BR112014029441B1 - Método de modificação de um dna alvo, composição, rna tendo como alvo dna, um ou mais ácidos nucleicos, kit, método para modular a transcrição específica do sítio em um dna alvo e método para modificar um polipeptídeo associado com um dna alvo - Google Patents

Método de modificação de um dna alvo, composição, rna tendo como alvo dna, um ou mais ácidos nucleicos, kit, método para modular a transcrição específica do sítio em um dna alvo e método para modificar um polipeptídeo associado com um dna alvo Download PDF

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Emmanuelle Charpentier
Jennifer A. Doudna
Martin Jinek
Krzysztof Chylinski
James Harrison Doudna Cate
Wendell Lim
Lei Qi
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Emmanuelle Charpentier
The Regents Of The University Of California
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Abstract

MÉTODO DE MODIFICAÇÃO DE UM DNA ALVO; COMPOSIÇÃO; RNAS TENDO COMO ALVOS DNAS; UM OU MAIS ÁCIDOS NUCLEICOS; KITS; CÉLULA EUCARIOTA GENETICAMENTE MODIFICADA; POLINUCLEOTÍDEO DE DNA; COMPOSIÇÃO COMPREENDENDO UM RNA; CÉLULA HOSPEDEIRA GENETICAMENTE MODIFICADA IN VITRO; VETOR DE EXPRESSÃO RECOMBINANTE; POLIPEPTÍDEO DE MODIFICAÇÃO DIRIGIDO A SÍTIO VARIANTE; MÉTODOS DE MODIFICAÇÃO ESPECÍFICA PARA SÍTIO DE UM DNA ALVO; MODULAÇÃO DE TRANSCRIÇÃO ESPECÍFICA PARA SÍTIO DENTRO DE UM DNA ALVO; MODIFICAÇÃO ESPECÍFICA PARA SÍTIO EM UM DNA ALVO; PROMOÇÃO DE CLIVAGEM ESPECÍFICA PARA SÍTIO E MODIFICAÇÃO DE UM DNA ALVO EM UMA CÉLULA; PRODUÇÃO DE UMA CÉLULA GENETICAMENTE MODIFICADA; MODULAÇÃO SELETIVA DA TRANSCRIÇÃO DE UM DNA ALVO EM UMA CÉLULA HOSPEDEIRA; ÁCIDO NUCLEICO ISOLADO; VETOR DE EXPRESSÃO RECOMBINANTE; CÉLULA HOSPEDEIRA GENETICAMENTE MODIFICADA; E BIBLIOTECA DE ÁCIDOS NUCLEICOS. A presente divulgação fornece um RNA tendo como alvo DNA que compreende uma sequência de alvo e, juntamente com o polipeptídeo de modificação, fornece modificação específica de sítio de um DNA de alvo e/ou um polipeptídeo associado como o DNA de alvo. A presente divulgação ainda fornece polipeptídeos de modificação específicos de sítio. A presente divulgação ainda fornece métodos de modificação específica de sítio de um DNA de alvo e/ou um polipeptídeo associado (...).

Description

REFERÊNCIA CRUZADA
[001] Este pedido reivindica o benefício do Pedido de Patente Provisório US N° 61/652.086, depositado em 25 de maio de 2012, 61/716.256, depositado em 19 de outubro de 2012, 61/757.640, depositado em 28 de janeiro de 2013, e 61/765.576, depositado em 15 de fevereiro de 2013, cada um de cujos pedidos é incorporado neste documento por referência em sua totalidade.
DECLARAÇÃO CONCERNENTE A PESQUISA PATROCINADA PELO GOVERNO FEDERAL
[002] Esta invenção foi feita com apoio do governo de acordo com a concessão N.° GM081879 concedida pelo National Institutes of Health. O governo tem determinados direitos na invenção.
INCORPORAÇÃO POR REFERÊNCIA DE LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS FORNECIDA COMO UM ARQUIVO DE TEXTO
[003] Uma Listagem de Sequências é fornecida junto com este documento como um arquivo de texto, “BERK- 187WO-SeqList_ST25.txt”, criado em 13 de março de 2013 e tendo um tamanho de 7645 KB. O conteúdo do arquivo de texto é incorporado por referência neste documento na íntegra.
FUNDAMENTOS
[004] Cerca de 60% de bactérias e 90% de archaea possuem sistemas CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/sistema associado a CRISPR (Cas) para conferir resistência a elementos de DNA externos. Sistema CRISPR Tipo II de Streptococcus pyogenes envolve apenas um único gene que codifica a proteína Cas9 e dois RNAs - um CRISPR RNA (crRNA) maduro e um RNA de ação trans parcialmente complementar (tracrRNA) - que são necessários e suficientes para silenciamento orientado por RNA de DNAs estrangeiros.
[005] Nos últimos anos, enzimas de nuclease engenheiradas projetadas para ter como alvo sequências de DNA específicas têm atraído considerável atenção como ferramentas poderosas para a manipulação genética de células e organismos inteiros, permitindo deleção, substituição e reparo de gene direcionados, bem como a inserção de sequências exógenas (transgenes) no genoma. Duas tecnologias importantes para engenheirar nucleases de DNA específicas de sítio emergiram, ambas as quais se baseiam na construção de enzimas endonucleases quiméricas nas quais um domínio de endonuclease de DNA não específica de sequência é fundido a um domínio de ligação de DNA engenheirado. No entanto, ter como alvo cada locus genômico novo requer o projeto de uma enzima nuclease nova, tornando estas abordagens tanto demoradas quanto dispendiosas. Além disso, ambas as tecnologias sofrem de precisão limitada, o que pode levar a efeitos imprevisíveis fora do alvo.
[006] A interrogação sistemática de genomas e a reprogramação genética de células envolvem alvejar conjuntos de genes para expressão ou repressão. Atualmente a abordagem mais comum para alvejar genes arbitrários para regulação é usar interferência de RNA (RNAi). Esta abordagem tem limitações. Por exemplo, RNAi pode exibir efeitos fora do alvo significativos e toxicidade.
[007] Há necessidade no campo de uma tecnologia que permita o direcionamento preciso de atividade de nuclease (ou outras atividades de proteína) para locais distintos dentro de um DNA alvo de uma forma que não requeira o projeto de uma nova proteína para cada nova sequência alvo. Além disso, há uma necessidade na arte de métodos de controle de expressão de gene com mínimos efeitos fora do alvo.
SUMÁRIO
[008] A presente divulgação fornece um RNA tendo como alvo DNA que compreende uma sequência de alvo e, juntamente com o polipeptídeo de modificação, fornece modificação específica de sítio de um DNA de alvo e/ou um polipeptídeo associado como o DNA de alvo. A presente divulgação ainda fornece polipeptídeos de modificação específicos de sítio. A presente divulgação ainda fornece métodos de modificação específica de sítio de um DNA de alvo e/ou um polipeptídeo associado com o DNA de alvo. A presente divulgação fornece métodos de modular transcrição de um ácido nucleico de alvo em uma célula de alvo, geralmente envolvendo contatar o ácido nucleico de alvo com um polipeptídeo Cas9 enzimaticamente inativo e um RNA tendo como alvo DNA. Kits e composições para realizar os métodos também são fornecidos. A presente divulgação fornece células modificadas geneticamente que produzem Cas9; e organismos multicelulares não humanos transgênicos Cas9.
CARACTERÍSTICAS
[009] Características da presente divulgação incluem um RNA tendo como alvo DNA compreendendo: (i) um primeiro segmento compreendendo uma sequência de nucleotídeo que é complementar a uma sequência em um DNA alvo; e (ii) um segundo segmento que interage com um polipeptídeo de modificação dirigido a sítio. Em alguns casos, o primeiro segmento compreende 8 nucleotídeos que têm 100% de complementariedade para uma sequência no DNA de alvo. Em alguns casos, o segundo segmento compreende uma sequência de nucleotídeo com pelo menos 60% de identidade sobre uma extensão de pelo menos 8 nucleotídeos contíguos para qualquer uma das sequências de nucleotídeos estabelecidas em SEQ ID NOs:431-682 (por exemplo, 431-562). Em alguns casos, o segundo segmento compreende uma sequência de nucleotídeo com pelo menos 60% de identidade sobre uma extensão de pelo menos 8 nucleotídeos contíguos para qualquer uma das sequências de nucleotídeos estabelecidas em SEQ ID NOs:563-682. Em alguns casos, o polipeptídeo de modificação dirigido a sítio compreende uma sequência de aminoácido tendo pelo menos cerca de 75% de identidade de sequência de aminoácido para os aminoácidos 7-166 ou 731-1003 da sequência de aminoácido de Cas9/Csn1 representada na Figura 3, ou para as porções correspondentes em qualquer uma das sequências de aminoácidos estabelecidas como SEQ ID NOs:1-256 e 795-1346.
[010] Características da presente divulgação incluem um polinucleotídeo de DNA que compreende uma sequência de nucleotídeo que codifica o RNA tendo como alvo DNA. Em alguns casos, um vetor de expressão recombinante compreende o polinucleotídeo de DNA. Em alguns casos, a sequência de nucleotídeo que codifica um RNA tendo como alvo DNA é operavelmente ligada a um promotor. Em alguns casos, o promotor é um promotor induzível. Em alguns casos, a sequência de nucleotídeo que codifica o RNA tendo como alvo DNA ainda compreende um sítio de clonagem múltiplo. Características da presente divulgação incluem uma célula hospedeira geneticamente modificada in vitro que compreende o polinucleotídeo de DNA.
[011] Características da presente divulgação incluem um vetor de expressão recombinante compreendendo: (i) uma sequência de nucleotídeo codificando um RNA tendo como alvo DNA, em que o RNA tendo como alvo DNA compreende: (a) um primeiro segmento compreendendo uma sequência de nucleotídeo que é complementar a uma sequência em um DNA alvo; e (b) um segundo segmento que interage com um polipeptídeo de modificação dirigido a sítio; e (ii) uma sequência de nucleotídeo codificando o polipeptídeo de modificação dirigido a sítio compreendendo: (a) uma porção de ligação a RNA que interage com o RNA tendo como alvo DNA; e (b) uma porção de atividade que exibe atividade enzimática dirigida a sítio, em que o sítio de atividade enzimática é determinado pelo RNA tendo como alvo DNA.
[012] Características da presente divulgação incluem um vetor de expressão recombinante compreendendo: (i) uma sequência de nucleotídeo codificando um RNA tendo como alvo DNA, em que o RNA tendo como alvo DNA compreende: (a) um primeiro segmento compreendendo uma sequência de nucleotídeo que é complementar a uma sequência em um DNA alvo; e (b) um segundo segmento que interage com um polipeptídeo de modificação dirigido a sítio; e (ii) uma sequência de nucleotídeo codificando o polipeptídeo de modificação dirigido a sítio, em que o polipeptídeo de modificação dirigido a sítio compreende: (a) uma porção de ligação a RNA que interage com o RNA tendo como alvo DNA; e (b) uma porção de atividade que modula transcrição dentro do DNA alvo, em que o sítio de transcrição modulada dentro do DNA alvo é determinado pelo RNA tendo como alvo DNA.
[013] Características da presente divulgação incluem um polipeptídeo de modificação dirigido a sítio variante compreendendo: (i) uma porção de ligação a RNA que interage com um RNA tendo como alvo DNA, em que o RNA tendo como alvo DNA compreende uma sequência de nucleotídeo que é complementar a uma sequência em um DNA alvo; e (ii) uma porção de atividade que exibe atividade enzimática dirigida a sítio reduzida, em que o sítio de atividade enzimática é determinado pelo RNA tendo como alvo DNA. Em alguns casos, o polipeptídeo de modificação dirigido a sítio variante compreende uma mutação H840A da sequência S. pyogenes SEQ ID NO:8 ou a mutação correspondente em qualquer uma das sequências de aminoácidos estabelecidas como SEQ ID NOs:1-256 e 795-1346. Em alguns casos, o polipeptídeo de modificação dirigido a sítio variante compreende uma mutação D10A da sequência S. pyogenes SEQ ID NO:8 ou a mutação correspondente em qualquer uma das sequências de aminoácidos estabelecidas como SEQ ID NOs:1-256 e 795-1346. Em alguns casos, o polipeptídeo de modificação dirigido a sítio variante compreende ambas (i) uma mutação D10A da sequência S. pyogenes SEQ ID NO:8 ou a mutação correspondente em qualquer uma das sequências de aminoácidos estabelecidas como SEQ ID NOs:1-256 e 795-1346; e (ii) uma mutação H840A da sequência S. pyogenes SEQ ID NO:8 ou a mutação correspondente em qualquer uma das sequências de aminoácidos estabelecidas como SEQ ID NOs:1-256 e 795-1346.
[014] Características da presente divulgação incluem um polipeptídeo de modificação dirigido a sítio quimérico compreendendo: (i) uma porção de ligação a RNA que interage com um RNA tendo como alvo DNA, em que o RNA tendo como alvo DNA compreende uma sequência de nucleotídeo que é complementar a uma sequência em um DNA alvo; e (ii) uma porção de atividade que exibe atividade enzimática dirigida a sítio, em que o sítio de atividade enzimática é determinado pelo RNA tendo como alvo DNA. Em alguns casos, o polipeptídeo de modificação dirigido a sítio quimérico compreende uma sequência de aminoácido tendo pelo menos cerca de 75% de identidade de sequência de aminoácido para os aminoácidos 7166 ou 731-1003 da sequência de aminoácido de Cas9/Csn1 representada na Figura 3, ou para as porções correspondentes em qualquer uma das sequências de aminoácidos estabelecidas como SEQ ID NOs:1-256 e 795-1346. Em alguns casos, o RNA tendo como alvo DNA ainda compreende uma sequência de nucleotídeo com pelo menos 60% de identidade sobre uma extensão de pelo menos 8 nucleotídeos contíguos para qualquer uma das sequências de nucleotídeos estabelecidas em SEQ ID NOs:431-682 (por exemplo, SEQ ID NOs:563-682). Em alguns casos, o RNA tendo como alvo RNA ainda compreende uma sequência de nucleotídeo com pelo menos 60% de identidade sobre uma extensão de pelo menos 8 nucleotídeos contíguos para qualquer uma das sequências de nucleotídeos estabelecidas em SEQ ID NOs:431-562. Em alguns casos, a atividade enzimática do polipeptídeo de modificação dirigido a sítio quimérico modifica o DNA alvo. Em alguns casos, a atividade enzimática do polipeptídeo de modificação dirigido a sítio é atividade de nuclease, atividade de metiltransferase, atividade de demetilase, atividade de reparo de DNA, atividade de dano de DNA, atividade de desaminação, atividade de dismutase, atividade de alquilação, atividade de depurinação, atividade de oxidação, atividade de formação de dímero de pirimidina, atividade de integrase, atividade de transposase, atividade de recombinase, atividade de polimerase, atividade de ligase, atividade de helicase, atividade de fotoliase ou atividade de glicosilase. Em alguns casos, a atividade enzimática do polipeptídeo de modificação dirigido a sítio quimérico é atividade de nuclease. Em alguns casos, a atividade de nuclease introduz uma quebra de filamento duplo no DNA de alvo. Em alguns casos, a atividade enzimática do polipeptídeo de modificação dirigido a sítio quimérico modifica um polipeptídeo alvo associados com o DNA alvo. Em alguns casos, a atividade enzimática do polipeptídeo de modificação dirigido a sítio é atividade de metiltransferase, atividade de demetilase, atividade de acetiltransferase, atividade de deacetilase, atividade de cinase, atividade de fosfatase, atividade de ubiquitina ligase, atividade de deubiquitinação, atividade de adenilação, atividade de deadenilação, atividade de SUMOilação, atividade de deSUMOilação, atividade de ribosilação, atividade de derribosilação, atividade de miristoilação ou atividade de demiristoilação.
[015] Características da presente divulgação incluem um polinucleotídeo que compreende uma sequência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo de modificação dirigido a sítio. Em alguns casos, o polinucleotídeo é um polinucleotídeo de RNA. Em alguns casos, o polinucleotídeo é um polinucleotídeo de DNA. Características da presente invenção incluem um vetor de expressão recombinante compreendendo o polinucleotídeo. Em alguns casos, o polinucleotídeo é operavelmente ligado a um promotor. Em alguns casos, o promotor é um promotor induzível. Características da presente divulgação incluem uma célula hospedeira geneticamente modificada in vitro que compreende o polinucleotídeo.
[016] Características da presente divulgação incluem um polipeptídeo de modificação dirigido a sítio quimérico compreendendo: (i) uma porção de ligação a RNA que interage com um RNA tendo como alvo DNA, em que o RNA tendo como alvo DNA compreende uma sequência de nucleotídeo que é complementar a uma sequência em um DNA alvo; e (ii) uma porção de atividade que modula transcrição dentro do DNA alvo, em que o sítio de transcrição modulada dentro do DNA alvo é determinado pelo RNA tendo como alvo DNA. Em alguns casos, a porção de atividade aumenta a transcrição dentro do DNA de alvo. Em alguns casos, a porção de atividade diminui a transcrição dentro do DNA de alvo.
[017] Características da presente divulgação incluem uma célula modificada geneticamente que compreende um polipeptídeo de modificação dirigido a sítio recombinante compreendendo uma porção de ligação a RNA que interage com um RNA tendo como alvo DNA; e uma porção de atividade que exibe atividade enzimática dirigida a sítio, em que o sítio de atividade enzimática é determinado pelo RNA tendo como alvo DNA. Em alguns casos, o polipeptídeo de modificação dirigido a sítio compreende uma sequência de aminoácido tendo pelo menos cerca de 75% de identidade de sequência de aminoácido para os aminoácidos 7-166 ou 731-1003 da sequência de aminoácido de Cas9/Csn1 representada na Figura 3, ou para as porções correspondentes em qualquer uma das sequências de aminoácidos estabelecidas como SEQ ID NOs:1-256 e 795-1346. Em alguns casos, a célula é selecionada do grupo consistindo em: uma célula archaeal, uma célula bacteriana, uma célula eucariótica, um organismo unicelular eucariótico, uma célula somática, uma célula germinal, uma célula tronco, uma célula de planta, uma célula de alga, uma célula de animal, uma célula de invertebrado, uma célula de vertebrado, uma célula de peixe, uma célula de sapo, uma célula de pássaro, uma célula de mamífero, uma célula de porco, uma célula de vaca, uma célula de cabra, uma célula de ovelha, uma célula de roedor, uma célula de rato, uma célula de camundongo, uma célula de primata não humano e uma célula de humano.
[018] Características da presente divulgação incluem um organismo não humano transgênico cujo genoma compreende um transgene que compreende uma sequência de nucleotídeo codificando um polipeptídeo de modificação dirigido a sítio recombinante compreendendo: (i) uma porção de ligação a RNA que interage com um RNA tendo como alvo DNA; e (ii) uma porção de atividade que exibe atividade enzimática dirigida a sítio, em que o sítio de atividade enzimática é determinado pelo RNA tendo como alvo DNA. Em alguns casos, o polipeptídeo de modificação dirigido a sítio compreende uma sequência de aminoácido tendo pelo menos cerca de 75% de identidade de sequência de aminoácido para os aminoácidos 7-166 ou 731-1003 da sequência de aminoácido de Cas9/Csn1 representada na Figura 3, ou para as porções correspondentes em qualquer uma das sequências de aminoácidos estabelecidas como SEQ ID NOs:1-256 e 795-1346. Em alguns casos, o organismo é selecionado do grupo consistindo em: uma archaea, uma bactéria, um organismo unicelular eucariótico, uma alga, uma planta, um animal, um invertebrado, uma mosca, uma lagarta, um cnidarian, um vertebrado, um peixe, um sapo, um pássaro, um mamífero, um ungulado, um roedor, um rato, um camundongo e um primata não humano.
[019] Características da presente divulgação incluem uma composição compreendendo: (i) um RNA tendo como alvo DNA, ou um polinucleotídeo de DNA codificando o mesmo, o RNA tendo como alvo DNA compreendendo: (a) um primeiro segmento compreendendo uma sequência de nucleotídeo que é complementar a uma sequência em um DNA alvo; e (b) um segundo segmento que interage com um polipeptídeo de modificação dirigido a sítio; e (ii) o polipeptídeo de modificação dirigido a sítio, ou um polinucleotídeo codificando o mesmo, o polipeptídeo de modificação dirigido a sítio compreendendo: (a) uma porção de ligação a RNA que interage com o RNA tendo como alvo DNA; e (b) uma porção de atividade que exibe atividade enzimática dirigida a sítio, em que o sítio de atividade enzimática é determinado pelo RNA tendo como alvo DNA. Em alguns casos, o primeiro segmento do RNA tendo como alvo DNA compreende 8 nucleotídeos que têm pelo menos 100% de complementariedade para uma sequência no DNA de alvo. Em alguns casos, o segundo segmento do RNA tendo como alvo DNA compreende uma sequência de nucleotídeo com pelo menos 60% de identidade sobre uma extensão de pelo menos 8 nucleotídeos contíguos para qualquer uma das sequências de nucleotídeos estabelecidas em SEQ ID NOs:431-682 (por exemplo, SEQ ID NOs:563-682). Em alguns casos, o segundo segmento do RNA tendo como alvo RNA compreende uma sequência de nucleotídeo com pelo menos 60% de identidade sobre uma extensão de pelo menos 8 nucleotídeos contíguos para qualquer uma das sequências de nucleotídeos estabelecidas em SEQ ID NOs:431- 562. Em alguns casos, o polipeptídeo de modificação dirigido a sítio compreende uma sequência de aminoácido tendo pelo menos cerca de 75% de identidade de sequência de aminoácido para os aminoácidos 7-166 ou 731-1003 da sequência de aminoácido de Cas9/Csn1 representada na Figura 3, ou para as porções correspondentes em qualquer uma das sequências de aminoácidos estabelecidas como SEQ ID NOs:1-256 e 795-1346. Em alguns casos, a atividade enzimática modifica o DNA de alvo. Em alguns casos, a atividade enzimática é atividade de nuclease, atividade de metiltransferase, atividade de demetilase, atividade de reparo de DNA, atividade de dano de DNA, atividade de desaminação, atividade de dismutase, atividade de alquilação, atividade de depurinação, atividade de oxidação, atividade de formação de dímero de pirimidina, atividade de integrase, atividade de transposase, atividade de recombinase, atividade de polimerase, atividade de ligase, atividade de helicase, atividade de fotoliase ou atividade de glicosilase. Em alguns casos, a atividade enzimática é atividade de nuclease. Em alguns casos, a atividade de nuclease introduz uma quebra de filamento duplo no DNA de alvo. Em alguns casos, a atividade enzimática modifica um polipeptídeo de alvo associado ao DNA de alvo. Em alguns casos, a atividade enzimática é atividade de metiltransferase, atividade de demetilase, atividade de acetiltransferase, atividade de deacetilase, atividade de cinase, atividade de fosfatase, atividade de ubiquitina ligase, atividade de deubiquitinação, atividade de adenilação, atividade de deadenilação, atividade de SUMOilação, atividade de deSUMOilação, atividade de ribosilação, atividade de derribosilação, atividade de miristoilação ou atividade de demiristoilação. Em alguns casos, o polipeptídeo de alvo é uma histona e a atividade enzimática é atividade de metiltransferase, atividade de demetilase, atividade de acetiltransferase, atividade de deacetilase, atividade de cinase, atividade de fosfatase, atividade de ubiquitina ligase ou atividade de deubiquitinação. Em alguns casos, o RNA tendo como alvo DNA é um RNA tendo como alvo DNA de molécula dupla e a composição compreende ambos um RNA de alvo e um RNA ativador, os segmentos formadores de duplex dos quais são complementares e hibiridizam para formar o segundo segmento do RNA tendo como alvo DNA. Em alguns casos, o segmento formador de duplex o RNA ativador compreende uma sequência de nucleotídeo com pelo menos 60% de identidade sobre uma extensão de pelo menos 8 nucleotídeos contíguos para qualquer uma das sequências de nucleotídeos estabelecidas em SEQ ID NO:SEQ ID NOs:431-682.
[020] Características da presente divulgação incluem uma composição compreendendo: (i) um RNA tendo como alvo DNA da presente divulgação, ou um polinucleotídeo de DNA codificando o mesmo; e (ii) um tampão para estabilizar ácidos nucleicos. Características da presente divulgação incluem uma composição compreendendo: (i) um polipeptídeo de modificação dirigido a sítio da presente divulgação, ou um polinucleotídeo codificando o mesmo; e (ii) um tampão para estabilizar ácidos nucleicos e/ou proteínas. Características da presente divulgação incluem uma composição compreendendo: (i) um RNA tendo como alvo DNA, ou um polinucleotídeo de DNA codificando o mesmo, o RNA tendo como alvo DNA compreendendo: (a) um primeiro segmento compreendendo uma sequência de nucleotídeo que é complementar a uma sequência em um DNA alvo; e (b) um segundo segmento que interage com um polipeptídeo de modificação dirigido a sítio; e (ii) o polipeptídeo de modificação dirigido a sítio, ou um polinucleotídeo codificando o mesmo, o polipeptídeo de modificação dirigido a sítio compreendendo: (a) uma porção de ligação a RNA que interage com o RNA tendo como alvo DNA; e (b) uma porção de atividade que modula transcrição dentro do DNA de alvo, em que o sítio de transcrição modulada dentro do DNA de alvo é determinado pelo RNA tendo como alvo DNA. Em alguns casos, a porção de atividade aumenta a transcrição dentro do DNA de alvo. Em alguns casos, a porção de atividade diminui a transcrição dentro do DNA de alvo. Características da presente divulgação incluem uma composição compreendendo: (i) um polipeptídeo de modificação dirigido a sítio, ou um polinucleotídeo codificando o mesmo; e (ii) um tampão para estabilizar ácidos nucleicos e/ou proteínas.
[021] Características da presente divulgação incluem um método de modificação específica de sítio de um DNA de alvo, o método compreendendo: contatar o DNA de alvo com: (i) um RNA tendo como alvo DNA, ou um polinucleotídeo de DNA codificando o mesmo, em que o RNA tendo como alvo DNA compreende: (a) um primeiro segmento compreendendo uma sequência de nucleotídeo que é complementar a uma sequência no DNA de alvo; e (b) um segundo segmento que interage com um polipeptídeo de modificação dirigido a sítio; e (ii) o polipeptídeo de modificação dirigido a sítio, ou um polinucleotídeo codificando o mesmo, em que o polipeptídeo de modificação dirigido a sítio compreende: (a) uma porção de ligação a RNA que interage com o RNA tendo como alvo DNA; e (b) uma porção de atividade que exibe atividade enzimática dirigida a sítio. Em alguns casos, o DNA de alvo é extracromossômico. Em alguns casos, o DNA de alvo compreende uma sequência PAM do filamento complementar que é 5’-CCY-3’, em que Y é qualquer nucleotídeo de DNA e Y é imediatamente 5’ da sequência alvo do filamento complementar do DNA de alvo. Em alguns casos, o DNA de alvo é parte de um cromossomo in vitro. Em alguns casos, o DNA de alvo é parte de um cromossomo in vivo. Em alguns casos, o DNA de alvo é parte de um cromossomo em uma célula. Em alguns casos, a célula é selecionada do grupo consistindo em: uma célula archaeal, uma célula bacteriana, uma célula eucariótica, um organismo unicelular eucariótico, uma célula somática, uma célula germinal, uma célula tronco, uma célula de planta, uma célula de alga, uma célula de animal, uma célula de invertebrado, uma célula de vertebrado, uma célula de peixe, uma célula de sapo, uma célula de pássaro, uma célula de mamífero, uma célula de porco, uma célula de vaca, uma célula de cabra, uma célula de ovelha, uma célula de roedor, uma célula de rato, uma célula de camundongo, uma célula de primata não humano e uma célula de humano. Em alguns casos, o RNA tendo como alvo DNA compreende uma sequência de nucleotídeo com pelo menos 60% de identidade sobre uma extensão de pelo menos 8 nucleotídeos contíguos para qualquer uma das sequências de nucleotídeos estabelecidas em SEQ ID NOs:431-682 (por exemplo, SEQ ID NOs:563-682). Em alguns casos, o RNA tendo como alvo RNA compreende uma sequência de nucleotídeo com pelo menos 60% de identidade sobre uma extensão de pelo menos 8 nucleotídeos contíguos para qualquer uma das sequências de nucleotídeos estabelecidas em SEQ ID NOs:431-562. Em alguns casos, o polipeptídeo de modificação de DNA compreende uma sequência de aminoácido tendo pelo menos cerca de 75% de identidade de sequência de aminoácido para os aminoácidos 7-166 ou 731-1003 da sequência de aminoácido de Cas9/Csn1 representada na Figura 3, ou para as porções correspondentes em qualquer uma das sequências de aminoácidos estabelecidas como SEQ ID NOs:1-256 e 795-1346. Em alguns casos, a atividade enzimática modifica o DNA de alvo. Em alguns casos, a atividade enzimática é atividade de nuclease, atividade de metiltransferase, atividade de demetilase, atividade de reparo de DNA, atividade de dano de DNA, atividade de desaminação, atividade de dismutase, atividade de alquilação, atividade de depurinação, atividade de oxidação, atividade de formação de dímero de pirimidina, atividade de integrase, atividade de transposase, atividade de recombinase, atividade de polimerase, atividade de ligase, atividade de helicase, atividade de fotoliase ou atividade de glicosilase. Em alguns casos, a atividade enzimática de modificação de DNA é atividade de nuclease. Em alguns casos, a atividade de nuclease introduz uma quebra de filamento duplo no DNA de alvo. Em alguns casos, o contato ocorre em condições que são permissivas para junção de extremidade não homóloga ou reparo dirigido a homologia. Em alguns casos, o método ainda compreende contatar o DNA de alvo com um polinucleotídeo doador, em que o polinucleotídeo doador, uma porção do polinucleotídeo doador, uma cópia do polinucleotídeo doador ou uma porção de uma cópia do polinucleotídeo doador integra no DNA de alvo. Em alguns casos, o método não compreende contatar a célula com um polinucleotídeo doador, em que o DNA de alvo é modificado de modo que os nucleotídeos dentro do DNA de alvo sejam deletados. Em alguns casos, a atividade enzimática modifica um polipeptídeo de alvo associado ao DNA de alvo. Em alguns casos, a atividade enzimática é atividade de metiltransferase, atividade de demetilase, atividade de acetiltransferase, atividade de deacetilase, atividade de cinase, atividade de fosfatase, atividade de ubiquitina ligase, atividade de deubiquitinação, atividade de adenilação, atividade de deadenilação, atividade de SUMOilação, atividade de deSUMOilação, atividade de ribosilação, atividade de derribosilação, atividade de miristoilação ou atividade de demiristoilação. Em alguns casos, o polipeptídeo de alvo é uma histona e a atividade enzimática é atividade de metiltransferase, atividade de demetilase, atividade de acetiltransferase, atividade de deacetilase, atividade de cinase, atividade de fosfatase, atividade de ubiquitina ligase ou atividade de deubiquitinação. Em alguns casos, o complexo ainda compreende um RNA ativador. Em alguns casos, o ativador de RNA compreende uma sequência de nucleotídeo com pelo menos 60% de identidade sobre uma extensão de pelo menos 8 nucleotídeos contíguos para qualquer uma das sequências de nucleotídeos estabelecidas em SEQ ID NOs:431-682.
[022] Características da presente divulgação incluem um método para modular transcrição específica de sítio dentro de um DNA de alvo, o método compreendendo contatar o DNA de alvo com: (i) um RNA tendo como alvo DNA, ou um polinucleotídeo de DNA codificando o mesmo, em que o RNA tendo como alvo DNA compreende: (a) um primeiro segmento compreendendo uma sequência de nucleotídeo que é complementar a uma sequência no DNA de alvo; e (b) um segundo segmento que interage com um polipeptídeo de modificação dirigido a sítio; e (ii) um polipeptídeo de modificação dirigido a sítio, ou um polinucleotídeo codificando o mesmo, em que o polipeptídeo de modificação dirigido a sítio compreende: (a) uma porção de ligação a RNA que interage com o RNA tendo como alvo DNA; e (b) uma porção de atividade que modula transcrição, em que o referido contato resulta em modular transcrição dentro do DNA de alvo. Em alguns casos, a transcrição dentro do DNA de alvo é aumentada. Em alguns casos, a transcrição dentro do DNA de alvo é diminuída.
[023] Características da presente divulgação incluem um método de modificação específica de sítio em um DNA de alvo, o método compreendendo: contatar o DNA de alvo com: (i) um RNA tendo como alvo DNA, ou um polinucleotídeo de DNA codificando o mesmo, em que o RNA tendo como alvo DNA compreende: (a) um primeiro segmento compreendendo uma sequência de nucleotídeo que é complementar a uma sequência no DNA de alvo; e (b) um segundo segmento que interage com um polipeptídeo de modificação dirigido a sítio; e (ii) um polipeptídeo de modificação dirigido a sítio, ou um polinucleotídeo codificando o mesmo, em que o polipeptídeo de modificação dirigido a sítio compreende: (a) uma porção de ligação a RNA que interage com o RNA tendo como alvo DNA; e (b) uma porção de atividade que modula transcrição dentro do DNA de alvo. Em alguns casos, o polipeptídeo de modificação dirigido a sítio aumenta transcrição dentro do DNA de alvo. Em alguns casos, o polipeptídeo de modificação dirigido a sítio diminui transcrição dentro do DNA de alvo.
[024] Características da presente divulgação incluem um método para promover clivagem específica de sítio e modificação de um DNA de alvo em uma célula, o método compreendendo introduzir na célula: (i) um RNA tendo como alvo DNA, ou um polinucleotídeo de DNA codificando o mesmo, em que o RNA tendo como alvo DNA compreende: (a) um primeiro segmento compreendendo uma sequência de nucleotídeo que é complementar a uma sequência no DNA de alvo; e (b) um segundo segmento que interage com um polipeptídeo de modificação dirigido a sítio; e (ii) o polipeptídeo de modificação dirigido a sítio, ou um polinucleotídeo codificando o mesmo, em que o polipeptídeo de modificação dirigido a sítio compreende: (a) uma porção de ligação a RNA que interage com o RNA tendo como alvo DNA; e (b) uma porção de atividade que exibe atividade de nuclease que cria uma quebra de filamento duplo no DNA de alvo; em que o sítio do filamento duplo é determinado pelo RNA tendo como alvo DNA, o contato ocorre em condições que são permissivas para junção de extremidade não homóloga ou reparo dirigido a homologia, e o DNA de alvo é clivado e reunido para produzir uma sequência de DNA modificada. Em alguns casos, o método ainda compreende contatar o DNA de alvo com um polinucleotídeo doador, em que o polinucleotídeo doador, uma porção do polinucleotídeo doador, uma cópia do polinucleotídeo doador ou uma porção de uma cópia do polinucleotídeo doador integra no DNA de alvo. Em alguns casos, o método não compreende contatar a célula com um polinucleotídeo doador, em que o DNA de alvo é modificado de modo que os nucleotídeos dentro do DNA de alvo sejam deletados. Em alguns casos, a célula é selecionada do grupo consistindo em: uma célula archaeal, uma célula bacteriana, uma célula eucariótica, um organismo unicelular eucariótico, uma célula somática, uma célula germinal, uma célula tronco, uma célula de planta, uma célula de alga, uma célula de animal, uma célula de invertebrado, uma célula de vertebrado, uma célula de peixe, uma célula de sapo, uma célula de pássaro, uma célula de mamífero, uma célula de porco, uma célula de vaca, uma célula de cabra, uma célula de ovelha, uma célula de roedor, uma célula de rato, uma célula de camundongo, uma célula de primata não humano e uma célula de humano. Em alguns casos, a célula está in vitro. Em alguns casos, a célula está in vivo.
[025] Características da presente divulgação incluem um método para produzir célula geneticamente modificada em um sujeito, o método compreendendo: (I) introduzir em uma célula: (i) um RNA tendo como alvo DNA, ou um polinucleotídeo de DNA codificando o mesmo, em que o RNA tendo como alvo DNA compreende: (a) um primeiro segmento compreendendo uma sequência de nucleotídeo que é complementar a uma sequência no DNA de alvo; e (b) um segundo segmento que interage com um polipeptídeo de modificação dirigido a sítio; e (ii) o polipeptídeo de modificação dirigido a sítio, ou um polinucleotídeo codificando o mesmo, em que o polipeptídeo de modificação dirigido a sítio compreende: (a) uma porção de ligação a RNA que interage com o RNA tendo como alvo DNA; e (b) uma porção de atividade que exibe atividade de nuclease que cria uma quebra de filamento duplo no DNA de alvo; em que o sítio do filamento duplo é determinado pelo RNA tendo como alvo DNA, o contato ocorre em condições que são permissivas para junção de extremidade não homóloga ou reparo dirigido a homologia, e o DNA de alvo é clivado e reunido para produzir uma sequência de DNA modificada; desse modo produzindo a célula modificada geneticamente; e (II) transplantar a célula modificada geneticamente para o sujeito. Em alguns casos, o método ainda compreende contatar a célula com um polinucleotídeo doador, em que o polinucleotídeo doador, uma porção do polinucleotídeo doador, uma cópia do polinucleotídeo doador ou uma porção de uma cópia do polinucleotídeo doador integra no DNA de alvo. Em alguns casos, o método não compreende contatar a célula com um polinucleotídeo doador, em que o DNA de alvo é modificado de modo que os nucleotídeos dentro do DNA de alvo sejam deletados. Em alguns casos, a célula é selecionada do grupo consistindo em: uma célula archaeal, uma célula bacteriana, uma célula eucariótica, um organismo unicelular eucariótico, uma célula somática, uma célula germinal, uma célula tronco, uma célula de planta, uma célula de alga, uma célula de animal, uma célula de invertebrado, uma célula de vertebrado, uma célula de peixe, uma célula de anfíbio, uma célula de pássaro, uma célula de mamífero, uma célula de ungulado, uma célula de roedor, uma célula de primata não humano e uma célula de humano.
[026] Características da presente divulgação incluem um método para modificar DNA de alvo em uma célula geneticamente modificada que compreende uma sequência de nucleotídeo codificando um polipeptídeo de modificação dirigido a sítio exógeno, o método compreendendo introduzir na célula geneticamente modificada um RNA tendo como alvo DNA, ou um polinucleotídeo de DNA codificando o mesmo, em que: compreende: (i) o RNA tendo como alvo DNA compreende: (a) um primeiro segmento compreendendo uma sequência de nucleotídeo que é complementar a uma sequência no DNA de alvo; e (b) um segundo segmento que interage com um polipeptídeo de modificação dirigido a sítio; e (ii) o polipeptídeo de modificação dirigido a sítio compreende: (a) uma porção de ligação a RNA que interage com o RNA tendo como alvo DNA; e (b) uma porção de atividade que exibe atividade de nuclease. Em alguns casos, o polipeptídeo de modificação dirigido a sítio compreende uma sequência de aminoácido tendo pelo menos cerca de 75% de identidade de sequência de aminoácido para os aminoácidos 7-166 ou 731-1003 da sequência de aminoácido de Cas9/Csn1 representada na Figura 3, ou para as porções correspondentes em qualquer uma das sequências de aminoácidos estabelecidas como SEQ ID NOs:1-256 e 795-1346. Em alguns casos, a célula é selecionada do grupo consistindo em: uma célula archaeal, uma célula bacteriana, uma célula eucariótica, um organismo unicelular eucariótico, uma célula somática, uma célula germinal, uma célula tronco, uma célula de planta, uma célula de alga, uma célula de animal, uma célula de invertebrado, uma célula de vertebrado, uma célula de peixe, uma célula de anfíbio, uma célula de pássaro, uma célula de mamífero, uma célula de ungulado, uma célula de roedor, uma célula de primata não humano e uma célula de humano. Em alguns casos, a célula está in vivo. Em alguns casos, a célula está in vitro. Em alguns casos, a expressão do polipeptídeo de modificação dirigido a sítio está sob o controle de um promotor induzível. Em alguns casos, a expressão do polipeptídeo de modificação dirigido a sítio está sob o controle de um promotor específico de tipo de célula.
[027] Características da presente divulgação incluem um kit compreendendo: o RNA tendo como alvo DNA ou um polinucleotídeo de DNA codificando o mesmo; e um reagente para reconstituição e/ou diluição. Em alguns casos, o kit compreende ainda um reagente selecionado do grupo consistindo em: um tampão para introduzir nas células o RNA tendo como alvo DNA, um tampão de lavagem, um reagente de controle, um vetor de expressão de controle ou polinucleotídeo de RNA, um reagente para transcrever o RNA tendo como alvo DNA e combinações dos mesmos.
[028] Características da presente divulgação incluem um kit compreendendo: um polipeptídeo de modificação dirigido a sítio da presente divulgação, ou um polinucleotídeo codificando o mesmo; e um reagente para reconstituição e/ou diluição. Em alguns casos, o kit compreende ainda um reagente selecionado do grupo consistindo em: um tampão para introduzir nas células o polipeptídeo de modificação dirigido a sítio, um tampão de lavagem, um reagente de controle, um vetor de expressão de controle ou polinucleotídeo de RNA, um reagente para produção in vitro do polipeptídeo de modificação dirigido a sítio a partir de DNA e combinações dos mesmos.
[029] Características da presente divulgação incluem um kit compreendendo: um polipeptídeo de modificação dirigido a sítio da presente divulgação, ou um polinucleotídeo codificando o mesmo; e um reagente para reconstituição e/ou diluição. Características da presente divulgação incluem um kit compreendendo: um RNA tendo como alvo DNA, ou um polinucleotídeo de DNA codificando o mesmo, o RNA tendo como alvo DNA compreendendo: (a) um primeiro segmento compreendendo uma sequência de nucleotídeo que é complementar a uma sequência em um DNA alvo; e (b) um segundo segmento que interage com um polipeptídeo de modificação dirigido a sítio; e (ii) o polipeptídeo de modificação dirigido a sítio, ou um polinucleotídeo codificando o mesmo, o polipeptídeo de modificação dirigido a sítio compreendendo: (a) uma porção de ligação a RNA que interage com o RNA tendo como alvo DNA; e (b) uma porção de atividade que exibe atividade enzimática dirigida a sítio, em que o sítio de atividade enzimática é determinado pelo RNA tendo como alvo DNA.
[030] Características da presente divulgação incluem um kit compreendendo: (i) um RNA tendo como alvo DNA, ou um polinucleotídeo de DNA codificando o mesmo, compreendendo: (a) um primeiro segmento compreendendo uma sequência de nucleotídeo que é complementar a uma sequência em um DNA alvo; e (b) um segundo segmento que interage com um polipeptídeo de modificação dirigido a sítio; e (ii) o polipeptídeo de modificação dirigido a sítio, ou um polinucleotídeo codificando o mesmo, compreendendo: (a) uma porção de ligação a RNA que interage com o RNA tendo como alvo DNA; e (b) uma porção de atividade que modula transcrição dentro do DNA de alvo, em que o sítio de transcrição modulada dentro do DNA de alvo é determinado pelo RNA tendo como alvo DNA.
[031] Características da presente divulgação incluem um kit compreendendo: (i) qualquer um dos vetores de expressão recombinantes acima; e (ii) um reagente para reconstituição e/ou diluição. Características da presente divulgação incluem um kit compreendendo: (i) qualquer um dos vetores de expressão recombinantes acima; e (ii) um vetor de expressão recombinante compreendendo uma sequência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo de modificação dirigido a sítio, em que o polipeptídeo de modificação dirigido a sítio compreende: (a) uma porção de ligação a RNA que interage com o RNA tendo como alvo DNA; e (b) uma porção de atividade que exibe atividade enzimática dirigida a sítio, em que o sítio de atividade enzimática é determinado pelo RNA tendo como alvo DNA. Características da presente divulgação incluem um kit compreendendo: (i) qualquer um dos vetores de expressão recombinantes acima; e (ii) um vetor de expressão recombinante compreendendo uma sequência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo de modificação dirigido a sítio, em que o polipeptídeo de modificação dirigido a sítio compreende: (a) uma porção de ligação a RNA que interage com o RNA tendo como alvo DNA; e (b) uma porção de atividade que modula transcrição dentro do DNA de alvo, em que o sítio de transcrição modulada dentro do DNA de alvo é determinado pelo RNA tendo como alvo DNA.
[032] Características da presente divulgação incluem um kit para direcionar DNA de alvo que compreende: dois ou mais RNAs tendo como alvo DNA ou polinucleotídeos de DNA codificando os mesmos, em que o primeiro segmento de pelo menos um dos dois ou mais RNAs tendo como alvo DNA difere em pelo menos um nucleotídeo do primeiro segmento de pelo menos um outro dos dois ou mais RNAs tendo como alvo DNA.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[033] Figuras 1A-B fornecem um desenho esquemático de dois RNAs tendo como alvo DNA em questão exemplares, cada um associado com um polipeptídeo de modificação dirigido a sítio e com um DNA de alvo.
[034] Figura 2 representa edição de DNA de alvo através de quebras de DNA de duplo filamento introduzidas usando um polipeptídeo de modificação dirigido a sítio Cas9/Csn1 e um RNA tendo como alvo DNA.
[035] Figuras 3A-B representam a sequência de aminoácidos de uma proteína Cas9/Csn1 de Streptococcus pyogenes (SEQ ID NO:8). Cas9 tem domínios homólogos a ambas as endonucleases HNH e RuvC. (A) Motifs 1-4 estão sublinhados (B) Domínios 1 e 2 estão sublinhados.
[036] Figuras 4A-B representam a percentagem de identidade entre as proteínas Cas9/Csn1 de múltiplas espécies. (A) Identidade de sequência relativa a Streptococcus pyogenes. Por exemplo, Domínio 1 são aminoácidos 7-166 e Domínio 2 são aminoácidos 731-1003 de Cas9/Csn1 de Streptococcus pyogenes como representado na Figura 3B. (B) Identidade de sequência relativa a Neisseria meningitidis. Por exemplo, Domínio 1 são aminoácidos 13-139 e Domínio 2 são aminoácidos 475-750 de Cas9/Csn1 de Neisseria meningitidis (SEQ ID NO:79).
[037] Figura 5 representa um alinhamento de sequências múltiplas de motifs 1-4 de proteínas Cas9/Csn1 de várias especies diversas selecionadas da tabela filogenética na Figura 32 (ver Figura 32, Figura 3A e Tabela 1) (Streptococcus pyogenes (SEQ ID NO:8), Legionella pneumophila (SEQ ID NO:17), Gamma proteobacterium (SEQ ID NO:107), Listeria innocua (SEQ ID NO:3), Lactobacillus gasseri (SEQ ID NO:152), Eubacterium rectale (SEQ ID NO:99), Staphylococcus lugdunensis (SEQ ID NO:185), Mycoplasma synoviae (SEQ ID NO:22), Mycoplasma mobile (SEQ ID NO:16), Wolinella succinogenes (SEQ ID NO:10), Flavobacterium columnare (SEQ ID NO:235), Fibrobacter succinogenes (SEQ ID NO:121), Bacteroides fragilis (SEQ ID NO:21), Acidothermus cellulolyticus (SEQ ID NO:42), e Bifidobacterium dentium (SEQ ID NO:131).
[038] Figuras 6A-B fornecem alinhamentos de sequências de tracrRNA (“RNA ativador”) ocorrendo naturalmente de várias espécies (L. innocua (SEQ ID NO:268); S. pyogenes (SEQ ID NO:267); S. mutans (SEQ ID NO:269); S. thermophilus1 (SEQ ID NO:270); M. mobile (SEQ ID NO:274); N. meningitides (SEQ ID NO:272); P. multocida (SEQ ID NO:273); S. thermophilus2 (SEQ ID NO:271); e S. pyogenes (SEQ ID NO:267). Alinhamento de sequências múltiplas de ortólogos (A) de tracrRNA selecionados (AlignX, pacote VectorNTI,Invitrogen) associado com loci de CRISPR/Cas de arquitetura similar e sequências de Cas9/Csn1 altamente similares. Caixas pretas representam alinhamento de múltiplas sequências de nucleotídeos compartilhados (B) de ortólogos de tracrRNA selecionados (AlignX, pacote VectorNTI, Invitrogen) associado com loci de CRISPR/Cas de arquitetura diferente e sequências de Cas9/Csn1 não intimamente relacionadas. Notem a similaridade de sequência de ortólogos de tracrRNA de N. meningitidis e P. multocida. Caixas pretas representam nucleotídeos compartilhados. Para mais sequências de RNA ativadoras exemplares, ver SEQ ID NOs:431-562.
[039] Figuras 7A-B fornecem alinhamentos de segmentos de formação de duplex ocorrendo naturalmente de sequências de crRNA (“RNA direcionador”) de várias espécies (L. innocua (SEQ ID NO://); S. pyogenes (SEQ ID NO://); S. mutans (SEQ ID NO://); S. thermophilus1 (SEQ ID NO://); C. jejuni (SEQ ID NO://); S. pyogenes (SEQ ID NO://); F. novicida (SEQ ID NO://); M. mobile (SEQ ID NO://); N. meningitides (SEQ ID NO://); P. multocida (SEQ ID NO://); e S. thermophilus2 (SEQ ID NO://). (A) alinhamentos de sequência múltipla de segmento exeplar de formalçao de duplexo das sequências de RNA direcionador (AlignX, VectorNTI package, Invitrogen) associados com os locais de arquitetura semelhente a sequências Cas9/Csn1 altamente semelhantes. (B) alinhamentos de sequência múltipla de segmento exemplar de formação de duplex de sequências RNA direcionadores (AlignX, VectorNTI package, Invitrogen) associados com os locais de diferente arquitetura e diversas sequências Cas9. Caixas pretas representam nucleotídeos compartilhados. Para segmentos exemplares de formação de duplex de sequências de RNA direcionador, ver SEQ ID NOs:563-679.
[040] Figura 8 fornece um esquema de hibridização para segmentos da crRNA de ocorrência natural formando duplex (“RNA direcionador”) com o segmento de formação de duplex do correspondente ortólogo tracrRNA (“RNA ativador”). Sequência superior, RNA direcionador; sequência inferior, segmento de formação de duplex do RNA ativador correspondente. Os loci CRISPR pertencem ao sistema do tipo II (Nmeni/CASS4) CRISPR/Cas. Nomenclatura está de acordo com o banco de dados CRISPR (CRISPR DB). S. pyogenes (SEQ ID NO:// e //); S. mutans (SEQ ID NO:// e //); S. thermophilus1 (SEQ ID NO:// e //); S. thermophilus2 (SEQ ID NO:// e //); L. innocua (SEQ ID NO:// e //); T. denticola (SEQ ID NO:// e //); N. meningitides (SEQ ID NO:// e //); S. gordonii (SEQ ID NO:// e //); B. bifidum (SEQ ID NO:// e //); L. salivarius (SEQ ID NO:// e //); F. tularensis (SEQ ID NO:// e //); e L. pneumophila (SEQ ID NO:// e //). Observe que algumas espécies contêm cada dois loci CRISPR de tipo II. Para mais sequências de RNA ativadoras exemplares, ver SEQ ID NOs:431-562. Para segmentos exemplares de formação de duplex de sequências de RNA direcionador, ver SEQ ID NOs:563-679.
[041] Figura 9 retrata sequências exemplares de tracrRNA (RNA ativador) e crRNA (RNA direcionador) de duas espécies. Existe um grau de intercambialidade; por exemplo, a proteína S.pyogenes Cas9/Csn1 é funcional com tracrRNA e crRNA, derivada de L.innocua. (|) denota um par de bases Watson-Crick canônico enquanto (•) denotes a G-U wobble base pair. “Variável 20nt” ou “20nt” representa o segmento de direcionamento de DNA complementar um DNA alvo (nesta região pode ser até sobre 100nt de comprimento). O design do RNA direcionado ao DNA de molécula simples que incorpora características do RNA direcionador e RNA ativador é também mostrado. (sequências de proteínas Cas9/Csn1 de uma grande variedade de espécies são representadas na Figura 3 e estabelecidas como SEQ: ID NOs: 1-256 e 795-1346) Streptococcus pyogenes: de cima para baixo: (SEQ ID NO://, //, //); Listeria innocua: de cima para baixo: (SEQ ID NO://, //, //). As sequências fornecidas são exemplos não limitantes e são destinadas a ilustrar como RNAs de direcionamento a DNA de molécula simples e duas moleculas de RNAs de direcionamento ao DNA podem ser projetadas com base em sequências naturalmente existentes entre uma grande variedade de espécies. Vários exemplos de sequências adequadas de uma grande variedade de espécies estão estabelecidos como se segue (proteína Cas9: SEQ ID NOs: 1-259; tracrRNAs: SEQ ID NO: 431-562, ou os complementos destas; crRNAs: SEQ ID NOs: 563-679, ou o complementar destas; e exemplos de RNAs de direcionamento a DNA de molécula simples: SEQ ID NO: 680- 682).
[042] Figuras 10A-E mostram que Cas9 é uma endonuclease DNA guiada por duas moléculas de RNA. Figura E (de cima para baixo, SEQ ID NO: 278-280, e //).
[043] Figuras 11A-B demonstram que Cas9 usa dois domínios de nuclease para clivar as duas fitas no DNA do alvo.
[044] Figuras 12A-E ilustram que clivagem catalisada por Cas9 do DNA alvo requer um domínio ativando em tracrRNA e é regido por uma sequência de semente no crRNA. Figura 12 (cima para baixo, SEQ ID NO: 278-280, e //); Figura 12D (de cima para baixo, SEQ ID NO: 281-290); e Figura 12E (de cima para baixo, SEQ ID NO: 291-292, 283, 293-298).
[045] Figuras 13A-C mostram que a PAM é necessária para liberar a clivagem de DNA alvo pelo complexo Cas9 - tracrRNA:crRNA.
[046] Figuras 14A-C ilustram que Cas9 pode ser programado usando uma única molécula de RNA projetada, combinando características de tracrRNA e crRNA. Quimera A (SEQ ID NO: 299); Quimera B (SEQ ID NO: 300).
[047] Figura 15 retrata a via imune de CRISPR/Cas mediada por RNA tipo II.
[048] Figuras 16A-B retratam a purificação de nucleases Cas9.
[049] Figuras 17A-C mostram que Cas9 guiado pelo dual-tracrRNA:crRNA cliva o plasmídeo protoespaçador e DNA do oligonucleotídeo. Figura 17B (de cima para baixo, SEQ ID NO: 301-303, e //); e figura 17 (cima para baixo, SEQ ID NO: 304-306, e //).
[050] Figuras 18A-B mostram que Cas9 é uma endonuclease dependente de Mg2+ com atividade de exonuclease 3'-5'.
[051] Figuras 19A-C ilustram que dual- tracrRNA:crRNA dirigido para clivagem Cas9 de DNA alvo é específico do sítio. Figura 19C (de cima para baixo, SEQ ID NO: 307-309, //, 337-339, e //).
[052] Figuras 20A-B mostram que dual- tracrRNA:crRNA dirigido a clivagem Cas9 de DNA alvo é rápido e eficiente.
[053] Figuras 21A-B mostram que domínios tipo HNH e RuvC de Cas9 direcionam a clivagem da fita de DNA complementar e não complementar, respectivamente.
[054] Figura 22 demonstra que tracrRNA é necessária para o reconhecimento de DNA alvo.
[055] Figuras 23A-B mostram que uma região mínima de tracrRNA é capaz de guiar dualtracrRNA: crRNA dirigido a clivagem do DNA alvo.
[056] Figuras 24A-D demonstram que clivagem de DNA alvo guiado por dual-tracrRNA:crRNA por Cas9 pode ser específica de espécie.
[057] Figuras 25A-C mostram que uma sequência semente em crRNA governa clivagem do DNA direcionada por dual tracrRNA:crRNA por Cas9. Figura 25A: sonda de DNA alvo 1 (SEQ ID NO: 310); espaçador 4 crRNA (1-42) (SEQ ID NO: 311); tracrRNA (15-89) (SEQ ID NO: //). Figura 25B Painel à esquerda (SEQ ID NO: 310).
[058] Figuras 26A-C demonstram que a sequência de PAM é essencial para a clivagem de DNA de plasmídeo protoespaçador por Cas9-tracrRNA:crRNA e por interferência de DNA do plasmídeo mediado por Cas9 em células bacterianas.Figura 26B (cima para baixo, SEQ ID NO: 312-314); e Figura 26 (cima para baixo, SEQ ID NO: 315-320).
[059] Figuras 27A-C mostram que Cas9 guiado por um único RNA quimérico imitando dual tracrRNA:crRNA cliva o DNA protoespaçador. Figura 27 (cima para baixo, SEQ ID NO: 321-324).
[060] Figuras 28A-D retratam de novo desenho de RNAs quimérico visando a sequência do gene da proteína fluorescente verde (GFP). Figura 28B (cima para baixo, SEQ ID NOs: 325-326). Figura 28: sequência alvo GFP1 (SEQ ID NO: 327); Sequência alvo GFP2 (SEQ ID NO: 328); Sequência alvo GFP3 (SEQ ID NO: 329); Sequência alvo GFP4 (SEQ ID NO: 330); Sequência alvo GFP5 (SEQ ID NO: 331); RNA Quimérico GFP1 (SEQ ID NO: 332); RNA quimérico GFP2 (SEQ ID NO: 333); RNA Quimérico GFP3 (SEQ ID NO: 334); RNA quimérico GFP4 (SEQ ID n: 335); RNA quimérico GFP5 (SEQ ID NO: 336).
[061] Figuras 29A-E demonstram essa coexpressão de Cas9 e guia de RNA em células humanas gera quebras de DNA fita dupla locus do alvo. Figura 29 (cima para baixo, SEQ ID NO: 425-428).
[062] Figuras 30A-B demonstram que lisados celulares contêm ativos Cas9:sgRNA e suportam clivagem de DNA específica ao sítio.
[063] Figuras 31A-B demonstram que extensão 3' de construções de sgRNA aumentam a mutagênese mediada por NHEJ específica por sítio. Figura 31A (cima para baixo, SEQ ID NO: 428-430).
[064] Figuras 32A-B retratam uma árvore filogenética de sequências de Cas9 representativas de vários organismos (A) bem como arquiteturas de locus Cas9 para os principais grupos da árvore (B).
[065] Figuras 33A-E retratam a arquitetura do CRISPR-Cas tipo II de espécies bacterianas selecionadas.
[066] Figuras 34A-B retratam tracrRNA e pre-crRNA co-processamento em sistemas de CRISPR Cas do tipo II selecionados. Figura 34 (de cima para baixo, SEQ ID NO://,//,//,//,//,//,//,//); Figura 34B (de cima para baixo, SEQ ID NO://,//,//,//).
[067] Figura 35 retrata um alinhamento da sequência de ortólogos de tracrRNA, demonstrando a diversidade de sequências tracrRNA.
[068] Figuras 36A-F retratam a expressão de ortólogos tracrRNA bacterianas e crRNAs revelados pelo sequenciamento profundo do RNA
[069] Figuras 37A-O listam todos os ortólogos de tracrRNA e crRNAs maduros obtidos por sequenciamento para as espécies bacterianas estudadas, incluindo coordenadas (região de interesse) e correspondentes sequências de cDNA (5' para 3').
[070] Figuras 38 A-B apresentam uma tabela de espécies bacterianas contendo loci de CRISPR-Cas tipo II, caracterizada pela presença da assinatura de gene cas9. Estas sequências foram usadas para análises filogenéticas.
[071] Figuras 39 A-B retratam o desenho do sistema de interferência de CRISPR (CRISPRi).
[072] Figuras 40 A-E demonstram que CRISPRi efetivamente silencia alongamento de transcrição e iniciação.
[073] Figuras 41 A-B demonstram que CRISPRi funciona através do bloqueio de alongamento da transcrição.
[074] Figuras 42 A-C demonstram a especificidade de direcionamento do sistema de CRISPRi.
[075] Figuras 43 A-F retratam a caracterização dos fatores que afetam a eficiência do silenciamento.
[076] Figuras 44 A-C retratam perfilamento funcional de uma complexa rede regulatória usando o knockdown de gene CRISPRi.
[077] Figuras 45 A-B demonstram o silenciamento de genes usando CRISPRi em células de mamíferos.
[078] Figura 46 retrata o mecanismo do sistema CRISPR tipo II de S. pyogenes.
[079] Figuras 47 A-B retratam as curvas de crescimento de culturas de células E. coli co-transformadas com dCas9 e sgRNA.
[080] Figura 48 mostra que CRISPRi poderia silenciar a expressão de um gene repórter em um plasmídeo de várias cópias.
[081] Figuras 49 A-C retratam dados de células RNA-seq com RNA-seq que direcionam a diferentes genes.
[082] Figuras 50 A-E retratam os efeitos de silenciamento de sgRNAs com incompatibilidades de duplas adjacentes.
[083] Figuras 51 A-C retratam os efeitos combinatórios de silenciamento do uso de dois sgRNAs para regular um único gene.
[084] Figura 52 mostra que a repressão de sgRNA é dependente dos loci alvo e relativamente da distância desde o início da transcrição.
[085] Figuras 53 A-C retratam resultados experimentais, demonstrando que uma variante de polipeptídeo direcionado ao sítio Cas9 (dCas9) funciona para os métodos objetos quando dCas9 reduziu a atividade em apenas no domínio RuvC1 (por exemplo, D10A), apenas o domínio HNH (por exemplo, H840A), ou ambos os domínios (por exemplo, D10A e H840A).
[086] Figuras 54 A-C listam exemplos de parceiros de fusão adequados (ou respectivos fragmentos) para um polipeptídeo direcionado por sítio Cas9 variante objeto. Os exemplos incluem, mas não estão limitados aos listados.
[087] Figuras 55 A-D demonstram que um polipeptídeo quimérico direcionado ao sítio pode ser usado para ativar a transcrição (aumentar) em células humanas.
[088] Figura 56 demonstra que um polipeptídeo quimérico direcionado ao sítio pode ser usado para reprimir a transcrição (diminuir) em células humanas.
[089] Figuras 57A-B demonstram que sequências artificiais que compartilham aproximadamente 50% de identidade com um tracrRNAs e crRNAs de ocorrência natural podem funcionar com Cas9 para clivar DNA alvo, contanto que a estrutura do domínio de ligação à proteína do RNA direcionado ao DNA alvo é conservada.
DEFINIÇÕES — PARTE I
[090] Os termos “polinucleotídeo” e “ácido nucleico,” usados de modo intercambiável aqui, se referem a uma forma polimérica de nucleotídeos de qualquer comprimento, ribonucleotídeos ou desoxirribonucleotídeos. Assim, este termo inclui, entre outros, DNA ou RNA de fita simples, dupla ou múltipla, DNA genômico, cDNA, híbridos DNA-RNA, ou um polímero composto por bases purina e pirimidina ou outras bases de nucleotídeos naturais, quimicamente ou bioquimicamente modificadas, não naturais, ou derivadas. “Oligonucleotídeo” geralmente se refere aos polinucleotídeos de entre cerca de 5 e cerca de 100 nucleotídeos de DNA de fita simples ou dupla. No entanto, para efeitos de divulgação, não há nenhum limite superior para o comprimento do oligonucleotídeo. Oligonucleotídeos são também conhecidos como “oligômeros” ou “oligos” e podem ser isolados de genes ou quimicamente sintetizados por métodos conhecidos na técnica. Os termos “polinucleotídeo” e “ácido nucleico” devem ser entendidos para incluir, conforme aplicável para as modalidades sendo descritas, polinucleotídeos de fita simples (como o senso ou antissenso) e fita dupla.
[091] Uma “estrutura em haste-alça” refere-se a um ácido nucleico, tendo uma estrutura secundária que inclui uma região de nucleotídeos, que são conhecidos ou previstos para formar uma fita dupla (porção haste) que está ligada de um lado por uma região de nucleotídeos predominantemente de fita simples (porção alça). Os termos estruturas “hairpin” e “dobra de volta” também são usadas neste documento para se referir às estruturas de haste-alça. Tais estruturas são bem conhecidas na técnica e estes termos são utilizados de forma consistente com seus significados conhecidos na técnica. Como é conhecido na técnica, uma estrutura haste-alça nao requer emparelhamento de base exato. Assim, a haste pode incluir um ou mais incompatibilidades de base. Como alternativa, o emparelhamento de base pode ser exato, ou seja, não inclui quaisquer incompatibilidades.
[092] Por “hibridizável” ou “complementares” ou “substancialmente complementares” entende-se que um ácido nucleico (por exemplo, RNA) é composto por uma sequência de nucleotídeos que permite a este uma ligação não covalentemente, ou seja, formar pares de bases Watson-Crick de e/ou pares de bases G/U, “anelar” ou “hibridizar”, para um outro ácido nucleico de uma maneira específica de sequência, antiparalela, (ou seja, um ácido nucleico especificamente se liga a um ácido nucleico complementar) nas condições in vitro e/ou in vivo adequadas de temperatura e força iônica de solução. Como é conhecido na técnica, emparelhamento de base de Watson-Crick padrão inclui: adenina (A) emparelhamento com timidina (T), adenina (A) emparelhamento com uracila (U) e guanina (G) emparelhamento com a citosina (C) [DNA, RNA]. Além disso, também é conhecido na técnica que para a hibridação entre duas moléculas de RNA (por exemplo, dsRNA), pares de base guanina (G) com uracila (U). Por exemplo, emparelhamento de base G/U é parcialmente responsável para a degeneração (ou seja, a redundância) do código genético no contexto de pareamento de base anti-códon de tRNA com códons de mRNA. No contexto de divulgação, uma guanina (G) de um segmento de ligação à proteína (dsRNA duplex) de uma molécula de RNA tendo como DNA alvo objeto é considerada complementar a uma uracila (U) e vice versa. Como tal, quando um par de base G/U pode ser preparado em uma determinada posição de nucleotídeo um segmento de ligação de proteína (dsRNA duplex) de uma molécula de RNA tendo como DNA alvo objeto, a posição não é considerada como não complementar, mas em vez disso é considerada complementar.
[093] Condições de hibridização e lavagem são bem conhecidas e exemplificadas em Sambrook, J., Fritsch, E. F. e Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (1989), particularmente o capítulo 11 e tabela 11.1 neste; e Sambrook, J. and Russell, W., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (2001). As condições de temperatura e força iônica determinam o “rigor” da hibridização.
[094] Hibridização requer que os dois ácidos nucléicos contenham sequências complementares, embora as incompatibilidades entre bases sejam possíveis. As condições adequadas para a hibridização entre dois ácidos nucleicos dependem da duração dos ácidos nucléicos e o grau de complementação, variáveis conhecidas na técnica. Quanto maior o grau de complementação entre duas sequências de nucleotídeos, maior o valor da temperatura de fusão (Tm) para híbridos ácidos nucleicos tendo essas sequências. Para hibridização entre ácidos nucleicos com trechos curtos de complementariedade (por exemplo, complementariedade, de 35 ou menos, 30 ou menos, 25 ou menos, 22, ou menos, 20 ou menos, ou 18 ou menos nucleotídeos) a posição de incompatibilidades torna-se importante (ver Sambrook et al., supra, 11.7-11.8). Tipicamente, o comprimento para um ácido nucleico hibridizável é de pelo menos cerca de 10 nucleotídeos. Comprimentos mínimos ilustrativos para um ácido nucleico hibridizável são: pelo menos cerca de 15 nucleotídeos; pelo menos cerca de 20 nucleotídeos; pelo menos cerca de 22 nucleotídeos; pelo menos cerca de 25 nucleotídeos; e pelo menos cerca de 30 nucleotídeos). Além disso, o especialista na técnica reconhecerá que a temperatura e concentração de sal na solução de lavagem podem ser ajustadas conforme necessário de acordo com fatores como o comprimento da região de complementação e o grau de complementação.
[095] Na técnica entende-se que a sequência de polinucleotídeos não precisa ser 100% complementar ao seu ácido nucleico alvo para ser especificamente hibridizável ou hibridizável. Além disso, um polinucleotídeo pode hibridizar sobre um ou mais segmentos, de modo que os segmentos adjacentes ou intermediários não estão envolvidos no evento da hibridização (por exemplo, uma estrutura de alça ou estrutura de hairpin). Um polinucleotídeo pode abranger pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos, 95%, pelo menos 99% ou 100% de complementariedade de sequência para uma região alvo dentro da sequência do ácido nucleico alvo à qual são direcionados. Por exemplo, um ácido nucleico antissenso em que 18 de 20 nucleotídeos do composto antissenso são complementares a uma região alvo e, portanto, iria hibridizar especificamente, representaria a complementariedade de 90 por cento. Neste exemplo, os nucleotídeos não complementares restantes podem ser agrupados ou interespaçados com nucleotídeos complementares e não precisam ser contíguos uns aos outros ou aos nucleotídeos complementares. Percentual de complementariedade entre trechos particulares de sequências de ácidos nucleicos dentro de ácidos nucleicos pode ser determinado rotineiramente usando programas BLAST (ferramentas de busca de alinhamento local básico) e programas PowerBLAST conhecidos na técnica (Altschul et al., J. Mol. Biol., 1990, 215, 403-410; Zhang and Madden, Genome Res., 1997, 7, 649-656) ou usando o programa Gap (pacote de análise de sequência de Wisconsin, versão 8 para Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison Wis.), usando as configurações padrões, que usam o algoritmo de Smith e Waterman U.S. Math., 1981, 2, 482-489).
[096] Os termos “peptídeo,” “polipeptídeo” e “proteína” são usados de modo intercambiável aqui e referem- se a uma forma polímero de aminoácidos de comprimento, que inclui aminoácidos codificados e não codificados, aminoácidos e polipeptídeos quimicamente ou bioquimicamente modificados ou derivatizados, tendo estrutura modificada do peptídeo.
[097] “Ligação” como usado aqui (por exemplo, com referência a um domínio de ligação do RNA de um polipeptídeo) refere-se a uma interação não covalente entre macromoléculas (por exemplo, entre uma proteína e um ácido nucleico). Enquanto em um estado de interação não covalente, as macromoléculas são ditas como estando “associadas” ou “interagindo” ou “ligadas” (por exemplo, quando uma molécula X é dita por interagir com uma molécula Y, significa que a molécula X se liga à molécula Y de forma não covalente). Nem todos os componentes de uma interação de ligação precisam ser específicos para a sequência (por exemplo, contatos com resíduos de fosfato em uma estrutura de DNA), mas algumas partes de uma interação de ligação podem ser específicas. Interações de ligação são geralmente caracterizadas por uma constante de dissociação (Kd) de menos de 10-6 M, menos de 107 M, menos de 10-8 M, menos de 10-9 M, menos de 10-10 M, menos de 10-11 M, menos de 10-12 M, menos de 10-13 M, menos de 10-14 M, oumenos de 10-15 M. “Afinidade” refere-se à força da ligação, aumento da afinidade de ligação, sendo correlacionada com uma baixa Kd.
[098] Por “domínio de ligação” entende-se um domínio da proteína que é capaz de ligar não covalentemente a outra molécula. Um domínio de ligação pode ligar para, por exemplo, uma molécula de DNA (uma proteína de ligação ao DNA), uma molécula de RNA (uma proteína de ligação ao RNA) e/ou uma molécula de proteína (uma proteína de ligação à proteína). No caso de uma proteína de ligação ao domínio de proteína, esta pode se ligar a si (para formar homodímeros, homotrímeros, etc.) e/ou pode ligar a uma ou mais moléculas de uma proteína ou proteínas diferentes.
[099] O termo “substituição de aminoácido conservado” refere-se à intercambialidade em proteínas de resíduos de aminoácidos tendo cadeias laterais semelhantes. Por exemplo, um grupo de aminoácidos com cadeias laterais alifáticas consiste em glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; consiste em um grupo de aminoácidos com cadeias laterais alifáticas-hidroxil da serina e treonina; um grupo de aminoácidos tendo amida contendo cadeias laterais consistindo em asparagina e glutamina; um grupo de aminoácidos com cadeias laterais aromáticas consiste em fenilalanina, tirosina e triptofano; um grupo de aminoácidos com cadeias laterais básicas consiste em lisina, arginina e histidina; um grupo de aminoácidos com cadeias laterais ácidas consiste em glutamato e aspartato; e consiste em um grupo de aminoácidos com enxofre contendo cadeias laterais de cisteína e a metionina. Grupos de substituição exemplares de aminoácidos conservados: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina e glutamina asparagina.
[0100] Um polinucleotídeo ou polipeptídeo tem uma certa porcentagem de “identidade de sequência” para outro polinucleotídeo ou polipeptídeo, significando que, quando alinhados, essa porcentagem de bases ou aminoácidos são os mesmos e na mesma posição relativa, comparando-se as duas sequências. Identidade de sequência pode ser determinada em um número de maneiras diferentes. Para determinar a identidade de sequência, sequências podem ser alinhadas usando vários métodos e programas de computador (por exemplo, BLAST, T-COFFEE, MUSCLE, MAFFT, etc.), disponíveis na world wide web, em sites, incluindo ncbi.nlm.nili.gov/BLAST, ebi.ac.uk/Tools/msa/tcoffee/, ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle/, mafft.cbrc.jp/alignment/software/. Ver, por exemplo, Altschul et al. (1990), J. Mol. Bioi. 215:403-10.
[0101] Uma sequência de DNA que “codifica” um determinado RNA é uma sequência de ácido nucleico de DNA que é transcrito em RNA. Um polinucleotídeo do DNA pode codificar um RNA (mRNA) que é traduzido em proteína, ou um polinucleotídeo do DNA pode codificar um RNA que não é traduzido em proteínas (por exemplo, tRNA, rRNA ou um RNA tendo como alvo DNA; também chamado de RNA “não codificante” ou “ncRNA”).
[0102] Uma “sequência de codificação de proteína” ou uma sequência que codifica uma determinada proteína ou polipeptídeo, é uma sequência do ácido nucleico que é transcrita em mRNA (no caso de DNA) e é traduzida (no caso do mRNA) em um polipeptídeo in vitro ou in vivo quando colocado sob o controle de sequências reguladoras apropriadas. Os limites da sequência de codificação são determinados por um códon de início no terminal 5' (N- terminal) e um códon de parada de tradução no terminal 3' (C- terminal). Uma sequência codificante pode incluir, entre outras, cDNA de mRNA procariotas ou eucariotas, sequências de DNA genômicos de DNA procariota ou eucariota e síntese de ácidos nucleicos. Uma sequência de terminação da transcrição geralmente será localizada em 3' para a sequência de codificação.
[0103] Como usado aqui, uma “sequência promotora” é uma região reguladora de DNA capaz de ligação a RNA polimerase e iniciar a transcrição de codificação à jusante (direção 3') ou sequência não codificante. Para fins de definição da presente invenção, a sequência promotora é limitada no seu terminal 3' pelo sítio de iniciação da transcrição e estende à montante (5' direção) para incluir o número mínimo de bases ou elementos necessários para iniciar a transcrição em níveis detectáveis acima do fundo. Dentro da sequência promotora será encontrado um sítio de iniciação da transcrição, bem como os domínios de ligação da proteína responsáveis para a ligação da RNA polimerase. Promotores eucarióticos irão frequentemente, mas nem sempre, conter caixas de “TATA” e “CAT”. Vários promotores, incluindo promotores induzíveis, podem ser utilizados para conduzir os vários vetores da presente invenção.
[0104] Um promotor pode ser um promotor constitutivamente ativo (ou seja, um promotor que é constitutivamente em um estado ativo/”ON”), pode ser um promotor induzível (ou seja, um promotor cujo estado, ativo/“ON” ou inativo/“OFF”, é controlado por um estímulo externo, por exemplo, a presença de uma determinada temperatura, composto ou proteína.), pode ser um promotor espacialmente restrito (ou seja, elemento de controle de transcrição, etc.) (por exemplo, promotor específico de tecido, promotor específico de tipo de célula, etc.), e pode ser um promotor temporalmente restrito (ou seja, o promotor está no estado “ON” ou estado “OFF” durante as fases específicas do desenvolvimento embrionário ou durante as fases específicas de um processo biológico, por exemplo, ciclo de folículo piloso em camundongos).
[0105] Promotores apropriados podem ser derivados de vírus e, portanto, podem ser referidos como promotores virais, ou podem ser derivados de qualquer organismo, incluindo organismos procariotas ou eucariotas. Promotores apropriados podem ser usados para dirigir a expressão por qualquer RNA polimerase (por exemplo, pol I, pol II, pol III). Promotores exemplares incluem, entre outros, ao promotor precoce SV40, promotor de repetição de terminal longo de vírus do tumor mamário de camundongos (LTR) mouse; promotor tardio de adenovírus principal (Ad MLP); um promotor de vírus herpes simplex (HSV), um promotor de citomegalovírus (CMV) como região promotora precoce de início imediato de CMV (CMVIE), um promotor de vírus rous sarcoma (RSV), um promotor nuclear pequeno U6 humano (U6) (Miyagishi et al, Nature Biotechnology 20, 497-500 (2002)), um promotor de U6 aprimorado (por exemplo, Xia et al., Nucleic Acids Res. 2003 Sep 1;31(17)), um promotor humano H1 (H1) e semelhantes.
[0106] Exemplos de promotores induzíveis incluem, entre outros ao promotor RNA polimerase T7, promotor RNA polimerase T3, promotor regulado por isopropil-beta-D- tiogalactopiranosídeo (IPTG), promotor induzido por lactose, promotor de choque do calor, promotor regulado por tetraciclina, promotor regulado por esteroide, promotor regulado por metal, promotor regulado por receptor de estrogênio, etc. Promotores induzíveis, portanto, podem ser regulados por moléculas, incluindo, entre outras,doxiciclina; RNA polimerase, por exemplo, RNA polimerase T7;um receptor de estrogênio; uma fusão de receptor de estrogênio; etc.
[0107] Em algumas modalidades, o promotor é um promotor espacialmente restrito (ou seja, promotor específico de tipo de célula, promotor específico de tecido, etc.), tal que em um organismo multicelular, o promotor está ativo (isto é, “ON”) em um subconjunto de células específicas. Promotores espacialmente restritos também podem ser referidos como potencializadores, elementos de controle de transcrição, sequências de controle, etc. Qualquer promotor espacialmente restrito conveniente pode ser usado e a escolha do promotor apropriado (por exemplo, um promotor específico do cérebro, um promotor que direciona a expressão em um subconjunto de neurônios, um promotor que impulsiona a expressão na linhagem germinativa, um promotor que direciona a expressão nos pulmões, um promotor que direciona a expressão nos músculos, um promotor que direciona a expressão em células das ilhotas do pâncreas, etc.) vai depender do organismo. Por exemplo, vários promotores espacialmente restritos são conhecidos para plantas, moscas, minhocas, mamíferos, camundongos, etc. Assim, um promotor espacialmente restrito pode ser usado para regular a expressão de um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo de modificação de sítio objeto em uma ampla variedade de tecidos diferentes e tipos de células, dependendo do organismo. Alguns promotores espacialmente restritos também são temporalmente restritos, tal que o promotor está no estado “ON” ou estado “OFF” durante fases específicas do desenvolvimento embrionário ou durante as fases específicas de um processo biológico (por exemplo, folículo piloso ciclo em camundongos).
[0108] Para fins de ilustração, exemplos de promotores espacialmente restritos incluem, entre outros, promotores específicos de neurônio, promotores específicos dos adipócitos, promotores específicos de cardiomiócito, promotores específicos de músculo liso, promotores específicos de fotorreceptores, etc. Promotores espacialmente restritos específicos de neurônios incluem, entre outros, um promotor de enolase específico de neurônio (NSE) (ver, por exemplo, EMBL HSENO2, X51956); um promotor de aminoácido aromático descarboxilase (AADC); um promotor de neurofilamento (ver, por exemplo, GenBank HUMNFL, L04147); um promotor sinapsina (ver, por exemplo, GenBank HUMSYNIB, M55301); um promotor de thy-1 (ver, por exemplo, Chen et al. (1987) Cell 51:7-19; e Llewellyn, et al. (2010) Nat. Med. 16(10):1161-1166); um promotor de receptores de serotonina (ver, por exemplo, GenBank S62283); promotor tirosina hidroxilase (TH) (ver, por exemplo, Oh et al. (2009) Gene Ther 16:437; Sasaoka et al. (1992) Mol. Brain Res. 16:274; Boundy et al. (1998) J. Neurosci. 18:9989; e Kaneda et al. (1991) Neuron 6:583-594); um promotor de GnRH (ver, por exemplo, Radovick et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:3402-3406); um promotor de L7 (ver, por exemplo, Oberdick et al. (1990) Science 248:223-226); um promotor DNMT (ver, por exemplo, Bartge et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:3648-3652); um promotor de encefalina (ver, por exemplo, Comb et al. (1988) EMBO J. 17:3793-3805); um promotor de mielina proteína básica (MBP); um promotor de proteína quinase II-alfa dependente de Ca2+-calmodulina (CamKIIα) (ver, por exemplo, Mayford et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:13250; e Casanova et al. (2001) Genesis 31:37); um promotor de fator de crescimento derivado de plaqueta β/potencializador de CMV (ver, por exemplo, Liu et al. (2004) Gene Therapy 11:52-60); e semelhantes.
[0109] Promotores específicos dos adipócitos espacialmente restritos incluem, entre outros, um promotor/potencializador de gene aP2, por exemplo, uma região de-5,4 kb para + 21 bp de um gene humano aP2 (ver, por exemplo, Tozzo et al. (1997) Endocrinol. 138:1604; Ross et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:9590; and Pavjani et al. (2005) Nat. Med. 11:797); um promotor de transportador de glicose 4 (GLUT4) (ver, por exemplo, Knight et al. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:14725); um promotor de ácido graxo translocase (FAT/CD36) (ver, por exemplo, Kuriki et al. (2002) Biol. Pharm. Bull. 25:1476; e Sato et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:15703); um promotor de estearoli-CoA desaturase-1 (SCD1) (Tabor et al. (1999) J. Biol. Chem. 274:20603); um promotor de leptina (ver, por exemplo, Mason et al. (1998) Endocrinol. 139:1013; e Chen et al. (1999) Biochem. Biophys. Res. Comm. 262:187); um promotor de adiponectina (ver, por exemplo, Kita et al. (2005) Biochem. Biophys. Res. Comm. 331:484; e Chakrabarti (2010) Endocrinol. 151:2408); um promotor de adipsina (ver, por exemplo, Platt et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:7490); um promotor resistina (ver, por exemplo, Seo et al. (2003) Molec. Endocrinol. 17:1522); e semelhantes.
[0110] Promotores específicos de cardiomiócitos espacialmente restritos incluem, entre outros para sequências de controle derivadas dos seguintes genes: cadeia leve de miosina-2, cadeia pesada de α-miosina, AE3, troponina cardíaca C, actina cardíaca e semelhantes. Franz et al. (1997) Cardiovasc. Res. 35:560-566; Robbins et al. (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci. 752:492-505; Linn et al. (1995) Circ. Res. 76:584-591; Parmacek et al. (1994) Mol. Cell. Biol. 14:1870-1885; Hunter et al. (1993) Hypertension 22:608-617; e Sartorelli et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4047-4051.
[0111] Promotores de músculo liso específicos espacialmente restritos incluem, entre outros, um promotor de SM22α (ver, por exemplo, Akyurek et al (2000) Mol. Med. 6:983; e Patente US 7.169.874); um promotor smootelina (Ver, por exemplo, WO 2001/018048); um promotor de actina de músculo liso-α; e semelhantes. Por exemplo, uma região de 0,4 kb do promotor SM22α, dentro do qual estão dois elementos de CArG, demonstrou mediar a expressão específica de células do músculo liso vascular (ver, por exemplo, Kim, et al. (1997) Mol. Cell. Biol. 17, 2266-2278; Li, et al., (1996) J. Cell Biol. 132, 849-859; e Moessler, et al. (1996) Development 122, 2415-2425).
[0112] Promotores espacialmente restritos específicos de fotorreceptores incluem, entre outros, um promotor de rodopsina; promotor rodopsina quinase (Young et al. (2003) Ophthalmol. Vis. Sci. 44:4076); um promotor de gene beta fosfodiesterase (Nicoud et al. (2007) J. Gene Med. 9:1015); um promotor do gene de retinite pigmentosa (Nicoud et al. (2007) supra); um intensificador de gene de proteína de ligação de retinoide interfotorreceptor (IRBP) (Nicoud et al. (2007) supra); um promotor do gene IRBP (Yokoyama et al. (1992) Exp Eye Res. 55:225); e semelhantes.
[0113] Os termos “sequências reguladoras de DNA”, “elementos de controle” e “elementos reguladores,” usados de modo intercambiável aqui, se referem às sequências de controle de transcrição e de tradução, como promotores, potencializadores, sinais de poliadenilação, terminadores, sinais de degradação de proteínas e semelhantes, que fornecem para e/ou regular a transcrição de uma sequência não codificante (por exemplo, RNA tendo como alvo DNA) ou uma sequência codificante (por exemplo, polipeptídeo modificador direcionado ao sítio ou polipeptídeo Cas9/Csn1) e/ou regular a tradução de um polipeptídeo codificado.
[0114] O termo “de ocorrência natural” ou “não modificado” como usado aqui como aplicado a um ácido nucleico, um polipeptídeo, uma célula ou um organismo, refere-se a um ácido nucleico, polipeptídeo, célula ou organismo que é encontrado na natureza. Por exemplo, uma sequência de polipeptídeo ou polinucleotídeo que está presente em um organismo (incluindo vírus) que pode ser isolada de uma fonte na natureza e que não foi intencionalmente modificada por um humano no laboratório é natural.
