TW202041533A - 用於鑑別表位(epitopes)及互補位(paratopes)之方法 - Google Patents

用於鑑別表位(epitopes)及互補位(paratopes)之方法 Download PDF

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Abstract

本發明揭示鑑別目標多肽上之表位的方法及鑑別抗體上之互補位的方法。

Description

用於鑑別表位(EPITOPES)及互補位(PARATOPES)之方法
抗體以高特異性及親和力結合目標抗原。以分子形式，藉由抗體(互補位)及抗原(表位)中之一組胺基酸促進結合，該組胺基酸有助於使結合發生之能量上有利的相互作用。測定控管抗體-抗原相互作用之結構特徵對於理解抗體之作用機制及作為輔助抗體工程工作之參考為重要的。X射線共結晶學為測定抗體-抗原複合物之結構的主要方法，其以高解析度詳述結構互補位及表位兩者。然而，實現高解析度共晶體結構具有相當大的資源、產出及特定的技術專項知識要求。表徵互補位及表位的其他方法提供更大的產出及實驗可接近性，但通常以解析度之取捨出現。藉由競爭結合之表位分組或藉由丙胺酸掃描之表位表徵與結晶學相比各自提供更高速度及產出，但無法提供如結晶學中表徵之分子細節或全面性。因此，此項技術中需要鑑別抗體與其所識別之抗原之間的表位及互補位區域之改良方法。
在一態樣中，本發明之特徵在於一種鑑別目標多肽(例如本文所描述之目標多肽)上之表位的方法，該方法包含： (a)將抗體分子(例如本文所描述之抗體分子)結合至該目標多肽之複數個變異體； (b)獲得(例如富集)複數個展現與該抗體分子之結合變更(例如減少)之變異體； (c)確定(例如計算)該複數個所獲得(例如富集)變異體中之每一者的富集分數； (d)產生抗體分子-目標多肽對接模型，其中該抗體分子-目標多肽對接模型根據該等富集分數受約束；及 (e)基於該抗體分子-目標多肽對接模型，鑑別該目標多肽上能夠由該抗體分子結合之位點； 藉此鑑別目標多肽上之表位。
在一實施例中，變更之結合包含變更之結合親和力，例如減少之結合親和力。
在一實施例中，步驟(a)包含將該抗體分子結合至呈現該目標多肽之複數個變異體之庫。在一實施例中，步驟(a)包含將該抗體分子結合至包含複數個表現(例如呈現)該目標多肽之複數個變異體之細胞的庫。在一實施例中，該複數個細胞中之每一者表現該目標多肽之約一種相異變異體。在一實施例中，該細胞為真核細胞，例如酵母細胞。
在一實施例中，該複數個變異體包含該目標多肽之一或多個表面殘基上之突變。在一實施例中，該複數個變異體包含該目標多肽之所選表面殘基之相異突變。在一實施例中，該複數個變異體包含該目標多肽之複數個所選表面殘基中之每一者的相異突變。
在一實施例中，相對於該目標多肽之野生型胺基酸序列，該複數個變異體包含單胺基酸取代。在一實施例中，相對於該目標多肽之野生型胺基酸序列，該複數個變異體中之每一者包含單胺基酸取代。在一實施例中，該單胺基酸取代發生在該目標多肽之表面殘基處。
在一實施例中，該變更(例如減少)之結合包含相對於針對野生型目標多肽及該抗體偵測之該結合，針對該變異體及該抗體分子偵測之結合的變更(例如減少)。
在一實施例中，步驟(b)包含獲得(例如富集)展現由野生型目標多肽所展現之與該抗體分子的結合的小於約80% (例如小於約0.01%、0.1%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%或80%)的變異體。在一實施例中，該結合減少係由野生型目標多肽展現之結合的至少約20% (例如至少約20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%)。
在一實施例中，步驟(b)包含獲得(例如富集)展現由包含野生型目標多肽之細胞展現的與該抗體分子之結合的小於約80% (例如小於約0.01%、0.1%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%或80%)的細胞。在一實施例中，該結合減少係由包含野生型目標多肽之細胞展現的該結合的至少約20% (例如至少約20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%)。
在一實施例中，步驟(b)包含對展現與該抗體分子結合減少之變異體進行一或多個，例如兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或超過十個的富集。
在一實施例中，該方法進一步包含例如在步驟(c)之前，例如藉由例如次世代定序法來定序編碼該等變異體之基因來鑑別展現與該抗體分子結合減少的該等變異體。
在一實施例中，步驟(c)包含測定該複數個所獲得(例如富集)之變體中之每一者的出現頻率。在一實施例中，步驟(c)進一步包含將在特定殘基處包含相異突變之各變異體之出現頻率聚集及/或獲得出現頻率更高之變異體的權重(例如使其權重更大)。
在一實施例中，該富集分數對該目標多肽之該胺基酸序列之單殘基具有特異性。在一實施例中，各富集分數對該目標多肽之該胺基酸序列之不同單殘基具有特異性。
在一實施例中，該方法進一步包含用該目標多肽之該複數個該等變異體之複製來重複步驟(a)-(c)至少一次(例如一次、兩次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次、十次或更多次)，且其中步驟(c)進一步包含省略一或多種雜亂突變，例如其中超過50%之複製具有大於30%之富集分數及其中超過75%之複製具有大於15%之富集分數的突變。
在一實施例中，藉由添加一或多種有吸引力之約束而約束該抗體分子-目標多肽對接模型，其中該有吸引力之約束用於具有大於第一預選值之富集分數的殘基。在一實施例中，該第一預選值在20%與40%之間，例如在25%與35%之間，例如約25%、約30%或約35%。在一實施例中，該有吸引力之約束包含基於該富集分數之線性調整紅利(linearly scaled bonus)。
在一實施例中，藉由對具有小於第二預選值之富集分數的殘基添加排斥約束來約束該抗體分子-目標多肽對接模型。在一實施例中，該第二預選值在5%與20%之間，例如在10%與15%之間，例如約10%、約12.5%或約15%。
在一實施例中，步驟(d)包含在該抗體分子之模型與該目標多肽之模型之間產生對接姿態。在一實施例中，步驟(d)包含在該抗體分子之模型與該目標多肽之模型之間產生複數個對接姿態。
在一實施例中，步驟(d)進一步包含根據例如SnugDock之對接演算法對該複數個對接姿態評分。在一實施例中，步驟(d)進一步包含選擇該複數個對接姿態之具有最高分數的子集，例如最高分數1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、300、400、500、600、700、800、900、1000或更高的對接姿態。在一實施例中，步驟(d)進一步包含使用該複數個對接姿態之該所選子集產生整體對接姿態，及根據該整體對接姿態設定該抗體分子之該模型及該目標多肽之該模型。
在一實施例中，該抗體分子之該模型包含衍生自該抗體之複數個同源性模型的整體抗體同源性模型。
在一實施例中，步驟(d)進一步包含移除抗體分子-目標多肽對接模型，其例如根據衍生自抗體-抗原晶體結構之結構過濾器而展現針對已知抗體-抗原複合物之非典型性接合模式。
在一實施例中，步驟(d)包含產生複數個抗體分子-目標多肽模型。
在一實施例中，步驟(e)包含鑑別該目標多肽上複數個能夠與該抗體分子結合之位點。
在一實施例中，該位點包含或由該目標多肽上之一或多個非連續區域組成。在一實施例中，該位點包含或由該目標多肽上之連續區域組成。
在另一態樣中，本發明之特徵在於一種鑑別目標多肽(例如本文所描述之目標多肽)上之表位的方法，該方法包含： (a)產生抗體-目標多肽對接模型，其中根據藉由包含以下之方法確定之複數個富集分數來約束該抗體-目標多肽對接模型： (i)將抗體分子(例如本文所描述之抗體分子)結合至該目標多肽之複數個變異體， (ii)獲得(例如富集)複數個展現與該抗體分子之結合變更(例如減少)之變異體，及 (iii)確定(例如計算)該複數個經富集變異體中之每一者的富集分數；及 (b)基於該抗體-目標多肽對接模型，鑑別該目標多肽上能夠由該抗體分子結合之位點； 藉此鑑別目標多肽上之表位。
在一實施例中，變更之結合包含變更之結合親和力，例如減少之結合親和力。
在一實施例中，步驟(a)(i)包含將該抗體分子結合至呈現該目標多肽之複數個變異體之庫。在一實施例中，步驟(a)(i)包含將該抗體分子結合至包含複數個表現(例如呈現)該目標多肽之複數個變異體之細胞的庫。在一實施例中，該複數個細胞中之每一者表現該目標多肽之約一種相異變異體。在一實施例中，該細胞為真核細胞，例如酵母細胞。
在一實施例中，該複數個變異體包含該目標多肽之一或多個表面殘基上之突變。在一實施例中，該複數個變異體包含該目標多肽之所選表面殘基之相異突變。在一實施例中，該複數個變異體包含該目標多肽之複數個所選表面殘基中之每一者的相異突變。
在一實施例中，相對於該目標多肽之野生型胺基酸序列，該複數個變異體包含單胺基酸取代。在一實施例中，相對於該目標多肽之野生型胺基酸序列，該複數個變異體中之每一者包含單胺基酸取代。在一實施例中，該單胺基酸取代發生在該目標多肽之表面殘基處。
在一實施例中，該變更(例如減少)之結合包含相對於針對野生型目標多肽及該抗體偵測之該結合，針對該變異體及該抗體分子偵測之結合的變更(例如減少)。
在一實施例中，步驟(a)(ii)包含獲得(例如富集)展現由野生型目標多肽所展現之與該抗體分子的結合的小於約80% (例如小於約0.01%、0.1%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%或80%)的變異體。在一實施例中，該結合減少係由野生型目標多肽展現之結合的至少約20% (例如至少約20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%)。
在一實施例中，步驟(a)(ii)包含獲得(例如富集)展現由包含野生型目標多肽之細胞展現的與該抗體分子之結合的小於約80% (例如小於約0.01%、0.1%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%或80%)的細胞。在一實施例中，該結合減少係由包含野生型目標多肽之細胞展現的該結合的至少約20% (例如至少約20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%)。
在一實施例中，步驟(a)(ii)包含對展現與該抗體分子結合減少之變異體進行一或多個，例如兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或超過十個的富集。
在一實施例中，該方法進一步包含例如在步驟(a)(iii)之前，例如藉由例如次世代定序法來定序編碼該等變異體之基因來鑑別展現與該抗體分子結合減少的該等變異體。
在一實施例中，步驟(a)(iii)包含測定該複數個所獲得(例如富集)之變體中之每一者的出現頻率。在一實施例中，步驟(a)(iii)進一步包含將在特定殘基處包含相異突變之各變異體之出現頻率聚集及/或獲得出現頻率更高之變異體的權重(例如使其權重更大)。
在一實施例中，該富集分數對該目標多肽之該胺基酸序列之單殘基具有特異性。在一實施例中，各富集分數對該目標多肽之該胺基酸序列之不同單殘基具有特異性。
在一實施例中，該方法進一步包含用該目標多肽之該複數個該等變異體之複製來重複步驟(a)(i)-(a)(iii)至少一次(例如一次、兩次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次、十次或更多次)，且其中步驟(a)(iii)進一步包含省略一或多種雜亂突變，例如其中超過50%之複製具有大於30%之富集分數及其中超過75%之複製具有大於15%之富集分數的突變。
在一實施例中，藉由添加一或多種有吸引力之約束而約束該抗體分子-目標多肽對接模型，其中該有吸引力之約束用於具有大於第一預選值之富集分數的殘基。在一實施例中，該第一預選值在20%與40%之間，例如在25%與35%之間，例如約25%、約30%或約35%。在一實施例中，該有吸引力之約束包含基於該富集分數之線性調整紅利。
在一實施例中，藉由對具有小於第二預選值之富集分數的殘基添加排斥約束來約束該抗體分子-目標多肽對接模型。在一實施例中，該第二預選值在5%與20%之間，例如在10%與15%之間，例如約10%、約12.5%或約15%。
在一實施例中，步驟(a)包含在該抗體分子之模型與該目標多肽之模型之間產生對接姿態。在一實施例中，步驟(a)包含在該抗體分子之模型與該目標多肽之模型之間產生複數個對接姿態。
在一實施例中，步驟(a)進一步包含根據例如SnugDock之對接演算法對該複數個對接姿態評分。在一實施例中，步驟(a)進一步包含選擇該複數個對接姿態之具有最高分數的子集，例如最高分數1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、300、400、500、600、700、800、900、1000或更高的對接姿態。在一實施例中，步驟(a)進一步包含使用該複數個對接姿態之該所選子集產生整體對接姿態，及根據該整體對接姿態設定該抗體分子之該模型及該目標多肽之該模型。
在一實施例中，該抗體分子之該模型包含衍生自該抗體之複數個同源性模型的整體抗體同源性模型。
在一實施例中，步驟(a)進一步包含移除抗體分子-目標多肽對接模型，其例如根據衍生自抗體-抗原晶體結構之結構過濾器而展現針對已知抗體-抗原複合物之非典型性接合模式。
在一實施例中，步驟(a)包含產生複數個抗體分子-目標多肽模型。
在一實施例中，步驟(b)包含鑑別該目標多肽上複數個能夠與該抗體分子結合之位點。
在一實施例中，該位點包含或由該目標多肽上之一或多個非連續區域組成。在一實施例中，該位點包含或由該目標多肽上之連續區域組成。
在又一態樣中，本發明之特徵在於一種鑑別抗體分子上之互補位的方法，該方法包含： (a)將該抗體分子結合至目標多肽之複數個變異體； (b)獲得(例如富集)複數個展現與該抗體分子之結合減少之變異體； (c)確定(例如計算)該複數個經富集變異體中之每一者的富集分數； (d)產生抗體分子-目標多肽對接模型，其中該抗體-目標多肽對接模型根據該等富集分數受約束；及 (e)基於該抗體-目標多肽對接模型，鑑別該抗體分子上能夠由該目標多肽結合之一或多個位點； 藉此鑑別抗體分子上之互補位。
