RS57073B1 - Životinje sa humanizovanom il-4 i il-4r alfa - Google Patents

Životinje sa humanizovanom il-4 i il-4r alfa

Info

Publication number
RS57073B1
RS57073B1 RS20180131A RSP20180131A RS57073B1 RS 57073 B1 RS57073 B1 RS 57073B1 RS 20180131 A RS20180131 A RS 20180131A RS P20180131 A RSP20180131 A RS P20180131A RS 57073 B1 RS57073 B1 RS 57073B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
rodent
human
gene
humanized
mouse
Prior art date
Application number
RS20180131A
Other languages
English (en)
Inventor
Li-Hsien Wang
Yingzi Xue
Andrew J Murphy
Sean Stevens
Original Assignee
Regeneron Pharma
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Regeneron Pharma filed Critical Regeneron Pharma
Publication of RS57073B1 publication Critical patent/RS57073B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • A01K67/0278—Knock-in vertebrates, e.g. humanised vertebrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/5406—IL-4
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • C07K14/7155—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons for interleukins [IL]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5082—Supracellular entities, e.g. tissue, organisms
    • G01N33/5088—Supracellular entities, e.g. tissue, organisms of vertebrates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2207/00—Modified animals
    • A01K2207/15—Humanized animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
    • A01K2217/072—Animals genetically altered by homologous recombination maintaining or altering function, i.e. knock in
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/20—Animal model comprising regulated expression system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/01—Animal expressing industrially exogenous proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A01K2267/035—Animal model for multifactorial diseases
    • A01K2267/0368—Animal model for inflammation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A01K2267/0393—Animal model comprising a reporter system for screening tests