[0115] O termo “quimérico” como usado aqui como aplicado a um ácido nucleico ou polipeptídeo refere-se a dois componentes que são definidos por estruturas derivadas de fontes diferentes. Por exemplo, onde “quimérico” é usado no contexto de um polipeptídeo quimérico (por exemplo, uma proteína Cas9/Csn1 quimérica), o polipeptídeo quimérico inclui sequências de aminoácidos que são derivadas de polipeptídeos diferentes. Um polipeptídeo quimérico pode incluir qualquer sequência de polipeptídeo modificada ou de ocorrência natural (por exemplo, uma primeira sequência de aminoácidos de uma proteína Cas9/Csn1 modificada ou não modificada; e uma segunda sequência de aminoácidos que não seja a proteína Cas9/Csn1). Da mesma forma, “quimérico” no contexto de um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo quimérico inclui sequências de nucleotídeos derivadas de diferentes regiões de codificação (por exemplo, uma primeira sequência de nucleotídeo que codifica uma proteína de Cas9/Csn1 modificada ou não modificada; e uma segunda sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que não seja uma proteína Cas9/Csn1).
[0116] O termo “polipeptídeo quimérico” refere- se a um polipeptídeo que é feito pela combinação (isto é, “fusão”) de outros dois segmentos separados de sequência amino, geralmente por meio de intervenção humana. Um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos quiméricos é um polipeptídeo quimérico. Alguns polipeptídeos quiméricoes podem ser referidos como “variantes da fusão.”
[0117] “Heterólogo”, como usado aqui, significa uma sequência de nucleotídeo ou polipeptídeo que não se encontra no ácido nucleico ou proteína nativos, respectivamente. Por exemplo, em uma proteína Cas9/Csn1 quimérica, o domínio de ligação do RNA de um polipeptídeo de Cas9/Csn1 bacteriano naturalmente (ou uma variante do mesmo) pode ser fundido a uma sequência heteróloga do polipeptídeo (ou seja, uma sequência de polipeptídeo de uma proteína diferente de Cas9/Csn1 ou uma sequência de polipeptídeo de outro organismo). A sequência do polipeptídeo heteróloga pode apresentar uma atividade (por exemplo, atividade enzimática) que também será apresentada pela proteína Cas9/Csn1 quimérica (por exemplo, atividade metiltransferase, atividade da acetiltransferase, atividade da quinase, atividade ubiquitinação, etc.). Uma sequência do ácido nucleico heteróloga pode estar ligada a uma sequência do ácido nucleico de ocorrência natural (ou uma variante do mesmo) (por exemplo, por engenharia genética) para gerar uma sequência de nucleotídeo quimérico que codifica um polipeptídeo quimérico. Como outro exemplo, em um polipeptídeo direcionado ao sítio de Cas9 variante de fusão, um polipeptídeo direcionado ao sítio de Cas9 variante pode ser fundido a um polipeptídeo heterólogo (ou seja, um polipeptídeo diferente de Cas9), que apresenta uma atividade que também será exibida pelo polipeptídeo direcionado ao sítio Cas9 de variante de fusão. Uma sequência do ácido nucleico heterólogo pode estar ligada a um polipeptídeo direcionado ao sítio Cas9 variante (por exemplo, por engenharia genética) para gerar uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo direcionado ao sítio Cas9 variante de fusão.
[0118] “Recombinante”, como usado aqui, significa que um ácido nucleico particular (DNA ou RNA) é o produto de várias combinações de clonagem, restrição, reação em cadeia da polimerase (PCR) e/ou etapas de ligadura, resultando em uma construção, tendo uma sequência de codificação ou não codificação estrutural distinguível de ácidos nucleicos endógenos encontrados em sistemas naturais. Sequências de DNA que codificam polipeptídeos podem ser montadas a partir de fragmentos de cDNA ou de uma série de oligonucleotídeos sintéticos, para fornecer um ácido nucleico sintético, que é capaz de ser expresso de uma unidade de transcricao recombinante contida em uma célula ou em um sistema de tradução e transcrição livre de célula. DNA genômico, compreendendo as sequências relevantes também pode ser usado na formação de um gene recombinante ou unidade transcricional. Sequências de DNA não traduzidas podem ser presente 5' ou 3' da região de leitura aberta, onde tais sequências não interferem com a manipulação ou expressão das regiões de codificação e de fato podem agir para modular a produção de um produto desejado por vários mecanismos (ver “Sequências reguladoras de DNA”, abaixo). Como alternativa, sequências de DNA que codificam RNA (por exemplo, RNA tendo como alvo DNA) que não é traduzido também podem ser consideradas recombinantes. Assim, por exemplo, o termo ácido nucleico “recombinante” refere-se a um que não é de ocorrência natural, por exemplo, feito pela combinação artificial de dois outros segmentos separados da sequência por meio de intervenção humana. Esta combinação artificial é muitas vezes realizada por qualquer meio de síntese química, ou pela manipulação artificial de segmentos isolados de ácidos nucleicos, por exemplo, através de técnicas de engenharia genética. Isto é normalmente feito para substituir um códon com um códon que codifica o mesmo aminoácido, um aminoácido conservado ou um aminoácido não conservado. Como alternativa, é realizado para unir segmentos de ácido nucleico de funções desejadas para gerar uma combinação desejada de funções. Esta combinação artificial é muitas vezes realizada por qualquer meio de síntese química, ou pela manipulação artificial de segmentos isolados de ácidos nucleicos, por exemplo, através de técnicas de engenharia genética. Quando um polinucleotídeo recombinante codifica um polipeptídeo, a sequência do polipeptídeo codificada pode ser de ocorrência natural (“tipo selvagem”) ou pode ser uma variante (por exemplo, um mutante) da sequência de ocorrência natural. Assim, o termo polipeptídeo “recombinante” não necessariamente se refere a um polipeptídeo cuja sequência não ocorre naturalmente. Em vez disso, um polipeptídeo “recombinante” é codificado por uma sequência de DNA recombinante, mas a sequência do polipeptídeo pode ser de ocorrência natural (“tipo selvagem”) ou não natural (por exemplo, uma variante, um mutante, etc.). Assim, um polipeptídeo “recombinante” é o resultado da intervenção humana, mas pode ser uma sequência de aminoácidos naturais.
[0119] Um “vetor” ou “vetor de expressão” é um replicon, como o plasmídeo, fago, vírus ou cosmídeo, para o qual outro segmento de DNA, ou seja, uma “inserção” pode ser ligada a fim de realizar a replicação do segmento anexado em uma célula.
[0120] Um “cassete de expressão” é composto por um DNA que codifica a sequência operacionalmente ligada a um promotor. “Operacionalmente ligado” refere-se a uma justaposição, em que os componentes assim descritos estão em uma relação permitindo que funcionem em sua forma pretendida. Por exemplo, um promotor é operacionalmente ligado à sequência de codificação se o promotor afeta sua transcrição ou expressão.
[0121] Os termos “vetor de expressão recombinante”, ou “construção de DNA” são usados de modo intercambiável aqui para se referir a uma molécula de DNA compreendendo um vetor e pelo menos uma inserção. Vetores de expressão recombinante são geralmente gerados com a finalidade de expressar e/ou a propagar as inserções, ou para a construção de outras sequências de nucleotídeos recombinantes. As inserções podem ou não estar operacionalmente associadas a uma sequência promotora e podem ou não estar operacionalmente ligadas às sequências reguladoras de DNA.
[0122] Uma célula foi “geneticamente modificada” ou “transformada” ou “transfectada” pelo DNA exógeno, por exemplo, um vetor de expressão recombinante, quando tal DNA foi introduzido dentro da célula. A presença do DNA exógeno resulta em mudança genética permanente ou transitória. O DNA de transformação pode ou não ser integrado (covalentemente ligado) no genoma da célula. Em células procariotas, de levedura e de mamíferos, por exemplo, o DNA de transformação pode ser mantido em um elemento epissomal como um plasmídeo. No que diz respeito às células eucarióticas, uma célula transformada de modo estável é uma no qual o DNA de transformação foi integrado em um cromossomo de modo que é herdado por células filhas através da replicação do cromossomo. Esta estabilidade é demonstrada pela capacidade da célula eucariótica em estabelecer linhagens de célula ou clones que compõem uma população de células filhas que contêm o DNA de transformação. Um “clone” é uma população de células derivadas de uma única célula ou ancestral comum por mitose. Uma “linhagem de célula” é um clone de uma célula primária que é capaz de um crescimento estável in vitro por muitas gerações.
[0123] Métodos apropriados de modificação genética (também referidos como “transformação”) incluem, por exemplo, infecção viral ou do bacteriófago, transfecção, conjugação, fusão de protoplastos, lipofecção, eletroporação, precipitação de fosfato de cálcio, transfecção mediada por polietilenoimina (PEI), transfecção mediada por DEAE- dextrano, transfecção mediada por lipossomas, tecnologia pistola de partículas, precipitação de fosfato de cálcio, micro injeção direta, liberação de ácido nucleico mediada por nanopartículas (ver, por exemplo, Panyam et., al Adv Drug Deliv Rev. 2012 Sep 13. pii: S0169-409X(12)00283-9. doi: 10.1016/j.addr.2012.09.023 ), e semelhantes.
[0124] A escolha do método de modificação genética é geralmente depende do tipo de célula sendo transformada e as circunstâncias sob as quais a transformação está ocorrendo (por exemplo, em vitro e ex vivo, ou in vivo). Uma discussão geral desses métodos pode ser encontrada em Ausubel, et al., Short Protocols in Molecular Biology, 3rd ed., Wiley & Sons, 1995.
[0125] Um “DNA alvo” como usado aqui é um polinucleotídeo do DNA que compreende um “sítio alvo” ou “sequência de destino”. Os termos “sítio de destino” ou “sequência de destino” ou “protoespaçador DNA alvo” são usados de modo intercambiável aqui para se referir a uma sequência de ácido nucleico presente em um DNA alvo ao qual um segmento de direcionamento ao DNA objeto de um RNA tendo como DNA alvo ligará (ver Figura 1 e figura 39), contanto que existam condições suficientes para ligação. Por exemplo, o sítio alvo (ou sequência alvo) 5'-GAGCATATC-3' (SEQ ID NO: //) dentro de um DNA alvo é direcionado por (ou está ligada por, ou hibridiza com ou é complementar a) sequência de RNA 5'-GAUAUGCUC-3' (SEQ ID NO: //). Condições adequadas de ligação de DNA/RNA incluem condições fisiológicas normalmente presentes em uma célula. Outras condições de ligação de DNA/RNA apropriadas (por exemplo, condições em um sistema livre de células) são conhecidas na técnica; ver, por exemplo, Sambrook, supra. A fita do DNA que é complementar a e hibridiza com o RNA tendo como DNA alvo é referida como a “fita complementar” e a fita do DNA que é complementar à “fita complementar” (e, portanto, não é complementar ao RNA que tem DNA como alvo) é referida como a “fita não complementar” ou “fita não complementare” (ver figura 12).
[0126] Por “polipeptídeo modificador direcionado ao sítio” ou “polipeptídeo direcionado ao sítio de ligação de RNA” ou “polipeptídeo modificador direcionado ao sítio de ligação ao RNA” ou “polipeptídeo direcionado ao sítio” significam um polipeptídeo que liga o RNA e é direcionado à sequência específica de DNA. Um polipeptídeo modificador direcionado ao sítio conforme descrito aqui é direcionado para uma sequência específica de DNA pela molécula de RNA à qual está ligado. A molécula de RNA é composta por uma sequência que é complementar a uma sequência alvo dentro do DNA alvo, direcionando, assim, o polipeptídeo acoplado a um local específico dentro do DNA alvo (a sequência alvo).
[0127] Por “clivagem” entende-se a ruptura da estrutura de uma molécula de DNA covalente. Clivagem pode ser iniciada por uma variedade de métodos, incluindo, entre outras, hidrólise enzimática ou química de uma ligação fosfodiéster. Tanto a clivagem de filamento único quanto a clivagem de filamento duplo são possíveis, e a clivagem de filamento duplo pode ocorrer como um resultado de dois eventos distintos de clivagem de filamento único. A clivagem de DNA pode resultar na produção ou de extremidades abruptas ou extremidades irregulares. Em determinadas modalidades, um complexo que inclui um RNA tendo como DNA alvo e um polipeptídeo modificador direcionado ao sítio é usado para clivagem de DNA dupla-hélice alvo.
[0128] “Nuclease” e “endonuclease” são usados de modo intercambiável aqui para significar uma enzima que possui atividade catalítica para clivagem de DNA.
[0129] Por “domínio de clivagem” ou “domínio ativo” ou “domínio de nuclease” de uma nuclease entende-se a sequência de polipeptídeo ou domínio dentro da nuclease que possui atividade catalítica para clivagem de DNA. Um domínio de clivagem pode estar contido em uma cadeia única de polipeptídeo ou atividade de clivagem pode resultar da associação de dois (ou mais) polipeptídeos. Um domínio único de nuclease pode consistir em mais de um trecho isolado de aminoácidos dentro de um determinado polipeptídeo.
[0130] A molécula de RNA que liga o polipeptídeo modificador direcionado ao sítio e alveja o polipeptídeo para um local específico dentro do DNA alvo é referida aqui como o “RNA que tem DNA como alvo” ou “polinucleotídicas de RNA que tem DNA como alvo” (também referido aqui como um “guia de RNA” ou “gRNA”). Um RNA tendo como DNA alvo objeto é composto por dois segmentos, um “segmento direcionado ao DNA” e um “segmento de proteína de ligação.” Por “segmento” entende-se um segmento/seção/região de uma molécula, por exemplo, um trecho contíguo de nucleotídeos em um RNA. Um segmento pode também significar uma região/seção de um complexo, de tal modo que um segmento pode incluir regiões de mais de uma molécula. Por exemplo, em alguns casos, o segmento de proteína de ligação (descrito abaixo) de um RNA tendo como alvo DNA é uma molécula de RNA e o segmento de ligação à proteína compreende, portanto, uma região dessa molécula de RNA. Em outros casos, o segmento de ligação à proteína (descrito abaixo) de um RNA tendo DNA como alvo é composto por duas moléculas separadas que são hibridizadas ao longo de uma região de complementariedade. Como um exemplo ilustrativo, não limitante, um segmento de ligação à proteína de um RNA tendo como alvo DNA que compreende duas moléculas separadas pode incluir (i) pares de base 40-75 de uma primeira molécula de RNA que é 100 pares de base de comprimento; e (ii) pares de base 10-25 de uma segunda molécula de RNA que tem 50 pares de bases de comprimento. A definição de “segmento”, a menos que especificamente definido em contrário em um contexto particular, não está limitada a um número específico de pares de bases total, não está limitada a qualquer determinado número de pares de bases de uma determinada molécula de RNA, não está limitada a um determinado número de moléculas separadas dentro de um complexo e pode incluir regiões de moléculas de RNA que são de comprimento total e podem ou não incluir as regiões com complementariedade com outras moléculas.
[0131] Segmento tendo como alvo o DNA (ou “sequência tendo como alvo o DNA”) é composto por uma sequência de nucleotídeos que é complementar a uma sequência específica dentro de um DNA alvo (a fita complementar do DNA alvo). O segmento de ligação à proteína (ou “sequência de ligação à proteína”) interage com um polipeptídeo modificador direcionado ao sítio. Quando o polipeptídeo modificador direcionado ao sítio é um Cas9 ou polipeptídeo relacionado a Cas9 (descrito em mais detalhes abaixo), clivagem específica de sítio do DNA ocorre em locais determinados por ambos (i) pareamento de base complementar entre o RNA tendo DNA como alvo e o DNA alvo; (ii) um curto motif (referido como o motif adjacente a protoespaçador (PAM)) no DNA do alvo.
[0132] O segmento de ligação à proteína de um RNA tendo como alvo DNA objeto é composto por dois trechos complementares de nucleotídeos que hibridizam a outro para formar um duplex de RNA de fita dupla (duplex do dsRNA).
[0133] Em algumas modalidades, um ácido nucleico objeto (por exemplo, um RNA tendo DNA como alvo, um ácido nucleico constituído por uma sequência de nucleotídeos de codificação de um RNA tendo DNA como alvo; um ácido nucleico de codificação de um polipeptídeo direcionado ao sítio; etc.) compreende uma modificação ou sequência que fornece para uma característica desejável adicional (por exemplo, estabilidade modificada ou regulada; direcionamento subcelular; rastreamento, por exemplo, um marcador fluorescente, um sítio de ligação para uma proteína ou complexa de proteína; etc.). Exemplos não limitantes incluem: um cap 5' (por exemplo, um 7-metilguanilato cap (m7G)); uma cauda poliadenilada 3' (ou seja, uma cauda 3' poli (A)); uma sequência de riboswitch (por exemplo, para permitir a estabilidade regulada e/ou acessibilidade regulada por proteínas e/ou complexos de proteína); uma sequência de controle de estabilidade; uma sequência que forma um dsRNA duplex (ou seja, um hairpin)); uma modificação ou sequência que tem como alvo o RNA para uma localização subcelular (por exemplo, núcleo, mitocôndrias, cloroplastos e semelhantes); uma modificação ou sequência que prevê rastreamento (por exemplo, conjugação direta de uma molécula fluorescente, conjugação a uma fração que facilita a detecção fluorescente, uma sequência que permite a detecção fluorescente, etc.); uma modificação ou sequência que fornece um sítio de ligação para proteínas (por exemplo, as proteínas que atuam no DNA, incluindo ativadores transcricionais, repressores transcricionais, DNA metiltransferases, DNA demetilases, histona acetiltransferases, histona deacetilases e semelhantes); e suas combinações.
[0134] Em algumas modalidades, um RNA tendo DNA como alvo compreende um segmento adicional na extremidade 5' ou 3' que fornece para qualquer das características descritas acima. Por exemplo, um terceiro segmento apropriado pode incluir um 5' cap (por exemplo, um 7-metilguanilato cap (m7G)); uma cauda de poliadenilada 3' (ou seja, uma 3' cauda poli (A)); uma sequência de riboswitch (por exemplo, para permitir a estabilidade regulada e/ou acessibilidade regulada por proteínas e complexos de proteína); uma sequência de controle de estabilidade; uma sequência que forma um dsRNA duplex (ou seja, um hairpin)); uma sequência que tem como alvo o RNA para uma localização subcelular (por exemplo, núcleo, mitocôndrias, cloroplastos e semelhantes); uma modificação ou sequência que prevê rastreamento (por exemplo, conjugação direta de uma molécula fluorescente, conjugação de uma fração que facilita detecção fluorescente, uma sequência que permite a detecção fluorescente, etc.); uma modificação ou sequência que fornece um sítio de ligação para proteínas (por exemplo, as proteínas que atuam sobre o DNA, incluindo ativadores transcricionais, repressors transcricionais, DNA metiltransferases, DNA demetilases, histona acetiltransferases, histona deacetilases e semelhantes); e suas combinações.
[0135] O RNA tendo DNA como alvo objeto e um polipeptídeo modificador direcionado ao sítio objeto (ou seja, polipeptídeo direcionado ao sítio) formam um complexo (ou seja, se ligam via interações não covalentes). O RNA tendo DNA como alvo fornece especificidade alvo para o complexo, composto por uma sequência de nucleotídeos que é complementar a uma sequência de DNA alvo. O polipeptídeo modificador direcionado ao sítio do complexo fornece a atividade específica do sítio. Em outras palavras, o polipeptídeo modificador direcionado ao sítio é guiado para uma sequência de DNA alvo (por exemplo, uma sequência alvo em um ácido nucleico cromossômico; uma sequência alvo em um ácido nucleico extracromossômico, por exemplo, um ácido nucleico epissomal, minicírcilo, etc.; uma sequência alvo do ácido nucleico mitocondrial; uma sequência alvo do ácido nucleico de cloroplasto; uma sequência alvo em um plasmídeo; etc.) em virtude de sua associação com o segmento de ligação à proteína do RNA tendo DNA como alvo.
[0136] Em algumas modalidades, um RNA tendo DNA como alvo objeto é composto por duas moléculas de RNA separadas (polinucleotídeo de RNA: um “RNA ativador” e um “RNA direcionador”, ver abaixo) e é referido aqui como um “RNA tendo DNA molécula dupla como alvo” ou um “RNA tendo DNA duas moléculas como alvo.” Em outras modalidades, o RNA tendo DNA como alvo objeto é uma única molécula de RNA (polinucleotídeo de RNA único) e é referido como um “RNA tendo DNA uma molécula como alvo,” um “RNA único-guia”, ou um “sgRNA”. O termo “RNA tendo DNA como alvo” ou “gRNA” é abrangente, referindo-se tanto para RNA tendo DNA de molécula dupla como alvo e RNA tendo DNA de molécula única como alvo (ou seja, sgRNAs).
[0137] Um exemplar do RNA tendo DNA de duas moléculas como alvo é composto por uma molécula tipo crRNA (“CRISPR RNA” ou “RNA direcionador” ou “crRNA” ou “crRNA de repetição”) e uma correspondente molécula tipo tracrRNA (“trans-atuação CRISPR RNA” ou “RNA ativador” ou “tracrRNA”). Uma molécula tipo crRNA (RNA direcionador) compreende ambos segmentos de direcionamento ao DNA (fita simples) do RNA tendo DNA como alvo e um trecho (“segmento formando duplex”) de nucleotídeos que forma metade de dsRNA duplex do segmento ligação à proteína do RNA tendo DNA como alvo. Uma molécula tipo tracrRNA correspondente (RNA ativador) compreende um trecho de nucleotídeos (segmento formando duplex) que forma a outra metade do duplex dsRNA do segmento de ligação à proteína do RNA tendo DNA como alvo. Em outras palavras, um trecho de nucleotídeos de uma molécula tipo crRNA é complementar a e hibridiza com um trecho de nucleotídeos de uma molécula tipo tracrRNA para formar o dsRNA duplex do domínio da ligação à proteína do RNA tendo DNA como alvo. Como tal, cada molécula tipo crRNA pode ser dito como tendo uma molécula tipo tracrRNA correspondente. A molécula de tipo crRNA, além disso, fornece o segmento direcionado ao DNA de fita dupla. Assim, uma molécula tipo crRNA e tipo tracrRNA (como um par correspondente) hibridizam para formar um RNA tendo DNA como alvo. A sequência exata de uma determinada molécula de crRNA ou tracrRNA é característica da espécie em que as moléculas de RNA são encontradas. Vários crRNAs e tracrRNAs são retratados em pares complementares correspondentes nas Figuras 8. Um RNA tendo DNA de molécula dupla como alvo objeto pode abranger qualquer par correspondente crRNA e tracrRNA. Um RNA tendo DNA de molécula dupla como alvo objeto pode abranger qualquer par correspondente crRNA e tracrRNA.
[0138] O termo “RNA ativator” é usado aqui para significar uma molécula tipo tracrRNA de um RNA tendo DNA de molécula dupla como alvo. O termo “RNA direcionador” é usado aqui para significar uma molécula tipo crRNA de um RNA tendo DNA de molécula dupla como alvo. O termo “segmento formador de duplex” é usado aqui para significar o trecho de nucleotídeos de um RNA ativador ou um RNA direcionador que contribui para a formação da duplex do dsRNA por hibridização para um trecho de nucleotídeos de um RNA ativador correspondente ou a molécula de RNA direcionador. Em outras palavras, um RNA ativador compreende um segmento formador de duplex complementar ao segmento formador de duplex do RNA direcionador correspondente. Como tal, um RNA ativador compreende um segmento formador de duplex enquanto um RNA direcionador compreende ambos um segmento formador de duplex e o segmento direcionado ao DNA do RNA tendo DNA como alvo. Portanto, um RNA tendo DNA de molécula dupla como alvo objeto pode ser composto de qualquer correspondente par RNA ativador e RNA direcionador.
[0139] Uma “célula hospedeira,” como usado aqui, denota uma célula eucariótica in vivo ou in vitro, uma célula procariótica (por exemplo, a célula bacteriana ou archaea) ou uma célula de um organismo multicelular (por exemplo, uma linhagem celular) cultivada como uma entidade unicelular, cujas células procarióticas ou eucarióticas podem ser, ou foram, usadas como receptoras para ácidos nucleicos e incluem a descendência da célula original, que foi transformada pelo ácido nucleico. Entende-se que a descendência de uma única célula pode não ser necessariamente completamente idêntica em morfologia ou em complemento de DNA genômico ou total como o parental original, devido à mutação natural, acidental ou deliberada. Uma “célula hospedeira recombinante” (também referida como uma “célula hospedeira geneticamente modificada”) é uma célula hospedeira, na qual foi introduzido um ácido nucleico heterólogo, por exemplo, um vetor de expressão. Por exemplo, uma célula hospedeira bacteriana objeto é uma célula hospedeira bacteriana geneticamente modificada em virtude da introdução em uma célula hospedeira bacteriana apropriada de um ácido nucleico exógeno (por exemplo, um plasmídeo ou vetor de expressão recombinante) e uma célula hospedeira eucariótica objeto é uma célula hospedeira eucariota geneticamente modificada (por exemplo, células germinativas de mamíferos), em virtude da introdução em uma célula hospedeira eucariótica apropriada de um ácido nucleico exógeno.
[0140] O termo “célula-tronco” é usado aqui para se referir a uma célula (por exemplo, células-tronco de planta, células-tronco de vertebrados) que tem a capacidade de se auto renovar e gerar um tipo de célula diferenciada (ver Morrison et al. (1997) Cell 88:287-298). No contexto da célula ontogenia, o adjetivo “diferenciada” ou “diferenciação” é um termo relativo. Uma “célula diferenciada” é uma célula que tem progredido ainda sob a via do desenvolvimento do que a célula que está sendo comparado com. Assim, células-tronco pluripotentes (descritas abaixo) pode se diferenciar em células progenitoras restritas de linhagem (por exemplo, células-tronco mesodérmicas), que por sua vez podem se diferenciar em células que são mais restritas (por exemplo, progenitores de neurônio), que pode se diferenciar em células de fase final (ou seja, células diferenciadas terminais, por exemplo, os neurônios, cardiomiócitos, etc.), que desempenham um papel característico em um determinado tipo de tecido e podem ou não podem manter a capacidade de se proliferarem ainda mais. Células-tronco podem ser caracterizadas pela presença de marcadores específicos (por exemplo, proteínas, RNAs, etc.) e a ausência de marcadores específicos. Células-tronco também podem ser identificadas por ensaios funcionais in vitro e in vivo, particularmente os ensaios relativos à capacidade de células-tronco em dar origem a vários descendentes diferenciados.
[0141] Células-tronco de interesse incluem as células-tronco pluripotentes (PSCs). O termo “células-tronco pluripotentes” ou “PSC” é usado aqui para significar uma célula-tronco capaz de produzir todos os tipos de células do organismo. Portanto, um PSC pode dar origem a células de todas as camadas germinativas do organismo (por exemplo, a endoderme, mesoderme e ectoderme de um vertebrado). Células pluripotentes são capazes de formar os teratomas e de contribuir para a ectoderme, mesoderme ou tecidos da endoderme em um organismo vivo. Células-tronco pluripotentes de plantas são capazes de dar origem a todos os tipos de célula da planta (por exemplo, células da raiz, caule, folhas, etc.).
[0142] PSCs de animais podem ser derivadas em um número de maneiras diferentes. Por exemplo, células-tronco embrionárias (ESCs) são derivadas da massa celular interna do embrião (Thomson et. al, Science. 1998 Nov 6;282(5391):1145- 7) considerando que células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) são derivadas de células somáticas (Takahashi et. al, Cell. 2007 Nov 30;131(5):861-72; Takahashi et. al, Nat Protoc. 2007;2(12):3081-9; Yu et. al, Science. 2007 Dec 21;318(5858):1917-20. Epub 2007 Nov 20). Porque o termo PSC refere-se às células-tronco pluripotentes independentemente de sua derivação, o termo que PSC engloba os termos ESC e iPSC, bem como as termo células-tronco germinativas embrionárias (EGSC), que são outro exemplo de um PSC. PSCs podem estar na forma de uma linhagem de células estabelecidas, podem ser obtidas diretamente do tecido embrionário primário, ou podem ser derivadas de uma célula somática. PSCs podem ser células alvo dos métodos descritos aqui.
[0143] Por “células-tronco embrionárias” (ESC) entende-se a PSC que foi isolada a partir de um embrião, normalmente a partir da massa celular interna do blastocisto. Linhagens ESC são listas em NIH Human Embryonic Stem Cell Registry, por exemplo, hESBGN-01, hESBGN-02, hESBGN-03, hESBGN-04 (BresaGen, Inc.); HES-1, HES-2, HES-3, HES-4, HES- 5, HES-6 (ES Cell International); Miz-hES1 (MizMedi Hospital- Seoul National University); HSF-1, HSF-6 (University of California at San Francisco); e H1, H7, H9, H13, H14 (Wisconsin Alumni Research Foundation (WiCell Research Institute)). Células-tronco de interesse também incluem células-tronco embrionárias de outros primatas, como as células-tronco Rhesus e células-tronco de sagui. As células- tronco podem ser obtidas com quaisquer espécies de mamíferos, por exemplo, humanos, equinos, bovinos, suínos, caninos, felinos, roedores, por exemplo, camundongos, ratos, hamster, primatas, etc (Thomson et al. (1998) Science 282:1145; Thomson et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci USA 92:7844; Thomson et al. (1996) Biol. Reprod. 55:254; Shamblott et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:13726, 1998). Em cultura, ESCs normalmente crescem como colônias planas com grandes proporções de nucleo-citoplasmáticas, bordas definidas e nucléolos proeminentes. Além disso, ESCs expressam SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81 e fosfatase alcalina, mas não SSEA-1. Exemplos de métodos para gerar e caracterizar ESCs podem ser encontrados em, por exemplo, patente US 7.029.913, patente US 5.843.780 e patente US 6.200.806, as divulgações de que são incorporadas aqui por referência. Métodos para hESCs proliferando na forma indiferenciada são descritos em WO 99/20741, WO 01/51616 e WO 03/020920.
[0144] Por “células-tronco embrionárias germinativas” (EGSC) ou “células germinativas embrionárias” ou “Célula EG” entende-se uma PSC que é derivada de células germinativas e/ou células germinativas progenitoras, por exemplo, células germinativas primordiais, ou seja, aqueles que se tornariam os espermatozoides e óvulos. Células germinativas embrionárias (células EG) parecem ter propriedades semelhantes a células-tronco embrionárias, conforme descrito acima. Exemplos de métodos para gerar e caracterizar células EG podem ser encontrados em, por exemplo, Patente US 7,153,684; Matsui, Y., et al., (1992) Cell 70:841; Shamblott, M., et al. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 113; Shamblott, M., et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:13726; and Koshimizu, U., et al. (1996) Development, 122:1235, as divulgações das quais são incorporadas aqui por referência.
[0145] Por “células-tronco pluripotentes induzidas” ou “iPSC” entende-se uma PSC que é derivada de uma célula que não é uma PSC (ou seja, a partir de uma célula que é diferenciado em relação a uma PSC). iPSCs podem ser derivadas de vários diferentes tipos de células, incluindo células terminalmente diferenciadas. iPSCs têm uma morfologia de célula tipo ES, crescendo como colônias planas com grandes proporções de nucleo-citoplasmáticas, bordas definidas e núcleos proeminentes. Além disso, iPSCs expressam um ou mais marcadores chaves de pluripotência conhecidos por um especialista na técnica, incluindo mas não limitado a fosfatase alcalina, SSEA3, SSEA4, Sox2, Oct3/4, Nanog, TRA160, TRA181, TDGF 1, Dnmt3b, FoxD3, GDF3, Cyp26a1, TERT e zfp42. Exemplos de métodos para gerar e caracterizar iPSCs podem ser encontrados em, por exemplo, publicação de patentes US US20090047263, US20090068742, US20090191159, US20090227032, US20090246875, e US20090304646, as divulgações das quais são incorporados aqui por referência. Geralmente, para gerar iPSCs, células somáticas são fornecidas com fatores de reprogramação (por exemplo, Oct4, SOX2, KLF4, MYC, Nanog, Lin28, etc.), conhecidos na técnica para reprogramar as células somáticas para se tornarem células estaminais pluripotentes.
[0146] Por “células somáticas” entende-se qualquer célula em um organismo que, na ausência de manipulação experimental, não gera normalmente todos os tipos de células em um organismo. Em outras palavras, as células somáticas são as células que tem diferenciado suficientemente que não irão gerar células de ocorrência natural de todas as três camadas germinativas do corpo, ou seja, a ectoderme, a mesoderme e a endoderme. Por exemplo, células somáticas incluem ambos os progenitores de neurônios e neurais, o último dos quais pode ser capaz de gerar naturalmente todos os alguns tipos de células do sistema nervoso central, mas não podem dar origem a células das linhagens mesoderme ou endoderme.
[0147] Por “célula mitótica” entende-se uma célula passando por mitose. Mitose é o processo pelo qual uma célula eucariótica separa os cromossomos em seu núcleo em dois conjuntos idênticos em dois núcleos separados. Geralmente é seguido imediatamente por citocinese, que divide os núcleos, citoplasma, organelas e membranas celulares em duas células que contêm partes aproximadamente iguais desses componentes celulares.
[0148] Por “célula pós-mitótica” entende-se uma célula que saiu da mitose, ou seja, é “quiescente”, ou seja, já não está passando por divisões. Este estado quiescente pode ser temporário, ou seja, reversível, ou pode ser permanente.
[0149] Por “célula meiótica” entende-se uma célula que está passando por meiose. Meiose é o processo pelo qual uma célula divide seu material nuclear para fins de produção de gametas ou esporos. Ao contrário da mitose, na meiose, os cromossomos passam por uma etapa de recombinação que embaralha o material genético entre cromossomos. Além disso, o resultado da meiose é quatro células haploides (geneticamente únicas), em comparação com as duas células diploides (geneticamente idênticas) produzidas a partir de mitose.
[0150] Por “recombinação” entende-se um processo de troca de informação genética entre dois polinucleotídeos.Como usado aqui, “reparação direcionada por homologia (HDR)” refere-se ao reparo de DNA de forma especializada que ocorre, por exemplo, durante a reparação de quebras de fitas duplas nas células. Este processo requer a homologia de sequência de nucleotídeos, usa uma molécula “doadora” para reparação de modelo de uma molécula “alvo” (ou seja, aquela que experimentou a ruptura de fita dupla) e leva à transferência de informação genética do doador para o alvo. Reparação direcionada para homologia pode resultar em uma alteração da sequência da molécula alvo (por exemplo, inserção, exclusão, mutação), se o polinucleotídeo doador difere da molécula alvo e parte ou toda a sequência de polinucleotídeo doador é incorporada ao DNA alvo. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo doador, uma porção de polinucleotídeo doador, uma cópia do polinucleotídeo doador, ou uma porção de uma cópia da polinucleotídeo doador integra o DNA alvo.
[0151] Por “junção terminal não homóloga (NHEJ)” entende-se o reparo de quebras da fita dupla no DNA pela ligação direta das extremidades de quebra a outra sem a necessidade de um modelo homólogo (em contraste com a reparação direcionada por homologia, que requer uma sequência homóloga para guiar a reparação). NHEJ muitas vezes resulta na perda (exclusão) da sequência de nucleotídeos perto do sítio da ruptura da fita dupla.
[0152] Os termos “tratamento”, “tratar” e similares são usados para geralmente significar a obtenção de um efeito farmacológico e/ou fisiológico desejado. O efeito pode ser profilático em termos de completamente ou parcialmente prevenir uma doença ou sintoma da mesma e/ou pode ser terapêutico em termos de uma cura completa ou parcial de uma doença e/ou efeitos adversos atribuíveis à doença. “Tratamento”, como utilizado aqui abrange qualquer tratamento de uma doença ou sintoma em um mamífero e inclui: (a) prevenir a doença ou sintoma de ocorrer em um sujeito que pode ter uma predisposição para adquirir a doença ou sintoma, mas ainda não foi diagnosticado como tendo; (b) inibir a doença ou sintoma, ou seja, interrompendo o seu desenvolvimento; ou (c) aliviando a doença, ou seja, causando regressão da doença. O agente terapêutico pode ser administrado antes, durante ou após o início da doença ou lesão. O tratamento da doença em curso, onde o tratamento estabiliza ou reduz os indesejáveis sintomas clínicos do paciente, é de particular interesse. Tal tratamento é desejavelmente realizado antes da perda completa da função nos tecidos afetados. A terapia objeto desejavelmente será administrada durante a fase sintomática da doença e em alguns casos, após a fase sintomática da doença.
[0153] Os termos “indivíduo”, “sujeito”, “hospedeiro” e “paciente”, são usados de modo intercambiável aqui e se referem a qualquer sujeito mamífero para quem o diagnóstico, tratamento ou terapia é desejado, particularmente os seres humanos.
[0154] Métodos gerais em bioquímica molecular e celular podem ser encontrados em tais textos padrões como Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed. (Sambrook et al., HaRBor Laboratory Press 2001); Short Protocols in Molecular Biology, 4a Ed. (Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons 1999); Protein Methods (Bollag et al., John Wiley & Sons 1996); Nonviral Vectors for Gene Therapy (Wagner et al. eds., Academic Press 1999); Viral Vectors (Kaplift & Loewy eds., Academic Press 1995); Immunology Methods Manual (I. Lefkovits ed., Academic Press 1997); and Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures in Biotechnology (Doyle & Griffiths, John Wiley & Sons 1998), as divulgações das quais são incorporadas aqui por referência.
[0155] Antes de a presente invenção ser ainda descrita, deve ser entendido que esta invenção não é limitada a determinadas modalidades descritas, como tal, é claro, variam. Deve ainda ser entendido que a terminologia usada aqui tem o propósito de descrever modalidades particulares apenas e não se destina a ser um fator limitante, uma vez que o escopo da presente invenção será limitado apenas pelas reivindicações anexadas.
[0156] Quando um intervalo de valores é fornecido, entende-se que cada valor intermediário, ao décimo da unidade de limite inferior a menos que o contexto claramente mencione o contrário, entre o limite superior e inferior do intervalo e qualquer outro valor declarado ou intermediário naquele intervalo determinado, é englobado dentro da invenção. Os limites superiores e inferiores desses intervalos menores podem independentemente ser incluídos nos intervalos menores e também são englobados dentro da invenção, sujeito a qualquer limite especificamente excluído no intervalo indicado. Onde a escala indicada inclui um ou ambos os limites, intervalos excluindo um ou ambos esses limites incluídos também estão incluídos na invenção.
[0157] Determinados intervalos são apresentados com valores numéricos sendo precedidos pelo termo “cerca de”. O termo “cerca de” é usado aqui para fornecer suporte literal de apoio para o número exato que ele precede, bem como um número que é perto de ou aproximadamente o número que precede o termo. Ao determinar se um número está perto de, ou aproximadamente um número especificamente mencionado, o número próximo ou aproximação não mencionado pode ser um número que, no contexto em que é apresentado, fornece o equivalente substancial do número especificamente mencionado.
[0158] A menos que definido em contrário, todos os termos técnicos e científicos aqui têm o mesmo significado como comumente compreendidos por um especialista na técnica a que pertence esta invenção. Embora quaisquer métodos e materiais similares ou equivalentes aos descritos aqui também podem ser usados na prática ou teste da presente invenção, os métodos e materiais preferenciais são agora descritos. Todas as publicações mencionadas aqui são incorporadas por referência para divulgar e descrever os métodos e/ou materiais em relação ao qual as publicações são citadas.
[0159] Todas as publicações e patentes citadas nesta especificação são aqui incorporadas por referência, como se cada publicação individual ou patente fosse individualmente e especificamente indicado como sendo incorporado por referência e são incorporados aqui por referência para divulgar e descrever os métodos e/ou materiais em relação ao qual as publicações são citadas. A menção de qualquer publicação é para a sua divulgação antes da data de depósito e não deve ser interpretada como uma admissão de que a presente invenção não é o direito de anteceder tal publicação em virtude de invenção prévia. Além disso, as datas de publicação fornecidas podem ser diferentes das datas de publicação real que podem precisar ser confirmadas de forma independente.
[0160] Nota-se que como usado neste documento e nas reivindicações anexas, as formas singulares "um", "uma" e "o/a" incluem os referentes plurais, a menos que o contexto claramente determine de outra forma. Assim, por exemplo, a referência a "um polinucleotídeo" inclui uma pluralidade desses polinucleotídeos e a referência a "o polipeptídeo" inclui referência a um ou mais polipeptídeos e equivalentes dos mesmos conhecidos por aqueles versados na técnica, e assim por diante. É ainda de notar que as reivindicações podem ser redigidas para excluir qualquer elemento opcional. Como tal, esta declaração se destina a servir como base antecedente para uso de tal terminologia exclusiva como "unicamente", "somente" e semelhantes em conexão com a recitação de elementos da reivindicação, ou uso de uma limitação "negativa".
[0161] É apreciado que determinadas características da invenção que são, para clareza, descritas no contexto de modalidades separadas, também podem ser fornecidas em combinação em uma única modalidade. Por outro lado, várias características da invenção que são, por brevidade, descritas no contexto de uma única modalidade, também podem ser fornecidas separadamente ou em qualquer subcombinação. Todas as combinações das modalidades pertencentes à invenção são especificamente englobadas pela presente invenção e são divulgadas neste documento apenas como se toda e qualquer combinação fosse individualmente e explicitamente divulgada. Além disso, todas as subcombinações das várias modalidades e elementos das mesmas também são especificamente englobadas pela presente invenção e são divulgadas neste documento apenas como se toda e qualquer combinação fosse individualmente e explicitamente divulgada.
[0162] As publicações discutidas neste document são fornecidas unicamente pela sua divulgação antes da data de depósito do presente pedido. Nada neste documento é para ser interpretado como uma admissão de que a presente invenção não tem o direito de antecipar essa divulgação em virtude de invenção anterior. Além disso, as datas de publicação fornecidas podem ser diferentes das datas de publicação real que podem precisar ser confirmadas de forma independente.
DESCRIÇÃO DETALHADA - PARTE I
[0163] A presente divulgação fornece um RNA tendo como alvo DNA que compreende uma sequência de alvo e, juntamente com o polipeptídeo de modificação, fornece modificação específica de sítio de um DNA de alvo e/ou um polipeptídeo associado como o DNA de alvo. A presente divulgação ainda fornece polipeptídeos de modificação específicos de sítio. A presente divulgação ainda fornece métodos de modificação específica de sítio de um DNA de alvo e/ou um polipeptídeo associado com o DNA de alvo. A presente divulgação fornece métodos de modular transcrição de um ácido nucleico de alvo em uma célula de alvo, geralmente envolvendo contatar o ácido nucleico de alvo com um polipeptídeo Cas9 enzimaticamente inativo e um RNA tendo como alvo DNA. Kits e composições para realizar os métodos também são fornecidos. A presente divulgação fornece células modificadas geneticamente que produzem Cas9; e organismos multicelulares não humanos transgênicos Cas9.
ÁCIDOS NUCLEICOS RNA tendo DNA como alvo
[0164] A presente divulgação fornece um RNA tendo DNA como alvo que direciona as atividades de um polipeptídeo associado (por exemplo, um polipeptídeo modificador direcionado ao sítio) para uma sequência alvo específica dentro de um DNA alvo. Um RNA tendo DNA como alvo objeto compreende: um primeiro segmento (também referido aqui como um “segmento tendo DNA como alvo” ou uma “sequência tendo DNA como alvo”) e um segundo segmento (também referido aqui como um “segmento de ligação à proteína” ou uma “sequência de ligação à proteína”).
Segmento tendo DNA como alvo de um RNA tendo DNA como alvo
[0165] O segmento tendo de DNA como alvo de um RNA tendo DNA como alvo objeto é composto por uma sequência de nucleotídeos que é complementar a uma sequência em um DNA alvo. Em outras palavras, o segmento tendo DNA como alvo de um RNA tendo DNA como alvo objeto interage com um DNA alvo em uma maneira específica de sequência através de hibridização (ou seja, emparelhamento de base). Como tal, a sequência de nucleotídeos do segmento tendo DNA como alvo pode variar e determina a localização dentro do DNA alvo que o RNA tendo DNA como alvo e o DNA alvo irão interagir. O segmento tendo DNA como alvo de RNA tendo DNA como alvo pode ser modificado (por exemplo, por engenharia genética) para hibridizar a qualquer sequência desejada dentro de um DNA alvo.
[0166] O segmento tendo DNA como alvo pode ter um comprimento de cerca de 12 nucleotídeos a cerca de 100 nucleotídeos. Por exemplo, o segmento tendo DNA como alvo pode ter um comprimento de cerca de 12 nucleotídeos (nt) a cerca de 80 nt, de cerca de 12 nt para sobre 50nt, de cerca de 12 nt a cerca de 40 nt, de cerca de 12 nt a cerca de 30 nt, de cerca de 12 nt a cerca de 25 nt, de cerca de 12 nt a cerca de 20 nt, ou a partir de cerca de 12 nt a cerca de 19 nt. Por exemplo, o segmento tendo DNA como alvo pode ter um comprimento de cerca de 19 nt a cerca de 20 nt, de cerca de 19 nt a cerca de 25 nt, de cerca de 19 nt a cerca de 30 nt, de cerca de 19 nt a cerca de 35 nt, de cerca de 19 nt a cerca de 40 nt, de cerca de 19 nt a cerca de 45 nt, de cerca de 19 nt a cerca de 50 nt, de cerca de 19 nt a cerca de 60 nt, de cerca de 19 nt a cerca de 70 nt, de cerca de 19 nt a cerca de 80 nt, de cerca de 19 nt a cerca de 90 nt, de cerca de 19 nt a cerca de 100 nt, de cerca de 20 nt a cerca de 25 nt, de cerca de 20 nt a cerca de 30 nt, de cerca de 20 nt a cerca de 35 nt, de cerca de 20 nt a cerca de 40 nt, de cerca de 20 nt a cerca de 45 nt, de cerca de 20 nt a cerca de 50 nt, de cerca de 20 nt a cerca de 60 nt, de cerca de 20 nt a cerca de 70 nt, de cerca de 20 nt a cerca de 80 nt, de cerca de 20 nt a cerca de 90 nt, ou de aproximadamente 20 nt a cerca de 100 nt. A sequência de nucleotídeos (a sequência tendo DNA como alvo) do segmento tendo DNA como alvo que é complementar a uma sequência de nucleotídeos (sequência de destino) do DNA do alvo pode ter um comprimento de pelo menos 12 nt. Por exemplo, a sequência tendo DNA como alvo do segmento tendo DNA como alvo complementar para uma sequência do DNA alvo do alvo pode ter um comprimento de pelo menos 12 nt, pelo menos uns 15 nt, pelo menos uns 18 anos nt, pelo menos 19 nt, pelo menos cerca de 20 nt, pelo menos cerca de 25 nt, pelo menos uns 30 nt, pelo menos uns 35 nt ou pelo menos cerca de 40 nt. Por exemplo, a sequência tendo DNA como alvo do segmento tendo DNA como alvo complementar para uma sequência do DNA alvo do alvo pode ter um comprimento de cerca de 12 nucleotídeos (nt) a cerca de 80 nt, de cerca de 12 nt a cerca de 50nt, de cerca de 12 nt a cerca de 45 nt, de cerca de 12 nt a cerca de 40 nt, de cerca de 12 nt a cerca de 35 nt, de cerca de 12 nt a cerca de 30 nt, de cerca de 12 nt a cerca de 25 nt, de cerca de 12 nt a cerca de 20 nt, de cerca de 12 nt a cerca de 19 nt, de cerca de 19 nt a cerca de 20 nt, de cerca de 19 nt a cerca de 25 nt, de cerca de 19 nt a cerca de 30 nt, de cerca de 19 nt a cerca de 35 nt, de cerca de 19 nt a cerca de 40 nt, de cerca de 19 nt a cerca de 45 nt, de cerca de 19 nt a cerca de 50 nt, de cerca de 19 nt a cerca de 60 nt, de cerca de 20 nt a cerca de 25 nt, de cerca de 20 nt a cerca de 30 nt, de cerca de 20 nt a cerca de 35 nt, de cerca de 20 nt a cerca de 40 nt, de cerca de 20 nt a cerca de 45 nt, de cerca de 20 nt a cerca de 50 nt, ou de aproximadamente 20 nt a cerca de 60 nt. A sequência de nucleotídeos (a sequência tendo DNA como alvo) do segmento tendo DNA como alvo que é complementar a uma sequência de nucleotídeos (sequência de destino) do DNA do alvo pode ter um comprimento de pelo menos 12 nt.
[0167] Em alguns casos, a sequência tendo DNA como alvo do segmento tendo DNA como alvo complementar para uma sequência do DNA alvo do alvo é 20 nucleotídeos de comprimento. Em alguns casos, a sequência tendo DNA como alvo do segmento tendo DNA como alvo complementar para uma sequência do DNA alvo do alvo é 19 nucleotídeos de comprimento.
[0168] A porcentagem de complementariedade entre a sequência tendo DNA como alvo do segmento tendo DNA como alvo e a sequência alvo do DNA alvo pode ser pelo menos 60% (por exemplo, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos, 99% ou 100%). Em alguns casos, a percentagem de complementariedade entre a sequência tendo DNA como alvo do segmento tendo DNA como alvo e a sequência alvo do DNA alvo é 100% sobre os sete contíguos 5'- nucleotídeos principais da sequência alvo da cadeia complementar do DNA alvo. Em alguns casos, a percentagem de complementariedade entre a sequência tendo DNA como alvo do segmento tendo DNA como alvo e a sequência alvo do DNA alvo é pelo menos 60% ao longo de cerca de 20 nucleotídeos contíguos. Em alguns casos, a percentagem de complementariedade entre a sequência tendo DNA como alvo do segmento tendo DNA como alvo e a sequência alvo do DNA alvo é 100% ao longo de catorze contíguos principais nucleotídeos 5' da sequência alvo da cadeia complementar do DNA alvo e tão baixo quanto 0% sobre o restante. Nesse caso, a sequência tendo DNA como alvo pode ser considerada sendo de 14 nucleotídeos de comprimento (ver figura 12D-E). Em alguns casos, a percentagem de complementariedade entre a sequência tendo DNA como alvo do segmento tendo DNA como alvo e a sequência alvo do DNA alvo é 100% sobre os sete nucleotídeos contíguos principais 5' da sequência alvo da cadeia complementar do DNA alvo e tão baixo quanto 0% sobre o restante. Nesse caso, a sequência tendo DNA como alvo pode ser considerada sendo de 7 nucleotídeos em comprimento.
Segmento de ligação à proteína de um RNA tendo DNA como alvo
[0169] O segmento de ligação à proteína de um RNA tendo DNA como alvo objeto interage com um polipeptídeo modificador direcionado ao sítio. O RNA tendo DNA como alvo objeto orienta o polipeptídeo ligado a uma sequência de nucleotídeo específica dentro do DNA alvo através do segmento tendo DNA como alvo acima mencionado. O segmento de ligação à proteína de um RNA tendo DNA como alvo objeto é composto por dois trechos de nucleotídeos complementares um ao outro. Os nucleotídeos complementares do segmento ligação à proteína hibridizam para formar um duplex de RNA de fita dupla (dsRNA) (ver figuras 1A e 1B).
[0170] Um RNA tendo DNA de molécula dupla como alvo objeto é composto por duas moléculas de RNA separadas. Cada um das duas moléculas de RNA de um RNA tendo DNA de molécula dupla como alvo objeto compreende um trecho de nucleotídeos que é complementar um ao outro, tal que os nucleotídeos complementares de duas moléculas de RNA que hibridizam para formar o RNA duplex de fita dupla do segmento de ligação de proteínas (figura 1A).
[0171] Em algumas modalidades, o segment formador de duplex do RNA ativador é pelo menos cerca de 60% idêntico a uma das moléculas do RNA ativador (tracrRNA) estabelecidas em SEQ ID NO: 431-562, ou um complemento das mesmas, ao longo de um trecho de pelo menos 8 nucleotídeos contíguos. Por exemplo, o segmento formador de duplex do RNA ativador (ou DNA que codifica o segmento formador de duplex do RNA ativador) é pelo menos cerca de 60% idêntico, pelo menos cerca de 65% idêntico, pelo menos cerca de 70% idêntico, pelo menos cerca 75% idêntico, pelo menos 80% idêntico, pelo menos cerca de 85% idêntico, pelo menos cerca de 90% idêntico, pelo menos cerca de 95% idêntico, pelo menos cerca de 98% idêntico, pelo menos cerca de 99% idêntico, ou 100% idêntico, a uma das sequências tracrRNA estabelecidas na SEQ ID NO: 431-562, ou um complemento das mesmas, ao longo de um trecho de pelo menos 8 nucleotídeos contíguos.
[0172] Em algumas modalidades, o segment formador de duplex do RNA direcionador é pelo menos cerca de 60% idêntico a uma das sequências de RNA direcionador (crRNA) estabelecidas nas SEQ ID NOs: 563-679, ou um complemento das mesmas, ao longo de um trecho de pelo menos 8 nucleotídeos contíguos. Por exemplo, o segmento formador de duplex do RNA direcionador (ou DNA de codificação do segmento formador de duplex do RNA direcionador) é pelo menos 65% idêntico, pelo menos cerca de 70% idêntico, pelo menos 75% idêntico, pelo menos 80% idêntico, pelo menos cerca de 85% idêntico, pelo menos 90% idêntico, pelo menos cerca de 95% idêntico, pelo menos cerca de 98% idêntico, pelo menos cerca de 99% idêntico ou 100% idêntico a uma das sequências de crRNA estabelecidas na SEQ ID NOs: 563-679, ou um complemento das mesmas, ao longo de um trecho de pelo menos 8 nucleotídeos contíguos.
[0173] Um RNA tendo DNA de duas moléculas como alvo pode ser projetado para permitir ligação controlada (ou seja, condicional) de um RNA direcionador com um RNA ativador. Porque um RNA tendo DNA de duas moléculas como alvo não é funcional, a menos que RNA ativador e o RNA direcionador estejam ligados em um complexo funcional com dCas9, um RNA tendo DNA de duas moléculas como alvo pode ser induzível (por exemplo, droga induzível) tornando a ligação entre o RNA ativador e RNA direcionador para ser induzível. Como um exemplo de não limitação, aptâmeros de RNA podem ser usados para regular (ou seja, controlar) a ligação do RNA ativador com o RNA direcionador. Nesse sentido, o RNA ativador e/ou o RNA direcionador pode incluir uma sequência de aptâmero de RNA.
[0174] Aptâmeros de RNA são conhecidos na técnica e são geralmente uma versão sintética de um riboswitch. Os termos “aptâmero de RNA” e “riboswitch” são usados de modo intercambiável aqui para abranger ambas as sequências de ácido nucleico sintéticas e naturais que fornecem regulação induzível da estrutura (e, portanto, a disponibilidade de sequências específicas) da molécula de RNA da qual fazem parte. Aptâmeros de RNA compreendem geralmente uma sequência que se dobra em uma estrutura particular (por exemplo, um hairpin), que se liga especificamente a uma droga em particular (por exemplo, uma pequena molécula). Ligação da droga provoca uma mudança estrutural na dobra do RNA, que muda uma característica do ácido nucleico do qual o aptâmero é uma parte. Como exemplos não limitantes: (i) um RNA ativador com um aptâmero pode não ser capaz de ligar o cognato RNA direcionador a menos que o aptâmero esteja ligado pela droga apropriada; (ii) um RNA direcionador com um aptâmero não pode ser capaz de ligar para o cognato de RNA ativador a menos que o aptâmero esteja ligado pela droga apropriada; e (iii) um RNA direcionador e um RNA ativador, cada um contendo um aptâmero diferente que liga uma droga diferente, não podem ser capazes de ligar uns aos outros a menos que ambas as drogas estejam presentes. Conforme ilustrado por esses exemplos, um RNA tendo DNA de duas moléculas como alvo pode ser projetado para ser induzível.
[0175] Exemplos de aptâmeros e riboswitches podem ser encontrados, por exemplo, em: Nakamura et al.,Genes Cells. 2012 May;17(5):344-64; Vavalle et al., Future Cardiol. 2012 May;8(3):371-82; Citartan et al., Biosens Bioelectron. 2012 Apr 15;34(1):1-11; e Liberman et al., Wiley Interdiscip Rev RNA. 2012 May-Jun;3(3):369-84; todos os quais são incorporados aqui por referência, na sua totalidade.
[0176] Exemplos não limitantes de sequências de nucleotídeos que podem ser incluídos em um RNA tendo DNA de duas moléculas como alvo incluem uma das sequências definidas nas SEQ ID NOs: 431-562, ou complementos das mesmas emparelhando com quaisquer sequências estabelecido nas SEQ ID NOs: 563-679, ou complementos das mesmas que podem hibridizar para formar um segmento de ligação à proteína.
[0177] Um RNA tendo DNA de molécula única como alvo objeto é composto por dois trechos de nucleotídeos (um RNA direcionador e um RNA ativador) que são complementares um ao outro, estão covalentemente ligados por nucleotídeos intermediárias (“ligantes” ou “nucleotídeos ligantes”) e hibridizam para formar o RNA duplex de fita dupla (dsRNA duplex) do segmento de ligação à proteína, resultando assim em uma estrutura de haste-alça (Figura 1B). O RNA direcionador e RNA ativador podem ser covalentemente ligados através de extremidade 3' do RNA direcionador e a extremidade 5' do RNA ativador. Alternativamente, RNA direcionador e RNA ativador podem ser covalentemente ligados através da extremidade 5' do RNA direcionador e extremidade 3' do RNA ativador.
[0178] O ligante do RNA tendo DNA de molécula única como alvo pode ter um comprimento de cerca de 3 nucleotídeos a cerca de 100 nucleotídeos. Por exemplo, o ligante pode ter um comprimento de cerca de 3 nucleotídeos (nt) a cerca de 90 nt, de cerca de 3 nucleotídeos (nt) a cerca de 80 nt, de cerca de 3 nucleotídeos (nt) a cerca de 70 nt, de cerca de 3 nucleotídeos (nt) a cerca de 60 nt, de cerca de 3 nucleotídeos (nt) a cerca de 50 nt, de cerca de 3 nucleotídeos (nt) a cerca de 40 nt, de cerca de 3 nucleotídeos (nt) a cerca de 30 nt, de cerca de 3 nucleotídeos (nt) a cerca de 20 nt ou de cerca de 3 nucleotídeos (nt) a cerca de 10 nt. Por exemplo, o ligante pode ter um comprimento de cerca de 3 nt a cerca de 5 nt, de cerca de 5 nt a cerca de 10 nt, de cerca de 10 nt a cerca de 15 nt, de cerca de 15 nt a cerca de 20 nt, de cerca de 20 nt a cerca de 25 nt, de cerca de 25 nt a cerca de 30 nt, de cerca de 30 nt a cerca de 35 nt, de cerca de 35 nt a cerca de 40 nt, de cerca de 40 nt a cerca de 50 nt, de cerca de 50 nt a cerca de 60 nt, de cerca de 60 nt a cerca de 70 nt, de cerca de 70 nt a cerca de 80 nt, de cerca de 80 nt a cerca de 90 nt, ou a partir de cerca de 90 nt a cerca de 100 nt. Em algumas modalidades, o ligante de um RNA tendo DNA de molécula única como alvo é 4 nt.
[0179] Um exemplar RNA tendo DNA de molécula única como alvo é composto por dois trechos complementares de nucleotídeos que hibridizam para formar um dsRNA duplex. Em algumas modalidades, um dos dois trechos complementares de nucleotídeos do RNA tendo DNA de molécula única como alvo (ou o DNA de codificação do trecho) é pelo menos cerca de 60% idêntico a uma das moléculas do RNA ativador (tracrRNA) estabelecidas em SEQ ID NO: 431-562, ou um complemento das mesmas, ao longo de um trecho de pelo menos 8 nucleotídeos contíguos. Por exemplo, um dos dois trechos complementares de nucleotídeos do RNA tendo DNA de molécula única como alvo (ou o DNA do trecho de codificação) é pelo menos 65% idêntico, pelo menos cerca de 70% idêntico, pelo menos 75% idêntico,pelo menos 80% idêntico, pelo menos cerca de 85% idêntico, pelo menos cerca de 90% idêntico, pelo menos cerca de 95% idêntico, pelo menos cerca de 98% idêntico, pelo menos cerca de 99% idêntico ou 100% idêntico a uma das sequências tracrRNA estabelecido na SEQ ID NO: 431-562, ou um complemento das mesmas, ao longo de um trecho de pelo menos 8 nucleotídeos contíguos.
[0180] Em algumas modalidades, um dos dois trechos complementares de nucleotídeos do RNA tendo DNA de molécula única como alvo (ou o DNA de codificação do trecho) é pelo menos cerca de 60% idêntico a uma das sequências de RNA direcionador (crRNA) estabelecidas nas SEQ ID NOs: 563-679, ou um complemento das mesmas, ao longo de um trecho de pelo menos 8 nucleotídeos contíguos. Por exemplo, um dos dois trechos complementares de nucleotídeos do RNA tendo DNA de molécula única como alvo (ou o DNA do trecho de codificação) é pelo menos 65% idêntico, pelo menos cerca de 70% idêntico, pelo menos 75% idêntico, pelo menos 80% idêntico, pelo menos cerca de 85% idêntico, pelo menos cerca de 90% idêntico, pelo menos cerca de 95% idêntico, pelo menos cerca de 98% idêntico, idênticos pelo menos cerca de 99% ou 100% idêntico a uma das sequências de crRNA sequências estabelecidas na SEQ ID NOs: 563-679, ou um complemento das mesmas, ao longo de um trecho de pelo menos 8 nucleotídeos contíguos.
[0181] Pares cognatos de crRNAs e tracrRNAs adequados de ocorrência natural podem ser determinados rotineiramente para SEQ ID NO: 431-679 tendo em conta nome da espécie e emparelhamento de base (para o duplex dsRNA do domínio da ligação à proteína) ao determinar os pares cognatos apropriados (ver Figura 8, como um exemplo não limitante).
[0182] No que diz respeito a ambos um RNA tendo DNA de molécula única como alvo objeto e para RNA tendo DNA de molécula dupla como alvo objeto, Figura 57 demonstra que sequências artificiais que compartilham muito pouco (cerca de 50% identidade) com um tracrRNAs e crRNAs de ocorrência natural podem funcionar com Cas9 para clivar DNA alvo, contanto que a estrutura do domínio da ligação à proteína do RNA tendo DNA como alvo seja conservada. Assim, a estrutura de dobra do RNA de um domínio de ligação à proteína de ocorrência natural de um RNA tendo DNA como alvo pode ser levada em conta, a fim de domínios artificiais da ligação à proteína (ou versões de duas moléculas ou moléculas unicas). Como um exemplo não limitante, o RNA tendo DNA como alvo artificial funcional da Figura 57 foi projetado com base na estrutura do segmento de ligação à proteína de ocorrência natural de DNA alço (por exemplo, incluindo o mesmo número de pares de bases ao longo do duplex RNA e incluindo na mesma região “buldge” como presente no RNA de ocorrência natural). Como estruturas prontamente podem ser produzidas por um especialista na técnica para qualquer par de crRNA:tracrRNA de ocorrência natural de quaisquer speices (ver SEQ ID NOs: 431-679 para sequências de crRNA e tracrRNA de uma grande variedade de espécies), um RNA tendo DNA como alvo artificial pode ser projetado para imitar a estrutura natural para uma determinada espécie quando usando o Cas9 (ou um relacionado a Cas9, ver figura 32A) a partir dessa espécie. (ver figura 24 e detalhes relacionados no exemplo 1). Assim, um RNA tendo DNA como alvo adequado pode ser um RNA artificialmente projetado (não natural) constituído por um domínio de ligação à proteína que foi projetado para imitar a estrutura de um domínio de ligação à proteína de um RNA tendo DNA como alvo de ocorrência natural. (ver SEQ ID NOs: 431-679, tendo em conta o nome da espécie ao determinar os pares cognatas apropriados).
[0183] O segmento de ligação à proteína pode ter um comprimento de cerca de 10 nucleotídeos a cerca de 100 nucleotídeos. Por exemplo, o segmento de ligação às proteínas pode ter um comprimento de cerca de 15 nucleotídeos (nt) a cerca de 80 nt, de cerca de 15 nt a cerca de 50 nt, de cerca de 15 nt a cerca de 40 nt, de cerca de 15 nt a cerca de 30 nt ou de aproximadamente 15 nt a cerca de 25 nt.
[0184] Também no que diz respeito a ambos um RNA tendo DNA de molécula única como alvo objeto e RNA tendo DNA de molécula dupla como alvo objeto, o duplex dsRNA do segmento ligação à proteína pode ter um comprimento de cerca de 6 pares de bases (bp) a cerca de 50bp. Por exemplo, o duplex dsRNA do segmento ligação à proteína pode ter um comprimento de cerca de 6 bp a cerca de 40 bp, de cerca de 6 bp sobre 30bp, de cerca de 6 bp a cerca de 25 bp, de cerca de 6 bp a cerca de 20 bp, de cerca de 6 bp a cerca de 15 bp, de cerca de 8 bp a cerca de 40 bp, de cerca de 8 bp sobre 30bp, de cerca de 8 bp a cerca de 25 bp, de cerca de 8 bp a cerca de 20 bp ou de cerca 8 bp a cerca de 15 bp. Por exemplo, o duplex dsRNA do segmento ligação à proteína pode ter um comprimento de cerca 8 bp a cerca de 10 bp, de cerca de 10 bp a cerca de 15 bp, de cerca de 15 bp a cerca de 18 bp, de cerca de 18 bp a cerca de 20 bp, de cerca de 20 bp a cerca de 25 bp, de cerca de 25 bp a cerca de 30 bp, de cerca de 30 bp a cerca de 35 bp, de cerca de 35 bp a cerca de 40 bp, ou a partir de cerca de 40 bp a cerca de 50 bp. Em algumas modalidades, o duplex dsRNA do segmento ligação à proteína tem um comprimento de 36 pares de bases. A percentagem de complementariedade entre as sequências de nucleotídeos que hibridizam para formar o dsRNA duplex do segmento de ligação de proteínas pode ser pelo menos cerca de 60%. Por exemplo, a percentagem de complementariedade entre as sequências de nucleotídeos que hibridizam para formar o dsRNA duplex do segmento ligação à proteína pode ser pelo menos uns 65%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos, cerca de 75%, pelo menos, cerca de 80%, pelo menos, cerca de 85%, pelo menos, cerca de 90%, pelo menos, cerca de 95%, pelo menos cerca de 98%, ou pelo menos cerca de 99%. Em alguns casos, a percentagem de complementariedade entre as sequências de nucleotídeos que hibridizam para formar o dsRNA duplex do segmento ligação às proteínas é de 100%.
Polipeptídeo modificador direcionado ao sítio
[0185] O RNA tendo DNA como alvo objeto e uma polipeptídeo modificador direcionado ao sítio objeto formam um complexo. O RNA tendo DNA como alvo fornece especificidade do alvo para o complexo composto por uma sequência de nucleotídeos que é complementar a uma sequência de um DNA alvo (como mencionado acima). O polipeptídeo modificador direcionado ao sítio do complexo fornece a atividade específica do sítio. Em outras palavras, o polipeptídeo modificador direcionado ao sítio é guiado para uma sequência de DNA (por exemplo, uma sequência cromossômica ou uma sequência extracromossômica, por exemplo, uma sequência epissomal, uma sequência de minicírculo, uma sequência mitocondrial, uma sequência de cloroplasto, etc.) em virtude de sua associação com pelo menos o segmento de ligação à proteína do RNA tendo DNA como alvo (descrito acima).
[0186] Um polipeptídeo modificador direcionado ao sítio objeto modifica o DNA alvo (por exemplo, clivagem ou metilação do DNA alvo) e/ou um polipeptídeo associado com DNA alvo (por exemplo, a metilação ou acetilação de uma cauda de histona). Um polipeptídeo modificador direcionado ao sítio é também referido aqui como um polipeptídeo “direcionado ao sítio” ou um “polipeptídeo modificador direcionado ao sítio de ligação ao RNA.”
[0187] Em alguns casos, o polipeptídeo modificador direcionado ao sítio é um polipeptídeo modificador de ocorrência natural. Em outros casos, o polipeptídeo modificador direcionado ao sítio não é um polipeptídeo de ocorrência natural (por exemplo, um polipeptídeo quimérico, como discutido abaixo ou um polipeptídeo de ocorrência natural que é modificado, por exemplo, a mutação, exclusão, inserção).
[0188] Exemplos de polipeptídeos modificador direcionado ao sítio de ocorrência natural estão estabelecidos em SEQ: ID NOs: 1-255 como uma lista exaustiva e não limitação de endonucleases Cas9/Csn1 de ocorrência natural. Estes polipeptídeos de ocorrência natural, conforme divulgado aqui, ligam um RNA tendo DNA como alvo, destinam- se, assim, para uma sequência específica dentro de um DNA alvo e cliva o DNA para gerar uma quebra de fita dupla. Um polipeptídeo modificador direcionado ao sítio objeto é composto por duas porções, uma porção de ligação a RNA e uma porção de atividade. Em algumas modalidades, um polipeptídeo modificador direcionado ao sítio objeto é composto por: (i) uma porção de ligação ao RNA que interage com um RNA tendo DNA como alvo, no qual o RNA tendo DNA como alvo é composto por uma sequência de nucleotídeos que é complementar a uma sequência em um DNA alvo; e (ii) uma porção de atividade que exibe atividade enzimática direcionada ao sítio a (por exemplo, a atividade para metilação de DNA), atividade para a clivagem do DNA, atividade para acetilação da histona, atividade para a metilação de histonas, etc., em que o sítio da atividade enzimática é determinado pelo RNA tendo DNA como alvo.
[0189] Em outras modalidades, um polipeptídeo modificador direcionado ao sítio objeto é composto por: (i) uma porção de ligação ao RNA que interage com um RNA tendo DNA como alvo, no qual o RNA tendo DNA como alvo é composto por uma sequência de nucleotídeos que é complementar a uma sequência em um alvo DNA; e (ii) uma porção de atividade que modula a transcrição dentro do DNA alvo (por exemplo, para aumentar ou diminuir a transcrição), em que o sítio da transcrição modulada dentro do DNA alvo é determinado pelo RNA tendo DNA como alvo.
[0190] Em alguns casos, um polipeptídeo modificador direcionado ao sítio objeto tem atividade enzimática que modifica o DNA alvo (por exemplo, atividade nuclease, atividade metiltransferase, atividade demetilase, atividade de reparo do DNA, atividade de dano do DNA, atividade de desaminação, atividade dismutase, atividade de alquilação, atividade depurinação, atividade de oxidação, atividade formadora de dímero de pirimidina, atividade integrase, atividade transposase , atividade de recombinase, atividade de polimerase, atividade de ligase, atividade de helicase, atividade de fotoliaseou atividade de glicosilase).
[0191] Em outros casos, um polipeptídeo modificador direcionado ao sítio objeto tem atividade enzimática que modifica um polipeptídeo (por exemplo, uma histona) associado com o DNA do alvo (por exemplo, atividade metiltransferase, atividade demetilase, atividade acetiltransferase, atividade deacetilase, atividade da quinase, atividade da fosfatase, atividade de ubiquitina ligase, atividade deubiquitinação, atividade adenilação, atividade desadenilação, Atividade SUMOilação, atividade desSUMOilação, atividade ribosilação, atividade desribosilação, atividade miristoilação ou atividade desmiristoilação).
Exemplos de polipeptídeos modificadores direcionados aos sítios
[0192] Em alguns casos, o polipeptídeo modificador direcionado ao sítio é composto por uma sequência de aminoácidos, tendo pelo menos cerca de 75%, pelo menos, cerca de 80%, pelo menos, cerca de 85%, pelo menos sobre 90%, pelo menos, cerca de 95%, pelo menos cerca de 99% ou 100% de identidade de sequência de aminoácidos de aminoácidos 7-166 ou 731-1003 da sequência de aminoácidos Cas9/Csn1 retratada na Figura 3, ou para as porções correspondentes em qualquer uma das sequências de aminoácidos estabelecidas como SEQ: ID NOs: 1-256 e 795-1346.
Modificações de ácido nucleico
[0193] Em algumas modalidades, um ácido nucleico objeto (por exemplo, um RNA tendo DNA como alvo) compreende uma ou mais modificações, por exemplo, uma modificação de base, uma modificação da estrutura, etc., para fornecer o ácido nucleico com um recurso novo ou aprimorado (por exemplo, estabilidade melhorada). Como é conhecido na técnica, uma nucleoside é uma combinação à base de açúcar. A parte base do nucleosídeo é normalmente uma base heterocíclica. As duas classes mais comuns de tais bases heterocíclicas são as purinas e as pirimidinas. Nucleotídeos são nucleosídeos que incluem ainda um grupo de fosfato covalentemente ligado à porção de açúcar do nucleosídeo. Para esses nucleosídeos que incluem um açúcar de pentofuranosil, o grupo fosfato pode ser ligado a 2', 3' ou 5' do grupo hidroxila do açúcar. Na formação de oligonucleotídeos, os grupos fosfato ligados covalentemente ligam nucleosídeos adjacentes um ao outro para formar um composto de polímero linear. Por sua vez, as respectivas extremidades deste composto de polímero linear podem ser ainda mais unidas para formar um composto circular, no entanto, compostos lineares são geralmente adequados. Além disso, compostos lineares podem ter base de nucleotídeo de complementariedade interna e, portanto, podem dobrar de forma a produzir um composto totalmente ou parcialmente fita dupla. Dentro de oligonucleotídeos, os grupos fosfato são comumente referidos como formando a estrutura do oligonucleotídeo internucleosídeo. A ligação normal ou a estrutura do RNA e DNA é uma ligação fosfodiéster 3' para 5'.
Estruturas modificadas e ligações internucleosídeo modificadas
[0194] Exemplos apropriados de ácidos nucleicos contendo modificações incluem ácidos nucleicos contendo estruturas modificadas ou ligações internucleosídeo não naturais. Ácidos nucleicos (tendo estruturas modificadas incluem aquelas que mantêm um átomo de fósforo na estrutura e aqueles que não têm um átomo de fósforo na estrutura).
[0195] Estruturas de oligonucleotídeos modificadas apropriadas contendo um átomo de fósforo nele incluem, por exemplo, fosforotioatos, fosforotioatos quirais, fosforoditioatos, fosfotriésteres, aminoalquilfosfotriésteres, metil e outros fosfonatos alquil incluindo 3'-alquileno fosfonatos, 5'-alquileno fosfonatos e fosfonatos quirais, fosfinatos, fosforamidatos incluindo 3'- amino fosforamidato e aminoalquilfosforamidatos, fosforodiamidatos, tionofosforamidatos, tionoalquilfosfonatos, tionoalquilfosfotriésteres, selenofosfatos e boranofosfatos tendo ligações normais 3'-5', análogos ligados 2'-5' destas e aquelas tendo polaridade invertida onde uma ou mais ligações internucleotídeo é uma ligação 3' para 3', 5' para 5' ou 2' para 2'. Oligonucleotídeos apropriados tendo polaridade invertida compõem uma única ligação 3' para 3' na ligação internucleotídeo de 3' principal, ou seja, um único resíduo nucleosídeo invertido que pode ser um básico (a nucleobase está faltando ou tem um grupo hidroxila em seu lugar). Também estão incluídos vários sais (como, por exemplo, potássio ou sódio), sais mistos e formas de ácido livre.
[0196] Em algumas modalidades, um ácido nucleico objeto compreende uma ou mais ligações internucleosídeo fosforotioato e/ou heteroátomo, em particular -CH2-NH-O-CH2-, -CH2-N(CH3)-O-CH2- (conhecido como um metileno (metilimino) ou estrutura MMI), -CH2-O-N(CH3)-CH2-, -CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2- e - O-N(CH3)-CH2-CH2- (em que a ligalçao internucleotídeo fosfodiéster nativa é representada como -O-P(=O)(OH)-O-CH2-).
Ligações internucleotideo tipo MMI type são reveladas acima na Patente US 5.489.677 referenciada. Ligações internucleosídeo amida adequadas são divulgadas na Patente US 5.602.240.
[0197] Também são adequados os ácidos nucleicos tendo estruturas morfolinon, conforme descrito em, por exemplo, Patente US 5.034.506. Por exemplo, em algumas modalidades, um ácido nucleico objeto é composto por um anel de 6 membros morfolino no lugar de um anel de ribose. Em algumas dessas modalidades, uma ligação internucleosídeo fosforodiamidato ou não fosfodiéster substitui uma ligação fosfodiéster.
[0198] Estruturas de polinucleotídeo modificado apropriadas que não incluem um átomo de fósforo nele têm estruturas que são formadas por alquil de cadeia curta ou ligações internucleosídeo cicloalquil, misto de heteroátomo e alquil ou ligações internucleosídeo cicloalquil ou uma ou mais ligações de internucleosídeo curtas de cadeia heteroatômica ou heterocíclica. Estes incluem aqueles que têm ligações morfolinos (formados em parte da porção de açúcar de um nucleosídeo); estruturas de siloxano; estruturas de sulfeto, sulfóxido e sulfona; estruturas de formacetil e tioformacetil; estruturas de formacetil e tioformacetil de metileno; estruturas riboacetil; estruturas contendo alqueno; estruturas sulfamato; estruturas de metilenoimino e metilenohidrazino; estruturas de sulfonato e sulfonamida; estruturas de amida; e outras tendo misturas de partes componentes de N, O, S e CHCH2.
Miméticos
[0199] Um ácido nucleico objeto pode ser um ácido nucleico mimético. O termo “mimético” como ele é aplicado aos polinucleotídeos destina-se a incluir polinucleotídeos onde somente o anel furanose ou ambos anel furanose e o ligação internucleotídeo são substituídos com grupos não furanose, substituição somente do anel furanose é também referida na técnica como sendo um substituto do açúcar. A fracai de base heterocíclica ou uma fração de base heterocíclica modificada é mantida para hibridização com um ácido nucleico alvo apropriado. Um dito ácido nucleico, um polinucleotídeo mimético que demonstrou ter propriedades excelentes de hibridização, é referido como um peptídeo de ácidos nucleicos (PNA). No PNA, a estrutura de açúcar de um polinucleotídeo é substituída com uma amida contendo estrutura, em particular uma estrutura aminoetilglicina. Os nucleotídeos são mantidos e são ligados direta ou indiretamente a átomos de nitrogênio aza da parte amida da estrutura.
[0200] Um polinucleotídeo mimético que relatou ter propriedades excelentes de hibridização é um peptídeo de ácidos nucleicos (PNA). A estrutura em compostos de PNA é duas ou mais unidades de aminoetilglicina ligadas que gera a PNA uma amida que contém a estrutura. As frações de base heterocíclicas são ligadas direta ou indiretamente aos átomos de nitrogênio aza da parte amida da estrutura. Patentes US representativas que descrevem a preparação de compostos PNA incluem, entre outras: Patentes US 5.539.082; 5.714.331; e 5.719.262.
[0201] Outra classe de polinucleotídeo mimético que foi estudado baseia-se em unidades morfolinos ligadas (ácido nucleico morfolino) tendo bases heterocíclicas anexadas ao anel morfolino. Um número de grupos de ligação foi relatado que ligam as unidades monoméricas morfolino em um ácido nucleico morfolino. Uma classe de ligação grupos foi selecionada para gerar um composto não iônico oligomérico. Os compostos oligoméricos morfolino não iônicos são menos propensos a terem interações indesejadas com proteínas celulares. Polinucleotídeos baseados em morfolino são miméticos não iônicos dos oligonucleotídeos que são menos propensos a formar interações indesejáveis com proteínas celulares (Dwaine A. Braasch e David R. Corey, Biochemistry, 2002, 41(14), 4503-4510). Polinucleotídeos baseados em morfolino são divulgados na Patente US 5.034.506. Uma variedade de compostos dentro da classe morfolino de polinucleotídeo foi preparada, tendo uma variedade de diferentes grupos de ligação, juntando as subunidades monoméricas.
[0202] Outra classe de mimético de polinucleotídeo é referida como ácidos nucleicos ciclohexenil (CeNA). O anel furanose normalmente presente em uma molécula de DNA/RNA é substituído com um anel de ciclohexenil. CeNA DMT protegidos por monômeros de fosforamidita foram preparados e usados para a síntese de compostos oligoméricos após química clássica de fosforamidita. Compostos oligoméricos CeNA totalmente modificados e oligonucleotídeos tendo posições específicas modificadas com CeNA foram preparados e estudados (ver Wang et al., J. Am. Chem. Soc., 2000, 122, 8595-8602). Em geral, a incorporação de monômeros de CeNA em uma cadeia de DNA aumenta sua estabilidade de um híbrido de DNA/RNA. Oligoadenilatos CeNA formaram complexos com complementos de RNA e DNA com estabilidade semelhante aos complexos nativos. O estudo para incorporar estruturas CeNA em estruturas de ácido nucleico naturais foi mostrado por NMR e dicroísmo circular para proceder com fácil adaptação conformacional.
[0203] A modificação adicional inclui ácidos nucleicos bloqueados (LNAs) em que grupo 2'-hidroxila está ligado ao átomo de carbono 4' do anel açúcar formando uma ligação 2'-C, 4'-C-oximetileno, formando assim uma porção açúcar bicíclico. A ligação pode ser um grupo metileno (-CH2- ), em ponte com o átomo de oxigênio 2' e o átomo de carbono 4' em que n é 1 ou 2 (Singh et al., Chem. Commun., 1998, 4, 455-456). LNA e análogos de LNA exibem estabilidades térmicas duplex muito altas com DNA e RNA complementar (Tm = + 3 a + 10 ° C), estabilidade no sentido de degradacao de 3'- exonucleolítica e propriedades de boa solubilidade. Oligonucleotídeos antissenso potentes e não tóxicos contendo LNAs foram descritos (Wahlestedt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 2000, 97, 5633-5638).
[0204] A síntese e a preparação da adenina de monômeros LNA, citosina, guanina, 5-metil-citosina, timina e uracila, juntamente com sua oligomerização e propriedades de reconhecimento do ácido nucleico foram descritos (Koshkin et al., Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630). LNAs e preparação das mesmas também são descritas em WO 98/39352 e WO 99/14226.
Partes de açúcar modificado
[0205] Um ácido nucleico objeto também pode incluir uma ou mais partes de açúcar substituído. Polinucleotídeo adequados compõem um grupo substituinte de açúcar selecionado a partir de: OH; F; O-, -S ou N-alquil; O, -S ou N-alquenil; O-, - S ou N-alquinil; ou O-alquil-O- alquil, no qual o alquil, alquenol e alquinil podem ser substituídos ou não substituídos C.sub.1 a C10 alquil ou C2 para C10 alquenil e alquinil. Particularmente adequados são O((CH2)nO) mCH3, O(CH2)nOCH3, O(CH2)nNH2, O(CH2)nCH3, O(CH2)nONH2, and O(CH2)nON((CH2)nCH3)2, onde n e m são de cerca de 1 a cerca de 10. Outros polinucleotídeos adequados compõem um grupo substituinte do açúcar selecionado a partir de: C1 a C10 alquil inferior, substituído alquil inferior, alquenil, alquenil, alcaril, aralquil, O-alcaril ou O-aralquil, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, heterocicloalquil, heterocicloalcaril, aminoalquilamino, polialquilamino, silil substituído, um grupo clivando RNA, um grupo repórter, um intercalador, um grupo para melhorar as propriedades farmacocinéticas do oligonucleotídeo ou um grupo para melhorar as propriedades farmacodinâmicas de um oligonucleotídeo e outros substituintes tendo propriedades semelhantes. Uma modificação apropriada inclui 2'-metoxietoxi (2'-O-CH2 CH2OCH3, também conhecido como 2'-O-(2-metoxietil) ou 2'-MOE) (Martin et al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486 504) ou seja, um grupo de alcoxialcoxi. Outra modificação mais adequada inclui 2'-dimetilaminooxietoxi, ou seja, um grupo O(CH2)2ON(CH3)2, também conhecido como 2'-DMAOE, conforme descrito em exemplos adiante e 2'- dimetilaminoetoxietoxi (também conhecido na técnica como 2'- O-dimetil-amino-etoxi-etil ou 2'-DMAEOE), ou seja, 2'-O-CH2- O-CH2-N(CH3)2.
[0206] Outros grupos substituintes adequados de açúcar incluem metoxi (-O-CH3), aminopropoxi (--O CH2 CH2 CH2NH2), alil (-CH2-CH=CH2), -O-alil (--O-- CH2—CH=CH2) e flúor (F). Grupos substituintes 2'-açúcar podem ser na posição arabino (acima) ou posição ribo (para baixo). Uma modificação apropriada 2'-arabino é 2'-F. Modificações semelhantes também podem ser feitas em outras posições no composto oligomérico, particularmente a posição 3' do açúcar sobre o nucleosídeo 3' terminal ou em oligonucleotídeos 2' - 5' ligados e a posição 5' do nucleotídeo terminal 5'. Compostos oligoméricos também podem ter miméticos de açúcar como frações cloroformiato no lugar do açúcar pentofuranosil.
