CN116200426A - Ditra疾病的非人动物模型及其用途 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及经遗传修饰的啮齿动物和人类疾病的啮齿动物模型。更具体地，本公开涉及基因组包含人源化Il1rl2基因(编码IL‑36R蛋白的IL1rl2亚基)和人IL‑36，以及配体基因的经遗传修饰的啮齿动物。本文所公开的经遗传修饰的啮齿动物分别在牛皮癣和IBD的临床前模型中显示出增强的皮肤和肠道炎症，并且可以充当人DITRA疾病的啮齿动物模型。

Description

DITRA疾病的非人动物模型及其用途
本申请是申请号为201980040953.1的中国专利申请的分案申请。
相关联申请的交叉引用
本专利申请要求2018年7月16日提交的美国临时申请No.62/698,459和2019年6月27日提交的美国临时申请No.62/867,477的优先权权益，这两个临时申请的全部内容以引用的方式并入本文。
技术领域
本公开涉及经遗传修饰的啮齿动物和人类疾病的啮齿动物模型。更具体地，本公开涉及基因组包含人源化Il1rl2基因(编码IL-36R的IL1rl2亚基)和人IL-36α、β和γ配体基因的经遗传修饰的啮齿动物。本文公开的经遗传修饰的啮齿动物分别在牛皮癣和炎性肠病(IBD)的临床前模型中显示出增强的皮肤和肠道炎症，并且可以充当人类白介素-36R拮抗剂缺乏(DITRA)疾病的啮齿动物模型。
序列表以引用的方式并入
序列表为2019年7月9日产生的名称为35950_10404US01_SequenceListing.txt、大小为65KB的ASCII文本文件，其经由EFS-Web提交给美国专利及商标局，并且以全文引用的方式并入本文。
背景技术
白介素(IL)-36亚家族由三种激动剂(IL-36α、β和γ，先前分别命名为IL1F6、IL1F8和IL1F9)和一种拮抗剂(IL36Ra)组成，所述三种激动剂和一种拮抗剂通过异二聚体受体(IL-36R)发出信号，导致核因子B(NFκB)和丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)的激活。与经典的IL-1家族成员相似，IL-36细胞因子参与免疫应答的启动和调节。IL-36家族的成员首先被证明主要在鳞状上皮组织中表达，并且尤其是在牛皮癣皮肤病变中表达。IL-36R与上皮介导的疾病之间的关联已在人类中基于IL-36Ra中导致全身性脓疱型牛皮癣(缩写为“GPP”)的诊断的功能性突变的丧失而得到证实，全身性脓疱型牛皮癣目前被理解为GPP的一种，称为白介素-36R拮抗剂缺乏(缩写为“DITRA”)。在GPP、掌跖脓疱型牛皮癣(PPPP)、炎性肠病(IBD)、类风湿和银屑病关节炎、哮喘、慢性阻塞性肺病、慢性肾病和鱼鳞病中报道了升高的IL-36表达。
发明内容
本文公开了被遗传修饰以包含编码具有与人IL1RL2胞外结构域基本上相同的胞外结构域的Il1rl2蛋白的人源化Il1rl2基因、以及分别编码人IL1F6、IL1F8和IL1F9的人Il1f6、Il1f8和Il1f9基因的啮齿动物的一些实施方案。Il1rl2是异二聚体IL-36R蛋白的一个亚基，其结合三种激动剂：IL1F6、IL1F8和IL1F9(也分别称为IL-36α、β和γ)。本文公开的啮齿动物，尽管包含人源化Il1rl2基因并表达三个人激动剂配体基因，但保持内源性IL-36Ra拮抗剂，其中所述内源性IL-36Ra在抑制人IL-36R信号传导方面的效力低了约20倍。本文已经示出了此类四重人源化啮齿动物(例如，人源化Il1rl2和人IL1F6、IL1F8和IL1F9)显示出其中IL-36Ra中的突变导致增强的IL-36R信号传导的DITRA患者的症状。因此，本文提供了经遗传修饰的啮齿动物、制备此类啮齿动物的组合物和方法、以及使用此类啮齿动物作为筛选和开发治疗剂的模型的方法。
在一些实施方案的一个方面，本文公开了经遗传修饰的啮齿动物，其基因组包含(1)在内源性啮齿动物Il1rl2基因座处的人源化Il1rl2基因，其中所述人源化Il1rl2基因编码包含与人IL1RL2蛋白的胞外结构域基本上相同的胞外结构域的人源化Il1rl2蛋白；(2)在内源性啮齿动物Il1f6基因座处的人IL1F6基因；(3)在内源性啮齿动物Il1f8基因座处的人IL1F8基因；和(4)在内源性啮齿动物Il1f9基因座处的人IL1F9基因。
在一些实施方案中，啮齿动物中的人源化Il1rl2基因编码包含与内源性啮齿动物Il1rl2蛋白的跨膜细胞质序列基本上相同的跨膜细胞质序列的人源化Il1rl2蛋白。在一些实施方案中，啮齿动物中的人源化Il1rl2基因编码包含与内源性啮齿动物Il1rl2蛋白的信号肽基本上相同的信号肽的人源化Il1rl2蛋白。
在一些实施方案中，啮齿动物中的人源化Il1rl2基因编码包含与人IL1RL2蛋白的胞外结构域基本上相同的胞外结构域的人源化Il1rl2蛋白，其中所述人IL1RL2蛋白包含如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，啮齿动物中的人源化Il1rl2基因编码包含胞外结构域的人源化Il1rl2蛋白，其中所述胞外结构域包含SEQ ID NO:7的氨基酸22-337。
在一些实施方案中，啮齿动物中的人源化Il1rl2基因编码包含如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列的人源化Il1rl2蛋白。
在一些实施方案中，啮齿动物中的人源化Il1rl2基因有效地连接至在内源性啮齿动物Il1rl2基因座处的内源性啮齿动物Il1rl2启动子。
在一些实施方案中，啮齿动物中的人源化Il1rl2基因是通过用人IL1RL2基因的核苷酸序列替换在内源性啮齿动物Il1rl2基因座处的内源性啮齿动物Il1rl2基因的基因组片段而产生的。
在一些实施方案中，人IL1RL2基因的核苷酸序列是人IL1RL2基因的基因组片段，其基本上编码人IL1RL2蛋白的胞外结构域。在一些实施方案中，人IL1RL2基因的基因组片段包含人IL1RL2基因的外显子3-8。
在一些实施方案中，在人源化替换后剩余的内源性啮齿动物Il1rl2基因的基因组序列包含内源性啮齿动物Il1rl2基因的外显子8下游的外显子。在一些实施方案中，在人源化替换后剩余的内源性啮齿动物Il1rl2基因的基因组序列包含内源性啮齿动物Il1rl2基因的外显子1-2。
在具体实施方案中，本文公开的啮齿动物中的人源化Il1rl2基因包含内源性啮齿动物Il1rl2基因的外显子1-2、人IL1RL2基因的外显子3-8、和内源性啮齿动物Il1rl2基因的外显子8下游的其余外显子。
在一些实施方案中，本文公开的啮齿动物中的人IL1F6基因替换在内源性啮齿动物Il1f6基因座处的内源性啮齿动物Il1f6基因。
在一些实施方案中，本文公开的啮齿动物中的人IL1F8基因替换在内源性啮齿动物Il1f8基因座处的内源性啮齿动物Il1f8基因。
在一些实施方案中，本文公开的啮齿动物中的人IL1F9基因替换在内源性啮齿动物Il1f9基因座处的内源性啮齿动物Il1f9基因。
在一些实施方案中，本文公开的啮齿动物对于四个人源化和/或人基因中的一个或多个是纯合的。在一些实施方案中，本文公开的啮齿动物对于四个人源化和/或人基因的每一个是纯合的。
在一些实施方案中，与野生型啮齿动物相比，本文公开的啮齿动物显示出缩短的结肠。在一些实施方案中，与野生型啮齿动物相比，本文公开的啮齿动物在实验诱导的炎症模型中显示出增强的炎症。在一些实施方案中，实验诱导的炎症模型是由咪喹莫特(IMQ)诱导的皮肤炎症模型。在一些实施方案中，实验诱导的炎症模型是由葡聚糖硫酸钠(DSS)或噁唑酮诱导的肠道炎症模型。
在一些实施方案中，本文公开的啮齿动物是小鼠或大鼠。
本文进一步公开了来自本文所述啮齿动物的分离的细胞或组织。
在一些实施方案的另外方面，本文公开了一种制备经遗传修饰的啮齿动物的方法，所述方法包括修饰啮齿动物基因组以包含(1)在内源性啮齿动物Il1rl2基因座处的人源化Il1rl2基因，其中所述人源化Il1rl2基因编码包含与人IL1RL2蛋白的胞外结构域基本上相同的胞外结构域的人源化Il1rl2蛋白；(2)在内源性啮齿动物Il1f6基因座处的人IL1F6基因；(3)在内源性啮齿动物Il1f8基因座处的人IL1F8基因；和(4)在内源性啮齿动物Il1f9基因座处的人IL1F9基因；和制备包含经修饰的基因组的啮齿动物。
在一些实施方案中，通过以下过程修饰啮齿动物基因组，所述过程包括：(i)制备包含在内源性啮齿动物Il1rl2基因座处的人源化Il1rl2基因的第一啮齿动物；(ii)制备包含在内源性啮齿动物Il1f6基因座处的人IL1F6基因、在内源性啮齿动物Il1f8基因座处的人IL1F8基因、在内源性啮齿动物Il1f9基因座处的人IL1F9基因的第二啮齿动物；和(iii)将所述第一啮齿动物与所述第二啮齿动物杂交以获得经修饰的啮齿动物基因组。
在一些实施方案中，通过以下方式来制备在内源性啮齿动物Il1rl2基因座处包含人源化Il1rl2基因的啮齿动物：提供啮齿动物胚胎干(ES)细胞、将人IL1RL2基因的核苷酸序列插入啮齿动物ES细胞的啮齿动物Il1rl2基因座中以在啮齿动物Il1rl2基因座处形成人源化Il1rl2基因，从而获得包含人源化Il1rl2基因的啮齿动物ES细胞，以及使用包含人源化Il1rl2基因的啮齿动物ES细胞制备啮齿动物。
在一些实施方案中，被插入的人IL1RL2基因的核苷酸序列替换在啮齿动物Il1rl2基因座处的啮齿动物Il1rl2基因的基因组片段。在一些实施方案中，人IL1RL2基因的核苷酸序列是人IL1RL2基因的基因组片段，其基本上编码人IL1RL2蛋白的胞外结构域。在一些实施方案中，人IL1RL2基因的基因组片段包含人IL1RL2基因的外显子3-8。在一些实施方案中，在替换后剩余的内源性啮齿动物Il1rl2基因的基因组序列包含内源性啮齿动物Il1rl2基因的外显子8下游的外显子。在一些实施方案中，在人源化替换后剩余的内源性啮齿动物Il1rl2基因的基因组序列包含内源性啮齿动物Il1rl2基因的外显子1-2。在一些实施方案中，由于人源化替换的结果的人源化Il1rl2基因包含内源性啮齿动物Il1rl2基因的外显子1-2、人IL1RL2基因的外显子3-8、和内源性啮齿动物Il1rl2基因的外显子8下游的其余外显子。
在一些实施方案中，通过以下方式制备包含人IL1F6基因、人IL1F8基因和人IL1F9基因的啮齿动物：提供啮齿动物胚胎干(ES)细胞；将人IL1F6基因插入啮齿动物ES细胞的啮齿动物Il1f6基因座中，将人IL1F8基因插入啮齿动物ES细胞的啮齿动物Il1f8基因座中，并将人IL1F9基因插入啮齿动物ES细胞的啮齿动物Il1f9基因座中，从而获得包含人IL1F6基因、人IL1F8基因和人IL1F9基因的啮齿动物ES细胞；并且使用包含人IL1F6基因、人IL1F8基因和人IL1F9基因的啮齿动物ES细胞制备啮齿动物。
在一些实施方案中，在连续的核酸分子中提供了人IL1F6基因、人IL1F8基因和人IL1F9基因。
在所述方法的一些实施方案中，人IL1F6基因替换在内源性啮齿动物Il1f6基因座处的内源性啮齿动物Il1f6基因。
在所述方法的一些实施方案中，人IL1F8基因替换在内源性啮齿动物Il1f8基因座处的内源性啮齿动物Il1f8基因。
在所述方法的一些实施方案中，人IL1F9基因替换在内源性啮齿动物Il1f9基因座处的内源性啮齿动物Il1f9基因。
在一些实施方案的另一个方面，本文公开了一种啮齿动物胚胎干(ES)细胞，其包含(1)在内源性啮齿动物Il1rl2基因座处的人源化Il1rl2基因，其中所述人源化Il1rl2基因编码包含与人IL1RL2蛋白的胞外结构域基本上相同的胞外结构域的人源化Il1rl2蛋白；(2)在内源性啮齿动物Il1f6基因座处的人IL1F6基因；(3)在内源性啮齿动物Il1f8基因座处的人IL1F8基因；和(4)在内源性啮齿动物Il1f9基因座处的人IL1F9基因。在一些实施方案中，可以通过本文公开的方法制备这种ES细胞。在一些实施方案中，还公开了使用这种ES细胞来制备啮齿动物。
在一些实施方案的又另一个方面，本文公开了靶向核酸构建体，其可用于修饰(例如在啮齿动物ES细胞中的)啮齿动物基因组以制备经修饰的啮齿动物。
在一些实施方案中，本文公开了一种靶向核酸构建体，其包含侧翼为5'和3'啮齿动物核苷酸序列的人IL1RL2基因的核苷酸序列，所述5'和3'啮齿动物核苷酸序列能够介导在啮齿动物Il1rl2基因座中人IL1RL2基因的核苷酸序列的同源重组和整合以形成人源化Il1rl2基因，其中所述人源化Il1rl2基因编码包含与人IL1RL2蛋白的胞外结构域基本上相同的胞外结构域的人源化Il1rl2蛋白。
在一些实施方案中，本文公开了包含连续核酸序列的靶向核酸构建体，所述连续核酸序列包含：人IL1F6基因、人IL1F8基因和人IL1F9基因，其中所述连续核酸序列侧翼为5'和3'啮齿动物核苷酸序列，所述5'和3'啮齿动物核苷酸序列能够介导在包含啮齿动物Il1f6基因、啮齿动物Il1f8基因和啮齿动物Il1f9基因的啮齿动物基因座中连续核酸序列的同源重组和整合。