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Description

Opis
UPUĆIVANJE NA SRODNE PRIJAVE
[0001] Ova prijava traži prednost priznanja prvenstva za američku provizornu prijavu (U.S. Provisional Application No.) br.61/989,757 podnetu 7. maja 2014.
OBLAST PRONALASKA
[0002] Ovde se opisuju nehumane životinje koje imaju sekvence nukleinske kiseline za kodiranje IL-4 i/ili IL-4Rα proteina koje sadrže humanu sekvencu. Transgenske nehumane životinje su takođe ovde opisane koje obuhvataju IL-4 i/ili IL-4Rα gen koji je u celini ili delimično ljudski gen. Takođe su opisane nehumane životinje koje izražavaju humane ili humanizovane IL-4 i/ili IL-4Rα proteine. Pored toga, opisani su postupci za pravljenje i korišćenje nehumanih životinja koje obuhvataju humane ili humanizovane IL-4 i/ili IL-4Rα sekvence nukleinske kiseline.
OBLAST PRONALASKA
[0003] IL-4 i IL-4Rα su terapijski ciljevi za lečenje raznovrsnih bolesti, pormećaja i stanja kod ljudi koji se povezuju sa nenormalnim ćelijama pomoćnicama tipa 2 T (Th2). Procena farmakokinetika (PK) i farmakodinamika (PD) terapijskih molekula koji specifično ciljaju humane IL-4 ili humane IL-4Rα proteine rutinski izvedeno u neumanim životinjama, npr., glodari, npr., miševi ili pacovi. Međutim, PD takvih terapijskih molekula ne može da bude propisno određen kod izvesnih nehumanih životinja zato što ovi terapijski molekuli ne ciljaju endogene IL-4 ili IL-4Rα proteine.
[0004] Pored toga, procena terapijske efikasnosti za ljude specifičnih antagonista IL-4 i IL-4Rα proteina korišćenjem različitih nehumanih modela životinja bolesti povezanih sa nepravilnim Th2 ćelijama je problematična kod nehumanih životinja kod kojih takvi antagonisti specifični za vrste ne reaguju međusobno sa endogenim IL-4 ili IL-4Rα proteinima.
[0005] S tim u skladu, postoji potreba za nehumanim životinjama, npr. glodarima, npr., životinjama mišje vrste, npr., miševi i pacovi, kod kojih IL-4 i/ili IL-4Rα geni nehumanih životinja jesu humanizovani u celini ili delimično ili zamenjeni (npr., na endogenim nehumanim mestima) sa humanim IL-4 i/ili IL-4Rα genima koji obuhvataju sekvence koje kodiraju humani ili humanizovani IL-4 i/ili IL-4Rα proteinima, prema opisanom redosledu.
[0006] Takođe postoji potreba za nehumanim životinjama koje obuhavataju IL-4 i/ili IL-4Rα gene (npr., humanizovane, ili humane) kod kojih su IL-4 i/ili IL-4R geni pod kontrolom nehumanih regulatornih elemenata (npr., endogenih regultornih elemenata).
[0007] Takođe postoji potreba za nehumanizovanim životinjama koje izražavaju humani ili humanizovani IL-4 protein u krvi, plazma ili serum pri koncentraciji sličnoj sa IL-4 proteinom prisutnoj u krvi, plazmi, ili serumu nehumane živoinje koja se starosno poklapa sa nehumanom životinjom koja izražava funkcionaln IL-4 protein, ali ne obuhvata humani ili humanizovane IL-4 gene, i/ili izražava humani ili humanizovani IL-4Rα protein na imune ćelija, npr., B i T ćelije, na nivou sličnom nivou IL- 4Rα proteina kod imunih ćelija, npr., B i T ćelije, životinje koja nije čovek a starosno odgovara koja izražava funkcionalni IL-4Rα protein, ali ne obuhvata humani ili humanizovani IL-4Rα gen. US 2014/056920 A1 opisuje postupke za lečenje ili sprečavanje astme primenom IL-4R antagonista.
KRATAK OPIS
[0008] Ovaj pronalazak daje glodara, koji obuhvata zamenu genomskog fragmenta glodarskog IL-4Rα gena na endogenom glodarskom IL-4Rα lokusu sa genomskim fragmentom humanog IL4-Rα gena da se formira humanizovani IL-4Rα gen koji obuhvata ATG kodon inicijacije eksona 1 kodiranja sve do eksona 5 kodiranja humanog IL-4Rα gena, i eksona 6-9 kodiranja glodarskog IL-4Rα gena, pri čemu genomski fragment glodarskog IL-4Rα gena obuhvata ATG kodon inicijacije kodirajućeg eksona 1 sve do kodirajućeg eksona5 glodarskog IL-4Rα gena, i genomski fragment humanog IL-4Rα gena obuhvata ATG kodon inicijacije kodirajućeg eksona 1 sve do kodirajućeg eksona 5 humanog IL- 4Rα gena, i pri čemu ekspresija humanizovanog IL-4Rα gena je pod kontrolom glodarskih IL-4Rα regulatornih elemenata na endogenom glodarskom IL-4Rα lokusu.
[0009] Ovaj pronalazak još obezbeđuje postupak za pravljenje humanizovanog glodara, koji obuhvata zamenu genomskog fragmenta glodara IL-4Rα gena na endogenom glodarskom IL-4Rα lokusu sa genomskim fragmentom humanog IL-4Rα gena da se formira humanizovani IL-4Rα gen koji obuhvata ATG kodon inicijacije kodirajućeg eksona 1 sve do kodirajućeg eksona 5 humanog IL-4Rα gena, i kodirajuće eksone 6-9 glodarskog IL-4Rα gena, pri čemu genomski fragment glodarskog IL-4Rα gena obuhvata ATG kodon inicijacije kodirajućeg eksona 1 sve do kodirajućeg eksona 5 glodarskog IL-4Rα gena, i genomski fragment humanog IL-4Rα gena obuhvata ATG gen inicijacije kodirajućeg eksona 1 sve do kodirajućeg eksona 5 humanog IL-4Rα gena, i humanizovan IL-4Rα gen je funkcionalno povezan na glodarske IL-4Rα regulatorne elemente na endogenom glodarskom IL-4Rα lokusu.
[0010] Ovaj pronalazak dodatno daje postupak za pretraživenje za utvrđivanje postojanja za ljude specifičnog IL-4 ili IL-4Rα antagonista, koji obuhvata:
obezbeđivanje dvostruko humanizovanog IL-4 i IL-4Rα glodara iz ovog pronalaska, pri čemu pomenuti glodar obuhvata humanizovani IL4Rα gen u skladu sa ovim pronalaskom i još obuhvata zamenu genomskog fragmenta glodarskog IL-4 gena na endogenom glodarskom IL-4 lokusu sa genomskim fragmentom humanog IL-4 gena da se formira humanizovan IL-4 gen, pri čemu genomski fragment glodarskog IL-4 gena obuhvata ATG kodon inicijacije eksona 1 do eksona 4 glodarskog IL-4 gena, i genomski fragment humanog IL-4 gena obuhvata ATG kodon inicijacije eksona 1 sve do eksona 4 humanog IL-4 gena, i pri čemu je ekspresija humanizovanog IL-4 gena je pod kontrolom glodarskih IL-4 regulatornih elemenata na nedogenom glodarskom IL-4 lokusu, indukovanje plućne upale kod pomenutog glodara,
primena agensa pomenutom glodaru,
određivanje da li je upala pluća smanjena delovanjem ovog agensa, i identifikovanje tog agesa kao za čoveka specifičnog IL-4 ili IL-4Rα antagonista na osnovu njegove sposobnosti da smanji upalu pluća, opciono pri čemu je nivo upale pluća određen merenjem nagomilavanja mukusa u disajnom putu, eozinofilnim infiltrirajućim ćelijama u fluidu bronhoalveolarne lavaže, i/ili ukupno cirkulišućeg IgE.
[0011] Ovaj pronalazak daje postupak za pretraživanje za utvrđivanje postojanja za ljude specifičnog IL-4 ili IL-4Rα antagonista, koji obuhvata:
obezbeđivanje dvostruko humanizovanog IL-4 i IL-4Rα glodara iz ovog pronalaska, kod pomenutog glodara se prouzrokuje upala kože,
primena agensa pomenutom glodaru,
određivanje da li je upala kože smanjena delovanjem ovog agensa, i identifikovanje tog agesa kao za čoveka specifičnog t.j. humanog IL-4 ili IL-4Rα antagonista na osnovu njegove sposobnosti da smanji upalu kože.
[0012] Nehumane životinje koje sadrže sekvence nukleinske kiseline koje kodiraju IL-4 i/ili IL-4Rα protein koji obuhvata humanu sekvencu su ovde opisane.
[0013] Ovde su opisane transgenske nehumane životinje obuhvataju IL-4 i/ili IL-4Rα gen koji je ljudski u celini ili delimično.
[0014] Ovde su opisane ne-humane životinje koje izražavaju humane ili humanizovane IL-4 i/ili IL-4Rα proteine.
[0015] Ovde su opisane ne-humane životinje koje imaju zamenu (u celini ili delimično) endogenih ne-humanih životinja IL-4 i/ili IL-4Rα gena.
[0016] Ovde su opisane ne-humane životinje koje obuhvataju IL-4 i/ili IL-4Rα humanizaciju (u celini ili delimično) na endogenim ne-humanim IL-4 i/ili IL-4Rα lokusima.
[0017] Ovde su opisane ne-humane životinje koje imaju humani ili humanizovani IL-4 gen, pri čemu ne-humane životinje ne izražavaju endogeni IL-4 protein, i pri čemu ne-humane životinje izražavaju humani ili humanizovani IL-4 protein u krvi, plazmi ili serumu pri koncentraciji sličnoj koncentraciji IL-4 proteina prisutnog u krvi, plazmi ili serumu starosno odgovarajuće ne-humane životinje koja izražava funkcionalni endogeni IL-4 protein, ali ne obuhvata humani ili humanizovani IL-4 gen.
[0018] Ovde su opisane ne-humane životinje koje imaju humani ili humanizovani IL-4Rα gen, pri ćemu nehumane životinje ne izražavaju endogeni IL-4Rα protein, i izražavaju humani ili humanizovani IL-4Rα protein na imunim ćelijama, npr., B i T ćelijama, na nivou sličnom nivou IL-4Rα proteina prisutnog na imunim ćelijama, npr., B i T ćelije, starosno odgovarajuće ne-humane životinje koja izražava funkcionalni endogeni IL-4Rα protein, ali ne obuhvata humani ili humanizovani IL-4Rα gen.
[0019] U jednom varijantnom rešenju, ovde su opisane ne-humane životinje obuhvataju humanu ili humanizovanu IL-4 i/ili IL-4Rα sekvencu nukleinske kiseline.
[0020] U jednom varijantnom rešenju, ovde su opisane genetski modifikovane nehumane životinje koje sadrže zamenu na endogenom IL-4 i/ili IL-4Rα lokusu gena koji kodira endogeni IL-4 i/ili IL-4Rα sa genom koji kodira humani ili humanizovani IL-4 i/ili IL-4Rα protein. Glodari, npr., miševi ili pacovi, su ovde opisani kod kojih postoji zamena endogenog IL-4 gena, na endogenom glodarskom IL-4 lokusu, sa humanim IL-4 genom, i/ili obuhvata zamenu endogenog IL-4Rα gena, na endogenom glodarskom IL-4Rα lokusu, sa humanim IL-4Rα genom. U jednom varijantnom rešenju, taj glodar je miš. U jednom varijantnom rešenju, taj glodar je pacov.
[0021] U jednom varijantnom rešenju, genetski modifikovani glodari, npr. miševi ili pacovi, su opisani ovde sa humanizacijom endogenog glodarskog IL-4 gena, pri čemu humanizacija obuhvata zamenu na endogenom glodarskom IL-4 lokusu glodarske nukleinske kiseline sa barem jednim eksonom glodarskog IL-4 gena sa sekvencom nukleinske kiseline koja obuhvata barem jedan ekson od humanog IL-4 gena da se formira modifikovan IL-4 gena, pri čemu je ekspresija modifikovanog IL-4 gena pod kontrolom regulatornih elemenata na endogenom glodarskom IL-4 lokusu.
[0022] U jednom varijantnom rešenju, glodar je miš ili pacov. U jednom varijantnom rešenju, taj glodar je miš. U jednom varijantnom rešenju, taj glodar je pacov.
[0023] U jednom varijantnom rešenju, modifikovani IL-4 gen kodira humani ili humanizovani IL-4 protein i obuhvata ekson 1 počevši od ATG kodona inicijacije sve do eksona 4 humanog IL-4 gena.
[0024] U jednom varijantnom rešenju, glodar je miš koji ne može da izražava mišji IL-4 protein.
[0025] U jednom varijantnom rešenju, glodar je miš koji izražava mišji IL-4Rα protein kodiran endogenim mišjim IL-4Rα genom.
[0026] U jednom varijantnom rešenju, glodar je miš koji izražava humani ili humanizovani IL-4Rα protein.
[0027] U jednom varijantnom rešenju, humanizovani IL-4Rα protein obuhvata ektodomen humanog IL-4Rα proteina.
[0028] U jednom varijantnom rešenju, humanizovani IL-4Rα protein obuhvata transmembranski domen i citoplazmni domen mišjeg IL-4Rα proteina.
[0029] U jednom varijantnom rešenju, glodar je miš koji obuhvata zamenu na endogenom mišjem IL-4Rα lokusu mišje nukleinske kiseline koja obuhvata barem jedan ekson mišjeg IL-4Rα gena sa sekvencom nukleinske kiseline koja obuvhata barem jedan ekson humanog IL-4Rα gena da seformira modifikovan IL-4Rα gene, pri čemu je ekspresija modifikovanog IL-4Rα gena pod kontrolom mišjih regulatornih elemenata na endogenom mišjem IL-4Rα lokusu.
[0030] U jednom varijantnom rešenju, glodar je miš, pri čemu dodirni genomski fragment mišje IL-4 sekvence obuhvata ekson 1 koji počinje od ATG kodona inicijacije sve do eksona 4 mišjeg IL-4 je zamenjeno sa dodirnim genomskim fragmentom humanog IL-4 sekvence obuhvataju ekson 1 koji počinje od ATG kodon inicijacije sve do ekson 4 humanog IL-4.
[0031] U jednom varijantnom rešenju, ekspresija modifikovanog IL-4Rα gena koji kodira humani ili humanizovani IL-4Rα protein je pod kontrolom mišjih regulatornih elemenata na endogenim mišjem IL-4Rα lokusu.
[0032] U jednom varijantnom rešenju, genetski modifikovane glodari, npr., miševi ili pacovi, su obezbeđeni koji obuhvataju humanizaciju endogenog glodarskog IL-4Rα gena, pri čemu humanizacija obuhvata zamenu na endogenom glodarskom IL-4Rα lokusu glodarske nukleinske kiseline koja obuhvata ekson glodarskog IL-4Rα gena sa sekvencom nukleinske kiseline koja kodira barem jedan ekson humanog IL-4Rα gena da se formira modifikovan (t.j., humanizovan) IL-4Rα gena pri čemu ekspresija modifikovanog, humanizovanih IL-4Rα gena je pod kontrolom glodarskih regulatornih elemenata na endogenog glodarskog IL-4Rα lokusa.
[0033] U jednom varijantnom rešenju, glodar je miš ili pacov. U jednom varijantnom rešenju, taj glodar je miš. U jednom varijantnom rešenju, taj glodar je pacov.
[0034] U jednom varijantnom rešenju, modifikovani IL-4Rα gen kodira humani ili humanizovani IL-4Rα protein i obuhvata ekson 1 počevši od ATG kodona inicijacije sve do eksona 5 humanog IL-4Rα gena.
[0035] U jednom varijantnom rešenju, glodar je miš koji ne može da izražava mišji IL-4Rα protein.
[0036] U jednom varijantnom rešenju, glodar je miš koji izražava mišji IL-4 protein kodiran endogenim mišjim IL-4 genom.
[0037] U jednom varijantnom rešenju, glodar je miš koji izražava humani ili humanizovani IL-4protein.
[0038] U jednom varijantnom rešenju, glodar je miš koji obuhvata zamenu na endogenom mišjem IL-4 lokusu mišje nukleinske kiseline koja obuhvata barem jedan ekson mišjeg IL-4 gena sa sekvencom nukleinske kiseline koja kodira barem jedan ekson humanog IL-4 gena da seformira modifikovan IL-4 gene, pri čemu je ekspresija modifikovanog IL-4 gena pod kontrolom mišjih regulatornih elemenata na endogenom mišjem IL-4 lokusu.
[0039] U jednom varijantnom rešenju, glodar je miš, pri čemu dodirni genomski fragment mišje IL-4Rα sekvence obuhvata obuhvata ekson 1 koji počinje od ATG kodona inicijacije sve do eksona 5 IL-4Rα je zamenjeno sa dodirnim genomskim fragmentom humane IL-4R α sekvence obuhvataju ekson 1 koji počinje od ATG kodona inicijacije sve do eksona 5 humanog IL-4Rα.
[0040] U jednom varijantnom rešenju, genetski modifikovani glodari, npr., miš ili pacov su ovde opisani koji izražavaju humani ili humanizovani IL-4 protein, pri čemu taj glodar izražava humani ili humanizovani IL-4 protein ima normalni imuni sistem, t.j., broj imunih ćelija, npr., B i T ćelija, u krvi, plazmi ili serumu glodara koji izražava humani ili humanizovani IL-4 protein su slični broju imunih ćelija, npr., B i T ćelija, u krvi, plazmi ili serumu glodara koji izražava funkcionalni endogeni IL-4 protein. U jednom varijantnom rešenju, taj glodar je miš. U jednom varijantnom rešenju, taj glodar je pacov.
[0041] U jednom varijantnom rešenju, obezbeđeni su genetski modifikovani glodari, npr., miš ili pacov, koji izražavaju IL-4 protein iz humanog ili humanizovanog IL-4 gena, pri čemu glodar izražava humani ili humanizovani IL-4 protein u svom serumu. U jednom varijantnom rešenju, taj glodar je miš. U jednom varijantnom rešenju, taj glodar je pacov.
[0042] U jednom varijantnom rešenju, serum glodara koji izražava humani ili humanizovani IL-4 protein ima približno isti nivo IL-4 proteina kao glodar koji izražava funkcionalni endogeni IL-4 protein, npr., miš divljeg tipa ili pacov. U jednom varijantnom rešenju, taj glodar je miš. U jednom varijantnom rešenju, taj glodar je pacov.
[0043] U jednom varijantnom rešenju, miš izražava humani ili humanizovani IL-4 protein u serumu pri koncentraciji od barem oko 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%,
190% ili 200% od nivoa IL-4 proteina prisutnog u serumu miša odgovarajuće starosti koji izražava funkcionalni endogeni IL-4 protein, ali ne obuhvata zamenu endogenog IL-4 gena, na endogenom mišjem IL-4 lokusu, sa humanim IL-4 genom.
[0044] U jednom varijantnom rešenju, miš izražava humani ili humanizovani IL-4 protein u serumu u koncentraciji od između oko 10% i oko 200%, između oko 20% i oko 150%, ili između oko 30% i oko 100% od nivoa mišjeg IL-4 proteina prisutnog u sermu odgovarajuće starog miša koji izražava funkcionalni endogeni IL-4 protein, ali ne obuhvata zamenu endogenog IL-4 gena, na endogenom mišjem IL-4 lokusu, sa humanim IL-4 genom.
[0045] U jednom varijantnom rešenju, genetski modifikovani glodari, npr., miš ili pacov su dati koji izražavaju humani ili humanizovani IL-4Rα protein, pri čemu glodar izražava humani ili humanizovani IL-4Rα protein na imunim ćelijama, npr., B i T ćelije, na nivou sličnom nivou IL-4Rα proteina prisutnog na imunim ćelijama, npr., B i T ćelije, odgovarajuće starog glodara koji izražava funkcionalni endogeni IL-4Rα protein. U jednom varijantnom rešenju, taj glodar je miš. U jednom varijantnom rešenju, taj glodar je pacov.
[0046] U jednom varijantnom rešenju, ovde su opisani genetski modifikovani glodari, npr., miš ili pacov, koji izražavaju IL-4Rα protein iz humanog IL-4Rα gena, pri čemu taj glodar izražava humani ili humanizovani IL-4Rα protein u imunim ćelijama, npr., B i T ćelijama. U jednom varijantnom rešenju, taj glodar je miš. U jednom varijantnom rešenju, taj glodar je pacov.
[0047] U jednom varijantnom rešenju, imune ćelije, npr., B i T ćelije, ovog glodara koje izražavaju humani ili humanizovani IL- 4Rα protein imaju približno isti nivo IL-4Rα proteina na imunim ćelijama, npr., B i T ćelije, glodara koje izražavaju funkcionalni endogeni IL-4Rα protein, npr., miša divljeg tipa ili pacova. U jednom varijantnom rešenju, taj glodar je miš. U jednom varijantnom rešenju, taj glodar je pacov.
[0048] U jednom varijantnom rešenju, miš izražava humani ili humanizovani IL-4Rα protein na imune ćelije, npr., B i T ćelije, u količini od barem oko 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190% or 200% od količine IL-4Rα proteina na imune ćelije, npr., B i T ćelije, odgovarajuće starog miša koji izražava funkcionalni endogeni IL-4Rα protein, ali ne obuhvata endogeni IL-4Rα gen, na endogenom mišjem IL-4Rα lokusu, sa humanim IL-4Rα genom.
[0049] U jednom varijantnom rešenju, taj miš izražava humani ili humanizovani IL4Rα protein na imune ćelije, npr., B i T ćelije, u količini od između oko 10% i oko 200%, između oko 20% i oko 150%, ili između oko 30% i oko 100% od količine mišjeg IL-4Rα proteina prisutnog na imunim ćelijama, np., B i T ćelijama, odgovarajuće starog miša koji izražava funkcionalni endogeni IL-4Rα protein, ali ne obuhvata zamenu na endogenom IL-4Rα genu, na endogenom mišjem IL-4Rα lokusu, sa humanim IL-4Rα genom.
[0050] U jednom varijantnom rešenju, genetski modifikovan glodar opisan ovde, obuhvata humanizovan IL-4Rα gen koji obuhvata zamenu glodarske IL-4Rα ektodomenom kodirajuće sekvence sa humanim IL-4Rα ektodomenom kodirajuće sekvence, pri čemu humanizovani IL-4Rα gen obuhvata glodarsku IL-4Rα sekvencu transmembransku glodarsku IL- 4Rα sekvencu citoplazme, pri čemu je humanizovani IL-4Rα gen pod kontrolom endogenih glodarskih IL-4Rα regulatornih elemenata na endogenom IL-4Rα lokusu, i pri čemu taj glodar još obuhvata humanizovani IL-4 gen koji kodira humani ili humanizovani IL-4 protein, pri čemu je humanizovani IL-4 gen pod kontrolom endogenih glodarskih IL-4 regulatornih elemenata na endogenom IL-4 lokusu.
[0051] U jednom varijantnom rešenju, glodar je miš ili pacov. U jednom varijantnom rešenju, taj glodar je miš. U jednom varijantnom rešenju, taj glodar je pacov.
[0052] U jednom varijantnom rešenju, miš nemože da izražava mišji IL-4 protein i ne može da izražava mišji IL-4Rα protein.
[0053] U jednom varijantnom rešenju, regulatorni elementri ili sekvence glodara na endogenom glodarskom IL-4 lokusu i/ili glodarskom IL-4Rα lokusu su od miša ili pacova.
[0054] U jednom varijantnom rešenju, regulatorni elementi ili sekvence glodara su endogeni glodarski regulatorni elementi ili sekvence na glodarskom IL-4 lousu i/ili glodarskom IL-4Rα lokusu.
[0055] U jednom varijantnom rešenju, nehumana životinja, npr. glodar, npr., miš ili pacov je ovde opisana koja izražava humane ili humanizovane IL-4 i/ili IL-4Rα proteine, pri čemu nehumana životinja izražava humane ili humanizovane IL- 4 i/ili IL-4Rα proteine iz endogenog nehumanog IL-4Rα lokusa i/ili endogenog nehumanog IL-4Rα lokusa. U jednom varijantnom rešenju, ne-humana životinja je glodar. U jednom varijantnom rešenju, taj glodar je miš. U jednom varijantnom rešenju, taj glodar je pacov.
[0056] U jednom varijantnom rešenju, genetski modifikovan miš je dat koji izražava humani ili humanizovani IL-4 protein iz endogenog mišjeg IL-4 lokusa, pri čemu je endogeni mišji IL-4 gen zamenjen, u celini ili delimično, sa humanim IL-4 genom.
[0057] U jednom varijantnom rešenju, dodirna mišja genomska nukleinska kiselina od oko 6,3 kb na endogenom mišjem IL-4 lokusu, uključujući ekson 1 počevši od ATG kodona incijacije sve do eksona 4 (uključujući 3’ netranslatiran region) i deo 3’ regiona nizvodno od eksona 4, je izbrisan i zamenjen sa oko 8,8 kb humane IL-4 sekvence nukleinske kiseline koja obuhvata ekson 1 počevši od ATG kodona inicijacije sve do eksona 4 (uključujući 3’ netranslatirani region) i deo 3’ regiona nizvodno od eksona 4 humanog IL-4 gena. U specifičnom varijantnom rešenju, humana IL-4 sekvenca nukleinske kiseline koja menja mišju genomsku nukleinsku sekvencu obuhvata ekson 1 koji počinje od ATG kodo na inicijacije sve do eksona 4 i dela 3’ regiona nizvodno od eksona 4 humanog IL-4 gena humanog BAC RP11-17K19. U specifičnom varijantnom rešenju, modifikovan IL-4 gen obuhvata mišje IL-45’ regulatorne elemente i humani IL-4 ekson 1 počevši od ATG kodona inicijacije sve do eksona 4, t.j., sekvenci kodiranja IL-4 proteina.
[0058] U jednom varijantnom rešenju, genetski modifikovan miš je opisan ovde koji obuhvata sekvencu nukleotida koja kodira humani ili humanizovani IL-4 protein, pri čemu sekvenca nukleotida koja kodira humani ili humanizovani IL-4 protein zamenjuje, u celini ili delimično endogenu sekvencu nukleotida koja kodira endogeni mišji IL-4 protein.
[0059] U jednom varijantnom rešenju, genetski modifikovan miš je ovde opisan koji izražava humani ili humanizovani IL-4Rα protein iz endogenog mišjeg IL-4Rα lokusa, pri čemu je zamenjen endogeni mišji IL-4Rα gen, u celini ili delimično, sa ljudskim IL-4Rα genom.
[0060] U jednom izvođenju, dodirna genomska nukleinska kiselina od oko 7,1 kb na endogenom mišjem IL- 4Rα lokusu, uključujući ekson 1 počevši od ATG kodona inicijacije sve do eksona 5 i dela introna 5, se briše i zamenjuje sa oko 15,6 kb humane IL-4Rα sekvence nukleinske kiseline koja obuhvata ekson 1 koji počinje od ATG kodona inicijacije sve do eksona 5 i dela introna 5 humanog IL-4Rα gena. U specifičnom izvođenju, humana IL-4α nukleinska kiselina koja menja mišju genomsku nukleinsku sekvencu obuhvata ekson 1 koji počinje od ATG kodona inicijacije sve do eksona 5 i dela introna 5 humanog IL-4 α gena humanog BAC RP11-16E24. U specifičnom izvođenju, humana IL-4Rα nukleinska kiselina koja menja mišju genomsku nukleinsku kisleinu obuhvata celu humanu sekvencu kodiranja IL-4Rα ektodomena.
[0061] U jednom varijantnom rešenju, ovde opisan postupak za pravljenje humanizovanog IL-4 glodara, obuhvata zamenu glodarske IL-4 sekvence gena koja kodira glodarski IL-4 protein sa humanom IL-4 sekvencom nukleinske kiseline koja obuhvata jedan ili više eksona humane IL-4 sekvence gena da se formira modifikovan, humanizovan IL-4 gen koji kodira humani ili humanizovani IL-4 protein, pri Čemu je zamena endogeni glodarski IL-4 lokus i humanizovana IL-4 sekvenca gena koja obuhvata jedan ili više eksona humane IL-4 sekvence gena i kodirajući humani ili humanizovani IL-4 protein je funkcionalno povezan na glodarske regulatorne elemente ili sekvence (npr., 5’ i/ili 3’ regulatorne elemente) na endogenom glodarskom IL- 4 lokusu.
