JP6580570B2 - 抗体安定性を向上させるための方法 - Google Patents
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Description
モノクローナル抗体および抗体ドメインベースの分子は、臨床試験が進められているタンパク質治療薬の大部分を占める(1、2)。モノクローナル抗体は、多岐にわたる治療的適応症に効力を有し、作製も容易である。抗体の特異性は主として、可変ドメインに位置するCDR内の配列によって決まる。臨床候補を選択する過程は、多数のモノクローナル抗体の機能特性に関するスクリーニングから始まる。スクリーニングに続いて、所望の機能的基準のすべてを満たし、さらに化学的および生物物理学的な安定性も示すモノクローナル抗体を同定するために、数百種にも及ぶ分子の詳細なインビトロプロファイリングが行われる。すなわち、製造中および貯蔵中の、ならびに適用後のインビボでの望まれない分解を避けるためには、その構造および生物学的機能に影響を及ぼす恐れのある不安定性という問題を抱えるモノクローナル抗体を同定して、選択から除外しなければならない。
(a)抗体Fv領域内の各Asp残基およびAsn残基に関して、ホモロジーモデルアンサンブルにより/において/を用いて、Cα原子の配座柔軟性を決定する段階、
(b)抗体Fv領域内の各Asp残基およびAsn残基に関して、該Asp残基またはAsn残基に対してすぐC末端側のアミノ酸残基のサイズを決定する段階、
(c)Cα原子が配座的に柔軟ではなくかつ/または該Asp残基もしくはAsn残基が大型のC末端側アミノ酸残基を有する抗体を選択する段階。
(a)2つ以上の抗体を用意する段階、
(b)抗体Fv領域内の各Asp残基およびAsn残基に関して、ホモロジーモデルアンサンブルにより/において/を用いて、Cα原子の配座柔軟性を決定する段階、
(c)抗体Fv領域内の各Asp残基およびAsn残基に関して、該Asp残基またはAsn残基に対してすぐC末端側のアミノ酸残基のサイズを決定する段階、
(d)Cα原子が配座的に柔軟ではなくかつ/または該Asp残基もしくはAsn残基が大型のC末端側アミノ酸残基を有する1つまたは複数の抗体を選択する段階。
(a)(多数の抗体Fv領域の)抗体Fv領域内の各Asp残基およびAsn残基に関して、ホモロジーモデルアンサンブルにより/において/を用いて、Cα原子の配座柔軟性を決定する段階、
(b)抗体Fv領域内の各Asp残基およびAsn残基に関して、該Asp残基またはAsn残基に対してすぐC末端側のアミノ酸残基のサイズを決定する段階、
(c)Cα原子が中程度ないし高度の配座柔軟性を有しかつ/または該Asp残基もしくはAsn残基が小型のC末端側アミノ酸残基を有する抗体を、(多数の抗体Fv領域からの)選択から除外する/除く段階。
(a)2つ以上の抗体を用意する段階、
(b)(多数の抗体Fv領域の)抗体Fv領域内の各Asp残基およびAsn残基に関して、ホモロジーモデルアンサンブルにより/において/を用いて、Cα原子の配座柔軟性を決定する段階、
(c)抗体Fv領域内の各Asp残基およびAsn残基に関して、該Asp残基またはAsn残基に対してすぐC末端側のアミノ酸残基のサイズを決定する段階、
(d)Cα原子が中程度ないし高度の配座柔軟性を有しかつ/または該Asp残基もしくはAsn残基が小型のC末端側アミノ酸残基を有する1つまたは複数の抗体を(多数の抗体Fv領域からの)選択から除外する/除く段階。
(a)抗体Fv領域内の各Asn残基に関して、ホモロジーモデルアンサンブルにより/において/を用いて、Cα原子の配座柔軟性を決定する段階、
(b)小型のC末端側アミノ酸残基を有する、抗体Fv領域内の各Asn残基に関して、骨格二面角φを決定する段階、
(c)小型のC末端側アミノ酸残基および-75.2度を上回る骨格二面角φを有する、抗体Fv領域内の各Asn残基に関して、溶媒露出、および該Asn残基に対してN末端側にある二次構造の変化の出現/存在、および該Asn残基を基準としてこの変化が起こったアミノ酸残基までの距離を決定する段階、ならびに
(d)以下の場合にアスパラギン(Asn)分解(脱アミドおよび/またはスクシンイミド形成)を起こしやすい抗体を同定するかまたは選択から除外する段階:
(i)該Asn残基がCDRループ1内にあり、そのCα原子が配座的に柔軟であり、かつC末端側アミノ酸残基がAsp、Pro、ThrもしくはAsnである場合、
(ii)該AsnのCα原子が配座的に柔軟であり、-75.2度未満の骨格二面角φを有し、かつ該Asn残基のC末端側にあるアミノ酸残基が小型である場合、または
(iii)該Asn残基のCα原子が配座的に柔軟であり、-75.2度を上回る骨格二面角φを有し、高度の溶媒露出を有し、かつ該Asn残基を基準として連続3アミノ酸残基超の範囲内でアミノ末端側の二次構造の変化が起こる場合。
(a)2つ以上の抗体を用意する段階、
(b)抗体Fv領域内の各Asn残基に関して、ホモロジーモデルアンサンブルにより/において/を用いて、Cα原子の配座柔軟性を決定する段階、
(c)小型のC末端側アミノ酸残基を有する、抗体Fv領域内の各Asn残基に関して、骨格二面角φを決定する段階、
(d)小型のC末端側アミノ酸残基および-75.2度を上回る骨格二面角φを有する、抗体Fv領域内の各Asn残基に関して、溶媒露出、および該Asn残基に対してN末端側にある二次構造の変化の出現/存在、および該Asn残基を基準としてこの変化が起こったアミノ酸残基までの距離を決定する段階、ならびに
(e)以下の場合にアスパラギン(Asn)分解(脱アミドおよび/またはスクシンイミド形成)を起こしやすい1つまたは複数の抗体を同定するかまたは選択から除外する段階:
(i)該Asn残基がCDRループ1内にあり、そのCα原子が配座的に柔軟であり、かつC末端側アミノ酸残基がAsp、Pro、ThrもしくはAsnである場合、
(ii)該AsnのCα原子が配座的に柔軟であり、-75.2度未満の骨格二面角φを有し、かつ該Asn残基のC末端側にあるアミノ酸残基が小型である場合、または
(iii)該Asn残基のCα原子が配座的に柔軟であり、-75.2度を上回る骨格二面角φを有し、高度の溶媒露出を有し、かつ該Asn残基を基準として連続3アミノ酸残基超の範囲内でアミノ末端側の二次構造の変化が起こる場合。
