JP2022528414A - ヒト化凝固因子１２遺伝子座を含む非ヒト動物 - Google Patents

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Abstract

ヒト化凝固因子ＸＩＩ（Ｆ１２）遺伝子座を含む非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞、および非ヒト動物、ならびにそのような非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞、および非ヒト動物を作成および使用する方法が提供される。ヒト化Ｆ１２遺伝子座を含む非ヒト動物細胞または非ヒト動物は、ヒト凝固因子ＸＩＩタンパク質またはキメラ凝固因子ＸＩＩタンパク質を発現し、その断片はヒト凝固因子ＸＩＩに由来する。ヒトＦ１２を標的化するように設計されたヌクレアーゼ剤などのヒト凝固因子ＸＩＩ標的化試薬のインビボ有効性を評価するために、ヒト化Ｆ１２遺伝子座を含むそのような非ヒト動物を使用するための方法が提供される。脳内で局所的に産生されるＦ１２の短いアイソフォーム、および短いアイソフォームを使用する方法も提供される。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年４月４日に出願された米国出願第６２／８２９，３２１号の利益を主張し、これはすべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
ＥＦＳ ＷＥＢを介してテキストファイルとして提出された配列表への参照
ファイル５４５９８６ＳＥＱＬＩＳＴ．ｔｘｔに記述された配列表は１２１キロバイトであり、２０２０年３月２２日に作成され、参照により本明細書に組み込まれる。
凝固因子は、血小板とともに、血管損傷時の止血の過程に関連する血液成分である。調節（すなわち、生産および／または活動）で不均衡が発生した場合、これらの成分が血栓症の原動力となり得ることは十分に確立されている。血栓性疾患は主に（組織因子を介した）外因性経路の異常な活性化から生じると考えられていたが、最近では、Ｆ１２欠損マウスおよび活性化凝固因子ＸＩＩ（第ＸＩＩａ因子）を標的とする分子を用いた前臨床研究により、凝固の内因性経路（接触経路としても知られている）も関与することが示唆されている。第ＸＩＩａ因子は接触経路の中心であり、第ＸＩ因子の切断を介して凝固を促進し得るか、血漿プレカリクレインの切断を介して炎症を促進し得る。したがって、第ＸＩＩ因子活性の阻害は、接触経路の活性化に関連する血栓性凝固および炎症の減少をもたらし得る。
しかしながら、ヒト凝固因子ＸＩＩ標的化試薬の真のヒト標的または真のヒト標的の近似を提供する好適な非ヒト動物の必要性が残っており、それにより、生きている動物においてそのような薬剤の有効性および作用機序の試験、ならびに薬物動態および薬力学の研究を可能にする。
ヒト化凝固因子ＸＩＩ（Ｆ１２）遺伝子座を含む非ヒト動物、ならびにそのような非ヒト動物を作製および使用する方法が提供される。ヒト化凝固因子ＸＩＩ（Ｆ１２）遺伝子座を含む非ヒト動物ゲノムまたは細胞、ならびにそのような非ヒト動物ゲノムまたは細胞を作製および使用する方法も提供される。非ヒト動物Ｆ１２遺伝子のヒト化に使用するためのヒト化非ヒト動物Ｆ１２遺伝子、ヌクレアーゼ剤および／または標的化ベクター、ならびにそのようなヒト化Ｆ１２遺伝子を作製および使用する方法も提供される。
一態様では、提供されるのは、ヒト化凝固因子ＸＩＩ（Ｆ１２）遺伝子座を含む、非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞、または非ヒト動物である。そのような非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞、または非ヒト動物は、内因性Ｆ１２遺伝子座のセグメントが削除され、対応するヒトＦ１２配列で置き換えられたヒト化内因性Ｆ１２遺伝子座をそのゲノム中に含むことができる。
いくつかのそのような非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞、または非ヒト動物において、ヒト化内因性Ｆ１２遺伝子座は、ヒト凝固因子ＸＩＩ重鎖を含むタンパク質をコードする。いくつかのそのような非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞、または非ヒト動物において、ヒト化内因性Ｆ１２遺伝子座は、ヒト凝固因子ＸＩＩ軽鎖を含むタンパク質をコードする。いくつかのそのような非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞、または非ヒト動物において、ヒト化内因性Ｆ１２遺伝子座は、ヒト凝固因子ＸＩＩシグナルペプチドを含むタンパク質をコードする。
いくつかのそのような非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞、または非ヒト動物において、コード配列および非コード配列の両方を含む内因性Ｆ１２遺伝子座の領域が削除され、コード配列および非コード配列の両方を含む対応するヒトＦ１２配列で置き換えられている。いくつかのそのような非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞、または非ヒト動物において、ヒト化内因性Ｆ１２遺伝子座は、内因性Ｆ１２プロモーターを含み、ヒトＦ１２配列は、内因性Ｆ１２プロモーターに作動可能に連結されている。いくつかのそのような非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞、または非ヒト動物において、内因性Ｆ１２遺伝子座の少なくとも１つのイントロンおよび少なくとも１つのエクソンが削除され、対応するヒトＦ１２配列で置き換えられている。
いくつかのそのような非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞、または非ヒト動物において、内因性Ｆ１２遺伝子座のＦ１２コード配列全体が削除され、対応するヒトＦ１２配列で置き換えられている。任意選択で、開始コドンから終止コドンまでの内因性Ｆ１２遺伝子座の領域が削除され、対応するヒトＦ１２配列で置き換えられている。
いくつかのそのような非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞、または非ヒト動物において、内因性Ｆ１２の３’非翻訳領域は削除されておらず、対応するヒトＦ１２配列で置き換えられていない。いくつかのそのような非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞、または非ヒト動物において、内因性Ｆ１２の５’非翻訳領域は削除されておらず、対応するヒトＦ１２配列で置き換えられていない。
いくつかのそのような非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞、または非ヒト動物において、開始コドンから終止コドンまでの内因性Ｆ１２遺伝子座の領域が削除され、対応するヒトＦ１２配列で置き換えられており、内因性Ｆ１２プロモーターは削除されておらず、対応するヒトＦ１２配列に置き換えられていない。
いくつかのそのような非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞、または非ヒト動物において、ヒト化内因性Ｆ１２遺伝子座におけるヒトＦ１２配列は、配列番号３１もしくは３２に記載の配列に対して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一の配列を含む。いくつかのそのような非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞、または非ヒト動物において、ヒト化内因性Ｆ１２遺伝子座は、配列番号５もしくは４６に記載の配列に対して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一の配列を含むタンパク質をコードする。いくつかのそのような非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞、または非ヒト動物において、ヒト化内因性Ｆ１２遺伝子座は、配列番号１３もしくは４８に記載の配列に対して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一の配列を含むコード配列を含む。いくつかのそのような非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞、または非ヒト動物において、ヒト化内因性Ｆ１２遺伝子座は、配列番号１７もしくは１８に記載の配列に対して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一の配列を含む。
いくつかのそのような非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞、または非ヒト動物において、ヒト化内因性Ｆ１２遺伝子座は、選択カセットまたはレポーター遺伝子を含まない。いくつかのそのような非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞、または非ヒト動物において、ヒト化内因性Ｆ１２遺伝子座は、対応するヒトＦ１２配列のイントロン内に選択カセットまたはレポーター遺伝子を含む。
いくつかのそのような非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞、または非ヒト動物において、非ヒト動物は、ヒト化内因性Ｆ１２遺伝子座についてホモ接合性である。
いくつかのそのような非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞、または非ヒト動物において、非ヒト動物は、その生殖系列にヒト化内因性Ｆ１２遺伝子座を含む。
いくつかのそのような非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞、または非ヒト動物において、非ヒト動物は哺乳動物である。任意選択で、非ヒト動物はラットまたはマウスである。任意選択で、非ヒト動物はマウスである。
いくつかのそのような非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞、または非ヒト動物において、非ヒト動物は、脳において短いヒト凝固因子ＸＩＩアイソフォームを発現する。任意選択で、短いヒト凝固因子ＸＩＩアイソフォームは、ヒトＦ１２のエクソン１１～１４に対するプローブによって検出されるが、ヒトＦ１２のエクソン１～６に対するプローブによっては検出されないＦ１２ ｍＲＮＡによってコードされる。任意選択で、短いヒト凝固因子ＸＩＩアイソフォームはＦＸＩＩ２９７－５９６である。任意選択で、短いヒト凝固因子ＸＩＩアイソフォームは脳のニューロンで発現する。任意選択で、短いヒト凝固因子ＸＩＩアイソフォームは、血漿カリクレインによって活性化され得、プロＨＧＦを活性ＨＧＦに変換することができる。
いくつかのそのような非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞、または非ヒト動物において、非ヒト動物は、対応する野生型非ヒト動物の活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）と顕著に異ならないａＰＴＴを有し、かつ／または非ヒト動物は、対応する野生型の非ヒト動物のプロトロンビン時間（ＰＴ）と顕著に異ならないＰＴを有する。
いくつかのそのような非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞、または非ヒト動物において、非ヒトは、少なくとも約５μｇ／ｍＬのヒト凝固因子ＸＩＩ血漿レベルを有する。
いくつかのそのような非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞、または非ヒト動物において、開始コドンから終止コドンまでの内因性Ｆ１２遺伝子座の領域が削除され、対応するヒトＦ１２配列で置き換えられており、内因性Ｆ１２プロモーターは削除されておらず、対応するヒトＦ１２配列に置き換えられておらず、非ヒト動物は脳内で短いヒト凝固因子ＸＩＩアイソフォームを発現し、任意選択で、（ｉ）短いヒト凝固因子ＸＩＩアイソフォームは、ヒトＦ１２のエクソン１１－１４に対するプローブによって検出されるが、ヒトＦ１２のエクソン１－６に対するプローブによっては検出されないＦ１２ ｍＲＮＡによってコードされ、かつ／または（ｉｉ）短いヒト凝固因子ＸＩＩアイソフォームはＦＸＩＩ２９７－５９６であり、かつ／または（ｉｉｉ）短いヒト凝固因子ＸＩＩアイソフォームが脳のニューロンで発現しており、かつ／または（ｉｖ）短いヒト凝固因子ＸＩＩアイソフォームは血漿カリクレインによって活性化され、プロＨＧＦを活性ＨＧＦに変換する。
別の態様では、ヒト化内因性Ｆ１２遺伝子座を生成するための標的化ベクターであって、内因性Ｆ１２遺伝子座のセグメントが削除され、対応するヒトＦ１２配列で置き換えられ、標的化ベクターが、内因性Ｆ１２遺伝子座の５’標的配列を標的とする５’ホモロジーアームと内因性Ｆ１２遺伝子座の３’標的配列を標的とする３’ホモロジーアームとが隣接する対応するヒトＦ１２配列を含むインサート核酸を含む、標的化ベクターが提供される。
別の態様では、ヒト化非ヒト動物Ｆ１２遺伝子であって、内因性Ｆ１２遺伝子座のセグメントが削除され、対応するヒトＦ１２配列で置き換えられている、ヒト化非ヒト動物Ｆ１２遺伝子が提供される。
別の態様では、インビボでのヒト凝固因子ＸＩＩ標的化試薬の活性を評価する方法が提供される。いくつかのそのような方法は、（ａ）上述の非ヒト動物のいずれかにヒト凝固因子ＸＩＩ標的化試薬を投与することと、（ｂ）非ヒト動物におけるヒト凝固因子ＸＩＩ標的化試薬の活性を評価することと、を含む。
いくつかのそのような方法において、投与することは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）媒介送達、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）媒介送達、流体力学的送達（ＨＤＤ）、または注射を含む。
いくつかのそのような方法において、ステップ（ｂ）は、非ヒト動物から血漿を単離することと、血漿中のヒト凝固因子ＸＩＩ標的化試薬の活性を評価することと、を含む。いくつかのそのような方法において、ステップ（ｂ）は、非ヒト動物の肝臓または脳におけるヒト凝固因子ＸＩＩ標的化試薬の活性を評価することを含む。いくつかのそのような方法において、ステップ（ｂ）は、凝固またはトロンビン生成を評価することを含む。いくつかのそのような方法において、ステップ（ｂ）は、ＨＧＦ－Ｍｅｔシグナル伝達を評価することを含む。いくつかのそのような方法において、ステップ（ｂ）は、ヒト化内因性Ｆ１２遺伝子座によってコードされるＦ１２メッセンジャーＲＮＡの発現を測定することを含む。いくつかのそのような方法において、ステップ（ｂ）は、ヒト化内因性凝固因子ＸＩＩ遺伝子座によってコードされる凝固因子ＸＩＩタンパク質の発現を測定することを含む。いくつかのそのような方法では、ヒト凝固因子ＸＩＩ標的化試薬はゲノム編集剤であり、ステップ（ｂ）はヒト化内因性Ｆ１２遺伝子座の改変を評価することを含む。いくつかのそのような方法において、ステップ（ｂ）は、ヒト化内因性Ｆ１２遺伝子座内の挿入または欠失の頻度を測定することを含む。
いくつかのそのような方法において、ヒト凝固因子ＸＩＩ標的化試薬は、ヒトＦ１２遺伝子の領域を標的化するように設計されたヌクレアーゼ剤を含む。任意選択で、ヌクレアーゼ剤は、Ｃａｓタンパク質およびヒトＦ１２遺伝子のガイドＲＮＡ標的配列を標的化するように設計されたガイドＲＮＡを含む。任意選択で、Ｃａｓタンパク質はＣａｓ９タンパク質である。
いくつかのそのような方法において、ヒト凝固因子ＸＩＩ標的化試薬は外因性ドナー核酸を含み、外因性ドナー核酸は、ヒトＦ１２遺伝子を標的化するように設計され、任意選択で、外因性ドナー核酸は、ＡＡＶを介して送達される。いくつかのそのような方法において、ヒト凝固因子ＸＩＩ標的化試薬は、ＲＮＡｉ剤またはアンチセンスオリゴヌクレオチドである。いくつかのそのような方法において、ヒト凝固因子ＸＩＩ標的化試薬は抗原結合タンパク質である。いくつかのそのような方法では、ヒト凝固因子ＸＩＩ標的化試薬は小分子である。
別の態様では、インビボでのヒト凝固因子ＸＩＩ標的化試薬の活性を最適化する方法が提供される。いくつかのそのような方法は、（Ｉ）ヒト化内因性Ｆ１２遺伝子座をそのゲノム中に含む第１の非ヒト動物において初めて上記の方法のいずれかを実施することと、（ＩＩ）変数を変更し、そのゲノムにヒト化内因性Ｆ１２遺伝子座を含む第２の非ヒト動物において、変更された変数を用いてステップ（Ｉ）の方法を２回目に実施することと、（ＩＩＩ）ステップ（Ｉ）のヒト凝固因子ＸＩＩ標的化試薬の活性をステップ（ＩＩ）のヒト凝固因子ＸＩＩ標的化試薬の活性と比較し、結果としてより高い活性が得られる方法を選択することと、を含む。
いくつかのそのような方法において、ステップ（ＩＩ）で変更された変数は、ヒト凝固因子ＸＩＩ標的化試薬を非ヒト動物に導入する送達方法である。いくつかのそのような方法において、ステップ（ＩＩ）で変更された変数は、ヒト凝固因子ＸＩＩ標的化試薬を非ヒト動物に導入する投与経路である。いくつかのそのような方法において、ステップ（ＩＩ）で変更された変数は、非ヒト動物に導入されたヒト凝固因子ＸＩＩ標的化試薬の濃度または量である。いくつかのそのような方法では、ステップ（ＩＩ）で変更された変数は、非ヒト動物に導入されたヒト凝固因子ＸＩＩ標的化試薬の形態である。いくつかのそのような方法では、ステップ（ＩＩ）で変更された変数は、非ヒト動物に導入されたヒト凝固因子ＸＩＩ標的化試薬である。
別の態様では、上記の非ヒト動物のいずれかを作製する方法が提供される。いくつかのそのような方法は、（ａ）非ヒト動物胚性幹（ＥＳ）細胞に、（ｉ）内因性Ｆ１２遺伝子座の標的配列を標的化するヌクレアーゼ剤、および（ｉｉ）内因性Ｆ１２遺伝子座の５’標的配列に対応する５’ホモロジーアームと内因性Ｆ１２遺伝子座の３’標的配列に対応する３’ホモロジーアームとが隣接するヒトＦ１２配列を含む核酸インサートを含む標的化ベクターを導入することであって、標的化ベクターが内因性Ｆ１２遺伝子座を組み替換えて、そのゲノムにヒトＦ１２配列を含むヒト化内因性Ｆ１２遺伝子座をゲノムに含む遺伝子改変された非ヒトＥＳ細胞を産生する、導入することと、（ｂ）遺伝子改変された非ヒトＥＳ細胞を非ヒト動物宿主胚に導入することと、（ｃ）非ヒト動物宿主胚を代理母において妊娠させることであって、代理母は、ヒトＦ１２配列を含むヒト化内因性Ｆ１２遺伝子座をそのゲノムに含むＦ０子孫遺伝子改変非ヒト動物を産生する、妊娠させることと、を含む。任意選択で、標的化ベクターは、少なくとも１０ｋｂの長さの大きな標的化ベクターであるか、または５’ホモロジーアームおよび３’ホモロジーアームの合計が少なくとも１０ｋｂの長さである。
いくつかのそのような方法は、（ａ）非ヒト動物１細胞期胚に、（ｉ）内因性Ｆ１２遺伝子座の標的配列を標的化するヌクレアーゼ剤、および（ｉｉ）内因性Ｆ１２遺伝子座の５’標的配列に対応する５’ホモロジーアームと内因性Ｆ１２遺伝子座の３’標的配列に対応する３’ホモロジーアームとが隣接するヒトＦ１２配列を含む核酸インサートを含む標的化ベクターを導入することであって、標的化ベクターが内因性Ｆ１２遺伝子座を組み替換えて、そのゲノムにヒトＦ１２配列を含むヒト化内因性Ｆ１２遺伝子座をゲノムに含む遺伝子改変された非ヒト動物１細胞期胚を産生する、導入することと、（ｂ）遺伝子改変された非ヒト動物１細胞期胚を代理母において妊娠させて、代理母は、ヒトＦ１２配列を含むヒト化内因性Ｆ１２遺伝子座をそのゲノムに含む遺伝子改変されたＦ０世代非ヒト動物を産生することと、を含む。
いくつかのそのような方法において、ヌクレアーゼ剤は、Ｃａｓタンパク質およびガイドＲＮＡを含む。任意選択で、Ｃａｓタンパク質はＣａｓ９タンパク質である。いくつかのそのような方法において、ステップ（ａ）は、内因性Ｆ１２遺伝子座内の第２の標的配列を標的化する第２のガイドＲＮＡを導入することをさらに含む。
いくつかのそのような方法は、（ａ）非ヒト動物宿主胚に、ヒト化内因性Ｆ１２遺伝子座をゲノムに含む遺伝子改変された非ヒト動物胚性幹（ＥＳ）細胞であって、内因性Ｆ１２遺伝子座のセグメントが削除され、対応するヒトＦ１２配列で置き換えられている、非ヒト動物胚性幹（ＥＳ）細胞を導入することと、（ｂ）非ヒト動物宿主胚を代理母において妊娠させることであって、代理母は、ヒト化内因性Ｆ１２遺伝子座を含むＦ０子孫遺伝子改変非ヒト動物を産生する、妊娠させることと、を含む。
いくつかのそのような方法は、（ａ）非ヒト動物胚性幹（ＥＳ）細胞に、内因性Ｆ１２遺伝子座の５’標的配列に対応する５’ホモロジーアームと内因性Ｆ１２遺伝子座の３’標的配列に対応する３’ホモロジーアームとが隣接するヒトＦ１２配列を含む核酸インサートを含む標的化ベクターを導入することであって、標的化ベクターが内因性Ｆ１２遺伝子座を組み替換えて、そのゲノムにヒトＦ１２配列を含むヒト化内因性Ｆ１２遺伝子座をゲノムに含む遺伝子改変された非ヒトＥＳ細胞を産生する、導入することと、（ｂ）遺伝子改変された非ヒトＥＳ細胞を非ヒト動物宿主胚に導入することと、（ｃ）非ヒト動物宿主胚を代理母において妊娠させることであって、代理母は、ヒトＦ１２配列を含むヒト化内因性Ｆ１２遺伝子座をそのゲノムに含むＦ０子孫遺伝子改変非ヒト動物を産生する、妊娠させることと、を含む。任意選択で、標的化ベクターは、少なくとも１０ｋｂの長さの大きな標的化ベクターであるか、または５’ホモロジーアームおよび３’ホモロジーアームの合計が少なくとも１０ｋｂの長さである。
いくつかのそのような方法は、（ａ）非ヒト動物１細胞期胚に、内因性Ｆ１２遺伝子座の５’標的配列に対応する５’ホモロジーアームと内因性Ｆ１２遺伝子座の３’標的配列に対応する３’ホモロジーアームとが隣接するヒトＦ１２配列を含む核酸インサートを含む標的化ベクターを導入することであって、標的化ベクターが内因性Ｆ１２遺伝子座を組み替換えて、そのゲノムにヒトＦ１２配列を含むヒト化内因性Ｆ１２遺伝子座をゲノムに含む遺伝子改変された非ヒト動物１細胞期胚を産生する、導入することと、（ｂ）遺伝子改変された非ヒト動物１細胞期胚を代理母において妊娠させて、代理母は、ヒトＦ１２配列を含むヒト化内因性Ｆ１２遺伝子座をそのゲノムに含む遺伝子改変されたＦ０世代非ヒト動物を産生することと、を含む。
いくつかのそのような方法において、ステップ（ａ）は、ヌクレアーゼ剤またはヌクレアーゼ剤をコードする核酸を導入することをさらに含み、ヌクレアーゼ剤は、内因性Ｆ１２遺伝子座の標的配列を標的化する。任意選択で、ヌクレアーゼ剤は、Ｃａｓタンパク質およびガイドＲＮＡを含む。任意選択で、Ｃａｓタンパク質はＣａｓ９タンパク質である。任意選択で、ステップ（ａ）は、内因性Ｆ１２遺伝子座内の第２の標的配列を標的化する第２のガイドＲＮＡを導入することをさらに含む。
いくつかのそのような方法では、非ヒト動物はマウスまたはラットである。任意選択で、非ヒト動物はマウスである。
別の態様では、生体サンプル中の短いＦ１２ ｍＲＮＡアイソフォームの発現を評価する方法が提供される。いくつかのそのような方法は、（ａ）Ｆ１２遺伝子のエクソン９～１４のうちの１つ以上に対するプライマーおよび／またはプローブを使用してＲＮＡ転写産物を検出および定量することと、（ｂ）Ｆ１２遺伝子のエクソン１～６のうちの１つ以上に対するプライマーおよび／またはプローブを使用してＲＮＡ転写産物を検出および定量することと、を含み、短いアイソフォームが、エクソン９～１４に対するプライマーおよび／またはプローブによって検出されるが、エクソン１～６に対するプライマーおよび／またはプローブによっては検出されない。
（正確な縮尺ではない）マウス凝固因子ＸＩＩ（Ｆ１２）遺伝子座のヒト化のための標的化スキームの概略図を示す。図の上部は、内因性マウスＦ１２遺伝子座および内因性ヒトＦ１２遺伝子座を示し、図の下部は、自己削除選択カセットがある場合またはない場合のヒト化遺伝子座を示す。 （正確な縮尺ではない）マウスＦ１２遺伝子座のヒト化をスクリーニングするためのＴＡＱＭＡＮ（登録商標）アッセイの概略図を示す。対立遺伝子獲得（ＧＯＡ）アッセイには、７３７４ｈＵおよび７３７４ｈＤが含まれる。対立遺伝子喪失（ＬＯＡ）アッセイには、７３７４ｍＴＵおよび７３７４ｍＴＤが含まれる。 ヒトおよびマウスの凝固因子ＸＩＩタンパク質（それぞれｈＦ１２およびｍＦ１２）のアラインメントを示す。シグナルペプチドは四角で囲まれ、重鎖および軽鎖領域を示す。 ヒト化Ｆ１２マウスおよび野生型（ＶＧ ＷＴ）マウスの血漿サンプル中のヒト凝固因子ＸＩＩレベルを示す。プールされた正常なヒト血漿を陽性対照として使用し、ヒトＦＸＩＩ－ＩＤ（ＦＸＩＩ免疫枯渇）血漿を陰性対照として使用した。スチューデントｔ検定；＊＊＊ｐ＜０．００１の場合、試験されたヒト血漿の場合は正常ヒト血漿に対し、マウス血漿の場合は野生型に対する。 野生型マウス（ＦＸＩＩ＋／＋）、Ｆ１２ノックアウトマウス（ＦＸＩＩ －／－）、およびヒト化Ｆ１２（ＦＸＩＩｈｕｍ／ｈｕｍ）マウス由来の血漿サンプルのウエスタンブロット解析を示す。マウス凝固因子ＸＩＩおよびヒト凝固因子ＸＩＩの発現を測定した。アルブミンをローディング対照として使用した。 野生型およびヒト化Ｆ１２マウスでの活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）の結果を示す。 ＦＸＩＩタンパク質ドメインに対するｑＰＣＲプローブの局在を示す概略図である。各プローブの下の線は、増幅されたＦ１２ ｍＲＮＡの領域を表す。 肝臓におけるすべてのＦ１２ ｍＲＮＡ領域の発現を実証するｑＰＣＲ分析の結果を示すが、全脳、海馬、および側頭葉ではエクソン７～１４の発現のみを示す。Ｆ１２の発現はＧＡＰＤＨに対して正規化され、肝臓レベルのパーセンテージとしてプロットされる。 ＧＴＥｘポータルからのＲＮＡｓｅｑデータが、ヒト肝臓のエクソン１からエクソン１４までの完全なＦ１２ ｍＲＮＡカバレッジを示すが、ヒト海馬および皮質では、エクソン７から１４までのカバレッジのみを示す。Ｆ１２エクソンは、遺伝子がマイナス鎖に存在するため、右から左に並べられている。データは２０１８年１２月にＧＴＥｘポータルから取得された。 ヒトおよびマウスのＦ１２遺伝子および転写産物を示すＵＣＳＣ Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｒｏｗｓｅｒ分析の概略図である。ヒトＦ１２には、マウスＦ１２に欠けているエクソン８～１２にまたがる１３６４塩基からなる大きなＣｐＧアイランド（ＣｐＧジヌクレオチド数＝１４１；６８．９％ＧＣ含量）があり、マウスでのＣｐＧアイランドは、１９というはるかに少ないＣｐＧ数を有し、２３１からなる。ＧｅｎＢａｎｋは、エクソン９から始まる５つのヒトＦ１２転写産物を示すが、これらはマウスＦ１２には存在しない。これらの５つの転写産物のうち、２つは実験的証拠によって裏付けられており、３つは合成である。エクソン９から始まるＦ１２転写産物のアクセッション番号は、ＢＣ０１２３９０、ＫＪ９０１４２２、ＫＲ７１０７２３、ＫＲ７１０７２４、およびＢＴ００７３５０である。データはＵＣＳＣ Ｇｅｎｏｍｅ ｂｒｏｗｓｅｒ（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ）から取得した。２０１３年１２月（ＧＲＣｈ３８／ｈｇ３８）アセンブリはヒトのデータに使用され、２０１１年１２月（ＧＲＣｍ３８／ｍｍ１０）アセンブリはマウスのデータに使用された。 ３つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の脳コードに見られるＦ１２ ｍＲＮＡを示し、ＯＲＦ１および２はβＦＸＩＩａ（Ｎ３３５～Ｓ５９６）と同様のタンパク質をコードしている。 ＦＸＩＩ２９７－５９６がカリクレインによる活性化により触媒活性を獲得し、プロＨＧＦをＨＧＦに変換できることを示す。 図９Ａでは、ＦＸＩＩ２９７－５９６をカリクレイン（１５ｎＭ）の非存在下でインキュベートし、ＦＸＩＩａ発色基質Ｓ－２３０２でＦＸＩＩ２９７－５９６の活性を測定する前に、カリクレイン活性をアプロチニンで阻害した。カリクレインとプレインキュベートされたＦＸＩＩ２９７－５９６からのシグナルは、ＦＸＩＩ２９７－５９６が省略されたサンプルでは活性が見られないため、残留カリクレイン活性によるものではない。平均±ＳＥＭが示される。 図９Ｂでは、ＦＸＩＩ（１．２５μＭ）をカテプシンＫ（Ｃａｔｈ Ｋ；１００ｎＭ）またはビヒクルとインキュベートし、反応産物を非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析した。約４０ｋＤａのＦＸＩＩ切断産物はＦＸＩＩ２９７－５９６を生成するＬ２９６とＭ２９７との間の切断が原因である可能性がある。カテプシンＫで切断されたＦＸＩＩの活性（３７５ｎＭのＦＸＩＩ、３０ｎＭのカテプシンＫ）は、発色基質アッセイによって分析された。カリクレインの活性化がない場合、カテプシンＫで切断されたＦＸＩＩの活性はごくわずかであり、カテプシンＫの切断だけでは活性なＦＸＩＩが生成されないことを示す。カリクレイン（１５ｎＭ）とインキュベートしたカテプシンで切断されたＦＸＩＩは、カリクレインとインキュベートした全長ＦＸＩＩよりもはるかに高い活性を示した。ＦＸＩＩ、カリクレイン、およびカテプシンＫ単独では、ごくわずかな活性しかなかった。平均±ＳＥＭが示される。 図９Ｃでは、プロＨＧＦ２５μｇ／ｍＬがＨＧＦＡおよびβＦＸＩＩａによって切断されたが、ｔＰＡまたはトロンビン（すべて５０ｎＭ）では切断されなかった。 図９Ｄでは、ＦＸＩＩ２９７－５９６（２２５ｎＭ）およびＦＸＩＩ（５０ｎＭ）がカリクレイン（１５ｎＭ）で活性化され、カリクレイン活性はプロＨＧＦ（２５μｇ／ｍＬ）とのインキュベーション前にアプロチニンで阻害された。プロＨＧＦは、カリクレイン活性化ＦＸＩＩ２９７－５９６およびカリクレイン活性化ＦＸＩＩ（矢印）によって切断されたが、不活性化カリクレイン単独では切断されなかった。ｔＰＡおよびＨＧＦＡ（２２５ｎＭ）は、陽性対照および陰性対照として含まれていた。 ヒトおよびマウス組織のＲＮＡｓｅｑデータを示す。図１０Ａは、２０１８年１２月にＧＴＥｘポータルから取得した選択したヒト組織でのＦ１２発現を示す。図１０Ｂは、Ｃ５７ＢＬ／６マウス組織のＲＮＡｓｅｑ分析から得られた選択したマウス組織におけるＦ１２発現を示す。グラフの縦線は、マップされた読み取り１００万当たりの転写産物のキロベース当たりの断片（ＦＰＫＭ）＝１を示す。 ヒトおよびマウス組織のＲＮＡｓｅｑデータを示す。図１０Ａは、２０１８年１２月にＧＴＥｘポータルから取得した選択したヒト組織でのＦ１２発現を示す。図１０Ｂは、Ｃ５７ＢＬ／６マウス組織のＲＮＡｓｅｑ分析から得られた選択したマウス組織におけるＦ１２発現を示す。グラフの縦線は、マップされた読み取り１００万当たりの転写産物のキロベース当たりの断片（ＦＰＫＭ）＝１を示す。 ＦＸＩＩ２９７－５９６（２２５ｎＭ）がカリクレイン（１５ｎＭ）で活性化され、カリクレイン活性がプレカリクレイン（２００ｎＭ）とのインキュベーション前にアプロチニンで阻害されたことを示す。プレカリクレインは、カリクレインで活性化されたＦＸＩＩ２９７－５９６によって切断されたが、不活性化されたカリクレインだけでは切断されなかった。ＦＸＩＩ２９７－５９６を活性化するために使用されるカリクレインのレベルが低いため、カリクレイン対照レーンではカリクレイン重鎖は観察されなかった。
定義
本明細書で互換的に使用される、「タンパク質」、「ポリペプチド」、および「ペプチド」という用語は、コード化および非コード化アミノ酸ならびに化学的または生化学的に改変または誘導体化したアミノ酸を含む、任意の長さのアミノ酸のポリマー形態を含む。これらの用語には、また、改変されたペプチド骨格を有するポリペプチドなどの改変されたポリマーが含まれる。「ドメイン」という用語は、特定の機能または構造を有するタンパク質またはポリペプチドの任意の部分を指す。
本明細書で互換的に使用される、「核酸」および「ポリヌクレオチド」という用語は、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、またはそれらの類似体もしくは改変バージョンを含む、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を含む。これらには、一本鎖、二本鎖、および多重鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド、およびプリン塩基、ピリミジン塩基、または他の天然、化学改変、生化学改変、非天然、もしくは誘導体化されたヌクレオチド塩基を含むポリマーが含まれる。
「ゲノムに組み込まれた」という用語は、ヌクレオチド配列が細胞のゲノムに組み込まれるように、細胞に導入されている核酸を指す。細胞のゲノムへの核酸の安定した組み込みのために、任意のプロトコルを使用してよい。
「標的化ベクター」という用語は、相同組換え、非相同末端結合媒介ライゲーション、または任意の他の組換え手段によって、細胞のゲノム中の標的位置に導入され得る組換え核酸を指す。
「ウイルスベクター」という用語は、ウイルス起源の少なくとも１つの要素を含み、ウイルスベクター粒子へのパッケージングに十分な、またはそれを許容する要素を含む組換え核酸を指す。ベクターおよび／または粒子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、または他の核酸を、インビトロ、エクスビボ、またはインビボで細胞に導入する目的で利用することができる。ウイルスベクターの多くの形態が知られている。
細胞、組織、タンパク質、および核酸に関して「分離された」という用語は、通常インサイチュで存在し得る他の細菌、ウイルス、細胞、または他の成分に関して比較的精製されている細胞、組織、タンパク質、および核酸、細胞、組織、タンパク質、および核酸の実質的に純粋な調製物までを含み、ならびにそれらの実質的に純粋な調製物を含む。「単離された」という用語はまた、天然に存在する対応物を有さず、化学的に合成され、それにより他の細胞、組織、タンパク質、および核酸が実質的に混入していないか、またはそれらに天然に付随する（例えば、他の細胞タンパク質、ポリヌクレオチド、もしくは他の成分）ほとんどの他の成分（例えば、細胞成分）から分離もしくは精製されているタンパク質および核酸も含む。
「野生型」という用語は、（変異体、病変した、改変したなどとは対照的に）正常な状態または文脈に見られるような構造および／または活性を有する実体を含む。野生型遺伝子およびポリペプチドは、多くの場合、複数の異なる形態（例えば、対立遺伝子）で存在する。
「内因性配列」という用語は、細胞または非ヒト動物内で自然に発生する核酸配列を指す。例えば、非ヒト動物の内因性Ｆ１２配列は、非ヒト動物のＦ１２遺伝子座で天然に存在する天然のＦ１２配列を指す。
「外因性」分子または配列には、その形態または位置（例えば、ゲノム遺伝子座）で細胞に通常は存在しない分子または配列が含まれる。通常の存在には、細胞の特定の発生段階および環境条件に関する存在が含まれる。外因性分子または配列には、例えば、内因性配列のヒト化バージョンなどの細胞内の対応する内因性配列の変異バージョンが含まれ得るか、または細胞内であるが、異なる形態の（すなわち、染色体内ではない）内因性配列に対応する配列が含まれ得る。対照的に、内因性分子または配列には、その形態および位置で、特定の細胞において、特定の発生段階で、特定の環境条件下で通常存在する分子または配列が含まれる。
核酸またはタンパク質の文脈で使用される場合の「異種」という用語は、核酸またはタンパク質が、同じ分子内で一緒に天然に存在しない少なくとも２つのセグメントを含むことを示す。例えば、「異種」という用語は、核酸のセグメントまたはタンパク質のセグメントに関して使用される場合、核酸またはタンパク質が、天然では互いに同じ関係で見出されない（例えば、一緒に連結された）２つ以上のサブ配列を含むことを示す。一例として、核酸ベクターの「異種」領域は、天然では他の分子と関連して見出されない別の核酸分子内の、またはそれに結合した核酸のセグメントである。例えば、核酸ベクターの異種領域は、天然のコード配列に関連して見出されない配列に隣接するコード配列を含むことができる。同様に、タンパク質の「異種」領域は、天然では他のペプチド分子と関連して見出されない別のペプチド分子内の、またはそれに結合したアミノ酸のセグメントである（例えば、融合タンパク質、またはタグを有するタンパク質）。同様に、核酸またはタンパク質は、異種標識または異種分泌または局在化配列を含むことができる。
「コドン最適化」は、アミノ酸を特定する多数の３塩基対コドンの組み合わせによって示されるように、コドンの縮重を利用し、一般に、天然アミノ酸配列を維持しながら、天然配列の少なくとも１つのコドンを、宿主細胞の遺伝子においてより頻繁にまたは最も頻繁に使用されるコドンで置き換えることによって、特定の宿主細胞における発現の増強のために核酸配列を改変するプロセスを含む。例えば、Ｃａｓ９タンパク質をコードする核酸を、天然に存在する核酸配列と比較すると、細菌細胞、酵母細胞、ヒト細胞、非ヒト細胞、哺乳動物細胞、齧歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、ハムスター細胞、または任意の他の宿主細胞を含む所与の原核細胞または真核細胞においてより高い使用頻度を有するコドンを置き換えるように改変することができる。コドン使用表は、例えば「コドン使用データベース」で容易に入手できる。これらの表は、様々な方法で適合させることができる。すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれるＮａｋａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２８：２９２を参照されたい。特定の宿主における発現のための特定の配列のコドン最適化のためのコンピュータアルゴリズム（例えば、Ｇｅｎｅ Ｆｏｒｇｅを参照のこと）もまた利用可能である。
「遺伝子座」という用語は、遺伝子（または重要な配列）、ＤＮＡ配列、ポリペプチドコード配列、または生物のゲノムの染色体上の位置の特定の位置を指す。例えば、「凝固因子ＸＩＩ遺伝子座」または「Ｆ１２遺伝子座」は、Ｆ１２遺伝子、Ｆ１２のＤＮＡ配列、凝固因子ＸＩＩをコードする配列、またはそのような配列が常駐すると同定されている生物のゲノムの染色体上のＦ１２の位置の特定の位置を指し得る。「Ｆ１２遺伝子座」は、例えば、エンハンサー、プロモーター、５’および／または３’非翻訳領域（ＵＴＲ）、またはそれらの組み合わせを含む、Ｆ１２遺伝子の調節エレメントを含み得る。
「遺伝子」という用語は、自然に存在する場合、少なくとも１つのコーディング領域と、少なくとも１つの非コーディング領域と、を含む可能性のある染色体内のＤＮＡ配列を指す。産物（例えば、非限定的に、ＲＮＡ産物および／またはポリペプチド産物）をコードする染色体中のＤＮＡ配列は、非コードイントロンで中断されたコード領域ならびに、５’端および３’端の両方のコード領域に隣接して位置する配列を含み得、遺伝子が全長のｍＲＮＡ（５’および３’の非翻訳配列を含む）に対応するようなる。さらに、調節配列を含む他の非コード配列（例えば、非限定的に、プロモーター、エンハンサー、および転写因子結合部位）、ポリアデニル化シグナル、配列内リボソーム進入部位、サイレンサー、絶縁配列、ならびにマトリックス結合領域も遺伝子に存在してもよい。これらの配列は、遺伝子のコード領域に近接（例えば、非限定的に、１０ｋｂ以内）してもよく、または離れていてもよく、それらは遺伝子の転写および翻訳のレベルまたは速度に影響を及ぼす。
「対立遺伝子」という用語は、遺伝子のバリアントを指す。いくつかの遺伝子は、染色体上の同じ位置、または遺伝子座に位置する様々な異なる形態を有する。二倍体生物は、各遺伝子座に２つの対立遺伝子を有する。対立遺伝子の各ペアは、特定の遺伝子座の遺伝子型を表す。遺伝子型は、特定の遺伝子座に２つの同一の対立遺伝子がある場合はホモ接合であり、２つの対立遺伝子が異なる場合はヘテロ接合であると記載される。
「プロモーター」は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩが特定のポリヌクレオチド配列のための適切な転写開始部位でＲＮＡ合成を開始することを指示することができるＴＡＴＡボックスを通常含むＤＮＡの調節領域である。プロモーターは、転写開始速度に影響を及ぼす他の領域をさらに含み得る。本明細書に開示されるプロモーター配列は、作動可能に連結されたポリヌクレオチドの転写を調節する。プロモーターは、本明細書に開示される１つ以上の細胞型（例えば、真核細胞、非ヒト哺乳動物細胞、ヒト細胞、げっ歯類細胞、多能性細胞、一細胞期胚、分化した細胞、またはそれらの組み合わせ）において活性であり得る。プロモーターは、例えば、構成的に活性なプロモーター、条件付きプロモーター、誘導性プロモーター、時間的に制限されたプロモーター（例えば、発生的に調節されたプロモーター）、または空間的に制限されたプロモーター（例えば、細胞特異的もしくは組織特異的プロモーター）であり得る。プロモーターの例は、例えば、ＷＯ２０１３／１７６７７２において見出すことができ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
誘導性プロモーターの例としては、例えば、化学的に調節されたプロモーターおよび物理的に調節されたプロモーターが挙げられる。化学的に調節されるプロモーターとしては、例えば、アルコール調節プロモーター（例えば、アルコールデヒドロゲナーゼ（ａｌｃＡ）遺伝子プロモーター）、テトラサイクリン調節プロモーター（例えば、テトラサイクリン応答性プロモーター、テトラサイクリンオペレーター配列（ｔｅｔＯ）、ｔｅｔ－Ｏｎプロモーター、もしくはｔｅｔ－Ｏｆｆプロモーター）、ステロイド調節プロモーター（例えば、ラットグルココルチコイド受容体、エストロゲン受容体のプロモーター、もしくはエクジソン受容体のプロモーター）、または金属調節プロモーター（例えば、金属タンパク質プロモーター）が挙げられる。物理的に調節されるプロモーターとしては、例えば、温度調節プロモーター（例えば、熱ショックプロモーター）、および光調節プロモーター（例えば、光誘導性プロモーターまたは光抑制性プロモーター）が挙げられる。
組織特異的プロモーターは、例えば、ニューロン特異的プロモーター、グリア特異的プロモーター、筋細胞特異的プロモーター、心臓細胞特異的プロモーター、腎臓細胞特異的プロモーター、骨細胞特異的プロモーター、内皮細胞特異的プロモーター、または免疫細胞特異的プロモーター（例えば、Ｂ細胞プロモーターもしくはＴ細胞プロモーター）であり得る。
発生的に調節されるプロモーターとしては、例えば、発生の胚段階の間のみ、または成体細胞においてのみ活性なプロモーターが挙げられる。
「作動可能な連結」または「作動可能に連結されている」とは、その両方の成分が正常に機能し、かつ構成要素の少なくとも１つが他の構成要素のうちの少なくとも１つに及ぶ機能を媒介し得る可能性を許すような、２つ以上の成分（例えば、プロモーターおよび別の配列要素）の並列を含む。例えば、プロモーターが、１つ以上の転写調節因子の存在または非存在に応じてコード配列の転写のレベルを制御する場合、そのプロモーターは、コード配列に作動可能に連結され得る。作動可能な連結は、そのような配列が相互に近接していること、またはトランスに作用する（例えば、調節配列が、コード配列の転写を制御するために離れて作用し得る）ことを含み得る。
核酸の「相補性」とは、核酸の一方の鎖のヌクレオチド配列が、その核酸塩基基の配向のために、反対側の核酸鎖の別の配列と水素結合を形成することを意味する。ＤＮＡの相補的塩基は通常ＡとＴ、およびＣとＧである。ＲＮＡでは通常ＣとＧ、およびＵとＡである。相補性は完全または実質的／十分であり得る。２つの核酸間の完全な相補性は、２つの核酸が二本鎖を形成することができ、二本鎖中のすべての塩基がワトソン－クリック対合によって相補的塩基に結合されることを意味する。「実質的」または「十分な」相補的とは、一方の鎖の配列が反対側の鎖の配列と完全にならびに／または完全に相補的ではないが、２つの鎖の塩基間で十分な結合が起こり、一連のハイブリダイゼーション条件（例えば、塩濃度および温度）で安定したハイブリッド複合体を形成することを意味する。このような条件は、配列および標準的な数学的計算を使用してハイブリダイズした鎖のＴｍ（融解温度）を予測するか、ルーチンの方法を使用してＴｍを経験的に決定することによって予測することができる。Ｔｍは、２つの核酸鎖の間に形成されたハイブリダイゼーション複合体の集団が５０％変性する（すなわち、二本鎖核酸分子の集団が一本鎖に半分解離する）温度を含む。Ｔｍより低い温度では、ハイブリダイゼーション複合体の形成に有利であるが、Ｔｍより高い温度では、ハイブリダイゼーション複合体中の鎖の融解または分離に有利である。他の既知のＴｍ計算は核酸の構造的特徴を考慮に入れるが、Ｔｍは、例えば、Ｔｍ＝８１．５＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）を使用することにより、１Ｍ ＮａＣｌ水溶液中の既知のＧ＋Ｃ含有量を有する核酸について推定することができる。
ハイブリダイゼーションは、２つの核酸が相補配列を含むことを必要とするが、塩基間のミスマッチが可能である。２つの核酸間のハイブリダイゼーションに適切な条件は、核酸の長さおよび相補性の程度に依存し、これらは既知の変数である。２つのヌクレオチド配列間の相補性の程度が大きいほど、それらの配列を有する核酸のハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）の値が大きくなる。短い区間の相補性（例えば、３５以下、３０以下、２５以下、２２以下、２０以下、または１８以下のヌクレオチドにわたる相補性）を有する核酸間のハイブリダイゼーションについて、ミスマッチの位置は、重要になる（上述のＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．の１１．７～－１１．８を参照）。典型的には、ハイブリダイズ可能な核酸の長さは少なくとも約１０ヌクレオチドである。ハイブリダイズ可能な核酸の例示的な最小の長さとしては、少なくとも約１５ヌクレオチド、少なくとも約２０ヌクレオチド、少なくとも約２２ヌクレオチド、少なくとも約２５ヌクレオチド、および少なくとも約３０ヌクレオチドが挙げられる。さらに、温度および洗浄液の塩濃度は、相補性の領域の長さおよび相補性の程度などの要因に従って、必要に応じて調整することができる。
ポリヌクレオチドの配列は、特異的にハイブリダイズするために、その標的核酸の配列と１００％相補的である必要はない。さらに、ポリヌクレオチドは、介在または隣接するセグメントがハイブリダイゼーションイベント（例えば、ループ構造もしくはヘアピン構造）に関与しないように、１つ以上のセグメントにわたってハイブリダイズすることができる。ポリヌクレオチド（例えば、ｇＲＮＡ）は、それらが標的とする標的核酸配列内の標的領域に対して、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％の配列相補性を含むことができる。例えば、２０ヌクレオチドのうち１８ヌクレオチドが標的領域に相補的であり、したがって特異的にハイブリダイズするｇＲＮＡは、９０％の相補性を表す。この例では、残りの非相補的ヌクレオチドは、相補的ヌクレオチドとともにクラスター化または散在している可能性があり、互いにまたは相補的ヌクレオチドに隣接している必要はない。
核酸内の特定の区間の核酸配列間の相補性パーセントは、ＢＬＡＳＴプログラム（基本的なローカルアラインメント検索ツール）およびＰｏｗｅｒＢＬＡＳＴプログラム（すべての目的のためにそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０、Ｚｈａｎｇ ａｎｄ Ｍａｄｄｅｎ（１９９７）Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．７：６４９－６５６）を使用するか、またはデフォルト設定を使用し、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれるＳｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ（１９８１）（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２－４８９のアルゴリズムを使用する、Ｇａｐプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ８ ｆｏｒ Ｕｎｉｘ（登録商標），Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋ，Ｍａｄｉｓｏｎ Ｗｉｓ．）を使用することによって日常的に決定され得る。
本明細書で提供される方法および組成物は、様々な異なる構成要素を使用する。説明全体の一部の構成要素は、活性バリアントおよびフラグメントを有することができる。このような構成要素には、例えば、Ｃａｓタンパク質、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、およびガイドＲＮＡが含まれる。これらの構成要素のそれぞれの生物学的活性は、本明細書の他の場所に記載されている。「機能性」という用語は、生物学的活性または機能を示すタンパク質または核酸（またはそのフラグメント、もしくはバリアント）の生来の能力を指す。そのような生物学的活性または機能には、例えば、Ｃａｓタンパク質がガイドＲＮＡおよび標的ＤＮＡ配列に結合する能力が含まれ得る。機能的断片またはバリアントの生物学的機能は、元の分子と比較して同じであるか、または実際に変更され得る（例えば、それらの特異性または選択性または有効性に関して）が、分子の基本的な生物学的機能を保持する。
「バリアント」という用語は、集団で最も一般的な配列とは異なるヌクレオチド配列（例えば、１ヌクレオチド）、または集団で最も一般的な配列とは異なるタンパク質配列（例えば、１アミノ酸）を指す。
「断片」という用語は、タンパク質に言及する場合、全長タンパク質よりも短いか、または少ないアミノ酸を有するタンパク質を意味する。「断片」という用語は、核酸に言及する場合、全長の核酸よりも短いか、または少ないヌクレオチドを有する核酸を意味する。断片は、例えば、Ｎ末端断片（すなわち、タンパク質のＣ末端の一部の除去）、Ｃ末端断片（すなわち、タンパク質のＮ末端の一部の除去）、または内部断片（すなわち、タンパク質のＮ末端およびＣ末端のそれぞれの一部の除去）であり得る。断片は、例えば、核酸断片を指す場合、５’断片（すなわち、核酸の３’末端の一部の除去）、３’断片（すなわち、核酸の５’末端の一部の除去）、または内部断片（すなわち、核酸の５’末端および３’末端のそれぞれの一部の除去）であり得る。
２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の文脈における「配列同一性」または「同一性」は、特定の比較ウィンドウで最大の一致のためにアラインさせる場合、同じである２つの配列の残基を指す。タンパク質に関して、配列同一性のパーセンテージを使用する場合、同一ではない残基位置は多くの場合に、保存的アミノ酸置換によって異なり、アミノ酸残基は、同様の化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を有する他のアミノ酸残基で置換されており、したがって、分子の機能特性を変化させない。配列が保存的置換で異なる場合、配列同一性パーセントを、置換の保存的性質について補正するために、上方に調整してもよい。そのような保存的置換によって異なる配列は、「配列類似性」または「類似性」を有すると言われる。この調整を行う手段は、周知である。典型的には、これは、保存的置換を完全なミスマッチではなく部分的なミスマッチとしてスコアリングして、それによって、配列同一性パーセンテージを増加させることを含む。したがって、例えば、同一のアミノ酸が１のスコアを与えられ、非保存的置換がゼロのスコアを与えられる場合に、保存的置換は、ゼロから１の間のスコアを与えられる。保存的置換のスコアリングは、例えば、プログラムＰＣ／ＧＥＮＥ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）で実行されるように計算される。
「配列同一性のパーセンテージ」は、比較ウィンドウにわたって２つの最適にアラインされた配列（完全にマッチする残基の数が最大）を比較することによって決定される値を含み、比較ウィンドウにおけるポリヌクレオチド配列の部分は、２つの配列の最適アラインメントのための（付加または欠失を含まない）参照配列と比較した場合に、付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含んでもよい。パーセンテージは、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両方の配列中に発生する位置の数を決定して一致した位置の数を得ることと、一致した位置の数を比較のウィンドウにおける位置の総数で割ることと、結果に１００を掛けて配列同一性のパーセンテージを得ることと、によって計算される。特に明記しない限り（例えば、短い方の配列が、連結された非相同配列を含む）、比較ウィンドウは、比較される２つの配列のうちの短い方の全長である。
