JP6838131B2 - ヒト化IL−4およびIL−4Rα動物 - Google Patents
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Description
本出願は、2014年5月7日出願の米国仮特許出願第61/989,757号の優先権の利益を主張するものであり、当該仮特許出願の内容全体は参照により本明細書に組み込まれる。
2015年5月7日に作成され、EFS−Webを介して米国特許商標庁に提出された31260_SEQ.txtという名称の16KBのASCIIテキストファイルの形態をとる配列表が、参照により本明細書に組み込まれる。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される:
(項目1)
内因性齧歯類IL−4R遺伝子のヒト化を含む齧歯類であって、前記ヒト化が、改変されたIL−4遺伝子を形成するための、内因性齧歯類IL−4遺伝子座における、ヒトIL−4遺伝子の少なくとも1つのエクソンを含む核酸配列によるIL−4遺伝子のエクソンを含む齧歯類核酸の置換を含み、前記改変されたIL−4遺伝子の発現が、前記内因性齧歯類IL−4遺伝子座の齧歯類調節エレメントの制御下にある、齧歯類。
(項目2)
前記齧歯類がマウスまたはラットである、項目1に記載の齧歯類。
(項目3)
前記改変されたIL−4遺伝子が、ヒトまたはヒト化IL−4タンパク質をコードし、前記ヒトIL−4遺伝子のATG開始コドンから開始するエクソン1からエクソン4までを含む、項目1に記載の齧歯類。
(項目4)
前記齧歯類が、マウスIL−4タンパク質を発現する能力を有しないマウスである、項目1に記載の齧歯類。
(項目5)
前記齧歯類が、内因性マウスIL−4Rα遺伝子によってコードされたマウスIL−4Rαタンパク質を発現するマウスである、項目1に記載の齧歯類。
(項目6)
前記齧歯類が、ヒトまたはヒト化IL−4Rαタンパク質を発現するマウスである、項目1に記載の齧歯類。
(項目7)
前記ヒト化IL−4Rαタンパク質が、前記ヒトIL−4Rαタンパク質の細胞外ドメインを含む、項目6に記載のマウス。
(項目8)
前記ヒト化IL−4Rαタンパク質が、前記マウスIL−4Rαタンパク質の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含む、項目7に記載のマウス。
(項目9)
前記マウスが、改変されたIL−4Rα遺伝子を形成するための、内因性マウスIL−4Rα遺伝子座における、ヒトIL−4Rα遺伝子の少なくとも1つのエクソンをコードする核酸配列によるマウスIL−4Rα遺伝子のエクソンを含むマウス核酸の置換を含み、前記改変されたIL−4Rα遺伝子の発現が、前記内因性マウスIL−4Rα遺伝子座のマウス調節エレメントの制御下にある、項目6に記載のマウス。
(項目10)
前記齧歯類がマウスであり、マウスIL−4のATG開始コドンから開始するエクソン1からエクソン4までを含むマウスIL−4配列の連続ゲノム断片が、ヒトIL−4のATG開始コドンから開始するエクソン1からエクソン4までを含むヒトIL−4配列の連続ゲノム断片で置換されている、項目1に記載の齧歯類。
(項目11)
前記齧歯類が、機能性内因性マウスIL−4タンパク質を発現するが前記置換を含まない同齢のマウスの血清中に存在するマウスIL−4タンパク質のレベルの少なくとも約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、110%、120%、130%、140%、150%、160%、170%、180%、190%、または200%の濃度にてヒトまたはヒト化IL−4タンパク質を血清中に発現するマウスである、項目1に記載の齧歯類。
(項目12)
前記齧歯類が、機能性内因性マウスIL−4タンパク質を発現するが前記置換を含まない同齢のマウスの血清中に存在するマウスIL−4タンパク質のレベルの約10%〜約200%、約20%〜約150%、または約30%〜約100%の濃度にてヒトIL−4タンパク質を血清中に発現するマウスである、項目1に記載の齧歯類。
(項目13)
内因性齧歯類IL−4Rα遺伝子のヒト化を含む齧歯類であって、前記ヒト化が、ヒト化IL−4Rα遺伝子を形成するための、内因性齧歯類IL−4Rα遺伝子座における、ヒトIL−4Rα遺伝子の少なくとも1つのエクソンを含む核酸配列による齧歯類IL−4Rα遺伝子のエクソンを含む齧歯類核酸の置換を含み、前記ヒト化IL−4Rα遺伝子の発現が、前記内因性齧歯類IL−4Rα遺伝子座の齧歯類調節エレメントの制御下にある、齧歯類。
