RS62345B1 - Životinje sa humanizovanim il-4 i il-4r alfa - Google Patents

Životinje sa humanizovanim il-4 i il-4r alfa

Info

Publication number
RS62345B1
RS62345B1 RS20211141A RSP20211141A RS62345B1 RS 62345 B1 RS62345 B1 RS 62345B1 RS 20211141 A RS20211141 A RS 20211141A RS P20211141 A RSP20211141 A RS P20211141A RS 62345 B1 RS62345 B1 RS 62345B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
human
rodent
gene
mouse
humanized
Prior art date
Application number
RS20211141A
Other languages
English (en)
Inventor
Li-Hsien Wang
Yingzi Xue
Andrew J Murphy
Sean Stevens
Original Assignee
Regeneron Pharma
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Regeneron Pharma filed Critical Regeneron Pharma
Publication of RS62345B1 publication Critical patent/RS62345B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • A01K67/0278—Knock-in vertebrates, e.g. humanised vertebrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/5406—IL-4
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • C07K14/7155—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons for interleukins [IL]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5082—Supracellular entities, e.g. tissue, organisms
    • G01N33/5088—Supracellular entities, e.g. tissue, organisms of vertebrates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2207/00—Modified animals
    • A01K2207/15—Humanized animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
    • A01K2217/072—Animals genetically altered by homologous recombination maintaining or altering function, i.e. knock in
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/20—Animal model comprising regulated expression system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/01—Animal expressing industrially exogenous proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A01K2267/035—Animal model for multifactorial diseases
    • A01K2267/0368—Animal model for inflammation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A01K2267/0393—Animal model comprising a reporter system for screening tests

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Description

Opis
UNAKRSNE REFERENCE NA POVEZANE PRIJAVE
[0001] Ova prijava polaže pravo prioriteta od SAD privremene patentne prijave br.61/989,757 podnete 7. maja 2014.
OBLAST PRONALASKA
[0002] Ovde su stavljene na uvid javnosti životinje koje nisu čovek (ne-humane) a koje sadrže sekvence nukleinskih kiselina koje kodiraju IL-4 i/ili IL-4Rα protein koji sadrži humanu sekvencu. Transgene ne-humane životinje su, takođe, ovde stavljene na uvid javnosti koje sadrže IL-4 i/ili IL-4Rα gen koji je u celini ili delimično humani. Ne-humane životinje koje eksprimuju humane ili humanizovane IL-4 i/ili IL-4Rα proteine su, takođe, stavljene na uvid javnosti. Osim toga, stavljeni su na uvid javnosti postupci za pravlјenje i upotrebu ne-humanih životinja, a koje sadrže sekvence nukleinske kiseline humanog ili humanizovanog IL-4 i/ili IL-4Rα.
STANJE TEHNIKE
[0003] IL-4 i IL-4Rα su terapijske mete za tretiranje različitih humanih bolesti, poremećaja i stanja koja su povezana sa abnormalnim T-pomoćnim ćelijama tipa 2 (Th2). Procena farmakokinetike (PK) i farmakodinamike (PD) terapijskih molekula koji specifično cilјaju humane IL-4 ili humane IL-4Rα proteine rutinski se obavlјaju kod ne-humanih životinja, na primer, glodara, na primer, miševa ili pacova. Međutim, PD takvih terapeutskih molekula ne može se pravilno odrediti kod određenih ne-humanih životinja, jer ovi terapeutski molekuli ne cilјaju endogene IL-4 ili IL-4Rα proteine.
[0004] Štaviše, procena terapeutske efikasnosti humano specifičnih IL-4 i IL-4Rα proteinskih antagonista primenom različitih ne-humanih životinjskih modela bolesti povezanih sa abnormalnim Th2 ćelijama problematična je kod ne-humanih životinja kod kojih takvi antagonisti specifični za vrstu ne stupaju u interakciju sa endogenim IL-4 ili IL-4Rα proteinima.
[0005] Shodno tome, postoji potreba za ne-humanim životinjama, npr. glodarima, npr. mišjim vrstama, npr. miševima ili pacovima, kod kojih su IL-4 i/ili IL-4Rα geni ne-humane životinje u celini ili delimično humanizovani ili zamenjeni (npr. na endogenim ne-humanim lokusima) humanim IL-4 i/ili IL-4Rα genima koji sadrže sekvence koje kodiraju humane ili humanizovane IL-4 i/ili IL-4Rα proteine, tim redosledom.
[0006] Takođe, postoji potreba za ne-humanim životinjama koje sadrže IL-4 i/ili IL-4Rα gene (npr. humanizovane ili humane) u kojima su IL-4 i/ili IL-4R geni pod kontrolom regulatornih elemenata koji nisu humani (npr. endogenih regulatornih elemenata).
[0007] Takođe, postoji potreba za humanizovanim ne-humanim životinjama koje eksprimuju humani ili humanizovani IL-4 protein u krvi, plazmi ili serumu u koncentraciji sličnoj onoj IL-4 proteina prisutnoj u krvi, plazmi ili serumu ne-humanih životinja istog uzrasta koje eksprimuju funkcionalni IL-4 protein, ali ne sadrže humane ili humanizovane IL-4 gene, i/ili eksprimuju humani ili humanizovani IL-4Rα protein na imunim ćelijama, npr. B i T ćelijama, na nivou sličnom onom od IL-4Rα proteina na imunim ćelijama, npr. B i T ćelijama, ne-humane životinje iste starosti koja eksprimuje funkcionalni IL-4Rα protein, ali ne sadrži humani ili humanizovani IL-4Rα gen.
[0008] US2014/056920 se odnosi na postupke za lečenje ili prevenciju astme davanjem IL-4R antagonista. US2011/016543 odnosi se na editovanje genoma gena uklјučenih u upalu.
KRATAK OPIS PRONALASKA
[0009] Pronalazak obezbeđuje glodara, koji obuhvata zamenu genomskog fragmenta IL-4 gena glodara na endogenom IL-4 lokusu glodara sa genomskim fragmentom humanog IL-4 gena da bi se formirao modifikovani IL-4 gen, pri čemu modifikovani IL-4 gen kodira humani IL-4 protein i sadrži egzon 1 počevši od kodona za inicijaciju ATG preko egzona 4 humanog IL-4 gena, pri čemu je ekspresija modifikovanog IL-4 gena pod kontrolom regulatornih elemenata glodara na endogenom IL-4 lokusu glodara.
[0010] Pronalazak dalјe obezbeđuje embrionalnu matičnu (ES) ćeliju glodara, koja sadrži zamenu genomskog fragmenta IL-4 gena glodara na endogenom IL-4 lokusu sa genomskim fragmentom humanog IL-4 gena da bi se formirao modifikovani IL-4 gen, pri čemu modifikovani IL-4 gen kodira humani IL-4 protein i sadrži egzon 1 počevši od kodona za inicijaciju ATG preko egzona 4 humanog IL-4 gena, pri čemu je ekspresija modifikovanog IL-4 gena pod kontrolom regulatornih elemenata glodara na endogenom IL-4 lokusu glodara.
[0011] Pronalazak dodatno obezbeđuje postupak pravlјenja glodara, koji obuhvata: (a) zamenu genomskog fragmenta IL-4 gena glodara na endogenom IL-4 lokusu glodara u ES ćeliji glodara sa genomskim fragmentom humanog IL-4 gena za formiranje humanizovanog IL-4 gena, pri čemu humanizovani IL-4 gen kodira humani IL-4 protein i sadrži egzon 1 počevši od kodona za inicijaciju ATG preko egzona 4 humanog IL-4 gena, pri čemu ekspresija modifikovanog IL-4 gena je pod kontrolom regulatornih elemenata glodara na endogenom IL-4 lokusu glodara; i (b) generisanje glodara iz ES ćelije iz koraka (a).
[0012] Ovde su opisane ne-humane životinje, koje sadrže sekvence nukleinskih kiselina koje kodiraju IL-4 i/ili IL-4Rα protein koji sadrži humanu sekvencu.
[0013] Ovde su opisane transgene ne-humane životinje koje sadrže IL-4 i/ili IL-4Rα gen koji je u celini ili delimično humani.
[0014] Ovde su opisane ne-humane životinje i koje eksprimuju humane ili humanizovane IL-4 i/ili IL-4Rα proteine.
[0015] Ovde su opisane ne-humane životinje životinje koje imaju zamenu (u celini ili delimično) endogenih IL-4 i/ili IL-4Rα gena ne-humane životinje.
[0016] Ovde su opisane ne-humane životinje koje sadrže IL-4 i/ili IL-4Rα humanizaciju (u celini ili delimično) na endogenim ne-humanim IL-4 i/ili IL-4Rα lokusima.
[0017] Ovde su opisane ne-humane životinje koje imaju humani ili humanizovani IL-4 gen, pri čemu ne-humane životinje ne eksprimuju endogeni IL-4 protein, i pri čemu ne-humane životinje eksprimuju humani ili humanizovani IL-4 protein u krvi, plazmi ili serumu u koncentraciji sličnoj onoj IL-4 proteina prisutnog u krvi, plazmi ili serumu nehumane životinje istog uzrasta koja eksprimuje funkcionalni endogeni IL-4 protein, ali ne sadrži humani ili humanizovani IL-4 gen.
[0018] Ovde su opisane ne-humane životinje koje imaju humani ili humanizovani IL-4Rα gen, pri čemu nehumane životinje ne eksprimuju endogeni IL-4Rα protein, već eksprimuju humani ili humanizovani IL-4Rα protein na imunim ćelijama, npr. B i T ćelijama, na nivou sličnom onom kod IL-4Rα proteina prisutnog na imunim ćelijama, npr. B i T ćelijama, ne-humanih životinja istog uzrasta a koje eksprimuju funkcionalni endogeni IL-4Rα protein, ali ne sadrže humani ili humanizovani IL-4Rα gen.
[0019] U jednom aspektu, ovde su opisane ne-humane životinje koje sadrže sekvencu nukleinske kiseline humanog ili humanizovanog IL-4 i/ili IL-4Rα.
