MX2008009494A

MX2008009494A - Metodos y composiciones de desarrollo dirigido de farmacos.

Info

Publication number: MX2008009494A
Application number: MX2008009494A
Authority: MX
Inventors: Joseph P Errico; Benjamin B Mugrage; Ignatius Joseph Turchi
Original assignee: Joseph P Errico
Priority date: 2006-01-23
Filing date: 2007-01-23
Publication date: 2009-01-07
Also published as: KR101535678B1; EP1981541A2; CA2638905A1; JP2013173755A; AU2007208340A1; WO2007087266A3; WO2007087266A2; EP1981541A4; US20080015194A1; CN101415415A; KR20080099278A; AU2007208340B2; IL192990A0; JP2009525274A; AU2007208340A2; IL192990A

Abstract

La presente invención está dirigida a métodos para desarrollar uno o más fármacos para una o más terapias dirigidas y composiciones derivadas de los mismos; de acuerdo con un aspecto de la presente invención se evitan técnicas combinatoriales de química para su uso con técnicas de selección de alto rendimiento para identificar la afinidad y/o las interacciones de actividad de moléculas pequeñas, en lugar de utilizar mecanismos naturales de respuesta de antígenos para efectuar una selección masivamente paralela de molécula existentes en la naturaleza contra un antígeno; otros aspectos de la invención proveen composiciones derivadas de los mismos así como métodos terapéuticos de uso para los compuestos.

Description

METODOS Y COMPOSICIONES DE DESARROLLO DIRIGIDO DE FARMACOS INTERREFERENCIA CON SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reclama la prioridad de la solicitud provisional de EE. UU. No. de serie 60/761 ,123, presentada el 23 de enero de 2006, que se incorpora aquí como referencia en su totalidad.

INCORPORACION DE MATERIAL DE REFERENCIA PRESENTADO EN DISCO COMPACTO El Listado de Secuencias, que es una parte de la presente descripción, incluye una forma legible en computadora y un listado de secuencias escrito que comprenden secuencias de nucleotidos y aminoácidos de la presente invención. La información del Listado de Secuencias registrado en forma legible en computadora es idéntica al listado de secuencias escrito. La materia del Listado de Secuencias se incorpora aquí como referencia en su totalidad.

CAMPO DE LA INVENCION En términos generales, la presente invención se refiere al desarrollo de entidades químicas nuevas para usarse en el tratamiento de una enfermedad, y mas particularmente a métodos para identificar moléculas guías para usarse en el diseño cuasi racional de fármacos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION El desarrollo típico de fármacos en el mundo farmacéutico moderno se basa en el desarrollo de modelos, o ensayos, de funciones bioquímicas dirigidas. Estos ensayos se exponen después a varias moléculas pequeñas, algunas de las cuales se pueden recolectar del mundo natural o se pueden sintetizar por completo en un laboratorio. Sin conocimiento adicional, literalmente se pueden requerir miles o millones de exposiciones químicas separadas antes de identificar una molécula guía que sea candidato viable. Este proceso es completamente aleatorio y, de hecho, es referido como exploración al azar. Por razones obvias, no hay diseño molecular racional asociado con este proceso, y por lo tanto la diezmilésima molécula probada contra el ensayo no tiene mayor probabilidad de ser más eficaz que la primera. Puesto que esta forma del proceso de exploración es al azar, el tiempo promedio para alcanzar el éxito solamente se acorta acelerando la velocidad a la cual se pueden reunir y exponer al ensayo los diversos agentes químicos por probar, por ejemplo, mediante exploración de alto rendimiento y química combinatoria.

La deficiencia de principio de este tipo de metodología, más allá del azar inherente de la misma, es que se ha estimado que el número de estructuras químicas posibles de tipo fármaco es mayor de diez elevado a la octava potencia. Por lo tanto, incluso usando el poder combinado de la exploración de alto rendimiento y la química combinatoria, será improbable que incluso una entidad química en diez a la septuagésima potencia sea sintetizada, mucho menos explorada. No obstante, el concepto de química combinatoria es valioso, ya que introduce un grado de procesamiento paralelo a la naturaleza de la exploración, por lo demás en serie. Sin embargo, los límites de la escalabilidad son tales que incluso la exploración de algunos cientos de entidades químicas distintas requiere reversión al análisis parcialmente señalizado, debido a los límites físicos de espacio en una sola bandeja. Una forma en la que los fabricantes de fármacos han continuado desarrollando fármacos nuevos sin tener que explorar es usando un fármaco ya aprobado como la guía para adiciones futuras a la clase. Esto es, una sustancia aprobada por la FDA es usada para encontrar si se pueden hacer modificaciones a la misma con la finalidad de aumentar su potencia, disminuir sus efectos secundarios, o hacerlo mas fácil de ingerir. Por esta razón, muchos fármacos dentro de esta clase son muy similares. Es por esta razón que la mayoría de los fármacos de molécula pequeña tienen únicamente una región objetivo específica (una proteína) para interacción efectiva, y siempre que conserven la porción con la que se acopla ese objetivo, otras moléculas pueden mostrar actividad similar. Por ejemplo, actualmente hay en el mercado más de media docena de beta-bloqueadores diferentes. Las estructuras químicas de seis de las versiones más ampliamente recetadas de esta clase de fármacos se proveen en las fórmulas 1A a 1 F. La fórmula 2 muestra el armazón químico, referido generalmente como el farmacoforo, que es sustancialmente común a todos los miembros de este grupo.

Fórmula 1 A Fórmula 1 B Fórmula l C Fórmula 1 D Esta clase de agrupación de fármacos alrededor de un armazón similar no es raro, ni tampoco es irracional; sin embargo, incluso las modificaciones que se intentan hacer al fármaco original (o "de primera clase") durante el desarrollo de estos fármacos de seguimiento, muchas veces también son aleatorias. Es este hecho, el que una proteína objetivo u otra estructura bioquímica usualmente tenga una región de superficie que se pueda acoplar con un fármaco para producir un efecto deseado, el que ha conducido a una variedad de técnicas diferentes de diseño racional de fármacos. El desarrollo racional de fármacos es un proceso de desarrollo de moléculas guías, no explorando al azar miles de moléculas en la esperanza ciega de encontrar una que muestre la actividad deseada, sino mas bien deduciendo el sitio activo del objetivo y contemplando un agente químico que interaccione con ese sitio de la manera apropiada. Sin embargo, esta estrategia ha experimentado un éxito moderado; la complejidad del potencial de interacción química la hace un proceso extraordinariamente difícil. Sin embargo, cuando es exitoso, generalmente da como resultado un fármaco de primera clase, que frecuentemente experimenta un periodo prolongado de dominio en el mercado, ya que los fabricantes de fármacos competidores no pueden empezar el proceso de copiado hasta que se publica la estructura del fármaco. Un ejemplo de un fármaco que ha sido producido por diseño racional de fármacos es el mesilato de imatinib, que es un inhibidor de la enzima tirosina cinasa. Las enzimas tirosina cinasas son una clase de estructuras moleculares que fosforilan el aminoácido tirosina en proteínas específicas. La fosforilación es una modificación crítica necesaria para señalizar proteínas, incluyendo aquellas que cuando no están reguladas pueden jugar una función en la proliferación de células del cáncer (especialmente en ciertos tipos de leucemia). Al identificar y caracterizar la región de actividad de la tirosina cinasa en el ABL-BCR (un gen quimérico que codifica una tirosina cinasa que permite a las células proliferar sin ser reguladas por citocinas, lo que a su vez permite a la célula hacerse cancerosa), fue diseñada una molécula pequeña que probablemente tendría la actividad inhibitoria deseada. Aunque el desarrollo racional de fármacos es una técnica muy prometedora porque cuando tiene éxito puede producir fármacos de primera clase, es una estrategia de conocimiento muy intensivo. El software de modelación de computadora actualmente disponible apenas ahora está siendo suficiente para predecir las interacciones de moléculas pequeñas con proteínas, con la exactitud suficiente para hacer viable este método. También es cierto que el desarrollo racional de fármacos frecuentemente retrasa la exploración simple de moléculas para evaluar la actividad básica deseada, hasta después de haber invertido tiempo y gastos considerables. Esto puede conducir a moléculas que en la computadora parece que se acoplan a un objetivo de la manera deseada, pero que se muestran, si acaso, poco prometedores in vitro. Para evitar esto, muchos defensores corporativos del desarrollo racional de fármacos han reintentado utilizar las técnicas tales como una exploración in silico por medio de las cuales las entidades químicas conocidas (que incluyen fármacos ya disponibles) son modeladas y exploradas contra el objetivo modelado en la computadora. Desde luego, esto elimina una de las ventajas principales de la técnica, que es la libertad de la tendencia a las moléculas ya conocidas. Estas desventajas han impulsado a algunas compañías que han invertido fuertemente en el desarrollo racional de fármacos, de regreso a las técnicas de exploración al azar del pasado. De hecho, muchas compañías no han considerado seriamente el diseño racional de fármacos y han dejado que las universidades y los laboratorios nacionales desarrollen la tecnología por ellos. Por la misma razón, las desventajas de la combinación de la exploración de alto rendimiento y el enfoque de química combinatoria son claramente el primerísimo lugar de la intensidad de recursos de la técnica, y en segundo lugar, el hecho de que las realidades corporativas orientan mucho del desarrollo lejos del desarrollo de fármacos de primera clase, a mejoramientos repetitivos para el tratamiento de las mismas condiciones. La técnica se beneficiaría de un método de identificación y desarrollo de fármacos guías, que combine las ventajas de la exploración de alto rendimiento y la química combinatoria, es decir, la capacidad de probar muchos miles de entidades químicas para encontrar un candidato fuertemente activo, con las ventajas del diseño racional de fármacos, es decir, el potencial de desarrollar fármacos de primera clase a un costo reducido.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION Entre los diversos aspectos de la presente invención se provee un método que puede probar literalmente trillones de estructuras químicas dentro de un hospedero vivo para encontrar estructuras químicas que se unen al objetivo (por ejemplo, una proteína u otra molécula grande); utiliza técnicas de análisis estándar para determinar cual de las estructuras químicas que se unen al objetivo proveerá la actividad deseada; o utiliza hechos ya conocidos acerca de las estructuras químicas de unión para guiar la construcción de la molécula pequeña guía. Un aspecto de la invención está dirigido a un método para producir una estructura molecular que tiene una actividad farmacéutica deseada con respecto a una biomolécula objetivo. Dicho método incluye los pasos de proveer por lo menos una proteína del sistema inmune que se une específicamente a una biomolécula objetivo; determinar la identidad y orientación espacial de por lo menos una porción de átomos de la proteína del sistema inmune, en donde la interacción de la porción de átomos de la proteína del sistema inmune con un sitio de unión de la biomolécula objetivo, resulta en su unión al mismo; y construir un farmacóforo, en donde el farmacóforo comprende un modelo de por lo menos una característica farmacofórica que se aproxima a por lo menos una parte de la identidad y orientaciones espaciales de los átomos de la proteína del sistema inmune, que se une específicamente a la proteína del sistema inmune, de tal manera que las características estructurales del farmacóforo son complementarias al sitio de unión de la biomolécula objetivo. En varias modalidades del aspecto anterior, el método puede incluir también el paso de identificar una molécula candidata con una pregunta de hipótesis de farmacóforo en una base de datos de moléculas de ligando anotadas, en donde un compuesto candidato identificado tiene una estructura que sustancialmente se alinea por lo menos con una característica farmacofórica. En varias modalidades del aspecto anterior, el método también puede incluir el paso de determinar una afinidad de acoplamiento de la molécula candidata por el sitio de unión de la biomolécula objetivo; en donde la afinidad de acoplamiento se cuantifica por la energía ganada por la interacción de la molécula candidata con la biomolécula objetivo, la energía requerida para lograr la conformación acoplada con respecto a la conformación de menor energía, o una combinación de las mismas. En varias modalidades, la proteína del sistema inmune tiene la capacidad de alterar la actividad de la biomolécula objetivo. Por ejemplo, la proteína del sistema inmune puede tener la capacidad de inhibir una actividad de la biomolécula objetivo. En varias modalidades, el paso de proveer una proteína del sistema inmune que se une específicamente a una biomolécula objetivo y que tiene la capacidad de alterar la actividad de la biomolécula objetivo, incluye los pasos de proveer una prueba en la cual la biomolécula objetivo exhibe una actividad que imita la actividad in vivo; exponer una pluralidad de proteínas del sistema inmune que tienen una afinidad de unión por la biomolécula objetivo, a la biomolécula objetivo de la prueba; y seleccionar por lo menos una proteína del sistema inmune que tenga la capacidad de alterar la actividad de la biomolécula objetivo dentro de la prueba. En varias modalidades, la proteína del sistema inmune que se une específicamente a la biomolécula objetivo también se une a por lo menos una biomolécula relacionada que difiere de la biomolécula objetivo en porciones de la misma, pero en donde la biomolécula relacionada retiene porciones similares o idénticas de la estructura y actividad de la molécula objetivo. En varias modalidades, la proteína del sistema inmune es un complejo de histocompatibilidad mayor, un receptor de células T, un receptor de células ß, o un anticuerpo, preferiblemente un anticuerpo monoclonal. En varias modalidades, la determinación de las identidades y orientaciones espaciales de por lo menos una porción de los átomos del anticuerpo monoclonal, incluye determinar las identidades y orientaciones espaciales de por lo menos una porción de los átomos de una punta de unión del anticuerpo monoclonal, preferiblemente una porción sustancial de los átomos de la punta de unión del anticuerpo monoclonal. En varias modalidades, las características de farmacóforo incluyen por lo menos una característica seleccionada de característica hidrofóbica, aromática, de aceptor de enlace de hidrógeno, donador de enlace de hidrógeno, catión, y anión. En varias modalidades, la biomolécula objetivo es una proteína, preferiblemente una enzima, una proteína de señalización, o una proteína receptora. En varias modalidades, la biomolécula objetivo se selecciona de: el agente causante de la fiebre aftosa, angiotensina II; ErB2; aglutinina de la influenza; hemaglutinina de la influenza; neuraminidasa de la influenza; interferón gamma; HER2; Neisseria meningitidis; proteasa de VIH1 ; transcriptasa inversa de VIH-1 ; rinovirus; receptor de fibrinógeno de plaqueta; oligosacárido de Salmonella; TGF-a; trombopoyetina; factor de tejido; factor de Von Willenbrand; VEGF; coronavirus (SARS); el agente causante de la enfermedad de Lyme; GP120 de VIH; GP41 de VIH; virus del Nilo occidental; dihidrofolato reductasa; y EGFR. Preferiblemente, la biomolécula objetivo es EGFR, VEGF, HER2 y ErbB2, de preferencia EGFR. En varias modalidades, la determinación de las identidades y orientaciones espaciales de por lo menos una porción de átomos de la proteína del sistema inmune incluye el análisis de datos cristalográficos de rayos X derivados de una forma cristalina de la proteína del sistema inmune, preferiblemente una forma cristalina de la proteína del sistema inmune unida a la biomolécula objetivo. En varias modalidades, la determinación de la identidad y orientación espacial de por lo menos una porción de átomos de la proteína del sistema inmune, incluye determinar la secuencia de péptidos de la proteína del sistema inmune; producir un modelo virtual de la estructura tridimensional de la proteína del sistema inmune; y analizar el modelo virtual de la estructura tridimensional de la proteína del sistema inmune, a fin de determinar la identidad y orientación espacial de por lo menos una porción de los átomos de la proteína del sistema inmune, que interacciona con un sitio de unión de la biomolécula objetivo dando como resultado su unión a la misma. En una modalidad, el método para producir una entidad molecular que tiene una actividad farmacéutica deseada con respecto a una biomolécula objetivo, incluye los pasos de: (i) proveer por lo menos un anticuerpo monoclonal; en donde el anticuerpo monoclonal se une específicamente a una biomolécula objetivo e inhibe la actividad de la biomolécula objetivo; en donde el anticuerpo monoclonal comprende una punta de unión; y en donde la punta de unión comprende una pluralidad de átomos que interaccionan con un sitio de unión de la biomolécula objetivo dando como resultado su unión a la misma; (ii) determinar la identidad y orientación espacial de una porción sustancial de los átomos de la punta de unión, que interacciona con el sitio de unión de la biomolécula objetivo; en donde dicha determinación de identidad y orientación espacial comprende el análisis de datos cristalográficos de rayos X derivados de una forma cristalina del anticuerpo monoclonal unido a la biomolécula objetivo; (iii) construir un farmacóforo; en donde el farmacóforo comprende una pluralidad de características farmacofóricas; en donde la pluralidad de características farmacofóricas se aproxima a la identidad y orientación espacial de por lo menos aproximadamente 75% de los átomos de la punta de unión del anticuerpo monoclonal, que interaccionan con el sitio de unión de la biomolécula objetivo; en donde la pluralidad de características farmacofóricas es complementaria al sitio de unión de la biomolécula objetivo; y en donde la pluralidad de características farmacofóricas comprende por lo menos una característica seleccionada del grupo que consiste en: hidrofóbica, aromática, de aceptor de enlace de hidrógeno, donador de enlace de hidrógeno, catión, y anión; y (iv) identificar una molécula candidata con una pregunta de hipótesis de farmacóforo en una base de datos de moléculas de ligando anotadas; en donde un compuesto candidato identificado tiene una estructura que se alinea sustanciaimente con al menos una característica del farmacoforo; en donde la molécula candidata inhibe la actividad de la biomolécula objetivo; y en donde la biomolécula objetivo es una enzima, una proteína de señalización o una proteína receptora. Otro aspecto de la invención está dirigido a una composición farmacéutica para la inhibición de EGFR. Dicha composición farmacéutica incluye por lo menos un inhibidor de EGFR seleccionado del grupo que consiste en los compuestos de las fórmulas (1 ), (7), (14), (19) y (25), incluyendo estereoisómeros o formas polimórficas de los mismos, y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. Las fórmulas son las siguientes: Fórmula (7) Fórmula (25) en donde S1 -S8 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en halógeno, hidroxilo, sulfhidrilo, carboxilato, alquilo, cicloalquilo, arilo y alcoxi (-OR); X se selecciona del grupo que consiste en hfe, O, S, N-R, N-OH, y N-NR2; Het es uno o mas átomos de N en cualquier posición del anillo; Z se selecciona del grupo que consiste en -COOH, -PO3H2, SO3H, anillo de tetrazol, sulfonamida, acil-sulfonamida, -CONH2, y -CONR2; y R es un grupo alquilo de cadena recta o ramificada de C1 -C6, sustituido opcionalmente con un halógeno, hidroxilo, sulfhidrilo, carboxilato, arilo, heteroarilo, amino, amino sustituido, o cicloamino que contiene 1 , 2, o 3 átomos de N en un anillo de 5 o 6 miembros.

Otro aspecto de la invención está dirigido a un método para el tratamiento de una enfermedad o trastorno asociado con EGFR, que incluye el paso de administrar a un mamífero en necesidad del mismo, una composición que incluye una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición farmacéutica de la invención. Dichas composiciones incluyen un inhibidor de EGFR seleccionado de los compuestos de las fórmulas (6), (13), (18), (24), (30), o esteroisómeros o formas polimórficas de los mismos. Las estructuras son las siguientes: Fórmula (6) AD4-1038 Fórmula (13) Fórmula (18) AD4.1132 Fórmula (24) Fórmula (30) Otros objetos y características serán en parte evidentes y en parte se señalarán mas adelante.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS Los expertos en la materia entenderán que los dibujos que se describen más abajo solo tienen fines ilustrativos. Se considera que los dibujos no limitan el alcance de las presentes enseñanzas en modo alguno. La figura 1 es una representación de una molécula de IgG. La figura 2 es una representación de Jmol de una proteína VEGF dimerizada unida a dos fragmentos de anticuerpo Fab, en donde la región de unión enmarcada está amplificada.

La figura 3 es un modelo de cinta de un dímero de VEGF. La figura 4 es una estructura química de una molécula guía que tiene actividad potencial contra VEGF, en donde dicha molécula guía ha sido diseñada basándose en la porción de unión de un anticuerpo que tiene alta afinidad por VEGF, como se contempla en los métodos de la presente invención. La figura 5 es una estructura química de una molécula guía que tiene actividad potencial contra la hemaglutinina, en donde dicha molécula guía ha sido diseñada basándose en la porción de unión de un anticuerpo que tiene alta afinidad por hemaglutinina, como se contempla en los métodos de la presente invención. La figura 6 es una imagen de Jmol de un fragmento Fab que tiene alta afinidad por la angiogenina, unido a una molécula de angiogenina, en donde la región enmarcada de la interfaz entre la molécula de angiogenina y la región de unión del fragmento Fab, está expandida. Las figuras 7A y 7B son modelos de bolas y varillas de las moléculas guías de las fórmulas C y D, respectivamente. La figura 8 representa el farmacóforo 1_gly54_asp58, derivado del cristal 1 YY9.pdb, sobrepuesto sobre la región gly54_asp58 del anticuerpo cetuximab. La figura 9 representa el farmacóforo 1 1_gly54_asp58, derivado del cristal 1 YY9.pdb, sobrepuesto sobre la región gly54_asp58 del anticuerpo cetuximab.

La figura 10 representa el íarmacóforo 21_gly54_asp58, derivado del cristal 1YY9.pdb, sobrepuesto sobre la región gly54_asp58 del anticuerpo cetuximab. La figura 1 representa el farmacóforo 22_gly54_asp58, derivado del cristal 1 YY9.pdb, sobrepuesto sobre la región gly54_asp58 del anticuerpo cetuximab. La figura 12 representa el farmacóforo 23_gly54_asp58, derivado del cristal 1 YY9.pdb, sobrepuesto sobre la región gly54_asp58 del anticuerpo cetuximab. La figura 13 representa el farmacóforo 24_gly54_asp58, derivado del cristal 1 YY9.pdb, sobrepuesto sobre la región gly54_asp58 del anticuerpo cetuximab. La figura 14 representa el farmacóforo 1_thr100_glu105, derivado del cristal 1 YY9.pdb, sobrepuesto sobre la región thr100_glu105 del anticuerpo cetuximab. La figura 15 representa el farmacóforo 2_thr100_glu105, derivado del cristal 1 YY9.pdb, sobrepuesto sobre la región thr100_glu105 del anticuerpo cetuximab. La figura 16 representa el farmacóforo 3_thr100_glu105, derivado del cristal YY9.pdb, sobrepuesto sobre la región thr100_glu 05 del anticuerpo cetuximab. La figura 17 representa el farmacóforo 10_thr100_glu105, derivado del cristal 1 YY9.pdb, sobrepuesto sobre la región thr100_glu105 del anticuerpo cetuximab. La figura 18 representa el farmacóforo 21_thr100_glu105, derivado del cristal 1 YY9.pdb, sobrepuesto sobre la región thr100_glu105 del anticuerpo cetuximab. La figura 19 representa el farmacóforo 22_thr100_glu105, derivado del cristal 1 YY9.pdb, sobrepuesto sobre la región thr 00_glu105 del anticuerpo cetuximab. La figura 20 representa el farmacóforo 1 n, derivado del cristal 1 CZ8.pdb, sobrepuesto sobre la región tyr101_ser106 del anticuerpo cetuximab. La figura 21 representa el farmacóforo 2n, derivado del cristal 1 CZ8.pdb, sobrepuesto sobre la región tyr101_ser 06 del anticuerpo cetuximab. La figura 22 representa el farmacóforo 3n, derivado del cristal 1 CZ8.pdb, sobrepuesto sobre la región tyr101_ser106 del anticuerpo cetuximab. La figura 23 representa el farmacóforo 4n, derivado del cristal 1 CZ8.pdb, sobrepuesto sobre la región tyr101_ser 06 del anticuerpo cetuximab. La figura 24 representa el farmacóforo 6n, derivado del cristal 1 CZ8.pdb, sobrepuesto sobre la región tyr101_ser106 del anticuerpo cetuximab. La figura 25 representa el farmacóforo 7n, derivado del cristal 1 CZ8.pdb, sobrepuesto sobre la región tyr101_ser106 del anticuerpo cetuximab. La figura 26 representa el farmacóforo 10b, derivado del cristal 1 CZ8.pdb, sobrepuesto sobre la región tyr101 _ser106 del anticuerpo cetuximab. La figura 27 representa el farmacóforo 1 b, derivado del cristal 1 N8Z.pdb, sobrepuesto sobre la región arg50, tyr92-thr94, gly103 del anticuerpo. La figura 28 representa el farmacóforo 2b, derivado del cristal 1 N8Z.pdb, sobrepuesto sobre la región arg50, tyr92-thr94, glyl 03 del anticuerpo. La figura 29 representa el farmacóforo 2n, derivado del cristal 1 N8Z.pdb, sobrepuesto sobre la región arg50, tyr92-thr94, gly 03 del anticuerpo. La figura 30 representa el farmacóforo 3n, derivado del cristal 1 N8Z.pdb, sobrepuesto sobre la región arg50, tyr92-thr94, glyl 03 del anticuerpo. La figura 31 representa el farmacóforo 5n, derivado del cristal 1 S78.pdb, sobrepuesto sobre la región asp31_tyr32, asn52_pro52a_asn53 del anticuerpo. La figura 32 representa el farmacóforo 6b, derivado del cristal 1 S78.pdb, sobrepuesto sobre la región asp31 _tyr32, asn52_pro52a_asn53 del anticuerpo.

La figura 33 representa el farmacóforo 3h, derivado del cristal 2EXQ.pdb, sobrepuesto sobre la región de cadena pesada tyr50_thr57 del anticuerpo. La figura 34 representa el farmacóforo 4h, derivado del cristal 2EXQ.pdb, sobrepuesto sobre la región de cadena pesada tyr50_thr57 del anticuerpo. La figura 35 representa el farmacóforo 5h, derivado del cristal 2EXQ.pdb, sobrepuesto sobre la región de cadena pesada tyr50_thr57 del anticuerpo. La figura 36 representa el farmacóforo 6h, derivado del cristal 2EXQ.pdb, sobrepuesto sobre la región de cadena pesada tyr50_thr57 del anticuerpo. La figura 37 representa el farmacóforo 7h, derivado del cristal 2EXQ.pdb, sobrepuesto sobre la región de cadena pesada tyr50_thr57 del anticuerpo. La figura 38 representa el farmacóforo 8h, derivado del cristal 2EXQ.pdb, sobrepuesto sobre la región de cadena pesada tyr50_thr57 del anticuerpo. La figura 39 representa el farmacóforo 9h, derivado del cristal 2EXQ.pdb, sobrepuesto sobre la región de cadena pesada tyr50_thr57 del anticuerpo. La figura 40 representa el farmacóforo 1 L y 2L (iguales), derivado del cristal 2EXQ.pdb, sobrepuesto sobre la región de cadena ligera Asn32_lle33_Gly34, Tyr49_His50_Gly51 , Tyr91 , Phe94, y Trp96 del anticuerpo. La figura 41 representa el farmacóforo 3L, derivado del cristal 2EXQ.pdb, sobrepuesto sobre la región de cadena ligera Asn32_lle33_Gly34, Tyr49_His50_Gly51 , Tyr91 , Phe94, y Trp96 del anticuerpo. La figura 42 representa el farmacóforo 1_gly54_asp58 sobrepuesto con los residuos GLY-54 a ASP-58 de la estructura del cristal de proteína de cetuximab (1 YY9.pdb). Se usaron restricciones de volumen para excluir el espacio ocupado por la proteína objetivo EGFR (SEQ ID NO: 1 ), con un grupo de esferas "fingidas" (gris oscuro) colocadas para ocupar la posición de átomos de la proteína objetivo durante una pregunta de farmacóforo. Esta representación se usa para aproximar la topología de superficie de la proteína objetivo EGFR. La figura 43 es un diagrama que representa el compuesto AD4-1025 acoplado con EGFR, como un modelo 2D con los residuos de aminoácido de EGFR anotados. Las figuras 44A y 44B son diagramas que representan el compuesto AD4-1038 acoplado con EGFR, como una vista 3D del modelo de varillas (figura 44A) o una vista 3D de la superficie de contacto (figura 44B). La figura 45 es un diagrama que representa el compuesto AD4- 1010 acoplado con EGFR como un modelo 2D, con los residuos de aminoácido de EGFR anotados. La figura 46 es un diagrama que representa el compuesto AD4- 1009 acoplado con EGFR como un modelo 2D, con los residuos de aminoácido de EGFR anotados. La figura 47 es un diagrama que representa el compuesto AD4- 1016 acoplado con EGFR como un modelo 2D, con los residuos de aminoácido de EGFR anotados. La figura 48 es un diagrama que representa el compuesto AD4- 1017 acoplado con EGFR como un modelo 2D, con los residuos de aminoácido de EGFR anotados. La figura 49 es un diagrama que representa el compuesto AD4-1018 acoplado con EGFR como un modelo 2D, con los residuos de aminoácido de EGFR anotados. La figura 50 es un diagrama que representa el compuesto AD4- 1020 acoplado con EGFR como un modelo 2D, con los residuos de aminoácido de EGFR anotados. La figura 51 es un diagrama que representa el compuesto AD4- 1021 acoplado con EGFR como un modelo 2D, con los residuos de aminoácido de EGFR anotados. La figura 52 es un diagrama que representa el compuesto AD4- 1022 acoplado con EGFR como un modelo 2D, con los residuos de aminoácido de EGFR anotados. La figura 53 es un diagrama que representa el compuesto AD4-1027 acoplado con EGFR como un modelo 2D, con los residuos de aminoácido de EGFR anotados.

