CN110269047B - 人源化IL-4和IL-4Rα动物 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了包含人或人源化IL‑4和/或IL‑4R核酸序列的非人动物。本发明描述了包含内源IL‑4基因和/或IL‑4R基因由人IL‑4基因和/或IL‑4R基因的整体或部分替换的非人动物，以及用于制备和使用非人动物的方法。本发明还提供了包含处于非人IL‑4调节元件控制下的人或人源化IL‑4基因的非人动物，包括具有在内源非人IL‑4基因座处非人IL‑4编码序列由人IL‑4编码序列的替换的非人动物。本发明还提供了包含处于非人IL‑4R调节元件控制下的人或人源化IL‑4R基因的非人动物，包括具有在内源非人C IL‑4R基因座处非人IL‑4R编码序列由人或人源化IL‑4R编码序列的替换的非人动物。本发明提供了包含人或人源化IL‑4基因和/或IL‑4R序列的非人动物，其中所述非人动物是啮齿类动物例如小鼠或大鼠。
Description
本申请是申请号为201580036907.6的中国发明专利申请的分案申请。所述申请号为201580036907.6的中国发明专利申请的申请日为2015年5月7日，优先权日期为2014年5月7日，发明名称为“人源化IL-4和IL-4Rα动物”。
与相关申请的交叉引用
本专利申请要求于2014年5月7日提交的美国临时申请号61/989,757的优先权利益，所述美国临时申请的整体内容以引用的方式并入本文。以引用的方式并入的序列表
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技术领域
本文公开了包含编码IL-4和/或IL-4Rα蛋白质的核酸序列的非人动物，所述IL-4和/或IL-4Rα蛋白质包含人序列。本文还公开了包含整体或部分为人的IL-4和/或IL-4Rα基因的转基因非人动物。本发明还公开了表达人或人源化IL-4和/或IL-4Rα蛋白质的非人动物。另外，本发明公开了用于制备和使用包含人或人源化IL-4和/或IL-4Rα核酸序列的非人动物的方法。
背景技术
IL-4和IL-4Rα是用于治疗与异常2型T辅助(Th2)细胞相关的各种人疾病、病症和状况的治疗靶。特异性靶向人IL-4或人IL-4Rα蛋白质的治疗分子的药代动力学(PK)和药效学(PD)的评估在非人动物例如啮齿类动物例如小鼠或大鼠中照常规执行。然而，此类治疗分子的PD不能在某些非人动物中适当地进行测定，因为这些治疗分子不靶向内源IL-4或IL-4Rα蛋白质。
此外，使用与异常Th2细胞相关的各种疾病的非人动物模型评估人特异性IL-4和IL-4Rα蛋白质拮抗剂的治疗功效在非人动物中是成问题的，在所述非人动物中，此类物种特异性拮抗剂不与内源IL-4或IL-4Rα蛋白质相互作用。
相应地，存在关于非人动物例如啮齿类动物例如鼠科动物例如小鼠或大鼠的需要，其中所述非人动物的IL-4和/或IL-4Rα基因是整体或部分人源化的，或分别用包含编码人或人源化IL-4和/或IL-4Rα蛋白质的序列的人IL-4和/或IL-4Rα基因替换(例如在内源非人基因座处)。
还存在关于包含IL-4和/或IL-4Rα基因(例如人源化或人)的非人动物的需要，在所述非人动物中，IL-4和/或IL-4R基因处于非人调节元件(例如内源调节元件)的控制下。
还存在关于人源化非人动物的需要，所述人源化非人动物在血液、血浆或血清中表达人或人源化IL-4蛋白质，其浓度类似于年龄匹配的非人动物的血液、血浆或血清中存在的IL-4蛋白质的浓度，所述年龄匹配的非人动物表达功能IL-4蛋白质，但不含人或人源化IL-4基因，和/或所述人源化非人动物在免疫细胞例如B细胞和T细胞上表达人或人源化IL-4Rα蛋白质，其水平类似于年龄匹配的非人动物的免疫细胞例如B细胞和T细胞上的IL-4Rα蛋白质的水平，所述年龄匹配的非人动物表达功能IL-4Rα蛋白质，但不含人或人源化IL-4Rα基因。
发明内容
本发明提供了包含编码IL-4和/或IL-4Rα蛋白质的核酸序列的非人动物，所述IL-4和/或IL-4Rα蛋白质包含人序列。
本发明提供了包含整体或部分为人的IL-4和/或IL-4Rα基因的转基因非人动物。
本发明提供了表达人或人源化IL-4和/或IL-4Rα蛋白质的非人动物。
本发明提供了具有内源非人动物IL-4和/或IL-4Rα基因的替换(整体或部分)的非人动物。
本发明提供了包含在内源非人IL-4和/或IL-4Rα基因座处的IL-4和/或IL-4Rα人源化(整体或部分)的非人动物。
本发明提供了具有人或人源化IL-4基因的非人动物，其中所述非人动物不表达内源IL-4蛋白质，并且其中所述非人动物在血液、血浆或血清中表达人或人源化IL-4蛋白质，其浓度类似于年龄匹配的非人动物的血液、血浆或血清中存在的IL-4蛋白质的浓度，所述年龄匹配的非人动物表达功能内源IL-4蛋白质，但不含人或人源化IL-4基因。
本发明提供了具有人或人源化IL-4Rα基因的非人动物，其中所述非人动物不表达内源IL-4Rα蛋白质，并且在免疫细胞例如B细胞和T细胞上表达人或人源化IL-4Rα蛋白质，其水平类似于年龄匹配的非人动物的免疫细胞例如B细胞和T细胞上存在的IL-4Rα蛋白质的水平，所述年龄匹配的非人动物表达功能内源IL-4Rα蛋白质，但不含人或人源化IL-4Rα基因。
在一个方面，本发明提供了包含人或人源化IL-4和/或IL-4Rα核酸序列的非人动物。
在一个方面，本发明提供了遗传修饰的非人动物，所述非人动物包含在内源IL-4和/或IL-4Rα基因座处编码内源IL-4和/或IL-4Rα的基因由编码人或人源化IL-4和/或IL-4Rα蛋白质的基因的替换。本发明提供了啮齿类动物例如小鼠或大鼠，所述啮齿类动物包含在内源啮齿类动物IL-4基因座处内源IL-4基因由人IL-4基因的替换，和/或包含在内源啮齿类动物IL-4Rα基因座处内源IL-4Rα基因由人IL-4Rα基因的替换。在一个实施例中，啮齿类动物是小鼠。在一个实施例中，啮齿类动物是大鼠。
在一个方面，本发明提供了包含内源啮齿类动物IL-4基因的人源化的遗传修饰的啮齿类动物，例如小鼠或大鼠，其中所述人源化包括在内源啮齿类动物IL-4基因座处包含啮齿类动物IL-4基因的至少一个外显子的啮齿类动物核酸由包含人IL-4基因的至少一个外显子的核酸序列的替换，以形成经修饰的IL-4基因，其中所述经修饰的IL-4基因的表达处于在内源啮齿类动物IL-4基因座处的啮齿类动物调节元件的控制下。
在一个实施例中，啮齿类动物是小鼠或大鼠。在一个实施例中，啮齿类动物是小鼠。在一个实施例中，啮齿类动物是大鼠。
在一个实施例中，经修饰的IL-4基因编码人或人源化IL-4蛋白质，并且包含人IL-4基因的从ATG起始密码子开始的外显子1到外显子4。
在一个实施例中，啮齿类动物是不能表达小鼠IL-4蛋白质的小鼠。
在一个实施例中，啮齿类动物是表达由内源小鼠IL-4Rα基因编码的小鼠IL-4Rα蛋白质的小鼠。
在一个实施例中，啮齿类动物是表达人或人源化IL-4Rα蛋白质的小鼠。
在一个实施例中，人源化IL-4Rα蛋白质包含人IL-4Rα蛋白质的胞外域。
在一个实施例中，人源化IL-4Rα蛋白质包含小鼠IL-4Rα蛋白质的跨膜结构域和细胞质结构域。
在一个实施例中，啮齿类动物是小鼠，所述小鼠包括在内源小鼠IL-4Rα基因座处包含小鼠IL-4Rα基因的至少一个外显子的小鼠核酸由包含人IL-4Rα基因的至少一个外显子的核酸序列的替换，以形成经修饰的IL-4Rα基因，其中所述经修饰的IL-4Rα基因的表达处于在所述内源小鼠IL-4Rα基因座处的小鼠调节元件的控制下。
在一个实施例中，啮齿类动物是小鼠，其中包含小鼠IL-4的从ATG起始密码子开始的外显子1到外显子4的小鼠IL-4序列的连续基因组片段被替换为包含人IL-4的从ATG起始密码子开始的外显子1到外显子4的人IL-4序列的连续基因组片段。
在一个实施例中，编码人或人源化IL-4Rα蛋白质的经修饰的IL-4Rα基因的表达处于在内源小鼠IL-4Rα基因座处的小鼠调节元件的控制下。
在一个方面，本发明提供了包含内源啮齿类动物IL-4Rα基因的人源化的遗传修饰的啮齿类动物，例如小鼠或大鼠，其中所述人源化包括在内源啮齿类动物IL-4Rα基因座处包含啮齿类动物IL-4Rα基因的外显子的啮齿类动物核酸由编码人IL-4Rα基因的至少一个外显子的核酸序列的替换，以形成经修饰的(即，人源化)IL-4Rα基因，其中所述经修饰的、人源化IL-4Rα基因的表达处于在内源啮齿类动物IL-4Rα基因座处的啮齿类动物调节元件的控制下。
在一个实施例中，啮齿类动物是小鼠或大鼠。在一个实施例中，啮齿类动物是小鼠。在一个实施例中，啮齿类动物是大鼠。
在一个实施例中，经修饰的IL-4Rα基因编码人或人源化IL-4Rα蛋白质，并且包含人IL-4Rα基因的从ATG起始密码子开始的外显子1到外显子5。
在一个实施例中，啮齿类动物是不能表达小鼠IL-4Rα蛋白质的小鼠。
在一个实施例中，啮齿类动物是表达由内源小鼠IL-4基因编码的小鼠IL-4蛋白质的小鼠。
在一个实施例中，啮齿类动物是表达人或人源化IL-4蛋白质的小鼠。
在一个实施例中，啮齿类动物是小鼠，所述小鼠包括在内源小鼠IL-4基因座处包含小鼠IL-4基因的外显子的小鼠核酸由编码人IL-4基因的至少一个外显子的核酸序列的替换，以形成经修饰的IL-4基因，其中所述经修饰的IL-4基因的表达处于在所述内源小鼠IL-4基因座处的小鼠调节元件的控制下。
在一个实施例中，啮齿类动物是小鼠，并且其中包含IL-4Rα的从ATG起始密码子开始的外显子1到外显子5的小鼠IL-4Rα序列的连续基因组片段被替换为包含人IL-4Rα的从ATG起始密码子开始的外显子1到外显子5的人IL-4Rα序列的连续基因组片段。
在一个方面，本发明提供了表达人或人源化IL-4蛋白质的遗传修饰的啮齿类动物，例如小鼠或大鼠，其中表达人或人源化IL-4蛋白质的啮齿类动物包含正常免疫系统，即表达人或人源化IL-4蛋白质的啮齿类动物的血液、血浆或血清中的免疫细胞例如B细胞和T细胞数目类似于表达功能内源IL-4蛋白质的啮齿类动物的血液、血浆或血清中的免疫细胞例如B细胞和T细胞数目。在一个实施例中，啮齿类动物是小鼠。在一个实施例中，啮齿类动物是大鼠。
在一个方面，本发明提供了表达来自人或人源化IL-4基因的IL-4蛋白质的遗传修饰的啮齿类动物，例如小鼠或大鼠，其中所述啮齿类动物在其血清中表达人或人源化IL-4蛋白质。在一个实施例中，啮齿类动物是小鼠。在一个实施例中，啮齿类动物是大鼠。
在一个实施例中，表达人或人源化IL-4蛋白质的啮齿类动物的血清具有与表达功能内源IL-4蛋白质的啮齿类动物，例如野生型小鼠或大鼠大约相同水平的IL-4蛋白质。在一个实施例中，啮齿类动物是小鼠。在一个实施例中，啮齿类动物是大鼠。
在一个实施例中，小鼠在血清中表达浓度为年龄匹配的小鼠的血清中存在的IL-4蛋白质水平的至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％或200％的人或人源化IL-4蛋白质，所述年龄匹配的小鼠表达功能内源IL-4蛋白质，但不含在内源小鼠IL-4基因座处内源IL-4基因由人IL-4基因的替换。
在一个实施例中，小鼠在血清中表达浓度为年龄匹配的小鼠的血清中存在的小鼠IL-4蛋白质水平的约10％至约200％、约20％至约150％、或约30％至约100％的人或人源化IL-4蛋白质，所述年龄匹配的小鼠表达功能内源IL-4蛋白质，但不含在内源小鼠IL-4基因座处内源IL-4基因由人IL-4基因的替换。
在一个方面，本发明提供了表达人或人源化IL-4Rα蛋白质的遗传修饰的啮齿类动物，例如小鼠或大鼠，其中所述啮齿类动物在免疫细胞例如B细胞和T细胞上表达人或人源化IL-4Rα蛋白质，其水平类似于表达功能内源IL-4Rα蛋白质的年龄匹配的啮齿类动物的免疫细胞例如B细胞和T细胞上存在的IL-4Rα蛋白质的水平。在一个实施例中，啮齿类动物是小鼠。在一个实施例中，啮齿类动物是大鼠。
在一个方面，本发明提供了表达来自人IL-4Rα基因的IL-4Rα蛋白质的遗传修饰的啮齿类动物，例如小鼠或大鼠，其中所述啮齿类动物在免疫细胞例如B细胞和T细胞上表达人或人源化IL-4Rα蛋白质。在一个实施例中，啮齿类动物是小鼠。在一个实施例中，啮齿类动物是大鼠。
在一个实施例中，表达人或人源化IL-4Rα蛋白质的啮齿类动物的免疫细胞例如B细胞和T细胞具有与表达功能内源IL-4Rα蛋白质的啮齿类动物，例如野生型小鼠或大鼠的免疫细胞例如B细胞和T细胞上大约相同水平的IL-4Rα蛋白质。在一个实施例中，啮齿类动物是小鼠。在一个实施例中，啮齿类动物是大鼠。
在一个实施例中，小鼠在免疫细胞例如B细胞和T细胞上表达量为年龄匹配的小鼠的免疫细胞例如B细胞和T细胞上的IL-4Rα蛋白质的量的至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％或200％的人或人源化IL-4Rα蛋白质，所述年龄匹配的小鼠表达功能内源IL-4Rα蛋白质，但不含在内源小鼠IL-4Rα基因座处内源IL-4Rα基因由人IL-4Rα基因的替换。
在一个实施例中，小鼠在免疫细胞例如B细胞和T细胞上表达量为年龄匹配的小鼠的免疫细胞例如B细胞和T细胞上存在的小鼠IL-4Rα蛋白质的量的约10％至约200％、约20％至约150％、或约30％至约100％的人或人源化IL-4Rα蛋白质，所述年龄匹配的小鼠表达功能内源IL-4Rα蛋白质，但不含在内源小鼠IL-4Rα基因座处内源IL-4Rα基因由人IL-4Rα基因的替换。
在一个方面，本发明提供了包含人源化IL-4Rα基因的遗传修饰的啮齿类动物，所述人源化IL-4Rα基因包括啮齿类动物IL-4Rα胞外域编码序列由人IL-4Rα胞外域编码序列的替换，其中所述人源化IL-4Rα基因包含啮齿类动物IL-4Rα跨膜序列和啮齿类动物IL-4Rα细胞质序列，其中所述人源化IL-4Rα基因处于在内源IL-4Rα基因座处的内源啮齿类动物IL-4Rα调节元件的控制下，并且其中所述啮齿类动物还包含编码人或人源化IL-4蛋白质的人源化IL-4基因，其中所述人源化IL-4基因处于在内源IL-4基因座处的内源啮齿类动物IL-4调节元件的控制下。
在一个实施例中，啮齿类动物是小鼠或大鼠。在一个实施例中，啮齿类动物是小鼠。在一个实施例中，啮齿类动物是大鼠。
在一个实施例中，小鼠不能表达小鼠IL-4蛋白质且不能表达小鼠IL-4Rα蛋白质。
在一个实施例中，在内源啮齿类动物IL-4基因座和/或啮齿类动物IL-4Rα基因座处的啮齿类动物调节元件或序列来自小鼠或大鼠。
在一个实施例中，啮齿类动物调节元件或序列是在啮齿类动物IL-4基因座和/或啮齿类动物IL-4Rα基因座处的内源啮齿类动物调节元件或序列。
在一个方面，本发明提供了表达人或人源化IL-4和/或IL-4Rα蛋白质的非人动物例如啮齿类动物例如小鼠或大鼠，其中所述非人动物表达来自内源非人IL-4Rα基因座和/或内源非人IL-4Rα基因座的人或人源化IL-4和/或IL-4Rα蛋白质。在一个实施例中，非人动物是啮齿类动物。在一个实施例中，啮齿类动物是小鼠。在一个实施例中，啮齿类动物是大鼠。
在一个方面，本发明提供了表达来自内源小鼠IL-4基因座的人或人源化IL-4蛋白质的遗传修饰的小鼠，其中所述内源小鼠IL-4基因已整体或部分被替换为人IL-4基因。
