
<400> 21
uuuucagcuc ugcaucguuu 20
<210> 22
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成
寡核苷酸”
<400> 22
ugagcacuga aagcaugauc 20
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<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成
寡核苷酸”
<400> 23
ugaaagcaug auccgggacg 20
<210> 24
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成
寡核苷酸”
<400> 24
caugauccgg gacguggagc 20
<210> 25
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成
寡核苷酸”
<400> 25
cuucuugggg agcgccuccu 20
<210> 26
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成
寡核苷酸”
<400> 26
gaggcgcucc ccaagaagac 20
<210> 27
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成
寡核苷酸”
<400> 27
aggcgcuccc caagaagaca 20
<210> 28
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成
寡核苷酸”
<400> 28
ggcgcucccc aagaagacag 20
<210> 29
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成
寡核苷酸”
<400> 29
gcgcucccca agaagacagg 20
<210> 30
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成
寡核苷酸”
<400> 30
caagaagaca ggggggcccc 20
<210> 31
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成
寡核苷酸”
<400> 31
ggggcccccc ugucuucuug 20
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<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成
寡核苷酸”
<400> 32
cuggggcccc ccugucuucu 20
<210> 33
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成
寡核苷酸”
<400> 33
aagcaccgcc uggagcccug 20
<210> 34
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成
寡核苷酸”
<400> 34
caagcaccgc cuggagcccu 20
<210> 35
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成
寡核苷酸”
<400> 35
gcugaggaac aagcaccgcc 20
<210> 36
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成
寡核苷酸”
<400> 36
ccucuucucc uuccugaucg 20
<210> 37
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成
寡核苷酸”
<400> 37
uucuccuucc ugaucguggc 20
<210> 38
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成
寡核苷酸”
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ggcgccugcc acgaucagga 20
<210> 39
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成
寡核苷酸”
<400> 39
ugguggcgcc ugccacgauc 20
<210> 40
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成
寡核苷酸”
<400> 40
cugcugcacu uuggagugau 20
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<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成
寡核苷酸”
<400> 41
cgaucacucc aaagugcagc 20
<210> 42
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成
寡核苷酸”
<400> 42
uuggagugau cggcccccag 20
<210> 43
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成
寡核苷酸”
<400> 43
uggagugauc ggcccccaga 20
<210> 44
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成
寡核苷酸”
<400> 44
aggcacucac cucuucccuc 20
<210> 45
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成
寡核苷酸”
<400> 45
ugauuagaga gaggucccug 20
<210> 46
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成
寡核苷酸”
<400> 46
cugauuagag agaggucccu 20
<210> 47
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成
寡核苷酸”
<400> 47
gcugauuaga gagagguccc 20
<210> 48
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成
寡核苷酸”
<400> 48
ccucucucua aucagcccuc 20
<210> 49
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成
寡核苷酸”
<400> 49
ccagagggcu gauuagagag 20
<210> 50
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成
寡核苷酸”
<400> 50
ucuaaucagc ccucuggccc 20
<210> 51
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成
寡核苷酸”
<400> 51
uacugacugc cugggccaga 20
<210> 52
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成
寡核苷酸”
<400> 52
uuacugacug ccugggccag 20
<210> 53
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成
寡核苷酸”
<400> 53
gagacacuua cugacugccu 20
<210> 54
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成
寡核苷酸”
<400> 54
ggagacacuu acugacugcc 20
<210> 55
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成
寡核苷酸”
<400> 55
gggcuacagg cuugucacuc 20
<210> 56
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成
寡核苷酸”
<400> 56
ugggcuacag gcuugucacu 20
<210> 57
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成
寡核苷酸”
<400> 57
uuaccuacaa caugggcuac 20
<210> 58
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成
寡核苷酸”
<400> 58
agagcucuua ccuacaacau 20
<210> 59
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成
寡核苷酸”
<400> 59
cagagcucuu accuacaaca 20
<210> 60
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成
寡核苷酸”
<400> 60
uccagcaaac ccucaagcug 20
<210> 61
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成
寡核苷酸”
<400> 61
cagcaaaccc ucaagcugag 20
<210> 62
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成
寡核苷酸”
<400> 62
ggagcugccc cucagcuuga 20
<210> 63
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成
寡核苷酸”
<400> 63
uggagcugcc ccucagcuug 20
<210> 64
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成
寡核苷酸”
<400> 64
agcuccagug gcugaaccgc 20
<210> 65
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成
寡核苷酸”
<400> 65
gcuccagugg cugaaccgcc 20
<210> 66
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成
寡核苷酸”
<400> 66
uggcccggcg guucagccac 20
<210> 67
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成
寡核苷酸”
<400> 67
ccgccgggcc aaugcccucc 20
<210> 68
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成
寡核苷酸”
<400> 68
ccaggagggc auuggcccgg 20
<210> 69
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成
寡核苷酸”
<400> 69
gccaaugccc uccuggccaa 20
<210> 70
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成
寡核苷酸”
<400> 70
gccauuggcc aggagggcau 20
<210> 71
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成
寡核苷酸”
<400> 71
ugcccuccug gccaauggcg 20
<210> 72
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成
寡核苷酸”
<400> 72
gcuccacgcc auuggccagg 20
<210> 73
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成
寡核苷酸”
<400> 73
ucagcuccac gccauuggcc 20
<210> 74
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成
寡核苷酸”
<400> 74
aucucucagc uccacgccau 20
<210> 75
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成
寡核苷酸”
<400> 75
ggagcugaga gauaaccagc 20
<210> 76
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成
寡核苷酸”
<400> 76
gcugagagau aaccagcugg 20
<210> 77
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成
寡核苷酸”
<400> 77
ccagcuggug gugccaucag 20
<210> 78
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成
寡核苷酸”
<400> 78
cagcuggugg ugccaucaga 20
<210> 79
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成
寡核苷酸”
<400> 79
augagguaca ggcccucuga 20
<210> 80
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成
寡核苷酸”
<400> 80
ccugggagua gaugagguac 20
<210> 81
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成
寡核苷酸”
<400> 81
uacucccagg uccucuucaa 20
<210> 82
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成
寡核苷酸”
<400> 82
cuuggcccuu gaagaggacc 20
<210> 83
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成
寡核苷酸”
<400> 83
ggcgaugcgg cugauggugu 20
<210> 84
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成
寡核苷酸”
<400> 84
cggcgaugcg gcugauggug 20
<210> 85
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成
寡核苷酸”
<400> 85
ggagacggcg augcggcuga 20
<210> 86
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成
寡核苷酸”
<400> 86
ucugguagga gacggcgaug 20
<210> 87
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成
寡核苷酸”
<400> 87
cgccgucucc uaccagacca 20
<210> 88
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成
寡核苷酸”
<400> 88
gagguugacc uuggucuggu 20
<210> 89
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成
寡核苷酸”
<400> 89
ggcagagagg agguugaccu 20
<210> 90
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成
寡核苷酸”
<400> 90
ccaucaagag ccccugccag 20
<210> 91
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成
寡核苷酸”
<400> 91
caucaagagc cccugccaga 20
<210> 92
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成
寡核苷酸”
<400> 92
cuggggucuc ccucuggcag 20
<210> 93
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成
寡核苷酸”
<400> 93
ucuggggucu cccucuggca 20
<210> 94
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成
寡核苷酸”
<400> 94
gaugggcuca uaccagggcu 20
<210> 95
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成
寡核苷酸”
<400> 95
cugguaugag cccaucuauc 20
<210> 96
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成
寡核苷酸”
<400> 96
agauagaugg gcucauacca 20
<210> 97
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成
寡核苷酸”
<400> 97
ugguaugagc ccaucuaucu 20
<210> 98
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成
寡核苷酸”
<400> 98
cagauagaug ggcucauacc 20
<210> 99
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成
寡核苷酸”
<400> 99
augagcccau cuaucuggga 20
<210> 100
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成
寡核苷酸”
<400> 100
ugagcccauc uaucugggag 20
<210> 101
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成
寡核苷酸”
<400> 101
aagaccccuc ccagauagau 20
<210> 102
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成
寡核苷酸”
<400> 102
gucggucacc cuucuccagc 20
<210> 103
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成
寡核苷酸”
<400> 103
gacucagcgc ugagaucaau 20
<210> 104
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成
寡核苷酸”
<400> 104
gauugaucuc agcgcugagu 20
<210> 105
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成
寡核苷酸”
<400> 105
ucggcaaagu cgagauaguc 20
<210> 106
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成
寡核苷酸”
<400> 106
cucggcaaag ucgagauagu 20
<210> 107
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成
寡核苷酸”
<400> 107
uaucucgacu uugccgaguc 20
<210> 108
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成
寡核苷酸”
<400> 108
aucucgacuu ugccgagucu 20
<210> 109
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成
寡核苷酸”
<400> 109
cgacuuugcc gagucugggc 20
<210> 110
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成
寡核苷酸”
<400> 110
gagucugggc aggucuacuu 20
<210> 111
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成
