KR101535678B1 - 표적 약물 개발의 방법 및 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 하나 이상의 표적 치료요법을 위한 하나 이상의 약물의 개발 방법 및 이로부터 유도된 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 한 측면에 따라, 소분자 친화성 및/또는 활성 상호작용의 확인을 위한 고처리량 스크리닝 기술과 함께 사용하기 위한 조합 화학 기술은 항원에 대한 천연 분자의 대량의 평행한 스크리닝을 수행하는 항원 반응의 천연 메카니즘을 대신 사용함으로써 회피된다. 본 발명의 다른 측면은 화합물의 치료적 사용 방법 뿐만 아니라 이로부터 유도된 조성물을 제공한다.
표적 생체분자, 면역계 단백질, 약물작용발생단, 고처리량 스크리닝 기술, 조합 화학 기술, 데이타베이스

Description

표적 약물 개발의 방법 및 조성물 {METHODS AND COMPOSITIONS OF TARGETED DRUG DEVELOPMENT}
관련 출원에 대한 교차-참고
본 출원은 2006년 1월 23일자로 출원된 미국 가출원 제60/761,123호를 우선권으로 청구하며, 상기 출원은 그 전문이 본원에 참고로 도입된다.
콤팩트 디스크로 제출된 자료의 참고에 의한 도입
본 개시물의 부분인 서열 목록은 본 발명의 뉴클레오티드 및/또는 아미노산 서열을 포함하는 컴퓨터 판독가능한 형태 및 서면의 서열 목록을 포함한다. 컴퓨터 판독가능한 형태로 기록된 서열 목록 정보는 서면의 서열 목록과 동일하다. 서열 목록의 대상은 그 전문이 본원에 참고로 도입된다.
본 발명은 일반적으로 질환의 치료에 사용하기 위한 신규 화학적 실체의 개발에 관한 것이며, 보다 구체적으로 준합리적 약물 설계에 사용하기 위한 리드 분자(lead molecule)의 확인 방법에 관한 것이다.
현대 제약 업계에서 전형적인 약물 개발은 표적 생화학적 기능의 모델 또는 검정법의 개발에 의존한다. 그 후, 이들 검정법을, 몇몇은 자연계로부터 수집될 수 있거나 또는 실험실에서 전체 합성될 수 있는 여러 소분자에 노출시킨다. 추가의 지식 없이, 실용적인 후보 리드 분자가 확인되기까지 사실상 수천 또는 수백만의 개별 화학적 노출을 수행할 수 있다. 상기 방법은 완전히 무작위이며, 사실 무작위 스크리닝이라고 지칭된다. 명백한 이유로, 상기 방법과 관련된 합리적 분자 설계는 없으며, 따라서 검정법에 대해 시험된 만번째 분자가 첫번째 분자보다 효과적일 가능성이 더 크지 않다.
상기 형태의 스크리닝 방법은 무작위이기 때문에, 성공에 도달하는 평균 시간은 다만 시험되는 여러 화학물질을 모아 검정법에 노출시키는 속도의 가속화에 의해서만 단축되므로, 예를 들어, 고처리량 스크리닝 및 조합 화학이 개발되었다.
원칙적인 무작위성 이외에, 상기 유형의 방법론은 원칙이 없기 때문에 가능한 약물-유사 화학적 구조의 수가 1080개 초과인 것으로 추정된다. 따라서, 고처리량 스크리닝 및 조합 화학의 조합된 힘을 이용하여도, 1070개 중에서 화학적 실체 하나 조차도 합성되기 어려우며, 거의 스크리닝되지 않는다. 조합 화학의 개념은 스크리닝의 다른 일련의 성질에 일정 정도의 평행 처리를 제공하는 한 여전히 가치가 있다. 그러나, 수백개의 별개의 화학적 실체의 스크리닝이 단일 트레이 상의 공간의 물리적 한계 때문에 부분적 일련의 시험에 대한 가역성을 요구하는 것이 확장성의 한계이다.
약물 제조자가 스크리닝의 필요 없이 신규 약물을 계속 개발하는 한 방법은 이미 승인된 약물을 리드로서 차후 그 부류에 더 추가하기 위해 사용하는 것이다. 즉, 효력을 향상시키거나, 부작용을 감소시키거나, 또는 섭취를 보다 용이하게 할 목적으로 변형할 수 있는가를 확인하기 위해 FDA 승인된 물질을 사용한다. 상기 이유로, 한 부류 내의 많은 약물은 매우 유사하다. 대부분의 소분자 약물이 효과적인 상호작용을 위한 특정 표적 영역 (예를 들어, 단백질)만을 가지므로, 표적으로 개입되는 부분이 보존되는 한, 다른 분자들는 유사한 활성을 나타낼 수 있다는 것이 당연하기 때문에 이것이 바로 이 경우이다.
예를 들어, 시장에는 6개 초과의 상이한 베타-차단제가 존재한다. 상기 약물 부류 중 가장 광범위하게 처방되는 버젼 중 6개의 화학적 구조는 도 1에 제공된다. 도 2는 상기 군의 구성원 모두에 실질적으로 공통적인, 일반적으로 약물작용발생단이라고 지칭되는 화학적 스캐폴드를 나타낸다.
유사한 스캐폴드 주변의 약물의 군의 상기 종류는 특별하지 않으며, 비합리적이지도 않으나; 오리지날 (또는 "최초의") 약물에 대한 시도된 변형은 심지어 이들 후속 약물의 개발 중에도 종종 무작위이다.
표적 단백질 또는 다른 생화학적 구조가 원하는 효과를 생성하는 약물에 의해 개입될 수 있는 하나의 표면 영역을 가지며, 이는 통상적으로 다양한 상이한 합리적 약물 설계 기술을 야기한다는 사실이다. 합리적 약물 개발은 원하는 활성을 나타내는 하나의 분자를 찾기 위한 맹목적인 바램으로 수천개의 분자의 무작위 스크리닝에 의해서가 아니라, 적절한 방식으로 표적의 활성 부위의 추정 및 상기 부위와 상호작용하는 화학물질의 고안에 의해 리드 분자를 개발하는 방법이다. 상기 전략은 알맞은 성공을 경험하였으나, 잠재적인 화학적 상호작용의 복잡성으로 인해 과정은 매우 어렵다. 그러나, 성공한다면, 이는 일반적으로 약물 구조가 공개될 때까지는 경쟁 약물 제조자가 카피 가공을 개시할 수 없기 때문에 장기간의 시장 점령을 종종 경험하는 최초의 약물을 제공한다.
합리적 약물 설계에 의해 제조된 약물의 예는 티로신 키나제 효소 억제제인 이마티닙 메실레이트이다. 티로신 키나제 효소는 특정 단백질에서 아미노산 티로신을 인산화하는 분자 구조의 부류이다. 인산화는 조절되지 않는 경우 암 세포 (특히, 특정 유형의 백혈병에서)의 증식에서 역할할 수 있는 것을 비롯한 신호전달 단백질에 필수적인 중요한 변형이다. ABL-BCR (사이토카인에 의해 조절되지 않고 세포를 증식하게 하며, 다시 세포가 암성 세포가 되도록 하는, 티로신 키나제를 코딩하는 키메라 유전자)에서 티로신 키나제 활성의 영역을 확인하고 특징화함으로써, 원하는 억제 활성을 가질 수 있도록 소분자를 설계하였다.
합리적 약물 개발은 성공적인 경우 최초의 약물을 제조할 수 있는 매우 유망한 기술이나, 이는 매우 지식-집약적 전략이다. 현재 이용가능한 컴퓨터 모델링 소프트웨어는 이제야 상기 방법을 실용적으로 만들기에 충분한 정확도로 단백질과 소분자의 상호작용을 예상하기에 충분하게 되었다.
합리적 약물 개발은 종종 상당한 시간 및 비용이 투자될 때까지 기본적 원하는 활성에 대한 분자의 단순한 스크리닝을 지연시키는 것도 사실이다. 이는 원하는 방식으로 표적에 개입하는 것으로 컴퓨터 상에 나타나나, 임의의 시험관내 전망을 거의 나타내지 않는 분자를 유도할 수 있다. 이를 회피하기 위해, 합리적 약물 개발의 많은 법인 지지자는 공지된 화학적 실체 (이미 이용가능한 약물을 포함함) 를 컴퓨터에서 모델링된 표적에 대해 모델링하고 스크리닝하는 컴퓨터가상실험(in silico) 스크리닝으로서 기술을 사용하는 것으로 재처리하였다. 물론, 이는 이미 공지된 분자에 대한 편견으로부터의 자유라는 이 기술의 주요 장점 중 하나를 제거한다.
이들 단점은 합리적 약물 개발에 많이 투자한 몇몇 회사를 다시 과거의 무작위 스크리닝 기술로 되돌아가게 하였다. 사실, 많은 회사는 합리적 약물 설계를 심각하게 취급하지 않으며, 이를 위한 기술의 진보를 대학 및 국가 실험실에게 남겨두었다.
같은 이유로, 고처리량 스크리닝 및 조합 화학 접근법의 조합의 단점은 명백히 무엇보다 첫째로 기술의 공급원 집약성, 및 두번째로 법인 실체가 동일한 상태의 치료를 위한 최초의 약물 개발로부터 반복적 개선까지 개발의 많은 부분을 이끌어야 한다는 사실이다.
당분야는 고처리량 스크리닝 및 조합 화학의 장점을 합하는 약물 리드 확인 및 개발의 방법으로부터 이득, 즉, 합리적 약물 설계의 장점으로 강하게 작용하는 후보를 찾기 위해 수천개의 많은 화학적 실체를 실험하는 능력, 즉 감소된 비용으로 최초의 약물의 개발의 잠재성을 얻을 것이다.
<발명의 요약>
본 발명의 여러 측면 중에서, 표적 (예를 들어, 단백질 또는 다른 대분자)에 결합하는 화학적 구조를 발견하기 위해 살아있는 숙주 내의 사실상 수조 개의 화학적 구조를 시험할 수 있는 방법의 제공; 표적에 결합하는 화학적 구조가 원하는 활 성을 제공하는가를 결정하기 위한 표준 검정 기술의 사용; 및/또는 소분자 리드의 구축을 안내하는 화학적 구조의 결합에 대한 이미 공지된 사실의 사용이다.
본 발명의 한 측면은 표적 생체분자에 대하여 원하는 제약 활성을 갖는 분자 구조의 제조 방법에 관한 것이다. 이러한 방법은 표적 생체분자에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 면역계 단백질을 제공하는 단계; 면역계 단백질의 원자의 적어도 한 부분과 표적 생체분자의 결합 부위와의 상호작용이 결합을 야기하는, 면역계 단백질의 원자의 적어도 한 부분의 동일성 및 공간 배향을 결정하는 단계; 및 약물작용발생단 구조적 특성이 표적 생체분자의 결합 부위에 상보적이 되도록, 면역계 단백질에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 면역계 단백질의 원자의 동일성 및 공간 배향의 적어도 한 부분을 모방하는 하나 이상의 약물작용발생단 특성의 모델을 포함하는 약물작용발생단을 구축하는 단계를 포함한다.
상기 측면의 여러 실시양태에서, 상기 방법은 애노테이션된 리간드 분자의 데이타베이스의 약물작용발생단 가설 조회를 이용해 후보 분자를 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 여기서 확인된 후보 화합물은 하나 이상의 약물작용발생단 특성에 대해 실질적으로 정렬하는 구조를 갖는다. 상기 측면의 여러 실시양태에서, 상기 방법은 표적 생체분자의 결합 부위에 대한 후보 분자의 도킹 친화성을 결정하는 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 여기서 도킹 친화성은 표적 생체분자와 후보 분자의 상호작용시 얻어지는 에너지, 최저 에너지 형태에 비해 도킹된 형태를 얻는데 필요한 에너지, 또는 이들의 조합에 의해 정량된다.
여러 실시양태에서, 면역계 단백질은 표적 생체분자의 활성을 변경시키는 능 력을 갖는다. 예를 들어, 면역계 단백질은 표적 생체분자의 활성을 억제하는 능력을 갖는다.
여러 실시양태에서, 표적 생체분자에 특이적으로 결합하고 표적 생체분자의 활성을 변경시키는 능력을 갖는 하나 이상의 면역계 단백질을 제공하는 단계는 표적 생체분자가 생체내 활성을 모방하는 활성을 디스플레이하는 검정법을 제공하는 단계; 검정법에서 표적 생체분자에 대한 결합 친화성을 갖는 다수의 면역계 단백질을 표적 생체분자에 노출시키는 단계; 및 검정법 내에서 표적 생체분자의 활성을 변경시키는 능력을 갖는 하나 이상의 면역계 단백질을 선택하는 단계를 포함한다.
여러 실시양태에서, 표적 생체분자에 특이적으로 결합하는 면역계 단백질은 또한 그의 부분에서 표적 생체분자와 상이한 하나 이상의 관련 생체분자에 결합하나, 여기서 표적 분자의 활성 및 구조의 유사한 또는 동일한 부분은 관련 생체분자에 의해 보유된다. 여러 실시양태에서, 면역계 단백질은 주요 조직적합성 복합체, T-세포 수용체, β-세포 수용체 또는 항체, 바람직하게는 모노클로날 항체이다.
여러 실시양태에서, 모노클로날 항체의 원자의 적어도 한 부분의 동일성 및 공간 배향을 결정하는 단계는 모노클로날 항체의 결합 팁의 원자의 적어도 한 부분, 바람직하게는 하나 이상의 모노클로날 항체의 결합 팁의 원자의 실질적인 부분의 동일성 및 공간 배향을 결정하는 것을 포함한다.
여러 실시양태에서, 약물작용발생단 특성은 소수성, 방향족, 수소 결합 수령체, 수소 결합 공여체, 양이온 및 음이온 특성으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 특성을 포함한다.
여러 실시양태에서, 표적 생체분자는 단백질, 바람직하게는 효소, 신호전달 단백질 또는 수용체 단백질이다.
여러 실시양태에서, 표적 생체분자는 구저병의 원인물질, 안지오텐신 II; ErbB2; Flu 응집소; Flu 적혈구응집소; Flu 뉴라미니다제; 감마 인터페론; HER2; 네이세리아 메닝기티디스(Neisseria Meningitidis); HIV1 프로테아제; HIV-1 역전사효소; 리노바이러스; 혈소판 피브리노겐 수용체; 살모넬라(Salmonella) 올리고당류; TGF-α; 트롬보포이에틴; 조직 인자; 본 윌렌브랜드(Von Willenbrand) 인자; VEGF; 코로나바이러스 (SARS); 라임병의 원인물질, HIV GP120; HIV GP41; 웨스트 나일 바이러스; 디히드로폴레이트 리덕타제; 및 EGFR에서 선택된다. 바람직하게는, 표적 생체분자는 EGFR, VEGF, HER2 및 ErbB2, 가장 바람직하게는 EGFR이다.
여러 실시양태에서, 하나 이상의 면역계 단백질의 원자의 적어도 한 부분의 동일성 및 공간 배향을 결정하는 단계는 하나 이상의 면역계 단백질의 결정질 형태, 바람직하게는 표적 생체분자에 결합된 하나 이상의 면역계 단백질의 결정질 형태로부터 유도된 X-선 결정학 데이타의 분석을 포함한다.
여러 실시양태에서, 하나 이상의 면역계 단백질의 원자의 적어도 한 부분의 동일성 및 공간 배향을 결정하는 단계는 하나 이상의 면역계 단백질의 펩티드 서열을 결정하는 단계; 면역계 단백질의 삼차원 구조의 가상 모델을 제조하는 단계; 및 표적 생체분자의 결합 부위와 상호작용하여 결합을 야기하는 하나 이상의 면역계 단백질의 원자의 적어도 한 부분의 동일성 및 공간 배향을 결정하기 위해, 면역계 단백질의 삼차원 구조의 가상 모델을 분석하는 단계를 포함한다.
한 실시양태에서, 표적 생체분자에 대하여 원하는 제약 활성을 갖는 분자 실체의 제조 방법은 (i) 표적 생체분자의 결합 부위와 상호작용하여 결합을 야기하는 다수의 원자를 포함하는 결합 팁을 포함하고, 표적 생체분자에 특이적으로 결합하고 표적 생체분자의 활성을 억제하는, 하나 이상의 모노클로날 항체를 제공하는 단계; (ii) 표적 생체분자에 결합된 하나 이상의 모노클로날 항체의 결정질 형태로부터 유도된 X-선 결정학 데이타의 분석을 포함하는, 표적 생체분자의 결합 부위와 상호작용하는 결합 팁 원자의 실질적인 부분의 동일성 및 공간 배향을 결정하는 단계; (iii) 표적 생체분자의 결합 부위와 상호작용하는 하나 이상의 모노클로날 항체 결합 팁 원자의 약 75％ 이상의 동일성 및 공간 배향을 모방하며; 표적 생체분자의 결합 부위에 상보적이고; 소수성, 방향족, 수소 결합 수령체, 수소 결합 공여체, 양이온 및 음이온으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 특성을 포함하는, 다수의 약물작용발생단 특성을 포함하는 약물작용발생단을 구축하는 단계; 및 (iv) 애노테이션된 리간드 분자의 데이타베이스의 약물작용발생단 가설 조회를 이용해 후보 분자를 확인하는 단계 (여기서, 확인된 후보 화합물은 하나 이상의 약물작용발생단 특성에 대해 실질적으로 정렬하는 구조를 갖고; 효소, 신호전달 단백질 또는 수용체 단백질인 표적 생체분자의 활성을 억제함)를 포함한다.
본 발명의 다른 측면은 EGFR 억제용 제약 조성물에 관한 것이다. 이러한 제약 조성물은 하기 화학식 1, 화학식 7, 화학식 14, 화학식 19 및 화학식 25로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 EGFR 억제제 또는 그의 입체이성질체 또는 다형체, 및 제약상 허용되는 담체 또는 희석제를 포함한다. 화학식들은 아래와 같다:
Figure 112008059781518-pct00001
Figure 112008059781518-pct00002
Figure 112008059781518-pct00003
Figure 112008059781518-pct00004
Figure 112008059781518-pct00005
상기 식들에서, S1 내지 S8은 할로겐, 히드록실, 술프히드릴, 카르복실레이트, 알킬, 시클로알킬, 아릴 및 알콕실 (-OR)로 구성된 군에서 독립적으로 선택되고; X는 H2, O, S, N-R, N-OH 및 N-NR2로 구성된 군에서 선택되고; Het은 임의의 고리 위치에서의 하나 이상의 N 원자이고; Z은 -COOH, -PO3H2, SO3H, 테트라졸 고리, 술폰아미드, 아실 술폰아미드, -CONH2 및 -CONR2로 구성된 군에서 선택되고; R은 할로겐, 히드록실, 술프히드릴, 카르복실레이트, 아릴, 헤테로아릴, 아미노, 치환된 아미노, 또는 5 또는 6원 고리에서 1, 2 또는 3개의 N 원자를 함유하는 시클로아미노로 임의로 치환된 C1-C6 직쇄 또는 분지된 알킬기이다.
본 발명의 다른 측면은 치료 유효량의 본 발명의 제약 조성물을 포함하는 조성물을 EGFR과 관련된 질환 또는 장애의 치료를 필요로 하는 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, EGFR과 관련된 질환 또는 장애의 치료 방법에 관한 것이다. 이러한 조성물은 하기 화학식 6, 화학식 13, 화학식 18, 화학식 24 및 화학식 30, 또는 그의 입체이성질체 또는 다형체으로 구성된 군에서 선택된 EGFR 억제제를 포함한다. 구조들은 아래와 같다:
Figure 112008059781518-pct00006
Figure 112008059781518-pct00007
Figure 112008059781518-pct00008
Figure 112008059781518-pct00009
Figure 112008059781518-pct00010
다른 목적 및 특성은 부분적으로 명백하게 될 것이며, 부분적으로 이하 지적될 것이다.
당업자는 하기 기재된 도면이 예시적 목적만을 위한 것이라는 것을 이해할 것이다. 도면은 임의의 방법으로 본 교시의 범위를 제한하려는 것이 아니다.
도 1A 내지 1F는 각각 아테놀롤, 비소프롤롤, 메토프롤롤, 라베탈롤, 프로프라놀롤 및 카르베딜롤의 화학적 구조를 나타낸다.
도 2는 아테놀롤, 비소프롤롤, 메토프롤롤, 라베탈롤, 프로프라놀롤 및 카르베딜롤 각각에 의해 실질적으로 도입된 공통적인 화학적 주쇄를 나타낸다.
도 3은 IgG 분자의 표시이다.
도 4는 2개의 Fab 항체 단편에 결합된 이량체화된 VEGF 단백질의 Jmol 표시이며, 여기서 박스의 결합 영역은 확대된 것이다.
도 5는 VEGF 이량체의 리본 모델이다.
도 6A 및 6B는 VEGF에 대한 잠재적 활성을 갖는 리드 분자의 화학적 구조이 며, 여기서 상기 리드 분자는 본 발명의 방법에 의해 고려된 바와 같이 VEGF에 대한 고친화성을 갖는 항체의 결합 부분을 기초로 설계되었다.
도 7A 및 7B는 적혈구응집소에 대한 잠재적 활성을 갖는 리드 분자의 화학적 구조이며, 여기서 상기 리드 분자는 본 발명의 방법에 의해 고려된 바와 같이 적혈구응집소에 대한 고친화성을 갖는 항체의 결합 부분을 기초로 설계되었다.
도 8은 안지오게닌의 분자에 결합된, 안지오게닌에 대한 고친화성을 갖는 Fab 단편의 Jmol 이미지이며, 여기서 안지오게닌 분자와 Fab 단편의 결합 영역 사이의 경계면에서 박스의 영역은 확장된 것이다.
도 9A 및 9B는 안지오게닌에 대한 잠재적 활성을 갖는 2개의 리드 분자의 화학적 구조이며, 여기서 상기 리드 분자는 본 발명의 방법에 의해 고려된 바와 같이 안지오게닌에 대한 고친화성을 갖는 항체의 2개의 밀접하게 관련된 결합 부분을 기초로 설계되었다.
도 10A 및 10B는 각각 도 9A 및 9B의 리드 분자의 공 막대 모델이다.
도 11은 항체 세툭시맙의 영역 gly54_asp58 상에 중첩된, 결정 1YY9.pdb로부터 유도된 약물작용발생단 1_gly54_asp58을 나타낸다.
도 12는 항체 세툭시맙의 영역 gly54_asp58 상에 중첩된, 결정 1YY9.pdb로부터 유도된 약물작용발생단 11_gly54_asp58을 나타낸다.
도 13은 항체 세툭시맙의 영역 gly54_asp58 상에 중첩된, 결정 1YY9.pdb로부터 유도된 약물작용발생단 21_gly54_asp58을 나타낸다.
도 14는 항체 세툭시맙의 영역 gly54_asp58 상에 중첩된, 결정 1YY9.pdb로부 터 유도된 약물작용발생단 22_gly54_asp58을 나타낸다.
도 15는 항체 세툭시맙의 영역 gly54_asp58 상에 중첩된, 결정 1YY9.pdb로부터 유도된 약물작용발생단 23_gly54_asp58을 나타낸다.
도 16은 항체 세툭시맙의 영역 gly54_asp58 상에 중첩된, 결정 1YY9.pdb로부터 유도된 약물작용발생단 24_gly54_asp58을 나타낸다.
도 17은 항체 세툭시맙의 영역 thr100_glu105 상에 중첩된, 결정 1YY9.pdb로부터 유도된 약물작용발생단 1_thr100_glu105를 나타낸다.
도 18은 항체 세툭시맙의 영역 thr100_glu105 상에 중첩된, 결정 1YY9.pdb로부터 유도된 약물작용발생단 2_thr100_glu105를 나타낸다.
도 19는 항체 세툭시맙의 영역 thr100_glu105 상에 중첩된, 결정 1YY9.pdb로부터 유도된 약물작용발생단 3_thr100_glu105를 나타낸다.
도 20은 항체 세툭시맙의 영역 thr100_glu105 상에 중첩된, 결정 1YY9.pdb로부터 유도된 약물작용발생단 10_thr100_glu105를 나타낸다.
도 21은 항체 세툭시맙의 영역 thr100_glu105 상에 중첩된, 결정 1YY9.pdb로부터 유도된 약물작용발생단 21_thr100_glu105를 나타낸다.
도 22는 항체 세툭시맙의 영역 thr100_glu105 상에 중첩된, 결정 1YY9.pdb로부터 유도된 약물작용발생단 22_thr100_glu105를 나타낸다.
도 23은 항체 세툭시맙의 영역 tyr101_ser106 상에 중첩된, 결정 1CZ8.pdb로부터 유도된 약물작용발생단 1n을 나타낸다.
도 24는 항체 세툭시맙의 영역 tyr101_ser106 상에 중첩된, 결정 1CZ8.pdb로 부터 유도된 약물작용발생단 2n을 나타낸다.
도 25는 항체 세툭시맙의 영역 tyr101_ser106 상에 중첩된, 결정 1CZ8.pdb로부터 유도된 약물작용발생단 3n을 나타낸다.
도 26은 항체 세툭시맙의 영역 tyr101_ser106 상에 중첩된, 결정 1CZ8.pdb로부터 유도된 약물작용발생단 4n을 나타낸다.
도 27은 항체 세툭시맙의 영역 tyr101_ser106 상에 중첩된, 결정 1CZ8.pdb로부터 유도된 약물작용발생단 6n을 나타낸다.
도 28은 항체 세툭시맙의 영역 tyr101_ser106 상에 중첩된, 결정 1CZ8.pdb로부터 유도된 약물작용발생단 7n을 나타낸다.
도 29는 항체 세툭시맙의 영역 tyr101_ser106 상에 중첩된, 결정 1CZ8.pdb로부터 유도된 약물작용발생단 10b를 나타낸다.
도 30은 항체의 영역 arg50, tyr92-thr94, gly103 상에 중첩된, 결정 1N8Z.pdb로부터 유도된 약물작용발생단 1b를 나타낸다.
도 31은 항체의 영역 arg50, tyr92-thr94, gly103 상에 중첩된, 결정 1N8Z.pdb로부터 유도된 약물작용발생단 2b를 나타낸다.
도 32는 항체의 영역 arg50, tyr92-thr94, gly103 상에 중첩된, 결정 1N8Z.pdb로부터 유도된 약물작용발생단 2n을 나타낸다.
도 33은 항체의 영역 arg50, tyr92-thr94, gly103 상에 중첩된, 결정 1N8Z.pdb로부터 유도된 약물작용발생단 3n을 나타낸다.
도 34는 항체의 영역 asp31_tyr32, asn_52_pro52a_asn53 상에 중첩된, 결정 1S78.pdb로부터 유도된 약물작용발생단 5n을 나타낸다.
도 35는 항체의 영역 asp31_tyr32, asn_52_pro52a_asn53 상에 중첩된, 결정 1S78.pdb로부터 유도된 약물작용발생단 6b를 나타낸다.
도 36은 항체의 중쇄 tyr50_thr57 영역 상에 중첩된, 결정 2EXQ.pdb로부터 유도된 약물작용발생단 3h를 나타낸다.