(a)2つ以上の抗体を用意する段階、
(b)各抗体Fv領域内の各Asn残基に関して、ホモロジーモデルアンサンブルにより/において/を用いて、Cα原子の配座柔軟性を決定する段階、
(c)小型のC末端側アミノ酸残基を有する各抗体Fv領域内の各Asn残基に関して、骨格二面角φを決定する段階、
(d)各抗体Fv領域内の、小型のC末端側アミノ酸残基および-75.2度を上回る骨格二面角φを有する各Asn残基に関して、溶媒露出、および該Asn残基に対してN末端側にある二次構造の変化の出現/存在、および該Asn残基を基準としてこの変化が起こったアミノ酸残基までの距離を決定する段階、
(e)以下のAsn残基のうちの少なくとも1つを有する抗体を、前記2つ以上の抗体から除く/削除する/選択から除外する段階:
(i)配座柔軟性を有するCα原子を有し、かつC末端側アミノ酸残基としてAsp、Pro、ThrもしくはAsnを有する、CDRループ1内のAsn残基、
(ii)配座的に柔軟なCα原子を有し、-75.2度未満の骨格二面角を有し、かつ小型のC末端側アミノ酸残基を有する、Asn残基、または
(iii)配座的に柔軟なCα原子を有し、-75.2度を上回る骨格二面角φを有し、高度の溶媒露出を有し、かつアミノ末端側の二次構造の変化がそのAsn残基を基準として連続3アミノ酸残基超の範囲内で起こる、Asn残基。
‐Cα原子の配座柔軟性を低下させる段階、
‐該Asn残基に対してC末端側にあるアミノ酸残基のサイズを増加させる段階。
(a)抗体Fv領域内の各Asp残基に関して、ホモロジーモデルアンサンブルにより/において/を用いて、Cα原子の配座柔軟性を決定する段階、
(b)抗体Fv領域内の各Asp残基に関して、該Asp残基に対してC末端側にあるアミノ酸残基のサイズを決定する段階、
(c)抗体Fv領域内の各Asp残基に関して、該Asp残基に対してC末端側にある二次構造の変化の出現/存在、および該Asp残基を基準としてこの変化が起こったアミノ酸残基までの距離を決定する段階、
(d)以下の場合にAsp分解(異性化および/またはスクシンイミド形成)を起こしやすい抗体を同定するかまたは選択から除外する段階:
(i)該Asp残基のCα原子が高度の配座柔軟性を有し、かつ該Asp残基に対してC末端側にあるアミノ酸残基が小型である場合、または
(ii)該Asp残基のCα原子が中程度の配座柔軟性を有し、該Asp残基に対するアミノ酸残基が小型であり、カルボキシ末端側の二次構造の変化が該Asp残基を基準として連続3アミノ酸残基未満の範囲内で起こる場合、または
(iii)該Asp残基のCα原子が中程度の配座柔軟性を有し、該Asp残基のC末端側にあるアミノ酸残基がGly残基であり、かつカルボキシ末端側の二次構造の変化が該Asp残基を基準として3アミノ酸残基より長い距離で起こる場合。
(a)2つ以上の抗体を用意する段階、
(b)抗体Fv領域内の各Asp残基に関して、ホモロジーモデルアンサンブルにより/において/を用いて、Cα原子の配座柔軟性を決定する段階、
(c)抗体Fv領域内の各Asp残基に関して、該Asp残基に対してC末端側にあるアミノ酸残基のサイズを決定する段階、
(d)抗体Fv領域内の各Asp残基に関して、該Asp残基に対してC末端側にある二次構造の変化の出現/存在、および該Asp残基を基準としてこの変化が起こったアミノ酸残基までの距離を決定する段階、ならびに
(e)以下の場合にAsp分解(異性化および/またはスクシンイミド形成)を起こしやすい1つまたは複数の抗体を同定するかまたは選択から除外する段階:
(i)該Asp残基のCα原子が高度の配座柔軟性を有し、かつ該Asp残基に対してC末端側にあるアミノ酸残基が小型である場合、または
(ii)該Asp残基のCα原子が中程度の配座柔軟性を有し、該Asp残基に対するアミノ酸残基が小型であり、かつカルボキシ末端側の二次構造の変化が該Asp残基を基準として連続3アミノ酸残基未満の範囲内で起こる場合、または
(iii)該Asp残基のCα原子が中程度の配座柔軟性を有し、該Asp残基のC末端側にあるアミノ酸残基がGly残基であり、かつカルボキシ末端側の二次構造の変化が該Asp残基を基準として3アミノ酸残基より長い距離で起こる場合。
(a)2つ以上の抗体を用意する段階、
(b)各抗体Fv領域内の各Asp残基に関して、ホモロジーモデルアンサンブルにより/において/を用いて、Cα原子の配座柔軟性を決定する段階、
(c)各抗体Fv領域内の各Asp残基に関して、該Asp残基に対してC末端側にあるアミノ酸残基のサイズを決定する段階、
(d)各抗体Fv領域内の各Asp残基に関して、該Asp残基に対してC末端側にある二次構造の変化の出現/存在、および該Asp残基を基準としてこの変化が起こったアミノ酸残基までの距離を決定する段階、ならびに
(e)以下のAsp残基のうちの少なくとも1つを有する抗体を、前記2つ以上の抗体から除く/削除する/選択から除外する段階:
(i)配座的に柔軟なCα原子を有し、かつ小型のC末端側アミノ酸残基を有する、Asp残基、
(ii)中程度の配座柔軟性を有するCα原子を有し、小型のC末端側のアミノ酸を有し、かつカルボキシ末端側の二次構造の変化がそのAsp残基から連続3アミノ酸残基未満の範囲内で起こる、Asp残基、または
(iii)中程度の配座柔軟性を有するCα原子を有し、C末端側アミノ酸残基としてGlyを有し、かつカルボキシ末端側の二次構造の変化がそのAsp残基から3アミノ酸残基より長い距離で起こる、Asp残基。
‐Cα原子の配座柔軟性を低下させる段階、
‐該Asn残基に対してC末端側にあるアミノ酸残基のサイズを増加させる段階。
(a)抗体Fv領域内の各Asp残基およびAsn残基に関して、ホモロジーモデルアンサンブルにより/において/を用いて、Cα原子の配座柔軟性を決定する段階、
(b)抗体Fv領域内の各Asp残基およびAsn残基に関して、該Asp残基またはAsn残基に対してC末端側のアミノ酸残基のサイズを決定する段階、
(c)Cα原子が配座的に柔軟ではなくかつ/またはAspもしくはAsnが大型のC末端側アミノ酸残基を有する抗体を選択する段階。
(a)2つ以上の抗体を用意する段階、
(b)抗体Fv領域内の各Asp残基およびAsn残基に関して、ホモロジーモデルアンサンブルにより/において/を用いて、Cα原子の配座柔軟性を決定する段階、