特に明記しない限り、配列同一性／類似性の値は、パラメーター：５０のＧＡＰ重量および３の長さ重量、ならびにｎｗｓｇａｐｄｎａ．ｃｍｐスコアリングマトリックスを使用するヌクレオチド配列の同一性％および類似性％；８のＧＡＰ重量および２の長さ重量、ならびにＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを使用するアミノ酸配列の同一性％および類似性％；またはその任意の同等のプログラムを使用し、ＧＡＰバージョン１０を使用して得られた値を含む。「同等のプログラム」は、問題の任意の２つの配列について、ＧＡＰバージョン１０によって生成された対応するアラインメントと比較した場合、同一のヌクレオチドまたはアミノ酸残基の一致および同一のパーセント配列同一性を有するアラインメントを生成する任意の配列比較プログラムを含む。
「保存的アミノ酸置換」という用語は、配列中に通常存在するアミノ酸の、類似のサイズ、電荷、または極性の、異なるアミノ酸との置換を指す。保存的置換の例には、イソロイシン、バリン、またはロイシンなどの非極性（疎水性）残基の、別の非極性残基との置換が含まれる。同様に、保存的置換の例には、アルギニンとリジンとの間、グルタミンとアスパラギンとの間、またはグリシンとセリンとの間などの、１つの極性（親水性）残基の別のものとの置換が含まれる。加えて、リシン、アルギニン、もしくはヒスチジンなどの塩基性残基から別のものへの置換、またはアスパラギン酸もしくはグルタミン酸などのある酸性残基から別の酸性残基への置換は、保存的置換の追加の例である。非保存的置換の例には、非極性（疎水性）アミノ酸残基、例えば、イソロイシン、バリン、ロイシン、アラニン、またはメチオニンから極性（親水性）残基、例えば、システイン、グルタミン、グルタミン酸、またはリシンへの、および／または極性残基から非極性残基への置換が含まれる。典型的なアミノ酸の分類は、以下の表１に要約されている。
Figure 2022528414000002
「相同」配列（例えば、核酸配列）としては、例えば、既知の参照配列と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一であるような、既知の参照配列と同一か、または実質的に同様である配列が挙げられる。相同配列は、例えば、オーソロガス配列およびパラロガス配列を含み得る。例えば、相同遺伝子は通常、種分化イベント（オーソロガス遺伝子）または遺伝子重複イベント（パラロガス遺伝子）のいずれかを介して、共通の祖先ＤＮＡ配列から派生する。「オーソロガス」遺伝子には、種分化によって共通の祖先遺伝子から進化した様々な種の遺伝子が含まれる。オーソログは通常、進化の過程で同じ機能を保持する。「パラロガス」遺伝子には、ゲノム内の重複によって関連する遺伝子が含まれる。パラログは、進化の過程で新しい機能を進化させることができる。
「インビトロ」という用語は、人工環境、および人工環境（例えば、試験管または単離された細胞もしくは細胞株）内で生じるプロセスまたは反応を含む。「インビボ」という用語は、天然環境（例えば、細胞または生物もしくは身体）、および天然環境内で生じるプロセスまたは反応を指す。「エクスビボ」という用語は、個体の体から取り出された細胞、およびそのような細胞内で起こるプロセスまたは反応を含む。
「レポーター遺伝子」という用語は、異種プロモーターおよび／またはエンハンサーエレメントに作動可能に連結されたレポーター遺伝子配列を含むコンストラクトがプロモーターおよび／またはエンハンサーエレメントの活性化に必要な因子を含む（または含むようにすることができる）細胞に導入される場合、容易かつ定量的にアッセイされる遺伝子産物（典型的には酵素）をコードする配列を有する核酸を指す。レポーター遺伝子の例としては、ベータガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）をコードする遺伝子、細菌のクロランフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ｃａｔ）遺伝子、ホタルルシフェラーゼ遺伝子、ベータグルクロニダーゼ（ＧＵＳ）をコードする遺伝子、および蛍光タンパク質をコードする遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。「レポータータンパク質」は、レポーター遺伝子によってコードされるタンパク質を指す。
本明細書で使用される場合、「蛍光レポータータンパク質」という用語は、蛍光に基づいて検出可能なレポータータンパク質を意味し、ここで、蛍光は、レポータータンパク質から直接、蛍光発生基質に対するレポータータンパク質の活性、または蛍光タグ付き化合物への結合について親和性を有するタンパク質のいずれかからのものであり得る。蛍光タンパク質の例としては、緑色蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ、ＧＦＰ－２、ｔａｇＧＦＰ、ｔｕｒｂｏＧＦＰ、ｅＧＦＰ、Ｅｍｅｒａｌｄ、Ａｚａｍｉ Ｇｒｅｅｎ、単量体Ａｚａｍｉ Ｇｒｅｅｎ、ＣｏｐＧＦＰ、ＡｃｅＧＦＰ、およびＺｓＧｒｅｅｎｌ）、黄色蛍光タンパク質（例えば、ＹＦＰ、ｅＹＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、ＰｈｉＹＦＰ、およびＺｓＹｅｌｌｏｗｌ）、青色蛍光タンパク質（例えば、ＢＦＰ、ｅＢＦＰ、ｅＢＦＰ２、Ａｚｕｒｉｔｅ、ｍＫａｌａｍａｌ、ＧＦＰｕｖ、Ｓａｐｐｈｉｒｅ、およびＴ－ｓａｐｐｈｉｒｅ）、シアン色蛍光タンパク質（例えば、ＣＦＰ、ｅＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ＣｙＰｅｔ、ＡｍＣｙａｎｌ、およびＭｉｄｏｒｉｉｓｈｉ－Ｃｙａｎ）、赤色蛍光タンパク質（例えば、ＲＦＰ、ｍＫａｔｅ、ｍＫａｔｅ２、ｍＰｌｕｍ、ＤｓＲｅｄモノマー、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＲＦＰ１、ＤｓＲｅｄ－Ｅｘｐｒｅｓｓ、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄモノマー、ＨｃＲｅｄ－Ｔａｎｄｅｍ、ＨｃＲｅｄｌ、ＡｓＲｅｄ２、ｅｑＦＰ６１１、ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、およびＪｒｅｄ）、オレンジ色蛍光タンパク質（例えば、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、Ｋｕｓａｂｉｒａ－Ｏｒａｎｇｅ、単量体Ｋｕｓａｂｉｒａ－Ｏｒａｎｇｅ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、およびｔｄＴｏｍａｔｏ）、ならびにフローサイトメトリー法で細胞内の存在を検出できるその他の好適な蛍光タンパク質メソッドが挙げられる。
二本鎖切断（ＤＳＢ）に応答した修復は、主に２つの保存されたＤＮＡ修復経路である相同組換え（ＨＲ）および非相同末端結合（ＮＨＥＪ）を介して生じる。すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｋａｓｐａｒｅｋ＆Ｈｕｍｐｈｒｅｙ（２０１１）Ｓｅｍｉｎ．Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２２（８）：８８６－８９７を参照されたい。同様に、外因性ドナー核酸によって媒介される標的核酸の修復は、２つのポリヌクレオチド間の遺伝情報の交換の任意のプロセスを含み得る。
「組換え」という用語は、２つのポリヌクレオチド間で遺伝情報を交換する任意のプロセスを含み、任意のメカニズムによって起こり得る。組換えは、相同組換え修復（ＨＤＲ）または相同組換え（ＨＲ）を介して起こり得る。ＨＤＲまたはＨＲには、ヌクレオチド配列の相同性を必要とする可能性のある核酸修復の形式が含まれ、「標的」分子（すなわち、二本鎖切断を経験した分子）の修復のテンプレートとして「ドナー」分子を使用し、ドナーから標的への遺伝情報の伝達をもたらす。いかなる特定の理論に拘束されることを望まないが、そのような伝達は、切断された標的とドナーとの間に形成されるヘテロ二本鎖ＤＮＡのミスマッチ補正、および／または標的の一部となる遺伝情報を再合成するためにドナーが使用される合成依存性鎖アニーリングおよび／または関連プロセスを含み得る。場合によっては、ドナーポリヌクレオチド、ドナーポリヌクレオチドの一部、ドナーポリヌクレオチドのコピー、またはドナーポリヌクレオチドのコピーの一部が標的ＤＮＡに組み込まれる。すべての目的のためにそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｃｅｌｌ １５３：９１０－９１８、Ｍａｎｄａｌｏｓ ｅｔ ａｌ．（２０１２）ＰＬｏＳ ＯＮＥ ７：ｅ４５７６８：１９、およびＷａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１：５３０－５３２を参照されたい。
非相同末端結合（ＮＨＥＪ）は、相同テンプレートを必要とせずに、切断末端を互いにまたは外因性配列への直接ライゲーションによる、核酸における二本鎖切断の修復を含む。ＮＨＥＪによる非隣接配列のライゲーションは、多くの場合、二本鎖切断部位の近くで欠失、挿入、または転座を引き起こす可能性がある。例えば、ＮＨＥＪはまた、切断末端を外因性ドナー核酸の末端と直接ライゲーションすること（すなわち、ＮＨＥＪベースの捕捉）により、外因性ドナー核酸の標的化された組み込みをもたらすことができる。このようなＮＨＥＪを介した標的組み込みは、相同組換え修復（ＨＤＲ）経路が容易に使用できない場合（例えば、非分裂細胞、一次細胞、および相同性に基づくＤＮＡ修復を不十分に行う細胞）、外因性ドナー核酸の挿入に適している。さらに、相同組換え修復とは対照的に、切断部位に隣接する配列同一性の大きな領域に関する知識は必要なく、これは、ゲノム配列の知識が限られているゲノムを有する生物への標的化挿入を試みるときに有益である。組み込みは、外因性ドナー核酸と切断されたゲノム配列との間の平滑末端のライゲーションを介して、または切断されたゲノム配列のヌクレアーゼ剤によって生成されたものと互換性がある突出に隣接する外因性ドナー核酸を使用する突出末端（すなわち、５’または３’突出を有する）のライゲーションを介して進行することができる。例えば、すべての目的のためにそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ２０１１／０２０７２２、ＷＯ２０１４／０３３６４４、ＷＯ２０１４／０８９２９０、およびＭａｒｅｓｃａ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．２３（３）：５３９－５４６を参照されたい。平滑末端がライゲーションされる場合、断片結合に必要なマイクロホモロジーの領域を生成するために標的および／またはドナー切除が必要になる場合があり、これにより標的配列に望ましくない変化が生じる可能性がある。
「抗原結合タンパク質」という用語には、抗原に結合する任意のタンパク質が含まれる。抗原結合タンパク質の例としては、抗体、抗体の抗原結合断片、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、ｓｃＦＶ、ビスｓｃＦＶ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、Ｖ－ＮＡＲ、ＶＨＨ、ＶＬ、Ｆ（ａｂ）、Ｆ（ａｂ）２、ＤＶＤ（デュアル可変ドメイン抗原結合タンパク質）、ＳＶＤ（単一可変ドメイン抗原結合タンパク質）、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）、またはデイビスボディが含まれる（すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，５８６，７１３号）。
１つ以上の列挙された要素を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」組成物または方法は、具体的に列挙されていない他の要素を含み得る。例えば、タンパク質を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」または「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」組成物は、タンパク質を単独で、または他の成分との組み合わせで含有し得る。「本質的にからなる」という移行句は、請求項の範囲が、請求項に記載された特定の要素、および請求された発明の基本的かつ新規の特性に実質的に影響を及ぼさない要素を包含すると解釈されることを意味する。したがって、本発明の請求項で使用される場合の「本質的にからなる」という用語は、「含む」と同等であると解釈されることを意図するものではない。
「任意選択的の」または「任意選択で」は、引き続いて記載された事象または状況が起こっても起こらなくてもよく、その記載が、当該事象または状況が起こる場合の例およびそれが起こらない場合の例を含むことを意味する。
値の範囲の指定は、その範囲内の、またはその範囲を定義するすべての整数、およびその範囲内の整数によって定義されるすべての部分範囲を含む。
文脈から特に明らかでない限り、「約」という用語は記載された値の±５である値を包含する。
「および／または」という用語は、関連する列挙される項目のうちの１つ以上の任意およびすべての可能な組み合わせ、代替物（「または」）で解釈されるときの組み合わせの欠如を指し、これらを包含する。
「または」という用語は、特定のリストの任意の１つのメンバーを指し、そのリストのメンバーの任意の組み合わせも含む。
冠詞「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」の単数形は、文脈が別段に明確に規定していない限り、複数形の言及を含む。例えば、「タンパク質」または「少なくとも１つのタンパク質」という用語は、それらの混合物を含む複数のタンパク質を含むことができる。
統計的に有意なとは、ｐ≦０．０５を意味する。
（発明を実施するための形態）
Ｉ．概要
本明細書に開示されるのは、ヒト化凝固因子ＸＩＩ（Ｆ１２）遺伝子座を含む非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞、および非ヒト動物、ならびにそのような非ヒト動物細胞および非ヒト動物を使用する方法である。非ヒト動物Ｆ１２遺伝子をヒト化する標的化遺伝子改変を含むヒト化非ヒト動物Ｆ１２遺伝子、ならびに非ヒト動物Ｆ１２遺伝子のヒト化に使用するためのヌクレアーゼ剤および標的化ベクターも本明細書に開示される。非ヒト動物細胞またはヒト化Ｆ１２遺伝子座を含む非ヒト動物は、ヒト凝固因子ＸＩＩタンパク質またはヒト凝固因子ＸＩＩタンパク質の１つ以上の断片を含むキメラ凝固因子ＸＩＩタンパク質を発現する。そのような非ヒト動物細胞および非ヒト動物を使用して、インビトロ、エクスビボ、またはインビボで、ヒト凝固因子ＸＩＩ標的化剤（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ゲノム編集剤もしくは抗原結合タンパク質）の送達または有効性を評価することができ、インビトロ、エクスビボ、またはインビボでそのような薬剤の有効性の送達を最適化する方法で使用することができる。
本明細書に開示される非ヒト動物細胞および非ヒト動物のいくつかにおいて、ヒトＦ１２ゲノムＤＮＡのほとんどまたはすべては、対応するオーソロガスな非ヒト動物Ｆ１２遺伝子座に挿入される。本明細書に開示される非ヒト動物細胞および非ヒト動物のいくつかでは、非ヒト動物Ｆ１２ゲノムＤＮＡのほとんどまたはすべては、対応するオーソロガスなヒトＦ１２ゲノムＤＮＡと１対１で置き換えられている。保存された調節エレメントは無傷のままである可能性が高く、ＲＮＡプロセシングを受けるスプライシングされた転写産物はｃＤＮＡよりも安定しているため、ｃＤＮＡが挿入された非ヒト動物と比較して、イントロン－エクソン構造およびスプライシング機構が維持されている場合、発現レベルは高くなるはずである。対照的に、非ヒト動物のＦ１２遺伝子座へのヒトＦ１２ ｃＤＮＡの挿入は、保存された調節エレメントを廃止する。非ヒト動物ゲノム配列を対応するオーソロガスなヒトゲノム配列で置き換えるか、または対応するオーソロガスな非ヒトＦ１２遺伝子座にヒトＦ１２ゲノム配列を挿入することは、内因性Ｆ１２遺伝子座からの導入遺伝子の忠実な発現をもたらす可能性が高い。例えば、ヒトＦ１２ゲノム配列は、（マウスＦ１２ゲノム配列と比較して）異なる内部調節エレメントを持ち、ニューロンでより短いアイソフォームの発現を促進する。これは、Ｆ１２ヒト化マウスで再現される表現型である。内因性の非ヒト動物Ｆ１２遺伝子座ではなくランダムなゲノム遺伝子座にヒト凝固因子ＸＩＩコード配列をトランスジェニック挿入したトランスジェニック非ヒト動物も、Ｆ１２発現の内因性調節を正確に反映しない。非ヒト動物ゲノムＤＮＡのほとんどまたはすべてを対応するオーソロガスなヒトゲノムＤＮＡで１対１で置き換えるか、対応するオーソロガスな非ヒトＦ１２遺伝子座にヒトＦ１２ゲノム配列を挿入することにより生じるヒト化Ｆ１２対立遺伝子は、真のヒト標的またはヒト凝固因子ＸＩＩ標的化試薬（例えば、ヒトＦ１２を標的化するように設計されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９試薬、またはヒト凝固因子ＸＩＩを標的とするように設計された抗体または小分子）の真のヒト標的の近似値を提供し、これにより、ヒト化タンパク質およびヒト化遺伝子が存在する凝固因子ＸＩＩおよびＦ１２の唯一のバージョンである状況での、生きている動物におけるそのような薬剤の有効性および作用様式、ならびに薬物動態学的および薬物動態学的研究の試験を可能にする。
ＩＩ．ヒト化凝固因子ＸＩＩ（Ｆ１２）遺伝子座を含む非ヒト動物
本明細書に開示される非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞、および非ヒト動物は、ヒト化凝固因子ＸＩＩ（Ｆ１２）遺伝子座を含む。ヒト化Ｆ１２遺伝子座を含む細胞または非ヒト動物は、ヒト凝固因子ＸＩＩタンパク質または部分的にヒト化されたキメラ凝固因子ＸＩＩタンパク質を発現し、天然凝固因子ＸＩＩタンパク質の１つ以上の断片がヒト凝固因子ＸＩＩからの対応する断片で置き換えられている。
Ａ．凝固因子ＸＩＩ（Ｆ１２）
本明細書に記載の細胞および非ヒト動物は、ヒト化凝固因子ＸＩＩ（Ｆ１２）遺伝子座を含む。凝固因子ＸＩＩ（第ＸＩＩ因子、ＦＸＩＩ、ハーゲマン因子、ベータ因子ＸＩＩａパート１、ベータ因子ＸＩＩａパート２、凝固因子ＸＩＩａ重鎖、または凝固因子ＸＩＩａ軽鎖としても知られている）は、Ｆ１２遺伝子（ＦＸＩＩ、ＨＡＥ３、ＨＡＥＸ、またはＨＡＦとして知られている）によってコードされる。凝固因子ＸＩＩは肝臓の肝細胞によって合成され、循環系に分泌され、そこで接触活性化システムを開始する。通常、循環に限定されると考えられているが、第ＸＩＩ因子タンパク質はアルツハイマー病および多発性硬化症の患者の脳で見出されており、接触系の活性化は人間の脳および脳脊髄液で観察されている。凝固因子ＸＩＩは、接触活性化システムを開始する循環セリンプロテアーゼである。負に帯電した表面または血漿カリクレインによる第ＸＩＩ因子の活性化は、活性化された第ＸＩＩ因子（第ＸＩＩａ因子）を生成する。第ＸＩＩａ因子は、内因性の凝固カスケードを開始し、トロンビンの生成および血餅の形成をもたらす。第ＸＩＩａ因子はまた、血漿プレカリクレインをカリクレインに変換し、カリクレイン－キニン経路を活性化して、血管作用性および炎症性ペプチドであるブラジキニンを放出する。これらのよく研究された機能に加えて、第ＸＩＩａ因子はインビトロで肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）および補体系を活性化することも示されている。第ＸＩＩ因子は一本鎖チモーゲンとして循環し、活性化中にＲ３５３で切断されると、酵素的に活性な２本鎖分子（αＦＸＩＩａ）になる。αＦＸＩＩａはさらに処理されてβＦＸＩＩａになる。これは、触媒ドメインを含む軽鎖と、重鎖のごく一部のみと、で構成されている。
ヒトＦ１２は第５染色体上の５ｑ３５．３に位置する（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ Ｇｅｎｅ ＩＤ ２１６１、アセンブリＧＲＣｈ３８．ｐ１２（ＧＣＦ＿０００００１４０５．３８）、位置ＮＣ＿０００００５．１０（１７７４０２１３８．．１７７４０９５７６相補体））。この遺伝子は１４個のエクソンを有すると報告されている。野生型ヒト凝固因子ＸＩＩタンパク質には、ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ００７４８が割り当てられている。１つのアイソフォームであるＰ００７４８－１（ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿０００４９６．２と同一）の配列は、配列番号４６に記載されている。このアイソフォームをコードするｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ）にはＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿０００５０５．３が割り当てられ、配列番号３４に記載されている。このアイソフォームの例示的なコード配列（ＣＤＳ）には、ＣＣＤＳ ＩＤ ＣＣＤＳ３４３０２．１が割り当てられ、配列番号４８に記載されている。位置６１９がエクソン６のＣである別の例示的なＣＤＳ（ｒｓ１７８７６０３０；ｃ．６１９Ｇ＞Ｃ；ｐ．Ａｌａ２０７Ｐｒｏ）は、配列番号１３に示され、配列番号５に示されるタンパク質をコードする。配列番号５に示される完全長のヒト凝固因子ＸＩＩタンパク質は、シグナルペプチド（アミノ酸１～１９）、重鎖（アミノ酸２０～３７２）、および軽鎖（アミノ酸３７３～６１５）を含む６１５個のアミノ酸を有する。同様に、配列番号４６に示される完全長のヒト凝固因子ＸＩＩタンパク質は、シグナルペプチド（アミノ酸１～１９）、重鎖（アミノ酸２０～３７２）、および軽鎖（アミノ酸３７３～６１５）を含む６１５個のアミノ酸を有する。これらのドメイン間の描写は、ＵｎｉＰｒｏｔで指定されているとおりである。ヒト凝固因子ＸＩＩまたはＦ１２への言及には、標準（野生型）型、ならびにすべての対立遺伝子型およびアイソフォームが含まれる。ヒト凝固因子ＸＩＩの他の任意の形態は、野生型形態（配列番号５または４６）との最大のアラインメントのために番号が付けられたアミノ酸を有し、アラインメントされたアミノ酸は同じ番号で示される。
マウスＦ１２は第１３染色体上の１３；１３ Ｂ１に位置する（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ Ｇｅｎｅ ＩＤ ５８９９２；アセンブリＧＲＣｍ３８．ｐ４（ＧＣＦ＿０００００１６３５．２４）；位置ＮＣ＿００００７９（５５４１７９５８．．５５４２６８０４相補体））。この遺伝子は１４個のエクソンを有すると報告されている。野生型マウス凝固因子ＸＩＩタンパク質には、ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｑ８０ＹＣ５が割り当てられている。マウス凝固因子ＸＩＩ（ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿０６７４６４．２と同一）の配列は、配列番号１に記載されている。標準型アイソフォーム（配列番号１）をコードする例示的なｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ）には、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿０２１４８９．３が割り当てられ、配列番号３３に記載されている。例示的なコード配列（ＣＤＳ）（ＣＣＤＳ ＩＤ ＣＣＤＳ３６６７５．１）は、配列番号９に示されている。配列番号１に示される標準的な全長マウス凝固因子ＸＩＩタンパク質は、シグナルペプチド（アミノ酸１～１９）、重鎖（アミノ酸２０～３５４）および軽鎖（アミノ酸３５５～５９７）を含む５９７個のアミノ酸を有する。これらのドメイン間の描写は、ＵｎｉＰｒｏｔで指定されているとおりである。マウス凝固因子ＸＩＩまたはＦ１２への言及には、標準（野生型）型、ならびにすべての対立遺伝子型およびアイソフォームが含まれる。マウス凝固因子ＸＩＩの他の任意の形態は、野生型形態との最大のアラインメントのために番号が付けられたアミノ酸を有し、アラインメントされたアミノ酸は同じ番号で示される。
他の多くの非ヒト動物の凝固因子ＸＩＩ配列も知られている。これらには、例えば、ラット（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｄ３ＺＴＥ０；ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ Ｇｅｎｅ ＩＤ３０６７６１）、ウシ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ９８１４０；ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ Ｇｅｎｅ ＩＤ２８０７８９）、モルモット（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｑ０４９６２）、およびブタ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｏ９７５０７；ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ Ｇｅｎｅ ＩＤ ３９７４７４）が含まれる。
Ｂ．ヒト化Ｆ１２遺伝子座
ヒト化Ｆ１２遺伝子座は、内因性Ｆ１２遺伝子座のセグメントが削除され、オーソロガスなヒトＦ１２配列で置き換えられたＦ１２遺伝子座である。ヒト化Ｆ１２遺伝子座は、Ｆ１２遺伝子全体が対応するオーソロガスなヒトＦ１２配列で置き換えられるＦ１２遺伝子座であり得るか、またはＦ１２遺伝子の一部のみが対応するオーソロガスなヒトＦ１２配列で置き換えられるＦ１２遺伝子座であり得る（すなわち、ヒト化）。代替的に、ヒト化Ｆ１２遺伝子座は、オーソロガスなヒトＦ１２遺伝子座の一部が挿入されているＦ１２遺伝子座であり得るか、またはＦ１２遺伝子の一部が削除され、オーソロガスなヒトＦ１２遺伝子座の一部が挿入されているＦ１２遺伝子座であり得る。挿入されるオーソロガスなヒトＦ１２遺伝子座の部分は、例えば、内因性Ｆ１２遺伝子座から削除されるよりも多くのヒトＦ１２遺伝子座を含むことができる。例えば、内因性Ｆ１２遺伝子座のＦ１２コード配列全体を削除して、対応するヒトＦ１２配列に置き換えることができる。内因性Ｆ１２配列の特定のセグメントに対応するヒトＦ１２配列は、ヒトＦ１２および内因性Ｆ１２が最適に整列される（完全に一致する残基の最大数）ときに内因性Ｆ１２配列の特定のセグメントと整列するヒトＦ１２の領域を指す。対応するオーソロガスなヒト配列は、例えば、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）またはゲノムＤＮＡを含み得る。任意選択で、対応するオーソロガスなヒトＦ１２配列は、非ヒト動物におけるコドン使用頻度に基づいてコドン最適化されるように改変される。置換された（すなわち、ヒト化された）領域は、エクソンなどのコード領域、イントロン、非翻訳領域、または調節領域（例えば、プロモーター、エンハンサー、もしくは転写リプレッサー結合要素）などの非コード領域、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。一例として、ヒトＦ１２遺伝子の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４個すべてのエクソンに対応するエクソンをヒト化することができる。例えば、ヒトＦ１２遺伝子のすべてのエクソン（すなわち、エクソン１～１４）に対応するエクソンをヒト化することができる。同様に、ヒトＦ１２遺伝子の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、または１３個すべてのイントロンに対応するイントロンを、ヒト化することも、内因性のままにすることもできる。例えば、ヒトＦ１２遺伝子のすべてのイントロン（すなわち、イントロン１～１３）に対応するイントロンをヒト化することができる。調節配列を含む隣接非翻訳領域は、ヒト化することも、内因性のままにすることもできる。例えば、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）、３’ＵＴＲ、もしくは５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲの両方をヒト化することができ、または５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、もしくは５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲの両方を内因性のままにすることができる。特定の例では、５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲの両方が内因性のままである。オーソロガスな配列による置換の程度に応じて、プロモーターなどの調節配列は、内因性であるか、または置換するヒトのオーソロガスな配列によって供給され得る。例えば、ヒト化Ｆ１２遺伝子座は、内因性非ヒト動物Ｆ１２プロモーターを含むことができる（すなわち、ヒトＦ１２配列は、内因性非ヒト動物プロモーターに作動可能に連結され得る）。
シグナルペプチド、重鎖、もしくは軽鎖をコードする１つ以上もしくはすべての領域をヒト化することができ、またはそのような領域の１つ以上を内因性のままにすることができる。マウス凝固因子ＸＩＩシグナルペプチド、重鎖、および軽鎖の例示的なコード配列は、それぞれ配列番号１０～１２に記載されている。ヒト凝固因子ＸＩＩシグナルペプチド、重鎖、および軽鎖の例示的なコード配列は、それぞれ配列番号１４～１６に記載されている。ヒト凝固因子ＸＩＩ重鎖の別の例示的なコード配列は、配列番号４９に示されている。
例えば、シグナルペプチドをコードするＦ１２遺伝子座の領域の全部もしくは一部をヒト化することができ、および／または重鎖をコードするＦ１２遺伝子座の領域の全部もしくは一部をヒト化することができ、および／または軽鎖をコードするＦ１２遺伝子座の領域の全部もしくは一部をヒト化することができる。代替的に、または追加的に、シグナルペプチドをコードするＦ１２遺伝子座の領域の全部もしくは一部を内因性のままにすることができ、および／または重鎖をコードするＦ１２遺伝子座の領域の全部もしくは一部を内因性のままにすることができ、および／または軽鎖をコードするＦ１２遺伝子座の領域の全部もしくは一部を内因性のままにすることができる。一例では、シグナルペプチド、重鎖、および軽鎖をコードするＦ１２遺伝子座の領域の全部または一部がヒト化されている。任意選択で、Ｆ１２遺伝子座のヒト化領域のＣＤＳは、配列番号１３（もしくはその縮重）に対して、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、もしくは約１００％同一である配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれらからなる。任意選択で、Ｆ１２遺伝子座のヒト化領域のＣＤＳは、配列番号４８（もしくはその縮重）に対して、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、もしくは約１００％同一である配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれらからなる。任意選択で、Ｆ１２遺伝子座のヒト化領域は、配列番号３１および／または３２に対して、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一である配列を含む。任意選択で、ヒト化Ｆ１２遺伝子座は、配列番号５もしくは４６に対して、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、もしくは約１００％同一である配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれらからなるタンパク質をコードする。任意選択で、ヒト化Ｆ１２遺伝子座は、配列番号１７もしくは１８に対して、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、もしくは約１００％同一である配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれらからなる。いずれの場合も、ヒト化凝固因子ＸＩＩタンパク質は、天然凝固因子ＸＩＩタンパク質および／またはヒト凝固因子ＸＩＩタンパク質の活性を保持することができる。
ヒト化Ｆ１２遺伝子座によってコードされる凝固因子ＸＩＩタンパク質は、ヒト凝固因子ＸＩＩタンパク質に由来する１つ以上のドメイン、および／または内因性（すなわち、天然）凝固因子ＸＩＩタンパク質に由来する１つ以上のドメインを含み得る。マウス凝固因子ＸＩＩシグナルペプチド、重鎖、および軽鎖の例示的なアミノ酸配列は、それぞれ配列番号２～４に記載されている。ヒト凝固因子ＸＩＩシグナルペプチド、重鎖、および軽鎖の例示的なアミノ酸配列は、それぞれ配列番号６～８に記載されている。ヒト凝固因子ＸＩＩ重鎖の別の例示的なアミノ酸配列は、配列番号４７に示されている。
凝固因子ＸＩＩタンパク質は、ヒト凝固因子ＸＩＩシグナルペプチド、ヒト凝固因子ＸＩＩ重鎖、およびヒト凝固因子ＸＩＩ軽鎖のうちの１つ以上またはすべてを含むことができる。代替的に、または追加的に、凝固因子ＸＩＩタンパク質は、内因性（すなわち、天然）非ヒト動物凝固因子ＸＩＩタンパク質に由来する１つ以上のドメインを含むことができる。例えば、凝固因子ＸＩＩタンパク質は、内因性（すなわち、天然）非ヒト動物凝固因子ＸＩＩタンパク質由来のシグナルペプチド、および／または内因性（すなわち、天然）非ヒト動物凝固因子ＸＩＩ由来の重鎖、および／または内因性（すなわち、天然）非ヒト動物凝固因子ＸＩＩタンパク質からのタンパク質由来の軽鎖を含み得る。一例として、凝固因子ＸＩＩタンパク質は、ヒトシグナルペプチド、重鎖、および軽鎖を含み得る。
ヒト凝固因子ＸＩＩタンパク質に由来するキメラ凝固因子ＸＩＩタンパク質のドメインは、完全にヒト化された配列によってコードされ得る（すなわち、そのドメインをコードする配列全体がオーソロガスなヒトＦ１２配列で置き換えられる）か、または部分的にヒト化された配列によってコード化され得る（すなわち、そのドメインをコードする配列の一部はオーソロガスなヒトＦ１２配列で置き換えられ、そのドメインをコードする残りの内因性（すなわち、天然）配列はオーソロガスなヒトＦ１２配列と同じアミノ酸をコードし、結果として、コードされたドメインは、ヒト凝固因子ＸＩＩタンパク質内のドメインと同一である）。同様に、内因性凝固因子ＸＩＩタンパク質に由来するキメラタンパク質のドメインは、完全に内因性の配列によってコードされ得る（すなわち、そのドメインをコードする配列全体が内因性のＦ１２配列である）か、または部分的にヒト化された配列によってコードされ得る（すなわち、そのドメインをコードする配列のいくつかはオーソロガスなヒトＦ１２配列で置き換えられるが、オーソロガスなヒトＦ１２配列は、置き換えられた内因性Ｆ１２配列と同じアミノ酸をコードし、結果として、コードされたドメインは、内因性凝固因子ＸＩＩタンパク質のそのドメインと同一である）。
一例として、ヒト化Ｆ１２遺伝子座によってコードされる凝固因子ＸＩＩタンパク質は、ヒト凝固因子ＸＩＩシグナルペプチドを含むことができる。任意選択で、ヒト凝固因子ＸＩＩシグナルペプチドは、配列番号６に対して、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一である配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれらからなる。任意選択で、ヒト凝固因子ＸＩＩシグナルペプチドのコード配列は、配列番号１４に対して、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一である配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれらからなる。別の例として、ヒト化Ｆ１２遺伝子座によってコードされる凝固因子ＸＩＩタンパク質は、ヒト凝固因子ＸＩＩ重鎖を含むことができる。任意選択で、ヒト凝固因子ＸＩＩ重鎖は、配列番号７もしくは４７に対して、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、もしくは約１００％同一である配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれらからなる。任意選択で、ヒト凝固因子ＸＩＩ重鎖のコード配列は、配列番号１５もしくは４９に対して、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、もしくは約１００％同一である配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれらからなる。別の例として、ヒト化Ｆ１２遺伝子座によってコードされる凝固因子ＸＩＩタンパク質は、ヒト軽鎖を含むことができる。任意選択で、ヒト軽鎖は、配列番号８に対して、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、もしくは約１００％同一である配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれらからなる。任意選択で、ヒト軽鎖のコード配列は、配列番号１６に対して、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、もしくは約１００％同一である配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれらからなる。例えば、ヒト化Ｆ１２遺伝子座によってコードされる凝固因子ＸＩＩタンパク質は、配列番号５もしくは４６に対して、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、もしくは約１００％同一である配列を含み得るか、本質的にそれからなり得るか、またはそれらからなり得る。任意選択で、ヒト化Ｆ１２遺伝子座によってコードされるＦ１２ ＣＤＳは、配列番号１３もしくは４８（もしくはそれらの縮合）に対して、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、もしくは約１００％同一である配列を含み得るか、本質的にそれからなり得るか、またはそれらからなり得る。いずれの場合も、ヒト化凝固因子ＸＩＩタンパク質は、天然凝固因子ＸＩＩタンパク質および／またはヒト凝固因子ＸＩＩタンパク質の活性を保持することができる。
任意選択で、ヒト化Ｆ１２遺伝子座は他のエレメントを含むことができる。そのようなエレメントの例としては、選択カセット、レポーター遺伝子、リコンビナーゼ認識部位、または他のエレメントが挙げられ得る。一例では、追加のエレメント（例えば、選択カセット）は、ヒト化Ｆ１２遺伝子座に挿入されたヒト配列のイントロンに位置している。別の例では、追加のエレメント（例えば、選択カセット）は、ヒト化Ｆ１２遺伝子座に挿入されたヒト配列の３’に位置している。代替的に、ヒト化Ｆ１２遺伝子座は他のエレメントを欠いていてもよい（例えば、選択マーカーまたは選択カセットを欠いていてもよい）。好適なレポーター遺伝子およびレポータータンパク質の例は、本明細書のいずこかに開示されている。好適な選択マーカーの例としては、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏｒ）、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ（ｈｙｇｒ）、ピューロマイシン－Ｎ－アセチルトランスフェラーゼ（ｐｕｒｏｒ）、ブラスチシジンＳデアミナーゼ（ｂｓｒｒ）、キサンチン／グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｇｐｔ）、および単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ｋ）が挙げられる。リコンビナーゼの例には、Ｃｒｅ、Ｆｌｐ、およびＤｒｅリコンビナーゼが含まれる。Ｃｒｅリコンビナーゼ遺伝子の一例はＣｒｅｉであり、Ｃｒｅリコンビナーゼをコードする２つのエクソンがイントロンによって分離され、原核細胞での発現を防ぐ。そのようなリコンビナーゼは、核への局在化を促進するための核局在化シグナルをさらに含むことができる（例えば、ＮＬＳ－Ｃｒｅｉ）。リコンビナーゼ認識部位には、部位特異的リコンビナーゼによって認識され、組換え事象の基質として機能することができるヌクレオチド配列が含まれる。リコンビナーゼ認識部位の例には、ＦＲＴ、ＦＲＴ１１、ＦＲＴ７１、ａｔｔｐ、ａｔｔ、ｒｏｘ、ならびにｌｏｘＰ、ｌｏｘ５１１、ｌｏｘ２２７２、ｌｏｘ６６、ｌｏｘ７１、ｌｏｘＭ２、およびｌｏｘ５１７１などのｌｏｘ部位が含まれる。
レポーター遺伝子または選択カセットなどの他のエレメントは、リコンビナーゼ認識部位に隣接する自己削除カセットであってもよい。例えば、すべての目的のためにそれぞれ全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ８，６９７，８５１およびＵＳ２０１３／０３１２１２９を参照されたい。一例として、自己削除カセットは、マウスＰｒｍ１プロモーターに作動可能に連結されたＣｒｅｉ遺伝子（イントロンによって分離されたＣｒｅリコンビナーゼをコードする２つのエクソンを含む）およびヒトユビキチンプロモーターに作動可能に連結されたネオマイシン耐性遺伝子を含み得る。Ｐｒｍ１プロモーターを使用することにより、Ｆ０動物のオスの生殖細胞で特異的に自己欠失カセットを削除することができる。選択マーカーをコードするポリヌクレオチドは、標的とされる細胞において活性なプロモーターに作動可能に連結され得る。プロモーターの例は、本明細書のいずこかに記載されている。別の具体例として、自己削除選択カセットは、１つ以上のプロモーター（例えば、ヒトユビキチンおよびＥＭ７プロモーターの両方）に作動可能に連結されたハイグロマイシン耐性遺伝子コード配列、続いてポリアデニル化シグナル、続いて１つ以上のプロモーター（例えば、ｍＰｒｍ１プロモーター）に作動可能に連結されたＣｒｅｉコード配列、続いて別のポリアデニル化シグナルを含み得、カセット全体がｌｏｘＰ部位に隣接している。
ヒト化Ｆ１２遺伝子座も条件付き対立遺伝子であってもよい。例えば、条件付き対立遺伝子は、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２０１１／０１０４７９９に記載されているように、多機能対立遺伝子であってよい。例えば、条件付き対立遺伝子は、以下を含むことができる：（ａ）標的遺伝子の転写に関してセンス方向の作動配列、（ｂ）センスまたはアンチセンス方向の薬物選択カセット（ＤＳＣ）、（ｃ）アンチセンス配向の目的のヌクレオチド配列（ＮＳＩ）、ならびに（ｄ）逆方向の条件付き反転モジュール（ＣＯＩＮ、エクソン分割イントロンおよび反転可能な遺伝子トラップのようなモジュールを利用）。例えばＵＳ２０１１／０１０４７９９を参照されたい。条件付き対立遺伝子は、第１のリコンビナーゼへの曝露時に再結合して、（ｉ）作動配列およびＤＳＣを欠き、（ｉｉ）センス方向のＮＳＩおよびアンチセンス方向のＣＯＩＮを含む、条件付き対立遺伝子を形成する再結合可能なユニットをさらに含むことができる。例えばＵＳ２０１１／０１０４７９９を参照されたい。
１つの例示的なヒト化Ｆ１２遺伝子座（例えば、ヒト化マウスＦ１２遺伝子座）は、開始コドンから終止コドンまでの領域が対応するヒト配列で置き換えられているものである。図１ならびに配列番号１７および１８を参照されたい。１つの具体例において、ヒト化内因性Ｆ１２遺伝子座におけるヒトＦ１２配列は、配列番号３１または３２に記載の配列に対して、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一である配列を含む。別の具体例において、ヒト化内因性Ｆ１２遺伝子座は、配列番号５または４６に記載の配列に対して、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一である配列を含むタンパク質をコードする。別の具体例において、ヒト化内因性Ｆ１２遺伝子座は、配列番号１３または４８に記載の配列に対して、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一である配列を含むコード配列を含む。別の具体例において、ヒト化内因性Ｆ１２遺伝子座は、配列番号１７または１８に記載の配列に対して、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一である配列を含む。
Ｃ．ヒト化凝固因子ＸＩＩ（Ｆ１２）遺伝子座を含む非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞、および非ヒト動物
本明細書のいずこかに記載されているようなヒト化凝固因子ＸＩＩ（Ｆ１２）遺伝子座を含む非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞、および非ヒト動物が提供される。ゲノム、細胞、または非ヒト動物は、オスまたはメスであり得る。ゲノム、細胞、または非ヒト動物は、ヒト化Ｆ１２遺伝子座に対してヘテロ接合またはホモ接合であり得る。二倍体生物は、各遺伝子座に２つの対立遺伝子を有する。対立遺伝子の各ペアは、特定の遺伝子座の遺伝子型を表す。遺伝子型は、特定の遺伝子座に２つの同一の対立遺伝子がある場合はホモ接合であり、２つの対立遺伝子が異なる場合はヘテロ接合であると記載される。ヒト化Ｆ１２遺伝子座を含む非ヒト動物は、その生殖系列にヒト化内因性Ｆ１２遺伝子座を含むことができる。
本明細書で提供される非ヒト動物ゲノムまたは細胞は、例えば、Ｆ１２遺伝子座またはヒトＦ１２遺伝子座に相同またはオーソロガスなゲノム遺伝子座を含む任意の非ヒト動物ゲノムまたは細胞であり得る。ゲノムは、例えば、真菌細胞（例えば、酵母）、植物細胞、動物細胞、哺乳動物細胞、非ヒト哺乳動物細胞、およびヒト細胞を含む真核細胞に由来することができ、または真核細胞であり得る。「動物」という用語は、例えば、哺乳類、魚類、爬虫類、両生類、鳥類、および虫類を含む、動物界の任意のメンバーを含む。哺乳動物細胞は、例えば、非ヒト哺乳動物細胞、齧歯類細胞、ラット細胞、マウス細胞、またはハムスター細胞であり得る。他の非ヒト哺乳動物には、例えば、非ヒト霊長類、サル、類人猿、オランウータン、ネコ、イヌ、ウサギ、ウマ、雄ウシ、シカ、バイソン、家畜（例えば、ウシ、去勢ウシなどのウシ種、ヒツジ、ヤギなどのヒツジ種、ならびにブタ、およびイノシシなどのブタ種）が含まれる。鳥類には、例えば、ニワトリ、シチメンチョウ、ダチョウ、ガチョウ、アヒルなどが含まれる。飼育動物および農業用動物も含まれる。「非ヒト」という用語はヒトを除外する。
細胞はまた、任意のタイプの未分化または分化状態であり得る。例えば、細胞は、全能性細胞、多能性細胞（例えば、ヒト多能性細胞、またはマウス胚性幹（ＥＳ）細胞もしくはラットＥＳ細胞などの非ヒト多能性細胞）、または非多能性細胞であってよい。全能性細胞には、任意の細胞型を生じさせることができる未分化細胞が含まれ、多能性細胞には、１種以上の分化細胞型へと発生する能力を有する未分化細胞が含まれる。そのような多能性および／または全能性細胞は、例えば、ＥＳ細胞または誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞などのＥＳ様細胞であり得る。ＥＳ細胞には、胚への導入時に発生中の胚の任意の組織に寄与することができる胚由来の全能性または多能性細胞が含まれる。ＥＳ細胞は、胚盤胞の内部細胞塊に由来し得、３つの脊椎動物胚葉（内胚葉、外胚葉、および中胚葉）のいずれかの細胞に分化することができる。
本明細書で提供される細胞はまた、生殖細胞（例えば、精子もしくは卵母細胞）であってよい。細胞は、有糸分裂能力のある細胞または有糸分裂的に不活性な細胞、減数分裂能力のある細胞または減数分裂的に不活性な細胞であり得る。同様に、細胞はまた、初代体細胞または初代体細胞ではない細胞であり得る。体細胞には、配偶子、生殖細胞、配偶子細胞、または未分化幹細胞ではない任意の細胞が含まれる。例えば、細胞は、肝芽細胞または肝細胞などの肝細胞であり得る。代替的に、細胞は、錐体神経細胞または皮質神経細胞などの神経細胞であり得る。
本明細書で提供される好適な細胞には、初代細胞も含まれる。初代細胞には、生物、臓器、もしくは組織から直接単離された細胞または細胞の培養物が含まれる。初代細胞には、形質転換も不死化もされていない細胞が含まれる。それらには、以前に組織培養で継代されていなかったか、もしくは以前に組織培養で継代されていたが、組織培養で無期限に継代することができない生物、臓器、または組織から得られた細胞が含まれる。そのような細胞は、従来の技術によって単離することができ、例えば、肝細胞または神経細胞を含む。
本明細書で提供される他の好適な細胞には、不死化細胞が含まれる。不死化細胞には、通常は無期限に増殖しないが、変異または改変のために、正常な細胞老化を回避し、代わりに分裂を続けることができる多細胞生物由来の細胞が含まれる。このような変異または改変は、自然に発生することも、意図的に誘発されることもある。不死化細胞株の具体例は、ＨｅｐＧ２ヒト肝癌細胞株である。多くの種類の不死化細胞がよく知られている。不死化細胞または初代細胞には、典型的には、培養または組換えの遺伝子またはタンパク質の発現に使用される細胞が含まれる。
本明細書で提供される細胞はまた、１細胞期の胚（すなわち、受精卵母細胞または接合子）を含む。このような１細胞期の胚は、任意の遺伝的背景（例えば、マウスの場合は、ＢＡＬＢ／ｃ、Ｃ５７ＢＬ／６、１２９、またはそれらの組み合わせ）に由来することができ、新鮮または凍結することができ、自然交配または体外受精に由来することができる。
本明細書で提供される細胞は、正常で健康な細胞であってよいか、または罹患した細胞または変異体を有する細胞であってよい。
本明細書に記載のヒト化Ｆ１２遺伝子座を含む非ヒト動物は、本明細書のいずこかに記載されている方法によって作製することができる。「動物」という用語は、例えば、哺乳類、魚類、爬虫類、両生類、鳥類、および虫類を含む、動物界の任意のメンバーを含む。具体例では、非ヒト動物は非ヒト哺乳動物である。非ヒト哺乳動物には、例えば、非ヒト霊長類、サル、類人猿、オランウータン、ネコ、イヌ、ウマ、雄ウシ、シカ、バイソン、ヒツジ、ウサギ、げっ歯類（例えば、マウス、ラット、ハムスター、およびモルモット）、ならびに家畜（例えば、ウシおよび去勢ウシなどのウシ種、ヒツジおよびヤギなどのヒツジ種、ならびにブタおよびイノシシなどのブタ種）が含まれる。鳥類には、例えば、ニワトリ、シチメンチョウ、ダチョウ、ガチョウ、およびアヒルが含まれる。飼育動物および農業用動物も含まれる。「非ヒト動物」という用語はヒトを除外する。好ましい非ヒト動物には、例えば、マウスおよびラットなどの齧歯動物が含まれる。
非ヒト動物は、あらゆる遺伝的背景からのものであってよい。例えば、好適なマウスは、１２９系統、Ｃ５７ＢＬ／６系統、１２９およびＣ５７ＢＬ／６の雑種、ＢＡＬＢ／ｃ系統、またはスイスウェブスター系統からのものであり得る。１２９系統の例には、１２９Ｐ１、１２９Ｐ２、１２９Ｐ３、１２９Ｘ１、１２９Ｓ１（例えば、１２９Ｓ１／ＳＶ、１２９Ｓ１／Ｓｖｌｍ）、１２９Ｓ２、１２９Ｓ４、１２９Ｓ５、１２９Ｓ９／ＳｖＥｖＨ、１２９Ｓ６（１２９／ＳｖＥｖＴａｃ）、１２９Ｓ７、１２９Ｓ８、１２９Ｔ１、および１２９Ｔ２が含まれる。例えば、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｆｅｓｔｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｍａｍｍ．Ｇｅｎｏｍｅ １０（８）：８３６を参照されたい。Ｃ５７ＢＬ系統の例には、Ｃ５７ＢＬ／Ａ、Ｃ５７ＢＬ／Ａｎ、Ｃ５７ＢＬ／ＧｒＦａ、Ｃ５７ＢＬ／Ｋａｌ＿ｗＮ、Ｃ５７ＢＬ／６、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、Ｃ５７ＢＬ／６ＢｙＪ、Ｃ５７ＢＬ／６ＮＪ、Ｃ５７ＢＬ／１０、Ｃ５７ＢＬ／１０ＳｃＳｎ、Ｃ５７ＢＬ／１０Ｃｒ、およびＣ５７ＢＬ／Ｏｌａが含まれる。好適なマウスはまた、前述の１２９系統ならびに前述のＣ５７ＢＬ／６系統の雑種（例えば、５０％１２９および５０％Ｃ５７ＢＬ／６）からのものであり得る。同様に、好適なマウスは、前述の１２９系統の雑種または前述のＢＬ／６系統の雑種（例えば、１２９Ｓ６（１２９／ＳｖＥｖＴａｃ）系統）からのものであり得る。
