JP2021087434A - ヒト化ＩＬ−４およびＩＬ−４Ｒα動物 - Google Patents

Abstract

【課題】非ヒト動物のＩＬ−４および／もしくはＩＬ−４Ｒα遺伝子が全体的または部分的にヒト化した、あるいはヒトまたはヒト化ＩＬ−４および／もしくはＩＬ−４Ｒαタンパク質をそれぞれコードする配列を含むヒトＩＬ−４および／もしくはＩＬ−４Ｒα遺伝子で置換された非ヒト動物（例えば齧歯類、例えばネズミ科の動物、例えばマウスまたはラット）を提供する。【解決手段】ヒト配列を含むＩＬ−４および／またはＩＬ−４Ｒαタンパク質をコードする核酸配列を含む非ヒト動物；全体的または部分的にヒト型であるＩＬ−４および／またはＩＬ−４Ｒα遺伝子を含むトランスジェニック非ヒト動物；ヒトまたはヒト化ＩＬ−４および／またはＩＬ−４Ｒαタンパク質を発現する非ヒト動物；内因性非ヒト動物ＩＬ−４および／またはＩＬ−４Ｒα遺伝子の置換（全体的または部分的）を有する非ヒト動物が提供される。【選択図】なし

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１４年５月７日出願の米国仮特許出願第６１／９８９，７５７号の優先
権の利益を主張するものであり、当該仮特許出願の内容全体は参照により本明細書に組み
込まれる。

配列表の参照による組み込み
２０１５年５月７日に作成され、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して米国特許商標庁に提出された
３１２６０＿ＳＥＱ．ｔｘｔという名称の１６ＫＢのＡＳＣＩＩテキストファイルの形態
をとる配列表が、参照により本明細書に組み込まれる。

ヒト配列を含むＩＬ−４および／またはＩＬ−４Ｒαタンパク質をコードする核酸配列
を含む非ヒト動物が本明細書に開示されている。全体的または部分的にヒト型であるＩＬ
−４および／またはＩＬ−４Ｒα遺伝子を含むトランスジェニック非ヒト動物も本明細書
に開示されている。ヒトまたはヒト化ＩＬ−４および／またはＩＬ−４Ｒαタンパク質を
発現する非ヒト動物も開示されている。さらに、ヒトまたはヒト化ＩＬ−４および／また
はＩＬ−４Ｒα核酸配列を含む非ヒト動物を作成・使用するための方法が開示されている
。

ＩＬ−４およびＩＬ−４Ｒαは、異常な２型ヘルパーＴ（Ｔｈ２）細胞と関連する様々
なヒトの疾患、障害、および状態を処置するための治療標的である。ヒトＩＬ−４または
ヒトＩＬ−４Ｒαタンパク質を特異的に標的とする治療用分子の薬物動態学（ＰＫ）およ
び薬力学（ＰＤ）の評価は、非ヒト動物、例えば、齧歯類（例えば、マウスまたはラット
）で日常的に遂行されている。しかしながら、ある特定の非ヒト動物では、これらの治療
用分子は内因性ＩＬ−４またはＩＬ−４Ｒαタンパク質を標的としないため、かかる治療
用分子のＰＤを適正に判定することができない。

さらに、異常なＴｈ２細胞と関連する疾患の様々な非ヒト動物モデルを使用する、ヒト
特異的なＩＬ−４およびＩＬ−４Ｒαタンパク質拮抗薬の治療有効性の評価は、かかる種
特異的な拮抗薬が内因性ＩＬ−４またはＩＬ−４Ｒαタンパク質と相互作用しない非ヒト
動物では問題がある。

したがって、非ヒト動物のＩＬ−４および／もしくはＩＬ−４Ｒα遺伝子が全体的また
は部分的にヒト化した、あるいはヒトまたはヒト化ＩＬ−４および／もしくはＩＬ−４Ｒ
αタンパク質をそれぞれコードする配列を含むヒトＩＬ−４および／もしくはＩＬ−４Ｒ
α遺伝子で（例えば、内因性非ヒト遺伝子座において）置換された非ヒト動物（例えば齧
歯類、例えばネズミ科の動物、例えばマウスまたはラット）に対するニーズがある。

ＩＬ−４および／またはＩＬ−４Ｒ遺伝子が非ヒト調節エレメント（例えば、内因性調
節エレメント）の制御下にある、ＩＬ−４および／またはＩＬ−４Ｒα遺伝子（例えば、
ヒト化したもの、またはヒトのもの）を含む非ヒト動物に対するニーズもある。

機能性ＩＬ−４タンパク質を発現するがヒトまたはヒト化ＩＬ−４遺伝子を含まない同
齢の非ヒト動物の血液、血漿、または血清中に存在するＩＬ−４タンパク質の濃度と類似
した濃度にてヒトまたはヒト化ＩＬ−４タンパク質を血液、血漿、または血清中に発現す
る、かつ／あるいは、機能性ＩＬ−４Ｒαタンパク質を発現するがヒトまたはヒト化ＩＬ
−４Ｒα遺伝子を含まない同齢の非ヒト動物の免疫細胞（例えば、Ｂ細胞およびＴ細胞）
上のＩＬ−４Ｒαタンパク質のレベルと類似したレベルにてヒトまたはヒト化ＩＬ−４Ｒ
αタンパク質を免疫細胞（例えば、Ｂ細胞およびＴ細胞）上に発現する、ヒト化した非ヒ
ト動物に対するニーズもある。

ヒト配列を含むＩＬ−４および／またはＩＬ−４Ｒαタンパク質をコードする核酸配列
を含む非ヒト動物が提供される。

全体的または部分的にヒト型であるＩＬ−４および／またはＩＬ−４Ｒα遺伝子を含む
トランスジェニック非ヒト動物が提供される。

ヒトまたはヒト化ＩＬ−４および／またはＩＬ−４Ｒαタンパク質を発現する非ヒト動
物が提供される。

内因性非ヒト動物ＩＬ−４および／またはＩＬ−４Ｒα遺伝子の置換（全体的または部
分的）を有する非ヒト動物が提供される。

ＩＬ−４および／またはＩＬ−４Ｒαのヒト化（全体的または部分的）を内因性非ヒト
ＩＬ−４および／またはＩＬ−４Ｒα遺伝子座において含む非ヒト動物が提供される。

ヒトまたはヒト化ＩＬ−４遺伝子を有する非ヒト動物が提供され、この非ヒト動物は内
因性ＩＬ−４タンパク質を発現せず、かつこの非ヒト動物は、機能性内因性ＩＬ−４タン
パク質を発現するがヒトまたはヒト化ＩＬ−４遺伝子を含まない同齢の非ヒト動物の血液
、血漿、または血清中に存在するＩＬ−４タンパク質の濃度と類似した濃度にてヒトまた
はヒト化ＩＬ−４タンパク質を血液、血漿、または血清中に発現する。

ヒトまたはヒト化ＩＬ−４Ｒα遺伝子を有する非ヒト動物が提供され、この非ヒト動物
は内因性ＩＬ−４Ｒαタンパク質を発現せず、かつこの非ヒト動物は、機能性内因性ＩＬ
−４Ｒαタンパク質を発現するがヒトまたはヒト化ＩＬ−４Ｒα遺伝子を含まない同齢の
非ヒト動物の免疫細胞（例えば、Ｂ細胞およびＴ細胞）上に存在するＩＬ−４Ｒαタンパ
ク質のレベルと類似したレベルにてヒトまたはヒト化ＩＬ−４Ｒαタンパク質を免疫細胞
（例えば、Ｂ細胞およびＴ細胞）上に発現する。

一態様では、ヒトまたはヒト化ＩＬ−４および／またはＩＬ−４Ｒα核酸配列を含む非
ヒト動物が提供される。

一態様では、内因性ＩＬ−４および／またはＩＬ−４Ｒα遺伝子座における内因性ＩＬ
−４および／またはＩＬ−４Ｒαをコードする遺伝子の、ヒトまたはヒト化ＩＬ−４およ
び／またはＩＬ−４Ｒαタンパク質をコードする遺伝子による置換を含む遺伝子改変非ヒ
ト動物が提供される。内因性齧歯類ＩＬ−４遺伝子座における内因性ＩＬ−４遺伝子の、
ヒトＩＬ−４遺伝子による置換を含む、および／または内因性齧歯類ＩＬ−４Ｒα遺伝子
座における内因性ＩＬ−４Ｒα遺伝子の、ヒトＩＬ−４Ｒα遺伝子による置換を含む、齧
歯類（例えば、マウスまたはラット）が提供される。一実施形態では、齧歯類はマウスで
ある。一実施形態では、齧歯類はラットである。

一態様では、内因性齧歯類ＩＬ−４遺伝子のヒト化を含む遺伝子改変齧歯類（例えば、
マウスまたはラット）が提供され、このヒト化は、改変されたＩＬ−４遺伝子を形成する
ための、内因性齧歯類ＩＬ−４遺伝子座における、ヒトＩＬ−４遺伝子の少なくとも１つ
のエクソンを含む核酸配列による齧歯類ＩＬ−４遺伝子の少なくとも１つのエクソンを含
む齧歯類核酸の置換を含み、改変されたＩＬ−４遺伝子の発現は内因性齧歯類ＩＬ−４遺
伝子座の齧歯類調節エレメントの制御下にある。

一実施形態では、齧歯類はマウスまたはラットである。一実施形態では、齧歯類はマウ
スである。一実施形態では、齧歯類はラットである。

一実施形態では、改変されたＩＬ−４遺伝子は、ヒトまたはヒト化ＩＬ−４タンパク質
をコードし、ヒトＩＬ−４遺伝子のＡＴＧ開始コドンから開始するエクソン１からエクソ
ン４までを含む。

一実施形態では、齧歯類は、マウスＩＬ−４タンパク質を発現する能力を有しないマウ
スである。

一実施形態では、齧歯類は、内因性マウスＩＬ−４Ｒα遺伝子によってコードされたマ
ウスＩＬ−４Ｒαタンパク質を発現するマウスである。

一実施形態では、齧歯類は、ヒトまたはヒト化ＩＬ−４Ｒαタンパク質を発現するマウ
スである。

一実施形態では、ヒト化ＩＬ−４Ｒαタンパク質はヒトＩＬ−４Ｒαタンパク質の細胞
外ドメインを含む。

一実施形態では、ヒト化ＩＬ−４Ｒαタンパク質はマウスＩＬ−４Ｒαタンパク質の膜
貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含む。

一実施形態では、齧歯類は、改変されたＩＬ−４Ｒα遺伝子を形成するための、内因性
マウスＩＬ−４Ｒα遺伝子座における、ヒトＩＬ−４Ｒα遺伝子の少なくとも１つのエク
ソンを含む核酸配列によるマウスＩＬ−４Ｒα遺伝子の少なくとも１つのエクソンを含む
マウス核酸の置換を含むマウスであり、改変されたＩＬ−４Ｒα遺伝子の発現は内因性マ
ウスＩＬ−４Ｒα遺伝子座のマウス調節エレメントの制御下にある。

一実施形態では、齧歯類はマウスであり、マウスＩＬ−４のＡＴＧ開始コドンから開始
するエクソン１からエクソン４までを含むマウスＩＬ−４配列の連続ゲノム断片（contig
uous genomic fragment）が、ヒトＩＬ−４のＡＴＧ開始コドンから開始するエクソン
１からエクソン４までを含むヒトＩＬ−４配列の連続ゲノム断片で置換されている。

一実施形態では、ヒトまたはヒト化ＩＬ−４Ｒαタンパク質をコードする改変されたＩ
Ｌ−４Ｒα遺伝子の発現は、内因性マウスＩＬ−４Ｒα遺伝子座のマウス調節エレメント
の制御下にある。

一態様では、内因性齧歯類ＩＬ−４Ｒα遺伝子のヒト化を含む遺伝子改変齧歯類（例え
ば、マウスまたはラット）が提供され、このヒト化は、改変された（すなわち、ヒト化し
た）ＩＬ−４Ｒα遺伝子を形成するための、内因性齧歯類ＩＬ−４Ｒα遺伝子座における
、ヒトＩＬ−４Ｒα遺伝子の少なくとも１つのエクソンをコードする核酸配列による齧歯
類ＩＬ−４Ｒα遺伝子のエクソンを含む齧歯類核酸の置換を含み、改変されたヒト化ＩＬ
−４Ｒα遺伝子の発現は、内因性齧歯類ＩＬ−４Ｒα遺伝子座の齧歯類調節エレメントの
制御下にある。

一実施形態では、齧歯類はマウスまたはラットである。一実施形態では、齧歯類はマウ
スである。一実施形態では、齧歯類はラットである。

一実施形態では、改変されたＩＬ−４Ｒα遺伝子は、ヒトまたはヒト化ＩＬ−４Ｒαタ
ンパク質をコードし、かつヒトＩＬ−４Ｒα遺伝子のＡＴＧ開始コドンから開始するエク
ソン１からエクソン５までを含む。

一実施形態では、齧歯類は、マウスＩＬ−４Ｒαタンパク質を発現する能力を有しない
マウスである。

一実施形態では、齧歯類は、内因性マウスＩＬ−４遺伝子によってコードされたマウス
ＩＬ−４タンパク質を発現するマウスである。

一実施形態では、齧歯類はヒトまたはヒト化ＩＬ−４タンパク質を発現するマウスであ
る。

一実施形態では、齧歯類は、改変されたＩＬ−４遺伝子を形成するための、内因性マウ
スＩＬ−４遺伝子座における、ヒトＩＬ−４遺伝子の少なくとも１つのエクソンをコード
する核酸配列によるマウスＩＬ−４遺伝子のエクソンを含むマウス核酸の置換を含むマウ
スであり、改変されたＩＬ−４遺伝子の発現は、内因性マウスＩＬ−４遺伝子座のマウス
調節エレメントの制御下にある。

一実施形態では、齧歯類はマウスであり、かつＩＬ−４ＲαのＡＴＧ開始コドンから開
始するエクソン１からエクソン５までを含むマウスＩＬ−４Ｒα配列の連続ゲノム断片が
、ヒトＩＬ−４ＲαのＡＴＧ開始コドンから開始するエクソン１からエクソン５までを含
むヒトＩＬ−４Ｒα配列の連続ゲノム断片で置換されている。

一態様では、ヒトまたはヒト化ＩＬ−４タンパク質を発現する遺伝子改変齧歯類（例え
ば、マウスまたはラット）が提供され、ここで、ヒトまたはヒト化ＩＬ−４タンパク質を
発現する齧歯類は正常な免疫系を含む、すなわちヒトまたはヒト化ＩＬ−４タンパク質を
発現する齧歯類の血液、血漿、または血清中の免疫細胞（例えば、Ｂ細胞およびＴ細胞）
の数が、機能性内因性ＩＬ−４タンパク質を発現する齧歯類の血液、血漿、または血清中
の免疫細胞（例えば、Ｂ細胞およびＴ細胞）の数と類似している。一実施形態では、齧歯
類はマウスである。一実施形態では、齧歯類はラットである。

一態様では、ヒトまたはヒト化ＩＬ−４遺伝子由来のＩＬ−４タンパク質を発現する遺
伝子改変齧歯類（例えば、マウスまたはラット）が提供され、齧歯類はその血清中にヒト
またはヒト化ＩＬ−４タンパク質を発現する。一実施形態では、齧歯類はマウスである。
一実施形態では、齧歯類はラットである。

一実施形態では、ヒトまたはヒト化ＩＬ−４タンパク質を発現する齧歯類の血清は、機
能性内因性ＩＬ−４タンパク質を発現する齧歯類（例えば、野生型のマウスまたはラット
）とほぼ同じレベルのＩＬ−４タンパク質を有する。一実施形態では、齧歯類はマウスで
ある。一実施形態では、齧歯類はラットである。

一実施形態では、マウスは血清中にヒトまたはヒト化ＩＬ−４タンパク質を、機能性内
因性ＩＬ−４タンパク質を発現するが内因性マウスＩＬ−４遺伝子座における内因性ＩＬ
−４遺伝子のヒトＩＬ−４遺伝子による置換を含まない同齢のマウスの血清中に存在する
ＩＬ−４タンパク質のレベルの少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、
６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％
、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、または２００％の濃度で発現す
る。

一実施形態では、マウスは血清中にヒトまたはヒト化ＩＬ−４タンパク質を、機能性内
因性ＩＬ−４タンパク質を発現するが内因性マウスＩＬ−４遺伝子座における内因性ＩＬ
−４遺伝子のヒトＩＬ−４遺伝子による置換を含まない同齢のマウスの血清中に存在する
マウスＩＬ−４タンパク質のレベルの約１０％〜約２００％、約２０％〜約１５０％、ま
たは約３０％〜約１００％の濃度で発現する。

一態様では、ヒトまたはヒト化ＩＬ−４Ｒαタンパク質を発現する遺伝子改変齧歯類（
例えば、マウスまたはラット）が提供され、齧歯類は、機能性内因性ＩＬ−４Ｒαタンパ
ク質を発現する同齢の齧歯類の免疫細胞（例えば、Ｂ細胞およびＴ細胞）上に存在するＩ
Ｌ−４Ｒαタンパク質のレベルと類似したレベルで、免疫細胞（例えば、Ｂ細胞およびＴ
細胞）上にヒトまたはヒト化ＩＬ−４Ｒαタンパク質を発現する。一実施形態では、齧歯
類はマウスである。一実施形態では、齧歯類はラットである。

一態様では、ヒトＩＬ−４Ｒα遺伝子由来のＩＬ−４Ｒαタンパク質を発現する遺伝子
改変齧歯類（例えば、マウスまたはラット）が提供され、齧歯類はヒトまたはヒト化ＩＬ
−４Ｒαタンパク質を免疫細胞（例えば、Ｂ細胞およびＴ細胞）上に発現する。一実施形
態では、齧歯類はマウスである。一実施形態では、齧歯類はラットである。

一実施形態では、ヒトまたはヒト化ＩＬ−４Ｒαタンパク質を発現する齧歯類の免疫細
胞（例えば、Ｂ細胞およびＴ細胞）は、ほぼ同じレベルのＩＬ−４Ｒαタンパク質を、機
能性内因性ＩＬ−４Ｒαタンパク質を発現する齧歯類（例えば、野生型のマウスまたはラ
ット）の免疫細胞（例えば、Ｂ細胞およびＴ細胞）上に有する。一実施形態では、齧歯類
はマウスである。一実施形態では、齧歯類はラットである。

一実施形態では、マウスはヒトまたはヒト化ＩＬ−４Ｒαタンパク質を免疫細胞（例え
ば、Ｂ細胞およびＴ細胞）上に、機能性内因性ＩＬ−４Ｒαタンパク質を発現するが内因
性マウスＩＬ−４Ｒα遺伝子座における内因性ＩＬ−４Ｒα遺伝子のヒトＩＬ−４Ｒα遺
伝子による置換を含まない同齢のマウスの免疫細胞（例えば、Ｂ細胞およびＴ細胞）上の
ＩＬ−４Ｒαタンパク質の量の少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、
６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％
、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、または２００％の量で発現する
。

一実施形態では、マウスはヒトまたはヒト化ＩＬ−４Ｒαタンパク質を免疫細胞（例え
ば、Ｂ細胞およびＴ細胞）上に、機能性内因性ＩＬ−４Ｒαタンパク質を発現するが内因
性マウスＩＬ−４Ｒα遺伝子座における内因性ＩＬ−４Ｒα遺伝子のヒトＩＬ−４Ｒα遺
伝子による置換を含まない同齢のマウスの免疫細胞（例えば、Ｂ細胞およびＴ細胞）上に
存在するマウスＩＬ−４Ｒαタンパク質の量の約１０％〜約２００％、約２０％〜約１５
０％、または約３０％〜約１００％の量で発現する。

一態様では、齧歯類ＩＬ−４Ｒα細胞外ドメインコード配列のヒトＩＬ−４Ｒα細胞外
ドメインコード配列による置換を含むヒト化ＩＬ−４Ｒα遺伝子を含む遺伝子改変齧歯類
が提供され、ヒト化ＩＬ−４Ｒα遺伝子は齧歯類ＩＬ−４Ｒα膜貫通配列および齧歯類Ｉ
Ｌ−４Ｒα細胞質配列を含み、ヒト化ＩＬ−４Ｒα遺伝子は内因性ＩＬ−４Ｒα遺伝子座
の内因性齧歯類ＩＬ−４Ｒα調節エレメントの制御下にあり、かつ齧歯類は、ヒトまたは
ヒト化ＩＬ−４タンパク質をコードするヒト化ＩＬ−４遺伝子をさらに含み、ヒト化ＩＬ
−４遺伝子は内因性ＩＬ−４遺伝子座の内因性齧歯類ＩＬ−４調節エレメントの制御下に
ある。

一実施形態では、齧歯類はマウスまたはラットである。一実施形態では、齧歯類はマウ
スである。一実施形態では、齧歯類はラットである。

一実施形態では、マウスは、マウスＩＬ−４タンパク質を発現する能力を有さず、かつ
マウスＩＬ−４Ｒαタンパク質を発現する能力を有しない。

一実施形態では、内因性齧歯類ＩＬ−４遺伝子座および／または齧歯類ＩＬ−４Ｒα遺
伝子座の齧歯類調節エレメントまたは配列は、マウスまたはラット由来である。

一実施形態では、齧歯類調節エレメントまたは配列は、齧歯類ＩＬ−４遺伝子座および
／または齧歯類ＩＬ−４Ｒα遺伝子座の内因性齧歯類調節エレメントまたは配列である。

一態様では、ヒトまたはヒト化ＩＬ−４および／またはＩＬ−４Ｒαタンパク質を発現
する非ヒト動物（例えば、齧歯類、例えば、マウスまたはラット）が提供され、非ヒト動
物は内因性非ヒトＩＬ−４Ｒα遺伝子座および／または内因性非ヒトＩＬ−４Ｒα遺伝子
座からヒトまたはヒト化ＩＬ−４および／またはＩＬ−４Ｒαタンパク質を発現する。一
実施形態では、非ヒト動物は齧歯類である。一実施形態では、齧歯類はマウスである。一
実施形態では、齧歯類はラットである。