在一个实施例中，包括从ATG起始密码子开始的外显子1到外显子4(包括3'非翻译区)和外显子4下游的3'区域的一部分，在内源小鼠IL-4基因座处约6.3kb的连续小鼠基因组核酸被缺失且被替换为约8.8kb的人IL-4核酸序列，所述人IL-4核酸序列包括人IL-4基因的从ATG起始密码子开始的外显子1到外显子4(包括3'非翻译区)和外显子4下游的3'区域的一部分。在一个具体实施例中，替换小鼠基因组核酸的人IL-4核酸序列包括人BACRP11-17K19的人IL-4基因的从ATG起始密码子开始的外显子1到外显子4和外显子4下游的3'区域的一部分。在一个具体实施例中，经修饰的IL-4基因包括小鼠IL-4 5'调节元件和从ATG起始密码子开始的人IL-4外显子1到外显子4，即IL-4蛋白质编码序列。
在一个方面，本发明提供了包含编码人或人源化IL-4蛋白质的核苷酸序列的遗传修饰的小鼠，其中编码人或人源化IL-4蛋白质的核苷酸序列整体或部分替换编码内源小鼠IL-4蛋白质的内源核苷酸序列。
在一个方面，本发明提供了表达来自内源小鼠IL-4Rα基因座的人或人源化IL-4Rα蛋白质的遗传修饰的小鼠，其中所述内源小鼠IL-4Rα基因已整体或部分被替换为人IL-4Rα基因。
在一个实施例中，包括从ATG起始密码子开始的外显子1到外显子5和内含子5的一部分，在内源小鼠IL-4Rα基因座处约7.1kb的连续小鼠基因组核酸被缺失且被替换为约15.6kb的人IL-4Rα核酸序列，所述人IL-4Rα核酸序列包括人IL-4Rα基因的从ATG起始密码子开始的外显子1到外显子5和内含子5的一部分。在一个具体实施例中，替换小鼠基因组核酸的人IL-4α核酸包括人BAC RP11-16E24的人IL-4α基因的从ATG起始密码子开始的外显子1到外显子5和内含子5的一部分。在一个具体实施例中，替换小鼠基因组核酸的人IL-4Rα核酸包括完整的人IL-4Rα胞外域编码序列。
在一个方面，本发明提供了用于制备人源化IL-4啮齿类动物的方法，所述方法包括用包含人IL-4基因序列的一个或多个外显子的人IL-4核酸序列替换编码啮齿类动物IL-4蛋白质的啮齿类动物IL-4基因序列，以形成编码人或人源化IL-4蛋白质的经修饰的、人源化IL-4基因，其中所述替换在内源啮齿类动物IL-4基因座处，并且包含人IL-4基因序列的一个或多个外显子且编码人或人源化IL-4蛋白质的人源化IL-4基因序列可操作地连接至在内源啮齿类动物IL-4基因座处的啮齿类动物调节元件或序列(例如5'和/或3'调节元件)。
在一个实施例中，啮齿类动物是小鼠或大鼠。在一个实施例中，啮齿类动物是小鼠。在一个实施例中，啮齿类动物是大鼠。
在一个实施例中，啮齿类动物调节元件或序列来源于小鼠。在一个实施例中，啮齿类动物调节元件或序列来源于大鼠。
在一个实施例中，啮齿类动物调节元件或序列是在啮齿类动物IL-4基因座处的内源啮齿类动物调节元件或序列。在一个实施例中，啮齿类动物是小鼠。在一个实施例中，啮齿类动物是大鼠。
在一个实施例中，替换啮齿类动物IL-4基因序列的人IL-4核酸序列包括人IL-4基因序列的至少一个外显子。在其他实施例中，替换啮齿类动物IL-4基因序列的人IL-4核酸序列包括人IL-4基因序列的至少2个或至少3个外显子。在一个实施例中，替换啮齿类动物IL-4基因序列的人IL-4核酸序列包括人IL-4基因序列的所有4个外显子。在一个实施例中，啮齿类动物是小鼠。在一个实施例中，啮齿类动物是大鼠。
在一个实施例中，替换啮齿类动物IL-4基因序列的人IL-4核酸序列编码与人IL-4(例如由GenBank登录号NM_000589.3s中所示的核酸编码的人IL-4蛋白质)约85％、90％、95％、96％、97％、98％或约99％等同的蛋白质。
在一个实施例中，替换在内源啮齿类动物IL-4基因座处，并且包括人IL-4基因序列的一个或多个外显子且编码人或人源化IL-4蛋白质的人源化IL-4基因序列可操作地连接至在内源啮齿类动物IL-4基因座处的内源啮齿类动物调节元件或序列(例如5'和/或3'调节元件)。
在一个方面，本发明提供了用于制备人源化IL-4小鼠的方法，所述方法包括将编码小鼠IL-4蛋白质的小鼠IL-4基因序列替换为人IL-4基因序列，以形成编码人或人源化IL-4蛋白质的经修饰的、人源化IL-4基因。
在一个实施例中，替换在内源小鼠IL-4基因座处，并且所得到的编码人或人源化IL-4蛋白质的人源化IL-4基因可操作地连接至在内源小鼠IL-4基因座处的小鼠调节元件或序列(例如5'和/或3'调节元件)。
在一个实施例中，替换在内源小鼠IL-4基因座处，并且编码人或人源化IL-4蛋白质的人源化IL-4基因可操作地连接至在内源小鼠IL-4基因座处的内源小鼠调节元件或序列(例如5'和/或3'调节元件)。
在一个方面，本发明提供了用于制备人源化IL-4Rα啮齿类动物的方法，所述方法包括用包含人IL-4Rα基因序列的一个或多个外显子的人IL-4Rα核酸序列替换编码啮齿类动物IL-4Rα蛋白质的啮齿类动物IL-4Rα基因序列，以形成编码人或人源化IL-4Rα蛋白质的经修饰的、人源化IL-4Rα基因，其中所述替换在内源啮齿类动物IL-4Rα基因座处，并且包含人IL-4Rα基因序列的一个或多个外显子且编码人或人源化IL-4Rα蛋白质的人源化IL-4Rα基因序列可操作地连接至在内源啮齿类动物IL-4Rα基因座处的啮齿类动物调节元件或序列(例如5'和/或3'调节元件)。
在一个实施例中，啮齿类动物是小鼠或大鼠。在一个实施例中，啮齿类动物是小鼠。在一个实施例中，啮齿类动物是大鼠。
在一个实施例中，啮齿类动物调节元件或序列来源于小鼠。在一个实施例中，啮齿类动物调节元件或序列来源于大鼠。
在一个实施例中，啮齿类动物调节元件或序列是在啮齿类动物IL-4Rα基因座处的内源啮齿类动物调节元件或序列。在一个实施例中，啮齿类动物是小鼠。在一个实施例中，啮齿类动物是大鼠。
在一个实施例中，替换啮齿类动物IL-4Rα基因序列的人IL-4Rα核酸序列包括人IL-4Rα基因序列的至少一个外显子。在其他实施例中，替换啮齿类动物IL-4Rα基因序列的人IL-4Rα核酸序列包括人IL-4Rα基因序列的至少2、3、4、5、6、7或8个外显子。在一个实施例中，替换啮齿类动物IL-4Rα基因序列的人IL-4Rα核酸序列包括人IL-4Rα基因序列的所有9个外显子。在一个实施例中，啮齿类动物是小鼠。在一个实施例中，啮齿类动物是大鼠。
在一个实施例中，替换啮齿类动物IL-4Rα基因序列的人IL-4Rα核酸序列编码与人IL-4Rα(例如由GenBank登录号NM_000418.3中所示的核酸编码的人IL-4Rα蛋白质)约85％、90％、95％、96％、97％、98％或约99％等同的蛋白质。
在一个实施例中，替换啮齿类动物IL-4Rα基因序列的人IL-4Rα核酸序列包括编码人IL-4Rα蛋白质的胞外域的人IL-4Rα基因序列的至少一个外显子。在其他实施例中，替换啮齿类动物IL-4Rα基因序列的人IL-4Rα核酸序列包括编码人IL-4Rα蛋白质的胞外域的人IL-4Rα基因序列的至少2、3或4个外显子。在一个实施例中，替换啮齿类动物IL-4Rα基因序列的人IL-4Rα核酸序列包括编码人IL-4Rα蛋白质的胞外域的人IL-4Rα基因序列的所有5个外显子。在一个实施例中，啮齿类动物是小鼠。在一个实施例中，啮齿类动物是大鼠。
在一个实施例中，替换啮齿类动物IL-4Rα基因序列的人或人源化IL-4Rα基因序列编码与人IL-4Rα蛋白质的胞外域(例如由GenBank登录号NM_000418.3中所示的核酸编码的人IL-4Rα蛋白质)约85％、90％、95％、96％、97％、98％或约99％等同的IL-4Rα蛋白质的胞外域。
在一个实施例中，替换在内源啮齿类动物IL-4Rα基因座处，并且包括人IL-4Rα基因序列的一个或多个外显子且编码人或人源化IL-4Rα蛋白质的人源化IL-4Rα基因序列可操作地连接在内源啮齿类动物IL-4Rα基因座处的内源啮齿类动物调节元件或序列(例如5'和/或3'调节元件)。
在一个方面，本发明提供了用于制备人源化IL-4Rα小鼠的方法，所述方法包括将编码小鼠IL-4Rα蛋白质的小鼠IL-4Rα基因序列替换为人IL-4Rα核酸序列，以形成编码人或人源化IL-4Rα蛋白质的人源化IL-4Rα基因。
在一个实施例中，替换在内源小鼠IL-4Rα基因座处，并且编码人或人源化IL-4Rα蛋白质的人源化IL-4Rα基因可操作地连接至在内源小鼠IL-4Rα基因座处的小鼠调节元件或序列(例如5'和/或3'调节元件)。
在一个实施例中，替换在内源小鼠IL-4Rα基因座处，并且编码人或人源化IL-4Rα蛋白质的人源化IL-4Rα基因可操作地连接至在内源小鼠IL-4Rα基因座处的内源小鼠调节元件或序列(例如5'和/或3'调节元件)。
在各个方面，本文描述的遗传修饰的非人动物例如啮齿类动物例如小鼠或大鼠包括在其种系中的遗传修饰。
在一个方面，本发明提供了包含如本文描述的遗传修饰的非人动物例如啮齿类动物例如小鼠或大鼠胚胎。
在一个方面，本发明提供了包含供体细胞的非人动物例如啮齿类动物例如小鼠或大鼠宿主胚胎，所述供体细胞包含如本文描述的遗传修饰。
在一个方面，本发明提供了包含如本文描述的遗传修饰的多能或全能非人动物例如啮齿类动物例如小鼠或大鼠细胞。在一个实施例中，细胞是啮齿类动物细胞。在一个实施例中，细胞是小鼠细胞。在一个实施例中，细胞是啮齿类动物ES细胞。在一个实施例中，细胞是小鼠ES细胞。
在一个方面，本发明提供了非人动物例如啮齿类动物例如小鼠或大鼠卵子，其中所述非人动物卵子包含异位非人动物染色体，其中所述异位非人动物染色体包含如本文描述的遗传修饰。在一个实施例中，非人动物是啮齿类动物。在一个实施例中，啮齿类动物是小鼠。在一个实施例中，啮齿类动物是大鼠。
在一个方面，遗传修饰为包含人IL-4基因或人IL-4Rα基因的小鼠胚胎、卵子或细胞是选自C57BL/A、C57BL/An、C57BL/GrFa、C57BL/KaLwN、C57BL/6、C57BL/6J、C57BL/6ByJ、C57BL/6NJ、C57BL/10、C57BL/10ScSn、C57BL/10Cr和C57BL/Ola的C57BL品系的小鼠的。在另一个实施例中，小鼠是选自其为129P1、129P2、129P3、129X1、129S1(例如129S1/SV、129S1/Svlm)、129S2、129S4、129S5、129S9/SvEvH、129S6(129/SvEvTac)、129S7、129S8、129T1、129T2的品系的129品系(参见例如Festing等人(1999)Revised nomenclature for strain129mice,Mammalian Genome 10:836，还参见Auerbach等人(2000)Establishment andChimera Analysis of 129/SvEv-and C57BL/6-Derived Mouse Embryonic Stem CellLines)。在一个具体实施例中，遗传修饰的小鼠是上述129品系和上述C57BL/6品系的混合品系(mix)。在另一个具体实施例中，小鼠是上述129品系的混合品系或上述BL/6品系的混合品系。在一个具体实施例中，混合品系的129品系是129S6(129/SvEvTac)品系。在另一个实施例中，小鼠是BALB品系例如BALB/c品系。在另外一个实施例中，小鼠是BALB品系和另一种上述品系的混合品系。在一个实施例中，小鼠是Swiss或Swiss Webster小鼠。
在各个方面，包含人或人源化IL-4R和/或IL-4核酸序列的非人动物选自哺乳动物和鸟类。在一个实施例中，非人动物是哺乳动物。在一个实施例中，哺乳动物是鼠科动物。
在一个方面，本发明提供了筛选人特异性IL-4或IL-4Rα拮抗剂的方法。该方法可用于鉴定治疗候选物且评估治疗功效。该方法包括给如本文描述的对于IL-4和IL-4Rα双重人源化的遗传修饰的啮齿类动物施用试剂，测定试剂对由IL-4/IL-4Rα信号传导途径介导的生物功能的作用，并且如果试剂在遗传修饰的啮齿类动物中拮抗由IL-4/IL-4Rα信号传导途径介导的功能，则将其鉴定为人特异性IL-4或IL-4Rα拮抗剂。
在一个实施例中，试剂包含结合IL-4或IL-4Rα的免疫球蛋白可变结构域。在一个实施例中，试剂特异性结合人IL-4或IL-4Rα，而不特异性结合啮齿类动物IL-4或IL-4Rα。在一个实施例中，试剂是抗体。在一个具体实施例中，试剂是特异性结合人IL-4Rα而不特异性结合啮齿类动物IL-4Rα的抗体。
在一个实施例中，筛选方法利用表达人IL-4蛋白质和人源化IL-4Rα蛋白质的双重人源化小鼠，其中所述人源化IL-4Rα蛋白质包括与内源小鼠IL-4Rα蛋白质的跨膜和细胞质结构域连接的人IL-4Rα蛋白质的胞外域，并且其中所述小鼠不表达鼠IL-4或鼠IL-4Rα。
在一些实施例中，筛选方法包括下述步骤：在如本文描述的双重人源化啮齿类动物中诱导与IL-4/IL-4Rα信号传导相关的疾病，给啮齿类动物施用试剂，测定试剂是否改善疾病，并且如果试剂改善疾病，则将试剂鉴定为适合于治疗疾病的人特异性IL-4或IL-4Rα拮抗剂。
在一些实施例中，与IL-4/IL-4Rα信号传导相关的疾病是气道炎症，其可通过以一个或多个剂量鼻内施用变应原(例如房尘螨提取物)一段时间在啮齿类动物中进行诱导。试剂的作用可通过测量气道炎症的程度(通过例如粘液累积、支气管肺泡灌洗液中的浸润细胞和/或总循环IgE水平反映)是否由于试剂施用而减轻进行测定。
在一些实施例中，与IL-4/IL-4Rα信号传导相关的疾病是皮肤炎症或特应性皮炎，其可通过制备皮肤损伤且使损伤的皮肤暴露于以一个或多个剂量的变应原(例如细菌毒素或房尘螨提取物)一段时间在啮齿类动物中进行诱导。试剂的作用可通过测量皮肤炎症是否由于试剂施用而减轻进行测定。
在一个进一步方面，其IL-4、IL-4Rα和IL-33基因已如本文描述人源化的三重人源化非人动物用于评估化合物或化合物组合的药效学(PD)和治疗功效。
本文描述的方面和实施例各自能够一起使用，除非根据实施例或方面的上下文明确或清楚排除。
附图说明
图1提供了关于IL-4和IL-13信号转导的受体以及dupilumab的作用机制的并非按比例绘制的图示，所述dupilumab是与人IL-4受体α链(IL-4Rα)特异性结合的中和性全人单克隆抗体。
图2A-2B提供了关于IL-4(Il4)和IL-4Rα(Il4ra)基因座的人源化策略的并非按比例绘制的图示。(2A)跨越从在ATG起始密码子处开始的外显子1到外显子4(包括3'非翻译区)的编码区和外显子4下游的3'区域的一部分的小鼠IL-4基因(上方的图)被缺失，且被替换为人IL-4基因的从在ATG密码子处开始的外显子1到外显子4(包括3'非翻译区)的编码区和外显子4下游的3'区域的一部分连同两侧加有loxP位点的(floxed)hygro选择盒loxP(下方的图)，如所示的。(2B)跨越从ATG起始密码子开始的外显子1到外显子5的编码区和内含子5的一部分的小鼠IL-4Rα基因(上方的图)被缺失，且被替换为人IL-4Rα基因的从ATG起始密码子开始的外显子1到外显子5的编码区和内含子5的一部分连同两侧加有loxP位点的neo选择盒(下方的图)，如所示的。
图3显示了在来自双重人源化IL-4/IL-4Rα(Il4hu/hu/Il4rahu/hu)小鼠的B细胞和T细胞上的人源化IL-4Rα蛋白质的表达。
图4显示了使用来源于人源化IL4Rα(Il4rahu/hu)小鼠的原代细胞的IL-4和IL-13配体特异性和受体功能性。
图5显示了在野生型而不是人源化IL4Rα(Il4rahu/hu)小鼠体内的IL-4依赖性IgE生产。