同様に、ラットは、例えば、ＡＣＩラット系統、Ｄａｒｋ Ａｇｏｕｔｉ（ＤＡ）ラット系統、Ｗｉｓｔａｒラット系統、ＬＥＡラット系統、Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラット系統、またはフィッシャーＦ３４４もしくはフィッシャーＦ６などのフィッシャーラット系統からのものであり得る。ラットはまた、上述の２つ以上の系統の雑種に由来する系統から得ることができる。例えば、好適なラットは、ＤＡ系統またはＡＣＩ系統からのものであり得る。ＡＣＩラット系統は、白い腹および足、ならびにＲＴ１ａｖ１ハプロタイプを有する黒いアグーチを持っていることを特徴としている。このような系統は、Ｈａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓを含む様々な供給源から入手できる。Ｄａｒｋ Ａｇｏｕｔｉ（ＤＡ）ラット系統は、アグーチコートおよびＲＴ１ａｖ１ハプロタイプを有することを特徴としている。このようなラットは、Ｃｈａｒｌｅｓ ＲｉｖｅｒおよびＨａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓを含む様々な供給源から入手できる。いくらかの好適なラットは近交系ラット系統に由来してもよい。例えば、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２０１４／０２３５９３３を参照されたい。
本明細書に記載のヒト化Ｆ１２遺伝子座を含む非ヒト動物は、脳内のニューロンなどの脳内で短いＦＸＩＩアイソフォームを発現することができる。例えば、短いＦＸＩＩアイソフォームは、エクソン１１～１４に対するプローブによって検出されるが、エクソン１～６に対するプローブによっては検出されないＦ１２ ｍＲＮＡによってコード化され得る。具体例では、短いアイソフォームは、ＦＸＩＩのプロリンリッチ触媒ドメインを含むタンパク質であるＦＸＩＩ２９７－５９６（Ｍ２９７～Ｓ５９６；配列番号７５によってコードされる配列番号７４）であり得る。短いＦＸＩＩアイソフォームは、例えば、血漿カリクレインによって活性化することができ、例えば、プロＨＧＦを活性ＨＧＦに変換することができる。短いＦＸＩＩアイソフォームは、例えば、カリクレインによる切断後に活性化することもできる。活性化された短いＦＸＩＩアイソフォームは、例えば、プレカリクレインをカリクレインに相互に活性化することができる。例えば、短いＦＸＩＩアイソフォームは、カリクレイン－キニン経路を開始することができる。例えば、短いＦＸＩＩアイソフォームの活性化は、ブラジキニンを生成できる。
本明細書に記載のヒト化Ｆ１２遺伝子座を含む非ヒト動物は、対応する野生型非ヒト動物における活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）凝固時間と著しく異ならないａＰＴＴ凝固時間を有することができる。同様に、本明細書に記載のヒト化Ｆ１２遺伝子座を含む非ヒト動物は、対応する野生型非ヒト動物のプロトロンビン時間（ＰＴ）値と著しく異ならないＰＴ値を有することができる。
本明細書に記載のヒト化Ｆ１２遺伝子座を含む非ヒト動物は、約１～約３０、約１～約２５、約１～約２０、約２～約３０、約２～約２５、約２～約２０、約３～約３０、約３～約２５、約３～約２０、約４～約３０、約４～約２５、約４～約２０、約５～約３０、約５～約２５、または約５～約２０μｇ／ｍＬの血漿中のヒト凝固因子ＸＩＩのレベルを有することができる。例えば、非ヒト動物におけるヒト凝固因子ＸＩＩは、約５～約１８μｇ／ｍＬであり得る。代替的に、本明細書に記載のヒト化Ｆ１２遺伝子座を含む非ヒト動物は、少なくとも約１μｇ／ｍＬ、少なくとも約２μｇ／ｍＬ、少なくとも約３μｇ／ｍＬ、少なくとも約４μｇ／ｍＬ、少なくとも約５μｇ／ｍＬ、少なくとも約６μｇ／ｍＬ、少なくとも約７μｇ／ｍＬ、少なくとも約８μｇ／ｍＬ、少なくとも約９μｇ／ｍＬ、または少なくとも約１０μｇ／ｍＬの血漿中のヒト凝固因子ＸＩＩのレベルを有することができる。
ＩＩＩ．ヒト化凝固因子ＸＩＩ（Ｆ１２）遺伝子座を含む非ヒト動物を使用して、インビボまたはエクスビボでヒト凝固因子ＸＩＩ標的化試薬の有効性を評価する方法
インビボまたはエクスビボでヒト凝固因子ＸＩＩ標的化試薬（例えば、治療用分子または複合体）の送達または有効性を評価または最適化するために、本明細書のいずこかに記載されるようなヒト化Ｆ１２遺伝子座を含む非ヒト動物を使用するための様々な方法が提供される。非ヒト動物はヒト化Ｆ１２遺伝子座を含むため、非ヒト動物はヒト凝固因子ＸＩＩ標的化試薬の有効性をより正確に反映する。このような非ヒト動物は、ヒトＦ１２遺伝子を標的化するように設計されたゲノム編集試薬を試験するのに特に有用である。なぜなら、本明細書に開示される非ヒト動物は、ランダムなゲノム遺伝子座でのヒトＦ１２配列のトランスジェニック挿入ではなくヒト化内因性Ｆ１２遺伝子座を含み、ヒト化内因性Ｆ１２遺伝子座は、人工ｃＤＮＡ配列ではなく、コード領域および非コード領域の両方からのオーソロガスなヒトゲノムＦ１２配列を含むことができるためである。
Ａ．インビボまたはエクスビボでのヒト凝固因子ＸＩＩ標的化試薬の有効性を試験する方法
本明細書のいずこかに記載されているように、ヒト化Ｆ１２遺伝子座を含む非ヒト動物を使用して、インビボでヒト凝固因子ＸＩＩ標的化試薬の送達または有効性を評価するための様々な方法が提供される。そのような方法は、（ａ）非ヒト動物にヒト凝固因子ＸＩＩ標的化試薬を導入すること（すなわち、ヒト凝固因子ＸＩＩ標的化試薬を非ヒト動物に投与すること）と、（ｂ）ヒト凝固因子ＸＩＩ標的化試薬の活性を評価することと、を含み得る。
ヒト凝固因子ＸＩＩ標的化試薬は、ヒトＦ１２遺伝子座（ヒトＦ１２遺伝子）、ヒトＦ１２ ｍＲＮＡ、またはヒト凝固因子ＸＩＩタンパク質を標的化する任意の生物学的または化学的薬剤であり得る。ヒト凝固因子ＸＩＩ標的化試薬の例は、本明細書のいずこかに開示されており、例えば、ゲノム編集剤または抗原結合タンパク質が含まれる。例えば、ヒト凝固因子ＸＩＩ標的化試薬は、Ｆ１２標的化核酸（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、もしくは低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ））、またはＦ１２標的化タンパク質（例えば、Ｃａｓ９などのＣａｓタンパク質、ＺＦＮ、もしくはＴＡＬＥＮ）をコードする核酸であってよい。代替的に、ヒト－Ｆ１２標的化試薬は、凝固因子ＸＩＩ標的化抗体もしくは抗原結合タンパク質、またはヒト凝固因子ＸＩＩを標的化する任意の他の高分子もしくは小分子であり得る。一例では、ヒト凝固因子ＸＩＩ標的化試薬は、ヌクレアーゼ剤および／または外因性ドナー核酸（例えば、標的化ベクター）などのゲノム編集剤である。
そのようなヒト凝固因子ＸＩＩ標的化試薬は、本明細書のいずこかでより詳細に開示されるような任意の送達方法（例えば、ＡＡＶ、ＬＮＰ、ＨＤＤ、または注射）および任意の投与経路によって投与することができる。治療用複合体および分子を送達する手段および投与経路は、本明細書のいずこかでより詳細に開示されている。特定の方法では、試薬はＡＡＶを介した送達を介して送達される。例えば、ＡＡＶ８を使用して肝臓を標的化することができる。他の特定の方法では、試薬はＬＮＰを介した送達によって送達される。他の特定の方法では、試薬は流体力学的送達（ＨＤＤ）によって送達される。用量は、任意の好適な用量であり得る。例えば、試薬（例えば、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡおよびｇＲＮＡ）がＬＮＰ媒介送達によって送達されるいくつかの方法において、用量は、約０．０１～約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．０１～約５ｍｇ／ｋｇ、約０．０１～約４ｍｇ／ｋｇ、約０．０１～約３ｍｇ／ｋｇ、約０．０１～約２ｍｇ／ｋｇ、約０．０１～約１ｍｇ／ｋｇ、約０．１～約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．１～約６ｍｇ／ｋｇ、約０．１～約５ｍｇ／ｋｇ、約０．１～約４ｍｇ／ｋｇ、約０．１～約３ｍｇ／ｋｇ、約０．１～約２ｍｇ／ｋｇ、約０．１～約１ｍｇ／ｋｇ、約０．３～約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．３～約６ｍｇ／ｋｇ、約０．３～約５ｍｇ／ｋｇ、約０．３～約４ｍｇ／ｋｇ、約０．３～約３ｍｇ／ｋｇ、約０．３～約２ｍｇ／ｋｇ、約０．３～約１ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．３ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ、または約３ｍｇ／ｋｇであってよい。特定の例では、用量は、約０．１～約６ｍｇ／ｋｇ、約０．１～約３ｍｇ／ｋｇ、または約０．１～約２ｍｇ／ｋｇである。
ヒト凝固因子ＸＩＩ標的化試薬の活性を評価するための方法はよく知られており、本明細書のいずこかで提供されている。活性の評価は、本明細書のいずこかに開示されているように、任意の細胞型、任意の組織型、または任意の臓器型であり得る。いくつかの方法では、活性の評価は血漿中で行われる。いくつかの方法では、活性の評価は肝細胞で行われる。凝固因子ＸＩＩ標的化試薬がゲノム編集試薬（例えば、ヌクレアーゼ剤）である場合、そのような方法は、ヒト化Ｆ１２遺伝子座の改変を評価することを含み得る。一例として、評価することは、ヒト化Ｆ１２遺伝子座での非相同末端結合（ＮＨＥＪ）活性を測定することを含み得る。これは、例えば、ヒト化Ｆ１２遺伝子座内の挿入または欠失の頻度を測定することを含み得る。例えば、評価することは、非ヒト動物から単離される１つ以上の細胞におけるヒト化Ｆ１２遺伝子座の配列決定（例えば、次世代配列決定）を含み得る。評価は、非ヒト動物から標的臓器（例えば、肝臓）または組織を単離すること、および標的臓器または組織におけるヒト化Ｆ１２遺伝子座の改変を評価することを含み得る。評価はまた、標的臓器または組織内の２つ以上の異なる細胞型におけるヒト化Ｆ１２遺伝子座の改変を評価することを含み得る。同様に、評価は、非標的臓器または組織（例えば、２つ以上の非標的臓器または組織）を非ヒト動物から単離すること、および非標的臓器または組織におけるヒト化Ｆ１２遺伝子座の改変を評価することを含み得る。
そのような方法はまた、ヒト化Ｆ１２遺伝子座によって産生されるｍＲＮＡの発現レベルを測定すること、またはヒト化Ｆ１２遺伝子座によってコードされるタンパク質の発現レベルを測定することを含み得る。例えば、タンパク質レベルは、特定の細胞、組織、または臓器の型（例えば、肝臓）で測定することができ、または分泌レベルは、血漿または血清で測定することができる。ヒト化Ｆ１２遺伝子座から発現されるＦ１２ ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現を評価するための方法は、本明細書のいずこかで提供されており、よく知られている。
１つの具体例として、ヒト凝固因子ＸＩＩ標的化試薬がゲノム編集試薬（例えば、ヌクレアーゼ剤）である場合、ヒト化Ｆ１２遺伝子座での編集パーセント（例えば、溶解細胞のプールからのＰＣＲ反応における、読み取られた配列の総数にわたって観察された挿入または欠失の総数）を評価することができる（例えば、肝細胞で）。
インビボでの活性を評価するための上述で提供された様々な方法はまた、本明細書のいずこかに記載されるように、エクスビボでヒト凝固因子ＸＩＩ標的化試薬の活性を評価するために使用され得る。
いくつかの方法において、ヒト凝固因子ＸＩＩ標的化試薬は、ヒトＦ１２遺伝子を標的化するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ剤などのヌクレアーゼ剤である。そのような方法は、例えば、（ａ）ヒトＦ１２遺伝子を切断するように設計されたヌクレアーゼ剤（例えば、Ｃａｓ９などのＣａｓタンパク質、およびヒトＦ１２遺伝子のガイドＲＮＡ標的配列を標的化するように設計されたガイドＲＮＡ）を非ヒト動物に導入することと、（ｂ）ヒト化Ｆ１２遺伝子座の改変を評価することと、を含み得る。
例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼの場合、ガイドＲＮＡがＣａｓタンパク質と複合体を形成し、Ｃａｓタンパク質をヒト化Ｆ１２遺伝子座に誘導し、Ｃａｓ／ガイドＲＮＡ複合体がガイドＲＮＡ標的配列を切断し、細胞による修復を引き起こす（例えば、ドナー配列が存在しない場合、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）を介して）、ヒト化Ｆ１２遺伝子座の改変が誘導される。
任意選択で、２つ以上のガイドＲＮＡを導入することができ、それぞれが、ヒトＦ１２遺伝子内の異なるガイドＲＮＡ標的配列を標的化するように設計されている。例えば、２つのガイドＲＮＡは、２つのガイドＲＮＡ標的配列の間のゲノム配列を切除するように設計することができる。ヒト化Ｆ１２遺伝子座の改変は、第１のガイドＲＮＡがＣａｓタンパク質と複合体を形成してＣａｓタンパク質をヒト化Ｆ１２遺伝子座に誘導し、第２のガイドＲＮＡがＣａｓタンパク質と複合体を形成し、Ｃａｓタンパク質をヒト化Ｆ１２遺伝子座に誘導し、第１のＣａｓ／ガイドＲＮＡ複合体が第１のガイドＲＮＡ標的配列を切断し、第２のＣａｓ／ガイドＲＮＡ複合体が第２のガイドＲＮＡ標的配列を切断し、介在する配列を切除する。
追加的または代替的に、ヒトＦ１２遺伝子と再結合および改変することができる外因性ドナー核酸（例えば、標的化ベクター）もまた、非ヒト動物に導入される。任意選択で、ヌクレアーゼ剤またはＣａｓタンパク質は、本明細書のいずこかに記載されているように、外因性ドナー核酸に係留され得る。ヒト化Ｆ１２遺伝子座の改変は、例えば、ガイドＲＮＡがＣａｓタンパク質と複合体を形成し、Ｃａｓタンパク質をヒト化Ｆ１２遺伝子座に誘導し、Ｃａｓ／ガイドＲＮＡ複合体がガイドＲＮＡ標的配列を切断し、ヒト化Ｆ１２遺伝子座は外因性ドナー核酸と再結合してヒト化Ｆ１２遺伝子座を改変する。外因性ドナー核酸は、例えば、相同組換え修復（ＨＤＲ）またはＮＨＥＪ媒介挿入を介して、ヒト化Ｆ１２遺伝子座と組換えることができる。任意のタイプの外因性ドナー核酸を使用することができ、その例は本明細書のいずこかに提供されている。
Ｂ．ヒト凝固因子ＸＩＩ標的化試薬のインビボまたはエクスビボでの送達または有効性を最適化する方法
細胞または非ヒト動物へのヒト凝固因子ＸＩＩ標的化試薬の送達を最適化するため、またはインビボでのヒト凝固因子ＸＩＩ標的化試薬の活性または有効性を最適化するための様々な方法が提供される。そのような方法は、例えば、（ａ）ヒト化Ｆ１２遺伝子座を含む第１の非ヒト動物または第１の細胞において、上述のヒト凝固因子ＸＩＩ標的化試薬の有効性を初めて試験する方法を実施することと、（ｂ）変数を変更し、ヒト化Ｆ１２遺伝子座を含む第２の非ヒト動物（すなわち、同じ種の）または第２の細胞において変更された変数を用いて２回目に方法を実施することと、（ｃ）ステップ（ａ）のヒト凝固因子ＸＩＩ標的化試薬の活性をステップ（ｂ）のヒト凝固因子ＸＩＩ標的化試薬の活性と比較し、より高い活性が結果として得られる方法を選択することと、を含む。
ヒト凝固因子ＸＩＩ標的化試薬の送達、有効性、または活性を測定する方法は、本明細書のいずこかに開示されている。例えば、そのような方法は、ヒト化Ｆ１２遺伝子座の改変を測定することを含み得る。ヒト化Ｆ１２遺伝子座のより効果的な改変は、非ヒト動物または細胞内の望ましい効果に応じて異なることを意味し得る。例えば、ヒト化Ｆ１２遺伝子座のより効果的な改変は、より高いレベルの改変、より高い精度、より高い一貫性、またはより高い特異性のうちの１つ以上またはすべてを意味し得る。ヒト化Ｆ１２遺伝子座のより高いレベルの改変（すなわち、より高い効力）は、特定の標的細胞型内、特定の標的組織内、または特定の標的臓器（例えば、肝臓）内で標的とされる細胞のより高いパーセンテージを指す。より高い精度は、ヒト化Ｆ１２遺伝子座のより正確な改変を意味する（例えば、同じ改変を有するか、または余分な意図しない挿入および欠失（例えば、ＮＨＥＪインデル）なしに所望の改変を有する標的細胞のより高いパーセンテージ）。より高い一貫性とは、１つを超えるタイプの細胞、組織、または臓器（例えば、肝臓内のより多い数の細胞型の改変）が標的化されている場合、異なるタイプの標的細胞、組織、または臓器の間でヒト化Ｆ１２遺伝子座のより一貫した改変を意味する。特定の臓器が標的化されている場合、より高い一貫性は、臓器（例えば、肝臓）内のすべての場所全体でより一貫性のある改変を指し得る。より高い特異性は、標的化されるゲノム遺伝子座または遺伝子座に関してより高い特異性、標的化される細胞型に関してより高い特異性、標的化される組織型に関してより高い特異性、または標的化される臓器に関してより高い特異性を指し得る。例えば、ゲノム遺伝子座の特異性の増加は、オフターゲットゲノム遺伝子座の改変が少ないことを意味する（例えば、標的ゲノム遺伝子座の改変の代わりに、またはそれに加えて、意図しないオフターゲットゲノム遺伝子座に改変がある標的細胞のパーセンテージが低い）。同様に、細胞型、組織、または臓器型の特異性の増加は、特定の細胞型、組織型、または臓器型が標的化されている場合、オフターゲットの細胞型、組織型、または臓器型の改変が少ないことを指す（例えば、特定の臓器が標的化される（例えば、肝臓）場合、意図された標的ではない臓器または組織の細胞の改変が少ない）。
代替的に、そのような方法は、Ｆ１２ ｍＲＮＡまたは凝固因子ＸＩＩタンパク質の発現を測定することを含み得る。一例では、より効果的なヒト凝固因子ＸＩＩ標的剤は、Ｆ１２ ｍＲＮＡまたは凝固因子ＸＩＩタンパク質の発現のより大きな減少をもたらす。代替的に、そのような方法は、凝固因子ＸＩＩ活性を測定することを含み得る。一例では、より効果的なヒト凝固因子ＸＩＩ標的剤は、凝固因子ＸＩＩ活性のより大きな減少をもたらす。
変更される変数は、任意のパラメーターにすることができる。一例として、変更された変数は、ヒト凝固因子ＸＩＩ標的化試薬または複数の試薬が細胞または非ヒト動物に導入されるパッケージングまたは送達方法（例えば、送達ビヒクル）であり得る。ＬＮＰ、ＨＤＤ、およびＡＡＶなどの送達方法または送達ビヒクルの例は、本明細書のいずこかに開示されている。例えば、変更される変数はＡＡＶ血清型であってよい。同様に、投与することはＬＮＰ媒介送達を含み得、そして変更される変数はＬＮＰ製剤であり得る。別の例として、変更される変数は、ヒト凝固因子ＸＩＩ標的化試薬または複数の試薬を細胞または非ヒト動物に導入するための投与経路であり得る。静脈内、硝子体内、実質内、および鼻腔内注入などの投与経路の例は、本明細書のいずこかに開示されている。
別の例として、変更される変数は、ヒト凝固因子ＸＩＩ標的化試薬または導入された試薬の濃度または量であり得る。別の例として、変更される変数は、導入された別のヒト凝固因子ＸＩＩ標的化試薬（例えば、ガイドＲＮＡ、Ｃａｓタンパク質、外因性ドナー核酸、ＲＮＡｉ剤、またはＡＳＯ）の濃度または量と比較した、導入された１つのヒト凝固因子ＸＩＩ標的化試薬（例えば、ガイドＲＮＡ、Ｃａｓタンパク質、外因性ドナー核酸、ＲＮＡｉ剤、またはＡＳＯ）の濃度または量であり得る。
別の例として、変更される変数は、試薬の活性または有効性を評価するタイミングと比較した、ヒト凝固因子ＸＩＩ標的化試薬または複数の試薬を導入するタイミングであり得る。別の例として、変更される変数は、ヒト凝固因子ＸＩＩ標的化試薬または複数の試薬が導入される回数または頻度であり得る。別の例として、変更される変数は、導入された別のヒト凝固因子ＸＩＩ標的化試薬（例えば、ガイドＲＮＡ、Ｃａｓタンパク質、外因性ドナー核酸、ＲＮＡｉ剤、またはＡＳＯ）の導入のタイミングと比較した、導入された１つのヒト凝固因子ＸＩＩ標的化試薬（例えば、ガイドＲＮＡ、Ｃａｓタンパク質、外因性ドナー核酸、ＲＮＡｉ剤、またはＡＳＯ）の導入のタイミングであり得る。
別の例として、変更される変数は、ヒト凝固因子ＸＩＩ標的化試薬または複数の試薬が導入される形態であり得る。例えば、ガイドＲＮＡは、ＤＮＡの形態またはＲＮＡの形態で導入することができる。Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９）は、ＤＮＡの形態、ＲＮＡの形態、またはタンパク質の形態（例えば、ガイドＲＮＡと複合体を形成している）で導入することができる。外因性ドナー核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、一本鎖、二本鎖、直線状、環状などであり得る。同様に、各構成要素は、安定性のため、オフターゲット効果を低減するため、送達を容易にするためなどのための修飾の様々な組み合わせを含むことができる。同様に、例えば、ＲＮＡｉ剤およびＡＳＯは、安定性のため、オフターゲット効果を低減するため、送達を容易にするためなどのための修飾の様々な組み合わせを含むことができる。
別の例として、変更される変数は、ヒト凝固因子ＸＩＩ標的化試薬または導入された試薬であり得る。例えば、ヒト凝固因子ＸＩＩ標的化試薬がガイドＲＮＡを含む場合、変更される変数は、異なる配列を有する異なるガイドＲＮＡを導入することであり得る（例えば、異なるガイドＲＮＡ標的配列を標的化する）。同様に、ヒト凝固因子ＸＩＩ標的化試薬がＲＮＡｉ剤またはＡＳＯを含む場合、変更される変数は、異なる配列を有する異なるＲＮＡｉ剤またはＡＳＯを導入することであり得る。同様に、ヒト凝固因子ＸＩＩ標的化試薬がＣａｓタンパク質を含む場合、変更された変数は、異なるＣａｓタンパク質（例えば、異なる配列を有する異なるＣａｓタンパク質、または異なる配列を有する核酸であるが同じＣａｓタンパク質アミノ酸配列をコードしている（例えば、コドン最適化））を導入することであり得る。同様に、ヒト凝固因子ＸＩＩ標的化試薬が外因性ドナー核酸を含む場合、変更される変数は、異なる配列を有する異なる外因性ドナー核酸（例えば、異なる挿入核酸または異なるホモロジーアーム（例えば、より長いまたはより短いホモロジーアームまたはヒトＦ１２遺伝子の異なる領域を標的化するホモロジーアーム）を導入することであり得る。
特定の例では、ヒト凝固因子ＸＩＩ標的化試薬は、Ｃａｓタンパク質と、ヒトＦ１２遺伝子のガイドＲＮＡ標的配列を標的化するように設計されたガイドＲＮＡと、を含む。そのような方法では、変更される変数は、ガイドＲＮＡ配列および／またはガイドＲＮＡ標的配列であり得る。いくつかのそのような方法において、Ｃａｓタンパク質およびガイドＲＮＡは、それぞれＲＮＡの形態で投与することができ、変更される変数は、ガイドＲＮＡに対するＣａｓ ｍＲＮＡの比であり得る（例えば、ＬＮＰ製剤において）。いくつかのそのような方法において、変更される変数は、ガイドＲＮＡ修飾であり得る（例えば、修飾されたガイドＲＮＡは、修飾されていないガイドＲＮＡと比較される）。
Ｃ．ヒト凝固因子ＸＩＩ標的化試薬
ヒト凝固因子ＸＩＩ標的化試薬は、ヒトＦ１２遺伝子、ヒトＦ１２ ｍＲＮＡ、またはヒト凝固因子ＸＩＩタンパク質を標的化する任意の試薬であり得る。例えば、それは、ヒトＦ１２遺伝子内の標的配列を切断するヌクレアーゼ剤および／もしくはヒトＦ１２遺伝子と再結合する外因性ドナー配列などのゲノム編集試薬であってよい、それは、ヒトＦ１２ ｍＲＮＡを標的化するアンチセンスオリゴヌクレオチドであってよい、それはヒト凝固因子ＸＩＩタンパク質のエピトープを標的化する抗原結合タンパク質であってよい、またはそれはヒト凝固因子ＸＩＩを標的化する小分子であってよい。本明細書に開示される方法におけるヒト凝固因子ＸＩＩ標的化試薬は、既知のヒト凝固因子ＸＩＩ標的化試薬であってよく、推定上のヒト凝固因子ＸＩＩ標的化試薬（例えば、ヒト凝固因子ＸＩＩを標的化するように設計された候補試薬）であってよく、またはヒト凝固因子ＸＩＩ標的化活性についてスクリーニングされている試薬でであってよい。
（１）ヒトＦ１２遺伝子を標的化するヌクレアーゼ剤
ヒト凝固因子ＸＩＩ標的化試薬は、ヒトＦ１２遺伝子内の標的配列を切断するヌクレアーゼ剤などのゲノム編集試薬であり得る。ヌクレアーゼ標的配列は、ヌクレアーゼ剤によってニックまたは二本鎖切断が誘導されるＤＮＡ配列を含む。ヌクレアーゼ剤の標的配列は、細胞に対して内因性（または天然）であり得るか、または標的配列は、細胞に対して外因性であり得る。細胞にとって外因性である標的配列は、細胞のゲノム内で天然に存在しない。標的配列はまた、標的遺伝子座に配置されることを望む目的のポリヌクレオチドに対して外因性であり得る。場合によっては、標的配列は宿主細胞のゲノムに一度だけ存在する。
標的配列の長さは様々であり得、例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）対について約３０～３６ｂｐ（すなわち、各ＺＦＮについて約１５～１８ｂｐ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）について約３６ｂｐ、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ガイドＲＮＡについて約２０ｂｐである標的配列が含まれる。
所望の標的配列においてニックまたは二本鎖切断を誘導する任意のヌクレアーゼ剤を、本明細書に開示される方法および組成物で使用することができる。ヌクレアーゼ剤が所望の標的配列においてニックまたは二本鎖切断を誘導する限り、天然に存在するまたは天然のヌクレアーゼ剤を使用することができる。あるいは、改変または操作されたヌクレアーゼ剤を使用することができる。「操作されたヌクレアーゼ剤」は、その天然の形態から操作された（改変または誘導された）ヌクレアーゼを含み、所望の標的配列においてニックまたは二本鎖切断を特異的に認識および誘導する。したがって、操作されたヌクレアーゼ剤は、天然の天然に存在するヌクレアーゼ剤から誘導することができ、または人工的に作成または合成することができる。操作されたヌクレアーゼは、例えば、標的配列においてニックまたは二本鎖切断を誘発することができ、標的配列は、天然の（非操作または非改変）ヌクレアーゼ剤によって認識された配列ではない。ヌクレアーゼ剤の改変は、タンパク質切断剤中のわずか１アミノ酸または核酸切断剤中の１ヌクレオチドであってもよい。標的配列または他のＤＮＡにニックまたは二本鎖切断を生じさせることは、本明細書では、標的配列または他のＤＮＡを「切断する（ｃｕｔｔｉｎｇ）」または「切断する（ｃｌｅａｖｉｎｇ）」と呼ぶことができる。
例示された標的配列の活性バリアントおよびフラグメントも提供される。そのような活性バリアントは、所与の標的配列に対して少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性を含むことができ、活性バリアントは生物学的活性を保持し、したがって配列特異的様式でヌクレアーゼ剤によって認識および切断され得る。ヌクレアーゼ剤による標的配列の二本鎖切断を測定するためのアッセイは既知である。例えば、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｆｒｅｎｄｅｗｅｙ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ４７６：２９５－３０７を参照されたい。
ヌクレアーゼ剤の標的配列は、Ｆ１２遺伝子座の中または近くのどこであってもよい。標的配列は、Ｆ１２遺伝子のコード領域内、または遺伝子の発現に影響を及ぼす調節領域内に位置してもよい。ヌクレアーゼ剤の標的配列は、イントロン、エクソン、プロモーター、エンハンサー、調節領域、または任意の非タンパク質コード領域に位置してもよい。
ヌクレアーゼ剤の１つの種類は、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）である。ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼは、原核生物または真核生物のゲノム内の特定の標的配列で二本鎖切断を行うために使用できる配列特異的ヌクレアーゼのクラスである。ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼは、天然または操作された転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクター、またはその機能的部分を、例えば、ＦｏｋＩなどのエンドヌクレアーゼの触媒ドメインに融合することによって生成される。独自のモジュラーＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインにより、所与のＤＮＡ認識特異性を備えたタンパク質の設計が可能になる。したがって、ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインは、特定のＤＮＡ標的部位を認識するように操作することができ、したがって、所望の標的配列で二本鎖切断を行うために使用することができる。これらのそれぞれが参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１０／０７９４３０；Ｍｏｒｂｉｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０７（５０）：２１６１７－２１６２２、Ｓｃｈｏｌｚｅ＆Ｂｏｃｈ（２０１０）Ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ １：４２８－４３２、Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（２０１０）１８６：７５７－７６１、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（２０１０）３９（１）：３５９－３７２、およびＭｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２９：１４３－１４８を参照されたい。
好適なＴＡＬヌクレアーゼの例、および好適なＴＡＬヌクレアーゼを調製するための方法は、例えば、これらのそれぞれが参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、ＵＳ２０１１／０２３９３１５（Ａ１）、ＵＳ２０１１／０２６９２３４（Ａ１）、ＵＳ２０１１／０１４５９４０（Ａ１）、ＵＳ２００３／０２３２４１０（Ａ１）、ＵＳ２００５／０２０８４８９（Ａ１）、ＵＳ２００５／００２６１５７（Ａ１）、ＵＳ２００５／００６４４７４（Ａ１）、ＵＳ２００６／０１８８９８７（Ａ１）、およびＵＳ２００６／００６３２３１（Ａ１）に開示されている。様々な実施形態では、例えば、目的の遺伝子座または目的のゲノム遺伝子座において標的核酸配列内またはその近くを切断するＴＡＬエフェクターヌクレアーゼが操作され、ここで、標的核酸配列は、ターゲティングベクターによって改変される配列またはその近くにある。本明細書で提供される様々な方法および組成物での使用に適したＴＡＬヌクレアーゼには、本明細書に記載の標的ベクターによって改変される標的核酸配列またはその近くに結合するように特別に設計されたものが含まれる。
一部のＴＡＬＥＮでは、ＴＡＬＥＮの各モノマーは、２つの超可変残基を介して単一の塩基対を認識する３３～３５のＴＡＬリピートを含む。一部のＴＡＬＥＮでは、ヌクレアーゼ剤は、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼなどの独立したヌクレアーゼに作動可能に連結されたＴＡＬリピートベースのＤＮＡ結合ドメインを含むキメラタンパク質である。例えば、ヌクレアーゼ剤は、第１のＴＡＬリピートベースのＤＮＡ結合ドメインおよび第２のＴＡＬリピートベースのＤＮＡ結合ドメインを含むことができ、第１および第２のＴＡＬリピートベースのＤＮＡ結合ドメインのそれぞれは、ＦｏｋＩヌクレアーゼに作動可能に連結され、第１および第２のＴＡＬリピートベースのＤＮＡ結合ドメインは、様々な長さ（１２～２０ｂｐ）のスペーサー配列によって分離された標的ＤＮＡ配列の各鎖における２つの連続した標的ＤＮＡ配列を認識し、ＦｏｋＩヌクレアーゼサブユニットは二量体化して、標的配列で二本鎖切断を行う活性ヌクレアーゼを生成する。
本明細書に開示される様々な方法および組成物で使用されるヌクレアーゼ剤は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）をさらに含むことができる。一部のＺＦＮでは、ＺＦＮの各モノマーは３つ以上のジンクフィンガーベースのＤＮＡ結合ドメインを含み、各ジンクフィンガーベースのＤＮＡ結合ドメインは３ｂｐのサブサイトに結合する。他のＺＦＮでは、ＺＦＮは、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼなどの独立したヌクレアーゼに作動可能に連結されたジンクフィンガーベースのＤＮＡ結合ドメインを含むキメラタンパク質である。例えば、ヌクレアーゼ剤は、第１のＺＦＮおよび第２のＺＦＮを含むことができ、第１および第２のＺＦＮのそれぞれは、ＦｏｋＩヌクレアーゼサブユニットに作動可能に連結され、第１のＺＦＮおよび第２のＺＦＮは、約５～７ｂｐのスペーサーで分離された標的ＤＮＡ配列のそれぞれの鎖において２つの連続した標的ＤＮＡ配列を認識し、ＦｏｋＩヌクレアーゼサブユニットが二量体化して、二本鎖切断を行う活性ヌクレアーゼを生成する。例えば、それぞれが参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ２００６／０２４６５６７、ＵＳ２００８／０１８２３３２、ＵＳ２００２／００８１６１４、ＵＳ２００３／００２１７７６、ＷＯ／２００２／０５７３０８Ａ２、ＵＳ２０１３／０１２３４８４、ＵＳ２０１０／０２９１０４８、ＷＯ／２０１１／０１７２９３Ａ２、およびＧａｊ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３１（７）：３９７４０５を参照されたい。
別のタイプのヌクレアーゼ剤は、操作されたメガヌクレアーゼである。メガヌクレアーゼは、保存された配列モチーフに基づいて４つのファミリーに分類されており、ファミリーはＬＡＧＬＩＤＡＤＧ、ＧＩＹ－ＹＩＧ、Ｈ－Ｎ－Ｈ、およびＨｉｓ－Ｃｙｓボックスファミリーである。これらのモチーフは、金属イオンの配位およびホスホジエステル結合の加水分解に関与する。メガヌクレアーゼは、それらの長い標的配列、およびそれらのＤＮＡ基質におけるいくつかの配列多型を許容することで注目に値する。メガヌクレアーゼドメイン、構造および機能は既知である。例えば、Ｇｕｈａｎ ａｎｄ Ｍｕｎｉｙａｐｐａ（２００３）Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３８：１９９－２４８、Ｌｕｃａｓ ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２９：９６０－９、Ｊｕｒｉｃａ ａｎｄ Ｓｔｏｄｄａｒｄ，（１９９９）Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ ５５：１３０４－２６、Ｓｔｏｄｄａｒｄ，（２００６）Ｑ Ｒｅｖ Ｂｉｏｐｈｙｓ ３８：４９－９５、およびＭｏｕｒｅ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ ９：７６４を参照されたい。いくつかの例では、天然に存在するバリアントおよび／または操作された誘導体メガヌクレアーゼが使用される。動態、補因子相互作用、発現、最適条件、および／または標的配列特異性を改変するための方法、ならびに活性のスクリーニングは既知である。例えば、すべての目的のためにそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｅｐｉｎａｔ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３１：２９５２－６２、Ｃｈｅｖａｌｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ １０：８９５－９０５、Ｇｉｍｂｌｅ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３３４：９９３－１００８、Ｓｅｌｉｇｍａｎ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３０：３８７０－９、Ｓｕｓｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３４２：３１－４１、Ｒｏｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，（２００６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３４：４７９１－８００、Ｃｈａｍｅｓ ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３３：ｅ１７８、Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，（２００６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３４：ｅ１４９、Ｇｒｕｅｎ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３０：ｅ２９、Ｃｈｅｎ ａｎｄ Ｚｈａｏ，（２００５）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３３：ｅ１５４、ＷＯ２００５１０５９８９、ＷＯ２００３０７８６１９、ＷＯ２００６０９７８５４、ＷＯ２００６０９７８５３、ＷＯ２００６０９７７８４、およびＷＯ２００４０３１３４６を参照されたい。
例えば、Ｉ－ＳｃｅＩ、Ｉ－ＳｃｅＩＩ、Ｉ－ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ－ＳｃｅＩＶ、Ｉ－ＳｃｅＶ、Ｉ－ＳｃｅＶＩ、Ｉ－ＳｃｅＶＩＩ、Ｉ－ＣｅｕＩ、Ｉ－ＣｅｕＡＩＩＰ、Ｉ－ＣｒｅＩ、Ｉ－ＣｒｅｐｓｂＩＰ、Ｉ－ＣｒｅｐｓｂＩＩＰ、Ｉ－ＣｒｅｐｓｂＩＩＩＰ、Ｉ－ＣｒｅｐｓｂＩＶＰ、Ｉ－ＴｌｉＩ、Ｉ－ＰｐｏＩ、ＰＩ－ＰｓｐＩ、Ｆ－ＳｃｅＩ、Ｆ－ＳｃｅＩＩ、Ｆ－ＳｕｖＩ、Ｆ－ＴｅｖＩ、Ｆ－ＴｅｖＩＩ、Ｉ－ＡｍａＩ、Ｉ－ＡｎｉＩ、Ｉ－ＣｈｕＩ、Ｉ－ＣｍｏｅＩ、Ｉ－ＣｐａＩ、Ｉ－ＣｐａＩＩ、Ｉ－ＣｓｍＩ、Ｉ－ＣｖｕＩ、Ｉ－ＣｖｕＡＩＰ、Ｉ－ＤｄｉＩ、Ｉ－ＤｄｉＩＩ、Ｉ－ＤｉｒＩ、Ｉ－ＤｍｏＩ、Ｉ－ＨｍｕＩ、Ｉ－ＨｍｕＩＩ、Ｉ－ＨｓＮＩＰ、Ｉ－ＬｌａＩ、Ｉ－ＭｓｏＩ、Ｉ－ＮａａＩ、Ｉ－ＮａｎＩ、Ｉ－ＮｃＩＩＰ、Ｉ－ＮｇｒＩＰ、Ｉ－ＮｉｔＩ、Ｉ－ＮｊａＩ、Ｉ－Ｎｓｐ２３６ＩＰ、Ｉ－ＰａｋＩ、Ｉ－ＰｂｏＩＰ、Ｉ－ＰｃｕＩＰ、Ｉ－ＰｃｕＡＩ、Ｉ－ＰｃｕＶＩ、Ｉ－ＰｇｒＩＰ、Ｉ－ＰｏｂＩＰ、Ｉ－ＰｏｒＩ、Ｉ－ＰｏｒＩＩＰ、Ｉ－ＰｂｐＩＰ、Ｉ－ＳｐＢｅｔａＩＰ、Ｉ－ＳｃａＩ、Ｉ－ＳｅｘＩＰ、Ｉ－ＳｎｅＩＰ、Ｉ－ＳｐｏｍＩ、Ｉ－ＳｐｏｍＣＰ、Ｉ－ＳｐｏｍＩＰ、Ｉ－ＳｐｏｍＩＩＰ、Ｉ－ＳｑｕＩＰ、Ｉ－Ｓｓｐ６８０３Ｉ、Ｉ－ＳｔｈＰｈｉＪＰ、Ｉ－ＳｔｈＰｈｉＳＴ３Ｐ、Ｉ－ＳｔｈＰｈｉＳＴｅ３ｂＰ、Ｉ－ＴｄｅＩＰ、Ｉ－ＴｅｖＩ、Ｉ－ＴｅｖＩＩ、Ｉ－ＴｅｖＩＩＩ、Ｉ－ＵａｒＡＰ、Ｉ－ＵａｒＨＧＰＡＩＰ、Ｉ－ＵａｒＨＧＰＡ１３Ｐ、Ｉ－ＶｉｎＩＰ、Ｉ－ＺｂｉＩＰ、ＰＩ－ＭｔｕＩ、ＰＩ－ＭｔｕＨＩＰ、ＰＩ－ＭｔｕＨＩＩＰ、ＰＩ－ＰｆｕＩ、ＰＩ－ＰｆｕＩＩ、ＰＩ－ＰｋｏＩ、ＰＩ－ＰｋｏＩＩ、ＰＩ－Ｒｍａ４３８１２ＩＰ、ＰＩ－ＳｐＢｅｔａＩＰ、ＰＩ－ＳｃｅＩ、ＰＩ－ＴｆｕＩ、ＰＩ－ＴｆｕＩＩ、ＰＩ－ＴｈｙＩ、ＰＩ－ＴｌｉＩ、ＰＩ－ＴｌｉＩＩ、またはそれらの活性バリアントまたはフラグメントを含む、任意のメガヌクレアーゼを使用することができる。
メガヌクレアーゼは、例えば、１２～４０塩基対の二本鎖ＤＮＡ配列を認識することができる。場合によっては、メガヌクレアーゼは、ゲノム内の完全に一致する１つの標的配列を認識する。
一部のメガヌクレアーゼは、ホーミングヌクレアーゼである。ホーミングヌクレアーゼの１つのタイプは、例えば、Ｉ－ＳｃｅＩ、Ｉ－ＣｒｅＩ、およびＩ－Ｄｍｏｌを含むホーミングヌクレアーゼのＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリーである。
ヌクレアーゼ剤は、以下により詳細に記載されるように、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムをさらに含むことができる。
ヌクレアーゼ剤の活性バリアントおよびフラグメント（すなわち、操作されたヌクレアーゼ剤）も提供される。そのような活性バリアントは、天然のヌクレアーゼ剤に対して少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性を含むことができ、活性バリアントは、所望の標的配列で切断する能力を保持し、したがって、ニックまたは二本鎖切断誘導活性を保持する。例えば、本明細書に記載のヌクレアーゼ剤のいずれも、天然のエンドヌクレアーゼ配列から改変することができ、天然のヌクレアーゼ剤によって認識されなかった標的配列でニックまたは二本鎖切断を認識および誘導するように設計することができる。したがって、いくつかの操作されたヌクレアーゼは、対応する天然のヌクレアーゼ剤標的配列とは異なる標的配列でニックまたは二本鎖切断を誘導する特異性を有する。ニックまたは二本鎖切断誘導活性のアッセイは既知であり、一般に、標的配列を含むＤＮＡ基質上のエンドヌクレアーゼの全体的な活性および特異性を測定する。
ヌクレアーゼ剤は、任意の既知の手段によって細胞または非ヒト動物に導入することができる。ヌクレアーゼ剤をコードするポリペプチドは、細胞または非ヒト動物に直接導入してもよい。代替的に、ヌクレアーゼ剤をコードするポリヌクレオチドを細胞または非ヒト動物に導入してもよい。ヌクレアーゼ剤をコードするポリヌクレオチドが導入されると、ヌクレアーゼ剤は、細胞内で一過性に、条件付きで、または構成的に発現され得る。ヌクレアーゼ剤をコードするポリヌクレオチドは、発現カセットに含まれ得、条件付きプロモーター、誘導性プロモーター、構成的プロモーター、または組織特異的プロモーターに作動可能に連結され得る。プロモーターの例は、本明細書のいずこかでさらに詳細に論じられている。代替的に、ヌクレアーゼ剤は、ヌクレアーゼ剤をコードするｍＲＮＡとして細胞に導入さ得る。
ヌクレアーゼ剤をコードするポリヌクレオチドは、細胞のゲノムに安定して組み込まれ、細胞内で活性なプロモーターに作動可能に連結され得る。代替的に、ヌクレアーゼ剤をコードするポリヌクレオチドは、標的化ベクターに存在し得る。
ヌクレアーゼ剤をコードするポリヌクレオチドの導入によりヌクレアーゼ剤が細胞に提供される場合、ヌクレアーゼ剤をコードするそのようなポリヌクレオチドは、天然に存在するヌクレアーゼ剤をコードするポリヌクレオチド配列と比較して、目的の細胞においてより高い使用頻度を有するコドンを置換するように改変され得る。例えば、ヌクレアーゼ剤をコードするポリヌクレオチドは、天然に存在するポリヌクレオチド配列と比較して、ヒト細胞、非ヒト細胞、哺乳動物細胞、げっ歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、または任意の他の目的の宿主細胞を含む所与の真核細胞においてより頻度高く使用される代替コドンへと改変することができる。
（２）ヒトＦ１２遺伝子を標的化するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム
特定のタイプのヒト凝固因子ＸＩＩ標的化試薬は、ヒトＦ１２遺伝子を標的化するクラスター化等間隔短鎖回文リピート（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）システムであり得る。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系には、Ｃａｓ遺伝子の発現に関与する、またはその活性を指示する転写産物およびその他の要素が含まれている。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、例えば、タイプＩ、タイプＩＩ、タイプＩＩＩシステム、またはタイプＶシステム（例えば、サブタイプＶ－ＡまたはサブタイプＶ－Ｂ）であり得る。本明細書に開示される組成物および方法で使用されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、天然に存在しなくてもよい。「天然に存在しない」系は、系の１つ以上の構成要素が、それらの天然に存在する状態から改変または変異されている、それらが天然に関連する少なくとも１つの他の構成要素を少なくとも実質的に含まない、またはそれらが天然に関連しない少なくとも１つの他の構成要素と関連するなど、ヒトの手の関与を示す任意のものを含む。例えば、一部のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、天然に存在しないｇＲＮＡおよびＣａｓタンパク質を含む天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ複合体を使用するか、天然に存在しないＣａｓタンパク質を使用するか、天然に存在しないｇＲＮＡを使用する。
Ｃａｓタンパク質およびＣａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチド。Ｃａｓタンパク質は一般に、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と相互作用できる少なくとも１つのＲＮＡ認識または結合ドメインを含む。Ｃａｓタンパク質はまた、ヌクレアーゼドメイン（例えば、ＤＮａｓｅドメインまたはＲＮａｓｅドメイン）、ＤＮＡ結合ドメイン、ヘリカーゼドメイン、タンパク質－タンパク質相互作用ドメイン、二量体化ドメイン、および他のドメインを含むことができる。いくつかのそのようなドメイン（例えば、ＤＮａｓｅドメイン）は、天然のＣａｓタンパク質に由来する可能性がある。他のそのようなドメインを追加して、改変されたＣａｓタンパク質を作成することができる。ヌクレアーゼドメインは、核酸分子の共有結合の切断を含む、核酸切断のための触媒活性を有する。切断は平滑末端または付着末端を生成することができ、一本鎖または二本鎖であってもよい。例えば、野生型のＣａｓ９タンパク質は、通常、平滑の切断産物を生成する。あるいは、野生型Ｃｐｆ１タンパク質（例えば、ＦｎＣｐｆ１）は、非標的鎖のＰＡＭ配列から１８番目の塩基対の後および標的鎖の２３番目の塩基の後に切断が生じる、５－ヌクレオチドの５’オーバーハングを有する切断産物をもたらし得る。Ｃａｓタンパク質は、完全な切断活性を有し、標的ゲノム遺伝子座で二本鎖切断を作成することができ（例えば、平滑末端を持つ二本鎖切断）、またはそれは、標的ゲノム遺伝子座で一本鎖切断を作成するニッカーゼであってもよい。
Ｃａｓタンパク質の例としては、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ５ｅ（ＣａｓＤ）、Ｃａｓ６、Ｃａｓ６ｅ、Ｃａｓ６ｆ、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８ａ１、Ｃａｓ８ａ２、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ８ｃ、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１またはＣｓｘ１２）、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１０ｄ、ＣａｓＦ、ＣａｓＧ、ＣａｓＨ、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１（ＣａｓＡ）、Ｃｓｅ２（ＣａｓＢ）、Ｃｓｅ３（ＣａｓＥ）、Ｃｓｅ４（ＣａｓＣ）、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、およびＣｕ１９６６、ならびにそれらの相同性または改変バージョンが挙げられる。
例示的なＣａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質またはＣａｓ９タンパク質に由来するタンパク質である。Ｃａｓ９タンパク質はＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系に由来するものであり、通常、保存された構造を有する４つの重要なモチーフを共有している。モチーフ１、２、および４はＲｕｖＣ様モチーフであり、モチーフ３はＨＮＨモチーフである。例示的なＣａｓ９タンパク質は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ種、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ ｄａｓｓｏｎｖｉｌｌｅｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｒｉｓｔｉｎａｅｓｐｉｒａｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｓｅｕｄｏｍｙｃｏｉｄｅｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｅｌｅｎｉｔｉｒｅｄｕｃｅｎｓ、Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｉｂｉｒｉｃｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｍｉｃｒｏｓｃｉｌｌａ ｍａｒｉｎａ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｌｅｓ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｉｖｏｒａｎｓ、Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ種、Ｃｒｏｃｏｓｐｈａｅｒａ ｗａｔｓｏｎｉｉ、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ種、Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ種、Ａｃｅｔｏｈａｌｏｂｉｕｍ ａｒａｂａｔｉｃｕｍ、Ａｍｍｏｎｉｆｅｘ ｄｅｇｅｎｓｉｉ、Ｃａｌｄｉｃｅｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ ｂｅｃｓｃｉｉ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｄｅｓｕｌｆｏｒｕｄｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ ｍａｇｎａ、Ｎａｔｒａｎａｅｒｏｂｉｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｐｅｌｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ、Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｄｕｓ、Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ、Ａｌｌｏｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ ｖｉｎｏｓｕｍ、Ｍａｒｉｎｏｂａｃｔｅｒ種、Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ、Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ ｗａｔｓｏｎｉ、Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ ｈａｌｏｐｌａｎｋｔｉｓ、Ｋｔｅｄｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｒａｃｅｍｉｆｅｒ、Ｍｅｔｈａｎｏｈａｌｏｂｉｕｍ ｅｖｅｓｔｉｇａｔｕｍ、Ａｎａｂａｅｎａ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ、Ｎｏｄｕｌａｒｉａ ｓｐｕｍｉｇｅｎａ、Ｎｏｓｔｏｃ種、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｍａｘｉｍａ、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓ、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ種、Ｌｙｎｇｂｙａ種、Ｍｉｃｒｏｃｏｌｅｕｓ ｃｈｔｈｏｎｏｐｌａｓｔｅｓ、Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ種、Ｐｅｔｒｏｔｏｇａ ｍｏｂｉｌｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ ａｆｒｉｃａｎｕｓ、Ａｃａｒｙｏｃｈｌｏｒｉｓ ｍａｒｉｎａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、またはＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉに由来する。Ｃａｓ９ファミリーメンバーの追加の例は、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１４／１３１８３３に記載されている。Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９（ＳｐＣａｓ９）（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔアクセッション番号Ｑ９９ＺＷ２が割り当てられている）は、例示的なＣａｓ９タンパク質である。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ由来のＣａｓ９（ＳａＣａｓ９）（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｊ７ＲＵＡ５が割り当てられている）は、別の例示的なＣａｓ９タンパク質である。Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ由来のＣａｓ９（ＣｊＣａｓ９）（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｑ０Ｐ８９７が割り当てられている）は、別の例示的なＣａｓ９タンパク質である。例えば、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，（２０１７）Ｎａｔ．Ｃｏｍｍ．８：１４５００を参照されたい。ＳａＣａｓ９はＳｐＣａｓ９よりも小さく、ＣｊＣａｓ９はＳａＣａｓ９およびＳｐＣａｓ９の両方よりも小さい。Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来のＣａｓ９（Ｎｍｅ２Ｃａｓ９）は、別の例示的なＣａｓ９タンパク質である。例えば、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれるＥｄｒａｋｉ ｅｔ ａｌ．，（２０１９）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ ７３（４）：７１４－７２６を参照されたい。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＣａｓ９タンパク質（例えば、ＣＲＩＳＰＲ１遺伝子座によってコードされるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＬＭＤ－９ Ｃａｓ９（Ｓｔ１Ｃａｓ９）またはＣＲＩＳＰＲ３遺伝子座由来のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ Ｃａｓ９（Ｓｔ３Ｃａｓ９））は他の例示的なＣａｓ９タンパク質である。Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ由来のＣａｓ９（ＦｎＣａｓ９）または代替ＰＡＭ（Ｅ１３６９Ｒ／Ｅ１４４９Ｈ／Ｒ１５５６Ａ置換）を認識するＲＨＡ Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ Ｃａｓ９バリアントは、他の例示的なＣａｓ９タンパク質である。これらおよび他の例示的なＣａｓ９タンパク質は、例えば、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｃｅｂｒｉａｎ－Ｓｅｒｒａｎｏ ａｎｄ Ｄａｖｉｅｓ（２０１７）Ｍａｍｍ．Ｇｅｎｏｍｅ ２８（７）：２４７－２６１に概説される。例示的なＣａｓ９タンパク質配列は、配列番号３５を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなることができる。Ｃａｓ９タンパク質をコードする例示的なＤＮＡは、配列番号３６を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなることができる。