一態様では、内因性マウスＩＬ−４遺伝子座からヒトまたはヒト化ＩＬ−４タンパク質
を発現する遺伝子改変マウスが提供され、内因性マウスＩＬ−４遺伝子は全体的または部
分的に、ヒトＩＬ−４遺伝子で置換されている。

一実施形態では、ＡＴＧ開始コドンから開始するエクソン１からエクソン４まで（３’
非翻訳領域を含む）およびエクソン４の下流の３’領域の一部分を含む、内因性マウスＩ
Ｌ−４遺伝子座の約６．３ｋｂの連続マウスゲノム核酸が除去され、ヒトＩＬ−４遺伝子
のＡＴＧ開始コドンから開始するエクソン１からエクソン４まで（３’非翻訳領域を含む
）およびエクソン４の下流の３’領域の一部分を含む約８．８ｋｂのヒトＩＬ−４核酸配
列で置換される。特定の実施形態では、マウスゲノム核酸と置き換わるヒトＩＬ−４核酸
配列は、ヒトＢＡＣ ＲＰ１１−１７Ｋ１９のヒトＩＬ−４遺伝子のＡＴＧ開始コドンか
ら開始するエクソン１からエクソン４までおよびエクソン４の下流の３’領域の一部分を
含む。特定の実施形態では、改変されたＩＬ−４遺伝子は、マウスＩＬ−４ ５’調節エ
レメント、およびＡＴＧ開始コドンから開始するヒトＩＬ−４エクソン１からエクソン４
まで（すなわち、ＩＬ−４タンパク質コード配列）を含む。

一態様では、ヒトまたはヒト化ＩＬ−４タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含
む遺伝子改変マウスが提供され、ヒトまたはヒト化ＩＬ−４タンパク質をコードするヌク
レオチド配列は全体的または部分的に、内因性マウスＩＬ−４タンパク質をコードする内
因性ヌクレオチド配列と置き換わる。

一態様では、内因性マウスＩＬ−４Ｒα遺伝子座からヒトまたはヒト化ＩＬ−４Ｒαタ
ンパク質を発現する遺伝子改変マウスが提供され、内因性マウスＩＬ−４Ｒα遺伝子は全
体的または部分的に、ヒトＩＬ−４Ｒα遺伝子で置換されている。

一実施形態では、ＡＴＧ開始コドンから開始するエクソン１からエクソン５までおよび
イントロン５の一部分を含む、内因性マウスＩＬ−４Ｒα遺伝子座の約７．１ｋｂの連続
マウスゲノム核酸が除去され、ヒトＩＬ−４Ｒα遺伝子のＡＴＧ開始コドンから開始する
エクソン１からエクソン５までおよびイントロン５の一部分を含む約１５．６ｋｂのヒト
ＩＬ−４Ｒα核酸配列で置換される。特定の実施形態では、マウスゲノム核酸と置き換わ
るヒトＩＬ−４α核酸は、ヒトＢＡＣ ＲＰ１１−１６Ｅ２４のヒトＩＬ−４α遺伝子の
ＡＴＧ開始コドンから開始するエクソン１からエクソン５までおよびイントロン５の一部
分を含む。特定の実施形態では、マウスゲノム核酸と置き換わるヒトＩＬ−４Ｒα核酸は
、ヒトＩＬ−４Ｒα細胞外ドメインコード配列全体を含む。

一態様では、ヒトまたはヒト化ＩＬ−４タンパク質をコードする改変されたヒト化ＩＬ
−４遺伝子を形成するために、齧歯類ＩＬ−４タンパク質をコードする齧歯類ＩＬ−４遺
伝子配列をヒトＩＬ−４遺伝子配列の１つ以上のエクソンを含むヒトＩＬ−４核酸配列で
置換することを含む、ヒト化ＩＬ−４齧歯類を作製するための方法が提供され、ここで、
置換は内因性齧歯類ＩＬ−４遺伝子座においてなされ、ヒトＩＬ−４遺伝子配列の１つ以
上のエクソンを含むヒト化ＩＬ−４遺伝子配列であってヒトまたはヒト化ＩＬ−４タンパ
ク質をコードするヒト化ＩＬ−４遺伝子配列は、内因性齧歯類ＩＬ−４遺伝子座の齧歯類
調節エレメントまたは配列（例えば、５’および／または３’調節エレメント）に作動可
能に連結される。

一実施形態では、齧歯類はマウスまたはラットである。一実施形態では、齧歯類はマウ
スである。一実施形態では、齧歯類はラットである。

一実施形態では、齧歯類調節エレメントまたは配列はマウス由来である。一実施形態で
は、齧歯類調節エレメントまたは配列はラット由来である。

一実施形態では、齧歯類調節エレメントまたは配列は、齧歯類ＩＬ−４遺伝子座の内因
性齧歯類調節エレメントまたは配列である。一実施形態では、齧歯類はマウスである。一
実施形態では、齧歯類はラットである。

一実施形態では、齧歯類ＩＬ−４遺伝子配列と置き換わるヒトＩＬ−４核酸配列は、ヒ
トＩＬ−４遺伝子配列の少なくとも１つのエクソンを含む。他の実施形態では、齧歯類Ｉ
Ｌ−４遺伝子配列と置き換わるヒトＩＬ−４核酸配列は、ヒトＩＬ−４遺伝子配列の少な
くとも２つまたは少なくとも３つのエクソンを含む。一実施形態では、齧歯類ＩＬ−４遺
伝子配列と置き換わるヒトＩＬ−４核酸配列は、ヒトＩＬ−４遺伝子配列の４つのエクソ
ンを全て含む。一実施形態では、齧歯類はマウスである。一実施形態では、齧歯類はラッ
トである。

一実施形態では、齧歯類ＩＬ−４遺伝子配列と置き換わるヒトＩＬ−４核酸配列は、ヒ
トＩＬ−４（例えば、GenBank Accession No. NM_000589.3sで示される核酸によって
コードされるヒトＩＬ−４タンパク質）と約８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、
９８％、または約９９％同一であるタンパク質をコードする。

一実施形態では、置換は内因性齧歯類ＩＬ−４遺伝子座においてなされ、ヒトＩＬ−４
遺伝子配列の１つ以上のエクソンを含むヒト化ＩＬ−４遺伝子配列であってヒトまたはヒ
ト化ＩＬ−４タンパク質をコードするヒト化ＩＬ−４遺伝子配列は、内因性齧歯類ＩＬ−
４遺伝子座の内因性齧歯類調節エレメントまたは配列（例えば、５’および／または３’
調節エレメント）に作動可能に連結される。

一態様では、ヒトまたはヒト化ＩＬ−４タンパク質をコードする改変されたヒト化ＩＬ
−４遺伝子を形成するために、マウスＩＬ−４タンパク質をコードするマウスＩＬ−４遺
伝子配列をヒトＩＬ−４遺伝子配列で置換することを含む、ヒト化ＩＬ−４マウスを作製
するための方法が提供される。

一実施形態では、置換は内因性マウスＩＬ−４遺伝子座においてなされ、その結果得ら
れるヒトまたはヒト化ＩＬ−４タンパク質をコードするヒト化ＩＬ−４遺伝子は、内因性
マウスＩＬ−４遺伝子座のマウス調節エレメントまたは配列（例えば、５’および／また
は３’調節エレメント）に作動可能に連結される。

一実施形態では、置換は内因性マウスＩＬ−４遺伝子座においてなされ、ヒトまたはヒ
ト化ＩＬ−４タンパク質をコードするヒト化ＩＬ−４遺伝子は、内因性マウスＩＬ−４遺
伝子座の内因性マウス調節エレメントまたは配列（例えば、５’および／または３’調節
エレメント）に作動可能に連結される。

一態様では、ヒトまたはヒト化ＩＬ−４Ｒαタンパク質をコードする改変されたヒト化
ＩＬ−４Ｒα遺伝子を形成するために、齧歯類ＩＬ−４Ｒαタンパク質をコードする齧歯
類ＩＬ−４Ｒα遺伝子配列をヒトＩＬ−４Ｒα遺伝子配列の１つ以上のエクソンを含むヒ
トＩＬ−４Ｒα核酸配列で置換することを含む、ヒト化ＩＬ−４Ｒα齧歯類を作製するた
めの方法が提供され、ここで、置換は内因性齧歯類ＩＬ−４Ｒα遺伝子座においてなされ
、ヒトＩＬ−４Ｒα遺伝子配列の１つ以上のエクソンを含むヒト化ＩＬ−４Ｒα遺伝子配
列であってヒトまたはヒト化ＩＬ−４Ｒαタンパク質をコードするヒト化ＩＬ−４Ｒα遺
伝子配列は、内因性齧歯類ＩＬ−４Ｒα遺伝子座の齧歯類調節エレメントまたは配列（例
えば、５’および／または３’調節エレメント）に作動可能に連結される。

一実施形態では、齧歯類はマウスまたはラットである。一実施形態では、齧歯類はマウ
スである。一実施形態では、齧歯類はラットである。

一実施形態では、齧歯類調節エレメントまたは配列はマウス由来である。一実施形態で
は、齧歯類調節エレメントまたは配列はラット由来である。

一実施形態では、齧歯類調節エレメントまたは配列は、齧歯類ＩＬ−４Ｒα遺伝子座の
内因性齧歯類調節エレメントまたは配列である。一実施形態では、齧歯類はマウスである
。一実施形態では、齧歯類はラットである。

一実施形態では、齧歯類ＩＬ−４Ｒα遺伝子配列と置き換わるヒトＩＬ−４Ｒα核酸配
列は、ヒトＩＬ−４Ｒα遺伝子配列の少なくとも１つのエクソンを含む。他の実施形態で
は、齧歯類ＩＬ−４αＲ遺伝子配列と置き換わるヒトＩＬ−４Ｒα核酸配列は、ヒトＩＬ
−４Ｒα遺伝子配列の少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、または８つのエ
クソンを含む。一実施形態では、齧歯類ＩＬ−４Ｒα遺伝子配列と置き換わるヒトＩＬ−
４Ｒα核酸配列は、ヒトＩＬ−４Ｒα遺伝子配列の９つのエクソンを全て含む。一実施形
態では、齧歯類はマウスである。一実施形態では、齧歯類はラットである。

一実施形態では、齧歯類ＩＬ−４Ｒα遺伝子配列と置き換わるヒトＩＬ−４Ｒα核酸配
列は、ヒトＩＬ−４Ｒα（例えば、GenBank Accession No. NM_000418.3で示される核
酸によってコードされるヒトＩＬ−４Ｒαタンパク質）と約８５％、９０％、９５％、９
６％、９７％、９８％、または約９９％同一であるタンパク質をコードする。

一実施形態では、齧歯類ＩＬ−４Ｒα遺伝子配列と置き換わるヒトＩＬ−４Ｒα核酸配
列は、ヒトＩＬ−４Ｒαタンパク質の細胞外ドメインをコードするヒトＩＬ−４Ｒα遺伝
子配列の少なくとも１つのエクソンを含む。他の実施形態では、齧歯類ＩＬ−４Ｒα遺伝
子配列と置き換わるヒトＩＬ−４Ｒα核酸配列は、ヒトＩＬ−４Ｒαタンパク質の細胞外
ドメインをコードするヒトＩＬ−４Ｒα遺伝子配列の少なくとも２つ、３つ、または４つ
のエクソンを含む。一実施形態では、齧歯類ＩＬ−４Ｒα遺伝子配列と置き換わるヒトＩ
Ｌ−４Ｒα核酸配列は、ヒトＩＬ−４Ｒαタンパク質の細胞外ドメインをコードするヒト
ＩＬ−４Ｒα遺伝子配列の５つのエクソンを全て含む。一実施形態では、齧歯類はマウス
である。一実施形態では、齧歯類はラットである。

一実施形態では、齧歯類ＩＬ−４Ｒα遺伝子配列と置き換わるヒトまたはヒト化ＩＬ−
４Ｒα遺伝子配列は、ヒトＩＬ−４Ｒαタンパク質（例えば、GenBank Accession No.
NM_000418.3で示される核酸によってコードされるヒトＩＬ−４Ｒαタンパク質）の細
胞外ドメインと約８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または約９９％同
一であるＩＬ−４Ｒαタンパク質の細胞外ドメインをコードする。

一実施形態では、置換は内因性齧歯類ＩＬ−４Ｒα遺伝子座においてなされ、ヒトＩＬ
−４Ｒα遺伝子配列の１つ以上のエクソンを含むヒト化ＩＬ−４Ｒα遺伝子配列であって
ヒトまたはヒト化ＩＬ−４Ｒαタンパク質をコードするヒト化ＩＬ−４Ｒα遺伝子配列は
、内因性齧歯類ＩＬ−４Ｒα遺伝子座の内因性齧歯類調節エレメントまたは配列（例えば
、５’および／または３’調節エレメント）に作動可能に連結される。

一態様では、ヒトまたはヒト化ＩＬ−４Ｒαタンパク質をコードする改変されたヒト化
ＩＬ−４Ｒα遺伝子を形成するために、マウスＩＬ−４Ｒαタンパク質をコードするマウ
スＩＬ−４Ｒα遺伝子配列をヒトＩＬ−４Ｒα核酸配列で置換することを含む、ヒト化Ｉ
Ｌ−４Ｒαマウスを作製するための方法が提供される。

一実施形態では、置換は内因性マウスＩＬ−４Ｒα遺伝子座においてなされ、ヒトまた
はヒト化ＩＬ−４Ｒαタンパク質をコードするヒト化ＩＬ−４Ｒα遺伝子は、内因性マウ
スＩＬ−４Ｒα遺伝子座のマウス調節エレメントまたは配列（例えば、５’および／また
は３’調節エレメント）に作動可能に連結される。

一実施形態では、置換は内因性マウスＩＬ−４Ｒα遺伝子座においてなされ、ヒトまた
はヒト化ＩＬ−４Ｒαタンパク質をコードするヒト化ＩＬ−４Ｒα遺伝子は、内因性マウ
スＩＬ−４Ｒα遺伝子座の内因性マウス調節エレメントまたは配列（例えば、５’および
／または３’調節エレメント）に作動可能に連結される。

様々な態様では、本明細書に記載される遺伝子改変非ヒト動物（例えば、齧歯類、例え
ば、マウスまたはラット）は、それらの生殖系列に遺伝子改変を含む。

一態様では、本明細書に記載されるような遺伝子改変を含む、非ヒト動物（例えば、齧
歯類、例えば、マウスまたはラット）の胚が提供される。

一態様では、本明細書に記載されるような遺伝子改変を含むドナー細胞を含む非ヒト動
物（例えば、齧歯類、例えば、マウスまたはラット）の宿主胚が提供される。

一態様では、本明細書に記載されるような遺伝子改変を含む多能性または全能性の非ヒ
ト動物（例えば、齧歯類、例えば、マウスまたはラット）の細胞が提供される。一実施形
態では、細胞は齧歯類細胞である。一実施形態では、細胞はマウス細胞である。一実施形
態では、細胞は齧歯類ＥＳ細胞である。一実施形態では、細胞はマウスＥＳ細胞である。

一態様では、非ヒト動物（例えば、齧歯類、例えば、マウスまたはラット）の卵子が提
供され、非ヒト動物の卵子は異所性非ヒト動物染色体を含み、異所性非ヒト動物染色体は
本明細書に記載されるような遺伝子改変を含む。一実施形態では、非ヒト動物は齧歯類で
ある。一実施形態では、齧歯類はマウスである。一実施形態では、齧歯類はラットである
。

一態様では、ヒトＩＬ−４遺伝子またはヒトＩＬ−４Ｒα遺伝子を含むように遺伝子改
変されたマウスの胚、卵子、または細胞は、Ｃ５７ＢＬ／Ａ、Ｃ５７ＢＬ／Ａｎ、Ｃ５７
ＢＬ／ＧｒＦａ、Ｃ５７ＢＬ／ＫａＬｗＮ、Ｃ５７ＢＬ／６、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、Ｃ５７
ＢＬ／６ＢｙＪ、Ｃ５７ＢＬ／６ＮＪ、Ｃ５７ＢＬ／１０、Ｃ５７ＢＬ／１０ＳｃＳｎ、
Ｃ５７ＢＬ／１０Ｃｒ、およびＣ５７ＢＬ／Ｏｌａから選択されるＣ５７ＢＬ系統のマウ
スのものである。別の実施形態では、マウスは、１２９Ｐ１、１２９Ｐ２、１２９Ｐ３、
１２９Ｘ１、１２９Ｓ１（例えば、１２９Ｓ１／ＳＶ、１２９Ｓ１／Ｓｖｌｍ）、１２９
Ｓ２、１２９Ｓ４、１２９Ｓ５、１２９Ｓ９／ＳｖＥｖＨ、１２９Ｓ６（１２９／ＳｖＥ
ｖＴａｃ）、１２９Ｓ７、１２９Ｓ８、１２９Ｔ１、１２９Ｔ２である系統からなる群か
ら選択される１２９系統である（例えば、Ｆｅｓｔｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｒ
ｅｖｉｓｅｄ ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ ｆｏｒ ｓｔｒａｉｎ １２９ ｍｉｃｅ，
Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｇｅｎｏｍｅ １０：８３６を参照のこと。また、Ａｕｅｒｂａｃ
ｈ ｅｔ ａｌ（２０００）Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ａｎｄ Ｃｈｉｍｅｒａ Ａ
ｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ １２９／ＳｖＥｖ− ａｎｄ Ｃ５７ＢＬ／６−Ｄｅｒｉｖｅｄ
Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅｓも参照のこと）。
特定の実施形態では、遺伝子改変マウスは、前述の１２９系統と前述のＣ５７ＢＬ／６系
統との混合である。別の特定の実施形態では、マウスは前述の１２９系統の混合、または
前述のＢＬ／６系統の混合である。特定の実施形態では、上記混合の１２９系統は１２９
Ｓ６（１２９／ＳｖＥｖＴａｃ）系統である。別の実施形態では、マウスはＢＡＬＢ系統
、例えばＢＡＬＢ／ｃ系統、である。さらに別の実施形態では、マウスはＢＡＬＢ系統と
別の前述の系統との混合である。一実施形態では、マウスはスイスマウスまたはスイスウ
ェブスターマウスである。

様々な態様では、ヒトまたはヒト化ＩＬ−４Ｒおよび／またはＩＬ−４核酸配列を含む
非ヒト動物は、哺乳類および鳥類から選択される。一実施形態では、非ヒト動物は哺乳類
である。一実施形態では、哺乳類はネズミ科である。

一態様では、ヒト特異的なＩＬ−４またはＩＬ−４Ｒα拮抗薬をスクリーニングする方
法が提供される。方法は、治療薬候補の同定および治療有効性の評価に有用である。方法
は、本明細書に記載されるようにＩＬ−４およびＩＬ−４Ｒαを二重にヒト化した遺伝子
改変齧歯類に薬剤を投与することと、ＩＬ−４／ＩＬ−４Ｒαシグナル伝達経路によって
媒介される生物学的機能に対する薬剤の効果を判定することと、薬剤が遺伝子改変齧歯類
においてＩＬ−４／ＩＬ−４Ｒαシグナル伝達経路によって媒介される機能と拮抗する場
合に薬剤をヒト特異的なＩＬ−４またはＩＬ−４Ｒα拮抗薬として同定することと、を含
む。

一実施形態では、薬剤は、ＩＬ−４またはＩＬ−４Ｒαと結合する免疫グロブリン可変
ドメインを含む。一実施形態では、薬剤は、ヒトＩＬ−４またはＩＬ−４Ｒαに特異的に
結合するが、齧歯類ＩＬ−４またはＩＬ−４Ｒαには結合しない。一実施形態では、薬剤
は抗体である。特定の実施形態では、薬剤は、ヒトＩＬ−４Ｒαと特異的に結合するが齧
歯類ＩＬ−４Ｒαとは結合しない抗体である。

一実施形態では、スクリーニング方法は、ヒトＩＬ−４タンパク質およびヒト化ＩＬ−
４Ｒαタンパク質を発現する二重にヒト化したマウスを利用し、ヒト化ＩＬ−４Ｒαタン
パク質は、内因性マウスＩＬ−４Ｒαタンパク質の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメイン
に連結されたヒトＩＬ−４Ｒαタンパク質の細胞外ドメインを含み、上記マウスはネズミ
のＩＬ−４またはネズミのＩＬ−４Ｒαを発現しない。

一部の実施形態では、スクリーニングの方法は、本明細書に記載されるように二重にヒ
ト化した齧歯類においてＩＬ−４／ＩＬ−４Ｒαシグナル伝達と関連する疾患を誘発する
ことと、薬剤を齧歯類に投与することと、薬剤が疾患を軽快させるかどうかを判定するこ
とと、薬剤が疾患を軽快させる場合に薬剤を、疾患を処置するために好適なヒト特異的な
ＩＬ−４またはＩＬ−４Ｒα拮抗薬として同定することと、を含む。

一部の実施形態では、ＩＬ−４／ＩＬ−４Ｒαシグナル伝達と関連する疾患は気道炎症
であり、これは、齧歯類において、アレルゲン（例えば、チリダニ類抽出物）を一定期間
、１回以上、鼻腔内投与することによって誘発できる。薬剤の投与の結果として気道炎症
の程度（例えば、粘液貯留、気管支肺胞洗浄液中の浸潤性細胞、および／または総循環Ｉ
ｇＥのレベルによって表される）が低減するかどうかを測定することによって薬剤の効果
を判定できる。