在一實施例中，變更之結合包含變更之結合親和力，例如減少之結合親和力。
在一實施例中，步驟(a)包含將該抗體分子結合至呈現該目標多肽之複數個變異體之庫。在一實施例中，步驟(a)包含將該抗體分子結合至包含複數個表現(例如呈現)該目標多肽之複數個變異體之細胞的庫。在一實施例中，該複數個細胞中之每一者表現該目標多肽之約一種相異變異體。在一實施例中，該細胞為真核細胞，例如酵母細胞。
在一實施例中，該複數個變異體包含該目標多肽之一或多個表面殘基上之突變。在一實施例中，該複數個變異體包含該目標多肽之所選表面殘基之相異突變。在一實施例中，該複數個變異體包含該目標多肽之複數個所選表面殘基中之每一者的相異突變。
在一實施例中，相對於該目標多肽之野生型胺基酸序列，該複數個變異體包含單胺基酸取代。在一實施例中，相對於該目標多肽之野生型胺基酸序列，該複數個變異體中之每一者包含單胺基酸取代。在一實施例中，該單胺基酸取代發生在該目標多肽之表面殘基處。
在一實施例中，該變更(例如減少)之結合包含相對於針對野生型目標多肽及該抗體偵測之該結合，針對該變異體及該抗體分子偵測之結合的變更(例如減少)。
在一實施例中，步驟(b)包含獲得(例如富集)展現由野生型目標多肽所展現之與該抗體分子的結合的小於約80% (例如小於約0.01%、0.1%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%或80%)的變異體。在一實施例中，該結合減少係由野生型目標多肽展現之結合的至少約20% (例如至少約20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%)。
在一實施例中，步驟(b)包含獲得(例如富集)展現由包含野生型目標多肽之細胞展現的與該抗體分子之結合的小於約80% (例如小於約0.01%、0.1%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%或80%)的細胞。在一實施例中，該結合減少係由包含野生型目標多肽之細胞展現的該結合的至少約20% (例如至少約20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%)。
在一實施例中，步驟(b)包含對展現與該抗體分子結合減少之變異體進行一或多個，例如兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或超過十個的富集。
在一實施例中，該方法進一步包含例如在步驟(c)之前，例如藉由例如次世代定序法來定序編碼該等變異體之基因來鑑別展現與該抗體分子結合減少的該等變異體。
在一實施例中，步驟(c)包含測定該複數個所獲得(例如富集)之變體中之每一者的出現頻率。在一實施例中，步驟(c)進一步包含將在特定殘基處包含相異突變之各變異體之出現頻率聚集及/或獲得出現頻率更高之變異體的權重(例如使其權重更大)。
在一實施例中，該富集分數對該目標多肽之該胺基酸序列之單殘基具有特異性。在一實施例中，各富集分數對該目標多肽之該胺基酸序列之不同單殘基具有特異性。
在一實施例中，該方法進一步包含用該目標多肽之該複數個該等變異體之複製來重複步驟(a)-(c)至少一次(例如一次、兩次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次、十次或更多次)，且其中步驟(c)進一步包含省略一或多種雜亂突變，例如其中超過50%之複製具有大於30%之富集分數及其中超過75%之複製具有大於15%之富集分數的突變。
在一實施例中，藉由添加一或多種有吸引力之約束而約束該抗體分子-目標多肽對接模型，其中該有吸引力之約束用於具有大於第一預選值之富集分數的殘基。在一實施例中，該第一預選值在20%與40%之間，例如在25%與35%之間，例如約25%、約30%或約35%。在一實施例中，該有吸引力之約束包含基於該富集分數之線性調整紅利。
在一實施例中，藉由對具有小於第二預選值之富集分數的殘基添加排斥約束來約束該抗體分子-目標多肽對接模型。在一實施例中，該第二預選值在5%與20%之間，例如在10%與15%之間，例如約10%、約12.5%或約15%。
在一實施例中，步驟(d)包含在該抗體分子之模型與該目標多肽之模型之間產生對接姿態。在一實施例中，步驟(d)包含在該抗體分子之模型與該目標多肽之模型之間產生複數個對接姿態。
在一實施例中，步驟(d)進一步包含根據例如SnugDock之對接演算法對該複數個對接姿態評分。在一實施例中，步驟(d)進一步包含選擇該複數個對接姿態之具有最高分數的子集，例如最高分數1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、300、400、500、600、700、800、900、1000或更高的對接姿態。在一實施例中，步驟(d)進一步包含使用該複數個對接姿態之該所選子集產生整體對接姿態，及根據該整體對接姿態設定該抗體分子之該模型及該目標多肽之該模型。
在一實施例中，該抗體分子之該模型包含衍生自該抗體之複數個同源性模型的整體抗體同源性模型。
在一實施例中，步驟(d)進一步包含移除抗體分子-目標多肽對接模型，其例如根據衍生自抗體-抗原晶體結構之結構過濾器而展現針對已知抗體-抗原複合物之非典型性接合模式。
在一實施例中，步驟(d)包含產生複數個抗體分子-目標多肽模型。
在一實施例中，步驟(e)包含鑑別該抗體分子上複數個能夠與該目標多肽結合之位點。
在一實施例中，該位點包含或由該抗體分子上之一或多個非連續區域組成。在一實施例中，該位點包含或由該抗體分子上之連續區域組成。
在再一態樣中，本發明之特徵在於一種鑑別抗體上之互補位的方法，該方法包含： (a)產生抗體-目標多肽對接模型，其中根據藉由包含以下之方法確定(例如計算)之複數個富集分數來約束該抗體-目標多肽對接模型： (i)將該抗體結合至該目標多肽之複數個變異體， (ii)獲得(例如富集)展現與該抗體分子之結合減少之變異體，及 (iii)確定(例如計算)該複數個所獲得(例如富集)變異體中之每一者的富集分數；及 (b)基於該抗體-目標多肽對接模型，鑑別該抗體分子上能夠由該目標多肽結合之一或多個位點； 藉此鑑別目標多肽上之互補位。
在一實施例中，變更之結合包含變更之結合親和力，例如減少之結合親和力。
在一實施例中，步驟(a)(i)包含將該抗體分子結合至呈現該目標多肽之複數個變異體之庫。在一實施例中，步驟(a)(i)包含將該抗體分子結合至包含複數個表現(例如呈現)該目標多肽之複數個變異體之細胞的庫。在一實施例中，該複數個細胞中之每一者表現該目標多肽之約一種相異變異體。在一實施例中，該細胞為真核細胞，例如酵母細胞。
在一實施例中，該複數個變異體包含該目標多肽之一或多個表面殘基上之突變。在一實施例中，該複數個變異體包含該目標多肽之所選表面殘基之相異突變。在一實施例中，該複數個變異體包含該目標多肽之複數個所選表面殘基中之每一者的相異突變。
在一實施例中，相對於該目標多肽之野生型胺基酸序列，該複數個變異體包含單胺基酸取代。在一實施例中，相對於該目標多肽之野生型胺基酸序列，該複數個變異體中之每一者包含單胺基酸取代。在一實施例中，該單胺基酸取代發生在該目標多肽之表面殘基處。
在一實施例中，該變更(例如減少)之結合包含相對於針對野生型目標多肽及該抗體偵測之該結合，針對該變異體及該抗體分子偵測之結合的變更(例如減少)。
在一實施例中，步驟(a)(ii)包含獲得(例如富集)展現由野生型目標多肽所展現之與該抗體分子的結合的小於約80% (例如小於約0.01%、0.1%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%或80%)的變異體。在一實施例中，該結合減少係由野生型目標多肽展現之結合的至少約20% (例如至少約20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%)。
在一實施例中，步驟(a)(ii)包含獲得(例如富集)展現由包含野生型目標多肽之細胞展現的與該抗體分子之結合的小於約80% (例如小於約0.01%、0.1%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%或80%)的細胞。在一實施例中，該結合減少係由包含野生型目標多肽之細胞展現的該結合的至少約20% (例如至少約20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%)。
在一實施例中，步驟(a)(ii)包含對展現與該抗體分子結合減少之變異體進行一或多個，例如兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或超過十個的富集。
在一實施例中，該方法進一步包含例如在步驟(a)(iii)之前，例如藉由例如次世代定序法來定序編碼該等變異體之基因來鑑別展現與該抗體分子結合減少的該等變異體。
在一實施例中，步驟(a)(iii)包含測定該複數個所獲得(例如富集)之變體中之每一者的出現頻率。在一實施例中，步驟(a)(iii)進一步包含將在特定殘基處包含相異突變之各變異體之出現頻率聚集及/或獲得出現頻率更高之變異體的權重(例如使其權重更大)。
在一實施例中，該富集分數對該目標多肽之該胺基酸序列之單殘基具有特異性。在一實施例中，各富集分數對該目標多肽之該胺基酸序列之不同單殘基具有特異性。
在一實施例中，該方法進一步包含用該目標多肽之該複數個該等變異體之複製來重複步驟(a)(i)-(a)(iii)至少一次(例如一次、兩次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次、十次或更多次)，且其中步驟(a)(iii)進一步包含省略一或多種雜亂突變，例如其中超過50%之複製具有大於30%之富集分數及其中超過75%之複製具有大於15%之富集分數的突變。
在一實施例中，藉由添加一或多種有吸引力之約束而約束該抗體分子-目標多肽對接模型，其中該有吸引力之約束用於具有大於第一預選值之富集分數的殘基。在一實施例中，該第一預選值在20%與40%之間，例如在25%與35%之間，例如約25%、約30%或約35%。在一實施例中，該有吸引力之約束包含基於該富集分數之線性調整紅利。
在一實施例中，藉由對具有小於第二預選值之富集分數的殘基添加排斥約束來約束該抗體分子-目標多肽對接模型。在一實施例中，該第二預選值在5%與20%之間，例如在10%與15%之間，例如約10%、約12.5%或約15%。
在一實施例中，步驟(a)包含在該抗體分子之模型與該目標多肽之模型之間產生對接姿態。在一實施例中，步驟(a)包含在該抗體分子之模型與該目標多肽之模型之間產生複數個對接姿態。
在一實施例中，步驟(a)進一步包含根據例如SnugDock之對接演算法對該複數個對接姿態評分。在一實施例中，步驟(a)進一步包含選擇該複數個對接姿態之具有最高分數的子集，例如最高分數1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、300、400、500、600、700、800、900、1000或更高的對接姿態。在一實施例中，步驟(a)進一步包含使用該複數個對接姿態之該所選子集產生整體對接姿態，及根據該整體對接姿態設定該抗體分子之該模型及該目標多肽之該模型。
在一實施例中，該抗體分子之該模型包含衍生自該抗體之複數個同源性模型的整體抗體同源性模型。
在一實施例中，步驟(a)進一步包含移除抗體分子-目標多肽對接模型，其例如根據衍生自抗體-抗原晶體結構之結構過濾器而展現針對已知抗體-抗原複合物之非典型性接合模式。
在一實施例中，步驟(a)包含產生複數個抗體分子-目標多肽模型。
在一實施例中，步驟(b)包含鑑別該目標多肽上複數個能夠與該抗體分子結合之位點。
在一實施例中，該位點包含或由該目標多肽上之一或多個非連續區域組成。在一實施例中，該位點包含或由該目標多肽上之連續區域組成。
在一態樣中，本發明之特徵在於一種抗體分子，其中根據如前述請求項中任一項之方法鑑別針對該抗體分子之目標多肽上之該表位或該目標多肽之該抗體分子上之該互補位。
在一態樣中，本發明之特徵在於一種核酸分子，其編碼本文所描述之該抗體分子或本文所描述之該抗體分子之一或多個鏈(例如VH及/或VL)。在另一態樣中，本發明之特徵在於一種載體，其包含本文所描述之核酸分子。在另一態樣中，本發明之特徵在於一種宿主細胞，其包含本文所描述之核酸分子或本文所描述之載體。在一態樣中，本發明之特徵在於一種製備抗體分子之方法，其包含在適合於表現該抗體分子之條件下培養本文所描述之宿主細胞。
相關申請案的交叉引用  本申請案主張2018年12月24日申請之美國臨時申請案第62/784,617號之權益。前述申請案之內容以全文引用之方式併入本文中。
定義  如本文所用，術語「抗體分子」係指包含來自免疫球蛋白重鏈可變區之足夠序列及/或來自免疫球蛋白輕鏈可變區之足夠序列以提供抗原特異性結合的多肽。其包含全長抗體以及支持抗原結合之其片段，例如Fab片段。通常，抗體分子將包含重鏈CDR1、CDR2及CDR3及輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列。抗體分子包括人類、人類化、經CDR移植之抗體及其抗原結合片段。在一實施例中，抗體分子包含包含至少一個免疫球蛋白可變區片段之蛋白質，例如提供免疫球蛋白可變域或免疫球蛋白可變域序列之胺基酸序列。
抗體分子之VH或VL鏈可進一步包括重鏈或輕鏈恆定區之全部或一部分，藉此分別形成重鏈或輕鏈免疫球蛋白鏈。在一個實施例中，抗體分子為兩個重免疫球蛋白鏈及兩個輕免疫球蛋白鏈之四聚體。
抗體分子可包含重鏈(或輕鏈)免疫球蛋白可變區區段中之一者或兩者。如本文所用，術語「重鏈(或輕鏈)免疫球蛋白可變區片段」係指能夠結合抗原之完整重鏈(或輕鏈)免疫球蛋白可變區或其片段。分別與輕鏈或重鏈配對之區段一起量測重鏈或輕鏈區段結合抗原之能力。在一些實施例中，小於全長可變區之重鏈或輕鏈區段在與適當鏈配對時將以在全長鏈分別與輕鏈或重鏈配對時所見之親和力之至少20、30、40、50、60、70、80、90或95%結合。
免疫球蛋白可變區區段可不同於參考或共通序列。如本文所用，「不同」意謂參考序列或共通序列中之殘基經不同殘基或不存在的或插入的殘基置換。
抗體分子可包含重(H)鏈可變區(本文中縮寫為VH)及輕(L)鏈可變區(本文中縮寫為VL)。在另一實例中，抗體包含兩個重(H)鏈可變區及兩個輕(L)鏈可變區或其抗體結合片段。免疫球蛋白之輕鏈可為κ或λ型。在一個實施例中，抗體分子經糖基化。抗體分子可對抗體依賴性細胞毒性及/或補體介導之細胞毒性具有功能性，或可對於此等活性中之一者或兩者具有非功能性。抗體分子可為完整抗體或其抗原結合片段。