Substituições e modificações de bases
[0207] Um ácido nucleico objeto pode também incluir substituições ou modificações de nucleobase (muitas vezes referido simplesmente como “base” na técnica). Como usado aqui, nucleobases “não modificadas” ou “naturais” incluem as bases purina adenina (A) e guanina (G), e bases pirimidina timina (T), citosina (C) e uracila (U). Nucleobases modificados incluem outros nucleobases sintéticos e naturais, como 5-metilcitosina (5-me-C), 5-hidroximetil citosina, xantina, hipoxantina, 2-aminoadenine, 6-metil e outros derivados alquil da adenina e guanina, 2-propil e outros derivados alquil de adenina e guanina, 2-tiouracil, 2- tiotimina 2-tiocitosina, 5-halouracil e citosina, 5-propinil (-C=C-CH3) uracil e citosina e outros derivados de alquinil de bases pirimidina, 6-azo uracila, citosina e timina, 5- uracil (pseudouracil), 4-tiouracil, 8-halo, 8-amino, 8-tiol, 8-tioalquil, 8-hidroxila e outros 8-substituídos adeninas e guaninas, 5-halo particularmente 5-bromo, 5-trifluorometil e outros 5-substituídos uracils e citosinas, metilguanina-7 e 7-metiladenina, 2-F-adenina, 2-amino-adenina, 8-azaguanina e 8-azaadenina, 7-deazaguanina e 7-deazaadenina e 3- deazaguanina e 3-deazaadenina. Mais nucleobases modificadas incluem pirimidinas tricíclicos como fenoxazine citidina(1H- pirimido(5,4-b)(1,4)benzoxazin-2(3H)-ona), fenotiazina citidina (1H-pirimido(5,4-b)(1,4)benzotiazin-2(3H)-ona), G- clumps como uma citidina fenoxazina substituídos (por exemplo, 9-(2-aminoetoxi)-H-pirimido(5,4-(b) (1,4)benzoxazin- 2(3H)-ona), carbazol citidina (2H-pirimido(4,5-b)indol-2- ona), piridoindol citidina (H-pirido(3',2':4,5)pirrolo(2,3- d)pirimidin-2-ona).
[0208] Frações de base de heterocíclicos também podem incluir aqueles em que a base purina ou pirimidina é substituída com outros heterocíclicos, por exemplo, 7- adenina-deaza, 7-deazaguanosina, 2-aminopiridina e 2- piridona. Nucleobases adicionais incluem aqueles divulgados na patente US 3.687.808, aquelas divulgadasem The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, páginas 858-859, Kroschwitz, J. I., ed. John Wiley & Sons, 1990, aquelas divulgadas por Englisch et al., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613, e aquelas divulgadas por Sanghvi, Y. S., Capítulo 15, Antisense Research and Applications, páginas 289-302, Crooke, S. T. e Lebleu, B., ed., CRC Press, 1993. Algumas destes nucleobases são úteis para aumentar a afinidade de ligação de um composto oligomérico. Estes incluem pirimidinas 5-substituídas, 6- azapirimidinas e purinas N-2, N-6 e 6-O substituídas, incluindo 2-aminopropiladenina, 5-propiniluracil e 5- propinilcitosina. Substituições 5-metilcitosina demonstraram aumentar a estabilidade de ácidos nucleicos duplex por 0,6-1,2° C. (Sanghvi et al., eds., Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278) e são substituições de base adequadas, por exemplo, quando combinadas com modificações de açúcar 2'-O-metoxietil. Conjugados
[0209] Outra modificação possível de ácido nucleico objeto envolve quimicamente ligar ao a polinucleotídeo uma ou mais porções ou conjugados que intensificam a atividade, distribuição celular ou absorção celular do oligonucleotídeo. Estas porções ou conjugados podem incluir grupos conjugados covalentemente aos grupos funcionais, como grupos hidroxila primária ou secundária. Grupos conjugados incluem, entre outros, intercaladores, moléculas repórter, poliaminas, poliamidas, polietileno glicóis, poliéteres, grupos que melhoram as propriedades farmacodinâmicas dos oligômeros e grupos que melhoram as propriedades farmacocinéticas de oligômeros. Grupos conjugados adequados incluem, entre outros, colesterol, lipídeos, fosfolipídeos, biotina, fenazina, ácido fólico, fenantridina, antraquinona, acridina, fluoresceínas, rodaminas, cumarinas e corantes. Grupos que melhoram as propriedades farmacodinâmicas incluem grupos que melhoram a absorção, aumentam a resistência à degradação e/ou reforçam a sequência específica de hibridização com o ácido nucleico alvo. Grupos que melhoram as propriedades farmacocinéticas incluem grupos que melhoram a absorção, distribuição, metabolismo ou excreção de ácido nucleico objeto.
[0210] Porções de conjugado incluem entre outros frações de lipídeos como um agrupamento de colesterol (Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86, 6553-6556), ácido cólico (Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1994, 4, 1053-1060), um tioéter, por exemplo, hexil-S-tritiltiol (Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660, 306-309; Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3, 2765-2770), um tiocolesterol (Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20, 533-538), uma cadeia alifática, por exemplo, resíduos de dodecandiol ou undecil (Saison-Behmoaras et al., EMBO J., 1991, 10, 1111-1118; Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259, 327-330; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75, 49-54), um fosfolípido, por exemplo, di-hexadecil-rac-glicerol ou trietilamônio 1,2-di-O- hexadecil-rac-glicero-3-H-fosfonato (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654; Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18, 3777-3783), uma poliamina ou uma cadeia de polietileno glicol (Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14, 969-973), ou ácido acético adamantano (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654), uma porção de palmitil (Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264, 229-237), ou uma porção de octadecilamina ou hexilamino-carbonil-oxicolesterol (Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277, 923-937.\
[0211] Um conjugado pode incluir um “Domínio de transdução da proteína” ou PTD (também conhecido como CPP - peptídeo penetrante de célula), que pode se referir a um polipeptídeo, polinucleotídeo, carboidrato ou compostos orgânicos ou inorgânicos que facilita a travessia de uma bicamada lipídica, micela, membrana celular, membrana das organelas ou membrana da vesícula. Um PTD ligado a outra molécula, que pode variar de uma pequena molécula polar a uma macromolécula grande e/ou uma nanopartícula, facilita a molécula de atravessar uma membrana, por exemplo, indo do espaço extracelular ao espaço intracelular ou citosol para dentro de uma organela. Em algumas modalidades, um PTD é covalentemente ligado a amino terminal de um polipeptídeo exógeno (por exemplo, um polipeptídeo modificador direcionado ao sítio). Em algumas modalidades, um PTD está ligado covalentemente o terminal carboxila de um polipeptídeo exógeno (por exemplo, um polipeptídeo modificador direcionado ao sítio). Em algumas modalidades, um PTD é covalentemente ligado a um ácido nucleico (por exemplo, um RNA tendo DNA como alvo, um polinucleotídeo de codificação de um RNA tendo DNA como alvo, um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo modificador direcionado a sítio, etc.). PTDs exemplares incluem entre outros um domínio de transdução da proteína undecapeptídeo mínimo (correspondente a resíduos 47-57 de HIV-1 TAT compreendendo YGRKKRRQRRR; SEQ ID NO: 264); uma sequência de poliarginina composta por um número de argininas suficientes para direcionar a entrada em uma célula (por exemplo, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou 10-50 argininas); um domínio VP22(Zender et al. (2002) Cancer Gene Ther. 9(6):489- 96); um domínio de transdução da proteína de Drosófila Antennapedia (Noguchi et al. (2003) Diabetes 52(7):1732- 1737); um peptídeo calcitonina humana truncado (Trehin et al. (2004) Pharm. Research 21:1248-1256); polylysine (Wender et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:13003-13008); RRQRRTSKLMKR (SEQ ID NO:265); Transportan GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL (SEQ ID NO:266); KALAWEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKCEA (SEQ ID NO:267); e RQIKIWFQNRRMKWKK (SEQ ID NO:268). PTDs Exemplares incluem entre outros, YGRKKRRQRRR (SEQ ID NO: 264), RKKRRQRRR (SEQ ID NO: 269); um homopolímero de arginina de 3 resíduos de arginina para 50 resíduos de arginina; sequências de aminoácidos de domínio PTD exemplares incluem, entre outras, qualquer uma das seguintes: YGRKKRRQRRR (SEQ ID NO: 264); RKKRRQRR (SEQ ID NO: 270); YARAAARQARA (SEQ ID NO: 271); THRLPRRRRRR (SEQ ID NO: 272); e GGRRARRRRRR (SEQ ID NO: 273). Em algumas modalidades, o PTD é uma PSC ativável (ACPP) (Aguilera et al. (2009) Integr Biol (Camb) June; 1(5-6): 371 381). ACPPs compõem um CPP policatiônico (por exemplo, Arg9 ou “R9”) conectado via um ligante clivável a um poliânion correspondente (por exemplo, Glu9 ou “E9”), que reduz carga líquida a quase zero e, assim, inibe a adesão e absorção em células. Após clivagem do ligante, é liberado o poliânion, localmente desmascarando a poliarginina e sua adesividade inerente, “ativando” assim o ACPP para atravessar a membrana.
RNAs tendo DNA como alvo exemplares
[0212] Em algumas modalidades, um RNA tendo DNA como alvo adequado compreende duas diferentes moléculas de RNA polinucleotídeo. A primeira das duas moléculas de RNA polinucleotídeo separadas (o RNA ativador) é composta por uma sequência de nucleotídeos, tendo pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 65%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos, cerca de 75%, pelo menos, cerca de 80%, pelo menos, cerca de 85%, pelo menos, cerca de 90%, pelo menos, cerca de 95%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99% ou 100% do identidade de sequência ao nucleotídeo ao longo de um trecho de pelo menos 8 nucleotídeos contíguos a qualquer uma das sequências de nucleotídeos estabelecidas na SEQ ID NO: 431-562, ou complementos das mesmas. A segunda das duas moléculas de RNA polinucleotídeo separadas (o RNA direcionador) é composta por uma sequência de nucleotídeos, tendo pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 65%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos, cerca de 75%, pelo menos, cerca de 80%, pelo menos, cerca de 85%, pelo menos, cerca de 90%, pelo menos, cerca de 95%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99% ou 100% de identidade de sequência ao nucleotídeo ao longo de um trecho de pelo menos 8 nucleotídeos contíguos a qualquer uma das sequências de nucleotídeos estabelecidos no SEQ ID NOs: 563-679, ou complementos das mesmas.
[0213] Em algumas modalidades, um RNA tendo DNA como alvo adequado é um único polinucleotídeo de RNA e é composto por uma primeira sequência de nucleotídeos tendo pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 65%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos, cerca de 75%, pelo menos, cerca de 80%, pelo menos, cerca de 85%, pelo menos, cerca de 90%, pelo menos, cerca de 95%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99% ou 100% de identidade de sequência ao nucleotídeos ao longo de um trecho de pelo menos 8 contíguo nucleotídeos para qualquer uma das sequências de nucleotídeos estabelecidos nas SEQ ID NOs: 431-562 e uma segunda sequência de nucleotídeo, tendo pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 65%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos, cerca de 75%, pelo menos, cerca de 80%, pelo menos, cerca de 85%, pelo menos, cerca de 90%, pelo menos, cerca de 95%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99% ou 100% de identidade de sequência ao nucleotídeo ao longo de um trecho de pelo menos 8 nucleotídeos contíguos a qualquer uma das sequências de nucleotídeos estabelecidas na SEQ ID NOs: 463-679.
[0214] Em algumas modalidades, o RNA tendo DNA como alvo é um RNA tendo DNA de molécula dupla alvo e o RNA direcionador compreende a sequência 5' GUUUUAGAGCUA 3' (SEQ ID NO: 679) ligada em sua extremidade 5' de um trecho de nucleotídeos que são complementares a um DNA alvo. Em algumas modalidades, o RNA tendo DNA como alvo é um RNA tendo DNA de molécula dupla alvo e o RNA ativador compreende a sequência 5' UAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCG 3' (SEQ ID NO: //).
[0215] Em algumas modalidades, o RNA tendo DNA como alvo é um RNA tendo DNA de molécula única como alvo e compreende a sequência 5'-GUUUUAGAGCUA-ligante- UAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCG-3' ligada em sua extremidade 5' de um trecho de nucleotídeos complementares para um DNA alvo (onde “ligante” denota qualquer sequência de nucleotídeos de ligante que pode abranger qualquer sequência nucleotídica) (SEQ ID NO: //). Outros exemplos de RNAs tendo DNA de molécula simples como alvo incluem aqueles estabelecidos na SEQ ID NOs: 680-682.
Ácidos nucleicos codificando um RNA tendo DNA como alvo objeto e/ou um polipeptídeo modificar direcionado ao sítio objeto
[0216] A presente divulgação fornece um ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica um RNA tendo DNA como alvo objeto e/ou um polipeptídeo modificador direcionado ao sítio objeto. Em algumas modalidades, um ácido nucleico que codifica RNA tendo DNA como alvo sujeito é um vetor de expressão, por exemplo, um vetor de expressão recombinante.
[0217] Em algumas modalidades, um método objeto envolve entrar em contato com um DNA alvo ou introduzir em uma célula (ou uma população de células) um ou mais ácidos nucleicos compostos por sequências de nucleotídeos que codificam um RNA tendo DNA como alvo e/ou um polipeptídeo modificador direcionado a sítio. Em algumas modalidades uma célula composta por um DNA alvo é in vitro. Em algumas modalidades uma célula composta por um DNA alvo é in vivo. Ácidos nucleicos adequados, compostos por sequências de nucleotídeos que codificam um RNA tendo DNA como alvo e/ou um polipeptídeo modificador direcionado ao sítio incluem vetores de expressão, onde um vetor de expressão, composto por uma sequência de nucleotídeos que codifica um RNA tendo DNA como alvo e/ou polipeptídeo modificador direcionado ao sítio é um “vetor de expressão recombinante.”
[0218] Em algumas modalidades, o vetor de expressão recombinante é uma construção viral, por exemplo, um constructo de vírus adeno-associado recombinante (ver, por exemplo, Patente US 7.078.387), um constructo de adenovírus recombinante, um constructo de Lentivírus recombinante, um constructo retroviral recombinante, etc.
[0219] Vetores de expressão adequados incluem, entre outros, vetores virais (por exemplo, vetores virais com base no vírus vaccinia; poliovírus; adenovírus (ver, por exemplo, Li et al., Invest Opthalmol Vis Sci 35:2543 2549, 1994; Borras et al., Gene Ther 6:515 524, 1999; Li and Davidson, PNAS 92:7700 7704, 1995; Sakamoto et al., H Gene Ther 5:1088 1097, 1999; WO 94/12649, WO 93/03769; WO 93/19191; WO 94/28938; WO 95/11984 e WO 95/00655); vírus adeno-associado (ver, por exemplo, Ali et al., Hum Gene Ther 9:81 86, 1998, Flannery et al., PNAS 94:6916 6921, 1997; Bennett et al., Invest Opthalmol Vis Sci 38:2857 2863, 1997; Jomary et al., Gene Ther 4:683 690, 1997, Rolling et al., Hum Gene Ther 10:641 648, 1999; Ali et al., Hum Mol Genet 5:591 594, 1996; Srivastava in WO 93/09239, Samulski et al., J. Vir. (1989) 63:3822-3828; Mendelson et al., Virol. (1988) 166:154-165; and Flotte et al., PNAS (1993) 90:10613-10617); SV40; vírus herpes simplex; vírus de imunodeficiência humana (ver, por exemplo, Miyoshi et al., PNAS 94:10319 23, 1997;Takahashi et al., J Virol 73:7812 7816, 1999); um vetor retroviral (por exemplo, vírus leucemia murino, vírus de necrose do baço e vetores derivados de retrovírus como vírus Rous Sarcoma, vírus do Sarcoma de Harvey, vírus da leucose aviária, um lentivírus, vírus da imunodeficiência humana, vírus do sarcoma mieloproliferativa e vírus do tumor mamário); e semelhantes.
[0220] Inúmeros vetores de expressão adequados são conhecidos por especialistas na técnica, e muitos estão comercialmente disponíveis. Os seguintes vetores são fornecidos a título de exemplo; para as células hospedeiras eucarióticas: pXT1, pSG5 (Stratagene), pSVK3, pBPV, pMSG, and pSVLSV40 (Pharmacia). No entanto, qualquer outro vetor pode ser usado, desde que seja compatível com a célula hospedeira.
[0221] Dependendo do sistema hospedeiro/vetor utilizado, qualquer um de um número elementos de controle de transcrição e de tradução adequados, incluindo promotores constitutivos e induzíveis, elementos potencializadores de transcrição, terminadores de transcrição, etc. podem ser utilizados no vetor de expressão (ver, por exemplo, Bitter et al. (1987) Methods in Enzymology, 153:516-544).
[0222] Em algumas modalidades, uma sequência de nucleotídeos que codifica um RNA tendo DNA como alvo e/ou um polipeptídeo modificador direcionado ao sítio está operacionalmente ligada a um elemento de controle, por exemplo, um elemento de controle de transcrição, como um promotor. O elemento de controle de transcrição pode ser funcional em qualquer uma célula eucariota, por exemplo, uma célula mamífera; ou uma célula procariótica (por exemplo, a célula bacteriana ou Archaea). Em algumas modalidades, uma sequência de nucleotídeos que codifica um RNA tendo DNA como alvo e/ou um polipeptídeo modificador direcionado ao sítio operacionalmente está ligada a vários elementos de controle que permitem a expressão da sequência de nucleotídeos que codifica um RNA tendo DNA como alvo e/ou um polipeptídeo modificador direcionado ao sítio em células procariotas e eucariotas.
[0223] Exemplos não limitantes de promotores eucariotas apropriados (promotores funcionais em uma célula eucariótica) incluem aqueles de citomegalovírus (CMV) imediato precoce, vírus herpes simplex (HSV) timidina quinase, SV40 precoce e tardio, repetições terminais longas (LTRs) de retrovírus e metalotioneína I de camundongo. Seleção do vetor apropriado e promotor está dentro do nível especialista na técnica. O vetor de expressão também pode conter um sítio de ligação ao ribossomo para iniciar a tradução e um terminador de transcrição. O vetor de expressão também pode incluir sequências apropriadas para amplificar a expressão. O vetor de expressão também pode incluir sequências nucleotídicas que codificam tags de proteína (por exemplo, 6xHis tag, tag de hemaglutinina, proteína verde fluorescente, etc.) que são fundidas para o polipeptídeo modificador direcionado a sítio, resultando assim em um polipeptídeo quimérico.
[0224] Em algumas modalidades, uma sequência de nucleotídeos que codifica um RNA tendo DNA como alvo e/ou um polipeptídeo modificador direcionado ao sítio operacionalmente está ligada a um promotor induzível. Em algumas modalidades, uma sequência de nucleotídeos que codifica um RNA tendo DNA como alvo e/ou um polipeptídeo modificador direcionado ao sítio operacionalmente é ligada a um promotor constitutivo.
[0225] Métodos de introdução de um ácido nucleico em uma célula hospedeira são conhecidos na técnica, e qualquer método conhecido pode ser usado para introduzir um ácido nucleico (por exemplo, um constructo de expressão) em uma célula. Métodos adequados incluem, por exemplo, infecção viral ou do bacteriófago, transfecção, conjugação, fusão de protoplastos, lipofecção, eletroporação, precipitação de fosfato de cálcio, transfecção mediada por polietilenoimina (PEI), transfecção mediada por DEAE-dextrano, transfecção mediada por lipossomas, tecnologia pistola de partículas, precipitação de fosfato de cálcio, microinjeção direta, liberação de ácido nucleico mediada por nanopartículas (ver, por exemplo, Panyam et., al Adv Drug Deliv Rev. 2012 Sep 13.pii: S0169-409X(12)00283-9. doi: 10.1016/j.addr.2012.09.023), e semelhantes.
POLIPEPTÍDEOS QUIMÉRICOS
[0226] A presente divulgação fornece um polipeptídeo modificador quimérico direcionado ao sítio. Um polipeptídeo modificador direcionado ao sítio quimérico objeto interage com (por exemplo, se liga a) um RNA tendo DNA como alvo objeto (descrito acima). O RNA tendo DNA como alvo orienta o polipeptídeo modificador quimérico direcionado ao sítio para uma sequência alvo dentro do DNA alvo (por exemplo, uma sequência cromossômica ou uma sequência extracromossômica, por exemplo, uma sequência epissomal, uma sequência de minicírculo, uma sequência mitocondrial, uma sequência de cloroplasto, etc.). Um polipeptídeo quimérico modificador direcionado ao sítio objeto modifica o DNA alvo (por exemplo, clivagem ou metilação do DNA alvo) e/ou um polipeptídeo associado com DNA alvo (por exemplo, a metilação ou acetilação de uma cauda de histona).
[0227] Um polipeptídeo quimérico modificador direcionado ao sítio objeto modifica o DNA alvo (por exemplo, clivagem ou metilação do DNA alvo) e/ou um polipeptídeo associado com DNA alvo (por exemplo, a metilação ou acetilação de uma cauda de histona). Um polipeptídeo modificador quimérico direcionado ao sítio também é referido aqui como um “polipeptídeo quimérico direcionado ao sítio” ou um “polipeptídeo modificador quimérico direcionado ao sítio de ligação ao RNA.”
[0228] Polipeptídeo quimérico modificador direcionado ao sítio objeto é composto por duas porções, uma porção de ligação ao RNA e uma porção de atividade. Um polipeptídeo quimérico modificador direcionado ao sítio objeto é composto por sequências de aminoácidos que são derivadas de pelo menos dois polipeptídeos diferentes. Um polipeptídeo quimérico modificador direcionado ao sítio objeto pode incluir sequências de polipeptídeo modificados e/ou de ocorrência natural (por exemplo, uma primeira sequência de aminoácidos de uma proteína de Cas9/Csn1 modificada ou não modificada; e uma segunda sequência de aminoácidos que não seja a proteína Cas9/Csn1).
Porção de ligação ao RNA
[0229] Em alguns casos, a porção de ligação ao RNA de um polipeptídeo quimérico modificador direcionado ao sítio objeto é um polipeptídeo de ocorrência natural. Em outros casos, a porção de ligação ao RNA de um polipeptídeo quimérico modificador direcionado ao sítio objeto não é uma molécula de ocorrência natural (modificado, por exemplo, mutação, exclusão, inserção). Porções de ligação ao RNA de ocorrência natural de interesse são derivadas de polipeptídeos modificador direcionado ao sítio, conhecidos na técnica. Por exemplo, SEQ ID NOs: 1-256 e 795-1346 fornecem uma lista exaustiva e não limitante de endonucleases Cas9/Csn1 de ocorrência natural que podem ser usadas como polipeptídeos modificadores direcionados aos sítios. Em alguns casos, a porção de ligação ao RNA de um polipeptídeo quimérico modificador direcionado ao sítio objeto é composta por uma sequência de aminoácidos com pelo menos cerca de 75%, pelo menos, cerca de 80%, pelo menos, cerca de 85%, pelo menos, cerca de 90%, pelo menos, cerca de 95%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos aproximadamente 99% ou 100% identidade sequência à de aminoácido à porção de ligação ao RNA de um polipeptídeo tendo qualquer uma das sequências de aminoácidos como SEQ ID NOs: 1-256 e 795-1346).
[0230] Em alguns casos, o polipeptídeo modificador direcionado ao sítio é composto por uma sequência de aminoácidos, tendo pelo menos cerca de 75%, pelo menos, cerca de 80%, pelo menos, cerca de 85%, pelo menos sobre 90%, pelo menos, cerca de 95%, pelo menos cerca de 99% ou 100% de identidade de sequência de aminoácidos de aminoácidos 7-166 ou 731-1003 da sequência de aminoácidos Cas9/Csn1 retratada na Figura 3, ou para as porções correspondentes em qualquer uma das sequências de aminoácidos estabelecidas como SEQ: ID NOs: 1-256 e 795-1346.
Porção de atividade
[0231] Além da porção de ligação ao RNA, o polipeptídeo quimérico modificador direcionado ao sítio compreende uma “porção de atividade”. Em algumas modalidades, a porção da atividade de um polipeptídeo quimérico modificador direcionado ao sítio objeto compreende a porção de atividade de ocorrência natural de um polipeptídeo modificador direcionado ao sítio (por exemplo, endonuclease Cas9/Csn1). Em outras modalidades, a porção da atividade de um polipeptídeo quimérico modificador direcionado ao sítio objeto é composta por uma sequência de aminoácidos modificada (por exemplo, substituição, exclusão, inserção) de uma porção de atividade de ocorrência natural de um polipeptídeo modificador direcionado ao sítio. Porções de atividade de interesse de ocorrência natural são derivadas de polipeptídeos modificadores direcionados ao sítio conhecidos na técnica. Por exemplo, SEQ ID NOs: 1-256 e 795-1346 fornecem uma lista exaustiva e não limitante de endonucleases Cas9/Csn1 de ocorrência natural que podem ser usadas como polipeptídeos modificadores direcionados aos sítios. A porção da atividade de um polipeptídeo quimérico modificador direcionado ao sítio objeto é variável e pode incluir qualquer sequência heteróloga do polipeptídeo que pode ser útil nos métodos divulgados aqui.
[0232] Em algumas modalidades, um polipeptídeo quimérico modificador direcionado ao sítio objeto é composto por: (i) uma porção de ligação ao RNA que interage com um RNA tendo DNA como alvo, no qual o RNA tendo DNA como alvo é composto por uma sequência de nucleotídeos que é complementar a uma sequência em um alvo DNA; e (ii) uma porção de atividade que apresenta atividade enzimática direcionada ao sítio (por exemplo, atividade de metilação do DNA, atividade para a clivagem do DNA, atividade para acetilação da histona, atividade para a metilação de histona, etc.), em que o sítio da atividade enzimática é determinado pelo RNA tendo DNA como alvo.
[0233] Em outras modalidades, um polipeptídeo quimérico modificador direcionado ao sítio objeto é composto por: (i) uma porção de ligação ao RNA que interage com um RNA tendo DNA como alvo, no qual o RNA tendo DNA como alvo é composto por uma sequência de nucleotídeos que é complementar a uma sequência em um alvo DNA; e (ii) uma porção de atividade que modula a transcrição dentro do DNA alvo (por exemplo, para aumentar ou diminuir a transcrição), em que o sítio da transcrição modulada dentro o DNA alvo é determinado pelo RNA tendo DNA como alvo.
[0234] Em alguns casos, a porção da atividade de um polipeptídeo quimérico modificador direcionado ao sítio objeto tem atividade enzimática que modifica o DNA alvo (por exemplo, atividade nuclease, atividade metiltransferase, atividade demetilase, atividade de reparo do DNA, atividade de dano do DNA, atividade de desaminação, atividade dismutase, atividade de alquilação, atividade depurinação, atividade de oxidação, atividade formadora de dímero de pirimidina, atividade integrase, atividade transposase, atividade de recombinase, atividade de polimerase, atividade de ligase, atividade de helicase, atividade de fotoliaseou atividade de glicosilase).
[0235] Em outros casos, a porção da atividade de um polipeptídeo quimérico modificador direcionado ao sítio objeto tem atividade enzimática (por exemplo, atividade metiltransferase, atividade demetilase, atividade acetiltransferase, atividade deacetilase, atividade da quinase, atividade da fosfatase, atividade de ubiquitina ligase, atividade deubiquitinação, atividade adenilação, atividade desadenilação, atividade SUMOilação, atividade desSUMOilação, atividade ribosilação, atividade desribosilação, atividade miristoilação ou atividade desmiristoilação) que modifica um polipeptídeo associado com DNA alvo (por exemplo, uma histona).
[0236] Em alguns casos, a porção da atividade de um polipeptídeo quimérico modificador direcionado ao sítio objeto apresenta atividade enzimática (descrita acima). Em outros casos, a porção da atividade de um polipeptídeo quimérico modificador direcionado ao sítio objeto modula a transcrição do DNA alvo (descrito acima). A porção da atividade de um polipeptídeo quimérico modificador direcionado ao sítio objeto é variável e pode incluir qualquer sequência heteróloga do polipeptídeo que pode ser útil nos métodos divulgados aqui.
Polipeptídeos quiméricos modificadores direcionados ao sítio exemplares
[0237] Em algumas modalidades, a porção da atividade do polipeptídeo quimérico modificador direcionado ao sítio compreende uma forma modificada da proteína Cas9/Csn1. Em alguns casos, a forma modificada da proteína Cas9/Csn1 compreende uma mudança de aminoácido (por exemplo, exclusão, inserção ou substituição) que reduz a atividade de nuclease de ocorrência natural da proteína Cas9/Csn1. Por exemplo, em alguns casos, a forma modificada da proteína Cas9/Csn1 tem menos de 50%, menos de 40%, menos de 30%, menos de 20%, menos de 10%, menos de 5%, ou menos de 1% da atividade nuclease do correspondente polipeptídeo de Cas9/Csn1 do tipo selvagem. Em alguns casos, a forma modificada do polipeptídeo Cas9/Csn1 não tem nenhuma atividade nuclease substancial.
[0238] Em algumas modalidades, a forma modificada do polipeptídeo Cas9/Csn1 é uma mutação D10A (aspartato para alanina na posição do aminoácido 10 de SEQ ID NO: 8) (ou a correspondente mutação de qualquer das proteínas apresentadas em SEQ: ID NOs: 1-256 e 795-1346) que pode clivar a fita complementar do DNA alvo, mas reduziu a capacidade de clivar a cadeia não complementar do DNA alvo (ver Figura 11). Em algumas modalidades, a forma modificada do polipeptídeo Cas9/Csn1 é uma mutação H840A (histidina para alanina na posição do aminoácido 840) (ou a correspondente mutação de qualquer das proteínas estabelecidas como SEQ: ID NOs: 1-256 e 795-1346) que pode clivar a cadeia não complementar do DNA alvo, mas reduziu a capacidade de clivar a cadeia complementar do DNA alvo (ver Figura 11). Em algumas modalidades, a forma modificada do polipeptídeo Cas9/Csn1 abriga as mutações D10A e H840A (ou as mutações correspondentes de qualquer das proteínas estabelecidas como SEQ: ID NOs: 1-256 e 795-1346) tal que o polipeptídeo tem uma redução da capacidade para clivar as fitas complementares e não complementares de DNA alvo. Outros resíduos podem ser uma mutação para alcançar os efeitos acima (ou seja, inativar uma ou outras partes de nuclease). Como exemplos não limitantes, resíduos D10, G12, G17, E762, H840, N854, N863, H982, H983,A984, D986, ou A987 (ou as mutações correspondentes de qualquer das proteínas estabelecidas como SEQ: ID NOs: 1-256 e 795-1346) podem ser alterados (ou seja, substituídos) (ver Figura 3, Figura 5, Figura 11A, e Tabela 1 para mais informações sobre a conservação de resíduos de aminoácidos Cas9). Além disso, mutações além de substituições de alanina são adequadas. Para obter mais informações importantes
[0239] Tabela 1. A Tabela 1 lista 4 motivos que estão presentes nas sequências Cas9 de várias espécies (ver também Figura 3 e Figura 5). Os aminoácidos listados aqui são a Cas9 de S. pyogenes (SEQ ID NO:8).
Figure img0001
[0240] Em alguns casos, o polipeptídeo quimérico modificador direcionado ao sítio compreende uma sequência de aminoácidos, tendo pelo menos cerca de 75%, pelo menos, cerca de 80%, pelo menos, cerca de 85%, pelo menos, cerca de 90%, pelo menos, cerca de 95%, pelo menos cerca de 99% ou 100% de identidade de sequência de aminoácidos aos aminoácidos 7-166 ou 731-1003 da sequência de aminoácidos de Cas9/Csn1 representada na Figura 3, ou para as partes correspondentes em qualquer uma das sequências de aminoácidos estabelecidas nas SEQ: ID NOs: 1-256 e 795-1346. Em alguns casos, o polipeptídeo modificador quimérico direcionado ao sítio é composto por 4 motivos (como listado na tabela 4 e representados na figura 3A e Figura 5), cada um com com sequências de aminoácido tendo pelo menos cerca de 75%, pelo menos, cerca de 80%, pelo menos, cerca de 85%, pelo menos, cerca de 90%, pelo menos, cerca de 95%, pelo menos cerca de 99% ou 100% de identidade de sequência de aminoácidos a cada um dos 4 motivos listados na tabela 1 (SEQ ID NO: 260-263), ou para as partes correspondentes em qualquer uma das sequências de aminoácidos estabelecidas como SEQ: ID NOs: 1-256 e 795-1346. Em alguns casos, o polipeptídeo quimérico modificador direcionado ao sítio compreende aminoácido sequências tendo pelo menos cerca de 75%, pelo menos, cerca de 80%, pelo menos, cerca de 85%, pelo menos, cerca de 90%, pelo menos, cerca de 95%, pelo menos cerca de 99% ou 100% de identidade de sequência de aminoácido aos aminoácidos 7-166 ou 731-1003 da sequência de aminoácidos Cas9/Csn1 retratada na Figura 3, ou as partes correspondentes em qualquer das sequências de aminoácidos estabelecidas como SEQ: ID NOs: 1-256 e 795-1346.
[0241] Em algumas modalidades, a porção de atividade do polipeptídeo direcionado ao sítio modificador compreende um polipeptídeo heterólogo que tem atividade modificadora de DNA e/ou atividade do fator de transcrição e/ou atividade modificadora de polipeptídeo associado ao DNA. Em alguns casos, um polipeptídeo heterólogo substitui uma parte do polipeptídeo Cas9/Csn1 que fornece a atividade da nuclease. Em outras modalidades, um polipeptídeo modificador direcionado ao sítio objeto compreende uma porção do polipeptídeo Cas9/Csn1 que normalmente fornece a atividade de nuclease (e essa porção pode ser totalmente ativa ou em vez disso pode ser modificada para ter menos de 100% da atividade correspondente tipo selvagem) e um polipeptídeo heterólogo. Em outras palavras, em alguns casos, um polipeptídeo quimérico modificador direcionado ao sítio objeto é um polipeptídeo de fusão que compreende a porção do polipeptídeo Cas9/Csn1 que normalmente fornece atividade nuclease e o polipeptídeo heterólogo. Em outros casos, um polipeptídeo quimérico modificador direcionado ao sítio objeto é um polipeptídeo de fusão que compreende uma variante modificada da porção de atividade do polipeptídeo Cas9/Csn1 (por exemplo, mudança de aminoácido, exclusão, inserção) e um polipeptídeo heterólogo. Em outros casos, um polipeptídeo quimérico modificador direcionado ao sítio objeto é um polipeptídeo de fusão composto por um polipeptídeo heterólogo e a porção de ligação ao RNA de uma ocorrência natural ou um polipeptídeo modificador direcionado ao sítio modificado.
[0242] Por exemplo, em uma proteína Cas9/Csn1 quimérica, um polipeptídeo de ocorrência natural (ou modificado, por exemplo, mutação, exclusão, inserção) de Cas9/Csn1 bacteriana pode ser fundido a uma sequência heteróloga do polipeptídeo (ou seja, uma sequência de polipeptídeo de uma proteína diferente de Cas9/Csn1) ou uma sequência de polipeptídeo de outro organismo. A sequência do polipeptídeo heteróloga pode apresentar uma atividade (por exemplo, atividade enzimática) que também será apresentada pela proteína Cas9/Csn1 quimérica (por exemplo, atividade metiltransferase, atividade da acetiltransferase, atividade da quinase, atividade ubiquitinação, etc.). Uma sequência do ácido nucleico heterólogo pode estar ligada a outra sequência de ácido nucleico (por exemplo, por engenharia genética) para gerar uma sequência de nucleotídeos quiméricos que codifica um polipeptídeo quimérico. Em algumas modalidades, um polipeptídeo Cas9/Csn1 quimérico é gerado pela fusão de um polipeptídeo Cas9/Csn1 (por exemplo, Cas9 tipo selvagem ou Cas9 variante, por exemplo, um Cas9 com atividade nuclease reduzida ou inativada) com uma sequência heteróloga que forence a localização subcelular (por exemplo, um sinal de localização nuclear (NLS) para o direcionamento para o núcleo; um sinal de localização mitocondrial para o direcionamento para as mitocôndrias; um sinal de localização do cloroplasto para o direcionamento de um cloroplasto; um sinal de retenção ER; e semelhantes). Em algumas modalidades, a sequência heteróloga pode fornecer um tag para facilitar o rastreamento ou a purificação (por exemplo, uma proteína fluorescente, por exemplo, a proteína verde fluorescente (GFP), YFP, RFP, PCP, mCherry, tdTomato e semelhantes; uma marcação HIS, por exemplo, uma marcação 6XHis; uma marcação de hemaglutinina (HA); um tag FLAG; uma marcação Myc; e semelhantes). Em algumas modalidades, a sequência heteróloga pode fornecer para estabilidade aumentada ou diminuída. Em algumas modalidades, a sequência heteróloga pode fornecer um domínio de ligação (por exemplo, fornecer a capacidade de um polipeptídeo Cas9 quimérico para ligar a outra proteína de interesse, por exemplo, um DNA ou proteínas modificadora de histona, um fator de transcrição ou repressor de transcrição, uma proteína de recrutamento, etc.).
[0243] Exemplos de vários parceiros de fusão apropriados adicionais (ou respectivos fragmentos) para um polipeptídeo direcionado ao sítio de Cas9 variante objeto incluem, entre outros, aqueles listados na Figura 54.
Ácido nucleico que codifica um polipeptídeo quimérico modificador direcionado ao sítio objeto
[0244] A presente divulgação fornece um ácido nucleico constituído por uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo quimérico modificador direcionado ao sítio objeto. Em algumas modalidades, o ácido nucleico constituído por uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo quimérico modificador direcionado ao sítio objeto é um vetor de expressão, por exemplo, um vetor de expressão recombinante.
[0245] Em algumas modalidades, um método objeto envolve entrar em contato com um DNA alvo ou introduzir em uma célula (ou uma população de células) de um ou mais ácidos nucleicos compreendendo um polipeptídeo quimérico modificador direcionado ao sítio. Ácidos nucleicos adequados, composto por sequências de nucleotídeos que codificam um polipeptídeo modificador quimérico direcionado ao sítio incluem vetores de expressão, onde um vetor de expressão composto por uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo quimérico modificador direcionado ao sítio é um “vetor de expressão recombinante.”
[0246] Em algumas modalidades, o vetor de expressão recombinante é um constructo viral, por exemplo, um constructo de vírus adeno-associado recombinante (ver, por exemplo, Patente US 7.078.387), um constructo de adenovírus recombinante, um constructo de Lentivirus recombinante, etc.
[0247] Vetores de expressão adequados incluem,entre outros, vetores virais (por exemplo, vetores virais com base no vírus vaccinia; poliovírus; adenovírus (ver, por exemplo, Li et al., Invest Opthalmol Vis Sci 35:2543 2549, 1994; Borras et al., Gene Ther 6:515 524, 1999; Li and Davidson, PNAS 92:7700 7704, 1995; Sakamoto et al., H Gene Ther 5:1088 1097, 1999; WO 94/12649, WO 93/03769; WO 93/19191; WO 94/28938; WO 95/11984 e WO 95/00655); vírus adeno-associado (ver, por exemplo, Ali et al., Hum Gene Ther 9:81 86, 1998, Flannery et al., PNAS 94:6916 6921, 1997; Bennett et al., Invest Opthalmol Vis Sci 38:2857 2863, 1997; Jomary et al., Gene Ther 4:683 690, 1997, Rolling et al., Hum Gene Ther 10:641 648, 1999; Ali et al., Hum Mol Genet 5:591 594, 1996; Srivastava in WO 93/09239, Samulski et al., J. Vir. (1989) 63:3822-3828; Mendelson et al., Virol. (1988) 166:154-165; and Flotte et al., PNAS (1993) 90:10613-10617); SV40; vírus herpes simplex; vírus de imunodeficiência humana (ver, por exemplo, Miyoshi et al., PNAS 94:10319 23, 1997; Takahashi et al., J Virol 73:7812 7816, 1999); um vetor retroviral (por exemplo, vírus leucemia murino, vírus de necrose do baço e vetores derivados de retrovírus como vírus Rous Sarcoma, vírus do Sarcoma de Harvey, vírus da leucose aviária, um lentivírus, vírus da imunodeficiência humana, vírus do sarcoma mieloproliferativa e vírus do tumor mamário); e semelhantes.
[0248] Inúmeros vetores de expressão adequados são conhecidos por especialistas na técnica, e muitos estão comercialmente disponíveis. Os seguintes vetores são fornecidos a título de exemplo; para as células hospedeiras eucarióticas: pXT1, pSG5 (Stratagene), pSVK3, pBPV, pMSG, and pSVLSV40 (Pharmacia). No entanto, qualquer outro vetor pode ser usado, desde que seja compatível com a célula hospedeira.
[0249] Dependendo do sistema hospedeiro/vetor utilizado, qualquer um de um número elementos de controle de transcrição e de tradução adequados, incluindo promotores constitutivos e induzíveis, elementos potencializadores de transcrição, terminadores de transcrição, etc. podem ser utilizados no vetor de expressão (ver, por exemplo, Bitter et al. (1987) Methods in Enzymology, 153:516-544).
[0250] Em algumas modalidades, uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo quimérico modificador direcionado ao sítio é operacionalmente ligada a um elemento de controle, por exemplo, um elemento de controle de transcrição, como um promotor. O elemento de controle de transcrição pode ser funcional em qualquer uma célula eucariota, por exemplo, uma célula mamífera; ou uma célula procariótica (por exemplo, a célula bacteriana ou Archaea). Em algumas modalidades, uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo quimérico modificador direcionado ao sítio operacionalmente está ligada a vários elementos de controle que permitem a expressão da sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo modificador quimérico direcionado ao sítio em células procariotas e eucariotas.
[0251] Exemplos não limitantes de promotores eucariotas apropriados (promotores funcionais em uma célula eucariótica) incluem aqueles de citomegalovírus (CMV) imediato precoce, vírus herpes simplex (HSV) timidina quinase, SV40 precoce e tardio, repetições terminais longas (LTRs) de retrovírus e metalotioneína I de camundongo. Seleção do vetor apropriado e promotor está dentro do nível especialista na técnica. O vetor de expressão também pode conter um sítio de ligação ao ribossomo para iniciar a tradução e um terminador de transcrição. O vetor de expressão também pode incluir sequências apropriadas para amplificar a expressão. O vetor de expressão também pode incluir sequências nucleotídicas que codificam tags de proteína (por exemplo, tag6xHis, tag de hemaglutinina (HA), uma proteína fluorescente (por exemplo, uma proteína verde fluorescente; uma proteína fluorescente amarela, etc.), etc.) que são fundidas ao polipeptídeo modificador direcionado ao sítio quimérico.
[0252] Em algumas modalidades, uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo quimérico modificador direcionado ao sítio operacionalmente está ligada a um promotor induzível (por exemplo, promotor de choque do calor, promotor regulado por tetraciclina, promotor regulado por esteroide, promotor regulado por metal, regulado por receptor de estrogênio, etc.). Em algumas modalidades, uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo quimérico modificador direcionado ao sítio operacionalmente está ligada a um promotor espacialmente restrito e/ou temporalmente restrito (por exemplo, um promotor específico de tecido, um promotor específico de tipo de célula, etc.). Em algumas modalidades, uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo quimérico modificador direcionado ao sítio operacionalmente está ligada a um promotor constitutivo.
[0253] Métodos de introdução de um ácido nucleico em uma célula hospedeira são conhecidos na técnica, e qualquer método conhecido pode ser usado para introduzir um ácido nucleico (por exemplo, um constructo de expressão) em uma célula-tronco ou célula progenitora. Métodos adequados incluem, por exemplo, transfecção viral ou infecção do bacteriófago, conjugação, fusão de protoplastos, lipofecção, eletroporação, precipitação de fosfato de cálcio, transfecção mediada por polietilenoimina (PEI), transfecção mediada por DEAE-dextrano, transfecção mediada por lipossomas, tecnologia pistola de partículas, precipitação de fosfato de cálcio, microinjeção direta, liberação de ácido nucleico mediada por nanopartículas (ver, por exemplo, Panyam et., al Adv Drug Deliv Rev. 2012 Sep 13. pii: S0169-409X(12)00283-9. doi:10.1016/j.addr.2012.09.023), e semelhantes.
MÉTODOS
[0254] A presente divulgação fornece métodos para modificar um DNA alvo e/ou um polipeptídeo associado ao DNA alvo. Geralmente, um método objeto envolve entrar em contato com um DNA alvo com um complexo (um “complexo alvo”), o complexo que compreende um RNA tendo DNA como alvo e um polipeptídeo modificador direcionado a sítio.
[0255] Como discutido acima, um RNA tendo DNA como alvo objeto e um polipeptídeo modificador direcionado ao sítio objeto formam um complexo. O RNA tendo DNA como alvo fornece especificidade alvo para o complexo, composto por uma sequência de nucleotídeos que é complementar a uma sequência de DNA alvo. O polipeptídeo modificador direcionado ao sítio do complexo fornece a atividade específica do sítio. Em algumas modalidades, um complexo objeto modifica um DNA alvo, levando, por exemplo, a clivagem de DNA, metilação de DNA, danos no DNA, reparo do DNA, etc. Em outras modalidades, um complexo objeto modifica um polipeptídeo alvo associado com DNA alvo (por exemplo, uma histona, uma ligação à proteína a DNA, etc), levando a, por exemplo, metilação de histonas, acetilação da histona, ubiquitinação de histona e semelhantes. O DNA do alvo pode ser, por exemplo, DNA nu in vitro, DNA cromossômico em células in vitro, DNA cromossômico em células in vivo, etc.
[0256] Em alguns casos, o polipeptídeo modificador direcionado ao sítio apresenta atividade nuclease que cliva o DNA alvo em uma sequência de DNA alvo definida pela região da complementariedade entre o RNA tendo DNA como alvo e o DNA alvo. Em alguns casos, quando o polipeptídeo modificador direcionado ao sítio é um polipeptídeo relacionado a Cas9 ou Cas9, clivagem específica de sítio do DNA alvo ocorre em locais determinados por ambos (i) emparelhamento de base complementar entre o RNA tendo DNA como alvo e o DNA alvo; e (ii) um curto motif [referido como o motif de protoespaçador adjacentes (PAM)] no DNA alvo. Em algumas modalidades (por exemplo, quando Cas9 de S. pyogenes, ou um Cas9 intimamente relacionado, é usado (ver SEQ: ID NOs: 1-256 e 795-1346)), a sequência de PAM de fita não complementar é 5'-XGG-3 ', onde X é qualquer nucleotide de DNA e X é imediatamente 3' da sequência alvo da fita não complementar do DNA alvo (ver Figura 10). Como tal, a sequência de PAM da fita complementar é 5'-CCY-3 ', onde Y é qualquer nucleotídeo de DNA e Y é imediatamente 5' da sequência alvo da fita complementar do DNA alvo (ver a Figura 10, onde o PAM da fita não complementar é 5'-GGG-3 'e o PAM de fita complementar é 5'-CCC-3'). Em algumas dessas modalidades, X e Y podem ser complementares e o par de base X-Y pode ser qualquer par de base (por exemplo, X = C e Y = G; X = G e Y = C; X = A e Y = T, X = T e Y = A).
[0257] Em alguns casos, proteínas Cas9 diferentes (ou seja, proteínas Cas9 de várias espécies) podem ser vantajosas para usar nos vários métodos fornecidos a fim de capitalizar sobre várias características enzimáticas das proteínas Cas9 diferentes (por exemplo, para diferentes preferências de sequência do PAM; para aumentada ou diminuição da atividade enzimática; para um nível de aumento ou diminuição da toxicidade celular; para alterar o equilíbrio entre NHEJ, reparação direcionada por homologia, quebras da fita simples, quebras de fita dupla, etc.). Proteínas Cas9 de várias espécies (ver SEQ: ID NOs: 1-256 e 795-1346) podem exigir diferente sequências PAM no DNA alvo. Assim, para uma determinada proteína de Cas9 de escolha, o requisito de sequência PAM pode ser diferente do que a sequência 5'-XGG-3' descrita acima.
[0258] Muitos Cas9 ortólogos de uma grande variedade de espécies foram identificados aqui e as proteínas compartilham apenas alguns aminoácidos idênticos. Todos identificados Cas9 ortólogos têm a mesma arquitetura de domínio com um domínio de endonuclease HNH central e um domínio split RuvC/RNaseH (ver figuras 3A, 3B, Figura 5 e tabela 1). Proteínas Cas9 compartilham 4 motivos principais com uma arquitetura conservada. Motivos 1, 2 e 4 são motivos tipo RuvC enquanto motif 3 é um motif HNH. Em alguns casos, um polipeptídeo modificador direcionado ao sítio apropriado é composto por uma sequência de aminoácidos, tendo 4 motivos, cada um dos motivos 1-4, tendo pelo menos cerca de 75%, pelo menos, cerca de 80%, pelo menos, cerca de 85%, pelo menos, cerca de 90%, pelo menos, cerca de 95%, pelo menos cerca de 99% ou 100% identidade de sequência de aminoácidos para os motivos 1-4 da sequência de aminoácidos Cas9/Csn1, representada na figura 3A (SEQ ID NO: 260-263, respectivamente, conforme ilustrado na tabela 1), ou para as porçãos correspondentes em qualquer uma das sequências de aminoácidos estabelecidos em SEQ: ID NOs: 1-256 e 795-1346 (consulte a Figura 5 para um alinhamento de motivos 1-4 de sequências divergentes de Cas9). Em alguns casos, um polipeptídeo modificador direcionado ao sítio apropriado é composto por uma sequência de aminoácidos, tendo pelo menos cerca de 75%, pelo menos, cerca de 80%, pelo menos, cerca de 85%, pelo menos, cerca de 90%, pelo menos, cerca de 95%, pelo menos cerca de 99% ou 100% de identidade de sequência de aminoácidos aos aminoácidos 7-166 ou 731-1003 da sequência de aminoácido Cas9/Csn1 representada na Figura 3, ou para as porções correspondentes em qualquer uma das sequências de aminoácidos estabelecidas como SEQ: ID NOs: 1-256 e 795-1346. Qualquer proteína Cas9 conforme definido acima pode ser usada como um polipeptídeo modificador direcionado ao sítio ou como porção de um polipeptídeo modificador quimérico direcionado ao sítio dos métodos objetos.
[0259] A atividade de nuclease cliva o DNA alvo para produzir quebras da cadeia dupla. Essas quebras são então reparadas pela célula de duas maneiras: junção terminal não homóloga e reparação direcionada por homologia (Figura 2). A junção terminal não homóloga (NHEJ), as quebras da fita dupla são reparadas pela ligação direta das extremidades de quebra a uma outra. Como tal, nenhum material novo do ácido nucleico é inserido no sítio, apesar de alguns materiais de ácidos nucleicos poderem ser perdidos, resultando em uma exclusão. Na reparação de direcionada por homologia, um polinucleotídeo doador com homologia para a sequência do DNA alvo clivada é usada como um modelo para o reparo da sequência de DNA alvo clivada, resultando na transferência de informação genética de polinucleotídeo doador ao DNA alvo. Como tal, novo material ácido nucleico pode ser inserido/copiado para o sítio. Em alguns casos, um DNA alvo é contatado com um polinucleotídeo doador objeto. Em alguns casos, um polinucleotídeo doador objeto é introduzido em uma célula objeto. As modificações do DNA alvo devido a NHEJ e/ou reparação de direcionada por homologia conduzem, por exemplo, a correção de gene, substituição do gene, marcação do gene, inserção do transgene, exclusão de nucleotídeos, quebra do gene, mutação genética, etc.
[0260] Assim, clivagem de DNA por um polipeptídeo modificador direcionado ao sítio pode ser usada para excluir material de ácido nucleico de uma sequência de DNA alvo (por exemplo, para interromper um gene que torna as células suscetíveis à infecção (por exemplo, o gene CCR5 ou CXCR4, que torna as células T suscetíveis à infecção pelo HIV), para remover sequências de repetição de trinucleotídeo que causam doenças nos neurônios, para criar os genes nocautes e mutações como modelos de doenças em pesquisa, etc.) clivando a sequência do DNA alvo e permitindo que a célula repare a sequência na ausência de um polinucleotídeo doador fornecido exogenamente. Assim, os métodos objetos podem ser usados para bater nocautear um gene (resultando em completa falta de transcrição ou transcrição alterada) ou para nocautear material genético em um locus de escolha no DNA alvo.
[0261] Como alternativa, se um RNA tendo DNA como alvo e um polipeptídeo modificador direcionado ao sítio são co-administrados para células com uma sequência de polinucleotídeo doador que inclui pelo menos um segmento com homologia para a sequência do DNA alvo, os métodos objetos podem ser utilizados para adicionar, ou seja, inserir ou substituir, material de ácido nucleico de um sequência de DNA alvo (por exemplo, “knock in” em um ácido nucleico que codifica para uma proteína, um siRNA, miRNA, etc), para adicionar uma marcação (por exemplo, 6xHis, uma proteína fluorescente (por exemplo, uma proteína verde fluorescente; uma proteína fluorescente amarela, etc.), a hemaglutinina (HA), FLAG, etc.), para adicionar uma sequência reguladora de um gene (por exemplo, promotor, sinal de poliadenilação, sequência de entrada interno de ribossoma (IRES), peptídeo 2A, códon de início, códon de parada, sinal splice, sinal de localização, etc.), para modificar uma sequência de ácido nucleico (por exemplo,apresentar uma mutação) e semelhantes. Como tal, um complexo que inclui um RNA tendo DNA como alvo e um polipeptídeo modificador direcionado ao sítio é útil em qualquer aplicação in vitro ou in vivo em qual é desejável para modificar o DNA de uma forma específica ao sítio, ou seja, “marcado”, por exemplo, gene nocaute, gene knock-in, edição de gene, marcação de gene, etc., como usado em, por exemplo, a terapia genética, por exemplo, para tratar uma doença ou como um antiviral, antipatogênico, ou terapêutico anticâncer, a produção de organismos geneticamente modificados na agricultura, a produção em larga escala de proteínas pelas células para fins terapêuticos, diagnóstico, ou de investigação, a indução de células iPS, pesquisa biológica, a marcação de genes de agentes patogênicos por exclusão ou substituição, etc.
[0262] Em algumas modalidades, o polipeptídeo modificador direcionado ao sítio compreende uma forma modificada da proteína Cas9/Csn1. Em alguns casos, a forma modificada da proteína Cas9/Csn1 compreende uma mudança de aminoácido (por exemplo, exclusão, inserção ou substituição) que reduz a atividade de nuclease de ocorrência natural da proteína Cas9/Csn1. Por exemplo, em alguns casos, a forma modificada da proteína Cas9/Csn1 tem menos de 50%, menos de 40%, menos de 30%, menos de 20%, menos de 10%, menos de 5%, ou menos de 1% da atividade nuclease do correspondente polipeptídeo de Cas9/Csn1 do tipo selvagem. Em alguns casos, a forma modificada do polipeptídeo Cas9/Csn1 não tem nenhuma atividade nuclease substancial. Quando um polipeptídeo modificador direcionado ao sítio objeto é uma forma modificada do polipeptídeo Cas9/Csn1 que não contém nenhuma atividade nuclease substancial, pode ser referido como “dCas9.”
[0263] Em algumas modalidades, a forma modificada do polipeptídeo Cas9/Csn1 é uma mutação D10A (aspartato para alanina na posição 10 do aminoácido de SEQ ID NO: 8) (ou a correspondente mutação de qualquer das proteínas estabelecidas como SEQ: ID NOs: 1-256 e 795-1346) que pode clivar a fita complementar do DNA alvo, mas reduziu a capacidade de clivar a cadeia não complementar do DNA alvo (resultando assim em uma quebra de fita simples (SSB), em vez de um DSB; Ver a Figura 11). Em algumas modalidades, a forma modificada do polipeptídeo Cas9/Csn1 é uma mutação H840A (histidina para alanina na posição do aminoácido 840 de SEQ ID NO: 8) (ou a correspondente mutação de qualquer das proteínas estabelecidas como SEQ: ID NOs: 1-256 e 795-1346) que pode clivar a cadeia não complementar do DNA alvo, mas reduziu a capacidade de clivar a fita complementar do DNA alvo (resultando assim em uma quebra de fita simples (SSB), em vez de um DSB; Ver a Figura 11). O uso da variante de D10A ou H840A de Cas9 (ou as mutações correspondentes em qualquer das proteínas estabelecidas como SEQ: ID NOs: 1-256 e 795-1346) podem alterar o resultado biológico esperado porque a junção terminal não homóloga (NHEJ) é muito mais provável de ocorrer quando DSBs estão presentes em oposição a SSBs. Assim, em alguns casos onde um desejo de reduzir a probabilidade de DSB (e, portanto, reduzir a probabilidade de NHEJ), uma variante D10A ou H840A de Cas9 pode ser usada. Outros resíduos podem ser uma mutação para conseguir o mesmo efeito (ou seja, inativar uma ou outras porções de nuclease). Como exemplos não limitantes, resíduos D10, G12, G17, E762, H840, N854, N863, H982, H983, A984, D986, ou A987 (ou as mutações correspondentes de qualquer das proteínas estabelecidas como SEQ: ID NOs: 1-256 e 795-1346) podem ser alterados (ou seja, substituídos) (ver Figura 3, Figura 5, Figura 11A, e Tabela 1 para mais informações sobre a conservação de resíduos de aminoácidos Cas9). Além disso, mutações além de substituições de alanina são adequadas. Em algumas modalidades quando um polipeptídeo direcionado ao sítio (por exemplo, polipeptídeo modificador direcionado ao sítio) reduziu a atividade catalítica (por exemplo, quando uma proteína Cas9 tem uma mutação D10, G12, G17, E762, H840, N854, N863, H982, H983, A984, D986, ou A987, por exemplo, D10A, G12A, G17A, E762A, H840A, N854A, N863A, H982A, H983A, A984A, ou D986A), o polipeptídeo pode ainda ligar ao DNA alvo de forma específica ao sítio (porque ainda é guiado para um sequência de DNA alvo por um RNA tendo DNA como alvo) contanto que retenha a capacidade de interagir com o RNA tendo DNA como alvo.
[0264] Em algumas modalidades, a forma modificada do polipeptídeo Cas9/Csn1 abriga as mutações D10A e H840A (ou as mutações correspondentes de qualquer das proteínas estabelecidas como SEQ: ID NOs: 1-256 e 795-1346) tal que o polipeptídeo tem uma redução da capacidade para clivar as fitas complementares e não complementares de DNA alvo (ou seja, a variante não pode ter nenhuma atividade nuclease substancial). Outros resíduos podem ser uma mutação para conseguir o mesmo efeito (ou seja, inativar uma ou outras porções de nuclease). Como exemplos não limitantes, resíduos D10, G12, G17, E762, H840, N854, N863, H982, H983, A984, D986, ou A987 (ou as mutações correspondentes de qualquer das proteínas estabelecidas como SEQ: ID NOs: 1-256 e 795-1346) podem ser alterados (ou seja, substituídos) (ver Figura 3, Figura 5, Figura 11A, e Tabela 1 para mais informações sobre a conservação de resíduos de aminoácidos Cas9). Além disso, mutações além de substituições de alanina são adequadas.
[0265] Em algumas modalidades, o polipeptídeo modificador direcionado ao sítio compreende uma sequência heteróloga (por exemplo, uma fusão). Em algumas modalidades, uma sequência heteróloga pode prever a localização subcelular do polipeptídeo modificador direcionado ao sítio (por exemplo, um sinal de localização nuclear (NLS) para o direcionamento ao núcleo; um sinal de localização mitocondrial para o direcionamento para as mitocôndrias; um sinal de localização do cloroplasto para o direcionamento a um cloroplasto; um sinal de retenção ER; e semelhantes). Em algumas modalidades, uma sequência heteróloga pode fornecer um tag para facilitar o rastreamento ou a depuração (por exemplo, uma proteína fluorescente, por exemplo, a proteína verde fluorescente (GFP), YFP, RFP, PCP, mCherry, tdTomato e semelhantes; uma marcação his, por exemplo, uma marcação 6XHis; uma marcação hemaglutinina (HA); uma marcação FLAG ; uma marcação Myc; e semelhantes). Em algumas modalidades, a sequência heteróloga pode fornecer para estabilidade aumentada ou diminuída.
[0266] Em algumas modalidades, um polipeptídeo modificador direcionado ao sítio objeto pode ser otimizado por códon. Este tipo de otimização é conhecido na técnica e implica a mutação do DNA derivado de estrangeiro para imitar as preferências de códon do organismo hospedeiro pretendido ou célula enquanto codifica a mesma proteína. Assim, os códons são alterados, mas a proteína codificada permanece inalterada. Por exemplo, se a célula alvo pretendida era uma célula humana, um Cas9 otimizado por códon humano (ou variante, por exemplo, a variante enzimaticamente inativa) seria um polipeptídeo modificador direcionado ao sítio apropriado (ver SEQ ID NO: 256 para um exemplo). Qualquer polipeptídeo modificador direcionado ao sítio apropriado (por exemplo, qualquer Cas9 como qualquer uma das sequências definidas em SEQ: ID NOs: 1-256 e 795-1346) pode ser otimizado por códon. Como outro exemplo não limitante, se a célula hospediera pretendida era uma célula de camundongo, então um Cas9 otimizado por códon de camundongo (ou variante, por exemplo, variante enzimaticamente inativa) seria um polipeptídeo modificador direcionado ao sítio apropriado. Enquanto a otimização por códon não é necessária, é aceitável e pode ser preferencial, em certos casos.
[0267] Em algumas modalidades, um RNA tendo DNA como alvo objeto e um polipeptídeo modificador direcionado ao sítio objeto são utilizados como um sistema induzível para desligar a expressão gênica em células bacterianas. Em alguns casos, os ácidos nucleicos que codifica um RNA tendo DNA como alvo adequado e/ou um polipeptídeo direcionado ao sítio apropriado são incorporados nos cromossomos de uma célula alvo e estão sob controle de um promotor induzível. Quando o RNA tendo DNA como alvo e/ou o polipeptídeo direcionado ao sítio são induzidos, o DNA alvo é clivado (ou alterado) no sítio de interesse (por exemplo, um gene alvo em um plasmídeo separado), quando ambos o RNA tendo DNA como alvo e o polipeptídeo modificador direcionado ao sítio estão presentes e formam um complexo. Como tal, em alguns casos, as cepas de expressão bacterianas são projetadas para incluir sequências de ácidos nucleicos que codificam um polipeptídeo modificador direcionado ao sítio apropriado no genoma bacteriano e/ou um RNA tendo DNA como alvo adequado em um plasmídeo (por exemplo, sob controle de um promotor induzível), permitindo que os experimentos em que a expressão de qualquer gene alvo (expressa de um plasmídeo separado introduzido na cepa) pode ser controlada através da indução de expressão de RNA tendo DNA como alvo e o polipeptídeo direcionado ao sítio.
[0268] Em alguns casos, o polipeptídeo modificador direcionado ao sítio tem atividade enzimática que modifica o DNA alvo de maneiras diferentes de introduzir quebras da cadeia dupla. Atividade enzimática de interesse que pode ser usada para modificar o DNA alvo (por exemplo, fundindo um polipeptídeo heterólogo com atividade enzimática de um polipeptídeo modificador direcionado a sítio, gerando assim um polipeptídeo modificador quimérico direcionado ao sítio) inclui, entre outras, atividade metiltransferase, atividade demetilase, atividade de reparo do DNA, atividade de dano do DNA, atividade de desaminação, atividade dismutase, atividade de alquilação, atividade depurinação, atividade de oxidação, atividade formadora de dímero de pirimidina, atividade de integrase, atividade transposase, atividade de recombinase, atividade de polimerase, atividade de ligase, atividade de helicase, atividade de fotoliase ou atividade de glicosilase. Metilação e demetilação são reconhecidos na técnica como um modo importante de regulamento epigenético do gene enquanto o dano de DNA e atividade de reparação é essencial para a sobrevivência da célula e para a manutenção adequada do genoma em resposta aos estresses ambientais.
[0269] Como tal, os métodos aqui encontram utilidade na modificação epigenética do DNA alvo e podem ser empregados para controlar modificações epigenéticas do DNA em qualquer localização em um DNA alvo por engenharia genética da sequência desejada complementar de ácido nucleico para o segmento tendo DNA como alvo de um RNA tendo DNA como alvo. Os métodos aqui também encontram uso no dano intencional e controlado do DNA em qualquer localização desejado dentro do DNA alvo. Os métodos aqui também encontram uso na reparação do DNA específica de sequência e controlada em qualquer localização desejada dentro do DNA alvo. Métodos para atividades enzimáticas de modificação de DNA alvo para locais específicos no DNA alvo encontram usam em pesquisas e aplicações clínicas.
[0270] Em alguns casos, o polipeptídeo modificador direcionado ao sítio tem atividade que modula a transcrição do DNA alvo (por exemplo, no caso de um polipeptídeo quimérico modificador direcionado a sítio, etc.). Em alguns casos, um polipeptídeo quimérico modificador direcionado ao sítio composto por um polipeptídeo heterólogo que apresenta a capacidade de aumentar ou diminuir a transcrição (por exemplo, polipeptídeos ativador transcricional ou repressor de transcrição) é usado para aumentar ou diminuir a transcrição do DNA alvo em um local específico em um DNA alvo, que é guiado pelo segmento tendo DNA como alvo do RNA tendo DNA como alvo alvo. Exemplos de polipeptídeos fonte para fornecer um polipeptídeo quimérico modificador direcionado ao sítio com atividade moduladora de transcrição incluem, entre outros, os reguladores de transcrição induzíveis por luz, reguladores de transcrição de pequena molécula/responsivo a drogas, fatores de transcrição, repressores de transcrição, etc. Em alguns casos, o método objeto é usado para controlar a expressão de um RNA de codificação alvejado (gene que codifica proteína) e/ou um RNA não codificante alvejado (por exemplo, tRNA, rRNA, snoRNA, siRNA, miRNA, ncRNA longo, etc.).
[0271] Em alguns casos, o polipeptídeo modificador direcionado ao sítio tem atividade enzimática que modifica um polipeptídeo associado com DNA (por exemplo, histona). Em algumas modalidades, a atividade enzimática é atividade metiltransferase, atividade demetilase, atividade da acetiltransferase, atividade deacetilase, atividade da quinase, atividade da fosfatase, atividade ligase de ubiquitina (ou seja, atividade de ubiquitinação), atividade deubiquitinação, atividade adenilação, atividade desadenilação, atividade SUMOilação, atividade deSUMOilação, atividade ribosilação, atividade desribosilação, atividade miristoilação, atividade desmiristoilação, atividade glicosilação (por exemplo, de O-GlcNAc transferase) ou atividade deglicosilação. As atividades enzimáticas listadas aqui catalisam modificações covalentes para proteínas. Tais modificações são conhecidas na técnica para alterar a estabilidade ou a atividade da proteína alvo (por exemplo, fosforilação devido à atividade quinase pode estimular ou silenciar a atividade da proteína dependendo da proteína alvo). De particular interesse como proteínas alvos são histonas. Proteínas histonas são conhecidas na técnica para ligar o DNA e formar complexos conhecidos como os nucleossomas. Histonas podem ser modificadas (por exemplo, por metilação, acetilação, ubiquitinação, fosforilação) para produzir alterações estruturais no DNA circundante, controlando assim a acessibilidade de porções potencialmente grandes de DNA para fatores de interação como fatores de transcrição, polimerases e semelhantes. Uma histona única pode ser modificada de várias maneiras e em várias combinações diferentes (por exemplo, trimetilação de lisina 27 de histona 3, H3K27, é associada às regiões de DNA da transcrição reprimida enquanto trimetilação de lisina 4 de histona 3, H3K4, é associada com as regiões de DNA da transcrição ativa). Assim, um polipeptídeo modificador direcionado ao sítio com atividade modificadora de histona encontra usar no controle específico de sítio da estrutura do DNA e pode ser usado para alterar o padrão de modificações da histona em uma região selecionada de DNA alvo. Tais métodos encontram uso em pesquisas e aplicações clínicas.
[0272] Em algumas modalidades, vários RNAs tendo DNA como alvo são utilizados simultaneamente para simultaneamente modificar locais diferentes no mesmo DNA alvo ou em diferentes DNAs alvos. Em algumas modalidades, dois ou mais RNAs tendo DNA como alvo alvejam o mesmo gene ou transcrição ou locus. Em algumas modalidades, dois ou mais RNAs tendo DNA como alvo alvejam diferentes loci diferentes. Em algumas modalidades, dois ou mais RNAs tendo DNA como alvo alvejam loci diferentes, mas relacionados.
[0273] Em alguns casos, o polipeptídeo modificador direcionado ao sítio é fornecido diretamente como uma proteína. Como um exemplo não limitante, fungos (por exemplo, levedura) podem ser transformados com a proteína exógena e/ou ácido nucleico usando a transformação do esferoplasto (ver Kawai et al., Bioeng Bugs. 2010 Nov- Dec;1(6):395-403 : “Transformation of Saccharomyces cerevisiae and other fungi: methods and possible underlying mechanism”; e Tanka et al., Nature. 2004 Mar 18;428(6980):323-8: “Conformational variations in an infectious protein determine prion strain differences”; ambos os quais são aqui incorporados por referência na sua totalidade). Assim, um polipeptídeo modificador direcionado ao sítio (por exemplo, Cas9) pode ser incorporado em um esferoplasto (com ou sem ácido nucleico que codifica um RNA tendo DNA como alvo e com ou sem um polinucleotídeo doador) e o esferoplasto pode ser usado para introduzir o conteúdo em uma célula de levedura. Um polipeptídeo modificador direcionado ao sítio pode ser introduzido em uma célula (fornecido à célula) por qualquer método conveniente; tais métodos são conhecidos por aqueles especialistas na técnica. Como outro exemplo não limitante, um polipeptídeo modificador direcionado ao sítio pode ser injetado diretamente em uma célula (por exemplo, com ou sem ácido nucleico que codifica um RNA tendo DNA como alvo e com ou sem um polinucleotídeo doador), por exemplo, uma célula de um embrião de peixe- zebra, o pronúcelo de um oócito fertilizado de camundongo, etc.
Células alvo de interesse
[0274] Em algumas das aplicações acima, os métodos objeto podem ser empregados para induzir a clivagem do DNA, modificação do DNA, e/ou modulação transcriptional em células mitóticas ou pós mitóticas in vivo e/ouex vivo e/ouin vitro (por exemplo, para produzir células geneticamente modificadas que podem ser reintroduzidas um indivíduo). Porque o RNA tendo DNA como alvo fornece especificidade por hibridização de DNA alvo, uma célula mitótica e/ou pós- mitótica de interesse nos métodos divulgados pode incluir uma célula de um organismo (por exemplo, uma célula bacteriana, uma célula de Archaea, uma célula de um organismo eucariótico unicelular, uma célula vegetal, uma célula de alga, por exemplo, Botryococcus braunii, Chlamydomonas reinhardtii, Nannochloropsis gaditana, Chlorella pyrenoidosa, Sargassum patens C. Agardh, e semelhantes, uma célula fúngica (por exemplo, uma célula de levedura), uma célula animal, uma célula de um animal invertebrado (por exemplo, mosca da fruta, Cnidários, equinodermos, nematódeo, etc.), uma célula de um animal vertebrado (por exemplo, peixes, anfíbios, répteis, pássaro, mamífero), uma célula de um mamífero, uma célula de um roedor, uma célula de um humano, etc.).
[0275] Qualquer tipo de célula pode ser de interesse (por exemplo, uma célula-tronco, por exemplo, uma célula-tronco embrionárias (ES), uma célula-tronco pluripotentes induzida (iPS), uma célula germinativa; uma célula somática, por exemplo, um fibroblasto, uma célula hematopoiética, um neurônio, uma célula muscular, uma célula óssea, um hepatócito, uma célula pancreática; uma célula embrionária in vitro ou in vivo de um embrião em qualquer fase, por exemplo, um embrião de peixe zebra de fase de 1 célula, 2 células, 4 células, 8 células etc.). As células podem ser de linhagens celulares estabelecidas ou podem ser as células primárias, onde “as células primárias”, “linhagens de célula primária” e “culturas primárias” são usadas de modo intercambiável aqui para se referir às células e culturas de células que foram derivadas de um sujeito e deixas crescer in vitro por um número limitado de passagens, ou seja, divisões, da cultura. Por exemplo, culturas primárias são culturas que podem ter sido passadas 0 vezes, 1 vez, 2 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 10 vezes ou 15 vezes, mas não muitas vezes passam a fase de crise. Normalmente, as linhagens de célula primária da presente invenção são mantidas por menos de 10 passagens in vitro. As células alvo são em muitas modalidades organismos unicelulares, ou são cultivadas em cultura.
[0276] Se as células são as células primárias, eles podem ser coletadas de um indivíduo por qualquer método conveniente. Por exemplo, leucócitos podem convenientemente coletados por aférese, leucocitaferese, separação de gradiente de densidade, etc., enquanto as células de tecidos como pele, músculos, medula óssea, baço, fígado, pâncreas, pulmão, estômago, intestino, etc. são mais convenientemente coletadas por biópsia. Uma solução adequada pode ser utilizada para dispersão ou suspensão das células coletadas. Tal solução geralmente será uma solução salina equilibrada, por exemplo, salina normal, salina tampão fosfato (PBS), solução de sal equilibrada de Hank, etc., convenientemente suplementado com soro fetal de bezerro ou outros fatores naturais, em conjunto com um tampão aceitável em baixa concentração, geralmente de 5 a 25 mM. Tampões convenientes incluem HEPES, tampões fosfato, tampoes lactato, etc. As células podem ser usadas imediatamente, ou podem ser armazenadas, congeladas por longos períodos de tempo, sendo descongeladas e capazes de serem reutilizadas. Em tais casos, as células geralmente serão congeladas em DMSO 10%, 50% de soro, 40% meio tamponado, ou alguma outra dita solução como é utilizado na técnica de preservar as células em tais temperaturas de congelamento e descongeladas em uma maneira como comumente conhecido na técnica para descongelar células cultivadas congeladas.
Ácidos nucleicos codificando um RNA tendo DNA como alvo objeto e/ou um polipeptídeo modificar direcionado ao sítio objeto
[0277] Em algumas modalidades, um método objeto envolve contatar um DNA alvo ou introduzir em uma célula (ou uma população de células) um ou mais ácidos nucleicos compreendendo sequências nucleotídicas que codifica um RNA tendo DNA como alvo e/ou um polipeptídeo modificador direcionado ao sítio e/ou polinucleotídeo doador. Ácidos nucleicos adequados, compostos por sequências de nucleotídeos que codificam um RNA tendo DNA como alvo e/ou um polipeptídeo modificador direcionado ao sítio incluem vetores de expressão, onde um vetor de expressão, composto por uma sequência de nucleotídeos que codifica um RNA tendo DNA como alvo e/ou polipeptídeo modificador direcionado ao sítio é um “vetor de expressão recombinante.”
[0278] Em algumas modalidades, o vetor de expressão recombinante é um constructo viral, por exemplo, um constructo de vírus adeno-associado recombinante (ver, por exemplo, Patente US 7.078.387), um constructo de adenovírus recombinante, um constructo de Lentivirus recombinante, etc.
[0279] Vetores de expressão adequados incluem, entre outros, vetores virais (por exemplo, vetores virais com base no vírus vaccinia; poliovírus; adenovírus (ver, por exemplo, Li et al., Invest Opthalmol Vis Sci 35:2543 2549, 1994; Borras et al., Gene Ther 6:515 524, 1999; Li and Davidson, PNAS 92:7700 7704, 1995; Sakamoto et al., H Gene Ther 5:1088 1097, 1999; WO 94/12649, WO 93/03769; WO 93/19191; WO 94/28938; WO 95/11984 e WO 95/00655); vírus adeno-associado (ver, por exemplo, Ali et al., Hum Gene Ther 9:81 86, 1998, Flannery et al., PNAS 94:6916 6921, 1997; Bennett et al., Invest Opthalmol Vis Sci 38:2857 2863, 1997; Jomary et al., Gene Ther 4:683 690, 1997, Rolling et al., Hum Gene Ther 10:641 648, 1999; Ali et al., Hum Mol Genet 5:591 594, 1996; Srivastava in WO 93/09239, Samulski et al., J. Vir. (1989) 63:3822-3828; Mendelson et al., Virol. (1988) 166:154-165; and Flotte et al., PNAS (1993) 90:10613-10617); SV40; vírus herpes simplex; vírus de imunodeficiência humana (ver, por exemplo, Miyoshi et al., PNAS 94:10319 23, 1997; Takahashi et al., J Virol 73:7812 7816, 1999); um vetor retroviral (por exemplo, vírus leucemia murino, vírus de necrose do baço e vetores derivados de retrovírus como vírus Rous Sarcoma, vírus do Sarcoma de Harvey, vírus da leucose aviária, um lentivírus, vírus da imunodeficiência humana, vírus do sarcoma mieloproliferativa e vírus do tumor mamário); e semelhantes.
[0280] Inúmeros vetores de expressão adequados são conhecidos por especialistas na técnica, e muitos estão comercialmente disponíveis. Os seguintes vetores são fornecidos a título de exemplo; para as células hospedeiras eucarióticas: pXT1, pSG5 (Stratagene), pSVK3, pBPV, pMSG, and pSVLSV40 (Pharmacia). No entanto, qualquer outro vetor pode ser usado, desde que seja compatível com a célula hospedeira.
[0281] Em algumas modalidades, uma sequência de nucleotídeos que codifica um RNA tendo DNA como alvo e/ou um polipeptídeo modificador direcionado ao sítio está operacionalmente ligada a um elemento de controle, por exemplo, um elemento de controle de transcrição, como um promotor. O elemento de controle de transcrição pode ser funcional em qualquer uma célula eucariota, por exemplo, uma célula mamífera, ou uma célula procariótica (por exemplo, a célula bacteriana ou Archaea). Em algumas modalidades, uma sequência de nucleotídeos que codifica um RNA tendo DNA como alvo e/ou um polipeptídeo modificador direcionado ao sítio operacionalmente está ligada a vários elementos de controle que permitem a expressão da sequência de nucleotídeos que codifica um RNA tendo DNA como alvo e/ou um polipeptídeo modificador direcionado ao sítio em células procariotas e eucariotas.
[0282] Dependendo do sistema hospedeiro/vetor utilizado, qualquer um de um número de elementos de controle transcrição e de tradução adequados, incluindo promotores constitutivos e induzíveis, elementos potencializadores de transcrição, terminadores de transcrição, etc. podem ser utilizados no vetor de expressão (por exemplo, promotor U6, promotor H1, etc.; ver acima) (ver por exemplo, Bitter et al. (1987) Methods in Enzymology, 153:516-544).
[0283] Em algumas modalidades, um RNA tendo DNA como alvo e/ou um polipeptídeo modificador direcionado ao sítio pode ser fornecido como o RNA. Em tais casos, o RNA tendo DNA como alvo e/ou RNA que codifica o polipeptídeo direcionado ao sítio modificador pode ser produzido pela síntese química direta ou pode ser transcrito in vitro de um DNA que codifica o RNA tendo DNA como alvo. Métodos de síntese do RNA a partir de um modelo de DNA são conhecidos na técnica. Em alguns casos, o RNA tendo DNA como alvo e/ou o RNA que codifica o polipeptídeo modificador direcionado ao sítio será sintetizado in vitro usando uma enzima RNA polimerase (por exemplo, polimerase T7, polimerase T3, polimerase SP6, etc.). Uma vez sintetizado, o RNA pode contatar diretamente um DNA alvo ou pode ser introduzido em uma célula por qualquer das técnicas conhecidas para a introdução de ácidos nucleicos nas células (por exemplo, microinjeção, eletroporação, transfecção, etc.).
[0284] Nucleotídeos que codificam um RNA tendo DNA como alvo (introduzido como DNA ou RNA) e/ou um polipeptídeo modificador direcionado ao sítio (introduzido como DNA ou RNA) e/ou um polinucleotídeo doador pode ser fornecido para as células, usando técnicas de transfecção bem desenvolvidas; ver, Angel and Yanik (2010) PLoS ONE 5(7): e11756, e os reagentes de TransMessenger ® comercialmente disponíveis da Qiagen, Stemfect™ RNA Transfection Kit da Stemgent, e TransIT®-mRNA Transfection Kit da Mirus Bio LLC. Ver também Beumer et al. (2008) Efficient gene targeting in Drosophila by direct embryo injection with zinc-finger nucleases. PNAS 105(50):19821-19826. Alternativamente, os ácidos nucleicos que codifica um RNA tendo DNA como alvo e/ou um polipeptídeo modificador direcionado ao sítio e/ou um polipeptídeo quimérico modificador direcionado ao sítio e/ou um polinucleotídeo doador pode ser fornecido em vetores de DNA. Muitos vetores, por exemplo, plasmídeos, cosmídeos, minicírculos, fago, vírus, etc., úteis para a transferência de ácidos nucleicos em células alvo estão disponíveis. Os vetores que compreende os ácidos nucleicos podem ser mantidos episomalmente, por exemplo, como plasmídeos, DNAs minicírculo, vírus como citomegalovírus, adenovírus, etc., ou eles podem ser integrados no genoma da célula alvo, através de recombinação homóloga ou integração aleatória, vetores derivados de retrovírus como MMLV, HIV-1, ALV, etc.
[0285] Vetores podem ser fornecidos diretamente para as células objeto. Em outras palavras, as células estão em contato com vetores, compreendendo o ácido nucleico que codifica RNA tendo DNA como alvo e/ou um polipeptídeo modificador direcionado ao sítio, um polipeptídeo modificador quimérico direcionado ao sítio ou um polinucleotídeo doador, tais que os vetores são ocupados pelas células. Métodos para contatar com as células com vetores de ácidos nucleicos que são plasmídeos, incluindo electroporação, transfecção de cloreto de cálcio, microinjeção e lipofecção são bem conhecidos na técnica. Para liberação de vetor viral, as células são contatadas com partículas virais, que inclui o ácido nucleico que codifica um RNA tendo DNA como alvo e/ou um polipeptídeo modificador direcionado ao sítio, um polipeptídeo quimérico modificador direcionado ao sítio ou um polinucleotídeo doador. Retrovírus, por exemplo, lentivírus, são especialmente adequados para o método da invenção. Vetores retrovirais comumente usados são “defeituosos”, ou seja, incapazes de produzir proteínas virais necessárias para a infecção produtiva. Pelo contrário, a replicação do vetor exige crescimento em uma linhagem celular empacotada. Para gerar partículas virais compostas por ácidos nucleicos de interesse, os ácidos nucleicos retrovirais compreendendo os ácidos nucleicos são compactados em capsídeos virais por uma linhagem de células empacotadas. Linhagens de células de diferentes empacotamentos fornecem uma proteína de envelope diferente (ecotrópica, anfotrópica ou xenotrópica) devem ser incorporadas ao capsídeo, esta proteína de envelope determina a especificidade da partícula viral para as células (ecotrópica para murino e rato; amfotrópica para maioria de tipos de células de mamíferos, incluindo humanos, cão e camundongo; e xenotrópica para maioria dos tipos de células de mamíferos, exceto as células de murino). A linhagem de células de empacotada apropriada pode ser usada para garantir que as células são alvejadas por partículas virais empacotadas. Métodos de introdução dos vetores retrovirais compreendendo o ácido nucleico que codifica os fatores de reprogramação em linhagens de células empacotadas e coleta de partículas virais que são geradas pelas linhagens empacotadas são bem conhecidos na técnica. Os ácidos nucleicos podem também ser introduzidos por microinjecção direta (por exemplo, injeção de RNA em um embrião de peixe-zebra).
[0286] Vetores usados para fornecer os ácidos nucleicos que codificam RNA tendo DNA como alvo e/ou um polipeptídeo modificador direcionado ao sítio e/ou um polipeptídeo quimérico modificador direcionado ao sítio e/ou um polinucleotídeo doador para as células objeto normalmente serão constituídos por promotores adequados para dirigir a expressão, ou seja, ativação transcricional do ácido nucleico de interesse. Em outras palavras, o ácido nucleico de interesse será operacionalmente associado a um promotor. Isto pode incluir promotores agindo ubiquitamente, por exemplo, o promotor CMV-β-actina ou promotores induzíveis, como promotores que estão ativos em populações de células específicas ou que respondem à presença de drogas como a tetraciclina. Por ativação transcricional, pretende-se que a transcrição seja aumentada acima dos níveis basais na célula alvo pelo menos umas 10 vezes, pelo menos cerca de 100 vezes,mais geralmente pelo menos cerca de 1000 vezes. Além disso,vetores usados para fornecer um RNA tendo DNA como alvo e/ou um polipeptídeo modificador direcionado ao sítio e/ou um polipeptídeo quimérico modificador direcionado ao sítio e/ou um polinucleotídeo doador para as células objeto podem incluir sequências de ácidos nucleicos que codificam para marcadores selecionáveis nas células alvo, a fim de identificar as células que assumiram o RNA tendo DNA como alvo e/ou um polipeptídeo modificador direcionado ao sítio, um polipeptídeo quimérico modificador direcionado ao sítio ou um polinucleotídeo doador.