寡核苷酸”
<400> 111
agucugggca ggucuacuuu 20
<210> 112
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成
寡核苷酸”
<400> 112
aaaguagacc ugcccagacu 20
<210> 113
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成
寡核苷酸”
<400> 113
ggauguucgu ccuccucaca 20
<210> 114
<211> 4140
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成
多核苷酸”
<400> 114
auggacaaga aguacuccau cggccuggac aucggcacca acuccguggg cugggccgug 60
aucaccgacg aguacaaggu gcccuccaag aaguucaagg ugcugggcaa caccgaccgg 120
cacuccauca agaagaaccu gaucggcgcc cugcuguucg acuccggcga gaccgccgag 180
gccacccggc ugaagcggac cgcccggcgg cgguacaccc ggcggaagaa ccggaucugc 240
uaccugcagg agaucuucuc caacgagaug gccaaggugg acgacuccuu cuuccaccgg 300
cuggaggagu ccuuccuggu ggaggaggac aagaagcacg agcggcaccc caucuucggc 360
aacaucgugg acgagguggc cuaccacgag aaguacccca ccaucuacca ccugcggaag 420
aagcuggugg acuccaccga caaggccgac cugcggcuga ucuaccuggc ccuggcccac 480
augaucaagu uccggggcca cuuccugauc gagggcgacc ugaaccccga caacuccgac 540
guggacaagc uguucaucca gcuggugcag accuacaacc agcuguucga ggagaacccc 600
aucaacgccu ccggcgugga cgccaaggcc auccuguccg cccggcuguc caagucccgg 660
cggcuggaga accugaucgc ccagcugccc ggcgagaaga agaacggccu guucggcaac 720
cugaucgccc ugucccuggg ccugaccccc aacuucaagu ccaacuucga ccuggccgag 780
gacgccaagc ugcagcuguc caaggacacc uacgacgacg accuggacaa ccugcuggcc 840
cagaucggcg accaguacgc cgaccuguuc cuggccgcca agaaccuguc cgacgccauc 900
cugcuguccg acauccugcg ggugaacacc gagaucacca aggccccccu guccgccucc 960
augaucaagc gguacgacga gcaccaccag gaccugaccc ugcugaaggc ccuggugcgg 1020
cagcagcugc ccgagaagua caaggagauc uucuucgacc aguccaagaa cggcuacgcc 1080
ggcuacaucg acggcggcgc cucccaggag gaguucuaca aguucaucaa gcccauccug 1140
gagaagaugg acggcaccga ggagcugcug gugaagcuga accgggagga ccugcugcgg 1200
aagcagcgga ccuucgacaa cggcuccauc ccccaccaga uccaccuggg cgagcugcac 1260
gccauccugc ggcggcagga ggacuucuac cccuuccuga aggacaaccg ggagaagauc 1320
gagaagaucc ugaccuuccg gauccccuac uacgugggcc cccuggcccg gggcaacucc 1380
cgguucgccu ggaugacccg gaaguccgag gagaccauca cccccuggaa cuucgaggag 1440
gugguggaca agggcgccuc cgcccagucc uucaucgagc ggaugaccaa cuucgacaag 1500
aaccugccca acgagaaggu gcugcccaag cacucccugc uguacgagua cuucaccgug 1560
uacaacgagc ugaccaaggu gaaguacgug accgagggca ugcggaagcc cgccuuccug 1620
uccggcgagc agaagaaggc caucguggac cugcuguuca agaccaaccg gaaggugacc 1680
gugaagcagc ugaaggagga cuacuucaag aagaucgagu gcuucgacuc cguggagauc 1740
uccggcgugg aggaccgguu caacgccucc cugggcaccu accacgaccu gcugaagauc 1800
aucaaggaca aggacuuccu ggacaacgag gagaacgagg acauccugga ggacaucgug 1860
cugacccuga cccuguucga ggaccgggag augaucgagg agcggcugaa gaccuacgcc 1920
caccuguucg acgacaaggu gaugaagcag cugaagcggc ggcgguacac cggcuggggc 1980
cggcuguccc ggaagcugau caacggcauc cgggacaagc aguccggcaa gaccauccug 2040
gacuuccuga aguccgacgg cuucgccaac cggaacuuca ugcagcugau ccacgacgac 2100
ucccugaccu ucaaggagga cauccagaag gcccaggugu ccggccaggg cgacucccug 2160
cacgagcaca ucgccaaccu ggccggcucc cccgccauca agaagggcau ccugcagacc 2220
gugaaggugg uggacgagcu ggugaaggug augggccggc acaagcccga gaacaucgug 2280
aucgagaugg cccgggagaa ccagaccacc cagaagggcc agaagaacuc ccgggagcgg 2340
augaagcgga ucgaggaggg caucaaggag cugggcuccc agauccugaa ggagcacccc 2400
guggagaaca cccagcugca gaacgagaag cuguaccugu acuaccugca gaacggccgg 2460
gacauguacg uggaccagga gcuggacauc aaccggcugu ccgacuacga cguggaccac 2520
aucgugcccc aguccuuccu gaaggacgac uccaucgaca acaaggugcu gacccggucc 2580
gacaagaacc ggggcaaguc cgacaacgug cccuccgagg agguggugaa gaagaugaag 2640
aacuacuggc ggcagcugcu gaacgccaag cugaucaccc agcggaaguu cgacaaccug 2700
accaaggccg agcggggcgg ccuguccgag cuggacaagg ccggcuucau caagcggcag 2760
cugguggaga cccggcagau caccaagcac guggcccaga uccuggacuc ccggaugaac 2820
accaaguacg acgagaacga caagcugauc cgggagguga aggugaucac ccugaagucc 2880
aagcuggugu ccgacuuccg gaaggacuuc caguucuaca aggugcggga gaucaacaac 2940
uaccaccacg cccacgacgc cuaccugaac gccguggugg gcaccgcccu gaucaagaag 3000
uaccccaagc uggaguccga guucguguac ggcgacuaca agguguacga cgugcggaag 3060
augaucgcca aguccgagca ggagaucggc aaggccaccg ccaaguacuu cuucuacucc 3120
aacaucauga acuucuucaa gaccgagauc acccuggcca acggcgagau ccggaagcgg 3180
ccccugaucg agaccaacgg cgagaccggc gagaucgugu gggacaaggg ccgggacuuc 3240
gccaccgugc ggaaggugcu guccaugccc caggugaaca ucgugaagaa gaccgaggug 3300
cagaccggcg gcuucuccaa ggaguccauc cugcccaagc ggaacuccga caagcugauc 3360
gcccggaaga aggacuggga ccccaagaag uacggcggcu ucgacucccc caccguggcc 3420
uacuccgugc uggugguggc caagguggag aagggcaagu ccaagaagcu gaaguccgug 3480
aaggagcugc ugggcaucac caucauggag cgguccuccu ucgagaagaa ccccaucgac 3540
uuccuggagg ccaagggcua caaggaggug aagaaggacc ugaucaucaa gcugcccaag 3600
uacucccugu ucgagcugga gaacggccgg aagcggaugc uggccuccgc cggcgagcug 3660
cagaagggca acgagcuggc ccugcccucc aaguacguga acuuccugua ccuggccucc 3720
cacuacgaga agcugaaggg cucccccgag gacaacgagc agaagcagcu guucguggag 3780
cagcacaagc acuaccugga cgagaucauc gagcagaucu ccgaguucuc caagcgggug 3840
auccuggccg acgccaaccu ggacaaggug cuguccgccu acaacaagca ccgggacaag 3900
cccauccggg agcaggccga gaacaucauc caccuguuca cccugaccaa ccugggcgcc 3960
cccgccgccu ucaaguacuu cgacaccacc aucgaccgga agcgguacac cuccaccaag 4020
gaggugcugg acgccacccu gauccaccag uccaucaccg gccuguacga gacccggauc 4080
gaccuguccc agcugggcgg cgacggcggc ggcuccccca agaagaagcg gaagguguga 4140
<210> 115
<211> 1379
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成
多肽”
<400> 115
Met Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Asp Ile Gly Thr Asn Ser Val
1 5 10 15
Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe
20 25 30
Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile
35 40 45
Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu
50 55 60
Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg Arg Lys Asn Arg Ile Cys
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met Ala Lys Val Asp Asp Ser
85 90 95
Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu Val Glu Glu Asp Lys Lys
100 105 110
His Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Ile Val Asp Glu Val Ala Tyr
115 120 125
His Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu Arg Lys Lys Leu Val Asp
130 135 140
Ser Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu Ile Tyr Leu Ala Leu Ala His
145 150 155 160
Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro
165 170 175
Asp Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe Ile Gln Leu Val Gln Thr Tyr
180 185 190
Asn Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile Asn Ala Ser Gly Val Asp Ala
195 200 205
Lys Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser Lys Ser Arg Arg Leu Glu Asn
210 215 220
Leu Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu Lys Lys Asn Gly Leu Phe Gly Asn
225 230 235 240
Leu Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr Pro Asn Phe Lys Ser Asn Phe
245 250 255
Asp Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu Gln Leu Ser Lys Asp Thr Tyr Asp
260 265 270
Asp Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln Ile Gly Asp Gln Tyr Ala Asp
275 280 285
Leu Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu Ser Asp Ala Ile Leu Leu Ser Asp
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Ile Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile Thr Lys Ala Pro Leu Ser Ala Ser
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Met Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His Gln Asp Leu Thr Leu Leu Lys
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Ala Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro Glu Lys Tyr Lys Glu Ile Phe Phe
340 345 350
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370 375 380
Gly Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys Leu Asn Arg Glu Asp Leu Leu Arg
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Lys Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser Ile Pro His Gln Ile His Leu
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Val Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala Gln Ser Phe Ile Glu Arg Met Thr
485 490 495
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500 505 510
Leu Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val Tyr Asn Glu Leu Thr Lys Val Lys
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Lys Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu Phe Lys Thr Asn Arg Lys Val Thr
545 550 555 560
Val Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr Phe Lys Lys Ile Glu Cys Phe Asp
565 570 575
Ser Val Glu Ile Ser Gly Val Glu Asp Arg Phe Asn Ala Ser Leu Gly
580 585 590
Thr Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile Ile Lys Asp Lys Asp Phe Leu Asp
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610 615 620
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Lys Leu Val Ser Asp Phe Arg Lys Asp Phe Gln Phe Tyr Lys Val Arg
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980 985 990
Val Gly Thr Ala Leu Ile Lys Lys Tyr Pro Lys Leu Glu Ser Glu Phe
995 1000 1005
Val Tyr Gly Asp Tyr Lys Val Tyr Asp Val Arg Lys Met Ile Ala
1010 1015 1020
Lys Ser Glu Gln Glu Ile Gly Lys Ala Thr Ala Lys Tyr Phe Phe
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Phe Lys Tyr Phe Asp Thr Thr Ile Asp Arg Lys Arg Tyr Thr Ser
1325 1330 1335
Thr Lys Glu Val Leu Asp Ala Thr Leu Ile His Gln Ser Ile Thr
1340 1345 1350
Gly Leu Tyr Glu Thr Arg Ile Asp Leu Ser Gln Leu Gly Gly Asp
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Gly Gly Gly Ser Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val
1370 1375
<210> 116
<211> 4140
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成
多核苷酸”
<400> 116
auggacaaga aguacagcau cggacuggac aucggaacaa acagcgucgg augggcaguc 60