抗體分子包括全長抗體之「抗原結合片段」，例如保留特異性結合於相關HA目標之能力的全長抗體之一或多個片段。全長抗體之術語「抗原結合片段」內涵蓋的結合片段之實例包括(i)Fab片段，由VL結構域、VH結構域、CL結構域及CH1結構域組成之單價片段；(ii)F(ab')或F(ab')2 片段，其為包括兩個在鉸鏈區處藉由二硫橋鍵連接之Fab片段的二價片段；(iii)Fd片段，其由VH及CH1結構域組成；(iv)Fv片段，其由抗體之單臂的VL結構域及VH結構域組成，(v)dAb片段(Ward等人, (1989) Nature 341:544-546)，其由VH域組成；及(vi)保持功能性之獨立互補決定區(CDR)。此外，儘管Fv片段之兩個結構域VL及VH係由獨立基因編碼，但其可以使用重組方法，藉由使其能夠以單一蛋白質鏈形式製造之合成連接子接合，其中VL與VH區域配對形成單價分子(稱為單鏈Fv(scFv))。參見例如Bird等人(1988) Science 242:423-426；及Huston等人(1988) Proc.  Natl. Acad. Sci.  USA 85:5879-5883。抗體分子包括雙功能抗體。
如本文所用，「抗體」係指多肽，例如四聚或單鏈多肽，其包含免疫球蛋白之結構及功能特徵，尤其抗原結合特徵。通常，人類抗體包含兩個相同輕鏈及兩個相同重鏈。各鏈包含可變區。
可變重鏈(VH)及可變輕鏈(VL)區可進一步再分成高變區，稱為「互補決定區」(「CDR」)，其中穿插有較保守區，稱為「構架區」(FR)。人類抗體具有三個VH CDR及三個VL CDR，其藉由構架區FR1-FR4分離。已精確定義FR及CDR之程度(參見Kabat, E.A.等人(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242；及Chothia, C.等人(1987) J. Mol. Biol. 196:901-917)。本文中使用Kabat定義。各VH及VL典型地由自胺基端至羧基端按以下順序配置之三個CDR及四個FR組成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。
重鏈及輕鏈免疫球蛋白鏈可藉由二硫鍵連接。重鏈恆定區通常包含三個恆定域，即CH1、CH2及CH3。輕鏈恆定區通常包含CL結構域。重鏈及輕鏈之可變區含有與抗原相互作用之結合域。抗體之恆定區通常介導抗體與宿主組織或因子之結合，其包括各種免疫系統之細胞(例如效應細胞)及經典補體系統之第一組分(Clq)。
術語「免疫球蛋白」包含各種廣泛類別之多肽，其可以生物化學方式區分。熟習此項技術者應瞭解，重鏈歸類為γ、μ、α、δ或ε (γ、μ、α、δ、ε)，其中一些亞類在其中(例如γ1- γ4)。此鏈之性質將抗體之「類別」分別確定為IgG、IgM、IgA IgD或IgE。免疫球蛋白子類(同型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1等充分表徵且已知賦予功能專門化。鑒於本發明，此等類別及同型中之每一者之經修改版本為熟習此項技術者可容易地辨別，且因此處於本發明之範疇內。所有免疫球蛋白類別清楚地在本發明之範疇內。將輕鏈歸類為κ或λ(κ、λ)。各重鏈類別可與κ或λ輕鏈結合。
適合抗體包括但不限於單株、單特異性、多株、多特異性、人類抗體、靈長類化抗體、嵌合抗體、雙特異性抗體、人類化抗體、共軛抗體(亦即與其他蛋白質共軛或稠合之抗體、放射性標記、細胞毒素)、小模塊免疫藥物(「SMIPTM 」)、單鏈抗體、駱駝抗體及抗體片段。
在一實施例中，抗體為人類化抗體。人類化抗體係指包含人類構架區及一或多個來自非人類(例如小鼠或大鼠)免疫球蛋白之CDR的免疫球蛋白。提供CDR之免疫球蛋白通常稱為「供體」且提供構架之人類免疫球蛋白通常稱為「受體」，儘管在一實施例中不暗示來源或製程限制。通常，人類化抗體包含人類化輕鏈及人類化重鏈免疫球蛋白。
「免疫球蛋白結構域」係指來自免疫球蛋白分子之可變域或恆定域之結構域。免疫球蛋白結構域通常含有兩個由約七個β股形成之β片，及保守二硫鍵(參見例如A. F. Williams及A. N. Barclay (1988) Ann. Rev. Immunol. 6:381-405)。
如本文中所使用，「免疫球蛋白可變域序列」係指可形成免疫球蛋白可變域之結構之胺基酸序列。舉例而言，序列可以包括天然存在之可變域之胺基酸序列的全部或一部分。舉例而言，序列可省略一個、兩個或更多個N端或C端胺基酸、內部胺基酸，可包括一或多個插入或額外末端胺基酸，或可包括其他更改。在一個實施例中，包含免疫球蛋白可變域序列之多肽可與另一免疫球蛋白可變域序列締合以形成目標結合結構(或「抗原結合位點」)，例如與目標抗原相互作用之結構。
如本文所用，術語抗體包含完整單株抗體、多株抗體、單結構域抗體(例如鯊魚單結構域抗體(例如IgNAR或其片段))、由至少兩個完整抗體形成之多特異性抗體(例如雙特異性抗體)及抗體片段，只要其展現所要生物活性即可。供用於本文中之抗體可為任何類型(例如IgA、IgD、IgE、IgG、IgM)。
抗體或抗體分子可衍生自哺乳動物，例如嚙齒動物，例如小鼠或大鼠、馬、豬或山羊。在一實施例中，使用重組細胞產生抗體或抗體分子。在一實施例中，抗體或抗體分子為嵌合抗體，例如來自小鼠、大鼠、馬、豬或其他物種、攜帶人類恆定及/或可變區結構域之嵌合抗體。
如本文所用，術語「變異體」係指包含胺基酸序列之多肽，該胺基酸序列相對於目標多肽之野生型形式的胺基酸序列包含一或多個突變(例如胺基酸取代、缺失、插入或此項技術中已知之任何其他突變)。在一些情況下，相對於目標多肽之野生型形式之胺基酸序列，變異體包括約一個胺基酸取代，例如對表面殘基進行取代。如本文所使用，「野生型」意指包含參考胺基酸序列之目標多肽之形式。在一些情況下，野生型目標多肽包含天然存在之胺基酸序列(例如來自活有機體之內源序列)。在其他情況下，野生型目標多肽包含任何參考胺基酸序列(例如共同胺基酸序列，例如自目標多肽之複數個天然產生之版本編譯)。
如本文所用，術語「目標多肽」係指抗體分子所合乎需要地結合之任何多肽。目標多肽可在其表面上包括一或多個由抗體分子接觸之表位區域。本文所描述之方法可用於鑑別此類表位區域。目標多肽可結合於抗體分子上之一或多個互補位區域，其同樣可根據本文中之方法鑑別。在一些情況下，術語「多肽」及「抗原」可互換使用。
如本文所使用，術語「表位」係指與另一多肽(例如抗體分子)接觸之目標多肽(例如如本文所描述)之一部分，例如抗體分子之一或多個CDR及/或抗體分子之一或多個構架殘基。在一些情況下，表位包含目標多肽之一或多個表面殘基。蛋白質或多肽之「表面殘基」一般為位於蛋白質或多肽之外表面上的胺基酸殘基，例如使得胺基酸(例如側鏈)之至少一部分可接入蛋白質或多肽外部之另一分子。表位殘基可為連續的或可不為連續的。在一些情況下，表位包含複數個與抗體分子接觸之區域或小塊(patch)。在某些情況下，區域或小塊中之兩者或更多不連續或不為緊密物理接近，例如構形表位。
如本文所用，術語「互補位」係指與目標多肽(例如如本文所描述)或其變異體接觸的抗體分子之一部分。互補位可包含抗體分子之一或多個CDR及/或抗體分子之一或多個構架殘基。在一些情況下，互補位包含抗體分子之一或多個表面殘基。互補位殘基可為連續的或可不為連續的。在一些情況下，互補位包含複數個與目標多肽接觸之區域或小塊。在某些情況下，區域或小塊中之兩者或更多不連續或不為緊密物理接近。
如本文所用，術語「模型」一般係指一或多個分子(例如目標多肽及/或抗體分子)之結構，例如三維模型，例如模擬及/或計算結構。在一些情況下，術語「模型化」係用以指產生模型之程序。可例如藉由X射線結晶學或藉由例如本文所描述之計算方法產生模型。可藉由聚集來自一或多個其他模型之資訊而產生模型。在一些情況下，模型包含複數個其他模型。在一些情況下，使用複數個其他模型產生模型。實體之「模型」係指表示實體之結構的模型。如本文所用，術語「對接模型」通常係指用於抗體分子與目標多肽或其變異體之間的相互作用之模型(例如三維模型)。在一些情況下，對接模型包含抗體分子之模型及目標多肽之模型或其變異體。在一些情況下，對接模型展示抗體分子與目標多肽或其變異體之間的接觸點。
如本文所用之術語「純化」及「分離」在自天然來源獲得之抗體分子(例如抗體、免疫原或一般多肽)之情形下係指基本上不含來自天然來源之污染物質(例如來自天然來源之細胞材料，例如細胞碎片、膜、細胞器、大多數核酸或存在於細胞中之蛋白質)的分子。因此，經分離之多肽(例如抗體分子)包括具有小於約30%、20%、10%、5%、2%或1% (以乾重計)之細胞材料及/或污染材料的多肽製劑。術語「純化」及「分離」當用於化學合成物種(例如抗體分子或免疫原)之上下文中時係指基本上不含涉及分子合成之化學前驅體或其他化學物質的物種。
可如下進行兩種序列之間的「同源性」或「序列一致性」或「一致性」計算(該等術語在本文中可互換使用)。出於最佳比較目的將序列對準(例如，可在第一及第二胺基酸或核酸序列中之一者或兩者中引入間隙以用於最優對準，且可出於比較目的忽略非同源序列)。使用GCG套裝軟體中之GAP程式，使用Blossum 62得分矩陣，使用間隙罰分12、間隙擴展罰分4及讀框轉移間隙罰分5之GCG套裝軟體中之GAP程式將最佳比對確定為最佳評分。接著比較相對應胺基酸位置或核苷酸位置處之胺基酸殘基或核苷酸。當第一序列中之位置由與第二序列中對應位置相同之胺基酸殘基或核苷酸佔據時，則分子在此位置上一致(如本文中所用，胺基酸或核酸「一致性」等效於胺基酸或核酸「同源性」)。兩個序列之間的一致性百分比為該等序列共有的一致位置數目之函數。
細胞呈現分析  本發明之方法一般涉及在細胞(例如酵母細胞)上呈現目標多肽之變異體且例如藉由富集展示對抗體展現減少之結合(例如減少之結合親和力)之變異體的細胞群來評估抗體對目標多肽之變異體的結合能力。可根據本文所描述之方法使用之細胞之實例包括但不限於真核細胞(例如真菌細胞，例如酵母細胞；哺乳動物細胞，例如CHO細胞或人類細胞)或原核細胞(例如細菌細胞，例如大腸桿菌細胞)。在一實施例中，細胞為酵母細胞。
在一實施例中，表位定位資料衍生自目標多肽(在本文中亦稱為抗原)庫之深度突變掃描，其解決典型突變誘發基因型-表型研究之低產出性質且使得能夠同時測試許多(例如數百、數千或數十萬)影響功能之突變變異體。該方法之產出可能夠對表面殘基以及每個殘基多個相異突變(亦即不僅突變成丙胺酸)進行更全面取樣，且因此能夠對表位(包括構形表位)進行更敏感及完全的定位。
在一實施例中，目標多肽之變異體表現於細胞(例如酵母細胞)之表面上，例如藉由經由連接子序列與內源細胞表面蛋白質(例如酵母蛋白質Aga2)融合。在一實施例中，例如目標多肽通常在連接子之間形成多聚體、長可撓性連接子序列(例如包含至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50或更多氨基酸連接子)且既定之變異體可為鄰近目標多肽分子之締合而提供足夠的接近，藉此表現天然四級結構。在一實施例中，連接子包含35個胺基酸。
在一實施例中，該方法包含一或多個描述於實例中之步驟。在一實施例中，根據實例進行該方法。
目標多肽變異體 在一實施例中，測試目標多肽之變異體群與相關抗體之結合能力及/或結合親和力。在一實施例中，目標多肽變異體之群可包括成為目標多肽之表面殘基的突變，其可用於例如使用本文所描述或如此項技術中已知之表位定位方法鑑別接觸所關注抗體之多肽的表面區域。舉例而言，變異體群中之每一者可包括表面殘基處之至少一個(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多個)胺基酸取代。在一實施例中，群包括具有適合於以所需分辨率鑑定抗體與目標多肽之間的接觸區域之表面殘基突變分佈的變異體。
例如如本文所描述，此類變異體之庫可例如藉由深度突變掃描產生。在一實施例中，變異體之庫經設計以例如藉由首先鑑定當突變時不太可能對蛋白質結構具有顯著有害作用之所有表面殘基使衍生自深度突變掃描之表位定位的資訊性輸出達到最大。在一實施例中，表面殘基可基於相對側鏈表面可接近性(例如使用Discovery Studio)來選擇。在一實施例中，選擇展現大於約25% (例如大於約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或99%)之相對側鏈表面可接近性的殘基進行突變。在一實施例中，可例如藉由目視檢查及/或其與相鄰殘基之相互作用及/或接近相鄰殘基之相互作用鑑別對突變具有耐受性之殘基。在一實施例中，目標多肽之所有表面殘基鑑別為具有與結合抗體直接接觸之可能性的一組殘基。在一實施例中，不考慮Pro及/或Gly殘基，因為此類殘基突變可更可能干擾蛋白質結構，其可經由對結合之間接作用而產生用於表位定位的假陽性。
在一實施例中，選擇待突變之一組殘基用於使跨越目標多肽表面之覆蓋率均勻。在一實施例中，殘基可視覺上經策展以確保均勻覆蓋，以選擇一組表面位置用於跨越整個表面之突變。在一實施例中，可選擇額外的N末端及/或C末端殘基用於突變。在一實施例中，可選擇目標多肽之X射線結晶學結構中未解析之一或多個殘基進行突變。在一實施例中，選擇至少約5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、225、250、275、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1000個殘基用於突變。
在一實施例中，例如使用NNK簡併合成表示所選擇之位置之單位點飽和突變誘發庫。合成庫之深度定序可用於驗證預期位置處之突變之存在。在一實施例中，藉由將單突變偶合至表型(例如使用非組合之位點-飽和庫)來維持基因型-表型之連接。
庫選擇 可將目標多肽變異體庫轉化成細胞且分析突變對結合之影響。在一實施例中，將庫轉化成酵母細胞。較佳地，該轉化提供獨特基因多樣性(例如各位置處之32種可能的密碼子)之徹底(例如約5000倍、例如約100倍、500倍、1000倍、2000倍、3000倍、4000倍、5000倍、6000倍、7000倍、8000倍、9000倍、10,000倍或更大)的全擴增。在一實施例中，將用於偵測破壞抗體結合之突變的靈敏度最大化，例如使用對應於細胞上所呈現之野生型目標多肽之最大結合約80% (例如約50%、60%、70%、80%、90%或100%)的抗體濃度。在一實施例中，抗體結合用於區分展現不同結合特性之變異體。在一實施例中，選擇展現減少之結合的變異體。在一實施例中，選擇展現增加之結合的變異體。