(項目14)
前記齧歯類がマウスまたはラットである、項目13に記載の齧歯類。
(項目15)
前記ヒト化IL−4Rα遺伝子が、ヒトまたはヒト化IL−4Rαタンパク質をコードし、前記ヒトIL−4Rα遺伝子のATG開始コドンから開始するエクソン1からエクソン5までを含む、項目13に記載の齧歯類。
(項目16)
前記齧歯類が、マウスIL−4Rαタンパク質を発現する能力を有しないマウスである、項目13に記載の齧歯類。
(項目17)
前記齧歯類が、内因性マウスIL−4遺伝子によってコードされたマウスIL−4タンパク質を発現するマウスである、項目13に記載の齧歯類。
(項目18)
前記齧歯類が、ヒトまたはヒト化IL−4タンパク質を発現するマウスである、項目17に記載のマウス。
(項目19)
前記マウスが、改変されたIL−4遺伝子を形成するための、内因性マウスIL−4遺伝子座における、ヒトIL−4遺伝子の少なくとも1つのエクソンを含む核酸配列によるマウスIL−4遺伝子のエクソンを含むマウス核酸の置換を含み、前記改変されたIL−4遺伝子の発現が、前記内因性マウスIL−4遺伝子座のマウス調節エレメントの制御下にある、項目18に記載のマウス。
(項目20)
前記齧歯類がマウスであり、マウスIL−4RαのATG開始コドンから開始するエクソン1からエクソン5までを含むマウスIL−4Rα配列の連続ゲノム断片が、ヒトIL−4RαのATG開始コドンから開始するエクソン1からエクソン5までを含むヒトIL−4Rα配列の連続ゲノム断片で置換されている、項目13に記載の齧歯類。
(項目21)
前記齧歯類が、機能性内因性マウスIL−4Rαタンパク質を発現するが前記置換を含まない同齢のマウスのB細胞および/またはT細胞のいずれかの免疫細胞上に存在するマウスIL−4Rαタンパク質のレベルの少なくとも約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、110%、120%、130%、140%、150%、160%、170%、180%、190%、または200%の量にて、B細胞および/またはT細胞のいずれかの免疫細胞上にヒトまたはヒト化IL−4Rαタンパク質を発現するマウスである、項目13に記載の齧歯類。
(項目22)
前記齧歯類が、機能性内因性マウスIL−4Rαタンパク質を発現するが前記置換を含まない同齢のマウスのB細胞および/またはT細胞のいずれかの免疫細胞上に存在するマウスIL−4Rαタンパク質のレベルの約10%〜約200%、約20%〜約150%、または約30%〜約100%の量にて、B細胞および/またはT細胞のいずれかの免疫細胞上にヒトまたはヒト化IL−4Rαタンパク質を発現するマウスである、項目13に記載の齧歯類。
(項目23)
ヒト化した齧歯類を作製するための方法であって、ヒトまたはヒト化IL−4タンパク質をコードする改変されたIL−4遺伝子を形成するために、ヒトIL−4遺伝子の1つ以上のエクソンを含むヒトIL−4核酸配列で齧歯類IL−4核酸配列を置換することを含み、前記置換が、内因性齧歯類IL−4遺伝子座にあり、ヒトIL−4遺伝子配列の1つ以上のエクソンを含む前記改変されたIL−4遺伝子配列が、内因性齧歯類IL−4遺伝子座の齧歯類調節エレメントまたは配列に作動可能に連結される、方法。
(項目24)
前記齧歯類がマウスまたはラットである、項目23に記載の方法。
(項目25)
前記齧歯類調節エレメントまたは配列がマウスまたはラットに由来する、項目23に記載の方法。
(項目26)
前記齧歯類調節エレメントまたは配列が、前記齧歯類IL−4遺伝子座の内因性齧歯類調節エレメントまたは配列である、項目23に記載の方法。
(項目27)
前記齧歯類IL−4核酸配列と置き換わる前記ヒトIL−4核酸配列が、前記ヒトIL−4遺伝子配列の少なくとも1つのエクソンを含む、項目23に記載の方法。
(項目28)
前記齧歯類IL−4核酸配列と置き換わる前記ヒトIL−4核酸配列が、前記ヒトIL−4遺伝子配列の少なくとも2つまたは少なくとも3つのエクソンを含む、項目27に記載の方法。
(項目29)
前記齧歯類IL−4核酸配列と置き換わる前記ヒトIL−4核酸配列が、前記ヒトIL−4遺伝子配列の4つのエクソンを全て含む、項目28に記載の方法。
(項目30)
前記置換が内因性齧歯類IL−4遺伝子座にあり、前記ヒトIL−4遺伝子配列の1つ以上のエクソンを含む前記ヒトIL−4核酸配列が、前記内因性齧歯類IL−4遺伝子座の内因性齧歯類調節エレメントまたは配列に作動可能に連結される、項目23に記載の方法。
(項目31)