[0020] U jednom aspektu, ovde su opisane genetski modifikovane ne-humane životinje koje sadrže zamenu na endogenom IL-4 i/ili IL-4Rα lokusu gena koji kodira endogeni IL-4 i/ili IL-4Rα sa genom koji kodira humani ili humanizovani IL-4 i/ili IL-4Rα protein. Ovde su opisani glodari, npr. miševi ili pacovi, koji sadrže zamenu endogenog IL-4 gena, na endogenom IL-4 lokusu, sa humanim IL-4 genom, i/ili sadrže zamenu endogenog IL-4Rα gena, na endogenom IL-4Rα lokusu, sa humanim genom IL-4Rα. U jednom aspektu, glodar je miš. U jednom aspektu, glodar je pacov.
[0021] U jednom aspektu, ovde su opisani genetski modifikovani glodari, npr. miševi ili pacovi, koji sadrže humanizaciju endogenog IL-4 gena glodara, pri čemu humanizacija obuhvata zamenu na endogenom IL-4 lokusu nukleinske kiseline glodara koja sadrži najmanje jedan egzon IL-4 gena glodara sa sekvencom nukleinske kiseline koja sadrži najmanje jedan egzon humanog IL-4 gena za formiranje modifikovanog IL-4 gena, pri čemu je ekspresija modifikovanog IL-4 gena pod kontrolom regulatornih elemenata glodara na endogenom IL-4 lokusu glodara.
[0022] U jednom aspektu, glodar je miš ili pacov. U jednom aspektu, glodar je miš. U jednom aspektu, glodar je pacov.
[0023] U jednom aspektu, modifikovani gen IL-4 kodira humani ili humanizovani IL-4 protein i sadrži egzon 1 počevši od kodona za inicijaciju ATG preko egzona 4 humanog IL-4 gena.
[0024] U jednom aspektu, glodar je miš koji nije sposoban da eksprimuje mišji IL-4 protein.
[0025] U jednom aspektu, glodar je miš koji eksprimuje mišji IL-4Rα protein kodiran endogenim mišjim IL-4Rα genom.
[0026] U jednom aspektu, glodar je miš koji eksprimuje humani ili humanizovani IL-4Rα protein.
[0027] U jednom aspektu, humanizovani IL-4Rα protein sadrži ektodomen humanog IL-4Rα proteina.
[0028] U jednom aspektu, humanizovani IL-4Rα protein sadrži transmembranski domen i citoplazmatski domen mišjeg IL-4Rα proteina.
[0029] U jednom aspektu, glodar je miš koji sadrži zamenu na endogenom mišjem IL-4Rα lokusu nukleinske kiseline miša koja sadrži najmanje jedan egzon mišjeg IL-4Rα gena sa sekvencom nukleinske kiseline koja sadrži najmanje jedan egzon humanog IL-4Rα gena za formiranje modifikovanog IL-4Rα gena, pri čemu je eksprimovanje modifikovanog IL-4Rα gena pod kontrolom regulatornih elemenata miša na mišjem endogenom IL-4Rα lokusu.
[0030] U jednom aspektu, glodar je miš, pri čemu je susedni genomski fragment mišje IL-4 sekvence koja sadrži egzon 1 koji počinje od kodona za inicijaciju ATG preko egzona 4 mišjeg IL-4 zamenjen sa susednim genomskim fragmentom humane IL-4 sekvence koja sadrži egzon 1 koji počinje od kodona za inicijaciju ATG preko egzona 4 humanog IL-4.
[0031] U jednom aspektu, ekspresija modifikovanog IL-4Rα gena koji kodira humani ili humanizovani IL-4Rα protein je pod kontrolom regulatornih elemenata miša na endogenom mišjem IL-4Rα lokusu.
[0032] Genetski modifikovani glodari, npr. miševi ili pacovi, mogu obuhvatiti humanizaciju endogenog IL-4Rα gena glodara, pri čemu humanizacija obuhvata zamenu na endogenom IL-4Rα lokusu nukleinske kiseline glodara koja sadrži egzon IL-4Rα gena glodara sa sekvencom nukleinske kiseline koja kodira najmanje jedan egzon humanog IL-4Rα gena da formira modifikovani (tj. humanizovani) IL-4Rα gen, pri čemu je ekspresija modifikovanog, humanizovanog IL-4Rα gena pod kontrolom regulatornih elemenata glodara na endogenom IL-4Rα lokusu glodara.
[0033] U jednom aspektu, glodar je miš ili pacov. U jednom aspektu, glodar je miš. U jednom aspektu, glodar je pacov.
[0034] U jednom aspektu, modifikovani IL-4Rα gen kodira humani ili humanizovani IL-4Rα protein i sadrži egzon 1 počevši od kodona za inicijaciju ATG preko egzona 5 humanog IL-4Rα gena.
[0035] U jednom aspektu, glodar je miš koji nije sposoban da eksprimuje mišji IL-4Rα protein.
[0036] U jednom aspektu, glodar je miš koji eksprimuje mišji IL-4 protein kodiran endogenim IL-4 genom miša.
[0037] U jednom aspektu, glodar je miš koji eksprimuje humani ili humanizovani IL-4 protein.
[0038] U jednom aspektu, glodar je miš koji sadrži zamenu na endogenom mišjem IL-4 lokusu nukleinske kiseline miša koja sadrži egzon mišjeg IL-4 gena sa sekvencom nukleinske kiseline koja kodira najmanje jedan egzon humanog IL -4 gena za formiranje modifikovanog IL-4 gena, pri čemu je ekspresija modifikovanog IL-4 gena pod kontrolom regulatornih elemenata miša na endogenom mišjem IL-4 lokusu.
[0039] U jednom aspektu, glodar je miš, i pri čemu je susedni genomski fragment mišje IL-4Rα sekvence koji sadrži egzon 1 koji počinje od kodona za inicijaciju ATG preko egzona 5 IL-4Rα zamenjen sa susednim genomskim fragmentom humane IL-4Rα sekvence koja sadrži egzon 1 koji počinje od kodona za inicijaciju ATG preko egzona 5 humanog IL-4Rα.
[0040] U jednom aspektu, ovde su opisani genetski modifikovani glodari, npr. miš ili pacov, koji eksprimuju humani ili humanizovani IL-4 protein, pri čemu glodar koji eksprimuje humani ili humanizovani IL-4 protein sadrži normalan imuni sistem, tj. broj imunih ćelija, npr. B i T ćelija, u krvi, plazmi ili serumu glodara koji eksprimuje humani ili humanizovani IL-4 protein sličan je broju imunih ćelija, npr. B i T ćelija, u krvi, plazmi ili serumu glodara koji eksprimuje funkcionalni endogeni IL-4 protein. U jednom aspektu, glodar je miš. U jednom aspektu, glodar je pacov.
[0041] Genetski modifikovani glodari, npr. miš ili pacov, mogu da eksprimuu IL-4 protein iz humanog ili humanizovanog IL-4 gena, pri čemu glodar eksprimuje humani ili humanizovani IL-4 protein u svom serumu. U jednom aspektu, glodar je miš. U jednom aspektu, glodar je pacov.
[0042] U jednom aspektu, serum glodara koji eksprimuje humani ili humanizovani IL-4 protein ima približno isti nivo IL-4 proteina kao glodar koji eksprimuje funkcionalan, endogeni IL-4 protein, npr. divlјeg tipa miša ili pacova. U jednom aspektu, glodar je miš. U jednom aspektu, glodar je pacov.
[0043] U jednom aspektu, miš eksprimuje humani ili humanizovani IL-4 protein u serumu u koncentraciji od najmanje oko 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190% ili 200% nivoa IL-4 proteina prisutnog u serumu miša istog uzrasta koji eksprimuje funkcionalni endogeni IL-4 protein, ali ne sadrži zamenu endogenog IL-4 gena, na endogenom mišjem IL-4 lokusu, sa humanim IL-4 genom.
[0044] U jednom aspektu, miš eksprimuje humani ili humanizovani IL-4 protein u serumu u koncentraciji između oko 10% i oko 200%, između oko 20% i oko 150%, ili između oko 30% i oko 100% nivoa mišjeg IL-4 proteina prisutnog u serumu miša istog uzrasta koji eksprimuje funkcionalni endogeni IL-4 protein, ali ne sadrži zamenu endogenog IL-4 gena, na endogenom mišjem IL-4 lokusu humanim IL-4 genom.
[0045] Genetski modifikovani glodari, npr. miš ili pacov, mogu da eksprimuju humani ili humanizovani IL-4Rα protein, pri čemu glodar eksprimuje humani ili humanizovani IL-4Rα protein na imunim ćelijama, npr. B i T ćelijama, na nivou sličnom onom IL-4Rα proteina prisutnog na imunim ćelijama, npr. B i T ćelijama, glodara istog uzrasta koji eksprimuje funkcionalni endogeni IL-4Rα protein. U jednom aspektu, glodar je miš. U jednom aspektu, glodar je pacov.
[0046] U jednom aspektu, ovde su opisani genetski modifikovani glodari, npr. miš ili pacov, koji eksprimuju IL-4Rα protein iz humanog IL-4Rα gena, pri čemu glodar eksprimuje humani ili humanizovani IL-4Rα protein na imunim ćelijama, npr. B i T ćelijama. U jednom aspektu, glodar je miš. U jednom aspektu, glodar je pacov.
[0047] U jednom aspektu, imune ćelije, npr. B i T ćelije glodara koje eksprimuju humani ili humanizovani IL-4Rα protein imaju približno isti nivo IL-4Rα proteina na imunim ćelijama, npr. glodar koji eksprimuje funkcionalan, endogeni IL-4Rα protein, npr. divlјeg tipa miša ili pacova. U jednom aspektu, glodar je miš. U jednom aspektu, glodar je pacov.