aucacagacg aauacaaggu cccgagcaag aaguucaagg uccugggaaa cacagacaga 120
cacagcauca agaagaaccu gaucggagca cugcuguucg acagcggaga aacagcagaa 180
gcaacaagac ugaagagaac agcaagaaga agauacacaa gaagaaagaa cagaaucugc 240
uaccugcagg aaaucuucag caacgaaaug gcaaaggucg acgacagcuu cuuccacaga 300
cuggaagaaa gcuuccuggu cgaagaagac aagaagcacg aaagacaccc gaucuucgga 360
aacaucgucg acgaagucgc auaccacgaa aaguacccga caaucuacca ccugagaaag 420
aagcuggucg acagcacaga caaggcagac cugagacuga ucuaccuggc acuggcacac 480
augaucaagu ucagaggaca cuuccugauc gaaggagacc ugaacccgga caacagcgac 540
gucgacaagc uguucaucca gcugguccag acauacaacc agcuguucga agaaaacccg 600
aucaacgcaa gcggagucga cgcaaaggca auccugagcg caagacugag caagagcaga 660
agacuggaaa accugaucgc acagcugccg ggagaaaaga agaacggacu guucggaaac 720
cugaucgcac ugagccuggg acugacaccg aacuucaaga gcaacuucga ccuggcagaa 780
gacgcaaagc ugcagcugag caaggacaca uacgacgacg accuggacaa ccugcuggca 840
cagaucggag accaguacgc agaccuguuc cuggcagcaa agaaccugag cgacgcaauc 900
cugcugagcg acauccugag agucaacaca gaaaucacaa aggcaccgcu gagcgcaagc 960
augaucaaga gauacgacga acaccaccag gaccugacac ugcugaaggc acuggucaga 1020
cagcagcugc cggaaaagua caaggaaauc uucuucgacc agagcaagaa cggauacgca 1080
ggauacaucg acggaggagc aagccaggaa gaauucuaca aguucaucaa gccgauccug 1140
gaaaagaugg acggaacaga agaacugcug gucaagcuga acagagaaga ccugcugaga 1200
aagcagagaa cauucgacaa cggaagcauc ccgcaccaga uccaccuggg agaacugcac 1260
gcaauccuga gaagacagga agacuucuac ccguuccuga aggacaacag agaaaagauc 1320
gaaaagaucc ugacauucag aaucccguac uacgucggac cgcuggcaag aggaaacagc 1380
agauucgcau ggaugacaag aaagagcgaa gaaacaauca caccguggaa cuucgaagaa 1440
gucgucgaca agggagcaag cgcacagagc uucaucgaaa gaaugacaaa cuucgacaag 1500
aaccugccga acgaaaaggu ccugccgaag cacagccugc uguacgaaua cuucacaguc 1560
uacaacgaac ugacaaaggu caaguacguc acagaaggaa ugagaaagcc ggcauuccug 1620
agcggagaac agaagaaggc aaucgucgac cugcuguuca agacaaacag aaaggucaca 1680
gucaagcagc ugaaggaaga cuacuucaag aagaucgaau gcuucgacag cgucgaaauc 1740
agcggagucg aagacagauu caacgcaagc cugggaacau accacgaccu gcugaagauc 1800
aucaaggaca aggacuuccu ggacaacgaa gaaaacgaag acauccugga agacaucguc 1860
cugacacuga cacuguucga agacagagaa augaucgaag aaagacugaa gacauacgca 1920
caccuguucg acgacaaggu caugaagcag cugaagagaa gaagauacac aggaugggga 1980
agacugagca gaaagcugau caacggaauc agagacaagc agagcggaaa gacaauccug 2040
gacuuccuga agagcgacgg auucgcaaac agaaacuuca ugcagcugau ccacgacgac 2100
agccugacau ucaaggaaga cauccagaag gcacagguca gcggacaggg agacagccug 2160
cacgaacaca ucgcaaaccu ggcaggaagc ccggcaauca agaagggaau ccugcagaca 2220
gucaaggucg ucgacgaacu ggucaagguc augggaagac acaagccgga aaacaucguc 2280
aucgaaaugg caagagaaaa ccagacaaca cagaagggac agaagaacag cagagaaaga 2340
augaagagaa ucgaagaagg aaucaaggaa cugggaagcc agauccugaa ggaacacccg 2400
gucgaaaaca cacagcugca gaacgaaaag cuguaccugu acuaccugca gaacggaaga 2460
gacauguacg ucgaccagga acuggacauc aacagacuga gcgacuacga cgucgaccac 2520
aucgucccgc agagcuuccu gaaggacgac agcaucgaca acaagguccu gacaagaagc 2580
gacaagaaca gaggaaagag cgacaacguc ccgagcgaag aagucgucaa gaagaugaag 2640
aacuacugga gacagcugcu gaacgcaaag cugaucacac agagaaaguu cgacaaccug 2700
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aagcugguca gcgacuucag aaaggacuuc caguucuaca aggucagaga aaucaacaac 2940
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aacaucauga acuucuucaa gacagaaauc acacuggcaa acggagaaau cagaaagaga 3180
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cacuacgaaa agcugaaggg aagcccggaa gacaacgaac agaagcagcu guucgucgaa 3780
cagcacaagc acuaccugga cgaaaucauc gaacagauca gcgaauucag caagagaguc 3840
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gaccugagcc agcugggagg agacggagga ggaagcccga agaagaagag aaaggucuag 4140
<210> 117
<211> 4197
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成
多核苷酸”
<400> 117
auggacaaga aguacuccau cggccuggac aucggcacca acuccguggg cugggccgug 60
aucaccgacg aguacaaggu gcccuccaag aaguucaagg ugcugggcaa caccgaccgg 120
cacuccauca agaagaaccu gaucggcgcc cugcuguucg acuccggcga gaccgccgag 180
gccacccggc ugaagcggac cgcccggcgg cgguacaccc ggcggaagaa ccggaucugc 240
uaccugcagg agaucuucuc caacgagaug gccaaggugg acgacuccuu cuuccaccgg 300
cuggaggagu ccuuccuggu ggaggaggac aagaagcacg agcggcaccc caucuucggc 360
aacaucgugg acgagguggc cuaccacgag aaguacccca ccaucuacca ccugcggaag 420
aagcuggugg acuccaccga caaggccgac cugcggcuga ucuaccuggc ccuggcccac 480
augaucaagu uccggggcca cuuccugauc gagggcgacc ugaaccccga caacuccgac 540
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cugaucgccc ugucccuggg ccugaccccc aacuucaagu ccaacuucga ccuggccgag 780
gacgccaagc ugcagcuguc caaggacacc uacgacgacg accuggacaa ccugcuggcc 840
cagaucggcg accaguacgc cgaccuguuc cuggccgcca agaaccuguc cgacgccauc 900
cugcuguccg acauccugcg ggugaacacc gagaucacca aggccccccu guccgccucc 960
augaucaagc gguacgacga gcaccaccag gaccugaccc ugcugaaggc ccuggugcgg 1020
cagcagcugc ccgagaagua caaggagauc uucuucgacc aguccaagaa cggcuacgcc 1080
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gugguggaca agggcgccuc cgcccagucc uucaucgagc ggaugaccaa cuucgacaag 1500
aaccugccca acgagaaggu gcugcccaag cacucccugc uguacgagua cuucaccgug 1560
uacaacgagc ugaccaaggu gaaguacgug accgagggca ugcggaagcc cgccuuccug 1620
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gugaagcagc ugaaggagga cuacuucaag aagaucgagu gcuucgacuc cguggagauc 1740
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aucaaggaca aggacuuccu ggacaacgag gagaacgagg acauccugga ggacaucgug 1860
cugacccuga cccuguucga ggaccgggag augaucgagg agcggcugaa gaccuacgcc 1920
caccuguucg acgacaaggu gaugaagcag cugaagcggc ggcgguacac cggcuggggc 1980
cggcuguccc ggaagcugau caacggcauc cgggacaagc aguccggcaa gaccauccug 2040
gacuuccuga aguccgacgg cuucgccaac cggaacuuca ugcagcugau ccacgacgac 2100
ucccugaccu ucaaggagga cauccagaag gcccaggugu ccggccaggg cgacucccug 2160
cacgagcaca ucgccaaccu ggccggcucc cccgccauca agaagggcau ccugcagacc 2220
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gacauguacg uggaccagga gcuggacauc aaccggcugu ccgacuacga cguggaccac 2520
aucgugcccc aguccuuccu gaaggacgac uccaucgaca acaaggugcu gacccggucc 2580
gacaagaacc ggggcaaguc cgacaacgug cccuccgagg agguggugaa gaagaugaag 2640
aacuacuggc ggcagcugcu gaacgccaag cugaucaccc agcggaaguu cgacaaccug 2700
accaaggccg agcggggcgg ccuguccgag cuggacaagg ccggcuucau caagcggcag 2760
cugguggaga cccggcagau caccaagcac guggcccaga uccuggacuc ccggaugaac 2820
accaaguacg acgagaacga caagcugauc cgggagguga aggugaucac ccugaagucc 2880
aagcuggugu ccgacuuccg gaaggacuuc caguucuaca aggugcggga gaucaacaac 2940
uaccaccacg cccacgacgc cuaccugaac gccguggugg gcaccgcccu gaucaagaag 3000
uaccccaagc uggaguccga guucguguac ggcgacuaca agguguacga cgugcggaag 3060
augaucgcca aguccgagca ggagaucggc aaggccaccg ccaaguacuu cuucuacucc 3120
aacaucauga acuucuucaa gaccgagauc acccuggcca acggcgagau ccggaagcgg 3180
ccccugaucg agaccaacgg cgagaccggc gagaucgugu gggacaaggg ccgggacuuc 3240
gccaccgugc ggaaggugcu guccaugccc caggugaaca ucgugaagaa gaccgaggug 3300
cagaccggcg gcuucuccaa ggaguccauc cugcccaagc ggaacuccga caagcugauc 3360
gcccggaaga aggacuggga ccccaagaag uacggcggcu ucgacucccc caccguggcc 3420
uacuccgugc uggugguggc caagguggag aagggcaagu ccaagaagcu gaaguccgug 3480
aaggagcugc ugggcaucac caucauggag cgguccuccu ucgagaagaa ccccaucgac 3540
uuccuggagg ccaagggcua caaggaggug aagaaggacc ugaucaucaa gcugcccaag 3600
uacucccugu ucgagcugga gaacggccgg aagcggaugc uggccuccgc cggcgagcug 3660
cagaagggca acgagcuggc ccugcccucc aaguacguga acuuccugua ccuggccucc 3720
cacuacgaga agcugaaggg cucccccgag gacaacgagc agaagcagcu guucguggag 3780
cagcacaagc acuaccugga cgagaucauc gagcagaucu ccgaguucuc caagcgggug 3840
auccuggccg acgccaaccu ggacaaggug cuguccgccu acaacaagca ccgggacaag 3900
cccauccggg agcaggccga gaacaucauc caccuguuca cccugaccaa ccugggcgcc 3960
cccgccgccu ucaaguacuu cgacaccacc aucgaccgga agcgguacac cuccaccaag 4020
gaggugcugg acgccacccu gauccaccag uccaucaccg gccuguacga gacccggauc 4080
gaccuguccc agcugggcgg cgacggcggc ggcuccccca agaagaagcg gaaggugucc 4140
gaguccgcca cccccgaguc cguguccggc uggcggcugu ucaagaagau cuccuga 4197
<210> 118
<211> 1398
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成
多肽”
<400> 118
Met Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Asp Ile Gly Thr Asn Ser Val
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Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe
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Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro
165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
Leu Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr Pro Asn Phe Lys Ser Asn Phe
245 250 255
Asp Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu Gln Leu Ser Lys Asp Thr Tyr Asp
260 265 270
Asp Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln Ile Gly Asp Gln Tyr Ala Asp
275 280 285
Leu Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu Ser Asp Ala Ile Leu Leu Ser Asp
290 295 300
Ile Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile Thr Lys Ala Pro Leu Ser Ala Ser
305 310 315 320
Met Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His Gln Asp Leu Thr Leu Leu Lys
325 330 335
Ala Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro Glu Lys Tyr Lys Glu Ile Phe Phe
340 345 350
Asp Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala Gly Tyr Ile Asp Gly Gly Ala Ser
355 360 365
Gln Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile Lys Pro Ile Leu Glu Lys Met Asp
370 375 380
Gly Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys Leu Asn Arg Glu Asp Leu Leu Arg
385 390 395 400
Lys Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser Ile Pro His Gln Ile His Leu
405 410 415
Gly Glu Leu His Ala Ile Leu Arg Arg Gln Glu Asp Phe Tyr Pro Phe
420 425 430