La figura 54 es un diagrama que representa el compuesto AD4-1030 acoplado con EGFR como un modelo 2D, con los residuos de aminoácido de EGFR anotados. Las figuras 55A y 55B son diagramas que representan el compuesto AD4-1 132 acoplado con EGFR como una vista 3D del modelo de varillas (figura 55A), o una vista 3D de la superficie de contacto (figura 55B). La figura 56 es un diagrama que representa el compuesto AD4-1 132 acoplado con EGFR como un modelo 2D, con los residuos de aminoácido de EGFR anotados. La figura 57 es un diagrama que representa el compuesto AD4- 1 142 acoplado con EGFR como una vista 3D del modelo de varillas (A), o una vista 3D de la superficie de contacto (B). La figura 58 es un diagrama que representa el compuesto AD4-1 142 acoplado con EGFR como un modelo 2D, con los residuos de aminoácido de EGFR anotados.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION La presente invención está dirigida a métodos y aparatos para desarrollar uno o más fármacos para una o más terapias dirigidas. De acuerdo con un aspecto de la presente invención, se evitan las técnicas de química combinatoria para usarse con técnicas de exploración de alto rendimiento para identificar interacciones de afinidad y actividad de molécula pequeña, utilizando en su lugar los mecanismos naturales de respuesta al antígeno para efectuar una exploración masivamente paralela de moléculas naturales contra un antígeno. Similarmente, de acuerdo con otro aspecto de la presente invención, las técnicas de diseño racional de fármacos pueden ser conducidas a la creación de moléculas guías para el desarrollo farmacéutico basado en la copia de subestructuras moleculares de las moléculas sintetizadas biológicamente, tales como inmunoglobulinas, que se sabe que tienen alta afinidad por las estructuras objetivo. En resumen, una modalidad preferida del método para desarrollar un fármaco para una o más terapias dirigidas, es de la siguiente manera. Se desarrollan proteínas del sistema inmune (por ejemplo, un anticuerpo, preferiblemente un anticuerpo monoclonal) contra una biomolécula objetivo, preferiblemente una proteína, de preferencia una enzima. La interacción de unión entre la molécula objetivo y la proteína del sistema inmune se caracteriza, por ejemplo, por medio de datos de cristalografía. De la caracterización de la unión se definen dominios de unión de proteína. Los dominios de unión de proteína pueden ser expresados como uno o más características de farmacoforo, o pueden ser recopilados en un modelo de farmacoforo que comprende uno o más características de farmacoforo. Las características de farmacoforo generalmente pueden derivar de porciones correspondientes de la proteína del sistema inmune en complejo con la biomolécula objetivo. La generación del farmacoforo puede ser de acuerdo con software diseñado para dicha tarea. Las moléculas candidatas (por ejemplo de una o más colecciones químicas) se seleccionan de aquellas moléculas que se alinean con los modelos de farmacóforo. Preferiblemente, las moléculas candidatas se acoplan y se califican in silico para evaluar su interacción con la proteína objetivo del sistema inmune. Nuevamente, el acoplamiento y la puntuación pueden ser de acuerdo con software diseñado para dicha tarea. Después de seleccionar las moléculas que se alinean con uno o mas modelos de farmacóforo, en donde opcionalmente dichas moléculas se acoplaron y calificaron in silico, las moléculas seleccionadas se obtienen por ejemplo por síntesis química o de una fuente comercial. La afinidad de unión o el efecto sobre la función de la biomolécula objetivo de las moléculas seleccionadas se pueden medir. Tal medición generalmente es de acuerdo con una prueba biológica. Las moléculas probadas se pueden seguir seleccionando de acuerdo con los parámetros medidos deseables. Opcionalmente, las moléculas seleccionadas o las moléculas ultraseleccionadas se pueden optimizar.

Selección de la biomolécula objetivo Se entenderá que los tipos de biomolécula objetivo para las moléculas guías generadas por los métodos de la presente invención pueden incluir uno o mas de: nucleotidos, oligonucleotidos (y derivados químicos de los mismos), ADN (de doble cadena o de una sola cadena), ARN total, ARN mensajero, ARNc, ARN mitocondrial, ARN artificial, aptámeros, APN (ácidos peptidonucleicos) anticuerpos monoclonales, policlonales, recombinantes, modificados por ingeniería, antígenos, haptenos, proteínas de subunidades de Fab de anticuerpo (modificados si es necesario), proteínas, proteínas modificadas, enzimas, cofactores o inhibidores de enzima, complejos de proteína, lectinas, proteínas marcadas con histidina quelatadores para componentes marcados con histidina (marca de HIS), proteínas marcadas, anticuerpos artificiales, impresiones moleculares, receptores de membrana de plasticuerpos, células completas, fragmentos celulares y subestructuras celulares, sinapsis, agonistas/antagonistas, células, organelos celulares, por ejemplo moléculas pequeñas de microsomas, tales como benzodiazepinas, prostaglandinas, antibióticos, fármacos, metabolitos, metabolitos de fármaco, productos naturales, carbohidratos y derivados, ligandos naturales y artificiales, esteroides, hormonas, péptidos, polímeros naturales o artificiales, sondas moleculares, receptores naturales y artificiales y derivados químicos de los mismos, reactivos quelantes, éteres de corona, ligandos, ensambles supramoleculares, indicadores (pH, potencial, potencial de membrana, potencial redox), y muestras de tejido (microarreglos de tejido). Preferiblemente, la biomolécula objetivo es una proteína, de preferencia una enzima. Las enzimas objetivo deseables incluyen aquellas para las cuales existen datos cristalográficos de proteína-anticuerpo. Los diversos métodos de la invención se pueden usar para generar modelos de farmacoforo para una variedad de objetivos de proteína (cristalizada con ligando), que incluyen, sin limitación: el agente causante de la fiebre aftosa (IQGC.pdb); angiotensina II (ICKO.pdb, 3CK0.pdb, 2CK0.pdb); ErbB2 en complejo con el anticuerpo pertuzumab (1L71.pdb, 1S78.pdb, 2GJJ.pdb); aglutinina de la influenza (IDNO.pdb, lOSP.pdb); hemaglutinina de la influenza (1E08.pdb, IQFU.pdb, 2VIR.pdb, 2VIS.pdb, 2VIT.pdb, IKEN.pdb, IFRG.pdb, IHIM.pdb, IHIN.pdb, HFH.pdb); neuraminidasa de la influenza (NCIO.pdb, 1A14.pdb, 1 NMB.pdb, INMC.pdb, 1 NMA.pdb, INCA.pdb, INCD.pdb, 2AEQ.pdb, INCB.pdb, INCC.pdb, 2AEP.pdb); interferón gamma (HuZAF.pdb, 1T3F.pdb, 1B2W.pdb, 1B4J.pdb, 1T04.pdb); HER2 en complejo con herceptina (1N8Z.pdb, IFVC.pdb); Neisseria meningitidis (IMNU.pdb, IMPA.pdb, 2MPA.pdb, lUWX.pdb); proteasa de VIH1 (1JP5.pdb, 1CL7.pdb, 1MF2.pdb, 2HRP.pdb, ISVZ.pdb); transcriptasa inversa de VIH1 (2HMI.pdb, 1J50.pdb, 1N5Y.pdb, 1N6Q.pdb, IHYS.pdb, 1C9R.pdb, IHYS.pdb, 1R08.pdb, 1T04.pdb, 2HRP.pdb); rinovirus (IFOR.pdb, IRVF.pdb, IBBD.pdb, 1A3R.pdb, 1A6T.pdb); receptor de fibrinógeno de plaqueta (ITXV.pdb, 1TY3.pdb, 1TY5.pdb, 1TY6.pdb, 1TY7.pdb); oligosacárido de Salmonella (1 MFB.pdb, IMFC.pdb, 1 MFE.pdb); TGF-alfa (1E4W.pdb, 1E4X.pdb); trombopoyetina en complejo con TN1 (1V7M.pdb, 1V7N.pdb); factor de tejido en complejo con 5G9 (IFGN.pdb, lAHW.pdb, UPS.pdb, 1UJ3.pdb); factor de Von Willenbrand en complejo con NMC-4 (lOAK.pdb, 2ADF.pdb, 1FE8.pdb, IFNS.pdb, 2ADF.pdb); VEGF en complejo con B20-4 (2FJH.pdb, 2FJF.pdb, 2FJG.pdb, ITZH.pdb, ITZI.pdb, 1CZ8.pdb, 1BJ1.pdb); coronavirus-SARS (2DD8.pdb, 2G75.pdb); enfermedad de Lyme (1P4P.pdb, IRJL.pdb); GP120 de VIH (lACY.pdb, 1F58.pdb, 1G9M.pdb, 1G9N.pdb, 1GC1.pdb, IQU.pdb, IQNZ.pdb, 1RZ7.pdb, 1RZ8.pdb, IRZF.pdb, IRZG.pdb, 1RZI, IRZJ.pdb, IRZK.pdb, 1 YYL.pdb, 1 YYM.pdb, 2B4C.pdb, 2F58.pdb, 2F5A.pdb); GP41 de VIH (ITJG.pdb, ITJH.pdb, ITJl.pdb, 1U92.pdb, 1U93.pdb, 1U95.pdb, 1U8H.pdb, 1U81.pdb, 1U8J.pdb, 1U8K.pdb, 1U8P.pdb, 1U8Q.pdb, 1U91.pdb, 1U8L.pdb, 1U8M.pdb, 1U8N.pdb, 1U80.pdb, 2F5B); virus del Nilo occidental (como se define en la solicitud de patente publicada de EE. UU. No. 2006/0115837); malaria (dihidroíolato reductasa) (como se define en Acta Crystallographia (2004), D60(11), 2054-2057); y EGFR (1181.pdb, 118K.pdb, 1YY8.pdb, 1YY9.pdb, 2EXP.pdb, 2EXQ.pdb).

Estructura y función de la proteína del sistema inmune Las proteínas del sistema inmune identificadas que se unen a la biomolécula objetivo se usan como un molde para dirigir la selección o construcción de inhibidores orgánicos de molécula pequeña, o farmacóforos de los mismos, de la biomolécula objetivo. En general, una proteína del sistema inmune es aquella que se une a proteínas no propias. En varias modalidades, las proteínas del sistema inmune se desarrollan contra una biomolécula objetivo. Se entiende que las múltiples estructuras producidas en el sistema inmune expresan selectivamente alta afinidad por estructuras moleculares correspondientes. Estas incluyen, por ejemplo, los complejos de histocompatibilidad mayor, varios receptores de células T y ß, y anticuerpos. Cualquiera de estas estructuras se puede usar en los pasos de las presentes invenciones. Sin embargo, para describir las modalidades preferidas de la presente se hará referencia a los anticuerpos. El experto en la materia entenderá que la siguiente exposición se aplica también a otras proteínas del sistema inmune. Preferiblemente, la proteína del sistema inmune se une a proteínas no propias con poca o ninguna distorsión estructural, causada por ejemplo por ajuste inducido. Esta propiedad de varias proteínas del sistema inmune es la que hace deseables, por lo menos en parte, a esta clase de moléculas en los métodos aquí descritos. En varias modalidades, la estructura de la proteína del sistema inmune es por lo menos aproximadamente 95% constante antes y después de la unión, de preferencia por lo menos aproximadamente 98% constante. En otras palabras, las proteínas del sistema inmune preferidas sufren menos de aproximadamente 5%, o menos de aproximadamente 2% de cambio conformacional, medido por la posición espacial de los átomos, después de la unión con un objetivo de proteína no propia. Por ejemplo, las proteínas del sistema inmune de varias modalidades experimentan un movimiento espacial atómico promedio menor de aproximadamente 3 Á, o menor de aproximadamente 2 Á, después de su unión con una biomolécula objetivo. Con respecto a las inmunoglobulinas, que son un aspecto del método preferido de esta invención, cualquier mamífero sano individual puede producir arriba de diez a la décima potencia anticuerpos diferentes, cada uno respondiendo a un antígeno diferente. Entre las especies e incluso entre el reino animal, la variabilidad intraespecie en los códigos genéticos (específicamente para los componentes de las regiones que definen la complementariedad (CDR) de los anticuerpos) y la forma de los anticuerpos (las estructuras generales siendo monoméricas, por ejemplo en camellos, contra diméricas, por ejemplo en humanos y ratones), elevan el número de posibles respuestas de anticuerpo a mas de diez a la vigésima potencia. Y cada animal individual que tiene un sistema inmune sano es capaz de desarrollar una pluralidad de anticuerpos contra casi cualquier antígeno. Cuando se inyecta una molécula extraña, por ejemplo una enzima, natural para otra especie, en el cuerpo de un animal que tiene un sistema inmune sano, este sistema desarrollará una respuesta contra la estructura. Durante esta respuesta, millones de células ß nacientes individuales, cada una expresando un receptor distinto que refleja el anticuerpo idéntico que finalmente producirá la célula ß, son expuestas a la molécula. Aquellas células ß que expresan los receptores que se unen fuertemente a la molécula extraña proliferan, suministrando así una colonia de células que producen, cada una, el mismo anticuerpo que es específico para el objetivo. Algunas de estas células ß son liberadas en el cuerpo para combatir la sustancia extraña, mientras que otros miembros permanecen dentro de los ganglios linfáticos, el bazo y el tálamo, en preparación para responder con un torrente de anticuerpos en caso de que la molécula extraña sea presentada en el futuro al sistema. Esta capacidad para permanecer en espera para la presentación futura de la molécula extraña, es referida como "inmunidad adquirida", ya que requiere una presentación inicial de la sustancia extraña antes de que se pueda adquirir la capacidad para responder en el futuro. Cuando una estructura molecular específica, por ejemplo una proteína, o mas específicamente una enzima, es un contribuyente de la patogénesis de una enfermedad, un agente farmacéutico que se una a esa molécula con alta especificidad o inhiba la actividad de esa molécula, es una ruta para encontrar una terapia (o curación) significativa para la enfermedad. Existen muchos ejemplos de dichas enzimas, que incluyen transcriptasa inversa de VIH, tirosina cinasa ABL-BCR de algunos tipos de leucemia, y factores de crecimiento endotelial vascular (VEGF's), algunos de los cuales están asociados con la angiogénesis de tumor. Como se describe en los antecedentes de la invención, un método elegido frecuentemente para identificar una molécula pequeña de guía que exhibe precisamente esta actividad, es explorar al azar muchos miles de moléculas pequeñas (sintetizadas o de otra manera para este fin) comparándolas con la molécula objetivo con la esperanza de que una de las moléculas pequeñas exhiba las propiedades funcionales deseadas. Aquella o aquellas que tengan las características buscadas son referidas como guías, y se siguen retinando hasta encontrar un fármaco. Este método de exploración y subsiguiente optimización es laborioso y no empieza usando algún apalancamiento de conocimiento de la molécula objetivo o de qué estructuras se podrían unir a la misma.

En contraste, la presente invención capitaliza las propiedades de afinidad de unión de las proteínas del sistema inmune a fin de proveer un procedimiento de exploración de afinidad de alto rendimiento. La presentación inicial de una molécula objetivo al sistema inmune resulta en la producción de un anticuerpo por parte del sistema inmune, en donde la producción de las muchas y distintas estructuras de inmunoglobulina actúa como un proceso de exploración de afinidad masivamente paralelo de alto rendimiento. Solamente las células que expresan receptores que se unen al objetivo son elegidas para proliferación. Esto se denomina selección clonal y está en el centro de la capacidad del sistema inmune para producir moléculas específicas de objetivo, tal como la exploración está en el centro del proceso de descubrimiento de fármacos guías. De hecho este paralelo entre la producción de anticuerpos del sistema inmune en respuesta a la presentación de una molécula objetivo, va mas allá de la similitud entre la presentación de objetivo/selección clonal y la exploración de alto rendimiento, pues una vez que las células ß que son capaces de producir anticuerpos que se unen al objetivo son impulsadas a proliferar, son activados los mecanismos que promueven sutilmente la mutación (maduración de afinidad). Este proceso permite la generación futura de células ß para generar anticuerpos sutilmente diferentes; algunos de los cuales se unirán al objetivo más fuertemente, mientras que otros se unirán menos fuertemente. Aquellos que se unen más fuertemente son inducidos a proliferar más, y aquellos que se unen menos fuertemente proliferan más lentamente. Esta lenta evolución hacia una afinidad de unión más alta se refleja en el desarrollo farmacéutico de un fármaco mediante los ciclos de optimización de guía. Los anticuerpos dentro del alcance de la invención incluyen, por ejemplo, anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales y fragmentos de anticuerpos. Son muy conocidos en la técnica muchos métodos para la producción, purificación, o fragmentación de anticuerpos desarrollados contra proteínas/enzimas objetivo (véase, en general, Cárter (2006) Nat Rev Immunol. 6(5), 343-357; Tellaud (2005), Expert Opin Biol Ther. 5 (Sup. 1 ) S15-27; Subramanian, ed. (2004) "Antibodies": Volumen 1 : "Production and Purification", Springer, ISBN 0306482452; Lo, ed. (2003) "Antibody Engineering Methods and Protocols", Humana Press, ISBN 1588290921 ; Ausubel y otros, ed. (2002) "Short Protocols in Molecular Biology" 5a ed., "Current Protocols", ISBN 0471250929; Brent y otros, ed (2003) "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons Inc, ISBN 047150338X;Coligan (2005), "Short Protocols in Immunology", John Wiley & Sons, ISBN 041715786; Sidhu (2005) "Phage Display In Biotechnology and Drug Discovery", CRC, ISBN-10: 0824754662). Los anticuerpos policlonales son poblaciones heterogéneas de moléculas de anticuerpo que se obtienen de animales inmunizados, usualmente del suero. Los anticuerpos policlonales pueden ser generados fácilmente por el experto en la materia de una variedad de animales de sangre caliente, como es muy conocido y se describe en muchas de las referencias anteriormente enlistadas. Además, los anticuerpos policlonales se pueden obtener de una variedad de fuentes comerciales. Los anticuerpos monoclonales son poblaciones homogéneas de anticuerpos para un antígeno particular. A diferencia de los anticuerpos policlonales que pueden ser específicos para varios epítopes de un antígeno, usualmente los anticuerpos monoclonales son específicos para una solo epítope. Generalmente, los anticuerpos monoclonales se producen removiendo células ß del bazo de un animal expuesto al antígeno (en donde el antígeno incluye las proteínas aquí descritas), y después fusionando estas células ß con células de tumor de mieloma que pueden crecer indefinidamente en cultivo. Las células híbridas fusionadas, o hibridomas, se multiplican rápidamente e indefinidamente, y pueden producir grandes cantidades de anticuerpos. Los hibridomas se pueden diluir y desarrollar suficientemente para obtener varias colonias diferentes, cada una produciendo solo un tipo de anticuerpo. Después, los anticuerpos de las diferentes colonias se pueden probar para determinar su capacidad para unirse al antígeno, seguido por la selección de los más eficaces. En particular, los anticuerpos monoclonales se pueden obtener mediante cualquier técnica que provea la producción de moléculas de anticuerpo mediante líneas celulares continuas en cultivo, tales como las que se describen en las referencias enlistadas anteriormente. Preferiblemente, se usan líneas celulares de mieloma que han perdido su capacidad para producir sus propios anticuerpos, a fin de no diluir el anticuerpo objetivo.

Preferiblemente, se usan células de mieloma que han perdido una enzima específica (por ejemplo hipoxantina-guanina fosforribosiltranferasa, HGPRT) y por lo tanto no pueden crecer bajo ciertas condiciones (particularmente en presencia de medio HAT). En dichas modalidades preferidas, se puede detectar la fusión exitosa entre las células ß sanas y las células de mieloma, en donde el socio sano suministra la enzima necesaria y la célula fusionada puede sobrevivir en el medio HAT. Los anticuerpos monoclonales también se pueden generar mediante otros métodos, tales como despliegue de fago (véase por ejemplo Sidhu (2005) "Phage Display in Biotechnology and Drug Discovery", CRC, ISBN-10: 0824754662). Tales anticuerpos pueden ser de cualquier clase de ¡nmunoglobulina, incluyendo IgG, IgM, IgE, IgA, IgD, y cualquier subclase de las mismas. Un hibridoma que produce un mAb de la invención se puede cultivar in vitro o in vivo. La capacidad para producir altos títulos de anticuerpos monoclonales in vivo hace a este un método de producción particularmente útil. Generalmente, los anticuerpos monoclonales tienen una vida media terminal más larga que muchos fragmentos de anticuerpo, lo que se traduce en mayor incorporación, que puede ser deseable para varias aplicaciones. Preferiblemente, el anticuerpo es de la clase de ¡nmunoglobulina IgG. Los siguientes comentarios están dirigidos a la clase preferida IgG, pero el experto en la materia entenderá que la exposición también se puede aplicar a otras clases. Cada molécula de IgG consiste en dos clases diferentes de cadenas de polipéptido, las cadenas pesadas y las cadenas ligeras. Estas cadenas pesadas y ligeras se subclasifican adicionalmente como segmentos constantes y variables. La construcción general de una molécula de IgG 100 es en forma de "Y", como se muestra en la figura 1 , con la base 102 de la "Y" siendo formada por dos pares de segmentos de cadena pesada constantes, 104, 106, (2 segmentos, CH2-CH3, de lado a lado). Cada uno de los segmentos superiores de esta estructura base está enlazado con una de las dos ramas de la "Y" 108, 1 10, y específicamente cada uno está unido a otro segmento pesado constante CH1 , 109. Cada uno de estos dos segmentos de cadena pesada CH1 está apareado con un segmento de cadena ligera constante CL1 , 1 12. Las puntas distales de los segmentos constantes de cadena pesada y ligera están unidas a segmentos variables de cadena pesada y ligera, VH1 1 14 y VL1 1 16 (un par de segmentos variables por rama). Estos segmentos variables apareados forman las puntas distales de la estructura en "Y", e incluyen las puntas de unión que se forman con tal especificidad de antígeno alta. La topografía de los sitios de unión de anticuerpo es revisada, por ejemplo, por Lee y otros (2006), J Org Chem 71 , 5082-5092. Aunque existe variabilidad en la estructura de los segmentos constantes a través de las especies, e incluso se ha observado cierta variación dentro de las especies, los segmentos pesados constantes CH1 , CH2 y CH3 de los mamíferos generalmente consisten en una secuencia de 1 10-120 aminoácidos altamente conservados. Similarmente, los segmentos constantes de cadena ligera consisten generalmente en una secuencia de 1 10-120 aminoácidos altamente conservados. Los segmentos de cadena variable ligera y pesada VH1 y VL1 , comprenden secuencias de péptidos muy similares a los segmentos constantes, pero para tres tramos de péptido pequeños que son de aproximadamente 5 a 15 aminoácidos de longitud. Estos tramos cortos son altamente variables y son referidos generalmente como las regiones hipervariables o regiones determinantes de complementariedad (CDR's) 1 18. Esta hipervariabilidad es el resultado del empalme y mezclado genético que ocurre durante la maduración de una célula productora de inmunoglobulina. Cada célula productora de inmunoglobulina madura producirá solo un tipo de anticuerpo (si es una célula productora de anticuerpo), pero diferentes células producirán diferentes inmunoglobulinas. Por lo tanto, este proceso genético da origen a la amplia variedad de anticuerpos producidos dentro de un solo animal. Las tres secuencias cortas de péptido hipervariables de cada uno de los segmentos variables forman un complejo de agrupaciones de seis aminoácidos que se empaquetan entre sí en cada una de las puntas distales del anticuerpo (las dos puntas distales siendo idénticas una a la otra). Por lo tanto, se puede considerar que la molécula de anticuerpo misma comprende una estructura grande que está dedicada simplemente a retener y presentar un pequeño grupo de aminoácidos, las CDR's, en una disposición estable, de tal manera que se pueda unir con una afinidad muy alta a una estructura objetivo muy específica. Como las secciones remanentes de los segmentos de cadena variable están altamente conservados con respecto a los tramos de péptido hipervariables, los aminoácidos específicos que forman las CDR's pueden ser identificados por métodos de secuenciación. Las regiones hipervariables del segmento de cadena ligera variable se encuentran por ejemplo en los tramos de péptidos 24-34, 50-56 y 89-97 (de acuerdo con el sistema de numeración usado por Kabat y Wu). Similarmente, las regiones hipervariables del segmento de cadena pesada variable se encuentran por ejemplo en 31 -35, 50-65, y 95-102. Se debe entender que las CDR's específicas pueden incluir un número de péptidos más grande que basándose solo en los números disponibles, es decir, CDR H3 muchas veces es mas grande que solo 8 péptidos, y en estas situaciones se usan caracteres alfanuméricos, por ejemplo 100A, 100B, etc., para describir de forma única los componentes de secuencia.

Selección de proteínas del sistema inmune Las proteínas del sistema inmune se seleccionan generalmente por su capacidad para unirse a la biomolécula objetivo. Preferiblemente, la proteína del sistema inmune se une a la biomolécula objetivo con una afinidad relativamente alta. Por ejemplo, las proteínas del sistema inmune preferidas se pueden unir a la biomolécula objetivo con una KD de por lo menos aproximadamente 1 mM, usualmente por lo menos aproximadamente 300 µ?, normalmente por lo menos aproximadamente 10 µ?, normalmente por lo menos aproximadamente 30 µ?, de preferencia por lo menos aproximadamente 10 µ?, y muy de preferencia por lo menos aproximadamente 3 µ?, o mejor. Preferiblemente, la proteína del sistema inmune de alta afinidad es un anticuerpo monoclonal de alta afinidad. El experto en la materia entenderá que aunque unas partes de la siguiente exposición se refieren a anticuerpos, y más específicamente a anticuerpos monoclonales, la exposición también se aplica a otros tipos de proteínas del sistema inmune anteriormente expuestas. Generalmente, la unión en, o cerca de, el sitio activo, es una modalidad preferida, dado que es más probable que dicha unión inhiba la actividad de la biomolécula objetivo. Sin embargo se contemplan otras modalidades en donde la unión de las proteínas del sistema inmune a las regiones de la biomolécula objetivo también puede dar como resultado la inhibición de la actividad, por ejemplo mediante unión alostérica (por ejemplo, estabilización de una conformación inactiva). Los algoritmos para identificar la clase de unión de la proteína del sistema inmune basados en la definición y sitio de unión son conocidos (véase Lee y otros (2006), J Org Chem 71 , 5082-5092). De acuerdo con el lenguaje de Lee y otros, en varias modalidades las proteínas del sistema inmune pueden tener una topografía de unión de cueva, cráter, cañón, valle o planicie. Preferiblemente, las proteínas del sistema inmune tienen una topografía de unión de cañón, valle o planicie, muy preferiblemente cañón o planicie. Una vez que se han identificado estructuras de anticuerpo de alta afinidad y se han creado líneas de células productoras de anticuerpo monoclonal para las mismas, un paso subsiguiente en el método de las modalidades de la presente invención es seleccionar los anticuerpos de unión de alta afinidad que se unen en, o cerca de, el sitio activo de entre la pluralidad de anticuerpos (por ejemplo anticuerpos monoclonales). Los anticuerpos monoclonales se pueden seleccionar basándose por ejemplo en su especificidad, alta afinidad de unión, isotipo, o estabilidad. Los anticuerpos monoclonales se pueden explorar o se puede determinar su especificidad usando cualquiera de una variedad de técnicas estándares que incluyen Western Blotting (Koren, E. y otros, Biochim, Biophys. Acta 876:91 -100 (1986)) y ensayo de inmunosorbente enlazado a enzima (ELISA) (Koren y otros, Biochim. Biophys. Acta 876:91 -100 (1986)). Los métodos para seleccionar los anticuerpos de unión de alta afinidad de sitio activo se pueden utilizar cuando existen otros miembros de una familia de moléculas y comparten la misma subestructura de la región activa del mismo. Un aspecto de la presente invención incluye un método para identificar si un anticuerpo de alta afinidad también es un anticuerpo de alta afinidad de sitio activo, determinando si también se une a otros miembros de una familia de proteínas similares que conservan su región activa. Si un anticuerpo de alta afinidad desarrollado contra una molécula objetivo (por ejemplo VEGF-A) no se une bien a otros miembros de la familia, es más probable que no se una a la región activa. Alternativamente, si un anticuerpo de alta afinidad cultivado por inoculación contra una molécula objetivo (por ejemplo, VEGF-A) se explora en otros miembros de la familia (por ejemplo, VEGF-B, VEGF-C, etc.), y también muestra una alta afinidad por ellos, es muy probable que el anticuerpo de alta afinidad también sea un anticuerpo de alta afinidad de sitio activo. En el caso de compuestos sin moléculas similares de familia, se pueden usar medios alternativos para determinar la naturaleza del sitio de unión. Un ejemplo de cómo se puede hacer esta determinación es produciendo un ensayo funcional del objetivo y exponiendo el anticuerpo al ensayo para determinar si el anticuerpo inhibe el funcionamiento del ensayo. Otro método ejemplar para seleccionar anticuerpos de alta afinidad de sitio activo de un grupo de anticuerpos de alta afinidad, que es completamente in silico, es secuenciar cada anticuerpo, modelar la estructura de la superficie de unión, y compararla con un modelo de la superficie activa del objetivo para ver si los dos son compatibles. Este método puede requerir el conocimiento del objetivo específico y tener acceso a uno de los varios programas que están disponibles para estimar la composición de superficie de los anticuerpos. Se contempla que este método alternativo de filtración de los anticuerpos de alta afinidad que no es de sitio activo, de aquellos anticuerpos que se unen al objetivo de superficie activa, será cada vez más eficiente conforme se caractericen completamente más estructuras objetivo, y la exactitud de la modelación de anticuerpo de la sola información de secuencia mejora de acuerdo con los diversos métodos descritos aquí o en otra parte. El hecho de saber que existen las CDR's del anticuerpo en tramos enumerados específicamente a lo largo de las cadenas ligeras y pesadas de péptido dentro del anticuerpo, da contabilidad adicional a este proceso. Esta técnica in silico también se puede relacionar con otros pasos del método de la invención (por ejemplo, determinación de la posición espacial específica de los átomos de la porción de unión del anticuerpo).