ヒト化IL−4マウスを作製するための方法であって、ヒトまたはヒト化IL−4タンパク質をコードする改変されたIL−4遺伝子を形成するために、マウスIL−4核酸配列をヒトIL−4核酸で置換することを含む、方法。
(項目32)
前記置換が内因性マウスIL−4遺伝子座にあり、ヒトまたはヒト化IL−4タンパク質をコードする前記改変された遺伝子が、内因性マウス調節配列に作動可能に連結される、項目31に記載の方法。
(項目33)
前記置換が内因性マウスIL−4遺伝子座にあり、ヒトまたはヒト化IL−4タンパク質をコードする前記改変された遺伝子が、内因性マウス調節配列に作動可能に連結される、項目31に記載の方法。
(項目34)
ヒト化した齧歯類を作製するための方法であって、ヒトまたはヒト化IL−4Rαタンパク質をコードする改変されたIL−4Rα遺伝子を形成するために、ヒトIL−4Rα遺伝子配列の1つ以上のエクソンを含むヒトIL−4Rα核酸配列で齧歯類IL−4Rα核酸配列を置換することを含み、前記置換が、内因性齧歯類IL−4Rα遺伝子座にあり、ヒトまたはヒト化IL−4Rαタンパク質をコードする前記改変されたIL−4Rα遺伝子が、前記内因性齧歯類IL−4Rα遺伝子座の齧歯類調節エレメントまたは配列に作動可能に連結される、方法。
(項目35)
前記齧歯類がマウスまたはラットである、項目34に記載の方法。
(項目36)
前記齧歯類調節エレメントまたは配列がマウスまたはラットに由来する、項目34に記載の方法。
(項目37)
前記齧歯類調節エレメントまたは配列が、前記齧歯類IL−4Rα遺伝子座の内因性齧歯類調節エレメントまたは配列である、項目34に記載の方法。
(項目38)
前記齧歯類IL−4Rα遺伝子配列と置き換わる前記ヒトIL−4Rα遺伝子配列が、前記ヒトIL−4Rα遺伝子配列の少なくとも1つのエクソンを含む、項目37に記載の方法。
(項目39)
前記齧歯類IL−4Rα核酸配列と置き換わる前記ヒトIL−4Rα核酸配列が、前記ヒトIL−4Rα遺伝子配列の少なくとも2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、または8つのエクソンを含む、項目38に記載の方法。
(項目40)
前記齧歯類IL−4Rα核酸配列と置き換わる前記ヒトIL−4Rα核酸配列が、前記ヒトIL−4Rα遺伝子配列の9つのエクソンを全て含む、項目39に記載の方法。
(項目41)
前記置換が内因性齧歯類IL−4Rα遺伝子座にあり、ヒトまたはヒト化IL−4Rαタンパク質をコードする前記改変されたIL−4Rα遺伝子が、前記内因性齧歯類IL−4Rα遺伝子座の内因性齧歯類調節エレメントまたは配列に作動可能に連結される、項目34に記載の方法。
(項目42)
ヒト化したマウスを作製するための方法であって、ヒト化IL−4Rα遺伝子を形成するために、ヒトIL−4Rαの細胞外ドメインをコードするヒトゲノム断片によりマウスIL−4Rαの細胞外ドメインをコードするマウスエクソンを置換することを含む、方法。
(項目43)
前記置換が内因性マウスIL−4Rα遺伝子座にあり、前記ヒト化IL−4Rα遺伝子がマウス調節配列に作動可能に連結される、項目42に記載の方法。
(項目44)
前記置換が内因性マウスIL−4Rα遺伝子座にあり、前記ヒト化IL−4Rα遺伝子が内因性マウス調節配列に作動可能に連結される、項目42に記載の方法。
(項目45)
ヒト化IL−4Rα遺伝子およびヒト化IL−4遺伝子を含む齧歯類であって、前記ヒト化IL−4Rα遺伝子は、ヒトIL−4Rα細胞外ドメインをコードする配列による齧歯類IL−4Rα細胞外ドメインをコードする配列の置換から結果として得られ、前記ヒト化IL−4Rα遺伝子は、齧歯類IL−4Rα膜貫通ドメインをコードする配列と齧歯類IL−4Rα細胞質ドメインをコードする配列とを含み、前記ヒト化IL−4Rα遺伝子は、内因性齧歯類IL−4Rα遺伝子座の内因性齧歯類IL−4Rα調節エレメントの制御下にあり、前記ヒト化IL−4遺伝子は、ヒトまたはヒト化IL−4タンパク質をコードし、前記ヒト化IL−4遺伝子は、内因性齧歯類IL−4R遺伝子座の内因性齧歯類IL−4調節エレメントの制御下にある、齧歯類。
(項目46)
前記齧歯類がマウスまたはラットである、項目45に記載の齧歯類。
(項目47)
前記齧歯類が、マウスIL−4タンパク質を発現する能力を有しないマウスであってマウスIL−4Rαタンパク質を発現する能力を有しないマウスである、項目45に記載の齧歯類。
(項目48)
前記内因性齧歯類IL−4遺伝子座および/または内因性齧歯類IL−4Rα遺伝子座の前記齧歯類調節エレメントまたは配列が、マウスまたはラット由来である、項目45に記載の齧歯類。