[0062] U jednom varijantnom rešenju, glodar je miš ili pacov. U jednom varijantnom rešenju, taj glodar je miš. U jednom varijantnom rešenju, taj glodar je pacov.
[0063] U jednom varijantnom rešenju, regualtorni elementi glodara ili sekvence izvedene iz miša. U jednom varijantnom rešenju, regualtorni elementi ili sekvence glodara su izvedeni iz pacova.
[0064] U jednom varijantnom rešenju, regulatorni elementi ili sekvence glodara su endogeni glodarski regulatorni elementi ili sekvence na glodarskom IL-4 lokusu. U jednom varijantnom rešenju, taj glodar je miš. U jednom varijantnom rešenju, taj glodar je pacov.
[0065] U jednom varijantnom rešenju, humana IL-4 sekvenca nukleinske kiseline koja menja glodarsku IL-4 sekvencu gena obuhvata barem jedan ekson humane IL-4 sekvence gena. Kod drugih varijantnih rešenja, humana IL-4 sekvenca nukleinske kiseline zamenjuje glodarsku IL-4 sekvencu gena obuhvata barem 2 ili barem 3 eksona humane IL-4 sekvence gena. U jednom varijantnom rešenju, humana IL-4 sekvenca nukleinske kiseline koja menja glodarsku IL-4 sekvencu gena obuhvata sva 4 eksona humane IL-4 sekvence gena. U jednom varijantnom rešenju, taj glodar je miš. U jednom varijantnom rešenju, taj glodar je pacov.
[0066] U jednom varijantnom rešenju, humana IL-4 sekvenca nukleinske kiseline koja menja glodarsku IL-4 sekvencu gena kodira protein koji je oko 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili oko 99% identična humanom IL-4 (npr., human IL-4 protein kodiran pomoću nukleinske kiseline iznete u GenBank pristupni br. NM_000589.3s).
[0067] U jednom varijantnom rešenju, zamena je na endogenom glodarskom IL-4 lokusu i humanizovana IL-4 sekvenca gena obuhvata jedan ili više eksona humane IL-4 sekvence gena i kodranje humanog ili humanizovanog IL-4 proteina je funkcionalno povezano na endogene glodarske regulatorne elemente ili sekvence (npr., 5’ i/ili 3’ regulatorni elementi) na endogenom glodarskom IL-4 lokusu.
[0068] U jednom varijantnom rešenju, ovde je opisan postupak za pravljenje humanizovanog IL-4 miša, koji obuhvata zamenu mišje IL-4 sekvence gena koja kodira mišji IL-4 protein sa humanom IL-4 sekvencom gena da se formira modifikovani, humanizovani IL- 4 gen koji kodira humani ili humanizovani IL-4 protein.
[0069] U jednom varijantnom rešenju, zamena je na endogenom mišjem IL-4 lokusu, i humanizovani IL-4 gen koji se dobije kao rezutlat kodira humani ili humanizovani IL-4 protein je funkcionalno povezan na regulatorne elemente ili sekvence miša (npr., 5’ i/ili 3’ regulatorne elemente) na endogenom mišjem IL-4 lokusu.
[0070] U jednom varijantnom rešenju, zamena je na endogenom mišjem IL-4 lokusu, i humanizovani IL-4 gen koji kodira humani ili humanizovani IL-4 protein je funkcionalno povezan na endogenem regulatorne elemente ili sekvence miša (npr., 5’ i/ili 3' regulatorne elemente) na endogenom mišjem IL-4 lokusu.
[0071] U jednom varijantnom rešenju, ovde opisan postupak za pravljenje humanizovanog IL-4Rα glodara, obuhvata zamenu glodarske IL-4Rα sekvence gena koja kodira glodarski IL-4Rα protein sa humanom IL-4Rα sekvencom nukleinske kiseline koja obuhvata jedan ili više eksona na humanoj IL-4Rα sekvenci gena da se formira modifikovani, humanizovani IL-4 Rα gen koji kodira humani ili humanizovani IL-4Rα protein, pri čemu je zamena na endogenom glodarskom IL-4Rα lokusu i humanizovana IL-4Rα sekvenca gena obuhvataju jedan ili više eksona humane IL-4Rα sekvence gena i kodiranje humanog ili humanizovanog IL-4Rα proteina je funkcionalno povezano na regulatorne elemente ili sekvence glodara (npr., 5’ i/ili 3’ regulatorni elementi) na endogenom glodarskom IL-4Rα lokusu.
[0072] U jednom varijantnom rešenju, glodar je miš ili pacov. U jednom varijantnom rešenju, taj glodar je miš. U jednom varijantnom rešenju, taj glodar je pacov.
[0073] U jednom varijantnom rešenju, regulatorni elementi glodara ili sekvence izvedene iz miša. U jednom varijantnom rešenju, regulatorni elementi glodara ili sekvence izvedene iz pacova.
[0074] U jednom varijantnom rešenju, regulatorni elementi ili sekvence glodara su endogeni regulatorni elementi ili sekvence glodara na glodarskom IL-4Rα lokusu. U jednom varijantnom rešenju, taj glodar je miš. U jednom varijantnom rešenju, taj glodar je pacov.
[0075] U jednom varijantnom rešenju, humana IL-4Rα sekvenca nukleinske kiseline koja menja glodarsku IL-4Rα sekvencu gena obuhvata barem jedan ekson humane IL-4Rα sekvence gena. U jednom varijantnom rešenju, humana IL-4Rα sekvenca nukleinske kiseline koja menja glodarsku IL-4Rα sekvencu gena obuhvata barem 2, 3, 4, 5, 6, 7, ili 8 eksona humane IL-4Rα sekvence gena. U jednom varijantnom rešenju, humana IL-4Rα nukleinska sekvenca koja menja gloarsku IL-4Rα sekvencu gena obuhvata svih 9 eksona humane IL-4α sekvence gena. U jednom varijantnom rešenju, taj glodar je miš. U jednom varijantnom rešenju, taj glodar je pacov.
[0076] U jednom varijantnom rešenju, humana IL-4Rα nukleinska sekvenca koja menja glodarsku IL-4Rα sekvencu gena kodira protein koji je oko 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili oko 99% identična humanom IL-4Rα (npr., human IL-4Rα protein kodiran pomoću nukleinske kiseline iznete u GenBank pristupni br. NM_000418.3).
[0077] U jednom varijantnom rešenju, humana IL-4Rα sekvenca nukleinske kiseline koja menja glodarsku IL-4Rα sekvencu gena obuhvata barem jedan ekson humane IL-4Rα sekvence gena koja kodira ektodomen humanog IL-4Rα proteina. U drugim varijantnim rešenjima, humana IL-4Rα sekvenca nukleinske kiseline koja menja glodarsku IL-4Rα sekvencu gena obuhvata barem jedan ekson humane IL-4Rα sekvence gena koja kodira ektodomen humanog IL-4Rα proteina. U jednom varijantnom rešenju, humana IL-4Rα sekvenca nukleinske kiseline koja menja glodarsku IL-4Rα sekvencu gena obuhvata svih 5 eksona humane IL-4Rα sekvence gena koja kodira ektodomen humanog IL-4Rα proteina. U jednom varijantnom rešenju, taj glodar je miš. U jednom varijantnom rešenju, taj glodar je pacov.
[0078] U jednom varijantnom rešenju, humana ili humanizovana IL-4Rα sekvenca gena menja glodarsku IL-4Rα sekvencu gena kodira ektodomen IL-4Rα proteina koji je oko 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili oko 99% identičan ektodomenu humanog IL-4Rα proteina (npr., humani IL-4Rα protein kodiran nukleinskom kiselinom iznetom u GenBank pristupni br. NM_000418.3).
[0079] U jednom varijantnom rešenju, zamena je na endogenom glodarskom IL-4Rα lokusu i humanizovana IL-4Rα sekvenca gena obuhvata jedan ili više eksona humane IL-4R α sekvence gena i kodranje humanog ili humanizovanog IL - IL-4α proteina je funkcionalno povezano na endogene regulatorne elemente ili sekvence glodara (npr., 5’ i/ili 3’ regulatorni elementi) na endogenom glodarskom IL-4Rα lokusu.
[0080] U jednom varijantnom rešenju, ovde je opisan postupak za pravljenje humanizovanog IL-4Rα miša, koji obuhvata zamenu mišje IL-4Rα sekvence gena koja kodira mišji IL-4Rα protein sa humanom IL-4Rα sekvencom nukleinske kiseline da se formira modifikovani, humanizovani IL-4Rα gen koji kodira humani ili humanizovani IL-4Rα protein.
[0081] U jednom varijantnom rešenju, zamena na endogenom mišjem IL-4Rα lokusu, i humanizovani IL-4Rα gen koji kodira humani ili humanizovani IL-4Rα protein je funkcionalno povezan na mišje regulatorne elemente ili sekvence (npr., 5’ i/ili 3’ regulatorne elemente) na endogenom mišjem IL-4Rα lokusu.
[0082] U jednom varijantnom rešenju, zamena je na endogenom mišjem IL-4Rα lokusu, i humanizovani IL-4Rα gen koji kodira humani ili humanizovani IL-4Rα protein je funkcionalno povezan na endogene mišje regulatorne elemente ili sekvence (npr., 5’ i/ili 3' regulatorne elemente) na endogenom mišjem IL-4Rα lokusu.
[0083] Kod različitih varijantnih rešenja, genetski modifikovane nehumane životinje, npr. glodari, npr. miševi ili pacovi, opisani ovde obuhvataju genetske modifikacije u njihovoj klicinoj liniji.
[0084] U jednom varijantnom rešenju, opisana je nehumana životinja, npr. glodar, npr., miš ili pacov, embrion koji obuhvata genetsku modifikaciju kako je ovde opisano.
[0085] U jednom varijantnom rešenju, nehumana životinja, npr. glodar, npr., miš ili pacov, embrion domaćina je ovde opisana da obuhvata ćeliju donatora koja obuhvata genetsku modifikaciju kako je ovde opisano.
[0086] U jednom varijantnom rešenju, opisana je pluripotentna ili totipotentna nehumana životinja, npr. glodar, npr., miš ili pacov, ćelija koja obuhvata genetsku modifikaciju kako je ovde opisano. U jednom varijantnom rešenju, ta ćelija je ćelija glodara. U jednom varijantnom rešenju, ta ćelija je ćelija miša. U jednom varijantnom rešenju, ta ćelija je ES ćelija glodara. U jednom varijantnom rešenju, ta ćelija je ES ćelija miša.
[0087] U jednom varijantnom rešenju, ovde je opisana nehumana životinja, npr. glodar, npr., miš ili pacov, jaje, pri čemu jaje nehumane životinje obuhvata ektopični hromozom nehumane životinje, pri čemu je ektopični hromozom nehumane životinje obuhvata genetsku modifikaciju kako je ovde opisano. U jednom varijantnom rešenju, ne-humana životinja je glodar. U jednom varijantnom rešenju, taj glodar je miš. U jednom varijantnom rešenju, taj glodar je pacov.
[0088] U jednom varijantnom rešenju, mišji embrion, jaje, ili ćelija je genetski modifikovan da obuhvati humani IL-4 gen ili humani IL-4Rα gen je od miša koji je C57BL soja izabranog iz C57BL/A, C57BL/An, C57BL/GrFa, C57BL/Ka-LwN, C57BL/6, C57BL/6J, C57BL/6ByJ, C57BL/6NJ, C57BL/10, C57BL/10ScSn, C57BL/10Cr, i C57BL/Ola. U jednom drugom varijantnom rešenju, miš je 129 soj izabran iz grupe koja obuhvata soj koji je 129P1, 129P2, 129P3, 129X1, 129S1 (npr., 129S1/SV, 129S1/Svlm), 12952, 12954, 12955, 12959/SvEvH, 129S6 (129/SvEvTac), 129S7, 12958, 129T1, 129T2 (videti, npr., Festing i saradnici (1999) Revised nomenclature for strain 129 mice, Mammalian Genome 10:836 (Revidirana nomenklatura za soj 129 miševa, genom sisara 10:836), videti takođe, Auerbach i saradnici (2000) Establishment and Chimera Analysis of 129/SvEv- and C57BL/6-Derived Mouse Embryonic Stem Cell Lines(Uspostavljanje i himerna analliza 129/SvEv- i C57BL/6 iz miša izvedenih ćelijskih linija embrionske matične ćelije). U specifičnom varijantnom rešenju, genetski modifikovan miš je mešavina gore pomenutog 129 soja i gore pomenutog C57BL/6 soja. U jednom drugom specifičnom varijantnom rešenju, miš je mešavina gore pomenutih 129 sojeva, ili mešavina gorepomenutih BL/6 sojeva. U specifičnom varijantnom rešenju, 129 soj mešavine je 129S6 (129/SvEvTac) soj. U jednom drugom varijantnom rešenju, miš je BALB soj, npr., BALB/c soj. U jednom drugom varijantnom rešenju, miš je mešavina BALB soja i jednog drugog gore pomenutog soja. U jednom varijantnom rešenju, miš je pripada soju tipa švajcarski miš ili švajcarski Vebster miš.
[0089] Kod različitih varijantnih rešenja, ne-humane životinje obuhvataju humanu ili humanizovanu IL-4R i/ili IL-4 sekvencu nukleinske kiseline se biraju iz sisara i ptica. U jednom varijantnom rešenju, ne-humane životinje su sisari. U jednom varijantnom ređenju, ti sisari su mišje vrste.
[0090] U jednom varijantnom rešenju, ovde je opisan postupak za pretraživanje za utvrđivanje postojanja za ljude specifičnog IL-4 ili IL-4Rα antagonista. Ovaj postupak je koristan za utvrđivanje terapijskih kandidata i procenu terapijske efikasnosti. Ovaj postupak obuhvata primenu agensa genetski modifikovanom glodaru koj je dvostruko humanizovan za IL-4 i IL-4Rα kako je ovde opisano, određivanje dejstva agensa na biološku funkciju posredovanu IL-4/IL-4Rα signalnom putanjom, i utvrđivanje agensa kao za ljude specifičnog IL-4 ili IL-4Rα antagonista ako antagonizuje funkciju posredovanu IL-4/IL-4Rα signalnom putanjom kod genetski modifikovanog glodara.
[0091] U jednom varijantnom rešenju, agens obuhvata varijabilni domen imunoglobulina koji vezuje IL-4 ili IL-4Rα. Kod jednog varijantnog rešenja, agens specifično vezuje humani IL-4 ili IL-4Rα, ali ne i glodarski IL-4 ili IL-4Rα. U jednom varijantnom rešenju, taj agens je antitelo. U specifičnom varijantnom rešenju, agens je antitelo koje specifično veže humani IL-4Rα, ali ne i glodarski IL-4Rα.
[0092] U jednom varijantom rešenju, postupak za pretraživanje za utvrđivanje postojanja pkoristi dvostruko humanizovanog miša koji izražava humani IL-4 protein, i humanizovani IL-4Rα protein, pri čemu humanizovani IL-4Rα protein obuhvata ektodomen humanog IL-4Rα proteina, povezan na transmembranski domen i citoplazmni domen endogenog mišjeg IL-4Rα proteina, i pri čemu miš ne izražava mišji IL-4 ili mišji IL-4Rα.
[0093] Kod nekih varijantnih rešenja, postupak pretraživanja za utvrđivanje postojanja obuhvata korake uvođenja u dvostruko humanizovanog glodara kako je ovde opisano bolest povezana sa IL-4/IL-4Rα signaliziranjem, primenom agensa glodaru, utvrđivanje da li agens poboljšava bolest, i utvrđivanje agensa kao za IL-4 ili IL-4Rα antagonista specifičnog za ljudska bića pogodnog za lečenje bolesti ako taj agens poboljšava bolest.
[0094] Kod nekih varijantnih rešenja povezanih sa IL-4/IL-4Rα signaliziranjem je upala disajnih puteva, koju je moguće indukovati kod glodara intranazalnom primenom alergena (npr., ekstrakt grinja kućne prašine) u jednoj ili više doza tokom izvesnog perioda vremena. Dejstvo agensa moguće je odrediti merenjem da li nivo upale disajnog puta (što se ogleda npr., nagomilavanjem sluzi, infiltriranje ćelija u bronhoalveolarni lavat i/ili nivoe ukupne cirkulacije (IgE), su smanjeni kao rezultat primene tog agensa.
[0095] Kod nekih varijantnih rešenja, bolest povezana sa IL-4/IL-4Rα signaliziranjem je upala kože ili atopični dermatitis, koji je moguće indukovati kod glodara stvaranjem povrede kože i izlaganjem povređene kože alergenu (npr., ekstraktu bakterijskog toksina ili ekstraktu grinje kućne prašine) u jednoj ili više doza tokom izvesnog perioda vremena. Dejstvo agensa moguće je odrediti merenjem da li je upala kože smanjena kao rezultat primene agensa.
[0096] U još jednom varijantnom rešenju, trostruko humanizovana nehumana životinja čiji su IL-4, IL-4Rα, i IL-33 geni humanizovani kako je ovde opisano se koristi da proceni farmakodinamiku (PD) i terapijsku efikasnost jedinjenja ili kombinaciju jedinjenja.
[0097] Svaki od varijantnih rešenja i izvođenja opisanih ovde su sposobni da se koriste zajedno, osim ako nisu isključene bilo eksplicitno ili jasno iz konteksta izvođenja pronalaska ili varijantnog rešenja.
KRATAK OPIS SLIKA
[0098]
Slika 1 obezbeđuje ilustraciju, nije u razmeri, receptora IL-4 i IL-13 prenos signala i mehanizam akcije dupilumaba, neutralizovanje potpuno ljudskog monoklonskog antitela koje se vežu specifično na humani IL-4 receptorski α lanac (IL-4Rα).
Slike 2A-2B obezbeđuju ilustraciju, nije u razmeri, strategije za humanizaciju IL-4 (Il4) i IL-4Rα (Il4ra) lokusa. (2A) Mišji IL-4 gen (vrh) proširuje region kodiranja iz eksona 1 koji počinje na ATG kodonu inicijacije sve do eksona 4 (uključujući 3’ netranslatirani region) i deo 3’ regiona nizvodno od eksona 4 se brišu i zamenjeni su regionom kodiranja od eksona 1 počevši od ATG kodon sve do eksona 4 (uključujući 3’ netranslatiran region) i deo 3’ regiona nizvodno od eksona 4 humanog IL-4 gena (dno) zajedno sa higro loxP kasetom izbora u sendviču, kako je naznačeno. (2B) Mišji IL-4Rα gen (vrh) proširuje region kodiranja od eksona 1 počevši od ATG kodona inicijacije sve do eksona 5 i dela introna 5 se brišu i zamenjuju regionom kodiranja od eksona 1 počevši od ATG inicijacije kodiranja sve do 5 i deo introna 5 humanog IL-4Rα gena (dno) i kasete izbora neo u sendviču, kako je navedeno.
Slika 3 pokazuje izražavanje humanizovanog IL-4Rα proteina na B i T ćelije iz dvostruko humanizovanih IL-4/IL-4Rα (Il4hu/hu/Il4rahu/hu) miševa.
Slika 4 pokazuje specifičnosti liganda IL-4 i IL-13 i funkcionalnosti receptora korišćenjem primarnih ćelija izvedenih iz humanizovanih IL4Rα (Il4rahu/hu) miševa. Slika 5 pokazuje IL-4 zavisnu IgE proizvodnju in vivo kod divljeg tipa, ali ne kod humanizovanih IL4Rα (Il4rahu/hu) miševa.
Slika 6 pokazuje da je od doze zavisna IL-4 indukcija mIgE proizvodnje ex vivo u mišjim B ćelijama (levi panel) blokirana putem dupilumaba, na od doze zavistan način (desni panel).
Slika 7 pokazuje da dupilumab, na od doze zavisan način, sprečava patologije puća koje su uz pomoć IL-25 indukovane in vivo kod humanizovakih IL4Rα (Il4rahu/hu) miševa.
Slika 8 pokazuje eksperimentalnu konstrukciju za procenu terapijske efikasnosti dupilumaba u ekstraktom grinje kućne prašne (HDM) indukovanom modelu upale pluća korišćenjem dvostruko humanizovanog IL-4 i IL-4Rα (IL-4hu/hu/IL-4Rhu/hu) miševa. "REGN668" se odnosi na ljudsko monoklonsko antitelo usmereno na ljudski IL-4Rα, takođe poznato kao dupilumab. "REGN129" se odnosi na mišji sol IL-13Rα2-Fc, koji je protein fuzije između ektodomena mišjeg IL- 13R2α i Fc.
Slika 9 pokazuje eksperimentalnu konstrukciju za procenu terapijske efikasnosti dupilumab na grinjom kućne prašine (HDM) indukovanom modelu upale pluća korišćenjem dvostruko humanizovanih IL-4 i IL-4Rα (IL-4hu/hu/IL-4Rhu/hu) miševa i izotipom kontrolisano antitelo.
Slike 10A-10C ilustruju strategije za humanizaciju mišjeg IL-33 lokusa. Slika 10A ilustruje da mišji IL-33 gen (vrh) koji se prostire u rasponu regiona kodiranja od eksona 2 počevši od ATG kodona inicijacije sve do kodona zaustavljanja u eksonu 8 se briše i zamenjuje regionom kodiranja od eksona 2 počevši na ATG kodonu sve do eksona 8 (uključujući 3’ netranslatirani region) humanog IL-33 gena (dno). Slika 10B pokazuje humanizovani IL-33 alel u mišjem klonu ES ćelije MAID 7060, koji sadrži kasetu izbora neomicina loxP. Slika 10C pokazuje humanizovani IL-33 alel u mišjoj ES klon ćeliji MAID 7061, kod koje je izbrisana kaseta izbora neomicina, sa loxP i mestima kloniranja (77bp) preostalih nizvodno od humanog IL-33 sekvence i mišje 3’ UTR zadržane nizvodno od loxP mesta.
DETALJAN OPIS
IL-4 i IL-4Rα kao terapijski ciljevi
[0099] Alergijski poremećaji su spektar bolesti koje se javljaju sve češće, posebno u zemljama u razvoju. Atopičan detmatitis, astma, i alergijski rinits su najčešća stanja upale kod pacijenata sa alergijama; ovi pacijenti često boluju od pojave više kliničkih simptoma. Patogeneza alergije je povezana sa nenoramlnim odgovorima imunog sistema na eksogene antigene (videti Mueller i saradnici (2002) Structure, binding, and antagonists in the IL-4/IL-13 receptor system (Struktura, vezivanje, i antagonisti u IL-4/IL-13 sistemu receptora), Biochim Biophys Acta 1592:237-250).
[0100] Prekomerna proizvodnja IgE specifičnog za antigen je ključna komponenta za pokretanje alergijske upale. Nenormalni tip-2 T ćelije pomoćnice (Th2) polarizacije doprinosi povećanim IgE odgovorima.
[0101] Interleukin-4 (IL-4) i interleukin-13 (IL-13), su originalno identifikovani iz aktiviranih T cells, su glavni citokini koji igraju ključnu ulogu u pokretanju, održavisti imunog sisema i upalnih reakcija kod alergija.
[0102] IL-4 i IL-13 signaliziranje su posredovani pomoću dva distinktivna kompleksa receptora sa zajedničkom podjedinicom IL-4 receptorom alfa (IL-4Rα), koji mogu da doprinesu preklapanju bioloških odgovora između ova dva citokina. Videti Sliku 1.
[0103] Receptori za interleukin-4/13 prenos signala i mehanizam delovanja dupilumaba. IL-4Rα formira dva distinktivna heterodirmena receptroska kompleksa da posreduju u biološkim funkcijama IL-4 i IL-13 na način specifičan za tkivo i odgovor. Tip I receptora je obuhvatio IL-4Rα i zajednički gama lanac citokinskog receptora (yC) je jedinstven za IL-4. Tip II receptora je formiran između IL-4Rα i IL-13Rα1 je primarnni receptor za IL-13, ali je takođe funkcionalan za IL-4. Pored toga, IL-13 će se vezati na drugi receptor visokog afiniteta, IL-13Rα2, koji je generalno priznat kao receptor-mamac ili sa mogućim proffibrotskim dejstovm u obliku pune dužine.
[0104] Dupilumab je antagonističko monoklonalno antitelo protiv humanog IL-4Rα koje inhibira indukovane biološke aktivnosti iz IL-4 i IL-13. Dupilumab blokira IL-4 prenos signala sprečavanjem njegovog vezivanja na podjedinice receptora, pri čemu inhibitorno dejstvo na IL-13 signaliziranje je najverovatnije posredovano ometanjem reakcije receptora.
[0105] Dupilumab, potpuno humano monoklonsko antitelo usmereno protiv zajedničke IL-4Rα podjedinice, je razvijeno u kompaniji Regeneron Pharmaceuticals, Inc. korišćenjem VelocImmune® miševa. Dupilumab prolazi klinička ispitivanja za lečenje umerene do ozbiljne astme i za lečenje mumerenog do ozbiljnog atopičnog dermatitisa.
[0106] Procena jačine dupilumaba za mišje modele predstavlja više testova: (a) dupilumab ne prepoznaje poznati mišji IL-4 receptor; i (b) postoji nedostatak funkcionalne interakcije između mišjeg IL-4 proteina i humanog IL-4 receptora.
IL-4 gen i protein
[0107] Taj IL-4 gen kodira izlučeni IL-4 protein, koji igra važnu ulogu u aktivaciji B ćelija, kao i drugih tipova ćelija (videti Sliku 1).
[0108] Humani IL-4. NCBI gen ID: 3565; Primarni izvor: HGNC:6014; RefSeq transkript: NM_000589.3; UniProt ID: P05112; Genomski sklop: GRCh37; Lokacija: chr5: 132,009,743-132,018,576 lanac.
[0109] Humani IL-4 gen se nalazi na hromozomu 5, na 5q31.1. Humani IL-4 gen ima 4 eksona i kodira polipeptidni prekurzor 153 amino kiselina u dužini, uključujući 24 amino kiselina dugačak signalni peptid, i 129 amino kiselina dugačak zreli IL-4 protein.
[0110] Mišji IL-4. NCBI gen ID: 16189; Primarni izvor: MGI:96556; RefSeq transkript: NM_021283.2; UniProt ID: P07750; Genomski sklop: GRCm38; Lokacija: chr11: 53,612,350-53,618,606 - lanac.
[0111] Mišji IL-4 gen se nalazi na hromozomu 11, na 1131,97 cM. Mišji IL-4 gen ima 4 eksona i kodira polipeptidni prekurzor sa 140 amino kiselina u dužini, uključujući 20 amino kiselina dugačak signalni peptid, i 120 amino kiselina dugačak zreli IL-4 protein.
IL-4Rα gen i protein
[0112] IL-4Rα gen kodira transmembranski receptor IL-4Rα protein, koji je izražen prvenstveno na B i T ćelijama, je receptor za IL-4 i IL-13 proteine (videti Sliku 1).
[0113] Humani IL-4Rα. NCBI gen ID: 3566; Primarni izvor: MGI:6015; RefSeq transkript: NM_000418.3; UniProt ID: P24394; Genomski sklop: GRCh37; Lokacija: chr16: 27,351,525-27,367,111+ lanac.
[0114] Humani IL-4Rα gen se nalazi na hromozomu 16 na 16p12.1-p11.2. Humani IL-4Rα gen ima 9 kodirajućih eksona i kodira polipeptidni prekurzor od 825 amino kiselina, uključujući 25 amino kiselina dug signalni peptid, i 800 amino kiselina dug zreli IL-4Rα protein, sa prvih 207 amino kiselina dugih ostataka zrelog proteina koji čine vanćelijski domen. Vanćelijski domen (t.j. ektodomen) humanog IL-4Rα proteina se kodira kodiranjem kodirajućih eksona 1 do 5 humanog IL-4Rα gena.
[0115] Mišji IL-4Rα. NCBI gen ID: 16190; Primarni izvor: MGI:105367; RefSeq transkript: NM_001008700.3; UniProt ID: P16382; Genomski sklop: GRCm38; Lokacija: chr11:125,565,655-125,572,745 lanac.
[0116] Mišji IL-4Rα gen je smešten na hromozom 7 na 768.94 cM. Humani IL-4Rα gen ima 9 kodirajućih eksona i kodira polipeptidni prekurzor od 810 amino kiselina, uključujući 25 amino kiselina dug signalni peptid, i 785 amino kiselina dug zreli IL-4Rα protein, sa prvih 208 amino kiselina dugih ostataka zrelog proteina koji čine vanćelijski domen. Vanćelijski domen (t.j. ektodomen) mišjeg IL-4Rα proteina se kodira kodiranjem kodirajućih eksona 1 do 5 mišjeg IL-4Rα gena.