[0287] O RNA tendo DNA como alvo objeto e/ou um polipeptídeo modificador direcionado ao sítio e/ou um polipeptídeo quimérico modificador direcionado ao sítio pode em vez disso ser usado para entrar em contato com DNA ou introduzido em células como RNA. Métodos de introdução de RNA em células são conhecidos na técnica e podem incluir, por exemplo, injeção direta, transfecção ou qualquer outro método utilizado para a introdução do DNA.
[0288] Em vez disso, o polipeptídeo modificador direcionado ao sítio objeto pode ser fornecido às células como um polipeptídeo. Tal um polipeptídeo, opcionalmente, pode ser fundido a um domínio de polipeptídeo que aumenta a solubilidade do produto. O domínio pode estar ligado ao polipeptídeo através de um sítio de clivagem de protease definido, por exemplo, uma sequência do TEV, que é clivada por uma protease TEV. O ligante também pode incluir uma ou mais sequências flexíveis, por exemplo, de 1 a 10 resíduos de glicina. Em algumas modalidades, a clivagem da proteína de fusão é executada em um tampão que mantém a solubilidade do produto, por exemplo, na presença de 0,5 a 2 M de ureia, na presença de polipeptídeos e/ou polinucleotídeos que aumentam a solubilidade e semelhantes. Domínios de interesse incluem domínios endosomolíticos, por exemplo, o domínio HA de influenza; e outros polipeptídeos que auxiliam na produção, por exemplo, domínio IF2, domínio GST, domínio GRPE e semelhantes. O polipeptídeo pode ser formulado para melhor a estabilidade. Por exemplo, os peptídeos podem ser peguilados, onde o grupo de polietilenooxi prevê maior tempo de vida na corrente sanguínea.
[0289] Além disso ou, alternativamente, o polipeptídeo modificador direcionado ao sítio objeto pode ser fundido a um domínio permeante de polipeptídeo para promover a absorção pela célula. Um número de domínios permeante é conhecido na técnica e pode ser usado nos polipeptídeos não integrantes da presente invenção, incluindo peptídeos, peptidomiméticos e transportador não peptídeo. Por exemplo, um peptídeo permeante pode ser derivado da terceira alfa- hélice de fator de transcrição Antennapaedia de Drosophila melanogaster, conhecido como penetratina, que compreende a sequência de aminoácidos RQIKIWFQNRRMKWKK (SEQ ID NO: //). Como outro exemplo, o peptídeo permeante compreende a sequência de aminoácidos básicos da região tat de HIV-1, que pode incluir, por exemplo, aminoácidos 49-57 de ocorrência natural da proteína tat. Outros domínios permeantes incluem motivos de poli-arginina, por exemplo, a região de aminoácidos 34-56 da proteína rev do HIV-1, nona-arginina, arginina-octa e semelhantes. (Ver, por exemplo, Futaki et al. (2003) Curr Protein Pept Sci. 2003 Apr; 4(2): 87-9 and 446; and Wender et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 2000 Nov. 21; 97(24):13003-8; pedidos de Patente U.S. publicados 20030220334; 20030083256; 20030032593; e 20030022831, especificamente aqui incorporadas por referência para os ensinamentos de translocação peptídeos e peptoides). A sequência de nona-arginina (R9) é um dos PTDs mais eficientes que foram caracterizados (Wender et al. 2000; Uemura et al. 2002). O sítio em que é feita a fusão pode ser selecionado a fim de otimizar a atividade biológica, características secreção ou de ligação do polipeptídeo. O sítio ideal será determinado pela experimentação de rotina.
[0290] Um polipeptídeo modificador direcionado ao sítio objeto pode ser produzido in vitro ou por células eucariotas ou células procariotas e pode ser ainda processamento por desdobramento, por exemplo, desnaturação por calor, redução de TDT, etc. e pode ser ainda novamente dobrado, usando métodos conhecidos na técnica.
[0291] Modificações de interesse que não alteram a sequência primária incluem derivatização química de polipeptídeos, por exemplo, acilação, acetilação, carboxilação, amidação, etc. Também estão incluídas alterações da glicosilação, por exemplo, aquelas feitas por modificação de padrões de glicosilação de um polipeptídeo durante sua síntese e processamento ou no etapas de processamento adicionais; por exemplo, ao expor o polipeptídeo às enzimas que afetam a glicosilação, como enzimas de glicosilação de mamíferos ou de desglicosilação. Também são incluídas as sequências que têm resíduos de aminoácidos fosforilados, por exemplo, fosfotirosina, fosfoserina ou fosfotreonina.
[0292] Também são incluídos na invenção objeto RNAs tendo DNA como alvo e polipeptídeos modificadores direcionados aos sítios que foram modificados usando técnicas biológicas moleculares comuns e química sintética, a fim de melhorar sua resistência à degradação proteolítica, mudando a especificidade da sequência alvo, para otimizar as propriedades de solubilidade, para alterar a atividade da proteína (por exemplo, atividade moduladora de transcrição, atividade enzimática, etc.) ou torná-las mais adequadas como um agente terapêutico. Os análogos de tais polipeptídeos incluem aqueles que contêm resíduos diferentes de L- aminoácidos, por exemplo, D-aminoácidos de ocorrência natural ou aminoácidos sintéticos não naturais. D-aminoácidos podem ser substituídos por alguns ou todos os resíduos de aminoácidos.
[0293] Os polipeptídeos modificadores direcionados aos sítios podem ser preparados por síntese in vitro, usando métodos convencionais, como conhecidos na técnica. Vários aparelhos sintéticos comerciais estão disponíveis, por exemplo, sintetizadores automatizados da Applied Biosystems, Inc., Beckman, etc. Usando sintetizadores, aminoácidos de ocorrência natural podem substituídos com aminoácidos não naturais. A sequência particular e o modo de preparação serão determinados pela conveniência, economia, pureza exigida e semelhantes.
[0294] Se desejado, vários grupos podem ser introduzidos no peptídeo durante a síntese, ou durante a expressão, que permite a ligação de outras moléculas ou a uma superfície. Assim cisteínas podem ser usadas para preparar tioéteres, histidinas para ligar a um complexo de íon metálico, grupos carboxil para formar amidas ou ésteres, grupos aminoácidos para formar amidas e semelhantes.
[0295] Polipeptídeos modificadores direcionados aos sítios também podem ser isolados e purificados em conformidade com os métodos convencionais de síntese recombinante. Um lisado pode ser preparado do hospedeiro de expressão e o lisado purificado usando HPLC, cromatografia de exclusão, gel de eletroforese, cromatografia de afinidade ou outra técnica de purificação. Na maior porção, as composições que são usadas incluirão pelo menos 20% em peso do produto desejado, mais geralmente pelo menos cerca de 75% em peso, de preferência pelo menos cerca de 95%, em peso e para fins terapêuticos, geralmente pelo menos cerca de 99,5% em peso, em relação aos contaminantes relacionados ao método de preparação do produto e sua purificação. Geralmente, as percentagens serão baseadas na proteína total.
[0296] Para induzir a clivagem do DNA e recombinação ou qualquer modificação desejada para um DNA alvo, ou qualquer modificação desejada para um polipeptídeo associado com o DNA alvo, o RNA tendo DNA como alvo e/ou o polipeptídeo direcionado ao sítio modificar e/ou polinucleotídeo o doador, se são introduzidos como ácidos nucleicos ou polipeptídeos, são fornecidos para as células por cerca de 30 minutos a cerca de 24 horas, por exemplo, 1 hora, 1,5 hora, 2 horas, 2,5 horas, 3 horas, 3,5 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 8 horas, 12 horas, 16 horas, 18 horas, 20 horas, ou qualquer outro período de cerca de 30 minutos a cerca de 24 horas, que pode ser repetido com uma frequência de cerca de todos os dias a cada 4 dias, por exemplo, a cada 1,5, a cada 2 dias, a cada 3 dias ou qualquer outra frequência de cerca de todos os dias a cada quatro dias. Os agentes podem ser fornecidos para as células objeto uma ou mais vezes, por exemplo, uma vez, duas vezes, três vezes, ou mais de três vezes e as células permitidas deixadas incubar com os agentes por uma determinada quantidade de tempo após cada evento de entrar em contato, por exemplo, 16 a 24 horas, após o que o meio é substituído com meio fresco e as células são cultivadas ainda mais.
[0297] Em casos em que dois ou mais diferentes complexos de direcionamentos são fornecidos para a célula (por exemplo, dois diferentes RNAs tendo DNA como alvo complementares às sequências diferentes dentro do mesmo ou diferente DNA alvo), os complexos podem ser fornecidos simultaneamente (por exemplo, como dois polipeptídeos e/ou ácidos nucleicos), ou liberados em simultâneo. Alternativamente, podem ser desde consecutivamente, por exemplo, o complexo de direcionado sendo fornecido em primeiro lugar, seguido pelo segundo complexo de direcionamento, etc., ou vice-versa.
[0298] Normalmente, uma quantidade eficaz de RNA tendo DNA como alvo e/ou polipeptídeo modificador direcionado ao sítio e/ou polinucleotídeo doador é fornecida para o DNA alvo ou células para induzir a clivagem. Uma quantidade eficaz de RNA tendo DNA como alvo e/ou polipeptídeo modificador direcionado ao sítio e/ou polinucleotídeo doador é a quantidade para induzir um aumento de 2 vezes ou mais na quantidade de modificação alvo observada entre duas sequências homólogas em relação a um controle negativo, por exemplo, uma célula em contato com um vetor vazio ou polipeptídeo irrelevante. Isso quer dizer, uma quantidade efetiva ou a dose do RNA tendo DNA como alvo e/ou polipeptídeo modificador direcionado ao sítio e/ou doador polinucleotídeo induzirá um aumento de 2 vezes, um aumento de 3 vezes, um aumento de 4 vezes ou mais na quantidade de modificação alvo observada em uma região de DNA alvo, em alguns casos, um aumento de 5 vezes, um aumento de 6 ou mais, às vezes aumento de 7 vezes ou 8 vezes ou mais na quantidade de recombinação observada, por exemplo, um aumento de 10 vezes, 50 vezes, ou 100 vezes ou mais, em alguns casos, um aumento de 200 vezes, 500 vezes, 700 vezes, ou 1000 vezes ou mais, por exemplo, um aumento de 5000 vezes, ou 10.000 vezes na quantidade de recombinação observada. A quantidade de modificação alvo pode ser medida por qualquer método conveniente. Como ensaio de outro, mais sensibilidade, por exemplo, a extensão da recombinação em uma região de DNA genômica de interesse composto por sequências de DNA alvo poderão ser avaliada por PCR ou hibridização do Sul da região após o contato com um RNA tendo DNA como alvo e/ou polipeptídeo modificador direcionado ao sítio e/ou doador polinucleotídeo, por exemplo, 2 horas, 4 horas, 8 horas, 12 horas, 24 horas, 36 horas, 48 horas, 72 horas ou mais após o contato com o RNA tendo DNA como alvo e/ou polipeptídeo modificador direcionado ao sítio e/ou polinucleotídeo doador. Como outro ensaio com mais sensibilidade, por exemplo, a extensão da recombinação em uma região de DNA genômica de interesse compreendendo sequências de DNA alvo poderá ser avaliada por PCR ou hibridização Southern da região após o contato com um RNA tendo DNA como alvo e/ou polipeptídeo modificador direcionado ao sítio e/ou polinucleotídeo doador, por exemplo, 2 horas, 4 horas, 8 horas, 12 horas, 24 horas, 36 horas, 48 horas, 72 horas ou mais após o contato com o RNA tendo DNA como alvo e/ou polipeptídeo modificador direcionado ao sítio e/ou polinucleotídeo doador.
[0299] Contatar as células com um RNA tendo DNA como alvo e/ou polipeptídeo modificador direcionado ao sítio e/ou polinucleotídeo doador pode ocorrer em qualquer meio de cultura e sob quaisquer condições de cultura que promovem a sobrevivência das células. Por exemplo, as células podem ser suspensas em qualquer meio de nutrientes adequado que é conveniente, como DMEM modificado por Iscove ou RPMI 1640, suplementado com soro fetal de bezerro ou inativados por calor, soro de cabra (cerca de 5-10%), L-glutamina, um tiol, particularmente, 2-mercaptoetanol e antibióticos, por exemplo, penicilina e estreptomicina. A cultura pode conter fatores de crescimento aos quais as células são sensíveis. Fatores de crescimento, conforme definido aqui, são moléculas capazes de promover a sobrevivência, crescimento e/ou diferenciação das células, na cultura ou no tecido intacto, através de efeitos específicos em um receptor transmembrana. Fatores de crescimento incluem os polipeptídeos e fatores não polipeptídeo. Condições que promovem a sobrevivência de células são tipicamente permissivas de junção na extremidade não homóloga e reparação direcionada por homologia.
[0300] Em aplicações em que é desejável inserir uma sequência de polinucleotídeo em uma sequência de DNA alvo, um polinucleotídeo compreendendo uma sequência doadora para ser inserida também é fornecida para a célula. Por uma “sequência doadora” ou “polinucleotídeo doador” entende-se uma sequência do ácido nucleico a ser inserida no sítio de clivagem, induzida por um polipeptídeo modificador direcionado ao sítio. O polinucleotídeo doador conterá homologia suficiente para uma sequência genômica no sítio de clivagem, por exemplo, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 100% de homologia com as sequências de nucleotídeo flanqueando o sítio de clivagem, por exemplo, dentro de cerca de 50 bases ou menos do sítio de clivagem, por exemplo, dentro de cerca de 30 bases, dentro de cerca de 15 bases, dentro de cerca de 10 bases, dentro sobre 5 bases, ou imediatamente flanqueando o sítio de clivagem, para apoiar a reparação direcionada por homologia entre esta e a sequência genômica com a qual mantém homologia. Aproximadamente 25, 50, 100, ou 200 nucleotídeos ou mais de 200 nucleotídeos, de homologia de sequência entre um doador e uma sequência genômica (ou qualquer valor inteiro entre 10 e 200 nucleotídeos, ou mais) apoiarão a reparação direcionada por homologia. Sequências doadoras podem ser de qualquer comprimento, por exemplo, 10 nucleotídeos ou mais, 50 nucleotídeos ou mais, 100 nucleotídeos ou mais, 250 nucleotídeos ou mais, 500 nucleotídeos ou mais, 1000 nucleotídeos ou mais, 5000 nucleotídeos ou mais, etc.
[0301] A sequência doadora normalmente não é idêntica à sequência genomic que substitui. Pelo contrário, a sequência doadora pode conter pelo menos uma ou mais alterações de base única, inserções, deleções, inversões ou rearranjos no que diz respeito à sequência genômica, enquanto homologia suficiente está presente para oferecer suporte à reparação direcionada por homologia. Em algumas modalidades, a sequência doadora é composta por uma sequência não homóloga, flanqueada por duas regiões de homologia, tal que reparação direcionada à homologia entre a região de DNA alvo e os resultados de duas sequências flanqueando na inserção da sequência não homóloga na região alvo. Sequências doadoras também podem incluir uma estrutura de vetor contendo sequências que não são homólogas à região de DNA de interesse e que não se destinam à inserção na região de DNA de interesse. Geralmente, a região ou regiões homólogas de uma sequência doadora terão pelo menos 50% identidade para uma sequência genômica, com a qual é desejada recombinação de sequências. Em determinadas modalidades, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 99,9% de identidade de sequência estão presentes. Qualquer valor entre 1% e 100% de identidade de sequência pode estar presente, dependendo do comprimento do polinucleotídeo doador.
[0302] A sequência doadora pode incluir certas diferenças de sequência em comparação com a sequência genômica, por exemplo, sítios de restrição, polimorfismos de nucleotídeo, marcadores selecionáveis (por exemplo, genes de resistência de droga, proteínas fluorescentes, enzimas etc.), etc., que podem ser utilizados para avaliar a inserção bem sucedida da sequência doadora no sítio de clivagem ou em alguns casos podem ser utilizados para outros fins (por exemplo, para significar a expressão para o locus genômico alvo). Em alguns casos, se localizadas em uma região da codificação, tais diferenças de sequência de nucleotídeos não vão mudar a sequência de aminoácidos, ou farão mudanças de aminoácidos silenciosos (ou seja, as alterações que não afetam a estrutura ou a função da proteína). Alternativamente, estas diferenças de sequências podem incluir sequências de recombinação flanqueando como FLPs, sequências loxP ou semelhantes, que podem ser ativadas em um momento posterior para a remoção da sequência marcadora.
[0303] A sequência doadora pode ser fornecida para a célula como DNA de fita simples, RNA de fita simples, DNA de fita dupla ou RNA de fita dupla. Este pode ser introduzido em uma célula na forma linear ou circular. Se introduzido de forma linear, as extremidades da sequência doadora podem ser protegidas (por exemplo, da degradação do exonucleolítico) por métodos conhecidos por especialistas na técnica. Por exemplo, um ou mais resíduos de dideoxinucleotídeo são adicionados ao terminal 3' de uma molécula linear e/ou oligonucleotídeos auto-complementares são ligados a uma ou ambas as extremidades. Ver, por exemplo, Chang et al. (1987) Proc. Natl. Acad Sci USA 84:4959-4963; Nehls et al. (1996) Science 272:886-889. Métodos adicionais para proteger polinucleotídeos exógenos de degradação incluem, entre outros, adição de grupos amino terminal e a utilização de ligações internucleotídeo modificadas, tais como, por exemplo, fosforotioatos, fosforamidatos e O-metil ribose ou resíduos desoxirribose. Como uma alternativa para proteger os terminais de uma sequência linear doadora, comprimentos adicionais da sequência podem ser incluídas fora das regiões de homologia que podem ser degradadas sem afetar a recombinação. Uma sequência doadora pode ser introduzida em uma célula como parte de uma molécula de vetor tendo sequências adicionais como, por exemplo, as origens de replicação, promotores e genes que codificam a resistência aos antibióticos. Além disso, as sequências doadoras podem ser introduzidas como ácido nucleico nu, como ácido nucleico complexado com um agente como um lipossoma ou poloxâmero, ou podem ser liberadas por vírus (por exemplo, adenovírus, vírus adeno-associados), como descrito acima para os ácidos nucleicos que codificam um RNA tendo DNA como alvo e/ou polipeptídeo modificador direcionado ao sítio e/ou polinucleotídeo doador.
[0304] Seguindo os métodos descritos acima, uma região de DNA de interesse pode ser clivada e modificada, ou seja, “geneticamente modificada”, ex vivo. Em algumas modalidades, como quando foi inserido um marcador selecionável para a região de DNA de interesse, a população de células pode ser enriquecida para aquelas que compreendem a modificação genética, separando as células geneticamente modificadas da população remanescente. Antes de enriquecer, as células “geneticamente modificadas” podem fazer apenas cerca de 1% ou mais (por exemplo, 2% ou mais, 3% ou mais, 4% ou mais, 5% ou mais, 6% ou mais, 7% ou mais, 8% ou mais, 9% ou mais, 10% ou mais, 15% ou mais, ou 20% ou mais) da população celular. Separação de células “geneticamente modificadas” pode ser alcançada por qualquer técnica de separação conveniente apropriada para o marcador selecionável usado. Por exemplo, se tiver sido inserido um marcador fluorescente, células podem estar separadas por classificação de célula de ativada por fluorescência, considerando que se foi inserido um marcador de superfície celular, as células podem ser separadas da população heterogênea por técnicas de separação por afinidade, por exemplo, a separação magnética, a cromatografia de afinidade, “panning” com um reagente de afinidade anexado a uma matriz sólida, ou outra técnica conveniente. Técnicas fornecendo a separação exata incluem classificadores de células ativadas por fluorescência, que podem ter vários graus de sofisticação, como múltiplos canais de cor, ângulo baixo e canais de deteccao de espalhamento de luz obtuso, canais de impedância, etc. As células podem ser selecionadas contra células mortas empregando corantes associados às células mortas (por exemplo, iodeto de propídio). Qualquer técnica pode ser empregada que não é indevidamente prejudicial para a viabilidade das células geneticamente modificadas. Composições de células que são altamente enriquecidas para células, incluindo DNA modificado são obtidas dessa forma. Por “altamente enriquecido”, entende-se que as células geneticamente modificadas serão 70% ou mais, 75% ou mais, 80% ou mais, 85% ou mais, 90% ou mais da composição celular, por exemplo, cerca de 95% ou mais, ou 98% ou mais da composição celular. Em outras palavras, a composição pode ser uma composição substancialmente pura de células geneticamente modificadas.
[0305] Células geneticamente modificadas produzidas pelos métodos descritos aqui podem ser usadas imediatamente. Alternativamente, as células podem ser congeladas em temperaturas de nitrogênio líquido e armazenadas por longos períodos de tempo, sendo descongeladas e capazes de serem reutilizadas. Em tais casos, as células serão geralmente congeladas em 10% dimetilsulfóxido (DMSO), 50% de soro, 40% meio tampão ou alguma outra tal solução que já é utilizada na técnica para preservar as células em tais temperaturas congelantes e descongeladas em uma maneira como comumente conhecido na técnica para descongelar células congeladas cultivadas.
[0306] Células geneticamente modificadas podem ser cultivadas in vitro sob diferentes condições de cultura. As células podem ser expandidas em cultura, ou seja, cultivadas em condições que promovem a sua proliferação. Meio de cultura pode ser líquido ou semissólido, por exemplo, contendo ágar, metilcelulose, etc. A população de células pode ser suspensa em um meio nutritivo apropriado, como DMEM modificado por Iscove ou RPMI 1640, normalmente suplementado com soro fetal de bezerro (cerca de 5-10%), L-glutamina, um tiol, particularmente, 2-mercaptoetanol e antibióticos, por exemplo, penicilina e estreptomicina. A cultura pode conter fatores de crescimento para as quais as células T reguladoras são responsivas. Fatores de crescimento, conforme definido aqui, são moléculas capazes de promover a sobrevivência, crescimento e/ou diferenciação das células, na cultura ou no tecido intacto, através de efeitos específicos em um receptor transmembrana. Fatores de crescimento incluem os polipeptídeos e fatores não polipeptídeo.
[0307] Células que foram geneticamente modificadas desta forma podem ser transplantadas para um sujeito para fins como terapia gênica, por exemplo, para tratar uma doença ou como um antiviral, antipatgênica, ou terapêutica anticâncer, para a produção de organismos geneticamente modificados na agricultura, ou para a investigação biológica. O sujeito pode ser um recém-nascido, uma criança ou um adulto. De particular interesse são sujeitos mamíferos. Espécies de mamíferos que podem ser tratadas com os presentes métodos incluem caninos e felinos;equinos; bovinos; ovinos; etc e primatas, especialmente os humanos. Modelos animais, particularmente pequenos mamíferos (por exemplo, rato, rato, cobaia, hamster, lagomorfos (por exemplo, coelho), etc.) podem ser utilizados para investigações experimentais.
[0308] Células podem ser fornecidas ao sujeito sozinhas ou com um substrato adequado ou matriz, por exemplo, para apoiar o seu crescimento e/ou organização do tecido ao qual eles estão sendo transplantados. Geralmente, pelo menos 1 x 103 células serão administradas, por exemplo 5 x 103 células, 1 x 104 células, 5 x 104 células, 1 x 105 células, 1 x 106 células ou mais. As células podem ser introduzidas ao sujeito através de qualquer uma das seguintes rotas: parenteral, subcutânea, intravenosa, intracraniana,intraspinal, intraocular ou na medula espinhal. As células podem ser introduzidas por injeção, cateter ou semelhantes. Exemplos de métodos para liberação local, ou seja, a liberação para o sítio da lesão incluem, por exemplo, através de um reservatório de Ommaya, por exemplo, para a liberação intratecal (ver por exemplo patentes US 5.222.982 e 5385582, incorporados aqui por referência); por injeção em bolus, por exemplo, uma seringa, por exemplo, em uma articulação; por infusão contínua, por exemplo, canulação, por exemplo, com convecção (ver por exemplo nos pedido US 20070254842, aqui incorporado por referência); ou por um dispositivo de implante em que as células foram reversivelmente afixadas (ver, por exemplo, pedidos US 20080081064 e 20090196903, incorporados aqui por referência). As células também podem ser introduzidas um embrião (por exemplo, um blastocisto), com a finalidade de gerar um animal transgênico (por exemplo, um rato transgênico).
[0309] O número de administrações do tratamento a um sujeito pode variar. Introdução das células geneticamente modificadas no sujeito pode ser um evento único; mas em certas situações, esse tratamento pode induzir a melhoria durante um período limitado de tempo e requerem uma série em curso de tratamentos repetidos. Em outras situações, várias administrações das células geneticamente modificadas podem ser necessárias antes que um efeito seja observado. Os protocolos exatos dependem da doença ou condição, o estágio da doença e parâmetros do sujeito individual a ser tratado.
[0310] Em outros aspectos da invenção, o RNA tendo DNA como alvo e/ou polipeptídeo modificador direcionado ao sítio e/ou polinucleotídeo doador são empregados para modificar o DNA celular na vivo, novamente para fins como terapia gênica, por exemplo, para tratar uma doença ou como um antiviral, antipatgênico, ou terapêutica anticâncer, para a produção de organismos geneticamente modificados na agricultura, ou para a investigação biológica. Nestas modalidades em vivo, um RNA tendo DNA como alvo e/ou polipeptídeo modificador direcionado ao sítio e/ou polinucleotídeo doador são administrados diretamente ao indivíduo. Um RNA tendo DNA como alvo e/ou polipeptídeo modificador direcionado ao sítio e/ou polinucleotídeo doador podem ser administrados por qualquer um de um número de métodos conhecidos na técnica para a administração de peptídeos, pequenas moléculas e ácidos nucleicos para um sujeito. Um RNA tendo DNA como alvo e/ou polipeptídeo modificador direcionado ao sítio e/ou polinucleotídeo doador podem ser incorporados em uma variedade de formulações. Mais particularmente, um RNA tendo DNA como alvo e/ou polipeptídeo modificador direcionado ao sítio e/ou polinucleotídeo doador da presente invenção podem ser formulados em composições farmacêuticas por combinação com carreadores ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis apropriados.
[0311] As preparações farmacêuticas são composições que incluem um ou mais um RNA tendo DNA como alvo e/ou polipeptídeo modificador direcionado ao sítio e/ou polinucleotídeo doador presentes em um veículo farmaceuticamente aceitável. “Veículos farmaceuticamente aceitáveis” podem ser veículos aprovado por uma agência reguladora do Governo Federal ou um Estado ou se refere a Farmacopéia dos Estados Unidos ou outra Farmacopéia geralmente reconhecida para uso em mamíferos, como os seres humanos. O termo “veículo” refere-se a um diluente, adjuvante, excipiente ou carreador com o qual um composto da invenção é formulado para a administração a um mamífero. Tais veículos farmacêuticos podem ser lipídeos, por exemplo, lipossomas, por exemplo, dendrímeros lipossomas; líquidos, como água e óleos, incluindo os de origem de petróleo, animal, vegetal ou sintéticos, como óleo de amendoim, óleo de soja, óleo mineral, óleo de gergelim e semelhantes, salina; goma acácia, gelatina, pasta de amido, talco, queratina, sílica coloidal, uréia e semelhantes. Além disso, auxiliares, estabilizadores, espessantes, lubrificantes e agentes de coloração podem ser usados. Composições farmacêuticas podem ser formuladas em preparações em formas sólidas, semissólidas, líquidas ou gasosas, como comprimidos, cápsulas, pós, granulados, pomadas, soluções, supositórios, injeções, inalantes, géis, microesferas e aerossóis. Como tal, administração da um RNA tendo DNA como alvo e/ou polipeptídeo modificador direcionado ao sítio e/ou polinucleotídeo doador podem ser conseguidas de várias maneiras, incluindo oral, bucal, retal, parenteral, intraperitoneal, intradérmica, transdérmica, intratraqueal, administração intraocular, etc. O agente ativo pode ser sistêmico após a administração, ou pode ser localizado pelo uso da administração regional, administração intramural ou uso de um implante que age para manter a dose ativa no sítio da implantação. O agente ativo pode ser formulado para atividade imediata ou pode ser formulado para liberação sustentada.
[0312] Para algumas condições, nomeadamente condições de sistema nervoso central, pode ser necessário formular agentes para atravessar a barreira hematoencefálica (BBB). Uma estratégia para a liberação da droga através da barreira hematoencefálica (BBB) implica o rompimento da BBB, por meios osmóticos como manitol ou leucotrienos ou bioquimicamente através da utilização de substâncias vasoativas, como a bradicinina. O potencial para usar abertura de BBB para agentes específicos alvos para tumores cerebrais também é uma opção. Um agente de rompimento da BBB pode ser administrado conjuntamente com as composições terapêuticas da invenção quando as composições são administradas por injeção intravascular. Outras estratégias para passar a BBB podem implicar a utilização de sistemas de transporte endógeno, incluindo transcitose mediada por Caveolina-1, transportadores mediados por carreador como glicose e transportadoras de aminoácidos, transcitose mediada por receptor para insulina ou transferrina, e transportadores de efluxo ativo como p-glicoproteína. Frações de transporte ativo também podem ser conjugadas com os compostos terapêuticos para uso na invenção para facilitar o transporte através da parede endotelial do vaso sanguíneo.Alternativamente, liberação de droga de agentes terapêuticos além da BBB pode ser pela liberação local, por exemplo, liberação intratecal, por exemplo, através de um reservatório de Ommaya (ver por exemplo patentes US 5.222.982 e 5385582, incorporados aqui por referência); por injeção em bolus, por exemplo, uma seringa, por exemplo, intravitrealmente ou intracraniano; por infusão contínua, por exemplo, canulação, por exemplo, com convecção (ver por exemplo pedidos 20070254842, aqui incorporados por referência); ou por um implantação do dispositivo no qual o agente foi reversivelmente anexado (ver por exemplo pedidos Nos. 20080081064 e 20090196903, incorporados aqui por referência).
[0313] Normalmente, uma quantidade efetiva de um RNA tendo DNA como alvo e/ou polipeptídeo modificador direcionado ao sítio e/ou polinucleotídeo doador são fornecidos. Como discutido acima, no que se refere aos métodos ex vivo, uma quantidade efetiva ou a dose efectiva de um RNA tendo DNA como alvo e/ou polipeptídeo modificador direcionado ao sítio e/ou polinucleotídeo doador in vivo é a quantidade de induzir um aumento de 2 vezes ou mais na quantidade de recombinação observadas entre duas sequências homólogas em relação a um controle negativo, por exemplo, uma célula em contato com um vetor vazio ou polipeptídeo irrelevante. A quantidade de recombinação pode ser medida por qualquer método conveniente, por exemplo, como descrito acima e conhecido na técnica. O cálculo da quantidade efetiva ou dose efetiva de um RNA tendo DNA como alvo e/ou polipeptídeo modificador direcionado ao sítio e/ou polinucleotídeo doador administrado estão dentro da habilidade de um especialista na técnica e será rotina aos especialistas na técnica. A quantidade final a ser administrada será dependente sobre a via de administração e sobre a natureza da doença ou condição que deve ser tratada.
[0314] A quantidade efetiva dada para um determinado paciente irá depender de uma variedade de fatores, vários dos quais irão variar de paciente para paciente. Um médico competente será capaz de determinar uma quantidade efetiva de um agente terapêutico para administrar a um paciente para interromper ou reverter a progressão da condição da doença conforme necessário. Utilizando dados obtidos em animais LD50 e outras informações disponíveis para o agente, um médico pode determinar a dose máxima segura para um indivíduo, dependendo da via de administração. Por exemplo, uma dose administrada por via intravenosa pode ser mais do que uma dose intratecal administrada, dado o maior corpo de fluido no qual a composição de terapêutica está sendo administrada. Da mesma forma, composições que são rapidamente retiradas do corpo podem ser administradas em doses mais elevadas, ou em doses repetidas, a fim de manter uma concentração terapêutica. Utilizando habilidade ordinária, o clínico competente será capaz de otimizar a dosagem de uma determinada terapêutica no curso de ensaios clínicos de rotina.
[0315] Para inclusão em um medicamento, um RNA tendo DNA como alvo e/ou polipeptídeo modificador direcionado ao sítio e/ou polinucleotídeo doador podem ser obtidos de uma fonte comercial adequada. Como uma proposição geral, a quantidade total de um RNA tendo DNA como alvo e/ou polipeptídeo modificador direcionado ao sítio e/ou polinucleotídeo doador farmaceuticamente eficaz administrados por via parenteral por dose será em uma escala que pode ser medida por uma curva de dose-resposta.
[0316] Terapias com base em um RNA tendo DNA como alvo e/ou polipeptídeo direcionado ao sítio modificar e/ou polinucleotídeo doador, ou seja, as preparações de um RNA tendo DNA como alvo/polipeptídeo modificador direcionado ao sítio ou polinucleotídeo doador a serem usadas para a administração da terapêutica, devem ser estéreis. Esterilidade é facilmente realizada por filtração através de membranas de filtração estéril (por exemplo, membranas de 0,2 μm). Composições terapêuticas geralmente são colocadas em um recipiente com uma porta de acesso estéril, por exemplo, uma bolsa de solução intravenosa ou frasco com uma rolha perfurável por uma agulha de injeção hipodérmica. As terapias com base em um RNA tendo DNA como alvo e/ou polipeptídeo modificador direcionado ao sítio e/ou polinucleotídeo doador podem ser armazenadas em recipientes de doses únicas ou múltiplas, por exemplo, ampolas vedadas ou tubos de ensaio, como uma solução aquosa ou como uma formulação liofilizada para reconstituição. Como um exemplo de uma formulação liofilizada, frascos de 10 mL são preenchidos com 5 ml de solução aquosa filtrada estéril 1% (p/v) do composto, e a mistura resultante é liofilizada. A solução de infusão é preparada por reconstituição do liofilizado composto usando água para injeção bacteriostática.
[0317] Composições farmacêuticas incluem, dependendo da formulação desejada, carreadores não tóxicos de diluentes farmaceuticamente aceitáveis, que são definidos como veículos comumente usados para formular composições farmacêuticas para a administração humana ou animal. O diluente é selecionado de modo a não afetar a atividade biológica da combinação. São exemplos de tais diluentes, água destilada, água tamponada, soro fisiológico, PBS, solução de Ringer, solução de dextrose e solução do Hank. Além disso, a composição farmacêutica ou formulação pode incluir outros carreadores, adjuvantes ou estabilizadores não tóxicos, não terapêuticos, não imunogênicos, excipientes e semelhantes. As composições também podem incluir substâncias adicionais para aproximar às condições fisiológicas, como ajuste de pH e agenes de tamponamento, agentes que ajustam a toxicidade, agentes molhantes e detergentes.
[0318] A composição também pode incluir qualquer de uma variedade de agentes de estabilização, como um antioxidante, por exemplo. Quando a composição farmacêutica inclui um polipeptídeo, o polipeptídeo pode ser complexado com vários compostos bem conhecidos que melhoram a estabilidade in vivo do polipeptídeo, ou outra forma de melhoram suas propriedades farmacológicas (por exemplo, aumentam a meia-vida do polipeptídeo, reduzem sua toxicidade, aumentam a solubilidade ou absorção). Exemplos de tais modificações ou agentes complexantes incluem sulfato, gluconato, citrato e fosfato. Os ácidos nucleicos ou polipeptídeos de composição também podem ser complexados com moléculas que melhoram seus atributos in vivo. Tais moléculas incluem, por exemplo, carboidratos, poliaminas, aminoácidos, outros peptídeos, íons (por exemplo, sódio, potássio, cálcio, magnésio, manganês) e lipídeos.
[0319] Outras orientações sobre formulações que são adequadas para vários tipos de administração podem ser encontradas em Remington's Pharmaceutical Sciences, Mace Publishing Company, Philadelphia, Pa., 17a ed. (1985). Para uma breve revisão dos métodos para a liberação da droga, ver, Langer, Science 249:1527-1533 (1990).
[0320] As composições farmacêuticas podem ser administradas para tratamentos profiláticos e/ou terapêuticos. Toxicidade e eficácia terapêutica do ingrediente ativo podem ser determinadas de acordo com os procedimentos padrões farmacêuticos em culturas de células e/ou animais experimentais, incluindo, por exemplo, determinar a DL50 (dose letal para 50% da população) e a ED50 (a dose terapêutica eficaz em 50% da população). A relação de dose entre efeitos tóxicos e terapêuticos é o índice terapêutico e pode ser expressa como a relação DL50/ED50. Terapias que apresentam grandes índices terapêuticos são preferenciais.
[0321] Os dados obtidos de estudos de cultura de célula e/ou animal podem ser usados na formulação de um intervalo de dosagens para seres humanos. A dosagem do ingrediente ativo normalmente se alinha dentro de um intervalo de concentrações que inclui a ED50 com baixa toxicidade em circulação. A dosagem pode variar dentro desse intervalo, dependendo da forma de dosagem empregada e a via de administração utilizada.
[0322] Os componentes usados para formular as composições farmacêuticas são preferencialmente de alta pureza e são substancialmente isentos de contaminantes potencialmente prejudiciais (por exemplo, pelo menos grau comestível nacional (NF), geralmente pelo menos qualidade analítica e mais geralmente pelo menos grau farmacêutico). Além disso, composições destinadas ao uso in vivo são geralmente estéreis. Na medida em que um determinado composto deve ser sintetizado antes de usar, o produto resultante é tipicamente substancialmente isento de quaisquer agentes potencialmente tóxicos, especialmente quaisquer endotoxinas, que podem estar presentes durante o processo de síntese ou purificação. Composições para administração parental também são estéreis, substancialmente isotônicas e preparadas sob condições GMP.
[0323] Quantidade efetiva de uma composição terapêutica sendo administrada a um determinado paciente irá depender de uma variedade de fatores, vários dos quais irão variar de paciente para paciente. Um médico competente será capaz de determinar uma quantidade efetiva de um agente terapêutico para administrar a um paciente para interromper ou reverter a progressão da condição da doença conforme necessário. Utilizando dados obtidos em animais LD50 e outras informações disponíveis para o agente, um médico pode determinar a dose máxima segura para um indivíduo, dependendo da via de administração. Por exemplo, uma dose administrada por via intravenosa pode ser mais do que uma dose intratecal administrada, dado o maior corpo de fluido no qual a composição de terapêutica está sendo administrada. Da mesma forma, composições que são rapidamente retiradas do corpo podem ser administradas em doses mais elevadas, ou em doses repetidas, a fim de manter uma concentração terapêutica. Utilizando habilidade ordinária, o clínico competente será capaz de otimizar a dosagem de uma determinada terapêutica no curso de ensaios clínicos de rotina.
CÉLULAS HOSPEDEIRAS GENETICAMENTE MODIFICADAS
[0324] A presente divulgação fornece células geneticamente modificadas, incluindo células isoladas do hospedeiro geneticamente modificadas, onde uma célula hospedeira geneticamente modificada objeto compreende (foi geneticamente modificado com: 1) um RNA tendo DNA como alvo exógeno; 2) um ácido nucleico exógeno, composto por uma sequência de nucleotídeos que codifica um RNA tendo DNA como alvo; 3) um polipeptídeo modificador direcionado ao sítio exógeno (por exemplo, um Cas9 de ocorrência natural; um modificado, ou seja, uma mutação ou variante de Cas9; um Cas9 quimérico; etc.); 4) um ácido nucleico exógeno, composto por uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo modificador direcionado ao sítio; ou 5) qualquer combinação das opções acima. Uma célula geneticamente modificada objeto é gerada por modificação genética de uma célula hospedeira, com, por exemplo: 1) um RNA tendo DNA exógeno como alvo; 2) um ácido nucleico exógeno, composto por uma sequência de nucleotídeos que codifica um RNA tendo DNA como alvo; 3) um polipeptídeo modificador direcionado ao sítio exógeno; 4) um ácido nucleico exógeno, composto por uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo modificador direcionado ao sítio; ou 5) qualquer combinação dos acima.
[0325] Todas as células adequadas para serem uma célula alvo também são adequadas para serem uma célula hospedeira geneticamente modificada. Por exemplo, um célula geneticamente modificads de interesse pode ser uma célula de um organismo (por exemplo, uma célula bacteriana, uma célula de Archaea, uma célula de um organismo eucariótico unicelular, uma célula vegetal, uma célula de alga, por exemplo, Botryococcus braunii, Chlamydomonas reinhardtii, Nannochloropsis gaditana, Chlorella pyrenoidosa, Sargassum patens C. Agardh, e semelhantes, uma célula fúngica (por exemplo, uma célula de levedura), uma célula animal, uma célula de um animal invertebrado (por exemplo, mosca da fruta, Cnidários, equinodermos, nematódeo, , etc.), uma célula de um animal vertebrado (por exemplo, peixes, anfíbios, répteis, pássaro, mamífero), uma célula de um mamífero (por exemplo, um porco, uma vaca, uma cabra, uma ovelha, um roedor, um rato, um camundongo, um primata não humano, um humano, etc.), etc.
[0326] Em algumas modalidades, uma célula hospedeira geneticamente modificada foi geneticamente modificada com um ácido nucleico exógeno, composto por uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo modificador direcionado ao sítio (por exemplo, um Cas9 natural; um modificado, ou seja, uma mutação ou variante de Cas9; um Cas9 quimérico; etc.). O DNA de uma célula hospedeira geneticamente modificada pode ser direcionado para modificação introduzindo dentro da célula um RNA tendo DNA como alvo (ou um DNA que codifica um RNA tendo DNA como alvo, que determina a localização/sequência genômica a ser modificada) e, opcionalmente, um doador do ácido nucleico. Em algumas modalidades, a sequência nucleotídica que codifica um polipeptídeo modificador direcionado ao sítio operacionalmente é ligada a um promotor induzível (por exemplo, promotor por choque do calor, promotor regulado por tetraciclina, promotor regulado por esteroide, promotor regulado por metal, promotor regulado por receptor de estrogênio, etc.). Em algumas modalidades, a sequência nucleotídica que codifica um polipeptídeo modificador direcionado ao sítio está operacionalmente ligada a um promotor espacialmente restrito e/ou temporalmente restrito (por exemplo, um promotor específico de tecido, um promotor específico de tipo de célula, etc.). Em algumas modalidades, a sequência nucleotídica que codifica um polipeptídeo modificador direcionado ao sítio está operacionalmente ligada a um promotor constitutivo.
[0327] Em algumas modalidades, uma célula hospedeira geneticamente modificada objeto é in vitro. Em algumas modalidades, uma célula hospedeira geneticamente modificada objeto é in vivo. Em algumas modalidades, uma célula hospedeira geneticamente modificada objeto é uma célula procariótica ou é derivada de uma célula procariótica. Em algumas modalidades, uma célula hospedeira geneticamente modificada objeto é uma célula bacteriana ou é derivada de uma célula bacteriana. Em algumas modalidades, uma célula hospedeira geneticamente modificada objeto é uma célula de Archaea ou é derivada de uma célula archeal. Em algumas modalidades, uma célula hospedeira geneticamente modificada objeto é uma célula eucariótica ou é derivada de uma célula eucariótica. Em algumas modalidades, uma célula hospedeira geneticamente modificada objeto é uma célula vegetal ou é derivada de uma célula vegetal. Em algumas modalidades, uma célula hospedeira geneticamente modificada objeto é uma célula animal ou é derivada de uma célula animal. Em algumas modalidades, uma célula hospedeira geneticamente modificada objeto é uma célula de invertebrados ou é derivada de uma célula de invertebrados. Em algumas modalidades, uma célula hospedeira geneticamente modificada objeto é uma célula de vertebrados ou é derivada de uma célula de vertebrados. Em algumas modalidades, uma célula hospedeira geneticamente modificada objeto é uma célula mamífera ou é derivada de uma célula mamífera. Em algumas modalidades, uma célula hospedeira geneticamente modificada objeto é uma célula de roedor ou é derivada de uma célula de roedor. Em algumas modalidades, uma célula hospedeira geneticamente modificada objeto é uma célula humana ou é derivada de uma célula humana.
[0328] A presente divulgação fornece ainda a descendência de uma célula geneticamente modificada de sujeito, onde a descendência pode incluir o mesmo ácido nucleico exógeno ou polipeptídeo que a célula geneticamente modificada objeto da qual foi derivada. A presente divulgação adicional fornece uma composição que inclui uma célula hospedeira geneticamente modificada objeto.
Células-tronco geneticamente modificadas e células progenitoras geneticamente modificadas
[0329] Em algumas modalidades, uma célula hospedeira geneticamente modificada objeto é uma célula- tronco ou célula progenitora geneticamente modificada. Células hospedeiras apropriadas incluem, por exemplo, as células-tronco (células-tronco adultas, células-tronco embrionárias, as células iPS, etc.) e células progenitoras (por exemplo, células progenitoras cardíacas, células progenitoras neurais, etc.).. As células hospedeiras adequadas incluem células-tronco de mamíferos e células progenitoras, incluindo, por exemplo, células-tronco de roedores, células progenitoras de roedores, células-tronco humanas, células progenitoras humana, etc. As células hospedeiras adequadas incluem células hospedeirasin vitro, por exemplo, as células hospedeiras isoladas.
[0330] Em algumas modalidades, uma célula hospedeira geneticamente modificada objeto compreende um RNA tendo DNA exógeno como alvo do ácido nucleico. Em algumas modalidades, uma célula hospedeira geneticamente modificada objeto é composta por um ácido nucleico exógeno, composto por uma sequência de nucleotídeos que codifica um RNA tendo DNA como alvo. Em algumas modalidades, uma célula hospedeira geneticamente modificada objeto compreende um polipeptídeo modificador direcionado ao sítio exógeno (por exemplo, um Cas9 natural; um modificado, ou seja, uma mutação ou variante de Cas9; um Cas9 quimérico; etc.). Em algumas modalidades, uma célula hospedeira geneticamente modificada objeto é composta por um ácido nucleico exógeno, composto por uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo modificador direcionado ao sítio. Em algumas modalidades, uma célula hospedeira geneticamente modificada objeto compreende ácido nucleico exógena constituído por uma sequência de nucleotídeos que codifica 1) um RNA tendo DNA como alvo e 2) um polipeptídeo modificador direcionado ao sítio.
[0331] Em alguns casos, o polipeptídeo modificador direcionado ao sítio é composto por uma sequência de aminoácidos, tendo pelo menos cerca de 75%, pelo menos, cerca de 80%, pelo menos, cerca de 85%, pelo menos sobre 90%, pelo menos, cerca de 95%, pelo menos cerca de 99% ou 100% de identidade de sequência de aminoácidos de aminoácidos 7-166 ou 731-1003 da sequência de aminoácidos Cas9/Csn1 retratada na Figura 3, ou para as porções correspondentes em qualquer uma das sequências de aminoácidos estabelecidas como SEQ: ID NOs: 1-256 e 795-1346.
COMPOSIÇÕES
[0332] A presente invenção fornece uma composição compreendendo um RNA tendo DNA como alvo objeto e/ou um polipeptídeo modificador direcionado ao sítio. Em alguns casos, o polipeptídeo modificador direcionado ao sítio é um polipeptídeo quimérico objeto. Uma composição objeto é útil para a realização de um método de divulgação presente, por exemplo, um método para modificação específica ao sítio de um DNA alvo; um método para modificação específica ao sítio de um polipeptídeo associado com um DNA alvo; etc.
Composições compreendendo um RNA tendo DNA como alvo
[0333] A presente invenção fornece uma composição compreendendo um RNA tendo DNA como alvo objeto. A composição pode incluir, além do RNA tendo DNA como alvo, um ou mais de: um sal, por exemplo, NaCl, MgCl2, KCl, MgSO4, etc.; um agente tamponante, por exemplo, um tampão Tris, ácido N-(2-Hidroxietil)piperazina-N'-(2-etanossulfônico) (HEPES), ácido 2-(N-morfolino)etanossulfônico (MES), sal de sódio do MES, ácido 3-(N-morfolino)propanossulfônico (MOPS), ácido [N-hidroximetil] metil-3-aminopropanossulfônico (TAPS), etc.; um agente solubilizante; um detergente, por exemplo, um detergente não iônico como Tween-20, etc.; um inibidor de nuclease; e semelhantes. Por exemplo, em alguns casos, uma composição objeto compreende um RNA tendo DNA como alvo objeto e um tampão para estabilização de ácidos nucleicos.
[0334] Em algumas modalidades, um RNA tendo DNA como alvo presente em uma composição objeto é puro, por exemplo, pelo menos cerca de 75%, pelo menos, cerca de 80%, pelo menos, cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos, cerca de 95%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos aproximadamente 99% ou mais de 99% puro, onde “% pureza” significa que o RNA tendo DNA como alvo é o percentual mencionado livre de outras macromoléculas, ou contaminantes que possam estar presentes durante a produção do RNA tendo DNA como alvo.
Composições compreendendo um polipeptídeo quimérico objeto
[0335] A presente invenção fornece uma composição um polipeptídeo quimérico objeto. A composição pode incluir, além do RNA tendo DNA como alvo, um ou mais de: um sal, por exemplo, NaCl, MgCl2, KCl, MgSO4, etc.; um agente tamponante, por exemplo, um tampão Tris, HEPES, MES, sal de sódio do MES, MOPS, TAPS, etc.; um agente solubilizante; um detergente, por exemplo, um detergente não iônico como Tween- 20, etc.; um inibidor da protease; um agente redutor (por exemplo, ditiotreitol); e semelhantes.
[0336] Em algumas modalidades, um polipeptídeo quimérico objeto presente em uma composição objeto é puro, por exemplo, pelo menos, cerca de 75%, pelo menos, cerca de 80%, pelo menos, cerca de 85%, pelo menos, cerca de 90%, pelo menos, cerca de 95%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos sobre 99% ou mais de 99% puro, onde “% de pureza” significa que a polipeptídeo modificador direcionado ao sítio é o percentual mencionado livre de outras proteínas, outras macromoléculas, ou contaminantes que possam estar presentes durante a produção do polipeptídeo quimérico.
Composições compreendendo um RNA tendo DNA como alvo e um polipeptídeo modificador direcionado ao sítio
[0337] A presente invenção fornece uma composição compreendendo: (i) um RNA tendo DNA como alvo ou um polinucleotídeo do DNA que codifica o mesmo; e ii) um polipeptídeo modificador direcionado ao sítio ou um polinucleotídeo codificando o mesmo. Em alguns casos, o polipeptídeo modificador direcionado ao sítio é um polipeptídeo quimérico modificador direcionado ao sítio objeto. Em outros casos, o polipeptídeo modificador direcionado ao sítio é um polipeptídeo modificador direcionado ao sítio de ocorrência natural. Em alguns casos, o polipeptídeo modificador direcionado ao sítio apresenta atividade enzimática que modifica um DNA alvo. Em outros casos, o polipeptídeo modificador direcionado ao sítio apresenta atividade enzimática que modifica um polipeptídeo que está associado com um DNA alvo. Em outros casos, ainda, o polipeptídeo modificador direcionado ao sítio modula a transcrição do DNA alvo.
[0338] A presente invenção fornece uma composição compreendendo: (i) um RNA tendo DNA como alvo,como descrito acima, ou um polinucleotídeo do DNA que codifica do mesmo, compreendendo o RNA tendo DNA como alvo: (a) um primeiro segmento, composto por uma sequência de nucleotídeos que é complementar a uma sequência em um DNA alvo; e (b) um segundo segmento que interage com um polipeptídeo modificador direcionado ao sítio; e (ii) o polipeptídeo modificador direcionado ao sítio, ou um polinucleotídeo que codifica o mesmo, o polipeptídeo modificador direcionado ao sítio composto por: (a) uma porção de ligação ao RNA que interage com o RNA do DNA-alvo; e (b) uma porção de atividade que apresenta atividade enzimática direcionada ao sítio, em que o sítio da atividade enzimática é determinado pelo RNA tendo DNA como alvo.
[0339] Em alguns casos, uma composição objeto compreende: uma composição que inclui: (i) um RNA tendo DNA como alvo objeto, o RNA tendo DNA como alvo composto por: (a) um primeiro segmento composto por uma sequência de nucleotídeos que é complementar a uma sequência em um DNA alvo; e (b) um segundo segmento que interage com um polipeptídeo modificador direcionado ao sítio; e (ii) o polipeptídeo modificador direcionado ao sítio, polipeptídeo modificador direcionado ao sítio composto por: (a) uma porção de ligação ao RNA que interage com o RNA tendo DNA como alvo; e (b) uma parcela de atividade que apresenta atividade enzimática direcionada ao sítio, em que o sítio da atividade enzimática é determinado pelo RNA tendo DNA como alvo.
[0340] Em outras modalidades, uma composição objeto compreende: (i) um polinucleotídeo que codifica um RNA tendo DNA como alvo objeto, o RNA tendo DNA como alvo composto por: (a) um primeiro segmento, composto por uma sequência de nucleotídeos que é complementar a uma sequência em um DNA alvo; e (b) um segundo segmento que interage com um polipeptídeo modificador direcionado ao sítio; e (ii) um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo modificador direcionado ao sítio, o polipeptídeo modificador direcionado ao sítio composto por: (a) uma porção de ligação ao RNA que interage com o RNA tendo DNA como alvo; e (b) uma porção de atividade que apresenta atividade enzimática direcionada ao sítio, em que o sítio da atividade enzimática é determinado pelo RNA tendo DNA como alvo.
[0341] Em algumas modalidades, uma composição objeto inclui ambas as moléculas de RNA de um RNA tendo DNA de molécula dupla como alvo. Como tal, em algumas modalidades, uma composição objeto inclui um RNA ativador que compreende um segmento formador de duplex que é complementar ao segmento formador de duplex de um RNA direcionador (ver figura 1A). Segmentos formadores de duplex de RNA ativador e o RNA direcionador hibridizam para formar o dsRNA duplex do segmento ligação à proteína do RNA tendo DNA como alvo. O RNA direcionador ainda fornece o segmento tendo DNA como alvo (fita simples) do RNA tendo DNA como alvo e, portanto, alveja o RNA tendo DNA como alvo para uma sequência específica dentro do DNA alvo. Como um exemplo não limitante, o segment formador de duplex do RNA ativador é composto por uma sequência de nucleotídeos que tem pelo menos cerca de 70%, pelo menos, cerca de 80%, pelo menos, cerca de 90%, pelo menos, cerca de 95%, pelo menos cerca de 98% ou 100% de identidade com a sequência 5'-UAGCAAGUUAAAAU-3' (SEQ ID NO: 562). Como outro exemplo não limitante, o segmento formador de duplex do RNA direcionador é composto por uma sequência de nucleotídeos que tem pelo menos cerca de 70%, pelo menos, cerca de 80%, pelo menos, cerca de 90%, pelo menos, cerca de 95%, pelo menos cerca de 98% ou 100% de identidade com a sequência 5'-GUUUUAGAGCUA-3' (SEQ ID NO: 679).
[0342] A presente divulgação fornece uma composição que inclua: (i) um RNA tendo DNA como alvo, ou um polinucleotídeo do DNA que codifica o mesmo, o RNA tendo DNA como alvo constituído por: (a) um primeiro segmento, composto por uma sequência de nucleotídeos que é complementar a uma sequência em um DNA alvo; e (b) um segundo segmento que interage com um polipeptídeo modificador direcionado ao sítio; e (ii) o polipeptídeo modificador direcionado ao sítio ou um polinucleotídeo que codifica o mesmo, o polipeptídeo modificador direcionado ao sítio composto por: (a) uma porção de ligação ao RNA que interage com o RNA tendo DNA como alvo; e (b) uma porção de atividade que modula a transcrição dentro do DNA alvo, em que o sítio da transcrição modulada dentro do DNA alvo é determinado pelo RNA tendo DNA como alvo.
[0343] Por exemplo, em alguns casos, uma composição objeto compreende: (i) um RNA tendo DNA como alvo, o RNA tendo DNA como alvo composto por: (a) um primeiro segmento composto por uma sequência de nucleotídeos que é complementar a uma sequência em um DNA alvo; e (b) um segundo segmento que interage com um polipeptídeo modificador direcionado ao sítio; e (ii) o polipeptídeo modificador direcionado ao sítio, polipeptídeo modificador direcionado ao sítio composto por: (a) uma porção de ligação ao RNA que interage com o RNA tendo DNA como alvo; e (b) uma porção de atividade que modula a transcrição dentro do DNA alvo, em que o sítio da transcrição modulada dentro do DNA alvo é determinado pelo RNA tendo DNA como alvo.
[0344] Como outro exemplo, em alguns casos, uma composição objeto é composta por: (i) um polinucleotídeo do DNA que codifica um RNA tendo DNA como alvo, o RNA tendo DNA como alvo composto por: (a) um primeiro segmento, composto por uma sequência de nucleotídeos que é complementar a uma sequência em um DNA alvo; e (b) um segundo segmento que interage com um polipeptídeo modificador direcionado ao sítio; e (ii) um polinucleotídeo que codifica polipeptídeo modificador direcionado ao sítio, o polipeptídeo modificador direcionado ao sítio composto por: (a) uma porção de ligação ao RNA que interage com o RNA tendo DNA como alvo; e (b) uma porção de atividade que modula a transcrição dentro do DNA alvo, no qual o sítio da transcrição modulado dentro do DNA alvo é determinado pelo RNA tendo DNA como alvo.
[0345] A composição objeto pode incluir, além de i) um RNA tendo DNA como alvo objeto, ou um polinucleotídeo do DNA que codifica o mesmo; e ii) um polipeptídeo modificador direcionado ao sítio, ou um polinucleotídeo o mesmo, um ou mais de codificação: um sal, por exemplo, NaCl, MgCl2, KCl, MgSO4, etc.; um agente tamponante, por exemplo, um tampão Tris, HEPES, MES, sal de sódio do MES, MOPS, TAPS, etc.; um agente solubilizante; um detergente, por exemplo, um detergente não iônico como Tween-20, etc.; um inibidor da protease; um agente redutor (por exemplo, ditiotreitol); e semelhantes.
[0346] Em alguns casos, os componentes da composição são individualmente puros, por exemplo, cada um dos componentes é pelo menos cerca de 75%, pelo menos, cerca de 80%, pelo menos, cerca de 90%, pelo menos, cerca de 95%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99%, ou pelo menos 99%, puro. Em alguns casos, os componentes individuais de uma composição objeto são puros antes de serem adicionados à composição.
[0347] Por exemplo, em algumas modalidades, um polipeptídeo modificador direcionado ao sítio presente em uma composição objeto é puro, por exemplo, pelo menos cerca de 75%, pelo menos, cerca de 80%, pelo menos, cerca de 85%, pelo menos, cerca de 90%, pelo menos, cerca de 95%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos sobre 99% ou mais de 99% puro, onde “% pureza” significa que o polipeptídeo modificador direcionado ao sítio é o percentual mencionado livre de outras proteínas (por exemplo,as proteínas que não são o polipeptídeo modificador direcionado ao sítio), outras macromoléculas, ou contaminantes que possam estar presentes durante a produção do polipeptídeo modificador direcionado ao sítio.
KITS
[0348] A presente divulgação fornece kits para a realização de um método objeto. Um kit objeto pode incluir um ou mais dos: um polipeptídeo modificador direcionado ao sítio; um ácido nucleico constituído por um nucleotídeo que codifica um polipeptídeo modificador direcionado ao sítio; um RNA tendo DNA como alvo; um ácido nucleico constituído por uma sequência de nucleotídeos que codifica um RNA tendo DNA como alvo; um RNA ativador; um ácido nucleico constituído por uma sequência de nucleotídeos que codifica um RNA ativador; um RNA direcionador; e é um ácido nucleico constituído por uma sequência de nucleotídeos que codifica um RNA direcionador. Um polipeptídeo modificador direcionado ao sítio; um ácido nucleico constituído por um nucleotídeo que codifica um polipeptídeo modificador direcionado ao sítio; um RNA tendo DNA como alvo; um ácido nucleico constituído por uma sequência de nucleotídeos que codifica um RNA tendo DNA como alvo; um RNA ativador; um ácido nucleico constituído por uma sequência de nucleotídeos que codifica um RNA ativador; um RNA direcionador; e um ácido nucleico constituído por uma sequência de nucleotídeos que codifica um RNA direcionador são descritos em detalhes acima. Um kit pode incluir um complexo que compreende dois ou mais de: um polipeptídeo modificador direcionado ao sítio; um ácido nucleico constituído por um nucleotídeo que codifica um polipeptídeo modificador direcionado ao sítio; um RNA tendo DNA como alvo; um ácido nucleico constituído por uma sequência de nucleotídeos que codifica um RNA tendo DNA como alvo; um RNA ativador; um ácido nucleico constituído por uma sequência de nucleotídeos que codifica um RNA ativador; um RNA direcionador; e um ácido nucleico constituído por uma sequência de nucleotídeos que codifica um RNA direcionador.
[0349] Em algumas modalidades, um kit objeto é composto por um polipeptídeo modificador direcionado ao sítio, ou um polinucleotídeo que codifica o mesmo. Em algumas modalidades, o polipeptídeo modificador direcionado ao sítio compreende: (a) uma porção de ligação ao RNA que interage com o RNA tendo DNA como alvo; e (b) uma porção de atividade que modula a transcrição dentro do DNA alvo, no qual o sítio da transcrição modulada dentro o DNA alvo é determinado pelo RNA tendo DNA como alvo. Em alguns casos, a porção da atividade do polipeptídeo modificador direcionado ao sítio apresenta atividade nuclease reduzida ou inativada. Em alguns casos, o polipeptídeo modificador direcionado ao sítio é um polipeptídeo quimérico modificador direcionado ao sítio.
[0350] Em algumas modalidades, um kit objeto é composto por: um polipeptídeo modificador direcionado ao sítio, ou um polinucleotídeo que codifica o mesmo e um reagente para reconstituir ou diluir o polipeptídeo modificador direcionado ao sítio. Em outras modalidades, um kit objeto é composto por um ácido nucleico (por exemplo, DNA, RNA) composto por um nucleotídeo que codifica um polipeptídeo modificador direcionado ao sítio. Em algumas modalidades, um kit objeto é composto por: um ácido nucleico (por exemplo, DNA, RNA) composto por um nucleotídeo que codifica um polipeptídeo modificador direcionado ao sítio; e um reagente para reconstituir ou diluir o polipeptídeo modificador direcionado ao sítio.
[0351] Um kit objeto é composto por um polipeptídeo modificador direcionado ao sítio, ou um polinucleotídeo que codifica o mesmo, pode ainda incluir um ou mais reagentes adicionais, onde tais reagentes adicionais podem ser selecionados em: um tampão para a introdução do polipeptídeo modificador direcionado ao sítio uma célula; um tampão de lavagem; um reagente de controle; um vetor de expressão de controle ou polinucleotídeo RNA; um reagente para produção in vitro do polipeptídeo modificador direcionado ao sítio do DNAe semelhantes. Em alguns casos, o polipeptídeo modificador direcionado ao sítio, incluído em um kit objeto é um polipeptídeo modificador direcionado ao sítio quimérico, como descrito acima.
[0352] Em algumas modalidades, um kit objeto compreende um RNA tendo DNA como alvo, ou um polinucleotídeo do DNA que codifica o mesmo, o RNA tendo DNA como alvo constituído por: (a) um primeiro segmento, composto por uma sequência de nucleotídeos que é complementar a uma sequência em um DNA alvo; e (b) um segundo segmento que interage com um polipeptídeo modificador direcionado ao sítio. Em algumas modalidades, o RNA tendo DNA como alvo compreende ainda um terceiro segmento (como descrito acima). Em algumas modalidades, um kit objeto é composto por: (i) um RNA tendo DNA como alvo, ou um polinucleotídeo do DNA que codifica o mesmo, o RNA tendo DNA como alvo constituído por: (a) um primeiro segmento, composto por uma sequência de nucleotídeos que é complementar a uma sequência em um DNA alvo; e (b) um segundo segmento que interage com um polipeptídeo modificador direcionado ao sítio; e (ii) um polipeptídeo modificador direcionado ao sítio, ou um polinucleotídeo que codifica o mesmo, o polipeptídeo modificador direcionado ao sítio composto por: (a) uma porção de ligação ao RNA que interage com o RNA tendo DNA como alvo; e (b) uma porção de atividade que apresenta atividade enzimática direcionada ao sítio, em que o sítio da atividade enzimática é determinado pelo RNA tendo DNA como alvo. Em algumas modalidades, a porção da atividade do polipeptídeo modificador direcionado ao sítio não apresenta atividade enzimática (compreende uma nuclease inativada, por exemplo, através de mutação). Em alguns casos, o kit é composto por um RNA tendo DNA como alvo e um polipeptídeo modificador direcionado ao sítio. Em outros casos, o kit é composto por: (i) um ácido nucleico constituído por uma sequência de nucleotídeos que codifica um RNA tendo DNA como alvo; e (ii) um ácido nucleico constituído por uma sequência de nucleotídeos que codifica polipeptídeo modificador direcionado ao sítio.
[0353] Como outro exemplo, um kit objeto pode incluir: (i) um RNA tendo DNA como alvo, ou um polinucleotídeo do DNA que codifica do mesmo, compreendendo: (a) um primeiro segmento, composto por uma sequência de nucleotídeos que é complementar a uma sequência em um DNA alvo; e (b) um segundo segmento que interage com um polipeptídeo modificador direcionado ao sítio; e (ii) o polipeptídeo modificador direcionado ao sítio ou um polinucleotídeo que codifica o mesmo, composto por: (a) uma porção de ligação ao RNA que interage com o RNA tendo DNA como alvo; e (b) uma porção de atividade que modula a transcrição dentro do DNA alvo, no qual o sítio da transcrição modulada dentro o DNA alvo é determinado pelo RNA tendo DNA como alvo. Em alguns casos, o kit é composto por: (i) um RNA tendo DNA como alvo; e um polipeptídeo modificador direcionado ao sítio. Em outros casos, o kit é composto por: (i) um ácido nucleico constituído por uma sequência de nucleotídeos que codifica um RNA tendo DNA como alvo; e (ii) um ácido nucleico constituído por uma sequência de nucleotídeos que codifica polipeptídeo modificador direcionado ao sítio.
[0354] A presente divulgação fornece um kit composto por: (1) um vetor de expressão recombinante composto por (i) uma sequência de nucleotídeos que codifica um RNA tendo DNA como alvo, no qual o RNA tendo DNA como alvo é composto por: (a) um primeiro segmento, composto por uma sequência de nucleotídeos que é complementar a uma sequência em um DNA alvo; e (b) um segundo segmento que interage com um polipeptídeo modificador direcionado ao sítio; e (ii) uma sequência de nucleotídeos que codifica polipeptídeo modificador direcionado ao sítio, no qual o polipeptídeo modificador direcionado ao sítio é composto por: (a) uma porção de ligação ao RNA que interage com o RNA tendo DNA como alvo; e (b) uma porção de atividade que apresenta atividade enzimática direcionada ao sítio, em que o sítio da atividade enzimática é determinado pelo RNA tendo DNA como alvo.; e (2) um reagente para a reconstituição e/ou diluição do vetor de expressão.
[0355] A presente divulgação fornece um kit composto por: (1) um vetor de expressão recombinante constituído por: (i) uma sequência de nucleotídeo que codifica um RNA tendo DNA como alvo, no qual o RNA tendo DNA como alvo é composto por: (a) um primeiro segmento, composto por uma sequência de nucleotídeos que é complementar a uma sequência em um DNA alvo; e (b) um segundo segmento que interage com um polipeptídeo modificador direcionado ao sítio; e (ii) uma sequência de nucleotídeos que codifica polipeptídeo modificador direcionado ao sítio, no qual o polipeptídeo modificador direcionado ao sítio é composto por: (a) uma porção de ligação ao RNA que interage com o RNA tendo DNA como alvo; e (b) uma porção de atividade que modula a transcrição dentro do DNA alvo, no qual o sítio da transcrição modulada dentro o DNA alvo é determinado pelo RNA tendo DNA como alvo; e (2) um reagente para a reconstituição e/ou diluição do vetor de expressão recombinante.
[0356] A presente divulgação fornece um kit composto por: (1) um vetor de expressão recombinante constituído por um ácido nucleico constituído por uma sequência de nucleotídeos que codifica um DNA alvo RNA compreendendo: (i) um primeiro segmento composto por uma sequência de nucleotídeos que é complementar a uma sequência em um DNA alvo; e (ii) um segundo segmento que interage com um polipeptídeo modificador direcionado ao sítio; e (2) um reagente para a reconstituição e/ou diluição do vetor de expressão recombinante. Em algumas modalidades deste kit, o kit é composto por: um vetor de expressão recombinante constituído por uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo modificador direcionado ao sítio, onde o polipeptídeo modificador direcionado ao sítio é composto por: (a) uma porção de ligação ao RNA que interage com o RNA tendo DNA como alvo; e (b) uma porção de atividade que apresenta atividade enzimática direcionada ao sítio, em que o sítio da atividade enzimática é determinado pelo RNA tendo DNA como alvo. Em outras modalidades deste kit, o kit é composto por: um vetor de expressão recombinante constituído por uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo modificador direcionado ao sítio, onde o polipeptídeo modificador direcionado ao sítio é composto por: (a) uma porção de ligação ao RNA que interage com o RNA tendo DNA como alvo; e (b) uma porção de atividade que modula a transcrição dentro do DNA alvo, no qual o sítio da transcrição modulada dentro o DNA alvo é determinado pelo RNA tendo DNA como alvo.
[0357] Em algumas modalidades de qualquer um dos kits acima, o kit é composto por um RNA ativador ou um RNA direcionador. Em algumas modalidades de qualquer um dos kits acima, o kit é composto por um RNA tendo como alvo DNA de molécula única. Em algumas modalidades de qualquer um dos kits acima, o kit é composto por dois ou mais molécula de dupla ou RNAs tendo DNA como alvo de molécula única. Em algumas modalidades de qualquer um dos kits acima, um RNA tendo DNA como alvo (por exemplo, incluindo dois ou mais RNAs tendo DNA como alvo) pode ser fornecido como uma matriz (por exemplo, uma matriz de moléculas de RNA, uma matriz de moléculas de DNA, que codifica os RNAs tendo DNA como alvo, etc.). Tais kits podem ser úteis, por exemplo, para uso em conjunto com células hospedeiras geneticamente modificadas descritas acima que compõem um polipeptídeo modificador direcionado ao sítio objeto. Em algumas modalidades de qualquer um dos kits acima, o kit compreende ainda um polinucleotídeo doador para efetuar a modificação genética desejada. Componentes de um kit objeto podem ser em recipientes separados; ou podem ser combinados em um único recipiente.
[0358] Qualquer um dos kits acima descritos pode ainda incluir um ou mais reagentes adicionais, onde tais reagentes adicionais podem ser selecionados em: um tampão de diluição; uma solução de reconstituição um tampão de lavagem; um reagente de controle; um vetor de expressão de controle ou polinucleotídeo de RNA; um reagente in vitro para produção do polipeptídeo modificador direcionado ao sítio do DNA e semelhantes.
[0359] Além dos componentes acima mencionados, um kit objeto pode ainda incluir instruções para usar os componentes do kit para praticar os métodos objeto. As instruções para a prática de métodos o sujeito geralmente são gravadas em um meio de gravação adequado. Por exemplo, as instruções podem ser impressas sobre um substrato, como papel ou plástico, etc. Como tal, as instruções podem estar presentes nos kits como uma bula, na rotulagem do recipiente do kit ou os seus componentes (isto é, associada à embalagem ou subembalagem) etc. Em outras modalidades, as instruções estão presentes como um arquivo de dados de armazenamento eletrônico presente em um meio de armazenamento legível de computador adequado, por exemplo, CD-ROM, disquete, pendrive, etc. Em ainda outras modalidades, as instruções reais não estão presentes no kit, mas significa obter as instruções de uma fonte remota, por exemplo, através da internet, são fornecidos. Um exemplo desta modalidade é um kit que inclui um endereço web, onde as instruções podem ser visualizadas e/ou das quais as instruções podem ser baixadas. Tal como acontece com as instruções, isto significa que para obter as instruções é gravado em um substrato adequado.
ORGANISMOS GENETICAMENTE MODIFICADOS NÃO HUMANOS
[0360] Em algumas modalidades, uma célula hospedeira geneticamente modificada foi geneticamente modificada com um ácido nucleico exógeno, composto por uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo modificador direcionado ao sítio (por exemplo, um Cas9 natural; um modificado, ou seja, uma mutação ou variante de Cas9; um Cas9 quimérico; etc.). Se dita uma célula é um organismo unicelular eucariota, então a célula modificada pode ser considerada um organismo geneticamente modificado. Em algumas modalidades, organismo geneticamente modificado do sujeito não humano é um organismo multicelular geneticamente modificado de Cas9.
[0361] Em algumas modalidades, uma célula hospedeira geneticamente modificada não humana objeto (por exemplo, uma célula que foi geneticamente modificada com um ácido nucleico exógeno, composto por uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo modificador direcionado ao sítio, por exemplo, um Cas9 natural; um modificado, ou seja, uma mutação ou variante de Cas9; um Cas9 quimérico; etc.) pode gerar um organismo geneticamente modificado não humano objeto (por exemplo, um rato, um peixe, uma rã, uma mosca, um verme, etc.). Por exemplo, se a célula hospedeira geneticamente modificada é uma célula-tronco pluripotente (ou seja, PSC) ou uma célula germinativa (por exemplo, esperma, oócito, etc.), um organismo geneticamente modificado pode ser derivado de célula hospedeira geneticamente modificada. Em algumas modalidades, célula hospedeira geneticamente modificada é uma célula-tronco pluripotente (por exemplo, ESC, iPSC, células-tronco pluripotentes de planta, etc.) ou uma célula germinativa (por exemplo, célula de esperma, oócito, etc.), in vivo ou in vitro, que pode dar origem a um organismo geneticamente modificado. Em algumas modalidades célula hospedeira geneticamente modificada é uma PSC de vertebrado (por exemplo, ESC, iPSC, etc.) e é usada para gerar um organismo geneticamente modificado (por exemplo, por injeção de uma PSC em um blastocisto para produzir um animal quimérico/mosaico, que então poderia ser combinado para gerar organismos geneticamente modificados não quiméricos/não mosaico; enxertando no caso das plantas; etc.). Qualquer método/protocolo conveniente para a produção de um organism geneticamente modificado, incluindo os métodos descritos aqui, é apropriado para produzir uma célula hospedeira geneticamente modificada, composta por um ácido nucleico exógeno, composto por uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo modificador direcionado ao sítio (por exemplo, um Cas9 natural; um modificado, ou seja, uma mutação ou variante de Cas9; um Cas9 quimérico; etc.). Métodos para produzir organismos geneticamente modificados são conhecidos na técnica. Por exemplo, ver Cho et al., Curr Protoc Cell Biol. 2009 Mar;Chapter 19:Unit 19.11: Generation of transgenic mice; Gama et al., Brain Struct Funct. 2010 Mar;214(2-3):91-109. Epub 2009 Nov 25: Animal transgenesis: uma visão geral; Husaini et al., GM Crops. 2011 Jun- Dec;2(3):150-62. Epub 2011 Jun 1: Approaches for gene targeting and targeted gene expression in plants.
[0362] Em algumas modalidades, um organism geneticamente modificado é composto por uma célula alvo para os métodos da invenção e assim pode ser considerado uma fonte de células alvo. Por exemplo, se uma célula geneticamente modificada, composta por um ácido nucleico exógeno, composto por uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo modificador direcionado ao sítio (por exemplo, um Cas9 natural; um modificado, ou seja, uma mutação ou variante de Cas9; um Cas9 quimérico; etc.) é usado para gerar um organismo geneticamente modificado, em seguida, as células do organismo geneticamente modificado compreendem o ácido nucleico exógeno, composto por uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo modificador direcionado ao sítio (por exemplo, um Cas9 de ocorrência natural; um modificado, isto é, uma mutação ou variante de Cas9; um Cas9 quimérico; etc.). Em algumas dessas modalidades, o DNA de uma célula ou células de um organismo geneticamente modificado pode ser direcionado para a modificação introduzindo na célula ou células um RNA tendo DNA como alvo (ou um DNA que codifica um RNA tendo DNA como alvo) e, opcionalmente, um doador do ácido nucleico. Por exemplo, a introdução de um RNA tendo DNA como alvo (ou um DNA que codifica um RNA tendo DNA como alvo) em um subconjunto de células (por exemplo, células cerebrais, células intestinais, células de rim, células pulmonares, as células do sangue, etc.) do organismo geneticamente modificado pode ter como alvo o DNA de tais células para modificação, cuja localização genômica dependerá da tendo DNA como alvo do RNA tendo DNA como alvo introduzido.
[0363] Em algumas modalidades, um organismo geneticamente modificado é uma fonte de células alvo para os métodos da invenção. Por exemplo, um organismo geneticamente modificado, que compreende as células que são geneticamente modificadas com um ácido nucleico exógeno, composto por uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo modificador direcionado ao sítio (por exemplo, um Cas9 natural; um modificado, ou seja, uma mutação ou variante de Cas9; um Cas9 quimérico; etc.) pode fornecer uma fonte de células geneticamente modificadas, por exemplo, PSCs (por exemplo, ESCs, iPSCs, espermatozoides, oócitos, etc.), os neurônios, as células progenitoras, cardiomiócitos, etc.
[0364] Em algumas modalidades, uma célula geneticamente modificada é uma PSC constituída por um ácido nucleico exógeno, composto por uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo modificador direcionado ao sítio (por exemplo, um Cas9 natural; um modificado, ou seja, uma mutação ou variante de Cas9; um Cas9 quimérico; etc.). Como tal, o PSC pode ser uma célula alvo, tal que o DNA do PSC pode ser direcionado para a modificação introduzindo ao PSC um RNA tendo DNA como alvo (ou um DNA que codifica um RNA tendo DNA como alvo) e, opcionalmente, um ácido nucleico doador e a localização genômica da modificação dependerá da sequência tendo DNA como alvo do RNA tendo DNA como alvo introduzido. Assim, em algumas modalidades, os métodos descritos aqui podem ser usados para modificar o DNA (por exemplo, excluir e/ou substituir qualquer sítio desejado genômico) de PSCs derivadas de um organismo geneticamente modificado. Ditas PSCs modificadas podem então ser usadas para gerar organismos tendo ambos (i) um exógeno ácido nucleico constituído por uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo modificador direcionado ao sítio (por exemplo, um Cas9 natural; um modificado, ou seja, uma mutação ou variante de Cas9; um Cas9 quimérico; etc.) e (ii) uma alteração de DNA que foi introduzida na PSC.
[0365] Um ácido nucleico exógeno, composto por uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo modificador direcionado ao sítio (por exemplo, um Cas9 natural; um modificado, ou seja, uma mutação ou variante de Cas9; um Cas9 quimérico; etc.) pode estar sob o controle de (ou seja, operacionalmente ligada a) um promotor desconhecido (por exemplo, quando o ácido nucleico aleatoriamente integra em um genoma celular do hospedeiro) ou pode estar sob o controle de (ou seja,operacionalmente ligado a) um promotor conhecido. Promotores conhecidos apropriados podem ser qualquer promotor conhecido e incluem promotores constitutivamente ativos (por exemplo, promotor CMV) promotores induzíveis (por exemplo, promotor de choque do calor, promotor regulado por tetraciclina, promotor regulado por esteroide, promotor regulado por metal, promotor regulado por receptor de estrogênio, etc.), promotores espacialmente restritos e/ou temporalmente restritos (por exemplo, um promotor específico de tecido, um promotor específico de tipo de célula, etc.), etc.
[0366] Um organismo geneticamente modificado objeto (por exemplo, um organismo cujas células compõem uma sequência nucleotídica que codifica um polipeptídeo modificador direcionado ao sítio, por exemplo, um Cas9 natural; um modificado, ou seja, uma mutação ou variante de Cas9; um Cas9 quimérico; etc.) pode ser qualquer organismo, incluindo, por exemplo, uma planta; algas; um invertebrado (por exemplo, cnidários, um equinodermo, um verme, umamosca, etc.), um vertebrado (por exemplo, um peixe (por exemplo,peixe-zebra, peixe-balão, peixe dourado, etc.), um anfíbio (por exemplo, salamandra, sapo, etc.), um réptil, um pássaro, um mamífero, etc.); um ungulado (por exemplo, um bode, um porco, uma ovelha, uma vaca, etc.); um roedor (por exemplo, um camundongo, um rato, um hamster, uma cobaia); um lagomorfo (por exemplo, um coelho); etc.
[0367] Em alguns casos, o polipeptídeo modificador direcionado ao sítio é composto por uma sequência de aminoácidos, tendo pelo menos cerca de 75%, pelo menos, cerca de 80%, pelo menos, cerca de 85%, pelo menos sobre 90%, pelo menos, cerca de 95%, pelo menos cerca de 99% ou 100% de identidade de sequência de aminoácidos de aminoácidos 7-166 ou 731-1003 da sequência de aminoácidos Cas9/Csn1 retratada na Figura 3, ou para as porções correspondentes em qualquer uma das sequências de aminoácidos estabelecidas como SEQ: ID NOs: 1-256 e 795-1346.
Animais transgênicos não humanos
[0368] Como descrito acima, em algumas modalidades, um ácido nucleico objeto (por exemplo, uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo modificador direcionado ao sítio, por exemplo, um Cas9 de ocorrência natural; um modificado, ou seja, uma mutação ou variante de Cas9; um Cas9 quimérico; etc.) ou um vetor de expressão recombinante objeto é usado como um transgene para gerar um animal transgênico que produz um polipeptídeo modificador direcionado ao sítio. Assim, a presente invenção mais fornece um animal não humano transgênico, cujo animal é composto por um transgene que compreende um ácido nucleico objeto constituído por uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo modificador direcionado ao sítio, por exemplo, um Cas9 de ocorrência natural; um modificado, isto é, uma mutação ou variante de Cas9; um Cas9 quimérico; etc., conforme descrito acima. Em algumas modalidades, o genoma do animal não humano transgênico compreende uma sequência de nucleotídeos objeto que codifica um polipeptídeo modificador direcionado ao sítio. Em algumas modalidades, o animal não humano geneticamente modificado é homozigoto para a modificação genética. Em algumas modalidades, o animal não humano geneticamente modificado é heterozigoto para a modificação genética. Em algumas modalidades, o animal não humano geneticamente modificado é um vertebrado, por exemplo, um peixe (por exemplo, peixe-zebra, peixe dourado, peixe- balão, peixes de cavernas, etc.), um anfíbio (sapo, salamandra, etc.), um pássaro (por exemplo, frango, Peru, etc.), um réptil (por exemplo, cobra, lagarto, etc.), um mamífero (por exemplo, um ungulado, por exemplo, um porco, uma vaca, uma cabra, uma ovelha, etc.; um lagomorfo (por exemplo, um coelho); um roedor (por exemplo, um rato, um camundongo); um primata não humano; etc., etc.
[0369] Um ácido nucleico exógeno, composto por uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo modificador direcionado ao sítio (por exemplo, um Cas9 natural; um modificado, ou seja, uma mutação ou variante de Cas9; um Cas9 quimérico; etc.) pode estar sob o controle de (ou seja, operacionalmente ligada a) um promotor desconhecido (por exemplo, quando o ácido nucleico aleatoriamente integra em um genoma celular do hospedeiro) ou pode estar sob o controle de (ou seja,operacionalmente ligado a) um promotor conhecido. Promotores conhecidos apropriados podem ser qualquer promotor conhecido e incluem promotores constitutivamente ativos (por exemplo, promotor CMV) promotores induzíveis (por exemplo, promotor de choque do calor, promotor regulado por tetraciclina, promotor regulado por esteroide, promotor regulado por metal, promotor regulado por receptor de estrogênio, etc.), promotores espacialmente restritos e/ou temporalmente restritos (por exemplo, um promotor específico de tecido, um promotor específico de tipo de célula, etc.), etc.
[0370] Em alguns casos, o polipeptídeo modificador direcionado ao sítio é composto por uma sequência de aminoácidos, tendo pelo menos cerca de 75%, pelo menos, cerca de 80%, pelo menos, cerca de 85%, pelo menos sobre 90%, pelo menos, cerca de 95%, pelo menos cerca de 99% ou 100% de identidade de sequência de aminoácidos de aminoácidos 7-166 ou 731-1003 da sequência de aminoácidos Cas9/Csn1 retratada na Figura 3, ou para as porções correspondentes em qualquer uma das sequências de aminoácidos estabelecidas como SEQ: ID NOs: 1-256 e 795-1346.
Plantas transgênicas
[0371] Como descrito acima, em algumas modalidades, um ácido nucleico objeto (por exemplo, uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo modificador direcionado ao sítio, por exemplo, um Cas9 de ocorrência natural; um modificado, ou seja, uma mutação ou variante de Cas9; um Cas9 quimérico; etc.) ou um vetor de expressão recombinante objeto é usado como um transgene para gerar uma planta transgênica que produz um polipeptídeo modificador direcionado ao sítio. Assim, a presente invenção ainda fornece uma planta transgênica, cuja planta é composta por um transgene que compreende um ácido nucleico objeto constituído por uma sequência de nucleotídeos que codifica direcionado ao sítio polipeptídeo modificador, por exemplo, um Cas9 de ocorrência natural; um modificado, isto é, uma mutação ou variante de Cas9; um Cas9 quimérico; etc., conforme descrito acima. Em algumas modalidades, o genoma da planta transgênica é composto por um ácido nucleico objeto. Em algumas modalidades, a planta transgênica é homozigota para a modificação genética. Em algumas modalidades, a planta transgênica é heterozigota para a modificação genética.