(c)抗体Fv領域内の各Asp残基およびAsn残基に関して、該Asp残基またはAsn残基に対してC末端側のアミノ酸残基のサイズを決定する段階、
(d)Cα原子が配座的に柔軟ではなくかつ/またはAspもしくはAsnが大型のC末端側アミノ酸残基を有する抗体を選択する段階。
(a)本明細書において報告された方法によって選択された、または本明細書において報告された方法によって得られた抗体をコードする核酸を含む哺乳動物細胞を培養する段階、
(b)該細胞または培養培地から該抗体を回収し、それによって該抗体を生産する段階。
(a)本明細書において報告された方法によって選択された抗体をコードする核酸を含む哺乳動物細胞を培養する段階、
(b)細胞または培養培地から抗体を回収し、それによって抗体を生産する段階。
(i)配座的に柔軟でないとは、RMSDが0.01Å以下であることであり、
(ii)配座的に柔軟であるとは、RMSDが0.01Åを上回ることであり、
(iii)中程度の配座柔軟性とは、RMSDが0.145Å〜0.485Åであることであり、
(iv)高度の配座柔軟性とは、RMSDが0.485Åを上回ることである。
‐抗体Fv領域のアミノ酸配列を用意する段階、
を含む。
[本発明1001]
以下の段階を含む、分解安定性を有する抗体を選択するための方法:
(a)抗体Fv領域内の各Asp残基およびAsn残基に関して、ホモロジーモデルアンサンブルを用いて、C α 原子の配座柔軟性を決定する段階、
(b)抗体Fv領域内の各Asp残基およびAsn残基に関して、該Asp残基または該Asn残基に対してC末端側のアミノ酸残基のサイズを決定する段階、
(c)C α 原子が配座的に柔軟ではなくかつAspまたはAsnが大型のC末端側アミノ酸残基を有する抗体を選択する段階。
[本発明1002]
以下の段階を含む、アスパラギン(Asn)分解を起こしやすい抗体を同定するための方法:
(a)抗体Fv領域内の各Asn残基に関して、ホモロジーモデルアンサンブルを用いて、C α 原子の配座柔軟性を決定する段階、
(b)小型のC末端側アミノ酸残基を有する、抗体Fv領域内の各Asn残基に関して、骨格二面角φを決定する段階、
(c)小型のC末端側アミノ酸残基および-75.2度を上回る骨格二面角φを有する、抗体Fv領域内の各Asn残基に関して、溶媒露出、および該Asn残基に対してN末端側にある二次構造の変化の出現、およびこの変化が起こったアミノ酸残基から該Asn残基までの距離を決定する段階、ならびに
(d)以下の場合にアスパラギン(Asn)分解を起こしやすい抗体を同定する段階:
(i)該Asn残基がCDRループ1内にあり、そのC α 原子が配座的に柔軟であり、かつC末端側アミノ酸残基がAsp、Pro、Thr、またはAsnである場合、
(ii)該Asn残基のC α 原子が、配座的に柔軟であり、-75.2度未満の骨格二面角φを有し、かつ該Asn残基のC末端側にあるアミノ酸残基が小型である場合、または
(iii)該Asn残基のC α 原子が、配座的に柔軟であり、-75.2度を上回る骨格二面角φを有し、高度の溶媒露出を有し、かつアミノ末端側の二次構造の変化が該Asn残基から3アミノ酸残基を超えて起こる場合。
[本発明1003]
以下の段階を含み、それによって、アスパラギン(Asn)安定性が向上した1つまたは複数の抗体を選択する、アスパラギン(Asn)安定性が向上した1つまたは複数の抗体を選択するための方法:
(a)2つ以上の抗体を用意する段階、
(b)各抗体Fv領域内の各Asn残基に関して、ホモロジーモデルアンサンブルを用いて、C α 原子の配座柔軟性を決定する段階、
(c)小型のC末端側アミノ酸残基を有する各抗体Fv領域内の各Asn残基に関して、骨格二面角φを決定する段階、
(d)各抗体Fv領域内の、小型のC末端側アミノ酸残基および-75.2度を上回る骨格二面角φを有する各Asn残基に関して、溶媒露出、および該Asn残基に対してN末端側にある二次構造の変化の出現、およびこの変化が起こったアミノ酸残基から該Asn残基までの距離を決定する段階、ならびに
(e)前記2つ以上の抗体から、以下のAsn残基のうちの少なくとも1つを有する抗体を除く段階:
(i)配座柔軟性を有するC α 原子を有し、かつC末端側アミノ酸残基としてAsp、Pro、Thr、またはAsnを有する、CDRループ1内のAsn残基、
(ii)配座的に柔軟なC α 原子を有し、-75.2度未満の骨格二面角φを有し、かつ小型のC末端側アミノ酸残基を有する、Asn残基、または
(iii)配座的に柔軟なC α 原子を有し、-75.2度を上回る骨格二面角φを有し、高度の溶媒露出を有し、かつアミノ末端側の二次構造の変化がそのAsn残基から3アミノ酸残基を超えて起こる、Asn残基。
[本発明1004]
以下の段階を含む、アスパラギン酸(Asp)分解を起こしやすい抗体を同定するための方法:
(a)抗体Fv領域内の各Asp残基に関して、ホモロジーモデルアンサンブルを用いて、C α 原子の配座柔軟性を決定する段階、
(b)抗体Fv領域内の各Asp残基に関して、該Asp残基に対してC末端側にあるアミノ酸残基のサイズを決定する段階、
(c)抗体Fv領域内の各Asp残基に関して、該Asp残基に対してC末端側にある二次構造の変化の出現、およびこの変化が起こったアミノ酸残基から該Asp残基までの距離を決定する段階、ならびに
(d)以下の場合にAsp分解を起こしやすい抗体を同定する段階:
(i)該Asp残基のC α 原子が高度の配座柔軟性を有し、かつC末端側アミノ酸残基が小型である場合、または
(ii)該Asp残基のC α 原子が中程度の配座柔軟性を有し、C末端側アミノ酸残基が小型であり、かつカルボキシ末端側の二次構造の変化が連続3アミノ酸残基未満の範囲内で起こる場合、または
(iii)該Asp残基のC α 原子が中程度の配座柔軟性を有し、C末端側アミノ酸残基がGlyであり、かつカルボキシ末端側の二次構造の変化が該Asp残基から3アミノ酸残基を超えて起こる場合。
[本発明1005]
以下の段階を含み、それによって、アスパラギン酸(Asp)安定性が向上した1つまたは複数の抗体を選択する、アスパラギン酸(Asp)安定性が向上した1つまたは複数の抗体を選択するための方法:
(a)2つ以上の抗体を用意する段階、
