KR20220165814A - 인간화 IL-4 및 IL-4Rα 동물 - Google Patents
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- A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
- A01K2267/035—Animal model for multifactorial diseases
- A01K2267/0368—Animal model for inflammation
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
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- A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
- A01K2267/0393—Animal model comprising a reporter system for screening tests
Abstract
인간 또는 인간화 IL-4 및/또는 IL-4R 핵산 서열을 포함하는 비-인간 동물이 제공된다. 전체적 또는 부분적으로, 내인성 IL-4 유전자 및/또는 IL-4R 유전자의 인간 IL-4 유전자 및/또는 IL-4R 유전자로의 치환을 포함하는 비-인간 동물, 및 비-인간 동물을 제조하고 사용하기 위한 방법이 기술된다. 내인성 비인간 IL-4 유전좌위(locus)에서 비인간 IL-4-암호화 서열의 인간 IL-4-암호화 서열로의 치환을 갖는 비-인간 동물을 포함하는, 비-인간 IL-4 조절 요소의 조절 하에 인간 또는 인간화 IL-4 유전자를 포함하는 비-인간 동물이 또한 제공된다. 내인성 비인간 C IL-4R 유전좌위에서 비인간 IL-4R-암호화 서열의 인간 또는 인간화 IL-4R-암호화 서열로의 치환을 갖는 비-인간 동물을 포함하는, 비인간 IL-4R 조절 요소의 조절 하에 인간 또는 인간화 IL-4R 유전자를 포함하는 비-인간 동물이 또한 제공된다. 인간 또는 인간화 IL-4 유전자 및/또는 IL-4R 서열을 포함하는 비-인간 동물이 제공되며, 비-인간 동물은 설치류, 예를 들어 마우스, 또는 랫트이다.
Description
관련 출원에 대한 교차 참조
본 출원은 그 내용 전체가 참조로서 본원에 통합되는 2014년 5월 7일에 출원된 미국 가출원 번호 61/989,757의 우선권의 혜택을 주장한다.
참조로서 서열 목록 포함
2015년 5월 7일에 생성되고, EFS-Web을 통해 미국 특허 상표청에 제출된 31260_SEQ.txt로 명명된 16 KB의 ASCII 텍스트 파일 내 서열 목록이 참조로서 본원에 통합된다.
기술 분야
인간 서열을 포함하는 IL-4 및/또는 IL-4Rα 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 비-인간 동물이 본원에 개시된다. 전체적 또는 부분적으로 인간 IL-4 및/또는 IL-4Rα 유전자를 포함하는 비-인간 유전자이식 동물이 또한 본원에 개시된다. 인간 또는 인간화 IL-4 및/또는 IL-4Rα 단백질을 발현하는 비-인간 동물도 또한 개시된다. 또한, 인간 또는 인간화 IL-4 및/또는 IL-4Rα 핵산 서열을 포함하는 비-인간 동물을 제조하고 사용하기 위한 방법이 개시된다.
IL-4 및 IL-4Rα는 비정상적인 2형 T 보조 (Th2) 세포와 관련된 다양한 인간 질환, 장애 및 병태의 치료를 위한 치료적 표적이다. 인간 IL-4 또는 인간 IL-4Rα 단백질을 특이적으로 표적으로 하는 치료적 분자의 약물동력학(PK) 및 약력학(PD)의 평가는 일상적으로 비-인간 동물, 예를 들어, 설치류, 예를 들어, 마우스 또는 랫트에서 수행된다. 그러나, 이러한 치료적 분자의 PD는 특정 비-인간 동물에서는 적절하게 결정될 수 없는데, 이는 이러한 치료적 분자가 내인성 IL-4 또는 IL-4Rα 단백질을 표적으로 하지 않기 때문이다.
더욱이, 비정상적인 Th2 세포와 관련된 질환에서 다양한 비-인간 동물 모델을 사용한 인간 특이적 IL-4 및 IL-4Rα 단백질 길항제의 치료적 효능의 평가는, 이러한 종-특이적 길항제가 내인성 IL-4 또는 IL-4Rα 단백질과 상호작용하지 않는 비-인간 동물에서 문제가 된다.
따라서, 비-인간 동물의 IL-4 및/또는 IL-4Rα 유전자가 전체적 또는 부분적으로 인간화되거나, 각각, 인간 또는 인간화 IL-4 및/또는 IL-4Rα 단백질을 암호화하는 서열을 포함하는 인간 IL-4 및/또는 IL-4Rα 유전자로 치환된(예를 들어, 내인성 비-인간 유전좌위에서), 비-인간 동물, 예를 들어, 설치류, 예를 들어, 쥐과 동물, 예를 들어, 마우스 또는 랫트가 필요하다.
또한, IL-4 및/또는 IL-4R 유전자가 비-인간 조절 요소(예를 들어, 내인성 조절 요소)의 조절 하에 있는 IL-4 및/또는 IL-4Rα 유전자(예를 들어, 인간화, 또는 인간)를 포함하는 비-인간 동물이 필요하다.
또한, 기능적 IL-4 단백질을 발현하지만 인간 또는 인간화 IL-4 유전자를 포함하지 않는 연령이 맞는 비-인간 동물의 혈액, 혈장 또는 혈청 내에 존재하는 IL-4 단백질의 농도와 유사한 농도로 혈액, 혈장 또는 혈청 내에 인간 또는 인간화 IL-4 단백질을 발현하고/하거나, 기능적 IL-4Rα 단백질을 발현하지만, 인간 또는 인간화 IL-4Rα 유전자를 포함하지 않는 연령이 맞는 비-인간 동물의 면역 세포, 예를 들어, B 및 T 세포 상의 IL-4Rα 단백질의 수준과 유사한 수준으로 면역 세포, 예를 들어, B 및 T 세포 상에 인간 또는 인간화 IL-4Rα 단백질을 발현하는, 인간화 비-인간 동물이 필요하다.
인간 서열을 포함하는 IL-4 및/또는 IL-4Rα 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 비-인간 동물이 제공된다.
전체적 또는 부분적으로 인간인 IL-4 및/또는 IL-4Rα 유전자를 포함하는 비-인간 유전자이식 동물이 제공된다.
인간 또는 인간화 IL-4 및/또는 IL-4Rα 단백질을 발현하는 비-인간 동물이 제공된다.
내인성 비-인간 동물 IL-4 및/또는 IL-4Rα 유전자의 치환(전체적 또는 부분적)을 갖는 비-인간 동물이 제공된다.
내인성 비-인간 IL-4 및/또는 IL-4Rα 유전좌위(locus)에서 IL-4 및/또는 IL-4Rα 인간화(전체적 또는 부분적)를 포함하는 비-인간 동물이 제공된다.
인간 또는 인간화 IL-4 유전자를 갖는 비-인간 동물이 제공되며, 비-인간 동물은 내인성 IL-4 단백질을 발현하지 않고, 비-인간 동물은 기능적 내인성 IL-4 단백질을 발현하지만 인간 또는 인간화 IL-4 유전자를 포함하지 않는 연령이 맞는 비-인간 동물의 혈액, 혈장 또는 혈청에 존재하는 IL-4 단백질의 농도와 유사한 농도로 혈액, 혈장 또는 혈청에 인간 또는 인간화 IL-4 단백질을 발현한다.
인간 또는 인간화 IL-4Rα 유전자를 갖는 비-인간 동물이 제공되며, 비-인간 동물은 내인성 IL-4Rα 단백질을 발현하지 않고, 기능적 내인성 IL-4Rα 단백질을 발현하지만 인간 또는 인간화 IL-4Rα 유전자를 포함하지 않는 연령이 맞는 비-인간 동물의 면역 세포, 예를 들어, B 및 T 세포 상에 존재하는 IL-4Rα 단백질의 수준과 유사한 수준으로 면역 세포, 예를 들어, B 및 T 세포 상에 인간 또는 인간화 IL-4Rα 단백질을 발현한다.
일 양태에서, 인간 또는 인간화 IL-4 및/또는 IL-4Rα 핵산 서열을 포함하는 비-인간 동물이 제공된다.
일 양태에서, 내인성 IL-4 및/또는 IL-4Rα 를 암호화하는 유전자의 내인성 IL-4 및/또는 IL-4Rα 유전좌위에서 인간 또는 인간화 IL-4 및/또는 IL-4Rα 단백질을 암호화하는 유전자로의 치환을 포함하는 유전적으로 변형된 비-인간 동물이 제공된다. 내인성 설치류 IL-4 유전좌위에서 내인성 IL-4 유전자의 인간 IL-4 유전자로의 치환을 포함하고/하거나, 내인성 설치류 IL-4Rα 유전좌위에서 내인성 IL-4Rα 유전자의 인간 IL-4Rα 유전자로의 치환을 포함하는 설치류, 예를 들어, 마우스 또는 랫트가 제공된다. 일 구현예에서, 설치류는 마우스이다. 일 구현예에서, 설치류는 랫트이다.
일 양태에서, 내인성 설치류 IL-4 유전자의 인간화를 포함하는 유전적으로 변형된 설치류, 예를 들어, 마우스 또는 랫트가 제공되며, 이러한 인간화는 설치류 IL-4 유전자의 적어도 하나의 엑손을 포함하는 설치류 핵산의 내인성 설치류 IL-4 유전좌위에서의 인간 IL-4 유전자의 적어도 하나의 엑손을 포함하는 핵산 서열로의 치환으로 변형된 IL-4 유전자의 형성을 포함하고, 변형된 IL-4 유전자의 발현은 내인성 설치류 IL-4 유전좌위의 설치류 조절 요소의 조절 하에 있다.
일 구현예에서, 설치류는 마우스 또는 랫트이다. 일 구현예에서, 설치류는 마우스이다. 일 구현예에서, 설치류는 랫트이다.
일 구현예에서, 변형된 IL-4 유전자는 인간 또는 인간화 IL-4 단백질을 암호화하고, 인간 IL-4 유전자의 ATG 개시 코돈으로부터 시작하는 엑손 1 내지 엑손 4를 포함한다.
일 구현예에서, 설치류는 마우스 IL-4 단백질을 발현할 수 없는 마우스이다.
일 구현예에서, 설치류는 내인성 마우스 IL-4Rα 유전자에 의해 암호화되는 마우스 IL-4Rα 단백질을 발현하는 마우스이다.
일 구현예에서, 설치류는 인간 또는 인간화 IL-4Rα 단백질을 발현하는 마우스이다.
일 구현예에서, 인간화 IL-4Rα 단백질은 인간 IL-4Rα 단백질의 엑토도메인을 포함한다.
일 구현예에서, 인간화 IL-4Rα 단백질은 마우스 IL-4Rα 단백질의 막관통 도메인 및 세포질도메인을 포함한다.
일 구현예에서, 설치류는 마우스 IL-4Rα 유전자의 적어도 하나의 엑손을 포함하는 마우스 핵산의 내인성 마우스 IL-4Rα 유전좌위에서 인간 IL-4Rα 유전자의 적어도 하나의 엑손을 포함하는 핵산 서열로의 치환으로 변형된 IL-4Rα 유전자의 형성을 포함하는 마우스로서, 변형된 IL-4Rα 유전자의 발현은 내인성 마우스 IL-4Rα 유전좌위의 마우스 조절 요소의 조절 하에 있다.
일 구현예에서, 설치류는 마우스로서, 마우스 IL-4의 ATG 개시 코돈으로부터 시작하는 엑손 1 내지 엑손 4를 포함하는 마우스 IL-4 서열의 인접(contiguous) 게놈 단편은 인간 IL-4의 ATG 개시 코돈으로부터 시작하는 엑손 1 내지 엑손 4를 포함하는 인간 IL-4 서열의 인접 게놈 단편으로 치환된다.
일 구현예에서, 인간 또는 인간화 IL-4Rα 단백질을 암호화하는 변형된 IL-4Rα 유전자의 발현은 내인성 마우스 IL-4Rα 유전좌위의 마우스 조절 요소의 조절 하에 있다.
일 양태에서, 내인성 설치류 IL-4Rα 유전자의 인간화를 포함하는 유전적으로 변형된 설치류, 예를 들어, 마우스 또는 랫트가 제공되며, 인간화는 내인성 설치류 IL-4Rα 유전좌위에서 설치류 IL-4Rα 유전자의 엑손을 포함하는 설치류 핵산의 인간 IL-4Rα 유전자의 적어도 하나의 엑손을 암호화하는 핵산 서열로의 치환으로 변형된(즉, 인간화) IL-4Rα 유전자의 형성을 포함하고, 변형된, 인간화 IL-4Rα 유전자의 발현은 내인성 설치류 IL-4Rα 유전좌위의 설치류 조절 요소의 조절 하에 있다.
일 구현예에서, 설치류는 마우스 또는 랫트이다. 일 구현예에서, 설치류는 마우스이다. 일 구현예에서, 설치류는 랫트이다.
일 구현예에서, 변형된 IL-4Rα 유전자는 인간 또는 인간화 IL-4Rα 단백질을 암호화하고 인간 IL-4Rα 유전자의 ATG 개시 코돈으로부터 시작하는 엑손 1 내지 엑손 5를 포함한다.
일 구현예에서, 설치류는 마우스 IL-4Rα 단백질을 발현할 수 없는 마우스이다.
일 구현예에서, 설치류는 내인성 마우스 IL-4 유전자에 의해 암호화되는 마우스 IL-4 단백질을 발현하는 마우스이다.
일 구현예에서, 설치류는 인간 또는 인간화 IL-4 단백질을 발현하는 마우스이다.
일 구현예에서, 설치류는 마우스 IL-4 유전자의 엑손을 포함하는 마우스 핵산의 내인성 마우스 IL-4 유전좌위에서 인간 IL-4 유전자의 적어도 하나의 엑손을 암호화하는 핵산 서열로의 치환으로 변형된 IL-4 유전자의 형성을 포함하는 마우스로서, 변형된 IL-4 유전자의 발현은 내인성 마우스 IL-4 유전좌위의 마우스 조절 요소의 조절 하에 있다.
일 구현예에서, 설치류는 마우스이고, IL-4Rα의 ATG 개시 코돈으로부터 시작하는 엑손 1 내지 엑손 5를 포함하는 마우스 IL-4Rα 서열의 인접 게놈 단편은 인간 IL-4Rα의 ATG 개시 코돈으로부터 시작하는 엑손 1 내지 엑손 5를 포함하는 인간 IL-4Rα 서열의 인접 게놈 단편으로 치환된다.
일 양태에서, 인간 또는 인간화 IL-4 단백질을 발현하는 유전적으로 변형된 설치류, 예를 들어, 마우스 또는 랫트가 제공되며, 인간 또는 인간화 IL-4 단백질을 발현하는 설치류는 정상적인 면역계를 포함하여, 즉, 인간 또는 인간화 IL-4 단백질을 발현하는 설치류의 혈액, 혈장 또는 혈청 내 면역 세포, 예를 들어, B 및 T 세포의 수는 기능적 내인성 IL-4 단백질을 발현하는 설치류의 혈액, 혈장 또는 혈청 내 면역 세포, 예를 들어, B 및 T 세포의 수와 유사하다. 일 구현예에서, 설치류는 마우스이다. 일 구현예에서, 설치류는 랫트이다.
일 양태에서, 인간 또는 인간화 IL-4 유전자로부터 IL-4 단백질을 발현하는 유전적으로 변형된 설치류, 예를 들어, 마우스 또는 랫트가 제공되며, 설치류는 혈청 내에 인간 또는 인간화 IL-4 단백질을 발현한다. 일 구현예에서, 설치류는 마우스이다. 일 구현예에서, 설치류는 랫트이다.
일 구현예에서, 인간 또는 인간화 IL-4 단백질을 발현하는 설치류의 혈청은, 기능적, 내인성 IL-4 단백질을 발현하는 설치류, 예를 들어, 야생형 마우스 또는 랫트와 대략 동일한 수준의 IL-4 단백질을 갖는다. 일 구현예에서, 설치류는 마우스이다. 일 구현예에서, 설치류는 랫트이다.
일 구현예에서, 마우스는, 기능적 내인성 IL-4 단백질을 발현하지만 내인성 마우스 IL-4 유전좌위에서 내인성 IL-4 유전자의 인간 IL-4 유전자로의 치환을 포함하지 않는 연령이 맞는 마우스의 혈청 내 존재하는 IL-4 단백질의 수준의 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190% 또는 200%의 농도로 혈청 내에 인간 또는 인간화 IL-4 단백질을 발현한다.
일 구현예에서, 마우스는, 기능적 내인성 IL-4 단백질을 발현하지만, 내인성 마우스 IL-4 유전좌위에서 내인성 IL-4 유전자의 인간 IL-4 유전자로의 치환을 포함하지 않는 연령이 맞는 마우스의 혈청 내 존재하는 마우스 IL-4 단백질의 수준의 약 10% 내지 약 200%, 약 20% 내지 약 150%, 또는 약 30% 내지 약 100%의 농도로 혈청 내에 인간 또는 인간화 IL-4 단백질을 발현한다.
일 양태에서, 인간 또는 인간화 IL-4Rα 단백질을 발현하는 유전적으로 변형된 설치류, 예를 들어, 마우스 또는 랫트가 제공되며, 설치류는, 기능적 내인성 IL-4Rα 단백질을 발현하는 연령이 맞는 설치류의 면역 세포, 예를 들어, B 및 T 세포 상에 존재하는 IL-4Rα 단백질의 수준과 유사한 수준으로 면역 세포, 예를 들어, B 및 T 세포 상에 인간 또는 인간화 IL-4Rα 단백질을 발현한다. 일 구현예에서, 설치류는 마우스이다. 일 구현예에서, 설치류는 랫트이다.
일 양태에서, 인간 IL-4Rα 유전자로부터 IL-4Rα 단백질을 발현하는 유전적으로 변형된 설치류, 예를 들어, 마우스 또는 랫트가 제공되며, 설치류는 면역 세포, 예를 들어, B 및 T 세포 상에 인간 또는 인간화 IL-4Rα 단백질을 발현한다. 일 구현예에서, 설치류는 마우스이다. 일 구현예에서, 설치류는 랫트이다.
일 구현예에서, 인간 또는 인간화 IL-4Rα 단백질을 발현하는 설치류의 면역 세포, 예를 들어, B 및 T 세포는, 기능적, 내인성 IL-4Rα 단백질을 발현하는 설치류, 예를 들어, 야생형 마우스 또는 랫트의 면역 세포, 예를 들어, B 및 T 세포 상에 대략 동일한 수준의 IL-4Rα 단백질을 갖는다. 일 구현예에서, 설치류는 마우스이다. 일 구현예에서, 설치류는 랫트이다.
일 구현예에서, 마우스는, 기능적 내인성 IL-4Rα 단백질을 발현하지만, 내인성 마우스 IL-4Rα 유전좌위에서 내인성 IL-4Rα 유전자의 인간 IL-4Rα 유전자로의 치환을 포함하지 않는 연령이 맞는 마우스의 면역 세포, 예를 들어, B 및 T 세포 상 IL-4Rα 단백질의 양의 적어도 약10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190% 또는 200%의 양으로 면역 세포, 예를 들어, B 및 T 세포 상에 인간 또는 인간화 IL-4Rα 단백질을 발현한다.
일 구현예에서, 마우스는, 기능적 내인성 IL-4Rα 단백질을 발현하지만, 내인성 마우스 IL-4Rα 유전좌위에서 내인성 IL-4Rα 유전자의 인간 IL-4Rα 유전자로의 치환을 포함하지 않는 연령이 맞는 마우스의 면역 세포, 예를 들어, B 및 T 세포 상에 존재하는 마우스 IL-4Rα 단백질의 양의 약 10% 내지 약 200%, 약 20% 내지 약 150%, 또는 약 30% 내지 약 100%의 양으로 면역 세포, 예를 들어, B 및 T 세포 상에 인간 또는 인간화 IL-4Rα 단백질을 발현한다.
일 양태에서, 설치류 IL-4Rα 엑토도메인-암호화 서열의 인간 IL-4Rα 엑토도메인-코딩 서열로의 치환을 포함하는 인간화 IL-4Rα 유전자를 포함하는 유전적으로 변형된 설치류가 제공되며, 인간화 IL-4Rα 유전자는 설치류 IL-4Rα 막관통 서열 및 설치류 IL-4Rα 세포질 서열을 포함하고, 인간화 IL-4Rα 유전자는 내인성 IL-4Rα 유전좌위의 내인성 설치류 IL-4Rα 조절 요소의 조절 하에 있고, 설치류는 인간 또는 인간화 IL-4 단백질을 암호화하는 인간화 IL-4 유전자를 더 포함하되, 인간화 IL-4 유전자는 내인성 IL-4 유전좌위의 내인성 설치류 IL-4 조절 요소의 조절 하에 있다.
일 구현예에서, 설치류는 마우스 또는 랫트이다. 일 구현예에서, 설치류는 마우스이다. 일 구현예에서, 설치류는 랫트이다.
일 구현예에서, 마우스는 마우스 IL-4 단백질을 발현할 수 없고 마우스 IL-4Rα 단백질을 발현할 수 없다.
일 구현예에서, 내인성 설치류 IL-4 유전좌위 및/또는 설치류 IL-4Rα 유전좌위의 설치류 조절 요소 또는 서열은 마우스 또는 랫트로부터 유래한다.
일 구현예에서, 설치류 조절 요소 또는 서열은 설치류 IL-4 유전좌위 및/또는 설치류 IL-4Rα 유전좌위의 내인성 설치류 조절 요소 또는 서열이다.
일 양태에서, 인간 또는 인간화 IL-4 및/또는 IL-4Rα 단백질을 발현하는 비-인간 동물, 예를 들어, 설치류, 예를 들어, 마우스 또는 랫트가 제공되며, 비-인간 동물은 내인성 비-인간 IL-4Rα 유전좌위 및/또는 내인성 비-인간 IL-4Rα 유전좌위로부터 인간 또는 인간화 IL-4 및/또는 IL-4Rα 단백질을 발현한다. 일 구현예에서, 비-인간 동물은 설치류이다. 일 구현예에서, 설치류는 마우스이다. 일 구현예에서, 설치류는 랫트이다.