[0372] Métodos de introdução exógena de ácidos nucleicos em células da planta são bem conhecidos na técnica. Tais células vegetais são consideradas “transformadas”, como definido acima. Métodos adequados incluem infecção viral (como vírus de DNA fita dupla), transfecção, conjugação, fusão de protoplastos, eletroporação, tecnologia pistola de partículas, precipitação de fosfato de cálcio, microinjeção direta, tecnologia de whiskers de carboneto de silício, transformação mediada por Agrobacterium-e semelhantes. A escolha do método é geralmente dependente do tipo de célula a ser transformada e as circunstâncias sob as quais a transformação está ocorrendo (ou seja, in vitro, ex vivo, ou in vivo).
[0373] Métodos de transformação baseados na bactéria de solo Agrobacterium tumefaciens são particularmente úteis para introduzir uma molécula do ácido nucleico exógeno em uma planta vascular. A forma de tipo selvagem de Agrobacterium contém um plasmídeo Ti (indução de tumor) que direciona a produção de crescimento de bugalho tumorigênico em plantas hospedeiras. Transferência de região de T-DNA de indução de tumor do plasmídeo Ti a um genoma vegetal requer genes de virulência codificados por plasmídeo Ti, bem como as bordas do T-DNA, que são um conjunto de repetições de DNA diretos que delineiam a região a ser transferida. Um vetor baseado em Agrobacterium é uma forma modificada de um plasmídeo Ti, em que as funções de indução de tumor são substituídas pela sequência de ácido nucleico de interesse a ser introduzida na planta hospedeira.
[0374] Transformação mediada por Agrobacterium geralmente emprega vetores cointegrados ou sistemas de vetor binário, em que os componentes do plasmídeo Ti são divididos entre um vetor auxiliar, que reside permanentemente no hospedeiro Agrobacterium e carrega os genes de virulência, e um vetor de transporte, que contém o gene de interesse delimitado pelas sequências do T-DNA. Uma variedade de vetores binários é bem conhecida na técnica e está disponível comercialmente, por exemplo, de Clontech (Palo Alto, Calif.). Métodos de cocultura de Agrobacterium com células de plantas cultivadas ou tecidos feridos como tecido foliar, explantes de raiz, hipocotiledonos, pedaços de tronco ou tubérculos, por exemplo, também são conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Glick and Thompson, (eds.), Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Boca Raton, Fla.: CRC Press (1993).
[0375] Transformação mediada por microprojétil também pode ser usada para produzir uma planta transgênica objeto. Este método, primeiramente descrito por Klein et al. (Nature 327:70-73 (1987)), baseia-se em microprojéteis como ouro ou tungstênio que são revestidos com a molécula do ácido nucleico desejada por precipitação com cloreto de cálcio, espermidina ou polietileno glicol. As partículas de microprojétil são aceleradas em alta velocidade em um tecido angiosperma usando um dispositivo, como o BIOLISTIC PD-1000 (Biorad; Hercules Calif.).
[0376] Um ácido nucleico objeto pode ser introduzido em uma planta de uma forma tal que o ácido nucleico é capaz de entrar em uma célula vegetal, por exemplo, através de um protocolo an in vivo ou ex vivo. Por "in vivo,” entende-se no ácido nucleico é administrado a um corpo vivo de uma planta, por exemplo, infiltração. Por “ex vivo” entende-se que as células ou explantes são modificados fora da planta, e então tais células ou órgãos são regenerados a uma planta. Um número de vetores apropriados para transformação estável de células vegetais ou a criação de plantas transgênicas foi descrito, incluindo os descritos em Weissbach and Weissbach, (1989) Methods for Plant Molecular Biology Academic Press, and Gelvin et al., (1990) Plant Molecular Biology Manual, Kluwer Academic Publishers. Exemplos específicos incluem aqueles derivados de um plasmídeo Ti da Agrobacterium tumefaciens, bem como aqueles divulgados por Herrera-Estrella et al. (1983) Nature 303: 209, Bevan (1984) Nucl Acid Res. 12: 8711-8721, Klee (1985) Bio/Technolo 3: 637-642. Alternativamente, vetores não Ti podem ser usados para transferir o DNA em plantas e células, usando técnicas de liberação de livres de DNA. Usando estes métodos de plantas transgênicas como trigo, arroz (Christou (1991) Bio/Technology 9:957-9 and 4462) e milho (Gordon-Kamm (1990) Plant Cell 2: 603-618) podem ser produzidos. Um embrião imaturo também pode ser um tecido bom alvo para monocotiledôneas para técnicas de liberação de DNA diretas usando a arma de partículas (Weeks et al. (1993) Plant Physiol 102: 1077-1084; Vasil (1993) Bio/Technolo 10: 667-674; Wan and Lemeaux (1994) Plant Physiol 104: 37-48 e e para a transferência de DNA mediada por Agrobacterium (Ishida et al. (1996) Nature Biotech 14: 745-750). Métodos exemplares para introdução de DNA em cloroplastos são bombardeamento de biobalística, transformação de polietileno glicol do protoplastos e microinjeção (Danieli et al Nat. Biotechnol 16:345-348, 1998; Staub et al Nat. Biotechnol 18: 333-338, 2000; O’Neill et al Plant J. 3:729-738, 1993; Knoblauch et al Nat. Biotechnol 17: 906-909; Patentes US 5.451.513, 5.545.817, 5.545.818 e 5.576.198; no Pedido internacional No. WO 95/16783; e em Boynton et al., Methods in Enzymology 217: 510-536 (1993), Svab et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 913-917 (1993), e McBride et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91: 7301-7305 (1994)). Qualquer vetor apropriado para os métodos de bombardeamento de biobalística, transformação de polietileno glicol do protoplastos e microinjeção apropriado como um vetor de direcionamento para transformação de cloroplastos. Qualquer vetor de DNA fita dupla pode ser usado como um vetor de transformação, especialmente quando o método de introdução não utiliza Agrobacterium.
[0377] Plantas que podem ser geneticamente modificadas incluem grãos, culturas forrageiras, frutos, legumes, oleaginosas, palmas, florestal e videiras. Exemplos específicos de plantas que podem ser modificados são: milho, banana, amendoim, ervilhas do campo, girassol, tomate, canola, tabaco, trigo, cevada, aveia, batata, soja, algodão, cravos, sorgo, lupin e arroz.
[0378] Também fornecido pela invenção objeto são células vegetais transformadas, tecidos, plantas e produtos que contêm as células vegetais transformadas. Uma característica dos tecidos e células transformados objetos e produtos que incluem o mesmo é a presença de um ácido nucleico objeto integrada no genoma e produção por células vegetais de um polipeptídeo modificador direcionado ao sítio, por exemplo, um Cas9 de ocorrência natural; um modificado, isto é, uma mutação ou variante de Cas9; um Cas9 quimérico; etc. Células vegetais recombinantes da presente invenção são úteis como as populações de células recombinantes, ou como tecido, semente, toda a planta, caule, fruto, folha, raiz, flor, tronco, tubérculo, grão, ração animal, um campo de plantas e semelhantes.
[0379] Um ácido nucleico constituído por uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo modificador direcionado ao sítio (por exemplo, um Cas9 de ocorrência natural; um modificado, ou seja, uma mutação ou variante de Cas9; um Cas9 quimérico; etc.) pode estar sob o controle de (ou seja, operacionalmente ligada a) um promotor desconhecido (por exemplo, quando o ácido nucleico aleatoriamente integra em um genoma celular do hospedeiro) ou pode estar sob o controle de (ou seja,operacionalmente ligado a) um promotor conhecido. Promotores conhecidos adequados podem ser qualquer promotor conhecido e incluem promotores constitutivamente ativos, promotores induzíveis, promotores espacialmente restritos e/ou temporalmente restritos, etc.
[0380] Em alguns casos, o polipeptídeo modificador direcionado ao sítio é composto por uma sequência de aminoácidos, tendo pelo menos cerca de 75%, pelo menos, cerca de 80%, pelo menos, cerca de 85%, pelo menos sobre 90%, pelo menos, cerca de 95%, pelo menos cerca de 99% ou 100% de identidade de sequência de aminoácidos de aminoácidos 7-166 ou 731-1003 da sequência de aminoácidos Cas9/Csn1 retratada na Figura 3, ou para as porções correspondentes em qualquer uma das sequências de aminoácidos estabelecidas como SEQ: ID NOs: 1-256 e 795-1346.
[0381] Também fornecido pela invenção objeto são os materiais de reprodução de uma planta transgênica objeto, onde os materiais de reprodução incluem sementes, plantas de progênie e material clonal.
DEFINIÇÕES — PARTE II
[0382] O termo “de ocorrência natural” ou “não modificado” como usado aqui como aplicado a um ácido nucleico, um polipeptídeo, uma célula ou um organismo, refere-se a um ácido nucleico, polipeptídeo, célula ou organismo que é encontrado na natureza. Por exemplo, uma sequência de polipeptídeo ou polinucleotídeo que está presente em um organismo (incluindo vírus) que pode ser isolada de uma fonte na natureza e que não foi intencionalmente modificada por um humano no laboratório é natural.
[0383] “Heterólogo”, como usado aqui, significa uma sequência de nucleotídeo ou polipeptídeo que não se encontra no ácido nucleico ou proteína nativos, respectivamente. Por exemplo, em um polipeptídeo direcionado ao sítio de Cas9 variante de fusão, um polipeptídeo direcionado ao sítio de Cas9 variante pode ser fundido a um polipeptídeo heterólogo (ou seja, um polipeptídeo diferente de Cas9). O polipeptídeo heterólogo pode apresentar uma atividade (por exemplo, atividade enzimática) que também será exibido pelo polipeptídeo direcionado ao sítio de Cas9 variante de fusão. Uma sequência do ácido nucleico heterólogo pode estar ligada a um polipeptídeo direcionado ao sítio Cas9 variante (por exemplo, por engenharia genética) para gerar uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo direcionado ao sítio Cas9 variante de fusão.
[0384] O termo “polipeptídeo quimérico” refere- se a um polipeptídeo que não é de ocorrência natural, por exemplo, é feita pela combinação artificial de dois outros segmentos separados de sequência de aminoácidos por meio de intervenção humana. Assim, um polipeptídeo quimérico é também o resultado da intervenção humana. Assim, um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácido quimérico é um polipeptídeo quimérico.
[0385] Por “polipeptídeo direcionado ao sítio” ou “polipeptídeo direcionado ao sítio de ligação ao RNA” ou “polipeptídeo direcionado ao sítio de ligação ao RNA” entende-se um polipeptídeo que liga o RNA e destina-se a uma sequência específica de DNA. Um polipeptídeo direcionado ao sítio conforme descrito aqui é direcionado para uma sequência específica de DNA pela molécula do RNA para o qual ele está ligado. A molécula de RNA é composta por uma sequência que é complementar a uma sequência alvo dentro do DNA alvo, direcionando, assim, o polipeptídeo acoplado a um local específico dentro do DNA alvo (a sequência alvo).
[0386] Em algumas modalidades, um ácido nucleico objeto (por exemplo, um RNA tendo DNA como alvo, um ácido nucleico constituído por uma sequência de nucleotídeos de codificação de um RNA tendo DNA como alvo; um ácido nucleico de codificação de um polipeptídeo direcionado ao sítio; etc.) compreende uma modificação ou sequência que fornece para uma característica desejável adicional (por exemplo, estabilidade modificada ou regulada; direcionamento subcelular; rastreamento, por exemplo, um marcador fluorescente, um sítio de ligação para uma proteína ou complexa de proteína; etc.). Exemplos não limitantes incluem: um cap 5' (por exemplo, um 7-metilguanilato cap (m7G)); uma cauda de poliadenilada 3' (ou seja, uma 3' cauda poli (A)); uma sequência de riboswitch (por exemplo, para permitir a estabilidade regulada e/ou acessibilidade regulada por proteínas e/ou complexos de proteína); uma modificação ou sequência que tem como alvo o RNA para uma localização subcelular (por exemplo, núcleo, mitocôndria, cloroplastos e semelhantes); uma modificação ou sequência que prevê rastreamento (por exemplo, conjugação direta de uma molécula fluorescente, conjugação de uma fração que facilita a detecção fluorescente, uma sequência que permite a detecção fluorescente, etc.); uma modificação ou sequência que fornece um sítio de ligação para proteínas (por exemplo, as proteínas que atuam sobre o DNA, incluindo ativadores transcricionais, repressores transcricionais, DNA metiltransferases, DNA demetilases, histone acetiltransferases, histona deacetilases e semelhantes); e suas combinações.
[0387] Em algumas modalidades, um RNA tendo DNA como alvo compreende um segmento adicional na extremidade 5' ou 3' que fornece para qualquer das características descritas acima. Por exemplo, um terceiro segmento apropriado pode incluir um cap 5' (por exemplo, um 7-metilguanilato cap (m7G)); uma cauda de poliadenilada 3' (ou seja, uma 3' cauda poli (a)); uma sequência de riboswitch (por exemplo permitir a estabilidade regulada e/ou acessibilidade regulada por proteínas e complexos de proteína); uma sequência que tem como alvo o RNA para uma localização subcelular (por exemplo, núcleo, mitocôndrias, cloroplastos e semelhantes); uma modificação ou sequência que prevê rastreamento (por exemplo,conjugação direta de uma molécula fluorescente, conjugação de uma fração que facilita detecção fluorescente, uma sequência que permite a detecção fluorescente, etc.); uma modificação ou sequência que fornece um sítio de ligação para proteínas (por exemplo, as proteínas que atuam sobre o DNA, incluindo ativadores transcricionais, repressores transcricionais, DNA metiltransferases, DNA demetilases, histone acetiltransferases, histona deacetilases e semelhantes); e suas combinações.
[0388] O RNA tendo DNA como alvo objeto e um polipeptídeo direcionado ao sítio objeto formam um complexo (ou seja, se liga via interações não covalentes). O RNA tendo DNA como alvo fornece especificidade alvo para o complexo, composto por uma sequência de nucleotídeos que é complementar a uma sequência de DNA alvo. O polipeptídeo direcionado ao sítio do complexo fornece a atividade específica do sítio. Em outras palavras, o polipeptídeo direcionado ao sítio é guiado para uma sequência de DNA alvo (por exemplo, uma sequência alvo em um ácido nucleico cromossômico; uma sequência alvo em um ácido nucleico extracromossômico, por exemplo, um ácido nucleico epissomal, minicírculo, etc.; uma sequência alvo em ácido nucleico mitocondrial; uma sequência alvo dos ácidos nucleicos cloroplasto; uma sequência do alvo em um plasmídeo; etc.) em virtude de sua associação com o segmento de ligação à proteína do RNA tendo DNA como alvo.
[0389] Em algumas modalidades, um RNA tendo DNA como alvo objeto é composto por duas moléculas de RNA separadas (polinucleotídeo de RNA) e é referido aqui como um “RNA tendo DNA de molécula dupla como alvo” ou um “RNA tendo DNA de duas moléculas como alvo.” Em outras modalidades, um RNA tendo DNA como alvo objeto é uma única molécula de RNA (polinucleotídeo único de RNA) e é referida como um “RNA tendo DNA uma molécula como alvo.” Se não especificado de outra forma, o termo “RNA tendo DNA como alvo” é inclusivo, referindo-se a ambos os RNAs tendo DNA de molécula única como alvo e RNA tendo DNA de molécula dupla como alvo.
[0390] Um RNA tendo DNA de duas moléculas como alvo objeto é composto por duas moléculas de RNA separadas (um “RNA direcionador” e um “RNA ativador”). Cada uma das duas moléculas de RNA de um sujeito RNA tendo DNA duas moléculas como alvo compreende um trecho de nucleotídeos que é complementar a outro, de tal modo que os nucleotídeos complementares de duas moléculas de RNA hibridizam para formar o RNA duplex de fita dupla do segmento de ligação à proteína.
[0391] Um RNA tendo DNA de molécula única como alvo objeto é composto por dois trechos de nucleotídeos (um RNA direcionador e um RNA ativador) que complementam um ao outro, estão covalentemente ligados por nucleotídeos intermediários (“ligantes” ou “nucleotídeos ligantes”) e hibridizam para formar RNA duplex de fita dupla (dsRNA duplex) do segmento de ligação à proteína, resultando assim em uma estrutura de haste-alça. O RNA direcionador e RNA ativador podem ser covalentemente ligados através de extremidade 3' do RNA direcionador e a extremidade 5' do RNA ativador. Alternativamente, RNA direcionador e RNA ativador podem ser covalentemente ligados através da extremidade 5' do RNA direcionador e extremidade 3' do RNA ativador.
[0392] Um exemplar do RNA tendo DNA de duas moléculas como alvo é composto por uma molécula tipo crRNA (“CRISPR RNA” ou “RNA direcionador” ou “crRNA” ou “crRNA de repetição”) e uma correspondente molécula tipo tracrRNA (“trans-atuação CRISPR RNA” ou “RNA ativador” ou “tracrRNA”). Uma molécula tipo crRNA (RNA direcionador) compreende ambos segmentos de direcionamento ao DNA (fita simples) do RNA tendo DNA como alvo e um trecho (“segmento formando duplex”) de nucleotídeos que forma metade de dsRNA duplex do segmento ligação à proteína do RNA tendo DNA como alvo. Uma molécula tipo tracrRNA correspondente (RNA ativador) compreende um trecho de nucleotídeos (segmento formando duplex) que forma a outra metade do duplex dsRNA do segmento de ligação à proteína do RNA tendo DNA como alvo. Em outras palavras, um trecho de nucleotídeos de uma molécula tipo crRNA é complementar a e hibridiza com um trecho de nucleotídeos de uma molécula tipo tracrRNA para formar o dsRNA duplex do domínio da ligação à proteína do RNA tendo DNA como alvo. Como tal, cada molécula tipo crRNA pode ser dito como tendo uma molécula tipo tracrRNA correspondente. A molécula de tipo crRNA, além disso, fornece o segmento direcionado ao DNA de fita dupla. Assim, uma molécula tipo crRNA e tipo tracrRNA (como um par correspondente) hibridizam para formar um RNA tendo DNA como alvo. A sequência exata de uma determinada molécula de crRNA ou tracrRNA é característica da espécie em que as moléculas de RNA são encontradas.
[0393] O termo “RNA ativator” é usado aqui para significar uma molécula tipo tracrRNA de um RNA tendo DNA de molécula dupla como alvo. O termo “RNA direcionador” é usado aqui para significar uma molécula tipo crRNA de um RNA tendo DNA de molécula dupla como alvo. O termo “segmento formador de duplex” é usado aqui para significar o trecho de nucleotídeos de um RNA ativador ou um RNA direcionador que contribui para a formação da duplex do dsRNA por hibridização para um trecho de nucleotídeos de um RNA ativador correspondente ou a molécula de RNA direcionador. Em outras palavras, um RNA ativador compreende um segmento formador de duplex complementar ao segmento formador de duplex do RNA direcionador correspondente. Como tal, um RNA ativador compreende um segmento formador de duplex enquanto um RNA direcionador compreende ambos um segmento formador de duplex e o segmento direcionado ao DNA do RNA tendo DNA como alvo. Portanto, um RNA tendo DNA de molécula dupla como alvo objeto pode ser composto de qualquer correspondente par RNA ativador e RNA direcionador.
[0394] Um RNA tendo DNA de duas moléculas como alvo pode ser projetado para permitir ligação controlada (ou seja, condicional) de um RNA direcionador com um RNA ativador. Porque um RNA tendo DNA de duas moléculas como alvo não é funcional, a menos que RNA ativador e o RNA direcionador estejam ligados em um complexo funcional com dCas9, um RNA tendo DNA de duas moléculas como alvo pode ser induzível (por exemplo, droga induzível) tornando a ligação entre o RNA ativador e RNA direcionador para ser induzível. Como um exemplo de não limitação, aptâmeros de RNA podem ser usados para regular (ou seja, controlar) a ligação do RNA ativador com o RNA direcionador. Nesse sentido, o RNA ativador e/ou o RNA direcionador pode incluir uma sequência de aptâmero de RNA.
[0395] Aptâmeros de RNA são conhecidos na técnica e são geralmente uma versão sintética de um riboswitch. Os termos “aptâmero de RNA” e “riboswitch” são usados de modo intercambiável aqui para abranger ambas as sequências de ácido nucleico sintéticas e naturais que fornecem regulação induzível da estrutura (e, portanto, a disponibilidade de sequências específicas) da molécula de RNA da qual fazem parte. Aptâmeros de RNA compreendem geralmente uma sequência que se dobra em uma estrutura particular (por exemplo, um hairpin), que se liga especificamente a uma droga em particular (por exemplo, uma pequena molécula). Ligação da droga provoca uma mudança estrutural na dobra do RNA, que muda uma característica do ácido nucleico do qual o aptâmero é uma parte. Como exemplos não limitantes: (i) um RNA ativador com um aptâmero pode não ser capaz de ligar o cognato RNA direcionador a menos que o aptâmero esteja ligado pela droga apropriada; (ii) um RNA direcionador com um aptâmero não pode ser capaz de ligar para o cognato de RNA ativador a menos que o aptâmero esteja ligado pela droga apropriada; e (iii) um RNA direcionador e um RNA ativador, cada um contendo um aptâmero diferente que liga uma droga diferente, não podem ser capazes de ligar uns aos outros a menos que ambas as drogas estejam presentes. Conforme ilustrado por esses exemplos, um RNA tendo DNA de duas moléculas como alvo pode ser projetado para ser induzível.
[0396] Exemplos de aptâmeros e riboswitches podem ser encontrados, por exemplo, em: Nakamura et al., Genes Cells. 2012 May;17(5):344-64; Vavalle et al., Future Cardiol. 2012 May;8(3):371-82; Citartan et al., Biosens Bioelectron. 2012 Apr 15;34(1):1-11; e Liberman et al., Wiley Interdiscip Rev RNA. 2012 May-Jun;3(3):369-84; todos os quais são incorporados aqui por referência, na sua totalidade.
[0397] Exemplos não limitantes de sequências de nucleotídeos que podem ser incluídas em um RNA tendo DNA de duas moléculas como alvo incluem RNAs direcionador (por exemplo, SEQ ID NO: 566-567) que pode parear com o segmento formando duplex de qualquer um do RNAs ativadores estabelecidos em SEQ ID NO: 671-678.
[0398] Um exemplar RNA tendo DNA de molécula única como alvo é composto por dois trechos complementares de nucleotídeos que hibridizam para formar um dsRNA duplex. Em algumas modalidades, um dos dois trechos complementares de nucleotídeos do RNA tendo DNA de molécula única como alvo (ou o DNA que codifica o trecho) é pelo menos cerca de 60% idêntico a uma das sequências de RNA ativador (tracrRNA) estabelecida em SEQ ID NO: 431-562 ao longo de um trecho de pelo menos 8 nucleotídeos contíguos. Por exemplo, um dos dois trechos complementares de nucleotídeos do RNA tendo DNA de molécula única como alvo (ou o DNA que codifica o trecho) é pelo menos 65% idêntico, pelo menos cerca de 70% idêntico, pelo menos 75% idêntico, pelo menos 80% idêntico, pelo menos cerca de 85% idêntico, pelo menos cerca de 90% idêntico, pelo menos cerca de 95% idêntico, pelo menos cerca de 98% idêntico, pelo menos cerca de 99% idêntico ou 100% idêntico a uma das sequências tracrRNA estabelecidas na SEQ ID NO: 431-562 sobre um trecho de pelo menos 8 nucleotídeos contíguos.
[0399] Em algumas modalidades, um dos dois trechos complementares de nucleotídeos do RNA tendo DNA de molécula única como alvo (ou o DNA que codifica o trecho) é pelo menos cerca de 60% idêntico a uma das sequências de RNA direcionador (crRNA) estabelecidas nas SEQ ID NOs: 563-679 ao longo de um trecho de pelo menos 8 nucleotídeos contíguos. Por exemplo, um dos dois trechos complementares de nucleotídeos do RNA tendo DNA de molécula única como alvo (ou o DNA que codifica o trecho) é pelo menos 65% idêntico, pelo menos cerca de 70% idêntico, pelo menos 75% idêntico, pelo menos 80% idêntico, pelo menos cerca de 85% idêntico, pelo menos cerca de 90% idêntico, pelo menos cerca de 95% idêntico, pelo menos cerca de 98% idêntico, pelo menos cerca de 99% idêntico ou 100% idêntico a uma das sequências de crRNA sequências estabelecidas na SEQ ID NOs: 563-679 ao longo de um trecho de pelo menos 8 nucleotídeos contíguos.
[0400] Como acima, uma “célula hospedeira”, como usado aqui, denota uma célula eucariótica in vivo ou in vitro, uma célula procariótica (por exemplo, a célula bacteriana ou Archaea) ou uma célula de um organismo multicelular (por exemplo, uma linhagem celular) cultivada como uma entidade unicelular, cujas células procarióticas ou eucariotas podem ser, ou foram, usadas como destinatárias para ácidos nucleicos e incluem a descendência da célula original, que foi transformada pelo ácido nucleico. Entende- se que a descendência de uma única célula pode não ser necessariamente completamente idêntica em morfologia ou em complemento de DNA genômico ou total como o parental original, devido à mutação natural, acidental ou deliberada. Uma “célula hospedeira recombinante” (também referida como uma “célula hospedeira geneticamente modificada”) é uma célula hospedeira, na qual foi introduzido um ácido nucleico heterólogo, por exemplo, um vetor de expressão. Por exemplo, uma célula hospedeira bacteriana objeto é uma célula hospedeira bacteriana geneticamente modificada em virtude da introdução em uma célula hospedeira bacteriana apropriada de um ácido nucleico exógeno (por exemplo, um plasmídeo ou vetor de expressão recombinante) e uma célula hospedeira eucariótica objeto é uma célula hospedeira eucariota geneticamente modificada (por exemplo, células germinativas de mamíferos), em virtude da introdução em uma célula hospedeira eucariótica apropriada de um ácido nucleico exógeno.
[0401] Definições dadas em “Definições - Parte I” também são aplicáveis à seção instantânea; ver “Definições - Parte I” para esclarecimentos adicionais dos termos.
[0402] Antes de a presente invenção ser ainda descrita, deve ser entendido que esta invenção não é limitada a determinadas modalidades descritas, como tal, é claro, variam. Deve ainda ser entendido que a terminologia usada aqui tem o propósito de descrever modalidades particulares apenas e não se destina a ser um fator limitante, uma vez que o escopo da presente invenção será limitado apenas pelas reivindicações anexadas.
[0403] Quando um intervalo de valores é fornecido, entende-se que cada valor intermediário, ao décimo da unidade de limite inferior a menos que o contexto claramente mencione o contrário, entre o limite superior e inferior do intervalo e qualquer outro valor declarado ou intermediário naquele intervalo determinado, é englobado dentro da invenção. Os limites superiores e inferiores desses intervalos menores podem independentemente ser incluídos nos intervalos menores e também são englobados dentro da invenção, sujeito a qualquer limite especificamente excluído no intervalo indicado. Onde a escala indicada inclui um ou ambos os limites, intervalos excluindo um ou ambos esses limites incluídos também estão incluídos na invenção.
[0404] A menos que definido em contrário, todos os termos técnicos e científicos aqui têm o mesmo significado como comumente compreendidos por um especialista na técnica a que pertence esta invenção. Embora quaisquer métodos e materiais similares ou equivalentes aos descritos aqui também podem ser usados na prática ou teste da presente invenção, os métodos e materiais preferenciais são agora descritos. Todas as publicações mencionadas aqui são incorporadas por referência para divulgar e descrever os métodos e/ou materiais em relação ao qual as publicações são citadas.
[0405] Deve-se notar que como usado aqui e na reivindicação acrescentada, as formas singulares “a”, “um” e “o/a” incluem referentes plurais a menos que o contexto claramente dite de outra forma. Assim, por exemplo, a referência ao “um polipeptídeo Cas9 enzimaticamente inativo” inclui uma pluralidade de tais polipeptídeos e referência ao “ácido nucleico alvo” inclui a referência a um ou mais ácidos nucleicos alvos e equivalentes respectivos conhecidos para aqueles qualificados na técnica e assim por diante. É ainda de notar que as reivindicações podem ser redigidas para excluir qualquer elemento opcional. Como tal, esta declaração se destina a servir como base antecedente para uso de tal terminologia exclusiva como "unicamente", "somente" e semelhantes em conexão com a recitação de elementos da reivindicação, ou uso de uma limitação "negativa".
[0406] É apreciado que determinadas características da invenção que são, para clareza, descritas no contexto de modalidades separadas, também podem ser fornecidas em combinação em uma única modalidade. Por outro lado, várias características da invenção que são, por brevidade, descritas no contexto de uma única modalidade, também podem ser fornecidas separadamente ou em qualquer subcombinação. Todas as combinações das modalidades pertencentes à invenção são especificamente englobadas pela presente invenção e são divulgadas neste documento apenas como se toda e qualquer combinação fosse individualmente e explicitamente divulgada. Além disso, todas as subcombinações das várias modalidades e elementos das mesmas também são especificamente englobadas pela presente invenção e são divulgadas neste documento apenas como se toda e qualquer combinação fosse individualmente e explicitamente divulgada.
[0407] As publicações discutidas neste document são fornecidas unicamente pela sua divulgação antes da data de depósito do presente pedido. Nada neste documento é para ser interpretado como uma admissão de que a presente invenção não tem o direito de antecipar essa divulgação em virtude de invenção anterior. Além disso, as datas de publicação fornecidas podem ser diferentes das datas de publicação real que podem precisar ser confirmadas de forma independente.
DESCRIÇÃO DETALHADA — PARTE II
[0408] A presente divulgação fornece métodos de modulação da transcrição de um ácido nucleico de alvo em uma célula hospedeira. Os métodos geralmente envolvem entrar em contato com o ácido nucleico alvo com um polipeptídeo Cas9 enzimaticamente inativo e um RNA único-guia. Os métodos são úteis em uma variedade de aplicações, que são também fornecidos.
[0409] Um método de modulação de transcrição da divulgação presente supera algumas das desvantagens dos métodos envolvendo RNAi. Um método de modulação de transcrição da presente divulgação encontra uso em uma ampla variedade de aplicações, incluindo aplicações de pesquisa, descoberta de drogas (por exemplo, triagem de alto rendimento), validação de alvo, aplicações industriais (por exemplo, engenharia das culturas; engenharia microbiana, etc.), aplicações ao diagnóstico, aplicações terapêuticas e técnicas de imagem.
MÉTODOS DE MODULAÇÃO DA TRANSCRIÇÃO
[0410] A presente divulgação fornece um método de transcrição de modulação seletivamente de um DNA alvo em uma célula hospedeira. O método geralmente envolve: a) introduzir na célula hospedeira: i) um RNA tendo DNA como alvo, ou um ácido nucleico constituído por uma sequência de nucleotídeos que codifica o RNA tendo DNA como alvo; e ii) um polipeptídeo direcionado ao sítio de variante Cas9 (“polipeptídeo de Cas9 variante”), ou um ácido nucleico constituído por uma sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo Cas9 variante, onde o polipeptídeo Cas9 variante apresenta atividade reduzida de endodeoxiribonuclease.
[0411] RNA tendo DNA como alvo (também referido aqui como “crRNA”; ou “guia de RNA”; ou “gRNA”) compreende: i) um primeiro segmento, composto por uma sequência de nucleotídeos que é complementar a uma sequência alvo em um DNA alvo; II) um segundo segmento que interage com um polipeptídeo direcionado ao sítio; e iii) um terminador de transcrição. O primeiro segmento, composto por uma sequência de nucleotídeos que é complementar a uma sequência alvo em um DNA alvo, é referido aqui como um “segmento alvo”. O segundo segmento, que interage com um polipeptídeo direcionado ao sítio, também é referido aqui como uma sequência de “ligação à proteína” ou “ligação hairpin dCas9”, ou “identificador de dCas9”. Por “segmento” entende-se um segmento/seção/região de uma molécula, por exemplo, um trecho contíguo de nucleotídeos em um RNA. A definição de “segmento”, a menos que especificamente indicado em contrário definido em um contexto particular, não está limitado a um número específico de total de pares de bases e pode incluir regiões de moléculas de RNA que são de comprimento total e podem ou não incluir as regiões com complementariedade com outras moléculas. Um RNA tendo DNA como alvo de acordo com a presente divulgação pode ser uma única molécula de RNA (polinucleotídeo do RNA único), que pode ser referida aqui como um “RNA tendo DNA de molécula única como alvo ”, um “RNA único-guia”, ou um “sgRNA”. Um RNA tendo DNA como alvo de acordo com a presente divulgação pode incluir duas moléculas de RNA. O termo “RNA tendo DNA como alvo” ou “gRNA” é abrangente, referindo-se tanto para RNAs tendo DNA de duas moléculas como alvo e RNA tendo DNA de molécula única como alvo (ou seja, sgRNAs).
[0412] O polipeptídeo direcionado ao sítio de Cas9 variante compreende: i) uma porção de ligação ao RNA que interage com o RNA tendo DNA como alvo; e ii) uma porção de atividade que apresenta atividade reduzida de endodeoxiribonuclease.
[0413] O RNA tendo DNA como alvo e o polipeptídeo Cas9 variante formam um complexo em célula hospedeira; o complexo seletivamente modula a transcrição de um DNA alvo na célula hospedeira.
[0414] Em alguns casos, um método de modulação de transcrição da presente divulgação prevê a modulação seletiva (por exemplo, redução ou aumento) de um ácido nucleico de alvo em uma célula hospedeira. Por exemplo, redução “seletiva” da transcrição de ácidos nucleicos alvo reduz a transcrição do ácido nucleico alvo em pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos, cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos, cerca de 80%, pelo menos, cerca de 90%, ou superior a 90%, em comparação com o nível de transcrição do ácido nucleico alvo na ausência de um complexo de RNA tendo DNA como alvo/polipeptídeo variante Cas9. Redução seletiva de transcrição de ácidos nucleicos alvo reduz a transcrição do ácido nucleico alvo, mas não substancialmente reduz a transcrição de um ácido nucleico não alvo, por exemplo, transcrição de ácidos nucleicos não alvo é reduzida, se em tudo, em menos de 10% em relação ao nível de transcrição do ácido nucleico não alvo na ausência do complexo de RNA tendo DNA como alvo/polipeptídeo Cas9 variante.
Aumento da transcrição
[0415] Transcrição “seletiva” aumentada de um DNA alvo pode aumentar a transcrição do DNA alvo em pelo menos cerca de 1,1 vez (por exemplo, pelo menos cerca de 1,2 vezes, pelo menos cerca de 1,3 vezes, pelo menos cerca de 1,4 vezes, pelo menos cerca de 1,5 vezes, pelo menos cerca de 1,6 vezes, pelo menos cerca de 1,7 vezes, pelo menos cerca de 1,8 vezes, pelo menos cerca de 1,9 vezes, pelo menos cerca de 2 vezes, pelo menos cerca de 2,5 vezes, pelo menos cerca de 3 vezes, pelo menos cerca de 3,5 vezes, pelo menos cerca de 4 vezes, pelo menos cerca de 4,5 vezes, pelo menos cerca de 5 vezes, pelo menos cerca de 6 vezes, pelo menos cerca de 7 vezes, pelo menos cerca de 8 vezes, pelo menos cerca de 9 vezes, pelo menos cerca de 10 vezes, pelo menos sobre 12 vezes, pelo menos 15 vezes, ou pelo menos cerca de 20 vezes) em comparação com o nível de transcrição do DNA alvo na ausência de um complexo de RNA tendo DNA como alvo/ polipeptídeo variante Cas9. Aumento da transcrição seletivo de DNA alvo aumenta a transcrição do DNA alvo, mas não aumenta substancialmente a transcrição de DNA não alvo, por exemplo, a transcrição de um DNA não alvo é aumentada, em sua totalidade, pelo menos do que sobre 5 vezes (por exemplo, menos do que cerca de 4 vezes, menos de cerca de 3 vezes, menos do que cerca de 2 vezes, menos de cerca de 1,8 vez, menos de menos de cerca de 1,6 vez, menos do que cerca de 1,4 vez, menos do que cerca de 1,2 vez ou menos de cerca de 1,1 vez) em comparação com o nível de transcrição do DNA não alvo na ausência do complexo de RNA tendo DNA como alvo/polipeptídeo Cas9 variante.
[0416] Como um exemplo não limitante, aumentado pode ser alcançado pela fusão de dCas9 a uma sequência heteróloga. Parceiros de fusão apropriados incluem, entre outros, um polipeptídeo que fornece uma atividade que indiretamente aumenta a transcrição por agir diretamente no DNA alvo ou em um polipeptídeo (por exemplo, uma histona ou outras proteínas de ligação ao DNA) associado com o DNA alvo. Parceiros de fusão apropriados incluem, entre outros, um polipeptídeo que fornece atividade metiltransferase, atividade demetilase, atividade da acetiltransferase, atividade deacetilase, atividade da quinase, atividade da fosfatase, atividade de ubiquitina ligase, atividade deubiquitinação, atividade adenilação, atividade desadenilação, Atividade SUMOilação, atividade deSUMOilação, atividade ribosilação, atividade desribosilação, atividade miristoilação ou atividade desmiristoilação.
[0417] Parceiros de fusão apropriado adicionais incluem, entre outros, um polipeptídeo que fornece diretamente para o aumento da transcrição do ácido nucleico alvo (por exemplo, um ativador de transcrição ou um fragmento do mesmo, uma proteína ou fragmento do mesmo que recruta um ativador de transcrição, um regulador de transcrição de pequena molécula/ responsivo a droga, etc.).
[0418] Um exemplo não limitante de um método objeto usando uma proteína de fusão de dCas9 para aumentar a transcrição em um procarionte inclui uma modificação do sistema bacteriano de um híbrido (B1H) ou dois híbridos (B2H). No sistema B1H, um domínio de ligação do DNA (BD) é fundido a um domínio de ativação de transcrição bacteriana (AD, por exemplo, a subunidade alfa da Escherichia coli RNA polimerase (RNAPα)). Assim, um dCas9 objeto pode ser fundido a uma sequência heteróloga compreendendo um AD. Quando a proteína de fusão dCas9 objeto chega em região à montante de um promotor (direcionado ali pelo RNA tendo DNA como alvo) o AD (por exemplo, RNAPα) da proteína de fusão do dCas9 recruta a holoenzima RNAP, levando à ativação de transcrição. No sistema B2H, a BD não é fundida diretamente à AD; em vez disso, sua interação é mediada por uma interação da proteína- proteína (por exemplo, interação GAL11P-GAL4). Para modificar esse sistema para uso em métodos objetos, dCas9 pode ser fundido a uma primeira sequência de proteínas que fornece interação proteína-proteína (por exemplo, a proteína de levedura GAL11P e/ou GAL4) e RNAα pode ser fundido a uma segunda sequência de proteínas que completa a interação proteína-proteína (por exemplo, GAL4 se GAL11P é fundido a dCas9, GAL11P se GAL4 é fundida a dCas9, etc.). A afinidade de ligação entre GAL11P e GAL4 aumenta a eficiência da ligação e a taxa de queima de transcrição.
[0419] Um exemplo não limitante de um método objeto usando uma proteína de fusão dCas9 para aumentar a transcrição em eucariontes inclui uma fusão de dCas9 para um domínio de ativação (AD) (por exemplo, GAL4, proteína de ativação VP16 ou VP64de herpesvírus, a subunidade p65 de fator nuclear humano NF-KB, etc.). Para processar o sistema induzível, expressão da proteína de fusão dCas9 pode ser controlada por um promotor induzível (por exemplo, Tet-ON, Tet-OFF, etc.). O RNA tendo DNA como alvo pode ser projetado para direcionar os elementos de resposta do transcrição conhecidos (por exemplo, promotores, melhoradores, etc.), sequências de ativação à montante conhecidas (UAS), sequências de função conhecida ou desconhecida que são suspeitas de serem capazes de controlar a expressão do DNA alvo, etc.
Parceiros adicionais de fusão
[0420] Exemplos não limitantes dos parceiros de fusão para realizar a transcrição aumentada ou diminuição são listados na Figura 54 e incluem domínios ativadores de transcrição e repressores de transcrição (por exemplo, Kruppel associado a vox (KRAB ou SKD); o domínio de interação Mad mSIN3 (SID); o domínio de repressor ERF (ERD), etc). Em alguns desses casos, a proteína de fusão dCas9 é direcionada a RNA tendo DNA como alvo para um sítio específico (ou seja, sequência) no DNA alvo e exerce regulação em locus específico como bloqueio de RNA polimerase, ligando a um promotor (que inibe seletivamente a função de ativador de transcrição), e/ou modifica o status de cromatina local (por exemplo, quando uma sequência de fusão é usada que modifica o DNA alvo ou modifica um polipeptídeo associado com o DNA alvo). Em alguns casos, as alterações são transitórias (por exemplo, a repressão da transcrição ou ativação). Em alguns casos, as alterações são herdáveis (por exemplo, quando modificações epigenéticas são feitas ao DNA alvo ou a proteínas associadas com o DNA alvo, por exemplo, as histonas nucleossomais).
[0421] Em algumas modalidades, a sequência heteróloga pode ser fundida ao C-terminal do polipeptídeo dCas9. Em algumas modalidades, a sequência heteróloga pode ser fundida a N-terminal do polipeptídeo dCas9. Em algumas modalidades, a sequência heteróloga pode ser fundida a uma porção interna (ou seja, uma porção diferente do N - ou C- terminal) do polipeptídeo dCas9.
[0422] Os efeitos biológicos de um método usando uma proteína de fusão de dCas9 objeto podem ser detectados por qualquer método conveniente (por exemplo, ensaios de expressão do gene; ensaios baseados em cromatina, por exemplo, imunoprecipitação da cromatina (ChiP), ensaio de cromatina na vivo do (CiA), etc.; e semelhantes).
[0423] Em alguns casos, um método objeto envolve o uso de dois ou mais diferentes RNAs tendo DNA como alvo. Por exemplo, dois diferentes RNAs tendo DNA como alvo podem ser usados em uma célula hospedeira única, onde os dois diferentes RNAs tendo DNA como alvo alvejam duas sequências alvo diferentes no mesmo ácido nucleico alvo.
[0424] Assim, por exemplo, um método de modulação de transcrição objeto pode ainda compreender introdução na célula hospedeira um segundo RNA tendo DNA como alvo, ou um ácido nucleico constituído por uma sequência de nucleotídeos que codifica segundo RNA tendo DNA como alvo, onde o segundo RNA tendo DNA como alvo compreende: i) um primeiro segmento, composto por uma sequência de nucleotídeos complementar uma segunda sequência alvo o DNA alvo; ii) um segundo segmento que interage com o polipeptídeo direcionado ao sítio; e iii) um terminador de transcrição. Em alguns casos, a utilização de dois diferentes RNAs tendo DNA como alvo visando duas sequências alvos diferentes no mesmo ácido nucleico alvo fornece modulação aumentada (por exemplo, redução ou aumento) na transcrição do ácido nucleico alvo.
[0425] Como outro exemplo, dois diferentes RNAs tendo DNA como alvo podem ser usados em uma célula hospedeira única, onde os dois diferentes RNAs tendo DNA como alvo alvejam dois ácidos nucleicos alvos diferentes. Assim, por exemplo, um método de modulação de transcrição objeto pode ainda compreender a introdução na célula hospedeira de um segundo RNA tendo DNA como alvo, ou um ácido nucleico constituído por uma sequência de nucleotídeos que codifica segundo RNA tendo DNA como alvo, onde o segundo RNA tendo DNA como alvo compreende: i) um primeiro segmento, composto por uma sequência de nucleotídeos que é complementar a uma sequência alvo em menos de um segundo DNA alvo; ii) um segundo segmento que interage com o polipeptídeo direcionado ao sítio; e iii) um terminador de transcrição.
[0426] Em algumas modalidades, um ácido nucleico objeto (por exemplo, um RNA tendo DNA como alvo, por exemplo, um RNA tendo DNA de molécula única como alvo, um RNA ativador, um RNA direcionador, etc.; um polinucleotídeo doador que codifica um polipeptídeo modificador direcionado ao sítio do ácido nucleico; etc.) é composto por uma modificação ou sequência que fornece uma característica desejável adicional (por exemplo, estabilidade modificada ou regulada; segmentação subcelular; rastreamento, por exemplo, um marcador fluorescente, um sítio de ligação para uma proteína ou complexa de proteína; etc.). Exemplos não limitantes incluem: um cap 5' (por exemplo, um 7- metilguanilato cap (m7G)); uma cauda de poliadenilada 3' (ou seja, uma 3' cauda poli (A)); uma sequência de riboswitch ou um aptâmero (por exemplo permitir a estabilidade regulada e/ou acessibilidade regulada por proteínas e/ou complexos de proteína); uma sequência terminadora; uma sequência que forma um dsRNA duplex (ou seja, um hairpin)); uma modificação ou sequência que tem como alvo o RNA para uma localização subcelular (por exemplo, núcleo, mitocôndrias, cloroplastos e semelhantes); uma modificação ou sequência que fornece rastreamento (por exemplo, conjugação direta de uma molécula fluorescente, conjugação de uma fração que facilita detecção fluorescente, uma sequência que permite a detecção fluorescente, etc.); uma modificação ou sequência que fornece um sítio de ligação para proteínas (por exemplo, as proteínas que atuam sobre o DNA, incluindo ativadores transcricionais, repressores transcricionais, DNA metiltransferases, DNA demetilases, histona acetiltransferases, histona deacetilases e semelhantes); e suas combinações.
Segmento de tendo DNA como alvo
[0427] O segmento tendo DNA como alvo (ou “sequência tendo DNA como alvo”) de um RNA tendo DNA como alvo (“crRNA”) é composto por uma sequência de nucleotídeos que é complementar a uma sequência específica dentro de um DNA alvo (a fita complementar do DNA alvo).
[0428] Em outras palavras, o segmento tendo DNA como alvo de um RNA tendo DNA como alvo objeto interage com um DNA alvo em uma maneira específica de sequência através de hibridização (ou seja, emparelhamento de base). Como tal, a sequência de nucleotídeos do segmento tendo DNA como alvo pode variar e determina a localização dentro do DNA alvo que o RNA tendo DNA como alvo e o DNA alvo irão interagir. O segmento tendo DNA como alvo de RNA tendo DNA como alvo pode ser modificado (por exemplo, por engenharia genética) para hibridizar a qualquer sequência desejada dentro de um DNA alvo.
[0429] O segmento tendo DNA como alvo pode ter um comprimento de cerca de 12 nucleotídeos a cerca de 100 nucleotídeos. Por exemplo, o segmento tendo DNA como alvo pode ter um comprimento de cerca de 12 nucleotídeos (nt) a cerca de 80 nt, de cerca de 12 nt para sobre 50nt, de cerca de 12 nt a cerca de 40 nt, de cerca de 12 nt a cerca de 30 nt, de cerca de 12 nt a cerca de 25 nt, de cerca de 12 nt a cerca de 20 nt, ou a partir de cerca de 12 nt a cerca de 19 nt. Por exemplo, o segmento tendo DNA como alvo pode ter um comprimento de cerca de 19 nt a cerca de 20 nt, de cerca de 19 nt a cerca de 25 nt, de cerca de 19 nt a cerca de 30 nt, de cerca de 19 nt a cerca de 35 nt, de cerca de 19 nt a cerca de 40 nt, de cerca de 19 nt a cerca de 45 nt, de cerca de 19 nt a cerca de 50 nt, de cerca de 19 nt a cerca de 60 nt, de cerca de 19 nt a cerca de 70 nt, de cerca de 19 nt a cerca de 80 nt, de cerca de 19 nt a cerca de 90 nt, de cerca de 19 nt a cerca de 100 nt, de cerca de 20 nt a cerca de 25 nt, de cerca de 20 nt a cerca de 30 nt, de cerca de 20 nt a cerca de 35 nt, de cerca de 20 nt a cerca de 40 nt, de cerca de 20 nt a cerca de 45 nt, de cerca de 20 nt a cerca de 50 nt, de cerca de 20 nt a cerca de 60 nt, de cerca de 20 nt a cerca de 70 nt, de cerca de 20 nt a cerca de 80 nt, de cerca de 20 nt a cerca de 90 nt, ou de aproximadamente 20 nt a cerca de 100 nt.
[0430] A sequência de nucleotídeos (a sequência tendo DNA como alvo) do segmento tendo DNA como alvo que é complementar a uma sequência de nucleotídeos (sequência de destino) do DNA do alvo pode ter um comprimento de pelo menos 12 nt. Por exemplo, a sequência tendo DNA como alvo do segmento tendo DNA como alvo complementar para uma sequência do DNA alvo do alvo pode ter um comprimento de pelo menos 12 nt, pelo menos uns 15 nt, pelo menos uns 18 anos nt, pelo menos 19 nt, pelo menos cerca de 20 nt, pelo menos cerca de 25 nt, pelo menos uns 30 nt, pelo menos uns 35 nt ou pelo menos cerca de 40 nt. Por exemplo, a sequência tendo DNA como alvo do segmento tendo DNA como alvo complementar para uma sequência do DNA alvo do alvo pode ter um comprimento de cerca de 12 nucleotídeos (nt) a cerca de 80 nt, de cerca de 12 nt a cerca de 50nt, de cerca de 12 nt a cerca de 45 nt, de cerca de 12 nt a cerca de 40 nt, de cerca de 12 nt a cerca de 35 nt, de cerca de 12 nt a cerca de 30 nt, de cerca de 12 nt a cerca de 25 nt, de cerca de 12 nt a cerca de 20 nt, de cerca de 12 nt a cerca de 19 nt, de cerca de 19 nt a cerca de 20 nt, de cerca de 19 nt a cerca de 25 nt, de cerca de 19 nt a cerca de 30 nt, de cerca de 19 nt a cerca de 35 nt, de cerca de 19 nt a cerca de 40 nt, de cerca de 19 nt a cerca de 45 nt, de cerca de 19 nt a cerca de 50 nt, de cerca de 19 nt a cerca de 60 nt, de cerca de 20 nt a cerca de 25 nt, de cerca de 20 nt a cerca de 30 nt, de cerca de 20 nt a cerca de 35 nt, de cerca de 20 nt a cerca de 40 nt, de cerca de 20 nt a cerca de 45 nt, de cerca de 20 nt a cerca de 50 nt, ou de aproximadamente 20 nt a cerca de 60 nt. A sequência de nucleotídeos (a sequência tendo DNA como alvo) do segmento tendo DNA como alvo que é complementar a uma sequência de nucleotídeos (sequência de destino) do DNA do alvo pode ter um comprimento de pelo menos 12 nt.
[0431] Em alguns casos, a sequência tendo DNA como alvo do segmento tendo DNA como alvo complementar para uma sequência do DNA alvo do alvo é 20 nucleotídeos de comprimento. Em alguns casos, a sequência tendo DNA como alvo do segmento tendo DNA como alvo complementar para uma sequência do DNA alvo do alvo é 19 nucleotídeos de comprimento.
[0432] A porcentagem de complementariedade entre a sequência tendo DNA como alvo do segmento tendo DNA como alvo e a sequência alvo do DNA alvo pode ser pelo menos 60% (por exemplo, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos, 99% ou 100%). Em alguns casos, a percentagem de complementariedade entre a sequência tendo DNA como alvo do segmento tendo DNA como alvo e a sequência alvo do DNA alvo é 100% sobre os sete contíguos 5'- nucleotídeos principais da sequência alvo da cadeia complementar do DNA alvo. Em alguns casos, a percentagem de complementariedade entre a sequência tendo DNA como alvo do segmento tendo DNA como alvo e a sequência alvo do DNA alvo é pelo menos 60% ao longo de cerca de 20 nucleotídeos contíguos. Em alguns casos, a percentagem de complementariedade entre a sequência tendo DNA como alvo do segmento tendo DNA como alvo e a sequência alvo do DNA alvo é 100% ao longo de catorze contíguos principais nucleotídeos 5' da sequência alvo da cadeia complementar do DNA alvo e tão baixo quanto 0% sobre o restante. Nesse caso, a sequência tendo DNA como alvo pode ser considerada 14 nucleotídeos de comprimento. Em alguns casos, a percentagem de complementariedade entre a sequência tendo DNA como alvo do segmento tendo DNA como alvo e a sequência alvo do DNA alvo é 100% sobre os sete nucleotídeos contíguos principais 5' da sequência alvo da cadeia complementar do DNA alvo e tão baixo quanto 0% sobre o restante. Nesse caso, a sequência tendo DNA como alvo pode ser considerada sendo de 7 nucleotídeos em comprimento.
Segmento de ligação à proteína
[0433] O segmento de ligação à proteína (ou seja, “sequência de ligação à proteína”) de um RNA tendo DNA como alvo interage com um polipeptídeo variante direcionado ao sítio. Quando o polipeptídeo direcionado ao sítio de Cas9 variante, juntamente com o RNA tendo DNA como alvo, se liga a um DNA alvo, a transcrição do DNA alvo é reduzida.
[0434] O segmento de ligação à proteína de um RNA tendo DNA como alvo é composto por dois trechos complementares de nucleotídeos que hibridizam para o outro para formar um duplex de RNA fita dupla (duplex do dsRNA).
[0435] O segmento de ligação à proteína de um RNA tendo DNA como alvo da presente divulgação é composto por dois trechos de nucleotídeos (um RNA direcionador e um RNA ativador) que complementam um ao outro, estão ligados covalentemente por nucleotídeos intermediários (por exemplo, no caso de um RNA tendo DNA de molécula única como alvo) (“ligantes” ou “nucleotídeos ligantes”) e hibridizam para formar o duplex de RNA fita dupla (dsRNA duplex, ou “dCas9- ligação hairpin”) do segmento de ligação à proteína, resultando assim em uma estrutura de Haste-alça. Essa estrutura de haste-alça é mostrada esquematicamente na Figura 39A. O RNA direcionador e RNA ativador podem ser covalentemente ligados através de extremidade 3' do RNA direcionador e a extremidade 5' do RNA ativador. Alternativamente, RNA direcionador e RNA ativador podem ser covalentemente ligados através da extremidade 5' do RNA direcionador e extremidade 3' do RNA ativador.
[0436] O segmento de ligação à proteína pode ter um comprimento de cerca de 10 nucleotídeos a cerca de 100 nucleotídeos, por exemplo, de cerca de 10 nucleotídeos (nt) a cerca de 20 nt, de cerca de 20 nt a cerca de 30 nt, de cerca de 30 nt a cerca de 40 nt, de cerca de 40 nt a cerca de 50 nt, de cerca de 50 nt a cerca de 60 nt, de cerca de 60 nt a cerca de 70 nt, de cerca de 70 nt a cerca de 80 nt, de cerca de 80 nt a cerca de 90 nt, ou a partir de cerca de 90 nt a cerca de 100 nt. Por exemplo, o segmento de ligação às proteínas pode ter um comprimento de cerca de 15 nucleotídeos (nt) a cerca de 80 nt, de cerca de 15 nt a cerca de 50 nt, de cerca de 15 nt a cerca de 40 nt, de cerca de 15 nt a cerca de 30 nt ou de aproximadamente 15 nt a cerca de 25 nt.
[0437] O dsRNA duplex do segmento de ligação à proteína pode ter um comprimento de cerca de 6 pares de bases (bp) a cerca de 50bp. Por exemplo, o duplex dsRNA do segmento ligação à proteína pode ter um comprimento de cerca de 6 bp a cerca de 40 bp, de cerca de 6 bp sobre 30bp, de cerca de 6 bp a cerca de 25 bp, de cerca de 6 bp a cerca de 20 bp, de cerca de 6 bp a cerca de 15 bp, de cerca de 8 bp a cerca de 40 bp, de cerca de 8 bp sobre 30bp, de cerca de 8 bp a cerca de 25 bp, de cerca de 8 bp a cerca de 20 bp ou de cerca 8 bp a cerca de 15 bp. Por exemplo, o duplex dsRNA do segmento ligação à proteína pode ter um comprimento de cerca 8 bp a cerca de 10 bp, de cerca de 10 bp a cerca de 15 bp, de cerca de 15 bp a cerca de 18 bp, de cerca de 18 bp a cerca de 20 bp, de cerca de 20 bp a cerca de 25 bp, de cerca de 25 bp a cerca de 30 bp, de cerca de 30 bp a cerca de 35 bp, de cerca de 35 bp a cerca de 40 bp, ou a partir de cerca de 40 bp a cerca de 50 bp. Em algumas modalidades, o duplex dsRNA do segmento ligação à proteína tem um comprimento de 36 pares de bases. A percentagem de complementariedade entre as sequências de nucleotídeos que hibridizam para formar o dsRNA duplex do segmento de ligação de proteínas pode ser pelo menos cerca de 60%. Por exemplo, a percentagem de complementariedade entre as sequências de nucleotídeos que hibridizam para formar o dsRNA duplex do segmento de ligação à proteína pode ser pelo menos uns 65%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos, cerca de 75%, pelo menos, cerca de 80%, pelo menos, cerca de 85%, pelo menos, cerca de 90%, pelo menos, cerca de 95%, pelo menos cerca de 98%, ou pelo menos cerca de 99%. Em alguns casos, a percentagem de complementariedade entre as sequências de nucleotídeos que hibridizam para formar o dsRNA duplex do segmento ligação às proteínas é de 100%.
[0438] O ligante pode ter um comprimento de cerca de 3 nucleotídeos a cerca de 100 nucleotídeos. Por exemplo, o ligante pode ter um comprimento de cerca de 3 nucleotídeos (nt) a cerca de 90 nt, de cerca de 3 nucleotídeos (nt) a cerca de 80 nt, de cerca de 3 nucleotídeos (nt) a cerca de 70 nt, de cerca de 3 nucleotídeos (nt) a cerca de 60 nt, de cerca de 3 nucleotídeos (nt) a cerca de 50 nt, de cerca de 3 nucleotídeos (nt) a cerca de 40 nt, de cerca de 3 nucleotídeos (nt) a cerca de 30 nt, de cerca de 3 nucleotídeos (nt) a cerca de 20 nt ou de cerca de 3 nucleotídeos (nt) a cerca de 10 nt. Por exemplo, o ligante pode ter um comprimento de cerca de 3 nt a cerca de 5 nt, de cerca de 5 nt a cerca de 10 nt, de cerca de 10 nt a cerca de 15 nt, de cerca de 15 nt a cerca de 20 nt, de cerca de 20 nt a cerca de 25 nt, de cerca de 25 nt a cerca de 30 nt, de cerca de 30 nt a cerca de 35 nt, de cerca de 35 nt a cerca de 40 nt, de cerca de 40 nt a cerca de 50 nt, de cerca de 50 nt a cerca de 60 nt, de cerca de 60 nt a cerca de 70 nt, de cerca de 70 nt a cerca de 80 nt, de cerca de 80 nt a cerca de 90 nt, ou a partir de cerca de 90 nt a cerca de 100 nt. Em algumas modalidades, o ligante de um RNA tendo DNA como alvo é 4 nt.
[0439] Exemplos não limitantes de sequências de nucleotídeos que podem ser incluídos em um segmento de ligação à proteína apropriado (ou seja, o identificador de dCas9) estão estabelecidos em SEQ ID NOs: 563-682 (para exemplos, ver a Figura 8 e Figura 9).
[0440] Em alguns casos, um segmento de ligação de proteína adequado é composto por uma sequência de nucleotídeos que difere por 1, 2, 3, 4 ou 5 nucleotídeos de qualquer uma das sequências acima listadas.
Sequência de controle de estabilidade (por exemplo, segmento terminador de transcrição)
[0441] Uma sequência de controle de estabilidade influencia a estabilidade de um RNA (por exemplo, um RNA tendo DNA como alvo, um RNA direcionador, um RNA ativador, etc.). Um exemplo de uma sequência de controle de estabilidade adequada é um segmento terminador de transcrição (ou seja, uma sequência de terminação de transcrição). Um segmento terminador de transcrição do RNA tendo DNA como alvo objeto pode ter um comprimento total de cerca de 10 nucleotídeos a cerca de 100 nucleotídeos, por exemplo, de cerca de 10 nucleotídeos (nt) a cerca de 20 nt, de cerca de 20 nt a cerca de 30 nt, de cerca de 30 nt a cerca de 40 nt, de cerca de 40 nt a cerca de 50 nt, de cerca de 50 nt a cerca de 60 nt, de cerca de 60 nt a cerca de 70 nt, de cerca de 70 nt a cerca de 80 nt, de cerca de 80 nt a cerca de 90 nt, ou a partir de cerca de 90 nt a cerca de 100 nt. Por exemplo, o segmento terminador de transcrição pode ter um comprimento de cerca de 15 nucleotídeos (nt) a cerca de 80 nt, de cerca de 15 nt a cerca de 50 nt, de cerca de 15 nt a cerca de 40 nt, de cerca de 15 nt a cerca de 30 nt ou de aproximadamente 15 nt a cerca de 25 nt.
[0442] Em alguns casos, a sequência de terminação da transcrição é aquela que é funcional em uma célula eucariótica. Em alguns casos, a sequência de terminação da transcrição é aquela que é funcional em uma célula procariótica.
[0443] Exemplos não limitantes de sequências de nucleotídeos que podem ser incluídos em uma sequência de controle de estabilidade (por exemplo, o segmento de terminação de transcrição, ou em qualquer segmento do RNA tendo DNA como alvo para fornecer maior estabilidade) incluem sequências estabelecidas em SEQ ID NO: 683-696 e, por exemplo,5’-UAAUCCCACAGCCGCCAGUUCCGCUGGCGGCAUUUU-5’ (SEQ ID NO:795) (um sítio de terminação trp independente de Rho).
Sequências adicionais
[0444] Em algumas modalidades, um RNA tendo DNA como alvo compreende pelo menos um segmento adicional na extremidade 5' ou 3'. Por exemplo, um segmento adicional apropriado pode incluir um cap 5' (por exemplo, um 7- metilguanilato cap (m7G)); uma cauda de poliadenilada 3' (ou seja, uma 3' cauda poli (A)); uma sequência de riboswitch (por exemplo permitir a estabilidade regulada e/ou acessibilidade regulada por proteínas e complexos de proteína); uma sequência que forma um dsRNA duplex (ou seja, um hairpin)); uma sequência que tem como alvo o RNA para uma localização subcelular (por exemplo, núcleo, mitocôndrias, cloroplastos e semelhantes); uma modificação ou sequência que fornece rastreamento (por exemplo, conjugação direta de uma molécula fluorescente, conjugação de uma fração que facilita detecção fluorescente, uma sequência que permite a detecção fluorescente, etc.); uma modificação ou sequência que fornece um sítio de ligação para proteínas (por exemplo, as proteínas que atuam sobre o DNA, incluindo ativadores de transcrição, repressores de transcrição, DNA metiltransferases, DNA demetilases, histona acetiltransferases, histona deacetilases e semelhantes) uma modificação ou sequência que fornece para aumentar, diminuir, e/ou estabilidade controlável; e suas combinações.
Vários RNAs tendo DNA como alvo simultâneos
[0445] Em algumas modalidades, vários RNAs tendo DNA como alvo são utilizados simultaneamente na mesma célula simultaneamente modulam a transcrição em diferentes locais no mesmo DNA alvo ou em diferentes DNAs alvos. Em algumas modalidades, dois ou mais RNAs tendo DNA como alvo alvejam o mesmo gene ou transcrição ou locus. Em algumas modalidades, dois ou mais RNAs tendo DNA como alvo alvejam diferentes loci diferentes. Em algumas modalidades, dois ou mais RNAs tendo DNA como alvo alvejam loci diferentes, mas relacionados.
[0446] Porque os RNAs tendo DNA como alvo são pequenos e robustos podem ser presentes simultaneamente sobre o mesmo vetor de expressão e podem até mesmo ser sob o mesmo controle de transcrição, se assim o desejar. Em algumas modalidades, dois ou mais (por exemplo, 3 ou mais, 4 ou mais, 5 ou mais, 10 ou mais, 15 ou mais, 20 ou mais, 25 ou mais, 30 ou mais, 35 ou mais, 40 ou mais, 45 ou mais, ou 50 ou mais) RNAs tendo DNA como alvo são expressos simultaneamente em uma célula alvo (a partir de vetores iguais ou diferentes). Os RNAs tendo DNA como alvo expressos podem ser reconhecidos de forma diferente por proteínas dCas9 de diferentes bactérias, como S. pyogenes, S. thermophilus, L. innocua, e N. meningitidis.
[0447] Para expressar vários RNAs tendo DNA como alvo, um sistema de processamento de RNA artificial mediado por Csy4 endoribonuclease pode ser usado. Vários RNAs tendo DNA como alvo podem ser concatenados em uma matriz em tandem em uma transcrição do precursor (por exemplo, expressa de um promotor U6) e separado por uma sequência de RNA específica para Csy4. Proteína Csy4 coexpressa cliva a transcrição de precursor em vários RNAs tendo DNA como alvo. Vantagens para o uso de um sistema de processamento de RNA incluem: primeiro, não há nenhuma necessidade de usar vários promotores; em segundo lugar, uma vez que todos os RNAs tendo DNA como alvo são processados de uma transcrição de precursor, suas concentrações são normalizadas para ligação de dCas9 semelhante.
[0448] Csy4 é uma pequena proteína endoribonuclease (RNase) derivada da bactéria Pseudomonas aeruginosa. Csy4 especificamente reconhece um hairpin de RNA 17-bp mínimo e apresenta rápida (< 1 min) e altamente eficiente (>99,9%) clivagem do RNA. Ao contrário da maioria das RNases, o fragmento de RNA clivado permanece estável e funcionalmente ativo. A clivagem do RNA baseado em Csy4 pode ser reutilizada em um sistema de processamento de RNA artificial. Neste sistema, os hairpin de RNA 17-bp são inseridos entre múltiplos fragmentos de RNA que são transcritos como uma transcrição de precursor de um único promotor. Coexpressão de Csy4 é eficaz na geração de fragmentos de RNA individuais.
Polipeptídeo direcionado ao sítio
[0449] Como mencionado acima, um RNA tendo DNA como alvo objeto e um polipeptídeo direcionado ao sítio variante Cas9 formam um complexo. O RNA tendo DNA como alvo fornece especificidade alvo para o complexo, composto por uma sequência de nucleotídeos que é complementar a uma sequência de DNA alvo.
[0450] O polipeptídeo direcionado ao sítio variante Cas9 reduziu a atividade endodeoxiribonuclease. Por exemplo, um polipeptídeo direcionado ao sítio variante Cas9 adequado para uso em um método de modulação de transcrição da presente divulgação apresenta menos de cerca de 20%, menos de cerca de 15%, menos do que cerca de 10%, menos de 5%, menos de 1%, ou menos de cerca de 0,1%, da atividade endodeoxiribonuclease de um polipeptídeo de Cas9 tipo selvagem, por exemplo, um polipeptídeo Cas9 tipo selvagem constituído por uma sequência de aminoácidos, como ilustrado na Figura 3 (SEQ ID NO: 8). Em algumas modalidades, o polipeptídeo direcionado ao sítio variante Cas9 tem substancialmente nenhuma atividade detectável endodeoxiribonuclease. Em algumas modalidades quando um polipeptídeo direcionado ao sítio reduziu a atividade catalítica (por exemplo, quando uma proteína Cas9 tem uma mutação D10, G12, G17, E762, H840, N854, N863, H982, H983, A984, D986, ou A987, por exemplo, D10A, G12A, G17A, E762A, H840A, N854A, N863A, H982A, H983A, A984A, ou D986A), o polipeptídeo pode ainda ligar ao DNA alvo de forma específica ao sítio (porque é ainda guiado para uma sequência de DNA alvo por um RNA tendo DNA como alvo), enquanto mantém a capacidade de interagir com o RNA tendo DNA como alvo.
[0451] Em alguns casos, uma polipeptídeo direcionado ao sítio Cas9 variante adequado é composto por uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos cerca de 75%, pelo menos, cerca de 80%, pelo menos, cerca de 85%, pelo menos, cerca de 90%, pelo menos, cerca de 95%, pelo menos cerca de 99% ou 100% de aminoácidos identidade de sequência de aminoácidos 7-166 ou 731-1003 da sequência de aminoácidos Cas9/Csn1 retratada na Figura 3 (SEQ ID NO: 8), ou para as porções correspondentes em qualquer uma das sequências de aminoácido SEQ ID NOs: 1-256 e 795-1346.
[0452] Em alguns casos, um polipeptídeo direcionado ao sítio variante Cas9 pode clivar a fita complementar do DNA alvo, mas capacidade reduzida de clivar a cadeia não complementar do DNA alvo. Por exemplo, o polipeptídeo direcionado ao sítio variante Cas9 pode ter uma mutação (substituição de aminoácido) que reduz a função do domínio de RuvC (por exemplo, “domínio 1” da Figura 3). Como um exemplo não limitante, em alguns casos, o polipeptídeo direcionado ao sítio variante Cas9 é uma mutação D10A (aspartato de alanina) da sequência de aminoácidos, representada na Figura 3 (ou a mutação correspondente de qualquer um dos conjunto das sequências de aminoácido estabelecidas em SEQ: ID NOs: 1-256 e 795-1346).
[0453] Em alguns casos, o polipeptídeo direcionado ao sítio variante Cas9 pode clivar a cadeia não complementar do DNA alvo, mas tem capacidade reduzida de clivar a fita complementar do DNA alvo. Por exemplo, o polipeptídeo direcionado ao sítio variante Cas9 pode ter uma mutação (substituição de aminoácido) que reduz a função do domínio de HNH (motivos de domínio RuvC/HNH/RuvC, “domínio 2” da Figura 3). Como um exemplo não limitante, em alguns casos, o polipeptídeo direcionado ao sítio variante Cas9 é uma H840A (histidina para alanina na posição de aminoácido 840 de SEQ ID NO: 8) ou a correspondente mutação de qualquer uma das sequências de aminoácido estabelecida na SEQ ID NOs: 1-256 e 795-1346).
[0454] Em alguns casos, o polipeptídeo direcionado ao sítio variante Cas9 tem uma capacidade reduzida para clivar as fitas complementares e as não complementares de DNA alvo. Como um exemplo não limitante, em alguns casos, o polipeptídeo direcionado ao sítio variante Cas9 abriga mutações D10A e H840A da sequência de aminoácidos, representada na Figura 3 (ou as mutações correspondentes de qualquer uma das sequências de aminoácidos estabelecidas em SEQ: ID NOs: 1-256 e 795-1346).
[0455] Outros resíduos podem ser uma mutação para conseguir o mesmo efeito (ou seja, inativar uma ou outras porções de nuclease). Como exemplos não limitantes, resíduos D10, G12, G17, E762, H840, N854, N863, H982, H983, A984, D986, ou A987 (ou as mutações correspondentes de qualquer das proteínas estabelecidas como SEQ: ID NOs: 1-256 e 795-1346) podem ser alterados (ou seja, substituídos) (ver Figura 3, Figura 5, Figura 11A, e Tabela 1 para mais informações sobre a conservação de resíduos de aminoácidos Cas9). Além disso, mutações além de substituições de alanina são adequadas.
[0456] Em alguns casos, o polipeptídeo direcionado ao sítio Cas9 variante é um polipeptídeo de fusão (um “polipeptídeo de fusão a Cas9 variante”), ou seja, uma fusão do polipeptídeo compreendendo: i) um polipeptídeo direcionado ao sítio Cas9 variante; e b) um polipeptídeo heterólogo covalentemente ligado (também referido como um “parceiro de fusão”).
[0457] O polipeptídeo heterólogo pode apresentar uma atividade (por exemplo, atividade enzimática) que também será exibida pelo polipeptídeo de fusão variante Cas9 (por exemplo, atividade metiltransferase, atividade da acetiltransferase, atividade da quinase, atividade ubiquitinação, etc.). Uma sequência do ácido nucleico heterólogo pode estar ligada a outra sequência de ácido nucleico (por exemplo, por engenharia genética) para gerar uma sequência de nucleotídeos quiméricos que codifica um polipeptídeo quimérico. Em algumas modalidades, um polipeptídeo de fusão Cas9 variante é gerado pela fusão de um polipeptídeo Cas9 variante com uma sequência heteróloga que prevê a localização subcelular (ou seja, a sequência heteróloga é uma sequência de localização subcelular, por exemplo, um sinal de localização nuclear (NLS) para o direcionamento ao núcleo; um sinal de localização mitocondrial para o direcionamento para as mitocôndrias; um sinal de localização do cloroplasto para o direcionamento de um cloroplasto; um sinal de retenção ER; e semelhantes). Em algumas modalidades, a sequência heteróloga pode fornecer uma marcação (ou seja, a sequência heteróloga é um marcador detectável) para facilitar o rastreamento e/ou purificação (por exemplo, uma proteína fluorescente, por exemplo, a proteína verde fluorescente (GFP), YFP, RFP, PCP, mCherry, tdTomato e semelhantes; uma histidina tag, por exemplo, uma marcação de 6XHis; uma marcação de hemaglutinina (HA); um tag FLAG; uma marcação Myc; e semelhantes). Em algumas modalidades, a sequência heteróloga pode fornecer estabilidade aumentada ou reduzida (isto é, a sequência heteróloga é um peptídeo de controle de estabilidade, por exemplo, um degron, que, em alguns casos, é controlável (por exemplo, uma sequência degron sensível à temperatura ou controlável por droga, ver abaixo). Em algumas modalidades, a sequência heteróloga pode fornecer transcrição aumentada ou reduzida do DNA alvo (ou seja, a sequência heteróloga é uma sequência de modulação de transcrição, por exemplo, um fator de transcrição/ativador ou um fragmento do mesmo, uma proteína ou fragmento que recruta um fator de transcrição/ativador, um repressor da transcrição ou um fragmento do mesmo, uma proteína ou fragmento que recruta um repressor da transcrição, um regulador de transcrição de pequena molécula/responsivo à droga, etc.). Em algumas modalidades, a sequência heteróloga pode fornecer um domínio de ligação (ou seja, a sequência heteróloga é uma sequência da proteína de ligação, por exemplo, para fornecer a capacidade de um polipeptídeo quimérico dCas9 para ligar a outra proteína de interesse, por exemplo, um DNA ou proteínas modificadoras de histona, um repressor de transcrição ou de fator transcrição, uma proteína de recrutamento, etc.).
[0458] Parceiros de fusão apropriados que fornece estabilidade aumentada ou reduzida incluem, entre outros sequências de degron. Degrons são prontamente compreendidos por um especialista na técnica sendo sequências de aminoácidos que controlam a estabilidade da proteína da qual fazem parte. Por exemplo, a estabilidade de uma proteína composta por uma sequência de degron é controlada pelo menos em parte pela sequência degron. Em alguns casos, um degron apropriado é constitutivo, tal que o degron exerce sua influência sobre a estabilidade da proteína independente de controle experimental (ou seja, o degron não é induzível por temperatura, induzível por droga, etc.). Em alguns casos, o degron fornece o polipeptídeo Cas9 variante com estabilidade controlável de tal modo que o polipeptídeo Cas9 variante pode ser transformado “on” (ou seja, estável) ou “off” (ou seja, instável, degradada) dependendo das condições desejadas. Por exemplo, se o degron é um degron sensível à temperatura, o polipeptídeo Cas9 variante pode ser funcional (ou seja, “on”, estável) abaixo de uma temperatura limite (por exemplo, 42°C, 41°C, 40°C, 39°C, 38°C, 37°C, 36°C, 35°C, 34°C, 33°C, 32°C, 31°C, 30°C, etc.), mas não funcional (ou seja, “off”, degradada) acima da temperatura limite. Como outro exemplo, se o degron é um degron induzível por droga, a presença ou ausência de drogas pode alternar a proteína de um estado “off” (ou seja, instável) para um estado “on” (ou seja, estável) ou vice-versa. Um degron induzível por drogas exemplar é derivado da proteína de FKBP12. A estabilidade da degron é controlada pela presença ou ausência de uma pequena molécula que liga ao degron.
[0459] Exemplos de degrons apropriados incluem, entre outros esses degrons controlados pelo Shield-1, DHFR, auxinas, e/ou temperatura. Exemplos não limitantes de degrons apropriados são conhecidos na técnica (por exemplo, Dohmen et al., Science, 1994. 263(5151): p. 1273-1276: Heat-inducible degron: a method for constructing temperature-sensitive mutants; Schoeber et al., Am J Physiol Renal Physiol. 2009 Jan;296(1):F204-11 : Conditional fast expression and function of multimeric TRPV5 channels using Shield-1 ; Chu et al., Bioorg Med Chem Lett. 2008 Nov 15;18(22):5941-4: Recent progress with FKBP-derived destabilizing domains; Kanemaki, Pflugers Arch. 2012 Dec 28: Frontiers of protein expression control with conditional degrons; Yang et al., Mol Cell. 2012 Nov 30;48(4):487-8: Titivated for destruction: the methyl degron; Barbour et al., Biosci Rep. 2013 Jan 18;33(1).: Characterization of the bipartite degron that regulates ubiquitin-independent degradation of thymidylate synthase; and Greussing et al., J Vis Exp. 2012 Nov 10;(69): Monitoring of ubiquitin-proteasome activity in living cells using a Degron (dgn)-destabilized green fluorescent protein (GFP)- based reporter protein; todos os quais são aqui incorporados em sua totalidade por referência).
[0460] Sequências degron exemplares foram bem caracterizadas e testadas em células e animais. Assim, fusão de dCas9 para uma sequência degron produz um polipeptídeo dCas9 “sintonizável” e “induzível”. Qualquer um dos parceiros de fusão aqui descritos pode ser usado em qualquer combinação desejável. Como um exemplo não limitante para ilustrar este ponto, uma proteína de fusão dCas9 pode incluir uma sequência YFP para detecção, uma sequência de degron para a estabilidade e a sequência ativadora da transcrição para aumentar a transcrição do DNA alvo. Além disso, o número de parceiros de fusão que podem ser usados em uma proteína de fusão dCas9 é ilimitado. Em alguns casos, uma proteína de fusão dCas9 compreende uma ou mais (por exemplo, duas ou mais, três ou mais, quatro ou mais, ou cinco ou mais) sequências heterólogos.
[0461] Parceiros de fusão adequados incluem,entre outros, um polipeptídeo que fornece atividade metiltransferase, atividade demetilase, atividade acetiltransferase, atividade deacetilase, atividade da quinase, atividade da fosfatase, atividade de ubiquitina ligase, atividade deubiquitinação, atividade adenilação, atividade desadenilação, atividade SUMOilação, atividade desSUMOilação, atividade ribosilação, atividade desribosilação, atividade miristoilação ou atividade demiristoilação, qualquer uma das quais pode ser direcionada, na modificação do DNA diretamente (por exemplo, a metilação do DNA) ou em modificador um polipeptídeo associado ao DNA (por exemplo, uma histona ou ligação à proteína do DNA). Outros parceiros de fusão adequados incluem, entre outros, os elementos de limite (por exemplo, CTCF), proteínas e fragmentos das mesmas que fornecem o recrutamento de periferia (por exemplo, lamina A, lamina B, etc.) e elementos de acoplamento à proteína (por exemplo, FKBP/FRB, Pil1/Aby1, etc.).
[0462] Exemplos de vários parceiros de fusão apropriados adicionais (ou respectivos fragmentos) para um polipeptídeo direcionado ao sítio de Cas9 variante objeto incluem, entre outros, aqueles listados na Figura 54.
[0463] Em algumas modalidades, um polipeptídeo modificador direcionado ao sítio objeto pode ser otimizado por códon. Este tipo de otimização é conhecido na técnica e implica a mutação do DNA derivado de estrangeiro para imitar as preferências de códon do organismo hospedeiro pretendido ou célula enquanto codifica a mesma proteína. Assim, os códons são alterados, mas a proteína codificada permanece inalterada. Por exemplo, se a célula alvo pretendida era uma célula humana, uma dCas9 humana otimizada por códon (ou dCas9 variante) seria um polipeptídeo modificador apropriado direcionado ao sítio. Como outro exemplo não limitante, se a célula hospedeira pretendida fosse uma célula de camundongo, do que um Cas9 otimizado por códon de camundongo (ou variante, por exemplo, variante enzimaticamente inativa) seria polipeptídeo direcionado ao sítio Cas9 apropriado. Enquanto a otimização por códon não é necessária, é aceitável e pode ser preferencial, em certos casos.
Células hospedeiras
[0464] Um método da presente divulgação para modular a transcrição pode ser empregado para induzir modulação de transcrição em células mitóticas ou pós mitóticas in vivo e/ou ex vivo e/ou in vitro. Porque o RNA tendo DNA como alvo fornece especificidade por hibridização de DNA alvo, uma célula mitótica e/ou pós-mitótica pode ser qualquer de uma variedade de célula hospedeira, onde as células do hospedeiro adequado incluem, entre outros, uma célula bacteriana; uma célula de Archaea; um organism eucariótico unicelular; uma célula vegetal; um célula de alga, por exemplo, Botryococcus braunii, Chlamydomonas reinhardtii, Nannochloropsis gaditana, Chlorella pyrenoidosa, Sargassum patens, C. agardh, e semelhantes; uma célula fúngica; uma célula animal e uma célula de um animal invertebrado (por exemplo, um inseto, um cnidários, um equinodermo, um nematódeo, etc.); um parasita eucariota (por exemplo, um parasita da malária, por exemplo, Plasmodium falciparum; um helminto; etc.); uma célula de um animal vertebrado (por exemplo, peixes, anfíbios, répteis, pássaro, mamífero); uma célula mamífera, por exemplo, uma célula de roedor, uma célula humana, uma célula de primatas não humanos, etc.As células do hospedeiro adequado incluem células de ocorrência natural; células geneticamente modificadas (por exemplo, as células geneticamente modificadas em um laboratório, por exemplo, pela “mão do homem”); e células manipuladas in vitro de qualquer maneira. Em alguns casos, uma célula hospedeira é isolada.
[0465] Qualquer tipo de célula pode ser de interesse (por exemplo, uma célula-tronco, por exemplo, uma célula-tronco embrionárias (ES), uma célula-tronco pluripotentes induzida (iPS), uma célula germinativa; uma célula somática, por exemplo, um fibroblasto, uma célula hematopoiética, um neurônio, uma célula muscular, uma célula óssea, um hepatócito, uma célula pancreática; uma célula embrionária in vitro ou in vivo de um embrião em qualquer fase, por exemplo, um embrião de peixe zebra de fase de 1 célula, 2 células, 4 células, 8 células etc.). As células podem ser de linhagens celulares estabelecidas ou podem ser as células primárias, onde “as células primárias”, “linhagens de célula primária” e “culturas primárias” são usadas de modo intercambiável aqui para se referir às células e culturas de células que foram derivadas de um sujeito e deixas crescer in vitro por um número limitado de passagens, ou seja, divisões, da cultura. Por exemplo, culturas primárias incluem culturas que podem ter sido passadas 10 vezes, 1 vez, 2 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 10 vezes ou 15 vezes, mas não muitas vezes passam a fase de crise. Linhagens primárias de células podem ser mantidas por menos de 10 passagens in vitro. As células alvo são em muitas modalidades organismos unicelulares, ou são cultivadas em cultura.
[0466] Se as células são células primárias, tais células podem ser coletadas de um indivíduo por qualquer método conveniente. Por exemplo, leucócitos podem convenientemente coletados por aférese, leucocitaferese, separação de gradiente de densidade, etc., enquanto as células de tecidos como pele, músculos, medula óssea, baço, fígado, pâncreas, pulmão, estômago, intestino, etc. são mais convenientemente coletadas por biópsia. Uma solução adequada pode ser utilizada para dispersão ou suspensão das células coletadas. Geralmente tal solução será uma solução salina equilibrada, por exemplo, salina, salina tampão fosfato (PBS), solução de sal equilibrada por Hank, etc., convenientemente suplementada com soro fetal de bezerro ou outros fatores naturais, em conjunto com um tampão aceitável em baixa concentração, por exemplo, de 5 a 25 mM. Tampões convenientes incluem HEPES, tampões fosfato, tampoes lactato, etc. As células podem ser usadas imediatamente, ou podem ser armazenadas, congeladas por longos períodos de tempo, sendo descongeladas e capazes de serem reutilizadas. Em tais casos, as células serão geralmente congeladas em 10% dimetilsulfóxido (DMSO), 50% de soro, meio 40% em tampão ou alguma outra dita solução como é utilizado na técnica de preservar as células em tais temperaturas congelantes e descongeladas em uma maneira como comumente conhecido na técnica para descongelar células congeladas cultivadas.
Introdução de ácidos nucleicos em uma célula hospedeira
[0467] RNA tendo DNA como alvo, ou um ácido nucleico constituído por uma sequência de nucleotídeos que codifica o mesmo, pode ser introduzido em uma célula hospedeira, por qualquer de uma variedade de métodos conhecidos. Da mesma forma, quando um método objeto envolve a introdução em uma célula hospedeira de um ácido nucleico constituído por uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo Cas9 variante direcionado ao sítio, dito um ácido nucleico pode ser introduzido em uma célula hospedeira por qualquer de uma variedade de métodos conhecidos.