在一些实施方案的另外方面，本文公开了本文所公开啮齿动物作为与失调的IL-36信号传导相关的人类疾病的啮齿动物模型的用途。作为本文所公开实施方案的非限制性实例，可以将所述啮齿动物用于研究与失调的IL-36信号传导相关的人类疾病(诸如但不限于DITRA)的病理学和分子基础，或者用于筛选、测试和开发可用于治疗此类疾病的治疗性化合物。
在一些实施方案的又另外方面，本文公开了评估候选化合物用于治疗与失调的IL-36信号传导相关的疾病的治疗功效的方法，所述方法包括向本文所公开的啮齿动物施用药剂以诱导炎症，向所述啮齿动物施用候选化合物，并确定所述候选化合物是否抑制和/或减少诱导的炎症。
在一些实施方案中，被施用以诱导炎症的药剂是DSS或噁唑酮，其在啮齿动物中诱导肠道炎症。在一些实施方案中，被施用以诱导炎症的药剂是IMQ，其在啮齿动物中诱导皮肤炎症。
在一些实施方案中，在施用诱导炎症的药剂之前、期间或之后，向啮齿动物施用候选化合物。在一些实施方案中，候选化合物可以是小分子化合物、核酸抑制剂或抗原结合蛋白诸如抗体。在一些实施方案中，候选化合物是特异性地结合人IL-36R的抗体。
附图说明
本专利文件含有至少一个用彩色表现的附图。本专利带有彩色附图的副本将会根据要求且在支付必要的费用后由专利及商标局提供。
图1A-1D示出了用于使小鼠Il1rl2人源化的示例性策略的实施方案。图1A未按比例示出了小鼠Il1rl2和人IL1RL2基因的基因组组织的图。跨越基因组序列放置的细条代表外显子。标明了待缺失的约25,324个碱基对(bp)的小鼠基因组片段和待插入的约32,389bp的人基因组片段。标明了实施例1所述的测定中所用的探针的位置。图1B未按比例展示了用于使内源性小鼠Il1rl2基因以及底部的连接序列(SEQ ID NO:26-28)人源化以实现(i)小鼠Il1rl2外显子3-8和中间内含子、以及3’155bp小鼠内含子2和5’642bp小鼠内含子8经人IL1RL2外显子3-8和中间内含子以及3’346bp人内含子2和5’1101bp人内含子8的替换、以及(ii)在内含子8中的人基因组片段的插入下游的loxP-hUb1-em7-Neo-pA-mPrm1-Crei-loxP盒(4996bp)的插入的示例性经修饰的BAC载体。图1C未按比例展示了已缺失新霉素盒后的人源化Il1rl2等位基因，以及底部的连接序列(SEQ ID NO:26和29)。图1D列出了小鼠Il1rl2蛋白(SEQ ID NO:4)、人IL1RL2蛋白(SEQ ID NO:2)和人源化Il1rl2蛋白(SEQ IDNO:7)的序列比对。
图2A-2D示出了用人IL1F8、IL1F9、和IL1F6替换小鼠Il1f8、Il1f9、和Il1f6的示例性策略的实施方案。图2A未按比例示出了小鼠Il1f8、Il1f9和Il1f6基因以及人IL1F8、IL1F9和IL1F6基因的基因组组织的图。跨越基因组序列放置的细条代表外显子。标明了待缺失的约76,548bp的小鼠基因组片段和待插入的约88,868bp的人基因组片段。标明了实施例1所述的测定中所用的探针的位置。图2B未按比例展示了用于替换内源性小鼠Il1f8、Il1f9和Il1f6基因以及底部的连接序列(SEQ ID NO:30-32)以实现(i)编码序列和非翻译区(UTR)以及小鼠Il1f8、Il1f9和Il1f6的基因间序列经对应的人序列IL1F8、IL1F9和IL1F6的替换；以及(ii)在人基因组片段的插入下游的loxP-hUb1-em7-Hygro-pA-mPrm1-Crei-loxP盒(5,218bp)的插入的示例性经修饰的BAC载体。图2C未按比例展示了在已缺失潮霉素盒后的人源化基因座、以及底部的连接序列(SEQ ID NO:30和33)。图2D列出了小鼠Il1f6(SEQ ID NO:11)和人IL1F6(SEQ ID NO:9)蛋白；小鼠Il1f8(SEQ ID NO:17)和人IL1F8(SEQID NO:15)蛋白；小鼠Il1f9(SEQ ID NO:23)和人IL1F9(SEQ ID NO:21)蛋白的序列比对。
图3A-3E示出了本发明的实施方案，显示了在人源化DITRA样小鼠中增强的IMQ诱导的皮肤炎症。通过局部应用IMQ连续4天来治疗DITRA样(在本文图中也缩写为“DITRA”)和野生型(WT)小鼠。在第5天，收集背部皮肤样品用于随后的组织病理学评价和qRT-PCR。(3A)在第5天，连续4天用凡士林(“Vas”，对照)或含IMQ的乳膏(Aldara)局部治疗的DITRA样和WT小鼠的代表性皮肤外观。(3B)来自DITRA样和WT小鼠的经凡士林和IMQ治疗的皮肤的代表性苏木精和曙红(“H&E”)染色。(3C)每天用凡士林或含IMQ的乳膏治疗的DITRA和WT小鼠的皮肤中促炎分子的mRNA表达(每组n＝10)。在连续4天局部应用IMQ后，在第5天，从Il1rl2单人源化小鼠(“1H”)、DITRA样小鼠和野生型小鼠中收集背部皮肤样品，用于随后的组织病理学评价和qRT-PCR。在每组条形中，从左到右是：WT Vas、DITRA Vas、WT IMQ和DITRA IMQ。(3D)在第5天用凡士林(对照)或含IMQ的乳膏(Aldara)局部治疗连续4天的1H、DITRA样和WT小鼠的代表性皮肤外观。(3E)每天用凡士林或含IMQ的乳膏治疗的1H、DITRA和WT小鼠的皮肤中促炎分子的mRNA表达(每组n＝10)。在每组条形中，从左到右是：WT Vas、1H Vas、DITRA样Vas、WT IMQ、1H IMQ和DITRA样IMQ。
图4A-4B.在一些实施方案中，DITRA样小鼠在稳态下显示出缩短的结肠。(4A)在3个月和10个月时，从DITRA样小鼠及其共同饲养的IL-36R KO和WT同窝幼仔中分离出的结肠的代表性图片。(4B)3个月和10个月大的DITRA样小鼠与其共同饲养的IL-36R KO和WT同窝幼仔相比的定量的结肠长度(每组n＝6)。误差棒代表平均值SD。
图5A-5E.在一些实施方案中，DITRA样小鼠在DSS诱导的慢性结肠炎中的粘膜愈合中表现出缺陷。DITRA样小鼠(n＝16)及其共同饲养的WT同窝幼仔对照(n＝14)通过施用2.5％DSS 7天、随后施用水11天和1.5％DSS 4天、随后施用水5天、总共27天来进行慢性DSS诱导的结肠炎。对照小鼠(n＝5)接受常规水。(5A)DITRA样小鼠及其WT共同饲养的同窝幼仔对照的体重减轻计算为在任何特定日期在原始体重与实际体重之间的百分比差异。(5B)在水和DSS治疗的DITRA样和WT小鼠中的结肠长度。(5C)水和DSS治疗的DITRA样和WT小鼠的结肠的苏木精和曙红(H&E)染色和病理学评分。(5D)在水和DSS治疗的DITRA样和WT小鼠中的结肠匀浆中的髓过氧化物酶(MPO)活性。(5E)在水和DSS治疗的DITRA样和WT小鼠中的结肠匀浆中促炎性细胞因子的水平。数据代表至少三个独立实验。误差棒代表平均值SD。在每组条形中，从左到右是：WT/水、DITRA/水、WT/DSS和DITRA/DSS。
图6A-6B.在一些实施方案中，在预防性给药时，与REGN抗人IL-36R抗体的人IL-36R拮抗作用改善了DITRA样小鼠中的IMQ诱导的皮肤炎症。在开始IMQ应用之前3天将DITRA样小鼠背部的皮肤剃毛，并连续4天用凡士林(对照)或含IMQ的乳膏(Aldara)对皮肤进行局部治疗。在第-3天和第1天以10mg/mL皮下注射PBS、hIL-36R mAb和hIgG4同种型对照(每个治疗组n＝9)。(6A)在第5天从DITRA样小鼠中分离的背部皮肤的H&E组织学切片和病理学评分。(6B)在第-3天和第1天每天应用IMQ和注射PBS、IL-36R mAb和同种型对照治疗的在第5天的DITRA样小鼠的皮肤匀浆中促炎性细胞因子的水平。数据代表三个独立的实验。误差棒代表平均值SD。在每组条形中，从左到右是：PBS、hIL-36R mAb和hIgG4同种型对照。
图7A-7C.在一些实施方案中，抗人IL-36R抗体的治疗性施用改善了DITRA样小鼠中的慢性IMQ诱导的皮肤炎症。在开始施用之前3天将DITRA样小鼠背部的皮肤剃毛，并用凡士林(对照)或含IMQ的乳霜(Aldara)局部治疗皮肤持续两轮(对于第一轮施用连续5天，随后2天不进行施用，然后第二轮连续4天施用，总共11天)。在第5天和第9天以10mg/mL皮下注射PBS、抗人IL-36R抗体和hIgG4同种型对照(每个治疗组n＝10)。(7A)在第12天在DITRA样小鼠中测量皮肤厚度。厚度以m为单位呈现。(7B)在第12天来自DITRA样小鼠的皮肤的H&E组织学切片和病理学评分。(7C)在第12天在DITRA样小鼠的皮肤匀浆中测量促炎性细胞因子的水平。数据代表两个独立的实验。误差棒代表平均值SD。在每组条形中，从左到右是：磷酸盐缓冲盐水(PBS)、hIL-36R mAb和hIgG4同种型对照。
图8A-8E.在一些实施方案中，类似于IL-12p40阻断，抗人IL-36R抗体的治疗性施用改善了DITRA样小鼠中的DSS诱导的慢性炎症，并拯救了它们无法从DSS诱导的粘膜损伤中治愈。DITRA样小鼠(n＝45)通过施用3％DSS 7天和2％DSS 13天、随后施用水、总共30天来进行慢性DSS诱导的结肠炎。对照小鼠(n＝5)接受常规水。在第7天、第10天、第14天、第17天、第21天和第24天以10mg/mL腹膜内注射PBS(n＝11)、IL-36R mAb(n＝11)、hIgG4同种型对照(n＝6)、mIL-12p40(BioxCell)(n＝11)和大鼠IgG2a同种型对照(n＝6)。(8A)DITRA样小鼠的体重减轻计算为在任何特定日期在原始体重与实际体重之间的百分比差异。(8B)在整个慢性结肠炎的第0天、第7天、第17天、第23天和第30天测量的DITRA样小鼠中的粪便脂质运载蛋白-2(Lcn2)水平。(8C)在第30天在DITRA样小鼠中的结肠长度。(8D)在第30天在DITRA样小鼠的结肠匀浆中的髓过氧化物酶(MPO)活性。(8E)在第30天在DITRA样小鼠的结肠匀浆中促炎性细胞因子的水平。数据代表两个独立的实验。误差棒代表平均值SD。在每组条形中，从左到右是：PBS/水、PBS/DSS、hIL-36R/DSS、hIgG4同种型对照/DSS、mIL-12p40/DSS、和大鼠IgG2a同种型对照/DSS。
图9A-9C.人IL-36R拮抗作用改善了DITRA样小鼠中的噁唑酮诱导的结肠炎。用溶解于100％乙醇中的3％噁唑酮溶液对DITRA样小鼠进行预致敏，并在第5天、第6天和第7天直肠内施用1.5％噁唑酮和媒介物(50％乙醇)。在预致敏后第2天、第5天和第7天，向小鼠腹膜内注射PBS、抗人IL-36R mAb和hIgG4同种型对照。(A)在噁唑酮施用期间，PBS、抗人IL-36R mAb和hIgG4对照治疗的DITRA样小鼠的体重。*相对于PBS治疗组p＜0.05。(B)在第8天在DITRA样小鼠中测量的结肠长度。(C)用PBS、抗人IL-36R mAb和hIgG4同种型对照注射的噁唑酮和媒介物治疗的DITRA样小鼠的结肠匀浆中促炎性细胞因子的水平。*-代表相对于PBS治疗组的显著性，#-代表相对于同型治疗组的显著性。数据代表每组5只小鼠的两个独立的实验。误差棒代表平均值±SEM。*p<0.05，**p<0.005，***p<0.0005，****p<0.00001。
具体实施方式
本文公开了被遗传修饰以包含人源化Il1rl2基因(编码具有与人IL1RL2胞外结构域基本上相同的胞外结构域的人源化IL1RL2蛋白)和编码人IL-36α、β、γ配体的人基因、同时保持在抑制人IL-36R信号传导方面的效力低20倍的内源性IL-36Ra拮抗剂的啮齿动物(诸如但不限于小鼠)。已经示出了本文所公开的经遗传修饰的啮齿动物显示出其中IL-36Ra中的突变导致增强的IL-36R信号传导的DITRA患者的症状。因此，本文所公开的经遗传修饰的啮齿动物可以用作适合于测试用于治疗DITRA和相关障碍的候选治疗剂的新型DITRA功能模型。下面进一步描述各种实施方案。
经遗传修饰的啮齿动物：四重人源化
在一些实施方案的一个方面，本公开提供了啮齿动物，所述啮齿动物在其基因组中包含编码人源化IL1RL2蛋白(IL-36R的亚基)的人源化Il1rl2基因、以及编码人IL-36α、β和γ配体的人基因。此类啮齿动物在本文中也称为四重人源化啮齿动物(即4H或DITRA样)。
当在核酸或蛋白质的上下文中使用时，术语“人源化”包括其结构(即核苷酸或氨基酸序列)已经全部或部分被修饰以包括在对应的人类核酸或蛋白质中发现的结构的啮齿动物核酸或蛋白质。含有人源化基因或表达人源化蛋白质的啮齿动物是“人源化”啮齿动物。
在一些实施方案中，本公开的啮齿动物包括作为非限制性实例的小鼠、大鼠和仓鼠。在一些实施方案中，本公开的啮齿动物包括作为非限制性实例的小鼠和大鼠。在一些实施方案中，啮齿动物选自总科鼠总科(Muroidea)。在一些实施方案中，本公开的啮齿动物来自选自下列的家族：丽仓鼠科(Calomyscidae)(例如，类小鼠的仓鼠)、仓鼠科(Cricetidae)(例如，仓鼠、新世界大鼠和小鼠、田鼠)、鼠科(Muridae)(真小鼠和大鼠、沙鼠、棘鼠、冠鼠)、马岛鼠科(Nesomyidae)(攀鼠、岩鼠、具尾大鼠、马达加斯加大鼠和小鼠)、刺山鼠科(Platacanthomyidae)(例如，刺棒睡鼠)和鼹形鼠科(Spalacidae)(例如，鼹鼠、竹鼠和鼢鼠)。在一些实施方案中，本公开的啮齿动物选自真小鼠或大鼠(鼠科)、沙鼠、棘鼠和冠鼠。在一些实施方案中，本公开的小鼠来自鼠科(Muridae)的成员。
