JP2022534560A - ヒト化アルブミン遺伝子座を含む非ヒト動物 - Google Patents

ヒト化アルブミン遺伝子座を含む非ヒト動物 Download PDF

Info

Publication number
JP2022534560A
JP2022534560A JP2021568885A JP2021568885A JP2022534560A JP 2022534560 A JP2022534560 A JP 2022534560A JP 2021568885 A JP2021568885 A JP 2021568885A JP 2021568885 A JP2021568885 A JP 2021568885A JP 2022534560 A JP2022534560 A JP 2022534560A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
albumin
human
human animal
sequence
locus
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2021568885A
Other languages
English (en)
Other versions
JPWO2020247812A5 (ja
Inventor
チン ファン，
チア－ジェン シャオ，
ダン チャロソーン，
ケーディー ライ，
リア サビン，
レイチェル サトラー，
ブライアン ザンブロウィッツ，
ローリ モートン，
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Regeneron Pharmaceuticals Inc
Original Assignee
Regeneron Pharmaceuticals Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Regeneron Pharmaceuticals Inc filed Critical Regeneron Pharmaceuticals Inc
Publication of JP2022534560A publication Critical patent/JP2022534560A/ja
Publication of JPWO2020247812A5 publication Critical patent/JPWO2020247812A5/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • A01K67/0278—Knock-in vertebrates, e.g. humanised vertebrates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/0004—Screening or testing of compounds for diagnosis of disorders, assessment of conditions, e.g. renal clearance, gastric emptying, testing for diabetes, allergy, rheuma, pancreas functions
    • A61K49/0008—Screening agents using (non-human) animal models or transgenic animal models or chimeric hosts, e.g. Alzheimer disease animal model, transgenic model for heart failure
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/76—Albumins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/76—Albumins
    • C07K14/765—Serum albumin, e.g. HSA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2207/00—Modified animals
    • A01K2207/15—Humanized animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
    • A01K2217/072—Animals genetically altered by homologous recombination maintaining or altering function, i.e. knock in
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
    • C12N2015/8527—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic for producing animal models, e.g. for tests or diseases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