[0048] U jednom aspektu, miš eksprimuje humani ili humanizovani IL-4Rα protein na imunim ćelijama, npr. B i T ćelijama, u količini od najmanje oko 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190% ili 200% količine IL-4Rα proteina na imunim ćelijama, npr. B i T ćelijama miša istog uzrasta koji eksprimuje funkcionalni endogeni IL-4Rα protein, ali ne sadrži zamenu za endogeni IL-4Rα gen, na endogenom mišjem IL-4Rα lokusu sa humanim IL-4Rα genom.
[0049] U jednom aspektu, miš eksprimuje humani ili humanizovani IL-4Rα protein na imunim ćelijama, npr. B i T ćelijama, u količini između oko 10% i oko 200%, između oko 20% i oko 150%, ili između oko 30% i oko 100% količine mišjeg IL-4Rα proteina prisutnog na imunim ćelijama, npr. B i T ćelijama, miša istog uzrasta koji eksprimuje funkcionalni endogeni IL-4Rα protein, ali ne sadrži zamenu endogenog IL-4Rα gena, na endogenom mišjem IL-4Rα lokusu, sa humanim IL-4Rα genom.
[0050] U jednom aspektu, genetski modifikovan glodar sadrži humanizovani IL-4Rα gen koji sadrži zamenu kodirajuće sekvence ektodomena IL-4Rα glodara sa kodirajućom sekvencom humanog IL-4Rα ektodomena, pri čemu humanizovani IL-4Rα gen sadrži transmembransku sekvencu IL-4Rα glodara i citoplazmatsku sekvencu IL-4Rα glodara, pri čemu je humanizovani IL-4Rα gen pod kontrolom endogenih regulatornih elemenata glodara IL-4Rα na endogenom IL-4Rα lokusu, i gde glodar dalјe sadrži humanizovani IL-4 gen koji kodira humani ili humanizovani IL-4 protein, pri čemu je humanizovani IL-4 gen pod kontrolom endogenih regulatornih elemenata glodara IL-4 na endogenom IL-4 lokusu.
[0051] U jednom aspektu, glodar je miš ili pacov. U jednom aspektu, glodar je miš. U jednom aspektu, glodar je pacov.
[0052] U jednom aspektu, miš nije sposoban da eksprimuje mišji IL-4 protein i nije sposoban je da eksprimuje mišji IL-4Rα protein.
[0053] U jednom aspektu, regulatorni elementi ili sekvence glodara na endogenom IL-4 lokusu i/ili IL-4Rα lokusu su iz miša ili pacova.
[0054] U jednom aspektu, regulatorni elementi ili sekvence glodara su endogeni regulatorni elementi ili sekvence glodara na IL-4 lokusu glodara i/ili IL-4Rα lokusu glodara.
[0055] U jednom aspektu, ovde je opisana ne-humana životinja, npr. glodar, npr. miš ili pacov, koja eksprimuje humane ili humanizovane IL-4 i/ili IL-4Rα proteine, pri čemu ne-humana životinja eksprimuje humani ili humanizovani proteini IL-4 i/ili IL-4Rα iz endogenog ne-humanog IL-4Rα lokusa i/ili endogenog ne-humanog IL-4Rα lokusa. U jednom aspektu, ne-humana životinja je glodar. U jednom aspektu, glodar je miš. U jednom aspektu, glodar je pacov.
[0056] Genetski modifikovani miš može eksprimovati humani ili humanizovani IL-4 protein iz endogenog mišjeg IL-4 lokusa, pri čemu je endogeni mišji IL-4 gen u celini ili delimično zamenjen humanim IL-4 genom.
[0057] U jednom aspektu, susedna mišja genomska nukleinska kiselina od oko 6.3 kb na endogenom mišjem IL-4 lokusu, uklјučujući egzon 1 počevši od kodona za inicijaciju ATG preko egzona 4 (uklјučujući 3’ neprevedeni region) i deo 3’ regiona nishodno od egzona 4, briše se i zamenjuje sa oko 8.8 kb sekvence humane IL-4 nukleinske kiseline koja sadrži egzon 1 počevši od kodona za inicijaciju ATG do egzona 4 (uklјučujući 3’ neprevedeni region) i deo 3’ regiona nishodno od egzona 4 humanog IL-4 gena. U specifičnom aspektu, sekvenca nukleinske kiseline humanog IL-4 koja zamenjuje mišju genomsku nukleinsku kiselinu sadrži egzon 1 koji počinje od kodona za inicijaciju ATG preko egzona 4 i deo 3’ regiona nishodno od egzona 4 humanog IL-4 gena humanog BAC RP11-17K19. U specifičnom aspektu, modifikovani IL-4 gen sadrži mišje IL-45’ regulatorne elemente i humani IL-4 egzon 1 počevši od kodona za inicijaciju ATG do egzona 4, tj. kodirajuće sekvence IL-4 proteina.
[0058] U jednom aspektu, ovde je opisan genetski modifikovan miš koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira humani ili humanizovani IL-4 protein, pri čemu nukleotidna sekvenca koja kodira humani ili humanizovani IL-4 protein zamenjuje, u celini ili delimično, endogenu nukleotidnu sekvencu koja kodira endogeni mišji IL-4 protein.
[0059] U jednom aspektu, ovde je opisan genetski modifikovan miš koji eksprimuje humani ili humanizovani IL-4Rα protein iz endogenog mišjeg IL-4Rα lokusa, pri čemu je endogeni mišji IL-4Rα gen zamenjen, u celini ili delimično, sa humanim IL-4Rα genom.
[0060] U jednom aspektu, susedna mišja genomska nukleinska kiselina od oko 7.1 kb na endogenom mišjem IL-4Rα lokusu, uklјučujući egzon 1 koji počinje od kodona za inicijaciju ATG preko egzona 5 i dela introna 5, briše se i zamenjuje sa oko 15.6 kb humane sekvence nukleinske kiseline IL-4Rα koja sadrži egzon 1 počevši od kodona za inicijaciju ATG preko egzona 5 i dela introna 5 humanog IL-4Rα gena. U specifičnom aspektu, humana nukleinska kiselina IL-4α koja zamenjuje mišju genomsku nukleinsku kiselinu sadrži egzon 1 počevši od kodona za inicijaciju ATG preko egzona 5 i dela introna 5 humanog IL-4α gena humanog BAC RP11-16E24. U specifičnom aspektu, humana IL-4Rα nukleinska kiselina koja zamenjuje mišju genomsku nukleinsku kiselinu sadrži celu sekvencu koja kodira humani IL-4Rα ektodomen.
[0061] U jednom aspektu, ovde je opisan postupak za stvaranje humanizovanog IL-4 glodara, koji obuhvata zamenu sekvence IL-4 gena glodara koja kodira IL-4 protein glodara sa sekvencom humane IL-4 nukleinske kiseline koja sadrži jedan ili više egzona sekvence humanog IL-4 gena za formiranje modifikovanog, humanizovanog IL-4 gena koji kodira humani ili humanizovani IL-4 protein, pri čemu je zamena na endogenom IL-4 lokusu glodara, a sekvenca humanizovanog IL-4 gena koja sadrži jedan ili više egzona sekvence humanog IL-4 gena i kodira humani ili humanizovani IL-4 protein je operativno povezana sa regulatornim elementima ili sekvencama glodara (npr.5’ i/ili 3’ regulatornim elementima) na endogenom IL-4 lokusu glodara.
[0062] U jednom aspektu, glodar je miš ili pacov. U jednom aspektu, glodar je miš. U jednom aspektu, glodar je pacov.
[0063] U jednom aspektu, regulatorni elementi ili sekvence glodara izvedeni su od miša. U jednom aspektu, regulatorni elementi ili sekvence glodara izvedeni su od pacova.
[0064] U jednom aspektu, regulatorni elementi ili sekvence glodara su endogeni regulatorni elementi ili sekvence glodara na IL-4 lokusu glodara. U jednom aspektu, glodar je miš. U jednom aspektu, glodar je pacov.
[0065] U jednom aspektu, sekvenca nukleinske kiseline humanog IL-4 koja zamenjuje sekvencu IL-4 gena glodara sadrži najmanje jedan egzon sekvence humanog IL-4 gena. U drugim aspektima, sekvenca humane IL-4 nukleinske kiseline koja zamenjuje sekvencu IL-4 gena glodara sadrži najmanje 2 ili najmanje 3 egzona sekvence humanog IL-4 gena. U jednom aspektu, sekvenca humane IL-4 nukleinske kiseline koja zamenjuje sekvencu IL-4 gena glodara sadrži sva 4 egzona sekvence humanog IL-4 gena. U jednom aspektu, glodar je miš. U jednom aspektu, glodar je pacov.
[0066] U jednom aspektu, sekvenca nukleinske kiseline humanog IL-4 koja zamenjuje sekvencu IL-4 gena glodara kodira protein koji je oko 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili oko 99% identičan humanom IL-4 (npr. humani IL-4 protein kodiran nukleinskom kiselinom navedenom u GenBank Accession No. NM_000589.3s).
[0067] U jednom aspektu, zamena je na endogenom IL-4 lokusu glodara, a humanizovana sekvenca IL-4 gena koja sadrži jedan ili više egzona humane sekvence IL-4 gena i kodira humani ili humanizovani IL-4 protein je operativno povezana sa endogenim regulatornim elementima ili sekvencom glodara (npr. 5’ i/ili 3’ regulatorni elementi) na endogenom IL-4 lokusu glodara.
[0068] U jednom aspektu, ovde je opisan postupak za pravlјenje humanizovanog IL-4 miša, koji se sastoji od zamene sekvence IL-4 gena miša koja kodira mišji IL-4 protein sa sekvencom humanog IL-4 gena da bi se formirao modifikovani, humanizovani IL-4 gen koji kodira humani ili humanizovani IL-4 protein.
[0069] U jednom aspektu, zamena je na endogenom mišjem IL-4 lokusu, a dobijeni humanizovani IL-4 gen koji kodira humani ili humanizovani IL-4 protein je operativno povezan sa regulatornim elementima ili sekvencama miša (npr.5’ i/ili 3’ regulatorni elementi) na endogenom mišjem IL-4 lokusu.
