ES2908669T3

ES2908669T3 - Animales no humanos que tienen un gen ANGPTL8 modificado genéticamente

Info

Publication number: ES2908669T3
Application number: ES17705276T
Authority: ES
Inventors: Viktoria Gusarova; Andrew J Murphy; Jesper Gromada; Dayong Guo
Original assignee: Regeneron Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Regeneron Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2016-02-04
Filing date: 2017-02-03
Publication date: 2022-05-03
Anticipated expiration: 2037-02-03
Also published as: MA43962A; KR102487839B1; KR20180104052A; MX2018009513A; CN108779159A; RU2742354C2; JP2019505216A; HK1258506A1; SG11201806176PA; AU2017213627B2; AU2017213627A1; RU2018130003A3; EP3411392A1; EP3411392B1; WO2017136712A1; RU2018130003A; US20170245481A1; US10582702B2; IL260620B; CA3012693A1

Abstract

Un roedor cuyo genoma comprende un gen Angptl8 modificado genéticamente en un locus de Angptl8 endógeno, en donde el gen Angptl8 modificado genéticamente: - comprende la región sin traducir 5' del gen Angptl8 endógeno de roedor, la porción codificante del exón 1 de un gen ANGPTL8 humano, y los exones 2-4 del gen ANGPTL8 humano; y - está unido operativamente a un promotor de Angptl8 endógeno de roedor en el locus de Angptl8 endógeno, en donde el roedor muestra niveles aumentados de triglicéridos en comparación con un roedor de tipo salvaje.

Description

DESCRIPCIÓN

Animales no humanos que tienen un gen ANGPTL8 modificado genéticamente

Referencia cruzada a la solicitud relacionada

Esta solicitud reivindica el beneficio de prioridad de la solicitud provisional de los Estados Unidos núm. 62/291,446, presentada el 4 de febrero de 2016.

Listado de secuencias

El listado de secuencias en el archivo de texto ASCII, denominado 34634_10232US01_SequenceListing.txt de 38 kb, se creó el 2 de febrero de 2017, y se presentó a la Oficina de Patentes y Marcas de los Estados Unidos a través de EFS-Web.

Antecedentes

De acuerdo con la Organización Mundial de la Salud (OMS), las enfermedades cardiovasculares son la principal causa de muerte cada año. En particular, se estima que 17,5 millones de personas murieron por enfermedades cardiovasculares en 2012, lo que representa aproximadamente el 31 % de todas las muertes en el mundo. Las enfermedades cardiovasculares incluyen trastornos del corazón y de la sangre y tienen varios factores de riesgo asociados, entre los que destacan los factores de riesgo de la conducta tales como el consumo de tabaco y/o alcohol, la dieta poco saludable y la obesidad y la inactividad física. Dichos factores de riesgo de la conducta incluyen, por ejemplo, presión arterial alta, azúcar elevada en sangre y/o niveles elevados de lípidos en sangre. Los lípidos (grasas), que incluyen tanto el colesterol como los triglicéridos, no son solubles en la sangre y se transportan a través del torrente sanguíneo a través de las lipoproteínas. Tener niveles elevados de lípidos en sangre puede aumentar el riesgo de enfermedades cardiovasculares y requiere tratamiento con medicamentos y, en algunos casos, cirugía.

Sumario

La presente invención abarca el reconocimiento de que es conveniente modificar genéticamente roedores para permitir sistemas in vivo mejorados para identificar y desarrollar nuevos agentes terapéuticos y/o regímenes terapéuticos que pueden usarse para el tratamiento de trastornos metabólicos que, en algunas modalidades, se caracterizan por disfunción lipídica. La presente invención también abarca el reconocimiento de que es conveniente modificar genéticamente roedores para permitir sistemas in vivo mejorados para identificar y desarrollar nuevos agentes terapéuticos que pueden usarse para tratar enfermedades, trastornos o afecciones cardiovasculares. Además, la presente invención también abarca el reconocimiento de que los roedores que tienen un gen de proteína similar a la angiopoyetina 8 modificado genéticamente (Angptl8) y/o que expresan, que contienen (por ejemplo, en la sangre) o que producen de cualquier otra manera un polipéptido de la proteína similar a la angiopoyetina 8 humana o humanizada son convenientes, por ejemplo, para su uso en la identificación y el desarrollo de agentes terapéuticos que pueden usarse para el tratamiento de la hipertrigliceridemia.

En consecuencia, la presente invención proporciona un roedor cuyo genoma comprende un gen Angptl8 modificado genéticamente en un locus de Angptl8 endógeno, en donde el gen Angptl8 modificado genéticamente: comprende la región sin traducir 5' del gen Angptl8 endógeno de roedor, la porción codificante del exón 1 de un gen ANGPTL8 humano, y los exones 2-4 del gen ANGPTL8 humano; y está unido operativamente a un promotor de Angptl8 endógeno de roedor en el locus de Angptl8 endógeno, en donde el roedor muestra niveles aumentados de triglicéridos en comparación con un roedor de tipo salvaje.

También se describe un roedor cuyo genoma comprende un gen Angptl8 que comprende una porción endógena y una porción humana, en donde las porciones endógena y humana están unidas operativamente a elementos reguladores de Angptl8 de roedor. En el roedor de la invención, el gen Angptl8 modificado genéticamente está unido operativamente a un promotor de Angptl8 endógeno de roedor en el locus de Angptl8 endógeno.

También se describe un roedor que expresa un polipéptido ANGPTL8 humano bajo el control de elementos reguladores de Angptl8 de roedor.

Una porción endógena de un gen Angptl8 incluye o comprende un promotor de Angptl8 endógeno de roedor. En algunas modalidades, una porción endógena de un gen Angptl8 incluye o comprende una secuencia o región 3' inmediatamente secuencia abajo de la región sin traducir 3' de un gen Angptl8 endógeno de roedor en el locus de Angptl8 endógeno de roedor.

Una porción endógena de un gen Angptl8 incluye o comprende una región sin traducir 5' endógena (UTR 5') y también puede comprender una región sin traducir 3' (UTR 3'). En algunas modalidades, una porción endógena de un gen Angptl8 incluye la región sin traducir 5' (UTR 5'), opcionalmente la región sin traducir 3' (UTR 3'), y además incluye un codón de inicio ATG de Angptl8 endógeno. En algunas modalidades, las UTR 5' y 3' de un gen Angptl8 endógeno cada una tiene una secuencia que es sustancialmente idéntica o idéntica a las UTR 5' y 3' correspondientes que aparecen en un gen Angptl8 de roedor. En algunas determinadas modalidades, cada UTR 5' y 3' de un gen Angptl8 endógeno tiene una secuencia que es al menos 50 %, al menos 55 %, al menos 60 %, al menos 65 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, o al menos 98 % idéntica a las correspondientes UTR 5' y 3' que aparecen en la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 3. En algunas modalidades, un gen Angptl8 como se describe en la presente descripción codifica un polipéptido que tiene una secuencia de al menos 50 %, al menos 55 %, al menos 60 %, al menos 65 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 % o al menos 98 % idéntica a la SEQ ID NO: 6 o la SEQ ID NO: 8. En algunas modalidades, un gen Angptl8 como se describe en la presente descripción codifica un polipéptido que tiene una secuencia que es sustancialmente idéntica o idéntica a la SEQ ID NO: 6 o la SEQ ID NO: 8.

Una porción humana incluye o comprende la porción codificante del exón 1 de un gen ANGPTL8 humano, y los exones 2-4 del gen ANGPTL8 humano. En algunas modalidades, la porción codificante del exón 1 de un gen ANGPTL8 humano, y los exones 2-4 del gen ANGPTL8 humano son al menos 50 %, al menos 55 %, al menos 60 %, al menos 65 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, o al menos 98 % idénticos a los exones 1-4 correspondientes, en su totalidad o en parte, que aparecen en una secuencia de ARNm de ANGPTL8 humano de la SEQ ID NO: 5. En algunas modalidades, la porción codificante del exón 1 de un gen ANGPTL8 humano, y los exones 2-4 de un gen ANGPTL8 humano son sustancialmente idénticos o idénticos a los exones 1-4 correspondientes, en su totalidad o en parte, que aparecen en una secuencia de ARNm de ANGPTL8 humano de la SEQ ID NO: 5. En algunas modalidades, una porción humana comprende además la UTR 3' de un gen ANGPTL8 humano. En algunas modalidades, una porción humana comprende una secuencia que tiene los codones optimizados para la expresión en un roedor.

En algunas modalidades, un polipéptido ANGPTL8 humano incluye o comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 50 %, al menos 55 %, al menos 60 %, al menos 65 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 % o al menos 98 % idéntica a los residuos de aminoácidos 22-198 de la SEQ ID NO: 6 o la SEQ ID NO: 8. En algunas modalidades, un polipéptido ANGPTL8 humano incluye o comprende una secuencia de aminoácidos que es sustancialmente idéntica o idéntica a los residuos de aminoácidos 22-198 de la SEQ ID NO: 6 o la SEQ ID NO: 8.

En algunas modalidades, un polipéptido ANGPTL8 humano está codificado por una secuencia que es al menos 50 %, al menos 55 %, al menos 60 %, al menos 65 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 % o al menos 98 % idéntica a la SEQ ID NO: 9. En algunas modalidades, un polipéptido ANGPTL8 humano está codificado por una secuencia que es sustancialmente idéntica o idéntica a la SEQ ID NO: 9. En algunas modalidades, un polipéptido ANGPTL8 humano está codificado por una secuencia que tiene los codones optimizados.

En algunas modalidades, un polipéptido ANGPTL8 humano es una variante de polipéptido ANGPTL8 humano. En algunas modalidades, una variante de polipéptido ANGPTL8 humano se caracteriza por una sustitución de aminoácido R59W. En algunas modalidades, una variante de polipéptido ANGPTL8 humano se caracteriza por una sustitución del aminoácido Q121X. En algunas modalidades, una variante de polipéptido ANGPTL8 humano se caracteriza por, o está asociada con, niveles más bajos de colesterol de lipoproteínas de baja densidad (LDL) y/o colesterol de lipoproteínas de alta densidad (HDL) en plasma. En algunas modalidades, una variante de polipéptido ANGPTL8 humano se caracteriza por, o está asociado con, niveles aumentados de triglicéridos. Un roedor de la invención muestra niveles aumentados de triglicéridos en comparación con un roedor de tipo salvaje.

En algunas modalidades, se proporciona una célula o tejido aislado de roedor, cuyo genoma comprende un gen Angptl8 como se describe en la presente descripción. En particular, la presente invención proporciona además una célula o tejido aislado de roedor cuyo genoma comprende un gen Angptl8 modificado genéticamente en un locus de Angptl8 endógeno, en donde el gen Angptl8 modificado genéticamente; comprende la región sin traducir 5' del gen Angptl8 endógeno de roedor, la porción codificante del exón 1 de un gen ANGPTL8 humano, y los exones 2-4 del gen ANGPTL8 humano; y está unido operativamente a un promotor de Angptl8 endógeno de roedor en el locus de Angptl8 endógeno, en donde la célula o tejido de roedor procede de un roedor que muestra niveles aumentados de triglicéridos en comparación con un roedor de tipo salvaje. En algunas modalidades, una célula es un linfocito. En algunas modalidades, una célula se selecciona de un linfocito B, una célula dendrítica, un macrófago, un monocito y un linfocito T. En algunas modalidades, un tejido se selecciona de adiposo, vejiga, cerebro, mama, médula ósea, ojo, corazón, intestino, riñón, hígado, pulmón, ganglio linfático, músculo, páncreas, plasma, suero, piel, bazo, estómago, timo, testículo, ovario y una combinación de estos.

En algunas modalidades, se proporciona una célula inmortalizada fabricada, generada o producida a partir de una célula aislada de un roedor como se describe en la presente descripción.

En algunas modalidades, se proporciona una célula madre embrionaria (ES) de roedor, cuyo genoma comprende un gen Angptl8 como se describe en la presente descripción. En particular, la presente invención proporciona además una célula madre embrionaria de roedor cuyo genoma comprende un gen Angptl8 modificado genéticamente en un locus de Angptl8 endógeno, en donde el gen Angptl8 modificado genéticamente comprende la región sin traducir 5' del gen Angptl8 endógeno de roedor, la porción codificante del exón 1 de un gen ANGPTL8 humano, y los exones 2 4 del gen ANGPTL8 humano; y está unido operativamente a un promotor de Angptl8 endógeno de roedor en el locus de Angptl8 endógeno. En algunas determinadas modalidades, una célula madre embrionaria de roedor es una célula madre embrionaria de ratón y es de una cepa 129, una cepa C57BL o una mezcla de estas. En algunas determinadas modalidades, una célula madre embrionaria de roedor es una célula madre embrionaria de ratón y es una mezcla de las cepas 129 y C57BL.

En algunas modalidades, se proporciona el uso de una célula madre embrionaria de roedor como se describe en la presente descripción para producir un animal roedor. En algunas determinadas modalidades, una célula madre embrionaria de roedor es una célula madre embrionaria de ratón y se usa para producir un ratón que comprende un gen Angptl8 (o locus) como se describe en la presente descripción. En algunas determinadas modalidades, una célula madre embrionaria de roedor es una célula madre embrionaria de rata y se usa para producir una rata que comprende un gen Angptl8 (o locus) como se describe en la presente descripción.

En algunas modalidades, se proporciona un embrión de roedor que comprende, se produce a partir de, se obtiene a partir de, o se genera a partir de una célula madre embrionaria de roedor como se describe en la presente descripción. Por lo tanto, la presente invención proporciona además un embrión de roedor generado a partir de una célula madre embrionaria de la presente invención. En algunas determinadas modalidades, el embrión de roedor es un embrión de ratón; en algunas modalidades, un embrión de rata.

En algunas modalidades, se proporciona el uso de un embrión de roedor descrito en la presente descripción para producir un roedor. En particular, la presente invención proporciona además un método para producir un roedor cuyo genoma comprende un gen Angptl8 modificado genéticamente que codifica un polipéptido ANGPTL8 humano, el método comprende modificar un genoma de roedor para que el genoma modificado comprenda un gen Angptl8 modificado genéticamente en un locus de Angptl8 endógeno, en donde el gen Angptl8 modificado genéticamente: - comprende la región sin traducir 5' del gen Angptl8 endógeno de roedor, la porción codificante del exón 1 de un gen ANGPTL8 humano, y los exones 2-4 del ANGPTL8 humano; y

- está bajo el control de un promotor de Angptl8 endógeno de roedor en el locus de Angptl8 endógeno, lo que produce de esta manera dicho roedor, en donde el roedor muestra niveles aumentados de triglicéridos en comparación con un roedor de tipo salvaje.

En algunas determinadas modalidades, un embrión de roedor es un embrión de ratón y se usa para producir un ratón que comprende un gen Angptl8 (o locus) como se describe en la presente descripción. En algunas determinadas modalidades, un embrión de roedor es un embrión de rata y se usa para producir una rata que comprende un gen Angptl8 (o locus) como se describe en la presente descripción.

En algunas modalidades, se proporciona un kit, que comprende una célula o tejido aislado de roedor como se describe en la presente descripción, una célula inmortalizada como se describe en la presente descripción, una célula madre embrionaria de roedor como se describe en la presente descripción, un embrión de roedor como se describe en la presente descripción, o un roedor como se describe en la presente descripción.

También se describe un kit como se describe en la presente descripción, para su uso en la fabricación y/o el desarrollo de un fármaco (por ejemplo, un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno de este) para la terapia o el diagnóstico.

También se describe un kit como se describe en la presente descripción, para su uso en la fabricación y/o el desarrollo de un fármaco (por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de este) para el tratamiento, la prevención o la mejora de una enfermedad, trastorno o afección.

También se describen en la presente descripción un transgén, construcción de ácido nucleico, construcción de ADN o vector de direccionamiento. En algunas determinadas modalidades, un transgén, construcción de ácido nucleico, construcción de ADN o vector de direccionamiento comprende un gen Angptl8 (o locus), en su totalidad o en parte, como se describe en la presente descripción. En algunas determinadas modalidades, un transgén, construcción de ácido nucleico, construcción de ADN o vector de direccionamiento comprende un fragmento de ADN que incluye un gen Angptl8 (o locus), en su totalidad o en parte, como se describe en la presente descripción. En algunas determinadas modalidades, un transgén, construcción de ácido nucleico, construcción de ADN, o vector de direccionamiento comprende un gen Angptl8 (o locus) que comprende cualquiera de la SEQ ID NO: 9, la SEQ ID NO: 10, la SEQ ID NO: 15, la SEQ ID No : 16 y la s Eq ID NO: 17. En algunas determinadas modalidades, un transgén, una construcción de ácido nucleico, una construcción de ADN o un vector de direccionamiento comprende un gen Angptl8 (o locus) que comprende la SEQ ID NO: 15, la SEQ ID NO: 16 y la SEQ ID NO: 17. En algunas determinadas modalidades, un transgén, construcción de ácido nucleico, construcción de ADN o vector de direccionamiento comprende además uno o más marcadores de selección. En algunas determinadas modalidades, un transgén, construcción de ácido nucleico, construcción de ADN o vector de direccionamiento comprende además uno o más sitios de recombinación específicos del sitio (por ejemplo, loxP, Frt, o las combinaciones de estos). En algunas determinadas modalidades, un transgén, construcción de ácido nucleico, construcción de ADN, o vector de direccionamiento se representa en la Figura 3.

También se proporciona el uso de un transgén, construcción de ácido nucleico, construcción de ADN o vector de direccionamiento como se describe en la presente descripción para producir una célula madre embrionaria de roedor, célula de roedor, embrión de roedor y/o roedor.

En algunas modalidades, se proporciona un método para producir un roedor cuyo genoma comprende un gen Angptl8 modificado genéticamente que codifica un polipéptido ANGPTL8 humano, el método comprende modificar un genoma de roedor de modo que el genoma modificado comprenda un gen Angptl8 modificado genéticamente en un locus de Angptl8 endógeno, en donde el gen Angptl8 modificado genéticamente:

- comprende la región sin traducir 5' del gen Angptl8 endógeno de roedor, la porción codificante del exón 1 de un gen ANGPTL8 humano, y los exones 2-4 del ANGPTL8 humano; y

- está bajo el control de un promotor de Angptl8 endógeno de roedor en el locus de Angptl8 endógeno,

lo que produce de esta manera dicho roedor, en donde el roedor muestra niveles aumentados de triglicéridos en comparación con un roedor de tipo salvaje. En una modalidad, el método comprende:

(a) colocar un fragmento genómico en un gen Angptl8 endógeno en una célula madre embrionaria de roedor, dicho fragmento genómico comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido ANGPTL8 humano en su totalidad o en parte; (b) obtener una célula madre embrionaria de roedor generada en (a); y, (c) generar un roedor mediante el uso de la célula madre embrionaria de roedor de (b). En algunas modalidades, una secuencia de nucleótidos comprende la porción codificante del exón 1 de un gen ANGPTL8 humano, y los exones 2-4 del gen ANGPTL8 humano. En algunas modalidades, una secuencia de nucleótidos comprende además una UTR 3' de un gen ANGPTL8 humano. En algunas modalidades, una secuencia de nucleótidos codifica la forma madura (es decir, sin un péptido señal) de un polipéptido ANGPTL8 humano. En algunas modalidades, una secuencia de nucleótidos codifica los aminoácidos 22-60, 77-134, 156-193 o 22-198 de un polipéptido ANGPTL8 humano. En algunas modalidades, una secuencia de nucleótidos comprende uno o más marcadores de selección. En algunas modalidades, una secuencia de nucleótidos comprende uno o más sitios de recombinación específicos del sitio. En algunas modalidades, una secuencia de nucleótidos comprende un gen de recombinasa y un marcador de selección flanqueado por sitios de reconocimiento de recombinasa, cuyos sitios de reconocimiento de recombinasa están orientados para dirigir una escisión. En algunas modalidades, un gen de recombinasa está unido operativamente a un promotor que dirige la expresión del gen de recombinasa en células diferenciadas y no dirige la expresión del gen de recombinasa en células no diferenciadas. En algunas modalidades, un gen de recombinasa está unido operativamente a un promotor que es transcripcionalmente competente y regulado por el desarrollo. En algunas modalidades, un promotor que es transcripcionalmente competente y regulado por el desarrollo es o comprende la SEQ ID NO: 12, la SEQ ID N^o: 13, o la ^sE^qID NO: 14; en algunas determinadas modalidades, un promotor que es transcripcionalmente competente y regulado por el desarrollo es o comprende la SEQ ID NO: 12. En algunas modalidades, una secuencia de nucleótidos comprende una o más secuencias que tienen los codones optimizados para la expresión en un roedor. En algunos casos de un método para producir un animal roedor que expresa un polipéptido ANGPTL8 humano a partir de un gen Angptl8 endógeno, el método comprende además una etapa de reproducción de roedor generado en (c) de modo que se genera un roedor homocigoto para expresar un polipéptido ANGPTL8 humano a partir de un gen Angptl8 endógeno.

También se describe un método para producir un roedor cuyo genoma comprende un gen Angptl8 que codifica un polipéptido ANGPTL8 humano, el método comprende modificar el genoma de un roedor para que comprenda un gen Angptl8 que codifica un polipéptido ANGPTL8 humano bajo el control de secuencias reguladoras de Angptl8 de roedor, lo que produce de esta manera dicho roedor.

Un gen Angptl8 se modifica para incluir la región sin traducir 5' del gen Angptl8 endógeno de roedor, la porción codificante del exón 1 de un gen ANGPTL8 humano, y los exones 2-4 del gen ANGPTL8 humano. En algunas modalidades, un gen Angptl8 se modifica para incluir además la UTR 3' de un gen ANGPTL8 humano.

En algunas modalidades, se proporciona un roedor que puede obtenerse por (producirse de, obtenerse de, o generarse de) cualquiera de los métodos como se describe en la presente descripción.

En algunas modalidades, se proporciona un método para evaluar la eficacia de reducción de triglicéridos o las propiedades farmacocinéticas de un fármaco dirigido a ANGPTL8 humano, el método comprende las etapas de: administrar el fármaco a un roedor de la invención; y realizar un ensayo para determinar una o más propiedades de reducción de triglicéridos, o una o más propiedades farmacocinéticas, del fármaco dirigido a ANGPTL8 humano; en donde opcionalmente el fármaco dirigido a ANGPTL8 humano es un anticuerpo anti-ANGPTL8

En algunas modalidades, se proporciona un método para evaluar las propiedades farmacocinéticas de un fármaco dirigido a ANGPTL8 humano, el método comprende las etapas de administrar el fármaco a un roedor como se describe en la presente descripción, y realizar un ensayo para determinar una o más propiedades farmacocinéticas del fármaco dirigido a ANGPTL8 humano.

