KR20210142092A - 에피토프 및 파라토프를 확인하는 방법 - Google Patents

에피토프 및 파라토프를 확인하는 방법 Download PDF

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KR20210142092A
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앤드류 엠. 울라콧
루크 로빈슨
부파티 라마크리쉬난
하미드 티시어
카르틱 비스와나탄
재커리 슈라이버
그레고리 밥콕
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비스테라, 인크.
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Abstract

본 발명에서는 표적 폴리펩타이드 상의 에피토프를 확인하는 방법 및 항체 상의 파라토프를 확인하는 방법이 개시된다.

Description

에피토프 및 파라토프를 확인하는 방법
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2018년 12월 24일에 출원된 미국 특허 가출원 제62/784,617호의 이익을 주장한다. 상기 출원의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
기술 분야
본 발명은 에피토프 및 파라토프를 확인하는 방법에 관한 것이다.
항체는 높은 특이성 및 친화도로 표적 항원에 결합한다. 분자적으로, 결합은 결합이 발생하기 위해 에너지적으로 유리한 상호작용에 기여하는, 항체(파라토프) 및 항원(에피토프)의 아미노산 세트에 의해 촉진된다. 항체-항원 상호작용을 조절하는 구조적 특징을 결정하는 것은 항체의 작용 메커니즘을 이해하고 항체 공학적 노력을 돕는 기준으로서 중요하다. X-선 공결정학(co-crystallography)은 항체-항원 복합체의 구조를 결정하는 선도적인 방법으로서, 구조 파라토프와 에피토프를 고분해능으로 자세히 설명한다. 그러나, 고분해능 공결정 구조를 달성하려면, 상당한 자원, 처리량 및 전문적인 기술 지식이 필요하다. 파라토프 및 에피토프를 특성화하는 다른 방법은 더 많은 처리량 및 실험적 접근성을 제공하지만, 일반적으로 분해능과 상충관계(tradeoff of resolution)가 발생한다. 경쟁 결합에 의한 에피토프 비닝(binning) 또는 알라닌 스캐닝에 의한 에피토프 특성화는 각각 결정학보다 더 빠른 속도 및 처리량을 제공하지만, 결정학에서와 같이 분자 세부 사항 또는 포괄적인 특성화를 제공할 수 없다. 따라서, 항체와 그의 인식되는 항원 사이의 에피토프 및 파라토프 영역을 확인하는 개선된 방법이 관련 기술 분야에 필요하다.
한 측면에서, 본 개시내용은 표적 폴리펩타이드(예를 들어, 본원에서 설명되는 표적 폴리펩타이드) 상의 에피토프를 확인하는 방법을 특징으로 하며, 상기 방법은
(a) 항체 분자(예를 들어, 본원에서 설명되는 항체 분자)를 표적 폴리펩타이드의 복수의 변이체에 결합시키는 단계;
(b) 항체 분자에 대해 변경된(예를 들어, 감소된) 결합을 나타내는 복수의 변이체를 수득(예를 들어, 농축)하는 단계;
(c) 복수의 수득된(예를 들어, 농축된) 변이체 각각에 대한 농축 점수를 결정(예를 들어, 계산)하는 단계;
(d) 항체 분자-표적 폴리펩타이드 도킹(docking) 모델을 생성하는 단계로서, 여기서 항체 분자-표적 폴리펩타이드 도킹 모델은 농축 점수에 따라 제약되는(constrained) 것인 단계; 및
(e) 항체 분자-표적 폴리펩타이드 도킹 모델에 기초하여 항체 분자에 의해 결합될 수 있는 표적 폴리펩타이드 상의 부위를 확인함으로써, 표적 폴리펩타이드 상의 에피토프를 확인하는 단계
를 포함한다.
한 실시양태에서, 변경된 결합은 변경된 결합 친화도, 예를 들어 감소된 결합 친화도를 포함한다.
한 실시양태에서, 단계 (a)는 항체 분자를 표적 폴리펩타이드의 복수의 변이체를 디스플레이하는 라이브러리에 결합시키는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 단계 (a)는 표적 폴리펩타이드의 복수의 변이체를 발현(예를 들어, 디스플레이)하는 복수의 세포를 포함하는 라이브러리에 항체 분자를 결합시키는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 복수의 세포는 각각 표적 폴리펩타이드의 대략 하나의 별개의 변이체를 발현한다. 한 실시양태에서, 세포는 진핵 세포, 예를 들어 효모 세포이다.
한 실시양태에서, 복수의 변이체는 표적 폴리펩타이드의 하나 이상의 표면 잔기 상의 돌연변이를 포함한다. 한 실시양태에서, 복수의 변이체는 표적 폴리펩타이드의 선택된 표면 잔기의 별개의 돌연변이를 포함한다. 한 실시양태에서, 복수의 변이체는 표적 폴리펩타이드의 복수의 선택된 표면 잔기 각각의 별개의 돌연변이를 포함한다.
한 실시양태에서, 복수의 변이체는 표적 폴리펩타이드의 야생형 아미노산 서열에 비해 단일 아미노산 치환을 포함한다. 한 실시양태에서, 복수의 변이체는 각각 표적 폴리펩타이드의 야생형 아미노산 서열에 비해 단일 아미노산 치환을 포함한다. 한 실시양태에서, 단일 아미노산 치환은 표적 폴리펩타이드의 표면 잔기에서 발생한다.
한 실시양태에서, 변경된(예를 들어, 감소된) 결합은 야생형 표적 폴리펩타이드 및 항체에 대해 검출된 결합에 비해 변이체 및 항체 분자에 대해 검출된 결합의 변경(예를 들어, 감소)을 포함한다.
한 실시양태에서, 단계 (b)는 야생형 표적 폴리펩타이드가 나타내는 항체 분자에 대한 결합의 약 80% 미만(예를 들어, 약 0.01%, 0.1%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% 또는 80% 미만)을 나타내는 변이체를 수득(예를 들어, 농축)하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 감소된 결합은 야생형 표적 폴리펩타이드가 나타내는 결합의 적어도 약 20%(예를 들어, 적어도 약 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%)이다.
한 실시양태에서, 단계 (b)는 야생형 표적 폴리펩타이드를 포함하는 세포가 나타내는 항체 분자에 대한 결합의 약 80% 미만(예를 들어, 약 0.01%, 0.1%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% 또는 80% 미만)을 나타내는 세포를 수득(예를 들어, 농축)하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 감소된 결합은 야생형 표적 폴리펩타이드를 포함하는 세포가 나타내는 결합의 적어도 약 20%(예를 들어, 적어도 약 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%)이다.
한 실시양태에서, 단계 (b)는 항체 분자에 대한 감소된 결합을 나타내는 변이체에 대해 1회 이상, 예를 들어 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10회 또는 그 초과의 농축을 수행하는 것을 포함한다.
한 실시양태에서, 방법은 예를 들어 단계 (c) 전에, 예를 들어 차세대 서열 분석에 의해, 예를 들어 변이체를 코딩하는 유전자를 서열 분석함으로써 항체 분자에 대한 변경된(예를 들어, 감소된) 결합을 나타내는 변이체를 확인하는 단계를 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, 단계 (c)는 복수의 수득된(예를 들어, 농축된) 변이체 각각에 대한 발생 빈도를 결정하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 단계 (c)는 특정 잔기에서 별개의 돌연변이를 포함하는 각각의 변이체의 발생 빈도를 집계하는 것 및/또는 더 높은 발생 빈도를 갖는 변이체에 가중치를 부여(예를 들어, 높은 가중치를 부여)하는 것을 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, 농축 점수는 표적 폴리펩타이드의 아미노산 서열의 단일 잔기에 특이적이다. 한 실시양태에서, 각각의 농축 점수는 표적 폴리펩타이드의 아미노산 서열의 상이한 단일 잔기에 특이적이다.
한 실시양태에서, 방법은 단계 (a)-(c)를 표적 폴리펩타이드의 복수의 변이체의 복제물을 사용하여 적어도 1회(예를 들어, 1회, 2회, 3회, 4회, 5회, 6회, 7회, 8회, 9회, 10회 또는 그 초과로) 반복하는 단계를 추가로 포함하고, 여기서 단계 (c)는 하나 이상의 무차별(promiscuous) 돌연변이, 예를 들어 50% 초과의 복제물이 30% 초과의 농축 점수를 갖고 75% 초과의 복제물이 15% 초과의 농축 점수를 갖는 돌연변이를 제외하는 것을 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, 항체 분자-표적 폴리펩타이드 도킹 모델은 선택적으로 하나 이상의 유인성 제약조건(attractive constraint)을 추가함으로써 제약되며, 여기서 유인성 제약조건은 제1 사전선택된 값보다 더 큰 농축 점수를 갖는 잔기에 대한 것이다. 한 실시양태에서, 제1 사전선택된 값은 20% 내지 40%, 예를 들어 25% 내지 35%, 예를 들어 약 25%, 약 30% 또는 약 35%이다. 한 실시양태에서, 유인성 제약조건은 농축 점수에 기초하여 선형적으로 스케일링된 보너스(linearly scaled bonus)를 포함한다.
한 실시양태에서, 항체 분자-표적 폴리펩타이드 도킹 모델은 제2 사전선택된 값보다 더 작은 농축 점수를 갖는 잔기에 대한 반발성 제약조건(repulsive constraint)을 추가함으로써 제약된다. 한 실시양태에서, 제2 사전선택된 값은 5% 내지 20%, 예를 들어 10% 내지 15%, 예를 들어 약 10%, 약 12.5%, 또는 약 15%이다.
한 실시양태에서, 단계 (d)는 항체 분자의 모델과 표적 폴리펩타이드의 모델 사이에 도킹된 포즈(docked pose)를 생성하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 단계 (d)는 항체 분자의 모델과 표적 폴리펩타이드의 모델 사이에 복수의 도킹된 포즈를 생성하는 것을 포함한다.
한 실시양태에서, 단계 (d)는 도킹 알고리즘, 예를 들어 SnugDock에 따라 복수의 도킹된 포즈를 스코어링하는 것을 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 단계 (d)는 최고 점수를 갖는 복수의 도킹된 포즈, 예를 들어 최고 점수의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000개 또는 그 초과의 도킹된 포즈의 하위세트를 선택하는 것을 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 단계 (d)는 복수의 도킹된 포즈의 선택된 하위세트를 사용하여 앙상블 도킹된 포즈(ensemble docked pose)를 생성하는 것, 및 앙상블 도킹된 포즈에 따라 항체 분자의 모델 및 표적 폴리펩타이드의 모델을 설정하는 것을 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, 항체 분자의 모델은 항체의 복수의 상동성 모델로부터 유래된 앙상블 항체 상동성 모델을 포함한다.
한 실시양태에서, 단계 (d)는 예를 들어 항체-항원 결정 구조로부터 유도된 구조 필터에 따라, 공지된 항체-항원 복합체에 대해 비정형적인 결합 방식을 나타내는 항체 분자-표적 폴리펩타이드 도케팅 모델을 제거하는 것을 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, 단계 (d)는 복수의 항체 분자-표적 폴리펩타이드 모델을 생성하는 것을 포함한다.
한 실시양태에서, 단계 (e)는 항체 분자에 의해 결합될 수 있는 표적 폴리펩타이드 상의 복수의 부위를 확인하는 것을 포함한다.
한 실시양태에서, 상기 부위는 표적 폴리펩타이드 상의 하나 이상의 비연속적인 영역을 포함하거나 상기 영역으로 이루어진다. 한 실시양태에서, 상기 부위는 표적 폴리펩타이드 상의 연속적인 영역을 포함하거나 상기 영역으로 이루어진다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 표적 폴리펩타이드(예를 들어, 본원에서 설명되는 표적 폴리펩타이드) 상의 에피토프를 확인하는 방법을 특징으로 하며, 상기 방법은
(a) 항체-표적 폴리펩타이드 도킹 모델을 생성하는 단계로서, 여기서 항체-표적 폴리펩타이드 도킹 모델은
(i) 항체 분자(예를 들어, 본원에서 설명되는 항체 분자)를 표적 폴리펩타이드의 복수의 변이체에 결합시키는 단계,
(ii) 항체 분자에 대한 변경된(예를 들어, 감소된) 결합을 나타내는 복수의 변이체를 수득(예를 들어, 농축)하는 단계, 및
(iii) 복수의 농축된 변이체 각각에 대한 농축 점수를 결정(예를 들어, 계산)하는 단계
를 포함하는 방법에 의해 결정되는 복수의 농축 점수에 따라 제약되는 것인 단계; 및
(b) 항체-표적 폴리펩타이드 도킹 모델에 기초하여 항체 분자에 의해 결합될 수 있는 표적 폴리펩타이드 상의 부위를 확인함으로써, 표적 폴리펩타이드 상의 에피토프를 확인하는 단계
를 포함한다.
한 실시양태에서, 변경된 결합은 변경된 결합 친화도, 예를 들어 감소된 결합 친화도를 포함한다.
한 실시양태에서, 단계 (a)(i)는 항체 분자를 표적 폴리펩타이드의 복수의 변이체를 디스플레이하는 라이브러리에 결합시키는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 단계 (a)(i)는 항체 분자를 표적 폴리펩타이드의 복수의 변이체를 발현(예를 들어, 디스플레이)하는 복수의 세포를 포함하는 라이브러리에 결합시키는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 복수의 세포는 각각 표적 폴리펩타이드의 대략 하나의 별개의 변이체를 발현한다. 한 실시양태에서, 세포는 진핵 세포, 예를 들어 효모 세포이다.
한 실시양태에서, 복수의 변이체는 표적 폴리펩타이드의 하나 이상의 표면 잔기 상의 돌연변이를 포함한다. 한 실시양태에서, 복수의 변이체는 표적 폴리펩타이드의 선택된 표면 잔기의 별개의 돌연변이를 포함한다. 한 실시양태에서, 복수의 변이체는 표적 폴리펩타이드의 복수의 선택된 표면 잔기 각각의 별개의 돌연변이를 포함한다.
한 실시양태에서, 복수의 변이체는 표적 폴리펩타이드의 야생형 아미노산 서열에 비해 단일 아미노산 치환을 포함한다. 한 실시양태에서, 복수의 변이체 각각은 표적 폴리펩타이드의 야생형 아미노산 서열에 비해 단일 아미노산 치환을 포함한다. 한 실시양태에서, 단일 아미노산 치환은 표적 폴리펩타이드의 표면 잔기에서 발생한다.
한 실시양태에서, 변경된(예를 들어, 감소된) 결합은 야생형 표적 폴리펩타이드 및 항체에 대해 검출된 결합에 비해 변이체 및 항체 분자에 대해 검출된 결합의 변경(예를 들어, 감소)을 포함한다.
한 실시양태에서, 단계 (a)(ii)는 야생형 표적 폴리펩타이드가 나타내는 항체 분자에 대한 결합의 약 80% 미만(예를 들어, 약 0.01%, 0.1%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% 또는 80% 미만)을 나타내는 변이체를 수득(예를 들어, 농축)하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 감소된 결합은 야생형 표적 폴리펩타이드가 나타내는 결합의 적어도 약 20%(예를 들어, 적어도 약 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%)이다.
한 실시양태에서, 단계 (a)(ii)는 야생형 표적 폴리펩타이드를 포함하는 세포가 나타내는 항체 분자에 대한 결합의 약 80% 미만(예를 들어, 약 0.01%, 0.1%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% 또는 80% 미만)을 나타내는 세포를 수득(예를 들어, 농축)하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 감소된 결합은 야생형 표적 폴리펩타이드를 포함하는 세포가 나타내는 결합의 적어도 약 20%(예를 들어, 적어도 약 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%)이다.
한 실시양태에서, 단계 (a)(ii)는 항체 분자에 대한 감소된 결합을 나타내는 변이체에 대해 1회 이상, 예를 들어 2회, 3회, 4회, 5회, 6회, 7회, 8회, 9회, 10회 또는 그 초과의 농축을 수행하는 것을 포함한다.
한 실시양태에서, 방법은 예를 들어 단계 (a)(iii) 이전에, 예를 들어 차세대 서열 분석에 의해 변이체를 코딩하는 유전자를 서열 분석함으로써 항체 분자에 대한 변경된(예를 들어, 감소된) 결합을 나타내는 변이체를 확인하는 단계를 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, 단계 (a)(iii)은 복수의 수득된(예를 들어, 농축된) 변이체 각각에 대한 발생 빈도를 결정하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, (a)(iii)은 특정 잔기에서 별개의 돌연변이를 포함하는 각각의 변이체의 발생 빈도를 집계하는 것 및/또는 더 높은 발생 빈도를 갖는 변이체에 가중치를 부여(예를 들어, 높은 가중치를 부여)하는 것을 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, 농축 점수는 표적 폴리펩타이드의 아미노산 서열의 단일 잔기에 특이적이다. 한 실시양태에서, 각각의 농축 점수는 표적 폴리펩타이드의 아미노산 서열의 상이한 단일 잔기에 특이적이다.
한 실시양태에서, 방법은 단계 (a)(i)-(a)(iii)을 표적 폴리펩타이드의 복수의 변이체의 복제물을 사용하여 적어도 1회(예를 들어, 1회, 2회, 3회, 4회, 5회, 6회, 7회, 8회, 9회, 10회 또는 그 초과로) 반복하는 단계를 추가로 포함하고, 여기서 단계 (a)(iii)은 하나 이상의 무차별 돌연변이, 예를 들어 50% 초과의 복제물이 30% 초과의 농축 점수를 갖고 75% 초과의 복제물이 15% 초과의 농축 점수를 갖는 돌연변이를 제외하는 것을 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, 항체 분자-표적 폴리펩타이드 도킹 모델은 선택적으로 하나 이상의 유인성 제약조건을 추가함으로써 제약되며, 여기서 유인성 제약조건은 제1 사전선택된 값보다 더 큰 농축 점수를 갖는 잔기에 대한 것이다. 한 실시양태에서, 제1 사전선택된 값은 20% 내지 40%, 예를 들어 25% 내지 35%, 예를 들어 약 25%, 약 30% 또는 약 35%이다. 한 실시양태에서, 유인성 제약조건은 농축 점수에 기초하여 선형적으로 스케일링된 보너스를 포함한다.
한 실시양태에서, 항체 분자-표적 폴리펩타이드 도킹 모델은 제2 사전선택된 값보다 더 작은 농축 점수를 갖는 잔기에 대한 반발성 제약조건을 추가함으로써 제약된다. 한 실시양태에서, 제2 사전선택된 값은 5% 내지 20%, 예를 들어 10% 내지 15%, 예를 들어 약 10%, 약 12.5%, 또는 약 15%이다.
한 실시양태에서, 단계 (a)는 항체 분자의 모델과 표적 폴리펩타이드의 모델 사이에 도킹된 포즈를 생성하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 단계 (a)는 항체 분자의 모델과 표적 폴리펩타이드의 모델 사이에 복수의 도킹된 포즈를 생성하는 것을 포함한다.
한 실시양태에서, 단계 (a)는 도킹 알고리즘, 예를 들어 SnugDock에 따라 복수의 도킹된 포즈를 스코어링하는 것을 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 단계 (a)는 최고 점수를 갖는 복수의 도킹된 포즈, 예를 들어 최고 점수의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000개 또는 그 초과의 도킹된 포즈의 하위세트를 선택하는 것을 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 단계 (a)는 복수의 도킹된 포즈의 선택된 하위세트를 사용하여 앙상블 도킹된 포즈를 생성하는 것, 및 앙상블 도킹된 포즈에 따라 항체 분자의 모델 및 표적 폴리펩타이드의 모델을 설정하는 것을 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, 항체 분자의 모델은 항체의 복수의 상동성 모델로부터 유래된 앙상블 항체 상동성 모델을 포함한다.
한 실시양태에서, 단계 (d)는 예를 들어 항체-항원 결정 구조로부터 유도된 구조 필터에 따라, 공지된 항체-항원 복합체에 대해 비정형적인 결합 방식을 나타내는 항체 분자-표적 폴리펩타이드 도케팅 모델을 제거하는 것을 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, 단계 (a)는 복수의 항체 분자-표적 폴리펩타이드 모델을 생성하는 것을 포함한다.
한 실시양태에서, 단계 (b)는 항체 분자에 의해 결합될 수 있는 표적 폴리펩타이드 상의 복수의 부위를 확인하는 것을 포함한다.
한 실시양태에서, 상기 부위는 표적 폴리펩타이드 상의 하나 이상의 비연속적인 영역을 포함하거나 상기 영역으로 이루어진다. 한 실시양태에서, 상기 부위는 표적 폴리펩타이드 상의 연속적인 영역을 포함하거나 상기 영역으로 이루어진다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 항체 분자 상의 파라토프를 확인하는 방법을 특징으로 하며, 상기 방법은
(a) 항체 분자를 표적 폴리펩타이드의 복수의 변이체에 결합시키는 단계;
(b) 항체 분자에 대한 감소된 결합을 나타내는 복수의 변이체를 수득(예를 들어, 농축)하는 단계;
(c) 복수의 농축된 변이체 각각에 대한 농축 점수를 결정(예를 들어, 계산)하는 단계;
(d) 항체 분자-표적 폴리펩타이드 도킹 모델을 생성하는 단계로서, 여기서 항체-표적 폴리펩타이드 도킹 모델은 농축 점수에 따라 제약되는 것인 단계; 및
(e) 항체-표적 폴리펩타이드 도킹 모델에 기초하여 표적 폴리펩타이드에 의해 결합될 수 있는 항체 분자 상의 하나 이상의 부위를 확인함으로써, 항체 분자 상의 파라토프를 확인하는 단계
를 포함한다.
한 실시양태에서, 변경된 결합은 변경된 결합 친화도, 예를 들어 감소된 결합 친화도를 포함한다.