Ｃａｓタンパク質の別の例は、Ｃｐｆ１（ＰｒｅｖｏｔｅｌｌａおよびＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａ １由来のＣＲＩＳＰＲ）タンパク質である。Ｃｐｆ１は、Ｃａｓ９の対応するドメインに相同なＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインと、Ｃａｓ９の特徴的なアルギニンに富むクラスターに対応するものを含む大きなタンパク質（約１３００アミノ酸）である。しかし、Ｃｐｆ１は、Ｃａｓ９タンパク質に存在するＨＮＨヌクレアーゼドメインを欠いており、ＲｕｖＣ様ドメインはＨＮＨドメインを含む長いインサートを含むＣａｓ９とは対照的に、Ｃｐｆ１配列において連続している。例えば、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｃｅｌｌ １６３（３）：７５９－７７１を参照されたい。例示的なＣｐｆ１タンパク質は、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ １、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ亜種、ｎｏｖｉｃｉｄａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ａｌｂｅｎｓｉｓ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ細菌ＭＣ２０１７ １、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ ｐｒｏｔｅｏｃｌａｓｔｉｃｕｓ、Ｐｅｒｅｇｒｉｎｉｂａｃｔｅｒｉａ細菌ＧＷ２０１１＿ＧＷＡ２＿３３＿１０、Ｐａｒｃｕｂａｃｔｅｒｉａ細菌ＧＷ２０１１＿ＧＷＣ２＿４４＿１７、Ｓｍｉｔｈｅｌｌａ種ＳＣＡＤＣ、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ種ＢＶ３Ｌ６、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ細菌ＭＡ２０２０、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｓｍａ ｔｅｒｍｉｔｕｍ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｌｉｇｅｎｓ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｂｏｖｏｃｕｌｉ ２３７、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎａｄａｉ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ細菌ＮＤ２００６、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｃｒｅｖｉｏｒｉｃａｎｉｓ ３、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｄｉｓｉｅｎｓ、およびＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｍａｃａｃａｅに由来する。Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ Ｕ１１２由来のＣｐｆ１（ＦｎＣｐｆ１；割り当てられたＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ａ０Ｑ７Ｑ２）は、例示的なＣｐｆ１タンパク質である。
Ｃａｓタンパク質は、野生型タンパク質（すなわち、自然界に存在するもの）、改変されたＣａｓタンパク質（すなわち、Ｃａｓタンパク質バリアント）、または野生型もしくは改変されたＣａｓタンパク質のフラグメントであってもよい。Ｃａｓタンパク質はまた、野生型または改変されたＣａｓタンパク質の触媒活性に関して、活性バリアントまたはフラグメントであってもよい。触媒活性に関する活性バリアントまたはフラグメントは、野生型または改変されたＣａｓタンパク質またはその一部に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を含むことができ、活性バリアントは、所望の切断部位で切断する能力を保持し、したがってニック誘導または二本鎖切断誘導活性を保持する。ニック誘導または二本鎖切断誘導活性のアッセイは既知であり、一般に、切断部位を含むＤＮＡ基質上のＣａｓタンパク質の全体的な活性および特異性を測定する。
Ｃａｓタンパク質は、核酸結合親和性、核酸結合特異性、および酵素活性のうちの１つ以上を増加または減少させるように改変することができる。Ｃａｓタンパク質はまた、安定性など、タンパク質の他の活性または特性を変更するように改変することができる。例えば、Ｃａｓタンパク質の１つ以上のヌクレアーゼドメインを改変、欠失、もしくは不活性化することができ、またはＣａｓタンパク質を切断して、タンパク質の機能に必須ではないドメインを除去するか、またはＣａｓタンパク質の活性もしくは特性を最適化（例えば、増強もしくは低減）することができる。
改変されたＣａｓタンパク質の一例は、改変されたＳｐＣａｓ９－ＨＦ１タンパク質であり、非特異的ＤＮＡ接触を減らすように設計された改変（Ｎ４９７Ａ／Ｒ６６１Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ）を含むＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓのＣａｓ９の忠実度の高いバリアントである。例えば、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｎａｔｕｒｅ ５２９（７５８７）：４９０－４９５を参照されたい。改変されたＣａｓタンパク質の別の例は、オフターゲット効果を低減するように設計された改変ｅＳｐＣａｓ９バリアント（Ｋ８４８Ａ／Ｋ１００３Ａ／Ｒ１０６０Ａ）である。例えば、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｓｌａｙｍａｋｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５１（６２６８）：８４－８８を参照されたい。他のＳｐＣａｓ９バリアントとしては、Ｋ８５５ＡおよびＫ８１０Ａ／Ｋ１００３Ａ／Ｒ１０６０Ａが挙げられる。これらおよび他の改変されたＣａｓタンパク質は、例えば、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｃｅｂｒｉａｎ－Ｓｅｒｒａｎｏ ａｎｄ Ｄａｖｉｅｓ（２０１７）Ｍａｍｍ．Ｇｅｎｏｍｅ ２８（７）：２４７－２６１に概説される。改変Ｃａｓ９タンパク質の別の例はｘＣａｓ９であり、これは、これはＰＡＭ配列の拡大された範囲を認識することができるＳｐＣａｓ９バリアントである。例えば、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｈｕ ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｎａｔｕｒｅ ５５６：５７－６３を参照されたい。
Ｃａｓタンパク質は、ＤＮａｓｅドメインなどの少なくとも１つのヌクレアーゼドメインを含むことができる。例えば、野生型Ｃｐｆ１タンパク質は、一般に、おそらく二量体構成で、標的ＤＮＡの両方の鎖を切断するＲｕｖＣ様ドメインを含む。Ｃａｓタンパク質はまた、ＤＮａｓｅドメインなどの少なくとも２つのヌクレアーゼドメインを含むことができる。例えば、野生型Ｃａｓ９タンパク質は、一般に、ＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインおよびＨＮＨ様ヌクレアーゼドメインを含む。ＲｕｖＣドメインおよびＨＮＨドメインはそれぞれ、二本鎖ＤＮＡの異なる鎖を切断して、ＤＮＡに二本鎖切断を生成することができる。例えば、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７（６０９６）：８１６－８２１を参照されたい。
ヌクレアーゼドメインの１つ以上またはすべてを欠失または変異させることで、それらがもはや機能しなくさせたり、ヌクレアーゼ活性が低下させたりすることができる。例えば、ヌクレアーゼドメインの１つがＣａｓ９タンパク質で欠失または変異している場合、得られたＣａｓ９タンパク質はニッカーゼと呼ばれ、二本鎖標的ＤＮＡ内で一本鎖切断を生成することができるが、二本鎖切断を生成することはできない（すなわち、相補鎖または非相補鎖を切断することができるが、両方を切断することはできない）。両方のヌクレアーゼドメインが欠失または変異した場合、結果として得られるＣａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９）は、二本鎖ＤＮＡの両方の鎖を切断する能力が低下する（例えば、ヌクレアーゼヌルもしくはヌクレアーゼ不活性Ｃａｓタンパク質、または触媒作用が破壊されているＣａｓタンパク質（ｄＣａｓ））。Ｃａｓ９をニッカーゼに変換する変異の例は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９のＲｕｖＣドメインにおけるＤ１０Ａ（Ｃａｓ９の位置１０でアスパラギン酸からアラニン）変異である。同様に、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９のＨＮＨドメインにあるＨ９３９Ａ（アミノ酸位置８３９でのヒスチジンからアラニン）、Ｈ８４０Ａ（アミノ酸位置８４０でのヒスチジンからアラニン）、またはＮ８６３Ａ（アミノ酸位置Ｎ８６３でのヒスチジンからアラニン）はＣａｓ９をニッカーゼに変換できる。Ｃａｓ９をニッカーゼに変換する変異の他の例には、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＣａｓ９への対応する変異が含まれる。例えば、すべての目的のためにそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｓａｐｒａｎａｕｓｋａｓ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３９（２１）：９２７５－９２８２およびＷＯ２０１３／１４１６８０を参照されたい。このような変異は、部位特異的変異誘発、ＰＣＲ媒介変異誘発、または全遺伝子合成などの方法を使用して生成することができる。ニッカーゼを作成する他の変異の例は、例えば、すべての目的のためにそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１３／１７６７７２およびＷＯ２０１３／１４２５７８に見出すことができる。Ｃａｓタンパク質においてすべてのヌクレアーゼドメインが欠失または変異している（例えば、Ｃａｓ９タンパク質において両方のヌクレアーゼドメインが欠失または変異している）場合、結果として生じるＣａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９）は、二本鎖ＤＮＡの両方の鎖を切断する能力が低下する（例えば、ヌクレアーゼヌル、またはヌクレアーゼ不活性Ｃａｓタンパク質）。１つの具体的な例は、Ｄ１０Ａ／Ｈ８４０ＡのＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓのＣａｓ９の二重変異体、またはＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓのＣａｓ９と最適に整列した場合の別の種由来のＣａｓ９の対応する二重変異体である。別の具体的な例は、Ｄ１０Ａ／Ｎ８６３ＡのＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓのＣａｓ９の二重変異体、またはＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓのＣａｓ９と最適に整列した場合の別の種由来のＣａｓ９の対応する二重変異体である。
ｘＣａｓ９の触媒ドメインにおける不活性化変異の例は、ＳｐＣａｓ９について前述したものと同じである。Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓのＣａｓ９タンパク質の触媒ドメインにおける不活性化変異の例も知られている。例えば、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓのＣａｓ９酵素（ＳａＣａｓ９）は、位置Ｎ５８０での置換（例えば、Ｎ５８０Ａ置換）および位置Ｄ１０での置換（例えば、Ｄ１０Ａ置換）を含み得、ヌクレアーゼ不活性Ｃａｓタンパク質をもたらす。例えば、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１６／１０６２３６を参照されたい。Ｎｍｅ２Ｃａｓ９の触媒ドメインにおける不活性化変異の例も知られている（例えば、Ｄ１６ＡおよびＨ５８８Ａの組み合わせ）。Ｓｔ１Ｃａｓ９の触媒ドメインにおける不活性化変異の例も既知である（例えば、Ｄ９Ａ、Ｄ５９８Ａ、Ｈ５９９Ａ、およびＮ６２２Ａの組み合わせ）。Ｓｔ３Ｃａｓ９の触媒ドメインにおける不活性化変異の例も既知である（例えば、Ｄ１０ＡおよびＮ８７０Ａの組み合わせ）。ＣｊＣａｓ９の触媒ドメインにおける不活性化変異の例も既知である（例えば、Ｄ８ＡおよびＨ５５９Ａの組み合わせ）。ＦｎＣａｓ９およびＲＨＡ ＦｎＣａｓ９の触媒ドメインにおける不活性化変異の例も既知である（例えば、Ｎ９９５Ａ）。
Ｃｐｆ１タンパク質の触媒ドメインにおける不活性化変異の例も知られている。Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ Ｕ１１２（ＦｎＣｐｆ１）、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ種ＢＶ３Ｌ６（ＡｓＣｐｆ１）、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ細菌ＮＤ２００６（ＬｂＣｐｆ１）、およびＭｏｒａｘｅｌｌａ ｂｏｖｏｃｕｌｉ ２３７（ＭｂＣｐｆ１ Ｃｐｆ１）由来のＣｐｆ１タンパク質を参照すると、このような変異には、ＡｓＣｐｆ１の９０８、９９３、もしくは１２６３の位置、またはＣｐｆ１オーソログの対応する位置、またはＬｂＣｐｆ１の８３２、９２５、９４７、もしくは１１８０の位置、またはＣｐｆ１オーソログの対応する位置が含まれ得る。そのような変異は、例えば、ＡｓＣｐｆ１の変異Ｄ９０８Ａ、Ｅ９９３Ａ、およびＤ１２６３ＡもしくはＣｐｆ１オルソログの対応する変異、またはＬｂＣｐｆ１のＤ８３２Ａ、Ｅ９２５Ａ、Ｄ９４７Ａ、およびＤ１１８０ＡもしくはＣｐｆ１オルソログの対応する変異の１つ以上を含むことができる。例えば、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２０１６／０２０８２４３を参照されたい。
Ｃａｓタンパク質（例えば、ヌクレアーゼ活性Ｃａｓタンパク質もしくはヌクレアーゼ不活性Ｃａｓタンパク質）はまた、融合タンパク質として異種ポリペプチドに作動可能に連結することができる。例えば、Ｃａｓタンパク質は切断ドメインまたはエピジェネティック修飾ドメインに融合させることができる。すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１４／０８９２９０を参照されたい。Ｃａｓタンパク質はまた、安定性の増加または減少を提供する異種ポリペプチドに融合することができる。融合ドメインまたは異種ポリペプチドは、Ｎ末端、Ｃ末端、またはＣａｓタンパク質の内部に位置することができる。
一例として、Ｃａｓタンパク質は、細胞内局在化を提供する１つ以上の異種ポリペプチドに融合してもよい。そのような異種ポリペプチドは、例えば、核を標的とするための単一部分ＳＶ４０ ＮＬＳおよび／または二部分アルファインポーチンＮＬＳなどの１つ以上の核局在化シグナル（ＮＬＳ）、ミトコンドリアを標的とするためのミトコンドリア局在化シグナル、ＥＲ保持シグナルなどを含んでもよい。例えば、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｌａｎｇｅ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８２（８）：５１０１－５１０５を参照されたい。このような細胞内局在化シグナルは、Ｎ末端、Ｃ末端、またはＣａｓタンパク質内のどこにでも位置することができる。ＮＬＳは、一続きの塩基性アミノ酸を含むことができ、一部分配列または二部分配列であってもよい。任意選択で、Ｃａｓタンパク質は、Ｎ末端にＮＬＳ（例えば、アルファ－インポーチンＮＬＳまたは単一部分ＮＬＳ）およびＣ末端にＮＬＳ（例えば、ＳＶ４０ ＮＬＳまたは二部分ＮＬＳ）を含む２つ以上のＮＬＳを含んでもよい。Ｃａｓタンパク質はまた、Ｎ末端に２つ以上のＮＬＳおよび／またはＣ末端に２つ以上のＮＬＳを含むことができる。
Ｃａｓタンパク質はまた、細胞透過性ドメインまたはタンパク質導入ドメインに操作可能に連結することができる。例えば、細胞透過性ドメインは、ＨＩＶ－１ ＴＡＴタンパク質、ヒトＢ型肝炎ウイルス由来のＴＬＭ細胞透過性モチーフ、ＭＰＧ、Ｐｅｐ－１、ＶＰ２２、単純ヘルペスウイルス由来の細胞透過性ペプチド、またはポリアルギニンペプチド配列に由来することができる。例えば、すべての目的のためにそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１４／０８９２９０およびＷＯ２０１３／１７６７７２を参照されたい。細胞透過性ドメインは、Ｎ末端、Ｃ末端、またはＣａｓタンパク質内のどこにでも位置することができる。
Ｃａｓタンパク質はまた、追跡または精製を容易にするために、蛍光タンパク質、精製タグ、またはエピトープタグなどの異種ポリペプチドに作動可能に連結してもよい。蛍光タンパク質の例としては、緑色蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ、ＧＦＰ－２、ｔａｇＧＦＰ、ｔｕｒｂｏＧＦＰ、ｅＧＦＰ、エメラルド、アザミグリーン、モノメリックアザミグリーン、ＣｏｐＧＦＰ、ＡｃｅＧＦＰ、ＺｓＧｒｅｅｎｌ）、黄色蛍光タンパク質（例えば、ＹＦＰ、ｅＹＦＰ、シトリン、ヴィーナス、ＹＰｅｔ、ＰｈｉＹＦＰ、ＺｓＹｅｌｌｏｗｌ）、青色蛍光タンパク質（例えば、ｅＢＦＰ、ｅＢＦＰ２、アズライト、ｍＫａｌａｍａｌ、ＧＦＰｕｖ、サファイア、Ｔサファイア）、シアン蛍光タンパク質（例えば、ｅＣＦＰ、セルリアン、ＣｙＰｅｔ、ＡｍＣｙａｎｌ、Ｍｉｄｏｒｉｉｓｈｉ－Ｃｙａｎ）、赤色蛍光タンパク質（例えば、ｍＫａｔｅ、ｍＫａｔｅ２、ｍＰｌｕｍ、ＤｓＲｅｄモノマー、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＲＦＰ１、ＤｓＲｅｄ－Ｅｘｐｒｅｓｓ、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄ－Ｍｏｎｏｍｅｒ、ＨｃＲｅｄ－Ｔａｎｄｅｍ、ＨｃＲｅｄｌ、ＡｓＲｅｄ２、ｅｑＦＰ６１１、ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊｒｅｄ）、オレンジ色蛍光タンパク質（例えば、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、Ｋｕｓａｂｉｒａ－Ｏｒａｎｇｅ、Ｍｏｎｏｍｅｒ Ｋｕｓａｂｉｒａ－Ｏｒａｎｇｅ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ｔｄＴｏｍａｔｏなど）、およびその他の好適な蛍光タンパク質が挙げられる。タグの例としては、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、マルトース結合タンパク質、チオレドキシン（ＴＲＸ）、ポリ（ＮＡＮＰ）、タンデムアフィニティー精製（ＴＡＰ）タグ、ｍｙｃ、ＡｃＶ５、ＡＵ１、ＡＵ５、Ｅ、ＥＣＳ、Ｅ２、ＦＬＡＧ、血球凝集素（ＨＡ）、ｎｕｓ、Ｓｏｆｔａｇ １、Ｓｏｆｔａｇ ３、Ｓｔｒｅｐ、ＳＢＰ、Ｇｌｕ－Ｇｌｕ、ＨＳＶ、ＫＴ３、Ｓ、Ｓ１、Ｔ７、Ｖ５、ＶＳＶ－Ｇ、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、ビオチンカルボキシルキャリアタンパク質（ＢＣＣＰ）、およびカルモジュリンが挙げられる。
Ｃａｓタンパク質は、標識された核酸またはドナー配列に係留してもよい。そのような係留（すなわち、物理的結合）は、共有相互作用もしくは非共有相互作用を介して達成することができ、係留は、直接（例えば、タンパク質またはインテイン修飾上のシステインまたはリジン残基の修飾によって達成することができる直接融合または化学的結合を介して）、またはストレプトアビジンもしくはアプタマーなどの１つ以上の介在するリンカーまたはアダプター分子を介して達成することができる。例えば、すべての目的のためにそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｐｉｅｒｃｅ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｍｉｎｉ Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．５（１）：４１－５５、Ｄｕｃｋｗｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．４６（４６）：８８１９－８８２２、Ｓｃｈａｅｆｆｅｒ ａｎｄ Ｄｉｘｏｎ（２００９）Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ Ｊ．Ｃｈｅｍ．６２（１０）：１３２８－１３３２、Ｇｏｏｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ．１０（９）：１５５１－１５５７、およびＫｈａｔｗａｎｉ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２０（１４）：４５３２－４５３９を参照されたい。タンパク質－核酸コンジュゲートを合成するための非共有戦略には、ビオチン－ストレプトアビジンおよびニッケル－ヒスチジン法が含まれる。共有結合タンパク質－核酸コンジュゲートは、様々な化学物質を使用して適切に機能化された核酸およびタンパク質を接続することによって合成できる。これらの化学物質のいくつかは、タンパク質表面のアミノ酸残基（例えば、リジンアミンもしくはシステインチオール）へのオリゴヌクレオチドの直接結合を含むが、他のより複雑なスキームは、タンパク質の翻訳後修飾または触媒もしくは反応性タンパク質ドメインの関与を必要とする。タンパク質の核酸への共有結合の方法には、例えば、オリゴヌクレオチドのタンパク質リジンまたはシステイン残基への化学的架橋、発現されたタンパク質ライゲーション、化学酵素的方法、および光アプタマーの使用が含まれ得る。外因性ドナー核酸または標識された核酸は、Ｃａｓタンパク質のＣ末端、Ｎ末端、または内部領域に係留されていてもよい。一例では、外因性ドナー核酸または標識された核酸は、Ｃａｓタンパク質のＣ末端またはＮ末端に係留される。同様に、Ｃａｓタンパク質は、外因性ドナー核酸または標識された核酸の５’末端、３’末端、または内部領域に係留されていてもよい。すなわち、外因性ドナー核酸または標識された核酸は、任意の方向および極性で係留してもよい。例えば、Ｃａｓタンパク質は、外因性ドナー核酸または標識された核酸の５’末端または３’末端に係留されていてもよい。
Ｃａｓタンパク質は任意の形態で提供してもよい。例えば、Ｃａｓタンパク質は、ｇＲＮＡと複合体を形成したＣａｓタンパク質などのタンパク質の形態で提供してもよい。代替的に、Ｃａｓタンパク質は、ＲＮＡ（例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ））またはＤＮＡなどの、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸の形態で提供してもよい。任意選択で、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、特定の細胞または生物におけるタンパク質への効率的な翻訳のためにコドン最適化してもよい。例えば、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、天然に存在するポリヌクレオチド配列と比較して、細菌細胞、酵母細胞、ヒト細胞、非ヒト細胞、哺乳動物細胞、げっ歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、または任意の他の目的の宿主細胞においてより頻度高く使用される代替コドンへと改変することができる。Ｃａｓタンパク質をコードする核酸が細胞に導入されると、Ｃａｓタンパク質は、一過性に、条件付きで、または構成的に細胞内で発現され得る。
ｍＲＮＡとして提供されるＣａｓタンパク質は、安定性および／または免疫原性の特性を改善するために修飾することができる。改変は、ｍＲＮＡ内の１つ以上のヌクレオシドに対して行うことができる。ｍＲＮＡ核酸塩基への化学改変の例としては、シュードウリジン、１－メチル－シュードウリジン、および５－メチル－シチジンが挙げられる。例えば、Ｎ１－メチルシュードウリジンを含むキャップおよびポリアデニル化されたＣａｓ ｍＲＮＡを使用することができる。同様に、Ｃａｓ ｍＲＮＡは、同義のコドンを使用してウリジンを枯渇させることによって改変することができる。
Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、細胞のゲノムに安定して組み込まれ、細胞内で活性のあるプロモーターに作動可能に連結することができる。代替的に、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、発現コンストラクト中のプロモーターに作動可能に連結され得る。発現コンストラクトは、遺伝子または他の目的の核酸配列（例えば、Ｃａｓ遺伝子）の発現を指示することができ、そのような目的の核酸配列を標的細胞に導入することができる任意の核酸コンストラクトを含む。例えば、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、核酸インサートを含む標的化ベクターに存在してもよいし、かつ／またはｇＲＮＡをコードするＤＮＡを含むベクター内に存在してもよい。あるいは、それは、核酸インサートを含む標的化ベクターとは別のおよび／またはｇＲＮＡをコードするＤＮＡを含むベクターとは別の、ベクターまたはプラスミドに存在してもよい。発現コンストラクトにおいて使用することができるプロモーターには、例えば、真核細胞、ヒト細胞、非ヒト細胞、哺乳動物細胞、非ヒト哺乳動物細胞、げっ歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、ハムスター細胞、ウサギ細胞、多能性細胞、胚性幹（ＥＳ）細胞、または接合体のうちの１つ以上において活性なプロモーターが含まれる。そのようなプロモーターは、例えば、条件付きプロモーター、誘導性プロモーター、構成的プロモーター、または組織特異的プロモーターであってよい。任意選択で、プロモーターは、一方向のＣａｓタンパク質および他の方向のガイドＲＮＡの両方の発現を駆動する双方向プロモーターであってもよい。このような双方向プロモーターは、（１）遠位配列要素（ＤＳＥ）、近位配列要素（ＰＳＥ）、およびＴＡＴＡボックスの３つの外部制御要素を含む完全な従来の一方向Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター、ならびに（２）ＤＳＥの５’末端に逆方向に融合されたＰＳＥおよびＴＡＴＡボックスを含む第２の基本的なＰｏｌ ＩＩＩプロモーターで構成してもよい。例えば、Ｈ１プロモーターでは、ＤＳＥはＰＳＥおよびＴＡＴＡボックスに隣接しており、プロモーターは、Ｕ６プロモーターに由来するＰＳＥおよびＴＡＴＡボックスを追加することによって逆方向の転写が制御されるハイブリッドプロモーターを作成することにより、双方向にすることができる。例えば、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２０１６／００７４５３５を参照されたい。双方向プロモーターを使用してＣａｓタンパク質およびガイドＲＮＡをコードする遺伝子を同時に発現させることにより、コンパクトな発現カセットを生成して送達を容易にすることができる。
ガイドＲＮＡ。「ガイドＲＮＡ」または「ｇＲＮＡ」は、Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９タンパク質）に結合し、Ｃａｓタンパク質を標的ＤＮＡ内の特定の位置に標的化するＲＮＡ分子である。ガイドＲＮＡは、「ＤＮＡ標的化セグメント」および「タンパク質結合セグメント」の２つのセグメントで構成できる。「セグメント」は、ＲＮＡ中のヌクレオチドの連続したストレッチなどの、分子のセクションまたは領域を含む。Ｃａｓ９用などの一部のｇＲＮＡは、「アクチベーターＲＮＡ」（例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡ）および「ターゲッターＲＮＡ」（例えば、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ）の２つの別個のＲＮＡ分子を含むことができる。他のｇＲＮＡは単一ＲＮＡ分子（単一ＲＮＡポリヌクレオチド）であり、これは「単一分子ｇＲＮＡ」、「単一ガイドＲＮＡ」、または「ｓｇＲＮＡ」と呼ばれることもある。例えば、すべての目的のためにそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１３／１７６７７２、ＷＯ２０１４／０６５５９６、ＷＯ２０１４／０８９２９０、ＷＯ２０１４／０９３６２２、ＷＯ２０１４／０９９７５０、ＷＯ２０１３／１４２５７８、およびＷＯ２０１４／１３１８３３を参照されたい。例えば、Ｃａｓ９の場合、シングルガイドＲＮＡは、（例えば、リンカーを介して）ｔｒａｃｒＲＮＡに融合したｃｒＲＮＡを含むことができる。例えば、Ｃｐｆ１の場合、標的配列への結合および／または切断を達成するために必要なのはｃｒＲＮＡのみである。「ガイドＲＮＡ」および「ｇＲＮＡ」という用語は、二重分子（すなわち、モジュラー）ｇＲＮＡおよび単一分子ｇＲＮＡの両方を含む。
例示的な２分子ｇＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ様（「ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ」または「ターゲッターＲＮＡ」または「ｃｒＲＮＡ」または「ｃｒＲＮＡリピート」）分子および対応するｔｒａｃｒＲＮＡ様（「トランス作用性ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ」または「アクチベーター－ＲＮＡ」または「ｔｒａｃｒＲＮＡ」）分子を含む。ｃｒＲＮＡは、ｇＲＮＡのＤＮＡ標的セグメント（一本鎖）および、ｇＲＮＡのタンパク質結合セグメントのｄｓＲＮＡ二重鎖の半分を形成するヌクレオチドのストレッチ（つまり、ｃｒＲＮＡテール）の両方を含む。ＤＮＡ標的化セグメントの下流（３’）に位置するｃｒＲＮＡテールの例は、ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵ（配列番号３７）を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。本明細書に開示されるＤＮＡ標的化セグメントのいずれも、配列番号３７の５’末端に結合して、ｃｒＲＮＡを形成することができる。
対応するｔｒａｃｒＲＮＡ（アクチベーター－ＲＮＡ）は、ｇＲＮＡのタンパク質結合セグメントのｄｓＲＮＡ二重鎖の残りの半分を形成するヌクレオチドのストレッチを含む。ｃｒＲＮＡのヌクレオチドのストレッチは、ｔｒａｃｒＲＮＡのヌクレオチドのストレッチと相補的であり、ハイブリダイズして、ｇＲＮＡのタンパク質結合ドメインのｄｓＲＮＡ二重鎖を形成する。したがって、各ｃｒＲＮＡは対応するｔｒａｃｒＲＮＡを有すると言える。ｔｒａｃｒＲＮＡ配列の例は、ＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵ（配列番号３８）を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。ｔｒａｃｒＲＮＡ配列の他の例は、ＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵ（配列番号８０）、またはＧＵＵＧＧＡＡＣＣＡＵＵＣＡＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（配列番号８１）を含むか、それらから本質的になるか、またはそれらからなる。
ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの両方が必要なシステムでは、ｃｒＲＮＡおよび対応するｔｒａｃｒＲＮＡがハイブリダイズして、ｇＲＮＡを形成する。ｃｒＲＮＡのみが必要な系では、ｃｒＲＮＡはｇＲＮＡであってもよい。ｃｒＲＮＡはさらに、標的ＤＮＡの相補鎖にハイブリダイズする一本鎖ＤＮＡ標的セグメントを提供する。細胞内での改変に使用する場合、所与のｃｒＲＮＡまたはｔｒａｃｒＲＮＡ分子の正確な配列は、ＲＮＡ分子が使用される種に固有になるように設計することができる。例えば、すべての目的のためにそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｍａｌｉ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９（６１２１）：８２３－８２６、Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７（６０９６）：８１６－８２１、Ｈｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１（３）：２２７－２２９、Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１（３）：２３３－２３９、およびＣｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９（６１２１）：８１９－８２３を参照されたい。
所与のｇＲＮＡのＤＮＡ標的セグメント（ｃｒＲＮＡ）は、以下により詳細に記載されるように、標的ＤＮＡの相補鎖上の配列に相補的なヌクレオチド配列を含む。ｇＲＮＡのＤＮＡ標的セグメントは、ハイブリダイゼーション（すなわち、塩基対形成）を介して配列特異的に標的ＤＮＡと相互作用する。したがって、ＤＮＡ標的セグメントのヌクレオチド配列は変化する可能性があり、ｇＲＮＡおよび標的ＤＮＡが相互作用する標的ＤＮＡ内の位置を決定する。対象のｇＲＮＡのＤＮＡ標的セグメントは、標的ＤＮＡ内の任意の所望の配列にハイブリダイズするように改変することができる。天然に存在するｃｒＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムおよび生物によって異なるが、２１から４６ヌクレオチドの長さの２つのダイレクトリピート（ＤＲ）が隣接する、２１から７２ヌクレオチドの長さの標的化セグメントをしばしば含む（例えば、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１４／１３１８３３を参照されたい）。Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓの場合、ＤＲは３６ヌクレオチド長であり、標的化セグメントは３０ヌクレオチド長である。３’に位置するＤＲは、対応するｔｒａｃｒＲＮＡに相補的であり、ハイブリダイズし、これが次に、Ｃａｓタンパク質に結合する。
ＤＮＡ標的化セグメントは、例えば、少なくとも約１２、１５、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、または４０ヌクレオチドの長さを有してもよい。そのようなＤＮＡ標的化セグメントは、例えば、約１２～約１００、約１２～約８０、約１２～約５０、約１２～約４０、約１２～約３０、約１２～約２５、または約１２～約２０ヌクレオチドの長さを有することができる。例えば、ＤＮＡ標的化セグメントは約１５～約２５ヌクレオチド（例えば、約１７～約２０ヌクレオチド、または約１７、１８、１９、もしくは２０ヌクレオチド）であってよい。例えば、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２０１６／００２４５２３を参照されたい。Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９の場合、典型的なＤＮＡ標的化セグメントは、１６～２０ヌクレオチド長、または１７～２０ヌクレオチド長である。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ由来のＣａｓ９の場合、典型的なＤＮＡ標的化セグメントは２１～２３ヌクレオチド長である。Ｃｐｆ１の場合、典型的なＤＮＡ標的化セグメントは、少なくとも１６ヌクレオチド長または少なくとも１８ヌクレオチド長である。
ｔｒａｃｒＲＮＡは、任意の形態（例えば、完全長ｔｒａｃｒＲＮＡまたは活性部分ｔｒａｃｒＲＮＡ）であってもよく、様々な長さであってもよい。それらには、一次転写物または処理された形態を含むことができる。例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡ（シングルガイドＲＮＡの一部として、もしくは２分子ｇＲＮＡの一部としての別個の分子として）は、野生型ｔｒａｃｒＲＮＡ配列のすべてまたは一部（例えば、野生型ｔｒａｃｒＲＮＡ配列の約２０、２６、３２、４５、４８、５４、６３、６７、８５、もしくはそれ以上のヌクレオチド）を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなることができる。Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来の野生型ｔｒａｃｒＲＮＡ配列の例には、１７１ヌクレオチド、８９ヌクレオチド、７５ヌクレオチド、および６５ヌクレオチドのバージョンが含まれる。例えば、すべての目的のためにそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｄｅｌｔｃｈｅｖａ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ ４７１（７３４０）：６０２－６０７、ＷＯ２０１４／０９３６６１を参照されたい。シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）内のｔｒａｃｒＲＮＡの例としては、ｓｇＲＮＡの＋４８、＋５４、＋６７、および＋８５バージョン内に見出されるｔｒａｃｒＲＮＡセグメントが挙げられ、ここで、「＋ｎ」は、野生型ｔｒａｃｒＲＮＡの最大＋ｎヌクレオチドがｓｇＲＮＡに含まれることを示す。すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ８，６９７，３５９を参照されたい。
ガイドＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントと標的ＤＮＡの相補鎖との間の相補性パーセントは、少なくとも６０％（例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）であってよい。ＤＮＡ標的セグメントと標的ＤＮＡの相補鎖との間のパーセント相補性は、約２０個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも６０％であってもよい。一例として、ＤＮＡ標的化セグメントと標的ＤＮＡの相補鎖との間の相補性パーセントは、標的ＤＮＡの相補鎖の５’末端にある１４個の連続するヌクレオチドに対して１００％であってよく、かつ残りの部分に対して０％まで低くてもよい。このような場合、ＤＮＡ標的セグメントは１４ヌクレオチド長であるとみなすことができる。別の例として、ＤＮＡ標的化セグメントと標的ＤＮＡの相補鎖との間の相補性パーセントは、標的ＤＮＡの相補鎖の５’末端にある７個の連続するヌクレオチドに対して１００％であってよく、かつ残りの部分に対して０％まで低くてもよい。このような場合、ＤＮＡ標的セグメントは７ヌクレオチド長であるとみなすことができる。一部のガイドＲＮＡでは、ＤＮＡ標的化セグメント内の少なくとも１７個のヌクレオチドが標的ＤＮＡの相補鎖に相補的である。例えば、ＤＮＡ標的化セグメントは２０ヌクレオチド長であり、標的ＤＮＡの相補鎖との１、２、または３個のミスマッチを含んでもよい。一例では、ミスマッチは、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列に対応する相補鎖（すなわち、ＰＡＭ配列の逆相補体）の領域に隣接していない（例えば、ミスマッチは、ガイドＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントの５’末端にあるか、またはミスマッチは、ＰＡＭ配列に対応する相補鎖の領域から少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、もしくは１９塩基対離れている）。
ｇＲＮＡのタンパク質結合セグメントは、互いに相補的な２つのヌクレオチドストレッチを含むことができる。タンパク質結合セグメントの相補的ヌクレオチドは、ハイブリダイズして二本鎖ＲＮＡ二重鎖（ｄｓＲＮＡ）を形成する。対象のｇＲＮＡのタンパク質結合セグメントは、Ｃａｓタンパク質と相互作用し、ｇＲＮＡは、結合したＣａｓタンパク質を、ＤＮＡ標的セグメントを介して標的ＤＮＡ内の特定のヌクレオチド配列に指向させる。
シングルガイドＲＮＡは、足場配列（すなわち、ガイドＲＮＡのタンパク質結合またはＣａｓ結合配列）に結合したＤＮＡ標的セグメントを含むことができる。例えば、そのようなガイドＲＮＡは、５’ＤＮＡ標的セグメントおよび３’足場配列を有することができる。例示的な足場配列は、ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵ（バージョン１、配列番号３９）；ＧＵＵＧＧＡＡＣＣＡＵＵＣＡＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（バージョン２、配列番号４０）；ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（バージョン３、配列番号４１）；およびＧＵＵＵＡＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＧＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＵＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（バージョン４、配列番号４２）を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなることができる。他の例示的な足場配列は、ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵＵＵＵ（バージョン５、配列番号８２）；ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵ（バージョン６、配列番号８３）；もしくはＧＵＵＵＡＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＧＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＵＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵＵＵ（バージョン７、配列番号８４）を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなることができる。任意のガイドＲＮＡ標的配列を標的化するガイドＲＮＡは、例えば、ガイドＲＮＡの３’末端の例示的なガイドＲＮＡ足場配列のいずれかに融合したガイドＲＮＡの５’末端のＤＮＡ標的化セグメントを含むことができる。すなわち、本明細書に開示されるＤＮＡ標的化セグメントのいずれも、配列番号３９～４２のうちのいずれか１つの５’末端に結合して、単一ガイドＲＮＡ（キメラガイドＲＮＡ）を形成することができる。本明細書の他の場所に開示されるガイドＲＮＡバージョン１、２、３、および４は、それぞれ、足場バージョン１、２、３、および４と結合されたＤＮＡ標的セグメント（すなわち、ガイド配列またはガイド）を指す。同様に、本明細書に開示されるＤＮＡ標的化セグメントのいずれも、配列番号８２～８４のうちのいずれか１つの５’末端に結合して、単一ガイドＲＮＡ（キメラガイドＲＮＡ）を形成することができる。本明細書の他の場所に開示されるガイドＲＮＡバージョン５、６、および７は、それぞれ、足場バージョン５、６、および７と結合されたＤＮＡ標的セグメント（すなわち、ガイド配列またはガイド）を指す。
ガイドＲＮＡは、追加の所望の特徴（例えば、改変もしくは調節された安定性、細胞内標的化、蛍光標識による追跡、タンパク質もしくはタンパク質複合体の結合部位など）を提供する改変または配列を含むことができる。そのような改変の例としては、例えば、５’キャップ（例えば、７－メチルグアニル酸キャップ（ｍ７Ｇ））、３’ポリアデニル化テール（すなわち、３’ポリ（Ａ）テール）、リボスイッチ配列（例えば、タンパク質および／またはタンパク質複合体による安定性の調節および／または接近性の調節を可能にする）、安定性制御配列、ｄｓＲＮＡ二重鎖を形成する配列（すなわち、ヘアピン）、ＲＮＡを細胞内の位置（例えば、核、ミトコンドリア、葉緑体など）に標的化する改変または配列、追跡を提供する改変または配列（例えば、蛍光分子への直接コンジュゲーション、蛍光検出を容易にする部分へのコンジュゲーション、蛍光検出を可能にする配列など）、タンパク質（例えば、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ＤＮＡデメチラーゼ、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼなどを含む、ＤＮＡに作用するタンパク質）に対する結合部位を提供する改変または配列、ならびにそれらの組み合わせが挙げられる。改変の他の例としては、操作されたステムループ二重構造、操作されたバルジ領域、ステムループ二重構造の３’側の操作されたヘアピン、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。例えば、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ２０１５／０３７６５８６を参照されたい。バルジは、ｃｒＲＮＡ様領域と最小のｔｒａｃｒＲＮＡ様領域で構成される二重鎖内のヌクレオチドの対になっていない領域であってもよい。バルジは、二重鎖の片側に、Ｘが任意のプリンであり、Ｙが反対側の鎖のヌクレオチドとゆらぎ塩基対を形成できるヌクレオチドであってもよい５’－ＸＸＸＹ－３’、および二重鎖の他方の側に対になっていないヌクレオチド領域を含むことができる。
改変されていない核酸は分解されやすい傾向がある可能性がある。外因性の核酸はまた、自然免疫応答を誘発することができる。改変は、安定性を導入し、免疫原性を低下させるのに役立つことができる。ガイドＲＮＡは、例えば、以下の（１）ホスホジエステル骨格結合における非連結リン酸酸素の一方または両方および／または連結リン酸酸素の１つ以上の変更または置換、（２）リボース糖の２’ヒドロキシルの変更または置換などのリボース糖の構成要素の変更または置換、（３）リン酸部分の脱リン酸化リンカーによる置換、（４）天然に存在する核酸塩基の改変または置換、（５）リボース－リン酸骨格の置換または改変、（６）オリゴヌクレオチドの３’末端または５’末端の改変（例えば、末端リン酸基の除去、改変または置換、または部分のコンジュゲーション）、ならびに（７）糖の改変のうちの１つ以上を含む改変ヌクレオシドおよび改変ヌクレオチドを含むことができる。他の可能なガイドＲＮＡ改変としては、ウラシルまたはポリウラシルトラクトの改変または置換が挙げられる。例えば、すべての目的のためにそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１５／０４８５７７およびＵＳ２０１６／０２３７４５５を参照されたい。同様の改変を、Ｃａｓ ｍＲＮＡなどのＣａｓをコードする核酸に加えることができる。例えば、Ｃａｓ ｍＲＮＡは、同義のコドンを使用してウリジンを枯渇させることによって修飾することができる。