En algunas modalidades, un fármaco dirigido a ANGPTL8 humano es un antagonista de ANGPTL8. En algunas modalidades, un fármaco dirigido a ANGPTL8 humano es un agonista de ANGPTL8. En algunas modalidades, un fármaco dirigido a ANGPTL8 humano es un anticuerpo anti-ANGPTL8. En algunas modalidades, un fármaco dirigido a ANGPTL8 humano se administra a un roedor como se describe en la presente descripción por vía intravenosa, intraperitoneal o subcutánea.

También se describe un roedor, cuyo genoma comprende un gen Angptl8 modificado genéticamente que incluye una porción endógena que comprende la UTR 5' de un gen Angptl8 endógeno, y una porción humana que comprende los exones 1-4, en su totalidad o en parte, y la UTR 3' de un gen ANGPTL8 humano, en donde la porción humana está unida operativamente a un codón de inicio ATG de Angptl8 endógeno de roedor y unida operativamente a un promotor de Angptl8 endógeno de roedor, y en donde el roedor expresa un polipéptido ANGPTL8 humano en su suero. El gen Angptl8 modificado genéticamente también puede incluir o estar unido o seguido por la UTR 3' de un gen Angptl8 endógeno, y/o una secuencia 3' inmediatamente aguas abajo de la UTR 3' de un gen Angptl8 endógeno en un locus de Angptl8 endógeno.

En algunas modalidades, se proporciona un modelo de roedor de hipertrigliceridemia, cuyo roedor expresa un polipéptido ANGPTL8 humano como se describe en la presente descripción.

En algunas modalidades, se proporciona un modelo de roedor de hipertrigliceridemia, cuyo roedor tiene un genoma que comprende un gen Angptl8 como se describe en la presente descripción.

También se describe un roedor o célula como se describe en la presente descripción, para su uso en la fabricación y/o el desarrollo de un fármaco para la terapia o el diagnóstico.

También se describe un roedor o célula como se describe en la presente descripción en la fabricación y/o el desarrollo de un fármaco o vacuna para su uso en la medicina, tal como el uso como un medicamento.

También se describe un roedor o célula como se describe en la presente descripción, para su uso en la fabricación de un medicamento para el tratamiento, la prevención o la mejora de una enfermedad, trastorno o afección. En algunos casos, una enfermedad, trastorno o afección es la hipertrigliceridemia. En algunos casos, una enfermedad, trastorno o afección es una enfermedad, trastorno o afección cardiovascular.

También se describe el uso de un roedor o célula como se describe en la presente descripción en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad, trastorno o afección caracterizada por disfunción lipídica. También se describe el uso de una célula o roedor como se describe en la presente descripción en la fabricación y/o el desarrollo de un anticuerpo que se une a ANGPTL8 humano.

En la invención, el gen Angptl8 modificado genéticamente está unido operativamente a un promotor de Angptl8 endógeno de roedor en el locus de Angptl8 endógeno.

En varias modalidades, un gen Angptl8 como se describe en la presente descripción es un gen Angptl8 humanizado. En varias modalidades, una porción humana de un gen Angptl8 codifica una secuencia de aminoácidos que codifica, entre otros, una secuencia de aminoácidos de un polipéptido ANGPTL8 humano que es responsable de la unión a lípidos o de la unión a ANGPTL3.

En diversas modalidades, una porción humana de un polipéptido Angptl8 comprende una secuencia de aminoácidos de dominio(s) enrollado(s) en espiral o la región N-terminal de un polipéptido ANGPTL8 humano.

En diversas modalidades, los roedores, como se describe en la presente descripción, expresan un polipéptido ANGPTL8 humano que es detectable en el suero de roedor. En diversas modalidades, los roedores que se describen en la presente descripción no expresan de manera detectable un polipéptido Angptl8 endógeno en el suero de roedor.

En varias modalidades, los roedores como se describe en la presente descripción comprenden un gen Angptl8 (o locus) que incluye la SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 11. En varias modalidades, los roedores como se describe en la presente descripción comprenden un gen Angptl8 (o locus) que incluye la SEQ ID NO: 15 y la SEQ ID NO: 18. En varias modalidades, un roedor como se describe en la presente descripción es un ratón; en algunas modalidades, una rata. En algunas modalidades, un ratón como se describe en la presente descripción se selecciona del grupo que consiste en una cepa 129, una cepa BALB/C, una cepa C57BL/6 y una cepa mixta 129xC57BL/6; en algunas determinadas modalidades, una cepa C57BL/6.

Como se usa en esta solicitud, los términos “alrededor de” y “aproximadamente” se usan como equivalentes. Cualquier número usado en esta solicitud con o sin alrededor de/aproximadamente pretende abarcar cualquiera de las fluctuaciones normales apreciadas por un experto en la técnica en cuestión.

Breve descripción de los dibujos

Los dibujos incluidos en la presente descripción, compuestos por las siguientes figuras, son solamente con propósitos de ilustración y no de limitación.

La Figura 1 muestra un diagrama representativo, no a escala, de la organización genómica de los genes de la proteína similar a la angiopoyetina 8 (ANGPTL8) de roedores (por ejemplo, ratones) y humanos. Los exones se numeran más abajo de cada exón. Las regiones sin traducir (cajas abiertas) también se indican para cada gen. Las porciones relativas de la secuencia codificante que codifican los péptidos señal se indican arriba del exón 1 para cada gen.

La Figura 2 muestra una alineación de secuencias de aminoácidos representativas de ANGPTL8 humano (hANGPTL8, SEQ ID NO: 6), Angptl8 de ratón (mAngptl8, SEQ ID NO: 4), Angptl8 de rata (rAngptl8, SEQ ID NO: 2) y Angptl8 modificado genéticamente (engAngptl 8; SEQ ID NO: 8). El asterisco (*) indica aminoácidos idénticos; los dos puntos (:) indica sustituciones conservadoras; el punto (.) indica sustituciones semiconservadoras; el espacio en blanco indica sustituciones no conservadoras; los residuos de aminoácidos encuadrados indican el péptido señal.

La Figura 3 muestra un esquema representativo, no a escala, de un método ilustrativo para la humanización de un gen Angptl8 de roedor. Parte superior: un vector de direccionamiento hecho de acuerdo con el Ejemplo 1 para la inserción en un locus de Angptl8 murino mediante recombinación homóloga; Parte inferior: locus de Angptl8 murino diana después de la inserción del vector de direccionamiento mediante recombinación homóloga y eliminación mediada por recombinasa de un casete de selección. Las ubicaciones de las uniones de nucleótidos seleccionadas se marcan con una línea más abajo de cada unión y cada una está indicada por la SEQ ID NO. La Figura 4 muestra un diagrama representativo, no a escala, de la organización genómica de genes de la proteína similar a la angiopoyetina 8 (ANGPTL8) humanos y de ratón que indica las ubicaciones aproximadas de las sondas empleadas en un ensayo descrito en el Ejemplo 1. Longitudes de un fragmento de ADN sintético ilustrativo empleado en la humanización de un gen Angptl8 endógeno murino y la eliminación correspondiente se indican debajo de cada gen respectivo y se describen en el Ejemplo 1.

La Figura 5 muestra niveles representativos de triglicéridos, colesterol total, colesterol de lipoproteínas de baja densidad (LDL-C) y colesterol de lipoproteínas de alta densidad (HLD-C) en ratones de tipo salvaje (WT) y homocigotos para un gen Angptl8 humanizado (ANGPTL8hum/hum) como se describe en el Ejemplo 2. Los niveles de lípidos se presentan como mg/dl en plasma separado de la sangre venosa.

La Figura 6 muestra la expresión representativa específica de tejido (hígado y tejidos adiposos) de ANGPTL8 humano en ratones homocigotos para un gen Angptl8 humanizado como se describe en el Ejemplo 3. Los niveles de expresión se muestran como lecturas por kilo base de transcripción por millón de lecturas asignadas (RPKM)

La Figura 7 muestra niveles representativos de triglicéridos en suero en ratones homocigotos para un gen Angptl8 humanizado como se describe en el Ejemplo 4 antes y después de la administración del anticuerpo anti-ANGPTL8 o control (IgG humana de isotipo coincidente con especificidad irrelevante). Los niveles de triglicéridos en suero se presentan como mg/dl antes (presangrado) y después (posadministración) del tratamiento con anticuerpos.

Figuras 8A-8K. Para las secuencias de ARNm, la letra en negrita indica la secuencia codificante y los exones consecutivos, cuando se indican, se encuentran separados por texto subrayado alterno; para las secuencias de ARNm modificadas genéticamente, las secuencias humanas se encuentran dentro de paréntesis. Para las secuencias de aminoácidos, las secuencias señal se indican mediante una fuente subrayada. 8A. ARNm de Angptl8 de Rattus norvegicus (SEQ ID NO: 1, secuencia de referencia NCBI: NM_001271710.1). 8B. Aminoácidos de Angptl8 de Rattus norvegicus (SEQ ID NO: 2, secuencia de Referencia NCBI: NP_001258639.1). 8C.ARNm de Angptl8 de Mus musculus (SEQ ID NO: 3, secuencia de referencia NCBI: NM_ 001080940.1). 8D. Aminoácidos de Angptl8 de Mus musculus (SEQ ID NO: 4, secuencia de referencia NCBI: NP_ 001074409.1). 8E. ARNm de ANg PtL8 de Homo sapiens (SEQ ID NO: 5, secuencia de referencia NCBI: NM_018687.6). 8F. Aminoácidos de ANGPTL8 de Homo sapiens (SEQ ID NO: 6, secuencia de referencia NCBI: NP_061157.3). 8G. ARNm de Angptl8 modificado genéticamente ilustrativo (SEQ ID NO: 7). 8H. Aminoácido Angptl8 modificado genéticamente ilustrativo (SEQ ID NO: 8). 8I. Fragmento de ADN sintético ilustrativo para modificar genéticamente un gen ANGPTL8 no humano (SEQ ID NO: 9; ~2,383 pb que incluye los exones 1-4 y una UTR 3' de un gen ANGPTL8 humano). 8J. Alelo Angptl8 modificado genéticamente ilustrativo que incluye un casete de selección (SEQ ID NO: 10; secuencia humana indicada en letra mayúscula en negrita, secuencia del casete de selección indicada en letra minúscula y secuencia de ratón indicada por letra mayúscula normal). 8K. Alelo Angptl8 modificado genéticamente ilustrativo después de la escisión mediada por recombinasa de un casete de selección (SEQ ID NO: 11; secuencia humana indicada en letra mayúscula en negrita, secuencia restante después de la eliminación mediada por recombinasa del casete de selección indicado en letra minúscula y secuencia de ratón indicada por letra mayúscula normal).

Figura 9A. Se muestra la secuencia de nucleótidos a través del punto de inserción secuencia arriba, que indica la secuencia endógena de ratón (contenida entre paréntesis más abajo con el codón de inicio ATG en letra en negrita) contigua a la secuencia genómica de ANGPTL8 humano en el punto de inserción.

Figura 9B. Se muestra la secuencia de nucleótidos a través del extremo 5' del casete de autoeliminación de neomicina, que indica la secuencia genómica de ANGPTL8 humano contigua a la secuencia del casete (contenida entre paréntesis más abajo con un sitio XhoI en cursiva y un sitio loxP en letra en negrita) secuencia abajo del punto de inserción.

Figura 9C. Se muestra la secuencia de nucleótidos a través del punto de inserción secuencia abajo en el extremo 3' del casete de autoeliminación de neomicina, que indica la secuencia del casete (contenida entre paréntesis más abajo con un sitio loxP en letra en negrita, un sitio de reconocimiento I-CeuI subrayado y un sitio de reconocimiento NheI en cursiva) contiguo con la secuencia genómica de Angptl8 de ratón.

Figura 9D. Se muestra la secuencia de nucleótidos a través del punto de inserción secuencia abajo después de la eliminación del casete de neomicina (77 pb restantes entre una UTR 3' de ANGPTL8 humano y una uTr 3' de Angptl8 de ratón), que indica la secuencia genómica humana y de ratón yuxtapuesta con la secuencia del casete restante (contenida entre paréntesis más abajo con los sitios de reconocimiento XhoI y NheI en cursiva, un sitio loxP en negrita y un sitio de restricción I-CeuI subrayado).

Definiciones

Esta invención no se limita a los métodos y condiciones experimentales particulares descritos en la presente descripción, ya que tales métodos y condiciones pueden variar. Además, debe entenderse que la terminología usada en la presente descripción es solamente para el propósito de describir modalidades particulares, y no pretende ser limitante, ya que el alcance de la presente invención se define en las reivindicaciones.

A menos que se defina de cualquier otra manera, todos los términos y frases usados en la presente descripción incluyen los significados que se atribuyen a los términos y frases en la técnica, a menos que se indique claramente lo contrario o resulte claramente evidente por el contexto en el cual se usa el término o frase. Aunque cualquiera de los métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente descripción puede usarse en la práctica o prueba de la presente invención, a continuación, se describirán métodos y materiales particulares.

Aproximadamente: como se aplica en la presente descripción a uno o más valores de interés, se refiere a un valor que es similar a un valor de referencia indicado. En determinadas modalidades, el término “aproximadamente" o “alrededor de’’ se refiere a un intervalo de valores que caen dentro de 25 %, 20 %, 19 %, 18 %, 17 %, 16 %, 15 %, 14 %, 13 %, 12 %, 11 %, 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 % o menos en cualquier dirección (mayor o menor) del valor de referencia indicado a menos que se indique de cualquier otra manera o resulte evidente de cualquier otra manera por el contexto (excepto cuando tal número exceda el 100 % de un valor posible).

Biológicamente activo: como se usa en la presente descripción, se refiere una característica de cualquier agente que tiene actividad en un sistema biológico, in vitro o in vivo (por ejemplo, en un organismo). Por ejemplo, un agente que, cuando está presente en un organismo, tiene un efecto biológico dentro de ese organismo, se considera biológicamente activo. En modalidades particulares, cuando una proteína o polipéptido es biológicamente activo, una porción de esa proteína o polipéptido que comparte al menos una actividad biológica de la proteína o polipéptido se denomina típicamente una porción “biológicamente activa’’.

Comparable: como se usa en la presente descripción, se refiere a dos o más agentes, entidades, situaciones, conjuntos de condiciones, etc., que pueden no ser idénticos entre sí pero que son suficientemente similares para permitir la comparación entre ellos de manera que puedan obtenerse conclusiones razonablemente en base a las diferencias o las similitudes observadas. Los expertos en la técnica comprenderán, en contexto, el grado de identidad necesario en cualquier circunstancia determinada para dos o más de tales agentes, entidades, situaciones, conjuntos de condiciones, etc., para considerarse comparables.

Conservadora: como se usa en la presente descripción, se refiere a los casos que describen una sustitución de aminoácido conservadora, que incluye la sustitución de un residuo de aminoácido por otro residuo de aminoácido que tiene un grupo R de cadena lateral con propiedades químicas similares (por ejemplo, carga o hidrofobicidad). En general, una sustitución de aminoácido conservadora no cambiará sustancialmente las propiedades funcionales de interés de una proteína, por ejemplo, la capacidad de un receptor de unirse a un ligando. Los ejemplos de grupos de aminoácidos que tienen cadenas laterales con propiedades químicas similares incluyen: cadenas laterales alifáticas, tales como glicina (Gly, G), alanina (Ala, A), valina (Val, V), leucina (Leu, L) e isoleucina (Ile, I); cadenas laterales de hidroxilo alifático, tales como serina (Ser, S) y treonina (Thr, T); cadenas laterales que contienen amida, tales como asparagina (Asn, N) y glutamina (Gln, Q); cadenas laterales aromáticas, tales como fenilalanina (Phe, F), tirosina (Tyr, Y) y triptófano (Trp, W); cadenas laterales básicas, tales como lisina (Lys, K), arginina (Arg, R) e histidina (His, H); cadenas laterales ácidas, tales como ácido aspártico (Asp, D) y ácido glutámico (Glu, E); y cadenas laterales que contienen azufre, tales como cisteína (Cys, C) y metionina (Met, M). Los grupos de sustitución de aminoácidos conservadores incluyen, por ejemplo, valina/leucina/isoleucina (Val/Leu/Ile, V/L/I), fenilalanina/tirosina (Phe/Tyr, F/Y), lisina/arginina (Lys/Arg, K/R), alanina/valina (Ala/Val, A/V), glutamato/aspartato (Glu/Asp, E/D) y asparagina/glutamina (Asn/Gln, N/Q). En algunas modalidades, una sustitución de aminoácido conservadora puede ser una sustitución de cualquier residuo natural en una proteína con alanina, como se usa en, por ejemplo, la mutagénesis por barrido de alanina. En algunas modalidades, se produce una sustitución conservadora que tiene un valor positivo en la matriz de probabilidad logarítmica PAM250 descrita en Gonnet, G.H. y otros, 1992, Science 256:1443-1445. En algunas modalidades, una sustitución es una sustitución moderadamente conservadora en donde la sustitución tiene un valor no negativo en la matriz de probabilidad logarítmica PAM250.

Control: como se usa en la presente descripción, se refiere al significado que se entiende en la técnica de un “control" que es un estándar contra el cual se comparan los resultados. Típicamente, los controles se usan para aumentar la integridad en los experimentos mediante el aislamiento de variables para llegar a una conclusión sobre tales variables. En algunas modalidades, un control es una reacción o un ensayo que se realiza de manera simultánea con una reacción o un ensayo de prueba para proporcionar un comparador. Como se usa en la presente descripción, un “control’ puede referirse a un “animal de control". Un “animal de control" puede tener una modificación como se describe en la presente descripción, una modificación que es diferente a como se describe en la presente descripción, o puede no tener modificaciones (es decir, un animal de tipo salvaje). En un experimento, se aplica la “prueba" (es decir, la variable que se analiza). En el segundo experimento, el “control" (es decir, la variable que se analiza) no se aplica. En algunas modalidades, un control es un control histórico (es decir, de una prueba o un ensayo realizados previamente, o una cantidad o resultado que se conoce previamente). En algunas modalidades, un control es o comprende un registro impreso o guardado de cualquier otra manera. Un control puede ser un control positivo o un control negativo.

Interrupción: como se usa en la presente descripción, se refiere al resultado de un evento de recombinación homóloga con una molécula de ADN (por ejemplo, con una secuencia homóloga endógena tal como un gen o locus génico). En algunas modalidades, una interrupción puede lograr o representar una inserción, una eliminación, una sustitución, un reemplazo, una mutación con cambio de sentido, o un desplazamiento del marco de una(s) secuencia(s) de ADN, o cualquiera de las combinaciones de estos. Las inserciones pueden incluir la inserción de genes completos o fragmentos de genes, por ejemplo, exones, que pueden ser de un origen distinto al de la secuencia endógena (por ejemplo, una secuencia heteróloga). En algunas modalidades, una interrupción puede aumentar la expresión y/o actividad de un gen o producto génico (por ejemplo, de una proteína codificada por un gen). En algunas modalidades, una interrupción puede disminuir la expresión y/o actividad de un gen o producto génico. En algunas modalidades, una interrupción puede alterar la secuencia de un gen o un producto génico codificado (por ejemplo, una proteína codificada). En algunas modalidades, una interrupción puede truncar o fragmentar un gen o un producto génico codificado (por ejemplo, una proteína codificada). En algunas modalidades, una interrupción puede extender un gen o un producto génico codificado; en algunas de tales modalidades, una interrupción puede lograr el ensamblaje de una proteína de fusión. En algunas modalidades, una interrupción puede afectar el nivel, pero no la actividad de un gen o producto génico. En algunas modalidades, una interrupción puede afectar la actividad, pero no el nivel de un gen o producto génico. En algunas modalidades, una interrupción puede no tener un efecto significativo sobre el nivel de un gen o producto génico. En algunas modalidades, una interrupción puede no tener un efecto significativo sobre la actividad de un gen o producto génico. En algunas modalidades, una interrupción puede no tener un efecto significativo sobre el nivel o la actividad de un gen o producto génico.

Determinar, medir, evaluar, valorar, ensayar y analizar, se usan indistintamente en la presente descripción para referirse a cualquier forma de medición, e incluyen determinar si un elemento está presente o no. Estos términos incluyen determinaciones cuantitativas y/o cualitativas. El ensayo puede ser relativo o absoluto. “Ensayar para determinar la presencia de" puede ser determinar la cantidad de algo presente y/o determinar si está presente o ausente.

Locus endógeno o gen endógeno: como se usa en la presente descripción, se refiere a un locus genético que se encuentra en un organismo original o de referencia antes de la introducción de una alteración, interrupción, eliminación, inserción, modificación, reemplazo o sustitución como se describe en la presente descripción. En algunas modalidades, el locus endógeno tiene una secuencia que se encuentra en la naturaleza. En algunas modalidades, el locus endógeno es un locus de tipo salvaje. En algunas modalidades, el organismo de referencia es un organismo de tipo salvaje. En algunas modalidades, el organismo de referencia es un organismo modificado genéticamente. En algunas modalidades, el organismo de referencia es un organismo criado en un laboratorio (ya sea de tipo salvaje o modificado genéticamente).

Promotor endógeno: como se usa en la presente descripción, se refiere a un promotor que se asocia naturalmente, por ejemplo, en un organismo de tipo salvaje, con un gen endógeno.