Specifičnost vrsta IL-4 i IL-4Rα proteina
[0117] Kako je ovde prikazano, miš, ali ne humani, IL-4 je funkcionalan za miševe divljeg tipa, i obratno, humani, ali ne mišji, IL-4 je funkcionalan za humanizovane IL-4Rα (II4rahu/hu) miševe. (Videti takođe, npr., Andrews i saradnici (2001) Reconstitution of a functional human type II IL-4/IL-13 receptor in mouse B cells: demonstration of species specificity (Rekonstitutcija funkcionalnog humanog tipa II IL-4/IL-13 receptor u mišjim B ćelijama: demonstracija specifičnosti vrsta), J Immunol.166:1716-1722).
Specifičnost vrsta humanih IL-4 i IL-4Rα inhibitora
[0118] Terapijski molekuli kandidati koji ciljaju IL-4 ili IL-4Rα proteine su obično procenjeni za farmakokinetička svojstva (PK) i farmacodinamička svojstva (PD) kod ne-humanih životinja, npr., glodare, npr., miševe i pacove. Takvi terapijski molekuli se takođe testiraju za in vivo terapijsku efikasnost kod ne-humanih životinja, npr., glodara, npr., miš ili pacov, modeli humanih bolesti, poremećaja i stanja povezanih sa nenormalnim Th2 ćelijama.
[0119] Međutim, terapijski molekuli koji su specifični za humane IL-4 ili IL-4Rα proteine, npr., IL-4 or IL-4Rα inhibitore specifične za ljude, ne mogu da budu odgovarajuće procenjeni za PD ili in vivo terapijsku efikasnost kod pacova, posebno miševa, jer nedostaju ciljevi (mete) oviH terapijskih molekula. Ovaj problem ne prevazilazi korišćenje transgenskih nehumaanih životinja, npr. glodara, npr., miševa ili pacova, koji izražavaju humane IL-4 ili IL-4Rα proteine zbog specifičnosti gore pomenutih vrsta IL-4 proteina.
[0120] S tim u skladu, u različitim varijantnim rešenjima, za procenu PD i in vivo terapijske efikasnosti IL-4 ili IL-4Rα antagonista proteina ili inhibitora za nehumane životinje, npr., glodare, npr., miševe ili pacove, poželjno je zameniti endogene IL-4 i/ili IL-4Rα proteine sa humanim IL-4 i/ili IL-4Rα proteinima.
[0121] Pored toga, u različitim varijantnim rešenjima, da bi se izbegli potencijalni problemi prekomerne ekspresije ili nedovoljne ekspresije humanog IL-4 i/ili IL-4Rα proteina, poželjno je umetnuti humane IL-4 i/ili IL-4Rα gene u genom ne-humanih životinja, npr., glodara, npr., miševa ili pacova, na endogenim IL-4 i/ili IL-4Rα genskim lokusima, i da se izraze humane IL- 4 i/ili IL-4Rα proteini u ne-humanim životinjama, npr., glodari, npr., miševi ili pacovi, pod kontrolom, barem delimično, endogenih IL-4 i/ili IL-4Rα regulatornih elemenata.
Genetski modifikovane ne-humane životinje
[0122] Ovde su opisane genetski modifikovane nehumane životinje čiji je endogeni IL-4 gen i/ili IL-4Rα gen zamenjen u celini ili delimično, na endogenom IL-4 lokusu i/ili IL-4Rα lokusu, sa humanom IL-4 nukleinskom kiselinom i/ili humana IL-4Rα nukleinska kiselina da se formira modifikovan IL-4 gen i/ili modifikovan IL-4Rα gen koji kodira humani ili humanizovani IL-4 i/ili humani ili humanizovani IL-4Rα protein.
[0123] Fraza "ne-humana životinja" kako se ovde koristi se odnosi na organizam bilo kog kičmenjaka koji nije humani. Kod nekih varijantnih rešenja, ne-humana životinja je sisar. Kod specifičnih izvođenja, nehumana životinja je glodar kao što je pacov ili miš.
[0124] U jednom varijantnom rešenju, genetski modifikovani glodari, npr., miševi ili pacovi, su opisani ovde čiji je endogeni glodarski IL-4 gen zamenjen u celini ili delimično, na endogenom IL-4 lokusu, sa humanom IL-4 nukleinskom kiselinom.
[0125] Ta zamena obuhvata zamenu barem jednog eksona, t.j., jednog ili više eksona, glodarskog IL-4 gena sa humanom nukleinskom kiselinom koja obuhvata barem jedan ekson humanog IL-4 gena. Kod nekih varijantnih rešenja, dodirni glodarski genomski fragment koji obuhvata ekson 1 počevši od ATG kodona inicijacije sve do eksona 4 mišjeg IL-4 je zamenjeno sa dodirnim genomskim fragmentom humanog IL-4 sekvence obuhvataju ekson 1 koji počinje od ATG kodon inicijacije sve do ekson 4 humanog IL-4 gena. U specifičnom varijantnom rešenju, glodar je miš, i dodirni mišji genomski fragment od oko 6,3 kb na endogenom mišjem IL-4 lokusu, obuhvata ekson 1 koji počinje od ATG kodona inicijacije sve do eksona 4 (uključujući 3’ netranslatirani region) i deo 3’ regiona nizvodno od eksona 4, je obrisan i zamenjuje sa oko 8,8 kb humane IL-4 sekvence nukleinske kiseline koja obuhvata ekson 1 koji počinje od ATG kodona inicijacije sve do eksona 4 (uključujući 3' netranslatirani region) i deo 3' regiona nizvodno od eksona 4 humanog IL-4 gena.
[0126] Kod nekih varijantnih rešenja, rezultati zamene u modifikovanom, humanizovanog IL-4 genu na lokusu endogenom IL-4 gena, pri čemu ekspresija modifikovanog IL-4 gena jeste pod kontrolom endogenih regulatornih elemenata na endogenom IL-4 lokusu. Pojam "regulatorni elementi" kako se ovde koristi se odnosi na transkripcione regulatorne sekvence, uključujući i 5’ transcripcione regulatorne sekvence kao što su elementi promotera, pospešivača, i potiskivača, i 3’ transkripcione regulatorne sekvence kao što je transkripciona sekvenca završetka. Kod nekih varijantnih rešenja, ekspresija modifikovanog IL-4 gena je pod kontrolom endogenih 5’ regulatornih elemenata. Kod drugih varijantnih rešenja, ekspresija modifikovanog IL-4 gena je pod kontrolom endogenih 3’ regulatornih elemenata. Kod nekih varijantnih rešenja, ekspresija modifikovanog IL-4 gena je pod kontrolom endogenih 5’ i 3’ regulatornih elemenata.
[0127] Modifikovan, humanizovani IL-4 gen formiran na endogenom IL-4 lokusu kodira humani ili humanizovani IL- 4 protein. Pojam "humanizovan" se odnosi na nukleinske kiseline ili proteine koji obuhvataju delove sekvenci gena ili proteina nađenog kod nehumane životinje (npr., glodara kao što je miš ili pacov), i takođe obuhvata delove ili sekvence koji se razlikuju od onih koji su nađeni kod nehumane životinje ali umesto toga odgovaraju (identično sa) delovima ili sekvencama duplikata (dvojnika) humanog gena ili proteina. Modifikovani, humanizovani IL-4 gen može da kodira IL-4 protein koji je barem 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% identičan, ili je 100% identičan, sa humanim IL-4 proteinom (npr., humani IL-4 protein je kodiran pomoću nukleinske kiseline iznete u GenBank pristupnom broju NM_000589.3).
[0128] Genetski modifikovan glodar koji ima zamenu endogenog glodarskog IL-4 gena u celini ili delimično, na endogenom IL-4 lokusu, sa humanom IL-4 nukleinskom kiselinom, može da bude homozigotan ili heterozigotan u vezi sa zamenom. Kod nekih varijantnih rešenja, genetski modifikovan glodar je heterozigotni modifikovani glodar je heterozigotni u pogledu zamene, t.j., samo jedna od dve kopije endogenog glodara IL-4 gena je zamenjena sa humanom IL-4 nukleinskom kiselinom. Kod nekih varijantnih rešenja, genetski modifikovan glodar je homozigotni u pogledu zamene, t.j., obe kopije endogenog glodarskog IL-4 gena su zamenjene sa humanom IL-4 nukleinskom kiselinom.
[0129] Genetski modifikovan glodar izražava humani ili humanizovani IL-4 protein u serumu. Kod nekih varijantnih rešenja, genetski modifikovan glodar ne izražava endogeni glodarski IL-4 protein. Kod jednog varijantnog rešenja, serum glodara koji izražava humani ili humanizovani IL-4 protein je približno istog nivoa kao i IL-4 protein kao glodar koji izražava funkcionalni, endogeni IL-4 protein, npr., glodar divljeg tipa (npr., glodar koji izražava funkcionalni endogeni IL-4 protein, ali ne obuhvata zamenu endogenog IL-4 gena u celini ili delimično, na endogenom IL-4 lokusu, sa humanom IL-4 nukleinskom kiselinom). Pod "približno istog nivoa" misli se na nivo koji spada unutar 25%, 20%, 15%, 10%, 5% ili manje u bilo kom smeru (t.j., veće od ili manje od) nivoa kod glodara divljeg tipa. Kod drugih varijantnih rešenja, glodar izražava humani ili humanizovani IL-4 protein u serumu pri koncentraciji od barem oko 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190% ili 200% nivoa IL-4 proteina prisutnog u serumu na odgovarajuće starom glodaru koji izražava funkcionalni endogeni IL-4 protein, ali ne obuhvata zamenu endogenog IL-4 gena u celini ili delimično, na endogenom IL-4 lokusu, sa humanom IL-4 nukleinskom kiselinom.
[0130] Kod nekih varijantnih rešenja, genetski modifikovan glodar ima zamenu endogenog glodarskog IL-4 gena u celini ili delimično sa humanom IL-4 nukleinskom kiselinom i ekspresiju humanog ili humanizovanog IL-4 proteina u serumu ima normalan imuni sistem, t.j., broj imunih ćelija, npr., B i T ćelije, u krvi, plazmi ili serumu glodara sa ekspresijom humanog ili humanizovanog IL-4 proteina su slični broju imunih ćelija, npr., B i T ćelija, u krvi, plazma ili serum glodara koji izražava funkcionalni endogeni IL-4 protein i nema zamenu endogenog glodarskog IL-4 gena u celini ili delimično sa humanom IL-4 nukleinskom kiselinom.
[0131] Kod dodatnih varijantnih rešenja, genetski modifikovan glodar ima zamenu endogenog glodarskog IL-4 gena u celini ili delimično sa humanom IL-4 nukleinskom kiselinom i izražava humani ili humanizovani IL-4 protein, takođe obuhvata zamenu endogenog glodarskog IL-4Rα gena u celini ili delimično, na endogenom IL-4 Rα lokusu, sa humanom IL-4Rα nukleinskom kiselinom, i kao rezultat, takođe izražava humani ili humanizovani IL-4Rα protein.
[0132] U drugom varijantnom rešenju, ovde su opisani genetski modifikovani glodari, npr., miševi ili pacovi, čiji je endogeni glodarski IL-4Rα gen zamenjen u celini ili delimično, na endogenom IL-4α lokusu, sa humanom IL-4Rα nukleinskom kiselinom.
[0133] Ta zamena obuhvata zamenu barem jednog eksona, t.j., jednog ili više eksona, glodarskog IL-4Rα gena sa humanom nukleinskom kiselinom koja obuhvata barem jedan ekson humanog IL-4Rα gena. Kod nekih varijantnih rešenja, zamena obuhvata zamenu barem jednog od eksona glodarskog IL-4Rα gena sa kodiranjem glodarskog ektodomena sa barem jednim od eksona humanog IL-4Rα gena sa kodiranjem humanog ektodomena. Kod nekih varijantnih rešenja, zamena obuhvata zamenu sa humanom nukleinskom kiselinom koja obuhvata barem 2, 3 ili 4 od 5 eksona sa kodiranjem ektodomena humanog IL-4Rα gena. Kod drugih izvođenja, dodirni glodarski genomski fragment koji obuhvata ekson 1 počevši od ATG kodona inicijacije sve do eksona 5 glodarskog IL-4Rα je zamenjen sa genomskim fragmentom uključujući ekson 1 koji počinje od ATG kodona inicijacije sve do eksona 5 humanog IL-4Rα gena. U specifičnom izvođenju, glodar je miš, i dodirni mišji genomski fragment od oko 7,1 kb na endogenom mišjem IL-4Rα lokusu, uključujući ekson 1 počevši od ATG kodona inicijacije sve do eksona 5 i dela introna 5, je obrisan i zamenjen sa oko 15,6 kb humane IL-4Rα sekvence nukleinske kiseline koja obuhvata ekson 1 počevši od ATG kodona inicijacije sve do eksona 5 i dela introna 5 humanog IL-4Rα gena.
[0134] Kod nekih varijantnih rešenja, rezultati zamene u modifikovanom, humanizovanom IL-4Rα genu na lokusu endogenog IL-4Rα gena, pri čemu ekspresija modifikovanog IL-4Rα gena jeste pod kontrolom endogenih regulatornih elemenata na na endogenom IL-4Rα lokusu.
[0135] Modifikovan, humanizovani IL-4Rα gen formiran na endogenom IL-4Rα lokusu kodira humani ili humanizovani IL-4Rα protein. Kod nekih varijantnih rešenja, modifikovani, humanizovani IL-4α gen kodira IL-4Rα protein koji je barem 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% identičan, ili je 100% identičan, sa humanim IL-4Rα proteinom (npr., humani IL-4 protein je kodiran pomoću nukleinske kiseline iznete u GenBank pristupnom broju NM_000418.3). IL-4Rα gen kodira humanizovani IL-4Rα protein obuhvata ektodomen koji je barem 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% identičan, ili je 100% identičan, sa ektodomenom humanog IL-4Rα proteina (npr., humani IL-4 protein kodiran pomoću nukleinske kiseline iznete u GenBank pristupnom broju NM_000418.3). U specifičnim varijantnim rešenjima, transmembranski i citoplazmni domeni humanizovanog IL-4Rα proteina su identični sa transmembranskim citoplazmnim domenima endogenog glodarskog IL-4Rα proteina.
[0136] Glodarski modifikovan glodar sa zamenom endogenog glodarskog IL-4Rα gena u celini ili delimično, na endogenom IL-4Rα lokusu, sa humanom IL-4Rα nukleinskom kiselinom, kada je reč o zameni, mogu biti homozigotni ili heterozigotni. Kod nekih varijantnih rešenja, genetski modifikovan glodar je, kada je reč o zameni, heterozigotan, t.j., samo jedna od dve kopije endogenog glodarskog IL-4Rα gena je zamenjena sa humanom IL-4Rα nukleinskom kiselinom. Kod drugih varijantnih rešenja, genetski modifikovan glodar je homozigotan u vezi sa zamenom, t.j., obe kopije endogenog glodarskog IL-4Rα gena su zamenjene sa humanom IL-4Rα nukleinskom kiselinom.
[0137] Genetski modifikovan glodar opisan ovde izražava humani ili humanizovani IL-4Rα protein na imunim ćelijama, npr., B i T ćelijama. Kod nekih varijantnih rešenja, genetski modifikovan glodar ne izražava endogeni glodarski IL-4Rα protein. Kod jednog varijantnog rešenje, imune ćelije glodara koje izražavaju humani ili humanizovani IL-4Rα protein imaju približno isti nivo IL-4Rα proteina na imune ćelije jer glodar koji izražava funkcionalni, endogeni IL-4Rα protein na imune ćelije glodara divljeg tipa koji izražava funkcionalni, endogeni IL-4Rα protein i ne izražava humani ili humanizovani IL-4Rα protein. Kod drugih varijantnih rešenja, glodar izražava humani ili humanizovani IL -4Rα protein na imune ćelije u količini od barem oko 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190% ili 200% količine IL-4Rα proteina prisutnog na imunim ćelijama odgovarajuće starog glodara koji izražava funkcionalni endogeni IL-4Rα protein, ali ne obuhvata zamenu endogenog IL-4Rα gena u celini ili delimično sa humanom IL-4Rα nukleinskom kiselinom.
[0138] Kod nekih varijantnih rešenja, genetski modifikovan glodar ima zamenu endogenog glodarskog IL-4Rα gena u celini ili delimično sa humanom IL-4Rα nukleinskom kiselinom i izražava humani ili humanizovani IL-4Rα protein ima normalan imuni sistem, t.j., broj imunih ćelija, npr., B i T ćelija, u krvi, plazmi ili serumu glodara koji izražava humani ili humanizovani IL-4Rα protein su slični izvesnom broju imunih ćelija, npr., B i T ćelija, u krvi, plazmi ili serumu glodara divljeg tipa (npr., glodara koji izražava funkcionalni endogeni IL-4Rα protein i nema zamenu endogenog glodarskog IL-4Rα gena u celini ili delimično sa humanom IL-4Rα nukleinskom kiselinom).
[0139] Kod nekih varijantnih rešenja, genetski modifikovan glodar ima zamenu endogenog glodarskog IL-4Rα gena u celini ili delimično sa humanom IL-4Rα nukleinskom kiselinom i ekspresija humanog ili humanizovanog IL-4Rα proteina je moguća i funkcionalna za posredovano od IL-4 zavisno signaliziranje i IL-13 zavisno signaliziranje. Na primer, humanizovani IL-4Rα protein sa ektodomenom humanog IL-4Rα proteina, izraženog na imunim ćelijama genetski modifikovanog glodara, interreaguju sa humanim IL-4 i posreduje od humanog IL-4 zavisno signalizovanje preko formiranja receptora tipa I (videti Sliku 1). Takav humanizovan IL-4Rα protein sa ektodomenom iz humanog IL-4Rα proteina takođe interreaguje sa humanim i mišjim IL-13, i posreduje od IL-13 zavisno signaliziranje preko formiranja receptora tipa II (videti Slika 1). Funkcionalnost humanizovanog IL-4Rα proteina izražena u genetski modifikovanom glodaru može da bude procenjena u različitim ogledima poznatim u ovoj oblasti, uključujući one koji su specifično opisani na primerima ovde dole u tekstu, kao što je ogled koji meri IL-4 indukovanu IgE promenu klase korišćenjem primarnih B ćelija izvedenih iz genetski modifikovanog glodara.
[0140] Kod dodatnih varijantnih rešenja, genetski modifikovan glodar ima zamenu endogenog glodarskog IL-4Rα gena u celini ili delimično sa humanom IL-4Rα nukleinskom kiselinom i ekspresiju humanog ili humanizovanog IL-4Rα proteina obuhvata zamenu endogenog glodarskog IL-4 gena u celini ili delimično, na endogenom IL-4 lokusu, sa humanom IL-4 nukleinskom kiselinom, i kao rezultat, takođe izražava humani ili humanizovani IL-4.
[0141] U jednom daljem varijantnom rešenju, ovde su opisani dvostruko modifikovani glodari, npr., miševi ili pacovi, čiji je endogeni glodarski IL-4 gen zamenjen u celini ili delimično, na endogenom IL-4 lokusu, sa humanom IL-4 nukleinskom kiselinom, i čiji endogeni glodarski IL-4Rα gen je takođe zamenjen u celini ili delimično, na endogenom IL-4 Rα lokusu, sa humanom IL-4Rα nukleinskom kiselinom. Takvi dvostruko humanizovani glodari mogu biti homozigotni ili heterozigotni u pogledu svake zamene humanizacijom. U specifičnom varijantnom rešenju, dvostruko humanizovani glodar je homozigotan u slučaju oba, humanizovanog IL-4 i humanizovanog IL-4Rα.
[0142] Genetska modifikacija na endogenom glodarskom IL-4 genu u dvostruko humanizovanom glodaru obuhvata one modifikacije ili zamene opisane ovde gore u tekstu za genetski modifikovanog glodara koji ima zamenu na endogenom glodarskom IL-4 genu u celini ili delimično sa humanom IL-4 nukleinskom kiselinom. Slično, genetska modifikacija na endogenom glodarskom IL-4Rα genu kod dvostruko humanizovanog glodara obuhvata one modifikacije ili zamene opisane ovde gore u tekstu za genetski modifikovanog glodara sa zamenom endogenog glodarskog IL-4Rα gena u celini ili delimično sa humanom IL-4Rα nukleinskom kiselinom. Dakle, karakteristike opisane ovde gore u tekstu u pogledu humanizacije glodarskog IL-4 gena i u pogledu humanizacije glodarskog gena, prema opisanom redosledu, su ovde ugrađene specifično za dvostruko humanizovanog glodara.
[0143] U specifičnm varijantnm rešenjima, dvostruko humanizovani glodar, npr., miš ili pacov, opisan je ovde, koji izražava humani IL-4 protein i humanizovani IL-4Rα protein, pri čemu humanizovani IL-4Rα protein obuhvata ektodomen humanog IL-4Rα proteina i transmembranski domen i citoplazmni domen glodarskog endogenog IL-4Rα proteina. Kod posebnih varijantnih rešenja, izraz human IL-4 protein i humanizovani IL-4Rα protein su pod kontrolom endogenih glodarskih regulatornih sekvenci na endogenom glodarskom IL-4 lokusu odnosno glodarskom IL-4Rα lokusu.
[0144] Kod nekih varijantnih rešenja, dvostruko humanizovani glodar ima normalni imuni sistem (t.j., određeni broj imunih ćelija približno isti kao kod glodara divljeg tipa), ima približno isti nivo IL-4 proteina u serumu, i izražava približno istu količinu IL-4Rα proteina na imune ćelije, kao glodar divljeg tipa, koji je glodar koji izražava funkcionalni, endogeni IL-4 protein i IL-4Rα protein i ne izražava humani ili humanizovani IL-4 protein ili IL-4Rα protein.
[0145] Kod određenih varijantnih rešenja, dvostruko humanizovani glodar ispoljava funkcionalnu IL-4 signalnu putanju. Pod "funkcionalna IL-4 signalna putanja" misli se na humani ili humanizovani IL-4 protein, i humani ili humanizovani IL-4Rα protein, su izraženi kod dvostruko humanizovanog glodara i međusobno reaguju jedan sa drugim u dvostruko humanizovanom glodaru tako da delotvorno posreduje kod prenosa signala nizvodno i izvodi biološke aktivnosti normalne IL-4 signalne putanje. Biološke aktivnosti normalne IL-4 signalne putanje su opisane ovde gore u tekstu i ilustrovane na Slici 1, uključujući one koje su posredovane putem receptora tipa I kao što je inicijacija i održavanje diferencijacije, promena klase u IgE i IgG4, i onih posredovanih signaliziranjem receptora tipa II kao što je hiperplazija peharaste ćelije, sub-epitelna fibroza, i preoblikovanje tkiva. Na primer, funkcionalna IL-4 signalna putanja kod dvostruko humanizovanog glodara je odražena upalnim fenotipom naznačenim putem, npr., povećan IgE u cirkulaciji, upala disajnih puteva i/ili ezofilnih infiltrirajućih ćelija kao odgovor na test na grinje iz kućne prašine, čiji je fenotip takođe primećen kod glodara divljeg tipa bez dvostruke humanizacije.
Postupak pravljenja genetski modifikovane nehumane životinje
[0146] Genetski modifikovanu nehumanu životinju kao što je glodar moguće je napraviti korišćenjem postupaka poznatih u ovoj oblasti. Na primer, ciljajući vektor je moguće napraviti da sadrži humanu nukleinsku kiselinu (kao što je humani IL-4 ili IL-4Rα gen, u celini ili delimično), priruban ne-humanim životinjskim homolognim uzvodnim i nizvodnim regionima. Ciljajući konstrukt može takođe da sadrži kasetu selekcije leka (npr. higro kasetu selekcije, koju je moguće naknadno ukloniti preaznim Cre vektorom ekspresije), koji je pozicioniran na 3’ na humanu nukleinsku kiselinu. Ciljajući vektor moguće je uvesti u genom ne-humane životinje, npr., embrionsku matičnu ćeliju (ES) ćelija (kao što je mišja ES ćelija) elektroporacijom, na primer. Pravilno ciljani klonovi ES ćelije mogu zatim biti uvedeni u embrion ranog stadijuma (npr., 8 ćelijski embrion mišje faze. Ne-humane životinje su potpuno izvedene iz pravilno ciljaniih ES ćelija su identifikovane na osnovu, na primer, analize alela. Jer su ne-humane životinje gde nisu dostupne gotove modifikaciono sposobne ES ćelije, druge postupke moguće je koristiti da se napravi nehumana životinj koja obuhvata ovd eopisane genetske modifikacije. Takvi postupci obuhvataju, npr., modifikovanje ne-ES ćelije (npr. fibroblast ili indukovana pluripotentna ćelja) i korišćenje nuklearnog prenosa modifikovanog genoma na pogodnu ćeliju, npr., oocit, i gestaciju modifikovane ćelije (nprr., modifikovani oocit) kod ne-humane životinje pod odgovarajući uslovima ne embriona
Postupak pravljenja genetski modifikovane nehumane životinje
[0147] U jednom varijantnom rešenju, genetski modifikovan IL-4 i/ili IL-4Rα ovde opisane nehumane životinje se koriste za evaluaciju farmakodinamičkih karakteristika (PD) i terapijske ef kasnosti IL-4 i/ili IL-4Rα antagonista koji znaju za svakog čoveka, npr., neutralizovanje anti-IL-4 i/ili anti- IL-4Rα antitela (npr. dupilumab) kod različitih modela bolesti, kako se dalje razvija, kako je ilustrovano na primerima dole.
[0148] Kod nekih varijantnih rešenja, ovaj pronalazak obezbeđuje postupak pretraživanja za utvrđivanje postojanja za humane specifičnih IL-4 ili IL-4Rα antagonista korišćenjem dvostruko humanizovanih IL-4 i IL-4Rα miševa opisanih ovde.
[0149] Pod "IL-4 ili IL-4Rα antagonistima" misli se na molekule (npr. antitela) koja blokiraju, potiskuju ili suzbijaju jednu ili više bioloških funkcija posredovanh IL-4 ili IL-4Rα. "IL-4 ili IL-4Rα antagonisti specifični za ljude" se odnose na antagoniste koji su specifični za humani IL-4 ili IL-4Rα, i pretežno ne deluju na glodarski IL-4 ili IL-4Rα.
[0150] Kod specifičnih varijantnih rešenja, postupak skrining koristi dvostruko humanizovanog miša koji ispoljava humani IL-4 protein, i humanizovani IL-4Rα protein, pri čemu humanizovani IL-4Rα protein obuhvata ektodomen humanog IL-4Rα proteina, povezan na transmembranski domen i citoplazmni domen endogenog mišjeg IL-4Rα proteina, i pri čemu taj miš ne izražava mišji IL-4 ili mišji IL-4Rα.
[0151] Kod nekih varijantnih rešenja, postupak skrininga za IL-4 or IL-4Rα antagonist specifičan za ljude obuvhata primenu agensa na genetski modifikovanog glodara koji je dvostruko humanizovan za IL-4 i IL-4Rα kako je ovde opisano, određivanje dejstva agensa na biološkom funkcijom posredovanu IL-4/IL-4Rα signalnu putanju, i identifikovanje agensa kao IL-4 ili IL-4Rα antagonista specifičnog za ljude ako antagonizuje funkciju posredovanu IL-4/IL-4Rα signalnom putanjom kod genetski modifikovanog glodara.