(b)各抗体Fv領域内の各Asp残基に関して、ホモロジーモデルアンサンブルを用いて、C α 原子の配座柔軟性を決定する段階、
(c)各抗体Fv領域内の各Asp残基に関して、該Asp残基に対してC末端側にあるアミノ酸残基のサイズを決定する段階、
(d)各抗体Fv領域内の各Asp残基に関して、該Asp残基に対してC末端側にある二次構造の変化の出現、およびこの変化が起こったアミノ酸残基から該Asp残基までの距離を決定する段階、ならびに
(e)前記2つ以上の抗体から、以下のAsp残基のうちの少なくとも1つを有する抗体を除く段階:
(i)配座的に柔軟なC α 原子を有し、小型のC末端側アミノ酸残基を有する、Asp残基、
(ii)中程度の配座柔軟性を有するC α 原子を有し、小型のC末端側アミノ酸を有し、かつカルボキシ末端側の二次構造の変化がそのAsp残基から連続3アミノ酸残基未満の範囲内で起こる、Asp残基、
(iii)中程度の配座柔軟性を有するC α 原子を有し、C末端側アミノ酸残基としてGlyを有し、かつカルボキシ末端側の二次構造の変化がそのAsp残基から3アミノ酸残基を超えて起こる、Asp残基。
[本発明1006]
以下の段階を含む、長期貯蔵安定性を有する抗体を選択するための方法:
(a)抗体Fv領域内の各Asp残基およびAsn残基に関して、ホモロジーモデルアンサンブルを用いて、C α 原子の配座柔軟性を決定する段階、
(b)抗体Fv領域内の各Asp残基およびAsn残基に関して、該Asp残基または該Asn残基に対してC末端側のアミノ酸残基のサイズを決定する段階、
(c)C α 原子が配座的に柔軟ではなくかつ該Aspまたは該Asnが大型のC末端側アミノ酸残基を有する抗体を選択する段階。
[本発明1007]
以下の段階を含む、抗体を生産するための方法:
(a)本発明1001、1003、1005、および1006のいずれかの方法によって選択された抗体をコードする核酸を含む哺乳動物細胞を培養する段階、
(b)該細胞または培養培地から該抗体を回収し、それによって該抗体を生産する段階。
[本発明1008]
前記配座柔軟性が、前記ホモロジーモデルアンサンブルにおける各Asn/Asp残基のC α 原子の根平均二乗偏差(RMSD)であることを特徴とする、本発明1001〜1007のいずれかの方法。
[本発明1009]
以下を特徴とする、本発明1008の方法:
(i)配座的に柔軟でないとは、RMSDが0.01Å以下のことである、
(ii)配座的に柔軟であるとは、RMSDが0.01Åを上回ることである、
(iii)中程度の配座柔軟性とは、RMSDが0.145Å〜0.485Åのことである、および
(iv)高度の配座柔軟性とは、RMSDが0.485Åを上回ることである。
[本発明1010]
前記ホモロジーモデルアンサンブルが抗体Fv断片によって作られることを特徴とする、本発明1001〜1009のいずれかの方法。
[本発明1011]
小型のアミノ酸残基がGly、Ala、Ser、Cys、またはAspであることを特徴とする、本発明1001〜1010のいずれかの方法。
[本発明1012]
小型のアミノ酸残基がGly、Ala、Ser、またはCysであることを特徴とする、本発明1011の方法。
モノクローナル抗体は、多様な適応症領域において最も有望なタンパク質治療薬である。モノクローナル抗体の作製のための標準的なアプローチにより、常にいくつかの適した候補が導かれる。製造時、貯蔵時、およびインビボでの分解を避けるためには、これらの候補から、化学的に安定であり、高い治療的効力を有するモノクローナル抗体を選択しなければならない。抗体はしばしば、アスパラギン(Asn)脱アミドおよびアスパラギン酸(Asp)異性化によって分解される。
‐参照構造の選択、
‐問題の配列と参照構造とのアライメント
‐モデルの構築、および
‐モデルの評価。
37種の異なる治療用IgG1およびIgG4モノクローナル抗体のコレクションについて調べた(表1)。
iD=異性化、suc=スクシンイミド、dea=脱アミド
* Aspのみが脱アミド種
‡ ホモロジーモデルによって表されないCDRグリコシル化部位との相互作用を理由としてホットスポットデータセットから除外
# 利用可能な方法(トリプシンペプチド、AspNペプチド、CID断片化、HCD断片化)では、修飾部位の証明が不可能
3%以上の修飾を有する分解ホットスポットはCDRループ内に位置することが見いだされた(表1参照)。ほとんどのホットスポットは軽鎖CDR1および重鎖CDR3に位置し、一方、重鎖CDR1はホットスポットを全く含まない。分析したモノクローナル抗体37種のうち15種は、少なくとも1つのAsn/AspホットスポットをCDRの1つに含んでいた。モノクローナル抗体mAb3、mAb4、mAb9、mAb10、mAb12、mAb16、mAb18、mAb19、mAb21、mAb27、mAb28、mAb29、mAb31、mAb33、ベバシズマブ、セツキシマブ、アダリムマブ、デノスマブ、エファリズマブ、バシリキシマブ、パリビズマブ、およびパニツマブのFv領域には、ホットスポットは全く観察されなかった。
抗体のFv断片におけるすべてのAsn残基およびAsp残基(すなわち、分解性および非分解性)の構造環境を、分解機序において役割があると推定される20種のパラメータのセットによって特徴づけた。最新式のホモロジーモデリング用ソフトウェアを用いてFab断片のホモロジーモデルを作成し、当該プログラムから得られたソリューションを、モデリングスコアに基づいて評価した。パラメータは、自動化手順によってインシリコでホモロジーモデルから抽出した。一般に、テンプレート構造との相同性が高ければ、フレームワーク領域および短いCDR領域の正確なホモロジーモデルを得られる。しかし、長いCDRループのモデリングではモデリングの不確定性が大きくなりやすく、その原因の一部は、そのようなループに固有の柔軟性の高さである(74〜77)。このため、すべてのCDRをループモデリング手順に供し、5つの構成要素からなるホモロジーモデルアンサンブルを得た。これと同様にして、異なる推定上のCDR立体配座に関する他の情報も、分子動力学的シミュレーションを課すことを必要とせずに取得した。構造パラメータとインビトロ分解との相関については機械学習アルゴリズムによって調べた。この予測モデルは、従来の配列モチーフに基づく方法に比較して、十分な精度および予測誤りの少なさを示すことが見いだされた。
