JPWO2020122195A1 - ゲノム編集された細胞の製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本願は、2018年12月12日に、日本に出願された特願2018−232946号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
CRISPR/Casシステムには、I型、II型、III型があるが、ゲノム編集で用いるのはもっぱらII型のCRISPR/Casシステムであり、II型ではRGNとしてCas9タンパク質が用いられている。S.pyogenes由来のCas9タンパク質はNGGという3つの塩基をPAM配列として認識するため、グアニンが2つ並んだ配列がありさえすればその上流を切断できる。
CRISPR/Casシステムを用いた方法は、標的DNA配列と相同な配列を有する短いsgRNAを合成するだけでよく、単一のタンパク質であるCas9タンパク質を用いてゲノム編集ができる。そのため、従来用いられていたジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)やトランス活性化因子様作動体(TALEN)のようにDNA配列ごとに異なる大きなタンパク質を合成する必要がなく、簡便かつ迅速にゲノム編集を行うことができる。
例えば、特許文献1には、S.pyogenes由来のCRISPR/Casシステムを活用したゲノム編集技術が開示されている。
例えば、疾患遺伝子と正常遺伝子とをヘテロに有する場合、ゲノム編集により疾患遺伝子をノックアウトしようとすると、正常遺伝子にも高頻度で変異が誘導されるおそれがある。また、HDRにより正常遺伝子をノックインしようとしても、両アレルでノックインが生じる確率は極めて低い。そのため、ノックインが誘導されなかったアレルでは、NHEJによりindelが導入されるおそれがある。
そのため、ゲノム編集により両方のアレルで二本鎖切断が生じた場合、片方のアレルに予期せぬ変異が誘導されるリスクがある。
[1](A)(a1)スペーサー配列の5’末端に1個以上のヌクレオチド残基が付加されたガイドRNA、(a2)標的配列に対して1塩基又は複数塩基のミスマッチを有するスペーサー配列を含むガイドRNA、及び(a3)前記(a1)若しくは前記(a2)のガイドRNAの発現ベクターからなる群より選択される少なくとも1種と、(B)Casタンパク質及びその発現ベクターからなる群より選択される少なくとも1種と、を細胞に導入する工程を含む、片側アレルのみがゲノム編集された細胞の製造方法。
[2]前記(A)が、スペーサー配列の5’末端に1個以上のヌクレオチド残基が付加され、且つ前記スペーサー配列が、標的配列に対して1塩基又は複数塩基のミスマッチを有するスペーサー配列である、ガイドRNA又はそれをコードする発現ベクターである、[1]に記載の片側アレルのみがゲノム編集された細胞の製造方法。
[3]前記スペーサー配列の5’末端に付加されたヌクレオチド残基が、全て同一のヌクレオチド残基である、[1]又は[2]に記載の片側アレルのみがゲノム編集された細胞の製造方法。
[4]前記スペーサー配列の5’末端に付加されたヌクレオチド残基が、シトシン残基又はグアニン残基である、[3]に記載の片側アレルのみがゲノム編集された細胞の製造方法。
[5]さらに、(C)ドナーベクターを細胞に導入する工程を含む、[1]〜[4]のいずれかに記載の片側アレルのみがゲノム編集された細胞の製造方法。
[6]前記Casタンパク質がCas9タンパク質である、[1]〜[5]のいずれか一項に記載の片側アレルのみがゲノム編集された細胞の製造方法。
[7]スペーサー配列の5’末端に1個以上のヌクレオチド残基が付加されたガイドRNA。
[8]前記スペーサー配列が、標的配列に対して1塩基又は複数塩基のミスマッチを有する、[7]に記載のガイドRNA。
[9][7]又は[8]に記載のガイドRNAの発現ベクター。
[10]さらに、Casタンパク質を発現可能な、[9]に記載の発現ベクター。
[11]前記Casタンパク質がCas9タンパク質である、[10]に記載の発現ベクター。
[12](A)(a1)スペーサー配列の5’末端に1個以上のヌクレオチド残基が付加されたガイドRNA、(a2)標的配列に対して1塩基又は複数塩基のミスマッチを有するスペーサー配列を含むガイドRNA、及び(a3)前記(a1)若しくは前記(a2)のガイドRNAの発現ベクター、からなる群より選択される少なくとも1種を含む、片側アレルのみがゲノム編集された細胞の製造キット。
[13](B)Casタンパク質及びその発現ベクターからなる群より選択される少なくとも1種をさらに含む、[12]に記載の製造キット。
[14](i)ガイドRNA若しくはその発現ベクター、及びCasタンパク質若しくはその発現ベクターを細胞に導入してゲノム編集を行う工程、(ii)前記ゲノム編集を行った細胞からDNAを抽出する工程、(iii)前記DNAから標的領域を含むDNA断片を増幅する工程、(iv)前記増幅したDNA断片の配列解析を行い、前記標的領域へのindel誘導率(P)を求める工程、及び(v)下記式(m)若しくは(m1)及び(b)若しくは(b1)により、片側アレルのみへのindel誘導率(mono)及び両側アレルへのindel誘導率(bi)を求める工程、を含む、ゲノム編集パターンの予測方法。
mono=2×P×(1−P) ・・・(m)
bi=P2 ・・・(b)
mono=−1.303P2+1.2761P+0.0274 ・・・(m1)
bi=0.6515P2+0.3619P−0.0137 ・・・(b1)
[15]一方のアレルに、局在化タンパク質コード配列と、切断部位と、第1の蛍光タンパク質コード配列と、がこの順にインフレームで連結されたキメラ遺伝子を含み、他方のアレルに、前記局在化タンパク質コード配列と、前記切断部位と、第2の蛍光タンパク質コード配列と、がこの順にインフレームで連結されたキメラ遺伝子を含む、細胞。
[16](I)[15]に記載の細胞に、前記切断部位を標的とするガイドRNA若しくはその発現ベクター、及びCasタンパク質若しくはその発現ベクターを導入してゲノム編集を行う工程、(II)前記工程(I)の後、前記細胞の蛍光パターンを解析する工程、並びに(III)前記工程(II)で解析した蛍光パターンに基づいて、ゲノム編集パターンを判定する工程、を含む、ゲノム編集パターンの解析方法。
本明細書において、「ポリヌクレオチド」及び「核酸」という用語は、相互に互換的に使用され、ヌクレオチドがホスホジエステル結合によって結合したヌクレオチドポリマーを指す。「ポリヌクレオチド」及び「核酸」は、DNAであってもよく、RNAであってもよく、DNAとRNAとの組み合わせから構成されてもよい。また、「ポリヌクレオチド」及び「核酸」は、天然ヌクレオチドのポリマーであってもよく、天然ヌクレオチドと非天然ヌクレオチド(天然ヌクレオチドの類似体、塩基部分、糖部分及びリン酸部分のうち少なくとも一つの部分が修飾されているヌクレオチド(例えば、ホスホロチオエート骨格)等)とのポリマーであってもよく、非天然ヌクレオチドのポリマーであってもよい。
本明細書において、「ポリヌクレオチド」又は「核酸」の塩基配列は、特に明示しない限り、一般的に認められている1文字コードで記載される。特に明示しない限り、塩基配列は、5’側から3’側に向かって記載する。
本明細書において、「ポリヌクレオチド」又は「核酸」を構成するヌクレオチド残基は、単に、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、又はウラシル等、あるいはそれらの1文字コードで記載される場合がある。
本明細書において、「ドナーベクター」という用語は、修復用鋳型DNAとして用いられる外来性DNAを指す。ドナーベクターは、ホモロジーアームとして標的領域に隣接する塩基配列を含む。本明細書においては、標的領域の5’側に隣接する塩基配列からなるホモロジーアームを「5’アーム」、標的配列の3’側に隣接する塩基配列からなるホモロジーアームを「3’アーム」と記載する場合がある。ドナーベクターは、5’アームと3’アームとの間に、所望の塩基配列を含むことができる。各ホモロジーアームの長さは、3kb以上が好ましく、通常5〜10kb程度である。5’アーム及び3’アームの長さは、同じであってもよく、異なっていてもよいが、同じであることが好ましい。
好ましい態様において、Casタンパク質は、クラス2のCRISPR/Cas系に関与するものであり、より好ましくはII型のCRISPR/Cas系に関与するものである。Casタンパク質の好ましい例としては、Cas9タンパク質が例示される。
Cas9タンパク質が由来する生物種は特に限定されないが、ストレプトコッカス(Streptococcus)属、スタフィロコッカス(Staphylococcus)属、ナイセリア(Neisseria)属、又はトレポネーマ(Treponema)属に属する細菌等が好ましく例示される。より具体的には、S.pyogenes、S.thermophilus、S.aureus、N.meningitidis、又はT.denticola等に由来するCas9タンパク質が好ましく例示される。好ましい態様において、Cas9タンパク質は、S.pyogenes由来のCas9タンパク質である。
ガイドRNAは、crRNAの3’末端にtracrRNAの5’末端を連結した一本鎖ガイドRNA(sgRNA)であってもよく、crRNA及びtracrRNAを別々のRNA分子とし、リピート配列及びアンチリピート配列で塩基対を形成させたものであってもよい。好ましい態様において、ガイドRNAはsgRNAである。
例えば、S.pyogenes由来のCas9タンパク質を用いる場合、sgRNAの長さは、50〜220ヌクレオチド(nt)程度とすることができ、60〜180nt程度が好ましく、80〜120nt程度がより好ましい。crRNAの長さは、スペーサー配列を含めて約25〜70塩基長とすることができ、25〜50nt程度が好ましい。tracrRNAの長さは10〜130nt程度とすることができ、30〜80nt程度が好ましい。
crRNAのリピート配列は、Casタンパク質が由来する細菌種におけるものと同じであってもよく、3’末端の一部を削除したものであってもよい。tracrRNAは、Casタンパク質が由来する細菌種における成熟tracrRNAと同じで配列を有していてもよく、当該成熟tracrRNAの5’末端及び/又は3’末端を切断した末端切断型であってもよい。例えば、tracrRNAは、成熟tracrRNAの3’末端から1〜40個程度のヌクレオチド残基を除去した末端切断型であり得る。また、tracrRNAは、成熟tracrRNAの5’末端から1〜80個程度のヌクレオチド残基を除去した末端切断型であり得る。また、tracrRNAは、例えば、5’末端から1〜20程度のヌクレオチド残基を除去し、かつ3’末端から1〜40個程度のヌクレオチド残基を除去した末端切断型であり得る。
sgRNA設計のためのcrRNAリピート配列及びtracrRNAの配列は、種々提案されており、当業者は、公知技術に基づいてsgRNAを設計することができる(例えば、Jinek et al. (2012) Science, 337, 816-21; Mali et al. (2013) Science, 339: 6121, 823-6; Cong et al. (2013) Science, 339: 6121, 819-23; Hwang et al. (2013) Nat. Biotechnol. 31: 3, 227-9; Jinek et al. (2013) eLife, 2, e00471)。
ガイドRNAにおいて、スペーサー配列は、crRNAの5’側に配置される。
本明細書において、「両側アレルindel」という用語は、ゲノム編集により両側アレルの標的領域にindelが生じた状態を指す。
本明細書において、「片側アレルindel」という用語は、ゲノム編集により片側アレルの標的領域のみにindelが生じた状態を指す。
本明細書において、「フレームシフトindel」という用語は、フレームシフトを生じるindelを指す。