일 양태에서, 내인성 마우스 IL-4 유전좌위로부터 인간 또는 인간화 IL-4 단백질을 발현하는 유전적으로 변형된 마우스가 제공되며, 내인성 마우스 IL-4 유전자는, 전체적 또는 부분적으로, 인간 IL-4 유전자로 치환된다.
일 구현예에서, ATG 개시 코돈으로부터 시작하는 엑손 1 내지 엑손 4(3' 미번역 영역 포함) 및 엑손 4의 하류의 3' 영역의 일부를 포함하는 내인성 마우스 IL-4 유전좌위의 약 6.3 kb의 인접 마우스 게놈 핵산이 결실되고, 인간 IL-4 유전자의 ATG 개시 코돈으로부터 시작하는 엑손 1 내지 엑손 4(3' 미번역 영역 포함) 및 엑손 4의 하류의 3' 영역의 일부를 포함하는 약 8.8 kb의 인간 IL-4 핵산 서열로 치환된다. 구체적인 일 구현예에서, 마우스 게놈 핵산을 치환한 인간 IL-4 핵산 서열은 인간 BAC RP11-17K19의 인간 IL-4 유전자의 ATG 개시 코돈으로부터 시작하는 엑손 1 내지 엑손 4 및 엑손 4의 하류의 3’ 영역의 일부를 포함한다. 구체적인 일 구현예에서, 변형된 IL-4 유전자는 마우스 IL-4 5’ 조절 요소 및 ATG 개시 코돈으로부터 시작하는 인간 IL-4 엑손 1 내지 엑손 4, 즉, IL-4 단백질 코딩 서열을 포함한다.
일 양태에서, 인간 또는 인간화 IL-4 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전적으로 변형된 마우스가 제공되며, 인간 또는 인간화 IL-4 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은, 전체적 또는 부분적으로, 내인성 마우스 IL-4 단백질을 암호화하는 내인성 뉴클레오티드 서열을 치환한다.
일 양태에서, 내인성 마우스 IL-4Rα 유전좌위로부터 인간 또는 인간화 IL-4Rα 단백질을 발현하는 유전적으로 변형된 마우스가 제공되며, 내인성 마우스 IL-4Rα 유전자는, 전체적 또는 부분적으로, 인간 IL-4Rα 유전자로 치환된다.
일 구현예에서, ATG 개시 코돈으로부터 시작하는 엑손 1 내지 엑손 5 및 인트론 5의 일부를 포함하는 내인성 마우스 IL-4Rα 유전좌위에서 약 7.1 kb의 인접 마우스 게놈 핵산이 결실되고, 인간 IL-4Rα 유전자의 ATG 개시 코돈으로부터 시작하는 엑손 1 내지 엑손 5 및 인트론 5의 일부를 포함하는 약 15.6 kb의 인간 IL-4Rα 핵산 서열로 치환된다. 구체적인 일 구현예에서, 마우스 게놈 핵산을 치환하는 인간 IL-4α 핵산은 인간 BAC RP11-16E24의 인간 IL-4α 유전자의 ATG 개시 코돈으로부터 시작하는 엑손 1 내지 엑손 5 및 인트론 5의 일부를 포함한다. 구체적인 일 구현예에서, 마우스 게놈 핵산을 치환하는 인간 IL-4Rα 핵산은 전체 인간 IL-4Rα 엑토도메인 코딩 서열을 포함한다.
일 양태에서, 설치류 IL-4 단백질을 암호화하는 설치류 IL-4 유전자 서열을 인간 IL-4 유전자 서열의 하나 이상의 엑손을 포함하는 인간 IL-4 핵산 서열로 치환하여, 인간 또는 인간화 IL-4 단백질을 암호화하는 변형된 인간화 IL-4 유전자를 형성하는 단계를 포함하는, 인간화 IL-4 설치류를 제조하기 위한 방법이 제공되며, 이러한 치환은 내인성 설치류 IL-4 유전좌위에서 일어나고, 인간 IL-4 유전자 서열의 하나 이상의 엑손을 포함하고, 인간 또는 인간화 IL-4 단백질을 암호화하는 인간화 IL-4 유전자 서열은 내인성 설치류 IL-4 유전좌위의 설치류 조절 요소 또는 서열(예를 들어, 5' 및/또는 3' 조절 요소)에 작동가능하게 연결된다.
일 구현예에서, 설치류는 마우스 또는 랫트이다. 일 구현예에서, 설치류는 마우스이다. 일 구현예에서, 설치류는 랫트이다.
일 구현예에서, 설치류 조절 요소 또는 서열은 마우스로부터 유래한다. 일 구현예에서, 설치류 조절 요소 또는 서열은 랫트로부터 유래한다.
일 구현예에서, 설치류 조절 요소 또는 서열은 설치류 IL-4 유전좌위의 내인성 설치류 조절 요소 또는 서열이다. 일 구현예에서, 설치류는 마우스이다. 일 구현예에서, 설치류는 랫트이다.
일 구현예에서, 설치류 IL-4 유전자 서열을 치환하는 인간 IL-4 핵산 서열은 인간 IL-4 유전자 서열의 적어도 하나의 엑손을 포함한다. 다른 구현예에서, 설치류 IL-4 유전자 서열을 치환하는 인간 IL-4 핵산 서열은 인간 IL-4 유전자 서열의 적어도 2 또는 적어도 3개의 엑손을 포함한다. 일 구현예에서, 설치류 IL-4 유전자 서열을 치환하는 인간 IL-4 핵산 서열은 인간 IL-4 유전자 서열의 4개의 엑손 모두를 포함한다. 일 구현예에서, 설치류는 마우스이다. 일 구현예에서, 설치류는 랫트이다.
일 구현예에서, 설치류 IL-4 유전자 서열을 치환하는 인간 IL-4 핵산 서열은 인간 IL-4(예를 들어, GenBank 등록 번호 NM_000589.3s에 제시된 핵산에 의해 암호화된 인간 IL-4 단백질)와 약 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 약 99% 동일한 단백질을 암호화한다.
일 구현예에서, 치환은 내인성 설치류 IL-4 유전좌위에서 일어나고, 인간 IL-4 유전자 서열의 하나 이상의 엑손을 포함하고 인간 또는 인간화 IL-4 단백질을 암호화하는 인간화 IL-4 유전자 서열은 내인성 설치류 IL-4 유전좌위의 내인성 설치류 조절 요소 또는 서열(예를 들어, 5' 및/또는 3' 조절 요소)에 작동가능하게 연결된다.
일 양태에서, 마우스 IL-4 단백질을 암호화하는 마우스 IL-4 유전자 서열을 인간 IL-4 유전자 서열로 치환하여, 인간 또는 인간화 IL-4 단백질을 암호화하는 변형된 인간화 IL-4 유전자를 형성하는 단계를 포함하는, 인간화 IL-4를 제조하기 위한 방법이 제공된다.
일 구현예에서, 이러한 치환은 내인성 마우스 IL-4 유전좌위에서 일어나고, 얻어진 인간 또는 인간화 IL-4 단백질을 암호화하는 인간화 IL-4 유전자는 내인성 마우스 IL-4 유전좌위에서 마우스 조절 요소 또는 서열(예를 들어, 5' 및/또는 3' 조절 요소)에 작동가능하게 연결된다.
일 구현예에서, 이러한 치환은 내인성 마우스 IL-4 유전좌위에서 일어나고, 인간 또는 인간화 IL-4 단백질을 암호화하는 인간화 IL-4 유전자는 내인성 마우스 IL-4 유전좌위에서 내인성 마우스 조절 요소 또는 서열(예를 들어, 5' 및/또는 3' 조절 요소)에 작동가능하게 연결된다.
일 양태에서, 설치류 IL-4Rα 단백질을 암호화하는 설치류 IL-4Rα 유전자 서열을 인간 IL-4Rα 유전자 서열의 하나 이상의 엑손을 포함하는 인간 IL-4Rα 핵산 서열로 치환하여, 인간 또는 인간화 IL-4Rα 단백질을 암호화하는 변형된 인간화 IL-4 Rα 유전자를 형성하는 단계를 포함하는, 인간화 IL-4Rα 설치류를 제조하기 위한 방법이 제공되며, 이러한 치환은 내인성 설치류 IL-4Rα 유전좌위에서 일어나고, 인간 IL-4Rα 유전자 서열의 하나 이상의 엑손을 포함하고 인간 또는 인간화 IL-4Rα 단백질을 암호화하는 인간화 IL-4Rα 유전자 서열은 내인성 설치류 IL-4Rα 유전좌위에서 설치류 조절 요소 또는 서열(예를 들어, 5' 및/또는 3' 조절 요소)에 작동가능하게 연결된다.
일 구현예에서, 설치류는 마우스 또는 랫트이다. 일 구현예에서, 설치류는 마우스이다. 일 구현예에서, 설치류는 랫트이다.
일 구현예에서, 설치류 조절 요소 또는 서열은 마우스로부터 유래한다. 일 구현예에서, 설치류 조절 요소 또는 서열은 랫트로부터 유래한다.
일 구현예에서, 설치류 조절 요소 또는 서열은 설치류 IL-4Rα 유전좌위의 내인성 설치류 조절 요소 또는 서열이다. 일 구현예에서, 설치류는 마우스이다. 일 구현예에서, 설치류는 랫트이다.
일 구현예에서, 설치류 IL-4Rα 유전자 서열을 치환하는 인간 IL-4Rα 핵산 서열은 인간 IL-4Rα 유전자 서열의 적어도 하나의 엑손을 포함한다. 다른 구현예에서, 설치류 IL-4Rα 유전자 서열을 치환하는 인간 IL-4Rα 핵산 서열은 인간 IL-4Rα 유전자 서열의 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8개의 엑손을 포함한다. 일 구현예에서, 설치류 IL-4Rα 유전자 서열을 치환하는 인간 IL-4Rα 핵산 서열은 인간 IL-4Rα 유전자 서열의 9개의 엑손 모두를 포함한다. 일 구현예에서, 설치류는 마우스이다. 일 구현예에서, 설치류는 랫트이다.
일 구현예에서, 설치류 IL-4Rα 유전자 서열을 치환하는 인간 IL-4Rα 핵산 서열은 인간 IL-4Rα(예를 들어, GenBank 등록 번호 NM_000418.3에 제시된 핵산에 의해 암호화되는 인간 IL-4R 단백질)와 약 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 약 99% 동일한 단백질을 암호화한다.
일 구현예에서, 설치류 IL-4Rα 유전자 서열을 치환하는 인간 IL-4Rα 핵산 서열은 인간 IL-4Rα 단백질의 엑토도메인을 암호화하는 인간 IL-4Rα 유전자 서열의 적어도 하나의 엑손을 포함한다. 다른 구현예에서, 설치류 IL-4Rα 유전자 서열을 치환하는 인간 IL-4Rα 핵산 서열은 인간 IL-4Rα 단백질의 엑토도메인을 암호화하는 인간 IL-4Rα 유전자 서열의 적어도 2, 3, 또는 4개의 엑손을 포함한다. 일 구현예에서, 설치류 IL-4Rα 유전자 서열을 치환하는 인간 IL-4Rα 핵산 서열은 인간 IL-4Rα 단백질의 엑토도메인을 암호화하는 인간 IL-4Rα 유전자 서열의 5개의 엑손 모두를 포함한다. 일 구현예에서, 설치류는 마우스이다. 일 구현예에서, 설치류는 랫트이다.
일 구현예에서, 설치류 IL-4Rα 유전자 서열을 치환하는 인간 또는 인간화 IL-4Rα 유전자 서열은 인간 IL-4Rα 단백질(예를 들어, GenBank 등록 번호 NM_000418.3에 제시된 핵산에 의해 암호화된 인간 IL-4Rα 단백질)의 엑토도메인에 약 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 약 99% 동일한 IL-4Rα 단백질의 엑토도메인을 암호화한다.
일 구현예에서, 이러한 치환은 내인성 설치류 IL-4R α 유전좌위에서 일어나고, 인간 IL-4Rα 유전자 서열의 하나 이상의 엑손을 포함하고 인간 또는 인간화 IL-4Rα 단백질을 암호화하는 인간화 IL-4Rα 유전자 서열은 내인성 설치류 IL-4Rα 유전좌위에서 내인성 설치류 조절 요소 또는 서열(예를 들어, 5' 및/또는 3' 조절 요소)에 작동가능하게 연결된다.
일 양태에서, 마우스 IL-4Rα 단백질을 암호화하는 마우스 IL-4Rα 유전자 서열을 인간 IL-4Rα 핵산 서열로 치환하여, 인간 또는 인간화 IL-4Rα 단백질을 암호화하는 인간화 IL-4Rα 유전자를 형성하는 단계를 포함하는, 인간화 IL-4Rα 마우스를 제조하기 위한 방법이 제공된다.
일 구현예에서, 이러한 치환은 내인성 마우스 IL-4Rα 유전좌위에서 일어나고, 인간 또는 인간화 IL-4Rα 단백질을 암호화하는 인간화 IL-4Rα 유전자는 내인성 마우스 IL-4Rα 유전좌위에서 마우스 조절 요소 또는 서열(예를 들어, 5' 및/또는 3' 조절 요소)에 작동가능하게 연결된다
일 구현예에서, 이러한 치환은 내인성 마우스 IL-4Rα 유전좌위에서 일어나고, 인간 또는 인간화 IL-4Rα 단백질을 암호화하는 인간화 IL-4Rα 유전자는 내인성 마우스 IL-4Rα 유전좌위에서 내인성 마우스 조절 요소 또는 서열(예를 들어, 5' 및/또는 3' 조절 요소)에 작동가능하게 연결된다.
다양한 양태에서, 본원에 기술된 유전적으로 변형된 비-인간 동물, 예를 들어, 설치류, 예를 들어, 마우스 또는 랫트는 그들의 생식계열 내에 유전적인 변형을 포함한다.
일 양태에서, 본원에 기술된 유전적 변형을 포함하는, 비-인간 동물, 예를 들어, 설치류, 예를 들어, 마우스 또는 랫트 배아가 제공된다.
일 양태에서, 본원에 기술된 유전적 변형을 포함하는 공여자 세포를 포함하는, 비-인간 동물, 예를 들어, 설치류, 예를 들어, 마우스 또는 랫트 숙주 배아가 제공된다.
일 양태에서, 본원에 기술된 유전적 변형을 포함하는 다능성 또는 전능성 비-인간 동물, 예를 들어, 설치류, 예를 들어, 마우스 또는 랫트 세포가 제공된다. 일 구현예에서, 세포는 설치류 세포이다. 일 구현예에서, 세포는 마우스 세포이다. 일 구현예에서, 세포는 설치류 ES 세포이다. 일 구현예에서, 세포는 마우스 ES 세포이다.
일 양태에서, 비-인간 동물, 예를 들어, 설치류, 예를 들어, 마우스 또는 랫트 난자가 제공되며, 비-인간 동물 난자는 비-인간 동물 이소성 염색체를 포함하고, 이러한 비-인간 동물 이소성 염색체는 본원에 기술된 유전적 변형을 포함한다. 일 구현예에서, 비-인간 동물은 설치류이다. 일 구현예에서, 설치류는 마우스이다. 일 구현예에서, 설치류는 랫트이다.
일 양태에서, 인간 IL-4 유전자 또는 인간 IL-4Rα 유전자를 포함하도록 유전적으로 변형된 마우스 배아, 난자, 또는 세포는, C57BL/A, C57BL/An, C57BL/GrFa, C57BL/KaLwN, C57BL/6, C57BL/6J, C57BL/6ByJ, C57BL/6NJ, C57BL/10, C57BL/10ScSn, C57BL/10Cr, 및 C57BL/Ola로부터 선택된 C57BL 계통인 마우스의 것이다. 다른 구현예에서, 마우스는 129P1, 129P2, 129P3, 129X1, 129S1(예를 들어, 129S1/SV, 129S1/Svlm), 129S2, 129S4, 129S5, 129S9/SvEvH, 129S6(129/SvEvTac), 129S7, 129S8, 129T1, 129T2(예를 들어, Festing et al. (1999) Revised nomenclature for strain 129 mice, Mammalian Genome 10:836 참조, 또한, Auerbach et al (2000) Establishment and Chimera Analysis of 129/SvEv- and C57BL/6-Derived Mouse Embryonic Stem Cell Lines 참조)인 주로 이루어진 군으로부터 선택된 129 계통이다. 구체적인 일 구현예에서, 유전적으로 변형된 마우스는 전술한 129 계통 및 전술한 C57BL/6 계통의 혼합이다. 다른 구체적인 구현예에서, 마우스는 전술한 129 계통들의 혼합, 또는 전술한 BL/6 계통들의 혼합이다. 구체적인 일 구현예에서, 혼합된 129 계통은 129S6(129/SvEvTac) 계통이다. 다른 구현예에서, 마우스는 BALB 계통, 예를 들어, BALB/c 계통이다. 또 다른 구현예에서, 마우스는 BALB 계통 및 전술한 다른 계통의 혼합이다. 일 구현예에서, 마우스는 Swiss 또는 Swiss Webster 마우스이다.
다양한 양태에서, 인간 또는 인간화 IL-4R 및/또는 IL-4 핵산 서열을 포함하는 비-인간 동물은 포유류 및 조류로부터 선택된다. 일 구현예에서, 비-인간 동물은 포유류이다. 일 구현예에서, 포유류는 쥐과다.
일 양태에서, 인간 특이적 IL-4 또는 IL-4Rα 길항제를 스크리닝하는 방법이 제공된다. 이러한 방법은 치료제 후보를 식별하고 치료적 효능을 평가하는 데 유용하다. 본 방법은 본원에 기술된 바와 같이 IL-4 및 IL-4Rα에 대하여 이중 인간화된 유전적으로 변형된 설치류에 약제를 투여하는 단계, IL-4/IL-4Rα 신호 전달 경로에 의해 매개되는 생물학적 기능에 대한 약제의 효과를 결정하는 단계, 및 약제가 유전적으로 변형된 설치류에서 IL-4/IL-4Rα 신호 전달 경로에 의해 매개되는 기능에 길항하는 경우 이 약제를 인간-특이적 IL-4 또는 IL-4Rα 길항제로 식별하는 단계를 포함한다.
일 구현예에서, 약제는 IL-4 또는 IL-4Rα에 결합하는 면역글로불린 가변 도메인을 포함한다. 일 구현예에서, 약제는 인간 IL-4 또는 IL-4Rα에 특이적으로 결합하지만, 설치류 IL-4 또는 IL-4Rα에는 특이적으로 결합하지 않는다. 일 구현예에서, 약제는 항체이다. 구체적인 일 구현예에서, 약제는 인간 IL-4Rα에는 특이적으로 결합하지만, 설치류 IL-4Rα에는 특이적으로 결합하지 않는 항체이다.
일 구현예에서, 스크리닝 방법은 인간 IL-4 단백질, 및 인간화 IL-4Rα 단백질을 발현하는 이중 인간화 마우스를 활용하며, 인간화 IL-4Rα 단백질은 내인성 마우스 IL-4Rα 단백질의 막관통 및 세포질 도메인에 연결된 인간 IL-4Rα 단백질의 엑토도메인을 포함하고, 마우스는 쥐과 IL-4 또는 쥐과 IL-4Rα를 발현하지 않는다.
일부 구현예에서, 스크리닝하는 방법은 본원에 기술된 이중 인간화 설치류에서 IL-4/IL-4Rα 신호 전달에 연관된 질환을 유도하는 단계, 설치류에 약제를 투여하는 단계, 약제가 질환을 개선하는지 여부를 결정하는 단계, 및 약제가 질환을 개선한 경우 약제를 질환 치료에 적합한 인간 특이적 IL-4 또는 IL-4Rα 길항제로 식별하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, IL-4/IL-4Rα 신호 전달에 연관된 질환은, 일정 기간 동안 일 이상의 투여량으로 알러지원(예를 들어, 집 먼지 진드기 추출물)의 비강내 투여에 의해 설치류에서 유도될 수 있는 기도 염증이다. 약제의 효과는 (예를 들어, 점액 축적, 기관지 폐포 세척액 내 침윤 세포, 및/또는 총 순환 IgE의 수준이 반영하는) 기도 염증의 정도가 약제의 투여 결과로 감소되는지 여부를 측정함으로써 결정할 수 있다.
일부 구현예에서, IL-4/IL-4Rα 신호 전달에 연관된 질환은, 피부 손상을 생성하고 손상된 피부를 일정 시간 동안 일 이상의 투여량으로 알러지원(예를 들어, 박테리아 독소 또는 집 먼지 진드기 추출물)에 노출함으로써 설치류에서 유도될 수 있는 피부 염증 또는 아토피성 피부염이다. 약제의 효과는, 피부 염증이 약제의 투여 결과로서 감소되는지 여부를 측정함으로써 결정될 수 있다.
추가의 일 양태에서, IL-4, IL-4Rα, 및 IL-33 유전자가 본원에 기술된 바와 같이 인간화된 삼중 인간화된 비-인간 동물이 화합물 또는 화합물의 조합의 약력학(PD) 및 치료적 효능을 평가하기 위해 사용된다.
본원에 기술된 각각의 양태들 및 구현예들은, 구현예 또는 양태의 문맥으로부터 명백하거나 분명하게 배제되지 않는 한 함께 사용될 수 있다.
도 1은 IL-4 및 IL-13 신호 전달을 위한 수용체 및 인간 IL-4 수용체 α
사슬(IL-4Rα)에 특이적으로 결합하는 완전한 중화 인간 단일클론 항체인 두필루맙(dupilumab)의 작용 기전의 도해(일정한 비율이 아님)를 제공한다.