도 37은 항체의 중쇄 tyr50_thr57 영역 상에 중첩된, 결정 2EXQ.pdb로부터 유도된 약물작용발생단 4h를 나타낸다.
도 38은 항체의 중쇄 tyr50_thr57 영역 상에 중첩된, 결정 2EXQ.pdb로부터 유도된 약물작용발생단 5h를 나타낸다.
도 39는 항체의 중쇄 tyr50_thr57 영역 상에 중첩된, 결정 2EXQ.pdb로부터 유도된 약물작용발생단 6h를 나타낸다.
도 40은 항체의 중쇄 tyr50_thr57 영역 상에 중첩된, 결정 2EXQ.pdb로부터 유도된 약물작용발생단 7h를 나타낸다.
도 41은 항체의 중쇄 tyr50_thr57 영역 상에 중첩된, 결정 2EXQ.pdb로부터 유도된 약물작용발생단 8h를 나타낸다.
도 42는 항체의 중쇄 tyr50_thr57 영역 상에 중첩된, 결정 2EXQ.pdb로부터 유도된 약물작용발생단 9h를 나타낸다.
도 43은 항체의 경쇄 Asn32_Ile33_Gly34, Tyr49_His50_Gly51, Tyr91, Phe94 및 Trp96 영역 상에 중첩된, 결정 2EXQ.pdb로부터 유도된 약물작용발생단 1L 및 2L (동일)을 나타낸다.
도 44는 항체의 경쇄 Asn32_Ile33_Gly34, Tyr49_His50_Gly51, Tyr91, Phe94 및 Trp96 영역 상에 중첩된, 결정 2EXQ.pdb로부터 유도된 약물작용발생단 3L을 나타낸다.
도 45는 세툭시맙의 단백질 결정 구조 (1YY9.pdb)로부터의 잔기 GLY-54 내지 ASP-58로 중첩된 약물작용발생단 1_gly54_asp58을 나타낸다. 부피 구속은 약물작용발생단 조회 중에 표적 단백질의 원자의 위치를 점거하도록 위치된 "모형" 구 (흑회색)의 군으로, EGFR 표적 단백질 (서열 1)에 의해 점거된 공간을 배제하는데 사용되었다. 상기 표시는 EGFR 표적 단백질의 표면 국소해부학을 모방하는데 사용된다.
도 46은 애노테이션된 EGFR의 아미노산 잔기로 2D 모델로서 EGFR에 도킹된 화합물 AD4-1025를 도시하는 다이아그램이다.
도 47은 3D 막대 모델 도면 (A) 또는 3D 접촉 표면 도면 (B)로서 EGFR에 도킹된 화합물 AD4-1038을 도시하는 다이아그램이다.
도 48은 애노테이션된 EGFR의 아미노산 잔기로 2D 모델로서 EGFR에 도킹된 화합물 AD4-1010을 도시하는 다이아그램이다.
도 49는 애노테이션된 EGFR의 아미노산 잔기로 2D 모델로서 EGFR에 도킹된 화합물 AD4-1009를 도시하는 다이아그램이다.
도 50은 애노테이션된 EGFR의 아미노산 잔기로 2D 모델로서 EGFR에 도킹된 화합물 AD4-1016을 도시하는 다이아그램이다.
도 51은 애노테이션된 EGFR의 아미노산 잔기로 2D 모델로서 EGFR에 도킹된 화합물 AD4-1017을 도시하는 다이아그램이다.
도 52는 애노테이션된 EGFR의 아미노산 잔기로 2D 모델로서 EGFR에 도킹된 화합물 AD4-1018을 도시하는 다이아그램이다.
도 53은 애노테이션된 EGFR의 아미노산 잔기로 2D 모델로서 EGFR에 도킹된 화합물 AD4-1020을 도시하는 다이아그램이다.
도 54는 애노테이션된 EGFR의 아미노산 잔기로 2D 모델로서 EGFR에 도킹된 화합물 AD4-1021을 도시하는 다이아그램이다.
도 55는 애노테이션된 EGFR의 아미노산 잔기로 2D 모델로서 EGFR에 도킹된 화합물 AD4-1022를 도시하는 다이아그램이다.
도 56은 애노테이션된 EGFR의 아미노산 잔기로 2D 모델로서 EGFR에 도킹된 화합물 AD4-1027을 도시하는 다이아그램이다.
도 57은 애노테이션된 EGFR의 아미노산 잔기로 2D 모델로서 EGFR에 도킹된 화합물 AD4-1030을 도시하는 다이아그램이다.
도 58은 3D 막대 모델 도면 (A) 또는 3D 접촉 표면 도면 (B)로서 EGFR에 도킹된 화합물 AD4-1132를 도시하는 다이아그램이다.
도 59는 애노테이션된 EGFR의 아미노산 잔기로 2D 모델로서 EGFR에 도킹된 화합물 AD4-1132를 도시하는 다이아그램이다.
도 60은 3D 막대 모델 도면 (A) 또는 3D 접촉 표면 도면 (B)로서 EGFR에 도킹된 화합물 AD4-1142를 도시하는 다이아그램이다.
도 61은 애노테이션된 EGFR의 아미노산 잔기로 2D 모델로서 EGFR에 도킹된 화합물 AD4-1142를 도시하는 다이아그램이다.
본 발명은 하나 이상의 표적 치료요법을 위한 하나 이상의 약물을 개발하기 위한 방법 및 장치에 관한 것이다. 본 발명의 한 측면에 따라, 소분자 친화성 및 활성 상호작용을 확인하기 위한 고처리량 스크리닝 기술과 사용하기 위한 조합 화학 기술은 항원에 대한 천연 분자의 대량의 평행한 스크리닝을 수행하는 항원 반응의 천연 메카니즘을 대신 사용함으로써 회피된다.
유사하게, 본 발명의 다른 측면에 따라, 합리적 약물 설계 기술은 표적 구조에 대한 고친화성을 갖는 것으로 공지되어 있는 이뮤노글로불린과 같은 생물학적으로 합성된 분자의 분자 하위구조를 복제하는 것을 기초로 하는 제약 개발을 위한 리드 분자의 개발로 안내될 수 있다.
요약해서, 하나 이상의 표적 치료요법을 위한 약물의 개발 방법의 바람직한 실시양태은 다음과 같다. 면역계 단백질 (예를 들어, 항체, 바람직하게는 모노클로날 항체)은 표적 생체분자, 바람직하게는 단백질, 보다 바람직하게는 효소에 대해 생성된다. 표적 분자 및 면역계 단백질 간의 결합 상호작용은 예를 들어 결정학 데이타를 통해 특징화된다. 결합 특징화로부터 단백질 결합 도메인이 정의된다. 단백질 결합 도메인은 하나 이상의 약물작용발생단 특성으로서 표현될 수 있고/거나 하나 이상의 약물작용발생단 특성을 포함하는 약물작용발생단 모델에 컴파일될 수 있다. 약물작용발생단 특성은 일반적으로 표적 생체분자와의 복합체에서 면역계 단백질의 상응하는 잔기로부터 유도될 수 있다. 약물작용발생단은 이러한 태스크를 위해 설계된 소프트웨어에 따라 제조될 수 있다. 후보 분자 (예를 들어, 하나 이상의 화학적 라이브러리로부터의 후보 분자)는 약물작용발생단 모델에 대해 정렬하는 분자로부터 선택된다. 바람직하게는, 후보 분자는 표적 면역계 단백질과의 상호작용을 위해 컴퓨터가상실험에서 도킹되고 점수매겨진다. 다시, 도킹 및 점수매김은 이러한 태스크를 위해 설계된 소프트웨어에 따라 수행될 수 있다. 하나 이상의 약물작용발생단 모델로 정렬하는 분자의 선택 후, 이러한 분자가 컴퓨터가상실험에서 임의로 도킹되고 점수매겨지는 경우, 선택된 분자는 예를 들어 화학적 합성에 의해 또는 상업적 공급원으로부터 얻어진다. 선택된 분자는 표적 생체분자에 대한 결합 친화성 및/또는 기능에 대한 효과에 대해 측정될 수 있다. 이러한 분석은 일반적으로 생물학적 검정법에 따라 수행된다. 시험된 분자는 바람직한 측정된 파라미터에 따라 추가로 선택될 수 있다. 선택된 분자 및/또는 추가로 선택된 분자는 임의로 추가로 최적화될 수 있다.
생체분자 표적 선택
본 발명의 방법에 의해 제조된 리드 분자를 위한 생체분자 표적의 유형으로는 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드 (및 그의 화학적 유도체), DNA (이중 가닥 또는 단일 가닥), 전체 RNA, 전령 RNA, cRNA, 미토콘드리아 RNA, 인공 RNA, 아프타머 PNA (펩티드 핵산) 폴리클로날, 모노클로날, 재조합, 조작된 항체, 항원, 합텐, 항체 FAB 하위단위 (필요하다면 변형됨) 단백질, 변형된 단백질, 효소, 효소 보조인자 또는 억제제, 단백질 복합체, 렉틴, 히스티딘 표지된 단백질, 히스티딘-태그 성분 (HIS-태그)에 대한 킬레이터, 태그가 부착된 단백질, 인공 항체, 분자 날인, 플라스티바디 막 수용체, 전세포, 세포 단편 및 세포 하위구조, 시냅스, 효능제(agonist)/길항제, 세포, 세포 소기관, 예를 들어 마이크로솜 소분자, 예컨대 벤조디아제핀, 프로스타글란딘, 항생제, 약물, 대사물질, 약물 대사물질, 천연 생성물, 탄수화물 및 유도체, 천연 및 인공 리간드 스테로이드, 호르몬 펩티드, 천연 또는 인공 중합체, 분자 프로브, 천연 및 인공 수용체, 및 그의 화학적 유도체, 킬레이팅제, 크라운 에테르, 리간드, 분자상 어셈블리 인디케이터 (pH, 전위, 막 전위, 산화환원 전위), 및 조직 샘플 (조직 마이크로어레이)을 들 수 있다는 것이 이해될 것이다. 표적 생체분자는 바람직하게는 단백질, 보다 바람직하게는 효소이다.
바람직한 표적 효소로는 단백질-항체 결정학 데이타가 존재하는 효소가 포함된다. 본 발명의 여러 방법은 구저병 (1QGC.pdb); 안지오텐신 Il (1CKO.pdb, 3CK0.pdb, 2CK0.pdb); 페르투주맙 항체와 복합체를 형성한 ErbB2 (1L7I.pdb, 1S78.pdb, 2GJJ. pdb); Flu 응집소 (1DNO.pdb, 1OSP.pdb); Flu 적혈구응집소 (1EO8.pdb, 1QFU.pdb, 2VIR.pdb, 2VIS.pdb, 2VIT.pdb, 1KEN.pdb, 1FRG.pdb, 1HIM.pdb, 1HIN.pdb, 1IFH.pdb); Flu 뉴라미니다제 (NC10.pdb, 1AI4.pdb, 1NMB.pdb, 1NMC.pdb, 1NMA.pdb, 1NCA.pdb, 1NCD.pdb, 2AEQ.pdb, 1NCB.pdb, 1NCC.pdb, 2AEP.pdb); 감마 인터페론 (HuZAF.pdb, 1T3F.pdb, 1B2W.pdb, 1B4J.pdb, 1T04.pdb); 헤르셉틴과 복합체를 형성한 HER2 (1N8Z.pdb, 1FVC.pdb); 네이세리아 메닝기티디스 (1MNU.pdb, 1MPA.pdb, 2MPA.pdb, 1UWX.pdb); HIV1 프로테아제 (1JP5.pdb, 1CL7.pdb, 1MF2.pdb, 2HRP.pdb, 1SVZ.pdb); HIV-1 역전사효소 (2HMI.pdb, 1J5O.pdb, 1N5Y.pdb, 1N6Q.pdb, 1HYS.pdb, 1C9R.pdb, 1HYS.pdb, 1R08.pdb, 1T04.pdb, 2HRP.pdb); 리노바이러스 (1FOR.pdb, 1RVF.pdb, 1BBD.pdb, 1A3R.pdb, 1A6T.pdb); 혈소판 피브리노겐 수용체 (1TXV.pdb, 1TY3.pdb, 1TY5.pdb, 1TY6.pdb, 1TY7.pdb); 살모넬라 올리고당류 (1MFB.pdb, 1MFC.pdb, 1MFE.pdb); TGF-알파 (1E4W.pdb, 1E4X.pdb); TN1과 복합체를 형성한 트롬보포이에틴 (1V7M.pdb, 1V7N.pdb); 5G9와 복합체를 형성한 조직 인자 (1FGN.pdb, 1AHW.pdb, 1JPS.pdb, 1UJ3.pdb); NMC-4와 복합체를 형성한 본 윌렌브랜드 인자 (1OAK.pdb, 2ADF.pdb, 1FE8.pdb, 1FNS.pdb, 2ADF.pdb); B20-4와 복합체를 형성한 VEGF (2FJH.pdb, 2FJF.pdb, 2FJG.pdb, 1TZH.pdb, 1TZI.pdb, 1CZ8.pdb, 1BJ1.pdb); 코로나바이러스 - SARS (2DD8.pdb, 2G75.pdb); 라임병 (1P4P.pdb, 1RJL.pdb); HIV GP120 (lACY.pdb, 1F58.pdb, 1G9M.pdb, 1G9N.pdb, 1GC1.pdb, 1Q1J.pdb, 1QNZ.pdb, 1RZ7.pdb, 1RZ8.pdb, 1RZF.pdb, 1RZG.pdb, 1RZI, 1RZJ.pdb, 1RZK.pdb, 1YYL.pdb, 1YYM.pdb, 2B4C.pdb, 2F58.pdb, 2F5A.pdb); HIV GP41 (1TJG.pdb, 1TJH.pdb, 1TJI.pdb, 1U92.pdb, 1U93.pdb, 1U95.pdb, 1U8H.pdb, 1U8I.pdb, 1U8J.pdb, 1U8K.pdb, 1U8P.pdb, 1U8Q.pdb, 1U91.pdb, 1U8L.pdb, 1U8M.pdb, 1U8N.pdb, 1U8O.pdb, 2F5B); 웨스트 나일 바이러스 (미국 특허 출원 공보 제2006/0115837호에 정의된 바와 같음); 말라리아 (디히드로폴레이트 리덕타제) (문헌 [Acta Crystallographia (2004), D60(11), 2054 - 2057]에 정의된 바와 같음); 및 EGFR (1I8I.pdb, 1I8K.pdb, 1YY8.pdb, 1YY9.pdb, 2EXP.pdb, 2EXQ.pdb)을 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 단백질 표적 (리간드로 결정화됨)에 대한 약물작용발생단 모델의 제조에 사용될 수 있다.
면역계 단백질 구조 및 기능
표적 생체분자에 결합하는 것으로 확인된 면역계 단백질은 표적 생체분자의 유기 소분자 억제제, 또는 그의 약물작용발생단의 선택 및/또는 구축을 지정하는 주형으로서 사용된다. 일반적으로, 면역계 단백질은 비-자가 단백질에 결합하는 단백질이다. 여러 실시양태에서, 면역계 단백질은 표적 생체분자에 대해 생성된다. 면역계에서 생성된 다중 구조가 상응하는 분자 구조에 대해 선택적으로 높은 친화성을 나타낸다는 것이 이해될 것이다. 이들로는 예를 들어, 주요 조직적합성 복합체, 여러 T- 및 β-세포 수용체, 및 항체를 들 수 있다. 이들 구조 중 임의의 한 구조는 본 발명의 단계에서 사용될 수 있으나, 그의 바람직한 실시양태를 기재하기 위해 항체가 언급될 수 있다. 당업자는 하기 논의가 다른 면역계 단백질에도 적용된다는 것을 이해할 것이다.
바람직하게는, 면역계 단백질은 예를 들어 유도된 맞음새에 의해 유발된 구조적 변형이 없거나 또는 거의 없이 비-자가 단백질에 결합한다. 상기 부류의 분자를 적어도 부분적으로 본원에 기재된 방법에 바람직하게 하는 여러 면역계 단백질의 상기 특성이 이것이다. 여러 실시양태에서, 면역계 단백질은 결합 이전 및 이후 구조에서 약 95％ 이상 불변, 보다 바람직하게는 약 98％ 이상 불변이다. 바꿔 말하면, 바람직한 면역계 단백질은 비-자가 단백질 표적으로의 결합시 원자의 공간 위치에 의해 측정된 바와 같이 약 5％ 미만 또는 약 2％ 미만의 형태 변화를 일으킨다. 예를 들어, 여러 실시양태의 면역계 단백질은 생체분자 표적으로의 결합 이후 약 3 Å 미만 또는 약 2 Å 미만의 평균 원자 공간 이동을 일으킨다.
본 발명의 바람직한 방법의 측면인 이뮤노글로불린과 관련해서, 모든 단일 건강한 포유동물은 상이한 항원에 대해 각각 반응하는 1010개 이상의 상이한 및 별개의 항체를 생성할 수 있다. 종에 걸쳐 및 심지어 동물 계에 걸쳐, 종내 유전자 코드 (항체의 상보성 결정 영역 (CDR) 성분에 대해 특이적으로) 및 항체의 형태 (단량체 (예를 들어, 낙타) 대 이량체 (예를 들어, 인간 및 마우스)인 전체 구조)의 다양성은 1020 초과로 수많은 가능한 항체 반응을 일으킨다. 그리고, 건강한 면역계를 갖는 모든 개별 동물은 대부분의 임의의 항원에 대해 다수의 항체를 생성할 수 있다.
외래 분자, 예를 들어 다른 종에 대한 상재 효소가 건강한 면역계를 갖는 동물의 체내로 주사되는 경우, 면역계의 반응이 상기 구조에 대해 유발될 것이다. 상기 반응 중에, β-세포가 궁극적으로 생성하는 동일한 항체를 반영하는 별개의 수용체를 각각 발현하는 수백만의 개별 신생의 β-세포가 상기 분자에 노출된다. 외래 분자에 단단히 결합하는 수용체를 발현하는 상기 β-세포는 증식하도록 유발되며, 이에 따라 표적에 대해 특이적인 동일한 항체를 각각 생성하는 세포의 콜로니를 제공한다. 이들 β-세포 중 몇몇은 체내로 방출되어 외래 물질과 분투하는 반면, 다른 구성원은 외래 분자가 미래에 시스템에 제공되는 경우에 항체의 범람에 반응하기 위해 제조되어 림프절, 비장 및 시상 내에 남아 있는다. 외래 분자의 미래 제시에 대비한 상기 능력은 "후천성 면역성"이라고 지칭되며, 이는 미래에 반응하는 능력이 획득될 수 있기 전에 외래 물질의 초기 제시를 필요로 하기 때문이다.
특이적 분자 구조, 예를 들어 단백질 또는 보다 구체적으로 효소가 질환의 병인으로 기여하는 경우, 상기 분자에 높은 특이성으로 결합하고/거나 상기 분자의 활성을 억제하는 약제는 질환을 위한 중요한 치료요법 (치유가 아닌 경우)을 찾는 하나의 경로이다. HIV의 역전사효소, 백혈병의 특정 유형의 ABL-BCR 티로신 키나제, 및 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)(이들 중 몇몇은 종양 혈관형성과 관련됨)를 비롯하여 이러한 효소의 많은 예가 있다.
본 발명의 배경기술에 기재된 바와 같이, 상기 활성을 정확하게 나타내는 리드 소분자의 확인방법 중 종종 선택되는 방법은 소분자 중 하나가 원하는 기능적 특성을 나타낼 것이라는 바램으로, 표적 분자에 대한 수천개의 많은 소분자 (합성된 또는 달리 상기 목적으로)를 무작위로 스크리닝하는 것이다. 적절한 특징을 갖는 분자 또는 분자들은 리드라고 지칭되며, 약물이 발견될 때까지 추가로 정제 처리된다. 스크리닝 및 후속의 최적화의 상기 방법은 힘든 작업이며, 표적 분자 또는 어떤 구조가 여기에 결합하는가의 지식의 임의의 수단의 사용에 의해 개시하지 않는다.
대조적으로, 본 발명은 고처리량 친화성 스크리닝 방법을 제공하기 위해 면역계 단백질의 결합 친화성 특성을 사용한다. 면역계로의 표적 분자의 초기 제시는 면역계에 의한 항체 생성을 야기하며, 여기서, 많은 상이한 및 별개의 이뮤노글로불린 구조의 생성은 대량의 평행한 고처리량 친화성 스크리닝 방법으로서 작용한다. 표적에 결합하는 수용체를 발현하는 세포만이 증식을 위해 선택된다. 이는 클로날 선택이라고 지칭되며, 표적 특이적 분자를 생성하는 면역계의 능력의 중심부이며, 스크리닝으로서 제약 리드 개발 방법의 그 중심부이다.
사실, 표적 분자의 제시에 대한 반응에서 항체의 면역계의 생성 간의 상기 평행은 표적 제시/클로날 선택 및 고처리량 스크리닝 간의 유사성보다 더하며, 표적에 결합하는 항체를 생성할 수 있는 β-세포가 증식하도록 유발되는 경우 돌연변이 (친화성 성숙)를 잠재적으로 촉진시키는 메카니즘이 촉발된다. 상기 방법은 상이한 항체를 잠재적으로 생성하는 β-세포의 미래 생성을 허용하며; 이들 중 몇몇은 표적에 보다 단단히 결합할 것이나, 다른 것들은 덜 단단히 결합할 것이다. 보다 단단히 결합하는 것은 더 증식하도록 유발되며, 덜 단단히 결합하는 것은 보다 천천히 증식한다. 더 높은 결합 친화성에 대한 상기 늦은 발전은 리드 최적화의 주기에 의한 약물의 제약 개발에서 반영된다.
본 발명의 범위 내의 항체로는 예를 들어 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 및 항체 단편이 포함된다. 표적 단백질/효소에 대해 유발된 항체의 생성, 정제 및/또는 단편화의 수많은 방법은 당분야에 익히 공지되어 있다 (일반적으로, 문헌 [Carter (2006) Nat Rev Immunol. 6(5), 343-357]; [Teillaud (2005) Expert Opin Biol Ther. 5(Supp. 1) S15-27]; [Subramanian, ed. (2004) Antibodies : Volume 1 : Production and Purification, Springer, ISBN 0306482452]; [Lo, ed. (2003) Antibody Engineering Methods and Protocols, Humana Press, ISBN 1588290921]; [Ausubel et al., ed. (2002) Short Protocols in Molecular Biology 5th Ed., Current Protocols, ISBN 0471250929]; [Brent et al., ed. (2003) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Inc. ISBN 047150338X]; [Coligan (2005) Short Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, ISBN 0471715786]; [Sidhu (2005) Phage Display in Biotechnology and Drug Discovery, CRC, ISBN-10: 0824754662)] 참조).
폴리클로날 항체는 면역화된 동물, 통상적으로 혈청으로부터 얻은 항체 분자의 불균일 집단이다. 폴리클로날 항체는 당분야에 익히 공지되고 상기 나열된 수많은 참고문헌에 기재된 바와 같이 다양한 온혈 동물로부터 당업자에 의해 쉽게 제조될 수 있다. 추가로, 폴리클로날 항체는 다양한 상업적 공급원으로부터 얻을 수 있다.
모노클로날 항체는 특정 항원에 대한 항체의 균일 집단이다. 항원의 여러 에피토프에 대해 특이적일 수 있는 폴리클로날 항체와는 대조적으로, 모노클로날 항체는 통상적으로 단일 에피토프에 대해 특이적이다. 일반적으로, 모노클로날 항체는 항원-시험감염된 동물의 비장으로부터 β-세포를 제거하고 (여기서, 항원은 본원에 기재된 단백질을 포함함), 그 후 배양물에서 불명확하게 성장할 수 있는 골수종 종양 세포와 이들 β-세포를 융합함으로써 제조된다. 융합된 하이브리드 세포, 또는 하이브리도마는 빠르고 불명확하게 복제하고 다량의 항체를 제조할 수 있다. 하이브리도마는 각각 한 유형의 항체만을 제조하는 수많은 상이한 콜로니를 얻기 위해 충분히 희석되고 성장될 수 있다. 그 후, 상이한 콜로니로부터의 항체는 항원에 결합하는 그의 능력에 대해 시험되고 가장 효과적인 것이 선택될 수 있다.
특히, 모노클로날 항체는 상기 나열된 참고문헌에 기재된 바와 같이 배양물에서 연속 세포주에 의한 항체 분자의 생성을 제공하는 임의의 기술에 의해 얻을 수 있다. 바람직하게는, 그의 자체 항체를 생성하는 능력을 손실한 골수종 세포주는 표적 항체를 희석하지 않도록 사용된다. 바람직하게는, 특이적 효소 (예를 들어, 하이포크산틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제, HGPRT)를 손실하여 특정 조건하에 (즉, HAT 배지의 존재하에) 성장할 수 없는 골수종 세포가 사용된다. 이러한 바람직한 실시양태에서, 건강한 파트너가 필요한 효소를 공급하는 경우 건강한 β-세포 및 골수종 세포 간의 성공적인 융합이 검출될 수 있으며, 융합된 세포는 HAT 배지에서 생존할 수 있다.
모노클로날 항체는 또한 다른 방법, 예컨대 파지 디스플레이 (예를 들어, 문헌 [Sidhu (2005) Phage Display in Biotechnology and Drug Discovery, CRC, ISBN-10: 0824754662)] 참조)에 의해 제조될 수 있다.
이러한 항체는 IgG, IgM, IgE, IgA, IgD를 비롯한 임의의 이뮤노글로불린 부류 및 그의 임의의 하위부류일 수 있다. 본 발명의 mAb를 생성하는 하이브리도마는 시험관내에서 또는 생체내에서 배양될 수 있다. 생체내 모노클로날 항체의 높은 역가를 생성하는 능력은 이를 특히 유용한 제조 방법으로 만든다. 모노클로날 항체는 일반적으로 더 많은 유입으로 번역하는 많은 항체 단편보다 더 긴 말단 반감기를 가지며, 이는 여러 적용에 바람직할 수 있다.
바람직하게는, 항체는 IgG 이뮤노글로불린 부류이다. 하기 기재는 바람직한 IgG 부류에 관한 것이나, 당업자는 논의가 다른 실시양태의 분류에도 적용될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
IgG 분자 각각은 두가지 상이한 부류의 폴리펩티드 쇄, 중쇄 및 경쇄로 구성된다. 이들 중쇄 및 경쇄는 불변 세그먼트 및 가변 세그먼트로서 추가로 하위부류된다. IgG 분자 100의 전반적인 구축은 불변 중쇄 세그먼트 (104,106) (2개의 세그먼트, CH2-CH3, 병렬 배치)의 두 쌍에 의해 형성된 "Y"의 베이스 (102)를 갖는, 도 3에 나타낸 바와 같은 "Y" 형상이다. 상기 베이스 구조의 상부 세그먼트 각각은 "Y"의 2개의 분지 (108,110) 중 하나와 연결되며, 구체적으로 각각은 다른 불변 중쇄 세그먼트 CH1 (109)에 연결된다. 이들 2개의 중쇄 세그먼트 CH1 각각은 불변 경쇄 세그먼트 CL1 (112)과 쌍을 형성한다. 불변 중쇄 및 경쇄 세그먼트의 원위 팁은 가변 중쇄 및 경쇄 세그먼트 VH1 (114) 및 VL1 (116) (분지 당 가변 세그먼트 한 쌍)에 연결된다. 이들 쌍을 형성한 가변 세그먼트는 "Y" 구조의 원위 팁을 형성하며, 이러한 높은 항원 특이성으로 형성된 결합 팁을 포함한다. 항체 결합 부위의 단층촬영은 예를 들어 문헌 [Lee et al. (2006) J Org Chem 71, 5082-5092]에 의해 검토된다.