在一實施例中，螢光活化細胞分選(FACS)用於選擇(例如富集)展現不同結合特性(例如相對於野生型目標多肽之結合減少或增加)的變異體。在一實施例中，選擇相對於野生型目標多肽展現減少之結合的變異體，例如由包含野生型目標多肽之細胞展現的結合之至少約20% (例如至少約20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%)之結合減少。在一實施例中，選擇相對於野生型目標多肽展現增加之結合的變異體，例如由包含野生型目標多肽之細胞展現的結合之至少約20% (例如至少約20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%)之結合增加。在一實施例中，進行至少兩(例如至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多)輪FACS富集(例如表現但非結合群之富集)。在一實施例中，針對既定樣品收集至少約1000個細胞(例如至少約1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10,000、15,000、20,000、25,000、30,000、35,000、40,000、45,000、50,000、60,000、70,000、80,000、90,000或100,000個細胞)。在一實施例中，針對既定樣品收集至少約30,000個細胞。在某一實施例中，FACS富集產生對其相應抗體缺乏任何顯著結合能力的群。
在一實施例中，例如按照對應於該抗體與目標多肽之最大結合的約80% (例如約50%、60%、70%、80%、90%或100%)的濃度，例如基於用表現野生型目標多肽之細胞(例如酵母細胞)進行的抗體滴定結合實驗，將表現目標多肽變異體庫之細胞(例如酵母細胞)暴露於抗體。
深度定序及生物資訊 在一實施例中，對來自結合實驗之所選變異體進行深度定序，例如以確定及定量潛在基因型。在一實施例中，自資料組移除品質分數低於預定臨限值(例如品質評分小於約30)之定序讀段。在一實施例中，自資料組移除包含插入及/或缺失突變之讀段。在一實施例中，自資料組移除包含超過預定臨限值(例如超過約5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、30、40或50個鹼基取代)之多個鹼基取代的讀段。在一實施例中，自資料組移除包含內部終止密碼子、非預期位置之突變及/或相對於野生型目標多肽之超過一個胺基酸取代的讀段。在一實施例中，將核苷酸讀段轉化為胺基酸讀段。在一實施例中，自資料組移除少於預定臨限數目個讀段(例如少於約10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、400、500、600、700、800、900或1000個讀段)之突變變異體。
在一實施例中，進行生物資訊分析以計算針對抗體之富集定序變異體之水準。在一實施例中，非結合群相對於起始庫富集之變異體表示減少抗體結合親和力之突變。在一實施例中，較高結合群相對於起始庫富集之變異體表示增加抗體結合親和力之突變。預期引起結合減少之機制包括例如直接作用，諸如與抗體直接接觸之殘基側鏈之變化及間接作用，諸如藉由與接觸殘基無關之局部或全域蛋白質結構之變化。結構上部分斷裂性突變可影響具有發散表位之抗體的結合。在一實施例中，將一組抗體併入不同結合模式(例如使用競爭結合實驗測定)以幫助計算成果來辨別可能對抗體結合產生間接作用的突變。
富集分數 可針對各變異體(例如基於如本文中所描述產生之選擇資料)計算表示在庫選擇之後特定變異體之富集水準的富集分數。在一實施例中，如下計算各突變之富集分數：對於在非結合集區中收集之各樣品，藉由表現集區中之該突變之出現頻率將樣品中之突變之出現之位置依賴性出現頻率正規化，且藉由非結合集區中發現之變異體的分率按比例調整，如下：
Figure 02_image001
其中
Figure 02_image003
為樣品(s)之位置(p)之既定胺基酸(aa)的富集分數，
Figure 02_image005
為非結合集區中發現之變異體之分率(集區尺寸)，且
Figure 02_image007
為樣品(s)或表現集區中之胺基酸之觀測位置頻率(wt)。在一實施例中，富集分數表示來自表現集區之突變之分率，其發現於非結合集區中(例如此處表示為百分比)。
在一實施例中，基於定序結果計算非結合集區中之各突變之分率。在一實施例中，對於各突變，相對於表現集區中發現之頻率，使用非結合集區中發現之出現頻率計算富集分數。在一實施例中，針對變異體計算之富集分數表示非結合集區中發現之特定突變之分率，例如在0至100%範圍內。在一實施例中，從考量中忽略對Pro、Gly或Cys之突變，因為其更高之更改三級或四級結構得傾向。在一實施例中，從考量中忽略經預測插入或移除糖基化位點之位點特異性突變。在一實施例中，藉由聚集特定殘基之各突變之富集分數(例如以使具有較高富集分數之突變權重明顯更大的方式)來計算殘基富集分數。具有更高富集分數之殘基一般反映對關於結合之突變之較大敏感性，例如指示此位置更可能作為表位之一部分。在一實施例中，接著將富集分數定位至目標多肽之表面，且將具有高富集分數之位置(例如目標多肽之表面小塊上)指定為表位之一部分。
不希望受理論所束縛，某些突變可展示跨越複數個系統(通常具有低至中等富集分值)之上文背景富集分數。對於許多抗體之結合的此混雜效應可在一些情況下表示假陽性，例如由經由間接機制之結合減少所引起。可憑經驗確定用於鑑別自表位定位移除之雜亂突變之臨限值，例如基於所有樣品之富集定位圖之檢驗。在一實施例中，將以下突變視為假陽性且將其移除以用於表位測定，其中超過約50% (例如約30%、40%、45%、50%、55%、60%或70%)樣品的富集分數大於約30% (例如約20%、25%、30%、35%、40%、45%或50%)且視情況其中超過約75% (例如約50%、60%、70%、75%、80%、90%或95%)之樣品的富集分數大於15% (例如約5%、10%、15%、20%、25%或30%)。在一實施例中，可藉由抗體-抗原複合物之結構分析鑑別雜亂突變，例如以展示此類殘基不涉及抗體-抗原接觸或突變可使例如二級、三級或四級結構去穩定化(例如藉由靜電引力或斥力)。
在一實施例中，可計算複數個生物複本(例如至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或30個生物複本)之富集分數及表位定位圖，例如以分析再現性。在一實施例中，可例如藉由與目標多肽之共晶體結構與抗體或其類似替代物(例如目標多肽之配體或受體)比較來驗證富集分數結果之準確性。
在一實施例中，可產生目標多肽上之既定胺基酸位置之突變資料的聚集體，例如用於胺基酸位置為表位之一部分的分析。在一實施例中，例如藉由聚集相應位置處之各突變之效應來計算各殘基之總富集分數。在一實施例中，如下計算富集分數：
Figure 02_image009
其中
Figure 02_image011
為過濾後在既定位置處之胺基酸突變之數目。一般而言，所計算之總殘基富集分數使展示較大富集分數之突變的作用權重明顯更大且/或使來自展示較低富集分數之突變的貢獻權重降低。此可確保展示可歸因於雜訊的多個突變之較低富集水準的位置不遮蔽來自可具有更少量突變但具有更高富集之位置處的信號。在一實施例中，一旦計算各位置之總富集分數，則可將總富集分數定位至蛋白質表面上以促進富集表位定位圖之可視化。
抗體-抗原複合物之計算模型化  本文所描述之方法一般涉及鑑別目標多肽上由所關注抗體或其抗原結合片段結合之一或多個表位區域或位點。例如如本文所描述，可例如使用抗體-抗原複合物之計算模型化(例如使用對接演算法)鑑別此類表位區域，其可例如藉由細胞呈現分析之結果告知。在一實施例中，細胞呈現分析之結果(例如富集得分，例如如本文中所描述)作為約束併入至對接演算法中。在一實施例中，該方法包含一或多個描述於實例中之步驟。在一實施例中，根據實例進行該方法。
抗體 - 抗原對接 一般而言，多步驟對接方法可經實施以產生抗體-抗原模型，其較佳(1)併有以實驗方式導出之表位定位作為約束，(2)使用抗體模型之集合以更好地說明同源性模型化之不確定性，及(3)利用大量抗體特異性結構知識以更有效地鑑別展現抗體-抗原複合物特有之特徵的對接模型。在一實施例中，例如自如本文所描述之深度突變掃描資料獲得之殘基富集分數用作對抗體-抗原全域對接演算法之約束，例如其在整個抗原表面上對抗體接合進行取樣。在一實施例中，約束用於當與較高富集位置形成最大接觸時，將抗體-抗原位姿標明為有利的，及/或當接觸經確定對突變具有耐受性之位置時，將抗體-抗原位姿標明為不利的。
在一實施例中，例如使用此項技術中已知之算法及/或協定(例如Rosetta抗體同源性模型化，例如叢生葉3.8或BioLuminate Schrödinger)產生抗體同源性模型(例如用於在產生抗體-抗原對接模型中使用)。在一實施例中，抗體同源性模型例如在CDR區域之構形(例如HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及/或LCDR3)中變化。在一實施例中，模型主要在HCDR3之構形中(例如在HCDR3環中)變化。
對接可例如使用不同抗體同源性模型之集合作為輸入來進行。在一實施例中，例如使用衍生自已知抗體重-抗原複合物之定製得分函數將對接程式PIPER用於全域對接。在一實施例中，在對接模型之產生期間使用來自富集分數之約束，例如，利用有吸引力及/或斥力約束來更改對接結果。此允許表位定位途徑鑑別具有高富集分數之殘基(例如轉化成對對接具有吸引力的約束)，及/或鑑別具有低富集分數之殘基，其預期不為表位之一部分(例如轉化成排斥約束)。在一實施例中，僅使用具有高富集分數或低富集分數之殘基產生約束，例如使得具有中間富集分數之殘基在對接期間不受約束。在一實施例中，使用由一組抗體產生之資料鑑別影響許多抗體之結合且因此更可能為假陽性之突變。在一實施例中，可在產生約束時不考慮此類假陽性。在一實施例中，如本文所描述之對接途徑不依賴於絕對截止值以確定是否應包括富集位置作為表位之一部分。
在一實施例中，將約束併入至對接運行中如下：向具有大於約30% (例如大於約20%、25%、30%、35%、40%、45%或50%)之殘基富集分數之位點添加有吸引力的約束，其中基於富集分數與有吸引力的加分項結合使用，例如自例如0.35至0.99線性調整。在一實施例中，向具有小於約12.5% (例如約5%、10%、11%、12%、12.5%、13%、14%、15%、20%、25%或30%)之殘基富集分數之位點添加排斥約束。在一實施例中，對一系列輸入抗體同源性模型(例如一系列至少約5、10、15、20、25、30、40、50或更多個輸入抗體同源性模型)中之每一者進行全域對接。在一實施例中，產生總共至少約50、100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000個對接姿態。在一實施例中，約30個位姿(例如約10、15、20、25、30、35、40、45或50個位姿)表示針對各樣品獲得之叢集中心。
在一實施例中，計算表位定位分數以分析各對接模型與實驗上確定之富集分數之間的一致性水準。在一實施例中，使用以下方程式計算表位定位分數：
Figure 02_image013
其中ES 為表位定位分數，N 為突變位點數目，
Figure 02_image015
為位置p 處之約束，且
Figure 02_image017
為位置p 處之富集分數。在一實施例中，對接模型藉由表位定位分數定級。在一實施例中，選擇某一數目前模型(例如前5個、10個、15個、20個、25個、30個、35個、40個、45個、50個、60個、70個、80個、90個、100個或更多個模型)。
在一實施例中，抗體-抗原對接涉及產生整體對接模型，其中複數個抗體同源性模型對接至抗原之一或多個模型。在一實施例中，將複數個抗體同源性模型對接至抗原之一個模型。在一實施例中，將複數個抗體同源性模型對接至抗原之複數個模型。在一實施例中，前溶液之集合用於表示抗體-抗原複合物。在另一實施例中，來自對接工作流程的單一頂級模型經選擇以表示對接錯合物。
在一實施例中，如本文中所描述所產生之對接姿態可例如使用局部對接演算法(例如SnugDock)加以改進。在一實施例中，局部對接演算法例如藉由探究小剛性本體移動來優化對接姿態，從而允許側鏈之重新封裝、CDR區域之重構(例如HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及/或LCDR3；較佳地HCDR2及/或HCDR3)、CDR環之改進(例如CDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及/或LCDR3；較佳地HCDR2及/或HCDR3)及/或VH/VL定向之重取樣。在一實施例中，在局部對接中使用來自富集分數之約束(例如如上文所描述對於全域對接)，例如利用有吸引力及/或斥力約束以更改局部對接結果。在一實施例中，具有高富集分數之殘基轉化為對對接有吸引力的約束。在一實施例中，具有低富集分數之殘基轉變成排斥約束。
在一實施例中，應用一組抗體特異性結構過濾器(例如衍生自一組可用抗體-抗原晶體結構)以移除呈現對於已知抗體-抗原複合物非典型之接合模式的模型。在一實施例中，結構過濾器係選自表 1 中所列之彼等結構過濾器(例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14，或表 1 中所列之所有結構過濾器)。在一實施例中，若兩個殘基中之一對重原子相隔＜5 Å，則認為殘基接觸。
表 1. 用於過濾對接姿 態之例示性抗體 - 抗原結構過濾器
過濾器 描述
SASA ＜ 1250 使用Rosetta計算之界面SASA
n表位＜=12 接觸抗體之抗原殘基之數目
n表位CDR ＜= 9 與CDR殘基接觸之抗原殘基之數目
n互補位＜= 16 接觸抗原之抗體殘基之數目
n互補位CDRs ＜= 12 接觸抗原之抗體CDR殘基之數目
百分比CDR ＜= 0.55 n互補位CDRs/n互補位
n成對接觸＜ 40 在抗體與抗原之間進行之成對接觸之數目
nCDR成對接觸＜ 25 在抗體CDR殘基與抗原之間產生之成對接觸(dist＜5A)之數目
nCDR環＜ 3 具有接觸抗原之殘基的CDR環之數目