도 2a~2b는 IL-4((Il4) 및 IL-4Rα(Il4ra) 유전좌위의 인간화를 위한 전략의 도해(일정한 비율이 아님)를 제공한다. (2a) 나타낸 바와 같이, ATG 개시 코돈에서 시작하는 엑손 1에서부터 엑손 4(3' 미번역 영역 포함함)까지의 코딩 영역 및 엑손 4의 하류의 3’ 영역의 일부에 걸친 마우스 IL-4 유전자(상단)가 결실되고, floxed hygro 선택 카세트 loxP를 따라, 인간 IL-4 유전자(하단)의 ATG 코돈에서 시작하는 엑손 1에서부터 엑손 4(3’ 미번역 영역 포함함)까지의 코딩 영역 및 엑손 4의 하류의 3’ 영역의 일부로 치환된다. (2b) 나타낸 바와 같이, ATG 개시 코돈으로부터 시작하는 엑손 1에서부터 엑손 5까지의 코딩 영역 및 인트론 5의 일부에 걸친 마우스 IL-4Rα 유전자(상단)가 결실되고, 인간 IL-4Rα 유전자(하단)의 ATG 개시 코딩으로부터 시작하는 엑손 1에서부터 엑손 5까지의 코딩 영역 및 인트론 5의 일부 및 floxed neo 선택 카세트로 치환된다.
도 3은 이중 인간화 IL-4/IL-4Rα(Il4hu/hu/Il4rahu/hu) 마우스로부터의 B 및 T 세포 상 인간화 IL-4Rα 단백질의 발현을 나타낸다.
도 4는 인간화 IL4Rα(Il4rahu/hu) 마우스로부터 유래된 일차 세포를 이용한 IL-4 및 IL-13 리간드 특이성 및 수용체 기능성을 나타낸다.
도 5는 야생형이지만, 인간화 IL4Raα(Il4rahu/hu)가 아닌 마우스에서의 생체 내 IL-4 의존적 IgE 생성을 나타낸다.
도 6은 마우스 B 세포(왼쪽 패널)에서의 생체 외 mIgE 생성의 용량 의존적 IL-4 유도가 용량 의존적 방식으로(오른쪽 패널) 두필루맙에 의해 차단되는 것을 나타낸다.
도 7은 두필루맙이, 용량 의존적 방식으로, 인간화 IL4Rα(Il4rahu/hu) 마우스에서 IL-25로 유도되는 생체 내 폐 병리를 예방하는 것을 나타낸다.
도 8은 이중 인간화 IL-4 및 IL-4Rα(IL-4hu/hu/IL-4Rhu/hu) 마우스를 사용하여 집 먼지 진드기 추출물(HDM)로 유도된 폐 염증 모델에서 두필루맙의 치료적 효능을 평가하기 위한 실험 설계를 나타낸다. “REGN668”은 두필루맙으로도 알려진 인간 IL-4Rα에 대하여 유도된 인간 단일클론 항체를 지칭한다. “REGN129”는 마우스 IL-13R2α의 엑토도메인과 Fc의 융합 단백질인 마우스 sol IL-13Rα2-Fc를 지칭한다.
도 9는 이중 인간화 IL-4 및 IL-4Rα (IL-4hu/hu/IL-4Rhu/hu) 마우스 및 이소형 대조군 항체를 사용하여 HDM으로 유도된 폐 염증 모델에서 두필루맙의 치료적 효능을 평가하기 위한 실험 설계를 보여준다.
도 10a~10c는 마우스 IL-33 유전좌위의 인간화를 위한 전략을 예시한다. 도 10a는 ATG 개시 코돈에서 시작하는 엑손 2에서부터 엑손 8 내의 중지 코돈까지의 코딩 영역에 걸친 마우스 IL-33 유전자(상단)가 결실되고, 인간 IL-33 유전자(하단)의 ATG 코돈에서 시작하는 엑손 2에서부터 엑손 8(3' 미번역 영역을 포함함)까지의 코딩 영역에 의해 치환되는 것을 예시한다. 도 10b는 loxP 네오마이신 선택 카세트를 포함하는 마우스 ES 세포 클론 MAID 7060 내 인간화 IL-33 대립형질을 나타낸 것이다. 도 10c는 네오마이신 선택 카세트가 삭제되고, loxP 및 인간 IL-33 서열의 하류에 남아 있는 클로닝 자리(77bp), 및 loxP 자리의 하류에 보유된 마우스 3' UTR를 포함하는, 마우스 ES 세포 클론 MAID 7061 내 인간화 IL-33 대립형질을 나타낸다.
사슬(IL-4Rα)에 특이적으로 결합하는 완전한 중화 인간 단일클론 항체인 두필루맙(dupilumab)의 작용 기전의 도해(일정한 비율이 아님)를 제공한다.
도 2a~2b는 IL-4((Il4) 및 IL-4Rα(Il4ra) 유전좌위의 인간화를 위한 전략의 도해(일정한 비율이 아님)를 제공한다. (2a) 나타낸 바와 같이, ATG 개시 코돈에서 시작하는 엑손 1에서부터 엑손 4(3' 미번역 영역 포함함)까지의 코딩 영역 및 엑손 4의 하류의 3’ 영역의 일부에 걸친 마우스 IL-4 유전자(상단)가 결실되고, floxed hygro 선택 카세트 loxP를 따라, 인간 IL-4 유전자(하단)의 ATG 코돈에서 시작하는 엑손 1에서부터 엑손 4(3’ 미번역 영역 포함함)까지의 코딩 영역 및 엑손 4의 하류의 3’ 영역의 일부로 치환된다. (2b) 나타낸 바와 같이, ATG 개시 코돈으로부터 시작하는 엑손 1에서부터 엑손 5까지의 코딩 영역 및 인트론 5의 일부에 걸친 마우스 IL-4Rα 유전자(상단)가 결실되고, 인간 IL-4Rα 유전자(하단)의 ATG 개시 코딩으로부터 시작하는 엑손 1에서부터 엑손 5까지의 코딩 영역 및 인트론 5의 일부 및 floxed neo 선택 카세트로 치환된다.
도 3은 이중 인간화 IL-4/IL-4Rα(Il4hu/hu/Il4rahu/hu) 마우스로부터의 B 및 T 세포 상 인간화 IL-4Rα 단백질의 발현을 나타낸다.
도 4는 인간화 IL4Rα(Il4rahu/hu) 마우스로부터 유래된 일차 세포를 이용한 IL-4 및 IL-13 리간드 특이성 및 수용체 기능성을 나타낸다.
도 5는 야생형이지만, 인간화 IL4Raα(Il4rahu/hu)가 아닌 마우스에서의 생체 내 IL-4 의존적 IgE 생성을 나타낸다.
도 6은 마우스 B 세포(왼쪽 패널)에서의 생체 외 mIgE 생성의 용량 의존적 IL-4 유도가 용량 의존적 방식으로(오른쪽 패널) 두필루맙에 의해 차단되는 것을 나타낸다.
도 7은 두필루맙이, 용량 의존적 방식으로, 인간화 IL4Rα(Il4rahu/hu) 마우스에서 IL-25로 유도되는 생체 내 폐 병리를 예방하는 것을 나타낸다.
도 8은 이중 인간화 IL-4 및 IL-4Rα(IL-4hu/hu/IL-4Rhu/hu) 마우스를 사용하여 집 먼지 진드기 추출물(HDM)로 유도된 폐 염증 모델에서 두필루맙의 치료적 효능을 평가하기 위한 실험 설계를 나타낸다. “REGN668”은 두필루맙으로도 알려진 인간 IL-4Rα에 대하여 유도된 인간 단일클론 항체를 지칭한다. “REGN129”는 마우스 IL-13R2α의 엑토도메인과 Fc의 융합 단백질인 마우스 sol IL-13Rα2-Fc를 지칭한다.
도 9는 이중 인간화 IL-4 및 IL-4Rα (IL-4hu/hu/IL-4Rhu/hu) 마우스 및 이소형 대조군 항체를 사용하여 HDM으로 유도된 폐 염증 모델에서 두필루맙의 치료적 효능을 평가하기 위한 실험 설계를 보여준다.
도 10a~10c는 마우스 IL-33 유전좌위의 인간화를 위한 전략을 예시한다. 도 10a는 ATG 개시 코돈에서 시작하는 엑손 2에서부터 엑손 8 내의 중지 코돈까지의 코딩 영역에 걸친 마우스 IL-33 유전자(상단)가 결실되고, 인간 IL-33 유전자(하단)의 ATG 코돈에서 시작하는 엑손 2에서부터 엑손 8(3' 미번역 영역을 포함함)까지의 코딩 영역에 의해 치환되는 것을 예시한다. 도 10b는 loxP 네오마이신 선택 카세트를 포함하는 마우스 ES 세포 클론 MAID 7060 내 인간화 IL-33 대립형질을 나타낸 것이다. 도 10c는 네오마이신 선택 카세트가 삭제되고, loxP 및 인간 IL-33 서열의 하류에 남아 있는 클로닝 자리(77bp), 및 loxP 자리의 하류에 보유된 마우스 3' UTR를 포함하는, 마우스 ES 세포 클론 MAID 7061 내 인간화 IL-33 대립형질을 나타낸다.
치료적 표적으로서 IL-4 및 IL-4Rα
알러지성 장애는, 특히 선진국에서 증가된 비율로 발생하는 질환의 영역이다. 아토피성 피부염, 천식, 및 알러지성 비염은 알러지를 갖는 환자 사이에서 가장 흔한 염증성 병태이다; 이러한 환자들은 종종 다수의 임상적 증상의 발병으로 고통 받는다. 알러지의 병인은 외부 항원에 대한 비정상적인 면역 반응과 관련된다 (Mueller et al. (2002) Structure, binding, and antagonists in the IL-4/IL-13 receptor system, Biochim Biophys Acta 1592:237-250 참조).
항원 특이적 IgE의 과생산은 알러지성 염증을 유발하는 필수적인 요소이다. 비정상적인 2형 T 보조 세포(Th2) 극성화가 증가된 IgE 반응에 기여한다.
처음에 활성화된 T 세포에서 식별된 인터루킨-4(IL-4) 및 인터루킨-13(IL-13)은 알러지에서 면역 및 염증 반응의 개시 및 유지에 중심 역할을 수행하는 주요 Th2 사이토카인이다.
IL-4 및 IL-13 신호 전달은, 이러한 2개의 사이토카인 사이의 중복되는 생물학적 반응에 기여할 수 있는, 공유 서브유닛인, IL-4 수용체 알파(IL-4Rα)를 가지는 2개의 별도의 수용체 복합체에 의해 매개된다. 도 1을 참조한다.
인터루킨-4/13 신호 전달을 위한 수용체 및 두필루맙의 작용 기전. IL-4Rα는 두 개의 별개 이종이량 수용체 복합체를 형성하여, 조직- 및 반응-특이적 방식으로 IL-4 및 IL-13의 생물학적 기능을 매개한다.IL-4Rα 및 공통의 사이토카인 수용체 감마 사슬(γC)로 구성된 I형 수용체는 IL-4에 대하여 고유하다. IL-4Rα 및 IL-13Rα1 사이에서 형성된 II형 수용체는 IL-13에 대한 일차 수용체이지만, IL-4에 대하여서도 기능한다. 또한, IL-13은 유인(decoy) 수용체로 인식되거나 전장 형태에서 가능한 전-섬유형성 효과를 가지는 두 번째로 높은 친화성 수용체인 IL-13Rα2에 결합할 것이다.
두필루맙은 IL-4 및 IL-13으로부터 유도된 생물학적 활성을 저해하는, 인간 IL-4Rα에 대한 길항성 단일클론 항체이다. 두필루맙은 수용체 서브유닛에 대한 결합을 방지하여 IL-4 신호 전달을 차단하며, IL-13 신호 전달에 대한 저해 효과는 이량체 수용체 상호작용을 방해하는 것을 통해 매개되는 것으로 보인다.
공유 IL-4Rα 서브유닛에 대하여 유도된 완전한 인간 단일클론 항체인 두필루맙은 Regeneron Pharmaceuticals, Inc.에서 VelocImmune® 마우스를 이용하여 개발되었다. 두필루맙은 중등도 내지는 중증 천식의 치료 및 중등도 내지는 중증 아토피성 피부염의 치료에 대한 임상 시험 중이다.
쥐과 모델에서 두필루맙의 효능 평가는 다수의 도전 과제를 제시한다: (a) 두필루맙은 동종(cognate) 마우스 IL-4 수용체를 인식하지 않는다; 그리고 (b) 마우스 IL-4 단백질과 인간 IL-4 수용체 사이에는 기능적 상호작용이 결여되어 있다.
IL-4 유전자 및 단백질
IL-4 유전자는 B 세포뿐 아니라 다른 세포 유형들의 활성화에서 중요한 역할을 수행하는 분비 IL-4 단백질을 암호화한다(도 1 참조).
인간 IL-4. NCBI 유전자 ID: 3565; 일차 공급원: HGNC:6014; RefSeq 전사물: NM_000589.3; UniProt ID: P05112; 게놈 조립: GRCh37; 위치: chr5:132,009,743-132,018,576 + 가닥.
인간 IL-4 유전자는 염색체 5상 5q31.1에 위치한다. 인간 IL-4 유전자는 4개의 엑손을 갖고, 24개 아미노산의 신호 펩티드, 및 129개 아미노산의 성숙 IL-4 단백질을 포함하는, 길이가 153개 아미노산인 전구체 폴리펩티드를 암호화한다.
마우스 IL-4. NCBI 유전자 ID: 16189; 일차 공급원: MGI:96556; RefSeq 전사물: NM_021283.2; UniProt ID: P07750; 게놈 조립: GRCm38; 위치: chr11:53,612,350-53,618,606 - 가닥.
마우스 IL-4 유전자는 염색체 11 상 11 31.97 cM에 위치한다. 마우스 IL-4 유전자는 4개의 엑손을 갖고 20개 아미노산의 신호 펩티드, 및 120개 아미노산의 성숙 IL-4 단백질을 포함하는, 길이가 140개의 아미노산인 전구체 폴리펩티드를 암호화한다.
IL-4Rα 유전자 및 단백질
IL-4Rα 유전자는 주로 B 및 T 세포 상에 발현되고, IL-4 및 IL-13 단백질을 위한 수용체인 막관통 수용체 IL-4Rα 단백질을 암호화한다(도 1 참조).
인간 IL-4Rα. NCBI 유전자 ID: 3566; 일차 공급원: MGI:6015; RefSeq 전사물 NM_000418.3; UniProt ID: P24394; 게놈 조립: GRCh37; 위치: chr16:27,351,525-27,367,111 + 가닥.
인간 IL-4Rα 유전자는 염색체 16 상 16p12.1-p11.2에 위치한다. 인간 IL-4Rα 유전자는 9개의 코딩 엑손을 갖고, 25개 아미노산의 신호 펩티드, 및 800개 아미노산의 성숙 IL-4Rα 단백질을 포함하는, 825개 아미노산의 전구체 폴리펩티드를 암호화하되, 성숙 단백질의 처음 207개 아미노산 잔기가 세포외 도메인을 구성한다. 인간 IL-4Rα 단백질의 세포외 도메인(즉, 엑토도메인)은 인간 IL-4Rα 유전자의 코딩 엑손 1 내지 5에 의해 암호화된다.
마우스 IL-4Rα. NCBI 유전자 ID: 16190; 일차 공급원: MGI:105367; RefSeq 전사물: NM_001008700.3; UniProt ID: P16382; 게놈 조립: GRCm38; 위치: chr11:125,565,655-125,572,745 + 가닥.
마우스 IL-4Rα 유전자는 염색체 7상 7 68.94 cM에 위치한다. 마우스 IL-4Rα 유전자는 9개의 코딩 엑손을 갖고, 25개 아미노산의 신호 펩티드, 및 785개 아미노산의 성숙 IL-4Rα 단백질을 포함하는 810개 아미노산의 전구체 폴리펩티드를 암호화하되, 성숙 단백질의 처음 208개 아미노산 잔기가 세포외 도메인을 구성한다. 마우스 IL-4Rα 단백질의 세포외 도메인(즉, 엑토도메인)은 마우스 IL-4Rα유전자의 코딩 엑손 1 내지 5에 의해 암호화된다.
IL-4 및 IL-4Rα 단백질의 종 특이성
본원에 나타낸 바와 같이, 마우스(그러나, 인간은 아님) IL-4는 야생형 마우스에서 기능성이고, 반대로, 인간(그러나, 마우스는 아님) IL-4는 인간화 IL-4Rα (Il4ra hu/hu ) 마우스에서 기능적이다. (또한, 예를 들어, Andrews et al. (2001) Reconstitution of a functional human type II IL-4/IL-13 receptor in mouse B cells: demonstration of species specificity, J Immunol. 166:1716-1722 참조).
인간 IL-4 및 IL-4Rα 저해제의 종 특이성
IL-4 또는 IL-4Rα 단백질을 표적으로 하는 후보 치료제 분자는, 통상적으로, 비-인간 동물, 예를 들어, 설치류, 예를 들어, 마우스 또는 랫트에서 약물동력학(PK) 및 약력학(PD)에 대하여 평가된다. 이러한 치료적 분자를, 또한, 비-인간 동물, 예를 들어, 설치류, 예를 들어, 마우스 또는 랫트 모델에서 비정상적인 Th2 세포와 연관된 인간 질환, 장애 및 병태의 생체 내 치료적 효능에 대하여 시험한다.
그러나, 인간 IL-4 또는 IL-4Rα 단백질에 특이적인 치료적 분자, 예를 들어, 인간-특이적 IL-4 또는 IL-4Rα 저해제는 설치류, 특히 마우스에서 PD 또는 생체 내 치료적 효능에 대하여 적절하게 평가할 수 없는데, 이는 이러한 치료적 분자의 표적이 없기 때문이다. 이러한 문제는, 위에 언급된 IL-4 단백질의 종 특이성으로 인해, 인간 IL-4 또는 IL-4Rα 단백질을 발현하는, 비-인간 유전자이식 동물, 예를 들어, 설치류, 예를 들어, 마우스 또는 랫트를 사용하는 것으로는 극복되지 않는다.
따라서, 다양한 구현예에서, 비-인간 동물, 예를 들어, 설치류, 예를 들어, 마우스 또는 랫트에서 인간 특이적 IL-4 또는 IL-4Rα 단백질 길항제 또는 저해제의 PD 및 생체 내 치료적 효능을 평가하기 위해, 내인성 IL-4 및/또는 IL-4Rα 단백질을 인간 IL-4 및/또는 IL-4Rα 단백질로 치환하는 것이 바람직하다.
또한, 다양한 구현예에서, 인간 IL-4 및/또는 IL-4Rα 단백질의 과발현 또는 저발현의 잠재적 문제를 회피하기 위해, 내인성 IL-4 및/또는 IL-4Rα 유전자의 유전좌위에서 인간 IL-4 및/또는 IL-4Rα 유전자를 비-인간 동물, 예를 들어, 설치류, 예를 들어, 마우스 또는 랫트의 게놈에 삽입하고, 적어도 부분적으로, 내인성 IL-4 및/또는 IL-4Rα 조절 요소의 조절 하에, 비-인간 동물, 예를 들어, 설치류, 예를 들어, 마우스 또는 랫트에서 인간 IL-4 및/또는 IL-4Rα 단백질을 발현시키는 것이 바람직하다.
유전적으로 변형된 비-인간 동물
전체적 또는 부분적으로, 내인성 IL-4 유전좌위 및/또는 IL-4Rα 유전좌위에서 내인성 IL-4 유전자 및/또는 IL-4Rα 유전자가 인간 IL-4 핵산 및/또는 인간 IL-4Rα 핵산으로 치환되어, 인간 또는 인간화 IL-4 및/또는 인간 또는 인간화 IL-4Rα 단백질을 암호화하는 변형된 IL-4 유전자 및/또는 변형된 IL-4Rα 유전자를 형성하는 유전적으로 변형된 비-인간 동물이 본원에 제공된다.
본원에서 사용된 "비-인간 동물"이라는 구절은 인간이 아닌 임의의 척추 동물 개체를 지칭한다. 일부 구현예에서, 비-인간 동물은 포유동물이다. 구체적인 구현예에서, 비-인간 동물은 랫트 또는 마우스와 같은 설치류이다.
일 양태에서, 내인성 IL-4 유전좌위에서 내인성 설치류 IL-4 유전자가 인간 IL-4 핵산으로 전체적 또는 부분적으로 치환된 유전적으로 변형된 설치류, 예를 들어, 마우스 또는 랫트가 제공된다.
이러한 치환은, 설치류 IL-4 유전자의 적어도 하나의 엑손, 즉, 하나 이상의 엑손의 인간 IL-4 유전자의 적어도 하나의 엑손을 포함하는 인간 핵산으로의 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 설치류 IL-4 유전자의 ATG 개시 코돈으로부터 시작하는 엑손 1 내지 엑손 4를 포함하는 인접 설치류 게놈 단편은 인간 IL-4 유전자의 ATG 개시 코돈으로부터 시작하는 엑손 1 내지 엑손 4를 포함하는 인접 인간 게놈 단편으로 치환된다. 구체적인 일 구현예에서, 설치류는 마우스이고, 내인성 마우스 IL-4 유전좌위에서, ATG 개시 코돈으로부터 시작하는 엑손 1 내지 엑손 4(3' 미번역 영역을 포함함) 및 엑손 4의 하류의 3' 영역의 일부를 포함하는 약 6.3 kb의 인접 마우스 게놈 단편이 결실되고, 인간 IL-4 유전자의 ATG 개시 코돈으로부터 시작하는 엑손 1 내지 엑손 4(3' 미번역 영역을 포함함) 및 엑손 4의 하류의 3' 영역의 일부를 포함하는 약 8.8 kb의 인간 IL-4 핵산 서열로 치환된다.