불변 세그먼트의 구조의 다양성은 종에 걸쳐 존재하며 심지어 몇몇 다양성은 종 내에서 보고되었으나, 포유동물에서 불변 중쇄 세그먼트 CH1, CH2 및 CH3은 일반적으로 매우 고도로 보존된 110 내지 120개의 아미노산 서열로 구성된다. 유사하게, 불변 경쇄 세그먼트는 일반적으로 매우 고도로 보존된 100 내지 110개의 아미노산 서열로 구성된다.
경쇄 및 중쇄 가변 세그먼트, VH1 및 VL1은 불변 세그먼트와 매우 유사한 펩티드 서열을 포함하나, 대략 5 내지 15개의 아미노산 길이의 3개의 작은 펩티드 스트레치는 상이하다. 이들 짧은 스트레치는 고도로 가변적이며, 일반적으로 초가변 영역 또는 상보성 결정 영역 (CDR) (118)이라고 지칭된다. 상기 초가변성은 이뮤노글로불린-생성 세포의 성숙 도중에 일어나는 유전자 슬라이싱 및 셔플링의 결과이다. 성숙 이뮤노글로불린-생성 세포 각각은 오직 한 유형의 항체 (항체 생성 세포인 경우)를 생성할 것이나, 상이한 세포는 상이한 이뮤노글로불린을 생성할 것이다. 따라서, 상기 유전적 프로세스는 단일 동물 내에서 생성된 항체의 광범위한 다양성을 유발한다.
가변 세그먼트 각각의 3개의 짧은 초가변 펩티드 서열은 항체의 원위 팁 각각 (서로 동일한 2개의 원위 팁)에서 함께 다발로 묶는 6개의 아미노산 분류의 복합체를 형성한다. 따라서, 항체 분자, 그 자체는 안정한 배열에서 아미노산의 작은 기를 간단하게 보유하고 제시하도록 이루어진 큰 구조, CDR을 포함하여, 매우 특이적 표적 구조에 매우 고친화성으로 결합할 수 있는 것으로 여겨질 수 있다.
가변 쇄 세그먼트의 남은 절편이 초가변 펩티드 스트레치에 대해 고도로 보존되어 있기 때문에, CDR을 형성하는 특이적 아미노산은 서열분석 방법에 의해 확인될 수 있다. 가변 경쇄 세그먼트의 초가변 영역은 예를 들어 펩티드 스트레치 24-34, 50-56 및 89-97 (카바트(Kabat) 및 우(Wu)에 의해 사용된 번호매김 시스템에 따름)에서 발견된다. 유사하게, 가변 중쇄 세그먼트의 초가변 영역은 예를 들어 31-35, 50-65 및 95-102에서 발견된다. 특이적 CDR이 이용가능한 수만을 기초로 달리 허용되는 것보다 많은 수의 펩티드를 포함할 수 있다는 것, 즉, CDR H3이 종종 단지 8개의 펩티드보다 크고, 이들 상황에서 서열 성분을 고유하게 기재하기 위해 알파뉴머릭, 예를 들어 100A, 100B 등이 사용된다는 것이 이해되어야 한다.
면역계 단백질의 선택
면역계 단백질은 일반적으로 생체분자 표적에 결합하는 그의 능력에 대해 선택된다. 바람직하게는, 면역계 단백질은 상대적으로 고친화성으로 생체분자 표적에 결합한다. 예를 들어, 바람직한 면역계 단백질은 적어도 KD가 약 1 mM, 보다 통상적으로 약 300 μM, 전형적으로 약 10 μM, 보다 전형적으로 약 30 μM, 바람직하게는 약 10 μM, 보다 바람직하게는 약 3 μM 또는 그보다 우수한 KD의 고친화성으로 생체분자 표적에 결합할 수 있다. 바람직하게는, 고친화성 면역계 단백질은 고친화성 모노클로날 항체이다. 당업자는 하기 논의의 부분이 항체, 및 보다 구체적으로 모노클로날 항체를 언급하는 반면 논의가 상기 논의된 다른 유형의 면역계 단백질에 또한 적용된다는 것을 이해할 것이다.
일반적으로, 활성 부위에, 내에 또는 근처에의 결합은 이러한 결합이 표적 생체분자의 활성을 보다 억제하기 용이하다면 바람직한 실시양태이다. 그러나, 표적 생체분자의 영역으로의 면역계 단백질의 결합이 또한 예를 들어 알로스테릭 결합 (예를 들어, 불활성 형태의 안정화)을 통해 활성의 억제를 야기할 수 있는 경우 다른 실시양태가 고려된다. 결합 부위의 정의 및 부위를 기초로 면역계 단백질 결합 부류를 확인하는 알고리즘은 당분야에 공지되어 있다 (문헌 [Lee et al. (2006) J Org Chem 71, 5082-5092] 참조). 여러 실시양태에서, 리(Lee) 등의 속칭에 따라, 면역계 단백질은 케이브, 크레이터, 캐년, 밸리 또는 플레인의 결합 단층촬영을 가질 수 있다. 바람직하게는, 면역계 단백질은 캐년, 밸리 또는 플레인, 보다 바람직하게는 캐년 또는 플레인의 결합 단층촬영을 갖는다.
고친화성 항체 구조가 확인되고 이들에 대한 모노클로날 항체-생성 세포주가 생성되면, 본 발명의 실시양태의 방법에서 후속의 단계는 다수의 항체로부터 활성 부위에, 내에 또는 근처에 결합하는 고친화성 결합 항체 (예를 들어, 모노클로날 항체)를 선택하는 것이다. 모노클로날 항체는 예를 들어 그의 특이성, 높은 결합 친화성, 이소형 및/또는 안정성을 기초로 선택될 수 있다. 모노클로날 항체는 웨스턴 블럿팅 (문헌 [Koren, E. et al., Biochim. Biophys. Acta 876:91-100 (1986)]) 및 효소 결합 면역흡착 검정법 (ELISA) (문헌 [Koren et al., Biochim. Biophys. Acta 876:91-100 (1986)])을 비롯한 임의의 다양한 표준 기술을 사용하여 특이성에 대해 스크리닝되거나 또는 시험될 수 있다.
활성 부위 고친화성 결합 항체의 선택 방법은 분자의 족의 다른 구성원이 존재하고 그의 활성 영역의 동일한 하위구조를 공유하는 경우 사용될 수 있다. 본 발명의 한 측면은 또한 그의 활성 영역을 보존하는 유사한 단백질의 족의 다른 구성원에 결합하는가를 결정함으로써, 고친화성 항체가 또한 활성 부위 고친화성 항체인가를 확인하는 방법을 포함한다. 표적 분자 (예를 들어, VEGF-A)에 대해 유발된 고친화성 항체가 족의 다른 구성원에 잘 결합하지 않는 경우, 활성 영역으로 결합하지 않는 것이 보다 쉽다. 대안으로, 표적 분자 (예를 들어, VEGF-A)에 대한 접종에 의해 배양된 고친화성 항체가 족의 여러 다른 구성원 (예를 들어, VEGF-B, VEGF-C 등)에 대해 스크리닝되고 또한 그들에 대해 고친화성을 나타내는 경우, 고친화성 항체는 또한 활성 부위 고친화성 항체이기 매우 쉽다.
유사한 족 분자가 없는 분자의 경우, 결합 부위의 성질의 대안적 결정 방법이 사용될 수 있다. 상기 결정이 행해질 수 있는 방법의 한 예는 표적의 기능적 검정을 제조하고 항체가 검정법의 기능을 억제하는가를 결정하는 검정법에 항체를 노출시키는 것에 의한 것이다.
완전히 컴퓨터가상실험인 고친화성 항체의 군으로부터 활성 부위 고친화성 항체의 선택 방법의 다른 예시적 방법은 항체 각각을 서열분석하고, 결합 표면의 구조를 모델링하고, 두개가 적합성이 있는가를 나타내기 위해 표적의 활성 표면의 모델에 이를 매칭시키는 것이다. 상기 방법은 특이적 표적에 대한 지식, 및 항체의 표면 조성물을 추정하는데 이용가능한 여러 프로그램 중 하나로의 접근을 필요로 할 수 있다. 활성 표면 표적에 결합하는 항체로부터 비활성 부위 고친화성 항체를 여과하는 대안적 방법이 보다 많은 표적 구조가 전체 특징화되고, 서열 정보 단독으로부터 항체 모델링의 정확도가 본원에 또는 다른 문헌에 개시된 여러 방법에 따라 향상되기 때문에 더욱더 효율적일 것이라는 것이 고려된다. 항체의 CDR이 항체 내 경쇄 및 중쇄 펩티드 쇄와 함께 구체적으로 나열된 스트레치에 존재하는 것으로 공지된 사실은 상기 방법에 추가 신뢰성을 제공한다. 상기 컴퓨터가상실험 기술은 또한 본 발명의 방법의 다른 단계 (예를 들어, 항체의 결합 부분의 원자의 특이적 공간 위치를 결정하는 단계)에 관한 것일 수 있다.
구조 공간 위치의 결정
면역계 단백질 (예를 들어, 활성 부위 고친화성 모노클로날 항체)이 선택된 후, 3D 단백질 결합 도메인이 정의된다. 단백질 결합 도메인(들)의 정의는 일반적으로 표적 생체분자와 상호작용하는 면역계 단백질의 결합 부분의 원자의 특이적 공간 위치의 결정을 포함한다.
결합 부분의 공간 위치의 결정은 여러 컴퓨터가상실험 기술에 의해 성취될 수 있다. 예를 들어, 결합 표면의 구조를 모델링하고 적합성의 수준을 분석하기 위해 표적의 활성 표면의 모델에 이를 매칭하는 소프트웨어 패키지가 사용될 수 있다. 이러한 소프트웨어로는 CAMAL이 포함된다. 또한, 결합 부위의 정의 및 부위를 기초로 면역계 단백질 결합 부류를 확인하는 알고리즘은 당분야에 공지되어 있다 (문헌 [Lee et al. (2006) J Org Chem 71, 5082-5092] 참조).
대안으로, 표적 분자 (특히, 항체와 같은 대분자) 내 원자의 삼차원 위치는 분자를 유사한 구조의 긴 어레이로 결정화한 후, 결정을 X-선 회절법에 노출시킴으로써 결정될 수 있다. X-선 회절법의 기술은 하나의 전자에 의해 회절된 하나의 광자가 확실하게 검출될 수 없기 때문에 일반적으로 분자의 결정화와 함께 개시된다. 그러나, 규칙적 결정질 구조로 인해, 광자는 많은 대칭적으로 배열된 분자에서 상응하는 전자에 의해 회절된다. 피크가 매칭하는 동일한 주파수의 파장이 서로 강화시키기 때문에, 신호가 검출가능하게 된다. X-선 결정학은 2 Å 이하의 하향 분해를 제공할 수 있다. 구조적 결정을 위한 X-선 결정학의 사용 기술은 당분야에 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Messerschmidt (2007) X-Ray Crystallography of Biomacromolecules: A Practical Guide, John Wiley & Sons, ISBN-10: 3527313966]; [Woolfson (2003) An Introduction to X-ray Crystallography, 2d Ed., Cambridge University Press, ISBN-10: 0521423597] 참조).
X-선 결정학은 표적 생체분자의 활성 부위에 고친화성으로 결합하는 것으로 공지된 구조 내의 원자의 구조를 결정한 후, 항체와 동일한 친화성 및/또는 활성을 보유하는 합성 분자를 구축하기 위해 상기 구조적 정보를 사용하는데 사용될 수 있다.
X-선 결정학을 통한 구조적 결정은 관심있는 분자의 결정을 필요로 한다. 면역계 단백질의 이러한 결정을 제조하는 여러 기술은 당분야에 공지되어 있으며, 월(Wall)의 미국 특허 제6,931,325호 및 세겔케(Segelke)의 미국 특허 제6,916,455호에 기재된 기술이 포함되며, 상기 문헌들의 명세서, 교시 및 참고문헌은 그 전문이 본원에 참고로 도입된다. 항체의 결정화 및 결합 팁의 잠재적 변형의 어려움을 극복하기 위해, 적절한 결합 구조가 포획되도록 항체는 표적 생체분자로 결정화될 수 있다 (예를 들어, RCSB 단백질 데이타 뱅크에서의 입력 1CZ8, 이는 친화성 성숙 항체와의 복합체 중 혈관 내피 성장 인자임).
제조되면, 결정은 수거되고, 임의로 기체 질소 또는 액체 질소에 의해 동결냉각될 수 있다. 결정을 동결냉각시키는 것은 데이타 수집 도중 초래되는 방사선조사 손상을 감소시킬 수 있고/거나 결정 내의 열 운동을 감소시킨다. 결정은 X-선의 빔을 방출하는 기계와 커플링된 회절분석기 상에 둔다. X-선은 결정에서 전자를 회절시키고, 회절법의 패턴은 필름 또는 고체 상태 검출기 상에 기록되고, 컴퓨터로 스캐닝된다. 이들 회절 이미지는 조합되고, 결정화된 분자의 전자 밀도 지도를 구축하는데 사용된다. 그 후, 원자는 전자 밀도 지도로 일치되고, 위치와 같은 여러 파라미터는 관찰된 회절 데이타에 양호하게 일치되도록 정립된다. X-선 결정학 관찰된 회절 데이타로부터 유도된 파라미터로는 수소 결합제, 비극성 소수성 접촉, 염 브릿지 상호작용, 도메인의 극성 표면적, 도메인의 비극성 표면적, 항체-표적 복합체에 대한 형상 상보성 점수, 및 뚜렷하게 위치된 물 분자가 포함되나 이에 제한되지 않는다. 원자 간의 결합의 특징화가 또한 유용하다. 단일 결합된 2개의 원자 간의 거리는 약 1.45 내지 약 1.55 Å의 범위이다. 함께 이중 결합된 원자는 전형적으로 약 1.2 내지 약 1.25 Å만큼 떨어져 있다. 단일 및 이중 결합 간의 공명 결합은 전형적으로 약 1.30 내지 약 1.35 Å 분리를 갖는다.
예로서, 친화성-성숙 항체 (그의 Fab 단편)에 결합된 VEGF (서열 2) 분자는 첸(Chen) 등에 의해 이미 결정화되었고 1CZ8로서 RCSB 데이타베이스에 공개되었다. 보다 구체적으로, 그의 결정화 데이타는 VEGF 이량체의 구성원인 영역 V 및 W, 및 Fab 분자의 항체 경쇄 및 중쇄를 나타내는 영역 L, H, X 및 Y를 포함한다 (보다 구체적으로, L 및 H 영역은 쇄 각각의 가변 및 불변 영역을 포함하는 Fab 분자의 분지 중 하나를 포함한다. 유사하게, X 및 Y는 Fab 분자의 다른 분지의 경쇄 및 중쇄임). 결정질 구조의 8000개 초과의 비-수소 원자의 공간 배열을 기하학적으로 분석함으로써 다른 구조의 원자의 특정 거리 내에 있는 한 구조의 원자를 확인할 수 있다. 이 필터는 2개의 분자에 걸쳐 관련된 펩티드의 모든 가능한 조합에 걸친 직접적 기하학적 비교에 의해 결정한다. 최대 분리 (예를 들어, 4 Å)를 사용하여, VEGF 이량체의 W 성분의 원자의 이러한 짧은 범위 내에 있는 중쇄 가변 쇄 (H)의 원자를 결정할 수 있으며, Fab 단편의 CDR 중 하나이기 가장 쉽다 (예를 들어, 실시예 1 참조).
약물작용발생단의 구축
원자 위치의 정의를 비롯한 면역계 단백질 구조적 정보는 유사한 위치에 유사한 원자를 갖는 소분자를 확인하는데 사용되는 약물작용발생단 모델을 구축하는데 사용될 수 있다. 면역계 단백질과 유사한 특성을 갖는 소분자는 표적 단백질과의 유사한 분자 상호작용을 나타내는 잠재성을 가지며, 따라서 유사한 치료 유용성을 갖는 유사한 생물학적 활성을 갖는다.
원자, 바람직하게는 실질적으로 모든 원자 및 보다 바람직하게는 면역계 단백질의 결합 영역(들)중 모든 원자 (예를 들어, 활성 부위 고친화성 모노클로날 항체의 결합 팁)의 공간 배향의 확인이 성취되면, 본 발명의 여러 실시양태의 후속의 단계는 생체분자 표적으로의 결합에 적어도 부분적으로 관여하는 면역계 단백질의 원자의 적어도 한 부분을 모방하는, 바람직하게는 실질적으로 모방하는 구조를 갖는 약물작용발생단의 제조이다. 예를 들어, 약물작용발생단은 생체분자 표적으로의 결합에 적어도 부분적으로 관여하는 면역계 단백질의 원자의 적어도 약 25％, 30％, 35％, 40％, 45％, 50％, 55％, 60％, 65％, 70％, 75％, 80％, 85％, 90％, 95％, 99％ 또는 100％를 모방할 수 있다. 드 노보(de novo) 화학적 구조의 상기 합성은 합리적 약물 설계 소프트웨어 및 기술을 사용하여 성취될 수 있다.
그러나, 여러 실시양태의 중요한 한 특성은 원하는 효과를 생성하는 방식으로 신규 화학적 구조를 표적 표면으로 매칭하고, 지침으로서 생체분자 표적에 결합하는 공지된 구조 (즉, 면역계 단백질)를 사용함으로써 리드 분자가 단독으로 구축되지 않는다는 점이다. 면역계 단백질은 그의 CDR 영역이 작은 유기 분자에서 상대적으로 용이하게 재생성될 수 있는, 상대적으로 단순한 유기 구조로 구축되기 때문에 지침으로서 특히 적합하다.
여러 실시양태에서, 컴퓨터가상실험 접근법은 접촉 통계학, 3D 표면 모델, 및 주형으로서 도킹된 리간드를 사용하는 단편 기재 접근법으로 드 노보 구조 설계에 사용될 수 있다. 상기 기재된 공간 위치 정보로부터, 및/또는 다른 파라미터로부터, 3D 리간드-수용체 모델 (예를 들어, 상호작용 패턴, 약물작용발생단 식), 표면 지도 (예를 들어, 단층촬영/형상, 정전기 프로파일, 소수성, 단백질 가요성), 및 도킹 모델 (예를 들어, 리간드 결합에 대한 점수매김 시스템, 최소 에너지 계산)을 유도할 수 있다.
약물작용발생단 모델 또는 식은 일반적으로 수용체 부위에서 리간드의 인식 및 그의 생물학적 활성과 관련된, 바람직하게는 직접적으로 관련된 리간드에서의 구조적 특성의 세트이다. 약물작용발생단 특성은 결정 구조로부터 취해진 그의 수용체와의 복합체에서 상응하는 공여체, 수령체, 상응하는 면역계 단백질의 방향족, 소수성, 및/또는 산성 또는 염기성 잔기로부터 유도될 수 있다. 약물작용발생단 식에서 사용되는 면역계 단백질 중 원자 (예를 들어, 활성 부위 고친화성 모노클로날 항체의 결합 팁의 원자)의 성질에 대한 추가 정보 (단순히 원자의 공간 위치는 아님)가 상기 신규 화학적 리드의 모델링 방법에서 보조할 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 이들 특징으로는 원자의 pKa 값, 위치에서 원자를 보유하는 결합의 회전 경직성, 결합 그 자체의 성질 (단일, 이중, 공명 등), 수소 결합 공여체 및 수령체 등의 투영 방향이 포함되나 이에 제한되지 않는다.
약물작용발생단 식의 제조에 유용한 전형적인 특성 성분으로는 원자 위치; 원자 반지름; 수소 결합 공여체 특성; 수소 결합 수령체 특성; 방향족 특성; 공여체 특성; 수령체 특성; 음이온 특성; 양이온 특성; 수령체 및 음이온 특성; 공여체 및 양이온 특성; 공여체 및 수령체 특성; 산 및 음이온 특성; 소수성 특성, 수소 결합 방향, 및 금속 리간드가 포함되나 이에 제한되지 않는다 (예를 들어, 실시예 4 참조). 이러한 특성은 예를 들어 단일 원자에서, 원자의 중심, 또는 공간 중 투영 방향성 위치에서 위치될 수 있다.
수많은 약물작용발생단 조회가 임의의 주어진 면역계 단백질 - 표적 생체분자 복합체에 대해 설계될 수 있다는 것이 고려된다. 이들 약물작용발생단 조회가 면역계 단백질에 의해 인식되는 부위에서 표적 생체분자와 상호작용하는 소분자 리간드를 확인하는데 유용할 것이라는 것이 추가로 고려된다.
이러한 모델링 및 조회를 성취하기 위한 예시적 수단으로는 MOE (CGG) (약물작용발생단 조회 및 시각화를 제공함), 글리드(Glide) (슈로딘거(Schrodinger)) (도킹 및 점수매김을 제공함), 어코드 포 엑셀(Accord for Excel)(악셀리즈(Accelrys))(화학적 구조 및 화학식을 비롯한 분자 정보의 조직화를 제공함), 및 ZINC 데이타베이스 (UCSF) (상업적 화합물의 라이브러리를 제공함)가 포함되나 이에 제한되지 않는다. 면역계 단백질로부터의 약물작용발생단의 제조를 위한 설계 수단 (표적 생체분자 구조적 결합 특징화)은 MOE, 또는 분자 작동 환경 (케미컬 컴퓨팅 그룹(Chemical Computing Group))이다. 모델 제조는 면역계 단백질에 상응하는 특성의 3D 위치를 결정하기 위해 기하학적 및 전자 구속을 사용한다. 이들 실시양태의 모델은 3D 공간에서 구형의 특성으로 구성된다. 구의 직경은 조절될 수 있다 (예를 들어, 약 0.5 내지 약 3.0 Å). 이러한 모델은 특성의 매칭 및/또는 부분적 매칭을 허용한다.
약물작용발생단 구조적 특성은 공간에서 표지된 점에 의해 나타낼 수 있다. 리간드 각각은 리간드의 약물작용발생단에 기여할 수 있는 구조적 특성의 한 세트인 애노테이션으로 지정될 수 있다 (예를 들어, 실시예 4 참조). 여러 실시양태에서, 애노테이션된 리간드의 데이타베이스는 약물작용발생단 가설을 나타내는 조회로 조사될 수 있다 (예를 들어, 실시예 5 참조). 이러한 조사의 결과는 조회의 약물작용발생단 특성을 조사된 데이타베이스의 리간드에 존재하는 약물작용발생단 특성에 대해 정렬하는 매칭의 세트이다 (예를 들어, 실시예 5, 표 23 내지 28 참조). 데이타베이스 내의 수많은 히트는 데이타베이스의 크기 및 약물작용발생단 조회의 한계성 (예를 들어, 부분적 매칭, 특성의 수 등)에 적어도 부분적으로 의존한다. 예로서, 실시예 4의 약물작용발생단 조회는 ZINC 데이타베이스에 대해 약 1,000 내지 약 3,000개의 히트를 제조하였다. 조사 데이타베이스 내에 존재하는 분자의 특성 및 파라미터는 조회의 성과에 초점을 맞추는데 사용된다. 예를 들어, 정의된 범위의 분자량 (MW) 또는 친유성 (logP)을 갖는 화합물은 화합물의 라이브러리 데이타베이스의 조사된 섹션에 존재할 수 있다.
후보 분자
본 발명의 방법은 다양한 상이한 후보 분자 (예를 들어, 잠재적 치료 후보 분자)의 스크리닝에서의 용도를 찾는다. 상기 기재된 바와 같이, 후보 분자는 약물작용발생단 조회를 사용하여 조사될 수 있다. 후보 분자는 수많은 화학적 부류를 포함하나, 전형적으로 이들은 유기 분자, 바람직하게는 50 달톤 초과 및 약 2,500 달톤 미만의 분자량을 갖는 작은 유기 화합물이다. 후보 분자는 단백질과의 구조적 상호작용, 특히 수소 결합에 필수적인 관능기를 포함하며, 전형적으로 적어도 아민, 카르보닐, 히드록실 또는 카르복실 기, 바람직하게는 2개 이상의 화학적 관능기를 포함한다. 후보 분자는 종종 하나 이상의 상기 관능기에 의해 치환된 시클릭 탄소 또는 헤테로시클릭 구조 및/또는 방향족 또는 폴리방향족 구조를 포함한다.
바람직한 실시양태에서, 후보 분자는 화합물의 라이브러리 데이타베이스에 속한 화합물이다. 당업자는 예를 들어 스크리닝을 위해 시판되는 화합물에 대한 수많은 데이타베이스에 일반적으로 친숙할 것이다 (예를 들어, 분자의 12개의 별개의 서브세트 상의 270만개의 화합물을 갖는 ZINC 데이타베이스, UCSF; 문헌 [Irwin and Shoichet (2005) J Chem lnf Model 45, 177-182] 참조). 당업자는 추가 시험을 위한 상업적 공급원 또는 바람직한 화합물 및 화합물의 부류의 확인을 위한 다양한 조사 엔진에 또한 친숙할 것이다 (예를 들어, ZINC 데이타베이스; eMolecules.com; 및 매각인에 의해 제공된 상업적 화합물의 전자 라이브러리, 예를 들어: 켐브릿지(ChemBridge), 프린스톤 바이오몰레큘라(Princeton BioMolecular), 암빈터(Ambinter) SARL, 엔아민(Enamine), ASDI, 라이프 케미칼즈(Life Chemicals) 등 참조).
본원에 기재된 방법에 따른 스크리닝을 위한 후보 분자는 리드-유사 화합물 및 약물-유사 화합물 둘 모두를 포함한다. 리드-유사 화합물은 일반적으로 상대적으로 특성이 거의 없는 (예를 들어, 약 3개 미만의 수소 공여체 및/또는 약 6개 미만의 수소 수령체; 약 -2 내지 약 4의 xlogP 소수성 특징) 상대적으로 작은 스캐폴드-유사 구조 (예를 들어, 약 150 내지 약 350 kD의 분자량)를 갖는 것으로 이해된다 (예를 들어, 문헌 [Angewante (1999) Chemie Int. ed. Engl. 24, 3943-3948] 참조). 대조적으로, 약물-유사 화합물은 일반적으로 상대적으로 보다 많은 특성 (예를 들어, 약 10개 미만의 수소 수령체 및/또는 약 8개 미만의 회전성 결합; 약 5 미만의 xlogP 소수성 특징)을 갖는 상대적으로 큰 스캐폴드 (예를 들어, 약 150 내지 약 500 kD의 분자량)를 갖는 것으로 이해된다 (예를 들어, 문헌 [Lipinski (2000) J. Pharm. Tox. Methods 44, 235-249] 참조). 바람직하게는, 초기 스크리닝은 리드-유사 화합물로 수행된다.