diffCDR31 ＜ -2 CDR3(H+L)中之殘基數目-接觸抗原之CDR1(H+L)中之殘基數目
nHCDR3 + nLCDR3 ＜ 5 接觸抗原之HCDR3及LCDR3中之殘基數目
接觸密度＜0.8 n成對接觸/(n表位+n互補位)
CDR接觸密度＜ 0.75 nCDR成對接觸/(n互補位CDRs+n表位CDRs)
環密度＜ 2.25 n互補位CDRS/nCDR環
分數EPII ＜ 0.03 基於抗體-抗原成對傾向之分數
在一實施例中，將至少約100(例如約100、150、200、250、300、350、400、450、500或更多)可用抗體-抗原複合物之結構用於產生結構過濾器。在一實施例中，移除界面附近具有缺失區域之複合物及/或界面處之配體或轉譯後修飾之複合物。一般而言，對於待用於產生結構過濾器之抗體-抗原複合物組，計算關鍵界面特性之結構特徵之分佈(例如接合表位之CDR及/或構架殘基之數目、相互作用中涉及之CDR環之數目及類型、表位殘基之數目、內埋表面積及/或成對殘基傾向)。在一實施例中，用於以上界面特性中之一或多者之臨限值經選擇使得結構之預定數量(例如至少約85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或99.9%)中不超過一個結構過濾器不合格。
在一實施例中，針對對接模型中之每一者計算界面特性。在一實施例中，移除出超過一個結構過濾器不合格之模型。在一實施例中，其餘對接模型基於表位定位分數過濾(例如如本文中所描述)。在一實施例中，對接模型允許與具有較低富集分數之少量殘基接觸。在一實施例中，移除富集分數小於所觀測表位定位分數最大值之約80%的模型。在一實施例中，其餘對接模型基於其界面能量(Isc)而定級，例如如使用Rosetta所計算。
在一實施例中，使用衍生自大量可用結構之抗體-抗原複合物之特異性知識鑑別近乎天然之模型。對接演算法一般利用已參數化為蛋白質相互作用之一般的基於物理之得分函數。在一實施例中，產生抗體-抗原結構之策展資料庫且計算結構特徵之分佈，例如包括內埋表面積、接合抗原之CDR殘基之數目及類型、來自CDR環之互補位殘基之分率及/或成對殘基傾向度。可接著在該等結構特徵上分析候選對接模型，同時可考慮到具有非典型界面之模型。
抗體工程 除鑑別與晶體結構一致之表位殘基之外，對接模型亦可提供互補位資訊。此可用於進一步工程改造抗體，例如在人類化、親和力成熟、抗原結合特異性更改及/或生物物理學特性(例如聚集傾向)改良方面。在一實施例中，可使用如本文所描述產生之抗體-抗原對接模型鑑別互補位殘基及/或區域。
在一實施例中，經鑑別之互補位殘基可經工程改造以調節抗體之活性或更改抗體之結構特徵。舉例而言，互補位殘基可經修飾以增加或減少目標多肽(例如小鼠及人類、食蟹獼猴及人類、小鼠及食蟹獼猴或物種之任何其他成對組合)之跨物種反應性，及/或提高或減少目標多肽及一或多種相關蛋白質之交叉反應性。
在一實施例中，本文中之揭示內容包括藉由本文所描述之方法工程改造之抗體分子。在一實施例中，本文中之揭示內容包括包含藉由本文所描述之方法工程改造之抗體分子及醫藥學上可接受之載劑的組合物(例如醫藥組合物)。在一實施例中，本文中之揭示內容包括編碼藉由本文所描述之方法工程改造之抗體分子的核酸分子。在一實施例中，本文中之揭示內容包括包含編碼藉由本文所描述之方法工程改造之抗體分子之核酸分子的載體。在一實施例中，本文中之揭示內容包括包含編碼藉由本文所描述之方法工程改造之抗體分子之核酸分子的細胞(例如宿主細胞)。在一實施例中，本文中之揭示內容包括製造藉由本文所描述之方法工程改造之抗體分子的方法。
本發明亦包括以下編號段落中之任一者：  1.一種鑑別目標多肽上之表位的方法，該方法包含： (a)將抗體分子結合至該目標多肽之複數個變異體； (b)獲得(例如富集)複數個展現與該抗體分子之結合減少(例如結合親和力減少)之變異體； (c)確定(例如計算)該複數個所獲得(例如富集)變異體中之每一者的富集分數； (d)產生抗體分子-目標多肽對接模型，其中該抗體分子-目標多肽對接模型根據該等富集分數受約束；及 (e)基於該抗體分子-目標多肽對接模型，鑑別該目標多肽上能夠由該抗體分子結合之位點； 藉此鑑別目標多肽上之表位。 2. 如段落1之方法，其中步驟(a)包含將該抗體分子結合至呈現該目標多肽之複數個變異體之庫。 3. 如段落1或2之方法，其中步驟(a)包含將該抗體分子結合至包含表現(例如呈現)該目標多肽之複數個變異體之複數個細胞的庫。 4. 如段落3之方法，其中該複數個細胞中之每一者表現該目標多肽之約一種相異變異體。 5. 如段落3或4之方法，其中該細胞為真核細胞，例如酵母細胞。 6. 如前述段落中任一段之方法，其中該複數個變異體包含該目標多肽之一或多個表面殘基上之突變。 7. 如前述段落中任一段之方法，其中該複數個變異體包含該目標多肽之所選表面殘基之相異突變 8. 如前述段落中任一段之方法，其中該複數個變異體包含該目標多肽之複數個所選表面殘基中之每一者的相異突變。 9. 如前述段落中任一段之方法，其中相對於該目標多肽之野生型胺基酸序列，該複數個變異體包含單胺基酸取代。 10. 如前述段落中任一段之方法，其中相對於該目標多肽之野生型胺基酸序列，該複數個變異體中之每一者包含單胺基酸取代。 11. 如段落9或10之方法，其中該單胺基酸取代發生於該目標多肽之表面殘基處。 12. 如前述段落中任一段之方法，其中該結合減少包含相對於針對野生型目標多肽及該抗體所偵測之結合，針對該變異體及該抗體分子所偵測之結合減少。 13. 如前述段落中任一段之方法，其中步驟(b)包含獲得(例如富集)展現由野生型目標多肽所展現之與該抗體分子的結合的小於約80% (例如小於約0.01%、0.1%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%或80%)的變異體。 14. 如段落13之方法，其中該結合減少係由該野生型目標多肽展現之結合的至少約20% (例如至少約20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%)。 15. 如前述段落中任一段之方法，其中步驟(b)包含獲得(例如富集)展現由包含野生型目標多肽之細胞展現的與該抗體分子之結合的小於約80% (例如小於約0.01%、0.1%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%或80%)的細胞。 16. 如段落15之方法，其中該結合減少係由包含該野生型目標多肽之細胞展現的該結合的至少約20% (例如至少約20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%)。 17. 如前述段落中任一段之方法，其中步驟(b)包含對展現與該抗體分子結合減少之變異體進行一或多個，例如兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或超過十個的富集。 18. 如前述段落中任一段之方法，其進一步包含例如在步驟(c)之前，例如藉由例如次世代定序法來定序編碼該等變異體之基因來鑑別展現與該抗體分子結合減少的該等變異體。 19. 如前述段落中任一段之方法，其中步驟(c)包含測定該複數個所獲得(例如富集)變異體中之每一者的出現頻率。 20. 如段落19之方法，其中步驟(c)進一步包含將在特定殘基處包含相異突變之各變異體之該出現頻率聚集及/或使出現頻率更高之變異體權重更大。 21. 如前述段落中任一段之方法，其中該富集分數對該目標多肽之該胺基酸序列的單殘基具有特異性。 22. 如前述段落中任一段之方法，其中各富集分數對該目標多肽之該胺基酸序列之不同單殘基具有特異性。 23. 如前述段落中任一段之方法，其進一步包含用該目標多肽之該複數個該等變異體之複製來重複步驟(a)-(c)至少一次(例如一次、兩次、三次、四次、五次或更多次)，且其中步驟(c)進一步包含省略一或多種雜亂突變，例如其中超過50%之複製具有大於30%之富集分數及其中超過75%之複製具有大於15%之富集分數的突變。 24. 如前述段落中任一段之方法，其中藉由添加一或多種有吸引力之約束而約束該抗體分子-目標多肽對接模型，其中該有吸引力之約束用於具有大於第一預選值之富集分數的殘基。 25. 如段落24之方法，其中該第一預選值在20%與40%之間，例如在25%與35%之間，例如約30%。 26. 如段落24或25之方法，其中該有吸引力之約束包含基於該富集分數之線性調整紅利。 27. 如前述段落中任一段之方法，其中藉由對具有小於第二預選值之富集分數的殘基添加排斥約束來約束該抗體分子-目標多肽對接模型。 28. 如段落27之方法，其中該第二預選值在5%與20%之間，例如在10%與15%之間，例如約12.5%。 29. 如前述段落中任一段之方法，其中步驟(d)包含在該抗體分子之模型與該目標多肽之模型之間產生對接姿態。 30. 如前述段落中任一段之方法，其中步驟(d)包含在該抗體分子之模型與該目標多肽之模型之間產生複數個對接姿態。 31. 如段落30之方法，其中步驟(d)進一步包含根據例如SnugDock之對接演算法對該複數個對接姿態評分。 32. 如段落31之方法，其中步驟(d)進一步包含選擇該複數個對接姿態之具有最高分數的子集，例如最高分數1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、300、400、500、600、700、800、900、1000或更高的對接姿態。 33. 如段落32之方法，其中步驟(d)進一步包含使用該複數個對接姿態之該所選子集產生整體對接姿態，及根據該整體對接姿態設定該抗體分子之該模型及該目標多肽之該模型。 34. 如段落29至33中任一項之方法，其中該抗體分子之該模型包含衍生自該抗體之複數個同源性模型的整體抗體同源性模型。 35. 如前述段落中任一段之方法，其中步驟(d)進一步包含移除抗體分子-目標多肽對接模型，其例如根據衍生自抗體-抗原晶體結構之結構過濾器而展現針對已知抗體-抗原複合物之非典型性接合模式。 36. 如前述段落中任一段之方法，其中步驟(d)包含產生複數個抗體分子-目標多肽模型。 37. 如前述段落中任一段之方法，其中步驟(e)包含鑑別該目標多肽上複數個能夠由該抗體分子結合之位點。 38. 一種鑑別目標多肽上之表位的方法，該方法包含： (a)產生抗體-目標多肽對接模型，其中根據藉由包含以下之方法確定之複數個富集分數來約束該抗體-目標多肽對接模型： (i)將該抗體分子結合至該目標多肽之複數個變異體， (ii)獲得(例如富集)複數個展現與該抗體分子之結合減少之變異體，及 (iii)確定(例如計算)該複數個經富集變異體中之每一者的富集分數；及 (b)基於該抗體-目標多肽對接模型，鑑別該目標多肽上能夠由該抗體分子結合之位點； 藉此鑑別目標多肽上之表位。 39. 一種鑑別抗體分子上之互補位的方法，該方法包含： (a)將該抗體分子結合至目標多肽之複數個變異體； (b)獲得(例如富集)複數個展現與該抗體分子之結合減少之變異體； (c)確定(例如計算)該複數個經富集變異體中之每一者的富集分數； (d)產生抗體分子-目標多肽對接模型，其中該抗體-目標多肽對接模型根據該等富集分數受約束；及 (e)基於該抗體-目標多肽對接模型，鑑別該抗體分子上能夠由該目標多肽結合之一或多個位點； 藉此鑑別抗體分子上之互補位。 40. 一種鑑別抗體上之互補位的方法，該方法包含： (a)產生抗體-目標多肽對接模型，其中根據藉由包含以下之方法確定(例如計算)之複數個富集分數來約束該抗體-目標多肽對接模型： (i)將該抗體結合至該目標多肽之複數個變異體， (ii)獲得(例如富集)展現與該抗體分子之結合減少之變異體，及 (iii)確定(例如計算)該複數個所獲得(例如富集)變異體中之每一者的富集分數；及 (b)基於該抗體-目標多肽對接模型，鑑別該抗體分子上能夠由該目標多肽結合之一或多個位點； 藉此鑑別目標多肽上之互補位。 41. 一種抗體分子，其中根據如前述段落中任一段之方法鑑別針對該抗體分子之目標多肽上之該表位或該目標多肽之該抗體分子上之該互補位。 42. 一種核酸分子，其編碼如段落41之該抗體分子之一或多個鏈(例如VH及/或VL)。 43. 一種載體，其包含如段落42之該核酸分子。 44. 一種宿主細胞，其包含如段落42之該核酸分子或如段落43之該載體。 45. 一種製備抗體分子之方法，其包含在適合於表現該抗體分子之條件下培養如段落44之該宿主細胞。
實例  實例1：藉由全面抗原庫之深度定序併入構形表位定位的抗體-抗原複合物之計算模型化  為改良抗體-APRIL模型結構之品質，將以實驗方式導出之抗原(APRIL)突變資料作為約束併入計算對接工作流程中。APRIL突變概況源自抗原庫之深度突變掃描，其闡述典型突變誘發基因型-表型研究之低產出性質且使得同時測試數千個影響結合之突變變異體。該方法之產出能夠對表面殘基及所有突變(亦即不僅僅為Ala)進行更徹底取樣，且因此提供促成抗體結合之抗原殘基之更敏感且更完全表徵。
使用酵母表面顯示器，歸因於其顯示構形完好抗原之能力及用於庫建構及選擇之系統的簡易性來促進全面突變庫之高產量篩選。發現huAPRIL在酵母表面上之生產性表現不良，與先前觀測結果一致。因此，設計小鼠APRIL(muAPRIL)之嵌合形式，其中位於TACI-結合位點中及周圍的表面殘基突變為huAPRIL中之等效殘基(圖 1 )以保存TACI及阻斷抗體之結合位點。除非另外規定，否則所得嵌合體在本文中稱為APRIL。經展示所有人類特異性抗APRIL抗體及TACI結合至此經設計之APRIL(圖 2 )，展現其構形完整性。
含有35-殘基可撓性連接子(以促進多聚合)之Aga2-APRIL融合蛋白展現與TACI之較強結合(圖 2 )。TACI之結合位點由跨越兩個相鄰APRIL單體之界面具有顯著接觸之四級結構構成。此等結合結果表明在酵母表面上形成生產性APRIL單體-單體界面。
針對在酵母上表現之APRIL測試一組小鼠衍生抗huAPRIL抗體。所有抗體展現可滴定結合(圖 2 )與其與經純化重組huAPRIL之結合一致，進一步支持在酵母表面上表現之APRIL蛋白之結構完整性。針對APRIL抗體篩選APRIL之位點飽和突變誘發之表面位置之酵母表面呈現庫以產生影響結合之突變之綜合概況，且結果用於約束計算抗體-抗原對接(圖 3 )。
實例2：庫選擇及深度定序  如本文所描述，使用NNK簡併合成單位點飽和突變誘發庫，且庫之深度定序確認在預定位置存在所有突變。將經合成之庫轉化成酵母，且產生類似於未突變APRIL之表面表現。使用TACI及一組抗APRIL抗體之結合研究揭示大部分庫保持強結合，少數展現結合減少或無結合(圖 4A- 圖 4B ，前兩列）。進行兩輪表現但非結合群體之FACS富集(圖 4A- 圖 4B ，最後一列)。來自不同結合實驗之非結合集區接著如本文所描述進行深度定序。