일부 구현예에서, 이러한 치환은 내인성 IL-4 유전자 유전좌위에서 변형된 인간화 IL-4 유전자를 초래하며, 변형된 IL-4 유전자의 발현은 내인성 IL-4 유전좌위의 내인성 조절 요소의 조절 하에 있다. 본원에서 사용된 "조절 요소"라는 용어는, 프로모터, 인핸서, 및 억제 요소와 같은 5' 전사 조절 서열 및 전사 종결 서열과 같은 3' 전사 조절 서열을 포함하는, 전사 조절 서열을 지칭한다. 일부 구현예에서, 변형된 IL-4 유전자의 발현은 내인성 5' 조절 요소의 조절 하에 있다. 다른 구현예에서, 변형된 IL-4 유전자의 발현은 내인성 3' 조절 요소의 조절 하에 있다. 특정 구현예에서, 변형된 IL-4 유전자의 발현은 내인성 5' 및 3' 조절 요소의 조절 하에 있다.
내인성 IL-4 유전좌위에서 형성된 변형된 인간화 IL-4 유전자는 인간 또는 인간화 IL-4 단백질을 암호화한다. "인간화"라는 용어는, 비-인간 동물(예를 들어, 마우스 또는 랫트와 같은 설치류)에서 발견되는 유전자 또는 단백질의 일부 또는 서열을 포함하고, 비-인간 동물에서 발견되는 것과는 다르지만, 대신, 대응하는 인간 유전자 또는 단백질의 일부 또는 서열에 상응하는(이와 동일한) 일부 또는 서열을 포함하는 핵산 또는 단백질을 지칭한다. 변형된 인간화 IL-4 유전자는 인간 IL-4 단백질(예를 들어, GenBank 등록 번호 NM_000589.3에 제시된 핵산에 의해 암호화된 인간 IL-4 단백질)과 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일하거나 100% 동일한 IL-4 단백질을 암호화할 수 있다.
전체적 또는 부분적으로, 내인성 IL-4 유전좌위에서 내인성 설치류 IL-4 유전자의 인간 IL-4 핵산으로의 치환을 가지는 유전적으로 변형된 설치류는 이러한 치환에 대하여 동형접합성 또는 이형접합성일 수 있다. 일부 구현예에서, 유전적으로 변형된 설치류는 이러한 치환에 대하여 이형접합성, 즉, 내인성 설치류 IL-4 유전자의 두 개의 카피 중 단지 하나만이 인간 IL-4 핵산으로 치환된다. 다른 구현예에서, 유전적으로 변형된 설치류는 이러한 치환에 대하여 동형접합성, 즉, 내인성 설치류 IL-4 유전자의 두 개의 카피가 인간 IL-4 핵산으로 치환된다.
유전적으로 변형된 설치류는 혈청에 인간 또는 인간화 IL-4 단백질을 발현한다. 일부 구현예에서, 유전적으로 변형된 설치류는 내인성 설치류 IL-4 단백질을 발현하지 않는다. 일 구현예에서, 인간 또는 인간화 IL-4 단백질을 발현하는 설치류의 혈청은 기능적, 내인성 IL-4 단백질을 발현하는 설치류, 예를 들어, 야생형 설치류(예를 들어, 기능적 내인성 IL-4 단백질을 발현하지만, 전체적 또는 부분적으로, 내인성 IL-4 유전좌위에서 내인성 IL-4 유전자의 인간 IL-4 핵산으로의 치환을 포함하지 않는 설치류)와 대략 동일한 수준의 IL-4 단백질을 가진다. "대략 동일한 수준"은, 양 방향으로, 야생형 설치류에서의 수준의 25%, 20%, 15%, 10%, 5% 이하(즉, 초과 또는 미만) 이내인 수준을 의미한다. 다른 구현예에서, 설치류는 기능적 내인성 IL-4 단백질을 발현하지만, 전체적 또는 부분적으로, 내인성 IL-4 유전좌위에서 내인성 IL-4 유전자의 인간 IL-4 핵산으로의 치환을 포함하지 않는 연령이 맞는 설치류의 혈청 내 존재하는 IL-4 단백질 수준의 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190% 또는 200%의 농도로 혈청에 인간 또는 인간화 IL-4 단백질을 발현한다.
일부 구현예에서, 전체적 또는 부분적으로 내인성 설치류 IL-4 유전자의 인간 IL-4 핵산으로의 치환을 갖고, 혈청 내에 인간 또는 인간화 IL-4 단백질을 발현하는 유전적으로 변형된 설치류는 정상적인 면역계를 가지는데, 즉, 인간 또는 인간화 IL-4 단백질을 발현하는 설치류의 혈액, 혈장 또는 혈청 내 면역 세포, 예를 들어, B 및 T 세포의 수가, 기능적 내인성 IL-4 단백질을 발현하고, 전체적 또는 부분적으로 내인성 설치류 IL-4 유전자의 인간 IL-4 핵산으로의 치환을 포함하지 않는 설치류의 혈액, 혈장 또는 혈청 내 면역 세포, 예를 들어, B 및 T 세포의 수와 유사하다.
추가의 구현예에서, 전체적 또는 부분적으로 내인성 설치류 IL-4 유전자의 인간 IL-4 핵산으로의 치환을 갖고, 인간 또는 인간화 IL-4 단백질을 발현하는 유전적으로 변형된 설치류는, 또한, 전체적 또는 부분적으로, 내인성 IL-4 Rα 유전좌위에서 내인성 설치류 IL-4Rα 유전자의 인간 IL-4Rα 핵산으로의 치환을 포함하고, 그 결과, 인간 또는 인간화 IL-4Rα 단백질도 또한 발현한다.
다른 양태에서, 내인성 IL-4 Rα 유전좌위에서 내인성 설치류 IL-4Rα 유전자가 전체적 또는 부분적으로 인간 IL-4Rα 핵산으로 치환된 유전적으로 변형된 설치류, 예를 들어, 마우스 또는 랫트가 제공된다.
이러한 치환은 설치류 IL-4Rα 유전자의 적어도 하나의 엑손, 즉, 하나 이상의 엑손을 인간 IL-4Rα 유전자의 적어도 하나의 엑손을 포함하는 인간 핵산으로 치환하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 이러한 치환은 설치류 엑토도메인을 암호화하는 설치류 IL-4Rα 유전자의 적어도 하나의 엑손의 인간 엑토도메인을 암호화하는 인간 IL-4Rα 유전자의 적어도 하나의 엑손으로의 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 이러한 치환은 인간 IL-4Rα 유전자의 엑토도메인을 암호화하는 5개의 엑손 중 적어도 2, 3 또는 4개를 포함하는 인간 핵산으로의 치환을 포함한다. 다른 구현예에서, 설치류 IL-4Rα 유전자의 ATG 개시 코돈으로부터 시작하는 엑손 1 내지 엑손 5를 포함하는 인접 설치류 게놈 단편이 인간 IL-4Rα 유전자의 ATG 개시 코돈으로부터 시작하는 엑손 1 내지 엑손 5를 포함하는 게놈 단편으로 치환된다. 구체적인 일 구현예에서, 설치류는 마우스이고, 내인성 마우스 IL-4Rα 유전좌위에서, ATG 개시 코돈으로부터 시작하는 엑손 1 내지 엑손 5 및 인트론 5의 일부를 포함하는 약 7.1 kb의 인접 마우스 게놈 단편이 결실되고, 인간 IL-4Rα 유전자의 ATG 개시 코돈으로부터 시작하는 엑손 1 내지 엑손 5 및 인트론 5의 일부를 포함하는 약 15.6 kb의 인간 IL-4Rα 핵산 서열로 치환된다.
일부 구현예에서, 이러한 치환은 내인성 IL-4Rα 유전자 유전좌위에서 변형된 인간화 IL-4Rα 유전자를 초래하며, 변형된 IL-4Rα 유전자의 발현은 내인성 IL-4Rα 유전좌위의 내인성 조절 요소의 조절 하에 있다.
내인성 IL-4Rα 유전좌위에서 형성된 변형된 인간화 IL-4Rα 유전자는 인간 또는 인간화 IL-4Rα 단백질을 암호화한다. 일부 구현예에서, 변형된 인간화 IL-4Rα 유전자는 인간 IL-4Rα 단백질(예를 들어, GenBank 등록 번호 NM_000418.3에 제시된 핵산에 의해 암호화된 인간 IL-4 단백질)과 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일하거나 100% 동일한 IL-4Rα 단백질을 암호화한다. 다른 구현예에서, 변형된 IL-4Rα 유전자는 인간 IL-4Rα 단백질(예를 들어, GenBank 등록 번호 NM_000418.3에 제시된 핵산에 의해 암호화된 인간 IL-4 단백질)의 엑토도메인과 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일하거나 100% 동일한 엑토도메인을 포함하는 인간화 IL-4Rα 단백질을 암호화한다. 구체적인 구현예에서, 인간화 IL-4Rα 단백질의 막관통 및 세포질 도메인은 내인성 설치류 IL-4Rα 단백질의 막관통 및 세포질 도메인과 동일하다.
전체적 또는 부분적으로, 내인성 IL-4Rα 유전좌위에서 내인성 설치류 IL-4Rα 유전자의 인간 IL-4Rα 핵산으로의 치환을 갖는 유전적으로 변형된 설치류는, 이러한 치환에 대하여 동형접합성 또는 이형접합성일 수 있다. 일부 구현예에서, 유전적으로 변형된 설치류는 이러한 치환에 대하여 이형접합성, 즉, 내인성 설치류 IL-4Rα 유전자의 두 개의 카피 중 단지 하나만 인간 IL-4Rα 핵산으로 치환된다. 다른 구현예에서, 유전적으로 변형된 설치류는 이러한 치환에 대하여 동형접합성, 즉, 내인성 설치류 IL-4Rα 유전자의 두 개의 카피가 인간 IL-4Rα 핵산으로 치환된다.
본원에 개시된 유전적으로 변형된 설치류는 면역 세포, 예를 들어, B 및 T 세포 상에 인간 또는 인간화 IL-4Rα 단백질을 발현한다. 일부 구현예에서, 유전적으로 변형된 설치류는 내인성 설치류 IL-4Rα 단백질을 발현하지 않는다. 일 구현예에서, 인간 또는 인간화 IL-4Rα 단백질을 발현하는 설치류의 면역 세포는, 기능적 내인성 IL-4Rα 단백질을 발현하고 인간 또는 인간화 IL-4Rα 단백질을 발현하지 않는 야생형 설치류의 면역 세포 상에 기능적 내인성 IL-4Rα 단백질을 발현하는 설치류와 대략 동일한 수준의 IL-4Rα 단백질을 면역 세포 상에 갖는다. 다른 구현예에서, 설치류는 기능적 내인성 IL-4Rα 단백질을 발현하지만 전체적 또는 부분적으로 내인성 IL-4Rα 유전자의 인간 IL-4Rα 핵산으로의 치환을 포함하지 않는 연령이 맞는 설치류의 면역 세포 상에 존재하는 IL-4Rα 단백질 양의 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190% 또는 200%의 양으로 면역 세포 상에 인간 또는 인간화 IL-4Rα 단백질을 발현한다.
일부 구현예에서, 전체적 또는 부분적으로 내인성 설치류 IL-4Rα 유전자의 인간 IL-4Rα 핵산으로의 치환을 갖고 인간 또는 인간화 IL-4Rα 단백질을 발현하는 유전적으로 변형된 설치류는 정상적인 면역계를 가지는데, 즉, 인간 또는 인간화 IL-4Rα 단백질을 발현하는 설치류의 혈액, 혈장 또는 혈청 내 면역 세포, 예를 들어, B 및 T 세포의 수가 야생형 설치류(예를 들어, 기능적 내인성 IL-4Rα 단백질을 발현하고 전체적 또는 부분적으로 내인성 설치류 IL-4Rα 유전자의 인간 IL-4Rα 핵산으로의 치환을 갖지 않는 설치류)의 혈액, 혈장 또는 혈청 내 면역 세포, 예를 들어, B 및 T 세포의 수와 유사하다.
일부 구현예에서, 전체적 또는 부분적으로 내인성 설치류 IL-4Rα 유전자의 인간 IL-4Rα 핵산으로의 치환을 갖고, 인간 또는 인간화 IL-4Rα 단백질을 발현하는 유전적으로 변형된 설치류는 IL-4 의존성 신호 전달 및 IL-13 의존성 신호 전달을 매개할 수 있고 기능적이다. 예를 들어, 유전적으로 변형된 설치류의 면역 세포 상에 발현된 인간 IL-4Rα 단백질의 엑토도메인을 갖는 인간화 IL-4Rα 단백질은 인간 IL-4와 상호작용하고, I형 수용체의 형성을 통해 인간 IL-4 의존성 신호 전달을 매개한다(도 1 참조). 인간 IL-4Rα 단백질의 엑토도메인을 갖는 이러한 인간화 IL-4Rα 단백질은, 또한, 인간 및 마우스 IL-13과 상호작용하고, II형 수용체의 형성을 통해 IL-13 의존성 신호 전달을 매개한다(도 1 참조). 유전적으로 변형된 설치류에서 발현되는 인간화 IL-4Rα 단백질의 기능성은, 유전적으로 변형된 설치류에서 유래된 일차 B 세포를 사용한 IL-4 유도된 IgE 클래스 전환을 측정하는 검정과 같이, 아래의 실시예에 구체적으로 기술된 검정을 포함하는, 당해 분야에 알려진 다양한 검정으로 평가할 수 있다.
추가의 구현예에서, 전체적 또는 부분적으로 내인성 설치류 IL-4Rα 유전자의 인간 IL-4Rα 핵산으로의 치환을 갖고, 인간 또는 인간화 IL-4Rα 단백질을 발현하는 유전적으로 변형된 설치류는, 또한, 내인성 IL-4 유전좌위에서, 전체적 또는 부분적으로 내인성 설치류 IL-4 유전자의 인간 IL-4 핵산으로의 치환을 포함하고, 그 결과, 인간 또는 인간화 IL-4도 발현한다.
추가의 일 양태에서, 내인성 IL-4 유전좌위에서 전체적 또는 부분적으로 내인성 설치류 IL-4 유전자가 인간 IL-4 핵산으로의 치환되고, 내인성 IL-4 Rα 유전좌위에서 전체적 또는 부분적으로 내인성 설치류 IL-4Rα 유전자도 또한 인간 IL-4Rα 핵산으로 치환된 이중 인간화 설치류, 예를 들어, 마우스 또는 랫트가 제공된다. 이러한 이중 인간화 설치류는 각각의 인간화 치환에 대하여 동형접합성 또는 이형접합성일 수 있다. 구체적인 일 구현예에서, 이중 인간화 설치류는 인간화 IL-4 및 인간화 IL-4Rα 둘 다에 대하여 동형접합성이다.
이중 인간화 설치류에서 내인성 설치류 IL-4 유전자에 대한 유전적 변형은, 전체적 또는 부분적으로, 내인성 설치류 IL-4 유전자의 인간 IL-4 핵산으로의 치환을 갖는 유전적으로 변형된 설치류에 대하여 전술한 변형 또는 치환을 포함한다. 유사하게, 이중 인간화 설치류에서 내인성 설치류 IL-4Rα 유전자에 대한 유전적 변형은, 전체적 또는 부분적으로, 내인성 설치류 IL-4Rα 유전자의 인간 IL-4Rα 핵산으로의 치환을 갖는 유전적으로 변형된 설치류에 대하여 전술한 변형 또는 치환을 포함한다. 따라서, 설치류 IL-4 유전자의 인간화 및 설치류 유전자의 인간화에 대하여 각각 위에 개시된 특징들은, 특히 이중 인간화 설치류를 위해 본원에 통합된다.
구체적인 구현예에서, 인간 IL-4 단백질 및 인간화 IL-4Rα 단백질을 발현하는 이중 인간화 설치류, 예를 들어, 마우스 또는 랫트가 제공되며, 인간화 IL-4Rα 단백질은 인간 IL-4Rα 단백질의 엑토도메인을 포함하고 설치류의 내인성 IL-4Rα 단백질의 막관통 및 세포질 도메인을 포함한다. 특정 구현예에서, 인간 IL-4 단백질 및 인간화 IL-4Rα 단백질의 발현은, 각각 내인성 설치류 IL-4 유전좌위 및 설치류 IL-4Rα 유전좌위의 내인성 설치류 조절 서열의 조절 하에 있다.
일부 구현예에서, 이중 인간화 설치류는 정상적인 면역계(즉, 면역 세포의 수가 야생형 설치류와 대략 동일함)를 갖고, 혈청 내에 대략 동일한 수준의 IL-4 단백질을 갖고, 면역 세포 상에 야생형 설치류(야생형 설치류는 기능적 내인성 IL-4 단백질 및 IL-4Rα 단백질을 발현하고 인간 또는 인간화 IL-4 단백질 또는 IL-4Rα 단백질을 발현하지 않는 설치류임)와 대략 동일한 양의 IL-4Rα 단백질을 발현한다.
특정 구현예에서, 이중 인간화 설치류는 기능적 IL-4 신호 전달 경로를 나타낸다. "기능적 IL-4 신호 전달 경로"란 인간 또는 인간화 IL-4 단백질, 및 인간 또는 인간화 IL-4Rα 단백질이 모두 이중 인간화 설치류에서 발현되고 이중 인간화 설치류에서 서로 상호작용하여 하류 신호 전달을 효과적으로 매개하고 정상적인 IL-4 신호 전달 경로의 생물학적 활성을 수행하는 것을 의미한다. Th2 분화의 개시 및 유지, B 세포의 활성화 및 생장, IgE 및 IgG4로의 클래스 전환과 같은 I형 수용체를 통해 매개되는 생물학적 활성 및 배상(Goblet) 세포 증식증, 상피하부 섬유증, 및 조직 재구성과 같은 II형 수용체 신호 전달을 통해 매개되는 생물학적 활성을 포함하는, 정상적인 IL-4 신호 전달 경로의 생물학적 활성은 위에 기술되고, 도 1에 예시되어 있다. 예를 들어, 이중 인간화 설치류에서 기능적 IL-4 신호 전달 경로는, 예를 들어, 집 먼지 진드기 챌린지에 대한 반응으로 순환계에서 증가된 IgE, 기도 염증 및/또는 호산구 침투 세포를 특징으로 하는 염증성 표현형에 의해 반영되는데, 이러한 표현형은 이중 인간화가 없는 야생형 설치류에서도 관찰된다.
유전적으로 변형된 비-인간 동물을 제조하는 방법
유전적으로 변형된 비-인간 동물, 예를 들어, 설치류는 당해 분야에 알려진 방법들을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 비-인간 동물 상동성 상류 및 하류 영역의 측면에 위치한 인간 핵산(예를 들어, 전체적 또는 부분적으로 인간 IL-4 또는 IL-4Rα 유전자)를 포함하는 표적 벡터가 제조될 수 있다. 표적 컨스트럭트는 또한, 인간 핵산에 대해 3'에 위치하는 약물 선택 카세트(예를 들어, 일시적 Cre-발현 벡터에 의해 순차적으로 제거될 수 있는 floxed hygro 선택 카세트)를 포함할 수 있다. 표적 벡터는, 예를 들어, 전기천공에 의해 비-인간 동물 세포, 예를 들어, 배아 줄기(ES) 세포(예를 들어, 마우스 ES 세포)의 게놈에 도입될 수 있다. 정확하게 표적화된 ES 세포 클론은, 그런 다음, 초기 단계 배아(예를 들어, 8-세포기 마우스 배아) 내에 도입될 수 있다. 정확하게 표적화된 ES 세포로부터 완전하게 유래된 비-인간 동물은, 예를 들어, 대립형질 분석을 기반으로 식별된다. 적절하게 유전적으로 변형가능한 ES 세포가 쉽게 이용가능하지 않은 비-인간 동물의 경우, 본원에 기술된 유전적 변형을 포함하는 비-인간 동물을 제조하기 위해 다른 방법들이 채용될 수 있다. 이러한 방법은, 예를 들어, 비-ES 세포 게놈(예를 들어, 섬유아세포 또는 유도된 다능성 세포)의 변형 및 적합한 세포, 예를 들어, 난모세포로 변형된 게놈을 이식하기 위한 핵 이식의 채용, 및 배아를 형성하기에 적합한 조건 하에 비-인간 동물에서 변형된 세포(예를 들어, 변형된 난모세포)의 잉태를 포함한다.
유전적으로 변형된 비-인간 동물을 채용하는 방법
일 양태에서, 본원에 개시된 유전적으로 변형된 IL-4 및/또는 IL-4Rα 비-인간 동물은, 아래의 실시예에 추가로 예시된 바와 같이, 다양한 질환 모델에서 인간 특이적 IL-4 및/또는 IL-4Rα 길항제, 예를 들어, 중화 항-IL-4 및/또는 항- IL-4Rα 항체(예를 들어, 두필루맙)의 약력학(PD) 및 치료적 효능을 평가하는 데 유용하다.
일부 구현예에서, 본 발명은 본원에 개시된 이중 인간화 IL-4 및 IL-4Rα 마우스를 사용하는 인간-특이적 IL-4 또는 IL-4Rα 길항제의 스크리닝 방법을 제공한다.
"IL-4 또는 IL-4Rα 길항제"는 IL-4 또는 IL-4Rα에 의해 매개되는 하나 이상의 생물학적 기능을 차단하거나, 억제하거나, 저해하는 분자(예를 들어, 항체)를 의미한다."인간 특이적 IL-4 또는 IL-4Rα 길항제"는 인간 IL-4 또는 IL-4Rα,에 특이적이고, 설치류 IL-4 또는 IL-4Rα에 대하여 실질적으로 작용하지 않는 길항제를 지칭한다.
구체적인 구현예에서, 스크리닝 방법은 인간 IL-4 단백질, 및 인간화 IL-4Rα 단백질을 발현하는 이중 인간화 마우스를 활용하며, 인간화 IL-4Rα 단백질은 내인성 마우스 IL-4Rα 단백질의 막관통 및 세포질 도메인에 연결된 인간 IL-4Rα 단백질의 엑토도메인을 포함하고, 마우스는 마우스 IL-4 또는 마우스 IL-4Rα를 발현하지 않는다.