Modificado genéticamente: como se usa en la presente descripción, en general, se refiere al aspecto de haberse manipulado por la mano del hombre. Por ejemplo, en algunas modalidades, un polinucleótido puede considerarse “modificado genéticamente" cuando dos o más secuencias que no están unidas entre sí en ese orden en la naturaleza se manipulan por la mano del hombre para unirse directamente entre sí en el polinucleótido modificado genéticamente. En algunas modalidades particulares tales, un polinucleótido modificado genéticamente puede comprender una secuencia reguladora que se encuentra en la naturaleza en asociación operativa con una primera secuencia codificante pero no en asociación operativa con una segunda secuencia codificante, se une por la mano del hombre de manera que se asocia operativamente con la segunda secuencia codificante. Alternativamente o adicionalmente, en algunas modalidades, las primera y segunda secuencias de ácido nucleico que cada uno codifica para elementos o dominios polipéptidos que en la naturaleza no están unidos entre sí pueden estar unidos entre sí en un único polinucleótido modificado genéticamente. De manera comparable, en algunas modalidades, una célula u organismo puede considerarse “modificado genéticamente" si se ha manipulado de manera que su información genética se altere (por ejemplo, se ha introducido nuevo material genético no presente previamente, o se ha alterado o eliminado material genético previamente presente). Como es la práctica común y se entiende por los expertos en la técnica, la progenie de un polinucleótido o célula modificados genéticamente se denomina típicamente todavía como “modificado genéticamente" aunque la manipulación real se realizó en una entidad anterior. Además, como apreciarán los expertos en la técnica, hay una variedad de metodologías disponibles a través de las cuales puede lograrse la “modificación genética" como se describe en la presente descripción. Por ejemplo, en algunas modalidades, la “modificación genética" puede implicar la selección o el diseño (por ejemplo, de secuencias de ácidos nucleicos, secuencias de polipéptidos, células, tejidos y/u organismos) mediante el uso de sistemas informáticos programados para realizar análisis o comparaciones, o de cualquier otra manera para analizar, recomendar y/o seleccionar secuencias, alteraciones, etc.). Alternativamente o adicionalmente, en algunas modalidades, la “modificación genética’’ puede implicar el uso de metodologías de síntesis química in vitro y/o tecnologías de ácido nucleico recombinante, tales como, por ejemplo, la amplificación de ácido nucleico (por ejemplo, a través de la reacción en cadena de la polimerasa) hibridación, mutación, transformación, transfección, etc., y/o cualquiera de una variedad de metodologías de acoplamiento controladas. Como apreciarán los expertos en la técnica, una variedad de tales técnicas establecidas (por ejemplo, para el ADN recombinante, la síntesis de oligonucleótidos, y el cultivo y transformación de tejidos [por ejemplo, electroporación, lipofección, etc.]) se conocen bien en la técnica y se describen en varias referencias generales y más específicas que se citan y/o se discuten a lo largo de la presente especificación. Ver, por ejemplo, Sambrook y otros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2da ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989).

Gen: como se usa en la presente descripción, se refiere una secuencia de ADN en un cromosoma que codifica para un producto (por ejemplo, un producto de ARN y/o un producto de polipéptido). En algunas modalidades, un gen incluye una secuencia codificante (es decir, una secuencia que codifica un producto particular). En algunas modalidades, un gen incluye una secuencia no codificante. En algunas modalidades particulares, un gen puede incluir tanto la secuencia codificante (por ejemplo, exónica) como la no codificante (por ejemplo, intrónica). En algunas modalidades, un gen puede incluir una o más secuencias reguladoras (por ejemplo, promotores, potenciadores, etc.) y/o secuencias intrón que, por ejemplo, pueden controlar o afectar uno o más aspectos de la expresión génica (por ejemplo, expresión específica de tipo celular, expresión inducible, etc.). Para fines de claridad, observamos que, como se usa en la presente solicitud, el término “gen" generalmente se refiere a una porción de un ácido nucleico que codifica un polipéptido; el término puede abarcar opcionalmente secuencias reguladoras, como se aclarará del contexto a los expertos en la técnica. Esta definición no pretende excluir la aplicación del término “gen" a las unidades de expresión no codificantes de proteínas sino más bien aclarar que, en la mayoría de los casos, el término como se usa en este documento se refiere a un ácido nucleico codificante de polipéptidos.

Heterólogo: como se usa en la presente descripción, se refiere a un agente o entidad de una fuente diferente. Por ejemplo, cuando se usa en referencia a un polipéptido, gen, o producto génico presente en una célula u organismo particular, el término aclara que el polipéptido, gen, o producto génico en cuestión: 1) se modificó genéticamente por la mano del hombre; 2) se introdujo en la célula u organismo (o un precursor de este) por la acción del hombre (por ejemplo, por medio de ingeniería genética); y/o 3) no se produce o no está presente naturalmente en la célula u organismo en cuestión (por ejemplo, el tipo de célula o el tipo de organismo en cuestión).

Célula huésped: como se usa en la presente descripción, se refiere a una célula en la cual se ha introducido un ácido nucleico o proteína heterólogos (por ejemplo, exógenos). Después de leer esta descripción los expertos entenderán que tales términos no se refieren solamente a la célula particular en cuestión, sino que se usan, además, para referirse a la progenie de tal una célula. Debido a que pueden producirse determinadas modificaciones en las generaciones posteriores ya sea debido a una mutación o a influencias del ambiente, tal progenie puede no ser, de hecho, idéntica a la célula original, pero todavía se incluye dentro del alcance del término “célula huésped" como se usa en la presente descripción. En algunas modalidades, una célula huésped es, o comprende, una célula procariota o eucariota. En general, una célula huésped es cualquier célula que sea adecuada para recibir y/o producir un ácido nucleico o polipéptido heterólogos, independientemente del reino de la vida al que pertenece la célula. Las células ilustrativas incluyen las de organismos procariotas y eucariotas (unicelulares o pluricelulares), células bacterianas (por ejemplo, cepas de E. coli, Bacillus spp, Streptomyces spp, etc.), células de micobacterias, células fúngicas, células de levaduras (por ejemplo, S. cerevisiae, S. pombe, P. pastoris, P. methanolica, etc.), células vegetales, células de insectos (por ejemplo, SF-9, SF-21, células de insectos infectadas con baculovirus, Trichoplusia ni, etc.), células de animales no humanos, células humanas, o fusiones de células tales como, por ejemplo, hibridomas o cuadromas. En algunas modalidades, la célula es una célula humana, de mono, simio, hámster, rata o ratón. En algunas modalidades, la célula es eucariota y se selecciona de las siguientes células: CHO (por ejemplo, CHO K1, DXB-11 CHO, Veggie-CHO), COS (por ejemplo, COS-7), célula de retina, Vero, CV1, renal (por ejemplo, HEK293, 293 EBNA, MSR 293, MDCK, HaK, BHK), HeLa, HepG2, WI38, MRC 5, Colo205, HB 8065, HL-60, (por ejemplo, BHK21), Jurkat, Daudi, A431 (epidérmica), CV-1, U937, 3T3, célula L, célula C127, SP2/0, NS-0, MMT 060562, célula de Sertoli, célula BRL 3A, célula HT1080, célula de mieloma, célula tumoral, y una línea celular derivada de una célula mencionada anteriormente. En algunas modalidades, la célula comprende uno o más genes virales, por ejemplo, una célula de retina que expresa un gen viral (por ejemplo, una célula PER.C6™). En algunas modalidades, una célula huésped es o comprende una célula aislada. En algunas modalidades, una célula huésped es parte de un tejido. En algunas modalidades, una célula huésped es parte de un organismo.

Humanizado: se usa en la presente descripción de acuerdo con su significado entendido en la técnica para referirse a ácidos nucleicos o polipéptidos cuyas estructuras (es decir, secuencias de nucleótidos o aminoácidos) incluyen porciones que corresponden sustancialmente o idénticamente con las estructuras de un gen o polipéptido particular que se encuentran en la naturaleza en un roedor, e incluyen, además, porciones que se diferencian de la encontrada en el gen o proteína de roedor particulares en cuestión y en lugar de eso corresponden de manera más cercana a estructuras comparables que se encuentran en un gen o polipéptido humano correspondientes. En algunas modalidades, un gen “humanizado" es uno que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos sustancialmente igual a la de un polipéptido humano (por ejemplo, una proteína humana o porción de esta - por ejemplo, una porción característica de esta). Por ejemplo, en el caso de un receptor de membrana, un gen “humanizado" puede codificar un polipéptido que tiene una porción extracelular, en su totalidad o en parte, que tiene una secuencia de aminoácidos igual a la de una porción extracelular humana y la secuencia restante igual a la de un polipéptido de roedor (por ejemplo, de ratón). En el caso de un polipéptido secretado, un gen “humanizado" puede codificar un polipéptido que tiene un péptido maduro, en su totalidad o en parte, que tiene una secuencia como la de un péptido maduro humano y la secuencia señal como la de un péptido de roedor (por ejemplo, ratón). En algunas modalidades, un gen humanizado comprende al menos una porción de una secuencia de ^aDⁿde un gen humano. En algunas modalidades, un gen humanizado comprende una secuencia de ADN completa de un gen humano o la secuencia de ADN de un gen humano que codifica un péptido o polipéptido maduro correspondiente a un péptido o polipéptido humano maduro. En algunas modalidades, un polipéptido humanizado comprende una secuencia que tiene una porción que aparece en un polipéptido humano. En algunas modalidades, un polipéptido humanizado comprende una secuencia completa de un polipéptido humano y se expresa a partir de un locus endógeno de un animal roedor que corresponde al homólogo o al ortólogo del gen humano.

Identidad: como se usa en la presente descripción en relación con una comparación de secuencias, se refiere a la identidad determinada mediante una serie de algoritmos diferentes conocidos en la técnica que pueden usarse para medir la identidad de secuencias de nucleótidos y/o aminoácidos. En algunas modalidades, las identidades como se describen en la presente descripción, se determinan mediante el uso de un alineamiento ClustalW v. 1.83 (lento) que emplea una penalización por apertura de interrupción de 10,0, una penalización por extensión de interrupción de 0,1, y mediante el uso de una matriz de similitud de Gonnet (MACVECTOR™ 10.0.2, MacVector Inc., 2008).

In vitro: como se usa en la presente descripción se refiere a los eventos que ocurren en un entorno artificial, por ejemplo, en un tubo de ensayo o recipiente de reacción, en un cultivo celular, etc., en lugar de dentro de un organismo multicelular.

In vivo: como se usa en la presente descripción se refiere a los eventos que ocurren dentro de un organismo multicelular, tal como un humano y un roedor. En el contexto de los sistemas basados en células, el término puede usarse para referirse a los eventos que ocurren dentro de una célula viva (en oposición a, por ejemplo, los sistemas in vitro).

Aislado: como se usa en la presente descripción, se refiere a una sustancia y/o entidad que (1) se ha separado de al menos algunos de los componentes con los que se asociaba cuando se produjo inicialmente (ya sea en la naturaleza y/o en un entorno experimental) y/o (2) se ha diseñado, producido, preparado y/o fabricado por la mano del hombre. Las sustancias y/o entidades aisladas pueden separarse de aproximadamente 10 %, aproximadamente 20 %, aproximadamente 30 %, aproximadamente 40 %, aproximadamente 50 %, aproximadamente 60 %, aproximadamente 70 %, aproximadamente 80 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 91 %, aproximadamente 92 %, aproximadamente 93 %, aproximadamente 94 %, aproximadamente 95 %, aproximadamente 96 %, aproximadamente 97 %, aproximadamente 98 %, aproximadamente 99 % o más de aproximadamente 99 % de los otros componentes con los que se asociaron inicialmente. En algunas modalidades, los agentes aislados son aproximadamente 80 %, aproximadamente 85 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 91 %, aproximadamente 92 %, aproximadamente 93 %, aproximadamente 94 %, aproximadamente 95 %, aproximadamente 96 %, aproximadamente 97 %, aproximadamente 98 %, aproximadamente 99 % o más de aproximadamente 99 % puros. Como se usa en la presente descripción, una sustancia es “pura" si está sustancialmente libre de otros componentes. En algunas modalidades, como entenderán los expertos en la técnica, una sustancia aún puede considerarse “aislada” o incluso “pura”, después de combinarse con otros componentes determinados tales como, por ejemplo, uno o más portadores o excipientes (por ejemplo, amortiguador, solvente, agua, etc.); en tales modalidades, el por ciento de aislamiento o pureza de la sustancia se calcula sin incluir tales portadores o excipientes. Para proporcionar un ejemplo, en algunas modalidades, un polímero biológico tal como un polipéptido o un polinucleótido que se produce en la naturaleza se considera “aislado” cuando: a) en virtud de su origen o fuente de obtención no se asocia con algunos o todos los componentes que lo acompañan en su estado natural en la naturaleza; b) está sustancialmente libre de otros polipéptidos o ácidos nucleicos de la misma especie que la especie que lo produce en la naturaleza; o c) se expresa por, o se encuentra de cualquier otra manera en asociación con componentes de una célula u otro sistema de expresión que no es de la especie que lo produce en la naturaleza. Por lo tanto, por ejemplo, en algunas modalidades, un polipéptido que se sintetiza químicamente o se sintetiza en un sistema celular diferente del que lo produce en la naturaleza se considera un polipéptido “aislado". Alternativamente o adicionalmente, en algunas modalidades, un polipéptido que se ha sometido a una o más técnicas de purificación puede considerarse un polipéptido “aislado” en la medida que se ha separado de otros componentes: a) con los que se asocia en la naturaleza; y/o b) con los que se asociaba cuando se produjo inicialmente.

Locus o Loci: como se usa en la presente descripción, incluye una(s) ubicación(ones) específica(s) de un gen (o secuencia significativa), secuencia de ADN, secuencia codificante de polipéptidos, o posición en un cromosoma del genoma de un organismo. Por ejemplo, un “locus de AngptlS’ puede referirse a la ubicación específica de un gen Angptl8, secuencia de ADN de Angptl8, secuencia codificante de Angptl8, o posición de Angptl8 en un cromosoma del genoma de un organismo que se ha identificado en cuanto a dónde reside dicha secuencia. Un “locus de Angptl8" puede comprender un elemento regulador de un gen Angptl8, que incluye, pero sin limitarse a, un potenciador, un promotor, UTR 5' y/o 3', o una combinación de estos. Los expertos en la técnica apreciarán que los cromosomas pueden, en algunas modalidades, contener cientos o incluso miles de genes y demostrar la colocalización física de loci genéticos similares al comparar entre diferentes especies. Tales loci genéticos pueden describirse como que tienen sintenia compartida.

Animal no humano: como se usa en la presente se refiere a cualquier organismo vertebrado que no sea un ser humano. Un animal modificado genéticamente como se describe en la presente descripción es un roedor. En algunas modalidades, un roedor como se describe en la presente descripción se selecciona de un ratón, una rata y un hámster. En algunas modalidades, un roedor como se describe en la presente descripción se selecciona de la superfamilia Muroidea. En algunas modalidades, un animal modificado genéticamente como se describe en la presente descripción es de una familia que se selecciona de Calomyscidae (por ejemplo, hámster similar a ratón), Cricetidae (por ejemplo, hámster, ratas y ratones del Nuevo Mundo, ratones campestres), Muridae (ratones y ratas verdaderos, jerbos, ratones espinosos, ratas crestadas), Nesomyidae (ratones trepadores, ratones de roca, ratas coliblancas, ratas y ratones de Madagascar), Platacanthomyidae (por ejemplo, lirones espinosos), y Spalacidae (por ejemplo, ratas topo, ratas de bambú, y zokor). En algunas determinadas modalidades, un roedor modificado genéticamente como se describe en la presente descripción se selecciona de un ratón o rata verdaderos (familia Muridae), un jerbo, un ratón espinoso y una rata crestada. En algunas determinadas modalidades, un ratón modificado genéticamente como se describe en la presente descripción es un miembro de la familia Muridae. En algunas determinadas modalidades, un roedor como se describe en la presente descripción se selecciona de un ratón y una rata. En algunas modalidades, un roedor como se describe en la presente descripción es un ratón.

En algunas modalidades, un roedor como se describe en la presente descripción, es un roedor que es un ratón de una cepa C57BL que se selecciona de C57BL/A, C57BL/An, C57BL/GrFa, C57BL/KaLwN, C57BL/6, C57BL/6J, C57BL/6ByJ, C57BL/6NJ, C57BL/10, C57BL/10ScSn, C57BL/10Cr y C57BL/Ola. En algunas determinadas modalidades, un ratón como se describe en la presente descripción es de una cepa 129 que se selecciona del grupo que consiste en una cepa que es 129P1, 129P2, 129P3, 129X1, 129S1 (por ejemplo, 129S1/SV, 129S1/SvIm), 129S2, 129S4, 129S5, 129S9/SvEvH, 129/SvJae, 129S6 (129/SvEvTac), 129S7, 129S8, 129T1, 129T2 (véanse por ejemplo, Festing y otros, 1999, Mammalian Genome 10:836; Auerbach, W. y otros, 2000, Biotech. 29(5): 1024-1028, 1030, 1032). En algunas determinadas modalidades, un ratón modificado genéticamente como se describe en la presente descripción es una mezcla de una cepa 129 mencionada anteriormente y una cepa C57BL/6 mencionada anteriormente. En algunas determinadas modalidades, un ratón como se describe en la presente descripción, es una mezcla de las cepas 129 mencionadas anteriormente, o una mezcla de las cepas BL/6 mencionadas anteriormente. En algunas determinadas modalidades, una cepa 129 de la mezcla como se describe en la presente descripción es una cepa 129S6 (129/SvEvTac). En algunas modalidades, un ratón como se describe en la presente descripción es una cepa BALB, por ejemplo, la cepa BALB/c. En algunas modalidades, un ratón como se describe en la presente descripción es una mezcla de una cepa BALB y otra cepa mencionada anteriormente.

En algunas modalidades, un roedor como se describe en la presente descripción es una rata. En algunas determinadas modalidades, una rata como se describe en la presente descripción, se selecciona de una rata Wistar, una cepa LEA, una cepa Sprague Dawley, una cepa Fischer, L344, L6 y Dark Agouti. En algunas determinadas modalidades, una cepa de rata como se describe en la presente descripción, es una mezcla de dos o más cepas que se seleccionan del grupo que consiste en Wistar, LEA, Sprague Dawley, Fischer, F344, F6 y Dark Agouti.

Ácido nucleico: como se usa en la presente descripción, en su sentido más amplio, se refiere a cualquier compuesto y/o sustancia que se incorpora o puede incorporarse en una cadena oligonucleotídica. En algunas modalidades, un “ácido nucleico" es un compuesto y/o sustancia que se incorpora o puede incorporarse a una cadena oligonucleotídica por medio de un enlace fosfodiéster. Como resultará evidente por el contexto, en algunas modalidades, “ácido nucleico" se refiere a residuos de ácidos nucleicos individuales (por ejemplo, nucleótidos y/o nucleósidos); en algunas modalidades, “ácido nucleico" se refiere a una cadena oligonucleotídica que comprende residuos de ácidos nucleicos individuales. En algunas modalidades, un “ácido nucleico" es o comprende ARN; en algunas modalidades, un “ácido nucleico" es o comprende ADN. En algunas modalidades, un “ácido nucleico" es, comprende, o consiste en uno o más residuos de ácidos nucleicos naturales. En algunas modalidades, un “ácido nucleico" es, comprende, o consiste en uno o más análogos de ácidos nucleicos. En algunas modalidades, un análogo de ácido nucleico se diferencia de un “ácido nucleico" en que no usa un cadena principal de fosfodiéster. Por ejemplo, en algunas modalidades, un “ácido nucleico" es, comprende, o consiste en uno o más “ácidos nucleicos peptídicos”, que se conocen en la técnica y tienen enlaces peptídicos en lugar de enlaces fosfodiéster en la cadena principal, y se consideran dentro del alcance de la presente invención. Alternativamente o adicionalmente, en algunas modalidades, un “ácido nucleico" tiene uno o más enlaces fosforotioato y/o 5'-N-fosforamidita en lugar de enlaces fosfodiéster. En algunas modalidades, un “ácido nucleico" es, comprende, o consiste en uno o más nucleósidos naturales (por ejemplo, adenosina, timidina, guanosina, citidina, uridina, desoxiadenosina, desoxitimidina, desoxiguanosina y desoxicitidina). En algunas modalidades, un “ácido nucleico" es, comprende, o consiste en uno o más análogos de nucleósidos (por ejemplo, 2-aminoadenosina, 2-tiotimidina, inosina, pirrolopirimidina, 3-metiladenosina, 5-metilcitidina, C-5 propinilcitidina, C-5 propiniluridina, 2-aminoadenosina, C5-bromouridina, C5-fluorouridina, C5-yodouridina, C5-propiniluridina, c5-propinilcitidina, C5-metilcitidina, 2-aminoadenosina, 7-deazaadenosina, 7-deazaguanosina, 8-oxoadenosina, 8-oxoguanosina, O(6)-metilguanina, 2-tiocitidina, bases metiladas, bases intercaladas y las combinaciones de estos). En algunas modalidades, un “ácido nucleico" comprende uno o más azúcares modificados (por ejemplo, 2'-fluororribosa, ribosa, 2'-desoxirribosa, arabinosa y hexosa) en comparación con los que se encuentran en los ácidos nucleicos naturales. En algunas modalidades, un “ácido nucleico" tiene una secuencia de nucleótidos que codifica un producto génico funcional tal como un ARN o una proteína. En algunas modalidades, un “ácido nucleico" incluye uno o más intrones. En algunas modalidades, un “ácido nucleico" se prepara mediante uno o más de aislamiento a partir de una fuente natural, síntesis enzimática por polimerización basada en una plantilla complementaria (in vivo o in vitro), reproducción en una célula o sistema recombinante y síntesis química. En algunas modalidades, un “ácido nucleico" es de al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 20, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000 o más residuos de largo. En algunas modalidades, un “ácido nucleico" es monocatenario; en algunas modalidades, un “ácido nucleico" es bicatenario. En algunas modalidades, un “ácido nucleico" tiene una secuencia de nucleótidos que comprende al menos un elemento que codifica, o es el complemento de una secuencia que codifica, un polipéptido. En algunas modalidades, un “ácido nucleico" tiene actividad enzimática.

Unido operativamente: como se usa en la presente descripción, se refiere a una yuxtaposición en donde los componentes descritos se encuentran en una relación que les permite funcionar en su manera prevista. Una secuencia de control “unida operativamente” a una secuencia codificante está ligada de manera que la expresión de la secuencia codificante se logra en condiciones compatibles con las secuencias de control. Las secuencias “unidas operativamente” incluyen tanto las secuencias de control de la expresión contiguas al gen de interés como las secuencias de control de la expresión que actúan en trans o a una distancia para controlar el gen de interés. El término “secuencia de control de la expresión”, como se usa en la presente descripción, se refiere a secuencias de polinucleótidos, que son necesarias para efectuar la expresión y el procesamiento de las secuencias codificantes a las que se ligan. Las “secuencias de control de la expresión” incluyen: secuencias adecuadas de iniciación, de terminación, promotoras y potenciadoras de la transcripción; señales de procesamiento de ARN eficientes, tales como señales de corte y empalme y de poliadenilación; secuencias que estabilizan el ARNm citoplasmático; secuencias que aumentan la eficiencia de la traducción (es decir, la secuencia de consenso Kozak); secuencias que aumentan la estabilidad de las proteínas; y cuando convenga, secuencias que aumentan la secreción de proteínas. La naturaleza de tales secuencias de control difiere en dependencia del organismo huésped. Por ejemplo, en procariotas, tales secuencias de control generalmente incluyen el promotor, el sitio de unión al ribosoma, y las secuencias de terminación de la transcripción, mientras que, en eucariotas, típicamente, tales secuencias de control incluyen los promotores y las secuencias de terminación de la transcripción. El término “secuencias de control” se destina a incluir componentes cuya presencia es esencial para la expresión y el procesamiento, y puede incluir, además, componentes adicionales cuya presencia es ventajosa, por ejemplo, secuencias líder y secuencias de parejas de fusión.