ヒト化アルブミン（ＡＬＢ）遺伝子座を含む非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞、および非ヒト動物、ならびにそのような非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞、および非ヒト動物を作製および使用する方法が提供される。ヒト化アルブミン遺伝子座を含む非ヒト動物細胞または非ヒト動物は、ヒトアルブミンタンパク質またはキメラアルブミンタンパク質を発現し、その断片はヒトアルブミンに由来する。ヒトアルブミンを標的化するように設計されたヌクレアーゼ剤などのヒトアルブミン標的化試薬のインビボ有効性を評価するために、ヒト化アルブミン遺伝子座を含むそのような非ヒト動物を使用するための方法が提供される。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年６月７日に出願された米国出願第６２／８５８，５８９号および２０１９年１０月１７日に出願された米国出願第６２／９１６，６６６号の権益を主張し、これらのそれぞれは、すべて目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
ＥＦＳ ＷＥＢを介してテキストファイルとして提出された配列表への参照
ファイル５４８１５７ＳＥＱＬＩＳＴ．ｔｘｔに記述された配列表は１５８キロバイトであり、２０２０年５月２７日に作成され、参照により本明細書に組み込まれる。
遺伝子療法は、いくつかのヒト疾患に対する有望な治療アプローチである。遺伝子療法に対する１つのアプローチは、ゲノム内のセーフハーバー遺伝子座に導入遺伝子を挿入することである。セーフハーバー遺伝子座には、導入遺伝子または他の外因性核酸インサートが、細胞の挙動または表現型を明白に変えることなく、目的のすべての組織で安定かつ確実に発現できる染色体遺伝子座が含まれる。多くの場合、セーフハーバー遺伝子座は、挿入された遺伝子配列の発現が、隣接する遺伝子からのリードスルー発現によって乱されない遺伝子座である。例えば、セーフハーバー遺伝子座には、内因性遺伝子の構造または発現に悪影響を及ぼすことなく、外因性ＤＮＡが予測可能な方法で組み込まれて機能できる染色体遺伝子座を含めることができる。セーフハーバー遺伝子座には、遺伝子外領域または遺伝子内領域、例えば、必須ではない、不要な、または明白な表現型の結果なしに破壊できる遺伝子内の遺伝子座を含めることができる。
セーフハーバー遺伝子座の一例はアルブミンである。しかしながら、インビボでの内因性アルブミン遺伝子座でのヒトアルブミン標的化試薬の真のヒトゲノムＤＮＡ標的または真のヒトゲノムＤＮＡ標的の厳密な近似を提供し、それによって生きている動物におけるそのような薬剤の有効性および作用機序の試験だけでなく、ヒト化遺伝子が存在するアルブミンの唯一のバージョンである環境での薬物動態学および薬力学研究を可能にする、適切な非ヒト動物の必要性が残っている。
ヒト化アルブミン（ＡＬＢ）遺伝子座を含む非ヒト動物、ならびにそのような非ヒト動物を作製および使用する方法が提供される。ヒト化アルブミン（ＡＬＢ）遺伝子座を含む非ヒト動物ゲノムまたは細胞も提供される。ヒト化アルブミン遺伝子も提供される。
一態様では、提供されるのは、ヒト化アルブミン（ＡＬＢ）遺伝子座を含む非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞、または非ヒト動物である。そのような非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞、または非ヒト動物は、それらのゲノム内にヒト化内因性アルブミン遺伝子座を含み得、内因性アルブミン遺伝子座のセグメントが削除され、対応するヒトアルブミン配列で置き換えられている。
いくつかのそのような非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞、または非ヒト動物では、ヒト化内因性アルブミン遺伝子座は、ヒト血清アルブミンペプチドを含むタンパク質をコードする。いくつかのそのような非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞、または非ヒト動物では、ヒト化内因性アルブミン遺伝子座は、ヒトアルブミンプロペプチドを含むタンパク質をコードする。いくつかのそのような非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞、または非ヒト動物では、ヒト化内因性アルブミン遺伝子座は、ヒトアルブミンシグナルペプチドを含むタンパク質をコードする。
いくつかのそのような非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞、または非ヒト動物では、コード配列および非コード配列の両方を含む内因性アルブミン遺伝子座の領域が削除され、コード配列および非コード配列の両方を含む対応するヒトアルブミン配列で置き換えられている。いくつかのそのような非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞、または非ヒト動物では、ヒト化内因性アルブミン遺伝子座は、内因性アルブミンプロモーターを含み、ヒトアルブミン配列は、内因性アルブミンプロモーターに作動可能に連結される。いくつかのそのような非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞、または非ヒト動物では、内因性アルブミン遺伝子座の少なくとも１つのイントロンおよび少なくとも１つのエキソンが削除され、対応するヒトアルブミン配列で置き換えられている。
いくつかのそのような非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞、または非ヒト動物では、内因性アルブミン遺伝子座のアルブミンコード配列全体が削除され、対応するヒトアルブミン配列で置き換えられている。任意選択で、開始コドンから終止コドンまでの内因性アルブミン遺伝子座の領域が削除され、対応するヒトアルブミン配列で置き換えられている。
いくつかのそのような非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞、または非ヒト動物では、ヒト化内因性アルブミン遺伝子座は、ヒトアルブミン３’非翻訳領域を含む。いくつかのそのような非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞、および非ヒト動物では、内因性アルブミン５’非翻訳領域が削除されておらず、対応するヒトアルブミン配列で置き換えられていない。
いくつかのそのような非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞、または非ヒト動物では、開始コドンから終止コドンまでの内因性アルブミン遺伝子座の領域が削除され、対応するヒトアルブミン配列およびヒトアルブミン３’非翻訳領域を含むヒトアルブミン配列で置き換えられており、かつ内因性アルブミン５’非翻訳領域は削除されておらず、対応するヒトアルブミン配列に置き換えられておらず、かつ内因性アルブミンプロモーターは削除されておらず、対応するヒトアルブミン配列に置き換えられていない。
いくつかのそのような非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞、または非ヒト動物では、ヒト化内因性アルブミン遺伝子座におけるヒトアルブミン配列は、配列番号３５に示される配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一の配列を含む。いくつかのそのような非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞、または非ヒト動物では、ヒト化内因性アルブミン遺伝子座は、配列番号５に示される配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一の配列を含むタンパク質をコードする。いくつかのそのような非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞、または非ヒト動物では、ヒト化内因性アルブミン遺伝子座は、配列番号１３に示される配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一の配列を含むコード配列を含む。いくつかのそのような非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞、または非ヒト動物では、ヒト化内因性アルブミン遺伝子座は、配列番号１７または１８に示される配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一の配列を含む。いくつかのそのような非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞、または非ヒト動物では、ヒト化内因性アルブミン遺伝子座におけるヒトアルブミン配列は、配列番号３５に示される配列と少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一の配列を含む。いくつかのそのような非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞、または非ヒト動物では、ヒト化内因性アルブミン遺伝子座は、配列番号５に示される配列と少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一の配列を含むタンパク質をコードする。いくつかのそのような非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞、または非ヒト動物では、ヒト化内因性アルブミン遺伝子座は、配列番号１３に示される配列と少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一の配列を含むコード配列を含む。いくつかのそのような非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞、または非ヒト動物では、ヒト化内因性アルブミン遺伝子座は、配列番号１７または１８に示される配列と少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一の配列を含む。
いくつかのそのような非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞、または非ヒト動物では、ヒト化内因性アルブミン遺伝子座は、選択カセットまたはレポーター遺伝子を含まない。
いくつかのそのような非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞、または非ヒト動物では、非ヒト動物は、ヒト化内因性アルブミン遺伝子座についてホモ接合性である。いくつかのそのような非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞、または非ヒト動物では、非ヒト動物は、その生殖系列にヒト化内因性アルブミン遺伝子座を含む。
いくつかのそのような非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞、または非ヒト動物では、非ヒト動物は哺乳動物である。任意選択で、非ヒト動物はラットまたはマウスである。任意選択で、非ヒト動物はマウスである。
いくつかのそのような非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞、または非ヒト動物では、非ヒト動物は、少なくとも約１０ｍｇ／ｍＬの血清アルブミンレベルを含む。いくつかのそのような非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞、または非ヒト動物では、非ヒト動物における血清アルブミンレベルは、野生型アルブミン遺伝子座を含む対照非ヒト動物における血清アルブミンレベルと少なくとも同じくらい高い。
いくつかのそのような非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞、または非ヒト動物では、ゲノム、細胞、または動物は、ヒト化内因性アルブミン遺伝子座についてヘテロ接合性である。いくつかのそのような非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞、または非ヒト動物では、ゲノム、細胞、または動物は、ヒト化内因性アルブミン遺伝子座についてホモ接合性である。いくつかのそのような非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞、または非ヒト動物では、ゲノム、細胞、または動物は、非ヒト動物の１つ以上の細胞内のヒト化内因性アルブミン遺伝子座の少なくとも１つの対立遺伝子に組み込まれた外因性タンパク質のコード配列をさらに含む。任意選択で、外因性タンパク質のコード配列は、（例えば、非ヒト動物の１つ以上の細胞内の）ヒト化内因性アルブミン遺伝子座の少なくとも１つの対立遺伝子のイントロン１に組み込まれている。いくつかのそのような非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞、または非ヒト動物では、ゲノム、細胞、または動物は、内因性アルブミン遺伝子座ではない不活化された内因性遺伝子座をさらに含む。任意選択で、非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞、または非ヒト動物は、（例えば、非ヒト動物の１つ以上の細胞内の）ヒト化内因性アルブミン遺伝子座の少なくとも１つの対立遺伝子に組み込まれた外因性タンパク質のコード配列をさらに含み、外因性タンパク質は、不活化された内因性遺伝子座の機能を置き換える。任意選択で、不活化された内因性遺伝子座は、不活化されたＦ９遺伝子座である。
別の態様では、上記の非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞、または非ヒト動物を生成するための標的化ベクターが提供される。そのような標的化ベクターは、ヒト化内因性アルブミン遺伝子座を生成するためのものであり、内因性アルブミン遺伝子座のセグメントが削除され、対応するヒトアルブミン配列で置き換えられており、標的化ベクターは、内因性アルブミン遺伝子座の５’標的配列を標的とする５’相同性アームおよび内因性アルブミン遺伝子座の３’標的配列を標的とする３’相同性アームに隣接する対応するヒトアルブミン配列を含む挿入核酸を含む。
別の態様では、インビボでのヒトアルブミン標的化試薬の活性を評価する方法が提供される。いくつかのそのような方法は、（ａ）上記の非ヒト動物にヒトアルブミン標的化試薬を投与することと、（ｂ）非ヒト動物におけるヒトアルブミン標的化試薬の活性を評価することとを含む。
いくつかのそのような方法では、投与は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）媒介送達、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）媒介送達、または流体力学的送達（ＨＤＤ）を含む。任意選択で、投与は、ＬＮＰ媒介送達を含む。任意選択で、ＬＮＰ用量は、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約２ｍｇ／ｋｇである。いくつかのそのような方法では、投与は、ＡＡＶ８媒介送達を含む。
いくつかのそのような方法では、ステップ（ｂ）は、非ヒト動物から肝臓を単離し、肝臓におけるヒトアルブミン標的化試薬の活性を評価することを含む。
いくつかのそのような方法では、ヒトアルブミン標的化試薬はゲノム編集剤であり、評価は、ヒト化内因性アルブミン遺伝子座の修飾を評価することを含む。任意選択で、評価は、ヒト化内因性アルブミン遺伝子座内の挿入または欠失の頻度を測定することを含む。
いくつかのそのような方法では、評価は、ヒト化内因性アルブミン遺伝子座によってコードされるアルブミンメッセンジャーＲＮＡの発現を測定することを含む。いくつかのそのような方法では、評価は、ヒト化内因性アルブミン遺伝子座によってコードされるアルブミンタンパク質の発現を測定することを含む。任意選択で、アルブミンタンパク質の発現を評価することは、非ヒト動物におけるアルブミンタンパク質の血清レベルを測定することを含む。任意選択で、アルブミンタンパク質の発現を評価することは、非ヒト動物の肝臓におけるアルブミンタンパク質の発現を測定することを含む。
いくつかのそのような方法では、ヒトアルブミン標的化試薬は、ヒトアルブミン遺伝子の領域を標的化するように設計されたヌクレアーゼ剤を含む。いくつかのそのような方法では、ヒトアルブミン標的化試薬は、ヌクレアーゼ剤またはヌクレアーゼ剤をコードする核酸を含み、ヌクレアーゼ剤は、ヒトアルブミン遺伝子の領域を標的化するように設計されている。任意選択で、ヌクレアーゼ剤は、Ｃａｓタンパク質およびヒトアルブミン遺伝子のガイドＲＮＡ標的配列を標的化するように設計されたガイドＲＮＡを含む。任意選択で、ガイドＲＮＡ標的配列は、ヒトアルブミン遺伝子のイントロン１にある。任意選択で、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質である。
いくつかのそのような方法では、ヒトアルブミン標的化試薬は、外因性ドナー核酸を含み、外因性ドナー核酸は、ヒトアルブミン遺伝子を標的化するように設計されており、任意選択で、外因性ドナー核酸は、ＡＡＶを介して送達される。任意選択で、外因性ドナー核酸は、一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）である。任意選択で、外因性ドナー核酸は、非相同末端結合によってヒト化アルブミン遺伝子座に挿入することができる。
いくつかの方法では、外因性ドナー核酸は、相同性アームを含まない。いくつかの方法では、外因性ドナー核酸は、ヒト化内因性アルブミン遺伝子座の５’標的配列を標的とする５’相同性アームおよびヒト化内因性アルブミン遺伝子座の３’標的配列を標的とする３’相同性アームに隣接する挿入核酸を含む。任意選択で、５’標的配列および３’標的配列の各々は、ヒトアルブミン遺伝子のイントロン１のセグメントを含む。
いくつかのそのような方法では、外因性ドナー核酸は、外因性タンパク質をコードする。任意選択で、外因性ドナー核酸で標的化されたヒト化内因性アルブミン遺伝子座によってコードされるタンパク質は、外因性タンパク質に融合されたヒトアルブミンシグナルペプチドを含む異種タンパク質である。任意選択で、外因性タンパク質は、第ＩＸ因子タンパク質である。任意選択で、評価は、非ヒト動物における第ＩＸ因子タンパク質の血清レベルを測定することを含み、かつ／または活性化部分トロンボプラスチン時間を評価すること、またはトロンビン生成アッセイを行うことを含む。任意選択で、非ヒト動物は、不活化されたＦ９遺伝子座をさらに含み、評価は、非ヒト動物における第ＩＸ因子タンパク質の血清レベルを測定することを含み、かつ／または活性化部分トロンボプラスチン時間を評価すること、またはトロンビン生成アッセイを行うことを含む。任意選択で、ヒトアルブミン標的化試薬は、（１）ヒトアルブミン遺伝子の領域を標的化するように設計されたヌクレアーゼ剤、および（２）外因性ドナー核酸を含み、外因性ドナー核酸は、ヒトアルブミン遺伝子を標的化するように設計され、外因性ドナー核酸は、外因性タンパク質をコードし、外因性ドナー核酸で標的化されたヒト化内因性アルブミン遺伝子座によってコードされたタンパク質は、外因性タンパク質に融合したヒトアルブミンシグナルペプチドを含む異種タンパク質である。任意選択で、評価は、外因性ドナー核酸によってコードされるメッセンジャーＲＮＡの発現を測定することを含む。任意選択で、評価は、外因性タンパク質の発現を測定することを含む。任意選択で、異種タンパク質の発現を評価することは、非ヒト動物における異種タンパク質の血清レベルを測定することを含む。任意選択で、異種タンパク質の発現を評価することは、非ヒト動物の肝臓における発現を測定することを含む。
別の態様では、インビボでのヒトアルブミン標的化試薬の活性を最適化する方法が提供される。いくつかのそのような方法は、（Ｉ）インビボでヒトアルブミン標的化試薬の活性を評価する上記の方法のいずれかを、ゲノム内にヒト化内因性アルブミン遺伝子座を含む第１の非ヒト動物において１回目に実行することと、（ＩＩ）可変要素を変更し、ステップ（Ｉ）の方法を、ゲノム内にヒト化内因性アルブミン遺伝子座を含む第２の非ヒト動物において変更された可変要素を用いて２回目に実行することと、（ＩＩＩ）ステップ（Ｉ）のヒトアルブミン標的化試薬の活性をステップ（ＩＩ）のヒトアルブミン標的化試薬の活性と比較し、より高い活性をもたらす方法を選択することとを含む。
いくつかのそのような方法では、ステップ（ＩＩ）における変更された可変要素は、ヒトアルブミン標的化試薬を非ヒト動物に導入する送達方法である。任意選択で、投与は、ＬＮＰ媒介送達を含み、ステップ（ＩＩ）における変更された可変要素は、ＬＮＰ製剤である。いくつかのそのような方法では、ステップ（ＩＩ）における変更された可変要素は、ヒトアルブミン標的化試薬を非ヒト動物に導入する投与経路である。いくつかのそのような方法では、ステップ（ＩＩ）における変更された可変要素は、非ヒト動物に導入されたヒトアルブミン標的化試薬の濃度または量である。いくつかのそのような方法では、ステップ（ＩＩ）における変更された可変要素は、非ヒト動物に導入されたヒトアルブミン標的化試薬の形態である。いくつかのそのような方法では、ステップ（ＩＩ）における変更された可変要素は、非ヒト動物に導入されたヒトアルブミン標的化試薬である。
いくつかのそのような方法では、ヒトアルブミン標的化試薬は、Ｃａｓタンパク質と、ヒトアルブミン遺伝子のガイドＲＮＡ標的配列を標的化するように設計されたガイドＲＮＡとを含む。いくつかのそのような方法では、ヒトアルブミン標的化試薬は、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸と、ガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡをコードするＤＮＡとを含み、ガイドＲＮＡは、ヒトアルブミン遺伝子のガイドＲＮＡ標的配列を標的化するように設計されている。任意選択で、ステップ（ＩＩ）における変更された可変要素は、ガイドＲＮＡ配列またはガイドＲＮＡ標的配列である。任意選択で、Ｃａｓタンパク質およびガイドＲＮＡは、それぞれＲＮＡの形態で投与され、ステップ（ＩＩ）における変更された可変要素は、Ｃａｓ ｍＲＮＡとガイドＲＮＡとの比である。任意選択で、ステップ（ＩＩ）における変更された可変要素は、ガイドＲＮＡ修飾である。任意選択で、ヒトアルブミン標的化試薬は、Ｃａｓタンパク質およびガイドＲＮＡをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含み、ステップ（ＩＩ）における変更された可変要素は、Ｃａｓ ｍＲＮＡとガイドＲＮＡとの比である。
いくつかのそのような方法では、ヒトアルブミン標的化試薬は、外因性ドナー核酸を含む。任意選択で、ステップ（ＩＩ）における変更された可変要素は、外因性ドナー核酸の形態である。任意選択で、外因性ドナー核酸は、ヒト化内因性アルブミン遺伝子座の５’標的配列を標的とする５’相同性アームおよびヒト化内因性アルブミン遺伝子座の３’標的配列を標的とする３’相同性アームに隣接する挿入核酸を含み、ステップ（ＩＩ）における変更された可変要素は、５’相同性アームの配列もしくは長さおよび／または３’相同性アームの配列もしくは長さである。
別の態様では、上記の非ヒト動物のいずれかを作製する方法が提供される。いくつかのそのような方法は、（ａ）非ヒト動物胚性幹（ＥＳ）細胞に、（ｉ）内因性アルブミン遺伝子座の標的配列を標的とするヌクレアーゼ剤、および（ｉｉ）内因性アルブミン遺伝子座の５’標的配列に対応する５’相同性アームおよび内因性アルブミン遺伝子座の３’標的配列に対応する３’相同性アームに隣接するヒトアルブミン配列を含む核酸インサートを含む標的化ベクターを導入することであって、標的化ベクターが、内因性アルブミン遺伝子座と再結合して、そのゲノム内にヒトアルブミン配列を含むヒト化内因性アルブミン遺伝子座を含む遺伝子修飾された非ヒトＥＳ細胞を産生する、導入することと、（ｂ）遺伝子修飾された非ヒトＥＳ細胞を非ヒト動物宿主胚に導入することと、（ｃ）代理母において非ヒト動物宿主胚を懐胎させることであって、代理母が、そのゲノム内にヒトアルブミン配列を含むヒト化内因性アルブミン遺伝子座を含むＦ０子孫遺伝子修飾された非ヒト動物を産生する、懐胎させることとを含む。別の態様では、上記の非ヒト動物のいずれかを作製する方法が提供される。いくつかのそのような方法は、（ａ）非ヒト動物胚性幹（ＥＳ）細胞に、（ｉ）ヌクレアーゼ剤またはヌクレアーゼ剤をコードする核酸（ヌクレアーゼ剤は、内因性アルブミン遺伝子座の標的配列を標的とする）、および（ｉｉ）内因性アルブミン遺伝子座の５’標的配列に対応する５’相同性アームおよび内因性アルブミン遺伝子座の３’標的配列に対応する３’相同性アームに隣接するヒトアルブミン配列を含む核酸インサートを含む標的化ベクターを導入することであって、標的化ベクターが、内因性アルブミン遺伝子座と再結合して、そのゲノム内にヒトアルブミン配列を含むヒト化内因性アルブミン遺伝子座を含む遺伝子修飾された非ヒトＥＳ細胞を産生する、導入することと、（ｂ）遺伝子修飾された非ヒトＥＳ細胞を非ヒト動物宿主胚に導入することと、（ｃ）代理母において非ヒト動物宿主胚を懐胎させることであって、代理母が、そのゲノム内にヒトアルブミン配列を含むヒト化内因性アルブミン遺伝子座を含むＦ０子孫遺伝子修飾された非ヒト動物を産生する、懐胎させることとを含む。任意選択で、標的化ベクターは、少なくとも１０ｋｂの長さの大きな標的化ベクターであるか、または５’および３’相同性アームの合計が少なくとも１０ｋｂの長さである。
いくつかのそのような方法は、（ａ）非ヒト動物の１細胞期胚に、（ｉ）内因性アルブミン遺伝子座の標的配列を標的とするヌクレアーゼ剤、および（ｉｉ）内因性アルブミン遺伝子座の５’標的配列に対応する５’相同性アームおよび内因性アルブミン遺伝子座の３’標的配列に対応する３’相同性アームに隣接するヒトアルブミン配列を含む核酸インサートを含む標的化ベクターを導入することであって、標的化ベクターが、内因性アルブミン遺伝子座と再結合して、そのゲノム内にヒトアルブミン配列を含むヒト化内因性アルブミン遺伝子座を含む遺伝子修飾された非ヒト１細胞期胚を産生する、導入することと、（ｂ）代理母において遺伝子修飾された非ヒト動物の１細胞期胚を懐胎させて、そのゲノム内にヒトアルブミン配列を含むヒト化内因性アルブミン遺伝子座を含む遺伝子修飾されたＦ０世代の非ヒト動物を産生する、懐胎させることとを含む。いくつかのそのような方法は、（ａ）非ヒト動物の１細胞期胚に、（ｉ）ヌクレアーゼ剤またはヌクレアーゼ剤をコードする核酸（ヌクレアーゼ剤は、内因性アルブミン遺伝子座の標的配列を標的とする）、および（ｉｉ）内因性アルブミン遺伝子座の５’標的配列に対応する５’相同性アームおよび内因性アルブミン遺伝子座の３’標的配列に対応する３’相同性アームに隣接するヒトアルブミン配列を含む核酸インサートを含む標的化ベクターを導入することであって、標的化ベクターが、内因性アルブミン遺伝子座と再結合して、そのゲノム内にヒトアルブミン配列を含むヒト化内因性アルブミン遺伝子座を含む遺伝子修飾された非ヒト１細胞期胚を産生する、導入することと、（ｂ）代理母において遺伝子修飾された非ヒト動物の１細胞期胚を懐胎させて、そのゲノム内にヒトアルブミン配列を含むヒト化内因性アルブミン遺伝子座を含む遺伝子修飾されたＦ０世代の非ヒト動物を産生する、懐胎させることとを含む。
いくつかのそのような方法では、ヌクレアーゼ剤は、Ｃａｓタンパク質およびガイドＲＮＡを含む。任意選択で、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質である。任意選択で、ステップ（ａ）は、内因性アルブミン遺伝子座内の第２の標的配列を標的とする第２のガイドＲＮＡを導入することをさらに含む。
いくつかのそのような方法では、非ヒト動物はマウスまたはラットである。任意選択で、非ヒト動物はマウスである。
別の態様では、上記の非ヒト動物のいずれかを作製する方法が提供される。いくつかのそのような方法は、（ａ）ヒト化内因性アルブミン遺伝子座を含むように多能性非ヒト動物細胞のゲノムを修飾することと、（ｂ）ヒト化内因性アルブミン遺伝子座を含む遺伝子修飾された多能性非ヒト動物細胞を同定または選択することと、（ｃ）遺伝子修飾された多能性非ヒト動物細胞を非ヒト動物宿主胚に導入することと、（ｄ）代理母に非ヒト動物宿主胚を懐胎させることとを含む。いくつかのそのような方法は、（ａ）ヒト化内因性アルブミン遺伝子座を含むように非ヒト動物の１細胞期胚のゲノムを修飾することと、（ｂ）ヒト化内因性アルブミン遺伝子座を含む遺伝子修飾された非ヒト動物の１細胞期胚を選択することと、（ｃ）代理母に遺伝子修飾された非ヒト動物の１細胞期胚を懐胎させることとを含む。
ネオマイシン選択カセット（ＭＡＩＤ ７６２６）を有するヒト化マウスアルブミン（Ａｌｂ）遺伝子座の概略図を示す（原寸に比例していない）。接合部Ａ、Ｂ、およびＣの配列は、それぞれ、配列番号１９～２１に示される。 ネオマイシン選択カセット（ＭＡＩＤ ７６２７）を除去した後のヒト化マウスアルブミン（Ａｌｂ）遺伝子座の概略図を示す（原寸に比例していない）。接合部ＡおよびＤの配列は、それぞれ、配列番号１９および２２に示される。 マウスアルブミン（Ａｌｂ）遺伝子座のヒト化をスクリーニングするためのＴＡＱＭＡＮ（登録商標）プローブの位置を示す（原寸に比例していない）。対立遺伝子獲得（ＧＯＡ）プローブには、７６２６ｈＵおよび７６２６ｈＤが含まれる。対立遺伝子喪失（ＬＯＡ）プローブには、７６２６ｍＴＵおよび７６２６ｍＴＤが含まれる。 マウス（マウスＡｌｂ）、ヒト（ヒトＡＬＢ）、およびヒト化（７６２６ ＨｕｍＩｎ Ｐｒｏｔ）アルブミンタンパク質のアラインメントを示す。ボックスの残基はシグナルペプチドを構成する。点線は血清アルブミンペプチド配列を示す。太い実線はプロペプチド配列を示す。ヒト化アルブミンタンパク質のすべての残基は、導入されたヒトエキソンによってコードされる。 同上。 ヒト化アルブミンマウス（ＡＬＢｈｕ／ｈｕ）および野生型（ＷＴ）マウスからの血漿サンプルにおけるヒトアルブミンレベルを示す。プールされた正常なヒト血漿（Ｇｅｏｒｇｅ Ｋｉｎｇ－Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｃ．）を陽性対照として使用した。ＶｅｌｏｃＩｍｍｕｎｅ（ＶＩ）マウスを陰性対照として使用した。 ヒト化アルブミンマウス（ＡＬＢｈｕ／ｈｕ）および野生型（ＷＴ）マウスからの血漿サンプルにおけるマウスアルブミンレベルを示す。プールされた正常なヒト血漿（Ｇｅｏｒｇｅ Ｋｉｎｇ－Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｃ．）を陰性対照として使用した。ＶＩマウスを陽性対照として使用した。 ヒト化アルブミンマウスにおけるＡＡＶ－ｈＦ９挿入からのヒト第ＩＸ因子血漿レベルを示す。 同上。 ＢＡＳＥＳＣＯＰＥ（商標）によって決定されたｈＡＬＢ－ｈＦＩＸ ｍＲＮＡに陽性の細胞のパーセンテージに対してプロットされた、ＡＡＶ－ｈＦ９ドナーおよびＬＮＰ－ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９の注射後７週目のヒト第ＩＸ因子血漿レベルを示す。 ＡＬＢｍ／ｈｕｘ Ｆ９－／－マウスにおけるＡＡＶ－ｈＦ９挿入からのヒト第ＩＸ因子血漿レベルを示す。 ＡＬＢｍ／ｈｕｘ Ｆ９－／－マウスにおけるＡＡＶ－ｈＦ９挿入からのヒトおよびマウスの血漿サンプルにおけるａＰＴＴ効果を示す。 ＴＧＡ－ＥＡプロファイルを表示す。図１０Ａは、ヒトの正常および第ＩＸ因子欠損血漿サンプルのＴＧＡ－ＥＡプロファイルを示す。図１０Ｂは、ＡＬＢｍ／ｈｕｘＦ９－／－マウスにおけるＡＡＶ－ｈＦ９挿入からのマウス血漿のＴＧＡ－ＥＡプロファイルを示す。 同上。 ＡＬＢｍ／ｈｕｘＦ９－／－マウスにおけるＡＡＶ－ｈＦ９挿入からのマウス血漿サンプルにおけるトロンビン生成を示す。
定義
本明細書で互換的に使用される、「タンパク質」、「ポリペプチド」、および「ペプチド」という用語は、コード化および非コード化アミノ酸ならびに化学的または生化学的に修飾または誘導体化したアミノ酸を含む、任意の長さのアミノ酸のポリマー形態を含む。これらの用語には、修飾されたペプチド骨格を有するポリペプチドなどの修飾されたポリマーも含まれる。「ドメイン」という用語は、特定の機能または構造を有するタンパク質またはポリペプチドの任意の部分を指す。
本明細書で互換的に使用される、「核酸」および「ポリヌクレオチド」という用語は、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、またはそれらの類似体もしくは修飾バージョンを含む、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を含む。これらには、一本鎖、二本鎖、および多重鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド、ならびにプリン塩基、ピリミジン塩基、または他の天然、化学的に修飾された、生化学的に修飾された、非天然、もしくは誘導体化されたヌクレオチド塩基を含むポリマーが含まれる。
「ゲノムに組み込まれた」という用語は、ヌクレオチド配列が細胞のゲノムに組み込まれるように、細胞に導入されている核酸を指す。細胞のゲノムへの核酸の安定した組み込みのために、任意のプロトコルを使用してよい。
「標的化ベクター」という用語は、相同組換え、非相同末端結合媒介ライゲーション、または細胞のゲノム中の標的位置への組換えの任意の他の手段によって導入され得る組換え核酸を指す。
「ウイルスベクター」という用語は、ウイルス起源の少なくとも１つのエレメントを含み、かつウイルスベクター粒子へのパッケージングに十分な、またはそれを許容するエレメントを含む、組換え核酸を指す。ベクターおよび／または粒子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、または他の核酸を、インビトロ、エクスビボ、またはインビボで細胞に導入する目的で利用することができる。ウイルスベクターの多くの形態が既知である。
細胞、組織（例えば、肝臓サンプル）、タンパク質、および核酸に関して「分離された」という用語は、通常インサイチュで存在し得る他の細菌、ウイルス、細胞、または他の成分に関して比較的精製されている細胞、組織（例えば、肝臓サンプル）、タンパク質、および核酸、細胞、組織（例えば、肝臓サンプル）、タンパク質、および核酸の実質的に純粋な調製物までを含み、ならびにそれらの実質的に純粋な調製物を含む。「単離された」という用語はまた、天然に存在する対応物を有さず、化学的に合成され、それにより他の細胞、組織（例えば、肝臓サンプル）、タンパク質、および核酸が実質的に混入していないか、またはそれらに天然に付随する（例えば、他の細胞タンパク質、ポリヌクレオチド、もしくは他の成分）ほとんどの他の成分（例えば、細胞成分）から分離もしくは精製されているタンパク質および核酸も含む。
「野生型」という用語は、（変異型、病変した、改変したなどとは対照的に）正常な状態または文脈に見られるような構造および／または活性を有する実体を指す。野生型遺伝子およびポリペプチドは、多くの場合、複数の異なる形態（例えば、対立遺伝子）で存在する。
「内因性配列」という用語は、細胞または非ヒト動物内で自然に発生する核酸配列を指す。例えば、非ヒト動物の内因性アルブミン配列は、非ヒト動物のアルブミン遺伝子座で天然に存在する天然のアルブミン配列を指す。
「外因性」分子または配列には、その形態または位置（例えば、ゲノム遺伝子座）で細胞に通常は存在しない分子または配列が含まれる。通常の存在には、細胞の特定の発生段階および環境条件に関する存在が含まれる。外因性分子または配列には、例えば、内因性配列のヒト化バージョンなどの細胞内の対応する内因性配列の変異バージョンが含まれ得るか、または細胞内であるが、異なる形態の（すなわち、染色体内ではない）内因性配列に対応する配列が含まれ得る。対照的に、内因性分子または配列には、その形態および位置で、特定の細胞において、特定の発生段階で、特定の環境条件下で通常存在する分子または配列が含まれる。
核酸またはタンパク質の文脈で使用される場合の「異種」という用語は、核酸またはタンパク質が、同じ分子内で一緒に天然に存在しない少なくとも２つのセグメントを含むことを示す。例えば、「異種」という用語は、核酸のセグメントまたはタンパク質のセグメントに関して使用される場合、核酸またはタンパク質が、自然界で互いに同じ関係（例えば、一緒に結合）で見出されない２つ以上のサブ配列を含むことを示す。一例として、核酸ベクターの「異種」領域は、自然界で他の分子と関連して見出されない、別の核酸分子内の、または別の核酸分子に結合した核酸のセグメントである。例えば、核酸ベクターの異種領域は、自然界のコード配列に関連して見出されない配列に隣接するコード配列を含み得る。同様に、タンパク質の「異種」領域は、自然界の他のペプチド分子（例えば、融合タンパク質、またはタグ付きタンパク質）に関連して見出されない、別のペプチド分子内にあるか、またはそれに結合しているアミノ酸のセグメントである。同様に、核酸またはタンパク質は、異種標識または異種分泌または局在化配列を含み得る。
「コドン最適化」は、アミノ酸を指定する３塩基対のコドンの組み合わせの多様性によって示されるように、コドンの縮重を利用し、一般に、天然アミノ酸配列を維持しながら、天然配列の少なくとも１つのコドンを、宿主細胞の遺伝子においてより頻繁にまたは最も頻繁に使用されるコドンで置き換えることによって、特定の宿主細胞における発現の増強のために核酸配列を改変するプロセスを含む。例えば、Ｃａｓ９タンパク質をコードする核酸は、天然に存在する核酸配列と比較して、細菌細胞、酵母細胞、ヒト細胞、非ヒト細胞、哺乳動物細胞、げっ歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、ハムスター細胞、または他の任意の宿主細胞を含む、所与の原核細胞または真核細胞においてより頻度高く使用される代替コドンへと改変することができる。コドン使用表は、例えば「コドン使用データベース」で容易に入手できる。これらの表は、様々な方法で適合させることができる。すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれるＮａｋａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２８：２９２を参照されたい。特定の宿主における発現のための特定の配列のコドン最適化のためのコンピュータアルゴリズム（例えば、Ｇｅｎｅ Ｆｏｒｇｅを参照のこと）もまた利用可能である。
「遺伝子座」という用語は、遺伝子（または重要な配列）、ＤＮＡ配列、ポリペプチドコード配列、または生物のゲノムの染色体上の位置（ｐｏｓｉｔｉｏｎ）の特定の位置（ｌｏｃａｔｉｏｎ）を指す。例えば、「アルブミン遺伝子座」または「Ａｌｂ遺伝子座」は、アルブミン（Ａｌｂ）遺伝子、アルブミンＤＮＡ配列、アルブミンをコードする配列、またはそのような配列が常駐すると同定されている生物のゲノムの染色体上のアルブミンの位置の特定の位置を指し得る。「アルブミン遺伝子座」は、例えば、エンハンサー、プロモーター、５’および／または３’非翻訳領域（ＵＴＲ）、またはそれらの組み合わせを含む、アルブミン遺伝子の調節エレメントを含み得る。
「遺伝子」という用語は、生成物（例えば、ＲＮＡ生成物および／またはポリペプチド生成物）をコードする染色体中のＤＮＡ配列を指し、遺伝子が完全長ｍＲＮＡ（５’および３’非翻訳配列を含む）に対応するように、５’および３’末端の両方で、非コードイントロンで中断されたコード領域およびコード領域に隣接して位置する配列を含む。「遺伝子」という用語はまた、調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、および転写因子結合部位）、ポリアデニル化シグナル、内部リボソーム侵入部位、サイレンサー、絶縁配列、およびマトリックス結合領域を含む他の非コード配列を含む。これらの配列は、遺伝子のコード領域に近い場合（例えば、１０ｋｂ以内）または離れた部位にある場合があり、それらは遺伝子の転写および翻訳のレベルまたは速度に影響する。
「対立遺伝子」という用語は、遺伝子のバリアント形態を指す。いくつかの遺伝子は、染色体上の同じ位置、または遺伝子座に位置する様々な異なる形態を有する。二倍体生物は、各遺伝子座に２つの対立遺伝子を有する。対立遺伝子の各対は、特定の遺伝子座の遺伝子型を表す。遺伝子型は、特定の遺伝子座に２つの同一の対立遺伝子がある場合はホモ接合として、および２つの対立遺伝子が異なる場合はヘテロ接合として記載されている。
「プロモーター」は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩが特定のポリヌクレオチド配列のための適切な転写開始部位でＲＮＡ合成を開始することを指示することができるＴＡＴＡボックスを通常含むＤＮＡの調節領域である。プロモーターは、転写開始速度に影響を及ぼす他の領域をさらに含み得る。本明細書に開示されるプロモーター配列は、作動可能に連結されたポリヌクレオチドの転写を調節する。プロモーターは、本明細書に開示される１つ以上の細胞型（例えば、真核細胞、非ヒト哺乳動物細胞、ヒト細胞、げっ歯類細胞、多能性細胞、一細胞期胚、分化した細胞、またはそれらの組み合わせ）において活性であり得る。プロモーターは、例えば、構成的に活性なプロモーター、条件付きプロモーター、誘導性プロモーター、時間的に制限されたプロモーター（例えば、発生的に調節されたプロモーター）、または空間的に制限されたプロモーター（例えば、細胞特異的または組織特異的プロモーター）であり得る。プロモーターの例は、例えば、ＷＯ２０１３／１７６７７２において見出すことができ、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
誘導性プロモーターの例としては、例えば、化学的に調節されたプロモーターおよび物理的に調節されたプロモーターが挙げられる。化学的に調節されるプロモーターとしては、例えば、アルコール調節プロモーター（例えば、アルコールデヒドロゲナーゼ（ａｌｃＡ）遺伝子プロモーター）、テトラサイクリン調節プロモーター（例えば、テトラサイクリン応答性プロモーター、テトラサイクリンオペレーター配列（ｔｅｔＯ）、ｔｅｔ－Ｏｎプロモーター、もしくはｔｅｔ－Ｏｆｆプロモーター）、ステロイド調節プロモーター（例えば、ラットグルココルチコイド受容体、エストロゲン受容体のプロモーター、もしくはエクジソン受容体のプロモーター）、または金属調節プロモーター（例えば、金属タンパク質プロモーター）が挙げられる。物理的に調節されるプロモーターとしては、例えば、温度調節プロモーター（例えば、熱ショックプロモーター）、および光調節プロモーター（例えば、光誘導性プロモーターまたは光抑制性プロモーター）が挙げられる。
組織特異的プロモーターは、例えば、ニューロン特異的プロモーター、グリア特異的プロモーター、筋細胞特異的プロモーター、心臓細胞特異的プロモーター、腎臓細胞特異的プロモーター、骨細胞特異的プロモーター、内皮細胞特異的プロモーター、または免疫細胞特異的プロモーター（例えば、Ｂ細胞プロモーターまたはＴ細胞プロモーター）であり得る。
発生的に調節されるプロモーターとしては、例えば、発生の胚段階の間のみ、または成体細胞においてのみ活性なプロモーターが挙げられる。
「作動可能な連結」または「作動可能に連結されている」とは、その両方の成分が正常に機能し、かつ成分の少なくとも１つが他の成分のうちの少なくとも１つに及ぶ機能を媒介し得る可能性を許すような、２つ以上の成分（例えば、プロモーターおよび別の配列エレメント）の並列を含む。例えば、プロモーターが、１つ以上の転写調節因子の存在または非存在に応じてコード配列の転写のレベルを制御する場合、そのプロモーターは、コード配列に作動可能に連結され得る。作動可能な連結は、そのような配列が相互に近接していること、またはトランスに作用する（例えば、調節配列が、コード配列の転写を制御するために離れて作用し得る）ことを含み得る。
核酸の「相補性」とは、核酸の一方の鎖のヌクレオチド配列が、その核酸塩基基の配向のために、反対側の核酸鎖の別の配列と水素結合を形成することを意味する。ＤＮＡの相補的塩基は通常ＡとＴ、ＣとＧである。ＲＮＡでは通常ＣとＧ、ＵとＡである。相補性は完全または実質的／十分であり得る。２つの核酸間の完全な相補性は、２つの核酸が二重鎖を形成できることを意味し、二重鎖のすべての塩基がワトソン－クリック対形成によって相補的な塩基に結合する。「実質的」または「十分」に相補的とは、一方の鎖の配列が反対側の鎖の配列と完全におよび／または完全に相補的ではないが、２つの鎖の塩基間で十分な結合が起こり、ハイブリダイゼーション条件のセット（例えば、塩濃度と温度）で安定したハイブリッド複合体を形成することを意味する。このような条件は、配列と標準的な数学的計算を使用してハイブリダイズした鎖のＴｍ（融解温度）を予測するか、日常的な方法を使用してＴｍを経験的に決定することによって予測できる。Ｔｍは、２つの核酸鎖の間に形成されるハイブリダイゼーション複合体の集団が５０％変性する（すなわち、二本鎖核酸分子の集団が一本鎖に半分解離する）温度を含む。Ｔｍより低い温度では、ハイブリダイゼーション複合体の形成が有利であるが、Ｔｍより高い温度では、ハイブリダイゼーション複合体中の鎖の融解または分離が有利である。他の既知のＴｍ計算は核酸の構造的特徴を考慮するが、Ｔｍは、例えば、Ｔｍ＝８１．５＋０．４１（Ｇ＋Ｃ％）を使用することにより、１Ｍ ＮａＣｌ水溶液中の既知のＧ＋Ｃ含有量を有する核酸について推定され得る。
ハイブリダイゼーションは、２つの核酸が相補配列を含むことを必要とするが、塩基間のミスマッチが可能である。２つの核酸間のハイブリダイゼーションに適切な条件は、周知の変数である、核酸の長さおよび相補性の度合いに依存する。２つの核酸配列間の相補性の度合いがより大きいと、それらの配列を有する核酸のハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）の値がより大きくなる。短い区間の相補性（例えば、３５以下、３０以下、２５以下、２２以下、２０以下、または１８以下のヌクレオチドにわたる相補性）を有する核酸間のハイブリダイゼーションについて、ミスマッチの位置は、重要になる（上述のＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．の１１．７～－１１．８を参照）。典型的には、ハイブリダイズ可能な核酸の長さは少なくとも約１０ヌクレオチドである。ハイブリダイズ可能な核酸の例示的な最小の長さは、少なくとも約１５ヌクレオチド、少なくとも約２０ヌクレオチド、少なくとも約２２ヌクレオチド、少なくとも約２５ヌクレオチド、および少なくとも約３０ヌクレオチドを含む。さらに、温度および洗浄溶液の塩濃度は、相補性の領域の長さおよび相補性の度合いなどの要素に従って、必要に応じて調整され得る。
ポリヌクレオチドの配列は、特異的にハイブリダイズするために、その標的核酸の配列と１００％相補的である必要はない。さらに、ポリヌクレオチドは、１つ以上のセグメントにわたってハイブリダイズし、介在するセグメント、または隣接するセグメントがハイブリダイゼーション事象に関与しない（例えば、ループ構造、またはヘアピン構造）ようになってもよい。ポリヌクレオチド（例えば、ｇＲＮＡ）は、それらが標的とされている標的核酸配列内の標的領域に対する少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％の配列相補性を含み得る。例えば、２０ヌクレオチドのうち１８ヌクレオチドが標的領域に相補的であり、したがって特異的にハイブリダイズするであろうｇＲＮＡは、９０％の相補性を表すであろう。この例において、残りの非相補性ヌクレオチドは、相補性ヌクレオチドとクラスターを形成するか、散在していてもよく、互いに、または相補性ヌクレオチドと連続的である必要はない。
核酸内の核酸配列の特定のストレッチ間の相補性のパーセントは、ＢＬＡＳＴプログラム（基本的なローカルアラインメント検索ツール）およびＰｏｗｅｒＢＬＡＳＴプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０、Ｚｈａｎｇ ａｎｄ Ｍａｄｄｅｎ（１９９７）Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．７：６４９－６５６、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる）を使用することによりまたはＧＡＰプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ８ ｆｏｒ Ｕｎｉｘ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋ，Ｍａｄｉｓｏｎ Ｗｉｓ．）を使用することにより、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ（１９８１） Ａｄｖ． Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２－４８９）のアルゴリズムを使用するデフォルト設定を使用して、日常的に決定することができる。
本明細書で提供される方法および組成物は、様々な異なる構成要素を使用する。記載全体の一部の成分には、活性バリアントと断片を含めることができる。このような成分には、例えば、Ｃａｓタンパク質、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、およびガイドＲＮＡが含まれる。これらの成分のそれぞれの生物学的活性は、本明細書のいずこかに記載されている。「機能性」という用語は、生物学的活性または機能を示すタンパク質または核酸（またはその断片、もしくはバリアント）の生来の能力を指す。そのような生物学的活性または機能には、例えば、Ｃａｓタンパク質がガイドＲＮＡおよび標的ＤＮＡ配列に結合する能力が含まれ得る。機能的断片またはバリアントの生物学的機能は、元の分子と比較して同じであるか、または実際に変更され得る（例えば、それらの特異性または選択性または有効性に関して）が、分子の基本的な生物学的機能を保持する。
「バリアント」という用語は、集団で最も一般的な配列とは異なるヌクレオチド配列（例えば、１ヌクレオチド）、または集団で最も一般的な配列とは異なるタンパク質配列（例えば、１アミノ酸）を指す。
「断片」という用語は、タンパク質に言及する場合、完全長タンパク質よりも短いか、または少ないアミノ酸を有するタンパク質を意味する。「断片」という用語は、核酸に言及する場合、完全長核酸よりも短いか、または少ないヌクレオチドを有する核酸を意味する。断片は、例えば、Ｎ末端断片（すなわち、タンパク質のＣ末端の一部の除去）、Ｃ末端断片（すなわち、タンパク質のＮ末端の一部の除去）、または内部断片（すなわち、タンパク質のＮ末端とＣ末端のそれぞれの一部の除去）であり得る。断片は、例えば、核酸断片を指す場合、５’断片（すなわち、核酸の３’末端の一部の除去）、３’断片（すなわち、核酸の５’末端の一部の除去）、または内部断片（すなわち、核酸の５’末端と３’末端のそれぞれの一部の除去）であり得る。
２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の文脈における「配列同一性」または「同一性」は、特定の比較ウィンドウで最大の一致のためにアラインさせる場合、同じである２つの配列の残基を指す。タンパク質に関して、配列同一性のパーセンテージを使用する場合、同一ではない残基位置は多くの場合に、保存的アミノ酸置換によって異なり、その保存的アミノ酸置換では、アミノ酸残基は同様の化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を有する他のアミノ酸残基で置換されており、したがって、分子の機能特性を変化させない。配列が保存的置換で異なる場合、配列同一性パーセントを、置換の保存的性質について補正するために、上方に調整してもよい。そのような保存的置換によって異なる配列は、「配列類似性」または「類似性」を有すると言われている。この調整を行う手段は、周知である。典型的には、これは、保存的置換を完全なミスマッチではなく部分的なミスマッチとしてスコアリングして、それによって、配列同一性パーセンテージを増加させることを含む。したがって、例えば、同一のアミノ酸が１のスコアを与えられ、非保存的置換が０のスコアを与えられる場合に、保存的置換は、０～１のスコアを与えられる。保存的置換のスコアリングは、例えば、プログラムＰＣ／ＧＥＮＥ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）で実行されるように計算される。
「配列同一性のパーセンテージ」は、比較ウィンドウにわたって２つの最適にアラインされた配列（完全にマッチする残基の数が最大）を比較することによって決定される値を含み、比較ウィンドウにおけるポリヌクレオチド配列の部分は、２つの配列の最適アラインメントのための（付加また欠失を含まない）参照配列と比較した場合に、付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含んでもよい。パーセンテージは、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両方の配列中に発生する位置の数を決定して一致した位置の数を得ること、一致した位置の数を比較のウィンドウにおける位置の総数で割ること、および結果に１００を掛けて配列同一性のパーセンテージを得ることによって計算される。別段の定めがない限り（例えば、短い方の配列が、連結された非相同配列を含む）、比較ウィンドウは、比較される２つの配列のうちの短い方の完全長である。
別段の記載がない限り、配列同一性／類似性の値は、次のパラメータ：５０のＧＡＰ重量および３の長さ重量、およびｎｗｓｇａｐｄｎａ．ｃｍｐスコアリングマトリックスを使用するヌクレオチド配列の同一性％および類似性％；８のＧＡＰ重量および２の長さ重量、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを使用するアミノ酸配列の同一性％および類似性％；またはその任意の同等のプログラムを使用し、ＧＡＰバージョン１０を使用して得られた値を含む。「同等のプログラム」は、問題の任意の２つの配列について、ＧＡＰバージョン１０によって生成された対応するアラインメントと比較した場合、同一のヌクレオチドまたはアミノ酸残基の一致および同一のパーセント配列同一性を有するアラインメントを生成する任意の配列比較プログラムを含む。
「保存的アミノ酸置換」という用語は、配列中に通常存在するアミノ酸の、類似のサイズ、電荷、または極性の、異なるアミノ酸との置換を指す。保存的置換の例には、イソロイシン、バリン、またはロイシンなどの非極性（疎水性）残基の、別の非極性残基との置換が含まれる。同様に、保存的置換の例には、アルギニンとリシンとの間、グルタミンとアスパラギンとの間、またはグリシンとセリンとの間などの、１つの極性（親水性）残基の別のものとの置換が含まれる。加えて、リシン、アルギニン、もしくはヒスチジンなどの塩基性残基から別のものへの置換、またはアスパラギン酸もしくはグルタミン酸などのある酸性残基から別の酸性残基への置換は、保存的置換の追加の例である。非保存的置換の例には、非極性（疎水性）アミノ酸残基、例えば、イソロイシン、バリン、ロイシン、アラニン、またはメチオニンから極性（親水性）残基、例えば、システイン、グルタミン、グルタミン酸、またはリシンへの、および／または極性残基から非極性残基への置換が含まれる。典型的なアミノ酸の分類は、以下の表１に要約されている。
Figure 2022534560000002
「相同」配列（例えば、核酸配列）は、例えば、既知の参照配列と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるような、既知の参照配列と同一であるか、または実質的に同様である配列を含む。相同配列は、例えば、オルソログ配列およびパラロガス配列を含み得る。例えば、相同遺伝子は典型的には、種分化事象（オルソログ遺伝子）または遺伝子重複事象（パラロガス遺伝子）のいずれかを介して、共通の祖先ＤＮＡ配列に由来する。「オルソログ」遺伝子には、種分化によって共通の祖先遺伝子から進化した様々な種の遺伝子が含まれる。オルソログは典型的には、進化の過程で同じ機能を保持する。「パラロガス」遺伝子には、ゲノム内の重複によって関連する遺伝子が含まれる。パラログは、進化の過程で新しい機能を進化させることができる。
「インビトロ」という用語は、人工環境、および人工環境（例えば、試験管または単離された細胞もしくは細胞株）内で生じるプロセスまたは反応を含む。「インビボ」という用語は、天然環境（例えば、細胞または生物または身体）、および天然環境内で生じるプロセスまたは反応を含む。「エクスビボ」という用語は、個体の身体から除去された細胞、およびそのような細胞内で生じるプロセスまたは反応を含む。
「レポーター遺伝子」という用語は、異種プロモーターおよび／またはエンハンサーエレメントに作動可能に連結されたレポーター遺伝子配列を含む構築物が、プロモーターおよび／またはエンハンサーエレメントの活性化に必要な因子を含む（または含むように作製され得る）細胞に導入された場合に容易かつ定量的にアッセイされる遺伝子生成物（典型的には酵素）をコードする配列を有する核酸を指す。レポーター遺伝子の例には、これらに限定されないが、ベータガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）をコードする遺伝子、細菌クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ｃａｔ）遺伝子、ホタルルシフェラーゼ遺伝子、ベータグルクロニダーゼ（ＧＵＳ）をコードする遺伝子、および蛍光タンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。「レポータータンパク質」は、レポーター遺伝子によってコードされるタンパク質を指す。
本明細書で使用される「蛍光レポータータンパク質」という用語は、蛍光に基づいて検出可能なレポータータンパク質を意味し、蛍光は、レポータータンパク質から直接、レポータータンパク質の蛍光発生基質上の活性、または蛍光タグ付き化合物への結合に親和性のあるタンパク質のいずれかからのものであり得る。蛍光タンパク質の例には、緑色蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ、ＧＦＰ－２、ｔａｇＧＦＰ、ｔｕｒｂｏＧＦＰ、ｅＧＦＰ、Ｅｍｅｒａｌｄ、Ａｚａｍｉ Ｇｒｅｅｎ、Ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ Ａｚａｍｉ Ｇｒｅｅｎ、ＣｏｐＧＦＰ、ＡｃｅＧＦＰ、およびＺｓＧｒｅｅｎｌ）、黄色蛍光タンパク質（例えば、ＹＦＰ、ｅＹＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、ＰｈｉＹＦＰ、およびＺｓＹｅｌｌｏｗｌ）、青色蛍光タンパク質（例えば、ＢＦＰ、ｅＢＦＰ、ｅＢＦＰ２、Ａｚｕｒｉｔｅ、ｍＫａｌａｍａｌ、ＧＦＰｕｖ、Ｓａｐｐｈｉｒｅ、およびＴ－ｓａｐｐｈｉｒｅ）、シアン蛍光タンパク質（例えば、ＣＦＰ、ｅＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ＣｙＰｅｔ、ＡｍＣｙａｎｌ、およびＭｉｄｏｒｉｉｓｈｉ－Ｃｙａｎ）、赤色蛍光タンパク質（例えば、ＲＦＰ、ｍＫａｔｅ、ｍＫａｔｅ２、ｍＰｌｕｍ、ＤｓＲｅｄ単量体、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＲＦＰ１、ＤｓＲｅｄ－Ｅｘｐｒｅｓｓ、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄ－Ｍｏｎｏｍｅｒ、ＨｃＲｅｄ－Ｔａｎｄｅｍ、ＨｃＲｅｄｌ、ＡｓＲｅｄ２、ｅｑＦＰ６１１、ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、およびＪｒｅｄ）、オレンジ色蛍光タンパク質（例えば、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、Ｋｕｓａｂｉｒａ－Ｏｒａｎｇｅ、Ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ Ｋｕｓａｂｉｒａ－Ｏｒａｎｇｅ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、およびｔｄＴｏｍａｔｏ）、およびフローサイトメトリー方法により細胞内の存在を検出することができる任意の他の好適な蛍光タンパク質が挙げられる。
二本鎖切断（ＤＳＢ）に応答した修復は、主に２つの保存されたＤＮＡ修復経路である相同組換え（ＨＲ）および非相同末端結合（ＮＨＥＪ）を介して生じる。Ｋａｓｐａｒｅｋ＆Ｈｕｍｐｈｒｅｙ（２０１１）Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ＆Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２２：８８６－８９７を参照されたく、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。同様に、外因性ドナー核酸によって媒介された標的核酸の修復は、２つのポリヌクレオチド間の遺伝的情報の交換の任意のプロセスを含み得る。
「組換え」という用語は、２つのポリヌクレオチド間で遺伝的情報を交換する任意のプロセスを含み、任意のメカニズムによって起こり得る。組換えは、相同性指向修復（ＨＤＲ）または相同組換え（ＨＲ）を介して起こり得る。ＨＤＲまたはＨＲには、ヌクレオチド配列の相同性を必要とし得る核酸修復の形式が含まれ、「標的」分子（すなわち、二本鎖切断を経験した分子）の修復のテンプレートとして「ドナー」分子を使用し、ドナーから標的への遺伝的情報の伝達をもたらす。いかなる特定の理論にも拘束されることを望まないが、そのような伝達は、壊れた標的とドナーとの間に形成されるヘテロ二本鎖ＤＮＡのミスマッチ補正、および／またはドナーが標的の一部となる遺伝的情報を再合成するために使用される合成依存性鎖アニーリング、および／または関連するプロセスを含み得る。いくつかの場合では、ドナーポリヌクレオチド、ドナーポリヌクレオチドの一部、ドナーポリヌクレオチドのコピー、またはドナーポリヌクレオチドのコピーの一部が標的ＤＮＡに組み込まれる。Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｃｅｌｌ １５３：９１０－９１８、Ｍａｎｄａｌｏｓ ｅｔ ａｌ．（２０１２）ＰＬＯＳ ＯＮＥ ７：ｅ４５７６８：１－９、およびＷａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１３） Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１：５３０－５３２を参照されたく、それらの各々は、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
非相同末端結合（ＮＨＥＪ）は、相同テンプレートを必要とせずに、切断末端を互いにまたは外因性配列への直接ライゲーションによる、核酸における二本鎖切断の修復を含む。ＮＨＥＪによる非隣接配列のライゲーションは、多くの場合、二本鎖切断の部位の近くで欠失、挿入、または転座をもたらし得る。例えば、ＮＨＥＪはまた、切断末端を外因性ドナー核酸の末端と直接ライゲーションすることにより、外因性ドナー核酸の標的化組み込みをもたらすことができる（すなわち、ＮＨＥＪベースの捕捉）。そのようなＮＨＥＪ媒介標的化組み込みは、相同性指向修復（ＨＤＲ）経路が容易に使用することができない場合（例えば、非分裂細胞、一次細胞、および相同性に基づくＤＮＡ修復を不十分に行う細胞）、外因性ドナー核酸の挿入に好ましい場合がある。さらに、相同性指向修復とは対照的に、切断部位に隣接する配列同一性の大きな領域に関する知識は必要なく、これは、ゲノム配列の知識が限られているゲノムを有する生物への標的化挿入を試みるときに有益であり得る。組み込みは、外因性ドナー核酸と切断されたゲノム配列との間の平滑末端のライゲーションを介して、または切断されたゲノム配列においてヌクレアーゼ剤によって生成されたものに適合するオーバーハングに隣接する外因性ドナー核酸を使用する粘着末端（すなわち、５’または３’オーバーハングを有する）のライゲーションを介して進行することができる。例えば、ＵＳ２０１１／０２０７２２、ＷＯ２０１４／０３３６４４、ＷＯ２０１４／０８９２９０、およびＭａｒｅｓｃａ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．２３（３）：５３９－５４６を参照されたく、これらの各々は、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。平滑末端がライゲーションされている場合、断片結合に必要なマイクロホモロジーの生成領域のために、標的および／またはドナーの切除が必要になる場合があり、これにより、標的配列に望ましくない改変が生じ得る。
１つ以上の列挙された要素を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」組成物または方法は、具体的に列挙されていない他の要素を含み得る。例えば、タンパク質を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」または「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」組成物は、タンパク質を単独で、または他の成分との組み合わせで含み得る。「から本質的になる」という移行句は、請求項の範囲が、特許請求の範囲に記載された特定の要素、および特許請求された発明の基本的かつ新規の特性に実質的に影響をしない要素を包含すると解釈されることを意味する。したがって、本発明の請求項で使用される場合の「から本質的になる」という用語は、「含む」と同等であると解釈されることを意図するものではない。
「任意選択的の」または「任意選択で」は、続いて記載された事象または状況が起こっても起こらなくてもよく、ならびに説明が、当該事象または状況が起こる場合およびそれが起こらない場合を含むことを意味する。
値の範囲の指定は、その範囲内の、またはその範囲を定義するすべての整数、およびその範囲内の整数によって定義されるすべての部分範囲を含む。
文脈から別段に明確ではない限り、「約」という用語は、規定の値の測定の標準誤差（例えば、ＳＥＭ）内の値を包含する。
「および／または」という用語は、関連する列挙された項目の１つ以上のありとあらゆる可能な組み合わせ、ならびに代替物（「または」）で解釈されるときの組み合わせの欠如を指し、包含する。
「または」という用語は、特定のリストの任意の１つのメンバーを指し、そのリストのメンバーの任意の組み合わせも含む。
冠詞「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」の単数形は、文脈が別段に明確に規定していない限り、複数形の言及を含む。例えば、「タンパク質」または「少なくとも１つのタンパク質」という用語は、それらの混合物を含む複数のタンパク質を含み得る。
統計的に有意とは、ｐ≦０．０５を意味する。
［発明を実施するための形態］
Ｉ．概要
本明細書では、ヒト化アルブミン（ＡＬＢ）遺伝子座を含む非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞、および非ヒト動物、ならびにそのような非ヒト動物細胞および非ヒト動物を使用する方法が提供される。ヒト化アルブミン遺伝子座を含む非ヒト動物細胞または非ヒト動物は、ヒトアルブミンタンパク質またはヒトアルブミンタンパク質の１つ以上の断片を含むキメラアルブミンタンパク質を発現する。このような非ヒト動物細胞および非ヒト動物は、インビトロ、エクスビボ、またはインビボでヒトアルブミン標的化剤（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ゲノム編集剤）の送達または有効性を評価するために使用でき、インビトロ、エクスビボ、またはインビボでのそのような薬剤の有効性の送達を最適化する方法で使用することができる。
本明細書に開示される非ヒト動物細胞および非ヒト動物のいくつかでは、ヒトアルブミンゲノムＤＮＡのほとんどまたはすべてが、対応するオーソロガスな非ヒト動物アルブミン遺伝子座に挿入される。本明細書に開示される非ヒト動物細胞および非ヒト動物のいくつかでは、非ヒト動物のアルブミンゲノムＤＮＡのほとんどまたはすべてが、対応するオーソロガスなヒトアルブミンゲノムＤＮＡと１対１で置き換えられている。保存された調節エレメントは無傷のままである可能性が高く、ＲＮＡプロセシングを受けるスプライシング転写物はｃＤＮＡよりも安定しているため、ｃＤＮＡが挿入された非ヒト動物と比較して、イントロン－エキソン構造とスプライシング機構が維持されている場合、発現レベルは高くなるはずである。対照的に、非ヒト動物のアルブミン遺伝子座へのヒトアルブミンｃＤＮＡの挿入は、非ヒト動物アルブミンの最初のエキソンおよびイントロン内に含まれるものなどの保存された調節エレメントを消滅させる。非ヒト動物のゲノム配列を対応するオーソロガスなヒトゲノム配列で置き換えるか、または対応するオーソロガスな非ヒトアルブミン遺伝子座にヒトアルブミンゲノム配列を挿入すると、内因性アルブミン遺伝子座からの導入遺伝子の忠実な発現をもたらす可能性が高くなる。同様に、内因性の非ヒト動物のアルブミン遺伝子座ではなくランダムなゲノム遺伝子座にヒトアルブミンコード配列をトランスジェニック挿入したトランスジェニック非ヒト動物は、アルブミン発現の内因性調節を正確に反映しない。非ヒト動物ゲノムＤＮＡのほとんどまたはすべてを１対１で対応するオーソロガスなヒトゲノムＤＮＡで置き換えるか、対応するオーソロガスな非ヒトアルブミン遺伝子座にヒトアルブミンゲノム配列を挿入することで生じるヒト化アルブミン対立遺伝子は、真のヒト標的またはヒトアルブミン標的化試薬の真のヒト標的の近似値を提供し（例えば、ヒトアルブミンを標的化するように設計されたＣＲＩＳＰＲ ／ Ｃａｓ９試薬）、それにより、生きている動物におけるそのような薬剤の有効性および作用機序の試験、ならびにヒト化タンパク質およびヒト化遺伝子が存在するアルブミンの唯一のバージョンである環境での薬物動態学および薬力学研究を可能にする。
ＩＩ．ヒト化アルブミン（ＡＬＢ）遺伝子座を含む非ヒト動物
本明細書に開示される非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞、および非ヒト動物は、ヒト化アルブミン（ＡＬＢ）遺伝子座を含む。ヒト化アルブミン遺伝子座を含む細胞または非ヒト動物は、ヒトアルブミンタンパク質または部分的にヒト化されたキメラアルブミンタンパク質を発現し、天然のアルブミンタンパク質の１つ以上の断片がヒトアルブミンからの対応する断片で置き換えられている。本明細書では、非ヒトアルブミン遺伝子のセグメントが削除され、対応するヒトアルブミン配列で置き換えられている、ヒト化非ヒト動物アルブミン遺伝子も開示される。