한 실시양태에서, 단계 (a)는 항체 분자를 표적 폴리펩타이드의 복수의 변이체를 디스플레이하는 라이브러리에 결합시키는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 단계 (a)는 항체 분자를 표적 폴리펩타이드의 복수의 변이체를 발현(예를 들어, 디스플레이)하는 복수의 세포를 포함하는 라이브러리에 결합시키는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 복수의 세포는 각각 표적 폴리펩타이드의 대략 하나의 별개의 변이체를 발현한다. 한 실시양태에서, 세포는 진핵 세포, 예를 들어 효모 세포이다.
한 실시양태에서, 복수의 변이체는 표적 폴리펩타이드의 하나 이상의 표면 잔기 상의 돌연변이를 포함한다. 한 실시양태에서, 복수의 변이체는 표적 폴리펩타이드의 선택된 표면 잔기의 별개의 돌연변이를 포함한다. 한 실시양태에서, 복수의 변이체는 표적 폴리펩타이드의 복수의 선택된 표면 잔기 각각의 별개의 돌연변이를 포함한다.
한 실시양태에서, 복수의 변이체는 표적 폴리펩타이드의 야생형 아미노산 서열에 비해 단일 아미노산 치환을 포함한다. 한 실시양태에서, 복수의 변이체 각각은 표적 폴리펩타이드의 야생형 아미노산 서열에 비해 단일 아미노산 치환을 포함한다. 한 실시양태에서, 단일 아미노산 치환은 표적 폴리펩타이드의 표면 잔기에서 발생한다.
한 실시양태에서, 변경된(예를 들어, 감소된) 결합은 야생형 표적 폴리펩타이드 및 항체에 대해 검출된 결합에 비해 변이체 및 항체 분자에 대해 검출된 결합의 변경(예를 들어, 감소)을 포함한다.
한 실시양태에서, 단계 (b)는 야생형 표적 폴리펩타이드가 나타내는 항체 분자에 대한 결합의 약 80% 미만(예를 들어, 약 0.01%, 0.1%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% 또는 80% 미만)을 나타내는 변이체를 수득(예를 들어, 농축)하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 감소된 결합은 야생형 표적 폴리펩타이드가 나타내는 결합의 적어도 약 20%(예를 들어, 적어도 약 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%)이다.
한 실시양태에서, 단계 (b)는 야생형 표적 폴리펩타이드를 포함하는 세포가 나타내는 항체 분자에 대한 결합의 약 80% 미만(예를 들어, 약 0.01%, 0.1%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% 또는 80% 미만)을 나타내는 세포를 수득(예를 들어, 농축)하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 감소된 결합은 야생형 표적 폴리펩타이드를 포함하는 세포가 나타내는 결합의 적어도 약 20%(예를 들어, 적어도 약 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%)이다.
한 실시양태에서, 단계 (b)는 항체 분자에 대한 감소된 결합을 나타내는 변이체에 대해 1회 이상, 예를 들어 2회, 3회, 4회, 5회, 6회, 7회, 8회, 9회, 10회 또는 그 초과의 농축을 수행하는 것을 포함한다.
한 실시양태에서, 방법은 예를 들어 단계 (c) 이전에, 예를 들어 차세대 서열 분석에 의해 변이체를 코딩하는 유전자를 서열 분석함으로써 항체 분자에 대한 변경된(예를 들어, 감소된) 결합을 나타내는 변이체를 확인하는 단계를 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, 단계 (c)는 복수의 수득된(예를 들어, 농축된) 변이체 각각에 대한 발생 빈도를 결정하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, (c)는 특정 잔기에서 별개의 돌연변이를 포함하는 각각의 변이체의 발생 빈도를 집계하는 것 및/또는 더 높은 발생 빈도를 갖는 변이체에 가중치를 부여(예를 들어, 높은 가중치를 부여)하는 것을 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, 농축 점수는 표적 폴리펩타이드의 아미노산 서열의 단일 잔기에 특이적이다. 한 실시양태에서, 각각의 농축 점수는 표적 폴리펩타이드의 아미노산 서열의 상이한 단일 잔기에 특이적이다.
한 실시양태에서, 방법은 단계 (a)-(c)를 표적 폴리펩타이드의 복수의 변이체의 복제물을 사용하여 적어도 1회(예를 들어, 1회, 2회, 3회, 4회, 5회, 6회, 7회, 8회, 9회, 10회 또는 그 초과로) 반복하는 단계를 추가로 포함하고, 여기서 단계 (c)는 하나 이상의 무차별 돌연변이, 예를 들어 50% 초과의 복제물이 30% 초과의 농축 점수를 갖고 75% 초과의 복제물이 15% 초과의 농축 점수를 갖는 돌연변이를 제외하는 것을 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, 항체 분자-표적 폴리펩타이드 도킹 모델은 선택적으로 하나 이상의 유인성 제약조건을 추가함으로써 제약되며, 여기서 유인성 제약조건은 제1 사전선택된 값보다 더 큰 농축 점수를 갖는 잔기에 대한 것이다. 한 실시양태에서, 제1 사전선택된 값은 20% 내지 40%, 예를 들어 25% 내지 35%, 예를 들어 약 25%, 약 30% 또는 약 35%이다. 한 실시양태에서, 유인성 제약조건은 농축 점수에 기초하여 선형적으로 스케일링된 보너스를 포함한다.
한 실시양태에서, 항체 분자-표적 폴리펩타이드 도킹 모델은 제2 사전선택된 값보다 더 작은 농축 점수를 갖는 잔기에 대한 반발성 제약조건을 추가함으로써 제약된다. 한 실시양태에서, 제2 사전선택된 값은 5% 내지 20%, 예를 들어 10% 내지 15%, 예를 들어 약 10%, 약 12.5%, 또는 약 15%이다.
한 실시양태에서, 단계 (d)는 항체 분자의 모델과 표적 폴리펩타이드의 모델 사이에 도킹된 포즈를 생성하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 단계 (d)는 항체 분자의 모델과 표적 폴리펩타이드의 모델 사이에 복수의 도킹된 포즈를 생성하는 것을 포함한다.
한 실시양태에서, 단계 (d)는 도킹 알고리즘, 예를 들어 SnugDock에 따라 복수의 도킹된 포즈를 스코어링하는 것을 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 단계 (d)는 최고 점수를 갖는 복수의 도킹된 포즈, 예를 들어 최고 점수의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000개 또는 그 초과의 도킹된 포즈의 하위세트를 선택하는 것을 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 단계 (d)는 복수의 도킹된 포즈의 선택된 하위세트를 사용하여 앙상블 도킹된 포즈를 생성하는 것, 및 앙상블 도킹된 포즈에 따라 항체 분자의 모델 및 표적 폴리펩타이드의 모델을 설정하는 것을 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, 항체 분자의 모델은 항체의 복수의 상동성 모델로부터 유래된 앙상블 항체 상동성 모델을 포함한다.
한 실시양태에서, 단계 (d)는 예를 들어 항체-항원 결정 구조로부터 유도된 구조 필터에 따라, 공지된 항체-항원 복합체에 대해 비정형적인 결합 방식을 나타내는 항체 분자-표적 폴리펩타이드 도케팅 모델을 제거하는 것을 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, 단계 (d)는 복수의 항체 분자-표적 폴리펩타이드 모델을 생성하는 것을 포함한다.
한 실시양태에서, 단계 (e)는 표적 폴리펩타이드에 의해 결합될 수 있는 항체 분자 상의 복수의 부위를 확인하는 것을 포함한다.
한 실시양태에서, 상기 부위는 항체 분자 상의 하나 이상의 비연속적인 영역을 포함하거나 상기 영역으로 이루어진다. 한 실시양태에서, 상기 부위는 항체 분자 상의 연속적인 영역을 포함하거나 상기 영역으로 이루어진다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 항체 상의 파라토프를 확인하는 방법을 특징으로 하며, 상기 방법은
(a) 항체-표적 폴리펩타이드 도킹 모델을 생성하는 단계로서, 여기서 항체-표적 폴리펩타이드 도킹 모델은
(i) 항체를 표적 폴리펩타이드의 복수의 변이체에 결합시키는 단계,
(ii) 항체 분자에 대한 감소된 결합을 나타내는 변이체를 수득(예를 들어, 농축)하는 단계, 및
(iii) 복수의 수득된(예를 들어, 농축된) 변이체 각각에 대한 농축 점수를 결정(예를 들어, 계산)하는 단계
를 포함하는 방법에 의해 결정되는(예를 들어, 계산되는) 복수의 농축 점수에 따라 제약되는 것인 단계; 및
(b) 항체-표적 폴리펩타이드 도킹 모델에 기초하여 표적 폴리펩타이드에 의해 결합될 수 있는 항체 분자 상의 하나 이상의 부위를 확인함으로써, 표적 폴리펩타이드 상의 파라토프를 확인하는 단계
를 포함한다.
한 실시양태에서, 변경된 결합은 변경된 결합 친화도, 예를 들어 감소된 결합 친화도를 포함한다.
한 실시양태에서, 단계 (a)(i)는 항체 분자를 표적 폴리펩타이드의 복수의 변이체를 디스플레이하는 라이브러리에 결합시키는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 단계 (a)(i)는 항체 분자를 표적 폴리펩타이드의 복수의 변이체를 발현(예를 들어, 디스플레이)하는 복수의 세포를 포함하는 라이브러리에 결합시키는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 복수의 세포는 각각 표적 폴리펩타이드의 대략 하나의 별개의 변이체를 발현한다. 한 실시양태에서, 세포는 진핵 세포, 예를 들어 효모 세포이다.
한 실시양태에서, 복수의 변이체는 표적 폴리펩타이드의 하나 이상의 표면 잔기 상의 돌연변이를 포함한다. 한 실시양태에서, 복수의 변이체는 표적 폴리펩타이드의 선택된 표면 잔기의 별개의 돌연변이를 포함한다. 한 실시양태에서, 복수의 변이체는 표적 폴리펩타이드의 복수의 선택된 표면 잔기 각각의 별개의 돌연변이를 포함한다.
한 실시양태에서, 복수의 변이체는 표적 폴리펩타이드의 야생형 아미노산 서열에 비해 단일 아미노산 치환을 포함한다. 한 실시양태에서, 복수의 변이체 각각은 표적 폴리펩타이드의 야생형 아미노산 서열에 비해 단일 아미노산 치환을 포함한다. 한 실시양태에서, 단일 아미노산 치환은 표적 폴리펩타이드의 표면 잔기에서 발생한다.
한 실시양태에서, 변경된(예를 들어, 감소된) 결합은 야생형 표적 폴리펩타이드 및 항체에 대해 검출된 결합에 비해 변이체 및 항체 분자에 대해 검출된 결합의 변경(예를 들어, 감소)을 포함한다.
한 실시양태에서, 단계 (a)(ii)는 야생형 표적 폴리펩타이드가 나타내는 항체 분자에 대한 결합의 약 80% 미만(예를 들어, 약 0.01%, 0.1%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% 또는 80% 미만)을 나타내는 변이체를 수득(예를 들어, 농축)하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 감소된 결합은 야생형 표적 폴리펩타이드가 나타내는 결합의 적어도 약 20%(예를 들어, 적어도 약 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%)이다.
한 실시양태에서, 단계 (a)(ii)는 야생형 표적 폴리펩타이드를 포함하는 세포가 나타내는 항체 분자에 대한 결합의 약 80% 미만(예를 들어, 약 0.01%, 0.1%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% 또는 80% 미만)을 나타내는 세포를 수득(예를 들어, 농축)하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 감소된 결합은 야생형 표적 폴리펩타이드를 포함하는 세포가 나타내는 결합의 적어도 약 20%(예를 들어, 적어도 약 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%)이다.
한 실시양태에서, 단계 (a)(ii)는 항체 분자에 대한 감소된 결합을 나타내는 변이체에 대해 1회 이상, 예를 들어 2회, 3회, 4회, 5회, 6회, 7회, 8회, 9회, 10회 또는 그 초과의 농축을 수행하는 것을 포함한다.
한 실시양태에서, 방법은 예를 들어 단계 (a)(iii) 이전에, 예를 들어 차세대 서열 분석에 의해 변이체를 코딩하는 유전자를 서열 분석함으로써 항체 분자에 대한 변경된(예를 들어, 감소된) 결합을 나타내는 변이체를 확인하는 단계를 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, 단계 (a)(iii)은 복수의 수득된(예를 들어, 농축된) 변이체 각각에 대한 발생 빈도를 결정하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, (a)(iii)은 특정 잔기에서 별개의 돌연변이를 포함하는 각각의 변이체의 발생 빈도를 집계하는 것 및/또는 더 높은 발생 빈도를 갖는 변이체에 가중치를 부여(예를 들어, 높은 가중치를 부여)하는 것을 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, 농축 점수는 표적 폴리펩타이드의 아미노산 서열의 단일 잔기에 특이적이다. 한 실시양태에서, 각각의 농축 점수는 표적 폴리펩타이드의 아미노산 서열의 상이한 단일 잔기에 특이적이다.
한 실시양태에서, 방법은 단계 (a)(i)-(a)(iii)을 표적 폴리펩타이드의 복수의 변이체의 복제물을 사용하여 적어도 1회(예를 들어, 1회, 2회, 3회, 4회, 5회, 6회, 7회, 8회, 9회, 10회 또는 그 초과로) 반복하는 단계를 추가로 포함하고, 여기서 단계 (a)(iii)은 하나 이상의 무차별 돌연변이, 예를 들어 50% 초과의 복제물이 30% 초과의 농축 점수를 갖고 75% 초과의 복제물이 15% 초과의 농축 점수를 갖는 돌연변이를 제외하는 것을 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, 항체 분자-표적 폴리펩타이드 도킹 모델은 선택적으로 하나 이상의 유인성 제약조건을 추가함으로써 제약되며, 여기서 유인성 제약조건은 제1 사전선택된 값보다 더 큰 농축 점수를 갖는 잔기에 대한 것이다. 한 실시양태에서, 제1 사전선택된 값은 20% 내지 40%, 예를 들어 25% 내지 35%, 예를 들어 약 25%, 약 30% 또는 약 35%이다. 한 실시양태에서, 유인성 제약조건은 농축 점수에 기초하여 선형적으로 스케일링된 보너스를 포함한다.
한 실시양태에서, 항체 분자-표적 폴리펩타이드 도킹 모델은 제2 사전선택된 값보다 더 작은 농축 점수를 갖는 잔기에 대한 반발성 제약조건을 추가함으로써 제약된다. 한 실시양태에서, 제2 사전선택된 값은 5% 내지 20%, 예를 들어 10% 내지 15%, 예를 들어 약 10%, 약 12.5%, 또는 약 15%이다.
한 실시양태에서, 단계 (a)는 항체 분자의 모델과 표적 폴리펩타이드의 모델 사이에 도킹된 포즈를 생성하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 단계 (a)는 항체 분자의 모델과 표적 폴리펩타이드의 모델 사이에 복수의 도킹된 포즈를 생성하는 것을 포함한다.
한 실시양태에서, 단계 (a)는 도킹 알고리즘, 예를 들어 SnugDock에 따라 복수의 도킹된 포즈를 스코어링하는 것을 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 단계 (a)는 최고 점수를 갖는 복수의 도킹된 포즈, 예를 들어 최고 점수의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000개 또는 그 초과의 도킹된 포즈의 하위세트를 선택하는 것을 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 단계 (a)는 복수의 도킹된 포즈의 선택된 하위세트를 사용하여 앙상블 도킹된 포즈를 생성하는 것, 및 앙상블 도킹된 포즈에 따라 항체 분자의 모델 및 표적 폴리펩타이드의 모델을 설정하는 것을 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, 항체 분자의 모델은 항체의 복수의 상동성 모델로부터 유래된 앙상블 항체 상동성 모델을 포함한다.
한 실시양태에서, 단계 (a)는 예를 들어 항체-항원 결정 구조로부터 유도된 구조 필터에 따라, 공지된 항체-항원 복합체에 대해 비정형적인 결합 방식을 나타내는 항체 분자-표적 폴리펩타이드 도케팅 모델을 제거하는 것을 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, 단계 (a)는 복수의 항체 분자-표적 폴리펩타이드 모델을 생성하는 것을 포함한다.
한 실시양태에서, 단계 (b)는 항체 분자에 의해 결합될 수 있는 표적 폴리펩타이드 상의 복수의 부위를 확인하는 것을 포함한다.
한 실시양태에서, 상기 부위는 표적 폴리펩타이드 상의 하나 이상의 비연속적인 영역을 포함하거나 상기 영역으로 이루어진다. 한 실시양태에서, 상기 부위는 표적 폴리펩타이드 상의 연속적인 영역을 포함하거나 상기 영역으로 이루어진다.
한 측면에서, 본 개시내용은 표적 폴리펩타이드 상의 에피토프 또는 표적 폴리펩타이드에 대한 항체 분자 상의 파라토프가 본원에서 설명되는 방법에 따라 확인되는 항체 분자를 특징으로 한다.
한 측면에서, 본 개시내용은 본원에서 설명되는 항체 분자 또는 본원에서 설명되는 항체 분자의 하나 이상의 사슬(예를 들어, VH 및/또는 VL)을 코딩하는 핵산 분자를 특징으로 한다. 또 다른 측면에서, 본 개시내용은 본원에서 설명되는 핵산 분자를 포함하는 벡터를 특징으로 한다. 또 다른 측면에서, 본 개시내용은 본원에서 설명되는 핵산 분자 또는 본원에서 설명되는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 특징으로 한다. 한 측면에서, 본 개시내용은 항체 분자의 발현에 적합한 조건 하에 본원에서 설명되는 숙주 세포를 배양하는 것을 포함하는, 항체 분자를 제조하는 방법을 특징으로 한다.
도 1a-1b는 APRIL의 표면에 조사된 위치를 보여주는 일련의 다이어그램이다. (a) 회색으로 강조 표시된 심층 돌연변이 스캐닝 라이브러리에서 조사된 위치와 함께 마우스 및 인간 APRIL의 정렬. APRIL의 키메라 형태는 muAPRIL에서 빨간색으로 밑줄이 그어진 5개의 위치를 huAPRIL에서 발견되는 상응하는 아미노산으로 돌연변이시킴으로써 생성되었다. (b) 항원 표면의 균일한 커버리지를 위해 선택된, 회색 음영 처리된 라이브러리에서 다양화를 위해 선택된 위치와 함께 제시된 APRIL 동종삼량체의 구조. 라이브러리 디자인에는 존재하지만 APRIL 결정 구조에서는 관찰되지 않는 APRIL의 9개의 N-말단 아미노산이 표시된다(구조 아래의 상자). 2개의 Lys 잔기가 다양화를 위해 선택되었다.
도 2는 효모의 표면에 발현된 APRIL에 대한 항체 및 TACI 친화도를 보여주는 그래프이다. 정제된 항-APRIL 항체 세트(2419, 4035, 4540 및 3530), 이소형 대조군 및 TACI를 효모의 표면에 발현된 APRIL에 대한 대략적인 친화도에 대해 평가하였다. 결합 등온선을 사용하여 각각의 항체에 대해 최대 결합의 80%를 유도하는 농도를 추정하고, 이를 라이브러리 농축에 사용하였다.
도 3은 컴퓨터를 사용한 도킹 워크플로우를 사용한 에피토프 매핑의 개요를 보여주는 일련의 다이어그램이다. APRIL 항원 라이브러리의 부위-포화 라이브러리가 생성되고, 이는 효모 표면 디스플레이에 의해 발현되었다. 항체를 효모 라이브러리에 적용하고, FACS 농축을 수행하여 라이브러리의 비결합 구성원을 농축하였다. 농축된 라이브러리는 근본적인 돌연변이를 확인하고 계수하기 위해 NGS에 적용되었다. 돌연변이 농축 점수는 매핑된 항체의 추정 에피토프 영역을 결정하기 위해 APRIL의 표면에 매핑되었다. 이러한 데이터는 항체-항원 도킹을 제약하여 돌연변이 프로파일 데이터와 일치하는 모델 클러스터를 생성하기 위해 사용되였다. 생성되는 높은 신뢰도 모델은 에피토프 및 파라토프 잔기의 분자적 정의를 제공한다.
도 4a-4b는 다중 항체 및 TACI에 대한 라이브러리의 FACS 농축을 보여주는 일련의 그래프이다. WT APRIL 또는 라이브러리 효모 집단의 유세포 분석은 농축 전후에 표시된다. X축은 APRIL 표면 발현(c-myc)을 나타내고, Y축은 항체/TACI 결합을 나타낸다. 첫 번째 컬럼은 효모의 표면에서 발현된 WT APRIL에 결합하는 각각의 항체 또는 TACI를 나타낸다. 두 번째 컬럼은 동일한 결합딩 조건을 나타내지만, 비농축된 출발 APRIL 라이브러리에 대한 것이다. 마지막 컬럼은 2회의 FACS 농축 라운드 후의 농축된 비결합 집단을 나타낸다.
도 5a-5d는 시험된 모든 항-APRIL 항체에 대한 돌연변이 프로파일 히트맵을 보여주는 일련의 다이어그램이다. 농축 히트맵(왼쪽)은 항체(a) 2419, (b) 4035, (c) 4540 및 (d) 3530에 대해 계산되었으며, 잔기 농축 점수는 각각의 항체에 대해 APRIL의 표면에 매핑되었다(오른쪽).
도 6a-6c는 TACI의 에피토프 매핑이 공결정 구조와 강한 일치를 나타내는 것을 보여주는 일련의 다이어그램이다. (a) APRIL의 표면에 매핑된 값(오른쪽)과 함께 제시된 TACI에 대한 계산된 농축 히트맵(왼쪽). (b) 돌연변이된 각각의 위치에 대해 계산된 TACI에 대한 총 농축 점수. 에피토프 잔기는 TACI로부터 5Å 미만의 무거운 원자 거리를 갖는 잔기로 정의된다. (c) APRIL과 복합체화된 TACI의 구조. TACI와 접촉하는 APRIL의 돌연변이된 위치(<5 Å)는 총 농축 점수에 따라 음영 처리된 구체로 표시된다.