[0070] U jednom aspektu, zamena je na endogenom mišjem IL-4 lokusu, a humanizovani IL-4 gen koji kodira humani ili humanizovani IL-4 protein je operativno povezan sa endogenim mišjim regulatornim elementima ili sekvencama (npr.5’ i/ili 3’ regulatorni elementi) na endogenom mišjem IL-4 lokusu.
[0071] U jednom aspektu, ovde je opisan postupak za dobijanje humanizovanog IL-4Rα glodara, koji obuhvata zamenu sekvence IL-4Rα gena glodara koja kodira IL-4Rα protein glodara sa sekvencom nukleinske kiseline humanog IL-4Rα koja sadrži jedan ili više egzona genske sekvence humanog IL-4Rα za formiranje modifikovanog, humanizovanog IL-4Rα gena koji kodira humani ili humanizovani IL-4Rα protein, pri čemu je zamena na endogenom IL-4Rα lokusu glodara, a sekvenca humanizovanog IL-4Rα gena koja sadrži jedan ili više egzona sekvence humanog IL-4Rα gena i kodira humani ili humanizovani IL-4Rα protein operativno je povezana sa regulatornim elementima ili sekvencama glodara (npr. 5’ i/ili 3’ regulatornim elementima) na endogenom IL-4Rα lokusu.
[0072] U jednom aspektu, glodar je miš ili pacov. U jednom aspektu, glodar je miš. U jednom aspektu, glodar je pacov.
[0073] U jednom aspektu, regulatorni elementi ili sekvence glodara izvedeni su od miša. U jednom aspektu, regulatorni elementi ili sekvence glodara izvedeni su od pacova.
[0074] U jednom aspektu, regulatorni elementi ili sekvence glodara su endogeni regulatorni elementi ili sekvence glodara na IL-4Rα lokusu glodara. U jednom aspektu, glodar je miš. U jednom aspektu, glodar je pacov.
[0075] U jednom aspektu, sekvenca nukleinske kiseline humanog IL-4Rα koja zamenjuje sekvencu IL-4Rα gena glodara sadrži najmanje jedan egzon sekvence humanog IL-4Rα gena. U drugim aspektima, nukleinska sekvenca humanog IL-4Rα koja zamenjuje sekvencu IL-4Rα gena glodara sadrži najmanje 2, 3, 4, 5, 6, 7 ili 8 egzona sekvence humanog IL-4Rα gena. U jednom aspektu, nukleinska sekvenca humanog IL-4Rα koja zamenjuje sekvencu IL-4Rα gena glodara sadrži svih 9 egzona sekvence humanog IL-4Rα gena. U jednom aspektu, glodar je miš. U jednom aspektu, glodar je pacov.
[0076] U jednom aspektu, nukleinska sekvenca humanog IL-4Rα koja zamenjuje sekvencu IL-4Rα gena glodara kodira protein koji je oko 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili oko 99% identičan humanom IL-4Rα (npr. humani IL-4Rα protein kodiran nukleinskom kiselinom navedenom u GenBank Accession No. NM_000418.3).
[0077] U jednom aspektu, sekvenca nukleinske kiseline humanog IL-4Rα koja zamenjuje sekvencu IL-4Rα gena glodara sadrži najmanje jedan egzon sekvence humanog IL-4Rα gena koja kodira ektodomen humanog IL-4Rα proteina. U drugim aspektima, sekvenca nukleinske kiseline humanog IL-4Rα koja zamenjuje sekvencu IL-4Rα gena glodara sadrži najmanje 2, 3 ili 4 egzona sekvence humanog IL-4Rα gena koja kodira ektodomen humanog IL-4Rα proteina. U jednom aspektu, sekvenca nukleinske kiseline humanog IL-4Rα koja zamenjuje sekvencu IL-4Rα gena glodara sadrži svih 5 egzona sekvence humanog IL-4Rα gena koja kodira ektodomen humanog IL-4Rα proteina. U jednom aspektu, glodar je miš. U jednom aspektu, glodar je pacov.
[0078] U jednom aspektu, humana ili humanizovana sekvenca IL-4Rα gena koja zamenjuje sekvencu IL-4Rα gena glodara kodira ektodomen IL-4Rα proteina koji je oko 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili oko 99% identičan ektodomenu humanog IL-4Rα proteina (npr. humani IL-4Rα protein kodiran nukleinskom kiselinom navedenom u GenBank Accession No. NM_000418.3).
[0079] U jednom aspektu, zamena je na endogenom IL-4Rα lokusu glodara, a humanizovana sekvenca IL-4Rα gena koja sadrži jedan ili više egzona sekvence humanog IL-4Rα gena i kodira humani ili humanizovani IL-4Rα protein je operativno povezana sa endogenim regulatornim elementima ili sekvencama (npr. 5’ i/ili 3’ regulatorni elementi) na endogenom IL-4Rα lokusu.
[0080] U jednom aspektu, ovde je opisan postupak za pravlјenje humanizovanog IL-4Rα miša, koji se sastoji od zamene sekvence mišjeg IL-4Rα gena koja kodira mišji IL-4Rα protein sa sekvencom nukleinske kiseline humanog IL-4Rα da se formira humanizovani IL-4Rα gen kodira humani ili humanizovani IL-4Rα protein.
[0081] U jednom aspektu, zamena je na endogenom mišjem IL-4Rα lokusu, a humanizovani IL-4Rα gen koji kodira humani ili humanizovani IL-4Rα protein je operativno povezan sa mišjim regulatornim elementima ili sekvencama (npr.5’ i/ili 3’ regulatorni elementi) na endogenom mišjem IL-4Rα lokusu.
[0082] U jednom aspektu, zamena je na endogenom mišjem IL-4Rα lokusu, a humanizovani IL-4Rα gen koji kodira humani ili humanizovani IL-4Rα protein je operativno povezan sa endogenim regulatornim elementima ili sekvencama miša (npr.5’ i/ili 3’ regulatorni elementi) na endogenom mišjem IL-4Rα lokusu.
[0083] U različitim aspektima, ovde opisane genetski modifikovane ne-humane životinje, npr. glodari, npr. miševi ili pacovi, sadrže genetske modifikacije u njihovoj zametnoj liniji.
[0084] U jednom aspektu, embrion ne-humane životinje, npr. glodara, npr. miša ili pacova, sadrži genetsku modifikaciju kao što je ovde opisano.
[0085] U jednom aspektu, ne-humana životinja, npr. glodar, npr. embrion miša ili pacova, ovde je opisan, koji sadrži ćeliju donora koja sadrži genetsku modifikaciju, kako je ovde opisano.
[0086] U jednom aspektu, pluripotentna ili totipotentna ne-humana životinja, npr. glodar, npr. miš ili pacov, ćelija sadrži genetsku modifikaciju kao što je ovde opisano. U jednom aspektu, ćelija je ćelija glodara. U jednom aspektu, ćelija je mišja ćelija. U jednom aspektu, ćelija je ES ćelija glodara. U jednom aspektu, ćelija je mišja ES ćelija.
[0087] U jednom aspektu, ovde je opisana ne-humana životinja, npr. glodar, npr. miš ili pacov, i jajašce, pri čemu jajašce ne-humanih životinja sadrži ektopični hromozom ne-humane životinje, pri čemu ektopični hromozom nehumanih životinja sadrži genetsku modifikaciju kao što je ovde opisano. U jednom aspektu, ne-humana životinja je glodar. U jednom aspektu, glodar je miš. U jednom aspektu, glodar je pacov.
[0088] U jednom aspektu, mišji embrion, jajašce ili ćelija koji su genetski modifikovani tako da sadrže humani IL-4 gen ili humani IL-4Rα gen su od miševa koji su iz C57BL soja izabranog iz C57BL/A, C57BL/An, C57BL/GrFa, C57BL/Ka-LwN, C57BL/6, C57BL/6J, C57BL/6ByJ, C57BL/6NJ, C57BL/10, C57BL/10ScSn, C57BL/10Cr i C57BL/Ola. U drugom aspektu, miš je soj 129 izabran iz grupe koja se sastoji iz soja koji je 129P1, 129P2, 129P3, 129X1, 129S1 (e.g., 129S1/SV, 129S1/Svlm), 129S2, 129S4, 129S5, 129S9/SvEvH, 129S6 (129/SvEvTac), 129S7, 129S8, 129T1, 129T2 (vidi npr. Festing et al. (1999) Revised nomenclature for strain 129 mice, Mammalian Genome 10:836, vidi takođe: Auerbach et al (2000) Establishment and Chimera Analysis of 129/SvEv- and C57BL/6-Derived Mouse Embryonic Stem Cell Lines). U specifičnom aspektu, genetski modifikovani miš je kombinacija gore pomenutog soja 129 i pomenutog soja C57BL/6. U drugom specifičnom aspektu, miš je kombinacija gore pomenutih sojeva 129 ili kombinacija gore pomenutih sojeva BL/6. U specifičnom aspektu, soj 129 kombinacije je soj 129S6 (129/SvEvTac). U drugom aspektu, miš je soj BALB, npr. soj BALB/c. U još jednom aspektu, miš je kombinacija soja BALB i drugog već pomenutog soja. U jednom aspektu, miš je švajcarski ili švajcarski Vebster miš.
[0089] U različitim aspektima, ne-humane životinje koje sadrže humanu ili humanizovanu sekvencu nukleinske kiseline IL-4R i/ili IL-4 odabrane su iz sisara i ptica. U jednom aspektu, ne-humane životinje su sisari. U jednom aspektu, sisari su iz roda miševa.
[0090] U jednom aspektu, ovde je opisan postupak skrininga za humano specifične IL-4 ili IL-4Rα antagoniste. Postupak je koristan za identifikaciju terapijskih kandidata i procenu terapijske efikasnosti. Postupak obuhvata davanje sredstva genetski modifikovanom glodaru koji je dvostruko humanizovan za IL-4 i IL-4Rα, kao što je ovde opisano, određujući efekat sredstva na biološku funkciju posredovanu putanjom IL-4/IL-4Rα signalizacije, i identifikovanje agensa kao humano specifičnog IL-4 ili IL-4Rα antagonista ako antagonizuje funkciju posredovanu putanjom IL-4/IL-4Rα signalizacije kod genetski modifikovanog glodara.