本明細書に開示される非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞、および非ヒト動物は、アルブミン遺伝子座ではない不活化（ノックアウト）内因性遺伝子をさらに含み得る。そのような非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞、および非ヒト動物を使用して、例えば、不活化された内因性遺伝子を置き換えるためにヒト化アルブミン遺伝子座に挿入するための遺伝子療法試薬（例えば、導入遺伝子）をスクリーニングすることができる。不活化された内因性遺伝子を置き換えるためのヒト化アルブミン遺伝子座への挿入は、例えば、ノックアウトを救済することができる。１つの特定の例では、本明細書に開示される非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞、および非ヒト動物は、不活化された（ノックアウトされた）内因性Ｆ９遺伝子（凝固第ＩＸ因子をコードする）をさらに含み得る。不活化された（ノックアウトされた）内因性Ｆ９遺伝子は、任意の凝固第ＩＸ因子（クリスマス因子、血漿トロンボプラスチン成分、またはＰＴＣとしても知られる）を発現しない遺伝子である。野生型ヒト凝固第ＩＸ因子タンパク質には、ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ００７４０が割り当てられており、ヒトＦ９遺伝子にはＧｅｎｅＩＤ２１５８が割り当てられている。野生型マウス凝固第ＩＸ因子タンパク質には、ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ１６２９４が割り当てられており、マウスＦ９遺伝子にはＧｅｎｅＩＤ１４０７１が割り当てられている。野生型ラット凝固第ＩＸ因子タンパク質には、ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ１６２９６が割り当てられており、ラットＦ９遺伝子にはＧｅｎｅＩＤ２４９４６が割り当てられている。
本明細書に開示される非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞、および非ヒト動物は、（例えば、非ヒト動物の１つ以上の肝細胞などの非ヒト動物の１つ以上の細胞の）ヒト化アルブミン遺伝子座の少なくとも１つの対立遺伝子に組み込まれた外因性タンパク質のコード配列をさらに含み得る。コード配列は、例えば、ヒト化アルブミン遺伝子座のイントロン１、イントロン１２、またはイントロン１３に組み込むことができる。場合によっては、ヒト化アルブミン遺伝子座からのヒトアルブミンの発現は、外因性タンパク質のコード配列が（例えば、非ヒト動物の１つ以上の肝細胞などの非ヒト動物の１つ以上の細胞の）ヒト化アルブミン遺伝子座の少なくとも１つの対立遺伝子に組み込まれた後、同じレベルで維持される。一例では、非ヒト動物ゲノム、細胞、または動物は、アルブミン遺伝子座ではない不活化された（ノックアウトされた）内因性遺伝子をさらに含み、外因性タンパク質は、不活化内因性遺伝子の機能を置き換える（例えば、ノックアウトを救済する） 。１つの特定の例では、外因性タンパク質は、凝固第ＩＸ因子（例えば、ヒト凝固第ＩＸ因子）である。
Ａ．アルブミン
本明細書に記載の細胞および非ヒト動物は、ヒト化アルブミン（ＡＬＢ）遺伝子座を含む。アルブミンは、ＡＬＢ遺伝子（アルブミン、血清アルブミン、ＰＲＯ０８８３、ＰＲＯ０９０３、ＨＳＡ、ＧＩＧ２０、ＧＩＧ４２、ＰＲＯ１７０８、ＰＲＯ２０４４、ＰＲＯ２６１９、ＰＲＯ２６７５、およびＵＮＱ６９６／ＰＲＯ１３４１としても知られる）によってコードされる。アルブミンは、肝臓で、新生タンパク質が粗面小胞体から放出される前に除去されるＮ末端ペプチドを有するプレプロアルブミンとして合成される。産物であるプロアルブミンは、次にゴルジ小胞で切断されて、分泌されたアルブミン（血清アルブミン）を産生する。ヒト血清アルブミンは、ヒトの血液に見られる血清アルブミンである。これは、ヒト血漿において最も豊富なタンパク質であり、血清タンパク質の約半分を構成する。これは肝臓で産生される。これは水に可溶性であり、単量体である。アルブミンは、他の機能の中でも特に、ホルモン、脂肪酸、および他の化合物を輸送し、ｐＨを緩衝し、膠質浸透圧を維持する。血清中のヒトアルブミン濃度は、典型的には、約３５～５０ｇ／Ｌ（３．５～５．０ｇ／ｄＬ）である。血清半減期は約２０日である。分子量は６６．５ｋＤａである。
アルブミンは、その非常に高い発現レベルと、他の組織と比較して遺伝子送達およびインビボ編集に対する肝臓の扱いやすさのために、ゲノムのセーフハーバー遺伝子座であると考えられている。セーフハーバー遺伝子座には、導入遺伝子または他の外因性核酸インサートが、細胞の挙動または表現型を明白に変えることなく、目的のすべての組織で安定かつ確実に発現できる染色体遺伝子座が含まれる。多くの場合、セーフハーバー遺伝子座は、挿入された遺伝子配列の発現が、隣接する遺伝子からのリードスルー発現によって乱されない遺伝子座である。例えば、セーフハーバー遺伝子座には、内因性遺伝子の構造または発現に悪影響を及ぼすことなく、外因性ＤＮＡが予測可能な方法で組み込まれて機能できる染色体遺伝子座を含めることができる。セーフハーバー遺伝子座には、遺伝子外領域または遺伝子内領域、例えば、必須ではない、不要な、または明白な表現型の結果なしに破壊できる遺伝子内の遺伝子座を含めることができる。
アルブミン遺伝子構造は、その第１エキソンが最終タンパク質産物から切断される分泌ペプチド（シグナルペプチド）をコードするため、イントロン配列への導入遺伝子の標的化に適している。例えば、スプライスアクセプターと治療用導入遺伝子を有するプロモーターのないカセットの組み込みは、多くの異なるタンパク質の発現と分泌をサポートする。
ヒトＡＬＢは第４染色体上のヒト４ｑ１３．３に位置する（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ Ｇｅｎｅ ＩＤ ２１３；Ａｓｓｅｍｂｌｙ ＧＲＣｈ３８．ｐ１２（ＧＣＦ＿０００００１４０５．３８）；ｌｏｃａｔｉｏｎ ＮＣ＿０００００４．１２（７３４０４２３９．．７３４２１４８４（＋）））。この遺伝子は１５個のエキソンを有すると報告されている。これらのうち、１４個のエキソンはコードエキソンであり、エキソン１５は３’非翻訳領域（ＵＴＲ）の一部である非コードエキソンである。野生型ヒトアルブミンタンパク質には、ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ０２７６８が割り当てられている。少なくとも３つのアイソフォームが知られている（Ｐ０２７６８－１～Ｐ０２７６８－３）。１つのアイソフォームであるＰ０２７６８－１（ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿０００４６８．１と同一）の配列は、配列番号５に示される。標準的なアイソフォームをコードするｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ）には、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿０００４７７．７が割り当てられており、配列番号３７に示される。例示的なコード配列（ＣＤＳ）には、ＣＣＤＳ ＩＤ ＣＣＤＳ３５５５．１が割り当てられており、配列番号１３に示される。配列番号５に示される完全長のヒトアルブミンタンパク質は、シグナルペプチド（アミノ酸１～１８）、プロペプチド（アミノ酸１９～２４）、および血清アルブミン（アミノ酸２５～６０９）を含む６０９個のアミノ酸を有する。これらのドメイン間の描写は、ＵｎｉＰｒｏｔで示されるとおりである。ヒトアルブミンへの言及には、標準的な（野生型）形態ならびにすべての対立遺伝子形態およびアイソフォームが含まれる。任意の他の形態のヒトアルブミンは、野生型形態との最大アライメントに対して番号が付けられたアミノ酸を有し、アラインされたアミノ酸は同じ番号で示される。
マウスＡｌｂは、第５染色体上のマウス５ Ｅ１；５ ４４．７ ｃＭに位置する（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ Ｇｅｎｅ ＩＤ １１６５７；Ａｓｓｅｍｂｌｙ ＧＲＣｍ３８．ｐ４（ＧＣＦ＿０００００１６３５．２４）；位置ＮＣ＿００００７１．６（９０，４６０，８７０．．９０，４７６，６０２（＋）））。この遺伝子は１５個のエキソンを有すると報告されている。これらのうち、１４個のエキソンはコードエキソンであり、エキソン１５は３’非翻訳領域（ＵＴＲ）の一部である非コードエキソンである。野生型マウスアルブミンタンパク質には、ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ０７７２４が割り当てられている。マウスアルブミンの配列（ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿０３３７８４．２と同一）は、配列番号１に記載されている。標準的なアイソフォームをコードする例示的なｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ）アイソフォームには、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００９６５４．４が割り当てられており、配列番号３６に示される。例示的なコード配列（ＣＤＳ）（ＣＣＤＳ ＩＤ ＣＣＤＳ１９４１２．１）は、配列番号９に示される。配列番号１に示される標準的な完全長マウスアルブミンタンパク質は、シグナルペプチド（アミノ酸１～１８）、プロペプチド（アミノ酸１９～２４）、および血清アルブミン（アミノ酸２５～６０８）を含む６０８個のアミノ酸を有する。これらのドメイン間の描写は、ＵｎｉＰｒｏｔで示されるとおりである。マウスアルブミンへの言及には、標準的な（野生型）形態ならびにすべての対立遺伝子形態およびアイソフォームが含まれる。任意の他の形態のマウスアルブミンは、野生型形態との最大アライメントに対して番号が付けられたアミノ酸を有し、アラインされたアミノ酸は同じ番号で示される。
他の多くの非ヒト動物のアルブミン配列も知られている。これらには、例えば、ウシ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ０２７６９；ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ Ｇｅｎｅ ＩＤ２８０７１７）、ラット（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ０２７７０；ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ Ｇｅｎｅ ＩＤ２４１８６）、ニワトリ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ１９１２１）、スマトラオランウータン（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｑ５ＮＶＨ５；ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ Ｇｅｎｅ ＩＤ１００１７４１４５）、ウマ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ３５７４７；ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ Ｇｅｎｅ ＩＤ１０００３４２０６）、ネコ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ４９０６４；ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ Ｇｅｎｅ ＩＤ４４８８４３）、ウサギ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ４９０６５；ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ Ｇｅｎｅ ＩＤ１００００９１９５）、イヌ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ４９８２２；ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ Ｇｅｎｅ ＩＤ４０３５５０）、ブタ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ０８８３５；ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ Ｇｅｎｅ ＩＤ３９６９６０）、スナネズミ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｏ３５０９０）、ｒｈｅｓｕｓ ｍａｃａｑｕｅ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｑ２８５２２）；ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ Ｇｅｎｅ ＩＤ７０４８９２）、ロバ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｑ５ＸＬＥ４；ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ Ｇｅｎｅ ＩＤ１０６８３５１０８）、ヒツジ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ１４６３９；ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ Ｇｅｎｅ ＩＤ４４３３９３）、ウシガエル（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ２１８４７）、ゴールデンハムスター（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ａ６ＹＦ５６）；ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ Ｇｅｎｅ ＩＤ１０１８３７２２９）、およびヤギ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ８５２９５）が含まれる。
Ｂ．ヒト化アルブミン遺伝子座
ヒト化アルブミン遺伝子座は、内因性アルブミン遺伝子座のセグメントが削除され、オーソロガスなヒトアルブミン配列で置き換えられているアルブミン遺伝子座である。ヒト化アルブミン遺伝子座は、アルブミン遺伝子全体が対応するオーソロガスなヒトアルブミン配列で置き換えられているアルブミン遺伝子座であり得るか、またはそれは、アルブミン遺伝子の一部のみが対応するオーソロガスなヒトアルブミン配列に置き換えられている（すなわち、ヒト化されている）アルブミン遺伝子座であり得る。例えば、内因性アルブミン遺伝子座のアルブミンコード配列全体を削除して、対応するヒトアルブミン配列で置き換えることができる。内因性アルブミン配列の特定のセグメントに対応するヒトアルブミン配列は、ヒトアルブミンおよび内因性アルブミンが最適にアラインされる場合に、内因性アルブミン配列の特定のセグメントとアラインするヒトアルブミンの領域を指す。最適にアラインされたとは、完全に一致した残基の最大数を指す。対応するオーソロガスなヒト配列は、例えば、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）またはゲノムＤＮＡを含み得る。任意選択で、対応するオーソロガスなヒトアルブミン配列は、非ヒト動物におけるコドン使用頻度に基づいてコドン最適化されるように修飾される。置換または挿入された（すなわち、ヒト化された）領域は、エキソンなどのコード領域、イントロンなどの非コード領域、非翻訳領域、もしくは調節領域（例えば、プロモーター、エンハンサー、もしくは転写リプレッサー結合要素）、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。一例として、ヒトアルブミン遺伝子の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５個すべてのエキソンに対応するエキソンをヒト化することができる。例えば、ヒトアルブミン遺伝子のすべてのエキソン（すなわち、エキソン１～１５）に対応するエキソンをヒト化することができる。別の例として、ヒトアルブミン遺伝子の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４個すべてのコードエキソンに対応するエキソンをヒト化することができる。例えば、ヒトアルブミン遺伝子のすべてのコードエキソン（すなわち、エキソン１～１４）に対応するエキソンをヒト化することができる。同様に、ヒトアルブミン遺伝子の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４個すべてのイントロンに対応するイントロンをヒト化することができるか、または内因性のままにすることができる。例えば、ヒトアルブミン遺伝子のイントロンのすべて（すなわち、イントロン１～１４）に対応するイントロンをヒト化することができる。同様に、ヒトアルブミン遺伝子のコードエキソン間のイントロンの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、または１３個すべてに対応するイントロンをヒト化することができるか、または内因性のままにすることができる。例えば、ヒトアルブミン遺伝子のコードエキソン間のイントロンのすべて（すなわち、イントロン１～１３）に対応するイントロンをヒト化することができる。調節配列を含む隣接する非翻訳領域も、ヒト化され得るか、または内因性のままであり得る。例えば、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）、３’ＵＴＲ、もしくは５’ＵＴＲと３’ＵＴＲの両方をヒト化することができるか、または５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、もしくは５’ＵＴＲと３’ＵＴＲの両方を内因性のままにすることができる。ヒトの５’および３’ＵＴＲの一方または両方を挿入することができ、および／または内因性の５’および３’ＵＴＲの一方または両方を削除することができる。特定の例では、５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲの両方が内因性のままである。別の特定の例では、５’ＵＴＲは内因性のままであり、３’ＵＴＲはヒト化されている。オーソロガス配列による置換の程度に応じて、プロモーターなどの調節配列は、内因性であるか、または置換するヒトオーソロガス配列によって供給され得る。例えば、ヒト化アルブミン遺伝子座は、内因性非ヒト動物アルブミンプロモーターを含み得る（すなわち、ヒトアルブミン配列は、内因性非ヒト動物プロモーターに作動可能に連結され得る）。
シグナルペプチド、プロペプチド、または血清アルブミンをコードする領域のうちの１つ以上またはすべてをヒト化することができるか、またはそのような領域のうちの１つ以上を内因性のままにすることができる。マウスアルブミンシグナルペプチド、プロペプチド、および血清アルブミンの例示的なコード配列は、それぞれ、配列番号１０～１２に記載されている。ヒトアルブミンシグナルペプチド、プロペプチド、および血清アルブミンの例示的なコード配列は、それぞれ、配列番号１４～１６に示される。
例えば、シグナルペプチドをコードするアルブミン遺伝子座の領域の全部もしくは一部をヒト化することができ、かつ／またはプロペプチドをコードするアルブミン遺伝子座の領域の全部もしくは一部をヒト化することができ、かつ／または血清アルブミンをコードするアルブミン遺伝子座の領域の全部もしくは一部をヒト化することができる。代替的または追加的に、シグナルペプチドをコードするアルブミン遺伝子座の領域の全部または一部を内因性のままにすることができ、かつ／またはプロペプチドをコードするアルブミン遺伝子座の領域の全部または一部を内因性のままにすることができ、かつ／または血清アルブミンをコードするアルブミン遺伝子座の領域の全部または一部を内因性のままにすることができる。一例では、シグナルペプチド、プロペプチド、および血清アルブミンをコードするアルブミン遺伝子座の領域の全部または一部がヒト化される。任意選択で、アルブミン遺伝子座のヒト化領域のＣＤＳは、配列番号１３（またはその縮重）と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一の配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれらからなる。任意選択で、アルブミン遺伝子座のヒト化領域のＣＤＳは、配列番号１３（またはその縮重）と少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一の配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれらからなる。任意選択で、アルブミン遺伝子座のヒト化領域は、配列番号３５と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一の配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれらからなる。任意選択で、アルブミン遺伝子座のヒト化領域は、配列番号３５と少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一の配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれらからなる。任意選択で、ヒト化アルブミン遺伝子座は、配列番号５と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一の配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなるタンパク質をコードする。任意選択で、ヒト化アルブミン遺伝子座は、配列番号５と少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一の配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなるタンパク質をコードする。任意選択で、ヒト化アルブミン遺伝子座は、配列番号１７または１８と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一の配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれらからなる。任意選択で、ヒト化アルブミン遺伝子座は、配列番号１７または１８と少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一の配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれらからなる。
ヒト化アルブミン遺伝子座によってコードされるアルブミンタンパク質は、ヒトアルブミンタンパク質に由来する１つ以上のドメイン、および／または内因性（すなわち、天然）アルブミンタンパク質に由来する１つ以上のドメインを含み得る。マウスアルブミンシグナルペプチド、プロペプチド、および血清アルブミンの例示的なアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号２～４に示される。ヒトアルブミンシグナルペプチド、プロペプチド、および血清アルブミンの例示的なアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号６～８に示される。
アルブミンタンパク質は、ヒトアルブミンシグナルペプチド、ヒトアルブミンプロペプチド、およびヒト血清アルブミンの１つ以上またはすべてを含み得る。代替的または追加的に、アルブミンタンパク質は、内因性（すなわち、天然）非ヒト動物アルブミンタンパク質に由来する１つ以上のドメインを含み得る。例えば、アルブミンタンパク質は、内因性（すなわち、天然）非ヒト動物アルブミンタンパク質由来のシグナルペプチドおよび／または内因性（すなわち、天然）非ヒト動物アルブミンタンパク質由来のプロペプチドおよび／または内因性（すなわち、天然）非ヒト動物アルブミンタンパク質由来の血清アルブミンを含み得る。一例として、アルブミンタンパク質は、ヒトシグナルペプチド、プロペプチド、および血清アルブミンを含み得る。
ヒトアルブミンタンパク質に由来するキメラアルブミンタンパク質のドメインは、完全にヒト化された配列によってコードされ得る（すなわち、そのドメインをコードする配列全体がオーソロガスなヒトアルブミン配列で置き換えられる）か、または部分的にヒト化された配列によってコードされ得る（すなわち、そのドメインをコードする配列の一部は、オーソロガスなヒトアルブミン配列で置き換えられ、そのドメインをコードする残りの内因性（すなわち、天然）配列は、コードされるドメインがヒトアルブミンタンパク質のそのドメインと同一であるように、オーソロガスなヒトアルブミン配列と同じアミノ酸をコードする）。同様に、内因性アルブミンタンパク質に由来するキメラタンパク質のドメインは、完全に内因性の配列によってコードされ得る（すなわち、そのドメインをコードする配列全体が内因性のアルブミン配列である）か、または部分的にヒト化された配列によってコードされ得る（すなわち、そのドメインをコードする配列の一部は、オーソロガスなヒトアルブミン配列で置き換えられるが、オーソロガスなヒトアルブミン配列は、コードされるドメインが内因性アルブミンタンパク質のそのドメインと同一であるように、置き換えられた内因性アルブミン配列と同じアミノ酸をコードする）。
一例として、ヒト化アルブミン遺伝子座によってコードされるアルブミンタンパク質は、ヒトアルブミンシグナルペプチドを含み得る。任意選択で、ヒトアルブミンシグナルペプチドは、配列番号６と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一の配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれらからなる。任意選択で、ヒトアルブミンシグナルペプチドは、配列番号６と少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一の配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれらからなる。別の例として、ヒト化アルブミン遺伝子座によってコードされるアルブミンタンパク質は、ヒトアルブミンプロペプチドを含み得る。任意選択で、ヒトアルブミンプロペプチドは、配列番号７と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一の配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれらからなる。任意選択で、ヒトアルブミンプロペプチドは、配列番号７と少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一の配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれらからなる。別の例として、ヒト化アルブミン遺伝子座によってコードされるアルブミンタンパク質は、ヒト血清アルブミンを含み得る。任意選択で、ヒト血清アルブミンは、配列番号８と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一の配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれらからなる。任意選択で、ヒト血清アルブミンは、配列番号８と少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一の配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれらからなる。ヒト化アルブミン遺伝子座によってコードされるアルブミンタンパク質は、配列番号５と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一の配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなり得る。例えば、ヒト化アルブミン遺伝子座によってコードされるアルブミンタンパク質は、配列番号５と少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一の配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなり得る。任意選択で、ヒト化アルブミン遺伝子座によってコードされるアルブミンＣＤＳは、配列番号１３（またはその縮重）と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一の配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれらからなり得る。任意選択で、ヒト化アルブミン遺伝子座によってコードされるアルブミンＣＤＳは、配列番号１３（またはその縮重）と少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一の配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれらからなり得る。
ヒト化アルブミンタンパク質は、天然のアルブミンタンパク質および／またはヒトアルブミンタンパク質の活性を保持することができる。
任意選択で、ヒト化アルブミン遺伝子座は他の要素を含むことができる。そのような要素の例には、選択カセット、レポーター遺伝子、リコンビナーゼ認識部位、または他の要素が含まれ得る。代替的に、ヒト化アルブミン遺伝子座は、他の要素を欠く可能性がある（例えば、選択マーカーまたは選択カセットを欠く可能性がある）。適切なレポーター遺伝子およびレポータータンパク質の例は、本明細書の他の場所に開示されている。適切な選択マーカーの例には、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏｒ）、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ（ｈｙｇｒ）、ピューロマイシン－Ｎ－アセチルトランスフェラーゼ（ｐｕｒｏｒ）、ブラストサイジンＳデアミナーゼ（ｂｓｒｒ）、キサンチン／グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｇｐｔ）、または単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ｋ）が含まれる。リコンビナーゼの例には、Ｃｒｅ、Ｆｌｐ、およびＤｒｅリコンビナーゼが含まれる。Ｃｒｅリコンビナーゼ遺伝子の一例はＣｒｅｉであり、Ｃｒｅリコンビナーゼをコードする２つのエキソンがイントロンによって分離され、原核細胞での発現を防ぐ。そのようなリコンビナーゼは、核への局在化を促進するための核局在化シグナルをさらに含むことができる（例えば、ＮＬＳ－Ｃｒｅｉ）。リコンビナーゼ認識部位には、部位特異的リコンビナーゼによって認識され、組換え事象の基質として機能することができるヌクレオチド配列が含まれる。リコンビナーゼ認識部位の例には、ＦＲＴ、ＦＲＴ１１、ＦＲＴ７１、ａｔｔｐ、ａｔｔ、ｒｏｘ、ならびにｌｏｘＰ、ｌｏｘ５１１、ｌｏｘ２２７２、ｌｏｘ６６、ｌｏｘ７１、ｌｏｘＭ２、およびｌｏｘ５１７１などのｌｏｘ部位が含まれる。
レポーター遺伝子または選択カセットなどの他の要素は、リコンビナーゼ認識部位に隣接する自己欠失カセットである可能性がある。例えば、すべての目的のためにそれぞれ全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ８，６９７，８５１およびＵＳ２０１３／０３１２１２９を参照されたい。一例として、自己削除カセットは、マウスＰｒｍ１プロモーターに作動可能に連結されたＣｒｅｉ遺伝子（イントロンによって分離されたＣｒｅリコンビナーゼをコードする２つのエキソンを含む）およびヒトユビキチンプロモーターに作動可能に連結されたネオマイシン耐性遺伝子を含み得る。Ｐｒｍ１プロモーターを使用することにより、Ｆ０動物のオスの生殖細胞で特異的に自己欠失カセットを削除することができる。選択マーカーをコードするポリヌクレオチドは、標的とされる細胞において活性なプロモーターに作動可能に連結され得る。プロモーターの例は、本明細書のいずこかに記載されている。別の特定の例として、自己欠失選択カセットは、１つ以上のプロモーター（例えば、ヒトユビキチンおよびＥＭ７プロモーターの両方）に作動可能に連結されたハイグロマイシン耐性遺伝子コード配列、それに続くポリアデニル化シグナル、続いて１つ以上のプロモーター（例えば、ｍＰｒｍ１プロモーター）に作動可能に連結されたＣｒｅｉコード配列、続いて別のポリアデニル化シグナルを含み得、カセット全体がｌｏｘＰ部位に隣接している。
ヒト化アルブミン遺伝子座も条件付き対立遺伝子である可能性がある。例えば、条件付き対立遺伝子は、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２０１１／０１０４７９９に記載されているように、多機能対立遺伝子であってよい。例えば、条件付き対立遺伝子は、以下を含むことができる：（ａ）標的遺伝子の転写に関してセンス方向の作動配列、（ｂ）センスまたはアンチセンス方向の薬物選択カセット（ＤＳＣ）、（ｃ）アンチセンス配向の目的のヌクレオチド配列（ＮＳＩ）、（ｄ）逆方向の条件付き反転モジュール（ＣＯＩＮ、エキソン分割イントロンと反転可能な遺伝子トラップのようなモジュールを利用）。例えばＵＳ２０１１／０１０４７９９を参照されたい。条件付き対立遺伝子は、第１のリコンビナーゼへの曝露時に再結合して、（ｉ）作動配列およびＤＳＣを欠き、（ｉｉ）センス方向のＮＳＩとアンチセンス方向のＣＯＩＮを含む、条件付き対立遺伝子を形成する再結合可能なユニットをさらに含むことができる。例えばＵＳ２０１１／０１０４７９９を参照されたい。
１つの例示的なヒト化アルブミン遺伝子座（例えば、ヒト化マウスアルブミン遺伝子座）は、開始コドンから終止コドンまでの領域が対応するヒト配列で置き換えられている遺伝子座である。図１Ａおよび１Ｂならびに配列番号１７および１８を参照されたい。特定の例では、ＡＴＧ開始コドンから終止コドンまでの領域（すなわち、エキソン１～１４をコードする）を、非ヒト動物（例えば、マウス）アルブミン（Ａｌｂ）遺伝子座から削除することができ、削除された内因性領域の代わりに、ＡＴＧ開始コドンから終止コドンの約１００ｂｐ下流までのヒトアルブミン（ＡＬＢ）の対応する領域を挿入することができる。
Ｃ．ヒト化アルブミン（ＡＬＢ）遺伝子座を含む非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞、および非ヒト動物
本明細書の他の場所に記載されるヒト化アルブミン（ＡＬＢ）遺伝子座を含む非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞、および非ヒト動物が提供される。ゲノム、細胞、または非ヒト動物は、雄または雌であってよい。ゲノム、細胞、または非ヒト動物は、ヒト化アルブミン遺伝子座についてヘテロ接合性またはホモ接合性であり得る。二倍体生物は、各遺伝子座に２つの対立遺伝子を有する。対立遺伝子の各対は、特定の遺伝子座の遺伝子型を表す。遺伝子型は、特定の遺伝子座に２つの同一の対立遺伝子がある場合はホモ接合として、および２つの対立遺伝子が異なる場合はヘテロ接合として記載されている。ヒト化アルブミン遺伝子座を含む非ヒト動物は、その生殖系列にヒト化内因性アルブミン遺伝子座を含み得る。
本明細書で提供される非ヒト動物ゲノムまたは細胞は、例えば、ヒトアルブミン遺伝子座に相同もしくはオーソロガスなアルブミン遺伝子座またはゲノム遺伝子座を含む任意の非ヒト動物ゲノムまたは細胞であり得る。ゲノムは、例えば、真菌細胞（例えば、酵母）、植物細胞、動物細胞、哺乳動物細胞、非ヒト哺乳動物細胞、およびヒト細胞を含む真核細胞であり得る。「動物」という用語は、例えば、哺乳類、魚類、爬虫類、両生類、鳥類、および虫類を含む、動物界の任意のメンバーを含む。哺乳動物細胞は、例えば、非ヒト哺乳動物細胞、げっ歯類細胞、ラット細胞、マウス細胞、またはハムスター細胞であり得る。他の非ヒト哺乳動物には、例えば、非ヒト霊長類、サル、類人猿、オランウータン、ネコ、イヌ、ウサギ、ウマ、雄ウシ、シカ、バイソン、家畜（例えば、ウシ、去勢雄牛などのウシ種、ヒツジ、ヤギなどのヒツジ種、ならびにブタおよびイノシシなどのブタ種）が含まれる。鳥類には、例えば、ニワトリ、シチメンチョウ、ダチョウ、ガチョウ、アヒルなどが含まれる。飼育動物および農業用動物も含まれる。「非ヒト」という用語はヒトを除外する。
細胞はまた、任意のタイプの未分化または分化状態であり得る。例えば、細胞は、全能性細胞、多能性細胞（例えば、ヒト多能性細胞、またはマウス胚性幹（ＥＳ）細胞またはラットＥＳ細胞などの非ヒト多能性細胞）、または非多能性細胞であってよい。全能性細胞には、任意の細胞型を生じさせることができる未分化細胞が含まれ、多能性細胞には、複数の分化細胞型に発達する能力を有する未分化細胞が含まれる。そのような多能性および／または全能性細胞は、例えば、誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞などのＥＳ細胞またはＥＳ様細胞であり得る。ＥＳ細胞には、胚への導入時に発達中の胚の任意の組織に寄与することができる胚由来の全能性または多能性細胞が含まれる。ＥＳ細胞は、胚盤胞の内部細胞塊に由来するものであり得、３つの脊椎動物胚葉（内胚葉、外胚葉、および中胚葉）のうちのいずれかの細胞に分化することができる。
本明細書で提供される細胞はまた、生殖細胞（例えば、精子または卵母細胞）であってよい。細胞は、有糸分裂能力のある細胞または有糸分裂的に不活性な細胞、減数分裂能力のある細胞または減数分裂的に不活性な細胞であり得る。同様に、細胞はまた、初代体細胞または初代体細胞ではない細胞であり得る。体細胞には、配偶子、生殖細胞、配偶子細胞、または未分化幹細胞ではない任意の細胞が含まれる。例えば、細胞は、肝芽細胞または肝細胞などの肝細胞であり得る。
本明細書で提供される適切な細胞には、一次細胞も含まれる。一次細胞には、生物、器官、または組織から直接単離された細胞または細胞の培養物が含まれる。一次細胞には、形質転換も不死化もされていない細胞が含まれる。それらには、以前に組織培養で継代されなかったか、または以前に組織培養で継代されたが、組織培養で無限に継代することができない生物、器官、または組織から得られた任意の細胞が含まれる。そのような細胞は、従来の技術によって単離することができ、例えば、肝細胞を含む。
本明細書で提供される他の適切な細胞には、不死化細胞が含まれる。不死化細胞には、通常は無限に増殖することはないが、変異または改変に起因して、正常な細胞老化を回避し、代わりに分裂を続けることができる多細胞生物からの細胞も含まれる。そのような変異または改変は、自然に発生し得るか、または意図的に誘導され得る。不死化細胞株の特定の例は、ＨｅｐＧ２ヒト肝癌細胞株である。多くの種類の不死化細胞が周知である。不死化細胞または一次細胞には、典型的には、組換え遺伝子またはタンパク質の培養または発現に使用される細胞が含まれる。
本明細書で提供される細胞はまた、１細胞期胚（すなわち、受精卵母細胞または接合子）を含む。このような１細胞期胚は、任意の遺伝的背景（例えば、マウスの場合はＢＡＬＢ／ｃ、Ｃ５７ＢＬ／６、１２９、またはそれらの組み合わせ）に由来し、新鮮または凍結することができ、自然繁殖または体外受精に由来することができる。
本明細書で提供される細胞は、正常で健康な細胞であってよいか、または罹患した細胞または変異を有する細胞であってよい。
本明細書に記載のヒト化アルブミンを含む非ヒト動物は、本明細書の他の場所に記載される方法によって作製することができる。「動物」という用語は、例えば、哺乳類、魚類、爬虫類、両生類、鳥類、および虫類を含む、動物界の任意のメンバーを含む。特定の例では、非ヒト動物は非ヒト哺乳動物である。非ヒト哺乳動物には、例えば、非ヒト霊長類、サル、類人猿、オランウータン、ネコ、イヌ、ウマ、雄ウシ、シカ、バイソン、ヒツジ、ウサギ、げっ歯類（例えば、マウス、ラット、ハムスター、およびモルモット）、および家畜（例えば、ウシおよび去勢雄牛などのウシ種、ヒツジおよびヤギなどのヒツジ種、ならびにブタおよびイノシシなどのブタ種）が含まれる。鳥には、例えば、鶏、七面鳥、ダチョウ、ガチョウ、およびアヒルが含まれる。家畜および農業用動物も含まれる。「非ヒト動物」という用語は、ヒトを除外する。好ましい非ヒト動物には、例えば、マウスおよびラットなどのげっ歯類が含まれる。
非ヒト動物は、あらゆる遺伝的背景からのものであってよい。例えば、適切なマウスは、１２９系統、Ｃ５７ＢＬ／６系統、１２９とＣ５７ＢＬ／６の雑種、ＢＡＬＢ／ｃ系統、またはスイスウェブスター系統からのものであり得る。１２９系統の例には、１２９Ｐ１、１２９Ｐ２、１２９Ｐ３、１２９Ｘ１、１２９Ｓ１（例えば、１２９Ｓ１／ＳＶ、１２９Ｓ１／Ｓｖｌｍ）、１２９Ｓ２、１２９Ｓ４、１２９Ｓ５、１２９Ｓ９／ＳｖＥｖＨ、１２９Ｓ６（１２９／ＳｖＥｖＴａｃ）、１２９Ｓ７、１２９Ｓ８、１２９Ｔ１、および１２９Ｔ２が含まれる。例えば、Ｆｅｓｔｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｇｅｎｏｍｅ １０：８３６を参照されたく、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。Ｃ５７ＢＬ系統の例には、Ｃ５７ＢＬ／Ａ、Ｃ５７ＢＬ／Ａｎ、Ｃ５７ＢＬ／ＧｒＦａ、Ｃ５７ＢＬ／Ｋａｌ＿ｗＮ、Ｃ５７ＢＬ／６、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、Ｃ５７ＢＬ／６ＢｙＪ、Ｃ５７ＢＬ／６ＮＪ、Ｃ５７ＢＬ／１０、Ｃ５７ＢＬ／１０ＳｃＳｎ、Ｃ５７ＢＬ／１０Ｃｒ、およびＣ５７ＢＬ／Ｏｌａが含まれる。適切なマウスはまた、前述の１２９系統と前述のＣ５７ＢＬ／６系統の雑種（例えば、５０％１２９と５０％Ｃ５７ＢＬ／６）からのものであり得る。同様に、適切なマウスは、前述の１２９系統の雑種または前述のＢＬ／６系統の雑種（例えば、１２９Ｓ６（１２９／ＳｖＥｖＴａｃ）系統）からのものであり得る。
同様に、ラットは、例えば、ＡＣＩラット系統、Ｄａｒｋ Ａｇｏｕｔｉ（ＤＡ）ラット系統、Ｗｉｓｔａｒラット系統、ＬＥＡラット系統、Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラット系統、またはフィッシャーＦ３４４またはフィッシャーＦ６などのフィッシャーラット系統からのものであり得る。ラットはまた、上述の２つ以上の系統の雑種に由来する系統から得ることができる。例えば、適切なラットは、ＤＡ系統またはＡＣＩ系統からのものであり得る。ＡＣＩラット系統は、白い腹と足、およびＲＴ１ａｖ１ハプロタイプを有する黒いアグーチを持っていることを特徴としている。このような系統は、Ｈａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓを含む様々な供給源から入手できる。Ｄａｒｋ Ａｇｏｕｔｉ（ＤＡ）ラット系統は、アグーチコートとＲＴ１ａｖ１ハプロタイプを有することを特徴としている。このようなラットは、Ｃｈａｒｌｅｓ ＲｉｖｅｒおよびＨａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓを含む様々な供給源から入手できる。いくつかの適切なラットは近交系ラット系統に由来する可能性がある。例えば、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２０１４／０２３５９３３を参照されたい。
ヒト化アルブミン遺伝子座（例えば、ホモ接合性ヒト化アルブミン遺伝子座）を含む非ヒト動物（例えば、マウスまたはラット）は、血清アルブミンレベル（例えば、血清ヒトアルブミンレベル）が対照の野生型非ヒト動物における血清アルブミンレベルに匹敵するように、ヒト化アルブミン遺伝子座からアルブミンを発現し得る。一例では、ヒト化アルブミン遺伝子座（例えば、ホモ接合性ヒト化アルブミン遺伝子座）を含む非ヒト動物は、対照の野生型非ヒト動物における血清アルブミンレベルの少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約１００％の血清アルブミンレベル（例えば、血清ヒトアルブミンレベル）を有し得る。別の例において、ヒト化アルブミン遺伝子座（例えば、ホモ接合性ヒト化アルブミン遺伝子座）を含む非ヒト動物は、対照の野生型非ヒト動物における血清アルブミンレベルと少なくとも同じくらい高い血清アルブミンレベル（例えば、血清ヒトアルブミンレベル）を有し得る。別の例において、ヒト化アルブミン遺伝子座（例えば、ホモ接合性ヒト化アルブミン遺伝子座）を含む非ヒト動物は、対照の野生型非ヒト動物における血清アルブミンレベルよりも高い血清アルブミンレベル（例えば、血清ヒトアルブミンレベル）を有し得る。例えば、ヒト化アルブミン遺伝子座（例えば、ホモ接合性ヒト化アルブミン遺伝子座）を含む非ヒト動物は、少なくとも約１ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約２ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約３ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約４ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約６ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約７ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約８ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約９ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約１０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約１１ｍｇ ／ｍＬ、少なくとも約１２ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約１３ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約１４ｍｇ／ｍＬ、または少なくとも約１５ｍｇ／ｍＬの血清アルブミンレベル（例えば、血清ヒトアルブミンレベル）を有し得る。より具体的な例では、ヒト化アルブミン遺伝子座（例えば、ホモ接合性ヒト化アルブミン遺伝子座）を含む非ヒト動物は、マウスであってもよく、少なくとも約１ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約２ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約３ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約４ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約６ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約７ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約８ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約９ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約１０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約１１ｍｇ ／ｍＬ、少なくとも約１２ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約１３ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約１４ｍｇ／ｍＬ、または少なくとも約１５ｍｇ／ｍＬの血清アルブミンレベル（例えば、血清ヒトアルブミンレベル）を有し得る。特定の例では、ヒト化アルブミン遺伝子座（例えば、ホモ接合性ヒト化アルブミン遺伝子座）を含む非ヒト動物（例えば、マウス）は、約１０ｍｇ／ｍＬ～約１５ｍｇ／ｍＬの血清アルブミンレベル（例えば、血清ヒトアルブミンレベル）を有し得る。上記の例のいずれにおいても、ヒト化アルブミン遺伝子座によってコードされるアルブミンは、例えば、ヒトアルブミンシグナルペプチドを含み得る。例えば、一例では、内因性アルブミン遺伝子座のアルブミンコード配列全体が削除され、対応するヒトアルブミン配列で置き換えられているか、または開始コドンから終止コドンまでの内因性アルブミン遺伝子座の領域が削除され、対応するヒトアルブミン配列置き換えられている。
ＩＩＩ．インビボまたはエクスビボでのヒトアルブミン標的化試薬の有効性を評価するためのヒト化アルブミン遺伝子座を含む非ヒト動物を使用する方法
インビボまたはエクスビボでのヒトアルブミン標的化試薬（例えば、治療用分子または複合体）の送達または有効性を評価または最適化するために、本明細書の他の場所に記載されるヒト化アルブミン遺伝子座を含む非ヒト動物を使用するための様々な方法が提供される。非ヒト動物はヒト化アルブミン遺伝子座を含むため、非ヒト動物はヒトアルブミン標的化試薬の有効性をより正確に反映する。本明細書に開示される非ヒト動物は、ランダムなゲノム遺伝子座でのヒトアルブミン配列のトランスジェニック挿入ではなくヒト化内因性アルブミン遺伝子座を含み、かつヒト化内因性アルブミン遺伝子座は、人工ｃＤＮＡ配列ではなく、コード領域と非コード領域の両方からのオーソロガスなヒトゲノムアルブミン配列を含み得るため、そのような非ヒト動物は、ヒトアルブミン遺伝子を標的化するように設計されたゲノム編集試薬を試験するのに特に有用である。
Ａ．インビボまたはエクスビボでのヒトアルブミン標的化試薬の有効性を試験する方法
本明細書の他の場所に記載されているように、ヒト化アルブミン遺伝子座を含む非ヒト動物を使用して、インビボでのヒトアルブミン標的化試薬の送達または有効性を評価するための様々な方法が提供される。そのような方法は、（ａ）非ヒト動物にヒトアルブミン標的化試薬を導入すること（すなわち、ヒトアルブミン標的化試薬を非ヒト動物に投与すること）と、（ｂ）ヒトアルブミン標的化試薬の活性を評価することとを含み得る。
ヒトアルブミン標的化試薬は、ヒトアルブミン遺伝子座（ヒトアルブミン遺伝子）、ヒトアルブミンｍＲＮＡ、またはヒトアルブミンタンパク質を標的化する任意の生物学的または化学的薬剤であり得る。ヒトアルブミン標的化試薬の例は、本明細書の他の場所に開示されており、例えば、ゲノム編集剤が含まれる。例えば、ヒトアルブミン標的化試薬は、アルブミン標的化核酸（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、もしくは低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ））またはアルブミン標的化タンパク質（例えば、Ｃａｓ９、ＺＦＮ、もしくはＴＡＬＥＮなどのＣａｓタンパク質）をコードする核酸であり得る。代替的に、ヒトアルブミン標的化試薬は、アルブミン標的化抗体または抗原結合タンパク質、あるいはヒトアルブミンを標的化する他の任意の大分子または小分子であり得る。一例では、ヒトアルブミン標的化試薬は、ヌクレアーゼ剤および／または外因性ドナー核酸（例えば、標的化ベクター）などのゲノム編集剤である。特定の例では、ゲノム編集剤は、ヒトアルブミン遺伝子のイントロン１、イントロン１２、またはイントロン１３を標的とし得る。例えば、ゲノム編集剤は、ヒトアルブミン遺伝子のイントロン１を標的とし得る。
そのようなヒトアルブミン標的化試薬は、本明細書の他の場所でより詳細に開示されるような任意の送達方法（例えば、ＡＡＶ、ＬＮＰ、またはＨＤＤ）および任意の投与経路によって投与することができる。治療用複合体および分子を送達する手段および投与経路は、本明細書の他の場所でより詳細に開示されている。特定の方法では、試薬はＡＡＶを介した送達を介して送達される。例えば、ＡＡＶ８を使用して肝臓を標的にすることができる。他の特定の方法では、試薬はＬＮＰを介した送達によって送達される。他の特定の方法では、試薬は流体力学的送達（ＨＤＤ）によって送達される。用量は、任意の適切な用量であり得る。例えば、試薬（例えば、Ｃａｓ９ｍＲＮＡおよびｇＲＮＡ）がＬＮＰ媒介送達によって送達されるいくつかの方法では、用量は、約０．０１～約１０ｍｇ／ｋｇの間、約０．０１～約５ｍｇ／ｋｇの間、約０．０１～約４ｍｇ／ｋｇの間、約０．０１～約３ｍｇ／ｋｇの間、約０．０１～約２ｍｇ／ｋｇの間、約０．０１～約１ｍｇ／ｋｇの間、約０．１～約１０ｍｇ／ｋｇの間、約０．１～約６ｍｇ／ｋｇの間；約０．１～約５ｍｇ／ｋｇの間、約０．１～約４ｍｇ／ｋｇの間、約０．１～約３ｍｇ／ｋｇの間、約０．１～約２ｍｇ／ｋｇの間、約０．１～約１ｍｇ／ｋｇの間、約０．３～約１０ｍｇ／ｋｇの間、約０．３～約６ｍｇ／ｋｇの間；約０．３～約５ｍｇ／ｋｇの間、約０．３～約４ｍｇ／ｋｇの間、約０．３～約３ｍｇ／ｋｇの間、約０．３～約２ｍｇ／ｋｇの間、約０．３～約１ｍｇ／ｋｇの間、約０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．３ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ、または約３ｍｇ／ｋｇであり得る。特定の例では、用量は約０．１～約６ｍｇ／ｋｇの間；約０．１～約３ｍｇ／ｋｇの間、または約０．１～約２ｍｇ／ｋｇの間である。
ヒトアルブミン標的化試薬の活性を評価するための方法はよく知られており、本明細書の他の場所で提供されている。活性の評価は、本明細書の他の場所に開示されているように、任意の細胞型、任意の組織型、または任意の器官型であり得る。いくつかの方法では、活性の評価は肝細胞で行われる。アルブミン標的化試薬がゲノム編集試薬（例えば、ヌクレアーゼ剤）である場合、そのような方法は、ヒト化アルブミン遺伝子座の修飾を評価することを含み得る。一例として、評価は、ヒト化アルブミン遺伝子座での非相同末端結合（ＮＨＥＪ）活性の測定を含み得る。これは、例えば、ヒト化アルブミン遺伝子座内の挿入または欠失の頻度を測定することを含み得る。例えば、評価は、非ヒト動物から単離された１つ以上の細胞におけるヒト化アルブミン遺伝子座の配列決定（例えば、次世代シーケンシング）を含み得る。評価は、非ヒト動物から標的器官または組織（例えば、肝臓）または組織を単離することと、標的器官または組織におけるヒト化アルブミン遺伝子座の修飾を評価することと、を含み得る。評価はまた、標的器官または組織内の２つ以上の異なる細胞型におけるヒト化アルブミン遺伝子座の修飾を評価することを含み得る。同様に、評価は、非標的器官または組織（例えば、２つ以上の非標的器官または組織）を非ヒト動物から単離することと、非標的器官または組織におけるヒト化アルブミン遺伝子座の修飾を評価することとを含み得る。
そのような方法はまた、ヒト化アルブミン遺伝子座によって産生されるｍＲＮＡの発現レベルを測定すること、またはヒト化アルブミン遺伝子座によってコードされるタンパク質の発現レベルを測定することを含み得る。例えば、タンパク質レベルは、特定の細胞、組織、または器官のタイプ（例えば、肝臓）で測定することができ、または分泌レベルは、血清で測定することができる。ヒト化アルブミン遺伝子座から発現されるアルブミンｍＲＮＡまたはタンパク質の発現を評価するための方法は、本明細書の他の場所で提供されており、よく知られている。一例として、ＢＡＳＥＳＣＯＰＥ（商標）ＲＮＡインサイチュハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）アッセイを使用して、例えば、細胞特異的に編集された転写物を定量化することができる。
いくつかの方法では、ヒトアルブミン標的化試薬は、外因性ドナー核酸（例えば、標的化ベクター）を含む。そのような外因性ドナー核酸は、野生型内因性アルブミン遺伝子座によってコード化または発現されない外因性タンパク質をコードすることができる（例えば、外因性タンパク質をコードする挿入核酸を含むことができる）。一例では、外因性タンパク質は、野生型内因性アルブミン遺伝子座によってコードまたは発現されていないタンパク質に融合されたヒトアルブミンシグナルペプチドを含む異種タンパク質であり得る。一例では、外因性ドナー核酸によってコードされる外因性タンパク質は、ヒト化アルブミン遺伝子座に一度組み込まれると、野生型内因性アルブミン遺伝子座によってコードまたは発現されていないタンパク質に融合されたヒトアルブミンシグナルペプチドを含む異種タンパク質であり得る。いくつかの方法では、評価は、外因性ドナー核酸によってコードされるメッセンジャーＲＮＡの発現を測定することを含み得る。評価は、外因性タンパク質の発現を測定することも含み得る。例えば、外因性タンパク質の発現は、非ヒト動物の肝臓において測定することができるか、または外因性タンパク質の血清レベルを測定することができる。
いくつかの方法では、本明細書の他の場所に記載されるヒト化アルブミン遺伝子座を含む非ヒト動物は、アルブミン遺伝子座ではない不活化（ノックアウト）内因性遺伝子をさらに含み、任意選択で、ヒトアルブミン標的化試薬は、不活化された内因性遺伝子の機能を置き換えるために外因性タンパク質をコードする外因性ドナー核酸（例えば、標的化ベクター）を含む。特定の例では、不活化された内因性遺伝子はＦ９であり、外因性タンパク質は凝固第ＩＸ因子（例えば、ヒト凝固第ＩＸ因子）である。
いくつかの方法では、ヒトアルブミン標的化試薬は、（１）ヒトアルブミン遺伝子の領域を標的化するように設計されたヌクレアーゼ剤と、（２）外因性ドナー核酸とを含み、外因性ドナー核酸は、ヒトアルブミン遺伝子を標的化するように設計されている。外因性ドナー核酸は、例えば、外因性タンパク質をコードすることができ、任意選択で、外因性ドナー核酸で標的化されたヒト化内因性アルブミン遺伝子座によってコードされるタンパク質は、外因性タンパク質に融合されたヒトアルブミンシグナルペプチドを含む異種タンパク質である。
１つの特定の例として、ヒトアルブミン標的化試薬がゲノム編集試薬（例えば、ヌクレアーゼ剤）である場合、ヒト化アルブミン遺伝子座での編集パーセント（例えば、溶解した細胞のプールからＰＣＲ反応で読み取られた配列の総数に対して観察された挿入または欠失の総数）を評価することができる（例えば、肝細胞において）。
インビボでの活性を評価するための上記で提供される様々な方法はまた、本明細書の他の場所に記載されるように、エクスビボでのヒトアルブミン標的化試薬の活性を評価するために使用され得る。
いくつかの方法では、ヒトアルブミン標的化試薬は、ヒトアルブミン遺伝子を標的化するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ剤などのヌクレアーゼ剤である。そのような方法は、例えば、（ａ）ヒトアルブミン遺伝子を切断するように設計されたヌクレアーゼ剤（例えば、Ｃａｓ９などのＣａｓタンパク質およびヒトアルブミン遺伝子のガイドＲＮＡ標的配列を標的とするように設計されたガイドＲＮＡ）を非ヒト動物に導入することと、（ｂ）ヒト化アルブミン遺伝子座の修飾を評価することとを含み得る。
例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼの場合、ガイドＲＮＡがＣａｓタンパク質と複合体を形成し、Ｃａｓタンパク質をヒト化アルブミン遺伝子座に向けると、ヒト化アルブミン遺伝子座の修飾が誘導され、Ｃａｓ／ガイドＲＮＡ複合体はガイドＲＮＡ標的配列を切断し、細胞による修復を引き起こす（例えば、ドナー配列が存在しない場合、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）を介して）。
任意選択で、２つ以上のガイドＲＮＡを導入することができ、それぞれが、ヒトアルブミン遺伝子内の異なるガイドＲＮＡ標的配列を標的化するように設計されている。例えば、２つのガイドＲＮＡは、２つのガイドＲＮＡ標的配列の間のゲノム配列を切除するように設計することができる。ヒト化アルブミン遺伝子座の修飾は、第１のガイドＲＮＡがＣａｓタンパク質と複合体を形成してＣａｓタンパク質をヒト化アルブミン遺伝子座に向け、第２のガイドＲＮＡがＣａｓタンパク質と複合体を形成してＣａｓタンパク質をヒト化アルブミン遺伝子座に向け、第１のＣａｓ／ガイドＲＮＡ複合体が第１のガイドＲＮＡ標的配列を切断し、かつ第２のＣａｓ／ガイドＲＮＡ複合体が第２のガイドＲＮＡ標的配列を切断したときに誘導され、その結果、介在する配列が切除される。
追加的または代替的に、ヒトアルブミン遺伝子と再結合でき、それを修飾することができる外因性ドナー核酸（例えば、標的化ベクター）もまた、非ヒト動物に導入される。任意選択で、ヌクレアーゼ剤またはＣａｓタンパク質は、本明細書の他の場所に記載されているように、外因性ドナー核酸に係留され得る。ヒト化アルブミン遺伝子座の修飾は、例えば、ガイドＲＮＡがＣａｓタンパク質と複合体を形成し、Ｃａｓタンパク質をヒト化アルブミン遺伝子座に向ける場合、Ｃａｓ／ガイドＲＮＡ複合体がガイドＲＮＡ標的配列を切断し、ヒト化アルブミン遺伝子座は外因性ドナー核酸と再結合してヒト化アルブミン遺伝子座を修飾する。外因性ドナー核酸は、例えば、相同性指向修復（ＨＤＲ）またはＮＨＥＪ媒介挿入を介して、ヒト化アルブミン遺伝子座と組換えることができる。任意のタイプの外因性ドナー核酸を使用することができ、その例は本明細書の他の場所に提供されている。
いくつかの方法では、ヒトアルブミン標的化試薬は、外因性ドナー核酸（例えば、標的化ベクター）を含む。そのような外因性ドナー核酸は、野生型内因性アルブミン遺伝子座によってコード化または発現されない外因性タンパク質をコードすることができる（例えば、外因性タンパク質をコードする挿入核酸を含むことができる）。一例では、外因性タンパク質は、野生型内因性アルブミン遺伝子座によってコードまたは発現されていないタンパク質に融合されたヒトアルブミンシグナルペプチドを含む異種タンパク質であり得る。例えば、外因性ドナー核酸は、スプライスアクセプターを含むプロモーターのないカセットであってよく、外因性ドナー核酸は、ヒトアルブミンの最初のイントロンを標的とすることができる。
Ｂ．インビボまたはエクスビボでのヒトアルブミン標的化試薬の送達または有効性を最適化する方法
細胞または非ヒト動物へのヒトアルブミン標的化試薬の送達を最適化するため、またはインビボでのヒトアルブミン標的化試薬の活性または有効性を最適化するために、様々な方法が提供される。そのような方法は、例えば、（ａ）ヒト化アルブミン遺伝子座を含む第１の非ヒト動物または第１の細胞において、上記のようなヒトアルブミン標的化試薬の有効性を試験する方法を１回目に実行することと、（ｂ）可変要素を変更し、方法を、ヒト化アルブミン遺伝子座を含む第２の非ヒト動物（すなわち、同じ種の）または第２の細胞において変更された可変要素を用いて２回目に実行することと、（ｃ）ステップ（ａ）のヒトアルブミン標的化試薬の活性をステップ（ｂ）のヒトアルブミン標的化試薬の活性と比較し、より高い活性をもたらす方法を選択することとを含み得る。
ヒトアルブミン標的化試薬の送達、有効性、または活性を測定する方法は、本明細書の他の場所に開示されている。例えば、そのような方法は、ヒト化アルブミン遺伝子座の修飾を測定することを含み得る。ヒト化アルブミン遺伝子座のより効果的な修飾は、非ヒト動物または細胞内の望ましい効果に応じて異なることを意味し得る。例えば、ヒト化アルブミン遺伝子座のより効果的な修飾は、より高いレベルの修飾、より高い精度、より高い一貫性、またはより高い特異性の１つ以上またはすべてを意味し得る。ヒト化アルブミン遺伝子座のより高いレベルの修飾（すなわち、より高い効力）は、特定の標的細胞型内、特定の標的組織内、または特定の標的器官（例えば、肝臓）内で標的化される細胞のより高いパーセンテージを指す。より高い精度は、ヒト化アルブミン遺伝子座のより正確な修飾（例えば、同じ修飾を有するか、または余分な意図しない挿入および欠失（例えば、ＮＨＥＪインデル）なしに所望の修飾を有する標的細胞のより高いパーセンテージ）を指す。より高い一貫性とは、複数の型の細胞、組織、または器官が標的化される場合、異なる型の標的細胞、組織、または器官の間でヒト化アルブミン遺伝子座のより一貫した修飾（例えば、肝臓内のより多くの細胞型の修飾）を指す。特定の器官が標的にされている場合、より高い一貫性は、器官内（例えば、肝臓）のすべての場所全体でより一貫性のある改変を指すこともできる。より高い特異性は、標的とされるゲノム遺伝子座もしくは複数の遺伝子座に関するより高い特異性、標的とされる細胞型に関するより高い特異性、標的とされる組織型に関するより高い特異性、または標的とされる器官に関するより高い特異性を指すことができる。例えば、ゲノム遺伝子座の特異性の増加は、オフターゲットゲノム遺伝子座の改変が少ないことを指す（例えば、標的ゲノム遺伝子座の改変に変えて、あるいは加えて、意図しないオフターゲットゲノム遺伝子座に改変を有する標的細胞のパーセンテージが低い）。同様に、細胞型、組織、または器官型の特異性の増加は、特定の細胞型、組織型、または器官型が標的にされている場合、オフターゲットの細胞型、組織型、または器官型の改変が少ないことを指す。（例えば、特定の器官（例えば、肝臓）が標的とされる場合、意図された標的ではない器官または組織の細胞の改変が少ない）。
変更される可変要素は、任意のパラメータにすることができる。一例として、変更された可変要素は、ヒトアルブミン標的化試薬または複数の試薬が細胞または非ヒト動物に導入されるパッケージングまたは送達方法であり得る。ＬＮＰ、ＨＤＤ、およびＡＡＶなどの送達方法の例は、本明細書の他の場所に開示されている。例えば、変更された可変要素はＡＡＶ血清型であり得る。同様に、投与はＬＮＰ媒介送達を含み得、変更された可変要素はＬＮＰ製剤であり得る。別の例として、変更された可変要素は、ヒトアルブミン標的化試薬または複数の試薬を細胞または非ヒト動物に導入するための投与経路であり得る。静脈内、硝子体内、実質内、および鼻腔内注入（ｎａｓａｌ ｉｎｓｔｉｌｌａｔｉｏｎ）などの投与経路の例は、本明細書の他の場所に開示されている。
別の例として、変更された可変要素は、導入されたヒトアルブミン標的化試薬または複数の試薬の濃度または量であり得る。別の例として、変更された可変要素は、導入された別のヒトアルブミン標的化試薬（例えば、ガイドＲＮＡ、Ｃａｓタンパク質、または外因性ドナー核酸）の濃度または量と比較した、導入された１つのヒトアルブミン標的化試薬（例えば、ガイドＲＮＡ、Ｃａｓタンパク質、または外因性ドナー核酸）の濃度または量であり得る。
別の例として、変更された可変要素は、試薬の活性または有効性を評価するタイミングと比較した、ヒトアルブミン標的化試薬または複数の試薬を導入するタイミングであり得る。別の例として、変更された可変要素は、ヒトアルブミン標的化試薬または複数の試薬が導入される回数または頻度であり得る。別の例として、変更された可変要素は、導入された別のヒトアルブミン標的化試薬（例えば、ガイドＲＮＡ、Ｃａｓタンパク質、または外因性ドナー核酸）のタイミングと比較した、導入された１つのヒトアルブミン標的化試薬（例えば、ガイドＲＮＡ、Ｃａｓタンパク質、または外因性ドナー核酸）のタイミングであり得る。
別の例として、変更された可変要素は、ヒトアルブミン標的化試薬または複数の試薬が導入される形態であり得る。例えば、ガイドＲＮＡは、ＤＮＡの形態またはＲＮＡの形態で導入することができる。Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９）は、ＤＮＡの形態、ＲＮＡの形態、またはタンパク質の形態（例えば、ガイドＲＮＡと複合体を形成している）で導入することができる。外因性ドナー核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、一本鎖、二本鎖、線状、環状などであり得る。同様に、各構成要素は、安定性のため、オフターゲット効果を低減するため、送達を容易にするためなどのための改変の様々な組み合わせを含むことができる。
別の例として、変更された可変要素は、導入されるヒトアルブミン標的化試薬または複数の試薬であり得る。例えば、ヒトアルブミン標的化試薬がガイドＲＮＡを含む場合、変更された可変要素は、異なる配列（例えば、異なるガイドＲＮＡ標的配列を標的化する）を有する異なるガイドＲＮＡを導入することができる。同様に、ヒトアルブミン標的化試薬がＣａｓタンパク質を含む場合、変更された可変要素は、異なるＣａｓタンパク質を導入することができる（例えば、異なる配列を有する異なるＣａｓタンパク質、または異なる配列を有する（例えば、コドン最適化）が、同じＣａｓタンパク質アミノ酸配列をコードする核酸を導入する）。同様に、ヒトアルブミン標的化試薬が外因性ドナー核酸を含む場合、変更された可変要素は、異なる配列（例えば、異なる挿入核酸または異なる相同性アーム（例えば、より長いまたはより短い相同性アームまたはヒトアルブミン遺伝子の異なる領域を標的化する相同性アーム））を有する異なる外因性ドナー核酸を導入することができる。
特定の例では、ヒトアルブミン標的化試薬は、Ｃａｓタンパク質と、ヒトアルブミン遺伝子のガイドＲＮＡ標的配列を標的化するように設計されたガイドＲＮＡとを含む。そのような方法では、変更された可変要素は、ガイドＲＮＡ配列および／またはガイドＲＮＡ標的配列であり得る。いくつかのそのような方法において、Ｃａｓタンパク質およびガイドＲＮＡは、それぞれＲＮＡの形態で投与することができ、変更された可変要素は、ガイドＲＮＡに対するＣａｓ ｍＲＮＡの比であり得る（例えば、ＬＮＰ製剤において）。いくつかのそのような方法において、変更された可変要素は、ガイドＲＮＡ改変であり得る（例えば、改変を有するガイドＲＮＡは、改変されていないガイドＲＮＡと比較される）。
Ｃ．ヒトアルブミン標的化試薬
ヒトアルブミン標的化試薬は、ヒトアルブミン遺伝子、ヒトアルブミンｍＲＮＡ、またはヒトアルブミンタンパク質を標的化する任意の試薬であり得る。例えば、それはヒトアルブミン遺伝子と再結合するヒトアルブミン遺伝子および／または外因性ドナー配列内の標的配列を切断するヌクレアーゼ剤などのゲノム編集試薬であり得るか、それはヒトアルブミンｍＲＮＡを標的化するアンチセンスオリゴヌクレオチドであり得るか、それはヒトアルブミンタンパク質のエピトープを標的化する抗原結合タンパク質であり得るか、またはそれはヒトアルブミンを標的化する小分子であり得る。本明細書に開示される方法におけるヒトアルブミン標的化試薬は、既知のヒトアルブミン標的化試薬であり得るか、推定上のアルブミン標的化試薬（例えば、ヒトアルブミンを標的化するように設計された候補試薬）であり得るか、またはヒトアルブミン標的化活性についてスクリーニングされている試薬であり得る。
（１）ヒトアルブミン遺伝子を標的化するヌクレアーゼ剤
ヒトアルブミン標的化試薬は、ヒトアルブミン遺伝子内の標的配列を切断するヌクレアーゼ剤などのゲノム編集試薬であり得る。ヌクレアーゼ標的配列は、ヌクレアーゼ剤によってニックまたは二本鎖切断が誘導されるＤＮＡ配列を含む。ヌクレアーゼ剤の標的配列は、細胞に対して内因性（または天然）であり得るか、または標的配列は、細胞に対して外因性であり得る。細胞にとって外因性である標的配列は、細胞のゲノム内で天然に存在しない。標的配列はまた、標的遺伝子座に配置されることを望む目的のポリヌクレオチドに対して外因性であり得る。場合によっては、標的配列は宿主細胞のゲノムに一度だけ存在する。特定の例では、ヌクレアーゼ標的配列は、ヒトアルブミン遺伝子のイントロン１、イントロン１２、またはイントロン１３であり得る。例えば、ヌクレアーゼ標的配列は、ヒトアルブミン遺伝子のイントロン１にあり得る。