Leu Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile Glu Lys Ile Leu Thr Phe Arg Ile
435 440 445
Pro Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg Gly Asn Ser Arg Phe Ala Trp
450 455 460
Met Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr Ile Thr Pro Trp Asn Phe Glu Glu
465 470 475 480
Val Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala Gln Ser Phe Ile Glu Arg Met Thr
485 490 495
Asn Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn Glu Lys Val Leu Pro Lys His Ser
500 505 510
Leu Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val Tyr Asn Glu Leu Thr Lys Val Lys
515 520 525
Tyr Val Thr Glu Gly Met Arg Lys Pro Ala Phe Leu Ser Gly Glu Gln
530 535 540
Lys Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu Phe Lys Thr Asn Arg Lys Val Thr
545 550 555 560
Val Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr Phe Lys Lys Ile Glu Cys Phe Asp
565 570 575
Ser Val Glu Ile Ser Gly Val Glu Asp Arg Phe Asn Ala Ser Leu Gly
580 585 590
Thr Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile Ile Lys Asp Lys Asp Phe Leu Asp
595 600 605
Asn Glu Glu Asn Glu Asp Ile Leu Glu Asp Ile Val Leu Thr Leu Thr
610 615 620
Leu Phe Glu Asp Arg Glu Met Ile Glu Glu Arg Leu Lys Thr Tyr Ala
625 630 635 640
His Leu Phe Asp Asp Lys Val Met Lys Gln Leu Lys Arg Arg Arg Tyr
645 650 655
Thr Gly Trp Gly Arg Leu Ser Arg Lys Leu Ile Asn Gly Ile Arg Asp
660 665 670
Lys Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu Asp Phe Leu Lys Ser Asp Gly Phe
675 680 685
Ala Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu Ile His Asp Asp Ser Leu Thr Phe
690 695 700
Lys Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln Val Ser Gly Gln Gly Asp Ser Leu
705 710 715 720
His Glu His Ile Ala Asn Leu Ala Gly Ser Pro Ala Ile Lys Lys Gly
725 730 735
Ile Leu Gln Thr Val Lys Val Val Asp Glu Leu Val Lys Val Met Gly
740 745 750
Arg His Lys Pro Glu Asn Ile Val Ile Glu Met Ala Arg Glu Asn Gln
755 760 765
Thr Thr Gln Lys Gly Gln Lys Asn Ser Arg Glu Arg Met Lys Arg Ile
770 775 780
Glu Glu Gly Ile Lys Glu Leu Gly Ser Gln Ile Leu Lys Glu His Pro
785 790 795 800
Val Glu Asn Thr Gln Leu Gln Asn Glu Lys Leu Tyr Leu Tyr Tyr Leu
805 810 815
Gln Asn Gly Arg Asp Met Tyr Val Asp Gln Glu Leu Asp Ile Asn Arg
820 825 830
Leu Ser Asp Tyr Asp Val Asp His Ile Val Pro Gln Ser Phe Leu Lys
835 840 845
Asp Asp Ser Ile Asp Asn Lys Val Leu Thr Arg Ser Asp Lys Asn Arg
850 855 860
Gly Lys Ser Asp Asn Val Pro Ser Glu Glu Val Val Lys Lys Met Lys
865 870 875 880
Asn Tyr Trp Arg Gln Leu Leu Asn Ala Lys Leu Ile Thr Gln Arg Lys
885 890 895
Phe Asp Asn Leu Thr Lys Ala Glu Arg Gly Gly Leu Ser Glu Leu Asp
900 905 910
Lys Ala Gly Phe Ile Lys Arg Gln Leu Val Glu Thr Arg Gln Ile Thr
915 920 925
Lys His Val Ala Gln Ile Leu Asp Ser Arg Met Asn Thr Lys Tyr Asp
930 935 940
Glu Asn Asp Lys Leu Ile Arg Glu Val Lys Val Ile Thr Leu Lys Ser
945 950 955 960
Lys Leu Val Ser Asp Phe Arg Lys Asp Phe Gln Phe Tyr Lys Val Arg
965 970 975
Glu Ile Asn Asn Tyr His His Ala His Asp Ala Tyr Leu Asn Ala Val
980 985 990
Val Gly Thr Ala Leu Ile Lys Lys Tyr Pro Lys Leu Glu Ser Glu Phe
995 1000 1005
Val Tyr Gly Asp Tyr Lys Val Tyr Asp Val Arg Lys Met Ile Ala
1010 1015 1020
Lys Ser Glu Gln Glu Ile Gly Lys Ala Thr Ala Lys Tyr Phe Phe
1025 1030 1035
Tyr Ser Asn Ile Met Asn Phe Phe Lys Thr Glu Ile Thr Leu Ala
1040 1045 1050
Asn Gly Glu Ile Arg Lys Arg Pro Leu Ile Glu Thr Asn Gly Glu
1055 1060 1065
Thr Gly Glu Ile Val Trp Asp Lys Gly Arg Asp Phe Ala Thr Val
1070 1075 1080
Arg Lys Val Leu Ser Met Pro Gln Val Asn Ile Val Lys Lys Thr
1085 1090 1095
Glu Val Gln Thr Gly Gly Phe Ser Lys Glu Ser Ile Leu Pro Lys
1100 1105 1110
Arg Asn Ser Asp Lys Leu Ile Ala Arg Lys Lys Asp Trp Asp Pro
1115 1120 1125
Lys Lys Tyr Gly Gly Phe Asp Ser Pro Thr Val Ala Tyr Ser Val
1130 1135 1140
Leu Val Val Ala Lys Val Glu Lys Gly Lys Ser Lys Lys Leu Lys
1145 1150 1155
Ser Val Lys Glu Leu Leu Gly Ile Thr Ile Met Glu Arg Ser Ser
1160 1165 1170
Phe Glu Lys Asn Pro Ile Asp Phe Leu Glu Ala Lys Gly Tyr Lys
1175 1180 1185
Glu Val Lys Lys Asp Leu Ile Ile Lys Leu Pro Lys Tyr Ser Leu
1190 1195 1200
Phe Glu Leu Glu Asn Gly Arg Lys Arg Met Leu Ala Ser Ala Gly
1205 1210 1215
Glu Leu Gln Lys Gly Asn Glu Leu Ala Leu Pro Ser Lys Tyr Val
1220 1225 1230
Asn Phe Leu Tyr Leu Ala Ser His Tyr Glu Lys Leu Lys Gly Ser
1235 1240 1245
Pro Glu Asp Asn Glu Gln Lys Gln Leu Phe Val Glu Gln His Lys
1250 1255 1260
His Tyr Leu Asp Glu Ile Ile Glu Gln Ile Ser Glu Phe Ser Lys
1265 1270 1275
Arg Val Ile Leu Ala Asp Ala Asn Leu Asp Lys Val Leu Ser Ala
1280 1285 1290
Tyr Asn Lys His Arg Asp Lys Pro Ile Arg Glu Gln Ala Glu Asn
1295 1300 1305
Ile Ile His Leu Phe Thr Leu Thr Asn Leu Gly Ala Pro Ala Ala
1310 1315 1320
Phe Lys Tyr Phe Asp Thr Thr Ile Asp Arg Lys Arg Tyr Thr Ser
1325 1330 1335
Thr Lys Glu Val Leu Asp Ala Thr Leu Ile His Gln Ser Ile Thr
1340 1345 1350
Gly Leu Tyr Glu Thr Arg Ile Asp Leu Ser Gln Leu Gly Gly Asp
1355 1360 1365
Gly Gly Gly Ser Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Ser Glu Ser Ala
1370 1375 1380
Thr Pro Glu Ser Val Ser Gly Trp Arg Leu Phe Lys Lys Ile Ser
1385 1390 1395
<210> 119
<211> 100
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成
多核苷酸”
<400> 119
ccagagcauc caaaagagug guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 120
<211> 100
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成
多核苷酸”
<400> 120
agagcucuua ccuacaacau guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 121
<211> 100
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成
多核苷酸”
<400> 121
gaucacgucg gccguuggcg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 122
<211> 534
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 122
atgcacagct cagcactgct ctgttgcctg gtcctcctga ctggggtgag ggccagccca 60
ggccagggca cccagtctga gaacagctgc acccacttcc caggcaacct gcctaacatg 120
cttcgagatc tccgagatgc cttcagcaga gtgaagactt tctttcaaat gaaggatcag 180
ctggacaact tgttgttaaa ggagtccttg ctggaggact ttaagggtta cctgggttgc 240
caagccttgt ctgagatgat ccagttttac ctggaggagg tgatgcccca agctgagaac 300
caagacccag acatcaaggc gcatgtgaac tccctggggg agaacctgaa gaccctcagg 360
ctgaggctac ggcgctgtca tcgatttctt ccctgtgaaa acaagagcaa ggccgtggag 420
caggtgaaga atgcctttaa taagctccaa gagaaaggca tctacaaagc catgagtgag 480
tttgacatct tcatcaacta catagaagcc tacatgacaa tgaagatacg aaac 534
<210> 123
<211> 534
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成
多核苷酸”
<400> 123
atgcacagct cagcactgct ctgttgcctg gtcctcctga ctggggtgag ggccagccca 60
ggccagggca cccagtctga gaacagctgc acccacttcc caggcatcct gcctaacatg 120
cttcgagatc tccgagatgc cttcagcaga gtgaagactt tctttcaaat gaaggatcag 180
ctggacaact tgttgttaaa ggagtccttg ctggaggact ttaagggtta cctgggttgc 240
caagccttgt ctgagatgat ccagttttac ctggaggagg tgatgcccca agctgagaac 300
caagacccag acatcaaggc gcatgtgatc tccctggggg agaacctgaa taccctcagg 360
ctgaggctac ggcgctgtca tcgactcctt ccctgtgaaa acaagagcaa ggccgtggag 420
caggtgaaga atgcctttaa taagctccaa gagaaaggca tctacaaagc catgagtgag 480
tttgacatct tcatcaacta catagaagcc tacatgacaa tgaagatacg aaac 534
<210> 124
<211> 178
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 124
Met His Ser Ser Ala Leu Leu Cys Cys Leu Val Leu Leu Thr Gly Val
1 5 10 15
Arg Ala Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His
20 25 30
Phe Pro Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe
35 40 45
Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu
50 55 60
Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys
65 70 75 80
Gln Ala Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro
85 90 95
Gln Ala Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His Val Asn Ser Leu
100 105 110
Gly Glu Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg
115 120 125
Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn
130 135 140
Ala Phe Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu
145 150 155 160
Phe Asp Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile
165 170 175
Arg Asn
<210> 125
<211> 178
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成
多肽”
<400> 125
Met His Ser Ser Ala Leu Leu Cys Cys Leu Val Leu Leu Thr Gly Val
1 5 10 15
Arg Ala Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His
20 25 30
Phe Pro Gly Ile Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe
35 40 45
Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu
50 55 60
Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys
65 70 75 80
Gln Ala Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro
85 90 95
Gln Ala Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His Val Ile Ser Leu
100 105 110
Gly Glu Asn Leu Asn Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg
115 120 125
Leu Leu Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn
130 135 140
Ala Phe Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu
145 150 155 160
Phe Asp Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile
165 170 175
Arg Asn
<210> 126
<211> 669
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 126
atggcctgct tgggcttcca aaggcataaa gcccagctta atcttgctac tcgcacgtgg 60
ccctgcacat tgctcttttt cctcctgttc attcccgtgt tttgcaaggc gatgcatgtg 120
gcacaacctg ccgtcgttct ggcatcatca agaggtattg ctagcttcgt ttgtgagtac 180
gcctcccctg gaaaagcgac ggaggtgcgc gtcactgtat tgcggcaagc cgacagccaa 240
gttactgaag tctgcgcggc aacgtatatg atgggcaatg agctgacatt ccttgacgat 300
tcaatctgca cgggaacaag tagtggtaac caggtgaatc tcactattca aggtctgaga 360
gccatggaca ccggcctcta catttgtaag gtggagctga tgtatcctcc cccatattat 420
ctggggatcg gaaatgggac acagatatat gttattgatc ccgagccatg tcccgatagt 480
gacttcctct tgtggatact tgccgctgtg agcagtggtt tgttttttta ttcattcctc 540
cttacggcag tatcactttc aaaaatgctc aagaagcgaa gtcctttgac aactggcgta 600