Paciente o sujeto: como se usa en la presente descripción, se refiere a cualquier organismo al que se administra o puede administrarse una composición proporcionada, por ejemplo, con propósitos experimentales, de diagnóstico, profilácticos, estéticos y/o terapéuticos. Los pacientes típicos incluyen animales (por ejemplo, mamíferos tales como ratones, ratas, conejos, primates no humanos, y/o seres humanos). En algunas modalidades, un paciente es un animal no humano. En algunas modalidades, un paciente o sujeto (por ejemplo, un paciente animal no humano) puede tener una modificación como se describe en la presente descripción, una modificación que es diferente a como se describe en la presente descripción o puede no tener modificaciones (es decir, un paciente animal no humano de tipo salvaje). En algunas modalidades, un animal no humano padece de uno o más trastornos o afecciones, o es susceptible a estos. En algunas modalidades, un animal no humano muestra uno o más síntomas de una enfermedad, trastorno o afección. En algunas modalidades, un animal no humano se ha diagnosticado con una o más enfermedades, trastornos o afecciones.

Polipéptido: como se usa en la presente descripción, se refiere a cualquier cadena polimérica de aminoácidos. En algunas modalidades, un polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos que se produce en la naturaleza. En algunas modalidades, un polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos que no se produce en la naturaleza. En algunas modalidades, un polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos que contiene porciones que se producen en la naturaleza separadas entre sí (es decir, de dos o más organismos diferentes, por ejemplo, porciones humanas y de roedores). En algunas modalidades, un polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos que está modificada genéticamente dado que se diseña y/o produce mediante la acción del hombre.

Promotor o secuencia promotora: como se usa en la presente descripción, se refiere a una región reguladora de ADN capaz de unirse a una ARN polimerasa en una célula (por ejemplo, directamente o a través de otros polipéptidos o sustancias unidos a promotores) e iniciar la transcripción de una secuencia codificante. Una secuencia promotora está, en general, unida en su extremo 3' por el sitio de inicio de la transcripción y se extiende secuencia arriba (dirección 5') para incluir el número mínimo de bases o elementos necesarios para iniciar la transcripción en cualquier nivel. El promotor puede estar asociado operativamente con, o unido operativamente a secuencias de control de la expresión, que incluyen secuencias potenciadoras y represoras o con un ácido nucleico de interés que se va a expresar. En algunas modalidades, un promotor puede ser inducible. En algunas modalidades, un promotor inducible puede ser unidireccional o bidireccional. En algunas modalidades, un promotor puede ser un promotor constitutivo. En algunas modalidades, un promotor puede ser un promotor híbrido, en el que la secuencia que contiene una región reguladora de la transcripción se obtiene de una fuente y la secuencia que contiene una región de inicio de la transcripción se obtiene de una segunda fuente. Los sistemas para enlazar elementos de control con secuencias codificantes dentro de un transgén se conocen bien en la técnica. Por ejemplo, las técnicas generales de biología molecular y ADN recombinante se describen en Principles of Gene Manipulation: An Introduction to Genetic Manipulation, 5ta Ed., ed. por Old, R.W. y S.B. Primrose, Blackwell Science, Inc., 1994; Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2da Ed., ed. por Sambrook, J. y otros, Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989.

Recombinante: como se usa en la presente descripción, se destina a referirse a polipéptidos que se diseñan, se modifican genéticamente, se preparan, se expresan, se generan o se aíslan por medios recombinantes, tales como polipéptidos que se expresan mediante el uso de un vector de expresión recombinante transfectado en una célula huésped, polipéptidos aislados a partir de una colección combinatoria de polipéptidos humanos recombinantes (Hoogenboom H. R., 1997, TIB Tech. 15:62-70; Azzazy H., y Highsmith W. E., 2002, Clin. Biochem. 35:425-45; Gavilondo J. V., y Larrick J. W., 2002, BioTech. 29:128-45; Hoogenboom H., y Chames P., 2000, Immunology Today 21:371-8), anticuerpos aislados de un animal (por ejemplo, un ratón) que es transgénico para genes de inmunoglobulina humana (véanse, por ejemplo, Taylor, L. D. y otros, 1992, Nucl. Acids Res. 20:6287-95; Kellermann S-A., y Green L. L., 2002, Curr. Opin. Biotechnol. 13:593-7; Little M. y otros, 2000, Immunol. Today 21:364-370; Murphy, A.J. y otros, 2014, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111(14):5153-8) o polipéptidos preparados, expresados, generados o aislados por cualquier otro medio que involucre el corte y empalme entre elementos de secuencia seleccionados entre sí. En algunas modalidades, uno o más de tales elementos de secuencia seleccionados se encuentran en la naturaleza. En algunas modalidades, uno o más de tales elementos de secuencia seleccionados se diseñan in silico. En algunas modalidades, uno o más de tales elementos de secuencia seleccionados son el resultado de la mutagénesis (por ejemplo, in vivo o in vitro) de un elemento de secuencia conocido, por ejemplo, de una fuente natural o sintética. Por ejemplo, en algunas modalidades, un polipéptido recombinante comprende secuencias que se encuentran en el genoma de un organismo fuente de interés (por ejemplo, humano, ratón, etc.). En algunas modalidades, un polipéptido recombinante tiene una secuencia de aminoácidos que es el resultado de la mutagénesis (por ejemplo, in vitro o in vivo, por ejemplo, en un animal roedor), de manera que las secuencias de aminoácidos de los polipéptidos recombinantes son secuencias que, si bien se originan de secuencias de polipéptidos y se relacionan con estas, pueden no existir naturalmente dentro del genoma de un roedor in vivo.

Reemplazo: como se usa en la presente descripción, se refiere a un proceso a través del cual una secuencia de ácido nucleico “reemplazada" (por ejemplo, un gen) que se encuentra en un locus huésped (por ejemplo, en un genoma) se elimina de ese locus, y un ácido nucleico diferente, de “reemplazo" se coloca en su lugar. En algunas modalidades, la secuencia de ácido nucleico reemplazada y las secuencias de ácidos nucleicos de reemplazo son comparables entre sí dado que, por ejemplo, son homólogas entre sí y/o contienen elementos correspondientes (por ejemplo, elementos de codificación de proteínas, elementos reguladores, etc.). En algunas modalidades, una secuencia de ácido nucleico reemplazada incluye uno o más de un promotor, un potenciador, un sitio donante de corte y empalme, un sitio receptor de corte y empalme, un intrón, un exón, una región sin traducir (UTR); en algunas modalidades, una secuencia de ácido nucleico de reemplazo incluye una o más secuencias codificantes. En algunas modalidades, una secuencia de ácido nucleico de reemplazo es un homólogo de la secuencia de ácido nucleico reemplazada. En algunas modalidades, una secuencia de ácido nucleico de reemplazo es un ortólogo de la secuencia reemplazada. En algunas modalidades, una secuencia de ácido nucleico de reemplazo es, o comprende, una secuencia de ácido nucleico humana. En algunas modalidades, una secuencia de ácido nucleico de reemplazo es, o comprende, una secuencia de ácido nucleico modificada genéticamente. En algunas modalidades, que incluyen cuando la secuencia de ácido nucleico de reemplazo es, o comprende, una secuencia de ácido nucleico humana, la secuencia de ácido nucleico reemplazada es, o comprende, una secuencia de roedor (por ejemplo, una secuencia de ratón o de rata). La secuencia de ácido nucleico así colocada puede incluir una o más secuencias reguladoras que son parte de la secuencia de ácido nucleico fuente usada para obtener la secuencia así colocada (por ejemplo, promotores, potenciadores, regiones sin traducir 5' o 3', etc.). Por ejemplo, en varias modalidades, el reemplazo es una sustitución de una secuencia endógena con una secuencia heteróloga que da como resultado la producción de un producto génico a partir de la secuencia de ácido nucleico así colocada (que comprende la secuencia heteróloga), pero no la expresión de la secuencia endógena; el reemplazo es de una secuencia genómica endógena con una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene una función similar a la del polipéptido codificado por la secuencia endógena (por ejemplo, la secuencia genómica endógena codifica un polipéptido Angptl8, y el fragmento de ADN codifica uno o más polipéptidos ANGPTL8 humano, en su totalidad o en parte). En varias modalidades, un gen endógeno o un fragmento de este se reemplaza con un gen humano correspondiente o un fragmento de este. Un gen humano correspondiente o un fragmento de este es un gen humano o un fragmento que es un ortólogo de, o es sustancialmente similar o igual en estructura y/o función, al gen endógeno o fragmento de este que se reemplaza.

Referencia: como se usa en la presente descripción, describe un estándar o agente de control, cohorte, individuo, población, muestra, secuencia o valor control contra el cual se compara un agente, animal, cohorte, individuo, población, muestra, secuencia o valor de interés. En algunas modalidades, un agente, cohorte, individuo, población, muestra, secuencia o valor de referencia se somete a prueba y/o se determina sustancialmente de manera simultánea con la prueba o determinación del agente, cohorte, individuo, población, muestra, secuencia o valor de interés. En algunas modalidades, un agente, animal, cohorte, individuo, población, muestra, secuencia o valor de referencia es una referencia histórica, materializada opcionalmente en un medio tangible. En algunas modalidades, una referencia puede referirse a un control. Como se usa en la presente descripción, una “referencia” puede referirse a un “animal de referencia". Un “animal de referencia" puede tener una modificación como se describe en la presente descripción, una modificación que es diferente a como se describe en la presente descripción o puede no tener modificaciones (es decir, un animal de tipo salvaje). Típicamente, como entenderán los expertos en la técnica, un agente, animal, cohorte, individuo, población, muestra, secuencia o valor de referencia se determina o caracteriza en condiciones comparables a las usadas para determinar o caracterizar el agente, animal (por ejemplo, un mamífero), cohorte, individuo, población, muestra, secuencia o valor de interés.

Sustancialmente: como se usa en la presente descripción, se refiere a la condición cualitativa de exhibir una medida o grado total o casi total de una característica o propiedad de interés. Un experto en las técnicas biológicas comprenderá que los fenómenos biológicos y químicos raramente, o nunca, llegan a completarse y/o se completan o logran o evitan un resultado absoluto. Por lo tanto, el término “sustancialmente" se usa en la presente descripción para capturar la carencia potencial de totalidad inherente en muchos fenómenos biológicos y químicos.

Homología sustancial: como se usa en la presente descripción, se refiere a una comparación entre secuencias de aminoácidos o ácidos nucleicos. Como apreciarán los expertos en la técnica, generalmente dos secuencias se consideran “sustancialmente homólogas” si contienen residuos homólogos en posiciones correspondientes. Los residuos homólogos pueden ser residuos idénticos. Alternativamente, los residuos homólogos pueden ser residuos no idénticos con características estructurales y/o funcionales adecuadamente similares. Por ejemplo, como bien conocen los expertos en la técnica, determinados aminoácidos se clasifican, típicamente, como aminoácidos “hidrófobos” o “hidrófilos”, y/o porque tienen cadenas laterales “polares" o “no polares”. La sustitución de un aminoácido por otro del mismo tipo puede considerarse frecuentemente una sustitución “homóloga”. Las clasificaciones de aminoácidos típicos se resumen más abajo:

Alanine Ala A Nonpolar Neutral 1,8

Arginine Arg R Polar Positive - 4,5

Asparagine Asn N Polar Neutral - 3,5

Aspartic acid Asp D Polar Negative -3,5

Cysteine Cys C Nonpolar Neutral 2,5

Glutamic acid Glu E Polar Negative -3,5

Glutamine Gln Q Polar Neutral -3,5

Glycine Gly G Nonpolar Neutral -0,4

Histidine His H Polar Positive -3,2

Isoleucine Ile I Nonpolar Neutral 4,5

Leucine Leu L Nonpolar Neutral 3,8

Lysine Lys K Polar Positive -3,9

Methionine Met M Nonpolar Neutral 1,9

Phenylalanine Phe F Nonpolar Neutral 2,8

Proline Pro P Nonpolar Neutral -1,6

Serine Ser S Polar Neutral -0,8

Threonine Thr T Polar Neutral -0,7

Tryptophan Trp W Nonpolar Neutral -0,9

Tyrosine Tyr Y Polar Neutral -1,3

Valine Val V Nonpolar Neutral 4,2

Ambiguous Amino Acids 3-Letter 1-Letter

Asparagine or aspartic acid Asx B

Glutamine or glutamic acid Glx Z

Leucine or Isoleucine Xle J

Unspecified or unknown amino acid Xaa X

Como se conoce bien en esta técnica, las secuencias de aminoácidos o ácidos nucleicos pueden compararse mediante el uso de cualquiera de una variedad de algoritmos, que incluyen los disponibles en programas informáticos comerciales, tales como BLASTN para secuencias de nucleótidos y BLASTP, gapped BLAST y PSI-BLAST para secuencias de aminoácidos. Tales programas ilustrativos se describen en Altschul y otros, 1990, Basic local alignment search tool, J. Mol. Biol., 215(3): 403-410; Altschul y otros, 1996, Methods Enzymol. 266:160-80; Altschul y otros, 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402; Baxevanis y otros, 1998 Bioinformatics: A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, Wiley; y Misener y otros (eds.) (1999) Bioinformatics Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology, Vol. 132), Humana Press. Además de identificar las secuencias homólogas, los programas mencionados anteriormente típicamente proporcionan una indicación del grado de homología. En algunas modalidades, dos secuencias se consideran sustancialmente homólogas si al menos 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más de sus residuos correspondientes son homólogos en un segmento de residuos en cuestión. En algunas modalidades, el segmento en cuestión es una secuencia completa. En algunas modalidades, el segmento en cuestión es de al menos 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 o más residuos. En algunas modalidades, el segmento en cuestión incluye residuos contiguos a lo largo de una secuencia completa. En algunas modalidades, el segmento en cuestión incluye residuos discontinuos a lo largo de una secuencia completa. En algunas modalidades, el segmento en cuestión es de al menos 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 o más residuos.

Identidad sustancial: como se usa en la presente descripción, se refiere a una comparación entre secuencias de aminoácidos o ácidos nucleicos. Como apreciarán los expertos en la técnica, generalmente, dos secuencias se consideran “sustancialmente idénticas" si contienen residuos idénticos en posiciones correspondientes. Como se conoce bien en esta técnica, las secuencias de aminoácidos o ácidos nucleicos pueden compararse mediante el uso de cualquiera de una variedad de algoritmos, que incluyen los disponibles en programas informáticos comerciales tales como BLASTN para las secuencias de nucleótidos y BLASTP, gapped BLAST, y PSI-BLAST para las secuencias de aminoácidos. Tales programas ilustrativos se describen en Altschul y otros, 1990, Basic local alignment search tool, J. Mol. Biol., 215(3): 403-410; Altschul y otros, 1996, Methods Enzymol. 266:160-80; Altschul y otros, 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402; Baxevanis y otros, 1998, Bioinformatics: A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, Wiley; Misener y otros, (eds.) (1999) Bioinformatics Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology, Vol. 132), Humana Press. Además de identificar secuencias idénticas, los programas mencionados anteriormente típicamente proporcionan una indicación del grado de identidad. En algunas modalidades, dos secuencias se consideran sustancialmente idénticas si al menos el 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más de sus residuos correspondientes son idénticos en un segmento de residuos en cuestión. En algunas modalidades, el segmento en cuestión es una secuencia completa. En algunas modalidades, el segmento en cuestión es de al menos 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 o más residuos.

Vector de direccionamiento o construcción de direccionamiento: como se usa en la presente descripción, se refiere a una molécula de polinucleótido que comprende una región de direccionamiento. Una región de direccionamiento comprende una secuencia que es idéntica o sustancialmente idéntica a una secuencia en una célula, tejido o animal diana y proporciona la integración de la construcción de direccionamiento en una posición dentro del genoma de la célula, tejido o animal por medio de la recombinación homóloga. Se incluyen, además, las regiones de direccionamiento que se dirigen hacia la diana mediante el uso de sitios de reconocimiento de recombinasas específicas de sitio (por ejemplo, sitios loxP y/o Frt). En algunas modalidades, una construcción de direccionamiento comprende, además, una secuencia de ácido nucleico o gen de interés particular, un marcador de selección, secuencias de control y/o reguladoras, y otras secuencias de ácidos nucleicos que permiten la recombinación mediada por la adición exógena de proteínas que ayudan o facilitan la recombinación que involucra a tales secuencias. En algunas modalidades, una construcción de direccionamiento comprende, además, un gen de interés en su totalidad o en parte, en donde el gen de interés es un gen heterólogo que codifica un polipéptido, en su totalidad o en parte, que tiene una función similar a la de un polipéptido codificado por una secuencia endógena. En algunas modalidades, una construcción de direccionamiento comprende, además, un gen humanizado de interés, en su totalidad o en parte, en donde el gen humanizado de interés codifica un polipéptido, en su totalidad o en parte, que tiene una función similar a la de un polipéptido codificado por la secuencia endógena. En algunas modalidades, una construcción de direccionamiento comprende, además, un gen de interés modificado genéticamente, en su totalidad o en parte, en donde el gen de interés modificado genéticamente codifica un polipéptido, en su totalidad o en parte, que tiene una función similar a la de un polipéptido codificado por la secuencia endógena.

Variante: como se usa en la presente descripción, se refiere a una entidad que muestra una identidad estructural significativa con una entidad de referencia, pero se diferencia estructuralmente de la entidad de referencia en la presencia o nivel de una o más porciones químicas en comparación con la entidad de referencia. En muchas modalidades, una “variante" se diferencia, además, funcionalmente de su entidad de referencia. En general, el hecho de que una entidad particular se considere adecuadamente como una "variante" de una entidad de referencia se basa en su grado de identidad estructural con la entidad de referencia. Como apreciarán los expertos en la técnica, cualquier entidad de referencia biológica o química tiene determinados elementos estructurales característicos. Una "variante", por definición, es una entidad química definida que comparte uno o más de tales elementos estructurales característicos. Para proporcionar algunos ejemplos, una molécula pequeña puede tener un elemento estructural central característico (por ejemplo, un macrociclo central) y/o una o más porciones colgantes características de manera que una variante de la molécula pequeña es una que comparte el elemento estructural central y las porciones colgantes características pero se diferencia en otras porciones colgantes y/o en los tipos de enlaces presentes (simples frente a dobles, E frente a Z, etcétera) dentro del núcleo central, un polipéptido puede tener un elemento de secuencia característico que comprende una pluralidad de aminoácidos que tienen posiciones designadas relacionadas entre sí en el espacio lineal o tridimensional y/o que contribuyen a una función biológica particular, un ácido nucleico puede tener un elemento de secuencia característico que comprende una pluralidad de residuos de nucleótidos que tienen posiciones designadas con relación a otras en el espacio lineal o tridimensional. Por ejemplo, una "variante de polipéptido" puede diferenciarse de un polipéptido de referencia como resultado de una o más diferencias en la secuencia de aminoácidos y/o una o más diferencias en las porciones químicas (por ejemplo, carbohidratos, lípidos, etcétera) unidas covalentemente a la cadena principal del polipéptido. En algunas modalidades, una “variante de polipéptido" muestra una identidad de secuencia general con un polipéptido de referencia que es al menos de 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 % o 99 %. Alternativamente o adicionalmente, en algunas modalidades, una “variante de polipéptido" no comparte al menos un elemento de secuencia característico con un polipéptido de referencia. En algunas modalidades, el polipéptido de referencia tiene una o más actividades biológicas. En algunas modalidades, una “variante de polipéptido" comparte una o más de las actividades biológicas del polipéptido de referencia. En algunas modalidades, una “variante de polipéptido" carece de una o más de las actividades biológicas del polipéptido de referencia. En algunas modalidades, una “variante de polipéptido" muestra un nivel reducido de una o más actividades biológicas en comparación con el polipéptido de referencia. En muchas modalidades, un polipéptido de interés se considera una "variante" de un polipéptido original o de referencia si el polipéptido de interés tiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica a la del original excepto por un pequeño número de alteraciones de la secuencia en posiciones particulares. Típicamente, menos de 20 %, 15 %, 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 % de los residuos en la variante están sustituidos en comparación con la original. En algunas modalidades, una "variante" tiene 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 residuos sustituidos en comparación con una original. Frecuentemente, una "variante" tiene un número muy pequeño (por ejemplo, menos de 5, 4, 3, 2 o 1) de residuos funcionales sustituidos (es decir, residuos que participan en una actividad biológica particular). Además, típicamente, una “variante" no tiene más de 5, 4, 3, 2, o 1 adiciones o eliminaciones, y frecuentemente no tiene adiciones o eliminaciones, en comparación con el original. Además, cualquiera de las adiciones o eliminaciones son típicamente menores que aproximadamente 25, aproximadamente 20, aproximadamente 19, aproximadamente 18, aproximadamente 17, aproximadamente 16, aproximadamente 15, aproximadamente 14, aproximadamente 13, aproximadamente 10, aproximadamente 9, aproximadamente 8, aproximadamente 7, aproximadamente 6, y comúnmente son menores que aproximadamente 5, aproximadamente 4, aproximadamente 3 o aproximadamente 2 residuos. En algunas modalidades, el polipéptido original o de referencia es uno que se encuentra en la naturaleza. Como entenderán los expertos en la técnica, una pluralidad de variantes de un polipéptido de interés particular puede encontrarse comúnmente en la naturaleza, particularmente cuando el polipéptido de interés es un agente polipéptido infeccioso.

Vector, como se usa en la presente descripción, se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al cual se asocia. En algunas modalidades, los vectores son capaces de replicarse de manera extracromosómica y/o expresar los ácidos nucleicos a los que se encuentran unidos en una célula huésped tal como una célula eucariota y/o procariota. Los vectores capaces de dirigir la expresión de genes unidos operativamente se denominan en la presente descripción “vectores de expresión".