一例として、ガイドＲＮＡの５’または３’末端のヌクレオチドは、ホスホロチオエート結合を含んでもよい（例えば、塩基は、ホスホロチオエート基である修飾リン酸基を有してもよい）。例えば、ガイドＲＮＡは、ガイドＲＮＡの５’または３’末端の２、３、または４つの末端ヌクレオチド間のホスホロチオアート結合を含むことができる。別の例として、ガイドＲＮＡの５’および／または３’末端のヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル改変を有することができる。例えば、ガイドＲＮＡは、ガイドＲＮＡの５’および／または３’末端（例えば、５’末端）の２、３、または４末端ヌクレオチドに２’－Ｏ－メチル改変を含むことができる。例えば、すべての目的のためにそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１７／１７３０５４（Ａ１）およびＦｉｎｎ ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．２２（９）：２２２７－２２３５を参照されたい。１つの特定の例では、ガイドＲＮＡは、最初の３つの５’および３’末端ＲＮＡ残基に２’－Ｏ－メチル類似体および３’ホスホロチオアートヌクレオチド間結合を含む。別の特定の例では、Ｃａｓ９タンパク質と相互作用しないすべての２’ＯＨ基が２’－Ｏ－メチル類似体で置き換えられるようにガイドＲＮＡが改変され、Ｃａｓ９との相互作用が最小限であるガイドＲＮＡのテール領域は、５’および３’ホスホロチオアートヌクレオチド間結合で改変される。例えば、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｙｉｎ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．３５（１２）：１１７９－１１８７を参照されたい。改変されたガイドＲＮＡの他の例は、例えば、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１８／１０７０２８（Ａ１）で提供される。そのような化学修飾は、例えば、エキソヌクレアーゼからのより優れた安定性および保護をガイドＲＮＡに提供して、それらが未修飾のガイドＲＮＡよりも長く細胞内に存続することを可能にする。このような化学修飾は、例えば、ＲＮＡを積極的に分解したり、細胞死をもたらす免疫カスケードを引き起こしたりする可能性のある自然免疫応答から保護することもできる。
ガイドＲＮＡはどのような形態で提供してもよい。例えば、ｇＲＮＡは、２つの分子（別個のｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ）または１つの分子（ｓｇＲＮＡ）のいずれかとして、かつ任意選択でＣａｓタンパク質との複合体の形態で、ＲＮＡの形態で提供してもよい。ｇＲＮＡはまた、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡの形態で提供してもよい。ｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、単一のＲＮＡ分子（ｓｇＲＮＡ）または別個のＲＮＡ分子（例えば、別個のｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ）をコードしてもよい。後者の場合、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、１つのＤＮＡ分子として、またはそれぞれｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡをコードする別個のＤＮＡ分子として提供してもよい。
ｇＲＮＡがＤＮＡの形態で提供される場合、ｇＲＮＡは一過性、条件付き、または構成的に細胞内で発現してもよい。ｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、細胞のゲノムに安定して組み込まれ、細胞内で活性のあるプロモーターに作動可能に連結してもよい。代替的に、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、発現コンストラクトのプロモーターに作動可能に連結してもよい。例えば、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸などの異種核酸を含むベクター内にあってもよい。代替的に、それは、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸を含むベクターとは別のベクターまたはプラスミドにあってもよい。そのような発現コンストラクトにおいて使用することができるプロモーターとしては、例えば、真核細胞、ヒト細胞、非ヒト細胞、哺乳動物細胞、非ヒト哺乳動物細胞、げっ歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、ハムスター細胞、ウサギ細胞、多能性細胞、胚性幹（ＥＳ）細胞、成体幹細胞、発生が制限された前駆細胞、誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞、または１細胞期胚のうちの１つ以上において活性なプロモーターが挙げられる。そのようなプロモーターは、例えば、条件付きプロモーター、誘導性プロモーター、構成的プロモーター、または組織特異的プロモーターであってよい。そのようなプロモーターはまた、例えば、双方向プロモーターであってよい。好適なプロモーターの具体例としては、ヒトＵ６プロモーター、ラットＵ６ポリメラーゼＩＩＩプロモーター、またはマウスＵ６ポリメラーゼＩＩＩプロモーターなどのＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターが挙げられる。
代替的に、ｇＲＮＡは他の様々な方法で調製してもよい。例えば、ｇＲＮＡは、例えば、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用するインビトロ転写によって調製してもよい（例えば、すべての目的のためにそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１４／０８９２９０およびＷＯ２０１４／０６５５９６を参照されたい）。ガイドＲＮＡはまた、化学合成によって調製された合成分子であってもよい。例えば、ガイドＲＮＡを化学的に合成して、最初の３つの５’および３’末端ＲＮＡ残基に２’－Ｏ－メチル類似体および３’ホスホロチオアートヌクレオチド間結合を含むことができる。
ガイドＲＮＡ（またはガイドＲＮＡをコードする核酸）は、１つ以上のガイドＲＮＡ（例えば、１、２、３、４、またはそれ以上のガイドＲＮＡ）と、ガイドＲＮＡの安定性を増加させる（例えば、所定の保存条件下（例えば、－２０℃、４℃、もしくは周囲温度）で、分解産物が閾値未満、例えば出発核酸もしくはタンパク質の０．５重量％未満のままである期間を延長する、またはインビボでの安定性を増加させる）担体と、を含む組成物であり得る。そのような担体の非限定的な例としては、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）ミクロスフェア、ポリ（Ｄ、Ｌ－乳酸－コグリコール酸）（ＰＬＧＡ）ミクロスフェア、リポソーム、ミセル、逆ミセル、脂質渦巻状物、および脂質微小管が挙げられる。そのような組成物は、Ｃａｓ９タンパク質などのＣａｓタンパク質、またはＣａｓタンパク質をコードする核酸をさらに含んでもよい。
ガイドＲＮＡ標的配列ガイドＲＮＡの標的ＤＮＡには、結合に十分な条件が存在する場合に、ｇＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントが結合するＤＮＡに存在する核酸配列が含まれる。好適なＤＮＡ／ＲＮＡ結合条件には、細胞に通常存在する生理学的条件が含まれる。他の好適なＤＮＡ／ＲＮＡ結合条件（例えば、無細胞系における条件）は、当該技術分野で知られている（例えば、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ Ｅｄ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ ２００１）を参照されたい）。ｇＲＮＡに相補的であり、ハイブリダイズする標的ＤＮＡの鎖は「相補鎖」と呼ぶことができ、「相補鎖」に相補的である（したがって、Ｃａｓタンパク質またはｇＲＮＡに相補的ではない）標的ＤＮＡの鎖は、「非相補鎖」または「テンプレート鎖」と呼ぶことができる。
標的ＤＮＡは、ガイドＲＮＡがハイブリダイズする相補鎖上の配列および非相補鎖上の対応する配列（例えば、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に隣接する）の両方を含む。本明細書で使用される場合、「ガイドＲＮＡ標的配列」という用語は、ガイドＲＮＡが相補鎖上でハイブリダイズする配列に対応する（すなわち、その逆相補体）非相補鎖上の配列を具体的に指す。すなわち、ガイドＲＮＡ標的配列は、ＰＡＭに隣接する非相補的鎖上の配列（例えば、Ｃａｓ９の場合、ＰＡＭの上流または５’）を指す。ガイドＲＮＡ標的配列はガイドＲＮＡのＤＮＡ標的セグメントと同等であるが、ウラシルの代わりにチミンを使用している。一例として、ＳｐＣａｓ９酵素のガイドＲＮＡ標的配列は、非相補鎖上の５’－ＮＧＧ－３’ＰＡＭの上流の配列を参照することができる。ガイドＲＮＡは、標的ＤＮＡの相補鎖に対して相補性を持つように設計されており、ガイドＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントと標的ＤＮＡの相補鎖とのハイブリダイゼーションにより、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成が促進される。ハイブリダイゼーションを引き起こし、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進するのに十分な相補性があれば、完全な相補性は必ずしも必要ではない。ガイドＲＮＡが本明細書でガイドＲＮＡ標的配列を標的とするものとして言及される場合、それは、ガイドＲＮＡが、非相補鎖上のガイドＲＮＡ標的配列の逆相補体である標的ＤＮＡの相補鎖配列にハイブリダイズすることを意味する。
標的ＤＮＡまたはガイドＲＮＡ標的配列は、任意のポリヌクレオチドを含むことができ、例えば、細胞の核もしくは細胞質内、またはミトコンドリアもしくは葉緑体などの細胞の細胞小器官内に位置することができる。標的ＤＮＡまたはガイドＲＮＡ標的配列は、細胞に対して内因性または外因性の任意の核酸配列であってよい。ガイドＲＮＡ標的配列は、遺伝子産物（例えば、タンパク質）をコードする配列もしくは非コード配列（例えば、調節配列）であってよく、または両方を含んでもよい。
Ｃａｓタンパク質による標的ＤＮＡの部位特異的結合および切断は、（ｉ）ガイドＲＮＡと標的ＤＮＡの相補鎖との間の塩基対形成相補性と、（ｉｉ）標的ＤＮＡの非相補鎖にあるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）と呼ばれる短いモチーフとの両方によって決定される位置で起こり得る。ＰＡＭはガイドＲＮＡ標的配列に隣接することができる。任意選択で、ガイドＲＮＡ標的配列の３’末端にＰＡＭを隣接させることができる（例えば、Ｃａｓ９の場合）。代替的に、ガイドＲＮＡ標的配列の５’末端にＰＡＭを隣接させることができる（例えば、Ｃｐｆ１の場合）。例えば、Ｃａｓタンパク質の切断部位は、ＰＡＭ配列の上流または下流（例えば、ガイドＲＮＡ標的配列内）の約１～約１０または約２～約５塩基対（例えば、３塩基対）であり得る。ＳｐＣａｓ９の場合、ＰＡＭ配列（すなわち、非相補鎖上）は５’－Ｎ１ＧＧ－３’であってよく、Ｎ１は任意のＤＮＡヌクレオチドであり、ＰＡＭは標的ＤＮＡの非相補鎖上のガイドＲＮＡ標的配列のすぐ３’にある。したがって、相補鎖（すなわち、逆相補鎖）上のＰＡＭに対応する配列は５’－ＣＣＮ２－３’であり、Ｎ２は任意のＤＮＡヌクレオチドであり、ガイドＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントが標的ＤＮＡの相補鎖にハイブリダイズする配列のすぐ５’にある。いくつかのこのような場合には、Ｎ１およびＮ２は、相補的であってもよく、Ｎ１－Ｎ２塩基対は、任意の塩基対であってもよい（例えば、Ｎ１＝ＣおよびＮ２＝Ｇ；Ｎ１＝ＧおよびＮ２＝Ｃ；Ｎ１＝ＡおよびＮ２＝Ｔ；またはＮ１＝Ｔ、およびＮ２＝Ａ）。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ由来のＣａｓ９の場合、ＰＡＭはＮＮＧＲＲＴまたはＮＮＧＲＲであり得、ＮはＡ、Ｇ、Ｃ、またはＴであり、ＲはＧまたはＡであり得る。Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ由来のＣａｓ９の場合、ＰＡＭは、例えば、ＮＮＮＮＡＣＡＣまたはＮＮＮＮＲＹＡＣであり得、ＮはＡ、Ｇ、Ｃ、またはＴであり、ＲはＧまたはＡであり得る。場合によっては（例えば、ＦｎＣｐｆ１の場合）、ＰＡＭ配列は５’末端の上流にあり、配列５’－ＴＴＮ－３’を有し得る。
ガイドＲＮＡ標的配列の例は、ＳｐＣａｓ９タンパク質によって認識されるＮＧＧモチーフの直前の２０ヌクレオチドのＤＮＡ配列である。例えば、ガイドＲＮＡ標的配列プラスＰＡＭの２つの例は、ＧＮ１９ＮＧＧ（配列番号４３）またはＮ２０ＮＧＧ（配列番号４４）である。例えば、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１４／１６５８２５を参照されたい。５’末端のグアニンは、細胞内のＲＮＡポリメラーゼによる転写を促進することができる。ガイドＲＮＡ標的配列プラスＰＡＭの他の例は、インビトロでのＴ７ポリメラーゼによる効率的な転写を促進するために、５’末端に２つのグアニンヌクレオチドを含み得る（例えば、ＧＧＮ２０ＮＧＧ；配列番号４５）。例えば、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１４／０６５５９６を参照されたい。他のガイドＲＮＡ標的配列プラスＰＡＭは、５’ＧまたはＧＧおよび３’ＧＧまたはＮＧＧを含む、配列番号４３～４５の４～２２ヌクレオチド長を有してもよい。さらに他のガイドＲＮＡ標的配列ＰＡＭは、配列番号４３～４５の１４～２０ヌクレオチド長を有してもよい。
標的ＤＮＡにハイブリダイズしたＣＲＩＳＰＲ複合体の形成は、ガイドＲＮＡ標的配列（すなわち、標的ＤＮＡの非相補鎖上、およびガイドＲＮＡがハイブリダイズする相補鎖の逆相補体上のガイドＲＮＡ標的配列）に対応する領域内またはその近くの標的ＤＮＡの一方または両方の鎖の切断をもたらし得る。例えば、切断部位は、ガイドＲＮＡ標的配列内（例えば、ＰＡＭ配列に対して定義された位置）にあってもよい。「切断部位」は、Ｃａｓタンパク質が一本鎖切断または二本鎖切断を生成する標的ＤＮＡの位置を含む。切断部位は、一本鎖のみ（例えば、ニッカーゼが使用される場合）または二本鎖ＤＮＡの両方の鎖上にあってもよい。切断部位は、両方の鎖の同じ位置にあってもよく（平滑末端を生成する；例えばＣａｓ９））、または各鎖の異なる部位にあってもよい（千鳥状の末端（すなわち、突出）を生成する；例えば、Ｃｐｆ１）。付着末端は、例えば、それぞれが異なる鎖の異なる切断部位で一本鎖切断を生成し、それによって二本鎖切断を生成する２つのＣａｓタンパク質を使用することによって生成することができる。例えば、第１のニッカーゼは二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の第１の鎖に一本鎖切断を生成することができ、第２のニッカーゼはｄｓＤＮＡの第２の鎖に一本鎖切断を生成して、オーバーハング配列を生成することができる。場合によっては、第１の鎖のニッカーゼのガイドＲＮＡ標的配列または切断部位は、第２の鎖のニッカーゼのガイドＲＮＡ標的配列または切断部位から、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００、２５０、５００、または１，０００塩基対離れている。
（３）ヒトＦ１２遺伝子を標的化する外因性ドナー核酸
本明細書に開示される方法および組成物は、ヌクレアーゼ剤によるヒト化Ｆ１２遺伝子座の切断後、またはヌクレアーゼ剤によるヒト化Ｆ１２遺伝子座の切断とは無関係に、外因性ドナー核酸を利用してヒト化Ｆ１２遺伝子座を改変することができる。ヌクレアーゼ剤を使用するこのような方法では、ヌクレアーゼ剤タンパク質がヒト化Ｆ１２遺伝子座を切断して一本鎖切断（ニック）または二本鎖切断を作成し、外因性ドナー核酸は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）媒介ライゲーションまたは相同組換え修復事象を介してヒト化Ｆ１２遺伝子座を再結合する。任意選択で、外因性ドナー核酸による修復は、ヌクレアーゼ標的配列を除去または破壊し、その結果、標的化された対立遺伝子は、ヌクレアーゼ剤によって再標的化され得ない。
外因性ドナー核酸は、ヒトＦ１２遺伝子の任意の配列を標的化することができる。いくつかの外因性ドナー核酸は、ホモロジーアームを含む。他の外因性ドナー核酸は、ホモロジーアームを含まない。外因性ドナー核酸は、相同組換え修復によってヒト化Ｆ１２遺伝子座に挿入することができ、かつ／またはそれらは、非相同末端結合によってヒト化Ｆ１２遺伝子座に挿入することができる。
外因性ドナー核酸は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）を含むことができ、それらは一本鎖または二本鎖であり得、かつそれらは直線状または環状の形態であり得る。例えば、外因性ドナー核酸は、一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）であり得る。例えば、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｙｏｓｈｉｍｉ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．７：１０４３１を参照されたい。外因性ドナー核酸は、ネイキッド核酸であってもよく、ＡＡＶなどのウイルスによって送達されてもよい。具体的な例では、外因性ドナー核酸は、ＡＡＶを介して送達することができ、非相同末端結合によってヒト化Ｆ１２遺伝子座に挿入することができる（例えば、外因性ドナー核酸は、ホモロジーアームを含まないものであってよい）。
例示的な外因性ドナー核酸は、約５０ヌクレオチド～約５ｋｂの長さであるか、約５０ヌクレオチド～約３ｋｂの長さであるか、または約５０～約１，０００ヌクレオチドの長さである。他の例示的な外因性ドナー核酸は、約４０～約２００ヌクレオチドの長さである。例えば、外因性ドナー核酸は、約５０～６０、６０～７０、７０～８０、８０～９０、９０～１００、１００～１１０、１１０～１２０、１２０～１３０、１３０～１４０、１４０～１５０、１５０～１６０、１６０～１７０、１７０～１８０、１８０～１９０、または１９０～２００ヌクレオチドの長さであってよい。代替的に、外因性ドナー核酸は、約５０～１００、１００～２００、２００～３００、３００～４００、４００～５００、５００～６００、６００～７００、７００～８００、８００～９００、または９００～１０００ヌクレオチドの長さであってよい。代替的に、外因性ドナー核酸は、約１～１．５、１．５～２、２～２．５、２．５～３、３～３．５、３．５～４、４～４．５、または４．５～５ｋｂであってよい。代替的に、外因性ドナー核酸は、例えば、５ｋｂ、４．５ｋｂ、４ｋｂ、３．５ｋｂ、３ｋｂ、２．５ｋｂ、２ｋｂ、１．５ｋｂ、１ｋｂ、９００ヌクレオチド、８００ヌクレオチド、７００クレオチド、６００ヌクレオチド、５００ヌヌクレオチド、４００ヌクレオチド、３００ヌクレオチド、２００ヌクレオチド、１００ヌクレオチド、または５０ヌクレオチド以下の長さであってよい。外因性ドナー核酸（例えば、標的化ベクター）もより長くてもよい。
一例では、外因性ドナー核酸は、約８０ヌクレオチド～約２００ヌクレオチドの長さのｓｓＯＤＮである。別の例では、外因性ドナー核酸は、約８０ヌクレオチド～約３ｋｂの長さのｓｓＯＤＮである。そのようなｓｓＯＤＮは、例えば、それぞれ約４０ヌクレオチド～約６０ヌクレオチドの長さであるホモロジーアームを有してもよい。そのようなｓｓＯＤＮはまた、例えば、それぞれ約３０ヌクレオチド～１００ヌクレオチドの長さであるホモロジーアームを有してもよい。ホモロジーアームは、対称的（例えば、各４０ヌクレオチドもしくは各６０ヌクレオチド長）であってもよく、またはそれらは非対称的（例えば、３６ヌクレオチド長である１つのホモロジーアーム、および９１ヌクレオチド長である１つのホモロジーアーム）であってもよい。
外因性ドナー核酸は、追加の望ましい特徴（例えば、修飾または調節された安定性、蛍光標識による追跡または検出、タンパク質またはタンパク質複合体の結合部位など）を提供する修飾または配列を含み得る。外因性ドナー核酸は、１つ以上の蛍光標識、精製タグ、エピトープタグ、またはそれらの組み合わせを含んでもよい。例えば、外因性ドナー核酸は、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、または少なくとも５つの蛍光標識などの１つ以上の蛍光標識（例えば、蛍光タンパク質または他のフルオロフォアまたは色素）を含んでもよい。例示的な蛍光標識としては、フルオレセイン（例えば、６－カルボキシフルオレセイン（６－ＦＡＭ））、テキサスレッド、ＨＥＸ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、パシフィックブルー、５－（および－６）－カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）およびＣｙ７などのフルオロフォアが挙げられる。オリゴヌクレオチドを標識するための幅広い蛍光色素が市販されている（例えば、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから）。そのような蛍光標識（例えば、内部蛍光標識）は、例えば、外因性ドナー核酸の末端と適合性のある突出端を有する切断された標的核酸に直接組み込まれた外因性ドナー核酸を検出するために使用することができる。標識またはタグは、外因性ドナー核酸の５’末端、３’末端、または内部にあってよい。例えば、外因性ドナー核酸は、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからＩＲ７００フルオロフォア（５’ＩＲＤＹＥ（登録商標）７００）を有する５’末端にコンジュゲートさせることができる。
外因性ドナー核酸はまた、ヒト化Ｆ１２遺伝子座に組み込まれるＤＮＡのセグメントを含む核酸インサートを含み得る。ヒト化Ｆ１２遺伝子座での核酸インサートの組み込みは、ヒト化Ｆ１２遺伝子座への目的の核酸配列の付加、ヒト化Ｆ１２遺伝子座での核酸配列の欠失、またはヒト化Ｆ１２遺伝子座での目的の核酸配列の置換（すなわち、欠失および挿入）をもたらし得る。いくつかの外因性ドナー核酸は、ヒト化Ｆ１２遺伝子座でのいずれかの対応する欠失なしに、ヒト化Ｆ１２遺伝子座での核酸インサートの挿入のために設計されている。他の外因性ドナー核酸は、核酸インサートのいずれかの対応する挿入なしに、ヒト化Ｆ１２遺伝子座で目的の核酸配列を欠失するように設計されている。さらに他の外因性ドナー核酸は、ヒト化Ｆ１２遺伝子座で目的の核酸配列を欠失し、それを核酸インサートで置き換えるように設計されている。
欠失および／または置換されるヒト化Ｆ１２遺伝子座における核酸インサートまたは対応する核酸は、様々な長さであってよい。欠失および／または置換されるヒト化Ｆ１２遺伝子座における例示的な核酸インサートまたは対応する核酸は、約１ヌクレオチドから約５ｋｂの長さであるか、または約１ヌクレオチドから約１，０００ヌクレオチドの長さである。例えば、削除および／または置換されるヒト化Ｆ１２遺伝子座の核酸インサートまたは対応する核酸は、約１～１０、１０～２０、２０～３０、３０～４０、４０～５０、５０～６０、６０～７０、７０～８０、８０～９０、９０～１００、１００～１１０、１１０～１２０、１２０～１３０、１３０～１４０、１４０～１５０、１５０～１６０、１６０～１７０、１７０～１８０、１８０～１９０、または１９０～１２０ヌクレオチドの長さであってよい。同様に、削除および／または置換されるヒト化Ｆ１２遺伝子座の核酸インサートまたは対応する核酸は、１～１００、１００～２００、２００～３００、３００～４００、４００～５００、５００～６００、６００～７００、７００～８００、８００～９００、または９００～１０００ヌクレオチドの長さであってよい。同様に、削除および／または置換されるヒト化Ｆ１２遺伝子座の核酸インサートまたは対応する核酸は、約１～１．５、１．５～２、２～２．５、２．５～３、３～３．５、３．５～４、４～４．５、または４．５～５ｋｂの長さ、またはそれ以上であってよい。
核酸インサートは、置換のために標的化される配列の全部または一部と相同またはオーソロガスである配列を含むことができる。例えば、核酸インサートは、ヒト化Ｆ１２遺伝子座での置換のために標的化する配列と比較して、１つ以上の点変異（例えば、１、２、３、４、５、またはそれ以上）を含む配列を含むことができる。任意選択で、そのような点変異は、コードされたポリペプチドにおいて保存的アミノ酸置換（例えば、アスパラギン酸［Ａｓｐ、Ｄ］のグルタミン酸［Ｇｌｕ、Ｅ］への置換）をもたらし得る。
いくつかの外因性ドナー核酸は、野生型内因性Ｆ１２遺伝子座によってコード化されないかまたは発現されない外因性タンパク質をコードすることができる（例えば、外因性タンパク質をコードする挿入核酸を含むことができる）。
非相同末端結合媒介挿入のためのドナー核酸一部の外因性ドナー核酸は、非相同末端結合によってヒト化Ｆ１２遺伝子座に挿入することができる。場合によっては、そのような外因性ドナー核酸はホモロジーアームを含まない。例えば、そのような外因性ドナー核酸は、ヌクレアーゼ剤による切断後の平滑末端二本鎖切断に挿入することができる。具体的な例では、外因性ドナー核酸は、ＡＡＶを介して送達することができ、非相同末端結合によってヒト化Ｆ１２遺伝子座に挿入することができる（例えば、外因性ドナー核酸は、ホモロジーアームを含まないものであってよい）。
他の外因性ドナー核酸は、５’末端および／または３’末端に短い一本鎖領域を有し、これは、ヒト化Ｆ１２遺伝子座でのヌクレアーゼ媒介切断によって作成される１つ以上の突出に相補的である。これらの突出は、５’および３’ホモロジーアームと呼ばれることもある。例えば、いくつかの外因性ドナー核酸は、ヒト化Ｆ１２遺伝子座における５’および／または３’標的配列でのヌクレアーゼ媒介切断によって作成された１つ以上の突出に相補的な５’末端および／または３’末端に短い一本鎖領域を有する。いくつかのそのような外因性ドナー核酸は、５’末端のみまたは３’末端のみに相補的領域を有する。例えば、いくつかのそのような外因性ドナー核酸は、ヒト化Ｆ１２遺伝子座の５’標的配列で作成された突出に相補的な５’末端にのみ、またはヒト化Ｆ１２遺伝子座の３’標的配列で作成された突出に相補的な３’末端にのみ相補領域を有する。他のそのような外因性ドナー核酸は、５’末端および３’末端の両方に相補的領域を有する。例えば、他のそのような外因性ドナー核酸は、ヒト化Ｆ１２遺伝子座でのヌクレアーゼ媒介切断によって生成される５’および３’末端の両方に、例えば、それぞれ第１および第２の突出に相補的である、相補的領域を有する。例えば、外因性ドナー核酸が二本鎖である場合、一本鎖相補的領域は、ドナー核酸の上部鎖の５’末端およびドナー核酸の下部鎖の５’末端から伸長し、両端に５’突出を作成することができる。代替的に、一本鎖相補領域は、ドナー核酸の上部鎖の３’末端から、およびテンプレートの下部鎖の３’末端から伸長し、３’突出を作成することができる。
相補的領域は、外因性ドナー核酸と標的核酸との間のライゲーションを促進するのに十分な任意の長さであり得る。例示的な相補的領域は、約１～約５ヌクレオチドの長さ、約１～約２５ヌクレオチドの長さ、または約５～約１５０ヌクレオチドの長さである。例えば、相補的領域は、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５ヌクレオチドの長さであってよい。例えば、相補的領域は、約５～１０、１０～２０、２０～３０、３０～４０、４０～５０、５０～６０、６０～７０、７０～８０、８０～９０、９０～１００、１００～１１０、１１０～１２０、１２０～１３０、１３０～１４０、または１４０～１５０ヌクレオチドの長さ、またはそれ以上であってよい。
このような相補的領域は、２対のニッカーゼによって作成された突出を相補的にすることができる。ＤＮＡの反対側の鎖を切断して第１の二本鎖切断を作成する第１および第２のニッカーゼ、ならびにＤＮＡの反対側の鎖を切断して第２の二本鎖切断を作成する第３および第４のニッカーゼを使用することにより、両端が千鳥状の２つの二本鎖切断を作成できる。例えば、Ｃａｓタンパク質を使用して、第１、第２、第３、および第４のガイドＲＮＡに対応する第１、第２、第３、および第４のガイドＲＮＡ標的配列にニックを入れることができる。第１および第２のガイドＲＮＡ標的配列は、ＤＮＡの第１および第２の鎖上の第１および第２のニッカーゼによって作成されたニックが二本鎖切断を作成するように、第１の切断部位を作成するように配置することができる（すなわち、第１の切断部位は、第１および第２のガイドＲＮＡ標的配列内のニックを含む）。同様に、第３および第４のガイドＲＮＡ標的配列は、ＤＮＡの第１および第２の鎖上の第３および第４のニッカーゼによって作成されたニックが二本鎖切断を作成するように、第２の切断部位を作成するように配置することができる（すなわち第２の切断部位は、第３および第４のガイドＲＮＡ標的配列内のニックを含む）。好ましくは、第１および第２のガイドＲＮＡ標的配列ならびに／または第３および第４のガイドＲＮＡ標的配列内のニックは、突出を作成するオフセットニックであり得る。オフセットウィンドウは、例えば、少なくとも約５ｂｐ、１０ｂｐ、２０ｂｐ、３０ｂｐ、４０ｂｐ、５０ｂｐ、６０ｂｐ、７０ｂｐ、８０ｂｐ、９０ｂｐ、１００ｂｐ、またはそれ以上であり得る。すべての目的のためにそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｒａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｃｅｌｌ １５４：１３８０－１３８９、Ｍａｌｉ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．３１：８３３－８３８、およびＳｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １１：３９９－４０４を参照されたい。そのような場合、二本鎖外因性ドナー核酸は、第１および第２のガイドＲＮＡ標的配列内のニックならびに第３および第４のガイドＲＮＡ標的配列内のニックによって作成された突出に相補的な一本鎖相補領域で設計することができる。次いで、そのような外因性ドナー核酸は、非相同末端結合媒介ライゲーションによって挿入することができる。
相同組換え修復による挿入のためのドナー核酸いくつかの外因性ドナー核酸は、ホモロジーアームを含む。外因性ドナー核酸が核酸インサートも含む場合、ホモロジーアームは核酸インサートに隣接することができる。参照を容易にするために、ホモロジーアームは、本明細書では５’および３’（すなわち、上流および下流）ホモロジーアームと呼ばれる。この用語は、外因性ドナー核酸内の核酸インサートに対するホモロジーアームの相対位置に関連している。５’および３’ホモロジーアームは、ヒト化Ｆ１２遺伝子座内の領域に対応し、これらは、本明細書では、それぞれ「５’標的配列」および「３’標的配列」と呼ばれる。
ホモロジーアームおよび標的配列は、２つの領域が相同組換え反応の基質として作用するのに十分なレベルの配列同一性を互いに共有する場合、互いに「対応する」または「対応している」。「相同性」という用語は、対応する配列と同一であるか、または配列同一性を共有するＤＮＡ配列を含む。所与の標的配列と外因性ドナー核酸に見られる対応するホモロジーアームとの間の配列同一性は、相同組換えが起こることを可能にする任意の程度の配列同一性であってよい。例えば、外因性ドナー核酸（またはその断片）のホモロジーアームおよび標的配列（またはその断片）によって共有される配列同一性の量は、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性であり得、これにより、配列は相同組換えを起こす。さらに、ホモロジーアームと対応する標的配列との間の対応する相同性領域は、相同組換えを促進するのに十分な任意の長さであり得る。例示的なホモロジーアームは、約２５ヌクレオチド～約２．５ｋｂの長さであるか、約２５ヌクレオチド～約１．５ｋｂの長さであるか、または約２５～約５００ヌクレオチドの長さである。例えば、所与のホモロジーアーム（もしくはホモロジーアームのいずれか）および／または対応する標的配列は、約２５～３０、３０～４０、４０～５０、５０～６０、６０～７０、７０～８０、８０～９０、９０～１００、１００～１５０、１５０～２００、２００～２５０、２５０～３００、３００～３５０、３５０～４００、４００～４５０、または４５０～５００ヌクレオチドの長さである対応する相同性領域を含み得、結果として、ホモロジーアームが、標的核酸内の対応する標的配列との相同組換えを受けるのに十分な相同性を有する。あるいは、所与の相同性アーム（または各相同性アーム）および／または対応する標的配列は、約０．５ｋｂ～約１ｋｂ、約１ｋｂ～約１．５ｋｂ、約１．５ｋｂ～約２ｋｂ、または約２ｋｂ～約２．５ｋｂ長である対応する相同性領域を含み得る。例えば、ホモロジーアームは、それぞれ約７５０ヌクレオチドの長さであり得る。相同性アームは対称的（それぞれの長さがほぼ同じサイズ）であってもよく、非対称的（一方が他方よりも長い）であってもよい。
ヌクレアーゼ剤を外因性ドナー核酸と組み合わせて使用する場合、ヌクレアーゼ切断部位での一本鎖切断（ニック）または二本鎖切断の際に、標的配列とホモロジーアームとの間の相同組換え事象の発生を促進するように、５’および３’標的配列をヌクレアーゼ切断部位に十分に近接して（例えば、ヌクレアーゼ標的配列に十分に近接して）配置することが好ましい。「ヌクレアーゼ切断部位」という用語は、ヌクレアーゼ剤（例えば、ガイドＲＮＡと複合体を形成したＣａｓ９タンパク質）によってニックまたは二本鎖切断が作成されるＤＮＡ配列を含む。外因性ドナー核酸の５’および３’ホモロジーアームに対応する標的化遺伝子座内の標的配列は、距離がヌクレアーゼ切断部位での一本鎖切断または二本鎖切断の際の５’および３’標的配列とホモロジーアームとの間の相同組換え事象の発生を促進するような距離である場合、ヌクレアーゼ切断部位に「十分に近接して位置する」。したがって、外因性ドナー核酸の５’および／または３’ホモロジーアームに対応する標的配列は、例えば、所与のヌクレアーゼ切断部位の少なくとも１ヌクレオチド内、または所与のヌクレアーゼ切断部位の少なくとも１０ヌクレオチド～約１，０００ヌクレオチド内であり得る。一例として、ヌクレアーゼ切断部位は、標的配列の少なくとも一方または両方に直接隣接し得る。
外因性ドナー核酸のホモロジーアームおよびヌクレアーゼ切断部位に対応する標的配列の空間的関係は変化し得る。例えば、標的配列は、ヌクレアーゼ切断部位の５’に位置してもよく、標的配列は、ヌクレアーゼ切断部位の３’に位置してもよく、または標的配列は、ヌクレアーゼ切断部位に隣接していてもよい。
（４）その他のヒト凝固因子ＸＩＩ標的化試薬
他の既知のまたは推定上のヒト凝固因子ＸＩＩ標的化試薬の活性もまた、本明細書に開示される非ヒト動物を使用して評価することができる。同様に、他の任意の分子は、本明細書に開示される非ヒト動物を使用して、ヒト凝固因子ＸＩＩ標的化活性についてスクリーニングすることができる。
一例として、ヒト凝固因子ＸＩＩ標的化試薬は、ヒト凝固因子ＸＩＩタンパク質のエピトープを標的化する抗原結合タンパク質であり得る。「抗原結合タンパク質」という用語には、抗原に結合する任意のタンパク質が含まれる。抗原結合タンパク質の例としては、抗体、抗体の抗原結合断片、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、ｓｃＦＶ、ビスｓｃＦＶ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、Ｖ－ＮＡＲ、ＶＨＨ、ＶＬ、Ｆ（ａｂ）、Ｆ（ａｂ）２、ＤＶＤ（デュアル可変ドメイン抗原結合タンパク質）、ＳＶＤ（単一可変ドメイン抗原結合タンパク質）、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）、またはデイビスボディが含まれる（すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，５８６，７１３号）。他のヒト凝固因子ＸＩＩ標的化試薬には、ヒト凝固因子ＸＩＩタンパク質を標的化する小分子が含まれる。
他のヒト凝固因子ＸＩＩ－標的化試薬には、ＲＮＡｉ剤を含めることができる。「ＲＮＡｉ剤」は、配列特異的な様式でメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）などの標的ＲＮＡの分解または翻訳の阻害を促進することができる小さな二本鎖のＲＮＡまたはＲＮＡ様（例えば、化学的に修飾されたＲＮＡ）オリゴヌクレオチド分子を含む組成物である。ＲＮＡｉ剤のオリゴヌクレオチドは、連結したヌクレオシドのポリマーであり、それぞれを独立して修飾することも、修飾しないこともできる。ＲＮＡｉ剤は、ＲＮＡ干渉メカニズムを介して機能する（すなわち、哺乳類細胞のＲＮＡ干渉経路機構（ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体またはＲＩＳＣ）との相互作用を介してＲＮＡ干渉を誘導する）。ＲＮＡｉ剤は、その用語が本明細書で使用される場合、主にＲＮＡ干渉メカニズムを介して機能すると考えられているが、開示されたＲＮＡｉ剤は、特定の経路または作用機序に拘束または限定されない。本明細書に開示されるＲＮＡｉ剤は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、これらに限定されないが、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、およびダイサー基質を含む。本明細書に記載のＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖は、標的ＲＮＡの配列（すなわち、標準的な命名法を使用して文字の連続で記載された核酸塩基またはヌクレオチドの連続または順序）に少なくとも部分的に相補的である。
他のヒト凝固因子ＸＩＩ－標的化試薬には、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を含めることができる。一本鎖ＡＳＯおよびＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、オリゴヌクレオチドがワトソン－クリック塩基対形成を介して標的ＲＮＡに結合するという基本原理を共有している。理論に縛られることを望まないが、ＲＮＡｉの間に、低分子ＲＮＡ二重鎖（ＲＮＡｉ剤）がＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と結合し、一方の鎖（パッセンジャー鎖）が失われ、残りの鎖（ガイド鎖）がＲＩＳＣと協力して相補的ＲＮＡに結合する。次いで、ＲＩＳＣの触媒成分であるアルゴノート２（Ａｇｏ２）が標的ＲＮＡを切断する。ガイド鎖は、相補的なセンス鎖またはタンパク質（ＲＩＳＣ）のいずれかに常に結合している。対照的に、ＡＳＯは生き残り、一本鎖として機能する必要がある。ＡＳＯは標的ＲＮＡに結合し、リボソームまたはスプライシング因子などの他の因子がＲＮＡに結合するのを遮断したり、ヌクレアーゼなどのタンパク質を動員したりする。所望の作用機序に基づいて、ＡＳＯに対して様々な修飾および標的領域が選択される。ギャップマーは、ＤＮＡの中央の８～１０塩基ギャップに隣接する各末端に２～５個の化学修飾ヌクレオチド（例えば、ＬＮＡまたは２’－ＭＯＥ）を含むＡＳＯオリゴヌクレオチドである。標的ＲＮＡに結合した後、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッドはＲＮａｓｅ Ｈの基質として機能する。
Ｄ．非ヒト動物または細胞へのヒト凝固因子ＸＩＩ標的化試薬の投与
本明細書に開示される方法は、非ヒト動物または細胞に、核酸、タンパク質、核酸－タンパク質複合体、タンパク質複合体、または小分子を含む、様々な分子（例えば、治療用分子または複合体などのヒト凝固因子ＸＩＩ標的化試薬）を導入することを含み得る。「導入すること」は、細胞の内部または非ヒト動物内の細胞の内部にアクセスできるように、細胞または非ヒト動物に分子（例えば、核酸またはタンパク質）を提供することを含む。導入することは、任意の手段によって達成することができ、２つ以上の構成要素（例えば、２つの構成要素、またはすべての構成要素）を、任意の組み合わせで同時にまたは逐次的に細胞または非ヒト動物に導入することができる。例えば、Ｃａｓタンパク質は、ガイドＲＮＡの導入前に細胞または非ヒト動物に導入することができ、またはガイドＲＮＡの導入後に導入することができる。別の例として、外因性ドナー核酸は、Ｃａｓタンパク質およびガイドＲＮＡの導入前に導入することができ、またはＣａｓタンパク質およびガイドＲＮＡの導入後に導入することができる（例えば、外因性ドナー核酸は、Ｃａｓタンパク質およびガイドＲＮＡの導入の約１、２、３、４、８、１２、２４、３６、４８、もしくは７２時間の前または後に投与することができる）。例えば、すべての目的のためにそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ２０１５／０２４０２６３およびＵＳ２０１５／０１１０７６２を参照されたい。さらに、２つ以上の構成要素は、同じ送達方法または異なる送達方法によって細胞または非ヒト動物に導入することができる。同様に、２つ以上の構成要素は、同じ投与経路または異なる投与経路によって非ヒト動物に導入することができる。
いくつかの方法では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの構成要素が非ヒト動物または細胞に導入される。ガイドＲＮＡは、ＲＮＡ（例えば、インビトロ転写されたＲＮＡ）の形態で、またはガイドＲＮＡをコードするＤＮＡの形態で非ヒト動物または細胞に導入することができる。ＤＮＡの形態で導入されると、ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡは、非ヒト動物内の細胞内で活性のあるプロモーターに作動可能に連結することができる。例えば、ガイドＲＮＡは、ＡＡＶを介して送達され、Ｕ６プロモーターの下でインビボで発現できる。そのようなＤＮＡは、１つ以上の発現コンストラクト中にあり得る。例えば、そのような発現コンストラクトは、単一の核酸分子の構成要素であり得る。代替的に、それらは、２つ以上の核酸分子の間で任意の組み合わせで分離することができる（すなわち、１つ以上のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡをコードするＤＮＡおよび１つ以上のｔｒａｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡは、別個の核酸分子の構成要素であり得る）。
同様に、Ｃａｓタンパク質は任意の形態で提供してもよい。例えば、Ｃａｓタンパク質は、ｇＲＮＡと複合体を形成したＣａｓタンパク質などのタンパク質の形態で提供してもよい。代替的に、Ｃａｓタンパク質は、ＲＮＡ（例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ））またはＤＮＡなどの、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸の形態で提供してもよい。任意選択で、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、特定の細胞または生物におけるタンパク質への効率的な翻訳のためにコドン最適化してもよい。例えば、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、天然に存在するポリヌクレオチド配列と比較して、哺乳動物細胞、げっ歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、または任意の他の目的の宿主細胞においてより頻度高く使用される代替コドンへと改変することができる。Ｃａｓタンパク質をコードする核酸が非ヒト動物に導入されると、Ｃａｓタンパク質は、一過性に、条件付きで、または構成的に非ヒト動物内の細胞内で発現され得る。
代替的に、Ｃａｓタンパク質またはガイドＲＮＡをコードする核酸は、発現コンストラクト中のプロモーターに作動可能に連結され得る。発現コンストラクトは、遺伝子または他の目的の核酸配列（例えば、Ｃａｓ遺伝子）の発現を指示することができ、そのような目的の核酸配列を標的細胞に導入することができる任意の核酸コンストラクトを含む。例えば、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、１つ以上のｇＲＮＡをコードするＤＮＡを含むベクター内に存在してもよい。代替的に、それは、１つ以上のｇＲＮＡをコードするＤＮＡを含むベクターとは別のベクターまたはプラスミドであってもよい。発現コンストラクトにおいて使用することができる好適なプロモーターとしては、例えば、真核細胞、ヒト細胞、非ヒト細胞、哺乳動物細胞、非ヒト哺乳動物細胞、げっ歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、ハムスター細胞、ウサギ細胞、多能性細胞、胚性幹（ＥＳ）細胞、成体幹細胞、発生が制限された前駆細胞、誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞、または１細胞期胚のうちの１つ以上において活性なプロモーターが挙げられる。そのようなプロモーターは、例えば、条件付きプロモーター、誘導性プロモーター、構成的プロモーター、または組織特異的プロモーターであってよい。任意選択で、プロモーターは、一方向のＣａｓタンパク質および他の方向のガイドＲＮＡの両方の発現を駆動する双方向プロモーターであってもよい。このような双方向プロモーターは、（１）遠位配列要素（ＤＳＥ）、近位配列要素（ＰＳＥ）、およびＴＡＴＡボックスの３つの外部制御要素を含む完全な従来の一方向Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター、ならびに（２）ＤＳＥの５’末端に逆方向に融合されたＰＳＥおよびＴＡＴＡボックスを含む第２の基本的なＰｏｌ ＩＩＩプロモーターで構成してもよい。例えば、Ｈ１プロモーターでは、ＤＳＥはＰＳＥおよびＴＡＴＡボックスに隣接しており、プロモーターは、Ｕ６プロモーターに由来するＰＳＥおよびＴＡＴＡボックスを追加することによって逆方向の転写が制御されるハイブリッドプロモーターを作成することにより、双方向にすることができる。例えば、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２０１６／００７４５３５を参照されたい。双方向プロモーターを使用してＣａｓタンパク質およびガイドＲＮＡをコードする遺伝子を同時に発現させることにより、コンパクトな発現カセットを生成して送達を容易にすることができる。
非ヒト動物または細胞に導入される分子（例えば、Ｃａｓタンパク質またはガイドＲＮＡまたはＲＮＡｉ剤またはＡＳＯ）は、導入される分子の安定性を増加させる（例えば、所定の保存条件下（例えば、－２０℃、４℃、もしくは周囲温度）で、分解産物が閾値未満、例えば出発核酸もしくはタンパク質の０．５重量％未満のままである期間を延長する、またはインビボでの安定性を増加させる）担体を含む組成物中で提供され得る。そのような担体の非限定的な例としては、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）ミクロスフェア、ポリ（Ｄ、Ｌ－乳酸－コグリコール酸）（ＰＬＧＡ）ミクロスフェア、リポソーム、ミセル、逆ミセル、脂質渦巻状物、および脂質微小管が挙げられる。
細胞または非ヒト動物への分子（例えば、核酸またはタンパク質）の導入を可能にするために、様々な方法および組成物が本明細書で提供される。分子を様々な細胞型に導入するための方法は知られており、例えば、安定トランスフェクション法、一過性トランスフェクション法、およびウイルス媒介法が含まれる。
トランスフェクションプロトコルおよび分子を細胞に導入するためのプロトコルは変動し得る。非限定的なトランスフェクション法には、リポソーム、ナノ粒子、リン酸カルシウム（Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．（１９７３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２（２）：４５６－６７、Ｂａｃｃｈｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ．（１９７７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７４（４）：１５９０－４、およびＫｒｉｅｇｌｅｒ，Ｍ（１９９１）．Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ．ｐｐ．９６－９７）、デンドリマー、またはＤＥＡＥ－デキストランもしくはポリエチレンイミンなどのカチオン性ポリマーを使用する化学物質ベースのトランスフェクション法が含まれる。非化学的方法には、エレクトロポレーション、ソノポレーション、および光トランスフェクションが含まれる。粒子ベースのトランスフェクションには、遺伝子銃の使用、または磁石支援トランスフェクションが含まれる（Ｂｅｒｔｒａｍ（２００６）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７，２７７－２８）。ウイルス法もトランスフェクションに使用できる。
細胞への核酸またはタンパク質の導入はまた、エレクトロポレーション、細胞質内注射、ウイルス感染、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、トランスフェクション、脂質媒介トランスフェクション、またはヌクレオフェクションによって媒介され得る。ヌクレオフェクションは、核酸基質を細胞質だけでなく核膜を介して核に送達することを可能にする改良されたエレクトロポレーション技術である。さらに、本明細書に開示される方法でのヌクレオフェクションの使用は、典型的には、通常のエレクトロポレーションよりもはるかに少ない細胞を必要とする（例えば、通常のエレクトロポレーションによる７００万に対してわずか約２００万）。一例では、ヌクレオは、ＬＯＮＺＡ（登録商標）ＮＵＣＬＥＯＦＥＣＴＯＲ（商標）システムを用いて行われる。
細胞（例えば、接合子）への分子（例えば、核酸またはタンパク質）の導入は、マイクロインジェクションによっても達成することができる。接合子（すなわち、１細胞期の胚）では、マイクロインジェクションは母体および／または父方の前核または細胞質に行うことができる。マイクロインジェクションが１つの前核のみに行われる場合は、サイズが大きいため、父方の前核が適している。ｍＲＮＡのマイクロインジェクションは、好ましくは細胞質内に対してであり（例えば、ｍＲＮＡを翻訳機構に直接送達するために）、一方、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードするまたはＲＮＡをコードするポリヌクレオチドのマイクロインジェクションは、核／前核に対することが好ましい。代替的に、マイクロインジェクションは、核／前核および細胞質の両方に注入することによって実行できる。針を最初に核／前核に導入して第１の量を注入し、１細胞期の胚から針を取り除いで第２目の量を細胞質に注入することができる。Ｃａｓタンパク質が細胞質に注入される場合、Ｃａｓタンパク質は、核／前核への送達を確実にするために、核局在化シグナルを含むことが好ましい。マイクロインジェクションを実行する方法はよく知られている。例えば、Ｎａｇｙ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｇｙ Ａ，Ｇｅｒｔｓｅｎｓｔｅｉｎ Ｍ，Ｖｉｎｔｅｒｓｔｅｎ Ｋ，Ｂｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｒ．，２００３，Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）を参照されたい。Ｍｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０７：１５０２２－１５０２６、およびＭｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０９：９３５４－９３５９も参照されたい。