(項目49)
前記齧歯類調節エレメントまたは配列が、前記齧歯類IL−4遺伝子座および/または齧歯類IL−4Rα遺伝子座の内因性齧歯類調節エレメントまたは配列である、項目45に記載の齧歯類。
(項目50)
ヒト特異的なIL−4またはIL−4Rα拮抗薬をスクリーニングする方法であって、
二重にヒト化したIL−4およびIL−4Rαマウスを提供することと、
前記マウスにおいて肺の炎症を誘発することと、
薬剤を前記マウスに投与することと、
前記薬剤によって肺の炎症が低減するかどうかを判定することと、
前記薬剤を、肺の炎症を低減するその能力に基づいてヒト特異的なIL−4またはIL−4Rα拮抗薬として同定することと、
を含む方法。
(項目51)
気道内の粘液貯留、気管支肺胞洗浄液中の好酸球性浸潤細胞、および/または総循環IgEを測定することによって肺の炎症の程度が判定される、項目50に記載の方法。
(項目52)
ヒト特異的なIL−4またはIL−4Rα拮抗薬をスクリーニングする方法であって、
二重にヒト化したIL−4およびIL−4Rαマウスを提供することと、
前記マウスにおいて皮膚炎症を誘発することと、
薬剤を前記マウスに投与することと、
前記薬剤によって皮膚炎症が低減するかどうかを判定することと、
前記薬剤を、皮膚炎症を低減するその能力に基づいてヒト特異的なIL−4またはIL−4Rα拮抗薬として同定することと、
を含む方法。
(項目53)
ヒト化IL−4Rα遺伝子が、ヒトIL−4Rα細胞外ドメインをコードする配列によるネズミのIL−4Rα細胞外ドメインをコードする配列の置換から結果として得られ、前記ヒト化IL−4Rα遺伝子が内因性のネズミのIL−4Rα遺伝子座の内因性のネズミのIL−4Rα調節エレメントの制御下にあり、ヒト化IL−4遺伝子がヒトまたはヒト化IL−4タンパク質をコードし、前記ヒト化IL−4遺伝子は、内因性齧歯類IL−4R遺伝子座の内因性齧歯類IL−4調節エレメントの制御下にある、項目50または52に記載の方法。
アレルギー性疾患は、特に先進国において、加速度的に増加して発生する、ある範囲の疾患である。アトピー性皮膚炎、喘息、およびアレルギー性鼻炎は、アレルギーを有する患者の中でも最も一般的な炎症状態であり、これらの患者はしばしば多重の臨床症状の発症を患う。アレルギーの病因は、外因性抗原に対する異常な免疫応答に関連付けられる(Mueller et al.(2002)Structure,binding,and antagonists in the IL−4/IL−13 receptor system,Biochim Biophys Acta 1592:237−250を参照のこと)。
IL−4遺伝子は、B細胞ならびに他の細胞タイプの活性化において重要な役割を果たす、分泌されるIL−4タンパク質をコードする(図1を参照のこと)。
IL−4Rα遺伝子は膜貫通受容体IL−4Rαタンパク質をコードし、IL−4Rαタンパク質は、主にB細胞およびT細胞上に発現し、IL−4タンパク質およびIL−13タンパク質に対する受容体である(図1を参照のこと)。
本明細書に示すように、野生型マウスではマウスIL−4は機能するが、ヒトIL−4は機能せず、また逆に、ヒト化IL−4Rα(Il4rahu/hu)マウスではヒトIL−4は機能するが、マウスIL−4は機能しない。(例えば、Andrews et al.(2001)Reconstitution of a functional human type II IL−4/IL−13 receptor in mouse B cells:demonstration of species specificity,J Immunol.166:1716−1722も参照のこと)。
IL−4またはIL−4Rαタンパク質を標的とする治療用分子の候補は典型的には薬物動態学(PK)および薬力学(PD)について非ヒト動物(例えば、齧歯類、例えば、マウスまたはラット)で評価される。かかる治療用分子は、異常なTh2細胞に関連するヒトの疾患、障害、および状態のモデルである非ヒト動物(例えば、齧歯類、例えば、マウスまたはラット)においてインビボでの治療有効性についても試験される。
本明細書では、ヒトまたはヒト化IL−4および/またはヒトまたはヒト化IL−4Rαタンパク質をコードする改変されたIL−4遺伝子および/または改変されたIL−4Rα遺伝子を形成するために、内因性IL−4遺伝子座および/またはIL−4Rα遺伝子座において、ヒトIL−4核酸および/またはヒトIL−4Rα核酸により、その内因性IL−4遺伝子および/またはIL−4Rα遺伝子が全体的または部分的に置換されている遺伝子改変非ヒト動物が提供される。