一部の実施形態では、ＩＬ−４／ＩＬ−４Ｒαシグナル伝達と関連する疾患は、皮膚炎
症またはアトピー性皮膚炎であり、これらは、齧歯類に皮膚損傷を生じさせ、損傷した皮
膚をアレルゲン（例えば、細菌毒素またはチリダニ類抽出物）に一定期間、１回以上、曝
露することによって誘発できる。薬剤の投与の結果として皮膚炎症が低減するかどうかを
測定することによって薬剤の効果を判定できる。

さらなる態様では、そのＩＬ−４、ＩＬ−４Ｒα、およびＩＬ−３３遺伝子が本明細書
に記載されるようにヒト化されている三重にヒト化した非ヒト動物が、化合物または化合
物の組み合わせの薬力学（ＰＤ）および治療有効性を評価するために使用される。

実施形態または態様の状況から明示的に、あるいは明らかに、除外されない限り、本明
細書に記載される態様および実施形態の各々を一緒に使用できる。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
内因性齧歯類ＩＬ−４Ｒ遺伝子のヒト化を含む齧歯類であって、前記ヒト化が、改変さ
れたＩＬ−４遺伝子を形成するための、内因性齧歯類ＩＬ−４遺伝子座における、ヒトＩ
Ｌ−４遺伝子の少なくとも１つのエクソンを含む核酸配列によるＩＬ−４遺伝子のエクソ
ンを含む齧歯類核酸の置換を含み、前記改変されたＩＬ−４遺伝子の発現が、前記内因性
齧歯類ＩＬ−４遺伝子座の齧歯類調節エレメントの制御下にある、齧歯類。
（項目２）
前記齧歯類がマウスまたはラットである、項目１に記載の齧歯類。
（項目３）
前記改変されたＩＬ−４遺伝子が、ヒトまたはヒト化ＩＬ−４タンパク質をコードし、
前記ヒトＩＬ−４遺伝子のＡＴＧ開始コドンから開始するエクソン１からエクソン４まで
を含む、項目１に記載の齧歯類。
（項目４）
前記齧歯類が、マウスＩＬ−４タンパク質を発現する能力を有しないマウスである、項
目１に記載の齧歯類。
（項目５）
前記齧歯類が、内因性マウスＩＬ−４Ｒα遺伝子によってコードされたマウスＩＬ−４
Ｒαタンパク質を発現するマウスである、項目１に記載の齧歯類。
（項目６）
前記齧歯類が、ヒトまたはヒト化ＩＬ−４Ｒαタンパク質を発現するマウスである、項
目１に記載の齧歯類。
（項目７）
前記ヒト化ＩＬ−４Ｒαタンパク質が、前記ヒトＩＬ−４Ｒαタンパク質の細胞外ドメ
インを含む、項目６に記載のマウス。
（項目８）
前記ヒト化ＩＬ−４Ｒαタンパク質が、前記マウスＩＬ−４Ｒαタンパク質の膜貫通ド
メインおよび細胞質ドメインを含む、項目７に記載のマウス。
（項目９）
前記マウスが、改変されたＩＬ−４Ｒα遺伝子を形成するための、内因性マウスＩＬ−
４Ｒα遺伝子座における、ヒトＩＬ−４Ｒα遺伝子の少なくとも１つのエクソンをコード
する核酸配列によるマウスＩＬ−４Ｒα遺伝子のエクソンを含むマウス核酸の置換を含み
、前記改変されたＩＬ−４Ｒα遺伝子の発現が、前記内因性マウスＩＬ−４Ｒα遺伝子座
のマウス調節エレメントの制御下にある、項目６に記載のマウス。
（項目１０）
前記齧歯類がマウスであり、マウスＩＬ−４のＡＴＧ開始コドンから開始するエクソン
１からエクソン４までを含むマウスＩＬ−４配列の連続ゲノム断片が、ヒトＩＬ−４のＡ
ＴＧ開始コドンから開始するエクソン１からエクソン４までを含むヒトＩＬ−４配列の連
続ゲノム断片で置換されている、項目１に記載の齧歯類。
（項目１１）
前記齧歯類が、機能性内因性マウスＩＬ−４タンパク質を発現するが前記置換を含まな
い同齢のマウスの血清中に存在するマウスＩＬ−４タンパク質のレベルの少なくとも約１
０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、
１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、
１９０％、または２００％の濃度にてヒトまたはヒト化ＩＬ−４タンパク質を血清中に発
現するマウスである、項目１に記載の齧歯類。
（項目１２）
前記齧歯類が、機能性内因性マウスＩＬ−４タンパク質を発現するが前記置換を含まな
い同齢のマウスの血清中に存在するマウスＩＬ−４タンパク質のレベルの約１０％〜約２
００％、約２０％〜約１５０％、または約３０％〜約１００％の濃度にてヒトＩＬ−４タ
ンパク質を血清中に発現するマウスである、項目１に記載の齧歯類。
（項目１３）
内因性齧歯類ＩＬ−４Ｒα遺伝子のヒト化を含む齧歯類であって、前記ヒト化が、ヒト
化ＩＬ−４Ｒα遺伝子を形成するための、内因性齧歯類ＩＬ−４Ｒα遺伝子座における、
ヒトＩＬ−４Ｒα遺伝子の少なくとも１つのエクソンを含む核酸配列による齧歯類ＩＬ−
４Ｒα遺伝子のエクソンを含む齧歯類核酸の置換を含み、前記ヒト化ＩＬ−４Ｒα遺伝子
の発現が、前記内因性齧歯類ＩＬ−４Ｒα遺伝子座の齧歯類調節エレメントの制御下にあ
る、齧歯類。
（項目１４）
前記齧歯類がマウスまたはラットである、項目１３に記載の齧歯類。
（項目１５）
前記ヒト化ＩＬ−４Ｒα遺伝子が、ヒトまたはヒト化ＩＬ−４Ｒαタンパク質をコード
し、前記ヒトＩＬ−４Ｒα遺伝子のＡＴＧ開始コドンから開始するエクソン１からエクソ
ン５までを含む、項目１３に記載の齧歯類。
（項目１６）
前記齧歯類が、マウスＩＬ−４Ｒαタンパク質を発現する能力を有しないマウスである
、項目１３に記載の齧歯類。
（項目１７）
前記齧歯類が、内因性マウスＩＬ−４遺伝子によってコードされたマウスＩＬ−４タン
パク質を発現するマウスである、項目１３に記載の齧歯類。
（項目１８）
前記齧歯類が、ヒトまたはヒト化ＩＬ−４タンパク質を発現するマウスである、項目１
７に記載のマウス。
（項目１９）
前記マウスが、改変されたＩＬ−４遺伝子を形成するための、内因性マウスＩＬ−４遺
伝子座における、ヒトＩＬ−４遺伝子の少なくとも１つのエクソンを含む核酸配列による
マウスＩＬ−４遺伝子のエクソンを含むマウス核酸の置換を含み、前記改変されたＩＬ−
４遺伝子の発現が、前記内因性マウスＩＬ−４遺伝子座のマウス調節エレメントの制御下
にある、項目１８に記載のマウス。
（項目２０）
前記齧歯類がマウスであり、マウスＩＬ−４ＲαのＡＴＧ開始コドンから開始するエク
ソン１からエクソン５までを含むマウスＩＬ−４Ｒα配列の連続ゲノム断片が、ヒトＩＬ
−４ＲαのＡＴＧ開始コドンから開始するエクソン１からエクソン５までを含むヒトＩＬ
−４Ｒα配列の連続ゲノム断片で置換されている、項目１３に記載の齧歯類。
（項目２１）
前記齧歯類が、機能性内因性マウスＩＬ−４Ｒαタンパク質を発現するが前記置換を含
まない同齢のマウスのＢ細胞および／またはＴ細胞のいずれかの免疫細胞上に存在するマ
ウスＩＬ−４Ｒαタンパク質のレベルの少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、
５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、
１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、または２００％の量に
て、Ｂ細胞および／またはＴ細胞のいずれかの免疫細胞上にヒトまたはヒト化ＩＬ−４Ｒ
αタンパク質を発現するマウスである、項目１３に記載の齧歯類。
（項目２２）
前記齧歯類が、機能性内因性マウスＩＬ−４Ｒαタンパク質を発現するが前記置換を含
まない同齢のマウスのＢ細胞および／またはＴ細胞のいずれかの免疫細胞上に存在するマ
ウスＩＬ−４Ｒαタンパク質のレベルの約１０％〜約２００％、約２０％〜約１５０％、
または約３０％〜約１００％の量にて、Ｂ細胞および／またはＴ細胞のいずれかの免疫細
胞上にヒトまたはヒト化ＩＬ−４Ｒαタンパク質を発現するマウスである、項目１３に記
載の齧歯類。
（項目２３）
ヒト化した齧歯類を作製するための方法であって、ヒトまたはヒト化ＩＬ−４タンパク
質をコードする改変されたＩＬ−４遺伝子を形成するために、ヒトＩＬ−４遺伝子の１つ
以上のエクソンを含むヒトＩＬ−４核酸配列で齧歯類ＩＬ−４核酸配列を置換することを
含み、前記置換が、内因性齧歯類ＩＬ−４遺伝子座にあり、ヒトＩＬ−４遺伝子配列の１
つ以上のエクソンを含む前記改変されたＩＬ−４遺伝子配列が、内因性齧歯類ＩＬ−４遺
伝子座の齧歯類調節エレメントまたは配列に作動可能に連結される、方法。
（項目２４）
前記齧歯類がマウスまたはラットである、項目２３に記載の方法。
（項目２５）
前記齧歯類調節エレメントまたは配列がマウスまたはラットに由来する、項目２３に記
載の方法。
（項目２６）
前記齧歯類調節エレメントまたは配列が、前記齧歯類ＩＬ−４遺伝子座の内因性齧歯類
調節エレメントまたは配列である、項目２３に記載の方法。
（項目２７）
前記齧歯類ＩＬ−４核酸配列と置き換わる前記ヒトＩＬ−４核酸配列が、前記ヒトＩＬ
−４遺伝子配列の少なくとも１つのエクソンを含む、項目２３に記載の方法。
（項目２８）
前記齧歯類ＩＬ−４核酸配列と置き換わる前記ヒトＩＬ−４核酸配列が、前記ヒトＩＬ
−４遺伝子配列の少なくとも２つまたは少なくとも３つのエクソンを含む、項目２７に記
載の方法。
（項目２９）
前記齧歯類ＩＬ−４核酸配列と置き換わる前記ヒトＩＬ−４核酸配列が、前記ヒトＩＬ
−４遺伝子配列の４つのエクソンを全て含む、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
前記置換が内因性齧歯類ＩＬ−４遺伝子座にあり、前記ヒトＩＬ−４遺伝子配列の１つ
以上のエクソンを含む前記ヒトＩＬ−４核酸配列が、前記内因性齧歯類ＩＬ−４遺伝子座
の内因性齧歯類調節エレメントまたは配列に作動可能に連結される、項目２３に記載の方
法。
（項目３１）
ヒト化ＩＬ−４マウスを作製するための方法であって、ヒトまたはヒト化ＩＬ−４タン
パク質をコードする改変されたＩＬ−４遺伝子を形成するために、マウスＩＬ−４核酸配
列をヒトＩＬ−４核酸で置換することを含む、方法。
（項目３２）
前記置換が内因性マウスＩＬ−４遺伝子座にあり、ヒトまたはヒト化ＩＬ−４タンパク
質をコードする前記改変された遺伝子が、内因性マウス調節配列に作動可能に連結される
、項目３１に記載の方法。
（項目３３）
前記置換が内因性マウスＩＬ−４遺伝子座にあり、ヒトまたはヒト化ＩＬ−４タンパク
質をコードする前記改変された遺伝子が、内因性マウス調節配列に作動可能に連結される
、項目３１に記載の方法。
（項目３４）
ヒト化した齧歯類を作製するための方法であって、ヒトまたはヒト化ＩＬ−４Ｒαタン
パク質をコードする改変されたＩＬ−４Ｒα遺伝子を形成するために、ヒトＩＬ−４Ｒα
遺伝子配列の１つ以上のエクソンを含むヒトＩＬ−４Ｒα核酸配列で齧歯類ＩＬ−４Ｒα
核酸配列を置換することを含み、前記置換が、内因性齧歯類ＩＬ−４Ｒα遺伝子座にあり
、ヒトまたはヒト化ＩＬ−４Ｒαタンパク質をコードする前記改変されたＩＬ−４Ｒα遺
伝子が、前記内因性齧歯類ＩＬ−４Ｒα遺伝子座の齧歯類調節エレメントまたは配列に作
動可能に連結される、方法。
（項目３５）
前記齧歯類がマウスまたはラットである、項目３４に記載の方法。
（項目３６）
前記齧歯類調節エレメントまたは配列がマウスまたはラットに由来する、項目３４に記
載の方法。
（項目３７）
前記齧歯類調節エレメントまたは配列が、前記齧歯類ＩＬ−４Ｒα遺伝子座の内因性齧
歯類調節エレメントまたは配列である、項目３４に記載の方法。
（項目３８）
前記齧歯類ＩＬ−４Ｒα遺伝子配列と置き換わる前記ヒトＩＬ−４Ｒα遺伝子配列が、
前記ヒトＩＬ−４Ｒα遺伝子配列の少なくとも１つのエクソンを含む、項目３７に記載の
方法。
（項目３９）
前記齧歯類ＩＬ−４Ｒα核酸配列と置き換わる前記ヒトＩＬ−４Ｒα核酸配列が、前記
ヒトＩＬ−４Ｒα遺伝子配列の少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、または
８つのエクソンを含む、項目３８に記載の方法。
（項目４０）
前記齧歯類ＩＬ−４Ｒα核酸配列と置き換わる前記ヒトＩＬ−４Ｒα核酸配列が、前記
ヒトＩＬ−４Ｒα遺伝子配列の９つのエクソンを全て含む、項目３９に記載の方法。
（項目４１）
前記置換が内因性齧歯類ＩＬ−４Ｒα遺伝子座にあり、ヒトまたはヒト化ＩＬ−４Ｒα
タンパク質をコードする前記改変されたＩＬ−４Ｒα遺伝子が、前記内因性齧歯類ＩＬ−
４Ｒα遺伝子座の内因性齧歯類調節エレメントまたは配列に作動可能に連結される、項目
３４に記載の方法。
（項目４２）
ヒト化したマウスを作製するための方法であって、ヒト化ＩＬ−４Ｒα遺伝子を形成す
るために、ヒトＩＬ−４Ｒαの細胞外ドメインをコードするヒトゲノム断片によりマウス
ＩＬ−４Ｒαの細胞外ドメインをコードするマウスエクソンを置換することを含む、方法
。
（項目４３）
前記置換が内因性マウスＩＬ−４Ｒα遺伝子座にあり、前記ヒト化ＩＬ−４Ｒα遺伝子
がマウス調節配列に作動可能に連結される、項目４２に記載の方法。
（項目４４）
前記置換が内因性マウスＩＬ−４Ｒα遺伝子座にあり、前記ヒト化ＩＬ−４Ｒα遺伝子
が内因性マウス調節配列に作動可能に連結される、項目４２に記載の方法。
（項目４５）
ヒト化ＩＬ−４Ｒα遺伝子およびヒト化ＩＬ−４遺伝子を含む齧歯類であって、前記ヒ
ト化ＩＬ−４Ｒα遺伝子は、ヒトＩＬ−４Ｒα細胞外ドメインをコードする配列による齧
歯類ＩＬ−４Ｒα細胞外ドメインをコードする配列の置換から結果として得られ、前記ヒ
ト化ＩＬ−４Ｒα遺伝子は、齧歯類ＩＬ−４Ｒα膜貫通ドメインをコードする配列と齧歯
類ＩＬ−４Ｒα細胞質ドメインをコードする配列とを含み、前記ヒト化ＩＬ−４Ｒα遺伝
子は、内因性齧歯類ＩＬ−４Ｒα遺伝子座の内因性齧歯類ＩＬ−４Ｒα調節エレメントの
制御下にあり、前記ヒト化ＩＬ−４遺伝子は、ヒトまたはヒト化ＩＬ−４タンパク質をコ
ードし、前記ヒト化ＩＬ−４遺伝子は、内因性齧歯類ＩＬ−４Ｒ遺伝子座の内因性齧歯類
ＩＬ−４調節エレメントの制御下にある、齧歯類。
（項目４６）
前記齧歯類がマウスまたはラットである、項目４５に記載の齧歯類。
（項目４７）
前記齧歯類が、マウスＩＬ−４タンパク質を発現する能力を有しないマウスであってマ
ウスＩＬ−４Ｒαタンパク質を発現する能力を有しないマウスである、項目４５に記載の
齧歯類。
（項目４８）
前記内因性齧歯類ＩＬ−４遺伝子座および／または内因性齧歯類ＩＬ−４Ｒα遺伝子座
の前記齧歯類調節エレメントまたは配列が、マウスまたはラット由来である、項目４５に
記載の齧歯類。
（項目４９）
前記齧歯類調節エレメントまたは配列が、前記齧歯類ＩＬ−４遺伝子座および／または
齧歯類ＩＬ−４Ｒα遺伝子座の内因性齧歯類調節エレメントまたは配列である、項目４５
に記載の齧歯類。
（項目５０）
ヒト特異的なＩＬ−４またはＩＬ−４Ｒα拮抗薬をスクリーニングする方法であって、
二重にヒト化したＩＬ−４およびＩＬ−４Ｒαマウスを提供することと、
前記マウスにおいて肺の炎症を誘発することと、
薬剤を前記マウスに投与することと、
前記薬剤によって肺の炎症が低減するかどうかを判定することと、
前記薬剤を、肺の炎症を低減するその能力に基づいてヒト特異的なＩＬ−４またはＩＬ
−４Ｒα拮抗薬として同定することと、
を含む方法。
（項目５１）
気道内の粘液貯留、気管支肺胞洗浄液中の好酸球性浸潤細胞、および／または総循環Ｉ
ｇＥを測定することによって肺の炎症の程度が判定される、項目５０に記載の方法。
（項目５２）
ヒト特異的なＩＬ−４またはＩＬ−４Ｒα拮抗薬をスクリーニングする方法であって、
二重にヒト化したＩＬ−４およびＩＬ−４Ｒαマウスを提供することと、
前記マウスにおいて皮膚炎症を誘発することと、
薬剤を前記マウスに投与することと、
前記薬剤によって皮膚炎症が低減するかどうかを判定することと、
前記薬剤を、皮膚炎症を低減するその能力に基づいてヒト特異的なＩＬ−４またはＩＬ
−４Ｒα拮抗薬として同定することと、
を含む方法。
（項目５３）
ヒト化ＩＬ−４Ｒα遺伝子が、ヒトＩＬ−４Ｒα細胞外ドメインをコードする配列によ
るネズミのＩＬ−４Ｒα細胞外ドメインをコードする配列の置換から結果として得られ、
前記ヒト化ＩＬ−４Ｒα遺伝子が内因性のネズミのＩＬ−４Ｒα遺伝子座の内因性のネズ
ミのＩＬ−４Ｒα調節エレメントの制御下にあり、ヒト化ＩＬ−４遺伝子がヒトまたはヒ
ト化ＩＬ−４タンパク質をコードし、前記ヒト化ＩＬ−４遺伝子は、内因性齧歯類ＩＬ−
４Ｒ遺伝子座の内因性齧歯類ＩＬ−４調節エレメントの制御下にある、項目５０または５
２に記載の方法。