Tipo salvaje: como se usa en la presente descripción, tiene su significado entendido en la técnica que se refiere a una entidad que tiene una estructura y/o actividad como la que se encuentra en la naturaleza en un estado o contexto “normal" (a diferencia de mutante, enfermo, alterado, etc.). Los expertos en la técnica apreciarán que los genes y polipéptidos de tipo salvaje existen frecuentemente en múltiples formas diferentes (por ejemplo, alelos). Descripción detallada de determinadas modalidades

La presente invención proporciona, entre otras cosas, roedores mejorados y/o modificados genéticamente que tienen material genético heterólogo que codifica una proteína similar a la angiopoyetina 8 (ANGPTL8) para determinar la eficacia terapéutica de los moduladores de ANGPTL8 (por ejemplo, anticuerpos anti-ANGPTL8) para el tratamiento de trastornos metabólicos y ensayos que miden el metabolismo de los lípidos (por ejemplo, triglicéridos), la homeostasis de la glucosa, diversos efectos sobre el peso corporal, la composición y el gasto de energía. Se contempla que tales roedores proporcionan una mejora en la determinación de la eficacia terapéutica de los moduladores de ANGPTL8 y su potencial para el bloqueo de ANGPTL8. Por lo tanto, la presente invención es particularmente útil para el desarrollo de terapias anti-ANGPTL8 para el tratamiento de enfermedades, trastornos o afecciones que resultan o se caracterizan por diversos trastornos metabólicos, que incluyen disfunción de triglicéridos, intolerancia a la glucosa y dislipidemia (Zhang y Abou-Samra, Cardiovascular Diabetology 2014, 13,133). En particular, la presente invención abarca la modificación genética de un gen Angptl8 de roedor (por ejemplo, murino) que da como resultado la expresión de un polipéptido ANGPTL8 humano en el suero de roedor. Estos roedores tienen la capacidad de proporcionar un modelo animal in vivo para determinar la eficacia de agentes terapéuticos anti-ANGPTL8 en el tratamiento de trastornos metabólicos y/o enfermedades, trastornos y/o afecciones cardiovasculares. Los roedores de la invención demuestran niveles aumentados de triglicéridos en comparación con los roedores de tipo salvaje. En algunas modalidades, los roedores, como se describe en la presente descripción, proporcionan un modelo animal in vivo para el metabolismo de las lipoproteínas. En algunas modalidades, los roedores, como se describe en la presente descripción, proporcionan un modelo animal in vivo de hipertrigliceridemia.

En algunas modalidades, los polipéptidos Angptl8 expresados (o secretados) por roedores como se describe en la presente descripción comprenden una secuencia correspondiente a los aminoácidos 22-60, 77-134, 156-193 o 22 198 de un polipéptido ANGPTL8 humano. En algunas modalidades, los polipéptidos Angptl8 codificados por el material genético dentro del genoma de los roedores descritos en la presente descripción comprenden una secuencia correspondiente al péptido señal, un polipéptido Angptl8 murino. En algunas modalidades, los roedores como se describe en la presente descripción comprenden en un locus de Angptl8 endógeno, un gen Angptl8 que contiene material genético del roedor y un ser humano. Un roedor de la invención comprende un gen Angptl8 modificado genéticamente, en donde el gen Angptl8 modificado genéticamente comprende la porción codificante del exón 1 y los exones 2-4 de un gen ANGPTL8 humano. En algunas modalidades, los roedores como se describen en la presente descripción comprenden un gen Angptl8 modificado genéticamente, en donde el gen Angptl8 modificado genéticamente comprende la porción codificante del exón 1 (o la porción codificante del exón 1 excluyendo el codón de inicio), el exón 2, el exón 3 y el exón 4 (que incluye la UTR 3') de un gen ANGPTL8 humano. En algunas determinadas modalidades, los roedores, como se describe en la presente descripción, comprenden un gen Angptl8 modificado genéticamente, en donde el gen Angptl8 modificado genéticamente comprende ~2,383 pb de un gen ANGPTL8 humano correspondiente a la porción codificante del exón 1 que comienza inmediatamente después del codón de inicio hasta el exón 4, que incluye la UTR 3' (por ejemplo, ~256 pb) de un gen ANGPTL8 humano. En algunas modalidades, los roedores como se describen en la presente descripción comprenden un gen Angptl8 modificado genéticamente en un locus de Angptl8 endógeno, en donde el gen Angptl8 modificado genéticamente comprende la UTR 5' de un gen Angptl8 endógeno, la porción codificante del exón 1, exón 2, exón 3 y exón 4 (que incluye la UTR 3') de un gen ANGPTL8 humano, unido operativamente a un promotor de Angptl8 endógeno; y en algunas modalidades, en la generación de dicho gen Angptl8 modificado genéticamente, se han eliminado la porción codificante del exón 1, los exones 2-3 y la porción codificante del exón 4 del gen Angptl8 endógeno en dicho locus de Angptl8 endógeno. En diversas modalidades, los roedores, como se describe en la presente descripción, no expresan de manera detectable un polipéptido Angptl8 endógeno, en su totalidad o en parte.

Varios aspectos de la invención se describen en detalle en las siguientes secciones. El uso de secciones no significa que limite la invención. Cada sección puede aplicarse a cualquier aspecto de la invención. En esta solicitud, el uso de “o" significa “y/o" a menos que se indique de cualquier otra manera.

Proteína similar a la angiopoyetina 8 (ANGPTL8)

ANGPTL8 (también conocido como TD26, RIFL, Lipasina, C19orf80 y Betatrofín) es un miembro de la familia ANGPTL recientemente reconocido que se ha implicado en el metabolismo de los triglicéridos y la glucosa. El análisis filogenético ha revelado que ANGPTL8 está estrechamente relacionado con ANGPTL3 y ANGPTL4 (Fu, Z. y otros, 2013, Biochem. Biophys. Res. Commun. 430:1126-31; Quagliarini F. y otros; 2012, PN^aS 109:19751-19756). ANGPTL8 es un polipéptido secretado que se expresa principalmente en el hígado y el tejido adiposo y, a diferencia de los miembros de la familia relacionados, ANGPTL3 y ANGPTL4, carece de un dominio similar al fibrinógeno C-terminal, pero contiene un dominio enrollado en espiral N-terminal, al igual que otros miembros de la familia ANGPTL (Matt-ijssen F. y Kersten S, Biochim Biophys Acta 1821, 2012:782-789).

La sobreexpresión hepática de ANGPTL8 se asocia con hipertrigliceridemia, mientras que la inactivación de Angptl8 provoca una reducción de los niveles de triglicéridos en plasma (Quagliarini, F. y otros, 2012, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 109(48):19751-6; Wang, Y. y otros, 2013, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 110:16109-14). A pesar de los informes de que ANGPTL8 está involucrado en la regulación de los lípidos, el mecanismo responsable aún está en debate. Para dar solo un ejemplo, un mecanismo razona que ANGPTL8 inhibe la actividad de lipoproteína lipasa, lo que da como resultado una reducción de la hidrólisis y eliminación de triglicéridos (Zhang, R. y otros, 2012, Biochem. Biophys. Res. Commun. 424:786-92). También se ha informado que ANGPTL8 desempeña un papel en la proliferación de células beta y la masa de células beta en ratones en los que el antagonista del receptor de insulina S961 indujo resistencia a la insulina (Yi, P. y otros, 2013, Cell 153:747-58). Sin embargo, estudios posteriores han revelado que ANGPTL8 no es necesario para la función de las células beta o la respuesta de crecimiento de las células beta a la resistencia a la insulina. Además, la sobreexpresión de ANGPTL8 no aumenta el área de las células beta ni mejora el control glucémico (Gusarova, V. y otros, 2014, Cell 159:691-6). Dado que la sobreexpresión hepática de ANGPTL8 se asocia con hipertrigliceridemia y la inactivación de Angptl8 da como resultado una reducción de los niveles de triglicéridos en plasma, un inhibidor o antagonista de ANGPTL8 puede resultar eficaz en el tratamiento de una enfermedad caracterizada, en parte, por niveles elevados de triglicéridos, tales como, pero sin limitarse a, la hipertrigliceridemia. De acuerdo con un informe que usó ratones de tipo salvaje, un anticuerpo monoclonal contra la lipasina disminuyó los niveles de triglicéridos en suero cuando se inyectó por vía intraperitoneal (Zhang, R., 2015, Endocrine Society's 97a Annual Meeting, Presentación Núm. OR13-6, marzo 5-8, San Diego, CA). Se necesita una comprensión más completa y detallada de las funciones mediadas por ANGPTL8 y la vía ANGPTL8 en el metabolismo de los lípidos, la homeostasis de la glucosa, el efecto sobre el peso corporal, la composición corporal, el gasto de energía y la función cardiovascular, para desarrollar terapias prácticas dirigidas para el tratamiento futuro de pacientes humanos que sufren de hipertrigliceridemia y otras enfermedades, trastornos o afecciones caracterizadas por niveles elevados de triglicéridos y lípidos.

Secuencias de ANGPTL8

ANGPTL8 (también conocido como TD26, RIFL, Lipasina, C19orf80 y Betatrofín) es un miembro de la familia de proteínas de angiopoyetina. “ANGPTL8”, como se usa en la presente descripción, se refiere a un polipéptido ANGPTL8 humano y, en algunas modalidades, un polipéptido ANGPTL8 humano sin un péptido señal (por ejemplo, un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos que se establece en 22-198 de la SEQ ID NO: 6). Las secuencias de ARNm y aminoácidos de ANGPTL8 humano ilustrativos (que incluye el péptido señal) pueden encontrarse en los números de acceso de GenBank NP_061157.3 (SEQ ID NO: 6) y NM_018687.6 (SEQ ID NO: 5), respectivamente (véanse las Figuras 8D y 8E). Los dominios enrollados en espiral N-terminales de ANGPTL8 humano abarcan los residuos de aminoácidos ~77-134 y 156-193 de la SEQ ID NO: 6.

En las Figuras 8A-8H se exponen secuencias de Angptl8 de roedor ilustrativas (por ejemplo, rata y ratón), humanas y modificadas genéticamente. Un fragmento de ADN sintético ilustrativo para modificar genéticamente un gen Angptl8 de roedor como se describe en la presente descripción también se expone en la Figura 8I. Para las secuencias de ARNm, la letra en negrita indica la secuencia codificante y los exones consecutivos, cuando se indican, se encuentran separados por texto subrayado alterno; para las secuencias de ARNm modificadas genéticamente, las secuencias humanas se encuentran dentro de paréntesis. Para las secuencias de aminoácidos, las secuencias señal se indican mediante una fuente subrayada.

Construcciones de ADN y producción de roedores que tienen un gen ANGPTL8 humanizado

Típicamente, una molécula de polinucleótido que contiene un gen Angptl8 (por ejemplo, un gen Angptl8 modificado genéticamente o heterólogo), en su totalidad o en parte, se inserta en un vector, preferentemente un vector de ADN, para replicar la molécula de polinucleótido en una célula huésped adecuada.

En dependencia del tamaño, un gen Angptl8 o secuencia codificante de Angptl8 pueden clonarse directamente de fuentes de ADNc disponibles de proveedores comerciales o diseñarse in silico a partir de secuencias publicadas disponibles de GenBank. Alternativamente, las colecciones de cromosomas artificiales bacterianos (BAC) pueden proporcionar secuencias de Angptl8 heterólogas a partir de genes de interés (por ejemplo, un gen Angptl8). Las colecciones de BAC contienen un tamaño de inserto promedio de 100-150 kb y son capaces de albergar insertos tan grandes como 300 kb (Shizuya, H. y otros, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A. 89:8794-7; Swiatek, P.J. y T. Gridley, 1993, Genes Dev. 7:2071-84; Kim, U.J. y otros, 1996, Genomics 34:213-8). Por ejemplo, se han construido colecciones de BAC genómicas humanas y de ratón y están disponibles comercialmente (por ejemplo, Invitrogen, Carlsbad Calif.). Las colecciones de BAC genómicas también pueden servir como una fuente de secuencias de Angptl8 heterólogas así como también de regiones de control de la transcripción.

Alternativamente, las secuencias de Angptl8 heterólogas pueden aislarse, clonarse y/o transferirse desde cromosomas artificiales de levadura (YAC). Un gen o locus heterólogo completo puede clonarse y contenerse dentro de uno o varios YAC. Si se emplean múltiples YAC y contienen regiones de homología de solapamiento, pueden recombinarse dentro de las cepas huésped de levadura para producir una única construcción que representa todo el locus. Los brazos del YAC pueden modificarse adicionalmente con casetes de selección de mamíferos mediante el reajuste para ayudar a introducir las construcciones en células madre embrionarias o embriones mediante métodos conocidos en la técnica y/o descritos en la presente descripción.

Se proporcionan las secuencias de ARNm y aminoácidos ilustrativas para su uso en la construcción de un gen Angptl8 humanizado en un roedor. También pueden encontrarse otras secuencias de Angptl8 heterólogas en la base de datos GenBank u otras bases de datos de secuencias conocidas en la técnica.

Las construcciones de ADN que contienen las secuencias de Angptl8 como se describe en la presente descripción, en algunas modalidades, comprenden las secuencias genómicas de ANGPTL8 humano (o ADNc) que codifican al menos aproximadamente los aminoácidos 22-60, 77-134, 156-193 o 22-198 de un polipéptido ANGPTL8 humano unido operativamente a secuencias reguladoras de roedor (por ejemplo, un promotor de roedor) para la expresión en un roedor transgénico. En algunas modalidades, las construcciones de ADN que contienen las secuencias de Angptl8 como se describe en la presente descripción comprenden las secuencias genómicas de ANGPTL8 humano (o ADNc) que codifican al menos aproximadamente los aminoácidos 22-60, 77-134, 156-193 o 22-198 de un polipéptido ANGPTL8 humano unido operativamente a un promotor de Angptl8 de roedor y una o más regiones sin traducir de Angptl8 de roedor (por ejemplo, UTR 5' y/o 3'). Las secuencias de Angptl8 humano y/o de roedor incluidas en las construcciones de ADN descritas en la presente descripción pueden ser idénticas o sustancialmente idénticas con las secuencias de Angptl8 humano y/o de roedor que se encuentran en la naturaleza (por ejemplo, genómica), artificiales (por ejemplo, sintéticas) o pueden ser modificadas genéticamente por la mano del hombre. En algunas modalidades, las secuencias de Angptl8 son de origen sintético, e incluyen una secuencia o secuencias que se encuentran en un gen ANGPTL8 humano que se encuentra en la naturaleza. Por ejemplo, una construcción de ADN puede incluir ADN sintético que corresponde a los exones 1-4 de un gen ANGPTL8 humano, y que codifica al menos aproximadamente los aminoácidos 22-60, 77-134, 156-193 o 22-198 de un polipéptido ANGPTL8 humano, unido operativamente a unas secuencias no codificantes (por ejemplo, una o más UTR de roedor) y reguladoras (por ejemplo, un promotor) de Angptl8 de roedor de modo que la construcción de ADN resultante codifica un polipéptido Angptl8 que tiene una secuencia que es totalmente o sustancialmente humana. Alternativamente, una construcción de ADN puede incluir ADN sintético que corresponde al material genético que codifica una porción funcional de un polipéptido ANGPTL8 humano (por ejemplo, uno o más dominios enrollados en espiral, una región N-terminal) unido operativamente a secuencias codificantes (por ejemplo, uno o más exones de roedor) y reguladoras (por ejemplo, un promotor) de Angptl8 de roedor de modo que la construcción de ADN resultante codifica un polipéptido Angptl8 que tiene porciones humana y de roedor. En algunas modalidades, las secuencias de Angptl8 comprenden una secuencia asociada naturalmente con un gen Angptl8 heterólogo (es decir, un gen ANGPTL8 humano). En algunas modalidades, las secuencias de Angptl8 comprenden una secuencia que no se asocia naturalmente con un gen Angptl8 heterólogo. En algunas modalidades, las secuencias de Angptl8 comprenden una secuencia que se optimiza para la expresión en un roedor. En algunas modalidades, las secuencias de Angptl8 heterólogas unidas operativamente a las secuencias de Angptl8 de roedor cada una codifican para una porción de un polipéptido Angptl8 que aparece en polipéptidos separados en la naturaleza. Si secuencias adicionales son útiles para optimizar la expresión de secuencias de Angptl8 heterólogas, tales secuencias pueden clonarse mediante el uso de secuencias existentes como sondas. Pueden obtenerse secuencias adicionales necesarias para maximizar la expresión de un gen Angptl8 heterólogo o una secuencia codificante de Angptl8 heteróloga a partir de secuencias genómicas u otras fuentes en dependencia del resultado deseado.

Las construcciones de ADN pueden prepararse mediante el uso de métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, una construcción de ADN puede prepararse como parte de un plásmido más grande. Tal preparación permite clonar y seleccionar las construcciones correctas de una manera eficiente como se conoce en la técnica. Los fragmentos de ADN que contienen una o más secuencias codificantes de nucleótidos como se describe en la presente descripción pueden localizarse entre sitios de restricción convenientes en el plásmido de manera que puedan aislarse fácilmente de las secuencias de plásmido restantes para su incorporación en el animal deseado.

En la técnica se conocen varios métodos empleados en la preparación de plásmidos y organismos huésped que los contienen. Para otros sistemas de expresión adecuados tanto para células procariotas como eucariotas, así como también para procedimientos recombinantes generales, véase Principles of Gene Manipulation: An Introduction to Genetic Manipulation, 5ta Ed., ed. por Old, R.W. y S.B. Primrose, Blackwell Science, Inc., 1994; Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2da Ed., ed. por Sambrook, J. y otros, Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989.

Se proporcionan roedores que expresan polipéptidos ANGPTL8 humanos, en su totalidad o en parte, en el suero de roedor como resultado de una modificación genética de un locus endógeno (por ejemplo, un locus de Angptl8) de roedor que codifica un polipéptido Angptl8. Los ejemplos adecuados descritos en la presente descripción incluyen ratones.

Un gen Angptl8 humanizado, en algunas modalidades, comprende un material genético de un ser humano, en donde el gen Angptl8 humanizado codifica un polipéptido Angptl8 que comprende la porción codificada del material genético del ser humano. En algunas modalidades, un gen Angptl8 humanizado, como se describe en la presente descripción, comprende ADN genómico de una especie heteróloga que codifica un polipéptido Angptl8 que se expresa en el suero de roedor, en donde el polipéptido Angptl8 tiene una secuencia que es totalmente o sustancialmente humana. También se proporcionan animales roedores, embriones, células y construcciones de direccionamiento para producir roedores, embriones de roedores y células que contienen dicho gen Angptl8 humanizado.

En algunas modalidades, se elimina un gen Angptl8 endógeno. En algunas modalidades, se altera un gen Angptl8 endógeno, en donde una porción del gen Angptl8 endógeno se reemplaza con una secuencia heteróloga (una secuencia de ANGPTL8 humano, en su totalidad o en parte). En algunas modalidades, la totalidad o sustancialmente la totalidad de un gen Angptl8 endógeno se reemplaza con un gen heterólogo (un gen ANGPTL8 humano, en su totalidad o en parte). Una porción de un gen Angptl8 heterólogo se inserta en un gen Angptl8 endógeno de roedor en un locus de Angptl8 endógeno. El gen heterólogo es un gen humano. En algunas modalidades, la modificación o la humanización se realiza a una de las dos copias de un gen Angptl8 endógeno, lo que da lugar a un roedor que es heterocigoto con respecto al gen Angptl8 humanizado. En otras modalidades, se proporciona un roedor que es homocigoto para un gen Angptl8 humanizado.

Un roedor como se describe en la presente descripción puede contener un gen ANGPTL8 humano, en su totalidad o en parte, en un locus Angptl8 endógeno no humano. También se describe un roedor como se describe en la presente descripción que contiene un gen ANGPTL8 humano, en su totalidad o en parte, en un lugar que no sea un locus de Angptl8 endógeno no humano. Por lo tanto, los roedores como se describen en la presente descripción pueden caracterizarse por tener un gen Angptl8 humanizado o heterólogo. El gen Angptl8 reemplazado, insertado, modificado o alterado en el locus de Angptl8 endógeno o un polipéptido expresado a partir de tal gen puede detectarse mediante el uso de una variedad de métodos que incluyen, por ejemplo, PCR, inmunoelectrotransferencia, transferencia Southern, polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP), o un ensayo de ganancia o pérdida de alelos. Un gen Angptl8 humanizado o heterólogo insertado al azar en el genoma de un roedor puede detectarse por medios iguales o similares. En algunas modalidades, un roedor como se describe en la presente descripción es heterocigoto con respecto a un gen Angptl8 humanizado o heterólogo como se describe en la presente descripción.

Un gen Angptl8 humanizado como se describe en la presente descripción incluye un gen Angptl8 que tiene la porción codificante del exón 1 (comenzando desde o inmediatamente después del codón de inicio ATG hasta el extremo 3' del exón 1), y los exones 2-4, de un gen ANGPTL8 humano.

En varias modalidades, un gen Angptl8 humanizado como se describe en la presente descripción incluye un gen Angptl8 que tiene un primer, segundo, tercer y cuarto exón, cada uno con una secuencia al menos 50 % (por ejemplo, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más) idéntica a un primer, segundo, tercer y cuarto exón que aparecen en la SEQ ID NO: 5 o la SEQ ID NO: 7.

En varias modalidades, un gen Angptl8 humanizado como se describe en la presente descripción incluye un gen Angptl8 que tiene un primer, segundo, tercer y cuarto exón cada uno con una secuencia que es sustancialmente idéntica o idéntica a un primer, segundo, tercer y cuarto exón que aparece en la SEQ ID NO: 5 o la SEQ ID NO: 7. En varias modalidades, un gen Angptl8 humanizado como se describe en la presente descripción comprende una secuencia al menos 50 % (por ejemplo, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más) idéntica a la SEQ ID NO: 10 o la SEQ ID NO: 11.

En varias modalidades, un gen Angptl8 humanizado como se describe en la presente descripción comprende una secuencia que es sustancialmente idéntica o idéntica a la SEQ ID NO: 10 o la SEQ ID NO: 11.

En varias modalidades, un gen Angptl8 humanizado como se describe en la presente descripción es o comprende la SEQ ID NO: 10 o la SEQ ID NO: 11.

En varias modalidades, un gen Angptl8 humanizado tal como se describe en la presente descripción comprende una región sin traducir 5' que tiene una secuencia de al menos 50 % (por ejemplo, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más) idéntica a una región sin traducir 5' que aparece en la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 3, y/o una región sin traducir 3' que tiene una secuencia de al menos 50 % (por ejemplo, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más) idéntica a una región sin traducir 3' que aparece en la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 3.