IL-1RL2人源化
IL-36R是白介素1受体家族的成员，并且是由称为IL1RL2(也称为IL-1Rrp2)的受体亚基和共受体亚基白介素1受体辅助蛋白IL-1RAcP组成的一种异二聚体(Garlanda C等人,Immunity 39,1003–1018(2013)；Towne JE等人,J.Biol.Chem.279,13677–13688(2004)，所述文献以引用的方式整体并入)。受体(IL-36R)可以识别和结合三种不同的激动剂IL-36α、IL-36β和IL-36γ(也称为IL1F6、IL1F8和IL1F9)以诱导炎性细胞因子的表达，并且识别和结合拮抗剂IL-36Ra，其与IL-36R结合并降低炎性细胞因子的表达。
IL1RL2含有信号肽、细胞外结构域(“ECD”或“胞外结构域”)、跨膜结构域和细胞内或细胞质结构域。例如参见图1D。序列表中公开了示例性IL1RL2序列，包括人、小鼠、大鼠和人源化Il1rl2核酸和蛋白质序列，并在下表中进行了概述。
表1
Figure BDA0003879168040000111
Figure BDA0003879168040000121
在一些实施方案中，本文所公开的啮齿动物在其基因组中包含包括内源性啮齿动物Il1rl2基因的核苷酸序列和人IL1RL2基因的核苷酸序列的人源化Il1rl2基因。如本文所用，“基因的核苷酸序列”包括基因的全部或部分的基因组序列、mRNA或cDNA序列。作为非限制性实例，人IL1RL2基因的核苷酸序列包括人IL1RL2基因的全部或部分的基因组序列、mRNA或cDNA序列。内源性啮齿动物Il1rl2基因的核苷酸序列和人IL1RL2基因的核苷酸序列彼此有效地连接，使得在啮齿动物基因组中的人源化Il1rl2基因编码Il1rl2蛋白，即具有Il1rl2蛋白质结构(由胞外结构域、跨膜结构域和细胞质结构域构成)并且执行Il1rl2功能(例如，与白介素1受体辅助蛋白(IL-1RacP)形成异二聚体并识别三种配体：IL-36α、IL-36β和IL-36γ)的蛋白质。
在一些实施方案中，经遗传修饰的啮齿动物在其基因组中含有人源化Il1rl2基因，其中所述人源化Il1rl2基因编码含有与人IL1RL2蛋白的胞外结构域基本上相同的胞外结构域的人源化Il1rl2蛋白。在一些实施方案中，与人IL1RL2蛋白的胞外结构域基本上相同的胞外结构域表现出与人IL1RL2蛋白的胞外结构域相同的功能性(例如，配体结合特性)。“与人IL1RL2蛋白的胞外结构域基本上相同”的胞外结构域或多肽在一些实施方案中意指与人IL1RL2蛋白的胞外结构域在序列上为至少95％、98％、99％或100％相同的多肽；在一些实施方案中，与人IL1RL2蛋白的胞外结构域相差不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸的多肽；以及在一些实施方案中，与人IL1RL2蛋白的胞外结构域仅在胞外结构域的N或C末端部分处例如通过在胞外结构域的N或C末端部分具有氨基酸的添加、缺失或置换但不超过5、4、3、2或1个氨基酸而不同的多肽。“胞外结构域的N或C末端部分”意指在胞外结构域的N或C末端的5-10个氨基酸内。在一些实施方案中，人IL1RL2蛋白具有与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列基本上相同的氨基酸序列(例如，至少95％、98％、99％或100％相同)。在具体实施方案中，人IL1RL2蛋白包含如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，并且其胞外结构域由SEQ ID NO:2的氨基酸20-335构成。在一些实施方案中，人源化Il1rl2基因编码含有与SEQID NO:2所示的人IL1RL2蛋白的胞外结构域基本上相同的胞外结构域(即SEQ ID NO:2的氨基酸20-335)的人源化Il1rl2蛋白。在一些实施方案中，人源化Il1rl2基因编码含有包含SEQ ID NO:7的氨基酸22-337的胞外结构域的人源化Il1rl2蛋白。
在一些实施方案中，人源化Il1rl2基因编码含有与内源性啮齿动物Il1rl2蛋白的跨膜细胞质序列基本上相同的跨膜细胞质序列(即，既包括跨膜结构域又包括细胞质结构域的序列)的人源化Il1rl2蛋白。在一些实施方案中，与内源性啮齿动物Il1rl2蛋白的跨膜细胞质序列基本上相同的跨膜细胞质序列表现出与内源性啮齿动物Il1rl2蛋白的跨膜细胞质序列相同的功能性(例如，信号转导和/或与细胞内分子的相互作用)。“与内源性啮齿动物Il1rl2蛋白的跨膜细胞质序列基本上相同”的跨膜细胞质序列或多肽在一些实施方案中意指与内源性啮齿动物Il1rl2蛋白的跨膜细胞质序列为至少95％、98％、99％或100％相同的多肽；在一些实施方案中，与内源性啮齿动物Il1rl2蛋白的跨膜细胞质序列相差不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸的多肽；在一些实施方案中，与内源性啮齿动物Il1rl2蛋白的跨膜细胞质序列仅在N或C末端例如通过在跨膜细胞质序列的N或C末端部分具有氨基酸的添加、缺失或置换但不超过5、4、3、2或1个氨基酸而不同的多肽。“跨膜细胞质序列的N或C末端部分”意指从跨膜结构域的N末端5-10个氨基酸以内或从细胞质结构域的C末端5-10个氨基酸以内。在一些实施方案中，人源化Il1rl2蛋白含有与小鼠Il1rl2蛋白(例如，与SEQ ID NO:4基本上相同(至少95％、98％、99％或100％相同)的小鼠Il1rl2蛋白)的跨膜细胞质序列、或者与大鼠Il1rl2蛋白(例如，与SEQ ID NO:6基本上相同(至少95％、98％、99％或100％相同)的大鼠Il1rl2蛋白)的跨膜细胞质序列基本上相同的跨膜细胞质序列。
在一些实施方案中，人源化Il1rl2基因编码含有与内源性啮齿动物Il1rl2蛋白的信号肽基本上相同的信号肽的人源化Il1rl2蛋白。“与内源性啮齿动物Il1rl2蛋白的信号肽基本上相同”的信号肽在一些实施方案中意指与内源性啮齿动物Il1rl2蛋白的信号肽为至少95％、98％、99％或100％相同的多肽；在一些实施方案中，与内源性啮齿动物Il1rl2蛋白的信号肽相差不超过3、2或1个氨基酸的多肽；在一些实施方案中，与内源性啮齿动物Il1rl2蛋白的信号肽仅在N或C末端例如通过在信号肽的N或C末端部分具有氨基酸的添加、缺失或置换但不超过3、2或1个氨基酸而不同的多肽。“信号肽的N或C末端部分”意指从信号肽的N或C末端5个氨基酸以内。在一些实施方案中，人源化Il1rl2蛋白包括与小鼠Il1rl2蛋白(例如，与SEQ ID NO:4基本上相同(至少95％、98％、99％或100％相同)的小鼠Il1rl2蛋白)的信号肽、或者与大鼠Il1rl2蛋白(例如，与SEQ ID NO:6基本上相同(至少95％、98％、99％或100％相同)的大鼠Il1rl2蛋白)的信号肽基本上相同的信号肽。
在一些实施方案中，经遗传修饰的啮齿动物的基因组中的人源化Il1rl2基因包括人IL1RL2基因的核苷酸序列(或“人IL1RL2核苷酸序列”)和内源性啮齿动物Il1rl2基因的核苷酸序列(或“内源性啮齿动物Il1rl2核苷酸序列”)，其中所述人IL1RL2核苷酸序列编码与由人IL1RL2基因编码的人IL1RL2蛋白的胞外结构域基本上相同的多肽。此类人IL1RL2核苷酸序列也被称为基本上编码人IL1RL2蛋白的胞外结构域。在一些实施方案中，人IL1RL2核苷酸序列是人IL1RL2基因的基因组片段。在一些实施方案中，人IL1RL2核苷酸序列是包含人IL1RL2基因的外显子3-8的基因组片段。在一些实施方案中，人IL1RL2核苷酸序列是包含人IL1RL2基因的内含子2的3’部分、外显子3-8和内含子8的5’部分的基因组片段。在一些实施方案中，人IL1RL2核苷酸序列是cDNA序列。
在一些实施方案中，经遗传修饰的啮齿动物的基因组中的人源化Il1rl2基因包括内源性啮齿动物Il1rl2核苷酸序列和人IL1RL2核苷酸序列，其中所述内源性啮齿动物Il1rl2核苷酸序列编码与内源性啮齿动物Il1rl2蛋白的跨膜细胞质序列基本上相同的多肽。此类啮齿动物Il1rl2核苷酸序列也被称为基本上编码内源性啮齿动物Il1rl2蛋白的跨膜细胞质序列。在一些实施方案中，在人源化Il1rl2基因中存在的内源性啮齿动物Il1rl2核苷酸序列编码内源性啮齿动物Il1rl2蛋白的跨膜细胞质序列。在一些实施方案中，在人源化Il1rl2基因中存在的内源性啮齿动物Il1rl2核苷酸序列包含在内源性啮齿动物Il1rl2基因中的外显子8下游的其余外显子。在一些实施方案中，在人源化Il1rl2基因中存在的内源性啮齿动物Il1rl2核苷酸序列包含在内源性啮齿动物Il1rl2基因中内含子8的3’部分和外显子8下游的其余外显子。
在一些实施方案中，经遗传修饰的啮齿动物的基因组中的人源化Il1rl2基因包括人IL1RL2核苷酸序列上游(5’)的内源性啮齿动物Il1rl2核苷酸序列，其中所述内源性啮齿动物Il1rl2核苷酸序列编码与内源性啮齿动物Il1rl2蛋白的信号肽基本上相同的多肽。这样的啮齿动物Il1rl2核苷酸序列也被称为基本上编码内源性啮齿动物Il1rl2蛋白的信号肽。在一些实施方案中，编码与内源性啮齿动物Il1rl2蛋白的信号肽基本上相同的多肽的内源性啮齿动物Il1rl2核苷酸序列包含内源性啮齿动物Il1rl2基因的外显子1-2；并且在一些实施方案中，内源性啮齿动物Il1rl2核苷酸序列包括内源性啮齿动物Il1rl2基因的外显子1-2和内含子2的5’部分。
在一些实施方案中，人源化Il1rl2基因有效地连接至内源性啮齿动物Il1rl2调控序列，例如一个或多个5’转录调控序列诸如启动子和/或增强子，诸如人源化Il1rl2基因的表达是在一个或多个啮齿动物Il1rl2 5’调控序列的控制下。
在一些实施方案中，人源化Il1rl2基因位于内源性啮齿动物Il1rl2基因座处。在一些实施方案中，人源化Il1rl2基因位于除内源性啮齿动物Il1rl2基因座之外的基因座；例如，由于随机整合的结果。在人源化Il1rl2基因位于除内源性啮齿动物Il1rl2基因座之外的基因座处的一些实施方案中，所述啮齿动物不能表达啮齿动物Il1rl2蛋白，例如由于内源性啮齿动物Il1rl2基因的失活(例如，全部或全部缺失)的结果。
在人源化Il1rl2基因位于内源性啮齿动物Il1rl2基因座处的一些实施方案中，所述人源化Il1rl2基因是由在内源性啮齿动物Il1rl2基因座处的内源性啮齿动物Il1rl2基因的核苷酸序列被人IL1RL2基因的核苷酸序列替换产生的。
在一些实施方案中，被替换的在内源性啮齿动物Il1rl2基因座处的内源性啮齿动物Il1rl2基因的核苷酸序列是基本上编码啮齿动物Il1rl2蛋白胞外结构域的内源性啮齿动物Il1rl2基因的基因组片段。在一些实施方案中，被替换的啮齿动物基因组片段包含内源性啮齿动物Il1rl2基因的外显子3-8。
在一些实施方案中，对在内源性啮齿动物Il1rl2基因座处的啮齿动物Il1rl2基因的基因组片段进行替换的人IL1RL2基因的核苷酸序列是cDNA序列。在一些实施方案中，对在内源性啮齿动物Il1rl2基因座处的啮齿动物Il1rl2基因的基因组片段进行替换的人IL1RL2核苷酸序列是人IL1RL2基因的基因组片段。在一些实施方案中，对在内源性啮齿动物Il1rl2基因座处的啮齿动物Il1rl2基因的基因组片段进行替换的人IL1RL2基因的基因组片段包括基本上编码人IL1RL2蛋白的胞外结构域的人IL1RL2基因的全部或部分外显子。在一些实施方案中，人基因组片段包含人IL1RL2基因的外显子3-8。
在一些实施方案中，在人源化替换后保留在内源性啮齿动物Il1rl2基因座处并与所插入的人IL1RL2核苷酸序列有效地连接的内源性啮齿动物Il1rl2基因的基因组序列基本上编码内源性啮齿动物Il1rl2蛋白的跨膜细胞质序列。在一些实施方案中，在人源化替换后保留在内源性啮齿动物Il1rl2基因座处的内源性啮齿动物Il1rl2基因的基因组序列包括内源性啮齿动物Il1rl2基因外显子8下游的外显子。
在一些实施方案中，在人源化替换后保留在内源性啮齿动物Il1rl2基因座处并且与所插入的人IL1RL2核苷酸序列有效地连接的内源性啮齿动物Il1rl2基因的基因组序列基本上编码内源性啮齿动物Il1rl2蛋白的信号肽。在一些实施方案中，在人源化替换后保留在内源性啮齿动物Il1rl2基因座处的内源性啮齿动物Il1rl2基因的基因组序列包括内源性啮齿动物Il1rl2基因的外显子1-2。
在一些实施方案中，在内源性啮齿动物Il1rl2蛋白和人IL1RL2蛋白在跨膜结构域与胞外结构域之间的连接附近共享共有氨基酸的情况下，可能不需要插入精确编码人IL1RL2蛋白的胞外结构域的人IL1RL2核苷酸序列。可以插入基本上编码人IL1RL2蛋白胞外结构域的人IL1RL2基因的稍稍更长或更短的核苷酸序列，所述核苷酸序列与基本上编码内源性啮齿动物Il1rl2蛋白的跨膜结构域(和胞质结构域)的内源性啮齿动物Il1rl2基因的基因组序列有效地连接，使得由所得的人源化Il1rl2基因编码的人源化Il1rl2蛋白包括与人IL1RL2蛋白的胞外结构域相同的胞外结构域和与内源性啮齿动物Il1rl2蛋白的跨膜结构域相同的跨膜结构域。