공간 배향 데이타로부터 리드를 설계하는 경우, 특정 분자 구조가 "약물-유사"인 것으로 특징화된 것을 이해하는 것이 유용할 수 있다. 이러한 특징화는 약전 내의 공지된 약물의 범위에 걸쳐 유사성을 비교함으로써 유도된 경험적으로 인식된 품질의 세트를 기초로 할 수 있다. 약물이 모든 또는 임의의 이들 특징화를 충족하는 것이 요구되는 것은 아니나, 약물 후보가 약물-유사인 경우 임상적 성공으로 충족하기가 훨씬 더 쉽다.
이들 "약물-유사" 특징 중 몇몇은 리핀스키(Lipinski)의 4 법칙으로 요약되어 있다 (이들 중 숫자 5의 유행 때문에 "5의 법칙"이라고 일반적으로 공지됨). 이들 법칙은 일반적으로 경구 흡수에 관한 것이며, 리드 최적화 도중 화합물의 생체이용율을 예측하는데 사용되며, 이들은 합리적 약물 설계 노력 도중 리드 분자의 구축에 효과적인 지침으로써 작용할 수 있으며, 예컨대 본 발명의 방법을 사용함으로써 성취될 수 있다.
네가지 "5의 법칙"은 후보 약물-유사 화합물이 하기 특징 중 세가지 이상을 가져야 한다고 언급한다: (i) 500 달톤 미만의 중량; (ii) 5 미만의 logP; (iii) 5개 이하의 수소 결합 공여체 (OH 및 NH 기의 합으로 표현됨); 및 (iv) 10개 이하의 수소 결합 수령체 (N 및 O 원자의 합).
또한, 약물-유사 분자는 전형적으로 약 8 Å 내지 약 15 Å의 스팬(폭)을 갖는다. 리드 분자로 함께 구조를 이루기에 충분히 인접한 결합에 포함된 원자의 하위군의 예에 대해서는 실시예 1의 표 3을 참조한다.
상기 설명된 바와 같이, 약물작용발생단에 대해 히트로서 확인된 수많은 분자는 데이타베이스의 크기 및 약물작용발생단 조회의 한계성에 적어도 부분적으로 의존한다. 약물작용발생단 조회로부터 히트로서 확인된 수많은 분자는 표적 생체분자의 결합 부위의 맞음새의 추가 모델링에 의해 감소될 수 있다. 이러한 모델링은 하기 기재된 바와 같이 도킹 및 점수매김 방법에 따라 행해질 수 있다.
도킹 및 점수매김
약물작용발생단 모델과 비교하여 유사한 위치에서 유사한 원자 및/또는 유사한 위치에서 유사한 특성을 갖는 것으로 확인된 후보 분자 (예를 들어, 상기 기재된 바와 같은 약물작용발생단 조회를 통해)는 표적 생체분자에 대한 도킹 친화성에 따라 추가로 선택될 수 있다 (예를 들어, 실시예 5 참조). 데이타베이스 조회에 대한 약물작용발생단 모델 제조 외에도, 화합물 확인 및 설계를 위한 제2 순차적 및 상보적 방법이 사용될 수 있다. 약물작용발생단 조회는 화합물을 빠르게 걸러낼 수 있으며, 도킹 및 점수매김은 리간드-표적 생체분자 결합을 보다 정확하게 평가할 수 있다. 단백질 또는 효소 표적 생체분자의 경우, 항체 접촉과 관련된 표적 단백질 또는 효소의 아미노산 잔기는 도킹 부위를 정의하는데 사용될 수 있다.
여러 실시양태에서, 약물작용발생단 조회로부터 선택된 화합물은 이러한 분석을 위해 설계된 소프트웨어 (예를 들어, 글리드 (슈로딘거, NY))를 사용하여 표적 단백질/효소 결합 부위로 도킹된다. 도킹 친화성은 예를 들어 단백질과 분자의 상호작용시 얻어지는 에너지 (예를 들어, "g_점수") 및/또는 최저 에너지 형태에 비해 도킹된 형태를 얻는데 필요한 에너지 (예를 들어, "e_모델")를 기초로 수치 (예를 들어, "글리드점수")로서 계산될 수 있다 (예를 들어, 실시예 5 참조). 이들 특정 예를 위해, 점수가 보다 음성일수록 도킹이 더 양호하다. 바람직하게는, g_점수는 약 -5 미만이다. 바람직하게는, e_모델 점수는 약 -30 미만이다. 도킹의 바람직한 수치 정량이 상이한 표적 생체분자 사이에서 다양할 수 있다는 것이 고려된다. 여러 실시양태에서, 역치 도킹 점수 (예를 들어, g_점수 및/또는 e_모델 점수)는 획득 및 추가 시험을 위해 수많은 분자를 관리하도록 선택될 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 여러 도킹 연구에서, VEGF (Pdb:1cz8)에서는 음의 5.0 (또는 음의 방향으로 더 큰 값)의 g_점수가 바람직한 도킹 점수로서 고려되었으며, 컷 오프가 이에 따라 조절되었으나; ErbB2 (pdb:1s78)에서는 음의 7.5 (또는 더 큰 값)의 g_점수가 바람직한 도킹 점수로서 고려된다. 이들 연구에서, g_점수의 크기는 획득되고 시험될 수 있는 실행가능한 수로 수많은 히트를 조절하는데 사용하였다. 예로서, 약물작용발생단 조회로부터 확인된 화합물의 총수가 약 1,000 내지 약 3,000인 경우, 도킹 점수는 추가 시험을 위해 약 100 내지 약 200개를 선택하도록 이러한 화합물을 등급화하는데 사용될 수 있다. 추가 시험을 위해 선택되는 수많은 화합물이 이들 추정치보다 낮거나 또는 높을 수 있다는 것이 고려된다. 바람직하게는, g_점수의 크기는 선택 기준으로서 사용되나, 특히 e_모델 점수가 낮은 크기의 경우 e_모델 점수가 유사하게 사용될 수 있다는 것이 고려된다. 선택 기준은 g_점수 및 e_모델 점수를 기초로 할 수 있다 (바람직하게는 g_점수를 향해 무게를 둠)는 것이 추가로 고려된다.
도킹 및 점수매김은 다중 형태 이성질체를 갖는 화합물의 군을 야기할 수 있다. 적합한 모델링 소프트웨어 (예를 들어, MOE)를 사용하여, 3D 구조를 2D로 전환할 수 있으며, 이에 의해 중복을 제거할 수 있다. 바람직한 화학적 구조의 얻어진 목록은 예를 들어 이러한 태스크를 위해 설계된 조사 엔진을 사용하여 상업적 매각인에 대한 조사에 사용될 수 있다 (예를 들어, eMolecules.com).
표적 생체분자에 대한 효과
약물작용발생단 조회에 따라 선택되고/거나 도킹 분석에 따라 추가로 선택된 후보 분자는 표적 생체분자에 대한 효과에 대해 시험될 수 있다. 생체분자 기능에 대한 분자의 효과 (예를 들어, 효소 활성의 억제)의 평가는 당분야에 공지된 여러 방법에 의해 평가될 수 있다 (예를 들어, 실시예 6 참조). 예를 들어, 표적 효소의 촉매 활성에 대한 후보 분자의 억제 효과는 표적 효소에 특이적인 공지된 활성 검정법에 의해 평가될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Reymond, ed. (2006) Enzyme Assays: High-throughput Screening, Genetic Selection and Fingerprinting, John Wiley & Sons, 386 p., ISBN-10: 3527310959]; [Eisenthall and Danson, Ed. (2002) Enzyme Assays, 2d edition, Oxford University Press, 384 p., ISBN-10: 0199638209] 참조).
추가 정제
선택된 후보 분자를 추가로 정제하는 여러 방법. 생물학적 검정으로부터의 데이타는 리드-유사 분자 및/또는 약물-유사 분자를 추가로 정제하도록 도킹 모델과 상호관련될 수 있다. 여러 소프트웨어 패키지 (예를 들어, MOE)는 드 노보 설계에 의한 변형에 적합한 주형 상의 부위를 확인하기 위해 표적 생체분자의 결합 부위에서 활성 화합물의 시각화에 사용될 수 있다. 활성 화합물의 유사체는 유사성 및 하위-구조 조사를 사용하여 확인될 수 있다 (예를 들어, 사이파인더(SciFinder); 이모델(eModel) 참조). 이용가능한 유사체는 상기 기재된 도킹 및 점수매김 절차에 따라 분석될 수 있다. 바람직한 도킹 점수를 갖는 유사체가 획득될 수 있으며, 상기 기재된 방법에 따라 표적 생체분자에 대한 생물학적 효과에 대해 추가로 시험될 수 있다. 당업자는 본원에 제공된 방법에 의해 확인된 후보 분자의 정제 및 추가 개발을 위한 이들 및 다른 방법을 이해할 것이다.
분자
본 발명의 다른 측면은 본원에 기재된 방법에 의해 확인되고, 확인하는 방법에 따라 표적 생체분자에 관련된 질환, 장애 또는 상태의 치료에 유용한 화합물을 포함한다. 예를 들어, 성장 인자 단백질의 억제가 종양학에서 특정 상태의 치료에 이점을 갖는다는 것은 익히 공지되어 있다.
AD4 -1025
다른 예로서, AD4-1025는 표피 성장 인자의 그의 수용체로의 결합의 억제제로서 확인된다 (예를 들어, 실시예 7 참조). 이러한 화합물은 종양학에서 치료제로서 유용하다. AD4-1038의 유사체 및 유도체는 동일한 억제 효과 및 유용성을 가질 것으로 기대된다. 약물작용발생단 모델, Pharm1_gly54_asp58은 약물작용발생단 모델을 설계하기 위한 1YY9 단백질 결정 구조로부터의 정보를 사용하여 설계되었다 (예를 들어, 실시예 4 참조). Pharm1_gly54_asp58 모델은 EGFR에 결합하는 소분자를 확인하는데 사용되었다 (서열 1). EGFR 단백질 상의 부위는 항체 세툭시맙 (서열 5 및 서열 6) (에르비툭스(Erbitux))의 아미노산 잔기 GLY-54 내지 ASP-58에 의해 인식된다. Pharm1_gly54_asp58은 잔기 GLY-54 내지 ASP-58 후 모델링되고, 항체 세툭시맙의 특성 및 성분을 갖는 소분자를 확인하는 수단으로서 설계된다. 구체적으로, 상기 영역은 세툭시맙의 항체 중쇄의 H2 CDR로서 정의된다. 세툭시맙의 이들 아미노산 잔기의 특성 및 성분은 약물작용발생단 모델의 제조에 사용되었다. 상기 약물작용발생단 모델로부터 하기 화합물이 유도된다:
<화학식 1>
Figure 112008059781518-pct00011
상기 식에서, S1 내지 S8은 하기 유형의 독립적 치환기를 나타내고: 할로겐 (F, Cl, Br, I); 히드록실 (-OH); 술프히드릴 (-SH); 카르복실레이트 (-COOH); 알킬 (C1-C4 탄소, 직쇄, 분지된, 또는 임의로 불포화를 함유함); 시클로알킬 (임의로 불포화를 함유하는 C1-C6); 페닐을 비롯한 아릴, 또는 1 내지 4개의 N, O 및 S 원자를 함유하는 헤테로아릴; 또는 알콕실 (-OR, 여기서 R은 할로겐, 히드록실, 술프히드릴, 카르복실레이트, 아릴, 헤테로아릴, 아미노 -NH2, 치환된 아미노 -NR2, 또는 5 또는 6원 고리에 1, 2 또는 3개의 N 원자를 함유하는 시클로아미노기에 의해 임의로 치환된, C1-C6 직쇄 또는 분지된 알킬기로서 정의됨); X는 H2, O, S, N-R, N-OH 및 N-NR2로서 정의되고; Het은 임의의 고리 위치에서의 하나 이상의 N 원자로서 정의되고; Z은 -COOH, -PO3H2, SO3H, 테트라졸 고리, 술폰아미드, 아실 술폰아미드, -CONH2 및 -CONR2로서 정의된다.
추가 유사체는 하나 이상의 질소 원자가 1개 또는 2개의 독립적 치환기를 함유하는 탄소 원자 또는 비치환된 탄소 원자로 대체된 화합물을 포함한다 (S9 내지 S11은 S1 내지 S8에 대해 상기 정의된 바와 같음):
Figure 112008059781518-pct00012
Figure 112008059781518-pct00013
Figure 112008059781518-pct00014
또한, 거울상이성질체가 동일한 유용성을 갖는 것으로 기대된다:
Figure 112008059781518-pct00015
상기 식에서, S1 내지 S8, X, Het 및 Z는 상기 정의된 바와 같다.
한 실시양태에서, 표피 성장 인자 수용체 (EGFR)로의 표피 성장 인자 (EGF)의 결합의 억제제는 AD4-1025 ((N1-(4-클로로페닐)-N2-(3-피리디닐메틸)-알파-아스파라긴; 화학식: C16H16ClN3O3; 분자량: 333.78)) (예를 들어, 실시예 7 참조)이다. EGFR로의 AD4-1025의 결합의 예시적 묘사는 도 46에 나타낸다. AD4-1025의 구조는 아래와 같다:
<화학식 6>
Figure 112008059781518-pct00016
AD4-1025의 25 μM의 농도에서, EGFR로의 EGF의 결합은 75.7％만큼 억제된다 (예를 들어, 실시예 6 참조).
AD4 -1038
AD4-1038은 표피 성장 인자의 그의 수용체로의 결합의 억제제로서 확인된다 (예를 들어, 실시예 8 참조). 이러한 화합물은 종양학에서 치료제로서 유용성을 갖는다. AD4-1038의 유사체 및 유도체는 동일한 억제 효과 및 유용성을 가질 것으로 기대된다. 약물작용발생단 모델, Pharm1_thr100_glu105은 약물작용발생단 모델을 설계하기 위한 1YY9 단백질 결정 구조로부터의 정보를 사용하여 설계되었다 (예를 들어, 실시예 4; 표 17; 도 17 참조). Pharm1_thr100_glu105 모델은 EGFR에 결합하는 소분자를 확인하는데 사용되었다. EGFR (서열 1) 단백질 상의 부위는 항체 세툭시맙 (서열 5 및 서열 6) (에르비툭스)의 아미노산 잔기 THR-100 내지 GLU-58에 의해 인식된다. Pharm1_thr100_glu105은 잔기 THR-100 내지 GLU-58 후 모델링되고, 항체 세툭시맙의 특성 및 성분을 갖는 소분자를 확인하는 수단으로서 설계된다. 세툭시맙의 이들 아미노산 잔기의 특성 및 성분은 약물작용발생단 모델의 제 조에 사용되었다. 상기 약물작용발생단 모델로부터 하기 화합물이 유도된다:
<화학식 7>
Figure 112008059781518-pct00017
상기 식에서, S1 내지 S4는 하기 유형의 독립적 치환기를 나타내고: 할로겐 (F, Cl, Br, I); 히드록실 (-OH); 술프히드릴 (-SH); 카르복실레이트 (-COOH); 알킬 (C1-C4 탄소, 직쇄, 분지된, 또는 임의로 불포화를 함유함); 시클로알킬 (임의로 불포화를 함유하는 C1-C6); 페닐을 비롯한 아릴, 또는 1 내지 4개의 N, O 및 S 원자를 함유하는 헤테로아릴; 알콕실 (-OR, 여기서 R은 할로겐, 히드록실, 술프히드릴, 카르복실레이트, 아릴, 헤테로아릴, 아미노 -NH2, 치환된 아미노 -NR2, 또는 5 또는 6원 고리에 1, 2 또는 3개의 N 원자를 함유하는 시클로아미노기에 의해 임의로 치환된, C1-C6 직쇄 또는 분지된 알킬기로서 정의됨); X는 O, S, N-R, N-OH 및 N-NR2로서 정의되고; Het은 임의의 고리 위치에서의 하나 이상의 N 원자로서 정의되고; Z은 -COOH, -PO3H2, SO3H, 테트라졸 고리, 술폰아미드, 아실 술폰아미드기, -CONH2 및 -CONR2로서 정의된다.
추가 유사체는 중심 질소 원자가 1개 또는 2개의 독립적 치환기를 함유하는 탄소 원자 또는 비치환된 탄소 원자로 대체된 화합물 또는 중심 탄소 원자가 상기 기재된 바와 같은 관능성 X를 함유하는 화합물을 포함한다 (S2 내지 S6은 S1 내지 S4에 대해 상기 정의된 바와 같음):
Figure 112008059781518-pct00018
Figure 112008059781518-pct00019
지시된 바와 같은 짧은 링커 잔기를 화합물은 또한 동일한 EGFR의 억제를 제공할 것으로 예상된다:
Figure 112008059781518-pct00020
상기 식에서, L은 C, N, O 및 S를 비롯한 1 내지 4개의 선형으로 연결된 원자로 구성된 링커로서 정의된다. C 및 S의 경우, 원자의 산화 상태는 단일 또는 이중 결합에 의해 부착된 1개 또는 2개의 산소를 가질 수 있다. C 및 N의 경우, 원자는 상기 정의된 기 S1 내지 S6에서 독립적으로 선택된 1개 또는 2개의 추가 치환기를 가질 수 있다.
또한, 라세메이트 및 거울상이성질체 이성질체를 비롯한 상이한 입체화학적 조성의 화합물은 또한 EGFR 억제제로서 유용성을 가질 것으로 기대된다:
Figure 112008059781518-pct00021
상기 식에서, S1 내지 S4, X, Het 및 Z는 상기 정의된 바와 같다.
한 실시양태에서, 표피 성장 인자 수용체 (EGFR)로의 표피 성장 인자 (EGF)의 결합의 억제제는 AD4-1038 (({2-[(4-히드록시-페닐)-메틸-아미노]-4-옥소-4,5-디히드로-티아졸-5-일}-아세트산; 화학식: C12H12N2O4S; 분자량: 280.30) (예를 들어, 실시예 8 참조)이다. EGFR로의 AD4-1038의 결합의 예시적 묘사는 도 47에 나타낸다. AD4-1038의 구조는 아래와 같다:
<화학식 13>
Figure 112008059781518-pct00022
AD4-1038의 25 μM의 농도에서, EGFR로의 EGF의 결합은 70.7％만큼 억제된다 (예를 들어, 실시예 6 참조).
AD4 -1020
AD4-1020은 표피 성장 인자의 그의 수용체로의 결합의 억제제로서 확인된다 (예를 들어, 실시예 10 참조). 이러한 화합물은 종양학에서 치료제로서 유용성을 갖는다. AD4-1020의 유사체 및 유도체는 동일한 억제 효과 및 유용성을 가질 것으로 기대된다. 약물작용발생단 모델, Pharm1_gly54_asp58은 약물작용발생단 모델을 설계하기 위한 1YY9 단백질 결정 구조로부터의 정보를 사용하여 설계되었다 (예를 들어, 실시예 4 참조). Pharm1_gly54_asp58 모델은 EGFR (서열 1)에 결합하는 소분자를 확인하는데 사용되었다. EGFR 단백질 상의 부위는 항체 세툭시맙 (서열 5 및 서열 6) (에르비툭스)의 아미노산 잔기 GLY-54 내지 ASP-58에 의해 인식된다. Pharm1_gly54_asp58은 잔기 GLY-54 내지 ASP-58 후 모델링되고, 항체 세툭시맙의 특성 및 성분을 갖는 소분자를 확인하는 수단으로서 설계된다. 구체적으로, 상기 영역은 세툭시맙의 항체 중쇄의 H2 CDR로서 정의된다. 세툭시맙의 이들 아미노산 잔기의 특성 및 성분은 약물작용발생단 모델의 제조에 사용되었다. 상기 약물작용발생단 모델로부터 하기 화합물이 유도된다:
<화학식 14>
Figure 112008059781518-pct00023
상기 식에서, S1 내지 S6은 하기 유형의 독립적 치환기를 나타낸다: 할로겐 (F, Cl, Br, I); 히드록실 (-OH); 술프히드릴 (-SH); 카르복실레이트 (-COOH); 알킬 (C1-C4 탄소, 직쇄, 분지된, 또는 임의로 불포화를 함유함); 시클로알킬 (임의로 불포화를 함유하는 C1-C6); 페닐을 비롯한 아릴, 또는 1 내지 4개의 N, O 및 S 원자를 함유하는 헤테로아릴; 또는 알콕실 (-OR, 여기서 R은 할로겐, 히드록실, 술프히드릴, 카르복실레이트, 아릴, 헤테로아릴, 아미노 -NH2, 치환된 아미노 -NR2, 또는 5 또는 6원 고리에 1, 2 또는 3개의 N 원자를 함유하는 시클로아미노기에 의해 임의로 치환된, C1-C6 직쇄 또는 분지된 알킬기로서 정의됨).
추가 유사체는 페닐 고리 중 하나 또는 둘 모두가 헤테로시클릭 고리에 의해 대체된 화합물을 포함한다 (여기서, X는 O, S, N-R, N-OH 및 N-NR2로서 정의되고; Het은 임의의 고리 위치에서의 하나 이상의 N 원자로서 정의되고; Z은 -COOH, -PO3H2, SO3H, 테트라졸 고리, 술폰아미드, 아실 술폰아미드, -CONH2 및 -CONR2로서 정의됨).
Figure 112008059781518-pct00024
추가 유사체는 지시된 바와 같은 짧은 링커 잔기를 갖는 화합물이 또한 동일한 EGFR의 억제를 제공할 것으로 기재되는 화합물을 포함하며, 여기서 L은 C, N, O 및 S를 비롯한 1 내지 4개의 선형으로 연결된 원자로 구성된 링커로서 정의된다. C 및 S의 경우, 원자의 산화 상태는 단일 또는 이중 결합에 의해 부착된 1개 또는 2개의 산소를 가질 수 있다. C 및 N의 경우, 원자는 상기 정의된 기 S1 내지 S6에서 독립적으로 선택된 1개 또는 2개의 추가 치환기를 가질 수 있다.
Figure 112008059781518-pct00025
추가 유사체는 나타낸 바와 같이 테트라졸 고리이 대안적 5-원 헤테로시클릭 고리로 대체된 화합물을 포함한다.
Figure 112008059781518-pct00026
상기 식에서, A는 C, N, O 및 S를 포함하는 군에서 독립적으로 선택된 원자이다. C 및 S의 경우, 원자의 산화 상태는 단일 또는 이중 결합에 의해 부착된 1개 또는 2개의 산소를 가질 수 있다. C 및 N의 경우, 원자는 상기 정의된 기 S1 내지 S6에서 독립적으로 선택된 1개 또는 2개의 추가 치환기를 가질 수 있다.
한 실시양태에서, 표피 성장 인자 수용체 (EGFR)로의 표피 성장 인자 (EGF)의 결합의 억제제는 AD4-1020 (({5-[4-(벤질옥시)페닐]-2H-테트라졸-2-일}아세트산); 화학식: C16H14N4O3; 분자량: 310.31) (예를 들어, 실시예 10 참조)이다. EGFR로의 AD4-1020의 결합의 예시적 묘사는 도 53에 나타낸다. AD4-1020의 구조는 아래와 같다:
<화학식 18>
Figure 112008059781518-pct00027
AD4-1020의 25 μM의 농도에서, EGFR로의 EGF의 결합은 47.8％만큼 억제된다 (예를 들어, 실시예 6 참조).
AD4 -1132
AD4-1132는 표피 성장 인자의 그의 수용체로의 결합의 억제제로서 확인된다 (예를 들어, 실시예 11 참조). 이러한 화합물은 종양학에서 치료제로서 유용성을 갖는다. AD4-1132의 유사체 및 유도체는 동일한 억제 효과 및 유용성을 가질 것으로 기대된다. 약물작용발생단 모델, Pharm23_gly54_asp58은 약물작용발생단 모델을 설계하기 위한 1YY9 단백질 결정 구조로부터의 정보를 사용하여 설계되었다 (예를 들어, 실시예 4; 표 17; 도 15 참조). Pharm23_gly54_asp58 모델은 EGFR (서열 1)에 결합하는 소분자를 확인하는데 사용되었다. EGFR 단백질 상의 부위는 항체 세툭시맙 (서열 5 및 서열 6) (에르비툭스)의 아미노산 잔기 GLY-54 내지 ASP-58에 의해 인식된다. Pharm23_gly54_asp58은 잔기 GLY-54 내지 ASP-58 후 모델링되고, 항체 세툭시맙의 특성 및 성분을 갖는 소분자를 확인하는 수단으로서 설계된다. 세툭시맙의 이들 아미노산 잔기의 특성 및 성분은 약물작용발생단 모델의 제조에 사용되었다. 상기 약물작용발생단 모델로부터 하기 화합물이 유도된다:
<화학식 19>
Figure 112008059781518-pct00028
상기 식에서, S1 내지 S6은 하기 유형의 독립적 치환기를 나타내고: 할로겐 (F, Cl, Br, I); 히드록실 (-OH); 술프히드릴 (-SH); 카르복실레이트 (-COOH); 알킬 (C1-C4 탄소, 직쇄, 분지된, 또는 임의로 불포화를 함유함); 시클로알킬 (임의로 불포화를 함유하는 C1-C6); 페닐을 비롯한 아릴, 또는 1 내지 4개의 N, O 및 S 원자를 함유하는 헤테로아릴; 또는 알콕실 (-OR, 여기서 R은 할로겐, 히드록실, 술프히드릴, 카르복실레이트, 아릴, 헤테로아릴, 아미노 -NH2, 치환된 아미노 -NR2, 또는 5 또는 6원 고리에 1, 2 또는 3개의 N 원자를 함유하는 시클로아미노기에 의 해 임의로 치환된, C1-C6 직쇄 또는 분지된 알킬기로서 정의됨), Z은 -COOH, -PO3H2, SO3H, 테트라졸 고리, 술폰아미드, 아실 술폰아미드기, -CONH2 및 -CONR2로서 정의된다.