本明細書において、「インフレームindel」という用語は、フレームシフトを生じないindelを指す。
本明細書において、「AIMS細胞」という用語は、AIMSを行うために構築された細胞を意味し、アレル特異的にindelを検出することができる細胞を指す。
したがって、本明細書で用いられる「自己切断部位」という用語は、当該配列が任意のさらなる分子を伴うことなく切断される又は切断可能である、あるいは、当該配列内のペプチド結合又はホスホジエステル結合の形成が最初の段階で(例えば、上述のような翻訳と同時の自己プロセシングを介して)妨げられる、アミノ酸配列内又はヌクレオチド配列内の切断部位を指す。切断部位は典型的に数個のアミノ酸を含む、または数個のコドンによりコードされる(例えば、そのような場合、「切断部位」はタンパク質へ翻訳されないが翻訳の妨害を引き起こす)ことが理解される。それゆえ、切断部位はまた、ペプチドリンカーという目的に適う、すなわち二つのペプチドを立体的に分離する。したがって、いくつかの実施形態では、「切断部位」は、ペプチドリンカーでもあり、上述の切断機能を提供するものでもある。この実施形態では、切断部位はさらなるN及び/又はC末端アミノ酸を包含してもよい。
本明細書において、「発現ベクター」という用語は、対象ポリヌクレオチドを含むベクターであって、該ベクターを導入した細胞内で、対象ポリヌクレオチドを発現可能な状態にするシステムを備えたベクターを指す。例えば、「Casタンパク質の発現ベクター」とは、該ベクターを導入した細胞内で、Casタンパク質を発現可能なベクターを意味する。また、例えば、「ガイドRNAの発現ベクター」とは、該ベクターを導入した細胞内で、ガイドRNAを発現可能なベクターを意味する。
1実施形態において、本発明は、(A)(a1)スペーサー配列の5’末端に1個以上のヌクレオチド残基が付加されたガイドRNA、(a2)標的配列に対して1塩基又は複数塩基のミスマッチを有するスペーサー配列を含むガイドRNA、及び(a3)前記(a1)若しくは前記(a2)のガイドRNAの発現ベクターからなる群より選択される少なくとも1種と、
(B)Casタンパク質及びその発現ベクターからなる群より選択される少なくとも1種と、を細胞に導入する工程を含む、片側アレルのみがゲノム編集された細胞の製造方法を提供する。
本実施形態の製造方法では、(a1)スペーサー配列の5’末端に1個以上のヌクレオチド残基が付加されたガイドRNA、(a2)標的配列に対して1塩基又は複数塩基のミスマッチを有するスペーサー配列を含むガイドRNA、及び(a3)前記(a1)若しくは前記(a2)のガイドRNAの発現ベクターからなる群より選択される少なくとも1種、を用いる。
(a1)のガイドRNAは、スペーサー配列の5’末端に1個以上のヌクレオチド残基が付加されたガイドRNAである。当該ガイドRNAを用いてゲノム編集を行うことにより、片側アレルのみでゲノム編集される割合が向上し、片側アレルのみがゲノム編集された細胞を製造することができる。
通常、スペーサー配列は、標的配列と同一配列であるが(但し、標的配列中の「T」はスペーサー配列では「U」となる)、標的配列の相補鎖に対する結合能を有する限り、ミスマッチを有していてもよい。一般的に、スペーサー配列の5’側におけるミスマッチは許容性を示す。本実施形態の製造方法では、後述の(a2)のガイドRNAのように、標的配列に対して1塩基ミスマッチを有するスペーサー配列が好ましい。
後述の(a3)の発現ベクターのように、(a1)のガイドRNAをコードする発現ベクターを用いる場合、付加ポリヌクレオチド残基は、通常、使用するプロモーターからの転写がストップするターミネーター配列の相補配列を含まない。例えば、U6プロモーターを用いる場合、チミンが5個連続すると転写がストップするため、付加ヌクレオチド残基は、通常、5個以上連続するウラシルの配列を含まない。
(a2)のガイドRNAは、標的配列に対して1塩基又は複数塩基のミスマッチを有するスペーサー配列を含むガイドRNAである。当該ガイドRNAを用いてゲノム編集を行うことにより、片側アレルのみでゲノム編集される割合が向上し、片側アレルのみがゲノム編集された細胞を製造することができる。
スペーサー配列が標的配列に対して1塩基又は複数塩基のミスマッチを有する位置は、特に限定されない。例えば、スペーサー配列が20塩基である場合、3’末端側から5’末端側に数えて1〜20番目の塩基のいずれにミスマッチがあってもよく、例えば1〜17番目の塩基にミスマッチを有することができる。スペーサー配列が前記範囲に1塩基ミスマッチを有することにより、片側アレルのみでゲノム編集される割合をより高めることができる。一例として、3’末端側から5’末端側に数えて2〜6番目、8〜9播目、及び15〜17番目からなる群より選択される1塩基又は複数塩基にミスマッチを有することができる。
本実施形態の製造方法に用いるガイドRNAは、上記(a1)及び(a2)のガイドRNAの特徴を併せ持つものであってもよい。すなわち、ガイドRNAは、スペーサー配列の5’末端に1個以上のヌクレオチド残基が付加され、且つ前記スペーサー配列が、標的配列に対して1塩基又は複数塩基のミスマッチを有するスペーサー配列である、ガイドRNAであってもよい。
上記(a1)及び(a2)の特徴を併せ持つことにより、片側アレルのみでゲノム編集される割合を向上させることができる。付加ヌクレオチド残基の数及び種類は、上記「≪(a1)のガイドRNA≫」で挙げたものと同様である。また、ミスマッチ塩基の位置及び種類は、上記≪(a2)のガイドRNA≫」で挙げたものと同様である。
本実施形態の製造方法では、上記(a1)、(a2)又は(a12)のガイドRNAに代えて、上記(a1)、(a2)又は(a12)のガイドRNAの発現ベクターを用いてもよい。好ましい態様において、本実施形態の製造方法は、上記(a1)、(a2)又は(a12)のガイドRNAの発現ベクターを用いる。
III系プロモーターが好ましい。pol III系プロモーターとしては、特に制限されないが、例えばマウス及びヒトのU6−snRNAプロモーター、ヒトH1−RNase P RNAプロモーター、ヒトバリン−tRNAプロモーター等が挙げられる。U6プロモーターを用いる場合、転写開始のためにガイドRNAの5’末端が「G」であることが好ましい。そのため、ガイドRNAが上記(a1)又は(a12)のガイドRNAである場合、スペーサー配列の5’末端に付加した5〜50個のヌクレオチド残基の5’末端にさらに「G」を付加することが好ましい。また、ガイドRNAが上記(a2)のガイドRNAである場合、5’末端が「G」であるスペーサー配列を選択するか、スペーサー配列の5’末端に「G」を付加することが好ましい。
発現ベクターとしては、例えば、プラスミドベクター、及びウイルスベクター等が挙げられる。
≪Casタンパク質≫
Casタンパク質は、CRISPR/Casシステムにおいて用いられるものであれば、特に限定されない。例えば、ガイドRNAと複合体を形成し、ガイドRNAにより標的領域に誘導されて、標的領域のDNAを2本鎖切断できるものを各種使用することができる。
本実施形態の製造方法において、Casタンパク質は、Cas9タンパク質が好ましく、S.pyogenesのCas9タンパク質がより好ましい。
(b1)野生型Casタンパク質のアミノ酸配列と、例えば85%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、さらに好ましくは98%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つCasタンパク質活性を有するタンパク質。
(b2)野生型Casタンパク質のアミノ酸配列に対して1個若しくは複数個(例えば2〜100個、好ましくは2〜50個、より好ましくは2〜20個、さらに好ましくは2〜10個、よりさらに好ましくは2〜5個、特に好ましくは2個)のアミノ酸が置換、欠失、付加、又は挿入されたアミノ酸配列からなり、且つCasタンパク質活性を有するタンパク質。
本実施形態の製造方法では、上記Casタンパク質に代えて、Casタンパク質の発現ベクターを用いてもよい。好ましい態様において、本実施形態の製造方法は、Casタンパク質の発現ベクターを用いる。
発現ベクターとしては、例えば、プラスミドベクター、及びウイルスベクター等が挙げられる。これらのベクターとしては、上記と同様のものが例示される。
中でも、発現ベクターとしては、プラスミドベクターが好ましい。
Database」(www.kazusa.or.jp/codon/)において容易に入手可能であり、これらの表を用いて、コドンを最適化することができる。特定の動物種における発現のために特定の配列をコドン最適化するためのコンピューターアルゴリズムについても、例えば、Gene Forge(Aptagen社;Jacobus、PA)等において入手可能である。
本実施形態の製造方法では、(A)上記(a1)、(a2)若しくは(a12)のガイドRNA又はその発現ベクター、及び(B)Casタンパク質又はその発現ベクターを、細胞に導入する工程を含む。
細胞の種類は、特に限定されず、例えば、各種組織由来又は各種性質の細胞、例えば血液細胞、造血幹細胞・前駆細胞、配偶子(精子、卵子)、受精卵、線維芽細胞、上皮細胞、血管内皮細胞、神経細胞、肝細胞、ケラチン生成細胞、筋細胞、表皮細胞、内分泌細胞、組織幹細胞、iPS細胞、ES細胞、がん細胞等が挙げられる。また、鎌形赤血球症、ハンチントン舞踏病、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、進行性骨化性線維異形成症(FOP)等の各種遺伝性疾患を有する細胞等が挙げられる。
発現ベクターの細胞への導入方法としては、例えば、リポフェクション法、マイクロインジェクション法、DEAEデキストラン法、遺伝子銃法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法などが挙げられる。発現ベクターがウイルスベクターである場合には、ウイルスベクターを細胞に感染させる方法としては、例えば、ポリブレン法が挙げられる。
本実施形態の製造方法は、上記導入工程に加えて、任意の工程を含んでいてもよい。任意の工程としては、例えば、(C)ドナーベクターを細胞に導入する工程が挙げられる。
ドナーベクターは、ホモロジーアームとして標的領域に隣接する塩基配列を含む。ドナーベクターは、5’アームと3’アームとの間に所望の塩基配列(以下、「ノックイン配列」という場合がある)を含むことができる。ノックイン配列は、特に限定されず、任意の配列とすることができる。ノックイン配列は、例えば、遺伝子ノックアウト用の配列であってもよく、塩基置換用の配列であってもよく、任意の遺伝子配列であってもよい。ノックイン配列が、任意の遺伝子配列である場合、セーフ・ハーバー領域内に標的配列を設定することが好ましい。
任意の工程は、上記(A)及び(B)、並びに必要に応じて上記(C)を細胞に導入後、細胞を培養する工程であってもよい。細胞の培養は、細胞の種類に応じて、適切な培養条件下で行えばよい。上記(A)、(B)及び/又は(C)が、薬剤耐性マーカーを含むベクターである場合には、培養は、当該薬剤の存在下で行ってもよい。当該薬剤の存在下で培養を行うことにより、ゲノム編集された細胞を効率よく選択することができる。また、細胞培養液の希釈又はプレーティング等により、細胞のクローン化を行ってもよい。
任意の工程は、前記(A)及び(B)、並びに必要に応じて上記(C)を細胞に導入後、ゲノム編集パターンを解析する工程であってもよい。
ゲノム編集パターンの解析方法は特に限定されないが、上記導入工程後、例えば、適宜、培養工程を行った後、細胞培養液のプレーティングを行い、生じたコロニーからDNAを抽出して標的領域の配列解析を行う方法等が挙げられる。
両アレルの標的領域の配列解析を行うことにより、当該細胞が、片側アレルのみがゲノム編集された細胞であるか否かを確認することができる。
1実施形態において、本発明は、スペーサー配列の5’末端に1個以上のヌクレオチド残基が付加されたガイドRNAを提供する。