在一些实施方案中，包含在内源性啮齿动物Il1rl2基因座处的内源性啮齿动物Il1rl2基因外显子3-8的基因组片段已被包含人IL1RL2基因外显子3-8的基因组片段替换。结果，人源化Il1rl2基因在内源性啮齿动物Il1rl2基因座处形成，并且包含内源性啮齿动物Il1rl2基因的外显子1-2、人IL1RL2基因的外显子3-8、以及内源性啮齿动物Il1rl2基因外显子8下游的其余外显子。
在一些实施方案中，本文提供的啮齿动物对于其基因组中的人源化Il1rl2基因是杂合的。在一些实施方案中，本文提供的啮齿动物对于其基因组中的人源化Il1rl2基因是纯合的。
在一些实施方案中，人源化Il1rl2基因导致在啮齿动物中表达所编码的人源化Il1rl2蛋白。在一些实施方案中，人源化Il1rl2蛋白以与对照啮齿动物(例如，没有人源化Il1rl2基因的啮齿动物)中的对应啮齿动物Il1rl2蛋白可比较的或基本上相同的模式表达。在一些实施方案中，人源化Il1rl2蛋白以与对照啮齿动物(例如，没有人源化Il1rl2基因的啮齿动物)中的对应啮齿动物Il1rl2蛋白可比较的或基本上相同的水平表达。在一些实施方案中，在细胞表面例如但不限于诸如角化细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、支气管和肠上皮细胞等细胞的表面表达和检测人源化Il1rl2蛋白。在将人源化啮齿动物中的人源化基因或蛋白质与对照啮齿动物中的内源性啮齿动物基因或蛋白质进行比较的上下文中，术语“可比较的”意指所比较的分子或水平可能彼此不同但足够相似以允许在两者之间进行比较，使得可以根据观察到的差异或相似性合理得出结论。在一些实施方案中，术语“基本上相同”在涉及表达水平时，包括所比较的水平彼此相差不超过20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％。
在一些实施方案中，本文所公开的啮齿动物不能表达啮齿动物Il1rl2蛋白，例如由于内源性啮齿动物Il1rl2基因的失活(例如，全部或部分缺失)或替换(全部或部分)的结果。
IL-36配体人源化
本文所公开的啮齿动物在生殖系中还包含编码人IL-36α、β和γ配体的基因。
表2
Figure BDA0003879168040000171
在一些实施方案中，本文所公开的啮齿动物具有包含编码人IL-36α蛋白的人IL-36α基因的基因组。提及“人IL-36α基因”包括编码人IL-36α蛋白并包含人IL-36α启动子的人基因组DNA。人IL-36α蛋白可以是人IL-36α蛋白的成熟形式或前体形式。在一些实施方案中，人IL-36α蛋白包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列。
在一些实施方案中，人IL-36α基因位于内源性啮齿动物Il-36α基因座处。在一些实施方案中，人IL-36α基因位于除内源性啮齿动物Il-36基因座之外的基因座处；例如，由于随机整合的结果。在人IL-36α基因位于除内源性啮齿动物Il-36α基因座之外的基因座处的一些实施方案中，啮齿动物例如由于内源性啮齿动物Il-36α基因的失活(例如，全部或部分缺失)的结果而不能表达啮齿动物Il-36α蛋白。
在一些实施方案中，人IL-36α基因替换在内源性啮齿动物Il-36α基因座处的内源性啮齿动物Il-36α基因。
在一些实施方案中，本文提供的啮齿动物对于其基因组中的人IL-36α基因是杂合的。在其他实施方案中，本文提供的啮齿动物对于其基因组中的人IL-36α基因是纯合的。
在一些实施方案中，人IL-36α基因导致所编码的人IL-36α蛋白在啮齿动物中(例如，在血清中、在粘膜部位诸如皮肤、肠上皮、肺和在各种类型的免疫系统细胞(例如，单核细胞、巨噬细胞、T细胞、树突状细胞)中表达。在一些实施方案中，人IL-36α蛋白以与对照啮齿动物(例如，没有人IL-36α基因的啮齿动物)中的对应啮齿动物II-36α蛋白可比较的或基本上相同的模式表达。在一些实施方案中，人IL-36α蛋白以与在对照啮齿动物(例如，没有人IL-36α基因的啮齿动物)中例如在血清中、在粘膜部位(例如，诸如皮肤、肠上皮、肺)和/或在免疫细胞(例如，单核细胞、巨噬细胞、T细胞、树突状细胞)中的对应啮齿动物II-36α蛋白可比较的或基本上相同的水平表达。
在一些实施方案中，本文所公开的啮齿动物例如由于内源性啮齿动物Il-36α基因的失活(例如，全部或部分缺失)或替换(全部或部分)的结果而不能表达啮齿动物Il-36α蛋白。
表3
Figure BDA0003879168040000181
在一些实施方案中，本文所公开的啮齿动物具有包含编码人IL-36β蛋白的人IL-36β基因的基因组。提及“人IL-36β基因”包括编码人IL-36β蛋白并包含人IL-36β启动子的人基因组DNA。人IL-36β蛋白可以是人IL-36β蛋白的成熟形式或前体形式。在一些实施方案中，人IL-36β蛋白包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列。
在一些实施方案中，人IL-36β基因位于内源性啮齿动物Il-36β基因座处。在一些实施方案中，人IL-36β基因位于除内源性啮齿动物Il-36β基因座之外的基因座处；例如，由于随机整合的结果。在人IL-36β基因位于除内源性啮齿动物Il-36β基因座之外的基因座处的一些实施方案中，啮齿动物例如由于内源性啮齿动物Il-36β基因的失活(例如，全部或部分缺失)的结果而不能表达啮齿动物Il-36β蛋白。
在一些实施方案中，人IL-36β基因替换在内源性啮齿动物Il-36β基因座处的内源性啮齿动物Il-36β基因。
在一些实施方案中，本文提供的啮齿动物对于其基因组中的人IL-36β基因是杂合的。在其他实施方案中，本文提供的啮齿动物对于其基因组中的人IL-36β基因是纯合的。
在一些实施方案中，人IL-36β基因导致所编码的人IL-36β蛋白在啮齿动物中(例如，在血清中、在粘膜部位(例如，诸如皮肤、肠上皮、肺)和/或在免疫细胞(例如，单核细胞、巨噬细胞、T细胞、树突状细胞)中表达。在一些实施方案中，人IL-36β蛋白以与对照啮齿动物(例如，没有人IL-36基因的啮齿动物)中的对应啮齿动物II-36β蛋白可比较的或基本上相同的模式表达。在一些实施方案中，人IL-36β蛋白以与在对照啮齿动物(例如，没有人IL-36β基因的啮齿动物)中(例如，在血清中、在粘膜部位(诸如皮肤、肠上皮、肺)和在各种类型的免疫系统细胞(例如，单核细胞、巨噬细胞、T细胞、树突状细胞)中)的对应啮齿动物II-36β蛋白可比较的或基本上相同的水平表达。
在一些实施方案中，本文所公开的啮齿动物例如由于内源性啮齿动物Il-36β基因的失活(例如，全部或部分缺失)或替换(全部或部分)的结果而不能表达啮齿动物I Il-36β蛋白。
表4
Figure BDA0003879168040000191
Figure BDA0003879168040000201
在一些实施方案中，本发明提供了一种啮齿动物，其基因组含有编码人IL-36γ蛋白的人IL-36γ基因。提及“人IL-36γ基因”包括编码人IL-36γ蛋白并包含人IL-36启动子的人基因组DNA。在一些实施方案中，人IL-36蛋白可以是人IL-36γ蛋白的成熟形式或前体形式。在一些实施方案中，人IL-36蛋白包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列。
在一些实施方案中，人IL-36γ基因位于内源性啮齿动物Il-36γ基因座处。在一些实施方案中，人IL-36γ基因位于除内源性啮齿动物Il-36γ基因座之外的基因座处；例如，由于随机整合的结果。在人IL-36γ基因位于除内源性啮齿动物Il-36γ基因座之外的基因座处的一些实施方案中，啮齿动物例如由于内源性啮齿动物Il-36γ基因的失活(例如，全部或部分缺失)的结果而不能表达啮齿动物Il-36γ蛋白。
在一些实施方案中，人IL-36γ基因替换在内源性啮齿动物Il-36γ基因座处的内源性啮齿动物Il-36γ基因。
在一些实施方案中，本文提供的啮齿动物对于其基因组中的人IL-36γ基因是杂合的。在其他实施方案中，本文提供的啮齿动物对于其基因组中的人IL-36γ基因是纯合的。
在一些实施方案中，人IL-36γ基因导致所编码的人IL-36γ蛋白(例如，与人IL-36γ蛋白相同的蛋白)在啮齿动物中(例如，在血清中、在粘膜部位诸如皮肤、肠上皮、肺和在各种类型的免疫系统细胞(例如，单核细胞、巨噬细胞、T细胞、树突状细胞)中表达。在一些实施方案中，人IL-36γ蛋白以与对照啮齿动物(例如，没有人IL-36γ基因的啮齿动物)中的对应啮齿动物II-36γ蛋白可比较的或基本上相同的模式表达。在一些实施方案中，人IL-36γ蛋白以与在对照啮齿动物(例如，没有人IL-36γ基因的啮齿动物)中例如在血清中、在粘膜部位(例如，诸如皮肤、肠上皮、肺)和/或在免疫细胞(例如，单核细胞、巨噬细胞、T细胞、树突状细胞)中的对应啮齿动物II-36γ蛋白可比较的或基本上相同的水平表达。
在一些实施方案中，本文所公开的啮齿动物例如由于内源性啮齿动物Il-36基因的失活(例如，全部或部分缺失)或替换(全部或部分)的结果而不能表达啮齿动物Il-36γ蛋白。
在一些实施方案中，提供了啮齿动物，其基因座包含涵盖在内源性基因座处的全部三种Il-36配体编码序列的连续基因组片段分别经包含与人IL-36α、β和γ基本上相同的三种配体的编码序列的连续核酸的替换。在一些实施方案中，所得的基因座从5'至3'包含，(i)人IL-36β基因，(ii)人IL-36γ基因，和(iii)人IL-36α基因的反义链。
四重人源化啮齿动物的表型
本文所公开的经遗传修饰的啮齿动物在稳定状态下不会发生任何自发性疾病；然而，如与没有人源化的年龄匹配的对照啮齿动物相比，这些啮齿动物在稳定状态和疾病状态下(例如，在DSS或IMQ治疗之后)都的确显示出缩短的结肠和在皮肤中增加的促炎性介质的表达。在一些实施方案中，经遗传修饰的啮齿动物在稳定状态或疾病状态下显示出比对照啮齿动物短至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％的结肠长度。
在一些实施方案中，在稳定状态下，经遗传修饰的啮齿动物显示出比对照啮齿动物短10％至15％(+/-5％)的结肠长度。在一些实施方案中，在稳定状态下，经遗传修饰的啮齿动物显示出比对照啮齿动物短15％至20％(+/-5％)的结肠长度。在一些实施方案中，在稳定状态下，经遗传修饰的啮齿动物显示出比对照啮齿动物短10％至20％(+/-5％)的结肠长度。
在其他实施方案中，在疾病状态下(例如，在DSS或噁唑酮治疗之后)，经遗传修饰的啮齿动物显示出比对照啮齿动物短20％至40％(+/-5％)的结肠长度。在其他实施方案中，在疾病状态下(例如，在DSS或噁唑酮治疗之后)，经遗传修饰的啮齿动物显示出比对照啮齿动物短30％至40％(+/-5％)的结肠长度。在其他实施方案中，在疾病状态下(例如，在DSS或噁唑酮治疗之后)，经遗传修饰的啮齿动物显示出比对照啮齿动物短20％至30％(+/-5％)的结肠长度。在其他实施方案中，在疾病状态下(例如，在DSS或噁唑酮治疗之后)，经遗传修饰的啮齿动物显示出比对照啮齿动物短25％至35％(+/-5％)的结肠长度。
尽管本文所公开的经遗传修饰的啮齿动物在稳定状态下不发生任何自发性疾病，但已显示它们在实验诱导的皮肤和肠道炎症模型(例如分别为牛皮癣和IBD的临床前模型)中显示出增强的皮肤和肠道炎症。
在一些实施方案中，将DSS用于诱导慢性结肠炎。在一些实施方案中，通过饮用至少0.5％、至少1％、至少1.5％、至少2.5％的水向啮齿动物施用DSS。在一些实施方案中，通过饮用不超过10％、9％、8％、7％、6％或5％的水向啮齿动物施用DSS。在一些实施方案中，将含有1.5％-3％的DSS的饮用水给予至啮齿动物。在一些实施方案中，将含有0.5％-3％的DSS的饮用水给予至啮齿动物。在一些实施方案中，将含有1％-3％的DSS的饮用水给予至啮齿动物。在一些实施方案中，将含有2％-3％的DSS的饮用水给予至啮齿动物。在一些实施方案中，将含有2.5％-3％的DSS的饮用水给予至啮齿动物。在一些实施方案中，将含有0.5％-2.5％的DSS的饮用水给予至啮齿动物。在一些实施方案中，将含有0.5％-2％的DSS的饮用水给予至啮齿动物。在一些实施方案中，将含有0.5％-1.5％的DSS的饮用水给予至啮齿动物。在一些实施方案中，将含有0.5％-1％的DSS的饮用水给予至啮齿动物。在一些实施方案中，将含有1％-2.5％的DSS的饮用水给予至啮齿动物。在一些实施方案中，将含有1.5％-2％的DSS的饮用水给予至啮齿动物。
在一些实施方案中，DSS的施用可以进行5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多天的时间段，并且是连续的或被中断了没有DSS施用的的几天。在一些实施方案中，向啮齿动物提供含有2.5％DSS的饮用水持续7天，然后提供含有1.5％DSS的饮用水持续5天，随后提供蒸馏水直到分析前的27-30天。在一些实施方案中，向啮齿动物提供含有3％DSS的饮用水持续7天，然后提供含有2％DSS的饮用水持续13天，随后提供蒸馏水直到分析前的27-30天。在一些实施方案中，没有在整个时期内给予DSS。在一些实施方案中，向啮齿动物提供含有2.5％DSS的饮用水持续7天，随后提供11天的蒸馏水，然后提供含有1.5％DSS的饮用水持续4天，随后是5天的蒸馏水–总共分析前的27天。在一些实施方案中，向啮齿动物提供含有3％DSS的饮用水持续7天，随后提供13天的水，然后提供含有2％DSS的饮用水持续4天，随后提供6天的蒸馏水直到分析前的30天。