추가 유사체는 페놀성 에테르 산소가 유형 Y의 원자에 의해 대체된 화합물을 포함한다 (여기서, X는 CH2, O, S, N-R, N-OH 및 N-NR2로서 정의됨). C 및 S의 경우, 원자의 산화 상태는 단일 또는 이중 결합에 의해 부착된 1개 또는 2개의 산소를 가질 수 있다. C 및 N의 경우, 원자는 상기 정의된 기 S1 내지 S6에서 독립적으로 선택된 1개 또는 2개의 추가 치환기를 가질 수 있으며; 페닐 고리 중 하나 또는 둘 모두는 헤테로시클릭 고리에 의해 임의로 대체되며; 여기서 Het은 임의의 고리 위치에서의 하나 이상의 N 원자로서 정의된다:
Figure 112008059781518-pct00029
추가 유사체는 지시된 바와 같은 짧은 링커 잔기를 갖는 화합물이 또한 동일한 EGFR의 억제를 제공할 것으로 기재되는 화합물을 포함하며, 여기서 L은 C, N, O 및 S를 비롯한 1 내지 4개의 선형으로 연결된 원자로 구성된 링커로서 정의된다:
Figure 112008059781518-pct00030
추가 유사체는 나타낸 바와 같이 아미드 질소가 대안적 기 A에 의해 대체되고 아미드 카르보닐이 기 X에 의해 임의로 대체된 화합물을 포함한다:
Figure 112008059781518-pct00031
상기 식에서, A는 CH2, N, O 및 S를 포함하는 군에서 독립적으로 선택된 원자이다. C 및 S의 경우, 원자의 산화 상태는 단일 또는 이중 결합에 의해 부착된 1개 또는 2개의 산소를 가질 수 있다. C 및 N의 경우, 원자는 상기 정의된 기 S1 내지 S6에서 독립적으로 선택된 1개 또는 2개의 추가 치환기를 가질 수 있으며, X는 H2, O, S, N-R, N-OH 또는 N-NR2로서 정의된다.
추가 유사체는 나타낸 바와 같이 레트로-아미드의 경우 (이에 제한되지 않음)에서 발견되는 기 A 및 C=X의 근위를 포함한다:
Figure 112008059781518-pct00032
한 실시양태에서, 표피 성장 인자 수용체 (EGFR)로의 표피 성장 인자 (EGF)의 결합의 억제제는 AD4-1132 ((2-{[(2,4-디메틸페녹시)아세틸]아미노}-5-히드록시벤조산); 화학식: C17H17NO5; 분자량: 315.32) (예를 들어, 실시예 11 참조)이다. AD4-1132의 구조는 아래와 같다:
<화학식 24>
Figure 112008059781518-pct00033
AD4-1132의 25 μM의 농도에서, EGFR로의 EGF의 결합은 59.6％만큼 억제된다 (예를 들어, 실시예 6 참조).
AD4 -1142
AD4-1142는 표피 성장 인자의 그의 수용체로의 결합의 억제제로서 확인된다 (예를 들어, 실시예 12 참조). 이러한 화합물은 종양학에서 치료제로서 유용성을 갖는다. AD4-1142의 유사체 및 유도체는 동일한 억제 효과 및 유용성을 가질 것으로 기대된다. 약물작용발생단 모델, Pharm23_gly54_asp58은 약물작용발생단 모델을 설계하기 위한 1YY9 단백질 결정 구조로부터의 정보를 사용하여 설계되었다 (예를 들어, 실시예 4 참조). Pharm23_gly54_asp58 모델은 EGFR (서열 1)에 결합하는 소분자를 확인하는데 사용되었다. EGFR 단백질 상의 부위는 항체 세툭시맙의 아미노산 잔기 GLY-54 내지 ASP-58에 의해 인식된다 (서열 5 및 서열 6) (에르비툭스). Pharm23_gly54_asp58은 잔기 GLY-54 내지 ASP-58 후 모델링되고, 항체 세툭시맙의 특성 및 성분을 갖는 소분자를 확인하는 수단으로서 설계된다. 구체적으로, 상기 영역은 세툭시맙의 항체 중쇄의 H2 CDR로서 정의된다. 세툭시맙의 이들 아미노산 잔기의 특성 및 성분은 약물작용발생단 모델의 제조에 사용되었다. 상기 약물작용발생단 모델로부터 하기 화합물이 유도된다:
<화학식 25>
Figure 112008059781518-pct00034
상기 식에서, S1 내지 S6은 하기 유형의 독립적 치환기를 나타내고: 수소 (-H); 할로겐 (F, Cl, Br, I); 히드록실 (-OH); 술프히드릴 (-SH); 카르복실레이트 (-COOH); 알킬 (C1-C4 탄소, 직쇄, 분지된, 또는 임의로 불포화를 함유함); 시클로알킬 (임의로 불포화를 함유하는 C1-C6); 페닐을 비롯한 아릴, 또는 1 내지 4개의 N, O 및 S 원자를 함유하는 헤테로아릴 고리; 또는 알콕실 (-OR, 여기서 R은 할로겐, 히드록실, 술프히드릴, 카르복실레이트, 아릴, 헤테로아릴, 아미노 -NH2, 치환된 아미노 -NR2, 또는 5 또는 6원 고리에 1, 2 또는 3개의 N 원자를 함유하는 시클로아미노기에 의해 임의로 치환된, C1-C6 직쇄 또는 분지된 알킬기로서 정의됨), Z은 -COOH, -PO3H2, SO3H, 테트라졸 고리, 술폰아미드, 아실 술폰아미드, -CONH2 및 -CONR2로서 정의된다.
추가 유사체는 술폰아미드 NH가 유형 Y (여기서, Y는 CH2, O, S, N-R, N-OH 및 N-NR2로서 정의됨)의 원자에 의해 임의로 대체되고; 페닐 고리 중 하나 또는 둘 모두가 헤테로시클릭 고리 (여기서, Het은 임의의 고리 위치에서의 1개 또는 2개의 N 원자임)에 의해 임의로 대체된 화합물이 포함한다:
Figure 112008059781518-pct00035
추가 유사체는 나타낸 바와 같은 짧은 링커 잔기를 갖는 화합물이 또한 동일한 EGFR의 억제를 제공할 것으로 기재되는 화합물을 포함하며, 여기서 L은 C, N, O 및 S를 비롯한 1 내지 4개의 선형으로 연결된 원자로 구성된 링커로서 정의된다. C 및 S의 경우, 원자의 산화 상태는 단일 또는 이중 결합에 의해 부착된 1개 또는 2개의 산소를 가질 수 있다. C 및 N의 경우, 원자는 상기 정의된 기 S1 내지 S6에서 독립적으로 선택된 1개 또는 2개의 추가 치환기를 가질 수 있다.
Figure 112008059781518-pct00036
추가 유사체는 나타낸 바와 같이 기 A 및 Y가 단일, 이중 및 삼중 결합에 의해 임의로 연결된 유사체를 비롯해, 방향족 기가 기 A 및 Y에 의해 연결된 화합물을 포함한다:
Figure 112008059781518-pct00037
상기 식에서, Y는 상기 정의된 바와 같고, A는 CH2, N, O 및 S를 포함하는 군에서 독립적으로 선택된 원자이다. C 및 S의 경우, 원자의 산화 상태는 단일 또 는 이중 결합에 의해 부착된 1개 또는 2개의 산소를 가질 수 있다. C 및 N의 경우, 원자는 상기 정의된 기 S1 내지 S6에서 독립적으로 선택된 1개 또는 2개의 추가 치환기를 가질 수 있다.
추가 유사체는 나타낸 바와 같이 기 A 및 Y가 단일, 이중 및 삼중 결합에 의해 임의로 연결된 유사체를 비롯해, 기 A 및 Y의 근위를 포함한다:
Figure 112008059781518-pct00038
한 실시양태에서, 표피 성장 인자 수용체 (EGFR)로의 표피 성장 인자 (EGF)의 결합의 억제제는 AD4-1142 {(5-{[(4-에틸페닐)술포닐]아미노}-2-히드록시벤조산); 화학식: C15H15NO5S; 분자량: 321.35) (예를 들어, 실시예 12 참조)이다. AD4-1142의 구조는 아래와 같다:
<화학식 30>
Figure 112008059781518-pct00039
AD4-1142의 25 μM의 농도에서, EGFR로의 EGF의 결합은 49.8％만큼 억제된다 (예를 들어, 실시예 6 참조).
제약 제제
본 발명의 조성물의 실시양태는 본원에 기재된 여러 화합물의 제약 제제를 포함한다. 본원에 기재된 화합물은 예를 들어, 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences (A.R. Gennaro, Ed.), 21st edition, ISBN: 0781746736 (2005)]에 기재된 바와 같이 하나 이상의 제약상 허용되는 담체 및/또는 부형제를 사용하는 임의의 통상적인 방식에 의해 제제화될 수 있다. 이러한 제제는 대상체에게 적절한 투여를 위한 형태를 제공하기 위해 치료 유효량의 작용제 (바람직하게는 정제된 형태로)를 적합한 양의 담체와 함께 함유할 수 있다. 제제는 투여 방식에 적합해야 한다. 본 발명에서 사용하는 작용제는 비경구, 폐, 경구, 국소, 피내(intradermal), 근육내, 복강내, 정맥내, 피하, 비강내, 경막외, 안내, 협측 및 직장을 포함하며 이에 제한되지 않는 여러 경로를 사용하여 대상체에게 투여하기 위해 공지된 방법에 의해 제제화될 수 있다. 개별 작용제는 또한 하나 이상의 본 발명의 추가 작용제 및/또는 다른 생물학적으로 활성 또는 생물학적으로 불활성 작용제와 함께 조합되어 투여될 수 있다. 이러한 생물학적으로 활성 또는 불활성 작용제는 유체이거나 또는 작용제(들)과의 기계적 전달이거나 또는 이온성, 공유결합, 반 데르 발스, 소수성, 친수성 또는 다른 물리적 힘에 의해 작용제(들)에 부착될 수 있다.
제어-방출형 (또는 서방형) 제제는 작용제의 활성을 연장시키고 투여 빈도를 감소시키기 위해 제제화될 수 있다. 제어-방출형 제제는 또한 작용 개시 시간 또는 다른 특징, 예컨대 작용제의 혈액 수준에 효과를 미치고 결과적으로 부작용의 발생에 영향을 주기 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 방법에서 사용되는 경우, 본원에 기재된 작용제의 치료 유효량은 제약상 허용되는 부형제와 함께 또는 상기 부형제 없이 순수한 형태 또는 제약상 허용되는 염 형태 (이러한 형태가 존재하는 경우)로 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 작용제는 화합물이 표적 생체분자와 관련된 질환, 장애 또는 상태의 치료 또는 예방에 특이적인 표적 생체분자를 억제하기에 충분한 충분량으로 적용가능한 합당한 이점/위험 비율에서 투여될 수 있다.
이러한 화합물 및 그의 제약 제제의 독성 및 치료 효능은 LD50 (집단의 50％를 치사시키는 용량) 및 ED50 (집단의 50％에서 치료적으로 효과적인 용량)을 결정하기 위해 세포 배양 및/또는 실험 동물에서 표준 제약 절차에 의해 결정될 수 있다. 독성 및 치료 효과 간의 용량 비율은 비율 LD50/ED50으로서 표현될 수 있는 치료 지수 (여기서, 큰 치료 지수가 바람직함)이다.
단일 투여량 형태를 제조하기 위해 제약상 허용되는 담체와 조합될 수 있는 본 발명의 화합물의 양은 치료되는 숙주 및 특정 투여 방식에 따라 달라질 것이다. 투여량 형태 각각의 개별 용량에 함유된 작용제의 단위 함량은 그 자체로 치료 유효량을 구성할 필요가 없으며, 이는 필수적 치료 유효량이 많은 개별 용량의 투여에 의해 도달될 수 있기 때문이라는 것이 당업자에 의해 이해될 것이다. 작용제는 단일 사건으로 또는 치료의 시간 과정에 따라 투여될 수 있다. 예를 들어, 작용제는 1일마다, 1주마다, 2주마다 또는 1개월마다 투여될 수 있다. 몇몇 상태에서, 치료는 수주로부터 수개월 또는 심지어 1년 이상까지 연장될 수 있다.
임의의 특정 대상체에 대해 치료적으로 효과적인 특정 용량 수준은 치료될 상태 및 상태의 중증도; 사용되는 특정 작용제의 활성; 사용되는 특정 조성물; 환자의 연령, 체중, 전반적 건강, 성별 및 식이; 투여 시간; 투여 경로; 사용되는 특 정 작용제의 배출 속도; 치료의 지속시간; 사용되는 특정 작용제와 조합으로 또는 동시에 사용되는 약물 및 의료 분야에 익히 공지된 인자를 비롯한 다양한 인자에 따라 달라질 것이다. 본 발명에서 사용하기 위한 화합물의 총 일일 사용량은 정상적인 의료 판단의 범위 내에서 담당 의사에 의해 결정될 것이라는 것이 이해될 것이다.
표적 생체분자를 억제하는 본 발명의 화합물은 또한 다른 치료 양식과 조합되어 사용될 수 있다. 따라서, 본원에 기재된 치료요법 이외에, 표적 생체분자와 관련된 특정 상태에 효능있다고 공지된 다른 치료요법을 대상체에게 또한 제공할 수 있다.
본 발명을 상세히 기재하였으나, 첨부된 청구의 범위에서 정의된 본 발명의 범위를 벗어나지 않고 변형, 변이 및 등가 실시양태가 가능하다는 것이 명백할 것이다. 추가로, 본 개시물에서 모든 실시예는 비제한적 실시예로서 제공된 것임이 이해되어야 한다.
본 발명을 추가로 예시하기 위해 하기 비제한적 실시예가 제공된다. 하기 실시예에 개시된 기술은 본 발명자들이 본 발명의 실시에서 잘 기능하는 것으로 밝힌 접근법을 대표하므로, 실시예를 그의 실시를 위한 방식으로 구성하는 것으로 고려될 수 있다는 것이 당업자에 의해 이해되어야 한다. 그러나, 당업자는 본 개시물의 관점에서 많은 변화가 개시된 특이적 실시양태에서 제조될 수 있으며, 본 발명의 취지 및 범위에서 벗어나지 않고 유사한 결과를 또한 얻을 수 있다는 것을 이 해해야 한다.
실시예 1: 혈관 내피 성장 인자
하기 실시예는 본 실시예 인간 혈관 내피 성장 인자 (VEGF-A) (서열 2)에서 표적 분자에 대해 유발된 항체에 적어도 부분적으로 기초하는 하나 이상의 약물작용발생단의 제조에 관한 것이다. 간단히, 인간 혈관 내피 성장 인자 (VEGF-A)는 수많은 동물 (예를 들어, 유전적으로 상이한 마우스의 군)에게 제공된다. VEGF-A의 접종 및 반복적 제시는 상기 분자에 대해 다양한 IgG 항체 (폴리클로날 고친화성 항체)를 유발하는 동물을 야기한다. 이들 항체는 각각이 항체 생성에 대한 별개의 유전적 잠재성 (가능한 CDR의 상이한 조합)을 갖기 때문에 동물에 걸쳐 상이하다. 항체에서의 변이는 이들이 분자의 상이한 표면적에서 VEGF-A 분자에 결합하도록 야기한다. 하나 이상의 항체가 VEGF-A 분자의 활성 영역에 결합할 것으로 예상된다.
명료화에 의해, VEGF 족은 현재 7개의 구성원을 포함한다: VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E, VEGF-F 및 PIGF. 모든 구성원은 역평행, 병렬 배치 배향으로 이량체화하는 단량체 각각 내에 보존된 중심 4-가닥의 베타-시트의 한 말단에서 분자간 및 분자내 디술피드 결합에 포함된 8개의 불변 시스테인 잔기를 갖는, 시스틴 노트(knot) 모티프를 포함하는 공통 VEGF 상동성 도메인을 갖는다.
MAB 생성; 결정화, X-선 회절법 ; 공간 위치
친화성-성숙 항체 (그의 Fab 단편)에 결합된 VEGF 분자는 첸 등에 의해 이미 결정화되었고 1CZ8로서 RCSB 데이타베이스에 공개되었다. 보다 구체적으로, 그의 결정화 데이타는 VEGF 이량체의 구성원인 영역 V 및 W, 및 Fab 분자의 항체 경쇄 및 중쇄를 나타내는 영역 L, H, X 및 Y를 포함한다 (보다 구체적으로, L 및 H 영역은 쇄 각각의 가변 및 불변 영역을 포함하는 Fab 분자의 분지 중 하나를 포함한다. 유사하게, X 및 Y는 Fab 분자의 다른 분지의 경쇄 및 중쇄임).
VEGF-A의 결정질 구조의 8천개 초과의 비-수소 원자의 공간 배열의 기하학적 분석에 의해, 다른 구조의 원자의 특정 거리 내에 있는 한 구조의 원자를 결정할 수 있었다. 상기 필터는 모든 가능한 조합, 2개의 분자에 걸쳐 관련된 펩티드에 걸친 직접적 기하학적 비교에 의해 결정하였다. 4 Å의 최대 분리를 사용하여, VEGF 이량체의 W 성분의 원자의 이러한 짧은 범위 내에 있는 중쇄 가변 쇄 (H)의 원자를 결정하였으며, 이는 Fab 단편의 CDR에 존재하기가 가장 쉬웠다.
본 실시예에서, 본 분석은 항체 단편의 H 영역 및 VEGF 분자의 W 영역의 하기 아미노산이 서로 4 Å내에 있는 측쇄 원자를 포함하였음을 밝혔다 (상기 범위 내에 있는 둘 사이의 측쇄 원자의 전체 번호로 표에 나열함).
Figure 112008059781518-pct00040
본 분석은 추가로 표적 단백질에 결합하는 항체가 항체의 CDR 간의 상호작용을 포함하며, 가변 중쇄 상의 CDR의 위치가 30-33, 50-55 및 100-110 범위에서 펩티드를 포함하기 때문에 올바르게 확인되었음을 입증하였다. 보다 구체적으로, Fab (204, 206)에 결합된 VEGF (202)의 컴퓨터 모의실험인 도 4에 나타낸 바와 같이, 표적 단백질을 이량체화된 분자 W (208) 및 V (210)로 구축하였다. 상기 항체가 친화성-성숙 버젼이라는 사실에도 불구하고, 낮은 Fab (204) 간의 상호작용이 중쇄의 가변 영역 (216)의 2개의 CDR (212, 214)로 제한된 것은 전체 분자 모델의 우측의 확대된 박스에서 관찰할 수 있다.
도 5는 이량체화된 VEGF 분자의 리본 모델을 나타내고, 항체에 의해 개입된 펩티드 (302)의 범위는 80 내지 100 범위에 있다는 것을 입증하였으며, 이는 다시 상기 표에 요약된 분석에 의한 것이다.
첸 등에 따라 시험관내 세포-기재 분석은 상기 친화성-성숙 항체가 VEGF-의존성 세포 증식의 억제에 대한 유의한 효력을 얻었음을 나타내었다. 본 발명의 측면은 항체의 결합 계면의 구조의 사용 가능성을 합성 리드 분자의 생성에 대한 지침으로서 인식하는 것이다.
이 정확도 수준은 표적으로의 결합에 관여하는 것으로 여겨지는 펩티드가 실제로 CDR의 구성원이며, 결정화 방법의 인공물인 원자의 인접성이 간단하지 않다는 것을 입증하는데 도움이 되었다. 그러나, 리드 분자의 합성을 위한 모델로서 사용하는, 결합에 관여되는 가장 중요한 원자를 단리하기 위해, 원자-대-원자 상호작용의 수를 가장 밀접하게 연관된 수로 좁히는 것이 필수적이었다. 이는 3 Å으로 필터에서 허용되는 분리를 감소시킴으로써 성취할 수 있었다. 하기 표 2는 상기 보다 초점을 맞춘 분석의 결과를 나타낸다.
Figure 112008059781518-pct00041
이들 12개의 원자, 및 보다 특히 표적의 원자와 결합하는 항체의 6개의 원자의 상대적 위치에 보다 밀접하게 주목하여 리드 분자를 구축할 수 있다. 하기 표는 이들 원자 각각이 다른 원자로부터 떨어진 상대적 거리를 포함한다.
Figure 112008059781518-pct00042
상기 보여지는 바와 같이, 표적 및 항체의 결합 영역에서 가장 밀접하게 관련된 원자는 산소 원자이다. 질소 원자는 또한 이들 고친화성 부위에서 매우 두드러진다. 산소 및 질소 원자는 수소 수령체 또는 공여체가 필수적인 경우 종종 상호변화가능하다.
결합 영역의 확인된 원자 사이의 거리를 나타내는, 표 3에서 별표가 있는 숫자는 리드 분자로 함께 구조를 이루기에 충분하게 인접한 결합에 포함된 원자의 이상적인 하위군을 나타낸다. 프롤린 (100), 티로신 (101 및 102) 및 세린 (106)의 4개의 산소 원자는 적합한 분자가 약물-유사 크기를 갖도록 구축되기에 충분하게 인접한다 (<13 Å 분리). 도 6A 및 6B는 이들 기준을 충족하는 리드 분자 구조를 나타낸다. 하기 표는 (i) 리드 분자의 합당한 형태에서 원자의 분리, 및 (ii) 결정화된 항체의 X-선 회절 분석으로부터의 데이타와 비교하여 리드에서 원자의 위치 간의 차이점을 나타낸다.
Figure 112008059781518-pct00043
Figure 112008059781518-pct00044
상기 표가 나타내는 바와 같이, 본 발명의 방법에 의해 제조된 제안된 리드 분자는 항체의 결합 팁에서의 그의 상대적 위치로부터 0.18 Å 편차의 평균 (및 0.42 Å 편차 이하)으로 위치된 중요한 원자를 제공한다.
상기 기재된 바와 같이, 네가지 "5의 법칙"은 후보 약물-유사 화합물이 하기 특징 중 세가지 이상을 가져야 한다고 언급한다: (i) 500 달톤 미만의 중량; (ii) 5 초과의 logP; (iii) 5개 이하의 수소 결합 공여체 (OH 및 NH 기의 합으로 표현됨); 및 (iv) 10개 이하의 수소 결합 수령체 (N 및 O 원자의 합). 본원에 기재된 리드, C21H20O4는 하기 특징을 갖는다: (i) 336의 분자량; (ii) 2개의 수소 결합 공여체; 및 (iii) 4개의 수소 결합 수령체.
실시예 2: 인플루엔자 당단백질
다른 바람직한 표적은 바이러스 감염과 관련된 단백질, 예를 들어 적혈구응집소일 수 있다. 적혈구응집소는 인플루엔자 바이러스의 표면 상에서 발견된 항원성 당단백질이며, 바이러스를 감염될 세포에 결합시키는데 관여한다.
백신 제조자, 의료 기관 및 공중 위생과 관련된 정부 조직에 의한 공격적 매체 캠페인에도 불구하고, 미국에서 수백만명이 매년 인플루엔자에 감염된다 (몇몇은 미국 거류자 중 10％ 내지 20％만큼 높은 범위로 추정). 인플루엔자에 걸린 대부분의 사람들은 1주 내지 2주에 회복될 것이나, 그외의 사람들은 생명 위협적인 합병증 (예컨대, 폐렴)을 발병할 것이다. 많은 사람들은 전형적으로 단순하게 감기의 나쁜 버젼인 것으로 고려하나, 인플루엔자는 특히 약자, 노령자 또는 만성 질환자에게 치명적일 수 있다. 미국에서 매년 평균 약 36,000명의 사람들이 인플루엔자로 사망하며, 매년 114,000명이 인플루엔자의 결과로서 병원에 입원한다. 세계보건기구에 의한 추정치에 따라, 세계적으로 매년 250,000 내지 500,000명이 인플루엔자 감염으로 사망한다. 1918년 내지 1920년에 5천만명 이상의 사람들을 사망하게 한 가장 치명적인 급증을 비롯하여, 몇몇 flu 유행병은 수백만명의 사람들을 사망하게 했다.
flu에 대한 백신의 사용의 많은 환자의 실패는 바이러스 코트에서 발견된 당단백질에서의 돌연변이가 연간 예방접종을 바이러스의 최신 버젼으로부터 개개인을 완전히 보호하기 위한 요구조건으로 만든다는 사실의 결과일 수 있다. 숙주의 세포에 결합하는 바이러스의 능력을 차단할 수 있는 의약 (오직 부분적으로 효과적이라고 할지라도)은 감염된 개별의 면역계가 임상적으로 중요한 증상이 나타나기 전에 감염을 패배시킬 가능성을 극적으로 향상시킬 것이다. 의약이 이러한 증상의 개시 후 이용가능하게 되는 경우, 감염의 중증도 및 지속시간의 감소가 또한 가능하다.
플오이리(Fleury) 등은 중화 항체와 복합체를 형성한 적혈구응집소의 그의 결정화의 결과를 공개하였다. 그의 X-선 결정화 노력으로부터의 데이타는 단백질 데이타 뱅크에서 제공되며, VEGF와 관련해서 본원에서 상기 개시된 바와 유사한 방식으로 그의 발명자에 의해 분석되었다 (실시예 1 참조).
보다 구체적으로, 중화 항체 결정질 구조와 복합체를 형성한 적혈구응집소의 8천개 초과의 비-수소 원자의 공간 배열의 기하학적 분석은 표적 단백질이 적혈구응집소로의 결합의 부분을 이루기에 충분히 인접한 항체 단편 (가변 중쇄 및 가변 경쇄)의 원자를 결정하기 위해 수행하였다. 직접적 기하학적 방법을 비롯해 사용된 필터는 가변 중쇄 CDR 영역 및 특히 CDR1 및 CDR3 내의 펩티드 (특히, 카바트 및 우 번호매김에 따른 펩티드 26-32 및 99-102)가 적혈구응집소 단백질로의 항체의 가장 단단한 결합을 제공하였음을 입증하였다.
4 Å의 최대 분리를 사용하여, 서로 개입된 표적 당단백질 내의 특정 원자 뿐만 아니라 이들 CDR 내의 원자들을 결정하였다. 이들은 하기 표에 제공된다.
Figure 112008059781518-pct00045
이들 8개의 원자, 및 보다 특히 표적의 원자와 결합하는 항체의 9개의 원자의 상대적 위치에 보다 밀접하게 주목하여 리드 분자를 구축할 수 있다. 하기 표는 이들 원자 각각이 다른 원자로부터 떨어진 상대적 거리를 포함한다.
Figure 112008059781518-pct00046
별표가 있는 숫자는 리드 분자로 함께 구조를 이루기에 충분하게 인접한 결합에 포함된 원자의 이상적인 하위군을 나타낸다. 보다 구체적으로, 약물-유사 분자는 전형적으로 8 내지 15 Å의 스팬 및 500 달톤 미만의 분자량을 갖는다. 티로신 (32), 아르기닌 (94), 트립토판 (100) 및 페닐알라닌 (100A)의 5개의 원자는 적합한 분자가 약물-유사 크기를 갖도록 구축되기에 충분하게 인접하였다 (<12 Å 분리). 도 7A 및 7B는 이들 기준을 충족하는 리드 분자 구조를 나타낸다. 하기 표는 (i) 리드 분자의 합당한 형태에서 원자의 분리, 및 (ii) 결정화된 항체의 X-선 회절 분석으로부터의 데이타와 비교하여 리드에서 원자의 위치 간의 차이점을 나타낸다.
Figure 112008059781518-pct00047
Figure 112008059781518-pct00048
상기 표가 나타내는 바와 같이, 본 발명의 방법에 의해 제조된 제안된 리드 분자는 항체의 결합 팁에서의 그의 상대적 위치로부터 0.33 Å 편차의 평균 (및 0.66 Å 편차 이하)으로 위치된 중요한 원자를 제공한다.