齧歯類などの遺伝子改変非ヒト動物を当該技術分野で既知の方法を使用して作製できる。例えば、非ヒト動物と相同性の上流領域および下流領域に隣接したヒト核酸(ヒトIL−4またはIL−4Rα遺伝子などの全体または部分)を含有する標的化ベクターを作製できる。標的化構築物は、ヒト核酸に対して3’側に位置する薬剤選択カセット(例えば、一過性Cre発現ベクターによって後で除去できるloxP導入hygro選択カセット)も含む可能性がある。標的化ベクターを、例えば、電気穿孔法によって非ヒト動物細胞、例えば胚性幹(ES)細胞(マウスES細胞などの)、のゲノム中に導入できる。次いで、適正に標的化されたES細胞クローンを初期胚(例えば、8細胞期のマウス胚)に導入できる。適正に標的化されたES細胞に完全に由来する非ヒト動物は、例えば対立遺伝子解析に基づいて同定される。好適な遺伝子改変可能ES細胞が直ちに利用可能でない非ヒト動物については、本明細書に記載されるような遺伝子改変を含む非ヒト動物を作製するために他の方法を採用できる。かかる方法としては、例えば、非ES細胞ゲノム(例えば、線維芽細胞または誘発された多能性細胞)を改変すること、および核移植を利用して好適な細胞、例えば卵母細胞、に改変されたゲノムを導入すること、および改変された細胞(例えば、改変された卵母細胞)を胚の形成に好適な条件下で非ヒト動物に懐胎させることが挙げられる。
一態様では、本明細書に開示される遺伝子改変IL−4および/またはIL−4Rα非ヒト動物は、以下の実施例でさらに例示されるように、ヒト特異的なIL−4および/またはIL−4Rα拮抗薬、例えば中和性の抗IL−4抗体および/または抗IL−4Rα抗体(例えば、デュピルマブ)、の薬力学(PD)および治療有効性を様々な疾患モデルにおいて評価するために使用される。
ヒトIL−4遺伝子による内因性マウスIL−4遺伝子の置換
ヒトIL−4遺伝子のATG開始コドンから開始するエクソン1からエクソン4まで(3’非翻訳領域を含む)のコーディング部分およびエクソン4の下流の3’領域の一部分を含有する8.8kbのヒトIL−4遺伝子により、ATG開始コドンから開始するエクソン1からエクソン4まで(3’非翻訳領域を含む)のコーディング部分およびエクソン4下流の3’領域の一部分に広がる6.3kbのネズミのIL−4遺伝子遺伝子座を置換した。図2Aを参照のこと。
ヒトIL−4Rα細胞外ドメイン遺伝子配列による内因性マウスIL−4Rα細胞外ドメイン遺伝子配列の置換
ヒトIL−4Rα遺伝子の、ATG開始コドンから開始するエクソン1からエクソン5まで、およびイントロン5の一部分、を含む15.6kbのヒトIL−4Rα遺伝子により、ATG開始コドンから開始するコーディングエクソン1からエクソン5およびイントロン5の一部分まで広がる7.1kbのネズミIL−4Rα遺伝子遺伝子座を置換した。マウスのエクソン6から9は保持され、エクソン1から5(すなわち、細胞外ドメイン)のみがヒト化された。図2Bを参照のこと。
二重にヒト化したIL−4/IL−4Rαマウスの生成
二重にヒト化したIL−4/IL−4Ra(Il4hu/hu/Il4rahu/hu)マウスを以下のように生成した。ヒト化IL−4Rα遺伝子およびloxP導入neoカセットを含むES細胞クローンMAID 803を、Cre発現ベクターを用いて電気穿孔し、loxP導入neoカセットを除去して、薬剤選択カセット無しでヒト化IL−4Rα遺伝子を含むES細胞クローンMAID 1444を生成した(実施例2を参照のこと)。ヒト化IL−4遺伝子およびloxP導入hygroカセットを含む、ES細胞クローンMAID 879を生成するために使用された同一の標的化構築物(実施例1を参照のこと)を、ES細胞クローンMAID 1444に電気穿孔して、879 Het/1444 Het(Il4+/hu/Il4ra+/hu)ES細胞を生成し、続いてこれを、Cre発現ベクターを用いて電気穿孔して、loxP導入hygroカセットを除去し、ヒト化IL−4遺伝子およびヒト化IL−4Rα遺伝子を含むES細胞クローン(MAID 1553/1444)を生成した。二重にヒト化したIL−4/IL−4Rαマウスを生成するために、薬剤カセットを有しないES細胞クローンMAID 1553/1444を8細胞期のSWマウス胚に導入した。
ヒトIL−4遺伝子置換およびヒトIL4Rα遺伝子置換を有するマウスにおける、完全ヒトIL−4Rα mAbであるデュピルマブの有効性評価