本実施形態のガイドRNAは、上記[片側アレルのみがゲノム編集された細胞の製造方法]<(A)ガイドRNA>の項で説明した(a1)のガイドRNAと同様である。
本実施形態のガイドRNAは、そのスペーサー配列が、標的配列に対して1塩基又は複数塩基のミスマッチを有する配列であることが好ましい。すなわち、上記(a12)のガイドRNAであることが好ましい。
本実施形態の発現ベクターは、上記[片側アレルのみがゲノム編集された細胞の製造方法]<(A)ガイドRNA>の項で説明した(a1)又は(a12)のガイドRNAの発現ベクターと同様である。
本実施形態の発現ベクターは、さらに、Casタンパク質コード配列(好ましくは、Cas9タンパク質コード配列)を発現可能な状態で含んでいてもよい。
(a1)及び(a2)のガイドRNAは、上記[片側アレルのみがゲノム編集された細胞の製造方法]<(A)ガイドRNA>の項で説明した(a1)及び(a2)のガイドRNAと同様である。ガイドRNAは、上記(a12)のガイドRNAであってもよい。
(a3)の発現ベクターは、上記[片側アレルのみがゲノム編集された細胞の製造方法]<(A)ガイドRNA>の項で説明した(a3)のガイドRNAの発現ベクターと同様である。
(B)のCasタンパク質及びその発現ベクターは、上記[片側アレルのみがゲノム編集された細胞の製造方法]<(B)Casタンパク質>の項で説明したものと同様である。
(A)及び(B)が発現ベクターである場合、ガイドRNAコード配列及びCasタンパク質コード配列は、同一の発現ベクターに、それぞれ発現可能な状態で含まれていてもよい。
本実施形態のキットは、前記(A)及び(B)に加えて、他の構成を備えていてもよい。他の構成は、特に制限されず、例えば、片側アレルのみがゲノム編集された細胞を作製するための説明書や、発現ベクターを細胞に導入するために用いる試薬等が挙げられる。
1実施形態において、本発明は、(i)ガイドRNA若しくはその発現ベクター、及びCasタンパク質若しくはその発現ベクターを細胞に導入してゲノム編集を行う工程、(ii)前記ゲノム編集を行った細胞からDNAを抽出する工程、(iii)前記DNAから標的領域を含むDNA断片を増幅する工程、(iv)前記増幅したDNA断片の配列解析を行い、前記標的領域へのindel誘導率(P)を求める工程、及び(v)下記式(m)若しくは(m1)及び(b)若しくは(b1)により、片側アレルのみへのindel誘導率(mono)及び両側アレルへのindel誘導率(bi)を求める工程、を含む、ゲノム編集パターンの予測方法を提供する。
mono=2×P×(1−P) ・・・(m)
bi=P2 ・・・(b)
mono=−1.303P2+1.2761P+0.0274 ・・・(m1)
bi=0.6515P2+0.3619P−0.0137 ・・・(b1)
工程(i)は、ガイドRNA若しくはその発現ベクター、及びCasタンパク質若しくはその発現ベクターを細胞に導入してゲノム編集を行う工程である。
ガイドRNAの発現ベクターは、上記[片側アレルのみがゲノム編集された細胞の製造方法]<(A)ガイドRNA>の項で説明した発現ベクターと同様に作製することができる。
Casタンパク質の発現ベクターは、上記[片側アレルのみがゲノム編集された細胞の製造方法]<(B)Casタンパク質>の項で説明した発現ベクターと同様に作製することができる。
細胞への導入後は、適宜、培養を行ってもよい。ガイドRNA及びCasタンパク質の発現ベクターを細胞に導入し、当該発現ベクターが薬剤耐性マーカーを有する場合には、当該薬剤の存在下で細胞を培養することにより、発現ベクターが導入された細胞を選択してもよい。
工程(ii)は、工程(i)でゲノム編集を行った細胞からDNAを抽出する工程である。
工程(iii)は、工程(ii)で抽出したDNAから標的領域を含むDNA断片を増幅する工程である。
増幅DNA断片の長さは、標的領域を含む限り、特に限定されないが、例えば、20〜1000bp程度、通常350〜750bp程度とすることができる。
工程(iv)は、工程(iii)で増幅したDNA断片の配列解析を行い、標的領域へのindel誘導率(P)を求める工程である。
工程(v)は、下記式(m)及び(b)により、片側アレルのみへのindel誘導率(mono)及び両側アレルへのindel誘導率(bi)を求める工程である。
mono=2×P×(1−P) ・・・(m)
bi=P2 ・・・(b)
mono=−1.303P2+1.2761P+0.0274 ・・・(m1)
bi=0.6515P2+0.3619P−0.0137 ・・・(b1)
1実施形態において、本発明は、一方のアレルに、局在化タンパク質コード配列と、切断部位コード配列と、第1の蛍光タンパク質コード配列と、がこの順にインフレームで連結されたキメラ遺伝子を含み、他方のアレルに、前記局在化タンパク質コード配列と、前記切断部位コード配列と、第2の蛍光タンパク質コード配列と、がこの順にインフレームで連結されたキメラ遺伝子を含む、細胞を提供する。なお、本明細書において、「第1の」および「第2の」という用語は便宜的な記載である。
局在化タンパク質は、ゲノム編集の対象となる細胞に応じて、適宜選択することができる。局在化タンパク質は、細胞内で局在するタンパク質であれば、天然のタンパク質であってもよく、人工タンパク質(例えば、天然局在化タンパク質の変異型タンパク質や切断型タンパク質、局在化シグナルを含むペプチドなど)であってもよい。局在化タンパク質が天然タンパク質である場合、前記天然タンパク質は、対象細胞の内因性タンパク質であってもよく、外因性タンパク質(他の生物由来の局在化タンパク質)であってもよい。局在化タンパク質は、対象細胞の内因性タンパク質であって、常に発現しているタンパク質であることが好ましい。局在化タンパク質は、核局在化タンパク質であってもよく、細胞膜局在化タンパク質であってもよい。
切断部位は、特に限定されないが、例えば、自己切断部位又はエンドペプチダーゼ切断部位が挙げられ、具体例としては、2Aペプチドコード配列が例示される。
2Aペプチドは、特に限定されず、公知の2Aペプチド又は2A様ペプチドを用いることができる。例えば、P2Aペプチド、F2Aペプチド、E2Aペプチド、及びT2Aペプチドからなる群より選択される2Aペプチドを用いることができる。
切断部位が、リボソームスキップのような自己切断配列又はペプチダーゼ認識配列のようなアミノ酸配列をコードする場合、サイレント変異を含んでいてもよい。例えば、2Aペプチドコード配列は、2Aペプチドをコードする塩基配列を有する限り特に限定されず、サイレント変異を含んでいてもよい。また、2Aペプチドコード配列は、対象細胞に応じて、コドン最適化されたものであってもよい。2Aペプチドコード配列の具体例として、P2Aペプチドコード配列、及び前記P2Aペプチドコード配列にサイレント変異を含むコード配列(aP2A)を、それぞれ配列番号14及び配列番号15に示す。
第1の蛍光タンパク質は、特に限定されず、公知の蛍光タンパク質を用いることができる。蛍光タンパク質としては、例えば、Sirius、BFP、EBFP、ECFP、mTurquoise、TagCFP、AmCyan、mTFP1、MidoriishiCyan、CFP、TurboGFP、AcGFP、TagGFP、Azami−Green、ZsGreen、EmGFP、GFP、EGFP、GFP2、HyPer、TagYFP、EYFP、Venus、YFP、PhiYFP、PhiYFP−m、TurboYFP、ZsYellow、mBanana、KusabiraOrange、mOrange、TurboRFP、tdTomato、DsRed、DsRed−Express、DsRed2、TagRFP、DsRed−Monomer、AsRed、AsRed2、mStrawberry、TurboFP602、RFP、ERFP、mRFP1、JRed、KillerRed、mCherry、HcRed、KeimaRed、TurboFP650、mRasberry、mPlum、PS−CFP、Dendra2、Kaede、EosFP、KikumeGR等が挙げられるが、これらに限定されない。
第2の蛍光タンパク質は、第1の蛍光タンパク質とは異なる蛍光タンパク質である。第2の蛍光タンパク質は、第1の蛍光タンパク質と異なるものである限り、特に限定されず、公知の蛍光タンパク質を用いることができる。蛍光タンパク質としては、上記第1の蛍光タンパク質で例示したものと同様のものが挙げられる。第2の蛍光タンパク質は、第1の蛍光タンパク質と蛍光波長が異なるものが好ましい。
本実施形態の細胞は、一方のアレル(以下、「第1アレル」という場合がある)に、局在化タンパク質コード配列と、切断部位(例えば、2Aペプチドコード配列)と、第1の蛍光タンパク質コード配列と、がこの順にインフレームで連結されたキメラ遺伝子(以下、「第1のキメラ遺伝子」という場合がある)を含んでいる。他方のアレル(以下、「第2アレル」という場合がある)には、局在化タンパク質コード配列と、切断部位(例えば、2Aペプチドコード配列)と、第2の蛍光タンパク質コード配列と、がこの順にインフレームで連結されたキメラ遺伝子(以下、「第2のキメラ遺伝子」という場合がある)を含んでいる。
第1のキメラ遺伝子及び第2のキメラ遺伝子が有する切断部位(例えば、2Aペプチドコード配列)は、同一のものである。第1のキメラ遺伝子及び第2のキメラ遺伝子が有する局在化タンパク質コード配列は、同一であることが好ましい。
第1のキメラ遺伝子及び第2のキメラ遺伝子は、細胞内において、それぞれ発現可能な状態で、第1アレル及び第2アレル上にそれぞれ存在している。
上記第1のキメラ遺伝子及び第2のキメラ遺伝子を含むAIMS細胞は、ゲノム編集等の技術を用いて作製することができる。以下に、AIMS細胞の作製方法の具体例を記載するが、これに限定されるわけではない。
導入方法は、上記[片側アレルのみがゲノム編集された細胞の製造方法]<導入工程>の項で説明した方法と同様の方法が挙げられる。
細胞への導入後は、適宜、培養を行ってもよい。ガイドRNA及びCasタンパク質の発現ベクターを細胞に導入し、当該発現ベクターが薬剤耐性マーカーを有する場合には、当該薬剤の存在下で細胞を培養することにより、発現ベクターが導入された細胞を選択してもよい。第1及び第2のキメラ遺伝子の各ノックインベクターが薬剤耐性マーカーを有する場合も、当該薬剤の存在下で細胞を培養することにより、ノックインベクターが導入された細胞を選択してもよい。
取得した細胞は、PCR等により、第1アレル及び第2アレルの各目的遺伝子座に、第1のキメラ遺伝子及び第2のキメラ遺伝子がそれぞれ挿入されていることを確認することができる。
一方、切断部位(例えば、2Aペプチドコード配列)を標的としてゲノム編集を行った結果、切断部位(例えば、2Aペプチドコード配列)にフレームシフトindelが生じると、蛍光タンパク質が生成されなくなる。そのため、フレームシフトindelが生じたアレルに導入された蛍光タンパク質の蛍光は消失する(図1A「frame−shift」参照)。
一方、切断部位(例えば2Aペプチド)を標的としてゲノム編集を行った結果、切断部位(例えば、2Aペプチドコード配列)にインフレームindelが生じると、2Aペプチドでの切断が起こらなくなる。そのため、フレームシフトindelが生じたアレルに導入された蛍光タンパク質は、局在化タンパク質と分離されることなく、局在化タンパク質に従って局在化する(図1A「in−frame」参照)。
対象細胞の種類は、特に限定されず、例えば、各種組織由来又は各種性質の細胞、例えば血液細胞、造血幹細胞・前駆細胞、配偶子(精子、卵子)、受精卵、線維芽細胞、上皮細胞、血管内皮細胞、神経細胞、肝細胞、ケラチン生成細胞、筋細胞、表皮細胞、内分泌細胞、組織幹細胞、iPS細胞、ES細胞、がん細胞等が挙げられる。また、鎌形赤血球症、ハンチントン舞踏病、デュシェンヌ型筋ジストロフィー等の各種遺伝性疾患を有する細胞等が挙げられる。