[0468] Métodos de introdução de um ácido nucleico em uma célula hospedeira são conhecidos na técnica, e qualquer método conhecido pode ser usado para introduzir um ácido nucleico (por exemplo, um constructo de expressão) em uma célula-tronco ou célula progenitora. Métodos adequados incluem, por exemplo, transfecção viral ou infecção do bacteriófago, conjugação, fusão de protoplastos, lipofecção, eletroporação, precipitação de fosfato de cálcio, transfecção mediada por polietilenoimina (PEI), transfecção mediada por DEAE-dextrano, transfecção mediada por lipossomas, tecnologia pistola de partículas, precipitação de fosfato de cálcio, microinjeção direta, liberação de ácido nucleico mediada por nanopartículas (ver, por exemplo, Panyam et., al Adv Drug Deliv Rev. 2012 Sep 13. pii: S0169-409X(12)00283-9. doi: 10.1016/j.addr.2012.09.023 ), e semelhantes.
ÁCIDOS NUCLEICOS
[0469] A presente divulgação fornece um ácido nucleico isolado, composto por uma sequência de nucleotídeos que codifica um RNA tendo DNA como alvo objeto. Em alguns casos, um ácido nucleico objeto também compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo Cas9 variante direcionado ao sítio.
[0470] Em algumas modalidades, um método objeto envolve a introdução em uma célula hospedeira (ou uma população de células hospedeiras) de um ou mais ácidos nucleicos compreendendo sequências de nucleotídeo que codificam um RNA tendo DNA como alvo e/ou um polipeptídeo direcionado ao sítio Cas9 variante. Em algumas modalidades uma célula composta por um DNA alvo é in vitro. Em algumas modalidades uma célula composta por um DNA alvo é in vivo. Ácidos nucleicos adequados, compostos por sequências de nucleotídeos codificam um RNA tendo DNA como alvo e/ou um polipeptídeo direcionado ao sítio incluem vetores de expressão, onde um vetor de expressão, composto por uma sequência de nucleotídeos que codifica um RNA tendo DNA como alvo e/ou um polipeptídeo direcionado ao sítio é um “vetor de expressão recombinante.”
[0471] Em algumas modalidades, o vetor de expressão recombinante é uma construção viral, por exemplo, um constructo de vírus adeno-associado recombinante (ver, por exemplo, Patente US 7.078.387), um constructo de adenovírus recombinante, um constructo de Lentivírus recombinante, um constructo retroviral recombinante, etc.
[0472] Vetores de expressão adequados incluem,entre outros, vetores virais (por exemplo, vetores virais com base no vírus vaccinia; poliovírus; adenovírus (ver, por exemplo, Li et al., Invest Opthalmol Vis Sci 35:2543 2549, 1994; Borras et al., Gene Ther 6:515 524, 1999; Li and Davidson, PNAS 92:7700 7704, 1995; Sakamoto et al., H Gene Ther 5:1088 1097, 1999; WO 94/12649, WO 93/03769; WO 93/19191; WO 94/28938; WO 95/11984 e WO 95/00655); vírus adeno-associado (ver, por exemplo, Ali et al., Hum Gene Ther 9:81 86, 1998, Flannery et al., PNAS 94:6916 6921, 1997; Bennett et al., Invest Opthalmol Vis Sci 38:2857 2863, 1997; Jomary et al., Gene Ther 4:683 690, 1997, Rolling et al., Hum Gene Ther 10:641 648, 1999; Ali et al., Hum Mol Genet 5:591 594, 1996; Srivastava in WO 93/09239, Samulski et al., J. Vir. (1989) 63:3822-3828; Mendelson et al., Virol. (1988) 166:154-165; and Flotte et al., PNAS (1993) 90:10613-10617); SV40; vírus herpes simplex; vírus de imunodeficiência humana (ver, por exemplo, Miyoshi et al., PNAS 94:10319 23, 1997; Takahashi et al., J Virol 73:7812 7816, 1999); um vetor retroviral (por exemplo, vírus leucemia murino, vírus de necrose do baço e vetores derivados de retrovírus como vírus Rous Sarcoma, vírus do Sarcoma de Harvey, vírus da leucose aviária, um lentivírus, vírus da imunodeficiência humana, vírus do sarcoma mieloproliferativa e vírus do tumor mamário); e semelhantes.
[0473] Inúmeros vetores de expressão adequados são conhecidos por especialistas na técnica, e muitos estão comercialmente disponíveis. Os seguintes vetores são fornecidos a título de exemplo; para as células hospedeiras eucarióticas: pXT1, pSG5 (Stratagene), pSVK3, pBPV, pMSG, and pSVLSV40 (Pharmacia). No entanto, qualquer outro vetor pode ser usado, desde que seja compatível com a célula hospedeira.
[0474] Dependendo do sistema hospedeiro/vetor utilizado, qualquer um de um número elementos de controle de transcrição e de tradução adequados, incluindo promotores constitutivos e induzíveis, elementos potencializadores de transcrição, terminadores de transcrição, etc. podem ser utilizados no vetor de expressão (ver, por exemplo, Bitter et al. (1987) Methods in Enzymology, 153:516-544).
[0475] Em algumas modalidades, uma sequência de nucleotídeos que codifica um RNA tendo DNA como alvo e/ou um polipeptídeo direcionado ao sítio Cas9 variante operacionalmente está ligada a um elemento de controle, por exemplo, um elemento de controle de transcrição, como um promotor. O elemento de controle de transcrição pode ser funcional em qualquer uma célula eucariota, por exemplo, uma célula mamífera; ou uma célula procariótica (por exemplo, a célula bacteriana ou Archaea). Em algumas modalidades, uma sequência de nucleotídeos que codifica um RNA tendo DNA como alvo e/ou uma polipeptídeo direcionado ao sítio variante Cas9 operacionalmente está ligada a vários elementos de controle que permitem a expressão da sequência de nucleotídeos que codifica um RNA tendo DNA como alvo e/ou um polipeptídeo direcionado ao sítio Cas9 variante em células procariotas e eucariotas.
[0476] Um promotor pode ser um promotor constitutivamente ativo (ou seja, um promotor que é constitutivamente em um estado ativo/”ON”), pode ser um promotor induzível (ou seja, um promotor cujo estado, ativo/“ON” ou inativo/“OFF”, é controlado por um estímulo externo, por exemplo, a presença de uma determinada temperatura, composto ou proteína.), pode ser um promotor espacialmente restrito (ou seja, elemento de controle de transcrição, etc.) (por exemplo, promotor específico de tecido, promotor específico de tipo de célula, etc.), e pode ser um promotor temporalmente restrito (ou seja, o promotor está no estado “ON” ou estado “OFF” durante as fases específicas do desenvolvimento embrionário ou durante as fases específicas de um processo biológico, por exemplo, ciclo de folículo piloso em camundongos).
[0477] Promotores apropriados podem ser derivados de vírus e, portanto, podem ser referidos como promotores virais, ou podem ser derivados de qualquer organismo, incluindo organismos procariotas ou eucariotas. Promotores apropriados podem ser usados para dirigir a expressão por qualquer RNA polimerase (por exemplo, pol I, pol II, pol III). Promotores exemplares incluem, entre outros, ao promotor precoce SV40, promotor de repetição de terminal longo de vírus do tumor mamário de camundongos (LTR) mouse; promotor tardio de adenovírus principal (Ad MLP); um promotor de vírus herpes simplex (HSV), um promotor de citomegalovírus (CMV) como região promotora precoce de início imediato de CMV (CMVIE), um promotor de vírus rous sarcoma (RSV), um promotor nuclear pequeno U6 humano (U6) (Miyagishi et al, Nature Biotechnology 20, 497-500 (2002)), um promotor de U6 aprimorado (por exemplo, Xia et al., Nucleic Acids Res. 2003 Sep 1;31(17)), um promotor humano H1 (H1) e semelhantes.
[0478] Exemplos de promotores induzíveis incluem, entre outros, promotor T7RNA polimerase, promotor T3RNA polimerase, promotor regulado por isopropil-beta-D- tiogalactopiranosídeo (IPTG), promotor induzido por pelo, promotor de choque do calor, promotor de regulado por tetraciclina (por exemplo, Tet-ON, Tet-OFF, etc), Promotor de regulado por esteroide, promotor regulado por metal, promotor regulado por receptor de estrogênio, etc. Promotores induzíveis, portanto, podem ser regulados por moléculas, incluindo, entre outras, doxiciclina; RNA polimerase, por exemplo, T7 RNA polimerase; um receptor de estrogênio; uma fusão de receptor de estrogênio; etc.
[0479] Em algumas modalidades, o promotor é um promotor espacialmente restrito (ou seja, promotor específico de tipo de célula, promotor específico de tecido, etc.), tal que em um organismo multicelular, o promotor está ativo (isto é, “ON”) em um subconjunto de células específicas. Promotores espacialmente restritos também podem ser referidos como potencializadores, elementos de controle de transcrição, sequências de controle, etc. Qualquer promotor espacialmente restrito conveniente pode ser usado e a escolha do promotor apropriado (por exemplo, um promotor específico do cérebro, um promotor que direciona a expressão em um subconjunto de neurônios, um promotor que impulsiona a expressão na linhagem germinativa, um promotor que direciona a expressão nos pulmões, um promotor que direciona a expressão nos músculos, um promotor que direciona a expressão em células das ilhotas do pâncreas, etc.) vai depender do organismo. Por exemplo, vários promotores espacialmente restritos são conhecidos para plantas, moscas, minhocas, mamíferos, ratos, etc. Assim, um promotor espacialmente restrito pode ser usado para regular a expressão de um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo objeto direcionado ao sítio em uma ampla variedade de tecidos diferentes e tipos de células, dependendo do organismo. Alguns promotores espacialmente restritos também são temporalmente restritos, tal que o promotor está no estado “ON” ou estado “OFF” durante fases específicas do desenvolvimento embrionário ou durante as fases específicas de um processo biológico (por exemplo, folículo piloso ciclo em camundongos).
[0480] Para fins de ilustração, exemplos de promotores espacialmente restritos incluem, entre outros, promotores específicos de neurônios, promotores específicos dos adipócitos, promotores específicos de cardiomiócitos, promotores específicos de músculo liso, promotores específicos fotorreceptores, etc. Promotores espacialmente restritos de neurônio específicos incluem, entre outros, um promotor de enolase específica de neurônio (NSE) (ver, por exemplo, HSENO2 de EMBL, X 51956); um promotor de aminoácido aromático descarboxilase (AADC); um promotor de neurofilamento (ver, por exemplo, GenBank HUMNFL, L04147); um promotor sinapsina (ver, por exemplo, GenBank HUMSYNIB, M55301); um promotor de thy-1 (ver, por exemplo, Chen et al. (1987) Cell 51:7-19; e Llewellyn, et al. (2010) Nat. Med. 16(10):1161-1166); um promotor de receptores de serotonina (ver, por exemplo, GenBank S62283); um promotor tirosina hidroxilase (TH) (ver, por exemplo, Oh et al. (2009) Gene Ther 16:437; Sasaoka et al. (1992) Mol. Brain Res. 16:274; Boundy et al. (1998) J. Neurosci. 18:9989; e Kaneda et al. (1991) Neuron 6:583-594); um promotor de GnRH (ver, por exemplo, Radovick et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:3402-3406); um promotor L7 (ver, por exemplo, Oberdick et al. (1990) Science 248:223-226); um promotor DNMT (ver, por exemplo, Bartge et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:3648-3652); um promotor de encefalina (ver, por exemplo, Comb et al. (1988) EMBO J. 17:3793-3805); um promotor de proteína básica de mielina (MBP); um promotor de proteína quinase alfa II dependente de calmodulina Ca2+ (ver, por exemplo, Mayford et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:13250; e Casanova et al. (2001) Genesis 31:37); um promotor de potencializador CMV/fator de crescimento derivado de plaqueta β (ver, por exemplo, Liu et al. (2004) Gene Therapy 11:52-60); e semelhantes.
[0481] Promotores específicas dos adipócitos espacialmente restritos incluem, entre outros um promotor gene aP2/potencializador, por exemplo, uma região de-5.4 kb para + 21 bp de um gene humano aP2 (ver, por exemplo, Tozzo et al. (1997) Endocrinol. 138:1604; Ross et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:9590; e Pavjani et al. (2005) Nat. Med. 11:797); um promotor de transporte de glicose 4 (GLUT4) (ver, por exemplo, Knight et al. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:14725); um promotor de ácido graxo translocase (FAT/CD36) (ver, por exemplo, Kuriki et al. (2002) Biol. Pharm. Bull. 25:1476; e Sato et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:15703); um promotor de estearoil-CoA desaturase-1 (SCD1) (Tabor et al. (1999) J. Biol. Chem. 274:20603); um promotor de leptina (ver, por exemplo, Mason et al. (1998) Endocrinol. 139:1013; e Chen et al. (1999) Biochem. Biophys. Res. Comm. 262:187); um promotor de adiponectina (ver, por exemplo, Kita et al. (2005) Biochem. Biophys. Res. Comm. 331:484; e Chakrabarti (2010) Endocrinol. 151:2408); um promotor de adipsina (ver, por exemplo, Platt et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:7490); um promotor de resistina (ver, por exemplo, Seo et al. (2003) Molec. Endocrinol. 17:1522); e semelhantes.
[0482] Promotores específicos de cardiomiócitos espacialmente restritos incluem, entre outros para sequências de controle derivadas dos seguintes genes: cadeia leve de miosina-2, cadeia pesada de α-miosina, AE3, troponina cardíaca C, actina cardíaca e semelhantes. Franz et al. (1997) Cardiovasc. Res. 35:560-566; Robbins et al. (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci. 752:492-505; Linn et al. (1995) Circ. Res. 76:584-591; Parmacek et al. (1994) Mol. Cell. Biol. 14:1870-1885; Hunter et al. (1993) Hypertension 22:608-617; e Sartorelli et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4047-4051.
[0483] Promotores de músculo liso específicos espacialmente restringidos incluem, entre outros um promotor de SM22α (ver, por exemplo, Akyürek et al. (2000) Mol. Med. 6:983; e Patente US 7.169.874); um promotor de smootelina (ver, por exemplo, WO 2001/018048); um promotor de actina do músculo liso α; e semelhantes. Por exemplo, uma região de 0,4 kb do promotor SM22α, dentro do qual estão dois elementos de CArG, demonstrou mediar a expressão específica de células do músculo liso vascular (ver, por exemplo, Kim, et al. (1997) Mol. Cell. Biol. 17, 2266-2278; Li, et al., (1996) J. Cell Biol. 132, 849-859; e Moessler, et al. (1996) Development 122, 2415-2425).
[0484] Promotores fotorreceptoras específicos espacialmente restringidos incluem, entre outros, um promotor de rodopsina; promotor de rodopsina quinase (Young et al. (2003) Ophthalmol. Vis. Sci. 44:4076); um promotor de gene beta fosfodiesterase (Nicoud et al. (2007) J. Gene Med. 9:1015); um promotor do gene de retinite pigmentosa (Nicoud et al. (2007) supra); um intensificador de gene de proteína de ligação a retinoide interfotorreceptor (IRBP) (Nicoud et al. (2007) supra); um promotor do gene IRBP (Yokoyama et al. (1992) Exp Eye Res. 55:225); e semelhantes.
BIBLIOTECAS
[0485] A presente divulgação fornece uma biblioteca de RNAs tendo DNA como alvo. A presente divulgação fornece uma biblioteca de ácidos nucleicos, composta por nucleotídeos RNAs tendo DNA como alvo de codificação. Uma biblioteca objeto de ácidos nucleicos, composta por nucleotídeos que codificam RNAs tendo DNA como alvo pode compreender uma biblioteca de vetores de expressão recombinante composta por nucleotídeos que codificam RNAs tendo DNA como alvo.
[0486] Uma biblioteca objeto pode incluir de cerca de 10 membros individuais a cerca de 1012 membros individuais; por exemplo, uma biblioteca objeto pode incluir de cerca de 10 membros individuais de cerca de 102 membros individuais, de cerca de membros individuais; por exemplo, uma biblioteca objeto pode incluir de cerca de 10 membros individuais de cerca de 102 membros individuais, de cerca de 10 2 membros individuais de cerca de 102 membros individuais, de cerca de 103 membros individuais, de cerca de 103 membros individuais, de cerca de 105 membros individuais, de cerca de 105 membros individuais, de cerca de 107 membros individuais, de cerca de 107 membros individuais, de cerca de 109 membros individuais, ou de cerca de 109 membros individuais, de cerca de 1012 membros individuais.
[0487] Um “membro individual” de uma biblioteca objeto difere de outros membros da biblioteca na sequência de nucleotídeos do segmento de DNA alvo do RNA tendo DNA como alvo. Assim, por exemplo, cada membro individual da biblioteca objeto pode incluir a mesma, ou substancialmente a mesma sequência de nucleotídeos do segmento de ligação às proteínas como todos os outros membros da biblioteca; e pode incluir a mesma, ou substancialmente a mesma sequência de nucleotídeos do segmento de terminação de transcrição como todos os outros membros da biblioteca; mas difere de outros membros da biblioteca na sequência de nucleotídeos do DNA alvejando o segmento do RNA tendo DNA como alvo. Desta forma, a biblioteca pode incluir membros que se ligam aos ácidos nucleicos alvos diferentes.
UTILIDADE
[0488] Um método de modulação da transcrição de acordo com a presente divulgação encontra uso em uma variedade de aplicações, que também são fornecidas. As aplicações incluem aplicações de pesquisa; aplicações diagnósticas; aplicações industriais; e aplicações de tratamento.
[0489] Aplicações de pesquisa incluem, por exemplo, determinar o efeito de redução ou aumento da transcrição de um ácido nucleico alvo em, por exemplo, desenvolvimento, metabolismo, expressão de um gene a jusante e semelhantes.
[0490] Análise genômica de alto rendimento pode ser realizada usando um método de modulação de transcrição objeto, em que apenas o segmento tendo DNA como alvo do RNA tendo DNA como alvo precisa ser variado, enquanto o segmento de ligação de proteínas e o segmento de terminação da transcrição podem (em alguns casos) ser mantidos constantes. Uma biblioteca (por exemplo, uma biblioteca objeto), compreendendo uma pluralidade de ácidos nucleicos, usados na análise genômica incluiria: um promotor operacionalmente ligado a uma sequência de nucleotídeos que codifica RNA tendo DNA como alvo, onde cada ácido nucleico incluiria um segmento tendo DNA como alvo diferente, um segmento de ligação às proteínas comum e um segmento de terminação da transcrição comum. Um chip pode conter mais de 5 x 104 RNAs tendo DNA únicos como alvo. Aplicações incluem fenotipagem em grande escala, mapeamento de gene para função e análise metagenômica.
[0491] Os métodos objetos aqui divulgados encontram utilidade no campo da engenharia metabólica. Porque os níveis de transcrição podem ser eficientemente e previsivelmente controlados ao projetar um RNA tendo DNA como alvo apropriado, conforme divulgado aqui, a atividade das vias metabólicas (por exemplo, vias biossintéticas) pode ser precisamente controlada e sintonizada, controlando o nível de enzimas específicas (por exemplo, através do da transcrição aumentada ou reduzida) dentro de uma via metabólica de interesse. Vias metabólicas de interesse incluem aqueles usados para química (produtos da química fina, combustível, antibióticos, toxinas, agonistas, antagonistas, etc.) e/ou produção de drogas.
[0492] Vias biossintéticas de interesse incluem entre outros (1) a via do mevalonato (por exemplo, via de HMG-CoA redutase) (converte a acetil-CoA, pirofosfato de dimetilalil (DMAPP) e pirofosfato de isopentenil (IPP), que são usados para a biossíntese de uma grande variedade de biomoléculas incluindo terpenoides/isoprenoides), (2) via do não mevalonato (ou seja, o “2-C-metil-D-eritritol 4- fosfato/1-deoxi-D-Xilulose 5-fosfato” ou “Via MEP/DOXP” ou “via DXP”) (também produz DMAPP e IPP em vez disso, convertendo piruvato e gliceraldeído 3-fosfato em DMAPP e IPP através de uma via alternativa para a via do mevalonato), (3) a via de síntese de policetídeo (produz uma variedade de policetídeos através de uma variedade de enzimas de policetídeo sintase. Policetídeos incluem pequenas moléculas de ocorrência natural usadas para quimioterapia (por exemplo, tetraciclina e macrolídeos) e policetídeos industrialmente importantes incluem rapamicina (imunossupressor), eritromicina (antibiótico), lovastatina (droga anticolesterol) e epotilona B (droga anticancerígena)), (4) vias de síntese de ácidos graxos, (5) a via de síntese DAHP (3-deoxi-D-arabino-heptulosonate 7-fosfato), (6) vias que produzem potencial de biocombustíveis (como alcoóis de cadeia curta e alcano, ésteres metílicos de ácidos graxos e alcoóis graxosisoprenoides, etc.), etc.
Redes e cascatas
[0493] Os métodos divulgados aqui podem ser usados para projetar redes integradas (ou seja, uma cascata ou cascatas) de controle. Por exemplo, um RNA tendo DNA como alvo objeto/polipeptídeo direcionado ao sítio Cas9 variante pode ser utilizado para controle (isto é, modular, por exemplo, aumentar, diminuir) a expressão de outro RNA tendo DNA como alvo ou outro polipeptídeo Cas9 variante direcionado ao sítio objeto. Por exemplo, um primeiro RNA tendo DNA como alvo pode ser projetado para atingir a modulação da transcrição de um segundo polipeptídeo quimérico dCas9 com uma função que é diferente do primeira polipeptídeo direcionado ao sítio de Cas9 variante (por exemplo, atividade metiltransferase, atividade demetilase, acetiltansferase atividade, atividade deacetilase, etc.). Além disso, porque diferentes proteínas dCas9 (por exemplo, derivadas de espécies diferentes) podem exigir um identificador de Cas9 diferente (ou seja, segmento de ligação da proteína), o segundo polipeptídeo dCas9 quimérico pode ser derivado de uma espécie diferente do primeiro polipeptídeo dCas9 acima. Assim, em alguns casos, o segundo polipeptídeo dCas9 quimérico pode ser selecionado, de tal modo que pode não interagir com o primeiro RNA tendo DNA como alvo. Em outros casos, o segundo polipeptídeo dCas9 quimérico pode ser selecionado de tal modo que interage com o primeiro RNA tendo DNA como alvo. Em alguns desses casos, as atividades de dois proteínas dCas9 (ou mais) podem competir (por exemplo, se os polipeptídeos têm atividades de oposição) ou pode ter sinergia (por exemplo, se os polipeptídeos têm atividades similares ou sinérgicas). Da mesma forma, como mencionado acima, qualquer um dos complexos (ou seja, RNA tendo DNA como alvo/polipeptídeo dCas9) na rede pode ser projetado para controlar outros RNAs tendo DNA como alvo ou polipeptídeos dCas9. Porque um RNA tendo DNA como alvo objeto e polipeptídeo direcionado ao sítio de Cas9 variante objeto pode ser direcionado para qualquer sequência de DNA desejada, os métodos descritos aqui podem ser usados para controlar e regular a expressão de qualquer alvo desejado. As redes integradas (ou seja, cascatas de interações) que podem ser projetadas variam de muito simples até muito complexas e são sem limite.
[0494] Em uma rede onde dois ou mais componentes (por exemplo, RNAs tendo DNA como alvo, RNA ativadores, RNA direcionadores ou polipeptídeos dCas9) cada um sob controle regulamentar do outro complexo de RNA tendo DNA como alvo/polipeptídeo dCas9, o nível de expressão de um componente da rede pode afetar o nível de expressão (por exemplo, pode aumentar ou diminuir a expressão) de outro componente da rede. Por este mecanismo, a expressão de um componente pode afetar a expressão de um componente diferente na mesma rede, e a rede pode incluir uma mistura de componentes que aumentam a expressão de outros componentes, bem como componentes que diminuem a expressão dos outros componentes. Como seria facilmente entendido por um especialista na técnica, os exemplos acima, nos quais o nível de expressão de um componente pode afetar o nível de expressão de um ou mais componentes diferentes são para fins ilustrativos e não limitantes. Uma camada adicional de complexidade pode ser introduzida, opcionalmente, uma rede, quando um ou mais componentes são modificados (como descrito acima) para serem manipuláveis (ou seja, sob controle experimental, por exemplo, controle de temperatura; controle de drogas, ou seja, controle induzível por drogas; controle de luz etc.).
[0495] Como um exemplo não limitante, um primeiro RNA tendo DNA como alvo pode ligar ao promotor de um segundo RNA tendo DNA como alvo, que controla a expressão de um gene terapêutico/metabólica alvo. Nesse caso, a expressão condicional do primeiro RNA tendo DNA como alvo indiretamente ativa o gene terapêutico/metabólico. Cascatas de RNA deste tipo são úteis, por exemplo, para converter facilmente um repressor em um ativador e podem ser usadas para controlar a lógica ou dinâmica da expressão de um gene alvo.
[0496] Um método de modulação de transcrição objeto também pode ser usado para descoberta de drogas e validação de alvo.
KITS
[0497] A presente divulgação fornece um kit para a realização de um método objeto. Um kit objeto é composto por: a) um RNA tendo DNA como alvo da presente divulgação, ou um ácido nucleico constituído por uma sequência de nucleotídeos que codifica o RNA tendo DNA como alvo, em que o RNA tendo DNA como alvo compreende: i)) um primeiro segmento, composto por uma sequência de nucleotídeos que é complementar a uma sequência de alvo em DNA alvo; ii)) um segundo segmento que interage com um polipeptídeo direcionado ao sítio; e iii) um terminador de transcrição; e b) um tampão. Em alguns casos, o ácido nucleico constituído por uma sequência de nucleotídeos que codifica o o RNA tendo DNA como alvo mais é composta por uma sequência de nucleotídeos que codificam uma polipeptídeo direcionado ao sítio Cas9 variante que apresenta reduzida atividade endodeoxiribonuclease em relação ao Cas9 tipo selvagem.
[0498] Em alguns casos, um kit objeto mais compreende ainda um polipeptídeo direcionado ao sítio Cas9 variante que apresenta reduzida atividade endodeoxiribonuclease em relação ao Cas9 tipo selvagem.
[0499] Em alguns casos, um kit objeto ainda é composto por um ácido nucleico constituído por uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo direcionado ao sítio Cas9 variante que apresenta reduzida atividade endodeoxiribonuclease em relação ao Cas9 tipo selvagem.
[0500] Um objeto pode ainda incluir um ou mais reagentes adicionais, onde tais reagentes adicionais podem ser selecionados em: um tampão de um tampão de lavagem; um reagente controle; um vetor de expressão de controle ou polinucleotídeo RNA; um reagente para produção in vitro do polipeptídeo Cas9 variante direcionado ao sítio do DNA; e semelhantes. Em alguns casos, o polipeptídeo direcionado ao sítio Cas9 variante incluído em um kit objeto é um polipeptídeo de fusão direcionado ao sítio Cas9 variante, conforme descrito acima.
[0501] Componentes de um kit objeto podem ser em recipientes separados; ou podem ser combinados em um único recipiente.
[0502] Além dos componentes acima mencionados, um kit objeto pode ainda incluir instruções para usar os componentes do kit para praticar os métodos objeto. As instruções para a prática de métodos o sujeito geralmente são gravadas em um meio de gravação adequado. Por exemplo, as instruções podem ser impressas sobre um substrato, como papel ou plástico, etc. Como tal, as instruções podem estar presentes nos kits como uma bula, na rotulagem do recipiente do kit ou os seus componentes (isto é, associada à embalagem ou subembalagem) etc. Em outras modalidades, as instruções estão presentes como um arquivo de dados de armazenamento eletrônico presente em um meio de armazenamento legível de computador adequado, por exemplo, CD-ROM, disquete, pendrive, etc. Em ainda outras modalidades, as instruções reais não estão presentes no kit, mas significa obter as instruções de uma fonte remota, por exemplo, através da internet, são fornecidos. Um exemplo desta modalidade é um kit que inclui um endereço web, onde as instruções podem ser visualizadas e/ou das quais as instruções podem ser baixadas. Tal como acontece com as instruções, isto significa que para obter as instruções é gravado em um substrato adequado.
EXEMPLOS
[0503] Os seguintes exemplos são apresentados a fim de fornecer aos especialistas na técnica uma divulgação completa e descrição de como preparara e usar a presente invenção e são não se destina a limitar o escopo de que os inventores consideram sua invenção nem pretende representar que os experimentos abaixo são todos ou únicos experimentos realizados. Foram envidados esforços para garantir a precisão em relação aos números usados (por exemplo, quantidades, temperatura, etc.), mas alguns erros experimentais e desvios devem ser contabilizados. Salvo indicação em contrário, as partes são partes em peso, peso molecular é a massa molecular média de peso, temperatura é em graus Celsius e pressão está próximo da atmosférica. Abreviaturas padrões podem ser usadas, por exemplo, bp, pares de base; KB, kilobase(s); pl, picolitro(s); s ou s, segundo(s); min, minuto(s); h ou h, hora(s); AA, aminoácido (s); KB, quilobase(s); BP, pares de base; NT, antissenso; i.m., intramuscular(mente); i.p., intraperitoneal(mente); s.c., subcutânea (mente); e semelhantes.
Exemplo 1: Uso de Cas9 para gerar modificações no DNA alvo. MATERIAIS E MÉTODOS Cepas bacterianas e as condições de cultura
[0504] Streptococcus pyogenes, cultivado em meio THY (caldo Todd Hewitt (THB, Bacto, Becton Dickinson) suplementado com 0,2% de extrato de levedura (Oxoid)) ou na TSA (Agar soja tripticase, BBL, Becton Dickinson), suplementado com 3% de sangue de ovelhas, foi incubado a 37°C em uma atmosfera suplementada com 5% CO2 sem agitação. Escherichia coli, cultivada em meio Luria-Bertani (LB) e ágar, foi incubada a 37°C, com agitação. Quando necessário, antibióticos apropriados foram adicionados ao meio no final com as seguintes concentrações: ampicilina, 100 μg/ml para E. coli; cloranfenicol, 33 μg/ml para Escherichia coli; canamicina, 25 μg/ml para E. coli e 300 μg/ml para S. pyogenes. Crescimento de células bacterianas foi monitorado periodicamente através da medição da densidade óptica das alíquotas de cultura a 620 nm, utilizando um leitor de microplacas (SLT Spectra Reader).
Transformação de células bacterianas
[0505] Transformação de plasmídeo em células de E. coli foi realizada de acordo com um protocolo de choque do calor. Transformação de S. pyogenes foi realizada conforme descrito anteriormente com algumas modificações. O ensaio de transformação realizado para monitorar a atividade CRISPR/Cas in vivo na manutenção do plasmídeo essencialmente foi realizado conforme descrito anteriormente. Brevemente, células eletrocompetentes de S. pyogenes foram equalizadas para a mesma densidade celular e eletroporaadas com 500 ng de DNA de plasmídeo. Cada transformação foi plaqueada duas a três vezes e o experimento foi realizado três vezes independentemente com grupos diferentes de células competentes para análise estatística. Eficiência de transformação foi calculada como UFC (unidades formadoras de colônia) por μg de DNA. Transformações de controle foram realizadas com água estéril e estrutura de vetor pEC85.
Manipulações de DNA
[0506] Manipulações de DNA, incluindo preparação de DNA, amplificação, digestão, ligação, purificação, eletroforese em gel de agarose foram realizadas de acordo com as técnicas convencionais, com pequenas modificações. Plasmídeos protoespaçadores para a clivagem in vitro e ensaios de transformação do S. pyogenes foram construídos conforme descrito anteriormente (4). Plasmídeos protoespaçadores com base em pUC19 adicionais para os ensaios de clivagem in vitro foram gerados pela ligação de oligonucleotídeos anelados entre sítios de EcoRI e BamHI digeridos em pUC19. O plasmídeo que contém o gene da GFP foi descrito anteriormente (41). Kits (Qiagen) foram utilizados para a preparação do plasmídeo e purificação de DNA. Mutagênese de plasmídeo foi realizada utilizando o kit de QuikChange ® II XL (Stratagene) ou kit de mutagênse direcionado ao sítio QuikChange (Agilent). VBC-Biotech Services, Sigma-Aldrich e Integrated DNA Technologies forneceram os oligonucleotídeos sintéticos e RNAs.
Oligonucleotídeos para modelos de transcrição in vitro
[0507] Modelos para in vitro CRISPR Tipo II-A tracrRNA transcrito e crRNAs de S. pyogenes (para tracrRNA - PCR em chr. DNA SF37 0; for crRNA - anelamento de dois oligonucleotídeos) T7-tracrRNA (75nt) OLEC1521 (F 5’ tracrRNA): SEQ ID NO:340 OLEC1522 T7-crRNA (R 3’ tracrRNA) (modelo) : SEQ ID NO:341 OLEC2176 (F crRNA-sp1): SEQ ID NO:342 OLEC2178 (R crRNA-sp1): SEQ ID NO:343 OLEC2177 (F crRNA-sp2): SEQ ID NO:344 OLEC2179 (R crRNA-sp2): SEQ ID NO:345
[0508] Modelos para in vitro N. meningitidis tracrRNA transcritos e crRNA-sp2 modificados (para tracrRNA -PCR em chr. DNA Z2491; para crRNA - anelamento de dois oligonucleotídeos) T7-tracrRNA OLEC2205 (F predito 5’): SEQ ID NO:346 OLEC2206 (R predito 3’): SEQ ID NO:347 T7-crRNA (modelo) OLEC2209 (F sp2(speM) + N.m. repetição): SEQ ID NO:348 OLEC2214 (R sp2(speM) + N.m. repetição): SEQ ID NO:349
[0509] Modelos para in vitro L. innocua tracrRNA transcrito e crRNA-sp2 modificado (para tracrRNA - PCR em chr. DNA Clip11262; para crRNA - anelamento de dois oligonucleotídeos) T7-tracrRNA OLEC2203 (F previsto 5’): SEQ ID NO:350 OLEC2204 (R previsto 3’): SEQ ID NO:351 T7-crRNA (modelo) OLEC2207 (F sp2(speM) + L.in. repetição): SEQ ID NO:352 OLEC2212 (R sp2(speM) + L.in. repetição): SEQ ID NO:353
Oligonucleotídeos para a construção de plasmídeos com protoespaçador para estudos in vitro e in vivo
[0510] Plasmídeos para análise speM (espaçador 2 (CRISPR tipo II-A, SF370; pró-fago protoespaçador ø8232.3 de MGAS8232) in vitro e in S. pyogenes (modelo: chr. DNA MGAS8232 ou plasmídeos contendo fragmentos speM ) pEC287 OLEC1555 (F speM): SEQ ID NO:354 OLEC1556 (R speM): SEQ ID NO:355 pEC488 OLEC2145 (F speM): SEQ ID NO:356 OLEC2146 (R speM): SEQ ID NO:357 pEC370 OLEC1593 (F pEC488 protoespaçador 2 A22G): SEQ ID NO:358 OLEC1594 (R pEC488 protoespaçador 2 A22G): SEQ ID NO:359 pEC371 OLEC1595 (F pEC488 protoespaçador 2 T10C): SEQ ID NO:360 OLEC1596 (R pEC488 protoespaçador 2 T10C): SEQ ID NO:361 pEC372 OLEC2185 (F pEC488 protoespaçador 2 T7A): SEQ ID NO:362 OLEC2186 (R pEC488 protoespaçador 2 T7A): SEQ ID NO:363 pEC373 OLEC2187 (F pEC488 protoespaçador 2 A6T): SEQ ID NO:364 OLEC2188 (R pEC488 protoespaçador 2 A6T): SEQ ID NO:365 pEC374 OLEC2235 (F pEC488 protoespaçador 2 A5T): SEQ ID NO:366 OLEC2236 (R pEC488 protoespaçador 2 A5T): SEQ ID NO:367 pEC375 OLEC2233 (F pEC488 protoespaçador 2 A4T): SEQ ID NO:368 OLEC2234 (R pEC488 protoespaçador 2 A4T): SEQ ID NO:369 pEC376 OLEC2189 (F pEC488 protoespaçador 2 A3T): SEQ ID NO:370 OLEC2190 (R pEC488 protoespaçador 2 A3T): SEQ ID NO:371 pEC377 OLEC2191 (F pEC488 protoespaçador 2 PAM G1C): SEQ ID NO:372 OLEC2192 (R pEC488 protoespaçador 2 PAM G1C): SEQ ID NO:373 pEC378 OLEC2237 (F pEC488 protoespaçador PAM GG1, 2CC): SEQ ID NO:374 OLEC2238 (R pEC488 protoespaçador 2 PAM GG1, 2CC): SEQ ID NO:375
[0511] Plasmídeos para análise SPy_0700 (espaçador 1 (CRISPR tipo II-A, SF370; pró-fago protoespaçador ø370.1 de SF370) in vitro e in S. pyogenes (template: chr. DNA SF370 ou plasmídeos contendo fragmentos de SPy_0700) pEC489 OLEC2106 (F Spy_0700): SEQ ID NO:376 OLEC2107 (R Spy_0700): SEQ ID NO:377 pEC573 OLEC2941 (F PAM TG1, 2GG): SEQ ID NO:378 OLEC2942 (R PAM TG1, 2GG): SEQ ID NO:379
[0512] Oligonucleotídeos para verificação de construções de plasmídeo e locais de corte por análise de sequenciamento ColE1 (pEC85) oliRN228 (sequenciamento R): SEQ ID NO:380 speM (pEC287) OLEC1557 (sequenciamento F): SEQ ID NO:381 OLEC1556 (sequenciamento R): SEQ ID NO:382 repDEG-pAMbeta1 (pEC85) OLEC787 (sequenciamento F): SEQ ID NO:383 Oligonucleotídeos para ensaios de clivagem in vitro
[0513] crRNA Espaçador 1 crRNA (1-42): SEQ ID NO:384 Espaçador 2 crRNA (1-42): SEQ ID NO:385 Espaçador 4 crRNA (1-42): SEQ ID NO:386 Espaçador 2 crRNA (1-36): SEQ ID NO:387 Espaçador 2 crRNA (1-32): SEQ ID NO:388 Espaçador 2 crRNA (11-42): SEQ ID NO:389
[0514] tracrRNA (4-89): SEQ ID NO:390 (15-89): SEQ ID NO:391 (23-89): SEQ ID NO:392 (15-53): SEQ ID NO:393 (15-44): SEQ ID NO:394 (15-36): SEQ ID NO:395 (23-53): SEQ ID NO:396 (23-48): SEQ ID NO:397 (23-44): SEQ ID NO:398 (1-26): SEQ ID NO:399
[0515] RNAs quiméricos Espaçador 1 – quimera A: SEQ ID NO:400 Espaçador 1 – quimera B: SEQ ID NO:401 Espaçador 2 – quimera A: SEQ ID NO:402 Espaçador 2 – quimera B: SEQ ID NO:403 Espaçador 4 – quimera A: SEQ ID NO:404 Espaçador 4 – quimera B: SEQ ID NO:405 GFP1: SEQ ID NO:406 GFP2: SEQ ID NO:407 GFP3: SEQ ID NO:408 GFP4: SEQ ID NO:409 GFP5: SEQ ID NO:410
[0516] Oligonucleotídeos de DNA como substratos para ensaios de clivagem (protoespaçador em negrito, sublinhado PAM) protoespaçador 1 - complementar – WT: SEQ ID NO: 411 protoespaçador 1 - não complementar -WT: SEQ ID NO: 412 protoespaçador 2 - não complementar – WT: SEQ ID NO:413 protoespaçador 2 - não complementar – WT: SEQ ID NO:414 protoespaçador 4 - complementar – WT: SEQ ID NO: 415 protoespaçador 4 - não complementar -WT: SEQ ID NO: 416 protoespaçador 2 - complementar – PAM1: SEQ ID NO: 417 protoespaçador 2 - não complementar – PAM1: SEQ ID NO: 418 protoespaçador 2 - complementar – PAM2: SEQ ID NO: 419 protoespaçador 2 - não complementar – PAM2: SEQ ID NO: 420 protoespaçador 4 - complementar – PAM1: SEQ ID NO: 421 protoespaçador 4 - não complementar – PAM1: SEQ ID NO: 422 protoespaçador 4 - complementar – PAM2: SEQ ID NO: 423 protoespaçador 4 - não complementar – PAM2: SEQ ID NO: 424
Transcrição e a purificação do RNA in vitro
[0517] RNA foi transcrito in vitro usando Kit de transcrição Flash T7 in vitro (Epicentre, Illumina company) e modelos de DNA gerados pelo PCR carregando uma sequência de promotor T7. RNA foi purificado em gel e qualidade verificada antes da utilização. Os iniciadores utilizados para a elaboração de modelos de RNA do S. pyogenes SF370, Listeria innocua Clip 11262 e Neisseria meningitidis Z2491 A são descritos acima.
Purificação de proteínas
[0518] A sequência que codifica Cas9 (resíduos 1-1368) foi amplificada por PCR a partir do DNA genômico de S. pyogenes SF370 e inserido em um vetor de expressão personalizado baseado em pET usando clonagem independente de ligação (LIC). Construção de fusão resultante continha um tag de proteína de ligação a N-terminal hexahistidina-maltose (His6 - MBP), seguido por uma sequência de peptídeo contendo um sítio de clivagem da protease do vírus do mosaico do tabaco (TEV). A proteína foi expressa em E. coli cepa BL21 Rosetta 2 (DE3) (EMD Biosciences), cultivada em meio 2xTY a 18°C, durante 16 h após indução com 0,2 mM IPTG. A proteína foi purificada por uma combinação de etapas cromatográficas de afinidade, troca iônica e de exclusão de tamanho. Resumidamente, as células foram lisadas em 20mm Tris pH 8,0, 500 mM NaCl, 1 mM TCEP (suplementado com coquetel inibidor de protease (Roche)) em um homogeneizador (Avestin). Lisado clarificado estava ligado no lote Ni-NTA agarose (Qiagen). A resina foi lavada extensivamente com 20mm Tris pH de 8,0, 500 mM NaCl e a proteína ligada foi eluída em 20mm Tris pH 8,0, 250 mM NaCl, 10% de glicerol. A tag de afinidade His6-MBP foi removida por clivagem com protease TEV, enquanto a proteína foi dialisada durante a noite contra HEPES 20 mM pH 7,5, 150 mM KCl, 1mm TCEP, 10% de glicerol. A proteína Cas9 clivada foi separada da tag de fusão por depuração em uma coluna de SP Sepharose HiTrap de 5ml (GE Life Sciences), eluindo com um gradiente linear de 100 mM - 1 M KCl. A proteína ainda foi purificada por cromatografia de exclusão em uma coluna de Superdex 200 16/60 em 20 mM HEPES de pH 7,5, 150 mM KCl e 1 mM TCEP. Proteína eluída concentrava-se a ~ 8 mg/ml, congelada em nitrogênio líquido e armazenada a-80 °C. Mutações pontuais Cas9 D10A, H840A e D10A/H840A foram geradas usando o kit de mutagênese direcionado ao sítio QuikChange (Agilent) e confirmada por sequenciamento de DNA. As proteínas foram depuradas, seguindo o mesmo procedimento para a proteína Cas9 tipo selvagem.
[0519] Ortólogos Cas9 de Streptococcus thermophilus (LMD-9, YP_820832.1), L. innocua (Clip11262, NP_472073.1), Campylobacter jejuni (subsp. jejuni NCTC 11168, YP_002344900.1) e N. meningitidis (Z2491, YP_002342100.1) foram expressos nas células BL21 Rosetta (DE3) pLysS (Novagen) como His6-MBP (N. meningitidis e c. jejuni), His6- tioredoxina (L. innocua) e proteínas da fusão His6-GST (S. thermophilus) e purificadas essencialmente como para Cas9 de S. pyogenes com as seguintes modificações. Devido às grandes quantidades de co-purificação de ácidos nucleicos, todas as quatro proteínas Cas9 foram purificadas por uma etapa de heparina sepharose adicional antes da filtragem em gel, eluindo a proteína ligada com um gradiente linear de 100 mM - 2m KCl. Isto com êxito removeu a contaminação de ácido nucleico de proteínas de C. jejuni, N. meningitidis e de L. innocua, mas não conseguiu retirar ácidos nucleicos de co- purificação da preparação de Cas9 de S. thermophilus. Todas as proteínas foram concentradas para 1-8 mg/ml em 20 mM HEPES de pH 7,5, 150 mM KCl e 1 mM TCEP, congeladas em N2 líquido e armazenadas a-80 °C.
Ensaio de clivagem de DNA plasmídeo
[0520] tracrRNA e crRNA sintéticos ou transcritos in vitro foram pré-anelados antes da reação por aquecimento a 95°C e lentamente resfriado até temperatura ambiente. DNA de plasmídeo linearizado por digestão de restrição ou nativo (300 ng (~ 8 nM)) foi incubado durante 60 minutos a 37°C com proteína Cas9 purificada (50-500 nM) e duplex tracrRNA:crRNA (50-500 nM, 1:1) em um tampão de clivagem plasmídeo Cas9 (20 mM HEPES pH 7,5, 150 mM KCl, 0,5 mM DTT, EDTA 0,1 mM) com ou sem 10 mM MgCl2. As reações foram paradas com tampão de carregamento de 5 X DNA contendo 250 mM EDTA, resolvidas por eletroforese em gel de agarose 0,8 ou 1% e visualizado com coloração de brometo de etídio. Para os ensaios de clivagem mutante Cas9, as reações foram paradas com tampão de carregamento 5 X SDS (30% de glicerol, 1,2% SDS, 250 mM EDTA) antes da carga sobre o gel de agarose.
Ensaio de clivagem dependente de metal
[0521] DNA de plasmídeo protoespaçador 2 (5 nM) foi incubado durante 1 h a 37°C com Cas9 (50 nM) pré-incubado com 50 nM tracrRNA:crRNA-sp2 em tampão de clivagem (20 mM HEPES pH 7,5, 150 mM KCl, 0,5 mM DTT, 0,1 mM EDTA) suplementado com 1, 5 ou 10 mM MgCl2, 1 ou 10 mM de MnCl2,CaCl2, ZnCl2, CoCl2, NiSO4 or CuSO4. A reação foi parada pela adição de tampão de carregamento 5 X SDS (30% de glicerol, 1,2% SDS, 250 mM EDTA), resolvida por eletroforese em gel de agarose a 1% e visualizada pela coloração de brometo de etídio.
Ensaio de retorno simples
[0522] Cas9 (25 nM) foi previamente incubado 15 min a 37 °C em tampão de clivagem (20 mM HEPES pH 7,5, 150 mM KCl, 10 mM MgCl2, 0,5 mM DTT, 0,1 mM EDTA) com duplex tracrRNA:crRNA-sp2 (25 nM, 1:1) ou ambos RNAs (25 nM) não pré-anelados e a reação foi iniciada pela adição de DNA de plasmídeo protoespaçador 2 (5 nM). A mistura de reação foi incubada a 37°C. Em intervalos de tempo definidos, as amostras foram retiradas da reação, tampão de carregamento 5 X SDS (30% de glicerol, 1,2% SDS, 250 mM EDTA) foi adicionado para parar a reação e a clivagem foi monitorada por eletroforese em gel de agarose 1% e coloração de brometo de etídio. O mesmo foi feito para a cinética de retorno único sem pré-incubação de Cas9 e RNA, onde DNA de plasmídeo protoespaçador 2 (5 nM) foi misturado no tampão de clivagem com tracrRNA:crRNA duplex-sp2 (25 nM) ou ambos os RNAs (25 nM) não pré-anelado, e a reação foi iniciada por adição de Cas9 (25 nM). Percentagem de clivagem foi analisada por densitometria e a média de três experimentos independentes foi plotada contra o tempo. Os dados foram ajustados por análise de regressão não linear e as taxas de clivagem (kobs [min-1]) foram calculados.
Ensaio de retorno múltiplo
[0523] Cas9 (1 nM) foi previamente incubado durante 15 min a 37 °C em tampão de clivagem (20 mM HEPES pH 7,5, 150 mM KCl, 10 mM MgCl2, 0,5 mM DTT, 0,1 mM EDTA) com tracrRNA:crRNA pré-anelado-sp2 (1 nM, 1:1). A reação foi iniciada pela adição de DNA de plasmídeo protoespaçador 2 (5 nM). Em intervalos de tempo definidos, as amostras foram retiradas e a reação foi interrompida pela adição de tampão de carregamento 5 X SDS (30% de glicerol, 1,2% SDS, 250 mM EDTA). A reação de clivagem foi resolvida por eletroforese em gel de agarose 1%, corado com brometo de etídio e a porcentagem de clivagem foi analisada por densitometria. Os resultados dos quatro experimentos independentes foram plotados contra o tempo (min).
Ensaio de clivagem de DNA do oligonucleotídeo
[0524] Oligonucleotídeos de DNA (10 pmol) foram radiomarcados incubando com 5 unidades T4 polinucleotídeo quinase (New England Biolabs) e ~ 3 - 6 pmol (~ 20 - 40 mCi) [Y—32P]—ATP (Promega) em tampão de reação de 1 X T4 polinucleotídeo quinase a 37°C por 30 min, em uma reação de 50 μL. Após a inativação por calor (65°C por 20 min), as reações foram purificadas através de uma coluna de Illustra MicroSpin G-25 (GE Healthcare) para remover o marcador não incorporado. Substratos duplex (100 nM) foram gerados pelo oligonucleotídeos marcados por anelamento com montantes equimolares de oligonucleotídeo complementar não marcado a 95°C por 3 min, seguido de resfriamento lento em temperatura ambiente. Para os ensaios de clivagem, tracrRNA e crRNA foram anelados por aquecimento a 95°C por 30 s, seguido de resfriamento lento em temperatura ambiente. Cas9 (concentração final de 500 nM) foi pré-incubado com o duplex tracrRNA:crRNA anelado (500 nM) no tampão de ensaio de clivagem (20 mM HEPES pH 7,5, 100 mM KCl, 5 mM MgCl2, 1 mM DTT, 5% glicerol) em um volume total de 9 μl. As reações foram iniciadas pela adição de 1 μl de DNA alvo (10 nM) e incubadas por 1 h a 37°C. Reações foram extintas pela adição de 20 μl de corante de carregamento (5 mM EDTA, SDS de 0,025%, 5% de glicerol em formamida) a aquecidas a 95°C por 5 min. Os produtos de clivagem foram resolvidos em 12% gel de poliacrilamida de desnaturação contendo 7m ureia e visualizados por fosforimageamento (Storm, GE Life Sciences). Ensaios de clivagem testando requisitos PAM (figura 13B) foram realizados utilizando substratos duplex de DNA que foram pré-anelados e purificados em um gel do acrilamida nativo de 8% e posteriormente radiomarcados em ambas as extremidades 5'. As reações foram ajustadas e analisadas como acima.
Ensaios de mudança de mobilidade eletroforética
[0525] Duplex DNA alvo foram formados pela mistura de cada fita (10 nmol) em água deionizada, aquecendo- se a 95°C por 3 min e resfriamento lento em temperatura ambiente. Todos os DNAs foram purificados em 8% nativo géis contendo 1 X TBE. Bandas de DNA foram visualizadas por sombreamento UV, cortadas e eluídas por imersão de pedaços de gel em H2O tratada com DEPC. DNA eluído foi precipitado em etanol e dissolvido em H2O tratada com DEPC. Amostras de DNA foram marcadas na extremidade 5' com [y - 32P]-ATP usando T4 polinucleotídeo quinase (New England Biolabs) por 30 min a 37 °C. PNK foi desnaturado por calor a 65°C por 20 min, e não radiomarcador não incorporado foi removido usando uma coluna Illustra MicroSpin G-25 (GE Healthcare). Ensaios de ligação foram realizados em solução tampão com HEPES 20 mM pH 7,5, 100 mM KCl, 5 mM MgCl2, 1 mM DTT e 10% glicerol em um volume total de 10 μl. Cas9 D10A/H840A duplo mutante foi programado com quantidades equimolares de duplex tracrRNA:crRNA pré- anelado e titulado de 100 pM a 1 μM. DNA radiomarcado foi adicionado a uma concentração final de 20 pM. As amostras foram incubadas durante 1 h a 37°C e resolvidas a 4°C em um gel de poliacrilamida nativo 8% contendo 1 X TBE e 5 mM MgCl2. Os géis foram secos e DNA visualizado pela fosforimageamento.
Análise em sílica de sequências de DNA e proteínas
[0526] Pacote de vetor NTI (Invitrogen) foi usado para análise de sequências de DNA (Vetor NTI) e análise comparativa de sequência de proteínas (AlignX).
Modelagem em sílica da estrutura do RNA e co- dobramento
[0527] Previsões em sílica foram realizadas usando os algoritmos de pacote de RNA de Viena (42, 43). Estruturas secundárias de RNA e modelos de co-dobramento foram previstos com RNAfold e RNAcofold, respectivamente e visualizados com VARNA (44).
RESULTADOS
[0528] Bactérias e archaea evoluíram sistemas de defesa adaptativos mediado por RNA chamados repetições palindrômicas curtas interespaçadas regularmente aglomeradas (CRISPR)/associado a CRISPR (Cas) que protegem organismos a partir de vírus invasores, e plasmídeos (1 - 3). Mostramos que em um subconjunto desses sistemas, o crRNA maduro que é emparelhado por base para trans ativar crRNA (tracrRNA) forma uma estrutura de dois RNAs que direcionam a proteína Cas9 associada a CRISPR a introduzir quebras de fita dupla (ds) no DNA alvo. Em locais complementares à sequência de crRNA-guia, o domínio de nuclease Cas9 HNH cliva a fita complementar, considerando que o domínio tipo Cas9 RuvC cliva a fita não complementar. O dual-tracrRNA:crRNA, quando projetadado como uma quimera RNA única, também direciona a clivagem de dsDNA Cas9 específica da sequência. Estes estudos revelam uma família de endonucleases que usam dual-RNAs para clivagem de DNA específica de sítio e destacar a capacidade de explorar o sistema para edição de genoma programável por RNA.
[0529] Sistemas de defesa CRISPR/Cas dependem de RNAs pequenos para a detecção específica para a sequência e silenciamento de ácidos nucleicos estrangeiros. Sistemas CRISPR/Cas são compostos de genes cas organizados em operon(s) e matrizes CRISPR consistindo em sequências tendo genoma como alvo (chamados de espaçadores) intercaladas com repetições idênticas (1 - 3). Imunidade mediada por CRISPR/Cas ocorre em três etapas. Na fase de adaptação, bactérias e archaea abrigam um ou mais loci CRISPR que respondem ao desafio viral ou plasmídeo por integração de fragmentos curtos de sequência estrangeira (protoespaçadores) no cromossomo hospedeiro na extremidade proximal da matriz CRISPR (1 - 3). Nas fases de expressão e interferência, transcrição do elemento espaçador de repetição em moléculas precursoras de CRISPR RNA (pré-crRNA) seguido por clivagem enzimática gera os crRNAs curtos que podem emparelhar com sequências complementares protoespaçadores de invasão viral ou plasmídeos alvos (4-11). Reconhecimento alvo por crRNAs direciona o silenciamento das sequências estrangeiras por meio de proteínas Cas que funcionam no complexo com o crRNAs (10, 12-20).
[0530] Existem três tipos de sistemas CRISPR/Cas (21-23). Os sistemas tipo I e III e compartilham algumas características abrangentes: endonucleases Cas especializadas processam os pré-crRNAs e uma vez maduros, cada crRNA monta em um complexo de proteína multi-Cas grande capaz de reconhecer e clivar ácidos nucleicos complementares para o crRNA. Em contraste, sistemas tipo II processam precrRNAs por um mecanismo diferente em que um crRNA trans-ativando (tracrRNA) complementar para as sequências de repetição em pré-crRNA dispara processamento pela ribonuclease RNase III específica para RNA de fita dupla (ds) na presença da proteína Cas9 (anteriormente Csn1) (Figura 15) (4, 24). Cas9 parece ser a única proteína responsável pela silenciamento orientado por crRNA de DNA estrangeiro (25-27).
[0531] Podemos mostrar isso em sistemas do tipo II, proteínas Cas9 constituem uma família de enzimas que requerem uma estrutura de base pareada formada entre a ativação de tracrRNA e o direcionamento a crRNA para clivar dsDNA alvo. Clivagem específica de sítio ocorre em locais determinados por ambos emparelhamentos de base de complementariedade entre o crRNA e o DNA protoespaçador alvo e um curto motif [referido como o motif adjacente ao protoespaçador (PAM)] justaposto à região complementar no DNA alvo. Nosso estudo ainda demonstra que a família de endonuclease Cas9 pode ser programada com moléculas de RNA simples para clivar sítios de DNA específicos, facilitando assim o desenvolvimento de um sistema simples e versátil direcionado ao RNA para gerar quebras de dsDNA para direcionamento e edição do genoma.
Cas9 é uma DNA endonuclease guiada por dois RNAs
[0532] Cas9, a proteína hallmark de sistemas do tipo II, parece estar envolvida na maturação de ambos maturação de crRNA e interferência do DNA guiada por crRNA (Figura 15) (4, 25-27). Cas9 está envolvido na maturação de crRNA (4), mas sua participação direta na destruição de DNA alvo não foi investigada. Para testar se e como Cas9 pode ser capaz de clivar DNA alvo, usamos um sistema de superexpressão para purificar a proteína Cas9 derivada do patógeno Streptococcus pyogenes (Figura 16, ver materiais complementares e métodos) e testamos sua capacidade de clivar um DNA de plasmídeo ou um duplex do oligonucleotídeo tendo uma sequência de protoespaçador complementar para um crRNA maduro e uma autêntica PAM. Demonstramos que esse crRNA maduro sozinho foi incapaz de direcionar a clivagem de DNA do plasmídeo catalisado por Cas9 (figura 10A e figura 17A). No entanto, além de tracrRNA, que pode emparelhar com a sequência de repetição de crRNA e é essencial para a maturação de crRNA neste sistema, disparou Cas9 para clivar DNA de plasmídeo (figura 10A e figura 17A). A reação de clivagem requereu ambos magnésio e a presença de uma sequência de crRNA complementar ao DNA; uma crRNA capaz de emparelhamento de base a tracrRNA mas que contém uma sequência de ligação ao DNA alvo não suportou a clivagem de plasmídeo catalisada por Cas9 (figura 10A; Figura 17A, comparar crRNA-sp2 para o crRNA-sp1; e figura 18A). Obtivemos resultados semelhantes com um substrato de dsDNA linear curto (figura 10B e figura 17, B e C). Assim, a tracrRNA trans- ativando é um pequeno RNA não codificante com duas funções críticas: desencadeando processamento de pré-crRNA pela enzima RNase III (4) e subsequentemente ativando a clivagem de DNA guiada por crRNA por Cas9.
[0533] Clivagem de ambos plasmídeo e dsDNA linear curto por Cas9 guiada por tracrRNA:crRNA é específica ao sítio (Figura 10, C e E e Figura 19, A e B). Clivagem de DNA de plasmídeo produziu extremidades sem corte em uma posição de três pares de base à montante da sequência de PAM (Figura 10, C e E e Figura 19, A e C) (26). Da mesma forma, dentro de duplexes dsDNA curtos, a fita de DNA que é complementar à sequência de ligação ao alvo em crRNA (a fita complementar) é clivada em um sítio de três pares de base à montante do PAM (Figura 10, D e E e Figura 19, B e C). A fita de DNA não complementar é clivada em um ou mais sítios dentro de três a oito pares de bases à montante do PAM. Investigação mais aprofundada revelou que fita não complementar é primeiro clivada endonucleoliticamente e posteriormente aparada por uma atividade de exonuclease 3 '-5 ' (figura 18B). As taxas de clivagem por Cas9 sob condições de retorno único variaram de 0,3 a 1 min-1, comparáveis às endonucleases de restrição (figura 20A), considerando que a incubação de complexo Cas9- tracrRNA:crRNA tipo selvagem (WT) com um excesso molar quíntuplo de substrato DNA forneceu evidências de que Cas9 guiado por dual-RNA é uma enzima de retorno múltiplo (figura 20B). Em contraste com o complexo de cascata de CRISPR tipo I (18), Cas9 cliva ambos plasmídeos linearizados e superenrolados (figuras 10A e 11A). Portanto, um plasmídeo invasor pode, em princípio, ser clivado várias vezes por proteínas Cas9 programadas com crRNAs diferentes.
[0534] Figura 10 (A) Cas9 foi programada com um crRNA-sp2 de 42 nucleotídeos (crRNA contendo uma sequência espaçadora 2) na presença ou ausência de tracrRNA de 75 nucleotídeos. O complexo foi adicionado ao DNA de plasmídeo circular ou linearizada por XhoI com uma sequência complementar ao espaçador 2 e um PAM funcional. crRNA-sp1, controle de especificidade; M, marcador de DNA; KBP, pares de quilobase. Ver figura 17A. (B) Cas9 foi programado com sp2- crRNA e tracrRNA (nucleotídeos 4 a 89). O complexo foi incubado com DNAs de fita simples ou dupla tendo uma sequência complementar ao espaçador 2 e uma PAM funcional (4). As fitas complementares ou não complementares do DNA foram 5'-radiomarcadas e aneladas com uma fita parceira não marcado. nt, nucleotídeos. Ver Figura 17, B e C. (C) Análise de sequenciamento dos produtos de clivagem da figura 10A. Terminação da extensão do iniciador na reação de sequenciamento indica a posição do sítio de clivagem. A saliência de 3' terminal A (asteriscos) é um artefato da reação de sequenciamento. Ver a Figura 19, A e C.(D) Os produtos de clivagem da figura 10B foram analisados juntamente com marcadores de tamanho marcados na extremidade 5‘ derivados das fitas complementares e não complementares do duplex de DNA alvo. M, marcador; P, produto de clivagem. Ver Figura 19, B e C.(E) Representação esquemática de sequências de tracrRNA, crRNA-sp2 e protoespaçador 2 DNA. Regiões da complementariedade de crRNA para tracrRNA (linha sobreposta) e o protoespaçador de DNA (sublinhado) são representados. A sequência de PAM é marcada; sítios de clivagem mapeados em (C) e (D) são representados por setas cheias brancas (C), uma seta cheia preta [(D), fita complementar] e uma barra preta [(D), fita não complementar].
[0535] Figura 15 retrata a via imune CRISPR/Cas mediada por RNA tipo II. As etapas de expressão e interferências são representadas no desenho. Os loci tipo II CRISPR/Cas são compostos de um operon de quatro genes que codificam as proteínas Cas9, Cas1, Cas2 e Csn2, uma matriz CRISPR consistindo em uma sequência líder, seguido por repetições idênticas (retângulos preto) intercaladas com espaçadores tendo genoma como alvo exclusivos (diamantes) e uma sequência de que codifica um tracrRNA trans-ativando. É representado aqui o locus CRISPR/Cas tipo II de S. pyogenes SF370 (número de acessão NC_002737) (4). Promotores experimentalmente confirmados e terminador de transcrição neste locus são indicados (4). A matriz CRISPR é transcrita como uma molécula precursora de CRISPR RNA (pré-crRNA) que sofre um processo de maturação específico para os sistemas de tipo II (4). Em S. pyogenes, SF370, tracrRNA é transcrito como duas transcrições primárias do 171 e 89 nt de comprimento que têm complementariedade a cada repetição da pré-crRNA. O primeiro evento de processamento envolve emparelhamento de tracrRNA de pré-crRNA, formando um RNA duplex que é reconhecido e clivado pela housekeeping endoribonuclease RNase III na presença da proteína Cas9. Clivagem mediada por RNase III do RNA duplex gera um tracrRNA transformado de 75-nt e um crRNAs intermediário de 66-nt que consiste em uma região central que contém uma sequência de um espaçador, flanqueado por porções da sequência de repetição. Um segundo evento de processamento, mediado por ribonuclease(s) desconhecidas, leva à formação de crRNAs maduros de 39 a 42 nt no comprimento de sequência guia derivada de espaçador 5'-terminal e sequência de 3'-terminal derivada de repetição. Após o primeiro e segundo eventos de processamento, tracrRNA maduro continua a ser emparelhado com os crRNAs maduros e ligados à proteína Cas9. Neste complexo ternário, a estrutura dual tracrRNA:crRNA atua como guia do RNA que direciona a endonuclease Cas9 ao DNA alvo cognato. Reconhecimento alvo pelo complexo Cas9-tracrRNA:crRNA é iniciado pela triagem de molécula de DNA invasora por homologia entre a sequência de protoespaçador no DNA alvo e a sequência derivada de espaçador no crRNA. Além da complementariedade de protoespaçador DNA-espaçador crRNA, DNA alvo requer a presença de um curto motif (NGG, onde N pode ser qualquer nucleotídeo) adjacente ao protoespaçador (motif adjacente ao protoespaçador - PAM). Após o emparelhamento entre o dual-RNA e a sequência protoespaçadora, uma R-alça é formada e Cas9 posteriormente introduz uma quebra de fita dupla (DSB) no DNA. Clivagem do DNA alvo por Cas9 requer dois domínios catalíticos na proteína. Em um sítio específico em relação o PAM, o domínio HNH cliva a fita complementar do DNA, enquanto o domínio tipo RuvC cliva a fita não complementar.
[0536] Figura 16 (A) Cas9 de S. pyogenes foi expressa em E. coli como uma proteína de fusão, que contém uma marcação de N-terminal His6-MBP e purificada por uma combinação de etapas de cromatografia de afinidade, troca iônica e exclusão por tamanho. A tag de afinidade foi removida por clivagem de protease TEV após a etapa de purificação de afinidade. É mostrado um cromatograma da etapa de cromatografia de exclusão por tamanho final em uma coluna 200 Superdex (16/60). Cas9 elui como um único pico monomérico desprovido de contaminantes ácidos nucleicos, como julgados pela razão das absorbâncias em 260 e 280 nm. Baixo-relevo; frações eluídas foram resolvidas por SDS-PAGE em um gel de poliacrilamida 10% e coradas com SimplyBlue Stain (Invitrogen). (B) Análise de SDS-PAGE de ortólogos Cas9 purificados. Ortólogos Cas9 foram purificados como descrito em Materiais e Métodos Suplementares. 2,5 μg de cada Cas9 purificado foram analisados em gel de poliacrilamida gradiente 4-20% e corados com SimplyBlue Safe Stain.
[0537] Figura 17 (ver ainda Figura 10). A sequência protoespaçadora 1 origina-se de S. pyogenes SF370 (M1) SPy_0700, alvo de S. pyogenes SF370 crRNAsp1 (4). Aqui, a sequência protoespaçadora 1 foi manipulada alterando o PAM de uma sequência não funcional (TTG) para um funcional (TGG). A sequência protoespaçadora 4 origina-se de S. pyogenes MGAS10750 (M4) MGAS10750_Spy1285, alvo de S. pyogenes SF370 crRNA-sp4 (4). (A) Clivagem de DNA de plasmídeo Protoespaçador 1 guiada pelo duplexes tracrRNA:crRNA cognatos. Os produtos de clivagem foram resolvidos por eletroforese em gel de agarose e visualizados com coloração de brometo de etídio. M, marcador de DNA; tamanhos de fragmento em pares de base são indicados. (B) Clivagem de DNA do oligonucleotídeo Protoespaçador 1 guiada por duplex tracrRNA:crRNA-sp1 cognato. Os produtos de clivagem foram resolvidos por eletroforese em gel de poliacrilamida desnaturante e visualizados por fosforimageamento. Tamanhos de fragmento em nucleotídeos são indicados. (C) Clivagem de DNA do oligonucleotídeo Protoespaçador 4 guiada por duplex tracrRNA:crRNA-sp4 cognato. Os produtos de clivagem foram resolvidos por eletroforese em gel de poliacrilamida desnaturante e visualizados por fosforimageamento. Tamanhos de fragmento em nucleotídeos são indicados. (A, B, C) Experimentos em (A) foram realizados como na Figura 10A; em (B) e em (C) omo na Figura 10B. (B, C) Um esquema da interação tracrRNA:crRNADNA alvo é mostrado abaixo. As regiões de complementariedade de crRNA para tracrRNA e o DNA de protoespaçador são sobrelinhada e sublinhadas, respectivamente. A sequência de PAM é marcada.
[0538] Figura 18 (Ver também a Figura 10). (A) DNA de Plasmídeo Protoespaçador 2 foi incubado com Cas9 complexado com tracrRNA:crRNA-sp2 na presença de diferentes concentrações de Mg2+, Mn2+, Ca2+, Zn2+, Co2+, Ni2+ ou Cu2+. Os produtos de clivagem foram resolvidos por eletroforese em gel de agarose e visualizados com coloração de brometo de etídio. Formas de plasmídeo são indicadas. (B) Um duplex DNA de oligonucleotídeo protoespaçador 4 contendo um motif PAM foi anelado e purificado em gel antes radiomarcado em ambas as extremidades 5'. O duplex (concentração final de 10 nM) foi incubado com Cas9 programado com tracrRNA (nucleotídeos 2389) e crRNAsp4 (500 nM concentração final, 1:1). Em pontos de tempo indicados (min), alíquotas de 10 μl da reação de clivagem foram extintas com tampão de formamida contendo 0,025% SDS e 5 mM EDTA e analisadas por desnaturação da eletroforese do gel de poliacrilamida conforme indicado na figura 10B. Tamanhos em nucleotídeos são indicados.
[0539] Figura 19 (A) Mapeamento de clivagem de DNA de plasmídeo protoespaçador 1. Produtos de clivagem da figura 17A foram analisados por sequenciamento, como na Figura 10C. Observe que a saliência 3' terminal A (asterisco) é um artefato da reação de sequenciamento. (B) Mapeamento de clivagem de DNA do oligonucleotídeo 4 protoespaçador. Produtos de clivagem da figura 17 foram analisados por eletroforese em gel de poliacrilamida desnaturante juntamente com marcadores de tamanho de oligonucleotídeo marcados na extremidade 5' derivados das fitas complementares e não complementares do DNA duplex de protoespaçador 4. M, marcador; P, produto de clivagem. Faixas 1-2: fita complementar. Faixas 3-4: fita não complementar. Tamanhos de fragmento em nucleotídeos são indicados. (C) Representações esquemáticas de sequências de tracrRNA, crRNA-sp1 e DNA protoespaçador 1 (topo) e tracrRNA, crRNAsp4 e protoespaçador 4 sequências de DNA (em baixo). tracrRNA:crRNA forma uma estrutura dual-RNA direcionada ao DNA protoespaçador complementar de através do emparelhamento de crRNA-DNA protoespaçador. As regiões de crRNA complementares para tracrRNA e o DNA de protoespaçador são sublinhadas e sublinhadas, respectivamente. Os sítios de clivagem nas fitas complementar e não complementares de DNA mapeadas em (A) (top) e (B) (inferior) são representados com setas (A e B, fita complementar) e uma barra preta (B, fita não complementar) acima das sequências, respectivamente.
[0540] Figura 20 (A) Cinética de retorno único da Cas9 sob diferentes condições de pré-anelamento de RNA e pré-incubação de proteínas RNA. DNA Plasmídeo Protoespaçador 2 foi incubado com Cas9 pré-incubado com tracrRNA:crRNA-sp2 pré-anelado (o), Cas9 não pré-incubado com tracrRNA:crRNA- sp2 pré-anelado (•), Cas9 pré-incubado com tracrRNA e crRNA- sp2 não pré-anelado (□) ou Cas9 não pré-incubado com RNAs não pré-anelado (■). A atividade de clivagem foi monitorada de forma dependente de tempo e analisada por eletroforese em gel de agarose seguido de coloração de brometo de etídio. A percentagem média de clivagem de três experimentos independentes é plotada contra o tempo (min) e ajustada com uma regressão não linear. As taxas de clivagem calculadas(kobs) são mostradas na tabela. Os resultados sugerem que a ligação do Cas9 aos RNAs não é limitante nas condições testadas. Formas de plasmídeo são indicadas. Os valores obtidos kobs são comparáveis às endonucleases de restrição, que são tipicamente da ordem de 1-10 por min (45-47). (B) Cas9 é uma endonuclease de retorno múltiplo. Cas9 carregado com tracrRNA:crRNA-sp2 duplexado (1 nM, 1:1:1 - indicado com linha cinza no gráfico) foi incubado com um excesso de 5 vezes de DNA de plasmídeo protoespaçador 2 nativo. Clivagem foi monitorada retirando amostras de reação em intervalos de tempo definidos (0 a 120 min) seguido por análise de eletroforese de gel de agarose (topo) e determinação da quantidade de produto de clivagem (nM) (inferior). Desvios-padrão de três experimentos independentes são indicados. No intervalo de tempo investigado, 1 nM Cas9 foi capaz de clivar ~2,5 nM de DNA de Plasmídeo.
Cada domínio de nuclease Cas9 cliva uma cadeia de DNA
[0541] Cas9 contém domínios homólogos para ambos HNH e RuvC endonucleases (figura 11A e Figura 3) (21-23, 27, 28). Projetamos e purificamos Cas9 variantes contendo mutações pontuais inativadoras nos resíduos catalíticas dos domínios tipo HNH ou RuvC (figura 11A e Figura 3) (23, 27). Incubação destas proteínas Cas9 variantes com plasmídeo de DNA nativo mostrou que proteínas mutantes de Cas9 guiadas por RNA geraram plasmídeos circulares abertos, considerando que o complexo de proteína Cas9 WT-tracrRNA:crRNA produziu um produto de DNA linear (Figuras 10A e 11A e Figuras 17A e 25A). Este resultado indica que os domínios tipo Cas9 HNH e RuvC cada um cliva uma cadeia de DNA de plasmídeo. Para determinar qual fita do DNA alvo é clivada por cada domínio catalítico Cas9, incubamos os complexos mutantes Cas9- tracrRNA:crRNA com substratos dsDNA curtos em que a fita complementar ou não complementar foi radiomarcada em sua extremidade 5’. Os produtos resultantes da clivagem indicaram que o domínio Cas9 HNH cliva a fita de DNA complementar, considerando que o domínio tipo Cas9 RuvC cliva a fita não complementar de DNA (Figura 11B e Figura 21B).
[0542] Figura 11(A) (Superior) Representação esquemática da estrutura de domínio Cas9 mostrando as posições das mutações de domínio. D10A, AsplO^AlalO; H840A;His840^Ala840. Complexos de proteínas Cas9 WT ou nuclease mutante com tracrRNA: crRNA-sp2 foram avaliados para atividade endonuclease conforme Figura 10A. (B) Complexos de Cas9 WT ou domínio mutantes de nuclease com tracrRNA e crRNA- sp2 foram testados para a atividade, como na Figura 10B.
[0543] Figura 3 A sequência de aminoácidos de Cas9 de S. pyogenes (SEQ ID NO:8) é representada. Proteínas Cas9/Csn1 de várias espécies diferentes têm 2 domínios que incluem motivos homólogos de ambas endonucleases HNH e RuvC. (A) Motivos 1-4 (números do motif são marcados no lado esquerdo da sequência) são mostrados para S. pyogenes Cas9/Csn1. Os três motivos tipo RuvC previstos (1, 2, 4) e o motif HNH previsto (3) são sobrelinhados. Resíduos Asp10 e His840, que foram substituídos por Ala neste estudo são destacados por um asterisco acima da sequência. Resíduos sublinhados são altamente conservados entre proteínas Cas9 de diferentes espécies. As mutações em resíduos sublinhadas são susceptíveis de ter consequências funcionais na atividade Cas9. Note que no presente estudo acoplamento das duas atividades tipo nuclease é demonstrado experimentalmente (Figura 11 e Figura 21). (B) Domínios 1 (aminoácidos 166-7) e 2 (aminoácidos 731-1003), que incluem motivos 1-4, são descritos para S. pyogenes Cas9/Csn1. Consulte a Tabela 1e Figura 5 para informações adicionais.
[0544] Figura 21 Clivagem de DNA Protoespaçador por Cas9 mutantes direcionadas ao tracrRNA:crRNA cognato contendo mutações no domínio tipo HNH ou RuvC. (A) Clivagem de DNA do plasmídeo Protoespaçador 1. O experimento foi realizado conforme indicado na Figura 11A. Conformações de DNA do plasmídeo e tamanhos em pares de base são indicados.(B) Clivagem de DNA do oligonucleotídeo Protoespaçador 4. O experimento foi realizado conforme indicado na Figura 11B. Tamanhos em nucleotídeos são indicados.
Requisitos de dual-RNA para ligação de DNA alvo e clivagem
[0545] tracrRNA pode ser necessário para direcionar a ligação ao DNA e/ou para estimular a atividade de nuclease de Cas9 a jusante de reconhecimento do alvo. Para distinguir entre estas possibilidades, usamos um ensaio de mudança de mobilidade eletroforética para monitorar a ligação de DNA alvo por Cas9 cataliticamente inativa na presença ou ausência de crRNA e/ou tracrRNA. Adição de tracrRNA substancialmente reforçou a ligação ao DNA alvo por Cas9, considerando que observamos pouca ligação específica ao DNA com Cas9 sozinho ou Cas9-crRNA (Figura 22). Isso indica que o tracrRNA é necessário para reconhecimento de DNA alvo, possivelmente pelo orientando corretamente o crRNA para a interação com a fita complementar de DNA alvo. A estrutura secundária de tracrRNA:crRNA prevista inclui emparelhamento de base entre os 22 nucleotídeos no terminal 3’ do crRNA e um segmento perto da extremidade 5’ do tracrRNA maduro (Figura 10E). Essa interação cria uma estrutura na qual os 20 nucleotídeos 5’-terminal do crRNA, que variam em sequência em crRNAs diferentes, estão disponíveis para ligação de DNA alvo. A maior porção do tracrRNA à jusante da região de pareamento de base de crRNA é livre para formar estruturas de RNA adicionais e/ou interagir com Cas9 ou o sítio do DNA alvo. Para determinar se o comprimento inteiro do tracrRNA é necessário para clivagem de DNA catalisada por Cas9 específica ao sítio, testamos complexos Cas9-tracrRNA:crRNA reconstituídos utilizando crRNA completo maduro (42 nucleotídeos) e várias formas sequências desprovidas de tracrRNA em suas extremidades 5’ ou 3’. Estes complexos foram testados para a segmentação usando um dsDNA alvo curto. Uma versão substancialmente truncada de tracrRNA retendo 23 a 48 de nucleotídeos da sequência nativo foi capaz de suportar robusta clivagem de DNA catalisada por Cas9 guiada por RNA dual (Figura 12, A e C e a Figura 23, A e B). Truncamento da crRNA de qualquer extremidade mostrou que a clivagem catalisada por Cas9 na presença de tracrRNA poderia ser disparada com crRNAs desprovido de 10 nucleotídeos de 3’- terminal (Figura 12, B e C). Em contraste, uma exclusão de 10 nucleotídeos da extremidade 5’ do crRNA aboliu a clivagem de DNA por Cas9 (Figura 12B). Também foram analisados ortólogos Cas9 de várias espécies bacterianas por sua capacidade de suporte da clivagem de DNA guiada por tracrRNA:crRNA de S. pyogenes. Em contraste ortólogos Cas9 intimamente relacionados de S. pyogenes, ortólogos mais distantemente relacionados não foram funcionais na reação de clivagem (Figura 24). Da mesma forma, Cas9 de S. pyogenes guiada por duplex tracrRNA:crRNA provenientes de sistemas mais distantes foi incapaz de clivar eficientemente o DNA (Figura 24). Especificidade de espécies de clivagem de DNA guiada por dual RNA indica coevolução de Cas9, tracrRNA e a repetição de crRNA, bem como a existência de uma estrutura ainda desconhecida e/ou sequência no dual-RNA que é essencial para a formação do complexo ternário com ortólogos Cas9 específicos.
[0546] Para investigar os requisitos de sequência protoespaçadora para imunidade de CRISPR tipo II/Cas em células bacterianas, analisamos uma série de DNAs de plasmídeo contendo protoespaçador, contendo mutações de nucleotídeo único para sua manutenção após a transformação em S. pyogenes e sua capacidade de ser clivada por Cas9 in vitro. Em contraste com mutações pontuais introduzidas na extremidade 5’ do protoespaçador, mutações na região próxima do PAM e os sítios de clivagem Cas9 não foram toleradas in vivo e resultou em diminuição da eficiência de clivagem do plasmídeo in vitro (Figura 12D). Nossos resultados estão de acordo com um relatório anterior de mutantes de escape de protoespaçador selecionados no tipo de sistema CRISPR tipo II de S. thermophilus in vivo (27, 29). Além disso, a manutenção do plasmídeo e clivagem resulta em hint na existência de uma região de “semente” localizada na extremidade 3’ da sequência protoespaçadora que é crucial para a interação com crRNA e clivagem subsequente por Cas9. Em apoio a esta noção, Cas9 melhorou a hibridização de fita complementar de DNA para o crRNA; essa melhora foi a mais forte na região 3’-terminal da sequência tendo crRNA como alvo (Figura 25A-C). Corroborando esta conclusão, um trecho contíguo de pelo menos 13 pares de base entre o crRNA e o sítio de DNA alvo proximal ao PAM é necessário para a clivagem alvo eficiente, considerando que até seis incompatibilidades contíguas na região 5’-terminal do protoespaçador são toleradas (Figura 12E). Esses achados são uma reminiscência das exigências observadas anteriormente na sequência semente para reconhecimento de ácido nucleico alvo em proteínas Argonaute (30, 31) e complexos de Cascata e Csy CRISPR (13, 14).
[0547] Figura 12 (A) Complexos Cas9-tracrRNA: crRNA foram reconstituídos usando crRNA-sp2 de 42 nucleotídeos e construções de tracrRNA truncadas e foram avaliados para atividade de clivagem, como na Figura 10B. (B) Cas9 programado com tracrRNA completo e truncamentos crRNA- sp2 foi analisada para a atividade, como em (A). (C) Regiões mínimas de tracrRNA e crRNA capazes de orientar a clivagem de DNA mediada por Cas9 (região sombreada). (D) Plasmídeos contendo sequências protoespaçadoras 2 WT ou mutantes com mutações pontuais indicadas foram clivados in vitro por Cas9 programado como na Figura 10A e utilizados para os ensaios de transformação de S. pyogenes WT ou deficientes em pré-crRNA. A eficiência de transformação foi calculada como unidades formadoras de Colônia (UFC) por micrograma de DNA de plasmídeo. Barras de erro representam SDs para três réplicas biológicas. (E) Plasmídeos contendo inserções protoespaçador 2 WT e mutante com extensão variando de incompatibilidades de DNA tendo crRNA como alvo (inferior) foram clivados in vitro por Cas9 programada (superior). As reações de clivagem foram ainda digeridas com XmnI. Os fragmentos de 1880 e 800 bp são produtos da clivagem gerados por Cas9. M, marcador de DNA.
[0548] Figura 22 Realizaram-se ensaios de mudança de mobilidade eletroforética usando protoespaçador 4 duplex de DNA alvo e Cas9 (contendo domínio nuclease inativando mutações D10A e H840) sozinho ou na presença de crRNA-sp4, tracrRNA (75nt) ou ambos. O duplex de DNA alvo foi radiomarcado em ambas as extremidades 5'. Cas9 (D10/H840A) e complexos foram titulados de 1 nM a 1 μM. Ligação foi analisada por eletroforese em gel de poliacrilamida nativo 8% e visualizada por fosforimageamento. Observe o que Cas9 sozinho liga DNA alvo com afinidade moderada. Essa ligação não é afetada pela adição de crRNA, sugerindo que esta representa a interação não específica de sequência com o dsDNA. Além disso, essa interação pode ser superada por tracrRNA sozinho na ausência de crRNA. Na presença de ambos os crRNA e tracrRNA, ligação ao DNA alvo é substancialmente reforçada e produz uma espécie com mobilidade eletroforética distinta, indicativa do reconhecimento do DNA alvo específico.
[0549] Figura 23 Um fragmento de tracrRNA, abrangendo uma parte da região pareada de crRNA e uma porção da região à jusante é suficiente para direcionar a clivagem do DNA oligonucleotídeo protoespaçador por Cas9. (A) Clivagem DNA do oligonucleotídeo Protoespaçador 1 e (B) Clivagem de DNA do oligonucleotídeo Protoespaçador 4 por Cas9 guiada com um crRNA maduro cognato e vários fragmentos de tracrRNA. (A, B) Tamanhos em nucleotídeos são indicados.