Determinación de la posición espacial de la estructura Después de seleccionar las proteínas del sistema inmune (por ejemplo, el anticuerpo monoclonal de alta afinidad de sitio activo), se definen los dominios de unión de proteína 3D. La definición de los dominios de unión de proteína incluye generalmente la determinación de la posición espacial específica de los átomos de la porción de unión de la proteína del sistema inmune que interaccionan con la biomolécula objetivo. La determinación de la posición espacial de la porción de unión se puede lograr por medio de varias técnicas in silico. Por ejemplo, se pueden usar paquetes de software que modelan la estructura de la superficie de unión y la comparan con un modelo de la superficie activa del objetivo para determinar grados de compatibilidad. Dicho software incluye CAMAL. También, algoritmos para identificar la clase de unión de la proteína del sistema inmune, basados en la definición y sitio de unión (véase Lee y otros (2006), J Org Chem 71 , 5082-5092). Alternativamente, se puede determinar la colocación tridimensional de los átomos dentro de una molécula objetivo (especialmente una molécula grande como un anticuerpo), por cristalización de la molécula en un arreglo grande de estructuras similares, y después exponiendo el cristal a difracción de rayos X. La técnica de difracción de rayos X empieza generalmente con la cristalización de la molécula porque un fotón difractado por un electrón no puede ser detectado confiablemente. Sin embargo, debido a la estructura cristalina regular, los fotones son difractados por electrones correspondientes en muchas moléculas dispuestas simétricamente. Como las ondas de la misma frecuencia cuyos picos coinciden se refuerzan una a otra, la señal se hace detectable. La cristalografía de rayos X puede proveer una resolución de hasta 2 Angstrom o menos. Las técnicas para usar cristalografía de rayos X para determinación estructural son conocidas (véase Messerschmidt (2007) "X-Ray Cristallography of Biomacromolecules: A Practical Guide", John Wiley & Sons, ISBN-10: 3527313966; Woolfson (2003) "An Introduction to X-ray Crystallography", 2a ed., Cambridge University Press, ISBN-10: 0521423597). La cristalografía de rayos X se puede usar para determinar la estructura de los átomos dentro de una estructura que se sabe que se une con alta afinidad al sitio activo de una biomolécula objetivo, y para usar entonces esta información estructural para construir una molécula sintética que retiene la misma afinidad o actividad que el anticuerpo.

La determinación estructural por cristalografía de rayos X requiere de cristales de la molécula de interés. Se conocen varias técnicas para crear dichos cristales de proteínas del sistema inmune, e incluyen las que se exponen en la patente de EE. UU. No. 6,931 ,325 de Wall, y la patente de EE. UU. No. 6,916,455 de Segelke, cuyas especificaciones, enseñanzas y referencias se incorporan aquí completamente como referencia. Para superar las dificultades en la cristalización de anticuerpos y la distorsión potencial de las puntas de unión, el anticuerpo puede ser cristalizado con la biomolécula objetivo para asegurar la captura de la estructura de unión adecuada (véase por ejemplo el registro 1 CZ8 del Banco de Datos de Proteína RCSB, que es un factor de crecimiento endotelial vascular en complejo con un anticuerpo de afinidad madura). Una vez preparados, los cristales se pueden cosechar y opcionalmente conservar en frío con nitrógeno gaseoso o líquido. La crioconservación de los cristales puede reducir el daño por radiación inducido durante la recolección de datos o disminuye del movimiento térmico dentro del cristal. Los cristales se colocan en un difractómetro acoplado con una máquina que emite un haz de rayos X. Los rayos X difractan los electrones en el cristal, y el patrón de difracción es registrado en detectores de película o estado sólido y escaneados en una computadora. Estas imágenes de difracción se combinan y se usan para construir un mapa de la densidad de electrones de la molécula que se cristalizó. Después, los átomos se acomodan en el mapa de densidad de electrones y se retinan varios parámetros tales como la posición, para ajustar mejor los datos de difracción observados. Los parámetros derivados de los datos de difracción observados en la cristalografía de rayos X incluyen, sin limitación, enlazadores de hidrógeno, contactos hidrofóbicos apolares, interacciones de puente de sal, área de superficie polar del dominio, área de superficie apolar del dominio, puntuación de complementariedad de forma para el complejo anticuerpo-objetivo, y explícitamente moléculas de agua colocadas. También es útil la caracterización de enlaces entre átomos. La distancia entre dos átomos que están enlazados por enlace sencillo varía de aproximadamente 1 .45 Á a aproximadamente 1 .55 Á. Los átomos que tienen doble enlace están separados por lo regular de aproximadamente 1 .2 Á a aproximadamente 1 .25 Á. Los enlaces que son resonantes entre enlaces sencillos y dobles tienen por lo regular una separación de aproximadamente 1 .30 Á a aproximadamente 1 .35 Á. A manera de ejemplo, una molécula de VEGF (SEQ ID NO:2) unida a un anticuerpo de afinidad madura (el fragmento Fab del mismo) ha cristalizada y publicada previamente por Chen y otros, en la base de datos RCSB como 1 CZ8. Más particularmente, sus datos de cristalización incluyen las regiones V y W, que son los miembros del dímero VEGF, y las regiones L, H, X y V que representan las cadenas ligera y pesada de anticuerpo de la molécula Fab (más particularmente, las regiones L y H comprenden una de las ramas de la molécula de Fab, incluyendo tanto las regiones variables como constantes de cada cadena. Similarmente, y V son las cadenas ligera y pesada de la otra rama de la molécula de Fab). Analizando geométricamente la disposición espacial de los más de ocho mil átomos que no son hidrógeno de la estructura cristalina, pueden ser identificados los átomos de una estructura que está dentro de una distancia especificada de átomos de otra estructura. Este filtro determina, mediante una comparación geométrica directa a través de todas las combinaciones posibles, los péptidos que están asociados en las dos moléculas. Usando una separación máxima (por ejemplo, 4 Á), pueden ser determinados los átomos de la cadena variable pesada (H) que están dentro de dicha escala corta de átomos del componente W del dímero de VEGF, y más probablemente son aquellos de las CDR's del fragmento Fab (véase el ejemplo 1 ).

Construcción de farmacóforos Se puede usar la información estructural de las proteínas del sistema inmune, que incluye la definición de la posición de átomos, para construir un modelo de farmacóforo usado para identificar moléculas pequeñas que tienen átomos similares en posiciones similares. Las moléculas pequeñas que tienen características similares a la proteína del sistema inmune tienen el potencial de mostrar interacciones moleculares similares con la proteína objetivo, y de esta manera actividad biológica similar con utilidad terapéutica similar. Una vez que se ha identificado la orientación espacial de átomos, preferiblemente sustancialmente todos los átomos, de preferencia todos los átomos, en la o las regiones de unión de una proteína del sistema inmune (por ejemplo, las puntas de unión de un anticuerpo monoclonal de alta afinidad de sitio activo), un paso subsiguiente de las diversas modalidades de la presente invención es la generación de un farmacóforo que tiene una estructura que se aproxima, de preferencia que se aproxima sustancialmente, a por lo menos una porción de los átomos de la proteína del sistema inmune responsable, por lo menos en parte, de unirse a la biomolécula objetivo. Por ejemplo, el farmacóforo se puede aproximar a por lo menos aproximadamente 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 99%, o 100% de los átomos de la proteína del sistema inmune, responsables por lo menos en parte de la unión a la biomolécula objetivo. Esta síntesis de una estructura química nueva puede ser realizada usando software y técnicas de diseño racional de fármacos. Una característica clave de varias modalidades, sin embargo, es que la molécula guía no sea construida únicamente comparando la estructura química nueva con la superficie objetivo, sino mas bien usando como guía una estructura conocida (es decir, una proteína del sistema inmune), que se une al objetivo biomolecular de una manera que produce el efecto deseado. Las proteínas del sistema inmune son particularmente adecuadas como guías porque sus regiones CDR están construidas de estructuras orgánicas relativamente simples que pueden ser recreadas con relativa facilidad en moléculas orgánicas pequeñas. En varias modalidades, se pueden usar enfoques in silico para el diseño de la estructura novedosa con un enfoque basado en fragmentos que usa estadística de contacto, modelos de superficie 3D y ligandos acoplados como moldes. De la información de la posición espacial, o de otros parámetros anteriormente descritos, se pueden derivar modelos 3D de ligando-receptor (por ejemplo, patrón de interacción, esquemas de farmacoforo), mapas de superficie (por ejemplo topografía/forma, perfil electrostático, hidrofobicidad, flexibilidad de proteína), y modelos de acoplamiento (por ejemplo sistema de puntuación para unión de ligando, cálculo de energía mínima). Un modelo o esquema de farmacoforo es generalmente una serie de características estructurales en un ligando que están relacionados, de preferencia relacionados directamente, con el reconocimiento del ligando en un sitio receptor y su actividad biológica. Las características de farmacoforo se pueden derivar de porciones correspondientes de donador, aceptor, aromática, hidrofóbica, o ácida o básica, de la proteína del sistema inmune correspondiente, en complejo con su receptor tomado de estructuras de cristal. Se entenderá que información adicional acerca de la naturaleza de los átomos de la proteína del sistema inmune usada en un esquema de farmacoforo (por ejemplo, los átomos en la punta de unión de un anticuerpo monoclonal de alta afinidad de sitio activo), y no simplemente la localización espacial de los átomos, puede ayudar en el proceso de modelación de esta guía química nueva. Estas características incluyen, sin limitación, los valores de pKa de los átomos, la rigidez rotacional de los enlaces que mantienen los átomos en su lugar, la naturaleza de los enlaces mismos (sencillo, doble, resonante, u otros), la direccionalidad proyectada de los donadores y aceptares de enlace de hidrógeno, etc. Los componentes característicos típicos útiles para generar un esquema de farmacoforo incluyen, sin limitación, posición atómica; radios atómicos; donador de enlace de hidrógeno; aceptor de enlace de hidrógeno; características aromáticas; de donador; aceptor; características aniónicas; características catiónicas; características de aceptor y anión; características de donador y catión; características de donador y aceptor; características de ácido y anión; características hidrofóbicas; direccionalidad de enlace de hidrógeno; y ligandos de metal (véase el ejemplo 4). Tales características se pueden ubicar por ejemplo en un solo átomo, en centroides de átomos, o en una posición direccional proyectada en el espacio. Se contempla que se pueden diseñar muchas preguntas de farmacoforo para cualquier complejo dado de proteína del sistema inmune-biomolécula objetivo. También se contempla que estas preguntas de farmacoforo serán útiles para identificar ligandos de molécula pequeña que interaccionan con la biomolécula objetivo en un sitio reconocido por la proteína del sistema inmune. Los recursos ejemplares para realizar dicha modelación y preguntas incluyen, sin limitación, MOE (CGG) (provisión de pregunta de farmacoforo y visualización), Glide (Schrodinger) (provisión de acoplamiento y puntuación), Accord para Excel (Accelrys) (provisión de organización de información molecular que incluye estructuras y fórmulas químicas), y la base de datos ZINC (UCSF) (que provee una colección de compuestos comerciales). Una herramienta de diseño para la generación de farmacóforos partiendo de la caracterización de la unión estructural de proteína del sistema inmune-biomolécula objetivo, es el MOE, o medio operativo molecular (Chemical Computing Group). La generación del modelo usa restricciones geométricas y electrónicas para determinar las posiciones 3D de características correspondientes con la proteína del sistema inmune. El modelo de estas modalidades consiste en características esféricas en el espacio 3D. El diámetro de las esferas se puede ajustar (por ejemplo, de aproximadamente 0.5 Á a aproximadamente 3.0 Á). Tales modelos permiten coincidencias o coincidencias parciales de las características. Las características estructurales farmacoforicas pueden ser representadas por puntos marcados en el espacio. A cada ligando se le puede asignar una anotación, que es un grupo de características estructurales que pueden contribuir al farmacóforo del ligando (véase el ejemplo 4). En varias modalidades se puede consultar una base de datos de ligandos anotados con una pregunta que representa una hipótesis de farmacóforo (véase el ejemplo 5). El resultado de dicha consulta es un grupo de coincidencias que alinean las características farmacoforicas de la pregunta con las características farmacoforicas presentes en los ligandos de la base de datos consultada (véase el ejemplo 5, cuadros 23-28). El número de aciertos dentro de la base de datos depende por lo menos en parte del tamaño de la base de datos y de las restricciones de la pregunta de farmacóforo (por ejemplo, coincidencias parciales, número de características, etc.). Como un ejemplo, las preguntas de farmacóforo del ejemplo 4 generaron de aproximadamente 1000 a aproximadamente 3000 aciertos contra la base de datos ZINC. Las propiedades y parámetros de las moléculas presentes dentro de la base de datos consultada se usan para enfocar el resultado de la pregunta. Por ejemplo, pueden estar presentes compuestos con una escala definida de peso molecular (PM) o lipofilicidad (logP) en la sección buscada de la base de datos de la colección de compuestos.

Moléculas candidatas Los presentes métodos se pueden usar para explorar una variedad de moléculas candidatas diferentes (por ejemplo, moléculas candidatas potencialmente terapéuticas). Como se describió arriba, las moléculas candidatas pueden ser buscadas usando una pregunta de farmacóforo. Las moléculas candidatas abarcan numerosas clases químicas, aunque normalmente son moléculas orgánicas, de preferencia compuestos orgánicos pequeños que tienen un peso molecular de más de 50 Dalton y menos de aproximadamente 2500 Dalton. Las moléculas candidatas comprenden los grupos funcionales necesarios para la interacción estructural con proteínas, particularmente enlaces de hidrógeno, y normalmente incluyen por lo menos un grupo amino, carbonilo, hidroxilo o carboxilo, preferiblemente por lo menos dos de los grupos químicos funcionales. Las moléculas candidatas muchas veces comprenden estructuras cíclicas de carbono o heterocíclicas, o aromáticas o poliaromáticas sustituidas con uno o más de los grupos funcionales anteriores. En modalidades preferidas, las moléculas candidatas son compuestos de una base de datos de una colección de compuestos. El experto en la materia estará familiarizado generalmente con muchas bases de datos para compuestos disponibles comercialmente, para la exploración (véase por ejemplo la base de datos ZINC, UCSF, con 2.7 millones de compuestos en 12 subgrupos distintos de moléculas; Irwin y Shoichet (2005), J Chem Inf Model 45 177-182). El experto en la materia también estará familiarizado con una variedad de máquinas de búsqueda para identificar fuentes comerciales o compuestos deseables, y clases de compuestos para análisis ulterior (véase por ejemplo la base de datos ZINC; eMolecules.com; y colecciones electrónicas de compuestos comerciales provistos por los vendedores, por ejemplo: ChemBridge, Princeton BioMolecular, Ambinter SARL, Enamine, ASDI, Life Chemicals, etc.). Las moléculas candidatas para exploración de acuerdo con los métodos aquí descritos incluyen tanto compuestos de tipo guía como compuestos de tipo fármaco. Se entiende generalmente que un compuesto de tipo guía tiene una estructura de tipo armazón relativamente mas pequeña (por ejemplo, con un peso molecular de aproximadamente 150 kD a aproximadamente 350 kD), con relativamente menos características (por ejemplo, menos de cerca de 3 donadores de hidrógeno, o menos de cerca de 6 aceptores de hidrógeno; carácter de hidrofobicidad xlogP de aproximadamente -2 a aproximadamente 4) (véase, por ejemplo, Angewante (1999) Chemie Int. Ed. Engl. 24, 3943-3948). En contraste, se entiende generalmente que un compuesto de tipo fármaco tiene un armazón relativamente más grande (por ejemplo con un peso molecular de aproximadamente 150 kD a aproximadamente 500 kD) con características relativamente más numerosas (por ejemplo, menos de aproximadamente 10 aceptores de hidrógeno o menos de cerca de 8 enlaces rotativos; carácter de hidrofobicidad xlogP menor de aproximadamente 5) (véase, por ejemplo, Lipinski (2000) J. Pharm. Tox. Methods 44, 235-249). Preferiblemente, la exploración inicial se realiza con compuestos de tipo guía. Cuando se diseña una guía partiendo de datos de orientación espacial, puede ser útil entender que algunas estructuras moleculares se caracterizan por ser "de tipo fármaco". Dicha caracterización se puede basar en un grupo de cualidades reconocidas empíricamente, derivadas comparando similitudes entre la amplitud de los fármacos conocidos de la farmacopea. Aunque no es necesario que los fármacos satisfagan todas, o incluso alguna de estas caracterizaciones, es mucho más probable que un candidato de fármaco tenga éxito clínico si es de tipo fármaco. Varias de estas características "de tipo fármaco" han sido resumidas en las 4 reglas de Lipinski (conocidas generalmente como la "regla de cincos" debido al predominio del número 5 entre ellas). Aunque estas reglas se refieren en general a la absorción oral y se usan para predecir la biodisponibilidad de un compuesto durante la optimización de la guía, pueden servir como guías efectivas para construir una molécula guía durante el trabajo del diseño racional de fármacos, tal como puede ser realizado usando los métodos de la presente invención. Las cuatro "reglas de cinco" afirman que un compuesto de tipo fármaco candidato debe tener por lo menos tres de las siguientes características: (i) un peso menor de 500 Dalton; (ii) un log P menor de 5; (iii) no mas de 5 donadores de enlace de hidrógeno (expresado como la suma de grupos OH y NH)¡ y (iv) no mas de 10 aceptores de enlace de hidrógeno (la suma de átomos de N y O). También, las moléculas de tipo fármaco normalmente tienen una extensión (amplitud) de entre aproximadamente 8 Á y aproximadamente 15 Á. Por ejemplo, de un subgrupo de los átomos implicados en la unión que están suficientemente cercanos para ser estructurados en una molécula guía, véase el cuadro 3 del ejemplo 1 . Como se explicó arriba, el número de moléculas identificadas como aciertos para el farmacoforo, depende por lo menos en parte del tamaño de la base de datos y de las restricciones de la pregunta del farmacoforo. El número de moléculas identificadas como aciertos de una pregunta de farmacoforo se puede reducir modelando más para ajustarse al sitio de unión de la biomolécula objetivo. Dicha modelación puede ser de acuerdo con métodos de acoplamiento y puntuación como se describe mas abajo.

Acoplamiento y puntuación Las moléculas candidatas identificadas porque tienen átomos similares en posiciones similares o características similares en posiciones similares, en comparación con un modelo de farmacóforo (por ejemplo mediante una pregunta de farmacóforo como se describe arriba), se pueden seleccionar adicionalmente de acuerdo con la afinidad de acoplamiento por la biomolécula objetivo (véase el ejemplo 5). Además de la generación del modelo de farmacóforo para consultar las bases de datos, se puede usar un segundo método secuencial y complementario para identificación y diseño del compuesto. Las preguntas de farmacóforo pueden filtrar compuestos rápidamente, y el acoplamiento y puntuación pueden evaluar con más precisión la unión ligando-biomolécula objetivo. En el caso de biomoléculas objetivo de proteína o enzima, los residuos de aminoácido de la proteína o enzima objetivo implicados con el contacto de anticuerpo se pueden usar para definir el sitio de acoplamiento. En varias modalidades, compuestos seleccionados de las preguntas de farmacóforo se acoplan con el sitio de unión de proteína/enzima objetivo usando un software diseñado para dicho análisis (por ejemplo, Gilde (Schrodinger, NY). La afinidad de acoplamiento se puede calcular como valores numéricos (por ejemplo, "la puntuación de Gilde") basados por ejemplo en la energía ganada por la interacción de la molécula con la proteína (por ejemplo, "g_score"), o la energía requerida para obtener la conformación acoplada con respecto a la conformación de energía mas baja (por ejemplo, "e_model") (véase el ejemplo 5). Para estos ejemplos particulares, a mayor puntuación negativa será mejor el acoplamiento. Preferiblemente, la g_score es menor de aproximadamente -5. Preferiblemente, la puntuación de e_model es menor de aproximadamente -30. Se contempla que la cuantificación numérica deseable del acoplamiento puede variar entre diferentes biomoléculas objetivo. En varias modalidades se puede elegir una puntuación de acoplamiento de umbral (por ejemplo, g_score o e_model score), a fin de manejar el número de moléculas para adquisición y análisis ulterior. Por ejemplo, en varios estudios de acoplamiento aquí descritos, para VEGF (Pdb: 1 cz8) una puntuación de g_score de -5.0 (o magnitud mayor en una dirección negativa) se consideró una puntuación de acoplamiento deseable, y el corte se ajustó en consecuencia; no obstante, para ErbB2 (pdb:1 s78) una puntuación g_score de -7.5 (o magnitud mayor) se consideró una puntuación de acoplamiento deseable. En estos estudios, se usó la magnitud de la puntuación g_score para ajustar el número de aciertos a un número manejable que pudiera ser adquirido y probado. Como un ejemplo, si el número total de compuestos identificados de una pregunta de farmacóforo fue de aproximadamente 1000 a aproximadamente 3000, las puntuaciones de acoplamiento se pueden usar para clasificar dichos compuestos a fin de seleccionar de aproximadamente 100 a aproximadamente 200 para análisis ulterior. Se contempla que el número de compuestos por seleccionar para análisis ulterior podría ser menor o mayor que estos estimados. Preferiblemente, la magnitud de la puntuación g_score se usa como un criterio de selección, pero se contempla que se podría usar similarmente la puntuación e_model, en especial cuando la puntuación de e_model es de magnitud baja. También se contempla que los criterios de selección se pueden basar tanto en la puntuación g_score como en e_model, de preferencia ponderada hacia la puntuación g_score. El acoplamiento y puntuación pueden dar como resultado un grupo de compuestos con múltiples confórmeros. Usando software de modelación adecuado (por ejemplo MOE), las estructuras 3D se pueden convertir en 2D y con ello se remueven los duplicados. La lista resultante de estructuras químicas preferidas se puede usar para buscar vendedores usando por ejemplo máquinas de búsqueda diseñadas para dicha tarea (por ejemplo, eMolecules.com).

Efecto sobre la biomolécula objetivo Las moléculas candidatas seleccionadas de acuerdo con la pregunta de farmacóforo o seleccionadas ulteriormente de acuerdo con análisis de acoplamiento, se pueden probar para determinar su efecto sobre la biomolécula objetivo. La determinación del efecto de una molécula sobre la función de una biomolécula (por ejemplo, inhibición de la actividad enzimática), puede ser realizada por varios métodos conocidos (véase el ejemplo 6). Por ejemplo, el efecto inhibidor de una molécula candidata sobre la actividad catalítica de una enzima objetivo puede ser determinado mediante pruebas de actividad conocidas específicas para la enzima objetivo (véase por ejemplo Reymond, ed. (2006) "Enzyme Assays: High-throughput Screening, Genetic Selection and Fingerprinting", John Wiley & Sons, 386 p., ISMN-10; 3527310959; Eisenthall y Danson, Ed. (2002) "Enzyme Assays", 2a edición, Oxford University Press, 384 p., ISBN-10: 0199638209).

Refinación adicional Varios métodos para retinar más las moléculas candidatas seleccionadas. Los datos de las pruebas biológicas se pueden correlacionar con el modelo de acoplamiento a fin de refinar más las moléculas de tipo guía o las moléculas de tipo fármaco. Se pueden usar varios paquetes de software (por ejemplo MOE), para visualizar compuestos activos en el sitio de unión de la biomolécula objetivo para identificar sitios sobre el molde adecuados para modificación por diseño de novo. Se pueden identificar análogos de compuestos activos usando búsquedas de similitud y subestructura (véase por ejemplo SciFinder; eModel). Los análogos disponibles se pueden analizar de acuerdo con los procedimientos de acoplamiento y puntuación anteriormente descritos. Los análogos con puntuaciones de acoplamiento deseables se pueden adquirir y probar ulteriormente para determinar su efecto biológico sobre la biomolécula objetivo de acuerdo con los métodos anteriormente descritos. El experto en la materia entenderá estos y otros métodos de refinación y desarrollo ulterior de moléculas candidatas identificadas por los métodos aquí presentados.

Moléculas Otro aspecto de la presente invención incluye compuestos, identificados mediante los métodos aquí descritos, útiles para el tratamiento de enfermedades, trastornos o condiciones relacionadas con la biomolécula objetivo de la cual fueron identificados. Por ejemplo, es bien conocido que la inhibición de proteínas del factor de crecimiento tiene un beneficio en el tratamiento de algunas condiciones de oncología. Como otro ejemplo, AD4-1025 AD4-1025 se identificó como un inhibidor de la unión del factor de crecimiento epidérmico con su receptor (véase el ejemplo 7). Tales compuestos tienen utilidad terapéutica en oncología. Se espera que los análogos y derivados de AD4- 038 tengan el mismo efecto inhibidor y utilidad. Se diseñó un modelo de farmacóforo, Pharm1 _gly54_asp58, usando la información de la estructura de cristal de la proteína 1 YY9 para diseñar un modelo de farmacóforo (véase el ejemplo 4). El modelo Pharm1_gly54_asp58 se utilizó para identificar moléculas pequeñas que se unen a EGFR (SEQ ID NO: 1 ). El sitio sobre la proteína EGFR es reconocido por los residuos de aminoácido GLY-54 a ASP-58 del anticuerpo cetuximab (SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6) (Erbitux). Pharm1 _gly54_asp58 se modeló después de los residuos GLY-54 a ASP-58 y se diseñó como una herramienta para identificar moléculas pequeñas que tienen las características y componentes del anticuerpo cetuximab. Específicamente, esta región es definida como la CDR H2 de la cadena pesada del anticuerpo de cetuximab. Las características y componentes de estos residuos de aminoácido de cetuximab se usaron para crear un modelo de farmacóforo. De este modelo de farmacóforo se derivó el siguiente compuesto: Fórmula (1 ) en donde S1 -S8 representan sustituyentes independientes del siguiente tipo: halógeno (F, Cl, Br, I); hidroxilo (-OH); sulfhidrilo (-SH); carboxilato (-COOH); alquilo (1 a 4 carbonos, cadena recta, ramificada, o que contiene opcionalmente insaturación); cicloalquilo (C1 -C6 que contiene opcionalmente insaturación); arilo que incluye fenilo, o heteroarilo que contiene de 1 a 4 átomos de N, O, y S; o alcoxi (-OR en donde R se define como un grupo alquilo de cadena recta o ramificada de C1 -C6, sustituido opcionalmente con halógeno, hidroxilo, sulfhidrilo, carboxilato, arilo, heteroarilo, amino -NH2, amino sustituido -NR2, o grupos cicloamino que contienen 1 , 2, o 3 átomos de N en un anillo de 5 o 6 miembros); X se define como H2l O, S, N-R, N-OH, o N-NR2; Het se define como uno o mas átomos de N en cualquier posición del anillo; y Z se define como -COOH, -PO3H2; SO3H, anillo de tetrazol, sulfonamida, acilsulfonamida, -CONH2 o -CONR2. Los análogos adicionales incluyen aquellos en donde uno o más de los átomos de nitrógeno son reemplazados con átomos de carbono no sustituidos o átomos de carbono que contienen uno o dos sustituyentes independientes, en donde S9-S1 1 son como se define arriba para S1 -S8: Fórmula (2) Fórmula (3) Fórmula (4) Adicionalmente, también se espera que los isómeros enantioméricos tengan la misma utilidad: Fórmula (5) en donde S1 -S8, X, Het y Z son como se define arriba. En una modalidad, el inhibidor de la unión del factor de crecimiento epidérmico (EGF) al receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) es AD4-1025 ((N1-(4-clorofenil)-N2-(3-piridinilmetil)-alfa-asparagina; fórmula: Ci6H16CIN3O3; peso molecular: 333.78)) (véase el ejemplo 7). En la figura 43 se muestra una representación ejemplar de la unión de AD4-1025 al EGFR. La estructura de AD4-1025 es como sigue: Fórmula (6) A una concentración de 25 µ? de AD4-1025, la unión de EGF al EGFR es inhibida en 75.7% (véase el ejemplo 6).