対象細胞は、初代培養細胞であっても、不死化処理が施された株化細胞であってもよい。株化細胞の例としては、ヒト由来のHela細胞、アフリカミドリザル由来のCOS7細胞、マウス由来の3T3細胞、ハムスター由来のCHO細胞、ラット由来のPC12細胞などが挙げられる。
1実施形態において、本発明は、(I)前記実施形態の細胞(AIMS細胞)に、前記切断部位(例えば、2Aペプチドコード配列)を標的とするガイドRNA若しくはその発現ベクター、及びCasタンパク質若しくはその発現ベクターを導入してゲノム編集を行う工程、(II)前記工程(I)の後、前記細胞の蛍光パターンを解析する工程、並びに(III)前記工程(II)で解析した蛍光パターンに基づいて、ゲノム編集パターンを判定する工程を含む、ゲノム編集パターンの解析方法を提供する。
工程(I)は、AIMS細胞に、切断部位(例えば、2Aペプチドコード配列)を標的とするガイドRNA若しくはその発現ベクター、及びCasタンパク質若しくはその発現ベクターを導入してゲノム編集を行う工程である。
ガイドRNA若しくはその発現ベクター、及びCasタンパク質若しくはその発現ベクター導入方法は、上記[片側アレルのみがゲノム編集された細胞の製造方法]<導入工程>の項で説明した方法と同様の方法が挙げられる。ガイドRNA及びCasタンパク質の発現ベクターを用いる場合、それらの発現ベクターは同一の発現ベクターであってもよい。
細胞への導入後は、適宜、培養を行ってもよい。ガイドRNA及びCasタンパク質の発現ベクターを細胞に導入し、当該発現ベクターが薬剤耐性マーカーを有する場合には、当該薬剤の存在下で細胞を培養することにより、発現ベクターが導入された細胞を選択してもよい。また、細胞培養液の希釈又はプレーティング等により、細胞のクローン化を行ってもよい。
工程(II)は、前記工程(I)の後、AIMS細胞の蛍光パターンを解析する工程である。
本工程により検出され得る蛍光パターンを表1に示す。
工程(III)は、前記工程(II)で解析した蛍光パターンに基づいて、ゲノム編集パターンを判定する工程である。
1実施形態において、本発明は、上述した本発明の実施形態により達成される片側アレルのゲノム編集による遺伝性疾患の治療、緩和及び/又は予防を提供する。すなわち、遺伝性疾患の原因とされるホモ接合変異もしくはヘテロ接合変異(複合ヘテロ接合変異(compound heterozygous mutation)を含む)を、上記本発明の実施形態により達成される片側アレルのゲノム編集により修復することで、当該疾患を治療、緩和及び/又は予防しうる。対象が疾患遺伝子と正常遺伝子とをヘテロで有する場合、疾患遺伝子のみを上記本発明の実施形態にかかる片側アレルのみをゲノム編集方法によりゲノム編集することで、遺伝性疾患を治療、緩和及び/又は予防することができる。対象が疾患遺伝子をホモで有する場合、一方のアレルを本発明の実施形態にかかる片側アレルのみをゲノム編集方法によりゲノム編集することでホモ接合型の疾患遺伝子を疾患遺伝子と正常遺伝子とのヘテロ接合型にし、それによって修復アレルから正常タンパク質が発現されることで遺伝性疾患を治療、緩和及び/又は予防することができる。上記本発明の実施形態により達成される片側アレルのゲノム編集は、後述するように、オンターゲットのゲノム編集活性は維持しつつ、オフターゲット効果を抑制し得るため、治療安全性が高い。上記本発明の実施形態にかかる片側アレルのゲノム編集により治療、緩和及び/又は予防されうる遺伝性疾患は、遺伝子変異に起因して生じる疾患であれば特に限定されず、例えば、がん、鎌形赤血球症、ハンチントン舞踏病、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、進行性骨化性線維異形成症(FOP)等が挙げられるが、これらに限定されない。上記実施形態の片側アレルのゲノム編集方法は、ゲノム編集に起因する細胞毒性が抑制されるため、遺伝性疾患の治療を好適に行うことができる。特に、後述の(a1)疾患遺伝子中の標的配列に対するスペーサー配列の5’末端に1個以上のヌクレオチド残基が付加されたガイドRNA、又は前記ガイドRNAの発現ベクターを用いるゲノム編集では、ゲノム編集に起因する細胞毒性を抑制することができる。
(A)(a1)疾患遺伝子中の標的配列に対するスペーサー配列の5’末端に1個以上のヌクレオチド残基が付加されたガイドRNA、(a2)前記標的配列に対して1塩基又は複数塩基のミスマッチを有するスペーサー配列を含むガイドRNA、及び(a3)前記(a1)若しくは前記(a2)のガイドRNAの発現ベクターからなる群より選択される少なくとも1種と、
(B)Casタンパク質及びその発現ベクターからなる群より選択される少なくとも1種と、
を対象に投与する工程を含む、遺伝性疾患の治療、緩和及び/又は予防方法を提供する。
(A)(a1)疾患遺伝子中の標的配列に対するスペーサー配列の5’末端に1個以上のヌクレオチド残基が付加されたガイドRNA、(a2)前記標的配列に対して1塩基又は複数塩基のミスマッチを有するスペーサー配列を含むガイドRNA、及び(a3)前記(a1)若しくは前記(a2)のガイドRNAの発現ベクターからなる群より選択される少なくとも1種、
を含む、遺伝性疾患を治療、緩和及び/又は予防するための医薬組成物を提供する。
(B)Casタンパク質及びその発現ベクターからなる群より選択される少なくとも1種、
を含んでもよい。
あるいは、当該医薬組成物は、
(B)Casタンパク質及びその発現ベクターからなる群より選択される少なくとも1種、
を含む、別の医薬組成物と組み合わせて用いられてもよい。この場合、当該別の医薬組成物は、前記本発明の医薬組成物と同時に投与されてもよく、別個に投与されてもよい。
当該疾患は、ヘテロ接合変異(複合ヘテロ接合変異を含む)に起因する疾患であってもよく、ホモ接合変異に起因する疾患であってもよい。本発明の医薬組成物の投与形態は特に限定されず、経口又は非経口的に投与することができる。非経口投与の形態として、例えば静脈内注射、点滴静注、皮下注射、皮内注射、又は腹腔内注射などが挙げられる。本発明の医薬組成物の投与量は、疾患の程度、対象の年齢、性別、体重、感受性差、投与方法、投与時期、投与間隔、投与期間、製剤の性質、有効成分の種類等によって異なるが、当業者であれば適宜設定することができる。
遺伝性疾患の治療、緩和及び/又は予防における使用のための
(A)(a1)疾患遺伝子中の標的配列に対するスペーサー配列の5’末端に1個以上のヌクレオチド残基が付加されたガイドRNA、(a2)前記標的配列に対して1塩基又は複数塩基のミスマッチを有するスペーサー配列を含むガイドRNA、及び(a3)前記(a1)若しくは前記(a2)のガイドRNAの発現ベクターからなる群より選択される少なくとも1種、及び
(B)Casタンパク質及びその発現ベクターからなる群より選択される少なくとも1種、
を提供する。
当該疾患は、ヘテロ接合変異(複合ヘテロ接合変異を含む)に起因する疾患であってもよく、ホモ接合変異に起因する疾患であってもよい。
遺伝性疾患の治療薬、緩和薬及び/又は予防薬の製造における、
(A)(a1)疾患遺伝子中の標的配列に対するスペーサー配列の5’末端に1個以上のヌクレオチド残基が付加されたガイドRNA、(a2)当該標的配列に対して1塩基又は複数塩基のミスマッチを有するスペーサー配列を含むガイドRNA、及び(a3)前記(a1)若しくは前記(a2)のガイドRNAの発現ベクターからなる群より選択される少なくとも1種、及び
(B)Casタンパク質及びその発現ベクターからなる群より選択される少なくとも1種、
の使用を提供する。
当該疾患は、ヘテロ接合変異(複合ヘテロ接合変異を含む)に起因する疾患であってもよく、ホモ接合変異に起因する疾患であってもよい。
1実施形態において、本発明は、上記本発明の実施形態により達成される片側アレルのゲノム編集により、遺伝性疾患モデル細胞を製造する方法、及び当該方法によって製造されるモデル細胞を提供する。すなわち、遺伝性疾患の原因遺伝子であることが既知である遺伝子又は遺伝性疾患の原因遺伝子である疑いのある遺伝子について、当該遺伝子の正常遺伝子を標的として、上記本発明の実施形態により達成される片側アレルのゲノム編集により、片側アレルにindel又は所望の変異を導入することで、遺伝性疾患モデル細胞を製造することができる。ゲノム編集の対象とする細胞は、正常遺伝子をホモ接合型で有するものであってもよく、正常遺伝子と疾患遺伝子とをヘテロ接合型で有するものであってもよい。本実施形態の遺伝性疾患モデル細胞が有する遺伝性疾患は、遺伝子変異に起因して生じる疾患であれば特に限定されず、例えば、がん、鎌形赤血球症、ハンチントン舞踏病、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、進行性骨化性線維異形成症(FOP)等が挙げられるが、これらに限定されない。
(A)(a1)遺伝性疾患の原因遺伝子又はその疑いのある遺伝子の正常遺伝子中の標的配列に対するスペーサー配列の5’末端に1個以上のヌクレオチド残基が付加されたガイドRNA、(a2)前記標的配列に対して1塩基又は複数塩基のミスマッチを有するスペーサー配列を含むガイドRNA、及び(a3)前記(a1)若しくは前記(a2)のガイドRNAの発現ベクターからなる群より選択される少なくとも1種と、
(B)Casタンパク質及びその発現ベクターからなる群より選択される少なくとも1種と、
をインビトロで細胞に投与(導入)する工程を含む、遺伝性疾患モデル細胞を製造する方法を提供する。
(A)及び(B)が投与される細胞は、初代培養細胞であっても、不死化処理が施された株化細胞であってもよい。株化細胞の例としては、ヒト由来のHela細胞、アフリカミドリザル由来のCOS7細胞、マウス由来の3T3細胞、ハムスター由来のCHO細胞、ラット由来のPC12細胞などが挙げられる。(A)及び(B)が投与される細胞は、多能性幹細胞、複能性幹細胞、単能性幹細胞、ES細胞、又はiPS細胞であってもよい。(A)及び(B)が投与される細胞は、例えば、ヒト、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、イヌ、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、サル、又はニワトリの細胞である。(A)及び(B)は同時に投与してもよく、別個に投与してもよい。(A)及び(B)の細胞への投与方法(導入方法)は、特に限定されず、公知の方法を用いることができる。例えば、上記[片側アレルのみがゲノム編集された細胞の製造方法]<導入工程>の項で説明した方法と同様の方法が挙げられる。
1実施形態において、本発明は、上記本発明の実施形態により達成される片側アレルのゲノム編集により、遺伝性疾患の非ヒトモデル動物を製造する方法、及び当該方法によって製造された非ヒトモデル動物を提供する。すなわち、遺伝性疾患の原因遺伝子であることが既知である遺伝子又は遺伝性疾患の原因遺伝子である疑いのある遺伝子について、当該遺伝子の正常遺伝子を標的として、上記本発明の実施形態により達成される片側アレルのゲノム編集により、片側アレルにindel又は所望の変異を導入することで、遺伝性疾患非ヒトモデル動物を製造することができる。ゲノム編集の対象とする動物は、正常遺伝子をホモ接合型で有するものであってもよく、正常遺伝子と疾患遺伝子とをヘテロ接合型で有するものであってもよい。本実施形態の遺伝性疾患モデル動物が有する遺伝性疾患は、遺伝子変異に起因して生じる疾患であれば特に限定されず、例えば、がん、鎌形赤血球症、ハンチントン舞踏病、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、進行性骨化性線維異形成症(FOP)等が挙げられるが、これらに限定されない。
(A)(a1)遺伝性疾患の原因遺伝子又はその疑いのある遺伝子の正常遺伝子中の標的配列に対するスペーサー配列の5’末端に1個以上のヌクレオチド残基が付加されたガイドRNA、(a2)前記標的配列に対して1塩基又は複数塩基のミスマッチを有するスペーサー配列を含むガイドRNA、及び(a3)前記(a1)若しくは前記(a2)のガイドRNAの発現ベクターからなる群より選択される少なくとも1種と、