En varias modalidades, un gen Angptl8 humanizado como se describe en la presente descripción comprende una región sin traducir 5' que tiene una secuencia que es sustancialmente idéntica o idéntica a una región sin traducir 5' que aparece en la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 3, y/o una región sin traducir 3' que tiene una secuencia que es sustancialmente idéntica o idéntica a una región sin traducir 3' que aparece en la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 3. En varias modalidades, un gen Angptl8 humanizado como se describe en la presente descripción comprende una región sin traducir 5' que tiene una secuencia que es sustancialmente idéntica o idéntica a la región sin traducir 5' de un gen Angptl8 endógeno de roedor, y/o una región sin traducir 3' que tiene una secuencia que es sustancialmente idéntica o idéntica a la región sin traducir 3' de un gen ANGPTL8 humano. En varias modalidades, un gen Angptl8 humanizado como se describe en la presente descripción comprende una región sin traducir 5' que tiene una secuencia que es sustancialmente idéntica o idéntica a una región sin traducir 5' que aparece en la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 3, y/o una región sin traducir 3' que tiene una secuencia que es sustancialmente idéntica o idéntica a una región sin traducir 3' que aparece en la SEQ ID NO: 5 o la SEQ ID NO: 7.

Un gen Angptl8 humanizado como se describe en la presente descripción comprende una región sin traducir 5' de un gen Angptl8 endógeno de roedor (por ejemplo, ratón o rata), la porción codificante del exón 1 de un gen Angptl8 humano, y los exones 2-4 de un gen ANGPTL8 humano, que incluyen la UTR 3' del gen ANGPTL8 humano.

En varias modalidades, un gen Angptl8 humanizado como se describe en la presente descripción comprende una secuencia codificante de nucleótidos (por ejemplo, una secuencia de ADNc) al menos 50 % (por ejemplo, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más) idéntica a una secuencia codificante de nucleótidos que aparece en la SEQ ID NO: 5 o la SEQ ID NO: 7.

En varias modalidades, un gen Angptl8 humanizado como se describe en la presente descripción comprende una secuencia codificante de nucleótidos (por ejemplo, una secuencia de ADNc) que es sustancialmente idéntica o idéntica a una secuencia codificante de nucleótidos que aparece en la SEQ ID NO: 5 o la SEQ ID NO: 7.

En varias modalidades, un gen Angptl8 humanizado como se describe en la presente descripción codifica un polipéptido Angptl8 que es idéntico o sustancialmente idéntico a un polipéptido ANGPTL8 humano. En varias modalidades, un gen Angptl8 humanizado tal como se describe en la presente descripción codifica un polipéptido Angptl8 que es idéntico o sustancialmente idéntico a una proteína ANGPTL8 humana de longitud completa traducida de un gen ANGPTL8 humano (que incluye un péptido señal de ANGPTL8 humano, o los primeros 21 aminoácidos de una proteína ANGPTL8 humana de longitud completa).

En varias modalidades, un gen Angptl8 humanizado como se describe en la presente descripción codifica un polipéptido Angptl8 que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 50 % (por ejemplo, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más) idéntica a una secuencia de aminoácidos que aparece en la SEQ ID NO: 6 o la SEQ ID NO: 8.

En varias modalidades, un gen Angptl8 humanizado como se describe en la presente descripción codifica un polipéptido Angptl8 que tiene una secuencia de aminoácidos que es sustancialmente idéntica o idéntica a una secuencia de aminoácidos que aparece en la SEQ ID NO: 6 o la SEQ ID NO: 8.

En varias modalidades, un polipéptido Angptl8 producido por un roedor como se describe en la presente descripción comprende una secuencia de aminoácidos al menos 50 % (por ejemplo, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más) idéntica a los residuos de aminoácidos 22-198 de la SEQ ID NO: 6 o la SEQ ID NO: 8.

En varias modalidades, un polipéptido Angptl8 producido por un roedor como se describe en la presente descripción comprende una secuencia de aminoácidos que es sustancialmente idéntica o idéntica a los residuos de aminoácidos 22-198 de la SEQ ID NO: 6 o la SEQ ID NO: 8.

En varias modalidades, un polipéptido Angptl8 producido por un roedor como se describe en la presente descripción comprende una secuencia de aminoácidos al menos 50 % (por ejemplo, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más) idéntica a los residuos de aminoácidos 77-134 de la SEQ ID NO: 6 o la SEQ ID NO: 8.

En varias modalidades, un polipéptido Angptl8 producido por un roedor como se describe en la presente descripción comprende una secuencia de aminoácidos que es sustancialmente idéntica o idéntica a los residuos de aminoácidos 77-134 de la SEQ ID NO: 6 o la SEQ ID NO: 8.

En varias modalidades, un polipéptido Angptl8 producido por un roedor como se describe en la presente descripción comprende una secuencia de aminoácidos al menos 50 % (por ejemplo, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más) idéntica a los residuos de aminoácidos 156-193 de la SEQ ID NO: 6 o la SEQ ID NO: 8.

En varias modalidades, un polipéptido Angptl8 producido por un roedor como se describe en la presente descripción comprende una secuencia de aminoácidos que es sustancialmente idéntica o idéntica a los residuos de aminoácidos 156-193 de la SEQ ID NO: 6 o la SEQ ID NO: 8.

En varias modalidades, un polipéptido Angptl8 producido por un roedor como se describe en la presente descripción comprende una secuencia de aminoácidos al menos 50 % (por ejemplo, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más) idéntica a los residuos de aminoácidos 22-60 de la SEQ ID NO: 6 o la SEQ ID NO: 8.

En varias modalidades, un polipéptido Angptl8 producido por un roedor como se describe en la presente descripción comprende una secuencia de aminoácidos que es sustancialmente idéntica o idéntica a los residuos de aminoácidos 22-60 de la SEQ ID NO: 6 o la SEQ ID NO: 8.

En diversas modalidades, un polipéptido Angptl8 producido por un roedor como se describe en la presente descripción incluye uno o más dominios enrollados en espiral, en donde dichos uno o más dominios enrollados en espiral comprenden una secuencia de aminoácidos de al menos 50 % (por ejemplo, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más) idéntico a uno o más dominios enrollados en espiral que aparecen en la SEQ ID NO: 6 o la SEQ ID NO: 8.

En diversas modalidades, un polipéptido Angptl8 producido por un roedor como se describe en la presente descripción incluye uno o más dominios enrollados en espiral, en donde dicho uno o más dominios enrollados en espiral comprenden una secuencia de aminoácidos que es sustancialmente idéntica o idéntica a uno o más dominios enrollados en espiral que aparecen en la SEQ ID NO: 6 o la SEQ ID NO: 8.

En diversas modalidades, un polipéptido Angptl8 producido por un roedor como se describe en la presente descripción tiene una región N-terminal, región N-terminal que comprende una secuencia de aminoácidos de al menos 50 % (por ejemplo, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más) idéntica a una región N-terminal que aparece en la SEQ ID NO: 6 o la SEQ ID NO: 8.

En diversas modalidades, un polipéptido Angptl8 producido por un roedor como se describe en la presente descripción tiene una región N-terminal, región N-terminal que comprende una secuencia de aminoácidos que es sustancialmente idéntica o idéntica a una región N-terminal que aparece en la SEQ ID NO: 6 o la SEQ ID NO: 8. Se proporcionan las composiciones y los métodos para producir roedores que expresan un polipéptido Angptl8 humanizado o humano, que incluye formas polimórficas específicas, variantes alélicas (por ejemplo, diferencias en un solo aminoácido) o alternativamente isoformas de corte y empalme, que incluyen las composiciones y los métodos para producir roedores que expresan tales polipéptidos a partir de un promotor humano y una secuencia reguladora humana. En algunas modalidades, se proporcionan, además, las composiciones y los métodos para producir roedores que expresan tales proteínas a partir de un promotor de roedor y una secuencia reguladora de roedor. En algunas modalidades, se proporcionan, además, las composiciones y los métodos para producir roedores que expresan tales proteínas a partir de un promotor endógeno y una secuencia reguladora endógena. Los promotores endógenos y las secuencias reguladoras endógenas son promotores endógenos de roedor y secuencias reguladoras endógenas de roedor. Los métodos incluyen insertar el material genético que codifica un polipéptido ANGPTL8 humano, en su totalidad o en parte, en un sitio preciso en el genoma de un roedor que corresponde a un gen Angptl8 endógeno para de esta manera generar un gen Angptl8 humanizado que expresa un polipéptido Angptl8 que es humano en su totalidad o en parte. En algunas modalidades, los métodos incluyen insertar ADN genómico correspondiente a los exones 1-4 de un gen ANGPTL8 humano en un gen Angptl8 endógeno de roedor para de esta manera generar un gen humanizado que codifica un polipéptido Angptl8 que contiene una porción humana que contiene aminoácidos codificados por los exones insertados.

Cuando sea adecuado, la región codificante del material genético o la(s) secuencia(s) de polinucleótido(s) que codifica(n) un polipéptido ANGPTL8 humano (o humanizado) en su totalidad o en parte pueden modificarse para incluir codones optimizados para la expresión en células en el roedor (por ejemplo, véanse las patentes de Estados Unidos núms. 5,670,356 y 5,874,304). Las secuencias optimizadas por codones son secuencias sintéticas, y, preferentemente, codifican el polipéptido idéntico (o un fragmento biológicamente activo de un polipéptido de longitud completa que tiene sustancialmente la misma actividad que el polipéptido de longitud completa) codificado por el polinucleótido original no optimizado por codones. En algunas modalidades, la región codificante del material genético que codifica un polipéptido ANGPTL8 humano (o humanizado), en su totalidad o en parte, puede incluir una secuencia alterada para optimizar el uso de codones en un tipo de célula particular (por ejemplo, una célula de roedor). Por ejemplo, los codones del ADN genómico correspondiente a los exones 1-4 de un gen ANGPTL8 humano a insertar en un gen Angptl8 endógeno de un roedor pueden optimizarse para su expresión en una célula de roedor. Una secuencia de este tipo puede describirse como una secuencia con codones optimizados.

Los métodos para generar roedores transgénicos, que incluyen desactivaciones génicas e inserciones génicas, se conocen bien en la técnica (véase, por ejemplo, Gene Targeting: A Practical Approach, Joyner, ed., Oxford University Press, Inc. (2000)). Por ejemplo, la generación de roedores transgénicos puede implicar opcionalmente la interrupción de los loci genéticos de uno o más genes endógenos de roedor (o segmentos de genes) y la introducción de uno o más genes heterólogos (o secuencias codificantes de Angptl8) en el genoma de roedor, en algunas modalidades, en el mismo lugar que un gen endógeno de roedor (o segmentos de genes).

En algunos casos, los genes Angptl8 heterólogos (por ejemplo, humano o humanizado) o las secuencias codificantes de Angptl8 heterólogas como se describe en la presente descripción se introducen aleatoriamente en el genoma de un roedor. En tales casos, los roedores que comprenden, contienen o albergan de cualquier otra manera heterólogos introducidos (o genes Angptl8 humanizados o secuencias codificantes de Angptl8 heterólogas) pueden caracterizarse por tener un transgén Angptl8 heterólogo o construcción de transgén Angptl8 heterólogo. Típicamente, un transgén y/o una construcción de transgén incluye, entre otras cosas, una secuencia de ácido nucleico (que codifica, por ejemplo, un polipéptido de interés, en su totalidad o en parte) que se introduce en una célula madre embrionaria de roedor por la mano del hombre mediante el uso de métodos descritos en la presente descripción o conocido de cualquier otra manera en la técnica. Además, un transgén puede ser parcial o totalmente heterólogo, es decir, extraño a un roedor o una célula en la que se introduce. Un transgén puede incluir además una o más secuencias reguladoras de la transcripción y cualquier otro ácido nucleico, tales como intrones o promotores (por ejemplo, constitutivos, específicos de tejido, etc.), que pueden ser necesarios para la expresión de una secuencia de ácido nucleico seleccionada. En algunas modalidades, los genes Angptl8 heterólogos (o humanizados) o las secuencias codificantes de Angptl8 heterólogas como se describen en la presente descripción se introducen en un gen Angptl8 endógeno en el genoma de un roedor; en algunas determinadas modalidades, un locus de gen Angptl8 endógeno se altera, manipula o modifica genéticamente para contener secuencias de ANGPTL8 humano (o fragmentos de genes) unidas operativamente a una o más secuencias de Angptl8 de roedor (o fragmentos de genes).

Como se describe en la presente descripción, los genes Angptl8 heterólogos (o humanizados) o las secuencias codificantes de Angptl8 heterólogas están unidas operativamente a secuencias de control de la expresión, tales como un promotor para impulsar la expresión de Angptl8 heterólogo (o humanizado) en los roedores. Tales promotores pueden ser promotores de Angptl8 de roedor. En particular, el gen Angptl8 modificado genéticamente está unido operativamente a un promotor de Angptl8 endógeno de roedor en el locus de Angptl8 endógeno.

Un enfoque del gen Angptl8 humanizado emplea una modificación relativamente mínima de las interacciones y la señalización de proteínas endógenas y da como resultado funciones y/o actividad mediadas por Angptl8 natural en el roedor, en varias modalidades, debido a que la secuencia genómica de las secuencias de Angptl8 está modificada en un solo fragmento y, por lo tanto, retiene la funcionalidad normal al incluir las secuencias reguladoras necesarias. Además, en varias modalidades, la modificación no afecta la secreción de un polipéptido Angptl8 funcional en el suero y mantiene funciones y/o interacciones normales a través de la unión a varios lípidos (por ejemplo, triglicéridos).

En la Figura 1 se proporciona una ilustración esquemática (que no está a escala) de la organización genómica de un gen Angptl8 endógeno murino y un gen ANGPTL8 humano. En la Figura 3 se proporciona un método ilustrativo para la humanización de un gen Angptl8 endógeno murino mediante el uso de un fragmento genómico que contiene los exones 1-4 y una UTR 3' de un gen ANGPTL8 humano. Como se ilustra, un fragmento de ADN sintético de 2,383 pb correspondiente a los exones 1-4 y una UTR 3' de un gen ANGPTL8 humano se inserta en el lugar de una secuencia de 1,576 pb de un locus de gen Angptl8 endógeno murino mediante una recombinación homóloga con una construcción de direccionamiento. El fragmento de ADN sintético de 2,383 pb puede clonarse directamente a partir de ADN humano o sintetizarse a partir de una secuencia fuente (por ejemplo, núm. de acceso de GenBank NM_018687.6, SEQ ID NO: 5). Este ADN genómico incluye la porción del gen que codifica al menos los aproximadamente los residuos de aminoácidos 22-198 de un polipéptido ANGPTL8 humano responsable de la unión al lípido.

Un roedor (por ejemplo, un ratón) que tiene un gen Angptl8 humanizado en un locus de Angptl8 endógeno puede producirse mediante cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, puede producirse un vector de direccionamiento que introduce un gen ANGPTL8 humano en su totalidad o en parte con un gen marcador de selección. La Figura 3 ilustra un vector de direccionamiento que contiene un locus de Angptl8 endógeno de un genoma de ratón que comprende una inserción de un fragmento de ADN sintético de 2,383 pb que corresponde a los exones 1-4 (específicamente, la porción codificante del exón 1, exón 2, exón 3 y exón 4 que incluye la UTR 3') de un gen ANGPTL8 humano. Como se ilustra, la construcción de direccionamiento contiene un brazo de homología 5' que contiene una secuencia arriba del exón 1 (es decir, que incluye el codón de inicio ATG) de un gen Angptl8 endógeno murino (~79 kb), seguido del fragmento de ADN sintético de 2,383 pb, un casete de selección de fármacos (por ejemplo, un gen de resistencia a neomicina flanqueado en ambos lados por secuencias loxP; -5 kb) y un brazo de homología 3' que contiene la UTR 3' de un gen Angptl8 endógeno murino (~ 148 kb). La construcción de direccionamiento contiene un casete de selección de autoeliminación de fármaco (por ejemplo, un gen de resistencia a neomicina flanqueado por secuencias loxP; véanse las patentes de Estados Unidos núms. 8,697,851, 8,518,392 y 8,354,389). Después de la electroporación en células madre embrionarias, se genera un gen Angptl8 endógeno modificado que incluye 2,383 pb de un gen ANGPTL8 humano (es decir, la porción codificante del exón 1, exón 2, exón 3 y exón 4 que incluye la UTR 3') en lugar de 1,576 pb de un gen Angptl8 endógeno de tipo salvaje, que está contenido en el vector de direccionamiento. Se genera un gen Angptl8 humanizado que da como resultado una célula o roedor que expresa un polipéptido Angptl8 humanizado que contiene aminoácidos codificados por el fragmento de ADN sintético de 2,383 pb. El casete de selección de fármacos se elimina de una manera dependiente del desarrollo, es decir, la progenie derivada de los ratones cuyas células de la línea germinal que contienen el gen Angptl8 humanizado descrito anteriormente liberarán el marcador de selección de las células diferenciadas durante el desarrollo (véase la parte inferior de la Figura 3).

Más abajo se proporcionan promotores ilustrativos que pueden estar unidos operativamente con casetes de selección de fármacos y/o genes de recombinasa incluidos en los vectores de direccionamiento descritos en la presente descripción. Los promotores adecuados adicionales que pueden usarse en los vectores de direccionamiento descritos en la presente descripción incluyen los descritos en las patentes de Estados Unidos núms. 8,697,851, 8,518,392 y 8,354,389). Las secuencias promotoras ilustrativas incluyen un promotor de Protamina 1 (Prm1) (SEQ ID NO: 12), un promotor Blimp 1 de 1 kb (SEQ ID NO: 13) y un promotor Blimp1 de 2 kb (SEQ ID NO: 14).

En algunas modalidades, un roedor que tiene un gen Angptl8 humanizado como se describe en la presente descripción puede caracterizarse como transgénico para el gen Angptl8 humanizado o un roedor Angptl8 transgénico. Tales descripciones se usan indistintamente en la presente descripción y se refieren a cualquier roedor de origen no natural en el que una o más de las células de roedor contienen una secuencia de ácido nucleico Angptl8 heteróloga y/o secuencia codificante de Angptl8, en su totalidad o en parte, como se describe en la presente descripción. En algunas modalidades, una secuencia de ácido nucleico Angptl8 heteróloga y/o secuencia codificante de Angptl8, en su totalidad o en parte, se introduce en una célula, directa o indirectamente por introducción en una célula precursora, por medio de una manipulación genética deliberada, tal como por microinyección o por infección con un virus recombinante. En tales modalidades, la manipulación genética no incluye técnicas de mejoramiento clásicas, sino que se dirige a la introducción de molécula(s) de ADN recombinante que contienen una secuencia de ácido nucleico Angptl8 heteróloga y/o secuencia codificante de Angptl8, en su totalidad o en parte, como se describe en la presente descripción. Tal molécula puede integrarse dentro de un cromosoma, o puede ser ADN de replicación extracromosómica. Como se describe en la presente descripción, los roedores transgénicos incluyen animales que son heterocigotos u homocigotos para una secuencia de ácido nucleico Angptl8 heteróloga y/o secuencia codificante de Angptl8, en su totalidad o en parte, y/o roedores que tienen copias únicas o múltiples de una secuencia de ácido nucleico Angptl8 heteróloga y/o secuencia codificante de Angptl8, en su totalidad o en parte, como se describe en la presente descripción.

Un roedor fundador transgénico puede identificarse en base a la presencia de un gen Angptl8 humanizado en su genoma y/o la expresión de polipéptidos Angptl8 que contienen aminoácidos codificados por el material genético insertado en tejidos o células de roedor. Un roedor fundador transgénico puede usarse entonces para criar roedores adicionales que portan el gen Angptl8 humanizado, lo que genera de esta manera una serie de roedores que portan cada uno una o más copias de un gen Angptl8 humanizado. Además, los roedores transgénicos que portan un gen Angptl8 humanizado pueden criarse además con otros roedores transgénicos que portan otros transgenes (por ejemplo, genes de inmunoglobulina humana) según se desee.

También pueden producirse roedores transgénicos de modo que contengan sistemas seleccionados que permitan la expresión regulada o dirigida del gen Angptl8 humanizado (o transgén Angptl8 humanizado). Los sistemas ilustrativos incluyen el sistema de la recombinasa Cre/loxP del bacteriófago P1 (véase, por ejemplo, Lakso, M. y otros, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:6232-6) y el sistema de la recombinasa FLP/Frt de S. cerevisiae (O'Gorman, S. y otros, 1991, Science 251:1351-5). Tales animales pueden proporcionarse mediante la construcción de animales transgénicos “dobles”, por ejemplo, mediante el apareamiento de dos animales transgénicos, uno que contiene un transgén que comprende una modificación seleccionada (por ejemplo, un transgén o gen Angptl8 humanizado) y el otro que contiene un transgén que codifica una recombinasa (por ejemplo, una recombinasa Cre).

Aunque las modalidades que emplean un gen Angptl8 humanizado en un ratón (es decir, un ratón con un gen Angptl8 que codifica un polipéptido Angptl8 que tiene una secuencia humana, en su totalidad o en parte) se discuten ampliamente en la presente descripción, también se proporcionan otros roedores que comprenden un gen Angptl8 humanizado. En algunas modalidades, tales no roedores comprenden un gen Angptl8 humanizado unido operativamente a un promotor de Angptl8 de roedor. En algunas modalidades, tales roedores comprenden un gen Angptl8 humanizado unido operativamente a un promotor de Angptl8 endógeno; en algunas modalidades, un promotor de Angptl8 endógeno de roedor. En algunas modalidades, tales roedores expresan un polipéptido Angptl8 humanizado de un locus endógeno, en donde el polipéptido Angptl8 humanizado comprende al menos los residuos de aminoácidos 22-60, 77-134, 156-193 o 22-198 de un polipéptido ANGPTL8 humano. Tales roedores incluyen cualquiera de los que pueden modificarse genéticamente para expresar un polipéptido Angptl8 como se describe en la presente descripción, que incluyen, por ejemplo, ratón, rata, etcétera. Por ejemplo, para aquellos roedores para los que no se dispone fácilmente de células ES genéticamente modificables adecuadas, se emplean otros métodos para producir un roedor que comprende la modificación genética. Tales métodos incluyen, por ejemplo, la modificación de un genoma de células que no son ES (por ejemplo, un fibroblasto o una célula pluripotente inducida) y el empleo de transferencia nuclear de células somáticas (SCNT) para transferir el genoma modificado genéticamente a una célula adecuada, por ejemplo, un ovocito enucleado, y la gestación de la célula modificada (por ejemplo, el ovocito modificado) en un roedor bajo condiciones adecuadas para formar un embrión.