[0152] U jednom varijantnom rešenju, agens obuhvata varijabilni domen imunoglobulina koji vezuje IL-4 ili IL-4Rα. Kod jednog varijantnog rešenja, agens specifično vezuje humani IL-4 ili IL-4Rα, ali ne i glodarski IL-4 ili IL-4Rα. U jednom varijantnom rešenju, taj agens je antitelo. U specifičnom varijantnom rešenju, agens je antitelo koje specifično veže humani IL-4Rα, ali ne i glodarski IL-4Rα.
[0153] U jednom varijantnom rešenju, postupak pretraživanja za utvrđivanje postojanja koristi dvostruko humanizovanog miša koji izražava humani IL-4Rα protein, pri čemu humanizovani IL-4Rα protein obuhvata ektodomen humanog IL-4Rα proteina, povezanog na transmembranski domen i citoplazmni domen endogenog mišjeg IL-4Rα proteina, i pri čemu taj miš ne izražava mišji IL-4 ili mišji IL-4Rα.
[0154] Kod nekih varijantnih rešenja, postupak pretraživanja za utvrđivanje postojanja obuhvata korake uvođenja dvostruko humanizovanog glodara kako je ovde opisan bolest poveznu sa IL-4/IL-4Rα signaliziranjem, primenom agensa na pacovu, određivanja da li agens poboljšava bolest, i identifikovanja agensa kao za čoveka specifičnog IL-4 ili IL-4Rα antagonista pogodnog za lečenje bolesti ako agens poboljšava tu bolest.
[0155] Pod "bolest povezana sa IL-4/IL-4Rα signaliziranjem" misli se na bolest kod koje je implicirana biološka funkcija posredovana pomoću IL-4/IL-4Rα signaliziranja. Primeri bolesti povezanih sa IL-4/IL-4Rα signaliziranjem obuhvataju, npr., upalne bolesti ili poremećaje, kao što je astma, atopični dermatitis, hronična opstruktivna bolest pluća (COPD) (što može kao rezultat imati barem delimično i dim cigarete), upalnu olest creva, multipla sklerozu, artritis, alergijski rinitis, eozinofilni ezofagitis i psorijazu. Astma može da bu eozinofilna ili neeozinofilna astma, i na steroide osetljiva ili na steroide otporna astma.
[0156] Kod nekih varijantnih rešenja, bolest povezana sa IL-4/IL-4Rα signaliziranjem je informacija o disajnom putu, koju je moguće indukovati kod glodara intranazalnom primenom alergena (npr., ekstrakt grinje iz kućne prašine) u jednoj ili više doza tokom nekog vremenskog perioda. Dejstvo agensa je moguće odrediti merenjem da li je nivo upale disajnih puteva (ogleda se npr., u akumulaciiji sluzi, eozinofilnih infiltrirajućih ćelija u bronhoalveolarnom lavatu, nivoi ukupno cirkulišućeg IgE, i/ili promene u profilu ekspresije koje je mogućeanalizom ekspresije mikroniza) je smanjen kao rezultat primene agensa. Alergen korišćen za indukovanje upale disajnih puteva i agens koji se terstira mogu da budu primenjeni istovremeno ili u različitim vremenskim periodima. Kod nekih varijantnih rešenja, alergen je dat glodaru u jednoj ili više doza, i taj agens se testira i primenjuje glodaru posle barem jedne doze tog alergena koja je data glodaru.
[0157] Kod nekih varijantnih rešenja, bolest povezana sa IL-4/IL-4Rα signaliziranjem je upala kože ili atopični dermatitis, koji je moguće indukovati kod glodara stvaranjem povrede kože i izlaganjem povređene kože alergenu (npr., ekstraktu bakterijskog toksina ili ekstraktu grinje kućne prašine) u jednoj ili više doza tokom izvesnog perioda vremena. Dejstvo agensa je moguće odrediti merenjem da li je upala kože smanjena kao rezultat primene tog agensa.
[0158] U daljem varijantnom rešenju, trostruko humanizovane nehumane životinje, t.j., nehumane životinje čije IL-4, IL-4Rα, i IL- 33 gena se koriste da procene farmakodinamička svojstva (PD) i terapijsku efikasnost kandidata jedinjenja kao što su, npr., IL-4 i/ili IL-4Rα antagonisti specifični za ljude, i IL-33 antagonisti specifični za ljude.
[0159] Pod " IL-33 antagonistima" misli se na molekule (npr. antitela) koja blokiraju, potiskuju ili suzbijaju jednu ili više bioloških funkcija ili signaliziranje posredovano pomoću IL-33. "IL-33 antagonisti specifični za ljude" se odnose na antagoniste koji su specifični za humani IL-33, i pretežno ne deluju na glodarski IL-33. IL-33 je poznato da se stimuliše prenos signala kroz ST2 i IL-1 RAcP, koji je nestao u prisustvu antagonista, kao što je IL-33 antitelo. Inhibicija IL-33 prenosa signala kroz ST2 i IL-1 RAcP može biti određeno ogledima za IL-33 prenos signala u in vitro ili in vivo ogledu, kao one koje su opisane u US objavu prijave 2014/0271658 A1. Na primer, ogled kao što je onaj koji je opisan u US objavi prijave 2014/0271658 A1 moguće ih je koristiti da se proceni dejstvo antitela na IL-33 na upalu pluća kod životinja senzitiziranih na alergen koje su homozigotne za ekspresiju humanog IL-33. IL-33 antitelo koje je delotvnorno kao IL-33 antagonist treba da pokaže trend prema smanjenju u ćelijama upale u plućima, kao trend prema smanjenju u citokinima kao što je IL-4 i IL-5.
[0160] U specifične aspekte, trostruko humanizovana ne-humana životinja se koristi ovde da se proceni da se procene jedinjenja kandidata, pri čemu trostruko humanizovana životinja jeste trostruko humanizovan miš koji izražava humani IL-4 protein, humanizovan IL-4Rα protein koji obuhvata ektodomen humanog IL-4Rα protein spojen na transmembranske domene i citoplazmne domene mišjeg IL-4Rα proteina, i humanog IL-33 proteina, pr čemu miš ne izražava mišji IL-4, mišji IL-4Rα ili mišji IL-33.
[0161] U nekim varijantnim rešenjima, trostruko humanizovana ne-humana životinja se koristi da se procene farmakodina-mičke karakteristike (PD) i terapijska efikasnost jedinjenja kandidata, kao što je, npr., IL-4 i/ili IL-4Rα antagonist specifičan za čoveka, ili IL-33 antagonist specifičan za čoveka. Na primer, IL-4 antitelo specifično za ljude, IL-4Rα antitelo specifično za ljude, i IL-33 antitelo specifično za ljudebody, moguće je ispitati individualno u trostruko humanizovanoj životinji (kao što je glodar, npr., miš ili pacov), i njihovi PD profili i terapijske efikasnosti moguće je proceniti i uporediti.
[0162] Kod drugih varijantih rešenja, trostruko humanizovana ne-humana životinja se koristi za procenu efikasnosti kombinacije jedinjenja, npr., kombinacija IL-4 i/ili IL-4Rα antagonističkog antitela specifičnog za ljude, sa IL- 33 antagonističkim antitelom specifičnim za ljude, u poređenju sa efikasnošću jedinjenja kada se koriste pojedinačno da se odredi, na primer, da li kombinacija jedinjenja ispoljava sinergističko terapijsko dejstvo. Kod specifičnih varijantnih rešenja, kombinacija IL-4 antitela specifičnog za ljude i IL-33 antitela specifičnog za ljude se testira na trostruko humanizovanoj ne-humanoj životinji. Kod drugih specifičnih varijantnih rešenja, kombinacija IL-4Rα antitela specifičnog za ljude i IL-33 antitela specifičnog za ljude se testira na trostruko humanizovanoj ne-humanoj životinji.
[0163] Da bi se procenilo jedinjenje kandidat ili kombinacija jedinjenja, bolest povezana sa IL-4/IL-4Rα signaliziranjem i IL-33 signaliziranje moguće je indukovati kod trostruko humanizovane životinje. Primeri bolesti pvoezanih sa IL-4/IL-4Rα signaliziranjem i IL-33 signaliziranjem obuhvataju, npr., bolesti ili poremećaje povezane za upale, kao što je astma, atopični dermatitis, hronična opstruktivna bolest pluća (COPD) (koja može nastati barem delimično iz dima cigarete), upalna bolest creva, multipla skleroza, artritis, alergijski rinitis, eozinofilni ezofagitis i psorijaza. Astma može da bude eozinofilna ili ne-eozinofilna astma, i na steroide osetljiva ili na steroide otporna astma. Dejstvo jedinjenja ili kombinacije jedinjenja moguće je proceniti slično IL-4/IL-4Rα dvostruko humanizovanoj životinji kako je opisano ovde gore u tekstu.
[0164] Ovaj pronalazak se još ilustruje sledećim, neograničavjaućim primerima.
Primer 1
Zamena endogenog mišjeg IL-4 gena humanim IL-4 genom
[0165] 8.8 kb humani IL-4 gen obuhvata kodirajući deo eksona 1 počevši od ATG kodona inicijacije sve do eksona 4 (uključujući 3’ netranslatirani region) i deo 3’ regiona nizvodno od eksona 4 humanog IL-4 gena su zamenili 6,3 kb mišjeg IL-4 genskog lokusa koji se prostire u rasponu kodirajućeg dela eksona 1 počevši od ATG kodona inicijacije sve do eksona 4 (uključujući 3’ netranslatirani region) i deo 3’ regiona nizvodno od eksona 4. Videti Sliku 2A.
[0166] Ciljajući konstrukt za zamenu mišjeg sa humanim IL-4 genom u jednom ciljajućem koraku je konstruisan korišćenjem VelociGene® tehnologije genetskog inženjeringa (videti Valenzuela i saradnici (2003) High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis (Visokopropusni inženjering mišjeg genoma spojen sa analizom ekspresije u visokoj rezoluciji), Nature Biotech, 21(6):652-659). Mišji i humani IL-4 DNK su dobijeni iz klonova bakterijskog veštačkog hromozoma (BAC) bMQ-41A12 i RP11-17K19, prema opisanom redosledu. Ukratko, SbfI linearizovani ciljajući konstrukt je generisan pomoću kloniranja za popravku praznine koje obuhvata mišje IL-4 uzvodne i nizvodne homologne krake bočne 8,8 kb humanoj IL-4 sekvenci koja se proteže od ATG kodona u eksonu 1 sve do eksona 4 (uključujući 3’ netranslatirani region) i deo 3’ regiona nizvodno od eksona 4 (genomske koordinate: GRCh37: chr5:132,009,743-132,018,576 (+ lanac)) i higro kasetu izbora u sendviču, je elektroporisana u F1H4 mišji embrionske matične (ES) ćelije (C57BL/6 x 129 F1 hibrid).
[0167] Pravilno ciljane ES ćelije (MAID 879) su dalje elektroporisane sa tranzijentnim vektorom Cre-ekspresije da se ukloni kaseta selekcije leka. Ciljani klonovi ES ćelije bez kasete leka (Ciljana ES ćelija se klonira bez kasete leka) (MAID 1553) su uvedene u 8. stadijum ćelije SW mišjeg embriona postupkom VelociMouse® (videti, U.S. Pat. Br.7,294,754, 7,576,259, 7,659,442, i Poueymirou i saradnici (2007) F0 generacija miševa koji su u suštini potpuno izvedeni iz donatorskih genom ciljanih ES ćelija omogućava neposredne fenotipne analize, Nature Biotech.
25(1):91-99). VelociMice® (F0 miševi potpuno izvednei iz donatorske ES ćelije) koji nose humanizovan IL-4 gen su identifikovani genotipovanjem za gubitak mišjeg alela i sticanje humanog alela korišćenjem modifikacije ogleda alela (videti, Valenzuela i saradnici, (2003)).
[0168] Pravilno ciljani klonovi ES ćelije su identifikovani ogledom gubitka nativnog alela (LONA) (Valenzuela i saradnici 2003) u kom je broj kopija nativan, nemodifkovan IL-4 gen su određeni pomoću dve TaqMan™ kvantitativne polimerazne lančane reakcije (qPCRs) specifične za sekvence u mišjem IL-4 genu koje su ciljane za brisanje. qPCR ogledi su sadržali sledeće komplete ogledne komplete početnice (prajmer) (upisano 5’ do 3’): uzvodna početnica prema napred, CATGCACGGAGATGGATGTG (SEK ID BR:1); uzvodna reverzna početnica, GACCCCTCAG GTCCACTTAC C (SEK ID BR:2); uzvodna sonda, FAM-AACGTCCTCA CAGCAACGA-MGB (SEK ID BR:3); nizvodna početnica prema napred, GTGCCCAGGT GT- GCTCATG (SEK ID BR:4); nizvodna reverzna početnica, CGCCTGCCTC CTCACTTTAT C (SEK ID BR:5); nizvodna sonda, FAM-ATCTGCTTCA CCATCCACT-MGB (SEK ID BR:6); u kojoj se FAM odnosi na 5-karboksifluorescein fluorescentnu sondu i BHQ se odnosi na uređaj za fluorescentno hlađenje koji pripada tipu uređaja za hlađenje crne rupe (Biosearch Technologies). DNK prečišćena iz klonova ES ćelije koji su uzeti na ciljajući vektor i ugrađeni u njihove genome je kombinovan sa glavnom mešavinom za ekspresiju gena TaqMan™ Gene Expression Master Mix (Life Technologies) prema predlozima proizvođača u ploči za PCR sa 384 preGrade (MicroAmp™ Optical 384-Well Reaction Plate, Life Technologies) i cikliran u prizmi kompanije Applied Biosystems Prism 7900HT, koja prikuplja podatke o fluorescenciji tokom PCR analiza i određuje prag ciklusa (Ct), frakcioni PCR ciklus pri kom akumulirana fluorescencija dostiže unapred postavljen prag vrednosti. Za IL-4 specifične qPCR analize uzvodnog i nizvodnog toka i dve qPCR (kvantitative polimerazne lančane reakcije) za neciljane referentne gene su izvršene za svaki DNK uzorak. Razlike u Ct vrednostima (ΔCt) između svake IL-4-specifične qPCR i svake referentne qPCR gena su izračunate, i onda je razlika između svakog ΔCt i srednjeg ΔCt za sve oglede izračunata da bi se dobile ΔΔCt vrednosti za svaki uzorak. Broj kopija IL-4 gena u svakom uzorku je izračunat iz sledeće formule: broj kopija=2x2-<ΔΔCt>. Pravilno ciljan klon, koji je izgubio jednu od svojih nativnih kopija, će imati za IL-4 gen broj kopija jednako jedna. Potvrda da je sekvenca humanog IL-4 gena zamenjena brisanom sekvencom mišjeg IL-4 gena u humanizovanom alelu je potvrđena pomoću TaqMan™ qPCR ogleda koji obuhvata sledeće komplete početnica-sonda (ispisano 5’ do 3’): humana početnica prema napred, GCCTGGACCA AGACTCTGT (SEK ID BR:7); humana reverzna početnica, ACCGTGGGAC GGCTTCTTAC (SEK ID BR:8); humana uzvodna početnica, FAM-CACCGAGTTG ACCGTAACAG ACATC-BHQ (SEK ID BR:9). Potvrda da je higro kaseta izbora umetnuta sa sekvencom humanog IL-4 gena u humanizovanom alelu je potvrđena pomoću TaqMan™ qPCR ogleda koji obuhvata sledeće komplete početnica-sonda (ispisano 5’ do 3’): higro početnica prema napred, TGCGGCCGAT CTTAGCC (SEK ID BR:10); higro reverzna početnica, TTGACCGATT CCTTGCGG (SEK ID BR:11); higro sonda, FAM-ACGAGCGGGT TCGGCCCATT C-BHQ (SEK ID BR:12).
[0169] Isti LONA ogled je korišćen da se ispita DNK prečišćena iz biopsija repova za miševe izvedene iz ciljanih ES ćelije da se odrede njihovi IL-4genotipovi i potvrdi da je humanizovani IL-4 alel je prenet kroz klicinu liniju. Dva heterozigna mladunca za zamenu su uzgajana da generišu miša koji je homozigotan za zamenu endogenog mišjeg IL-4 gena humanim IL-4 genom. Mladunci koji su homozigotni za zamenu su korišćeni za fenotipovanje.
[0170] Uzvodni spoj mišjeg IL-4 lokusa i sekvence koja obuvhata humani IL-4 gen je projektovan da bude unutar 5’-TGCTGATTGG CCCAGAATAA CTGACAATCT GGTGTAATAA AATTTTCCAA TGTAAACTCA TTTTC- CCTTG GTTTCAGCAA CTTTAACTCT ATATATAGAG AGACCTCTGC CAGCATTGCA TTGTTAGCAT CTCTTGATAA ACTTAATTGT CTCTCGTCAC TGACGGCACA GAGCTATTG(A TGGGTCTCAC CTCCCAACTG CTTCCCCCTC TGT- TCTTCCT GCTAGCATGT GCCGGCAACT TTGTCCACGG ACACAAGTGC GATATCACCT TACAGGAGAT CAT- CAAAACT TTGAACAGCC TCACAGAGCA GAAG)GTGAGT ACCTATCTGG CACCATCTCT CCAGATGTTC TGGT-GATGCT CTCAGTATTT CTAGGCATGA AAACGTTAAC AGCTGCTAGA GAAGTTGGAA CTGGTGGTTG GTGGCAGTCC AGGGCACACA GCGAGGCTTC TCCCCTGC
(SEK ID BR:13), pri čemu su humane IL-4 sekvence kurzivirane i IL-4 kodirajuće sekvence su u zagradama. Nizvodni spoj sekvence koja obuhvata humani IL-4 gen i kasete izbora higro u sendviču je pojektovan da bude unutar 5’-TGTTTATTTT GCAG(AATTCC TGTCCT- GTGA AGGAAGCCAA CCAGAGTACG TTGGAAAACT TCTTGGAAAG GCTAAAGACG ATCATGAGAG AGAAATAT-TC AAAGTGTTCG AGCTGA)ATAT TTTAATTTAT GAGTTTTTGA TAGCTTTATT TTTTAAGTAT TTATATATTT ATAACTCATC ATAAAATAAA GTATATATAG AATCTAACAG CAATGGCATT TAATGTATTG GCTATGTTTA CTT- GACAAAT GAAATTATGG TTTGCAACTT TTAGGGAAAT CAATTTAGTT TACCAAGAGA CTATAAATGC TAT- GGGAGCA AAACAGGAAA GACCACTTCC CCCTCGAGGG GTTCCCTCTC GAGTTAGGGA CATAACACAC AAGA- TAATTA AAGAACACAA GGCCATACAA GATGCGGCCG CACCGGTATA ACTTCGTATA AGGTATCCTA TAC-GAAGTTA TATGCATGGC CTCCGCGCCG GGTTTTGGCG CCTCCCGCGG GCGCCCCCCT CCTCACGGCG AGCGCTGCCA CGTCAGACGA AGGGCGCAGC GAGCGTCCTG ATCCT (SEK ID BR:14), pri čemu su humane IL-4 sekvence kurzivirane i IL-4 kodirajuće sekvence su u zagradama. Nizvodni spoj sekvence kasete izbora higro u sendviču i mišjeg IL-4 lokusa je projektovan da bude unutar 5’-TGCCAAGTTC TAATTCCAT- CAGACCTCGAC CTGCAGCCGG CGCGCCATAA CTTCGTATAA GGTATCCTAT ACGAAGTTAT CTCGAGAGGA GTTCCCACCC TTCTCAAGAG CATAATGCGC AGATCATTAA GGGACAGATG CAGGCTGGGG AGACGGTTCA GCAGTTAGGA GTACCTGTTG CTCTTCCAGA GGACCCAGGT TCAATTCCCG GCACTCACAT AGCAGCTTAA AACAATAACT CAAGTTCTGG GGGAGCTGAT GCTCTCCTCT GGCCTCCTGT GGAGGTACAC AGACCACATG CCTGTAGGCA AGACACCCAC ACACATAAAA ACAAAATAAA ATAAGGATAG AAAGGCCAGG GGGATGAATC CA- GAGGTAGA AGAAAACTTA TTCCCTGGAA TTGTCCTCTG ACTCCCCTCC CAAAACCTCT AACACGCAT (SEK ID BR:15), pri čemu su sekvence kasete higro kurzivirane.
Primer 2
Zamena endogene mišje IL-4Rα sekvence gena ektodomena sa humanom IL-4Rα sekvencom gena ektodomena
[0171] 15,6 kb humanog IL-4Rα gena koji sadrži ekson 1 počevši od ATG kodona inicijacije sve do eksona 5 i deo introna 5 humanog IL-4Rα gena je zamenilo 7,1 kb mišjeg IL-4Rα genskog lokusa koji se prostire u rasponu kodirajućeg eksona 1 počevši od ATG kodona inicijacije sve do eksona 5 i dela introna 5. Mišji eksoni 6 do 9 su zadržani; samo eksoni 1 do 5 (t.j., ektodomen) su humanizovani. Videti Sliku 2B.
[0172] Ciljajući konstrukt za zamenu mišjeg sa humanim IL-4Rα genom u jednom ciljajućem koraku je konstruisan korišćenjem VelociGene® tehnologije genetičkog inženjeringa (videti Valenzuela i saradnici (2003) High-throughput - of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis (Visokopropusni inženjering mišjeg genoma spojen sa analizom ekspresije u visokoj rezoluciji), Nature Biotech, 21(6):652-659). Mišji i humani IL-4Rα DNK su dobijeni iz klonova bakterijskog veštačkog hromozoma (BAC) klonovi RP23-136G14 i RP11-166E24, prema opisanom redosledu. Ukratko, NotI linearizovan ciljajući konstrukt je generisan kloniranjem za popravku praznine koje obuhvata uzvodne i nizvodne homologne krake mišjeg IL-4Rα gena prirubne 15,6 kb humanoj IL-4Rα sekvenci koja se pruža od ATG kodona u eksonu 1 sve do eksona 5 i deo introna 5 (genomske koordinate: GRCh37: chr16: 27,351,525-27,367,111 (+ lanac)) i neo kaseta izbora u sendviču, je elektroporisan u F1H4 mišje embrionske matične (ES) ćelije (C57BL/6 x 129 F1 hibrid). Pravilno ciljane ES ćelije (MAID 803) su dalje elektroporisane sa tranzijentnim vektorom Cre-ekspresije da se ukloni kaseta selekcije leka. Ciljani klonovi ES ćelije bez kasete leka (MAID 1444) su uvedeni u SW mišji embrion u stadijumu od 8 ćelija VelociMouse® postupkom (videti, U.S. Pat. Br. 7,294,754, 7,576,259, 7,659,442, i Poueymirou i saradnici (2007) F0 generacija miševa koji su u suštini potpuno izvedeni iz donatorskih genom ciljanih ES ćelija omogućava neposredne fenotipne analize, Nature Biotech. 25(1):91-99). VelociMice® (F0 miševi potpuno izvedeni iz donatorske ES ćelije) koji nose humanizovan IL-4Rα gen su identifikovani genotipovanjem za gubitak mišjeg alela i sticanje humanog alela korišćenjem modifikacije ogleda alela (videti, Valenzuela i saradnici, (2003)).
[0173] Pravilno ciljani klonovi ES ćelije su identifikovani ogledom gubitka nativnog alela (LONA) (Valenzuela i saradnici 2003) u kom je broj kopija nativanog, nemodifkovanog IL-4Rα gena određen pomoću dve TaqMan™ kvantitativne polimerazne lančane reakcije (qPCRs) specifične za sekvence u mišjem IL-4Rα genu koje su ciljane za brisanje. qPCR ogledi su sadržali sledeće ogledne komplete početnice (prajmer) (upisano 5’ do 3’): uzvodna početnica prema napred, CCGCTGGCAT GTGTATTGTG (SEK ID BR:16); uzvodna reverzna početnica, TGAGTGTGGG ACCCTCAAGA G (SEK ID BR:17); uzvodna sonda, FAM-TGACCCAAGC CCTACATGGC CACT-BHQ (SEK ID BR:18); nizvodna početnica prema napred, TGAG- GAGAGC TCACGGGAAT C (SEK ID BR:19); nizvodna reverzna početnica, ACCCATCTCC TGCGTTTCTG (SEK ID BR:20); nizvodna sonda, FAM-TTGACACGCC AGCTACACTG CTCCA-BHQ (SEK ID BR:21); kod koje se FAM odnosi na 5-karboksifluorescein fluorescentnu sondu i BHQ se odnosi na uređaj za fluorescentno hlađenje tipa uređaja za hlađenje sa crnom rupom (Biosearch Technologies). DNK prečišćena iz klonova ES ćelije koji su uzeti na ciljajući vektor i ugrađeni u njihove genome je kombinovan sa glavnom mešavinom za ekspresiju gena TaqMan™ Gene Expression Master Mix (Life Technologies) prema predlozima proizvođača u ploči za PCR sa 384 preGrade (MicroAmp™ Optical 384-Well Reaction Plate, Life Technologies) i cikliran u prizmi kompanije Applied Biosystems Prism 7900HT, koja prikuplja podatke o fluorescenciji tokom PCR analiza i određuje prag ciklusa (Ct), frakcioni PCR ciklus pri kom akumulirana fluorescencija dostiže unapred postavljen prag vrednosti. Uzvodne i nizvodne za IL-4Rα-specifične qPCR reakcije i dve qPCR reakcije za neciljane referentne gene su urađene za svaki DNK uzorak. Razlike u Ct vrednostima (ΔCt) između svake IL-4Rα-specifične qPCR i svake referentne qPCR gena su izračunate, i onda je razlika između svakog ΔCt i srednjeg ΔCt za sve oglede izračunata da bi se dobile ΔΔCt vrednosti za svaki uzorak. Broj kopija IL-4Rα gena u svakom uzorku je izračunat iz sledeće formule: broj kopija=2x2-<ΔΔCt>. Pravilno ciljan klon, pošto je izgubio jednu od svojih nativnih kopija, će imati broj kopija IL-4Rα gena jednak jednoj. Potvrda da je humana IL-4Rα sekvenca gena zamenjena brisanom mišjom IL-4Rα sekvencom gena u humanizovanom alelu je potvrđena ogledom TaqMan™ qPCR kojii obuhvata sledeće početnica-sonda komplete (pisane 5’ do 3’): humana početnica prema napred, ACCTGCGTCT CCGACTACAT G (SEK ID BR:22); humani reverzni prajmer, GAGCTCGGTG CTGCAATTG (SEQ ID NO:23); humana sonda, FAM-TGGGAC- CATT CATCTTCCAC TCGCA-BHQ (SEK ID BR:24). Potvrda da je neo kaseta selekcije bila umetnuta sa humanim IL-4Rα sekvencom gena u humanizovnaom alelu je potvrđena pomoću TaqMan™ qPCR ogleda koji obuhvata sledeće komplete početnica-sonda (upisano 5’ do 3’): neo napredna početnica, GGTGGAGAGG CTATTCGGC (SEK ID BR:25); neo reverzna početnica, GAACACGGCG GCATCAG (SEK ID BR:26); neo sonda, FAM-TGGGCACAAC AGACAATCGG CTG-BHQ (SEK ID BR:27).
[0174] Isti LONA ogled je korišćen da se ispita DNK prečišćena iz biopsija repova za miševe izvedene iz ciljanih ES ćelije da se odrede njihovi IL-4Rα genotipovi i potvrdi da je humanizovani IL-4Rα alel je prenet kroz klicinu liniju. Dva heterozigna mladunca za zamenu su uzgajana da se dobije miš koji je homozigotan za zamenu endogenog mišjeg IL-4Rα gena humanim IL-4Rα genom. Mladunci koji su homozigotni za zamenu su korišćeni za fenotipovanje.
[0175] Uzvodni spoj mišje IL-4Rα lokusa i sekvence koja obuhvata humani IL-4Rα gen je projektovan da bude unutar 5’-TGGGGGAGGG AGGCCATGAC ACAAATGAAA TGGACCCCGC TGACCCAGGA TCAG- CATCTG CCCACTCTTC TTTCTGCAGG CACCTTTTGT GTCCCCA(ATG GGGTGGCTTT GCTCTGGGCT CCTGT- TCCCT GTGAGCTGCC TGGTCCTGCT GCAGGTGGCA AGCTCTG)GTA AGTCACCACT TCTCAATCAT TCATTT-GTTG GCTATTAATG GCGTGCCAGG GTCCTGCAGT ATGTCACCTG GCC (SEK ID BR:28), pri čemu su humane IL- 4Rα sekvence italizirane i IL-4Rα sekvence kodiranja su podvučene. Nizvodni spoj sekvence koja obuhvata humani IL-4Rα gen i neo kaseta izbora u sendviču je projektovana da bude unutar 5’-GTCAGATCGT GGAGGGTCTC GGACGAGGG TCCTGACCCT GGGTCTCCAG TCCTGGGAAG TGGAGCCCAG GCTGTACCAT GGCTGACCTC AGCTCATGGC
Tcccgggctc gataactata acggtcctaa ggtagcgact cgagataact tcgtataatg tatgctatac gaagt- tatat gcatggcctc cgcgccgggt tttggcgcct cccgcgggcg cccccctcct cacggcgagc gctg (SEK ID BR:29), pri čemu su humane IL-4Rα sekvence kurzivne i sekvence kasete su napisane malim slovima. Nizvodni spoj sekvence kasete izbora neo u sendviču i mišjeg IL-4Rα lokusa je projektovan da bude unutar 5’- tattgttttg ccaagttcta attccatcag acctcgacct gcagccccta gataacttcg tataatgtat gctatacgaa gttatcctag gttggagctc TCTGTAGCCA GGTAACCAAG GGTC- CCAGGG GAACCCCCAG TGTGGACGCG GACTGCACAT GACACAGGGC GGCCTCCCCA TTCATGACTG TTTT-TCTCCT TGCAG(ACTTC CAGCTGCCCC TGATACAGCG CCTTCCACTG GGGGTCACCA TCTCCTGCCT CTGCATCCCG TTGTTTTGCC TGTTCTGTTA CTTCAGCATT ACCAA)GTGAG TTCCTGCTTT GGCTGGTGTC TCT- GGCTGGC CCTTCAGCAG TGCTCTCAGA GGTCACAGTC ATTGTGCTGG CTGAGAAAAG (SEK ID BR:30), pri čemu su mišje IL-4Rα kodirajuće sekvence u zagradama, i sekvence neo kasete su napisane malim slovima.