在一些实施方案中，将噁唑酮用于诱导结肠炎。在一些实施方案中，将噁唑酮直肠内地给予至啮齿动物以诱导结肠炎。在一些实施方案中，将噁唑酮以三次施用直肠内地给予至啮齿动物以诱导结肠炎。在一些实施方案中，在直肠内施用之前，将噁唑酮局部地施用给啮齿动物进行预致敏。在一些实施方案中，通过在剃毛的皮肤上局部施用噁唑酮溶液(例如，溶解于100％乙醇中的3％噁唑酮溶液)、随后三次直肠内施用噁唑酮溶液(例如，溶解于50％乙醇中的1.0-2.0％噁唑酮)，将噁唑酮给予至啮齿动物进行预致敏。在一些实施方案中，预致敏采用溶解于100％乙醇中的1.5％、2.0％、2.5％、3.0％、3.5％或4.0％的噁唑酮溶液。在一些实施方案中，直肠内施用采用溶解于50％乙醇中的1.0％、1.1％、1.2％、1.3％、1.5％、1.6％、1.7％、1.8％、1.9％或2.0％的噁唑酮溶液。在一些实施方案中，直肠内施用是在预致敏后数天(例如3、4、5、6或7天)进行。在一些实施方案中，通过将溶解于100％乙醇中的3.0％噁唑酮溶液局部施用到皮肤上，随后在第5天、第6天和第7天三次直肠内施用溶解于50％乙醇中的1.0-2.0％噁唑酮溶液，将噁唑酮给予至啮齿动物。
在一些实施方案中，通过对以下特点进行评分来评价结肠炎的程度：炎症(严重性和程度)、上皮变化(糜烂/溃疡)、隐窝变化(隐窝损失、隐窝炎/隐窝脓肿、再生/增生、杯状细胞损失)、粘膜下水肿和具有病理的组织面积相对于载玻片上总组织面积的百分比。使用0-4评分量表：0-0-在正常范围内，1-最小程度，2-轻度，3-中度和4-重度。通过将各个组织病理学特点得分相加，计算出每只啮齿动物的总病理得分。在一些实施方案中，通过测量粪便样品中的脂质运载蛋白2(Lcn2)的水平来评价结肠炎。在一些实施方案中，通过测量结肠匀浆中的髓过氧化物酶(MPO)活性水平来测量结肠炎。在一些实施方案中，通过测量结肠匀浆中炎性细胞因子的水平来评价结肠炎。
在一些实施方案中，如与已经经历相同DSS施用的野生型对照啮齿动物相比，经遗传修饰的啮齿动物显示出增加的肠病理学得分，例如增加了至少50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％或更多。在一些实施方案中，与已经经历相同DSS施用的野生型对照啮齿动物相比，经遗传修饰的啮齿动物显示出增加的肠病理学得分，例如，增加了50％-400％、50％-300％、50％-200％、50％-100％、100％-400％、100％-300％、100-200％或200％-400％。在一些实施方案中，与已经经历相同DSS施用的野生型对照啮齿动物相比，经遗传修饰的啮齿动物在结肠匀浆中表现出增加的髓过氧化物酶(“MPO”)水平，例如增加了至少50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％或更多。在一些实施方案中，与已经经历相同DSS施用的野生型对照啮齿动物相比，经遗传修饰的啮齿动物在结肠匀浆中显示出增加的MPO水平，例如增加了50％-400％、50％-300％、50％-200％、50％-100％、100％-400％、100％-300％、100-200％或200％-400％。在一些实施方案中，如与已经经历相同DSS施用的野生型对照啮齿动物相比，经遗传修饰的啮齿动物表现出增加的粪便Lcn水平，例如增加了至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％或更多。在一些实施方案中，如与已经经历相同DSS施用的野生型对照啮齿动物相比，经遗传修饰的啮齿动物表现出在结肠匀浆中的一种或多种促炎性介质(例如，KC-GRO、IL-6、IL-1β、TNFα、IL-21、IL-12p40、IL-17f、IL-17a和IL-17c)的mRNA表达和/或蛋白质水平增加，例如增加了至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％或更多。在一些实施方案中，经遗传修饰的啮齿动物表现出在结肠匀浆中的一种或多种促炎性介质的mRNA表达和/或蛋白水平增加，例如增加了20％-900％、20％-800％、20％-700％、20％-600％、20％-500％、20％-400％、20％-300％、20％-200％或20％-100％。在一些实施方案中，经遗传修饰的啮齿动物表现出在结肠匀浆中的一种或多种促炎性介质的mRNA表达和/或蛋白水平增加，例如增加了30％-900％、30％-800％、30％-700％、30％-600％、30％-500％、30％-400％、30％-300％、30％-200％或30％-100％。在一些实施方案中，经遗传修饰的啮齿动物表现出在结肠匀浆中的一种或多种促炎性介质的mRNA表达和/或蛋白水平增加，例如增加了40％-900％、40％-800％、40％-700％、40％-600％、40％-500％、40％-400％、40％-300％、40％-200％或40％-100％。在一些实施方案中，经遗传修饰的啮齿动物表现出在结肠匀浆中的一种或多种促炎性介质的mRNA表达和/或蛋白水平增加，例如增加了50％-900％、50％-800％、50％-700％、50％-600％、50％-500％、50％-400％、50％-300％、50％-200％或50％-100％。
在一些实施方案中，将IMQ局部地施用给啮齿动物的皮肤上以诱导皮肤炎症。在一些实施方案中，将IMQ在适合于局部施用的载体中提供，所述载体例如为乳膏、凝胶，包括可商购获得的IMQ乳膏(例如，诸如来自Aldara的那些)。在一些实施方案中，为了诱导皮肤炎症，每天以1至5mg、2至4mg或3-3.5mg的每日剂量将IMQ施用给啮齿动物皮肤，持续2、3、4、5、6、7、8、9、10天或更长时间的时间段。在一些实施方案中，以约3.125mg的每日剂量每天局部施用持续4天适合于诱导急性皮肤炎症，并且以约3.125mg的每日剂量每天局部施用持续9天适合于诱导慢性皮肤炎症。在一些实施方案中，在进行分析或测定之前，将IMQ局部地施用多轮(例如2、3或4轮)，其中连续4-5天的IMQ施用，随后每轮2天的无IMQ施用。在具体实施方案中，在分析之前，将IMQ局部地施用两轮，其中连续5天的IMQ施用，随后在第一轮2天的无IMQ施用，然后在第二轮连续4天的IMQ施用(参见例如，图7A-图7C)。在一些实施方案中，可以通过以下方式评价炎症的严重性：(i)使用基于测量皮肤的红斑、脱皮和增厚的临床牛皮癣面积和严重性指数(Psoriasis Area and Severity Index)的改编版本；(ii)进行皮肤组织的组织病理学分析，例如，以评价角化不全、正角化、芒罗(Munro)微脓肿、棘皮症、表皮溃疡、真皮和皮下组织的炎症、真皮和皮下组织的血管充血、滤泡性角化过度和上皮增生的存在，并确定总病理得分；(iii)测量在皮肤匀浆中促炎性介质的mRNA表达和/或蛋白水平，包括例如Cxcl1、IL-17f、IL-17a、IL-23a、S100A8和Defb4等的mRNA表达和/或蛋白质水平；和(iv)(i)-(iii)的组合。
在一些实施方案中，如与已经经历相同IMQ施用的野生型对照啮齿动物相比，经遗传修饰的啮齿动物显示出增加的皮肤病理学得分，例如增加了至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％或更多。在一些实施方案中，如与已经经历相同IMQ施用的野生型对照啮齿动物相比，经遗传修饰的啮齿动物表现出一种或多种促炎性介质(例如但不限于Cxcl1、IL-17f、IL-17a、IL-23a、S100A8和Defb4)的mRNA表达和/或蛋白质水平增加，例如增加了至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％或更多。在一些实施方案中，如与在稳定状态下的对照野生型啮齿动物相比，在稳定状态下的经遗传修饰的啮齿动物表现出在皮肤匀浆中的一种或多种促炎性介质(例如但不限于，Cxcl1、IL-17f、IL-17a、IL-23a、S100A8和Defb4)的mRNA表达和/或蛋白质水平增加，例如增加了至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％或更多。
对于IMQ诱导的皮肤炎症，如在皮肤的组织病理学和在皮肤中的促炎性分子的RNA表达所反映，单Il1rl2人源化小鼠表现出与野生型啮齿动物相似的表型(参见图3D和图3E)。在另一方面，在IMQ施用之后，与WT和1H小鼠相比，DITRA样小鼠(即，包含人源化Il1rl2和人IL1F6、IL1F8和IL1F9的四重人源化小鼠)发展出增加的皮肤炎症(参见图3D和图3E)。
经遗传修饰的啮齿动物的组织和细胞
在一些实施方案中，本文公开了来自如本文所述的啮齿动物的分离的细胞或组织。在一些实施方案中，细胞选自树突状细胞、淋巴细胞(例如，B细胞或T细胞)、巨噬细胞和单核细胞。在一些实施方案中，组织选自脂肪、膀胱、大脑、乳房、骨髓、眼、心、肠、肾、肝、肺、淋巴结、肌肉、胰腺、血浆、血清、皮肤、脾、胃、胸腺、睾丸、卵子以及它们的组合。在一些实施方案中，分离的细胞或组织在其基因组中包含本文所述的四重人源化特征。
用于制备四重人源化啮齿动物的组合物和方法
本公开的另外方面涉及用于制备上述经遗传修饰的啮齿动物的方法，以及适合用于在制备经遗传修饰的啮齿动物中使用的核酸载体和啮齿动物胚胎干细胞。
可以通过制备单Il1rl2人源化啮齿动物品系、以及Il1f6、Il1f8和Il1f9三重人啮齿动物品系，随后将单人源化和三重人品系一起繁殖以获得四重人源化啮齿动物来产生四重人源化啮齿动物，即包含人源化Il1rl2和人IL1F6、IL1F8和IL1F9基因的啮齿动物。如本文中关于啮齿动物所用，术语“繁殖”或“杂交”是指啮齿动物的交配以产生后代。本领域技术人员将理解，为了实现纯合性可能需要超过一次杂交。
在一些实施方案中，本文公开了包含期望被整合到啮齿动物基因座中的人核苷酸序列的靶向载体(或核酸构建体)。在一些实施方案中，人核苷酸序列可以是编码与人IL1RL2胞外结构域基本上相同的胞外结构域的人IL1RL2基因核苷酸序列，例如，包含人IL1RL2基因的外显子3-8的核苷酸序列。在一些实施方案中，人核苷酸序列可以是涵盖人IL-36α的编码序列、人Il-36β的编码序列和人IL-36γ编码序列的互补链的核苷酸序列。靶向载体还包括介导人核苷酸序列在靶标啮齿动物基因座(例如，Il1rl2基因座，或其中啮齿动物Il1f6、Il1f8和Il1f9基因所在的基因座)中的同源重组和整合的、位于待整合的人核苷酸序列侧翼的5'和3'啮齿动物序列，也称为同源臂。在一些实施方案中，5'和3'侧翼啮齿动物序列是位于靶标啮齿动物基因座的对应啮齿动物核苷酸序列侧翼的将被人核苷酸序列替换的核苷酸序列。例如，在用编码人胞外结构域的序列(例如，人IL1RL2基因的外显子3-8)替换编码啮齿动物胞外结构域的核苷酸序列(例如，啮齿动物Il1rl2基因的外显子3-8)的实施方案中，5’侧翼序列可以包括啮齿动物Il1rl2基因的外显子1-2，并且3’侧翼序列可以包括啮齿动物Il1rl2基因的外显子8下游的其余外显子。在其中编码全部三种IL-36配体的啮齿动物核苷酸序列将被人核苷酸序列替换的一些实施方案中，5’侧翼序列可以包括Il1f6基因的编码序列上游的啮齿动物核苷酸序列，并且3’侧翼序列可以包括Il1f9基因的编码序列上游的啮齿动物核苷酸序列。
在一些实施方案中，靶向载体包含选择标记基因。在一些实施方案中，靶向载体包含一个或多个位点特异性重组位点。在一些实施方案中，靶向载体包含选择标记基因，其侧翼为位点特异性重组位点，使得所述选择标记基因可以由于位点之间的重组而被缺失。
在示例性实施方案中，可以使用细菌同源重组和
Figure BDA0003879168040000261
技术来修饰携带啮齿动物基因组片段的细菌人工染色体(BAC)克隆(参见例如，U.S.6,586,251和Valenzuela等人(2003)Nature Biotech.21(6):652-659；所述文献以引用的方式整体并入本文)。结果，从原始的BAC克隆中缺失了啮齿动物基因组序列，并且插入了人核苷酸序列，从而产生了携带侧翼为5'和3'啮齿动物同源臂的人核苷酸序列的经修饰的BAC克隆。在一些实施方案中，人核苷酸序列可以是编码(i)全部或部分人的人IL1RL2(例如，人IL1RL2蛋白的胞外结构域)或(ii)人IL1F6、IL1F8和IL1F9中的全部三种的cDNA序列或人基因组DNA。经修饰的BAC克隆一旦线性化，就可以被引入啮齿动物胚胎干(ES)细胞中。
在一些实施方案中，本发明提供了如本文所述的靶向载体用于制备经修饰的啮齿动物胚胎干(ES)细胞的用途。例如，可以通过例如电穿孔将靶向载体引入啮齿动物ES细胞中。本领域已经描述了小鼠ES细胞和大鼠ES细胞。参见例如，US 7,576,259、US 7,659,442、US 7,294,754和US 2008-0078000 A1(所述专利全部以引用的方式整体并入本文)，它们描述小鼠ES细胞和用于制备经遗传修饰的小鼠的