[0550] Figura 24 Como Cas9 de S. pyogenes, ortólogos Cas9 estreitamente relacionadas por bactérias gram- positivas L. innocua e S. thermophilus clivam DNA protoespaçador quando alvo de tracrRNA:crRNA de S. pyogenes. No entanto, nas mesmas condições, clivagem de DNA pelo ortólogos Cas9 menos estreitamente relacionados da bactéria Gram negativa C. jejuni e N. meningitidis não é observada. Spy, S. pyogenes SF370 (número de acessão NC_002737); Sth, S. thermophilus LMD-9 (STER_1477 Cas9 ortholog; número de acessão NC_008532); Lin, L. innocua Clip11262 (número de acessão NC_003212); Cje, C. jejuni NCTC 11168 (número de acessão NC_002163); Nme, N. meningitidis A Z2491 (número de acessão NC_003116). (A) Clivagem do DNA do plasmídeo protoespaçador. DNA de plasmídeo protoespaçador 2 (300 ng) foi submetido a clivagem por diferentes ortólogos Cas9 (500 nM) guiados por duplexes híbridos tracrRNA:crRNA-sp2 (500 nM, 1:1) de espécies diferentes. Para projetar os duplex RNA, previmos sequências tracrRNA de L. innocua e N. meningitidis com base nos dados anteriormente publicados de Northern (4). Os duplex de RNA duplo-híbrido consistem em tracrRNA específico de espécie e um crRNA heterólogo. A sequência heteróloga de crRNA foi projetada para conter a sequência sp2 tendo DNA como alvo de S. pyogenes na extremidade 5' fundida a L. innocua ou N. meningitidis sequência de repetição de ligação a tracrRNA na extremidade 3'. Ortólogos Cas9 de S. thermophilus e L. innocua, mas não de N. meningitidis ou C. jejuni, podem ser guiados por S. pyogenes tracrRNA:crRNA-sp2 para clivar DNA plasmídeo de protoespaçador 2, apesar de com eficiência ligeiramente reduzida. Da mesma forma, o híbrido de L. innocua tracrRNA:crRNA-sp2 pode guiar S. pyogenes Cas9 para clivar o DNA alvo com alta eficiência, enquanto que o híbrido de N. meningitidis tracrRNA:crRNA-sp2 aciona apenas ligeiramente a atividade de clivagem de DNA por Cas9 de S. pyogenes. Como controles, ortólogos Cas9 de N. meningitidis e L. innocua clivam DNA de plasmídeo protoespaçador 2 quando guiados pelo híbrido cognato tracrRNA:crRNA-sp2. Observe que, como mencionado acima, a sequência de tracrRNA de N. meningitidis é prevista apenas e ainda não foi confirmada por sequenciamento de RNA. Portanto, a baixa eficiência de clivagem pode ser o resultado de qualquer baixa atividade de ortólogos Cas9 ou o uso de uma sequência de tracrRNA não projetada idealmente. (B) Clivagem do DNA oligonucleotídeo protoespaçador. Extremidade 5' da fita complementar do oligonucleotídeo radioativamente marcada (10 nM) pré-anelada com fita não complementar sem marcador do oligonucleotídeo (protoespaçador 1) (10 nM) (à esquerda) ou extremidade 5' de fita não complementar marcada radioativamente do oligonucleotídeo (10 nM) pré-anelada com fita complementar não marcada do oligonucleotídeo (10 nM) (direita) (protoespaçador 1) foi submetida a clivagem por vários ortólogos Cas9 (500 nM) guiado por tracrRNA:crRNA-sp1 duplex de S. pyogenes (500 nM, 1:1). Ortólogos Cas9 de S. thermophilus e L. innocua, mas não de N. meningitidis ou C. jejuni podem ser guiados por S. pyogenes cognato dual-RNA para clivar o DNA de oligonucleotídeo protoespaçador, embora com eficiência reduzida. Observe que o sítio de clivagem na fita complementar do DNA é idêntico para todos os três ortólogos. Clivagem da fita não complementar ocorre em posições distintas. (C) Identidade de sequência de aminoácidos de ortólogos Cas9. Ortólogos Cas9 de S. pyogenes, S. thermophilus e L. innocua Cas9 compartilham alta porcentagem de identidade de aminoácidos. Em contraste, as proteínas Cas9 de C. jejuni e N. meningitidis diferem na sequência e comprimento (~300-400 aminoácidos a menos). (D) Co-dobragens de sequências de crRNA heterólogo específico de espécie projetadas com os correspondentes ortólogos de tracrRNA de S. pyogenes (confirmada experimentalmente, (4)), L. innocua (prevista) ou N. meningitidis (prevista). tracrRNAs; framentos de crRNA espaçador 2; e fragmentos de repetições de crRNA são traçados e marcados. Híbridos de L. innocua e S. pyogenes tracrRNA:crRNA-sp2 duplexes compartilham características estruturais muito semelhantes, embora distindos do híbrido de N. meningitidis tracrRNA:crRNA. Juntamente com os dados de clivagem descritos acima em (A) e (B), as previsões de co-dobra indicaria que a clivagem de especificidade de espécie do DNA alvo por Cas9 alvo-tracrRNA:crRNA é ditada por uma característica estrutural ainda desconhecida no duplex tracrRNA:crRNA que é reconhecida especificamente por um ortólogo Cas9 cognato. Foi previsto que a especificidade de espécie da clivagem observada em (A) e (B) ocorre ao nível da ligação do Cas9 a dual-tracrRNA:crRNA. Clivagem Cas9 guiada por dual-RNA do DNA alvo pode ser específica de espécie. Dependendo do grau de diversidade/evolução entre proteínas Cas9 e duplexes tracrRNA:crRNA, Cas9 e ortólogos dual-RNA são parcialmente intercambiáveis.
[0551] Figura 25 Uma série de sondas de DNA de 8 nucleotídeos complementares às regiões no crRNA abrangendo a região tendo DNA como alvo e região de ligação a tracrRNA foram analisadas por sua capacidade de hibridizar ao crRNA no contexto de um duplex de tracrRNA:crRNA e o Cas9- tracrRNA:crRNA complexo ternário. (A) Representação esquemática das sequências de sondas de DNA utilizadas no ensaio e seus locais de ligação no crRNA-sp4. (B-C) Ensaios de mudança de mobilidade eletroforética de sondas de DNA alvo com tracrRNA:crRNA-sp4 ou Cas9-tracrRNA:crRNA-sp4. A construção do tracrRNA(15-89) foi usada no experimento. Ligação do duplexes ou complexos para direcionar aos DNAs oligonucleotídeo foi analisada em gel de poliacrilamida nativo 16% e visualizada por fosforimageamento. Um motif de pequena sequência dita formação R-alça
[0552] Em vários sistemas CRISPR/Cas, reconhecimento de si versus não si tem sido mostrado por envolver um motif de sequência curto que é preservado no genoma estrangeiro, conhecido como o PAM (27, 29, 32-34). Motivos PAM são apenas alguns pares de base de comprimento, e sua sequência exata e posição variam de acordo com o tipo de sistema CRISPR/Cas (32). No sistema tipo II de S. pyogenes, o PAM está de acordo com uma sequência de consenso NGG, contendo dois pares de base G:C que ocorrem um par de base à jusante da sequência de ligação crRNA, dentro do DNA alvo (4). Ensaios de transformação demonstraram que o motif da GG é essencial para a eliminação de DNA de plasmídeo protoespaçador por CRISPR/Cas em células bacterianas (Figura 26A), consistente com as observações anteriores em S. thermophilus (27). O motif também é essencial para a clivagem de plasmídeo protoespaçador in vitro por Cas9 guiado por tracrRNA:crRNA (Figura 26B). Para determinar o papel do PAM na clivagem de DNA alvo pelo complexo Cas9-tracrRNA: crRNA, testamos uma série de dsDNA duplex contendo mutações na sequência de PAM sobre as fitas complementares ou não complementares, ou ambas (Figura 13A). Ensaios de clivagem usando estes substratos mostraram que clivagem de DNA catalisada por Cas9 era particularmente sensível à mutações na sequência de PAM na fita não complementar do DNA, em contraste ao reconhecimento de PAM da fita complementar por sistemas CRISPR/Cas tipo I (18, 34). Clivagem de DNAs alvos fita simples foi afetada por mutações do motif PAM. Esta observação sugere que o motif PAM é exigido somente no contexto dsDNA alvo e, portanto, pode ser necessário para licenciar desenrolamento de duplex, invasão de fita, e a formação de uma estrutura de alça-R. Quando usamos um par de diferentes crRNA- DNA alvo (crRNA-sp4 e protoespaçador 4 DNA), selecionados devido à presença de um PAM canônico não presente no DNA alvo de protoespaçador 2, descobrimos que ambos os nucleotídeos G do PAM eram necessários para eficiente clivagem de DNA catalisada por Cas9 (Figura 13B e Figura 26). Para determinar se o PAM desempenha um papel direto no recrutamento do complexo Cas9-tracrRNA:crRNA para o sítio de DNA alvo correto, analisamos afinidades de ligação do complexo para sequências de DNA alvo por ensaios de mudança de mobilidade de gel nativo (Figura 13). Mutação de qualquer G na sequência PAM reduziu substancialmente a afinidade de Cas9-tracrRNA: crRNA para o DNA alvo. Esta constatação ilustra um papel para a sequência de PAM na ligação de DNA alvo por Cas9.
[0553] Figura 13 (A) Cas9 programado por RNA dual foi testado para a atividade, como na Figura 10B. Sequências PAM WT e mutante em DNAs alvos são indicados com linhas. (B) Duplex de DNA alvo Protoespaçador 4 (marcado em ambas extremidades 5‘) contendo motivos PAM WT e mutante foram incubados com Cas9 programado com tracrRNA:crRNA-sp4 (nucleotídeos 23 a 89). Nos pontos de tempo indicados (em minutos), alíquotas da reação de clivagem foram tiradas e analisadas conforme indicado na Figura 10B. (C) Ensaios de mudança de mobilidade eletroforética foram realizados utilizando Cas9 programado por RNA (D10A/H840A) e duplex DNA alvo protoespaçador 4 [mesmo que em (B)] contendo motivos PAM WT e mutados. O complexo Cas9 (D10A/H840A)-RNA foi titulado de 100 pM a 1 mM.
[0554] Figura 26 (A) Mutações da sequência PAM em DNA de plasmídeo protoespaçador 2 abolem a interferência da manutenção do plasmídeo pelo sistema CRISPR tipo II /Cas em células bacterianas. Plasmídeos protoespaçador tipo selvagem 2 com uma PAM funcional ou mutante foram transformados em tipo selvagem (cepa SF370, também chamado EC904) e mutante deficiente em pré-crRNA (EC1479) (EC1479) S. pyogenes como na Figura 12D. Mutações do PAM não são toleradas pelo sistema CRISPR tipo II/Cas in vivo. Os valores médios e desvios-padrão de três réplicas biológicas são mostrados. (B) Mutações da sequência de PAM no DNA de plasmídeo protoespaçador abolem a clivagem por Cas9- tracrRNA:crRNA. Plasmídeo de protoespaçador 2 tipo selvagem com um PAM funcional ou mutante foram submetidas à clivagem Cas9 conforme indicado na Figura 10A. Os plasmídeos mutantes PAM não são clivados pelo complexo Cas9-tracrRNA:crRNA. (C) Mutações da sequência canônica de PAM abolem a interferência da manutenção do plasmídeo pelo sistema CRISPR tipo II/Cas em células bacterianas. Plasmídeos de Protoespaçador tipo selvagem 4 com um PAM funcional ou mutante foram clivados com Cas9 programado com tracrRNA e crRNA-sp2. As reações de clivagem foram realizadas na presença da endonuclease de restrição XmnI para visualizar os produtos de clivagem Cas9 como dois fragmentos (1880 ~ e ~ 800 bp). Tamanhos de fragmento em pares de base são indicados. Cas9 pode ser programado com um único RNA quimérico
[0555] Exame da estrutura secundária provável do duplex tracrRNA:crRNA (Figuras 10 e 12 C) sugeriu a possibilidade de que os recursos necessários para a clivagem específica de sítio de DNA catalisada por Cas9 podem ser capturados em um único RNA quimérico. Embora o mecanismo de seleção de alvo tracrRNA:crRNA funcione eficientemente na natureza, a possibilidade de um Cas9 guiado por RNA único é atraente devido à sua potencial utilidade para clivagem de DNA programada e edição de genoma (Figura 1A-B). Nós projetamos duas versões de um RNA quimérico contendo uma sequência de reconhecimento alvo na extremidade 5’, seguida por uma estrutura hairpin mantendo as interações de emparelhamento de base que ocorrem entre o tracrRNA e o crRNA (Figura 14A). Esta transcrição única efetivamente funde a extremidade 3’ do crRNA à extremidade 5’ do tracrRNA, imitando, assim, a estrutura dual-RNA necessária para guiar a clivagem de DNA específica de sítio por Cas9. Em ensaios de clivagem usando Plasmídeo de DNA, observamos que os RNAwas quiméricos maiores capazes de orientar a clivagem de DNA catalisada por Cas9 de forma semelhante ao observado para o duplex tracrRNA:crRNA truncado (Figura 14A e Figura 27, A e C). O RNA quimérico mais curto não funcionou com eficiência neste ensaio, confirmando que nucleotídeos que estão nas posições de 5 a 12 além da interação de emparelhamento de base de tracrRNA:crRNA são importantes para eficiente ligação a Cas9 e/ou reconhecimento do alvo. Obtivemos resultados semelhantes em ensaios de clivagem usando dsDNA curto como um substrato, ainda indicando que a posição do sítio de clivagem no DNA alvo é idêntica àquela observada usando o tracrRNA:crRNA dual como um guia (Figura 14B e Figura 27, B e C). Finalmente, para estabelecer se o desenho do RNA quimérico pode ser universalmente aplicável, projetamos cinco diferentes RNAs guias quiméricos para direcionar uma porção do gene que codifica a proteína verde fluorescente (GFP) (Figura 28, A a C) e testamos sua eficácia contra um plasmídeo carregando a sequência de codificação GFP in vitro. Em todos os cinco casos, Cas9 programado com estes RNAs quiméricoes eficientemente clivou o plasmídeo no sítio alvo correto (Figura 14C e Figura 28D), indicando que o projeto racional de RNAs quiméricos é robusto e poderia, em princípio, habilitar o direcionamento de qualquer sequência de DNA de interesse com poucas restrições, além da presença de um dinucleótido GG adjacente à sequência alvo.
[0556] Figura 1 Um RNA tendo DNA como alvo é composto por um “segmento tendo DNA como alvo” de fita simples e um “segmento de ligação à proteína,” que compreende um trecho de RNA fita dupla. (A) Um RNA tendo DNA como alvo pode abranger duas moléculas de RNA separadas (referidas como um RNA tendo DNA como alvo de “molécula dupla” ou “duas moléculas”). Um RNA tendo DNA de molécula dupla alvo é composto por um “RNA direcionador” e um “RNA ativador”. (B) Um RNA tendo DNA como alvo pode incluir uma única molécula de RNA (referida como um RNA tendo DNA como alvo de “única molécula”). Um RNA tendo DNA de molécula única como alvo é composto por “nucleotídeos ligantes.”
[0557] Figura 14 (A) Um plasmídeo abrigando sequência alvo protoespaçadora 4 e um PAM WT foi submetido a clivagem por Cas9 programado com tracrRNA(4-89):crRNA-sp4 duplex ou RNAs quiméricos transcritos in vitro construídos juntando-se a extremidade 3’ de crRNA à extremidade 5’ do tracrRNA com uma tetraalça GAAA. Reações de clivagem foram analisadas pelo mapeamento de restrição com XmnI. Sequências de RNAs quiméricos A e B são mostradas com DNA como alvo (sublinhado), sequências de repetição derivadas de crRNA (sublinhadas), e sequências derivadas de tracrRNA (tracejado sublinhado). (B) Reações de clivagem de DNA duplex Protoespaçador 4 foram realizadas conforme indicado na Figura 10B. (C) Cinco RNAs quiméricos projetados para atingir o gene GFP foram usados para programar Cas9 para clivar um plasmídeo contendo gene GFP. Reações de clivagem do plasmídeo foram realizadas conforme indicado na Figura 12E, exceto que o plasmídeo de DNA foi mapeado com restrição com AvrII após clivagem Cas9.
[0558] Figura 27 (A) Um único quimérico RNA orienta clivagem catalisada por Cas9 de DNA do plasmídeo protoespaçador cognato (protoespaçador 1 e protoespaçador 2). As reações de clivagem foram realizadas na presença da endonuclease de restrição XmnI para visualizar os produtos de clivagem Cas9 como dois fragmentos (1880 ~ e ~ 800 bp). Tamanhos de fragmento em pares de base são indicados. (B) Um único RNA quimérico orienta clivagem catalisada por Cas9 de DNA do oligonucleotídeo de protoespaçador cognate (protoespaçador 1 e protoespaçador 2). Tamanhos de fragmento em nucleotídeos são indicados. (C) Representações esquemáticas dos RNAs quiméricos usados no experimento. Sequências de RNAs quiméricos A e B são mostradas com a sequência tendo DNA 5' protoespaçador como alvo de crRNA (sublinhado), a sequência de ligação a tracrRNA de crRNA (sobrelinhada) e a sequência derivada de tracrRNA (tracejado sublinhado).
[0559] Figura 28 (A) Representação esquemática do plasmídeo de expressão de GFP pCFJ127. A porção variável da região aberta de leitura GFP é indicada com uma seta preta. (B) Close-up da sequência da região de destino. Sequências alvejadas pelos RNAs quiméricos são mostradas com barras cinza. Dinucleotídeos PAM estão em caixas. Um sítio único de restrição SalI é localizado 60 bp à montante do locus do alvo. (C) Esquerda: sequências de DNA alvo são mostradas juntamente com seus motivos de PAM adjacentes.Direita: Sequências do guia quimérico de RNAs. (D) pCFJ127 foi clivado por Cas9 programado com RNAs quiméricos GFP1-5, conforme indicado. Além disso, o plasmídeo foi digerido com SalI e as reações foram analisadas por eletroforese em um gel de agarose a 3% e visualizadas por coloração com SYBR Safe.
Conclusões
[0560] Mecanismo de interferência de DNA foi identificado, envolvendo uma estrutura dual-RNA que direciona uma Cas9 endonuclease para introduzir quebras de fita dupla específicas do sítio no DNA alvo. A proteína Cas9 guiada por tracrRNA:crRNA faz uso de domínios distintos de endonuclease (domínios tipo RuvC e HNH) para clivar as duas fitas no DNA alvo. Reconhecimento do alvo por Cas9 requer uma sequência de semente no crRNA e uma sequência PAM contendo GG dinucleotídeo adjacente à região de ligação crRNA no DNA alvo. Ainda, mostramos que a endonuclease Cas9 pode ser programada com RNA guia projetado como uma transcrição única alvo e cliva qualquer sequência de dsDNA de interesse. O sistema é eficiente, versátil e programável, alterando a sequência de ligação ao DNA alvo no RNA quimérico guia. Nucleases de dedo de zinco e nucleases efetoras tipo ativador de transcrição têm atraído considerável interesse como enzimas artificiais projetadas para manipular genomas (3538). Isto representa a metodologia alternativa baseada em Cas9 programado pelo RNA que facilita direcionamento ao gene e aplicações de edição de genoma.
Referências Citadas
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Exemplo 2 : Edição de genoma programado por RNA em células humanas
[0562] Os dados fornecidos abaixo demonstram que Cas9 pode ser expressa e localizada no núcleo das células humanas, e que reúne com RNA único guia (“sgRNA”; englobando as características necessárias para ligação a Cas9 e reconhecimento de sítio DNA alvo) em uma célula humana. Estes complexos podem gerar quebras fitas duplas e estimular o reparo de junção da extremidade não homóloga (NHEJ) em DNA genômico em um sítio complementar à sequência de sgRNA, uma atividade que requer ambos Cas9 e o sgRNA. Extensão da sequência de RNA em sua extremidade 3' realça atividade de direcionamento a DNA em células vivas. Além disso,experimentos utilizando extratos de células transfectadas mostram que a montagem de sgRNA em Cas9 é o fator limitante para a clivagem de DNA mediada por Cas9. Estes resultados demonstram que edição genoma programada por RNA trabalha em células vivas e in vivo.
MATERIAIS E MÉTODOS Construção e desenho de plasmídeo
[0563] A sequência de que codifica Cas9 de Streptococcus pyogenes (resíduos 1-1368) fundida a um epítopo HA (sequência de aminoácidos DAYPYDVPDYASL (SEQ ID NO: 274)), um sinal de localização nuclear (sequência de aminoácidos PKKKRKVEDPKKKRKVD (SEQ ID NO: 275)) foi otimizada por códons para expressão humana e sintetizado por GeneArt. A sequência de DNA é SEQ ID NO: 276 e a sequência de proteínas é SEQ ID NO: 277. Clonagem independente de ligação (LIC) foi usada para inserir essa sequência em um GFP derivado de pcDNA3.1 e vetores LIC mCherry (vetores 6D e 6B, respectivamente, obtidos a partir da UC Berkeley MacroLab), resultando em fusões Cas9-HA-NLS-GFP e Cas9-HA-NLS-mCherry expressas sob o controle do promotor CMV. sgRNAs guias foram expressos usando vetor de expressão pSilencer 2.1-U6 puro (Life Technologies) e pSuper (Oligoengine). Construções de expressão de RNA foram geradas pelo anelamento de oligonucleotídeos complementares para formar a sequência de DNA tendo RNA como alvo e ligando o fragmento de DNA anelado entre os sítios BamHI e HindIII em pSilencer 2.1-U6 puro e BglII e sítios HindIII em pSuper. Condições de cultura celular e transfecções de DNA
[0564] Células HEK293T foram mantidas em meio de eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) em uma incubadora umidificada com 5% CO2. As células foram transitoriamente transfectadas com plasmídeo usando o reagente de Transfecção de DNA X-tremeGENE (Roche) ou reagente de Transfecção Turbofect (Thermo Scientific) com protocolos recomendados. Brevemente, células HEK293T foram transfectadas na confluência de 60-80% em placas de 6 poços usando 0,5 μg do plasmídeo de expressão Cas9 e 2,0 μg de plasmídeo de expressão do RNA. As eficiências de transfecção foram estimadas em 30-50% para Tubofect (Figuras 29E e 37A-B) e 80-90% para X-tremegene (Figura 31B), com base na fração de células positivas para GFP observadas por microscopia de fluorescência. 48 horas pós transfecção, as células foram lavadas com salina tampão fosfato (PBS) e lisadas aplicando 250 μl tampão de lise (20 mM Hepes pH 7,5, 100 mM de cloreto de potássio (KCl), 5mM cloreto de magnésio (MgCl2), 1 mM ditiotreitol (DTT), 5% de glicerol, 0,1% Triton X-100, suplementado com coquetel inibidor de Protease Roche) e depois giradas por 10 min a 4 °C. O lisado celular total resultante foi dividido em alíquotas para posterior análise. DNA genômico foi isolado de 200 μl lisado celular usando o Kit DNeasy de sangue e tecido (Qiagen) de acordo com o protocolo do fabricante.
Análise Western blot de expressão Cas9
[0565] HEK293T, transfectadas com o plasmídeo de expressão Cas9-HA-NLS-GFP, foram coletadas e lisadas 48 horas após a transfecção acima. 5 ul de lisado foram eletroforados em gel de poliacrilamida SDS 10%, manchados em uma membrana PVDF e analisados com anticorpo anti-HA conjugado a HRP (Sigma, diluição de 1:1000 em PBS 1x).
Ensaio de Surveyor
[0566] O ensaio Surveyor foi realizado como anteriormente descrito [10, 12, 13]. Brevemente, o locus de cadeia leve A de clatrina humana (CLTA) foi amplificado por PCR de 200 ng de DNA genômico, usando uma polimerase de alta fidelidade, Herculase II Fusion DNA Polymerase (Agilent Technologies) e iniciador direto 5'-GCAGCAGAAGAAGCCTTTGT-3' (SEQ ID NO: //) e iniciador reverso 5'-TTCCTCCTCTCCCTCCTCTC- 3' (SEQ ID NO: //). 300 ng do amplicon de 360 bp foi então desnaturado por aquecimento a 95°C e novamente anelado lentamente usando um bloco de calor para novamente hibridizar aleatoriamente cepas de DNA tipo selvagem e mutante. As amostras foram então incubadas com nuclease Cel-1 (Kit Surveyor, Transgenomic) por 1 hora em 42°C. Cel-1 reconhece e cliva hélices de DNA que contêm incompatibilidades (hibridização tipo selvagem: mutante). Produtos de digestão de nuclease Cel-1 foram separados em um gel de acrilamida 10% e visualizados por coloração com SYBR Safe (Life Technologies). Quantificação de bandas de clivagem foi realizada utilizando o software ImageLab (Bio-Rad). O percentual de clivagem foi determinado dividindo-se a intensidade média de produtos de clivagem (160-200 bps) pela soma das intensidades do produto do PCR não clivado (360 bp) e o produto de clivagem.
Transcrição In vitro
[0567] Guia de RNA foi transcrito <i0>in vitro</i0> usando recombinante T7 RNA polimerase e um modelo de DNA gerados pelo anelamento complementar de oligonucleotídeos sintéticos como descrito anteriormente [14]. RNAs foram purificados por eletroforese em gel do acrilamida de ureia 7M desnaturante, precipitado em etanol e dissolvido na água tratada com DEPC.
Análise de Northern blot
[0568] RNA foi purificado de células HEK293T usando o kit de isolamento de RNA pequeno mirVana (Ambion). Para cada amostra, 800 ng de RNA foram separados em um gel de ureia-PAGE 10% após desnaturação por 10 min a 70°C em tampão de carregamento do RNA (0,5 X TBE (pH7,5), 0,5 mg/ml azul de bromofenol, xileno cianol 0,5 mg e 47% formamida). Após eletroforese em 10W no tampão de TBE X 0,5 até o corante azul de bromofenol atingir o fundo do gel, amostras foram eletroborradas em uma membrana de Nytran a 20 volts por 1,5 horas em 0,5 X TBE. Os RNAs transferidos foram reticulados na membrana de Nytran em UV-Crosslinker (Strategene) e foram pré-hibridizados a 45°C por 3 horas em um tampão que contém 40% formamida, 5 X SSC, 3 X Dernhardt (0,1% cada de ficoll, polivinilpirrolidona e BSA) e 200 μg/ml DNA de esperma de salmão. As membranas pré-hibridizadas foram incubadas durante a noite no tampão pré-hibridização suplementado com sonda de oligo DNA antissenso marcado com 5’-32P em 1 milhão cpm/ml. Após várias lavagens em tampão SSC (lavagem final em 0,2 X SCC), as membranas foram imageadas com fosforimageamento.
Ensaio de clivagem in vitro
[0569] Lisados celulares foram preparados conforme descrito acima e incubados com o plasmídeo doador de CLTA-RFP [10]. Reações de clivagem foram realizadas em um volume total de 20 μl e continham 10 μl de lisado, 2 μl de 5 x tampão de clivagem (100 mM HEPES pH 7,5, 500 mM KCl, 25 mM MgCl2, 5 mM DTT, 25% de glicerol) e 300 ng do plasmídeo. Onde indicado, as reações foram suplementadas com 10 pmol de sgRNA de CLTA1 transcrito in vitro. As reações foram incubadas a 37°C por uma hora e posteriormente digeridas com 10 U de XhoI (NEB) por um adicional 30 min a 37°C. As reações foram paradas pela adição de Proteinase K (Thermo Scientific) e incubadas a 37°C por 15 min. Os produtos de clivagem foram analisados por eletroforese em um gel de agarose a 1% e corados com SYBR Safe. A presença de fragmentos de ~ 2230 e ~ 3100 bp é indicativa de clivagem mediada por Cas9.
Resultados
[0570] Para testar se Cas9 poderia ser programado para clivar DNA genômico em células vivas, Cas9 foi coexpressa juntamente com um sgRNA projetado para atingir o gene de cadeia leve de Clatrina humana(CLTA). O locus genômico CLTA já havia sido alvejado e editado usando ZFNs [10]. Primeiro testamos a expressão de uma versão otimizada por códon humana da proteína Cas9 de Streptococcus pyogenes e sgRNA em células HEK293T humanas. A proteína Cas9 de 160 kDa foi expressa como uma proteína de fusão tendo um epítopo HA, um sinal de localização nuclear (NLS) e proteína verde fluorescente (GFP) anexada ao C-terminal da Cas9 (Figura 29A). Análise de células transfectadas com um vetor que codifica uma Cas9 fundida a GFP revelou abundante expressão de Cas9 e localização nuclear (Figura 29B). Western blotting confirmou que a proteína Cas9 é expressa em grande parte intacta em extratos destas células (Figura 29A). Para programar Cas9, expressamos sgRNA tendo uma sequência de 20 nucleotídeos 5'-terminal complementar para a sequência de DNA alvo, e uma estrutura de haste-alça de 42 nucleotídeos 3'- terminal necessária para ligação de Cas9 (Figura 29C). Esta sequência de 3'-terminal corresponde à estrutura mínima haste-alça que anteriormente foi usada para programar Cas9 in vitro [8]. A expressão deste sgRNA foi impulsionada pelo promotor humano U6 (RNA polimerase III) [11]. Análise Northern blotting analysis do RNA extraído de células transfectadas com o vetor de expressão de plasmídeo sgRNA direcionado por promotor U6 mostrou que o sgRNA realmente é expresso, e que sua estabilidade é reforçada pela presença de Cas9 (Figura 29D).
[0571] Figura 29 demonstra que essa coexpressão de Cas9 e guia de RNA em células humanas gera quebras de DNA fita dupla no locus alvo. (A) Superior; diagrama esquemático da constructo de expressão Cas9-HA-NLS-GFP. Inferior; lisado de células HEK293T transfectadas com o plasmídeo de expressão Cas9 foi analisado por Western blotting usando um anticorpo anti-HA. (B) Microscopia de fluorescência de células HEK293T expressando Cas9-HA-NLS-GFP. (C) Desenho de um RNA guia único (sgRNA, ou seja, um RNA tendo DNA de molécula única como alvo ) visando o locus CLTA humano. Superior; diagrama esquemático do sítio alvo sgRNA no éxon 7 do gene humano CLTA. A sequência alvo que hibridiza o segmento guia de CLTA1 sgRNA é indicada por “CLTA1 sgRNA”. O motif adjacente protoespaçador GG di-nucleotídeo (PAM) é marcado por uma seta. Linhas pretas indicam as regiões de ligação de DNA da proteína ZFN de controle. O códon de parada de tradução da região de leitura aberta CLTA é marcado com uma linha pontilhada para referência. Meio; diagrama esquemático da constructo de expressão sgRNA. O RNA é expresso sob o controle de um trato de promotor U6 Pol III e poli(T) que serve como um sinal de terminador de transcrição Pol III. Inferior; clivagem guiada por sgRNA do DNA alvo por Cas9. O sgRNA consiste em um segmento guia de 20-nt 5'-terminal, seguido por uma estrutura haste-alça de 42-nt exigida para ligação a Cas9. Clivagem mediada por Cas9 das duas fitas de DNA alvo ocorre no desenrolamento do DNA alvo e formação de um duplex entre o segmento guia do sgRNA e o DNA alvo. Isto é dependente da presença de um motif de PAM (apropriado para o Cas9 sendo usado, por exemplo, dinucleotídeo de GG, ver o exemplo 1 acima) à jusante da sequência alvo no DNA alvo. Observe que a sequência do alvo é invertida em relação ao diagrama superior. (D) Análise Northern blot de expressão de sgRNA nas células HEK239T. (E) Ensaio de nuclease Surveyor de DNA genômico isolados de células HEK293T expressando Cas9 e/ou CLTA sgRNA. Um constructo ZFN anteriormente usado para direcionar o locus CLTA [10] foi usado como controle positivo para a detecção de reparo de DNA induzido por DSB por junção de extremidade não homóloga.
[0572] Em seguida, investigamos se DSBs específicas ao sítio são gerados em células HEK293T transfectadas com Cas9-HA-NLS-mCherry e o sgRNA de CLTA1. Para fazer isso, sondamos pequenas inserções e deleções no locus resultantes de reparo imperfeito por NHEJ induzida pelo DSB usando o ensaio de nuclease Surveyor [12]. Região de DNA genômico alvejado por Cas9:sgRNA é amplificado por PCR e os produtos resultantes são desnaturados e novamente anelados. Os produtos PCR novamente hibridizados são incubados com a endonuclease de reconhecimento de incompatibilidade Cel-1 e resolvidos em um gel de acrilamida para identificar bandas de clivagem Cel-1. Como reparo de DNA por NHEJ normalmente é induzido por uma DSB, um sinal positivo no ensaio Surveyor indica que a clivagem de DNA genômico ocorreu. Usando este ensaio, detectamos a clivagem do locus CLTA em uma posição alvejada por sgRNA CLTA1 (Figura 29E). Um par de ZFNs que alveja um sítio vizinho no locus CLTA forneceu um controle positivo nesses experimentos [10].
[0573] Para determinar se expressão Cas9 ou sgRNA é um fator limitante nas reações de edição genoma observadas, lisados preparados a partir das células transfectadas foram incubados com DNA de plasmídeo abrigando um fragmento do gene CLTA alvejado pelo sgRNA CLTA1. Clivagem de DNA de plasmídeo não foi observada após incubação com lisado preparado a partir de células transfectadas com o vetor de expressão Cas9-HA-NLS-GFP sozinho, consistente com os resultados do ensaio Surveyor. No entanto, clivagem do plasmídeo robusto foi detectada quando o lisado foi complementado com CLTA1 sgRNA in vitro transcrito (Figura 30A). Além disso, lisado preparado a partir de células transfectadas com amboso vetores de expressão Cas9 e sgRNA suportaram a clivagem do plasmídeo, enquanto lisados de células transfectadas com o vetor de codificação de sgRNA sozinho não (Figura 30A). Estes resultados sugerem que um fator limitante para a função Cas9 em células humanas pode ser conjunto com o sgRNA. Testamos esta possibilidade diretamente através da análise de clivagem do plasmídeo em lisados de células transfectadas como antes na presença e na ausência de sgRNA exógena adicionado. Nomeadamente, quando sgRNA exógeno foi adicionado ao lisado de células transfectadas com ambos vetores de expressão Cas9 e sgRNA, um aumento substancial na atividade de clivagem de DNA foi observado (Figura 30B). Este resultado indica que o fator limitante para função Cas9 nas células HEK293T é a expressão da sgRNA ou seu carregamento em Cas9.
[0574] Figura 30 demonstra que lisados celulares contêm Cas9:sgRNA ativo e suportam clivagem de DNA específica de sítio. (A) Lisados de células transfectadas com os plasmídeos indicados à esquerda foram incubadas com o plasmídeo contendo uma PAM e a sequência alvo complementar para o CLTA1sgRNA; onde indicado, a reação foi suplementada com 10 pmol de CLTA1 sgRNA transcrito in vitro; clivagem secundária com XhoI gerou fragmentos de fragmentos ~ 2230 e ~ 3100 bp indicativos de clivagem mediada por Cas9. Uma reação de controle usando lisado de células transfectadas com um constructo de expressão ZFN mostra fragmentos de tamanho ligeiramente diferentes, refletindo o deslocamento do sítio alvo ZFN em relação ao sítio alvo de CLTA1. (B) Lisados de células transfectadas com plasmídeo de expressão Cas9-GFP e, quando indicado, o plasmídeo de expressão de sgRNA de CLTA1, foram incubadas com DNA de plasmídeo alvo como em (A) na ausência ou presença de CLTA1 sgRNA transcrito in vitro.
[0575] Como um meio para melhorar a montagem Cas9:sgRNA em células vivas, em seguida testamos o efeito da extensão da região de ligação a Cas9 presumível do guia de RNA. Duas novas versões do sgRNA CLTA1 foram projetadas para incluir mais seis ou doze pares de bases na hélice que imita as interações de emparelhamento de base entre o crRNA e tracrRNA (Figura 31A). Além disso, a extremidade 3' do guia de RNA foi estendida por cinco nucleotídeos baseados na sequência nativa de tracrRNA de S. pyogenes [9]. Vetores que codificam estes sgRNAs de 3' estendida sob o controle dos promotores do U6 ou H1 Pol III foram transfectados em células juntamente com o vetor de expressão Cas9-HA-NLS-GFP e clivagem do genoma específica ao sítio foi testada usando o ensaio de Surveyor (Figura 31B). Os resultados confirmaram que clivagem requereu ambos Cas9 e o CLTA1 sgRNA, mas não ocorreu quando o sgRNA ou Cas9 foram expressos isolados. Além disso, observamos um aumento substancial das frequências de NHEJ, como detectado por clivagem de Cel-1nuclease, enquanto a frequência de mutagênese NHEJ obtida com o controle de par ZFN foi praticamente inalterada.
[0576] Figura 31 demonstra que extensão 3' de construções de sgRNA aumenta a mutagênese específica ao sítio mediada por NHEJ. (A) A construção para a expressão de sgRNA CLTA1 (superior) foi projetada para gerar transcrições contendo a sequência de ligação ao Cas original (v 1.0), ou dsRNA duplexes estendidos por 4 pares de bases (v 2.1) ou 10 pares de bases (v. 2.2). (B) Ensaio Surveyor de nuclease de DNA genômico isolado de células HEK293T expressando Cas9 e/ou CLTA sgRNA v 1.0, v 2.1 e/ou v 2.2. Um constructo ZFN anteriormente usado para direcionar o locus CLTA [10] foi usado como controle positivo para a detecção de reparo de DNA induzido por DSB por junção de extremidade não homóloga.
[0577] Os resultados, portanto, fornecem a estrutura para implementação de Cas9 como uma ferramenta molecular para diversas aplicações de edição de genoma. Uma característica poderosa deste sistema é o potencial para programar Cas9 com vários sgRNAs na mesma célula, também para aumentar a eficiência da clivagem em um único locus, ou como um meio de atingir vários loci simultaneamente. Tais estratégias encontrariam aplicação ampla em experimentos de genoma completo e esforços de investigação em grande escala como o desenvolvimento de modelos de doenças multigênica.
Exemplo 3: As famílias de tracrRNA e Cas9 de sistemas de imunidade CRISPR-Cas tipo II
[0578] Pesquisamos todos os loci putativos CRISPR-Cas tipo II existentes atualmente em genomas bacterianas publicamente disponíveis por triagem para sequências homólogas de Cas9, a proteína hallmark do sistema tipo II. Nós construímos uma árvore filogenética de um alinhamento múltiplo da ortólogos Cas9 identificados. O comprimento de repetição CRISPR e organização do gene de operons cas dos sistemas Tipo II associados foram analisados nos diferentes subconjuntos de Cas9. Uma subclassificação dos loci tipo II foi proposta e dividida em subgrupos com base na seleção de75 representante ortólogos Cas9. Então previmos sequências tracrRNA principalmente recuperando sequências de repetição CRISPR e triagem para anti-repetições dentro ou nas imediações dos genes cas e matrizes CRISPR dos loci Tipo II selecionados. Realizou-se análise comparativa das sequências e estruturas previstas de ortólogos de tracrRNA escolhidos. Finalmente, determinamos os perfis de expressão e de processamento de tracrRNAs e crRNAs de cinco espécies bacterianas.
MATERIAIS E MÉTODOS Cepas bacterianas e as condições de cultura
[0579] Os seguintes meios foram utilizados para cultivar bactérias em placas: TSA (ágar soja tripticase, Trypticase™ Soy Agar (TSA II) BD BBL, Becton Dickinson) suplementado com sangue de cordeiro de 3% para S. mutans (UA159) e ágar BHI (infusão cérebro coração, BD Bacto™ Brain Heart Infusion, Becton Dickinson) para L. innocua (Clip11262). Quando cultivada em culturas líquidas, meio THY (Todd Hewitt Broth (THB, Bacto, Becton Dickinson) suplementado com 0,2% de extrato de levedura (Servabacter®) foi usado para S. mutans, caldo BHI para L. innocua, meio líquido BHI contendo 1% mistura de vitamina VX (Difco, Becton Dickinson) para N. meningitidis (A Z2491), caldo MH (Mueller Hinton Broth, Oxoid) incluindo 1% mistura de vitamina VX para C. jejuni (NCTC 11168; ATCC 700819) e TSB (caldo soja tríptico, caldo BD BBL™ Trypticase™) para F. novicida (U112). S. mutans foi incubada a 37°C, 5% CO2 sem agitação. Cepas de L. innocua, N. meningitidis e F. novicida foram cultivadas por via aeróbia a 37°C, com agitação. C. jejuni foi cultivada a 37°C em condições microaerofílicas usando atmosfera campygen (Oxoid). Crescimento de células bacterianas foi seguido pela medição da densidade óptica das culturas a 620 nm (OD620 nm) em intervalos de tempo regulares usando um leitor de microplacas (BioTek PowerWave™).Sequenciamento de bibliotecas de RNA pequeno bacteriano.
[0580] C. jejuni NCTC 11168 (ATCC 700819), F. novicida U112, L. innocua Clip11262, N. meningitidis A Z2491 e S. mutans UA159 foram cultivados até a fase de crescimento meio-logarítmica e o RNA total foi extraído com TRIzol (Sigma-Aldrich). 10 μg de RNA total de cada cepa foram tratados com o TURBO™ DNase (Ambion) para remover qualquer DNA genômico residual. RNAs ribossomais foram removidos usando o Ribo-Zero™ rRNA Removal Kits® para bactérias gram- positivas ou Gram-negativas (epicentro), de acordo com as instruções do fabricante. Após a purificação com o RNA Clean & Concentrator™-5 kit (Zymo Research), as bibliotecas a seguir foram preparadas usando ScriptMiner™ Small RNA-Seq Library Preparation Kit (Multiplex, Illumina® compatível) seguindo as instruções do fabricante. RNAs foram tratados com o ácido pirofosfatase do tabaco (TAP) (Epicentre). Colunas de RNA Clean & Concentrator™-5 (Zymo Research) foram usadas para purificação de RNA subsequente e e o Phusion® High-Fidelity DNA Polymerase (New England Biolabs) foi utilizado para amplificação por PCR. Códigos de barras específicos definidos pelo usuário foram adicionados a cada biblioteca (RNA-Seq Barcode Iniciadores (Illumina ®-compatível) Epicentre) e as amostras foram sequenciadas para o sequenciamento de próxima geração (unidade CSF NGS; na web em “csf.” seguido por “ac.at”) instalação do Biocenter Viena, Viena, Áustria (sequenciamento de extremidade única Illumina).
Análise de dados de sequenciamento de crRNA e tracrRNA
[0581] Leituras de sequenciamento RNA foram separadas usando a ferramenta illumina2bam e aparadas por (i) a remoção de sequências de adaptador Illumina (cutadapt 1.0) e (ii) remoção de 15 nt na extremidade 3' para melhorar a qualidade de leituras. Após a remoção de leituras inferiores a 15 nt, leituras de cDNA foram alinhadas para seu respectivo genoma usando Bowtie permitindo 2 incompatibilidades: C. jejuni (GenBank: NC_002163), F. novicida (GenBank: NC_008601), N. meningitidis (GenBank: NC_003116), L. innocua (GenBank: NC003212) e S. mutans (GenBank: NC004350). Cobertura das leituras foi calculada em cada posição do nucleotídeo separadamente para as duas cadeias de DNA usando BEDTools-Version-2.15.0. Um arquivo de wiggle normalizado contendo cobertura na leitura por milhões (rpm) foi criado e visualizado usando a ferramenta de Integrative Genomics Viewer (IGV) (“www.” seguido por “broadinstitute.org/igv/”) (Figura 36). Usando SAMTools flagstat80 a proporção de leituras mapeadas foi calculada sobre um total de 9914184 leituras mapeadas para C. jejuni, 48205 leituras para F. novicida, 13110087 leituras para N. meningitidis, 161865 leituras para L. innocua e 1542239 leituras para S. mutans. Um arquivo contendo o número de leituras de início (5') e final (3') em cada posição de nucleotídeo único foi criado e visualizado no IGV. Para cada ortólogo tracrRNA e crRNA, o número total de leituras obtido foi calculado usando o SAMtools.
Análise de sequência Cas9, alinhamento de sequências múltiplas e construção da árvore guia
[0582] Programa Position-Specific Iterated (PSI)-BLAST foi usado para recuperar os homólogos da família Cas9 no banco de dados não redundante de NCBI. Sequências inferiores a 800 aminoácidos foram descartadas. O programa de BLASTClust configurado com um limite de cobertura de comprimento de 0,8 e um limiar de cobertura de pontuação (pontuação de bit dividida pelo comprimento do alinhamento) de 0,8 foi usado para reunir as sequências restantes (Figura 38). Este procedimento produziu 78 agrupamentos (48 daqueles foram representados por uma sequência apenas). Um (ou raramente alguns representantes) foi selecionado de cada agrupamento e alinhamento múltiplo para essas sequências foi construído usando o programa MUSLCE com parâmetros padrão, seguidos por uma correção manual com base em alinhamentos locais obtidos usando programas PSI-BLAST e HHpred. Algumas sequências mais foram também não alinháveis e excluídas de alinhamentos finais. Os blocos alinhados com confiança com 272 posições informativos foram usados para a reconstrução de árvore de máxima probabilidade usando o programa FastTree com os parâmetros padrão: modelo evolucionista JTT, modelo gama discreto com 20 categorias de taxa. O mesmo programa foi usado para calcular os valores de bootstrap.
[0583] Figura 38 retrata as sequências que foram agrupadas de acordo com o programa de agrupamento BLASTclust. Apenas sequências maiores que 800 aminoácidos foram selecionadas para a análise de BLASTclust (ver materiais e métodos). Cepas representativas abrigando genes de ortólogo cas9 foram usadas. Algumas sequências não agruparam, mas foram verificadas como sequências Cas9 devido à presença de motivos conservados e/ou outros genes cas em suas imediações.
Análise dos loci CRISPR-Cas
[0584] As sequências de repeticao CRISPR foram recuperadas do banco de dados CRISPRdb ou previstas usando a ferramenta CRISPRFinder (Grissa I et al., BMC Bioinformatics 2007; 8:172; Grissa I et al., Nucleic Acids Res 2007). Os genes de cas foram identificados usando o algoritmo de BLASTp e/ou verificados com o banco de dados KEGG (na web em “www.” seguido por kegg.jp/).
Previsão em sílica e análise de ortólogos de tracrRNA
[0585] Anti-repetições putativas foram identificadas utilizando o software Vetor NTI ® (Invitrogen) por triagem para sequências de repetição adicionais degeneradas que não pertenciam à matriz de repetição- espaçador em ambas as fitas dos respectivos genomas permitindo até 15 incompatibilidades. Os promotores de transcrição e terminadores independentes de rho foram previstos usando o programa BDGP Neural Network Promoter Prediction (“www.” seguido por fruitfly.org/seq_tools/promoter.html) e o software TransTermHP, respectivamente. Os alinhamentos múltiplos da sequência foram realizados utilizando o programa MUSCLE com parâmetros padrão. Os alinhamentos foram analisados para a presença de motivos de estrutura conservada usando o algoritmo de RNAalifold do pacote Viena RNA 2.0.
RESULTADOS Sistemas do CRISPR-Cas tipo II são difundidos em bactérias.
[0586] Além do DNA que codifica para tracrRNA e a matriz de repetição-espaçador, loci CRISPR-Cas tipo II normalmente é composto de três ou quatro genes cas organizados em um operon (Figura 32A-B). Cas9 é a característica de proteína de assinatura para tipo II e está envolvida nas etapas de expressão e de interferência. Cas1 e Cas2 são proteínas do núcleo que são compartilhadas por todos os sistemas CRISPR-Cas e estão envolvidas na aquisição de espaçador. Csn2 e Cas4 estão presentes em apenas um subconjunto dos sistemas tipo II e sugere-se que desempenhem um papel na adaptação. Para recuperar um número máximo de loci CRISPR-Cas tipo II, contendo tracrRNA, primeiro triamos genomas publicamente disponíveis para sequências homólogas às proteínas de Cas9 já anotadas. 235 ortólogos Cas9 foram identificados em 203 espécies bacterianas. Um conjunto de 75 diversas sequências representativas de todos os ortólogos Cas9 recuperados foi selecionado para posterior análise (Figura 32, Figura 38 e materiais e métodos).
[0587] Figura 32 retrata (A) uma árvore filogenética de sequências de Cas9 representativas de vários organismos, bem como (B) arquitetura de locus Cas9 representantes. Valores Bootstrap calculados para cada nó são indicados. Mesmo ramos de cor representam subconjuntos selecionados de semelhante ortólogos Cas9. Comprimento da repetição CRISPR em nucleotídeos, tamanho médio de proteína Cas9 em aminoácidos (aa) e arquitetura de locus de consenso são mostradas para cada subagrupamento. *- gi|116628213 **- gi|116627542 + - gi|34557790 Φ- gi|34557932. Tipo II-A é caracterizado por cas9- csx12, cas1, cas2, cas4. Tipo II-B caracterizado por cas9, cas1, cas2 seguido por uma csn2 variante. Tipo II-C caracterizado por um operon conservado cas9, cas1, cas2 (Ver ainda Figura 38).
[0588] Em seguida, realizamos um alinhamento múltiplo de ortólogos Cas9 selecionados. A análise comparativa revelou alta diversidade na composição de aminoácidos e tamanho das proteínas. Os ortólogos Cas9 compartilham apenas alguns aminoácidos idênticos e todas as sequências recuperadas têm a mesma arquitetura de domínio com um domínio de endonuclease HNH central e domínio dividido RuvC/RNaseH. Os comprimentos das proteínas Cas9 variam de 984 (Campylobacter jejuni) até 1629 (Francisella novicida) aminoácidos com tamanhos típicos de ~1100 ou ~1400 aminoácidos. Devido à alta diversidade de sequências Cas9, especialmente no comprimento das regiões entre domínios, selecionamos apenas posições bem alinhadas, informativas do alinhamento preparado para reconstruir uma árvore filogenética das sequências analisadas (Figura 32 e materiais e métodos). Ortólogos Cas9 agrupados em três principais agrupamentos monofiléticos com algumas sequências outlier. Topologia observada da árvore Cas9 é bem de acordo com a classificação atual do loci tipo II, anteriormente definido tipo II-A e tipo II-B formando agrupamentos separados, monofiléticos. Para caracterizar ainda mais os agrupamentos, examinamos detalhadamente as composições de operon cas e sequências de repetição CRISPR de todas as cepas listadas.
Subagrupamento Cas9 reflete a diversidade em arquitetura de loci CRISPR-Cas tipo II
[0589] Uma análise mais profunda dos loci de tipo II selecionados revelou que o agrupamento de sequências de ortólogo Cas9 correlaciona-se com a diversidade de comprimento da repetição CRISPR. Para a maioria dos sistemas CRISPR-Cas tipo II, o comprimento de repetição é 36 nucleotídeos (nt), com algumas variações para os três subagrupamentos da árvore Cas9. Agrupamento Tipo II-A (Figura 32) compreende loci que codificam ortólogo Cas9 longo, anteriormente denominado Csx12, as repetições CRISPR são 37 nt de comprimento. O pequeno subagrupamento composto por sequências de bactérias que pertencem ao filo Bacteroidetes (Figura 32) caracteriza-se por repetições CRISPR não comumente longas, até 48 nt em tamanho. Além disso, notamos que o subagrupamento de sequências Cas9 correlaciona-se com distintas arquiteturas de operon cas, conforme representado na Figura 32. O terceiro agrupamento principal (Figura 32) e os loci de outlier (Figura 32) consistem principalmente no mínimo operon composto dos genes cas9, cas1 e cas2, com exceção de alguns loci incompletos que são discutidos mais tarde. Todos os outros loci dos dois primeiros agrupamentos principais são associados com um quarto gene, principalmente cas4, específicos para o tipo II-A ou tipo csn2, específicos para o tipo II-B (Figura 32). Identificamos os genes que codificam as variantes mais curtas da proteína Csn2, Csn2a, dentro de loci semelhante ao tipo II-B de S. pyogenes CRISPR01 e S. thermophilus CRISPR3 (Figura 32). A variante mais longa de Csn2, Csn2b, demonstrou estar associada com loci semelhante ao tipo II-B de S. thermophilus CRISPR1 (Figura 32). Curiosamente, nós identificamos genes cas adicionais putativos que codificam proteínas sem nenhuma similaridade da sequência óbvia para variantes de Csn2 descritas anteriormente. Uma destas proteínas descaracterizadas está exclusivamente associada com loci de tipo II-B da espécie de micoplasma (Figura 32 e Figura 33). Dois outros foram encontrados codificados em loci de tipo II- B da espécie Staphylococcus (Figura 33). Em todos os casos a diversidade de arquitetura de operon cas é assim consistente com o subagrupamento de sequências Cas9. Estas características em conjunto com a topologia geral da árvore de Cas9 dividida em três agrupamentos principais, distintos, monofiléticos, nos levou a propor uma nova divisão do sistema tipo II CRISPR-Cas em três subtipos. Tipo II-A está associado a Csx12, como Cas9 e Cas4, tipo II-B está associado com tipo Csn2 e tipo II-C contém apenas um conjunto mínimo de genes cas9, cas1 e cas2, conforme representado na Figura 32.
[0590] Figura 33 retrata a arquitetura do CRISPR-Cas tipo II de espécies bacterianas selecionadas. As barras verticais agrupam loci que codificam ortólogos Cas9 pertencentes à mesma árvore de subagrupamento (compare com Figura 32). Barra preta horizontal, sequência líder; retângulos preto e diamantes, matriz de repetição-espaçador. Anti-repetições previstas são representadas por setas indicando a direção da transcrição de ortólogo tracrRNA putativo. Observe que para os loci que não foram verificados experimentalmente, a matriz de repetição-espaçador CRISPR é considerada aqui sendo transcrita da mesma fita como o operon do cas. A direção da transcrição de ortólogo a tracrRNA putativo é indicada nesse sentido.
Previsões in silico de novos ortólogos tracrRNA
[0591] Loci tipo II selecionados anteriormente baseados nos 75 ortólogos Cas9 representantes foram projetados para a presença de ortólogos tracrRNA putativos. Nossa análise anterior realizada em um número restrito de sequências tracrRNA revelou que nem as sequências de tracrRNAs nem sua localização dentro do loci CRISPR-Cas parecia ser conservada. No entanto, como mencionado acima, tracrRNAs também são caracterizados por uma sequência de anti-repetição capaz de emparelhamento de base com cada uma das repetições pré-crRNA para formar repetição tracrRNA:precrRNA que são clivadas por RNase III na presença de Cas9 duplex. Para prever novos tracrRNAs, aproveitamos esta característica e usamos o seguinte fluxo de trabalho: (i) triar potenciais anti-repetições (sequencial de emparelhamento de base com repetições CRISPR) dentro do loci CRISPR-Cas, (ii) selecionar anti-repetições localizadas nas regiões intergênicas, (iii) validar anti- repetição CRISPR: repetir emparelhamento de base e (iv) prever promotores e terminadores de transcrição independentes de Rho, associados a tracrRNAs identificados.
[0592] Para triar anti-repetições putativas, recuperamos sequências repetidas de banco de dados de CRISPRdb ou, quando a informação não estava disponível, previmos as sequências de repetição utilizando o software CRISPRfinder. Em nosso estudo anterior, mostramos experimentalmente que a direção da transcrição da matriz de repetição-espaçador, comparada com a do operon cas variou entre loci. Aqui a análise de sequenciamento de RNA confirmou esta observação. Em alguns dos loci analisados, nomeadamente em F. novicida, N. meningitidis e C. jejuni, a matriz de repetição-espaçador é transcrita na direção oposta do operon cas (ver parágrafo ‘Sequenciamento do RNA profundo valida a expressão de novos ortólogos tracrRNA’ e Figuras 33 e 34) enquanto em S. pyogenes, S. mutans, S. thermophilus e L. innocua, a matriz e o operon cas são transcritos na mesma direção. Estas são os únicos dados de expressão de matriz repetição-espaçador tipo II disponíveis até o momento. Para prever a direção da transcrição de outras matrizes de repetição-espaçador, consideramos a observação anterior segundo a qual se as últimas repetições das matrizes são geralmente uma mutação. Esta observação está de acordo com o atual modelo de aquisição de espaçador, em que normalmente a primeira repetição da matriz é duplicada mediante a inserção de uma sequência espaçadora durante a fase de adaptação. Para 37matrizes de repetição espaçadora, conseguimos identificar a repetição mutante no final putativo das matrizes. Observamos que a orientação prevista da transcrição para N. meningitidis e matriz de repetição-espaçador de C. jejuni seria oposta à orientação determinada experimentalmente (sequenciamento do RNA e análise Northern blot). Como a orientação prevista não é consistente dentro dos agrupamentos e como na maioria dos casos poderíamos detectar potenciais promotores em ambas as extremidades das matrizes, consideramos a transcrição das matrizes de repetição- espaçador para estar na mesma direção que a transcrição do operon cas, se não validado de outro modo.
[0593] Figura 34 retrata co-processamento de tracrRNA e pré-crRNA em sistemas CRISPR Cas tipo II selecionados. Arquiteturas de loci CRISPR com posições verificadas e direções de transcrição tracrRNA e pré-crRNA são mostradas. Sequências superiores, repetições pré-crRNA; sequências inferiores, sequências de tracrRNA emparelhamento de base com repetições crRNA. Sítios de processamento de RNA putativo como revelado por sequenciamento do RNA são indicadas com setas. Para cada locus, tamanhos de setas representam quantidades relativas das extremidades 5' e 3' recuperadas (ver também Figura 37).
[0594] Figura 37 lista todos os ortólogos tracrRNA e crRNAs maduros obtidos por sequenciamento para as espécies bacterianas estudadas, incluindo coordenadas (região de interesse) e correspondentes sequências de cDNA (5' para 3'). As setas representam a direção de transcrição (fita). Número de leituras de cDNA (calculado usando o SAMtools), números de cobertura (percentual de leituras mapeadas) e extremidades predominantes associadas com cada transcrição é indicado. Números de leituras iniciando ou parando em cada posição do nucleotídeo ao redor das extremidades 5' e 3' de cada transcrição são exibidos. Os tamanhos de cada forma de crRNA maduro são indicados. O número atribuído a cada espécie de crRNA corresponde à posição de sequência do espaçador no pré-crRNA, de acordo com o CRISPRdb. O número atribuído a cada espécie de tracrRNA corresponde a formas diferentes da mesma transcrição.
[0595] Nós então triamos o loci CRISPR-Cas selecionados, incluindo sequências localizadas 1 kb à montante e à jusante em ambas as fitas para possíveis sequências de repetição que não pertenciam à matriz de repetição-espaçador, permitindo até 15 incompatibilidades. Em média, encontramos uma a três sequências de repetição degeneradas por locus que corresponderiam a anti-repetições dos ortólogos tracrRNA e selecionadas as sequências localizadas no interior das regiões intergênicas. As anti- repetições putativas foram encontradas em quatro localizações típicas: à montante do gene cas9, na região entre cas9 e cas1 e à montante ou à jusante da matriz de repetição-espaçador (Figura 33). Para cada sequência obtida, nós validamos a extensão do emparelhamento de base formado entre a repetição e anti-repetição (Figura 44) prevendo a interação possível RNA:RNA e focando especialmente os candidatos com a região maior e de perfeita complementariedade, formando uma estrutura fita dupla ideal para processamento de RNase III. Para prever a promotores e terminadores de transcrição flanqueando a anti-repetição, definimos o início da transcrição putativa e sítios de terminação para serem incluídos dentro de uma região localizada maximamente 200 nt à montante e 100 nt à jusante da sequência anti-repetição, respectivamente, com base em nossas observações anteriores26. Como mencionado acima, informações experimentais sobre a direção da transcrição da maioria de matrizes de repetição- espaçador de sistemas do tipo II são carentes. Nos algoritmos de previsão de promotor em sílica frequentemente gera resultados falso-positivos e apontam para promotores putativos que poderiam levar à transcrição de matrizes de repetição-espaçador de ambas as fitas. Em alguns casos não poderíamos prever terminadores de transcrição, mesmo que a expressão de ortólogo de tracrRNA pudesse ser validada experimentalmente, como exemplifica o locus de C. jejuni (ver parágrafo ‘Sequenciamento do RNA profundo valida a expressão de novos ortólogos tracrRNA). Sugerimos considerar promotor e previsões de terminador de transcrição apenas como um apoio, mas não é essencial, a etapa da diretriz descrita acima.
[0596] Figura 44 retrata pareamento de base repetição pré-crRNA:tracrRNA anti-repetição previsto em espécies bacterianas selecionadas. bOs loci CRISPR pertencem ao sistema tipo II (Nmeni/CASS4) CRISPR-Cas. Nomenclatura está de acordo com o banco de dados CRISPR (CRISPRdb). Observe que S. thermophilus LMD-9 e W. succinogenes contêm dois loci de tipo II.cSequência superior, sequência consenso de repetição pré-crRNA (5' para 3'); sequência inferior, sequência de homólogo tracrRNA anelando para a repetição (anti-repetição; 3' para 5'). Observe que a sequência de repetição indicada baseia-se no pressuposto de que a matriz de repetição-espaçador CRISPR é transcrita da mesma fita como o operon do cas. Para as sequências que foram validadas experimentalmente neste estudo, dados de sequenciamento de RNA foram levados em conta para determinar emparelhamento de base. Ver Figura 33. dDuas possíveis anti-repetições foram identificadas na F. tularensis subsp. novicida, W. succinogenes e gamma proteobacterium loci HTCC5015 tipo II-A . Emparelhamento da sequência superior, anti-repetição dentro da sequência líder putativa; emparelhamento de sequência inferior, anti-repetição à jusante da matriz espaçador de repetição. Ver Figura 33. eDuas possíveis anti-repetições foram identificadas no locus S. wadsworthensis tipo II-A. Emparelhamento de sequência superior, anti-repetição; emparelhamento de sequência inferior, anti-repetição dentro da sequência líder putativa ver Figura 33.fDuas possíveis anti-repetições foram identificadas no locus L. gasseri tipo II-B. Emparelhamento sequência superior, anti-repetição à montante do cas9; emparelhamento sequência inferior, anti- repetição entre os genes cas9 e cas1. Ver Figura 33.gDuas possíveis anti-repetições foram identificadas em loci C. jejuni tipo II-C. Emparelhamento sequência superior, anti- repetição à montante do cas9; emparelhamento sequência inferior, anti-repetição à jusante da matriz de repetição- espaçador. Ver Figura 33. hDuas possíveis anti-repetições foram identificadas no locus R. rubrum tipo II-C. Emparelhamento sequência superior, anti-repetição à jusante da matriz de repetição-espaçador; emparelhamento sequência inferior, anti-repetição à montante do cas1. Ver Figura 33.
Uma pletora de ortólogos tracrRNA
[0597] Previmos ortólogos tracrRNA putativo para 56 de 75 loci selecionados anteriormente. Os resultados das previsões estão representados na Figura 33. Como já mencionado, a direção da transcrição tracrRNA indicada nesta Figura é hipotética e com base na direção indicada da transcrição de matriz repetição-espaçador. Como foi referido anteriormente, sequências que codificam ortólogos tracrRNA putativos foram identificadas acima, dentro e à jusante do operon do cas, bem como à jusante das matrizes de repetição espaçador, incluindo as sequências de líder putativas, comumente encontradas em loci tipo II-A (Figura 33). No entanto, observamos que o anti-repetições de localização similar dentro de loci CRISPR-Cas podem ser transcritas em diferentes direções (como observado ao comparar, por exemplo, Lactobacillus rhamnosus e Eubacterium rectale ou Mycoplasma mobile e S. pyogenes ou N. meningitidis) (Figura 33). Notavelmente, loci agrupados dentro de um mesmo subagrupamento da árvore Cas9 guia compartilham uma arquitetura comum em relação à posição do gene que codifica tracrRNA. Identificamos anti-repetições em torno da matriz de repetição-espaçador em loci de tipo II-A e principalmente à montante do gene cas9 em tipos II-B e II-C, com várias exceções notáveis para o tracrRNA putativo localizado entre cas9 e cas1 em três subconjuntos distintos do tipo II-B.
Alguns loci tipo II CRISPR-Cas têm matrizes de repetição-espaçador com defeito e/ou ortólogos tracrRNA
[0598] Para seis loci tipo II (Fusobacterium nucleatum, Aminomonas paucivorans, Helicobacter mustelae, Azospirillum sp., Prevotella ruminicola e Akkermansia muciniphila), identificamos potenciais anti-repetições com fraco emparelhamento de base para a sequência de repetição ou localizado dentro de regiões de leitura abertas. Notadamente, nestes loci, uma anti-repetição fraca dentro da região de leitura aberta do gene que codifica uma ATPase putativa em A. paucivorans, uma forte anti-repetição dentro dos primeiros 100 nt do gene cas9 em Azospirillum sp. B510 e uma forte sobreposição de anti-repetição com cas9 e cas1 em A. muciniphila foram identificados (Figura 33). Para doze loci adicionais (Peptoniphilus duerdenii, Coprococcus catus, Acidaminococcus intestini, Catenibacterium mitsuokai, Staphylococcus pseudintermedius, Ilyobacter polytropus, Elusimicrobium minutum, Bacteroides fragilis, Acidothermus cellulolyticus, Corynebacterium diphteriae, Bifidobacterium longum e Bifidobacterium dentium), não pudemos detectar qualquer anti-repetição putativa. Não há nenhuma informação disponível na expressão de pré-crRNA e processamento nestes loci CRISPR-Cas. Portanto, a funcionalidade dos sistemas de tipo II na ausência de um ortólogo tracrRNA claramente definido permanece a ser endereçada. Para sete loci analisados não pudemos identificar qualquer matriz de repetição espaçador (Parasutterella excrementihominis, Bacillus cereus, Ruminococcus albus, Rhodopseudomonas palustris, Nitrobacter hamburgensis, Bradyrhizobium sp. e Prevotella micans) (Figura 33) e em três daqueles (Bradyrhizobium sp. BTAi1, N. hamburgensis e B. cereus) detectamos cas9 como um único gene com nenhum outro gene de cas na vizinhança. Para estes três loci, não conseguimos prever qualquer sequência de RNA pequena à montante ou à jusante do gene cas9. No caso de R. albus e P. excrementihominis, o contig genômico contendo cas9 é muito curto para permitir a previsão da matriz espaçador repetição.
Sequenciamento de RNA profundo valida a expressão da novos ortólogos tracrRNA
[0599] Para verificar as previsões tracrRNA em silico e determinar padrões de coprocessamento tracrRNA:pré- crRNA, RNAs de bactérias selecionadas Gram-positivas (S. mutans e L. innocua) e Gram-negativas (N. meningitidis, C. jejuni e F. novicida) foram analisadas por sequenciamento profundo. Sequências de ortólogos tracrRNA e crRNAs processados foram recuperadas (Figura 36 e Figura 37). Consistente com dados de sequenciamento tracrRNA diferencial anteriormente publicados em S. pyogenes26, ortólogos tracrRNA foram altamente representados nas bibliotecas, variando de 0,08 a 6,2% da leituras totais mapeadas. TracrRNAs transformados também foram mais abundantes do que os transcritos primários, variando de 66% a mais de 95% da quantidade total de leituras de tracrRNA (Figura 36 e Figura 37).
[0600] Figura 36 retrata a expressão do ortólogos tracrRNA bacterianos e crRNAs revelados pelo sequenciamento profundo do RNA. Perfis de expressão de ortólogos tracrRNA e crRNAs de cepas de bactérias selecionadas são representados ao longo de genomas correspondentes aos gráficos de barras (imagens capturadas da ferramenta Integrative Genomics Viewer (IGV)). Campylobacter jejuni (GenBank: NC_002163), Francisella novicida (GenBank: NC_008601), Neisseria meningitidis (GenBank: NC_003116),Listeria innocua (GenBank: NC_003212) e Streptococcus mutans (GenBank: NC_004350). Coordenadas genômicas são dadas.aCobertura de sequência calculada usando BEDTools- Version-2.15.0 (escala dada em leituras por milhão). b Distribuição de leituras iniciais (5') e final (3') em cada posição do nucleotídeo são indicadas (escala dada em número de leituras). Os painéis superiores correspondem a transcrições de fita positiva e painéis inferiores correspondem às transcrições de fita negativa. Os valores de cobertura negativa e picos apresentados abaixo dos eixos indicam a transcrição da fita negativa do genoma. Extremidades 5'- e 3' predominantes das leituras são plotadas para todos os RNAs. Observe que dada a baixa qualidade da biblioteca de cDNA L. innocua, as leituras são encurtadas para crRNAs, e é observado um acúmulo das leituras na extremidade 3' de tracrRNA, presumivelmente devido à degradação do RNA.
[0601] Para avaliar as extremidades 5' de transcritos primários tracrRNA, analisamos a abundância de todas as leituras de extremidade 5' de tracrRNA e recuperamos as leituras mais proeminentes à montante ou na proximidade da extremidade 5' da sequência de anti-repetição prevista. As extremidades 5' dos ortólogos de tracrRNA foram confirmadas ainda mais usando o algoritmo de previsão do promotor. As extremidades identificadas 5' do tracrRNAs de S. mutans, L. innocua e N. meningitidis se correlacionaram com ambos em previsões silico e análises de Northern blot de expressão de tracrRNA 26. A extremidade 5' mais proeminente de C. jejuni tracrRNA foi identificada no meio da sequência de anti- repetição. Cinco nucleotídeos à montante, uma extremidade 5' putativa adicional correlacionando com a previsão silico em fornecer sequência mais longa de interação com a sequência de repetição CRISPR foram detectados. Recuperamos quantidade relativamente baixa de leituras da biblioteca de F. novicida que correspondia quase exclusivamente para transcrições transformadas. Análise da quantidade muito pequena de leituras de transcritos primários forneceram uma extremidade 5' que correspondia às fortes previsões de promotor em silico. Sondagem Northern blot de F. novicida tracrRNA ainda confirmou a validade das previsões mostrando a abundância baixa das transcrições ao redor de 90 nt em comprimento. Os resultados são listados na tabela 2.. Para todas as espécies examinadas, exceto N. meningitidis, transcrições tracrRNA primárias foram identificadas como única espécie de RNA pequeno de 75 a 100 nt em comprimento. No caso de N. meningitidis, encontramos uma forma de tracrRNA primária predominante de ~ 110 nt e uma transcrição putativa maior de ~ 170 nt representada por uma quantidade muito baixa de leituras e detectadas anteriormente como uma banda fraca por análise de Northern blot.
[0602] Tabela 2. Ortólogos tracrRNA selecionados
Figure img0002
atracrRNA ortólogos de S. Thermophilus, P. multocida e M. Mobile, foram preditos in silico. bSeq. RNA revelou por sequenciamento de RNA (Tabela S3); primeira leitura, primeira posição na extremidade 5’ recuperada por sequenciamento; mais proeminente, extremidade 5’ abundante de acordo com dados de seq. de RNA; predito, predição in silico de sítio de início de transcrição; sublinhado, extremidade 5’ escolhida para tracrRNA primário ser alinhado. c Extremidade 3’ estimada de acordo com dados de seq. de RNA e predição de terminador transcricional.
Sítios de coprocessamento de tracrRNA e pré-crRNA caem na região anti-repetição:repetição.
[0603] Examinamos as transcrições transformadas tracrRNA analisando abundantes extremidades 5' de tracrRNA dentro da sequência de anti-repetição e abundantes extremidades 3' de crRNA maduro (Figura 34 e 45). Em todas as espécies, identificamos as extremidades proeminentes 5' de ortólogos tracrRNA que poderiam resultar em co-processamento de duplex tracrRNA:repetição pré-crRNA por RNase III. Também identificamos as extremidades 5' processadas dos crRNAs que muito provavelmente resultam de um segundo evento de apara putativa, consistente com as observações anteriores. Notável, em pares de RNA estreitamente relacionadas de S. pyogenes, S. mutans e L. innocua, observamos o mesmo sítio de processamento ao redor do par de base G:C no meio da sequência de anti repetição. Em ambos S. mutans e L. innocua, detectamos tracrRNA extremidades 5’ e crRNA extremidades 3’ adicionais proeminentes que poderiam sugerir outra apara do duplex tracrRNA:crRNA, com crRNA 3' extremidade sendo encurtado adicionalmente para aparar a já mencionada extremidade 5', seguindo o primeiro evento de processamento catalisado por RNase III. Da mesma forma, em C. jejuni, encontramos apenas uma pequena quantidade de extremidades 3’ crRNA que caberia nos padrões de processamento da RNase III e recuperamos a correspondente extremidade 5' de tracrRNA transformado. Assim, o aparamento putativo de duplex tracrRNA:crRNA após clivagem inicial por RNase III resultaria em porção derivada de repetição mais curta em crRNAs maduros, produzindo duplex tracrRNA:crRNA mais curto estabilizados por um emparelhamento de base triplo G:C para a interação com a endonuclease Cas9 e clivagem subsequente de DNAs alvos. O duplex RNA de N. meningitidis parece ser processado em dois sítios primários na extremidade 3' da repetição CRISPR, resultando em uma porção longa derivada de repetição em crRNA madura e interação RNA:RNA estável apesar do bojo central dentro do duplex. Curiosamente, o tracrRNA:pré-crRNA duplex de F. novicida parece ser clivado dentro da região da baixa complementariedade e algumas das extremidades 5' obtidas abundantes da tracrRNA sugerem ainda sua apara sem apara concomitante de crRNA. Diferenças de tamanhos do transcrito primário e nos sítios de processamento resulta em vários comprimentos de tracrRNAs processados variando de ~ 65 a 85 nt. As coordenadas e tamanhos de transcrições proeminente tracrRNA transformados são mostrados na Tabela 2 e Figura 37. Os padrões observados de processamento de tracrRNA e crRNA estão de acordo com o modelo anteriormente proposto de dois eventos de maturação. A outra apara putativa de algumas 5'- extremidades e crRNA e 3'-extremidades de tracrRNA poderiam derivar o segundo evento de maturação ou alternativamente, ser um artefato da preparação de biblioteca de cDNA ou sequenciamento do RNA. A natureza destes processamentos permanece para ser investigada.
Sequências de ortólogos de tracrRNA são altamente diversificadas
[0604] Semelhanças de sequências de ortólogos tracrRNA selecionado também foram determinadas. Realizamos alinhamentos múltiplos da sequência de transcritos primários tracrRNA de S. pyogenes (forma de nt 89 apenas), S.mutans, L. innocua e N. meningitidis (forma de 110 nt apenas), S. thermophilus, P. multocida e M. mobile (Tabela 2, Figura 35). Observamos alta diversidade em sequências tracrRNA, mas significativa conservação das sequências de loci de CRISPR- Cas estreitamente relacionados. tracrRNAs de L. innocua, S. pyogenes, S. mutans e S. thermophiles compartilham em média 77% de identidade e tracrRNAs de N. meningitidis e P. multocida compartilha 82% de identidade de acordo com alinhamentos emparelhadas. A identidade média das sequências tracrRNA analisadas é de 56%, comparável à identidade de sequências de RNA aleatórias. Esta observação confirma ainda que a previsão de ortólogos de tracrRNA com base na similaridade da sequência pode ser executada apenas no caso de loci estreitamente relacionados. Procuramos também possível conservação de estrutura tracrRNA, mas não poderia encontrar qualquer semelhança significativa exceto uma covariação e estrutura de terminadora de transcrição conservada (Figura 35).
[0605] Figura 35 retrata a diversidade de sequência de ortólogos tracrRNA. Sequência alinhamento múltiplo tracrRNA. S. thermophilus e S. thermophilus2, tracrRNA associado com SEQ ID NO: 41 e SEQ ID NO: 40 ortólogos Cas9, em conformidade. Preto, altamente conservada; cinza escuro, conservada; cinza claro, fracamente conservada. Estrutura de consenso prevista é retratada na porção superior do alinhamento. As setas indicam as covariações de nucleotídeos. S. pyogenes SF370, S. mutans UA159, L. innocua Clip11262, C. jejuni NCTC 11168, F. novicida U112 e N. meningitidis A Z2491 tracrRNAs foram validadas por sequenciamento do RNA e análise Northern blot. S. thermophiles LMD-9 tracrRNA foi validado pela análise de Northern blot. P. multocida Pm70 tracrRNA foi prevista de alta similaridade do locus CRISPR-Cas com o de N. meningitidis Z2491 A. M. mobile 163K tracrRNA foi previsto em sílica de previsões fortes de promotor e terminador de transcrição.
Exemplo 4: Redefinição de CRISPR como uma plataforma guiada por RNA para controle de sequência específica da expressão do Gene
[0606] Regulação do gene alvo na escala do genoma é uma poderosa estratégia para interrogar, perturbar e projetar sistemas celulares. Os inventores desenvolveram um novo método para controlar a expressão gênica, com base em Cas9, uma DNA endonuclease guiada por RNA de um sistema CRISPR tipo II. Este exemplo demonstra que um Cas9 cataliticamente morto, desprovido de atividade endonuclease, quando coexpressa com um guia de RNA, gera um complexo de reconhecimento de DNA que especificamente pode interferir com alongamento de transcrição, ligação a RNA polimerase ou ligação ao fator de transcrição. Este sistema, chamado interferência CRISPR (CRISPRi), com eficiência pode reprimir a expressão de genes alvo em Escherichia coli sem efeitos detectáveis fora do alvo. CRISPRi pode ser usado para reprimir múltiplos genes alvo simultaneamente, e seus efeitos são reversíveis. Além disso, o sistema pode ser adaptado para a repressão de genes em células de mamíferos. Esta plataforma de reconhecimento de DNA guiado por RNA fornece uma abordagem simples para seletivamente perturbar a expressão gênica na escala do genoma.
MATERIAIS E MÉTODOS Cepas e meio
[0607] A Escherichia coli K-12 cepa MG1655 foi usada como a cepa hospedeira para as medições de fluorescência in vivo. Uma cepa E. coli derivada de MG1655 que endogenamente expressa uma variante da RNAP com um tag epítopo 3 x-FLAG anexada à extremidade C-terminal de subunidade RpoC foi usado para todos os experimentos de sequenciamento. Meios definidos ricos em EZ (EZ-RDM, Teknoka) foi usado como o meio de crescimento para os ensaios in vivo de fluorescência. Transformação genética e verificação de transformação foram feitas usando protocolos padrão, usando genes AmpR, CmR ou KanR como marcadores selecionáveis.
Construção do plasmídeo e clonagem de genoma de E. coli
[0608] Os genes Cas9 e dCas9 foram clonados do vetor anterior descrito pMJ806 e pMJ841, respectivamente. Os genes foram amplificados por PCR e inseridos em um vetor que contém um promotor PLtetO-1 induzível por anidrotetraciclina (aTc), um marcador selecionável de cloranfenicol e uma origem de replicação de p15A. O modelo sgRNA foi clonado em um vetor que contém um mínimo promotor sintético (J23119) com um sítio de início de transcrição anotado, um marcador selecionável de ampicilina e uma origem de replicação de ColE1. O PCR inverso foi usado para gerar cassetes sgRNA com novas regiões complementares de 20-bp. Para inserir os genes repórter fluorescentes em genomas de E. coli, o gene de fluorescência foi primeiro clonado em um vetor de entrada, que foi então amplificado por PCR para gerar fragmentos de DNA linearizados que continham sequências nsfA UTR 5'/3', o gene fluorescente e um marcador KanR selecionável. A cepa de E. coli MG1655 foi transformada com um plasmídeo pKD46 sensível à temperatura que continha proteínas de recombinação À-Red (Exo, Beta e Gama). Culturas de células foram crescidas em 30 °C a uma OD (600 nm) de ~ 0,5, e 0,2% arabinose foi adicionado para induzir a expressão das proteínas de recombinação À-Red por 1h. As células foram coletadas em 4°C e utilizadas para a transformação dos fragmentos de DNA linearizados por eletroporação. As células que contêm inserções de genoma corretas foram selecionadas por meio de 50 μg/mL canamicina.
Análise e citometria de fluxo
[0609] Cepas foram cultivadas em EZ-RDM contendo 100 μg/mL carbenicilina e cloranfenicol 34 μg/mL em 2mL de placas de poço profundo de 96 poços (Costar 3960) durante a noite a 37HC e 1200 r.p.m. 1 μL desta cultura durante a noite então foi adicionado a 249 μL de EZ-RDM fresco com as mesmas concentrações de antibiótico com 2 μM aTc suplementado fim de induzir a produção da proteína dCas9. Quando as células foram crescidas para fase de meio log (~ 4 h), os níveis de proteína de fluorescência foram determinados utilizando o citômetro de fluxo LSRII (BD Biosciences) equipado com um amostrador de alta produtividade. As células foram amostradas com uma baixa taxa de fluxo até pelo menos 20.000 células terem sido coletadas. Os dados foram analisados usando FCS Express (De Novo Software) por canal em uma região poligonal contendo 60% da população celular no gráfico de dispersão direta-dispersão lateral. Para cada experimento, culturas em triplicadas foram medidas, e seu desvio-padrão foi indicado como a barra de erro.
Ensaio de B-galactosidase
[0610] Para executar ensaio de B-galactosidase,1 μ l de cultura durante a noite, preparada como acima foi adicionado a 249 μl de EZ-RDM fresco com as mesmas concentrações de antibióticos com 2 μM de aTc, com ou sem 1 mM isopropil e-D-1-tiogalactopiranosídeo (IPTG). As células foram cultivadas para fase de meio log. A atividade de LacZ de 100 uL desta cultura foi medida usando o kit de ensaio de β-galactosidase de levedura (Pierce) seguindo as instruções.
Extração e purificação de RNA total
[0611] Para cada amostra, um anticorpo monoclonal cultura de E. coli foi cultivada a 37°C de uma OD (600 nm) 0,1 em 500 mL de EZ-RDM para fase inicial de log (OD 0,45 ± 0,05), no ponto em que as células foram coletadas por filtração sobre filtros de nitrocelulose de 0,22 μm (GE) e congeladas em nitrogênio líquido para parar simultaneamente todo o progresso de transcrição. Células congeladas (100 μg) foram pulverizadas um moedor misturador Qiagen TissueLyser II 6 vezes a 15 Hz por 3 min na presença de 500 μL de tampão de lise congelado (Tris 20mm pH de 8, 0,4% Triton X-100, 0,1% NP-40, 100mm NH4Cl, 50 U/mL SUPERase^In (Ambion) e 1 x coquetel de inibidor de protease (completo, livre de EDTA, Roche), complementado com 10mM MnCl2 e 15 μM Tagetin de transcrição inibidor (Epicentre).
[0612] O lisado foi ressuspenso no gelo por pipetagem. RQ1 DNase I (110 U total, Promega) foi adicionado e incubado por 20 min no gelo. A reação foi extinta com EDTA (final de 25 mM) e o lisado clarificado a 4°C por centrifugação a 20.000 g durante 10 minutos. O lisado foi carregado em uma coluna de PD MiniTrap G-25 (GE Healthcare) e eluída com tampão de lise suplementado com 1 mM EDTA.
Purificação de mRNA total
[0613] RNA total foi purificado a partir do lisado clarificado usando o kit de miRNeasy (Qiagen). 1 μg de RNA em 20 μL de 10 mM Tris de pH 7 foi misturado com um volume igual de 2x solução alcalina de fragmentação (2 mM EDTA, 10 mM Na2CO3, 90mM NaHCO3, pH 9,3) e incubada por ~ 25 min a 95 °C para gerar fragmentos variando de 30-100 nt. A reação de fragmentação foi interrompida pela adição de 0,56 mL da solução de precipitação gelada (300mM NaOAc pH 5,5 mais GlycoBlue (Ambion)), e o RNA foi purificado por uma precipitação do isopropanol padrão. O mRNA fragmentada foi então defosforilado em uma reação de 50 μL com 25 U T4 PNK (NEB) em tampão 1 x PNK (sem ATP) mais 0,5 U SUPERase^In e precipitado com GlycoBlue através de métodos de precipitação do isopropanol padrão.
Purificação de RNA nascente
[0614] Para a purificação de RNA nascente, o lisado clarificado foi adicionado ao gel de afinidade 0,5 mL anti-FLAG M2 (Sigma-Aldrich) conforme descrito anteriormente. O gel de afinidade foi lavado duas vezes com tampão de Lise suplementado com 1 mM de EDTA antes de incubação com o lisado clarificado a 4°C para 2,5 h com nutação. A imunoprecipitação foi lavada 4 x 10 ml com tampão de Lise suplementado com 300 mM KCl, e RNAP ligado foi eluído duas vezes com tampão de Lise suplementado com 1 mM de EDTA e 2 mg/mL 3 x peptídeo FLAG (Sigma-Aldrich). RNA nascente foi purificado a partir o eluato usando o kit de miRNeasy (Qiagen) e convertido em DNA usando um protocolo de geração de biblioteca estabelecida anteriormente.
Preparação de biblioteca de DNA e sequenciamento de DNA
[0615] Biblioteca de DNA foi sequenciada em uma Illumina HiSeq 2000. Leituras foram processadas utilizando o pacote HTSeq Python e outro software personalizado escrito em Python. A extremidade 3' da transcrição sequenciada foi alinhada para o genoma de referência usando Bowtie (“bowtie-bio” anterior “.sourceforge.net”) e os perfis RNAP gerados no MochiView (“johnsonlab.ucsf” anterior “.edu/mochi.html”).
Desenho de Plasmídeo e construção para CRISPRi em células humanas
[0616] A sequência de que codifica códon de mamíferos otimizados por Streptococcus pyogenes Cas9 (DNA 2.0) foi fundida com três sequências de localização nuclear SV40 C-terminal (NLS) ou para tagBFP, flanqueada por duas NLS. Usando clonagem independente de ligação padrão clonamos estas duas proteínas de fusão em MSCV-Puro (Clontech). Guia sgRNAs foram expressas usando um vetor de expressão com base em Lentiviral U6 derivado de pSico que expressa co mCherry de um promotor de CMV. Os plasmídeos de expressão sgRNA foram clonados inserindo iniciadores anelados no vetor de expressão com base em lentiviral U6 que foi digerido por BstXI e XhoI.