實例3：各抗體之突變概況之產生  為產生各抗體之定量突變概況，進行生物資訊分析以計算針對各抗體之各抗原變異體之富集水準，如本文所描述。非結合群體相對於起始庫富集之變異體表示減少抗體結合親和力之突變。認為兩種主要方法可能引起結合減少：直接作用，諸如與抗體直接接觸之側鏈；及由局部或全域蛋白質結構之變化引起的間接作用，不衍生自突變成接觸殘基。所表徵之抗體組識別不同表位(使用競爭結合實驗測定，表 2 )，其幫助辨別突變中之計算工作可能引起經由蛋白質結構變化(亦即影響與大部分或所有抗體之結合)對抗體結合的間接作用。針對所有抗體產生查詢之所有APRIL突變之突變概況(圖 5A- 圖 5D )及TACI(圖 6A )。
表 2. 抗體競爭研究之結果 (+) 指示兩種抗體競爭 ( 競爭 ELISA 中結合減少 ＞90%) 。
   2419 3530 4540 4035
2419 + - + -
3530 - + - -
4540 + - + +
4035 - - + +
觀測到若干APRIL突變，其展示跨越大部分配體之以上背景富集分數。鑒於由競爭實驗測定之所有抗體之非重疊表位(表 2 )，對於許多抗體之結合之此混雜作用可能表示由經由間接機制之結合減少引起之假陽性。基於所有樣品之富集定位圖之檢驗來測定用於鑑別移除之雜亂突變之臨限值(參見支持資訊)。
觀測到V132突變成Asp或Glu之雜亂突變之說明性實例。此等突變導致所有配體之高富集分數(圖 7 )除3530以外，包含對結合至TACI之兩個生物複製樣品之顯著影響。與APRIL複合之TACI的結構分析清楚地展示此等殘基不與TACI接觸且預期將不會對結合造成直接影響。值得注意地，在兩個單體之間的界面處發現殘基V132且在另一單體上在結構上與E182相鄰。在V132處成為Asp或Glu之突變可導致具有E182之靜電排斥，使APRIL之四級結構去穩定且從而對與配體組之結合發揮間接影響。即使V132處帶負電殘基之突變消除與大部分抗體之結合，但與多種其他胺基酸之突變導致僅對抗體2419具有特異性之結合減少(圖 7 )。在此情況下，將突變V132D及V132E視為假陽性，依照進一步考量將其移除，且不包括於總殘基富集之計算中。
實例4：突變概況之分析  除3530之外，所有樣品均顯示2至6個位置，對於該位置，突變成大部分其他胺基酸而破壞結合(圖 5 )。如所預期，一些位置，諸如針對TACI結合分析之R197(圖 6A )展示對Ala突變較低之富集分數，但對其他胺基酸之突變敏感，表明藉由位點飽和突變誘發更徹底詢問各位置之益處。
在具有muAPRIL之已知的共晶體結構之情形下分析對照蛋白TACI之突變概況。由於預期富集水準與對結合之影響水準相關，因此保留此定量資訊用於分析及結構性可視化。將富集分數定位至APRIL之表面以供可視化，且展示由具有位於表位中之最高殘基富集分數之8個殘基構成的定義明確之小塊(圖 6B )與X射線結構良好一致。在APRIL之二聚體界面中發現此等位置；在一個單體上發現殘基F167、V172、R186、I188及R222，且在相鄰單體上發現R197、Y199及H232，再次表明表現於酵母表面上之APRIL形成富有成效之單體-單體界面。展示在表位周邊處發現之四個殘基(T183、D123、S192及E196)具有與非表位殘基不可區分之富集分數(圖 6C )，表明此等位置之突變耐受性。總體而言，TACI之突變概況結果與來自共晶體結構資料之結構概況緊密匹配。
對於各抗體，在APRIL之表面上使突變概況資料(對於所有鏈)可視化，且亦觀測到具有較高分數之位置叢集至表面小塊，指示各抗體之可能表位區域(圖 5 )。類似於TACI，抗體2419之表位區域在視覺檢查時展示由衍生自跨越二聚體界面之不同單體之殘基形成的表面小塊。當在表面上可視化時，抗體4035及4540之高殘基富集小塊呈現比2419更大且更分散。定位圖之清晰度的差異部分地歸因於同源寡聚APRIL分子之對稱性及形狀。不同APRIL單體上之等效殘基位置靠近分子之頂點緊密接近(圖 8 )使得頂點結合分子之小塊(如4035)呈現更大得多。
與識別APRIL之N端處之線性表位之抗體3530一致，僅APRIL之N端中之兩個殘基展示較高富集分數，其兩者均未在muAPRIL之X射線結構中解析。不同於其他抗體及TACI(圖 2 )，此與針對獨特地展現極低百分比非結合子之APRIL位點-飽和庫測試之抗體3530的觀測結果一致。藉由與APRIL之結合結果在N端肽(圖 9A- 圖 9D )缺失下證實此等結果且研究表明3530缺乏與其他抗體(表 2 )之結合競爭。
實例5：計算抗體-抗原對接  實施多步驟對接途徑以產生抗體-抗原模型(圖 10 )。針對APRIL之各抗體使用與其以實驗方式導出之富集分數按比例加重之位點約束進行全域剛性主體對接；此確保當與高富集位置產生最大接觸時抗體-抗原位姿最有利，同時相反地不利與確定結合不受突變影響之位置相互作用。接著使用頂級對接姿態作為對於基於局部對接演算法SnugDock之輸入。預期所得等級前100個模型位姿富集，該等模型關於抗體-抗原定向通常為正確的，且可使得能夠鑑別表位及互補位中之接觸殘基，且在更小水準上能夠鑑別表位-互補位殘基之相互作用對。將基於殘基之對接可信度分數計算為所選擇模型之分率，其中發現殘基與抗體或抗原接觸。
實例6：使用晶體結構比較2419對接模型  為驗證對接結果，解決具有huAPRIL之2419之共晶體結構。在6.5 Å解析度下測定與huAPRIL(殘基115-250)複合之2419之Fab結構域的單晶結構。在晶體結構中，Fab-APRIL複合物形成與非結晶偽三倍對稱性相關之3:3分子複合物。huAPRIL分子形成類似於所見之muAPRIL(PDB:1U5Y)之同源三聚體。跨越同源三聚體界面結合各Fab結構域，使兩種huAPRIL單體交聯。歸因於低解析度，對於2419及huAPRIL之側鏈，未觀測到明顯電子密度；然而，huAPRIL之結構先前已在高解析度(PDB:4ZCH)下藉由BAFF解析為異源三聚體。huAPRIL之先前確定之結構明確擬合2419-huAPRIL之電子密度且因此用於模擬複合物，使得能夠在高可信度下自複合物鑑定出huAPRIL表位殘基。基於電子密度圖，相對於huAPRIL之定向2419為清楚的，允許闡明核心互補位殘基，但由於CDR區中之較大不確定度，可能不能明確界定周邊互補位殘基。觀測到VH及VL結構域之CDR主要結合於跨越同源三聚體界面之個別huAPRIL單體，其中VH遮擋TACI之結合位點。
2419之對接結果之分析展示對接模型與APRIL之接合模式與天然結構強烈一致性。獲得展示近乎天然抗體-抗原定向之大量模型，其中大部分模型(90/100)具有低抗體配體RMSD(L_rms)＜10Å，形成透明結合能量漏斗(圖 11A )。抗體配體RMSD藉由僅重疊抗原座標且隨後分析RMSD而在抗體構架主鏈原子上提供對接模型與天然結構之嚴格比較。使用基於抗體配體RMSD之CAPRI型等級，將27/100模型視為中等品質(L_rms＜5Å)，63/100為可接受品質(L_rms在5Å與10Å之間)且將10模型基於此單一度量視為不正確的。相對於圖 11B 中之天然結構(僅在抗原上疊加)展示頂級模型，且可觀測到接合模式之良好一致性。對於2419而言，具有較高以實驗方式導出之富集分數之殘基亦具有高對接可信度分數(圖 11C )，表明大部分對接模型接觸展示對突變時的結合之最大影響的彼等殘基。
雖然對接模型之接合模式類似於2419之天然結構，但模型化HCDR3不採用類天然構形。對於典型CDR，經前100個得分模型計算之平均RMSD為：H1:1.17 Å、H2:1.72 Å、L1:1.57 Å、L2:1.90 Å及L3:1.93 Å。然而，對於HCDR3而言，平均RMSD為6.17 Å。前10得分模型之RMSD值展示於表 3 中。
表 3. 觀測到的 2419 之前 10 個對接模型之 Ca RMSD(Å) 。抗體配體為在疊加抗原殘基之後經抗體構架殘基計算之 RMSD 。在基於抗體構架殘基疊加之後，計算六個 CDR 環 (Chothia 定義 ) 中之每一者的 RMSD 。
模型 抗體配體 HCDR1 HCDR2 HCDR3 LCDR1 LCDR2 LCDR3
模型1 5.89 0.93 3.14 4.47 1.07 1.93 1.24
模型2 3.71 0.98 1.86 3.55 1.22 2.08 1.30
模型3 6.96 0.82 0.88 3.15 1.14 2.00 1.34
模型4 6.56 1.35 1.14 6.28 2.02 2.26 1.41
模型5 6.97 0.95 1.40 6.04 1.44 1.97 1.24
模型6 9.71 0.80 1.13 4.02 1.07 2.10 1.15
模型7 7.18 1.11 1.45 5.28 1.17 2.13 1.25
模型8 10.59 1.16 2.31 4.03 1.17 2.06 1.24
模型9 4.53 0.81 1.38 4.33 1.18 2.11 1.32
模型10 4.90 1.01 2.35 3.90 1.13 1.95 1.28
2419之HCDR3含有11個殘基(使用Chothia編號)，且此長度之環一般認為難以精確模型化。儘管在精確模型化用於2419之HCDR3構形方面具有挑戰，但包括實驗資料作為用於模型化之約束，僅針對抗原衍生出足以引導對接工作流程以鑑別抗體及抗原相互作用表面之幾乎正確的接觸。
自2419對接模型確定之表位之分析展示比僅僅衍生自實驗資料之表面小塊更詳細的表面小塊。在自2419之天然結構確定的22個接觸表位殘基中，14突變，但僅發現此等中之7個具有高富集分數(＞20%)(圖 11C )。相比之下，頂級對接模型從表位上的22個接觸殘基中正確鑑別出21個。即使當彼等殘基不突變時或當其具有較低以實驗方式確定之富集分數時頂級對接模型仍可正確地鑑別2419之表位殘基(由圖 11C 中之星號表示)。
除鑑別與晶體結構一致之表位殘基之外，對接模型亦提供互補位資訊。儘管對互補位不存在以實驗方式確定之約束，但由對接模型確定之互補位與低解析度天然結構(14個天然互補位殘基中有10個具有＞50%之對接可信度分數)具有良好總體一致性(圖 12A- 圖 12B )。與表位殘基之確定相比，鑑別若干假陽性(3個具有對接分數＞50%之殘基)，其中對接模型中之殘基與在天然結構中未觀測到之抗原接觸。對於2419而言，在HCDR3環上發現此等殘基反映在正確模型化此環之構形方面之誤差。藉由採用不正確構形，對接模型中之HCDR3殘基可與天然結構中未觀測到之抗原接觸。在一些情況下，抗體同源性模型化(包括SnugDock中之HCDR3重構)錯誤以及缺乏明確實驗約束之組合的抗體可使得互補位定位與表位定位相比更不準確。總體而言，預測與實際互補位表面之間存在良好一致性。
實例7：約束對對接之影響  此計算工作流程利用漏斗途徑以在與實驗資料一致且因此更可能為近乎天然位姿(圖 13A- 圖 13D )之模型中變窄。為分析併入工作流程中之約束之影響，將2419用作分析由藉由三種不同方法產生之前模型對接表位結果之實例：(i)在不使用實驗突變概況資料的情況下進行全域對接，(ii)使用突變概況資料之全域對接，及(iii)完整對接工作流程(包括基於抗體-抗原界面特徵之SnugDock及過濾)。
如所預期，不包括以實驗方式導出之約束的全域對接導致對接模型之較大多樣性。此處，大部分對接模型預測2419以可視化之定向結合至APRIL之基底附近的某處，但模型之間存在極少共識。此產生具有低總體對接可信度分數之定位圖(圖 13A )，且其與2419 (圖 13D )之實際表位具有極少相似性。在全域對接程序中包括突變概況資料使得較大數目之重疊在近乎真實表位附近聚焦，但仍觀測到相對結合定向之較大變化(圖 13B )。使用完整對接工作流程(包括整體局部對接組分(SnugDock))產生接近天然位姿之緊密叢集(圖 13C )及高度類似於衍生自晶體結構之表位定位圖。包括以實驗方式導出之突變概況資料產生具有接近天然結構之清晰對接漏斗，而在無約束之情況下進行對接工作流程產生高得多數目的非天然模型(圖 14A- 圖 14B ）。此結果顯示，併入突變概況資料可克服在選擇接近天然模型中之計算對接得分方法中之缺陷。
實例8：對接模型之分析揭示機理洞察  所有3種抗體之TCR模型指示其與APRIL之接合模式及其阻斷TACI結合之方式(圖 15A- 圖 15C ）。2419跨越二聚體界面結合，其中其重鏈結合於APRIL之赤道區，且由此閉合TACI結合位點。4035在APRIL之頂點附近結合，且其重鏈展現與TACI結合位點之實質性相互作用。對於4540，對接模型表現出其主要為閉合TACI結合位點之輕鏈。所有3種抗體之對接模型揭露各抗體之相異表位，且表位之重疊與競爭結合資料一致，其展示4540與2419及4035競爭，而2419不與4035競爭(表 2 )。前對接模型之視覺檢查展示所有抗體可以符合抗體之3:3結合比率的方式接合APRIL，由此阻斷APRIL同源三聚體之所有3個單體上的TACI結合位點。
實例9：抗體工程應用  對於治療性抗體發展，可能需要與嚙齒動物及人類物種兩者之交叉反應性結合以促進嚙齒動物模型中之更方便功效及PK/PD測試。因此，作為分子定義之表位及互補位之效用及準確性的說明，使用模型化結果實現合理工程改造以改良跨物種反應性。muAPRIL及huAPRIL具有85.6%序列一致性(圖 1 )，且可在muAPRIL結構上使序列差異可視化且在對接可信度圖之情形下對其進行分析，該等對接可信度圖係針對使用模型化工作流程獲得之各抗體產生。最少非保守性突變發現於2419之表位小塊中。與其他抗體相比，此等突變發現於2419表位之周邊(圖 16A )。在胺基酸尺寸、電荷或疏水性方面產生顯著差異之非保守性突變將預期對抗體結合具有較大影響。
在前模型複合物中之APRIL-2419界面殘基之視覺檢查展示兩種非保守人類對小鼠突變、Q181R及I219K接近2419之重鏈上之R54(圖 16B )。假設在muAPRIL中之位置181及219處存在兩個帶正電殘基將導致靜電排斥以及可能的空間碰撞，其中Arg54在2419之HCDR2上，且可為缺乏2419與muAPRIL結合之主要決定子。預測HCDR2上之R54突變成Asp與muAPRIL中之R181及K219處之正電荷形成有利相互作用，同時不顯著影響與人類殘基Q181及I219之結合。另外，將2419之若干其他突變指定為與R54D組合，其中殘基突變成更小胺基酸(T28A、L53V及S56A)以緩解可由在muAPRIL中之位置181及219處存在更大側鏈而產生的任何潛在空間對撞。此等突變之實驗結果展示所有3種設計之2419變異體均展現與muAPRIL實質性結合(圖 16C )，其僅對結合至huAPRIL具有輕微影響(圖 17 )。此等結果展示工作流程產生品質足以促進結構引導之抗體重新設計之抗體-抗原結構模型。