AD4-1038 AD4-1038 se identificó como un inhibidor de la unión del factor de crecimiento epidérmico a su receptor (véase el ejemplo 8). Tales compuestos tienen utilidad terapéutica en oncología. Se espera que los análogos y derivados de AD4-1038 tengan el mismo efecto inhibidor y utilidad. Se diseñó un modelo de farmacóforo, Pharm1_thr100_glu105, usando la información de la estructura de cristal de la proteína 1 YY9 para diseñar un modelo de farmacóforo (véase el ejemplo 4, cuadro 17 y figura 14). El modelo Pharm1 _thr100_glu105 se utilizó para identificar moléculas pequeñas que se unen a EGFR. El sitio sobre la proteína EGFR (SEQ ID NO: 1 ) es reconocido por los residuos de aminoácido THR-100 a GLU-58 del anticuerpo cetuximab (SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6) (Erbitux). Pharm1 _thr100_glu 105 se modeló después de los residuos THR-100 a GLU-58 y se diseñó como una herramienta para identificar moléculas pequeñas que tienen las características y componentes del anticuerpo cetuximab. Las características y componentes de estos residuos de aminoácido de cetuximab se usaron para crear un modelo de farmacóforo. De este modelo de farmacóforo se derivó el siguiente compuesto: Fórmula (7) en donde S1 -S4 representan sustituyentes independientes del siguiente tipo: halógeno (F, Cl, Br, o I); hidroxilo (-OH); sulfhidrilo (-SH); carboxilato (-COOH); alquilo (1 a 4 carbonos, cadena recta, ramificada, o que contiene opcionalmente insaturación); cicloalquilo (C1 -C6 que contiene opcionalmente insaturación); arilo que incluye fenilo, o heteroarilo que contiene de 1 a 4 átomos de N, O, y S; o alcoxi (-OR en donde R se define como un grupo alquilo de cadena recta o ramificada de C1 -C6, sustituido opcionalmente con halógeno, hidroxilo, sulfhidrilo, carboxilato, arilo, heteroarilo, amino -NH2, amino sustituido -NR2, o grupos cicloamino que contienen 1 , 2, o 3 átomos de N en un anillo de 5 o 6 miembros); X se define como O, S, N-R, N-OH, o N-NR2; Het se define como uno o mas átomos de N en cualquier posición del anillo; Z se define como un grupo -COOH, -PO3H2; SO3H, anillo de tetrazol, sulfonamida, acilsulfonamida, -CONH2 o -CONR2. Los análogos adicionales incluyen aquellos en donde el átomo de nitrógeno central es reemplazado con átomos de carbono no sustituidos o átomos de carbono que contienen uno o dos sustituyentes independientes, en donde S2 y S6 son como se define arriba para S1 -S4, o el átomo de carbono central lleva el grupo funcional X como se describe arriba: Fórmula (8) Fórmula (9) También se espera que los compuestos que tienen una porción enlazadora corta como se indica exhiban la misma inhibición de EGFR: Fórmula (10) en donde L se define como un enlazador que consiste en 1 -4 átomos unidos linealmente, que incluyen C, N, O y S. En el caso de C y S, el estado de oxidación del átomo puede tener uno o dos oxígenos unidos por un enlace sencillo o doble. En el caso de C o N, el átomo puede tener uno o dos sustituyentes adicionales seleccionados independientemente del grupo S1 -S6 definido arriba. Adicionalmente, también se espera que los compuestos de composición estereoquímica diferente, incluyendo racematos e isómeros enantioméricos, tengan utilidad como inhibidores de EGFR: Fórmula (1 1 ) Fórmula (12) en donde S1 -S4, X, Het y Z son como se define arriba. En una modalidad, el inhibidor de la unión del factor de crecimiento epidérmico (EGF) al receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) es AD4-1038 ((ácido {2-[(4-hidroxifenil)-metil-amino]-4-oxo-4,5-dihidro-tiazol-5-il}-acético; fórmula: C12H12N2O4S; peso molecular: 280.30)) (véase el ejemplo 8). En las figuras 44A y 44B se muestra una representación ejemplar de la unión de AD4-1038 al EGFR. La estructura de AD4-1038 es como sigue: AD -1038 Fórmula (13) A una concentración de 25 µ? de AD4-1025, la unión de EGF al EGFR es inhibida en 75.7% (véase el ejemplo 6).

AD4-1020 AD4-1020 se identificó como un inhibidor de la unión del factor de crecimiento epidérmico a su receptor (véase el ejemplo 10). Tales compuestos tienen utilidad terapéutica en oncología. Se espera que los análogos y derivados de AD4-1020 tengan el mismo efecto inhibidor y utilidad. Se diseñó un modelo de farmacóforo, Pharm1 _gly54_asp58, usando la información de la estructura de cristal de la proteína 1 YY9 para diseñar un modelo de farmacóforo (véase el ejemplo 4). El modelo Pharm1 _gly54_asp58 se utilizó para identificar moléculas pequeñas que se unen a EGFR (SEQ ID NO: 1 ). El sitio sobre la proteína EGFR es reconocido por los residuos de aminoácido GLY-54 a ASP-58 del anticuerpo cetuximab (SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6) (Erbitux). Pharm1_gly54_asp58 se modeló después de los residuos GLY-54 a ASP-58 y se diseñó como una herramienta para identificar moléculas pequeñas que tienen las características y componentes del anticuerpo cetuximab. Específicamente, esta región es definida como la CDR H2 de cadena pesada del anticuerpo cetuximab. Las características y componentes de estos residuos de aminoácido de cetuximab se usaron para crear un modelo de farmacóforo. De este modelo de farmacóforo se derivó el siguiente compuesto: Fórmula (14) en donde S1 -S6 representan sustituyentes independientes del siguiente tipo: halógeno (F, Cl, Br, I); hidroxilo (-OH); sulfhidrilo (-SH); carboxilato (-COOH); alquilo (1 a 4 carbonos, cadena recta, ramificada, o que contiene opcionalmente insaturación); cicloalquilo (C1 -C6 que contiene opcionalmente insaturación); arilo que incluye fenilo, o heteroarilo que contiene de 1 a 4 átomos de N, O, y S; o alcoxi (-OR en donde R se define como un grupo alquilo de cadena recta o ramificada de C1 -C6, sustituido opcionalmente con halógeno, hidroxilo, sulfhidrilo, carboxilato, arilo, heteroarilo, amino -NH2, amino sustituido -NR2, o grupos cicloamino que contienen 1 , 2, o 3 átomos de N en un anillo de 5 o 6 miembros). Los análogos adicionales incluyen aquellos en donde uno o los dos anillos de fenilo están reemplazados con un anillo heterocíclico, en donde X se define como O, S, N-R, N-OH, o N-NR2; Het se define como uno o mas átomos de N en cualquier posición del anillo; y Z se define como -COOH, -P03H2; SO3H, anillo de tetrazol, sulfonamida, acilsulfonamida, -CONH2 o -CONR2.

Fórmula (15) También se espera que los análogos adicionales que incluyen compuestos que tienen una porción enlazadora corta como se indica exhiban la misma inhibición de EGFR, en donde L se define como un enlazador que consiste en 1 -4 átomos unidos linealmente, que incluyen C, N, O y S. En el caso de C y S, el estado de oxidación del átomo puede tener uno o dos oxígenos unidos por un enlace sencillo o doble. En el caso de C o N, el átomo puede tener uno o dos sustituyentes adicionales seleccionados independientemente del grupo S1 -S6 definido arriba.

Fórmula (16) Los análogos adicionales incluyen los compuestos en donde el anillo de terazol está reemplazado con un anillo heterocíclico de 5 miembros alternativo como se indica, Fórmula (17) en donde A es un átomo seleccionado independientemente de un grupo que incluye C, N, O, y S. En el caso de C y S, el estado de oxidación del átomo puede tener uno o dos oxígenos unidos por un enlace sencillo o doble. En el caso de C o N, el átomo puede tener uno o dos sustituyentes adicionales seleccionados independientemente del grupo S1 -S6 definido arriba. En una modalidad, el inhibidor de la unión del factor de crecimiento epidérmico (EGF) al receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) es AD4-1020 ((ácido {5-[4-(benciloxi)fenil]-2H-tetrazol-2-il}acético; fórmula: C16Hi4N403; peso molecular: 310.31 )) (véase el ejemplo 10). En la figura 50 se muestra una representación ejemplar de la unión de AD4-1020 al EGFR. La estructura de AD4-1020 es como sigue: AD4--J 02O Fórmula (18) A una concentración de 25 µ? de AD4-1020, la unión de EGF al EGFR es inhibida en 47.8% (véase el ejemplo 6).

AD4-1 132 AD4-1 132 se identificó como un inhibidor de la unión del factor de crecimiento epidérmico a su receptor (véase el ejemplo 1 1 ). Tales compuestos tienen utilidad terapéutica en oncología. Se espera que los análogos y derivados de AD4-1 132 tengan el mismo efecto inhibidor y utilidad. Se diseñó un modelo de farmacóforo, Pharm23_gly54_asp58, usando la información de la estructura de cristal de la proteína 1 YY9 para diseñar un modelo de farmacóforo (véase el ejemplo 4, cuadro 17, figura 12). El modelo Pharm23_gly54_asp58 se utilizó para identificar moléculas pequeñas que se unen a EGFR (SEQ ID NO: 1 ). El sitio sobre la proteína EGFR es reconocido por los residuos de aminoácido GLY-54 a ASP-58 del anticuerpo cetuximab (SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6) (Erbitux). Pharm23_gly54_asp58 se modeló después de los residuos GLY-54 a ASP-58 y se diseñó como una herramienta para identificar moléculas pequeñas que tienen las características y componentes del anticuerpo cetuximab. Las características y componentes de estos residuos de aminoácido de cetuximab se usaron para crear un modelo de farmacóforo. De este modelo de farmacóforo se derivó el siguiente compuesto: Fórmula (19) en donde S1 -S6 representan sustítuyentes independientes del siguiente tipo: halógeno (F, Cl, Br, I); hidroxilo (-OH); sulfhidrilo (-SH); carboxilato (-COOH); alquilo (1 a 4 carbonos, cadena recta, ramificada, o que contiene opcionalmente insaturación); cicloalquilo (C1 -C6 que contiene opcíonalmente insaturación); arilo que incluye fenilo, o heteroarilo que contiene de 1 a 4 átomos de N, O, y S; o alcoxi (-OR en donde R se define como un grupo alquilo de cadena recta o ramificada de C1 -C6, sustituido opcionalmente con halógeno, hidroxilo, sulfhidrilo, carboxilato, arilo, heteroarilo, amino -NH2, amino sustituido -NR2, o grupos cicloamino que contienen 1 , 2, o 3 átomos de N en un anillo de 5 o 6 miembros), y Z se define como un grupo -COOH, -PO3H2; SO3H, anillo de tetrazol, sulfonamida, acilsulfonamida, -CONH2 o -CONR2. Los análogos adicionales incluyen aquellos en donde el oxígeno del éter fenólico es reemplazado por un átomo de tipo Y, en donde Y se define como CH2, O, S, N-R, N-OH, o N-NR2. En el caso de C y S, el estado de oxidación del átomo puede tener uno o dos oxígenos unidos por enlace sencillo o doble. En el caso de C o N, el átomo puede tener uno o dos sustituyentes adicionales seleccionados independientemente del grupo S1 -S6 definido arriba; y uno o los dos anillos de fenilo están reemplazados opcionalmente con un anillo heterocíclico; en donde Het se define como uno o más átomos de N, ubicados en cualquier posición del anillo: Fórmula (20) También se espera que los análogos adicionales que incluyen compuestos que tienen una porción enlazadora corta como se indica exhiban la misma inhibición de EGFR, en donde L se define como un enlazador que consiste en 1 -4 átomos unidos linealmente, que incluyen C, N, O y S, como se indica: Fórmula (21 ) Los análogos adicionales incluyen los compuestos en los que el nitrógeno de la amida está reemplazado con un grupo A alternativo, y el carbonilo de la amida está reemplazado opcionalmente con el grupo X, como se indica: Fórmula (22) en donde A es un átomo seleccionado independientemente del grupo que incluye CH2, N, O, y S. En el caso de C y S, el estado de oxidación del átomo puede tener uno o dos oxígenos unidos por enlace sencillo o doble.

En el caso de C o N, el átomo puede tener uno o dos sustituyentes adicionales seleccionados independientemente del grupo S1 -S6 definido arriba, y X se define como H2, O, S, N-R, N-OH o N-NF¡2. Los análogos adicionales incluyen la yuxtaposición de los grupos A, y C=X como se encuentra, sin limitación, en el caso de una retro-amida como se indica: Fórmula (23) En una modalidad, el inhibidor de la unión del factor de crecimiento epidérmico (EGF) al receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) es AD4-1 132 ((ácido 2-{[(2,4-dimetilfenoxi)acetil]amino}-5-hidroxibenzoico); fórmula: d7H17N05; peso molecular: 315.32) (véase el ejemplo 1 1 ). La estructura de AD4- 132 es como sigue: Fórmula (24) A una concentración de 25 µ? de AD4-1 132, la unión de EGF al EGFR es inhibida en 59.6% (véase el ejemplo 6).

AD4-1 142 AD4-1 142 se identificó como un inhibidor de la unión del factor de crecimiento epidérmico a su receptor (véase el ejemplo 12). Tales compuestos tienen utilidad terapéutica en oncología. Se espera que los análogos y derivados de AD4-1 142 tengan el mismo efecto inhibidor y utilidad. Se diseñó un modelo de farmacóforo, Pharm23_gly54_asp58, usando la información de la estructura de cristal de la proteína 1 YY9 para diseñar un modelo de farmacóforo (véase el ejemplo 4). El modelo Pharm23_gly54_asp58 se utilizó para identificar moléculas pequeñas que se unen a EGFR (SEQ ID NO: 1 ). El sitio sobre la proteína EGFR es reconocido por los residuos de aminoácido GLY-54 a ASP-58 del anticuerpo cetuximab (SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6) (Erbitux). Pharm23_gly54_asp58 se modeló después de los residuos GLY-54 a ASP-58 y se diseñó como una herramienta para identificar moléculas pequeñas que tienen las características y componentes del anticuerpo cetuximab. Específicamente, esta región se define como la CDR H2 de la cadena pesada del anticuerpo cetuximab. Las características y componentes de estos residuos de aminoácido de cetuximab se usaron para crear un modelo de farmacóforo. De este modelo de farmacóforo se derivó el siguiente compuesto: Fórmula (25) en donde S1 -S6 representan sustituyentes independientes del siguiente tipo: hidrógeno (-H), halógeno (F, Cl, Br, I); hidroxilo (-OH); sulfhidrilo (-SH); carboxilato (-COOH); alquilo (1 a 4 carbonos, cadena recta, ramificada, o que contiene opcionalmente insaturacion); cicloalquilo (C1 -C6 que contiene opcionalmente insaturacion); arilo que incluye anillos de fenilo o heteroarilo que contiene de 1 a 4 átomos de N, O, y S; o alcoxi (-OR en donde R se define como , un grupo alquilo de cadena recta o ramificada de C1 -C6, sustituido opcionalmente con halógeno, hidroxilo, sulfhidrilo, carboxilato, arilo, heteroarilo, amino -NH2, amino sustituido -NR2, o grupos cicloamino que contienen 1 , 2, o 3 átomos de N en un anillo de 5 o 6 miembros), y Z se define como un grupo -COOH, -P03H2; S03H, anillo de tetrazol, sulfonamida, acilsulfonamida, -CONH2 o -CONR2. Los análogos adicionales incluyen aquellos en donde el NH de la sulfonamida está reemplazado opcionalmente con un átomo de tipo Y, en donde Y se define como CH2) O, S, N-R, N-OH, o N-NR2, y uno o los dos anillos de fenilo están reemplazados opcionalmente con un anillo heterocíclico; en donde Het se define como uno o dos átomos de N en cualquier posición del anillo.

Fórmula (26) También se espera que los análogos adicionales que incluyen compuestos que tienen una porción enlazadora corta como se indica exhiban la misma inhibición de EGFR, en donde L se define como un enlazador que consiste en 1 -4 átomos unidos linealmente, que incluyen C, N, O y S. En el caso de C y S, el estado de oxidación del átomo puede tener uno o dos oxígenos unidos por un enlace sencillo o doble. En el caso de C o N, el átomo puede tener uno o dos sustituyentes adicionales seleccionados independientemente del grupo S1 -S6 definido arriba.

Fórmula (27) Los análogos adicionales incluyen compuestos en donde los grupos aromáticos están unidos por grupos A, y y como se indica; incluyendo análogos en donde los grupos A y Y están unidos opcionalmente por enlaces sencillos, dobles o triples: Fórmula (28) en donde Y se define como arriba y A es un átomo seleccionado independientemente de un grupo que incluye CH2, N, O, y S. En el caso de C y S, el estado de oxidación del átomo puede tener uno o dos oxígenos unidos por un enlace sencillo o doble. En el caso de C o N, el átomo puede tener uno o dos sustituyentes adicionales seleccionados independientemente del grupo S1 -S6 definido arriba. Los análogos adicionales incluyen la yuxtaposición de los grupos A y Y como se indica, incluyendo análogos en donde los grupos A y Y están unidos opcionalmente por enlaces sencillos, dobles o triples: Fórmula (29) En una modalidad, el inhibidor de la unión del factor de crecimiento epidérmico (EGF) al receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) es AD4-1 142 ((ácido 5-{[(4-etilfenil)sulfonil]amino}-2-hidroxibenzoico); fórmula: C15H15NO5S; peso molecular: 321 .35) (véase el ejemplo 12). La estructura de AD4-1 142 es como sigue: Fórmula (30) A una concentración de 25 µ? de AD4-1 142, la unión de EGF al EGFR es inhibida en 49.8% (véase el ejemplo 6).

Formulaciones farmacéuticas Las modalidades de las composiciones de la invención incluyen formulaciones farmacéuticas de los diversos compuestos aquí descritos. Los compuestos aquí descritos se pueden formular mediante cualquier forma convencional usando uno o más vehículos o excipientes farmacéuticamente aceptables, como se describe por ejemplo en "Remington's Pharmaceutical Sciences" (A. R. Gennaro, Ed.), 21 a edición, ISBN: 0781746736 (2005). Tales formulaciones contendrán una cantidad terapéuticamente efectiva del agente, preferiblemente en forma purificada, junto con una cantidad adecuada de vehículo, a fin de proveer la forma para su administración adecuada al sujeto. La formulación se debe adecuar al modo de administración. Los agentes para usarse con la presente invención se pueden formular mediante los métodos conocidos para su administración a un sujeto, usando diversas vías que incluyen, sin limitación, parenteral, pulmonar, oral, tópica, intradérmíca, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, intranasal, epidural, oftálmica, bucal y rectal. Los agentes individuales también se pueden administrar en combinación con uno o más agentes adicionales de la presente invención, o junto con otros agentes biológicamente activos o biológicamente inertes. Dichos agentes biológicamente activos o agentes inertes pueden estar en comunicación de fluido o mecánica con los agentes, o pueden estar unidos a los agentes por medio de enlace covalente, fuerzas de Van der Waals, hidrofóbicas, hidrofílicas, u otras fuerzas físicas. Se pueden formular preparaciones de liberación controlada (o liberación sostenida) para prolongar la actividad del agente y reducir la frecuencia de las dosis. Las preparaciones de liberación controlada también se pueden usar para afectar el tiempo de inicio de acción u otras características, tales como las concentraciones en sangre del agente, y afectar consecuentemente la ocurrencia de efectos secundarios. Cuando se usan en los métodos de la invención, se puede usar una cantidad terapéuticamente efectiva de uno de los agentes aquí descritos en forma pura, o cuando existe dicha forma, en forma de sal farmacéuticamente aceptable, con o sin un excipiente farmacéuticamente aceptable. Por ejemplo, los agentes de la invención se pueden administrar a una relación razonable de beneficio/riesgo aplicable, en una cantidad suficiente para inhibir la biomolécula objetivo para la cual es específico el compuesto para el tratamiento o profilaxis de una enfermedad, trastorno o condición asociada con la biomolécula objetivo. La toxicidad y eficacia terapéutica de dichos compuestos, y las formulaciones farmacéuticas de los mismos, pueden ser determinadas por medio de procedimientos farmacéuticos estándares en cultivos de células o animales experimentales, para determinar la DL50 (la dosis letal para el 50% de la población) y la DE50, (la dosis terapéuticamente efectiva en el 50% de la población). La relación de dosis entre los efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico, que puede ser expresado como la relación DL5o/DE5o, en donde se prefieren los índices terapéuticos grandes. La cantidad de un compuesto de la invención que se puede combinar con un vehículo farmacéuticamente aceptable para producir una sola forma de dosis, varía dependiendo del hospedero tratado y el modo particular de administración. Los expertos en la materia apreciarán que el contenido unitario del agente contenido en una dosis individual de cada forma de dosis no requiere por si solo constituir una cantidad terapéuticamente efectiva, ya que la cantidad terapéuticamente efectiva puede ser alcanzada por la administración de varias dosis individuales. La administración del agente puede ocurrir como un solo evento o como un curso de tratamiento. Por ejemplo, un agente se puede administrar diariamente, semanalmente, bisemanalmente o mensualmente. Para algunas condiciones, el tratamiento se puede extender de varias semanas a varios meses, o incluso un año o más. La escala de dosis terapéuticamente efectivas, específica para cualquier sujeto particular, dependerá de una variedad de factores que incluyen la condición tratada y la severidad de la condición; la actividad del agente específico usado; la composición específica usada; la edad, peso corporal, salud general, sexo y dieta del paciente; el tiempo de administración; la vía de administración; la velocidad de excreción del agente específico usado; la duración del tratamiento; los fármacos usados en combinación o coincidentes con el agente específico usado, y factores similares muy conocidos en las ciencias médicas. El técnico experto entenderá que la dosis diaria total de los compuestos de la presente invención será decidida por el médico a cargo según su buen criterio médico. Los compuestos de la invención que inhiben la biomolécula objetivo también se pueden usar en combinación con otras modalidades terapéuticas. De esta manera, además de las terapias aquí descritas, también se pueden proveer al sujeto otras terapias conocidas que son eficaces para condiciones particulares asociadas con la biomolécula objetivo. Habiendo descrito la invención en detalle, será evidente que son posibles modificaciones, variaciones, y modalidades equivalentes, sin apartarse del alcance de la invención definida en las reivindicaciones anexas. Además, se apreciará que todos los ejemplos de la presente descripción se proveen como ejemplos no limitativos.

EJEMPLOS Los siguientes ejemplos no limitativos se proveen para ilustrar más la presente invención. Los expertos en la materia apreciarán que las técnicas descritas en los ejemplos que siguen representan propuestas que los inventores han encontrado que funcionan bien en la práctica de la invención, y por lo tanto se considera que constituyen ejemplos de los modos de su práctica. Sin embargo, los expertos en la materia apreciarán a la luz de la presente descripción que se pueden hacer muchos cambios en las modalidades específicas que se describen, y obtener no obstante un resultado parecido o similar sin apartarse del espíritu y alcance de la invención.

EJEMPLO 1 Factor de crecimiento endotelial vascular El siguiente ejemplo está dirigido a la generación de uno o más farmacóforos basados por lo menos en parte en anticuerpos desarrollados contra una molécula objetivo, en este ejemplo el factor de crecimiento endotelial vascular humano (VEGF-A) (SEQ ID NO: 2). En resumen, un factor de crecimiento endotelial vascular humano (VEGF-A) se presenta a varios animales (por ejemplo, un grupo de ratones genéticamente diferentes). La inoculación y presentación repetida del VEGF-A da como resultado que los animales desarrollen una variedad de anticuerpos IgG contra la molécula (anticuerpos policlonales de alta afinidad). Estos anticuerpos difieren entre los animales, ya que cada uno tiene un potencial genético distinto para la producción del anticuerpo (combinaciones diferentes de CDR's posibles). La variación de los anticuerpos da como resultado que se unan a la molécula de VEGF-A en diferentes áreas de superficie de la molécula. Es de esperar que por lo menos uno de los anticuerpos se una a la región activa de la molécula de VEGF-A Para aclarar esto, la familia de VEGF comprende actualmente siete miembros: VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E, VEGF-F, y PIGF. Todos los miembros tienen un dominio de homología común de VEGF que incluye un motivo de nudo de cistina, con ocho residuos de cisteína invariables implicados en enlaces disulfuro intermoleculares e intramoleculares en un extremo de una lámina beta central' conservada de cuatro cadenas dentro de cada monómero, que se dimerizan en una orientación antiparalela de lado a lado.

Generación de mAb; cristalización, difracción de rayos X; posición espacial. Una molécula de VEGF unida a un anticuerpo de afinidad madura (el fragmento Fab del mismo) ha sido cristalizada y publicada previamente por Chen y otros en la base de datos RCSB como 1 CZ8. Más particularmente, sus datos de cristalización incluyen las regiones V y W, que son los miembros de dímero de VEGF, y las regiones L, H, X, y Y que representan las cadenas ligeras y pesadas de anticuerpo de la molécula de Fab (más particularmente, las regiones L y H comprenden una de las ramas de la molécula de Fab, que incluyen las regiones variables y constantes de cada cadena; similarmente, X y Y son las cadenas ligera y pesada de la otra rama de la molécula de Fab). Analizando geométricamente la disposición espacial de los más de ocho mil átomos que no son hidrógeno de la estructura cristalina de VEGF-A, se pueden determinar los átomos de una estructura que están dentro de una distancia especificada de los átomos de otra estructura. Este filtro determina, mediante una comparación geométrica directa a través de todas las combinaciones posibles, los péptidos que están en asociación a través de las dos moléculas. Usando una separación máxima de cuatro Angstrom, se determinan aquellos átomos de la cadena variable pesada (H) que están dentro de dicha escala corta de átomos del componente W del dímero VEGF, que son más probablemente los de las CDR's del fragmento Fab. En el presente caso, este análisis reveló que los siguientes aminoácidos de la región H del fragmento de anticuerpo y la región W de la molécula de VEGF, incluían átomos de cadena lateral que estaban en el espacio de 4 Angstrom uno de otro (indicado en un cuadro con el número total de átomos de cadena lateral entre los dos que están dentro de esa escala): CUADRO 1 Este análisis confirma adicionalmente que la unión de anticuerpo a la proteína objetivo ha sido identificada correctamente, ya que implica una interacción entre las CDR's del anticuerpo, ya que la ubicación de las CDR's sobre la cadena de cada variable incluye los péptidos en los intervalos 30-33, 50-55, y 100-1 10. Más específicamente, como se muestra en la figura 2, que es una simulación de computadora del VEGF 202 unido a los Fabs 204,206, la proteína objetivo está construida de las moléculas dimerizadas W 208 y V 210. A pesar del hecho de que este anticuerpo es una versión de afinidad madura, se puede ver en el recuadro amplificado a la derecha del modelo molecular completo que la interacción entre el Fab 204 inferior está limitada a dos de las CDR's 212, 214 de la región variable 216 de la cadena pesada. La figura 3 muestra el modelo de cinta de la molécula de VEGF dimerizada y confirma que el intervalo de péptidos 302 que son acoplados por el anticuerpo está en el intervalo de 80 a 100, que nuevamente el análisis resumido en el cuadro anterior. De acuerdo con Chen y otros, las pruebas basadas en células in vitro muestran que este anticuerpo de afinidad madura produjo una significativa potencia para inhibir la proliferación de células dependiente de VEGF. Un aspecto de la presente invención es reconocer la posibilidad de usar la estructura de la interfaz de unión del anticuerpo como una guía para la generación de una molécula guía sintética. Este grado de exactitud es valioso para confirmar que los péptidos que se creían involucrados en la unión al objetivo son realmente miembros de las CDR's, y la cercanía de los átomos no es simplemente un artefacto del proceso de cristalización. Para aislar los átomos más vitales implicados en la unión, sin embargo, para usarse como un modelo para la síntesis de una molécula guía, es necesario reducir el número de interacciones de átomo y átomo hasta únicamente las pocas que están asociadas más estrechamente. Esto se puede lograr reduciendo la separación aceptable en el filtro a 3 Angstrom. El cuadro 2 que está más abajo muestra los resultados de este análisis más enfocado.

CUADRO 2 Mirando más de cerca la colocación relativa de estos 12 átomos, y más particularmente los seis átomos del anticuerpo que se unen con los átomos del objetivo, se puede construir una molécula guía. El siguiente cuadro incluye las distancias relativas de estos átomos entre sí.