図１は、ＩＬ−４およびＩＬ−１３のシグナル伝達のための受容体、ならびに、ヒトＩＬ−４受容体α鎖（ＩＬ−４Ｒα）に特異的に結合する中和性完全ヒトモノクローナル抗体であるデュピルマブ（dupilumab）の作用機序を図示したものである（実寸に比例していない）。 図２Ａ〜図２Ｂは、ＩＬ−４（Ｉｌ４）およびＩＬ−４Ｒα（Ｉｌ４ｒａ）遺伝子座のヒト化のための戦略を図示したものである（実寸に比例していない）。（２Ａ）図示されるように、ＡＴＧ開始コドンにおいて開始するエクソン１からエクソン４（３’非翻訳領域を含む）までコード領域が広がるマウスＩＬ−４遺伝子（上方）およびエクソン４の下流の３’領域の一部分が除去され、ｌｏｘＰ導入ｈｙｇｒｏ選択カセットｌｏｘＰ、ならびにヒトＩＬ−４遺伝子（下方）のＡＴＧコドンにおいて開始するエクソン１からエクソン４（３’非翻訳領域を含む）までのコード領域およびエクソン４の下流の３’領域の一部分によって置換される。 図２Ａ〜図２Ｂは、ＩＬ−４（Ｉｌ４）およびＩＬ−４Ｒα（Ｉｌ４ｒａ）遺伝子座のヒト化のための戦略を図示したものである（実寸に比例していない）。（２Ｂ）図示されるように、ＡＴＧ開始コドンから開始するエクソン１からエクソン５までコード領域が広がるマウスＩＬ−４Ｒα遺伝子（上方）およびイントロン５の一部分が削除され、ヒトＩＬ−４Ｒα遺伝子（下方）のＡＴＧ開始コードから開始するエクソン１からエクソン５までのコード領域およびイントロン５の一部分、ならびにｌｏｘＰ導入ｎｅｏ選択カセットによって置換される。 図３は、二重にヒト化したＩＬ−４／ＩＬ−４Ｒα（Ｉｌ４^{ｈｕ／ｈｕ}／Ｉｌ４ｒａ^{ｈｕ／ｈｕ}）マウス由来のＢ細胞およびＴ細胞上のヒト化ＩＬ−４Ｒαタンパク質の発現を示す。 図４は、ヒト化ＩＬ４Ｒα（Ｉｌ４ｒａ^{ｈｕ／ｈｕ}）マウス由来の初代細胞を使用してＩＬ−４およびＩＬ−１３のリガンド特異性および受容体機能性を示す。 図５は、野生型マウスにおけるインビボでのＩＬ−４依存的なＩｇＥ産生を示すが、ヒト化したＩＬ４Ｒα（Ｉｌ４ｒａ^{ｈｕ／ｈｕ}）マウスでは示されない。 図６は、エクスビボにおけるマウスＢ細胞での用量依存的なＩＬ−４によるｍＩｇＥ産生の誘発（左パネル）がデュピルマブによって用量依存的な様式で遮断される（右パネル）ことを示す。 図７は、デュピルマブが用量依存的な様式で、ヒト化ＩＬ４Ｒα（Ｉｌ４ｒａ^{ｈｕ／ｈｕ}）マウスにおいてインビボで、ＩＬ−２５が誘発する肺疾患を防止することを示す。 図８は、チリダニ類抽出物（ＨＤＭ）によって誘発された肺炎症モデルにおいて、二重にヒト化したＩＬ−４およびＩＬ−４Ｒα（ＩＬ−４^{ｈｕ／ｈｕ}／ＩＬ−４Ｒ^{ｈｕ／ｈｕ}）マウスを使用してデュピルマブの治療有効性を評価するための実験計画を示す。「ＲＥＧＮ６６８」は、ヒトＩＬ−４Ｒαを対象とするヒトモノクローナル抗体を指し、これはデュピルマブとしても知られる。「ＲＥＧＮ１２９」は、マウスｓｏｌ ＩＬ−１３Ｒα２−Ｆｃを指し、これはマウスＩＬ−１３Ｒ２αの細胞外ドメインとＦｃとの間の融合タンパク質である。 図９は、ＨＤＭによって誘発された肺炎症モデルにおいて、二重にヒト化したＩＬ−４およびＩＬ−４Ｒα（ＩＬ−４^{ｈｕ／ｈｕ}／ＩＬ−４Ｒ^{ｈｕ／ｈｕ}）マウスおよびアイソタイプ対照抗体を使用してデュピルマブの治療有効性を評価するための実験計画を示す。 図１０Ａ〜図１０ＣはマウスＩＬ−３３遺伝子座のヒト化のための戦略を図示する。図１０Ａは、ＡＴＧ開始コドンにおいて開始するエクソン２からエクソン８の終止コドンまでコード領域が広がるマウスＩＬ−３３遺伝子（上方）が削除され、ヒトＩＬ−３３遺伝子（下方）のＡＴＧコドンにおいて開始するエクソン２からエクソン８（３’非翻訳領域を含む）までのコード領域によって置換されることを図示する。 図１０Ａ〜図１０ＣはマウスＩＬ−３３遺伝子座のヒト化のための戦略を図示する。図１０Ｂは、マウスＥＳ細胞クローンＭＡＩＤ ７０６０のヒト化ＩＬ−３３対立遺伝子を示し、これはｌｏｘＰネオマイシン選択カセットを含有する。 図１０Ａ〜図１０ＣはマウスＩＬ−３３遺伝子座のヒト化のための戦略を図示する。図１０Ｃは、マウスＥＳ細胞クローンＭＡＩＤ ７０６１のヒト化ＩＬ−３３対立遺伝子を示し、ここで、ネオマイシン選択カセットは除去されており、ｌｏｘＰおよびクローニング部位（７７ｂｐ）はヒトＩＬ−３３配列の下流に残っており、マウス３’ＵＴＲはｌｏｘＰ部位の下流に保持されている。

治療標的としてのＩＬ−４およびＩＬ−４Ｒα
アレルギー性疾患は、特に先進国において、加速度的に増加して発生する、ある範囲の
疾患である。アトピー性皮膚炎、喘息、およびアレルギー性鼻炎は、アレルギーを有する
患者の中でも最も一般的な炎症状態であり、これらの患者はしばしば多重の臨床症状の発
症を患う。アレルギーの病因は、外因性抗原に対する異常な免疫応答に関連付けられる（
Ｍｕｅｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｂｉｎｄｉｎｇ，ａｎ
ｄ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ ｉｎ ｔｈｅ ＩＬ−４／ＩＬ−１３ ｒｅｃｅｐｔｏｒ
ｓｙｓｔｅｍ，Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １５９２：２３７−２５
０を参照のこと）。

抗原特異的なＩｇＥの過剰産生は、アレルギー性炎症を引き起こすために不可欠な要素
である。異常な２型ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ２）の極性化はＩｇＥ応答の増加に寄与する。

元々は活性化Ｔ細胞から同定されたインターロイキン−４（ＩＬ−４）およびインター
ロイキン−１３（ＩＬ−１３）は、アレルギーにおける免疫反応および炎症反応の開始お
よび維持において中心的な役割を果たす主要なＴｈ２サイトカインである。

ＩＬ−４およびＩＬ−１３シグナル伝達は、共通のサブユニットであるＩＬ−４受容体
アルファ（ＩＬ−４Ｒα）を有する２種類の別個の受容体複合体によって媒介され、ＩＬ
−４受容体アルファは、これら２種のサイトカインの間で重複する生物学的応答に寄与す
る可能性がある。図１を参照のこと。

インターロイキン−４／１３シグナル伝達のための受容体およびデュピルマブの作用機
序。ＩＬ−４Ｒαは、組織特異的および応答特異的な様式でＩＬ−４およびＩＬ−１３の
生物学的機能を媒介する２種類の別個のヘテロ二量体受容体複合体を形成する。ＩＬ−４
Ｒαおよび一般的なサイトカイン受容体ガンマ鎖（γＣ）からなるＩ型受容体は、ＩＬ−
４にとって一意的である。ＩＬ−４ＲαとＩＬ−１３Ｒα１との間で形成されるＩＩ型受
容体は、ＩＬ−１３の主要な受容体であるが、これはＩＬ−４に対しても機能する。さら
に、ＩＬ−１３は、２番目に親和性の高い受容体であるＩＬ−１３Ｒα２に結合すること
になり、ＩＬ−１３Ｒα２は一般的に、デコイ受容体として、または全長形態で線維化促
進効果を有する可能性のあるものとして、認識される。

デュピルマブは、ヒトＩＬ−４Ｒαに対する拮抗性モノクローナル抗体であり、これは
ＩＬ−４およびＩＬ−１３から誘発される生物学的活性を阻害する。デュピルマブは、受
容体サブユニットへのＩＬ−４の結合を妨げることによってＩＬ−４シグナル伝達を遮断
するが、一方で、ＩＬ−１３シグナル伝達に対する阻害効果は、二量体の受容体の相互作
用に干渉することによって媒介される可能性がある。

共通のＩＬ−４Ｒαサブユニットに対して向けられた完全ヒトモノクローナル抗体であ
るデュピルマブは、ＶｅｌｏｃＩｍｍｕｎｅ（登録商標）マウスを使用してＲｅｇｅｎｅ
ｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．にて開発された。デュピルマブにつ
いては、中程度から重度の喘息の処置、および中程度から重度のアトピー性皮膚炎の処置
のための臨床試験が実施中である。

ネズミモデルにおけるデュピルマブの有効性の評価は、複数の課題を提起する：（ａ）
デュピルマブは同起源のマウスＩＬ−４受容体を認識しない、および（ｂ）マウスＩＬ−
４タンパク質とヒトＩＬ−４受容体との間に機能的相互作用の欠如がある。

ＩＬ−４遺伝子およびタンパク質
ＩＬ−４遺伝子は、Ｂ細胞ならびに他の細胞タイプの活性化において重要な役割を果た
す、分泌されるＩＬ−４タンパク質をコードする（図１を参照のこと）。

ヒトＩＬ−４。ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：３５６５；一次ソース：ＨＧＮＣ：６０１４；Ｒ
ｅｆＳｅｑ転写物：ＮＭ＿０００５８９．３；ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ：Ｐ０５１１２；ゲ
ノムアセンブリ：ＧＲＣｈ３７；場所：ｃｈｒ５：１３２，００９，７４３−１３２，０
１８，５７６ ＋ストランド。

ヒトＩＬ−４遺伝子は、染色体５上で５ｑ３１．１に位置する。ヒトＩＬ−４遺伝子は
４つのエクソンを有し、２４アミノ酸のシグナルペプチドおよび１２９アミノ酸の成熟Ｉ
Ｌ−４タンパク質を含む、長さ１５３アミノ酸の前駆体ポリペプチドをコードする。

マウスＩＬ−４。ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：１６１８９；一次ソース：ＭＧＩ：９６５５６
；ＲｅｆＳｅｑ転写物：ＮＭ＿０２１２８３．２；ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ：Ｐ０７７５０
；ゲノムアセンブリ：ＧＲＣｍ３８；場所：ｃｈｒ１１：５３，６１２，３５０−５３，
６１８，６０６ −ストランド。

マウスＩＬ−４遺伝子は、染色体１１上で１１ ３１．９７ ｃＭに位置する。マウス
ＩＬ−４遺伝子は４つのエクソンを有し、２０アミノ酸のシグナルペプチドおよび１２０
アミノ酸の成熟ＩＬ−４タンパク質を含む、長さ１４０アミノ酸の前駆体ポリペプチドを
コードする。

ＩＬ−４Ｒα遺伝子およびタンパク質
ＩＬ−４Ｒα遺伝子は膜貫通受容体ＩＬ−４Ｒαタンパク質をコードし、ＩＬ−４Ｒα
タンパク質は、主にＢ細胞およびＴ細胞上に発現し、ＩＬ−４タンパク質およびＩＬ−１
３タンパク質に対する受容体である（図１を参照のこと）。

ヒトＩＬ−４Ｒα。ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：３５６６；一次ソース：ＭＧＩ：６０１５；
ＲｅｆＳｅｑ転写物：ＮＭ＿０００４１８．３；ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ：Ｐ２４３９４；
ゲノムアセンブリ：ＧＲＣｈ３７；場所：ｃｈｒ１６：２７，３５１，５２５−２７，３
６７，１１１ ＋ストランド。

ヒトＩＬ−４Ｒα遺伝子は、染色体１６上で１６ｐ１２．１−ｐ１１．２に位置する。
ヒトＩＬ−４Ｒα遺伝子は９つのコーディングエクソンを有し、２５アミノ酸のシグナル
ペプチドおよび８００アミノ酸の成熟ＩＬ−４Ｒαタンパク質を含む８２５アミノ酸の前
駆体ポリペプチドをコードし、成熟タンパク質の最初の２０７個のアミノ酸残基は細胞外
領域を構成する。ヒトＩＬ−４Ｒαタンパク質の細胞外領域（すなわち、細胞外ドメイン
）は、ヒトＩＬ−４Ｒα遺伝子のコーディングエクソン１から５までによってコードされ
る。

マウスＩＬ−４Ｒα。ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：１６１９０；一次ソース：ＭＧＩ：１０５
３６７；ＲｅｆＳｅｑ転写物：ＮＭ＿００１００８７００．３；ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ：
Ｐ１６３８２；ゲノムアセンブリ：ＧＲＣｍ３８；場所：ｃｈｒ１１：１２５，５６５，
６５５−１２５，５７２，７４５ ＋ストランド。

マウスＩＬ−４Ｒα遺伝子は、染色体７上で７ ６８．９４ ｃＭに位置する。マウス
ＩＬ−４Ｒα遺伝子は９つのコーディングエクソンを有し、２５アミノ酸のシグナルペプ
チドおよび７８５アミノ酸の成熟ＩＬ−４Ｒαタンパク質を含む８１０アミノ酸の前駆体
ポリペプチドをコードし、成熟タンパク質の最初の２０８個のアミノ酸残基は細胞外領域
を構成する。マウスＩＬ−４Ｒαタンパク質の細胞外領域（すなわち、細胞外ドメイン）
は、マウスＩＬ−４Ｒα遺伝子のコーディングエクソン１から５までによってコードされ
る。

ＩＬ−４およびＩＬ−４Ｒαタンパク質の種特異性
本明細書に示すように、野生型マウスではマウスＩＬ−４は機能するが、ヒトＩＬ−４
は機能せず、また逆に、ヒト化ＩＬ−４Ｒα（Ｉｌ４ｒａ^{ｈｕ／ｈｕ}）マウスではヒトＩ
Ｌ−４は機能するが、マウスＩＬ−４は機能しない。（例えば、Ａｎｄｒｅｗｓ ｅｔ
ａｌ．（２００１）Ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ
ｈｕｍａｎ ｔｙｐｅ ＩＩ ＩＬ−４／ＩＬ−１３ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｉｎ ｍｏｕ
ｓｅ Ｂ ｃｅｌｌｓ：ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｐｅｃｉｅｓ ｓｐｅｃ
ｉｆｉｃｉｔｙ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６６：１７１６−１７２２も参照のこと）。

ヒトＩＬ−４およびＩＬ−４Ｒα阻害剤の種特異性
ＩＬ−４またはＩＬ−４Ｒαタンパク質を標的とする治療用分子の候補は典型的には薬
物動態学（ＰＫ）および薬力学（ＰＤ）について非ヒト動物（例えば、齧歯類、例えば、
マウスまたはラット）で評価される。かかる治療用分子は、異常なＴｈ２細胞に関連する
ヒトの疾患、障害、および状態のモデルである非ヒト動物（例えば、齧歯類、例えば、マ
ウスまたはラット）においてインビボでの治療有効性についても試験される。

しかしながら、ヒトＩＬ−４またはＩＬ−４Ｒαタンパク質に特異的な治療用分子（例
えば、ヒト特異的なＩＬ−４またはＩＬ−４Ｒα阻害剤）を齧歯類では、特にマウスでは
、ＰＤまたはインビボでの治療有効性について適切に評価することができない。これは、
これらの治療用分子の標的が無いためである。上述のＩＬ−４タンパク質の種特異性のた
めに、ヒトＩＬ−４またはＩＬ−４Ｒαタンパク質を発現するトランスジェニック非ヒト
動物（例えば、齧歯類、例えば、マウスまたはラット）を使用しても、この問題は克服さ
れない。

したがって、様々な実施形態では、ヒト特異的なＩＬ−４またはＩＬ−４Ｒαタンパク
質拮抗薬または阻害剤のＰＤおよびインビボでの治療有効性を非ヒト動物（例えば、齧歯
類、例えば、マウスまたはラット）において評価するために、ヒトＩＬ−４および／また
はＩＬ−４Ｒαタンパク質で内因性ＩＬ−４および／またはＩＬ−４Ｒαタンパク質を置
換するのが望ましい。

さらに、様々な実施形態では、ヒトＩＬ−４および／またはＩＬ−４Ｒαタンパク質の
過剰発現または過少発現という潜在的な問題を避けるために、内因性ＩＬ−４および／ま
たはＩＬ−４Ｒα遺伝子の遺伝子座においてヒトＩＬ−４および／またはＩＬ−４Ｒα遺
伝子を非ヒト動物（例えば、齧歯類、例えば、マウスまたはラット）のゲノム内に挿入す
ること、および少なくとも部分的に内因性ＩＬ−４および／またはＩＬ−４Ｒα調節エレ
メントの制御下でヒトＩＬ−４および／またはＩＬ−４Ｒαタンパク質を非ヒト動物（例
えば、齧歯類、例えば、マウスまたはラット）において発現させることが望ましい。

遺伝子改変非ヒト動物
本明細書では、ヒトまたはヒト化ＩＬ−４および／またはヒトまたはヒト化ＩＬ−４Ｒ
αタンパク質をコードする改変されたＩＬ−４遺伝子および／または改変されたＩＬ−４
Ｒα遺伝子を形成するために、内因性ＩＬ−４遺伝子座および／またはＩＬ−４Ｒα遺伝
子座において、ヒトＩＬ−４核酸および／またはヒトＩＬ−４Ｒα核酸により、その内因
性ＩＬ−４遺伝子および／またはＩＬ−４Ｒα遺伝子が全体的または部分的に置換されて
いる遺伝子改変非ヒト動物が提供される。

本明細書で使用される場合、「非ヒト動物」という句は、ヒトではない任意の脊椎のあ
る生物体を指す。一部の実施形態では、非ヒト動物は哺乳類である。特定の実施形態では
、非ヒト動物はラットまたはマウスなどの齧歯類である。

一態様では、内因性ＩＬ−４遺伝子座において、ヒトＩＬ−４核酸により、その内因性
齧歯類ＩＬ−４遺伝子が全体的または部分的に置換されている遺伝子改変齧歯類（例えば
、マウスまたはラット）が提供される。

置換は、ヒトＩＬ−４遺伝子の少なくとも１つのエクソンを含むヒト核酸による齧歯類
ＩＬ−４遺伝子の少なくとも１つのエクソン、すなわち１つ以上のエクソン、の置換を伴
う。一部の実施形態では、齧歯類ＩＬ−４遺伝子のＡＴＧ開始コドンから開始するエクソ
ン１からエクソン４までを含む連続齧歯類ゲノム断片が、ヒトＩＬ−４遺伝子のＡＴＧ開
始コドンから開始するエクソン１からエクソン４までを含む連続ヒトゲノム断片で置換さ
れている。特定の実施形態では、齧歯類はマウスであり、ＡＴＧ開始コドンから開始する
エクソン１からエクソン４まで（３’非翻訳領域を含む）およびエクソン４の下流の３’
領域の一部分を含む内因性マウスＩＬ−４遺伝子座における約６．３ｋｂの連続マウスゲ
ノム断片が削除され、ヒトＩＬ−４遺伝子のＡＴＧ開始コドンから開始するエクソン１か
らエクソン４まで（３’非翻訳領域を含む）およびエクソン４の下流の３’領域の一部分
を含む約８．８ｋｂのヒトＩＬ−４核酸配列で置換される。

一部の実施形態では、置換は内因性ＩＬ−４遺伝子遺伝子座に、改変されたヒト化ＩＬ
−４遺伝子を生じさせ、改変されたＩＬ−４遺伝子の発現は内因性ＩＬ−４遺伝子座の内
因性調節エレメントの制御下にある。本明細書で使用される場合、「調節エレメント」と
いう用語は、プロモーター、エンハンサー、および抑制エレメントなどの５’転写調節配
列および転写終結配列などの３’転写調節配列の両方を含む転写調節配列を指す。一部の
実施形態では、改変されたＩＬ−４遺伝子の発現は、内因性の５’調節エレメントの制御
下にある。他の実施形態では、改変されたＩＬ−４遺伝子の発現は、内因性の３’調節エ
レメントの制御下にある。ある特定の実施形態では、改変されたＩＬ−４遺伝子の発現は
、内因性の５’調節エレメントおよび３’調節エレメントの制御下にある。

内因性ＩＬ−４遺伝子座において形成された、改変されたヒト化ＩＬ−４遺伝子は、ヒ
トまたはヒト化ＩＬ−４タンパク質をコードする。「ヒト化」という用語は、非ヒト動物
（例えば、マウスまたはラットなどの齧歯類）に見出される遺伝子またはタンパク質の部
分または配列を含む核酸またはタンパク質であって、非ヒト動物に見出されるものとは異
なるが、代わりに、対応するヒト遺伝子またはタンパク質の部分または配列に該当する（
それと同一である）部分または配列も含む、核酸またはタンパク質を指す。改変された、
ヒト化ＩＬ−４遺伝子は、ヒトＩＬ−４タンパク質（例えば、GenBank Accession No.
NM_000589.3で示される核酸によってコードされるヒトＩＬ−４タンパク質）と少なく
とも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるか、
または１００％同一であるＩＬ−４タンパク質をコードしてよい。

内因性ＩＬ−４遺伝子座における内因性齧歯類ＩＬ−４遺伝子のヒトＩＬ−４核酸によ
る全体的または部分的な置換を有する遺伝子改変齧歯類を、置換に関してホモ接合性また
はヘテロ接合性とすることができる。一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類は置換に関
してヘテロ接合性である、すなわち、内因性齧歯類ＩＬ−４遺伝子の２つのコピーのうち
１つのみがヒトＩＬ−４核酸で置換されている。他の実施形態では、遺伝子改変齧歯類は
置換に関してホモ接合性、すなわち、内因性齧歯類ＩＬ−４遺伝子の両方のコピーがヒト
ＩＬ−４核酸で置換されている。

遺伝子改変齧歯類は、ヒトまたはヒト化ＩＬ−４タンパク質を血清中に発現する。一部
の実施形態では、遺伝子改変齧歯類は、内因性齧歯類ＩＬ−４タンパク質を発現しない。
一実施形態では、ヒトまたはヒト化ＩＬ−４タンパク質を発現する齧歯類の血清は、機能
性内因性ＩＬ−４タンパク質を発現する齧歯類、例えば、野生型齧歯類（例えば、機能性
内因性ＩＬ−４タンパク質を発現するが、内因性ＩＬ−４遺伝子座における内因性ＩＬ−
４遺伝子のヒトＩＬ−４核酸による全体的または部分的な置換を含まない齧歯類）、とほ
ぼ同一のレベルのＩＬ−４タンパク質を有する。「ほぼ同一のレベル」とは、何れかの方
向へ（すなわち、より大きいまたはより小さい）野生型齧歯類におけるレベルの２５％、
２０％、１５％、１０％、５％以下以内に含まれるレベルを意味する。他の実施形態では
、齧歯類は、機能性内因性ＩＬ−４タンパク質を発現するが内因性ＩＬ−４遺伝子座にお
ける内因性ＩＬ−４遺伝子のヒトＩＬ−４核酸による全体的または部分的な置換を含まな
い同齢の齧歯類の血清中に存在するＩＬ−４タンパク質のレベルの少なくとも約１０％、
２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０
％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０
％、または２００％の濃度にてヒトまたはヒト化ＩＬ−４タンパク質を血清中に発現する
。