方法
8.8kbのヒトIL−4ゲノム配列によるマウス全長IL−4遺伝子座の置換(実施例1および図2Aを参照のこと)、および対応するヒトIL−4RαゲノムDNAの15.6kbの断片によるマウスIL−4Rα(CD124)遺伝子の細胞外領域(すなわち、細胞外ドメイン)の置換(実施例2および図2Bを参照のこと)の両方のために、VelociGene(登録商標)技術を使用して、遺伝子改変マウスを生成した。
ヒト化IL−4Rαマウスは以下を示すように特徴付けられた。(a)二重にヒト化したIL−4/IL−4Rα(Il4hu/hu/Il4rahu/hu)マウス由来の初代細胞上のヒトIL−4Rαの発現(図3を参照のこと)、(b)ヒト化IL−4Rα(Il4rahu/hu)マウスにおけるIL−4リガンド特異性の変化(図4を参照のこと)、および(c)ヒト化IL−4Rα(Il4rahu/hu)マウスにおけるIL−13経路の機能性(図4を参照のこと)。
上記結果は、サイトカインに誘発された炎症を有する遺伝子改変マウスモデルにおける、完全ヒト抗ヒトIL−4Rαモノクローナル抗体であるデュピルマブの薬理活性を実証している。
チリダニ類抽出物(HDM)に誘発された肺炎症モデル
チリダニ類(HDM)抽出物(Greer laboratories)の鼻腔内曝露によって、二重にヒト化したIL−4およびIL−R4αマウスにおいて慢性気道炎症を誘発した。簡潔に述べると、先ず、10日間のHDM懸濁液(2.5μg/mLの濃度にて20μl)の鼻腔内滴下によってマウスの感受性を高めた。2週間の回復期間後、5週目と12週目との間に週3回、鼻腔内HDM適用によってマウスは再曝露された。皮下注射によるデュピルマブ(抗IL4Rα抗体)の処置を、週に2回の頻度で7週目から開始し、12週目の実験終了まで行った。さらなる解析のために、組織サンプルを回収した。図8に実験計画を図示する。
上述のプロトコルを使用して、二重にヒト化したIL−4およびIL−4Rα(IL−4hu/hu/IL−4Rhu/hu)マウスにおいて気道疾患を誘発した。肺組織の組織学的解析により、鼻腔内へのHDM滴下が気道における粘液産生の増加を引き起こしたことが示された。デュピルマブの処置は、HDMに曝露されたマウスにおける粘液貯留を低減した。気管支肺胞洗浄液(BALF)中の浸潤細胞の解析により、好酸球数が、HDM滴下によって増加し、デュピルマブの処置によって減少したことが示される。ヒト化したマウスにおけるHDMの処置によって総循環IgEが上昇したが、これは有能なIL−4シグナル伝達経路を示唆する。デュピルマブの使用により、IgEのレベルを低減できた。対照的に、IL−4シグナル伝達に干渉することなくIL−13とのみ拮抗するコンパレーター分子であるIL13R2α−Fcは、粘液貯留の低減および好酸球浸潤の防止において同等の活性を有した。にもかかわらず、循環IgEレベルでは、デュピルマブとIL−13拮抗薬であるIL13R2α−Fcとの間で差を示す効果が検出された。IL−13経路単独の遮断は、HDMに誘発されたIgEレベルを低減するには不十分であったが、一方で、デュピルマブは、IL−4経路およびIL−13経路の両方を遮断することによって、アレルギーの主たる病原性媒介物であるIgEの産生を低減した。
抗原に誘発された皮膚炎症モデル
二重にヒト化したIl−4およびIl−4Rαマウスにおける慢性皮膚炎を、以下の手順で誘発できる。ヒト化したマウスの背中の毛を電気バリカンで剃り、次いで粘着テープで剥いで軽い傷を負わせ、皮膚バリアを破壊した。アレルゲン(オボアルブミンに細菌毒素またはチリダニ類抽出物を加えたものなど)の溶液に浸したガーゼパッチを1週間、皮膚に取り付け、これに続く2週間を回復期間とした。合計で7週間の間に、この手順を3回繰り返し、アトピー性皮膚炎様の皮膚病巣を誘発する。処置したマウスは、IgEレベルの増加、掻痒、上皮の肥厚、アトピー性皮膚炎の典型的な症状を有することになる。
ヒト化IL−4Rαを発現するマウスにおける抗ヒトIL−4Rα抗体のPKプロファイルの特徴付け
この実施例は、REGN668(ヒトIL−4Rαを対象とするヒトモノクローナル抗体、「デュピルマブ」としても知られる)および対照抗体REGN646(サル代用、抗mfIL−4R非結合対照抗体)のPKプロファイルを評価するために実施される実験を記載する。
ヒト化IL−4および/またはIL−4Rαは、ヒト特異的なIL−4および/またはIL−4Rα拮抗薬(例えば、中和性の抗IL−4抗体および/または抗IL−4Rα抗体、例えば、デュピルマブ)の薬力学(PD)を評価するために有用である。