[0091] U jednom aspektu, sredstvo sadrži varijabilni domen imunoglobulina koji vezuje IL-4 ili IL-4Rα. U jednom aspektu, sredstvo specifično vezuje humani IL-4 ili IL-4Rα, ali ne i IL-4 ili IL-4Rα glodara. U jednom aspektu, sredstvo je antitelo. U specifičnom aspektu, sredstvo je antitelo koje specifično vezuje humani IL-4Rα, ali ne i IL-4Rα glodara.
[0092] U jednom aspektu, postupak skrininga koristi dvostruko humanizovanog miša koji eksprimuje humani IL-4 protein i humanizovani IL-4Rα protein, pri čemu humanizovani IL-4Rα protein uklјučuje ektodomen humanog IL-4Rα proteina, koji je povezan sa transmembranskim i citoplazmatskim domenima endogenog mišjeg IL-4Rα proteina, pri čemu miš ne eksprimuje mišji IL-4 ili mišji IL-4Rα.
[0093] U nekim aspektima, postupak skrininga uklјučuje korake indukcije kod dvostruko humanizovanog glodara, kao što je ovde opisano, bolesti povezane sa IL-4/IL-4Rα signalizacijom, davanje sredstva glodaru, utvrđivanje da li sredstvo ublažava bolest, i identifikovanje sredstva kao humano specifičnog IL-4 ili IL-4Rα antagonista pogodnog za lečenje bolesti ako sredstvo ublažava bolest.
[0094] U nekim aspektima, bolest povezana sa IL-4/IL-4Rα signalizacijom je upala disajnih puteva, koja se može izazvati kod glodara intranazalnom primenom alergena (npr. ekstrakta grinje iz kućne prašine) u jednoj ili više doza tokom određenog perioda. Efekat sredstva može se odrediti merenjem da li je stepen upale disajnih puteva (odražen, npr. nakuplјanjem sluzi, infiltracionim ćelija u tečnosti za ispiranje bronhoalveolarnih ćelija, i/ili nivoima ukupnog cirkulišućeg IgE), smanjen kao rezultat primene sredstva.
[0095] U nekim aspektima, bolest povezana sa IL-4/IL-4Rα signalizacijom je upala kože ili atopijski dermatitis, koji se može izazvati kod glodara stvaranjem povrede kože i izlaganjem povređene kože alergenu (npr. bakterijskom toksinu ili ekstraktu grinje iz kućne prašine) u jednoj ili više doza tokom određenog perioda. Dejstvo sredstva može se odrediti merenjem da li je upala kože smanjena kao posledica primene sredstva.
[0096] U dalјem aspektu, trostruko humanizovana ne-humana životinja, čiji su IL-4, IL-4Rα i IL-33 geni humanizovani kako je ovde opisano, koristi se za procenu farmakodinamike (PD) i terapeutske efikasnosti jedinjenja ili kombinacije jedinjenja.
[0097] Svaki od ovde opisanih aspekata i realizacija može se koristiti zajedno, osim ako nije eksplicitno ili jasno isklјučen iz konteksta realizacije ili aspekta.
KRATAK OPIS CRTEŽA
[0098]
Slika 1 obezbeđuje ilustraciju, ne u razmeri, receptora za transdukciju IL-4 i IL-13 signala i mehanizam delovanja dupilumaba, potpuno neutrališućeg monoklonskog antitela koje se specifično veže za α lanac humanog IL-4 receptora (IL-4Rα).
Slike 2A-2B obezbeđuju ilustraciju, ne u razmeri, strategija za humanizaciju IL-4 (Il4) i IL-4Rα (Il4ra) lokusa. (2A) Mišji IL-4 gen (na vrhu) koji obuhvata kodirajući region od egzona 1 počevši od kodona za inicijaciju ATG preko egzona 4 (uklјučujući 3’ neprevedeni region) i dela 3’ regiona nishodno od egzona 4 se brišu i zamenjuju kodirajućim regionom iz egzona 1 počevši od ATG kodona preko egzona 4 (uklјučujući 3’ neprevedeni region) i dela 3’ regiona nishodno od egzona 4 humanog IL-4 gena (dole) zajedno sa floksiranom higro selekcionom kasetom loxP, kako je naznačeno. (2B) Mišji IL-4Rα gen (na vrhu) koji obuhvata kodirajući region od egzona 1 počevši od kodona za inicijaciju ATG do egzona 5 i dela introna 5 se briše i zamenjuje kodirajućim regionom iz egzona 1 počevši od kodiranja inicijacije ATG kroz egzon 5 i deo introna 5 humanog IL-4Rα gena (dole) i floksiranu neoselekcionu kasetu, kako je naznačeno.
Slika 3 prikazuje ekspresiju humanizovanog IL-4Rα proteina na B i T ćelijama iz miševa sa dvostruko humanizovanim IL-4/IL-4Rα (Il4<hu/hu>/Il4ra<hu/hu>).
Slika 4 prikazuje specifičnosti liganda IL-4 i IL-13 i funkcionalnost receptora koristeći primarne ćelije izvedene iz miševa sa humanizovanim IL4Rα (Il4ra<hu/hu>).
Slika 5 prikazuje IL-4 zavisnu proizvodnju IgE in vivo kod divlјeg tipa, ali ne kod miševa sa humanizovanim IL4Rα (Il4ra<hu/hu>).
Slika 6 prikazuje da indukciju IL-4 zavisnu od doze proizvodnje mIgE ex vivo u B ćelijama miša (leva ploča) blokira dupilumab, na način koji je zavisan od doze (desna ploča).
Slika 7 pokazuje da dupilumab, na način koji zavisi od doze, sprečava patologije pluća izazvane IL-25 in vivo kod miševa sa humanizovanom IL4Rα (Il4ra<hu/hu>).
Slika 8 prikazuje eksperimentalni dizajn za procenu terapeutske efikasnosti dupilumaba u modelu plućne upale izazvane ekstraktom grinja iz kućne prašine (HDM) korišćenjem miševa sa dvostruko humanizovanim IL-4 i IL-4Rα (IL-4<hu/hu>/IL-4R<hu/hu>). „REGN668“ se odnosi na humano monoklonsko antitelo usmereno na humani IL-4Rα, takođe poznato kao dupilumab. „REGN129“ se odnosi na mišji sol IL-13Rα2-Fc, koji je fuzioni protein između ektodomena mišjeg IL-13R2α i Fc.
Slika 9 prikazuje eksperimentalni dizajn za procenu terapijske efikasnosti dupilumaba u modelu plućne upale izazvane HDM-om korišćenjem miševa sa dvostruko humanizovanim IL-4 i IL-4Rα (IL-4<hu/hu>/IL-4R<hu/hu>) i antitela za kontrolu izotipa.
Slike 10A-10C prikazuju strategije humanizacije mišjeg IL-33 lokusa. Slika 10A prikazuje da se mišji IL-33 gen (na vrhu) koji obuhvata kodirajući region od egzona 2 počevši od kodona za inicijaciju ATG preko stop kodona u egzonu 8 briše i zamenjuje kodirajućim regionom od egzona 2 počevši od ATG kodona do egzona 8 (uklјučujući 3’ neprevedeni region) humanog IL-33 gena (dole). Slika 10B prikazuje humanizovani IL-33 alel u klonu mišje ES ćelije MAID 7060, koji sadrži selekcionu kasetu za neomicina loxP.
Slika 10C prikazuje humanizovani IL-33 alel u klonu mišje ES ćelije MAID 7061, u kome je izbrisana selekciona kaseta za neomicin, sa loxP i mestima za kloniranje (77 bp) preostalim nishodno od humane sekvence IL-33, i 3’ UTR miša zadržanim nishodno od lokacije loxP.
DETALJAN OPIS
IL-4 i IL-4Rα kao terapijski ciljevi
[0099] Alergijski poremećaji su spektar bolesti koje se sve češće pojavlјuju, posebno u razvijenim zemlјama. Atopijski dermatitis, astma i alergijski rinitis najčešća su upalna stanja među pacijentima sa alergijama; ovi pacijenti često pate od pojave više kliničkih simptoma. Patogeneza alergije povezana je sa abnormalnim imunološkim odgovorom na egzogene antigene (vidi Mueller et al. (2002) Structure, binding, and antagonists in the IL-4/IL-13 receptor system, Biochim Biophys Acta 1592:237-250).
[0100] Prekomerna proizvodnja IgE specifičnog antigena je bitna komponenta za izazivanje alergijske upale. Abnormalna polarizacija T-pomoćnih ćelija tipa 2 (Th2) doprinosi povećanom IgE odgovoru.
[0101] Interleukin-4 (IL-4) i interleukin-13 (IL-13), prvobitno identifikovani iz aktiviranih T ćelija, glavni su Th2 citokini koji igraju centralnu ulogu u pokretanju i održavanju imunoloških i inflamatornih reakcija kod alergija.
[0102] Signalizaciju IL-4 i IL-13 posreduju dva različita receptorska kompleksa sa zajedničkom podjedinicom, IL-4 receptorom alfa (IL-4Rα), što može doprineti preklapanju bioloških odgovora između ova dva citokina. Vidi sliku 1.
[0103] Receptori za interleukin-4/13 transdukciju signala i mehanizam delovanja dupilumaba. IL-4Rα formira dva različita kompleksa heterodimernih receptora koji posreduju u biološkim funkcijama IL-4 i IL-13 na način specifičan za tkivo i za odgovor. Receptor tipa I koji se sastoji od IL-4Rα i zajedničkog gama lanca citokinskih receptora (yC) je jedinstven za IL-4. Receptor tipa II formiran između IL-4Rα i IL-13Rα1 primarni je receptor za IL-13, ali je takođe funkcionalan za IL-4. Osim toga, IL-13 će se vezati za drugi receptor visokog afiniteta, IL-13Rα2, koji je opšte prepoznat kao receptor-mamac ili sa mogućim, pro-fibrotičnim efektom u punoj dužini.