CUADRO 3 Atomos de cadena THR TYR PRO TYR TYR SER pesada en contacto más 30 99 100 101 102 106 cercano con la molécula O OH O OH OH OG objetivo de VEGF THR 30 O 0.00 13.07 10.77 13.90 12.39 13.18 TYR 99 OH 13.07 0.00 9.65 18.53 14.69 9.70 PRO 100 O 10.77 9.65 * 0.00 * 9.15 * 8.35 * 6.99 TYR 101 OH 13.90 18.53 * 9.15 * 0.00 * 7.89 *12.17 TYR 102 OH 12.39 14.69 * 8.35 * 7.89 * 0.00 * 6.09 SER 106 OG 13.18 9.70 * 6.99 *12.17 * 6.09 * 0.00 Como puede verse arriba, los átomos que están asociados más de cerca en la región de unión del objetivo y el anticuerpo son átomos de oxígeno. Los átomos de nitrógeno también son altamente predominantes entre estos sitios de afinidad alta. Frecuentemente los átomos de oxígeno y nitrógeno son intercambiables cuando es necesario un aceptor o donador de hidrógeno.

Los números con asterisco del cuadro 3, que muestran las distancias entre los átomos identificados de la región de unión, representan un subgrupo ideal de los átomos implicados en la unión, que están suficientemente cercanos entre sí para ser estructurados en una molécula guía. Los 4 átomos de oxígeno de la prolina 100, tirosinas 101 y 102, y la cerina 106, están suficientemente cercanos (separados <13Á) para poder construir una molécula adecuada que tiene un tamaño de tipo fármaco. La figura 4 y la fórmula A muestran una estructura de molécula guía que cumple con estos criterios. Los cuadros siguientes muestran (i) la separación de los átomos en una conformación razonable de la molécula guía, y (ii) la diferencia entre las posiciones de los átomos de la guía en comparación con los datos del análisis de difracción de rayos X del anticuerpo cristalizado.

Fórmula A CUADRO 4 CUADRO 5 Como muestran los cuadros anteriores, la molécula guía propuesta, generada por los métodos de la presente invención, provee átomos clave que están colocados con un promedio de 0.18 Á de desviación (no más de 0.42 Á de desviación) de sus localizaciones relativas en la punta de unión del anticuerpo. Como se describe arriba, las cuatro "reglas de cinco" establecen que un compuesto candidato de tipo fármaco debe tener por lo menos tres de las siguientes características: (i) un peso menor de 500 Dalton, (ii) tener un logP mayor de 5; (iii) tener no más de cinco donadores de enlace de hidrógeno (expresados como la suma de grupos OH y NH); y (iv) no tener más de 10 aceptores de enlace de hidrógeno (la suma de los átomos de N y O). La guía actualmente descrita, C2iH2oO4, tiene las siguientes características: (i) un peso molecular de 336; (ii) dos donadores de enlace de hidrógeno; y (iii) cuatro aceptores de enlace de hidrógeno.

EJEMPLO 2 Glicoproteína de la influenza Otro objetivo deseable podría ser una proteína asociada con una infección viral, por ejemplo la hemaglutinina. La hemaglutinina es una glicoproteína antigénica encontrada sobre la superficie de los virus de la influenza, y es responsable de la unión del virus a la célula a la que está infectando. Millones de personas en los Estados Unidos (algunos cálculos dan hasta de 10% a 20% de los residentes en los Estados Unidos) son infectados de influenza cada año, a pesar de una campaña agresiva en los medios de los fabricantes de vacunas, asociaciones médicas y organizaciones gubernamentales encargadas de la salud pública. La mayoría de las personas que adquieren la influenza se recuperarán en una a dos semanas, pero otras desarrollarán complicaciones peligrosas (tales como neumonía). Aunque típicamente es considerada por muchos como simplemente una mala versión de un resfriado, la influenza puede ser mortal, especialmente para los débiles, viejos o enfermos crónicamente. Un promedio de cerca de 36,000 personas mueren cada año por la influenza en los Estados Unidos, y 1 14,000 son admitidas cada año a un hospital como resultado de la influenza. De acuerdo con las estimaciones de la Organización Mundial de la Salud, cada año mueren en todo el mundo entre 250,000 y 500,000 personas por la infección de la influenza. Algunas pandemias de influenza han matado a millones de personas, incluyendo el brote más mortal que mató a más de 50 millones de personas entre 1918 y 1920. La causa de que en muchos pacientes las vacunas contra la influenza no funcionan puede ser el resultado de que las mutaciones de las glicoproteínas que se encuentran en la envoltura viral hacen que las vacunaciones anuales sean un requisito para proteger completamente al individuo de la última versión del virus. Un medicamento capaz de bloquear la capacidad del virus para unirse a las células del hospedero, incluso si solamente es parcialmente efectivo, aumentaría dramáticamente la probabilidad de que el sistema inmune de la persona infectada derrote la infección antes de que aparezcan síntomas clínicamente significativos. Si el medicamento estuviera disponible después del comienzo de dichos síntomas, también es posible una reducción de la severidad y duración de la infección. Fleury y otros han publicado los resultados de su cristalización de hemaglutinina en complejo con un anticuerpo neutralizante. Los datos de sus trabajos de cristalización de rayos X se proveen en el banco de datos de proteínas y fueron analizadas por el inventor de la misma de una manera similar a la que se describe anteriormente con respecto a VEGF (véase el ejemplo 1 ). Más específicamente, se realizó un análisis geométrico de la disposición espacial de los más de ocho mil átomos que no son hidrógeno de la hemaglutinina en complejo con una estructura cristalina de anticuerpo neutralizante, para determinar los átomos de los fragmentos de anticuerpo (cadenas variables pesada y ligera) que están suficientemente cerca de la proteína objetivo para ser parte de la unión con la hemaglutinina. Los filtros usados, incluyendo métodos geométricos directos, confirmaron que las regiones CDR de cadena pesada variables, y en particular los péptidos dentro de CDR1 y CDR3 (en particular, los péptidos 26-32 y 99-102 de acuerdo con la numeración de Kabat y Wu), fueron los que dieron la unión más fuerte del anticuerpo con la proteína hemaglutinina.

Usando una separación máxima de cuatro Angstrom, se determinaron los átomos dentro de estas CDR's, así como también los átomos específicos dentro de la glicoproteína objetivo que se acoplan uno con otro. Estos se dan en el siguiente cuadro: CUADRO 6 Observando más de cerca las posiciones relativas de estos dieciocho átomos, y más particularmente los nueve átomos del anticuerpo que se unen con los átomos del objetivo, se puede construir una molécula guía. El cuadro siguiente incluye las distancias relativas entre cada uno de estos átomos.

CUADRO 7 Los números con asterisco representan un subgrupo de los átomos implicados en la unión que están suficientemente cercanos entre sí para ser estructurados en una molécula guía, más específicamente, una molécula de tipo fármaco tiene normalmente una extensión de 8-15 Á y un peso molecular menor de 500 Dalton. Los 5 átomos de la tirosina 32, arginina 94, triptófano 00, y fenilalanina 100A están suficientemente cerca (separados <12Á) para poder construir una molécula adecuada que tenga el tamaño de tipo fármaco. La figura 5 y la fórmula B muestran una estructura de molécula guía que cumple con estos criterios. Los cuadros que se dan más abajo muestran (i) la separación de los átomos en una conformación razonable de la molécula guía, y (ii) la diferencia entre las posiciones de los átomos en la guía en comparación con los datos del análisis de difracción de rayos X del anticuerpo cristalizado.

Fórmula 7A HN \ „NH-, H CUADRO 8 Atomos clave con OH NH NH N C respecto a las posiciones en la TYR ARG ARG TRP PHE molécula guía OH TYR 0.00 5.79 7.44 12.19 8.03 NH ARG 5.79 0.00 2.24 10.08 6.91 NH ARG 7.44 2.24 0.00 8.26 5.83 N TRP 12.19 10.08 8.26 0.00 4.17 C de "anillo resonante" 8.03 6.91 5.83 4.17 0.00 CUADRO 9 Diferencia de anticuerpo OH NH NH N C a molécula guía TYR ARG ARG TRP PHE OH TYR 0.00 0.33 0.52 0.55 0.66 NH ARG 0.33 0.00 0.07 0.09 0.42 NH ARG 0.52 0.07 0.00 0.05 0.13 N TRP 0.55 0.09 0.05 0.00 0.54 C de "anillo resonante" 0.66 0.42 0.13 0.54 0.00 Como muestran los cuadros anteriores, la molécula guía propuesta, generada por los métodos de la presente invención, provee átomos clave que están colocados con un promedio de 0.33 Á de desviación (y no más de 0.66 Á de desviación) de sus localizaciones relativas en la punta de unión del anticuerpo. Como se describe arriba, las cuatro "reglas de cinco" establecen que un compuesto candidato de tipo fármaco debe tener por lo menos tres de las siguientes características: (i) un peso menor de 500 Dalton, (ii) tener un logP mayor de 5; (iií) tener no más de cinco donadores de enlace de hidrógeno (expresados como la suma de grupos OH y NH); y (iv) no tener más de 10 aceptores de enlace de hidrógeno (la suma de los átomos de N y O). La guía actualmente descrita, C22Hi8N4O, tiene las siguientes características: (i) un peso molecular de 354; (ii) 3 donadores de enlace de hidrógeno; y (iii) 5 aceptores de enlace de hidrógeno.

EJEMPLO 3 Angionenina La angiogénesis (el brote de vasos capilares nuevos de la vasculatura preexistente) es un aspecto crítico del desarrollo en el feto y en los niños, ya que su sistema circulatorio se expande durante el crecimiento. En los adultos, la angiogénisis se requiere durante la reparación normal de tejido y para la remodelación de los órganos reproductores femeninos (ovulación y desarrollo placentario). Sin embargo, algunas condiciones patológicas, tales como crecimiento de tumor y retinopatía diabética, también requieren angiogénesis. Un factor conocido implicado en la angiogénesis es la angiogenina, que es un polipéptido de una sola cadena de 123 aminoácidos. La angiogenina es una de las citocinas normales que es reclutada por el cáncer para ayudar a su rápido crecimiento. En este caso, las células de tumor segregan angiogenina para reclutar mayor flujo sanguíneo hacia el tumor. Por lo tanto, sería de gran valor encontrar un fármaco que pueda inhibir la producción o la actividad de la angiogenina. Chavali y otros han publicado los resultados de su cristalización de angiogenina en complejo con un anticuerpo neutralizante. Los datos de su trabajo de cristalización de rayos X se dan en el banco de datos de proteínas y han sido analizados por el inventor del mismo de una manera similar a la que se describe anteriormente con respecto a VEGF y hemaglutinina. Más específicamente, se realizó un análisis geométrico de la disposición espacial de los átomos que no son hidrógeno de la estructura cristalina, para determinar los átomos de los fragmentos de anticuerpo (cadena variable pesada y ligera) que están suficientemente cercanos a la molécula de angiogenina para ser parte de la unión a la misma. Los filtros usados, que incluyen métodos geométricos directos, confirmaron que como puede verse en la figura 6, tanto la cadena pesada como ligera variable, y en particular los péptidos dentro de la CDR1 de la cadena ligera y las CDR's 2 y 3 de la cadena pesada, fueron las que dieron la unión más fuerte del anticuerpo con la angiogenina. Usando un máximo de separación de cuatro Angstrom, se determinaron los átomos dentro de estas CDR's, así como también los átomos específicos dentro de la glicoproteína objetivo que se acoplan entre sí. Estos se proveen en el siguiente cuadro: CUADRO 10 Observando más de cerca las posiciones relativas de estos dieciocho átomos, y más particularmente los nueve átomos del anticuerpo que se unen a los átomos de objetivo, se identificaron sobre la angiogenina dos vistas objetivo potenciales separadas. Esto significa que (como se muestra en los cuadros 1 1 y 12) se pueden construir dos moléculas guías separadas para unirse con la angiogenina. Los cuadros siguientes incluyen las distancias relativas entre cada uno de estos átomos de cada grupo.

CUADRO 11 Como se indicó anteriormente, una molécula de tipo fármaco normalmente tiene una extensión de 8-15Á y un peso molecular menor de 500 Dalton. En el cuadro 1 1 se puede ver que el OH de la tirosina 30B, el nitrógeno de la asparagina 30A, el carbón resonante CD2 de la tirosina 98, y el OH de la tirosina 100B, están suficientemente cercanos (separados <1 1 Á) para poder construir una molécula adecuada que tenga el tamaño de tipo fármaco. Similarmente, con respecto al cuadro 12, el oxígeno de la treonina 33, el OH de la tirosina 58, y los oxígenos de la serina 90 y asparagina 56, están suficientemente cercanos (separados <14Á) para construir otra molécula adecuada. Las fórmulas C y D son estructuras químicas de dos moléculas guías que tienen actividad potencial contra la angiogenina, en donde dichas moléculas guías han sido diseñadas basándose en dos porciones de unión estrechamente asociadas de un anticuerpo que tiene alta afinidad por angiogenina; cumplen con los criterios para la primera y segunda región de las moléculas de angiogenina, como se contempla en los métodos de la presente invención. Fórmula C Fórmula D Los cuadros siguientes muestran (i) la separación de los átomos en una conformación razonable de la primera molécula guía, y (ii) la diferencia entre las posiciones de los átomos en la primera guía en comparación con los datos del análisis de difracción de rayos X del anticuerpo cristalizado.

CUADRO 13 CUADRO 14 Posiciones relativas de los OH N C OH átomos clave en la segunda TYR ASN TYR TYR molécula guía OH TYR 0.00 3.51 7.03 8.06 N ASN 3.51 0.00 9.41 10.75 C de "anillo resonante" 7.03 9.41 0.00 3.95 OH TYR 8.06 10.75 3.95 0.00 Similarmente, los cuadros siguientes muestran (i) la separación de los átomos en una conformación razonable de la segunda molécula guía, y (ii) la diferencia entre las posiciones de los átomos en la segunda guía en comparación con los datos del análisis de difracción de rayos X del anticuerpo cristalizado.

CUADRO 15 Posiciones relativas de los O OH O O átomos clave en la 2° THR TYR SER ASN molécula guía O THR 0.00 7.17 1 1 .15 9.23 OH TYR 7.17 0.00 9.89 3.65 O SER 1 1 .15 9.89 0.00 3.47 O ASN 9.23 3.65 13.47 0.00 CUADRO 16 Diferencia del anticuerpo con O OH O O la 2o molécula guía THR TYR SER ASN O THR 0.00 0.01 0.13 0.15 OH TYR 0.01 0.00 0.07 0.O3 O SER 0.13 0.07 0.00 0.00 O ASN 0.15 0.03 0.00 0.00 Como muestran los cuadros anteriores, la molécula guía propuesta, generada por los métodos de la presente invención, provee átomos clave que están colocados con un promedio de 0.05 Á de desviación (y no más de 0.15 Á de desviación) de sus localizaciones relativas en la punta de unión del anticuerpo.

Como se describe arriba, las cuatro "reglas de cinco" establecen que un compuesto candidato de tipo fármaco debe tener por lo menos tres de las siguientes características: (i) un peso menor de 500 Dalton, (ii) tener un logP mayor de 5; (iii) tener no más de cinco donadores de enlace de hidrógeno (expresados como la suma de grupos OH y NH); y (iv) no tener más de 10 aceptores de enlace de hidrógeno (la suma de los átomos de N y O). El primer candidato de guía, C22H19NO2, tiene las siguientes características: (i) un peso molecular de 329; (ii) 4 donadores de enlace de hidrógeno; y (iii) 4 aceptores de enlace de hidrógeno. El segundo candidato de guía, C-22H20O4, tiene las siguientes características: (i) un peso molecular de 348; (ii) 4 donadores de enlace de hidrógeno; y (iii) 4 aceptores de enlace de hidrógeno.

EJEMPLO 4 Generación de farmacóforos para la inhibición del objetivo El siguiente ejemplo describe el análisis de complejos de estructura proteína objetivo-cristal de anticuerpo, y la generación de farmacóforos para identificar moléculas que inhiben la unión de EGFR, HER2, y ErbB2. La estructura cristalina de proteína de cetuximab en complejo con EGFR es reportada por Ferguson y otros {Cáncer Cell, 2005, 7, 301 -31 1 ), y los datos cristalográficos se depositaron en el banco de datos de proteína como PDB código 1 YY9. La información estructural que define la posición de los átomos de cetuximab (SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6) se utilizó para construir un modelo de farmacóforo usado para identificar moléculas pequeñas que tienen átomos correspondientes en posiciones similares. Las moléculas pequeñas que tienen características similares al anticuerpo pueden mostrar actividad biológica similar y por lo tanto tiene utilidad terapéutica similar. La generación de las características del farmacóforo y el módulo de exploración virtual de farmacóforo del software Molecular Operating Environment (MOE) de Chemical Computing Group (CCG) (Montreal, Quebec, Canadá) se usaron en las definiciones de farmacóforo que se describen más abajo. Las aplicaciones de farmacóforo del MOE utilizan una noción general de que un farmacóforo es un grupo de características estructurales en un ligando que están relacionados directamente con el reconocimiento del ligando en un sitio de receptor y por lo tanto con su actividad biológica. En el MOE, las características estructurales farmacofóricas son representadas por puntos marcados en el espacio. A cada ligando se le asigna una anotación, que es un grupo de características estructurales que pueden contribuir al farmacóforo del ligando. Se puede buscar en una base de datos de ligandos anotados con una pregunta que representa una hipótesis de farmacóforo. El resultado de dicha búsqueda es un grupo de coincidencias que alinean las características farmacofóricas de la consulta con las características farmacofóricas presentes en los ligandos de la base de datos consultada. La suite del software MOE provee modificaciones interactivas (se pueden ajustar interactivamente posiciones, radios, así como también otras características de la pregunta farmacofórica); comparación sistemática (todas las coincidencias posibles del ligando y la pregunta son examinadas sistemáticamente); comparación parcial (el algoritmo de búsqueda es capaz de encontrar ligandos que coinciden solo con una porción de la pregunta); y filtración de volumen (la pregunta se puede enfocar añadiendo restricciones sobre la forma de los ligandos comparados en forma de un grupo de volúmenes). Las características de farmacóforo de este ejemplo se generaron usando el editor Pharmacophore Query en MOE. Todas las características de donador de enlace de hidrógeno son esferas de 1 .2 Angstrom de radio y están de color púrpura. Todas las características de aceptor de enlace de hidrógeno son esferas de 1 .2 Angstrom de radio y están de color azul. Todas las características aromáticas son esferas de 1 .2 Angstrom de radio y están de color verde. Todas las características combinadas de farmacóforo aceptor-anión son esferas de 1 .2 Angstrom de radio y están de color gris. Todas las características combinadas de donador-aceptor son esferas de 1 .2 Angstrom de radio y están de color de rosa. Todas las características combinadas de donador-catión son esferas de 1 .2 Angstrom y están de color rojo. Todas las características de direccionalidad de donador, aceptor, aromático, combinado ácido-anión y combinado donador-aceptor, son esferas de 1 .5 Angstrom de radio y están de color gris oscuro para donadores, azul oscuro para aceptores, verde oscuro para aromáticos, azul oscuro para combinados ácido-aniones, y gris oscuro para combinados donador-aceptor. Una característica que se marca como esencial en la pregunta de farmacóforo debe estar contenida en el ligando para que este ligando sea un acierto. Todas las características de farmacóforo se derivaron de las porciones correspondientes de donador, aceptor, aromático y ácido del anticuerpo correspondiente en complejo con su receptor (por ejemplo, cetuximab en complejo con EGFr, número de registro pdb 1 YY9), tomadas de las estructuras de cristal depositadas en el banco de datos de proteína (PDB: 1 YY9), con dos excepciones. En algunos casos se usaron dos métodos provistos por el software MOE para poner las características de farmacóforo. Estos se explican más abajo. La estadística de contacto calculó, usando las coordenadas atómicas 3D de un receptor, los sitios preferidos de átomos de ligando hidrofóbicos e hidrof ílicos, usando métodos estadísticos. Usando este método, se pusieron características hidrofóbica-aromática y de enlace de H, como se indica en las definiciones de farmacóforo individuales. La búsqueda MultiFragment Search pone esencialmente un número relativamente grande de copias de un fragmento (por ejemplo 200 copias de etano) en el sitio activo de un receptor. Estos fragmentos se colocan al azar alrededor de los átomos del sitio activo y se supone que no interaccionan uno con otro; no se considera el traslapo de fragmentos. Después, se usa un protocolo especial de minimización de energía para refinar la colocación inicial: los átomos de receptor sienten las fuerzas promedio de los fragmentos, mientras que cada fragmento siente la fuerza completa del receptor pero no de los otros fragmentos. Usando esta técnica, fue posible poner características hidrofóbicas, de donadores y aceptores de enlace de H, y aniones y cationes, en posiciones favorables dentro de los receptores, para usarse como las características de farmacóforo del MOE.

Se generaron volúmenes excluidos para los farmacóforos definidos más abajo excepto cuando se indica. Estos se derivaron de la posición de los átomos de receptor cerca del sitio de unión de anticuerpo. Los volúmenes excluidos son posiciones en el espacio en donde se deben excluir los átomos de ligando para evitar el choque en el receptor. Se generaron en MOE seleccionando los residuos de receptor en el espacio de 5 Angstrom del anticuerpo, y seleccionando "unión" del editor de pregunta de farmacoforo en el MOE. En las definiciones de farmacoforo individuales que se describen más abajo, las abreviaciones son las siguientes: F = característica de farmacoforo; Donador = Don, Aceptor = Acc, Anión = Ani, Catión = Cat, Aceptor y Anión = Acc&Ani, Donador y Catión = Don&Cat, Donador y Aceptor = Don&Acc, Aromático = Aro, Hidrófobo = Hyd.

EGFR en complejo con el anticuerpo cetuximab (1 YY9.pdb) El cristal (1 YY9.pdb) de la proteína de EGFR (SEQ ID NO: 1 ) en complejo con el anticuerpo cetuximab (SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO:6), se analizó de acuerdo con los procedimientos anteriormente descritos. Los resultados mostraron que dos grupos de residuos del anticuerpo cetuximab hacen contacto con el receptor. Estos son Gly54-Asp58 y Thr100-Glu105. Puesto que estos grupos de residuos del anticuerpo no están muy próximos entre sí, se usaron para generar dos grupos de modelos de farmacóforos, para las regiones gly54_asp58 y thr100_glu 05, que se describen a continuación en el cuadro 17 y se representan en las figuras 8-19.

CUADRO 17 CUADRO 17 (Continuación) CUADRO 17 (Continuación) CUADRO 17 (Continuación) Farmacóforo F Comentario 2_thr100_glu105 Esta pregunta de farmacóforo es la misma que 1_thr100_glu105, excepto que F8 Acc&Ani no se marca como esencial Coincidencia parcial, el ligando debe coincidir por lo menos con 7 características de farmacóforo Figura 15 3_thr100_glu105 F1 Derivado del OH de cadena lateral de Tyr 02 del Don&Acc anticuerpo. Este OH dona un enlace de H al carbonilo de cadena lateral de Gln408 del receptor y acepta un enlace de H del NH2 de cadena lateral Coincidencia parcial, el de Gln384 del receptor ligando debe coincidir por F2 Aro Derivado del anillo de fenol de cadena lateral de lo menos con 5 Tyrl 02 del anticuerpo, formando una interacción características de hidrofóbica favorable con la cadena lateral de farmacóforo Val417 del receptor. F3 Aro Derivado del anillo de fenol de cadena lateral de Tyr101 del anticuerpo, formando una interacción Figura 16 coulómbica favorable con la cadena lateral de imidazol de His409 del receptor. F4 Derivado del OH de cadena lateral de Tyr101. Don&Acc F5 Acc Derivado del carbonilo de esqueleto de Tyr102 del anticuerpo, aceptando un enlace de H del OH de cadena lateral de Ser440 del receptor. F6, F7 Derivado del carboxilato de cadena lateral de Acc&Ani Asp103 del anticuerpo. El aceptor acepta un enlace de H del mismo o el anión forma un puente de sal con el NH3+ de Lys465 del receptor. V1 Volumen excluido 10_thr100_glu105 F1 Derivado del OH de cadena lateral de Tyr102 del Don&Acc anticuerpo. Este OH dona un enlace de H al carbonilo de cadena lateral de Gln408 del receptor Coincidencia parcial, el y acepta un enlace de H del NH2 de cadena lateral ligando debe coincidir por de Gln384 del receptor. lo menos con 5 F2 Aro Derivado del anillo de fenol de cadena lateral de características de Tyr102 de anticuerpo, formando una interacción farmacóforo. Todas las hidrofóbica favorable con la cadena lateral de esferas de farmacóforos Val417 del receptor tienen un radio de 0.8 Angstrom CUADRO 17 (Continuación) Farmacóforo F Comentario F3 Acc Derivado del carbonilo de esqueleto de Tyr102 del anticuerpo, aceptando un enlacé de H del OH de cadena lateral de Ser440 del receptor. F4, F5 Derivado del carboxilato de cadena lateral de Acc&Ani Asp103 del anticuerpo. El aceptor acepta un Figura 17 enlace de H del mismo o el anión forma un puente de sal con el NH3+ de Lys465 del receptor. F6 Derivado del OH de cadena lateral de Tyr104 del Don&Acc anticuerpo, donando o aceptando un enlace de H del OH de cadena lateral de Ser440 del receptor. F7 Aro Derivado del anillo de fenol de cadena lateral de Tyr104 del anticuerpo, formando una interacción hidrofóbica favorable con Ser468 del receptor. 21_thr100_glu105 F1 Derivado del OH de cadena lateral de Tyr102 del Don&Acc anticuerpo. Este OH dona un enlace de H al carbonilo de cadena lateral de Gln408 del receptor, y acepta un enlace de H del NH2 de cadena lateral Coincidencia parcial, el de Gln384 del receptor. ligando debe coincidir por F2 Acc Derivado del carbonilo de esqueleto de Tyr102 del lo menos con 7 anticuerpo, aceptando un enlace de H del OH de características de cadena lateral de Ser440 del receptor. farmacóforo. F3 Acc2 Direccionalidad de F2 con respecto al OH de Ser440. F4 Aro Derivado del anillo de fenol de cadena lateral de Tyr101 del anticuerpo, formando una interacción Figura 18 coulómbica favorable con la cadena lateral de imidazol de His409 del receptor. F5 Aro2 Direccionalidad de F4 con respecto al imidazol de His409. F6 Derivado del carboxilato de cadena lateral de Acc&Ani Asp103 del anticuerpo. El aceptor acepta un enlace de H del mismo o el anión forma un puente de sal con el NH3+ de Lys465 del receptor. F7 Acc2 Direccionalidad de F6 con respecto a la cadena lateral de Lys465. F8 Don Derivado del OH de cadena lateral de Tyr102 del anticuerpo. Este OH dona un enlace de H al carbonilo de cadena lateral de Gln408 del receptor. Esta característica se marca como esencial. F9 Don2 Direccionalidad con respecto al carbonilo de cadena lateral de Gln408 del receptor V1 Volumen excluido CUADRO 17 (Continuación) VEGF en complejo con el anticuerpo cetuximab (1 CZ8) El cristal (1 CZ8) de la proteína VEGF (SEQ ID NO: 2) en complejo con anticuerpo, se analizó de acuerdo con los procedimientos que se describen arriba. Los resultados mostraron que un grupo de seis residuos del anticuerpo hace contacto con el receptor; este es Tyr101 -Ser106. Esta sección del anticuerpo se usó para generar los modelos de farmacóforo que se describen abajo en el cuadro 18 y en las figuras 20-26.

CUADRO 18 Farmacóforos del cristal l CZ8.pdb de la proteína VEGF en complejo con anticuerpo Farmacóforo F Comentario 1 n F1 Aro Derivado de estadística de contacto hidrofóbico, interacción coulómbica favorable con la guanidina de Arg82 del receptor. Coincidencia parcial, el F2 Aro2 Direccionalidad de F1 con respecto a la guanidina ligando debe coincidir por de Arg82 lo menos con 6 F3 Don Derivado del OH de cadena lateral de Tyr101 del características de anticuerpo. Este OH dona un enlace de H al farmacóforo carboxilato de cadena lateral de Glu93 del receptor. F4 Derivado del carbonilo de esqueleto de Gly1 04 del Figura 20 Acc&Ani anticuerpo. El aceptor acepta un enlace de H del mismo o el anión forma un puente de sal con la cadena lateral de guanidina de Arg82 del receptor. F5 Don Derivado del OH de cadena lateral de Tyr102 del anticuerpo. Este OH dona un enlace de H al carbonilo de esqueleto de Ile80 del receptor. F6 Don2 Direccionalidad de F5 con respecto al carbonilo de esqueleto de Ile80. F7 Don Derivado del NH de esqueleto de Gly104 del anticuerpo. Este NH dona un enlace de H al carbonilo de esqueleto de Glu93 del receptor. F8 Acc2 Direccionalidad de F7 con respecto al carbonilo de esqueleto de Glu93 V1 Volumen excluido 2n F1 Aro Derivado de estadística de contacto hidrofóbico, interacción coulómbica favorable con la guanidina de Arg82 del receptor. Coincidencia parcial, el F2 Aro2 Direccionalidad de F1 con respecto a la guanidina ligando debe coincidir por de Arg82 lo menos con 7 F3 Don Derivado del OH de cadena lateral de Tyr101 del características de anticuerpo. Este OH dona un enlace de H al farmacóforo carboxilato de cadena lateral de: Glu93 del receptor. Esta característica se marca como ignorada. Figura 21 F4 Derivado del carbonilo de esqueleto de Gly104 del Acc&Ani anticuerpo. El aceptor acepta un enlace de H del mismo o el anión forma un puente de sal con la cadena lateral de guanidina de Arg82 del receptor. F5 Don Derivado del OH de cadena lateral de Tyr102 del anticuerpo. Este OH dona un enlace de H al carbonilo de esqueleto de Ile80 del receptor. F6 Don2 Direccionalidad de F5 con respecto al carbonilo de esqueleto de Ile80.