一部の実施形態では、ヒトＩＬ−４核酸による内因性齧歯類ＩＬ−４遺伝子の全体的ま
たは部分的な置換を有し、かつヒトまたはヒト化ＩＬ−４タンパク質を血清中に発現する
遺伝子改変齧歯類は、正常な免疫系を有する。すなわち、ヒトまたはヒト化ＩＬ−４タン
パク質を発現する齧歯類の血液、血漿、または血清中の免疫細胞（例えば、Ｂ細胞および
Ｔ細胞）の数が、機能性内因性ＩＬ−４タンパク質を発現する齧歯類であってヒトＩＬ−
４核酸による内因性齧歯類ＩＬ−４遺伝子の全体的または部分的な置換を有しない齧歯類
の血液、血漿、または血清中の免疫細胞（例えば、Ｂ細胞およびＴ細胞）の数と類似であ
る。

さらなる実施形態では、ヒトＩＬ−４核酸による内因性齧歯類ＩＬ−４遺伝子の全体的
または部分的な置換を有し、かつヒトまたはヒト化ＩＬ−４タンパク質を発現する、遺伝
子改変齧歯類は、内因性ＩＬ−４Ｒα遺伝子座における内因性齧歯類ＩＬ−４Ｒα遺伝子
のヒトＩＬ−４Ｒα核酸による全体的または部分的な置換も含み、結果として、ヒトまた
はヒト化ＩＬ−４Ｒαタンパク質も発現する。

別の態様では、その内因性齧歯類ＩＬ−４Ｒα遺伝子が内因性ＩＬ−４Ｒα遺伝子座に
おいてヒトＩＬ−４Ｒα核酸で全体的または部分的に置換されている遺伝子改変齧歯類（
例えば、マウスまたはラット）が提供される。

置換は、ヒトＩＬ−４Ｒα遺伝子の少なくとも１つのエクソンを含むヒト核酸による、
齧歯類ＩＬ−４Ｒα遺伝子の少なくとも１つのエクソン、すなわち１つ以上のエクソン、
の置換を伴う。一部の実施形態では、置換は、ヒト細胞外ドメインをコードするヒトＩＬ
−４Ｒα遺伝子のエクソンのうちの少なくとも１つによる齧歯類細胞外ドメインをコード
する齧歯類ＩＬ−４Ｒα遺伝子のエクソンのうちの少なくとも１つの置換を伴う。一部の
実施形態では、置換は、ヒトＩＬ−４Ｒα遺伝子の細胞外ドメインをコードする５つのエ
クソンのうちの少なくとも２つ、３つ、または４つを含むヒト核酸による置換を伴う。他
の実施形態では、齧歯類ＩＬ−４Ｒα遺伝子のＡＴＧ開始コドンから開始するエクソン１
からエクソン５までを含む連続齧歯類ゲノム断片が、ヒトＩＬ−４Ｒα遺伝子のＡＴＧ開
始コドンから開始するエクソン１からエクソン５までを含むゲノム断片で置換されている
。特定の実施形態では、齧歯類はマウスであり、ＡＴＧ開始コドンから開始するエクソン
１からエクソン５までおよびイントロン５の一部分を含む、内因性マウスＩＬ−４Ｒα遺
伝子座の約７．１ｋｂの連続マウスゲノム断片が除去され、ヒトＩＬ−４Ｒα遺伝子のＡ
ＴＧ開始コドンから開始するエクソン１からエクソン５までおよびイントロン５の一部分
を含む、約１５．６ｋｂのヒトＩＬ−４Ｒα核酸配列で置換される。

一部の実施形態では、置換は内因性ＩＬ−４Ｒα遺伝子遺伝子座に、改変されたヒト化
ＩＬ−４Ｒα遺伝子を生じさせ、改変されたＩＬ−４Ｒα遺伝子の発現は、内因性ＩＬ−
４Ｒα遺伝子座の内因性調節エレメントの制御下にある。

内因性ＩＬ−４Ｒα遺伝子座において形成された、改変されたヒト化ＩＬ−４Ｒα遺伝
子は、ヒトまたはヒト化ＩＬ−４Ｒαタンパク質をコードする。一部の実施形態では、改
変されたヒト化ＩＬ−４Ｒα遺伝子は、ヒトＩＬ−４Ｒαタンパク質（例えば、GenBank
Accession No. NM_000418.3で示される核酸によってコードされるヒトＩＬ−４タン
パク質）と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９
％同一であるか、または１００％同一であるＩＬ−４Ｒαタンパク質をコードする。他の
実施形態では、改変されたＩＬ−４Ｒα遺伝子は、ヒトＩＬ−４Ｒαタンパク質（例えば
、GenBank Accession No. NM_000418.3で示される核酸によってコードされるヒトＩＬ
−４タンパク質）の細胞外ドメインと少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７
％、９８％、もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である細胞外ドメインを
含むヒト化ＩＬ−４Ｒαタンパク質をコードする。特定の実施形態では、ヒト化ＩＬ−４
Ｒαタンパク質の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインは、内因性齧歯類ＩＬ−４Ｒαタ
ンパク質の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインと同一である。

内因性ＩＬ−４Ｒα遺伝子座における内因性齧歯類ＩＬ−４Ｒα遺伝子のヒトＩＬ−４
Ｒα核酸による全体的または部分的な置換を有する遺伝子改変齧歯類は、置換に関してホ
モ接合性またはヘテロ接合性とすることができる。一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯
類は置換に関してヘテロ接合性である、すなわち、内因性齧歯類ＩＬ−４Ｒα遺伝子の２
つのコピーのうち１つのみがヒトＩＬ−４Ｒα核酸で置換されている。他の実施形態では
、遺伝子改変齧歯類は置換に関してホモ接合性である、すなわち、内因性齧歯類ＩＬ−４
Ｒα遺伝子の両方のコピーがヒトＩＬ−４Ｒα核酸で置換されている。

本明細書に開示される遺伝子改変齧歯類は、免疫細胞（例えば、Ｂ細胞およびＴ細胞）
上にヒトまたはヒト化ＩＬ−４Ｒαタンパク質を発現する。一部の実施形態では、遺伝子
改変齧歯類は、内因性齧歯類ＩＬ−４Ｒαタンパク質を発現しない。一実施形態では、ヒ
トまたはヒト化ＩＬ−４Ｒαタンパク質を発現する齧歯類の免疫細胞は、機能性内因性Ｉ
Ｌ−４Ｒαタンパク質を発現する野生型齧歯類であってヒトまたはヒト化ＩＬ−４Ｒαタ
ンパク質を発現しない野生型齧歯類の免疫細胞上に機能性内因性ＩＬ−４Ｒαタンパク質
を発現する齧歯類とほぼ同一のレベルのＩＬ−４Ｒαタンパク質を免疫細胞上に有する。
他の実施形態では、齧歯類は、機能性内因性ＩＬ−４Ｒαタンパク質を発現するがヒトＩ
Ｌ−４Ｒα核酸による内因性ＩＬ−４Ｒα遺伝子の全体的または部分的な置換を含まない
同齢の齧歯類の免疫細胞上に存在するＩＬ−４Ｒαタンパク質の量の少なくとも約１０％
、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１
０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９
０％、または２００％の量で、ヒトまたはヒト化ＩＬ−４Ｒαタンパク質を免疫細胞上に
発現する。

一部の実施形態では、ヒトＩＬ−４Ｒα核酸による内因性齧歯類ＩＬ−４Ｒα遺伝子の
全体的または部分的な置換を有し、ヒトまたはヒト化ＩＬ−４Ｒαタンパク質を発現する
遺伝子改変齧歯類は、正常な免疫系を有する。すなわち、ヒトまたはヒト化ＩＬ−４Ｒα
タンパク質を発現する齧歯類の血液、血漿、または血清中の免疫細胞（例えば、Ｂ細胞お
よびＴ細胞）の数が、野生型齧歯類（例えば、機能性内因性ＩＬ−４Ｒαタンパク質を発
現し、かつヒトＩＬ−４Ｒα核酸による内因性齧歯類ＩＬ−４Ｒα遺伝子の全体的または
部分的な置換を有しない齧歯類）の血液、血漿、または血清中の免疫細胞（例えば、Ｂ細
胞およびＴ細胞）の数と類似である。

一部の実施形態では、ヒトＩＬ−４Ｒα核酸による内因性齧歯類ＩＬ−４Ｒα遺伝子の
全体的または部分的な置換を有し、ヒトまたはヒト化ＩＬ−４Ｒαタンパク質を発現する
遺伝子改変齧歯類は、ＩＬ−４依存的シグナル伝達およびＩＬ−１３依存的シグナル伝達
を媒介する能力を有し、かつＩＬ−４依存的シグナル伝達およびＩＬ−１３依存的シグナ
ル伝達を媒介する上で機能する。例えば、遺伝子改変齧歯類の免疫細胞上に発現されたヒ
トＩＬ−４Ｒαタンパク質の細胞外ドメインを有するヒト化ＩＬ−４Ｒαタンパク質は、
ヒトＩＬ−４と相互作用し、Ｉ型受容体の形成を介してヒトＩＬ−４依存的シグナル伝達
を媒介する（図１を参照のこと）。ヒトＩＬ−４Ｒαタンパク質の細胞外ドメインを有す
るかかるヒト化ＩＬ−４Ｒαタンパク質はまた、ヒトおよびマウスのＩＬ−１３と相互作
用し、ＩＩ型受容体の形成を介してＩＬ−１３依存的シグナル伝達を媒介する（図１を参
照のこと）。遺伝子改変齧歯類において発現されたヒト化ＩＬ−４Ｒαタンパク質の機能
性は、遺伝子改変齧歯類に由来する一次Ｂ細胞（primary B cells）を使用してＩＬ−
４が誘発したＩｇＥクラススイッチングを測定するアッセイなどの、以下の実施例で具体
的に記載されるものを含む、当該技術分野で既知の様々なアッセイで評価することができ
る。

さらなる実施形態では、ヒトＩＬ−４Ｒα核酸による内因性齧歯類ＩＬ−４Ｒα遺伝子
の全体的または部分的な置換を有し、ヒトまたはヒト化ＩＬ−４Ｒαタンパク質を発現す
る遺伝子改変齧歯類は、内因性ＩＬ−４遺伝子座における内因性齧歯類ＩＬ−４遺伝子の
ヒトＩＬ−４核酸による全体的または部分的な置換も含み、結果として、ヒトまたはヒト
化ＩＬ−４タンパク質も発現する。

さらなる態様では、その内因性齧歯類ＩＬ−４遺伝子が内因性ＩＬ−４遺伝子座におい
てヒトＩＬ−４核酸で全体的または部分的に置換されており、かつその内因性齧歯類ＩＬ
−４Ｒα遺伝子が内因性ＩＬ−４Ｒα遺伝子座においてヒトＩＬ−４Ｒα核酸で全体的ま
たは部分的に置換されてもいる、二重にヒト化した齧歯類（例えば、マウスまたはラット
）が提供される。かかる二重にヒト化した齧歯類は、各々のヒト化置換に関してホモ接合
性またはヘテロ接合性とすることができる。特定の実施形態では、二重にヒト化した齧歯
類は、ヒト化ＩＬ−４およびヒト化ＩＬ−４Ｒαの両方に関してホモ接合性である。

二重にヒト化した齧歯類における内因性齧歯類ＩＬ−４遺伝子に対する遺伝子改変は、
ヒトＩＬ−４核酸による内因性齧歯類ＩＬ−４遺伝子の全体的または部分的な置換を有す
る遺伝子改変齧歯類について本明細書で上述される改変または置換を含む。同様に、二重
にヒト化した齧歯類における内因性齧歯類ＩＬ−４Ｒα遺伝子に対する遺伝子改変は、ヒ
トＩＬ−４Ｒα核酸による内因性齧歯類ＩＬ−４Ｒα遺伝子の全体的または部分的な置換
を有する遺伝子改変齧歯類について本明細書で上述される改変または置換を含む。従って
、本明細書では、齧歯類ＩＬ−４遺伝子のヒト化に関しておよび齧歯類遺伝子のヒト化に
関して上記で開示される特徴はそれぞれ、二重にヒト化した齧歯類に対して明確に組み込
まれる。

特定の実施形態では、ヒトＩＬ−４タンパク質およびヒト化ＩＬ−４Ｒαタンパク質を
発現する二重にヒト化した齧歯類（例えば、マウスまたはラット）が提供され、ヒト化Ｉ
Ｌ−４Ｒαタンパク質は、ヒトＩＬ−４Ｒαタンパク質の細胞外ドメインを含み、齧歯類
の内因性ＩＬ−４Ｒαタンパク質の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含む。特定の
実施形態では、ヒトＩＬ−４タンパク質およびヒト化ＩＬ−４Ｒαタンパク質の発現は、
それぞれ、内因性齧歯類ＩＬ−４遺伝子座および齧歯類ＩＬ−４Ｒα遺伝子座の内因性齧
歯類調節配列の制御下にある。

一部の実施形態では、二重にヒト化した齧歯類は正常な免疫系（すなわち、免疫細胞の
数が野生型齧歯類とほぼ同一である）を有し、血清中に野生型齧歯類とほぼ同一のレベル
のＩＬ−４タンパク質を有し、野生型齧歯類とほぼ同一の量のＩＬ−４Ｒαタンパク質を
免疫細胞上に発現し、ここで野生型齧歯類は、機能性内因性ＩＬ−４タンパク質およびＩ
Ｌ−４Ｒαタンパク質を発現する齧歯類であってヒトまたはヒト化ＩＬ−４タンパク質ま
たはＩＬ−４Ｒαタンパク質を発現しない齧歯類である。

特定の実施形態では、二重にヒト化した齧歯類は、機能性ＩＬ−４シグナル伝達経路を
提示する。「機能性ＩＬ−４シグナル伝達経路」とは、ヒトまたはヒト化ＩＬ−４タンパ
ク質およびヒトまたはヒト化ＩＬ−４Ｒαタンパク質の両方が、二重にヒト化した齧歯類
において発現し、かつ二重にヒト化した齧歯類において互いに相互作用して、これにより
下流のシグナル伝達を有効に媒介し、正常なＩＬ−４シグナル伝達経路の生物学的活性を
達成することを意味する。正常なＩＬ−４シグナル伝達経路の生物学的活性が本明細書に
おいて上述され、図１に図示されており、これらはＴｈ２分化の開始および維持、Ｂ細胞
の活性化および成長、ＩｇＥおよびＩｇＧ４へのクラススイッチングなどのＩ型受容体を
介して媒介されるもの、および杯細胞過形成、上皮下線維症、および組織リモデリングな
どのＩＩ型受容体シグナル伝達を介して媒介されるものを含む。例えば、二重にヒト化し
た齧歯類における機能性ＩＬ−４シグナル伝達経路は、例えば、チリダニへの曝露に応答
した循環器におけるＩｇＥの増加、気道炎症、および／または好酸球性浸潤細胞（eosino
philic infiltrating cells）により特徴付けられる炎症表現型によって表され、この
表現型は二重のヒト化を有しない野生型齧歯類内でも観察される。

遺伝子改変非ヒト動物を作成する方法
齧歯類などの遺伝子改変非ヒト動物を当該技術分野で既知の方法を使用して作製できる
。例えば、非ヒト動物と相同性の上流領域および下流領域に隣接したヒト核酸（ヒトＩＬ
−４またはＩＬ−４Ｒα遺伝子などの全体または部分）を含有する標的化ベクターを作製
できる。標的化構築物は、ヒト核酸に対して３’側に位置する薬剤選択カセット（例えば
、一過性Ｃｒｅ発現ベクターによって後で除去できるｌｏｘＰ導入ｈｙｇｒｏ選択カセッ
ト）も含む可能性がある。標的化ベクターを、例えば、電気穿孔法によって非ヒト動物細
胞、例えば胚性幹（ＥＳ）細胞（マウスＥＳ細胞などの）、のゲノム中に導入できる。次
いで、適正に標的化されたＥＳ細胞クローンを初期胚（例えば、８細胞期のマウス胚）に
導入できる。適正に標的化されたＥＳ細胞に完全に由来する非ヒト動物は、例えば対立遺
伝子解析に基づいて同定される。好適な遺伝子改変可能ＥＳ細胞が直ちに利用可能でない
非ヒト動物については、本明細書に記載されるような遺伝子改変を含む非ヒト動物を作製
するために他の方法を採用できる。かかる方法としては、例えば、非ＥＳ細胞ゲノム（例
えば、線維芽細胞または誘発された多能性細胞）を改変すること、および核移植を利用し
て好適な細胞、例えば卵母細胞、に改変されたゲノムを導入すること、および改変された
細胞（例えば、改変された卵母細胞）を胚の形成に好適な条件下で非ヒト動物に懐胎させ
ることが挙げられる。

遺伝子改変非ヒト動物を利用する方法
一態様では、本明細書に開示される遺伝子改変ＩＬ−４および／またはＩＬ−４Ｒα非
ヒト動物は、以下の実施例でさらに例示されるように、ヒト特異的なＩＬ−４および／ま
たはＩＬ−４Ｒα拮抗薬、例えば中和性の抗ＩＬ−４抗体および／または抗ＩＬ−４Ｒα
抗体（例えば、デュピルマブ）、の薬力学（ＰＤ）および治療有効性を様々な疾患モデル
において評価するために使用される。

一部の実施形態では、本発明は、本明細書に開示される二重にヒト化したＩＬ−４およ
びＩＬ−４Ｒαマウスを使用してヒト特異的なＩＬ−４またはＩＬ−４Ｒα拮抗薬をスク
リーニングする方法を提供する。

「ＩＬ−４またはＩＬ−４Ｒα拮抗薬」とは、ＩＬ−４またはＩＬ−４Ｒαによって媒
介される１つ以上の生物学的機能を遮断、抑制、または阻害する分子（例えば、抗体）を
意味する。「ヒト特異的なＩＬ−４またはＩＬ−４Ｒα拮抗薬」は、ヒトＩＬ−４または
ＩＬ−４Ｒαに特異的な拮抗薬であって齧歯類ＩＬ−４またはＩＬ−４Ｒαに対しては実
質的に作用しない拮抗薬を指す。

特定の実施形態では、スクリーニング方法は、ヒトＩＬ−４タンパク質およびヒト化Ｉ
Ｌ−４Ｒαタンパク質を発現する二重にヒト化したマウスを利用し、ここでヒト化ＩＬ−
４Ｒαタンパク質は、内因性マウスＩＬ−４Ｒαタンパク質の膜貫通ドメインおよび細胞
質ドメインに連結されたヒトＩＬ−４Ｒαタンパク質の細胞外ドメインを含み、このマウ
スは、マウスＩＬ−４またはマウスＩＬ−４Ｒαを発現しない。

一部の実施形態では、ヒト特異的なＩＬ−４またはＩＬ−４Ｒα拮抗薬のスクリーニン
グ方法は、本明細書に記載されるようにＩＬ−４およびＩＬ−４Ｒαについて二重にヒト
化した遺伝子改変齧歯類に薬剤を投与することと、ＩＬ−４／ＩＬ−４Ｒαシグナル伝達
経路によって媒介される生物学的な機能に対する薬剤の効果を判定することと、薬剤が遺
伝子改変齧歯類においてＩＬ−４／ＩＬ−４Ｒαシグナル伝達経路によって媒介される機
能と拮抗する場合に、薬剤をヒト特異的なＩＬ−４またはＩＬ−４Ｒα拮抗薬として同定
することと、を含む。

一実施形態では、薬剤は、ＩＬ−４またはＩＬ−４Ｒαと結合する免疫グロブリン可変
ドメインを含む。一実施形態では、薬剤は、ヒトＩＬ−４またはＩＬ−４Ｒαと特異的に
結合するが、齧歯類ＩＬ−４またはＩＬ−４Ｒαとは結合しない。一実施形態では、薬剤
は抗体である。特定の実施形態では、薬剤は、ヒトＩＬ−４Ｒαと特異的に結合するが齧
歯類ＩＬ−４Ｒαとは結合しない抗体である。

一実施形態では、スクリーニング方法は、ヒトＩＬ−４タンパク質およびヒト化ＩＬ−
４Ｒαタンパク質を発現する二重にヒト化したマウスを利用し、ここでヒト化ＩＬ−４Ｒ
αタンパク質は、内因性マウスＩＬ−４Ｒαタンパク質の膜貫通ドメインおよび細胞質ド
メインに連結されたヒトＩＬ−４Ｒαタンパク質の細胞外ドメインを含み、このマウスは
、ネズミのＩＬ−４またはネズミのＩＬ−４Ｒαを発現しない。

一部の実施形態では、スクリーニングの方法は、本明細書に記載されるように二重にヒ
ト化した齧歯類においてＩＬ−４／ＩＬ−４Ｒαシグナル伝達と関連する疾患を誘発する
ことと、当該齧歯類に薬剤を投与することと、薬剤が疾患を軽快させるかどうかを判定す
ることと、薬剤が疾患を軽快させる場合に薬剤を、疾患を処置するために好適なヒト特異
的なＩＬ−４またはＩＬ−４Ｒα拮抗薬として同定することと、を含む。