상기 기재된 바와 같이, 네가지 "5의 법칙"은 후보 약물-유사 화합물이 하기 특징 중 세가지 이상을 가져야 한다고 언급한다: (i) 500 달톤 미만의 중량; (ii) 5 미만의 logP; (iii) 5개 이하의 수소 결합 공여체 (OH 및 NH 기의 합으로 표현됨); 및 (iv) 10개 이하의 수소 결합 수령체 (N 및 O 원자의 합). 본원에 기재된 리드, C22H18N4O는 하기 특징을 갖는다: (i) 354의 분자량; (ii) 3개의 수소 결합 공여체; 및 (iii) 5개의 수소 결합 수령체.
실시예 3: 안지오게닌
혈관형성 (선재하는 혈관계로부터 신규 모세 혈관의 돌기돌출)은 태아 및 소아의 발달에 중요한 측면이며, 이는 그의 순환계가 성장 중에 확장하기 때문이다. 성인에서, 혈관형성은 정상적인 조직 복구 중에, 및 여성 생식 기관의 리모델링 (배란 및 태반 발달)을 위해 요구된다. 그러나, 특정 병리학적 상태, 예컨대 종양 성장 및 당뇨병성 망막병증도 혈관형성을 필요로 한다. 혈관형성에 관련된 공지된 인자는 123개의 아미노산의 단일 폴리펩티드 쇄인 안지오게닌이다.
안지오게닌은 암의 급속 성장을 돕기 위해 암에 의해 사용되는 정상적인 사이토카인 중 하나이다. 이 경우, 종양 세포는 종양으로 혈액 유량을 더 많이 보충하기 위해 안지오게닌을 분비한다. 따라서, 안지오게닌의 생성 또는 활성을 억제할 수 있는 약물을 개발하는 것은 매우 가치있을 것이다.
샤발리(Chavali) 등은 중화 항체와 복합체를 형성한 안지오게닌의 그의 결정화의 결과를 공개하였다. 그의 X-선 결정화 노력으로부터의 데이타는 단백질 데이타 뱅크에서 제공되며, VEGF 및 적혈구응집소와 관련해서 본원에서 상기 개시된 바와 유사한 방식으로 그의 발명자에 의해 분석되었다.
보다 구체적으로, 결정질 구조의 비-수소 원자의 공간 배열의 기하학적 분석은 안지오게닌 분자가 적혈구응집소로의 결합의 부분을 이루기에 충분히 인접한 항체 단편 (가변 중쇄 및 가변 경쇄)의 원자를 결정하기 위해 수행하였다. 직접적 기하학적 방법을 비롯해 사용된 필터는 가변 경쇄 및 중쇄, 및 특히 경쇄의 CDR1 및 중쇄의 CDR 2 및 3 내의 펩티드가 안지오게닌으로의 항체의 가장 단단한 결합을 제공하였음을 입증하였다 (도 8에서 볼 수 있음).
4 Å의 최대 분리를 사용하여, 서로 개입된 표적 당단백질 내의 특정 원자 뿐만 아니라 이들 CDR 내의 원자들을 결정하였다. 이들은 하기 표에 제공된다.
Figure 112008059781518-pct00049
이들 8개의 원자, 및 보다 특히 표적의 원자와 결합하는 항체의 9개의 원자의 상대적 위치에 보다 밀접하게 주목하여, 2개의 별도의 잠재적 표적 부위를 안지오게닌 상에서 확인하였다. 이는 (표 11 및 12에 나타낸 바와 같이) 2개의 별도의 리드 분자가 안지오게닌과 결합하도록 구축될 수 있음을 의미한다. 하기 표는 각 기의 이들 원자 각각이 다른 원자로부터 떨어진 상대적 거리를 포함한다.
Figure 112008059781518-pct00050
Figure 112008059781518-pct00051
상기 언급된 바와 같이, 약물-유사 분자는 전형적으로 8 내지 15 Å의 스팬 및 500 달톤 미만의 분자량을 갖는다. 표 11에서, 티로신 3OB의 OH, 아스파라긴 3OA의 질소, 티로신 98의 공명 탄소 CD2, 및 티로신 100B의 OH는 적합한 분자가 약물-유사 크기를 갖도록 구축되기에 충분하게 인접하였다 (<11 Å 분리)는 것을 볼 수 있다. 유사하게, 표 12와 관련해서, 트레오닌 33의 산소, 티로신 58의 OH, 세린 90 및 아스파라긴 56의 산소는 다른 적합한 분자가 구축되기에 충분하게 인접하였다 (<14 Å 분리). 도 9A 및 9B는 안지오게닌 분자의 제1 영역 및 제2 영역에 대한 기준을 충족하는 2개의 리드 분자 구조를 각각 나타낸다.
하기 표는 (i) 제1 리드 분자의 합당한 형태에서 원자의 분리, 및 (ii) 결정화된 항체의 X-선 회절 분석으로부터의 데이타와 비교하여 제1 리드에서 원자의 위치 간의 차이점을 나타낸다.
Figure 112008059781518-pct00052
Figure 112008059781518-pct00053
유사하게, 하기 표는 (i) 제2 리드 분자의 합당한 형태에서 원자의 분리, 및 (ii) 결정화된 항체의 X-선 회절 분석으로부터의 데이타와 비교하여 제2 리드에서 원자의 위치 간의 차이점을 나타낸다.
Figure 112008059781518-pct00054
Figure 112008059781518-pct00055
상기 표가 나타내는 바와 같이, 본 발명의 방법에 의해 제조된 제안된 리드 분자는 항체의 결합 팁에서의 그의 상대적 위치로부터 0.05 Å 편차의 평균 (및 0.15 Å 편차 이하)으로 위치된 중요한 원자를 제공한다.
상기 소개된 바와 같이, 네가지 "5의 법칙"은 후보 약물-유사 화합물이 하기 특징 중 세가지 이상을 가져야 한다고 언급한다: (i) 500 달톤 미만의 중량; (ii) 5 미만의 logP; (iii) 5개 이하의 수소 결합 공여체 (OH 및 NH 기의 합으로 표현됨); 및 (iv) 10개 이하의 수소 결합 수령체 (N 및 O 원자의 합). 제1 리드 후보, C22H19NO2는 하기 특징을 갖는다: (i) 329의 분자량; (ii) 4개의 수소 결합 공여체; 및 (iii) 4개의 수소 결합 수령체. 제2 리드 후보, C22H20O4는 하기 특징을 갖는다: (i) 348의 분자량; (ii) 4개의 수소 결합 공여체; 및 (iii) 4개의 수소 결합 수령체.
실시예 4: 표적 억제를 위한 약물작용발생단의 제조
하기 실시예에는 EGFR, HER2 및 ErbB2 결합을 억제하는 분자의 확인을 위한 표적 단백질-항체 결정 구조 복합체의 분석 및 약물작용발생단의 제조가 기재되어 있다.
EGFR에 복합체를 형성한 세툭시맙의 단백질 결정 구조는 퍼거슨(Ferguson) 등의 문헌 [Cancer Cell, 2005, 7, 301-311]에 보고되어 있으며, 결정학 데이타는 단백질 데이타 뱅크에 PDB 코드 1YY9로서 기탁되어 있다. 세툭시맙 (서열 5 및 서열 6)의 원자의 위치를 정의하는 구조적 정보는 유사한 위치에서 상응하는 원자를 갖는 소분자의 확인에 사용되는 약물작용발생단 모델의 구축에 사용하였다. 항체와 유사한 특성을 갖는 소분자는 유사한 생물학적 활성을 나타낼 수 있으므로, 유사한 치료 유용성을 가질 수 있다.
케미컬 컴퓨팅 그룹 (CCG) (캐나다 퀘벡 몬트리올 소재)으로부터의 분자 작동 환경 (MOE) 소프트웨어의 약물작용발생단 특성 생성 및 약물작용발생단 가상 스크리닝 모듈을 하기 기재된 약물작용발생단 정의에서 사용하였다. MOE의 약물작용발생단 적용은 수용체 부위에서 리간드의 인식 및 따라서 그의 생물학적 활성과 직접적으로 관련된 리간드에서의 구조적 특성의 세트인 약물작용발생단의 일반적인 개념을 사용하였다.
MOE에서, 약물작용발생단 구조적 특성은 공간에서 표지된 점에 의해 나타내었다. 리간드 각각은 리간드의 약물작용발생단에 기여할 수 있는 구조적 특성의 한 세트인 애노테이션으로 지정하였다. 애노테이션된 리간드의 데이타베이스는 약물작용발생단 가설을 나타내는 조회로 조사할 수 있다. 이러한 조사의 결과는 조회의 약물작용발생단 특성을 조사된 데이타베이스의 리간드에 존재하는 약물작용발생단 특성에 대해 정렬하는 매칭의 세트이다. MOE 소프트웨어 스위트는 상호작용성 변형 (위치, 반지름, 뿐만 아니라 약물작용발생단 조회의 다른 특징이 상호작용적으로 조절될 수 있음); 시스템적 매칭 (리간드 및 조회의 모든 가능한 매칭을 시스템적으로 시험함); 부분 매칭 (조사 알고리즘은 조회의 부분만을 매칭하는 리간드를 찾을 수 있음); 및 부피 필터링 (조회는 매칭된 리간드의 형상에 대한 제한을 부피의 세트의 형태에 첨가함으로써 주목될 수 있음)을 제공한다.
본 실시예의 약물작용발생단 특성은 MOE에서 약물작용발생단 조회 편집기를 사용하여 제조하였다. 모든 수소 결합 공여체 특성은 반지름 1.2 Å의 구이고, 보라색이다. 모든 수소 결합 수령체 특성은 반지름 1.2 Å의 구이고, 청록색이다. 모든 방향족 특성은 반지름 1.2 Å의 구이고, 녹색이다. 모든 조합된 수령체-음이온 약물작용발생단 특성은 반지름 1.2 Å의 구이고, 회색이다. 모든 조합된 공여체-수령체 특성은 반지름 1.2 Å의 구이고, 분홍색이다. 모든 조합된 공여체-양이온 특성은 반지름 1.2 Å의 구이고, 적색이다. 모든 공여체, 수령체, 방향족, 조합된 산-음이온, 및 조합된 공여체-수령체 방향 특성은 반지름 1.5 Å의 구이고, 공여체에 대해서는 흑회색, 수령체에 대해서는 어두운 청록색, 방향족에 대해서는 어두운 녹색, 조합된 산-음이온에 대해서는 어두운 청록색, 조합된 공여체-수령체에 대해서는 흑회색이다. 약물작용발생단 조회에 필수적인 것으로 표지된 특성은 리간드가 히트가 되도록 상기 리간드에 함유되어야 한다.
모든 약물작용발생단 특성은 2개의 예외를 갖는 단백질 데이타뱅크 (PDB:1YY9)에 기탁된 결정 구조로부터 취한 수용체 (예를 들어, EGFR과 복합체를 형성한 세툭시맙, pdb 승인 번호 1YY9)와의 복합체 중 상응하는 공여체, 수령체, 상응하는 항체의 방향족 및 산 잔기로부터 유도하였다. 몇몇 경우에, MOE 소프트웨어에 의해 제공된 2개의 방법은 약물작용발생단 특성을 위치시키는데 사용하였다. 이들은 하기 설명되어 있다.
접촉 통계학은 통계학적 방법을 사용하고 수용체의 3D 원자 좌표를 사용하여, 소수성 및 친수성 리간드 원자에 바람직한 위치를 계산하였다. 상기 방법을 사용하여, 소수성-방향족 및 H-결합 특성은 개별 약물작용발생단 정의에 언급된 바와 같이 위치시켰다.
다중단편 조사는 단편의 상대적으로 다수의 카피 (예를 들어, 에탄의 200개의 카피)를 수용체의 활성 부위로 필수적으로 위치시켰다. 단편은 활성 부위 원자 주위에 무작위로 위치시켰으며, 서로 상호작용하지 않는 것으로 가정되었으며, 단편 중첩에 관련이 없었다. 다음, 특별 에너지 최소화 프로토콜은 초기 위치를 정제하는데 사용하였다: 수용체 원자는 단편의 평균 힘을 감지하는 반면, 단편 각각은 수용체의 전체 힘을 감지하나, 다른 단편은 그렇지 않다. 상기 기술을 사용하여, MOE 약물작용발생단 특성으로서 사용하기 위한 수용체 내에 바람직한 위치에서 소수성, H-결합 공여체, 수령체 및 음이온 및 양이온을 위치시키는 것이 가능하였다.
배제된 부피는 명시되는 경우를 제외하고 하기 정의된 약물작용발생단에 대해 생성하였다. 이들은 항체 결합 부위에 인접한 수용체 원자의 위치로부터 유도하였다. 배제된 부피는 수용체로의 범핑을 회피하기 위해 리간드 원자가 배제되어야 하는 공간의 위치이다. 이들은 항체로부터 5 Å 내의 수용체 잔기를 선택하고, MOE에서 약물작용발생단 조회 편집기로부터 "유니온"을 선택함으로써 MOE에서 생성하였다.
하기 기재된 개별 약물작용발생단 정의에서, 약어는 다음와 같다: F = 약물작용발생단 특성; 공여체 = Don, 수령체 = Acc, 음이온 = Ani, 양이온 = Cat, 수령체 및 음이온 = Acc&Ani, 공여체 및 양이온 = Don&Cat, 공여체 및 수령체 = Don&Acc, 방향족 = Aro, 소수성 물질 = Hyd.
항체 세툭시맙와 복합체를 형성한 EGFR (1 YY9 . pdb )
항체 세툭시맙 (서열 5 및 서열 6)와 복합체를 형성한 단백질 EGFR (서열 1)의 결정 (1YY9.pdb)을 상기 기재된 절차에 따라 분석하였다. 결과는 항체 세툭시맙의 잔기의 2개의 세트가 수용체와의 접촉을 생성한다는 것을 나타내었다. 이들은 Gly54-Asp58 및 Thr100-Glu105이다. 항체의 잔기의 이들 세트가 서로 밀접하게 인접하지 않으므로, 하기 표 17에 기재하고 도 11 내지 22에 표시된, 영역 gly54_asp58 및 thr100_glu105에 대한 약물작용발생단 모델의 2개의 그룹을 제조하는데 이들을 사용하였다.
Figure 112008059781518-pct00056
Figure 112008059781518-pct00057
Figure 112008059781518-pct00058
Figure 112008059781518-pct00059
항체 세툭시맙과 복합체를 형성한 VEGF (1 CZ8 )
항체와 복합체를 형성한 단백질 VEGF (서열 2)의 결정 (1CZ8)을 상기 기재된 절차에 따라 분석하였다. 결과는 항체의 6개의 잔기의 한 세트가 수용체와의 접촉을 생성한다는 것을 나타내었다. 이는 Thr101-Ser106이다. 항체의 이 분비는 하기 표 18 및 도 23 내지 29에 기재된 약물작용발생단 모델을 제조하는데 사용하였다.
Figure 112008059781518-pct00060
Figure 112008059781518-pct00061
Figure 112008059781518-pct00062
Figure 112008059781518-pct00063
항체와 복합체를 형성한 HER2 (1 N8Z . pdb )
항체 트라스투즈맙 (서열 7 및 서열 8)과 복합체를 형성한 단백질 HER2 (서열 3)의 결정 (1N8Z.pdb)을 상기 기재된 절차에 따라 분석하였다. 결과는 항체의 5개의 잔기가 수용체와의 접촉을 생성한다는 것을 나타내었다. 이들은 Arg50, Tyr92-Thr94 및 Gly103이다. 항체의 이들 잔기는 서로 밀접하게 인접하였다. 이들은 하기 표 19 및 도 30 내지 33에 기재된 약물작용발생단 모델의 한 군을 제조하는데 사용하였다.
Figure 112008059781518-pct00064
Figure 112008059781518-pct00065
항체와 복합체를 형성한 ErbB2 (1 S78 . pdb )
항체 페르투즈맙 (서열 9 및 서열 10)과 복합체를 형성한 단백질 ERBB2 (서열 4)의 결정 (1S78.pdb)을 상기 기재된 절차에 따라 분석하였다. 결과는 항체의 5개의 잔기가 수용체와의 접촉을 생성한다는 것을 나타내었다. 이들은 Asp31-Tyr32 및 Asn52-Pro52A-Asn53이었다. 항체의 이들 잔기는 서로 밀접하게 인접하였다. 이들은 하기 표 20 및 도 34 및 35에 기재된 2개의 약물작용발생단 모델을 제조하는데 사용하였다.
Figure 112008059781518-pct00066
Figure 112008059781518-pct00067
항체 세툭시맙의 중쇄와 복합체를 형성한 EGFR (2 EXQ . pdb )
항체 세툭시맙 (서열 5 및 서열 6)의 중쇄와 복합체를 형성한 단백질 EGFR (서열 1)의 결정 (2EXQ.pdb)을 상기 기재된 절차에 따라 분석하였다. 결과는 약물작용발생단 모델의 제1 세트에서 항체의 중쇄의 8개의 잔기가 수용체와의 접촉을 생성한다는 것을 나타내었다. 이들은 Tyr50_Thr57이었다. 이들은 하기 표 21 및 도 36 내지 42에 기재된 7개의 약물작용발생단 모델을 제조하는데 사용하였다.
Figure 112008059781518-pct00068
Figure 112008059781518-pct00069
Figure 112008059781518-pct00070
Figure 112008059781518-pct00071
항체 세툭시맙의 경쇄와 복합체를 형성한 EGFR (2 EXQ . pdb )
항체 세툭시맙 (서열 5 및 서열 6)의 경쇄와 복합체를 형성한 단백질 EGFR (서열 1)의 결정 (2EXQ.pdb)을 상기 기재된 절차에 따라 분석하였다. 결과는 약물작용발생단 모델의 제1 세트에서 항체의 경쇄의 9개의 잔기가 수용체와의 접촉을 생성한다는 것을 나타내었다. 이들은 Asn32_Ile33_Gly34, Tyr49_His50_Gly51, Tyr91, Phe94 및 Trp96이었다. 이들은 하기 표 22 및 도 43 및 44에 기재된 6개의 약물작용발생단 모델을 제조하는데 사용하였다.
Figure 112008059781518-pct00072
Figure 112008059781518-pct00073
Figure 112008059781518-pct00074
상기 기재된 방법을 사용하여, 하기를 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 단백질 표적 (리간드로 결정화됨)에 대한 약물작용발생단 모델을 제조할 수 있다: 구저병 (1QGC.pdb); 안지오텐신 II (1CK0.pdb, 3CK0.pdb, 2CK0.pdb); 페르투주맙 항체와 복합체를 형성한 ErbB2 (1L7I.pdb, 1S78.pdb, 2GJJ.pdb); Flu 응집소 (1DN0.pdb, 1OSP.pdb); Flu 적혈구응집소 (1EO8.pdb, 1QFU.pdb, 2VIR.pdb, 2VIS.pdb, 2VIT.pdb, 1KEN.pdb, 1FRG.pdb, 1HIM.pdb, 1HIN.pdb, 1IFH.pdb); Flu 뉴라미니다제 (NC10.pdb, 1AI4.pdb, 1NMB.pdb, 1NMC.pdb, 1NMA.pdb, 1NCA.pdb, 1NCD.pdb, 2AEQ.pdb, 1NCB.pdb, 1NCC.pdb, 2AEP.pdb); 감마 인터페론 (HuZAF.pdb, 1T3F.pdb, 1B2W.pdb, 1B4J.pdb, 1TO4.pdb); 헤르셉틴과 복합체를 형성한 HER2 (1N8Z.pdb, 1FVC.pdb); 네이세리아 메닝기티디스 (1MNU.pdb, 1MPA.pdb, 2MPA.pdb, 1UWX.pdb); HIV1 프로테아제 (1JP5.pdb, 1CL7.pdb, 1MF2.pdb, 2HRP.pdb, 1SVZ.pdb); HIV-1 역전사효소 (2HMI.pdb, 1J5O.pdb, 1N5Y.pdb, 1N6Q.pdb, 1HYS.pdb, 1C9R.pdb, 1HYS.pdb, 1R08.pdb, 1T04.pdb, 2HRP.pdb); 리노바이러스 (1FOR.pdb, 1RVF.pdb, 1BBD.pdb, 1A3R.pdb, 1A6T.pdb); 혈소판 피브리노겐 수용체 (1TXV.pdb, 1TY3.pdb, 1TY5.pdb, 1TY6.pdb, 1TY7.pdb); 살모넬라 올리고당류 (1MFB.pdb, 1MFC.pdb, 1MFE.pdb); TGF-알파 (1E4W.pdb, 1E4X.pdb); TN1와 복합체를 형성한 트롬보포이에틴 (1V7M.pdb, 1V7N.pdb); 5G9와 복합체를 형성한 조직 인자 (1FGN.pdb, 1AHW.pdb, 1JPS.pdb, 1UJ3.pdb); NMC-4와 복합체를 형성한 본 윌렌브랜드 인자 (1OAK.pdb, 2ADF.pdb, 1FE8.pdb, 1FNS.pdb, 2ADF.pdb); B20-4와 복합체를 형성한 VEGF (2FJH.pdb, 2FJF.pdb, 2FJG.pdb, 1TZH.pdb, 1TZI.pdb, 1CZ8.pdb, 1BJ1.pdb); 코로나바이러스-SARS (2DD8.pdb, 2G75.pdb); 라임병 (1P4P.pdb, 1RJL.pdb); HIV GP120 (1ACY.pdb, 1F58.pdb, 1G9M.pdb, 1G9N.pdb, 1GC1.pdb, 1Q1J.pdb, 1QNZ.pdb, 1RZ7.pdb, 1RZ8.pdb, 1RZF.pdb, 1RZG.pdb, 1RZI, 1RZJ.pdb, 1RZK.pdb, 1YYL.pdb, 1YYM.pdb, 2B4C.pdb, 2F58.pdb, 2F5A.pdb); HIV GP41 (1TJG.pdb, 1TJH.pdb, 1TJI.pdb, 1U92.pdb, 1U93.pdb, 1U95.pdb, 1U8H.pdb, 1U8I.pdb, 1U8J.pdb, 1U8K.pdb, 1U8P.pdb, 1U8Q.pdb, 1U91.pdb, 1U8L.pdb, 1U8M.pdb, 1U8N.pdb, 1U8O.pdb, 2F5B); 웨스트 나일 바이러스 (미국 특허 출원 공보 제2006/0115837호에 정의된 바와 같음); 말라리아 (디히드로폴레이트 리덕타제) (문헌 [Acta Crystallographia (2004), D60(11), 2054 - 2057]에 정의된 바와 같음); 및 EGFR (1I8I.pdb, 1I8K.pdb, 1YY8.pdb, 1YY9.pdb, 2EXP.pdb, 2EXQ.pdb).
실시예 5: 리간드 도킹 및 점수매김
표적 단백질로의 도킹을 위해 선택된 화합물은 MOE 모델링 소프트웨어에서 제조된 약물작용발생단 모델에 정렬하기 위해 발견된 화합물이었다 (실시예 4 참조). 이들 화합물은 ZINC 데이타베이스로부터 MOE 데이타베이스 형식으로 얻었다 (문헌 [Irwin and Shoichet (2005) J Chem lnf Model 45, 177-182] 참조). 이들 화합물의 삼차원 원자 좌표는 수소를 첨가하지 않고 MOE 데이타베이스 창에서 엑스포트 명령을 사용하여 구조 데이타 형식 (*.sdf) 파일로 작성하였다.
도킹을 위한 화합물의 제조를 위해 마에스트로 모델링 소프트웨어 (슈로딘거 LLC, NY, NY)의 리그프렙(LigPrep) 소프트웨어 모듈을 다음에 사용하였다. 리그프렙을 사용하여 *.sdf 파일을 마에스트로 형식으로 전환하였다. 그 후, 수소를 첨가하고, 임의의 대전된 기를 중화하였다. 리간드에 대해 7.0 +/- 1.0 pH 단위에서 이온화 조건을 제조하였다. 그 후, 필요하다면 호변이성질체를 제조하고, 대안적 키랄성을 제조하고, 저에너지 고리 형태 이성질체를 제조하였다. 그 후, 매크로모델 소프트웨어 모듈을 사용하여 얻어진 리간드를 최소화하는 에너지 및 임의의 문제 구조를 제거하였다. 최종적으로, 마에스트로 파일 (*.mae)은 도킹을 위해 이제 준비된 리간드에 대해 작성하였다. 모든 이들 단계는 슈로딘거, LLC에 의해 공급된 피톤 스크립트를 통해 자동화하였다.
하기는 단백질 제조를 기재하였다. 제1 단백질을 PDB 형식으로 마에스트로에 임폴트하였다. 수소를 첨가하고, 임의의 오차, 예컨대 불완전 잔기를 복구하였다. 금속 이온 및 보조인자에 대해 단백질 구조를 체크하였다. 하전 및 원자 유형은 필요하다면 금속 이온 및 보조인자에 대해 고정하였다. 필요하다면 리간드 결합 차수 및 형태 하전을 조절하였다. 마에스트로 (글리드)에서 리간드 (1YY9에 대해, 항체의 Thr100-Tyr101-Tyr102-Asp103-Tyr104-Glu105 또는 Gly54-Gly55-Asn56-Thr57-Asp58 조각임)를 고름으로써 결합 부위를 결정하였다. 프로그램은 고른 리간드의 중심을 결정하였으며, 박스의 중심에서 리간드의 중심으로 설정하는 디폴트를 나타내는 20 Å 박스를 도시하였다. 박스는 도킹되는 리간드에 대한 결합 부위였다. 글리드에서 자동화된 단백질 제조 설비는 2개의 구성부분, 제조 및 정제로 구성되었다. 제조 구성부분은 수소를 첨가하고, 결합 부위에 인접하지 않고 염 브릿지에 참여하지 않는 측쇄를 중화시켰다. 정제 구성부분은 측쇄 히드록실기를 재배향하고 잠재적 입체 충돌을 완화시킨 공결정화된 복합체의 방해된 최소화를 수행하였다.
하기는 수용체 그리드 제조를 기재한다. 글리드는 하나 이상의 리간드 분자 및 수용체 분자, 통상적으로 단백질 간의 바람직한 상호작용에 대해 조사하였다. 수용체의 형상 및 특성은 수소 결합, 쿨롱 (즉, 하전-하전) 상호작용, 소수성 상호작용, 및 단백질과 리간드의 입체 충돌을 비롯한 분야의 여러 상이한 세트에 의해 그리드에 대해 나타내었다. 제1 단계에서, 수용체를 정의해야 한다. 이는 리간드를 고름으로써 수행하였다. 구조의 고르지 않은 부분은 수용체였다. 리간드는 그리드 계산에 포함되지 않았으나, 상기 기재된 바와 같이 결합 부위를 정의하는데 사용하였다. 수용체의 비극성 원자의 스케일링은 본 도킹 실행에 포함하지 않았다. 그리드 자체는 봉입 박스의 공간 내에서 계산하였다. 이는 상기 기재된 박스이며, 모든 리간드 원자는 상기 박스에 포함되어야 한다. 약물작용발생단 구속을 사용하지 않았는데, 이는 글리드 여분의 정밀도 점수매김 함수가 이들 구속 없이 양호하게 수행하기 때문이다.