도 7a-7b는 무차별 돌연변이의 예를 보여주는 일련의 다이어그램이다. (a) 시험된 리간드 패널에 대한 APRIL의 잔기 V132에 대한 농축 히트맵. Asp 및 Glu에 대한 무차별 돌연변이가 강조 표시되고(컬럼), 2419에 대한 항체 특이적 돌연변이(행)가 강조 표시된다. (b) APRIL(밝은 회색)에 결합된 TACI(어두운 회색)의 구조. 상이한 단량체 상의 APRIL의 잔기 V132 및 E182는 APRIL 동종삼량체의 구조에서 근접하여 위치한다.
도 8a-8c는 APRIL의 동종-올리고머 조립체의 대칭성이 상이한 사슬의 동등한 잔기 위치를 수평 방향 영역 근처가 아닌, 분자의 정점에 매우 근접하여 배치한다는 것을 보여주는 일련의 다이어그램이다. 사슬(a) 및 잔기 위치(b 및 c)에 따라 색상이 지정된 APRIL의 구조. (b)에서, 정점에 있는 밝은 회색의 잔기는 동종삼량체의 세 가지 상이한 사슬로부터 유래한다. (c) (b)에 대해 90° 회전된 APRIL 동종삼량체는 상이한 사슬의 동등한 잔기 위치가 수평 방향 영역에서 근접하지 않음을 보여준다.
도 9a-9d는 3530 결합이 N-말단 절단된 APRIL에 대해 특유하게 손실되었음을 보여주는 일련의 그래프이다. 항체 3530 및 TACI는 2개의 상이한 형태의 효모 표면 발현 APRIL에 결합한다. 전장 APRIL(잔기 96-241)에 대한 결합은 3530(a) 및 TACI(c)에 대해 표시된다. N-말단 절단된 APRIL(잔기 106-241)에 대한 결합은 3530(b) 및 TACI(d)에 대해 표시된다.
도 10은 심층 돌연변이 스캐닝으로부터 유래된 돌연변이 데이터에 따른 정보에 근거한 항체-항원 도킹을 사용하여 분자적으로 정의된 에피토프 및 파라토프 지도를 생성하기 위한 예시적인 컴퓨터를 사용한 도킹 워크플로우를 보여주는 개략도이다.
도 11a-11c는 모델링된 2419의 컴퓨터를 사용한 도킹이 공결정 구조와 잘 일치함을 보여주는 일련의 다이어그램이다. (a) 2419-APRIL 복합체의 상위 500개 도킹된 모델에 대해 계산된 로제타(Rosetta) 계면 점수(Isc) 대 천연 구조와 관련된 계면 RMSD. 상위 100개의 도킹된 모델은 밝은 회색(FW RMSD < 5 Å), 중간 회색(5 Å < FW RMSD < 10 Å) 및 어두운 회색(FW RMSD > 10 Å)으로 음영 처리된다. (b) 높은 중첩 정도를 보여주는, 2419-APRIL의 상위 도킹 모델과 2419-APRIL의 천연 구조의 오버레이. 도킹된 모델 및 천연 구조는 APRIL 리간드의 Cα 좌표만을 기준으로 하여 중첩되었다. (c) APRIL에 대한 2419 결합에 대해 실험적으로 결정된 잔기 농축 점수. 막대는 도킹 신뢰 점수(상위 100개의 도킹된 포즈에서 상응하는 잔기가 2419와 접촉(< 5 Å)하는 것으로 확인된 빈도)에 따라 음영 처리된다. 별표는 천연 구조로부터 확인된 접촉 위치를 나타낸다.
도 12a-12b는 파라토프 도킹 점수 및 2419의 표면에 매핑된 위치를 보여주는 일련의 다이어그램이다. (a) 2419의 표면에 매핑된 도킹 신뢰 점수(파라토프). (b) huAPRIL-2419의 천연 구조로부터 유래된, 검은색의 파라토프 위치. 잔기 사이의 접촉은 5 Å 미만의 무거운 원자 거리로서 정의된다.
도 13a-13d는 컴퓨터를 사용한 워크플로우에 통합된 실험적으로 유도된 제약조건이 거의 천연 결합 방식으로 수렴할 수 있음을 보여주는 일련의 다이어그램이다. 패널의 상단 행은 도킹된 모델에서 잔기가 항체와 접촉하는 빈도에 의해 음영 처리된, 2419에 대한 APRIL 접촉 잔기를 보여준다(무거운 원자 거리 < 5 Å). 하단 행은 상위 10개의 스코어링 도킹된 2419-APRIL 모델 또는 천연 구조를 보여준다. (a) 실험적 제약조건이 없는 전체적인 도킹. (b) 농축 점수 제약조건을 통합한 전체적인 도킹. (c) 전체 에피토프 매핑 워크플로우(제약된 전체적인 도킹, 이어서 제약된 SnugDock, 이후 항체 특이적 구조 필터 사용). (d) 2419-APRIL의 천연 구조.
도 14a-14b는 도킹 결과에 대한 제약조건의 영향을 보여주는 일련의 그래프이다. 제약조건으로서 농축 점수를 사용하지 않으면서(a) 및 제약조건으로서 농축 점수를 사용하면서(b), 2419-APRIL 복합체의 천연 구조와 비교한, 로제타 대 항체 리간드(프레임워크) RMSD(항원에만 중첩)에 의해 계산된 도킹 계면 점수의 플롯. 상위 100개의 스코어링 도킹된 모델은 상위 100개의 표시된 회색에 해당하지 않는 모델과 함께 다음 색상으로 표시된다: 밝은 회색(FW RMSD < 5 Å), 중간 회색(5 Å < FW RMSD < 10 Å) 및 어두운 회색(FW RMSD > 10 Å).
도 15a-15c는 APRIL에 대한 각각의 항체의 예측된 결합 방식을 보여주는 일련의 다이어그램이다. 상단 패널: APRIL 잔기는 항원 잔기가 항체와 접촉하는(무거운 원자 거리 < 5 Å) 모델의 백분율로서 계산된 도킹 신뢰 점수를 기초로 하여 음영 처리된다. 2419(컬럼 A), 4035(컬럼 B) 및 4540(컬럼 C)에 대한 지도가 표시된다. 하단 패널: 명확성을 위해, ARIL(회색)과 상호작용하고 TACI(중간 회색)의 결합을 차단하는 단일 상위 스코어링 항체 포즈가 표시된다. 항체 결합으로 인해 TACI에서 예측된 입체 충돌 영역은 밝은 회색으로 표시된다.
도 16a-16c는 컴퓨터를 사용한 모델이 종 결합 특이성에 대한 합리적 항체 공학을 가능하게 한다는 것을 보여주는 일련의 다이어그램이다. (a) APRIL의 구조 상에 강조 표시된 마우스 및 인간 APRIL의 차이점. 비상동성 돌연변이는 중간 회색으로, 상동성 돌연변이는 어두운 회색으로 표시된다. 각각의 항체(상위 평가 모델)에 대한 도킹된 에피토프는 밝은 회색 윤곽선으로 표시된다. (b) 위치 E181 및 I219는 도킹 결과를 기초로 하여 APRIL의 중쇄 내에서 R54에 근접한 것으로 예측된다. muAPRIL 구조의 위치 181 및 219에서의 아르기닌 및 라이신에 대한 돌연변이는 2419의 HCDR2 상의 R54와의 상호작용을 불안정화할 것으로 예측된다. (c) ELISA에 의해 결정된, muAPRIL에 대한 디자인된 변이체 항체 및 2419의 결합. 디자인된 변이체는 다음과 같은 치환이 포함된다: R54D(Design1); T28A_R54D(Design2); L53V_R54D_S56A(Design3).
도 17은 인간 APRIL에 대한 2419 재디자인의 결합을 보여주는 그래프이다. 인간 APRIL에 대한 2419 및 디자인된 변이체의 ELISA 결합 결과. 디자인된 변이체는 다음과 같은 치환을 포함한다: R54D(Design1); T28A_R54D(Design2); L53V_R54D_S56A(Design3). 최대 결합의 1/2을 유도하는 농도는 20 nM(2419), 73 nM(Design1), 63 nM(Design2) 및 306 nM(Design3)이었다.
상세한 설명
정의
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "항체 분자"는 항원 특이적 결합을 제공하기 위해 면역글로불린 중쇄 가변 영역으로부터의 충분한 서열 및/또는 면역글로불린 경쇄 가변 영역으로부터의 충분한 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 지칭한다. 이는 항원 결합을 지지하는 전장 항체 및 이의 단편, 예를 들어 Fab 단편을 포함한다. 일반적으로, 항체 분자는 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 및 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함한다. 항체 분자는 인간, 인간화, CDR 이식 항체 및 이의 항원 결합 단편을 포함한다. 한 실시양태에서, 항체 분자는 적어도 하나의 면역글로불린 가변 영역 세그먼트를 포함하는 단백질, 예를 들어 면역글로불린 가변 도메인 또는 면역글로불린 가변 도메인 서열을 제공하느 아미노산 서열을 포함한다.
항체 분자의 VH 또는 VL 사슬은 중쇄 또는 경쇄 불변 영역의 전부 또는 일부를 추가로 포함하여, 각각 중쇄 또는 경쇄 면역글로불린을 형성할 수 있다. 한 실시양태에서, 항체 분자는 2개의 면역글로불린 중쇄 및 2개의 면역글로불린 경쇄의 사량체이다.
항체 분자는 중쇄(또는 경쇄) 면역글로불린 가변 영역 세그먼트 중 하나 또는 둘 모두를 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "중쇄(또는 경쇄) 면역글로불린 가변 영역 세그먼트"는 항원에 결합할 수 있는 전체 중쇄(또는 경쇄) 면역글로불린 가변 영역 또는 이의 단편을 지칭한다. 항원에 결합하는 중쇄 또는 경쇄 세그먼트의 능력은 각각 경쇄 또는 중쇄와 쌍을 이룬 세그먼트로 측정된다. 일부 실시양태에서, 전장 가변 영역 미만의 중쇄 또는 경쇄 세그먼트는 적절한 사슬과 쌍을 이룰 때, 전장 사슬이 각각 경쇄 또는 중쇄와 쌍을 이룰 때 보이는 것의 적어도 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 95%인 친화도로 결합할 것이다.
면역글로불린 가변 영역 세그먼트는 참조 또는 컨센서스 서열과 상이할 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "상이하다"는 것은 참조 서열 또는 컨센서스 서열의 잔기가 상이한 잔기 또는 부재 또는 삽입된 잔기로 대체됨을 의미한다.
항체 분자는 중쇄(H) 가변 영역(본원에서 VH로 약칭함) 및 경쇄(L) 가변 영역(본원에서 VL로 약칭함)을 포함할 수 있다. 또 다른 예에서, 항체는 2개의 중쇄(H) 가변 영역 및 2개의 경쇄(L) 사슬 가변 영역 또는 이의 항체 결합 단편을 포함한다. 면역글로불린의 경쇄는 카파 또는 람다 유형일 수 있다. 한 실시양태에서, 항체 분자는 글리코실화된다. 항체 분자는 항체 의존성 세포독성 및/또는 보체 매개 세포독성에 대해 기능적일 수 있거나, 이러한 활성 중 하나 또는 둘 모두에 대해 비기능적일 수 있다. 항체 분자는 무손상 항체 또는 이의 항원 결합 단편일 수 있다.
항체 분자는 전장 항체의 "항원 결합 단편", 예를 들어 관심있는 HA 표적에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 전장 항체의 하나 이상의 단편을 포함한다. 전장 항체의 "항원 결합 단편"이라는 용어 내에 포함되는 결합 단편의 예는 (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어지는 1가 단편인 Fab 단편; (ii) 힌지 영역에서 디설파이드 다리에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab') 또는 F(ab')2 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어지는 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 아암의 VL 및 VH 도메인으로 이루어지는 Fv 단편, (v) VH 도메인으로 이루어지는 dAb 단편(Ward et al., (1989) Nature 341:544-546); 및 (vi) 기능을 보유하는 단리된 상보성 결정 영역(CDR). 또한, Fv 단편의 2개의 도메인인 VL 및 VH는 별개의 유전자에 의해 코딩되지만, 이들은 VL 및 VH 영역이 쌍을 이루어 단일 사슬 Fv(scFv)로 알려진 1가 분자를 형성하는 단일 단백질 사슬로 만들 수 있는 합성 링커에 의해, 재조합 방법을 사용하여 연결될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Bird et al. (1988) Science 242:423-426]; 및 [Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883]을 참조한다. 항체 분자에는 디아바디가 포함된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "항체"는 면역글로불린의 구조적 및 기능적 특성, 특히 항원 결합 특성을 포함하는 폴리펩타이드, 예를 들어 사량체 또는 단일 사슬 폴리펩타이드를 지칭한다. 일반적으로, 인간 항체는 2개의 동일한 경쇄 및 2개의 동일한 중쇄를 포함한다. 각각의 사슬은 가변 영역을 포함한다.
가변 중쇄(VH) 및 가변 경쇄(VL) 영역은 "프레임워크 영역"(FR)으로 지칭되는 보다 보존된 영역이 산재되어 있는 "상보성 결정 영역"("CDR")으로 지칭되는 초가변 영역으로 추가로 세분화될 수 있다. 인간 항체는 프레임워크 영역 FR1-FR4에 의해 분리된 3개의 VH CDR 및 3개의 VL CDR을 가지고 있다. FR 및 CDR의 범위는 정확하게 정의된 바 있다(문헌 [Kabat, E.A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242; 및 Chothia, C. et al. (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917] 참조). 여기에서는 카바트 정의가 사용된다. 각각의 VH 및 VL은 일반적으로 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성되며, 아미노 말단으로부터 카르복실 말단으로 다음 순서로 정렬된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.
중쇄 및 경쇄 면역글로불린 사슬은 디설파이드 결합에 의해 연결될 수 있다. 중쇄 불변 영역은 일반적으로 3개의 불변 도메인, 즉 CH1, CH2 및 CH3을 포함한다. 경쇄 불변 영역은 일반적으로 CL 도메인을 포함한다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 포함한다. 항체의 불변 영역은 일반적으로 면역계의 다양한 세포(예를 들어, 이펙터 세포) 및 고전적 보체 시스템의 제1 성분(C1q)을 포함하는 숙주 조직 또는 인자에 대한 항체의 결합을 매개한다.
용어 "면역글로불린"은 생화학적으로 구별될 수 있는 다양한 광범위한 클래스의 폴리펩타이드를 포함한다. 관련 기술 분야의 통상의 기술자는 중쇄가 감마, 뮤, 알파, 델타, 또는 엡실론(γ, μ, α, δ, ε)으로 분류되고, 그들 중에 일부 하위클래스(예를 들어, γ1-γ4)가 있음을 이해할 것이다. 항체의 "클래스"를 각각 IgG, IgM, IgA IgD 또는 IgE로서 결정하는 것은 상기 사슬의 특성이다. 면역글로불린 하위클래스(이소형), 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 등은 잘 특성화되고 기능적 전문화를 부여하는 것으로 알려져 있다. 이들 클래스 및 이소형의 각각의 변형된 버전은 본 개시내용을 고려하여 통상의 기술자가 쉽게 확인할 수 있고, 따라서 본 개시내용의 범위 내에 있다. 모든 면역글로불린 클래스는 분명히 본 개시내용의 범위 내에 있다. 경쇄는 카파 또는 람다(κ, λ)로 분류된다. 각각의 중쇄 클래스는 카파 또는 람다 경쇄와 결합될 수 있다.
적합한 항체는 모노클로날, 단일 특이적, 폴리클로날, 다중 특이적, 인간 항체, 영장류화 항체, 키메라 항체, 이중 특이적 항체, 인간화 항체, 접합 항체(즉, 다른 단백질, 방사성 표지, 세포 독소에 접합되거나 융합된 항체), 스몰 모듈라 이뮤노파마슈티칼스(Small Modular ImmunoPharmaceuticals; "SMIPs™"), 단일 사슬 항체, 카멜로이드 항체 및 항체 단편을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.
한 실시양태에서, 항체는 인간화 항체이다. 인간화 항체는 인간 프레임워크 영역 및 비인간, 예를 들어 마우스 또는 래트 면역글로불린으로부터의 하나 이상의 CDR을 포함하는 면역글로불린을 지칭한다. CDR을 제공하는 면역글로불린은 종종 "공여자"로 지칭되고, 프레임워크를 제공하는 인간 면역글로불린은 종종 "수용자"라고 불리지만, 실시양태에서 공급원 또는 공정에 대한 어떠한 제한도 시사되지 않는다. 일반적으로, 인간화 항체는 인간화 경쇄 및 인간화 중쇄 면역글로불린을 포함한다.
"면역글로불린 도메인"은 면역글로불린 분자의 가변 또는 불변 도메인으로부터의 도메인을 의미한다. 면역글로불린 도메인은 일반적으로 약 7개의 β-가닥 및 보존된 디설파이드 결합으로 형성된 2개의 β-시트를 포함한다(예를 들어, 문헌 [A. F. Williams and A. N. Barclay (1988) Ann. Rev. Immunol. 6:381-405] 참조).
본원에서 사용되는 바와 같이, "면역글로불린 가변 도메인 서열"은 면역글로불린 가변 도메인의 구조를 형성할 수 있는 아미노산 서열을 의미한다. 예를 들어, 서열은 자연 발생 가변 도메인의 아미노산 서열의 전부 또는 일부를 포함할 수 있다. 예를 들어, 서열은 하나, 둘 또는 그 초과의 N- 또는 C-말단 아미노산, 내부 아미노산을 생략할 수 있고, 하나 이상의 삽입 또는 추가의 말단 아미노산을 포함할 수 있거나, 또는 다른 변형을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 면역글로불린 가변 도메인 서열을 포함하는 폴리펩타이드는 또 다른 면역글로불린 가변 도메인 서열과 결합하여 표적 결합 구조(또는 "항원 결합 부위"), 예를 들어 표적 항원과 상호작용하는 구조를 형성할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 항체는 무손상 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 단일 도메인 항체(예를 들어, 상어 단일 도메인 항체(예를 들어, IgNAR 또는 이의 단편)), 적어도 2개의 무손상 항체로 형성된 다중 특이적 항체(예를 들어, 이중 특이적 항체), 및 원하는 생물학적 활성을 나타내는 항체 단편을 포함한다. 본원에서 사용하기 위한 항체는 임의의 유형(예를 들어, IgA, IgD, IgE, IgG, IgM)일 수 있다.
항체 또는 항체 분자는 포유동물, 예를 들어 설치류, 예를 들어 마우스 또는 래트, 말, 돼지 또는 염소로부터 유래될 수 있다. 한 실시양태에서, 항체 또는 항체 분자는 재조합 세포를 사용하여 생산된다. 한 실시양태에서, 항체 또는 항체 분자는 예를 들어 인간 불변 및/또는 가변 영역 도메인을 보유하는, 마우스, 래트, 말, 돼지 또는 다른 종으로부터의 키메라 항체이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "변이체"는 야생형 형태의 표적 폴리펩타이드의 아미노산 서열에 대해 하나 이상의 돌연변이(예를 들어, 아미노산 치환, 결실, 삽입 또는 관련 기술 분야에 공지된 임의의 다른 돌연변이)를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 지칭한다. 일부 예에서, 변이체는 야생형 형태의 표적 폴리펩타이드의 아미노산 서열에 비해, 예를 들어 표면 잔기에 대한 약 1개의 아미노산 치환을 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "야생형"은 참조 아미노산 서열을 포함하는 표적 폴리펩타이드의 형태를 의미한다. 일부 경우에, 야생형 표적 폴리펩타이드는 자연에서 발생하는 아미노산 서열(예를 들어, 살아있는 유기체로부터의 내인성 서열)을 포함한다. 다른 경우에는, 야생형 표적 폴리펩타이드는 임의의 참조 아미노산 서열(예를 들어, 표적 폴리펩타이드의 복수의 자연 발생 버전으로부터 편집된, 예를 들어 컨센서스 아미노산 서열)을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "표적 폴리펩타이드"는 항체 분자에 의해 바람직하게 결합되는 임의의 폴리펩타이드를 지칭한다. 표적 폴리펩타이드는 항체 분자에 의해 접촉되는 표면 상에 하나 이상의 에피토프 영역을 포함할 수 있다. 본원에서 설명되는 방법은 이러한 에피토프 영역을 확인하는 데 사용될 수 있다. 표적 폴리펩타이드는 항체 분자 상의 하나 이상의 파라토프 영역에 결합할 수 있으며, 이는 마찬가지로 본원의 방법에 따라 확인될 수 있다. 일부 예에서, 용어 "표적 폴리펩타이드" 및 "항원"은 상호 교환 가능하게 사용될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "에피토프"는 또 다른 폴리펩타이드, 예를 들어, 항체 분자, 예를 들어 항체 분자의 하나 이상의 CDR 및/또는 항체 분자의 하나 이상의 프레임워크 잔기에 의해 접촉되는 표적 폴리펩타이드(예를 들어, 본원에서 설명되는 바와 같은)의 일부를 지칭한다. 일부 경우에, 에피토프는 표적 폴리펩타이드의 하나 이상의 표면 잔기를 포함한다. 단백질 또는 폴리펩타이드의 "표면 잔기"는 일반적으로, 예를 들어 아미노산의 적어도 일부(예를 들어, 측쇄)가 단백질 또는 폴리펩타이드의 외부에 존재하는 또 다른 분자에 접근할 수 있도록 하는, 단백질 또는 폴리펩타이드의 외부 표면에 위치하는 아미노산 잔기이다. 에피토프 잔기는 인접하거나 인접하지 않을 수 있다. 일부 예에서, 에피토프는 항체 분자와 접촉하는 복수의 영역 또는 패치를 포함한다. 특정 예에서, 2개 이상의 영역 또는 패치는 예를 들어 입체형태적 에피토프에서처럼 연속적이거나 물리적으로 근접하지 않는다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "파라토프"는 표적 폴리펩타이드(예를 들어, 본원에서 설명되는 바와 같은) 또는 그의 변이체에 의해 접촉되는 항체 분자의 일부를 지칭한다. 파라토프는 항체 분자의 하나 이상의 CDR 및/또는 항체 분자의 하나 이상의 프레임워크 잔기를 포함할 수 있다. 일부 예에서, 파라토프는 항체 분자의 하나 이상의 표면 잔기를 포함한다. 파라토프 잔기는 인접하거나 인접하지 않을 수 있다. 일부 예에서, 파라토프는 표적 폴리펩타이드와 접촉하는 복수의 영역 또는 패치를 포함한다. 특정 예에서, 2개 이상의 영역 또는 패치는 인접하거나 물리적으로 근접하지 않는다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "모델"은 일반적으로 하나 이상의 분자(예를 들어, 표적 폴리펩타이드 및/또는 항체 분자)의 구조, 예를 들어 3차원 모델, 예를 들어 시뮬레이션 및/또는 계산된 구조를 지칭한다. 일부 예에서, "모델링"이라는 용어는 모델을 생성하는 프로세스를 지칭하기 위해 사용된다. 모델은 예를 들어 X-선 결정학 또는 예를 들어 본원에서 설명되는 계산 방법에 의해 생성될 수 있다. 하나 이상의 다른 모델로부터의 정보를 함께 모음으로써 모델을 생성할 수 있다. 일부 예에서, 모델은 복수의 다른 모델을 포함한다. 일부 예에서, 모델은 복수의 다른 모델을 사용하여 생성된다. 엔티티의 "모델"은 엔티티의 구조를 나타내는 모델을 지칭한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "도킹 모델"은 일반적으로 항체 분자와 표적 폴리펩타이드 또는 이의 변이체 사이의 상호작용에 대한 모델(예를 들어, 3차원 모델)이다. 일부 예에서, 도킹 모델은 항체 분자의 모델 및 표적 폴리펩타이드의 모델 또는 이의 변이체의 모델을 포함한다. 일부 예에서, 도킹 모델은 항체 분자와 표적 폴리 펩타이드 또는 이의 변이체 사이의 접촉 지점을 보여준다.