標的配列の長さは変動してもよく、例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）対の場合は約３０～３６ｂｐ（すなわち、各ＺＦＮについて約１５～１８ｂｐ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）の場合は約３６ｂｐ、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ガイドＲＮＡの場合は約２０ｂｐの標的配列を含む。
所望の標的配列においてニックまたは二本鎖切断を誘導する任意のヌクレアーゼ剤を、本明細書に開示される方法および組成物で使用することができる。ヌクレアーゼ剤が所望の標的配列においてニックまたは二本鎖切断を誘導する限り、天然に存在するまたは天然のヌクレアーゼ剤を使用することができる。代替的に、改変または操作されたヌクレアーゼ剤を使用することができる。「操作されたヌクレアーゼ剤」は、その天然の形態から操作された（改変または誘導された）ヌクレアーゼを含み、所望の標的配列においてニックまたは二本鎖切断を特異的に認識および誘導する。したがって、操作されたヌクレアーゼ剤は、天然の天然に存在するヌクレアーゼ剤から誘導することができ、または人工的に作成または合成することができる。操作されたヌクレアーゼは、例えば、標的配列においてニックまたは二本鎖切断を誘導することができ、標的配列は、天然の（非操作または非修飾）ヌクレアーゼ剤によって認識されたであろう配列ではない。ヌクレアーゼ剤の改変は、タンパク質切断剤中のわずか１アミノ酸または核酸切断剤中の１ヌクレオチドであってもよい。標的配列または他のＤＮＡにニックまたは二本鎖切断を生じさせることは、本明細書では、標的配列または他のＤＮＡを「切断する（ｃｕｔｔｉｎｇ）」または「切断する（ｃｌｅａｖｉｎｇ）」と呼ぶことができる。
例示された標的配列の活性バリアントおよび断片も提供される。そのような活性変異体は、所与の標的配列に対して少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性を含むことができ、活性変異体は生物学的活性を保持し、したがって配列特異的様式でヌクレアーゼ剤によって認識および切断され得る。ヌクレアーゼ剤による標的配列の二本鎖切断を測定するためのアッセイは公知である。例えば、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれるＦｒｅｎｄｅｗｅｙ ｅｔ ａｌ．（２０１０） Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ４７６：２９５－３０７を参照されたい。
ヌクレアーゼ剤の標的配列は、アルブミン遺伝子座の中または近くのどこであってもよい。標的配列は、アルブミン遺伝子のコード領域内、または遺伝子の発現に影響を及ぼす調節領域内に位置してもよい。ヌクレアーゼ剤の標的配列は、イントロン、エキソン、プロモーター、エンハンサー、調節領域、または任意の非タンパク質コード領域に位置してもよい。
ヌクレアーゼ剤の１つの種類は、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）である。ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼは、原核生物または真核生物のゲノム内の特定の標的配列で二本鎖切断を行うために使用できる配列特異的ヌクレアーゼのクラスである。ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼは、天然または操作された転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクター、またはその機能的部分を、例えば、ＦｏｋＩなどのエンドヌクレアーゼの触媒ドメインに融合することによって作成される。独自のモジュラーＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインにより、特定のＤＮＡ認識特異性を備えたタンパク質の設計が可能になる。したがって、ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインは、特定のＤＮＡ標的部位を認識するように操作することができ、したがって、所望の標的配列で二本鎖切断を行うために使用することができる。ＷＯ２０１０／０７９４３０、Ｍｏｒｂｉｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１０） ＰＮＡＳ １０．１０７３／ｐｎａｓ．１０１３１３３１０７、Ｓｃｈｏｌｚｅ ＆ Ｂｏｃｈ （２０１０） Ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ １：４２８－４３２、Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ （２０１０） １８６：７５７－７６１、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．（２０１０） Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（２０１０） ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｑ７０４、およびＭｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１１） Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２９：１４３－１４８を参照されたく、これらのうちのそれぞれが、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
適切なＴＡＬヌクレアーゼの例、および適切なＴＡＬヌクレアーゼを調製するための方法は、例えば、これらのうちのそれぞれがその全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ２０１１／０２３９３１５Ａ１、ＵＳ２０１１／０２６９２３４Ａ１、ＵＳ２０１１／０１４５９４０Ａ１、ＵＳ２００３／０２３２４１０Ａ１、ＵＳ２００５／０２０８４８９Ａ１、ＵＳ２００５／００２６１５７Ａ１、ＵＳ２００５／００６４４７４Ａ１、ＵＳ２００６／０１８８９８７Ａ１、およびＵＳ２００６／００６３２３１Ａ１に開示されている。様々な実施形態では、例えば、目的の遺伝子座または目的のゲノム遺伝子座において標的核酸配列内またはその近くを切断するＴＡＬエフェクターヌクレアーゼが操作され、ここで、標的核酸配列は、ターゲティングベクターによって改変される配列またはその近くにある。本明細書で提供される様々な方法および組成物での使用に適したＴＡＬヌクレアーゼには、本明細書に記載の標的ベクターによって改変される標的核酸配列またはその近くに結合するように特別に設計されたものが含まれる。
一部のＴＡＬＥＮでは、ＴＡＬＥＮの各モノマーは、２つの超可変残基を介して単一の塩基対を認識する３３～３５のＴＡＬリピートを含む。一部のＴＡＬＥＮでは、ヌクレアーゼ剤は、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼなどの独立したヌクレアーゼに作動可能に連結されたＴＡＬリピートベースのＤＮＡ結合ドメインを含むキメラタンパク質である。例えば、ヌクレアーゼ剤は、第１のＴＡＬリピートベースのＤＮＡ結合ドメインおよび第２のＴＡＬリピートベースのＤＮＡ結合ドメインを含むことができ、第１および第２のＴＡＬリピートベースのＤＮＡ結合ドメインのそれぞれは、ＦｏｋＩヌクレアーゼに作動可能に連結され、第１および第２のＴＡＬリピートベースのＤＮＡ結合ドメインは、様々な長さ（１２～２０ｂｐ）のスペーサー配列によって分離された標的ＤＮＡ配列の各鎖における２つの隣接する標的ＤＮＡ配列を認識し、ＦｏｋＩヌクレアーゼサブユニットは二量体化して、標的配列で二本鎖切断を行う活性ヌクレアーゼを作成する。
本明細書に開示される様々な方法および組成物で使用されるヌクレアーゼ剤は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）をさらに含むことができる。一部のＺＦＮでは、ＺＦＮの各モノマーは３つ以上のジンクフィンガーベースのＤＮＡ結合ドメインを含み、各ジンクフィンガーベースのＤＮＡ結合ドメインは３ｂｐのサブサイトに結合する。他のＺＦＮでは、ＺＦＮは、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼなどの独立したヌクレアーゼに作動可能に連結されたジンクフィンガーベースのＤＮＡ結合ドメインを含むキメラタンパク質である。例えば、ヌクレアーゼ剤は、第１のＺＦＮおよび第２のＺＦＮを含むことができ、第１および第２のＺＦＮのそれぞれは、ＦｏｋＩヌクレアーゼサブユニットに作動可能に連結され、第１および第２のＺＦＮは、約５～７ｂｐのスペーサーで分離された標的ＤＮＡ配列の各鎖における２つの隣接する標的ＤＮＡ配列を認識し、ＦｏｋＩヌクレアーゼサブユニットは二量体化して、二本鎖切断を行う活性ヌクレアーゼを生成する。例えば、これらのうちのそれぞれは、参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ２００６／０２４６５６７、ＵＳ２００８／０１８２３３２、ＵＳ２００２／００８１６１４、ＵＳ２００３／００２１７７６、ＷＯ／２００２／０５７３０８Ａ２、ＵＳ２０１３／０１２３４８４、ＵＳ２０１０／０２９１０４８、ＷＯ／２０１１／０１７２９３Ａ２、およびＧａｊ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３１（７）：３９７－４０５を参照されたい。
別の種類のヌクレアーゼ剤は、操作されたメガヌクレアーゼである。メガヌクレアーゼは、保存された配列モチーフに基づいて４つのファミリーに分類されており、ファミリーはＬＡＧＬＩＤＡＤＧ、ＧＩＹ－ＹＩＧ、Ｈ－Ｎ－Ｈ、およびＨｉｓ－Ｃｙｓボックスファミリーである。これらのモチーフは、金属イオンの配位とホスホジエステル結合の加水分解に関与する。メガヌクレアーゼは、それらの長い標的配列、およびそれらのＤＮＡ基質におけるいくつかの配列多型を許容することで注目に値する。メガヌクレアーゼドメインは、構造および機能は既知であり、例えば、Ｇｕｈａｎ ａｎｄ Ｍｕｎｉｙａｐｐａ（２００３）Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３８：１９９－２４８、Ｌｕｃａｓ ｅｔ ａｌ．，（２００１） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２９：９６０－９、Ｊｕｒｉｃａ ａｎｄ Ｓｔｏｄｄａｒｄ，（１９９９）Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ ５５：１３０４－２６、Ｓｔｏｄｄａｒｄ，（２００６）Ｑ Ｒｅｖ Ｂｉｏｐｈｙｓ ３８：４９－９５、およびＭｏｕｒｅ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ ９：７６４を参照されたい。いくつかの例では、天然に存在する変異体および／または操作された誘導体メガヌクレアーゼが使用される。動態、補因子相互作用、発現、最適条件、および／または標的配列特異性を改変するための方法、および活性のスクリーニングは公知である。例えば、これらのうちのそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｅｐｉｎａｔ ｅｔ ａｌ．，（２００３） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３１：２９５２－６２、Ｃｈｅｖａｌｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２００２） Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ １０：８９５－９０５、Ｇｉｍｂｌｅ ｅｔ ａｌ．，（２００３） Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３３４：９９３－１００８、Ｓｅｌｉｇｍａｎ ｅｔ ａｌ．，（２００２） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３０：３８７０－９、Ｓｕｓｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，（２００４） Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３４２：３１－４１、Ｒｏｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，（２００６） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３４：４７９１－８００、Ｃｈａｍｅｓ ｅｔ ａｌ．，（２００５） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３３：ｅ１７８、Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，（２００６） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３４：ｅ１４９、Ｇｒｕｅｎ ｅｔ ａｌ．，（２００２） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３０：ｅ２９、Ｃｈｅｎ ａｎｄ Ｚｈａｏ，（２００５） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３３：ｅ１５４、ＷＯ２００５／１０５９８９、ＷＯ２００３／０７８６１９、ＷＯ２００６／０９７８５４、ＷＯ２００６／０９７８５３、ＷＯ２００６／０９７７８４、およびＷＯ２００４／０３１３４６を参照されたい。
例えば、Ｉ－ＳｃｅＩ、Ｉ－ＳｃｅＩＩ、Ｉ－ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ－ＳｃｅＩＶ、Ｉ－ＳｃｅＶ、Ｉ－ＳｃｅＶＩ、Ｉ－ＳｃｅＶＩＩ、Ｉ－ＣｅｕＩ、Ｉ－ＣｅｕＡＩＩＰ、Ｉ－ＣｒｅＩ、Ｉ－ＣｒｅｐｓｂＩＰ、Ｉ－ＣｒｅｐｓｂＩＩＰ、Ｉ－ＣｒｅｐｓｂＩＩＩＰ、Ｉ－ＣｒｅｐｓｂＩＶＰ、Ｉ－ＴｌｉＩ、Ｉ－ＰｐｏＩ、ＰＩ－ＰｓｐＩ、Ｆ－ＳｃｅＩ、Ｆ－ＳｃｅＩＩ、Ｆ－ＳｕｖＩ、Ｆ－ＴｅｖＩ、Ｆ－ＴｅｖＩＩ、Ｉ－ＡｍａＩ、Ｉ－ＡｎｉＩ、Ｉ－ＣｈｕＩ、Ｉ－ＣｍｏｅＩ、Ｉ－ＣｐａＩ、Ｉ－ＣｐａＩＩ、Ｉ－ＣｓｍＩ、Ｉ－ＣｖｕＩ、Ｉ－ＣｖｕＡＩＰ、Ｉ－ＤｄｉＩ、Ｉ－ＤｄｉＩＩ、Ｉ－ＤｉｒＩ、Ｉ－ＤｍｏＩ、Ｉ－ＨｍｕＩ、Ｉ－ＨｍｕＩＩ、Ｉ－ＨｓＮＩＰ、Ｉ－ＬｌａＩ、Ｉ－ＭｓｏＩ、Ｉ－ＮａａＩ、Ｉ－ＮａｎＩ、Ｉ－ＮｃＩＩＰ、Ｉ－ＮｇｒＩＰ、Ｉ－ＮｉｔＩ、Ｉ－ＮｊａＩ、Ｉ－Ｎｓｐ２３６ＩＰ、Ｉ－ＰａｋＩ、Ｉ－ＰｂｏＩＰ、Ｉ－ＰｃｕＩＰ、Ｉ－ＰｃｕＡＩ、Ｉ－ＰｃｕＶＩ、Ｉ－ＰｇｒＩＰ、Ｉ－ＰｏｂＩＰ、Ｉ－ＰｏｒＩ、Ｉ－ＰｏｒＩＩＰ、Ｉ－ＰｂｐＩＰ、Ｉ－ＳｐＢｅｔａＩＰ、Ｉ－ＳｃａＩ、Ｉ－ＳｅｘＩＰ、Ｉ－ＳｎｅＩＰ、Ｉ－ＳｐｏｍＩ、Ｉ－ＳｐｏｍＣＰ、Ｉ－ＳｐｏｍＩＰ、Ｉ－ＳｐｏｍＩＩＰ、Ｉ－ＳｑｕＩＰ、Ｉ－Ｓｓｐ６８０３Ｉ、Ｉ－ＳｔｈＰｈｉＪＰ、Ｉ－ＳｔｈＰｈｉＳＴ３Ｐ、Ｉ－ＳｔｈＰｈｉＳＴｅ３ｂＰ、Ｉ－ＴｄｅＩＰ、Ｉ－ＴｅｖＩ、Ｉ－ＴｅｖＩＩ、Ｉ－ＴｅｖＩＩＩ、Ｉ－ＵａｒＡＰ、Ｉ－ＵａｒＨＧＰＡＩＰ、Ｉ－ＵａｒＨＧＰＡ１３Ｐ、Ｉ－ＶｉｎＩＰ、Ｉ－ＺｂｉＩＰ、ＰＩ－ＭｔｕＩ、ＰＩ－ＭｔｕＨＩＰ、ＰＩ－ＭｔｕＨＩＩＰ、ＰＩ－ＰｆｕＩ、ＰＩ－ＰｆｕＩＩ、ＰＩ－ＰｋｏＩ、ＰＩ－ＰｋｏＩＩ、ＰＩ－Ｒｍａ４３８１２ＩＰ、ＰＩ－ＳｐＢｅｔａＩＰ、ＰＩ－ＳｃｅＩ、ＰＩ－ＴｆｕＩ、ＰＩ－ＴｆｕＩＩ、ＰＩ－ＴｈｙＩ、ＰＩ－ＴｌｉＩ、ＰＩ－ＴｌｉＩＩ、またはそれらのアクティブな変異体またはフラグメントを含む、任意のメガヌクレアーゼを使用することができる。
メガヌクレアーゼは、例えば、１２～４０塩基対の二本鎖ＤＮＡ配列を認識することができる。場合によっては、メガヌクレアーゼは、ゲノム内の完全に一致する１つの標的配列を認識する。
一部のメガヌクレアーゼは、ホーミングヌクレアーゼである。ホーミングヌクレアーゼの１つのタイプは、例えば、Ｉ－ＳｃｅＩ、Ｉ－ＣｒｅＩ、およびＩ－Ｄｍｏｌを含むホーミングヌクレアーゼのＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリーである。
ヌクレアーゼ剤は、以下により詳細に記載されるように、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムをさらに含むことができる。
ヌクレアーゼ剤（すなわち、操作されたヌクレアーゼ剤）の活性バリアントおよび断片も提供される。そのような活性バリアントは、天然のヌクレアーゼ剤に対して、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有していてもよく、活性バリアントは、所望の標的配列で切断する能力を保持し、したがって、ニックまたは二本鎖切断誘導活性を保持する。例えば、本明細書に記載のヌクレアーゼ剤のいずれも、天然エンドヌクレアーゼ配列から改変し、天然ヌクレアーゼ剤によって認識されなかった標的配列でニックまたは二本鎖切断を認識および誘導するように設計してもよい。したがって、いくつかの操作されたヌクレアーゼは、対応する天然のヌクレアーゼ剤標的配列とは異なる標的配列でニックまたは二本鎖切断を誘導する特異性を有する。ニックまたは二本鎖切断誘導活性のためのアッセイは知られており、一般に、標的配列を含むＤＮＡ基質上のエンドヌクレアーゼの全体的な活性および特異性を測定する。
ヌクレアーゼ剤は、任意の既知の手段によって細胞または非ヒト動物に導入することができる。ヌクレアーゼ剤をコードするポリペプチドは、細胞または非ヒト動物に直接導入してもよい。代替的に、ヌクレアーゼ剤をコードするポリヌクレオチドを細胞または非ヒト動物に導入してもよい。ヌクレアーゼ剤をコードするポリヌクレオチドが導入されると、ヌクレアーゼ剤は、一時的、条件付き、または構成的に細胞内で発現され得る。ヌクレアーゼ剤をコードするポリヌクレオチドは、発現カセットに含まれ得、条件付きプロモーター、誘導性プロモーター、構成的プロモーター、または組織特異的プロモーターに作動可能に連結され得る。プロモーターの例は、本明細書の他の場所でさらに詳細に論じられている。代替的に、ヌクレアーゼ剤は、ヌクレアーゼ剤をコードするｍＲＮＡとして細胞に導入され得る。
ヌクレアーゼ剤をコードするポリヌクレオチドは、細胞のゲノムに安定して組み込まれ、細胞内で活性なプロモーターに作動可能に連結され得る。代替的に、ヌクレアーゼ剤をコードするポリヌクレオチドは、標的化ベクター内にあり得る。
ヌクレアーゼ剤をコードするポリヌクレオチドの導入によりヌクレアーゼ剤が細胞に提供される場合、ヌクレアーゼ剤をコードするそのようなポリヌクレオチドは、天然に存在するヌクレアーゼ剤をコードするポリヌクレオチド配列と比較して、目的の細胞においてより高い使用頻度を有するコドンを置換するように改変され得る。例えば、ヌクレアーゼ剤をコードするポリヌクレオチドは、天然に存在するポリヌクレオチド配列と比較して、ヒト細胞、非ヒト細胞、哺乳動物細胞、げっ歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、または任意の他の目的の宿主細胞を含む、目的の所与の真核細胞においてより頻度高く使用される代替コドンへと改変することができる。
（２）ヒトアルブミン遺伝子を標的化するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系
特定の種類のヒトアルブミン標的化試薬は、ヒトアルブミン遺伝子を標的とするクラスター化等間隔短鎖回文リピート（ＣＲＩＳＰＲ）／ ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）系であり得る。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系には、Ｃａｓ遺伝子の発現に関与する、またはその活性を指示する転写産物および他のエレメントが含まれる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、例えば、タイプＩ、タイプＩＩ、タイプＩＩＩシステム、またはタイプＶ系（例えば、サブタイプＶ－ＡまたはサブタイプＶ－Ｂ）であり得る。本明細書に開示される組成物および方法で使用されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、非天然発生型であり得る。「非天然発生型」系には、自然発生状態から改変もしくは変異されているか、それらが本質的に自然に関連付けられている少なくとも１つの他の構成要素から少なくとも実質的に自由であるか、またはそれらが自然に関連付けられていない少なくとも１つの他の構成要素に関連付けられている、系の１つ以上の構成要素など、人間の助けの関与を示すものが含まれる。例えば、一部のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、天然に発生しないｇＲＮＡおよびＣａｓタンパク質を一緒に含む非天然発生型ＣＲＩＳＰＲ複合体を用いるか、天然に発生しないＣａｓタンパク質を用いるか、または天然に発生しないｇＲＮＡを用いる。
Ｃａｓタンパク質およびキメラＣａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチド。Ｃａｓタンパク質は一般に、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と相互作用できる少なくとも１つのＲＮＡ認識または結合ドメインを含む。Ｃａｓタンパク質はまた、ヌクレアーゼドメイン（例えば、ＤＮａｓｅドメインまたはＲＮａｓｅドメイン）、ＤＮＡ結合ドメイン、ヘリカーゼドメイン、タンパク質－タンパク質相互作用ドメイン、二量体化ドメイン、および他のドメインを含み得る。いくつかのそのようなドメイン（例えば、ＤＮａｓｅドメイン）は、ネイティブのＣａｓタンパク質に由来し得る。他のそのようなドメインを追加して、修飾されたＣａｓタンパク質を作製することができる。ヌクレアーゼドメインは、核酸分子の共有結合の切断を含む、核酸切断に対する触媒活性を有する。切断は、平滑末端または千鳥状の末端を生成することができ、それは一本鎖または二本鎖であり得る。例えば、野生型のＣａｓ９タンパク質は、通常、平滑端切断産物を生成する。代替的に、野生型Ｃｐｆ１タンパク質（例、ＦｎＣｐｆ１）は、５ヌクレオチドの５’オーバーハングを含む切断産物をもたらすことができ、切断は、非標的化鎖のＰＡＭ配列から１８番目の塩基対の後および標的化鎖の２３番目の塩基後に発生する。Ｃａｓタンパク質は、完全な切断活性を有し、標的ゲノム遺伝子座で二本鎖切断を作成することができるか（例えば、平滑末端を含む二本鎖切断）、またはそれは標的ゲノム遺伝子座で一本鎖切断を作成するニッカーゼであり得る。
Ｃａｓタンパク質の例には、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ５ｅ（ＣａｓＤ）、Ｃａｓ６、Ｃａｓ６ｅ、Ｃａｓ６ｆ、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８ａ１、Ｃａｓ８ａ２、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ８ｃ、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１またはＣｓｘ１２）、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１０ｄ、ＣａｓＦ、ＣａｓＧ、ＣａｓＨ、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１（ＣａｓＡ）、Ｃｓｅ２（ＣａｓＢ）、Ｃｓｅ３（ＣａｓＥ）、Ｃｓｅ４（ＣａｓＣ）、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、およびＣｕ１９６６、ならびにそれらの相同体または修飾バージョンが挙げられる。
例示的なＣａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質またはＣａｓ９タンパク質に由来するタンパク質である。Ｃａｓ９タンパク質は、タイプＩＩ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系に由来するものであり、典型的には、保存されたアーキテクチャを有する４つの重要なモチーフを共有する。モチーフ１、２、および４は、ＲｕｖＣ様モチーフであり、モチーフ３は、ＨＮＨモチーフである。例示的なＣａｓ９タンパク質は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ ｄａｓｓｏｎｖｉｌｌｅｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｒｉｓｔｉｎａｅｓｐｉｒａｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｓｅｕｄｏｍｙｃｏｉｄｅｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｅｌｅｎｉｔｉｒｅｄｕｃｅｎｓ、Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｉｂｉｒｉｃｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｍｉｃｒｏｓｃｉｌｌａ ｍａｒｉｎａ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｌｅｓ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｉｖｏｒａｎｓ、Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ ｓｐ．、Ｃｒｏｃｏｓｐｈａｅｒａ ｗａｔｓｏｎｉｉ、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ ｓｐ．、Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ａｃｅｔｏｈａｌｏｂｉｕｍ ａｒａｂａｔｉｃｕｍ、Ａｍｍｏｎｉｆｅｘ ｄｅｇｅｎｓｉｉ、Ｃａｌｄｉｃｅｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ ｂｅｃｓｃｉｉ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｄｅｓｕｌｆｏｒｕｄｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ ｍａｇｎａ、Ｎａｔｒａｎａｅｒｏｂｉｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｐｅｌｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ、Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｄｕｓ、Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ、Ａｌｌｏｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ ｖｉｎｏｓｕｍ、Ｍａｒｉｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．、Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ、Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ ｗａｔｓｏｎｉ、Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ ｈａｌｏｐｌａｎｋｔｉｓ、Ｋｔｅｄｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｒａｃｅｍｉｆｅｒ、Ｍｅｔｈａｎｏｈａｌｏｂｉｕｍ ｅｖｅｓｔｉｇａｔｕｍ、Ａｎａｂａｅｎａ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ、Ｎｏｄｕｌａｒｉａ ｓｐｕｍｉｇｅｎａ、Ｎｏｓｔｏｃ ｓｐ．、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｍａｘｉｍａ、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓ、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｓｐ．、Ｌｙｎｇｂｙａ ｓｐ．、Ｍｉｃｒｏｃｏｌｅｕｓ ｃｈｔｈｏｎｏｐｌａｓｔｅｓ、Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ ｓｐ．、Ｐｅｔｒｏｔｏｇａ ｍｏｂｉｌｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ ａｆｒｉｃａｎｕｓ、Ａｃａｒｙｏｃｈｌｏｒｉｓ ｍａｒｉｎａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、またはＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉに由来する。Ｃａｓ９ファミリーメンバーの追加の例は、ＷＯ２０１４／１３１８３３に記載されており、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ（ＳｐＣａｓ９）由来のＣａｓ９（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔアクセッション番号Ｑ９９ＺＷ２が割り当てられている）は、例示的なＣａｓ９タンパク質である。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（ＳａＣａｓ９）由来のＣａｓ９（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｊ７ＲＵＡ５が割り当てられている）は、別の例示的なＣａｓ９タンパク質である。Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ（ＣｊＣａｓ９）由来のＣａｓ９（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｑ０Ｐ８９７が割り当てられている）は、別の例示的なＣａｓ９タンパク質である。例えば、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｎａｔ．Ｃｏｍｍ．８：１４５００を参照されたく、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。 ＳａＣａｓ９は、ＳｐＣａｓ９よりも小さく、ＣｊＣａｓ９は、ＳａＣａｓ９およびＳｐＣａｓ９の両方よりも小さい。例示的なＣａｓ９タンパク質は、配列番号３８を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。Ｃａｓ９タンパク質をコードする例示的なＤＮＡは、配列番号３９を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。
Ｃａｓタンパク質の別の例は、Ｃｐｆ１（ＰｒｅｖｏｔｅｌｌａおよびＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａ １のＣＲＩＳＰＲ）タンパク質である。Ｃｐｆ１は、Ｃａｓ９の対応するドメインに相同なＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインを、Ｃａｓ９の特徴的なアルギニンに富むクラスターの対応物と共に含む大きなタンパク質（約１３００アミノ酸）である。しかしながら、Ｃｐｆ１は、Ｃａｓ９タンパク質に存在するＨＮＨヌクレアーゼドメインを欠いており、ＨＮＨドメインを含む長い挿入を含むＣａｓ９とは対照的に、ＲｕｖＣ様ドメインは、Ｃｐｆ１配列において隣接している。例えば、Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｃｅｌｌ １６３（３）：７５９－７７１を参照されたく、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。例示的なＣｐｆ１タンパク質は、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ １、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｎｏｖｉｃｉｄａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ａｌｂｅｎｓｉｓ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＭＣ２０１７ １、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ ｐｒｏｔｅｏｃｌａｓｔｉｃｕｓ、Ｐｅｒｅｇｒｉｎｉｂａｃｔｅｒｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＧＷ２０１１＿ＧＷＡ２＿３３＿１０、Ｐａｒｃｕｂａｃｔｅｒｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＧＷ２０１１＿ＧＷＣ２＿４４＿１７、Ｓｍｉｔｈｅｌｌａ ｓｐ．ＳＣＡＤＣ、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＢＶ３Ｌ６、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＭＡ２０２０、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｓｍａ ｔｅｒｍｉｔｕｍ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｌｉｇｅｎｓ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｂｏｖｏｃｕｌｉ ２３７、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎａｄａｉ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＮＤ２００６、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｃｒｅｖｉｏｒｉｃａｎｉｓ ３、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｄｉｓｉｅｎｓ、およびＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｍａｃａｃａｅに由来する。Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ Ｕ１１２由来のＣｐｆ１（ＦｎＣｐｆ１；ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ａ０Ｑ７Ｑ２が割り当てられている）は、例示的なＣｐｆ１タンパク質である。
Ｃａｓタンパク質は、野生型タンパク質（すなわち、本質的に発生するもの）、修飾Ｃａｓタンパク質（すなわち、Ｃａｓタンパク質バリアント）、または野生型もしくは修飾Ｃａｓタンパク質の断片であり得る。Ｃａｓタンパク質はまた、野生型または改変されたＣａｓタンパク質の触媒活性に関して、活性なバリアントまたは断片であり得る。触媒活性に関する活性なバリアントまたは断片は、野生型または修飾されたＣａｓタンパク質またはその一部に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を含み得、活性なバリアントは、所望の切断部位で切断する能力を保持し、したがってニック誘導または二本鎖切断誘導活性を保持する。ニック誘導または二本鎖切断誘導活性のアッセイは知られており、一般に、切断部位を含むＤＮＡ基質上のＣａｓタンパク質の全体的な活性および特異性を測定する。
Ｃａｓタンパク質は、核酸結合親和性、核酸結合特異性、および酵素活性のうちの１つ以上を増加または減少させるように修飾され得る。Ｃａｓタンパク質はまた、安定性など、タンパク質の他の活性または特性を変更するように改変することができる。例えば、Ｃａｓタンパク質の１つまたは複数のヌクレアーゼドメインを改変、欠失、または不活化することができ、あるいはＣａｓタンパク質を切断して、タンパク質の機能に必須ではないドメインを除去するか、あるいはＣａｓタンパク質の活性または特性を最適化（例えば、増強または低減）することができる。
修飾Ｃａｓタンパク質の一例は、修飾ＳｐＣａｓ９－ＨＦ１タンパク質であり、これは、非特異的ＤＮＡ接触を低減するように設計された改変を内包するＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９の忠実度の高いバリアント（Ｎ４９７Ａ／Ｒ６６１Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ）である。例えば、Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｎａｔｕｒｅ ５２９（７５８７）：４９０－４９５を参照されたく、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。修飾Ｃａｓタンパク質の別の例は、オフターゲット効果を低減するように設計された修飾ｅＳｐＣａｓ９バリアント（Ｋ８４８Ａ／Ｋ１００３Ａ／Ｒ１０６０Ａ）である。例えば、Ｓｌａｙｍａｋｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５１（６２６８）：８４－８８を参照されたく、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。他のＳｐＣａｓ９バリアントには、Ｋ８５５ＡおよびＫ８１０Ａ／Ｋ１００３Ａ／Ｒ１０６０Ａが含まれる。
Ｃａｓタンパク質は、ＤＮａｓｅドメインなどの少なくとも１つのヌクレアーゼドメインを含み得る。例えば、野生型Ｃｐｆ１タンパク質は、一般に、おそらく二量体立体配座で、標的ＤＮＡの両方の鎖を切断するＲｕｖＣ様ドメインを含む。Ｃａｓタンパク質はまた、ＤＮａｓｅドメインなどの少なくとも２つのヌクレアーゼドメインを含み得る。例えば、野生型Ｃａｓ９タンパク質は、一般に、ＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインおよびＨＮＨ様ヌクレアーゼドメインを含む。ＲｕｖＣドメインおよびＨＮＨドメインは各々、二本鎖ＤＮＡの異なる鎖を切断して、ＤＮＡに二本鎖切断を行うことができる。例えば、Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７：８１６－８２１を参照されたく、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
ヌクレアーゼドメインの１つ以上またはすべてを欠失または変異させることで、それらがもはや機能しなくさせるか、またはヌクレアーゼ活性が低下させすことができる。例えば、Ｃａｓ９タンパク質でヌクレアーゼドメインの１つが削除または変異されている場合、得られたＣａｓ９タンパク質はニッカーゼと称され、二本鎖標的ＤＮＡ内で一本鎖切断を生成することができるが、二本鎖切断では生成することができない（すなわち、相補鎖または非相補鎖を切断することができるが、両方を切断することはできない）。ヌクレアーゼドメインの両方が削除または変異された場合、得られたＣａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９）は、二本鎖ＤＮＡの両方の鎖（例えば、ヌクレアーゼヌルまたはヌクレアーゼ不活性Ｃａｓタンパク質、または触媒活性を伴わないＣａｓタンパク質（ｄＣａｓ））を切断する能力が低減される。Ｃａｓ９をニッカーゼに変換する変異の例は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９のＲｕｖＣドメインにおけるＤ１０Ａ（Ｃａｓ９の１０位でのアスパラギン酸塩からアラニンへ）変異である。同様に、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９のＨＮＨドメインにあるＨ９３９Ａ（アミノ酸８３９位でのヒスチジンからアラニンへ）、Ｈ８４０Ａ（アミノ酸８４０位でのヒスチジンからアラニンへ）、またはＮ８６３Ａ（アミノ酸Ｎ８６３位でのアスパラギンからアラニンへ）は、Ｃａｓ９をニッカーゼに変換し得る。Ｃａｓ９をニッカーゼに変換する変異の他の例には、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＣａｓ９への対応する変異が挙げられる。例えば、Ｓａｐｒａｎａｕｓｋａｓ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ３９）：９２７５－９２８２およびＷＯ２０１３／１４１６８０を参照されたく、それらの各々は、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。そのような変異は、部位特異的変異導入、ＰＣＲを介した変異導入、または全遺伝子合成などの方法を使用して生成され得る。ニッカーゼを生成する他の変異の例は、例えば、ＷＯ２０１３／１７６７７２およびＷＯ２０１３／１４２５７８において見出すことができ、それらの各々は、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。ヌクレアーゼドメインのすべてがＣａｓタンパク質で削除または変異された場合（例えば、ヌクレアーゼドメインの両方がＣａｓ９タンパク質で削除または変異された場合）、得られたＣａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９）は、二本鎖ＤＮＡの両方の鎖（例えば、ヌクレアーゼヌルまたはヌクレアーゼ不活性Ｃａｓタンパク質）を切断する能力が低減される。１つの特定の例は、Ｄ１０Ａ／Ｈ８４０Ａ Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９二重変異体、またはＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９と最適にアラインされた場合の別の種からのＣａｓ９の対応する二重変異体である。別の特定の例は、Ｄ１０Ａ／Ｎ８６３Ａ Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９二重変異体、またはＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９と最適にアラインされた場合の別の種からのＣａｓ９の対応する二重変異体である。
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓのＣａｓ９タンパク質の触媒ドメインにおける不活化変異の例も知られている。例えば、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓのＣａｓ９酵素（ＳａＣａｓ９）は、位置Ｎ５８０での置換（例えば、Ｎ５８０Ａ置換）および位置Ｄ１０での置換（例えば、Ｄ１０Ａ置換）を含み得、ヌクレアーゼ不活性Ｃａｓタンパク質をもたらす。例えば、ＷＯ２０１６／１０６２３６を参照されたく、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
Ｃｐｆ１タンパク質の触媒ドメインにおける不活化変異の例も既知である。Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ Ｕ１１２（ＦｎＣｐｆ１）、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＢＶ３Ｌ６（ＡｓＣｐｆ１）、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＮＤ２００６（ＬｂＣｐｆ１）、およびＭｏｒａｘｅｌｌａ ｂｏｖｏｃｕｌｉ ２３７（ＭｂＣｐｆ１ Ｃｐｆ１）由来のＣｐｆ１タンパク質に関して、そのような変異には、ＡｓＣｐｆ１の９０８、９９３、もしくは１２６３位またはＣｐｆ１オルソログの対応する位置、あるいはＬｂＣｐｆ１の８３２、９２５、９４７、もしくは１１８０位またはＣｐｆ１オルソログの対応する位置での変異が含まれ得る。そのような変異は、例えば、ＡｓＣｐｆ１の変異Ｄ９０８Ａ、Ｅ９９３Ａ、およびＤ１２６３ＡもしくはＣｐｆ１オルソログの対応する変異、またはＬｂＣｐｆ１のＤ８３２Ａ、Ｅ９２５Ａ、Ｄ９４７Ａ、およびＤ１１８０ＡもしくはＣｐｆ１オルソログの対応する変異のうちの１つ以上を含み得る。例えば、ＵＳ２０１６／０２０８２４３を参照されたく、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
Ｃａｓタンパク質（例えば、ヌクレアーゼ活性Ｃａｓタンパク質またはヌクレアーゼ不活性Ｃａｓタンパク質）はまた、融合タンパク質として異種ポリペプチドに作動可能に連結され得る。例えば、Ｃａｓタンパク質は切断ドメインまたはエピジェネティック修飾ドメインに融合させることができる。すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１４／０８９２９０を参照されたい。Ｃａｓタンパク質は、安定性の増加または減少を提供する異種ポリペプチドに融合することもできる。融合ドメインまたは異種ポリペプチドは、Ｎ末端、Ｃ末端、またはＣａｓタンパク質の内部に位置し得る。
一例として、Ｃａｓタンパク質は、細胞内局在化を提供する１つ以上の異種ポリペプチドに融合してもよい。そのような異種ポリペプチドには、例えば、核を標的とするための単節型（ｍｏｎｏｐａｒｔｉｔｅ）ＳＶ４０ ＮＬＳおよび／または双節型（ｂｉｐａｒｔｉｔｅ）アルファ－インポーチンＮＬＳなどの１つ以上の核局在化シグナル（ＮＬＳ）、ミトコンドリアを標的とするためのミトコンドリア局在化シグナル、ＥＲ保持シグナルなどが含まれ得る。例えば、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｌａｎｇｅ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８２：５１０１－５１０５を参照されたい。そのような細胞内局在化シグナルは、Ｎ末端、Ｃ末端、またはＣａｓタンパク質内の任意の場所に位置し得る。ＮＬＳは、一続きの塩基性アミノ酸を含むことができ、単節型配列または双節型配列であり得る。任意選択で、Ｃａｓタンパク質は、Ｎ末端にＮＬＳ（例えば、アルファ－インポーチンＮＬＳまたは単節型ＮＬＳ）およびＣ末端にＮＬＳ（例えば、ＳＶ４０ ＮＬＳまたは双節型ＮＬＳ）を含む２つ以上のＮＬＳを含むことができる。Ｃａｓタンパク質はまた、Ｎ末端に２つ以上のＮＬＳおよび／またはＣ末端に２つ以上のＮＬＳを含み得る。
Ｃａｓタンパク質はまた、細胞透過性ドメインまたはタンパク質導入ドメインに作動可能に連結され得る。例えば、細胞透過性ドメインは、ＨＩＶ－１ ＴＡＴタンパク質、ヒトＢ型肝炎ウイルスからのＴＬＭ細胞透過性モチーフ、ＭＰＧ、Ｐｅｐ－１、ＶＰ２２、単純ヘルペスウイルスからの細胞透過性ペプチド、またはポリアルギニンペプチド配列に由来し得る。例えば、ＷＯ２０１４／０８９２９０およびＷＯ２０１３／１７６７７２を参照されたく、それらの各々は、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。細胞透過性ドメインは、Ｎ末端、Ｃ末端、またはＣａｓタンパク質内の任意の場所に位置し得る。
Ｃａｓタンパク質はまた、追跡または精製を容易にするために、蛍光タンパク質、精製タグ、またはエピトープタグなどの異種ポリペプチドに作動可能に連結され得る。蛍光タンパク質の例には、緑色蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ、ＧＦＰ－２、ｔａｇＧＦＰ、ｔｕｒｂｏＧＦＰ、ｅＧＦＰ、Ｅｍｅｒａｌｄ、Ａｚａｍｉ Ｇｒｅｅｎ、Ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ Ａｚａｍｉ Ｇｒｅｅｎ、ＣｏｐＧＦＰ、ＡｃｅＧＦＰ、ＺｓＧｒｅｅｎｌ）、黄色蛍光タンパク質（例えば、ＹＦＰ、ｅＹＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、ＰｈｉＹＦＰ、ＺｓＹｅｌｌｏｗｌ）、青色蛍光タンパク質（例えば、ｅＢＦＰ、ｅＢＦＰ２、Ａｚｕｒｉｔｅ、ｍＫａｌａｍａｌ、ＧＦＰｕｖ、Ｓａｐｐｈｉｒｅ、Ｔ－ｓａｐｐｈｉｒｅ）、シアン蛍光タンパク質（例えば、ｅＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ＣｙＰｅｔ、ＡｍＣｙａｎｌ、Ｍｉｄｏｒｉｉｓｈｉ－Ｃｙａｎ）、赤色蛍光タンパク質（例えば、ｍＫａｔｅ、ｍＫａｔｅ２、ｍＰｌｕｍ、ＤｓＲｅｄ単量体、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＲＦＰ１、ＤｓＲｅｄ－Ｅｘｐｒｅｓｓ、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄ－Ｍｏｎｏｍｅｒ、ＨｃＲｅｄ－Ｔａｎｄｅｍ、ＨｃＲｅｄｌ、ＡｓＲｅｄ２、ｅｑＦＰ６１１、ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊｒｅｄ）、オレンジ色蛍光タンパク質（例えば、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、Ｋｕｓａｂｉｒａ－Ｏｒａｎｇｅ、Ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ Ｋｕｓａｂｉｒａ－Ｏｒａｎｇｅ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ｔｄＴｏｍａｔｏ）、および任意の他の好適な蛍光タンパク質が挙げられる。タグの例には、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、マルトース結合タンパク質、チオレドキシン（ＴＲＸ）、ポリ（ＮＡＮＰ）、タンデムアフィニティー精製（ＴＡＰ）タグ、ｍｙｃ、ＡｃＶ５、ＡＵ１、ＡＵ５、Ｅ、ＥＣＳ、Ｅ２、ＦＬＡＧ、ヘマグルチニン（ＨＡ）、ｎｕｓ、Ｓｏｆｔａｇ １、Ｓｏｆｔａｇ ３、Ｓｔｒｅｐ、ＳＢＰ、Ｇｌｕ－Ｇｌｕ、ＨＳＶ、ＫＴ３、Ｓ、Ｓ１、Ｔ７、Ｖ５、ＶＳＶ－Ｇ、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、ビオチンカルボキシルキャリアタンパク質（ＢＣＣＰ）、およびカルモジュリンが挙げられる。
Ｃａｓタンパク質はまた、外部ドナー核酸または標識核酸に係留してもよい。そのような係留（すなわち、物理的結合）は、共有相互作用または非共有相互作用を介して達成することができ、係留は、直接（例えば、タンパク質またはインテイン修飾上のシステインまたはリジン残基の修飾によって達成することができる直接融合または化学的結合を介して）、またはストレプトアビジンまたはアプタマーなどの１つ以上の介在するリンカーまたはアダプター分子を介して達成することができる。例えば、すべての目的のためにそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｐｉｅｒｃｅ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｍｉｎｉ Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．５（１）：４１－５５、Ｄｕｃｋｗｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．４６（４６）：８８１９－８８２２、Ｓｃｈａｅｆｆｅｒ ａｎｄ Ｄｉｘｏｎ （２００９） Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ Ｊ．Ｃｈｅｍ．６２（１０）：１３２８－１３３２、Ｇｏｏｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．（２００９） Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ．１０（９）：１５５１－１５５７、およびＫｈａｔｗａｎｉ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２０（１４）：４５３２－４５３９を参照されたい。タンパク質－核酸コンジュゲートを合成するための非共有戦略には、ビオチン－ストレプトアビジンおよびニッケル－ヒスチジン法が含まれる。共有結合タンパク質－核酸コンジュゲートは、様々な化学物質を使用して適切に機能化された核酸とタンパク質を接続することによって合成できる。これらの化学物質のいくつかは、タンパク質表面のアミノ酸残基（例えば、リジンアミンまたはシステインチオール）へのオリゴヌクレオチドの直接結合を含むが、他のより複雑なスキームは、タンパク質の翻訳後修飾または触媒もしくは反応性タンパク質ドメインの関与を必要とする。タンパク質の核酸への共有結合の方法には、例えば、オリゴヌクレオチドのタンパク質リジンまたはシステイン残基への化学的架橋、発現されたタンパク質ライゲーション、化学酵素的方法、および光アプタマーの使用が含まれ得る。外因性ドナー核酸または標識核酸は、Ｃａｓタンパク質のＣ末端、Ｎ末端、または内部領域に係留されていてもよい。一例では、外因性ドナー核酸または標識核酸は、Ｃａｓタンパク質のＣ末端またはＮ末端に係留される。同様に、Ｃａｓタンパク質は、外因性ドナー核酸または標識核酸の５’末端、３’末端、または内部領域に係留されていてもよい。すなわち、外因性ドナー核酸または標識核酸は、任意の方向および極性で係留されてもよい。例えば、Ｃａｓタンパク質は、外因性ドナー核酸または標識核酸の５’末端または３’末端に係留されていてもよい。
Ｃａｓタンパク質は任意の形態で提供してもよい。例えば、Ｃａｓタンパク質は、ｇＲＮＡと複合体を形成したＣａｓタンパク質などのタンパク質の形態で提供してもよい。代替的に、Ｃａｓタンパク質は、ＲＮＡ（例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ））またはＤＮＡなどの、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸の形態で提供してもよい。任意に、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、特定の細胞または生物におけるタンパク質への効率的な翻訳のためにコドン最適化することができる。例えば、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、天然に存在するポリヌクレオチド配列と比較して、細菌細胞、酵母細胞、ヒト細胞、非ヒト細胞、哺乳動物細胞、げっ歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、または任意の他の目的の宿主細胞においてより頻度高く使用される代替コドンへと改変することができる。Ｃａｓタンパク質をコードする核酸が細胞に導入されると、Ｃａｓタンパク質は、一時的、条件付き、または構成的に細胞内で発現され得る。
ｍＲＮＡとして提供されるＣａｓタンパク質は、安定性および／または免疫原性の特性を改善するために修飾することができる。修飾は、ｍＲＮＡ内の１つ以上のヌクレオシドに対して行われ得る。ｍＲＮＡ核酸塩基への化学修飾の例には、シュードウリジン、１－メチル－シュードウリジン、および５－メチル－シチジンが挙げられる。例えば、Ｎ１－メチルシュードウリジンを含むキャップされポリアデニル化されたＣａｓ ｍＲＮＡを使用することができる。同様に、Ｃａｓ ｍＲＮＡは、同義コドンを使用してウリジンを枯渇させることによって修飾され得る。
Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、細胞のゲノムに安定して組み込まれ、細胞内で活性のあるプロモーターに作動可能に連結することができる。代替的に、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、発現構築物中のプロモーターに作動可能に連結され得る。発現構築物は、遺伝子または他の目的の核酸配列（例えば、Ｃａｓ遺伝子）の発現を指示することができ、かつそのような目的の核酸配列を標的細胞に移すことができる任意の核酸構築物を含む。例えば、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、核酸インサートを含む標的化ベクターおよび／またはｇＲＮＡをコードするＤＮＡを含むベクター内に存在してもよい。代替的に、それは、核酸インサートを含む標的化ベクターとは別の、および／またはｇＲＮＡをコードするＤＮＡを含むベクターとは別のベクターまたはプラスミドであってもよい。発現コンストラクトにおいて使用することができるプロモーターには、例えば、真核細胞、ヒト細胞、非ヒト細胞、哺乳動物細胞、非ヒト哺乳動物細胞、げっ歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、ハムスター細胞、ウサギ細胞、多能性細胞、胚性幹（ＥＳ）細胞、または接合体のうちの１つ以上において活性なプロモーターが含まれる。そのようなプロモーターは、例えば、条件付きプロモーター、誘導性プロモーター、構成的プロモーター、または組織特異的プロモーターであり得る。任意選択で、プロモーターは、一方向のＣａｓタンパク質と他の方向のガイドＲＮＡの両方の発現を駆動する双方向プロモーターであってもよい。このような双方向プロモーターは、（１）遠位配列要素（ＤＳＥ）、近位配列要素（ＰＳＥ）、およびＴＡＴＡボックスの３つの外部制御要素を含む完全な従来の一方向Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター、ならびに（２）ＤＳＥの５’末端に逆方向に融合されたＰＳＥおよびＴＡＴＡボックスを含む第２の基本的なＰｏｌ ＩＩＩプロモーターで構成してもよい。例えば、Ｈ１プロモーターでは、ＤＳＥはＰＳＥとＴＡＴＡボックスに隣接しており、プロモーターは、Ｕ６プロモーターに由来するＰＳＥおよびＴＡＴＡボックスを追加することによって逆方向の転写が制御されるハイブリッドプロモーターを作成することにより、双方向にすることができる。例えば、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２０１６／００７４５３５を参照されたい。双方向プロモーターを使用してＣａｓタンパク質とガイドＲＮＡをコードする遺伝子を同時に発現させることにより、コンパクトな発現カセットを生成して送達を容易にすることができる。
ガイドＲＮＡ「ガイドＲＮＡ」または「ｇＲＮＡ」は、Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９タンパク質）に結合し、かつＣａｓタンパク質を標的ＤＮＡ内の特定の位置に標的化するＲＮＡ分子である。ガイドＲＮＡは、「ＤＮＡ標的化セグメント」および「タンパク質結合セグメント」の２つのセグメントを含み得る。「セグメント」は、ＲＮＡ中のヌクレオチドの連続したストレッチなどの、分子のセクションまたは領域を含む。Ｃａｓ９のものなど、いくつかのｇＲＮＡは、「アクチベーターＲＮＡ」（例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡ）および「ターゲッターＲＮＡ」（例えば、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ）の２つの別個のＲＮＡ分子を含み得る。他のｇＲＮＡは、単一ＲＮＡ分子（単一ＲＮＡポリヌクレオチド）であり、これはまた「単一分子ｇＲＮＡ」、「単一ガイドＲＮＡ」、または「ｓｇＲＮＡ」と呼ばれ得る。例えば、ＷＯ２０１３／１７６７７２、ＷＯ２０１４／０６５５９６、ＷＯ２０１４／０８９２９０、ＷＯ２０１４／０９３６２２、ＷＯ２０１４／０９９７５０、ＷＯ２０１３／１４２５７８、およびＷＯ２０１４／１３１８３３を参照されたく、それらの各々は、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。例えば、Ｃａｓ９の場合、単一ガイドＲＮＡは、（例えば、リンカーを介して）ｔｒａｃｒＲＮＡに融合したｃｒＲＮＡを含み得る。例えば、Ｃｐｆ１の場合、標的配列への結合および／またはその切断を実現するために必要なのはｃｒＲＮＡだけである。「ガイドＲＮＡ」および「ｇＲＮＡ」という用語は、二重分子（すなわち、モジュラー）ｇＲＮＡおよび単一分子ｇＲＮＡの両方を含む。
例示的な２分子ｇＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ様（「ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ」または「ターゲッターＲＮＡ」または「ｃｒＲＮＡ」または「ｃｒＲＮＡリピート」）分子および対応するｔｒａｃｒＲＮＡ様（「トランス作用性ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ」または「アクチベーターＲＮＡ」または「ｔｒａｃｒＲＮＡ」）分子を含む。ｃｒＲＮＡは、ｇＲＮＡのＤＮＡ標的セグメント（一本鎖）と、ｇＲＮＡのタンパク質結合セグメントのｄｓＲＮＡ二重鎖の半分を形成するヌクレオチドのストレッチ（つまり、ｃｒＲＮＡテール）の両方を含む。ＤＮＡ標的化セグメントの下流（３’）に位置するｃｒＲＮＡテールの例は、ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵ（配列番号４０）を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。本明細書に開示されるＤＮＡ標的化セグメントのいずれも、配列番号４０の５’末端に結合して、ｃｒＲＮＡを形成することができる。
対応するｔｒａｃｒＲＮＡ（アクチベーターＲＮＡ）は、ｇＲＮＡのタンパク質結合セグメントのｄｓＲＮＡ二重鎖の残りの半分を形成するヌクレオチドのストレッチを含む。ｃｒＲＮＡのヌクレオチドのストレッチは、ｔｒａｃｒＲＮＡのヌクレオチドのストレッチと相補的であり、それをハイブリダイズして、ｇＲＮＡのタンパク質結合ドメインのｄｓＲＮＡ二重鎖を形成する。したがって、各ｃｒＲＮＡは、対応するｔｒａｃｒＲＮＡを有すると言われ得る。 ｔｒａｃｒＲＮＡ配列の例は、ＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵ（配列番号４１）を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。
ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの両方が必要とされる系では、ｃｒＲＮＡおよび対応するｔｒａｃｒＲＮＡは、ハイブリダイズしてｇＲＮＡを形成する。ｃｒＲＮＡのみが必要とされる系では、ｃｒＲＮＡは、ｇＲＮＡであり得る。ｃｒＲＮＡはさらに、標的ＤＮＡの相補鎖にハイブリダイズする一本鎖ＤＮＡ標的化セグメントを提供する。細胞内での修飾に使用される場合、所与のｃｒＲＮＡまたはｔｒａｃｒＲＮＡ分子の正確な配列は、ＲＮＡ分子が使用される種に特異的になるように設計され得る。例えば、Ｍａｌｉ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９：８２３－８２６、Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７：８１６－８２１、Ｈｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１：２２７－２２９、Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１：２３３－２３９、およびＣｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９：８１９－８２３を参照されたく、それらの各々は、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
所与のｇＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメント（ｃｒＲＮＡ）は、以下により詳細に記載されるように、標的ＤＮＡの相補鎖上の配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む。ｇＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントは、ハイブリダイゼーション（すなわち、塩基対合）を介して配列特異的様式で標的ＤＮＡと相互作用する。したがって、ＤＮＡ標的化セグメントのヌクレオチド配列は変化してもよく、ｇＲＮＡおよび標的ＤＮＡが相互作用する標的ＤＮＡ内の位置を決定する。目的のｇＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントは、標的ＤＮＡ内の任意の所望の配列にハイブリダイズするように修飾され得る。天然発生型ｃｒＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系および生物によって異なるが、２１～４６ヌクレオチドの長さの２つのダイレクトリピート（ＤＲ）が隣接する、２１～７２ヌクレオチド長の標的化セグメントを含むことが多い（例えば、ＷＯ２０１４／１３１８３３を参照されたく、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる）。Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓの場合、ＤＲは３６ヌクレオチド長であり、標的化セグメントは３０ヌクレオチド長である。３’に位置するＤＲは、対応するｔｒａｃｒＲＮＡと相補的であり、それをハイブリダイズし、それは順にＣａｓタンパク質と結合する。
ＤＮＡ標的化セグメントは、例えば、少なくとも約１２、１５、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、または４０ヌクレオチドの長さを有し得る。そのようなＤＮＡ標的化セグメントは、例えば、約１２～約１００、約１２～約８０、約１２～約５０、約１２～約４０、約１２～約３０、約１２～約２５、または約１２～約２０ヌクレオチドの長さを有し得る。例えば、ＤＮＡ標的化セグメントは、約１５～約２５ヌクレオチド（例えば、約１７～約２０ヌクレオチド、または約１７、１８、１９、もしくは２０ヌクレオチド）であり得る。例えば、ＵＳ２０１６／００２４５２３を参照されたく、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９の場合、典型的なＤＮＡ標的化セグメントは、１６～２０ヌクレオチド長、または１７～２０ヌクレオチド長である。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ由来のＣａｓ９の場合、典型的なＤＮＡ標的化セグメントは、２１～２３ヌクレオチド長である。Ｃｐｆ１の場合、典型的なＤＮＡ標的化セグメントは、少なくとも１６ヌクレオチド長または少なくとも１８ヌクレオチド長さである。
ＴｒａｃｒＲＮＡは、任意の形態（例えば、完全長ｔｒａｃｒＲＮＡまたは活性な部分ｔｒａｃｒＲＮＡ）、および様々な長さであり得る。それらには、一次転写物または処理された形態が含まれ得る。例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡ（単一ガイドＲＮＡの一部として、または２分子ｇＲＮＡの一部としての別個の分子として）は、野生型ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（例えば、野生型ｔｒａｃｒＲＮＡ配列の約２０、２６、３２、４５、４８、５４、６３、６７、８５、またはそれ以上のヌクレオチド）のすべてまたは一部を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり得る。Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来の野生型ｔｒａｃｒＲＮＡ配列の例には、１７１ヌクレオチド、８９ヌクレオチド、７５ヌクレオチド、および６５ヌクレオチドのバージョンが挙げられる。例えば、Ｄｅｌｔｃｈｅｖａ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ ４７１：６０２－６０７、ＷＯ２０１４／０９３６６１を参照されたく、それらの各々は、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）内のｔｒａｃｒＲＮＡの例には、ｓｇＲＮＡの＋４８、＋５４、＋６７、および＋８５のバージョン内に見出されるｔｒａｃｒＲＮＡセグメントが挙げられ、「＋ｎ」は、野生型ｔｒａｃｒＲＮＡの最大＋ｎヌクレオチドがｓｇＲＮＡに含まれることを示す。ＵＳ８，６９７，３５９を参照されたく、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
ガイドＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントと標的ＤＮＡの相補鎖との間の相補性パーセントは、少なくとも６０％（例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）であり得る。ＤＮＡ標的化セグメントと標的ＤＮＡの相補鎖との間の相補性パーセントは、約２０個の連続するヌクレオチドにわたって少なくとも６０％であり得る。一例として、ＤＮＡ標的化セグメントと標的ＤＮＡの相補鎖との間の相補性パーセントは、標的ＤＮＡの相補鎖の５’末端にある１４個の連続するヌクレオチドにわたって１００％であってもよく、残りの部分にわたって０％まで低くてもよい。そのような場合、ＤＮＡ標的化セグメントは、１４ヌクレオチド長であるとみなされ得る。別の例として、ＤＮＡ標的化セグメントと標的ＤＮＡの相補鎖との間の相補性パーセントは、標的ＤＮＡの相補鎖の５’末端にある７個の連続するヌクレオチドにわたって１００％であってもよく、残りの部分にわたって０％まで低くてもよい。そのような場合、ＤＮＡ標的化セグメントは、７ヌクレオチド長であるとみなされ得る。一部のガイドＲＮＡでは、ＤＮＡ標的化セグメント内の少なくとも１７個のヌクレオチドが標的ＤＮＡの相補鎖に相補的である。例えば、ＤＮＡ標的化セグメントは２０ヌクレオチドの長さであり得、標的ＤＮＡの相補鎖との１、２、または３個のミスマッチを含み得る。一例では、ミスマッチは、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列に対応する相補鎖（すなわち、ＰＡＭ配列の逆相補体）の領域に隣接していない（例えば、ミスマッチは、ガイドＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントの５’末端にあるか、またはミスマッチは、ＰＡＭ配列に対応する相補鎖の領域から、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、もしくは１９塩基対離れている）。