Figure BDA0003879168040000271
方法； US 2014/0235933 A1(Regeneron Pharmaceuticals,Inc.)，US 2014/0310828 A1(RegeneronPharmaceuticals,Inc.)，Tong等人(2010)Nature 467:211-215，和Tong等人(2011)NatProtoc.6(6):doi:10.1038/nprot.2011.338(所述文献全部以引用的方式整体并入本文)，它们描述了大鼠ES细胞和用于制备经遗传修饰的大鼠的方法，所述经遗传修饰的大鼠可用于制备经修饰的啮齿动物胚胎，所述经修饰的啮齿动物胚胎进而可以用于制备啮齿动物。
在一些实施方案中，可以选择具有整合在基因组中的人核苷酸序列的ES细胞。在一些实施方案中，基于啮齿动物等位基因的丢失和/或人等位基因测定的获得来选择ES细胞。在一些实施方案中，然后将所选择的ES细胞用作供体ES细胞以通过使用
Figure BDA0003879168040000272
方法(参见例如US 7,576,259、US 7,659,442、US 7,294,754和US2008-0078000 A1，所述专利全部以引用的方式整体并入)或在US 2014/0235933 A1和US2014/0310828 A1(所述专利均以引用的方式整体)中描述的方法注射到桑椹胚前期胚胎(例如，8细胞期胚胎)中。在一些实施方案中，孵育包含供体ES细胞的胚胎直至胚泡期，然后植入到代理孕母体中以产生完全源自供体ES细胞的F0啮齿动物。可以通过使用啮齿动物等位基因的丢失和/或人等位基因测定的获得，通过对从剪尾分离的DNA进行基因分型来鉴定携带人核苷酸序列的啮齿动物幼崽。
在一些实施方案中，可以使对于人源化基因而言杂合的啮齿动物杂交以产生纯合的啮齿动物。
采用四重人源化啮齿动物的方法
本文所公开的啮齿动物提供了有用的体内系统和生物材料来源，用于鉴定和测试可用于治疗与失调的IL-36信号传导相关的疾病或病症的化合物。
“与失调的IL-36信号传导相关的疾病”意指其中表现出异常的IL-36信号传导的疾病，这可能直接或间接引起所述疾病或加剧所述疾病的症状。与失调的IL-36信号传导相关的疾病的非限制性实例包括全身性脓疱性牛皮癣(GPP或DITRA)(Marrakchi S.等人,NEngl J.Med.365:620-628(2011)和Onoufriadis A.等人,Am J.Hum Genet 89:432-437(2011)，所述文献以引用的方式整体并入本文)、掌跖脓疱型牛皮癣(PPPP)(BissonnetteR.等人,PLoS One 11:e0155215(2016)，所述文献以引用的方式整体并入本文)、炎性肠病(IBD)(Medina-Contreras等人,J Immunol 196:34-38(2016)；Nishida A.等人,InflammBowel Dis 22:303-314(2016)和Russell SE等人,Mucosal Immunol.9:1193-1204(2016)，所述文献以引用的方式整体并入本文)、类风湿性关节炎和银屑病关节炎(Frey S.等人,Ann Rheum Dis 72:1569-1574(2013)，所述文献以引用的方式整体并入本文)、哮喘、慢性阻塞性肺病(Chen H.等人,J.Proteomics 75:2835-2843(2012)，所述文献以引用的方式整体并入本文)、慢性肾病(Shaik Y.等人,Int J Immunopathol Pharmacol 26:27-36(2013)，所述文献以引用的方式整体并入本文)和鱼鳞病(Paller AS等人,J Allergy ClinImmunol 139:152-165(2017)，所述文献以引用的方式整体并入本文)。
在一些实施方案中，可以使用所公开的啮齿动物评价的化合物包括IL-36信号传导的候选抑制剂，例如但不限于小分子抑制剂、基于核酸的抑制剂(例如，siRNA、核酶、反义构建体等)、抗原结合蛋白(例如，抗体或其抗原结合片段)或封闭肽/肽抑制剂。
在一些实施方案中，候选抑制剂是抗体或其抗原结合片段。单克隆抗体和多克隆抗体都适合在本文所公开的啮齿动物中进行测试。在一些实施方案中，抗体特异性地结合人IL-36R蛋白。在一些实施方案中，抗体特异性地结合人IL-36R蛋白的IL1RL2亚基。
可以通过在本文所公开的啮齿动物中诱导炎症(例如，IMQ诱导的皮肤炎症或DSS诱导的肠道炎症)并确定候选化合物是否可以治疗或抑制所诱导的炎症来评价候选化合物。术语“治疗”或“抑制”包括改善所诱导的炎症和症状或其组合严重性，减慢所诱导的炎症和症状或其组合的进展，消除所诱导的炎症和症状或其组合，延迟或预防所诱导的炎症和症状或其组合的发作。
在一些实施方案中，在施用诱导炎症的药剂之前、同时或之后，向啮齿动物施用候选化合物。候选化合物可以经由各种所需的施用途径(包括肠胃外和非肠胃外施用途径)来给药。肠胃外途径包括例如静脉内、动脉内、门静脉内、肌内、皮下、腹膜内、脊柱内、鞘内、脑室内、颅内、胸膜内或其他注射途径。非肠胃外途径包括例如口服、鼻腔、透皮、肺部、直肠、面颊、阴道、眼部。施用也可以通过连续输注、局部施用、从植入物(凝胶、膜等)持续释放和/或静脉内注射来进行。
在一些实施方案中，合适的对照啮齿动物可以包括，例如，没有经历诱导的炎症的人源化啮齿动物；在没有使用任何化合物或使用预期没有任何治疗功效的对照化合物(例如同种型对照抗体)的经历了诱导的炎症的人源化啮齿动物；和经历了诱导的炎症并且使用了已知具有治疗作用的化合物的人源化啮齿动物。
为了评估候选化合物对皮肤炎症的功效，可以在IMQ治疗之前、期间或之后将化合物施用给啮齿动物。在具体实施方案中，在施用IMQ的皮肤区域处或其附近皮下地施用候选化合物。如果与不施用化合物的对照啮齿动物相比所述化合物抑制皮肤炎症，则认为所述化合物是有效的。例如，如果将总病理得分降低了10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多(例如，降低了20％-90％、20％-80％、20％-70％、20％-60％、20％-50％、20％-40％、30％-90％、30％-80％、30％-70％、30％-60％、30％-50％或30％-40％)；或者如果一种或多种促炎性介质的浓度降低了10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多(例如，降低了20％-90％、20％-80％、20％-70％、20％-60％、20％-50％、20％-40％、30％-90％、30％-80％、30％-70％、30％-60％、30％-50％或30％-40％)，则认为所述化合物是有效的。
为了评估候选化合物对结肠炎症的功效，可以在DSS或噁唑酮治疗之前、期间或之后将化合物施用给啮齿动物。在一些实施方案中，在DSS治疗开始之后数天(例如，5、6、7、8或9天)腹膜内地施用候选化合物。在一些实施方案中，在噁唑酮治疗期间多次腹膜内地施用候选化合物；例如，在局部施用噁唑酮后2-3天、在一次或多次直肠内施用噁唑酮时(例如，在第一次直肠内施用噁唑酮时，以及在第三次直肠内施用噁唑酮时)。如果与不施用化合物的对照DITRA啮齿动物相比所述化合物抑制结肠炎，则认为所述化合物是有效的。例如，如果总病理得分降低了10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多(例如，降低了20％-90％、20％-80％、20％-70％、20％-60％、20％-50％、20％-40％、30％-90％、30％-80％、30％-70％、30％-60％、30％-50％或30％-40％)；如果一种或多种促炎性介质的浓度降低了10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多(例如，降低了20％-90％、20％-80％、20％-70％、20％-60％、20％-50％、20％-40％、30％-90％、30％-80％、30％-70％、30％-60％、30％-50％或30％-40％)；如果粪便Lcn2降低了10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多(例如，降低了20％-90％、20％-80％、20％-70％、20％-60％、20％-50％、20％-40％、30％-90％、30％-80％、30％-70％、30％-60％、30％-50％或30％-40％)；如果结肠匀浆中的MPO活性降低了10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多(例如，降低了20％-90％、20％-80％、20％-70％、20％-60％、20％-50％、20％-40％、30％-90％、30％-80％、30％-70％、30％-60％、30％-50％或30％-40％)；如果结肠长度增加了10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多(例如，减少了20％-90％、20％-80％、20％-70％、20％-60％、20％-50％、20％-40％、30％-90％、30％-80％、30％-70％、30％-60％、30％-50％或30％-40％)；或其组合，则认为所述化合物是有效的。
通过以下实施例进一步说明本说明书，所述实施例不应解释为以任何方式具有限制性。所有引用文献(包括贯穿本申请所引用的参考文献、发布的专利和公布的专利申请)的内容据此以引用的方式整体明确并入。
实施例1.四重人源化小鼠品系的产生
使用
Figure BDA0003879168040000301
技术创建了两个基因工程化小鼠品系(Poueymirou等人,NatBiotechnol.2007年1月；25(1):91-9；Valenzuela等人,Nat Biotechnol 2003年6月；21:652-59；所述文献以引用的方式整体并入本文)：Il1rl2单人源化小鼠品系、以及Il1f6、Il1f8、Il1f9三重人源化小鼠品系。通过将单人源化和三重人源化品系一起交配产生“四重人源化”品系。
单人源化Il1rl2小鼠品系的产生
产生了一种“单人源化”品系，其中编码小鼠Il1rl2(白介素1受体样2蛋白)的细胞外结构域的小鼠Il1rl2基因的部分被编码人IL1RL2的对应细胞外结构域的人IL1RL2基因的片段替换(分别为Il1rl2/IL1RL2外显子3-8，具有插入的内含子和部分侧翼内含子)(图1A)。所得的人源化基因编码一种嵌合受体，所述嵌合受体维持小鼠的细胞内信号传导特异性，同时使细胞外结构域成为人的并能够结合人配体IL1F6、IL1F8和IL1F9，分别也称为IL36A、B和G。纯合的人源化Il1rl2小鼠被称为Il1rl2hu/hu。
更具体地，使用含有小鼠Il1rl2基因的小鼠细菌人工染色体(BAC)克隆RP23-235L22，并如下进行修饰以提供靶向载体。产生DNA片段以包括5’小鼠同源核苷酸序列，约32,389bp的人IL1RL2基因组DNA(含有内含子2的3'346bp、具有所有插入的内含子的外显子3-8、以及内含子8的5'1101bp)、约4,996bp的自缺失新霉素盒和3'小鼠同源序列(图1B)。此DNA片段用于通过细菌细胞中的同源重组来修饰BAC克隆RP23-235L22。结果，在BAC克隆中的编码胞外结构域的小鼠Il1rl2基因组片段(约25,324bp，包括小鼠内含子2的3'155bp、具有所有插入的内含子的外显子3至8、以及小鼠内含子8的5'642bp)被人IL1RL2基因组DNA替换，随后是自缺失新霉素盒(图1B)。所得的经修饰的BAC克隆从5'至3'包括，(i)5’小鼠同源臂，其含有约112.2kb的小鼠基因组DNA、小鼠Il1rl2外显子1-2和内含子2的5’部分；(ii)人IL1RL2基因组片段，其包括内含子2的3'部分、外显子3至8、内含子8的5'部分；(iii)约4,996bp的自缺失新霉素盒，随后是(iv)31.3kb的3’小鼠同源臂，其含有外显子8下游的其余小鼠Il1rl2外显子、所有插入的内含子和3'UTR。参见图1B。在图1B的底部也列出了连接序列。
如上所述，含有人源化Il1rl2基因的经修饰的BAC克隆被用作靶向载体来电穿孔小鼠F1H4胚胎干细胞(50％C57BL/6NTac/50％129S6/SvEvTac)，以创建包含人源化Il1rl2基因的经修饰的ES细胞。通过检测人IL1RL2序列的存在和确认小鼠Il1rl2序列的丧失和/或保留的测定(Valenzuela等人，出处同上)来鉴定包含人源化Il1rl2基因的正向靶向的ES细胞。表5中列出了如上所述的用于确认人源化的引物和探针。一旦选择了正确靶向的ES细胞克隆，就可以切除新霉素选择盒。在图1C中描绘了缺失所述盒后的人源化Il1rl2基因座，连接序列也示于图1C中。
表5
Figure BDA0003879168040000311
Figure BDA0003879168040000321
将选择的ES细胞克隆显微注射到来自哎Charles River Laboratories SwissWebster白化病小鼠的8细胞胚胎中，产生100％源自靶向细胞的F0