图6显示了在小鼠B细胞中剂量依赖性IL-4诱导的离体mIgE生产(左图)被dupilumab以剂量依赖性方式阻断(右图)。
图7显示了dupilumab以剂量依赖性方式预防人源化IL4Rα(Il4rahu/hu)小鼠体内IL-25诱导的肺病理学。
图8显示了用于使用双重人源化IL-4和IL-4Rα(IL-4hu/hu/IL-4Rhu/hu)小鼠评估dupilumab在房尘螨提取物(HDM)诱导的肺炎症模型中的治疗功效的实验设计。“REGN668”指针对人IL-4Rα的人单克隆抗体，也称为dupilumab。“REGN129”指小鼠sol IL-13Rα2-Fc，其为小鼠IL-13R2α的胞外域和Fc之间的融合蛋白。
图9显示了用于使用双重人源化IL-4和IL-4Rα(IL-4hu/hu/IL-4Rhu/hu)小鼠和同种型对照抗体评估dupilumab在HDM诱导的肺炎症模型中的治疗功效的实验设计。
图10A-10C示出了关于小鼠IL-33基因座的人源化策略。图10A示出了跨越从在ATG起始密码子处开始的外显子2到外显子8中的终止密码子的编码区的小鼠IL-33基因(上方的图)被缺失，且被替换为人IL-33基因的从在ATG密码子处开始的外显子2到外显子8(包括3'非翻译区)的编码区(下方的图)。图10B显示了在小鼠ES细胞克隆MAID 7060中的人源化IL-33等位基因，其含有loxP新霉素选择盒。图10C显示了在小鼠ES细胞克隆MAID 7061中的人源化IL-33等位基因，其中新霉素选择盒已被缺失，而loxP和克隆位点(77bp)保留在人IL-33序列下游，并且小鼠3'UTR保留在loxP位点下游。
具体实施方式
作为治疗靶的IL-4和IL-4Rα
变应性病症是尤其在发达国家以增加速率出现的疾病谱。特应性皮炎、哮喘和变应性鼻炎是患有变态反应的患者中最常见的炎性状况；这些患者通常遭受多重临床症状的发作。变态反应的发病机制与针对外源性抗原的异常免疫应答联系(常见Mueller等人(2002)Structure,binding,and antagonists in the IL-4/IL-13receptor system,Biochim Biophys Acta 1592:237-250)。
抗原特异性IgE的过度生产是触发变应性炎症的必需组分。异常2型T辅助细胞(Th2)极化促成增加的IgE应答。
最初由活化T细胞鉴定的白细胞介素-4(IL-4)和白细胞介素-13(IL-13)是在起始且维持变态反应中的免疫和炎症反应中起关键作用的主要Th2细胞因子。
IL-4和IL-13信号传导通过具有共享亚基IL-4受体α(IL-4Rα)的两种不同的受体复合物介导，这可促成这两种细胞因子之间的重叠生物应答。参见图1。
关于白细胞介素-4/13信号转导的受体和dupilumab的作用机制。IL-4Rα形成两种不同的异二聚受体复合物，以组织和应答特异性方式介导IL-4和IL-13的生物学功能。由IL-4Rα和共同细胞因子受体γ链(γC)组成的I型受体对于IL-4是独特的。在IL-4Rα和IL-13Rα1之间形成的II型受体是关于IL-13的主要受体，但对于IL-4也是有功能的。另外，IL-13与第二高亲和力受体IL-13Rα2结合，所述IL-13Rα2一般公认为诱饵受体或在全长形式中具有可能的促纤维化效应。
Dupilumab是针对人IL-4Rα的拮抗性单克隆抗体，其抑制由IL-4和IL-13诱导的生物活性。Dupilumab通过阻止其与受体亚基的结合来阻断IL-4信号转导，而对IL-13信号传导的抑制作用有可能通过干扰二聚受体相互作用来介导。
Dupilumab，针对共享的IL-4Rα亚基的全人单克隆抗体，使用
小鼠在Regeneron Pharmaceuticals,Inc.开发。Dupilumab处于治疗中度至重度哮喘和治疗中度至重度特应性皮炎的临床试验中。
在鼠模型中评估dupilumab的功效提出多重挑战：(a)dupilumab不识别同源小鼠IL-4受体；和(b)存在小鼠IL-4蛋白质和人IL-4受体之间的功能相互作用的缺乏。
IL-4基因和蛋白质
IL-4基因编码分泌的IL-4蛋白质，所述IL-4蛋白质在B细胞以及其他细胞类型的活化中起重要作用(参见图1)。
人IL-4。NCBI基因ID：3565；原始源：HGNC:6014；RefSeq转录物：NM_000589.3；UniProt ID：P05112；基因组装配：GRCh37；位置：chr5:132,009,743-132,018,576+链。
人IL-4基因位于染色体5上5q31.1处。人IL-4基因具有4个外显子且编码长度153个氨基酸的前体多肽，包括24个氨基酸的信号肽和129个氨基酸的成熟IL-4蛋白质。
小鼠IL-4。NCBI基因ID：16189；原始源：MGI:96556；RefSeq转录物：NM_021283.2；UniProt ID：P07750；基因组装配：GRCm38；位置：chr11:53,612,350-53,618,606–链。
小鼠IL-4基因位于染色体11上11 31.97cM处。小鼠IL-4基因具有4个外显子且编码长度140个氨基酸的前体多肽，包括20个氨基酸的信号肽和120个氨基酸的成熟IL-4蛋白质。
IL-4Rα基因和蛋白质
IL-4Rα基因编码跨膜受体IL-4Rα蛋白质，所述IL-4Rα蛋白质主要在B细胞和T细胞上表达，是关于IL-4和IL-13蛋白质的受体(参见图1)。
人IL-4Rα。NCBI基因ID：3566；原始源：MGI:6015；RefSeq转录物：NM_000418.3；UniProt ID：P24394；基因组装配：GRCh37；位置：chr16:27,351,525-27,367,111+链。
人IL-4Rα基因位于染色体16上16p12.1-p11.2处。人IL-4Rα基因具有9个编码外显子且编码825个氨基酸的前体多肽，包括25个氨基酸的信号肽和800个氨基酸的成熟IL-4Rα蛋白质，其中成熟蛋白质的前207个氨基酸残基构成细胞外结构域。人IL-4Rα蛋白质的细胞外结构域(即胞外域)由人IL-4Rα基因的编码外显子1到5编码。
小鼠IL-4Rα。NCBI基因ID：16190；原始源：MGI:105367；RefSeq转录物：NM_001008700.3；UniProt ID：P16382；基因组装配：GRCm38；位置：chr11:125,565,655-125,572,745+链。
小鼠IL-4Rα基因位于染色体7上7 68.94cM处。小鼠IL-4Rα基因具有9个编码外显子且编码810个氨基酸的前体多肽，包括25个氨基酸的信号肽和785个氨基酸的成熟IL-4Rα蛋白质，其中成熟蛋白质的前208个氨基酸残基构成细胞外结构域。小鼠IL-4Rα蛋白质的细胞外结构域(即胞外域)由小鼠IL-4Rα基因的编码外显子1到5编码。
IL-4和IL-4Rα蛋白质的物种特异性
如本文所示，小鼠而不是人IL-4在野生型小鼠中是有功能的，并且相反，人而不是小鼠IL-4在人源化IL-4Rα(Il4rahu/hu)小鼠中是有功能的。(还参见例如Andrews等人(2001)Reconstitution of a functional human type II IL-4/IL-13receptor in mouse Bcells:demonstration of species specificity,J Immunol.166:1716-1722)。
人IL-4和IL-4Rα抑制剂的物种特异性
靶向IL-4或IL-4Rα蛋白质的候选治疗分子通常就在非人动物例如啮齿类动物例如小鼠或大鼠中的药代动力学(PK)和药效学(PD)进行评估。此类治疗分子也就在与异常Th2细胞相关的人疾病、病症和状况的非人动物例如啮齿类动物例如小鼠或大鼠模型中的体内治疗功效进行测试。
然而，对于人IL-4或IL-4Rα蛋白质特异性的治疗分子，例如人特异性IL-4或IL-4Rα抑制剂，不能就啮齿类动物特别是小鼠中的PD或体内治疗功效进行充分评估，因为这些治疗分子的靶是缺失的。由于IL-4蛋白质的上述物种特异性，该问题无法使用表达人IL-4或IL-4Rα蛋白质的转基因非人动物例如啮齿类动物例如小鼠或大鼠得到克服。
相应地，在各个实施例中，为了评价人特异性IL-4或IL-4Rα蛋白质拮抗剂或抑制剂在非人动物例如啮齿类动物例如小鼠或大鼠中的PD和体内治疗功效，期望用人IL-4和/或IL-4Rα蛋白质替换内源IL-4和/或IL-4Rα蛋白质。
此外，在各个实施例中，为了避免人IL-4和/或IL-4Rα蛋白质的过度表达或表达不足的潜在问题，期望将人IL-4和/或IL-4Rα基因插入在内源IL-4和/或IL-4基因基因座处的非人动物例如啮齿类动物例如小鼠或大鼠的基因组内，并且在非人动物例如啮齿类动物例如小鼠或大鼠中表达至少部分处于内源IL-4和/或IL-4Rα调节元件的控制下的人IL-4和/或IL-4Rα蛋白质。
遗传修饰的非人动物
本文提供了遗传修饰的非人动物，其内源IL-4基因和/或IL-4Rα基因已在内源IL-4基因座和/或IL-4Rα基因座处整体或部分被替换为人IL-4核酸和/或人IL-4Rα核酸，以形成编码人或人源化IL-4和/或人或人源化IL-4Rα蛋白质的经修饰的IL-4基因和/或经修饰的IL-4Rα基因。
如本文使用的，短语“非人动物”指并非人的任何脊椎动物生物。在一些实施例中，非人动物是哺乳动物。在具体实施例中，非人动物是啮齿类动物例如大鼠或小鼠。
在一个方面，本发明提供了遗传修饰的啮齿类动物，例如小鼠或大鼠，其内源啮齿类动物IL-4基因已在内源IL-4基因座处整体或部分被替换为人IL-4核酸。
替换涉及啮齿类动物IL-4基因的至少一个外显子即一个或多个外显子由包含人IL-4基因的至少一个外显子的人核酸的替换。在一些实施例中，包括啮齿类动物IL-4基因的从ATG起始密码子开始的外显子1到外显子4的连续啮齿类动物基因组片段已被替换为包括人IL-4基因的从ATG起始密码子开始的外显子1到外显子4的连续人基因组片段。在一个具体实施例中，啮齿类动物是小鼠，并且包括从ATG起始密码子开始的外显子1到外显子4(包括3'非翻译区)和外显子4下游的3'区域的一部分，在内源小鼠IL-4基因座处约6.3kb的连续小鼠基因组片段被缺失且被替换为约8.8kb的人IL-4核酸序列，所述人IL-4核酸序列包括人IL-4基因的从ATG起始密码子开始的外显子1到外显子4(包括3'非翻译区)和外显子4下游的3'区域的一部分。
在一些实施例中，替换导致在内源IL-4基因基因座处的经修饰的、人源化IL-4基因，其中所述经修饰的IL-4基因的表达处于在内源IL-4基因座处的内源调节元件的控制下。如本文使用的，术语“调节元件”指转录调节序列，包括5'转录调节序列例如启动子、增强子和抑制元件，以及3'转录调节序列例如转录终止序列。在一些实施例中，经修饰的IL-4基因的表达处于内源5'调节元件的控制下。在其他实施例中，经修饰的IL-4基因的表达处于内源3'调节元件的控制下。在某些实施例中，经修饰的IL-4基因的表达处于内源5'和3'调节元件的控制下。
在内源IL-4基因座处形成的经修饰的、人源化IL-4基因编码人或人源化IL-4蛋白质。术语“人源化”指核酸或蛋白质，所述核酸或蛋白质包括在非人动物(例如啮齿类动物例如小鼠或大鼠)中发现的基因或蛋白质的部分或序列，并且还包括不同于在非人动物中发现的那些而是对应于(等同于)配对人基因或蛋白质的部分或序列的部分或序列。经修饰的、人源化IL-4基因可编码与人IL-4蛋白质(例如由GenBank登录号NM_000589.3中所示的核酸编码的人IL-4蛋白质)至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％等同，或100％等同的IL-4蛋白质。
具有在内源IL-4基因座处的内源啮齿类动物IL-4基因整体或部分由人IL-4核酸的替换的遗传修饰的啮齿类动物就替换而言可为纯合或杂合的。在一些实施例中，遗传修饰的啮齿类动物就替换而言是杂合的，即内源啮齿类动物IL-4基因的两个拷贝中仅一个已被替换为人IL-4核酸。在其他实施例中，遗传修饰的啮齿类动物就替换而言是纯合的，即内源啮齿类动物IL-4基因的两个拷贝均已被替换为人IL-4核酸。
遗传修饰的啮齿类动物在血清中表达人或人源化IL-4蛋白质。在一些实施例中，遗传修饰的啮齿类动物不表达内源啮齿类动物IL-4蛋白质。在一个实施例中，表达人或人源化IL-4蛋白质的啮齿类动物的血清具有与表达功能内源IL-4蛋白质的啮齿类动物例如野生型啮齿类动物(例如表达功能内源IL-4蛋白质，但不含在内源IL-4基因座处内源IL-4基因整体或部分由人IL-4核酸的替换的啮齿类动物)大约相同水平的IL-4蛋白质。“大约相同的水平”意指落入在野生型啮齿类动物中的水平的任一方向上(即大于或小于)25％、20％、15％、10％、5％或更少内的水平。在其他实施例中，啮齿类动物在血清中表达浓度为年龄匹配的啮齿类动物的血清中存在的IL-4蛋白质水平的至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％或200％的人或人源化IL-4蛋白质，所述年龄匹配的啮齿类动物表达功能内源IL-4蛋白质，但不含在内源IL-4基因座处内源IL-4基因整体或部分由人IL-4核酸的替换。
在一些实施例中，具有内源啮齿类动物IL-4基因整体或部分由人IL-4核酸的替换且在血清中表达人或人源化IL-4蛋白质的遗传修饰的啮齿类动物具有正常免疫系统，即表达人或人源化IL-4蛋白质的啮齿类动物的血液、血浆或血清中的免疫细胞例如B细胞和T细胞数目类似于表达功能内源IL-4蛋白质且不具有内源啮齿类动物IL-4基因整体或部分由人IL-4核酸的替换的啮齿类动物的血液、血浆或血清中的免疫细胞例如B细胞和T细胞数目。
在另外的实施例中，具有内源啮齿类动物IL-4基因整体或部分由人IL-4核酸的替换且表达人或人源化IL-4蛋白质的遗传修饰的啮齿类动物还包括在内源IL-4Rα基因座处内源啮齿类动物IL-4Rα基因整体或部分由人IL-4Rα核酸的替换，并且因此还表达人或人源化IL-4Rα蛋白质。
在另一个方面，本发明提供了遗传修饰的啮齿类动物例如小鼠或大鼠，其内源啮齿类动物IL-4Rα基因已在内源IL-4Rα基因座处整体或部分被替换为人IL-4Rα核酸。
替换涉及啮齿类动物IL-4Rα基因的至少一个外显子即一个或多个外显子由包含人IL-4Rα基因的至少一个外显子的人核酸的替换。在一些实施例中，替换涉及编码啮齿类动物胞外域的啮齿类动物IL-4Rα基因的外显子中的至少一个由编码人胞外域的人IL-4Rα基因的外显子中的至少一个的替换。在一些实施例中，替换涉及由包含编码人IL-4Rα基因的胞外域的5个外显子中的至少2、3或4个的人核酸的替换。在其他实施例中，包括啮齿类动物IL-4Rα基因的从ATG起始密码子开始的外显子1到外显子5的连续啮齿类动物基因组片段已被替换为包括人IL-4Rα基因的从ATG起始密码子开始的外显子1到外显子5的基因组片段。在一个具体实施例中，啮齿类动物是小鼠，并且包括从ATG起始密码子开始的外显子1到外显子5和内含子5的一部分，在内源小鼠IL-4Rα基因座处约7.1kb的连续小鼠基因组片段被缺失且被替换为约15.6kb的人IL-4Rα核酸序列，所述人IL-4Rα核酸序列包括人IL-4Rα基因的从ATG起始密码子开始的外显子1到外显子5和内含子5的一部分。
在一些实施例中，替换导致在内源IL-4Rα基因基因座处的经修饰的、人源化IL-4Rα基因，其中所述经修饰的IL-4Rα基因的表达处于在内源IL-4Rα基因座处的内源调节元件的控制下。