Aspの場合、データセットは、非ホットスポットAsp残基と区別される必要のあるわずか2.7%のホットスポットからなる。デシジョンツリーの最初の2つの分割は、すべての非ホットスポットのうち93%を分離することができる(第1の分割で1105個;第2の分割で260個)。非ホットスポットは、柔軟でないか、または、その後続のカルボキシ末端側アミノ酸が大型(例えば、Pro、Thr、asn、Val、Leu、Glu、His、Gln、Ile、Met、Lys、Phe、Tyr、Arg、もしくはTrpなど)である。したがって、これから分類される残りのAspは、柔軟であり、かつ、その後ろが(Gly、Ala、Ser、Cys、またはAspであり得る)小型のアミノ酸である。これらから、最大である第1のAspホットスポットクラスが分離されるが、これは、配座柔軟性が高いこと(RMSD>0.485Å)およびその後ろがAsp、Cys、Ser、Ala、またはGlyであることを特徴とする。これは、5つのホットスポット(それぞれ5つの構成要素)および2つの偽陽性Asp残基(それぞれ5つの構成要素)を含む。
治療用タンパク質におけるAsn残基およびAsp残基の自然分解は、生産時、貯蔵時、およびインビボで起こりうる。標的との結合に関与する場合、分解産物であるスクシンイミド、イソAsp、およびCDR内に埋め込まれたAspの形成は、標的への結合効力の低下、および薬物効力の低下につながる恐れがある。
モノクローナル抗体の出所
24種のモノクローナル抗体は、ヒトまたはヒト化IgG1またはIgG4抗体である。13種のモノクローナル抗体は市販品であり、これには、アバスチン(Avastin)(ベバシズマブ、Genentech/Roche);CYT387(ニモツズマブ、Oncoscience、Ch.B.:911017W002);エルビタックス(Erbitux)(セツキシマブ、Bristol-Myers Squibb and Eli Lilly and Company、ロット:7666001);ハーセプチン(Herceptin)(トラスツズマブ、RO-45-2317/000、ロット.HER401-4、Genentech);ヒュミラ(Humira)(アダリムマブ、Abbott, Ch.B.:90054XD10);プラリア(Prolia)(デノスマブ、Amgen, Ch.B.:1021509);ラプティバ(Raptiva)(エファリズマブ、Genentech、Merck Serono、ロット:Y11A6845);レミケード(Remicade)(インフリキシマブ、Centocor, Ch.B.:0RMA66104);シムレクト(Simulect)(バシリキシマブ、Novartis, Ch.B.:S0014);シナジス(Synagis)(パリビズマブ、Medimmune、ロット.:122-389-12);タイサブリ(Tysabri)(ナタリズマブ、BiogenIdec and Elan、LotA:080475);ベクチビックス(Vectibix)(パニツムマブ、Amgen, Ch.B.:1023731);およびゾレア(Xolair)(オマリズマブ、Genentech/Novartis, Ch.B.:S0053)が含まれる。
分解が誘導された試料の作製
すべての治療用モノクローナル抗体を誘導分解に供した(ストレス試料)。2mgの各抗体を、D-Tube Dialyzers(Novagen、MWCO 6〜8kDa)において、希釈緩衝液(20mMのヒスチジン塩化物、pH 6.0)に対する4℃での一晩の透析処理にかけた。濃度を決定し(Nanodrop)、希釈緩衝液によって5mg/mlに調整した。無菌濾過(Pall Nanosep MF、0.2μm)および滅菌ねじ蓋付きチューブ内に移した後、すべてのモノクローナル抗体試料を、静止下にて40℃で2週間インキュベートした。
トリプシンペプチドマッピング実験のためのモノクローナル抗体試料の調製
80μgのモノクローナル抗体参照試料およびストレス試料の変性および還元を、最終容積124.5μLの100mM Tris、5.6Mグアニジン塩酸塩、10mM TCEP(トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン、Pierce Protein Biology Products, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)、pH 6.0中にて37℃で1時間かけて実施した。緩衝液を、0.5mlのZeba Spin Desalting Column(Pierce Protein Biology Products, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)中にて、20mMヒスチジン塩化物、0.5mM TCEP、pH 6.0に交換した。抗体1μg当たり0.05μgのトリプシン(Promega、Madison)を最終容積140μLとして添加することにより、モノクローナル抗体を37℃で一晩かけて消化した。7μLの10%ギ酸(FA)溶液の添加によって消化を停止させ、さらに分析を行うまで試料を-80℃で凍結した。
液体クロマトグラフィータンデム質量分析法による修飾ペプチドの検出
消化された抗体14μgを、分離のために、Varian(Darmstadt, Germany)製のVarian Polaris 3 C18‐Etherカラム (1×250mm;粒径3μm、孔径180Å)でのRP-HPLC(Agilent 1100 Cap LC, Agilent Technologies, Boeblingen, Germany)にアプライした。さらに、mAb2、mAb14、およびニモツズマブ消化物を、RP-UPLC(ACQUITY BEH300 C18カラム、1×150mm、ビーズサイズ1.7μm、孔径300Å、Waters, Manchester, UK)によって分離した。Triversa NanoMate(Advion, Ithaca, NY, USA)を用いてHPLCまたはUPLCの溶出液を分け、陽イオンモードで動作させているLTQ Orbitrap古典的タンデム質量分析計(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)に380nL/分で注入した。