항체 분자, 예를 들어, 천연 공급원으로부터 수득된 항체, 면역원 또는 일반적으로 폴리펩타이드와 관련하여 본원에서 사용되는 용어 "정제된" 및 "단리된"은 천연 공급원으로부터의 오염 물질, 예를 들어, 천연 공급원으로부터의 세포 물질, 예를 들어 세포에 존재하는 세포 파편, 막, 소기관, 핵산 또는 단백질의 대부분이 실질적으로 없는 분자를 지칭한다. 따라서, 단리된 폴리펩타이드, 예를 들어 항체 분자는 약 30%, 20%, 10%, 5%, 2% 또는 1%(건조 중량 기준) 미만의 세포 물질 및/또는 오염 물질을 갖는 폴리펩타이드의 제제를 포함한다. 화학적으로 합성된 물질종, 예를 들어 항체 분자 또는 면역원과 관련하여 사용될 때 "정제된" 및 "단리된"이라는 용어는 분자의 합성에 관련되는 화학적 전구체 또는 다른 화학물질이 실질적으로 없는 물질종을 지칭한다.
두 서열 사이의 "상동성" 또는 "서열 동일성" 또는 "동일성"(이들 용어는 본원에서 상호 교환 가능하게 사용됨)의 계산은 다음과 같이 수행될 수 있다. 서열은 최적의 비교 목적을 위해 정렬된다(예를 들어, 갭은 최적의 정렬을 위해 제1 또는 제2 아미노산 또는 핵산 서열 중 하나 또는 둘 모두에 도입될 수 있고, 비상동성 서열은 비교 목적으로 무시할 수 있다). 최적의 정렬은 갭 패널티 12, 갭 연장 패널티 4, 프레임쉬프트 갭 패널티 5의 Blossum 62 스코어링 매트릭스를 사용하는 GCG 소프트웨어 패키지의 GAP 프로그램을 사용하여 최고 점수로서 결정된다. 이어서, 상응하는 아미노산 위치 또는 뉴클레오타이드 위치의 아미노산 잔기 또는 뉴클레오타이드가 비교된다. 제1 서열의 위치가 제2 서열의 상응하는 위치와 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오타이드에 의해 점유될 때, 분자는 해당 위치에서 동일한 것이다(본원에서 사용되는 바와 같이, 아미노산 또는 핵산 "동일성"은 아미노산 또는 핵산 "상동성"과 동등한 것이다). 2개의 서열 간의 퍼센트 동일성은 서열에 의해 공유된 동일 위치의 수의 함수이다.
세포 디스플레이 검정
본 발명의 방법은 일반적으로 세포(예를 들어, 효모 세포) 상에 표적 폴리펩타이드의 변이체를 디스플레이하고, 예를 들어 항체에 대한 감소된 결합(예를 들어, 감소된 결합 친화도)을 나타내는 변이체를 디스플레이하는 세포의 집단을 농축함으로써, 표적 폴리펩타이드의 변이체에 대한 항체의 결합 능력을 평가하는 것을 포함한다. 본원에서 설명되는 방법에 따라 사용될 수 있는 세포의 예는 진핵 세포(예를 들어, 진균 세포, 예를 들어, 효모 세포; 포유동물 세포, 예를 들어 CHO 세포 또는 인간 세포) 또는 원핵 세포(예를 들어, 박테리아 세포, 예를 들어 이. 콜라이(E. coli) 세포))를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 한 실시양태에서, 세포는 효모 세포이다.
한 실시양태에서, 에피토프 매핑 데이터는 전형적인 돌연변이 유발 유전자형-표현형 연구의 저처리량 특성을 해결하고 기능에 영향을 미치는 많은(예를 들어, 수백, 수천 또는 수만의) 돌연변이 변이체의 동시 시험을 가능하게 하는 표적 폴리펩타이드(본원에서 항원이라고도 지칭됨)의 라이브러리에 대한 심층 돌연변이 스캐닝으로부터 유도된다. 상기 방법의 처리량은 표면 잔기의 보다 포괄적인 샘플링뿐만 아니라, 잔기당 여러 개의 별개의 돌연변이(즉, 알라닌으로의 돌연변이뿐만 아니라), 따라서 입체형태적 에피토프를 포함한 에피토프의 보다 민감하고 완전한 매핑을 가능하게 할 수 있다.
한 실시양태에서, 표적 폴리펩타이드의 변이체는 예를 들어 링커 서열을 통해 내인성 세포 표면 단백질, 예를 들어 효모 단백질 Aga2에 융합시킴으로써 세포(예를 들어, 효모 세포)의 표면에서 발현된다. 예를 들어, 표적 폴리펩타이드가 일반적으로 다량체를 형성하는 한 실시양태에서, 링커와 주어진 변이체 사이의 긴 가요성 링커 서열(예를 들어, 적어도 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50개 또는 그 초과의 아미노산을 포함하는 링커)은 인접한 표적 폴리펩타이드 분자가 결합하기에 충분한 근접성을 제공하여, 천연 4차 구조를 제공할 수 있다. 한 실시양태에서, 링커는 35개의 아미노산을 포함한다.
한 실시양태에서, 방법은 실시예에서 설명되는 하나 이상의 단계를 포함한다. 한 실시양태에서, 방법은 실시예에 따라 수행된다.
표적 폴리펩타이드 변이체
한 실시양태에서, 표적 폴리펩타이드의 변이체 집단은 관심 항체에 대한 결합 능력 및/또는 결합 친화도에 대해 시험된다. 한 실시양태에서, 표적 폴리펩타이드 변이체의 집단은 표적 폴리펩타이드의 표면 잔기에 대한 돌연변이를 포함할 수 있으며, 이는 예를 들어 본원에서 설명된 에피토프 매핑 방법을 사용하여 또는 관련 기술 분야에 알려진 바와 같이 관심 항체와 접촉하는 폴리펩타이드의 표면 영역을 확인하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 각각의 변이체 집단은 표면 잔기에 적어도 하나의(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15개 또는 그 초과의) 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 상기 집단은 원하는 분해능에서 항체와 표적 폴리펩타이드 사이의 접촉 영역을 확인하기에 적합한 표면 잔기의 분포를 갖는 변이체를 포함한다.
예를 들어, 이러한 변이체의 라이브러리는 예를 들어 본원에서 설명되는 바와 같이 심층 돌연변이 스캐닝에 의해 생성될 수 있다. 한 실시양태에서, 변이체의 라이브러리는 예를 들어 돌연변이될 때 단백질 구조에 상당한 해로운 영향을 미칠 것으로 보이지 않는 모든 표면 잔기를 먼저 확인함으로써, 심층 돌연변이 스캐닝으로부터 유도된 에피토프 매핑에 대한 정보 출력을 최대화하도록 디자인된다. 한 실시양태에서, 표면 잔기는 상대적인 측쇄 표면 접근성을 기반으로 하여 선택될 수 있다(예를 들어, Discovery Studio를 사용하여). 한 실시양태에서, 약 25% 초과(예를 들어, 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 초과)의 상대적인 측쇄 표면 접근성을 나타내는 잔기가 돌연변이를 위해 선택된다. 한 실시양태에서, 예를 들어 육안 검사 및/또는 인접한 잔기와의 상호작용 및 상기 잔기에 대한 근접성에 의해 돌연변이에 내성이 있는 잔기가 확인될 수 있다. 한 실시양태에서, 표적 폴리펩타이드의 모든 표면 잔기는 결합된 항체와 직접 접촉 할 잠재력이 있는 잔기의 세트로서 확인된다. 한 실시양태에서, Pro 및/또는 Gly 잔기는 고려 대상에서 제외되는데, 상기 잔기를 돌연변이시키는 것은 단백질 구조를 교란시킬 가능성이 더 높고, 이것은 결합에 대한 간접적인 효과를 통해 에피토프 매핑에 대한 위양성을 유발할 수 있기 때문이다.
한 실시양태에서, 돌연변이되는 잔기의 세트는 표적 폴리펩타이드의 표면에 걸쳐 균일한 커버리지를 위해 선택된다. 한 실시양태에서, 잔기는 전체 표면에 걸친 돌연변이를 위한 표면 위치 세트의 선택을 위해 균일한 커버리지를 보장하도록 가시적으로 큐레이팅될 수 있다. 한 실시양태에서, 추가의 N-말단 및/또는 C-말단 잔기가 돌연변이를 위해 선택될 수 있다. 한 실시양태에서, 표적 폴리펩타이드의 X-선 결정 구조에서 분해되지 않은 하나 이상의 잔기가 돌연변이를 위해 선택될 수 있다. 한 실시양태에서, 적어도 약 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 225, 250, 275, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 또는 1000개의 잔기가 돌연변이를 위해 선택된다.
한 실시양태에서, 선택된 위치를 나타내는 단일 부위 포화 돌연변이 유발 라이브러리는 예를 들어 NNK 축퇴성(degeneracy)을 사용하여 합성된다. 합성된 라이브러리의 심층 서열 분석을 사용하여 의도된 위치에서 돌연변이의 존재를 확인할 수 있다. 한 실시양태에서, 유전자형-표현형의 연결은 예를 들어 비-조합, 부위-포화 라이브러리를 사용하여 단일 돌연변이를 표현형에 커플링함으로써 유지된다.
라이브러리 선택
표적 폴리펩타이드 변이체의 라이브러리는 세포로 형질전환될 수 있고 결합에 대한 돌연변이의 영향에 대해 평가될 수 있다. 한 실시양태에서, 라이브러리는 효모 세포로 형질전환된다. 바람직하게는, 형질전환은 특유한 유전적 다양성(예를 들어, 각각의 위치에서 가능한 32개의 코돈)의 철저한(예를 들어, 약 5000배, 예를 들어, 약 100배, 500배, 1000배, 2000배, 3000배, 4000배, 5000배, 6000배, 7000배, 8000배, 9000배, 10,000배 또는 그 초과의) 과다샘플링을 제공한다. 한 실시양태에서, 항체 결합을 방해하는 돌연변이의 검출에 대한 민감도는 예를 들어 세포 상에 디스플레이되는 야생형 표적 폴리펩타이드에 대한 최대 결합의 약 80%(예를 들어, 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%)에 상응하는 항체의 농도를 사용하여 최대화된다. 한 실시양태에서, 항체 결합은 상이한 결합 특성을 나타내는 변이체를 구별하기 위해 사용된다. 한 실시양태에서, 감소된 결합을 나타내는 변이체가 선택된다. 한 실시양태에서, 증가된 결합을 나타내는 변이체가 선택된다.
한 실시양태에서, 형광 활성화 세포 분류(FACS)는 상이한 결합 특성(예를 들어, 야생형 표적 폴리펩타이드에 비해 감소 또는 증가된 결합)을 나타내는 변이체를 선택(예를 들어, 농축)하기 위해 사용된다. 한 실시양태에서, 야생형 표적 폴리펩타이드에 비해 감소된 결합, 예를 들어, 야생형 표적 폴리펩타이드를 포함하는 세포가 나타내는 결합의 적어도 약 20%(예를 들어, 적어도 약 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90 %, 95% 또는 100%)의 감소된 결합을 나타내는 변이체가 선택된다. 한 실시양태에서, 야생형 표적 폴리펩타이드에 비해 증가된 결합을 나타내는 변이체, 예를 들어, 야생형 표적 폴리펩타이드를 포함하는 세포가 나타내는 결합의 적어도 약 20%(예를 들어, 적어도 약 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90 %, 95% 또는 100%)의 증가된 결합을 나타내는 변이체가 선택된다. 한 실시양태에서, 적어도 2(예를 들어, 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 또는 그 초과) 라운드의 FACS 농축(예를 들어, 발현되지만 결합하지 않는 집단의 농축)이 수행된다. 한 실시양태에서, 적어도 약 1000개의 세포(예를 들어, 적어도 약 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10,000, 15,000, 20,000, 25,000, 30,000, 35,000, 40,000, 45,000, 50,000, 60,000, 70,000, 80,000, 90,000 또는 100,000개의 세포)가 주어진 샘플에 대해 수집된다. 한 실시양태에서, 주어진 샘플에 대해 적어도 약 30,000개의 세포가 수집된다. 특정 실시양태에서, FACS 농축은 그 각각의 항체에 대한 임의의 유의한 결합 능력이 결여된 집단을 생성한다.
한 실시양태에서, 표적 폴리펩타이드 변이체의 라이브러리를 발현하는 세포(예를 들어, 효모 세포)는 예를 들어 야생형 표적 폴리펩타이드를 발현하는 세포(예를 들어, 효모 세포)를 사용한 항체 적정 결합 실험에 기초하여, 예를 들어 표적 폴리펩타이드에 대한 항체의 최대 결합의 약 80%(예를 들어, 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%)에 상응하는 농도에서 항체에 노출된다.
심층 서열 분석 및 생물 정보학
한 실시양태에서, 결합 실험으로부터 선택된 변이체는 예를 들어 근본적인 유전자형을 확인하고 정량하기 위해 심층 서열 분석에 적용된다. 한 실시양태에서, 미리 결정된 역치 미만의 품질 점수(예를 들어, 약 30 미만의 품질 점수)를 갖는 서열 분석 리드(read)가 데이터 세트로부터 제거된다. 한 실시양태에서, 삽입 및/또는 결실 돌연변이를 포함하는 리드는 데이터 세트로부터 제거된다. 한 실시양태에서, 미리 결정된 역치 초과의 많은 염기 치환(예를 들어, 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 13, 14, 15, 20, 30, 40 또는 50개 초과의 염기 치환)을 포함하는 리드가 데이터 세트로부터 제거된다. 한 실시양태에서, 야생형 표적 폴리펩타이드에 비해 내부 정지 코돈, 의도하지 않은 위치에서의 돌연변이, 및/또는 하나 초과의 아미노산 치환이 데이터 세트로부터 제거된다. 한 실시양태에서, 뉴클레오타이드 리드는 아미노산 리드로 전환된다. 한 실시양태에서, 미리 결정된 역치수 미만의 리드(예를 들어, 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 또는 1000개 미만의 리드)가 데이터 세트로부터 제거된다.
한 실시양태에서, 항체에 대한 농축된 서열 분석된 변이체의 수준을 계산하기 위해 생물 정보학 분석이 수행된다. 한 실시양태에서, 출발 라이브러리에 비해 비결합 집단에서 농축된 변이체는 항체 결합 친화도를 감소시키는 돌연변이를 나타낸다. 한 실시양태에서, 출발 라이브러리에 비해 상승된 결합 집단에서 농축된 변이체는 항체 결합 친화도를 증가시키는 돌연변이를 나타낸다. 감소된 결합을 유발하는 것으로 고려되는 메커니즘은 예를 들어 항체와 직접 접촉하는 잔기 측쇄의 변화와 같은 직접적인 효과, 및 접촉 잔기와 관련되지 않은 국소적인 또는 전체적인 단백질 구조의 변화와 같은 간접적 효과를 포함한다. 구조적으로 파괴적인 돌연변이는 다양한 에피토프에 대한 항체의 결합에 영향을 미칠 수 있다. 한 실시양태에서, 항체 결합에 간접적인 영향을 미칠 가능성이 있는 돌연변이를 식별하기 위한 컴퓨터를 사용한 연구를 돕기 위해 항체 패널을 상이한 결합 방식(예를 들어, 경쟁 결합 실험을 사용하여 결정된)에 적용시킨다.
농축 점수
라이브러리 선택 후 특정 변이체의 농축 수준을 나타내는 농축 점수는 예를 들어 본원에서 설명되는 바와 같이 생성된 선택 데이터에 기초하여 각각의 변이체에 대해 계산될 수 있다. 한 실시양태에서, 각각의 돌연변이에 대한 농축 점수는 다음과 같이 계산된다: 비결합 풀에서 수집된 각각의 샘플에 대해, 샘플에서 돌연변이의 위치 의존적 발생 빈도는 발현자 풀(expresser pool)에서의 해당 돌연변이의 발생 빈도에 의해 정규화되고, 다음과 같이 비결합 풀에서 발견된 변이체의 분획으로 확장된다:
Figure pct00001
여기서,
Figure pct00002
는 샘플(들)에 대해 위치(p)에서 주어진 아미노산(aa)에 대한 농축 점수이고, NB S 는 비결합 풀에서 발견된 변이체의 분획(풀 크기)이고, f p,aa 는 샘플(s) 또는 발현자 풀(wt)에서 관찰된 아미노산의 위치 빈도이다. 한 실시양태에서, 농축 점수는 비결합 풀에서 발견되는 발현자 풀로부터의 돌연변이의 분획을 나타낸다(예를 들어, 여기서 백분율로 표시됨).
한 실시양태에서, 비결합 풀에서 각각의 돌연변이의 분획은 서열 분석 결과에 기초하여 계산된다. 한 실시양태에서, 각각의 돌연변이에 대해, 발현자 풀에서 발견된 빈도에 비해 비결합 풀에서 발견된 발생 빈도를 사용하여 농축 점수를 계산한다. 한 실시양태에서, 변이체에 대해 계산된 농축 점수는 비결합 풀에서 발견된 특정 돌연변이의 분획을, 예를 들어 0-100% 범위로 나타낸다. 한 실시양태에서, Pro, Gly 또는 Cys으로의 돌연변이는 3차 또는 4차 구조를 변경하는 보다 높은 성향으로 인해 고려 대상에서 제외되었다. 한 실시양태에서, 글리코실화 부위를 삽입하거나 제거할 것으로 예측되는 부위 특이적 돌연변이는 고려 대상에서 제외되었다. 한 실시양태에서, 잔기 농축 점수는 예를 들어 높은 농축 점수를 갖는 돌연변이에 대해 더 높은 가중치를 부여하는 방식으로 특정 잔기에 대한 각각의 돌연변이의 농축 점수를 집계함으로써 계산된다. 보다 높은 농축 점수를 갖는 잔기는 일반적으로 결합과 관련하여 돌연변이에 대한 더 큰 민감성을 반영하며, 이는 예를 들어 상기 위치가 에피토프의 일부일 가능성이 더 높다는 것을 나타낸다. 한 실시양태에서, 농축 점수는 이어서 표적 폴리펩타이드의 표면에 매핑되고, 농축 점수가 높은 위치(예를 들어, 표적 폴리펩타이드의 표면 패치 상의)는 에피토프의 일부로 지정된다.
이론에 얽매이지 않으면서, 특정 돌연변이는 복수의 시스템에 걸쳐 배경 초과의 농축 점수를 보여줄 수 있으며, 종종 중저가의 농축 점수 값을 갖는다. 많은 항체에 대한 결합에 대한 이러한 무차별 효과는 일부 경우에 예를 들어 간접 메커니즘을 통한 결합 감소로 인한 위양성을 나타낼 수 있다. 에피토프 매핑으로부터 제거하기 위한 무차별 돌연변이를 확인하기 위한 역치는 예를 들어 모든 샘플에 대한 농축 지도의 검사에 기초하여 경험적으로 결정될 수 있다. 한 실시양태에서, 약 50% 초과(예를 들어, 약 30%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60% 또는 70%)의 샘플이 약 30% 초과(예를 들어, 약 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% 또는 50%)의 농축 점수를 갖는, 및 선택적으로 약 75% 초과(예를 들어, 약 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 또는 95%)의 샘플이 15% 초과(예를 들어, 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25% 또는 30%)의 농축 점수를 갖는 돌연변이는 위양성으로 간주되고, 에피토프 결정을 위해 제거된다. 한 실시양태에서, 무차별 돌연변이는 항체-항원 복합체의 구조적 분석에 의해 확인될 수 있으며, 예를 들어 이러한 잔기가 항체-항원 접촉에 관여하지 않거나 또는 돌연변이가 예를 들어 2차, 3차 또는 4차 구조를 불안정화할 수 있음(예를 들어, 정전기적 인력 또는 반발력에 의해)을 보여줄 수 있다.