在内源IL-4Rα基因座处形成的经修饰的、人源化IL-4Rα基因编码人或人源化IL-4Rα蛋白质。在一些实施例中，经修饰的、人源化IL-4Rα基因编码与人IL-4Rα蛋白质(例如由GenBank登录号NM_000418.3中所示的核酸编码的人IL-4Rα蛋白质)至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％等同，或100％等同的IL-4Rα蛋白质。在其他实施例中，经修饰的IL-4Rα基因编码包括胞外域的人源化IL-4Rα蛋白质，所述胞外域与人IL-4Rα蛋白质(例如由GenBank登录号NM_000418.3中所示的核酸编码的人IL-4Rα蛋白质)的胞外域至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％等同，或100％等同。在具体实施例中，人源化IL-4Rα蛋白质的跨膜和细胞质结构域与内源啮齿类动物IL-4Rα蛋白质的跨膜和细胞质结构域等同。
具有在内源IL-4Rα基因座处的内源啮齿类动物IL-4Rα基因整体或部分由人IL-4Rα核酸的替换的遗传修饰的啮齿类动物就替换而言可为纯合或杂合的。在一些实施例中，遗传修饰的啮齿类动物就替换而言是杂合的，即内源啮齿类动物IL-4Rα基因的两个拷贝中仅一个已被替换为人IL-4Rα核酸。在其他实施例中，遗传修饰的啮齿类动物就替换而言是纯合的，即内源啮齿类动物IL-4Rα基因的两个拷贝均已被替换为人IL-4Rα核酸。
本文公开的遗传修饰的啮齿类动物在免疫细胞例如B细胞和T细胞上表达人或人源化IL-4Rα蛋白质。在一些实施例中，遗传修饰的啮齿类动物不表达内源啮齿类动物IL-4Rα蛋白质。在一个实施例中，表达人或人源化IL-4Rα蛋白质的啮齿类动物的免疫细胞具有与在野生型啮齿类动物(所述野生型啮齿类动物表达功能内源IL-4Rα蛋白质，而不表达人或人源化IL-4Rα蛋白质)的免疫细胞上表达功能内源IL-4Rα蛋白质的啮齿类动物在免疫细胞上大约相同水平的IL-4Rα蛋白质。在其他实施例中，啮齿类动物在免疫细胞上表达量为年龄匹配的啮齿类动物的免疫细胞上存在的IL-4Rα蛋白质的量的至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％或200％的人或人源化IL-4Rα蛋白质，所述年龄匹配的啮齿类动物表达功能内源IL-4Rα蛋白质，但不含内源IL-4Rα基因整体或部分由人IL-4Rα核酸的替换。
在一些实施例中，具有内源啮齿类动物IL-4Rα基因整体或部分由人IL-4Rα核酸的替换且表达人或人源化IL-4Rα蛋白质的遗传修饰的啮齿类动物具有正常免疫系统，即表达人或人源化IL-4Rα蛋白质的啮齿类动物的血液、血浆或血清中的免疫细胞例如B细胞和T细胞数目类似于野生型啮齿类动物(例如表达功能内源IL-4Rα蛋白质，且不具有内源啮齿类动物IL-4Rα基因整体或部分由人IL-4Rα核酸的替换的啮齿类动物)的血液、血浆或血清中的免疫细胞例如B细胞和T细胞数目。
在一些实施例中，具有内源啮齿类动物IL-4Rα基因整体或部分由人IL-4Rα核酸的替换且表达人或人源化IL-4Rα蛋白质的遗传修饰的啮齿类动物能够介导IL-4依赖性信号传导和IL-13依赖性信号传导，并且在介导IL-4依赖性信号传导和IL-13依赖性信号传导中有功能。例如，在遗传修饰的啮齿类动物的免疫细胞上表达的具有人IL-4Rα蛋白质的胞外域的人源化IL-4Rα蛋白质与人IL-4相互作用，并且经由形成I型受体介导人IL-4依赖性信号传导(参见图1)。此类具有人IL-4Rα蛋白质的胞外域的人源化IL-4Rα蛋白质还与人和小鼠IL-13相互作用，并且经由形成II型受体介导IL-13依赖性信号传导(参见图1)。在遗传修饰的啮齿类动物中表达的人源化IL-4Rα蛋白质的功能性可在本领域已知的各种测定中进行评估，所述测定包括在下文实例中具体描述的那些，例如使用来源于遗传修饰的啮齿类动物的原代B细胞测量IL-4诱导的IgE类别转换的测定。
在另外的实施例中，具有内源啮齿类动物IL-4Rα基因整体或部分由人IL-4Rα核酸的替换且表达人或人源化IL-4Rα蛋白质的遗传修饰的啮齿类动物还包括在内源IL-4基因座处内源啮齿类动物IL-4基因整体或部分由人IL-4核酸的替换，并且因此还表达人或人源化IL-4。
在一个进一步方面，本发明提供了双重人源化啮齿类动物例如小鼠或大鼠，其内源啮齿类动物IL-4基因已在内源IL-4基因座处整体或部分被替换为人IL-4核酸，并且其内源啮齿类动物IL-4Rα基因已在内源IL-4Rα基因座处整体或部分被替换为人IL-4Rα核酸。此类双重人源化啮齿类动物就每种人源化替换而言可为纯合或杂合的。在一个具体实施例中，双重人源化啮齿类动物就人源化IL-4和人源化IL-4Rα两者而言是纯合的。
在双重人源化啮齿类动物中对内源啮齿类动物IL-4基因的遗传修饰包括上文对于遗传修饰的啮齿类动物描述的那些修饰或替换，所述遗传修饰的啮齿类动物具有内源啮齿类动物IL-4基因整体或部分由人IL-4核酸的替换。类似地，在双重人源化啮齿类动物中对内源啮齿类动物IL-4Rα基因的遗传修饰包括上文对于遗传修饰的啮齿类动物描述的那些修饰或替换，所述遗传修饰的啮齿类动物具有内源啮齿类动物IL-4Rα基因整体或部分由人IL-4Rα核酸的替换。因此，上文就啮齿类动物IL-4基因的人源化而言和就啮齿类动物基因的人源化而言分别公开的特征对于双重人源化啮齿类动物特别并入本文。
在具体实施例中，本发明提供了双重人源化啮齿类动物例如小鼠或大鼠，其表达人IL-4蛋白质和人源化IL-4Rα蛋白质，其中所述人源化IL-4Rα蛋白质包括人IL-4Rα蛋白质的胞外域，且包括啮齿类动物的内源IL-4Rα蛋白质的跨膜和细胞质结构域。在特定实施例中，人IL-4蛋白质和人源化IL-4Rα蛋白质的表达分别处于在内源啮齿类动物IL-4基因座和啮齿类动物IL-4Rα基因座处的内源啮齿类动物调节序列的控制下。
在一些实施例中，双重人源化啮齿类动物具有正常免疫系统(即免疫细胞的数目与野生型啮齿类动物大约相同)具有在血清中大约相同水平的IL-4蛋白质，并且在免疫细胞上表达与野生型啮齿类动物大约相同量的IL-4Rα蛋白质，野生型啮齿类动物是表达功能内源IL-4蛋白质和IL-4Rα蛋白质且不表达人或人源化IL-4蛋白质或IL-4Rα蛋白质的啮齿类动物。
在特定实施例中，双重人源化啮齿类动物显示出功能IL-4信号传导途径。“功能IL-4信号传导途径”意指人或人源化IL-4蛋白质和人或人源化IL-4Rα蛋白质两者在双重人源化啮齿类动物中表达，并且在双重人源化啮齿类动物中彼此相互作用，以便有效介导下游信号转导且进行正常IL-4信号传导途径的生物活性。正常IL-4信号传导途径的生物活性在上文描述且在图1中示出，包括通过I型受体介导的那些例如Th2分化的起始和维持、B细胞的活化和生长、类别转换为IgE和IgG4，以及通过II型受体信号传导介导的那些例如杯状细胞增生、亚上皮纤维化和组织重塑。例如，在双重人源化啮齿类动物中的功能IL-4信号传导途径通过炎性表型反映，所述炎性表型的特征在于例如响应房尘螨攻击在循环中增加的IgE、气道炎症和/或嗜酸性浸润细胞，所述表型还在不含双重人源化的野生型啮齿类动物中观察到。
制备遗传修饰的非人动物的方法
遗传修饰的非人动物例如啮齿类动物可使用本领域已知的方法进行制备。例如，可制备含有侧面为非人动物同源上游和下游区的人核酸(例如整体或部分的人IL-4或IL-4Rα基因)的靶向载体。靶向构建体还可含有位于人核酸3’的药物选择盒(例如随后可通过瞬时Cre表达载体去除的两侧加有loxP位点的hygro选择盒)。靶向载体可例如通过电穿孔引入非人动物细胞，例如胚胎干(ES)细胞(例如小鼠ES细胞)的基因组内。正确靶向的ES细胞克隆随后可引入早期胚胎(例如8细胞期小鼠胚胎)内。完全来源于正确靶向的ES细胞的非人动物基于例如等位基因分析进行鉴定。对于其中合适的遗传修饰的ES细胞无法容易获得的非人动物，其他方法可用于制备包含如本文描述的遗传修饰的非人动物。此类方法包括例如修饰非ES细胞基因组(例如成纤维细胞或诱导的多能细胞)且采用核转移以将经修饰的基因组转移至合适细胞例如卵母细胞，且在合适的条件下在非人动物中孕育经修饰的细胞(例如经修饰的卵母细胞)，以形成胚胎。
采用遗传修饰的非人动物的方法
在一个方面，本文公开的遗传修饰的IL-4和/或IL-4Rα非人动物用于评估人特异性IL-4和/或IL-4Rα拮抗剂，例如中和性抗IL-4和/或抗IL-4Rα抗体(例如dupilumab)在各种疾病模型中的药效学(PD)和治疗功效，如下文实例中进一步示出的。
在一些实施例中，本发明提供了使用本文公开的双重人源化IL-4和IL-4Rα小鼠筛选人特异性IL-4或IL-4Rα拮抗剂的方法。
“IL-4或IL-4Rα拮抗剂”意指阻断、压制或抑制由IL-4或IL-4Rα介导的一种或多种生物学功能的分子(例如抗体)。“人特异性IL-4或IL-4Rα拮抗剂”指对人IL-4或IL-4Rα特异性且基本上不作用于啮齿类动物IL-4或IL-4Rα的拮抗剂。
在具体实施例中，筛选方法利用表达人IL-4蛋白质和人源化IL-4Rα蛋白质的双重人源化小鼠，其中所述人源化IL-4Rα蛋白质包括与内源小鼠IL-4Rα蛋白质的跨膜和细胞质结构域连接的人IL-4Rα蛋白质的胞外域，并且其中所述小鼠不表达小鼠IL-4或小鼠IL-4Rα。
在一些实施例中，关于人特异性IL-4或IL-4Rα拮抗剂的筛选方法包括给如本文描述的对于IL-4和IL-4Rα双重人源化的遗传修饰的啮齿类动物施用试剂，测定试剂对由IL-4/IL-4Rα信号传导途径介导的生物功能的作用，并且如果试剂在遗传修饰的啮齿类动物中拮抗由IL-4/IL-4Rα信号传导途径介导的功能，则将其鉴定为人特异性IL-4或IL-4Rα拮抗剂。
在一个实施例中，试剂包含结合IL-4或IL-4Rα的免疫球蛋白可变结构域。在一个实施例中，试剂特异性结合人IL-4或IL-4Rα，而不特异性结合啮齿类动物IL-4或IL-4Rα。在一个实施例中，试剂是抗体。在一个具体实施例中，试剂是特异性结合人IL-4Rα而不特异性结合啮齿类动物IL-4Rα的抗体。
在一个实施例中，筛选方法利用表达人IL-4蛋白质和人源化IL-4Rα蛋白质的双重人源化小鼠，其中所述人源化IL-4Rα蛋白质包括与内源小鼠IL-4Rα蛋白质的跨膜和细胞质结构域连接的人IL-4Rα蛋白质的胞外域，并且其中所述小鼠不表达鼠IL-4或鼠IL-4Rα。
在一些实施例中，筛选方法包括下述步骤：在如本文描述的双重人源化啮齿类动物中诱导与IL-4/IL-4Rα信号传导相关的疾病，给啮齿类动物施用试剂，测定试剂是否改善疾病，并且如果试剂改善疾病，则将试剂鉴定为适合于治疗疾病的人特异性IL-4或IL-4Rα拮抗剂。
“与IL-4/IL-4Rα信号传导相关的疾病”意指其中牵涉由IL-4/IL-4Rα信号传导介导的生物学功能的疾病。与IL-4/IL-4Rα信号传导相关的疾病的例子包括例如炎性疾病或病症，如哮喘、特应性皮炎、慢性阻塞性肺疾病(COPD)(其可至少部分起因于香烟烟雾)、炎性肠病、多发性硬化、关节炎、过敏性鼻炎、嗜酸细胞性食管炎和牛皮癣。哮喘可为嗜酸性或非嗜酸性哮喘和类固醇敏感性或类固醇抵抗性哮喘。
在一些实施例中，与IL-4/IL-4Rα信号传导相关的疾病是气道炎症，其可通过以一个或多个剂量鼻内施用变应原(例如房尘螨提取物)一段时间在啮齿类动物中进行诱导。试剂的作用可通过测量气道炎症的程度(通过例如粘液累积、支气管肺泡灌洗液中的嗜酸性浸润细胞、总循环IgE水平和/或可通过微阵列表达分析测量的表达谱中的改变反映)是否由于试剂施用而减少进行测定。用于诱导气道炎症的变应原和被测试的试剂可同时或在不同时间施用。在一些实施例中，变应原在一个或多个剂量中给予啮齿类动物，并且被测试的试剂在变应原的至少一个剂量已给予啮齿类动物后施用于啮齿类动物。
在一些实施例中，与IL-4/IL-4Rα信号传导相关的疾病是皮肤炎症或特应性皮炎，其可通过制备皮肤损伤且使损伤的皮肤暴露于以一个或多个剂量的变应原(例如细菌毒素或房尘螨提取物)一段时间在啮齿类动物中进行诱导。试剂的作用可通过测量皮肤炎症是否由于试剂施用而减轻进行测定。
在一个进一步方面，三重人源化非人动物，即其IL-4、IL-4Rα和IL-33基因已人源化的非人动物，用于评估候选化合物例如人特异性IL-4和/或IL-4Rα拮抗剂和人特异性IL-33拮抗剂的药效学(PD)和治疗功效。
“IL-33拮抗剂”意指阻断、压制或抑制由IL-33介导的一种或多种生物学功能或信号传导的分子(例如抗体)。“人特异性IL-33拮抗剂”指对人IL-33特异性且基本上不作用于啮齿类动物IL-33的拮抗剂。已知IL-33刺激通过ST2和IL-1RAcP的信号转导，所述信号转导在拮抗剂例如IL-33抗体的存在下减少。通过ST2和IL-1RAcP的IL-33信号转导的抑制可通过在体外或体内测定中测定IL-33信号转导进行测定，所述体外或体内测定例如美国公开申请2014/0271658A1中所述的那些，所述美国公开申请的完整内容以引用的方式并入本文。例如，测定例如美国公开申请2014/0271658A1中所述的那种可用于评价针对IL-33的抗体对变应原致敏动物中的肺炎症的作用，所述变应原致敏动物对于人IL-33的表达是纯合的。作为IL-33拮抗剂有效的IL-33抗体应证实朝向肺中的炎症细胞减少的趋势，以及朝向细胞因子例如IL-4和IL-5中的减少的趋势。
在具体实施例中，三重人源化非人动物在本文中用于评估候选化合物，其中所述三重人源化动物是表达人IL-4蛋白质、人源化IL-4Rα蛋白质(其包括与小鼠IL-4Rα蛋白质的跨膜和细胞质结构域连接的人IL-4Rα蛋白质的胞外域)、以及人IL-33蛋白质的三重人源化小鼠，其中所述小鼠不表达小鼠IL-4、小鼠IL-4Rα或小鼠IL-33。
在一些实施例中，三重人源化非人动物用于评估候选化合物例如人特异性IL-4和/或IL-4Rα拮抗剂或人特异性IL-33拮抗剂的药效学(PD)和治疗功效。例如，人特异性IL-4抗体、人特异性IL-4Rα抗体和人特异性IL-33抗体可在三重人源化动物(例如啮齿类动物，例如小鼠或大鼠)中个别进行测试，并且可评估且比较其PD谱和治疗功效。
在其他实施例中，三重人源化非人动物用于评估与化合物个别使用时的功效相比较，化合物组合例如人特异性IL-4和/或IL-4Rα拮抗剂抗体与人特异性IL-33拮抗剂抗体的组合的功效，以测定例如化合物组合是否显示出协同治疗功效。在具体实施例中，人特异性IL-4抗体和人特异性IL-33抗体的组合在三重人源化非人动物中进行测试。在其他具体实施例中，人特异性IL-4Rα抗体和人特异性IL-33抗体的组合在三重人源化非人动物中进行测试。
为了评估候选化合物或化合物组合，与IL-4/IL-4Rα信号传导和IL-33信号传导相关的疾病可在三重人源化动物中进行诱导。与IL-4/IL-4Rα信号传导和IL-33信号传导相关的疾病的例子包括例如炎性疾病或病症，如哮喘、特应性皮炎、慢性阻塞性肺疾病(COPD)(其可至少部分起因于香烟烟雾)、炎性肠病、多发性硬化、关节炎、过敏性鼻炎、嗜酸细胞性食管炎和牛皮癣。哮喘可为嗜酸性或非嗜酸性哮喘和类固醇敏感性或类固醇抵抗性哮喘。化合物或化合物组合的效应可与如上所述的IL-4/IL-4Rα双重人源化动物类似地进行评价。
本发明还通过下述非限制性实例进行举例说明。
实例1
内源小鼠IL-4基因由人IL-4基因的替换