ヒトIL−33遺伝子による内因性マウスIL−33遺伝子の置換
マウスIL−33遺伝子(NCBI遺伝子ID:77125、一次ソース:MGI:1924375;RefSeq転写物:NM_001164724.1;UniProt ID:Q8BVZ5;ゲノムアセンブリ:NCBI37/mm9;場所:chr19:29,999,604−30,035,205 +ストランド)は、8個のエクソンを有し、266アミノ酸のタンパク質をコードする(GenBank Accession No. NP_001158196.1)。
上流(「mTU」):
フォワードプライマー、TTGGACTAGTAACAAGAAGGGTAGCA(配列番号:31);
リバースプライマー、CCTTTCCCATCACCCTCTAACTT(配列番号:32);
プローブ(MGB)、AGCTCTGGTGGACAGA(配列番号:33);
下流(「mTD」):
フォワードプライマー、TCTCTGCCAAGCTGCTTATCC(配列番号:34);
リバースプライマー、GGCTGCATGGAAGAGGTGAA(配列番号:35);
プローブ(MGB)、CTCTCCACAAATCG(配列番号:36)。
上流(「hTU」)
フォワードプライマー、CAGGCAGGAATAGCTGAGATAATCT(配列番号:37);
リバースプライマー、TGTGGAGCAAAAAGTGGTTGAT(配列番号:38);
プローブ(MGB)、CCTGTGAATAGTGATAAAC(配列番号:39);
下流(「hTD」):
フォワードプライマー、CAGTTCCAAACGATAGGCTCAA(配列番号:40);
リバースプライマー、ATAATTCTGTGAAGCATCTGGTCTTC(配列番号:41);
プローブ(MGB)、CTAGAGCTGCTAGTAAAA(配列番号:42)。
Claims (17)
- 三重にヒト化したマウスであって、
(i)ヒト化IL−4Rα遺伝子を形成するための、内因性マウスIL−4Rα遺伝子座における、ヒトIL−4Rα遺伝子のヒトゲノムDNAによる、マウスIL−4Rα遺伝子のゲノムDNAの置換であって、前記マウスIL−4Rα遺伝子の前記ゲノムDNAが、前記マウスIL−4Rα遺伝子のエクソン1のATG開始コドンからエクソン5までを含み、前記ヒトIL−4Rα遺伝子の前記ヒトゲノムDNAが、前記ヒトIL−4Rα遺伝子のエクソン1のATG開始コドンからエクソン5までを含み、前記ヒト化IL−4Rα遺伝子が、前記ヒトIL−4Rα遺伝子のエクソン1のATG開始コドンからエクソン5までと、前記マウスIL−4α遺伝子のエクソン6から9までを含み、前記ヒト化IL−4Rα遺伝子の発現が、前記内因性マウスIL−4Rα遺伝子座におけるマウスIL−4Rαプロモーターの制御下にある、置換;
(ii)ヒト化IL−4遺伝子を形成するための、内因性マウスIL−4遺伝子座における、ヒトIL−4遺伝子のゲノムDNAによる、マウスIL−4遺伝子のゲノムDNAの置換であって、前記マウスIL−4遺伝子の前記ゲノムDNAが、前記マウスIL−4遺伝子のエクソン1のATG開始コドンからエクソン4までを含み、前記ヒトIL−4遺伝子の前記ゲノムDNAが、前記ヒトIL−4遺伝子のエクソン1のATG開始コドンからエクソン4までを含み、前記ヒト化IL−4遺伝子の発現が、前記内因性マウスIL−4遺伝子座におけるマウスIL−4プロモーターの制御下にある、置換;および
(iii)内因性マウスIL−33遺伝子座における、前記遺伝子座がマウスIL−33ではなくヒトIL−33をコードするようになる、ヒトIL−33遺伝子のゲノムDNAによる、マウスIL−33遺伝子のゲノムDNAの置換
を含む、マウス。 - 置き換わる前記内因性マウスIL−33遺伝子座において、前記マウスIL−33遺伝子の前記ゲノムDNAが、前記マウスIL−33遺伝子のエクソン2のATG開始コドンからエクソン8の終止コドンまでを含み、前記ヒトIL−33遺伝子の前記ゲノムDNAが、前記ヒトIL−33遺伝子のエクソン2のATG開始コドンからエクソン8までを含む、請求項1に記載のマウス。
- 前記マウスが、マウスIL−4Rαタンパク質、マウスIL−4タンパク質およびマウスIL−33タンパク質を発現する能力を有しないマウスである、請求項1に記載のマウス。
- 前記マウスが、マウスIL−4Rαタンパク質、マウスIL−4タンパク質およびマウスIL−33タンパク質を発現する能力を有しないマウスである、請求項2に記載のマウス。
- マウス胚性幹細胞であって、