tatgtcaaaa tgccaccaac agagcccgaa tgtgagaaac agttccagcc gtactttatt 660
cctataaac 669
<210> 127
<211> 669
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成
多核苷酸”
<400> 127
atggcctgct tgggcttcca aaggcataaa gcccagctta atcttgctac tcgcacgtgg 60
ccctgcacat tgctcttttt cctcctgttc attcccgtgt tttgcaaggc gatgcatgtg 120
gcacaacctg ccgtcgttct ggcatcatca agaggtattg ctagcttcgt ttgtgagtac 180
gcctcccctg gaaaatacac ggaggtgcgc gtcactgtat tgcggcaagc cgacagccaa 240
gttactgaag tctgcgcggc aacgtatatg atgggcaatg agctgacatt ccttgacgat 300
tcaatctgca cgggaacaag tagtggtaac caggtgaatc tcactattca aggtctgaga 360
gccatggaca ccggcctcta catttgtaag gtggagctga tgtatcctcc cccatattat 420
gaggggatcg gaaatgggac acagatatat gttattgatc ccgagccatg tcccgatagt 480
gacttcctct tgtggatact tgccgctgtg agcagtggtt tgttttttta ttcattcctc 540
cttacggcag tatcactttc aaaaatgctc aagaagcgaa gtcctttgac aactggcgta 600
tatgtcaaaa tgccaccaac agagcccgaa tgtgagaaac agttccagcc gtactttatt 660
cctataaac 669
<210> 128
<211> 669
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成
多核苷酸”
<400> 128
atggcctgct tgggcttcca aaggcataaa gcccagctta atcttgctac tcgcacgtgg 60
ccctgcacat tgctcttttt cctcctgttc attcccgtgt tttgcaaggc gatgcatgtg 120
gcacaacctg ccgtcgttct ggcatcatca agaggtattg ctagcttcgt ttgtgagtac 180
gcctcccctg gaaaacatac ggaggtgcgc gtcactgtat tgcggcaagc cgacagccaa 240
gttactgaag tctgcgcggc aacgtatatg atgggcaatg agctgacatt ccttgacgat 300
tcaatctgca cgggaacaag tagtggtaac caggtgaatc tcactattca aggtctgaga 360
gccatggaca ccggcctcta catttgtaag gtggagctga tgtatcctcc cccatattat 420
ctggggatcg gaaatgggac acagatatat gttattgatc ccgagccatg tcccgatagt 480
gacttcctct tgtggatact tgccgctgtg agcagtggtt tgttttttta ttcattcctc 540
cttacggcag tatcactttc aaaaatgctc aagaagcgaa gtcctttgac aactggcgta 600
tatgtcaaaa tgccaccaac agagcccgaa tgtgagaaac agttccagcc gtactttatt 660
cctataaac 669
<210> 129
<211> 669
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成
多核苷酸”
<400> 129
atggcctgct tgggcttcca aaggcataaa gcccagctta atcttgctac tcgcacgtgg 60
ccctgcacat tgctcttttt cctcctgttc attcccgtgt tttgcaaggc gatgcatgtg 120
gcacaacctg ccgtcgttct ggcatcatca agaggtattg ctagcttcgt ttgtgagtac 180
gcctcccctg gacatcacac ggaggtgcgc gtcactgtat tgcggcaagc cgacagccaa 240
gttactgaag tctgcgcggc aacgtatatg atgggcaatg agctgacatt ccttgacgat 300
tcaatctgca cgggaacaag tagtggtaac caggtgaatc tcactattca aggtctgaga 360
gccatggaca ccggcctcta catttgtaag gtggagctga tgtatcctcc cccatattat 420
ctggggatcg gaaatgggac acagatatat gttattgatc ccgagccatg tcccgatagt 480
gacttcctct tgtggatact tgccgctgtg agcagtggtt tgttttttta ttcattcctc 540
cttacggcag tatcactttc aaaaatgctc aagaagcgaa gtcctttgac aactggcgta 600
tatgtcaaaa tgccaccaac agagcccgaa tgtgagaaac agttccagcc gtactttatt 660
cctataaac 669
<210> 130
<211> 223
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 130
Met Ala Cys Leu Gly Phe Gln Arg His Lys Ala Gln Leu Asn Leu Ala
1 5 10 15
Thr Arg Thr Trp Pro Cys Thr Leu Leu Phe Phe Leu Leu Phe Ile Pro
20 25 30
Val Phe Cys Lys Ala Met His Val Ala Gln Pro Ala Val Val Leu Ala
35 40 45
Ser Ser Arg Gly Ile Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly
50 55 60
Lys Ala Thr Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg Gln Ala Asp Ser Gln
65 70 75 80
Val Thr Glu Val Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met Gly Asn Glu Leu Thr
85 90 95
Phe Leu Asp Asp Ser Ile Cys Thr Gly Thr Ser Ser Gly Asn Gln Val
100 105 110
Asn Leu Thr Ile Gln Gly Leu Arg Ala Met Asp Thr Gly Leu Tyr Ile
115 120 125
Cys Lys Val Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Leu Gly Ile Gly
130 135 140
Asn Gly Thr Gln Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu Pro Cys Pro Asp Ser
145 150 155 160
Asp Phe Leu Leu Trp Ile Leu Ala Ala Val Ser Ser Gly Leu Phe Phe
165 170 175
Tyr Ser Phe Leu Leu Thr Ala Val Ser Leu Ser Lys Met Leu Lys Lys
180 185 190
Arg Ser Pro Leu Thr Thr Gly Val Tyr Val Lys Met Pro Pro Thr Glu
195 200 205
Pro Glu Cys Glu Lys Gln Phe Gln Pro Tyr Phe Ile Pro Ile Asn
210 215 220
<210> 131
<211> 223
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成
多肽”
<400> 131
Met Ala Cys Leu Gly Phe Gln Arg His Lys Ala Gln Leu Asn Leu Ala
1 5 10 15
Thr Arg Thr Trp Pro Cys Thr Leu Leu Phe Phe Leu Leu Phe Ile Pro
20 25 30
Val Phe Cys Lys Ala Met His Val Ala Gln Pro Ala Val Val Leu Ala
35 40 45
Ser Ser Arg Gly Ile Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly
50 55 60
Lys Tyr Thr Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg Gln Ala Asp Ser Gln
65 70 75 80
Val Thr Glu Val Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met Gly Asn Glu Leu Thr
85 90 95
Phe Leu Asp Asp Ser Ile Cys Thr Gly Thr Ser Ser Gly Asn Gln Val
100 105 110
Asn Leu Thr Ile Gln Gly Leu Arg Ala Met Asp Thr Gly Leu Tyr Ile
115 120 125
Cys Lys Val Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Glu Gly Ile Gly
130 135 140
Asn Gly Thr Gln Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu Pro Cys Pro Asp Ser
145 150 155 160
Asp Phe Leu Leu Trp Ile Leu Ala Ala Val Ser Ser Gly Leu Phe Phe
165 170 175
Tyr Ser Phe Leu Leu Thr Ala Val Ser Leu Ser Lys Met Leu Lys Lys
180 185 190
Arg Ser Pro Leu Thr Thr Gly Val Tyr Val Lys Met Pro Pro Thr Glu
195 200 205
Pro Glu Cys Glu Lys Gln Phe Gln Pro Tyr Phe Ile Pro Ile Asn
210 215 220
<210> 132
<211> 223
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成
多肽”
<400> 132
Met Ala Cys Leu Gly Phe Gln Arg His Lys Ala Gln Leu Asn Leu Ala
1 5 10 15
Thr Arg Thr Trp Pro Cys Thr Leu Leu Phe Phe Leu Leu Phe Ile Pro
20 25 30
Val Phe Cys Lys Ala Met His Val Ala Gln Pro Ala Val Val Leu Ala
35 40 45
Ser Ser Arg Gly Ile Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly
50 55 60
Lys His Thr Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg Gln Ala Asp Ser Gln
65 70 75 80
Val Thr Glu Val Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met Gly Asn Glu Leu Thr
85 90 95
Phe Leu Asp Asp Ser Ile Cys Thr Gly Thr Ser Ser Gly Asn Gln Val
100 105 110
Asn Leu Thr Ile Gln Gly Leu Arg Ala Met Asp Thr Gly Leu Tyr Ile
115 120 125
Cys Lys Val Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Leu Gly Ile Gly
130 135 140
Asn Gly Thr Gln Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu Pro Cys Pro Asp Ser
145 150 155 160
Asp Phe Leu Leu Trp Ile Leu Ala Ala Val Ser Ser Gly Leu Phe Phe
165 170 175
Tyr Ser Phe Leu Leu Thr Ala Val Ser Leu Ser Lys Met Leu Lys Lys
180 185 190
Arg Ser Pro Leu Thr Thr Gly Val Tyr Val Lys Met Pro Pro Thr Glu
195 200 205
Pro Glu Cys Glu Lys Gln Phe Gln Pro Tyr Phe Ile Pro Ile Asn
210 215 220
<210> 133
<211> 223
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成
多肽”
<400> 133
Met Ala Cys Leu Gly Phe Gln Arg His Lys Ala Gln Leu Asn Leu Ala
1 5 10 15
Thr Arg Thr Trp Pro Cys Thr Leu Leu Phe Phe Leu Leu Phe Ile Pro
20 25 30
Val Phe Cys Lys Ala Met His Val Ala Gln Pro Ala Val Val Leu Ala
35 40 45
Ser Ser Arg Gly Ile Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly
50 55 60
His His Thr Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg Gln Ala Asp Ser Gln
65 70 75 80
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85 90 95
Phe Leu Asp Asp Ser Ile Cys Thr Gly Thr Ser Ser Gly Asn Gln Val
100 105 110
Asn Leu Thr Ile Gln Gly Leu Arg Ala Met Asp Thr Gly Leu Tyr Ile
115 120 125
Cys Lys Val Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Leu Gly Ile Gly
130 135 140
Asn Gly Thr Gln Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu Pro Cys Pro Asp Ser
145 150 155 160
Asp Phe Leu Leu Trp Ile Leu Ala Ala Val Ser Ser Gly Leu Phe Phe
165 170 175
Tyr Ser Phe Leu Leu Thr Ala Val Ser Leu Ser Lys Met Leu Lys Lys
180 185 190
Arg Ser Pro Leu Thr Thr Gly Val Tyr Val Lys Met Pro Pro Thr Glu
195 200 205
Pro Glu Cys Glu Lys Gln Phe Gln Pro Tyr Phe Ile Pro Ile Asn
210 215 220
<210> 134
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成
寡核苷酸”
<400> 134
guuuuagagc uaugcuguuu ug 22
<210> 135
<211> 80
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成
寡核苷酸”
<400> 135
guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu 60
ggcaccgagu cggugcuuuu 80
<210> 136
<211> 76
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成
寡核苷酸”
<400> 136
guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu 60
ggcaccgagu cggugc 76
<210> 137
<211> 672
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 137
atggcctgct tgggcttcca aaggcataaa gcccagctta atcttgctac tcgcacgtgg 60
ccctgcacat tgctcttttt cctcctgttc attcccgtgt tttgcaaggc gatgcatgtg 120
gcacaacctg ccgtcgttct ggcatcatca agaggtattg ctagcttcgt ttgtgagtac 180
gcctcccctg gaaaagcgac ggaggtgcgc gtcactgtat tgcggcaagc cgacagccaa 240
gttactgaag tctgcgcggc aacgtatatg atgggcaatg agctgacatt ccttgacgat 300
tcaatctgca cgggaacaag tagtggtaac caggtgaatc tcactattca aggtctgaga 360
gccatggaca ccggcctcta catttgtaag gtggagctga tgtatcctcc cccatattat 420
ctggggatcg gaaatgggac acagatatat gttattgatc ccgagccatg tcccgatagt 480
gacttcctct tgtggatact tgccgctgtg agcagtggtt tgttttttta ttcattcctc 540
cttacggcag tatcactttc aaaaatgctc aagaagcgaa gtcctttgac aactggcgta 600
tatgtcaaaa tgccaccaac agagcccgaa tgtgagaaac agttccagcc gtactttatt 660
cctataaact ga 672
<210> 138
<211> 537
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 138
atgcacagct cagcactgct ctgttgcctg gtcctcctga ctggggtgag ggccagccca 60
ggccagggca cccagtctga gaacagctgc acccacttcc caggcaacct gcctaacatg 120
cttcgagatc tccgagatgc cttcagcaga gtgaagactt tctttcaaat gaaggatcag 180
ctggacaact tgttgttaaa ggagtccttg ctggaggact ttaagggtta cctgggttgc 240
caagccttgt ctgagatgat ccagttttac ctggaggagg tgatgcccca agctgagaac 300
caagacccag acatcaaggc gcatgtgaac tccctggggg agaacctgaa gaccctcagg 360
ctgaggctac ggcgctgtca tcgatttctt ccctgtgaaa acaagagcaa ggccgtggag 420