分子（例えば、核酸またはタンパク質）を細胞または非ヒト動物に導入するための他の方法には、例えば、ベクター送達、粒子媒介送達、エキソソーム媒介送達、脂質ナノ粒子媒介送達、細胞透過性ペプチド媒介送達、または埋め込み型デバイスを介した送達が含まれ得る。具体的な例として、核酸またはタンパク質は、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）マイクロスフェア、ポリ（Ｄ、Ｌ－乳酸－コグリコール酸）（ＰＬＧＡ）マイクロスフェア、リポソーム、ミセル、逆ミセル、脂質渦巻状物、または脂質微小管などの担体中で、細胞または非ヒト動物に導入することができる。非ヒト動物への送達のいくつかの具体例には、流体力学的送達、ウイルス媒介送達（例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）媒介送達による）、および脂質ナノ粒子媒介送達が含まれる。
細胞または非ヒト動物への核酸およびタンパク質の導入は、流体力学的送達（ＨＤＤ）によって達成することができる。流体力学的送達は、インビボでの細胞内ＤＮＡ送達の方法として出現した。実質細胞への遺伝子送達では、必須のＤＮＡ配列のみを選択した血管から注射する必要があり、現在のウイルスおよび合成ベクターに関連する安全性の懸念が排除される。ＤＮＡは血流に注入されると、血液にアクセスできる様々な組織の細胞に到達することができる。流体力学的送達は、循環中の非圧縮性血液への大量の溶液の迅速な注射によって生成される力を利用して、大きくて膜不透過性の化合物が実質細胞に入るのを妨げる内皮および細胞膜の物理的障壁を克服する。ＤＮＡの送達に加えて、この方法は、ＲＮＡ、タンパク質、およびその他の小さな化合物をインビボで効率的に細胞内に送達するのに役立つ。例えば、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｂｏｎａｍａｓｓａ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．２８（４）：６９４－７０１を参照されたい。
核酸の導入は、ＡＡＶ媒介送達またはレンチウイルス媒介送達などのウイルス媒介送達によっても達成することができる。他の例示的なウイルス／ウイルスベクターには、レトロウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、および単純ヘルペスウイルスが含まれる。ウイルスは、分裂細胞、非分裂細胞、または分裂細胞および非分裂細胞の両方に感染できる。ウイルスは宿主ゲノムに組み込まれてもよく、または代替的に宿主ゲノムに組み込まれなくてもよい。このようなウイルスは、免疫力が低下するように操作することもできる。ウイルスは、複製可能であってもよく、複製欠損（例えば、ビリオン複製および／またはパッケージングの追加ラウンドに必要な１つ以上の遺伝子に欠陥がある）であってもよい。ウイルスは、一過性の発現、長期的な発現（例えば、少なくとも１週間、２週間、１ヶ月、２ヶ月、もしくは３ヶ月）、または永続的な発現（例えば、Ｃａｓ９および／もしくはｇＲＮＡの）を引き起こし得る。例示的なウイルス力価（例えば、ＡＡＶ力価）は、１０１２、１０１３、１０１４、１０１５、および１０１６ベクターゲノム／ｍＬを含む。
ｓｓＤＮＡ ＡＡＶゲノムは、２つのオープンリーディングフレーム、ＲｅｐおよびＣａｐで構成され、相補ＤＮＡ鎖の合成を可能にする２つの末端逆位配列が隣接している。ＡＡＶトランスファープラスミドを構築する場合、導入遺伝子は２つのＩＴＲの間に配置され、ＲｅｐおよびＣａｐはトランスで供給される。ＲｅｐおよびＣａｐに加えて、ＡＡＶはアデノウイルス由来の遺伝子を含むヘルパープラスミドを必要とする場合がある。これらの遺伝子（Ｅ４、Ｅ２ａ、およびＶＡ）はＡＡＶ複製を仲介する。例えば、トランスファープラスミド、Ｒｅｐ／Ｃａｐ、およびヘルパープラスミドをアデノウイルス遺伝子Ｅ１＋を含むＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトして、感染性ＡＡＶ粒子を生成することができる。代替的に、Ｒｅｐ、Ｃａｐ、およびアデノウイルスヘルパー遺伝子を組み合わせて単一のプラスミドとすることもできる。同様のパッケージングセルおよび方法は、レトロウイルスなどの他のウイルスにも使用できる。
ＡＡＶの複数の血清型が確認されている。これらの血清型は、感染する細胞の種類（すなわち、それらの指向性）が異なり、特定の細胞型の優先的な形質導入を可能にする。ＣＮＳ組織に対する血清型には、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８、およびＡＡＶ９が含まれる。心臓組織に対する血清型には、ＡＡＶ１、ＡＡＶ８、およびＡＡＶ９が含まれる。腎臓組織に対する血清型にはＡＡＶ２が含まれる。肺組織に対する血清型には、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、およびＡＡＶ９が含まれる。膵臓組織に対する血清型にはＡＡＶ８が含まれる。光受容細胞に対する血清型には、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、およびＡＡＶ８が含まれる。網膜色素上皮組織に対する血清型には、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、およびＡＡＶ８が含まれる。骨格筋組織に対する血清型には、ＡＡＶ１、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、およびＡＡＶ９が含まれる。肝臓組織に対する血清型には、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、およびＡＡＶ９、ならびに、特にＡＡＶ８が含まれる。
指向性は、キャプシドおよび異なるウイルス血清型からのゲノムの混合である偽型付けによってさらに洗練することができる。例えば、ＡＡＶ２／５は、血清型５のキャプシドにパッケージされた血清型２のゲノムを含むウイルスを示す。偽型ウイルスの使用は、形質導入効率を改善するだけでなく、指向性を変えることができる。異なる血清型に由来するハイブリッドキャプシドを使用して、ウイルスの指向性を改変することもできる。例えば、ＡＡＶ－ＤＪには、８つの血清型由来のハイブリッドキャプシドが含まれており、インビボで幅広い細胞型にわたって高い感染力を示す。ＡＡＶ－ＤＪ８は、ＡＡＶ－ＤＪの特性を示すが、脳への取り込みが強化された別の例である。ＡＡＶ血清型は、変異によっても改変できる。ＡＡＶ２の変異改変の例には、Ｙ４４４Ｆ、Ｙ５００Ｆ、Ｙ７３０Ｆ、およびＳ６６２Ｖが含まれる。ＡＡＶ３の変異改変の例には、Ｙ７０５Ｆ、Ｙ７３１Ｆ、およびＴ４９２Ｖが含まれる。ＡＡＶ６の変異改変の例には、Ｓ６６３ＶおよびＴ４９２Ｖが含まれる。他の偽型／改変ＡＡＶバリアントには、ＡＡＶ２／１、ＡＡＶ２／６、ＡＡＶ２／７、ＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／９、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ８．２、およびＡＡＶ／ＳＡＳＴＧが含まれる。
導入遺伝子の発現を加速するために、自己相補的ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）バリアントを使用することができる。ＡＡＶは細胞のＤＮＡ複製機構に依存して、ＡＡＶの一本鎖ＤＮＡゲノムの相補鎖を合成するため、導入遺伝子の発現が遅れる可能性がある。この遅延に対処するために、感染時に自発的にアニーリングすることができる相補的配列を含むｓｃＡＡＶを使用することができ、宿主細胞のＤＮＡ合成の必要性を排除する。しかしながら、一本鎖ＡＡＶ（ｓｓＡＡＶ）ベクターも使用できる。
パッケージング容量を増やすために、より長い導入遺伝子を、１つ目は３’スプライスドナーと、２つ目は５’スプライスアクセプターである２つのＡＡＶトランスファープラスミドとの間に分割することができる。細胞の共感染時に、これらのウイルスはコンカテマーを形成し、一緒にスプライシングされ、完全長の導入遺伝子を発現させることができる。これにより、より長い導入遺伝子の発現が可能になるが、発現の効率は低下する。容量を増やすための同様の方法は、相同組換えを利用する。例えば、導入遺伝子は２つのトランスファープラスミドに分割できるが、共発現が相同組換えおよび全長導入遺伝子の発現を誘導するように、実質的な配列の重複がある。
核酸とタンパク質の導入は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）媒介送達によっても達成できる。例えば、ＬＮＰ媒介送達は、Ｃａｓ ｍＲＮＡおよびガイドＲＮＡの組み合わせ、またはＣａｓタンパク質およびガイドＲＮＡの組み合わせを送達するために使用することができる。このような方法による送達は、一過性のＣａｓ発現をもたらし、生分解性脂質はクリアランスを改善し、忍容性を改善し、免疫原性を低下させる。脂質製剤は、生体分子を分解から保護すると同時に、細胞への取り込みを改善することができる。脂質ナノ粒子は、分子間力によって互いに物理的に結合した複数の脂質分子を含む粒子である。これらには、ミクロスフェア（単層および多層ベシクル、例えばリポソームを含む）、エマルジョン中の分散相、ミセル、または懸濁液中の内相が含まれる。そのような脂質ナノ粒子は、送達のために１つ以上の核酸またはタンパク質をカプセル化するために使用することができる。カチオン性脂質を含む製剤は、核酸などのポリアニオンを送達するのに有用である。含めることができる他の脂質は、中性脂質（すなわち、非荷電または両性イオン脂質）、陰イオン脂質、トランスフェクションを増強するヘルパー脂質、およびナノ粒子がインビボで存在できる時間を増加させるステルス脂質である。好適なカチオン性脂質、中性脂質、アニオン性脂質、ヘルパー脂質、およびステルス脂質の例は、それぞれがすべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１６／０１０８４０（Ａ１）に見出すことができる。例示的な脂質ナノ粒子は、カチオン性脂質および１つ以上の他の成分を含むことができる。一例では、他の成分は、コレステロールなどのヘルパー脂質を含むことができる。別の例では、他の成分は、コレステロールなどのヘルパー脂質およびＤＳＰＣなどの中性脂質を含むことができる。別の例では、他の成分は、コレステロールなどのヘルパー脂質、ＤＳＰＣなどの任意の中性脂質、およびＳ０１０、Ｓ０２４、Ｓ０２７、Ｓ０３１、またはＳ０３３などのステルス脂質を含むことができる。
ＬＮＰは、以下の１つ以上またはすべてを含み得る：（ｉ）カプセル化およびエンドソーム脱出のための脂質、（ｉｉ）安定化のための中性脂質、（ｉｉｉ）安定化のためのヘルパー脂質、ならびに（ｉｖ）ステルス脂質を含む。例えば、すべての目的のためにそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｆｉｎｎ ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ２２：１－９およびＷＯ２０１７／１７３０５４（Ａ１）を参照されたい。特定のＬＮＰでは、カーゴはガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡをコードする核酸を含むことができる。特定のＬＮＰにおいて、カーゴは、Ｃａｓ９などのＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ、およびガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡをコードする核酸を含み得る。
カプセル化およびエンドソーム脱出のための脂質は、カチオン性脂質であり得る。脂質はまた、生分解性イオン化可能脂質などの生分解性脂質であり得る。好適な脂質の一例は、３－（（４，４－ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）－２－（（（（３－（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピル（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエノアートとも呼ばれる、（９Ｚ，１２Ｚ）－３－（（４，４－ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）－２－（（（（３－（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピルオクタデカ－９，１２－ジエノアートである脂質ＡまたはＬＰ０１である。例えば、すべての目的のためにそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｆｉｎｎ ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ２２：１－９およびＷＯ２０１７／１７３０５４（Ａ１）を参照されたい。好適な脂質の別の例は、（（５－（（ジメチルアミノ）メチル）－１，３－フェニレン）ビス（オキシ））ビス（オクタン－８，１－ジイル）ビス（デカノアート）とも呼ばれる、（（５－（（ジメチルアミノ）メチル）－１，３－フェニレン）ビス（オキシ））ビス（オクタン－８，１－ジイル）ビス（デカノアート）である脂質Ｂである。好適な脂質の別の例は、２－（（４－（（（３－（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）ヘキサデカノイル）オキシ）プロパン－１，３－ジイル（９Ｚ，９’Ｚ，１２Ｚ，１２’Ｚ）－ビス（オクタデカ－９，１２－ジエノアート）である脂質Ｃである。好適な脂質の別の例は、３－（（（３－（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）－１３－（オクタノイルオキシ）トリデシル３－オクチルウンデカノアートである脂質Ｄである。他の好適な脂質としては、ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イル４－（ジメチルアミノ）ブタノエート（Ｄｌｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ（ＭＣ３））としても知られる）が挙げられる。
本明細書に記載のＬＮＰでの使用に適したいくつかのそのような脂質は、インビボで生分解性である。例えば、そのような脂質を含むＬＮＰには、脂質の少なくとも７５％が、８、１０、１２、２４、もしくは４８時間以内、または３、４、５、６、７、もしくは１０日以内に血漿から除去されるものが含まれる。別の例として、ＬＮＰの少なくとも５０％が、８、１０、１２、２４、もしくは４８時間以内、または３、４、５、６、７、もしくは１０日以内に血漿から除去される。
このような脂質は、それらが含まれる培地のｐＨに応じてイオン化可能であってよい。例えば、わずかに酸性の培地では、脂質はプロトン化され、したがって正電荷を帯びることができる。逆に、例えば、ｐＨが約７．３５である血液などのわずかに塩基性の媒体では、脂質はプロトン化されない可能性があり、したがって電荷を帯びない可能性がある。いくつかの実施形態では、脂質は、少なくとも約９、９．５、または１０のｐＨでプロトン化され得る。そのような脂質が電荷を帯びる能力は、その固有のｐＫａに関連している。例えば、脂質は、独立して、約５．８～約６．２の範囲のｐＫａを有し得る。
中性脂質は、ＬＮＰを安定化し、その加工を改善するよう機能する。好適な中性脂質の例には、様々な中性、非荷電、または双性イオン性脂質が含まれる。本開示における使用に好適な中性リン脂質の例としては、５－ヘプタデシルベンゼン－１，３－ジオール（レゾルシノール）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジステロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ホスファチジルコリン（ＰＬＰＣ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＡＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）、ジラウリロイルホスファチジルコリン（ＤＬＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、１－ミリストイル－２－パルミトイルホスファチジルコリン（ＭＰＰＣ）、１－パルミトイル－２－ミリストイルホスファチジルコリン（ＰＭＰＣ）、１－パルミトイル－２－ステアロイルホスファチジルコリン（ＰＳＰＣ）、１，２－ジアラキドイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＢＰＣ）、１－ステアロイル－２－パルミトイルホスファチジルコリン（ＳＰＰＣ）、１，２－ジエイコセノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＥＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、リソホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジリノレオイルホスファチジルコリンジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、パルミトイルロレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、イソホスファチジルエタノールアミン、およびこれらの組み合わせが挙げられるが、これらには限定されない。例えば、中性リン脂質は、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、およびジミリストイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）からなる群から選択され得る。
ヘルパー脂質には、トランスフェクションを促進する脂質が含まれる。ヘルパー脂質がトランスフェクションを強化する機序は、粒子安定性を増強することを含んでもよい。場合によっては、ヘルパー脂質が膜の融合性を高めることができる。ヘルパー脂質は、ステロイド、ステロール、およびアルキルレゾルシノールを含む。好適なヘルパー脂質の例には、コレステロール、５－ヘプタデシルレゾルシノール、およびヘミコハク酸コレステロールが好適に含まれる。一例では、ヘルパー脂質はコレステロールまたはヘミコハク酸コレステロールであり得る。
ステルス脂質には、ナノ粒子がインビボで存在できる時間の長さを変える脂質が含まれる。ステルス脂質は、例えば、粒子凝集を低減し、粒子サイズを制御することによって製剤化プロセスにおいて有用である。ステルス脂質は、ＬＮＰの薬物動態特性を調節し得る。好適なステルス脂質には、脂質部分に連結された親水性頭部基を有する脂質が含まれる。
ステルス脂質の親水性頭部基は、例えば、ＰＥＧ（しばしばポリ（エチレンオキシド）と呼ばれる）、ポリ（オキサゾリン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（グリセロール）、ポリ（Ｎ－ビニルピロリドン）、ポリアミノ酸、およびポリＮ－（２－ヒドロキシプロピル）メタクリルアミドに基づくポリマーから選択されるポリマー部分を含んでもよい。ＰＥＧという用語は、ポリエチレングリコールまたは他のポリアルキレンエーテルポリマーを意味する。特定のＬＮＰ製剤では、ＰＥＧはＰＥＧ２０００とも呼ばれるＰＥＧ－２Ｋであり、平均分子量は約２，０００ダルトンである。例えば、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１７／１７３０５４（Ａ１）を参照されたい。
ステルス脂質の脂質部分は、例えば、独立して約Ｃ４～約Ｃ４０の飽和または不飽和の炭素原子を含むアルキル鎖長を有するジアルキルグリセロールまたはジアルキルグリカミド基を含むものを含むジアシルグリセロールまたはジアシルグリカミドから由来し得、ここで鎖は１つ以上の、例えばアミドまたはエステルなどの官能基を含み得る。ジアルキルグリセロールまたはジアルキルグリカミド基は、１つ以上の置換アルキル基をさらに含み得る。
一例として、ステルス脂質は、ＰＥＧ－ジラウロイルグリセロール、ＰＥＧ－ジミリストイルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＭＧ）、ＰＥＧ－ジパルミトイルグリセロール、ＰＥＧ－ジステアロイルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＳＰＥ）、ＰＥＧ－ジラウリルグリカミド、ＰＥＧ－ジミリスチルグリカミド、ＰＥＧ－ジパルミトイルグリカミド、およびＰＥＧ－ジステアロイルグリカミド、ＰＥＧ－コレステロール（Ｉ－［８’－（コレスト－５－エン－３［ベータ］－オキシ）カルボキシアミド－３’，６’－ジオキサオクタニル］カルバモイル－［オメガ］－メチル－ポリ（エチレングリコール）、ＰＥＧ－ＤＭＢ（３，４－ジテトラデコキシルベンジル－［オメガ］－メチル－ポリ（エチレングリコール）エーテル）、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００］（ＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００］（ＰＥＧ２ｋ－ＤＳＰＥ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロール、メトキシポリエチレングリコール（ＰＥＧ２ｋ－ＤＳＧ）、ポリ（エチレングリコール）－２０００－ジメタクリレート（ＰＥＧ２ｋ－ＤＭＡ））、および１，２－ジステアリルオキシプロピル－３－アミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００］（ＰＥＧ２ｋ－ＤＳＡ）から選択してもよい。１つの具体的な例において、ステルス脂質は、ＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧであってよい。
ＬＮＰは、製剤中の成分脂質の異なるそれぞれのモル比を含むことができる。ＣＣＤ脂質のモル％は、例えば、約３０モル％～約６０モル％、約３５モル％～約５５モル％、約４０モル％～約５０モル％、約４２モル％～約４７モル％、または約４５％であってよい。ヘルパー脂質のモル％は、例えば、約３０モル％～約６０モル％、約３５モル％～約５５モル％、約４０モル％～約５０モル％、約４１モル％～約４６モル％、または約４４モル％であってよい。中性脂質のモル％は、例えば、約１モル％～約２０モル％、約５モル％～約１５モル％、約７モル％～約１２モル％、または約９モル％であってよい。ステルス脂質のモル％は、例えば、約１モル％～約１０モル％、約１モル％～約５モル％、約１モル％～約３モル％、約２モル％、または約１モル％であってよい。
ＬＮＰは、生分解性脂質（Ｎ）の正に帯電したアミン基と、カプセル化される核酸の負に帯電したリン酸基（Ｐ）との間で異なる比を有することができる。これは、方程式Ｎ／Ｐで数学的に表すことができる。例えば、Ｎ／Ｐ比は、約０．５～約１００、約１～約５０、約１～約２５、約１～約１０、約１～約７、約３～約５、約４～約５、約４、約４．５、または約５であってよい。Ｎ／Ｐ比はまた、約４～約７、または約４．５～約６であり得る。具体例では、Ｎ／Ｐ比は４．５または６にすることができる。
一部のＬＮＰでは、カーゴは、Ｃａｓ ｍＲＮＡおよびｇＲＮＡを含むことができる。Ｃａｓ ｍＲＮＡおよびｇＲＮＡは、異なる比であってよい。例えば、ＬＮＰ製剤は、約２５：１～約１：２５の範囲、約１０：１～約１：１０の範囲、約５：１～約１：５、または約１：１のＣａｓ ｍＲＮＡとｇＲＮＡの比を含んでもよい。代替的に、ＬＮＰ製剤は、約１：１～約１：５、または約１０：１のＣａｓ ｍＲＮＡとｇＲＮＡ核酸の比を含んでもよい。代替的に、ＬＮＰ製剤は、約１：１０、２５：１、１０：１、５：１、３：１、１：１、１：３、１：５、１：１０、または１：２５のＣａｓ ｍＲＮＡとｇＲＮＡ核酸の比を含んでもよい。代替的に、ＬＮＰ製剤は、約１：１～約１：２の、ｃａｓ ｍＲＮＡとｇＲＮＡ核酸の比を含んでもよい。具体例において、Ｃａｓ ｍＲＮＡとｇＲＮＡとの比は、約１：１または約１：２であってよい。
一部のＬＮＰでは、カーゴは外因性ドナー核酸およびｇＲＮＡを含むことができる。外因性ドナー核酸およびｇＲＮＡは異なる比にすることができる。例えば、ＬＮＰ製剤は、約２５：１～約１：２５の範囲、約１０：１～約１：１０の範囲、約５：１～約１：５、または約１：１の外因性ドナー核酸とｇＲＮＡの比を含んでもよい。代替的に、ＬＮＰ製剤は、約１：１～約１：５、約５：１～約１：１、約１０：１、または約１：１０の外因性ドナー核酸とｇＲＮＡの比を含んでもよい。代替的に、ＬＮＰ製剤は、約１：１０、２５：１、１０：１、５：１、３：１、１：１、１：３、１：５、１：１０、または１：２５の外因性ドナー核酸とｇＲＮＡ核酸の比を含んでもよい。
好適なＬＮＰの具体的な例は、４．５の窒素対リン酸塩（Ｎ／Ｐ）比を持ち、４５：４４：９：２のモル比で生分解性カチオン性脂質、コレステロール、ＤＳＰＣ、およびＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧを含む。生分解性カチオン性脂質は、３－（（４，４－ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）－２－（（（（３－（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピル（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエノアートとも呼ばれる、（９Ｚ，１２Ｚ）－３－（（４，４－ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）－２－（（（（３－（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピルオクタデカ－９，１２－ジエノアートであり得る。例えば、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｆｉｎｎ ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ２２：１－９を参照されたい。Ｃａｓ９ ｍＲＮＡは、ガイドＲＮＡに対して重量比で１：１にすることができる。好適なＬＮＰの別の具体的な例には、Ｄｌｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ（ＭＣ３）、コレステロール、ＤＳＰＣ、およびＰＥＧ－ＤＭＧが５０：３８．５：１０：１．５のモル比で含まれている。
好適なＬＮＰの別の具体的な例は、６の窒素対リン酸塩（Ｎ／Ｐ）比を持ち、５０：３８：９：３のモル比で生分解性カチオン性脂質、コレステロール、ＤＳＰＣ、およびＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧを含む。生分解性カチオン性脂質は、３－（（４，４－ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）－２－（（（（３－（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピル（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエノアートとも呼ばれる、（９Ｚ，１２Ｚ）－３－（（４，４－ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）－２－（（（（３－（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピルオクタデカ－９，１２－ジエノアートであり得る。Ｃａｓ９ ｍＲＮＡは、ガイドＲＮＡに対して重量比で１：２にすることができる。
免疫原性を低下させるために、送達様式を選択することができる。例えば、Ｃａｓタンパク質およびｇＲＮＡは、異なる様式（例えば、二峰性送達）によって送達され得る。これらの異なる様式は、対象の送達された分子（例えば、Ｃａｓまたはコードする核酸、ｇＲＮＡまたはコードする核酸、または外因性ドナー核酸／修復テンプレート）に異なる薬力学または薬物動態特性を与える可能性がある。例えば、異なる様式は、異なる組織分布、異なる半減期、または異なる時間的分布をもたらす可能性がある。いくつかの送達様式（例えば、自律複製またはゲノム組み込みによって細胞内で持続する核酸ベクターの送達）は、分子のより持続的な発現および存在をもたらすが、他の送達様式は、一過性で持続性が低い（例えば、ＲＮＡまたはタンパク質の送達）。例えばｍＲＮＡまたはタンパク質としてのＣａｓタンパク質のより一過性の様式での送達は、Ｃａｓ／ｇＲＮＡ複合体が短期間のみ存在し、活性であることを保証し得、ＭＨＣ分子によって細胞の表面に提示される細菌由来のＣａｓ酵素からのペプチドによって引き起こされる免疫原性を低下させることができる。このような一時的な送達は、オフターゲットの改変の可能性を減らすこともできる。
インビボでの投与は、例えば、非経口、静脈内、経口、皮下、動脈内、頭蓋内、髄腔内、腹腔内、局所、鼻腔内、または筋肉内を含む任意の好適な経路によることができる。全身投与様式には、例えば、経口および非経口経路が含まれる。非経口経路の例には、静脈内、動脈内、骨内、筋肉内、皮内、皮下、鼻腔内、および腹腔内経路が含まれる。具体的な例は静脈内注入である。鼻腔内注入および硝子体内注射は、他の特定の例である。局所投与様式には、例えば、髄腔内、脳室内、実質内（例えば、線条体（例えば、尾状核または被殻へ）、大脳皮質、前中心回旋、海馬（例えば、歯状回またはＣＡ３領域）、側頭皮質、扁桃体、前頭皮質、視床、小脳、髄質、視床、視蓋、被殻、またはニグラ実質への局所的な実質内送達）、眼内、眼窩内、結膜下、硝子体内、網膜下、および強膜を介した経路が含まれる。（全身的アプローチと比較して）有意に少量の成分は、全身的に投与された場合（例えば、静脈内）と比較して、局所的に投与された場合（例えば、実質内または硝子体内）に効果を発揮し得る。局所投与様式はまた、治療有効量の成分が全身投与されるときに起こり得る潜在的に毒性の副作用の発生率を低減または排除し得る。
インビボでの投与は、例えば、非経口、静脈内、経口、皮下、動脈内、頭蓋内、髄腔内、腹腔内、局所、鼻腔内、または筋肉内を含む任意の好適な経路によることができる。具体的な例は静脈内注入である。ガイドＲＮＡおよび／またはＣａｓタンパク質（またはガイドＲＮＡおよび／またはＣａｓタンパク質をコードする核酸）を含む組成物は、１つ以上の生理学的および薬学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤、または助剤を使用して製剤化することができる。製剤は、選択した投与経路に依存する可能性がある。「薬学的に許容される」という用語は、担体、希釈剤、賦形剤、または補助剤が製剤の他の成分と適合性であり、そのレシピエントに実質的に有害ではないことを意味する。
投与の頻度および投与回数は、他の要因の中でもとりわけ、外因性ドナー核酸、ガイドＲＮＡ、もしくはＣａｓタンパク質（またはガイドＲＮＡもしくはＣａｓタンパク質をコードする核酸）の半減期および投与経路に依存し得る。細胞または非ヒト動物への核酸またはタンパク質の導入は、ある期間にわたって１回または複数回実施することができる。例えば、導入は、ある期間にわたって少なくとも２回、ある期間にわたって少なくとも３回、ある期間にわたって少なくとも４回、ある期間にわたって少なくとも５回、ある期間にわたって少なくとも６回、ある期間にわたって少なくとも７回、ある期間にわたって少なくとも８回、ある期間にわたって少なくとも９回、ある期間にわたって少なくとも１０回、ある期間にわたって少なくとも１１回、ある期間にわたって少なくとも１２回、ある期間にわたって少なくとも１３回、ある期間にわたって少なくとも１４回、ある期間にわたって少なくとも１５回、ある期間にわたって少なくとも１６回、ある期間にわたって少なくとも１７回、ある期間にわたって少なくとも１８回、ある期間にわたって少なくとも１９回、またはある期間にわたって少なくとも２０回、実施することができる。
Ｅ．インビボまたはエクスビボでのヒト凝固因子ＸＩＩ標的化試薬の送達、活性、または有効性の測定
本明細書に開示される方法は、ヒト凝固因子ＸＩＩ標的化試薬の活性を検出または測定することをさらに含むことができる。そのような試薬の活性を測定することは、例えば、凝固因子ＸＩＩの発現または活性または予測される活性を測定することを含み得る。例えば、評価は、凝固またはトロンビン生成の測定を含み得る。代替的に、評価は、プロＨＧＦから活性ＨＧＦへの変換を評価するなど、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）－チロシン－プロテインキナーゼＭｅｔ（Ｍｅｔ）シグナル伝達活性（例えば、ニューロンにおける）の可能性を測定することを含み得る。
一例として、ヒト凝固因子ＸＩＩ標的化試薬がゲノム編集試薬（例えば、ヒトＦ１２遺伝子座を標的化するように設計されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）である場合、測定することは、改変についてヒト化Ｆ１２遺伝子座を評価することを含み得る。
標的化遺伝子改変を有する細胞を同定するために様々な方法を使用することができる。スクリーニングは、親染色体の対立遺伝子の改変（ＭＯＡ）を評価するための定量的アッセイを含むことができる。例えば、すべての目的のためにそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ２００４／００１８６２６、ＵＳ２０１４／０１７８８７９、ＵＳ２０１６／０１４５６４６、ＷＯ２０１６／０８１９２３、およびＦｒｅｎｄｅｗｅｙ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．４７６：２９５－３０７を参照されたい。例えば、定量的アッセイは、リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）などの定量的ＰＣＲを介して実施することができる。リアルタイムＰＣＲは、標的遺伝子座を認識する第１のプライマーセットおよび非標的参照遺伝子座を認識する第２のプライマーセットを利用することができる。プライマーセットは、増幅された配列を認識する蛍光プローブを含むことができる。好適な定量的なアッセイの他の例としては、蛍光媒介インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、比較ゲノムハイブリダイゼーション、等温ＤＮＡ増幅、固定化プローブすべてに対する定量的ハイブリダイゼーション、ＩＮＶＡＤＥＲ（登録商標）プローブ、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）分子ビーコンプローブ、またはＥｃｌｉｐｓｅ（商標）プローブ技術が挙げられる（例えば、の目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ２００５／０１４４６５５を参照されたい）。
次世代シーケンシング（ＮＧＳ）もスクリーニングに使用できる。次世代シーケンシングは、「ＮＧＳ」または「超並列シーケンシング」または「ハイスループットシーケンシング」と呼ばれることもある。ＮＧＳは、ＭＯＡアッセイに加えてスクリーニングツールとして使用して、標的となる遺伝子改変の正確な性質、およびそれが細胞タイプ、組織タイプ、または臓器タイプ間で一貫しているかどうかを定義できる。
非ヒト動物におけるヒト化Ｆ１２遺伝子座の改変を評価することは、任意の組織または臓器からの任意の細胞型にあり得る。例えば、評価は、同じ組織または臓器からの複数の細胞型、または組織または臓器内の複数の場所からの細胞で行うことができる。これは、標的組織または臓器内のどの細胞型が標的化されているか、または組織または臓器のどのセクションがヒト凝固因子ＸＩＩ標的化試薬によって到達されているかについての情報を提供することができる。別の例として、評価は複数の種類の組織または複数の臓器で行うことができる。特定の組織、臓器、または細胞型が標的にされる方法では、これは、その組織または臓器がどれほど効果的に標的にされるか、および他の組織または臓器にオフターゲット効果があるかどうかについての情報を提供することができる。
試薬がヒト化Ｆ１２遺伝子座を不活性化する、ヒト化Ｆ１２遺伝子座の発現に影響を与える、ヒト化Ｆ１２ ｍＲＮＡの翻訳を防止する、またはヒト化凝固因子ＸＩＩタンパク質を除去するように設計されている場合、測定することはヒト化Ｆ１２ ｍＲＮＡまたはタンパク質発現を評価することを含めることができる。この測定することは、特定の細胞型もしくは臓器（例えば、肝臓もしくは肝臓内の特定の細胞型もしくは領域、または海馬錐体層（錐体ニューロン）および皮質ニューロンなどの脳もしくは脳の特定の細胞型もしくは領域）内で行うことができ、またはヒト化凝固因子ＸＩＩタンパク質の血清もしくは血漿レベルの測定を含んでもよい。
使用できるアッセイの一例は、無傷の固定組織との関連で、単一ヌクレオチドの変化を含む、細胞特異的に編集された転写産物を定量化することができる方法である、ＲＮＡＳＣＯＰＥ（商標）およびＢＡＳＥＳＣＯＰＥ（商標）ＲＮＡインサイチュハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）アッセイである。ＢＡＳＥＳＣＯＰＥ（商標）ＲＮＡ ＩＳＨアッセイは、遺伝子編集の特性評価においてＮＧＳおよびｑＰＣＲを補完することができる。ＮＧＳ／ｑＰＣＲは野生型および編集された配列の定量的平均値を提供できるが、組織内の編集された細胞の不均一性またはパーセンテージに関する情報は提供しない。ＢＡＳＥＳＣＯＰＥ（商標）ＩＳＨアッセイは、組織全体のランドスケープビューと、編集されたｍＲＮＡ転写物を含む標的組織内の実際の細胞数を定量化できる単一細胞分解能での野生型対編集された転写物の定量化とを提供できる。ＢＡＳＥＳＣＯＰＥ（商標）アッセイは、ペアオリゴ（「ＺＺ」）プローブを使用して非特異的なバックグラウンドなしでシグナルを増幅し、単一分子ＲＮＡ検出を実現する。しかしながら、ＢＡＳＥＳＣＯＰＥ（商標）プローブの設計とシグナル増幅システムにより、ＺＺプローブを使用した単一分子ＲＮＡの検出が可能になり、無傷の固定組織における単一ヌクレオチドの編集および変異を差次的に検出できる。
ヒト化凝固因子ＸＩＩタンパク質の産生および分泌は、任意の既知の手段によって評価することができる。例えば、発現は、既知のアッセイを使用して、非ヒト動物におけるコードされたｍＲＮＡのレベルまたはコードされたタンパク質のレベルを測定することによって（例えば、血漿または血清レベルを測定することによって）評価することができる。
ヒト化凝固因子ＸＩＩタンパク質の活性は、任意の既知の手段によって評価することができる。そのようなアッセイは、例えば、プレカリクレインのカリクレインへの活性化の評価、ＦＸＩの活性化の評価、プロＨＧＦのＨＧＦへの活性化の評価、または古典的補体経路の活性化の評価を含み得る。
ＩＶ．ヒト化Ｆ１２遺伝子座を含む非ヒト動物を作製する方法
本明細書のいずこかに開示されるように、ヒト化凝固因子ＸＩＩ（Ｆ１２）遺伝子座を含む非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞、または非ヒト動物を作製するための様々な方法が提供される。同様に、本明細書のいずこかに開示されるように、ヒト化凝固因子ＸＩＩ（Ｆ１２）遺伝子または遺伝子座を作製するため、またはヒト化凝固因子ＸＩＩ（Ｆ１２）遺伝子座を含む非ヒト動物ゲノムまたは非ヒト動物細胞を作製するための様々な方法が提供される。遺伝子組換え生物を生産するための任意の便利な方法またはプロトコルは、そのような遺伝子改変された非ヒト動物を生産するのに適している。例えば、すべての目的のためにそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｐｏｕｅｙｍｉｒｏｕ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２５（１）：９１－９９、ＵＳ７，２９４，７５４、ＵＳ７，５７６，２５９、ＵＳ７，６５９，４４２、ＵＳ８，８１６，１５０、ＵＳ９，４１４，５７５、ＵＳ９，７３０，４３４、およびＵＳ１０，０３９，２６９を参照されたい（遺伝子改変マウスを作製するためのマウスＥＳ細胞およびＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）を記載している）。すべての目的のためにそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ２０１４／０２３５９３３（Ａ１）、ＵＳ２０１４／０３１０８２８（Ａ１）、ＵＳ１０，３８５，３５９、およびＵＳ１０，３２９，５８２も参照されたい（ラットＥＳ細胞および遺伝子改変ラットの作製方法を記載している）。すべての目的のためにそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｔｏｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４２：１９．１１．１－１９．１１．２２（ｄｏｉ：１０．１００２／０４７１１４３０３０．ｃｂ１９１１ｓ４２）およびＧａｍａ Ｓｏｓａ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｂｒａｉｎ Ｓｔｒｕｃｔ．Ｆｕｎｃｔ．２１４（２－３）：９１－１０９も参照されたい。そのような遺伝子改変された非ヒト動物は、例えば、標的化されたＦ１２遺伝子座での遺伝子ノックインを介して生成することができる。
例えば、ヒト化Ｆ１２遺伝子座を含む非ヒト動物を作製する方法は、（１）多能性細胞のゲノムを改変して、ヒト化Ｆ１２遺伝子座を含むようにすることと、（２）ヒト化Ｆ１２遺伝子座を含む遺伝子改変された多能性細胞を同定または選択することと、（３）遺伝子改変された多能性細胞を非ヒト動物宿主胚に導入することと、（４）代理母に宿主胚を移植して妊娠させることと、を含むことができる。例えば、ヒト化Ｆ１２遺伝子座を含む非ヒト動物を作製する方法は、（１）ヒト化Ｆ１２遺伝子座を含む多能性細胞、例えば、マウスＥＳ細胞またはラットＥＳ細胞などの胚性幹（ＥＳ）細胞を提供することと、（２）遺伝子改変された多能性細胞を非ヒト動物宿主胚に導入することと、（３）代理母に宿主胚を妊娠させることと、を含むことができる。
別の例として、ヒト化Ｆ１２遺伝子座を含む非ヒト動物を作製する方法は、（１）多能性細胞（例えば、マウスＥＳ細胞またはラットＥＳ細胞などの胚性幹（ＥＳ）細胞）のゲノムを改変して、ヒト化Ｆ１２遺伝子座を含むようにすることと、（２）ヒト化Ｆ１２遺伝子座を含む遺伝子改変された多能性細胞を同定または選択することと、（３）遺伝子改変された多能性細胞を非ヒト動物宿主胚に導入することと、（４）代理母に宿主胚を妊娠させることと、を含むことができる。ドナー細胞は、胚盤胞期または桑実胚前期（すなわち、４細胞期または８細胞期）などの任意の段階で宿主胚に導入することができる。任意選択で、改変された多能性細胞（例えば、非ヒトＥＳ細胞）を含む宿主胚は、Ｆ０非ヒト動物を産生するために代理母に着床および妊娠される前に胚盤胞段階までインキュベートしてもよい。次いで、代理母は、ヒト化Ｆ１２遺伝子座を含む（そして生殖細胞系列を介して遺伝子改変を伝達することができる）Ｆ０世代の非ヒト動物を生成することができる。
この方法は、改変された標的ゲノム遺伝子座を有する細胞または動物を同定することをさらに含み得る。標的化遺伝子改変を有する細胞および動物を同定するために様々な方法を使用することができる。
代替的に、本明細書のいずこかに記載の非ヒト動物を生成する方法は、（１）多能性細胞を改変するための上記の方法を使用して、ヒト化Ｆ１２遺伝子座を含むように１細胞期胚のゲノムを改変することと、（２）遺伝子組換え胚を選択することと、（３）代理母に遺伝子組換え胚を妊娠させることと、を含むことができる生殖細胞系列を通じて遺伝子改変を伝達できる子孫が生成される。
核移植技術は、非ヒト哺乳動物を生成するためにも使用できる。簡潔に述べると、核移植のための方法は、：（１）卵母細胞を脱核するか、または脱核された卵母細胞を提供することと、（２）脱核した卵母細胞と組み合わせるドナー細胞または核を単離または提供することと、（３）細胞または核を脱核した卵母細胞に挿入して、再構成された細胞を形成することと、（４）再構成された細胞を動物の子宮に移植して胚を形成することと、（５）胚を発生させることと、を含むことができる。このような方法では、卵母細胞は一般に死亡した動物から回収されるが、生きている動物の卵管および／または卵巣からも分離してみよい。卵母細胞は、除核前に様々なよく知られた培地で成熟させることができる。卵母細胞の除核は、多くのよく知られた方法で行うことができる。再構成された細胞を形成するための脱核卵母細胞へのドナー細胞または核の挿入は、融合の前に透明帯の下にドナー細胞をマイクロインジェクションすることによって行うことができる。融合は、接触／融合面を横切るＤＣ電気パルスの印加（電気融合）、ポリエチレングリコールなどの融合促進化学物質への細胞の曝露、またはセンダイウイルスなどの不活化ウイルスによって誘発され得る。再構成された細胞は、核のドナーおよびレシピエントの卵母細胞の融合の前、その最中、および／またはその後に、電気的および／または非電気的手段によって活性化することができる。活性化方法には、電気パルス、化学的に誘発されたショック、精子による浸透、卵母細胞における二価カチオンのレベルの増加、および卵母細胞における細胞タンパク質のリン酸化の減少（キナーゼ阻害剤による）が含まれる。活性化された再構成された細胞、または胚は、よく知られた培地で培養され、次いで動物の子宮に移植され得る。例えば、すべての目的のためにそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ２００８／００９２２４９、ＷＯ１９９９／００５２６６、ＷＯ２００４／０１７７３９０、ＷＯ２００８／０１７２３４、およびＵＳ７，６１２，２５０を参照されたい。
改変細胞または１細胞期胚は、例えば、（ａ）例えば、５’および３’標的部位（例えば、挿入核酸による欠失および置換を目的とする内因性配列に隣接する標的部位）に対応する５’および３’ホモロジーアームが隣接する挿入核酸を含む１つ以上の外因性ドナー核酸（例えば、標的化ベクター）を細胞に導入することであって、挿入核酸は、ヒト化Ｆ１２遺伝子座を生成するためのヒトＦ１２配列を含む、導入することと、（ｂ）内因性Ｆ１２遺伝子座に組み込まれた挿入核酸をそのゲノムに含む少なくとも１つの細胞を同定すること（すなわち、ヒト化Ｆ１２遺伝子座を含む少なくとも１つの細胞を同定することと）と、による組換えを介して生成され得る。同様に、改変された非ヒト動物ゲノムまたはヒト化非ヒト動物Ｆ１２遺伝子は、例えば、（ａ）ゲノムまたは遺伝子を、５’および３’標的部位に対応する５’および３’ホモロジーアーム（例えば、５’および３’ホモロジーアームに隣接する、欠失および挿入核酸での置換を目的とする内因性配列に隣接する標的部位（例えば、ヒト化Ｆ１２遺伝子座を生成するためのヒトＦ１２配列を含む））を含む１つ以上の外因性ドナー核酸（例えば、標的化ベクター）と接触させることによる組換えによって生成することができ、ここで、外因性ドナー核酸は、内因性非ヒト動物Ｆ１２遺伝子座のヒト化のために設計されている。
代替的に、改変された多能性細胞または一細胞期胚は、（ａ）細胞に（ｉ）ヌクレアーゼ剤であって、ヌクレアーゼ剤は、内因性Ｆ１２遺伝子座内の標的部位でニックまたは二本鎖切断を誘導するヌクレアーゼ剤、ならびに（ｉｉ）例えば、５’および３’標的部位（例えば、欠失および挿入核酸による置換を目的とする内因性配列に隣接する標的部位）に対応する５’および３’ホモロジーアームに隣接する挿入核酸を含む１つ以上の外因性ドナー核酸（例えば、標的化ベクター）を導入することであって、挿入核酸は、ヒト化Ｆ１２遺伝子座を生成するためのヒトＦ１２配列を含む、導入することと、（ｃ）内因性Ｆ１２遺伝子座に組み込まれた挿入核酸をそのゲノムに含む少なくとも１つの細胞を同定すること（すなわち、ヒト化Ｆ１２遺伝子座を含む少なくとも１つの細胞を同定することと）と、によって生成され得る。同様に、改変された非ヒト動物ゲノムまたはヒト化非ヒト動物Ｆ１２遺伝子は、ゲノムまたは遺伝子を：（ｉ）ヌクレアーゼ剤であって、ヌクレアーゼ剤は、内因性Ｆ１２遺伝子座または遺伝子内の標的部位においてニックまたは二本鎖切断を誘導する、ヌクレアーゼ剤と、（ｉｉ）例えば、５’および３’標的部位（例えば、欠失および挿入核酸による置換を目的とした内因性配列に隣接する標的部位）に対応する５’および３’ホモロジーアームに隣接する挿入核酸（例えば、ヒト化Ｆ１２遺伝子座を生成するためのヒトＦ１２配列を含む）を含む１つ以上の外因性ドナー核酸（例えば、標的化ベクター）であって、外因性ドナー核酸は、内因性Ｆ１２遺伝子座のヒト化のために設計されている外因性ドナー核酸と、に接触させることによって生成することができる。所望の認識部位へのニックまたは二本鎖切断を誘発する任意のヌクレアーゼ剤を使用することができる。好適なヌクレアーゼの例としては、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、メガヌクレアーゼ、およびクラスター化等間隔短鎖回文リピート（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）システム（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システム）、またはそのようなシステムの構成要素（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９）が挙げられる。例えば、すべての目的のためにそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ２０１３／０３０９６７０およびＵＳ２０１５／０１５９１７５を参照されたい。一例では、ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９タンパク質およびガイドＲＮＡを含む。別の例では、ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９タンパク質と、２つ以上、３つ以上、または４つ以上のガイドＲＮＡと、を含む。
ゲノムを改変するステップは、例えば、外因性修復テンプレートまたはドナー核酸（例えば、標的化ベクター）を利用して、Ｆ１２遺伝子座を改変して、本明細書に開示されるヒト化Ｆ１２遺伝子座を含むようにすることができる。一例として、標的化ベクターは、内因性Ｆ１２遺伝子座（例えば、内因性非ヒト動物Ｆ１２遺伝子座）でヒト化Ｆ１２遺伝子を生成するためのものであり得、標的化ベクターは、内因性Ｆ１２遺伝子座の５’標的配列を標的化する５’ホモロジーアームおよび内因性Ｆ１２遺伝子座の３’標的配列を標的化する３’ホモロジーアームに隣接するＦ１２遺伝子座に組み込まれるヒトＦ１２配列を含む核酸インサートを含む。Ｆ１２遺伝子座での核酸インサートの組み込みは、Ｆ１２遺伝子座での目的の核酸配列の付加、Ｆ１２遺伝子座での核酸配列の欠失、またはＦ１２遺伝子座での目的の核酸配列の置換（すなわち、欠失および挿入）をもたらし得る。ホモロジーアームは、ヒトＦ１２配列を含む挿入核酸に隣接して、ヒト化Ｆ１２遺伝子座を生成することができる（例えば、内因性Ｆ１２遺伝子座のセグメントを削除し、オーソロガスなヒトＦ１２配列で置き換えるため）。
外因性修復テンプレートまたはドナー核酸は、非相同末端結合を介した挿入または相同組換えのためのものであってもよい。外因性修復テンプレートまたはドナー核酸は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）を含むことができ、それらは一本鎖または二本鎖であり得、かつそれらは直線状または環状の形態であり得る。例えば、修復テンプレートは、一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）であり得る。
外因性ドナー核酸はまた、標的化されていない内因性Ｆ１２遺伝子座に存在しない異種配列を含み得る。例えば、外因性ドナー核酸は、リコンビナーゼ認識部位に隣接する選択カセットなどの選択カセットを含むことができる。
いくつかの外因性ドナー核酸は、ホモロジーアームを含む。外因性ドナー核酸が核酸インサートも含む場合、ホモロジーアームは核酸インサートに隣接することができる。参照を容易にするために、ホモロジーアームは、本明細書では５’および３’（すなわち、上流および下流）ホモロジーアームと呼ばれる。この用語は、外因性ドナー核酸内の核酸インサートに対するホモロジーアームの相対位置に関連している。５’および３’ホモロジーアームは、Ｆ１２遺伝子座内の領域に対応し、これらは、本明細書では、それぞれ「５’標的配列」および「３’標的配列」と呼ばれる。