(B)Casタンパク質及びその発現ベクターからなる群より選択される少なくとも1種と、
を非ヒト動物に投与する工程を含む、遺伝性疾患の非ヒトモデル動物を製造する方法を提供する。
(A)及び(B)が投与される非ヒト動物としては、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、イヌ、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、サル、ニワトリ等の、当該技術分野において入手可能な任意の実験動物を用いることができる。(A)及び(B)の投与方法は、片側アレルのゲノム編集が起こり得る方法であれば、特に限定されず、経口投与であっても非経口投与であってもよい。非経口投与の形態として、例えば静脈内注射、点滴静注、皮下注射、皮内注射、又は腹腔内注射などが挙げられる。(A)及び(B)は同時に投与してもよく、別個に投与してもよい。(A)及び(B)の投与量は、投与される非ヒト動物の種類、週齢/月齢、性別、体重、感受性差、投与方法、投与時期、投与間隔、投与期間等によって異なるが、当業者であれば適宜設定することができる。
P2A−tdTomatoアレル:P2A−tdTomatoキメラ遺伝子がノックインされたアレル
P2A−Venusアレル:P2A−Venusキメラ遺伝子がノックインされたアレル
P2A−Neoアレル:P2A−Neoキメラ遺伝子がノックインされたアレル
オールインワンCRISPRプラスミド:Cas9、sgRNA、及び選択マーカーを発現するプラスミド
p:RCP:選択マーカーとしてピューロマイシン耐性遺伝子(Puro)を有するオールインワンCRISPRプラスミド
PX459:pSpCas9(BB)−2A−Puro(PX459)V2.0 plasmid(Addgene,plasmid #62988)
P2A_PX459:P2Aペプチドコード配列を標的とするスペーサー配列が、BpiIサイトに挿入されたPX459
aP2A_PX459:aP2A配列を標的とするスペーサー配列が、BpiIサイトに挿入されたPX459
PX459(del_Cas9−T2A−Puro):PX459からCas9−T2A−Puroキメラ遺伝子が除去されたプラスミド
Cdh1−P2A−tdTomato KIベクター:Cdh1遺伝子下流にP2A−tdTomatoキメラ遺伝子をノックインするためのノックインベクター
Cdh1−P2A−Venus KIベクター:Cdh1遺伝子下流にP2A−Venusキメラ遺伝子をノックインするためのノックインベクター
Tbx3−P2A−tdTomato KIベクター:Tbx3遺伝子下流にP2A−tdTomatoキメラ遺伝子をノックインするためのノックインベクター
Tbx3−P2A−Venus KIベクター:Tbx3遺伝子下流にP2A−Venusキメラ遺伝子をノックインするための鋳型プラスミド
Cdh1−aP2A−tdTomato KIベクター:Cdh1遺伝子下流にaP2A−tdTomatoキメラ遺伝子をノックインするためのノックインベクター
Cdh1−aP2A−Venus KIベクター:Cdh1遺伝子下流にaP2A−Venusキメラ遺伝子をノックインするためのノックインベクター
Tbx3−P2A−Neo KIベクター:Tbx3遺伝子下流にP2A−Neoキメラ遺伝子をノックインするためのノックインベクター
Cdh1−P2A−AIMS:両アレルのCdh1遺伝子座に、それぞれCdh1−P2A−tdTomatoキメラ遺伝子及びCdh1−P2A−Venusキメラ遺伝子を有するAIMS細胞
Tbx3−P2A−AIMS:両アレルのTbx3遺伝子座に、それぞれTbx3−P2A−tdTomatoキメラ遺伝子及びTbx3−P2A−Venusキメラ遺伝子を有するAIMS細胞
Cdh1−aP2A−AIMS:両アレルのCdh1遺伝子座に、それぞれCdh1−aP2A−tdTomatoキメラ遺伝子及びCdh1−aP2A−Venusキメラ遺伝子を有するAIMS細胞
P2A(ミスマッチ):P2Aペプチドコード配列内の標的配列に対して1塩基ミスマッチを有するスペーサー配列
aP2A(ミスマッチ):aP2A配列内の標的配列に対して1塩基ミスマッチを有するスペーサー配列
P2A(nX):5’末端にn個のヌクレオチド残基Xが付加された、P2Aペプチドコード配列を標的とするスペーサー配列
aP2A(nX):5’末端にn個のヌクレオチド残基Xが付加された、aP2A配列を標的とするスペーサー配列
P2A(5’付加):5’末端に任意数のヌクレオチド残基が付加された、P2Aペプチドコード配列を標的とするスペーサー配列
aP2A(5’付加):5’末端に任意数のヌクレオチド残基が付加された、aP2A配列を標的とするスペーサー配列
P2A(ミスマッチ_nX):P2Aペプチドコード配列内の標的配列に対して1塩基ミスマッチを有し、且つ5’末端にn個のヌクレオチド残基Xが付加されたスペーサー配列。
マウスES細胞を、DMEM(ダルベッコ改変イーグル培地;Nacalai Tesque)で培養した。培養に用いたDMEMは、2mMのGlutamax(Nacalai Tesque)、1×非必須アミノ酸(NEAA)(Nacalai Tesque)、1mMのピルビン酸ナトリウム、100U/mLのペニシリン、100μg/mLのストレプトマイシン(P/S)(Nacalai Tesque)、0.1mMの2−メルカプトエタノール(Sigma)、及び15%のウシ胎仔血清(FBS)(GIBCO)を含み、さらに、1μMもしくは0.2μMのPD0325901(Sigma)、3μMのCHIR99021(Cayman)及び1,000U/mLの組換えマウスLIF(Millipore)を添加したものである。細胞は、フィーダーフリー条件下、37℃、5%CO2で維持した。細胞を継代した際に、Y−27632(10μM、Sigma)を添加した。
(AIMSの概要)
図1は、本実施例で構築したAIMSの概要を説明する図である。図1Aは、本実施例で作製したAIMS細胞が有する遺伝子構成を説明する図であり、図1BはAIMSによるindelの評価方法を説明する図である。
以上のように、AIMS細胞を用いることにより、両側アレルindel導入率、及び片側アレルindel導入率をそれぞれ評価することができる。
P2A−Venusキメラ遺伝子を含むプラスミド、又はP2A−tdTomatoキメラ遺伝子を含むプラスミドに、Cdh1の5’アーム及び3’アームをライゲーションし、Cdh1−P2A−tdTomato KIベクター及びCdh1−P2A−tdTomato KIベクターを作製した。E−カドヘリン(Cdh1)及び蛍光タンパク質(tdTomato又はVenus)をそれぞれ独立に産生するように、Cdh1コード配列末端がインフレームでP2Aコード配列に連結するように、Cdh1の5’アームを設計した。
Cdh1の5’アーム及び3’アームに代えて、Tbx3の5’アーム及び3’アームを用いたこと以外は、上記と同様の方法で、Tbx3−P2A−tdTomato KIベクター及びTbx3−P2A−tdTomato KIベクターを作製した。
P2A配列に代えて、aP2A配列を用いたことを以外は、上記と同様の方法で、Cdh1−aP2A−tdTomato KIベクター及びCdh1−aP2A−tdTomato KIベクターを作製した。
PX459のBpiIサイトに、Tbx中の標的配列(3’−CCAGTTTGGTCAAATCTGCCAGT−5’(配列番号94))を標的とするスペーサー配列のコード配列を含むsgRNA用アダプターリンカー(配列番号63,64)をライゲーションし、AIMS細胞作製用のオールインワンCRISPRプラスミドを作製した。同様に、PX459のBpiIサイトに、をCdh中の配列を標的とするスペーサー配列のコード配列を含むsgRNA用アダプターリンカー(配列番号65,66)をライゲーションし、AIMS細胞作製用のオールインワンCRISPRプラスミドを作製した。ストップコドンの下流を標的とするsgRNAは、CRISPR DESIGN(crispr.mit.edu/)を用いて設計した。
Lipofectamine(登録商標) 3000(ThermoFisher SCIENTIFIC)を用いて、上記で作製したオールインワンCRISPRプラスミド、Cdh1−P2A−tdTomato KIベクター及びCdh1−P2A−Venus KIベクターを、マウスES細胞に同時導入した。ゼラチンコートした24ウェルプレートに分注した500μLの2iL+Y培地に、トリプシン(Nacalai Tesque)で分離したES細胞を播種した。Lipofectamine 3000の標準プロトコールに従い、核酸−リポフェクタミン3000複合体を調製した。1μLのLipofectamine 3000を25μLのOpti−MEM培地(ThermoFisher SCIENTIFIC)に添加した。また、250ngの前記3種のプラスミド及び1μLのP3000試薬を別の25μLのOpti−MEM培地に添加して混合した。これらの混合液を一緒にして混合し、室温で5分間インキュベートした。その後、ES細胞を播種した24ウェルプレートに添加した。細胞が自然にプレートの底に沈降した後、プレートを600g、37℃で1時間遠心分離し、次いで、一晩、インキュベートした。1〜2日間のトランスフェクションの後、細胞をピューロマイシン(12μg/mL)で24〜48時間処理した。ピューロマイシン処理で選択されたピューロマイシン耐性細胞を、ピューロマイシン非存在下で数日間培養し、二色陽性(dual color−positive)のコロニーを採取した。採取したコロニーの遺伝子型をPCRで確認した。両アレルにおいて、それぞれ、Cdh1−P2A−tdTomatキメラ遺伝子及びCdh1−P2A−Venusキメラ遺伝子の導入が確認された細胞を、Cdh1−P2A−AIMSとして用いた。
AIMS細胞を用いたindelパターンの解析は、以下のように行った。
P2Aペプチドコード配列内又はaP2A配列内に標的配列を設定し、sgRNAを設計した。当該sgRNAのスペーサー配列のコード配列を、PX459のBpiIサイトにライゲーションし、p:RCPを作製した。実施例で用いたp:RCPの構造を図2Aに示す。
1回のトランスフェクションで、30〜170個のクローンのindelパターン解析を行った。1種類のsgRNAについて、トランスフェクション及びその後のindelパターン解析を最低3回行った。
sgRNAのスペーサー配列に、標的配列に対する1塩基ミスマッチを導入することにより、両側アレルindel及び片側アレルindelの導入率が変化するかを調べた。
P2Aの標的配列(TAACTTCAGCCTGCTGAAGC:配列番号95)のいずれか1個の塩基を、異なる塩基に置換した1塩基ミスマッチスペーサー配列をそれぞれ設計した(図3A参照)。PAMに隣接する塩基(1位)に1塩基ミスマッチを有するスペーサー配列のコード配列に、PX459のBpiIサイトにライゲーションするためのアダプター配列を付加して、1塩基ミスマッチsgRNA用アダプターリンカーを作製した(配列番号69,70)。同様のアダプター配列を付加して、ミスマッチ塩基の位置が2〜20位(PAMに隣接する塩基を1位とし、3’→5’に向かって2位→20位とする)である1塩基ミスマッチsgRNA用アダプターリンカーをそれぞれ作製した。
P2A標的配列にミスマッチを有さないsgRNA用アダプターリンカーの配列を配列番号67,68に示す。
同様に、aP2Aの標的配列(TAGTCTACTAAAACAAGCCG:配列番号96)のいずれか1個を、異なる塩基に置換した1塩基ミスマッチスペーサー配列をそれぞれ設計し、当該スペーサー配列のコード配列にアダプター配列を付加して、1塩基ミスマッチsgRNA用アダプターリンカーをそれぞれ作製した。aP2Aの標的配列に対して、PAMに隣接する塩基(1位)に1塩基ミスマッチを有する、1塩基ミスマッチsgRNA用アダプターリンカーの配列を配列番号73,74に示す。他の1塩基ミスマッチsgRNA用アダプターリンカーも、ミスマッチの位置が異なる以外は同様である。aP2A標的配列にミスマッチを有さないsgRNA用アダプターリンカーの配列を配列番号71,72に示す。