Por ejemplo, una célula pluripotente y/o totipotente de rata puede ser de cualquier cepa de rata, que incluye, por ejemplo, una cepa de rata ^aCⁱ, una cepa de rata Dark Agouti (DA), una cepa de rata Wistar, una cepa de rata LEA, una cepa de rata Sprague Dawley (SD), o una cepa de rata Fischer tal como Fisher F344 o Fisher F6. Las células pluripotentes y/o totipotentes de rata también pueden obtenerse a partir de una cepa derivada de una mezcla de dos o más cepas mencionadas anteriormente. Por ejemplo, una célula pluripotente y/o totipotente de rata puede ser de una cepa DA o una cepa ACI. Una cepa de rata ACI se caracteriza por tener agutí negro, con el vientre y las patas blancas y un haplotipo RTlav1. Dichas cepas están disponibles en una variedad de fuentes, que incluyen los laboratorios Harlan. Un ejemplo de una línea de células ES de rata de una rata ACI es una célula ES de rata ACI.G1. Una cepa de ratas Dark Agouti (DA) se caracteriza por tener un pelaje agutí y un haplotipo RTlav1. Dichas ratas están disponibles en una variedad de fuentes que incluyen Charles River y Harlan Laboratories. Ejemplos de una línea de células ES de rata de una rata DA son la línea de células ES de rata DA.2B y la línea de células ES de rata DA.2C. En algunos casos, las células pluripotentes y/o totipotentes de rata proceden de una cepa de rata endogámica. Ver, por ejemplo, la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos núm. 2014-0235933 A1.

Los métodos para modificar un genoma de roedor (por ejemplo, genoma de cerdo, vaca, roedor, pollo, etc.) incluyen, por ejemplo, emplear una nucleasa con dedos de zinc (ZFN), una nucleasa efectora de tipo activadora de la transcripción (TALEN), o una proteína Cas (es decir, un sistema CRISPR/Cas) para modificar un genoma para incluir un gen Angptl8 humanizado.

Métodos que emplean roedores que tienen genes ANGPTL8 humanizados

La presente invención se basa, entre otras cosas, en el reconocimiento de que la generación de un sistema in vivo que explota las moléculas reguladoras del metabolismo de los lípidos puede hacerse mediante el uso de un gen Angptl8 humanizado como se describe en la presente descripción. Tal sistema in vivo permite el desarrollo de agentes terapéuticos y/o regímenes terapéuticos que se centran en mejorar los efectos de la disfunción lipídica en pacientes humanos. Además, tal sistema in vivo también proporciona el desarrollo de agentes terapéuticos y/o regímenes terapéuticos que se centran en alterar la regulación asociada a la angiopoyetina del metabolismo de los lípidos en hipertrigliceridemia y/o enfermedades, trastornos o afecciones cardiovasculares.

Los roedores como se describe en la presente descripción proporcionan un sistema in vivo mejorado y una fuente de materiales biológicos (por ejemplo, células) que expresan ANGPTL8 humano (o humanizado) que son útiles para una variedad de ensayos. En varias modalidades, los roedores como se describe en la presente descripción se usan para desarrollar agentes terapéuticos que se dirigen a ANGPTL8 humano y/o modulan la señalización de ANGPTL8 humano (por ejemplo, mediante la alteración de las interacciones con los compañeros de unión a ANGPTL8 humano, tales como ANGPTL3). En varias modalidades, los roedores como se describe en la presente descripción se usan para seleccionar y desarrollar agentes terapéuticos candidatos (por ejemplo, anticuerpos) que bloquean la interacción de ANGPTL8 humano con ANGPTL3 humano. En varias modalidades, los roedores como se describen en la presente descripción se usan para determinar el perfil de unión de antagonistas y/o agonistas de un ANGPTL8 humano en un roedor como se describe en la presente descripción; en algunas modalidades, los roedores como se describen en la presente descripción se usan para determinar el epítopo o los epítopos de uno o más anticuerpos terapéuticos candidatos que se unen a ANGPTL8 humano.

En varias modalidades, los roedores como se describe en la presente descripción se usan para determinar los perfiles farmacocinéticos de los anticuerpos anti-ANGPTL8. En varias modalidades, uno o más roedores como se describe en la presente descripción y uno o más roedores de control o de referencia se exponen cada uno a uno o más de anticuerpos anti-ANGPTL8 candidatos terapéuticos a varias dosis (por ejemplo, 0,1 mg/kg, 0,2 mg/kg, 0,3 mg/kg, 0,4 mg/kg, 0,5 mg/kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg, 3 mg/kg, 4 mg/kg, 5 mg/kg, 7,5 mg/kg, 10 mg/kg, 15 mg/kg, 20 mg/kg, 25 mg/kg, 30 mg/kg, 40 mg/kg o 50 mg/kg o más). Los anticuerpos terapéuticos candidatos pueden dosificarse por medio de cualquier vía de administración deseada que incluye las vías de administración parenteral y no parenteral. Las vías parenterales incluyen, por ejemplo, intravenosa, intraarterial, intraportal, intramuscular, subcutánea, intraperitoneal, intraespinal, intratecal, intracerebroventricular, intracraneal, intrapleural u otras vías de inyección. Las vías no parenterales incluyen, por ejemplo, oral, nasal, transdérmica, pulmonar, rectal, bucal, vaginal, ocular. La administración puede ser, además, por infusión continua, administración local, liberación sostenida a partir de implantes (geles, membranas o similares), y/o inyección intravenosa. La sangre se aísla de los roedores (humanizados y control) en varios puntos de tiempo (por ejemplo, 0 h, 6 h, 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 8 días, 9 días, 10 días, 11 días, o hasta 30 o más días). Varios ensayos pueden realizarse para determinar los perfiles farmacocinéticos de los anticuerpos terapéuticos candidatos administrados mediante el uso de muestras obtenidas a partir de roedores como se describe en la presente descripción, que incluyen, pero sin limitarse a, IgG total, respuesta contra el anticuerpo terapéutico, aglutinación, etc.

En varias modalidades, los roedores como se describe en la presente descripción se usan para medir el efecto terapéutico de bloquear o modular la señalización de ANGPTL8 y el efecto sobre la expresión génica como un resultado de cambios celulares. En varias modalidades, un roedor como se describe en la presente descripción o células aisladas del mismo se exponen a un candidato terapéutico que se une a un polipéptido ANGPTL8 humano (o una porción de un polipéptido ANGPTL8 humano) en el roedor y, después de un período de tiempo posterior, se analizan los efectos en procesos dependientes de ANGPTL8, por ejemplo, metabolismo de triglicéridos, actividad de lipoproteína lipasa y captación de diversas lipoproteínas (por ejemplo, lipoproteína de baja densidad, LDL).

Los roedores como se describe en la presente descripción expresan el polipéptido ANGPTL8 humano (o humanizado), por lo tanto, pueden generarse células, líneas celulares y cultivos celulares que sirven como fuente de ANGPTL8 humano para su uso en ensayos funcionales y de unión, por ejemplo, para el ensayo de la unión o función de un antagonista o agonista de ANGPTL8, particularmente cuando el antagonista o agonista es específico para una secuencia o epítopo de ANGPTL8 humano o, alternativamente, específico para una secuencia o epítopo de ANGPTL8 humano que se asocia con ANGPTL3. En varias modalidades, los epítopos de ANGPTL8 unidos a los anticuerpos terapéuticos candidatos pueden determinarse mediante el uso de células aisladas de roedores como se describe en la presente descripción. En varias modalidades, un polipéptido ANGPTL8 humano (o humanizado) expresado por un roedor como se describe en la presente descripción puede comprender una variante de secuencia de aminoácidos. En varias modalidades, los roedores como se describe en la presente descripción expresan una variante de ANGPTL8 humano (humanizado). En varias modalidades, la variante es polimórfica en una posición de aminoácido asociada con la unión al ligando. En varias modalidades, los roedores como se describe en la presente descripción se usan para determinar el efecto de la unión al ligando a través de la interacción con una variante polimórfica de ANGPTL8 humano. Las variantes de polipéptidos ANGPTL8 humano ilustrativas incluyen una variante caracterizada por una sustitución de aminoácidos R59W (Quagliarini, F. y otros, 2012, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 109(48):19751-6) o Q121X (Clapham y otros, BMC Endocr Disord. 2016, 16:7). En algunas modalidades, una variante de polipéptido ANGPTL8 humano se asocia con niveles más bajos de colesterol de lipoproteínas de baja densidad (LDL) y/o colesterol de lipoproteínas de alta densidad (HDL) en plasma. En algunas modalidades, una variante de polipéptido ANGPTL8 humano se asocia con niveles más bajos de triglicéridos y/o colesterol de HDL en plasma.

Las células de los roedores como se describe en la presente descripción pueden aislarse y usarse sobre una base ad hoc, o pueden mantenerse en cultivo por muchas generaciones. En varias modalidades, las células de un roedor como se describe en la presente descripción se inmortalizan (por ejemplo, por medio del uso de un virus) y se mantienen en cultivo indefinidamente (por ejemplo, en cultivos en serie).

Los roedores como se describe en la presente descripción proporcionan un sistema in vivo para evaluar las propiedades farmacocinéticas de un fármaco (por ejemplo, un modulador de ANGPTL8). En varias modalidades, un fármaco puede suministrarse o administrarse a uno o más roedores como se describe en la presente descripción, seguido de la monitorización de, o la realización de uno o más ensayos en, los roedores (o células aisladas a partir de estos), para determinar el efecto del fármaco sobre el roedor. Las propiedades farmacocinéticas incluyen, pero sin limitarse a, la manera en que un animal procesa el fármaco hacia varios metabolitos (o detección de la presencia o ausencia de uno o más metabolitos del fármaco, que incluyen, metabolitos tóxicos), vida media del fármaco, niveles circulantes del fármaco después de su administración (por ejemplo, concentración sérica del fármaco), respuesta contra el fármaco (por ejemplo, anticuerpos contra el fármaco), absorción y distribución del fármaco, vía de administración, vías de excreción y/o eliminación del fármaco. En algunas modalidades, las propiedades farmacocinéticas y farmacodinámicas de los fármacos se monitorean en o a través del uso de roedores como se describe en la presente descripción.

En algunas modalidades, la realización de un ensayo incluye determinar el efecto sobre el fenotipo y/o el genotipo de roedor al que se administra el fármaco. En algunas modalidades, la realización de un ensayo incluye determinar la variabilidad lote a lote para un fármaco. En algunas modalidades, la realización de un ensayo incluye determinar las diferencias entre los efectos de un fármaco administrado a un roedor como se describe en la presente descripción y a un roedor de referencia. En varias modalidades, los roedores de referencia pueden tener una modificación como se describe en la presente descripción, una modificación que es diferente a una como se describe en la presente descripción o puede no tener modificaciones (es decir, un roedor de tipo salvaje).

Los parámetros ilustrativos que pueden medirse en roedores (o en y/o mediante el uso de las células aisladas de los mismos) para evaluar las propiedades farmacocinéticas de un fármaco incluyen, pero sin limitarse a, aglutinación, autofagia, división celular, muerte celular, hemólisis mediada por complemento, integridad del ADN, título de anticuerpos específicos a fármaco, metabolismo del fármaco, matrices de expresión génica, actividad metabólica, actividad mitocondrial, estrés oxidativo, fagocitosis, biosíntesis de proteínas, degradación de proteínas, secreción de proteínas, respuesta al estrés, concentración del fármaco en el tejido diana, concentración de fármaco en el tejido que no es diana, actividad transcripcional y similares. En varias modalidades, los roedores como se describe en la presente descripción se usan para determinar una dosis farmacéuticamente efectiva de un fármaco.

Los roedores como se describe en la presente descripción proporcionan un sistema in vivo para el análisis y prueba de un fármaco o vacuna. En varias modalidades, un fármaco o vacuna candidato puede administrarse a uno o más roedores como se describe en la presente descripción, seguido de la monitorización de los roedores para determinar una o más de la respuesta inmunitaria al fármaco o vacuna, el perfil de seguridad del medicamento o vacuna, o el efecto sobre una enfermedad o afección. Los métodos ilustrativos usados para determinar el perfil de seguridad incluyen mediciones de toxicidad, concentración de dosis óptima, eficacia del fármaco o vacuna, y posibles factores de riesgo. Tales fármacos o vacunas pueden mejorarse y/o desarrollarse en roedores.

La eficacia de la vacuna puede determinarse de varias maneras. Brevemente, los roedores descritos en la presente descripción se vacunan mediante el uso de los métodos conocidos en la técnica y luego se exponen a una vacuna, o se administra una vacuna a roedores ya infectados. La respuesta de un roedor a una vacuna puede medirse al controlar y/o realizar uno o más ensayos en el(los) roedor(es) (o células aisladas de los mismos) para determinar la eficacia de la vacuna. A continuación, se compara la respuesta de uno(s) roedor(es) a la vacuna con animales de control, mediante el uso de una o más medidas conocidas en la técnica y/o descritas en la presente descripción.

La eficacia de la vacuna puede determinarse además mediante ensayos de neutralización viral. Brevemente, los roedores descritos en la presente descripción se inmunizan y el suero se recoge varios días después de la inmunización. Las diluciones en serie de suero se preincuban con un virus durante el cual los anticuerpos en el suero que son específicos para el virus se unirán a él. A continuación, la mezcla de virus/suero se añade a las células permisivas para determinar la ineficacia mediante un ensayo de placas o un ensayo de microneutralización. Si los anticuerpos en el suero neutralizan el virus, hay menos placas o unidades relativas de luciferasa más bajas en comparación con un grupo de control.

En diversas modalidades, los roedores como se describe en la presente descripción se usan en estudios de eficacia para determinar el efecto in vivo de los agentes terapéuticos anti-ANGPTL8 (por ejemplo, anticuerpos anti-ANGPTL8) sobre los niveles de triglicéridos circulantes. Por ejemplo, los roedores, como se describe en la presente descripción, se desangran antes de la administración de los agentes terapéuticos candidatos o controles y se organizan en varios grupos de tratamiento según se desee. Los agentes terapéuticos candidatos o los controles se administran a la dosis deseada y se desangran en días consecutivos después de la administración. Los niveles plasmáticos de triglicéridos, glucosa y/o insulina pueden medirse mediante el uso del suero recolectado. Los niveles de los agentes terapéuticos candidatos pueden medirse también según convenga. Los ensayos ilustrativos que pueden usarse para la detección de varias moléculas incluyen ensayos ELISA y otros como se describe en Wang, Y. y otros, 2013, Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 110(40):16109-114; Quagliarini, F. y otros, 2012, Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 109(48):19751-6.

En diversas modalidades, los roedores, como se describe en la presente descripción, se usan para determinar la actividad de lipoproteína lipasa (LPL) después del tratamiento con agentes terapéuticos anti-ANGPTL8 (por ejemplo, anticuerpos anti-ANGPTL8). Por ejemplo, los roedores, como se describe en la presente descripción, se desangran antes de la administración de los agentes terapéuticos candidatos o controles y se colocan en varios grupos de tratamiento según se desee. Los agentes terapéuticos candidatos o controles se administran a la dosis deseada y se desangran en días consecutivos después de la administración. Después de un tiempo suficiente (por ejemplo, varios días), se administra a los roedores un anticoagulante (por ejemplo, heparina) para que se libere lPl de las superficies endoteliales vasculares y se obtenga sangre de los roedores poco después. El plasma posterior a la heparina se fracciona para separar la LPL mediante el uso de la cromatografía de heparina-Sepharose y las actividades de LPL se ensayan mediante el uso de un sustrato de lipasa. Por ejemplo, los métodos y ensayos generales se describen en Wang, Y. y otros, 2013, Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 110(40): 16109-114; Quagliarini, F. y otros, 2012, Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 109(48):19751-6.

En diversas modalidades, los roedores, como se describe en la presente descripción, se usan en pruebas de tolerancia a los lípidos para determinar el aclaramiento de triglicéridos mediante la carga aguda de grasa después del tratamiento con agentes terapéuticos anti-ANGPTL8 (por ejemplo, anticuerpos anti-ANGPTL8). Por ejemplo, los roedores, como se describe en la presente descripción, se desangran antes de la administración de los agentes terapéuticos candidatos o controles y se colocan en varios grupos de tratamiento. Los agentes terapéuticos candidatos o controles se administran a la dosificación deseada. Después de varios días, los roedores se someten a un régimen de ayuno tras la administración de una emulsión de lípidos (por ejemplo, una concentración del 20 %) de acuerdo con el peso corporal. Los niveles de triglicéridos en plasma se determinan en la sangre extraída de los animales roedores en cada grupo de tratamiento. Por ejemplo, los métodos y ensayos generales se describen en Wang, Y. y otros, 2013, Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 110(40):16109-114; Quagliarini, F. y otros, 2012, Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 109(48):19751-6.

Los roedores como se describe en la presente descripción proporcionan un sistema in vivo mejorado para el desarrollo y la caracterización de agentes terapéuticos candidatos para su uso en la hipertrigliceridemia. En diversas modalidades, los roedores, como se describe en la presente descripción, pueden someterse a un régimen de alimentación específico (por ejemplo, sobrealimentación o ayuno), seguido de la administración de uno o más agentes terapéuticos candidatos. En algunas modalidades, los agentes terapéuticos candidatos pueden incluir un anticuerpo multiespecífico (por ejemplo, un anticuerpo biespecífico) o un cóctel de anticuerpos; en algunas modalidades, los agentes terapéuticos candidatos incluyen una terapia combinada tal como, por ejemplo, la administración de anticuerpos monoespecíficos dosificados de manera secuencial o simultánea. Los roedores pueden someterse al régimen de alimentación durante un tiempo suficiente para que los niveles de ANGPTL8 estén en un nivel alto en uno o más lugares (por ejemplo, hígado y/o tejido adiposo) dentro del roedor. Los niveles plasmáticos de triglicéridos, glucosa y/o insulina, y la actividad de lipoproteína lipasa, etc., pueden medirse tanto antes como después de la administración de agente(s) terapéutico(s) candidato(s). La citotoxicidad de los agentes terapéuticos candidatos puede medirse, además, en el roedor según convenga.

Los roedores, como se describe en la presente descripción, pueden usarse para desarrollar uno o más modelos de enfermedad para evaluar o comprobar los agentes terapéuticos candidatos y/o regímenes terapéuticos (por ejemplo, monoterapia, terapia combinada, pruebas de intervalo de dosis, etc.) para tratar eficazmente enfermedades, trastornos o afecciones que afectan a humanos. Diversas afecciones de enfermedad pueden establecerse en los animales no humanos como se describe en la presente descripción seguidas de la administración de una o más moléculas candidatas (por ejemplo, fármacos dirigidos a ANGPTL8) de manera que pueda determinarse la eficacia de una o más moléculas candidatas en una afección de enfermedad. Los roedores pueden colocarse en diferentes grupos de tratamiento de acuerdo con la dosis de manera que pueda determinarse una dosis o intervalo de dosis óptima que se correlacione con el tratamiento efectivo de una enfermedad establecida. En algunas modalidades, los modelos de enfermedad incluyen enfermedades, trastornos o afecciones cardiovasculares.

Las moléculas candidatas pueden administrarse a modelos de enfermedad en roedores mediante el uso de cualquier método de administración que incluye vías de administración parenterales y no parenterales. Las vías parenterales incluyen, por ejemplo, intravenosa, intraarterial, intraportal, intramuscular, subcutánea, intraperitoneal, intraespinal, intratecal, intracerebroventricular, intracraneal, intrapleural u otras vías de inyección. Las vías no parenterales incluyen, por ejemplo, oral, nasal, transdérmica, pulmonar, rectal, bucal, vaginal, ocular. La administración puede ser, además, por infusión continua, administración local, liberación sostenida a partir de implantes (geles, membranas o similares), y/o inyección intravenosa. Cuando se evalúa una terapia combinada en los roedores como se describe en la presente descripción, las moléculas candidatas pueden administrarse por medio de la misma vía de administración o por medio de vías de administración diferentes. Cuando se evalúa un régimen de dosificación en los roedores como se describe en la presente descripción, las moléculas candidatas pueden administrarse bimensualmente, mensualmente, trisemanalmente, bisemanalmente, semanalmente, diariamente, a intervalos variables y/o en concentraciones escalonadas para determinar un régimen de dosificación que demuestre un efecto terapéutico o profiláctico deseado en un roedor en el que se han establecido uno o más modelos de enfermedad.

Kits

También se describe un paquete o kit que comprende uno o más contenedores llenos con al menos un roedor, una célula de roedor, un fragmento (o construcción) de ADN y/o un vector de direccionamiento como se describe en la presente descripción. Los kits pueden usarse en cualquier método aplicable (por ejemplo, un método de investigación). Opcionalmente, asociarse con tal(es) contenedor(es) puede ser un aviso en la forma prescrita por una agencia gubernamental que regula la fabricación, uso o venta de productos farmacéuticos o biológicos, el aviso refleja (a) la aprobación por parte de la agencia de fabricación, uso o venta para administración humana, (b) instrucciones de uso, o ambos, o un contrato que rige la transferencia de materiales y/o productos biológicos (por ejemplo, un roedor o una célula de roedor como se describe en la presente descripción) entre dos o más entidades. Otras características de la invención se harán evidentes en el curso de las siguientes descripciones de las modalidades ilustrativas que se proporcionan para ilustración y no pretenden ser limitantes de esta.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos se proporcionan para describir a los expertos en la técnica cómo producir y usar los métodos y composiciones de la invención, y no pretenden limitar el alcance de lo que los inventores consideran como su invención. A menos que se indique de cualquier otra manera, la temperatura se indica en Celsius, y la presión es la atmosférica o cercana a ella.