Primer 3
Proizvodnja dvostruko humanizovanih IL-4/IL-4Rα miševa
[0176] Dvostruko humanizovani IL-4/IL-4Ra (Il4hu/hu/Il4rahu/hu) miševi su generisani kao u nastavku. Klon ES ćelije MAID 803, obuhvata humanizovani IL-4Rα gen i neo kasetu u sendviču, je elektroporisan sa vektorom Cre ekspresije da se ukloni neo kaseta u sendviču da se generiše klon ES ćelije MAID 1444, koji obuhvata humanizovani IL-4Rα gen bez kasete izbora leka (videti Primer 2). Isti ciljajući konstrukt koji je korišćen da bi se generisao klon ES ćelije MAID 879, obuhvata humanizovani IL-4 gen i higro kasetu u sendviču (videti Primer 1), je elektroporisan u klon ES ćelije MAID 1444 da bi se generisale 879 Het/1444 Het (Il4+/hu/Il4ra+/hu) ES ćelije, koje su naknadno elektroporisane sa vektorom Cre ekspresije da bi se uklonila higro kaseta u sendviču da bi se generisao klon ES ćelije (MAID 1553/1444) koji obuhvata humanizovane IL-4 i IL-4Rα gene. Klon ES ćelije MAID 1553/1444 bez kasete leka je uveden u 8 stadijum ćelije SW mišjeg embriona da bi se generisali dvostruko humanizovani IL-4/IL-4Rα miševi.
Primer 4
Procena efikanosti Dupilumaba, potpuno humanih IL-4Rα mAb, kod miševa sa humanim IL-4 i IL4Rα zamenama gena
Postupci
[0177] Genetski projektovani miševi su kreirani korišćenjem VelociGene® tehnologije da bi se zamenio kako mišji IL-4 lokus pune dužine sa 8,8 kb humanih IL-4 genomskih sekvenci (videti Primer 1 i Sliku 2A) i vanćelijski domen (t.j., ektodomen) mišjeg IL-4Rα (CD124) gena sa 15,6 kb fragmentom odgovarajuće humane IL-4Rα genomske DNK (videti Primer 2 i Slika 2B).
[0178] Kod miševa sa homozigotnim humanizovanim IL-4Rα genom je validiran u pogledu ekspresije i funkcije humanog gena. Da bi se odredila ekspresija humanog IL-4Rα humanizovanim miševima, splenociti iz divljeg tipa i humanizovanih miševa su prikupljeni i prerađeni za analizu fluorescentnog razvrstavanja aktivirane ćelije (FACS) sa fluorescentno označenim antitelima protiv mišjeg CD3, mišjeg CD19, humanog CD124, i mišjeg CD124. (Videti, npr., Blaeser i saradnici (2003) Ciljana inaktivacija IL-4 receptora lanca I4R motiva pospešuje alergijsku upalu disajnog puta, J Exp Med 198(8):1189-1200).
[0179] Da bi se pokazale specifičnosti liganda i funkcionalnosti receptora, korišćene su primarne ćelije izvedene iz humanizovanih IL- 4Rα miševa. Makrogazi izvedeni iz koštane srži su kultivisani korišćenjem ćelija koštane srži bedrene kosti (femura) iz divljeg tipa i humanizovanih IL-4Rα miševa u DMEM koji sadrži 10% serum goveđeg fetusa i uz to 20% L ćelijom kondicioniran medijum tokom 7 dana.
[0180] Ćelije su zatim lečene pojedinačno sa 20 ng/ml mišjeg IL-4, mišjeg IL-13, humanog IL-4, humanog IL-13, ili pomoćno sredstvo razblaženo u podlozi kulture tokom 20 sati. Učetvorostručeni uzorci iz svakog stanja su prikupljeni za analizu ekspresije gena.
[0181] Ukupna RNK iz ovih uzoraka je ekstrahovana i pojačana u kRNK inkorporiranjem Cy3-CTP. Cy3 označena kRNK iz svakog uzorka je zatim hibridizovana da se prilagodi Agilent nizu koji obuhvata 43,538 60-mer oligonukleotdie koji obuhvataju mišje transkriptome. Podaci su ekstrahovani iz skeniranog niza slika korišćenjem softvera sa karakteristikom prilagodljivog izvlačenja Agilent Feature Extraction Software 9.5.
[0182] Diferencijalno izraženi geni između eksperimentalnih grupa su identifikovani korišćenjem Studentskog t testa (p<0,05, promena nabora ≥1.5). Skup ekspresije ovih gena je generisan korišćenjem Pearsonovog korelacionog algoritma grupisanja iz GeneSpring GX7.3.
[0183] Neutralizovano dejstvo dupilumaba protiv IL-4 je procenjeno korišćenjem in vitro IgE ogleda promene klase sa primarnim B ćelijama izolovanim iz humanizovanih IL-4Rα (Il4rahu/hu) miševa.
[0184] Miševi divljeg tipa (WT) i humanizovani IL-4Rα (Il4rahu/hu) su primili visoku količinu (hidrodinamički) pogonjene isporuke gene rastvora DNK plazmida za ekspresiju mišjeg IL-25 in vivo. (Videti, npr., Liu i saradnici. (1999) Hydrody- namics-based transfection in animals by systemic administration of plasmid DNA (Transfekcija kod životinja zasnovana na hidrodinamici sistemskom primenom DNK plazmida), Gene Therapy 6:1258-1266.) Periferna krv je prikupljena posle 8 dana da se izmere nivoi mišjeg IgE (mIgE) u serumu korišćenjem komercijalnog ELISA kompleta (R & D systems, MN).
[0185] Prečišćene primarne B ćelije iz humanizovanih mišjih splenocita su aktivirane sa bakterijskim LPS i pomešane sa povećanim količinama rekombinantnog humanog IL-4 u kulturi staroj 7 dana da bi se indukovalo prebacivanje klase imunoglobulina. Za eksperiment blokade antitela, prečišćene B ćelije su inkubirane sa povećanjem doza dupilumaba tokom 30 minuta pre dodavanja 0,167 nM rekombinantnog humanog IL-4 i kultivisane su tokom 7 dana. Proizvodnja IgE u odsustvu IL-4 ili sa izotipnim kontrolinim mAb je prikazana na (e) i (n), prema opisanom redosledu. Mišji IgE nivoi u supernatantima kulture su izmereni korišćenjem kompercijalnog ELISA kompleta. (Videti, npr., Moon i saradnici (1989) Regulation of IgG1 and IgE synthesis by interleukin 4 in mouse B cells (Regulacija IgG1 i IgE sinteze interleukinom 4 u mišjim B ćelijama), Scand I Immunol 30:355-361.)
[0186] Interleukin 25 (IL-25) je citokin proizveden pomoću Th2 ćelija čije su glavne aktivnosti posredovane proizvodnjom IL-4 i IL-13 da bi se indukovale patologije specifične za tkivo, kao što je povećana proizvodnja sluzi u plućima i hiperplazija peharaste ćelije. (Videti Fort i saradnici. (2001) IL-25 indukuje IL-4, IL-5, i IL-13 i Th2 povezane patologije in vivo, Immunity 15(6):985-995.)
[0187] Nedostatak IL-13 štiti životinje od IL-25 indukovanih patologija u ciljnom organu. Samim tim, IL-25 pogonjen model upale je korišćen da bi se procenila farmakodinamička svojstva (PD) dupilumaba in vivo kod miševa sa humanizovanim IL-4 i/ili IL-4Rα genima.
[0188] Ti PD odgovori dupilumaba na receptore tipa II su karakteriovani korišćenjem postupka upale indukovane dejstvom IL-25 tako što je mereno nagomilavanje sluzi u plućima u humanizovanim IL-4Rα (Il4rahu/hu) miševima.
[0189] Na dan 0, miševi divljeg tipa (WT) i humanizovani IL-4Rα (Il4rahu/hu) miševi su primili hidrodinamičku isporuku mišjeg vektora IL-25 ekspresije i posle toga je usledilo ubrizgavanje dupilumaba ili izotipna kontrola mAb u naznačenim dozama. Dodatne doze antibiotika su primenjene svakog drugog dana tokom ukupno 4 doze.8. dana, tkiva pluća su prikupljena od eutaniziranih miševa i prerađene sekcije pluća su bojene periodičnom kiselinom acid-Schiff pre nego što su nasumično registrovani za postojanje patoloških promena.
Rezultati
[0190] Humanizovane IL-4Rα miševe karakteriše to da pokazuju: (a) ekspresija humanog IL-4Rα na primarnim ćelijama iz dvostruko humanizovanih IL-4/IL-4Rα (Il4rahu/hu/Il4rahu/hu) miševa (videti Sliku 3); (b) promena specifičnosti IL-4 liganda kod humanizovanih IL-4Rα (Il4rahu/hu) miševa (videti Sliku 4); i (c) funkcionalnost IL-13 putanje kod humanizovanih IL- 4Rα (Il4rahu/hu) miševa (videti Sliku 4).
[0191] Kako je prikazano na Slici 3, na kojoj su obeleženi profili IL-4Rα (CD124) na modifikovanim populacijama B i T ćelije su prikazani i raspodela odgovarajuće neoznačene populacije ćelije je prikazana u osenčenom području, divlji tip i humanizovani IL4Rα (Il4rahu/hu) miševi izražavaju slične količine IL-4Rα proteina na površini B (CD19+, CD3-) i T (CD19-, CD3+) ćelija.
[0192] Kako je prikazano na Slici 4 (leva strana), miševi divljeg tipa (Il4ra+/+) odgovaraju na mišji, ali ne i humani, IL-4, i odgovaraju i na mišji i na humani IL-13. Kako je prikazano na Slici 4 (desna strana), humanizovani IL-4Rα (Il4rahu/hu) miševi dogovaraju na humani, ali ne na mišji, IL-4, i odgovaraju i na mišji i na humani IL-13.
[0193] Ovi podaci pokazuju da IL-4, ali ne IL-13, prikazuje specifičnost za vrste kod miševa divljeg tipa i humanizovanih IL-4Rα (Il4rahu/hu) miševa.
[0194] Kako je prikazano na Slici 5, uloga IL-4 kao glavnog činioca posredovanja prebacivanja IgE klase je podržana nedostatkom povišenih nivoa cirkulišućeg IgE posle isporuke mišjeg IL-25 gena u humanizovane IL-4Rα (Il4rahu/hu) miševe.
[0195] Dupilumab monoklonalno antitelo je ispitivano in vitro i in vivo.
[0196] Kako je prikaznao na Slici 6, dupilumab sprečava humanim IL-4 indukovanu IgE proizvodnju u humanizovanim IL-4Rα (Il4rahu/hu) iz miševa izvedenim primarnim B kulturama ćelija.
[0197] Kako je prikazano na Slici 7, dupilumab doza je zavisno smanjila putem IL-25 indukovane patologije pluća na 10 mg/kg i iznad (25 mg/kg je smanjila patologiju sluzi
Zaključci
[0198] Rezultati pokazuju farmakološku aktivnost dupilumaba, potpuno humanog antihumanog IL-4Rα monoklonskog antitela, na modelu genetski modifikovanog miša sa upalom indukovanom citokinom.
[0199] Generisanje genetski modifikovanih miševa sa humanim IL-4 i/ili IL-4Rα zamenama gena obezbeđuje moćan alat za procenu funkcije ortologa gena i in vivo efikasnost kandidata antitela sa ograničenom reaktivnošću između vrsta.
Primer 5
Ekstraktom grinje kućne prašine (HDM) indukovan model upale pluća
[0200] Hronična upala disajnih putava kod dvostruko humanizovanih IL-4 i IL-R4α miševa je indukovana intranazalnim testiranjem ekstrakta grinje kućne prašine (HDM) (Greer laboratories). Ukratko, miševi su prvo senzitizovani intranazalnim usađivanjem HDM suspenzije (20 ml u koncentraciji od 2,5 mg/ml) tokom 10 dana. Posle dvonedeljnog intervala rezolucije, miševi su ponovo ispitivani intranazalnom HDM primenom 3 puta nedeljno između nedelje 5 i 12. Lečenje dupilumabom (anti- IL4Rα antitelo) je započeto od 7. nedelje u frekvenciji od dvaput nedeljno potkožnih injekcija sve do kraja eksperimenta u nedelji 12. Uzorci tkiva su prikupljeni za dalje analize. Eksperimentalna konstrukcija je prikazana na Slici 8.
Prikazivanje terapijske efikasnosti dupilumaba na modelu upale disajnog puta indukovane sa HDM korišćenjem dvostrukohumanizovanih IL-4 i IL-4Rα miševa
[0201] Bolest disajnih puteva je indukovana kod dvostruko humanizovanih IL-4 i IL-4Rα (IL-4hu/hu/IL-4Rhu/hu) miševa korišćenjem protokola opisanog gore u tekstu. Histološka analiza plućnog tkiva je pokazala da je intranazalno usađivanje grinje kućne prašine (HDM) prouzrokovalo povećanu proizvodnju sluzi u disajnom putu. Lečenje dupilumabom je smanjilo nagomilavanje sluzi u mišu testiranom na grinje kućne prašine. Analiza infiltrirajućih ćelija u bronhoalveolarnom lavatu (BALF) označava da su povećane količine i brojevi eozinofila povećane usađivanjem grinja kućne prašine i da su smanjene tretmanom dupilumaba. Ukupno cirkulišući IgE su podignuti tretiranjem HDM kod humanizovanih miševa, što ukazuje da se radi o kompetentnoj IL-4 signalnoj putanji. Korišćenje dupilumaba je bilo moguće u pogledu smanjenja nivoa IgE. Nasuprot tome, molekul poređenja, IL13R2α-Fc, koji antagonizuje IL-13 samo bez ometanja IL-4 prenosa signala, je imalo uporedive aktivnosti za smanjenje nagomilavanja sluzi i sprečavanje usađivanja eozinofila. Međutim, diferencijalno dejstvo je detektovano u nivou cirkulacije IgE između dupilumaba i IL-13 antagonista, IL13R2α-Fc. Blokada IL-13 putanje sama po sebi nije bila dovoljna da smanji HDM indukovan nivo IgE nivo; pri čemu je dupilumab smanjio proizvodnju IgE, glavni patogeni posrednik alergije blokiranjem i putanje IL-4 i putanje IL-13.
[0202] U odvojenom nizu eksperimenata, bolest disajnog puta je indukovana kod dvostruko humanizovanih IL-4 i IL-4Rα (IL-4hu/hu/IL-4Rhu/hu) miševa korišćenjem istog protokola opisanog gore u tekstu, izuzev što je korišćena drugačije kontrolno sredstvo. Izotipno kontrolno antitelo istog IgG izotipa kao dupilumab je korišćeno u ovim eksperimentima. Eksperimentalna konstrukcija je prikazana na Slici 9. iRNK je pročišćena iz ukupne RNK korišćenjem iDNK kompleta perlica (Life Tech) i za lanac specifične biblioteke RNK sekvenci iz iRNK korišćenjem pripremnog kompleta biblioteke RNK Scriptseq RNA Library Prep kit (Illumina). Biblioteka je sekvencionirana korišćenjem HiSeq 2000 (Illumina) pri dužini čitanja od 33bp i nivoi ekspresije gena su bili ekstrahovani iz sirovih iščitavanja korišćenjem procesa rada RNK sekvence Clcbio (Qiagen) RNA-Seq. Diferencijalno izraženi geni između eksperimentalnih grupa su identifikovani korišćenjem Studentskog t testa (p<0,05, promena nabora ≥1,5). Skup ekspresije ovih gena je generisan korišćenjem Pearsonovog korelacionog algoritma grupisanja iz GeneSpring GX7.3. Utvrđeno je da grinja kućne prašine indukkuje promenu ekspresije pulmonarnog gena u dvostruko humanizovanom IL-4 i IL-4Rα miševima i takva promena je blokirana putem dupilumaba. Uzorci seruma su prikupljeni iz eutaniziranih miševa na kraju perioda lečenja. Nivoi mišjeg IgE seruma su izmereni korišćenjem komercijalnog ELISA kompleta (R & D sistemi). Statistička analiza je izvedena korišćenjem uobičajenog jednosmernog postupka ANOVA.
Primer 6
Model upale kože indukovan antigenom
[0203] Hronična upala kože kod dvostruko humanizovanih Il-4 i Il-4Rα miševa može da bude indukovana sledećim postupkom. Dlake na leđima humanizovanih miševa su obrijane električnim žiletom i zatim su prugasto raspoređene lepljivom trakm da se stvore manje povrede i prekine prepreka koju predstavlja koža. Zavoj od gaze je natopljen rastvorom alergena (kao što je ovalbumin plus bakterijski toksin ili ekstrakt grinje kućne prašine) spojen na kožu tokom nedelju dana posle čega je usledio period rezolucije od dve nedelje. Postupak je ponovljen tri puta za ukupno 7 nedelja da bi se indukovale lezije na koži slične o atopični dermatitisu. Tretirani miševi će imati povećane IgE nivoe, pruritis, zadebljanja epidermisa, uobičajene simptome atopičnog dermatitisa.
Primer 7
Karakterisanje PK profila anti-humanih IL-4Rα antitela kod miševa sa ekspresijom humanizovanog IL-4Rα
[0204] Ovaj primer opisuje eksperimente izvedene da se procene PK profili REGN 668 (humanog monoklonskog antitela usmerene na humani IL-4Rα, takođe poznat kao "dupilumab") i kontrolno antitelo REGN646 (surogat majmuna, anti-mfIL-4R ne vezujuće kontrolno antitelo).
[0205] Miševi korišćeni u ovim eksperimentima su bili MAID 1444 (homozigotni za humanizovan IL-4Rα, ili "IL-4Rα HumIn", u kom je IL-4Rα ektodoman humani i transmembranski region i citoplazmni region su mišji) i podudarni soj (75% C57BL/6/25%129Sv) divljeg tipa ("WT") miševa od 20-23 nedelje. Studijska grupa je obuhvatila ukupno 40 miševa, mužjaka i ženki, sa veličinom kohorte po leku/po dozi 5 homozigota i 5 divljeg tipa podudarnog soja. Antitela (u PBS puferskom sredstvu) su data miševima preko potkožne injekcije na 10 mg/kg. Uzorci krvi su uzeti za analizu na dan injekcije (vremenska tačka "0" ili dan 0), u 6 sati posle injekcije, na dan 1, dan 3, dan 7, dan 10, dan 14, dan 21, i dan 30, prema opisanom redosledu.
[0206] Nivoi cirkulišućeg leka (t.j., REGN668 ili REGN646) su određeni analizom ukupnog humanog antitela korišćenjem ELISA imunoogleda. Ukratko, kozje anti-humano IgG poliklonsko antitelo (Jackson ImmunoResearch, #109-005-098) je bilo obloženo na ploče sa 96 pregrada da se uhvate testirana antitela čveka u tim serumima, i zatim su antitela vezana za ploču detektovana korišćenjem kozjeg anti-humanog IgG poliklonalnog antitela konjugovana sa peroksidazom iz rena (Jackson ImmunoResearch, #109-035-098) i TMB supstrat (BD Pharmingen). Uzorci seruma su bili u serijskim razblaženjima od šest doza po uzroku u opsegu od 1:100-1:243,000 i referentni satandardi odgovarajućih antitela su bili u serijskim razblaženjima od 12 doza. Koncentracije antitela u leku u serumima su izračunate na osnovu referentne standardne krivulje generisane korišćenjem Graphpad Prism softvera.
[0207] Utvrđeno je da je poluživot REGN 668 bio skraćen kod IL-4Rα HumIn miševa u poređenju sa miševima divljeg tipa sa samo mišjim IL-4Rα proteinom. Ova razlika u PK profilima bi mogla biti objašnjena ciljem posredovanom interakcijom i klirensom između monoklonskih antitela i humanog IL-4α receptora. Samim tim, miševi koji izražavaju humani ili humanizovani IL-4Rα obezbeđuju pogodnu simulaciju da se karakterišu PK svojstva anti-humanih IL-4Rα antitela (npr., dupilumab) na pretkliničkom modelu miša.
Upotrebe za humanizovane IL-4 i/ili IL-4Rα miševe
[0208] Humanizovani IL-4 i/ili IL-4Rα su korisni za procenu farmakodinamičkih svojstava (PD) za ljude specifičnih IL-4 i/ili IL-4Rα antagonista, npr., neutralizovanje anti-IL-4 i/ili ili anti-IL-4Rα antitela, npr., dupilumab.
[0209] Farmakokinetici (PK) i PD ogledi u humanizovanim IL-4 i/ili IL-4Rα miševima su izvedeni u skladu sa standardnim procedurama poznatim u ovoj oblasti.
[0210] Humanizovani IL-4 i/ili IL-4Rα miševi su korisni za testiranje in vivo terapijske efikasnosti za ljude specifičnih IL-4 i/ili IL-4Rα antagonista, npr., neutralizovanje anti-IL-4 i/ili IL-4Rα antitela, npr., dupilumab, na različtim modelima bolesti poznatim uu ovoj oblasti, npr., kako je prikazano ovde gore u tekstu.
Primer 8
Zamena endogenog mišjeg IL-33 gena humanim IL-33 genom
[0211] Mišji IL-33 gen (NCBI gen ID: 77125, primarni izvor: MGI:1924375; RefSeq transkript: NM_001164724.1; UniProt ID: Q8BVZ5; Genomski sklop: NCB137/mm9; Lokacija: chr19:29,999,604-30,035,205 lanac) ima 8 eksona i kodira protein od 266 amino kiselina (GenBank pristupni broj. NP_001158196.1).
[0212] Humani IL-33 gen (NCBI ID gena: 90865, Primarni izvor: HGNC:16028; RefSeq transkript: NM_033439.3; UniProt ID: 095760; Genomski sklop: GRCh37/hg19; Lokacija: chr9: 6,215,149-6,257,983 lanac) takođe ima 8 eksona i kodira protein sa 270 amino kiselina (GenBank pristupni broj NP_254274.1).
[0213] A 16333bp human genomski segment koji obuhvata ekson 2 počevši od ATG kodona inicijacije sve do eksona 8 (uključujući 3’ netranslatirani region) humanog IL-33 gena je zamenio 9381 bp mišjeg IL-33 genskog lokusa koji se prostire u rasponu eksona 2 počevši od ATG kodona inicijacije sve do kodirajućeg dela eksona 8 uključujući zaustavni kodon. Videti Sliku 10A.
[0214] Ciljajući konstrukt za zamenu mišjeg IL-33 gena sa humanim IL-33 u jednom genomskog segmentu u jednom ciljajućem koraku je konstruisan korišćenjem VelociGene® tehnologije genetičkog inženjeringa (videti Valenzuela i saradnici (2003) High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis (Visokopropusni inženjering mišjeg genoma spojen sa analizom ekspresije u visokoj rezoluciji), Nature Biotech, 21(6):652-659), slično postupku opisanom u Primeru 1 iznad za zamenu mišjeg IL-4 gena sa humanim IL-4 genomskim segmentom, izuzev što su mišja i humana IL-33 DNK dobijene iz bakterijskog veštačkog hromozoma (BAC) klonovi bMQ-350I18 iCTD-3015M15, prema opisanom redosledu, i što je ciljajući vektor sadržao loxP neomicin kasetu izbora (Slika 10B).
[0215] Pravilno ciljani klonovi ćelije ES (MAID 7060) su identifikovani ogledom gubitka nativnog alela (LONA) (Valenzuela i saradnici 2003) u kom je broj kopija nativan, nemodifkovan IL-33 gen su određeni pomoću dve TaqMan™ kvantitativne polimerazne lančane reakcije (qPCRs) specifične za sekvence u mišjem IL-33 genu koje su ciljane za brisanje. qPCR ogledi su sadržali sledeće komplete početnica-proba (upisano 5’ do 3’):
uzvodno ("mTU"):
početnica prema napred, TTGGACTAGTAACAAGAAGGGTAGCA (SEK ID BR: 31); reverzna početnica, CCTTTCCCATCACCCTCTAACTT (SEK ID BR: 32); sonda (MGB), AGCTCTGGTGGACAGA (SEK ID BR: 33);
nizvodno ("mTD"):
početnica prema nazad, TCTCTGCCAAGCTGCTTATCC (SEK ID BR: 34); reverzna početnica, GGCTGCATGGAAGAGGTGAA (SEK ID BR: 35); sonda (MGB), CTCTCCACAAATCG (SEK ID BR: 36).
[0216] Potvrda da je humana IL-33 sekvenca gena zamenjena mišjom IL-33 sekvencom gena u humanizovanom alelu je potvrđena putem TaqMan™ qPCR ogleda koji obuhvata sledeće kompleta početnica proba (ispisano 5’ do 3’):
uzvodno ("hTU")
početnica prema napred, CAGGCAGGAATAGCTGAGATAATCT (SEK ID BR: 37); reverzna početnica, TGTGGAGCAAAAAGTGGTTGAT (SEK ID BR: 38); sonda (MGB), CCTGTGAATAGTGATAAAC (SEK ID BR: 39);
nizvodno ("hTD"):
početnica prema napred, CAGTTCCAAACGATAGGCTCAA (SEK ID BR: 40); reverzna početnica, ATAATTCTGTGAAGCATCTGGTCTTC (SEK ID BR: 41); sonda (MGB), CTAGAGCTGCTAGTAAAA (SEK ID BR: 42).
[0217] Uzvodni spoj mišjeg IL-33 lokusa i sekvence koji obuhvata humani IL-33 gen (prikazan kao "I" na Slici 10B) je projektovan da bude unutar 5’- ATAGCCAAGG TTGCTTCTGA TGACTTCAGG TCCATATAGT TGGAT-TAATG TTATATTTCA ATCCCACAGA AACCTGAAAA ATGAAGCCTA AAATGAAGTA TTCAACCAAC AAAATTTCCA CAGCAAAGTG GAAGAACACA GCAAGCAAAG CCTTGTGTTT -3’ (SEK ID BR: 43), pri čemu humana IL-33 sekvenca je kurzivna i humani start kodon ATG je podvučen. Nizvodni spoj sekvence koja obuhvata humanu IL-33 genomsku sekvencu i kaseta izbora neomicina loxP (prikazana kao "II" na Slici 10B) je projektovana da bude unutar 5’- TTTATATTAT TGAATAAAGTATATTTTCCA AATGTATGTGAGACTATAAT GATTTTATCA TATGAT-GACTCAATATTCTG/CTCGAGATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATATGC ATGGCCTCCGCGCCGG GTTTTGGCGC CTCCCGCGGG -3’ (SEK ID BR: 44), pri čemu humana IL-33 sekvenca jeste kurzivno ispisana i spoj je naveden pomoću simbola "/", i lox P mesto je podvučeno. Nizvodni spoj sekvence kasete izbora neo loxP i mišjeg IL-33 lokusa (prikazan kao "III" na Slici 10C) je projektovan da bude unutar 5’-AGCCCCTAGA TAACTTCGTA TAATGTATGC TATACGAAGT TATGCTAGTA ACTATAACGG TCCTAAGGTA GCGAGCTAGC/CGCCTGTGCG TTCTGGGTTG AATGACTTAA TGCTTCCAAC TGAAGAAAGG GTAACAGAGA GAAAGAAAGC CATTCTTGGC-3’ (SEK ID BR: 45), pri čemu je spoj prikazan simbolom "/", i loxP mesto je podvučeno.
[0218] Pravilno ciljane ES ćelije (MAID 7060) su dodatno elektroporisane sa prelaznim vektrom Cre ekspresije da bi se uklonila kaseta izbora leka i da bi se dobili klonovi ES ćelije bez kasete leka (MAID 7061). Uzvodni spoj u ovim MAID 7061 ES ćelijama (pokazan kao "I" na Slici 18C) je isti kao u MAID 7060 ES ćelijama. NizvodnI spoj (kako je prikazano kao "II" na Slici 18C) je projektovan da bude unutar 5’-TTTATATTAT TGAATAAAGT ATATTTTCCA AATG- TATGTG AGACTATAAT GATTTTATCA TATGATGACT CAATATTCTG/CTCGAGATAA CTTCGTATAA TGTATGCTAT ACGAAGTTAT GCTAGTAACT ATAACGGTCC TAAGGTAGCG AGCTAGC/CGCCTGTGCG TTCTGGGTTG AAT- GACTTAA TGCTTCCAAC TGAAGAAAGG GTAACAGAGA GAAAGAAAGC CATTCTTGGC-3’ (SEK ID BR: 46),pri čemu kod 3’ humane IL-33 sekvence je kurzivom ispisan pre prvog simbola "/", i mišja IL-333’ sekvenca je kurzivirana posle drugog "/" simbola, i loxP mesto je podvučeno.
[0219] Pravilno ciljane ES ćelije (MAID 7060 ili MAID 7061) su uvedene u stadiju 8 ćeljija SW mišjeg embriona postupkom VelociMouse® (videti U.S. Pat. Br.7,294,754, 7,576,259, 7,659,442, i Poueymirou i saradnici (2007) F0 generacija miševa koji su u suštini potpuno izvedeni iz donatorskih genom ciljanih ES ćelija omogućava neposredne fenotipne analize, Nature Biotech.25(1):91-99). VelociMice® (F0 miševi potpuno izvednei iz donatorske ES ćelije) koji nose humanizovan IL-33 gen su identifikovani genotipovanjem za gubitak mišjeg alela i sticanje humanog alela korišćenjem modifikacije ogleda alela (videti, Valenzuela i saradnici, (2003)). Isti LONA ogled je korišćen da se ispita DNK prečišćena iz biopsija repova za miševe izvedene iz ciljanih ES ćelija da se odrede njihovi IL-33 genotipovi i potvrdi da je humanizovani IL-33 alel je prenet kroz klicinu liniju. Dva heterozigna mladunca za zamenu su uzgajana da bi se generisao miš koji je homozigotan za zamenu endogenog mišjeg IL-33 gena humanim IL-33 genom.
SPISAK SEKVENCI
[0220]