(i)ヒト化IL−4Rα遺伝子を形成するための、内因性マウスIL−4Rα遺伝子座における、ヒトIL−4Rα遺伝子のヒトゲノムDNAによる、マウスIL−4Rα遺伝子のゲノムDNAの置換であって、前記マウスIL−4Rα遺伝子の前記ゲノムDNAが、前記マウスIL−4Rα遺伝子のエクソン1のATG開始コドンからエクソン5までを含み、前記ヒトIL−4Rα遺伝子の前記ヒトゲノムDNAが、前記ヒトIL−4Rα遺伝子のエクソン1のATG開始コドンからエクソン5までを含み、前記ヒト化IL−4Rα遺伝子が、前記ヒトIL−4Rα遺伝子のエクソン1のATG開始コドンからエクソン5までと、前記マウスIL−4α遺伝子のエクソン6から9までを含み、前記ヒト化IL−4Rα遺伝子の発現が、前記内因性マウスIL−4Rα遺伝子座におけるマウスIL−4Rαプロモーターの制御下にある、置換;
(ii)ヒト化IL−4遺伝子を形成するための、内因性マウスIL−4遺伝子座における、ヒトIL−4遺伝子のゲノムDNAによる、マウスIL−4遺伝子のゲノムDNAの置換であって、前記マウスIL−4遺伝子の前記ゲノムDNAが、前記マウスIL−4遺伝子のエクソン1のATG開始コドンからエクソン4までを含み、前記ヒトIL−4遺伝子の前記ゲノムDNAが、前記ヒトIL−4遺伝子のエクソン1のATG開始コドンからエクソン4までを含み、前記ヒト化IL−4遺伝子の発現が、前記内因性マウスIL−4遺伝子座におけるマウスIL−4プロモーターの制御下にある、置換;および
(iii)内因性マウスIL−33遺伝子座における、前記遺伝子座がマウスIL−33ではなくヒトIL−33をコードするようになる、ヒトIL−33遺伝子のゲノムDNAによる、マウスIL−33遺伝子のゲノムDNAの置換
を含む、マウス胚性幹細胞。 - 請求項5に記載のマウス胚性幹細胞を含む、マウス胚。
- 請求項1に記載のマウスを提供することと、
前記マウスに、候補ヒトIL−4またはIL−4Rα拮抗薬と、候補ヒトIL−33拮抗薬とを投与することと、
前記候補ヒトIL−4またはIL−4Rα拮抗薬、および、前記候補ヒトIL−33拮抗薬の薬力学プロファイルを評価することと
を含む、方法。 - 置き換わる前記内因性マウスIL−33遺伝子座において、前記マウスIL−33遺伝子の前記ゲノムDNAが、前記マウスIL−33遺伝子のエクソン2のATG開始コドンからエクソン8の終止コドンまでを含み、前記ヒトIL−33遺伝子の前記ゲノムDNAが、前記ヒトIL−33遺伝子のエクソン2のATG開始コドンからエクソン8までを含む、請求項7に記載の方法。
- 前記マウスが、マウスIL−4Rαタンパク質、マウスIL−4タンパク質およびマウスIL−33タンパク質を発現する能力を有しないマウスである、請求項8に記載の方法。
- 前記候補ヒトIL−4またはIL−4Rα拮抗薬が、ヒトIL−4またはIL−4Rαに特異的な抗体であり、前記候補ヒトIL−33拮抗薬が、ヒトIL−33に特異的な抗体である、請求項9に記載の方法。
- 請求項1に記載のマウスを提供することと、
前記マウスにおいて炎症状態を誘発することと、
前記マウスに、候補ヒトIL−4またはIL−4Rα拮抗薬と、候補ヒトIL−33拮抗薬とを投与することと、
前記投与によって前記炎症状態が低減するかどうかを判定することと
を含む、方法。 - 置換される前記内因性マウスIL−33遺伝子座において、前記マウスIL−33遺伝子の前記ゲノムDNAが、前記マウスIL−33遺伝子のエクソン2のATG開始コドンからエクソン8の終止コドンまでを含み、前記ヒトIL−33遺伝子の前記ゲノムDNAが、前記ヒトIL−33遺伝子のエクソン2のATG開始コドンからエクソン8までを含む、請求項11に記載の方法。
- 前記マウスが、マウスIL−4Rαタンパク質、マウスIL−4タンパク質およびマウスIL−33タンパク質を発現する能力を有しないマウスである、請求項12に記載の方法。
- 前記候補ヒトIL−4またはIL−4Rα拮抗薬が、ヒトIL−4またはIL−4Rαに特異的な抗体であり、前記候補ヒトIL−33拮抗薬が、ヒトIL−33に特異的な抗体である、請求項13に記載の方法。
- 誘発される前記炎症状態が肺の炎症である、請求項11に記載の方法。
- 前記肺の炎症の程度が、(a)気道内の粘液貯留、(b)気管支肺胞洗浄液中の好酸球性浸潤細胞、(c)総循環IgE、または、(d)これらの任意の組み合わせを測定することによって判定される、請求項15に記載の方法。
- 誘発される前記炎症状態が皮膚炎症である、請求項11に記載の方法。
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