일부 구현예에서, 인간 특이적 IL-4 또는 IL-4Rα 길항제에 대한 스크리닝 방법은, 본원에 기술된 IL-4 및 IL-4Rα에 대하여 이중 인간화된 유전적으로 변형된 설치류에 약제를 투여하는 단계, IL-4/IL-4Rα 신호 전달 경로에 의해 매개되는 생물학적 기능에 대한 약제의 효과를 결정하는 단계, 및 약제가 유전적으로 변형된 설치류에서 IL-4/IL-4Rα 신호 전달 경로에 의해 매개되는 기능에 길항하는 경우 약제를 인간-특이적 IL-4 또는 IL-4Rα 길항제로 식별하는 단계를 포함한다.
일 구현예에서, 약제는 IL-4 또는 IL-4Rα에 결합하는 면역글로불린 가변 도메인을 포함한다. 일 구현예에서, 약제는 인간 IL-4 또는 IL-4Rα에는 특이적으로 결합하지만, 설치류 IL-4 또는 IL-4Rα에는 특이적으로 결합하지 않는다. 일 구현예에서, 약제는 항체이다. 구체적인 일 구현예에서, 약제는 인간 IL-4Rα에는 특이적으로 결합하지만, 설치류 IL-4Rα에는 특이적으로 결합하지 않는 항체이다.
일 구현예에서, 스크리닝 방법은 인간 IL-4 단백질, 및 인간화 IL-4Rα 단백질을 발현하는 이중 인간화 마우스를 활용하며, 인간화 IL-4Rα 단백질은 내인성 마우스 IL-4Rα 단백질의 막관통 및 세포질 도메인에 연결된 인간 IL-4Rα 단백질의 엑토도메인을 포함하고, 마우스는 쥐과 IL-4 또는 쥐과 IL-4Rα를 발현하지 않는다.
일부 구현예에서, 스크리닝 방법은 본원에 기술된 이중 인간화 설치류에서 IL-4/IL-4Rα 신호 전달에 연관된 질환을 유도하는 단계, 설치류에 약제를 투여하는 단계, 약제가 질환을 개선하는지 여부를 결정하는 단계, 및 약제가 질환을 개선한 경우 약제를 질환의 치료에 적합한 인간-특이적 IL-4 또는 IL-4Rα 길항제로 식별하는 단계를 포함한다.
"IL-4/IL-4Rα 신호 전달에 연관된 질환"은 IL-4/IL-4Rα 신호 전달에 의해 매개되는 생물학적 기능이 연루된 질환을 의미한다. IL-4/IL-4Rα 신호 전달에 연관된 질환의 예는, 예를 들어, 천식, 아토피성 피부염, 만성 폐쇄성 폐 질환(COPD)(적어도 부분적으로 담배 연기로부터 기인할 수 있음), 염증성 장 질환, 다발성 경화증, 관절염, 알러지성 비염, 호산구 식도염 및 건선과 같은 염증성 질환 또는 장애를 포함한다. 천식은 호산구 또는 비호산구 천식, 및 스테로이드 감응성 또는 스테로이드 저항성 천식일 수 있다.
일부 구현예에서, IL-4/IL-4Rα 신호 전달에 연관된 질환은 일정 시간 동안 일 이상의 투여량으로 알러지원(예를 들어, 집 먼지 진드기 추출물)의 비강내 투여에 의해 설치류에서 유도될 수 있는 기도 염증이다. 약제의 효과는 기도 염증(예를 들어, 점액 축적, 기관지 폐포 세척액 내 호산구 침투 세포, 총 순환 IgE의 수준 및/또는 마이크로어레이 발현 분석에 의해 측정될 수 있는 발현 프로파일에서의 변형에 의해 반영됨)의 정도가 약제 투여의 결과로서 감소되는지 여부를 측정하여 결정될 수 있다. 시험하는 약제 및 기도 염증을 유도하기 위해 사용되는 알러지원은 동시에 또는 상이한 시간에 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 알러지원은 일 이상의 투여량으로 설치류에 제공되고, 시험하는 약제는 적어도 일 투여량의 알러지원이 설치류에 제공된 후에 설치류에 투여된다.
일부 구현예에서, IL-4/IL-4Rα 신호 전달에 연관된 질환은, 피부 손상을 생성하고, 손상된 피부를 일정 시간 동안 일 이상의 투여량으로 알러지원(예를 들어, 박테리아 독소 또는 집 먼지 진드기 추출물)에 노출함으로써 설치류에서 유도될 수 있는 피부 염증 또는 아토피성 피부염이다. 약제의 효과는 피부 염증이 약제 투여의 결과로 감소하는지 여부를 측정하여 결정할 수 있다.
추가의 일 양태에서, 삼중 인간화된 비-인간 동물, 즉, IL-4, IL-4Rα, 및 IL-33 유전자가 인간화된 비-인간 동물이, 예를 들어, 인간 특이적 IL-4 및/또는 IL-4Rα 길항제, 및 인간-특이적 IL-33 길항제와 같은 후보 화합물의 약력학(PD) 및 치료적 효능을 평가하기 위해 사용된다.
"IL-33 길항제"는 IL-33에 의해 매개되는 하나 이상의 생물학적 기능 또는 신호 전달을 차단하거나, 억제하거나, 저해하는 분자(예를 들어, 항체)를 의미한다. "인간-특이적 IL-33 길항제"는 인간 IL-33,에 특이적이고, 설치류 IL-33에 대해서는 실질적으로 작용하지 않는 길항제를 지칭한다. IL-33은, IL-33 항체와 같은 길항제의 존재 하에 감소하는, ST2 및 IL-1 RAcP을 통한 신호 전달을 자극하는 것으로 알려져 있다. ST2 및 IL-1 RAcP을 통한 IL-33 신호 전달의 저해는, 그 내용 전체가 참조로서 본원에 통합된 미국 출원 공개 2014/0271658 A1에 기술된 바와 같은 시험관 내 또는 생체 내 검정으로 IL-33 신호 전달에 대하여 분석함으로써 결정할 수 있다. 예를 들어, 미국 출원 공개 2014/0271658 A1에 기술된 검정과 같은 검정이, 인간 IL-33의 발현을 위한 동형접합성인 알러지원-감작 동물에서 폐 염증 상 IL-33에 대한 항체의 효과를 평가하기 위해 사용될 수 있다. IL-33 길항제로서 유효한 IL-33 항체는 폐의 염증 세포에서의 감소 경향뿐 아니라 IL-4 및 IL-5과 같은 사이토카인의 감소 경향을 나타내야 한다.
구체적인 구현예에서, 삼중 인간화된 비-인간 동물은 본원에서 후보 화합물을 평가하기 위해 사용되며, 삼중 인간화 동물은 인간 IL-4 단백질, 마우스 IL-4Rα 단백질의 막관통 및 세포질 도메인에 연결된 인간 IL-4Rα 단백질의 엑토도메인을 포함하는 인간화 IL-4Rα 단백질, 및 인간 IL-33 단백질을 발현하는 삼중 인간화 마우스이고, 마우스는 마우스 IL-4, 마우스 IL-4Rα 또는 마우스 IL-33을 발현하지 않는다.
일부 구현예에서, 삼중 인간화된 비-인간 동물은, 예를 들어, 인간특이적 IL-4 및/또는 IL-4Rα 길항제, 또는 인간-특이적 IL-33 길항제와 같은 후보 화합물의 약력학(PD) 및 치료적 효능을 평가하기 위해 사용된다. 예를 들어, 인간-특이적 IL-4 항체, 인간-특이적 IL-4Rα 항체, 및 인간-특이적 IL-33 항체를 삼중 인간화 동물(예를 들어, 마우스 또는 랫트와 같은 설치류)에서 개별적으로 시험할 수 있고, 이들의 PD 프로파일 및 치료적 효능을 평가 및 비교할 수 있다.
다른 구현예에서, 예를 들어, 화합물의 조합이 상승적 치료 효과를 나타내는지 여부를 결정하기 위해, 개별적으로 사용하였을 때의 화합물의 효과와 비교하여, 화합물의 조합, 예를 들어 인간 특이적 IL-4 및/또는 IL-4Rα 길항제 항체와 인간-특이적 IL-33 길항제 항체의 조합의 효능을 평가하기 위해 삼중 인간화된 비-인간 동물이 사용된다. 구체적인 구현예에서, 인간 특이적 IL-4 항체와 인간-특이적 IL-33 항체의 조합을 삼중 인간화된 비-인간 동물에서 시험한다. 다른 구체적인 구현예에서, 인간 특이적 IL-4Rα 항체와 인간-특이적 IL-33 항체의 조합을 삼중 인간화된 비-인간 동물에서 시험한다.
후보 화합물 또는 화합물들의 조합을 평가하기 위해, IL-4/IL-4Rα 신호 전달 및 IL-33 신호 전달에 연관된 질환이 삼중 인간화 동물에서 유도될 수 있다. IL-4/IL-4Rα 신호 전달 및 IL-33 신호 전달에 연관된 질환의 예는, 예를 들어, 천식, 아토피성 피부염, 만성 폐쇄성 폐 질환(COPD)(적어도 부분적으로 담배 연기로부터 기인할 수 있음), 염증성 장 질환, 다발성 경화증, 관절염, 알러지성 비염, 호산구 식도염 및 건선과 같은 염증성 질환 또는 장애를 포함한다. 천식은 호산구 또는 비호산구 천식, 및 스테로이드 감응성 또는 스테로이드 저항성 천식일 수 있다. 화합물 또는 화합물들의 조합의 효과는 본원에 전술된 IL-4/IL-4Rα 이중 인간화 동물과 유사하게 평가할 수 있다.
본 발명은 다음의 비-제한적인 실시예들에 의해 더 자세히 설명된다.
실시예 1
내인성 마우스 IL-4 유전자의 인간 IL-4 유전자로의 치환
인간 IL-4 유전자의 ATG 개시 코돈으로부터 시작하는 엑손 1 내지 엑손 4(3' 미번역 영역을 포함함)의 코딩 부위 및 엑손 4의 하류의 3' 영역의 일부를 함유하는 8.8 kb 인간 IL-4 유전자로 ATG 개시 코돈으로부터 시작하는 엑손 1 내지 엑손 4(3' 미번역 영역을 포함함)의 코딩 부위 및 엑손 4의 하류의 3' 영역의 일부에 걸친 6.3 kb의 쥐과 IL-4 유전자 유전좌위를 치환하였다. 도 2a를 참조한다.
단일 표적화 단계로 마우스를 인간 IL-4 유전자로 치환하기 위한 표적 컨스트럭트를, VelociGene® 유전자 조작 기술(Valenzuela et al. (2003) High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, Nature Biotech, 21(6):652-659 참조)을 사용하여 제작하였다. 마우스 및 인간 IL-4 DNA를, 각각 박테리아 인공 염색체(BAC) 클론 bMQ-41A12 및 RP11-17K19로부터 수득하였다. 간략하게, 엑손 1 내 ATG 코돈에서부터 엑손 4(3' 미번역 영역을 포함함)까지 연장되는 8.8 kb 인간 IL-4 서열 측면의 마우스 IL-4 상류 및 하류 상동 암(arm) 및 엑손 4의 하류의 3' 영역의 일부(게놈 좌표: GRCh37: chr5:132,009,743-132,018,576(+ 가닥)) 및 floxed hygro 선택 카세트를 포함하는, 갭 복구 클로닝에 의해 생성된 SbfI 선형 표적 컨스트럭트를 F1H4 마우스 배아 줄기(ES) 세포((C57BL/6 x 129 F1 혼성체)로 전기천공하였다. 정확하게 표적화된 ES 세포(MAID 879)를 일시적 Cre-발현 벡터로 추가로 전기천공하여 약물 선택 카세트를 제거하였다. 약물 카세트가 없는 표적화 ES 세포 클론(MAID 1553)을 VelociMouse® 방법(미국 특허 번호 7,294,754, 7,576,259, 7,659,442, 및 Poueymirou et al. (2007) F0 generation mice that are essentially fully derived from the donor gene-targeted ES cells allowing immediate phenotypic analyses, Nature Biotech. 25(1):91-99)에 의해 8-세포기 SW 마우스 배아에 도입하였다. 인간화 IL-4 유전자를 지니는 VelociMice®(전체가 공여자 ES 세포로부터 유래된 F0 마우스)를 대립형질 검정의 변형을 사용하여 마우스 대립형질의 소실 및 인간 대립형질의 획득에 대한 유전형 분석을 통해 식별하였다(Valenzuela et al. (2003) 참조).
정확하게 표적화된 ES 세포 클론을, 원래의 미변형 IL-4 유전자의 카피의 수가 결실을 위하여 표적화된 마우스 IL-4 유전자 내 서열에 특이적인 2가지 TaqMan™ 정량적 중합효소 연쇄 반응(qPCR)에 의해 결정되었던 원래의 대립형질의 소실(loss-of-native-allele, LONA) 검정(Valenzuela et al. 2003)에 의해 식별하였다. qPCR 검정은 다음의 프라이머-프로브 세트(5'에서 3'으로 기재됨)를 포함하였다: 상류 정방향 프라이머, CATGCACGGA GATGGATGTG(서열 번호 1); 상류 역방향 프라이머, GACCCCTCAG GTCCACTTAC C(서열 번호 2); 상류 프로브, FAM-AACGTCCTCA CAGCAACGA-MGB(서열 번호 3); 하류 정방향 프라이머, GTGCCCAGGT GTGCTCATG(서열 번호 4); 하류 역방향 프라이머, CGCCTGCCTC CTCACTTTAT C(서열 번호 5); 하류 프로브, FAM-ATCTGCTTCA CCATCCACT-MGB(서열 번호 6); 여기에서, FAM은 5-카복시플루오레세인 형광 프로브를 지칭하고, BHQ는 블랙 홀 ??처 타입(Biosearch Technologies)의 형광 ??칭제를 지칭한다. 표적 벡터를 취득하고, 게놈 내에 삽입한 ES 세포 클론으로부터 정제된 DNA를, 제조자의 제안에 따라 384-웰 PCR 플레이트(MicroAmp™ Optical 384-웰 반응 플레이트, Life Technologies)에서 TaqMan™ 유전자 발현 마스터 믹스(Life Technologies)와 조합하고, PCR의 과정 중 형광 데이터를 수집하고, 축적된 형광이 사전 설정된 임계에 도달하는 분획 PCR 사이클인 임계 사이클(Ct)을 결정하는 Applied Biosystems Prism 7900HT에서 사이클을 진행하였다. 상류 및 하류 IL-4-특이적 qPCR 및 비표적 참조 유전자에 대한 2종의 qPCR을 각각의 DNA 시료에 대하여 시행하였다. 각각의 IL-4-특이적 qPCR 및 각각의 참조 유전자 qPCR 사이의 Ct 값(△Ct)에서의 차이를 계산한 다음, 검정한 모든 시료에 대한 각각의 △Ct 및 중앙값 △Ct 사이의 차이를 계산하여 각각의 시료에 대한 △△Ct 값을 수득하였다. 각각의 시료에서 IL-4 유전자의 카피 수를 다음의 식으로부터 계산하였다: 카피 수=2x2-△△Ct. 원래의 카피 중 하나의 소실을 갖는 정확하게 표적화된 클론은 하나와 동일한 IL-4 유전자 카피 수를 가질 것이다. 인간 IL-4 유전자 서열로 인간화 대립형질에서 결실된 마우스 IL-4 유전자 서열을 치환한 것에 대한 확인은 다음의 프라이머-프로브 세트(5'에서 3'으로 기재됨)를 포함하는 TaqMan™ qPCR 검정에서 확인하였다: 인간 정방향 프라이머, GCCTGGACCA AGACTCTGT(서열 번호 7); 인간 역방향 프라이머, ACCGTGGGAC GGCTTCTTAC(서열 번호 8); 인간 상류 프로브, FAM-CACCGAGTTG ACCGTAACAG ACATC-BHQ(서열 번호 9). hygro 선택 카세트가 인간화 대립형질 내 인간 IL-4 유전자 서열 내에 삽입된 것에 대한 확인은 다음의 프라이머-프로브 세트(5'에서 3'으로 기재됨)를 포함하는 TaqMan™ qPCR 검정으로 확인하였다: hygro 정방향 프라이머, TGCGGCCGAT CTTAGCC(서열 번호 10); hygro 역방향 프라이머, TTGACCGATT CCTTGCGG(서열 번호 11); hygro 프로브, FAM-ACGAGCGGGT TCGGCCCATT C-BHQ(서열 번호 12).
IL-4 유전자형을 결정하고, 인간화 IL-4 대립형질이 생식계열을 통해 전달된 것을 확인하기 위해, 표적화 ES 세포로부터 유래된 마우스에 대한 꼬리 생검으로부터 정제된 DNA를 검정하기 위해, 동일한 LONA 검정을 사용하였다. 치환에 대하여 이형접합성인 두 마리의 새끼를 교배하여, 인간 IL-4 유전자에 의한 내인성 마우스 IL-4 유전자의 치환에 대해 동형접합성인 마우스를 생성하였다. 치환에 대해 동형접합성인 새끼를 표현형 분석을 위해 사용하였다.
쥐과 IL-4 유전좌위 및 인간 IL-4 유전자를 포함하는 서열의 상류 접합점을 5'-TGCTGATTGG CCCAGAATAA CTGACAATCT GGTGTAATAA AATTTTCCAA TGTAAACTCA TTTTCCCTTG GTTTCAGCAA CTTTAACTCT ATATATAGAG AGACCTCTGC CAGCATTGCA TTGTTAGCAT CTCTTGATAA ACTTAATTGT CTCTCGTCAC TGACGGCACA GAGCTATTG(A TGGGTCTCAC CTCCCAACTG CTTCCCCCTC TGTTCTTCCT GCTAGCATGT GCCGGCAACT TTGTCCACGG ACACAAGTGC GATATCACCT TACAGGAGAT CATCAAAACT TTGAACAGCC TCACAGAGCA GAAG)GTGAGT ACCTATCTGG CACCATCTCT CCAGATGTTC TGGTGATGCT CTCAGTATTT CTAGGCATGA AAACGTTAAC AGCTGCTAGA GAAGTTGGAA CTGGTGGTTG GTGGCAGTCC AGGGCACACA GCGAGGCTTC TCCCCTGC (서열 번호 13) 내에 설계하고, 인간 IL-4 서열은 이탤릭체로 표기하고, IL-4 코딩 서열은 괄호로 묶는다. 인간 IL-4 유전자를 함유하는 서열과 floxed hygro 선택 카세트의 하류 접합점을 5'-TGTTTATTTT GCAG(AATTCC TGTCCTGTGA AGGAAGCCAA CCAGAGTACG TTGGAAAACT TCTTGGAAAG GCTAAAGACG ATCATGAGAG AGAAATATTC AAAGTGTTCG AGCTGA)ATAT TTTAATTTAT GAGTTTTTGA TAGCTTTATT TTTTAAGTAT TTATATATTT ATAACTCATC ATAAAATAAA GTATATATAG AATCTAACAG CAATGGCATT TAATGTATTG GCTATGTTTA CTTGACAAAT GAAATTATGG TTTGCAACTT TTAGGGAAAT CAATTTAGTT TACCAAGAGA CTATAAATGC TATGGGAGCA AAACAGGAAA GACCACTTCC CCCTCGAGGG GTTCCCTCTC GAGTTAGGGA CATAACACAC AAGATAATTA AAGAACACAA GGCCATACAA
GATGCGGCCG CACCGGTATA ACTTCGTATA AGGTATCCTA TACGAAGTTA TATGCATGGC CTCCGCGCCG GGTTTTGGCG CCTCCCGCGG GCGCCCCCCT CCTCACGGCG AGCGCTGCCA CGTCAGACGA AGGGCGCAGC GAGCGTCCTG ATCCT (서열 번호 14) 내에 설계하고, 인간 IL-4 서열은 이탤릭체로 표기하고, IL-4 코딩 서열은 괄호로 묶는다. floxed hygro 선택 카세트의 서열과 쥐과 IL-4 유전좌위의 하류 접합점을 5'-TGCCAAGTTC TAATTCCATC AGACCTCGAC CTGCAGCCGG CGCGCCATAA CTTCGTATAA GGTATCCTAT ACGAAGTTAT CTCGAGAGGA GTTCCCACCC TTCTCAAGAG CATAATGCGC AGATCATTAA GGGACAGATG CAGGCTGGGG AGACGGTTCA GCAGTTAGGA GTACCTGTTG CTCTTCCAGA GGACCCAGGT TCAATTCCCG GCACTCACAT AGCAGCTTAA AACAATAACT CAAGTTCTGG GGGAGCTGAT GCTCTCCTCT GGCCTCCTGT GGAGGTACAC AGACCACATG CCTGTAGGCA AGACACCCAC ACACATAAAA ACAAAATAAA ATAAGGATAG AAAGGCCAGG GGGATGAATC CAGAGGTAGA AGAAAACTTA TTCCCTGGAA TTGTCCTCTG ACTCCCCTCC CAAAACCTCT AACACGCAT (서열 번호 15) 내에 설계하고, hygro 카세트 서열은 이탤릭체로 나타낸다.
실시예 2
내인성 마우스 IL-4Rα 엑토도메인 유전자 서열의 인간 IL-4Rα 엑토도메인 유전자 서열로의 치환
인간 IL-4Rα 유전자의 ATG 개시 코돈으로부터 시작하는 엑손 1 내지 엑손 5 및 인트론 5의 일부를 함유하는 15.6 kb 인간 IL-4Rα 유전자로 코딩 ATG 개시 코돈으로부터 시작하는 코딩 엑손 1 내지 엑손 5 및 인트론 5의 일부에 걸친 7.1 kb의 쥐과 IL-4Rα 유전자 유전좌위를 교체하였다. 마우스 엑손 6 내지 9는 보존되었고; 단지 엑손 1 내지 5(즉, 엑토도메인)만 인간화되었다. 도 2b 참조.