これらの1塩基ミスマッチsgRNA用アダプターリンカーを、PX459プラスミドのBpiIサイトにそれぞれ挿入し、各P2A(ミスマッチ)_PX459を作製した。
これらの各P2A(ミスマッチ)_PX459を、AIMS細胞にそれぞれ導入して、indelの評価を行った。
図3Bのグラフの横軸はP2A標的配列を示し、その下にP2A(ミスマッチ)における置換後の塩基を示した。グラフの上部に、置換した塩基のPAMからの距離(PAMに隣接する塩基を1としたときの各塩基の位置)を示した。「P」は、P2A_PX459(ミスマッチなし)を用いた場合であり、「N」はPX459(スペーサー配列なし)を用いた場合である。
図3Bに示すように、P2A_PX459を用いた場合には、ほぼ100%両側アレルindelが導入された。一方、P2A(ミスマッチ)_PX459を用いた場合には、片側アレルindelの導入率が高くなった。また、ミスマッチを導入する位置により、indelの導入傾向に差が見られた。
図3Cに示すように、ミスマッチを導入する位置及びミスマッチ塩基の種類により、indel導入率、両側アレルindel導入率、及び片側アレルindel導入率に差が見られた。
図3Dに示すように、完全一致sgRNAを用いた場合には、ほぼ100%両側アレルindelが導入された。一方、aP2A(ミスマッチ)_PX459を用いた場合には、片側アレルindelの導入率が高くなった。また、ミスマッチを導入する位置により、indelの導入傾向に差が見られた。図3Bとは、indelの導入傾向に差が見られた。
(P2A(5’付加)_PX459によるindel導入)
sgRNAのスペーサー配列の5’末端に、ヌクレオチド残基を付加することにより、両側アレルindel及び片側アレルindelの導入率が変化するかを調べた。
P2A標的配列の5’側に、0〜40個のシトシンを付加したスペーサー配列をそれぞれ設計した(図4A参照)。これらのスペーサー配列のコード配列に、PX459のBpiIサイトにライゲーションするためのアダプター配列を付加して、5’C付加sgRNA用アダプターリンカーをそれぞれ作製した。
同様に、P2Aの標的配列の5’側に、15個のグアニン、アデニン、又はウラシルを付加したスペーサー配列をそれぞれ設計し、当該スペーサー配列のコード配列にアダプター配列を付加して、P2A(15G)、P2A(15A)、P2A(15U)sgRNA用アダプターリンカーをそれぞれ作製した。これらのsgRNA用アダプターリンカーを、PX459プラスミドのBpiIサイトにそれぞれ挿入し、P2A(5’付加)_PX459をそれぞれ作製した。
上記プラスミドの作製に用いたsgRNA用アダプターリンカーの一例として、スペーサー配列の5’末端に15Gを付加するsgRNA用アダプターリンカーの配列を配列番号75,76に示す。他のsgRNA用アダプターリンカーも、スペーサー配列の5’末端に付加されるヌクレオチド残基の数及び種類が異なる以外は、全て同様の配列を有する。なお、aP2Aを標的とするスペーサー配列の5’末端に5Cを付加するsRNA用アダプターリンカーの配列を配列番号81,82に示す。
上記で作製したP2A(5’付加)_PX459を、AIMS細胞にそれぞれ導入し、indelの評価を行った。
図4Bのグラフの横軸には、標的配列の5’末端に付加したヌクレオチド残基を示した。図4Bに示すように、P2A_PX459(0C)を用いた場合には、ほぼ100%両側アレルindelが導入された。一方、付加したシトシンの個数が多くなるに従い、indel導入率は減少した。また、付加したシトシンの個数が多くなるに従い、片側アレルindelの導入率が高くなった。ただし、シトシン付加数が25個以上では、indel導入傾向に差が見られなくなった。
標的配列の5’側にヌクレオチド残基を付加することによりindel導入率が低下するのは、付加ヌクレオチド残基によりsgRNAの転写が抑制されることに起因する可能性がある。そこで、トランスフェクションに用いるsgRNA発現プラスミドの使用量が、indel導入率に及ぼす影響を評価した。
AIMS用マウスES細胞としてTbx3−P2A−AIMSを用い、P2A_PX459をトランスフェクションした。トランスフェクションに用いたP2A_PX459の使用量は、2.5ng、25ng、250ng、又は2500ngとした。
上記の試験では、sgRNA、Cas9、及びピューロマイシン耐性遺伝子の全てを発現するp:RCPを用いたため、トランスフェクション後に得られたピューロマイシン耐性細胞では、ほぼ100%両側アレルindelが導入されていた可能性がある。そこで、PX459をKpnI及びNotIで切断した後、切断末端をT4ポリメラーゼで平滑化し、ライゲーションすることにより、PX459(del_Cas9−T2A−Puro)を作製した。PX459(del_Cas9−T2A−Puro)のBpiIサイトに、aP2Aを標的とするスペーサー配列のコード配列を挿入し、aP2A_PX459(del_Cas9−T2A−Puro)を作製した。aP2A_PX459(del_Cas9−T2A−Puro)の量(0〜250ng)を変化させて、一定量(250ng)のPX459(スペーサー配列なし)とともに、AIMS細胞にコトランスフェクションした。AIMS細胞にはCdh1−aP2A−AIMSを用いた。
PX459のBpiIサイトに、下記のアダプターリンカー配列をそれぞれ挿入し、10C(8A)リンカーPX459及び25C(23A)リンカーPX459をそれぞれ作製した。これらのプラスミドのBPiIサイトに、所望のスペーサー配列のコード配列を挿入することにより、5’側に10C及び23Cが付加されたsgRNAをそれぞれ発現させることができる。ただし、これらのプラスミドでは、BPiIサイトへのライゲーション用のオーバーハング配列CACCを導入するために、10Cの8番目及び25Cの23番目のCがそれぞれAに置換されている。
10C(8A)アダプターリンカー:
(F)5’−CACCGCCCCCCCACCGGGTCTTCGAGAAGACCT−3’(配列番号59)
(R)5’−AAACAGGTCTTCTCGAAGACCCGGTGGGGGGGC−3’(配列番号60)
25C(23A)アダプターリンカー:
(F)5’−CACCGCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCACCGGGTCTTCGAGAAGACCT−3’(配列番号61)
(R)5’−AAACAGGTCTTCTCGAAGACCCGGTGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGC−3’(配列番号62)
図4Bにおける結果と同様に、ヌクレオチド付加を行わない場合(0C)には、ほぼ100%両側アレルindelが導入された。一方、Rosa26及びアルブミン遺伝子(Alb)のいずれにおいても、付加したシトシンの個数が多くなるに従い、indel導入率は減少した。また、シトシン付加により、片側アレルindelの導入率が高くなった。
これらの結果から、内在性遺伝子を標的とした場合も、標的配列の5’末端にヌクレオチド残基を付加することにより、片側アレルindelの導入率が上昇することが確認された。
(評価方法の概要)
次に、AIMS細胞を用いて、indelを含まない相同組換えの導入率を評価した。
図5Aは、本試験で用いた方法の概略を説明する図である。本試験では、P2Aコード配列内の配列を標的とするp:RCPと、Tbx3−P2A−Neo KIベクターとを、Tbx3−P2A−AIMSにコトランスフェクションする。両プラスミドが導入されたTbx3−P2A−AIMSでは、まず、オールインワンCRISPRプラスミドからP2Aを標的とするsgRNA及びCas9が発現し、これらによりP2Aコード配列が切断される。次いで、Tbx3−P2A−Neo KIベクターとの相同組換えにより、Tbx3遺伝子下流にP2A−Neoキメラ遺伝子がノックインされる(図5A左図参照)。コトランスフェクション後、ピューロマイシン存在下で培養し、次いでジェネティシン存在下で培養することにより、ゲノム編集によりP2A−Neoキメラ遺伝子がノックインされた細胞を選択することができる。
このようにして、ノックインされていない方のアレルにindelを含むか否かを評価することができる。両アレルに同時にノックインされることは非常に稀であるため、tdTomatoおよびVenusの両方の蛍光が消失したものは全て、一方のアレルにP2A−Neoキメラ遺伝子がノックインされ、他方のアレルにフレームシフトindelが生じたものとみなした。
Rosa26 mT/mG plasmid (Addgene,plasmid#17787)をテンプレートとして、PCRにより、P2A−Neoキメラ遺伝子を増幅した。PCRに用いたプライマーの配列を配列番号30,32に示す。前記P2A−Neoキメラ遺伝子を、Tbx3−P2A−tdTomato KIベクターのP2A−tdTomatoキメラ遺伝子と置換して、Tbx3−P2A−Neo KIベクターを作製した。
試験対象のスペーサー配列のコード配列を含むp:RCPと、Tbx3−P2A−Neo KIベクターとを、Tbx3−P2A−AIMSに、コトランスフェクションし、ピューロマイシン処理を行った。コトランスフェクション及びピューロマイシン処理の条件は、実施例2の「(AIMS細胞を用いたindelパターン解析)」で記載した方法と同様である。
コトランスフェクションから3日後に、ピューロマイシンを除去し、ジェネティシン(400μg/mL,GIBCO)を含む培地を添加して、ジェネティシンン耐性細胞を選択した。得られたジェネティシン耐性細胞をクローン化し、9クローンのジェノタイピングを行った。その結果、9クローン全てにおいて、P2A−Neoキメラ遺伝子のノックインが確認された。この結果から、ジェネティシン耐性クローンの多くが、P2A−Neoキメラ遺伝子のノックインクローンであることが確認された。また、9クローン全てにおいてTomatoの蛍光が観察されたため、P2A−Venusアレルへの片側ノックインであると判定された。
実施例3と同様に、P2Aの標的配列(配列番号95)のいずれか1個を、異なる塩基に置換した1塩基ミスマッチスペーサー配列をそれぞれ設計し、当該スペーサー配列のコード配列にアダプター配列を付加して1塩基ミスマッチsgRNA用アダプターリンカーを作製した。これらの1塩基ミスマッチsgRNA用アダプターリンカーを、PX459プラスミドのBpiIサイトにそれぞれ挿入し、各P2A(ミスマッチ)_PX459を作製した。これらの各P2A(ミスマッチ)_PX459を、コトランスフェクション用のp:RCPとして用いた。
図5Bに示すように、P2A_PX459を用いた場合には、ほぼ100%indelを伴う相同組換えであった。一方、P2A(ミスマッチ)_PX459を用いた場合には、indelを伴わない相同組換えの割合が増加した。また、ミスマッチの位置により、indelを伴わない相同組換えの割合に差が見られた。
以上の結果から、ミスマッチ法は、indelを伴わない相同組換えの誘導方法として有効であることが確認された。
P2A標的配列(配列番号95)の5’側に、10個又は20個のシトシンを付加したスペーサー配列をそれぞれ設計し、これらのスペーサー配列のコード配列にアダプター配列を付加して、5’C付加sgRNA用アダプターリンカーをそれぞれ作製した。これらのsgRNA用アダプターリンカーを、PX459プラスミドのBpiIサイトにそれぞれ挿入し、P2A(5’付加)_PX459をそれぞれ作製した。これらの各P2A(5’付加)_PX459を、コトランスフェクション用のp:RCPとして用いた。
図5Cに示すように、P2A_PX459を用いた場合には、ほぼ100%indelを伴う相同組換えであった。一方、P2A(5’)_PX459を用いた場合には、indelを伴わない相同組換えの割合が増加した。また、付加したシトシンの個数の増加に伴い、indelを伴わない相同組換えの割合が増加した。