ｇＲＮＡのタンパク質結合セグメントは、互いに相補的であるヌクレオチドの２つのストレッチを含み得る。タンパク質結合セグメントの相補的ヌクレオチドは、ハイブリダイズして二本鎖ＲＮＡ二重鎖（ｄｓＲＮＡ）を形成する。目的のｇＲＮＡのタンパク質結合セグメントは、Ｃａｓタンパク質と相互作用し、ｇＲＮＡは、結合したＣａｓタンパク質を、ＤＮＡ標的化セグメントを介して標的ＤＮＡ内の特定のヌクレオチド配列に配向する。
シングルガイドＲＮＡは、足場配列（すなわち、ガイドＲＮＡのタンパク質結合またはＣａｓ結合配列）に結合したＤＮＡ標的セグメントを含むことができる。例えば、そのようなガイドＲＮＡは、５’ＤＮＡ標的化セグメントおよび３’足場配列を有し得る。例示的な足場配列は、ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵ（バージョン１；配列番号４２）、ＧＵＵＧＧＡＡＣＣＡＵＵＣＡＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（バージョン２；配列番号４３）、ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（バージョン３；配列番号４４）、およびＧＵＵＵＡＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＧＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＵＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（バージョン４；配列番号４５）を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。任意のガイドＲＮＡ標的配列を標的化するガイドＲＮＡは、例えば、ガイドＲＮＡの３’末端の例示的なガイドＲＮＡ足場配列のうちのいずれかに融合したガイドＲＮＡの５’末端のＤＮＡ標的化セグメントを含み得る。すなわち、本明細書に開示されるＤＮＡ標的化セグメントのうちのいずれかは、配列番号４２～４５のうちのいずれか１つの５’末端に結合して、単一ガイドＲＮＡ（キメラガイドＲＮＡ）を形成することができる。本明細書の他の場所に開示されるガイドＲＮＡバージョン１、２、３、および４は、それぞれ、足場バージョン１、２、３、および４と結合されたＤＮＡ標的セグメント（すなわち、ガイド配列またはガイド）を指す。
ガイドＲＮＡは、追加の望ましい特徴（例えば、修飾または調節された安定性；細胞内標的化；蛍光標識による追跡；タンパク質またはタンパク質複合体の結合部位など）を提供する修飾または配列を含み得る。そのような改変の例としては、例えば、５’キャップ（例えば、７－メチルグアニル酸キャップ（ｍ７Ｇ））、３’ポリアデニル化テール（すなわち、３’ポリ（Ａ）テール）、リボスイッチ配列（例えば、タンパク質および／またはタンパク質複合体による安定性の調節および／または接近性の調節を可能にする）、安定性制御配列、ｄｓＲＮＡ二重鎖を形成する配列（すなわち、ヘアピン）、ＲＮＡを細胞内の位置（例えば、核、ミトコンドリア、葉緑体など）に標的化する改変または配列、追跡を提供する改変または配列（例えば、蛍光分子への直接コンジュゲーション、蛍光検出を容易にする部分へのコンジュゲーション、蛍光検出を可能にする配列など）、タンパク質（例えば、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ＤＮＡデメチラーゼ、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼなどを含む、ＤＮＡに作用するタンパク質）に対する結合部位を提供する改変または配列、およびそれらの組み合わせが挙げられる。修飾の他の例には、操作されたステムループ二重構造、操作されたバルジ領域、ステムループ二重構造の操作されたヘアピン３’、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。例えば、ＵＳ２０１５／０３７６５８６を参照されたく、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。バルジは、ｃｒＲＮＡ様領域と最小のｔｒａｃｒＲＮＡ様領域で構成される二重鎖内のヌクレオチドの対になっていない領域であり得る。バルジは、二重鎖の片側に、対になっていない５’－ＸＸＸＹ－３’を含むことができ、Ｘは、任意のプリンであり、Ｙは、反対側の鎖のヌクレオチドおよび二重鎖の反対側の対になっていないヌクレオチドの領域とゆらぎ対を形成し得るヌクレオチドであり得る。
修飾されていない核酸は、分解されやすい場合がある。外因性核酸はまた、自然免疫応答を誘導し得る。修飾は、安定性を導入し、免疫原性を低減するのに役立ち得る。ガイドＲＮＡは、例えば、以下：（１）ホスホジエステル骨格結合において、非結合リン酸酸素の一方または両方および／もしくは結合リン酸酸素の１つ以上の改変または置換、（２）リボース糖の２’ヒドロキシルの改変または置換などのリボース糖の構成要素の改変または置換、（３）リン酸部分のデホスホリンカーによる置換、（４）天然発生型核酸塩基の修飾または置換、（５）リボース－リン酸骨格の置換または修飾、（６）オリゴヌクレオチドの３’末端または５’末端の修飾（例えば、末端リン酸基の除去、修飾、もしくは置換、または部分の複合体化）、ならびに（７）糖の修飾のうちの１つ以上を含む修飾ヌクレオシドおよび修飾ヌクレオチドを含み得る。他の可能なガイドＲＮＡ修飾には、ウラシルまたはポリ－ウラシルトラクトの修飾または置換が含まれる。例えば、ＷＯ２０１５／０４８５７７およびＵＳ２０１６／０２３７４５５を参照されたく、それらの各々は、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。同様の修飾を、Ｃａｓ ｍＲＮＡなどのＣａｓコード核酸に行うことができる。
一例として、ガイドＲＮＡの５’または３’末端のヌクレオチドは、ホスホロチオエート結合を含んでもよい（例えば、塩基は、ホスホロチオエート基である修飾リン酸基を有してもよい）。例えば、ガイドＲＮＡは、ガイドＲＮＡの５’または３’末端の２、３、または４つの末端ヌクレオチド間のホスホロチオエート結合を含み得る。別の例として、ガイドＲＮＡの５’および／または３’末端のヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル修飾を有し得る。例えば、ガイドＲＮＡは、ガイドＲＮＡの５’および／または３’末端（例えば、５’末端）の２、３、または４つの末端ヌクレオチドに２’－Ｏ－メチル修飾を含み得る。例えば、ＷＯ２０１７／１７３０５４Ａ１およびＦｉｎｎ ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ２２：１－９を参照されたく、それらの各々は、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。１つの具体的な例において、ガイドＲＮＡは、最初の３つの５’および３’末端ＲＮＡ残基に２’－Ｏ－メチル類似体および３’ホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。別の具体的な例では、ガイドＲＮＡは、Ｃａｓ９タンパク質と相互作用しないすべての２’ＯＨ基が２’－Ｏ－メチル類似体に置き換えられ、Ｃａｓ９と最小限の相互作用をゆするガイドＲＮＡのテール領域は、５’および３’ホスホロチオエートヌクレオチド間結合で修飾されている。例えば、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｙｉｎ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．３５（１２）：１１７９－１１８７を参照されたい。改変されたガイドＲＮＡの他の例は、例えば、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１８／１０７０２８Ａ１に提供されている。
ガイドＲＮＡは、任意の形態で提供され得る。例えば、ｇＲＮＡは、２つの分子（別個のｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ）または１つの分子（ｓｇＲＮＡ）のいずれかとしてＲＮＡの形態で、および任意にＣａｓタンパク質との複合体の形態で提供され得る。ｇＲＮＡはまた、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡの形態で提供され得る。ｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、単一ＲＮＡ分子（ｓｇＲＮＡ）または別個のＲＮＡ分子（例えば、別個のｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ）をコードすることができる。後者の場合、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、１つのＤＮＡ分子として、またはｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡをそれぞれコードする別個のＤＮＡ分子として提供され得る。
ｇＲＮＡがＤＮＡの形態で提供される場合、ｇＲＮＡは、一時的、条件付き、または構成的に細胞内で発現され得る。ｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、細胞のゲノムにおいて安定して組み込まれ、細胞において活性なプロモーターに作動可能に連結され得る。代替的に、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、発現構築物中のプロモーターに作動可能に連結され得る。例えば、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸などの異種核酸を含むベクター内にあり得る。代替的に、それは、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸を含むベクターとは別個のベクターまたはプラスミドであり得る。このような発現コンストラクトにおいて使用することができるプロモーターとしては、例えば、真核細胞、ヒト細胞、非ヒト細胞、哺乳動物細胞、非ヒト哺乳動物細胞、げっ歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、ハムスター細胞、ウサギ細胞、多能性細胞、胚性幹（ＥＳ）細胞、成体幹細胞、発生が制限された前駆細胞、誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞、または１細胞期胚のうちの１つ以上において活性なプロモーターが挙げられる。そのようなプロモーターは、例えば、条件付きプロモーター、誘導性プロモーター、構成的プロモーター、または組織特異的プロモーターであり得る。そのようなプロモーターはまた、例えば、双方向プロモーターであってよい。好適なプロモーターの特定の例には、ヒトＵ６プロモーター、ラットＵ６ポリメラーゼＩＩＩプロモーター、またはマウスＵ６ポリメラーゼＩＩＩプロモーターなどのＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターを挙げられる。
代替的に、ｇＲＮＡは、他の様々な方法で調製され得る。例えば、ｇＲＮＡは、例えば、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用するインビトロ転写によって調製され得る（例えば、ＷＯ２０１４／０８９２９０およびＷＯ２０１４／０６５５９６を参照されたく、それらの各々は、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる）。ガイドＲＮＡはまた、化学的合成によって調製された合成的に生成された分子であり得る。
ガイドＲＮＡ（またはガイドＲＮＡをコードする核酸）は、１個以上のガイドＲＮＡ（例えば、１、２、３、４、またはそれ以上のガイドＲＮＡ）と、ガイドＲＮＡの安定性を増加させる（例えば、所定の保存条件下（例えば、－２０℃、４℃、または周囲温度）で、分解産物が閾値未満、例えば出発核酸またはタンパク質の０．５重量％未満のままである期間を延長する、あるいはインビボでの安定性を増加させる）担体と、を含む組成物であり得る。そのような担体の非限定的な例には、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）ミクロスフェア、ポリ（Ｄ，Ｌ－乳酸－コグリコール－酸）（ＰＬＧＡ）ミクロスフェア、リポソーム、ミセル、逆ミセル、脂質コキレート（ｃｏｃｈｌｅａｔｅｓ）、および脂質微小管が挙げられる。そのような組成物は、Ｃａｓ９タンパク質などのＣａｓタンパク質、またはＣａｓタンパク質をコードする核酸をさらに含み得る。
ガイドＲＮＡ標的配列。ガイドＲＮＡの標的ＤＮＡには、結合に十分な条件が存在する場合に、ｇＲＮＡのＤＮＡ標的セグメントが結合するＤＮＡに存在する核酸配列が含まれる。好適なＤＮＡ／ＲＮＡ結合条件には、細胞に通常存在する生理学的条件が含まれる。他の好適なＤＮＡ／ＲＮＡ結合条件（例えば、無細胞系における条件）は、当該技術分野で知られている（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ Ｅｄ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ ２００１）を参照されたく、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる）。ｇＲＮＡに相補的であり、かつそれとハイブリダイズする標的ＤＮＡの鎖は、「相補的鎖」と呼ばれることができ、「相補的鎖」に相補的である（したがって、Ｃａｓタンパク質またはｇＲＮＡに相補的ではない）標的ＤＮＡの鎖は、「非相補鎖」または「テンプレート鎖」と呼ばれることができる。
標的ＤＮＡは、ガイドＲＮＡがハイブリダイズする相補鎖上の配列と非相補鎖上の対応する配列（例えば、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に隣接する）の両方を含む。本明細書で使用される「ガイドＲＮＡ標的配列」という用語は、具体的には、ガイドＲＮＡが相補鎖上でハイブリダイズする配列に対応する（すなわち、その逆相補体）非相補鎖上の配列を指す。すなわち、ガイドＲＮＡ標的配列は、ＰＡＭに隣接する非相補鎖上の配列を指す（例えば、Ｃａｓ９の場合、ＰＡＭの上流または５’）。ガイドＲＮＡ標的配列は、ガイドＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントと同等であるが、ウラシルの代わりにチミンを含む。一例として、ＳｐＣａｓ９酵素のガイドＲＮＡ標的配列は、非相補鎖上の５’－ＮＧＧ－３’ ＰＡＭの上流の配列を指し得る。ガイドＲＮＡは、標的ＤＮＡの相補鎖に対して相補性を有するように設計されており、ガイドＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントと標的ＤＮＡの相補鎖とのハイブリダイゼーションにより、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成が促進される。ハイブリダイゼーションを引き起こし、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進するのに十分な相補性があれば、完全な相補性は必ずしも必要ではない。ガイドＲＮＡが本明細書においてガイドＲＮＡ標的配列を標的化するものとして言及される場合、それは、ガイドＲＮＡが、非相補鎖上のガイドＲＮＡ標的配列の逆相補体である標的ＤＮＡの相補鎖配列にハイブリダイズすることを意味する。
標的ＤＮＡまたはガイドＲＮＡ標的配列は、任意のポリヌクレオチドを含み得、例えば、細胞の核または細胞質内、あるいはミトコンドリアまたは葉緑体などの細胞の細胞小器官内に位置し得る。標的ＤＮＡまたはガイドＲＮＡ標的配列は、細胞に対して内因性または外因性の任意の核酸配列であってよい。ガイドＲＮＡ標的配列は、遺伝子産物（例えば、タンパク質）をコードする配列または非コード配列（例えば、調節配列）であり得るか、または両方を含み得る。特定の例では、ガイドＲＮＡ標的配列は、ヒトアルブミン遺伝子のイントロン１、イントロン１２、またはイントロン１３であり得る。例えば、ガイドＲＮＡ標的配列は、ヒトアルブミン遺伝子のイントロン１にあり得る。
Ｃａｓタンパク質による標的ＤＮＡの部位特異的結合および切断は、（ｉ）ガイドＲＮＡと標的ＤＮＡの相補鎖との間の塩基対合相補性、および（ｉｉ）標的ＤＮＡの非相補鎖にある、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）と呼ばれる短いモチーフの両方によって決定される位置で起こり得る。ａ ＰＡＭは、ガイドＲＮＡ標的配列に隣接し得る。任意選択で、ガイドＲＮＡ標的配列は、３’末端でＰＡＭが隣接し得る（例えば、Ｃａｓ９の場合）。代替的に、ガイドＲＮＡ標的配列は、５’末端でＰＡＭが隣接し得る（例えば、Ｃｐｆ１の場合）。例えば、Ｃａｓタンパク質の切断部位は、ＰＡＭ配列の上流または下流（例えば、ガイドＲＮＡ標的配列内）の約１～約１０または約２～約５塩基対（例えば、３塩基対）であり得る。ＳｐＣａｓ９の場合、ＰＡＭ配列（すなわち、非相補鎖上）は、５’－Ｎ１ＧＧ－３’であり得、Ｎ１は、任意のＤＮＡヌクレオチドであり、ＰＡＭは、標的ＤＮＡの非相補鎖上のガイドＲＮＡ標的配列の３’のすぐ近くである。したがって、相補鎖上のＰＡＭに対応する配列（すなわち、逆相補体）は、５’－ＣＣＮ２－３’であり、Ｎ２は、任意のＤＮＡヌクレオチドであり、ガイドＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントが標的ＤＮＡの相補鎖にハイブリダイズする配列の５’のすぐ近くである。いくつかのそのような場合、Ｎ１およびＮ２は、相補的であることができ、Ｎ１～Ｎ２塩基対は、任意の塩基対であり得る（例えば、Ｎ１＝ＣおよびＮ２＝Ｇ、Ｎ１＝ＧおよびＮ２＝Ｃ、Ｎ１＝ＡおよびＮ２＝Ｔ、またはＮ１＝ＴおよびＮ２＝Ａ）。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ由来のＣａｓ９の場合、ＰＡＭは、ＮＮＧＲＲＴまたはＮＮＧＲＲであり得、Ｎは、Ａ、Ｇ、Ｃ、またはＴであり得、Ｒは、ＧまたはＡであり得る。Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ由来のＣａｓ９の場合、ＰＡＭは、例えば、ＮＮＮＮＡＣＡＣまたはＮＮＮＮＲＹＡＣであり得、Ｎは、Ａ、Ｇ、Ｃ、またはＴであり得、Ｒは、ＧまたはＡであり得る。いくつかの場合（例えば、ＦｎＣｐｆ１の場合）では、ＰＡＭ配列は、５’の上流にあり、配列５’－ＴＴＮ－３’を有し得る。
ガイドＲＮＡ標的配列の例は、ＳｐＣａｓ９タンパク質によって認識されるＮＧＧモチーフの直前の２０ヌクレオチドのＤＮＡ配列である。例えば、ガイドＲＮＡ標的配列＋ＰＡＭの２つの例は、ＧＮ１９ＮＧＧ（配列番号４６）またはＮ２０ＮＧＧ（配列番号４７）である。例えば、ＷＯ２０１４／１６５８２５を参照されたく、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。５’末端のグアニンは、細胞内のＲＮＡポリメラーゼによる転写を促進することができる。ガイドＲＮＡ標的配列＋ＰＡＭの他の例は、インビトロでのＴ７ポリメラーゼによる効率的な転写を促進するための、５’末端に２つのグアニンヌクレオチドを含み得る（例えば、ＧＧＮ２０ＮＧＧ；配列番号４８）。例えば、ＷＯ２０１４／０６５５９６を参照されたく、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。他のガイドＲＮＡ標的配列＋ＰＡＭは、５’ＧまたはＧＧおよび３’ＧＧまたはＮＧＧを含む、配列番号４６～４８の４～２２ヌクレオチドの長さを有し得る。さらに他のガイドＲＮＡ標的配列ＰＡＭは、配列番号４６～４８の１４～２０ヌクレオチドの長さを有し得る。
標的ＤＮＡにハイブリダイズしたＣＲＩＳＰＲ複合体の形成は、ガイドＲＮＡ標的配列（すなわち、標的ＤＮＡの非相補鎖上、およびガイドＲＮＡがハイブリダイズする相補鎖の逆相補体上のガイドＲＮＡ標的配列）に対応する領域内またはその近くの標的ＤＮＡの一方または両方の鎖の切断をもたらし得る。例えば、切断部位は、ガイドＲＮＡ標的配列内にあり得る（例えば、ＰＡＭ配列に対して定義された位置に）。「切断部位」は、Ｃａｓタンパク質が一本鎖切断または二本鎖切断を生成する標的ＤＮＡの位置を含む。切断部位は、一本鎖のみ（例えば、ニッカーゼが使用される場合）または二本鎖ＤＮＡの両方の鎖上にあり得る。切断部位は、両方の鎖上の同じ位置にあり得るか（平滑末端を生成する；例えば、Ｃａｓ９）、または各鎖上の異なる部位にあり得る（千鳥状の末端を生成する（すなわち、オーバーハング）；例えば、Ｃｐｆ１）。千鳥状の末端は、例えば、各々が異なる鎖上の異なる切断部位で一本鎖切断を生成し、それによって二本鎖切断を生成する２つのＣａｓタンパク質を使用することによって生成され得る。例えば、第１のニッカーゼは、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の第１の鎖上に一本鎖切断を作成することができ、第２のニッカーゼは、オーバーハング配列が作成されるようにｄｓＤＮＡの第２の鎖上に一本鎖切断を作成することができる。いくつかの場合では、第１の鎖のニッカーゼのガイドＲＮＡ標的配列または切断部位は、第２の鎖のニッカーゼのガイドＲＮＡ標的配列または切断部位から少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００、２５０、５００、または１，０００塩基対分離されている。
（３）ヒトアルブミン遺伝子を標的化する外因性ドナー核酸
本明細書に開示される方法および組成物は、外因性ドナー核酸を利用して、ヌクレアーゼ剤によるヒト化アルブミン遺伝子座の切断後、またはヌクレアーゼ剤によるヒト化アルブミン遺伝子座の切断とは無関係に、ヒト化アルブミン遺伝子座を修飾することができる。ヌクレアーゼ剤を使用するそのような方法では、ヌクレアーゼ剤タンパク質がヒト化アルブミン遺伝子座を切断して一本鎖切断（ニック）または二本鎖切断を作成し、外因性ドナー核酸が非相同末端結合（ＮＨＥＪ）媒介ライゲーションまたは相同性指向修復事象を介してヒト化アルブミン遺伝子座を再結合する。任意選択で、外因性ドナー核酸による修復は、ヌクレアーゼ標的配列を除去または破壊し、その結果、標的化された対立遺伝子は、ヌクレアーゼ剤によって再標的化され得ない。
外因性ドナー核酸は、ヒトアルブミン遺伝子の任意の配列を標的化することができる。いくつかの外因性ドナー核酸は、ホモロジーアームを含む。他の外因性ドナー核酸は、ホモロジーアームを含まない。外因性ドナー核酸は、相同組換え修復によってヒト化アルブミン遺伝子座に挿入することができ、かつ／またはそれらは、非相同末端結合によってヒト化アルブミン遺伝子座に挿入することができる。一例では、外因性ドナー核酸（例えば、標的化ベクター）は、ヒトアルブミン遺伝子のイントロン１、イントロン１２、またはイントロン１３を標的化することができる。例えば、外因性ドナー核酸は、ヒトアルブミン遺伝子のイントロン１を標的化することができる。
外因性ドナー核酸は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）を含むことができ、それらは一本鎖または二本鎖であり得、そしてそれらは直線状または環状の形態であり得る。例えば、外因性ドナー核酸は、一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）であり得る。例えば、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｙｏｓｈｉｍｉ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．７：１０４３１を参照されたい。外因性ドナー核酸は、ネイキッド核酸であってもよく、ＡＡＶなどのウイルスによって送達されてもよい。具体的な例では、外因性ドナー核酸は、ＡＡＶを介して送達することができ、非相同末端結合によってヒト化アルブミン遺伝子座に挿入することができる（例えば、外因性ドナー核酸は、ホモロジーアームを含まないものであってよい）。
例示的な外因性ドナー核酸は、約５０ヌクレオチド～約５ｋｂの長さであるか、約５０ヌクレオチド～約３ｋｂの長さであるか、または約５０～約１，０００ヌクレオチドの長さである。他の例示的な外因性ドナー核酸は、約４０～約２００ヌクレオチドの長さである。例えば、外因性ドナー核酸は、約５０～６０、６０～７０、７０～８０、８０～９０、９０～１００、１００～１１０、１１０～１２０、１２０～１３０、１３０～１４０、１４０～１５０、１５０～１６０、１６０～１７０、１７０～１８０、１８０～１９０、または１９０～２００ヌクレオチドの長さであり得る。代替的に、外因性ドナー核酸は、約５０～１００、１００～２００、２００～３００、３００～４００、４００～５００、５００～６００、６００～７００、７００～８００、８００～９００、または９００～１０００ヌクレオチドの長さであり得る。代替的に、外因性ドナー核酸は、約１～１．５、１．５～２、２～２．５、２．５～３、３～３．５、３．５～４、４～４．５、または４．５～５ｋｂの長さであり得る。代替的に、外因性ドナー核酸は、例えば、５ｋｂ、４．５ｋｂ、４ｋｂ、３．５ｋｂ、３ｋｂ、２．５ｋｂ、２ｋｂ、１．５ｋｂ、１ｋｂ、９００ヌクレオチド、８００ヌクレオチド、７００ヌクレオチド、６００ヌクレオチド、５００ヌクレオチド、４００ヌクレオチド、３００ヌクレオチド、２００ヌクレオチド、１００ヌクレオチド、または５０ヌクレオチド以下の長さであり得る。外因性ドナー核酸（例えば、標的化ベクター）もより長くなる可能性がある。
一例では、外因性ドナー核酸は、約８０ヌクレオチド～約２００ヌクレオチドの長さのｓｓＯＤＮである。別の例では、外因性ドナー核酸は、約８０ヌクレオチド～約３ｋｂの長さのｓｓＯＤＮである。そのようなｓｓＯＤＮはまた、例えば、それぞれ約４０ヌクレオチド～約６０ヌクレオチドの長さである相同性アームを有してもよい。そのようなｓｓＯＤＮはまた、例えば、それぞれ約３０ヌクレオチド～１００ヌクレオチドの長さである相同性アームを有してもよい。相同性アームは、対称的であってもよく（例えば、それぞれ４０ヌクレオチドまたはそれぞれ６０ヌクレオチドの長さ）、またはそれらは非対称的（例えば、３６ヌクレオチドの長さである１つの相同性アームと９１ヌクレオチドの長さである１つの相同性アーム）であってもよい。
外因性ドナー核酸は、追加の望ましい特徴（例えば、修飾または調節された安定性；蛍光標識による追跡または検出；タンパク質またはタンパク質複合体の結合部位など）を提供する修飾または配列を含み得る。外因性ドナー核酸は、１つ以上の蛍光標識、精製タグ、エピトープタグ、またはそれらの組み合わせを含んでもよい。例えば、外因性ドナー核酸は、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、または少なくとも５つの蛍光標識などの１つ以上の蛍光標識（例えば、蛍光タンパク質または他のフルオロフォアまたは色素）を含んでもよい。例示的な蛍光標識としては、フルオレセイン（例えば、６－カルボキシフルオレセイン（６－ＦＡＭ））、テキサスレッド、ＨＥＸ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、パシフィックブルー、５－（および－６）－カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）およびＣｙ７などのフルオロフォアが挙げられる。オリゴヌクレオチドを標識するための幅広い蛍光色素が市販されている（例えば、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから）。そのような蛍光標識（例えば、内部蛍光標識）は、例えば、外因性ドナー核酸の末端と適合性のある突出端を有する切断された標的核酸に直接組み込まれた外因性ドナー核酸を検出するために使用することができる。標識またはタグは、外因性ドナー核酸の５’末端、３’末端、または内部にあってよい。例えば、外因性ドナー核酸は、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからＩＲ７００フルオロフォア（５’ＩＲＤＹＥ（登録商標）７００）を有する５’末端にコンジュゲートさせることができる。
外因性ドナー核酸はまた、ヒト化アルブミン遺伝子座に組み込まれるＤＮＡのセグメントを含む核酸インサートを含み得る。ヒト化アルブミン遺伝子座での核酸インサートの組込みは、ヒト化アルブミン遺伝子座への目的の核酸配列の付加、ヒト化アルブミン遺伝子座での目的の核酸配列の欠失、ヒト化アルブミン遺伝子座での目的の核酸配列の置換（すなわち、欠失および挿入）をもたらし得る。いくつかの外因性ドナー核酸は、ヒト化アルブミン遺伝子座での対応する欠失なしに、ヒト化アルブミン遺伝子座での核酸インサートの挿入のために設計されている。他の外因性ドナー核酸は、対応する任意の核酸インサートの挿入なしに、ヒト化アルブミン遺伝子座で目的の核酸配列を削除するように設計されている。さらに他の外因性ドナー核酸は、ヒト化アルブミン遺伝子座で目的の核酸配列を削除し、それを核酸インサートで置き換えるように設計されている。
削除および／または置換されるヒト化アルブミン遺伝子座における核酸インサートまたは対応する核酸は、様々な長さであってよい。削除および／または置換されるヒト化アルブミン遺伝子座における例示的な核酸インサートまたは対応する核酸は、約１ヌクレオチド～約５ｋｂの長さであるか、または約１ヌクレオチド～約１，０００ヌクレオチドの長さである。例えば、削除および／または置換されるヒト化アルブミン遺伝子座の核酸インサートまたは対応する核酸は、約１～１０、１０～２０、２０～３０、３０～４０、４０～５０、５０～６０、６０～７０、７０～８０、８０～９０、９０～１００、１００～１１０、１１０～１２０、１２０～１３０、１３０～１４０、１４０～１５０、１５０～１６０、１６０～１７０、１７０～１８０、１８０～１９０、または１９０～１２０ヌクレオチドの長さであり得る。同様に、削除および／または置換されるヒト化アルブミン遺伝子座の核酸インサートまたは対応する核酸は、１～１００、１００～２００、２００～３００、３００～４００、４００～５００、５００～６００、６００～７００、７００～８００、８００～９００、または９００～１０００ヌクレオチドの長さであり得る。同様に、削除および／または置換されるヒト化アルブミン遺伝子座の核酸インサートまたは対応する核酸は、約１～１．５、１．５～２、２～２．５、２．５～３、３～３．５、３．５～４、４～４．５、もしくは４．５～５ｋｂ、またはそれ以上の長さであり得る。
核酸インサートは、置換の対象となる配列の全部または一部と相同またはオーソロガスである配列を含むことができる。例えば、核酸インサートは、ヒト化アルブミン遺伝子座での置換を標的とする配列と比較して、１つ以上の点変異（例えば、１、２、３、４、５、またはそれ以上）を含む配列を含むことができる。任意選択で、そのような点変異は、コードされたポリペプチドにおいて保存的アミノ酸置換（例えば、アスパラギン酸［Ａｓｐ、Ｄ］のグルタミン酸［Ｇｌｕ、Ｅ］への置換）をもたらし得る。
いくつかの外因性ドナー核酸は、野生型内因性アルブミン遺伝子座によってコードまたは発現されない外因性タンパク質をコードすることができる（例えば、外因性タンパク質をコードする挿入核酸を含み得る）。一例では、外因性ドナー核酸によって標的化されるヒト化アルブミン遺伝子座は、野生型内因性アルブミン遺伝子座によってコードまたは発現されていないタンパク質に融合されたヒトアルブミンシグナルペプチドを含む異種タンパク質をコードし得る。例えば、外因性ドナー核酸は、スプライスアクセプターを含むプロモーターのないカセットであってよく、外因性ドナー核酸は、ヒトアルブミンの最初のイントロンを標的とすることができる。
非相同末端結合媒介挿入のためのドナー核酸。いくつかの外因性ドナー核酸は、非相同末端結合によってヒト化アルブミン遺伝子座に挿入することができる。場合によっては、そのような外因性ドナー核酸はホモロジーアームを含まない。例えば、そのような外因性ドナー核酸は、ヌクレアーゼ剤による切断後の平滑末端二本鎖切断に挿入することができる。具体的な例では、外因性ドナー核酸は、ＡＡＶを介して送達することができ、非相同末端結合によってヒト化アルブミン遺伝子座に挿入することができる（例えば、外因性ドナー核酸は、ホモロジーアームを含まないものであってよい）。具体的な例では、外因性ドナー核酸は、相同性に依存しない標的化された組み込みを介して挿入することができる。例えば、ヒト化アルブミン遺伝子座に挿入される外因性ドナー核酸の挿入配列は、各側でヌクレアーゼ剤の標的部位（例えば、ヒト化アルブミン遺伝子座と同じ標的部位、およびヒト化アルブミン遺伝子座の標的部位を切断するために使用されているのと同じヌクレアーゼ剤）に隣接し得る。次いで、ヌクレアーゼ剤は、挿入配列に隣接する標的部位を切断することができる。具体的な例では、外因性ドナー核酸は、ＡＡＶ媒介送達で送達され、挿入配列に隣接する標的部位の切断は、ＡＡＶの末端逆位配列（ＩＴＲ）を除去することができる。いくつかの方法では、挿入配列が正しい方向でヒト化アルブミン遺伝子座に挿入された場合、ヒト化アルブミン遺伝子座の標的部位（例えば、隣接するプロトスペーサー隣接モチーフを含むｇＲＮＡ標的配列）はもはや存在しないが、挿入配列がヒト化アルブミン遺伝子座に反対方向に挿入されると再形成される。これは、挿入配列が発現のために正しい方向に挿入されることを確実にするのに役立ち得る。
他の外因性ドナー核酸は、５’末端および／または３’末端に短い一本鎖領域を有し、これらは、ヒト化アルブミン遺伝子座でのヌクレアーゼ剤媒介切断によって作成される１つ以上のオーバーハングに相補的である。これらのオーバーハングは、５’および３’相同性アームと呼ばれることもある。例えば、いくつかの外因性ドナー核酸は、５’末端および／または３’末端に短い一本鎖領域を有し、これらはヒト化アルブミン遺伝子座の５’および／または３’標的配列でのヌクレアーゼ媒介切断によって作成された１つ以上のオーバーハングに相補的である。いくつかのそのような外因性ドナー核酸は、５’末端のみまたは３’末端のみに相補的領域を有する。例えば、いくつかのそのような外因性ドナー核酸は、ヒト化アルブミン遺伝子座の５’標的配列で作成されたオーバーハングに相補的な５’末端にのみ、またはヒト化アルブミン遺伝子座の３’標的配列で作成されたオーバーハングに相補的な３’末端にのみ、相補的領域を有する。他のそのような外因性ドナー核酸は、５’末端と３’末端の両方に相補的領域を有する。例えば、他のそのような外因性ドナー核酸は、ヒト化アルブミン遺伝子座でのヌクレアーゼ媒介切断によって生成される５’と３’末端の両方に相補的領域（例えば、それぞれ第１および第２のオーバーハングに相補的）を有する。例えば、外因性ドナー核酸が二本鎖である場合、一本鎖相補的領域は、ドナー核酸の上部鎖の５’末端およびドナー核酸の下部鎖の５’末端から伸長し、両端に５’突出を作成することができる。代替的に、一本鎖相補領域は、ドナー核酸の上部鎖の３’末端から、およびテンプレートの下部鎖の３’末端から伸長し、３’突出を作成することができる。
相補的領域は、外因性ドナー核酸と標的核酸との間のライゲーションを促進するのに十分な任意の長さであり得る。例示的な相補的領域は、約１～約５ヌクレオチドの長さ、約１～約２５ヌクレオチドの長さ、または約５～約１５０ヌクレオチドの長さである。例えば、相補的領域は、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５ヌクレオチドの長さであってよい。代替的に、相補的領域は、約５～１０、１０～２０、２０～３０、３０～４０、４０～５０、５０～６０、６０～７０、７０～８０、８０～９０、９０～１００、１００～１１０、１１０～１２０、１２０～１３０、１３０～１４０、もしくは１４０～１５０ヌクレオチド、またはそれ以上の長さであり得る。
このような相補的領域は、２対のニッカーゼによって作成された突出を相補的にすることができる。ＤＮＡの反対側の鎖を切断して第１の二本鎖切断を作成する第１および第２のニッカーゼ、およびＤＮＡの反対側の鎖を切断して第２の二本鎖切断を作成する第３および第４のニッカーゼを使用することにより、両端が千鳥状の２つの二本鎖切断を作成できる。例えば、Ｃａｓタンパク質を使用して、第１、第２、第３、および第４のガイドＲＮＡに対応する第１、第２、第３、および第４のガイドＲＮＡ標的配列にニックを入れることができる。第１および第２のガイドＲＮＡ標的配列は、ＤＮＡの第１および第２の鎖上の第１および第２のニッカーゼによって作成されたニックが二本鎖切断を作成するように、第１の切断部位を作成するように配置することができる（すなわち、第１の切断部位は、第１および第２のガイドＲＮＡ標的配列内のニックを含む）。同様に、第３および第４のガイドＲＮＡ標的配列は、ＤＮＡの第１および第２の鎖上の第３および第４のニッカーゼによって作成されたニックが二本鎖切断を作成するように、第２の切断部位を作成するように配置することができる（すなわち第２の切断部位は、第３および第４のガイドＲＮＡ標的配列内のニックを含む）。好ましくは、第１および第２のガイドＲＮＡ標的配列および／または第３および第４のガイドＲＮＡ標的配列内のニックは、オーバーハングを作成するオフセットニックであり得る。オフセットウィンドウは、例えば、少なくとも約５ｂｐ、１０ｂｐ、２０ｂｐ、３０ｂｐ、４０ｂｐ、５０ｂｐ、６０ｂｐ、７０ｂｐ、８０ｂｐ、９０ｂｐ、１００ｂｐ、またはそれ以上であり得る。これらの各々が、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｒａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｃｅｌｌ １５４：１３８０－１３８９、Ｍａｌｉ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．３１：８３３－８３８、およびＳｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １１：３９９－４０４を参照されたい。そのような場合、二本鎖外因性ドナー核酸は、第１および第２のガイドＲＮＡ標的配列内のニックおよび第３および第４のガイドＲＮＡ標的配列内のニックによって作成された突出に相補的な一本鎖相補領域で設計することができる。次いで、そのような外因性ドナー核酸は、非相同末端結合媒介ライゲーションによって挿入することができる。
相同性指向修復による挿入のためのドナー核酸。いくつかの外因性ドナー核酸は、ホモロジーアームを含む。外因性ドナー核酸が核酸インサートも含む場合、ホモロジーアームは核酸インサートに隣接することができる。参照を容易にするために、ホモロジーアームは、本明細書では５’および３’（すなわち、上流および下流）ホモロジーアームと呼ばれる。この用語は、外因性ドナー核酸内の核酸インサートに対するホモロジーアームの相対位置に関連している。５’および３’相同性アームは、ヒト化アルブミン遺伝子座内の領域に対応し、これらは、本明細書では、それぞれ「５’標的配列」および「３’標的配列」と呼ばれる。
ホモロジーアームおよび標的配列は、２つの領域が相同組換え反応の基質として作用するのに十分なレベルの配列同一性を互いに共有する場合、互いに「対応する」または「対応している」。「相同性」という用語は、対応する配列と同一であるか、または配列同一性を共有するＤＮＡ配列を含む。所与の標的配列と外因性ドナー核酸に見られる対応するホモロジーアームとの間の配列同一性は、相同組換えが起こることを可能にする任意の程度の配列同一性であってよい。例えば、外因性ドナー核酸（またはその断片）のホモロジーアームおよび標的配列（またはその断片）によって共有される配列同一性の量は、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性であり得、これにより、配列は相同組換えを起こす。さらに、ホモロジーアームと対応する標的配列との間の対応する相同性領域は、相同組換えを促進するのに十分な任意の長さであり得る。例示的なホモロジーアームは、約２５ヌクレオチド～約２．５ｋｂの長さであるか、約２５ヌクレオチド～約１．５ｋｂの長さであるか、または約２５～約５００ヌクレオチドの長さである。例えば、所与の相同性アーム（または各相同性アーム）および／または対応する標的配列は、約２５～３０、３０～４０、４０～５０、５０～６０、６０～７０、７０～８０、８０～９０、９０～１００、１００～１５０、１５０～２００、２００～２５０、２５０～３００、３００～３５０、３５０～４００、４００～４５０、または４５０～５００ヌクレオチドの長さである対応する相同性領域を含むことができ、その結果、相同性アームが、標的核酸内の対応する標的配列との相同組換えを受けるのに十分な相同性を有する。代替的に、所与のホモロジーアーム（または各ホモロジーアーム）および／または対応する標的配列は、約０．５ｋｂ～約１ｋｂ、約１ｋｂ～約１．５ｋｂ、約１．５ｋｂ～約２ｋｂ、または約２ｋｂ～約２．５ｋｂの長さである対応する相同性領域を含み得る。例えば、ホモロジーアームは、それぞれ約７５０ヌクレオチドの長さであり得る。ホモロジーアームは対称的（それぞれの長さがほぼ同じサイズ）であってもよく、非対称的（一方が他方よりも長い）であってもよい。
ヌクレアーゼ剤を外因性ドナー核酸と組み合わせて使用する場合、ヌクレアーゼ切断部位での一本鎖切断（ニック）または二本鎖切断の際に、標的配列と相同性アームとの間の相同組換え事象の発生を促進するように、５’および３’標的配列をヌクレアーゼ切断部位に十分に近接して（例えば、ヌクレアーゼ標的配列に十分に近接して）配置することが好ましい。「ヌクレアーゼ切断部位」という用語は、ヌクレアーゼ剤（例えば、ガイドＲＮＡと複合体を形成したＣａｓ９タンパク質）によってニックまたは二本鎖切断が作成されるＤＮＡ配列を含む。外因性ドナー核酸の５’および３’ホモロジーアームに対応する標的化遺伝子座内の標的配列は、距離がヌクレアーゼ切断部位での一本鎖切断または二本鎖切断の際の５’および３’標的配列とホモロジーアームとの間の相同組換え事象の発生を促進するような距離である場合、ヌクレアーゼ切断部位に「十分に近接して位置する」。したがって、外因性ドナー核酸の５’および／または３’ホモロジーアームに対応する標的配列は、例えば、所与のヌクレアーゼ切断部位の少なくとも１ヌクレオチド内、または所与のヌクレアーゼ切断部位の少なくとも１０ヌクレオチド～約１，０００ヌクレオチド内であり得る。一例として、ヌクレアーゼ切断部位は、標的配列の少なくとも一方または両方に直接隣接し得る。
外因性ドナー核酸のホモロジーアームおよびヌクレアーゼ切断部位に対応する標的配列の空間的関係は変化し得る。例えば、標的配列は、ヌクレアーゼ切断部位の５’に位置してもよく、標的配列は、ヌクレアーゼ切断部位の３’に位置してもよく、または標的配列は、ヌクレアーゼ切断部位に隣接していてもよい。
（４）その他のヒトアルブミン標的化試薬
他の既知のまたは推定上のヒトアルブミン標的化試薬のいずれかの活性もまた、本明細書に開示される非ヒト動物を使用して評価することができる。同様に、他の任意の分子は、本明細書に開示される非ヒト動物を使用して、ヒトアルブミン標的化活性についてスクリーニングすることができる。
他のヒトアルブミン標的化試薬の例には、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を介して作用するアンチセンスオリゴヌクレオチド（例えば、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ）が含まれる。アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）またはアンチセンスＲＮＡは、標的タンパク質をコードするＲＮＡに選択的に結合し、それによって翻訳を防止することにより、標的タンパク質の発現を防ぐように設計されたヌクレオチドの短い合成ストリングである。これらの化合物は、十分に特徴付けられたワトソン－クリック塩基対合（ハイブリダイゼーション）を介して、高い親和性および選択性でＲＮＡに結合する。ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、遺伝子発現を制御するための内因性の細胞機序であり、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に結合する小さな干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）が標的メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の切断を媒介する。
他のヒトアルブミン標的化試薬には、ヒトアルブミンエピトープに特異的に結合するように設計された抗体または抗原結合タンパク質が含まれる。他のヒトアルブミン標的化試薬には、小分子試薬が含まれる。
Ｄ．非ヒト動物または細胞へのヒトアルブミン標的化試薬の投与
本明細書に開示される方法は、例えば、核酸、タンパク質、核酸－タンパク質複合体、またはタンパク質複合体を含む、様々な分子（例えば、治療用分子または複合体などのヒトアルブミン標的化試薬）を、非ヒト動物または細胞に導入することを含み得る。「導入すること」は、細胞の内部または非ヒト動物細胞の内部にアクセスできるような方法で、細胞または非ヒト動物に分子（例えば、核酸またはタンパク質）を提示することが含まれる。導入することは、任意の手段によって達成することができ、２つ以上の構成要素（例えば、２つの構成要素、またはすべての構成要素）を、任意の組み合わせで同時にまたは逐次的に細胞または非ヒト動物に導入することができる。例えば、Ｃａｓタンパク質は、ガイドＲＮＡの導入前に細胞または非ヒト動物に導入することができ、またはガイドＲＮＡの導入後に導入することができる。別の例として、外因性ドナー核酸は、Ｃａｓタンパク質およびガイドＲＮＡの導入前に導入することができるか、またはＣａｓタンパク質およびガイドＲＮＡの導入後に導入することができる（例えば、外因性ドナー核酸は、Ｃａｓタンパク質およびガイドＲＮＡの導入の約１、２、３、４、８、１２、２４、３６、４８、または７２時間前または後に投与することができる）。例えば、ＵＳ ２０１５／０２４０２６３およびＵＳ ２０１５／０１１０７６２を参照されたく、それらの各々は、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。さらに、２つ以上の構成要素は、同じ送達方法または異なる送達方法によって細胞または非ヒト動物に導入することができる。同様に、２つ以上の成分は、同じ投与経路または異なる投与経路によって非ヒト動物に導入することができる。
いくつかの方法では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの構成要素が非ヒト動物または細胞に導入される。ガイドＲＮＡは、ＲＮＡ（例えば、インビトロ転写されたＲＮＡ）の形態で、またはガイドＲＮＡをコードするＤＮＡの形態で非ヒト動物または細胞に導入することができる。ＤＮＡの形態で導入されると、ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡは、非ヒト動物の細胞内で活性のあるプロモーターに作動可能に連結することができる。例えば、ガイドＲＮＡは、ＡＡＶを介して送達され、Ｕ６プロモーターの下でインビボで発現できる。そのようなＤＮＡは、１つ以上の発現コンストラクト中にあり得る。例えば、そのような発現コンストラクトは、単一の核酸分子の構成要素であり得る。代替的に、それらは、２つ以上の核酸分子の間で任意の組み合わせで分離することができる（すなわち、１つ以上のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡをコードするＤＮＡおよび１つ以上のｔｒａｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡは、別個の核酸分子の構成要素であり得る）。
同様に、Ｃａｓタンパク質は任意の形態で提供してもよい。例えば、Ｃａｓタンパク質は、ｇＲＮＡと複合体を形成したＣａｓタンパク質などのタンパク質の形態で提供してもよい。代替的に、Ｃａｓタンパク質は、ＲＮＡ（例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ））またはＤＮＡなどの、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸の形態で提供してもよい。任意に、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、特定の細胞または生物におけるタンパク質への効率的な翻訳のためにコドン最適化することができる。例えば、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、天然に存在するポリヌクレオチド配列と比較して、哺乳動物細胞、げっ歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、または任意の他の目的の宿主細胞においてより頻度高く使用される代替コドンへと改変することができる。Ｃａｓタンパク質をコードする核酸が非ヒト動物に導入されると、Ｃａｓタンパク質は、一時的、条件付き、または構成的に細胞内で発現され得る。
Ｃａｓタンパク質またはガイドＲＮＡをコードする核酸は、発現コンストラクト中のプロモーターに作動可能に連結され得る。発現構築物は、遺伝子または他の目的の核酸配列（例えば、Ｃａｓ遺伝子）の発現を指示することができ、かつそのような目的の核酸配列を標的細胞に移すことができる任意の核酸構築物を含む。例えば、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、１つ以上のｇＲＮＡをコードするＤＮＡを含むベクター内に存在してもよい。代替的に、それは、１つ以上のｇＲＮＡをコードするＤＮＡを含むベクターとは別のベクターまたはプラスミドであってもよい。発現コンストラクトにおいて使用することができる適切プロモーターとしては、例えば、真核細胞、ヒト細胞、非ヒト細胞、哺乳動物細胞、非ヒト哺乳動物細胞、げっ歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、ハムスター細胞、ウサギ細胞、多能性細胞、胚性幹（ＥＳ）細胞、成体幹細胞、発生が制限された前駆細胞、誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞、または１細胞期胚のうちの１つ以上において活性なプロモーターが挙げられる。そのようなプロモーターは、例えば、条件付きプロモーター、誘導性プロモーター、構成的プロモーター、または組織特異的プロモーターであり得る。任意選択で、プロモーターは、一方向のＣａｓタンパク質と他の方向のガイドＲＮＡの両方の発現を駆動する双方向プロモーターであってもよい。このような双方向プロモーターは、（１）遠位配列要素（ＤＳＥ）、近位配列要素（ＰＳＥ）、およびＴＡＴＡボックスの３つの外部制御要素を含む完全な従来の一方向Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター、ならびに（２）ＤＳＥの５’末端に逆方向に融合されたＰＳＥおよびＴＡＴＡボックスを含む第２の基本的なＰｏｌ ＩＩＩプロモーターで構成してもよい。例えば、Ｈ１プロモーターでは、ＤＳＥはＰＳＥとＴＡＴＡボックスに隣接しており、プロモーターは、Ｕ６プロモーターに由来するＰＳＥおよびＴＡＴＡボックスを追加することによって逆方向の転写が制御されるハイブリッドプロモーターを作成することにより、双方向にすることができる。例えば、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２０１６／００７４５３５を参照されたい。双方向プロモーターを使用してＣａｓタンパク質とガイドＲＮＡをコードする遺伝子を同時に発現させることにより、コンパクトな発現カセットを生成して送達を容易にすることができる。
非ヒト動物または細胞に導入された分子（例えば、Ｃａｓタンパク質またはガイドＲＮＡ）は、導入された分子の安定性を増加させる担体（例えば、所与の貯蔵条件下（例えば、－２０°Ｃ、４°Ｃ、または周囲温度）での、分解産物が閾値未満、例えば出発核酸またはタンパク質の０．５重量％未満のままである期間を延長する、またはインビボでの安定性を増加させる）を含む組成物で提供することができる。そのような担体の非限定的な例には、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）ミクロスフェア、ポリ（Ｄ，Ｌ－乳酸－コグリコール－酸）（ＰＬＧＡ）ミクロスフェア、リポソーム、ミセル、逆ミセル、脂質コキレート（ｃｏｃｈｌｅａｔｅｓ）、および脂質微小管が挙げられる。
細胞または非ヒト動物への分子（例えば、核酸またはタンパク質）の導入を可能にするために、様々な方法および組成物が本明細書で提供される。分子を様々な細胞型に導入するための方法は既知であり、例えば、安定したトランスフェクション法、一過性トランスフェクション法、およびウイルス媒介法が含まれる。
トランスフェクションプロトコル、ならびに分子を細胞に導入するためのプロトコルは異なり得る。非限定的なトランスフェクション法には、リポソーム、ナノ粒子、リン酸カルシウム（Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．（１９７３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２（２）：４５６－６７、Ｂａｃｃｈｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ．（１９７７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７４（４）：１５９０－４、およびＫｒｉｅｇｌｅｒ，Ｍ（１９９１）．Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ．ｐｐ．９６－９７）、デンドリマー、またはＤＥＡＥ－デキストランもしくはポリエチレンイミンなどのカチオン性ポリマーを使用する化学物質ベースのトランスフェクション法が含まれる。非化学的方法には、電気穿孔法、ソノポレーション、および光トランスフェクションが含まれる。粒子ベースのトランスフェクションには、遺伝子銃の使用、またはマグネットアシストトランスフェクション（Ｂｅｒｔｒａｍ（２００６）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７，２７７－２８）が含まれる。ウイルス法もトランスフェクションに使用することができる。
細胞への分子（例えば核酸またはタンパク質）の導入はまた、電気穿孔法、細胞質内注射、ウイルス感染、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、トランスフェクション、脂質媒介トランスフェクション、またはヌクレオフェクションによって媒介され得る。ヌクレオフェクションは、核酸基質を細胞質だけでなく核膜を介して核に送達することを可能にする改善された電気穿孔法技術である。さらに、本明細書に開示される方法でのヌクレオフェクションの使用は、典型的には、通常の電気穿孔法よりもはるかに少ない細胞を必要とする（例えば、通常の電気穿孔法による７００万に対してわずか約２００万）。一例では、ヌクレオフェクションは、ＬＯＮＺＡ（登録商標）ＮＵＣＬＥＯＦＥＣＴＯＲ（商標）システムを使用して行われる。
細胞（例えば、接合子）への分子（例えば、核酸またはタンパク質）の導入は、マイクロインジェクションによっても達成され得る。接合子（すなわち、１細胞期胚）では、マイクロインジェクションは母体および／または父方の前核または細胞質に行うことができる。マイクロインジェクションが１つの前核のみに行われる場合は、サイズが大きいため、父方の前核が適している。ｍＲＮＡのマイクロインジェクションは、好ましくは細胞質へ（例えば、ｍＲＮＡを翻訳機構に直接送達するために）のものであるが、一方で、Ｃａｓタンパク質もしくはＣａｓタンパク質をコードするかまたはＲＮＡをコードするポリヌクレオチドのマイクロインジェクションは、核／前核へのものが好ましい。代替的に、マイクロインジェクションは、核／前核および細胞質の両方への注射によって実施することができ、針を最初に核／前核に導入し、最初の量を注射することができ、１細胞期胚から針を除去しながら、２番目の量を細胞質に注射することができる。Ｃａｓタンパク質が細胞質に注入される場合、Ｃａｓタンパク質は、核／前核への送達を確実にするために、核局在化シグナルを含むことが好ましい。マイクロインジェクションを実施する方法は周知である。例えば、Ｎａｇｙ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｇｙ Ａ，Ｇｅｒｔｓｅｎｓｔｅｉｎ Ｍ，Ｖｉｎｔｅｒｓｔｅｎ Ｋ，Ｂｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｒ．，２００３，Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）を参照されたく、またＭｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０７：１５０２２－１５０２６、およびＭｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０９：９３５４－９３５９も参照されたい。
分子（例えば、核酸またはタンパク質）を細胞または非ヒト動物に導入するための他の方法には、例えば、ベクター送達、粒子媒介送達、エクソソーム媒介送達、脂質ナノ粒子媒介送達、細胞透過性ペプチド媒介送達、または埋め込み型デバイス媒介配達が含まれ得る。具体的な例として、核酸またはタンパク質は、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）マイクロスフェア、ポリ（Ｄ、Ｌ－乳酸－コグリコール酸）（ＰＬＧＡ）マイクロスフェア、リポソーム、ミセル、逆ミセル、脂質渦巻状物、または脂質微小管などの担体中で、細胞または非ヒト動物に導入することができる。非ヒト動物への送達のいくつかの具体的な例には、流体力学的送達、ウイルス媒介送達（例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）媒介送達）、および脂質ナノ粒子媒介送達が含まれる。
細胞または非ヒト動物への核酸およびタンパク質の導入は、流体力学的送達（ＨＤＤ）によって達成することができる。実質細胞への遺伝子送達では、必須のＤＮＡ配列のみを選択した血管から注射する必要があり、現在のウイルスおよび合成ベクターに関連する安全性の懸念が排除される。ＤＮＡは血流に注入されると、血液にアクセスできる様々な組織の細胞に到達することができる。流体力学的送達は、循環中の非圧縮性血液への大量の溶液の迅速な注射によって生成される力を利用して、大きくて膜不透過性の化合物が実質細胞に入るのを妨げる内皮および細胞膜の物理的障壁を克服する。ＤＮＡの送達に加えて、この方法は、ＲＮＡ、タンパク質、およびその他の小さな化合物をインビボで効率的に細胞内に送達するのに役立つ。例えば、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｂｏｎａｍａｓｓａ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．２８（４）：６９４－７０１を参照されたい。
核酸の導入は、ＡＡＶ媒介送達またはレンチウイルス媒介送達などのウイルス媒介送達によっても達成することができる。他の例示的なウイルス／ウイルスベクターには、レトロウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、および単純ヘルペスウイルスが含まれる。ウイルスは、分裂細胞、非分裂細胞、または分裂細胞と非分裂細胞の両方に感染できる。ウイルスは宿主ゲノムに組み込まれてもよく、または代替的に宿主ゲノムに組み込まれなくてもよい。このようなウイルスは、免疫力が低下するように操作することもできる。ウイルスは、複製可能であってもよく、複製欠損（例えば、ビリオン複製および／またはパッケージングの追加ラウンドに必要な１つ以上の遺伝子に欠陥がある）であってもよい。ウイルスは、一過性の発現、長期的な発現（例えば、少なくとも１週間、２週間、１ヶ月、２ヶ月、または３ヶ月）、または永続的な発現（例えば、Ｃａｓ９および／またはｇＲＮＡの）を引き起こし得る。例示的なウイルス力価（例えば、ＡＡＶ力価）は、１０１２、１０１３、１０１４、１０１５、および１０１６ベクターゲノム／ｍＬを含む。
ｓｓＤＮＡ ＡＡＶゲノムは、２つのオープンリーディングフレーム、ＲｅｐとＣａｐで構成され、相補ＤＮＡ鎖の合成を可能にする２つの末端逆位配列が隣接している。ＡＡＶトランスファープラスミドを構築する場合、導入遺伝子は２つのＩＴＲの間に配置され、ＲｅｐとＣａｐはトランスで供給される。ＲｅｐとＣａｐに加えて、ＡＡＶはアデノウイルス由来の遺伝子を含むヘルパープラスミドを必要とする場合がある。これらの遺伝子（Ｅ４、Ｅ２ａ、およびＶＡ）はＡＡＶ複製を仲介する。例えば、トランスファープラスミド、Ｒｅｐ／Ｃａｐ、およびヘルパープラスミドをアデノウイルス遺伝子Ｅ１＋を含むＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトして、感染性ＡＡＶ粒子を生成することができる。代替的に、Ｒｅｐ、Ｃａｐ、およびアデノウイルスヘルパー遺伝子を組み合わせて単一のプラスミドとすることもできる。同様のパッケージングセルおよび方法は、レトロウイルスなどの他のウイルスにも使用できる。
ＡＡＶの複数の血清型が確認されている。これらの血清型は、感染する細胞の種類（すなわち、それらの指向性）が異なり、特定の細胞型の優先的な形質導入を可能にする。ＣＮＳ組織に対する血清型には、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８、およびＡＡＶ９が含まれる。心臓組織に対する血清型には、ＡＡＶ１、ＡＡＶ８、およびＡＡＶ９が含まれる。腎臓組織に対する血清型にはＡＡＶ２が含まれる。肺組織に対する血清型には、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、およびＡＡＶ９が含まれる。膵臓組織に対する血清型にはＡＡＶ８が含まれる。光受容細胞に対する血清型には、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、およびＡＡＶ８が含まれる。網膜色素上皮組織に対する血清型には、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、およびＡＡＶ８が含まれる。骨格筋組織に対する血清型には、ＡＡＶ１、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、およびＡＡＶ９が含まれる。肝臓組織に対する血清型には、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、およびＡＡＶ９、特にＡＡＶ８が含まれる。
指向性は、キャプシドと異なるウイルス血清型からのゲノムの混合である偽型付けによってさらに洗練することができる。例えば、ＡＡＶ２／５は、血清型５のキャプシドにパッケージされた血清型２のゲノムを含むウイルスを示す。偽型ウイルスの使用は、形質導入効率を改善するだけでなく、指向性を変えることができる。異なる血清型に由来するハイブリッドキャプシドを使用して、ウイルスの指向性を改変することもできる。例えば、ＡＡＶ－ＤＪには、８つの血清型由来のハイブリッドキャプシドが含まれており、インビボで幅広い細胞型にわたって高い感染力を示す。ＡＡＶ－ＤＪ８は、ＡＡＶ－ＤＪの特性を示すが、脳への取り込みが強化された別の例である。ＡＡＶ血清型は、変異によっても改変できる。ＡＡＶ２の変異改変の例には、Ｙ４４４Ｆ、Ｙ５００Ｆ、Ｙ７３０Ｆ、およびＳ６６２Ｖが含まれる。ＡＡＶ３の変異改変の例には、Ｙ７０５Ｆ、Ｙ７３１Ｆ、およびＴ４９２Ｖが含まれる。ＡＡＶ６の変異改変の例には、Ｓ６６３ＶおよびＴ４９２Ｖが含まれる。他の偽型／改変ＡＡＶ変異体には、ＡＡＶ２／１、ＡＡＶ２／６、ＡＡＶ２／７、ＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／９、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ８．２、およびＡＡＶ／ＳＡＳＴＧが含まれる。
導入遺伝子の発現を加速するために、自己相補的ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）バリアントを使用することができる。ＡＡＶは細胞のＤＮＡ複製機構に依存して、ＡＡＶの一本鎖ＤＮＡゲノムの相補鎖を合成するため、導入遺伝子の発現が遅れる可能性がある。この遅延に対処するために、感染時に自発的にアニーリングすることができる相補的配列を含むｓｃＡＡＶを使用することができ、宿主細胞のＤＮＡ合成の必要性を排除する。しかしながら、一本鎖ＡＡＶ（ｓｓＡＡＶ）ベクターも使用できる。
パッケージング容量を増やすために、より長い導入遺伝子を、１つ目は３’スプライスドナー、２つ目は５’スプライスアクセプターである２つのＡＡＶトランスファープラスミドに分割することができる。細胞の共感染時に、これらのウイルスはコンカテマーを形成し、一緒にスプライシングされ、完全長の導入遺伝子を発現させることができる。これにより、より長い導入遺伝子の発現が可能になるが、発現の効率は低下する。容量を増やすための同様の方法は、相同組換えを利用する。例えば、導入遺伝子は２つのトランスファープラスミドに分割できるが、共発現が相同組換えと全長導入遺伝子の発現を誘導するように、実質的な配列の重複がある。
核酸とタンパク質の導入は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）媒介送達によっても達成できる。例えば、ＬＮＰ媒介送達は、Ｃａｓ ｍＲＮＡとガイドＲＮＡの組み合わせ、またはＣａｓタンパク質とガイドＲＮＡの組み合わせを送達するために使用することができる。このような方法による送達は、Ｃａｓの一時的発現をもたらし、生分解性脂質はクリアランスを改善し、忍容性を改善し、免疫原性を低下させる。脂質製剤は、生体分子を分解から保護すると同時に、細胞への取り込みを改善することができる。脂質ナノ粒子は、分子間力によって互いに物理的に結合した複数の脂質分子を含む粒子である。これらには、ミクロスフェア（単層および多層ベシクル、例えばリポソームを含む）、エマルジョン中の分散相、ミセル、または懸濁液中の内相が含まれる。そのような脂質ナノ粒子は、送達のために１つ以上の核酸またはタンパク質をカプセル化するために使用することができる。カチオン性脂質を含む製剤は、核酸などのポリアニオンを送達するのに有用である。含めることができる他の脂質は、中性脂質（すなわち、非荷電または両性イオン脂質）、陰イオン脂質、トランスフェクションを増強するヘルパー脂質、およびナノ粒子がインビボで存在できる時間を増加させるステルス脂質である。適切なカチオン性脂質、中性脂質、アニオン性脂質、ヘルパー脂質、およびステルス脂質の例は、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１６／０１０８４０Ａ１に見出すことができる。例示的な脂質ナノ粒子は、カチオン性脂質および１つ以上の他の成分を含むことができる。一例では、他の成分は、コレステロールなどのヘルパー脂質を含むことができる。別の例では、他の成分は、コレステロールなどのヘルパー脂質およびＤＳＰＣなどの中性脂質を含むことができる。別の例では、他の成分は、コレステロールなどのヘルパー脂質、ＤＳＰＣなどの任意の中性脂質、およびＳ０１０、Ｓ０２４、Ｓ０２７、Ｓ０３１、またはＳ０３３などのステルス脂質を含むことができる。
ＬＮＰは、以下の１つ以上またはすべてを含み得る：（ｉ）カプセル化およびエンドソーム脱出のための脂質、（ｉｉ）安定化のための中性脂質、（ｉｉｉ）安定化のためのヘルパー脂質、および（ｉｖ）ステルス脂質。例えば、それらの各々が、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｆｉｎｎ ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ２２：１－９およびＷＯ２０１７／１７３０５４Ａ１を参照されたい。特定のＬＮＰでは、カーゴはガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡをコードする核酸を含むことができる。特定のＬＮＰにおいて、カーゴは、Ｃａｓ９などのＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ、およびガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡをコードする核酸を含み得る。
カプセル化およびエンドソーム脱出のための脂質は、カチオン性脂質であり得る。脂質はまた、生分解性イオン化可能脂質などの生分解性脂質であり得る。適切な脂質の一例は、３－（（４，４－ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）－２－（（（（３－（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピル（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエノアートとも呼ばれる、（９Ｚ，１２Ｚ）－３－（（４，４－ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）－２－（（（（３－（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピルオクタデカ－９，１２－ジエノアートである脂質ＡまたはＬＰ０１である。例えば、それらの各々が、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｆｉｎｎ ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ２２：１－９およびＷＯ２０１７／１７３０５４Ａ１を参照されたい。適切な脂質の別の例は、（（５－（（ジメチルアミノ）メチル）－１，３－フェニレン）ビス（オキシ））ビス（オクタン－８，１－ジイル）ビス（デカノアート）とも呼ばれる、（（５－（（ジメチルアミノ）メチル）－１，３－フェニレン）ビス（オキシ））ビス（オクタン－８，１－ジイル）ビス（デカノアート）である脂質Ｂである。適切な脂質の別の例は、２－（（４－（（（３－（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）ヘキサデカノイル）オキシ）プロパン－１，３－ジイル（９Ｚ，９’Ｚ，１２Ｚ，１２’Ｚ）－ビス（オクタデカ－９，１２－ジエノアート）である脂質Ｃである。適切な脂質の別の例は、３－（（（３－（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）－１３－（オクタノイルオキシ）トリデシル３－オクチルウンデカノアートである脂質Ｄである。他の適切な脂質としては、ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イル４－（ジメチルアミノ）ブタノエート（Ｄｌｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ（ＭＣ３）としても知られる）））が含まれる。