ホモロジーアームおよび標的配列は、２つの領域が相同組換え反応の基質として作用するのに十分なレベルの配列同一性を互いに共有する場合、互いに「対応する」または「対応している」。「相同性」という用語は、対応する配列と同一であるか、または配列同一性を共有するＤＮＡ配列を含む。所与の標的配列と外因性ドナー核酸に見られる対応するホモロジーアームとの間の配列同一性は、相同組換えが起こることを可能にする任意の程度の配列同一性であってよい。例えば、外因性ドナー核酸（またはその断片）のホモロジーアームおよび標的配列（またはその断片）によって共有される配列同一性の量は、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性であり得、これにより、配列は相同組換えを起こす。さらに、ホモロジーアームと対応する標的配列との間の対応する相同性領域は、相同組換えを促進するのに十分な任意の長さであり得る。一部の標的化ベクターでは、内因性Ｆ１２遺伝子座の意図された変異は、ホモロジーアームに隣接するインサート核酸に含まれている。
１細胞期胚以外の細胞において、外因性ドナー核酸は、細胞内で相同組換えを行うことを目的とした他のアプローチで典型的に使用されるものよりも大きい核酸配列に対応し、それに由来するホモロジーアームを含む標的化ベクターを含む、「大きい標的化ベクター」または「ＬＴＶＥＣ」であり得る。例えば、すべての目的のためにそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ２００４／００１８６２６、ＷＯ２０１３／１６３３９４、ＵＳ９，８３４，７８６、ＵＳ１０，３０１，６４６、ＷＯ２０１５／０８８６４３、ＵＳ９，２２８，２０８、ＵＳ９，５４６，３８４、ＵＳ１０，２０８，３１７、およびＵＳ２０１９－０１１２６１９を参照されたい。ＬＴＶＥＣにはまた、細胞内で相同組換えを行うことを目的とした他のアプローチで通常使用されるものよりも大きい核酸配列を有する核酸インサートを含む標的化ベクターが含まれる。例えば、ＬＴＶＥＣは、サイズの制限のために従来のプラスミドベースの標的化ベクターでは対応できない大きな遺伝子座の変更を可能にする。例えば、標的化された遺伝子座は、従来の方法を使用して標的化できないか、またはヌクレアーゼ剤（例えば、Ｃａｓタンパク質）によって誘導されるニックもしくは二本鎖切断の非存在下で不正確にのみ、または有意に低い効率でのみ標的化され得る細胞の遺伝子座であってもよい（すなわち、５’および３’相同性アームが対応し得る）。ＬＴＶＥＣは任意の長さであってもよく、通常は少なくとも１０ｋｂ長である。ＬＴＶＥＣの５’ホモロジーアームおよび３’ホモロジーアームの合計は、典型的には、少なくとも１０ｋｂである。ＶＥＬＯＣＩＧＥＮＥ（登録商標）遺伝子工学技術を使用する細菌相同組換え（ＢＨＲ）反応によって細菌人工染色体（ＢＡＣ）ＤＮＡ由来大きな標的化ベクター（ＬＴＶＥＣｓ）の生成および使用は、例えば、ＵＳ６，５８６，２５１およびＶａｌｅｎｚｕｅｌａ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１（６）：６５２－６５９に記載され、これらのそれぞれは、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。インビトロアセンブリ法によるＬＴＶＥＣの生成は、例えば、すべての目的のためにそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ２０１５／０３７６６２８およびＷＯ２０１５／２００３３４に記載されている。
この方法は、改変された標的ゲノム遺伝子座を有する細胞または動物を同定することをさらに含み得る。標的化遺伝子改変を有する細胞および動物を同定するために様々な方法を使用することができる。スクリーニングステップは、例えば、親染色体の対立遺伝子の改変（ＭＯＡ）を評価するための定量的アッセイを含むことができる。例えば、すべての目的のためにそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ２００４／００１８６２６、ＵＳ２０１４／０１７８８７９、ＵＳ２０１６／０１４５６４６、ＷＯ２０１６／０８１９２３、およびＦｒｅｎｄｅｗｅｙ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．４７６：２９５－３０７を参照されたい。例えば、定量的アッセイは、リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）などの定量的ＰＣＲを介して実施することができる。リアルタイムＰＣＲは、標的遺伝子座を認識する第１のプライマーセットおよび非標的参照遺伝子座を認識する第２のプライマーセットを利用することができる。プライマーセットは、増幅された配列を認識する蛍光プローブを含むことができる。
好適な定量的なアッセイの他の例としては、蛍光媒介インシチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、比較ゲノムハイブリダイゼーション、等温ＤＮＡ増幅、固定化プローブに対する定量的ハイブリダイゼーション、ＩＮＶＡＤＥＲ（登録商標）プローブ、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）分子ビーコンプローブ、またはＥＣＬＩＰＳＥ（商標）プローブ技術が挙げられる（例えば、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ２００５／０１４４６５５を参照されたい）。
好適な多能性細胞の例は、胚性幹（ＥＳ）細胞（例えば、マウスＥＳ細胞またはラットＥＳ細胞）である。改変された多能性細胞は、例えば、（ａ）例えば、５’および３’標的部位に対応する５’および３’ホモロジーアームが隣接する挿入核酸を含む１つ以上の外因性ドナー核酸（例えば、標的化ベクター）を細胞に導入することであって、挿入核酸は、ヒト化Ｆ１２遺伝子座を生成するためのヒトＦ１２配列を含む、導入することと、（ｂ）内因性Ｆ１２遺伝子座に組み込まれた挿入核酸をそのゲノムに含む少なくとも１つの細胞を同定すること（すなわち、ヒト化Ｆ１２遺伝子座を含む少なくとも１つの細胞を同定することと）と、による組換えを介して生成され得る。改変された多能性細胞は、例えば、（ａ）５’および３’標的部位に対応する５’および３’ホモロジーアームが隣接する挿入核酸を含む１つ以上の標的化ベクターを細胞に導入することであって、挿入核酸は、ヒト化Ｆ１２遺伝子座を含む、導入することと、（ｂ）標的ゲノム遺伝子座に組み込まれた挿入核酸をそのゲノムに含む少なくとも１つの細胞を同定することと、による組換えを介して生成され得る。
代替的に、改変された多能性細胞は、（ａ）細胞に（ｉ）ヌクレアーゼ剤であって、ヌクレアーゼ剤は、内因性Ｆ１２遺伝子座内の標的部位でニックまたは二本鎖切断を誘導するヌクレアーゼ剤、ならびに（ｉｉ）例えば、ヌクレアーゼ標的部位に十分に近接して位置する５’および３’標的部位に対応する５’および３’ホモロジーアームに隣接する挿入核酸を任意選択で含む１つ以上の外因性ドナー核酸（例えば、標的化ベクター）を導入することであって、挿入核酸は、ヒト化Ｆ１２遺伝子座を生成するためのヒトＦ１２配列を含む、導入することと、（ｃ）内因性Ｆ１２遺伝子座に組み込まれた挿入核酸をそのゲノムに含む少なくとも１つの細胞を同定すること（すなわち、ヒト化Ｆ１２遺伝子座を含む少なくとも１つの細胞を同定することと）と、によって生成され得る。代替的に、改変された多能性細胞は、（ａ）細胞に（ｉ）ヌクレアーゼ剤であって、ヌクレアーゼ剤は、標的ゲノム遺伝子座内の認識部位でニックまたは二本鎖切断を誘導するヌクレアーゼ剤、ならびに（ｉｉ）認識部位に十分に近接して位置する５’および３’標的部位に対応する５’および３’ホモロジーアームに隣接する挿入核酸を含む１つ以上の標的化ベクターを導入することであって、挿入核酸は、ヒト化Ｆ１２遺伝子座を含む、導入することと、（ｃ）標的ゲノム遺伝子座に改変（すなわち、挿入核酸の組み込みを含む少なくとも１つの細胞を同定すること）と、によって生成され得る。所望の認識部位へのニックまたは二本鎖切断を誘発する任意のヌクレアーゼ剤を使用することができる。好適なヌクレアーゼの例としては、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、メガヌクレアーゼ、およびクラスター化等間隔短鎖回文リピート（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）システム（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システム）、またはそのようなシステムの構成要素（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９）が挙げられる。例えば、すべての目的のためにそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ２０１３／０３０９６７０およびＵＳ２０１５／０１５９１７５を参照されたい。
ドナー細胞は、胚盤胞期または桑実胚前期（すなわち、４細胞期または８細胞期）などの任意の段階で宿主胚に導入することができる。生殖細胞系列を通じて遺伝子改変を伝達できる子孫が生成される。例えば、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，２９４，７５４号を参照されたい。
代替的に、本明細書のいずこかに記載の非ヒト動物を生成する方法は、（１）多能性細胞を改変するための上記の方法を使用して、ヒト化Ｆ１２遺伝子座を含むように１細胞期胚のゲノムを改変することと、（２）遺伝子組換え胚を選択することと、（３）代理母に遺伝子組換え胚を移植して妊娠させることと、を含むことができる。代替的に、本明細書のいずこかに記載の非ヒト動物を生成する方法は、（１）多能性細胞を改変するための上記の方法を使用して、ヒト化Ｆ１２遺伝子座を含むように１細胞期胚のゲノムを改変することと、（２）遺伝子組換え胚を選択することと、（３）代理母に遺伝子組換え胚を妊娠させることと、を含むことができる生殖細胞系列を通じて遺伝子改変を伝達できる子孫が生成される。
核移植技術は、非ヒト哺乳動物を生成するためにも使用できる。簡潔に述べると、核移植のための方法は、：（１）卵母細胞を脱核するか、または脱核された卵母細胞を提供することと、（２）脱核した卵母細胞と組み合わせるドナー細胞または核を単離または提供することと、（３）細胞または核を脱核した卵母細胞に挿入して、再構成された細胞を形成することと、（４）再構成された細胞を動物の子宮に移植して胚を形成することと、（５）胚を発生させることと、を含むことができる。このような方法では、卵母細胞は一般に死亡した動物から回収されるが、生きている動物の卵管および／または卵巣からも分離してみよい。卵母細胞は、除核前に様々なよく知られた培地で成熟させることができる。卵母細胞の除核は、多くのよく知られた方法で行うことができる。再構成された細胞を形成するための脱核卵母細胞へのドナー細胞または核の挿入は、融合の前に透明帯の下にドナー細胞をマイクロインジェクションすることによって行うことができる。融合は、接触／融合面を横切るＤＣ電気パルスの印加（電気融合）、ポリエチレングリコールなどの融合促進化学物質への細胞の曝露、またはセンダイウイルスなどの不活化ウイルスによって誘発され得る。再構成された細胞は、核のドナーおよびレシピエントの卵母細胞の融合の前、その最中、および／またはその後に、電気的および／または非電気的手段によって活性化することができる。活性化方法には、電気パルス、化学的に誘発されたショック、精子による浸透、卵母細胞における二価カチオンのレベルの増加、および卵母細胞における細胞タンパク質のリン酸化の減少（キナーゼ阻害剤による）が含まれる。活性化された再構成された細胞、または胚は、よく知られた培地で培養され、次いで動物の子宮に移植され得る。例えば、すべての目的のためにそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ２００８／００９２２４９、ＷＯ１９９９／００５２６６、ＷＯ２００４／０１７７３９０、ＷＯ２００８／０１７２３４、および米国特許第７，６１２，２５０号を参照されたい。
本明細書で提供される様々な方法は、遺伝子改変された非ヒトＦ０動物の生成を可能にし、遺伝子改変されたＦ０動物の細胞は、ヒト化Ｆ１２遺伝子座を含む。Ｆ０動物を生成するために使用される方法に応じて、ヒト化Ｆ１２遺伝子座を有するＦ０動物内の細胞の数が変動することが認識されるであろう。マウスでの、例えば、対応する生物由来のドナーＥＳ細胞の桑実胚前期胚（例えば、８細胞期マウス胚）への、例えば、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）方法を介する導入は、Ｆ０マウスの細胞集団のうちのより大きなパーセンテージが、標的化遺伝子改変を含む目的のヌクレオチド配列を有する細胞を含むことを可能にする。例えば、非ヒトＦ０動物の、少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８５％、８６％、８７％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、の９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の細胞寄与は、標的改変を有する細胞集団を含むことができる。
遺伝子改変されたＦ０動物の細胞は、ヒト化Ｆ１２遺伝子座に対してヘテロ接合であってもよく、ヒト化Ｆ１２遺伝子座に対してホモ接合であってもよい。
Ｖ．短いＦ１２アイソフォームを評価または使用する方法
ヒト神経細胞で発現される短い凝固因子ＸＩＩアイソフォームを評価または使用する様々な方法が提供されている。実施例３に記載されているように、短いＦＸＩＩアイソフォームは、エクソン１１～１４に対するプローブによって検出されるが、エクソン１～６に対するプローブによっては検出されないＦ１２ ｍＲＮＡによってコード化され得る。具体例では、短いアイソフォームは、ＦＸＩＩ２９７－５９６（配列番号７４、配列番号７５によってコードされる）であり得、ＦＸＩＩのプロリンに富む触媒ドメイン（Ｍ２９７～Ｓ５９６）を含むタンパク質である。
評価することは、例えば、生体サンプルにおける短いアイソフォームの発現を測定すること、または短いアイソフォームの活性を測定することを含むことができる。短いアイソフォームの発現は、エクソン１１～１４に対するプローブなど、エクソン９、１０、１１、１２、１３、または１４に対するプライマーおよび／またはプローブ（例えば、定量ＰＣＲ用）を使用して、ｍＲＮＡレベルで測定できる。これは、短いアイソフォームを検出しないエクソン１、２、３、４、５、または６に対するプローブと比較して行うことができる。代替的に、短いアイソフォームの発現は、エクソン１１～１４に対するプローブなど、エクソン７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４に対するプライマーおよび／またはプローブ（例えば、定量ＰＣＲ用）を使用して、ｍＲＮＡレベルで測定できる。これは、短いアイソフォームを検出しないエクソン１、２、３、４、５、または６に対するプローブと比較して行うことができる。代替的に、短いアイソフォームの発現は、エクソン１１～１４に対するプローブなど、エクソン９、１０、１１、１２、１３、もしくは１４に対するプライマーおよび／またはプローブ（例えば、定量ＰＣＲ用）を使用して、ｍＲＮＡレベルで測定できる。これは、短いアイソフォームを検出しないエクソン１、２、３、４、５、６、７、または８に対するプローブと比較して行うことができる。例えば、そのような方法は、上述のように、Ｆ１２遺伝子のエクソンに対するプライマーおよび／またはプローブを使用して、ＲＮＡ転写産物を検出および定量化することを含み得る。これは、例えば、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）または定量的ＰＣＲ（例えば、ＲＴ－ｑＰＣＲ）を含み得る。ＲＴ－ｑＰＣＲでは、ＲＮＡ転写産物を最初にｃＤＮＡに逆転写し、次にｑＰＣＲを実行することによって定量化する。標準的なＰＣＲと同様に、ＤＮＡは、変性、アニーリング、および伸長の３つの繰り返しステップで増幅される。しかしながら、ｑＰＣＲでは、蛍光標識によりＰＣＲの進行に合わせてデータを収集できる。
短いアイソフォームの活性を評価することは、例えば、プロＨＧＦの活性ＨＧＦへの変換を評価することなど、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）－チロシン－プロテインキナーゼＭｅｔ（Ｍｅｔ）シグナル伝達活性（例えば、ニューロンにおいて）を測定することを含み得る。そのようなアッセイはまた、例えば、プレカリクレインのカリクレインへの活性化の評価、ＦＸＩの活性化の評価、プロＨＧＦのＨＧＦへの活性化の評価、または古典的補体経路の活性化の評価を含み得る。
評価すること（例えば、発現または活性を測定すること）は、任意の臓器、組織型、または細胞型などの任意の生体サンプルで行うことができる。例えば、発現を測定することは、ニューロン（例えば、錐体ニューロンまたは皮質ニューロン）などの脳で行うことができる。臓器、組織、または細胞は、ヒト由来であり得るか、または非ヒト動物（例えば、本明細書のいずこかで詳細に記載されるようなヒト化Ｆ１２遺伝子座を有する非ヒト動物）由来であり得る。
上記または下記で引用されているすべての特許出願、ウェブサイト、他の刊行物、アクセッション番号などは、各項目が、参照により組み込まれることが具体的にかつ個別に示されたのと同じ程度に、すべての目的に関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。配列の異なるバージョンが違う時間にアクセッション番号に関連付けられている場合、本出願の有効な出願日においてアクセッション番号に関連付けられるバージョンを意味する。有効な出願日とは、該当する場合、アクセッション番号に関する実際の出願日以前または優先出願の出願日を意味する。同様に、刊行物、ウェブサイトなどの異なるバージョンが違う時間に公開されている場合、別段の指定のない限り、本出願の有効な出願日の直近に公開されたバージョンを意味する。別段に他の指示がない限り、本発明の任意の特徴、ステップ、要素、実施形態、または態様を、任意の他のものと組み合わせて使用することができる。本発明は、明瞭さおよび理解の目的に対し図表および例を介していくつかの詳細が記載されているが、添付の特許請求の範囲内で、ある特定の変化および改変を実施することができることが明らかになろう。
配列の簡単な説明
添付の配列表に列記されているヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、ヌクレオチド塩基のための標準的な文字略語、ならびにアミノ酸のための三文字表記を使用して示されている。ヌクレオチド配列は、配列の５’末端から始まって先へ（すなわち、各行で左から右へ）進み３’末端に至る標準規則に従っている。各ヌクレオチド配列の１本の鎖のみが示されているが、相補鎖は、示されている鎖を任意に参照することによって含まれると理解される。アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列が提供される場合、同じアミノ酸配列をコードするそのコドン縮重バリアントもまた提供されることが理解される。アミノ酸配列は、配列のアミノ末端から始まって先へ（すなわち、各行で左から右へ）進みカルボキシ末端に至る標準規則に従っている。
Figure 2022528414000003
Figure 2022528414000004
Figure 2022528414000005
実施例１．ヒト化凝固因子ＸＩＩ（Ｆ１２）遺伝子座を含むマウスの生成
６２．４ｋｂのマウスＦ１２遺伝子座（ゲノムビルドＧＲＣｍ３８／ｍｍ１０から）を含む５’ホモロジーアームおよび１０７．２ｋｂのマウスＦ１２遺伝子座（ゲノムビルドＧＲＣｍ３８／ｍｍ１０から）を含む３’ホモロジーアームを含む大きな標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）を、マウスＦ１２遺伝子からの８．６ｋｂ（８，６７０ｂｐ）の領域を、７．２ｋｂ（７，２３６ｂｐ）の対応するＦ１２のヒト配列（ゲノムビルドＧＲＣｈ３８／ｈｇ３８から）で置き換えるために生成した。マウスおよびヒトのＦ１２に関する情報を表３に示す。ＬＴＶＥＣに関する情報を表４に示す。ＶＥＬＯＣＩＧＥＮＥ（登録商標）遺伝子工学技術を使用する細菌相同組換え（ＢＨＲ）反応によって細菌人工染色体（ＢＡＣ）ＤＮＡ由来大きな標的化ベクター（ＬＴＶＥＣｓ）の生成および使用は、例えば、ＵＳ６，５８６，２５１およびＶａｌｅｎｚｕｅｌａ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１（６）：６５２－６５９に記載され、これらのそれぞれは、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。インビトロアセンブリ法によるＬＴＶＥＣの生成は、例えば、すべての目的のためにそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ２０１５／０３７６６２８およびＷＯ２０１５／２００３３４に記載されている。
Figure 2022528414000006
Figure 2022528414000007
具体的には、ＡＴＧ開始コドンから終止コドンまでの領域がマウスＦ１２遺伝子座から削除された。削除されたマウス領域の代わりに、ＡＴＧ開始コドンから終止コドンまでのヒトＦ１２の対応する領域を挿入した。ｌｏｘＰ－ｍＰｒｍ１－Ｃｒｅｉ－ｐＡ－ｈＵｂ１－ｅｍ７－Ｎｅｏ－ｐＡ－ｌｏｘＰカセット（４，７６６ｂｐ）がヒトイントロン４（エクソン４の後８１ｂｐ、およびエクソン５の前２２０ｂｐ）に含まれていた。自己削除カセットの上流のヒトＦ１２領域には３，８７４ｂｐ（ヒトＡＴＧからエクソン４、およびイントロン４の８１ｂｐ）が含まれ、自己削除カセットの下流のヒトＦ１２領域には３，３６２ｂｐ（２２０ｂｐのヒトイントロン４、およびエクソン５から終止コドン）が含まれていた。これはＭＡＩＤ７３７４対立遺伝子である。図１の下を参照されたい。カセット削除の後、ｌｏｘＰおよびクローニングサイトはヒトＦ１２イントロン４に残った。これはＭＡＩＤ７３７５対立遺伝子である。
マウス凝固因子ＸＩＩシグナルペプチド、重鎖、および軽鎖の配列は、それぞれ配列番号２～４に記載されており、対応するコード配列は、それぞれ配列番号１０～１２に記載されている。ヒト凝固因子ＸＩＩシグナルペプチド、重鎖、および軽鎖の配列は、それぞれ配列番号６～８に記載されており、対応するコード配列は、それぞれ配列番号１４～１６に記載されている。予想されるコード化されたヒト化凝固因子ＸＩＩタンパク質は、ヒト凝固因子ＸＩＩタンパク質と同一である。図１を参照されたい。マウスおよびヒトの凝固因子ＸＩＩタンパク質のアラインメントを図３に示す。マウスおよびヒトのＦ１２コード配列は、それぞれ配列番号９および１３に示されている。マウスおよびヒトの凝固因子ＸＩＩタンパク質配列は、それぞれ配列番号１および５に示されている。予想されるヒト化ＡＬＢコード配列および予想されるヒト化凝固因子ＸＩＩタンパク質の配列は、それぞれ配列番号１３および５に記載されている。
変異対立遺伝子を生成するために、上述の大きな標的化ベクターをＦ１Ｈ４マウス胚性幹細胞に導入した。Ｆ１Ｈ４マウスＥＳ細胞は、メスのＣ５７ＢＬ／６ＮＴａｃマウスをオスの１２９５６／ＳｖＥｖＴａｃマウスと交配することによって生成されたハイブリッド胚に由来した。例えば、すべての目的のためにそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ２０１５－０３７６６５１およびＷＯ２０１５／２００８０５を参照されたい。抗生物質選択後、コロニーを、採取し、拡大し、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）によりスクリーニングした。図２を参照されたい。内因性マウス対立遺伝子の喪失を検出するために対立遺伝子喪失アッセイを実施し、表５に記載のプライマーおよびプローブを使用してヒト化対立遺伝子の獲得を検出するために対立遺伝子獲得アッセイを実施した。
Figure 2022528414000008
対立遺伝子喪失（ＬＯＡ）および対立遺伝子獲得（ＧＯＡ）アッセイを含む対立遺伝子改変（ＭＯＡ）アッセイは、例えば、ＵＳ２０１４／０１７８８７９、ＵＳ２０１６／０１４５６４６、ＷＯ２０１６／０８１９２３、およびＦｒｅｎｄｅｗｅｙ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．４７６：２９５－３０７に記載されており、これらのそれぞれは、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。対立遺伝子喪失（ＬＯＡ）アッセイは、従来のスクリーニングロジックを逆にし、変異が誘導された天然遺伝子座のゲノムＤＮＡサンプルのコピー数を定量化する。正しく標的化されたヘテロ接合細胞クローンでは、ＬＯＡアッセイは２つの天然対立遺伝子（ＸまたはＹ染色体上にない遺伝子の場合）の１つを検出し、もう１つの対立遺伝子は標的化された改変によって破壊される。ゲノムＤＮＡサンプルに挿入された標的化ベクターのコピー数を定量化するために、対立遺伝子獲得（ＧＯＡ）アッセイと同じ原理を逆に適用することができる。
Ｆ０マウスは、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）法を用いて改変されたＥＳ細胞から生成された。具体的には、上述のＭＯＡアッセイによって選択されたマウスＥＳ細胞クローンを、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）法を使用して８細胞期胚に注入した。例えば、すべての目的のためにそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ７，５７６，２５９、ＵＳ７，６５９，４４２、ＵＳ７，２９４，７５４、ＵＳ２００８／００７８０００、およびＰｏｕｅｙｍｉｒｏｕ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２５（１）：９１－９９を参照されたい。ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）法では、標的化マウス胚性幹（ＥＳ）細胞は、桑実胚前期胚、例えば、８細胞期胚にレーザアシスト注入を介して注入され、完全にＥＳ細胞に由来するＦ０世代のマウスを効率的にもたらす。
実施例２．ヒト化凝固因子ＸＩＩ（Ｆ１２）遺伝子座を含むマウスの検証
ヒト化Ｆ１２マウスを検証するために、ヒト凝固因子ＸＩＩのＥＬＩＳＡキット（ｈＦＸＩＩ Ｔｏｔａｌ Ａｎｔｉｇｅｎ ＥＬＩＳＡキットＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓカタログ番号ＨＦＸＩＩＫＴ－ＴＯＴ）を使用して、カセットを削除したヒト化Ｆ１２マウスの血漿サンプルでヒト凝固因子ＸＩＩレベルを測定した。ヒト凝固因子ＸＩＩは、正常なヒト血漿では２３．６μｇ／ｍＬのレベルで、ヒト化Ｆ１２マウスの血漿では５～１８μｇ／ｍＬのレベルで検出された。おそらくマウス凝固因子ＸＩＩとの最小限の交差反応のために、野生型マウス血漿中に少量が検出された。図４を参照されたい。
血漿サンプルのウエスタンブロット分析（実施例３で提供されるプロトコル）もまた、野生型マウスおよびヒト化Ｆ１２マウスにおけるマウス凝固因子ＸＩＩおよびヒト凝固因子ＸＩＩの発現を測定するために行われた。血漿のウエスタンブロット分析は、野生型（ＦＸＩＩ＋／＋）マウス血漿におけるマウス第ＸＩＩ因子の存在およびヒト第ＸＩＩ因子の欠如、ならびにヒト化Ｆ１２（ＦＸＩＩｈｕｍ／ｈｕｍ）マウス血漿におけるヒト第ＸＩＩ因子の存在およびマウス第ＸＩＩ因子の欠如を示す。Ｆ１２ノックアウトマウス血漿では、ヒトもマウスの第ＸＩＩ因子も検出されなかった。図５を参照されたい。
ヒト化Ｆ１２マウスをさらに検証するために、２つの機能的血漿アッセイを実施した：（１）活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）および（２）プロトロンビン時間（ＰＴ）。ａＰＴＴ試験は、カルシウムおよびエラグ酸の添加後に血餅が形成される時間を測定することにより、凝固カスケードの内因性および共通経路のすべての凝固因子を評価するが、ＰＴ試験は、カルシウムおよび組織因子の添加後に血餅が形成される時間を測定することによる凝固カスケードの外因性および共通経路のすべての凝固因子を評価する。
野生型マウスとヒト化Ｆ１２マウスとの間でａＰＴＴ凝固時間に顕著な差は観察されなかった。図６を参照されたい。同様に、ＰＴ値は野生型マウスとヒト化Ｆ１２マウスとの間で顕著な差がなく、それぞれ９～１１秒の値を有した（データ示さず）。
凝固アッセイ：ＰＴ－プロトロンビン時間
このアッセイは、潜在的な出血の問題を検出するための術前スクリーニングとして使用される。それは、外因性凝固系（第ＩＩ因子、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、および第Ｘ因子）の欠陥について高感度である（正常なヒト血漿ＰＴは約１０～１３秒である）。使用する機器は、Ｓｔａｒｔ４止血アナライザー（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｓｔａｇｏ）である。使用する試薬はＴｒｉｎｉＣＬＯＴ ＰＴ Ｅｘｃｅｌ ６ｍＬ（Ｓｔａｇｏ Ｔ１１０６）である。例示的な手順は以下の通りである。
１．アナライザーの電源を入れる。マシンは自動的に「セルフチェック」を実行し、ウォームアップする。アッセイは３７℃でのみ実施される。
２．「テストモード」の場合はキーボードの「１」キーを押し、Ｅｎｔｅｒキーで確認し、ＰＴテストの場合は「１」キーを押してからＥｎｔｅｒキーで確認する。
３．患者ＩＤ番号またはサンプル番号を入力して、作業画面に表示する。
４．３７℃で予熱するために、キュベットストリップをインキュベーションエリアに置く。
５．キュベットストリップの各キュベットにボールを分配する。
６．各キュベットに５０μＬの血漿サンプル（対照、患者、または薬物治療サンプル）を分注する（気泡を発生させてはならない）。
７．任意選択で、血漿中に５μＬの２倍の連続希釈した阻害剤を添加し（薬物用量反応をテストする場合のみ）、混合物を３７℃で５分間インキュベートする。
８．インキュベーションカラムに対応するタイマーを開始し（タイマーキーを押す）、１８０秒間インキュベーションする。機器がビープ音を鳴らしたら、キュベットストリップをテストカラムにすばやく移す。
９．Ｆｉｎｎｐｉｐｅｔｔｅを開始試薬（３７℃で予熱したＰＴ試薬）で開始する。
１０．テストカラムで、ピペットコントロールキーを押してＦｉｎｎｐｉｐｅｔｔｅを活性化し（ボールがキュベット内で前後に動き始める）、予熱した１００μＬのＰＴ試薬を各キュベットに分注する。
１１．血餅が形成されると、ボールの動きが止まり、凝固時間が記録される（同じキュベットストリップで４回すべての凝固時間が行われた後、結果が印刷される）。
修正ａＰＴＴ：活性化部分トロンボプラスチン時間
このアッセイは、内因性凝固系の異常を検出するために使用され、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子、および第ＸＩＩ因子の欠乏に高感度である（正常なヒト血漿で２８～３４秒のａＰＴＴ）。使用する機器は、Ｓｔａｒｔ４止血アナライザー（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｓｔａｇｏ、Ｍａｎｕａｌ Ｒｅｆ ０９３１０７９Ａ）である。使用する試薬は次のとおりである。ＡＰＴＴ－ＸＬエラグ酸ＡＣＴＣＶ ４ｍＬ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号９５０５９－８０４）、ＣａＣｌ２ ０．０２Ｍ １０ｍＬ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号９５０５９－８０８）、またはＴｒｉｎｉＣＬＯＴ ａＰＴＴ Ｓ １０ｍＬ（Ｓｔａｇｏ Ｔ１２０１）。例示的な手順は以下の通りである。
１．アナライザーの電源を入れる。マシンは自動的に「セルフチェック」を実行し、ウォームアップする。アッセイは３７℃でのみ実施される。
２．「テストモード」の場合はキーボードの「１」キーを押し、Ｅｎｔｅｒキーで確認し、ＡＰＴＴテストの場合は「２」キーを押してからＥｎｔｅｒキーで確認する。
３．患者ＩＤ番号またはサンプル番号を入力して、作業画面に表示する。
４．３７℃で予熱するために、キュベットストリップをインキュベーションエリアに置く。
５．キュベットストリップの各キュベットにボールを分配する。各キュベットストリップには４つのキュベットが接続されている。
６．各キュベットに５０μＬの血漿サンプル（対照、患者、または薬物治療サンプル）を分注し（血漿はゆっくりとピペッティングする。気泡を発生させてはならない）、３７℃で１時間加熱する。
７．任意選択で、血漿中に５μＬの２倍の連続希釈した阻害剤を添加し（薬物用量反応をテストする場合のみ）、混合物を３７℃で５分間インキュベートする。
８．各キュベットに５０μＬのトリガー（すなわち、エラグ酸またはカオリン）を追加する。
９．インキュベーションカラムに対応するタイマーを開始し（タイマーキーを押す）、３００秒間インキュベーションし、次いでキュベットストリップをテストカラムにすばやく移す。
１０．Ｆｉｎｎｐｉｐｅｔｔｅを開始試薬（３７℃で予熱した０．０２ＭのＣａＣｌ２）で開始する。
１１．テストカラムで、ピペットコントロールキーを押してＦｉｎｎｐｉｐｅｔｔｅを活性化し（ボールがキュベット内で前後に動き始める）、予熱した５０μＬのＣａＣｌ２を各キュベットに分注する。
１２．血餅が形成されると、ボールの動きが止まり、凝固時間が記録される。４つのキュベットの凝固時間がすべて記録された後、結果は自動的に印刷される。
実施例３．ヒトとマウスのＦ１２ゲノム配列の違いは、ヒト化Ｆ１２マウスで再現される表現型であるヒトの短いアイソフォームの発現を駆動できる
凝固因子ＸＩＩ（ＦＸＩＩ）は肝臓の肝細胞によって合成され、循環系に分泌され、そこで接触活性化システムを開始する。通常、循環に限定されると考えられているが、ＦＸＩＩタンパク質はアルツハイマー病および多発性硬化症の患者の脳で見出されており、接触系の活性化はヒトの脳および脳脊髄液で観察されている。しかしながら、脳内のＦＸＩＩタンパク質の供給源は解明されておらず、脳内でのその潜在的な役割は不明である。インサイチュハイブリダイゼーションおよびＲＮＡｓｅｑを使用して、短いＦＸＩＩアイソフォームが、ヒトおよびＦＸＩＩヒト化マウスの脳のニューロンで発現し、錐体ニューロンで最も高い発現が観察されることを示す。この短いＦ１２ｍ ＲＮＡ転写産物には、プロリンリッチ触媒ドメインにまたがるＦＸＩＩの部分をコードするオープンリーディングフレームが含まれている。この短いＦＸＩＩタンパク質の組換えバージョンは、血漿カリクレインによって活性化され、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）を活性ＨＧＦに変換する。ＨＧＦ－Ｍｅｔシグナル伝達はニューロンの発生および生存に役割を果たしており、その調節不全は神経発達障害および神経変性に関係している。ここで初めて、Ｆ１２ ｍＲＮＡの短いアイソフォームが脳内で局所的に生成されることを示し、脳由来ＦＸＩＩがニューロンのＨＧＦ－Ｍｅｔシグナル伝達に関与している可能性を高める。
凝固因子ＸＩＩ（ＦＸＩＩ）は、接触活性化システムを開始する循環セリンプロテアーゼである。負に帯電した表面または血漿カリクレインによるＦＸＩＩの活性化は、活性化されたＦＸＩＩ（ＦＸＩＩａ）を生成する。ＦＸＩＩａは、内因性の凝固カスケードを開始し、トロンビンの生成および血餅の形成をもたらす。ＦＸＩＩａはまた、血漿プレカリクレインをカリクレインに変換し、カリクレイン－キニン経路を活性化して、血管作用性および炎症性ペプチドであるブラジキニンを放出する。これらのよく研究された機能に加えて、ＦＸＩＩａはインビトロで肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）および補体系を活性化することも示されている。例えば、すべての目的のためにそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｓｈｉｍｏｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２９：２５７－２６１、Ｐｅｅｋ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：４７８０４－４７８０９、およびＧｈｅｂｒｅｈｉｗｅｔ ｅｔ ａｌ．（１９８１）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５３：６６５－６７６を参照されたい。ＦＸＩＩは一本鎖チモーゲンとして循環し、活性化中にＲ３５３で切断されると、酵素的に活性な２本鎖分子（αＦＸＩＩａ）になる。αＦＸＩＩａはさらに処理されてβＦＸＩＩａになる。これは、触媒ドメインを含む軽鎖、および重鎖のごく一部のみで構成されている。
ＦＸＩＩは肝臓の肝細胞によって合成され、循環系に分泌される。典型的には、循環に制限されていると考えられているが、ＦＸＩＩタンパク質は、アルツハイマー病（ＡＤ）患者の脳および多発性硬化症（ＭＳ）患者の脳病変でＡβプラークと共局在していることが判明している。例えば、すべての目的のためにそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｙａｓｕｈａｒａ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．６５４：２３４－２４０およびＧｏｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．７：１１６２６を参照されたい。血液脳関門（ＢＢＢ）は典型的には、循環するタンパク質の脳実質への移動を妨げるため、ＦＸＩＩは健康なヒトの脳に入らないはずである。したがって、ＡＤおよびＭＳ患者の脳で観察されるＦＸＩＩは、機能不全のＢＢＢを介した循環から来ているか、局所的に合成されている可能性がある。以前に脳で発見されたＦＸＩＩタンパク質の供給源が末梢であるか局所であるかは、十分に特徴付けられていない。例えば、すべての目的のためにそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｙａｓｕｈａｒａ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．６５４：２３４－２４０およびＧｏｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．７：１１６２６を参照されたい。
脳内のＦＸＩＩは、ヒトの脳および脳脊髄液で観察されている接触系の局所的な活性化を引き起こす可能性がある。例えば、すべての目的のためにそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ａｓｈｂｙ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ａｇｉｎｇ ３３：１３４５－１３５５およびＢｅｒｇａｍａｓｃｈｉｎｉ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｍｅｃｈ．Ａｇｅｉｎｇ Ｄｅｖ．１２２：１９７１－１９８３を参照されたい。脳ＦＸＩＩは、受容体Ｍｅｔを介してニューロンの発生および生存に役割を果たすＨＧＦ、またはシナプスの完全性および可塑性を媒介する補体系を活性化することもできる。例えば、すべての目的のためにそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｋａｔｏ（２０１７）Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｐ．７：４９５－５０３、Ｗｒｉｇｈｔ ａｎｄ Ｈａｒｄｉｎｇ（２０１５）Ｊ．Ａｌｚｈｅｉｍｅｒｓ Ｄｉｓ．４５：９８５－１０００、およびＨａｍｍｏｎｄ ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．３４：５２３－５４４を参照されたい。末梢からのＦＸＩＩの漏出は病理学的に発生する可能性があるが、脳内の局所的なＦ１２ ｍＲＮＡ合成は、脳内のこれらのシステムの生理学的活性化のメカニズムである可能性がある。ここでは、βＦＸＩＩａ様タンパク質をコードする可能性のある新規Ｆ１２ ｍＲＮＡ転写産物が、ヒトの脳のニューロンによって発現されることを示す。この推定脳ＦＸＩＩタンパク質は、血漿カリクレインによって活性化され、プロＨＧＦを活性ＨＧＦに変換することができる。
発表された研究は、脳におけるＦ１２の発現に関して相反する結果を示している。エクソン７～９にまたがるＰＣＲプライマーを使用した１つの研究では、脳のＦ１２ ｍＲＮＡが検出された（Ｙａｓｕｈａｒａ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．６５４：２３４－２４０、すべての目的で参照により本明細書に完全に組み込まれる）が、エクソン３～５内の別のプライマーを使用すると実質的にＦ１２シグナルを示さなかった（Ｎｅｔｈ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．８５：１０４３－１０４７、すべての目的で参照により本明細書に完全に組み込まれる）。これら２つの研究間の不一致が、検出用に選択されたエクソンによるものかどうかを調査するために、Ｆ１２内の７つの領域（エクソン１～２、エクソン３～４、エクソン５～６、エクソン７、エクソン９、エクソン１１、およびエクソン１４；図７Ａおよび表６）に対してｑＰＣＲプローブを設計した。すべてのプローブがヒト肝臓でＦ１２を検出したのに対し、エクソン７、９、１１、および１４に対するプローブのみがヒト脳でＦ１２を検出したことが判明した（図７Ｂ）。
Figure 2022528414000009
我々の結果は、遺伝子型－組織発現（ＧＴＥｘ）プロジェクト（Ｇ．Ｔ．Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ，Ｔｈｅ Ｇｅｎｏｔｙｐｅ－Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（ＧＴＥｘ）ｐｒｏｊｅｃｔ，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，４５（２０１３）５８０－５８５、参照により本明細書に組み込まれる）を通じて利用可能なＲＮＡｓｅｑデータによって裏付けられている。データは、肝臓でのＦ１２ ｍＲＮＡの発現が高く、他の組織では発現がはるかに低いことを示している。肝臓の外側では、最高レベルのＦ１２発現のいくつかが脳領域に見られる（図１０Ａ）。予想通り、ヒト肝臓におけるＦ１２ ｍＲＮＡ読み取りのエクソンごとの分析は、１４個のエクソンすべてをカバーしていることを示している。しかしながら、ヒトの皮質および海馬でのＦ１２ ｍＲＮＡの読み取りは、エクソン７とエクソン１４との間でのみカバーされる（図７Ｃ）。
次に、ＲＮＡインサイチュハイブリダイゼーションを使用して、ヒト海馬におけるＦ１２ｍ ＲＮＡの分布を調査した。この目的のために、Ｆ１２に対する２つのＲＮＡｓｃｏｐｅプローブが設計された。１つはエクソン１～６に対して、およびもう１つはエクソン１１～１４に対してである。ｑＰＣＲの結果および公開されているＧＴＥｘデータと一致して、Ｆ１２ ｍＲＮＡは、ヒト海馬でエクソン１１～１４に対するプローブによってのみ検出された（データ示さず）。Ｆ１２ ｍＲＮＡシグナルが最も豊富な領域は海馬錐体層であり、歯状回の顆粒細胞にいくらかのシグナルが見られた（データ示さず）。ヘマトキシリン染色された細胞核の外側のＲＮＡｓｃｏｐｅシグナルは、プローブがプレｍＲＮＡではなく成熟ｍＲＮＡを検出していることを示唆している。ＲＮＡｓｃｏｐｅ分析に適した一貫して高いＲＮＡ品質を備えたヒト脳組織を取得することは困難であるため、脳内のＦ１２発現をさらに研究するためにマウス組織に目を向けた。
マウス脳におけるＦ１２ｍ ＲＮＡの分布を調査するために、第ＸＩＩ因子タンパク質を産生しないＦ１２ノックアウトマウス（ＦＸＩＩ－／－）を対照として使用して、野生型マウス（ＦＸＩＩ＋／＋）でＲＮＡｓｃｏｐｅ分析を行った。予想通り、エクソン１～６およびエクソン１１～１４の両方のプローブが、野生型マウスの肝臓でＦ１２を検出した（データ示さず）。ヒトの脳と同様に、エクソン１１～１４に対するプローブのみが野生型マウスの脳でＦ１２ ｍＲＮＡを検出したが（データ示さず）、ＦＸＩＩ－／－マウスの脳または肝臓ではシグナルが検出されず、プローブのＦ１２に対する特異性が確認された。マウスの脳におけるＦ１２エクソン１１～１４プローブからのシグナルの量は、ヒトの脳で観察されたものよりも少ないようであり、マウスとヒトの組織における肝外Ｆ１２ ｍＲＮＡ発現レベルを比較するよう促した。脳を含むいくつかの組織が検出可能なＦ１２ｍ ＲＮＡレベルを有するヒトにおけるＦ１２の顕著な肝外発現と比較して（図１０Ａ）、マウスにおけるＦ１２の発現は肝臓の外側では検出されなかった（図１０Ｂ）。これらのデータは、ヒトの脳と比較して野生型マウスの脳でＲＮＡｓｃｏｐｅによって検出されたＦ１２ ｍＲＮＡレベルを裏付け、ＲＮＡｓｃｏｐｅによってマウスの脳で検出されたＦ１２ ｍＲＮＡレベルは、ＲＮＡｓｅｑによってバルク組織で検出するには不十分であることを示唆している。
ヒトとマウスの脳における短いＦ１２ ｍＲＮＡの差次的発現が、ヒトＦ１２遺伝子内の特定の要素によるものなのか、より一般的な種間差によるものなのかを調べるために、次に、ヒト第ＸＩＩ因子のみを産生するＦ１２ヒト化マウス（ＦＸＩＩｈｕｍ／ｈｕｍ）を分析した。完全長のヒトＦ１２ ｍＲＮＡは、ＦＸＩＩｈｕｍ／ｈｕｍマウス肝臓で両方のプローブによって検出されたが（データ示さず）、ヒトＦ１２エクソン１１～１４に対するプローブのみがＦＸＩＩｈｕｍ／ｈｕｍ脳でシグナルを生成した。野生型マウスと比較して、ＦＸＩＩｈｕｍ／ｈｕｍマウスの脳ははるかに高いシグナルを示し、ヒトＦ１２は、マウスＦ１２と比較して脳での発現に有利な明確な調節機能を持っている可能性があることを示唆している。ヒトの脳で観察されたパターンと同様にＦＸＩＩｈｕｍ／ｈｕｍマウスの脳でのＦ１２の発現は、海馬錐体層および皮質ニューロンで強いシグナルを伴って、ほとんどニューロンであるように見えた（データ示さず）。大部分がグリアで構成されている脳梁、および側脳室を裏打ちする上衣細胞では、シグナルはほとんどまたはまったく観察されなかった（データ示さず）。
Ｆ１２の潜在的なニューロン発現をさらに調査するために、ＦＸＩＩｈｕｍ／ｈｕｍマウス脳の連続切片でＦ１２エクソン１１～１４に対するプローブとニューロンマーカーＮｅｕＮを使用して、ＲＮＡｓｃｏｐｅテクノロジーと免疫蛍光抗体法を組み合わせた。連続した脳切片でＮｅｕＮ免疫蛍光抗体法およびＦ１２のＲＮＡｓｃｏｐｅシグナルの分布に重複が見られ（データ示さず）、Ｆ１２が主にニューロンで発現していることが示唆された。Ｆ１２の最も強い発現は、海馬のＣＡ２／ＣＡ３領域の錐体ニューロンで検出された（データ示さず）。
Ｆ１２の発現は主にニューロンであると思われるため、次にＦ１２ ｍＲＮＡが初代ニューロンおよびニューロン細胞株でＲＮＡｓｅｑによって検出できるかどうかを調べた。実際、Ｆ１２ ｍＲＮＡはｉＰＳ由来のヒトニューロン（５．８２［１．６５－７．３８］ＦＰＫＭ）で発現していたが、マウスの初代皮質ニューロンでは検出できなかった（データ示さず）。ヒトの脳組織と同様に、エクソンごとのｍＲＮＡ読み取り分析はヒトｉＰＳニューロンがＦ１２ ｍＲＮＡの短いアイソフォームを発現することを示した（データ示さず）。ヒトとマウスとの間の脳のＦ１２ ｍＲＮＡ発現のこの興味深い違いは、種間のＦ１２遺伝子の違いを調べるように促した。
私たちの結果は、ヒトＦ１２ゲノム配列がニューロンの短いアイソフォームの発現を駆動する異なる内部調節エレメントを持っている可能性を高めている。実際、ＵＣＳＣブラウザー（Ｋｅｎｔ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．１２：９９６－１００６、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる）を介して入手可能なデータは、複数の調節エレメントがヒトおよびマウスの両方のＦ１２遺伝子でエクソン７～１０にまたがる領域に位置することを示し、ヒトＦ１２のユニークな特徴は、エクソン８～１２にまたがる大きなＣｐＧアイランドである。ＣｐＧアイランドは、転写開始部位に関連することが多いゲノムの領域であり、ＧおよびＣ塩基組成の上昇ならびにＣｐＧジヌクレオチド頻度の上昇を特徴としている。多くの場合、既知の転写産物に関連しない部位にＣｐＧアイランドが存在すると、新規転写産物が発見された（Ｄｅａｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．２５：１０１０－１０２２、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる）。したがって、ヒトに大きなＣｐＧアイランドが存在し、マウスのＦ１２配列に存在しないことが、ヒトの脳における転写の増加の根底にある可能性がある。
次に、翻訳される推定タンパク質を予測するために、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の存在についてヒトの脳で検出されたＦ１２ ｍＲＮＡ配列を調べた。ヒトニューロンのＦ１２配列に、全長Ｆ１２とフレーム内の開始コドンおよび終止コドンの存在によって定義される３つのＯＲＦが見つかった（図８Ｂ）。これらの３つのＯＲＦのうち、ＯＲＦ２および３のみがマウスで保存されており、ＯＲＦ１領域でのアミノ酸配列アラインメントは不十分であった。興味深いことに、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）（Ｂｅｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．４１：Ｄ３６－４２、本明細書にすべての目的のためにその全体が参考として援用される）は、エクソン９で開始する５つの短いヒトＦ１２のｍＲＮＡを列挙し、これはＯＲＦ１に対応し、エクソン１０で開始するヒトＦ１２のｍＲＮＡ（ＯＲＦ２に対応）は同定されなかった。エクソン９または１０で開始するマウスＦ１２ ｍＲＮＡは記載されていない（図８Ａ）。ヒトのエクソン９に見られるＡＴＧは、マウスでは保存されていない。まとめると、これらのデータは、エクソン９で開始するヒトのＯＲＦ１をコードする短いＦ１２アイソフォームのより高い転写を裏付け、ヒトおよびマウスのＦ１２遺伝子の配列ならびに調節エレメントの違いを特定し、これはマウスの脳での短いＦ１２の低い発現を説明することを助け得る。
ここでは、ｑＰＣＲ、ＲＮＡｓｃｏｐｅ、およびＲＮＡｓｅｑを使用して、Ｆ１２ｍ ＲＮＡがヒトおよびＦＸＩＩｈｕｍ／ｈｕｍマウスの脳のニューロンで発現していることを示す。ＲＮＡｓｃｏｐｅを使用して、脳内で短いＦ１２ ｍＲＮＡを発現する初代細胞型としてニューロンを特定し、ＲＮＡｓｅｑによってｉＰＳ由来のグルタミン酸作動性ニューロンでの発現を確認した。興味深いことに、ＲＮＡｓｃｏｐｅによると、野生型マウスの脳と比較して、ＦＸＩＩｈｕｍ／ｈｕｍマウスおよびヒトの脳ではるかに高いレベルのＦ１２ ｍＲＮＡが観察された。この種間の違いは、ヒトの脳と比較してマウスの脳でのＦ１２の発現がごくわずかであることを示すＲＮＡｓｅｑデータによってさらに裏付けられた。ヒトおよびマウスのＦ１２遺伝子の調節エレメントの分析により、エクソン９で開始するヒトＦ１２転写産物の発現は、ヒトに見られるがマウスに見られない、エクソン８～１２にまたがる大きなＣｐＧアイランドが原因である可能性が示唆された。
短い脳ＦＸＩＩアイソフォームの可能な機能的役割を決定するために、脳のＦ１２転写産物で予測される３つのＯＲＦを評価した（図８Ｂ）。ＯＲＦ１の翻訳により、ＦＸＩＩのプロリンに富む触媒ドメインを含むタンパク質（Ｍ２９７－Ｓ５９６；配列番号７４（タンパク質）および７５（ＤＮＡ））が得られる。ＯＲＦ２の翻訳により、触媒ドメインおよび重鎖からの３つの追加残基を含むタンパク質（Ｍ３５１－Ｓ５９６；配列番号７６（タンパク質）および７７（ＤＮＡ））が得られる。ＯＲＦ３は、触媒三残基を含まない触媒ドメインの一部を含むタンパク質（Ｍ５２７－Ｓ５９６；配列番号７８（タンパク質）および７９（ＤＮＡ））を生成する。ＯＲＦ２に起因するタンパク質は、対になっていないシステイン（Ｃ４６７）を持ち、不安定性をもたらす可能性があり、ＯＲＦ３に起因するタンパク質には無傷の触媒ドメインがないため、ＯＲＦ１（ＦＸＩＩ２９７－５９６）から生成されるタンパク質に焦点を当てることにした。この選択はさらに、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）でのＯＲＦ２および３ではなく、ＯＲＦ１で開始するＦ１２転写産物の存在によって支持された（図８Ａ）。