글리드를 사용하기 위해, 수용체는 1개 초과의 분자, 예를 들어 단백질 및 보조인자를 포함할 수 있는 반면, 리간드 각각은 단일 분자이어야 한다. 글리드는 경직 또는 가요성 도킹 방식으로 수행할 수 있으며; 후자는 주입 리간드 각각에 대한 형태를 자동적으로 생성시켰다. 수용체에 대한 리간드의 위치 및 배향의 조합은 가요성 도킹에서의 그의 형태와 함께 리간드 포즈로서 지칭된다. 모든 도킹 실행은 가요성 도킹 방식을 사용하여 수행하였다. 글리드가 생성하는 리간드 포즈는 수용체와 리간드의 상호작용을 평가하는 일련의 계층 필터를 통한 통과를 생성하였다. 초기 필터는 정의된 활성 부위로 리간드의 공간 맞춤을 시험하고, 그리드-기재 방법을 사용하여 리간드-수용체 상호작용의 상보성을 시험하였다. 이들 초기 스크리닝을 통과하는 포즈는 알고리즘의 최종 단계로 도입하였으며, 이는 OPLS-AA 비결합된 리간드-수용체 상호작용 에너지에 대한 그리드 근사의 최소화 및 평가를 포함하였다. 그 후, 에너지-최소화된 포즈에 대해 최종 점수매김을 수행하였다. 디폴트에 의해, 슈로딘거 소유의 글리드점수 다중-리간드 점수매김 함수는 포즈를 점수매기는데 사용하였다. 글리드점수를 점수매김 함수로서 선택한 경우, 리간드 각각의 포즈를 등급매기고 사용자에게 보고되는 포즈를 선택하는데 복합 이모델 점수를 사용하였다. 이모델은 글리드점수, 비결합된 상호작용 에너지, 및 가요성 도킹에 대한 생성된 리간드 형태의 과잉의 내부 에너지를 조합하였다. 형태 가요성은 광범위한 형태 조사에 의해 글리드에서 조작하였으며, 부적합한 형태, 예컨대 긴-범위 내부 수소 결합을 갖는 형태를 급속하게 제거하는 발견적 스크리닝에 의해 증가하였다.
본 실시예의 도킹 실행에서 사용되는 설정은 아래와 같다. 그리드 파일을 판독하였다. 여분의 정밀도 (XP) 점수매김 함수를 사용하였다. 형태 가요성을 사용하여 도킹하였다. 초기 글리드 스크리닝를 위한 리간드 당 5000 포즈를 유지하였다 (디폴트). 초기 포즈를 유지하기 위한 점수매김 창은 100.0 (디폴트)이었다. 에너지 최소화를 위한 리간드 당 최상의 800 포즈를 유지하였다 (디폴트). 에너지 최소화를 위해, 2.0의 거리 의존성 유전 상수를 사용하였으며, 접합 기울기 단계의 최대치는 100이었다 (디폴트). 그 후, 리간드 파일을 로딩하였다. > 120 원자 및/또는 > 20 회전성 결합을 갖는 분자는 도킹하지 않았다 (디폴트). 부분 하전 < 0.15를 갖는 리간드 원자의 반 데르 발스 반지름은 0.80에 의해 스케일링하였다. 이는 수용체 가요성을 모방하기 위해 수행하였다. 구속 및 유사성은 사용하지 않았다. 쿨롱 + 반 데르 발스 에너지 > 0.0를 갖는 포즈를 거절하였다. 분자 각각에 대한 포즈가 형태적으로 구별되도록 하기 위해, RMS 편차 < 0.5 및/또는 1.3 Å의 최대 원자 변위를 갖는 포즈는 버렸다.
하기는 글리드 점수매김을 기재한다. 리간드 각각에 대한 최상의 도킹된 구조의 선택은 에너지 그리드 점수, 글리드점수에 의해 예측되는 결합 친화성, 및 (가요성 도킹에 대해) 형태-조사 알고리즘의 지정을 위해 사용되는 모델 잠재성에 대한 내부 균주 에너지를 합하는 모델 에너지 점수 (이모델)를 사용하여 수행하였다. 또한, 글리드는 하전-쌍극자 및 쌍극자-쌍극자 상호작용의 소비로 하전-하전 상호작용을 과도하게 보상하는 것을 회피하기 위해 제제화된 특별하게 구축된 쿨롱-반 데르 발스 상호작용-에너지 점수 (CvdW)를 계산하였다. 상기 점수는 "비가공" 쿨롱-반 데르 발스 상호작용 에너지보다 상이한 리간드의 결합 친화성의 비교에 보다 적합하도록 의도하였다. 최종 데이타 마무리작업에서, 데이타베이스 스크리닝 적용에서 강화 인자를 개선하는 것을 도울 수 있는 복합 점수를 제공하기 위해 계산된 글리드점수 및 "변형된" 쿨롱-반 데르 발스 점수 값을 합할 수 있다. 글리드점수의 수학적 형태는 아래와 같다:
GScore = 0.065×EvdW + 0.130×Coul + Lipo + Hbond + metal + BuryP + RotB + Site
여기서, EvdW는 반 데르 발스 에너지 (형태 하전을 갖는 기, 예컨대 금속, 카르복실레이트 및 구아니디늄 상의 감소된 순 이온성 하전으로 계산됨)이고; Coul은 쿨롱 에너지 (형태 하전을 갖는 기, 예컨대 금속, 카르복실레이트 및 구아니디늄 상의 감소된 순 이온성 하전으로 계산됨)이고; Lipo는 친유성 접촉 용어 (바람직한 소수성 상호작용을 보상함)이고; Hbond는 수소-결합 용어 (공여체 및 수령체가 중성인가, 또는 하나는 중성이고 다른 하나는 대전되었는가, 또는 둘다 대전되었는가에 따라 상이하게 중량된 성분으로 분리됨)이고; metal은 금속-결합 용어 (음이온성 수령체 원자 간의 상호작용만이 포함됨; 아포단백질 중 순 금속 하전이 양성이면 음이온성 리간드에 대한 선호도가 포함되고; 순 하전이 0이면 선호도는 억제됨)이고; BuryP는 묻힌 극성기에 대한 벌칙이고; RotB는 동결 회전성 결합에 대한 벌칙이고; Site는 활성 부위에서의 극성 상호작용이다 (소수성 영역에서 극성이나 비-수소-결합인 원자가 보상됨).
하기는 스크리닝된 가상 화합물 라이브러리의 제조를 기재한다. 시판되는 화합물의 무료의 가상 데이타베이스로부터의 리드-유사 화합물을 ZINC 데이타베이스 (문헌 [Irwin and Shoichet (2005) J. Chem. Inf. Model. 45(1), 177-182]로부터 구조 데이타 형식 (sdf, 몰레큘라 디자인 리미티드)으로 다운로딩하였다. 리드-유사 데이타베이스는 33개 세그먼트로 분할된 대략 890,000개의 화합물로 구성되었다. MOE에 의한 스크리닝을 위한 형태 이성질체의 데이타베이스를 제조하는데 이를 사용하였다. 그 후, 수소를 첨가하였다. 약물작용발생단 조사를 위해, 저에너지 형태 이성질체의 데이타베이스를 제조해야 한다. 형태 임폴트 명령어를 상기 sdf 파일에 적용하였다. 형태 이성질체를 제조한 후, 형태 이성질체 데이타베이스의 예비프로세싱을 적용하였다. 특성 애노테이션이라고 지칭되는 상기 단계는 분자/형태 및 그의 기하학적 관계 각각에서 약물작용발생단 특성의 유형을 결정하였다. 그 후, 이를 조회와 비교하고, 주어진 허용량 내에서 조회를 매칭한 상기 분자/형태를 히트로서 저장하였다.
EGFR
항체 세툭시맙 (서열 5 및 서열 6)와 복합체를 형성한 단백질 EGFR (서열 1)의 1YY9.pdb 결정으로부터 확인된 (예를 들어, 실시예 4; 표 17 참조) 약물작용발생단에 대한 ZINC 데이타베이스로부터의 화합물의 분석은 183개의 유사한 화합물을 확인하였다. 이들 화합물을 상기 기재된 도킹 및 점수매김 방법에 따라 분석하였다. 도킹 및 점수매김 시험으로부터의 예시적 결과는 하기 표 23에 나타낸다.
Figure 112008059781518-pct00075
Figure 112008059781518-pct00076
Figure 112008059781518-pct00077
EGFR로의 화합물 AD4-1009의 도킹은 예를 들어 도 49에 나타낸다. EGFR로의 화합물 AD4-1010의 도킹은 예를 들어 도 48에 나타낸다. EGFR로의 화합물 AD4-1016의 도킹은 예를 들어 도 50에 나타낸다. EGFR로의 화합물 AD4-1017의 도킹은 예를 들어 도 51에 나타낸다. EGFR로의 화합물 AD4-1018의 도킹은 예를 들어 도 52에 나타낸다. EGFR로의 화합물 AD4-1025의 도킹은 예를 들어 도 46에 나타낸다. EGFR로의 화합물 AD4-1038의 도킹은 예를 들어 도 47에 나타낸다.
VEGF
상기 기재된 방법에 따라 항체 페르투주맙과 복합체를 형성한 단백질 VEGF (서열 2)의 1CZ8.pdb 결정 (실시예 4; 표 18 참조)으로부터 확인된 약물작용발생단에 대한 ZINC 데이타베이스로부터의 화합물의 분석은 하기 표 24의 화합물을 비롯한 화합물들을 확인하였다. 상기 기재된 약물작용발생단 조회로부터 히트 상으로 글리드점수를 생성하였다. 글리드점수에 따라 얻어진 데이타를 배열하고, 약물작용발생단 6n을 사용하여 확인된 화합물을 나타내기 위해 -5.0 (또는 그 이상의 크기)의 g_점수 + ZINC02338377 (AD4-2008) (g_점수 = -4.9156을 갖음)을 갖는 것을 기초로 13개의 AD4 화합물을 선택하였다.
Figure 112008059781518-pct00078
HER2
상기 기재된 방법에 따라 항체 트라스투주맙 (서열 7 및 서열 8)와 복합체를 형성한 단백질 HER2 (서열 3)의 1N8Z.pdb 결정 (참조 실시예 4; 표 19)으로부터 확인된 약물작용발생단에 대한 ZINC 데이타베이스로부터의 화합물의 분석은 하기 표 25의 화합물을 비롯한 화합물들을 확인하였다. 상기 기재된 약물작용발생단 조회로부터 히트 상으로 글리드점수를 생성하였다. 글리드점수에 따라 얻어진 데이타를 배열하고, 약물작용발생단 3n을 사용하여 확인된 화합물을 나타내기 위해 -6.0 (또는 그 이상의 크기)의 g_점수 + ZINC00177228 (AD4-3006) (g_점수 = -5.8263을 갖음)을 갖는 것을 기초로 18개의 AD4 화합물을 선택하였다.
Figure 112008059781518-pct00079
ErbB2
상기 기재된 방법에 따라 항체 페르투주맙 (서열 9 및 서열 10)과 복합체를 형성한 단백질 ERBB2 (서열 4)의 1S78.pdb 결정 (실시예 4; 표 19 참조)으로부터 확인된 약물작용발생단에 대한 ZINC 데이타베이스로부터의 화합물의 분석은 하기 표 26의 화합물을 비롯한 화합물들을 확인하였다. 상기 기재된 약물작용발생단 조회로부터 히트 상으로 글리드점수를 생성하였다. 글리드점수에 따라 얻어진 데이타를 배열하고, 약물작용발생단 5n을 사용하여 확인된 화합물을 나타내기 위해 -7.5 (또는 그 이상의 크기)의 g_점수 + ZINC01800927 (AD4-3044) (g_점수 = -7.3143을 갖음)을 갖는 것을 기초로 17개의 AD4 화합물을 선택하였다.
Figure 112008059781518-pct00080
실시예 6: EGFR 억제를 위한 약물작용발생단으로부터 확인된 화합물의 시험
여러 약물작용발생단 모델을 나타내는 확인된 화합물을 25 μM에서 EGFR을 억제하는 능력에 대해 시험하였다.
AD4-화합물을 약물작용발생단 모델 (실시예 4 참조)을 사용하여 확인한 후, 세툭시맙의 정의된 CDR에 의해 인식되는 EGFR (서열 1)의 결합 부위로 도킹하였다. 그 후, AD4-화합물에 의한 표피 성장 인자 결합의 억제를 결정하였다 (미국 메릴랜드주 한오버 소재의 노바스크리린 바이오사이언시스(NovaScreen BioSciences). EGF 결합의 억제를 25 μM 농도에서 결정하였다.
억제제 검정에 대해, KD (결합 친화성)은 1.04 nM이었으나, Bmax (수용체 수)는 43.0 fmol/mg 조직 (습윤 중량)이었다. 수용체 공급원은 래트 간막이었다. 방사성리간드는 0.36 nM의 최종 리간드 농도에서 [125I]EGF (150-200 Ci/㎍)이었다. EGF - [100 nM]로서 비특이적 결정부위를 사용하였다. 기준 화합물 및 양성 대조군은 EGF이었다. 25℃에서 60분 동안 0.1％ BSA를 함유하는 10 mM HEPES (pH 7.4)에서 반응을 수행하였다. 유리 섬유 필터 상에서 급속 진공 여과에 의해 반응을 종결시켰다. 필터 상에 포획된 방사성을 결정하고, EGF 결합 부위와 시험 화합물의 임의의 상호작용을 확인하기 위해 대조군 값과 비교하였다. EGF 억제제 검정법을 예를 들어 문헌 [Mukku (1984) J. Biol. Chem. 259, 6543-6546]; [Duh et al. (1990) World J. Surgery 14, 410-418]; [Lokeshwar et al. (1989) J. Biol. Chem. 264(32), 19318-19326]으로부터 변형하였다.
여러 약물작용발생단 모델을 나타내는 확인된 화합물에 대한 EGFR 억제 검정의 결과는 하기 표 27에 제공된다.
Figure 112008059781518-pct00081
Figure 112008059781518-pct00082
Figure 112008059781518-pct00083
Figure 112008059781518-pct00084
Figure 112008059781518-pct00085
Figure 112008059781518-pct00086
실시예 7: AD4 -1025 화합물
AD4-1025 (N1-(4-클로로페닐)-N2-(3-피리디닐메틸)-알파-아스파라긴; 화학식: C16H16ClN3O3; 분자량: 333.78)는 표피 성장 인자 수용체 (EGFR (서열 1))로의 표피 성장 인자 (EGF)의 결합의 억제제이다.
<화학식 6>
Figure 112008059781518-pct00087
AD4-1025의 25 μM의 농도에서, EGFR (서열 1)로의 EGF의 결합은 75.7％만큼 억제되었다 (예를 들어, 실시예 6 참조). EGFR로 복합체를 형성한 세툭시맙의 단백질 결정 구조는 문헌 [Ferguson et al. ((2005) Cancer Cell 7, 301-311)]에 보고되었으며, 결정학 데이타는 단백질 데이타 뱅크에 PDB 코드 1YY9 ("1YY9.pdb")로서 기탁되었다.
AD4-1025는 약물작용발생단 모델을 설계하기 위해 1YY9 단백질 결정 구조로부터의 정보를 사용하여 확인하였다 (예를 들어, 실시예 4 참조). EGFR에 결합하는 소분자를 확인하기 위해 모델, Pharm1_gly54_asp58을 사용하였다. EGFR 단백질 상의 부위는 항체 세툭시맙 (서열 5 및 서열 6) (에르비툭스)의 아미노산 잔기 GLY-54 내지 ASP-58에 의해 인식되었다. Pharm1_gly54_asp58을 잔기 GLY-54 내지 ASP-58 후 모델링하고, 항체 세툭시맙의 특성 및 성분을 갖는 소분자를 확인하는데 사용하였다. 구체적으로, 상기 영역을 세툭시맙의 항체 중쇄의 H2 CDR로서 정의하였다. 세툭시맙의 이들 아미노산 잔기의 특성 및 성분을 약물작용발생단 모델의 제조에 사용하였다.
Pharm1_gly54_asp58의 약물작용발생단 특성 (F) 및 성분은 다음과 같다: F1:Aro - EGFR의 ARG353과 상호작용하기 위해 위치된 1.2 Å의 구형 반지름을 갖는 방향족 고리 중심 성분; F2:Aro2 - EGFR의 ARG353과 상호작용하기 위해 투영 방향을 모델링하도록 위치된 1.5 Å의 구형 반지름을 갖는 방향족 고리 중심 성분; F3:Acc&Ani - 세툭시맙의 GLY-54의 카르보닐을 모델링하도록 위치된 1.2 Å의 구형 반지름을 갖는 수소 결합 수령체 및 음이온 성분; F4:Acc2 - EGFR의 ARG353과 수소 결합에 개입하기 위해 단백질 결정 구조 PDB:1YY9에 나타나는 세툭시맙의 GLY-54의 카르보닐의 전자의 고립 쌍의 방향을 모델링하도록 위치된 1.5 Å의 구형 반지름을 갖는 수소 결합 수령체 성분; F5:Acc&Ani - 세툭시맙의 ASP-58의 카르복실레이트 산소 원자를 모델링하도록 위치된 1.4 Å의 구형 반지름을 갖는 수소 결합 수령체 및 음이온 성분; 및 F6:Acc - THR57의 아미드 카르보닐의 전자의 고립 쌍의 방향을 모델링하도록 위치된 1.2 Å의 구형 반지름을 갖는 수소 결합 수령체 성분 (예를 들어, 표 17; 도 11 참조).
약물작용발생단 10에 대해, 모든 성분이 한번에 필수적인 것은 아니다. 약물작용발생단 모델 Pharm1_gly54_asp58은 6개의 특성 및 성분 중 5개의 부분 매칭을 허용한다. 또한, 배제된 부피 구속으로서 공지된 특성은 Pharm1_gly54_asp58에 도입하였다. 표적 단백질 (이 경우 EGFR)에 의해 점거된 공간을 배제하는데 배제된 부피 구속을 사용하였다. 약물작용발생단 조회 도중 확인된 소분자의 기하학을 제한하기 위해, 표적 단백질의 원자의 위치를 점거하도록 "모형" 구의 군을 위치시켰다. 이들은 도 45에서 흑회색 구로서 나타낼 수 있다. 상기 표시는 표적 단백질, EGFR의 표면 국소해부학을 모방하기 위해 사용하였다 (예를 들어, 도 45 참조).
850,000개의 상업적 화합물의 데이타베이스의 조사를 기초로 하는 약물작용발생단을 사용하여 소분자를 확인하였다 (예를 들어, 실시예 4 참조). 그 후, Pharm1_gly54_asp58에 의해 확인된 화합물은 표적 억제제의 목록을 제공하기 위해 컴퓨터가상실험에서 EGFR (예를 들어, 도 46 참조)의 결합 부위의 아미노산 잔기에 대해 도킹하였다 (예를 들어, 실시예 5 참조).
세툭시맙의 아미노산 GLY54 내지 ASP58을 모델링하기 위해 Pharm1_glu54_asp58이라고 지칭되는 약물작용발생단을 사용하여 화합물 AD4-1025를 확인하였다. 추가 시험은 화합물 AD4-1025가 25 μM에서 EGFR을 76％만큼 억제했다는 것을 나타내었다. EGFR의 결합 부위의 아미노산 잔기와의 AD4-1025 도킹의 예시적 묘사는 도 46에 제공된다.
다른 소분자 EGFR 억제제를 Pharm1_glu54_asp58로 확인하였다: AD4-1020 (25 μM에서 48％ 억제); AD4-1021 (25 μM에서 43％ 억제); AD4-1027 (25 μM에서 39％ 억제); AD4-1022 (25 μM에서 39％ 억제); AD4-1030 (25 μM에서 38％ 억제); 및 AD4-1039 (25 μM에서 32％ 억제).
실시예 8: AD4 -1038 화합물
AD4-1038 ({2-[(4-히드록시-페닐)-메틸-아미노]-4-옥소-4,5-디히드로-티아졸-5-일}-아세트산; 화학식: C12H12N2O4S; 분자량: 280.30)은 표피 성장 인자 수용체 (EGFR (서열 1))로의 표피 성장 인자 (EGF)의 결합의 억제제이다.
<화학식 13>
Figure 112008059781518-pct00088
AD4-1038의 25 μM의 농도에서, EGFR로의 EGF의 결합은 70.7％만큼 억제되었다 (예를 들어, 실시예 6 참조). EGFR에 결합하는 소분자를 확인하기 위해 모델, Pharm1_thr100_glu105를 사용하였다. EGFR 단백질 상의 부위는 항체 세툭시맙 (서열 5 및 서열 6) (에르비툭스)의 아미노산 잔기 THR-100 내지 GLU-105에 의해 인식되었다. Pharm1_thr100_glu105을 잔기 THR-100 내지 GLU-105 후 모델링하고, 항체 세툭시맙의 특성 및 성분을 갖는 소분자를 확인하는데 사용하였다. 구체적으로, 상기 영역은 세툭시맙의 항체 중쇄 상에 위치한 H3 CDR로서 정의된다. 세툭시맙의 이들 아미노산 잔기의 특성 및 성분을 약물작용발생단 모델의 제조에 사용하였다.
Pharm1_thr100_glu105의 약물작용발생단 특성 (F) 및 성분은 F1 - F8을 포함한다 (예를 들어, 표 17; 도 17 참조). EGFR의 결합 부위의 아미노산 잔기와의 AD4-1038 도킹의 예시적 묘사는 도 47에 제공된다. Pharm1_thr100_glu105로 확인된 다른 소분자 EGFR 억제제는 AD4-1009 (25 μM에서 35.01％ 억제)이었다.
실시예 9: AD4 -1010 화합물
AD4-1010 (4-(4-히드록시페닐)-6-메틸-N-(3-메틸페닐)-2-옥소-1,2,3,4-테트라히드로-5-피리미딘카르복스아미드; 화학식: C19H19N3O3; 분자량: 337.37)은 표피 성장 인자 수용체 (EGFR (서열 1))로의 표피 성장 인자 (EGF)의 결합의 억제제이다.
Figure 112008059781518-pct00089
AD4-1010의 25 μM의 농도에서, EGFR로의 EGF의 결합은 39.40％만큼 억제되었다 (예를 들어, 실시예 6 참조). EGFR로 복합체를 형성한 세툭시맙의 단백질 결정 구조는 문헌 [Ferguson et al. ((2005) Cancer Cell 7, 301-311)]에 보고되었으며, 결정학 데이타는 단백질 데이타 뱅크에 PDB 코드 1YY9 ("1YY9.pdb")로서 기탁되었다.
AD4-1010은 다른 약물작용발생단 모델을 설계하기 위해 1YY9 단백질 결정 구조로부터의 정보를 사용하여 확인하였다. EGFR 억제제의 상이한 세트를 확인하기 위해 상기 모델을 사용하였다. EGFR 단백질 상의 부위는 항체 세툭시맙 (서열 5 및 서열 6) (에르비툭스)의 아미노산 잔기 TYR-101 내지 TYR-104에 의해 인식되었다. Pharm2_thr100_glu105을 잔기 TYR-101 내지 TYR-104 후 모델링하고, 항체 세툭시맙의 특성 및 성분을 갖는 소분자를 확인하는데 사용하였다 (예를 들어, 실시예 4 참조). 구체적으로, 상기 영역은 항체 중쇄의 H3 CDR로서 정의된다. 세툭시맙의 이들 아미노산 잔기의 특성 및 성분을 약물작용발생단 모델 Pharm2_thr100_glu105의 제조에 사용하였다 (예를 들어, 실시예 4 참조).
약물작용발생단 특성 (F) 및 성분은 다음과 같다: F1:Don&Acc - 세툭시맙의 TYR-102의 히드록실을 모델링하도록 위치된 0.8 Å의 구형 반지름을 갖는 수소 결합 공여체 및 수소 결합 수령체 성분; F2:Aro - 세툭시맙의 TYR-102의 페닐 고리를 모델링하도록 위치된 1.2 Å의 구형 반지름을 갖는 방향족 고리 성분; F3:Acc - TYR-102의 카르보닐 산소를 모델링하도록 위치된 0.8 Å의 구형 반지름을 갖는 수소 결합 수령체 성분; F4 및 F5:Acc&Ani - 세툭시맙의 ASP-103의 카르복실레이트 산소 원자를 모델링하도록 위치된 0.8 Å의 구형 반지름을 갖는 수소 결합 수령체 및 음이온 성분; F6:Don&Acc - 세툭시맙의 TYR-104의 히드록실을 모델링하도록 위치된 0.8 Å의 구형 반지름을 갖는 수소 결합 공여체 및 수소 결합 수령체 성분; 및 F7:Aro - 세툭시맙의 TYR-104의 페닐 고리를 모델링하도록 위치된 1.2 Å의 구형 반지름을 갖는 방향족 고리 성분 (예를 들어, 표 17; 도 18 참조).
약물작용발생단에 대해, 모든 성분이 한번에 필수적인 것은 아니다. 7개의 특성 및 성분 중 5개의 부분 매칭을 허용하였다. 세툭시맙의 단백질 결정 구조로부터의 잔기 TYR-100 내지 TYR-104로 중첩된 Pharm2_thr100_glu105의 표시는 예를 들어 도 18에 나타낸다.
AD4-1010은 Pharm2_thr100_glu105를 사용하여 상업적 화합물의 조사에 의해 확인하였다. EGFR의 결합 부위의 아미노산 잔기와의 AD4-1010 도킹의 예시적 묘사는 도 48에 제공된다.
실시예 10: AD4 -1020
AD4-1020 ({5-[4-(벤질옥시)페닐]-2H-테트라졸-2-일}아세트산; 화학식: C16H14N4O3; 분자량: 310.31)은 표피 성장 인자 (EGF)의 그의 수용체 (EGFR (서열 1))로의 결합의 억제제이다.
<화학식 28>
Figure 112008059781518-pct00090
AD4-1020의 25 μM의 농도에서, EGFR로의 EGF의 결합은 47.8％만큼 억제된다 (예를 들어, 실시예 6 참조). EGFR로 복합체를 형성한 세툭시맙의 단백질 결정 구조는 문헌 [Ferguson et al. ((2005) Cancer Cell 7, 301-311)]에 보고되었으며, 결정학 데이타는 단백질 데이타 뱅크에 PDB 코드 1YY9 ("1YY9.pdb")로서 기탁되었다.
AD4-1020은 다른 약물작용발생단 모델을 설계하기 위해 1YY9 단백질 결정 구조로부터의 정보를 사용하여 확인하였다. EGFR 억제제의 상이한 세트를 확인하기 위해 상기 모델을 사용하였다. EGFR 단백질 상의 부위는 항체 세툭시맙 (서열 5 및 서열 6) (에르비툭스)의 아미노산 잔기 GLY-54 내지 ASP-58에 의해 인식되었다. Pharm1_gly54_asp58을 잔기 GLY-54 내지 ASP-58 후 모델링하고, 항체 세툭시맙의 특성 및 성분을 갖는 소분자를 확인하는데 사용하였다 (예를 들어, 실시예 4 참조). 구체적으로, 상기 영역은 항체 중쇄의 H2 CDR로서 정의된다. 세툭시맙의 이들 아미노산 잔기의 특성 및 성분은 약물작용발생단 모델 Pharm1_gly54_asp58의 제조에 사용되었다 (예를 들어, 실시예 4 참조).