本明細書に記載のＬＮＰでの使用に適したいくつかのそのような脂質は、インビボで生分解性である。例えば、そのような脂質を含むＬＮＰには、脂質の少なくとも７５％が、８、１０、１２、２４、もしくは４８時間以内、または３、４、５、６、７、もしくは１０日以内に血漿から除去されるものが含まれる。別の例として、ＬＮＰの少なくとも５０％が、８、１０、１２、２４、もしくは４８時間以内、または３、４、５、６、７、もしくは１０日以内に血漿から除去される。
このような脂質は、それらが含まれる培地のｐＨに応じてイオン化可能であってよい。例えば、わずかに酸性の培地では、脂質はプロトン化され、したがって正電荷を帯びることができる。逆に、例えば、ｐＨが約７．３５である血液などのわずかに塩基性の媒体では、脂質はプロトン化されない可能性があり、したがって電荷を帯びない可能性がある。いくつかの実施形態では、脂質は、少なくとも約９、９．５、または１０のｐＨでプロトン化され得る。そのような脂質が電荷を帯びる能力は、その固有のｐＫａに関連している。例えば、脂質は、独立して、約５．８～約６．２の範囲のｐＫａを有し得る。
中性脂質は、ＬＮＰを安定化し、その加工を改善するよう機能する。適切な中性脂質の例には、様々な中性、非荷電、または双性イオン性脂質が含まれる。本開示における使用に好適な中性リン脂質の例は、５－ヘプタデシルベンゼン－１，３－ジオール（レゾルシノール）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジステロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ホスファチジルコリン（ＰＬＰＣ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＡＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）、ジラウリロイルホスファチジルコリン（ＤＬＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、１－ミリストイル－２－パルミトイルホスファチジルコリン（ＭＰＰＣ）、１－パルミトイル－２－ミリストイルホスファチジルコリン（ＰＭＰＣ）、１－パルミトイル－２－ステアロイルホスファチジルコリン（ＰＳＰＣ）、１，２－ジアラキドイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＢＰＣ）、１－ステアロイル－２－パルミトイルホスファチジルコリン（ＳＰＰＣ）、１，２－ジエイコセノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＥＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、リソホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジリノレオイルホスファチジルコリンジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、パルミトイルロレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、リソホスファチジルエタノールアミンおよびこれらの組み合わせを含むが、これらには限定されない。例えば、中性リン脂質は、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、およびジミリストイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）からなる群から選択され得る。
ヘルパー脂質には、トランスフェクションを促進する脂質が含まれる。ヘルパー脂質がトランスフェクションを強化する機序は、粒子安定性を増強することを含んでもよい。場合によっては、ヘルパー脂質が膜の融合性を高めることができる。ヘルパー脂質は、ステロイド、ステロール、およびアルキルレゾルシノールを含む。適切なヘルパー脂質の例には、コレステロール、５－ヘプタデシルレゾルシノール、およびヘミコハク酸コレステロールが含まれる。一例では、ヘルパー脂質はコレステロールまたはヘミコハク酸コレステロールであり得る。
ステルス脂質には、ナノ粒子がインビボで存在できる時間の長さを変える脂質が含まれる。ステルス脂質は、例えば、粒子凝集を低減し、粒子サイズを制御することによって製剤化プロセスにおいて有用である。ステルス脂質は、ＬＮＰの薬物動態特性を調節し得る。適切なステルス脂質には、脂質部分に連結された親水性頭部基を有する脂質が含まれる。
ステルス脂質の親水性頭部基は、例えば、ＰＥＧ（しばしばポリ（エチレンオキシド）と呼ばれる）、ポリ（オキサゾリン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（グリセロール）、ポリ（Ｎ－ビニルピロリドン）、ポリアミノ酸、およびポリＮ－（２－ヒドロキシプロピル）メタクリルアミドに基づくポリマーから選択されるポリマー部分を含んでもよい。ＰＥＧという用語は、ポリエチレングリコールまたは他のポリアルキレンエーテルポリマーを意味する。特定のＬＮＰ製剤では、ＰＥＧはＰＥＧ２０００とも呼ばれるＰＥＧ－２Ｋであり、平均分子量は約２，０００ダルトンである。例えば、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１７／１７３０５４Ａ１を参照されたい。
ステルス脂質の脂質部分は、例えば、独立して約Ｃ４～約Ｃ４０の飽和または不飽和の炭素原子を含むアルキル鎖長を有するジアルキルグリセロールまたはジアルキルグリカミド基を含むものを含むジアシルグリセロールまたはジアシルグリカミドから由来し得、ここで鎖は１つ以上の、例えばアミドまたはエステルなどの官能基を含み得る。ジアルキルグリセロールまたはジアルキルグリカミド基は、１つ以上の置換アルキル基をさらに含み得る。
一例として、ステルス脂質は、ＰＥＧ－ジラウロイルグリセロール、ＰＥＧ－ジミリストイルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＭＧ）、ＰＥＧ－ジパルミトイルグリセロール、ＰＥＧ－ジステアロイルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＳＰＥ）、ＰＥＧ－ジラウリルグリカミド、ＰＥＧ－ジミリスチルグリカミド、ＰＥＧ－ジパルミトイルグリカミド、およびＰＥＧ－ジステアロイルグリカミド、ＰＥＧ－コレステロール（Ｉ－［８’－（コレスト－５－エン－３［ベータ］－オキシ）カルボキシアミド－３’，６’－ジオキサオクタニル］カルバモイル－［オメガ］－メチル－ポリ（エチレングリコール）、ＰＥＧ－ＤＭＢ（３，４－ジテトラデコキシルベンジル－［オメガ］－メチル－ポリ（エチレングリコール）エーテル）、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００］（ＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００］（ＰＥＧ２ｋ－ＤＳＰＥ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロール、メトキシポリエチレングリコール（ＰＥＧ２ｋ－ＤＳＧ）、ポリ（エチレングリコール）－２０００－ジメタクリレート（ＰＥＧ２ｋ－ＤＭＡ））、および１，２－ジステアリルオキシプロピル－３－アミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００］（ＰＥＧ２ｋ－ＤＳＡ）から選択してもよい。１つの具体的な例において、ステルス脂質は、ＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧであってよい。
ＬＮＰは、製剤中の成分脂質の異なるそれぞれのモル比を含むことができる。ＣＣＤ脂質のモル％は、例えば、約３０モル％～約６０モル％、約３５モル％～約５５モル％、約４０モル％～約５０モル％、約４２モル％～約４７モル％、または約４５％であってよい。ヘルパー脂質のモル％は、例えば、約３０モル％～約６０モル％、約３５モル％～約５５モル％、約４０モル％～約５０モル％、約４１モル％～約４６モル％、または約４４モル％であってよい。中性脂質のモル％は、例えば、約１モル％～約２０モル％、約５モル％～約１５モル％、約７モル％～約１２モル％、または約９モル％であってよい。ステルス脂質のモル％は、例えば、約１モル％～約１０モル％、約１モル％～約５モル％、約１モル％～約３モル％、約２モル％、または約１モル％であってよい。
ＬＮＰは、生分解性脂質（Ｎ）の正に帯電したアミン基と、カプセル化される核酸の負に帯電したリン酸基（Ｐ）との間で異なる比を有することができる。これは、方程式Ｎ／Ｐで数学的に表すことができる。例えば、Ｎ／Ｐ比は、約０．５～約１００、約１～約５０、約１～約２５、約１～約１０、約１～約７、約３～約５、約４～約５、約４、約４．５、または約５であってよい。Ｎ／Ｐ比はまた、約４～約７または約４．５～約６であり得る。特定の例では、Ｎ／Ｐ比は４．５または６にすることができる。
一部のＬＮＰでは、カーゴはＣａｓ ｍＲＮＡとｇＲＮＡを含むことができる。Ｃａｓ ｍＲＮＡとｇＲＮＡは、異なる比であってよい。例えば、ＬＮＰ製剤は、約２５：１～約１：２５の範囲、約１０：１～約１：１０の範囲、約５：１～約１：５の範囲、または約１：１のＣａｓ ｍＲＮＡとｇＲＮＡの比を含んでもよい。代替的に、ＬＮＰ製剤は、約１：１～約１：５、または約１０：１のＣａｓ ｍＲＮＡとｇＲＮＡ核酸の比を含んでもよい。代替的に、ＬＮＰ製剤は、約１：１０、２５：１、１０：１、５：１、３：１、１：１、１：３、１：５、１：１０、または１：２５のＣａｓ ｍＲＮＡとｇＲＮＡ核酸の比を含んでもよい。代替的に、ＬＮＰ製剤は、約１：１～約１：２の、Ｃａｓ ｍＲＮＡとｇＲＮＡ核酸との比を含んでもよい。具体的な例において、Ｃａｓ ｍＲＮＡとｇＲＮＡとの比は、約１：１または約１：２であってよい。
一部のＬＮＰでは、カーゴは外因性ドナー核酸とｇＲＮＡを含むことができる。外因性ドナー核酸とｇＲＮＡは異なる比にすることができる。例えば、ＬＮＰ製剤は、約２５：１～約１：２５の範囲、約１０：１～約１：１０の範囲、約５：１～約１：５、または約１：１の外因性ドナー核酸とｇＲＮＡの比を含んでもよい。代替的に、ＬＮＰ製剤は、約１：１～約１：５、約５：１～約１：１、約１０：１、または約１：１０の外因性ドナー核酸とｇＲＮＡの比を含んでもよい。代替的に、ＬＮＰ製剤は、約１：１０、２５：１、１０：１、５：１、３：１、１：１、１：１：３、１：５、１：１０、または１：２５の外因性ドナー核酸とｇＲＮＡ核酸の比を含んでもよい。
適切なＬＮＰの具体的な例は、４．５の窒素対リン酸塩（Ｎ／Ｐ）比を持ち、４５：４４：９：２のモル比で生分解性カチオン性脂質、コレステロール、ＤＳＰＣ、およびＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧを含む。生分解性カチオン性脂質は、３－（（４，４－ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）－２－（（（（３－（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピル（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエノアートとも呼ばれる、（９Ｚ，１２Ｚ）－３－（（４，４－ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）－２－（（（（３－（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピルオクタデカ－９，１２－ジエノアートであり得る。例えば、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｆｉｎｎ ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ２２：１－９を参照されたい。Ｃａｓ９ ｍＲＮＡは、ガイドＲＮＡに対して重量比で１：１にすることができる。適切なＬＮＰの別の具体的な例には、Ｄｌｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ（ＭＣ３）、コレステロール、ＤＳＰＣ、およびＰＥＧ－ＤＭＧが５０：３８．５：１０：１．５のモル比で含まれている。
適切なＬＮＰの別の具体的な例は、６の窒素対リン酸塩（Ｎ／Ｐ）比を持ち、５０：３８：９：３のモル比で生分解性カチオン性脂質、コレステロール、ＤＳＰＣ、およびＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧを含む。生分解性カチオン性脂質は、３－（（４，４－ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）－２－（（（（３－（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピル（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエノアートとも呼ばれる、（９Ｚ，１２Ｚ）－３－（（４，４－ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）－２－（（（（３－（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピルオクタデカ－９，１２－ジエノアートであり得る。Ｃａｓ９ ｍＲＮＡは、ガイドＲＮＡに対して重量比で１：２にすることができる。
免疫原性を低下させるために、送達様式を選択することができる。例えば、Ｃａｓタンパク質およびｇＲＮＡは、異なる様式（例えば、バイモーダル（ｂｉ－ｍｏｄａｌ）送達）によって送達され得る。これらの異なる様式は、対象の送達された分子（例えば、Ｃａｓまたは核酸をコードする、ｇＲＮＡまたは核酸をコードする、または外因性ドナー核酸／修復テンプレート）に異なる薬力学または薬物動態特性を与える可能性がある。例えば、異なる様式は、異なる組織分布、異なる半減期、または異なる時間的分布をもたらす可能性がある。いくつかの送達様式（例えば、自律複製またはゲノム組み込みによって細胞内で持続する核酸ベクターの送達）は、分子のより持続的な発現および存在をもたらすが、他の送達様式は、一過性で持続性が低い（例えば、ＲＮＡまたはタンパク質の送達）。例えばｍＲＮＡまたはタンパク質としてのより一時的な方法でのＣａｓタンパク質の送達は、Ｃａｓ／ｇＲＮＡ複合体が短期間のみ存在し、活性であることを保証し、ＭＨＣ分子によって細胞の表面に表示される細菌由来のＣａｓ酵素からのペプチドによって引き起こされる免疫原性を低下させることができる。このような一時的な送達は、オフターゲットの改変の可能性を減らすこともできる。
インビボでの投与は、例えば、非経口、静脈内、経口、皮下、動脈内、頭蓋内、髄腔内、腹腔内、局所、鼻腔内、または筋肉内を含む任意の適切な経路によることができる。全身投与様式には、例えば、経口および非経口経路が含まれる。非経口経路の例には、静脈内、動脈内、骨内、筋肉内、皮内、皮下、鼻腔内、および腹腔内経路が含まれる。具体的な例は静脈内注入である。鼻腔内注入および硝子体内注射は、他の特定の例である。局所投与様式には、例えば、髄腔内、脳室内、実質内（例えば、線条体（例えば、尾状核または被殻へ）、大脳皮質、前中心回旋、海馬（例えば、歯状回またはＣＡ３領域）、側頭皮質、扁桃体、前頭皮質、視床、小脳、髄質、視床、視蓋、被殻、またはニグラ実質への局所的な実質内送達）、眼内、眼窩内、結膜下、硝子体内、網膜下、および強膜を介した経路が含まれる。（全身的アプローチと比較して）有意に少量の成分は、全身的に投与された場合（例えば、静脈内）と比較して、局所的に投与された場合（例えば、実質内または硝子体内）に効果を発揮し得る。局所投与様式はまた、治療有効量の成分が全身投与されるときに起こり得る潜在的に毒性の副作用の発生率を低減または排除し得る。
インビボでの投与は、例えば、非経口、静脈内、経口、皮下、動脈内、頭蓋内、髄腔内、腹腔内、局所、鼻腔内、または筋肉内を含む任意の適切な経路によることができる。具体的な例は静脈内注入である。ガイドＲＮＡおよび／またはＣａｓタンパク質（またはガイドＲＮＡおよび／またはＣａｓタンパク質をコードする核酸）を含む組成物は、１つ以上の生理学的および薬学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤または助剤を使用して処方することができる。製剤は、選択した投与経路に依存する可能性がある。「薬学的に許容される」という用語は、担体、希釈剤、賦形剤、または補助剤が製剤の他の成分と適合性であり、そのレシピエントに実質的に有害ではないことを意味する。
投与の頻度および投与回数は、他の要因の中でもとりわけ、外因性ドナー核酸、ガイドＲＮＡ、またはＣａｓタンパク質（またはガイドＲＮＡもしくはＣａｓタンパク質をコードする核酸）の半減期および投与経路に依存し得る。細胞または非ヒト動物への核酸またはタンパク質の導入は、ある期間にわたって１回または複数回実施することができる。例えば、導入は、ある期間にわたって少なくとも２回、ある期間にわたって少なくとも３回、ある期間にわたって少なくとも４回、ある期間にわたって少なくとも５回、ある期間にわたって少なくとも６回、ある期間にわたって少なくとも７回、ある期間にわたって少なくとも８回、ある期間にわたって少なくとも９回、ある期間にわたって少なくとも１０回、ある期間にわたって少なくとも１１回、ある期間にわたって少なくとも１２回、ある期間にわたって少なくとも１３回、ある期間にわたって少なくとも１４回、ある期間にわたって少なくとも１５回、ある期間にわたって少なくとも１６回、ある期間にわたって少なくとも１７回、ある期間にわたって少なくとも１８回、ある期間にわたって少なくとも１９回、またはある期間にわたって少なくとも２０回、実施することができる。
Ｅ．インビボまたはエクスビボでのヒトアルブミン標的化試薬の送達、活性、または有効性の測定
本明細書に開示される方法は、ヒトアルブミン標的化試薬の活性を検出または測定することをさらに含み得る。例えば、ヒトアルブミン標的化試薬がゲノム編集試薬（例えば、ヒトアルブミン遺伝子座を標的化するように設計されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）である場合、測定は、修飾のためのヒト化アルブミン遺伝子座を評価することを含み得る。
標的化遺伝子改変を有する細胞を同定するために様々な方法を使用することができる。スクリーニングは、親染色体の対立遺伝子の修飾（ＭＯＡ）を評価するための定量的アッセイを含み得る。例えば、ＵＳ２００４／００１８６２６、ＵＳ２０１４／０１７８８７９、ＵＳ２０１６／０１４５６４６、ＷＯ２０１６／０８１９２３、およびＦｒｅｎｄｅｗｅｙ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．４７６：２９５－３０７を参照されたく、それらの各々は、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。例えば、定量的アッセイは、リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）などの定量的ＰＣＲを介して実施することができる。リアルタイムＰＣＲは、標的遺伝子座を認識する第１のプライマーセットおよび非標的参照遺伝子座を認識する第２のプライマーセットを利用することができる。プライマーセットは、増幅された配列を認識する蛍光プローブを含むことができる。好適な定量的なアッセイの他の例としては、蛍光媒介インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、比較ゲノムハイブリダイゼーション、等温ＤＮＡ増幅、固定化プローブすべてに対する定量的ハイブリダイゼーション、ＩＮＶＡＤＥＲ（登録商標）プローブ、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）分子ビーコンプローブ、またはＥｃｌｉｐｓｅ（商標）プローブ技術が挙げられる（例えば、の目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ２００５／０１４４６５５を参照されたい）。
次世代シーケンシング（ＮＧＳ）もスクリーニングに使用できる。次世代シーケンシングは、「ＮＧＳ」または「超並列シーケンシング」または「ハイスループットシーケンシング」と呼ばれることもある。ＮＧＳは、ＭＯＡアッセイに加えてスクリーニングツールとして使用して、標的となる遺伝子改変の正確な性質と、それが細胞タイプ、組織タイプ、または臓器タイプ間で一貫しているかどうかを定義できる。
非ヒト動物におけるヒト化アルブミン遺伝子座の修飾を評価することは、任意の組織または臓器からの任意の細胞型にあり得る。例えば、評価は、同じ組織または臓器からの複数の細胞型、または組織または臓器内の複数の場所からの細胞で行うことができる。これは、標的組織または臓器内のどの細胞型が標的化されているか、または組織または臓器のどのセクションがヒトアルブミン標的化試薬によって到達されているかについての情報を提供することができる。別の例として、評価は複数の種類の組織または複数の臓器で行うことができる。特定の組織、臓器、または細胞型が標的にされる方法では、これは、その組織または臓器がどれほど効果的に標的にされるか、および他の組織または臓器にオフターゲット効果があるかどうかについての情報を提供することができる。
試薬が、ヒト化アルブミン遺伝子座を不活化する、ヒト化アルブミン遺伝子座の発現に影響を与える、ヒト化アルブミンｍＲＮＡの翻訳を防止する、またはヒト化アルブミンタンパク質を除去するように設計されている場合、測定にはヒト化アルブミンｍＲＮＡまたはタンパク質発現の評価を含めることができる。この測定は、肝臓内または肝臓内の特定の細胞型または領域内で行うことができるか、または分泌されたヒト化アルブミンタンパク質の血清レベルを測定することを含むことができる。
試薬が、野生型内因性アルブミン遺伝子座によってコードまたは発現されない外因性タンパク質をコードする外因性ドナー核酸である場合、測定は、外因性ドナー核酸によってコードされるｍＲＮＡの発現を評価すること、または外因性タンパク質の発現を評価することを含み得る。この測定は、肝臓内または肝臓内の特定の細胞型または領域内で行うことができるか、または分泌された外因性タンパク質の血清レベルを測定することを含み得る。特定の例では、外因性タンパク質は、第ＩＸ因子タンパク質である。任意選択で、評価は、非ヒト動物における第ＩＸ因子タンパク質の血清レベルを測定することを含み、かつ／または活性化部分トロンボプラスチン時間を評価すること、またはトロンビン生成アッセイを行うことを含む。任意選択で、非ヒト動物は、不活化されたＦ９遺伝子座をさらに含み、評価は、非ヒト動物における第ＩＸ因子タンパク質の血清レベルを測定することを含み、かつ／または活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）を評価すること、またはトロンビン生成アッセイ（ＴＧＡ）を行うことを含む。これらのアッセイは、実施例でより詳細に説明される。
使用することができるアッセイの一例は、無傷の固定組織との関連で、単一ヌクレオチドの変化を含む、細胞特異的に編集された転写物を定量化することができる方法である、ＢＡＳＥＳＣＯＰＥ（商標）ＲＮＡインサイチュハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）アッセイである。ＢＡＳＥＳＣＯＰＥ（商標）ＲＮＡ ＩＳＨアッセイは、遺伝子編集の特性評価においてＮＧＳおよびｑＰＣＲを補完することができる。ＮＧＳ／ｑＰＣＲは野生型および編集された配列の定量的平均値を提供できるが、組織内の編集された細胞の不均一性またはパーセンテージに関する情報は提供しない。ＢＡＳＥＳＣＯＰＥ（商標）ＩＳＨアッセイは、組織全体のランドスケープビューと、編集されたｍＲＮＡ転写物を含む標的組織内の実際の細胞数を定量化できる単一細胞分解能での野生型対編集された転写物の定量化とを提供できる。ＢＡＳＥＳＣＯＰＥ（商標）アッセイは、ペアオリゴ（「ＺＺ」）プローブを使用して非特異的なバックグラウンドなしでシグナルを増幅し、単一分子ＲＮＡ検出を実現する。しかしながら、ＢＡＳＥＳＣＯＰＥ（商標）プローブの設計とシグナル増幅システムにより、ＺＺプローブを使用した単一分子ＲＮＡの検出が可能になり、無傷の固定組織における単一ヌクレオチドの編集と変異を差次的に検出できる。
ヒト化アルブミンタンパク質または外因性タンパク質の産生および分泌は、任意の既知の手段によって評価することができる。例えば、発現は、既知のアッセイを使用して、非ヒト動物の肝臓におけるコードされたｍＲＮＡのレベルまたは非ヒト動物の肝臓におけるコードされたタンパク質のレベルを測定することによって評価することができる。ヒト化アルブミンタンパク質または外因性タンパク質の分泌は、既知のアッセイを使用して、非ヒト動物におけるコードされたヒト化アルブミンタンパク質または外因性タンパク質のまたは血漿レベルまたは血清レベルを測定することによって評価することができる。
ＩＶ．ヒト化アルブミン遺伝子座を含む非ヒト動物を作製する方法
本明細書の他の場所に開示されるように、ヒト化アルブミン（ＡＬＢ）遺伝子座を含む非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞、または非ヒト動物を作製するための様々な方法が提供される。遺伝子改変された生物を産生するための任意の便利な方法またはプロトコルは、そのような遺伝子改変された非ヒト動物を産生するのに適している。例えば、Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ４２：１９．１１：１９．１１．１－１９．１１．２２およびＧａｍａ Ｓｏｓａ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｂｒａｉｎ Ｓｔｒｕｃｔ．Ｆｕｎｃｔ．２１４（２－３）：９１－１０９を参照されたく、それらの各々は、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。そのような遺伝子修飾された非ヒト動物は、例えば、標的化アルブミン遺伝子座での遺伝子ノックインを介して生成することができる。
例えば、ヒト化アルブミン遺伝子座を含む非ヒト動物を産生する方法は、（１）ヒト化アルブミン遺伝子座を含むように多能性細胞のゲノムを修飾することと、（２）ヒト化アルブミン遺伝子座を含む遺伝子修飾された多能性細胞を同定または選択することと、（３）遺伝子修飾された多能性細胞を非ヒト動物宿主胚に導入することと、（４）代理母に宿主胚を着床させて懐胎させることとを含み得る。例えば、ヒト化アルブミン遺伝子座を含む非ヒト動物を産生する方法は、（１）ヒト化アルブミン遺伝子座を含むように多能性細胞のゲノムを修飾することと、（２）ヒト化アルブミン遺伝子座を含む遺伝子修飾された多能性細胞を同定または選択することと、（３）遺伝子修飾された多能性細胞を非ヒト動物宿主胚に導入することと、（４）代理母に宿主胚を懐胎させることとを含み得る。任意選択で、改変された多能性細胞（例えば、非ヒトＥＳ細胞）を含む宿主胚は、Ｆ０非ヒト動物を産生するために代理母に着床させおよび懐胎させる前に胚盤胞段階までインキュベートされ得る。次に、代理母は、ヒト化アルブミン遺伝子座を含むＦ０世代の非ヒト動物を産生することができる。
この方法は、修飾された標的ゲノム遺伝子座を有する細胞または動物を同定することをさらに含み得る。標的化遺伝子改変を有する細胞を同定するために様々な方法を使用することができる。
ゲノムを修飾するステップは、例えば、外因性ドナー核酸（例えば、標的化ベクター）を利用して、本明細書に開示されるヒト化アルブミン遺伝子座を含むようにアルブミン遺伝子座を修飾することができる。一例として、標的化ベクターは、内因性アルブミン遺伝子座（例えば、内因性非ヒト動物アルブミン遺伝子座）でヒト化アルブミン遺伝子を生成するためのものであり得、標的化ベクターは、内因性アルブミン遺伝子座の５’標的配列を標的とする５’相同性アーム、および内因性アルブミン遺伝子座の３’標的配列を標的とする３’相同性アームを含む。外因性ドナー核酸はまた、アルブミン遺伝子座に組み込まれるＤＮＡのセグメントを含む核酸インサートを含み得る。アルブミン遺伝子座での核酸インサートの組込みは、アルブミン遺伝子座での目的の核酸配列の付加、アルブミン遺伝子座での目的の核酸配列の欠失、またはアルブミン遺伝子座での目的の核酸配列の置換（すなわち、欠失および挿入）をもたらし得る。相同性アームは、ヒトアルブミン配列を含む挿入核酸に隣接して、ヒト化アルブミン遺伝子座を生成することができる（例えば、内因性アルブミン遺伝子座のセグメントを削除し、オーソロガスなヒトアルブミン配列で置き換えるため）。
外因性ドナー核酸は、非相同末端結合を介した挿入または相同組換えのためのものであり得る。外因性ドナー核酸は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）を含むことができ、それらは一本鎖または二本鎖であり得、そしてそれらは直線状または環状の形態であり得る。例えば、修復テンプレートは、一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）であり得る。
異種ドナー核酸はまた、標的化されていない内因性アルブミン遺伝子座に存在しない異種配列を含み得る。例えば、外因性ドナー核酸は、リコンビナーゼ認識部位に隣接する選択カセットなどの選択カセットを含み得る。
いくつかの外因性ドナー核酸は、相同性アームを含む。外因性ドナー核酸が核酸インサートも含む場合、ホモロジーアームは核酸インサートに隣接することができる。参照を容易にするために、ホモロジーアームは、本明細書では５’および３’（すなわち、上流および下流）ホモロジーアームと呼ばれる。この用語は、外因性ドナー核酸内の核酸インサートに対するホモロジーアームの相対位置に関連している。５’および３’相同性アームは、アルブミン遺伝子座内の領域に対応し、これらは、本明細書では、それぞれ「５’標的配列」および「３’標的配列」と呼ばれる。
相同性アームおよび標的配列は、２つの領域が相同組換え反応の基質として作用するのに十分なレベルの配列同一性を互いに共有する場合、互いに「対応する」または「対応している」。「相同性」という用語は、対応する配列と同一であるか、または配列同一性を共有するＤＮＡ配列を含む。所与の標的配列と外因性ドナー核酸に見られる対応するホモロジーアームとの間の配列同一性は、相同組換えが起こることを可能にする任意の程度の配列同一性であってよい。例えば、外因性ドナー核酸（またはその断片）のホモロジーアームおよび標的配列（またはその断片）によって共有される配列同一性の量は、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性であり得、これにより、配列は相同組換えを起こす。さらに、ホモロジーアームと対応する標的配列との間の対応する相同性領域は、相同組換えを促進するのに十分な任意の長さであり得る。いくつかの発現ベクターでは、内因性アルブミン遺伝子座の意図された変異は、相同性アームに隣接する挿入核酸に含まれる。
１細胞期胚以外の細胞では、外因性ドナー核酸は、「標的化ベクター」または「ＬＴＶＥＣ」であってよく、これには、細胞内で相同組換えを行うことを目的とした他のアプローチで典型的に使用されるものよりも大きい核酸配列に対応し、それに由来する相同性アームを含む標的化ベクターが含まれる。ＬＴＶＥＣにはまた、細胞内で相同組換えを行うことを目的とした他のアプローチで通常使用されるものよりも大きい核酸配列を有する核酸インサートを含む標的化ベクターが含まれる。例えば、ＬＴＶＥＣは、サイズの制限のために従来のプラスミドベースの標的化ベクターでは対応できない大きな遺伝子座の変更を可能にする。例えば、標的化された遺伝子座は、従来の方法を使用して標的化できないか、またはヌクレアーゼ剤（例えば、Ｃａｓタンパク質）によって誘導されるニックもしくは二本鎖切断の非存在下で不正確にのみ、または有意に低い効率でのみ標的化され得る細胞の遺伝子座であってもよい（すなわち、５’および３’相同性アームが対応し得る）。ＬＴＶＥＣは任意の長さであってもよく、通常は少なくとも１０ｋｂ長である。ＬＴＶＥＣの５’相同性アームと３’相同性アームの合計は、典型的には、少なくとも１０ｋｂである。
スクリーニングステップは、例えば、親染色体の対立遺伝子の改変（ＭＯＡ）を評価するための定量的アッセイを含むことができる。例えば、定量的アッセイは、リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）などの定量的ＰＣＲを介して実施することができる。リアルタイムＰＣＲは、標的遺伝子座を認識する第１のプライマーセットおよび非標的参照遺伝子座を認識する第２のプライマーセットを利用することができる。プライマーセットは、増幅された配列を認識する蛍光プローブを含むことができる。
好適な定量的なアッセイの他の例としては、蛍光媒介インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、比較ゲノムハイブリダイゼーション、等温ＤＮＡ増幅、固定化プローブに対する定量的ハイブリダイゼーション、ＩＮＶＡＤＥＲ（登録商標）プローブ、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）分子ビーコンプローブ、またはＥＣＬＩＰＳＥ（商標）プローブ技術が挙げられる（例えば、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ２００５／０１４４６５５を参照されたい）。
適切な多能性細胞の例は、胚性幹（ＥＳ）細胞（例えば、マウスＥＳ細胞またはラットＥＳ細胞）である。修飾された多能性細胞は、例えば、（ａ）例えば、５’および３’標的部位に対応する５’および３’相同性アームに隣接する挿入核酸を含む１つ以上の外因性ドナー核酸（例えば、標的化ベクター）を細胞に導入することであって、挿入核酸がヒト化アルブミン遺伝子座を生成するためにヒトアルブミン配列を含む、導入すること、および（ｂ）そのゲノム内に内因性アルブミン遺伝子座に組み込まれた挿入核酸を含む少なくとも１つの細胞を同定する（すなわち、ヒト化アルブミン遺伝子座を含む少なくとも１つの細胞を同定する）ことによる組換えによって生成することができる。修飾された多能性細胞は、例えば、（ａ）５’および３’標的部位に対応する５’および３’相同性アームに隣接する挿入核酸を含む１つ以上の標的化ベクターを細胞に導入することであって、挿入核酸がヒト化アルブミン遺伝子座を含む、導入すること、および（ｂ）そのゲノム内に標的ゲノム遺伝子座に組み込まれた挿入核酸を含む少なくとも１つの細胞を同定することによる組換えによって生成することができる。
代替的に、修飾された多能性細胞は、（ａ）細胞に（ｉ）ヌクレアーゼ剤であって、ヌクレアーゼ剤が内因性アルブミン遺伝子座内の標的部位でニックまたは二本鎖切断を誘導する、ヌクレアーゼ剤と、（ｉｉ）任意選択で、例えば、ヌクレアーゼ標的部位に十分に近接して位置する５’および３’標的部位に対応する５’および３’相同性アームに隣接する挿入核酸を含む１つ以上の外因性ドナー核酸（例えば、標的化ベクター）であって、挿入核酸がヒト化アルブミン遺伝子座を生成するためにヒトアルブミン配列を含む、外因性ドナー核酸と、を導入することと、（ｃ）そのゲノム内に内因性アルブミン遺伝子座に組み込まれた挿入核酸を含む少なくとも１つの細胞を同定すること（すなわち、ヒト化アルブミン遺伝子座を含む少なくとも１つの細胞を同定すること）とによって生成され得る。代替的に、修飾された多能性細胞は、（ａ）細胞に（ｉ）ヌクレアーゼ剤またはヌクレアーゼ剤をコードする核酸であって、ヌクレアーゼ剤が内因性アルブミン遺伝子座内の標的部位でニックまたは二本鎖切断を誘導する、ヌクレアーゼ剤またはヌクレアーゼ剤をコードする核酸と、（ｉｉ）任意選択で、例えば、ヌクレアーゼ標的部位に十分に近接して位置する５’および３’標的部位に対応する５’および３’相同性アームに隣接する挿入核酸を含む１つ以上の外因性ドナー核酸（例えば、標的化ベクター）であって、挿入核酸がヒト化アルブミン遺伝子座を生成するためにヒトアルブミン配列を含む、外因性ドナー核酸と、を導入することと、（ｃ）そのゲノム内に内因性アルブミン遺伝子座に組み込まれた挿入核酸を含む少なくとも１つの細胞を同定すること（すなわち、ヒト化アルブミン遺伝子座を含む少なくとも１つの細胞を同定すること）とによって生成され得る。代替的に、修飾された多能性細胞は、（ａ）細胞に（ｉ）ヌクレアーゼ剤であって、ヌクレアーゼ剤が標的ゲノム遺伝子座内の認識部位でニックまたは二本鎖切断を誘導する、ヌクレアーゼ剤と、（ｉｉ）認識部位に十分に近接して位置する５ ’および３’標的部位に対応する５ ’および３’相同性アームに隣接する挿入核酸を含む１つ以上の標的化ベクターであって、挿入核酸がヒト化アルブミン遺伝子座を含む、標的化ベクターと、を導入することと、（ｃ）標的ゲノム遺伝子座に修飾（例えば、挿入核酸の組み込み）を含む少なくとも１つの細胞を同定することとによって生成され得る。ニックまたは二本鎖切断を所望の認識部位に誘導する任意のヌクレアーゼ剤を使用することができる。代替的に、修飾された多能性細胞は、（ａ）細胞に（ｉ）ヌクレアーゼ剤またはヌクレアーゼ剤をコードする核酸であって、ヌクレアーゼ剤が標的ゲノム遺伝子座内の認識部位でニックまたは二本鎖切断を誘導する、ヌクレアーゼ剤またはヌクレアーゼ剤をコードする核酸と、（ｉｉ）認識部位に十分に近接して位置する５ ’および３’標的部位に対応する５ ’および３’相同性アームに隣接する挿入核酸を含む１つ以上の標的化ベクターであって、挿入核酸がヒト化アルブミン遺伝子座を含む、標的化ベクターと、を導入することと、（ｃ）標的ゲノム遺伝子座に修飾（例えば、挿入核酸の組み込み）を含む少なくとも１つの細胞を同定することとによって生成され得る。ニックまたは二本鎖切断を所望の認識部位に誘導する任意のヌクレアーゼ剤を使用することができる。適切なヌクレアーゼの例には、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、メガヌクレアーゼ、およびクラスター化等間隔短鎖回文リピート（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連 （Ｃａｓ）系（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／ Ｃａｓ９系）またはそのような系（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９）の成分が含まれる。例えば、ＵＳ ２０１３／０３０９６７０およびＵＳ ２０１５／０１５９１７５を参照されたく、それらの各々は、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
ドナー細胞は、胚盤胞期または前桑実胚期（ｐｒｅ－ｍｏｒｕｌａ ｓｔａｇｅ）（すなわち、４細胞期または８細胞期）などの任意の段階で宿主胚に導入することができる。生殖細胞系列を介して遺伝子改変を伝達することができる子孫が生成される。例えば、米国特許第７，２９４，７５４を参照されたく、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
代替的に、本明細書の他の場所に記載の非ヒト動物を作製する方法は、（１）多能性細胞を修飾するための上記の方法を使用してヒト化アルブミン遺伝子座を含むように１細胞期胚のゲノムを修飾することと、（２）遺伝子修飾された胚を選択することと、（３）代理母に遺伝子修飾された胚を着床させて懐胎させることとを含み得る。代替的に、本明細書の他の場所に記載の非ヒト動物を作製する方法は、（１）多能性細胞を修飾するための上記の方法を使用して、ヒト化アルブミン遺伝子座を含むように１細胞期胚のゲノムを修飾することと、（２）遺伝子修飾された胚を選択することと、 （３）代理母に遺伝子修飾された胚を懐胎させることとを含み得る。生殖細胞系列を介して遺伝子改変を伝達することができる子孫が生成される。
核移植技術はまた、非ヒト哺乳動物を生成するために使用することができる。簡単に言えば、核移植の方法は、（１）卵母細胞を除核するか、または除核された卵母細胞を提供するステップと、（２）除核した卵母細胞と組み合わせるドナー細胞または核を単離または提供するステップと、（３）細胞または核を除核した卵母細胞に挿入して、再構成された細胞を形成するステップと、（４）再構成された細胞を動物の子宮に着床させて胚を形成するステップと、（５）胚の発育させるステップと、を含めることができる。このような方法では、卵母細胞は一般に死亡した動物から回収されるが、生きている動物の卵管および／または卵巣からも単離され得る。卵母細胞は、除核前にさまざまなよく知られた培地で成熟させることができる。卵母細胞の除核は、多くのよく知られた方法で行うことができる。再構成された細胞を形成するための除核卵母細胞へのドナー細胞または核の挿入は、融合の前に透明帯の下にドナー細胞をマイクロインジェクションすることによって行うことができる。融合は、接触／融合面を横切るＤＣ電気パルスの印加（電気融合）、ポリエチレングリコールなどの融合促進化学物質への細胞の曝露、またはセンダイウイルスなどの不活化ウイルスによって誘発され得る。再構成された細胞は、核のドナーとレシピエントの卵母細胞の融合の前、最中、および／または後に、電気的および／または非電気的手段によって活性化することができる。活性化方法には、電気パルス、化学的に誘発されたショック、精子による浸透、卵母細胞における二価カチオンのレベルの増加、および卵母細胞における細胞タンパク質のリン酸化の低減（キナーゼ阻害剤による）が含まれる。活性化された再構成された細胞、または胚は、よく知られた培地で培養され、次に動物の子宮に移され得る。例えば、ＵＳ２００８／００９２２４９、ＷＯ１９９９／００５２６６、ＵＳ２００４／０１７７３９０、ＷＯ２００８／０１７２３４、および米国特許第７，６１２，２５０号を参照されたく、これらの各々は、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書で提供される様々な方法は、遺伝子修飾された非ヒトＦ０動物の生成を可能にし、遺伝子修飾されたＦ０動物の細胞は、ヒト化アルブミン遺伝子座を含む。Ｆ０動物を生成するために使用される方法に応じて、ヒト化アルブミン遺伝子座を有するＦ０動物内の細胞の数が異なることが認識される。例えば、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）方法を介して、対応する生物からの前桑実胚期の胚（例えば、８細胞期マウス胚）にドナーＥＳ細胞の導入することにより、Ｆ０動物の細胞集団のより大きな割合が、標的化遺伝子改変を含む目的のヌクレオチド配列を有する細胞を含むことを可能にする。例えば、非ヒトＦ０動物の細胞寄与の少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８５％、８６％、８７％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％が、標的化改変を有する細胞集団を含むことができる。
遺伝子修飾されたＦ０動物の細胞は、ヒト化アルブミン遺伝子座に対してヘテロ接合性であり得るか、またはヒト化アルブミン遺伝子座に対してホモ接合性であり得る。
上記または下記で引用されているすべての特許出願、ウェブサイト、他の刊行物、アクセッション番号などは、各項目が、参照により組み込まれることが具体的にかつ個別に示されたのと同じ程度に、すべての目的に関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。配列の異なるバージョンが違う時間にアクセッション番号に関連付けられている場合、本出願の有効な出願日においてアクセッション番号に関連付けられるバージョンを意味する。有効な出願日とは、該当する場合、アクセッション番号に関する実際の出願日以前または優先出願の出願日を意味する。同様に、刊行物、ウェブサイトなどの異なるバージョンが違う時間に公開されている場合、別段の指定のない限り、本出願の有効な出願日の直近に公開されたバージョンを意味する。別段に他の指示がない限り、本発明の任意の特徴、ステップ、要素、実施形態、または態様を、任意の他のものと組み合わせて使用することができる。本発明は、明瞭さおよび理解の目的に対し図表および例を介していくつかの詳細が記載されているが、添付の特許請求の範囲内で、ある特定の変化および改変を実施することができることが明らかになろう。
配列の簡単な説明
添付の配列表に列記されているヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、ヌクレオチド塩基のための標準的な文字略語、およびアミノ酸のための三文字表記を使用して示されている。ヌクレオチド配列は、配列の５’末端から始まって先へ（すなわち、各行で左から右へ）進み３’末端に至る標準規則に従っている。各ヌクレオチド配列の１本の鎖のみが示されているが、相補鎖は、示されている鎖を任意に参照することによって含まれると理解される。アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列が提供される場合、同じアミノ酸配列をコードするそのコドン縮重バリアントもまた提供されることが理解される。アミノ酸配列は、配列のアミノ末端から始まって先へ（すなわち、各行で左から右へ）進みカルボキシ末端に至る標準規則に従っている。
Figure 2022534560000003
Figure 2022534560000004
実施例１．ヒト化アルブミン（ＡＬＢ）遺伝子座を含むマウスの生成
２０ｋｂのマウスアルブミン（Ａｌｂ）遺伝子座（ｂＭＱ－１２７Ｇ８由来）を含む５’相同性アームと、１２７ｋｂのマウスアルブミン（Ａｌｂ）遺伝子座（ｂＭＱ－１２７Ｇ８由来）を含む３’相同性アームとを含む大きな標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ） を生成して、マウスアルブミン（Ａｌｂ）遺伝子の１４．４ｋｂ（１４，３７６ ｂｐ）の領域を、対応するヒトアルブミン配列（ＡＬＢ）の１７．３ ｋｂ（１７，３３５ ｂｐ）（ＲＰ１１－３１Ｐ１２由来）で置き換えた。マウスおよびヒトアルブミンに関する情報を表３に示す。ＶＥＬＯＣＩＧＥＮＥ（登録商標）遺伝子工学技術を使用した細菌相同組換え（ＢＨＲ）による細菌人工染色体（ＢＡＣ）ＤＮＡに由来する大きな標的化ベクター（ＬＴＶＥＣｓ）の生成および使用は、例えば、ＵＳ ６，５８６，２５１およびＶａｌｅｎｚｕｅｌａ ｅｔ ａｌ．（２００３） Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２１（６）：６５２－６５９に記載されており、それらの各々は、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。インビトロアセンブリ法によるＬＴＶＥＣの生成は、例えば、ＵＳ ２０１５／０３７６６２８およびＷＯ２０１５／２００３３４を参照されたく、それらの各々は、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
Figure 2022534560000005
具体的には、ＡＴＧ開始コドンから終止コドンまでの領域（すなわち、コードエキソン１～１４）がマウスアルブミン（Ａｌｂ）遺伝子座から削除された。削除されたマウス領域の代わりに、ＡＴＧ開始コドンから終止コドンの１００ｂｐ下流までのヒトアルブミン（ＡＬＢ）の対応する領域を挿入した。ｌｏｘＰ－ｍＰｒｍ１－Ｃｒｅｉ－ｐＡ－ｈＵｂ１－ｅｍ７－Ｎｅｏ－ｐＡ－ｌｏｘＰカセット（４，７６６ｂｐ）を、カセットの直前の３’ＵＴＲ後の約１００ｂｐの３’ヒト配列のバッファーと共にヒト３’ＵＴＲの下流に挿入した。これはＭＡＩＤ７６２６対立遺伝子である。図１Ａを参照されたい。カセットの削除後、ｌｏｘＰおよびクローニング部位（３８ｂｐ）は、残りのｌｏｘＰ部位の直前の３’ＵＴＲ後の約１００ｂｐの３’ヒト配列のバッファーと共にヒト３’ＵＴＲの下流に残存した。これはＭＡＩＤ７６２７対立遺伝子である。図１Ｂを参照されたい。
マウスアルブミンシグナルペプチド、プロペプチド、および血清アルブミンの配列は、それぞれ配列番号２～４に示され、対応するコード配列は、それぞれ配列番号１０～１２に示される。ヒトアルブミンシグナルペプチド、プロペプチド、および血清アルブミンの配列は、それぞれ配列番号６～８に示され、対応するコード配列は、それぞれ配列番号１４～１６に示される。予想されるコードされたヒト化アルブミンタンパク質は、ヒトアルブミンタンパク質と同一である。図１Ａおよび１Ｂを参照されたい。ヒト化アルブミンタンパク質と共に、マウスおよびヒトアルブミンタンパク質のアラインメントを図３Ａ～３Ｂに示す。マウスおよびヒトＡｌｂ／ＡＬＢのコード配列は、それぞれ配列番号９および１３に示される。マウスおよびヒトのアルブミンタンパク質配列は、それぞれ配列番号１および５に示される。予想されるヒト化ＡＬＢコード配列および予想されるヒト化アルブミンタンパク質の配列は、それぞれ配列番号１３および５に示される。
変異対立遺伝子を生成するために、上記の大きな標的化ベクターをＦ１Ｈ４マウス胚性幹細胞に導入した。Ｆ１Ｈ４マウスＥＳ細胞は、雌のＣ５７ＢＬ／６ＮＴａｃマウスを雄の１２９５６／ＳｖＥｖＴａｃマウスと交配することによって産生されたハイブリッド胚に由来した。例えば、ＵＳ２０１５／－０３７６６５１およびＷＯ２０１５／２００８０５を参照されたく、それらの各々は、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。抗生物質選択後、コロニーを採取し、拡大し、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）でスクリーニングした。図２を参照されたい。表４に記載のプライマーおよびプローブを使用して、内因性マウス対立遺伝子の喪失を検出するために対立遺伝子喪失アッセイを実施し、ヒト化対立遺伝子の獲得を検出するために対立遺伝子獲得アッセイを実施した。
Figure 2022534560000006
対立遺伝子喪失（ＬＯＡ）および対立遺伝子獲得（ＧＯＡ）アッセイを含む対立遺伝子修飾（ＭＯＡ）アッセイは、例えば、ＵＳ２０１４／０１７８８７９、ＵＳ２０１６／０１４５６４６、ＷＯ２０１６／０８１９２３、およびＦｒｅｎｄｅｗｅｙ ｅｔ ａｌ．（２０１０） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．４７６：２９５－３０７に記載されており、それらの各々は、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。対立遺伝子喪失（ＬＯＡ）アッセイは、従来のスクリーニングの論理を反転させ、変異が向けられた天然遺伝子座のゲノムＤＮＡサンプルのコピー数を定量化する。正しく標的化されたヘテロ接合性細胞のクローンでは、ＬＯＡアッセイは２つの天然の対立遺伝子（ＸまたはＹ染色体上にない遺伝子の場合）のうちの一方を検出し、もう一方の対立遺伝子は標的化された修飾によって破壊される。ゲノムＤＮＡサンプルにおける挿入された標的化ベクターのコピー数を定量化するために、対立遺伝子獲得（ＧＯＡ）アッセイと同じ原理を逆に適用することができる。
Ｆ０マウスを、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）法を使用して修飾されたＥＳ細胞から生成した。具体的には、上記のＭＯＡアッセイによって選択された上記のヒト化アルブミン遺伝子座を含むマウスＥＳ細胞のクローンを、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）法を使用して、８細胞期胚に注射した。例えば、ＵＳ７，５７６，２５９、ＵＳ７，６５９，４４２、ＵＳ７，２９４，７５４；ＵＳ２００８／００７８０００、およびＰｏｕｅｙｍｉｒｏｕ ｅｔ ａｌ．（２００７） Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２５（１）：９１－９９を参照されたく、それらの各々は、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）法では、標的化マウス胚性幹（ＥＳ）細胞を、例えば、完全にＥＳ細胞由来のＦ０世代マウスを効率的にもたらす前桑実胚期胚、例えば、８細胞期胚に、レーザ支援注射を介して注射する。ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）法では、注射された前桑実胚期胚を、胚盤胞期まで培養し、胚盤胞期胚を代理母に導入し、懐胎させて、Ｆ０世代マウスを産生する。標的修飾についてホモ接合性であるマウスＥＳ細胞のクローンから始めると、標的修飾についてホモ接合性のＦ０マウスが産生される。標的修飾についてヘテロ接合性のマウスＥＳ細胞のクローンから始めると、その後に育種を行って、標的修飾についてホモ接合性のマウスを産生することができる。
実施例２．ヒト化アルブミン（ＡＬＢ）遺伝子座を含むマウスの検証
ヒト化アルブミンマウスを検証するために、ヒトおよびマウスの血清アルブミンＥＬＩＳＡキット（それぞれＡｂｃａｍ ａｂ１７９８８７およびａｂ２０７６２０）を使用して、血漿サンプル中のマウスおよびヒトのアルブミンレベルを測定した。検証に使用されたヒト化マウスは、自己削除選択カセットが自己削除されたＦ１マウスであった。ヒトアルブミンタンパク質は、正常なヒト血漿およびヒト化アルブミンマウス血漿サンプルで検出されたが、野生型（ＷＴ）マウスまたはＶｅｌｏｃＩｍｍｕｎｅ（ＶＩ）マウス血漿サンプルでは検出されなかった。図４を参照されたい。マウスアルブミンタンパク質は、野生型マウス血漿サンプルおよびＶＩマウス血漿サンプルで検出されたが、ヒト化アルブミンマウス血漿サンプルでは検出されなかった。図５を参照されたい。特に、プールされた正常なヒト血漿（Ｇｅｏｒｇｅ Ｋｉｎｇ－Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｃ．から購入）には、約３０～４０ｍｇ／ｍＬのヒトアルブミンが含まれていた。ヒト化アルブミンマウス血漿には、約１０～１５ｍｇ／ｍＬのヒトアルブミンが含まれていたが、マウスアルブミンは検出されなかった。正常なＶＩおよびＷＴマウス血漿には、約７～１３ｍｇ／ｍＬのマウスアルブミンが含まれていた。
実施例３．ヒト化アルブミン（ＡＬＢ）遺伝子座－Ｆ９挿入のためにヒトアルブミンを標的とするガイドＲＮＡを含むマウスの検証
ヒト化アルブミンマウスをさらに検証するために、ヒト化アルブミンマウスを使用して、Ｆ９導入遺伝子をアルブミン遺伝子座に組み込むためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術の使用を評価した。具体的には、ホモ接合性ヒト化アルブミンマウスにおける組み込まれたヒトＦ９ Ｐａｄｕａバリアント（ｈＦ９－Ｒ３３８Ｌ）の組み込みおよび組み込まれたヒトＦ９ Ｐａｄｕａバリアント（ｈＦ９－Ｒ３３８Ｌ）の発現を試験した。ヒトアルブミン遺伝子座のイントロン１に対して様々なガイドＲＮＡが設計された。ＡＬＢｈｕ／ｈｕマウスを使用して２つの別個のマウス実験を設定し、各々がヒトアルブミン遺伝子座の最初のイントロンを標的とする合計１１のガイドＲＮＡをスクリーニングした。実験の０日目にすべてのマウスの体重を測定し、尾静脈から注射した。１、３、４、および６週目に尾出血により採血し、血漿を分離した。マウスは７週目に屠殺した。大静脈から採血し、血漿を分離した。肝臓および脾臓も解剖した。これらのガイドＲＮＡのガイド配列（ＤＮＡ標的化セグメント）を表５に示す。
Figure 2022534560000007
最初の実験では、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡならびに次の６つのガイドＲＮＡ：Ｇ００９８５２、Ｇ００９８５９、Ｇ００９８６０、Ｇ００９８６４、Ｇ００９８７４、およびＧ０１２７６４の各々を別個に含むＬＮＰを試験した。ＬＮＰを０．３ｍｇ／ｋｇに希釈し（平均重量３０グラムを使用）、マウスあたり３Ｅ１１ウイルスゲノムの用量で、双方向ｈＦ９挿入テンプレート（配列番号６３；ＩＴＲ－スプライスアクセプター－ｈＦ９（エキソン２～８）－ｂＧＨ－ＳＶ４０ポリＡ－コドン最適化ｈＦ９－ｐＬａｃ－ｐＭＢ－スプライスアクセプター－Ｋａｎ耐性）をパッケージジングしたＡＡＶ８と同時注射した。１２～１４週齢の、群あたり５匹のＡＬＢｈｕ／ｈｕ雄マウスに注射した。同じコホートからの５匹のマウスに、ｈＦ９のエピソーム発現をもたらすｈＦ９に作動可能に連結されたＣＡＧＧプロモーター（配列番号６４；ＣＡＧＧ－ＩＴＲ－ｈＦ９－ＷＰＲＥ－ｂＧＨ－ＩＴＲ－ｐＬａｃ－ｐＭＢ－Ａｍｐ耐性）をパッケージジングしたＡＡＶ８を注射した（マウスあたり３Ｅ１１ウイルスゲノムで）。バッファーのみ、双方向ｈＦ９挿入テンプレートのみをパッケージジングしたＡＡＶ８、またはＬＮＰ－Ｇ００９８７４のみを注射した、群あたり３匹のマウスを含む３つの陰性対照群があった。
２番目の実験では、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡならびに次の６つのガイドＲＮＡ：Ｇ００９８６０、Ｇ０１２７６４、Ｇ００９８４４、Ｇ００９８５７、Ｇ０１２７５２、Ｇ０１２７５３、およびＧ０１２７６１の各々を別個に含むＬＮＰを試験した。ＬＮＰを０．３ｍｇ／ｋｇに希釈し（平均重量４０グラムを使用）、マウスあたり３Ｅ１１ウイルスゲノムの用量で、双方向ｈＦ９挿入テンプレート（配列番号６３）をパッケージジングしたＡＡＶ８と同時注射した。３０週齢の、群あたり５匹のＡＬＢｈｕ／ｈｕ雄マウスに注射した。同じコホートからの５匹のマウスに、ｈＦ９のエピソーム発現をもたらすｈＦ９に作動可能に連結されたＣＡＧＧプロモーター（配列番号６４）をパッケージジングしたＡＡＶ８を注射した（マウスあたり３Ｅ１１ウイルスゲノムで）。バッファーのみ、双方向ｈＦ９挿入テンプレートのみをパッケージジングしたＡＡＶ８、またはＬＮＰ－Ｇ００９８７４のみを注射した、群あたり３匹のマウスを含む３つの陰性対照群があった。
分析のために、ＥＬＩＳＡを実施して、各時点でのマウスにおけるｈＦＩＸ循環レベルを測定した。この目的のためにヒト第ＩＸ因子ＥＬＩＳＡキット（ａｂ１８８３９３）を使用し、すべてのプレートを、陽性アッセイ対照としてＧｅｏｒｇｅ Ｋｉｎｇ Ｂｉｏ－Ｍｅｄｉｃａｌからのヒトプール正常血漿で実行した。注射後６週目の各群の血漿サンプルにおけるヒト第ＩＸ因子の発現レベルを図６Ａおよび６Ｂに示す。インビトロ挿入データと一致して、ガイドＲＮＡ Ｇ００９８５２を使用した場合、第ＩＸ因子血清レベルは低から検出されなかった。ヒトアルブミンにおける隣接するＰＡＭ配列の欠如と一致して、ガイドＲＮＡ Ｇ００９８６４を使用した場合、第ＩＸ因子血清レベルは検出されなかった。Ｇ００９８６４のガイド配列（ＤＮＡ標的化セグメント）は、ＵＡＣＵＵＵＧＣＡＣＵＵＵＣＣＵＵＡＧＵ（配列番号６１）であり、ｃｙｎｏゲノム座標（ｍｆ５）ｃｈｒ５：６１１９９１８７－６１１９９２０７を標的とする。血清における第ＩＸ因子の発現は、Ｇ００９８５７、Ｇ００９８５９、Ｇ００９８６０、Ｇ００９８７４、およびＧ００１２７６４を含む他のガイドＲＮＡのいくつかで観察された。
脾臓およびすべての肝臓の左側葉の一部は、次世代配列決定（ＮＧＳ）分析に提出された。ＮＧＳを使用して、ＡＡＶ－ｈＦ９ドナーおよびＬＮＰ－ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９の注射後７週目に、ヒト化アルブミン遺伝子座に挿入／欠失（インデル）がある肝細胞のパーセンテージを評価した。ヒトアルブミンにおける隣接するＰＡＭ配列の欠如と一致して、ガイドＲＮＡ Ｇ００９８６４を使用した場合、肝臓で編集は検出されなかった。ガイドＲＮＡ Ｇ００９８５９、Ｇ００９８６０、Ｇ００９８７４、およびＧ０１２７６４を使用した群では、肝臓での編集が観察された（データ図示せず）。
残りの肝臓を１０％中性緩衝ホルマリンで２４時間固定し、７０％エタノールに移した。別個の葉からの４～５個のサンプルを切り取り、ＨｉｓｔｏＷｉｓｚに送り、処理し、パラフィンブロックに埋め込んだ。次に、各パラフィンブロックから５ミクロンの切片を切り取り、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｅｌｌ ＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓによるユニバーサルＢＡＳＥＳＣＯＰＥ（商標）手順および試薬、ならびに組み込みおよび転写が成功した場合にＡＬＢｈｕ／ｈｕアルブミン遺伝子座の最初のイントロンからのヒトアルブミンシグナル配列とｈＦ９導入遺伝子との間に形成される固有のｍＲＮＡ接合部を標的とするカスタム設計のプローブを使用して、Ｖｅｎｔａｎａ Ｕｌｔｒａ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（Ｒｏｃｈｅ）で、ＢＡＳＥＳＣＯＰＥ（商標）を実施した。次に、ＨＡＬＯイメージングソフトウェア（Ｉｎｄｉｃａ Ｌａｂｓ）を使用して、各サンプルの陽性細胞のパーセンテージを定量化した。次に、各動物の複数の葉にわたる陽性細胞のパーセンテージの平均を、７週目の血清におけるｈＦＩＸレベルと相関させた。結果を図７および表６に示す。７週目の血清レベルおよびｈＡＬＢ－ｈＦＩＸ ｍＲＮＡの陽性細胞％は強く相関した（ｒ＝０．８９；Ｒ２＝０．７９）。
Figure 2022534560000008
実施例４．Ｆ９ ＫＯマウスにおけるヒト化アルブミン（ＡＬＢ）遺伝子座－Ｆ９挿入を含むマウスの検証
ヒト化アルブミンマウスをさらに検証するために、ヒト化アルブミンマウスをＦ９ノックアウトマウスと交配して、ＡＬＢｍ／ｈｕｘＦ９－／－マウス（アルブミン遺伝子座のヒト化についてヘテロ接合性およびホモ接合性Ｆ９ノックアウト）を作成し、Ｆ９導入遺伝子をアルブミン遺伝子座に組み込むためのＣＲＩＳＰＲ ／ Ｃａｓ９技術の使用を評価する。
次に、ヒト化アルブミンＦ９ ＫＯマウスを使用して、ヒトＦ９ Ｐａｄｕａバリアント（ｈＦ９－Ｒ３３８Ｌ）導入遺伝子の、ヒト化アルブミン遺伝子座のイントロン１への挿入を試験した。実験の０日目にすべてのマウスの体重を測定し、尾静脈から注射した。１および３週目に尾出血により採血し、血漿を分離した。マウスは４週目に屠殺した。大静脈から採血し、血漿を分離した。肝臓および脾臓も解剖した。
Ｃａｓ９ ｍＲＮＡならびに次の２つのガイドＲＮＡ：Ｇ００９８６０（ヒトアルブミン遺伝子座の最初のイントロンを標的とする）およびＧ０００６６６（マウスアルブミン遺伝子座の最初のイントロンを標的とする）を別個に含むＬＮＰを試験した。Ｇ００９８６０のガイド配列（ＤＮＡ標的化セグメント）を表５に示す。Ｇ０００６６６のガイド配列は、ＣＡＣＵＣＵＵＧＵＣＵＧＵＧＧＡＡＡＣＡ（配列番号６２）であり、マウスゲノム座標（ｍｍ１０）ｃｈｒ５：９０４６１７０９－９０４６１７２９を標的とする。Ｇ００９８６０を０．３ｍｇ／ｋｇに希釈し、Ｇ０００６６６を１．０ｍｇ／ｋｇに希釈し（平均重量３１．２グラムを使用）、両方ともマウスあたり３Ｅ１１ウイルスゲノムの用量で、双方向ｈＦ９挿入テンプレート（配列番号６３）をパッケージジングしたＡＡＶ８と同時注射した。群あたり５匹のＡＬＢｍｓ／ｈｕｘＦ９－／－雄マウス（１６週齢）に注射した。同じコホートからの５匹のマウスに、ｈＦ９のエピソーム発現をもたらすｈＦ９に作動可能に連結されたＣＡＧＧプロモーター（配列番号６４）をパッケージジングしたＡＡＶ８を注射した（マウスあたり３Ｅ１１ウイルスゲノムで）。バッファーのみまたは双方向ｈＦ９挿入テンプレートのみをパッケージングしたＡＡＶ８を注射した、群あたり１匹のマウス、ならびにそれぞれ０．３ｍｇ／ｋｇおよび１．０ｍｇ／ｋｇのＬＮＰ－Ｇ００９８６０またはＬＮＰ－Ｇ０００６６６のみを注射した、群あたり２匹のマウスの６匹の陰性対照動物がいた。
分析のために、ＥＬＩＳＡを実施して、各時点でのマウスにおけるｈＦＩＸ循環レベルを測定した。この目的のためにヒト第ＩＸ因子ＥＬＩＳＡキット（ａｂ１８８３９３）を使用し、すべてのプレートを、陽性アッセイ対照としてＧｅｏｒｇｅ Ｋｉｎｇ Ｂｉｏ－Ｍｅｄｉｃａｌからのヒトプール正常血漿で実行した。脾臓およびすべての肝臓の左側葉の一部は、ＮＧＳ分析に提出された。
注射後１、２、および４週目の各群の血漿サンプルにおけるヒト第ＩＸ因子の発現レベルを図８および表７に示す。さらに、肝臓および脾臓におけるアルブミン遺伝子座での挿入および欠失（インデル）レベルを示すＮＧＳの結果を表７に示す。図８および表７に示すように、ｈＦＩＸは、１、３、および４週間で処置されたＡｌｂ＋／ｈｕ／Ｆ９－／－マウスの血漿で検出され、ＥＬＩＳＡは、１、３、および４週間で０．５～１０μｇ／ｍＬの発現値を示した。
Figure 2022534560000009
残りの肝臓を１０％中性緩衝ホルマリンで２４時間固定し、７０％エタノールに移した。別個の葉からの４～５個のサンプルを切り取り、ＨｉｓｔｏＷｉｚに送り、処理し、パラフィンブロックに埋め込んだ。次に、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｅｌｌ ＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓによるユニバーサルＢＡＳＥＳＣＯＰＥ（商標）手順および試薬、ならびに組み込みおよび転写が成功した場合にＡＬＢｍｓ／ｈｕマウスにおける各それぞれのアルブミン遺伝子座の最初のイントロンからのヒトまたはマウスアルブミンシグナル配列のいずれかとｈＦ９導入遺伝子との間に形成される固有のｍＲＮＡ接合部を標的とするカスタム設計のプローブを使用して、Ｖｅｎｔａｎａ Ｕｌｔｒａ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（Ｒｏｃｈｅ）で、ＢＡＳＥＳＣＯＰＥ（商標）を介した分析のために、各パラフィンブロックから５ミクロンの切片を切り取った。ＨＡＬＯイメージングソフトウェア（Ｉｎｄｉｃａ Ｌａｂｓ）を使用して、各サンプルの陽性細胞のパーセンテージを定量化する。
次に、活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）およびトロンビン生成アッセイ（ＴＧＡ）による機能的凝固活性の評価に終末血を使用した。活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）は、血漿中の内因性経路凝固活性の臨床測定値である。エラグ酸またはカオリンの添加により血漿が凝固するように誘導され、どちらも凝固の内因性経路（接触経路として知られる）で凝固第ＸＩＩ因子を活性化し、その後トロンビンが活性化されるとフィブリノーゲンからフィブリンが生成される。ａＰＴＴアッセイは、血餅を生成する個人の能力の推定値を提供し、この情報を使用して、出血または血栓症のリスクを判断することができる。ａＰＴＴを試験するために、電気機械的血餅検出法（粘度ベースの検出システム）を備えた半自動ベンチトップシステム（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｓｔａｇｏ ＳＴａｒｔ ４）を使用して、血漿中の血餅を評価した。鋼球の入った各キュベットに、５０μＬのクエン酸血漿を添加し、３７℃で５分間インキュベートした後、３７℃で３００秒間、５０μＬのエラグ酸（最終濃度３０μＭ）を添加して凝固を開始させた。各キュベットに５０μＬの０．０２５Ｍ塩化カルシウム（最終濃度８ｍＭ）を添加して凝固を最終的に活性化した後、鋼球は、２つのドライブコイル間で前後に振動し始めた。球の動きは受信コイルによって検出された。フィブリンの生成は、ボールが動かなくなるまで血漿粘度を増加させ、これを凝固時間として記録した。測定された唯一のパラメータは凝固時間であった。実行は二つ組で実行された。
トロンビン生成アッセイ（ＴＧＡ）は、活性化血漿におけるトロンビン生成の動態の非臨床評価である。トロンビンは、他の凝固因子の活性化およびフィブリノーゲンからフィブリンへの変換のためのさらなるトロンビンの伝播（ＦＸＩ活性化を介して）に関与するため、トロンビンの生成は凝固のプロセスに必須である。トロンビン生成アッセイは、トロンビンを生成する個人の能力の推定値を提供し、この情報を使用して、出血または血栓症のリスクを判断することができる。ＴＧＡを実施するために、キャリブレーションされた自動トロンボグラムを使用して、分光光度計（Ｔｈｒｏｍｂｉｎｏｇｒａｐｈ（商標）、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でトロンビン生成レベルを評価した。ハイスループット実験には、９６ウェルプレート（Ｉｍｍｕｌｏｎ ＩＩ ＨＢ）を使用した。各ウェルに５５μＬのクエン酸血漿（マウス血漿用の生理食塩水で４倍希釈）を添加し、３７℃で３０分間インキュベートした。トロンビンの生成は、３７℃で４５分間、１５μＬの２μＭエラグ酸（最終濃度０．３３μＭ）を添加することで開始される。トロンビンの生成は、１６ｍＭ ＣａＣｌ２（ＦｌｕＣａ；Ｔｈｒｏｍｂｉｎｏｓｃｏｐｅ ＢＶ）を含む１５μＬの蛍光発生基質を各ウェルに自動注射した後に決定された。蛍光発生基質は生成されたトロンビンと反応し、これは血漿中で３３秒ごとに４６０ｎｍで９０分間連続的に測定された。蛍光強度はトロンビンのタンパク質分解活性に比例した。トレーシングで測定された主なパラメータは、ラグタイム、トロンビン生成のピーク、トロンビン生成のピークまでの時間、および内因性トロンビン電位（ＥＴＰ）であった。ラグタイムは、血漿中のトロンビンの初期検出に必要な時間の推定値を提供する。ピークは、活性化後の所与の時間に生成されるトロンビンの最大量である。トロンビン生成のピークまでの時間は、凝固カスケードの開始からトロンビンの生成のピークまでの時間である。ＥＴＰは、測定された６０分間の間に生成されたトロンビンの総量である。実行は二つ組で実行された。
図９および表８に示すように、マウスアルブミンｇＲＮＡまたはヒトアルブミンｇＲＮＡのいずれかを使用したｈＦ９導入遺伝子の挿入は、ａＰＴＴアッセイにおいて凝固機能の回復を示した。生理食塩水、ＡＡＶのみ、およびＬＮＰのみの陰性対照サンプルは、４５～６０秒のａＰＴＴ時間の延長を示した。陽性対照のＣＡＧＧおよび試験サンプル（ＡＡＶ８＋ＬＮＰ）は、２８～３４秒の正常なヒトａＰＴＴに近かった。
Figure 2022534560000010
図１０Ａ、１０Ｂ、および１１ならびに表８に示すように、マウスアルブミンｇＲＮＡまたはヒトアルブミンｇＲＮＡのいずれかを使用したｈＦ９導入遺伝子の挿入は、ＴＧＡ－ＥＡ分析においてトロンビン生成の増加を示した。トロンビン濃度は、陰性対照サンプルと比較して、陽性対照ＣＡＧＧおよびＡＡＶ８＋ＬＮＰで高かった。
結論として、ｈＦＩＸは、１、３、および４週間でＡｌｂ＋／ｈｕ／Ｆ９－／－マウスの血漿において検出され、トロンビンがＴＧＡアッセイにおいて生成され、ａＰＴＴ凝固時間が改善されたため、発現されたｈＦＩＸ－Ｒ３３８Ｌは機能的であることがわかった。