含有人IL-4基因的从ATG起始密码子开始的外显子1到外显子4(包括3'非翻译区)的编码部分和外显子4下游的3'区域的一部分的8.8kb人IL-4基因替换跨越从ATG起始密码子开始的外显子1到外显子4(包括3'非翻译区)的编码部分和外显子4下游的3'区域的一部分的6.3kb鼠IL-4基因基因座。参见图2A。
使用
基因工程技术(参见Valenzuela等人(2003)High-throughputengineering of the mouse genome coupled with high-resolution expressionanalysis,Nature Biotech,21(6):652-659)，在单个靶向步骤中构建用于将小鼠替换为人IL-4基因的靶向构建体。小鼠和人IL-4DNA分别得自细菌人工染色体(BAC)克隆bMQ-41A12和RP11-17K19。简言之，通过缺口修复克隆生成的SbfI线性化靶向构建体被电穿孔到F1H4小鼠胚胎干(ES)细胞(C57BL/6x 129F1杂种)内，所述SbfI线性化靶向构建体含有小鼠IL-4上游和下游同源臂和两侧加有loxP位点的hygro选择盒，所述小鼠IL-4上游和下游同源臂在从外显子1中的ATG密码子延伸到外显子4(包括3'非翻译区)和外显子4下游的3'区域的一部分的8.8kb人IL-4序列(基因组坐标：GRCh37:chr5:132,009,743-132,018,576(+链))侧面。正确靶向的ES细胞(MAID 879)还用瞬时Cre表达载体进行电穿孔，以去除药物选择盒。不含药物盒的靶向ES细胞克隆(MAID 1553)通过
方法(参见美国专利号7,294,754、7,576,259、7,659,442，以及Poueymirou等人(2007)F0generation mice thatare essentially fully derived from the donor gene-targeted ES cells allowingimmediate phenotypic analyses,Nature Biotech.25(1):91-99)引入8细胞期SW小鼠胚胎内。使用等位基因测定(参见Valenzuela等人(2003))的修饰，通过就小鼠等位基因的丧失和人等位基因的获得进行基因分型，来鉴定荷有人源化IL-4基因的
(完全来源于供体ES细胞的F0小鼠)。
正确靶向的ES细胞克隆通过天然等位基因丧失(LONA)测定(Valenzuela等人2003)进行鉴定，其中通过对于靶向用于缺失的小鼠IL-4基因中的序列特异性的两种TaqManTM定量聚合酶链反应(qPCR)，来测定天然、未经修饰的IL-4基因的拷贝数。qPCR测定包括下述引物-探针组(从5'到3'书写)：上游正向引物，CATGCACGGA GATGGATGTG(SEQ IDNO:1)；上游反向引物，GACCCCTCAG GTCCACTTAC C(SEQ ID NO:2)；上游探针，FAM-AACGTCCTCA CAGCAACGA-MGB(SEQ ID NO:3)；下游正向引物，GTGCCCAGGT GTGCTCATG(SEQID NO:4)；下游反向引物，CGCCTGCCTC CTCACTTTAT C(SEQ ID NO:5)；下游探针，FAM-ATCTGCTTCA CCATCCACT-MGB(SEQ ID NO:6)；其中FAM指5'羧基荧光素荧光探针，并且BHQ指黑洞淬灭型荧光淬灭剂(Biosearch Technologies)。根据制造商的建议，由已吸收靶向载体且掺入其基因组内的ES细胞克隆纯化的DNA与TaqManTM Gene Expression Master Mix(Life Technologies)在384孔PCR板(MicroAmpTM Optical 384-Well Reaction Plate,Life Technologies)中组合，并且在Applied Biosystems Prism 7900HT中循环，所述Applied Biosystems Prism 7900HT收集在PCR过程期间的荧光数据，且测定阈值循环(Ct)，即累积的荧光在其下达到预置阈值的分数PCR循环。对于每种DNA样品运行上游和下游IL-4特异性qPCR以及关于非靶向参考基因的两种qPCR。计算在每种IL-4特异性qPCR和每种参考基因qPCR之间的Ct值中的差异(ΔCt)，并且随后计算对于测定的所有样品在每个ΔCt和中值ΔCt之间的差异，以获得关于每种样品的ΔΔCt值。由下式计算每种样品中的IL-4基因的拷贝数：拷贝数＝2×2-ΔΔCt。已丧失其天然拷贝之一的正确靶向的克隆具有等于一的IL-4基因拷贝数。在人源化等位基因中人IL-4基因序列替换缺失的小鼠IL-4基因序列的证实通过TaqManTM qPCR测定加以证实，所述TaqManTM qPCR测定包括下述引物-探针组(从5'到3'书写)：人正向引物，GCCTGGACCA AGACTCTGT(SEQ ID NO:7)；人反向引物，ACCGTGGGAC GGCTTCTTAC(SEQ ID NO:8)；人上游探针，FAM-CACCGAGTTG ACCGTAACAGACATC-BHQ(SEQ ID NO:9)。hygro选择盒与人IL-4基因序列一起插入人源化等位基因的证实通过TaqManTM qPCR测定加以证实，所述TaqManTM qPCR测定包括下述引物-探针组(从5'到3'书写)：hygro正向引物，TGCGGCCGAT CTTAGCC(SEQ ID NO:10)；hygro反向引物，TTGACCGATT CCTTGCGG(SEQ ID NO:11)；hygro探针，FAM-ACGAGCGGGT TCGGCCCATT C-BHQ(SEQ ID NO:12)。
相同LONA测定用于测定由来源于靶向ES细胞的小鼠的尾部活组织检查纯化的DNA，以测定其IL-4基因型且证实人源化IL-4等位基因已通过种系传递。进行对于替换杂合的两只幼鼠的育种，以生成对于内源小鼠IL-4基因被人IL-4基因的替换纯合的小鼠。对于替换纯合的幼鼠用于表型分型。
鼠IL-4基因座和含有人IL-4基因的序列的上游连接设计为在
内，其中人IL-4序列是斜体的，并且IL-4编码序列是圆括号内的。含有人IL-4基因的序列和两侧加有loxP位点的hygro选择盒的下游连接设计为在
(SEQ ID NO:14)内，其中人IL-4序列是斜体的，并且IL-4编码序列是圆括号内的。两侧加有loxP位点的hygro选择盒的序列和鼠IL-4基因座的下游连接设计为在
内，其中hygro盒序列是斜体的。
实例2
内源小鼠IL-4Rα胞外域基因序列由人IL-4Rα胞外域基因序列的替换
含有人IL-4Rα基因的从ATG起始密码子开始的外显子1到外显子5和内含子5的一部分的15.6kb人IL-4Rα基因替换跨越从ATG起始密码子开始的外显子1到外显子5和内含子5的一部分的7.1kb鼠IL-4Rα基因基因座。小鼠外显子6到9被保留；仅外显子1到5(即胞外域)是人源化的。参见图2B。
使用
基因工程技术(参见Valenzuela等人(2003)High-throughputengineering of the mouse genome coupled with high-resolution expressionanalysis,Nature Biotech,21(6):652-659)，在单个靶向步骤中构建用于将小鼠替换为人IL-4Rα基因的靶向构建体。小鼠和人IL-4RαDNA分别得自细菌人工染色体(BAC)克隆RP23-136G14和RP11-166E24。简言之，通过缺口修复克隆生成的NotI线性化靶向构建体被电穿孔到F1H4小鼠胚胎干(ES)细胞(C57BL/6x 129F1杂种)内，所述NotI线性化靶向构建体含有小鼠IL-4Rα基因上游和下游同源臂和两侧加有loxP位点的neo选择盒，所述小鼠IL-4Rα基因上游和下游同源臂在从外显子1中的ATG密码子延伸到外显子5和内含子5的一部分的15.6kb人IL-4Rα序列(基因组坐标：GRCh37:chr16:27,351,525-27,367,111(+链))侧面。正确靶向的ES细胞(MAID 803)还用瞬时Cre表达载体进行电穿孔，以去除药物选择盒。不含药物盒的靶向ES细胞克隆(MAID 1444)通过
方法(参见美国专利号7,294,754、7,576,259、7,659,442，以及Poueymirou等人(2007)F0generation mice that areessentially fully derived from the donor gene-targeted ES cells allowingimmediate phenotypic analyses,Nature Biotech.25(1):91-99)引入8细胞期SW小鼠胚胎内。使用等位基因测定(参见Valenzuela等人(2003))的修饰，通过就小鼠等位基因的丧失和人等位基因的获得进行基因分型，来鉴定荷有人源化IL-4Rα基因的
(完全来源于供体ES细胞的F0小鼠)。
正确靶向的ES细胞克隆通过天然等位基因丧失(LONA)测定(Valenzuela等人2003)进行鉴定，其中通过对于靶向用于缺失的小鼠IL-4Rα基因中的序列特异性的两种TaqManTM定量聚合酶链反应(qPCR)，来测定天然、未经修饰的IL-4Rα基因的拷贝数。qPCR测定包括下述引物-探针组(从5'到3'书写)：上游正向引物，CCGCTGGCAT GTGTATTGTG(SEQ IDNO:16)；上游反向引物，TGAGTGTGGG ACCCTCAAGA G(SEQ ID NO:17)；上游探针，FAM-TGACCCAAGC CCTACATGGC CACT-BHQ(SEQ ID NO:18)；下游正向引物，TGAGGAGAGCTCACGGGAAT C(SEQ ID NO:19)；下游反向引物，ACCCATCTCC TGCGTTTCTG(SEQ ID NO:20)；下游探针，FAM-TTGACACGCC AGCTACACTG CTCCA-BHQ(SEQ ID NO:21)；其中FAM指5'羧基荧光素荧光探针，并且BHQ指黑洞淬灭型荧光淬灭剂(Biosearch Technologies)。根据制造商的建议，由已吸收靶向载体且掺入其基因组内的ES细胞克隆纯化的DNA与TaqManTM GeneExpression Master Mix(Life Technologies)在384孔PCR板(MicroAmpTM Optical 384-Well Reaction Plate,Life Technologies)中组合，并且在Applied Biosystems Prism7900HT中循环，所述Applied Biosystems Prism 7900HT收集在PCR过程期间的荧光数据，且测定阈值循环(Ct)，即累积的荧光在其下达到预置阈值的分数PCR循环。对于每种DNA样品运行上游和下游IL-4Rα特异性qPCR以及关于非靶向参考基因的两种qPCR。计算在每种IL-4Rα特异性qPCR和每种参考基因qPCR之间的Ct值中的差异(ΔCt)，并且随后计算对于测定的所有样品在每个ΔCt和中值ΔCt之间的差异，以获得关于每种样品的ΔΔCt值。由下式计算每种样品中的IL-4Rα基因的拷贝数：拷贝数＝2×2-ΔΔCt。已丧失其天然拷贝之一的正确靶向的克隆具有等于一的IL-4Rα基因拷贝数。在人源化等位基因中人IL-4Rα基因序列替换缺失的小鼠IL-4Rα基因序列的证实通过TaqManTM qPCR测定加以证实，所述TaqManTMqPCR测定包括下述引物-探针组(从5'到3'书写)：人正向引物，ACCTGCGTCT CCGACTACAT G(SEQ ID NO:22)；人反向引物，GAGCTCGGTG CTGCAATTG(SEQ ID NO:23)；人探针，FAM-TGGGACCATT CATCTTCCAC TCGCA-BHQ(SEQ ID NO:24)。neo选择盒与人IL-4Rα基因序列一起插入人源化等位基因的证实通过TaqManTM qPCR测定加以证实，所述TaqManTM qPCR测定包括下述引物-探针组(从5'到3'书写)：neo正向引物，GGTGGAGAGG CTATTCGGC(SEQ ID NO:25)；neo反向引物，GAACACGGCG GCATCAG(SEQ ID NO:26)；neo探针，FAM-TGGGCACAACAGACAATCGG CTG-BHQ(SEQ ID NO:27)。
相同LONA测定用于测定由来源于靶向ES细胞的小鼠的尾部活组织检查纯化的DNA，以测定其IL-4Rα基因型且证实人源化IL-4Rα等位基因已通过种系传递。进行对于替换杂合的两只幼鼠的育种，以生成对于内源小鼠IL-4Rα基因被人IL-4Rα基因的替换纯合的小鼠。对于替换纯合的幼鼠用于表型分型。
鼠IL-4Rα基因座和含有人IL-4Rα基因的序列的上游连接设计为在
内，其中人IL-4Rα序列是斜体的，并且IL-4Rα编码序列是有下划线的。含有人IL-4Rα基因的序列和两侧加有loxP位点的neo选择盒的下游连接设计为在
内，其中人IL-4Rα序列是斜体的，并且盒序列是小写字母。两侧加有loxP位点的neo选择盒的序列和鼠IL-4Rα基因座的下游连接设计为在
内，其中小鼠IL-4Rα编码序列是圆括号内的，并且neo盒序列是小写字母。
实例3
双重人源化IL-4/IL-4Rα小鼠的生成
如下生成双重人源化IL-4/IL-4Ra(Il4hu/hu/Il4rahu/hu)小鼠。包括人源化IL-4Rα基因和两侧加有loxP位点的neo盒的ES细胞克隆MAID 803用Cre表达载体进行电穿孔，以去除两侧加有loxP位点的neo盒，以生成包括人源化IL-4Rα基因不含药物选择盒的ES细胞克隆MAID 1444(参见实例2)。用于生成包括人源化IL-4基因和两侧加有loxP位点的hygro盒(参见实例1)的ES细胞克隆MAID 879的相同靶向构建体被电穿孔到ES细胞克隆MAID 1444内，以生成879Het/1444Het(Il4+/hu/Il4ra+/hu)ES细胞，所述细胞随后用Cre表达载体进行电穿孔，以去除两侧加有loxP位点的hygro盒，以生成包括人源化IL-4和IL-4Rα基因的ES细胞克隆(MAID 1553/1444)。将不含药物盒的ES细胞克隆MAID 1553/1444引入8细胞期SW小鼠胚胎内，以生成双重人源化IL-4/IL-4Rα小鼠。
实例4
Dupilumab，全人IL-4RαmAb在具有人IL-4和IL4Rα基因替换的小鼠中的功效评估
方法
使用
技术制备基因工程小鼠，以用8.8kb人IL-4基因组序列(参见实例1和图2A)替换小鼠全长IL-4基因座和用相应的人IL-4Rα基因组DNA的15.6kb片段替换小鼠IL-4Rα(CD124)基因的细胞外结构域(即胞外域)(参见实例2和图2B)。
具有纯合人源化IL-4Rα基因的小鼠就人基因的表达和功能加以验证。为了测定通过人源化小鼠的人IL-4Rα表达，收集来自野生型和人源化小鼠的脾细胞且加工用于荧光激活细胞分选(FACS)分析，使用针对小鼠CD3、小鼠CD19、人CD124和小鼠CD124的荧光标记的抗体。(参见例如Blaeser等人(2003)Targeted inactivation of the IL-4receptor achain I4R motif promotes allergic airway inflammation,J Exp Med 198(8):1189-1200)。