[0104] Dupilumab je antagonističko monoklonsko antitelo protiv humanog IL-4Rα koje inhibira indukovane biološke aktivnosti iz IL-4 i IL-13. Dupilumab blokira transdukciju signala IL-4 sprečavajući njegovo vezivanje za podjedinice receptora, dok je inhibitorni efekat na IL-13 signalizaciju verovatno posredovan ometanjem interakcije sa dimernim receptorom.
[0105] Dupilumab, potpuno humano monoklonsko antitelo usmereno protiv zajedničke podjedinice IL-4Rα, razvijeno je u Regeneron Pharmaceuticals, Inc. korišćenjem miševa VelocImmune®. Dupilumab je u toku kliničkih ispitivanja za lečenje umerene do teške astme i za lečenje umerenog do teškog atopijskog dermatitisa.
[0106] Procena potencijala dupilumaba u mišjim modelima predstavlјa više izazova: (a) dupilumab ne prepoznaje srodne mišje IL-4 receptore; i (b) postoji nedostatak funkcionalne interakcije između mišjeg IL-4 proteina i humanog IL-4 receptora.
IL-4 gen i protein
[0107] IL-4 gen kodira izlučeni IL-4 protein, koji igra važnu ulogu u aktivaciji B ćelija, kao i drugih tipova ćelija (vidi sliku 1).
[0108] Humani IL-4. NCBI Genski ID: 3565; Primarni izvor: HGNC:6014; RefSeq transkript: NM_000589.3; UniProt ID: P05112; Genomski sklop: GRCh37; Lokacija: chr5:132,009,743-132,018,576 soj.
[0109] Humani IL-4 gen se nalazi na hromozomu 5, na 5q31.1. Humani IL-4 gen ima 4 egzona i kodira prekursorski polipeptid dužine 153 amino-kiseline, uklјučujući signalni peptid od 24 amino-kiseline i zreli IL-4 protein sa 129 amino-kiselina.
[0110] Mišji IL-4. NCBI Genski ID: 16189; Primarni izvor: MGI:96556; RefSeq transkript: NM_021283.2; UniProt ID: P07750; Genomski sklop: GRCm38; Lokacija: chr11:53,612,350-53,618,606 - soj.
[0111] Mišji IL-4 gen se nalazi na hromozomu 11, na 11, 31.97 cM. Mišji IL-4 gen ima 4 egzona i kodira prekursorski polipeptid dužine 140 amino-kiselina, uklјučujući signalni peptid od 20 amino-kiselina i zreli IL-4 protein sa 120 amino-kiselina.
IL-4Rα gen i protein
[0112] IL-4Rα gen kodira transmembranski receptorski IL-4Rα protein, koji se eksprimuje prvenstveno na B i T ćelijama, receptor je za IL-4 i IL-13 proteine (videti sliku 1).
[0113] Humani lL-4Rα. NCBI Genski ID: 3566; Primarni izvor: MGI:6015; RefSeq transkript: NM_000418.3; UniProt ID: P24394; Genomski sklop: GRCh37; Lokacija: chr16:27,351,525-27,367,111+ soj.
[0114] Humani IL-4Rα gen se nalazi na hromozomu 16 na 16p12.1-p11.2. Humani IL-4Rα gen ima 9 kodirajućih egzona i kodira prekursorski polipeptid od 825 amino-kiselina, uklјučujući signalni peptid od 25 amino-kiselina i zreli IL-4Rα protein od 800 amino-kiselina, sa prvih 207 amino-kiselinskih ostataka zrelog proteina koji čine vanćelijski domen. Vanćelijski domen (tj. ektodomen) humanog IL-4Rα proteina kodiran je kodiranjem egzona 1 do 5 humanog IL-4Rα gena.
[0115] Mišji IL-4Rα. NCBI Genski ID: 16190; Primarni izvor: MGI: 105367; RefSeq transkript: NM_001008700.3; UniProt ID: P16382; Genomski sklop: GRCm38; Lokacija: chr11:125,565,655-125,572,745 soj.
[0116] Mišji IL-4Rα gen nalazi se na hromozomu 7 na 768.94 cM. Mišji IL-4Rα gen ima 9 kodirajućih egzona i kodira prekursorski polipeptid od 810 amino-kiselina, uklјučujući signalni peptid od 25 amino-kiselina i zreli IL-4Rα protein od 785 amino-kiselina, sa prvih 208 amino-kiselinskih ostataka zrelog proteina koji čine vanćelijski domen. Vanćelijski domen (tj. ektodomen) mišjeg IL-4Rα proteina kodiran je kodiranjem egzona 1 do 5 mišjeg IL-4Rα gena.
Specifičnost vrsta IL-4 i IL-4Rα proteina
[0117] Kao što je ovde prikazano, mišji, ali ne i humani, IL-4 je funkcionalan kod miševa divlјeg tipa, i obrnuto, humani, ali ne i mišji, IL-4 je funkcionalan kod miševa sa humanizovanim IL-4Rα (Il4ra<hu/hu>). (Vidi, takođe, npr. Andrews et al. (2001) Reconstitution of a functional human type II IL-4/IL-13 receptor in mouse B cells: demonstration of species specificity, J Immunol.166:1716-1722).
Specifičnost vrsta humanih IL-4 i IL-4Rα inhibitora
[0118] Terapeutski molekuli kandidati koji cilјaju IL-4 ili IL-4Rα proteine obično se procenjuju na farmakokinetiku (PK) i farmakodinamiku (PD) kod ne-humanih životinja, npr. glodara, npr. miševa ili pacova. Takvi terapeutski molekuli se, takođe, testiraju na in vivo terapijsku efikasnost kod ne-humanih životinja, npr. glodara, npr. miša ili pacova, modela humanih bolesti, poremećaja i stanja povezanih sa abnormalnim Th2 ćelijama.
[0119] Međutim, terapijski molekuli koji su specifični za humane IL-4 ili IL-4Rα proteine, npr. za humano specifične IL-4 ili IL-4Rα inhibitore, ne mogu se adekvatno proceniti za PD ili in vivo terapijsku efikasnost kod glodara, posebno miševa, jer nedostaju mete ovih terapijskih molekula. Ovaj problem se ne može prevazići korišćenjem transgenih ne-humanih životinja, npr. glodara, npr. miševa ili pacova, koji eksprimuju humane IL-4 ili IL-4Rα proteine zbog gore navedenih specifičnosti vrsta IL-4 proteina.
[0120] Shodno tome, u različitim aspektima, za procenu PD i in vivo terapeutske efikasnosti IL-4 ili IL-4Rα proteinskih antagonista ili inhibitora humano specifičnih kod ne-humanih životinja, npr. glodara, npr. miševa ili pacova, poželјno je da se endogeni IL-4 i/ili IL-4Rα proteini zamene humanim IL-4 i/ili IL-4Rα proteinima.
[0121] Dalјe, u različitim aspektima, kako bi se izbegli potencijalni problemi prekomerne ili nedovolјne ekspresije humanih IL-4 i/ili IL-4Rα proteina, poželјno je umetanje humanih IL-4 i/ili IL-4Rα gena u genom ne-humanih životinja, npr. glodara, npr. miševa ili pacova, na endogenim lokusima IL-4 i/ili IL-4Rα gena, i da se eksprimuju humani IL-4 i/ili IL-4Rα proteini kod ne-humanih životinja, npr. glodara, npr. miševa ili pacova, pod kontrolom, bar delimično, endogenih regulatornih elemenata IL-4 i/ili IL-4Rα.
Genetski modifikovane ne-humane životinje
[0122] Ovde su opisane genetski modifikovane ne-humane životinje čiji je endogeni IL-4 gen i/ili IL-4Rα gen zamenjen u celini ili delimično, na endogenom IL-4 lokusu i/ili IL-4Rα lokusu, sa nukleinskom kiselinom humanog IL-4 i/ili nukleinskom kiselinom humanog IL-4Rα da se formira modifikovani IL-4 gen i/ili modifikovani IL-4Rα gen koji kodira humani ili humanizovani IL-4 i/ili humani ili humanizovani IL-4Rα protein.
[0123] Izraz „ne-humana životinja", kao što se ovde koristi, odnosi se na bilo koji organizam kičmenjaka koji nije čovek. U nekim aspektima, ne-humana životinja je sisar. U specifičnim aspektima, ne-humana životinja je glodar, poput pacova ili miša.
[0124] U jednom aspektu, ovde su opisani genetski modifikovani glodari, npr. miševi ili pacovi čiji je endogeni IL-4 gen glodara zamenjen u celini ili delimično, na endogenom IL-4 lokusu, sa nukleinskom kiselinom humanog IL-4.
[0125] Zamena uklјučuje zamenu najmanje jednog egzona, tj. jednog ili više egzona, IL-4 gena glodara sa humanom nukleinskom kiselinom koja sadrži najmanje jedan egzon humanog IL-4 gena. U nekim aspektima, susedni genomski fragment glodara koji uklјučuje egzon 1 koji počinje od kodona za inicijaciju ATG preko egzona 4 IL-4 gena glodara zamenjen je susednim humanim genomskim fragmentom koji uključuje egzon 1 počevši od kodona za inicijaciju ATG do egzona 4 humanog IL-4 gena. U specifičnom aspektu, glodar je miš i susedni genomski fragment miša od oko 6.3 kb na endogenom mišjem IL-4 lokusu, uklјučujući egzon 1 koji počinje od kodona za inicijaciju ATG do egzona 4 (uklјučujući 3’ neprevedeni region) i dela 3’ regiona nishodno od egzona 4, briše se i zamenjuje sa oko 8.8 kb sekvence nukleinske kiseline humanog IL-4 koja sadrži egzon 1 počevši od kodona za inicijaciju ATG do egzona 4 (uklјučujući 3’ neprevedeni region) i dela 3’ regiona nishodno od egzona 4 humanog IL-4 gena.