Claims (12)

Patentni zahtevi
1. Glodar, koji obuhvata zamenu genomskog fragmenta glodarskog IL-4Rα gena na endogenom glodarskom 4Rα lokusu sa genomskim fragmentom humanog IL4-Rα gena da se formira humanizovani IL-4Rα gen koji obuhvata ATG kodon inicijacije kodirajućeg eksona 1 sve do kodirajućeg eksona 5 humanog IL-4Rα gena, i kodirajućih eksona 6-9 glodarskog IL-4Rα gena, pri čemu genomski fragment glodarskog IL-4Rα gena obuhvata ATG kodon inicijacije kodirajućeg eksona 1 sve do kodirajućeg eksona 5 glodarskog IL-4Rα gena, i genomski fragment humanog IL-4Rα gena obuhvata ATG kodon inicijacije kodirajućeg eksona 1 sve do kodirajućeg eksona 5 humanog IL-4Rα gena, i pri čemu ekspresija humanizovanog IL-4Rα gena je pod kontrolom glodarskih IL-4Rα regulatornih elemenata na endogenom glodarskom IL-4Rα lokusu.
2. Glodar iz patentnog zahteva 1, pri čemu je taj glodar miš ili pacov.
3. Glodar iz patentnog zahteva 1, pri čemu je glodar je miš koji ne može da izražava mišji IL-4Rα protein.
4. Glodar iz patentnog zahteva 1, pri čemu je taj glodar izražava humani ili humanizovani IL-4 protein.
5. Glodar iz patentnog zahteva 4, pri čemu je taj glodar miš koji ne može da izražava mišji IL-4 protein.
6. Glodar z patentnog zahteva 1, pri čemu taj glodar obuhvata zamenu genomskog fragmenta glodarskog IL-4 gena na endogenom glodarskom IL-4 lokusu sa genomskim fragmentom humanog IL-4 gena da se formira humanizovan IL-4 gen, pri čemu genomski fragment glodarskog IL-4 gena obuhvata ATG kodon inicijacije eksona 1 do eksona 4 glodarskog IL-4 gena, i genomski fragment humanog IL-4 gena obuhvata ATG kodon inicijacije eksona 1 sve do eksona 4 humanog IL-4 gena, i pri čemu je ekspresija humanizovanog IL-4 gena pod kontrolom glodarskih IL-4 regulatornih elemenata na endogenom glodarskom IL-4 lokusu.
7. Glodar iz bilo kog od patentnih zahteva 1-2, 4 i 6 koji je miš.
8. Postupak za pravljenje humanizovanog glodara, koji obuhvata zamenu genomskog fragmenta glodarskog IL-4Rα gena na endogenom glodarskom IL-4Rα lokusu sa genomskim fragmentom humanog IL-4Rα gena da se formira humanizovani IL-4Rα gen koji obuhvata ATG kodon inicijacije kodirajućeg eksona 1 sve do kodirajućeg eksona 5 humanog IL-4Rα gena, i kodirajuće eksone 6-9 glodarskog IL-4Rα gena, pri čemu genomski fragment glodarskog IL-4Rα gena obuhvata ATG kodon inicijacije kodirajućeg eksona 1 sve do kodirajućeg eksona 5 glodarskog IL-4Rα gena, i genomski fragment humanog IL-4Rα gena obuhvata ATG gen inicijacije kodirajućeg eksona 1 sve do kodirajućeg eksona 5 humanog IL-4Rα gena, i humanizovani IL-4Rα gen je funkcionalno povezan na glodarske IL-4Rα regulatorne elemente na endogenom glodarskom IL-4Rα lokusu.
9. Postupak iz patentnog zahteva 8, pri čemu je taj glodar miš ili pacov.
10. Postupak iz patentnog zahteva 8 ili 9, pri čemu je taj glodar miš.
11. Postupak za pretraživanje za utvrđivanje postojanja za ljude specifičnog IL-4 ili IL-4Rα antagonista, koji obuhvata:
obezbeđivanje dvostruko humanizovanog IL-4 i IL-4Rα glodara kako je definisano u patentnom zahtevu 6,
indukovanje upale pluća kod pomenutog glodara,
primena agensa pomenutom glodaru,
određivanje da li je plućna upala smanjena putem agensa, i identifikovanje agensa kao specifično humanog- IL-4 ili IL-4Rα antagonista na osnovu njegove sposobnosti da smanji upalu pluća, opciono pri čemu se nivo upale pluća odredi merenjem nagomilavanja sluzi u disajnom putu, eozinofilne infiltrirajuće ćelije u bronhoalveolarnom lavatu, i/ili ukupan cirkulišući IgE.
12. Postupak za pretraživanje za utvrđivanje postojanja za ljude specifičnog IL-4 ili IL-4Rα antagonista, koji obuhvata:
obezbeđivanje dvostruko humanizovanog IL-4 i IL-4Rα glodara kako je definisano u patentnom zahtevu 6,
indukovanje upale kože pomenutom glodaru,
primena agensa pomenutom glodaru,
određivanje da li je upala kože smanjena putem agensa, i identifikovanje agensa kao specifičnog za humani-IL-4 ili IL-4Rα antagonista na osnovu njegove sposobnosti da smanji upalu kože.
RS20180131A 2014-05-07 2015-05-07 Životinje sa humanizovanom il-4 i il-4r alfa RS57073B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201461989757P 2014-05-07 2014-05-07
PCT/US2015/029638 WO2015171861A1 (en) 2014-05-07 2015-05-07 Humanized il-4 and il-4r alpha animals
EP15727106.5A EP3027015B1 (en) 2014-05-07 2015-05-07 Humanized il-4 and il-4r alpha animals