한 실시양태에서, 농축 점수 및 에피토프 지도는 예를 들어 재현성을 평가하기 위해 복수의 생물학적 복제물(예를 들어, 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 또는 30개의 생물학적 복제물)에 대해 계산될 수 있다. 한 실시양태에서, 농축 점수 결과의 정확성은 예를 들어 상기 결과를, 항체 또는 이의 대등한 대용물(예를 들어, 표적 폴리펩타이드에 대한 리간드 또는 수용체)과 표적 폴리펩타이드의 공결정 구조에 비교함으로써 검증될 수 있다.
한 실시양태에서, 예를 들어 아미노산 위치가 에피토프의 일부라는 평가를 위해, 표적 폴리펩타이드 상의 주어진 아미노산 위치에 대한 돌연변이 데이터의 집합체가 생성될 수 있다. 한 실시양태에서, 총 농축 점수는 예를 들어 상응하는 위치에서 각각의 돌연변이의 효과를 집계함으로써 각각의 잔기에 대해 계산된다. 한 실시양태에서, 농축 점수는 다음과 같이 계산된다:
Figure pct00003
여기서, N p,aa 는 여과 후 주어진 위치에서의 아미노산 돌연변이의 수이다. 일반적으로, 계산된 총 잔기 농축 점수는 높은 농축 점수를 나타내는 돌연변이의 효과에 보다 높은 가중치를 부여하고/하거나, 낮은 농축 점수를 나타내는 돌연변이의 기여도에 대해 낮은 가중치를 부여한다. 이것은 노이즈로 인해 발생할 수 있는, 다중 돌연변이에 대해 낮은 농축 수준을 나타내는 위치가 보다 적은 수의 돌연변이를 갖지만 보다 고도로 농축될 수 있는 위치로부터의 신호를 마스킹하지 않도록 보장할 수 있다. 한 실시양태에서, 일단 총 농축 점수가 각각의 위치에 대해 계산되면, 총 농축 점수는 농축 에피토프 지도의 가시화를 용이하게 하기 위해 단백질 표면에 매핑될 수 있다.
항체-항원 복합체의 컴퓨터를 사용한 모델링
본원에서 설명되는 방법은 일반적으로 관심 항체 또는 그의 항원-결합 단편에 의해 결합된 표적 폴리펩타이드 상의 하나 이상의 에피토프 영역 또는 부위를 확인하는 것을 포함한다. 이러한 에피토프 영역은 예를 들어 항체-항원 복합체의 컴퓨터를 사용한 모델링을 사용하여(예를 들어, 도킹 알고리즘을 사용하여) 확인될 수 있으며, 이는 예를 들어 본원에서 설명되는 바와 같은 세포 디스플레이 검정 결과에 따른 정보를 기초로 할 수 있다. 한 실시양태에서, 세포 디스플레이 검정의 결과(예를 들어, 본원에서 설명되는 바와 같은 농축 점수)는 제약조건으로서 도킹 알고리즘에 통합된다. 한 실시양태에서, 방법은 실시예에서 설명되는 하나 이상의 단계를 포함한다. 한 실시양태에서, 방법은 실시예에 따라 수행된다.
항체-항원 도킹
일반적으로, 바람직하게는 (1) 실험을 통해 유도된 에피토프 매핑을 제약조건으로서 통합하고, (2) 상동성 모델링의 불확실성을 보다 잘 설명하기 위해 항체 모델의 앙상블을 사용하고, (3) 항체-항원 복합체의 특징을 나타내는 도킹된 모델을 보다 효과적으로 확인하기 위해 다량의 항체 특이적 구조 지식을 이용하는 항체-항원 모델을 생성하기 위해 다단계 도킹 접근 방식을 실행할 수 있다. 한 실시양태에서, 예를 들어 본원에서 설명되는 바와 같은 심층 돌연변이 스캐닝 데이터로부터 수득된 잔기 농축 점수는 예를 들어 항원 표면 전체에 걸쳐 항체 참여를 샘플링하는, 전체적인 항체-항원 도킹 알고리즘에 대한 제약조건으로서 사용된다. 한 실시양태에서, 제약조건은 고농축 위치와 접촉할 때 항체-항원 포즈를 유리한 것으로 지정하기 위해 및/또는 돌연변이에 내성이 있는 것으로 결정된 위치와 접촉할 때 항체-항원 포즈를 불리한 것으로 지정하기 위해 사용된다.
한 실시양태에서, 항체 상동성 모델(예를 들어, 항체-항원 도킹 모델의 생성에 사용하기 위한)은 예를 들어 관련 기술 분야에 공지된 알고리즘 및/또는 프로토콜(예를 들어, 로제타 항체 상동성 모델링, 예를 들어, Rosette 3.8, 또는 BioLuminate Schroedinger)로 사용하여 생성된다. 한 실시양태에서, 항체 상동성 모델은 예를 들어 CDR 영역(예를 들어, HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, 및/또는 LCDR3)의 입체형태에서 다양하다. 한 실시양태에서, 모델은 주로 HCDR3의 입체형태에서(예를 들어, HCDR3 루프에서) 다양하다.
예를 들어, 상이한 항체 상동성 모델의 앙상블을 입력으로 사용하여 도킹을 수행할 수 있다. 한 실시양태에서, 도킹 프로그램 PIPER는 예를 들어 공지된 항체-항원 복합체로부터 유래된 맞춤형 점수 함수를 사용하여 전체적인 도킹에 사용된다. 한 실시양태에서, 농축 점수로부터의 제약조건은 예를 들어 도킹 결과를 변경하기 위해 유인성 및/또는 반발성 제약조건을 이용하여, 도킹된 모델의 생성 동안에 사용된다. 이는 높은 농축 점수(예를 들어, 도킹을 위한 유인성 제약조건으로 변환됨)를 가진 잔기를 확인하고/하거나, 에피토프의 일부가 될 것으로 예상되지 않는 낮은 농축 점수(예를 들어, 반발성 제약조건으로 변환됨)를 갖는 잔기를 확인하는 에피토프 매핑 접근법을 허용한다. 한 실시양태에서, 제약조건은 예를 들어 중간 농축 점수를 가진 잔기가 도킹 동안 제약되지 않도록, 높거나 낮은 농축 점수를 갖는 잔기만을 사용하여 생성된다. 한 실시양태에서, 항체 패널로부터 생성된 데이터는 많은 항체의 결합에 영향을 미치고 따라서 위양성일 가능성이 보다 높은 돌연변이를 확인하기 위해 사용된다. 한 실시양태에서, 이러한 위양성은 제약조건을 생성할 때 고려 대상에서 제외될 수 있다. 한 실시양태에서, 본원에서 설명되는 도킹 접근법은 농축된 위치가 에피토프의 일부로서 포함되어야 하는지 여부를 결정하기 위해 절대적인 컷오프에 의존하지 않는다.
한 실시양태에서, 제약조건은 다음과 같이 도킹 실행에 포함된다: 잔기 농축 점수가 약 30% 초과(예를 들어, 약 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% 또는 50% 초과)인 부위에 대해, 유인성 제약조건이 예를 들어 농축 점수를 기준으로 하여 예를 들어 0.35에서 0.99까지 선형적으로 스케일링된 유인하는 보너스와 함께 추가된다. 한 실시양태에서, 잔기 농축 점수가 약 12.5%(예를 들어, 약 5%, 10%, 11%, 12%, 12.5%, 13%, 14%, 15%, 20%, 25% 또는 30%) 미만인 잔기에 대해 반발성 제약조건이 추가된다. 한 실시양태에서, 일련의 투입 항체 상동성 모델(예를 들어, 적어도 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50개 또는 그 초과의 일련의 투입 항체 상동성 모델) 각각에 대해 전체적인 도킹이 수행된다. 한 실시양태에서, 적어도 약 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 또는 1000개의 총 도킹된 포즈가 생성된다. 한 실시양태에서, 클러스터 중심을 나타내는 약 30개의 포즈(예를 들어, 약 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50개의 포즈)가 각각의 샘플에 대해 수득된다.
한 실시양태에서, 각각의 도킹된 모델과 실험적으로 결정된 농축 점수 사이의 일치 수준을 평가하기 위해 에피토프 지도 점수가 계산된다. 한 실시양태에서, 에피토프 지도 점수는 다음 식을 사용하여 계산된다:
Figure pct00004
여기서, ES는 에피토프 지도 점수이고, N은 돌연변이된 부위의 수이고, c p 는 위치 p에서의 제약조건이고, E p 는 위치 p에서의 농축 점수이다. 한 실시양태에서, 도킹된 모델은 에피토프 지도 점수에 의해 순위가 매겨진다. 한 실시양태에서, 특정 수의 상위 모델(예를 들어, 상위 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100개 또는 그 초과의 모델)이 선택된다.
한 실시양태에서, 항체-항원 도킹은 복수의 항체 상동성 모델이 하나 이상의 항원 모델에 도킹되는 앙상블 도킹 모델을 생성하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 복수의 항체 상동성 모델은 한 항원 모델에 도킹된다. 한 실시양태에서, 복수의 항체 상동성 모델은 복수의 항원 모델에 도킹된다. 한 실시양태에서, 항체-항원 복합체를 나타내기 위해 상부 용액의 앙상블이 사용된다. 또 다른 실시양태에서, 도킹 워크플로우로부터의 단일 상위 순위의 모델이 도킹된 복합체를 나타내기 위해 선택된다.
한 실시양태에서, 본 명세서에 설명된 바와 같이 생성된 도킹된 포즈는 예를 들어 국소 도킹 알고리즘(예를 들어, SnugDock)을 사용하여 개선될 수 있다. 한 실시양태에서, 국소 도킹 알고리즘은 예를 들어 작은 경질체 움직임을 탐색하고, 측쇄의 재패킹, CDR 영역(예를 들어, HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, 및/또는 LCDR3; 바람직하게는 HCDR2 및/또는 HCDR3)의 리모델링, CDR 루프(예를 들어, HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및/또는 LCDR3; 바람직하게는 HCDR2 및/또는 HCDR3)의 개선, 및/또는 VH/VL 배향의 리샘플링을 허용함으로써 도킹된 포즈를 개선한다. 한 실시양태에서, 농축 점수로부터의 제약조건은 예를 들어 국소 도킹 결과를 변경하기 위해 유인성 및/또는 반발성 제약조건을 이용하여 국소 도킹에 사용된다(예를 들어, 전체적인 도킹에 대해 상기 설명한 바와 같이). 한 실시양태에서, 농축 점수가 높은 잔기는 도킹을 위한 유인성 제약조건으로 변환된다. 한 실시양태에서, 농축 점수가 낮은 잔기는 반발성 제약조건으로 변환된다.
한 실시양태에서, 예를 들어 이용 가능한 항체-항원 결정 구조 세트로부터 유래된 항체 특이적 구조 필터의 세트를 적용하여 공지된 항체-항원 복합체에 대해 비정형적인 결합 방식을 나타내는 모델을 제거한다. 한 실시양태에서, 구조 필터는 표 1에 제시된 것들로부터 선택된다(예를 들어, 표 1에 제시된 구조 필터의 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14개, 또는 전부). 한 실시양태에서, 두 잔기 내의 무거운 원자의 쌍이 5 Å 미만의 거리로 떨어져 있으면, 잔기는 접촉하는 것으로 간주된다.
Figure pct00005
한 실시양태에서, 구조 필터를 생성하기 위해 적어도 약 100개(예를 들어, 약 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500개 또는 그 초과)의 이용 가능한 항체-항원 복합체의 구조가 사용된다. 한 실시양태에서, 계면 근처에 영역이 누락된 복합체 및/또는 계면에 리간드 또는 번역 후 변형을 갖는 복합체가 제거된다. 일반적으로, 구조 필터를 생성하는 데 사용되는 항체-항원 복합체 세트의 경우, 주요 계면 특성에 대한 구조적 특징의 분포가 계산된다(예를 들어, 에피토프와 결합하는 CDR 및/또는 프레임워크 잔기의 수, 상호작용에 관련된 CDR 루프의 수 및 유형, 에피토프 잔기의 수, 매립된 표면적 및/또는 쌍별 잔기 성향). 한 실시양태에서, 상기 계면 특성 중 하나 이상에 대한 역치는 미리 결정된 양(예를 들어, 적어도 약 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 99.9%)의 구조가 단지 하나의 구조 필터에서 실패하도록 선택된다.
한 실시양태에서, 도킹된 모델 각각에 대해 계면 특성이 계산된다. 한 실시양태에서, 하나 초과의 구조 필터에서 실패한 모델은 제거된다. 한 실시양태에서, 나머지 도킹된 모델은 에피토프 지도 점수(예를 들어, 본원에서 설명되는 바와 같은)에 기초하여 여과된다. 한 실시양태에서, 도킹된 모델은 낮은 농축 점수를 갖는 소수의 잔기와 접촉하도록 허용된다. 한 실시양태에서, 관찰된 최대 에피토프 지도 점수의 약 80% 미만의 농축 점수를 갖는 모델이 제거된다. 한 실시양태에서, 나머지 도킹된 모델은 예를 들어 로제타를 사용하여 계산된 바와 같이 그의 계면 에너지(Isc)에 기초하여 순위가 매겨진다.
한 실시양태에서, 이용 가능한 매우 많은 구조로부터 유래된 항체-항원 복합체에 대한 특정 지식을 사용하여 거의 천연 모델을 확인한다. 도킹 알고리즘은 일반적으로 단백질-단백질 상호작용에 대해 일반적으로 매개변수화된 물리 기반 스코어링 기능을 사용한다. 한 실시양태에서, 항체-항원 구조의 큐레이팅된 데이터베이스가 생성되고, 예를 들어 매립된 표면적, 항원과 결합하는 CDR 잔기의 수 및 유형, CDR 루프로부터 유래된 파라토프 잔기의 분획, 및/또는 쌍별 잔기 성향을 포함하는 구조적 특징의 분포가 계산된다. 그런 다음, 도킹된 모델 후보를 이러한 구조적 특징에 대해 평가할 수 있으며, 비정형적인 계면을 갖는 모델은 고려 대상에서 제거할 수 있다.
항체 공학(antibody engineering)
결정 구조와 일치하는 에피토프 잔기를 확인하는 것 외에도, 도킹된 모델은 또한 파라토프 정보를 제공할 수도 있다. 이것은 예를 들어 인간화, 친화도 성숙, 항원 결합 특이성의 변경, 및/또는 생물물리적 특성(예를 들어, 응집 성향)의 개선에서 항체의 추가의 조작에 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 파라토프 잔기 및/또는 영역은 본원에서 설명되는 바와 같이 생성된 항체-항원 도킹 모델을 사용하여 확인될 수 있다.
한 실시양태에서, 확인된 파라토프 잔기는 항체의 활성을 조절하거나 구조적 특성을 변경하도록 조작될 수 있다. 예를 들어, 파라토프 잔기는 표적 폴리펩타이드(예를 들어, 마우스 및 인간, 사이노몰구스 및 인간, 마우스 및 사이노몰구스, 또는 종의 임의의 다른 쌍별 조합)에 대한 종간 반응성을 증가 또는 감소시키기 위해, 및/또는 표적 폴리펩타이드 및 하나 이상의 관련 단백질에 대한 교차 반응성을 증가 또는 감소시키기 위해 변형될 수 있다.
한 실시양태에서, 본원의 개시내용은 본원에서 설명되는 방법에 의해 조작된 항체 분자를 포함한다. 한 실시양태에서, 본원의 개시내용은 본원에서 설명되는 방법에 의해 조작된 항체 분자 및 약제학상 허용되는 담체를 포함하는 조성물(예를 들어, 약제학적 조성물)을 포함한다. 한 실시양태에서, 본원의 개시내용은 본원에서 설명되는 방법에 의해 조작된 항체 분자를 코딩하는 핵산 분자를 포함한다. 한 실시양태에서, 본원의 개시내용은 본원에서 설명되는 방법에 의해 조작된 항체 분자를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터를 포함한다. 한 실시양태에서, 본원의 개시내용은 본원에서 설명되는 방법에 의해 조작된 항체 분자를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 세포(예를 들어, 숙주 세포)를 포함한다. 한 실시양태에서, 본원의 개시내용은 본원에서 설명되는 방법에 의해 조작된 항체 분자를 제조하는 방법을 포함한다.
본 개시내용은 또한 다음의 번호가 매겨진 단락 중 임의의 것을 포함한다:
1. 표적 폴리펩타이드 상의 에피토프를 확인하는 방법으로서,
(a) 표적 폴리펩타이드의 복수의 변이체에 항체 분자를 결합시키는 단계;
(b) 항체 분자에 대해 감소된 결합(예를 들어, 감소된 결합 친화도)을 나타내는 복수의 변이체를 수득(예를 들어, 농축)하는 단계;
(c) 복수의 수득된(예를 들어, 농축된) 변이체 각각에 대한 농축 점수를 결정(예를 들어, 계산)하는 단계;
(d) 항체 분자-표적 폴리펩타이드 도킹 모델을 생성하는 단계로서, 여기서 항체 분자-표적 폴리펩타이드 도킹 모델이 농축 점수에 따라 제약되는 것인 단계; 및
(e) 항체 분자-표적 폴리펩타이드 도킹 모델에 기초하여 항체 분자에 의해 결합될 수 있는 표적 폴리펩타이드 상의 부위를 확인함으로써, 표적 폴리펩타이드 상의 에피토프를 확인하는 단계
를 포함하는 방법.
2. 단락 1에 있어서, 단계 (a)가 표적 폴리펩타이드의 복수의 변이체를 디스플레이하는 라이브러리에 항체 분자를 결합시키는 것을 포함하는 것인 방법.
3. 단락 1 또는 단락 2에 있어서, 단계 (a)가 표적 폴리펩타이드의 복수의 변이체를 발현하는(예를 들어, 디스플레이하는) 복수의 세포를 포함하는 라이브러리에 항체 분자를 결합시키는 것을 포함하는 것인 방법.
4. 단락 3에 있어서, 복수의 세포가 각각 표적 폴리펩타이드의 대략 하나의 별개의 변이체를 발현하는 것인 방법.
5. 단락 3 또는 단락 4에 있어서, 세포가 진핵 세포, 예를 들어 효모 세포인 방법.
6. 단락 1 내지 단락 5 중 어느 한 단락에 있어서, 복수의 변이체가 표적 폴리펩타이드의 하나 이상의 표면 잔기 상의 돌연변이를 포함하는 것인 방법.
7. 단락 1 내지 단락 6 중 어느 한 단락에 있어서, 복수의 변이체가 표적 폴리펩타이드의 선택된 표면 잔기의 별개의 돌연변이를 포함하는 것인 방법.
8. 단락 1 내지 단락 7 중 어느 한 단락에 있어서, 복수의 변이체가 표적 폴리펩타이드의 복수의 선택된 표면 잔기 각각의 별개의 돌연변이를 포함하는 것인 방법.
9. 단락 1 내지 단락 8 중 어느 한 단락에 있어서, 복수의 변이체가 표적 폴리펩타이드의 야생형 아미노산 서열에 비해 단일 아미노산 치환을 포함하는 것인 방법.
10. 단락 1 내지 단락 9 중 어느 한 단락에 있어서, 복수의 변이체 각자가 표적 폴리펩타이드의 야생형 아미노산 서열에 비해 단일 아미노산 치환을 포함하는 것인 방법.
11. 단락 9 또는 단락 10에 있어서, 단일 아미노산 치환이 표적 폴리펩타이드의 표면 잔기에서 발생하는 것인 방법.
12. 단락 1 내지 단락 11 중 어느 한 단락에 있어서, 감소된 결합이 야생형 표적 폴리펩타이드 및 항체에 대해 검출된 결합에 비해 변이체 및 항체 분자에 대해 검출된 결합의 감소를 포함하는 것인 방법.
13. 단락 1 내지 단락 12 중 어느 한 단락에 있어서, 단계 (b)가 야생형 아미노산 서열에 의해 나타난 항체 분자에 대한 결합의 약 80% 미만(예를 들어, 약 0.01%, 0.1%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% 또는 80% 미만)을 나타내는 변이체를 수득(예를 들어, 농축)하는 것을 포함하는 것인 방법.
14. 단락 13에 있어서, 감소된 결합이 야생형 표적 폴리펩타이드에 의해 나타난 결합의 적어도 약 20%(예를 들어, 적어도 약 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%)인 방법.
15. 단락 1 내지 단락 14 중 어느 한 단락에 있어서, 단계 (b)가 야생형 표적 폴리펩타이드를 포함하는 세포에 의해 나타난 항체 분자에 대한 결합의 약 80% 미만(예를 들어, 약 0.01%, 0.1%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% 또는 80% 미만)을 나타내는 세포를 수득(예를 들어, 농축)하는 것을 포함하는 것인 방법.
16. 단락 15에 있어서, 감소된 결합이 야생형 표적 폴리펩타이드를 포함하는 세포에 의해 나타난 결합의 적어도 약 20%(예를 들어, 적어도 약 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%)인 방법.