Claims (87)

  1. 非ヒト動物であって、そのゲノム内にヒト化内因性アルブミン遺伝子座を含み、前記内因性アルブミン遺伝子座のセグメントが削除され、対応するヒトアルブミン配列で置き換えられている、非ヒト動物。
  2. 前記ヒト化内因性アルブミン遺伝子座が、ヒト血清アルブミンペプチドを含むタンパク質をコードする、請求項１に記載の非ヒト動物。
  3. 前記ヒト化内因性アルブミン遺伝子座が、ヒトアルブミンプロペプチドを含むタンパク質をコードする、請求項１または２に記載の非ヒト動物。
  4. 前記ヒト化内因性アルブミン遺伝子座が、ヒトアルブミンシグナルペプチドを含むタンパク質をコードする、先行請求項のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
  5. コード配列および非コード配列の両方を含む前記内因性アルブミン遺伝子座の領域が削除され、コード配列および非コード配列の両方を含む対応するヒトアルブミン配列で置き換えられている、先行請求項のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
  6. 前記ヒト化内因性アルブミン遺伝子座が、前記内因性アルブミンプロモーターを含み、前記ヒトアルブミン配列が、前記内因性アルブミンプロモーターに作動可能に連結されている、先行請求項のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
  7. 前記内因性アルブミン遺伝子座の少なくとも１つのイントロンおよび少なくとも１つのエキソンが削除され、前記対応するヒトアルブミン配列で置き換えられている、先行請求項のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
  8. 前記内因性アルブミン遺伝子座の全アルブミンコード配列が削除され、前記対応するヒトアルブミン配列で置き換えられている、先行請求項のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
  9. 開始コドンから終止コドンまでの前記内因性アルブミン遺伝子座の前記領域が削除され、前記対応するヒトアルブミン配列で置き換えられている、請求項８に記載の非ヒト動物。
  10. 前記ヒト化内因性アルブミン遺伝子座が、ヒトアルブミン３’非翻訳領域を含む、先行請求項のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
  11. 内因性アルブミン５’非翻訳領域が削除されておらず、前記対応するヒトアルブミン配列で置き換えられていない、先行請求項のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
  12. 前記開始コドンから前記終止コドンまでの前記内因性アルブミン遺伝子座の前記領域が削除され、前記対応するヒトアルブミン配列およびヒトアルブミン３’非翻訳領域を含むヒトアルブミン配列で置き換えられており、かつ
    前記内因性アルブミン５’非翻訳領域が削除されておらず、前記対応するヒトアルブミン配列で置き換えられておらず、かつ
    前記内因性アルブミンプロモーターが削除されておらず、前記対応するヒトアルブミン配列で置き換えられていない、先行請求項のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
  13. （ｉ）前記ヒト化内因性アルブミン遺伝子座におけるヒトアルブミン配列が、配列番号３５に記載の配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一の配列を含むか、または
    （ｉｉ）前記ヒト化内因性アルブミン遺伝子座が、配列番号５に記載の配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは少なくとも１００％同一の配列を含むタンパク質をコードし、
    （ｉｉｉ）前記ヒト化内因性アルブミン遺伝子座が、配列番号１３に記載の配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一の配列を含むコード配列を含むか、または
    （ｉｖ）前記ヒト化内因性アルブミン遺伝子座が、配列番号１７もしくは１８に記載の配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一の配列を含む、先行請求項のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
  14. 前記ヒト化内因性アルブミン遺伝子座が、選択カセットまたはレポーター遺伝子を含まない、先行請求項のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
  15. 前記非ヒト動物が、前記ヒト化内因性アルブミン遺伝子座についてホモ接合性である、先行請求項のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
  16. 前記非ヒト動物が、その生殖系列において前記ヒト化内因性アルブミン遺伝子座を含む、先行請求項のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
  17. 前記非ヒト動物が哺乳動物である、先行請求項のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
  18. 前記非ヒト動物がラットまたはマウスである、請求項１７に記載の非ヒト動物。
  19. 前記非ヒト動物がマウスである、請求項１８に記載の非ヒト動物。
  20. 前記非ヒト動物が、前記ヒト化内因性アルブミン遺伝子座についてホモ接合性である、先行請求項のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
  21. 前記非ヒト動物が、前記ヒト化内因性アルブミン遺伝子座についてヘテロ接合性である、請求項１～１９のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
  22. 前記非ヒト動物が、少なくとも約１０ｍｇ／ｍＬの血清アルブミンレベルを含む、先行請求項のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
  23. 前記非ヒト動物における血清アルブミンレベルが、野生型アルブミン遺伝子座を含む対照非ヒト動物における血清アルブミンレベルと少なくとも同じくらい高い、先行請求項のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
  24. 前記非ヒト動物が、前記非ヒト動物の１つ以上の細胞内の前記ヒト化内因性アルブミン遺伝子座の少なくとも１つの対立遺伝子に組み込まれた外因性タンパク質のコード配列をさらに含む、先行請求項のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
  25. 前記外因性タンパク質の前記コード配列が、前記非ヒト動物の前記１つ以上の細胞内の前記ヒト化内因性アルブミン遺伝子座の前記少なくとも１つの対立遺伝子のイントロン１に組み込まれている、請求項２４に記載の非ヒト動物。
  26. 前記非ヒト動物が、前記内因性アルブミン遺伝子座ではない不活化された内因性遺伝子座をさらに含む、先行請求項のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
  27. 前記非ヒト動物が、前記非ヒト動物の１つ以上の細胞内の前記ヒト化内因性アルブミン遺伝子座の少なくとも１つの対立遺伝子に組み込まれた外因性タンパク質のコード配列をさらに含み、前記外因性タンパク質が、前記不活化された内因性遺伝子座の機能を置き換える、先行請求項のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
  28. 前記不活化された内因性遺伝子座が、不活化されたＦ９遺伝子座である、請求項２６または２７に記載の非ヒト動物。
  29. 非ヒト動物細胞であって、そのゲノム内にヒト化内因性アルブミン遺伝子座を含み、前記内因性アルブミン遺伝子座のセグメントが削除され、対応するヒトアルブミン配列で置き換えられている、非ヒト動物細胞。
  30. ヒト化内因性アルブミン遺伝子座を含む非ヒト動物ゲノムであって、前記内因性アルブミン遺伝子座のセグメントが削除され、対応するヒトアルブミン配列で置き換えられている、非ヒト動物ゲノム。
  31. ヒト化非ヒト動物アルブミン遺伝子であって、前記非ヒトアルブミン遺伝子のセグメントが削除され、対応するヒトアルブミン配列で置き換えられている、ヒト化非ヒト動物アルブミン遺伝子。
  32. ヒト化内因性アルブミン遺伝子座を生成するための標的化ベクターであって、前記内因性アルブミン遺伝子座のセグメントが削除され、対応するヒトアルブミン配列で置き換えられており、前記標的化ベクターが、前記内因性アルブミン遺伝子座の５’標的配列を標的とする５’相同性アームおよび前記内因性アルブミン遺伝子座の３’標的配列を標的とする３’相同性アームに隣接する対応するヒトアルブミン配列を含む挿入核酸を含む、標的化ベクター。
  33. インビボでのヒトアルブミン標的化試薬の活性を評価する方法であって、
    （ａ）請求項１～２８のいずれか一項に記載の非ヒト動物に前記ヒトアルブミン標的化試薬を投与することと、
    （ｂ）前記非ヒト動物における前記ヒトアルブミン標的化試薬の活性を評価することと、を含む、方法。
  34. 前記投与が、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）媒介送達、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）媒介送達、または流体力学的送達（ＨＤＤ）を含む、請求項３３に記載の方法。
  35. 前記投与が、ＬＮＰ媒介送達を含む、請求項３４に記載の方法。
  36. 前記ＬＮＰ用量が、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約２ｍｇ／ｋｇである、請求項３５に記載の方法。
  37. 前記投与が、ＡＡＶ８媒介送達を含む、請求項３４に記載の方法。
  38. ステップ（ｂ）が、前記非ヒト動物から肝臓を単離することと、前記肝臓における前記ヒトアルブミン標的化試薬の活性を評価することとを含む、請求項３３～３７のいずれか一項に記載の方法。
  39. 前記ヒトアルブミン標的化試薬が、ゲノム編集剤であり、前記評価が、前記ヒト化内因性アルブミン遺伝子座の修飾を評価することを含む、請求項３３～３８のいずれか一項に記載の方法。
  40. 前記評価が、前記ヒト化内因性アルブミン遺伝子座内の挿入または欠失の頻度を測定することを含む、請求項３９に記載の方法。
  41. 前記評価が、前記ヒト化内因性アルブミン遺伝子座によってコードされるアルブミンメッセンジャーＲＮＡの発現を測定することを含む、請求項３３～４０のいずれか一項に記載の方法。
  42. 前記評価が、前記ヒト化内因性アルブミン遺伝子座によってコードされるアルブミンタンパク質の発現を測定することを含む、請求項３３～４１のいずれか一項に記載の方法。
  43. 前記アルブミンタンパク質の発現を評価することが、前記非ヒト動物における前記アルブミンタンパク質の血清レベルを測定することを含む、請求項４２に記載の方法。
  44. 前記アルブミンタンパク質の発現を評価することが、前記非ヒト動物の前記肝臓における前記アルブミンタンパク質の発現を測定することを含む、請求項４２に記載の方法。
  45. 前記ヒトアルブミン標的化試薬が、ヌクレアーゼ剤または前記ヌクレアーゼ剤をコードする核酸を含み、前記ヌクレアーゼ剤が、ヒトアルブミン遺伝子の領域を標的化するように設計されている、請求項３３～４３のいずれか一項に記載の方法。
  46. 前記ヌクレアーゼ剤が、Ｃａｓタンパク質および前記ヒトアルブミン遺伝子のガイドＲＮＡ標的配列を標的化するように設計されたガイドＲＮＡを含む、請求項４５に記載の方法。
  47. 前記ガイドＲＮＡ標的配列が、前記ヒトアルブミン遺伝子のイントロン１にある、請求項４６に記載の方法。
  48. 前記Ｃａｓタンパク質が、Ｃａｓ９タンパク質である、請求項４６または４７に記載の方法。
  49. 前記ヒトアルブミン標的化試薬が、外因性ドナー核酸を含み、前記外因性ドナー核酸が、前記ヒトアルブミン遺伝子を標的化するように設計されており、任意選択で、前記外因性ドナー核酸が、ＡＡＶを介して送達される、請求項３３～４８のいずれか一項に記載の方法。
  50. 前記外因性ドナー核酸が、一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）である、請求項４９に記載の方法。
  51. 前記外因性ドナー核酸が、相同性アームを含まない、請求項４９または５０に記載の方法。
  52. 前記外因性ドナー核酸が、前記ヒト化内因性アルブミン遺伝子座の５’標的配列を標的とする５’相同性アームおよび前記ヒト化内因性アルブミン遺伝子座の３’標的配列を標的とする３’相同性アームに隣接する挿入核酸を含む、請求項４９または５０に記載の方法。
  53. 前記５’標的配列および前記３’標的配列の各々が、前記ヒトアルブミン遺伝子のイントロン１のセグメントを含む、請求項５２に記載の方法。
  54. 前記外因性ドナー核酸が、外因性タンパク質をコードする、請求項４９～５３のいずれか一項に記載の方法。
  55. 前記外因性ドナー核酸で標的化されたヒト化内因性アルブミン遺伝子座によってコードされる前記タンパク質が、前記外因性タンパク質に融合されたヒトアルブミンシグナルペプチドを含む異種タンパク質である、請求項５４に記載の方法。
  56. 前記外因性タンパク質が、第ＩＸ因子タンパク質である、請求項５４または５５に記載の方法。
  57. 前記評価が、前記非ヒト動物における第ＩＸ因子タンパク質の血清レベルを測定することを含み、かつ／または活性化部分トロンボプラスチン時間を評価すること、もしくはトロンビン生成アッセイを行うことを含む、請求項５６に記載の方法。
  58. 前記ヒトアルブミン標的化試薬が、（１）ヒトアルブミン遺伝子の領域を標的化するように設計されたヌクレアーゼ剤、および（２）外因性ドナー核酸を含み、
    前記外因性ドナー核酸が、前記ヒトアルブミン遺伝子を標的化するように設計されており、
    前記外因性ドナー核酸が、外因性タンパク質をコードし、
    前記外因性ドナー核酸で標的化されたヒト化内因性アルブミン遺伝子座によってコードされる前記タンパク質が、前記外因性タンパク質に融合されたヒトアルブミンシグナルペプチドを含む異種タンパク質である、請求項３３～５７のいずれか一項に記載の方法。
  59. 前記評価が、前記外因性ドナー核酸によってコードされるメッセンジャーＲＮＡの発現を測定することを含む、請求項５４～５８のいずれか一項に記載の方法。
  60. 前記評価が、単一細胞分解能で前記外因性ドナー核酸によってコードされる前記メッセンジャーＲＮＡの発現を定量化するためのインサイチュハイブリダイゼーションアッセイを含む、請求項５９に記載の方法。
  61. 前記評価が、前記非ヒト動物の前記肝臓由来の複数の葉における前記外因性ドナー核酸によってコードされる前記メッセンジャーＲＮＡの発現を測定することを含む、請求項５９または６０に記載の方法。
  62. 前記評価が、前記外因性タンパク質の発現を測定することを含む、請求項５４～６１のいずれか一項に記載の方法。
  63. 前記異種タンパク質の発現を評価することが、前記非ヒト動物における前記異種タンパク質の血清レベルを測定することを含む、請求項６２に記載の方法。
  64. 前記異種タンパク質の発現を評価することが、前記非ヒト動物の前記肝臓における発現を測定することを含む、請求項６２に記載の方法。
  65. インビボでのヒトアルブミン標的化試薬の活性を評価する方法であって、
    （Ｉ）請求項３３～６４のいずれか一項に記載の方法を、そのゲノム内にヒト化内因性アルブミン遺伝子座を含む第１の非ヒト動物において、１回目に実行することと、
    （ＩＩ）可変要素を変更し、ステップ（Ｉ）の前記方法を、ゲノム内にヒト化内因性アルブミン遺伝子座を含む第２の非ヒト動物において、変更された可変要素を用いて２回目に実行することと、
    （ＩＩＩ）ステップ（Ｉ）の前記ヒトアルブミン標的化試薬の前記活性を、ステップ（ＩＩ）の前記ヒトアルブミン標的化試薬の前記活性と比較し、より高い活性をもたらす方法を選択することとを含む、方法。
  66. ステップ（ＩＩ）における前記変更された可変要素が、前記ヒトアルブミン標的化試薬を前記非ヒト動物に導入する送達方法である、請求項６５に記載の方法。
  67. 前記投与が、ＬＮＰ媒介送達を含み、ステップ（ＩＩ）における変更された可変要素が、ＬＮＰ製剤である、請求項６６に記載の方法。
  68. ステップ（ＩＩ）における前記変更された可変要素が、前記ヒトアルブミン標的化試薬を前記非ヒト動物に導入する投与経路である、請求項６５に記載の方法。
  69. ステップ（ＩＩ）における前記変更された可変要素が、前記非ヒト動物に導入された前記ヒトアルブミン標的化試薬の濃度または量である、請求項６５に記載の方法。
  70. ステップ（ＩＩ）における前記変更された可変要素が、前記非ヒト動物に導入された前記ヒトアルブミン標的化試薬の形態である、請求項６５に記載の方法。
  71. ステップ（ＩＩ）における前記変更された可変要素が、前記非ヒト動物に導入された前記ヒトアルブミン標的化試薬である、請求項６５に記載の方法。
  72. 前記ヒトアルブミン標的化試薬が、Ｃａｓタンパク質または前記Ｃａｓタンパク質をコードする核酸と、ガイドＲＮＡまたは前記ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡとを含み、前記ガイドＲＮＡが、ヒトアルブミン遺伝子のガイドＲＮＡ標的配列を標的化するように設計されている、請求項６５に記載の方法。
  73. ステップ（ＩＩ）における前記変更された可変要素が、前記ガイドＲＮＡ配列または前記ガイドＲＮＡ標的配列である、請求項７２に記載の方法。
  74. 前記ヒトアルブミン標的化試薬が、Ｃａｓタンパク質およびガイドＲＮＡをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含み、ステップ（ＩＩ）における前記変更された可変要素が、Ｃａｓ ｍＲＮＡとガイドＲＮＡとの比である、請求項７２に記載の方法。
  75. ステップ（ＩＩ）における前記変更された可変要素が、ガイドＲＮＡ修飾である、請求項７２に記載の方法。
  76. 前記ヒトアルブミン標的化試薬が、外因性ドナー核酸を含む、請求項６５に記載の方法。
  77. ステップ（ＩＩ）における前記変更された可変要素が、前記外因性ドナー核酸の形態である、請求項７６に記載の方法。
  78. 前記外因性ドナー核酸が、前記ヒト化内因性アルブミン遺伝子座の５’標的配列を標的とする５’相同性アームおよび前記ヒト化内因性アルブミン遺伝子座の３’標的配列を標的とする３’相同性アームに隣接する挿入核酸を含み、ステップ（ＩＩ）における前記変更された可変要素が、前記５’相同性アームの配列もしくは長さおよび／または前記３’相同性アームの配列もしくは長さである、請求項７６に記載の方法。
  79. 請求項１～２８のいずれか一項に記載の非ヒト動物を作製する方法であって、
    （ａ）非ヒト動物の胚性幹（ＥＳ）細胞に、
    （ｉ）ヌクレアーゼ剤または前記ヌクレアーゼ剤をコードする核酸であって、前記ヌクレアーゼ剤が、前記内因性アルブミン遺伝子座の標的配列を標的とする、ヌクレアーゼ剤または前記ヌクレアーゼ剤をコードする核酸、ならびに
    （ｉｉ）前記内因性アルブミン遺伝子座の５’標的配列に対応する５’相同性アームおよび前記内因性アルブミン遺伝子座の３’標的配列に対応する３’相同性アームに隣接するヒトアルブミン配列を含む核酸インサートを含む、標的化ベクターであって、
    前記標的化ベクターが、前記内因性アルブミン遺伝子座と再結合して、そのゲノム内に前記ヒトアルブミン配列を含む前記ヒト化内因性アルブミン遺伝子座を含む遺伝子修飾された非ヒトＥＳ細胞を産生する、標的化ベクターを導入することと、
    （ｂ）前記遺伝子修飾された非ヒトＥＳ細胞を非ヒト動物宿主胚に導入することと、
    （ｃ）代理母において前記非ヒト動物宿主胚を懐胎させることであって、前記代理母が、そのゲノム内に前記ヒトアルブミン配列を含む前記ヒト化内因性アルブミン遺伝子座を含むＦ０子孫遺伝子修飾された非ヒト動物を産生する、懐胎させることと、を含む、方法。
  80. 前記標的化ベクターが少なくとも１０ｋｂの長さの大きな標的化ベクターであるか、または前記５’および３’相同性アームの合計が少なくとも１０ｋｂの長さである、請求項７９に記載の方法。
  81. 請求項１～２８のいずれか一項に記載の非ヒト動物を作製する方法であって、
    （ａ）非ヒト動物の１細胞期胚に、
    （ｉ）ヌクレアーゼ剤または前記ヌクレアーゼ剤をコードする核酸であって、前記ヌクレアーゼ剤が、前記内因性アルブミン遺伝子座の標的配列を標的とする、ヌクレアーゼ剤または前記ヌクレアーゼ剤をコードする核酸、ならびに
    （ｉｉ）前記内因性アルブミン遺伝子座の５’標的配列に対応する５’相同性アームおよび前記内因性アルブミン遺伝子座の３’標的配列に対応する３’相同性アームに隣接するヒトアルブミン配列を含む核酸インサートを含む、標的化ベクターであって、
    前記標的化ベクターが、前記内因性アルブミン遺伝子座と再結合して、そのゲノム内に前記ヒトアルブミン配列を含む前記ヒト化内因性アルブミン遺伝子座を含む遺伝子修飾された非ヒト１細胞期胚を産生する、標的化ベクターを導入することと、
    （ｂ）代理母において前記遺伝子修飾された非ヒト動物の１細胞期胚を懐胎させて、そのゲノム内に前記ヒトアルブミン配列を含む前記ヒト化内因性アルブミン遺伝子座を含む遺伝子修飾されたＦ０世代の非ヒト動物を産生することと、を含む、方法。
  82. 前記ヌクレアーゼ剤が、Ｃａｓタンパク質およびガイドＲＮＡを含む、請求項７９～８１のいずれか一項に記載の方法。
  83. 前記Ｃａｓタンパク質が、Ｃａｓ９タンパク質である、請求項８２に記載の方法。
  84. ステップ（ａ）が、前記内因性アルブミン遺伝子座内の第２の標的配列を標的化する第２のガイドＲＮＡを導入することをさらに含む、請求項８２に記載の方法。
  85. 前記非ヒト動物が、マウスまたはラットである、請求項７９～８４のいずれか一項に記載の方法。
  86. 前記非ヒト動物が、マウスである、請求項８５に記載の方法。
  87. 請求項１～２８のいずれか一項に記載の非ヒト動物を作製する方法であって、
    （Ｉ）（ａ）前記ヒト化内因性アルブミン遺伝子座を含むように、多能性非ヒト動物細胞のゲノムを修飾することと、
    （ｂ）前記ヒト化内因性アルブミン遺伝子座を含む前記遺伝子修飾された多能性非ヒト動物細胞を同定または選択することと、
    （ｃ）前記遺伝子改変された多能性非ヒト動物細胞を非ヒト動物宿主胚に導入することと、
    （ｄ）代理母に前記非ヒト動物宿主胚を懐胎させることと、を含むか、または
    （ＩＩ）（ａ）前記ヒト化内因性アルブミン遺伝子座を含むように、非ヒト動物の１細胞期胚のゲノムを修飾することと、
    （ｂ）前記ヒト化内因性アルブミン遺伝子座を含む前記遺伝子修飾された非ヒト動物の１細胞期胚を選択することと、
    （ｃ）代理母に前記遺伝子改変された非ヒト動物の１細胞期胚を懐胎させることを含む、方法。
JP2021568885A 2019-06-07 2020-06-05 ヒト化アルブミン遺伝子座を含む非ヒト動物 Pending JP2022534560A (ja)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201962858589P 2019-06-07 2019-06-07
US62/858,589 2019-06-07
US201962916666P 2019-10-17 2019-10-17
US62/916,666 2019-10-17
PCT/US2020/036412 WO2020247812A1 (en) 2019-06-07 2020-06-05 Non-human animals comprising a humanized albumin locus