RP-HPLCの移動相は、0.1%ギ酸を含む水(溶媒A)および0.1%ギ酸を含むアセトニトリル(溶媒B)からなった。HPLCは、流速60μL/分で、溶媒Bを2%から開始して、5分目から15分目までに15%に上昇させ、15分目から70分目までに32%に、70分目から80分目までに38%に、80分目から90分目までに100%に上昇させた上で、最後に92分目から110分目までに2%までに低下させる段階的な勾配を用いて実施した。UPLCは、0〜130分かけて溶媒Bを1〜40%にする直線的勾配を用いて行った。UV吸光を220nmおよび280nmで測定した。データ取得は、Xcalibur(商標)ソフトウェア(Thermo Fisher Scientific、Waltham, MA, USA)による制御下で行った。MS/MS測定に関しては、LTQにおいてヘリウムを衝突ガスとし、衝突エネルギー35%とする低エネルギーCIDによって、断片化を誘導した。mAb14およびニモツズマブに関する断片イオンに対してより高度の分解能を得るために、Orbitrapにおいて親質量リスト、単離幅3、親質量幅0.2Da、AGC Target 400000、および取得時間5000msを用いて断片化を行った。
MS/MS評価のためのmAb14およびニモツズマブ試料の調製
さらなる特性決定のために、mAb14およびニモツズマブのストレス試料を以下の通りに処理した。250μgのモノクローナル抗体を、最終容積が240μLとなるように変性緩衝液(0.4 M Tris(Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany)、8Mグアニジン塩酸塩(Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany)、pH 8)を添加することによって変性させた。還元は、変性緩衝液によって新たに調製した20μLの0.24Mジチオトレイトール(DTT)(Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany)を添加して、37℃でのインキュベーションを60分間行うことによって実施した。その後、20μLの0.6Mヨード酢酸(Merck KgaA、Darmstadt, Germany)水溶液中で、暗下にて室温で15分間かけて試料をアルキル化した。余分なアルキル化試薬は、30μLのDTT溶液の添加によって失活させた。続いて、NAP5 Sephadex G-25 DNAグレードカラム(GE Healthcare, Germany)を用いて、試料の緩衝液をおよそ480μLの50mM Tris/HCl、pH 7.5に交換した。抗体1μg当たり0.03μgのトリプシン(Promega、Madison)を最終容積500μLとして添加することにより、モノクローナル抗体を37℃で5時間かけて消化した。20μLの10%ギ酸溶液の添加によって消化を停止させ、さらに分析を行うまで試料を-80℃で凍結した。
修飾レベルの定量のためのデータ分析
SIEVEソフトウェア・バージョン2.0(VAST Scientific Inc., Cambridge, MA)を用いて、ストレス試料と参照試料との間の差に関してデータのプレフィルター処理を行った。決定的なSIEVE設定は、フレーム時間幅1.0分、m/z幅8.0ppm、および強度閾値50,000カウントであった。モノアイソトピック質量(prelement=0)に関してフィルター処理したSIEVEデータを、修飾ペプチドおよび非修飾ペプチドの理論的な質量電荷比を含むモノクローナル抗体の重鎖および軽鎖のインシリコでのトリプシン消化によるデータとともに、マクロ動作可能なEXCELワークブックにインポートした。該当するペプチドのm/z値のシグナル強度または保持時間の差(参照とストレスとの比較)を、マクロ動作可能なEXCELワークブック(Microsoft, Redmond, WA, USA)によって半自動的な様式で検出した。得られた76種のペプチドマップからのプレフィルター処理されたペプチドを個別に検査し、AsnおよびAsp修飾をそれらの実験的質量スペクトル内のm/z値によって検証した。定量に関しては、関心対象のペプチドの抽出されたイオンクロマトグラム(XIC)を、それらのモノアイソトピック質量に基づいて作成し、Xcaliburソフトウェア(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)を用いて荷電状態を検出した。修飾ペプチドおよび非修飾ペプチドの相対量を、対応するピーク面積を個別に積分した後に計算した。さらに、推定されるホットスポットモチーフ(Asn-Gly、Asn-Thr、Asn-Ser、Asn-Asn、Asp-Gly、Asp-Thr、Asp-Ser、Asp-Asp、Asp-His)を含むCDR領域内に位置するすべてのペプチドを、データの完全性を保証するためのSIEVEソフトウェア分析の後に注意喚起が行われなかった場合であっても分析した。
ホモロジーモデリングならびに二次元および三次元パラメータの抽出
ホモロジーモデルは、プログラムMODELER 9v7用の自動化ソフトウェアスクリプトを用いて作成した(83)。モデリング用テンプレートは、最小分解能が2.8Åで可変領域内の内部残基を欠いていないヒト抗体、マウス抗体、およびキメラ抗体のFab断片の結晶構造からなる参照構造データベースから配列保存性に基づいて選択した。各モノクローナル抗体に関して最も良い結果が得られたモデルを、ループ精密化法のための基盤として用いた(LOOPER, Discovery Studio, Accelrys Inc., San Diego, USA)(84)。続いて、ループ精密化による最も可能性の高いソリューション上位5つを選択して、各モノクローナル抗体に関する構造のアンサンブルとして用いた。これらのホモロジーモデルアンサンブルから、コンピュータ計算によってパラメータを抽出した(表2)。pKa値は、プログラムpropkaをpdb2pqrの一部として用いて計算した(79)。二次構造要素(シート、ヘリックス、ターン、コイル)は、Discovery Studio(Accelrys Inc.