为了证实配体特异性和受体功能性，使用来源于人源化IL-4Rα小鼠的原代细胞。使用在DMEM中的来自野生型和人源化IL-4Rα小鼠的股骨骨髓细胞培养骨髓衍生的巨噬细胞共7天，所述DMEM含有10％胎牛血清加上20％L细胞条件化培养基。
细胞随后用20ng/ml在培养基中稀释的小鼠IL-4、小鼠IL-13、人IL-4、人IL-13或媒介物个别处理20小时。收获来自每种条件的一式四份样品用于基因表达分析。
提取来自这些样品的总RNA且通过掺入Cy3-CTP扩增成cRNA。来自每种样品的Cy3标记的cRNA随后与由覆盖小鼠转录组的43,538种60聚体寡核苷酸组成的定制Agilent阵列杂交。使用Agilent Feature Extraction Software 9.5从扫描阵列图像中提取数据。
使用斯氏t检验鉴定在实验组之间差异表达的基因((p<0.05，倍数变化≥1.5)。使用来自GeneSpring GX7.3的皮尔逊相关聚类算法生成这些基因的表达簇。
使用体外IgE类别转换测定连同从人源化IL-4Rα(Il4rahu/hu)小鼠中分离的原代B细胞，评估dupilumab针对IL-4的中和效应。
野生型(WT)和人源化IL-4Rα(Il4rahu/hu)小鼠接受高体积(水动力)驱动的裸露质粒DNA溶液的基因递送，用于在体内表达小鼠IL-25。(参见例如Liu等人(1999)Hydrodynamics-based transfection in animals by systemic administration ofplasmid DNA,Gene Therapy 6:1258-1266.)。8天后收集外周血，以使用商业ELISA试剂盒(R&D systems,MN)测量血清鼠IgE(mIgE)水平。
来自人源化小鼠脾细胞的纯化的原代B细胞用细菌LPS活化，且在7天培养物中与渐增量的重组人IL-4混合，以诱导免疫球蛋白类别转换。对于抗体阻断实验，在加入0.167nM重组人IL-4之前，使纯化的B细胞与渐增剂量的dupilumab一起温育30分钟，且培养7天。在不存在IL-4的情况下或连同同种型对照mAb的IgE生产分别以(◇)和(△)显示。使用商业ELISA试剂盒测量培养上清液中的鼠IgE水平。(参见例如Moon等人(1989)Regulationof IgG1and IgE synthesis by interleukin 4in mouse B cells,Scand I Immunol 30:355-361.)。
白细胞介素-25(IL-25)是通过Th2细胞产生的细胞因子，所述Th2细胞的主要活性通过IL-4和IL-13的产生进行介导，以诱导组织特异性病理学，例如增加的肺粘液产生和杯状细胞增生。(参见Fort等人(2001)IL-25induces IL-4,IL-5,and IL-13and Th2-associated pathologies in vivo,Immunity15(6):985-995.)。
IL-13的缺乏使动物免于IL-25诱导的靶器官中的病理学。因此，IL-25驱动的肺炎症模型用于评价dupilumab在包括人源化IL-4和/或IL-4Rα基因的小鼠体内的药效学(PD)特性。
使用IL-25诱导的炎症方法，通过测量人源化IL-4Rα(Il4rahu/hu)小鼠中的肺粘液累积，来表征dupilumab对II型受体的PD应答。
在第0天时，WT和人源化IL-4Rα(Il4rahu/hu)小鼠接受小鼠IL-25表达载体的水动力递送，且随后为以所示剂量的dupilumab或同种型对照mAb的注射。每隔一天施用抗体的另外剂量，总共4个剂量。在第8天时，从被安乐死的小鼠中收集肺组织，并且通过过碘酸希夫染色经加工的肺切片，然后就病理变化进行不知情评分。
结果
人源化IL-4Rα小鼠表征为显示：(a)在来自双重人源化IL-4/IL-4Rα(Il4hu/hu/Il4rahu/hu)小鼠的原代细胞上的人IL-4Rα的表达(参见图3)；(b)在人源化IL-4Rα(Il4rahu /hu)小鼠中的IL-4配体特异性的变化(参见图4)；和(c)在人源化IL-4Rα(Il4rahu/hu)小鼠中的IL-13途径的功能性(参见图4)。
如图3中所示，其中显示了在门控的B细胞和T细胞群体上的IL-4Rα(CD124)的标记谱，并且在阴影区域中显示了相应的未染色细胞群体的分布，野生型和人源化IL-4Rα(Il4rahu/hu)小鼠在B(CD19+,CD3-)和T(CD19-,CD3+)细胞的表面上表达相似量的IL-4Rα蛋白质。
如图4(左侧)中所示，野生型(Il4ra+/+)小鼠响应小鼠IL-4而不响应人IL-4，并且响应小鼠和人IL-13两者。如图4(右侧)中所示，人源化IL-4Rα(Il4rahu/hu)小鼠响应人IL-4而不响应小鼠IL-4，并且响应小鼠和人IL-13两者。
该数据显示IL-4而不是IL-13在野生型和人源化IL-4Rα(Il4rahu/hu)小鼠展示物种特异性。
如图5中所示，IL-4作为介导IgE类别转换的主要因素的作用通过在人源化IL-4Rα(Il4rahu/hu)小鼠中的小鼠IL-25基因递送后缺乏升高水平的循环IgE得到支持。
dupilumab单克隆抗体在体外和体内进行调查。
如图6中所示，dupilumab阻止人源化IL-4Rα(Il4rahu/hu)小鼠衍生的原代B细胞培养物中的人IL-4诱导的IgE生产。
如图7中所示，dupilumab在10mg/kg及以上时剂量依赖性减少IL-25诱导的肺病理学(25mg/kg减少粘液病理学)。
结论
结果证实dupilumab，全人抗人IL-4Rα单克隆抗体，在具有细胞因子诱导的炎症的遗传修饰的小鼠模型中的药理学活性。
具有人IL-4和/或IL-4Rα基因替换的遗传修饰的小鼠的生成提供了评估基因直向同源物的功能和具有有限交叉物种反应性的抗体候选物的体内功效的有力工具。
实例5
房尘螨提取物(HDM)诱导的肺炎症模型
在双重人源化IL-4和IL-R4α小鼠中的慢性气道炎症通过房尘螨(HDM)提取物(Greer laboratories)的鼻内攻击进行诱导。简言之，小鼠首先通过HDM悬浮液(以2.5μg/ml的浓度20μl)的鼻内滴注致敏10天。在两周消退间隔后，在第5至12周之间，小鼠用鼻内HDM应用再攻击3次/周。dupilumab(抗IL-4Rα抗体)治疗以每周两次的频率通过皮下注射从第7周开始，直至在第12周时实验结束时。收集组织样品用于进一步分析。实验设计在图8中描述。
使用双重人源化IL-4和IL-4Rα小鼠证实dupilumab在HDM诱导的气道炎症模型中的治疗功效
使用上述方案在双重人源化IL-4和IL-4Rα(IL-4hu/hu/IL-4Rhu/hu)小鼠中诱导气道疾病。肺组织的组织学分析显示鼻内HDM滴注引起气道中增加的粘液产生。dupilumab治疗减少HDM攻击的小鼠中的粘液累积。支气管肺泡灌洗液(BALF)中的浸润细胞分析指示嗜酸性粒细胞计数通过HDM滴注增加，并且通过dupilumab治疗减少。总循环IgE通过人源化小鼠中的HDM治疗得到升高，提示有能力的IL-4信号传导途径。dupilumab的使用能够减少IgE的水平。相比之下，仅拮抗IL-13而不干扰IL-4信号转导的比较物分子IL13R2α-Fc在减少粘液累积和阻止嗜酸性粒细胞浸润中具有可比较的活性。然而，在dupilumab和IL-13拮抗剂IL13R2α-Fc之间的循环IgE水平中检测到差异效应。IL-13途径单独的阻断不足以减少HDM诱导的IgE水平；而dupilumab通过阻断IL-4和IL-13途径两者减轻变态反应的主要致病性介质IgE的生产。
在一组分开的实验中，使用上述相同方案在双重人源化IL-4和IL-4Rα(IL-4hu/hu/IL-4Rhu/hu)小鼠中诱导气道疾病，除了使用不同对照之外。与dupilumab为相同IgG同种型的同种型对照抗体用于这些实验中。实验设计在图9中描述。使用Dynabeads mRNA试剂盒(Life Tech)从总RNA中纯化mRNA，并且使用Scriptseq RNA Library Prep试剂盒(Illumina)由mRNA制备链特异性RNA-Seq文库。使用HiSeq 2000(Illumina)以33bp的读数长度进行文库测序，并且使用Clcbio(Qiagen)RNA-Seq工作流，从原始读数中提取基因表达水平。使用斯氏t检验鉴定在实验组之间差异表达的基因(p<0.05，倍数变化≥1.5)。使用来自GeneSpring GX7.3的皮尔逊相关聚类算法生成这些基因的表达簇。发现HDM诱导双重人源化IL-4和IL-4Rα小鼠中的肺基因表达的改变，并且此类改变被dupilumab阻断。在治疗期结束时从被安乐死的小鼠中收集血清样品。使用商业ELISA试剂盒(R&D systems)测量血清鼠IgE水平。使用普通的单向ANOVA方法执行统计分析。
实例6
抗原诱导的皮肤炎症模型
双重人源化Il-4和Il-4Rα小鼠中的慢性皮肤炎症可通过下述程序进行诱导。用电动剪刀剃掉人源化小鼠的背部毛发，并且随后用胶带剥离以制备微小损伤且破坏皮肤屏障。用变应原(例如卵白蛋白加上细菌毒素或房尘螨提取物)溶液浸泡的纱布贴片附着至皮肤共一周，随后为两周消退期。将该程序重复三次总7周，以诱导特应性皮炎样皮肤病损。经处理的小鼠具有增加的IgE水平、瘙痒、表皮增厚、特应性皮炎的典型症状。
实例7
表征抗人IL-4Rα抗体在表达人源化IL-4Rα的小鼠中的PK谱
该实例描述为评估REGN 668(针对人IL-4Rα的人单克隆抗体，也称为“dupilumab”)和对照抗体REGN646(猴子替代物，抗mfIL-4R非结合对照抗体)的PK谱而进行的实验。
在这些实验中使用的小鼠是20-23周的MAID 1444(对于人源化IL-4Rα纯合的或“IL-4RαHumIn”，其中IL-4Rα胞外域是人的，并且跨膜和细胞质区是小鼠的)和品系匹配的(75％C57BL/6/25％129Sv)野生型(“WT”)小鼠。研究组包括总共40只小鼠，雄性和雌性，具有5只纯合和5只品系匹配WT的群组大小/药物//剂量。抗体(在PBS缓冲液中)经由皮下注射以10mg/kg给予小鼠。分别在注射当天(时间点“0”或第0天)、在注射后6小时以及在第1天、第3天、第7天、第10天、第14天、第21天和第30天时，获得血样用于分析。
循环药物(即REGN668或REGN646)水平通过总人抗体分析使用ELISA免疫测定进行测定。简言之，将山羊抗人IgG多克隆抗体(Jackson ImmunoResearch,#109-005-098)涂布到96孔板上，以捕获血清中的测试的人抗体，并且随后使用与辣根过氧化物酶缀合的山羊抗人IgG多克隆抗体(Jackson ImmunoResearch,#109-035-098)和TMB底物(BDPharmingen)，检测板结合的抗体。血清样品在范围为1:100-1:243,000的六剂量系列稀释/样品中，并且分别抗体的参考标准在12剂量系列稀释中。基于使用Graphpad Prism软件生成的参考标准曲线计算血清中的药物抗体浓度。
发现与仅具有小鼠IL-4Rα蛋白质的野生型小鼠相比较，REGN 668的半衰期在IL-4RαHumIn小鼠中缩短。PK谱中的这种差异可通过在单克隆抗体和人IL-4α受体之间的靶介导的相互作用和清除加以解释。因此，表达人或人源化IL-4Rα的小鼠提供了合适模拟，以在临床前小鼠模型中表征抗人IL-4Rα抗体(例如dupilumab)的PK特性。
人源化IL-4和/或IL-4Rα小鼠的用途
人源化IL-4和/或IL-4Rα可用于评估人特异性IL-4和/或IL-4Rα拮抗剂例如中和性抗IL-4和/或抗IL-4Rα抗体例如dupilumab的药效学(PD)。
根据本领域已知的标准程序，执行在人源化IL-4和/或IL-4Rα小鼠中的药代动力学(PK)和PD测定。
人源化IL-4和/或IL-4Rα小鼠可用于测试人特异性IL-4和/或IL-4Rα拮抗剂例如中和性抗IL-4和/或IL-4Rα抗体例如dupilumab在例如如上文所示的本领域已知的各种疾病模型中的体内治疗功效。
实例8
内源小鼠IL-33基因由人IL-33基因的替换
小鼠IL-33基因(NCBI基因ID：77125，主要源：MGI:1924375；RefSeq转录物：NM_001164724.1；UniProt ID：Q8BVZ5；基因组装配：NCBI37/mm9；位置：chr19:29,999,604-30,035,205+链)具有8个外显子，且编码266个氨基酸的蛋白质(GenBank登录号NP_001158196.1)。
人IL-33基因(NCBI基因ID：90865，主要源：HGNC:16028；RefSeq转录物：NM_033439.3；UniProt ID：O95760；基因组装配：GRCh37/hg19；位置：chr9:6,215,149-6,257,983+链)也具有8个外显子，且编码270个氨基酸的蛋白质(GenBank登录号NP_254274.1)。
含有人IL-33基因的从ATG起始密码子开始的外显子2到外显子8(包括3'非翻译区)的16333bp人基因组区段替换跨越从ATG起始密码子开始的外显子2到外显子8的编码部分包括终止密码子的9381bp小鼠IL-33基因。参见图10A。
使用
基因工程技术(参见Valenzuela等人(2003)High-throughputengineering of the mouse genome coupled with high-resolution expressionanalysis,Nature Biotech,21(6):652-659))，在单个靶向步骤中构建关于用人IL-33基因组片段替换小鼠IL-33基因的靶向构建体，类似于上文实例1中描述的关于用人IL-4基因组区段替换小鼠IL-4基因的程序，除了小鼠和人IL-33DNA分别得自细菌人工染色体(BAC)克隆bMQ-350I18和CTD-3015M15之外，以及除了靶向载体含有loxP新霉素选择盒之外(图10B)。
正确靶向的ES细胞克隆(MAID 7060)通过天然等位基因丧失(LONA)测定(Valenzuela等人2003)进行鉴定，其中通过对于靶向用于缺失的小鼠IL-33基因中的序列特异性的两种TaqManTM定量聚合酶链反应(qPCR)，来测定天然、未经修饰的IL-33基因的拷贝数。qPCR测定包括下述引物-探针组(从5'到3'书写)：
上游("mTU")：
正向引物，TTGGACTAGTAACAAGAAGGGTAGCA(SEQ ID NO:31)；
反向引物，CCTTTCCCATCACCCTCTAACTT(SEQ ID NO:32)；
探针(MGB)，AGCTCTGGTGGACAGA(SEQ ID NO:33)；
下游("mTD")：
正向引物，TCTCTGCCAAGCTGCTTATCC(SEQ ID NO:34)；
反向引物，GGCTGCATGGAAGAGGTGAA(SEQ ID NO:35)；
探针(MGB)，CTCTCCACAAATCG(SEQ ID NO:36)。
在人源化等位基因中人IL-33基因序列替换小鼠IL-33基因序列的证实通过TaqManTM qPCR测定加以证实，所述TaqManTM qPCR测定包括下述引物-探针组(从5'到3'书写)：
上游("hTU")