단일 표적화 단계로 마우스를 인간 IL-4Rα 유전자로 치환하기 위한 표적 컨스트럭트를 VelociGene® 유전자 조작 기술(Valenzuela et al. (2003) High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, Nature Biotech, 21(6):652-659 참조)을 사용하여 제작하였다. 마우스 및 인간 IL-4Rα DNA를, 각각 박테리아 인공 염색체(BAC) 클론 RP23-136G14 및 RP11-166E24로부터 수득하였다. 간략하게, 엑손 1 내 ATG 코돈에서부터 엑손 5 및 인트론 5의 일부(게놈 좌표: GRCh37: chr16:27,351,525-27,367,111(+ 가닥))까지 연장되는 15.6 kb 인간 IL-4Rα 서열 측면의 마우스 IL-4Rα 유전자 상류 및 하류 상동 암 및 floxed neo 선택 카세트를 함유하는, 갭 복구 클로닝에 의해 생성된 NotI 선형 표적 컨스트럭트를 F1H4 마우스 배아 줄기(ES) 세포(C57BL/6 x 129 F1 혼성체)로 전기천공하였다. 정확하게 표적화된 ES 세포(MAID 803)를 일시적 Cre-발현 벡터로 추가로 전기천공하여 약물 선택 카세트를 제거하였다. 약물 카세트(MAID 1444)가 없는 표적화 ES 세포 클론을 VelociMouse® 방법에 의해 8-세포기 SW 마우스 배아에 도입하였다 (미국 특허 번호 7,294,754, 7,576,259, 7,659,442, 및 Poueymirou et al. (2007) F0 generation mice that are essentially fully derived from the donor gene-targeted ES cells allowing immediate phenotypic analyses, Nature Biotech. 25(1):91-99 참조). 인간화 IL-4Rα 유전자를 지니는 VelociMice®(완전히 공여자 ES 세포로부터 유래된 FO 마우스)를 대립형질 검정의 변형을 사용하여 마우스 대립형질의 소실 및 인간 대립형질의 획득에 대한 유전자형 분석으로 식별하였다(Valenzuela et al. (2003) 참조).
정확하게 표적화된 ES 세포 클론을, 결실에 대해 표적화된 마우스 IL-4Rα 유전자 내 서열에 특이적인 2종의 TaqMan™ 정량적 중합효소 연쇄 반응(qPCR)으로 원래의 미변형 IL-4Rα 유전자의 카피 수를 결정하는 원래의 대립형질의 소실(LONA) 검정(Valenzuela et al. 2003)에 의해 식별하였다. qPCR 검정은 다음의 프라이머-프로브 세트(5'에서 3'으로 기재됨)를 포함하였다: 상류 정방향 프라이머, CCGCTGGCAT GTGTATTGTG(서열 번호 16); 상류 역방향 프라이머, TGAGTGTGGG ACCCTCAAGA G(서열 번호 17); 상류 프로브, FAM-TGACCCAAGC CCTACATGGC CACT-BHQ(서열 번호 18); 하류 정방향 프라이머, TGAGGAGAGC TCACGGGAAT C(서열 번호 19); 하류 역방향 프라이머, ACCCATCTCC TGCGTTTCTG(서열 번호 20); 하류 프로브, FAM-TTGACACGCC AGCTACACTG CTCCA-BHQ(서열 번호 21); 여기에서, FAM은 5-카복시플루오레세인 형광 프로브를 지칭하고, BHQ는 블랙 홀 ??처 유형(Biosearch Technologies)의 형광 ??칭제를 지칭한다. 표적 벡터를 취득하고 게놈 내에 삽입한 ES 세포 클론으로부터 정제된 DNA를 제조자의 제안에 따라 384-웰 PCR 플레이트(MicroAmp™ Optical 384-웰 반응 플레이트, Life Technologies)에서 TaqMan™ 유전자 발현 마스터 믹스(Life Technologies)와 조합하고, PCR의 과정 동안 형광 데이터를 수집하고, 축적된 형광이 사전 설정된 임계에 도달하는 분획 PCR 사이클인 임계 사이클(Ct)을 결정하는 Applied Biosystems Prism 7900HT에서 사이클을 수행하였다. 상류 및 하류 IL-4Rα-특이적 qPCR 및 비표적 참조 유전자에 대한 2종의 qPCR을 각각의 DNA 시료에 대하여 수행하였다. 각각의 IL-4Rα-특이적 qPCR 및 각각의 참조 유전자 qPCR 사이의 Ct 값(△Ct)에서의 차이를 계산한 다음, 검정된 모든 시료에 대한 각각의 △Ct 및 중앙값 △Ct 사이의 차이를 계산하여 각각의 시료에 대한 △△Ct 값을 수득하였다. 각각의 시료 내 IL-4Rα 유전자의 카피 수를 다음의 식으로부터 계산하였다: 카피 수=2x2-△△Ct. 원래의 카피 중 하나의 소실을 갖는 정확하게 표적화된 클론은 하나와 동일한 IL-4Rα 유전자 카피 수를 가질 것이다. 인간화 대립형질에서 인간 IL-4Rα 유전자 서열로 결실된 마우스 IL-4Rα 유전자 서열을 치환한 확인은 다음의 프라이머-프로브 세트(5'에서 3'으로 기재됨)를 포함하는 TaqMan™ qPCR 검정으로 확인하였다: 인간 정방향 프라이머, ACCTGCGTCT CCGACTACAT G(서열 번호 22); 인간 역방향 프라이머, GAGCTCGGTG CTGCAATTG(서열 번호 23); 인간 프로브, FAM-TGGGACCATT CATCTTCCAC TCGCA-BHQ(서열 번호 24). 인간화 대립형질에서 neo 선택 카세트가 인간 IL-4Rα 유전자 서열 내에 삽입된 확인은 다음의 프라이머-프로브 세트(5'에서 3'으로 기재됨)를 포함하는 TaqMan™ qPCR 검정에서 학인하였다: neo 정방향 프라이머, GGTGGAGAGG CTATTCGGC(서열 번호 25); neo 역방향 프라이머, GAACACGGCG GCATCAG(서열 번호 26); neo 프로브, FAM-TGGGCACAAC AGACAATCGG CTG-BHQ(서열 번호 27).
IL-4Rα 유전자형을 결정하고, 인간화 IL-4Rα 대립형질이 생식계열을 통해 전달된 것을 확인하기 위해, 동일한 LONA 검정을 사용하여 표적화 ES 세포로부터 유래된 마우스에 대한 꼬리 생검으로부터 정제된 DNA를 검정하였다. 치환에 대한 이형접합성인 2마리의 새끼를 교배하여 인간 IL-4Rα 유전자에 의한 내인성 마우스 IL-4Rα 유전자의 치환에 대해 동형접합성인 마우스를 생성한다. 치환에 대해 동형접합성인 새끼를 표현형 분석을 위해 사용한다.
쥐과 IL-4Rα 유전좌위와 인간 IL-4Rα 유전자를 함유하는 서열의 상류 접합점을 5'-TGGGGGAGGG AGGCCATGAC ACAAATGAAA TGGACCCCGC TGACCCAGGA TCAGCATCTG CCCACTCTTC TTTCTGCAGG CACCTTTTGT GTCCCCA(ATG GGGTGGCTTT GCTCTGGGCT CCTGTTCCCT GTGAGCTGCC TGGTCCTGCT GCAGGTGGCA AGCTCTG)GTA AGTCACCACT TCTCAATCAT TCATTTGTTG GCTATTAATG GCGTGCCAGG GTCCTGCAGT ATGTCACCTG GCC (서열 번호 28)내에 설계하고, 인간 IL-4Ra 서열은 이탤릭체로 표기하고, IL-4Rα 코딩 서열에는 밑줄을 친다. 인간 IL-4Rα 유전자를 함유하는 서열과 floxed neo 선택 카세트의 하류 접합점을 5'-GTCAGATCGT GGAGGGTCTC GGACGAGGG TCCTGACCCT GGGTCTCCAG TCCTGGGAAG TGGAGCCCAG GCTGTACCAT GGCTGACCTC AGCTCATGGC Tcccgggctc gataactata acggtcctaa ggtagcgact cgagataact tcgtataatg tatgctatac gaagttatat gcatggcctc cgcgccgggt tttggcgcct cccgcgggcg cccccctcct cacggcgagc gctg(서열 번호 29)내에 설계하고, 인간 IL-4Ra 서열은 이탤릭체로 표기하고, 카세트 서열은 소문자로 나타낸다. floxed neo 선택 카세트의 서열과 쥐과 IL-4Rα 유전좌위의 하류 접합점은 5'- tattgttttg ccaagttcta attccatcag acctcgacct gcagccccta gataacttcg tataatgtat gctatacgaa gttatcctag gttggagctc TCTGTAGCCA GGTAACCAAG GGTCCCAGGG GAACCCCCAG TGTGGACGCG GACTGCACAT GACACAGGGC GGCCTCCCCA TTCATGACTG TTTTTCTCCT TGCAG(ACTTC CAGCTGCCCC TGATACAGCG CCTTCCACTG GGGGTCACCA TCTCCTGCCT CTGCATCCCG TTGTTTTGCC TGTTCTGTTA CTTCAGCATT ACCAA)GTGAG TTCCTGCTTT GGCTGGTGTC TCTGGCTGGC CCTTCAGCAG TGCTCTCAGA GGTCACAGTC ATTGTGCTGG CTGAGAAAAG (서열 번호 30)내에 설계하고, 마우스 IL-4Ra 코딩 서열은 괄호로 묶고 neo 카세트 서열은 소문자로 나타낸다.
실시예 3
이중 인간화 IL-4/IL-4Rα 마우스의 생성
이중 인간화 IL-4/IL-4Rα(Il4 hu/hu /Il4rα hu/hu ) 마우스를 다음과 같이 생성하였다. 인간화 IL-4Rα 유전자 및 floxed neo 카세트를 포함하는 ES 세포 클론 MAID 803에 Cre 발현 벡터를 전기천공하여 floxed neo 카세트를 제거하여, 약물 선택 카세트 없이 인간화 IL-4Ra 유전자를 포함하는 ES 세포 클론 MAID 1444를 생성하였다(실시예 2). 인간화 IL-4 유전자 및 floxed hygro 카세트를 포함하는 ES 세포 클론 MAID 879를 생성하기 위해 사용되었던 동일한 표적 컨스트럭트(실시예 1 참조)를 ES 세포 클론 MAID 1444내에 전기천공하여, 879 Het/1444 Het(Il4 +/hu /Il4ra +/hu ) ES 세포를 생성하였고, 이어서 이를 Cre 발현 벡터로 전기천공하여 floxed hygro 카세트를 제거하고 인간화 IL-4 및 IL-4Rα 유전자를 포함하는 ES 세포 클론(MAID 1553/1444)을 생성하였다. 약물 카세트가 없는 ES 세포 클론 MAID 1553/1444를 8-세포기 SW 마우스 배아에 도입하여 이중 인간화 IL-4/IL-4Ra 마우스를 생성하였다.
실시예 4
인간 IL-4 및 IL4Rα 유전자 치환을 갖는 마우스에서 완전한 인간 IL-4Rα mAb인 두필루맙의 효능 평가
방법
마우스 전장 IL-4 유전좌위를 8.8 kb의 인간 IL-4 게놈 서열로 치환(실시예 1 및 도 2a 참조)하고, 마우스 IL-4Ra(CD124) 유전자의 세포외 도메인(즉, 엑토도메인)을 상응하는 인간 IL-4Rα 게놈 DNA의 15.6 kb 단편으로 치환(실시예 2 및 도 2b 참조)하기 위해, VelociGene® 기술을 사용하여 유전적으로 조작된 마우스를 생성하였다.
동형접합성 인간화 IL-4Rα 유전자를 갖는 마우스를 인간 유전자의 발현 및 기능에 대하여 검증하였다. 인간화 마우스에 의한 인간 IL-4Rα의 발현을 결정하기 위해, 야생형 및 인간화 마우스로부터의 비장세포를 수집하고, 마우스 CD3, 마우스 CD19, 인간 CD124, 및 마우스 CD124에 대하여 형광 표지된 항체를 이용한 형광 활성화 세포 분류(FACS) 분석을 위해 가공하였다. (예를 들어, Blaeser et al. (2003) Targeted inactivation of IL-4 receptor a chain I4R motif promotes allergic airway inflammation, J Exp Med198(8):1189-1200 참조).
리간드 특이성 및 수용체 기능성을 입증하기 위해, 인간화 IL-4Rα 마우스로부터 유래된 일차 세포를 사용하였다. 골수 유래 대식세포를, 20% L-세포 조건 배지가 첨가된 10% 우태아 혈청을 함유하는 DMEM에서 7일간 야생형 및 인간화 IL-4Rα 마우스로부터의 대퇴부 골수 세포를 사용하여 배양하였다.
다음에, 세포를, 배양 배지에 희석된 20 ng/mL의 마우스 IL-4, 마우스 IL-13, 인간 IL-4, 인간 IL-13, 또는 비히클로 개별적으로 20시간 동안 처리하였다. 유전자 발현 분석을 위해 각각의 조건으로부터 사중화 시료를 수확하였다.
이러한 시료로부터의 총 RNA를 추출하고, Cy3-CTP를 삽입함으로써 cRNA로 증폭하였다. 각각의 시료로부터 Cy3 표지된 cRNA를, 다음에, 마우스 전사체를 커버하는 43,538 60-머(mer) 올리고를 포함하는 맞춤 Agilent 어레이에 혼성화하였다. Agilent Feature Extraction Software 9.5를 사용하여 스캐닝한 어레이 이미지로부터 데이터를 추출하였다.
실험군 간 차등 발현된 유전자를 스튜던트 t 검정(Student's t-test)(p<0.05, 배율 변화≥1.5)을 사용하여 식별하였다. 이러한 유전자의 발현 클러스터를 GeneSpring GX7.3로부터의 피어슨(Pearson) 상관관계 클러스터링 알고리즘을 사용하여 생성하였다.
IL-4에 대한 두필루맙의 중화 효과를 인간화 IL-4Rα (Il4ra hu/hu )마우스로부터 단리된 일차 B 세포를 이용한 시험관 내 IgE 클래스 전환 검정을 사용하여 평가하였다.
야생형(WT) 및 인간화 IL-4Rα (Il4ra hu/hu )마우스는, 마우스 IL-25 생체 내 발현을 위해 그대로의(naked) 플라스미드 DNA 용액의 고부피(유체역학) 유래 유전자 전달을 받았다. (예를 들어, Liu et al. (1999) Hydrodynamics-based transfection in animals by systemic administration of plasmid DNA, Gene Therapy 6:1258-1266 참조). 말초 혈액을 8일 후 수집하여 상업적 ELISA 키트(R & D systems, MN)를 사용하여 혈청 쥐과 IgE(mIgE) 수준을 측정하였다.
인간화 마우스 비장세포로부터 정제된 일차 B 세포를 박테리아 LPS로 활성화하고, 7일 배양물에서 증가하는 양의 재조합 인간 IL-4와 혼합하여 면역글로불린 클래스 전환을 유도하였다. 항체 차단 실험을 위해, 정제된 B 세포를, 0.167 nM 재조합 인간 IL-4를 첨가하기 전, 증가하는 용량의 두필루맙과 30분 간 항온배양하였고, 7일간 배양하였다. IL-4의 부재 하 또는 이소형 대조군 mAb 존재 하의 IgE 생성을, 각각 (◇) 및(△)에 나타낸다. 배양 상등액 내 쥐과 IgE 수준을 상업적 ELISA 키트를 사용하여 측정하였다. (예를 들어, Moon et al. (1989) Regulation of IgG1 and IgE synthesis by interleukin 4 in mouse B cells, Scand I Immunol 30:355-361 참조.)
인터루킨-25(IL-25)는 Th2 세포에 의해 생성되는 사이토카인으로, 이의 주요 활성은 IL-4 및 IL-13 의 생성을 통해 매개되어 조직 특이적 병리, 예를 들어, 증가된 폐 점액 생성 및 배상 세포 증식증을 유도한다. (Fort et al. (2001) IL-25 induces IL-4, IL-5, and IL-13 and Th2-associated pathologies in vivo, Immunity 15(6):985-995 참조.)
IL-13의 결여는 표적 기관에서 IL-25 유도 병리로부터 동물을 보호한다. 따라서, IL-25 유래 폐 염증모델을 인간화 IL-4 및/또는 IL-4Rα 유전자를 포함하는 마우스에서 생체 내 두필루맙의 약력학(PD) 특성을 평가하기 위해 사용하였다.
II형 수용체에 대한 두필루맙의 PD 반응을 IL-25-유도 염증 방법을 사용하여 인간화 IL-4Rα (Il4ra hu/hu ) 마우스에서 폐 점액 축적을 측정함으로써 특성분석하였다.
0일 차에, WT 및 인간화 IL-4Rα(Il4ra hu/hu ) 마우스는 마우스 IL-25 발현 벡터의 유체역학적 전달을 받았고, 지시된 용량으로 두필루맙 또는 이소형 대조군 mAb의 주사가 이어졌다. 추가적인 용량의 항체가 총 4회의 용량으로 격일로 투여되었다. 8일 차에, 폐 조직을 안락사된 마우스로부터 수집하였고, 가공된 폐 절편을 병리학적 변화에 대한 블라인드 점수화 전, 과요오드산-시프(Schiff)로 염색하였다.
결과
인간화 IL-4Rα 마우스를 특성분석하여 다음을 나타내었다: (a) 이중 인간화 IL-4/IL-4Ra (Il4 hu/hu /Il4ra hu/hu ) 마우스로부터의 일차 세포 상 인간 IL-4Ra의 발현(도 3 참조); (b) 인간화 IL-4Ra (Il4ra hu/hu ) 마우스에서 IL-4 리간드 특이성의 변화(도 4 참조); 및 (c) 인간화 IL-4Ra (Il4ra hu/hu ) 마우스에서 IL-13 경로의 기능성(도 4 참조).
B 및 T 세포 군집에 대하여 게이팅한 IL-4Rα(CD124)의 표지 프로파일을 나타내고, 음영을 준 영역에 상응하는 미염색 세포 군집의 분포를 나타낸, 도 3에 나타낸 바와 같이, 야생형 및 인간화 IL-4Ra (Il4ra hu/hu ) 마우스는 B(CD19+, CD3-) 및 T (CD19-, CD3+) 세포의 표면에 유사한 양의 IL-4Rα 단백질을 발현한다.
도 4(좌측)에 나타낸 바와 같이, 야생형(Il4ra +/+ ) 마우스는, 마우스(그러나, 인간은 아님) IL-4에 반응하고, 마우스 및 인간 IL-13 둘 다에 반응한다. 도 4(우측)에 나타낸 바와 같이, 인간화 IL-4Rα (Il4ra hu/hu ) 마우스는 인간(그러나, 마우스는 아님) IL-4에 반응하고, 마우스 및 인간 IL-13 둘 다에 반응한다.
이러한 데이터는 IL-4(그러나, IL-13은 아님)가 야생형 및 인간화 IL-4Ra(Il4ra hu/hu ) 마우스에서 종 특이성을 나타낸다는 것을 보여준다.
도 5에 나타낸 바와 같이, IgE 클래스 전환 을 매개하는 주요 인자로서의 IL-4 의 역할은 인간화 IL-4Rα (Il4ra hu/hu ) 마우스로의 마우스 IL-25 유전자 전달 후 순환 IgE의 수준의 상승의 결여 에 의해 뒷받침되었다.
두필루맙 단일클론 항체를 시험관 내 및 생체 내에서 평가하였다.
도 6에 나타낸 바와 같이, 두필루맙은 인간화 IL-4Rα (Il4ra hu/hu ) 마우스-유래 일차 B 세포 배양물에서 인간 IL-4로 유도된 IgE 생성을 방지한다.
도 7에 나타낸 바와 같이, 두필루맙은 10 mg/kg 이상(25 mg/kg은 점액 병리를 감소시켰음)에서 IL-25로 유도된 폐 병리를 용량 의존적으로 감소시켰다.
결론
이러한 결과는 사이토카인으로 유도된 염증을 갖는 유전적으로 변형된 마우스 모델에서 완전한 인간 항-인간 IL-4Rα 단일클론 항체인 두필루맙의 약리학적 활성을 입증하는 것이다.
인간 IL-4 및/또는 IL-4Rα 유전자 치환을 갖는 유전적으로 변형된 마우스의 생성은 제한된 종간 교차 반응성을 갖는 항체 후보의 유전자 오소로그 및 생체 내 효능의 기능을 평가하기 위한 강력한 툴을 제공한다.
실시예 5
집 먼지 진드기 추출물(HDM)로 유도된 폐 염증모델
이중 인간화 IL-4 및 IL-R4α 마우스에서 만성 기도 염증은 집 먼지 진드기(HDM) 추출물(Greer laboratories)의 비강 챌린지에 의해 유도된다. 간략하게, 마우스를 먼저 10일 간 HDM 현탁액(2.5 μg/mL 용량으로 20 μL)의 비강 적하로 감작시켰다. 2주 간격의 분리 후, 5 및 12주 사이에 주 당 3회 비강 HDM 적용으로 마우스를 다시 챌린징한다. 두필루맙(항-IL4Rα 항체)으로의 치료를 주당 2회의 빈도로 7주째부터 피하 주사로 시작하여 12주에서의 실험의 종료시까지 계속하였다. 추가의 분석을 위해 조직 시료를 수집하였다. 실험 설계는 도 8에 도시되어 있다.