caggtgaaga atgcctttaa taagctccaa gagaaaggca tctacaaagc catgagtgag 480
tttgacatct tcatcaacta catagaagcc tacatgacaa tgaagatacg aaactga 537
<210> 139
<211> 1299
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 139
atgcccaacc ccaggcctgg caagccctcg gccccttcct tggcccttgg cccatcccca 60
ggagcctcgc ccagctggag ggctgcaccc aaagcctcag acctgctggg ggcccggggc 120
ccagggggaa ccttccaggg ccgagatctt cgaggcgggg cccatgcctc ctcttcttcc 180
ttgaacccca tgccaccatc gcagctgcag ctgcccacac tgcccctagt catggtggca 240
ccctccgggg cacggctggg ccccttgccc cacttacagg cactcctcca ggacaggcca 300
catttcatgc accagctctc aacggtggat gcccacgccc ggacccctgt gctgcaggtg 360
caccccctgg agagcccagc catgatcagc ctcacaccac ccaccaccgc cactggggtc 420
ttctccctca aggcccggcc tggcctccca cctgggatca acgtggccag cctggaatgg 480
gtgtccaggg agccggcact gctctgcacc ttcccaaatc ccagtgcacc caggaaggac 540
agcacccttt cggctgtgcc ccagagctcc tacccactgc tggcaaatgg tgtctgcaag 600
tggcccggat gtgagaaggt cttcgaagag ccagaggact tcctcaagca ctgccaggcg 660
gaccatcttc tggatgagaa gggcagggca caatgtctcc tccagagaga gatggtacag 720
tctctggagc agcagctggt gctggagaag gagaagctga gtgccatgca ggcccacctg 780
gctgggaaaa tggcactgac caaggcttca tctgtggcat catccgacaa gggctcctgc 840
tgcatcgtag ctgctggcag ccaaggccct gtcgtcccag cctggtctgg cccccgggag 900
gcccctgaca gcctgtttgc tgtccggagg cacctgtggg gtagccatgg aaacagcaca 960
ttcccagagt tcctccacaa catggactac ttcaagttcc acaacatgcg accccctttc 1020
acctacgcca cgctcatccg ctgggccatc ctggaggctc cagagaagca gcggacactc 1080
aatgagatct accactggtt cacacgcatg tttgccttct tcagaaacca tcctgccacc 1140
tggaagaacg ccatccgcca caacctgagt ctgcacaagt gctttgtgcg ggtggagagc 1200
gagaaggggg ctgtgtggac cgtggatgag ctggagttcc gcaagaaacg gagccagagg 1260
cccagcaggt gttccaaccc tacacctggc ccctgataa 1299
<210> 140
<211> 431
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 140
Met Pro Asn Pro Arg Pro Gly Lys Pro Ser Ala Pro Ser Leu Ala Leu
1 5 10 15
Gly Pro Ser Pro Gly Ala Ser Pro Ser Trp Arg Ala Ala Pro Lys Ala
20 25 30
Ser Asp Leu Leu Gly Ala Arg Gly Pro Gly Gly Thr Phe Gln Gly Arg
35 40 45
Asp Leu Arg Gly Gly Ala His Ala Ser Ser Ser Ser Leu Asn Pro Met
50 55 60
Pro Pro Ser Gln Leu Gln Leu Pro Thr Leu Pro Leu Val Met Val Ala
65 70 75 80
Pro Ser Gly Ala Arg Leu Gly Pro Leu Pro His Leu Gln Ala Leu Leu
85 90 95
Gln Asp Arg Pro His Phe Met His Gln Leu Ser Thr Val Asp Ala His
100 105 110
Ala Arg Thr Pro Val Leu Gln Val His Pro Leu Glu Ser Pro Ala Met
115 120 125
Ile Ser Leu Thr Pro Pro Thr Thr Ala Thr Gly Val Phe Ser Leu Lys
130 135 140
Ala Arg Pro Gly Leu Pro Pro Gly Ile Asn Val Ala Ser Leu Glu Trp
145 150 155 160
Val Ser Arg Glu Pro Ala Leu Leu Cys Thr Phe Pro Asn Pro Ser Ala
165 170 175
Pro Arg Lys Asp Ser Thr Leu Ser Ala Val Pro Gln Ser Ser Tyr Pro
180 185 190
Leu Leu Ala Asn Gly Val Cys Lys Trp Pro Gly Cys Glu Lys Val Phe
195 200 205
Glu Glu Pro Glu Asp Phe Leu Lys His Cys Gln Ala Asp His Leu Leu
210 215 220
Asp Glu Lys Gly Arg Ala Gln Cys Leu Leu Gln Arg Glu Met Val Gln
225 230 235 240
Ser Leu Glu Gln Gln Leu Val Leu Glu Lys Glu Lys Leu Ser Ala Met
245 250 255
Gln Ala His Leu Ala Gly Lys Met Ala Leu Thr Lys Ala Ser Ser Val
260 265 270
Ala Ser Ser Asp Lys Gly Ser Cys Cys Ile Val Ala Ala Gly Ser Gln
275 280 285
Gly Pro Val Val Pro Ala Trp Ser Gly Pro Arg Glu Ala Pro Asp Ser
290 295 300
Leu Phe Ala Val Arg Arg His Leu Trp Gly Ser His Gly Asn Ser Thr
305 310 315 320
Phe Pro Glu Phe Leu His Asn Met Asp Tyr Phe Lys Phe His Asn Met
325 330 335
Arg Pro Pro Phe Thr Tyr Ala Thr Leu Ile Arg Trp Ala Ile Leu Glu
340 345 350
Ala Pro Glu Lys Gln Arg Thr Leu Asn Glu Ile Tyr His Trp Phe Thr
355 360 365
Arg Met Phe Ala Phe Phe Arg Asn His Pro Ala Thr Trp Lys Asn Ala
370 375 380
Ile Arg His Asn Leu Ser Leu His Lys Cys Phe Val Arg Val Glu Ser
385 390 395 400
Glu Lys Gly Ala Val Trp Thr Val Asp Glu Leu Glu Phe Arg Lys Lys
405 410 415
Arg Ser Gln Arg Pro Ser Arg Cys Ser Asn Pro Thr Pro Gly Pro
420 425 430
<210> 141
<211> 8028
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成
多核苷酸”
<400> 141
acgcgtgtag tcttatgcaa tactcttgta gtcttgcaac atggtaacga tgagttagca 60
acatgcctta caaggagaga aaaagcaccg tgcatgccga ttggtggaag taaggtggta 120
cgatcgtgcc ttattaggaa ggcaacagac gggtctgaca tggattggac gaaccactga 180
attgccgcat tgcagagata ttgtatttaa gtgcctagct cgatacataa acgggtctct 240
ctggttagac cagatctgag cctgggagct ctctggctaa ctagggaacc cactgcttaa 300
gcctcaataa agcttgcctt gagtgcttca agtagtgtgt gcccgtctgt tgtgtgactc 360
tggtaactag agatccctca gaccctttta gtcagtgtgg aaaatctcta gcagtggcgc 420
ccgaacaggg acttgaaagc gaaagggaaa ccagaggagc tctctcgacg caggactcgg 480
cttgctgaag cgcgcacggc aagaggcgag gggcggcgac tggtgagtac gccaaaaatt 540
ttgactagcg gaggctagaa ggagagagat gggtgcgaga gcgtcagtat taagcggggg 600
agaattagat cgcgatggga aaaaattcgg ttaaggccag ggggaaagaa aaaatataaa 660
ttaaaacata tagtatgggc aagcagggag ctagaacgat tcgcagttaa tcctggcctg 720
ttagaaacat cagaaggctg tagacaaata ctgggacagc tacaaccatc ccttcagaca 780
ggatcagaag aacttagatc attatataat acagtagcaa ccctctattg tgtgcatcaa 840
aggatagaga taaaagacac caaggaagct ttagacaaga tagaggaaga gcaaaacaaa 900
agtaagacca ccgcacagca agcggccact gatcttcaga cctggaggag gagatatgag 960
ggacaattgg agaagtgaat tatataaata taaagtagta aaaattgaac cattaggagt 1020
agcacccacc aaggcaaaga gaagagtggt gcagagagaa aaaagagcag tgggaatagg 1080
agctttgttc cttgggttct tgggagcagc aggaagcact atgggcgcag cgtcaatgac 1140
gctgacggta caggccagac aattattgtc tggtatagtg cagcagcaga acaatttgct 1200
gagggctatt gaggcgcaac agcatctgtt gcaactcaca gtctggggca tcaagcagct 1260
ccaggcaaga atcctggctg tggaaagata cctaaaggat caacagctcc tggggatttg 1320
gggttgctct ggaaaactca tttgcaccac tgctgtgcct tggaatgcta gttggagtaa 1380
taaatctctg gaacagattt ggaatcacac gacctggatg gagtgggaca gagaaattaa 1440
caattacaca agcttaatac actccttaat tgaagaatcg caaaaccagc aagaaaagaa 1500
tgaacaagaa ttattggaat tagataaatg ggcaagtttg tggaattggt ttaacataac 1560
aaattggctg tggtatataa aattattcat aatgatagta ggaggcttgg taggtttaag 1620
aatagttttt gctgtacttt ctatagtgaa tagagttagg cagggatatt caccattatc 1680
gtttcagacc cacctcccaa ccccgagggg acccgacagg cccgaaggaa tagaagaaga 1740
aggtggagag agagacagag acagatccat tcgattagtg aacggatctc gacggtatcg 1800
atggccgccc ccttcaccga gggcctattt cccatgattc cttcatattt gcatatacga 1860
tacaaggctg ttagagagat aattggaatt aatttgactg taaacacaaa gatattagta 1920
caaaatacgt gacgtagaaa gtaataattt cttgggtagt ttgcagtttt aaaattatgt 1980
tttaaaatgg actatcatat gcttaccgta acttgaaagt atttcgattt cttggcttta 2040
tatatcttgt ggaaaggacg aaacaccgga gtcttctttt ttgaagacac ttcggactgt 2100
agaactctga acctcgagca atttaaaaga aaagggggga ttggggggta cagtgcaggg 2160
gaaagaatag tagacataat agcaacagac atacaaacta aagaattaca aaaacaaatt 2220
acaaaaattc aaaatttctg cgttgttgtc ggtgctcgtt ctctgctctt cacgctactg 2280
aattcatcac cggttcttcg aaggcctccg cgccgggttt tggcgcctcc cgcgggcgcc 2340
cccctcctca cggcgagcgc tgccacgtca gacgaagggc gcagcgagcg tcctgatcct 2400
tccgcccgga cgctcaggac agcggcccgc tgctcataag actcggcctt agaaccccag 2460
tatcagcaga aggacatttt aggacgggac ttgggtgact ctagggcact ggttttcttt 2520
ccagagagcg gaacaggcga ggaaaagtag tcccttctcg gcgattctgc ggagggatct 2580
ccgtggggcg gtgaacgccg atgattatat aaggacgcgc cgggtgtggc acagctagtt 2640
ccgtcgcagc cgggatttgg gtcgcggttc ttgtttgtgg atcgctgtga tcgtcacttg 2700
gtctagacgc caccatgagc gggggcgagg agctgttcgc cggcatcgtg cccgtgctga 2760
tcgagctgga cggcgacgtg cacggccaca agttcagcgt gcgcggcgag ggcgagggcg 2820
acgccgacta cggcaagctg gagatcaagt tcatctgcac caccggcaag ctgcccgtgc 2880
cctggcccac cctggtgacc accctctgct acggcatcca gtgcttcgcc cgctaccccg 2940
agcacatgaa gatgaacgac ttcttcaaga gcgccatgcc cgagggctac atccaggagc 3000
gcaccatcca gttccaggac gacggcaagt acaagacccg cggcgaggtg aagttcgagg 3060
gcgacaccct ggtgaaccgc atcgagctga agggcaagga cttcaaggag gacggcaaca 3120
tcctgggcca caagctggag tacagcttca acagccacaa cgtgtacatc cgccccgaca 3180
aggccaacaa cggcctggag gctaacttca agacccgcca caacatcgag ggcggcggcg 3240
tgcagctggc cgaccactac cagaccaacg tgcccctggg cgacggcccc gtgctgatcc 3300
ccatcaacca ctacctgagc actcagacca agatcagcaa ggaccgcaac gaggcccgcg 3360
accacatggt gctcctggag tccttcagcg cctgctgcca cacccacggc atggacgagc 3420
tgtacagggg atccgagggc agaggaagcc ttctaacatg cggtgacgtg gaggagaatc 3480
ccggcccttc cgggatgacc gagtacaagc ccacggtgcg cctcgccacc cgcgacgacg 3540
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ccgtcgatcc ggaccgccac atcgagcggg tcaccgagct gcaagaactc ttcctcacgc 3660
gcgtcgggct cgacatcggc aaggtgtggg tcgcggacga cggcgccgcg gtggcggtct 3720
ggaccacgcc ggagagcgtc gaagcggggg cggtgttcgc cgagatcggc ccgcgcatgg 3780
ccgagttgag cggttcccgg ctggccgcgc agcaacagat ggaaggcctc ctggcgccgc 3840
accggcccaa ggagcccgcg tggttcctgg ccaccgtcgg cgtctcgccc gaccaccagg 3900
gcaagggtct gggcagcgcc gtcgtgctcc ccggagtgga ggcggccgag cgcgccgggg 3960
tgcccgcctt cctggagacc tccgcgcccc gcaacctccc cttctacgag cggctcggct 4020
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agcccggtgc ctgaatctag gtcgacaatc aacctctgga ttacaaaatt tgtgaaagat 4140
tgactggtat tcttaactat gttgctcctt ttacgctatg tggatacgct gctttaatgc 4200
ctttgtatca tgctattgct tcccgtatgg ctttcatttt ctcctccttg tataaatcct 4260
ggttgctgtc tctttatgag gagttgtggc ccgttgtcag gcaacgtggc gtggtgtgca 4320
ctgtgtttgc tgacgcaacc cccactggtt ggggcattgc caccacctgt cagctccttt 4380
ccgggacttt cgctttcccc ctccctattg ccacggcgga actcatcgcc gcctgccttg 4440
cccgctgctg gacaggggct cggctgttgg gcactgacaa ttccgtggtg ttgtcgggga 4500
aatcatcgtc ctttccttgg ctgctcgcct gtgttgccac ctggattctg cgcgggacgt 4560
ccttctgcta cgtcccttcg gccctcaatc cagcggacct tccttcccgc ggcctgctgc 4620
cggctctgcg gcctcttccg cgtctccgcc ttcgccctca gacgagtcgg atctctcttt 4680
gggccgcctc cccgcctggt acctttaaga ccaatgactt acaaggcagc tgtagatctt 4740
agccactttt taaaagaaaa ggggggactg gaagggctaa ttcactccca acgaagataa 4800