正向引物，CAGGCAGGAATAGCTGAGATAATCT(SEQ ID NO:37)；
反向引物，TGTGGAGCAAAAAGTGGTTGAT(SEQ ID NO:38)；
探针(MGB)，CCTGTGAATAGTGATAAAC(SEQ ID NO:39)；
下游("hTD")：
正向引物，CAGTTCCAAACGATAGGCTCAA(SEQ ID NO:40)；
反向引物，ATAATTCTGTGAAGCATCTGGTCTTC(SEQ ID NO:41)；
探针(MGB)，CTAGAGCTGCTAGTAAAA(SEQ ID NO:42)。
鼠IL-33基因座和含有人IL-33基因的序列的上游连接(在图10B中显示为"I")设计为在
内，其中人IL-33序列是斜体的，并且人起始密码子ATG是有下划线的。含有人IL-33基因组序列的序列和loxP新霉素选择盒的下游连接(在图10B中显示为"II")设计为在
内，其中人IL-33序列是斜体的，并且连接由"/"符号指示，并且lox P位点是有下划线的。loxP neo选择盒的序列和鼠IL-33基因座的下游连接(在图10B中显示为"III")设计为在
内，其中连接通过"/"符号显示，并且loxP位点是有下划线的。
正确靶向的ES细胞(MAID 7060)还用瞬时Cre表达载体进行电穿孔，以去除药物选择盒且获得不含药物盒的ES细胞克隆(MAID 7061)。这些MAID 7061 ES细胞中的上游连接(在图10C中显示为"I")与MAID 7060 ES细胞中相同。下游连接(在图10C中显示为"II")设计为在
内，其中3'人IL-33序列是第一个"/"符号之前斜体的，并且小鼠IL-33 3'序列是第二个"/"符号之后斜体的，并且loxP位点是有下划线的。
正确靶向的ES细胞(MAID 7060或MAID 7061)通过
方法(参见美国专利号7,294,754、7,576,259、7,659,442，以及Poueymirou等人(2007)F0 generationmice that are essentially fully derived from the donor gene-targeted ES cellsallowing immediate phenotypic analyses,Nature Biotech.25(1):91-99)引入8细胞期SW小鼠胚胎内。使用等位基因测定(参见Valenzuela等人(2003))的修饰，通过就小鼠等位基因的丧失和人等位基因的获得进行基因分型，来鉴定荷有人源化IL-33基因的
(完全来源于供体ES细胞的F0小鼠)。相同LONA测定用于测定由来源于靶向ES细胞的小鼠的尾部活组织检查纯化的DNA，以测定其IL-33基因型且证实人源化IL-33等位基因已通过种系传递。进行对于替换杂合的两只幼鼠的育种，以生成对于内源小鼠IL-33基因被人IL-33基因的替换纯合的小鼠。
综上所述，本发明的实施方案可以如下所述：
1.一种包含内源啮齿类动物IL-4R基因的人源化的啮齿类动物，其中所述人源化包括在内源啮齿类动物IL-4基因座处包含IL-4基因的外显子的啮齿类动物核酸由包含人IL-4基因的至少一个外显子的核酸序列的替换，以形成经修饰的IL-4基因，其中所述经修饰的IL-4基因的表达处于在所述内源啮齿类动物IL-4基因座处的啮齿类动物调节元件的控制下。
2.根据实施方案1所述的啮齿类动物，其中所述啮齿类动物是小鼠或大鼠。
3.根据实施方案1所述的啮齿类动物，其中所述经修饰的IL-4基因编码人或人源化IL-4蛋白质，并且包含所述人IL-4基因的从ATG起始密码子开始的外显子1到外显子4。
4.根据实施方案1所述的啮齿类动物，其中所述啮齿类动物是不能表达小鼠IL-4蛋白质的小鼠。
5.根据实施方案1所述的啮齿类动物，其中所述啮齿类动物是表达由内源小鼠IL-4Rα基因编码的小鼠IL-4Rα蛋白质的小鼠。
6.根据实施方案1所述的啮齿类动物，其中所述啮齿类动物是表达人或人源化IL-4Rα蛋白质的小鼠。
7.根据实施方案6所述的小鼠，其中所述人源化IL-4Rα蛋白质包含所述人IL-4Rα蛋白质的胞外域。
8.根据实施方案7所述的小鼠，其中所述人源化IL-4Rα蛋白质包含所述小鼠IL-4Rα蛋白质的跨膜结构域和细胞质结构域。
9.根据实施方案6所述的小鼠，其中所述小鼠包括在内源小鼠IL-4Rα基因座处包含小鼠IL-4Rα基因的外显子的小鼠核酸由编码人IL-4Rα基因的至少一个外显子的核酸序列的替换，以形成经修饰的IL-4Rα基因，其中所述经修饰的IL-4Rα基因的表达处于在所述内源小鼠IL-4Rα基因座处的小鼠调节元件的控制下。
10.根据实施方案1所述的啮齿类动物，其中所述啮齿类动物是小鼠，并且其中包含小鼠IL-4的从ATG起始密码子开始的外显子1到外显子4的小鼠IL-4序列的连续基因组片段被替换为包含人IL-4的从ATG起始密码子开始的外显子1到外显子4的人IL-4序列的连续基因组片段。
11.根据实施方案1所述的啮齿类动物，其中所述啮齿类动物是小鼠，所述小鼠在血清中表达浓度为年龄匹配的小鼠的血清中存在的小鼠IL-4蛋白质水平的至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％或200％的人或人源化IL-4蛋白质，所述年龄匹配的小鼠表达功能内源小鼠IL-4蛋白质，但不含所述替换。
12.根据实施方案1所述的啮齿类动物，其中所述啮齿类动物是小鼠，所述小鼠在血清中表达浓度为年龄匹配的小鼠的血清中存在的小鼠IL-4蛋白质水平的约10％至约200％、约20％至约150％、或约30％至约100％的人IL-4蛋白质，所述年龄匹配的小鼠表达功能内源IL-4蛋白质，但不含所述替换。
13.一种包含内源啮齿类动物IL-4Rα基因的人源化的啮齿类动物，其中所述人源化包括在内源啮齿类动物IL-4Rα基因座处包含啮齿类动物IL-4Rα基因的外显子的啮齿类动物核酸由包含人IL-4Rα基因的至少一个外显子的核酸序列的替换，以形成人源化IL-4Rα基因，其中所述人源化IL-4Rα基因的表达处于在所述内源啮齿类动物IL-4Rα基因座处的啮齿类动物调节元件的控制下。
14.根据实施方案13所述的啮齿类动物，其中所述啮齿类动物是小鼠或大鼠。
15.根据实施方案13所述的啮齿类动物，其中所述人源化IL-4Rα基因编码人或人源化IL-4Rα蛋白质，并且包含所述人IL-4Rα基因的从ATG起始密码子开始的外显子1到外显子5。
16.根据实施方案13所述的啮齿类动物，其中所述啮齿类动物是不能表达小鼠IL-4Rα蛋白质的小鼠。
17.根据实施方案13所述的啮齿类动物，其中所述啮齿类动物是表达由内源小鼠IL-4基因编码的小鼠IL-4蛋白质的小鼠。
18.根据实施方案17所述的小鼠，其中所述啮齿类动物是表达人或人源化IL-4蛋白质的小鼠。
19.根据实施方案18所述的小鼠，其中所述小鼠包括在内源小鼠IL-4基因座处包含小鼠IL-4基因的外显子的小鼠核酸由包含人IL-4基因的至少一个外显子的核酸序列的替换，以形成经修饰的IL-4基因，其中所述经修饰的IL-4基因的表达处于在所述内源小鼠IL-4基因座处的小鼠调节元件的控制下。
20.根据实施方案13所述的啮齿类动物，其中所述啮齿类动物是小鼠，并且其中包含IL-4Rα的从ATG起始密码子开始的外显子1到外显子5的小鼠IL-4Rα序列的连续基因组片段被替换为包含人IL-4Rα的从ATG起始密码子开始的外显子1到外显子5的人IL-4Rα序列的连续基因组片段。
21.根据实施方案13所述的啮齿类动物，其中所述啮齿类动物是小鼠，所述小鼠在免疫细胞B细胞和/或T细胞上表达人或人源化IL-4Rα蛋白质，其表达的量为年龄匹配的小鼠的免疫细胞B细胞和/或T细胞上存在的小鼠IL-4Rα蛋白质水平的至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％或200％，所述年龄匹配的小鼠表达功能内源小鼠IL-4Rα蛋白质，但不含所述替换。
22.根据实施方案13所述的啮齿类动物，其中所述啮齿类动物是小鼠，所述小鼠在免疫细胞B细胞和/或T细胞上表达人或人源化IL-4Rα蛋白质，其表达的量为年龄匹配的小鼠的免疫细胞B细胞和/或T细胞上存在的小鼠IL-4Rα蛋白质水平的约10％至约200％、约20％至约150％、或约30％至约100％，所述年龄匹配的小鼠表达功能内源小鼠IL-4Rα蛋白质，但不含所述替换。
23.一种用于制备人源化啮齿类动物的方法，所述方法包括用包含人IL-4基因的一个或多个外显子的人IL-4核酸序列替换啮齿类动物IL-4核酸序列，以形成编码人或人源化IL-4蛋白质的经修饰的IL-4基因，其中所述替换在内源啮齿类动物IL-4基因座处，并且包含所述人IL-4基因序列的一个或多个外显子的所述经修饰的IL-4基因序列可操作地连接至在所述内源啮齿类动物IL-4基因座处的啮齿类动物调节元件或序列。
24.根据实施方案23所述的方法，其中所述啮齿类动物是小鼠或大鼠。
25.根据实施方案23所述的方法，其中所述啮齿类动物调节元件或序列来自小鼠或大鼠。
26.根据实施方案23所述的方法，其中所述啮齿类动物调节元件或序列是在所述啮齿类动物IL-4基因座处的内源啮齿类动物调节元件或序列。
27.根据实施方案23所述的方法，其中替换所述啮齿类动物IL-4核酸序列的所述人IL-4核酸序列包含所述人IL-4基因序列的至少一个外显子。
28.根据实施方案27所述的方法，其中替换所述啮齿类动物IL-4核酸序列的所述人IL-4核酸序列包含所述人IL-4基因序列的至少2个或至少3个外显子。
29.根据实施方案28所述的方法，其中替换所述啮齿类动物IL-4核酸序列的所述人IL-4核酸序列包含所述人IL-4基因序列的所有4个外显子。
30.根据实施方案23所述的方法，其中所述替换在内源啮齿类动物IL-4基因座处，并且包含所述人IL-4基因序列的一个或多个外显子的所述人IL-4核酸序列可操作地连接至在所述内源啮齿类动物IL-4基因座处的内源啮齿类动物调节元件或序列。
31.一种用于制备人源化IL-4小鼠的方法，所述方法包括用人IL-4核酸替换小鼠IL-4核酸序列，以形成编码人或人源化IL-4蛋白质的经修饰的IL-4基因。
32.根据实施方案31所述的方法，其中所述替换在内源小鼠IL-4基因座处，并且编码人或人源化IL-4蛋白质的所述经修饰的基因可操作地连接至内源小鼠调节序列。
33.根据实施方案31所述的方法，其中所述替换在内源小鼠IL-4基因座处，并且编码人或人源化IL-4蛋白质的所述经修饰的基因可操作地连接至内源小鼠调节序列。
34.一种用于制备人源化啮齿类动物的方法，所述方法包括用包含人IL-4Rα基因序列的一个或多个外显子的人IL-4Rα核酸序列替换啮齿类动物IL-4Rα核酸序列，以形成编码人或人源化IL-4Rα蛋白质的经修饰的IL-4Rα基因，其中所述替换在内源啮齿类动物IL-4Rα基因座处，并且编码人或人源化IL-4Rα蛋白质的所述经修饰的IL-4Rα基因可操作地连接至在所述内源啮齿类动物IL-4Rα基因座处的啮齿类动物调节元件或序列。
35.根据实施方案34所述的方法，其中所述啮齿类动物是小鼠或大鼠。
36.根据实施方案34所述的方法，其中所述啮齿类动物调节元件或序列来自小鼠或大鼠。
37.根据实施方案34所述的方法，其中所述啮齿类动物调节元件或序列是在所述啮齿类动物IL-4Rα基因座处的内源啮齿类动物调节元件或序列。
38.根据实施方案37所述的方法，其中替换所述啮齿类动物IL-4Rα基因序列的所述人IL-4Rα基因序列包含所述人IL-4Rα基因序列的至少一个外显子。
39.根据实施方案38所述的方法，其中替换所述啮齿类动物IL-4Rα核酸序列的所述人IL-4Rα核酸序列包含所述人IL-4Rα基因序列的至少2、3、4、5、6、7或8个外显子。
40.根据实施方案39所述的方法，其中替换所述啮齿类动物IL-4Rα核酸序列的所述人IL-4Rα核酸序列包含所述人IL-4Rα基因序列的所有9个外显子。
41.根据实施方案34所述的方法，其中所述替换在内源啮齿类动物IL-4Rα基因座处，并且编码人或人源化IL-4Rα蛋白质的所述经修饰的IL-4Rα基因可操作地连接至在所述内源啮齿类动物IL-4Rα基因座处的内源啮齿类动物调节元件或序列。
42.一种用于制备人源化小鼠的方法，所述方法包括用编码人IL-4Rα的胞外域的人基因组片段替换编码小鼠IL-4Rα的胞外域的小鼠外显子，以形成人源化IL-4Rα基因。
43.根据实施方案42所述的方法，其中所述替换在内源小鼠IL-4Rα基因座处，并且所述人源化IL-4Rα基因可操作地连接至小鼠调节序列。
44.根据实施方案42所述的方法，其中所述替换在内源小鼠IL-4Rα基因座处，并且所述人源化IL-4Rα基因可操作地连接至内源小鼠调节序列。
45.一种包含人源化IL-4Rα基因和人源化IL-4基因的啮齿类动物，其中所述人源化IL-4Rα基因起因于啮齿类动物IL-4Rα胞外域编码序列由人IL-4Rα胞外域编码序列的替换，并且所述人源化IL-4Rα基因包含啮齿类动物IL-4Rα跨膜结构域编码序列和啮齿类动物IL-4Rα细胞质结构域编码序列，并且其中所述人源化IL-4Rα基因处于在内源啮齿类动物IL-4Rα基因座处的内源啮齿类动物IL-4Rα调节元件的控制下；并且其中所述人源化IL-4基因编码人或人源化IL-4蛋白质，并且所述人源化IL-4基因处于在所述内源啮齿类动物IL-4R基因座处的内源啮齿类动物IL-4调节元件的控制下。
46.根据实施方案45所述的啮齿类动物，其中所述啮齿类动物是小鼠或大鼠。
47.根据实施方案45所述的啮齿类动物，其中所述啮齿类动物是不能表达小鼠IL-4蛋白质且不能表达小鼠IL-4Rα蛋白质的小鼠。
48.根据实施方案45所述的啮齿类动物，其中在所述内源啮齿类动物IL-4基因座和/或内源啮齿类动物IL-4Rα基因座处的所述啮齿类动物调节元件或序列来自小鼠或大鼠。
49.根据实施方案45所述的啮齿类动物，其中所述啮齿类动物调节元件或序列是在所述啮齿类动物IL-4基因座和/或啮齿类动物IL-4Rα基因座处的内源啮齿类动物调节元件或序列。
50.一种筛选人特异性IL-4或IL-4Rα拮抗剂的方法，所述方法包括：
提供双重人源化IL-4和IL-4Rα小鼠，
在所述小鼠中诱导肺炎症，
给所述小鼠施用试剂，
测定肺炎症是否通过所述试剂减轻，和
基于所述试剂减轻肺炎症的能力，将其鉴定为人特异性IL-4或IL-4Rα拮抗剂。
51.根据实施方案50所述的方法，其中所述肺炎症的程度通过测量气道中的粘液累积、支气管肺泡灌洗液中的嗜酸性浸润细胞和/或总循环IgE进行测定。
52.一种筛选人特异性IL-4或IL-4Rα拮抗剂的方法，所述方法包括：
提供双重人源化IL-4和IL-4Rα小鼠，
在所述小鼠中诱导皮肤炎症，
给所述小鼠施用试剂，
测定皮肤炎症是否通过所述试剂减轻，和
基于所述试剂减轻皮肤炎症的能力，将其鉴定为人特异性IL-4或IL-4Rα拮抗剂。
53.根据实施方案50或52所述的方法，其中所述人源化IL-4Rα基因起因于鼠IL-4Rα胞外域编码序列由人IL-4Rα胞外域编码序列的替换，并且所述人源化IL-4Rα基因处于在内源鼠IL-4Rα基因座处的内源鼠IL-4Rα调节元件的控制下；并且其中所述人源化IL-4基因编码人或人源化IL-4蛋白质，并且所述人源化IL-4基因处于在所述内源啮齿类动物IL-4R基因座处的内源啮齿类动物IL-4调节元件的控制下。
序列表
<110> Wang, Li-Hsien
Xue, Yingzi
Murphy, Andrew J.