[0126] U nekim aspektima, zamena rezultira modifikovanim, humanizovanim IL-4 genom na endogenom lokusu IL-4 gena, pri čemu je eksprimovanje modifikovanog IL-4 gena pod kontrolom endogenih regulatornih elemenata na endogenom IL-4 lokusu. Izraz „regulatorni elementi“ koji se ovde koristi odnosi se na transkripcione regulatorne sekvence, uklјučujući i 5’ transkripcione regulatorne sekvence kao što su promotor, pojačivač i supresorski elementi, i 3’ transkripcione regulatorne sekvence, kao što je transkripciona terminaciona sekvenca. U nekim aspektima, ekspresija modifikovanog IL-4 gena je pod kontrolom endogenih 5’ regulatornih elemenata. U drugim aspektima, ekspresija modifikovanog IL-4 gena je pod kontrolom endogenih 3’ regulatornih elemenata. U određenim aspektima, ekspresija modifikovanog IL-4 gena je pod kontrolom endogenih 5’ i 3’ regulatornih elemenata.
[0127] Modifikovani, humanizovani IL-4 gen formiran na endogenom IL-4 lokusu kodira humani ili humanizovani IL-4 protein. Izraz „humanizovani“ odnosi se na nukleinske kiseline ili proteine koji uklјučuju delove ili sekvence gena ili proteina koji se nalaze u ne-humanoj životinji (npr. glodaru kao što je miš ili pacov), a takođe uklјučuju delove ili sekvence koji se razlikuju od onih pronađenih u ne-humanoj životinji, ali umesto toga odgovaraju (identični su sa) delovima ili sekvencama sličnog humanog gena ili proteina. Modifikovani, humanizovani IL-4 gen može kodirati IL-4 protein koji je najmanje 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičan, ili je 100%identičan, sa humanim IL-4 proteinom (npr. humani IL-4 protein kodiran nukleinskom kiselinom naveden u GenBank Accession No. NM_000589.3).
[0128] Genetski modifikovan glodar koji ima zamenu endogenog IL-4 gena glodara u celini ili delimično, na endogenom IL-4 lokusu, sa nukleinskom kiselinom humanog IL-4, može biti homozigotan ili heterozigotan u odnosu na zamenu. U nekim aspektima, genetski modifikovani glodar je heterozigotan u odnosu na zamenu, tj. samo je jedna od dve kopije endogenog IL-4 gena glodara zamenjena nukleinskom kiselinom humanog IL-4. U drugim aspektima, genetski modifikovani glodar je homozigotan u odnosu na zamenu, tj. obe kopije endogenog IL-4 gena glodara zamenjene su nukleinskom kiselinom humanog IL-4.
[0129] Genetski modifikovani glodar eksprimuje humani ili humanizovani IL-4 protein u serumu. U nekim aspektima, genetski modifikovani glodar ne eksprimuje endogeni IL-4 protein glodara. U jednom aspektu, serum glodara koji eksprimuje humani ili humanizovani IL-4 protein ima približno isti nivo IL-4 proteina kao i glodar koji eksprimuje funkcionalan, endogeni IL-4 protein, npr. divlјeg tipa glodara (npr. glodar koji eksprimuje funkcionalni endogeni IL-4 protein, ali ne obuhvata zamenu endogenog IL-4 gena u celini ili delimično, na endogenom IL-4 lokusu, sa nukleinskom kiselinom humanog IL-4). Pod „približno istim nivoom“ podrazumeva se nivo koji pada unutar 25%, 20%, 15%, 10%, 5% ili manje u oba smera (tj. veći od ili manji od) nivoa divljeg tipa glodara. U drugim aspektima, glodar eksprimuje humani ili humanizovani IL-4 protein u serumu u koncentraciji od najmanje oko 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190% ili 200% nivoa IL-4 proteina prisutnog u serumu glodara istog uzrasta koji eksprimuje funkcionalni endogeni IL-4 protein, ali ne obuhvata zamenu endogenog IL-4 gena u celini ili delimično, na endogenom IL-4 lokusu, nukleinskom kiselinom humanog IL-4.
[0130] U nekim aspektima, genetski modifikovani glodar koji ima zamenu endogenog IL-4 gena glodara u celini ili delimično sa nukleinskom kiselinom humanog IL-4 i koji eksprimuje humani ili humanizovani IL-4 protein u serumu ima normalan imunološki sistem, tj. broj imunih ćelija, npr. B i T ćelija, u krvi, plazmi ili serumu glodara koji eksprimuje humani ili humanizovani IL-4 protein sličan je broju imunih ćelija, npr. B i T ćelija, u krvi, plazmi ili serumu glodara koji eksprimuje funkcionalni endogeni IL-4 protein i nema zamenu endogenog IL-4 gena u celini ili delimično sa nukleinskom kiselinom humanog IL-4.
[0131] U dodatnim aspektima, genetski modifikovani glodar koji ima zamenu endogenog IL-4 gena glodara u celini ili delimično sa nukleinskom kiselinom humanog IL-4 i koji eksprimuje humani ili humanizovani IL-4 protein, takođe, uklјučuje zamenu endogenog IL-4Rα gena glodara u celini ili delimično, na endogenom IL-4 Rα lokusu, sa nukleinskom kiselinom humanog IL-4Rα, i kao rezultat, takođe eksprimuje humani ili humanizovani IL-4Rα protein.
[0132] U drugom aspektu, ovde su opisani genetski modifikovani glodari, npr. miševi ili pacovi, čiji je endogeni IL-4Rα gen glodara potpuno ili delimično zamenjen na endogenom IL-4 Rα lokusu, sa nukleinskom kiselinom humanog IL-4Rα.
[0133] Zamena uklјučuje zamenu najmanje jednog egzona, tj. jednog ili više egzona, IL-4Rα gena glodara sa humanom nukleinskom kiselinom koja sadrži najmanje jedan egzon humanog IL-4Rα gena. U nekim aspektima, zamena uklјučuje zamenu najmanje jednog od egzona IL-4Rα gena glodara koji kodira ektodomen glodara sa najmanje jednim od egzona humanog IL-4Rα gena koji kodira humani ektodomen. U nekim aspektima, zamena uklјučuje zamenu humanom nukleinskom kiselinom koja sadrži najmanje 2, 3 ili 4 od 5 egzona koji kodiraju ektodomen humanog IL-4Rα gena. U drugim aspektima, susedni genomski fragment glodara koji uklјučuje egzon 1 koji počinje od kodona za inicijaciju ATG preko egzona 5 IL-4Rα gena glodara zamenjen je genomskim fragmentom koji uklјučuje egzon 1 počevši od kodona za inicijaciju ATG do egzona 5 humanog IL-4Rα gena. U specifičnim aspektima, glodar je miš, a susedni genomski fragment miša od oko 7.1 kb na endogenom mišjem IL-4Rα lokusu, uklјučujući egzon 1 koji počinje od kodona za inicijaciju ATG preko egzona 5 i dela introna 5, je izbrisan i zamenjen sa oko 15.6 kb sekvence nukleinske kiseline humanog IL-4Rα koja sadrži egzon 1 počevši od kodona za inicijaciju ATG preko egzona 5 i dela introna 5 humanog IL-4Rα gena.
1
[0134] U nekim aspektima, zamena dovodi do modifikovanog, humanizovanog IL-4Rα gena na endogenom lokusu IL-4Rα gena, pri čemu je ekspresija modifikovanog IL-4Rα gena pod kontrolom endogenih regulatornih elemenata na endogenom IL-4Rα lokusu.
[0135] Modifikovani, humanizovani IL-4Rα gen formiran na endogenom IL-4Rα lokusu kodira humani ili humanizovani IL-4Rα protein. U nekim aspektima, modifikovani, humanizovani IL-4Rα gen kodira IL-4Rα protein koji je najmanje 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičan, ili je 100% identičan, sa humanim IL-4Rα proteinom (npr. humani IL-4 protein kodiran nukleinskom kiselinom navedenom u GenBank Accession No. NM_000418.3). U drugim aspektima, modifikovani IL-4Rα gen kodira humanizovani IL-4Rα protein koji sadrži ektodomen koji je najmanje 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičan, ili je 100% identičan, sa ektodomenom humanog IL-4Rα proteina (npr. humani IL-4 protein kodiran nukleinskom kiselinom navedenom u GenBank Accession No. NM_000418.3). U specifičnim aspektima, transmembranski i citoplazmatski domeni humanizovanog IL-4Rα proteina identični su sa transmembranskim i citoplazmatskim domenima endogenog IL-4Rα proteina glodara.
[0136] Genetski modifikovani glodar koji ima zamenu endogenog IL-4Rα gena u celini ili delimično, na endogenom IL-4Rα lokusu, sa nukleinskom kiselinom humanog IL-4Rα, može biti homozigotan ili heterozigotan u odnosu na zamenu. U nekim aspektima, genetski modifikovani glodar je heterozigotan u odnosu na zamenu, tj. samo je jedna od dve kopije endogenog IL-4Rα gena glodara zamenjena nukleinskom kiselinom humanog IL-4Rα. U drugim aspektima, genetski modifikovani glodar je homozigotan u odnosu na zamenu, tj. obe kopije endogenog IL-4Rα gena glodara zamenjene su nukleinskom kiselinom humanog IL-4Rα.
[0137] Ovde opisani genetski modifikovani glodar eksprimuje humani ili humanizovani IL-4Rα protein na imunim ćelijama, npr. B i T ćelijama. U nekim aspektima, genetski modifikovani glodar ne eksprimuje endogeni IL-4Rα protein glodara. U jednom aspektu, imune ćelije glodara koje eksprimuju humani ili humanizovani IL-4Rα protein imaju približno isti nivo IL-4Rα proteina na imunim ćelijama kao glodar koji eksprimuje funkcionalan, endogeni IL-4Rα protein na imunim ćelijama glodara divlјeg tipa koji eksprimuje funkcionalan, endogeni IL-4Rα protein i ne eksprimuje humani ili humanizovani IL-4Rα protein. U drugim aspektima, glodar eksprimuje humani ili humanizovani IL-4Rα protein na imunim ćelijama u količini od najmanje oko 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% , 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190% ili 200% količine IL-4Rα proteina prisutne na imunološkim ćelijama glodara istog uzrasta koji eksprimuje funkcionalni endogeni IL-4Rα protein, ali ne sadrži zamenu endogenog IL-4Rα gena u celini ili delimično sa nukleinskom kiselinom humanog IL-4Rα.