이중 인간화 IL-4 및 IL-4Rα 마우스를 이용한 HDM으로 유도된 기도 염증 모델에서 두필루맙의 치료적 효능의 입증
전술된 프로토콜을 사용하여 이중 인간화 IL-4 및 IL-4Rα (IL-4 hu/hu /IL-4R hu/hu ) 마우스에서 기도 질환을 유도하였다. 폐 조직의 조직학적 분석은 비강 HDM 적하가 기도에서 증가된 점액의 생성을 유발한 것을 보여주었다. 두필루맙 치료는 HDM 챌린지 마우스에서 점액 축적을 감소시켰다. 기관지 폐포 세척액(BALF)에서 침윤 세포의 분석은 호산구 수가 HDM 적하에 의해 증가하였고 두필루맙 치료에 의해 감소하였다는 것을 나타낸다. 총 순환 IgE는 인간화 마우스에서 HDM의 처리에 의해 증가하였는데, 이는 양호한 IL-4 신호 전달 경로를 시사하는 것이다. 두필루맙의 사용은 IgE의 수준을 감소시킬 수 있었다. 반대로, IL-4 신호 전달의 방해 없이 IL-13에만 길항하는 경쟁 분자인 IL13R2a-Fc는 점액 축적의 감소 및 호산구 침윤의 방지에서 비견할 만한 활성을 가졌다. 두말할 나위 없이, 두필루맙과 IL-13 길항제인 IL13R2a-Fc 사이에 순환 IgE 수준에서 차등 효과가 검출되었다. IL-13 경로의 차단만으로는 HDM으로 유도된 IgE 수준을 감소시키는 데 충분하지 않았지만; 두필루맙은 IL-4 및 IL-13 경로 둘 다를 차단함으로써 알러지의 주요 병리 매개체인 IgE의 생성을 감소시켰다.
별도 세트의 실험에서, 상이한 대조군이 사용되었다는 것을 제외하고는, 전술된 동일한 프로토콜을 사용하여 이중 인간화 IL-4 및 IL-4Rα (IL-4 hu/hu /IL-4R hu/hu ) 마우스에서 기도 질환을 유도하였다. 두필루맙과 동일한 IgG 이소형의 이소형 대조군 항체가 이러한 실험에 사용되었다. 실험 설계는 도 9에 도시되어 있다. Dynabeads mRNA 키트(Life Tech)를 사용하여 총 RNA로부터 mRNA를 분리하였고, Scriptseq RNA Library Prep 키트(Illumina)를 사용하여 mRNA로부터 가닥 특이적 RNA-Seq 라이브러리를 준비하였다. 라이브러리를, 33bp의 판독 길이로 HiSeq 2000(Illumina)을 사용하여 시퀀싱하였고, Clcbio(Qiagen) RNA-Seq 워크플로우를 사용하여 미처리 판독물로부터 유전자 발현 수준을 추출하였다. 실험군 간 차등 발현된 유전자를 스튜던트 t 검정(p<0.05, 배율 변화 ≥1.5)을 사용하여 식별하였다. GeneSpring GX7.3으로부터의 피어슨(Pearson) 상호연관 클러스터링 알고리즘을 사용하여 이러한 유전자의 발현 클러스터를 생성하였다. HDM은 이중 인간화 IL-4 및 IL-4Ra 마우스에서 폐 유전자 발현에서의 변형을 유도하는 것으로 확인되었고, 이러한 변형은 두필루맙에 의해 차단되었다. 치료 기간의 종료 후 안락사된 마우스로부터 혈청 시료를 수집하였다. 혈청 쥐과 IgE 수준을, 상업적 ELISA 키트(R & D systems)을 사용하여 측정하였다. 통계적 분석을 보통의 일원 ANOVA 방법을 사용하여 수행하였다.
실시예 6
항원으로 유도된 피부 염증모델
다음의 절차에 따라 이중 인간화 Il-4 및 Il-4Rα 마우스에서 만성 피부 염증을 유도할 수 있다. 인간화 마우스의 뒷머리를 전기 클리퍼로 면도한 다음, 접착 테잎으로 벗겨내, 작은 손상을 생성하고 피부 장벽을 깨뜨린다. 알러지원(박테리아 독소 또는 집 먼지 진드기 추출물이 더해진 오브알부민)의 용액으로 적셔진 거즈 패치를 일 주일간 피부에 부착한 다음 2주간의 분리 기간이 이어졌다. 이러한 절차를 총 7주간 3회 반복하여 피부 병변과 같은 아토피성 피부염을 유도한다. 처리된 마우스는 증가된 IgE 수준, 소양증, 진피층의 비후화, 아토피성 피부염의 통상적인 증상을 가질 것이다.
실시예 7
인간화 IL-4Rα를 발현하는 마우스에서 항-인간 IL-4Rα 항체의 PK 프로파일 특성분석
본 실시예는 REGN 668("두필루맙"으로도 알려진 인간 IL-4Rα에 대하여 유도된 인간 단일클론 항체) 및 대조군 항체 REGN646(원숭이 대용체, 항-mfIL-4R 미결합 대조군 항체)의 PK 프로파일을 평가하기 위해 수행한 실험을 기술한다.
이러한 실험에 사용된 마우스는 20 내지 23주의 MAID 1444(IL-4Rα 엑토도메인이 인간이고 막관통 및 세포질 영역이 마우스인, 인간화 IL-4Rα, 또는 "IL-4Rα HumIn"에 대해 동형접합성) 및 주 매치(75% C57BL/6/25%129Sv) 야생형("WT") 마우스였다. 연구군은 5마리의 동형접합성 및 5마리의 주 매치 WT의 약물/용량 코호트 크기를 갖는 수컷 및 암컷 총 40마리의 마우스를 포함하였다. 항체(PBS 완충액 내)를 10 mg/kg의 피하 주사를 통해 마우스에 제공하였다. 주사 당일(시점"0" 또는 0일), 주사 6시간 후, 및 1일, 3일, 7일, 10일, 14일, 21일, 및 30일에 각각 분석을 위한 혈액 시료를 취득하였다.
순환 약물(즉, REGN668 또는 REGN646) 수준을 ELISA 면역검정을 사용한 총 인간 항체 분석에 의해 결정하였다. 간략하게, 염소 항-인간 IgG 다중클론 항체(Jackson ImmunoResearch, #109-005-098)를 96-웰 플레이트에 코팅하여 혈청 내 시험한 인간 항체를 포획한 다음, 플레이트에 결합된 항체를 호스래디시 페록시다제에 접합된 염소 항-인간 IgG 다중클론항체(Jackson ImmunoResearch, #109-035-098) 및 TMB 기질(BD Pharmingen)을 사용하여 검출하였다. 혈청 시료는 1:100~1:243,000 범위인 시료 당 6개의 용량 계대 희석액이었고, 각각의 항체의 참조 표준은 12-용량 계대 희석액이었다. 혈청 내 약물 항체 농도를 Graphpad Prism 소프트웨어를 사용해 생성된 참조 표준 곡선에 기반하여 계산하였다.
REGN 668의 반감기는 마우스 IL-4Rα 단백질만 갖는 야생형 마우스에 비하여 IL-4Rα HumIn 마우스에서 단축되는 것으로 밝혀졌다. PK 프로파일에서의 이러한 차이는 표적 매개 상호작용 및 단일클론 항체 및 인간 IL-4α 수용체 사이의 제거에 의해 설명할 수 있다. 따라서, 인간 또는 인간화 IL-4Rα를 발현하는 마우스는 전임상 마우스 모델에서 항-인간 IL-4Rα 항체(예를 들어, 두필루맙)의 PK 특성을 특성분석하기 위한 적합한 시뮬레이션을 제공한다.
인간화 IL-4 및/또는 IL-4Rα 마우스를 위한 용도
인간화 IL-4 및/또는 IL-4Rα는 인간-특이적 IL-4 및/또는 IL-4Rα 길항제, 예를 들어, 중화 항-IL-4 및/또는 항-IL-4Rα 항체, 예를 들어, 두필루맙의 약물동력학(PD)을 평가하는 데 유용하다.
인간화 IL-4 및/또는 IL-4Rα 마우스에서의 약물동력학(PK) 및 PD 검정은 당해 분야에 알려진 표준 절차에 따라 수행된다.
인간화 IL-4 및/또는 IL-4Rα 마우스는 예를 들어, 전술한 바와 같은 당해 분야에 알려진 다양한 질환 모델에서 인간-특이적 IL-4 및/또는 IL-4Rα 길항제, 예를 들어, 중화 항-IL-4 및/또는 IL-4Rα 항체, 예를 들어, 두필루맙의 생체 내 치료적 효능을 시험하는 데 유용하다.
실시예 8
내인성 마우스 IL-33 유전자의 인간 IL-33 유전자로의 치환
마우스 IL-33 유전자(NCBI 유전자 ID: 77125, 일차 공급원: MGI:1924375; RefSeq 전사물: NM_001164724.1; UniProt ID: Q8BVZ5; 게놈 조립: NCBI37/mm9; 위치: chr19:29,999,604-30,035,205 + 가닥)는 8개의 엑손을 갖고 266개의 아미노산의 단백질을 암호화한다(GenBank 등록 번호 NP_001158196.1).
인간 IL-33 유전자(NCBI 유전자 ID: 90865, 일차 공급원: HGNC:16028; RefSeq 전사물: NM_033439.3; UniProt ID: O95760; 게놈 조립: GRCh37/hg19; 위치: chr9:6,215,149-6,257,983 + 가닥)도, 또한, 8개의 엑손을 갖고 270개의 아미노산의 단백질을 암호화한다(GenBank 등록 번호 NP_254274.1).
인간 IL-33 유전자의 ATG 개시 코돈으로부터 시작하는 엑손 2 내지 엑손 8(3' 미번역 영역을 포함함)을 포함하는 16333bp 인간 게놈 세그먼트로 ATG 개시 코돈에서부터 시작하는 엑손 2에서부터 중지 코돈을 포함하는 엑손 8의 코딩 부위에 걸친 9381 bp의 마우스 IL-33 유전자 유전좌위를 치환하였다. 도 10a 참조.
마우스 및 인간 IL-33 DNA가, 각각 박테리아 인공 염색체(BAC) 클론 bMQ-350I18 및 CTD-3015M15로부터 수득되고, 표적 벡터가 loxP 네오마이신 선택 카세트를 포함한 것을 제외하고는, 마우스 IL-4 유전자를 인간 IL-4 게놈 세그먼트로 치환하기 위한 위의 실시예 1에 기술된 절차와 유사하게 VelociGene® 유전자 조작 기술(Valenzuela et al. (2003) High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, Nature Biotech, 21(6):652-659 참조)을 사용하여 단일 표적화 단계로 마우스 IL-33 유전자를 인간 IL-33 게놈 세그먼트로 치환하기 위한 표적 컨스트럭트를 제작하였다(도 10b).
정확하게 표적화된 ES 세포 클론(MAID 7060)을, 결실에 대해 표적화된 마우스 IL-33 유전자 내 서열에 특이적인 2종의 TaqMan™ 정량적 중합효소 연쇄 반응(qPCR)에 의해 원래의 미변형 IL-33 유전자의 카피 수가 결정되는 원래의 대립형질의 소실(LONA) 검정(Valenzuela et al., (2003))에 의해 식별하였다. qPCR 검정은 다음의 프라이머-프로브 세트를 포함하였다(5'에서 3'으로 기재됨):
상류("mTU"):
정방향 프라이머, TTGGACTAGTAACAAGAAGGGTAGCA (서열 번호 31);
역방향 프라이머, CCTTTCCCATCACCCTCTAACTT (서열 번호: 32);
프로브 (MGB), AGCTCTGGTGGACAGA (서열 번호 33);
하류("mTD"):
정방향 프라이머, TCTCTGCCAAGCTGCTTATCC (서열 번호 34);
역방향 프라이머, GGCTGCATGGAAGAGGTGAA (서열 번호 35);
프로브(MGB), CTCTCCACAAATCG (서열 번호 36).
인간화 대립형질에서 인간 IL-33 유전자 서열로 마우스 IL-33 유전자 서열을 치환한 확인은 다음의 프라이머-프로브 세트(5'에서 3'으로 기재됨)를 포함하는 TaqMan™ qPCR 검정에서 확인하였다:
상류("hTU")
정방향 프라이머, CAGGCAGGAATAGCTGAGATAATCT (서열 번호 37);
역방향 프라이머, TGTGGAGCAAAAAGTGGTTGAT (서열 번호 38);
프로브(MGB), CCTGTGAATAGTGATAAAC (서열 번호 39);
하류("hTD"):
정방향 프라이머, CAGTTCCAAACGATAGGCTCAA (서열 번호 40);
역방향 프라이머, ATAATTCTGTGAAGCATCTGGTCTTC (서열 번호 41);
프로브(MGB), CTAGAGCTGCTAGTAAAA (서열 번호 42).
쥐과 IL-33 유전좌위와 인간 IL-33 유전자를 함유하는 서열의 상류 접합점(도 10b에 "I"로 나타냄)이 5'- ATAGCCAAGG TTGCTTCTGA TGACTTCAGG TCCATATAGT TGGATTAATG TTATATTTCA ATCCCACAGA AACCTGAAAA ATG AAGCCTA AAATGAAGTA TTCAACCAAC AAAATTTCCA CAGCAAAGTG GAAGAACACA GCAAGCAAAG CCTTGTGTTT -3'(서열 번호 43) 내에 설계되며, 인간 IL-33 서열은 이탤릭체로 나타내고, 인간 시작 코돈 ATG에는 밑줄이 쳐져 있다. 인간 IL-33 게놈 서열을 함유하는 서열과 loxP 네오마이신 선택 카세트의 하류 접합점(도 10b에 "II"로 나타냄)은 5'- TTTATATTAT TGAATAAAGT ATATTTTCCA AATGTATGTG AGACTATAAT GATTTTATCA TATGATGACT CAATATTCTG/CTCGAGATAA CTTCGTATAA TGTATGCTAT ACGAAGTTAT ATGCATGGCC TCCGCGCCGG GTTTTGGCGC CTCCCGCGGG -3'(서열 번호 44) 내에 설계되며, 인간 IL-33 서열은 이탤릭체로 나타내고, 접합점은 "/" 기호로 나타내고, lox P 자리에는 밑줄이 쳐져 있다. loxP neo 선택 카세트의 서열과 쥐과 IL-33 유전자위의 하류 접합점(도 10c에 "III"로 나타냄)은 5'- AGCCCCTAGA TAACTTCGTA TAATGTATGC TATACGAAGT TATGCTAGTA ACTATAACGG TCCTAAGGTA GCGAGCTAGC/CGCCTGTGCG TTCTGGGTTG AATGACTTAA TGCTTCCAAC TGAAGAAAGG GTAACAGAGA GAAAGAAAGC CATTCTTGGC-3' (서열 번호 45) 내에 설계되며, 접합점은 "/" 기호로 나타내고 loxP 자리에는 밑줄이 쳐져 있다.
정확하게 표적화된 ES 세포(MAID 7060)에 일시적 Cre-발현 벡터를 추가로 전기천공하여 약물 선택 카세트를 제거하고, 약물 카세트가 없는 ES 세포 클론(MAID 7061)을 수득하였다. 이러한 MAID 7061 ES 세포(도 18c에 "I"로 나타냄)의 상류 접합점은 MAID 7060 ES 세포에서와 동일하다. 하류 접합점(도 18c에 "II"로 나타냄)은 5'- TTTATATTAT TGAATAAAGT ATATTTTCCA AATGTATGTG AGACTATAAT GATTTTATCA TATGATGACT CAATATTCTG/CTCGAGATAA CTTCGTATAA TGTATGCTAT ACGAAGTTAT GCTAGTAACT ATAACGGTCC TAAGGTAGCG AGCTAGC/CGCCTGTGCG TTCTGGGTTG AATGACTTAA TGCTTCCAAC TGAAGAAAGG GTAACAGAGA GAAAGAAAGC CATTCTTGGC--3'(서열 번호 46) 내에 설계되며, 3' 인간 IL-33 서열은 첫번째 "/" 기호 전에 이탤릭체로 나타나 있고, 마우스 IL-33 3' 서열은 두번째 "/" 기호 후에 이탤릭체로 나타나 있고, loxP 자리에는 밑줄이 쳐져 있다.
정확하게 표적화된 ES 세포(MAID 7060 또는 MAID 7061)는 VelociMouse® 방법에 의해 8-세포기 SW 마우스 배아 내에 도입되었다(미국 특허 번호 7,294,754, 7,576,259, 7,659,442, 및 Poueymirou et al. (2007) F0 generation mice that are essentially fully derived from the donor gene-targeted ES cells allowing immediate phenotypic analyses, Nature Biotech. 25(1):91-99 참조). 인간화 IL-33 유전자를 지니는 VelociMice®(완전히 공여자 ES 세포로부터 유래된 F0 마우스)를 대립형질 검정의 변형을 사용하여 마우스 대립형질의 소실 및 인간 대립형질의 획득에 대한 유전자형 분석으로 식별하였다(Valenzuela et al. (2003) 참조). IL-33 유전자형을 결정하고, 인간화 IL-33 대립형질이 생식계열을 통해 전달되었는지를 확인하기 위해, 동일한 LONA 검정을 사용하여 표적화 ES 세포로부터 유래된 마우스의 꼬리 생검으로부터 정제된 DNA를 검정하였다. 치환에 대해 이형접합체인 2마리의 새끼를 교배하여 인간 IL-33 유전자에 의한 내인성 마우스 IL-33 유전자의치환에 대해 동형접합성인 마우스를 생성하였다.
SEQUENCE LISTING
<110> Wang, Li-Hsien
Xue, Yingzi
Murphy, Andrew J.