Cultura de células, transfecções de DNA e as medidas de fluorescência para CRISPRi em células humanas
[0617] Células HEK293 foram mantidas em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) em 10% FBS, 2mM glutamina, 100unidades/mL estreptomicina e 100μg/mL penicilina . HEK293 foram infectadas com um retrovírus MSCV expressando GFP usando protocolos padrão e classificados por citometria de fluxo, usando um BD FACS Aria2 para expressão de GFP. Células HEK293 expressando GFP foram transfectadas transitoriamente usando o reagente de transfecção TransI-LT1 (Mirus) com os protocolos recomendados pelos fabricantes em placas de 24 poços usando 0,5 μ g do plasmídeo de expressão dCas9 e 0,5 μ g do plasmídeo de expressão de RNA (com 0,25 μ g do plasmídeo de repórter GFP para Figura 45B). 72 horas após a transfecção, as células foram tripsinizadas a uma suspensão de célula única. O vetor U6 contém um promotor constitutivo do CMV dirigindo um gene mCherry. Expressão de GFP foi analisada usando uma máquina de BD LSRII FACS pelo gating sobre as populações positivas para mCherry (> 10 vezes mais brilhante mCherry sobre as células de controle negativo).
RNAs projetados
[0618] Desenhos de sgRNA utilizados nas figuras: apenas os 20 região correspondente do nucleotídeo (segmento tendo DNA como alvo) são listados (a menos que indicado em contrário): Os sgRNAs tendo mRFP como alvo utilizado na Figura 40 (SEQ ID NO: 741-746); Os sgRNAs tendo promotor como alvo usado na Figura 40 (SEQ ID NO: 747-751); Sequência de promotor alvo na Figura 40 (SEQ ID NO: 752); Os sgRNAs tendo mRFP como alvo utilizado na Figura 43B (SEQ ID NO: 753-760); O sgRNA tendo sfGFP como alvo (gfp) usado na Figura 42B (SEQ ID NO: 761); Os sgRNAs tendo sfGFP como alvo utilizados na Figura 43B (SEQ ID NOs: 762-769); Os experimentos tendo duplo-sgRNO como alvo na Figura 43F e Figura 51 (SEQ ID NOs: 770-778); Os sgRNAs tendo lac operon como alvo usado na Figura 44B (SEQ ID NO: 779-787); e Os sgRNAs tendo EGFP como alvo usados na Figura 45 (SEQ ID NOs: 788-794). Tabela 3. Sequências usadas nas figuras do Exemplo 4 (listado acima)
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RESULTADOS
[0619] Sistema CRISPR (repetições palindrômicas curtas interespaçadas regularmente aglomeradas) fornece uma nova plataforma potencial para regulação do gene alvo. Cerca de 40% das bactérias e 90% archaea possuem sistemas associados a CRISPR/CRISPR (Cas) para conferir resistência aos elementos externos do DNA. Sistemas CRISPR usam pequenos RNAs emparelhamento de base para alvo e clivar elementos estrangeiros de DNA em uma maneira específica de sequência. Existem diversos sistemas CRISPR em organismos diferentes, e um dos mais simples é o sistema CRISPR tipo II de Streptococcus pyogenes: apenas um único gene que codifica a proteína Cas9 e dois RNAs, um CRISPR RNA maduro (crRNA) e um RNA de trans-atuação parcialmente complementar (tracrRNA), são necessários e suficientes para silenciamento de RNA guiado por DNAs de estrangeiros (Figura 46). Maturação de crRNA requer tracrRNA e RNase III. No entanto, esta exigência pode ser ignorada, usando um pequeno guia do RNA modificado (sgRNA) contendo um hairpin projetado que imita o complexo tracrRNA-crRNA. Emparelhamento de base entre o sgRNA e o DNA alvo provoca rupturas da fita dupla (DSBs) devido a atividade endonuclease de Cas9. Especificidade de ligação é determinada por pareamento de base sgRNA-DNA e um curto motif de DNA (motif adjacente protoespaçador ou PAM, sequência: NGG) justaposta à região complementar de DNA. Assim, o sistema CRISPR requer apenas um conjunto mínimo de duas moléculas, a proteína de Cas9 e o sgRNA e, portanto, detém o potencial para ser usado como uma plataforma tendo gene como alvo independente de hospedeiro. Foi demonstrado que o Cas9/CRISPR pode ser aproveitado para edição do genoma guiado por RNA seletivo para o sítio (Figura 39A).
[0620] Figura 46 retrata o mecanismo do sistema CRISPR tipo II de S. pyogenes. O sistema consiste em um conjunto de proteínas associadas a CRISPR (Cas) e um locus CRISPR que contém uma matriz de sequências de espaçador repetidas. Todas as repetições são as mesmas e todos os espaçadores são diferentes e complementares para as sequências de DNA alvo. Quando a célula está infectada por elementos estrangeiros de DNA, o locus CRISPR irá transcrever em uma transcrição precursora longa, que será clivada em fragmentos menores. A clivagem é mediada por um RNA antisenso de transação (tracrRNA) e o RNase III hospedeiro. Após a clivagem, uma única proteína, Cas9, reconhece e liga-se à forma clivada do crRNA. Cas9 guia crRNA para DNA e verifica a molécula de DNA. O complexo é estabilizado por pareamento de base entre o crRNA e o DNA alvo. Neste caso, Cas9 provoca quebras de DNA dupla-hélice devido a sua atividade nuclease. Isto geralmente remove moléculas de DNA cognatas e células conferem imunidade para determinadas populações DNA.
[0621] Figura 39 retrata o desenho do sistema CRISPR interferência (CRISPRi). (A) O sistema de interferência mínimo consiste em uma proteína simples e uma quimera sgRNA projetado. A quimera de sgRNA consiste em três domínios (região em uma caixa): uma região complementar de 20-nucleotídeo (nt) para ligação específica de DNA, um hairpin de 42-nt para a ligação de Cas9 (identificador Cas9) e um terminador de 40-nt transcrição derivado de S. pyogenes. A proteína Cas9 do tipo selvagem contém a atividade de nuclease. A proteína dCas9 está é defeituosa na atividade da nuclease. (B) A proteína Cas9 tipo selvagem se liga ao sgRNA e forma um complexo de proteína-RNA. O complexo se liga a alvos específicos do DNA por pareamento de base Watson-Crick entre o sgRNA e o DNA alvo. No caso do Cas9 tipo selvagem, o DNA será clivado devido a atividade de nuclease da proteína Cas9. No caso da nuclease Cas9 defeituosa, o complexo interrompe a transcrição apropriada.
Um sistema de CRISPRi mínimo consiste em uma única proteína e RNA e efetivamente pode silenciar alongamento e iniciação da transcrição
[0622] Para implementar dita plataforma CRISPRi em E. coli, gene Cas9 tipo selvagem de S. pyogenes e um sgRNA foram expressos de vetores bacterianos para determinar se o sistema poderia perturbar a expressão do gene em um locus alvo (Figura 40A). O sistema CRISPR S. pyogenes é ortogonal ao sistema nativo de E. coli. A proteína Cas9 é expressa a partir de um protomor induzível por anhidrotetraciclina (aTc) em um plasmídeo que contém uma origem de replicação de p15A e o sgRNA é expresso de um promotor constitutivo mínimo em um plasmídeo que contém uma origem de replicação de ColE1. Como uma estratégia alternativa, Cas9 mutante cataliticamente morto (dCas9), que está com defeito na clivagem de DNA, foi usado e mostrou que esta forma de Cas9 ainda age como um complexo de ligação ao DNA tendo RNA como alvo.
[0623] Figura 40 demonstra que CRISPRi efetivamente silenciar o alongamento e iniciação da transcrição. (A) O sistema CRISPRi consiste em uma proteína Cas9 induzível e uma quimera sgRNA projetada. O dCas9 contém mutações dos domínios da nuclease RuvC1 e HNH. O quimera sgRNA contém três domínios funcionais, como descrito na Fig. 1. (B) Sequência de sgRNA projetado (NT1) e o DNA alvo. NT1 tem como alvo a fita DNA não molde da região de codificação de mRFP. Apenas a região em torno do motif emparelhamento de base (20-nt) é mostrada. Emparelhamentos de base de nucleotídeos são numerados e o hairpin de ligação dCas9 é sobrelinhada. A sequência de PAM está sublinhada. (C) CRISPRi bloqueou o alongamento de transcrição de forma específica da fita. Um sistema de repórter baseado em fluorescência sintético contendo um gene de codificação de mRFP foi inserido no genoma MG1655 de E. coli (o locus nsfA). Seis sgRNAs que ligam a cadeia do DNA molde ou a fita de DNA não molde foram coexpressas com a proteína de dCas9, com seus efeitos sobre o mRFP alvo medidos pelo ensaio de fluorescência in vivo. Apenas sgRNAs que ligam a fita do DNA não molde mostrou silenciar (10 ~ 300 vezes). O controle mostra fluorescência das células com proteína de dCas9, mas sem o sgRNA. (D) CRISPRi bloqueou a iniciação da transcrição. Cinco sgRNAs foram projetados para ligar a diferentes regiões ao redor de um promotor de E. coli (J23119). O sítio de início de transcrição foi marcado como + 1. O oval pontilhado mostra o complexo inicial de RNAP que abrange uma região de 75-bp de -55 a + 20. Apenas regiões tendo sgRNAs como alvos dentro do complexo RNAP inicial mostraram repressão (P1-P4). Ao contrário de bloco de alongamento da transcrição, silenciamento foi independente da cadeia do DNA alvo. (E) Regulação de CRISPRi foi reversível. Ambos dCas9 e sgRNA (NT1) estavam sob o controle de um promotor induzível por aTc. Cultura de células foi mantida durante a fase exponencial. No tempo T = 0, 1 μM de aTc foi suplementado para células com OD = 0,001. Repressão mRFP alvo iniciou dentro de 10 min. O sinal de fluorescência decaiu em uma maneira que é consistente com o crescimento de células, sugerindo que a decadência foi devido à divisão celular. Em 240 min, a fluorescência alcançou o nível totalmente reprimido. Em T = 370 min, aTc é lavada do meio de crescimento, e as células foram diluídas para OD = 0,001. Fluorescência começou a aumentar após 50 min e levou cerca de 300 min para subir para o mesmo nível como o controle positivo. Controle positivo: sempre sem o indutor; controle negativo: sempre com 1 μM.de indutor de aTc Fluorescência resulta em 2 C, 2D e 2E representam média e SEM pelo menos três repetições biológicas. Ver também Figura 47 e 48 Figura.
[0624] Moléculas de sgRNA coexpressas com Cas9 cada consistem em três segmentos: uma região complementar específica para o sítio de 20-nucleotídeo (nt), um hairpin de ligação a Cas9 de 42-nt (identificador Cas9) e um terminador de transcrição de 40-nt derivada de S. pyogenes (Figura 40B). Um sistema repórter baseado em uma proteína fluorescente vermelha (mRFP), foi inserido no genoma da E. coli MG1655.
[0625] A coexpressão da proteína Cas9 tipo selvagem e um sgRNA (NT1) direcionados para sequência de codificação mRFP drasticamente reduziu a eficiência de transformação, provavelmente devido a quebras de fita dupla induzidas por Cas9 no genoma (Figura 47). Sequenciamento de algumas colônias sobrevivente mostrou que todos eles tinham rearranjos de sequência em torno do sítio de mRFP alvo no genoma, sugerindo que havia forte seleção contra expressão do Cas9 tipo selvagem e um sgRNA direcionados para uma sequência hospedeira. O gene mutante dCas9 (não clivado), que continha duas mutações de silenciamento dos domínios nuclease de RuvC1 e HNH (D10A e H841A), aliviaram esta letalidade, como verificado pela eficiência de transformação e taxas de crescimento de E. coli (Figure 47A&B).
[0626] Figura 47 está relacionada à Figura 40 e mostra as curvas de crescimento de culturas de células de E. coli cotransformadas com dCas9 e sgRNA. (A) Eficiência de transformação para a transformação de células de E. coli com dois plasmídeos. Um plasmídeo contém um sgRNA que tem como alvo uma cópia de genoma de mRFP e o outro plasmídeo contém o Cas9 tipo selvagem ou dCas9. Cotransformação do Cas9 tipo selvagem e sgRNA é altamente tóxica, que pode ser aliviado usando dCas9. (B) O sgRNA (NT1) é projetado para alvejar a sequência de código de mRFP. Coexpressão de dCas9 e sgRNA não apresenta quase nenhum efeito sobre as taxas de crescimento celular, sugerindo que a interação de dCas9-sgRNA com DNA é forte o suficiente para bloquear RNA polimerase mas não DNA polimerase ou replicação celular. Os resultados representam média e SEM de pelo menos três experimentos independentes.
[0627] Para testar se o complexo dCas9:sgRNA poderia render repressão altamente eficiente da expressão gênica, sgRNAs complementares para diferentes regiões da sequência de codificação de mRFP foram projetadas, ligando à fita de DNA molde ou fita de DNA não molde. Os resultados indicaram que sgRNAs tendo como alvo a fita de DNA não molde demonstrada silenciamento de gene eficaz (10 a 300 vezes de repressão), enquanto aqueles que têm como alvo a fita molde mostraram pouco efeito (Figura 40). O sistema exibiu efeitos semelhantes de repressão de genes que estavam dentro do genoma de E. coli ou em um plasmídeo de alta cópia (Figura 48). Além disso, visando a região promotora também levou à eficaz silenciamento de gene (Figura 40). Direcionamento do sgRNA para ao box -35 significativamente derrubou a expressão gênica (P1, ~ 100 vezes de repressão), considerando que o direcionamento para outras regiões adjacentes mostrou um efeito umedecido (P2-P4). Direcionamento às sequências de cerca de 100-bp à montante do promotor não mostrou nenhum efeito (P5). Ao contrário de direcionamento da sequência de codificação, que tem como alvo o promotor, a eficiência de silenciamento é independente da fita do DNA; direcionamento das fitas de molde ou não molde é igualmente eficaz (P2 e P3).
[0628] Figura 48 está relacionada com a Figura 40 e mostra que CRISPRi poderia silenciar a expressão de um gene repórter em um plasmídeo de várias cópias. O gene mRFP foi clonado em um plasmídeo p15A. Presença do dCas9 e um sgRNA específico de mRFP (NT1) reprime fortemente mRFP (~ 300 vezes). O efeito da repressão é semelhante ao observado usando o mRFP no genoma (Figura 40). Silenciamento só é eficaz quando a sgRNA age sobre a fita de DNA não molde, mas não a fita de DNA molde (T1). Também, silenciamento é altamente específico, como um 3 sgRNA específico a GFP não mostra nenhum efeito na expressão de mRFP. Resultados de fluorescência representam média e SEM de pelo menos três replicatas biológicas.
Knockdown de gene CRISPRi é induzível e reversível
[0629] Ao contrário dos métodos de nocaute do gene, uma vantagem de usar knock down baseado em CRISPRi de expressão gênica é o fato de que esta perturbação deve ser reversível. Para testar se regulação de CRISPRi poderia ser induzida e subsequentemente invertida, ambos sgRNA específicos para dCas9 e mRFP (NT1) foram colocados sob o controle do promotor induzível por aTc e medições de tempo- curso de regulação mediada por CRISPRi de mRFP em resposta a indutores foram realizadas (Figura 40E). No tempo zero, cultura de células que cresceram para primeira fase exponencial sem indutores foi completada com 1 μM de aTc. Os dados indicaram que o sistema poderia responder rapidamente à presença de indutores - o sinal de proteína fluorescente repórter começou a diminuir dentro de 10 min após a adição da molécula de indutor. Porque a proteína mRFP é estável, a taxa de decréscimo do sinal de fluorescência é limitada pela diluição da proteína devido ao crescimento da célula, como pode ser visto por uma célula similar, dobrando o tempo e a perda de metade do tempo de fluorescência (ambos ~ 36 min). Em 240 min, todas as células eram uniformemente reprimidas para o mesmo nível como controle negativo. Em 420 min, o indutor foi lavado longe do meio de crescimento e células foram diluídas para um menor OD. Após um decaimento de 50 min, fluorescência de mRFP começou a aumentar. Levou um total de 300 min para a fluorescência de célula única aumentar ao mesmo nível que o controle positivo. O decaimento de 50 min é mais provável determinado pela taxa deslocamento de retorno de dCas9/sgRNA por diluição por divisão e crescimento celular. Em resumo, estes resultados demonstram que os efeitos de silenciamento de dCas9-sgRNA podem ser induzidos e invertidos.
Sequenciamento de transcrição de alongamento nativo (NET-Seq) confirma que CRISPRi funciona bloqueando a transcrição
[0630] dCas9 parecia estar funcionando como um complexo de ligação ao DNA tendo RNA como alvo que poderia bloquear a ligação da RNA polimerase (RNAP) durante o alongamento da transcrição. Uma vez que a fita de DNA não molde compartilha a mesma identidade de sequência como o mRNA transcrito e apenas sgRNAs que ligam a fita de DNA não molde apresentou silenciamento, manteve-se a possibilidade de que o complexo dCas9:sgRNA interage com mRNA e altera a sua tradução ou estabilidade. Para distinguir estas possibilidades, uma abordagem de sequenciamento de transcrição de alongamento nativo descrito (NET-seq) foi aplicada para E. coli, que pode ser usada para globalmente perfilar as posições de RNA polimerase alongando e monitorar o efeito do complexo do dCas9:sgRNA na transcrição. Neste método de NET-seq, o sistema CRISPRi foi transformado em uma cepa E. coli derivada de MG1655 que continha uma FLAG-tagged RNAP. O CRISPRi contido um sgRNA (NT1) que liga a região de codificação de mRFP. Imunopurificação in vitro da RNAP tagged seguido por sequenciamento de transcrições nascentes associadas com RNAPs alongando permitiu distinguir os locais de pausa da RNAP.
[0631] Esses experimentos demonstraram que o sgRNA induziu forte de transcrição pausando à montante do locus de alvo a sgRNA (Figura 41A). A distância entre o sítio de pausa e o sítio alvo é 19-bp, que está em perfeita conformidade com a distância de ~ 18-bp relatada anteriormente entre a incorporação de nucleotídeos da RNAP e sua borda dianteira. Este achado é consistente com um mecanismo de CRISPRi no qual o bloco de transcrição é devido a colisão física entre a RNAP alongando e o complexo de dCas9:sgRNA (Figura 41B). Ligação do complexo dCas9:sgRNA para a fita do molde teve pouco efeito repressivo, sugerindo que RNAP foi capaz de ler através do complexo nesta orientação específica. Neste caso, o sgRNA enfrenta a RNAP, que pode ser descompactada pela atividade helicase de RNAP. Estes experimentos têm demonstrado que o CRISPRi utiliza RNAs para bloquear diretamente a transcrição. Esse mecanismo é distinto de RNAi, para o qual nocaute da expressão de gene requer a destruição dos RNAs mensageiros já transcritos, antes da sua tradução.
[0632] Figura 41 demonstra que CRISPRi funciona através do bloqueio de alongamento da transcrição. (A) Moléculas FLAG-tagged RNAP foram imunoprecipitadas e as transcrições de mRNA nascentes associadas foram sequenciadas. O painel superior mostra resultados de sequenciamento de transcrição mRFP nascente em células sem sgRNA, e o painel inferior mostra resultados em células com sgRNA. Na presença de sgRNA, uma pausa de transcrição forte foi observada 19-bp à montante do sítio de destino, após o qual o número de leituras de sequenciamento cai precipitadamente. (B) Um mecanismo de CRISPRi proposto baseado em colisão física entre RNAP e dCas9-sgRNA. A distância entre o centro da RNAP para sua borda dianteira é ~ 19 bp, cujas correspondências conferem com nossa distância medida entre o sítio de pausa de transcrição e 3' da região de pareamento de base sgRNA. RNAP pausado anula alongamento de transcrição ao se deparar com o bloqueio de dCas9-sgRNA.
Silenciamento de gene guiado por CRISPRi sgRNA é altamente específico
[0633] Para avaliar a especificidade do CRISPRi na escala do genoma, sequenciamento shotgun de transcriptoma completo (RNA-seq) de células transformadas por dCas9 com e sem coexpressão de sgRNA foi realizado (Figura 42). Na presença do sgRNA direcionado para mRFP (NT1), a transcrição de mRFP foi o único gene exibindo uma diminuição na abundância. Nenhum outro gene mostrou mudança significativa na expressão mediante a adição da sgRNA, em erros de sequenciamento. Também realizamos seq-RNA em células com diferentes sgRNAs que diferentes genes alvo. Nenhum desses experimentos mostrou mudanças significativas de genes além do gene alvo (Figura 49). Assim, direcionamento ao gene alvo guiado por sgRNA e regulação são altamente específicos e não têm efeitos significativos fora do alvo.
[0634] Figura 42 demonstra a especificidade do direcionamento do sistema CRISPRi. (A) Sequenciamento de mRNA de escala do genoma (RNA-seq) confirmou que direcionamento de CRISPRi tem sem efeitos fora do alvo. O sgRNA NT1 que se liga à região que codifica mRFP foi usado. Os genes dCas9, mRFP e sfGFP são destacados. (B) sgRNAs múltiplas podem independentemente silenciar dois repórteres de proteína fluorescente na mesma célula. Cada sgRNA especificamente reprimiu seu gene cognato mas não o outro gene. Quando ambos os sgRNAs estavam presentes, ambos os genes foram silenciados. Barras de erro representam SEM de pelo menos três repetições biológicas. (C) Imagens microscópicas para o uso de dois sgRNAs para controlar duas proteínas fluorescentes. O painel superior mostra as imagens de campo claro das células de E. coli, painel do meio mostra o canal RFP, e a porção inferior mostra o painel GFP. Coexpressão de um sgRNA e dCas9 apenas silencia a proteína fluorescente cognata, mas não a outra. O efeito “knockdown” foi forte, como quase nenhuma fluorescência foi observada de células com determinadas proteínas fluorescentes silenciadas. Barra de escala, 10 μm. Controle mostra células sem nenhuma proteína repórter fluorescente. Resultados de fluorescência representam média e SEM de pelo menos três replicatas biológicas. Ver também Figura 49.
[0635] Figura 49 está relacionada com a Figura 42A e retrata os dados do RNA-seq de células com sgRNAs que têm como alvo diferentes genes. (A) (+/-) sgRNA que tem como alvo o promotor do gene endógeno lacl em E. coli. O mesmo sgRNA tendo como alvo lacl foi usado como na Figura 44. (B) (+/-) 1 mM IPTG para células sem sgRNA auto-inibiu (sgRNA reprimiu seu próprio promotor). (C) (+/-) sgRNA que tem como alvo o gene lacZ endógeno em E. coli. O mesmo sgRNA tendo como alvo lacZ foo usado como na Figura 44. 1 mM de IPTG também foi completado para células com o sgRNA tendo como alvo o lacZ.
CRISPRi pode ser usado para regular simultaneamente múltiplos genes
[0636] O sistema CRISPRi pode permitir o controle de múltiplos genes de forma independente, sem interferência. Foi concebido um sistema de duas cores do repórter de fluorescência baseado em mRFP e sfGFP. Dois sgRNAs com regiões complementares distintas para cada gene foram projetados. Expressão de cada sgRNA só silenciou o gene cognato e não teve efeito sobre o outro. Coexpressão de dois sgRNAs derrubou os dois genes (Figura 42B & C). Estes resultados sugerem que o direcionamento guiado por sgRNA é específico, com a especificidade ditada pela sua identidade de sequência e não é afetada pela presença de outros sgRNAs. Esse comportamento deve permitir controle multiplex de vários genes simultaneamente pelo CRISPRi.
Fatores que determinam o silenciamento de eficiência de CRISPRi
[0637] Para encontrar os determinantes de eficiência visando CRISPRi, o papel do comprimento, complementariedade de sequência e posição na eficiência de silenciamento foi investigada (Figura 43A). Como sugerido na Figura 40, o local da sequência de sgRNA alvo ao longo do gene foi importante para a eficiência. sgRNAs foram ainda projetados para cobrir toda a extensão das regiões que codificam para mRFP e sfGFP (dados complementares para sequências de sgRNA). Em todos os casos, a repressão foi inversamente correlacionada com a distância alvo do sítio de início da transcrição (Figura 43B). Observou-se uma forte correlação linear para mRFP. Uma similar, mas ligeiramente mais fraca correlação foi observada quando o sfGFP foi usado como o destino, talvez indicando cinética variando da RNA polimerase durante diferentes pontos no alongamento deste gene.
[0638] O sgRNA contém uma região complementar de 20-bp para o alvo. Para identificar a importância desta região de pareamento de base, o comprimento de sgRNA que NT1 foi alterado (Figura 43). Enquanto extensão da região da extremidade 5' não afetou o silenciamento, o truncamento da região diminuiu severamente a repressão. O comprimento mínimo da região de pareamento de base, necessário para o silenciamento de genes foi 12bp, com outro truncamento levando a perda completa da função. Mutações únicas foram introduzidas na região de pareamento de base de sgRNA NT1 e o impacto global sobre o silenciamento foi testado. A partir dos resultados, podem ser discernidas três sub-regiões, cada uma com uma contribuição distinta para a ligação geral e silenciamento (Figura 43D). Qualquer mutação única dos primeiros 7 nucleotídeos dramaticamente reduziu a repressão, sugerindo que esta sequência constitui uma “região de semente” para a ligação, conforme observado anteriormente para ambos os sistemas CRISPR tipo I e tipo II. Nucleotídeos adjacentes foram também mutados em pares (Figura 43E e Figura 50). Na maioria dos casos, a atividade de repressão relativa a uma dupla mutação foi multiplicativa, em relação os efeitos dos mutantes únicos, sugerindo uma relação independente entre as incompatibilidades. Além disso, de acordo com os resultados anteriores sobre a importância da sequência de PAM, uma PAM incorreta totalmente aboliu o silenciamento mesmo com uma região de ligação perfeita de 20-bp (Figura 43E). Assim, a especificidade do sistema de CRISPRi é determinada conjuntamente por PAM (2-bp) e pelo menos um trecho 12-bp de sgRNA-DNA, o espaço que é grande o suficiente para cobrir a maioria dos genomas bacterianas para sítios alvos únicos.
[0639] Dois SgRNAs, ambos alvejando o mesmo gene foram testados (Figura 43F e Figura 51). Dependendo do posicionamento relativo de vários sgRNAs, observaram-se efeitos combinatórios distintos. Combinar dois sgRNAs, cada um com cerca de 300 vezes de repressão, permitiu silenciamento geral aumentado até mil vezes. Combinar dois sgRNAs mais fracos (~ 5 vezes) mostrou efeitos multiplicativos, quando usados juntos. Efeitos supressivos combinatórios foram observados usando dois sgRNAs cujos alvos sobrepunham. Isto era provavelmente devido à concorrência de ambos os sgRNAs para a ligação com a mesma região.
[0640] Figura 43 retrata a caracterização dos fatores que afetam a eficiência do silenciamento. (A) Os efeitos de silenciamento foram medidos de sgRNAs com diferentes loci de direcionamento no mesmo gene (distância do códon de início de tradução) e sgRNAs com diferentes comprimentos da região pareamento de base para o mesmo locus de alvo (baseado no NT1). (B) A eficiência de silenciamento correlacionou-se inversamente com a distância alvo do códon de início de tradução (laranja - mRFP e verde - sfGFP). A atividade de repressão relativa foi calculada normalizando a repressão de cada sgRNA para que o sgRNA com a maior mudança de dobra de repressão. Barras de erro representam SEM de três réplicas biológicas. (C) O comprimento de região de pareamento de base Watson-Crick entre o sgRNA e o DNA alvo afeta a eficiência da repressão. Extensões da região de pareamento de base todas exibiram forte efeito de silenciamento e truncamentos diminuíram drasticamente a repressão. O comprimento mínimo da região de pareamento de base para repressão detectável é representam de barras de erro 12-bp. Barras de erro representam SEM de três réplicas biológicas. (D) Incompatibilidades únicas foram introduzidas em cada nucleotídeo no sgRNA (NT1, Figura 40B) como essas incompatibilidades únicas afetaram a eficiência de repressão foi medida. Podem distinguir-se três sub-regiões com importância distinta para o silenciamento geral. Eles mostram uma função de etapa. A primeira região de 7 nucleotídeos foi fundamental para silenciamento e provavelmente constitui uma região de “semente” para sondar ligação de sgRNAs para o destino do DNA. A sequência de PAM (NGG) foi indispensável para silenciamento. Barras de erro representam SEM de três réplicas biológicas. (E) Efeitos de silenciamento de sgRNAs com incompatibilidades de duplas adjacentes. A atividade de repressão relativa de sgRNAs de incompatibilidade única é mostrada com a posição de incompatibilidade na porção inferior. Atividade experimentalmente medida de sgRNAs de incompatibilidade dupla é mostrada. Atividade calculada multiplicando-se os efeitos de dois sgRNAs de incompatibilidade única é mostrada em branco e marcada com “Com.” Na maioria dos casos, a atividade de silenciamento de um sgRNA incompatibilidade dupla foi simplesmente uma multiplicação das atividades de sgRNAs de incompatibilidade única (exceto Figura 50B), sugerindo uma relação independente entre incompatibilidades únicas. Barras de erro representam SEM de três réplicas biológicas. (F) Efeitos de silenciamento combinatorial do uso de sgRNAs duplos para direcionar um gene mRFP único. Usando dois sgRNAs que direcionam para o mesmo gene, o efeito geral de knockdown pode ser melhorado por quase 1.000 vezes. Quando dois sgRNAs ligam às sequências de não sobreposição de um mesmo gene, repressão foi aumentada. Quando dois sgRNAs alvejam regiões alvo sobrepostas, a repressão foi suprimida. Barras de erro representam SEM de três réplicas biológicas.
[0641] Figura 50 está relacionada com a Figura 43E e retrata os efeitos de silenciamento de sgRNAs com incompatibilidades duplas adjacentes. A atividade de repressão relativa de sgRNAs de incompatibilidade única é mostrada com a posição de incompatibilidade na porção inferior. Também é mostrada atividade experimentalmente medida de sgRNAs de incompatibilidades duplas. Atividade calculada multiplicando-se os efeitos de dois sgRNAs de incompatibilidades únicas é mostrada em branco e marcada com “Com”. Resultados de fluorescência representam média e SEM de três repetições biológicas.
[0642] Figura 51 está relacionada com a Figura 43F e retrata os efeitos combinatórios de silenciamento do uso de dois sgRNAs para regular um único gene. Em todos os casos, sgRNAs de não sobreposição mostram efeitos de silenciamento aumentativo e sgRNAs de sobreposição mostraram efeitos supressivos. O efeito combinatório foi independente de se o sgRNA tinha como alvo as fitas de DNA molde ou não molde. Resultados de fluorescência representam média e SEM das três repetições biológicas.
Interrogar uma rede reguladora endógena usando o knockdown de gene CRISPRi
[0643] O sistema CRISPRi em seguida foi usado como uma plataforma de knockdown de gene para interrogar redes de gene endógeno. Métodos anteriores para interrogar redes de genes microbianos têm invocado principalmente engenharia genômica trabalhosa e dispendiosa e procedimentos de nocaute. Por outro lado, knockdown de gene com CRISPRi requer apenas o projeto e a síntese de um sgRNA pequeno, tendo uma região complementar de 20-bp para os genes desejados. Para demonstrar isso, o CRISPRi foi usado para criar cepas knockdown de E. coli através da concepção de sgRNAs para perturbar sistematicamente genes que faziam parte da via regulatória de lactose de E. coli bem caracterizada (Figura 44). Ensaios de β-galactosidase foram realizados para medir a expressão de LacZ das cepas knockdown, com e sem isopropílico β-D-1-tiogalactopiranosideo (IPTG), um produto químico que inibe o repressor lac (LacI). Em células de tipo selvagem, adição de IPTG induziu expressão LacZ. Os resultados mostraram que um sgRNA específico de lacZ fortemente poderia reprimir a expressão LacZ (Figura 44B). Por outro lado, um sgRNA tendo como alvo o gene lacI levou à ativação da expressão de LacZ, mesmo na ausência de IPTG, como seria de esperar para silenciamento de um repressor direto de expressão LacZ.
[0644] Sabe-se que cAMP-CRP é um ativador essencial de expressão do LacZ por ligação a um sítio cis regulador à montante do promotor (sítio A). Consistentemente, o sgRNA que foi direcionado para o gene do crp ou o um sítio no promotor LacZ levou à repressão, demonstrando um meio para ligar um regulador a sua sequência de cis-regulatória usando experimentos de CRISPRi. Direcionamento do gene adenilato ciclase (cya), que é necessário para produzir o cAMP que torna o CRP mais eficaz no promotor LacZ, só levou à repressão parcial. Adição de 1mm cAMP ao meio de crescimento complementou os efeitos para knockdown de cya, mas não para knockdown crp, sugerindo que cya é um regulador indireto do LacZ. Além disso, visando sítio cis-regulatórios de LacI (sítio O) com um sgRNA levou à inibição, presumivelmente porque ligação ao complexo Cas9 neste sítio estericamente bloqueia RNA polimerase, imitando o comportamento do repressor da transcrição LacI. O direcionamento ao sítio de ligação a RNAP conhecido (sítio P) também bloqueou a expressão. Em resumo, esses estudos demonstram que o método de knockdown de gene com base em CRISPRi fornece uma abordagem rápida e eficaz para interrogar as funções reguladoras (ativando ou reprimindo) de genes e elementos cis em uma rede regulatória complexa (Figura 44).
[0645] Figura 44 demonstra a criação de perfil funcional de uma rede complexa regulatória usando o knockdown de gene CRISPRi. (A) SgRNAs (A) foram concebidos e usados para derrubar os genes (cya, crp, lacI, lacZ, lacY, lacA) na via regulatória lac ou bloquear sítios operadores de transcrição (A-P-O). LacI é um repressor do operon lacZYA por ligação a um sítio de operador de transcrição (sítio O). O gene lacZ codifica uma enzima que catalisa a lactose em glicose. Alguns genes de hospedeiros trans-atuando como cya e crp estão envolvidos na ativação do sistema lacZYA. O complexo de cAMP-CRP se liga a um sítio operador de transcrição (sítio A) e recruta a ligação da RNA polimerase ao sítio P, que inicia a transcrição do lacZYA. IPTG, um produto químico que inibe a função de LacI, induz a expressão de LacZ. (B) Ensaio de β-galactosidase das cepas knockdown sem (branco) e com IPTG (cinza). Controle mostra que as células tipo selvagem sem perturbação de CRISPRi poderiam ser induzidas pela adição de IPTG. O sgRNA que tem como alvo o LacZ fortemente reprimiu a expressão LacZ, mesmo na presença de IPTG. Quando LacI foi alvejado, expressão de LacZ foi alta, mesmo sem IPTG. Direcionamento aos genes cya e crp levou à redução de nível de expressão de LacZ na presença de IPTG. Presença de 1mM cAMP resgatou knockdown cya mas não knockdown de crp. Bloqueio de sítios operadores da transcrição resultou na repressão de LacZ, sugerindo que estes são importantes locais regulatórios de cis-agindo para LacZ. Após perturbação, a expressão reduzida (para baixo) e aumentada (setas para cima) de LacZ é indicada. Barras de erro representam SEM de três réplicas biológicas. (C) Experimentos knockdown nos permitiram perfilar os papéis dos reguladores no circuito regulador lac. Os dados de um gráfico 2D, com eixo x mostraram atividade de LacZ sem IPTG e eixo y mostrando sua atividade com IPTG. A propagação das ovais ao longo de cada eixo mostra os desvios padrão. Os resultados do ensaio de β-galactosidase representam média e SEM das três repetições biológicas. Para dados de RNA-seq em direcionamento LacI e LacZ, consulte também Figura 49.
CRISPRi pode derrubar a expressão do gene alvo em células humanas
[0646] Para testar a generalidade da abordagem CRISPRi para usar o complexo dCas9-sgRNA para reprimir a transcrição, o sistema foi testado em células de mamíferos HEK293. A proteína de dCas9 foi otimizado por códon, fundida a três cópias de uma sequência de localização nuclear (NLS) e expressa de um vetor retroviral de vírus de células tronco murinas (MSCV). O mesmo desenho de sgRNA mostrado na Figura 40B foi usado para expressar o promotor U6 de RNA polimerase III. Uma linhagem de células HEK293 repórter expressando EGFP sob o promotor SV40 foi criada por infecção viral. Usando um sgRNA (eNT2) direcionado à fita de DNA não molde da região que codifica EGFP, um knockdown da expressão do gene moderado, mas reprodutível foi observado (46% de repressão, Figura 45A). A repressão foi dependente em ambas proteínas dCas9 e o sgRNA, implicando que a repressão foi devido ao complexo dCas9-sgRNA e direcionamento guiado ao RNA. O mesmo sgRNA exibiu melhor repressão no gene mesmo quando transitoriamente expresso de um plasmídeo (63% de repressão, Figura 52). Consistente com o sistema bacteriano, apenas sgRNAs direcionados para a fita não molde exibiu a repressão. Fatores como a distância entre o início de transcrição e o estado de cromatina local podem ser parâmetros críticos, determinando a eficiência da repressão (Figura 52). Otimização da expressão dCas9 e sgRNA, estabilidade, localização nuclear e interação permitirão ainda mais a melhoria da eficiência de CRISPRi em células de mamíferos.
[0647] Figura 45 demonstra que CRISPRi pode reprimir a expressão gênica em células humanas. (A) Um sistema CRISPRi em células HEK293. O cassete de expressão SV40-EGFP foi inserido no genoma via infecção retroviral. A proteína de dCas9 foi otimizado por códon e fundida com três cópias da sequência NLS. O sgRNA foi expresso de um vetor U6 de RNA polimerase III. Cotransfecção de dCas9 e um sgRNA (eNT2) que tem como alvo a fita não molde da EGFP diminuiu a fluorescência (~ 46%), enquanto a expressão do dCas9 ou sgRNA isolado não mostrou efeito. (B) A repressão mediada por dCas9:sgRNA foi dependente os loci de alvo. Sete sgRNAs foram projetados para atingir diferentes regiões alvos da sequência de que codifica EGFP na fita molde ou não molde. Apenas eNT2 e eNT5 mostraram moderada repressão. Resultados de fluorescência de 7A e 7B representam média e erro de duas replicatas biológicas.
[0648] Figura 52 está relacionada à Figura 45 e mostra que a repressão sgRNA é dependente no loci alvo e relativamente a distância desde o início da transcrição. O mesmo sgRNA foi usado para reprimir o mesmo gene EGFP com promotores diferentes. Complexos Cas9/sgRNA reprimidos da transcrição do DNA do plasmídeo transitoriamente transfectado. O nível de repressão de transcrição foi um pouco melhor (63%) do que o observado para genes do genoma e a percentagem de células negativas para GFP aumentada na presença de sgRNA. O locus alvo tem distância diferente desde o início da transcrição. Enquanto SV40-EGFP mostrou a repressão, LTR-EGFP não teve efeito. Resultados de fluorescência representam média e erro de duas repetições biológicas.
CRISPRi eficientemente e seletivamente reprime a transcrição dos genes alvos
[0649] O sistema CRISPRi é uma plataforma relativamente simples para regulação de gene alvo. CRISPRi não depende da presença de fatores do hospedeiro complexo, mas em vez disso, requer apenas os guias de RNAs e proteínas dCas9 e, portanto, é flexível e altamente projetável. O sistema pode de forma eficiente silenciar genes em bactérias. O silenciamento é muito eficiente, como foram detectados sem efeitos fora do alvo. Além disso, a eficiência do knockdown pode ser ajustada alterando os loci alvo e o grau de pareamento de base entre o sgRNA e o gene alvo. Isto tornará possível criar série alélica de hipomorfos - um recurso que é especialmente útil para o estudo de genes essenciais. As funções do sistema bloquearam diretamente a transcrição, de forma que pode ser facilmente programada através da concepção de sgRNAs. Mecanicamente, isto é distinto do silenciamento baseado em RNAi, que exige a destruição dos mRNAs já transcritos.
[0650] Além disso, estes complexos de dCas9:sgRNA também podem modular transcrição, orientando os principais motivos de cis-atuação dentro de qualquer promotor, estericamente bloqueando a associação de seus fatores de transcrição cognatos trans-atuação. Assim, além de sua utilização como uma ferramenta de gene knockdown, CRISPRi poderia ser usado para mapeamento funcional dos promotores e outros módulos de regulação genômicos.
CRISPRi é passível de análise em escala de genoma e regulamentação
[0651] O método CRISPRi baseia-se na utilização de RNAs tendo DNA como alvo, e somente o segmento tendo DNA como alvo precisa ser projetado para alvos específicos do gene. Com os avanços da tecnologia de síntese do DNA oligonucleotídeo em larga escala, gerando grandes conjuntos de oligonucleotídeos que contêm regiões de 20-bp exclusivas para o direcionamento do genoma é rápida e barata. Essas bibliotecas do oligonucleotídeo poderiam nos permitir um grande número alvo de genes individuais para inferir a função dos genes ou de pares de genes alvos para mapear interações genéticas. Além disso, CRISPRi poderia ser usado para simultaneamente modular a expressão de grandes conjuntos de genes, uma vez que o pequeno tamanho da sgRNAs permite concatenar múltiplos elementos no mesmo vetor de expressão.
CRISPRi fornece novas ferramentas para manipular genomas microbianas
[0652] Porque a plataforma CRISPRi é compacta e autônoma, pode ser adaptada para diferentes organismos. CRISPRi é uma ferramenta poderosa para o estudo de organismos não modelo para que métodos de engenharia genética não sejam bem desenvolvidos, incluindo patógenos ou organismos úteis industrialmente. Ao contrário da maioria dos eucariontes, a maioria das bactérias é desprovida da maquinaria de RNAi. Como consequência, regulação de genes endógenos utilizando RNAs sintéticos projetados é atualmente limitado. CRISPRi poderia fornecer um método de tipo RNAi para perturbação de gene em micróbios.
CRISPRi como uma plataforma para a engenharia de redes de regulação de transcrição
[0653] O CRISPRi pode ser utilizado como uma estrutura flexível para redes de engenharia de regulação de transcrição. A plataforma CRISPRi, porque é essencialmente um complexo de ligação ao DNA guiado por RNA, também fornece uma estrutura flexível para dirigir diversas máquinas reguladoras para locais específicos no genoma. Além de simplesmente bloquear a transcrição dos genes alvos, é possível conjugar a proteína dCas9 com numerosos domínios regulatórios para modular processos biológicos diferentes e gerar resultados funcionais diferentes (por exemplo ativação de transcrição, modificações de cromatina).
[0654] No sistema CRISPRi, é possível ligar vários sgRNAs em circuitos de transcrição em que um sgRNA à montante controla a expressão de um sgRNA diferente à jusante. Como moléculas de RNA em micro-organismos tendem a ser de curta duração, suspeitamos que os programas genéticos regulados por sgRNAs podem mostrar cinética rápida distinta de circuitos que envolvem processos lentos como expressão e degradação da proteína. Em resumo, o sistema CRISPRi é uma plataforma de programação genética geral apropriada para uma variedade de pesquisa biomédica e aplicações clínicas, incluindo o perfilamento funcional em escala do genoma, engenharia metabólica microbiana e reprogramação celular.
Exemplo 5: Um polipeptídeo direcionado ao sítio quimérico pode ser usado para modular (ativar ou reprimir) a transcrição em células humanas.
[0655] Temos demonstrado que em células humanas, uma proteína de fusão compreendendo uma Cas9 cataliticamente inativa e um domínio ativador ou um domínio repressor pode aumentar ou diminuir a transcrição do DNA alvo, respectivamente.
[0656] Figura 55.. Fundimos a Cas9 cataliticamente inativa humanizada com um domínio de ativador de transcrição VP64. (A) Para testar a eficiência para a ativação do gene usando este sistema, inserimos um promotor induzível GAL4 UAS que controla um GFP no genoma HEK293 (células de cultura de tecido humano). (B) Promotor GAL4 UAS pode ser induzido na presença de proteína GAL4 derivada de leveduras. A fusão de dCas9-VP64 efetivamente ativa GAL4 UAS por 20 vezes na presença de um guia cognato do RNA que se liga à região GAL4 UAS. (C) Imagens microscópicas para ativação de dCas9-VP64. (D) Dados de citometria de fluxo para ativação de dCas9-VP64.
[0657] Figura 56 Fundimos a Cas9 cataliticamente inativa humanizada com um domínio de repressor da transcrição KRAB. (Superior) Projetamos 10 guias de RNAs que se destinam a um promotor precoce SV40 bem caracterizado e um guia de RNA que tem como alvo a região de codificação de EGFP. (Inferior) Usando um dCas9 não quimérico, observamos 2 ~ 3 vezes de repressão para gRNAs de P9 e NT2. Essa eficiência foi muito melhorada usando a fusão dCas9-KRAB. Por exemplo, com fusão de dCas9-KRAB, P9 e NT2 mostraram repressão de 20 vezes e 15 vezes, respectivamente. Além disso, P1-P6 mostrou uma redução significativa na expressão quando a proteína de fusão foi usada, mas limitada repressão quando um dCas9 não quimérico foi usado.
Exemplo 6: Cas9 pode usar guias de RNAs artificiais, não existentes na natureza, para realizar a clivagem de DNA alvo
[0658] Um crRNA artificial e um tracrRNA artificial foram projetado baseados no segmento de ligação à proteína de transcrições de ocorrência natural de crRNA e tracrRNAs de S. pyogenes, modificado para imitar a protuberância assimétrica dentro do duplex natural de crRNA:tracrRNA de S. pyogenes (ver o bojo do domínio da ligação à proteína de moléculas de RNA artificiais (topo) e naturais (inferior) representadas na Figura 57A). A sequência de tracrRNA artificial compartilha menos do que 50% de identidade com o tracrRNA natural. A estrutura secundária prevista do duplex de ligação à proteína de crRNA:tracrRNA é a mesma para ambos os pares de RNA, mas a estrutura prevista do resto dos RNAs é muito diferente.
[0659] Figura 57 demonstra que sequências artificiais que compartilham muito pouco (cerca de 50% identidade) com um tracrRNAs e crRNAs de ocorrência natural podem funcionar com Cas9 para clivar DNA alvo, enquanto a estrutura do domínio da ligação à proteína do RNA tendo DNA como alvo é conservada. (A) Co-dobra do tracrRNA e crRNA de S. pyogenes e tracrRNA e crRNA artificial. (B) Combinações de ortólogos Cas9 e tracrRNA:crRNA de S. pyogenesforam utilizadas para realizar ensaios de clivagem de DNA do plasmídeo.Spy - S. pyogenes, Lin - L. innocua, Nme - N. meningitidis, Pmu - P. multocida. Cas9 de S. pyogenes pode ser guiado por alguns, mas nem todos os ortólogos tracrRNA:crRNA de ocorrência natural ocorrendo em espécies bacterianas selecionadas. Notavelmente, S. pyogenes Cas9 pode ser guiada pelo par artificial de tracrRNA:crRNA, que foi projetado com base na estrutura do segmento de ligação à proteína do RNA tendo DNA como alvo de ocorrência natural usando sequência completamente não relacionada ao sistema CRISPR.
[0660] O “tracrRNA” artificial (RNA ativador) utilizado foi 5’- GUUUUCCCUUUUCAAAGAAAUCUCCUGGGCACCUAUCUUCUUAGGUGCCCUCCCUUGUUUA AACCUGACCAGUUAACCGGCUGGUUAGGUUUUU-3’ (SEQ ID NO:1347). O “crRNA” artificial (RNA direcionador) usado foi: 5’- GAGAUUUAUGAAAAGGGAAAAC-3’ (SEQ ID NO:1348).
Exemplo 7: Geração de Organismos Transgênicos não Humanos
[0661] Um camundongo transgênico expressando Cas9 (seja não modificado, modificado para ter atividade enzimática reduzida, modificado como uma proteína de fusão para algum dos propósitos delineados acima) é gerado usando um método conveniente conhecido como daqueles versados na técnica (por exemplo, (i) mutação de gene em um locus de alvo (por exemplo, ROSA 26) de uma célula tronco embrionária de camundongo (célula ES) seguida por injeção de blastócito e a geração de camundongo quimérico; (ii) injeção de um transgene de integração aleatória no pronúcleo de um oócito de camundongo fertilizado seguida por implantação de óvulo em uma fêmea pseudográvida; etc.). A proteína Cas9 está sob o controle de um promotor que expressa pelo menos em células tronco embrionárias e pode ser adicionalmente sob controle temporal ou específica de tecido (por exemplo, droga induzível, controlado por um sistema de promotor baseado em Cre/Lox, etc.). Uma vez que uma linhagem de camundongos transgênicos expressando Cas9 é gerada, células tronco embrionárias são isoladas e cultivadas e em alguns casos as células ES são congeladas para uso futuro. Porque as células isoladas de ES expressam Cas9 (e, em alguns casos, a expressão está sob controle temporal (por exemplo, induzível por droga), novo knock-out ou knock-in em células (e, portanto, camundongos) são gerados rapidamente em qualquer locus desejado no genoma introduzindo um RNA tendo DNA como alvo adequadamente concebido que tem como alvo o Cas9 para um determinado locus de escolha. Tal sistema e muitas variações do mesmo, é usado para gerar novos organismos geneticamente modificados em qualquer locus de escolha. Quando Cas9 modificado é usado para modular a transcrição e/ou modificar o DNA e/ou modificar polipeptídeos associados com o DNA, as células ES próprias (ou quaisquer células derivadas de diferenciadas de células ES (por exemplo, um camundongo inteiro, uma linhagem de células diferenciadas, etc.) são utilizadas para estudar as propriedades de qualquer gene de escolha (ou qualquer produto de expressão de escolha, ou qualquer locus genômico de escolha) simplesmente introduzindo um RNA tendo DNA como alvo adequado em uma célula que expressa Cas9 desejado.
[0662] Embora a presente invenção tenha sido descrita com referência às modalidades específicas respectivas, deve ser entendido por especialistas na técnica que podem ser feitas várias alterações e equivalentes podem ser substituídos sem se afastar do verdadeiro espírito e do escopo da invenção. Além disso, muitas modificações podem ser feitas para adaptar uma situação particular, material, composição de matéria, processo, etapa ou etapas do processo, ao objetivo, espírito e o escopo da presente invenção. Todas essas modificações são destinadas a estar no escopo das reivindicações anexadas a este.

Claims (72)

1. MÉTODO DE MODIFICAÇÃO DE UM DNA ALVO, caracterizado por compreender o contato do DNA alvo com um complexo compreendendo: (a) um polipeptídeo de Cas9, e (b) um RNA tendo como alvo DNA de uma molécula individual compreendendo: (i) um segmento tendo como alvo DNA que compreende uma sequência de nucleotídeos que é complementar a uma sequência no DNA alvo, e (j) ) um segmento de ligação à proteína que interage com o dito polipeptídeo de Cas9, em que o segmento de ligação à proteína compreende dois trechos complementares de nucleotídeos que hibridizam para formar um duplex de RNA de fita dupla (dsRNA), em que o dito duplex de dsRNA compreende nucleotídeos complementares de um tracrRNA e um CRISPR RNA (crRNA), em que os ditos dois trechos complementares de nucleotídeos estão covalentemente ligados através de nucleotídeos intervenientes, em que o dito contato é in vitro ou em uma célula ex vivo; e em que a dita modificação é clivagem do DNA alvo.
2. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo contato compreender a introdução, em uma célula, (a) do dito polipeptídeo de Cas9 ou um polinucleotídeo que codifica o dito polipeptídeo de Cas9, e (b) do dito RNA tendo como alvo DNA ou um polinucleotídeo de DNA que codifica o dito RNA tendo como alvo DNA.
3. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo polinucleotídeo que codifica o dito polipeptídeo de Cas9 e/ou o polinucleotídeo de DNA que codifica o dito RNA tendo como alvo DNA ser um vetor de expressão recombinante e, opcionalmente, um vetor viral.
4. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 ou 3, caracterizado por ainda compreender a introdução, na célula, de um polinucleotídeo doador.
5. COMPOSIÇÃO, caracterizada por compreender: (a) um polipeptídeo de Cas9 ou um polinucleotídeo que codifica o dito polipeptídeo de Cas9, e (b) um RNA tendo como alvo DNA de uma molécula individual ou um polinucleotídeo de DNA que codifica o dito RNA tendo como alvo DNA, em que o dito RNA tendo como alvo DNA de uma molécula individual compreende: (i) um segmento tendo como alvo DNA que compreende uma sequência de nucleotídeos que é complementar a uma sequência em um DNA alvo, e (j) ) um segmento de ligação à proteína que interage com o dito polipeptídeo de Cas9, em que o segmento de ligação à proteína compreende dois trechos complementares de nucleotídeos que hibridizam para formar um duplex de RNA de fita dupla (dsRNA), em que o dito duplex de dsRNA compreende nucleotídeos complementares de um tracrRNA e um CRISPR RNA (crRNA); e em que os ditos dois trechos complementares de nucleotídeos estão covalentemente ligados através de nucleotídeos intervenientes.
6. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo polipeptídeo de Cas9 e o RNA tendo como alvo DNA de uma molécula individual estarem em uma célula in vitro ou ex vivo.
7. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 ou 6, caracterizada pelo polinucleotídeo que codifica o dito polipeptídeo de Cas9 e/ou o polinucleotídeo de DNA que codifica o dito RNA tendo como alvo DNA estarem um vetor de expressão recombinante e, opcionalmente, um vetor viral.
8. RNA TENDO COMO ALVO DNA, de uma molécula individual ou um polinucleotídeo de DNA que codifica o dito RNA tendo como alvo DNA, caracterizado pelo RNA, tendo como alvo DNA de uma molécula individual compreender: (a) um segmento tendo como alvo DNA que compreende uma sequência de nucleotídeos que é complementar a uma sequência em um DNA alvo, e (b) um segmento de ligação à proteína que interage com uma proteína Cas9, em que o segmento de ligação à proteína compreende dois trechos complementares de nucleotídeos que hibridizam para formar um duplex de RNA fita dupla (dsRNA), em que o dito duplex de dsRNA compreende nucleotídeos complementares de um tracrRNA e um CRISPR RNA (crRNA) e em que os ditos dois trechos complementares de nucleotídeos estão covalentemente ligados através de nucleotídeos intervenientes.
9. RNA TENDO COMO ALVO DNA, de uma molécula individual ou um polinucleotídeo de DNA que codifica o dito RNA tendo como alvo DNA, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo polinucleotídeo de DNA que codifica o dito RNA tendo como alvo DNA ser um vetor de expressão recombinante e, opcionalmente, um vetor viral.
10. UM OU MAIS ÁCIDOS NUCLEICOS, caracterizados por compreenderem: (a) uma primeira sequência de nucleotídeos que codifica um RNA tendo como alvo DNA de uma molécula individual compreendendo: (i) um segmento tendo como alvo DNA que compreende uma sequência de nucleotídeos que é complementar a uma sequência em um DNA alvo, e (ii) um segmento de ligação à proteína que interage com um polipeptídeo de Cas9, em que o segmento de ligação à proteína compreende dois trechos complementares de nucleotídeos que hibridizam para formar um duplex de RNA fita dupla (dsRNA), em que o dito duplex de dsRNA compreende nucleotídeos complementares de um tracrRNA e um CRISPR RNA (crRNA) e em que os ditos dois trechos complementares de nucleotídeos estão covalentemente ligados através de nucleotídeos intervenientes; em que a primeira sequência de nucleotídeos que codifica o dito RNA tendo como alvo DNA está operativamente ligada a um promotor; e, opcionalmente, (b) uma segunda sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo de Cas9, em que a sequência de nucleotídeos que codifica o dito polipeptídeo de Cas9 está operativamente ligada a um promotor.
11. UM OU MAIS ÁCIDOS NUCLEICOS, de acordo com a reivindicação 10, caracterizados pelos ditos ácidos nucleicos serem um ou mais vetores de expressão recombinantes e, opcionalmente, um ou mais de vetores virais.
12. KIT, caracterizado por compreender: (a) um polipeptídeo de Cas9 ou um ácido nucleico que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica o dito polipeptídeo de Cas9; e (b) um RNA tendo como alvo DNA de uma molécula individual, ou um ácido nucleico que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica o dito RNA tendo como alvo DNA de uma molécula individual, em que o RNA tendo como alvo DNA de uma molécula individual compreende: (i) um segmento tendo como alvo DNA que compreende uma sequência de nucleotídeos que é complementar a uma sequência em um DNA alvo, e (j) ) um segmento de ligação à proteína que interage com o dito polipeptídeo de Cas9, em que o segmento de ligação à proteína compreende dois trechos complementares de nucleotídeos que hibridizam para formar um duplex de RNA fita dupla (dsRNA), em que o dito duplex de dsRNA compreende nucleotídeos complementares de um tracrRNA e um CRISPR RNA (crRNA) e, em que os ditos dois trechos complementares de nucleotídeos estão covalentemente ligados através de nucleotídeos intervenientes, e em que (a) e (b) estão nos mesmos ou em recipientes separados.
13. KIT, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo dito ácido nucleico que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica o dito polipeptídeo de Cas9 e/ou o dito ácido nucleico que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica o dito RNA tendo como alvo DNA de uma molécula individual ser um vetor de expressão recombinante e, opcionalmente, um vetor viral.
14. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, ou a composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 7, ou RNA tendo como alvo DNA de uma molécula individual, de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 ou 9, ou um ou mais ácidos nucléicos, de acordo com uma das reivindicações 10 ou 11, ou kit, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 ou 13, caracterizado pelo RNA tendo como alvo DNA de uma molécula individual compreender um ou mais de uma nucleobase modificada, um esqueleto modificado ou uma ligação internucleosídeo não natural, uma porção de açúcar modificada, um Ácido Nucleico Bloqueado ou um Ácido Nucleico Peptídico.
15. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 7, ou RNA tendo como alvo DNA de uma molécula individual ou um polinucleotídeo de DNA que codifica o dito RNA tendo como alvo DNA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 ou 9, ou o um ou mais ácidos nucléicos, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 ou 11, ou kit, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 ou 13, caracterizado por: (i) o dito duplex de dsRNA ter um comprimento de 8 pares de bases (pb) a 30 pb; e/ou (ii) a complementaridade percentual entre os nucleotídeos que hibridizam para formar o duplex de dsRNA do segmento de ligação à proteína ser maior do que 70 %.
16. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4 ou 15, ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 7 ou 15, ou RNA tendo como alvo DNA de uma molécula individual ou um polinucleotídeo de DNA que codifica o dito RNA tendo como alvo DNA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 ou 9 ou 15, ou um ou mais ácidos nucléicos, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 ou 11 ou 15, ou kit de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 ou 13 ou 15, caracterizado pelo DNA alvo estar presente em uma célula bacteriana, uma célula de archaea, um organismo eucariota unicelular, uma célula de planta, uma célula de um animal invertebrado ou uma célula de um animal vertebrado e, opcionalmente, em que o DNA alvo é DNA cromossômico.
17. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4 ou 15 ou 16, ou composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 7 ou 15 ou 16, ou RNA tendo como alvo DNA de uma molécula individual ou um polinucleotídeo de DNA que codifica o dito RNA tendo como alvo DNA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 ou 9 ou 15 ou 16, ou o um ou mais ácidos nucléicos, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 ou 11 ou 15 ou 16, ou kit, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 ou 13 ou 15 ou 16, caracterizado por: (i) os ditos nucleotídeos de um crRNA compreenderem uma sequência de nucleotídeos conforme apresentadas nas SEQ ID NOs: 563-679 ao longo de um trecho de pelo menos 8 nucleotídeos contíguos; e/ou (ii) os ditos nucleotídeos de um tracrRNA compreendem uma sequência de nucleotídeos conforme apresentadas nas SEQ ID NOs: 431-562 ao longo de um trecho de pelo menos 8 nucleotídeos contíguos.
18. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4 ou 15 a 17, ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 7 ou 15 a 17, ou o um ou mais ácidos nucléicos, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 ou 11 ou 15 a 17, ou kit, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 ou 13 ou 15 a 17, caracterizado por um domínio de transdução de proteína que facilita a travessia do polipeptídeo de Cas9 do citosol para dentro de um organela de uma célula estar covalentemente ligado a uma extremidade do polipeptídeo de Cas9.
19. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4 ou 15 a 17, ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 7 ou 15 a 17, ou um ou mais ácidos nucleicos de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 ou 11 ou 15 a 17, ou kit, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 ou 13 ou 15 a 17, caracterizado pelo polipeptídeo de Cas9 compreender uma sequência de aminoácidos tendo aminoácidos 7-166 ou 731-1003 da sequência de aminoácidos de Cas9/Csn1 representada na Figura 3 ou porções correspondentes em qualquer uma das sequências de aminoácidos apresentadas como SEQ ID NOs: 1-256 e 795-1346.
20. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4 ou 15 a 19, ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 7 ou 15 a 19, ou RNA tendo como alvo DNA de uma molécula individual ou um polinucleotídeo de DNA que codifica o dito RNA tendo como alvo DNA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 ou 9 ou 15 a 17, ou o um ou mais ácidos nucléicos, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 ou 11 ou 15 a 19, ou kit, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 ou 13 ou 15 a 19, caracterizado por ser para uso em um método de tratamento terapêutico de um paciente.
21. COMPOSIÇÃO, caracterizado por compreender: (a) uma proteína Cas9 quimérica, ou um polinucleotídeo que codifica a dita proteína Cas9 quimérica, em que a proteína Cas9 quimérica compreende uma proteína Cas9 modificada com atividade de nuclease reduzida em comparação com o Cas9 de tipo selvagem correspondente e compreende um polipeptídeo heterólogo que: (i) possui atividade modificadora de DNA, ou (ii) exibe a capacidade de aumentar ou diminuir a transcrição, ou (iii) possui atividade enzimática que modifica um polipeptídeo associado ao DNA; e (b) um RNA tendo DNA como alvo ou um ou mais polinucleotídeos de DNA que codificam o dito RNA tendo DNA como alvo, em que o referido RNA alvo de DNA compreende: (i) um segmento alvo de DNA compreendendo uma sequência nucleotídica que é complementar a uma sequência em um DNA alvo, e (ii) um segmento de ligação a proteína que interage com a dita proteína Cas9 quimérica, em que o segmento de ligação a proteína compreende dois trechos complementares de nucleotídeos que hibridizam para formar um duplex de RNA de fita dupla (dsRNA).
22. MÉTODO DE MODIFICAÇÃO DE UM DNA ALVO, o método compreendendo o contato do DNA alvo com um complexo compreendendo: (a) uma proteína Cas9 quimérica, que compreende uma proteína Cas9 modificada com atividade de nuclease reduzida em comparação com a Cas9 de tipo selvagem correspondente e compreende um polipeptídeo heterólogo que possui atividade de modificação de DNA; e (b) um RNA tendo DNA como alvo, caracterizado pelo fato de que compreende: (i) um segmento alvo de DNA compreendendo uma sequência de nucleotídeo que é complementar a uma sequência de DNA alvo, e (ii) um segmento de ligação a proteínas que interage com a dita proteína Cas9 quimérica, em que o segmento de ligação a proteína compreende dois trechos complementares de nucleotídeos que hibridizam para formar um duplex de RNA de fita dupla (dsRNA), em que o dito contato é in vitro ou em uma célula ex vivo.
23. MÉTODO PARA MODULAR A TRANSCRIÇÃO ESPECÍFICA DO SÍTIO EM UM DNA ALVO, o método compreendendo o contato do DNA alvo com um complexo compreendendo: (a) uma proteína Cas9 quimérica, que compreende uma proteína Cas9 modificada com atividade de nuclease reduzida em comparação com o Cas9 do tipo selvagem correspondente e compreende um polipeptídeo heterólogo que exibe a capacidade de aumentar ou diminuir a transcrição; e (b) um RNA tendo DNA como alvo, caracterizado por compreender: (i) um segmento de DNA alvo compreendendo uma sequência nucleotídica que é complementar a uma sequência no DNA alvo, e (ii) um segmento de ligação a proteína que interage com a referida proteína Cas9 quimérica, em que o segmento de ligação a proteína compreende dois trechos complementares de nucleotídeos que hibridizam para formar um duplex de RNA de fita dupla (dsRNA), em que o referido contato é in vitro ou em uma célula ex vivo.
24. MÉTODO PARA MODIFICAR UM POLIPEPTÍDEO ASSOCIADO COM UM DNA ALVO, o método compreendendo o contato do DNA alvo com um complexo compreendendo: (a) uma proteína Cas9 quimérica, que compreende uma proteína Cas9 modificada com atividade de nuclease reduzida em comparação com a Cas9 do tipo selvagem correspondente e compreende um polipeptídeo heterólogo que possui atividade de enzimática que modifica um polipeptídeo associado com DNA; e (b) um RNA tendo DNA como alvo, caracterizado por compreender: (i) um segmento de DNA alvo compreendendo uma sequência de nucleotídeo que é complementar a uma sequência de DNA alvo, e (ii) um segmento de ligação a proteína que interage com a dita proteína Cas9 quimérica, em que o segmento de ligação a proteína compreende dois trechos complementares de nucleotídeos que hibridizam para formar um duplex de RNA de fita dupla (dsRNA), em que o dito contato é in vitro ou em uma célula ex vivo.
25. KIT, caracterizado por compreender: (a) uma proteína Cas9 quimérica ou um polinucleotídeo que codifica a proteína Cas9 quimérica, em que a referida proteína Cas9 quimérica compreende uma proteína Cas9 modificada com atividade de nuclease reduzida em comparação com a Cas9 do tipo selvagem correspondente e compreende um polipeptídeo heterólogo que: (i) possui atividade modificadora de DNA, ou (ii) exibe a capacidade de aumentar ou diminuir a transcrição, ou (iii) possui atividade enzimática que modifica um polipeptídeo associado ao DNA; e (b) um RNA tendo DNA como alvo ou um ou mais polinucleotídeos de DNA que codificam o referido RNA tendo DNA como alvo, em que o referido RNA tendo DNA como alvo compreende: (i) um segmento de DNA alvo compreendendo uma sequência nucleotídica que é complementar a uma sequência alvo em um DNA alvo, e (j) ) um segmento de ligação a proteína que interage com a proteína Cas9 quimérica, em que o segmento de ligação a proteína compreende dois trechos complementares de nucleotídeos que hibridizam para formar um duplex de RNA de fita dupla (dsRNA), em que (a) e (b) estão no mesmo recipiente ou em recipientes separados.
26. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 21, ou o método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 24, ou o kit da reivindicação 25, caracterizado pelo referido dsRNA duplex ter um comprimento de 8 pares de bases (bp) a 30 bp.
27. COMPOSIÇÃO, método ou kit, de acordo com a reivindicação 26, caracterizada pelo referido dsRNA duplex ter um comprimento de 8 a 10 pb.
28. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 21, 26 ou 27, método de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 24, ou 26 a 27, ou kit de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 a 27, caracterizado pela complementaridade percentual entre os nucleotídeos que hibridizam para formar o duplex de dsRNA do segmento de ligação à proteína ser superior a 70%.
29. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 ou 26 a 28, ou método de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 24, ou 26 a 28, ou kit de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 a 28, caracterizado pelo RNA tendo DNA como alvo ser um RNA tendo DNA como alvo de duas moléculas e compreender duas moléculas de RNA separadas, cada uma das quais compreende um dos dois trechos complementares de nucleotídeos que hibridizam para formar o duplex dsRNA.
30. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 ou 26 a 28, ou o método de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 24, ou 26 a 28, ou o kit de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 a 28, caracterizado pelo RNA tendo DNA como alvo ser um RNA tendo DNA como alvo de molécula única, e em que no segmento de ligação a proteína os dois trechos complementares de nucleotídeos são covalentemente ligados por nucleotídeos intervenientes.
31. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 24 ou 26 a 30, caracterizado pelo fato de que o contato compreende a introdução em uma célula (a) do referido polipeptídeo Cas9 quimérico, ou um polinucleotídeo que codifica o referido polipeptídeo Cas9 quimérico, e (b) o referido RNA tendo DNA como alvo, ou um ou mais polinucleotídeos de DNA que codificam o referido RNA tendo DNA como alvo.
32. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 ou 26 a 30, ou método da reivindicação 21, ou kit de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 a 30, caracterizado por (a) um ou mais polinucleotídeos de DNA que codificam o referido RNA tendo DNA como alvo serem um ou mais vetores de expressão recombinantes; e / ou (b) um ou mais polinucleotídeos que codificam o referido polipeptídeo Cas9 quimérico serem um ou mais vetores de expressão recombinantes.
33. COMPOSIÇÃO, método ou kit, de acordo com a reivindicação 32, caracterizada pelo fato de que o um ou mais vetores de expressão recombinantes são um ou mais vetores virais.
34. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 21, ou 26 a 30, ou 32 a 33, ou o método de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 24, ou 26 a 33, ou o kit de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 a 30 ou 32 a 33, caracterizado pelo RNA tendo DNA como alvo compreender uma ou mais de uma nucleobase modificada, uma estrutrura principal modificada ou ligação internucleosídica não natural, uma fração de açúcar modificada, um ácido nucleico bloqueado ou um ácido nucleico de peptídeo.
35. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 21, ou 26 a 30, ou 32 a 34, ou método de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 24, ou 26 a 34, ou kit de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 a 30 ou 32 a 34, caracterizado pelo DNA alvo estar presente em uma célula bacteriana, uma célula archaeal, um organismo eucariótico unicelular, uma célula vegetal, uma célula de um animal invertebrado ou uma célula de um animal vertebrado.
36. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 21, ou 26 a 30, ou 32 a 35, ou método de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 24, ou 26 a 35, ou kit de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 a 30, ou 32 a 35, caracterizado pelo DNA alvo ser DNA cromossômico.
37. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 ou 26 a 30 ou 32 a 36, ou o método de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 ou 26 a 36, ou o kit de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 a 30 ou 32 a 36, caracterizado pelo polipeptídeo heterólogo possuir atividade modificadora de DNA, cuja atividade é selecionada a partir de: atividade de metiltransferase, atividade de desmetilase, atividade de reparo de DNA, atividade de dano ao DNA, atividade de desaminação, atividade de dismutase, atividade de alquilação, atividade de depurinação, atividade de oxidação, atividade de formação de dímero de pirimidina, atividade integrase, atividade transposase, atividade recombinase, atividade polimerase, atividade ligase, atividade helicase, atividade fotolase ou atividade glicosilase.
38. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 21, ou 26 a 30 ou 32 a 36, ou método de acordo com qualquer uma das reivindicações 23, ou 26 a 36, ou kit de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 a 30 ou 32 a 36, caracterizado pelo polipeptídeo heterólogo exibir a capacidade de aumentar ou diminuir a transcrição, e em que o polipeptídeo heterólogo é um ativador da transcrição ou polipeptídeo repressor da transcrição.
39. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 21, ou 26 a 30, ou 32 a 36, ou método de acordo com qualquer uma das reivindicações 24, ou 26 a 36, ou kit de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 a 30, ou 32 a 36, caracterizado pelo polipeptídeo heterólogo ter atividade enzimática que modifica um polipeptídeo associado ao DNA, cuja atividade é uma atividade modificadora de histona.
40. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 21, ou 26 a 30, ou 32 a 36, ou 39, ou o método de acordo com qualquer uma das reivindicações 24, ou 26 a 36, ou 39, ou o kit ou qualquer uma das reivindicações 25 a 30 ou 32 a 36 ou 39, caracterizado pelo polipeptídeo heterólogo ter atividade enzimática que modifica um polipeptídeo associado ao DNA, cuja atividade é selecionada a partir de: atividade de metiltransferase, atividade de desmetilase, atividade de acetiltransferase, atividade de desacetilase, atividade de quinase, atividade de fosfatase, atividade de ubiquitina ligase, atividade de desubiquitinação, atividade de adenilação, deadenilação atividade, atividade SUMOilante, atividade desSUMOilante, atividade de ribosilação, atividade de desibosilação, atividade de miristoilação, atividade de desmistoistoilação, atividade de glicosilação ou atividade de desglicosilação.
41. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 21, ou 26 a 30, ou 32 a 40, ou kit de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 a 30, ou 32 a 40, caracterizado por ser para uso em um método de tratamento terapêutico de um paciente.
42. MÉTODO DE MODIFICAÇÃO DE UM DNA ALVO, o método compreendendo o contato do DNA alvo com um complexo compreendendo: (a) um polipeptídeo Cas9; e (b) um RNA tendo DNA como alvo, caracterizado por compreender: (i) um segmento de DNA alvo compreendendo uma sequência nucleotídica que é complementar a uma sequência no DNA alvo, e (ii) um segmento de ligação a proteína que interage com o polipeptídeo Cas9, em que o segmento de ligação a proteína compreende dois trechos complementares de nucleotídeos que hibridizam para formar um duplex de RNA de fita dupla (dsRNA), em que o DNA alvo está presente em um organismo eucariótico unicelular, uma célula animal ou uma célula vegetal, em que a referida modificação é a clivagem do DNA alvo, e em que o referido contato é in vitro ou em uma célula ex vivo.
43. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 42, caracterizado pelo RNA tendo DNA como alvo compreender uma ou mais de uma nucleobase modificada, uma estrutura principal modificada ou ligação internucleosídica não natural, uma fração de açúcar modificada, um ácido nucleico bloqueado ou um ácido nucleico peptídico.
44. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 42 ou reivindicação 43, caracterizado pelo referido duplex dsRNA ter: (i) um comprimento de 8 pares de bases (pb) a 15 pb; (ii) um comprimento de 8 pares de bases (pb) a 30 pb; ou (iii) um comprimento de 15 pares de bases (pb) a 18 pb.
45. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 42 a 44, caracterizado pela porcentagem de complementaridade entre os nucleotídeos que hibridizam para formar o duplex dsRNA do segmento de ligação à proteína ser superior a 70%.
46. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 42 a 45, caracterizado pelo contato compreender a introdução em uma célula (a) do polipeptídeo Cas9, ou um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo Cas9 e (b) o RNA tendo DNA como alvo, ou um ou mais polinucleotídeos de DNA que codificam o RNA tendo DNA como alvo; opcionalmente, em que o método compreende ainda a introdução na célula de um polinucleotídeo doador.
47. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 42 a 46, caracterizado pela sequência nucleotídica que é complementar a uma sequência no DNA alvo ter 15 a 18 nucleotídeos (nt) de comprimento, 18 a 20 nt de comprimento ou 20 a 25 nt de comprimento.
48. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 42 a 47, caracterizado pelo domínio de transdução de proteínas estar covalentemente ligado ao terminal amino do polipeptídeo Cas9, em que o domínio de transdução de proteína facilita a passagem do polipeptídeo Cas9 do citosol para dentro de uma organela do uma célula.
49. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 42 a 47, caracterizado pelo domínio de transdução de proteína estar covalentemente ligado ao terminal carboxil do polipeptídeo Cas9, em que o domínio de transdução de proteína facilita a passagem do polipeptídeo Cas9 do citosol para dentro de uma organela de uma célula.
50. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 42 a 49, caracterizado pelo RNA tendo DNA como alvo ser um RNA tendo DNA como alvo de duas moléculas e que compreende duas moléculas de RNA separadas, cada uma das quais compreende uma das duas extensões complementares de nucleotídeos que hibridizam com formar o duplex dsRNA.
51. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 42 a 50, caracterizado pelo DNA alvo ser DNA cromossômico.
52. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 42 a 51, caracterizado pelo DNA alvo estar presente em uma célula de um animal invertebrado, uma célula de um animal vertebrado, uma célula de um mamífero, uma célula de um roedor ou uma célula de um humano.
53. COMPOSIÇÃO, caracterizado por compreender: (a) um polipeptídeo Cas9, ou um polinucleotídeo que codifica o referido polipeptídeo Cas9, e (b) um RNA tendo DNA como alvo ou um ou mais polinucleotídeos de DNA que codificam o referido RNA tendo DNA como alvo, em que o RNA tendo DNA como alvo compreende: (i) um segmento de DNA alvo compreendendo uma sequência de nucleotídeos que possui 100% de complementaridade com uma longa sequência alvo de 18-25 nucleotídeos em um DNA alvo, e (ii) um segmento de ligação a proteína que interage com o referido polipeptídeo Cas9, em que o segmento de ligação a proteína compreende dois trechos complementares de nucleotídeos que hibridizam para formar um duplex de RNA de fita dupla (dsRNA); em que o DNA alvo está presente em um organismo eucariótico unicelular, uma célula animal ou uma célula vegetal.
54. UM OU MAIS ÁCIDOS NUCLEICOS, caracterizado por compreender: (a) uma primeira sequência de nucleotídeos que codifica um RNA tendo DNA como alvo, compreendendo: (i) um segmento de DNA alvo compreendendo uma sequência de nucleotídeos que possui 100% de complementaridade com uma longa sequência alvo de 18-25 nucleotídeos em um DNA alvo, e (ii) um segmento de ligação a proteína que interage com um polipeptídeo Cas9, em que o segmento de ligação a proteína compreende dois trechos complementares de nucleotídeos que hibridizam para formar um duplex de RNA de fita dupla (dsRNA); em que a primeira sequência nucleotídica que codifica o referido RNA tendo DNA como alvo está operacionalmente ligada a um promotor; e, opcionalmente, (b) uma segunda sequência nucleotídica que codifica um polipeptídeo Cas9, em que a sequência nucleotídica que codifica o referido polipeptídeo Cas9 está operacionalmente ligada a um promotor; em que o DNA alvo está presente em um organismo eucariótico unicelular, uma célula animal ou uma célula vegetal.
55. UM OU MAIS ÁCIDOS NUCLEICOS, de acordo com a reivindicação 54, caracterizado pelos referidos ácidos nucleicos serem um ou mais vetores de expressão recombinantes, opcionalmente, em que um ou mais vetores de expressão recombinantes são um ou mais vetores virais.
56. UM OU MAIS ÁCIDOS NUCLEICOS, de acordo com a reivindicação 54 ou reivindicação 55, caracterizado pela sequência nucleotídica que codifica o referido RNA tendo DNA como alvo estar operacionalmente ligada a um promotor que é funcional em uma célula eucariótica e/ou a sequência nucleotídica que codificam um polipeptídeo Cas9 é operacionalmente ligado a um promotor que é funcional em uma célula eucariótica.
57. KIT, caracterizado por compreender: (a) um polipeptídeo Cas9, ou um polinucleotídeo que codifica o referido polipeptídeo Cas9; e (b) um RNA tendo DNA como alvo ou um ou mais polinucleotídeos de DNA que codificam o referido RNA tendo DNA como alvo, em que o RNA tendo DNA como alvo compreende: (i) um segmento de DNA alvo compreendendo uma sequência de nucleotídeos que possui 100% de complementaridade com uma longa sequência alvo de 18-25 nucleotídeos em um DNA alvo, e (j) ) um segmento de ligação a proteína que interage com o referido polipeptídeo Cas9, em que o segmento de ligação a proteína compreende dois trechos complementares de nucleotídeos que hibridizam para formar um duplex de RNA de fita dupla (dsRNA), em que (a) e (b) estão no mesmo ou em recipientes separados, e em que o DNA alvo está presente em um organismo eucariótico unicelular, uma célula animal ou uma célula vegetal.
58. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 53, o um ou mais ácidos nucleicos, de acordo com qualquer uma das reivindicações 54-56, ou o kit da reivindicação 57, caracterizado pelo RNA tendo DNA como alvo compreende uma ou mais de uma nucleobase modificada, uma estrutura principal modificada ou ligação internucleosídica não natural, uma porção de açúcar modificada, um ácido nucleico bloqueado ou um ácido nucleico peptídico.
59. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 53, ou 58, o um ou mais ácidos nucleicos, de acordo com qualquer uma das reivindicações 54-56 e 58, ou o kit da reivindicação 57 ou 58, caracterizado pelo: (i) referido duplex dsRNA ter um comprimento de 8 pares de bases (pb) a 15 pb; (ii) referido duplex dsRNA ter um comprimento de 8 pares de bases (pb) a 30 pb; ou (iii) referido duplex dsRNA ter um comprimento de 15 pares de bases (bp) a 18 bp.
60. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 53 e 58-59, o um ou mais ácidos nucleicos de qualquer uma das reivindicações 54-56 e 58-59, ou o kit de qualquer uma das reivindicações 57-59, caracterizado por: (i) a complementaridade percentual entre os nucleotídeos que hibridizam para formar o duplex dsRNA do segmento de ligação à proteína ser superior a 70%; e/ou (ii) o DNA alvo ser DNA cromossômico.
61. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 53 e 58-60, o um ou mais ácidos nucleicos de qualquer uma das reivindicações 54-56 e 58-60, ou o kit de qualquer uma das reivindicações 57-60, caracterizado pela proteína do domínio de transdução estar covalentemente ligada ao terminal amino do polipeptídeo Cas9, em que o domínio de transdução da proteína facilita a travessia do polipeptídeo Cas9 do citosol para dentro de uma organela de uma célula.
62. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 53 e 58-60, o um ou mais ácidos nucleicos de qualquer uma das reivindicações 54-56 e 58-60, ou o kit de qualquer uma das reivindicações 57-60, caracterizado pela transdução da proteína do domínio estar covalentemente ligada ao terminal carboxil do polipeptídeo Cas9, em que o domínio de transdução de proteína facilita a passagem do polipeptídeo Cas9 do citosol para dentro de um organela de uma célula.
63. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 53 e 58-62, o um ou mais ácidos nucleicos de qualquer uma das reivindicações 54-57 e 58-62, ou o kit de qualquer uma das reivindicações 57-62, caracterizado pelo RNA tendo DNA como alvo ser um RNA tendo DNA como alvo de duas moléculas e compreender duas moléculas de RNA separadas, cada uma das quais compreende um dos dois trechos complementares de nucleotídeos que hibridizam para formar o duplex dsRNA.
64. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 53 e 58-63, o um ou mais ácidos nucleicos de qualquer uma das reivindicações 54-56 e 58-63, ou o kit de qualquer uma das reivindicações 57-63, caracterizado por ser para o uso em um método de tratamento terapêutico de um paciente.
65. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 53 e 59-63, o um ou mais ácidos nucleicos de qualquer uma das reivindicações 54-56 e 58-63, ou o kit de qualquer uma das reivindicações 57-63, caracterizado pelo DNA alvo estar presente em uma célula de um animal invertebrado, uma célula de um animal vertebrado, uma célula de um mamífero, uma célula de um roedor ou uma célula de um humano.
66. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-4, 14-20 e 42-52, caracterizado por 18-20 nucleotídeos ou 20-25 nucleotídeos da sequência nucleotídica que é complementar à sequência no DNA alvo hibridizem com o DNA alvo.
67. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-4, 14-20 e 42-52, caracterizado por mais de 18 nucleotídeos da sequência nucleotídica que é complementar à sequência no DNA alvo hibridizem com o DNA alvo.
68. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5-7, 14-20, 53 e 58-65, ou o RNA tendo como alvo DNA de uma molécula individual ou o polinucleotídeo de DNA que codifica o referido RNA tendo como alvo DNA de acordo com qualquer uma das reivindicações 8-9 e 14-20, ou um ou mais ácidos nucleicos de acordo com qualquer uma das reivindicações 10-11,15-20, 54-56 e 58-65, ou o kit de acordo com qualquer uma das reivindicações 12-13, 14-20, e 57-65, caracterizado pela sequência de nucleotídeos que é complementar à sequência no DNA alvo ter 18 a 20 nucleotídeos de comprimento ou 20 a 25 nucleotídeos de comprimento.
69. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5-7, 14-20, 53 e 58-65, ou o RNA tendo como alvo DNA de uma molécula individual ou um polinucleotídeo de DNA que codifica o referido RNA tendo como alvo DNA de acordo com qualquer uma das reivindicações 8- 9 e 14-20, ou um ou mais ácidos nucleicos de acordo com qualquer uma das reivindicações 10-11,15-20, 54-56 e 58-65, ou o kit de acordo com qualquer uma das reivindicações 12-13, 14-20, e 57-65, caracterizado pela sequência nucleotídica que é complementar à sequência no DNA alvo ter mais de 18 nucleotídeos de comprimento.
70. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-4 e 14-20, ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5-7 e 14-20, ou o RNA tendo como alvo DNA de uma molécula individual ou um polinucleotídeo de DNA que codifica o referido RNA tendo como alvo DNA de acordo com qualquer uma das reivindicações 8-9 e 14-20, ou um ou mais ácidos nucleicos de acordo com qualquer uma das reivindicações 10-11 e 15-20, ou o kit de qualquer uma das reivindicações 12-13 e 14-20, caracterizado pelos referidos nucleotídeos intermediários terem de 3 a 5 nucleotídeos.
71. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5-7, 14-20, 53 e 58-65, caracterizado pela referida composição compreender um inibidor de nuclease, um agente tamponante, um detergente, uma poliamina, um adjuvante, um agente umectante, um agente estabilizador, um antioxidante, um agente complexante ou qualquer combinação dos mesmos.
72. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5-7, 14-20, 53 e 58-65, ou o RNA tendo como alvo DNA de uma molécula individual ou um polinucleotídeo de DNA que codifica o referido RNA tendo como alvo DNA de acordo com qualquer uma das reivindicações 8-9 e 14-20, ou um ou mais ácidos nucleicos de qualquer uma das reivindicações 10-11,1520, 54-56 e 58-65, ou o kit de qualquer uma das reivindicações 12-13, 14-20 e 57-65, caracterizado pelo RNA de direcionamento de DNA junto com a proteína Cas9 proporciona a clivagem do DNA alvo.
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