약물작용발생단 특성 (F) 및 성분은 다음과 같다: F1 Aro - 수용체의 Arg353 의 구아니딘과의 바람직한 쿨롱 상호작용, 소수성 접촉 통계학으로부터 유도됨; F2 Aro2 - Arg353의 구아니딘과 관련된 F1의 방향; F3 Acc&Ani - 항체 세툭시맙의 Gly54 주쇄 카르보닐로부터 유도됨, 음이온 형태는 수용체 Arg353의 구아니딘으로 염 브릿지를 형성하거나 또는 수령체는 이로부터 H-결합을 수령함; F4 Acc2 - Arg353의 구아니딘과 관련된 F3의 방향; F5 Acc&Ani - Asp58 측쇄 카르복실레이트로부터 유도됨, 음이온 형태는 수용체의 Lys 443 측쇄의 NH3 +으로 염 브릿지를 형성하거나 또는 수령체는 이로부터 H-결합을 수령함; F6 Acc - 친수성 접촉 통계학으로부터 유도됨, 수용체의 Ser448의 측쇄 OH로부터 H-결합을 수령함; V1 - 배제된 부피 (명료성을 위해 나타내지 않음).
약물작용발생단에 대해, 모든 성분이 한번에 필수적인 것은 아니다. 6개의 특성 및 성분 중 5개의 부분 매칭을 허용하였다. 세툭시맙의 단백질 결정 구조로부터의 잔기 GLY-54 내지 ASP-58로 중첩된 Pharm1_gly54_asp58의 표시는 예를 들어 도 11에 나타낸다.
AD4-1020은 Pharm1_gly54_asp58을 사용하여 상업적 화합물의 조사에 의해 확인하였다. EGFR의 결합 부위의 아미노산 잔기와의 AD4-1020 도킹의 예시적 묘사는 도 53에 제공된다.
실시예 11: AD4 -1132
AD4-1132 ((2-{[(2,4-디메틸페녹시)아세틸]아미노}-5-히드록시벤조산); 화학식: C17H17NO5; 분자량: 315.32)은 표피 성장 인자 (EGF)의 그의 수용체 (EGFR (서열 1))로의 결합의 억제제이다.
<화학식 24>
Figure 112008059781518-pct00091
AD4-1132의 25 μM의 농도에서, EGFR로의 EGF의 결합은 59.6％만큼 억제되었다 (예를 들어, 실시예 6 참조). EGFR로 복합체를 형성한 세툭시맙의 단백질 결정 구조는 문헌 [Ferguson et al. ((2005) Cancer Cell 7, 301-311)]에 보고되었으며, 결정학 데이타는 단백질 데이타 뱅크에 PDB 코드 1YY9 ("1YY9.pdb")로서 기탁되었다.
AD4-1132는 다른 약물작용발생단 모델을 설계하기 위해 1YY9 단백질 결정 구조로부터의 정보를 사용하여 확인하였다. EGFR 억제제의 상이한 세트를 확인하기 위해 상기 모델을 사용하였다. EGFR 단백질 상의 부위는 항체 세툭시맙 (서열 5 및 서열 6) (에르비툭스)의 아미노산 잔기 GLY-54 내지 ASP-58에 의해 인식되었다. Pharm23_gly54_asp58을 잔기 GLY-54 내지 ASP-58 후 모델링하고, 항체 세툭시맙의 특성 및 성분을 갖는 소분자를 확인하는데 사용하였다 (예를 들어, 실시예 4 참조). 구체적으로, 상기 영역은 항체 중쇄의 H2 CDR로서 정의되었다. 세툭시맙의 이들 아미노산 잔기의 특성 및 성분을 약물작용발생단 모델 Pharm23_gly54_asp58의 제조에 사용하였다 (예를 들어, 실시예 4 참조).
약물작용발생단 특성 (F) 및 성분은 다음과 같다: F1 Don - 수용체 Ser418 측쇄 OH와 H-결합을 형성하는 Asn56의 항체 측쇄 NH2로부터 유도됨; F2 Acc&Ani - 항체 세툭시맙의 Gly54 주쇄 카르보닐로부터 유도됨, 음이온 형태는 수용체 Arg353의 구아니딘으로 염 브릿지를 형성하거나 또는 수령체는 이로부터 H-결합을 수령함; F3 Acc2 - Arg353의 구아니딘과 관련된 F3의 방향; F4 Acc&Ani - H-결합을 수령하거나 또는 수용체 Lys 443의 NH3 +로 염 브릿지를 형성하는 항체 Asp58 측쇄 카르복실레이트로부터 유도됨; F5 Don - 수용체 Gln384의 측쇄 카르보닐과 H-결합을 형성하는 항체 Gly54 주쇄 NH로부터 유도됨; F6 Aro - 필수적인 수용체의 Arg353의 구아니딘과의 바람직한 쿨롱 상호작용, 소수성 접촉 통계학으로부터 유도됨; 및 F7 Aro2 - Arg353의 구아니딘과 관련된 F6의 방향.
약물작용발생단에 대해, 모든 성분이 한번에 필수적인 것은 아니다. 7개의 특성 및 성분 중 5개의 부분 매칭을 허용하였다. 세툭시맙의 단백질 결정 구조로부터의 잔기 GLY-54 내지 ASP-58로 중첩된 Pharm23_gly54_asp58의 표시는 예를 들어 도 15에 나타낸다.
AD4-1132는 Pharm23_gly54_asp58을 사용하여 상업적 화합물의 조사에 의해 확인하였다. EGFR의 결합 부위의 아미노산 잔기와의 AD4-1132 도킹의 예시적 묘사는 도 58 및 59에 제공된다.
실시예 12: AD4 -1142
AD4-1142 ((5-{[(4-에틸페닐)술포닐]아미노}-2-히드록시벤조산); 화학식: C15H15NO5S; 분자량: 321.35)은 표피 성장 인자 (EGF)의 그의 수용체 (EGFR (서열 1))로의 결합의 억제제이다. AD4-1142의 구조는 아래와 같다:
<화학식 30>
Figure 112008059781518-pct00092
AD4-1142의 25 μM의 농도에서, EGFR로의 EGF의 결합은 49.8％만큼 억제되었다 (예를 들어, 실시예 6 참조). EGFR로 복합체를 형성한 세툭시맙의 단백질 결정 구조는 문헌 [Ferguson et al. ((2005) Cancer Cell 7, 301-311)]에 보고되었으며, 결정학 데이타는 단백질 데이타 뱅크에 PDB 코드 1YY9 ("1YY9.pdb")로서 기탁되었다.
AD4-1142는 다른 약물작용발생단 모델을 설계하기 위해 1YY9 단백질 결정 구조로부터의 정보를 사용하여 확인하였다. EGFR 억제제의 상이한 세트를 확인하기 위해 상기 모델을 사용하였다. EGFR 단백질 상의 부위는 항체 세툭시맙 (서열 5 및 서열 6) (에르비툭스)의 아미노산 잔기 GLY-54 내지 ASP-58에 의해 인식되었다. Pharm23_gly54_asp58을 잔기 GLY-54 내지 ASP-58 후 모델링하고, 항체 세툭시맙의 특성 및 성분을 갖는 소분자를 확인하는데 사용하였다 (예를 들어, 실시예 4 참조). 구체적으로, 상기 영역은 항체 중쇄의 H2 CDR로서 정의되었다. 세툭시맙의 이들 아미노산 잔기의 특성 및 성분을 약물작용발생단 모델 Pharm23_gly54_asp58의 제조에 사용하였다 (예를 들어, 실시예 4 참조).
약물작용발생단 특성 (F) 및 성분은 다음과 같다: F1 Don - 수용체 Ser418 측쇄 OH와 H-결합을 형성하는 Asn56의 항체 측쇄 NH2로부터 유도됨; F2 Acc&Ani - 항체 세툭시맙의 Gly54 주쇄 카르보닐로부터 유도됨, 음이온은 수용체 Arg353의 구아니딘으로 염 브릿지를 형성하거나 또는 수령체는 이로부터 H-결합을 수령함; F3 Acc2 - Arg353의 구아니딘과 관련된 F3의 방향; F4 Acc&Ani - H-결합을 수령하거나 또는 수용체 Lys 443의 NH3 +으로 염 브릿지를 형성하는 항체 Asp58 측쇄 카르복실레이트로부터 유도됨; F5 Don - 수용체 Gln384의 측쇄 카르보닐과 H-결합을 형성하는 항체 Gly54 주쇄 NH로부터 유도됨; F6 Aro - 필수적인 수용체의 Arg353의 구아니딘과의 바람직한 쿨롱 상호작용, 소수성 접촉 통계학으로부터 유도됨; 및 F7 Aro2 - Arg353의 구아니딘과 관련된 F6의 방향.
약물작용발생단에 대해, 모든 성분이 한번에 필수적인 것은 아니다. 7개의 특성 및 성분 중 5개의 부분 매칭을 허용하였다. 세툭시맙의 단백질 결정 구조로부터의 잔기 GLY-54 내지 ASP-58로 중첩된 Pharm23_gly54_asp58의 표시는 예를 들어 도 15에 나타낸다.
AD4-1142는 Pharm23_gly54_asp58을 사용하여 상업적 화합물의 조사에 의해 확인하였다. EGFR의 결합 부위의 아미노산 잔기와의 AD4-1142 도킹의 예시적 묘사는 도 60 및 61에 제공된다.
SEQUENCE LISTING <110> Joseph P Errico Errico, Joseph P Mugrage, Benjamin V Turchi, Ignatius J <120> METHODS AND COMPOSITIONS OF TARGETED DRUG DEVELOPMENT <130> 812004240-0004 <150> US 60/761,123 <151> 2006-01-23 <160> 12 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 613 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Glu Glu Lys Lys Val Cys Gln Gly Thr Ser Asn Lys Leu Thr Gln Leu 1 5 10 15 Gly Thr Phe Glu Asp His Phe Leu Ser Leu Gln Arg Met Phe Asn Asn 20 25 30 Cys Glu Val Val Leu Gly Asn Leu Glu Ile Thr Tyr Val Gln Arg Asn 35 40 45 Tyr Asp Leu Ser Phe Leu Lys Thr Ile Gln Glu Val Ala Gly Tyr Val 50 55 60 Leu Ile Ala Leu Asn Thr Val Glu Arg Ile Pro Leu Glu Asn Leu Gln 65 70 75 80 Ile Ile Arg Gly Asn Met Tyr Tyr Glu Asn Ser Tyr Ala Leu Ala Val 85 90 95 Leu Ser Asn Tyr Asp Ala Asn Lys Thr Gly Leu Lys Glu Leu Pro Met 100 105 110 Arg Asn Leu Gln Glu Ile Leu His Gly Ala Val Arg Phe Ser Asn Asn 115 120 125 Pro Ala Leu Cys Asn Val Glu Ser Ile Gln Trp Arg Asp Ile Val Ser 130 135 140 Ser Asp Phe Leu Ser Asn 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Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp 355 360 365 Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala 370 375 380 Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile 385 390 395 400 Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val 405 410 415 Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser 420 425 430 Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn 435 440 445 Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys 450 455 460 Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu Asn Lys Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val 465 470 475 480 Cys His Ala Leu Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg 485 490 495 Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp 500 505 510 Lys Cys Lys Leu Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser 515 520 525 Glu Cys Ile Gln Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile 530 535 540 Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr 545 550 555 560 Ile Asp Gly Pro His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met Gly 565 570 575 Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val Cys 580 585 590 His Leu Cys His Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly Leu 595 600 605 Arg Gly Cys Pro Thr 610 <210> 2 <211> 94 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Val Val Lys Phe Met Asp Val Tyr Gln Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile 1 5 10 15 Glu Thr Leu Val Asp Ile Phe Gln Glu Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr 20 25 30 Ile Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys 35 40 45 Asn Asp Glu Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Glu Glu Ser Asn Ile Thr 50 55 60 Met Gln Ile Met Arg Ile Lys Pro His Gln Gly Gln His Ile Gly Glu 65 70 75 80 Met Ser Phe Leu Gln His Asn Lys Cys Glu Cys Arg Pro Lys 85 90 <210> 3 <211> 214 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 4 <211> 555 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Thr Gln Val Cys Thr Gly Thr Asp Met Lys Leu Arg Leu Pro Ala Ser 1 5 10 15 Pro Glu Thr His Leu Asp Met Leu Arg His Leu Tyr Gln Gly Cys Gln 20 25 30 Val Val Gln Gly Asn Leu Glu Leu Thr Tyr Leu Pro Thr Asn Ala Ser 35 40 45 Leu Ser Phe Leu Gln Asp Ile Gln Glu Val Gln Gly Tyr Val Leu Ile 50 55 60 Ala His Asn Gln Val Arg Gln Val Pro Leu Gln Arg Leu Arg Ile Val 65 70 75 80 Arg Gly Thr Gln Leu Phe Glu Asp Asn Tyr Ala Leu Ala Val Leu Asp 85 90 95 Asn Gly Asp Pro Leu Ser Pro Gly Gly Leu Arg Glu Leu Gln Leu Arg 100 105 110 Ser Leu Thr Glu Ile Leu Lys Gly Gly Val Leu Ile Gln Arg Asn Pro 115 120 125 Gln Leu Cys Tyr Gln Asp Thr Ile Leu Trp Lys Asp Ile Phe His Lys 130 135 140 Asn Asn Gln Leu Ala Leu Thr Leu Ile Asp Thr Asn Arg Ser Arg Ala 145 150 155 160 Cys His Pro Cys Ser Pro Met Cys Lys Gly Ser Arg Cys Trp Gly Glu 165 170 175 Ser Ser Glu Asp Cys Gln Ser Leu Thr Arg Thr Val Cys Ala Gly Gly 180 185 190 Cys Ala Arg Cys Lys Gly Pro Leu Pro Thr Asp Cys Cys His Glu Gln 195 200 205 Cys Ala Ala Gly Cys Thr Gly Pro Lys His Ser Asp Cys Leu Ala Cys 210 215 220 Leu His Phe Asn His Ser Gly Ile Cys Glu Leu His Cys Pro Ala Leu 225 230 235 240 Val Thr Tyr Asn Thr Asp Thr Phe Glu Ser Met Pro Asn Pro Glu Gly 245 250 255 Arg Tyr Thr Phe Gly Ala Ser Cys Val Thr Ala Cys Pro Tyr Asn Tyr 260 265 270 Leu Ser Thr Asp Val Gly Ser Cys Thr Leu Val Cys Pro Leu His Asn 275 280 285 Gln Glu Val Thr Ala Glu Asp Gly Thr Gln Arg Cys Glu Lys Cys Ser 290 295 300 Lys Pro Cys Ala Arg Val Cys Tyr Gly Leu Gly Met Glu His Leu Arg 305 310 315 320 Glu Val Arg Ala Val Thr Ser Ala Asn Ile Gln Glu Phe Ala Gly Cys 325 330 335 Lys Lys Ile Phe Gly Ser Leu Ala Phe Leu Pro Glu Ser Phe Asp Gly 340 345 350 Asp Pro Ala Ser Asn Thr Ala Pro Leu Gln Pro Glu Gln Leu Gln Val 355 360 365 Phe Glu Thr Leu Glu Glu Ile Thr Gly Tyr Leu Tyr Ile Ser Ala Trp 370 375 380 Pro Asp Ser Leu Pro Asp Leu Ser Val Phe Gln Asn Leu Gln Val Ile 385 390 395 400 Arg Gly Arg Ile Leu His Asn Gly Ala Tyr Ser Leu Thr Leu Gln Gly 405 410 415 Leu Gly Ile Ser Trp Leu Gly Leu Arg Ser Leu Arg Glu Leu Gly Ser 420 425 430 Gly Leu Ala Leu Ile His His Asn Thr His Leu Cys Phe Val His Thr 435 440 445 Val Pro Trp Asp Gln Leu Phe Arg Asn Pro His Gln Ala Leu Leu His 450 455 460 Thr Ala Asn Arg Pro Glu Asp Glu Cys Val Gly Glu Gly Leu Ala Cys 465 470 475 480 His Gln Leu Cys Ala Arg Gly His Cys Trp Gly Pro Gly Pro Thr Gln 485 490 495 Cys Val Asn Cys Ser Gln Phe Leu Arg Gly Gln Glu Cys Val Glu Glu 500 505 510 Cys Arg Val Leu Gln Gly Leu Pro Arg Glu Tyr Val Asn Ala Arg His 515 520 525 Cys Leu Pro Cys His Pro Glu Cys Gln Pro Gln Asn Gly Ser Val Thr 530 535 540 Cys Phe Gly Pro Glu Ala Asp Gln Cys Val Ala 545 550 555 <210> 5 <211> 211 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Val Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn 20 25 30 Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro Thr 85 90 95 Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg 210 <210> 6 <211> 220 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr 50 55 60 Ser Arg Leu Ser Ile Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe 65 70 75 80 Lys Met Asn Ser Leu Gln Ser Asn Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155 160 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180 185 190 Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro 195 200 205 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys 210 215 220 <210> 7 <211> 213 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu Ile 35 40 45 Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Val Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu 210 <210> 8 <211> 218 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Asp Phe Thr His Tyr 20 25 30 Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe 50 55 60 Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Tyr Pro Tyr Tyr Tyr Gly Thr Ser His Trp Tyr Phe Asp Val 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly 115 120 125 Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys 130 135 140 Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser 145 150 155 160 Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser 165 170 175 Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser 180 185 190 Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn 195 200 205 Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys 210 215 <210> 9 <211> 214 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 10 <211> 220 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro 210 215 220 <210> 11 <211> 214 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Gly 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 12 <211> 222 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155 160 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180 185 190 Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro 195 200 205 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys 210 215 220

Claims (24)

  1. (a) 표적 생체분자에 특이적으로 결합하는 1종의 모노클로날 항체를 제공하는 단계로서, 여기서의 상기 모노클로날 항체는 표적 생체분자의 결합 부위와 상호작용하여 그와 결합하게 하는 다수의 원자를 포함하는 결합 팁을 포함하며, 이때
    (i) 표적 생체분자는 VEGF, 적혈구응집소, 안지오게닌, EGFR, HER2, 및 ErbB2로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    (ii) 모노클로날 항체는 항-VEGF 모노클로날 항체, 항-적혈구응집소 모노클로날 항체, 항-안지오게닌 모노클로날 항체, 항-EGFR 모노클로날 항체, 항-HER2 모노클로날 항체, 및 항-ErbB2 모노클로날 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 단계;
    (b) 상기 모노클로날 항체의 결합 팁 원자의 적어도 한 부분의 동일성(identity) 및 공간 배향을 결정하는 단계이며, 이때
    (i) 상기 모노클로날 항체의 결합 팁 원자의 적어도 한 부분과 표적 생체분자의 결합 부위와의 상호작용이 그와 결합하게 하고;
    (ii) 상기 모노클로날 항체의 결합 팁 원자의 적어도 한 부분의 동일성 및 공간 배향을 결정하는 단계는 표적 생체분자에 결합된 모노클로날 항체의 결정질 형태로부터 유도된 X-선 결정학 데이타의 분석을 포함하는 것인 단계; 및
    (c) 표적 생체분자에 특이적으로 결합하는 상기 모노클로날 항체의 결합 팁 원자의 동일성 및 공간 배향의 적어도 한 부분을 모방하는 1종 이상의 약물작용발생단 특성의 모델을 포함하여 구조적 특성이 표적 생체분자의 결합 부위에 상보적인 약물작용발생단을 구축하는 단계
    를 포함하는, 표적 생체분자에 대하여 원하는 제약 활성을 갖는 유기 소분자의 제조 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    애노테이션된 리간드 분자의 데이타베이스의 약물작용발생단 가설 조회(query)를 이용해 후보 분자를 확인하는 단계
    를 추가로 포함하며, 여기서 확인된 후보 화합물은 1종 이상의 약물작용발생단 특성에 대해 실질적으로 정렬하는 구조를 갖는 것인 방법.
  3. 제2항에 있어서,
    표적 생체분자의 결합 부위에 대한 후보 분자의 도킹 친화성을 결정하는 단계
    를 추가로 포함하며, 여기서 도킹 친화성은 표적 생체분자와 후보 분자의 상호작용시 얻어지는 에너지, 최저 에너지 형태에 비해 도킹된 형태를 얻는데 필요한 에너지, 또는 이들의 조합에 의해 정량되는 것인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 모노클로날 항체가 표적 생체분자의 활성을 변경시키는 능력을 갖는 것인 방법.
  5. 제4항에 있어서, 모노클로날 항체가 표적 생체분자의 활성을 억제하는 능력을 갖는 것인 방법.
  6. 제4항에 있어서, 표적 생체분자에 특이적으로 결합하고 표적 생체분자의 활성을 변경시키는 능력을 갖는 모노클로날 항체를 제공하는 단계가,
    표적 생체분자가 생체내 활성을 모방하는 활성을 디스플레이하는 검정법을 제공하는 단계;
    검정법에서 표적 생체분자에 대한 결합 친화성을 갖는 다수의 모노클로날 항체를 표적 생체분자에 노출시키는 단계; 및
    검정법에서 표적 생체분자의 활성을 변경시키는 능력을 갖는 1종 이상의 모노클로날 항체를 선택하는 단계
    를 포함하는 것인 방법.
  7. 제1항에 있어서, 표적 생체분자에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체가 또한 그의 부분에서 상기 표적 생체분자와는 상이한 1종 이상의 관련 생체분자에 결합하나, 여기서 상기 표적 분자의 활성 및 구조의 유사 또는 동일 부분이 상기 1종 이상의 관련 생체분자에 의해 보유되는 것인 방법.
  8. 제1항에 있어서, 모노클로날 항체가 세툭시맙, 트라스투주맙, 및 페르투주맙으로 구성된 군에서 선택되는 것인 방법.
  9. 제1항에 있어서, 동일성 및 공간 배향이, 1종 이상의 모노클로날 항체의 결합 팁 원자의 실질적인 부분에 대해 결정되는 것인 방법.
  10. 제1항에 있어서, 약물작용발생단 특성이 소수성, 방향족, 수소 결합 수령체, 수소 결합 공여체, 양이온 및 음이온으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 특성을 포함하는 것인 방법.
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 제1항에 있어서, 표적 생체분자가 EGFR, VEGF, HER2 및 ErbB2로 구성된 군에서 선택된 것인 방법.
  15. 제14항에 있어서, 표적 생체분자가 EGFR이고, 유기 소분자의 제약 활성이 EGFR 억제 활성인 방법.
  16. 삭제
  17. 삭제
  18. 제1항에 있어서, 표적 생체분자의 결합 부위와 상호작용하는 모노클로날 항체의 결합 팁 원자의 적어도 한 부분의 동일성 및 공간 배향을 결정하는 단계가,
    모노클로날 항체의 펩티드 서열을 결정하는 단계;
    모노클로날 항체의 삼차원 구조의 가상 모델을 제조하는 단계; 및
    모노클로날 항체의 삼차원 구조의 가상 모델을 분석하여, 표적 생체분자의 결합 부위와 상호작용하는 모노클로날 항체의 결합 팁 원자의 적어도 한 부분의 동일성 및 공간 배향을 결정하는 단계
    를 포함하는 것인 방법.
  19. 제1항에 있어서,
    모노클로날 항체가 표적 생체분자에 특이적으로 결합하고 표적 생체분자의 활성을 억제하는 것이고, 표적 생체분자에 고친화성을 가져서 약 3 μM 또는 그보다 우수한 KD로 표적 생체분자에 결합하고,
    약물작용발생단이, 표적 생체분자의 결합 부위와 상호작용하는 모노클로날 항체 결합 팁 원자의 약 75％ 이상의 동일성 및 공간 배향을 모방하는 다수의 약물작용발생단 특성을 포함하고,
    다수의 약물작용발생단 특성이 표적 생체분자의 결합 부위에 상보적이고;
    다수의 약물작용발생단 특성이 소수성, 방향족, 수소 결합 수령체, 수소 결합 공여체, 양이온 및 음이온으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 특성을 포함하며,
    애노테이션된 리간드 분자의 데이타베이스의 약물작용발생단 가설 조회를 이용해 후보 유기 소분자를 확인하는 단계로서, 여기서 확인된 후보 화합물은 약물작용발생단의 1종 이상의 특성에 대해 실질적으로 정렬되는 구조를 가지며, 상기 후보 분자는 표적 생체분자의 활성을 억제하는 것인 단계를 추가로 포함하며,
    표적 생체분자는 EGFR, VEGF, HER2 및 ErbB2로 구성된 군에서 선택된 것인 방법.
  20. 하기 화학식 1, 화학식 7, 화학식 14, 화학식 19 및 화학식 25로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 EGFR 억제제 또는 그의 입체이성질체 또는 다형체, 및 제약상 허용되는 담체 또는 희석제를 포함하고, EGFR의 활성을 억제하는, 암의 치료에 사용하기 위한 제약 조성물.
    <화학식 1>
    Figure 112014126197443-pct00176
    <화학식 7>
    Figure 112014126197443-pct00177
    <화학식 14>
    Figure 112014126197443-pct00178
    <화학식 19>
    Figure 112014126197443-pct00179
    <화학식 25>
    Figure 112014126197443-pct00180
    상기 식들에서,
    S1 내지 S8은 할로겐, 히드록실, 술프히드릴, 카르복실레이트, 알킬, 시클로알킬, 아릴 및 알콕실 (-OR)로 구성된 군에서 독립적으로 선택되고;
    X는 H2, O, S, N-R, N-OH 및 N-NR2로 구성된 군에서 선택되고;
    Het은 임의의 고리 위치에서의 1개 이상의 N 원자이고;
    Z은 -COOH, -PO3H2, SO3H, 테트라졸 고리, 술폰아미드, 아실 술폰아미드, -CONH2 및 -CONR2로 구성된 군에서 선택되고;
    R은 할로겐, 히드록실, 술프히드릴, 카르복실레이트, 아릴, 헤테로아릴, 아미노, 치환된 아미노, 또는 5 또는 6원 고리에 1, 2 또는 3개의 N 원자를 함유하는 시클로아미노로 임의로 치환된 C1-C6 직쇄 또는 분지된 알킬기이다.
  21. 제20항에 있어서, 1종 이상의 EGFR 억제제가 하기 화학식 6, 화학식 13, 화학식 18, 화학식 24 및 화학식 30, 또는 그의 입체이성질체 또는 다형체로 구성된 군에서 선택되는 것인 제약 조성물.
    <화학식 6>
    Figure 112014010011923-pct00181
    <화학식 13>
    Figure 112014010011923-pct00182
    <화학식 18>
    Figure 112014010011923-pct00183
    <화학식 24>
    Figure 112014010011923-pct00184
    <화학식 30>
    Figure 112014010011923-pct00185
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