gatctgcttt ttgcttgtac tgggtctctc tggttagacc agatctgagc ctgggagctc 4860
tctggctaac tagggaaccc actgcttaag cctcaataaa gcttgccttg agtgcttcaa 4920
gtagtgtgtg cccgtctgtt gtgtgactct ggtaactaga gatccctcag acccttttag 4980
tcagtgtgga aaatctctag cagtagtagt tcatgtcatc ttattattca gtatttataa 5040
cttgcaaaga aatgaatatc agagagtgag aggaacttgt ttattgcagc ttataatggt 5100
tacaaataaa gcaatagcat cacaaatttc acaaataaag catttttttc actgcattct 5160
agttgtggtt tgtccaaact catcaatgta tcttatcatg tctggctcta gctatcccgc 5220
ccctaactcc gcccatcccg cccctaactc cgcccagttc cgcccattct ccgccccatg 5280
gctgactaat tttttttatt tatgcagagg ccgaggccgc ctcggcctct gagctattcc 5340
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atgtcatagc tgtttcctgt gtgaaattgt tatccgctca caattccaca caacatacga 5460
gccggaagca taaagtgtaa agcctggggt gcctaatgag tgagctaact cacattaatt 5520
gcgttgcgct cactgcccgc tttccagtcg ggaaacctgt cgtgccagct gcattaatga 5580
atcggccaac gcgcggggag aggcggtttg cgtattgggc gctcttccgc ttcctcgctc 5640
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gtaatacggt tatccacaga atcaggggat aacgcaggaa agaacatgtg agcaaaaggc 5760
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ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga 5880
ctataaagat accaggcgtt tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc 5940
ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat 6000
agctcacgct gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg 6060
cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc 6120
aacccggtaa gacacgactt atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga 6180
gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact 6240
agaagaacag tatttggtat ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt 6300
ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag 6360
cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg 6420
tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt taagggattt tggtcatgag attatcaaaa 6480
aggatcttca cctagatcct tttaaattaa aaatgaagtt ttaaatcaat ctaaagtata 6540
tatgagtaaa cttggtctga cagttaccaa tgcttaatca gtgaggcacc tatctcagcg 6600
atctgtctat ttcgttcatc catagttgcc tgactccccg tcgtgtagat aactacgata 6660
cgggagggct taccatctgg ccccagtgct gcaatgatac cgcgagaccc acgctcaccg 6720
gctccagatt tatcagcaat aaaccagcca gccggaaggg ccgagcgcag aagtggtcct 6780
gcaactttat ccgcctccat ccagtctatt aattgttgcc gggaagctag agtaagtagt 6840
tcgccagtta atagtttgcg caacgttgtt gccattgcta caggcatcgt ggtgtcacgc 6900
tcgtcgtttg gtatggcttc attcagctcc ggttcccaac gatcaaggcg agttacatga 6960
tcccccatgt tgtgcaaaaa agcggttagc tccttcggtc ctccgatcgt tgtcagaagt 7020
aagttggccg cagtgttatc actcatggtt atggcagcac tgcataattc tcttactgtc 7080
atgccatccg taagatgctt ttctgtgact ggtgagtact caaccaagtc attctgagaa 7140
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catagcagaa ctttaaaagt gctcatcatt ggaaaacgtt cttcggggcg aaaactctca 7260
aggatcttac cgctgttgag atccagttcg atgtaaccca ctcgtgcacc caactgatct 7320
tcagcatctt ttactttcac cagcgtttct gggtgagcaa aaacaggaag gcaaaatgcc 7380
gcaaaaaagg gaataagggc gacacggaaa tgttgaatac tcatactctt cctttttcaa 7440
tattattgaa gcatttatca gggttattgt ctcatgagcg gatacatatt tgaatgtatt 7500
tagaaaaata aacaaatagg ggttccgcgc acatttcccc gaaaagtgcc acctgacgtc 7560
taagaaacca ttattatcat gacattaacc tataaaaata ggcgtatcac gaggcccttt 7620
cgtctcgcgc gtttcggtga tgacggtgaa aacctctgac acatgcagct cccggagacg 7680
gtcacagctt gtctgtaagc ggatgccggg agcagacaag cccgtcaggg cgcgtcagcg 7740
ggtgttggcg ggtgtcgggg ctggcttaac tatgcggcat cagagcagat tgtactgaga 7800
gtgcaccata tgcggtgtga aataccgcac agatgcgtaa ggagaaaata ccgcatcagg 7860
cgccattcgc cattcaggct gcgcaactgt tgggaagggc gatcggtgcg ggcctcttcg 7920
ctattacgcc agctggcgaa agggggatgt gctgcaaggc gattaagttg ggtaacgcca 7980
gggttttccc agtcacgacg ttgtaaaacg acggccagtg ccaagctg 8028
<210> 142
<211> 7127
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成
多核苷酸”
<400> 142
gcgatcgcag taatcaatta cggggtcatt agttcatagc ccatatatgg agttccgcgt 60
tacataactt acggtaaatg gcccgcctgg ctgaccgccc aacgaccccc gcccattgac 120
gtcaataatg acgtatgttc ccatagtaac gccaataggg actttccatt gacgtcaatg 180
ggtggagtat ttacggtaaa ctgcccactt ggcagtacat caagtgtatc atatgccaag 240
tacgccccct attgacgtca atgacggtaa atggcccgcc tggcattatg cccagtacat 300
gaccttatgg gactttccta cttggcagta catctacgta ttagtcatcg ctattaccat 360
ggtgatgcgg ttttggcagt acatcaatgg gcgtggatag cggtttgact cacggggatt 420
tccaagtctc caccccattg acgtcaatgg gagtttgttt tggcaccaaa atcaacggga 480
ctttccaaaa tgtcgtaaca actccgcccc attgacgcaa atgggcggta ggcgtgtacg 540
gtgggaggtc tatataagca gagctcgttt agtgaaccgg ggtctctctg gttagaccag 600
atctgagcct gggagctctc tggctaacta gggaacccac tgcttaagcc tcaataaagc 660
ttgccttgag tgcttcaagt agtgtgtgcc cgtctgttgt gtgactctgg taactagaga 720
tccctcagac ccttttagtc agtgtggaaa atctctagca gtggcgcccg aacagggacc 780
tgaaagcgaa agggaaacca gagctctctc gacgcaggac tcggcttgct gaagcgcgca 840
cggcaagagg cgaggggcgg cgactggtga gtacgccaaa aattttgact agcggaggct 900
agaaggagag agatgggtgc gagagcgtca gtattaagcg ggggagaatt agatcgcgat 960
gggaaaaaat tcggttaagg ccagggggaa agaaaaaata taaattaaaa catatagtat 1020
gggcaagcag ggagctagaa cgattcgcag ttaatcctgg cctgttagaa acatcagaag 1080
gctgtagaca aatactggga cagctacaac catcccttca gacaggatca gaagaactta 1140
gatcattata taatacagta gcaaccctct attgtgtgca tcaaaggata gagataaaag 1200
acaccaagga agctttagac aagatagagg aagagcaaaa caaaagtaag accaccgcac 1260
agcaagcggc cgctgatctt cagacctgga ggaggagata tgagggacaa ttggagaagt 1320
gaattatata aatataaagt agtaaaaatt gaaccattag gagtagcacc caccaaggca 1380
aagagaagag tggtgcagag agaaaaaaga gcagtgggaa taggagcttt gttccttggg 1440
ttcttgggag cagcaggaag cactatgggc gcagcctcaa tgacgctgac ggtacaggcc 1500
agacaattat tgtctggtat agtgcagcag cagaacaatt tgctgagggc tattgaggcg 1560
caacagcatc tgttgcaact cacagtctgg ggcatcaagc agctccaggc aagaatcctg 1620
gctgtggaaa gatacctaaa ggatcaacag ctcctgggga tttggggttg ctctggaaaa 1680
ctcatttgca ccactgctgt gccttggaat gctagttgga gtaataaatc tctggaacag 1740
atttggaatc acacgacctg gatggagtgg gacagagaaa ttaacaatta cacaagctta 1800
atacactcct taattgaaga atcgcaaaac cagcaagaaa agaatgaaca agaattattg 1860
gaattagata aatgggcaag tttgtggaat tggtttaaca taacaaattg gctgtggtat 1920
ataaaattat tcataatgat agtaggaggc ttggtaggtt taagaatagt ttttgctgta 1980
ctttctatag tgaatagagt taggcaggga tattcaccat tatcgtttca gacccacctc 2040
ccaaccccga ggggacccga caggcccgaa ggaatagaag aagaaggtgg agagagagac 2100
agagacagat ccattcgatt agtgaacgga tctcgacggt atcggttaac ttttaaaaga 2160
aaagggggga ttggggggta cagtgcaggg gaaagaatag tagacataat agcaacagac 2220
atacaaacta aagaattaca aaaacaaatt acaaaaattc aaaattttgg ctcccgatcg 2280
ttgcgttaca cacacaatta ctgctgatcg agtgtagcct tcgaatgaaa gaccccacct 2340
gtaggtttgg caagatagct gcagtaacgc cattttgcaa ggcatggaaa aataccaaac 2400
caagaataga gaagttcaga tcaagggcgg gtacatgaaa atagctaacg ttgggccaaa 2460
caggatatct gcggtgagca gtttcggccc cggcccgggg ccaagaacag atggtcaccg 2520
cagtttcggc cccggcccga ggccaagaac agatggtccc cagatatggc ccaaccctca 2580
gcagtttctt aagacccatc agatgtttcc aggctccccc aaggacctga aatgaccctg 2640
cgccttattt gaattaacca atcagcctgc ttctcgcttc tgttcgcgcg cttctgcttc 2700
ccgagctcta taaaagagct cacaacccct cactcggcgc gccagtcctc cgattgactg 2760
agtcgccctg atcattgtcg atcctaccat ccactcgaca cacccgccag ggccctgcca 2820
agcttccgag ctctcgatat caaaggaggt acccaacatg gtcagcaagg gcgaggaact 2880
gttcaccggg gtggtgccca tcctggtcga gctggacggc gacgtaaacg gccacaagtt 2940
cagcgtgtcc ggcgagggcg agggcgatgc cacctacggc aagctgaccc tgaagttcat 3000
ctgtaccacc ggcaagctgc ccgtgccctg gcccaccctc gtgaccaccc tgacctacgg 3060
cgtgcaatgc ttcagccgct accccgacca catgaagcag cacgacttct tcaagtccgc 3120
catgcccgaa ggctacgtcc aggagcgcac catcttcttc aaggacgacg gcaactacaa 3180
gacccgcgcc gaggtgaagt tcgagggcga caccctggtg aaccgcatcg agctgaaggg 3240
catcgacttc aaggaggacg gcaacatcct ggggcacaag ctggagtaca actacaacag 3300
ccacaacgtc tatatcatgg ccgacaagca gaagaacggc atcaaggtga acttcaagat 3360
ccgccacaac atcgaggacg gcagcgtgca actcgccgac cactaccagc agaacacccc 3420
catcggcgac ggccccgtgc tgctgcccga caaccactac ctgagcaccc agtccgccct 3480
gagcaaagac cccaacgaga agcgcgatca catggtcctg ctggagttcg tgaccgccgc 3540
cgggatcact ctcggcatgg acgagctgta caagtagaag ttgtctcctc ctgcactgac 3600
tgactgatac aatcgatttc tggatccgca ggcctctgct agaagttgtc tcctcctgca 3660
ctgactgact gatacaatcg atttctggat ccgcaggcct ctgctagctt gactgactga 3720
gtcgacaatc aacctctgga ttacaaaatt tgtgaaagat tgactggtat tcttaactat 3780
gttgctcctt ttacgctatg tggatacgct gctttaatgc ctttgtatca tgctattgct 3840
tcccgtatgg ctttcatttt ctcctccttg tataaatcct ggttgctgtc tctttatgag 3900
gagttgtggc ccgttgtcag gcaacgtggc gtggtgtgca ctgtgtttgc tgacgcaacc 3960
cccactggtt ggggcattgc caccacctgt cagctccttt ccgggacttt cgctttcccc 4020
ctccctattg ccacggcgga actcatcgcc gcctgccttg cccgctgctg gacaggggct 4080
cggctgttgg gcactgacaa ttccgtggtg ttgtcgggga agctgacgtc ctttccatgg 4140
ctgctcgcct gtgttgccac ctggattctg cgcgggacgt ccttctgcta cgtcccttcg 4200
gccctcaatc cagcggacct tccttcccgc ggcctgctgc cggctctgcg gcctcttccg 4260
cgtcttcgcc ttcgccctca gacgagtcgg atctcccttt gggccgcctc cccgcctgga 4320
attcgagctc ggtaccttta agaccaatga cttacaaggc agctgtagat cttagccact 4380
ttttaaaaga aaagggggga ctggaagggc taattcactc ccaacgaaga caagatctgc 4440
tttttgcttg tactgggtct ctctggttag accagatctg agcctgggag ctctctggct 4500
aactagggaa cccactgctt aagcctcaat aaagcttgcc ttgagtgctt caagtagtgt 4560
gtgcccgtct gttgtgtgac tctggtaact agagatccct cagacccttt tagtcagtgt 4620
ggaaaatctc tagcagtcct ggccaacgtg agcaccgtgc tgacctccaa atatcgttaa 4680
gctggagcct gggagccggc ctggccctcc gcccccccca cccccgcagc ccacccctgg 4740
tctttgaata aagtctgagt gagtggccga cagtgcccgt ggagttctcg tgacctgagg 4800
tgcagggccg gcgctaggga cacgtccgtg cacgtgccga ggccccctgt gcagctgcaa 4860