Stevens, Sean
<120> HUMANIZED IL-4 AND IL-4Ra ANIMALS
<130> 31260 (T0029)
<150> 61/989,757
<151> 2014-05-07
<160> 46
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 1
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<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 2
gacccctcag gtccacttac c 21
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<220>
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<222> (1)..(1)
<223> Labled with FAM: 5-carboxyfluorescein fluorescent prob
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(25)
<223> Labled with BHQ: fluorescence quencher of the black hole quencher
type
<400> 3
aacgtcctca cagcaacga 19
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<211> 19
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 4
gtgcccaggt gtgctcatg 19
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<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 5
cgcctgcctc ctcactttat c 21
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<211> 19
<212> DNA
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<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<220>
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<222> (1)..(1)
<223> Labled with FAM: 5-carboxyfluorescein fluorescent probe
<220>
<221> misc_feature
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<223> Labled with BHQ: fluorescence quencher of the black hole
quencher
type
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atctgcttca ccatccact 19
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<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 7
gcctggacca agactctgt 19
<210> 8
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 8
accgtgggac ggcttcttac 20
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<220>
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<222> (1)..(1)
<223> Labled with FAM: 5-carboxyfluorescein fluorescent probe
<220>
<221> misc_feature
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<223> Labled with BHQ: fluorescence quencher of the black hole quencher
type
<400> 9
caccgagttg accgtaacag acatc 25
<210> 10
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 10
tgcggccgat cttagcc 17
<210> 11
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 11
ttgaccgatt ccttgcgg 18
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<220>
<221> misc_feature
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<223> Labled with FAM: 5-carboxyfluorescein fluorescent probe
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(21)
<223> Labled with BHQ: fluorescence quencher of the black hole quencher
type
<400> 12
acgagcgggt tcggcccatt c 21
<210> 13
<211> 458
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Nucleic acid sequence containing the upstream junction of Murine
IL4 Locus and Human IL4 sequence
<400> 13
tgctgattgg cccagaataa ctgacaatct ggtgtaataa aattttccaa tgtaaactca 60
ttttcccttg gtttcagcaa ctttaactct atatatagag agacctctgc cagcattgca 120
ttgttagcat ctcttgataa acttaattgt ctctcgtcac tgacggcaca gagctattga 180
tgggtctcac ctcccaactg cttccccctc tgttcttcct gctagcatgt gccggcaact 240
ttgtccacgg acacaagtgc gatatcacct tacaggagat catcaaaact ttgaacagcc 300
tcacagagca gaaggtgagt acctatctgg caccatctct ccagatgttc tggtgatgct 360
ctcagtattt ctaggcatga aaacgttaac agctgctaga gaagttggaa ctggtggttg 420
gtggcagtcc agggcacaca gcgaggcttc tcccctgc 458
<210> 14
<211> 565
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Nucleic acid sequence containing the downstream junction of Human
IL4 sequence and floxed hygo selection cassett
<400> 14
tgtttatttt gcagaattcc tgtcctgtga aggaagccaa ccagagtacg ttggaaaact 60
tcttggaaag gctaaagacg atcatgagag agaaatattc aaagtgttcg agctgaatat 120
tttaatttat gagtttttga tagctttatt ttttaagtat ttatatattt ataactcatc 180
ataaaataaa gtatatatag aatctaacag caatggcatt taatgtattg gctatgttta 240
cttgacaaat gaaattatgg tttgcaactt ttagggaaat caatttagtt taccaagaga 300
ctataaatgc tatgggagca aaacaggaaa gaccacttcc ccctcgaggg gttccctctc 360
gagttaggga cataacacac aagataatta aagaacacaa ggccatacaa gatgcggccg 420
caccggtata acttcgtata aggtatccta tacgaagtta tatgcatggc ctccgcgccg 480
ggttttggcg cctcccgcgg gcgcccccct cctcacggcg agcgctgcca cgtcagacga 540
agggcgcagc gagcgtcctg atcct 565
<210> 15
<211> 438
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Nucleic acid sequence containing the downstream junction of
floxed hygo selection cassett and Murine IL-4 locus
<400> 15
tgccaagttc taattccatc agacctcgac ctgcagccgg cgcgccataa cttcgtataa 60
ggtatcctat acgaagttat ctcgagagga gttcccaccc ttctcaagag cataatgcgc 120
agatcattaa gggacagatg caggctgggg agacggttca gcagttagga gtacctgttg 180
ctcttccaga ggacccaggt tcaattcccg gcactcacat agcagcttaa aacaataact 240
caagttctgg gggagctgat gctctcctct ggcctcctgt ggaggtacac agaccacatg 300
cctgtaggca agacacccac acacataaaa acaaaataaa ataaggatag aaaggccagg 360
gggatgaatc cagaggtaga agaaaactta ttccctggaa ttgtcctctg actcccctcc 420
caaaacctct aacacgca 438
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 16
ccgctggcat gtgtattgtg 20
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 17
tgagtgtggg accctcaaga g 21
<210> 18
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Labled with FAM: 5-carboxyfluorescein fluorescent probe
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(24)
<223> Labled with BHQ: fluorescence quencher of the black hole quencher
type
<400> 18
tgacccaagc cctacatggc cact 24
<210> 19
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 19
tgaggagagc tcacgggaat c 21
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 20
acccatctcc tgcgtttctg 20
<210> 21
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Labled with FAM: 5-carboxyfluorescein fluorescent probe
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(25)
<223> Labled with BHQ: fluorescence quencher of the black hole quencher
type
<400> 21
ttgacacgcc agctacactg ctcca 25
<210> 22
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 22
acctgcgtct ccgactacat g 21
<210> 23
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 23
gagctcggtg ctgcaattg 19
<210> 24
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Labled with FAM: 5-carboxyfluorescein fluorescent probe
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(25)
<223> Labled with BHQ: fluorescence quencher of the black hole quencher
type
<400> 24
tgggaccatt catcttccac tcgca 25
<210> 25
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 25
ggtggagagg ctattcggc 19
<210> 26
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 26
gaacacggcg gcatcag 17
<210> 27
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Labled with FAM: 5-carboxyfluorescein fluorescent probe
<220>
<221> misc_feature
<222> (23)..(23)
<223> Labled with BHQ: fluorescence quencher of the black hole quencher
type
<400> 27
tgggcacaac agacaatcgg ctg 23
<210> 28
<211> 243
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Portion of Murine IL-4Ralpha locus and sequence containing
IL-4Ralpha gene
<400> 28
tgggggaggg aggccatgac acaaatgaaa tggaccccgc tgacccagga tcagcatctg 60
cccactcttc tttctgcagg caccttttgt gtccccaatg gggtggcttt gctctgggct 120
cctgttccct gtgagctgcc tggtcctgct gcaggtggca agctctggta agtcaccact 180
tctcaatcat tcatttgttg gctattaatg gcgtgccagg gtcctgcagt atgtcacctg 240
gcc 243
<210> 29
<211> 243
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Nucleic acid sequence containing the downstream junction of Human
IL-4Ralpha sequence and floxed neo selection cassett
<400> 29
gtcagatcgt ggagggtctc ggacgagggt cctgaccctg ggtctccagt cctgggaagt 60
ggagcccagg ctgtaccatg gctgacctca gctcatggct cccgggctcg ataactataa 120
cggtcctaag gtagcgactc gagataactt cgtataatgt atgctatacg aagttatatg 180
catggcctcc gcgccgggtt ttggcgcctc ccgcgggcgc ccccctcctc acggcgagcg 240
ctg 243
<210> 30
<211> 390
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Portion of the sequence of the floxed neo selection cassett and
the Murine IL-4Ralpha locus
<400> 30
tattgttttg ccaagttcta attccatcag acctcgacct gcagccccta gataacttcg 60
tataatgtat gctatacgaa gttatcctag gttggagctc tctgtagcca ggtaaccaag 120
ggtcccaggg gaacccccag tgtggacgcg gactgcacat gacacagggc ggcctcccca 180
ttcatgactg tttttctcct tgcagacttc cagctgcccc tgatacagcg ccttccactg 240
ggggtcacca tctcctgcct ctgcatcccg ttgttttgcc tgttctgtta cttcagcatt 300
accaagtgag ttcctgcttt ggctggtgtc tctggctggc ccttcagcag tgctctcaga 360
ggtcacagtc attgtgctgg ctgagaaaag 390
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ttggactagt aacaagaagg gtagca 26
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atagccaagg ttgcttctga tgacttcagg tccatatagt tggattaatg ttatatttca 60
atcccacaga aacctgaaaa atgaagccta aaatgaagta ttcaaccaac aaaatttcca 120
cagcaaagtg gaagaacaca gcaagcaaag ccttgtgttt 160
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<400> 44
tttatattat tgaataaagt atattttcca aatgtatgtg agactataat gattttatca 60
tatgatgact caatattctg ctcgagataa cttcgtataa tgtatgctat acgaagttat 120
atgcatggcc tccgcgccgg gttttggcgc ctcccgcggg 160
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agcccctaga taacttcgta taatgtatgc tatacgaagt tatgctagta actataacgg 60
tcctaaggta gcgagctagc cgcctgtgcg ttctgggttg aatgacttaa tgcttccaac 120
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<400> 46
tttatattat tgaataaagt atattttcca aatgtatgtg agactataat gattttatca 60
tatgatgact caatattctg ctcgagataa cttcgtataa tgtatgctat acgaagttat 120
gctagtaact ataacggtcc taaggtagcg agctagccgc ctgtgcgttc tgggttgaat 180
gacttaatgc ttccaactga agaaagggta acagagagaa agaaagccat tcttggc 237
Claims (53)
- 내인성 설치류 IL-4R 유전자의 인간화를 포함하는 설치류에 있어서, 상기 인간화가 변형된 IL-4 유전자를 형성하기 위해 IL-4 유전자의 엑손을 포함하는 설치류 핵산의 내인성 설치류 IL-4 유전좌위(locus)에서의 인간 IL-4 유전자의 적어도 하나의 엑손을 포함하는 핵산 서열로의 치환을 포함하고, 상기 변형된 IL-4 유전자의 발현은 상기 내인성 설치류 IL-4 유전좌위의 설치류 조절 요소의 조절 하에 있는, 설치류.
- 제1항에 있어서, 상기 설치류가 마우스 또는 랫트인, 설치류.
- 제1항에 있어서, 상기 변형된 IL-4 유전자가 인간 또는 인간화 IL-4 단백질을 암호화하고, 상기 인간 IL-4 유전자의 ATG 개시 코돈으로부터 시작하는 엑손 1 내지 엑손 4를 포함하는, 설치류.
- 제1항에 있어서, 상기 설치류가 마우스 IL-4 단백질을 발현할 수 없는 마우스인, 설치류.
- 제1항에 있어서, 상기 설치류가 내인성 마우스 IL-4Rα 유전자에 의해 암호화된 마우스 IL-4Rα 단백질을 발현하는 마우스인, 설치류.
- 제1항에 있어서, 상기 설치류가 인간 또는 인간화 IL-4Rα 단백질을 발현하는 마우스인, 설치류.
- 제6항에 있어서, 상기 인간화 IL-4Rα 단백질이 상기 인간 IL-4Rα 단백질의 엑토도메인을 포함하는, 마우스.
- 제7항에 있어서, 상기 인간화 IL-4Rα 단백질이 상기 마우스 IL-4Rα 단백질의 막관통 도메인 및 세포질 도메인을 포함하는, 마우스.
- 제6항에 있어서, 상기 마우스가 변형된 IL-4Rα 유전자를 형성하기 위해 마우스 IL-4Rα 유전자의 엑손을 포함하는 마우스 핵산의 내인성 마우스 IL-4Rα 유전좌위에서의 인간 IL-4Rα 유전자의 적어도 하나의 엑손을 암호화하는 핵산 서열로의 치환을 포함하고, 상기 변형된 IL-4Rα 유전자의 발현이 상기 내인성 마우스 IL-4Rα 유전좌위의 마우스 조절 요소의 조절 하에 있는, 마우스.
- 제1항에 있어서, 상기 설치류가 마우스이고, 마우스 IL-4의 ATG 개시 코돈으로부터 시작하는 엑손 1 내지 엑손 4를 포함하는 마우스 IL-4 서열의 인접 게놈 단편이 인간 IL-4의 ATG 개시 코돈으로부터 시작하는 엑손 1 내지 엑손 4를 포함하는 인간 IL-4 서열의 인접 게놈 단편으로 치환된, 설치류.
- 제1항에 있어서, 상기 설치류가 기능적 내인성 마우스 IL-4 단백질을 발현하지만, 상기 치환을 포함하지 않는 연령이 맞는 마우스의 혈청 내 존재하는 마우스 IL-4 단백질 수준의 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190% 또는 200%의 농도로 혈청 내에 인간 또는 인간화 IL-4 단백질을 발현하는 마우스인, 설치류.
- 제1항에 있어서, 상기 설치류가 기능적 내인성 IL-4 단백질을 발현하지만, 상기 치환을 포함하지 않는 연령이 맞는 마우스의 혈청 내 존재하는 마우스 IL-4 단백질 수준의 약 10% 내지 약 200%, 약 20% 내지 약 150%, 또는 약 30% 내지 약 100%의 농도로 혈청 내에 인간 IL-4 단백질을 발현하는 마우스인, 설치류.
- 내인성 설치류 IL-4Rα 유전자의 인간화를 포함하는 설치류에 있어서, 상기 인간화가 인간화 IL-4Rα 유전자를 형성하기 위해 설치류 IL-4Rα 유전자의 엑손을 포함하는 설치류 핵산의 내인성 설치류 IL-4Rα 유전좌위에서의 인간 IL-4Rα 유전자의 적어도 하나의 엑손을 포함하는 핵산 서열로의 치환을 포함하고, 상기 인간화 IL-4Rα 유전자의 발현이 상기 내인성 설치류 IL-4Rα 유전좌위의 설치류 조절 요소의 조절 하에 있는, 설치류.
- 제13항에 있어서, 상기 설치류가 마우스 또는 랫트인, 설치류.
- 제13항에 있어서, 상기 인간화 IL-4Rα 유전자가 인간 또는 인간화 IL-4Rα 단백질을 암호화하고, 상기 인간 IL-4Rα 유전자의 ATG 개시 코돈으로부터 시작하는 엑손 1 내지 엑손 5를 포함하는, 설치류.
- 제13항에 있어서, 상기 설치류가 마우스 IL-4Rα 단백질을 발현할 수 없는 마우스인, 설치류.
- 제13항에 있어서, 상기 설치류가 내인성 마우스 IL-4 유전자에 의해 암호화된 마우스 IL-4 단백질을 발현하는 마우스인, 설치류.
- 제17항에 있어서, 상기 설치류가 인간 또는 인간화 IL-4 단백질을 발현하는 마우스인, 마우스.
- 제18항에 있어서, 상기 마우스가 변형된 IL-4 유전자를 형성하기 위해 마우스 IL-4 유전자의 엑손을 포함하는 마우스 핵산의 내인성 마우스 IL-4 유전좌위에서의 인간 IL-4 유전자의 적어도 하나의 엑손을 포함하는 핵산 서열로의 치환을 포함하고, 상기 변형된 IL-4 유전자의 발현이 상기 내인성 마우스 IL-4 유전좌위의 마우스 조절 요소의 조절 하에 있는, 마우스.
- 제13항에 있어서, 상기 설치류가 마우스이고, IL-4Rα의 ATG 개시 코돈으로부터 시작하는 엑손 1 내지 엑손 5를 포함하는 마우스 IL-4Rα 서열의 인접 게놈 단편이 인간 IL-4Rα의 ATG 개시 코돈으로부터 시작하는 엑손 1내지 엑손 5를 포함하는 인간 IL-4Rα 서열의 인접 게놈 단편으로 치환된, 설치류.
- 제13항에 있어서, 상기 설치류가 기능적 내인성 마우스 IL-4Rα 단백질을 발현하지만 상기 치환을 포함하지 않는 연령이 맞는 마우스의 B 및/또는 T 세포인 면역 세포 상에 존재하는 마우스 IL-4Rα 단백질 수준의 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190% 또는 200%의 양으로 B 및/또는 T 세포인 면역 세포 상에 인간 또는 인간화 IL-4Rα 단백질을 발현하는 마우스인, 설치류.
- 제13항에 있어서, 상기 설치류가 기능적 내인성 마우스 IL-4Rα 단백질을 발현하지만, 상기 치환을 포함하지 않는 연령이 맞는 마우스의 B 및/또는 T 세포인 면역 세포 상에 존재하는 마우스 IL-4Rα 단백질 수준의 약 10% 내지 약 200%, 약 20% 내지 약 150%, 또는 약 30% 내지 약 100%의 양으로 B 및/또는 T 세포인 면역 세포 상에 인간 또는 인간화 IL-4Rα 단백질을 발현하는 마우스인, 설치류.
- 설치류 IL-4 핵산 서열을 인간 IL-4 유전자의 하나 이상의 엑손을 포함하는 인간 IL-4 핵산 서열로 치환하여 인간 또는 인간화 IL-4 단백질을 암호화하는 변형된 IL-4 유전자를 형성하는 단계를 포함하는, 인간화 설치류를 제조하는 방법으로서, 상기 치환이 내인성 설치류 IL-4 유전좌위에서 일어나고, 상기 인간 IL-4 유전자 서열의 하나 이상의 엑손을 포함하는 상기 변형된 IL-4 유전자 서열이 상기 내인성 설치류 IL-4 유전좌위의 설치류 조절 요소 또는 서열에 작동가능하게 연결되는, 방법.
- 제23항에 있어서, 상기 설치류가 마우스 또는 랫트인, 방법.
- 제23항에 있어서, 상기 설치류 조절 요소 또는 서열이 마우스 또는 랫트로부터 유래되는, 방법.
- 제23항에 있어서, 상기 설치류 조절 요소 또는 서열이 상기 설치류 IL-4 유전좌위의 내인성 설치류 조절 요소 또는 서열인, 방법.
- 제23항에 있어서, 상기 설치류 IL-4 핵산 서열을 치환하는 상기 인간 IL-4 핵산 서열이 상기 인간 IL-4 유전자 서열의 적어도 하나의 엑손을 포함하는, 방법.
- 제27항에 있어서, 상기 설치류 IL-4 핵산 서열을 치환하는 상기 인간 IL-4 핵산 서열이 상기 인간 IL-4 유전자 서열의 적어도 2개 또는 적어도 3개의 엑손을 포함하는, 방법.
- 제28항에 있어서, 상기 설치류 IL-4 핵산 서열을 치환하는 상기 인간 IL-4 핵산 서열이 상기 인간 IL-4 유전자 서열의 4개의 엑손 모두를 포함하는, 방법.
- 제23항에 있어서, 상기 치환은 내인성 설치류 IL-4 유전좌위에서 일어나고, 상기 인간 IL-4 유전자 서열의 하나 이상의 엑손을 포함하는 상기 인간 IL-4 핵산 서열이 상기 내인성 설치류 IL-4 유전좌위의 내인성 설치류 조절 요소 또는 서열에 작동가능하게 연결되는, 방법.
- 마우스 IL-4 핵산 서열을 인간 IL-4 핵산으로 치환하여 인간 또는 인간화 IL-4 단백질을 암호화하는 변형된 IL-4 유전자를 형성하는 단계를 포함하는, 인간화 IL-4 마우스의 제조 방법.
- 제31항에 있어서, 상기 치환이 내인성 마우스 IL-4 유전좌위에서 일어나고, 인간 또는 인간화 IL-4 단백질을 암호화하는 상기 변형된 유전자가 내인성 마우스 조절 서열에 작동가능하게 연결되는, 방법.
- 제31항에 있어서, 상기 치환이 내인성 마우스 IL-4 유전좌위에서 일어나고, 인간 또는 인간화 IL-4 단백질을 암호화하는 상기 변형된 유전자가 내인성 마우스 조절 서열에 작동가능하게 연결되는, 방법.
- 설치류 IL-4Rα 핵산 서열을 인간 IL-4Rα 유전자 서열의 하나 이상의 엑손을 포함하는 인간 IL-4Rα 핵산 서열로 치환하여 인간 또는 인간화 IL-4Rα 단백질을 암호화하는 변형된 IL-4Rα 유전자를 형성하는 단계를 포함하는 인간화 설치류의 제조 방법으로서, 상기 치환이 내인성 설치류 IL-4Rα 유전좌위에서 일어나고, 인간 또는 인간화 IL-4Rα 단백질을 암호화하는 상기 변형된 IL-4Rα 유전자가 상기 내인성 설치류 IL-4Rα 유전좌위의 설치류 조절 요소 또는 서열에 작동가능하게 연결되는, 방법.
- 제34항에 있어서, 상기 설치류가 마우스 또는 랫트인, 방법.
- 제34항에 있어서, 상기 설치류 조절 요소 또는 서열이 마우스 또는 랫트로부터 유래되는, 방법.
- 제34항에 있어서, 상기 설치류 조절 요소 또는 서열이 상기 설치류 IL-4Rα 유전좌위의 내인성 설치류 조절 요소 또는 서열인, 방법.
- 제37항에 있어서, 상기 설치류 IL-4Rα 유전자 서열을 치환하는 상기 인간 IL-4Rα 유전자 서열이 상기 인간 IL-4Rα 유전자 서열의 적어도 하나의 엑손을 포함하는, 방법.
- 제38항에 있어서, 상기 설치류 IL-4Rα 핵산 서열을 치환하는 상기 인간 IL-4Rα 핵산 서열이 상기 인간 IL-4Rα 유전자 서열의 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8개의 엑손을 포함하는, 방법.
- 제39항에 있어서, 상기 설치류 IL-4Rα 핵산 서열을 치환하는 상기 인간 IL-4Rα 핵산 서열이 상기 인간 IL-4Rα 유전자 서열의 9개의 엑손 모두를 포함하는, 방법.
- 제34항에 있어서, 상기 치환이 내인성 설치류 IL-4Rα 유전좌위에서 일어나고, 인간 또는 인간화 IL-4Rα 단백질을 암호화하는 상기 변형된 IL-4Rα 유전자가 상기 내인성 설치류 IL-4Rα 유전좌위의 내인성 설치류 조절 요소 또는 서열에 작동가능하게 연결되는, 방법.
- 마우스 IL-4Rα의 엑토도메인을 암호화하는 마우스 엑손을 인간 IL-4Rα의 엑토도메인을 암호화하는 인간 게놈 단편으로 치환하여 인간화 IL-4Rα 유전자를 형성하는 단계를 포함하는, 인간화 마우스의 제조 방법.
- 제42항에 있어서, 상기 치환이 내인성 마우스 IL-4Rα 유전좌위에서 일어나고, 상기 인간화 IL-4Rα 유전자가 마우스 조절 서열에 작동가능하게 연결되는, 방법.
- 제42항에 있어서, 상기 치환이 내인성 마우스 IL-4Rα 유전좌위에서 일어나고, 상기 인간화 IL-4Rα 유전자가 내인성 마우스 조절 서열에 작동가능하게 연결되는, 방법.
- 인간화 IL-4Rα 유전자 및 인간화 IL-4 유전자를 포함하는 설치류에 있어서, 상기 인간화 IL-4Rα 유전자가 설치류 IL-4Rα 엑토도메인-코딩 서열의 인간 IL-4Rα 엑토도메인-코딩 서열로의 치환에 기인하고, 상기 인간화 IL-4Rα 유전자는 설치류 IL-4Rα 막관통 도메인 코딩 서열 및 설치류 IL-4Rα 세포질 도메인 코딩 서열을 포함하고, 상기 인간화 IL-4Rα 유전자는 내인성 설치류 IL-4Rα 유전좌위의 내인성 설치류 IL-4Rα 조절 요소의 조절 하에 있고; 상기 인간화 IL-4 유전자가 인간 또는 인간화 IL-4 단백질을 암호화하고, 상기 인간화 IL-4 유전자는 상기 내인성 설치류 IL-4R 유전좌위의 내인성 설치류 IL-4 조절 요소의 조절 하에 있는, 설치류.
- 제45항에 있어서, 상기 설치류가 마우스 또는 랫트인, 설치류.
- 제45항에 있어서, 상기 설치류가 마우스 IL-4 단백질을 발현할 수 없고, 마우스 IL-4Rα 단백질을 발현할 수 없는 마우스인, 설치류.
- 제45항에 있어서, 상기 내인성 설치류 IL-4 유전좌위 및/또는 내인성 설치류 IL-4Rα 유전좌위의 설치류 조절 요소 또는 서열이 마우스 또는 랫트로부터 유래되는, 설치류.
- 제45항에 있어서, 상기 설치류 조절 요소 또는 서열이 상기 설치류 IL-4 유전좌위 및/또는 설치류 IL-4Rα 유전좌위의 내인성 설치류 조절 요소 또는 서열인, 설치류.
- 인간-특이적 IL-4 또는 IL-4Rα 길항제의 스크리닝 방법으로서:
이중 인간화 IL-4 및 IL-4Rα 마우스를 제공하는 단계,
상기 마우스에서 폐 염증을 유도하는 단계,
상기 마우스에 약제를 투여하는 단계,
폐 염증이 상기 약제에 의해 감소되는지 여부를 결정하는 단계, 및
폐 염증을 감소시키는 능력에 기초하여 상기 약제를 인간 특이적 IL-4 또는 IL-4Rα 길항제로 식별하는 단계를 포함하는, 방법. - 제50항에 있어서, 상기 폐 염증의 정도가 기도 내 점액 축적, 기관지 폐포 세척액 내 호산구 침윤 세포, 및/또는 총 순환 IgE를 측정함으로써 결정되는, 방법.
- 인간-특이적 IL-4 또는 IL-4Rα 길항제의 스크리닝 방법으로서:
이중 인간화 IL-4 및 IL-4Rα 마우스를 제공하는 단계,
상기 마우스에서 피부 염증을 유도하는 단계,
상기 마우스에 약제를 투여하는 단계,
피부 염증이 상기 약제에 의해 감소되는지 여부를 결정하는 단계, 및
피부 염증을 감소시키는 능력에 기초하여 상기 약제를 인간 특이적 IL-4 또는 IL-4Rα 길항제로 식별하는 단계를 포함하는, 방법. - 제50항 또는 제52항에 있어서, 상기 인간화 IL-4Rα 유전자가 쥐과 IL-4Rα 엑토도메인-코딩 서열의 인간 IL-4Rα 엑토도메인-코딩 서열로의 치환에 기인하고, 상기 인간화 IL-4Rα 유전자는 내인성 쥐과 IL-4Rα 유전좌위의 내인성 쥐과 IL-4Rα 조절 요소의 조절 하에 있고; 상기 인간화 IL-4 유전자가 인간 또는 인간화 IL-4 단백질을 암호화하고, 상기 인간화 IL-4 유전자는 상기 내인성 설치류 IL-4R 유전좌위의 내인성 설치류 IL-4 조절 요소의 조절 하에 있는, 방법.
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