「ＩＬ−４／ＩＬ−４Ｒαシグナル伝達と関連する疾患」とは、ＩＬ−４／ＩＬ−４Ｒ
αシグナル伝達によって媒介される生物学的機能が関係している疾患を意味する。ＩＬ−
４／ＩＬ−４Ｒαシグナル伝達と関連する疾患の例としては、例えば、喘息、アトピー性
皮膚炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）（タバコの煙に少なくとも部分的に起因する場合
がある）、炎症性腸疾患、多発性硬化症、関節炎、アレルギー性鼻炎、好酸球性食道炎、
および乾癬などの炎症疾患または障害が挙げられる。喘息は、好酸球性または非好酸球性
の喘息である可能性があり、またステロイド感受性喘息またはステロイド抵抗性喘息であ
る可能性がある。

一部の実施形態では、ＩＬ−４／ＩＬ−４Ｒαシグナル伝達と関連する疾患は気道炎症
であり、これは、齧歯類において、アレルゲン（例えば、チリダニ類抽出物）を一定期間
、１回以上、鼻腔内投与することによって誘発できる。薬剤の投与の結果として、気道炎
症の程度（例えば、粘液貯留、気管支肺胞洗浄液中の好酸球性浸潤細胞、総循環ＩｇＥの
レベル、および／またはマイクロアレイ発現解析によって測定可能な発現プロファイルの
変化によって表される）が低減したかどうかを測定することによって薬剤の効果を判定で
きる。気道炎症を誘発するために使用されるアレルゲンおよび試験される薬剤を同時また
は異なる時期に投与できる。一部の実施形態では、アレルゲンは１回投与または複数回投
与で齧歯類に与えられ、試験される薬剤は、少なくとも１回のアレルゲン投与が齧歯類に
なされた後に齧歯類に投与される。

一部の実施形態では、ＩＬ−４／ＩＬ−４Ｒαシグナル伝達と関連する疾患は、皮膚炎
症またはアトピー性皮膚炎であり、これらは、齧歯類に皮膚損傷を生じさせ、損傷した皮
膚をアレルゲン（例えば、細菌毒素またはチリダニ類抽出物）に一定期間、１回以上、曝
露することによって誘発できる。薬剤の投与の結果として皮膚炎症が低減するかどうかを
測定することによって薬剤の効果を判定できる。

更なる態様では、三重にヒト化した非ヒト動物（すなわち、そのＩＬ−４、ＩＬ−４Ｒ
α、およびＩＬ−３３遺伝子がヒト化された非ヒト動物）が、例えば、ヒト特異的なＩＬ
−４および／またはＩＬ−４Ｒα拮抗薬、およびヒト特異的なＩＬ−３３拮抗薬などの候
補化合物の薬力学（ＰＤ）および治療有効性を評価するために使用される。

「ＩＬ−３３拮抗薬」とは、ＩＬ−３３によって媒介される１つ以上の生物学的機能ま
たはシグナル伝達を遮断、抑制、または阻害する分子（例えば、抗体）を意味する。「ヒ
ト特異的なＩＬ−３３拮抗薬」は、ヒトＩＬ−３３に特異的である拮抗薬であって齧歯類
ＩＬ−３３に対しては実質的に作用しない拮抗薬を指す。ＩＬ−３３は、ＩＬ−３３抗体
などの拮抗薬の存在下で減退するＳＴ２およびＩＬ−１ ＲＡｃＰを介したシグナル伝達
を刺激することが知られている。米国特許出願公開第２０１４／０２７１６５８ Ａ１号
（その全内容が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているものなどのインビ
トロまたはインビボのアッセイでＩＬ−３３シグナル伝達をアッセイすることによってＳ
Ｔ２およびＩＬ−１ ＲＡｃＰを介したＩＬ−３３シグナル伝達の阻害を判定できる。例
えば、米国特許出願公開第２０１４／０２７１６５８ Ａ１号に記載されるものなどのア
ッセイを、ヒトＩＬ−３３の発現についてホモ接合性であるアレルゲン感受性を高めた動
物においてＩＬ−３３に対する抗体の肺の炎症に対する効果を評価するために使用できる
。ＩＬ−３３拮抗薬として効果的であるＩＬ−３３抗体は、肺の炎症細胞の減少に向かう
傾向ならびにＩＬ−４およびＩＬ−５などのサイトカインの減少に向かう傾向を示すはず
である。

特定の実施形態では、三重にヒト化した非ヒト動物が、候補化合物を評価するために本
明細書において使用され、ここで、三重にヒト化した動物は、ヒトＩＬ−４タンパク質、
マウスＩＬ−４Ｒαタンパク質の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインに連結されたヒト
ＩＬ−４Ｒαタンパク質の細胞外ドメインを含むヒト化ＩＬ−４Ｒαタンパク質、および
ヒトＩＬ−３３タンパク質を発現する三重にヒト化したマウスであり、当該マウスは、マ
ウスＩＬ−４、マウスＩＬ−４Ｒα、またはマウスＩＬ−３３を発現しない。

一部の実施形態では、例えば、ヒト特異的なＩＬ−４および／もしくはＩＬ−４Ｒα拮
抗薬、またはヒト特異的なＩＬ−３３拮抗薬などの候補化合物の薬力学（ＰＤ）および治
療有効性を評価するために、三重にヒト化した非ヒト動物が使用される。例えば、ヒト特
異的なＩＬ−４抗体、ヒト特異的なＩＬ−４Ｒα抗体、およびヒト特異的なＩＬ−３３抗
体を、三重にヒト化した動物（齧歯類（例えば、マウスまたはラット）など）で個別に試
験することができ、これらのＰＤプロファイルおよび治療有効性を評価および比較するこ
とができる。

他の実施形態では、例えば、化合物の組み合わせが相乗的な治療効果を示すかどうかを
判定するために、化合物の組み合わせ（例えば、ヒト特異的なＩＬ−４および／またはＩ
Ｌ−４Ｒα拮抗薬抗体とヒト特異的なＩＬ−３３拮抗薬抗体との組み合わせ）の有効性を
、個別に使用されたときの化合物の有効性と比較して評価するために、三重にヒト化した
非ヒト動物が使用される。特定の実施形態では、ヒト特異的なＩＬ−４抗体とヒト特異的
なＩＬ−３３抗体との組み合わせが、三重にヒト化した非ヒト動物で試験される。他の特
定の実施形態では、ヒト特異的なＩＬ−４Ｒα抗体とヒト特異的なＩＬ−３３抗体との組
み合わせが、三重にヒト化した非ヒト動物で試験される。

候補化合物または化合物の組み合わせを評価するために、ＩＬ−４／ＩＬ−４Ｒαシグ
ナル伝達およびＩＬ−３３シグナル伝達と関連する疾患を、三重にヒト化した動物におい
て誘発できる。ＩＬ−４／ＩＬ−４Ｒαシグナル伝達およびＩＬ−３３シグナル伝達と関
連する疾患の例としては、例えば、喘息、アトピー性皮膚炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰ
Ｄ）（タバコの煙に少なくとも部分的に起因する場合がある）、炎症性腸疾患、多発性硬
化症、関節炎、アレルギー性鼻炎、好酸球性食道炎、および乾癬などの炎症疾患または障
害が挙げられる。喘息は好酸球性または非好酸球性の喘息である可能性があり、またステ
ロイド感受性喘息またはステロイド抵抗性喘息である可能性がある。化合物または化合物
の組み合わせの効果を、本明細書で上述されたようなＩＬ−４／ＩＬ−４Ｒα二重ヒト化
動物と同様に評価できる。

本発明は以下の非限定的な実施例によってさらに例示される。

実施例１
ヒトＩＬ−４遺伝子による内因性マウスＩＬ−４遺伝子の置換
ヒトＩＬ−４遺伝子のＡＴＧ開始コドンから開始するエクソン１からエクソン４まで（
３’非翻訳領域を含む）のコーディング部分およびエクソン４の下流の３’領域の一部分
を含有する８．８ｋｂのヒトＩＬ−４遺伝子により、ＡＴＧ開始コドンから開始するエク
ソン１からエクソン４まで（３’非翻訳領域を含む）のコーディング部分およびエクソン
４下流の３’領域の一部分に広がる６．３ｋｂのネズミのＩＬ−４遺伝子遺伝子座を置換
した。図２Ａを参照のこと。

単一の標的化工程でマウスＩＬ−４遺伝子をヒトＩＬ−４遺伝子で置換するための標的
化構築物は、ＶｅｌｏｃｉＧｅｎｅ（登録商標）遺伝子工学技術（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ
ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
ｏｆ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ ｇｅｎｏｍｅ ｃｏｕｐｌｅｄ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ−ｒ
ｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏ
ｔｅｃｈ，２１（６）：６５２−６５９を参照のこと）を使用して構築した。マウスＩＬ
−４ＤＮＡおよびヒトＩＬ−４ＤＮＡは、それぞれ、細菌人工染色体（ＢＡＣ）クローン
ｂＭＱ−４１Ａ１２およびＲＰ１１−１７Ｋ１９から得た。簡潔に述べると、エクソン１
のＡＴＧコドンからエクソン４（３’非翻訳領域を含む）およびエクソン４の下流の３’
領域の一部分まで広がる８．８ｋｂのヒトＩＬ−４配列（ゲノム座標：ＧＲＣｈ３７：ｃ
ｈｒ５：１３２，００９，７４３−１３２，０１８，５７６（＋ストランド））およびｌ
ｏｘＰ導入ｈｙｇｒｏ選択カセットに隣接したマウスＩＬ−４の上流相同性アームおよび
下流相同性アームを含有する、ギャップ修復クローニングによって生成され、ＳｂｆＩで
直線化された標的化構築物をＦ１Ｈ４マウス胚性幹（ＥＳ）細胞（Ｃ５７ＢＬ／６×１２
９Ｆ１雑種）に電気穿孔した。適正に標的化されたＥＳ細胞（ＭＡＩＤ ８７９）を、薬
剤選択カセットを除去するために一過性Ｃｒｅ発現ベクターを用いてさらに電気穿孔した
。薬剤カセット（ＭＡＩＤ １５５３）を有しない標的化されたＥＳ細胞クローンを、Ｖ
ｅｌｏｃｉＭｏｕｓｅ（登録商標）法によって８細胞期のＳＷマウス胚に導入した（米国
特許第７，２９４，７５４号、同第７，５７６，２５９号、同第７，６５９，４４２号、
およびＰｏｕｅｙｍｉｒｏｕ ｅｔ ａｌ．（２００７） Ｆ０ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ
ｍｉｃｅ ｔｈａｔ ａｒｅ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｆｕｌｌｙ ｄｅｒｉｖｅｄ
ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｄｏｎｏｒ ｇｅｎｅ−ｔａｒｇｅｔｅｄ ＥＳ ｃｅｌｌｓ ａ
ｌｌｏｗｉｎｇ ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ ａｎａｌｙｓｅｓ，Ｎａ
ｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２５（１）：９１−９９を参照のこと）。ヒト化ＩＬ−４遺
伝子を有するＶｅｌｏｃｉＭｉｃｅ（登録商標）（ドナーＥＳ細胞に完全に由来するＦ０
マウス）を、対立遺伝子アッセイの改変を用いてマウス対立遺伝子の消失およびヒト対立
遺伝子の獲得について遺伝子型を決定することによって同定した（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ
ｅｔ ａｌ．（２００３）を参照のこと）。

適正に標的化されたＥＳ細胞クローンをロスオブネイティブアレル（ＬＯＮＡ）アッセ
イ（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ ｅｔ ａｌ．２００３）によって同定した。上記アッセイで
は、除去の対象となったマウスＩＬ−４遺伝子内の配列に対して特異的な２つのＴａｑＭ
ａｎ（商標）定量ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）によって、天然の改変されていない
ＩＬ−４遺伝子のコピー数を決定した。ｑＰＣＲアッセイは、以下のプライマー−プロー
ブのセット（５’から３’へと記載される）を含んだ：上流フォワードプライマー、ＣＡ
ＴＧＣＡＣＧＧＡ ＧＡＴＧＧＡＴＧＴＧ（配列番号：１）；上流リバースプライマー、
ＧＡＣＣＣＣＴＣＡＧ ＧＴＣＣＡＣＴＴＡＣ Ｃ（配列番号：２）；上流プローブ、Ｆ
ＡＭ−ＡＡＣＧＴＣＣＴＣＡ ＣＡＧＣＡＡＣＧＡ−ＭＧＢ（配列番号：３）；下流フォ
ワードプライマー、ＧＴＧＣＣＣＡＧＧＴ ＧＴＧＣＴＣＡＴＧ（配列番号：４）；下流
リバースプライマー、ＣＧＣＣＴＧＣＣＴＣ ＣＴＣＡＣＴＴＴＡＴ Ｃ（配列番号：５
）；下流プローブ、ＦＡＭ−ＡＴＣＴＧＣＴＴＣＡ ＣＣＡＴＣＣＡＣＴ−ＭＧＢ（配列
番号：６）；ここでＦＡＭは５−カルボキシフルオレセイン蛍光プローブを指し、ＢＨＱ
はブラックホール消光剤型の蛍光消光剤を指す（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｉｅｓ）。標的化ベクターを取り込み、そのゲノムに組み込んだＥＳ細胞クローンから
精製されたＤＮＡを、３８４ウェルＰＣＲプレート（ＭｉｃｒｏＡｍｐ（商標）Ｏｐｔｉ
ｃａｌ ３８４−Ｗｅｌｌ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｐｌａｔｅ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｉｅｓ）中で製造業者の推奨に従ってＴａｑＭａｎ（商標）Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓ
ｓｉｏｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と組み合わせ
て、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｐｒｉｓｍ ７９００ＨＴ（これはＰＣＲ
過程の間に蛍光データを収集し、蓄積した蛍光が予め設定された閾値に達するフラクショ
ナルＰＣＲサイクル（fractional PCR cycle）である閾値サイクル（Ｃｔ）を決定する
）においてサイクルさせた。上流および下流ＩＬ−４特異的ｑＰＣＲおよび標的ではない
参照遺伝子に対する２つのｑＰＣＲが、各ＤＮＡサンプルについて実行された。各ＩＬ−
４特異的ｑＰＣＲと各参照遺伝子ｑＰＣＲとの間のＣｔ値（ΔＣｔ）の差を算出し、次い
で各ΔＣｔとアッセイされたサンプル全てについてのメジアンΔＣｔとの間の差を算出し
て、各サンプルについてのΔΔＣｔ値を得た。各サンプルにおけるＩＬ−４遺伝子のコピ
ー数を以下の式から算出した：コピー数＝２×２^{−ΔΔＣｔ}。そのネイティブコピーのう
ちの１つを失った、適正に標的化されたクローンは、１と等しいＩＬ−４遺伝子コピー数
を有することになる。ヒトＩＬ−４遺伝子配列が、ヒト化した対立遺伝子において除去さ
れたマウスＩＬ−４遺伝子配列と置き換わったことの確認は、以下のプライマー−プロー
ブのセット（５’から３’へと記載される）を含むＴａｑＭａｎ（商標）ｑＰＣＲアッセ
イによって確認された：ヒトフォワードプライマー、ＧＣＣＴＧＧＡＣＣＡ ＡＧＡＣＴ
ＣＴＧＴ（配列番号：７）；ヒトリバースプライマー、ＡＣＣＧＴＧＧＧＡＣ ＧＧＣＴ
ＴＣＴＴＡＣ（配列番号：８）；ヒト上流プローブ、ＦＡＭ−ＣＡＣＣＧＡＧＴＴＧ Ａ
ＣＣＧＴＡＡＣＡＧ ＡＣＡＴＣ−ＢＨＱ（配列番号：９）。ｈｙｇｒｏ選択カセットが
ヒトＩＬ−４遺伝子配列と共に、ヒト化した対立遺伝子に挿入されたことの確認は、以下
のプライマー−プローブのセット（５’から３’へと記載される）を含むＴａｑＭａｎ（
商標）ｑＰＣＲアッセイによって確認された：ｈｙｇｒｏフォワードプライマー、ＴＧＣ
ＧＧＣＣＧＡＴ ＣＴＴＡＧＣＣ（配列番号：１０）；ｈｙｇｒｏリバースプライマー、
ＴＴＧＡＣＣＧＡＴＴ ＣＣＴＴＧＣＧＧ（配列番号：１１）；ｈｙｇｒｏプローブ、Ｆ
ＡＭ−ＡＣＧＡＧＣＧＧＧＴ ＴＣＧＧＣＣＣＡＴＴ Ｃ−ＢＨＱ（配列番号：１２）。

標的化されたＥＳ細胞に由来するマウスについて、尾部の生検から精製されたＤＮＡを
アッセイして、それらのＩＬ−４遺伝子型を決定し、ヒト化ＩＬ−４対立遺伝子が生殖系
列を通じて伝達されたことを確認するために、同一のＬＯＮＡアッセイを使用した。置換
についてヘテロ接合性の２匹の子を交配して、ヒトＩＬ−４遺伝子による内因性マウスＩ
Ｌ−４遺伝子の置換についてホモ接合性であるマウスを生じさせる。表現型の決定のため
に、置換についてホモ接合性である子を使用する。

ネズミのＩＬ−４遺伝子座とヒトＩＬ−４遺伝子を含む配列との上流ジャンクションは
、

内となるように設計され、ここで、ヒトＩＬ−４配列は斜字体で示され、ＩＬ−４コード
配列は括弧付きで示される。ヒトＩＬ−４遺伝子を含有する配列とｌｏｘＰ導入ｈｙｇｒ
ｏ選択カセットとの下流ジャンクションは、

内となるように設計され、ここで、ヒトＩＬ−４配列は斜字体で示され、ＩＬ−４コード
配列は括弧付きで示される。ｌｏｘＰ導入ｈｙｇｒｏ選択カセットの配列とネズミのＩＬ
−４遺伝子座との下流ジャンクションは、

内となるように設計され、ここで、ｈｙｇｒｏカセット配列は斜字体で示される。

実施例２
ヒトＩＬ−４Ｒα細胞外ドメイン遺伝子配列による内因性マウスＩＬ−４Ｒα細胞外ドメ
イン遺伝子配列の置換
ヒトＩＬ−４Ｒα遺伝子の、ＡＴＧ開始コドンから開始するエクソン１からエクソン５
まで、およびイントロン５の一部分、を含む１５．６ｋｂのヒトＩＬ−４Ｒα遺伝子によ
り、ＡＴＧ開始コドンから開始するコーディングエクソン１からエクソン５およびイント
ロン５の一部分まで広がる７．１ｋｂのネズミＩＬ−４Ｒα遺伝子遺伝子座を置換した。
マウスのエクソン６から９は保持され、エクソン１から５（すなわち、細胞外ドメイン）
のみがヒト化された。図２Ｂを参照のこと。

単一の標的化工程でマウスＩＬ−４Ｒα遺伝子をヒトＩＬ−４Ｒα遺伝子で置換するた
めの標的化構築物は、ＶｅｌｏｃｉＧｅｎｅ（登録商標）遺伝子工学技術（Ｖａｌｅｎｚ
ｕｅｌａ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｅｎｇｉｎｅｅ
ｒｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ ｇｅｎｏｍｅ ｃｏｕｐｌｅｄ ｗｉｔｈ ｈｉ
ｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｎａｔｕｒｅ
Ｂｉｏｔｅｃｈ，２１（６）：６５２−６５９を参照のこと）を使用して構築した。マ
ウスＩＬ−４ＲαＤＮＡおよびヒトＩＬ−４ＲαＤＮＡは、それぞれ、細菌人工染色体（
ＢＡＣ）クローンＲＰ２３−１３６Ｇ１４およびＲＰ１１−１６６Ｅ２４から得た。簡潔
に述べると、エクソン１のＡＴＧコドンからエクソン５およびイントロン５の一部分まで
広がる１５．６ｋｂのヒトＩＬ−４Ｒα配列（ゲノム座標：ＧＲＣｈ３７：ｃｈｒ１６：
２７，３５１，５２５−２７，３６７，１１１（＋ストランド））およびｌｏｘＰ導入ｎ
ｅｏ選択カセットに隣接したマウスＩＬ−４Ｒα遺伝子の上流相同性アームおよび下流相
同性アームを含有する、ギャップ修復クローニングによって生成され、ＮｏｔＩで直線化
された標的化構築物を、Ｆ１Ｈ４マウス胚性幹（ＥＳ）細胞（Ｃ５７ＢＬ／６×１２９Ｆ
１雑種）に電気穿孔した。適正に標的化されたＥＳ細胞（ＭＡＩＤ ８０３）を、薬剤選
択カセットを除去するために一過性Ｃｒｅ発現ベクターを用いてさらに電気穿孔した。薬
剤カセット（ＭＡＩＤ １４４４）を有しない標的化されたＥＳ細胞クローンを、Ｖｅｌ
ｏｃｉＭｏｕｓｅ（登録商標）法によって８細胞期のＳＷマウス胚に導入した（米国特許
第７，２９４，７５４号、同第７，５７６，２５９号、同第７，６５９，４４２号、およ
びＰｏｕｅｙｍｉｒｏｕ ｅｔ ａｌ．（２００７） Ｆ０ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｍ
ｉｃｅ ｔｈａｔ ａｒｅ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｆｕｌｌｙ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆ
ｒｏｍ ｔｈｅ ｄｏｎｏｒ ｇｅｎｅ−ｔａｒｇｅｔｅｄ ＥＳ ｃｅｌｌｓ ａｌｌ
ｏｗｉｎｇ ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ ａｎａｌｙｓｅｓ，Ｎａｔｕ
ｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２５（１）：９１−９９を参照のこと）。ヒト化ＩＬ−４Ｒα遺
伝子を有するＶｅｌｏｃｉＭｉｃｅ（登録商標）（ドナーＥＳ細胞に完全に由来するＦ０
マウス）を、対立遺伝子アッセイの改変を用いてマウス対立遺伝子の消失およびヒト対立
遺伝子の獲得について遺伝子型を決定することによって同定した（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ
ｅｔ ａｌ．（２００３）を参照のこと）。