實例10：材料及方法選擇 APRIL 突變體位置 簡言之，使用同源三聚小鼠APRIL(PDB:1XU1)作為引導物之結構，藉由選擇具有＞25%之相對側鏈表面可接近性之殘基且確保蛋白質表面上之位置的表面覆蓋均勻來選擇一組初始表面殘基。選擇在結構中解析之四十六個表面位置，且選擇未解析之蛋白質之N端處之額外兩個殘基用於突變詢問(在圖 1 中之APRIL之序列及結構上突出顯示)。在各位置使用NNK簡併密碼子以得到改變來設計部位-飽和庫且合成(IDT)。
酵母庫建構及 FACS 選擇 如先前所描述進行酵母表面呈現。簡言之，使用突變成人類APRIL(huAPRIL)基因(A120D、H163Q、R181Q、K219I、N224R)中所存在之胺基酸的小鼠序列(殘基96-241)設計嵌合APRIL基因(亦參見圖 1A )，該小鼠序列在TACI結合位點上及周圍具有5個位置。APRIL基因之合成的簡併(NNK)庫經PCR擴增且經線性化表現載體共轉型至EBY100酵母中且如先前所描述培養。表現APRIL庫之酵母以對應於80%最大結合之濃度暴露於抗體，用螢光抗體染色成測試抗體及酵母APRIL表面表現標記Myc，且使用BD FACSAria分選。選擇展現cMyc表現及結合低於非突變APRIL之酵母。進行兩輪FACS，且富集庫之APRIL基因藉由Illumina MiSeq 2x75 PE(Genewiz)PCR擴增及定序。
次世代定序 (NGS) 分析 簡言之，組裝高品質讀段，選擇相對於模板基因(APRIL)含有單一胺基酸變化之彼等讀段用於進一步分析。以類似於先前描述之方式計算各突變之富集分數，其表示在FACS之後在非結合集區中發現之來自表現集區之突變的分數。
將高品質讀段與模板基因(APRIL)比對，移除含有N's、插入缺失及具有＞10個鹼基取代之讀段。將核苷酸讀段轉化成胺基酸讀段，移除相對於模板基因含有終止密碼子、非預期位置之突變或超過一個胺基酸取代的彼等胺基酸讀段。組合正向及反向胺基酸讀段，且若觀測到超過1次取代，或若重疊區域上之序列不一致，則移除組合讀段。各樣品中各突變之中值計數為1,845，範圍為453(第5個百分點)至7,760(第95個百分點)。依照考量移除觀測到小於100個讀段之突變。以類似於先前描述之方式計算各突變之富集分數：對於在非結合集區中收集之各樣品，藉由表現集區中之該突變之出現頻率將樣品中之突變之出現之位置依賴性出現頻率正規化，且藉由非結合集區中發現之變異體的分率按比例調整，如下：
Figure 02_image019
其中
Figure 02_image021
為樣品(s)之位置(p)之既定胺基酸(aa)的富集分數，
Figure 02_image023
為非結合集區中發現之變異體之分率(集區尺寸)，且
Figure 02_image025
為樣品(s)之非結合集區或表現集區中之胺基酸之觀測位置頻率(wt)。富集分數表示來自表現集區之突變之分率，其在FACS之後發現於非結合集區中(此處表示為百分比)。
自進一步分析移除至Pro、Gly或Cys之突變，同樣預測引入或移除N糖基化位點之突變。移除觀測到影響大部分蛋白質之結合的突變，因為此等突變更可能經由諸如三級或四級結構之更改的間接作用發揮其作用。藉由聚集相應位置處之各突變之效應來計算各殘基之總富集分數。具有更高富集分數之殘基反映對關於結合之突變之較大敏感性，從而指示該位置更可能作為表位之一部分。對於此研究，自進一步分析(「混雜效應」，對蛋白質摺疊之全域影響)移除其中大於50%之樣品具有＞30.0%之富集分數且其中大於75%之樣品具有＞15.0%之富集分數的突變，導致在此研究中從可能的816個突變中移除68個。
儘管對於眾多單點突變體計算富集分數，但當確定殘基是否為表位之一部分時必須考慮各位置之突變資料之聚集體。藉由聚集相應位置處之各突變之效應來計算各殘基之總富集分數。如下計算富集分數：
Figure 02_image027
其中
Figure 02_image029
為過濾後在既定位置處之胺基酸突變之數目。所計算之總殘基富集分數使展示較大富集分數之突變的效果權重明顯更大且使來自展示較低富集分數之突變的貢獻權重降低，而非各突變之富集分數之簡單求和。一旦針對各位置計算，將殘基富集分數定位至蛋白質表面上以促進藉由可視化進行之分析。
抗體及 APRIL 同源性模型化 十種結構上不同之抗體同源性模型係選自2,800個模型，該等模型係遵循公開用於選擇模型之方案中所描述之指導使用最近所描述之Rosetta抗體同源性模型化方案(實施於Rosetta 3.8中)產生。亦使用BioLuminate's(Schrödinger Release 2016-4:BioLuminate,Schrödinger,LLC,New York,NY,2016)抗體同源性模型化方案使用預設設定產生同源性模型。為2個等級最高之非同源結構模板中之每一者產生五個模型；2419之模板為3DGG及3S35，4035為1FLD及4EDW，且4540為2E27及5AZ2。
使用muAPRIL(PDB:1XU1)之結構作為模板，用Rosetta產生抗原APRIL之同源性模型。使用fixbb設計方案引入APRIL中存在之5個突變(相對於muAPRIL)，確保在同源三聚體中之鏈中之每一者處進行適當突變。隨後使用實施於Rosetta中之鬆弛方案產生抗原結構之集合，基於其Rosetta總分自100個鬆弛結構選擇25個最低得分模型。
具有約束之全域對接 簡言之，使用PIPER進行全域剛性主體對接，如在BioLuminate中使用預設設定來實施且將更高可信度富集分數併為位點約束。添加針對當突變時觀測到對結合有實質性影響之位點的有吸引力的約束(在本文中定義為殘基富集分數＞30.0%)，且添加對最低限度地影響突變時結合之位點的排斥限制(在本文中定義為殘基富集分數＜12.5%)。對20個輸入抗體同源性模型中之每一者進行全域對接，產生總共600個對接姿態(針對各樣品獲得30個表示叢集中心之位姿)。
使用以下方程式計算「表位分數」以分析各對接模型與以實驗方式確定之富集分數之間的一致性水準：
Figure 02_image031
其中ES 為表位分數，N 為具有約束之位點數目，
Figure 02_image033
為位置p 處之約束，且
Figure 02_image035
為位置p 之以實驗方式導出之富集分數(如先前所描述計算)。對於各抗體，藉由表位分數將600個對接模型定級，且選擇前25個模型作為用於進一步局部對接之起始模板。
具有 SnugDock 之局部對接 在全域對接之後，使用Ensemble SnugDock(實施於Rosetta 3.8中)使用最近所描述之方案來進行局部對接。20種抗體同源性模型用作抗體結構之集合。首先使用Rosetta放寬由BioLuminate產生之同源性模型以確保所有模型係由相同有力場產生且與相同有力場一致。將前25全域對接姿態用作用於Ensemble SnugDock之起始輸入座標，且針對每一輸入產生200個對接模型，從而產生總共5,000個對接模型。如同PIPER，基於富集分數針對SnugDock採用對接約束。為解釋同源三聚體之對稱性，將Rosetta不明確之位點約束(使用S形函數)應用於抗原殘基以使其衍生自APRIL之任何單體。局部對接中所約束之該組殘基與全域對接中所約束之殘基相等。
過濾由SnugDock產生之對接姿態以移除具有非典型抗體-抗原界面之界面的模型。獲得公開可獲得抗體-蛋白質複合物之非冗餘資料庫，4 且經策展以移除界面附近缺失區域之結構或界面處具有配體或轉譯後修飾之複合物。對於所得297複合物，計算關鍵界面特性之結構特徵之分佈，包括接合表位之CDR及構架殘基之數目、相互作用中所涉及之CDR環之數目及類型、表位殘基之數目、內埋表面積及成對殘基傾向(表 1 )。憑經驗選擇適當臨限值，使得95.2%之天然結構不損壞超過一個結構過濾器。所計算之過濾器及其臨限值列於表 1 中。針對對接模型中之每一者計算界面特性，且移除超過一個結構過濾器失效之彼等模型。基於表位定位分數過濾剩餘對接模型(如針對全域對接所描述)。由於可預期表位之周邊上之殘基對突變更具耐受性，因此對接模型允許與較小數目之具有較低富集分數之殘基接觸；此處吾人移除富集分數＜所觀測表位定位最大值之80%的模型。如使用Rosetta所計算，基於界面能量(Isc)將其餘對接模型定級。
競爭 ELISA 將經生物素標記之測試抗體(以50 ng/mL固定)及未標記之競爭性抗體(以10,000 ng/mL起始之8點連續稀釋液)以0.1 µg/孔轉移至預塗有人類APRIL之孔中。洗滌培養盤且添加抗生蛋白鏈菌素-辣根過氧化酶，隨後使用3,3',5,5'-四甲基聯苯胺基質洗滌及顯影。在經生物素標記之測試抗體之結合中部分或完全減少之觀測指示抗體與重疊或相鄰表位結合之間的競爭。將抗體歸類為「非競爭性」(若不能阻斷＞90%之結合信號)，即使當測試抗體(10,000對50 ng/ml)以200×莫耳濃度過量存在時。
製備、結晶及結構測定 人類APRIL(殘基105-250，(His)6 表位標記)及小鼠抗體2419分別在Expi293細胞中重組表現且使用鎳或蛋白質A親和性層析法純化。藉由番木瓜蛋白酶分解產生2419之Fab片段。APRIL及Fab在溶液中形成3:3複合物(如藉由尺寸排阻層析法測定)且純化複合物。使用2.2 M硫酸銨、160 mM硝酸銨、4%乙二醇及1 mM NiCl2 作為沈澱劑獲得繞射品質晶體。使用20%-36%乙二醇作為低溫保護劑，在100K下自晶體收集繞射僅至多7 Å解析度及完整X射線繞射資料組之大多數晶體(表 4 )。
表 4.X 射線資料收集及改進參數。
X射線束波長 0.9793 Å
空間群 P41 21 2
   單位晶胞參數 a =b = 209.60 Åc = 110.64 Å α = β = γ = 90°
解析度(Å) 75 - 6.5 (6.73 - 6.5) †
所量測之反射 52669
唯一反射 5176
R sym (%) 16.7 (56)†
完整度(%) 98.3 (96.8)†
I /σ 9.7 (3.0)†
冗餘度 10.2 (9.3)†
改進參數
解析度範圍(Å) 148.2-6.5
R結晶/R不含結晶(%) 29.5/36.8
鍵長,rms(Å) 0.009
鍵角,rms(°) 1.212
拉曼圖(Ramachandran plot)(%) 較佳 允許 離群值    80.8 18.8 0.4
† 最高解析度殼體。
自動旋轉函數表明偽三倍對稱性之存在，從而確認3:3 APRIL-Fab複合物藉由此偽三倍對稱性相關。藉由分子置換使用基於小鼠APRIL同源三聚體晶體結構(PDB 1U5Y)產生之同源三聚體APRIL模型以及Fab結構來解決結構，得到含有三個結合於APRIL同源三聚體之Fab分子的獨特結構解決方案。最終改進統計資料展示於表 4 中。
其他例示性方法描述於Wollacott等人,J Mol Recognit. 2019; 32(7): e2778，其內容以全文引用之方式併入。
以引用之方式併入  本文中提及之所有公開案、專利及寄存編號以全文引用的方式併入本文中，如同各個別公開案或專利專門且單獨地指定為以引用的方式併入。
等效物  儘管已論述本發明之特定實施例，但以上說明為說明書性而非限制性的。熟習此項技術者在審閱本說明書及下文申請專利範圍後，將顯而易知本發明之諸多變化形式。本發明之完整範疇以及其等效物之完整範疇，及說明書，以及此類變體，應參照申請專利範圍確定。
圖 1A- 圖 1B 為展示在APRIL之表面上詢問之位置的一系列圖式。(A)小鼠與人類APRIL之比對，其中位置在以灰色突出顯示之深度突變掃描庫中詢問。藉由使APRIL中用紅色強調之5個位置突變成huAPRIL中所發現之對應胺基酸來產生APRIL之嵌合形式。(B)APRIL同源三聚體之結構，其中選擇位置以使庫陰影灰色處多樣化，選擇該等位置以使抗原表面均勻覆蓋。表示了庫設計中所存在但未在APRIL晶體結構中觀測到的APRIL之九個N端胺基酸(結構以下之方框)；選擇兩個Lys殘基進行多樣化。
圖 2 為展示對酵母表面上表現之APRIL之抗體及TACI親和力的圖表。分析一組經純化之抗APRIL抗體(2419、4035、4540及3530)、同型對照及TACI的表現於酵母表面上之APRIL的近似親和力。使用結合等溫線來估計濃度，得到各抗體之80%最大結合，其用於庫富集。
圖 3 為展示具有計算對接工作流程之表位定位概述之一系列圖式。產生APRIL抗原庫之位點-飽和庫且藉由酵母表面呈現表示。將抗體應用於酵母庫，且進行FACS富集以富集庫之非結合成員。富集庫經歷NGS以確定且計數潛在突變。突變富集分數定位於APRIL之表面上以確定所定位抗體之假定表位區域。此等資料用於約束抗體-抗原對接，產生與突變概況資料一致之模型叢集。所得高可信度模型提供表位及互補位殘基之分子定義。
圖 4A- 圖 4B 為展示針對多種抗體及TACI之庫之FACS富集的一系列圖式。在富集之前或之後展示WT APRIL或庫酵母群之流式細胞測量術分析。X軸表示APRIL表面表現(c-myc)且Y軸表示抗體/TACI結合。第一行展現結合至表現於酵母表面上之WT APRIL的各抗體或TACI。第二行表示相同結合條件，但針對起始的非富集APRIL庫。最後一行表示兩輪FACS富集之後的富集非結合群。
圖 5A- 圖 5D 為展示所有所測試之抗APRIL抗體之突變特徵熱圖之一系列圖式。計算抗體(A)2419、(B)4035、(C)4540及(D)3530之富集熱圖(左)，其中殘基富集分數定位至各抗體之APRIL表面(右)。
圖 6A- 圖 6C 為展示TACI之表位定位展現與共晶體結構之較強一致性的一系列圖式。(A)計算TACI之富集熱圖(左)，其值定位至APRIL之表面(右)。(B) 針對經突變之各位置計算之TACI的總富集分數。表位殘基定義為具有距TACI＜5 Å之重原子距離的彼等殘基。(C)TACI與APRIL複合之結構。APRIL上與TACI接觸之突變位置(＜5 Å)展示於根據其總富集分數加陰影之球體中。