以上の結果から、5’ヌクレオチド付加法は、indelを伴わない相同組換えの誘導方法として有効であることが確認された。
実施例3で評価したミスマッチ法と、実施例4で評価した5’ヌクレオチド付加法とを組み合わせることにより、片側アレルindelの導入率が増加するかを試験した。AIMS細胞として、Tbx3−P2A−AIMSを用いた。
実施例3の図3Bと同様に、P2A_PX459を用いた場合には、ほぼ100%両側アレルindelが導入された。一方、P2A(ミスマッチ)_PX459を用いた場合には、片側アレルindelの導入率が高くなった。
図6Bでは、図6Aの結果と比較して、片側アレルindelの導入率が全体的に増加した。
図6Cでは、図6A及び図6Bの結果と比較して、indel導入率が低下した。特に、両側アレルindelの導入率が大きく低下した。その結果、片側アレルindelのみが誘導されるミスマッチ位置が増加した。
CRISPR−Cas9による標的領域へのindel誘導率をPとすると、片側アレルindelの頻度、両側アレルindelの頻度、及びindelなしの頻度は、それぞれ以下の式(m)、(b)、及び(n)で表すことができる。
片側アレルindelの頻度(mono)=2×P×(1−P) ・・・(m)
両側アレルindelの頻度(bi)=P2 ・・・(b)
indelなしの頻度(none)=(1−P)2 ・・・(n)
P=(2×bi+mono)/2 ・・・(1)
前記式(m)により算出された片側アレルindelの頻度と、図3B〜3D、図4B、及び図6A〜6Cにおいて実際に検出された片側アレルindelの頻度との相関関係を図7に示した。
(Pre−Demo−Prediction)
Pre−Demo−Predictionは、前記式(1)によりP値を算出するための簡易な試験方法である。Pre−Demo−Predictionは、図8Aに示すプロトコールに従って行った。
任意の標的配列に対するスペーサー配列のコード配列を、PX459のBpiIサイトにライゲーションし、p:RCPを作製した。前記p:RCPを、実施例2の「(AIMS細胞を用いたindelパターン解析)」で記載した方法と同様に細胞にトランスフェクションし、ピューロマイシン処理を行い、ピューロマイシン耐性細胞を選択した。
得られたピューロマイシン耐性細胞のDNAを抽出し、標的配列を含む領域をPCRにより増幅し、増幅断片をT−Easy Vector(pGEM−T Easy Vector System;Promega)に挿入してクローニングした。20〜30個のクローンの配列解析を行い、indelが確認されたクローンの割合を算出した。この値をindel誘導率(P)とした。さらに、算出したP値を用いて、前記式(m)、(b)、及び(n)により、片側アレルindelの頻度、両側アレルindelの頻度、及びindelなしの頻度をそれぞれ予測した。
ゲノム編集の標的遺伝子として、アルブミン遺伝子(Alb)を選択し、Albを標的とするスペーサー配列のコード配列を含むsgRNA用リンカー(配列番号89,90)を用いて、p:RCPとしてAlb_PX459、Alb(10C(8A))_PX459及びAlb(25C(23A))_PX459を作製した。これらを野生型ES細胞にそれぞれ導入し、上記のようにPre−Demo−Predictionを行った。その予測結果を図8Bの左図に示す。
1塩基ミスマッチを有するsgRNAによる標的配列のゲノム編集は、標的配列とスペーサー配列とが一致していないため、オフターゲットのゲノム編集と考えることができる。そこで、5’ヌクレオチド付加法により、オフターゲット効果を抑制できるかを検討した。
図9Aは、図6A〜6Cのデータに基づき、前記式(1)によりindel誘導率(P)を算出した結果を示す。1〜20の位置に1塩基ミスマッチを有するsgRNAによる標的配列のゲノム編集は、オフターゲットのゲノム編集とみなすことができる。
図9Aに示すように、5’末端にシトシンを付加することにより、オフターゲット作用を抑制することができた。例えば、1の位置にミスマッチを有するsgRNAを用いた場合、シトシンを付加していないと、indel誘導率(P)は、ほぼ1である。しかし、スペーサー配列の5’末端にシトシンを10個付加すると、indel誘導率(P)が有意に低下する。一方、ミスマッチを有さないsgRNAを用いた場合、10個のシトシンを付加しても、indel誘導率(P)はそれほど低下しない。この結果は、5’ヌクレオチド付加法により、オンターゲットのゲノム編集活性は維持しつつ、オフターゲット効果を抑制し得ることを示している。
EMX1遺伝子中の標的配列(GAGTCCGAGCAGAAGAAGAA:配列番号83(sgRNA作製用リンカー)の5〜24番目)に対して、オフターゲット領域であるMFAP1遺伝子領域(GAGTCtaAGCAGAAGAAGAA:配列番号91;EMX1遺伝子中の標的配列とは異なる部分を小文字で示す)におけるindelをHEK293T細胞で検証した。
上記実施例4で作製した10C(8A)リンカーPX459又は25C(23A)リンカーPX459に、前記EMX1遺伝子を標的とするスペーサー配列のコード配列を挿入し、EMX1_PX459(10C(8A))、及びEMX1_PX459(25C(23A))をそれぞれ作製した。プラスミドの作製に使用したリンカーを配列番号83、84に示す。これらのプラスミドを、HEK293T細胞に導入した。上記の「(AIMS細胞の作製)」で記載した方法と同様にトランスフェクション及びピューロマイシン処理を行った。Indelの確認はT7E1アッセイとシークエンス解析により行った。
トランスフェクション及びピューロマイシン処理を行ったHEK293T細胞から抽出したDNAを、PCR(EMX1オンターゲット領域増幅用プライマー:配列番号85,86;MFARオフターゲット領域増幅用プライマー:配列番号92,93)で増幅し、0Cに関しては増幅断片をT−easy Vectorに挿入してクローニングした。次いで、T7E1酵素(NEB)でのアッセイ及びシークエンス解析によりindelの誘導率(P)を決定した。0C以外の(P)は増幅させたPCR産物を直接T7E1アッセイし、切断バンド量の比率から(P)値を算出し、図9Bに示した。
スペーサー配列の5’末端にシトシンを付加することにより、オンターゲットであるEMX1遺伝子中の標的配列(オンターゲット領域)よりも、MFAP1遺伝子中のオフターゲット領域において、indel誘導率の顕著な低下が確認された。この結果から、5’末端にヌクレオチドを付加することにより、オフターゲット効果を低減できることが示された。
トランスフェクション及びピューロマイシン処理を行ったHEK293T細胞から抽出したDNAを、PCR(EMX1オンターゲット領域増幅用プライマー:配列番号85,86;MFARオフターゲット領域増幅用プライマー:配列番号92,93)で増幅し、0Cに関しては増幅断片をT−easy Vectorに挿入してクローニングした。次いで、T7E1酵素(NEB)でのアッセイ及びシークエンス解析によりindelの誘導率(P)を決定した。0C以外の(P)は増幅させたPCR産物を直接T7E1アッセイし、切断バンド量の比率から(P)値を算出し、図9Cに示した。
スペーサー配列の5’末端にシトシンを付加することにより、オンターゲットであるEMX1遺伝子中の標的配列(オンターゲット領域)よりも、MFAP1遺伝子中のオフターゲット領域において、indel誘導率の顕著な低下が確認された。この結果から、5’末端にヌクレオチドを付加することにより、オフターゲット効果を低減できることが示された。
(細胞株)
ACVR1遺伝子のアレルの一方に、FOP遺伝性疾患変異((206位のアルギニン(CGC)がヒスチジン(CAC)に変異:R206H))を有するヒトiPS細胞(wt/R206H)を用いた。
FOP遺伝性疾患変異修復方法の概要を図10Aに示した。
ACVR1遺伝子の変異アレル(R206H)に対する選択的標的配列として、(GGCTC[A]CCAGATTACACTGT:配列番号112;[]は変異塩基を示す。)を選択し、前記標的配列にアダプター配列を付加したDNA(配列番号100、101)を作製した。これをPX459、5C(3A)リンカーPX459、10C(8A)リンカーPX459、及び15C(13A)リンカーPX459のBPiIサイトに挿入し、ACVR1(R206H)_PX459、ACVR1(R206H)_PX459(5C(3A))、ACVR1(R206H)_PX459(10C(8A))、及びACVR1(R206H)_PX459(15C(13A))をそれぞれ作製した。その結果、スペーサー配列の5’末端に0個、5個(内1個がA)、10個(内1個がA)又は15個(内1個がA)のシトシンが付加された配列を含むsgRNAと、Cas9を発現する変異アレル(R206H)編集用プラスミドを得た。これらのプラスミドをヒトiPS細胞(wt/R206H)に導入すると、Cas9により変異アレル(R206H)が優先的に切断される(図10Aドット矢印)。
上記の方法によりHDRを誘導したiPS細胞クローンについて、genotype解析を行い、HDRの誘導効率を確認した。HDR誘導後のクローンについて、プライマーPr.KW1181(配列番号No.103)及びPr.KW1182(配列番号No.104)を用いて、前記標的部位のDNAをPCRで増幅した。増幅断片がBustUIで切断されたものに関して、Pr.KW1181を用いてシークエンス解析を行った。
結果を図10Bに示す。図10B中、「overall」は、HDRが誘導されたクローンのうち、wt/correct以外のgenotype(indel/correct、wt/correct+indel等)を含むクローンの割合である。図10Bに示すように、5’末端にシトシンが付加されていないsgRNA(0C)では、正しく修復されたwt/correctのクローンは取得できなかった。一方、5個又は10個のシトシンを付加したsgRNA(5C、10C)では、wt/correctのクローンを取得することができた。
前記変異アレル(R206H)編集用の各プラスミドのいずれかを、ヒトiPS細胞(wt/R206H)に導入し、ACVR1遺伝子配列内の変異アレル(R206H)を標的としてゲノム編集を行った。次いで、細胞からゲノムを回収し、プライマーPr.KW1181及びPr.KW1182を用いて、DNAをPCR増幅した。次いで、増幅断片を用いて、T7 Endonuclease I(T7E1)(NEB社から購入)による切断アッセイを行い、indel誘導効率を測定した。
(細胞株)
Acvr1遺伝子の変異を有さないマウスES細胞(wt/wt)を用いた。
FOP遺伝性疾患変異誘導方法の概要を図11Aに示した。
Acvr1遺伝子(wt/wt)に対する標的配列として、(GGCTCGCCAGATAACCCTGT:配列番号115)を選択し、前記標的配列にアダプター配列を付加したDNA(配列番号105、106)を作製した。これをPX459、5C(3A)リンカーPX459、10C(8A)リンカーPX459、15C(13A)リンカーPX459、20C(18A)リンカーPX459、25C(23A)リンカーPX459、及び30C(28A)リンカーPX459のBPiIサイトに挿入し、ACVR1(R206H)_PX459、ACVR1(R206H)_PX459(5C(3A))、ACVR1(R206H)_PX459(10C(8A))、ACVR1(R206H)_PX459(15C(13A))、ACVR1(R206H)_PX459(20C(18A))、ACVR1(R206H)_PX459(25C(23A))、及びACVR1(R206H)_PX459(30C(28A))をそれぞれ作製した。その結果、スペーサー配列の5’末端に0個、5個(内1個がA)、10個(内1個がA)、15個(内1個がA)、20個(内1個がA)、25個(内1個がA)又は30個(内1個がA)のシトシンが付加された配列を含むsgRNAと、Cas9を発現するAcvr1遺伝子(wt/wt)編集用プラスミドを得た。これらのプラスミドをマウスES細胞に導入すると、Cas9によりAcvr1遺伝子のwtアレルが切断される(図11Aドット矢印)。