適正に標的化されたＥＳ細胞クローンを、ロスオブネイティブアレル（ＬＯＮＡ）アッ
セイ（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ ｅｔ ａｌ．２００３）によって同定した。上記アッセイ
では、除去の対象となったマウスＩＬ−４Ｒα遺伝子内の配列に対して特異的な２つのＴ
ａｑＭａｎ（商標）定量ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）によって、天然の、改変され
ていないＩＬ−４Ｒα遺伝子のコピー数を決定した。ｑＰＣＲアッセイは、以下のプライ
マー−プローブのセット（５’から３’へと記載される）を含んだ：上流フォワードプラ
イマー、ＣＣＧＣＴＧＧＣＡＴ ＧＴＧＴＡＴＴＧＴＧ（配列番号：１６）；上流リバー
スプライマー、ＴＧＡＧＴＧＴＧＧＧ ＡＣＣＣＴＣＡＡＧＡ Ｇ（配列番号：１７）；
上流プローブ、ＦＡＭ−ＴＧＡＣＣＣＡＡＧＣ ＣＣＴＡＣＡＴＧＧＣ ＣＡＣＴ−ＢＨ
Ｑ（配列番号：１８）；下流フォワードプライマー、ＴＧＡＧＧＡＧＡＧＣ ＴＣＡＣＧ
ＧＧＡＡＴ Ｃ（配列番号：１９）；下流リバースプライマー、ＡＣＣＣＡＴＣＴＣＣ
ＴＧＣＧＴＴＴＣＴＧ（配列番号：２０）；下流プローブ、ＦＡＭ−ＴＴＧＡＣＡＣＧＣ
Ｃ ＡＧＣＴＡＣＡＣＴＧ ＣＴＣＣＡ−ＢＨＱ（配列番号：２１）；ここでＦＡＭは５
−カルボキシフルオレセイン蛍光プローブを指し、ＢＨＱはブラックホール消光剤型の蛍
光消光剤を指す（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。標的化ベクターを
取り込み、そのゲノムに組み込んだＥＳ細胞クローンから精製されたＤＮＡを、３８４ウ
ェルＰＣＲプレート（ＭｉｃｒｏＡｍｐ（商標）Ｏｐｔｉｃａｌ ３８４−Ｗｅｌｌ Ｒ
ｅａｃｔｉｏｎ Ｐｌａｔｅ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で製造業者の推
奨に従ってＴａｑＭａｎ（商標）Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉ
ｘ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と組み合わせて、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓ
ｙｓｔｅｍｓ Ｐｒｉｓｍ ７９００ＨＴ（これはＰＣＲ過程の間に蛍光データを収集し
、蓄積した蛍光が予め設定された閾値に達するフラクショナルＰＣＲサイクルである閾値
サイクル（Ｃｔ）を決定する）においてサイクルさせた。上流および下流ＩＬ−４Ｒα特
異的ｑＰＣＲおよび標的ではない参照遺伝子に対する２つのｑＰＣＲが、各ＤＮＡサンプ
ルについて実行された。各ＩＬ−４Ｒα特異的ｑＰＣＲと各参照遺伝子ｑＰＣＲとの間の
Ｃｔ値（ΔＣｔ）の差を算出し、次いで各ΔＣｔとアッセイされたサンプル全てについて
のメジアンΔＣｔとの間の差を算出して、各サンプルについてのΔΔＣｔ値を得た。各サ
ンプルにおけるＩＬ−４Ｒα遺伝子のコピー数を以下の式から算出した：コピー数＝２×
２^{−ΔΔＣｔ}。そのネイティブコピーのうちの１つを失った、適正に標的化されたクロー
ンは、１と等しいＩＬ−４Ｒα遺伝子コピー数を有することになる。ヒトＩＬ−４Ｒα遺
伝子配列が、ヒト化した対立遺伝子において除去されたマウスＩＬ−４Ｒα遺伝子配列と
置き換わったことの確認は、以下のプライマー−プローブのセット（５’から３’へと記
載される）を含むＴａｑＭａｎ（商標）ｑＰＣＲアッセイによって確認された：ヒトフォ
ワードプライマー、ＡＣＣＴＧＣＧＴＣＴ ＣＣＧＡＣＴＡＣＡＴ Ｇ（配列番号：２２
）；ヒトリバースプライマー、ＧＡＧＣＴＣＧＧＴＧ ＣＴＧＣＡＡＴＴＧ（配列番号：
２３）；ヒトプローブ、ＦＡＭ−ＴＧＧＧＡＣＣＡＴＴ ＣＡＴＣＴＴＣＣＡＣ ＴＣＧ
ＣＡ−ＢＨＱ（配列番号：２４）。ｎｅｏ選択カセットがヒトＩＬ−４Ｒα遺伝子配列と
共に、ヒト化した対立遺伝子に挿入されたことの確認は、以下のプライマー−プローブの
セット（５’から３’へと記載される）を含むＴａｑＭａｎ（商標）ｑＰＣＲアッセイに
よって確認された：ｎｅｏフォワードプライマー、ＧＧＴＧＧＡＧＡＧＧ ＣＴＡＴＴＣ
ＧＧＣ（配列番号：２５）；ｎｅｏリバースプライマー、ＧＡＡＣＡＣＧＧＣＧ ＧＣＡ
ＴＣＡＧ（配列番号：２６）；ｎｅｏプローブ、ＦＡＭ−ＴＧＧＧＣＡＣＡＡＣ ＡＧＡ
ＣＡＡＴＣＧＧ ＣＴＧ−ＢＨＱ（配列番号：２７）。

標的化されたＥＳ細胞に由来するマウスについて、尾部の生検から精製されたＤＮＡを
アッセイして、それらのＩＬ−４Ｒα遺伝子型を決定し、ヒト化ＩＬ−４Ｒα対立遺伝子
が生殖系列を通じて伝達されたことを確認するために、同一のＬＯＮＡアッセイを使用し
た。置換についてヘテロ接合性の２匹の子を交配して、ヒトＩＬ−４Ｒα遺伝子による内
因性マウスＩＬ−４Ｒα遺伝子の置換についてホモ接合性であるマウスを生じさせる。表
現型決定のために、置換についてホモ接合性である子を使用する。

ネズミのＩＬ−４Ｒα遺伝子座とヒトＩＬ−４Ｒα遺伝子を含有する配列との上流ジャ
ンクションは、

内となるように設計され、ここで、ヒトＩＬ−４Ｒα配列は斜字体で示され、ＩＬ−４Ｒ
αコード配列は下線付きで示される。ヒトＩＬ−４Ｒα遺伝子を含有する配列とｌｏｘＰ
導入ｎｅｏ選択カセットとの下流ジャンクションは、

内となるように設計され、ここで、ヒトＩＬ−４Ｒα配列は斜字体で示され、カセット配
列は小文字で示される。ｌｏｘＰ導入ｎｅｏ選択カセットの配列とネズミのＩＬ−４Ｒα
遺伝子座との下流ジャンクションは、５’− ｔａｔｔｇｔｔｔｔｇ ｃｃａａｇｔｔｃ
ｔａ ａｔｔｃｃａｔｃａｇ ａｃｃｔｃｇａｃｃｔ ｇｃａｇｃｃｃｃｔａ ｇａｔａ
ａｃｔｔｃｇ ｔａｔａａｔｇｔａｔ ｇｃｔａｔａｃｇａａ ｇｔｔａｔｃｃｔａｇ
ｇｔｔｇｇａｇｃｔｃ ＴＣＴＧＴＡＧＣＣＡ ＧＧＴＡＡＣＣＡＡＧ ＧＧＴＣＣＣＡ
ＧＧＧ ＧＡＡＣＣＣＣＣＡＧ ＴＧＴＧＧＡＣＧＣＧ ＧＡＣＴＧＣＡＣＡＴ ＧＡＣ
ＡＣＡＧＧＧＣ ＧＧＣＣＴＣＣＣＣＡ ＴＴＣＡＴＧＡＣＴＧ ＴＴＴＴＴＣＴＣＣＴ
ＴＧＣＡＧ（ＡＣＴＴＣ ＣＡＧＣＴＧＣＣＣＣ ＴＧＡＴＡＣＡＧＣＧ ＣＣＴＴＣ
ＣＡＣＴＧ ＧＧＧＧＴＣＡＣＣＡ ＴＣＴＣＣＴＧＣＣＴ ＣＴＧＣＡＴＣＣＣＧ Ｔ
ＴＧＴＴＴＴＧＣＣ ＴＧＴＴＣＴＧＴＴＡ ＣＴＴＣＡＧＣＡＴＴ ＡＣＣＡＡ）ＧＴ
ＧＡＧ ＴＴＣＣＴＧＣＴＴＴ ＧＧＣＴＧＧＴＧＴＣ ＴＣＴＧＧＣＴＧＧＣ ＣＣＴ
ＴＣＡＧＣＡＧ ＴＧＣＴＣＴＣＡＧＡ ＧＧＴＣＡＣＡＧＴＣ ＡＴＴＧＴＧＣＴＧＧ
ＣＴＧＡＧＡＡＡＡＧ（配列番号：３０）内となるように設計され、ここで、マウスＩ
Ｌ−４Ｒαコード配列は括弧付きで示され、ｎｅｏカセット配列は小文字で示される。

実施例３
二重にヒト化したＩＬ−４／ＩＬ−４Ｒαマウスの生成
二重にヒト化したＩＬ−４／ＩＬ−４Ｒa（Ｉｌ４^{ｈｕ／ｈｕ}／Ｉｌ４ｒａ^{ｈｕ／ｈｕ}
）マウスを以下のように生成した。ヒト化ＩＬ−４Ｒα遺伝子およびｌｏｘＰ導入ｎｅｏ
カセットを含むＥＳ細胞クローンＭＡＩＤ ８０３を、Ｃｒｅ発現ベクターを用いて電気
穿孔し、ｌｏｘＰ導入ｎｅｏカセットを除去して、薬剤選択カセット無しでヒト化ＩＬ−
４Ｒα遺伝子を含むＥＳ細胞クローンＭＡＩＤ １４４４を生成した（実施例２を参照の
こと）。ヒト化ＩＬ−４遺伝子およびｌｏｘＰ導入ｈｙｇｒｏカセットを含む、ＥＳ細胞
クローンＭＡＩＤ ８７９を生成するために使用された同一の標的化構築物（実施例１を
参照のこと）を、ＥＳ細胞クローンＭＡＩＤ １４４４に電気穿孔して、８７９ Ｈｅｔ
／１４４４ Ｈｅｔ（Ｉｌ４^＋／ｈｕ／Ｉｌ４ｒａ^＋／ｈｕ）ＥＳ細胞を生成し、続いて
これを、Ｃｒｅ発現ベクターを用いて電気穿孔して、ｌｏｘＰ導入ｈｙｇｒｏカセットを
除去し、ヒト化ＩＬ−４遺伝子およびヒト化ＩＬ−４Ｒα遺伝子を含むＥＳ細胞クローン
（ＭＡＩＤ １５５３／１４４４）を生成した。二重にヒト化したＩＬ−４／ＩＬ−４Ｒ
αマウスを生成するために、薬剤カセットを有しないＥＳ細胞クローンＭＡＩＤ １５５
３／１４４４を８細胞期のＳＷマウス胚に導入した。

実施例４
ヒトＩＬ−４遺伝子置換およびヒトＩＬ４Ｒα遺伝子置換を有するマウスにおける、完全
ヒトＩＬ−４Ｒα ｍＡｂであるデュピルマブの有効性評価
方法
８．８ｋｂのヒトＩＬ−４ゲノム配列によるマウス全長ＩＬ−４遺伝子座の置換（実施
例１および図２Ａを参照のこと）、および対応するヒトＩＬ−４ＲαゲノムＤＮＡの１５
．６ｋｂの断片によるマウスＩＬ−４Ｒα（ＣＤ１２４）遺伝子の細胞外領域（すなわち
、細胞外ドメイン）の置換（実施例２および図２Ｂを参照のこと）の両方のために、Ｖｅ
ｌｏｃｉＧｅｎｅ（登録商標）技術を使用して、遺伝子改変マウスを生成した。

ホモ接合性ヒト化ＩＬ−４Ｒα遺伝子を有するマウスを、ヒト遺伝子の発現および機能
について検証した。ヒト化したマウスによるヒトＩＬ−４Ｒαの発現を判定するために、
野生型およびヒト化したマウスの脾臓細胞を収集し、蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）解
析のためにマウスＣＤ３、マウスＣＤ１９、ヒトＣＤ１２４、およびマウスＣＤ１２４に
対する蛍光標識抗体で処理した。（例えば、Ｂｌａｅｓｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００３）
Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＩＬ−４ ｒｅｃｅｐｔ
ｏｒ ａ ｃｈａｉｎ Ｉ４Ｒ ｍｏｔｉｆ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ａｌｌｅｒｇｉｃ ａ
ｉｒｗａｙ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １９８（８）：１１８９
−１２００を参照のこと）。

リガンドの特異性および受容体の機能性を実証するために、ヒト化ＩＬ−４Ｒαマウス
に由来する初代細胞を使用した。野生型およびヒト化ＩＬ−４Ｒαマウス由来の大腿骨骨
髄細胞を使用して骨髄由来マクロファージを、１０％のウシ胎児血清を含有するＤＭＥＭ
に２０％のＬ−細胞ならし培地を加えたものの中で７日間培養した。

次いで細胞を、培地中で希釈した２０ｎｇ／ｍＬのマウスＩＬ−４、マウスＩＬ−１３
、ヒトＩＬ−４、ヒトＩＬ−１３、またはビヒクルで個別に２０時間処理した。各条件由
来の４連のサンプルを遺伝子発現解析のために採取した。

これらのサンプル由来の全ＲＮＡを抽出し、Ｃｙ３−ＣＴＰを組み込むことによってｃ
ＲＮＡへと増幅した。次いで、各サンプル由来のＣｙ３標識ｃＲＮＡを、マウスのトラン
スクリプトームをカバーする４３，５３８個の６０塩基長のオリゴからなるカスタム仕様
のＡｇｉｌｅｎｔアレイにハイブリダイズさせた。Ａｇｉｌｅｎｔ Ｆｅａｔｕｒｅ Ｅ
ｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ９．５を使用して、スキャンしたアレイ画像から
データを抽出した。

実験群間で差を示すように発現した遺伝子を、スチューデントのｔ検定（ｐ＜０．０５
、変動比≧１．５）を使用して同定した。これらの遺伝子の発現クラスターを、Ｇｅｎｅ
Ｓｐｒｉｎｇ ＧＸ７．３由来のピアソン相関クラスタリングアルゴリズムを使用して生
成した。

ヒト化ＩＬ−４Ｒα（Ｉｌ４ｒａ^{ｈｕ／ｈｕ}）マウスから単離された一次Ｂ細胞を用い
たインビトロＩｇＥクラススイッチングアッセイを使用して、ＩＬ−４に対するデュピル
マブの中和効果を評価した。

インビボでのマウスＩＬ−２５の発現のために、野生型（ＷＴ）およびヒト化ＩＬ−４
Ｒα（Ｉｌ４ｒａ^{ｈｕ／ｈｕ}）マウスに、裸プラスミドＤＮＡ溶液の大容積（ハイドロダ
イナミック）駆動遺伝子送達を受容させた（例えば、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．（１９９９）
Ｈｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃｓ−ｂａｓｅｄ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ａｎｉｍ
ａｌｓ ｂｙ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｓｍｉ
ｄ ＤＮＡ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ６：１２５８−１２６６を参照のこと）。８日
後に末梢血液を回収して、市販のＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、米国ミネ
ソタ州）を使用して血清ネズミＩｇＥ（ｍＩｇＥ）レベルを測定した。

７日間培養で、ヒト化マウス脾臓細胞由来精製一次Ｂ細胞を、細菌性ＬＰＳで活性化す
ると共に、増加する量の組み換え型ヒトＩＬ−４と混合して、免疫グロブリンのクラスス
イッチングを誘発した。抗体遮断実験のために、精製したＢ細胞を、増加する用量のデュ
ピルマブと共に３０分間インキュベートした後、０．１６７ｎＭの組み換え型ヒトＩＬ−
４を添加して７日間培養した。ＩＬ−４非存在下でのＩｇＥ産生またはアイソタイプ対照
ｍＡｂを用いた場合のＩｇＥ産生が、それぞれ、（◇）および（△）で示される。市販の
ＥＬＩＳＡキットを使用して培養上清中のネズミのＩｇＥのレベルを測定した（例えば、
Ｍｏｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＩｇＧ１ ａｎｄ
ＩｇＥ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｂｙ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ４ ｉｎ ｍｏｕｓｅ
Ｂ ｃｅｌｌｓ，Ｓｃａｎｄ Ｉ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３０：３５５−３６１を参照のこと
）。

インターロイキン−２５（ＩＬ−２５）は、Ｔｈ２細胞によって産生されるサイトカイ
ンであり、その主な活性はＩＬ−４およびＩＬ−１３の産生を介して媒介され、肺の粘液
産生の増加および杯細胞過形成などの組織特異的な症状を誘発する（Ｆｏｒｔ ｅｔ ａ
ｌ．（２００１）ＩＬ−２５ ｉｎｄｕｃｅｓ ＩＬ−４，ＩＬ−５，ａｎｄ ＩＬ−１
３ ａｎｄ Ｔｈ２−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐａｔｈｏｌｏｇｉｅｓ ｉｎ ｖｉｖｏ
，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １５（６）：９８５−９９５を参照のこと）。

ＩＬ−１３の欠如は、標的器官におけるＩＬ−２５が誘発する症状から動物を保護する
。したがって、ヒト化ＩＬ−４遺伝子および／またはヒト化ＩＬ−４Ｒα遺伝子を含むマ
ウスにおいて、インビボでのデュピルマブの薬力学特性（ＰＤ）を評価するために、ＩＬ
−２５駆動性肺炎症モデルを使用した。

ヒト化ＩＬ−４Ｒα（Ｉｌ４ｒａ^{ｈｕ／ｈｕ}）マウスにおいて、肺の粘液貯留を測定す
ることにより、ＩＬ−２５−誘発性炎症法（IL-25-induced inflammation method）を
使用して、ＩＩ型受容体に対するデュピルマブのＰＤ応答の特性を明らかにした。

０日目に、ＷＴおよびヒト化ＩＬ−４Ｒα（Ｉｌ４ｒａ^{ｈｕ／ｈｕ}）マウスにマウスＩ
Ｌ−２５発現ベクターのハイドロダイナミック送達を受容させ、その後、示された用量で
デュピルマブまたはアイソタイプ対照ｍＡｂを注射した。一日おきに合計４投与、追加的
な抗体投与がなされた。８日目に、安楽死させたマウスから肺組織を回収し、処理した肺
切片を過ヨウ素酸シッフによって染色した後、病理学的変化について盲検法によりスコア
化した。

結果
ヒト化ＩＬ−４Ｒαマウスは以下を示すように特徴付けられた。（ａ）二重にヒト化し
たＩＬ−４／ＩＬ−４Ｒα（Ｉｌ４^{ｈｕ／ｈｕ}／Ｉｌ４ｒａ^{ｈｕ／ｈｕ}）マウス由来の初
代細胞上のヒトＩＬ−４Ｒαの発現（図３を参照のこと）、（ｂ）ヒト化ＩＬ−４Ｒα（
Ｉｌ４ｒａ^{ｈｕ／ｈｕ}）マウスにおけるＩＬ−４リガンド特異性の変化（図４を参照のこ
と）、および（ｃ）ヒト化ＩＬ−４Ｒα（Ｉｌ４ｒａ^{ｈｕ／ｈｕ}）マウスにおけるＩＬ−
１３経路の機能性（図４を参照のこと）。

ゲーテッドＢ細胞およびＴ細胞の集団（gated B and T cell populations）上の
ＩＬ−４Ｒα（ＣＤ１２４）の標識化プロファイルが示され、陰影を付けた区域で対応す
る染色されていない細胞集団の分布が示される図３に示すように、野生型およびヒト化Ｉ
Ｌ−４Ｒα（Ｉｌ４ｒａ^{ｈｕ／ｈｕ}）マウスは類似した量のＩＬ−４Ｒαタンパク質をＢ
細胞（ＣＤ１９^＋、ＣＤ３⁻）およびＴ細胞（ＣＤ１９⁻、ＣＤ３^＋）上に発現する。

図４（左側）に示すように、野生型（Ｉｌ４ｒａ^＋／＋）マウスは、ヒトＩＬ−４では
なくマウスＩＬ−４に応答し、マウスＩＬ−１３およびヒトＩＬ−１３の両方に応答する
。図４（右側）に示すように、ヒト化ＩＬ−４Ｒα（Ｉｌ４ｒａ^{ｈｕ／ｈｕ}）マウスは、
マウスＩＬ−４ではなくヒトＩＬ−４に応答し、マウスＩＬ−１３およびヒトＩＬ−１３
の両方に応答する。

このデータは、ＩＬ−１３ではなくＩＬ−４が野生型およびヒト化ＩＬ−４Ｒα（Ｉｌ
４ｒａ^{ｈｕ／ｈｕ}）マウスにおいて種特異性を呈することを示す。

図５に示すように、ＩＬ−４のＩｇＥクラススイッチングを媒介する主要な因子として
の役割が、ヒト化ＩＬ−４Ｒα（Ｉｌ４ｒａ^{ｈｕ／ｈｕ}）マウスにおけるマウスＩＬ−２
５遺伝子送達の後の循環ＩｇＥレベルの上昇の欠如によって支持された。