圖 7A- 圖 7B 為展示雜亂突變之實例的一系列圖式。(A)相對於所測試配位體組的APRIL之殘基V132的富集熱圖。突出顯示Asp及Glu之雜亂突變(行)，且突出顯示2419(列)之抗體-特異性突變。(B)結合至APRIL(淺灰色)之TACI(深灰色)結構。不同單體上APRIL之殘基V132及E182在含APRIL同源三聚體之情形下接近。
圖 8A- 圖 8C 為展示APRIL之同源寡聚組件之對稱性的一系列圖式，該組件置放來自鄰近分子之頂點但不靠近赤道區域的不同鏈之等效殘基位置。APRIL結構，其由鏈(A)及殘基位置(B及C)著色。(B)中之頂點處之淺灰色殘基衍生自同源三聚體之三個不同鏈。(C)APRIL同源三聚體相對於(B)旋轉90°以展示來自不同鏈之等效殘基位置在赤道區域處不臨近。
圖 9A- 圖 9D 為展示3530結合獨特地丟失為N端截短之APRIL的一系列圖表。抗體3530及TACI結合至兩種不同形式之酵母表面表現之APRIL。針對3530(A)及TACI(C)展示與全長APRIL(殘基96-241)之結合。針對3530(B)及TACI(D)展示與N端截短之APRIL(殘基106-241)之結合。
圖 10 為展示例示性計算對接工作流程之示意圖，其用於使用由衍生自深度突變掃描之突變資料告知的抗體-抗原對接來產生分子定義之表位及互補位定位圖。
圖 11A- 圖 11C 為展示模型化2419之計算對接展示與共晶體結構之良好一致的一系列圖式。(A)經計算之2419-APRIL複合物之前500對接模型之Rosetta界面分數(Isc)對相對於天然結構之界面RMSD。前100個得分對接模型加陰影：淺灰色(FW RMSD ＜5 Å)、中等灰色(5 Å＜FW RMSD ＜10 Å)及深灰色(FW RMSD ＞10 Å)。(B)2419-APRIL之頂級對接模型及2419-APRIL之天然結構的疊對，其展示較高水準之重疊。對接模型及天然結構僅基於APRIL配體之Cα座標疊加(C)以實驗方式確定與APRIL結合之2419之殘基富集分數。基於對接可信度分數(發現對應殘基在前100個對接姿態中接觸2419(＜5 Å)之頻率)將條形圖加陰影。星號指示自天然結構鑑別之接觸位置。
圖 12A- 圖 12B 為展示互補位對接得分及定位至2419之表面的位置的一系列圖式。(A)定位至2419之表面的對接可信度分數(互補位)。(B)源自huAPRIL-2419之天然結構的在黑色中著色之互補位位置。殘基之間的接觸定義為重原子距離＜5 Å。
圖 13A- 圖 13D 為展示併入至能夠收斂至接近天然的接合模式中之計算工作流程的以實驗方式導出之約束的一系列圖式。組中之前列展示具有2419之APRIL接觸殘基，該等接觸殘基按在對接模型(重原子距離＜5 Å)中殘基與抗體接觸的頻率來加陰影。底部列展示對接2419-APRIL模型或天然結構之前10個得分。(A)不具有實驗限制之全域對接。(B)併入富集分數限制之全域對接。(C)完整表位定位工作流程(受約束之全域對接，隨後受約束之SnugDock，且隨後使用抗體特異性結構過濾器)。(D)2419-APRIL之天然結構。
圖 14A- 圖 14B 為展示約束對對接結果之影響的一系列圖表。與不使用富集分數作為約束(A)且使用富集分數作為約束(B)之情況下的2419-APRIL複合物之天然結構相比，由Rosetta計算之對接界面分數對抗體配體(構架)RMSD(僅在抗原上疊加)的曲線圖。將前100個得分對接模型著色：淺灰色(FW RMSD ＜5 Å)、中等灰色(5 Å ＜FW RMSD ＜10 Å)及深灰色(FW RMSD ＞10 Å)，其中在著色灰色之前100個中之模型未被定級。
圖 15A- 圖 15C 為展示各抗體對APRIL之預測接合模式的一系列圖式。前組：基於對接可信度分數對APRIL殘基加陰影，將該APRIL殘基計算為其中抗原殘基與抗體接觸(重原子距離＜5 Å)之模型的百分比。為2419(列A)、4035(列B)及4540(列C)展示定位圖。底部組：為了清楚起見，展示單一最高得分抗體位姿與ARIL(灰色)相互作用，且阻斷TACI(中等灰色)之結合。由於抗體結合，在TACI上之預測空間對撞區域以淺灰色指示。
圖 16A- 圖 16C 為展示計算模型實現物種結合特異性之合理抗體工程的一系列圖式。(A)小鼠與人類APRIL之間的差異突出顯示於APRIL結構上。非同源突變著色為中等灰色，且同源突變以深灰色指示。各抗體(頂級模型)之對接表位以淺灰色概述展示。(B)基於對接結果預測位置E181及I219在APRIL之重鏈中接近於R54。預測在muAPRIL結構中位置181及219處之突變為精胺酸及離胺酸將導致與2419之HCDR2上之R54的不穩定相互作用。(C)藉由ELISA測定，2419及經設計之變異體抗體與muAPRIL之結合。經設計之變異體含有取代：R54D (設計1)；T28A_R54D (設計2)；L53V_R54D_S56A (設計3)。
圖 17 為展示2419再設計與人類APRIL之結合的圖表。2419及經設計之變異體與人類APRIL的ELISA結合結果。經設計之變異體含有取代：R54D (設計1)；T28A_R54D (設計2)；L53V_R54D_S56A (設計3)。半最大結合濃度為20 nM(2419)、73 nM(設計1)、63 nM(設計2)及306 nM(設計3)。

Claims (45)

  1. 一種鑑別目標多肽上之表位的方法，該方法包含： (a)將抗體分子結合至該目標多肽之複數個變異體； (b)獲得(例如富集)複數個展現與該抗體分子之結合減少(例如結合親和力減少)之變異體； (c)確定(例如計算)該複數個所獲得(例如富集)變異體中之每一者的富集分數； (d)產生抗體分子-目標多肽對接模型，其中該抗體分子-目標多肽對接模型根據該等富集分數受約束；及 (e)基於該抗體分子-目標多肽對接模型，鑑別該目標多肽上能夠由該抗體分子結合之位點； 藉此鑑別目標多肽上之表位。
  2. 如請求項1之方法，其中步驟(a)包含將該抗體分子結合至呈現該目標多肽之複數個變異體之庫。
  3. 如請求項1或2之方法，其中步驟(a)包含將該抗體分子結合至包含表現(例如呈現)該目標多肽之複數個變異體之複數個細胞的庫。
  4. 如請求項3之方法，其中該複數個細胞中之每一者表現該目標多肽之約一種相異變異體。
  5. 如請求項3或4之方法，其中該細胞為真核細胞，例如酵母細胞。
  6. 如前述請求項中任一項之方法，其中該複數個變異體包含該目標多肽之一或多個表面殘基上之突變。
  7. 如前述請求項中任一項之方法，其中該複數個變異體包含該目標多肽之所選表面殘基之相異突變。
  8. 如前述請求項中任一項之方法，其中該複數個變異體包含該目標多肽之複數個所選表面殘基中之每一者的相異突變。
  9. 如前述請求項中任一項之方法，其中相對於該目標多肽之野生型胺基酸序列，該複數個變異體包含單胺基酸取代。
  10. 如前述請求項中任一項之方法，其中相對於該目標多肽之野生型胺基酸序列，該複數個變異體中之每一者包含單胺基酸取代。
  11. 如請求項9或10之方法，其中該單胺基酸取代發生於該目標多肽之表面殘基處。
  12. 如前述請求項中任一項之方法，其中該結合減少包含相對於針對野生型目標多肽及該抗體所偵測之結合，針對該變異體及該抗體分子所偵測之結合減少。
  13. 如前述請求項中任一項之方法，其中步驟(b)包含獲得(例如富集)展現由野生型目標多肽所展現之與該抗體分子的該結合的小於約80% (例如小於約0.01%、0.1%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%或80%)的變異體。
  14. 如請求項13之方法，其中該結合減少係由該野生型目標多肽展現之該結合的至少約20% (例如至少約20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%)。
  15. 如前述請求項中任一項之方法，其中步驟(b)包含獲得(例如富集)展現由包含野生型目標多肽之細胞展現的與該抗體分子之該結合的小於約80% (例如小於約0.01%、0.1%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%或80%)的細胞。
  16. 如請求項15之方法，其中該結合減少係由包含該野生型目標多肽之細胞展現的該結合的至少約20% (例如至少約20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%)。
  17. 如前述請求項中任一項之方法，其中步驟(b)包含對展現與該抗體分子結合減少之變異體進行一或多個，例如兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或超過十個的富集。
  18. 如前述請求項中任一項之方法，其進一步包含例如在步驟(c)之前，例如藉由例如次世代定序法來定序編碼該等變異體之基因來鑑別展現與該抗體分子結合減少的該等變異體。
  19. 如前述請求項中任一項之方法，其中步驟(c)包含測定該複數個所獲得(例如富集)變異體中之每一者的出現頻率。
  20. 如請求項19之方法，其中步驟(c)進一步包含將在特定殘基處包含相異突變之各變異體之該出現頻率聚集及/或使出現頻率更高之變異體權重更大。
  21. 如前述請求項中任一項之方法，其中該富集分數對該目標多肽之該胺基酸序列的單殘基具有特異性。
  22. 如前述請求項中任一項之方法，其中各富集分數對該目標多肽之該胺基酸序列之不同單殘基具有特異性。
  23. 如前述請求項中任一項之方法，其進一步包含用該目標多肽之該複數個變異體之複製來重複步驟(a)-(c)至少一次(例如一次、兩次、三次、四次、五次或更多次)，且其中步驟(c)進一步包含省略一或多種雜亂突變，例如其中超過50%之複製具有大於30%之富集分數及其中超過75%之複製具有大於15%之富集分數的突變。
  24. 如前述請求項中任一項之方法，其中藉由添加一或多種有吸引力之約束而約束該抗體分子-目標多肽對接模型，其中該有吸引力之約束係用於具有大於第一預選值之富集分數的殘基。
  25. 如請求項24之方法，其中該第一預選值係在20%與40%之間，例如在25%與35%之間，例如約30%。
  26. 如請求項24或25之方法，其中該有吸引力之約束包含基於該富集分數之線性調整紅利(linearly scaled bonus)。
  27. 如前述請求項中任一項之方法，其中藉由對具有小於第二預選值之富集分數的殘基添加排斥約束來約束該抗體分子-目標多肽對接模型。
  28. 如請求項27之方法，其中該第二預選值係在5%與20%之間，例如在10%與15%之間，例如約12.5%。
  29. 如前述請求項中任一項之方法，其中步驟(d)包含在該抗體分子之模型與該目標多肽之模型之間產生對接姿態。
  30. 如前述請求項中任一項之方法，其中步驟(d)包含在該抗體分子之模型與該目標多肽之模型之間產生複數個對接姿態。
  31. 如請求項30之方法，其中步驟(d)進一步包含根據例如SnugDock之對接演算法對該複數個對接姿態評分。
  32. 如請求項31之方法，其中步驟(d)進一步包含選擇該複數個對接姿態之具有最高分數的子集，例如最高分數1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、300、400、500、600、700、800、900、1000或更高的對接姿態。
  33. 如請求項32之方法，其中步驟(d)進一步包含使用該複數個對接姿態之該所選子集產生整體對接姿態，及根據該整體對接姿態設定該抗體分子之該模型及該目標多肽之該模型。
  34. 如請求項29至33中任一項之方法，其中該抗體分子之該模型包含衍生自該抗體之複數個同源性模型的整體抗體同源性模型。
  35. 如前述請求項中任一項之方法，其中步驟(d)進一步包含移除以下抗體分子-目標多肽對接模型，其例如根據衍生自抗體-抗原晶體結構之結構過濾器而展現針對已知抗體-抗原複合物之非典型性接合模式。
  36. 如前述請求項中任一項之方法，其中步驟(d)包含產生複數個抗體分子-目標多肽模型。
  37. 如前述請求項中任一項之方法，其中步驟(e)包含鑑別該目標多肽上複數個能夠由該抗體分子結合之位點。
  38. 一種鑑別目標多肽上之表位的方法，該方法包含： (a)產生抗體-目標多肽對接模型，其中根據藉由包含以下之方法確定之複數個富集分數來約束該抗體-目標多肽對接模型： (i)將該抗體分子結合至該目標多肽之複數個變異體， (ii)獲得(例如富集)複數個展現與該抗體分子之結合減少之變異體，及 (iii)確定(例如計算)該複數個經富集變異體中之每一者的富集分數；及 (b)基於該抗體-目標多肽對接模型，鑑別該目標多肽上能夠由該抗體分子結合之位點； 藉此鑑別目標多肽上之表位。
  39. 一種鑑別抗體分子上之互補位的方法，該方法包含： (a)將該抗體分子結合至目標多肽之複數個變異體； (b)獲得(例如富集)複數個展現與該抗體分子之結合減少之變異體； (c)確定(例如計算)該複數個經富集變異體中之每一者的富集分數； (d)產生抗體分子-目標多肽對接模型，其中該抗體-目標多肽對接模型根據該等富集分數受約束；及 (e)基於該抗體-目標多肽對接模型，鑑別該抗體分子上能夠由該目標多肽結合之一或多個位點； 藉此鑑別抗體分子上之互補位。
  40. 一種鑑別抗體上之互補位的方法，該方法包含： (a)產生抗體-目標多肽對接模型，其中根據藉由包含以下之方法確定(例如計算)之複數個富集分數來約束該抗體-目標多肽對接模型： (i)將該抗體結合至該目標多肽之複數個變異體， (ii)獲得(例如富集)展現與該抗體分子之結合減少之變異體，及 (iii)確定(例如計算)該複數個所獲得(例如富集)變異體中之每一者的富集分數；及 (b)基於該抗體-目標多肽對接模型，鑑別該抗體分子上能夠由該目標多肽結合之一或多個位點； 藉此鑑別目標多肽上之互補位。
  41. 一種抗體分子，其中根據如前述請求項中任一項之方法鑑別針對該抗體分子之目標多肽上之表位或該目標多肽之該抗體分子上之互補位。
  42. 一種核酸分子，其編碼如請求項41之抗體分子之一或多個鏈(例如VH及/或VL)。
  43. 一種載體，其包含如請求項42之核酸分子。
  44. 一種宿主細胞，其包含如請求項42之核酸分子或如請求項43之載體。
  45. 一種製備抗體分子之方法，其包含在適合於表現該抗體分子之條件下培養如請求項44之宿主細胞。
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