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS57073B1 true RS57073B1 (sr) 2018-06-29

Family

ID=53284509

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20211141A RS62345B1 (sr) 2014-05-07 2015-05-07 Životinje sa humanizovanim il-4 i il-4r alfa
RS20180131A RS57073B1 (sr) 2014-05-07 2015-05-07 Životinje sa humanizovanom il-4 i il-4r alfa

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20211141A RS62345B1 (sr) 2014-05-07 2015-05-07 Životinje sa humanizovanim il-4 i il-4r alfa

Country Status (26)

Country Link
US (7) US9565841B2 (sr)
EP (3) EP3906781A1 (sr)
JP (5) JP6640740B2 (sr)
KR (2) KR102473565B1 (sr)
CN (2) CN106470545B (sr)
AU (3) AU2015255977B2 (sr)
BR (1) BR112016025745A2 (sr)
CA (2) CA2947307C (sr)
CY (2) CY1119773T1 (sr)
DK (2) DK3281521T3 (sr)
ES (2) ES2656529T3 (sr)
HR (2) HRP20211455T1 (sr)
HU (2) HUE038028T2 (sr)
IL (3) IL304841B2 (sr)
LT (2) LT3027015T (sr)
MX (1) MX370672B (sr)
NO (1) NO2785538T3 (sr)
PH (1) PH12016502058A1 (sr)
PL (2) PL3281521T3 (sr)
PT (2) PT3027015T (sr)
RS (2) RS62345B1 (sr)
RU (1) RU2703139C2 (sr)
SG (2) SG10201912354PA (sr)
SI (2) SI3027015T1 (sr)
SM (2) SMT201800018T1 (sr)
WO (1) WO2015171861A1 (sr)

Families Citing this family (38)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NO2785538T3 (sr) 2014-05-07 2018-08-04
HUE048677T2 (hu) 2014-06-19 2020-07-28 Regeneron Pharma Humanizált programozott sejthalál 1 génnel rendelkezõ nem-humán állatok
WO2016042072A1 (en) * 2014-09-17 2016-03-24 Oerlikon Surface Solutions Ag, Trübbach Method for producing a double-layer coated cutting tool with improved wear resistance
KR20240055876A (ko) 2014-11-24 2024-04-29 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 인간화 cd3 복합체를 발현하는 비인간 동물
KR102617691B1 (ko) 2014-12-05 2023-12-27 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 인간화 분화 클러스터 47 유전자를 가진 비인간 동물
NZ731954A (en) 2014-12-09 2024-11-29 Regeneron Pharma Non-human animals having a humanized cluster of differentiation 274 gene
AU2016358101B2 (en) 2015-11-20 2022-12-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals having a humanized Lymphocyte-activation gene 3
CN108779159B (zh) 2016-02-04 2022-12-30 瑞泽恩制药公司 具有经改造的angptl8基因的非人动物
JP6980674B2 (ja) * 2016-02-29 2021-12-15 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッドRegeneron Pharmaceuticals, Inc. ヒト化ｔｍｐｒｓｓ遺伝子を有する齧歯類
TWI857389B (zh) * 2016-12-01 2024-10-01 美商再生元醫藥公司 治療發炎症狀的方法
MX2019012171A (es) 2017-04-13 2019-11-25 Regeneron Pharma Tratamiento e inhibicion de enfermedades pulmonares inflamatorias en pacientes que tienen alelos de riesgo en los genes que codifican la il33 e il1rl1.
JP7657440B2 (ja) 2017-06-12 2025-04-07 ブルーフィン バイオメディシン， インコーポレイテッド 抗－ｉｌ１ｒａｐ抗体および抗体薬物コンジュゲート
ES2962277T3 (es) 2017-09-29 2024-03-18 Regeneron Pharma Roedores que comprenden un locus Ttr humanizado y métodos de uso
IL274740B2 (en) 2017-11-30 2024-06-01 Regeneron Pharma Non-human animals comprising a humanized trkb locus
JP7328243B2 (ja) 2018-03-26 2023-08-16 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド 治療薬を試験するためのヒト化げっ歯類
IL307286B1 (en) 2018-04-11 2025-11-01 Regeneron Pharma Methods and compositions for quantifying il-33
JP7048051B2 (ja) 2018-07-11 2022-04-05 正徳 染井 痒みを軽減するアトピー性皮膚炎治療剤
HRP20240999T1 (hr) * 2018-07-16 2024-10-25 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Glodavački modeli bolesti ditra i njihova upotreba
WO2020074005A1 (en) * 2018-10-12 2020-04-16 Beijing Biocytogen Co., Ltd Genetically modified non-human animal with human or chimeric genes
CN114164177A (zh) * 2019-01-17 2022-03-11 百奥赛图(北京)医药科技股份有限公司 人源化转基因动物
WO2020206139A1 (en) 2019-04-04 2020-10-08 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals comprising a humanized coagulation factor 12 locus
EP3801011A1 (en) 2019-06-04 2021-04-14 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals comprising a humanized ttr locus with a beta-slip mutation and methods of use
AU2020289581B2 (en) 2019-06-07 2024-11-21 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals comprising a humanized albumin locus
US20220272953A1 (en) * 2019-07-29 2022-09-01 Biocytogen Pharmaceuticals (Beijing) Co., Ltd. Genetically modified non-human animal with human or chimeric il33
CN112430621B (zh) * 2019-08-09 2022-09-27 百奥赛图(北京)医药科技股份有限公司 Il2ra基因人源化的非人动物的构建方法及应用
US20220378025A1 (en) * 2019-11-11 2022-12-01 Biocytogen Pharmaceuticals (Beijing) Co., Ltd. Genetically modified non-human animal with human or chimeric genes
CN114786479B (zh) * 2019-12-25 2023-12-15 江苏集萃药康生物科技股份有限公司 一种il-15人源化小鼠模型及其用途
US12250931B2 (en) * 2020-01-28 2025-03-18 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Genetically modified mouse with a humanized PNPLA3 gene and methods of use
CN111149767B (zh) * 2020-02-24 2021-07-20 中南大学湘雅二医院 一种人源化皮肤型红斑狼疮小鼠模型的构建方法和应用
CN113527485B (zh) 2020-04-17 2024-11-15 湖南麦济生物技术股份有限公司 抗人白细胞介素-4受体α抗体及其制备方法和应用
CN111808882B (zh) * 2020-09-01 2020-12-29 北京百奥赛图基因生物技术有限公司 Il7r基因人源化改造的动物模型的构建方法及其应用
CN111793646B (zh) * 2020-09-08 2021-01-15 北京百奥赛图基因生物技术有限公司 Il1r1基因人源化改造的非人动物的构建方法及其应用
CN111926039B (zh) * 2020-09-23 2021-03-16 百奥赛图(北京)医药科技股份有限公司 Il-13基因人源化的非人动物的构建方法和应用
JP2024500153A (ja) * 2020-12-21 2024-01-04 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド ヒト化ｔｓｌｐ遺伝子、ヒト化ｔｓｌｐ受容体遺伝子、及び／又はヒト化ｉｌ７ｒａ遺伝子を有する非ヒト動物
WO2022247936A1 (en) * 2021-05-28 2022-12-01 Biocytogen Pharmaceuticals (Beijing) Co., Ltd. Genetically modified non-human animal with human or chimeric cd36
WO2024067796A1 (zh) * 2022-09-28 2024-04-04 百奥赛图(北京)医药科技股份有限公司 一种il5和/或il5ra基因人源化修饰的非人动物
WO2024151707A1 (en) * 2023-01-11 2024-07-18 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Systems and methods for a regulatory-compliant automated assay
WO2025175099A1 (en) 2024-02-16 2025-08-21 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. A rodent copd model

Family Cites Families (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU643427B2 (en) * 1988-10-31 1993-11-18 Immunex Corporation Interleukin-4 receptors
US6596541B2 (en) * 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
AU2005295269B2 (en) 2004-10-19 2010-05-13 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Method for generating an animal homozygous for a genetic modification
JP2007252370A (ja) * 2006-02-22 2007-10-04 Institute Of Physical & Chemical Research Ｉｌ−４初期発現系トランスジェニック非ヒト動物およびその利用
US7608693B2 (en) * 2006-10-02 2009-10-27 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. High affinity human antibodies to human IL-4 receptor
US20110016543A1 (en) * 2008-12-04 2011-01-20 Sigma-Aldrich Co. Genomic editing of genes involved in inflammation
WO2011002727A1 (en) * 2009-06-29 2011-01-06 Qingfeng Chen Methods of producing humanized non-human mammals
AU2010275432A1 (en) * 2009-07-24 2012-02-02 Sigma-Aldrich Co. Llc. Method for genome editing
RU2425880C2 (ru) * 2009-07-30 2011-08-10 Учреждение Российской академии наук Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН Способ получения трансгенных мышей
CA3040377C (en) 2009-10-06 2025-12-30 Yale University Genetically modified mice and engraftment comprising the knock-in of a human thrombopoietin (tpo) gene
ES3040596T3 (en) 2011-02-15 2025-11-03 Regeneron Pharma Humanized m-csf mice and uses thereof
RS56656B1 (sr) 2011-10-28 2018-03-30 Regeneron Pharma Miševi sa genetski modifikovanim glavnim kompleksom gena tkivne podudarnosti
RS56330B1 (sr) 2011-10-28 2017-12-29 Regeneron Pharma Genetski modifikovani miševi sa ekspresijom himernih molekula klase ii glavnog kompleksa histokompatibilnosti (mhc)
MY186903A (en) * 2011-10-28 2021-08-26 Regeneron Pharma Humanized il-6 and il-6 receptor
US8962913B2 (en) * 2012-06-18 2015-02-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Humanized IL-7 rodents
WO2014031610A1 (en) * 2012-08-21 2014-02-27 Sanofi Methods for treating or preventing asthma by administering an il-4r antagonist
KR102287541B1 (ko) 2012-09-07 2021-08-10 예일 유니버시티 유전적으로 변형된 비-인간 동물 및 이것들의 사용 방법
EP4389764B1 (en) 2012-11-05 2026-03-18 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Genetically modified rodents and methods of use thereof
KR20240147707A (ko) 2013-02-20 2024-10-08 리제너론 파아마슈티컬스, 인크. 사람화된 ｔ-세포 보조-수용체를 발현하는 마우스
CN110192541B (zh) 2013-02-22 2022-02-18 瑞泽恩制药公司 表达人源化主要组织相容性复合物的小鼠
JO3532B1 (ar) 2013-03-13 2020-07-05 Regeneron Pharma الأجسام المضادة لمضاد انترلوكين-33 واستعمالاتها
DK3175706T3 (en) 2013-09-23 2019-03-04 Regeneron Pharma Non-human animals with a humanized signal regulatory protein gene
SMT201900177T1 (it) 2013-10-15 2019-05-10 Regeneron Pharma Animali con il-15 umanizzata
SG10201811701YA (en) 2013-11-19 2019-01-30 Regeneron Pharma Non-human animals having a humanized a proliferation-inducing ligand gene
CN105792646B (zh) 2013-11-19 2018-03-02 瑞泽恩制药公司 具有人源化的b细胞活化因子基因的非人动物
ES2794942T3 (es) 2014-04-08 2020-11-19 Regeneron Pharma Animales no humanos que tienen receptores Fc-gamma humanizados
JP6598798B2 (ja) 2014-05-05 2019-10-30 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド ヒト化ｃ５およびｃ３動物
NO2785538T3 (sr) 2014-05-07 2018-08-04

Also Published As

Publication number Publication date
NO2785538T3 (sr) 2018-08-04
KR102517112B1 (ko) 2023-04-03
JP6838131B2 (ja) 2021-03-03
IL248358A0 (en) 2016-11-30
US20170311580A1 (en) 2017-11-02
ES2887852T3 (es) 2021-12-28
PH12016502058A1 (en) 2017-01-09
DK3027015T3 (en) 2018-01-22
IL304841B1 (en) 2025-09-01
JP2024159985A (ja) 2024-11-08
JP2017514501A (ja) 2017-06-08
JP2021087434A (ja) 2021-06-10
AU2021218060B2 (en) 2024-04-11
EP3027015B1 (en) 2017-11-08
RS62345B1 (sr) 2021-10-29
IL297105B2 (en) 2024-01-01
SG11201608570YA (en) 2016-11-29
JP6640740B2 (ja) 2020-02-05
MX370672B (es) 2019-12-19
JP7145250B2 (ja) 2022-09-30
HRP20211455T1 (hr) 2022-01-07
JP2020058379A (ja) 2020-04-16
RU2019131253A (ru) 2019-12-06
US10477842B2 (en) 2019-11-19
US11109578B2 (en) 2021-09-07
CA2947307C (en) 2023-09-26
LT3281521T (lt) 2021-09-27
PT3281521T (pt) 2021-09-16
BR112016025745A2 (pt) 2018-01-16
SMT202100560T1 (it) 2021-11-12
AU2021218060A1 (en) 2021-09-09
US20230027494A1 (en) 2023-01-26
US20180000056A1 (en) 2018-01-04
IL304841A (en) 2023-09-01
CN106470545A (zh) 2017-03-01
KR102473565B1 (ko) 2022-12-02
PT3027015T (pt) 2018-02-09
SI3027015T1 (en) 2018-02-28
AU2015255977B2 (en) 2021-09-02
RU2016143376A (ru) 2018-06-09
MX2016014563A (es) 2017-02-23
CA3207834C (en) 2025-10-14
AU2024204694A1 (en) 2024-09-05
IL297105A (en) 2022-12-01
US12310340B2 (en) 2025-05-27
CY1124605T1 (el) 2022-07-22
AU2015255977A1 (en) 2016-11-17
US11963521B2 (en) 2024-04-23
CN106470545B (zh) 2019-08-20
RU2703139C2 (ru) 2019-10-15
EP3281521B1 (en) 2021-06-30
RU2016143376A3 (sr) 2018-11-22
US20200022344A1 (en) 2020-01-23
NZ725615A (en) 2024-05-31
JP7755699B2 (ja) 2025-10-16
IL304841B2 (en) 2026-01-01
JP2022171841A (ja) 2022-11-11
US9565841B2 (en) 2017-02-14
CY1119773T1 (el) 2018-06-27
SG10201912354PA (en) 2020-02-27
PL3281521T3 (pl) 2022-01-03
US20150320021A1 (en) 2015-11-12
CN110269047A (zh) 2019-09-24
DK3281521T3 (da) 2021-09-20
IL297105B1 (en) 2023-09-01
US10588298B2 (en) 2020-03-17
EP3906781A1 (en) 2021-11-10
US9743647B2 (en) 2017-08-29
EP3281521A1 (en) 2018-02-14
NZ763861A (en) 2024-05-31
WO2015171861A1 (en) 2015-11-12
SI3281521T1 (sl) 2021-11-30
US20150320022A1 (en) 2015-11-12
ES2656529T3 (es) 2018-02-27
IL248358B (en) 2022-11-01
US20210368753A1 (en) 2021-12-02
HUE055860T2 (hu) 2021-12-28
CA2947307A1 (en) 2015-11-12
PL3027015T3 (pl) 2018-04-30
KR20160150637A (ko) 2016-12-30
EP3027015A1 (en) 2016-06-08
KR20220165814A (ko) 2022-12-15
IL248358B2 (en) 2023-03-01
CN110269047B (zh) 2021-11-02
SMT201800018T1 (it) 2018-03-08
HRP20180242T1 (hr) 2018-03-09
HUE038028T2 (hu) 2018-09-28
CA3207834A1 (en) 2015-11-12
LT3027015T (lt) 2018-01-25
AU2021218060C1 (en) 2024-11-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2021218060B2 (en) Humanized il-4 and il-4r alpha animals
HK40053187A (en) Humanized il-4 and il-4r alpha animals
HK1245011B (en) Humanized il-4 and il-4r alpha animals
HK1245011A1 (en) Humanized il-4 and il-4r alpha animals
HK1225575A1 (en) Humanized il-4 and il-4r alpha animals
HK1225575B (en) Humanized il-4 and il-4r alpha animals