CUADRO 18 (Continuación) Farmacóforo F Comentario F7 Don Derivado del NH de esqueleto de Gly104 del anticuerpo. Este NH dona un enlace de H al carbonilo de esqueleto de Glu93 del receptor. F8 Acc2 Direccionalidad de F7 con respecto al carbonilo de esqueleto de Glu93. F9 Acc Derivado del carbonilo de esqueleto de Tyr102 del anticuerpo, aceptando un enlace de H del NH de esqueleto de Glu93 del receptor;. F10 Don Derivado del NH de esqueleto de Tyr102 del anticuerpo. Este NH dona un enlace de H al carbonilo de esqueleto de Ile91 del receptor. V1 Volumen excluido 3n F1 Aro Derivado del fenol de cadena lateral de Tyr103, formando una interacción hidrofobica favorable con la cadena lateral de Glu93 del receptor. F2 Aro2 Direccionalidad de F1 con respecto a la cadena Coincidencia parcial, el lateral de Glu93 ligando debe coincidir por F3 Don Derivado del NH de esqueleto de Tyr102 del lo menos con 8 anticuerpo. Este NH dona un enlace de H al características de carbonilo de esqueleto de Ile91 del receptor. farmacóforo F4 Don2 Direccionalidad de F3 con respécto al carbonilo de esqueleto de Ile91 del receptor. F5 Don Derivado del OH de cadena lateral de Tyr102 del anticuerpo. Este OH dona un enlace de H al carbonilo de esqueleto de Ile80 del receptor.

Figura 22 F6 Don2 Direccionalidad de F5 con respecto al carbonilo de esqueleto de4 Ile80 del receptor. F7 Acc Derivado del carbonilo de esqueleto de Tyr102, aceptando un enlace de H del NH de esqueleto de Glu93 del receptor. F8 Acc2 Direccionalidad de F7 con respecto al NH de esqueleto de Glu93 del esqueleto. V1 Volumen excluido 4n F1 Don Derivado del NH de esqueleto de Tyr102 del anticuerpo. Este NH dona un enlace de H al carbonilo de esqueleto de Ile91 del receptor.

Coincidencia parcial, el F2 Don2 Direccionalidad de F1 con respecto al carbonilo de ligando debe coincidir por esqueleto de Ile91 . lo menos con 7 F3 Acc Derivado del carbonilo de esqueleto de Tyr102 del características de anticuerpo, aceptando un enlacé de H del NH de farmacóforo esqueleto de Glu93 del receptor. F4 Acc2 Direccionalidad de F3 con respécto al NH de esqueleto de Glu93 del receptor.

CUADRO 18 (Continuación) Farm acóf oro F Comentario F5 Derivado del carbonilo de esqueleto de Gly104 del Acc&Ani anticuerpo. El aceptor acepta un enlace de H del Figura 23 mismo, o el anión forma un puente de sal con la cadena lateral de guanidina de Arg82 del receptor. Esta característica se marca como esencial. F6 Acc2 Direccionalidad de F5 con respecto a la guanidina de cadena lateral de Arg82 del receptor. F7 Don Derivado del OH de cadena lateral de Tyr102 del anticuerpo. Este OH dona un enlace de H al carbonilo de esqueleto de Ile80 del receptor. F8 Aro Derivado del fenol de cadena lateral de Tyr103, formando una interacción hidrofóbica favorable con la cadena lateral de Glu93 del receptor. F9 Aro2 Direccionalidad de F8 con respecto a la cadena lateral de Glu93. V1 Volumen excluido 6n F1 Don Derivado del OH de cadena lateral de Tyr102 del anticuerpo. Este OH dona un enlace de H al carbonilo de esqueleto de Ile80 ,del receptor. Coincidencia parcial, el F2 Don2 Direccionalidad de F1 con respecto al carbonilo de ligando debe coincidir por esqueleto de Ile80 lo menos con 8 F3 Acc Derivado del carbonilo de esqueleto de Tyr102 de características de esqueleto, aceptando un enlace de H del NH de farmacóforo. esqueleto de Glu93 del receptor. F4 Acc2 Direccionalidad de F3 con respecto al NH de esqueleto de Glu93 del receptor. F5 Derivado del carbonilo de esqueleto de Gly104 del Figura 24 Acc&Ani anticuerpo. El aceptor acepta un enlace de H del mismo o el anión forma un puente de sal con la cadena lateral de guanidina de Arg82 del receptor. F6 Acc2 Direccionalidad de F5 con respecto a la guanidina de cadena lateral de Arg82 del receptor. F7 Don Derivado del OH de cadena latéral de Tyr102 del anticuerpo. Este OH dona un enlace de H al carbonilo de esqueleto de Ile80 del receptor. F8 Aro Derivado del fenol de cadena lateral de Tyr102, interacción coulómbica favorable con la guanidina de cadena lateral de Arg82 del receptor. F9 Aro2 Direccionalidad de F8 con respecto a la guanidina de cadena lateral de Arg82 del receptor. V1 Volumen excluido CUADRO 18 (Continuación) Farm acóf oro F Comentario 7n F1 Don Derivado del NH de esqueleto de Tyr102 del anticuerpo. Este NH dona un enlace de H al carbonilo de esqueleto de Ile91 del receptor. F2 Don2 Direccionalidad de F1 con respecto al carbonilo de Coincidencia parcial, el esqueleto de Ile91 . ligando debe coincidir por F3 Acc Derivado del carbonilo de esqueleto de Tyr102 del lo menos con 8 anticuerpo, aceptando un enlace de H del NH de características de esqueleto de Glu93 del receptor. farmacóforo. F4 Acc2 Direccionalidad de F3 con respecto al NH de esqueleto de Glu93 del receptor. F5 Derivado del carbonilo de esqueleto de Gly104 del Acc&Ani anticuerpo. El aceptor acepta un enlace de H del Figura 25 mismo o el anión forma un puente de sal con la guanidina de cadena lateral de Arg82 del receptor. F6 Acc2 Direccionalidad de F5 con respecto a la guanidina de cadena lateral de Arg82 del receptor. F7 Don Derivado del OH de cadena lateral de Tyr102 del anticuerpo. Este OH dona un enlace de H al carbonilo de esqueleto de Ile80 del receptor. F8 Aro Derivado del fenol de cadena lateral de Tyr102 del anticuerpo, interacción coulombica favorable con la guanidina de cadena lateral de Arg82 del receptor. F9 Aro2 Direccionalidad de F8 con respecto a la guanidina de cadena lateral de Arg82 del receptor. FIO Don Derivado del OH de cadena lateral de Tyr101 del anticuerpo. Este OH dona un enlace de H al carboxilato de cadena lateral de Glu93 del receptor. F1 1 Don2 Direccionalidad de F10 con respecto al carboxilato de cadena lateral de Glu93 del receptor. V1 Volumen excluido 10b F1 Derivado del OH de cadena lateral de Tyr102 del Don&Acc anticuerpo, donando un enlace de H al carbonilo de esqueleto de Ile80 del receptor.' F2 Acc Derivado del carbonilo de esqueleto de Gly104 del Coincidencia parcial, el anticuerpo, que acepta un enlace de H de la ligando debe coincidir por cadena lateral de guanidina de Arg82 del receptor. lo menos con 5 F3 Derivado del OH de cadena lateral de Ser106 del características de Don&Acc anticuerpo, donando un enlace de H a un nitrógeno farmacóforo. Todas las de anillo de imidazol de His90. esferas características de F4 Don Derivado del NH de esqueleto de Tyr102 de farmacóforo tienen un anticuerpo. Este NH dona un enlace de H al radio de 0.8 Angstrom. carbonilo de esqueleto de Ile91 del receptor. F5 Acc Derivado del carbonilo de esqueleto de Tyr102 del anticuerpo, aceptando un enlace de H del NH de esqueleto de Glu93 del receptor.

CUADRO 18 (Continuación) HER2 en complejo con anticuerpo (1 N8Z.pdb) El cristal (1 N8Z.pdb) de la proteína HER2 (SEQ ID NO: 3) en complejo con el anticuerpo trastuzmab (SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8), se analizó de acuerdo con los procedimientos que se describen arriba. Los resultados mostraron que cinco residuos del anticuerpo hicieron contacto con el receptor; estos son Arg50, Tyr92-Thr94, y Gly103. Estos residuos del anticuerpo están en estrecha cercanía entre sí. Se usaron para generar un grupo de modelos de farmacóforo que se describen abajo en el cuadro 19 y en las figuras 27-30.

CUADRO 19 Farmacóforos del cristal 1 N8Z.pdb de la proteína HER2 en complejo con el anticuerpo trastuzumab Farmacoforo F Comentario F1 Derivado del OH de cadena lateral de Tyr92 del 1 b Don&Acc anticuerpo, aceptando un enlace de H del NH3+ de cadena lateral de Lys569 del receptor. F2 Derivado de la guanidina de cadena lateral de Coincidencia parcial, el Don&Cat Arg50 de anticuerpo, donando un enlace de H al ligando debe coincidir por lo carboxilato de cadena lateral de Glu558 del menos con 5 características receptor. de farmacoforo. F3 Don2 Direccionalidad de F2 con respecto al carboxilato de cadena lateral de Glu558 del receptor. F4 Acc Derivado de la cadena lateral de Thr94 del Figura 27 anticuerpo. F5 Don2 Direccionalidad de F7 F6 Acc Derivado del carbonilo de esqueleto de Gly103 del anticuerpo, aceptando un enlace de H del NH3+ de cadena lateral de Lys593. F7 Derivado de la guanidina de cadena lateral de Don&Cat Arg50 de anticuerpo, donando un enlace de H al carboxilato de cadena lateral dé Asp560 del receptor. F8 Don2 Direccionalidad de F7 con respecto al carboxilato de cadena lateral de Asp560 del receptor. F9 Aro Derivado de Lys569 de cadena lateral del anticuerpo, formando una interacción hidrofóbica favorable con el anillo lateral de pirrolidina de Pro571 . V1 Volumen excluido. 2b El modelo de farmacoforo 2b es el mismo que 1 b, con las siguientes excepciones: F2, F3, F4, F5, F7 y F8 se marcan como Coincidencia parcial, el esenciales. ligando debe coincidir por lo menos con 6 características de farmacoforo. Figura 28 CUADRO 19 (Continuación) Farmacóforo F Comentario 2n F1 Aro Derivado de Lys569 de cadena lateral del anticuerpo, formando una interacción hidrofóbica favorable con el anillo lateral de pirrolidina de Pro571 . Esta característica se marca como Coincidencia parcial, el esencial. ligando debe coincidir por lo F2 Acc Derivado del OH de cadena lateral de Tyr92 del menos con 5 características anticuerpo, aceptando un enlace de H del NH3+ de de farmacóforo. cadena lateral de Lys569 del receptor. F3 Derivado de la guanidina de cadena lateral de Don&Cat Arg50 del anticuerpo, donando un enlace de H al Figura 29 carboxilato de cadena lateral de Asp560 del receptor. Esta característica se marca como ' esencial. F4 Don2 Direccionalidad de F3 con respecto al carboxilato de cadena lateral de Asp560 del receptor. F5 Derivado de la guanidina de cadena lateral de Don&Cat Arg50 del anticuerpo, donando un enlace de H al carboxilato de cadena lateral de Glu558 del receptor. F6 Don2 Direccionalidad de F5 con respecto al carboxilato de cadena lateral de Glu558 del receptor. F7 Acc Derivado del carbonilo de esqueleto de Gly103 del anticuerpo, aceptando un enlace de H del NH3+ de cadena lateral de Lys593. F8 Hyd Hidrófobo, radio de la esfera de 1.8 Angstrom, de color verde oscuro. Derivado de MFSS. El hidrófobo forma una interacción hidrofóbica favorable con el fenilo de cadena lateral de Phe573 del receptor. V1 Volumen excluido. 3n F1 Aro Derivado de Lys569 de cadena lateral del anticuerpo, formando una interacción hidrofóbica favorable con el anillo de pirrolidina lateral de Coincidencia parcial, el Pro571. ligando debe coincidir por lo F2 Acc Derivado del OH de cadena lateral de Tyr92 del menos con 3 características anticuerpo, aceptando un enlace de H del NH3+ de de farmacóforo. cadena lateral de Lys569 del receptor. F3 Derivado de la guanidina de cadena lateral de Don&Cat Arg50 del anticuerpo, donando un enlace de H al carboxilato de cadena lateral de Asp560. Esta característica se marca como esencial. El radio de la esfera es de 1.0 Angstrom.

CUADRO 19 (Continuación) ErbB2 en complejo con anticuerpo (1 S78.pdb) El cristal (1 S78.pdb) de la proteína ERBB2 (SEQ ID NO: 4) en complejo con el anticuerpo pertuzumab (SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10), se analizó de acuerdo con los procedimientos que se describen arriba. Los resultados mostraron que cinco residuos del anticuerpo hicieron contacto con el receptor; estos son Asp31 -Tyr32, y Asn52-Pro52A-Asn53. Estos residuos del anticuerpo están en estrecha cercanía entre sí. Se usaron para generar los dos modelos de farmacoforo que se describen abajo en el cuadro 20 y en las figuras 31 -32.

CUADRO 20 Farmacóforos del cristal 1 S78.pdb de la proteína ErbB2 en complejo con el anticuerpo pertuzumab Farm acóf oro F Comentario 5n F1 Acc Derivado del carbonilo de esqueleto de Asn53 del anticuerpo, aceptando un enlace de H del NH de esqueleto de Cys246. F2 Don Derivado de estadística de contacto hidrofílico, Coincidencia parcial, el donando un enlace de H al carbonilo de esqueleto ligando debe coincidir por lo de Gly287 del receptor. menos con 8 características F3 Don2 Direccionalidad de F2 con respecto al carbonilo de de farm acóf oro. esqueleto de Gly287 del receptor F4 Don Derivado del NH2 de cadena lateral de Asn53 del Figura 31 anticuerpo, donando un enlace de H al carbonilo de esqueleto de Val286 del receptor. F5 Acc Derivado del carbonilo de cadena lateral de Asn53 del anticuerpo, aceptando un enlace de H del OH de cadena lateral de Thr268 del receptor. F6 Aro Derivado del anillo de fenol de cadena lateral de Tyr32 del anticuerpo, formando ¡una interacción hidrofóbica favorable con el anillo de pirrolidina de Pro294 del receptor. F7 Acc Derivado del OH de cadena lateral de Tyr32 del anticuerpo, aceptando un enlace de H del carbonilo de esqueleto de Leu295 del receptor. F8 Hyd Esfera de 1.8 Angstrom: derivado de MFSS, formando una interacción hidrofóbica favorable con la cadena lateral de Cys246 del receptor. F9 Don Derivado del NH2 de cadena lateral de Asn52 del anticuerpo, donando un enlace de H al carbonilo de esqueleto de Val286 del receptor. F10 Direccionalidad de F9 con respecto al carbonilo de Don2 esqueleto de Val288 del receptor. F1 1 Derivado del carboxilato de cadena lateral de Acc&Ani Asp31 del anticuerpo, aceptando un enlace de H del OH de cadena lateral de Ser288 del receptor. V1 Volumen excluido 6b F1 Acc Derivado del OH de cadena lateral de Tyr32 del anticuerpo, aceptando un enlacé de H del carbonilo de esqueleto de Leu295 del receptor. Coincidencia parcial, el F2 Derivado del carboxilato de cadena lateral de ligando debe coincidir por lo Acc&Ani Asp31 del anticuerpo, aceptando un enlace de H menos con 5 características del OH de cadena lateral de Ser288 del receptor. de farm acóf oro. Esta característica se marca como esencial. F3 Don2 Direccionalidad de F6 F4 Acc Derivado del carbonilo de esqueleto de Asn53 del anticuerpo, aceptando un enlace de H del NH de Figura 32 esqueleto de Cys246. esta característica se marca como esencial CUADRO 20 (Continuación) EGFR en complejo con la cadena pesada del anticuerpo cetuximab (2EXQ.pdb) El cristal (2EXQ.pdb) de la proteína EGFR (SEQ ID NO: 1 ) en complejo con la cadena pesada del anticuerpo cetuximab (SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6), se analizó de acuerdo con los procedimientos que se describen arriba. Los resultados mostraron que, en el primer grupo de modelos de farmacoforo, ocho residuos de la cadena pesada del anticuerpo hicieron contacto con el receptor; estos son Tyr50_Thr57. Estos se usaron para generar los siete modelos de farmacoforo que se describen abajo en el cuadro 21 y en las figuras 33-39.

CUADRO 21 Farmacótoros del cristal 2EXQ.pdb de la proteína EGFr en complejo con la cadena pesada del anticuerpo cetuximab Farm acóf oro F Comentario 3h F1 Aro Derivado del fenol de cadena lateral de Tyr50 de anticuerpo, formando una interacción hidrofóbica favorable con la cadena lateral de Lys303 del receptor. Esta característica se marca como Coincidencia parcial, el esencial. ligando debe coincidir por lo F2 Don Derivado del NH de esqueleto de Thr57 del menos con 5 características anticuerpo, donando un enlace de H al carbonilo de de farmacóforo. esqueleto de Lys304 del receptor. F3 Don2 Direccionalidad de F2 con respecto al carbonilo de esqueleto de Lys304 del receptor F4 Derivado del OH de cadena lateral de Thr57 del Figura 33 Acc&Ani anticuerpo, aceptando un enlace de H del NH3+ de cadena lateral de Lys304. Esta característica se marca como esencial. F5 Don Derivado del NH2 de cadena lateral de Asn56 del anticuerpo, donando un enlace de H al carboxilato de cadena lateral de Glu293 del receptor. F6 Don2 Direccionalidad de F5 con respecto al carboxilato de cadena lateral de Glu293 del receptor. V1 Volumen excluido 4h F1 Aro Derivado del fenol de cadena lateral de Tyr50 del anticuerpo, formando una interacción hidrofóbica favorable con la cadena lateral de Lys303 del Coincidencia parcial, el receptor. ligando debe coincidir por lo F2 Don Derivado del NH de esqueleto de Thr57 del menos con 5 características anticuerpo, donando un enlace de H al carbonilo de de farmacóforo. esqueleto de Lys304 del receptor. F3 Don2 Direccionalidad de F2 con respecto al carbonilo de esqueleto de Lys304 del receptor. F4 Derivado del OH de cadena latéral de Thr57 del Figura 34 Acc&Ani anticuerpo, aceptando un enlace de H del NH3+ de cadena lateral de Lys304. Esta característica se marca como esencial. F5 Don Derivado del NH2 de cadena lateral de Asn56 del anticuerpo, donando un enlace de H al carboxilato de cadena lateral de Glu293 dej receptor. F6 Don2 Direccionalidad de F5 con respecto a al carboxilato de cadena lateral de Glu293 del receptor. F7-F9 Ignorado F10 Don Derivado del OH de cadena latéral de Tyr53 del anticuerpo, donando un enlace-de H del carbonilo de esqueleto de Tyr292 del receptor. Esta característica se marca como esencial. V1 Volumen excluido.

CUADRO 21 (Continuación) Farmacóforo F Comentario 5h F1 Aro Derivado del fenol de cadena lateral de Tyr50 del anticuerpo, formando una interacción hidrofóbica favorable con la cadena lateral de Lys303 del receptor. Esta característica se marca como Coincidencia parcial, el esencial. ligando debe coincidir por lo F2 Don Derivado del NH de esqueleto de Thr57 del menos con 5 características anticuerpo, donando un enlace de H al carbonilo de de farmacóforo. esqueleto de Lys304 del receptor. F3 Don2 Direccionalidad de F2 con respecto al carbonilo de esqueleto de Lys304 del receptor F4 Derivado del OH de cadena lateral de Thr57 del Figura 35 Acc&Ani anticuerpo, aceptando un enlace de H del NH3+ de cadena lateral de Lys304. Esta característica se marca como esencial. F5 Don Derivado del NH2 de cadena lateral de Asn56 del anticuerpo, donando un enlace de H al carboxilato de cadena lateral de Glu293 del receptor. F6 Don2 Direccionalidad de F5 con respecto al carboxilato de cadena lateral de Glu293 del receptor. F7-F9 Ignorado. F10 Don Derivado del OH de cadena lateral de Tyr53 del anticuerpo, donando un enlace de H al carbonilo de esqueleto de Tyr292 de3l receptor. V1 Volumen excluido 6h F1 Aro Derivado del fenol de cadena lateral de Tyr50 del anticuerpo, formando una interacción hidrofóbica favorable con la cadena lateral de Lys303 del Coincidencia parcial, el receptor. Esta característica se marca como ligando debe coincidir por lo esencial. menos con 4 características F2 Don Derivado del NH de esqueleto de Thr57 del de farmacóforo. anticuerpo, donando un enlace de H al carbonilo de esqueleto de Lys304 del receptor. F3 Don2 Direccionalidad de F2 con respecto al carbonilo de esqueleto de Lys304 del receptor. Figura 36 F4 Derivado del OH de cadena lateral de Thr57 del Acc&Ani anticuerpo, aceptando un enlace de H del NH3+ de cadena lateral de Lys304. F5 Don Derivado del NH2 de cadena lateral de Asn56 del anticuerpo, donando un enlace de H al carboxilato de cadena lateral de Glu293 del receptor. F6 Don2 Direccionalidad de F5 con respecto al carboxilato de cadena lateral de Glu293 del receptor. F7-F9 Ignorado F10 Don Derivado del OH de cadena lateral de Tyr53 del anticuerpo, donando un enlace de H al carbonilo de I esqueleto de Tyr292 del receptor.

CUADRO 21 (Continuación) Farm acóf oro F Comentario F1 1 Derivado de estadística de contacto hidrof ílico. Acc&Ani Esta característica acepta un enlace de H del NH de esqueleto de Met294 del receptor, o el NH3+ de cadena lateral de Lys303 del receptor, o forma un puente de sal con el NH3+ de cadena lateral de Lys303 del receptor. Esta característica se marca como esencial. V1 Volumen excluido 7 F1 Aro Derivado del fenol de cadena lateral de Tyr50 del anticuerpo, formando una interacción hidrofóbica favorable con la cadena lateral de Lys303 del Coincidencia parcial, el receptor. ligando debe coincidir por lo F2 Don Derivado del NH de esqueleto de Thr57 del menos con 4 características anticuerpo, donando un enlace de H al carbonilo de de farmacóforo. esqueleto de Lys304 del receptor. F3 Don2 Direccionalidad de F2 con respecto al carbonilo de esqueleto de Lys304 del receptor. F4 Derivado del OH de cadena lateral de Thr57 del Figura 37 Acc&Ani anticuerpo, aceptando un enlace de H del NH3+ de cadena lateral de Lys304. Esta característica se marca como esencial F5 Don Derivado del NH2 de cadena lateral de Asn56 del anticuerpo, donando un enlace de H al carboxilato de cadena lateral de Glu293 del receptor. F6 Don2 Direccionalidad de F5 con respecto al carboxilato de cadena lateral de Glu293 del receptor. F7-F9 Ignorado F10 Don Derivado del OH de cadena lateral de Tyr53 del anticuerpo, donando un enlace de H al carbonilo de esqueleto de Tyr292 del receptor. F1 1 Derivado de estadística de contacto hidrof ílico. Acc&Ani Esta característica acepta un enlace de H del NH de esqueleto de Met294 del receptor, o el NH3+ de cadena lateral de Lys303 del receptor, o forma un puente de sal con el NH3+ de cadena lateral de Lys303 del receptor. Esta característica se marca como esencial. V1 Volumen excluido 8h F1 Aro Derivado del fenol de cadena lateral de Tyr50 del anticuerpo, formando una interacción hidrofóbica favorable con la cadena lateral de Lys303 del receptor. F2 Don Derivado del NH de esqueleto de Thr57 del anticuerpo, donando un enlace de H al carbonilo de esqueleto de Lys304 del receptor.

CUADRO 21 (Continuación) Farmacóforo F Comentario Coincidencia parcial, el F3 Don2 Direccionalidad de F2 con respecto al carbonilo de ligando debe coincidir por lo esqueleto de Lys304 del receptor. menos con 4 características F4 Derivado del OH de cadena lateral de Thr57 del de farmacóforo. Acc&Ani anticuerpo, aceptando un enlace de H del NH3+ de cadena lateral de Lys304. F5 Don Derivado del NH2 de cadena lateral de Asn56 del anticuerpo, donando un enlace de H al carboxilato Figura 38 de cadena lateral de Glu293 del receptor. Esta característica se marca como esencial. F6 Don2 Direccionalidad de F5 con respecto al carboxilato de cadena lateral de Glu293 del receptor. F7-F9 Ignorado F10 Don Derivado del OH de cadena lateral de Tyr53 del anticuerpo, donando un enlace de H al carbonilo de esqueleto de Tyr292 del receptor. F1 1 Derivado de estadística de contacto hidrof ílico. Acc&Ani Esta característica acepta un enlace de H del NH de esqueleto de Met294 del receptor, o el NH3+ de cadena lateral de Lys303 del receptor, o forma un puente de sal con el NH3+ de cadena lateral de Lys303 del receptor. Esta característica se marca como esencial. V1 Volumen excluido 9h F1 Aro Derivado del fenol de cadena lateral de Tyr50 del anticuerpo, formando una interacción hidrofóbica favorable con la cadena lateral de Lys303 del Coincidencia parcial, el receptor. ligando debe coincidir por lo F2 Don Derivado del NH de esqueleto de Thr57 del menos con 4 características anticuerpo, donando un enlace de H al carbonilo de de farmacóforo. esqueleto de Lys304 del receptor. Esta característica se marca como esencial. F3 Don2 Direccionalidad de F2 con respecto a al carbonilo de esqueleto de Lys304 del receptor. Figura 39 F4 Derivado del OH de cadena lateral de Thr57 del Acc&Ani anticuerpo, aceptando un enlace de H del NH3+ de cadena lateral de Lys304. F5 Don Derivado del NH2 de cadena lateral de Asn56 del anticuerpo, donando un enlace de H al carboxilato de cadena lateral de Glu293 del receptor. Esta característica se marca como esencial. F6 Don2 Direccionalidad de F5 con respecto al carboxilato de cadena lateral de Glu293 del receptor. F7-F9 Ignorado F10 Don Derivado del OH de cadena lateral de Tyr53 del anticuerpo, donando un enlace de H al carbonilo de esqueleto de Tyr292 del receptor.

CUADRO 21 (Continuación) EGFr en complejo con la cadena ligera del anticuerpo cetuximab (2EXQ.pdb) El cristal (2EXQ.pdb) de la proteína EGFR (SEQ ID NO: 1 ) en complejo con la cadena ligera del anticuerpo cetuximab (SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6), se analizó de acuerdo con los procedimientos que se describen arriba. Los resultados mostraron que, en el primer grupo de modelos de farmacóforo, nueve residuos de la cadena ligera del anticuerpo hicieron contacto con el receptor; estos son Asn32_lle33_Gly34, Tyr49_His50_Gly5 , Tyr91 , Phe94 y Trp96. Estos se usaron para generar los seis modelos de farmacóforo que se describen abajo en el cuadro 22 y en las figuras 40-41 .

CUADRO 22 Farmacóforos del cristal 2EXQ.pdb de la proteína EGFr en complejo con la cadena ligera del anticuerpo cetuximab Farm acóf oro F Comentario 1 L F1 Don Derivado del OH de cadena lateral de Tyr91 del anticuerpo, donando un enlace de H al carbonilo de esqueleto de Asp297 del receptor. Coincidencia parcial, el F2 Derivado del carbonilo de cadena lateral de Asn32 ligando debe coincidir por lo Acc&Ani del anticuerpo, aceptando un enlace de H del menos con 4 características mismo, o formando un puente de sal con el NH3+ de farmacóforo. de cadena lateral de Lys301 del receptor. F3 Aro Derivado del fenilo de cadena lateral de Phe94 del anticuerpo, formando una interacción coulómbica favorable con el NH3+ de cadena lateral de Lys304 Figura 40 del receptor. F4 Aro Derivado del fenilo de cadena lateral de Trp96 del anticuerpo, formando una interacción coulómbica favorable con el carboxilato de cadena lateral de Glu296 del receptor. F5 Don Derivado del NH de esqueleto de His50 del anticuerpo, donando un enlacé de H al carboxilato de cadena lateral de Asp297 del receptor. F6 Derivado de estadística de contacto hidrofílico. Acc&Ani Esta característica acepta un enlace de H del mismo, o forma un puente de sal con el NH3+ de cadena lateral de Lys303 del receptor. Esta característica se marca como esencial. F7 Aro Derivado del fenol de cadena lateral de Tyr91 del anticuerpo, formando una interacción hidrofóbica favorable con la cadena lateral de Asp297 del receptor. V1 Volumen excluido 2L Este modelo es el mismo que 1 L, excepto que tanto F2 Acc&Ani como F6 Acc&Ani se marcan como esenciales. Coincidencia parcial, el ligando debe coincidir por lo menos con 3 características de farmacóforo.