デュピルマブモノクローナル抗体は、インビトロおよびインビボで研究された。

図６に示すように、デュピルマブは、ヒト化ＩＬ−４Ｒα（Ｉｌ４ｒａ^{ｈｕ／ｈｕ}）マ
ウス由来の一次Ｂ細胞の培養液において、ヒトＩＬ−４に誘発されたＩｇＥ産生を妨げる
。

図７に示すように、デュピルマブは、１０ｍｇ／ｋｇ以上で、ＩＬ−２５に誘発された
肺の症状を用量依存的に低減した（２５ｍｇ／ｋｇで粘液に関する症状を低減した）。

結論
上記結果は、サイトカインに誘発された炎症を有する遺伝子改変マウスモデルにおける
、完全ヒト抗ヒトＩＬ−４Ｒαモノクローナル抗体であるデュピルマブの薬理活性を実証
している。

ヒトＩＬ−４遺伝子および／またはヒトＩＬ−４Ｒα遺伝子による置換を有する遺伝子
改変マウスの生成は、異種間での交差反応性が制限された状態で遺伝子オルソログの機能
および抗体候補のインビボでの有効性を評価するための強力なツールを提供する。

実施例５
チリダニ類抽出物（ＨＤＭ）に誘発された肺炎症モデル
チリダニ類（ＨＤＭ）抽出物（Ｇｒｅｅｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の鼻腔内曝露
によって、二重にヒト化したＩＬ−４およびＩＬ−Ｒ４αマウスにおいて慢性気道炎症を
誘発した。簡潔に述べると、先ず、１０日間のＨＤＭ懸濁液（２．５μｇ／ｍＬの濃度に
て２０μｌ）の鼻腔内滴下によってマウスの感受性を高めた。２週間の回復期間後、５週
目と１２週目との間に週３回、鼻腔内ＨＤＭ適用によってマウスは再曝露された。皮下注
射によるデュピルマブ（抗ＩＬ４Ｒα抗体）の処置を、週に２回の頻度で７週目から開始
し、１２週目の実験終了まで行った。さらなる解析のために、組織サンプルを回収した。
図８に実験計画を図示する。

二重にヒト化したＩＬ−４およびＩＬ−４Ｒαマウスを使用した、ＨＤＭに誘発された気
道炎症モデルにおけるデュピルマブの治療有効性の実証
上述のプロトコルを使用して、二重にヒト化したＩＬ−４およびＩＬ−４Ｒα（ＩＬ−
４^{ｈｕ／ｈｕ}／ＩＬ−４Ｒ^{ｈｕ／ｈｕ}）マウスにおいて気道疾患を誘発した。肺組織の組
織学的解析により、鼻腔内へのＨＤＭ滴下が気道における粘液産生の増加を引き起こした
ことが示された。デュピルマブの処置は、ＨＤＭに曝露されたマウスにおける粘液貯留を
低減した。気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）中の浸潤細胞の解析により、好酸球数が、ＨＤ
Ｍ滴下によって増加し、デュピルマブの処置によって減少したことが示される。ヒト化し
たマウスにおけるＨＤＭの処置によって総循環ＩｇＥが上昇したが、これは有能なＩＬ−
４シグナル伝達経路を示唆する。デュピルマブの使用により、ＩｇＥのレベルを低減でき
た。対照的に、ＩＬ−４シグナル伝達に干渉することなくＩＬ−１３とのみ拮抗するコン
パレーター分子であるＩＬ１３Ｒ２α−Ｆｃは、粘液貯留の低減および好酸球浸潤の防止
において同等の活性を有した。にもかかわらず、循環ＩｇＥレベルでは、デュピルマブと
ＩＬ−１３拮抗薬であるＩＬ１３Ｒ２α−Ｆｃとの間で差を示す効果が検出された。ＩＬ
−１３経路単独の遮断は、ＨＤＭに誘発されたＩｇＥレベルを低減するには不十分であっ
たが、一方で、デュピルマブは、ＩＬ−４経路およびＩＬ−１３経路の両方を遮断するこ
とによって、アレルギーの主たる病原性媒介物であるＩｇＥの産生を低減した。

別個の実験の組では、異なる対照を使用したことを除いて上述のものと同一のプロトコ
ルを使用して、二重にヒト化したＩＬ−４およびＩＬ−４Ｒα（ＩＬ−４^{ｈｕ／ｈｕ}／Ｉ
Ｌ−４Ｒ^{ｈｕ／ｈｕ}）マウスにおいて気道疾患を誘発した。これらの実験では、デュピル
マブと同一のＩｇＧアイソタイプのアイソタイプ対照抗体を使用した。図９に実験計画を
図示する。Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ｍＲＮＡキット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈ）を使用して全Ｒ
ＮＡからｍＲＮＡを精製し、Ｓｃｒｉｐｔｓｅｑ ＲＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐキ
ット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用してｍＲＮＡからストランド特異的なＲＮＡ配列ライブ
ラリを調製した。３３ｂｐの読み取り長さでＨｉＳｅｑ ２０００（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）
を使用してライブラリをシーケンシングし、Ｃｌｃｂｉｏ（Ｑｉａｇｅｎ）ＲＮＡ−Ｓｅ
ｑワークフローを使用して未加工の読み取りから遺伝子発現レベルを抽出した。実験群間
で差を示すように発現された遺伝子を、スチューデントのｔ検定（ｐ＜０．０５、変動比
≧１．５）を使用して同定した。これらの遺伝子の発現クラスターをＧｅｎｅＳｐｒｉｎ
ｇ ＧＸ７．３由来のピアソン相関クラスタリングアルゴリズムを使用して生成した。二
重にヒト化したＩＬ−４およびＩＬ−４Ｒαマウスにおいて、ＨＤＭが肺の遺伝子発現の
変動を誘発することが見出され、かかる変動は、デュピルマブによって遮断された。処置
期間の終了時に安楽死させたマウスから血清サンプルを回収した。血清のネズミＩｇＥレ
ベルを市販のＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して測定した。通常の
一元配置ＡＮＯＶＡ法を使用して統計解析をおこなった。

実施例６
抗原に誘発された皮膚炎症モデル
二重にヒト化したＩｌ−４およびＩｌ−４Ｒαマウスにおける慢性皮膚炎を、以下の手
順で誘発できる。ヒト化したマウスの背中の毛を電気バリカンで剃り、次いで粘着テープ
で剥いで軽い傷を負わせ、皮膚バリアを破壊した。アレルゲン（オボアルブミンに細菌毒
素またはチリダニ類抽出物を加えたものなど）の溶液に浸したガーゼパッチを１週間、皮
膚に取り付け、これに続く２週間を回復期間とした。合計で７週間の間に、この手順を３
回繰り返し、アトピー性皮膚炎様の皮膚病巣を誘発する。処置したマウスは、ＩｇＥレベ
ルの増加、掻痒、上皮の肥厚、アトピー性皮膚炎の典型的な症状を有することになる。

実施例７
ヒト化ＩＬ−４Ｒαを発現するマウスにおける抗ヒトＩＬ−４Ｒα抗体のＰＫプロファイ
ルの特徴付け
この実施例は、ＲＥＧＮ６６８（ヒトＩＬ−４Ｒαを対象とするヒトモノクローナル抗
体、「デュピルマブ」としても知られる）および対照抗体ＲＥＧＮ６４６（サル代用、抗
ｍｆＩＬ−４Ｒ非結合対照抗体）のＰＫプロファイルを評価するために実施される実験を
記載する。

これらの実験で使用されたマウスは、ＭＡＩＤ １４４４（ヒト化ＩＬ−４Ｒα、また
は「ＩＬ−４ＲαＨｕｍＩｎ」についてホモ接合性であり、ＩＬ−４Ｒα細胞外ドメイン
はヒトのものであり、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインはマウスのものである）およ
び系統を一致させた（７５％がＣ５７ＢＬ／６、２５％が１２９Ｓｖ）野生型（「ＷＴ」
）の２０〜２３週齢のマウスであった。研究群は、薬剤当たり／投与当たりのコホートサ
イズが５匹のホモ接合性および５匹の系統を一致させたＷＴである、オスおよびメスの、
合計４０匹のマウスを含んだ。抗体（ＰＢＳ緩衝液中）を、皮下注射により１０ｍｇ／ｋ
ｇにてマウスに与えた。解析のために、注射した日（タイムポイント「０」または０日目
）、注射の６時間後、ならびに１日目、３日目、７日目、１０日目、１４日目、２１日目
、および３０日目にそれぞれ血液サンプルを採取した。

循環する薬剤（すなわち、ＲＥＧＮ６６８またはＲＥＧＮ６４６）のレベルは、ＥＬＩ
ＳＡイムノアッセイを使用する全ヒト抗体解析によって決定した。簡潔に述べると、ヤギ
抗ヒトＩｇＧポリクローナル抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、＃
１０９−００５−０９８）を９６ウェルプレート上にコーティングして、試験される血清
中のヒト抗体を捕捉し、次いでプレートに結合した抗体を、西洋ワサビペルオキシダーゼ
を結合させたヤギ抗ヒトＩｇＧポリクローナル抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅ
ｓｅａｒｃｈ、＃１０９−０３５−０９８）およびＴＭＢ基質（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇ
ｅｎ）を用いて検出した。血清サンプルを、１：１００〜１：２４３，０００の範囲でサ
ンプルごとに６段階に段階希釈し、それぞれの抗体の参照標準を１２段階に段階希釈した
。血清中の薬剤抗体濃度を、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して作成
した参照標準曲線に基づいて算出した。

マウスＩＬ−４Ｒαタンパク質のみを有する野生型マウスと比較して、ＩＬ−４Ｒα
ＨｕｍＩｎマウスでは、ＲＥＧＮ ６６８の半減期が短くなることが見出された。ＰＫプ
ロファイルにおけるこの差異は、モノクローナル抗体とヒトＩＬ−４α受容体との間の、
標的により媒介される相互作用および排除によって説明できる。したがって、ヒトまたは
ヒト化ＩＬ−４Ｒαを発現するマウスは、前臨床マウスモデルにおいて抗ヒトＩＬ−４Ｒ
α抗体（例えば、デュピルマブ）のＰＫ特性を特徴付けるために好適なシミュレーション
を提供する。

ヒト化ＩＬ−４および／またはＩＬ−４Ｒαマウスの用途
ヒト化ＩＬ−４および／またはＩＬ−４Ｒαは、ヒト特異的なＩＬ−４および／または
ＩＬ−４Ｒα拮抗薬（例えば、中和性の抗ＩＬ−４抗体および／または抗ＩＬ−４Ｒα抗
体、例えば、デュピルマブ）の薬力学（ＰＤ）を評価するために有用である。

ヒト化ＩＬ−４および／またはＩＬ−４Ｒαマウスにおける薬物動態学（ＰＫ）アッセ
イおよびＰＤアッセイは、当該技術分野で既知の標準的な手順に従って遂行される。

ヒト化ＩＬ−４および／またはＩＬ−４Ｒαマウスは、ヒト特異的なＩＬ−４および／
またはＩＬ−４Ｒα拮抗薬（例えば、中和性の抗ＩＬ−４抗体および／または抗ＩＬ−４
Ｒα抗体、例えば、デュピルマブ）のインビボでの治療有効性を、例えば本明細書の上記
に示したような、当該技術分野で既知の様々な疾患モデルにおいて試験するために有用で
ある。

実施例８
ヒトＩＬ−３３遺伝子による内因性マウスＩＬ−３３遺伝子の置換
マウスＩＬ−３３遺伝子（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：７７１２５、一次ソース：ＭＧＩ：１
９２４３７５；ＲｅｆＳｅｑ転写物：ＮＭ＿００１１６４７２４．１；ＵｎｉＰｒｏｔ
ＩＤ：Ｑ８ＢＶＺ５；ゲノムアセンブリ：ＮＣＢＩ３７／ｍｍ９；場所：ｃｈｒ１９：２
９，９９９，６０４−３０，０３５，２０５ ＋ストランド）は、８個のエクソンを有し
、２６６アミノ酸のタンパク質をコードする（GenBank Accession No. NP_001158196.
1）。

ヒトＩＬ−３３遺伝子（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：９０８６５、一次ソース：ＨＧＮＣ：１
６０２８；ＲｅｆＳｅｑ転写物：ＮＭ＿０３３４３９．３；ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ：Ｏ９
５７６０；ゲノムアセンブリ：ＧＲＣｈ３７／ｈｇ１９；場所：ｃｈｒ９：６，２１５，
１４９−６，２５７，９８３ ＋ストランド）も、８個のエクソンを有し、２７０アミノ
酸のタンパク質をコードする（GenBank Accession No. NP_254274.1）。

ヒトＩＬ−３３遺伝子のＡＴＧ開始コドンから開始するエクソン２からエクソン８まで
（３’非翻訳領域を含む）を含有する１６３３３ｂｐのヒトゲノムセグメントにより、Ａ
ＴＧ開始コドンから開始するエクソン２から終止コドンを含むエクソン８のコーディング
部分まで広がる９３８１ｂｐのマウスＩＬ−３３遺伝子遺伝子座を置換した。図１０Ａを
参照のこと。

単一の標的化工程で、ヒトＩＬ−３３ゲノムセグメントによりマウスＩＬ−３３遺伝子
を置換するための標的化構築物は、ＶｅｌｏｃｉＧｅｎｅ（登録商標）遺伝子工学技術（
Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｅ
ｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ ｇｅｎｏｍｅ ｃｏｕｐｌｅｄ ｗ
ｉｔｈ ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ，
Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ，２１（６）：６５２−６５９を参照のこと）を使用して
構築した。これは、マウスおよびヒトのＩＬ−３３ ＤＮＡを、それぞれ、細菌人工染色
体（ＢＡＣ）クローンであるｂＭＱ−３５０Ｉ１８およびＣＴＤ−３０１５Ｍ１５から得
たこと、ならびに標的化ベクターがｌｏｘＰネオマイシン選択カセットを含んでいたこと
を除いて、ヒトＩＬ−４ゲノムセグメントによりマウスＩＬ−４遺伝子を置換するための
上記の実施例１に記載された手順と類似である（図１０Ｂ）。

適正に標的化されたＥＳ細胞クローン（ＭＡＩＤ ７０６０）を、ロスオブネイティブ
アレル（ＬＯＮＡ）アッセイ（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ ｅｔ ａｌ．２００３）によって
同定した。上記アッセイでは、除去の対象となったマウスＩＬ−３３遺伝子内の配列に対
して特異的な２つのＴａｑＭａｎ（商標）定量ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）によっ
て、天然の、改変されていないＩＬ−３３遺伝子のコピーの数を決定した。ｑＰＣＲアッ
セイは、以下のプライマー−プローブのセットを含んだ（５’から３’へと記載される）
：
上流（「ｍＴＵ」）：
フォワードプライマー、ＴＴＧＧＡＣＴＡＧＴＡＡＣＡＡＧＡＡＧＧＧＴＡＧＣＡ（
配列番号：３１）；
リバースプライマー、ＣＣＴＴＴＣＣＣＡＴＣＡＣＣＣＴＣＴＡＡＣＴＴ（配列番号
：３２）；
プローブ（ＭＧＢ）、ＡＧＣＴＣＴＧＧＴＧＧＡＣＡＧＡ（配列番号：３３）；
下流（「ｍＴＤ」）：
フォワードプライマー、ＴＣＴＣＴＧＣＣＡＡＧＣＴＧＣＴＴＡＴＣＣ（配列番号：
３４）；
リバースプライマー、ＧＧＣＴＧＣＡＴＧＧＡＡＧＡＧＧＴＧＡＡ（配列番号：３５
）；
プローブ（ＭＧＢ）、ＣＴＣＴＣＣＡＣＡＡＡＴＣＧ（配列番号：３６）。

ヒトＩＬ−３３遺伝子の配列が、ヒト化した対立遺伝子においてマウスＩＬ−３３遺伝
子配列と置き換わったことの確認は、以下のプライマー−プローブのセットを含むＴａｑ
Ｍａｎ（商標）ｑＰＣＲアッセイによって確認された（５’から３’へと記載される）：
上流（「ｈＴＵ」）
フォワードプライマー、ＣＡＧＧＣＡＧＧＡＡＴＡＧＣＴＧＡＧＡＴＡＡＴＣＴ（配
列番号：３７）；
リバースプライマー、ＴＧＴＧＧＡＧＣＡＡＡＡＡＧＴＧＧＴＴＧＡＴ（配列番号：
３８）；
プローブ（ＭＧＢ）、ＣＣＴＧＴＧＡＡＴＡＧＴＧＡＴＡＡＡＣ（配列番号：３９）
；
下流（「ｈＴＤ」）：
フォワードプライマー、ＣＡＧＴＴＣＣＡＡＡＣＧＡＴＡＧＧＣＴＣＡＡ（配列番号
：４０）；
リバースプライマー、ＡＴＡＡＴＴＣＴＧＴＧＡＡＧＣＡＴＣＴＧＧＴＣＴＴＣ（配
列番号：４１）；
プローブ（ＭＧＢ）、ＣＴＡＧＡＧＣＴＧＣＴＡＧＴＡＡＡＡ（配列番号：４２）。

ネズミのＩＬ−３３遺伝子座とヒトＩＬ−３３遺伝子を含有する配列との上流ジャンク
ション（図１０Ｂでは「Ｉ」で示される）は、

内となるように設計され、ここで、ヒトＩＬ−３３配列は斜字体で示され、ヒト開始コド
ンＡＴＧは下線付きで示される。ヒトＩＬ−３３ゲノム配列を含む配列とｌｏｘＰネオマ
イシン選択カセットとの下流ジャンクション（図１０Ｂでは「ＩＩ」で示される）は、

内となるように設計され、ここで、ヒトＩＬ−３３配列は斜字体で示され、ジャンクショ
ンは「／」記号で示され、ｌｏｘ Ｐ部位は下線付きで示される。ｌｏｘＰｎｅｏ選択カ
セットの配列とネズミのＩＬ−３３遺伝子座との下流ジャンクション（図１０Ｃでは「Ｉ
ＩＩ」で示される）は、５’−ＡＧＣＣＣＣＴＡＧＡ ＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡ ＴＡＡＴ
ＧＴＡＴＧＣ ＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴ ＴＡＴＧＣＴＡＧＴＡ ＡＣＴＡＴＡＡＣＧＧ
ＴＣＣＴＡＡＧＧＴＡ ＧＣＧＡＧＣＴＡＧＣ／ＣＧＣＣＴＧＴＧＣＧ ＴＴＣＴＧＧＧ
ＴＴＧ ＡＡＴＧＡＣＴＴＡＡ ＴＧＣＴＴＣＣＡＡＣ ＴＧＡＡＧＡＡＡＧＧ ＧＴＡ
ＡＣＡＧＡＧＡ ＧＡＡＡＧＡＡＡＧＣ ＣＡＴＴＣＴＴＧＧＣ−３’（配列番号：４５
）内となるように設計され、ここで、ジャンクションは「／」記号によって示され、ｌｏ
ｘＰ部位は下線付きで示される。

適正に標的化されたＥＳ細胞（ＭＡＩＤ ７０６０）を、一過性Ｃｒｅ発現ベクターを
用いてさらに電気穿孔して、薬剤選択カセットを除去し、薬剤カセットを有さないＥＳ細
胞クローン（ＭＡＩＤ ７０６１）を得た。これらのＭＡＩＤ ７０６１ ＥＳ細胞内の
上流ジャンクション（図１８Ｃでは「Ｉ」で示される）は、ＭＡＩＤ ７０６０ ＥＳ細
胞内のものと同一である。下流ジャンクション（図１８Ｃでは「ＩＩ」で示される）は、

内となるように設計され、ここで、３’ヒトＩＬ−３３配列は、最初の「／」記号の前ま
で斜字体で示され、マウスＩＬ−３３ ３’配列は、２番目の「／」記号の後ろから斜字
体で示され、ｌｏｘＰ部位は下線付きで示される。

適正に標的化されたＥＳ細胞（ＭＡＩＤ ７０６０またはＭＡＩＤ ７０６１）を、Ｖ
ｅｌｏｃｉＭｏｕｓｅ（登録商標）法によって８細胞期のＳＷマウス胚に導入した（米国
特許第７，２９４，７５４号、同第７，５７６，２５９号、同第７，６５９，４４２号、
およびＰｏｕｅｙｍｉｒｏｕ ｅｔ ａｌ．（２００７） Ｆ０ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ
ｍｉｃｅ ｔｈａｔ ａｒｅ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｆｕｌｌｙ ｄｅｒｉｖｅｄ
ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｄｏｎｏｒ ｇｅｎｅ−ｔａｒｇｅｔｅｄ ＥＳ ｃｅｌｌｓ ａ
ｌｌｏｗｉｎｇ ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ ａｎａｌｙｓｅｓ，Ｎａ
ｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２５（１）：９１−９９を参照のこと）。ヒト化ＩＬ−３３
遺伝子を有するＶｅｌｏｃｉＭｉｃｅ（登録商標）（ドナーＥＳ細胞に完全に由来するＦ
０マウス）を、対立遺伝子アッセイの改変を用いてマウス対立遺伝子の消失およびヒト対
立遺伝子の獲得について遺伝子型を決定することによって同定した（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌ
ａ ｅｔ ａｌ．（２００３）を参照のこと）。標的化されたＥＳ細胞に由来するマウス
ついて、尾部の生検から精製されたＤＮＡをアッセイして、それらのＩＬ−３３遺伝子型
を決定し、ヒト化ＩＬ−３３対立遺伝子が生殖系列を通じて伝達されたことを確認するた
めに、同一のＬＯＮＡアッセイを使用した。置換についてヘテロ接合性の２匹の子を交配
して、内因性マウスＩＬ−３３遺伝子のヒトＩＬ−３３遺伝子による置換についてホモ接
合性であるマウスを生成した。

Claims (1)

1. 明細書に記載の発明。

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