Stevens, Sean
<120> 人源化IL-4和IL-4Ra动物
<130> 31260 (T0029)
<150> 61/989,757
<151> 2014-05-07
<160> 46
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1
catgcacgga gatggatgtg 20
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 2
gacccctcag gtccacttac c 21
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 用FAM（5-羧基荧光素荧光探针）进行标记
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(25)
<223> 用BHQ（黑洞淬灭型荧光淬灭剂）进行标记
<400> 3
aacgtcctca cagcaacga 19
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 4
gtgcccaggt gtgctcatg 19
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 5
cgcctgcctc ctcactttat c 21
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 用FAM（5-羧基荧光素荧光探针）进行标记
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)..(19)
<223> 用BHQ（黑洞淬灭型荧光淬灭剂）进行标记
<400> 6
atctgcttca ccatccact 19
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 7
gcctggacca agactctgt 19
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 8
accgtgggac ggcttcttac 20
<210> 9
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 用FAM（5-羧基荧光素荧光探针）进行标记
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)..(19)
<223> 用BHQ（黑洞淬灭型荧光淬灭剂）进行标记
<400> 9
caccgagttg accgtaacag acatc 25
<210> 10
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 10
tgcggccgat cttagcc 17
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 11
ttgaccgatt ccttgcgg 18
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 用FAM（5-羧基荧光素荧光探针）进行标记
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(21)
<223> 用BHQ（黑洞淬灭型荧光淬灭剂）进行标记
<400> 12
acgagcgggt tcggcccatt c 21
<210> 13
<211> 458
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 含有鼠IL4基因座和人IL4序列的上游连接的核酸序列
<400> 13
tgctgattgg cccagaataa ctgacaatct ggtgtaataa aattttccaa tgtaaactca 60
ttttcccttg gtttcagcaa ctttaactct atatatagag agacctctgc cagcattgca 120
ttgttagcat ctcttgataa acttaattgt ctctcgtcac tgacggcaca gagctattga 180
tgggtctcac ctcccaactg cttccccctc tgttcttcct gctagcatgt gccggcaact 240
ttgtccacgg acacaagtgc gatatcacct tacaggagat catcaaaact ttgaacagcc 300
tcacagagca gaaggtgagt acctatctgg caccatctct ccagatgttc tggtgatgct 360
ctcagtattt ctaggcatga aaacgttaac agctgctaga gaagttggaa ctggtggttg 420
gtggcagtcc agggcacaca gcgaggcttc tcccctgc 458
<210> 14
<211> 565
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 含有人IL4序列和两侧加有loxP位点的hygo选择盒的下游连接的
核酸序列
<400> 14
tgtttatttt gcagaattcc tgtcctgtga aggaagccaa ccagagtacg ttggaaaact 60
tcttggaaag gctaaagacg atcatgagag agaaatattc aaagtgttcg agctgaatat 120
tttaatttat gagtttttga tagctttatt ttttaagtat ttatatattt ataactcatc 180
ataaaataaa gtatatatag aatctaacag caatggcatt taatgtattg gctatgttta 240
cttgacaaat gaaattatgg tttgcaactt ttagggaaat caatttagtt taccaagaga 300
ctataaatgc tatgggagca aaacaggaaa gaccacttcc ccctcgaggg gttccctctc 360
gagttaggga cataacacac aagataatta aagaacacaa ggccatacaa gatgcggccg 420
caccggtata acttcgtata aggtatccta tacgaagtta tatgcatggc ctccgcgccg 480
ggttttggcg cctcccgcgg gcgcccccct cctcacggcg agcgctgcca cgtcagacga 540
agggcgcagc gagcgtcctg atcct 565
<210> 15
<211> 438
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 含有两侧加有loxP位点的hygo选择盒和鼠IL-4基因座的下游连接的
核酸序列
<400> 15
tgccaagttc taattccatc agacctcgac ctgcagccgg cgcgccataa cttcgtataa 60
ggtatcctat acgaagttat ctcgagagga gttcccaccc ttctcaagag cataatgcgc 120
agatcattaa gggacagatg caggctgggg agacggttca gcagttagga gtacctgttg 180
ctcttccaga ggacccaggt tcaattcccg gcactcacat agcagcttaa aacaataact 240
caagttctgg gggagctgat gctctcctct ggcctcctgt ggaggtacac agaccacatg 300
cctgtaggca agacacccac acacataaaa acaaaataaa ataaggatag aaaggccagg 360
gggatgaatc cagaggtaga agaaaactta ttccctggaa ttgtcctctg actcccctcc 420
caaaacctct aacacgca 438
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 16
ccgctggcat gtgtattgtg 20
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 17
tgagtgtggg accctcaaga g 21
<210> 18
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 用FAM（5-羧基荧光素荧光探针）进行标记
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(24)
<223> 用BHQ（黑洞淬灭型荧光淬灭剂）进行标记
<400> 18
tgacccaagc cctacatggc cact 24
<210> 19
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 19
tgaggagagc tcacgggaat c 21
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 20
acccatctcc tgcgtttctg 20
<210> 21
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 用FAM（5-羧基荧光素荧光探针）进行标记
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(25)
<223> 用BHQ（黑洞淬灭型荧光淬灭剂）进行标记
<400> 21
ttgacacgcc agctacactg ctcca 25
<210> 22
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 22
acctgcgtct ccgactacat g 21
<210> 23
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 23
gagctcggtg ctgcaattg 19
<210> 24
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 用FAM（5-羧基荧光素荧光探针）进行标记
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(25)
<223> 用BHQ（黑洞淬灭型荧光淬灭剂）进行标记
<400> 24
tgggaccatt catcttccac tcgca 25
<210> 25
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 25
ggtggagagg ctattcggc 19
<210> 26
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 26
gaacacggcg gcatcag 17
<210> 27
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 用FAM（5-羧基荧光素荧光探针）进行标记
<220>
<221> misc_feature
<222> (23)..(23)
<223> 用BHQ（黑洞淬灭型荧光淬灭剂）进行标记
<400> 27
tgggcacaac agacaatcgg ctg 23
<210> 28
<211> 243
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 鼠IL-4Rα基因座和含有IL-4Rα基因的序列的部分
<400> 28
tgggggaggg aggccatgac acaaatgaaa tggaccccgc tgacccagga tcagcatctg 60
cccactcttc tttctgcagg caccttttgt gtccccaatg gggtggcttt gctctgggct 120
cctgttccct gtgagctgcc tggtcctgct gcaggtggca agctctggta agtcaccact 180
tctcaatcat tcatttgttg gctattaatg gcgtgccagg gtcctgcagt atgtcacctg 240
gcc 243
<210> 29
<211> 243
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 含有人IL-4Rα序列和两侧加有loxP位点的neo选择盒的下游连接的
核酸序列
<400> 29
gtcagatcgt ggagggtctc ggacgagggt cctgaccctg ggtctccagt cctgggaagt 60
ggagcccagg ctgtaccatg gctgacctca gctcatggct cccgggctcg ataactataa 120
cggtcctaag gtagcgactc gagataactt cgtataatgt atgctatacg aagttatatg 180
catggcctcc gcgccgggtt ttggcgcctc ccgcgggcgc ccccctcctc acggcgagcg 240
ctg 243
<210> 30
<211> 390
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 两侧加有loxP位点的neo选择盒的序列和鼠IL-4Rα基因座的部分
<400> 30
tattgttttg ccaagttcta attccatcag acctcgacct gcagccccta gataacttcg 60
tataatgtat gctatacgaa gttatcctag gttggagctc tctgtagcca ggtaaccaag 120
ggtcccaggg gaacccccag tgtggacgcg gactgcacat gacacagggc ggcctcccca 180
ttcatgactg tttttctcct tgcagacttc cagctgcccc tgatacagcg ccttccactg 240
ggggtcacca tctcctgcct ctgcatcccg ttgttttgcc tgttctgtta cttcagcatt 300
accaagtgag ttcctgcttt ggctggtgtc tctggctggc ccttcagcag tgctctcaga 360
ggtcacagtc attgtgctgg ctgagaaaag 390
<210> 31
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 31
ttggactagt aacaagaagg gtagca 26
<210> 32
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 32
cctttcccat caccctctaa ctt 23
<210> 33
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 33
agctctggtg gacaga 16
<210> 34
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 34
tctctgccaa gctgcttatc c 21
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 35
ggctgcatgg aagaggtgaa 20
<210> 36
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 36
ctctccacaa atcg 14
<210> 37
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 37
caggcaggaa tagctgagat aatct 25
<210> 38
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 38
tgtggagcaa aaagtggttg at 22
<210> 39
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 39
cctgtgaata gtgataaac 19
<210> 40
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 40
cagttccaaa cgataggctc aa 22
<210> 41
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 41
ataattctgt gaagcatctg gtcttc 26
<210> 42
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 42
ctagagctgc tagtaaaa 18
<210> 43
<211> 160
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 43
atagccaagg ttgcttctga tgacttcagg tccatatagt tggattaatg ttatatttca 60
atcccacaga aacctgaaaa atgaagccta aaatgaagta ttcaaccaac aaaatttcca 120
cagcaaagtg gaagaacaca gcaagcaaag ccttgtgttt 160
<210> 44
<211> 160
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 44
tttatattat tgaataaagt atattttcca aatgtatgtg agactataat gattttatca 60
tatgatgact caatattctg ctcgagataa cttcgtataa tgtatgctat acgaagttat 120
atgcatggcc tccgcgccgg gttttggcgc ctcccgcggg 160
<210> 45
<211> 160
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 45
agcccctaga taacttcgta taatgtatgc tatacgaagt tatgctagta actataacgg 60
tcctaaggta gcgagctagc cgcctgtgcg ttctgggttg aatgacttaa tgcttccaac 120
tgaagaaagg gtaacagaga gaaagaaagc cattcttggc 160
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 46
tttatattat tgaataaagt atattttcca aatgtatgtg agactataat gattttatca 60
tatgatgact caatattctg ctcgagataa cttcgtataa tgtatgctat acgaagttat 120
gctagtaact ataacggtcc taaggtagcg agctagccgc ctgtgcgttc tgggttgaat 180
gacttaatgc ttccaactga agaaagggta acagagagaa agaaagccat tcttggc 237
Claims (15)
1.一种经遗传修饰的啮齿类动物基因组，其包含在内源啮齿类动物IL-4基因座处啮齿类动物IL-4基因的基因组DNA由人IL-4基因的基因组DNA的替换，以形成经修饰的IL-4基因，其中所述经修饰的IL-4基因编码人IL-4蛋白质并且包含所述人IL-4基因的从ATG起始密码子开始的外显子1到外显子4，其中所述经修饰的IL-4基因的表达处于在所述内源啮齿类动物IL-4基因座处的啮齿类动物调节元件的控制下，并且其中所述啮齿类动物选自小鼠或大鼠。
2.根据权利要求1所述的经遗传修饰的啮齿类动物基因组，其中所述啮齿类动物是小鼠。
3.根据权利要求2所述的经遗传修饰的啮齿类动物基因组，其中所述替换是包含小鼠IL-4基因的从ATG起始密码子开始的外显子1到外显子4的基因组DNA由包含人IL-4基因的从ATG起始密码子开始的外显子1到外显子4的基因组DNA的替换。
4.根据权利要求1所述的经遗传修饰的啮齿类动物基因组，其还包含在内源啮齿类动物IL-4Rα基因座处包含啮齿类动物IL-4Rα基因的外显子的啮齿类动物基因组DNA由包含人IL-4Rα基因的至少一个外显子的基因组DNA的替换，以形成编码人源化IL-4Rα蛋白质的经修饰的IL-4Rα基因，其中所述经修饰的IL-4Rα基因的表达处于在所述内源啮齿类动物IL-4Rα基因座处的啮齿类动物调节元件的控制下。
5.根据权利要求4所述的经遗传修饰的啮齿类动物基因组，其中所述人源化IL-4Rα蛋白质包含所述人IL-4Rα蛋白质的胞外域。
6.根据权利要求5所述的经遗传修饰的啮齿类动物基因组，其中所述人源化IL-4Rα蛋白质包含所述内源啮齿类动物IL-4Rα蛋白质的跨膜结构域和细胞质结构域。
7.根据权利要求4所述的经遗传修饰的啮齿类动物基因组，其中在内源啮齿类动物IL-4Rα基因座处的替换是啮齿类动物IL-4Rα基因的基因组片段由人IL-4Rα基因的基因组片段的替换，以形成人源化IL-4Rα基因，其包含人IL-4Rα基因的外显子1的ATG起始密码子到外显子5和啮齿类动物IL-4Rα基因的外显子6-9，其中所述啮齿类动物IL-4Rα基因的基因组片段包含啮齿类动物IL-4Rα基因的外显子1的ATG起始密码子到外显子5，并且所述人IL-4Rα基因的基因组片段包含人IL-4Rα基因的外显子1的ATG起始密码子到外显子5，并且其中所述人源化IL-4Rα基因的表达处于在所述内源啮齿类动物IL-4Rα基因座处的啮齿类动物IL-4Rα调节元件的控制下。
8.根据权利要求4-7中任一项所述的经遗传修饰的啮齿类动物基因组，其中所述啮齿类动物是小鼠。
9.根据权利要求4-7中任一项所述的经遗传修饰的啮齿类动物基因组，其中所述啮齿类基因组还包含在内源啮齿类动物IL-33基因座处啮齿类动物IL-33基因的基因组DNA由人IL-33基因的基因组DNA的替换，以使得所述基因座编码人IL-33而不编码啮齿类动物IL-33。
10.根据权利要求9所述的经遗传修饰的啮齿类动物基因组，其中所述啮齿类动物是小鼠。
11.一种用于制备经遗传修饰的啮齿类动物的方法，所述方法包括在内源啮齿类动物IL-4基因座处用人IL-4基因的基因组DNA替换啮齿类动物IL-4基因的基因组DNA，以形成经修饰的IL-4基因，其中所述经修饰的IL-4基因编码人IL-4蛋白质并且包含所述人IL-4基因的从ATG起始密码子开始的外显子1到外显子4，其中所述经修饰的IL-4基因的表达处于在所述内源啮齿类动物IL-4基因座处的啮齿类动物调节元件的控制下，并且其中所述啮齿类动物选自小鼠或大鼠。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述啮齿类动物是小鼠。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述替换在小鼠胚胎干细胞中实现，所述小鼠胚胎干细胞随后用于产生所述经遗传修饰的小鼠。
14.三重人源化IL-4、IL-4Rα和IL-33啮齿类动物用作用于评估人特异性IL-4或IL-4Rα拮抗剂或人特异性IL-33拮抗剂的药效学和治疗功效的啮齿类动物模型的用途，其中所述三重人源化IL-4、IL-4Rα和IL-33啮齿类动物包含：
(i)在内源啮齿类动物IL-4Rα基因座处啮齿类动物IL-4Rα基因的基因组片段由人IL-4Rα基因的基因组片段的替换，以形成人源化IL-4Rα基因，其包含人IL-4Rα基因的外显子1的ATG起始密码子到外显子5和啮齿类动物IL-4Rα基因的外显子6-9，其中所述啮齿类动物IL-4Rα基因的基因组片段包含啮齿类动物IL-4Rα基因的外显子1的ATG起始密码子到外显子5，并且所述人IL-4Rα基因的基因组片段包含人IL-4Rα基因的外显子1的ATG起始密码子到外显子5，并且其中所述人源化IL-4Rα基因的表达处于在所述内源啮齿类动物IL-4Rα基因座处的啮齿类动物IL-4Rα调节元件的控制下；
(ii)在内源啮齿类动物IL-4基因座处啮齿类动物IL-4基因的基因组片段由人IL-4基因的基因组片段的替换，以形成人源化IL-4基因，其中所述啮齿类动物IL-4基因的基因组片段包含啮齿类动物IL-4基因的外显子1的ATG起始密码子到外显子4，并且所述人IL-4基因的基因组片段包含人IL-4基因的外显子1的ATG起始密码子到外显子4，并且其中所述人源化IL-4基因的表达处于在所述内源啮齿类动物IL-4基因座处的啮齿类动物IL-4调节元件的控制下；和
(iii)在内源啮齿类动物IL-33基因座处啮齿类动物IL-33基因的基因组DNA由人IL-33基因的基因组DNA的替换，以使得所述基因座编码人IL-33而不编码啮齿类动物IL-33；
其中所述啮齿类动物选自小鼠或大鼠。
15.根据权利要求14所述的用途，其中所述啮齿动物是小鼠。
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