推定ニューロンＦＸＩＩアイソフォーム（ＦＸＩＩ２９７－５９６）が全長ＦＸＩＩによって引き起こされる経路を活性化できるかどうかを評価した。血漿カリクレインによるＲ３５３での切断は、完全長ＦＸＩＩの活性化に必要であり、重鎖および軽鎖の分離をもたらす。本発明者らは、重鎖の大部分を欠く組換えヒトＦＸＩＩ２９７－５９６が、酵素活性のために血漿カリクレインによる切断を必要とするかどうかを試験した。図８Ｂに示すように、カリクレインの非存在下でＦＸＩＩａ基質Ｓ－２３０２とインキュベートした場合、ＦＸＩＩ２９７－５９６は、酵素活性はまったく観察されなかったが、カリクレイン（図９Ａ）とのプレインキュベーション後に、ＦＸＩＩ２９７－５９６は、酵素活性を獲得した。発色基質を添加する前に、すべての反応をカリクレイン阻害剤アプロチニンで処理して、酵素活性がカリクレインを介した基質の切断の結果ではないことを確認した。これらの結果は、全長ＦＸＩＩと同様に、推定される脳のＦＸＩＩアイソフォームは、カリクレインによる切断後に活性化されることを示唆した。次に、活性化されたＦＸＩＩ２９７－５９６は、プレカリクレインをカリクレインに相互に活性化することができる。非活性化ＦＸＩＩ２９７－５９６ではプレカリクレインの切断は観察されなかったが、カリクレイン重鎖の生成を通して見られるように、活性化ＦＸＩＩ２９７－５９６はプレカリクレインをカリクレインに変換した（図１１）。したがって、ＦＸＩＩ２９７－５９６はカリクレイン－キニン経路を開始することができ、ＦＸＩＩ２９７－５９６の活性化がブラジキニンの生成をもたらす可能性があることを示す。
最近、重鎖の一部を放出するそのプロリンリッチドメイン内でのＦＸＩＩの切断が、Ｒ３５３でのカリクレインによる活性化に対するＦＸＩＩの感受性を増加させることが示された。例えば、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、ｄｅ Ｍａａｔ ｅｔ ａｌ．（２０１９）Ｊ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．１７：１８３－１９４を参照されたい。重鎖Ｎ末端からプロリンリッチドメインが欠落しているＦＸＩＩ２９７－５９６は本質的に事前に切断されており、したがって全長ＦＸＩＩを活性化しないカリクレインのレベルによる活性化の影響を受けやすい可能性があると仮定した。この研究で使用された組換えＦＸＩＩ２９７－５９６はＥ．ｃｏｌｉで生産され、グリコシル化が欠如していたため、活性化に対する感受性をヒト血漿から精製された全長ＦＸＩＩの感受性と直接比較することはできなかった。したがって、我々は、全長のＦＸＩＩからＦＸＩＩ２９７－５９６に類似したタンパク質を酵素的に生成しようとした。Ｐｒｏｓｐｅｒソフトウェア（Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１２）ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ７：ｅ５０３００、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる）を使用したＦＸＩＩアミノ酸配列の推定切断部位の分析は、Ｌ２９６とＭ２９７との間のカテプシンＫ切断部位を明らかにした。これは、脳で発現する可能性のあるアイソフォーム（ＦＸＩＩ２９７－５９６）と同一の短縮型ＦＸＩＩタンパク質を生成する。
図９Ｂに示すように、全長ＦＸＩＩをカテプシンＫとインキュベートすると、Ｌ２９６とＭ２９７との間の切断を裏付けるサイズの安定したＦＸＩＩ断片が生成され、グリコシル化により約４０ｋＤａで泳動すると予想される約３５ｋＤａの２つの断片が生成される。次に、全長ＦＸＩＩおよびカテプシンＫ切断によって生成された短縮型ＦＸＩＩの酵素活性を比較した。予想通り、全長ＦＸＩＩおよびカテプシンＫ切断ＦＸＩＩは、それ自体ではごくわずかな活性しかなかったが、血漿カリクレインとインキュベートした場合、カテプシンＫ切断ＦＸＩＩは全長ＦＸＩＩと比較して劇的に活性が増加した（図９Ｂ）。我々の結果は、カテプシンＫがカリクレインと相乗的に作用してＦＸＩＩを活性化することを示した最近の研究と一致しており（ｄｅ Ｍａａｔ ｅｔ ａｌ．（２０１９）Ｊ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．１７：１８３－１９４、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる）、カテプシン－Ｋ切断ＦＸＩＩに類似している推定脳ＦＸＩＩ２９７－５９６アイソフォームが、血漿カリクレイン、およびおそらく他のプロテアーゼによる活性化に対する感受性を増加させた可能性があることを示唆する。
プレカリクレインおよび内因性凝固経路を活性化することに加えて、ＦＸＩＩａはプロＨＧＦを活性ＨＧＦに変換することが示されている。例えば、すべての目的のためにそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｓｈｉｍｏｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２９：２５７－２６１およびＰｅｅｋ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：４７８０４－４７８０９を参照されたい。肝細胞増殖因子活性化因子（ＨＧＦＡ）およびβＦＸＩＩａがプロＨＧＦを切断する能力を確認した（図９Ｃ）。さらに、カリクレイン活性化ＦＸＩＩ２９７－５９６がプロＨＧＦを切断して活性な２鎖型とすることを発見し（図９Ｄ）、脳ＦＸＩＩが局所ＨＧＦ活性化に寄与する可能性があることを示唆している。トロンビンおよび組織プラスミノーゲン活性化因子などの脳に見られる他のセリンプロテアーゼはプロＨＧＦをＨＧＦに変換しなかったため、プロＨＧＦを活性化するこの能力は特異的である（図９Ｃおよび９Ｄ）。
蓄積された証拠は、凝固および接触系タンパク質の発現が、特に病理学的条件下で、肝臓の外側で起こることを示唆している。例えば、すべての目的のためにそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ａｓｈｂｙ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ａｇｉｎｇ ３３：１３４５－１３５５、Ｙｉｎ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１７６：１６００－１６０６、およびＴａｋａｎｏ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．９７８：７２－８２を参照されたい。肝外ＦＸＩＩ発現の役割も浮上している。最近の研究では、ＦＸＩＩが肺線維芽細胞で発現していること（Ｊａｂｌｏｎｓｋａ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８５：１１６３８－１１６５１、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる）、ならびにその好中球発現ＦＸＩＩは好中球の活性化および炎症部位への移動に寄与することが示されている（Ｓｔａｖｒｏｕ ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１２８：９４４－９５９、すべての目的で参照により本明細書に完全に組み込まれる）。ここでは、ｑＰＣＲ、ＲＮＡｓｃｏｐｅ、およびＲＮＡｓｅｑを使用して、Ｆ１２ｍ ＲＮＡがヒトおよびＦＸＩＩｈｕｍ／ｈｕｍマウスの脳のニューロンで発現していることを初めて示す。以前の研究は、ヒトの脳におけるＦ１２の発現に関して相反する結果を生み出した。エクソン７～９にまたがるプライマーを使用して、１つグループは、Ｆ１２ ｍＲＮＡを検出した（Ｙａｓｕｈａｒａ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．６５４：２３４－２４０、すべての目的で参照により本明細書に完全に組み込まれる）が、エクソン３～５内のプライマーおよびプローブを使用して実施されたｑＰＣＲは、実質的にＦ１２シグナルを示さなかった（Ｎｅｔｈ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．８５：１０４３－１０４７、すべての目的で参照により本明細書に完全に組み込まれる）。これらの研究は異なる方法を使用したため、直接比較することはできない。しかしながら、Ｙａｓｕｈａｒａ ｅｔ ａｌ．はＦ１２ ｍＲＮＡは脳にあると結論付けたが、Ｎｅｔｈｅｔ ａｌ．はＦ１２ｍ ＲＮＡは肝臓にのみ見られると結論付けた。エクソン７～１４に対応するＦ１２ ｍＲＮＡが脳に見られ、エクソン１～６では見られないことが判明したため（図７Ｃ）、我々の結果はこの不一致を解決するのに役立ち、これにより、両方のレポートが裏付けられる。
ＲＮＡｓｃｏｐｅを使用して、脳内で短いＦ１２ ｍＲＮＡを発現する初代細胞型としてニューロンを特定し、ＲＮＡｓｅｑによってｉＰＳ由来のグルタミン酸作動性ニューロンでの発現を確認した。興味深いことに、ＲＮＡｓｃｏｐｅによると、ＷＴマウスの脳と比較して、ＦＸＩＩｈｕｍ／ｈｕｍマウスおよびヒトの脳ではるかに高いレベルのＦ１２ ｍＲＮＡが観察された。この種間の違いは、ヒトの脳と比較してマウスの脳でのＦ１２の発現がごくわずかであることを示すＲＮＡｓｅｑデータによってさらに裏付けられた。ヒトおよびマウスのＦ１２遺伝子の調節エレメントの分析により、エクソン９で開始するヒトＦ１２転写産物の発現は、ヒトに見られるがマウスＦ１２に見られない、エクソン８～１２にまたがる大きなＣｐＧアイランドが原因である可能性が示唆された。ヒトとマウスのニューロンとの間のこの相違の機能的重要性は不明である。
最近の研究は、ＦＸＩＩ２９７－５９６にまたがる潜在的な脳ＦＸＩＩタンパク質の機能的意味を示唆している。ＦＸＩＩの活性化は、ＦＸＩＩがエラスターゼまたはカテプシンＫなどの他の酵素によって最初に処理されるときに、閾値以下のレベルの血漿カリクレインによって達成できる。例えば、すべての目的のためにそのすべてが参照により本明細書に組み込まれる、ｄｅ Ｍａａｔ ｅｔ ａｌ．（２０１９）Ｊ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．１７：１８３－１９４を参照されたい。ＦＸＩＩ重鎖の切断は、ＦＸＩＩ活性化切断部位（Ｒ３５３－Ｖ３５４）を明らかにし、溶液中でのより効率的な活性化を可能にすると考えられている。例えば、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、ｄｅ Ｍａａｔ ｅｔ ａｌ．（２０１９）Ｊ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．１７：１８３－１９４を参照されたい。インシリコ分析に基づいて、推定ニューロンＦＸＩＩ２９７－５９６は、カテプシンＫによる全長ＦＸＩＩの切断によって生成できる。ＦＸＩＩ上の正確なカテプシンＫ切断部位はまだ示されていないが、カテプシンＫ切断ＦＸＩＩによる結果は、推定上のニューロンＦＸＩＩアイソフォームが低レベルのカリクレインによって活性化される可能性があることを示唆している。この点で、血漿プレカリクレインのｍＲＮＡおよびタンパク質は様々な脳領域で発見されており（Ａｓｈｂｙ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ａｇｉｎｇ ３３：１３４５－１３５５およびＮｅｔｈ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．８５：１０４３－１０４７、これらのそれぞれは、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる）、それは、この研究で使用されたものと同等である（Ｃｅｒｆ ａｎｄ Ｒａｉｄｏｏ（２０００）Ｍｅｔａｂ．Ｂｒａｉｎ Ｄｉｓ．１５：３１５－３２３、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる）。さらに、血漿プレカリクレインの発現は海馬ニューロンに局在しており（Ｃｅｒｆ ａｎｄ Ｒａｉｄｏｏ（２０００）Ｍｅｔａｂ．Ｂｒａｉｎ Ｄｉｓ．１５：３１５－３２３、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる）、我々が最高レベルの短いＦ１２ ｍＲＮＡを発見した細胞は、ニューロンＦＸＩＩの活性化がインビボで起こり得ることを示唆している。さらに、我々の結果は、ニューロンのＦＸＩＩアイソフォームが、おそらくニューロンまたは他の脳細胞によって産生され、全長のＦＸＩＩを活性化しない他のプロテアーゼによる活性化に対する感受性を高めた可能性を高めている。
プロＨＧＦのＨＧＦへの活性化は、Ｍｅｔ受容体を介したシグナル伝達に必要である。ニューロンにおけるＨＧＦ－Ｍｅｔシグナル伝達の役割は確立されているが（Ｋａｔｏ（２０１７）Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｐ．７：４９５－５０３およびＴｙｎｄａｌｌ ａｎｄ Ｗａｌｉｋｏｎｉｓ（２００６）Ｃｅｌｌ Ｃｙｃｌｅ ５：１５６０－１５６８、これらのそれぞれは、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる）、プロＨＧＦが脳内でどのように活性化されるかはよく特徴付けられていない。ＨＧＦＡは循環中の主要なＨＧＦ活性化因子である。例えば、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｉｔｏｈ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １２７：１４２３－１４３５を参照されたい。ＨＧＦＡノックアウトマウスには発生異常がないため（Ｉｔｏｈ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １２７：１４２３－１４３５、すべての目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、ＨＧＦノックアウトマウスは胚致死性であり（Ｕｅｈａｒａ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ ３７３：７０２－７０５、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる）、他のＨＧＦ活性化因子が、組織におけるＨＧＦ活性化に関与する可能性が高い。興味深いことに、ＦＸＩＩはＨＧＦＡのホモログであり（Ｐｏｎｃｚｅｋ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｊ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．６：１８７６－１８８３、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる）、インビトロでプロＨＧＦを活性ＨＧＦに変換することが示されている。例えば、すべての目的のためにそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｓｈｉｍｏｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２９：２５７－２６１およびＰｅｅｋ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：４７８０４－４７８０９を参照されたい。推定ニューロンＦＸＩＩは、脳内でプロＨＧＦからアクティブＨＧＦへの変換に関与し、ニューロンＨＧＦ－Ｍｅｔシグナル伝達に寄与する可能性があると仮定する。
ニューロンのＭｅｔシグナル伝達は、神経突起伸長、樹状突起の樹状突起形成、長期増強、および記憶を含む、様々な生理学的プロセスに関与している。例えば、すべての目的のためにそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｋａｔｏ（２０１７）Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｐ．７：４９５－５０３、Ｗｒｉｇｈｔ ａｎｄ Ｈａｒｄｉｎｇ（２０１５）Ｊ．Ａｌｚｈｅｉｍｅｒｓ Ｄｉｓ．４５：９８５－１０００、およびＴｙｎｄａｌｌ ａｎｄ Ｗａｌｉｋｏｎｉｓ（２００６）Ｃｅｌｌ Ｃｙｃｌｅ ５：１５６０－１５６８を参照されたい。海馬および新皮質錐体ニューロンにおけるＦ１２ｍ ＲＮＡの豊富な発現を観察し、推定ニューロンＦＸＩＩによるＨＧＦの活性化がこれらの細胞で発生する可能性を高めた。興味深いことに、背側パリウムから生じるニューロン（海馬および新皮質ニューロンを含む）のＭｅｔの削除は、自発的交代および活動低下の欠損をもたらし（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ａｎｄ Ｌｅｖｉｔｔ（２０１５）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｄｅｖ．Ｄｉｓｏｒｄ．７：３５、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる）、Ｆ１２ｍ ＲＮＡを発現することが見出された細胞におけるＨＧＦ－Ｍｅｔシグナル伝達の重要性を支持する。短いＦＸＩＩアイソフォームの機能に関するさらなる調査は、これらの細胞集団におけるその役割に光を当てる可能性がある。
インビトロおよび動物研究から得られたニューロンＨＧＦ－Ｍｅｔシグナル伝達の役割に関する洞察に加えて、蓄積された証拠は、ＨＧＦ－Ｍｅｔシグナル伝達の調節不全がヒトの神経発達障害および神経変性に寄与することを示唆している。すべての目的のためにそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｅａｇｌｅｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｂｉｏｌ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ ８１：４２４－４３３、Ｐｅｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．１１３：１３５－１６５、およびＷｒｉｇｈｔ ａｎｄ Ｈａｒｄｉｎｇ（２０１５）Ｊ．Ａｌｚｈｅｉｍｅｒｓ Ｄｉｓ．４５：９８５－１０００を参照されたい。特に、Ｍｅｔタンパク質の発現はＡＤ患者の海馬ニューロンで減少し（Ｈａｍａｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ ３４：２８４－２９０、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる）、ＨＧＦタンパク質レベルはＡＤ脳で増加する（Ｆｅｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．７７９：２６２－２７０、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる）。ニューロンのＦＸＩＩレベルがＡＤまたは他の病状で変化するかどうか、およびニューロンのＦＸＩＩが疾患プロセスで役割を果たすかどうかは未解決の問題である。将来の研究は、ニューロンのＦＸＩＩ発現の詳細、ならびに脳内のＨＧＦおよび接触経路の生理学的および病理学的活性化におけるニューロンＦＸＩＩアイソフォームの役割に光を当てるであろう。
材料および方法
ｑＰＣＲ。ヒト肝臓、ヒト全脳、海馬、側頭葉、および皮質からの全ＲＮＡは、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ ＵＳＡ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）から入手した。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＶＩＬＯ（商標）Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｂｙ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を使用して、ｍＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写した。ｃＤＮＡを０．５～５ｎｇ／μＬに希釈し、２．５～２５ｎｇのｃＤＮＡ入力をＳｅｎｓｉＦＡＳＴ Ｈｉ－ＲＯＸ ＭａｓｔｅｒＭｉｘ（Ｂｉｏｌｉｎｅ、Ｔａｕｎｔｏｎ，ＭＡ）で、ＡＢＩ ７９００ＨＴ配列検出システム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）によって増幅した。使用したヒトＦ１２およびＧＡＰＤＨに対するプライマーおよびプローブを表５に示す。データは、対照組織で見られる標的遺伝子発現の％として表される（２－（ΔΔＣｔ）＊１００）。
ヒトの脳組織。ＲＮＡｓｃｏｐｅ分析では、ヒトの脳組織の２つの供給源を使用した。ハーバード脳組織リソースセンター（Ｂｅｌｍｏｎｔ，ＭＡ）からの新鮮な凍結海馬脳組織を１０μｍでスライスし、ＶＷＲスーパーフロストスライドにマウントし、－８０℃で保存した。事前にマウントされた５μｍのホルマリン固定パラフィン包埋ヒト海馬切片は、Ａｂｃａｍ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）から入手した。
血漿採取。血漿採取のために、クエン酸ナトリウムでプライミングされた針を使用して大静脈から血液を採取した。血液を１５００×ｇ、室温で１０分間回転させ、血小板の少ない血漿を採取して－８０℃で保存した。組織収集のために、マウスを０．９％生理食塩水で経心的に灌流した。脳および肝臓を取り出し、最適切断温度コンパウンドのドライアイスで凍結し、－８０℃で保存した。１０μｍの切片をＳｕｐｅｒｆｒｏｓｔ ｐｌｕｓスライド（ＶＷＲ、Ｒａｄｎｏｒ，ＰＡ）にマウントし、－８０℃で保存した。
インサイチュＲＮＡハイブリダイゼーション。インサイチュＲＮＡハイブリダイゼーションは、ＲＮＡｓｃｏｐｅ ２．５ ＨＤシステムＲＥＤ（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｅｌｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｎｅｗａｒｋ，ＣＡ）を使用して、新鮮凍結またはホルマリン固定、パラフィン包埋組織に対して、製造元のプロトコルに従って実施された。プローブ（ＡＣＤｂｉｏカタログＮｏ．３１３９０１（ＰＰＩＢ（ヒト））、３１３９１１（ＰＰＩＢ（マウス））、３１００４３（ＤＡＰＢ）、４９３１９１（Ｆ１２エクソン１～６（ヒト））、４７３７８１（Ｆ１２エクソン１１～１４（ヒト））、４９３２０１（Ｆ１２エクソン１～６（マウス））、および４８３９７１（Ｆ１２エクソン１１～１４（マウス）））をシングルプレックス手動ＲＮＡｓｃｏｐｅアッセイで使用し、ＲＮＡｓｃｏｐｅプローブからの比色シグナルを、Ａｐｅｒｉｏスライドスキャナー（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ；Ｂｕｆｆａｌｏ Ｇｒｏｖｅ，ＩＬ）を使用して、４０倍対物レンズでキャプチャした。組織がＲＮＡ分析に適していることを確認するために、遍在的に発現する遺伝子（シクロフィリンＢ；ＰＰＩＢ）に対するプローブを陽性対照として使用し、細菌遺伝子（４－ヒドロキシ－テトラヒドロジピコリン酸レダクターゼ；ＤａｐＢ）に対するプローブを陰性対照として使用した。ＲＮＡｓｃｏｐｅプローブの特異性が高いため、マウスおよびヒトのＦ１２に特異的な個別のＲＮＡｓｃｏｐｅプローブが設計された。
免疫蛍光／ＲＮＡｓｃｏｐｅ。蛍光抗体法およびＲＮＡｓｃｏｐｅは、ＦＸＩＩｈｕｍ／ｈｕｍマウスの脳の連続切片で実施された。ＲＮＡｓｃｏｐｅは、組織をＤＡＰＩで対比染色し、Ｚｅｉｓｓ ＡｘｉｏＳｃａｎ Ｚ．１スライドスキャナー（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ；Ｔｈｏｒｎｗｏｏｄ，ＮＹ）で、ＲＮＡｓｃｏｐｅ ＲＥＤの場合は５９０／６１７、ＤＡＰＩの場合は３５８／４６１のＥｘ／Ｅｍで、２０倍の対物レンズを使用して画像を取得したことを除いて、Ｆ１２エクソン１１～１４に対するプローブを使用して上述のように実施した。ＲＮＡｓｃｏｐｅシグナルは、Ｈａｌｏソフトウェア（Ｉｎｄｉｃａ Ｌａｂｓ、Ｃｏｒｒａｌｅｓ，ＮＭ）を使用して白色に疑似着色された。免疫蛍光のために、組織をリン酸緩衝液中の４％パラホルムアルデヒド（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｈａｔｆｉｅｌｄ，ＰＡ）で後固定し、ＰＢＳ中の０．２５％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を含む、３％ロバ血清（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）でブロッキングした。次いで、スライドをブロッキングバッファーで１：５００に希釈したＮｅｕＮ抗体（Ａｂｃａｍ；カタログ番号Ａｂ１７７４８７）と４℃で一晩インキュベートし、次いで３％ロバ血清で希釈したＡｌｅｘａ－４８８コンジュゲート二次抗体（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）およびＤＡＰＩ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳで洗浄した後、Ａｑｕａ－Ｍｏｕｎｔ封入剤（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用してスライドをカバースリップした。画像は、ＡｘｉｏＳｃａｎ Ｚ．１スライドスキャナーでＡｌｅｘａ－４８８の場合は４９０／５２５、ＤＡＰＩの場合は３５８／４６１のＥｘ／Ｅｍで２０倍対物レンズを使用して取得された。
ＦＸＩＩａ活性アッセイ。血漿カリクレインによるＦＸＩＩ２９７－５９６の活性化を測定するために、組換えヒトＦＸＩＩ２９７－５９６（Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ、Ｒｏｓｅｍｏｎｔ，ＩＬ）を１５ｎＭ血漿カリクレイン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ、Ｎｏｖｉ，ＭＩ）と３７℃、１４０ｍＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４（ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水；ＨＢＳ）で１８時間インキュベートした。次に、カリクレイン活性を１００ＫＩＵ／ｍＬアプロチニン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を使用して阻害し、ＦＸＩＩａ活性を０．８ｍＭの濃度の発色基質Ｓ－２３０２（Ｈ－Ｄ－Ｐｒｏ－Ｐｈｅ－Ａｒｇ－ｐＮＡ－２ＨＣｌ；Ｄｉａｐｈａｒｍａ、Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ，ＯＨ）を使用して測定した。アッセイは、平底９６ウェルポリスチレンＭａｘｉＳｏｒｐプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）で３７℃で実施した。Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ ｉ３Ｘマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｄｏｗｎｉｎｇｔｏｗｎ，ＰＡ）を使用して、４０５ｎｍでの吸光度の変化として酵素活性を検出した。
カテプシンＫで切断されたＦＸＩＩは、ＦＸＩＩ（１．２５ ｕＭ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ）とカテプシンＫ（１００ｎＭ；Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）をＨＢＳ中でインキュベートすることによって生成された。非還元サンプルバッファーを添加し、１００℃で５分間加熱することにより、反応を停止した。ＦＸＩＩ断片はＳＤＳ－ＰＡＧＥで分離され、クマシーブルー染色で視覚化された。カテプシンＫで切断されたＦＸＩＩのタンパク質分解活性は、ＦＸＩＩ（３７５ｎＭ）をカテプシンＫ（３０ｎＭ）またはビヒクルと血漿カリクレイン（１５ｎＭ）とで１５分間インキュベートすることによって分析された。次いで、カリクレイン活性をアプロチニンで阻害し、ＦＸＩＩａ活性をＳ－２３０２発色基質で測定した。
血漿プレカリクレイン切断を分析するために、ＦＸＩＩ２９７－５９６（３００ｎＭ）を最初に血漿カリクレイン（１５ｎＭ）またはビヒクルと３７℃で１８時間インキュベートした。次いで、カリクレイン活性をアプロチニン（１００ＫＩＵ／ｍＬ；Ｓｉｇｍａ）を使用して不活化した。ヒト血漿（２００ｎＭ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ）から精製したプレカリクレインを、カリクレインまたはビヒクルで活性化したＦＸＩＩ２９７－５９６（２２５ｎＭ）またはＦＸＩＩ（２２５ｎＭ）と３７℃で２時間ＨＢＳでインキュベートした。還元サンプルバッファーを加えることにより反応を停止させた。ＳＤＳ－ＰＡＧＥを上記のように実施し、ブロットをヒトプレカリクレインに対する抗体（Ａｂｃａｍ；カタログ番号ａｂ１００６）で分析した。
ウエスタンブロット。ＦＸＩＩ－／－、ＦＸＩＩ＋／＋、およびＦＸＩＩｈｕｍ／ｈｕｍからの血漿を、ウエスタンブロットによって還元条件下で分析した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥは４～２０％Ｔｒｉｓ－Ｇｌｙｃｉｎｅゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して行い、ゲルを０．２μｍＰＶＤＦメンブレン（ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）に転写し、マウス第ＸＩＩ因子（ＣｌｏｕｄＣｌｏｎｅ Ｃｏｒｐ、Ｋａｔｙ，ＴＸ；カタログ番号ＰＡＡ６７７Ｍｕ０１）、ヒト第ＸＩＩ因子（Ａｂｃａｍ；カタログ番号Ａｂ１９６６７０）、およびアルブミン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｉｅｒｃｅ、Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ；カタログ番号ＰＡ１－２９３３５）に対する抗体で分析した。
ＨＧＦの活性化を分析するために、ＦＸＩＩ２９７－５９６（３００ｎＭ）を最初に血漿カリクレイン（１５ｎＭ）またはビヒクルと３７℃で１８時間インキュベートした。次いで、カリクレイン活性をアプロチニン（１００ＫＩＵ／ｍＬ；Ｓｉｇｍａ）を使用して不活化した。組換えヒトプロＨＧＦ（２５μｇ／ｍＬ；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を、カリクレインまたはビヒクル活性化ＦＸＩＩ２９７－５９６（２２５ｎＭ）、組換えヒト肝細胞増殖因子活性化因子（２２５ｎＭ；Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、Ｗａｙｎｅ，ＰＡ）、二本鎖組織プラスミノーゲン活性化因子（２２５ｎＭ；Ｏｘｆｏｒｄ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ Ｈｉｌｌｓ，ＭＩ）、またはβＦＸＩＩａ（５０ｎＭ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ）とともに、３７℃、ＨＢＳで５時間でインキュベートした。還元サンプルバッファーを加えることにより反応を停止させた。ＳＤＳ－ＰＡＧＥを上記のように実施し、ブロットをヒトＨＧＦに対する抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；カタログ番号ＡＦ－２９４－ＳＰ）で分析した。
細胞培養。ヒトｉＰＳグルタミン酸作動性ニューロン（ｉＣｅｌｌ（登録商標）Ｇｌｕｔａｎｅｕｒｏｎｓ；Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を製造元の使用説明書に従って培養し、ＲＮＡｓｅｑによって分化を検証した。細胞は、２つのよく知られたニューロンマーカーである微小管関連タンパク質２（ＭＡＰ２）および小胞グルタミン酸トランスポーターＶＧＬＵＴ２（ＳＣＬ１７Ａ６）の高発現、ならびにＧＦＡＰ（星状細胞マーカー）およびＮＥＳ（神経幹細胞と増殖内皮細胞のマーカー）の低発現を示した（データ示さず）。アメリカンタイプティッシュコレクション（ＡＴＣＣ；Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）のＳＨ－ＳＹ５Ｙヒト神経芽細胞腫細胞およびＮｅｕｒｏ－２ａマウス神経芽細胞腫細胞を、Ｌ－グルタミン酸、ペニシリン、ストレプトマイシン、および１０％ウシ胎仔血清（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を含むＥＭＥＭ（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｓａｎｔａ Ａｎａ，ＣＡ）で培養した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスの初代皮質ニューロン（Ｌｏｎｚａ）を、製造元の使用説明書に従って培養した。
ＲＮＡｓｅｑ。ＲＮＡ抽出および配列決定ライブラリー調製のプロトコルは、以前に記載されたものと同様であった（Ａｔａｎａｓｉｏ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．６：２３２０４、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる）。鎖特異的ＲＮＡ－ｓｅｑライブラリーは、ＫＡＰＡ鎖ｍＲＮＡ－Ｓｅｑキット（ＫＡＰＡ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して５００ｎｇ ＲＮＡから調製した。ライブラリーは１２サイクルのＰＣＲによって増幅された。配列決定は、イルミナＨｉＳｅｑ（登録商標）２０００（イルミナ）で、マルチプレックスシングルリードラン（ｉＰＳヒトニューロン、マウス初代ニューロン、およびマウス組織の場合）、またはペアリードラン（ＳＨ－ＳＹ５ＹおよびＮｅｕｒｏ－２Ａ細胞株の場合）によって実行された。結果のＦＡＳＴＱファイルは、十分なデータ品質を確保するためにＦａｓｔＱＣを介して分析された。読み取りは、２つのミスマッチが許容される商用ソフトウェアＡｒｒａｙＳｔｕｄｉｏ（ＯｍｉｃＳｏｆｔ）を使用して、ヒトゲノム（ｈｇ１９）またはマウスゲノム（ｍｍ１０）にマッピングされた。サンプルでは、８３％～９０％の読み取りが一意にマッピングされた。遺伝子発現は、ＯｍｉｃＳｏｆｔ ＡｒｒａｙＳｔｕｄｉｏ ＲＮＡＳｅｑ分析パイプライン（Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．）を使用した生の配列決定読み取りから導き出された。各遺伝子について、遺伝子のエクソンに一意にマッピングされた読み取りが特定され、カウントされた。得られた読み取りカウントは、生の発現として遺伝子レベルで要約された。

Claims (61)

  1. ヒト化内因性Ｆ１２遺伝子座をゲノムに含む非ヒト動物であって、前記内因性Ｆ１２遺伝子座のセグメントが削除され、対応するヒトＦ１２配列で置き換えられている、非ヒト動物。
  2. 前記ヒト化内因性Ｆ１２遺伝子座が、ヒト凝固因子ＸＩＩ重鎖を含むタンパク質をコードする、請求項１に記載の非ヒト動物。
  3. 前記ヒト化内因性Ｆ１２遺伝子座が、ヒト凝固因子ＸＩＩ軽鎖を含むタンパク質をコードする、請求項１または２に記載の非ヒト動物。
  4. 前記ヒト化内因性Ｆ１２遺伝子座が、ヒト凝固因子ＸＩＩシグナルペプチドを含むタンパク質をコードする、先行請求項のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
  5. コード配列および非コード配列の両方を含む前記内因性Ｆ１２遺伝子座の領域が削除され、コード配列および非コード配列の両方を含む対応するヒトＦ１２配列で置き換えられている、先行請求項のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
  6. 前記ヒト化内因性Ｆ１２遺伝子座が前記内因性Ｆ１２プロモーターを含み、前記ヒトＦ１２配列が前記内因性Ｆ１２プロモーターに作動可能に連結されている、先行請求項のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
  7. 前記内因性Ｆ１２遺伝子座の少なくとも１つのイントロンおよび少なくとも１つのエクソンが削除され、前記対応するヒトＦ１２配列で置き換えられている、先行請求項のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
  8. 前記内因性Ｆ１２遺伝子座のＦ１２コード配列全体が削除され、前記対応するヒトＦ１２配列で置き換えられている、先行請求項のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
  9. 開始コドンから終止コドンまでの前記内因性Ｆ１２遺伝子座の前記領域が削除され、前記対応するヒトＦ１２配列で置き換えられている、請求項８に記載の非ヒト動物。
  10. 内因性Ｆ１２の３’非翻訳領域が削除されておらず、前記対応するヒトＦ１２配列で置き換えられていない、先行請求項のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
  11. 内因性Ｆ１２の５’非翻訳領域が削除されておらず、前記対応するヒトＦ１２配列で置き換えられていない、先行請求項のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
  12. 前記開始コドンから前記終止コドンまでの前記内因性Ｆ１２遺伝子座の前記領域が削除され、前記対応するヒトＦ１２配列で置き換えられており、
    内因性Ｆ１２プロモーターが削除されておらず、前記対応するヒトＦ１２配列で置き換えられていない、先行請求項のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
  13. （ｉ）前記ヒト化内因性Ｆ１２遺伝子座の前記ヒトＦ１２配列が、配列番号３１もしくは３２に記載の配列に対して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一の配列を含み、かつ／または
    （ｉｉ）前記ヒト化内因性Ｆ１２遺伝子座が、配列番号５もしくは４６に記載の配列に対して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一の配列を含むタンパク質をコードし、かつ／または
    （ｉｉｉ）前記ヒト化内因性Ｆ１２遺伝子座が、配列番号１３もしくは４８に記載の配列に対して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一の配列を含むコード配列を含み、かつ／または
    （ｉｖ）前記ヒト化内因性Ｆ１２遺伝子座が、配列番号１７もしくは１８に記載の配列に対して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一の配列を含む、先行請求項のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
  14. 前記ヒト化内因性Ｆ１２遺伝子座が、前記対応するヒトＦ１２配列のイントロン内に選択カセットもしくはレポーター遺伝子を含むか、または前記ヒト化内因性Ｆ１２遺伝子座が選択カセットまたはレポーターを含まない、先行請求項のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
  15. 前記非ヒト動物が、前記ヒト化内因性Ｆ１２遺伝子座に対してホモ接合である、先行請求項のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
  16. 前記非ヒト動物がその生殖系列に前記ヒト化内因性Ｆ１２遺伝子座を含む、先行請求項のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
  17. 前記非ヒト動物が哺乳動物である、先行請求項のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
  18. 前記非ヒト動物がラットまたはマウスである、請求項１７に記載の非ヒト動物。
  19. 前記非ヒト動物がマウスである、請求項１８に記載の非ヒト動物。
  20. 前記非ヒト動物が、脳内で短いヒト凝固因子ＸＩＩアイソフォームを発現する、先行請求項のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
  21. （ｉ）前記短いヒト凝固因子ＸＩＩアイソフォームが、ヒトＦ１２のエクソン１１～１４に対するプローブによって検出されるが、ヒトＦ１２のエクソン１～６に対するプローブによっては検出されないＦ１２ ｍＲＮＡによってコードされ、かつ／または
    （ｉｉ）前記短いヒト凝固因子ＸＩＩアイソフォームがＦＸＩＩの２９７－５９６であり、かつ／または
    （ｉｉｉ）前記短いヒト凝固因子ＸＩＩアイソフォームが前記脳内のニューロンで発現しており、かつ／または
    （ｉｖ）前記短いヒト凝固因子ＸＩＩアイソフォームが、血漿カリクレインによって活性化され得、プロＨＧＦを活性ＨＧＦに変換する、請求項２０に記載の非ヒト動物。
  22. 前記非ヒト動物が、対応する野生型非ヒト動物の活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）と顕著に異ならないａＰＴＴを有し、かつ／または前記非ヒト動物が、対応する野生型の非ヒト動物のプロトロンビン時間（ＰＴ）と顕著に異ならないＰＴを有する、先行請求項のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
  23. 前記非ヒトが少なくとも約５μｇ／ｍＬのヒト凝固因子ＸＩＩ血漿レベルを有する、先行請求項のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
  24. ヒト化内因性Ｆ１２遺伝子座をゲノムに含む非ヒト動物細胞であって、前記内因性Ｆ１２遺伝子座のセグメントが削除され、対応するヒトＦ１２配列で置き換えられている、非ヒト動物細胞。
  25. ヒト化内因性Ｆ１２遺伝子座を含む非ヒト動物ゲノムであって、前記内因性Ｆ１２遺伝子座のセグメントが削除され、対応するヒトＦ１２配列で置き換えられている、非ヒト動物ゲノム。
  26. ヒト化内因性Ｆ１２遺伝子座を生成するための標的化ベクターであって、前記内因性Ｆ１２遺伝子座のセグメントが削除され、対応するヒトＦ１２配列で置き換えられ、前記標的化ベクターが、前記内因性Ｆ１２遺伝子座の５’標的配列を標的とする５’ホモロジーアームと前記内因性Ｆ１２遺伝子座の３’標的配列を標的とする３’ホモロジーアームとが隣接する前記対応するヒトＦ１２配列を含むインサート核酸を含む、標的化ベクター。
  27. ヒト化非ヒト動物Ｆ１２遺伝子であって、前記内因性Ｆ１２遺伝子座のセグメントが削除され、対応するヒトＦ１２配列で置き換えられている、ヒト化非ヒト動物Ｆ１２遺伝子。
  28. インビボでのヒト凝固因子ＸＩＩ標的化試薬の活性を評価する方法であって、
    （ａ）前記ヒト凝固因子ＸＩＩ標的化試薬を、請求項１～２３のいずれか一項に記載の非ヒト動物に投与することと、
    （ｂ）前記非ヒト動物における前記ヒト凝固因子ＸＩＩ標的化試薬の前記活性を評価することと、を含む、方法。
  29. 前記投与することが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）媒介送達、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）媒介送達、流体力学的送達（ＨＤＤ）、または注射を含む、請求項２８に記載の方法。
  30. ステップ（ｂ）が、前記非ヒト動物から血漿を単離することと、前記血漿中の前記ヒト凝固因子ＸＩＩ標的化試薬の活性を評価することと、を含む、請求項２８または２９に記載の方法。
  31. ステップ（ｂ）が、前記非ヒト動物の肝臓または脳における前記ヒト凝固因子ＸＩＩ標的化試薬の前記活性を評価することを含む、請求項２８～３０のいずれか一項に記載の方法。
  32. ステップ（ｂ）が、凝固またはトロンビン生成を評価することを含む、請求項２８～３１のいずれか一項に記載の方法。
  33. ステップ（ｂ）がＨＧＦ－Ｍｅｔシグナル伝達を評価することを含む、請求項２８～３２のいずれか一項に記載の方法。
  34. ステップ（ｂ）が、前記ヒト化内因性Ｆ１２遺伝子座によってコードされるＦ１２メッセンジャーＲＮＡの発現を測定することを含む、請求項２８～３３のいずれか一項に記載の方法。
  35. ステップ（ｂ）が、前記ヒト化内因性凝固因子ＸＩＩ遺伝子座によってコードされる凝固因子ＸＩＩタンパク質の発現を測定することを含む、請求項２８～３４に記載のいずれか一項に記載の方法。
  36. 前記ヒト凝固因子ＸＩＩ標的化試薬がゲノム編集剤であり、ステップ（ｂ）が前記ヒト化内因性Ｆ１２遺伝子座の改変を評価することを含む、請求項２８～３５のいずれか一項に記載の方法。
  37. ステップ（ｂ）が、前記ヒト化内因性Ｆ１２遺伝子座内の挿入または欠失の頻度を測定することを含む、請求項３６に記載の方法。
  38. 前記ヒト凝固因子ＸＩＩ標的化試薬が、ヒトＦ１２遺伝子の領域を標的化するように設計されたヌクレアーゼ剤を含む、請求項２８～３７のいずれか一項に記載の方法。
  39. 前記ヌクレアーゼ剤が、Ｃａｓタンパク質および前記ヒトＦ１２遺伝子のガイドＲＮＡ標的配列を標的化するように設計されたガイドＲＮＡを含む、請求項３８に記載の方法。
  40. 前記Ｃａｓタンパク質が、Ｃａｓ９タンパク質である、請求項３９に記載の方法。
  41. 前記ヒト凝固因子ＸＩＩ標的化試薬が外因性ドナー核酸を含み、前記外因性ドナー核酸が前記ヒトＦ１２遺伝子を標的化するように設計されており、任意選択で、前記外因性ドナー核酸がＡＡＶを介して送達される、請求項２８～４０のいずれか一項に記載の方法。
  42. 前記ヒト凝固因子ＸＩＩ標的化試薬が、ＲＮＡｉ剤またはアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項２８～３５のいずれか一項に記載の方法。
  43. 前記ヒト凝固因子ＸＩＩ標的化試薬が抗原結合タンパク質である、請求項２８～３５のいずれか一項に記載の方法。
  44. 前記ヒト凝固因子ＸＩＩ標的化試薬が小分子である、請求項２８～３５のいずれか一項に記載の方法。
  45. インビボでのヒト凝固因子ＸＩＩ標的化試薬の活性を最適化する方法であって、
    （Ｉ）ゲノムにヒト化内因性Ｆ１２遺伝子座を含む第１の非ヒト動物において、請求項２８～４４のいずれか一項に記載の方法を１回目に実施することと、
    （ＩＩ）変数を変更し、ゲノムにヒト化内因性Ｆ１２遺伝子座を含む第２の非ヒト動物において、前記変更された変数を用いてステップ（Ｉ）の方法を２回目に実施することと、
    （ＩＩＩ）ステップ（Ｉ）の前記ヒト凝固因子ＸＩＩ標的化試薬の前記活性をステップ（ＩＩ）の前記ヒト凝固因子ＸＩＩ標的化試薬の前記活性と比較し、結果としてより高い活性が得られる前記方法を選択することと、を含む、方法。
  46. ステップ（ＩＩ）の前記変更された変数が、前記ヒト凝固因子ＸＩＩ標的化試薬を前記非ヒト動物に導入する送達方法である、請求項４５に記載の方法。
  47. ステップ（ＩＩ）の前記変更された変数が、前記ヒト凝固因子ＸＩＩ標的化試薬を前記非ヒト動物に導入する投与経路である、請求項４５に記載の方法。
  48. ステップ（ＩＩ）の前記変更された変数が、前記非ヒト動物に導入された前記ヒト凝固因子ＸＩＩ標的化試薬の濃度または量である、請求項４５に記載の方法。
  49. ステップ（ＩＩ）の前記変更された変数が、前記非ヒト動物に導入された前記ヒト凝固因子ＸＩＩ標的化試薬の形態である、請求項４５に記載の方法。
  50. ステップ（ＩＩ）の前記変更された変数が、前記非ヒト動物に導入された前記ヒト凝固因子ＸＩＩ標的化試薬である、請求項４５に記載の方法。
  51. 請求項１～２３のいずれか一項に記載の非ヒト動物を作製する方法であって、
    （ａ）非ヒト動物宿主胚に、ヒト化内因性Ｆ１２遺伝子座をゲノムに含む遺伝子改変された非ヒト動物胚性幹（ＥＳ）細胞を導入することであって、前記内因性Ｆ１２遺伝子座のセグメントが削除され、対応するヒトＦ１２配列で置き換えられている、導入することと、
    （ｂ）前記非ヒト動物宿主胚を代理母において妊娠させることであって、前記代理母が、前記ヒト化内因性Ｆ１２遺伝子座を含むＦ０子孫遺伝子改変非ヒト動物を産生する、妊娠させることと、を含む、方法。
  52. 請求項１～２３のいずれか一項に記載の非ヒト動物を作製する方法であって、
    （ａ）非ヒト動物胚性幹（ＥＳ）細胞に、前記内因性Ｆ１２遺伝子座の５’標的配列に対応する５’ホモロジーアームと前記内因性Ｆ１２遺伝子座の３’標的配列に対応する３’ホモロジーアームとが隣接する前記ヒトＦ１２配列を含む核酸インサートを含む標的化ベクターを導入することであって、
    前記標的化ベクターが前記内因性Ｆ１２遺伝子座を組換えて、前記ヒトＦ１２配列を含む前記ヒト化内因性Ｆ１２遺伝子座をゲノムに含む遺伝子改変された非ヒトＥＳ細胞を産生する、導入することと、
    （ｂ）前記遺伝子改変された非ヒトＥＳ細胞を非ヒト動物宿主胚に導入することと、
    （ｃ）前記非ヒト動物宿主胚を代理母において妊娠させることであって、前記代理母が、前記ヒトＦ１２配列を含む前記ヒト化内因性Ｆ１２遺伝子座をゲノムに含むＦ０子孫遺伝子改変非ヒト動物を産生する、妊娠させることと、を含む、方法。
  53. 前記標的化ベクターが、少なくとも１０ｋｂの長さの大きな標的化ベクターであるか、または前記５’ホモロジーアームおよび前記３’ホモロジーアームの合計が少なくとも１０ｋｂの長さである、請求項５２に記載の方法。
  54. 請求項１～２３のいずれか一項に記載の非ヒト動物を作製する方法であって、
    （ａ）非ヒト動物１細胞期胚に、前記内因性Ｆ１２遺伝子座の５’標的配列に対応する５’ホモロジーアームと前記内因性Ｆ１２遺伝子座の３’標的配列に対応する３’ホモロジーアームとが隣接する前記ヒトＦ１２配列を含む核酸インサートを含む標的化ベクターを導入することであって、
    前記標的化ベクターが前記内因性Ｆ１２遺伝子座を組換えて、前記ヒトＦ１２配列を含む前記ヒト化内因性Ｆ１２遺伝子座をゲノムに含む遺伝子改変された非ヒト動物１細胞期胚を産生する、導入することと、
    （ｂ）前記遺伝子改変された非ヒト動物１細胞期胚を代理母において妊娠させて、前記ヒトＦ１２配列を含む前記ヒト化内因性Ｆ１２遺伝子座をゲノムに含む遺伝子改変されたＦ０世代非ヒト動物を産生することと、を含む、方法。
  55. ステップ（ａ）が、ヌクレアーゼ剤または前記ヌクレアーゼ剤をコードする核酸を導入することをさらに含み、前記ヌクレアーゼ剤が、前記内因性Ｆ１２遺伝子座の標的配列を標的化する、請求項５２～５４のいずれか一項に記載の方法。
  56. 前記ヌクレアーゼ剤が、Ｃａｓタンパク質およびガイドＲＮＡを含む、請求項５５に記載の方法。
  57. 前記Ｃａｓタンパク質が、Ｃａｓ９タンパク質である、請求項５６に記載の方法。
  58. ステップ（ａ）が、前記内因性Ｆ１２遺伝子座内の第２の標的配列を標的化する第２のガイドＲＮＡを導入することをさらに含む、請求項５６または５７に記載の方法。
  59. 前記非ヒト動物がマウスまたはラットである、請求項５１～５８のいずれか一項に記載の方法。
  60. 前記非ヒト動物がマウスである、請求項５９に記載の方法。
  61. 生体サンプルにおける短いＦ１２ ｍＲＮＡアイソフォームの発現を評価する方法であって、
    （ａ）Ｆ１２遺伝子のエクソン９～１４のうちの１つ以上に対するプライマーおよび／またはプローブを使用してＲＮＡ転写産物を検出および定量することと、
    （ｂ）前記Ｆ１２遺伝子のエクソン１～６のうちの１つ以上に対するプライマーおよび／またはプローブを使用してＲＮＡ転写産物を検出および定量することと、を含み、
    前記短いアイソフォームが、エクソン９～１４に対するプライマーおよび／またはプローブによって検出されるが、エクソン１～６に対するプライマーおよび／またはプローブによっては検出されない、方法。
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