Figure BDA0003879168040000322
(Poueymirou等人2007,出处同上)。使用检测到人基因序列存在的等位基因测定改型(Valenzuela等人，出处同上)，通过从剪尾分离的DNA的基因分型，再次确认和鉴定携带人源化基因座的小鼠。通过杂交杂合的动物来制备对于人源化基因座而言纯合的动物。
在图1D中提供了所得的人源化/嵌合Il1rl2受体(SEQ ID NO:7)、小鼠Il1rl2蛋白(SEQ ID NO:4)和人IL1RL2蛋白(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列的比对。
三重人源化小鼠品系的产生
产生了“三重人源化”品系，其中小鼠Il1f6、Il1f8和Il1f9基因中的每个的完整编码序列分别被人IL1F6、IL1F8和IL1F9基因的完整编码序列替换。此策略导致了编码人配体的人源化基因，所述人配体能够结合嵌合Il1rl2受体的人细胞外结构域。纯合的人源化Il1f6、Il1f8、Il1f9小鼠被称为Il1f6hu/hu、Il1f8hu/hu、Il1f9hu/hu。
更具体地，使用含有小鼠Il1f8、Il1f9和Il1f6基因和基因间序列的小鼠细菌人工染色体(BAC)克隆RP23-90G23，并如下进行修饰以提供靶向载体。产生DNA片段以包括5'小鼠同源核苷酸序列、约88,868bp的人基因组DNA(含有启动子、非翻译区、以及人IL1F8、IL1F9和IL1F6的编码序列)、约5,218bp的自缺失潮霉素盒和3’小鼠同源序列(图2B)。此DNA片段用于通过细菌细胞中的同源重组来修饰BAC克隆RP23-90G23。结果，在BAC克隆中的约76,548bp的小鼠基因组片段被人基因组DNA替换，随后是自缺失盒(图2A-2B)。所得的经修饰的BAC克隆从5'至3'包括，(i)5’小鼠同源臂，其含有约5.7kb小鼠基因组DNA，(ii)约88,868bp的人基因组片段(含有启动子、非翻译区、以及人IL1F8、IL1F9和IL1F6的编码序列)，(iii)约5,218bp的自缺失潮霉素盒，和(iv)约29.7kb的3’小鼠同源序列。参见图2B。在图2B的底部也列出了连接序列。
如上所述，含有人IL1F8、IL1F9和IL1F6基因序列的经修饰的BAC克隆被用作靶向载体来电穿孔小鼠F1H4胚胎干细胞(50％C57BL/6NTac/50％129S6/SvEvTac)，以创建包含人IL1F8、IL1F9、和IL1F6基因序列的经修饰的ES细胞。通过检测人序列的存在和确认小鼠序列的丧失和/或保留的测定(Valenzuela等人，出处同上)来鉴定含有人IL1F8、IL1F9、和IL1F6基因序列的的正向靶向的ES细胞。表6中列出了如上所述的用于确认人源化的引物和探针。一旦选择了正确靶向的ES细胞克隆，就可以切除湿霉素选择盒。在图2C中描绘了缺失所述盒后的人源化基因座，连接序列也示于图2C中。
表6
Figure BDA0003879168040000331
将选择的ES细胞克隆显微注射到来自哎Charles River Laboratories SwissWebster白化病小鼠的8细胞胚胎中，产生100％源自靶向细胞的F0
Figure BDA0003879168040000332
(Poueymirou等人2007,出处同上)。使用检测到人基因序列存在的等位基因测定改型(Valenzuela等人，出处同上)，通过从剪尾分离的DNA的基因分型，再次确认和鉴定携带人源化基因座的小鼠。通过杂交杂合的动物来制备对于人源化基因座而言纯合的动物。
三重人源化小鼠品系的产生
通过将单人源化和三重人源化品系一起交配并在100％C57BL/6NTac背景下将两个基因座均繁殖成纯合子来产生“四重人源化”品系。纯合的四重人源化品系被称为Il1rl2hu/hu Il1f6hu/hu Il1f8hu/hu Il1f9hu/hu、或“DITRA样”小鼠。通过自缺失技术在F0生殖系中缺失了Neo和hygro盒。
实施例2.DITRA小鼠的表征
材料和方法
在DITRA样小鼠中的急性和慢性IMQ诱导的皮肤炎症诱导和抗体治疗-为了诱导皮肤炎症，使用小鼠毛发修剪器(Oster,MiniMax，目录#78049-100)对8-10周龄人源化DITRA样雌性小鼠的背部进行剃毛，并在施用IMQ乳霜前三天用0.5g Veet脱毛凝胶对皮肤脱毛。在小鼠剃过毛的背部皮肤上施用可商购获得IMQ乳膏(5％)(Aldara,GM Health CareLimited,NDC 99207-206-12，批号QJ044A)或凡士林(CVS Pharmacy，NDC 59779-902-88)的62.5mg每日局部剂量，对于慢性疾病持续连续四天，对于慢性疾病诱导持续连续九天。62.5mg每日局部剂量的Aldara转化为3.125mg每日剂量的活性化合物。在急性IMQ诱导的皮肤炎症中，在开始IMQ施用之前3天和之后1天以10mg/kg的皮下地施用抗人IL-36R抗体到背部皮肤中。对照组接受PBS和10mg/kg的hIgG4同种型对照注射。在慢性IMQ诱导的皮肤炎症中，在开始IMQ施用之后的第4天和第8天，以10mg/kg治疗性地皮下施用相同的抗人IL-36R抗体到背部皮肤中。治疗后两天或三天，小鼠的背部皮肤开始出现红斑、脱皮和增厚的迹象。每天使用改良版的临床牛皮癣面积和严重性指数测量炎症的严重性。红斑、脱皮和增厚分别以0–4的量表独立评分：0，无；1，轻度；2，中度；3，显著；和4，非常显著(van der Fits等人,J Immunol 2009,182:5836–5845，所述文献以引用的方式整体并入本文)。在急性IMQ诱导的皮肤炎症的第4天和慢性IMQ诱导的皮肤炎症的第11天，使用卡尺(Kaefer)测量皮肤厚度。
组织病理学-将从鼠背6mm直径的皮肤组织固定在10％福尔马林缓冲液中，并用苏木精和曙红对4-5m石蜡包埋的切片进行染色。盲目评价皮肤切片中的角化不全、正角化、芒罗微脓肿、棘皮症、表皮溃疡、真皮和皮下组织的炎症、真皮和皮下组织的血管充血、滤泡性角化过度和上皮增生的存在。使用0-4评分量表：0-在正常范围内，1-最小程度，2-轻度，3-中度和4-重度(van der Fits等人,J Immunol 2009,182:5836–5845，所述文献以引用的方式整体并入本文)。通过将各个组织病理学特点得分相加，计算出每只小鼠的总病理得分。使用GraphPad Prism软件进行数据分析。
测量皮肤匀浆中的细胞因子-取自鼠背的直径为6mm的全厚度皮肤组织，并将其置于含有T-per缓冲液(Thermo Scientific，目录号378510，批号RF236217)和1x Halt蛋白酶抑制剂混合物(Thermo Scientific，目录号87786，批号QG221763)和5M EDTA溶液(ThermoScientifi，目录号3 78429)的15mL管中。使用Polytron(PT10-35 GT-D，目录号9158158)在28000rpm下将皮肤组织破坏1分钟，并放在冰上。将产生的皮肤匀浆在4℃下以1500rpm离心8分钟，并将上清液收集到96孔板中。使用蛋白测定染料(BioRad，目录号500-0006，批号210008149)对皮肤匀浆进行Bradford蛋白测定，以定量总蛋白含量。皮肤匀浆中的细胞因子浓度根据制造商的说明书使用Proinflammatory Panel 1(小鼠)多重免疫测定试剂盒(MesoScale Discovery，目录号K15048D)进行测量。简言之，将50L/孔的校准物和样品(在稀释剂41中稀释)添加到预先用捕获抗体包被的板中，并在室温下以700rpm摇动的同时孵育2小时。然后将板用含有0.05％(w/v)Tween-20的1xPBS洗涤3次，随后添加在稀释剂45中稀释的25μL检测抗体溶液。在室温下在摇动的同时孵育2小时后，将板洗涤3次，并且向每个孔中添加150μL的2x读数缓冲液。立即在MSD
Figure BDA0003879168040000351
仪器上读取电化学发光。使用GraphPad Prism软件进行数据分析。将细胞因子水平相对于总蛋白含量进行归一化。
在DITRA样小鼠中DSS诱导的慢性结肠炎模型的诱导和抗体治疗-为了诱导慢性DSS介导的结肠炎，向12-20周龄、平均体重超过23g的雌性DITRA样小鼠给予在饮用水中的1.5-3％DSS(Sigma-Aldrich目录号87786，批号PJ203966B)持续7天，随后给予蒸馏水持续11-13天。进行第二个周期的DSS治疗(持续4天)，随后加水(5-6天)，直到第27-30天。在研究期间，对照组接受蒸馏水。从第7天开始，每两周以10mg/kg腹膜内地施用抗人IL-36R和mIL-12p40(Bioxcell目录号BE0051，克隆C17.8)抗体。对照组接受10mg/kg的PBS以及相应的hIgG4和大鼠IgG2a(Bioxcell目录号BE0089，克隆2A3)同种型对照注射。每天给小鼠称重并监测结肠炎的临床体征(例如大便稠度和粪便血)。在第27-30天，对小鼠实施安乐死并测量结肠长度。为了评价DSS结肠炎，对以下特征进行了评分：炎症(严重性和程度)、上皮变化(糜烂/溃疡)、隐窝变化(隐窝损失、隐窝炎/隐窝脓肿、再生/增生、杯状细胞损失)、粘膜下水肿和具有病理的组织面积相对于载玻片上总组织面积的百分比。使用0-4评分量表：0-0-在正常范围内，1-最小程度，2-轻度，3-中度和4-重度。通过将各个组织病理学特点得分相加，计算出每只小鼠的总病理得分。
粪便样品中Lcn-2的测量-为了在整个研究过程中监测肠道炎症，每周将来自个体DITRA样小鼠的粪便收集到2mL深孔板中，并储存在-80℃下。研究完成后，将不同天收集的粪便进行匀浆。简言之，将粪便样品用含有0.1％Tween-20、1x Halt蛋白酶抑制剂混合物(Thermo Scientific，目录号87786，批号QG221763)和5M EDTA溶液(Thermo Scientifi，目录号3 78429)的1mL PBS进行重构。在向孔中添加2颗3mm碳化钨珠(Qiagen，目录号69997)之后，将板在振荡器上以最高速度于4℃放置过夜。将同质的粪便悬浮液在4℃下以1200rpm离心10分钟，并将上清液收集到96孔板中。使用小鼠Duoset脂质运载蛋白2/NGAL ELISA试剂盒(R&D Systems，目录号DY1857，批号P116359)根据制造商的说明书测量粪便中的脂质运载蛋白2(Lcn2)水平。使用GraphPad Prism软件进行数据分析。
测量结肠匀浆中的髓过氧化物酶(MPO)活性-取几片结肠远端部分放入2mL微量离心管中，所述微量离心管含有2颗3mm碳化钨珠(Qiagen，目录号69997)并含有T-per缓冲液(Thermo Scientific，目录号378510，批号RF236217)、1x Halt蛋白酶抑制剂混合物(Thermo Scientific，目录号87786，批号QG221763)和5M EDTA溶液(Thermo Scientifi，目录号78429)。使用Qiagen Tissue Lyser II以27.5s-1的频率破坏结肠组织10分钟。将管在4℃下以1500rpm离心8分钟，并将上清液收集到96孔板中。使用蛋白测定染料(BioRad，目录号500-0006，批号210008149)对结肠匀浆进行Bradford蛋白测定，以定量总蛋白含量。使用小鼠MPO ELISA试剂盒(Hycult Biotech，目录号HK210-02，批号21022KO617-Y)根据制造商的说明书测量结肠匀浆中的髓过氧化物酶(MPO)活性。使用GraphPad Prism软件进行数据分析。将MPO水平相对于总蛋白含量进行归一化。
结肠匀浆中细胞因子的测量-皮肤匀浆中的细胞因子浓度根据制造商的说明书使用Proinflammatory Panel 1(小鼠)多重免疫测定试剂盒(MesoScale Discovery，目录号K15048D)进行测量。简言之，将50L/孔的校准物和样品(在稀释剂41中稀释)添加到预先用捕获抗体包被的板中，并在室温下以700rpm摇动的同时孵育2小时。然后将板用含有0.05％(w/v)Tween-20的1xPBS洗涤3次，随后添加在稀释剂45中稀释的25μL检测抗体溶液。在室温下在摇动的同时孵育2小时后，将板洗涤3次，并且向每个孔中添加150μL的2x读数缓冲液。立即在MSD
Figure BDA0003879168040000361
仪器上读取电化学发光。使用GraphPad Prism软件进行数据分析。将细胞因子水平相对于总蛋白含量进行归一化。
统计分析-组内的统计显著性是通过单因子方差与Tukey多重比较后检验确定的(*p<0.05，**p<0.005，***p<0.0005，****p<0.0001)(对于*-与PBS治疗组的统计学意义和#-与对应同种型治疗组的统计学意义都相同)。
结果
人源化DITRA样小鼠在IMQ诱导的牛皮癣模型中表现出增强的皮肤炎症