17. 단락 1 내지 단락 16 중 어느 한 단락에 있어서, 단계 (b)가 항체 분자에 대한 감소된 결합을 나타내는 변이체에 대해 1회 이상, 예를 들어 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10회 또는 그 초과의 농축을 수행하는 것을 포함하는 것인 방법.
18. 단락 1 내지 단락 17 중 어느 한 단락에 있어서, 예를 들어 단계 (c) 전에, 예를 들어 차세대 서열 분석에 의해, 예를 들어 변이체를 코딩하는 유전자를 서열 분석함으로써, 항체 분자에 대한 감소된 결합을 나타내는 변이체를 확인하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
19. 단락 1 내지 단락 18 중 어느 한 단락에 있어서, 단계 (c)가 복수의 수득된(예를 들어, 농축된) 변이체 각각에 대한 발생 빈도를 결정하는 것을 포함하는 것인 방법.
20. 단락 19에 있어서, 단계 (c)가 특정 잔기에서 별개의 돌연변이를 포함하는 각각의 변이체의 발생 빈도를 집계하는 것 및/또는 더 높은 발생 빈도를 갖는 변이체에 높은 가중치를 부여하는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.
21. 단락 1 내지 단락 20 중 어느 한 단락에 있어서, 농축 점수가 표적 폴리펩타이드의 아미노산 서열의 단일 잔기에 특이적인 것인 방법.
22. 단락 1 내지 단락 21 중 어느 한 단락에 있어서, 각각의 농축 점수가 표적 폴리펩타이드의 아미노산 서열의 상이한 단일 잔기에 특이적인 것인 방법.
23. 단락 1 내지 단락 22 중 어느 한 단락에 있어서, 단계 (a)-(c)를 표적 폴리펩타이드의 복수의 변이체의 복제물을 사용하여 적어도 1회(예를 들어, 1회, 2회, 3회, 4회, 5회 또는 그 초과)로 반복하는 단계를 추가로 포함하고, 여기서 단계 (c)가 하나 이상의 무차별 돌연변이, 예를 들어 50% 초과의 복제물이 30% 초과의 농축 점수를 갖고 75% 초과의 복제물이 15% 초과의 농축 점수를 갖는 돌연변이를 제외하는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.
24. 단락 1 내지 단락 23 중 어느 한 단락에 있어서, 항체 분자-표적 폴리펩타이드 도킹 모델이 하나 이상의 유인성 제약조건을 추가함으로써 제약되며, 여기서 유인성 제약조건이 제1 사전선택된 값보다 더 큰 농축 점수를 갖는 잔기에 대한 것인 방법.
25. 단락 24에 있어서, 제1 사전선택된 값이 20% 내지 40%, 예를 들어 25% 내지 35%, 예를 들어 약 30%인 방법.
26. 단락 24 또는 단락 25에 있어서, 유인성 제약조건이 농축 점수에 기초하여 선형적으로 스케일링된 보너스를 포함하는 것인 방법.
27. 단락 1 내지 단락 26 중 어느 한 단락에 있어서, 항체 분자-표적 폴리펩타이드 도킹 모델이 제2 사전선택된 값보다 더 작은 농축 점수를 갖는 잔기에 대한 반발성 제약조건을 추가함으로써 제약되는 것인 방법.
28. 단락 27에 있어서, 제2 사전선택된 값이 5% 내지 20%, 예를 들어 10% 내지 15%, 예를 들어 약 12.5%인 방법.
29. 단락 1 내지 단락 28 중 어느 한 단락에 있어서, 단계 (d)가 항체 분자의 모델과 표적 폴리펩타이드의 모델 사이에 도킹된 포즈를 생성하는 것을 포함하는 것인 방법.
30. 단락 1 내지 단락 29 중 어느 한 단락에 있어서, 단계 (d)가 항체 분자의 모델과 표적 폴리펩타이드의 모델 사이에 복수의 도킹된 포즈를 생성하는 것을 포함하는 것인 방법.
31. 단락 30에 있어서, 단계 (d)가 도킹 알고리즘, 예를 들어 SnugDock에 따라 복수의 도킹된 포즈를 스코어링하는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.
32. 단락 31에 있어서, 단계 (d)가 최고 점수를 갖는 복수의 도킹된 포즈, 예를 들어 최고 점수의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000개 또는 그 초과의 도킹된 포즈의 하위세트를 선택하는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.
33. 단락 32에 있어서, 단계 (d)가 복수의 도킹된 포즈의 선택된 하위세트를 사용하여 앙상블 도킹된 포즈를 생성하는 것, 및 앙상블 도킹된 포즈에 따라 항체 분자의 모델 및 표적 폴리펩타이드의 모델을 설정하는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.
34. 단락 29 내지 단락 33 중 어느 한 단락에 있어서, 항체 분자의 모델이 항체의 복수의 상동성 모델로부터 유래된 앙상블 항체 상동성 모델을 포함하는 것인 방법.
35. 단락 1 내지 단락 34 중 어느 한 단락에 있어서, 단계 (d)가, 예를 들어 항체-항원 결정 구조로부터 유도된 구조 필터에 따라, 공지된 항체-항원 복합체에 대해 비정형적인 결합 방식을 나타내는 항체 분자-표적 폴리펩타이드 도케팅 모델을 제거하는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.
36. 단락 1 내지 단락 35 중 어느 한 단락에 있어서, 단계 (d)가 복수의 항체 분자-표적 폴리펩타이드 모델을 생성하는 것을 포함하는 것인 방법.
37. 단락 1 내지 단락 36 중 어느 한 단락에 있어서, 단계 (e)가 항체 분자에 의해 결합될 수 있는 표적 폴리펩타이드 상의 복수의 부위를 확인하는 것을 포함하는 것인 방법.
38. 표적 폴리펩타이드 상의 에피토프를 확인하는 방법으로서,
(a) 항체-표적 폴리펩타이드 도킹 모델을 생성하는 단계로서, 여기서 항체-표적 폴리펩타이드 도킹 모델이
(i) 표적 폴리펩타이드의 복수의 변이체에 항체 분자를 결합시키는 단계,
(ii) 항체 분자에 대한 감소된 결합을 나타내는 복수의 변이체를 수득(예를 들어, 농축)하는 단계, 및
(iii) 복수의 농축된 변이체 각각에 대한 농축 점수를 결정(예를 들어, 계산)하는 단계
를 포함하는 방법에 의해 결정되는 복수의 농축 점수에 따라 제약되는 것인 단계; 및
(b) 항체-표적 폴리펩타이드 도킹 모델에 기초하여 항체 분자에 의해 결합될 수 있는 표적 폴리펩타이드 상의 부위를 확인함으로써, 표적 폴리펩타이드 상의 에피토프를 확인하는 단계
를 포함하는 방법.
39. 항체 분자 상의 파라토프를 확인하는 방법으로서,
(a) 표적 폴리펩타이드의 복수의 변이체에 항체 분자를 결합시키는 단계;
(b) 항체 분자에 대해 감소된 결합을 나타내는 복수의 변이체를 수득(예를 들어, 농축)하는 단계;
(c) 복수의 농축된 변이체 각각에 대한 농축 점수를 결정(예를 들어, 계산)하는 단계;
(d) 항체 분자-표적 폴리펩타이드 도킹 모델을 생성하는 단계로서, 여기서 항체-표적 폴리펩타이드 도킹 모델이 농축 점수에 따라 제약되는 것인 단계; 및
(e) 항체-표적 폴리펩타이드 도킹 모델에 기초하여 표적 폴리펩타이드에 의해 결합될 수 있는 항체 분자 상의 하나 이상의 부위를 확인함으로써, 항체 분자 상의 파라토프를 확인하는 단계
를 포함하는 방법.
40. 항체 상의 파라토프를 확인하는 방법으로서,
(a) 항체-표적 폴리펩타이드 도킹 모델을 생성하는 단계로서, 여기서 항체-표적 폴리펩타이드 도킹 모델이
(i) 표적 폴리펩타이드의 복수의 변이체에 항체를 결합시키는 단계,
(ii) 항체 분자에 대한 감소된 결합을 나타내는 변이체를 수득(예를 들어, 농축)하는 단계, 및
(iii) 복수의 수득된(예를 들어, 농축된) 변이체 각각에 대한 농축 점수를 결정(예를 들어, 계산)하는 단계
를 포함하는 방법에 의해 결정되는(예를 들어, 계산되는) 복수의 농축 점수에 따라 제약되는 것인 단계; 및
(b) 항체-표적 폴리펩타이드 도킹 모델에 기초하여 표적 폴리펩타이드에 의해 결합될 수 있는 항체 분자 상의 하나 이상의 부위를 확인함으로써, 표적 폴리펩타이드 상의 파라토프를 확인하는 단계
를 포함하는 방법.
41. 표적 폴리펩타이드 상의 에피토프 또는 표적 폴리펩타이드에 대한 항체 분자 상의 파라토프가 단락 1 내지 단락 40 중 어느 한 단락의 방법에 따라 확인되는 항체 분자.
42. 단락 41의 항체 분자의 하나 이상의 사슬(예를 들어, VH 및/또는 VL)을 코딩하는 핵산 분자.
43. 단락 42의 핵산 분자를 포함하는 벡터.
44. 단락 42의 핵산 분자 또는 단락 43의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
45. 항체 분자를 제조하는 방법으로서, 항체 분자의 발현에 적합한 조건 하에 단락 44의 숙주 세포를 배양하는 것을 포함하는 방법.
실시예
실시예 1: 포괄적인 항원 라이브러리의 심층 서열 분석에 의한 입체형태적 에피토프 매핑을 포함하는 항체-항원 복합체의 컴퓨터를 사용한 모델링
항체-APRIL 모델 구조의 품질을 개선하기 위해, 실험적으로 유도된 항원(APRIL) 돌연변이 데이터를 컴퓨터를 사용한 도킹 워크플로우에 제약조건으로 포함시켰다. APRIL 돌연변이 프로파일은 항원 라이브러리의 심층 돌연변이 스캐닝으로부터 유도되었으며, 이는 전형적인 돌연변이 유발 유전자형-표현형 연구의 저처리량 특성을 해결하고, 결합에 미치는 영향에 대해 수천 개의 돌연변이 변이체를 동시에 시험할 수 있게 하였다. 이 방법의 처리량은 표면 잔기 및 모든 돌연변이(즉, Ala뿐만 아니라)의 보다 철저한 샘플링을 가능하게 하였으며, 따라서 항체 결합에 기여하는 항원 잔기의 보다 민감하고 완전한 특성화를 제공하였다.
효모 표면 디스플레이는 입체형태적으로 손상되지 않은 항원을 디스플레이하는 능력 및 라이브러리 구축 및 선택을 위한 시스템의 용이성으로 인해 포괄적인 돌연변이 라이브러리의 고처리량 스크리닝을 용이하게 하기 위해 사용되었다. 효모 표면에서의 huAPRIL의 생산적 발현은 이전의 관찰과 일치하게 불량한 것으로 밝혀졌다. 따라서, TACI에 대한 결합 부위를 보존하고 항체를 차단하기 위해 huAPRIL에서의 동등한 잔기로 돌연변이된 TACI-결합 부위 내부 및 그 주위의 표면 잔기를 갖는 키메라 형태의 마우스 APRIL(muAPRIL)이 디자인되었다(도 1). 생성된 키메라는 달리 명시되지 않는 한, 본원에서 APRIL로 지칭된다. 모든 인간 특이적 항-APRIL 항체 및 TACI는 상기 디자인된 APRIL에 결합하는 것으로 나타났으며(도 2), 이는 그의 입체형태적 완전성을 입증하였다.
35개 잔기의 가요성 링커(다량체화를 촉진하기 위한)를 포함하는 Aga2-APRIL 융합 단백질은 TACI에 대한 강한 결합을 나타냈다(도 2). TACI의 결합 부위는 4차 구조로 구성되며, 인접한 2개의 APRIL 단량체의 계면을 가로질러 상당한 접촉이 존재한다. 이러한 결합 결과는 효모 표면에 생산적인 APRIL 단량체-단량체 계면이 형성됨을 시사하였다.
마우스 유래 항-huAPRIL 항체의 패널을 효모에서 발현된 APRIL에 대해 시험하였다. 모든 항체는 정제된 재조합 huAPRIL에 대한 결합과 일치하는 적정 가능한 결합을 나타내었으며(도 2), 효모 표면에서 발현된 APRIL 단백질의 구조적 완전성을 추가로 지지한다. APRIL의 부위 포화 돌연변이된 표면 위치의 효모 표면 디스플레이 라이브러리를 APRIL 항체에 대해 스크리닝하여 결합에 영향을 미치는 돌연변이의 포괄적인 프로파일을 생성하고, 그 결과를 컴퓨터를 사용한 항체-항원 도킹을 제약하기 위해 사용하였다(도 3).
실시예 2: 라이브러리 선택 및 심층 서열 분석
단일 부위 포화 돌연변이 유발 라이브러리는 본원에서 설명되는 바와 같이 NNK 축퇴를 사용하여 합성되었고, 라이브러리의 심층 서열 분석을 통해 의도된 위치에서 모든 돌연변이의 존재를 확인하였다. 합성된 라이브러리는 효모로 형질전환되었으며, 돌연변이되지 않은 APRIL과 유사한 표면 발현을 생성하였다. TACI 및 항-APRIL 항체 패널을 사용한 결합 연구는 대부분의 라이브러리가 강한 결합을 유지하고, 소수는 결합이 감소된 결합을 나타내거나 결합을 나타내지 않음을 보여주었다(도 4a-4b, 처음 2개의 컬럼). 발현되지만 결합하지 않는 집단에 대한 2회의 FACS 농축을 수행하였다(도 4a-4b, 마지막 컬럼). 이어서, 상이한 결합 실험으로부터의 비결합 풀을 본원에서 설명되는 바와 같은 심층 서열 분석에 적용하였다.
실시예 3: 각각의 항체에 대한 돌연변이 프로파일 생성
각각의 항체에 대한 정량적 돌연변이 프로파일을 생성하기 위해, 본원에서 설명되는 바와 같이, 각각의 항체에 대한 모든 항원 변이체의 농축 수준을 계산하기 위해 생물정보학 분석을 수행하였다. 출발 라이브러리에 비해 비결합 집단에서 농축된 변이체는 항체 결합 친화도를 감소시키는 돌연변이를 나타냈다. 다음과 같은 두 가지 주요 방법이 결합 감소를 유발할 가능성이 있는 것으로 간주되었다: 항체와 직접 접촉하는 측쇄와 같은 직접적인 효과, 및 접촉 잔기에 대한 돌연변이에 의해 발생하는 것이 아니라, 국소 또는 전체적인 단백질 구조의 변화로 인해 야기되는 간접 효과. 특성화된 항체 패널은 단백질 구조 변화(즉, 대부분의 또는 모든 항체에 대한 결합에 영향을 미침)를 통해 항체 결합에 간접적인 영향을 미칠 가능성이 있는 돌연변이를 식별하기 위한 컴퓨터를 사용한 연구를 돕는 상이한 에피토프를 인식하였다(경쟁 결합 실험을 사용하여 결정, 표 2). 조사된 모든 APRIL 돌연변이에 대한 돌연변이 프로파일은 모든 항체(도 5a-5d) 및 TACI(도 6a)에 대해 생성되었다.
Figure pct00006
대부분의 리간드에 걸쳐 배경 초과의 농축 점수를 나타내는 여러 APRIL 돌연변이가 관찰되었다. 경쟁 실험(표 2)으로부터 결정된 모든 항체의 비중첩 에피토프를 감안할 때, 많은 항체의 결합에 대한 상기 무차별 효과는 아마도 간접 메커니즘을 통한 결합 감소에 의해 야기되는 위양성을 나타내었다. 제거를 위한 무차별 돌연변이를 확인하기 위한 역치는 모든 샘플에 대한 농축 지도의 검사를 기초로 하여 결정되었다(지원 정보 참조).
무차별 돌연변이의 예시적인 예가 V132의 Asp 또는 Glu로의 돌연변이에 대해 관찰되었다. 이들 돌연변이는 TACI의 두 생물학적 복제물 샘플에 대한 결합에 대한 상당한 영향을 비롯하여 3530 이외의 다른 모든 리간드에 대해 높은 농축 점수를 초래하였다(도 7). APRIL과 복합체를 형성한 TACI에 대한 구조 분석은 이러한 잔기가 TACI와 접촉하지 않고, 결합에 대한 직접적인 영향을 미치지 않을 것으로 예상됨을 보여주었다. 특히, 잔기 V132는 두 단량체 사이의 계면에서 발견되었고, 또 다른 단량체의 E182에 구조적으로 인접하였다. V132에서 Asp 또는 Glu로의 돌연변이는 E182와의 정전기적 반발을 일으켜 APRIL의 4차 구조를 불안정하게 하고, 이에 의해 리간드 패널에 대한 결합에 간접적인 영향을 미칠 수 있다. V132에서 음으로 하전된 잔기로의 돌연변이가 대부분의 항체에 대한 결합을 제거하더라도, 다양한 다른 아미노산에 대한 돌연변이는 항체 2419에 대해서만 특이적인 결합의 감소를 초래하였다(도 7). 이 경우, 돌연변이체 V132D 및 V132E는 위양성으로 간주되어 추가의 고려 사항에서 제거되었으며, 총 잔기 농축의 계산에 포함되지 않았다.
실시예 4: 돌연변이 프로파일의 분석
3530을 제외한 모든 샘플은 대부분의 다른 아미노산에 대한 돌연변이가 결합을 방해하는 2 내지 6개의 위치를 나타냈다(도 5). 예상대로, TACI 결합에 대해 평가된 R197과 같은 일부 위치(도 6a)는 Ala에 대한 돌연변이에 대해 낮은 농축 점수를 보였지만 다른 아미노산에 대한 돌연변이에 민감하여, 부위 포화 돌연변이 유발에 의해 각각의 위치를 보다 철저히 조사한다는 이점을 입증하였다.
대조군 단백질인 TACI에 대한 돌연변이 프로파일은 muAPRIL과의 그의 알려진 공결정 구조의 측면에서 분석되었다. 농축 수준은 결합에 미치는 영향의 정도와 관련이 있을 것으로 예상되었으므로, 이 정량적 정보는 분석 및 구조 가시화를 위해 유지되었다. 농축 점수는 가시화를 위해 APRIL의 표면에 매핑되었으며, X-선 구조와 잘 일치하는, 에피토프 중앙에 위치한 가장 높은 잔기 농축 점수(도 6b)를 가진 8개의 잔기로 구성된 잘 정의된 패치를 보여주었다. 이러한 위치는 APRIL의 이량체 계면에서 발견되었고; 잔기 F167, V172, R186, I188 및 R222는 하나의 단량체에서 발견되었으며, R197, Y199 및 H232는 인접한 단량체에서 발견되었으며, 이는 다시 효모의 표면에 발현된 APRIL이 생산적인 단량체-단량체 계면을 형성하였음을 보여준다. 에피토프의 주변에서 발견된 4개의 잔기(T183, D123, S192 및 E196)는 비-에피토프 잔기와 구별할 수없는 농축 점수를 갖는 것으로 밝혀졌으며(도 6c), 이것은 이들 위치에서의 돌연변이 내성을 시사한다. 전체적으로, TACI에 대한 돌연변이 프로파일 결과는 공결정 구조 데이터의 구조 프로파일과 거의 일치하였다.
각각의 항체에 대해, 돌연변이 프로파일 데이터는 APRIL의 표면(모든 사슬에 대해)에서 가시화되었으며, 높은 점수를 가진 위치가 또한 표면 패치로 클러스터링되는 것으로 관찰되었고, 이것은 각각의 항체에 대한 가능한 에피토프 영역을 나타낸다(도 5). TACI와 유사하게, 항체 2419에 대한 에피토프 영역은 육안으로 검사했을 때 이량체 계면에 걸쳐 서로 상이한 단량체로부터 유래한 잔기에 의해 형성된 표면 패치를 나타냈다. 표면 상에 가시화했을 때, 항체 4035 및 4540에 대한 높은 잔기 농축의 패치는 2419보다 더 크고 더 분산된 것으로 보였다. 지도의 선명도 차이는 부분적으로는, 동종 올리고머 APRIL 분자의 대칭성 및 형태 때문이었다. 상이한 APRIL 단량체 상의 동등한 잔기 위치는 분자의 정점 근처에서 매우 근접하여(도 8), 4035처럼 정점 결합 분자에 대한 패치를 훨씬 더 크게 보이도록 만들었다.
APRIL의 N-말단의 선형 에피토프를 인식하는 항체 3530과 일치하게, APRIL의 N-말단에 있는 단지 2개의 잔기만이 높은 농축 점수를 보였으며, 둘 모두 muAPRIL의 X- 선 구조에서 분해되지 않았다. 이것은 다른 항체 및 TACI와 달리 매우 낮은 비율의 비결합제를 특유하게 나타낸, APRIL 부위-포화 라이브러리에 대해 시험된 항체 3530의 관찰과 일치하였다(도 2). 이러한 결과는 N-말단 펩타이드가 결실된 APRIL에 대한 결합 결과(도 9a-9d) 및 다른 항체에 대한 3530에 의한 결합 경쟁의 결여를 보여주는 연구(표 2)에 의해 확증되었다.