、San Diego, USA)を、個別仕様のスクリプトを用いて抽出した。「隣の異なるN末端側二次構造」、「隣の異なるC末端側二次構造」および「コイル内の位置」というパラメータは、Pipeline Pilot(Accelrys Inc., San Diego, USA)に実装されているブール則(表2)を用いて、周囲残基の二次構造情報から推定した。「コイル内の「縁」位置」は、隣の異なる二次構造要素がN末端方向またはC末端方向のいずれかに1残基または2残基隔たっている場合に指定される。「コイル内の「中心」位置」は、N末端方向およびC末端方向のいずれかについて二次構造が4残基にわたって同じであるか、または両方向において4つを上回る残基がある場合に指定される。「Fabでの場所」というパラメータは、抗体に関するChothiaおよびKabatのCDR定義の組み合わせから導き出された番号である(82)(Kabat)。「Fabでの場所」の1番は、重鎖のフレームワーク(FRH)1に対応し、2番はCDRH1に、3番はFRH2に、4番はCDRH2に、5番はFRH3に、6番はCDRH3に、7番はFRH4に、8番は軽鎖のフレームワーク(FRL)1に、9番はCDRL1に、10番はFRL2に、11番はCDRL2に、12番はFRL3に、13番はCDRL3に、そして14番はFRL4に対応する。「CDRループ」は、軽鎖および重鎖のいずれについても同じく、1から3までの範囲にわたる番号である。「後続残基のサイズ」とは、Å2単位での溶媒露出表面積(85)であり、以下の通りに定義される:Ala、64.78;Cys、95.24;Asp、110.21;Glu、143.92;Phe、186.7;Gly、23.13;His、146.45;Ile、151.24;Lys、177.37;Leu、139.52;Met、164.67;Asn、113.19;Pro、111.53;Gln、147.86;Arg、210.02;Ser、81.22;Thr、111.6;Val、124.24;Trp、229.62;Tyr、200.31。本発明者らのデータコレクションにおいて、末端残基(φおよびψを欠く)に印を付している。他のすべてのパラメータは、PyMOLにおいて自ら書いたpythonスクリプトを用いて、PDBファイルから抽出した(5)(表2)。
分類評価のために用いた機械学習アルゴリズム
可能な範囲の中で最良の分類器を見いだす目的で、この種の分類課題に最も適するとされるいくつかの異なる方法、すなわち、サポートベクターマシン、再帰分割アルゴリズム、正則化判別分析、およびニューラルネットワークによる検討を行った。それらは、統計ソフトウェアRまたはPipeline Pilot(Accelrys Inc., San Diego, USA)においてパッケージとして利用可能であった。サポートベクターマシン(SVM)は、いわゆる核関数の助けを借りて、所与のデータセットをより高次元に変換する別の手段を与える。本明細書では、パッケージe1071によるsvm法(86)およびkernlabパッケージによるksvm法(87)を用いた。再帰的分割法は、その所与のデータセットをサブセットに分割し、それによってデシジョンツリーを生成することにより、パラメータを段階的な様式で同定する。アルゴリズム間の違いは、主として、所与の段階で最良の分割パラメータを判断するための方法の違いによる。「ツリー」法(88)および「rpart」法(89)をRにて用い、その際に、いくつかの異なる分割方法について検討した。出所となる訓練セットのサブセットに基づくデシジョンツリーを、いわゆるランダムフォレストと組み合わせることによって、より一般的な形態の分類器を得ることもできる。正則化判別分析では、可能な範囲の中で最良の判別を行う目的で、正則化群共分散行列を用いて、入手可能なパラメータのサブセットを組み合わせることによって分類器を作成する。この方法は、klaRパッケージ(90)に「rda」機能として実装されている。ニューラルネットワークでは、相互に接続された1つまたはいくつかのニューロン層の基本的な機能をエミュレートするための試行を行う。Rの「nnet」法(91)に実装されている、いわゆる単隠れ層ニューラルネットワークを適用した。最後に、ある特定のクラスに属し、訓練データを与えるデータ試料の確率をベイズ定理を用いて計算する確率論的な方法である単純ベイズ分類器を、Rの「NaiveBayes」法を用いて検討した。
再帰分割および予測
実施例7における方法の比較評価の後で、最も成績の良かった分類アルゴリズムは、Pipeline Pilot(Accelrys Inc., San Diego, USA)における単一ツリー型の先読み可能な再帰分割アルゴリズムであった。このモデルを、ホモロジーモデルのFv領域のみに由来する残基を用いて、AsnおよびAspの予測のために別々に訓練した。すなわち、1045個のAsn残基および1520個のAsp残基を用いて訓練を実施したところ、そのうちそれぞれ60個および35個がホットスポットであり、その学習特性はホットスポットと定義された。末端残基、ならびにストレス試料における修飾率が3%未満であった残基(ウィークスポットおよび反応性スポット)は訓練から除外した。記載した20種のパラメータすべてを訓練セットに与えた。Pipeline Pilotにおける単一ツリー型再帰分割分類アルゴリズムの主な特徴は、さらに別の分割を検討することによってより優れた分類を可能にする、ある特定の「先読み」深度が指定される見込みがあることである。
Claims (8)
- 以下の段階を含み、それによって、分解安定性を有する1つまたは複数の抗体を選択する、分解安定性を有する1つまたは複数の抗体を選択するための方法:
(a)2つ以上の抗体を用意する段階、
(b)抗体Fv領域内の各Asp残基およびAsn残基に関して、ホモロジーモデルアンサンブルを用いて、Cα原子の配座柔軟性を決定する段階、
(c)抗体Fv領域内の各Asp残基およびAsn残基に関して、該Asp残基または該Asn残基に対してC末端側のアミノ酸残基のサイズを決定する段階、
(d)Cα原子が配座的に柔軟ではなくかつAspまたはAsnが111Å 2 以上の溶媒露出表面積(SASA)を有するC末端側アミノ酸残基を有する1つまたは複数の抗体を選択する段階、