为了询问与GPP或DITRA(用于“白介素36受体拮抗剂的缺乏”)患者相似的失调的IL-36R信号传导的作用，产生了具有人源化IL-36R(例如Il1rl2)和人IL-36α、β、γ配体但不是IL-36Ra拮抗剂的小鼠，如实施例1所述。所得的hIL-36R/hIL-36α、β、γ小鼠被称为DITRA样小鼠，因为小鼠IL-36Ra对人IL-36R的亲和力降低20倍导致与DITRA患者相似的增强的IL-36R信号传导(对于DITRA患者的更详细讨论，参见例如，Marrakchi等人,N Engl JMed 2011,365:620-628，所述文献以引用的方式整体并入本文)。
在未受挑战的状态下，DITRA样小鼠没有发生任何自发性疾病。相比之下，在就表型和组织学特征而言与人牛皮癣病变非常相似的IMQ诱导的牛皮癣状皮炎的临床前模型中(有关牛皮癣状皮炎的特征的更详细讨论，参见van der Fits等人,J Immunol 2009,182:5836–5845；Swindell等人,PLoS One 2011,6:e18266，所述文献全部以引用的方式整体并入本文)，DITRA样小鼠与其WT同窝幼仔相比显示出增强的皮肤炎症(图3A-图3B)。简言之，每天将IMQ施用于DITRA样和WT小鼠的剃过毛的背部皮肤，持续连续四天。在第5天，收获皮肤用于随后的组织病理学评价、蛋白质和RNA分离。与WT同窝幼仔相比，IMQ治疗的DITRA样小鼠发展出更严重的牛皮癣病变，诸如脱皮、红斑和皮肤增厚(图3A)。与临床特征一致，皮肤的组织病理学评价揭示在DITRA样小鼠中更多增强的棘皮病、角化不全和扰乱的角化细胞分化(图3B)。IMQ治疗的DITRA样小鼠也显示出与GPP患者相似的显著增加的芒罗脓肿或脓疱数量。此外，IMQ施用导致与WT同窝幼仔相比在DITRA样小鼠皮肤中的牛皮癣中失调的促炎性分子(促炎性分子包括例如IL-17a、IL-17f、IL-23a、S100A8、Defb4)水平增加(图3C)。此外，分别与经凡士林治疗的DITRA样小鼠和经凡士林治疗的野生型小鼠相比，在经IMQ治疗的DITRA样小鼠和经IMQ治疗的野生型小鼠中IL-36α、IL-36β和IL-36γmRNA的表达均相等地增加；然而，与野生型小鼠的炎症皮肤中的水平相比，在DITRA样小鼠的炎症皮肤中检测到2倍更高浓度的IL-36α和IL-36β细胞因子的蛋白质水平。
人源化DITRA样小鼠在DSS诱导的慢性结肠炎模型中显示出黏膜愈合的缺陷-近年来，对患者亚组进行的多项研究证明了在IBD中IL-36轴的失调的表达及其对肠道炎症的可能贡献。显示在溃疡性结肠炎患者的炎症黏膜中IL-36α和IL-36β的表达升高(参见Medina-Contreras等人,J Immunol 2016,196:34-38；Nishida等人,Inflamm Bowel Dis 2016,22:303-314，和Russell,Mucosal Immunol 2016,9:1193-1204，所述文献全部以引用的方式整体并入本文)。在临床前模型中，IL-36R缺乏预防DSS和噁唑酮诱导的结肠炎(Medina-Contreras等人,J Immunol 2016,196:34-38；Harusato等人,Mucosal Immunol 2017,10:1455-1467，所述文献全部以引用的方式整体并入本文)。在稳定状态下，DITRA样小鼠没有发生自发性回肠炎/结肠炎，但是在年轻和老年时(分别为3个月大和10个月大)都显示出显著缩短的结肠(图4A和图4B)。另外，在稳定状态下并且与野生型小鼠相比，DITRA样小鼠表现出在结肠中的IL-36细胞因子的水平升高、以及IL-17F和IL-17A水平增加和IL-21水平降低的趋势。
为了评价IL-36轴在肠道炎症中的作用，通过口服施用损伤结肠上皮(Okayasu等人,Gastroenterology 1990,98:694-702，以引用的方式整体并入本文)并引发有效的炎症反应(Rakoff-Nahoum等人,Cell 2004,118:229-241，以引用的方式整体并入本文)从而表现出IBD(特别是溃疡性结肠炎)的主要特征的DSS来使用化学诱导的肠损伤模型。通过施用2.5％DSS持续7天，随后施用11天的水(第一个周期)和1.5％DSS持续4天，随后5天的水(第二个周期)，对DITRA样小鼠及其共同饲养的WT同窝幼仔进行DSS诱导的慢性结肠炎方案。在所述疾病的急性期，类似于共同饲养的WT同窝幼仔，DITRA样小鼠发生肠道炎症(图5A)。有趣的是，在疾病的修复阶段，DITRA样小鼠显示出无法从DSS诱导的粘膜损伤中恢复，这反映在持续的体重减轻(图5A)、结肠长度显著减少(图5B)、更为严重的病理得分(与更严重的溃疡、广泛的上皮糜烂和嗜中性粒细胞浸润相关)(图5C)、粪便脂质运载蛋白2(Lcn2)水平和髓过氧化物酶活性显著增加(图5D)、促炎性细胞因子(诸如KC-GRO、TNF-α和IL-6)上调、以及结肠中IL-22水平的降低(图5E)中。另外，DITRA样小鼠表现出约62.5％的死亡率(数据未显示)。相比之下，WT小鼠在结肠炎的修复阶段确实恢复了，并且具有25％的死亡率。还通过用异硫氰酸荧光素(FITC)-葡聚糖对DITRA样小鼠和野生型小鼠口服灌肠来研究肠上皮完整性。在DSS治疗的第14天，在DITRA样小鼠的血清中观察到FITC-葡聚糖水平的显著增加，表明IL-36途径在肠损伤期间参与调节肠通透性。因此，在DITRA样小鼠中增强的IL-36信号传导导致肠道炎症的加剧和粘膜修复的缺陷，表明IL-36在调节参与肠组织重塑的机制中的作用。
抗人IL-36R单克隆抗体在预防性给药时在DITRA样小鼠中抑制急性皮肤炎症-为了检查IL-36R在皮肤炎症中的作用，在IMQ诱导的银屑病性皮炎模型中测试了抗人IL-36R单克隆抗体。连续四天每天将IMQ施用于DITRA样小鼠的剃过毛的背部皮肤。在开始IMQ施用前3天(-3d)和后一天(d1)以10mg/kg施用抗人IL-36R单克隆抗体。对照组接受10mg/kg的PBS和hIgG4同种型对照注射。在第5天，收获皮肤用于随后的组织病理学评价和蛋白质分离。与PBS和同种型对照治疗组相比，抗人IL-36R单克隆抗体显著降低了IMQ诱导的总病理得分，包括角化不全和芒罗微脓肿(图6A)。人IL-36R阻断还导致KC-GRO、IL-6和TNFα降低66-93％(图6B)。重要的是，抗人IL-36R抗体治疗显著降低了牛皮癣中失调的促炎性细胞因子的水平(例如，IL-12p40、IL-17f和IL-17a)(图6B)，表明在这些细胞因子途径之间的相互作用受到严格调节。观察到的抗人IL-36R单克隆抗体在消除急性IMQ诱导的皮肤炎症中的功效是剂量依赖性的，与1mg/kg的剂量相比，10mg/kg剂量导致对皮肤炎症的抑制更强，如根据病理得分、皮肤厚度和皮肤匀浆中促炎性细胞因子水平所确定的(数据未显示)。
抗人IL-36R单克隆抗体在治疗剂量下抑制慢性皮肤炎症-为了进一步检查体内人IL-36R拮抗作用的治疗功效，在慢性IMQ诱导的皮肤炎症模型中测试了相同的抗人IL-36R单克隆抗体。在两周的持续时间内，在由不进行治疗的两天间隔的两轮中，连续九天将IMQ施用于DITRA样小鼠的剃过毛的背部皮肤。在以10mg/kg的剂量开始IMQ施用后第5天和第9天，皮下地施用抗人IL-36R单克隆抗体。对照组接受10mg/kg的PBS和hIgG4同种型对照注射。在第12天，测量皮肤厚度并收获组织用于随后的组织病理学评价和蛋白质分离。与急性IMQ诱导的炎症相似，延长的IMQ施用会导致DITRA样小鼠皮肤中促炎性介质的上调(数据未显示)。抗人IL-36R单克隆抗体在DITRA样小鼠中在降低IMQ诱导的皮肤厚度和病理学病变得分方面显示出显著的功效(分别为图7A和和7B)。另外，抗人IL-36R单克隆抗体的施用导致在DITRA样小鼠的皮肤中IMQ诱导的促炎性细胞因子产生的显著抑制(图7C)。
总之，这些数据证明了抗人IL-36R抗体在体内改善急性和慢性IMQ诱导的皮肤炎症方面的预防和治疗功效。
抗人IL-36R单克隆抗体在治疗剂量下改善DITRA样小鼠中的DSS诱导的慢性结肠炎-已证明了由于DITRA样小鼠中IL-36信号传导增强而引起的粘膜愈合的缺陷，因此进一步研究了IL-36阻断是否可以挽救观察到的表型。通过施用7天的3％DSS、随后13天的水、持续两个周期，使DITRA样小鼠遭受慢性DSS诱导的结肠炎。从第7天开始，每两周以10mg/kg施用相同的抗人IL-36R单克隆抗体和抗mIL-12p40单克隆抗体(已批准用于治疗克罗恩病的Ustekinumab小鼠替换物)。对照组接受PBS以及10mg/kg的对应的hIgG4和大鼠IgG2a同种型对照注射。与DITRA样小鼠中的PBS和同种型对照治疗相比，用抗人IL-36R单克隆抗体进行的治疗挽救了DITRA样小鼠无法从DSS诱导的粘膜损伤中恢复并且降低了疾病的严重性(图8A)。为了监测在疾病的不同阶段的肠道炎症，每周收集个体小鼠的粪便，以测量粪便脂质运载蛋白2(Lcn2)蛋白，这是肠损伤中炎症的非侵入性生物标志物(程序描述于例如Thorsvik等人,J Gastroenterol Hepatol 2017,32:128-135中，所述文献以引用的方式整体并入本文)。如图8B中所示，与单独的水相比，经PBS、hIgG4和大鼠IgG2a治疗的组在第17天、第23天和第30天显示粪便Lcn2水平的显著上调。与PBS和同种型治疗组相比，抗人IL-36R单克隆抗体的施用令人惊讶地导致Lcn2水平的显著降低。在第17天、第23天和第30天，在抗人IL-36抗体治疗组中观察到粪便Lcn2水平的持续降低(图8B)。
进一步的结果包括用抗人IL-36R单克隆抗体进行的hIL-36R阻断导致在经DSS治疗的DITRA样小鼠的结肠中的结肠长度增加(图8C)和髓过氧化物酶(MPO)活性降低(图8D)和促炎性细胞因子降低61-95％(图8E)。抗人IL-36R单克隆抗体在改善DSS诱导的慢性结肠炎方面显示出与IL-12p40阻断课比较的功效，这反映在DITRA样小鼠结肠中的粪便Lcn2、MPO活性和促炎性细胞因子的水平的相似降低(图8A-图8E)。
在噁唑酮诱导的结肠炎中的IL-36R阻断-在噁唑酮诱导的结肠炎(是组织学与人溃疡性结肠炎类似另一种IBD临床前模型)(Heller等人,Immunity 17,629-638(2002),所述文献以全文引用的方式整体并入)中测试了IL-36R阻断的功效。与PBS和同种型对照治疗组相比，在DITRA样小鼠中预防性施用抗人IL-36R抗体显著降低了噁唑酮诱导的疾病的严重性，如平均体重减轻和平均结肠长度所反应(图9A-图9B)。另外，IL-36R拮抗作用导致在经噁唑酮治疗的DITRA样小鼠的结肠中IL-4和TNF-α的水平显著降低(图9C)。
在整个说明书中引用了各种出版物，包括专利、专利申请、公开的专利申请、登录号、技术文章和学术文章。这些引用的出版物中的每一个出于所有目的均全文以引用方式并入本文件中。

Claims (10)

1.一种经遗传修饰的的啮齿动物，其基因组包含：
(1)在内源性啮齿动物Il1rl2基因座处的人源化Il1rl2基因，其中所述人源化Il1rl2基因编码包含与人IL1RL2蛋白的胞外结构域基本上相同的胞外结构域的人源化Il1rl2蛋白；
(2)在内源性啮齿动物Il1f6基因座处的人IL1F6基因；
(3)在内源性啮齿动物Il1f8基因座处的人IL1F8基因；和
(4)在内源性啮齿动物Il1f9基因座处的人IL1F9基因。
2.根据权利要求1所述的经遗传修饰的啮齿动物，其中所述人源化Il1rl2蛋白包含与所述内源性啮齿动物Il1rl2蛋白的跨膜细胞质序列基本上相同的跨膜细胞质序列。
3.根据权利要求1或2所述的经遗传修饰的啮齿动物，其中所述人源化Il1rl2蛋白包含与所述内源性啮齿动物Il1rl2蛋白的信号肽基本上相同的信号肽。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的经遗传修饰的啮齿动物，其中所述人IL1RL2蛋白包含如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
5.根据权利要求1-3中任一项所述的经遗传修饰的啮齿动物，其中所述人源化Il1rl2蛋白的所述胞外结构域包含SEQ ID NO:7的氨基酸22-337。
6.根据权利要求1-3中任一项所述的经遗传修饰的啮齿动物，其中所述人源化Il1rl2蛋白包含如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的经遗传修饰的啮齿动物，其中所述人源化Il1rl2基因有效地连接至在所述内源性啮齿动物Il1rl2基因座处的所述内源性啮齿动物Il1rl2启动子。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的经遗传修饰的啮齿动物，其中所述人源化Il1rl2基因是通过用人IL1RL2基因的核苷酸序列替换在所述内源性啮齿动物Il1rl2基因座处的所述内源性啮齿动物Il1rl2基因的基因组片段而产生的。
9.根据权利要求8所述的经遗传修饰的啮齿动物，其中所述人IL1RL2基因的核苷酸序列是基本上编码所述人IL1RL2蛋白的所述胞外结构域的所述人IL1RL2基因的基因组片段。
10.根据权利要求9所述的经遗传修饰的啮齿动物，其中所述人IL1RL2基因的所述基因组片段包含所述人IL1RL2基因的外显子3-8。
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