Figura 40 CUADRO 22 (Continuación) Farmacóforo F Comentario 3L F1 Don Derivado del OH de cadena lateral de Tyr91 del anticuerpo, donando un enlace de H al carbonilo de esqueleto de Asp297 del receptor. Coincidencia parcial, el F2 Derivado del carbonilo de cadena lateral de Asn32 ligando debe coincidir por lo Acc&Ani del anticuerpo, aceptando un enlace de H del menos con 4 características mismo, o formando un puente de sal con el NH3+ de farmacóforo. de cadena lateral de Lys301 del receptor. F3 Aro Derivado del fenilo de cadena lateral de Phe94 del anticuerpo, formando una interacción coulómbica favorable con el NH3+ de cadena lateral de Lys304 Figura 41 del receptor. F4 Aro Derivado del fenilo de cadena lateral de Trp96 del anticuerpo, formando una interacción coulómbica favorable con el carboxilato de cadena lateral de Glu296 del receptor. F5 Don Derivado del NH de esqueleto de His50 del anticuerpo, donando un enlace de H al carboxilato de cadena lateral de Asp297 del receptor. F6 Derivado de estadística de contacto hidrofílico. Acc&Ani Esta característica acepta un enlace de H del mismo, o forma un puente de sal con el NH3+ de cadena lateral de Lys303 del receptor. Esta característica se marca como esencial. F7 Aro Derivado del fenol de cadena lateral de Tyr91 del anticuerpo, formando una interacción hidrofóbica favorable con la cadena lateral de Asp297 del receptor. F8 Aro Derivado de la cadena lateral de imidazol de His50 del anticuerpo, formando una interacción coulómbica favorable con la cadena lateral de carboxilato de Asp297 del receptor. V1 Volumen excluido 5L Este modelo es el mismo que 3L, excepto que F1 Don se marca como esencial. Coincidencia parcial, el ligando debe coincidir por lo menos con 4 características de farmacóforo.

Figura 41 CUADRO 22 (Continuación) Usando la metodología descrita, se pueden generar modelos de farmacóforo para una variedad de proteínas objetivo (cristalizadas con ligando), incluyendo sin limitación: el agente causante de la fiebre aftosa (I QGC.pdb); angiotensina II (I CKO.pdb, 3CK0.pdb, 2CK0.pdb); ErbB2 en complejo con el anticuerpo pertuzumab (1 L71.pdb, 1 S78.pdb, 2GJJ.pdb); aglutinina de la influenza (I DNO.pdb, OSP.pdb); hemaglutinina de la influenza (1 E08.pdb, I QFU.pdb, 2VIR.pdb, 2VIS.pdb, 2VIT.pdb, I KEN.pdb, 1 FRG.pdb, I HIM.pdb, I HIN.pdb, H FH.pdb); neuraminidasa de la influenza (NCIO.pdb, 1A14.pdb, 1 NMB.pdb, INMC.pdb, 1 NMA.pdb, INCA.pdb, INCD.pdb, 2AEQ.pdb, INCB.pdb, INCC.pdb, 2AEP.pdb); interferón gamma (HuZAF.pdb, 1T3F.pdb, 1B2W.pdb, 1B4J.pdb, 1T04.pdb); HER2 en complejo con herceptina (1N8Z.pdb, IFVC.pdb); Neissería meningitidis (IMNU.pdb, IMPA.pdb, 2MPA.pdb, lUWX.pdb); proteasa de VIH1 (1JP5.pdb, 1CL7.pdb, 1MF2.pdb, 2HRP.pdb, ISVZ.pdb); transcriptasa inversa de VIH1 (2HMI.pdb, 1J50.pdb, 1N5Y.pdb, N6Q.pdb, IHYS.pdb, 1C9R.pdb, IHYS.pdb, 1R08.pdb, 1T04.pdb, 2HRP.pdb); rinovirus (IFOR.pdb, IRVF.pdb, 1 BBD.pdb, 1A3R.pdb, 1A6T.pdb); receptor de fibrinógeno de plaqueta (UXV.pdb, 1TY3.pdb, 1TY5.pdb, 1TY6.pdb, 1TY7.pdb); oligosacárido de Salmonella (1 MFB.pdb, IMFC.pdb, 1 MFE.pdb); TGF-alfa (1E4W.pdb, 1E4X.pdb); trombopoyetina en complejo con TN1 (1V7M.pdb, 1V7N.pdb); factor de tejido en complejo con 5G9 (IFGN.pdb, lAHW.pdb, UPS.pdb, 1UJ3.pdb); factor de Von Willenbrand en complejo con NMC-4 (lOAK.pdb, 2ADF.pdb, 1FE8.pdb, IFNS.pdb, 2ADF.pdb); VEGF en complejo con B20-4 (2FJH.pdb, 2FJF.pdb, 2FJG.pdb, ITZH.pdb, UZl.pdb, 1CZ8.pdb, 1BJ1.pdb); coronavirus-SARS (2DD8.pdb, 2G75.pdb); enfermedad de Lyme (1P4P.pdb, IRJL.pdb); GP120 de VIH (lACY.pdb, 1F58.pdb, 1G9M.pdb, 1G9N.pdb, 1GC1.pdb, IQU.pdb, IQNZ.pdb, 1RZ7.pdb, 1RZ8.pdb, IRZF.pdb, IRZG.pdb, 1RZI, IRZJ.pdb, IRZK.pdb, 1 YYL.pdb, 1 YYM.pdb, 2B4C.pdb, 2F58.pdb, 2F5A.pdb); GP41 de VIH (ITJG.pdb, ITJH.pdb, ITJl.pdb, 1U92.pdb, 1U93.pdb, 1U95.pdb, 1U8H.pdb, 1U81.pdb, 1U8J.pdb, 1U8K.pdb, 1U8P.pdb, 1U8Q.pdb, 1U91.pdb, 1U8L.pdb, 1U8M.pdb, 1U8N.pdb, 1U80.pdb, 2F5B); virus del Nilo occidental (como se define en la solicitud de patente publicada de EE. UU. No. 2006/01 15837); malaria (dihidrofolato reductasa) (como se define en Acta Crystallographia (2004), D60(1 1 ), 2054-2057); y EGFR (1 181 .pdb, 1 18K.pdb, 1 YY8.pdb, 1 YY9.pdb, 2EXP.pdb, 2EXQ.pdb).

EJEMPLO 5 Acoplamiento de ligando y puntuación Los compuestos seleccionados para acoplamiento con la proteína objetivo fueron aquellas que se alinearon con los modelos de farmacóforo generados en el software de modelación MOE (véase el ejemplo 4). Estos compuestos se obtuvieron en el formato de base de datos MOE de la base de datos ZINC (véase Irwin y Shoichet (2005), J Chem Inf Model 45, 177-182). Las coordenadas atómicas tridimensionales de estos compuestos se escribieron para un archivo en formato de datos de estructura (*.sdf) usando el comando de exportación de la ventana de base datos MOE sin agregar hidrógenos. El módulo de software LigPrep del software de modelación Maestro (Schrodinger LLC, NY, N.Y.) se usó después para preparar los compuestos para acoplamiento. El archivo *.sdf se convirtió al formato Maestro usando LigPrep. Después se añadieron hidrógenos y cualquier grupo cargado se neutralizó. Se generaron estados de ionización para los ligandos a 7.0+/-1 .0 unidades de pH. Después de esto, se generaron tautómeros cuando fue necesario, se generaron quiralidades alternativas y se produjeron confórmeros de anillos de baja energía. Esto continuó con remoción de cualquier estructura problemática y minimizando la energía de los ligandos resultantes usando el módulo de software MacroModel. Finalmente, se escribió un archivo Maestro (*.mae) de los ligandos que ahora estaban listos para acoplamiento. Todos estos pasos se automatizaron por medio de un script python provisto por Schrodinger, LLC. Lo siguiente describe la preparación de la proteína. En primer lugar, una proteína se importó al Maestro en formato PDB. Se añadieron hidrógenos y se reparó cualquier error tal como residuos incompletos. La estructura de la proteína se verificó para ver los iones de metal y cofactores. Se pusieron cargas y tipos de átomo a los iones de metal y los cofactores conforme fue necesario. Los órdenes de enlace de ligando y las cargas formales se ajustaron cuando fue necesario. El sitio de unión se determinó escogiendo el ligando (para 1 YY9 son las piezas Thr100-Tyr101 -Tyr102-Asp103-Tyr104-Glu105 o Gly54-Gly55-Asn56-Thr57-Asp58 del anticuerpo) en el Maestro (Glide). El programa determina el centroide del ligando escogido y dibuja un cuadro de 20 Angstrom que representa la colocación por omisión con el centroide de ligando en el centro del cuadro. El cuadro fue el sitio de unión para que los ligandos se acoplaran. La facilidad de preparación de proteína, que es automática en Glide, consiste en dos componentes, preparación y refinación. El componente de preparación añadió hidrógenos y neutralizó cadenas laterales que no están cercanas al sitio de unión y no participan en puentes de sal. El componente de refinación realizó una minimización restringida del complejo cocristalizado que reorientó los grupos hidroxilo de cadena lateral y alivió los conflictos estéricos potenciales. Lo siguiente describe la generación de rejilla de receptor. Glide busca interacciones favorables entre una o más moléculas de ligando y una molécula de receptor, usualmente una proteína. La forma y propiedades del receptor son representadas en una rejilla por varios grupos diferentes de campos que incluyen uniones de hidrógeno, interacciones coulombicas (es decir, de carga-carga), interacciones hidrofóbicas, conflictos estéricos del ligando con la proteína. En el primer paso se debe definir el receptor. Esto se hizo escogiendo el ligando. La parte no escogida de la estructura fue el receptor. El ligando no se incluyó en el cálculo de rejilla pero se usó para definir el sitio de unión como se describe arriba. La escalación de los átomos no polares del receptor no se incluyó en las estas corridas de acoplamiento. Las rejillas por si solas se calcularon dentro del espacio del cuadro encerrado. Este es el cuadro descrito arriba y todos los átomos del ligando deben estar contenidos en este cuadro. No se usaron restricciones de farmacóforo porque la función de puntuación de precisión extra de Glide se desempeña mejor sin estas restricciones. Para usar Glide, cada ligando debe ser una sola molécula, mientras que el receptor puede incluir más de una molécula, por ejemplo una proteína y un cofactor. El Glide se puede correr en modos de acoplamiento rígido o flexible; este último genera automáticamente conformaciones para cada ligando de entrada. La combinación de posición y orientación de un ligando con respecto al receptor, junto con su conformación en acoplamiento flexible, son referidas como una pose de ligando. Todas las corridas de acoplamiento se hacen usando el modo de acoplamiento flexible. Las poses de ligando que genera Glide pasan a través de una serie de filtros jerárquicos que evalúan la interacción del ligando con el receptor. Los filtros iniciales prueban el ajuste espacial del ligando con el sitio activo definido, y examinan la complementariedad de las interacciones ligando-receptor usando un método basado en rejilla. Las poses que pasan por estos tamices iniciales entran a la etapa final del algoritmo, que incluye evaluación y minimización de una aproximación de rejilla a la energía de la interacción ligando no unido-receptor OPLS-AA. La puntuación final es llevada entonces sobre las poses de energía minimizada. Por omisión se usa la función de puntuación de multiligando GlideScore de Schrodinger para calificar las poses. Si se seleccionó GlideScore como la función de puntuación, se usa entonces una puntuación combinada Emodel para calificar las poses de cada ligando y para seleccionar las poses que se van a informar al usuario. El Emodel combina GlideScore, la energía de interacción no enlazada, y, para acoplamiento flexible, el exceso de energía interna de la conformación del ligando generado. La flexibilidad conformacional se maneja en Glide mediante una búsqueda conformacional extensa, aumentada por una exploración heurística que elimina rápidamente las conformaciones inadecuadas, tales como las conformaciones que tienen enlaces de hidrógeno internos de escala grande.

Los parámetros usados en las corridas de acoplamiento de este ejemplo fueron de la siguiente manera. El archivo Grid se leyó. Se usó la función de puntuación de precisión extra (XP). Se acopló usando flexibilidad conformacional. Se mantuvieron 5,000 poses por ligando para la exploración inicial de Glide (por omisión). La ventana de puntuación para mantener las poses iniciales fue de 100.0 (por omisión). Se mantuvieron (por omisión) las mejores 800 poses por ligando para la minimización de energía. Para la minimización de energía se usó una constante dieléctrica dependiente de distancia de 2.0, y el número máximo de pasos de gradiente de conjugado fue de 100 (omisiones). El archivo de ligando se cargó entonces. Las moléculas con > 120 átomos o > 20 enlaces rotativos no fueron acoplados (omisión). Los radios de Van der Waals de los átomos de ligando con cargas parciales <0.15 fueron escalados en 0.80. Esto se hizo para imitar la flexibilidad del receptor. No se usaron restricciones ni similitud. Las poses con energías de Coulomb más Van der Waals >0.0 se rechazaron. Para asegurar que las poses de cada molécula fueran conformacionalmente distintas, se descartaron las poses con una desviación RMS <0.5 o un desplazamiento atómico máximo de 1 .3 Angstrom. Lo siguiente describe la puntuación de Glide. La elección de la estructura mejor acoplada para cada ligando se hizo usando una puntuación de energía de modelo (Emodel), que combina la puntuación de rejilla de energía, la afinidad de unión predicha por GlideScore, y (para acoplamiento flexible) la energía de deformación interna para el potencial de modelo usado para dirigir el algoritmo conformacional-búsqueda. El Glide también calculó una puntuación de interacción de energía Coulomb-van der Waals especialmente construida (CvdW), que se formuló para no retribuir demasiado las interacciones de carga-carga a expensas de las interacciones de carga-dipolo y dipolo-dipolo. Esta puntuación se adaptó para comparar las afinidades de unión de los diferentes ligandos más que la energía de interacción Coulomb-van der Waals "en bruto". En el tratamiento final de datos, se pueden combinar los valores de puntación de GlideScore y los valores de la puntuación Coulomb-van der Waals "modificados" para dar una puntuación combinada que puede ayudar a mejorar los factores de enriquecimiento en aplicaciones de exploración de base de datos. La forma matemática de la puntuación de Glide es: GScore=0.065*EvdW+0.130*Coul+Lipo+Hbond+Metal+BuryP+R otB+Site en donde EvdW es la energía de van der Waals (calculada con cargas iónicas netas reducidas sobre grupos con cargas formales, tales como metales, carboxilatos y guanidinios); Coul es la energía de Coulomb (calculada con cargas iónicas netas reducidas sobre grupos cargas formales, tales como metales, carboxilatos y guanidinios); Lipo es el término de contacto lipofílico (retribuye interacciones hidrofóbicas favorables); HBond es el término de unión de hidrógeno (separado en componentes ponderados diferentemente que dependen de si el donador y el aceptor son neutros, uno es neutro y el otro está cargado, o los dos están cargados); Metal es el término de unión de metal (solo se incluyen las interacciones con átomos aceptores aniónicos; si la carga neta del metal en la apoproteína es positiva, se incluye la preferencia de ligandos aniónicos; si la carga neta es cero, la preferencia se suprime); BuryP es la penalización por grupos polares enterrados; RotB es la penalización por congelar enlaces rotativos; y Site son las interacciones polares en el sitio activo (son retribuidos átomos polares pero no de unión de hidrógeno en una región hidrofóbica). Lo siguiente describe la generación de la colección virtual de compuestos que se exploró. Los compuestos de tipo guía son de una base de datos virtual libre, de compuestos disponibles comercialmente, se descargaron en su formato de datos de estructura (sdf, Molecular Design Limited) de la base de datos ZINC (Irwin y Shoichet (2005) J. Chem. Inf. Model. 45(1 ), 177-182). La base de datos de tipo guía está comprendida de aproximadamente 890,000 compuestos divididos en 33 segmentos. Esta se usó para generar la base de datos de confórmeros para exploración con MOE. Después se añadieron los hidrógenos. Para una búsqueda de farmacóforo se debe generar una base de datos de confórmeros de energía baja. Se aplicó el comando de importación de conformación al archivo sdf anterior. Después de generar los confórmeros, se aplicó un procesamiento previo de la base de datos de confórmeros. Este paso, denominado anotación de característica, determinó los tipos de características de farmacóforo en cada molécula/conformación y sus relaciones geométricas. Después, esto se comparó con la pregunta y aquellas moléculas/conformaciones que coincidieron con la pregunta dentro de la tolerancia dada se guardaron como aciertos.

EGFR El análisis de los compuestos de la base de datos ZINC contra los farmacóforos identificados del cristal 1 YY9.pdb de la proteína EGFR (SEQ ID NO: 1 ) en complejo con el anticuerpo cetuximab (SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO:6) (véase el ejemplo 4; cuadro 17), identificó 183 compuestos similares. Los compuestos se analizaron de acuerdo con los métodos de acoplamiento y puntuación anteriormente descritos. En el cuadro 23 se presentan resultados ejemplares de las pruebas de acoplamiento y puntuación.

CUADRO 23 ZINC # AD4 # objetivo G_score E_model Modelo de farmacóforo ZINC04342589 AD4-1020 EGFR -7.51718 -36.781 1 1_gly54_asp58 ZINC00148428 AD4- 1021 EGFR -7.34233 -37.5868 1_gly54_asp58 ZINC04649255 AD4- 1 78 EGFR -7.13496 -41.4482 23_gly54_asp58 ZINC00073705 AD4- 1 142 EGFR -6.9552 -43.1905 23_gly54_asp58 Similar a AD4- 1175 EGFR -6.83 -38.3 Similar - ZINC04342589 1_gly54_asp58 ZINC04824860 AD4- 1022 EGFR -6.73644 -42.2379 1_gly54_asp58 ZINC04651 153 AD4-1070 EGFR -6.69071 -38.8887 1_gly54_asp58 ZINC00528869 AD4-1 76 EGFR -6.54409 -45.9287 23_gly54_asp58 ZINC04687278 AD4-1025 EGFR -6.4093 -51.0833 1_gly54_asp58 ZINC00459879 AD4-1 133 EGFR -6.33665 -42.7825 23_thr100_glu105 ronda 2 ZINC004825941 AD4-1 132 EGFR -6.28522 -42.9355 23_thr100_glu105 ronda 2 ZINC04124337 AD4-1027 EGFR -6.2615 -31.6679 1_gly54_asp58 ZINC0101 1300 AD4-1 109 EGFR -6.21569 -29.4831 22_thr100_glu105- ronda 2 Similar a AD4-1 165 EGFR -6.14168 -47.3274 Similar a ZINC05257849 1_t r100_glu105 ZINC00062419 AD4- 1 108 EGFR -6.04072 -40.5308 21_gly54_asp58 CUADRO 23 (Continuación) El acoplamiento del compuesto AD4-1009 con EGFR se representa, por ejemplo, en la figura 46. El acoplamiento del compuesto AD4-1010 con EGFR se representa, por ejemplo, en la figura 45. El acoplamiento del compuesto AD4-1016 con EGFR se representa, por ejemplo, en la figura 47. El acoplamiento del compuesto AD4-1017 con EGFR se representa, por ejemplo, en la figura 48. El acoplamiento del compuesto AD4-1018 con EGFR se representa, por ejemplo, en la figura 49. El acoplamiento del compuesto AD4-1025 con EGFR se representa, por ejemplo, en la figura 43. El acoplamiento del compuesto AD4-1038 con EGFR se representa, por ejemplo, en las figuras 44A y 44B.

VEGF El análisis de los compuestos de la base de datos ZINC contra los farmacóforos identificados del cristal 1 CZ8.pdb de la proteína VEGF (SEQ ID NO: 2) en complejo con el anticuerpo pertuzumab (véase el ejemplo 4; cuadro 18), de acuerdo con los métodos antes descritos, identificó compuestos que incluyen los del cuadro 24. Se generaron puntuaciones de Glide sobre los aciertos de las preguntas de farmacóforo anteriormente descritas. Los datos resultantes se dispusieron de acuerdo con la puntuación de Glide y se seleccionaron 13 compuestos AD4 basándose en que tienen una puntuación g_score de -5.0 (o mayor), más ZINC02338377 (AD4-2008) (que tiene una g_score = -4.9156), para representar un compuesto identificado usando el farmacóforo 6n.

CUADRO 24 HER2 El análisis de los compuestos de la base de datos ZINC contra los farmacoforos identificados del cristal 1 N8Z.pdb de la proteína HER2 (SEQ ID NO: 3) en complejo con el anticuerpo trastuzumab (SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8) (véase el ejemplo 4; cuadro 19), de acuerdo con los métodos antes descritos, identificó compuestos que incluyen los del cuadro 25. Se generaron puntuaciones de Glide sobre los aciertos de las preguntas de farmacóforo anteriormente descritas. Los datos resultantes se dispusieron de acuerdo con la puntuación de Glide y se seleccionaron 18 compuestos AD4 basándose en que tienen una puntuación g_score de -6.0 (o mayor), más ZINC00177228 (AD4-3006) (que tiene una g_score = -5.8263), para representar un compuesto identificado usando el farmacóforo 3n.

CUADRO 25 ZINC # AD4 # Objetivo G_score E_model Modelo de farmacóforo ZINC02431339 AD4- HER2 -7.3043 -30.04 2b 3047 ZINC04301095 AD4- HER2 -7.273 -42.59 1 b 3035 ZINC04844436 AD4- HER2 -7.1972 -34.22 2b 3048 ZINC02874992 AD4- HER2 -7.1271 -35.43 2b 3001 ZINC02215883 AD4- HER2 -7.0761 -37.48 2b 3049 ZINC04085319 AD4- HER2 -7.0274 -41 .7 1 b 3050 ZINC02203252 AD4- HER2 -6.7834 -35.72 1 b 3051 ZINC023381 16 AD4- HER2 -6.71 16 -35.45 2b 3052 ZINC00069553 AD4- HER2 -6.6966 -35.83 2b 3005 ZINC04085335 AD4- HER2 -6.6431 -35.55 1 b 3053 ZINC05274525 AD4- HER2 -6.6279 -37.32 2b 3066 ZINC05052130 AD4- HER2 -6.5488 -36.83 2b 3036 ZINC02275796 AD4- HER2 -6.5398 -31 .77 2b 3054 ZINC02151 172 AD4- HER2 -6.2257 -35.14 1 b 3055 CUADRO 25 (Continuación) ErbB2 El análisis de los compuestos de la base de datos ZINC contra los farmacóforos identificados del cristal 1 S78.pdb de la proteína ERBB2 (SEQ ID NO: 4) en complejo con el anticuerpo pertuzumab (SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10) (véase el ejemplo 4; cuadro 19), de acuerdo con los métodos antes descritos, identificó compuestos que incluyen los del cuadro 26. Se generaron puntuaciones de Glide sobre los aciertos de las preguntas de farmacóforo anteriormente descritas. Los datos resultantes se dispusieron de acuerdo con la puntuación de Glide y se seleccionaron 17 compuestos AD4 basándose en que tienen una puntuación g_score de -7.5 (o mayor), más ZINC01800927 (AD4-3044) (que tiene una g_score = -7.3143), para representar un compuesto identificado usando el farmacóforo 5n.

CUADRO 26 ZINC # AD4 # Objetivo G_score E_mode! Modelo de farmacóforo ZINC02705114 AD4- ErbB2 -11.291 -42.61 6b 3045 ZINC00068737 AD4- ErbB2 -9.9158 -39.64 6b 3065 ZINC01237884 AD4- ErbB2 -9.4174 -37.89 6b 3040 ZINC02700145 AD4- ErbB2 -8.7023 -37.78 6b 3028 ZINC04174810 AD4- ErbB2 -8.4735 -40.81 6b 3017 ZINC00206522 AD4- ErbB2 -8.3726 -44.14 6b 3025 ZINC02671 167 AD4- ErbB2 -8.1816 -36.3 6b 3030 ZINC02755700 AD4- ErbB2 -8.1703 -43.73 6b 3018 ZINC04065004 AD4- ErbB2 -8.0536 -50.41 6b 3041 ZINC00214733 AD4- ErbB2 -8.0259 -39.94 6b 3019 ZINC04187766 AD4- ErbB2 -7.7892 -48.09 6b 3042 ZINC04825536 AD4- ErbB2 -7.7817 -44.39 6b 3031 ZINC048186 4 AD4- ErbB2 -7.7392 -39.97 6b 3033 ZINC00467700 AD4- ErbB2 -7.6976 -35.65 6b 3027 ZINC04551629 AD4- ErbB2 -7.5778 -37.9 6b 3063 ZINC01533049 AD4- ErbB2 -7.5731 -38.17 6b 3016 ZINC01800927 AD4- ErbB2 -7.3143 -58.84 5n 3044 EJEMPLO 6 Pruebas de inhibición de EGFR de los compuestos identificados de los farmacóforos Se probó la capacidad para inhibir EGFR a 25 µ? de los compuestos identificados, que representan varios modelos de farmacoforo. Los compuestos AD4 se identificaron usando modelos de farmacoforo (véase el ejemplo 4) y después se acoplaron con el sitio de unión de EGFR (SEQ ID NO: 1 ) que es reconocido por CDR's definidas de cetuximab. Después se determinó la inhibición de la unión del factor de crecimiento epidérmico por compuestos AD-4 (NovaScreen BioSciences, Hanover, Maryland). La unión de EGF se determinó a una concentración de 25 µ?. Para las pruebas del inhibidor, la KD (afinidad de unión) fue de 1 .04 nM, mientras que la Bmax (número de receptor) fue de 43.0 fmol/mg de tejido (peso húmedo). La fuente de receptor fueron membranas de hígado de rata. El radioligando fue [125I]EGF (150-200 Ci/pg) a una concentración final de ligando de 0.36 nM. Se usó un determinante no específico como EGF-[100 nM]. El compuesto de referencia y el control positivo fue EGF. Las reacciones se efectuaron en 10 mM de HEPES (pH 7.4) que contenía 0.1 % de BSA a 25 °C durante 60 minutos. La reacción se terminó mediante filtración al vacío rápida sobre filtros de fibra de vidrio. La radioactividad atrapada en los filtros se determinó y se comparó con los valores de control para evaluar cualquier interacción de los compuestos de prueba con el sitio de unión de EGF. Las pruebas de inhibidor de EGF se modificaron, por ejemplo, de Mukku (1984) J. Biol. Chem. 259, 6543-6546; Duh y otros (1990) World J. Surgery ^ 4, 410-418; Lokeshwar y otros (1989) J. Biol. Chem. 264(32), 19318- 19326. Los resultados de las pruebas de inhibición de EGFR para compuestos identificados que representan varios modelos de farmacoforo se representan en el cuadro 27.