gggacaggcc tagccctgca ggcctaactc cgcccatccc gcccctaact ccgcccagtt 4920
ccgcccattc tccgcctcat ggctgactaa ttttttttat ttatgcagag gccgaggccg 4980
cctcggcctc tgagctattc cagaagtagt gaggacgctt ttttggaggc cgaggctttt 5040
gcaaagatcg aacaagagac aggacctgca ggttaattaa atttaaatca tgtgagcaaa 5100
aggccagcaa aaggccagga accgtaaaaa ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct 5160
ccgcccccct gacgagcatc acaaaaatcg acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac 5220
aggactataa agataccagg cgtttccccc tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc 5280
gaccctgccg cttaccggat acctgtccgc ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc 5340
tcatagctca cgctgtaggt atctcagttc ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg 5400
tgtgcacgaa ccccccgttc agcccgaccg ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga 5460
gtccaacccg gtaagacacg acttatcgcc actggcagca gccactggta acaggattag 5520
cagagcgagg tatgtaggcg gtgctacaga gttcttgaag tggtggccta actacggcta 5580
cactagaaga acagtatttg gtatctgcgc tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag 5640
agttggtagc tcttgatccg gcaaacaaac caccgctggt agcggtggtt tttttgtttg 5700
caagcagcag attacgcgca gaaaaaaagg atctcaagaa gatcctttga tcttttctac 5760
ggggtctgac gctcagtgga acgaaaactc acgttaaggg attttggtca tgagattatc 5820
aaaaaggatc ttcacctaga tccttttaaa ttaaaaatga agttttaaat caatctaaag 5880
tatatatgag taaacttggt ctgacagtta ccaatgctta atcagtgagg cacctatctc 5940
agcgatctgt ctatttcgtt catccatagt tgcatttaaa tggccggcct ggcgcgccgt 6000
ttaaacctag atattgatag tctgatcggt caacgtataa tcgagtccta gcttttgcaa 6060
acatctatca agagacagga tcagcaggag gctttcgcat gagtattcaa catttccgtg 6120
tcgcccttat tccctttttt gcggcatttt gccttcctgt ttttgctcac ccagaaacgc 6180
tggtgaaagt aaaagatgct gaagatcagt tgggtgcgcg agtgggttac atcgaactgg 6240
atctcaacag cggtaagatc cttgagagtt ttcgccccga agaacgcttt ccaatgatga 6300
gcacttttaa agttctgcta tgtggcgcgg tattatcccg tattgacgcc gggcaagagc 6360
aactcggtcg ccgcatacac tattctcaga atgacttggt tgagtattca ccagtcacag 6420
aaaagcatct tacggatggc atgacagtaa gagaattatg cagtgctgcc ataaccatga 6480
gtgataacac tgcggccaac ttacttctga caacgattgg aggaccgaag gagctaaccg 6540
cttttttgca caacatgggg gatcatgtaa ctcgccttga tcgttgggaa ccggagctga 6600
atgaagccat accaaacgac gagcgtgaca ccacgatgcc tgtagcaatg gcaacaacct 6660
tgcgtaaact attaactggc gaactactta ctctagcttc ccggcaacag ttgatagact 6720
ggatggaggc ggataaagtt gcaggaccac ttctgcgctc ggcccttccg gctggctggt 6780
ttattgctga taaatctgga gccggtgagc gtgggtctcg cggtatcatt gcagcactgg 6840
ggccagatgg taagccctcc cgtatcgtag ttatctacac gacggggagt caggcaacta 6900
tggatgaacg aaatagacag atcgctgaga taggtgcctc actgattaag cattggtaac 6960
cgattctagg tgcattggcg cagaaaaaaa tgcctgatgc gacgctgcgc gtcttatact 7020
cccacatatg ccagattcag caacggatac ggcttcccca acttgcccac ttccatacgt 7080
gtcctcctta ccagaaattt atccttaaga tcccgaatcg tttaaac 7127
<210> 143
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成
肽”
<400> 143
Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val
1 5
<210> 144
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成
肽”
<400> 144
Pro Lys Lys Lys Arg Arg Val
1 5
<210> 145
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成
肽”
<400> 145
Lys Arg Pro Ala Ala Thr Lys Lys Ala Gly Gln Ala Lys Lys Lys Lys
1 5 10 15
<210> 146
<211> 100
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成
多核苷酸”
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“对于替代和优选实施方案的详细描述，参见提交的说明书”
<400> 146
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 100
<210> 147
<211> 100
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成
多核苷酸”
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(100)
<223> /注释= “这个序列可包含20、30、40、50、60、70、80、
90或100个核苷酸”
<400> 147
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 100
<210> 148
<211> 300
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成
多核苷酸”
<220>
<221> 来源
<223> /注释= “对于替代和优选实施方案的详细描述，参见提交的说明书”
<400> 148
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 120
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 180
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 240
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 300
<210> 149
<211> 100
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成
多核苷酸”
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(100)
<223> /注释= “这个序列可包含95-100个核苷酸”
<400> 149
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 100

Claims (57)

1.一种工程化T细胞，其包含：
i)在启动子序列的控制下的编码调节性T细胞促进分子的异源核酸；
ii)编码干扰素-γ(IFNG)的内源核酸序列的修饰，其中所述修饰敲低所述IFNG的表达；和
iii)编码肿瘤坏死因子α(TNFA)的内源核酸序列的修饰，其中所述修饰敲低TNFA的表达。
2.如权利要求1所述的工程化T细胞，其中所述调节性T细胞促进分子选自白细胞介素-10(IL10)、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA4)、转化生长因子β1(TGFB1)、吲哚胺2,3-双加氧酶1(IDO1)、外切核苷三磷酸二磷酸水解酶1(ENTPD1)、外切5’-核苷酸酶(NT5E)、白细胞介素-22(IL-22)、双调蛋白(AREG)、白细胞介素-35(IL35)、GARP、CD274分子(CD274)、叉头盒P3(FOXP3)、IKAROS家族锌指2(IKZF2)、家族性嗜酸性粒细胞增多症(EOS)、干扰素调节因子4(IRF4)、淋巴增强因子结合因子1(LEF1)以及BTB结构域和CNC同源物2(BACH2)。
3.如权利要求1或2所述的工程化T细胞，其中所述调节性T细胞促进分子是IL10。
4.如权利要求1至2所述的工程化T细胞，其中所述调节性T细胞促进分子是CTLA4。
5.如权利要求1至4中任一项所述的工程化T细胞，其中所述调节性T细胞促进分子是第一调节性T细胞促进分子，并且所述工程化T细胞还包含在启动子序列的控制下的编码第二调节性T细胞促进分子的异源核酸。
6.如权利要求5所述的工程化T细胞，其中所述第一调节性T细胞促进分子和第二调节性T细胞促进分子是IL10和CTLA4。
7.如权利要求1至6中任一项所述的工程化T细胞，其还包含编码白细胞介素17A(IL17A)、白细胞介素-2(IL2)、白细胞介素6(IL6)、穿孔素1(PRF1)、颗粒酶A(GZMA)或颗粒酶B(GZMB)的内源核酸序列的修饰，其中所述修饰分别敲低所述IL17A、所述IL2、所述IL6、所述PRF1、所述GZMA或所述GZMB的表达。
8.如权利要求1至7中任一项所述的工程化T细胞，其还包含编码内源T细胞受体(TCR)的内源核酸序列的修饰，其中所述修饰敲低所述内源TCR的表达。
9.如权利要求1至8中任一项所述的工程化T细胞，其还包含在启动子序列的控制下的靶向受体的异源编码序列。
10.如权利要求9所述的工程化T细胞，其中所述靶向受体靶向选自以下的配体：粘膜血管地址素细胞粘附分子1(MADCAM1)、肿瘤坏死因子α(TNFA)、CEA细胞粘附分子6(CEACAM6)、血管细胞粘附分子1(VCAM1)、瓜氨酸化波形蛋白、髓鞘碱性蛋白(MBP)、MOG(髓鞘少突胶质细胞糖蛋白)、蛋白脂质蛋白1(PLP1)、CD19分子(CD19)、CD20分子(CD20)、TNF受体超家族成员17(TNFRSF17)、二肽基肽酶样6(DPP6)、溶质载体家族2成员2(SCL2A2)、谷氨酸脱羧酶(GAD2)、桥粒芯糖蛋白3(DSG3)和MHC I类HLA-A(HLA-A*02)。
11.如权利要求9或10所述的工程化T细胞，其中所述靶向受体包含嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)。
12.如权利要求9至11中任一项所述的工程化T细胞，其中编码所述靶向受体的所述异源核酸被并入表达构建体中。
13.如权利要求9至12中任一项所述的工程化T细胞，其中编码所述靶向受体的所述异源核酸在不包含编码调节性T细胞促进分子的核酸的表达构建体中。
14.如权利要求5至13中任一项所述的工程化T细胞，其中编码所述第一调节性T细胞促进分子的所述异源核酸被并入表达构建体中，并且编码所述第二调节性T细胞促进分子的所述异源核酸被并入表达构建体中。
15.如权利要求5至14中任一项所述的工程化T细胞，其中编码所述第一调节性T细胞促进分子的所述异源核酸和编码所述第二调节性T细胞促进分子的所述异源核酸被并入分开的表达构建体中。
16.如权利要求13或14所述的工程化T细胞，其中编码所述第一调节性T细胞促进分子的所述异源核酸和编码所述第二调节性T细胞促进分子的所述异源核酸被并入单个表达构建体中。
17.如权利要求12或14至16所述的工程化T细胞，其中所述表达构建体还包含编码靶向受体的核酸。
18.如权利要求12至17中任一项所述的工程化T细胞，其中至少一个异源编码序列在游离表达构建体中。
19.如权利要求1至17中任一项所述的工程化T细胞，其中至少一个异源编码序列被插入基因组中。
20.如权利要求19所述的工程化T细胞，其中所述基因组中的所述插入是非靶向插入。
21.如权利要求19所述的工程化T细胞，其中所述插入是靶向插入。
22.如权利要求21所述的工程化T细胞，其中所述靶向插入是在选自TCR基因座、TNF基因座、IFNG基因座、IL17A基因座、IL6基因座、IL2基因座、腺相关病毒整合位点1(AAVS1)基因座的位点中。
23.如权利要求22所述的工程化T细胞，其中所述TCR基因座是T细胞受体α恒定(TRAC)基因座。
24.如权利要求1至23中任一项所述的工程化T细胞，其中敲低基因表达的所述修饰包括插入、缺失或取代中的一种或多种。
25.一种细胞群体，其包含权利要求1至24中任一项所述的工程化T细胞。
26.如权利要求1至24中任一项所述的工程化T细胞群体，其中所述群体的至少30％、优选至少40％的细胞包含在启动子序列的控制下的编码调节性T细胞促进分子的异源核酸序列；
所述群体的至少50％，优选至少70％的细胞包含编码IFNG的内源核酸序列的修饰；和
所述群体的至少50％，优选至少70％的细胞包含编码TNFA的内源核酸序列的修饰。
27.如权利要求26所述的工程化T细胞群体，其中包含插入或修饰的细胞的百分比由通过下一代测序(NGS)测得的读段百分比确定。
28.如权利要求26或27所述的工程化T细胞群体，其中所述调节性T细胞促进分子选自白细胞介素-10(IL10)、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA4)、转化生长因子β1(TGFB1)、吲哚胺2,3-双加氧酶1(IDO1)、外切核苷三磷酸二磷酸水解酶1(ENTPD1)、外切5’-核苷酸酶(NT5E)、白细胞介素-22(IL22)、双调蛋白(AREG)、叉头盒P3(FOXP3)、IKAROS家族锌指2(IKZF2)、家族性嗜酸性粒细胞增多症(EOS)、干扰素调节因子4(IRF4)、淋巴增强因子结合因子1(LEF1)以及BTB结构域和CNC同源物2(BACH2)。
29.如权利要求26至28中任一项所述的工程化T细胞群体，其中所述调节性T细胞促进分子是IL10。
30.如权利要求26至29中任一项所述的工程化T细胞群体，其中所述调节性T细胞促进分子是CTLA4。
31.如权利要求26至30中任一项所述的工程化T细胞群体，其中所述调节性T细胞促进分子是第一调节性T细胞促进分子，并且所述工程化T细胞群体还包含在启动子序列的控制下的编码第二调节性T细胞促进分子的异源核酸。
32.如权利要求31所述的工程化T细胞，其中所述第一调节性T细胞促进分子和第二调节性T细胞促进分子是IL10和CTLA4。
33.如权利要求26至32中任一项所述的工程化T细胞群体，其还包含编码白细胞介素17A(IL17A)、白细胞介素6(IL6)、白细胞介素2(IL2)、穿孔素1(PRF1)、颗粒酶A(GZMA)或颗粒酶B(GZMB)的至少一种内源核酸序列的修饰，其中在至少70％的所述细胞群体中，优选至少80％的所述细胞群体中，所述细胞群体分别包含所述IL17A、所述IL6、所述IL2、所述PRF1、所述GZMA或所述GZMB中的至少一种的修饰，其中所述修饰分别敲低所述IL17A、所述IL6、所述IL2、所述PRF1、所述GZMA或所述GZMB中的至少一种的表达。
34.如权利要求26至33中任一项所述的工程化T细胞群体，其中至少50％，优选至少70％的所述细胞包含TCR的敲低。
35.如权利要求26至34中任一项所述的工程化T细胞群体，其中至少30％、优选至少40％的所述细胞包含靶向受体的核酸编码序列的插入。
36.如权利要求35所述的工程化T细胞群体，其中所述靶向受体特异性结合选自以下的配体：粘膜血管地址素细胞粘附分子1(MADCAM1)、肿瘤坏死因子α(TNFA)、CEA细胞粘附分子6(CEACAM6)、血管细胞粘附分子1(VCAM1)、瓜氨酸化波形蛋白、髓鞘碱性蛋白(MBP)、MOG(髓鞘少突胶质细胞糖蛋白)、蛋白脂质蛋白1(PLP1)、CD19分子(CD19)、CD20分子(CD20)、TNF受体超家族成员17(TNFRSF17)、二肽基肽酶样6(DPP6)、溶质载体家族2成员2(SCL2A2)、谷氨酸脱羧酶(GAD2)、桥粒芯糖蛋白3(DSG3)和MHC I类HLA-A(HLA-A*02)。
37.如权利要求35或36所述的工程化T细胞群体，其中所述靶向受体包含嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)。
38.如权利要求35至37中任一项所述的工程化T细胞群体，其中编码所述靶向受体的所述异源核酸被并入表达构建体中。
39.如权利要求38所述的工程化T细胞群体，其中编码所述靶向受体的所述异源核酸在不包含编码调节性T细胞促进分子的核酸的表达构建体中。
40.如权利要求26至39中任一项所述的工程化T细胞群体，其中编码所述至少一种调节性T细胞促进分子中的第一种的所述异源核酸被并入表达构建体中，并且编码所述至少一种调节性T细胞促进分子中的第二种的所述异源核酸被并入表达构建体中。
41.如权利要求40所述的工程化T细胞群体，其中编码所述第一调节性T细胞促进分子的所述异源核酸和编码所述第二调节性T细胞促进分子的所述异源核酸被并入分开的表达构建体中。
42.如权利要求40所述的工程化T细胞群体，其中编码所述第一调节性T细胞促进分子的所述异源核酸和编码所述第二调节性T细胞促进分子的所述异源核酸被并入单个表达构建体中。
43.如权利要求38或40至42所述的工程化T细胞群体，其中表达构建体还包含编码靶向受体的核酸。
44.如权利要求26至43中任一项所述的工程化T细胞群体，其中至少一个异源编码序列在游离表达构建体中。
45.如权利要求26至44中任一项所述的工程化T细胞群体，其中至少一个异源编码序列被插入基因组中。
46.如权利要求45所述的工程化T细胞群体，其中所述基因组中的所述插入是非靶向插入。
47.如权利要求45所述的工程化T细胞群体，其中所述插入是靶向插入。
48.如权利要求47所述的工程化T细胞群体，其中所述靶向插入是在选自TCR基因座、TNF基因座、IL2基因座、IL6基因座、IL17A基因座、IFNG基因座、腺相关病毒整合位点1(AAVS1)基因座的位点中。
49.如权利要求48所述的工程化T细胞群体，其中所述TCR基因座是T细胞受体α恒定(TRAC)基因座。
50.如权利要求26至49所述的工程化T细胞群体，其中敲低基因表达的所述修饰包括插入、缺失或取代中的一种或多种。
51.一种药物组合物，其包含权利要求1至24所述的工程化T细胞中的任一种或权利要求25至50所述的工程化T细胞群体。
52.一种向受试者施用权利要求1至24中任一项所述的细胞或权利要求25至50中任一项所述的细胞群体或权利要求51所述的药物组合物的方法或用途。
53.如权利要求52所述的方法或用途，其中所述受试者需要免疫抑制。
54.如权利要求52或53所述的方法或用途，其用于治疗免疫病症。
55.如权利要求52至54中任一项所述的使用方法，其用于治疗自身免疫疾病。
56.如权利要求55所述的方法或用途，其中所述自身免疫疾病选自溃疡性结肠炎、克罗恩病、类风湿性关节炎、银屑病、多发性硬化、系统性红斑狼疮和1型糖尿病。
57.如权利要求52至54中任一项所述的方法或用途，其用于治疗移植物抗宿主疾病(GvHD)。
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