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2022534560A true JP2022534560A (ja) 2022-08-02
JPWO2020247812A5 JPWO2020247812A5 (ja) 2023-05-30

Family

ID=71899847

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2021568885A Pending JP2022534560A (ja) 2019-06-07 2020-06-05 ヒト化アルブミン遺伝子座を含む非ヒト動物

Country Status (13)

Country Link
US (2) US11622547B2 (ja)
EP (1) EP3796776A1 (ja)
JP (1) JP2022534560A (ja)
KR (1) KR20220017939A (ja)
CN (1) CN113939595A (ja)
AU (1) AU2020289581A1 (ja)
BR (1) BR112021022722A2 (ja)
CA (1) CA3137764A1 (ja)
IL (1) IL288606A (ja)
MX (1) MX2021015122A (ja)
SG (1) SG11202111256XA (ja)
TW (1) TW202112229A (ja)
WO (1) WO2020247812A1 (ja)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MX2020003589A (es) 2017-09-29 2020-07-22 Regeneron Pharma Animales no humanos que comprenden un locus ttr humanizado y metodos de uso.
CA3133360A1 (en) 2019-04-04 2020-10-08 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals comprising a humanized coagulation factor 12 locus
US11891618B2 (en) 2019-06-04 2024-02-06 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Mouse comprising a humanized TTR locus with a beta-slip mutation and methods of use
AU2020289581A1 (en) 2019-06-07 2021-11-18 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals comprising a humanized albumin locus

Family Cites Families (151)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5523226A (en) 1993-05-14 1996-06-04 Biotechnology Research And Development Corp. Transgenic swine compositions and methods
AU8587598A (en) 1997-07-26 1999-02-16 Wisconsin Alumni Research Foundation Trans-species nuclear transfer
US6599692B1 (en) 1999-09-14 2003-07-29 Sangamo Bioscience, Inc. Functional genomics using zinc finger proteins
US20030104526A1 (en) 1999-03-24 2003-06-05 Qiang Liu Position dependent recognition of GNN nucleotide triplets by zinc fingers
US20050144655A1 (en) 2000-10-31 2005-06-30 Economides Aris N. Methods of modifying eukaryotic cells
US6586251B2 (en) 2000-10-31 2003-07-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
US6596541B2 (en) 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
AU2884102A (en) 2000-12-07 2002-06-18 Sangamo Biosciences Inc Regulation of angiogenesis with zinc finger proteins
US7273923B2 (en) 2001-01-22 2007-09-25 Sangamo Biosciences, Inc. Zinc finger proteins for DNA binding and gene regulation in plants
AU2002225187A1 (en) 2001-01-22 2002-07-30 Sangamo Biosciences, Inc. Zinc finger polypeptides and their use
AUPR446701A0 (en) * 2001-04-18 2001-05-17 Gene Stream Pty Ltd Transgenic mammals for pharmacological and toxicological studies
AUPR451401A0 (en) 2001-04-20 2001-05-24 Monash University A method of nuclear transfer
BRPI0307383B1 (pt) 2002-01-23 2019-12-31 The Univ Of Utah Research Foundation método de recombinação genética direcionada em célula de planta hospedeira
DE60316124T3 (de) 2002-03-15 2018-03-22 Cellectis Hybride and einzelkettige meganukleasen und deren anwendungen
WO2003080809A2 (en) 2002-03-21 2003-10-02 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for using zinc finger endonucleases to enhance homologous recombination
US7612250B2 (en) 2002-07-29 2009-11-03 Trustees Of Tufts College Nuclear transfer embryo formation method
WO2004037977A2 (en) 2002-09-05 2004-05-06 California Institute Of Thechnology Use of chimeric nucleases to stimulate gene targeting
AU2003290518A1 (en) 2002-09-06 2004-04-23 Fred Hutchinson Cancer Research Center Methods and compositions concerning designed highly-specific nucleic acid binding proteins
US8409861B2 (en) 2003-08-08 2013-04-02 Sangamo Biosciences, Inc. Targeted deletion of cellular DNA sequences
US7888121B2 (en) 2003-08-08 2011-02-15 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for targeted cleavage and recombination
EP1591521A1 (en) 2004-04-30 2005-11-02 Cellectis I-Dmo I derivatives with enhanced activity at 37 degrees C and use thereof
WO2006033859A2 (en) 2004-09-16 2006-03-30 Sangamo Biosciences, Inc. Compositions and methods for protein production
PT1802193E (pt) 2004-10-19 2014-06-23 Regeneron Pharma Método para gerar um murganho homozigótico para uma modificação genética
WO2006097784A1 (en) 2005-03-15 2006-09-21 Cellectis I-crei meganuclease variants with modified specificity, method of preparation and uses thereof
US20110158974A1 (en) 2005-03-15 2011-06-30 Cellectis Heterodimeric Meganucleases and Use Thereof
CN101117633B (zh) 2006-08-03 2011-07-20 上海交通大学附属儿童医院 一种细胞核移植方法
BRPI0720048A8 (pt) 2006-12-14 2023-02-07 Dow Agrosciences Llc Proteínas de dedo de zinco não-canônicas otimizadas
WO2009126161A1 (en) 2008-04-11 2009-10-15 Utc Fuel Cells, Llc Fuel cell and bipolar plate having manifold sump
EP2206723A1 (en) 2009-01-12 2010-07-14 Bonas, Ulla Modular DNA-binding domains
US20110239315A1 (en) 2009-01-12 2011-09-29 Ulla Bonas Modular dna-binding domains and methods of use
AU2010226313B2 (en) 2009-03-20 2014-10-09 Sangamo Therapeutics, Inc. Modification of CXCR4 using engineered zinc finger proteins
US8772008B2 (en) 2009-05-18 2014-07-08 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for increasing nuclease activity
US20120178647A1 (en) 2009-08-03 2012-07-12 The General Hospital Corporation Engineering of zinc finger arrays by context-dependent assembly
US8518392B2 (en) 2009-08-14 2013-08-27 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Promoter-regulated differentiation-dependent self-deleting cassette
US8541646B2 (en) 2009-10-06 2013-09-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Genetically modified mice and engraftment
CA2779858C (en) 2009-10-29 2019-10-29 Aris N. Economides Multifunctional alleles
CN102770539B (zh) 2009-12-10 2016-08-03 明尼苏达大学董事会 Tal效应子介导的dna修饰
RU2577978C2 (ru) 2011-02-15 2016-03-20 Ридженерон Фармасьютикалз, Инк. Гуманизированные m-csf мыши
CA2836921C (en) 2011-06-07 2020-08-18 Wisconsin Alumni Research Foundation Hepatocyte based insulin gene therapy for diabetes
CA2848417C (en) 2011-09-21 2023-05-02 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for regulation of transgene expression
JP6120451B2 (ja) 2011-10-28 2017-04-26 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッドＲｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． ヒト化ｉｌ−６および／またはｉｌ−６受容体
MY164836A (en) 2011-10-28 2018-01-30 Regeneron Pharma Genetically modified major histocompatibility complex mice
US9637739B2 (en) 2012-03-20 2017-05-02 Vilnius University RNA-directed DNA cleavage by the Cas9-crRNA complex
WO2013141680A1 (en) 2012-03-20 2013-09-26 Vilnius University RNA-DIRECTED DNA CLEAVAGE BY THE Cas9-crRNA COMPLEX
WO2013158309A2 (en) 2012-04-18 2013-10-24 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Non-disruptive gene targeting
WO2013163394A1 (en) 2012-04-25 2013-10-31 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Nuclease-mediated targeting with large targeting vectors
DK3401400T3 (da) 2012-05-25 2019-06-03 Univ California Fremgangsmåder og sammensætninger til rna-styret mål-dna-modifikation og til rna-styret transskriptionsmodulering
US8962913B2 (en) 2012-06-18 2015-02-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Humanized IL-7 rodents
ES2613691T3 (es) 2012-07-11 2017-05-25 Sangamo Biosciences, Inc. Métodos y composiciones para el tratamiento de enfermedades por almacenamiento lisosomal
US10648001B2 (en) 2012-07-11 2020-05-12 Sangamo Therapeutics, Inc. Method of treating mucopolysaccharidosis type I or II
WO2014033644A2 (en) 2012-08-28 2014-03-06 Novartis Ag Methods of nuclease-based genetic engineering
CN110643600A (zh) 2012-10-23 2020-01-03 基因工具股份有限公司 用于切割靶dna的系统及其用途
EP4389764A2 (en) 2012-11-05 2024-06-26 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Genetically modified non-human animals and methods of use thereof
WO2014089212A1 (en) 2012-12-05 2014-06-12 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for regulation of metabolic disorders
JP6620018B2 (ja) 2012-12-06 2019-12-11 シグマ−アルドリッチ・カンパニー・リミテッド・ライアビリティ・カンパニーＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．， ＬＬＣ Ｃｒｉｓｐｒに基づくゲノム修飾および制御
MX2015007550A (es) 2012-12-12 2017-02-02 Broad Inst Inc Suministro, modificación y optimización de sistemas, métodos y composiciones para la manipulación de secuencias y aplicaciones terapéuticas.
US8697359B1 (en) 2012-12-12 2014-04-15 The Broad Institute, Inc. CRISPR-Cas systems and methods for altering expression of gene products
EP3553174A1 (en) 2012-12-17 2019-10-16 President and Fellows of Harvard College Rna-guided human genome engineering
CN109913495B (zh) 2013-02-20 2022-11-25 瑞泽恩制药公司 大鼠的遗传修饰
PL2958937T3 (pl) 2013-02-22 2019-01-31 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Myszy ekspresjonujące humanizowany główny układ zgodności tkankowej
US20150342163A1 (en) 2013-02-22 2015-12-03 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Genetically modified major histocompatibility complex mice
EP2922393B2 (en) 2013-02-27 2022-12-28 Helmholtz Zentrum München - Deutsches Forschungszentrum für Gesundheit und Umwelt (GmbH) Gene editing in the oocyte by cas9 nucleases
CA2907198C (en) 2013-03-15 2019-12-10 The General Hospital Corporation Using rna-guided foki nucleases (rfns) to increase specificity for rna-guided genome editing
CN105518146B (zh) 2013-04-04 2022-07-15 哈佛学院校长同事会 利用CRISPR/Cas系统的基因组编辑的治疗性用途
CN111500630A (zh) 2013-04-16 2020-08-07 瑞泽恩制药公司 大鼠基因组的靶向修饰
US10604771B2 (en) 2013-05-10 2020-03-31 Sangamo Therapeutics, Inc. Delivery methods and compositions for nuclease-mediated genome engineering
CN116083487A (zh) 2013-05-15 2023-05-09 桑格摩生物治疗股份有限公司 用于治疗遗传病状的方法和组合物
AU2014281028B2 (en) 2013-06-17 2020-09-10 Massachusetts Institute Of Technology Delivery and use of the CRISPR-Cas systems, vectors and compositions for hepatic targeting and therapy
RS64573B1 (sr) 2013-09-23 2023-10-31 Regeneron Pharma Ne-humana životinja sa humanizovanim signalno-regulatornim proteinskim genom
US20160237455A1 (en) 2013-09-27 2016-08-18 Editas Medicine, Inc. Crispr-related methods and compositions
EP3461331A1 (en) 2013-10-15 2019-04-03 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Humanized il-15 animals
ES2881473T3 (es) 2013-10-17 2021-11-29 Sangamo Therapeutics Inc Métodos de suministro y composiciones para la modificación por ingeniería genética del genoma mediada por nucleasas
CA2931637C (en) 2013-12-09 2023-10-10 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for treating hemophilia
US9546384B2 (en) 2013-12-11 2017-01-17 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for the targeted modification of a mouse genome
WO2015089419A2 (en) 2013-12-12 2015-06-18 The Broad Institute Inc. Delivery, use and therapeutic applications of the crispr-cas systems and compositions for targeting disorders and diseases using particle delivery components
US10370680B2 (en) 2014-02-24 2019-08-06 Sangamo Therapeutics, Inc. Method of treating factor IX deficiency using nuclease-mediated targeted integration
CN106460009A (zh) 2014-03-21 2017-02-22 小利兰·斯坦福大学托管委员会 无核酸酶的基因组编辑
RU2020103811A (ru) 2014-05-05 2020-02-18 Регенерон Фармасьютикалз, Инк. Гуманизированные животные по с5 и с3
NO2785538T3 (ja) 2014-05-07 2018-08-04
KR102627332B1 (ko) 2014-05-19 2024-01-26 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 인간 epo를 발현하는 유전자 변형된 비-인간 동물
WO2015191693A2 (en) 2014-06-10 2015-12-17 Massachusetts Institute Of Technology Method for gene editing
EP3155101B1 (en) 2014-06-16 2020-01-29 The Johns Hopkins University Compositions and methods for the expression of crispr guide rnas using the h1 promoter
SI3354732T1 (sl) 2014-06-23 2020-07-31 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Z nukleazo posredovan DNA sklop
US20150376587A1 (en) 2014-06-25 2015-12-31 Caribou Biosciences, Inc. RNA Modification to Engineer Cas9 Activity
HUE041584T2 (hu) 2014-06-26 2019-05-28 Regeneron Pharma Célzott genetikai módosítások és alkalmazási módszerek és készítmények
JP6778175B2 (ja) 2014-07-16 2020-10-28 ノバルティス アーゲー 脂質ナノ粒子ホスト中に核酸を封入する方法
BR112017005245A2 (pt) 2014-09-19 2017-12-12 Regeneron Pharma animal não humano geneticamente modificado, métodos para produzir célula t, hibridoma de célula t, um ácido nucleico, um anticorpo específico, uma célula humana, um animal não humano geneticamente modificado e para induzir uma resposta imunológica, célula, hibridoma de célula t, ácido nucleico, anticorpo específico, receptor de antígeno quimérico, embrião não humano, locus de um receptor de antígeno quimérico, e, composição de ácidos nucleicos.
PT3221457T (pt) 2014-11-21 2019-06-27 Regeneron Pharma Métodos e composições para modificação genética visada através da utilização de arn guia emparelhados
WO2016106236A1 (en) 2014-12-23 2016-06-30 The Broad Institute Inc. Rna-targeting system
RU2732628C2 (ru) 2015-04-06 2020-09-21 Регенерон Фармасьютикалз, Инк. Опосредованные гуманизированными т-клетками иммунные ответы у не относящихся к человеку животных
WO2016197133A1 (en) 2015-06-04 2016-12-08 Protiva Biotherapeutics, Inc. Delivering crispr therapeutics with lipid nanoparticles
US9790490B2 (en) 2015-06-18 2017-10-17 The Broad Institute Inc. CRISPR enzymes and systems
CA2991301A1 (en) 2015-07-13 2017-01-19 Sangamo Therapeutics, Inc. Delivery methods and compositions for nuclease-mediated genome engineering
EP3159407A1 (en) 2015-10-23 2017-04-26 Silence Therapeutics (London) Ltd Guide rnas, methods and uses
AU2016343887B2 (en) 2015-10-28 2023-04-06 Sangamo Therapeutics, Inc. Liver-specific constructs, factor VIII expression cassettes and methods of use thereof
EP3371305A1 (en) 2015-11-06 2018-09-12 Crispr Therapeutics AG Materials and methods for treatment of glycogen storage disease type 1a
US10306874B2 (en) 2015-11-20 2019-06-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals having a humanized lymphocyte-activation gene 3
CA3004349A1 (en) 2015-11-23 2017-06-01 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for engineering immunity
CA3006618A1 (en) 2015-12-01 2017-06-08 Crispr Therapeutics Ag Materials and methods for treatment of alpha-1 antitrypsin deficiency
BR112018012894A2 (pt) 2015-12-23 2018-12-04 Crispr Therapeutics Ag materiais e métodos para tratamento de esclerose lateral amiotrófica e/ou degeneração lobular frontotemporal
WO2017134529A1 (en) 2016-02-02 2017-08-10 Crispr Therapeutics Ag Materials and methods for treatment of severe combined immunodeficiency (scid) or omenn syndrome
ES2908669T3 (es) 2016-02-04 2022-05-03 Regeneron Pharma Animales no humanos que tienen un gen ANGPTL8 modificado genéticamente
EP3416689B1 (en) 2016-02-18 2023-01-18 CRISPR Therapeutics AG Materials and methods for treatment of severe combined immunodeficiency (scid) or omenn syndrome
EP3429632B1 (en) 2016-03-16 2023-01-04 CRISPR Therapeutics AG Materials and methods for treatment of hereditary haemochromatosis
TWI773666B (zh) 2016-03-30 2022-08-11 美商英特利亞醫療公司 Crispr/cas 組分之脂質奈米粒子調配物
US10767175B2 (en) 2016-06-08 2020-09-08 Agilent Technologies, Inc. High specificity genome editing using chemically modified guide RNAs
WO2018002812A1 (en) 2016-06-29 2018-01-04 Crispr Therapeutics Ag Materials and methods for treatment of myotonic dystrophy type 1 (dm1) and other related disorders
WO2018007871A1 (en) 2016-07-08 2018-01-11 Crispr Therapeutics Ag Materials and methods for treatment of transthyretin amyloidosis
WO2018013932A1 (en) 2016-07-15 2018-01-18 Salk Institute For Biological Studies Methods and compositions for genome editing in non-dividing cells
CN110022904B (zh) 2016-10-20 2024-04-19 桑格摩生物治疗股份有限公司 用于治疗法布里病的方法和组合物
CN110291198A (zh) 2016-12-08 2019-09-27 因特利亚治疗公司 经修饰的指导rna
CA3045122A1 (en) 2016-12-09 2018-06-14 Sangamo Therapeutics, Inc. Delivery of target specific nucleases
EP3562515A4 (en) 2016-12-29 2020-11-18 Applied StemCell, Inc. GENE EDITING PROCESS USING A VIRUS
EP3585899A1 (en) 2017-02-22 2020-01-01 CRISPR Therapeutics AG Materials and methods for treatment of primary hyperoxaluria type 1 (ph1) and other alanine-glyoxylate aminotransferase (agxt) gene related conditions or disorders
SG11201907606XA (en) 2017-02-27 2019-09-27 Regeneron Pharma Humanized model of kidney and liver disorders
KR20180136914A (ko) 2017-06-15 2018-12-26 주식회사 툴젠 간에서 목적하는 단백질 발현하기 위한 플랫폼
US11981898B2 (en) 2017-06-16 2024-05-14 Applied Stemcell, Inc. Gene editing methods with increased knock-in efficiency
MX2020003589A (es) 2017-09-29 2020-07-22 Regeneron Pharma Animales no humanos que comprenden un locus ttr humanizado y metodos de uso.
SG11202003464VA (en) 2017-10-17 2020-05-28 Crispr Therapeutics Ag Compositions and methods for gene editing for hemophilia a
CN111727251A (zh) 2017-11-21 2020-09-29 克里斯珀医疗股份公司 用于治疗常染色体显性色素性视网膜炎的材料和方法
MA51113A (fr) 2017-12-06 2020-10-14 Generation Bio Co Édition de gène à l'aide d'un adn modifié à extrémités fermées (adnce)
WO2019118875A1 (en) 2017-12-15 2019-06-20 Ou Li Crispr-mediated genome editing with vectors
CN111886341A (zh) 2018-01-05 2020-11-03 香港中文大学 使用crispr的高效体内敲入
WO2019140330A1 (en) 2018-01-12 2019-07-18 Casebia Therapeutics Limited Liability Partnership Compositions and methods for gene editing by targeting transferrin
MA51869A (fr) 2018-02-16 2020-12-23 Bayer Healthcare Llc Compositions et méthodes pour l'édition génique par ciblage du fibrinogène-alpha
JP7328243B2 (ja) 2018-03-26 2023-08-16 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド 治療薬を試験するためのヒト化げっ歯類
US11690921B2 (en) 2018-05-18 2023-07-04 Sangamo Therapeutics, Inc. Delivery of target specific nucleases
MX2020013293A (es) 2018-06-08 2021-05-12 Intellia Therapeutics Inc Guías modificadas de arn para edición génica.
AU2019288373A1 (en) 2018-06-19 2021-01-14 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Lipid nanoparticle compositions for delivery of mRNA and long nucleic acids
US20220306699A1 (en) 2018-06-27 2022-09-29 Altius Institute For Biomedical Sciences Nucleic Acid Binding Domains and Methods of Use Thereof
US20230257722A1 (en) 2018-06-27 2023-08-17 Altius Institute For Biomedical Sciences Nucleases For Genome Editing
US20210371847A1 (en) 2018-06-27 2021-12-02 Altius Institute For Biomedical Sciences Gapped And Tunable Repeat Units For Use In Genome Editing And Gene Regulation Compositions
CA3098040A1 (en) 2018-07-16 2020-01-23 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animal models of ditra disease and uses thereof
BR112021002332A2 (pt) 2018-08-10 2021-05-11 Logicbio Therapeutics, Inc. terapia gênica não-disruptiva para o tratamento de mma
CN113348247A (zh) 2018-10-15 2021-09-03 泰莱托恩基金会 基因组编辑方法与构建体
BR112021007403A2 (pt) 2018-10-17 2021-12-07 Bayer Healthcare Llc Composições e métodos para entrega de transgenes
TW202027797A (zh) 2018-10-18 2020-08-01 美商英特利亞醫療公司 用於治療α-1抗胰蛋白酶不足的組成物及方法
CN113260701A (zh) 2018-10-18 2021-08-13 英特利亚治疗股份有限公司 用于表达因子ix的组合物和方法
CN113272428A (zh) 2018-10-18 2021-08-17 英特利亚治疗股份有限公司 核酸构建体和使用方法
US20200270617A1 (en) 2018-10-18 2020-08-27 Intellia Therapeutics, Inc. Compositions and methods for transgene expression from an albumin locus
AU2019387219A1 (en) 2018-11-28 2021-06-10 Bayer Healthcare Llc Optimized mRNA encoding CAS9 for use in LNPs
WO2020168362A1 (en) 2019-02-15 2020-08-20 Crispr Therapeutics Ag Gene editing for hemophilia a with improved factor viii expression
KR20210148154A (ko) 2019-04-03 2021-12-07 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 세이프 하버 좌위 내로의 항체 코딩 서열의 삽입을 위한 방법 및 조성물
CA3133360A1 (en) 2019-04-04 2020-10-08 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals comprising a humanized coagulation factor 12 locus
WO2020210552A1 (en) 2019-04-11 2020-10-15 California Institute Of Technology Methods and compositions for in vivo gene editing based cell-type-specific cellular engineering
EP3967649A4 (en) 2019-05-30 2023-01-18 National University Corporation Hokkaido University LIPID NANOPARTICLE
US11891618B2 (en) 2019-06-04 2024-02-06 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Mouse comprising a humanized TTR locus with a beta-slip mutation and methods of use
AU2020289581A1 (en) 2019-06-07 2021-11-18 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals comprising a humanized albumin locus
US20230416776A1 (en) 2019-10-08 2023-12-28 Regents Of The University Of Minnesota Crispr-mediated human genome editing with vectors
WO2021083073A1 (zh) 2019-10-31 2021-05-06 华东师范大学 一种基于肝细胞Alb基因的疾病治疗的产品
EP4146284A1 (en) 2020-05-06 2023-03-15 Cellectis S.A. Methods to genetically modify cells for delivery of therapeutic proteins

Also Published As

Publication number Publication date
KR20220017939A (ko) 2022-02-14
EP3796776A1 (en) 2021-03-31
AU2020289581A1 (en) 2021-11-18
US11622547B2 (en) 2023-04-11
WO2020247812A1 (en) 2020-12-10
TW202112229A (zh) 2021-04-01
US20230232797A1 (en) 2023-07-27
MX2021015122A (es) 2022-04-06
BR112021022722A2 (pt) 2022-01-04
IL288606A (en) 2022-02-01
CN113939595A (zh) 2022-01-14
SG11202111256XA (en) 2021-11-29
US20200383304A1 (en) 2020-12-10
CA3137764A1 (en) 2020-12-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US12010979B2 (en) Non-human animals comprising a humanized TTR locus and methods of use
US20210261985A1 (en) Methods and compositions for assessing crispr/cas-mediated disruption or excision and crispr/cas-induced recombination with an exogenous donor nucleic acid in vivo
US11622547B2 (en) Genetically modified mouse that expresses human albumin
JP7449291B2 (ja) ヌクレアーゼ媒介リピート伸長
US11891618B2 (en) Mouse comprising a humanized TTR locus with a beta-slip mutation and methods of use
JP7506686B2 (ja) ヒト化凝固因子１２遺伝子座を含む非ヒト動物
US20190032156A1 (en) Methods and compositions for assessing crispr/cas-induced recombination with an exogenous donor nucleic acid in vivo

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20230519

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20230519

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20240515