CUADRO 27 CUADRO 27 (Continuación) CUADRO 27 (Continuación) Estructura Número Inhibición Modelo de farmacóforo AD4 de EGFR AD4-1 150 43.07% Pharm1_gly54_asp58 AD4-1010 39.40% Pharm2_thr100_glu105 AD4-1 139 38.97% Pharm22_thr100_glu105 AD4-1022 38.57% Pharm 11 _gly54_asp58 COOH AD4-1027 38.57% Pharm 11 _gly54_asp58 OH AD4-1 128 38.05% Pharm23_gly54_asp58 H3C ° CUADRO 27 (Continuación) CUADRO 27 (Continuación) CUADRO 27 (Continuación^ CUADRO 27 (Continuación) EJEMPLO 7 Compuesto AD4-1025 El AD4-1025 (N1-(4-clorofenil)-N2-(3-piridinilmetil)-alfa-asparagina; Fórmula: C16H16CIN303; peso molecular: 333.78) es un inhibidor de la unión del factor del crecimiento epidérmico (EGF) al receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR (SEQ ID NO: 1 )) Fórmula (6) A una concentración de 25 µ? de AD4-1025, la unión de EGF a EGFR (SEQ ID NO: 1 ) es inhibida en 75.7% (véase por ejemplo el ejemplo 6). La estructura de cristal de proteína de cetuximab en complejo con EGFR ha sido reportada por Ferguson y otros ((2005) Cáncer Cell 7, 301 -31 1 ), y los datos cristalográficos se depositaron en el banco de datos de proteína como PDB código 1 YY9 ("1 YY9.pdb"). El AD4- 025 se identificó usando la información de la estructura de cristal de la proteína 1 YY9 para diseñar un modelo de farmacóforo (véase el ejemplo 4). El modelo, Pharm1 _gly54_asp58, se utilizó para identificar moléculas pequeñas que se unen a EGFR. El sitio sobre la proteína EGFR es reconocido por los residuos de aminoácido GLY-54 a ASP-58 del anticuerpo cetuximab (SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO:6) (Erbitux). El Pharm1_gly54_asp58 es modelado después de los residuos GLY-54 a ASP-58 y diseñado como una herramienta para identificar moléculas pequeñas que tienen características y componentes del anticuerpo cetuximab. Específicamente, esta región es definida como la CDR H2 de la cadena pesada de anticuerpo de cetuximab. Las características y componentes de estos residuos de aminoácido de cetuximab se usaron para crear un modelo de farmacóforo. Las características (F) y componentes de farmacóforo de Pharm1_gly54_asp58 incluyen: F1 :Aro -un componente de centro de anillo aromático con un radio esférico de 1 .2 Angstrom colocado para interaccionar con ARG353 de EGFR; F2:Aro2 - un componente de centro de anillo aromático con un radio esférico de 1 .5 Angstrom colocado para modelar la direccionalidad proyectada para interaccionar con AGR353 de EGFR; F3:Acc&Ani - un componente de aceptor de enlace de hidrógeno y anión con radios esféricos de 1 .2 Angstrom colocados para modelar el carbonilo de GLY-54 de cetuximab; F4:Acc2 - un componente de aceptor de enlace de hidrógeno con un radio esférico de 1 .5 Angstrom colocado para modelar la direccionalidad del par único de electrones del grupo carbonilo de GLY54 de cetuximab, que es observado en la estructura de cristal de proteína PDB:1 YY9 para acoplamiento con un enlace de hidrógeno con ARG353 de EGFR; F5:Acc&Ani - un componente de aceptor de enlace de hidrógeno y anión con radios esféricos de 1 .4 Angstrom colocados para modelar los átomos de oxígeno de carboxilato de ASP-58 de cetuximab; y F6:Acc - un componente de aceptor de enlace de hidrógeno con un radio esférico de 1 .2 Angstrom colocado para modelar la direccionalidad del par único de electrones del carbonilo de la amida de THR57 (véase por ejemplo el cuadro 17; figura 8). Para el farmacóforo 10, no todos los componentes son esenciales al mismo tiempo. El modelo de farmacoforo Pharm1 _gly54_asp58 permite una coincidencia parcial de 5 de las 6 características y componentes. Adicionalmente, se incorpora una característica conocida como restricciones de volumen excluido en Pharm1 _gly54_asp58. Las restricciones de volumen excluido se usan para excluir el espacio ocupado por la proteína objetivo, en este caso EGFR. Para restringir la geometría de las moléculas pequeñas identificadas durante una consulta de farmacoforo, se colocó un grupo de esferas "falsas" para ocupar la posición de los átomos de la proteína objetivo. Estos se pueden observar en la figura 42 como las esferas de color gris oscuro. Esta representación se usa para aproximarse a la topología de superficie de la proteína objetivo EGFR (véase por ejemplo la figura 42). Se identificaron moléculas pequeñas usando una búsqueda basada en farmacoforo de una base de datos de 850,000 compuestos comerciales (véase el ejemplo 4). Los compuestos identificados por Pharm1 _gly54_asp58 se acoplaron después in silico (véase el ejemplo 5) con los residuos de aminoácido del sitio de unión de EGFR (véase la figura 43 por ejemplo), para proveer una lista de inhibidores alcanzados. Usando el farmacoforo designado como Pharm1_gly54_asp58 para modelar los aminoácidos GLY54 a ASP58 de cetuximab, se identificó el compuesto AD4-1025. El análisis ulterior demostró que el compuesto AD4-1025 inhibió EGFR en 76% a 25 µ?. Una representación ejemplar del acoplamiento de AD4- 025 con los residuos de aminoácido del sitio de unión de EGFR se provee en la figura 43.

Otros inhibidores de EGFR de molécula pequeña identificados con Pharm1_gly54_asp58 incluyeron: AD4-1020 (48% de inhibición a 25 pM); AD4- 021 (43% de inhibición a 25 pM); AD4-1020 (48% de inhibición a 25 pM); AD4-1027 (39% de inhibición a 25 pM); AD4-1022 (39% de inhibición a 25 pM); AD4-1030 (38% de inhibición a 25 pM); y AD4-1039 (32% de inhibición a 25 pM).

EJEMPLO 8 Compuesto AD4-1038 El AD4-1038 (ácido {2-[(4-hidroxi-fenil)-metil-amino]-4-oxo-4,5-dihidro-tiazol-5-il}-acético; Fórmula: Ci2H 2N2O4S; peso molecular: 280.30) es un inhibidor de la unión del factor de crecimiento epidérmico (EGF) al receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR (SEQ ID NO: 1 )).

Fórmula (13) A una concentración de 25 pM de AD4-1038, la unión de EGF a EGFR fue inhibida en 70.7% (véase el ejemplo 6). El modelo, Pharm1_thr100_glu105, se utilizó para identificar pequeñas moléculas que se unen a EGFR. El sitio sobre la proteína EGFR es reconocido por los residuos de aminoácido THR100_GLU105 del anticuerpo cetuximab (SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO:6) (Erbitux). El Pharm1 _thr100_glu105 fue modelado después de los residuos de aminoácido de cetuximab THR-100 a GLU-105, y se diseñó como una herramienta para identificar moléculas pequeñas que tienen características y componentes del anticuerpo cetuximab. Específicamente, esta región es definida como la CDR H3, que se localiza en la cadena pesada del anticuerpo cetuximab. Se usaron las características y componentes de estos residuos de aminoácido de cetuximab para crear un modelo de farmacóforo. Las características (F) y componentes de farmacóforo de Pharm1_thr100_glu105 incluyen F1 -F8 (véase por ejemplo cuadro 17; figura 14). Una representación ejemplar del acoplamiento de AD4-1038 con los residuos de aminoácido del sitio de unión de EGFR se da en las figuras 44A y 44B. Otro inhibidor de EGFR de molécula pequeña identificado con Pharm1_thr100_glu105 fue AD4-1009 (35.01 % de inhibición a 25 µ?).

EJEMPLO 9 Compuesto AD4-1010 El AD4-1010 (4-(4-hidroxifenil)-6-metil-N-(3-metilfenil)-2-oxo-1 ,2,3,4-tetrahidro-5-pirimidincarboxamida; Fórmula: C19H19N3O3; Peso molecular: 337.37)) es un inhibidor de la unión del factor de crecimiento epidérmico (EGF) al receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR (SEQ ID NO: 1 )).

Fórmula (31 ) A una concentración de 25 µ? de AD4-1010, la unión de EGF a EGFR fue inhibida en 39.40% (véase el ejemplo 6). La estructura del cristal de proteína de cetuximab en complejo con EGFR fue reportada por Ferguson y otros (2005) {Cáncer Cell 7, 301 -31 1 ), y los datos cristalográficos se depositaron en el banco de datos de proteína como PDB código 1 YY9 ("1 YY9.pdb"). El AD4-1010 se identificó usando información de la estructura del cristal de proteína 1 YY9 para diseñar otro modelo de farmacóforo. Este modelo se usó para identificar un grupo diferente de inhibidores de EGFR. El sitio sobre la proteína EGFR es reconocido por los residuos de aminoácido TYR-101 a TYR-104 del anticuerpo cetuximab (SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6) (Erbitux). Pharm2_thr100_glu105 se modeló después de los residuos TYR-101 a TYR104 y se diseñó como una herramienta para identificar moléculas pequeñas que tienen las características y componentes del anticuerpo cetuximab (véase el ejemplo 4). Específicamente, esta región es definida como la CDR H3 de la cadena pesada del anticuerpo. Las características y componentes de estos residuos de aminoácido de cetuximab se usaron para crear el modelo de farmacóforo Pharm2_thr100_glu105 (véase el ejemplo 4). Las características (F) y componentes de farmacóforo incluyen: F1 : Don&Acc -un componente de donador de enlace de hidrógeno y aceptor de enlace de hidrógeno con un radio esférico de 0.8 Angstrom colocado para modelar el hidroxilo de TYR- 02 de cetuximab; F2: Aro -un componente de anillo aromático con un radio esférico de 1 .2 Angstrom colocado para modelar el anillo de fenilo de TYR-102 de cetuximab; F3: Acc -un componente aceptor de enlace de hidrógeno con un radio esférico de 0.8 Angstrom colocado para modelar el oxígeno del carbonilo de TYR-102; F4 y F5: Acc&Ani -componentes de aceptor de enlace de hidrógeno y anión con radios esféricos de 0.8 Angstrom, colocados para modelar los átomos de oxígeno del carboxilato de ASP-103 de cetuximab; F6: Don&Acc -un componente de donador de enlace de hidrógeno y aceptor de enlace de hidrógeno con un radio esférico de 0.8 Angstrom colocado para modelar el hidroxilo de TYR- 04 de cetuximab; y F7: Aro -un componente de anillo aromático con un radio esférico de 1 .2 Angstrom colocado para modelar el anillo de fenilo de TYR-104 de cetuximab (véase el cuadro 17; figura 15). Para el farmacóforo no todos los componentes son esenciales al mismo tiempo. Se permite una coincidencia parcial de 5 de las 7 características y componentes. Por ejemplo, en la figura 15 se muestra una representación de Pharm2_thr100_glu105 sobrepuesta con los residuos de TYR-100 y TYR- 04 de la estructura de cristal de la proteína cetuximab. AD4-1010 se identificó por medio de una búsqueda de compuestos comerciales usando Pharm2_thr100_glu105. En la figura 45 se da una representación ejemplar del acoplamiento de AD4-1010 con los residuos de aminoácido del sitio de unión de EGFR.

EJEMPL0 10 AP4-1020 AD4-1020 (ácido {5-[4-(benciloxi)fenil]-2H-tetrazol-2-il}acético; Fórmula: C 6Hi N403; Peso molecular: 310.31 ) es un inhibidor de la unión del factor de crecimiento epidérmico (EGF) a su receptor (EGFR (SEQ ID NO: 1 )).

AQ4-1020 Fórmula (28) A una concentración de 25 µ? de AD4-1020, la unión de EGF a EGFR fue inhibida en 47.8% (véase el ejemplo 6). La estructura del cristal de proteína de cetuximab en complejo con EGFR fue reportada por Ferguson y otros (2005) (Cáncer Cell 7, 301 -31 1 ), y los datos cristalográficos se depositaron en el banco de datos de proteína como PDB código 1 YY9 ("1 YY9.pdb"). El AD4-1020 se identificó usando información de la estructura del cristal de proteína 1 YY9 para diseñar otro modelo de farmacóforo. Este modelo se usó para identificar un grupo diferente de inhibidores de EGFR. El sitio sobre la proteína EGFR es reconocido por los residuos de aminoácido GLY-54 a ASP-58 del anticuerpo cetuximab (SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6) (Erbitux). Pharm1_gly54_asp58 se modeló después de los residuos GLY-54 a ASP-58 y se usó para identificar moléculas pequeñas que tienen las características y componentes del anticuerpo cetuximab (véase el ejemplo 4). Específicamente, esta región es definida como la CDR H2 de la cadena pesada del anticuerpo. Las características y componentes de estos residuos de aminoácido de cetuximab se usaron para crear el modelo de farmacóforo Pharm1_gly54_asp58 (véase el ejemplo 4). Las características (F) y componentes de farmacóforo incluyen: F1 Aro -derivado de estadística de contacto hidrofóbico, interacción coulómbica favorable con la guanidina de Arg353 del receptor; F2 Aro2 direccionalidad de F1 con respecto a la guanidina de Arg353; F3 Acc&Ani -derivado del carbonilo de esqueleto de Gly54 del anticuerpo cetuximab, el aceptor acepta un enlace de H del mismo o el anión forma un puente de sal con la guanidina de Arg353 del receptor; F4 Acc2 -direccionalidad de F3 con respecto a la guanidina de Arg353; F5 Acc&Ani -derivado del carboxilato lateral de Asp58, el aceptor acepta un enlace de H del mismo o el anión forma un puente de sal con NH3+ de Lys 443 de cadena lateral del receptor; F6 Acc -derivado de estadística de contacto hidrof ílico, acepta un enlace de H del OH de cadena lateral de Ser448 del receptor; V1 -volúmenes excluidos (no mostrados para dar claridad). Para el farmacóforo no todos los componentes son esenciales al mismo tiempo. Se permite una coincidencia parcial de 5 de las 6 características y componentes. Por ejemplo, en la figura 8 se muestra una representación de Pharm1_gly54_asp58 sobrepuesta con los residuos de GLY-54 a ASP-58 de la estructura de cristal de la proteína cetuximab. AD4-1020 se identificó por medio de una búsqueda de compuestos comerciales usando Pharm1_gly54_asp58. En la figura 50 se da una representación ejemplar del acoplamiento de AD4-1020 con los residuos de aminoácido del sitio de unión de EGFR.

EJEMPLO 11 AD4-1132 AD4-1 132 (ácido (2-{[(2,4-dimetilfenoxi)acetil]amino}-5-hidroxibenzoico); Fórmula: C17H17NO5; Peso molecular: 315.32) es un inhibidor de la unión del factor de crecimiento epidérmico (EGF) a su receptor (EGFR (SEQ ID NO: 1 )).

AD4-D132 Fórmula (24) A una concentración de 25 µ? de AD4-1 132, la unión de EGF a EGFR fue inhibida en 59.6% (véase el ejemplo 6). La estructura del cristal de proteína de cetuximab en complejo con EGFR fue reportada por Ferguson y otros (2005) {Cáncer Cell 7, 301 -31 1 ), y los datos cristalográficos se depositaron en el banco de datos de proteína como PDB código 1 YY9 ("1YY9.pdb"). El AD4-1 132 se identificó usando información de la estructura del cristal de proteína 1YY9 para diseñar otro modelo de farmacóforo. Este modelo se usó para identificar un grupo diferente de inhibidores de EGFR. El sitio sobre la proteína EGFR es reconocido por los residuos de aminoácido GLY-54 a ASP-58 del anticuerpo cetuximab (SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6) (Erbitux). Pharm23_gly54_asp58 se modeló después de los residuos GLY-54 a ASP-58 y se usó para identificar moléculas pequeñas que tienen las características y componentes del anticuerpo cetuximab (véase el ejemplo 4). Específicamente, esta región es definida como la CDR H2 de la cadena pesada del anticuerpo. Las características y componentes de estos residuos de aminoácido de cetuximab se usaron para crear el modelo de farmacóforo Pharm23_gly54_asp58 (véase el ejemplo 4). Las características (F) y componentes de farmacóforo incluyen: F1 Don -derivado del NH2 de cadena lateral de Asn56 del anticuerpo, forma un enlace de H con el OH de Ser418 de cadena lateral del receptor; F2 Acc&Ani -derivado del carbonilo de esqueleto de Gly54 del anticuerpo cetuximab, el aceptor acepta un enlace de H del mismo o el anión forma un puente de sal con la guanidina de Arg353 del receptor; F3 Acc2 -direccionalidad de F3 con respecto a la guanidina de Arg353; F4 Acc&Ani -derivado del carboxilato de cadena lateral de Asp58 del anticuerpo, aceptando un enlace de H del mismo o formando un puente de sal con NH3+ de Lys443 del receptor; F5 Don -derivado del NH de esqueleto de Gly54 del anticuerpo, formando un enlace de H con el carbonilo de cadena lateral de Gln384 del receptor; F6 Aro -derivado de estadística de contacto hidrofóbico, interacción coulombica favorable con la guanidina de Arg353 del receptor, esencial; y F7 Aro2 -direccionalidad de F6 con respecto a la guanidina de Arg353. Para el farmacóforo no todos los componentes son esenciales al mismo tiempo. Se permite una coincidencia parcial de 5 de las 7 características y componentes. Por ejemplo, en la figura 12 se muestra una representación de Pharm23_gly54_asp58 sobrepuesta con los residuos de GLY-54 a ASP-58 de la estructura de cristal de la proteína cetuximab. AD4-1 132 se identificó por medio de una búsqueda de compuestos comerciales usando Pharm23_gly54_asp58. En las figuras 55A, 55B y 56 se da una representación ejemplar del acoplamiento de AD4-1 132 con los residuos de aminoácido del sitio de unión de EGFR.

EJEMPLO 12 AD4-1142 AD4-1 142 (ácido (5-{[(4-etilfenil)sulfonil]amino}-2- hidroxibenzoico); Fórmula: C^H^NOsS; Peso molecular: 321 .35) es un inhibidor de la unión del factor de crecimiento epidérmico (EGF) a su receptor (EGFR (SEQ ID NO: 1 )). La estructura de AD4-1 142 es la siguiente: Fórmula (30) A una concentración de 25 µ? de AD4-1 142, la unión de EGF a EGFR fue inhibida en 49.8% (véase el ejemplo 6). La estructura del cristal de proteína de cetuximab en complejo con EGFR fue reportada por Ferguson y otros (2005) (Cáncer Cell 7, 301 -31 1 ), y los datos cristalográficos se depositaron en el banco de datos de proteína como PDB código 1 YY9 ("1 YY9.pdb"). El AD4-1 142 se identificó usando información de la estructura del cristal de proteína 1 YY9 para diseñar otro modelo de farmacóforo. Este modelo se usó para identificar un grupo diferente de inhibidores de EGFR. El sitio sobre la proteína EGFR es reconocido por los residuos de aminoácido GLY-54 a ASP-58 del anticuerpo cetuximab (SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6) (Erbitux). Pharm23_gly54_asp58 se modeló después de los residuos GLY-54 a ASP-58 y se usó para identificar moléculas pequeñas que tienen las características y componentes del anticuerpo cetuximab (véase el ejemplo 4). Específicamente, esta región es definida como la CDR H2 de la cadena pesada del anticuerpo. Las características y componentes de estos residuos de aminoácido de cetuximab se usaron para crear el modelo de farmacóforo Pharm23_gly54_asp58 (véase el ejemplo 4). Las características (F) y componentes de farmacóforo incluyen: F1 Don -derivado del NH2 de Asn56 de cadena lateral del anticuerpo, forma un enlace de H con el OH de cadena lateral de Ser418 del receptor; F2 Acc&Ani -derivado del carbonilo de esqueleto de Gly54 del anticuerpo cetuximab, el aceptor acepta un enlace de H del mismo o el anión forma un puente de sal con la guanidina de Arg353 del receptor; F3 Acc2 -direccionalidad de F3 con respecto a la guanidina de Arg353; F4 Acc&Ani -derivado del carboxilato de cadena lateral de Asp58 del anticuerpo, aceptando un enlace de H del mismo, o formando un puente de sal con NH3+ de Lys443 del receptor; F5 Don -derivado del NH de esqueleto de Gly54 del anticuerpo, formando un enlace de H con el carbonilo de cadena lateral de Gln384 del receptor; F6 Aro -derivado de estadística hidrofóbica de contacto, interacción coulómbica favorable con la guanidina de Arg353 del receptor, esencial; y F7 Aro2 -direccionalidad de F6 con respecto a la guanidina de Arg353. Para el farmacóforo no todos los componentes son esenciales al mismo tiempo. Se permite una coincidencia parcial de 5 de las 7 características y componentes. Por ejemplo, en la figura 12 se muestra una representación de Pharm23_gly54_asp58 sobrepuesta con los residuos de GLY-54 a ASP-58 de la estructura de cristal de la proteína cetuximab. AD4-1 142 se identificó por medio de una búsqueda de compuestos comerciales usando Pharm23_gly54_asp58. En las figuras 57A, 57B y 58 se da una representación ejemplar del acoplamiento de AD4-1 142 con los residuos de aminoácido del sitio de unión de EGFR.

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES

1 . - Un método para producir una estructura molecular que tiene una actividad farmacéutica deseada con respecto a una biomolécula objetivo, que comprende los pasos de: proveer por lo menos una proteína del sistema inmune que se une específicamente a una biomolécula objetivo; determinar la identidad y orientación espacial de por lo menos una porción de los átomos de la proteína del sistema inmune, en donde la interacción de por lo menos una porción de los átomos de la proteína del sistema inmune con un sitio de unión de la biomolécula objetivo, resulta en su unión a la misma; y construir un farmacoforo, en donde el farmacoforo comprende un modelo de por lo menos una característica farmacofórica que se aproxima a por lo menos una parte de la identidad y orientaciones espaciales de los átomos de la proteína del sistema inmune, que se une específicamente a la proteína del sistema inmune, de tal manera que las características estructurales del farmacoforo son complementarias al sitio de unión de la biomolécula objetivo.

2. - El método que se reclama en la reivindicación 1 , que además comprende el paso de: identificar una molécula candidata con una pregunta de hipótesis de farmacoforo de una base de datos de moléculas de ligando anotadas, en donde un compuesto candidato identificado tiene una estructura que sustancialmente se alinea por lo menos con una característica farmacofórica.

3. - El método que se reclama en la reivindicación 2, que además comprende el paso de: determinar una afinidad de acoplamiento de la molécula candidata por el sitio de unión de la biomolécula objetivo; en donde la afinidad de acoplamiento se cuantifica por la energía ganada por la interacción de la molécula candidata con la biomolécula objetivo, la energía requerida para lograr la conformación acoplada con respecto a la conformación de menor energía, o una combinación de las mismas.

4. - El método que se reclama en la reivindicación 1 , en donde la proteína del sistema inmune tiene la capacidad de alterar la actividad de la biomolécula objetivo.

5. - El método que se reclama en la reivindicación 4, en donde la proteína del sistema inmune tiene la capacidad de inhibir la actividad de la biomolécula objetivo.

6. - El método que se reclama en la reivindicación 4, en donde el paso de proveer por lo menos una proteína del sistema inmune que se une específicamente a una biomolécula objetivo y tiene la capacidad de alterar la actividad de la biomolécula objetivo, comprende los pasos de: proveer una prueba en la cual la biomolécula objetivo exhibe una actividad que imita la actividad in vivo; exponer una pluralidad de proteínas del sistema inmune que tienen afinidad de unión por la biomolécula objetivo a la biomolécula objetivo en la prueba; y seleccionar por lo menos una proteína del sistema inmune que tenga la capacidad de alterar la actividad de la biomolécula objetivo en la prueba.

7. - El método que se reclama en la reivindicación 1 , en donde la proteína del sistema inmune que se une específicamente a la biomolécula objetivo, también se une a por lo menos una biomolécula relacionada que difiere de la biomolécula objetivo en porciones de la misma, pero en donde la biomolécula relacionada retiene porciones similares o idénticas de la estructura y actividad de la biomolécula objetivo.

8. - El método que se reclama en la reivindicación 1 , en donde la proteína del sistema inmune es por lo menos una del grupo que consiste en un complejo de histocompatibilidad mayor, un receptor de células T, un receptor de células ß, y un anticuerpo.

9. - El método que se reclama en la reivindicación 8, en donde la proteína del sistema inmune es por lo menos un anticuerpo monoclonal. 0. - El método que se reclama en la reivindicación 9, en donde la determinación de las identidades y orientaciones espaciales de por lo menos una porción de los átomos del anticuerpo monoclonal, comprende determinar las identidades y orientaciones espaciales de por lo menos una porción de los átomos de una punta de unión del anticuerpo monoclonal. . - El método que se reclama en la reivindicación 10, en donde las identidades y orientaciones espaciales son determinadas para una porción sustancial de los átomos de la punta de unión del anticuerpo monoclonal. 12. - El método que se reclama en la reivindicación 1 , en donde las características de farmacóforo comprenden por lo menos una característica seleccionada del grupo que consiste en hidrofóbica, aromática, un aceptor de enlace de hidrógeno, un donador de enlace de hidrógeno, un catión, y un anión. 13.- El método que se reclama en la reivindicación 1 , en donde la biomolécula objetivo es una proteína. 14.- El método que se reclama en la reivindicación 13, en donde la biomolécula objetivo es una enzima, una proteína de señalización, o una proteína receptora. 15. - El método que se reclama en la reivindicación 1 , en donde la biomolécula objetivo se selecciona del grupo que consiste en el agente causante de la fiebre aftosa, angiotensina II; ErB2; aglutinina de la influenza; hemaglutinina de la influenza; neuraminidasa de la influenza; interíerón gamma; HER2; Neisseria meningitidis; proteasa de VIH1 ; transcriptasa inversa de VIH-1 ; rinovirus; receptor de fibrinógeno de plaqueta; oligosacárido de Salmonella; TGF-a; trombopoyetina; factor de tejido; factor de Von Willenbrand; VEGF; coronavirus (SARS); el agente causante de la enfermedad de Lyme; GP120 de VIH; GP41 de VIH; virus del Nilo occidental; dihidrofolato reductasa; y EGFR. 16. - El método que se reclama en la reivindicación 15, en donde la biomolécula objetivo se selecciona del grupo que consiste en EGFR, VEGF, HER2 y ErbB2. 17. - El método que se reclama en la reivindicación 16, en donde la biomolécula objetivo es EGFR. 18. - El método que se reclama en la reivindicación 1 , en donde el paso de determinar las identidades y orientaciones espaciales de por lo menos una porción de los átomos de la proteína del sistema inmune, comprende el análisis de datos cristalográficos de rayos X derivados de una forma cristalina de la proteína del sistema inmune. 19.- El método que se reclama en la reivindicación 18, en donde los datos cristalográficos de rayos X derivan de una forma cristalina de la proteína del sistema inmune enlazada a la biomolécula objetivo. 20. - El método que se reclama en la reivindicación 1 , en donde el paso de determinar la identidad y orientación espacial de por lo menos una porción de los átomos de la proteína del sistema inmune, comprende los pasos de: determinar la secuencia de péptidos de la proteína del sistema inmune; producir un modelo virtual de la estructura tridimensional de la proteína del sistema inmune; y analizar el modelo virtual de la estructura tridimensional de la proteína del sistema inmune, a fin de determinar la identidad y orientación espacial de por lo menos una porción de los átomos de la proteína del sistema inmune, que interacciona con el sitio de unión de la biomolécula objetivo resultando en la unión a la misma. 21 . - Un método para producir una entidad molecular que tiene una actividad farmacéutica deseada con respecto a una biomolécula objetivo, que comprende los pasos de: (i) proveer por lo menos un anticuerpo monoclonal, en donde el anticuerpo monoclonal se une específicamente a una biomolécula objetivo e inhibe la actividad de la biomolécula objetivo, en donde el anticuerpo monoclonal comprende una punta de unión, y en donde la punta de unión comprende una pluralidad de átomos que interaccionan con un sitio de unión de la biomolécula objetivo, resultando en la unión a la misma; (ii) determinar la identidad y orientación espacial de una porción sustancial de los átomos de la punta de unión que interaccionan con el sitio de unión de la biomolécula objetivo, en donde dicha determinación de la identidad y orientación espacial comprende el análisis de datos cristalográficos de rayos X derivados de una forma cristalina del anticuerpo monoclonal enlazado a la biomolécula objetivo; (iii) construir un farmacóforo, en donde el farmacóforo comprende una pluralidad de características farmacoforicas, en donde la pluralidad de características farmacoforicas se aproxima a la identidad y orientación espacial de por lo menos aproximadamente 75% de los átomos de la punta de unión del anticuerpo monoclonal, que interaccionan con el sitio de unión de la biomolécula objetivo, en donde la pluralidad de características farmacoforicas es complementaria al sitio de unión de la biomolécula objetivo, y en donde la pluralidad de características farmacoforicas comprende por lo menos una característica seleccionada del grupo que consiste en hidrofóbica, aromática, un aceptor de enlace de hidrógeno, un donador de enlace de hidrógeno, un catión, y un anión; y (iv) identificar una molécula candidata con una pregunta de hipótesis de farmacóforo en una base de datos de moléculas de ligando anotadas, en donde el compuesto candidato identificado tiene una estructura que se alinea sustancialmente con al menos una característica del farmacóforo, en donde la molécula candidata inhibe la actividad de la biomolécula objetivo, y en donde la biomolécula objetivo es una enzima, una proteína de señalización, o una proteína receptora. 22.- Una composición farmacéutica para la inhibición de EGFR, que comprende por lo menos un inhibidor de EGFR seleccionado del grupo que consiste en los compuestos de las fórmulas (1 ), (7), (14), (19) y (25), incluyendo estereoisomeros o formas polimorficas de los mismos, y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable: Fórmula (1 ) Fórmula (7) Fórmula (14) Fórmula (19) Fórmula (25) en donde S1 -S8 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en halógeno, hidroxilo, sulfhidrilo, carboxilato, alquilo, cicloalquilo, arilo y alcoxi (-OR); X se selecciona del grupo que consiste en H2, O, S, N-R, N-OH, y N-NR2; Het es uno o mas átomos de N en cualquier posición del anillo; Z se selecciona del grupo que consiste en -COOH, -PO3H2, SO3H, anillo de tetrazol, sulfonamida, acil-sulfonamida, -CONH2, y -CONR2; y R es un grupo alquilo de cadena recta o ramificada de C1 -C6, sustituido opcionalmente con un halógeno, hidroxilo, sulfhidrilo, carboxilato, arilo, heteroarilo, amino, amino sustituido, o cicloamino que contiene uno, dos, o tres átomos de N en un anillo de 5 o 6 miembros. 23.- El uso de por lo menos una composición farmacéutica como la que se reclama en la reivindicación 22, en la fabricación de un medicamento útil para el tratamiento de una enfermedad o condición asociada con EGFR en un mamífero. 24.- El uso que se reclama en la reivindicación 23, en donde el inhibidor de EGFR se selecciona del grupo que consiste en los compuestos de las fórmulas (6), (13), (18), (24) y (30), o estereoisómeros o formas polimórficas de los mismos: Fórmula (6) Fórmula (13) AC-MC20 Fórmula (18) AD4-1132 Fórmula (24) Fórmula (30)