실시예 5: 컴퓨터를 사용한 항체-항원 도킹
항체-항원 모델을 생성하기 위해 다단계 도킹 방법을 실시하였다(도 10). 실험적으로 유도된 농축 점수에 비례하여 가중치가 부여된 부위 제약조건을 사용하여, APRIL에 대한 각각의 항체에 대해 전체적인 경질체 도킹을 수행하였고; 이것은 항체-항원 포즈가 고농축 위치와 최대한 접촉할 때 가장 선호되는 반면, 반대로 결합이 돌연변이에 의해 영향을 받지 않는 것으로 결정된 위치와의 상호작용을 불리하게 만든다. 이어서, 상위 순위의 도킹된 포즈는 앙상블 기반 국소 도킹 알고리즘인 SnugDock의 입력으로서 사용되었다. 생성되는 상위 순위 100개의 모델은 항체-항원 배향과 관련하여 일반적으로 정확하고 에피토프 및 파라토프에서 접촉 잔기, 및 더 작은 정도로는, 상호작용하는 에피토프-파라토프 잔기의 쌍의 확인을 가능하게 할 수 있는 포즈가 풍부할 것으로 예상되었다. 잔기 기반 도킹 신뢰 점수는 잔기가 항체 또는 항원과 접촉하는 것으로 밝혀진 선택된 모델의 분획으로서 계산되었다.
실시예 6: 결정 구조와 2419 도킹된 모델의 비교
도킹 결과를 검증하기 위해, huAPRIL과 함께 2419의 공결정 구조가 밝혀졌다. huAPRIL(잔기 115-250)과 복합체를 이루는 2419의 Fab 도메인의 단결정 구조는 6.5 Å 분해능에서 결정되었다. 결정 구조에서, Fab-APRIL 복합체는 비결정학적 의사 삼중 대칭(pseudo three-fold symmetry)에 의해 3:3 분자 복합체를 형성하였다. huAPRIL 분자는 muAPRIL(PDB:1U5Y)에서 발견된 것과 유사한 동종삼량체를 형성하였다. 각각의 Fab 도메인은 2개의 huAPRIL 단량체를 가교결합시키는 동종삼량체 계면에 걸쳐 결합되었다. 낮은 분해능으로 인해, 2419 및 huAPRIL의 측쇄에 대해 명확한 전자 밀도가 관찰되지 않았다. 그러나, huAPRIL의 구조는 이전에 고분해능(PDB:4ZCH)에서 BAFF를 갖는 이종삼량체로서 밝혀졌다. 이전에 결정된 huAPRIL의 구조는 2419-huAPRIL의 전자 밀도에 명백하게 적합하고, 따라서 복합체를 모델링하는 데 사용되었고, 이것은 고신뢰도로 복합체로부터 huAPRIL 에피토프 잔기의 확인을 가능하게 한다. 전자 밀도 지도에 기초하여, huAPRIL에 대한 2419의 배향이 명확하여 핵심 파라토프 잔기의 규명을 허용했지만, CDR 영역의 더 큰 불확실성으로 인해 주변 파라토프 잔기를 명확하게 정의할 수 없었다. VH 및 VL 도메인의 CDR은 대부분 동종삼량체 계면에 걸쳐 개별 huAPRIL 단량체에 결합되는 것으로 관찰되었으며, VH는 TACI에 대한 결합 부위를 차단한다.
2419에 대한 도킹 결과를 분석한 결과, APRIL에 대한 도킹 모델의 결합 방식이 천연 구조와 강력하게 일치하는 것으로 나타났다. 대부분의 모델(90/100)이 10 Å 미만의 낮은 항체 리간드 RMSD(L_rms)를 갖고 명확한 결합 에너지 깔때기(binding energy funnel)를 형성하는 거의 천연 항체-항원 배향을 입증하는 매우 많은 모델이 얻어졌다(도 11a). 항체 리간드 RMSD는 항원 좌표만을 중첩한 후, 항체 프레임워크 백본 원자에 대한 RMSD를 평가함으로써 천연 구조에 대한 도킹된 모델의 엄격한 비교를 제공하였다. 항체 리간드 RMSD에 기초한 CAPRI-유형 순위를 사용하여, 27/100 모델이 중간 품질(L_rms < 5 Å)로 간주되었고, 63/100은 허용 가능한 품질(5 Å 내지 10 Å의 L_rms)이었으며, 상기 단일 측정 항목을 기초로 하여 10개의 모델이 적정하지 않은 것으로 간주되었다. 상위 순위 모델은 도 11b에서 천연 구조와 관련하여 제시되고(항원에만 중첩됨), 결합 방식에서 양호한 일치가 관찰될 수 있다. 2419의 경우, 실험적으로 유도된 농축 점수가 높은 잔기는 또한 도킹 신뢰 점수가 높았으며(도 11c), 이것은 대부분의 도킹 모델이 돌연변이에 대한 결합에 가장 큰 영향을 미치는 잔기와 접촉했음을 보여준다.
도킹된 모델의 결합 방식은 2419의 천연 구조와 유사하였지만, 모델링된 HCDR3은 천연과 유사한 입체형태를 채택하지 않았다. 표준 CDR의 경우, 상위 점수 100개의 모델에 대해 계산된 평균 RMSD는 다음과 같았다: H1: 1.17 Å, H2: 1.72 Å, L1: 1.57 Å, L2: 1.90 Å, 및 L3: 1.93 Å. 그러나, HCDR3의 경우, 평균 RMSD는 6.17 Å이었다. 상위 점수 10개의 모델에 대한 RMSD 값은 표 3에 제시되어 있다.
Figure pct00007
2419에 대한 HCDR3에는 11개의 잔기(코티아 넘버링 사용)가 포함되어 있으며, 이 길이의 루프는 일반적으로 정확하게 모델링하기 어려운 것으로 간주된다. 2419에 대한 HCDR3 입체형태를 정확하게 모델링하는 데 어려움이 있었음에도 불구하고, 항원에 대해서만 유도된, 모델링을 위한 제약조건으로서 실험 데이터를 포함하는 것은 항체와 항원 상호작용 표면의 거의 정확한 접촉을 확인하기 위한 도킹 워크플로우를 안내하기에 충분하였다.
2419 도킹 모델로부터 결정된 에피토프의 분석은 실험 데이터로부터만 유도된 것보다 훨씬 더 상세한 표면 패치를 보여주었다. 2419의 천연 구조로부터 결정된 22개의 접촉 에피토프 잔기 중에서 14개가 돌연변이되었지만, 이들 중 7개만이 높은 농축 점수(>20%)를 갖는 것으로 밝혀졌다(도 11c). 이와 대조적으로, 상위 순위의 도킹된 모델은 에피토프 상의 22개 접촉 잔기 중에서 21개를 정확하게 확인하였다. 상위 순위의 도킹된 모델은 2419에 대한 에피토프 잔기(도 11c에서 별표로 표시됨)가 돌연변이되지 않았거나 실험적으로 결정된 농축 점수가 낮을 때에도 정확하게 확인할 수 있었다.
결정 구조와 일치하는 에피토프 잔기을 확인하는 것 외에도, 도킹된 모델은 또한 가치 있는 파라토프 정보를 제공하였다. 파라토프에 대한 실험적으로 결정된 제약조건이 없었지만, 도킹된 모델로부터 결정된 파라토프는 저분해능 천연 구조와 전반적으로 잘 일치하였다(14개의 천연 파라토프 잔기 중 10개가 50% 초과의 도킹 신뢰 점수를 가짐)(도 12a-12b). 에피토프 잔기의 결정과는 대조적으로, 도킹된 모델의 잔기가 천연 구조에서 관찰되지 않은 항원에 접촉하는 몇 개의 위양성(50% 초과의 도킹 점수를 갖는 3개의 잔기)이 확인되었다. 2419의 경우, 이들 잔기는 HCDR3 루프의 입체형태를 정확하게 모델링할 때 오류를 반영하여 상기 루프에서 발견되었다. 부정확한 입체형태를 채택함으로써, 도킹된 모델에서 HCDR3 잔기는 천연 구조에서 관찰되지 않는 항원과 접촉할 수 있다. 일부 경우에서, 항체 상동성 모델링(SnugDock의 HCDR3 재모델링 포함)의 오류가 명시적인 실험 제약조건의 결여와 조합되어 파라토프 매핑이 에피토프 매핑보다 덜 정확해질 수 있다. 전반적으로, 예측된 파라토프 표면과 실제 파라토프 표면 사이에 양호한 일치가 존재하였다.
실시예 7: 제약조건이 도킹에 미치는 영향
상기 컴퓨터를 사용한 워크플로우는 실험 데이터와 일치하는 모델에서 범위를 좁히기 위해 깔때기 접근 방식을 사용하였고, 따라서 천연에 가까운 포즈일 가능성이 더 컸다(도 13a-13d). 워크플로우에 제약조건을 통합한 영향을 평가하기 위해, 2419를 다음과 같은 세 가지의 상이한 방법에 의해 생성된 상위 모델로부터의 도킹 에피토프 결과를 평가하기 위한 예로서 사용하였다: (i) 실험적 돌연변이 프로파일 데이터를 사용하지 않는 전체적인 도킹, (ii) 돌연변이 프로파일 데이터를 사용한 전체적인 도킹, 및 (iii) 전체적인 도킹 워크플로우(SnugDock 및 항체-항원 계면 특성에 기반한 여과 포함).
예상한 바와 같이, 실험적으로 유도된 제약조건을 포함하지 않은 전체적인 도킹은 도킹된 모델의 다양성을 초래하였다. 여기서, 대부분의 도킹된 모델은 2419를 가시화된 배향에서 APRIL의 베이스 근처 어딘가에서 결합할 것으로 예측했지만, 모델 사이에서 일치는 거의 없었다. 이것은 낮은 전체 도킹 신뢰 점수를 갖는 지도(도 13a)를 생성하고, 2419에 대한 실제 에피토프와 거의 유사성을 나타내지 않았다(도 13d). 전체적인 도킹 절차에 돌연변이 프로파일 데이터를 포함하면, 실제 에피토프 근처에 초점을 맞춘 더 많은 수의 중첩 포즈가 발생하였지만, 상대적인 결합 배향의 큰 변화가 여전히 관찰되었다(도 13b). 앙상블 국소 도킹 구성 요소(SnugDock)를 포함하는 전체 도킹 워크플로우의 사용으로 인해, 거의 천연 포즈가 밀집된 클러스터(도 13c) 및 결정 구조로부터 유래된 것과 매우 유사한 에피토프 지도가 생성되었다. 실험적으로 유도된 돌연변이 프로파일 데이터를 포함하면, 천연에 가까운 구조의 명확한 도킹 깔때기가 생성된 반면, 제약조건이 없이 도킹 워크플로우를 수행하면 훨씬 더 많은 수의 비천연 모델이 생성되었다(도 14a-14b). 이 결과는 돌연변이 프로파일 데이터를 포함하면, 거의 천연 모델을 선택할 때 컴퓨터를 사용한 도킹 스코어링 방법의 결함을 극복할 수 있음을 보여주었다.
실시예 8: 도킹된 모델의 분석은 메카니즘적 통찰을 보여준다.
3개의 모든 항체에 대한 도킹된 모델은 APRIL에 대한 그의 결합 방식 및 이들이 TACI 결합을 차단하는 방식을 나타냈다(도 15a-15c). 2419는 이량체 계면을 가로질러 결합하고, APRIL의 수평 방향 영역에 그의 중쇄가 결합하여 TACI 결합 부위를 차단한다. 4035는 APRIL의 정점 근처에서 결합하며, 그의 중쇄는 TACI 결합 부위와 실질적인 상호작용을 나타냈다. 4540의 경우, 도킹된 모델은 상기 항체가 주로 TACI 결합 부위를 차단하는 경쇄라고 제안하였다. 3개의 모든 항체의 도킹된 모델은 각각의 항체에 대해 별개의 에피토프를 보여주었고, 에피토프의 중첩은 4540이 2419 및 4035 둘 모두와 경쟁하는 반면, 2419는 4035와 경쟁하지 않음을 보여주는 경쟁 결합 데이터와 일치하였다(표 2). 상위 도킹 모델에 대한 시각적 검사는 모든 항체가 항체의 3:3 결합 비율과 일치하는 방식으로 APRIL과 결합하여, APRIL 동종삼량체의 3 개의 모든 단량체 상의 TACI 결합 부위를 차단할 수 있음을 보여주었다.
실시예 9: 항체 공학에 대한 적용
치료용 항체 개발을 위해, 설치류 모델에서 보다 편리한 효능 및 PK/PD 시험을 촉진하기 위해 설치류와 인간 종 둘 모두에 대한 교차 반응 결합이 바람직할 수 있다. 따라서, 모델링 결과는 분자적으로 정의된 에피토프 및 파라토프의 유용성 및 정확성을 보여주는 예시로서, 합리적인 조작이 종간 교차 반응성을 개선할 수 있도록 하기 위해 사용되었다. muAPRIL 및 huAPRIL은 85.6%의 서열 동일성을 공유하고(도 1), 서열 차이는 muAPRIL의 구조에서 가시화되고, 모델링 워크플로우를 사용하여 수득한 각각의 항체에 대해 생성된 도킹 신뢰 지도의 측면에서 분석되었다. 2419에 대한 에피토프 패치에서 가장 적은 비보존적 돌연변이가 발견되었다. 다른 항체와 대조적으로, 이러한 돌연변이는 2419 에피토프의 주변에서 발견되었다(도 16a). 아미노산 크기, 전하 또는 소수성의 극적인 차이를 초래하는 비보존적 돌연변이는 항체 결합에 더 큰 영향을 미칠 것으로 예상된다.
상위 모델 복합체에서 APRIL-2419 계면 잔기의 육안 검사는 2개의 비보존적 인간 대 마우스 돌연변이, 즉 Q181R 및 I219K가 2419의 중쇄 상의 R54에 근접함을 보여주었다(도 16b). muAPRIL의 위치 181 및 219에 양으로 하전된 2개의 잔기가 존재하면, 2419의 HCDR2 상의 Arg54와의 잠재적 입체 충돌뿐만 아니라 정전기적 반발이 유발될 것이며, muAPRIL에 대한 2419 결합의 결여에 대한 주요 결정 요인이 될 수 있다는 가설을 세웠다. HCDR2 상에서 R54의 Asp로의 돌연변이는 muAPRIL의 R181 및 K219에서 양전하와 유리한 상호작용을 형성하는 것으로 예측되었지만, 인간 잔기 Q181 및 I219에 대한 결합에 대해서는 큰 영향을 미치지 않았다. 추가로, 2419에 대한 몇 가지 다른 돌연변이가 R54D와 조합되도록 지정되었고, 여기서 muAPRIL의 위치 181 및 219에서 더 큰 측쇄의 존재로 인해 발생할 수 있는 임의의 잠재적 입체 충돌을 완화하기 위해 잔기가 더 작은 아미노산으로 돌연변이되었다(T28A, L53V 및 S56A). 이들 돌연변이에 대한 실험 결과는 2419의 3개의 모든 디자인된 변이체가 muAPRIL에 대한 실질적인 결합을 나타내었고(도 16c), huAPRIL에 대한 결합에 대해서는 미미한 영향만을 미침을 보여주었다(도 17). 이러한 결과는 워크플로우가 구조 유도 항체 재디자인를 촉진하기에 충분한 품질의 항체-항원 구조 모델을 생성하였음을 보여주었다.
실시예 10: 재료 및 방법
APRIL 돌연변이CP 위치의 선택
간단히 설명하면, 동종삼량체 마우스 APRIL(PDB: 1XU1)의 구조를 가이드로서 사용하여, 상대적인 측쇄 표면 접근성이 25%를 초과하는 잔기를 선택하고 단백질 표면 상의 위치의 균일한 표면 커버리지를 보장함으로써 초기 표면 잔기의 세트를 선택하였다. 구조에서 분해된 46개의 표면 위치를 선택하고, 분해되지 않은 단백질의 N-말단에 있는 추가의 2개의 잔기를 돌연변이 조사를 위해 선택하였다(도 1에서 APRIL의 서열 및 구조에서 강조 표시됨). 부위 포화 라이브러리는 변이되는 각각의 위치에서 NNK 축퇴성 코돈을 사용하여 디자인되고 합성(IDT)되었다.
효모 라이브러리 구축 및 FACS 선택
효모 표면 디스플레이는 이전에 설명한대로 수행되었다. 간단히 설명하면, 키메라 APRIL 유전자는 TACI 결합 부위 내 및 주위의 5개의 위치가 인간 APRIL(huAPRIL) 유전자에서 발견되는 아미노산으로 돌연변이(A120D, H163Q, R181Q, K219I, N224R)되도록 마우스 서열(잔기 96-241)을 사용하여 디자인되었다(또한, 도 1a 참조). APRIL 유전자의 합성된 축퇴성(NNK) 라이브러리를 PCR에 의해 증폭하고, 선형화된 발현 벡터와 함께 EBY100 효모 내로 공동 형질전환하고, 이전에 설명한 바와 같이 배양하였다. APRIL 라이브러리를 발현하는 효모를 최대 결합의 80%에 상응하는 농도로 항체에 노출시키고, 시험 항체 및 효모 APRIL 표면 발현 태그 Myc에 대한 형광 항체로 염색하고, BD FACSAria를 사용하여 분류하였다. cMyc 발현을 나타내고 돌연변이되지 않은 APRIL보다 낮은 결합을 보이는 효모를 선택하였다. 두 라운드의 FACS를 수행하고, 농축된 라이브러리의 APRIL 유전자를 PCR에 의해 증폭하고, Illumina MiSeq 2x75 PE(Genewiz)에 의해 서열 분석하였다.
차세대 서열 분석(NGS)
간단히 설명하면, 추가의 분석을 위해 주형 유전자(APRIL)에 비해 단일 아미노산 변화를 포함하는 것을 선택하여 고품질 리드를 조립하였다. 각각의 돌연변이에 대한 농축 점수는 FACS 후 비결합 풀에서 발견되는 발현자 풀의 돌연변이 분획을 나타내는, 이전에 설명한 것과 유사한 방식으로 계산되었다.
고품질 리드를 주형 유전자(APRIL)에 정렬하여 N, indel 및 10개 초과의 염기 치환을 포함하는 리드를 제거하였다. 뉴클레오타이드 리드를 아미노산 리드로 변환하여 정지 코돈, 의도하지 않은 위치에서의 돌연변이 또는 주형 유전자에 비해 하나 초과의 아미노산 치환을 포함하는 리드를 제거하였다. 정방향 및 역방향 아미노산 리드를 조합하고, 1개 초과의 치환이 관찰되거나 중첩 영역의 서열이 일치하지 않는 경우 조합된 리드를 제거하였다. 각각의 샘플에서 각각의 돌연변이의 중앙값은 1,845이었으며, 범위는 453(5번째 백분위수) 내지 7,760(95번째 백분위수)이었다. 100개 미만의 리드가 관찰된 돌연변이는 고려 대상에서 제외되었다. 이전에 설명한 것과 유사한 방식으로 각각의 돌연변이에 대한 농축 점수를 계산하였고; 비결합 풀에서 수집된 각각의 샘플에 대해 샘플에서 위치 의존적 돌연변이 발생 빈도는 발현자 풀에서 해당 돌연변이의 발생 빈도에 의해 정규화되고, 다음과 같이 비결합 풀에서 발견된 변이체의 분획으로 확장된다:
Figure pct00008
여기서,
Figure pct00009
는 샘플(들)에 대해 위치(p)에서 주어진 아미노산(aa)에 대한 농축 점수이고, NB S 는 비결합 풀에서 발견된 변이체의 분획(풀 크기)이고, f p,aa 는 샘플(s) 또는 발현자 풀(wt)에서 관찰된 아미노산의 위치 빈도이다. 따라서, 농축 점수는 FACS 후에 비결합 풀에서 발견되는 발현자 풀로부터의 돌연변이의 분획을 나타낸다(예를 들어, 여기서 백분율로 표시됨).
Pro, Gly 또는 Cys으로의 돌연변이는 N-글리코실화 부위를 도입하거나 제거 할 것으로 예측된 돌연변이와 마찬가지로 추가의 분석으로부터 제외되었다. 거의 대부분의 단백질의 결합에 영향을 미치는 것으로 관찰된 돌연변이는 3차 또는 4차 구조의 변경과 같은 간접적인 효과를 통해 그의 효과를 발휘할 가능성이 더 높기 때문에 제외되었다. 해당 위치에서 각각의 돌연변이의 효과를 집계함으로써 각각의 잔기에 대한 총 농축 점수를 계산하였다. 더 높은 농축 점수를 갖는 잔기는 결합과 관련하여 돌연변이에 대한 더 큰 민감성을 반영하고, 이것은 위치가 에피토프의 일부일 가능성이 더 높다는 것을 나타낸다. 이 연구에서는, 50% 초과의 샘플이 30.0% 초과의 농축 점수를 갖고 75% 초과의 샘플이 15.0% 초과의 농축 점수를 갖는 돌연변이가 추가의 분석으로부터 제거되었고("무차별 효과", 단백질 폴딩에 대한 전체적인 영향), 따라서, 이 연구에서 가능한 816개의 돌연변이 중 68개가 제외되었다.
다수의 단일 포인트 돌연변이에 대해 농축 점수가 계산되었지만, 잔기가 에피토프의 일부인지의 여부를 결정할 때 각각의 위치에 대한 돌연변이 데이터의 집합체를 고려하여야 한다. 총 농축 점수는 상응하는 위치에서 각각의 돌연변이의 효과를 집계함으로써 각각의 잔기에 대해 계산하였다. 농축 점수는 다음과 같이 계산하였다:
Figure pct00010
여기서, N p,aa 는 여과 후 주어진 위치에서의 아미노산 돌연변이의 수이다. 각각의 돌연변이에 대한 농축 점수의 단순한 합계보다는, 계산된 총 잔기 농축 점수는 높은 농축 점수를 나타낸 돌연변이의 효과에 보다 높은 가중치를 부여하고, 낮은 농축 점수를 나타낸 돌연변이의 기여도에 대해 낮은 가중치를 부여하였다. 일단 각각의 위치에 대해 계산되면, 잔기 농축 점수는 가시화에 의해 분석을 용이하게 하기 위해 단백질 표면에 매핑되었다.