ここで、前記配座柔軟性が、前記ホモロジーモデルアンサンブルにおける各Asn/Asp残基のC α 原子の根平均二乗偏差(RMSD)であり、および
(i)配座的に柔軟でないとは、RMSDが0.01Å以下のことであり、
(ii)配座的に柔軟であるとは、RMSDが0.01Åを上回ることであり、
(iii)中程度の配座柔軟性とは、RMSDが0.145Å〜0.485Åのことであり、および
(iv)高度の配座柔軟性とは、RMSDが0.485Åを上回ることである。 - 以下の段階を含み、それによって、アスパラギン(Asn)安定性が向上した1つまたは複数の抗体を選択する、アスパラギン(Asn)安定性が向上した1つまたは複数の抗体を選択するための方法:
(a)2つ以上の抗体を用意する段階、
(b)各抗体Fv領域内の各Asn残基に関して、ホモロジーモデルアンサンブルを用いて、Cα原子の配座柔軟性を決定する段階、
(c)111Å 2 未満の溶媒露出表面積(SASA)を有するC末端側アミノ酸残基を有する各抗体Fv領域内の各Asn残基に関して、骨格二面角φを決定する段階、
(d)各抗体Fv領域内の、111Å 2 未満の溶媒露出表面積(SASA)を有するC末端側アミノ酸残基および-75.2度を上回る骨格二面角φを有する各Asn残基に関して、溶媒露出、および該Asn残基に対してN末端側にある二次構造の変化の出現、およびこの変化が起こったアミノ酸残基から該Asn残基までの距離を決定する段階、ならびに
(e)前記2つ以上の抗体から、以下のAsn残基のうちの少なくとも1つを有する抗体を除く段階:
(i)配座柔軟性を有するCα原子を有し、かつC末端側アミノ酸残基としてAsp、Pro、Thr、またはAsnを有する、CDRループ1内のAsn残基、
(ii)配座的に柔軟なCα原子を有し、-75.2度未満の骨格二面角φを有し、かつ111Å 2 未満の溶媒露出表面積(SASA)を有するC末端側アミノ酸残基を有する、Asn残基、または
(iii)配座的に柔軟なCα原子を有し、-75.2度を上回る骨格二面角φを有し、高度の溶媒露出(SASA>89.4Å 2 )を有し、かつアミノ末端側の二次構造の変化がそのAsn残基から3アミノ酸残基を超えて起こる、Asn残基、
ここで、前記配座柔軟性が、前記ホモロジーモデルアンサンブルにおける各Asn/Asp残基のC α 原子の根平均二乗偏差(RMSD)であり、および
(i)配座的に柔軟でないとは、RMSDが0.01Å以下のことであり、
(ii)配座的に柔軟であるとは、RMSDが0.01Åを上回ることであり、
(iii)中程度の配座柔軟性とは、RMSDが0.145Å〜0.485Åのことであり、および
(iv)高度の配座柔軟性とは、RMSDが0.485Åを上回ることである。 - 以下の段階を含み、それによって、アスパラギン酸(Asp)安定性が向上した1つまたは複数の抗体を選択する、アスパラギン酸(Asp)安定性が向上した1つまたは複数の抗体を選択するための方法:
(a)2つ以上の抗体を用意する段階、
(b)各抗体Fv領域内の各Asp残基に関して、ホモロジーモデルアンサンブルを用いて、Cα原子の配座柔軟性を決定する段階、
(c)各抗体Fv領域内の各Asp残基に関して、該Asp残基に対してC末端側にあるアミノ酸残基のサイズを決定する段階、
(d)各抗体Fv領域内の各Asp残基に関して、該Asp残基に対してC末端側にある二次構造の変化の出現、およびこの変化が起こったアミノ酸残基から該Asp残基までの距離を決定する段階、ならびに
(e)前記2つ以上の抗体から、以下のAsp残基のうちの少なくとも1つを有する抗体を除く段階:
(i)配座的に柔軟なCα原子を有し、111Å 2 未満の溶媒露出表面積(SASA)を有するC末端側アミノ酸残基を有する、Asp残基、
(ii)中程度の配座柔軟性を有するCα原子を有し、111Å 2 未満の溶媒露出表面積(SASA)を有するC末端側アミノ酸を有し、かつカルボキシ末端側の二次構造の変化がそのAsp残基から連続3アミノ酸残基未満の範囲内で起こる、Asp残基、
(iii)中程度の配座柔軟性を有するCα原子を有し、C末端側アミノ酸残基としてGlyを有し、かつカルボキシ末端側の二次構造の変化がそのAsp残基から3アミノ酸残基を超えて起こる、Asp残基、
ここで、前記配座柔軟性が、前記ホモロジーモデルアンサンブルにおける各Asn/Asp残基のC α 原子の根平均二乗偏差(RMSD)であり、および
(i)配座的に柔軟でないとは、RMSDが0.01Å以下のことであり、
(ii)配座的に柔軟であるとは、RMSDが0.01Åを上回ることであり、
(iii)中程度の配座柔軟性とは、RMSDが0.145Å〜0.485Åのことであり、および
(iv)高度の配座柔軟性とは、RMSDが0.485Åを上回ることである。 - 以下の段階を含む、抗体を生産するための方法:
(a)請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法によって選択された抗体をコードする核酸を含む哺乳動物細胞を培養する段階、
(b)該細胞または培養培地から該抗体を回収し、それによって該抗体を生産する段階。 - 前記ホモロジーモデルアンサンブルが抗体Fv断片によって作られることを特徴とする、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 111Å 2 未満の溶媒露出表面積(SASA)を有するアミノ酸残基がGly、Ala、Ser、Cys、またはAspであることを特徴とする、請求項2〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 111Å 2 未満の溶媒露出表面積(SASA)を有するアミノ酸残基がGly、Ala、Ser、またはCysであることを特徴とする、請求項6に記載の方法。
- 以下の段階を含む、抗体を生産するための方法:
(a)請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法によって選択された抗体をコードする核酸を含む哺乳動物細胞を培養する段階、および
(b)細胞または培養培地から抗体を回収し、それによって抗体を生産する段階。
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