Ejemplo 1. Modificación de un gen endógeno de la proteína similar a la angiopoyetina 8

Este ejemplo ilustra métodos ilustrativos para modificar un gen Angptl8 endógeno en un roedor (por ejemplo, un ratón) para que dicho gen Angptl8 endógeno codifique un polipéptido ANGPTL8 humano. Los métodos descritos en este ejemplo pueden emplearse para modificar un gen Angptl8 endógeno de un animal roedor mediante el uso de cualquier secuencia humana (por ejemplo, una variante), o combinación de secuencias humanas (o fragmentos de secuencias) según se desee. En este ejemplo, un fragmento de ADN sintético de 2,383 pb que contiene los exones 1-4 (que excluye el codón de inicio ^aT^g) de un gen ANGPTL8 humano que aparece en el acceso de GenBank NM_018687.6 (SEQ ID NO: 5) se emplea para modificar un gen Angptl8 endógeno de un ratón. Se representa en la Figura 2 la alineación del polipéptido ANGPTL8 humano ilustrativo, y de ratón y humano expresado por un roedor como se describe en la presente descripción, con el péptido señal indicado en recuadros para cada secuencia. La Figura 3 muestra un vector de direccionamiento para modificar un gen Angptl8 endógeno de un roedor para codificar un polipéptido ANGPTL8 humano que se construyó mediante el uso de la tecnología VELOCIGENE® (véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos núm. 6,586,251 y Valenzuela y otros, 2003, Nature Biotech. 21(6):652-659). Brevemente, el clon RP23-198h22 (Invitrogen) del cromosoma artificial bacteriano (BAC) de ratón se modificó para eliminar la secuencia que contenía inmediatamente secuencia abajo del codón de inicio ATG de Angptl8 endógeno hasta 9 pb más allá del codón de terminación (es decir, exón 1 excepto los 11 nucleótidos 5', exones 2-3 y la porción 5' del exón 4 a 9 pb más allá del codón de terminación) e insertar justo secuencia abajo del codón de inicio ATG de ANGPTL8 humano más allá de la UTR 3' de ANGPTL8 humano (es decir, la porción codificante del exón 1 que comienza justo secuencia abajo del codón de inicio ATG hasta el exón 4) mediante el uso de un fragmento de ADN sintético de 2,383 pb, que codifica un polipéptido ANGPTL8 humano. Se retuvo el ADN endógeno que contenía las regiones sin traducir 5' y 3' (UTR), así como también el codón de inicio ATG de Angptl8 endógeno. Por lo tanto, los exones 1-4 de un gen ANGPTL8 humano, sin el codón de inicio de ANGPTL8 humano, se fusionó en el marco con el codón de inicio ATG de Angptl8 endógeno. El análisis de la secuencia del fragmento de ADN sintético de 2,383 pb (es decir, correspondiente a los exones 1-4 de un gen ANGPTL8 humano) confirmó todos los exones de ANGPTL8 humano y las señales de corte y empalme. El análisis de secuencia reveló que la secuencia coincidía con el genoma de referencia y el transcrito NM_018687.6 de ANGPTL8.

El fragmento de ADN sintético de 2,383 pb se sintetizó por Genescript Inc. (Piscataway, NJ) y se clonó en un vector plásmido resistente a ampicilina. Se emplearon sitios únicos de reconocimiento de enzimas de restricción para ligar un casete de autoeliminación de neomicina de ~4,996 pb flanqueado por sitios de reconocimiento de recombinasa (loxP-hUb1-em7-Neo-pA-mPrm1-Crei-loxP; véanse las patentes de Estados Unidos núms. 8,697,851, 8,518,392 y 8,354,389). La selección posterior en células bacterianas se realizó mediante placas en medio de agar que contenía neomicina. El vector de direccionamiento se linealizó antes de la recombinación homóloga con el clon de BAC de ratón RP23-198H22. Por diseño, la unión entre el fragmento de ANGPTL8 humano de 2,383 pb y la secuencia abajo del ratón incluían una UTR 3' de ANGPTL8 humano seguida de una UTR 3' de Angptl8 de ratón (Figura 3). El vector de direccionamiento resultante contenía, de 5' a 3', un brazo de homología 5' que contenía ~79 kb de ADN genómico de ratón del clon de BAC RP23-198h22, un fragmento de ADN sintético de 2,383 pb (correspondiente a los exones 1-4 de un gen ANGPTL8 humano), un casete de autoeliminación de neomicina flanqueado por sitios loxP y ~148 kb de ADN genómico de ratón del clon de BAC RP23-198h22.

El clon de BAC bMQ-400017 modificado descrito anteriormente se usó para someter a electroporación las células madre embrionarias (ES) de ratón para generar células ES modificadas que comprendían un gen Angptl8 endógeno que se humaniza desde el exón 1 (menos el codón de inicio ATG) hasta el exón 4, que incluye una UTR 3' de ANGPTL8 humano (es decir, eliminación de 1,576 pb de un gen Angptl8 endógeno e inserción de 2,383 pb de secuencia codificante de ANGPTL8 humano). Las células ES dirigidas positivamente que contenían un gen Angptl8 modificado se identificaron mediante un ensayo (Valenzuela y otros, arriba) que detectó la presencia de las secuencias de ANGPTL8 humano (por ejemplo, exones 1-4) y confirmó la eliminación y/o la retención de las secuencias de Angptl8 de ratón (por ejemplo, exones 1-4 y/o uTr 5' y 3'). La Tabla 1 expone los cebadores y las sondas que se usaron para confirmar la modificación de un gen Angptl8 endógeno como se describió anteriormente (Figura 4).

La secuencia de nucleótidos a través del punto de inserción secuencia arriba incluyó lo siguiente, que indica la secuencia endógena de ratón (contenida entre paréntesis más abajo con el codón de inicio ATG en letra en negrita) contigua con la secuencia genómica de ANGPTL8 humano en el punto de inserción: (AAGGCAGCCG CAGCGGCCCG GGAACCACAC CCAC- GAAACT GTCAGCCATG) CCAGTGCCTG CTCTGTGCCT GCTCTGGGCC CTGGCAATGG TGACCCGGCC (SEQ ID NO: 15) (Figura 9A). Véase, también, la Figura 3.

La secuencia de nucleótidos a través del extremo 5' del casete de autoeliminación de neomicina incluyó lo siguiente, que indica la secuencia genómica de ANGPTL8 humano contigua a la secuencia del casete (contenida entre paréntesis más abajo con un sitio XhoI en cursiva y un sitio loxP en letra en negrita) secuencia abajo del punto de inserción: GGGAGACCCC ACCCAGCATG ATGTATGAAT ACCTCCCATT CAAGTGCCCA (CTCGAG ATAACTTCG TATAATGTAT GCTATAC- GAA GTTAT ATGCATGGCC TCCGCGCCGG GTTTTGGCGC CTCCCGCGGG CGCCCCCCTC CTCACGGCGA GCGCTGCCAC GTCAGACGAA GGGCGCAGCG AGCGTCCTGA) (SEQ ID NO: 16) (Figura 9B). Véase, también, la Figura 3.

La secuencia de nucleótidos a través del punto de inserción secuencia abajo en el extremo 3' del casete de autoeliminación de neomicina incluyó lo siguiente, que indica la secuencia del casete (contenida entre paréntesis más abajo con un sitio loxP en letra en negrita, un sitio de reconocimiento I-CeuI subrayado y un sitio de reconocimiento NheI en cursiva) contiguo con la secuencia genómica de Angptl8 de ratón: (TTTCACTGCAT TCTAGTTGTG GTTTGTCCAA ACTCATCAAT GTATCTTATC ATGTCT-GGA AT AACTTCGT AT AAT GTATGCTAT ACGAAGTT AT GCTAGTAACTATAACGGTCCTAAGGTAGCGA GCTAGC) GATGCCACCGA GGACCAGTTGT GCTGCAAGGAA CACTGAAGCG CTCCACC (SEQ ID NO: 17) (Figura 9C). Véase, también, la Figura 3.

La secuencia de nucleótidos a través del punto de inserción secuencia abajo después de la eliminación del casete de neomicina (77 pb restante entre una uTr 3' de ANGPTL8 humano y una UTR 3' de Angptl8 de ratón) incluyó lo siguiente, que indica la secuencia genómica de ratón y humana yuxtapuesta con la secuencia del casete restante (contenida entre paréntesis más abajo con sitios de reconocimiento XhoI and NheI en cursiva, un sitio loxP en letra en negrita y un sitio de restricción I-CeuI subrayado): GGGAGACCCC ACCCAGCATG ATGTATGAAT ACCTCCCATT CAAGTGCCCA (GTCGAG ATAACTTCGTATAAT- GTATGCTATACGAAGTTAT GCTAGTAACTATAACGGTCCTAAGGTAGCGA GCTAGC) GATGCCACCG AGGAC- CAGTT GTGCTGCAAG GAACACTGAA GCGCTCCACC (SEQ ID NO: 18) (Figura 9D). Véase, también, la Figura 3.

Después, los clones de células ES positivas se usaron para su implantación en ratones hembras mediante el uso del método VELOCIMOUSE® (véanse, por ejemplo, la patente de Estados Unidos núm. 7,294,754 y Poueymirou y otros, 2007, Nature Biotech. 25(1):91-99) para generar una camada de crías que contienen una inserción de los exones 1 4 de ANGPTL8 (que incluyen UTR 3' de ANGPTL8 humano) en un locus de Angptl8 endógeno de un ratón. Los ratones que portan los exones 1-4 de ANGPTL8 humano (es decir, el fragmento de ADN sintético de 2,383 pb) en lugar de los exones 1-4 de gen Angptl8 endógeno se confirmaron e identificaron nuevamente mediante el genotipado del ADN aislado de cortes de cola mediante el uso de un ensayo como se describió anteriormente (Valenzuela y otros, arriba) que detectó la presencia de las secuencias de ANGPTL8 humano (Figura 4). Las crías se genotipifican y se seleccionan las cohortes de animales heterocigotos para las secuencias de ANGPTL8 humano para su caracterización.

TABLA 1

Nombre Cebador Secuencia (5'-3')

Directo GGTGTTGGTGGCAGGTAAGAGT (SEQID NO: 19) 7182mU Sonda TGAGGAAATGGTAAACCCAGAACAGA (SEQID NO: 20)

Inverso TGGTGTGTCATCAGGGTATGTTTC (SEQID NO: 21) Directo TGAGCCTGGTGGGATTACTCT (SEQID NO: 22) 7182mD Sonda TAGCAGTGGAAGTTGCCTAGGTCC (SEQID NO: 23)

Inverso CCGTCAAGGCCAGTGCTT GCAAGCCTGTTGGAGACTCAG (SEQ ID NO: 24) (SEQ Directo ID NO: 25) 7182hU Sonda CACCGTAGCTGCGACACTGTGG (SEQID NO: 26)

Inverso AGACACGAACTCCTCTTTGGA TGGGCTGAGCCACATCTC (SEQ ID NO: 27) (SEQ Directo ID NO: 28) 7182hD Sonda CAGACTCCACACAGCGGCGCT (SEQID NO: 29)

Inverso TCAGTTCCATCCAGGCAGATTC (SEQID NO: 30) Ejemplo 2. Expresión de ANGPTL8 humano en roedores

Este ejemplo demuestra que los roedores que contienen un gen Angptl8 modificado genéticamente de acuerdo con el Ejemplo 1 expresa (o secreta) el polipéptido ANGPTL8 humano (o humanizado) que es detectable en el plasma de roedor. En particular, como se describe más abajo, los roedores que tienen un gen Angptl8 modificado genéticamente demuestra niveles aumentados de triglicéridos en comparación con los roedores de tipo salvaje (por ejemplo, roedores de tipo salvaje) que contienen un gen Angptl8 de tipo salvaje.

Brevemente, se recolectó sangre venosa en condiciones sin ayuno de ratones de tipo salvaje (n=9) y homocigotos para un gen Angptl8 modificado genéticamente (n=8) en tubos EDTA del plexo retroorbitario. El plasma se aisló por centrifugación de la sangre recolectada a 4,000 rpm durante 10 minutos. Se analizó el plasma para determinar la expresión de ANGPTL8 humano por un ensayo ELISA mediante el uso de un anticuerpo anti-ANGPLT8.

Los datos demostraron que ANGPTL8 humano se secretó en el plasma de ratones homocigotos para un gen Angptl8 humanizado. En particular, la expresión de proteína de ANGPTL8 humano promedió aproximadamente 400 ng/ml para todos los ratones humanizados de los que se extrajo sangre. Por lo tanto, los roedores que contienen un gen Angptl8 modificado genéticamente de acuerdo con el Ejemplo 1 expresa de manera detectable (y secreta) ANGPTL8 humano en el plasma. En particular, dicha expresión (o secreción) de ANGPTL8 humano está bajo el control de elementos reguladores de Angptl8 de roedor (por ejemplo, un promotor de Angptl8 de roedor) en estos animales.

En otro experimento, el plasma de ratones de tipo salvaje y homocigotos para un gen Angptl8 modificado genéticamente (como se describió anteriormente) recogido en condiciones sin ayuno también se usó para determinar los niveles de lípidos en plasma.

Brevemente, los lípidos en plasma (triglicéridos, colesterol total, colesterol de lipoproteínas de baja densidad [LDL-C], colesterol de lipoproteínas de alta densidad [HDL-C]) se midieron mediante el uso del analizador de química sérica ADVIA® 1800 (Siemens) de acuerdo con las especificaciones del fabricante. Los resultados representativos se muestran en la Figura 5.

Como se muestra en la Figura 5, los roedores que tienen un gen Angptl8 modificado genéticamente como se describe en la presente descripción demuestran niveles aumentados de triglicéridos en comparación con los roedores de tipo salvaje.

Ejemplo 3. Expresión en el tejido de ANGPTL8 humano en roedores

Este ejemplo demuestra que los roedores que contienen un gen Angptl8 modificado genéticamente de acuerdo con el Ejemplo 1 expresa (o secreta) el polipéptido ANGPTL8 humano (o humanizado) que es detectable en varios tejidos de roedor. En particular, como se describe más abajo, los roedores que tienen un gen Angptl8 modificado genéticamente demuestran la expresión de ANGPTL8 humano en el hígado y los tejidos adiposos.

Brevemente, la preparación de ARN y el mapeo de lectura de ARNsec se realizaron como se describió anteriormente (Mastaitis, J. y otros, 2015, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 112 (6):1845-9) mediante el uso de tejidos de ratones homocigotos para un gen Angptl8 modificado genéticamente, como se describe en el Ejemplo 1, recogido en condiciones de realimentación. Los resultados representativos se muestran en la Figura 6.

Como se muestra en la Figura 6, la expresión de ANGPTL8 humano se identificó en el hígado y los tejidos adiposos (por ejemplo, tejido adiposo blanco, subcutáneo y grasa parda) de ratones Anptl8 humanizados. Este ejemplo demuestra que la ingeniería de un gen Angptl8 murino como se describe en la presente descripción da como resultado la expresión de un polipéptido ANGPTL8 humano de una manera específica de tejido y, por lo tanto, proporciona un modelo animal in vivo para determinar la eficacia de los agentes terapéuticos anti-ANGPTL8 para reducir los niveles de triglicéridos in vivo.

Ejemplo 4. Eficacia in vivo de moduladores de ANGPTL8

Este ejemplo demuestra que los roedores modificados para contener un gen Angptl8 humanizado de acuerdo con el Ejemplo 1 puede usarse en un ensayo in vivo para detectar moduladores de Angptl8 (por ejemplo, anticuerpos anti-ANGPTL8) para su eficacia de reducción de triglicéridos. En este ejemplo, se examinan anticuerpos anti-ANGPTL8 representativos en ratones homocigotos para un gen Angptl8 humanizado para determinar la eficacia de la terapia con anticuerpos monoclonales para reducir los niveles elevados de triglicéridos.

Brevemente, los ratones homocigóticos para un gen Angptl8 modificado genéticamente (como se describió anteriormente) se desangran previamente 5 días antes del experimento y se clasificaron en grupos de tratamiento (n=5 por grupo de tratamiento) en función de sus niveles de triglicéridos para que el nivel medio de triglicéridos en cada grupo fuera igual. Se administraron anticuerpos anti-ANGPTL8 o control (control de IgG4 humana de isotipo coincidente con especificidad irrelevante) a una dosis de 10 mg/kg mediante inyección subcutánea el día 0 del estudio. Los ratones se desangran 4 días después de la inyección y se determinaron los niveles de triglicéridos en suero mediante el analizador químico de suero ADVIA® 1800 (Siemens). Los resultados se expresaron como Media ± SEM para cada grupo para todos los anticuerpos analizados. Los resultados representativos se muestran en la Figura 7.

Como se muestra en la Figura 7, la terapia con anticuerpos anti-ANGPTL8 redujo significativamente los niveles de triglicéridos circulantes en comparación con el anticuerpo de control. Además, estos datos sugieren que los ratones que contienen un gen Angptl8 modificado genéticamente como se describe en el Ejemplo 1 expresa ANGPTL8 humano y puede usarse en la detección de agentes terapéuticos para el tratamiento de niveles elevados de triglicéridos. En conjunto, la presente descripción demuestra que los roedores proporcionados en la presente descripción ofrecen una sistema in vivo para evaluar la eficacia de reducción de triglicéridos de los anticuerpos anti-ANGPTL8 y, en algunas modalidades, proporcionar un modelo animal in vivo de hipertrigliceridemia.

Equivalentes

Habiendo descrito así varios aspectos de al menos una modalidad de esta invención, se debe apreciar que varias alteraciones, modificaciones y mejoras se producirán fácilmente para los expertos en la técnica. En consecuencia, la descripción y los dibujos anteriores son solo a manera de ejemplo y la invención se describe en detalle en las reivindicaciones que siguen.

El uso de términos ordinales tales como “primero”, “segundo”, “tercero”, etcétera, en las reivindicaciones para modificar un elemento de reivindicación no connota por sí mismo ninguna prioridad, precedencia u orden de un elemento de reivindicación sobre otro o el orden temporal en el que se realizan los actos de un método, sino que se usan simplemente como etiquetas para distinguir un elemento de reivindicación que tiene un nombre determinado de otro elemento que tiene el mismo nombre (excepto por el uso del término ordinal) para distinguir los elementos de reivindicación.

Debe entenderse que los artículos “un” y “una” como se usan en la presente descripción y en las reivindicaciones, a menos que se indique claramente lo contrario, incluyen los referentes plurales. Las reivindicaciones o descripciones que incluyen “o” entre uno o más miembros de un grupo se consideran satisfechas si uno, más de uno o todos los miembros del grupo están presentes en, se emplean en o son relevantes de cualquier otra manera para un producto o proceso dado, a menos que se indique lo contrario o sea evidente de cualquier otra manera por el contexto. La invención incluye modalidades en las que exactamente un miembro del grupo está presente en, se emplea en o es relevante de cualquier otra manera para un producto o proceso dado. La invención también incluye modalidades en las que más de uno, o todos los miembros del grupo están presentes, se emplean en o son relevantes de cualquier otra manera para un producto o proceso dado. Además, debe entenderse que la invención abarca todas las variaciones, combinaciones y permutaciones en las que una o más limitaciones, elementos, cláusulas, términos descriptivos, etc., de una o más de las reivindicaciones enumeradas se introducen en otra reivindicación dependiente de la misma reivindicación base (o, según corresponda, cualquier otra reivindicación) a menos que se

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un roedor cuyo genoma comprende un gen Angptl8 modificado genéticamente en un locus de Angptl8 endógeno, en donde el gen Angptl8 modificado genéticamente:

- comprende la región sin traducir 5' del gen Angptl8 endógeno de roedor, la porción codificante del exón 1 de un gen ANGPTL8 humano, y los exones 2-4 del gen ANGPTL8 humano; y

- está unido operativamente a un promotor de Angptl8 endógeno de roedor en el locus de Angptl8 endógeno,

en donde el roedor muestra niveles aumentados de triglicéridos en comparación con un roedor de tipo salvaje.

2. El roedor de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el gen Angptl8 modificado genéticamente incluye la región sin traducir 3' (UTR) del gen Angptl8 endógeno de roedor.

3. El roedor de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde el gen Angptl8 modificado genéticamente codifica un polipéptido que tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 6 o un polipéptido que comprende los residuos de aminoácidos 22-198 de la SEQ ID NO: 6.

4. El roedor de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde el roedor es una rata o un ratón.

5. Una célula o tejido aislado de roedor cuyo genoma comprende un gen Angptl8 modificado genéticamente en un locus de Angptl8 endógeno, en donde el gen Angptl8 modificado genéticamente:

en donde la célula o tejido de roedor procede de un roedor que muestra niveles aumentados de triglicéridos en comparación con un roedor de tipo salvaje.

6. Una célula madre embrionaria de roedor cuyo genoma comprende un gen Angptl8 modificado genéticamente en un locus de Angptl8 endógeno, en donde el gen Angptl8 modificado genéticamente:

- comprende la región sin traducir 5' de gen Angptl8 endógeno de roedor, la porción codificante del exón 1 de un gen ANGPTL8 humano, y los exones 2-4 del gen ANGPTL8 humano; y

- está unido operativamente a un promotor de Angptl8 endógeno de roedor en el locus de Angptl8 endógeno.

7. La célula madre embrionaria de roedor de acuerdo con la reivindicación 6, en donde la célula madre embrionaria es una célula madre embrionaria de rata o de ratón.

8. Un embrión de roedor generado a partir de la célula madre embrionaria de acuerdo con la reivindicación 6 o 7.

9. Un método para producir un roedor cuyo genoma comprende un gen Angptl8 modificado genéticamente que codifica un polipéptido ANGPTL8 humano, el método comprende modificar un genoma de roedor para que el genoma modificado comprenda un gen Angptl8 modificado genéticamente en un locus de Angptl8 endógeno, en donde el gen Angptl8 modificado genéticamente:

10. El método de la reivindicación 9, en donde dicha modificación del genoma de un roedor comprende

(a) colocar un fragmento genómico en un gen Angptl8 endógeno en una célula madre embrionaria de roedor, dicho fragmento genómico comprende una secuencia de nucleótidos que codifica dicho polipéptido ANGPTL8 humano en su totalidad o en parte;

(b) obtener la célula madre embrionaria de ratón generada en (a); y,

(c) generar un roedor mediante el uso de la célula madre embrionaria de roedor de (b).

11. El método de la reivindicación 9 o 10, en donde el polipéptido ANGPTL8 humano comprende los residuos de aminoácidos 22-198 de la SEQ ID NO: 6.

12. El método de cualquiera de las reivindicaciones 9-11, en donde el roedor es un ratón o rata.

13. Un método para evaluar la eficacia de reducción de triglicéridos o las propiedades farmacocinéticas de un fármaco dirigido a ANGPTL8 humano, el método comprende las etapas de

administrar el fármaco a un roedor de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4; y

realizar un ensayo para determinar, respectivamente, una o más propiedades de reducción de triglicéridos, o una o más propiedades farmacocinéticas, del fármaco dirigido a ANGPTL8 humano; en donde opcionalmente el fármaco dirigido a ANGPTL8 humano es un anticuerpo anti-ANGPTL8.