항체 및 APRIL 상동성 모델링
모델 선택을 위해 공개된 프로토콜에 설명된 지침에 따라 가장 최근에 설명된 로제타 항체 상동성 모델링 프로토콜(Rosetta 3.8에서 실행됨)을 사용하여 생성된 2,800개의 모델로부터 10개의 구조적으로 다양한 항체 상동성 모델을 선택하였다. 또한, 디폴트 설정을 사용하는 바이오루미네이트(Schroedinger Release 2016-4: BioLuminate, Schroedinger, LLC, New York, NY, 2016) 항체 상동성 모델링 프로토콜을 사용하여 상동성 모델을 생성하였다. 상위 2개의 비상동성 구조 주형 각각에 대해 5개의 모델이 생성되었다: 2419에 대한 주형은 3DGG 및 3S35이었고, 4035에 대한 주형은 1FLD 및 4EDW이었고, 4540에 대한 주형은 2E27 및 5AZ2이었다.
항원 APRIL에 대한 상동성 모델은 주형으로서 muAPRIL(PDB: 1XU1)의 구조를 사용하여 로제타에 의해 생성되었다. fixbb 디자인 프로토콜을 사용하여 muAPRIL에 비해 APRIL에 존재하는 5개의 돌연변이를 도입하여, 동종삼량체의 각각의 사슬에 적절한 돌연변이가 만들어졌는지 확인하였다. 그런 다음, 로제타에서 실행된 이완 프로토콜을 사용하여 항원 구조의 앙상블이 생성되었으며, 그의 로제타 총 점수를 기초로 하여 100개의 이완된 구조로부터 25개의 가장 낮은 점수의 모델을 선택하였다.
제약조건이 있는 전체적인 도킹
간단히 설명하면, 전체적인 경질체 도킹은 디폴트 설정을 사용하고 더 높은 신뢰 농축 점수를 부위 제약조건으로서 포함하는 바이오루미네이트에서 실행된 PIPER를 사용하여 수행되었다. 돌연변이시 결합에 대한 실질적인 영향이 관찰된 부위(여기서는 잔기 농축 점수 > 30.0%로 정의됨)에 유인성 제약조건을 추가하고, 돌연변이시 결합에 최소한으로 영향을 미치는 부위(여기서는 잔기 농축 점수 < 12.5%로 정의됨)에 대해 반발성 제약조건을 추가하였다. 20개의 투입 항체 상동성 모델 각각에 대해 전체적인 도킹을 수행하여, 총 600개의 도킹된 포즈를 생성하였다(각각의 샘플에 대해 클러스터 중심을 나타내는 30개의 포즈가 수득됨).
다음 식을 사용하여 각각의 도킹된 모델과 실험적으로 결정된 농축 점수 간의 일치 수준을 평가하기 위해 "에피토프 점수"를 계산하였다.
Figure pct00011
여기서, ES는 에피토프 점수이고, N은 제약조건이 있는 부위의 수이고, c p 는 위치 p에서의 제약조건이고, E p 는 위치 p에서의 실험적으로 유도된 농축 점수(이전에 설명한 바와 같이 계산됨)이다. 각각의 항체에 대해, 600개의 도킹된 모델이 에피토프 점수에 의해 순위가 매겨졌으며, 상위 25개의 모델이 추가의 국소 도킹을 위한 출발 주형으로서 선택되었다.
SnugDock을 사용한 국소 도킹
전체적인 도킹에 이어서, 가장 최근에 설명된 프로토콜을 사용하여 Ensemble SnugDock(Rosetta 3.8에서 실행됨)을 사용하여 국소 도킹을 수행하였다. 20개의 항체 상동성 모델이 항체 구조의 앙상블로서 사용되었다. 바이오루미네이트에 의해 생성된 상동성 모델은 먼저 로제타를 사용하여 이완되어, 모든 모델이 동일한 역장(forcefield)에 의해 생성되고 일치하는지 확인하였다. 전체적으로 도킹된 상위 25개의 포즈는 Ensemble SnugDock의 출발 투입 좌표로서 사용되었으며, 각각의 투입에 대해 200개의 도킹된 모델이 생성되어 총 5,000개의 도킹된 모델이 생성되었다. PIPER와 마찬가지로, 농축 점수를 기초로 하여 SnugDock에 대해 도킹 제약조건이 사용되었다. 동종삼량체의 대칭성을 설명하기 위해, 로제타 모호 부위 제약조건(시그모이드 기능 사용)을 항원 잔기에 적용하여 APRIL의 임의의 단량체로부터 기원할 수 있도록 하였다. 국소 도킹에서 제약되는 잔기의 세트는 전체적인 도킹에서 제한되는 것과 동일하였다.
SnugDock에 의해 생성된 도킹된 포즈를 여과하여 항체-항원 계면의 비정형적 계면을 가진 모델을 제거하였다. 공개적으로 사용 가능한 항체-단백질 복합체의 비중복 데이터베이스를 확보하였고, 경계면 근처에 누락된 영역이 있는 구조, 또는 계면에서 리간드와의 복합체 또는 번역 후 변형을 제거하도록 큐레이팅된다. 생성된 297개의 복합체에 대해, 에피토프에 결합하는 CDR 및 프레임워크 잔기의 수, 상호작용에 관련되는 CDR 루프의 수 및 유형, 에피토프 잔기의 수, 매립된 표면적, 및 쌍별 잔기 성향을 포함하는 주요 계면 특성에 대한 구조적 특징의 분포가 계산되었다(표 1). 적절한 역치를 경험적으로 선택하여 천연 구조의 95.2%가 단지 하나의 구조 필터에서 실패하였다. 계산된 필터 및 그의 역치는 표 1에 제시되어 있다. 계면 특성은 도킹된 각각의 모델에 대해 계산되었으며, 하나 초과의 구조 필터에 실패한 모델은 제거되었다. 나머지 도킹된 모델은 에피토프 지도 점수(전체적인 도킹에 대해 설명된 바와 같은)에 기초하여 여과되었다. 에피토프의 주변에 있는 잔기는 돌연변이에 더 내성이 있을 것으로 예상될 수 있기 때문에, 도킹된 모델은 낮은 농축 점수를 갖는 소수의 잔기와 접촉하도록 허용되었고; 여기서, 본 발명자들은 관찰된 최대 에피토프 지도의 약 80% 미만의 농축 점수를 갖는 모델을 제거하였다. 나머지 도킹된 모델은 로제타를 사용하여 계산된 바와 같이 계면 에너지(Isc)에 기초하여 순위가 매겨졌다.
경쟁 ELISA
비오티닐화된 시험 항체(50 ng/mL로 고정) 및 표지되지 않은 경쟁 항체(10,000 ng/mL에서 시작하는 8포인트 연속 희석)를 0.1 μg/웰로 인간 APRIL로 사전 코팅된 웰에 옮겼다. 플레이트를 세척하고, 스트렙타비딘-호스래디쉬 퍼옥시다제를 첨가한 후, 세척하고 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 기질을 사용하여 발색시켰다. 비오티닐화된 시험 항체의 결합에서 부분적 또는 완전한 감소의 관찰은 중첩되거나 인접한 에피토프에 대한 결합을 위한 항체 사이의 경쟁을 나타냈다. 항체는 시험 항체에 대해 200X 몰 과량(10,000 대 50 ng/ml)으로 존재할 때에도 90% 초과의 결합 신호를 차단할 수 없는 경우에 "비경쟁성"으로 분류되었다.
제조, 결정화 및 구조 결정
인간 APRIL(잔기 105-250, (His)6 에피토프 태그)) 및 마우스 항체 2419를 Expi293 세포에서 재조합적으로 발현시키고, 니켈 또는 단백질 A 친화도 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다. 2419의 Fab 단편은 파파인 분해에 의해 생성되었다. APRIL 및 Fab는 용액에서 3:3 복합체를 형성하였고(크기 배제 크로마토그래피에 의해 측정됨), 복합체를 정제하였다. 2.2 M 황산암모늄, 160 mM 질산암모늄, 4% 에틸렌 글리콜 및 1 mM NiCl2를 침전제로서 사용하여 회절 품질 결정을 얻었다. 대부분의 결정은 단지 7 Å까지의 분해능으로 회절되었고, 완전한 X-선 회절 데이터 세트는 동결 방지제로서 20-36% 에틸렌 글리콜을 사용하여 100K에서 결정으로부터 수집되었다(표 4).
Figure pct00012
자가 회전 함수는 3:3 APRIL-Fab 복합체가 상기 의사 삼중 대칭과 관련이 있음을 확인해주는 의사 삼중 대칭의 존재를 제안하였다. 이 구조는 Fab 구조와 함께 마우스 APRIL 동종삼량체 결정 구조(PDB 1U5Y)를 기반으로 하여 생성된 동종삼량체 APRIL 모델을 사용하여 분자 치환에 의해 밝혀졌고, APRIL 동종삼량체에 결합된 3개의 Fab 분자를 포함하는 특유한 구조 용액을 생성하였다. 최종 개선 통계는 표 4에 제시되어 있다.
다른 예시적인 방법은 그 내용 전체가 본원에 참고로 포함된 문헌 [Wollacott et al., J Mol Recognit. 2019; 32(7):e2778]에 기재되어 있다.
참조에 의한 통합
본원에서 언급되는 모든 간행물, 특허 및 수탁 번호는 각각의 개별 간행물 또는 특허가 참조로 포함되는 것으로 구체적이고 개별적으로 표시된 것처럼 그 전부가 본원에 참조로 포함된다.
균등물
본 발명의 특정 실시양태가 논의되었지만, 상기 명세서는 예시적인 것으로서, 제한적인 것이 아니다. 본 발명의 많은 변형은 본 명세서 및 아래의 청구범위를 검토하면 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게는 자명해질 것이다. 본 발명의 전체 범위는 균등물의 전체 범위와 함께 청구범위를 참조하며 그리고 상기 변형과 함께 명세서를 참조하여 결정되어야 한다.

Claims (45)

  1. 표적 폴리펩타이드 상의 에피토프를 확인하는 방법으로서,
    (a) 표적 폴리펩타이드의 복수의 변이체에 항체 분자를 결합시키는 단계;
    (b) 항체 분자에 대해 감소된 결합(예를 들어, 감소된 결합 친화도)을 나타내는 복수의 변이체를 수득(예를 들어, 농축)하는 단계;
    (c) 복수의 수득된(예를 들어, 농축된) 변이체 각각에 대한 농축 점수를 결정(예를 들어, 계산)하는 단계;
    (d) 항체 분자-표적 폴리펩타이드 도킹 모델을 생성하는 단계로서, 여기서 항체 분자-표적 폴리펩타이드 도킹 모델이 농축 점수에 따라 제약되는 것인 단계; 및
    (e) 항체 분자-표적 폴리펩타이드 도킹 모델에 기초하여 항체 분자에 의해 결합될 수 있는 표적 폴리펩타이드 상의 부위를 확인함으로써, 표적 폴리펩타이드 상의 에피토프를 확인하는 단계
    를 포함하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 단계 (a)가 표적 폴리펩타이드의 복수의 변이체를 디스플레이하는 라이브러리에 항체 분자를 결합시키는 것을 포함하는 것인 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 단계 (a)가 표적 폴리펩타이드의 복수의 변이체를 발현하는(예를 들어, 디스플레이하는) 복수의 세포를 포함하는 라이브러리에 항체 분자를 결합시키는 것을 포함하는 것인 방법.
  4. 제3항에 있어서, 복수의 세포가 각각 표적 폴리펩타이드의 대략 하나의 별개의 변이체를 발현하는 것인 방법.
  5. 제3항 또는 제4항에 있어서, 세포가 진핵 세포, 예를 들어 효모 세포인 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 변이체가 표적 폴리펩타이드의 하나 이상의 표면 잔기 상의 돌연변이를 포함하는 것인 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 변이체가 표적 폴리펩타이드의 선택된 표면 잔기의 별개의 돌연변이를 포함하는 것인 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 변이체가 표적 폴리펩타이드의 복수의 선택된 표면 잔기 각각의 별개의 돌연변이를 포함하는 것인 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 변이체가 표적 폴리펩타이드의 야생형 아미노산 서열에 비해 단일 아미노산 치환을 포함하는 것인 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 변이체 각자가 표적 폴리펩타이드의 야생형 아미노산 서열에 비해 단일 아미노산 치환을 포함하는 것인 방법.
  11. 제9항 또는 제10항에 있어서, 단일 아미노산 치환이 표적 폴리펩타이드의 표면 잔기에서 발생하는 것인 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 감소된 결합이 야생형 표적 폴리펩타이드 및 항체에 대해 검출된 결합에 비해 변이체 및 항체 분자에 대해 검출된 결합의 감소를 포함하는 것인 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)가 야생형 아미노산 서열에 의해 나타난 항체 분자에 대한 결합의 약 80% 미만(예를 들어, 약 0.01%, 0.1%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% 또는 80% 미만)을 나타내는 변이체를 수득(예를 들어, 농축)하는 것을 포함하는 것인 방법.
  14. 제13항에 있어서, 감소된 결합이 야생형 표적 폴리펩타이드에 의해 나타난 결합의 적어도 약 20%(예를 들어, 적어도 약 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%)인 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)가 야생형 표적 폴리펩타이드를 포함하는 세포에 의해 나타난 항체 분자에 대한 결합의 약 80% 미만(예를 들어, 약 0.01%, 0.1%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% 또는 80% 미만)을 나타내는 세포를 수득(예를 들어, 농축)하는 것을 포함하는 것인 방법.
  16. 제15항에 있어서, 감소된 결합이 야생형 표적 폴리펩타이드를 포함하는 세포에 의해 나타난 결합의 적어도 약 20%(예를 들어, 적어도 약 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%)인 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)가 항체 분자에 대한 감소된 결합을 나타내는 변이체에 대해 1회 이상, 예를 들어 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10회 또는 그 초과의 농축을 수행하는 것을 포함하는 것인 방법.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 예를 들어 단계 (c) 전에, 예를 들어 차세대 서열 분석에 의해, 예를 들어 변이체를 코딩하는 유전자를 서열 분석함으로써, 항체 분자에 대한 감소된 결합을 나타내는 변이체를 확인하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (c)가 복수의 수득된(예를 들어, 농축된) 변이체 각각에 대한 발생 빈도를 결정하는 것을 포함하는 것인 방법.
  20. 제19항에 있어서, 단계 (c)가 특정 잔기에서 별개의 돌연변이를 포함하는 각각의 변이체의 발생 빈도를 집계하는 것 및/또는 더 높은 발생 빈도를 갖는 변이체에 높은 가중치를 부여하는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 농축 점수가 표적 폴리펩타이드의 아미노산 서열의 단일 잔기에 특이적인 것인 방법.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 농축 점수가 표적 폴리펩타이드의 아미노산 서열의 상이한 단일 잔기에 특이적인 것인 방법.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a)-(c)를 표적 폴리펩타이드의 복수의 변이체의 복제물을 사용하여 적어도 1회(예를 들어, 1회, 2회, 3회, 4회, 5회 또는 그 초과)로 반복하는 단계를 추가로 포함하고, 여기서 단계 (c)가 하나 이상의 무차별 돌연변이, 예를 들어 50% 초과의 복제물이 30% 초과의 농축 점수를 갖고 75% 초과의 복제물이 15% 초과의 농축 점수를 갖는 돌연변이를 제외하는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 분자-표적 폴리펩타이드 도킹 모델이 하나 이상의 유인성 제약조건을 추가함으로써 제약되며, 여기서 유인성 제약조건이 제1 사전선택된 값보다 더 큰 농축 점수를 갖는 잔기에 대한 것인 방법.
  25. 제24항에 있어서, 제1 사전선택된 값이 20% 내지 40%, 예를 들어 25% 내지 35%, 예를 들어 약 30%인 방법.
  26. 제24항 또는 제25항에 있어서, 유인성 제약조건이 농축 점수에 기초하여 선형적으로 스케일링된 보너스를 포함하는 것인 방법.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 분자-표적 폴리펩타이드 도킹 모델이 제2 사전선택된 값보다 더 작은 농축 점수를 갖는 잔기에 대한 반발성 제약조건을 추가함으로써 제약되는 것인 방법.
  28. 제27항에 있어서, 제2 사전선택된 값이 5% 내지 20%, 예를 들어 10% 내지 15%, 예를 들어 약 12.5%인 방법.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (d)가 항체 분자의 모델과 표적 폴리펩타이드의 모델 사이에 도킹된 포즈를 생성하는 것을 포함하는 것인 방법.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (d)가 항체 분자의 모델과 표적 폴리펩타이드의 모델 사이에 복수의 도킹된 포즈를 생성하는 것을 포함하는 것인 방법.
  31. 제30항에 있어서, 단계 (d)가 도킹 알고리즘, 예를 들어 SnugDock에 따라 복수의 도킹된 포즈를 스코어링하는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.
  32. 제31항에 있어서, 단계 (d)가 최고 점수를 갖는 복수의 도킹된 포즈, 예를 들어 최고 점수의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000개 또는 그 초과의 도킹된 포즈의 하위세트를 선택하는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.
  33. 제32항에 있어서, 단계 (d)가 복수의 도킹된 포즈의 선택된 하위세트를 사용하여 앙상블 도킹된 포즈를 생성하는 것, 및 앙상블 도킹된 포즈에 따라 항체 분자의 모델 및 표적 폴리펩타이드의 모델을 설정하는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.
  34. 제29항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 분자의 모델이 항체의 복수의 상동성 모델로부터 유래된 앙상블 항체 상동성 모델을 포함하는 것인 방법.
  35. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (d)가, 예를 들어 항체-항원 결정 구조로부터 유도된 구조 필터에 따라, 공지된 항체-항원 복합체에 대해 비정형적인 결합 방식을 나타내는 항체 분자-표적 폴리펩타이드 도케팅 모델을 제거하는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.
  36. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (d)가 복수의 항체 분자-표적 폴리펩타이드 모델을 생성하는 것을 포함하는 것인 방법.
  37. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (e)가 항체 분자에 의해 결합될 수 있는 표적 폴리펩타이드 상의 복수의 부위를 확인하는 것을 포함하는 것인 방법.
  38. 표적 폴리펩타이드 상의 에피토프를 확인하는 방법으로서,
    (a) 항체-표적 폴리펩타이드 도킹 모델을 생성하는 단계로서, 여기서 항체-표적 폴리펩타이드 도킹 모델이
    (i) 표적 폴리펩타이드의 복수의 변이체에 항체 분자를 결합시키는 단계,
    (ii) 항체 분자에 대한 감소된 결합을 나타내는 복수의 변이체를 수득(예를 들어, 농축)하는 단계, 및
    (iii) 복수의 농축된 변이체 각각에 대한 농축 점수를 결정(예를 들어, 계산)하는 단계
    를 포함하는 방법에 의해 결정되는 복수의 농축 점수에 따라 제약되는 것인 단계; 및
    (b) 항체-표적 폴리펩타이드 도킹 모델에 기초하여 항체 분자에 의해 결합될 수 있는 표적 폴리펩타이드 상의 부위를 확인함으로써, 표적 폴리펩타이드 상의 에피토프를 확인하는 단계
    를 포함하는 방법.
  39. 항체 분자 상의 파라토프를 확인하는 방법으로서,
    (a) 표적 폴리펩타이드의 복수의 변이체에 항체 분자를 결합시키는 단계;
    (b) 항체 분자에 대해 감소된 결합을 나타내는 복수의 변이체를 수득(예를 들어, 농축)하는 단계;
    (c) 복수의 농축된 변이체 각각에 대한 농축 점수를 결정(예를 들어, 계산)하는 단계;
    (d) 항체 분자-표적 폴리펩타이드 도킹 모델을 생성하는 단계로서, 여기서 항체-표적 폴리펩타이드 도킹 모델이 농축 점수에 따라 제약되는 것인 단계; 및
    (e) 항체-표적 폴리펩타이드 도킹 모델에 기초하여 표적 폴리펩타이드에 의해 결합될 수 있는 항체 분자 상의 하나 이상의 부위를 확인함으로써, 항체 분자 상의 파라토프를 확인하는 단계
    를 포함하는 방법.
  40. 항체 상의 파라토프를 확인하는 방법으로서,
    (a) 항체-표적 폴리펩타이드 도킹 모델을 생성하는 단계로서, 여기서 항체-표적 폴리펩타이드 도킹 모델이
    (i) 표적 폴리펩타이드의 복수의 변이체에 항체를 결합시키는 단계,
    (ii) 항체 분자에 대한 감소된 결합을 나타내는 변이체를 수득(예를 들어, 농축)하는 단계, 및
    (iii) 복수의 수득된(예를 들어, 농축된) 변이체 각각에 대한 농축 점수를 결정(예를 들어, 계산)하는 단계
    를 포함하는 방법에 의해 결정되는(예를 들어, 계산되는) 복수의 농축 점수에 따라 제약되는 것인 단계; 및
    (b) 항체-표적 폴리펩타이드 도킹 모델에 기초하여 표적 폴리펩타이드에 의해 결합될 수 있는 항체 분자 상의 하나 이상의 부위를 확인함으로써, 표적 폴리펩타이드 상의 파라토프를 확인하는 단계
    를 포함하는 방법.
  41. 표적 폴리펩타이드 상의 에피토프 또는 표적 폴리펩타이드에 대한 항체 분자 상의 파라토프가 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항의 방법에 따라 확인되는 항체 분자.
  42. 제41항의 항체 분자의 하나 이상의 사슬(예를 들어, VH 및/또는 VL)을 코딩하는 핵산 분자.
  43. 제42항의 핵산 분자를 포함하는 벡터.
  44. 제42항의 핵산 분자 또는 제43항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  45. 항체 분자를 제조하는 방법으로서, 항체 분자의 발현에 적합한 조건 하에 제44항의 숙주 세포를 배양하는 것을 포함하는 방법.
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