上記の方法によりHDRを誘導したES細胞クローンについて、genotype解析を行い、HDRの誘導効率を確認した。HDR誘導後のクローンについて、プライマーPr.KW1201(配列番号No.108)及びPr.KW1202(配列番号No.109)を用いて、前記標的部位のDNAをPCRで増幅した。増幅断片について、Pr.KW1201を用いてシークエンス解析を行った。
結果を図11Bに示す。図11B中、「overall」は、HDRが誘導されたクローンのうち、wt/R206H以外のgenotype(indel/R206H、wt/R206H+indel等)を含むクローンの割合である。図11Bに示すように、5’末端に5個のシトシンを付加したsgRNA(5C)において、HDR誘導効率が最も高かった。シトシン付加数の増加によるCas9の活性低下(図11C)に伴い、HDR誘導効率も低くなった。一方、ヘテロ型変異クローン(wt/R206H)の取得率は、シトシン付加数の増加によるCas9活性の低下(図11C)に伴い増加した。
前記wtアレル編集用の各プラスミドのいずれかを、マウスES細胞(wt/wt)に導入し、Acvr1遺伝子配列を標的としてゲノム編集を行った。次いで、細胞からゲノムを回収し、プライマーPr.KW1201及びPr.KW1202を用いて、DNAをPCR増幅した。次いで、増幅断片を用いて、T7 Endonuclease I(T7E1)(NEB社から購入)による切断アッセイを行い、indel誘導効率を測定した。
上記試験で取得したヘテロ型変異クローン(wt/R206H)を、マウスの受精卵にマイクロインジェクションし、キメラマウスを作製した。前記キメラマウスでは、ES細胞が寄与した部位で異常な骨の形成が観察された(図11Dの矢印)。以上の結果より、FOP遺伝性疾患モデル動物を作製できることが実証された。
(AIMSを用いた細胞毒性評価試験)
実施例4と同様の方法で、P2Aの標的配列(TAACTTCAGCCTGCTGAAGC:配列番号95)を標的として、AIMS細胞のゲノム編集を行った。スペーサー配列として、前記P2A標的配列の5’末端に0〜20個のシトシンを付加した配列を用いた。ゲノム編集後、細胞数をカウントした。
ACVR1遺伝子に対する標的配列として、(GGCTCGCCAGATTACACTGT:配列番号113)を選択し、前記標的配列にアダプター配列を付加したDNA(配列番号110、111)を作製した。これをPX459、5C(3A)リンカーPX459、10C(8A)リンカーPX459、15C(13A)リンカーPX459、及び20C(18A)リンカーPX459のBpiIサイトに挿入し、ACVR1(R206H)_PX459、ACVR1(R206H)_PX459(5C(3A))、ACVR1(R206H)_PX459(10C(8A))、ACVR1(R206H)_PX459(15C(13A))、及びACVR1(R206H)_PX459(20C(18A))をそれぞれ作製した。その結果、スペーサー配列の5’末端に0個、5個(内1個がA)、10個(内1個がA)、15個(内1個がA)又は20個(内1個がA)のシトシンが付加された配列を含むsgRNAと、Cas9を発現するwt/wt編集用プラスミドを得た。これらのプラスミドをヒトiPS細胞(wt/wt)に導入し、ゲノム編集を行った。ゲノム編集後、細胞数をカウントした。
AIMSから得られた253個のデータ(C付加gRNA、mismatch gRNA、C付加+mismatch gRNAの全てからなる)を取得し、これらのデータに基づいて、前記式(1)によりP値を算出した。この算出したP値を横軸とし、Bi,Meno,Noneそれぞれのindelデータ値Pを縦軸としてプロットした。このグラフから、二次関数の数式を得た(図13A)。これらの得られた数式にP値を当てはめると、Bi, Mono, Noneのindel割合がそれぞれ予測できる。
図13Bの下図は、Bi indel(P)+Mono indel(P)+None(P)=1であるため、None(P)=1−Bi indel(P)−Mono indel(P)として作製した。
図13C中図に、得られたデータから、上記式(1)で算出されたP値を図13Aの数式(P=x)に当てはめて作成した予測グラフを示す。
図13C下図に、図13C上図の実験の際に抽出したゲノムに対してPCRを行い、上記「[ゲノム編集パターンの予測方法]」に従って行ったバクテリア(大腸菌)アッセイ(実施例8:Pre−Demo−Prediction)からP値を求め、図13Aの数式に当てはめて得られたindelパターン予測グラフを示す。図13C下図が、図13C上図とほぼ一致することから、図13Aの数式の正確性に加え、バクテリアアッセイの有効性が証明された。したがって、AIMSを使用しなくても、内在性遺伝子(ゲノム)をターゲットとする場合でも、ゲノム編集誘導後の細胞ゲノムに対してPCRを行い、バクテリアアッセイを行うことで、アレル別intelパターンが正確に予測することができる。
Cdh1−P2A−AIMS ES細胞に対してP2A−sgRNA1(リンカーの配列番号67,68)とCdh1−sgRNA4(リンカーの配列番号125,126)の2箇所の標的配列を設定した(図14A)。それぞれの片側アレルindelを、異なるアレル(トランスの関係)に発生させて、Compound heterozygous indelクローンを1度の組換え操作で作製した(図14B)。蛍光パターン(P2A部位に関して:シークエンスの必要なし)と、設定プライマー(内在性Cdh1遺伝子領域)でのPCRによるPCR産物のシークエンスにより、遺伝子型を決定した。Tomato alleleのCdh1−sgRNA4 target領域のgenotypeは、Pr.KW1287(配列番号127)とPr.KW1118(配列番号54)である。Venus alleleのCdh1−sgRNA4 target領域のgenotypeは、Pr.KW558(配列番号39)とPr.KW1118 (配列番号54)である。
全てhetero型P=Gene A Mono(P) x Gene B Mono(P) x Gene C Mono(P)
全てhomo型P=Gene A Bi(P) x Gene B Bi(P) x Gene C Bi(P)
混合型P=Gene A Bi(P) x Gene B Mono(P) x Gene C None(P)
P.KW13−3プラスミド(配列番号4)を鋳型とし、Pr.KW541(配列番号41)とPr.KW607(配列番号128)をプライマーとして、PCRを行った。PCR産物300ng(951bp)に対して、sgRNAとCas9の複合体をin vitroで作用させて、C付加gRNA−Cas9のDNA切断活性を測定した(切断DNA:741bpと210bp)。
[0C]sgRNA、[10C]sgRNA、及び[25C]sgRNAは、以下の手順で作製した。P2A−gRNA1リンカー(配列番号67,68)が挿入されたPX459プラスミドを鋳型として、それぞれフォワードプライマー(Pr.KW1105(配列番号129),Pr.KW1106(配列番号130),Pr.KW1107(配列番号131))と、リバースプライマー(Pr.KW1108(配列番号132))を用いてPCRを行った。このPCR産物に対してT7 RNA polymeraseによるin vitro転写を行うことで、上記各sgRNAを得た。Cas9タンパク質はIDT社より購入した。
Claims (16)
- (A)(a1)スペーサー配列の5’末端に1個以上のヌクレオチド残基が付加されたガイドRNA、(a2)標的配列に対して1塩基又は複数塩基のミスマッチを有するスペーサー配列を含むガイドRNA、及び(a3)前記(a1)若しくは前記(a2)のガイドRNAの発現ベクターからなる群より選択される少なくとも1種と、
(B)Casタンパク質及びその発現ベクターからなる群より選択される少なくとも1種と、
を細胞に導入する工程を含む、片側アレルのみがゲノム編集された細胞の製造方法。 - 前記(A)が、スペーサー配列の5’末端に1個以上のヌクレオチド残基が付加され、且つ前記スペーサー配列が、標的配列に対して1塩基又は複数塩基のミスマッチを有するスペーサー配列である、ガイドRNA又はそれをコードする発現ベクターである、請求項1に記載の片側アレルのみがゲノム編集された細胞の製造方法。
- 前記スペーサー配列の5’末端に付加されたヌクレオチド残基が、全て同一のヌクレオチド残基である、請求項1又は2に記載の片側アレルのみがゲノム編集された細胞の製造方法。
- 前記スペーサー配列の5’末端に付加されたヌクレオチド残基が、シトシン残基又はグアニン残基である、請求項3に記載の片側アレルのみがゲノム編集された細胞の製造方法。
- さらに、(C)ドナーベクターを細胞に導入する工程を含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載の片側アレルのみがゲノム編集された細胞の製造方法。
- 前記Casタンパク質がCas9タンパク質である、請求項1〜5のいずれか一項に記載の片側アレルのみがゲノム編集された細胞の製造方法。
- スペーサー配列の5’末端に1個以上のヌクレオチド残基が付加されたガイドRNA。
- 前記スペーサー配列が、標的配列に対して1塩基又は複数塩基のミスマッチを有する、請求項7に記載のガイドRNA。
- 請求項7又は8に記載のガイドRNAの発現ベクター。
- さらに、Casタンパク質を発現可能な、請求項9に記載の発現ベクター。
- 前記Casタンパク質がCas9タンパク質である、請求項10に記載の発現ベクター。
- (A)(a1)スペーサー配列の5’末端に1個以上のヌクレオチド残基が付加されたガイドRNA、(a2)標的配列に対して1塩基又は複数塩基のミスマッチを有するスペーサー配列を含むガイドRNA、及び(a3)前記(a1)若しくは前記(a2)のガイドRNAの発現ベクター、からなる群より選択される少なくとも1種を含む、片側アレルのみがゲノム編集された細胞の製造キット。
- (B)Casタンパク質及びその発現ベクターからなる群より選択される少なくとも1種をさらに含む、請求項12に記載の製造キット。
- (i)ガイドRNA若しくはその発現ベクター、及びCasタンパク質若しくはその発現ベクターを細胞に導入してゲノム編集を行う工程、
(ii)前記ゲノム編集を行った細胞からDNAを抽出する工程、
(iii)前記DNAから標的領域を含むDNA断片を増幅する工程、
(iv)前記増幅したDNA断片の配列解析を行い、前記標的領域へのindel誘導率(P)を求める工程、及び
(v)下記式(m)若しくは(m1)及び(b)若しくは(b1)により、片側アレルのみへのindel誘導率(mono)及び両側アレルへのindel誘導率(bi)を求める工程、
を含む、ゲノム編集パターンの予測方法。
mono=2×P×(1−P) ・・・(m) bi=P2 ・・・(b)
mono=−1.303P2+1.2761P+0.0274 ・・・(m1)
bi=0.6515P2+0.3619P−0.0137 ・・・(b1) - 一方のアレルに、局在化タンパク質コード配列と、切断部位と、第1の蛍光タンパク質コード配列と、がこの順にインフレームで連結されたキメラ遺伝子を含み、
他方のアレルに、前記局在化タンパク質コード配列と、前記切断部位と、第2の蛍光タンパク質コード配列と、がこの順にインフレームで連結されたキメラ遺伝子を含む、
細胞。 - (I)請求項15に記載の細胞に、前記切断部位を標的とするガイドRNA若しくはその発現ベクター、及びCasタンパク質若しくはその発現ベクターを導入してゲノム編集を行う工程、
(II)前記工程(I)の後、前記細胞の蛍光パターンを解析する工程、並びに
(III)前記工程(II)で解析した蛍光パターンに基づいて、ゲノム編集パターンを判定する工程、
を含む、ゲノム編集パターンの解析方法。
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