[0138] U nekim aspektima, genetski modifikovani glodar koji ima zamenu za endogeni IL-4Rα gen glodara u celini ili delimično sa nukleinskom kiselinom humanog IL-4Rα i koji eksprimuje humani ili humanizovani IL-4Rα protein ima normalan imunološki sistem, tj. broj imunih ćelija, npr. B i T ćelija, u krvi, plazmi ili serumu glodara koji eksprimuje humani ili humanizovani IL-4Rα protein sličan je broju imunih ćelija, npr. B i T ćelija, u krvi, plazmi ili serumu glodara divlјeg tipa (npr. glodar koji eksprimuje funkcionalni endogeni IL-4Rα protein i nema zamenu endogenog IL-4Rα gena glodara u celini ili delimično sa nukleinskom kiselinom humanog IL-4Rα).
[0139] U nekim aspektima, genetski modifikovani glodar koji ima zamenu endogenog IL-4Rα gena glodara u celini ili delimično sa nukleinskom kiselinom humanog IL-4Rα i koji eksprimuje humani ili humanizovani IL-4Rα protein je sposoban i funkcionalan u posredovanju IL -4 zavisne signalizacije i IL-13 zavisne signalizacije. Npr. humanizovani IL-4Rα protein koji ima ektodomen humanog IL-4Rα proteina, eksprimovan na imunim ćelijama genetski modifikovanog glodara, stupa u interakciju sa humanim IL-4 i posreduje u signalizaciji zavisnoj od humanog IL-4 formiranjem receptora tipa I (vidi sliku 1). Takav humanizovani IL-4Rα protein koji ima ektodomen humanog IL-4Rα proteina, takođe, stupa u interakciju sa humanim i mišjim IL-13 i posreduje u signalizaciji zavisnoj od IL-13 formiranjem receptora tipa II (vidi sliku 1). Funkcionalnost humanizovanog IL-4Rα proteina eksprimovanog u genetski modifikovanom glodaru može se proceniti različitim testovima poznatim u tehnici, uklјučujući one koji su posebno opisani u dole navedenim primerima, kao što je test koji meri prebacivanje klase IgE izazvano IL-4 korišćenjem primarnih B ćelija izvedenih od genetski modifikovanog glodara.
[0140] U dodatnim aspektima, genetski modifikovani glodar koji ima zamenu endogenog IL-4Rα gena glodara u celini ili delimično sa nukleinskom kiselinom humanog IL-4Rα i koji eksprimuje humani ili humanizovani IL-4Rα protein, takođe uklјučuje zamenu endogenog IL-4 gena glodara u celini ili delimično, na endogenom IL-4 lokusu, sa nukleinskom kiselinom humanog IL-4, i kao rezultat, takođe eksprimuje humani ili humanizovani IL-4.
[0141] U dalјem aspektu, ovde su opisani dvostruko humanizovani glodari, npr. miševi ili pacovi, čiji je endogeni IL-4 gen glodara zamenjen u celini ili delimično, na endogenom IL-4 lokusu, sa nukleinskom kiselinom humanog IL-4, i čiji je endogeni IL-4Rα gen glodara, takođe, potpuno ili delimično zamenjen na endogenom IL-4 Rα lokusu, nukleinskom kiselinom humanog IL-4Rα. Takvi dvostruko humanizovani glodari mogu biti homozigotni ili heterozigotni u odnosu na svaku zamenu humanizacije. U specifičnom aspektu, dvostruko humanizovani glodar je homozigotan u odnosu i na humanizovani IL-4 i na humanizovani IL-4Rα.
[0142] Genetska modifikacija endogenog IL-4 gena glodara kod dvostruko humanizovanog glodara uklјučuje one modifikacije ili zamene opisane gore za genetski modifikovanog glodara koji ima zamenu endogenog IL-4 gena glodara u celini ili delimično sa nukleinskom kiselinom humanog IL-4. Slično, genetska modifikacija na endogenom IL-4Rα genu glodara kod dvostruko humanizovanog glodara uklјučuje one modifikacije ili zamene opisane gore za genetski modifikovanog glodara koji ima zamenu endogenog IL-4Rα gena glodara u celini ili delimično sa nukleinskom kiselinom humanog IL -4Rα. Prema tome, karakteristike koje su gore opisane u pogledu humanizacije IL-4 gena glodara, i u odnosu na humanizaciju gena glodara, ovde su inkorporirana posebno za dvostruko humanizovanog glodara.
[0143] U specifičnim aspektima, ovde je opisan dvostruko humanizovani glodar, npr. miš ili pacov, koji eksprimuje humani IL-4 protein i humanizovani IL-4Rα protein, pri čemu humanizovani IL-4Rα protein uklјučuje ektodomen humanog IL-4Rα proteina i uklјučuje transmembranske i citoplazmatske domene endogenog IL-4Rα proteina glodara. U posebnim aspektima, ekspresija humanog IL-4 proteina i humanizovanog IL-4Rα proteina su pod kontrolom endogenih regulatornih sekvenci glodara na endogenom IL-4 lokusu glodara i IL-4Rα lokusu glodara, tim redosledom.
[0144] U nekim aspektima, dvostruko humanizovani glodar ima normalan imunološki sistem (tj. broj imunoloških ćelija je približno isti kao kod divlјeg tipa glodara), ima približno isti nivo IL-4 proteina u serumu i eksprimuje približno istu količinu IL-4Rα proteina na imunim ćelijama, kao divlјi tip glodara, divlјi tip glodara je glodar koji eksprimuje funkcionalni, endogeni IL-4 protein i IL-4Rα protein i ne eksprimuje humani ili humanizovani IL-4 protein ili IL-4Rα protein.
[0145] U posebnim aspektima, dvostruko humanizovani glodar pokazuje funkcionalnu putanju IL-4 signalizacije. Pod „funkcionalnom putanjom IL-4 signalizacije“ podrazumeva se da su i humani ili humanizovani IL-4 protein, i humani ili humanizovani IL-4Rα protein, eksprimovani u dvostruko humanizovanom glodaru i međusobno deluju u dvostruko humanizovanom glodaru tako da efikasno posreduju nizvodnu transdukciju signala i sprovode biološke aktivnosti normalne putanje IL-4 signalizacije. Biološke aktivnosti normalne putanje IL-4 signalizacije opisane su gore i prikazane na slici 1, uklјučujući one posredovane preko receptora tipa I, kao što su inicijacija i održavanje Th2 diferencijacije, aktivacija i uzgoj B ćelija, prelazak klase na IgE i IgG4 i one posredovane signalizacijom receptora tipa II, poput hiperplazije peharastih ćelija, subepitelne fibroze i remodeliranja tkiva. Npr. funkcionalna putanja IL-4 signallizacije kod dvostruko humanizovanog glodara odražava se upalnim fenotipom koji karakteriše, npr. povećan IgE u cirkulaciji, upala disajnih puteva i/ili eozinofilne infiltrirajuće ćelije kao odgovor na izazov grinja iz kućne prašine, čiji fenotip takođe se primećuje kod glodara divlјeg tipa bez dvostruke humanizacije.
Postupci pravljenja genetski modifikovane ne-humane životinje
[0146] Genetski modifikovana ne-humana životinja, poput glodara, može se napraviti postupcima poznatim u tehnici. Na primer, može se napraviti ciljajući vektor koji sadrži humanu nukleinsku kiselinu (kao što je humani IL-4 ili IL-4Rα gen, u celini ili delimično), okružen homolognim ushodnim i nishodnim regionima homologa ne-humanih životinja. Ciljajući konstrukt, takođe, može da sadrži selekcionu kasetu za lek (npr. floksiranu higro selekcionu kasetu, koja se naknadno može ukloniti prolaznim vektorom Cre-ekspresije), koja je pozicionirana 3’ u odnosu na humanu nukleinsku kiselinu. Ciljajući vektor se može uvesti u genom ne-humane životinjske ćelije, npr. embrionalne matične (ES) ćelije (kao što je ES ćelija miša) elektroporacijom, na primer. Pravilno cilјani klonovi ES ćelija se tada mogu uvesti u embrion u ranoj fazi (npr. embrion miša u fazi od 8 ćelija). Ne-humane životinje koje su u potpunosti izvedene iz pravilno cilјanih ES ćelija identifikuju se na osnovu, npr. analize alela. Za ne-humane životinje za koje pogodne genetski modifikovane ES ćelije nisu lako dostupne, koriste se drugi postupci da se napravi ne-humana životinja koja sadrži genetske modifikacije, kao ovde opisane. Takvi postupci uključuju, na primer, modifikaciju ne-ES ćelijskog genoma (npr. fibroblast ili indukovanu pluripotentnu ćeliju) i korišćenje nuklearnog prenosa za prenos modifikovanog genoma u odgovarajuću ćeliju, npr. oocit, i gestaciju modifikovane ćelije (npr. modifikovanog oocita) kod ne-humane životinje, pod pogodnim uslovima da formira embrion.
Postupci primene genetski modifikovane ne-humane životinje
[0147] U jednom aspektu, ne-humane životinje genetski modifikovanog IL-4 i/ili IL-4Rα, ovde opisane, koriste se za procenu farmakodinamike (PD) i terapeutske efikasnosti humano specifičnih IL-4 i/ili IL-4Rα antagonista, npr. neutralizovanje anti-IL-4 i/ili anti-IL-4Rα antitela (npr. dupilumaba) u različitim modelima bolesti, kako je dalјe prikazano u dole navedenim primerima.
[0148] Ovde je, takođe, opisan postupak skrininga za humano specifične IL-4 ili IL-4Rα antagoniste korišćenjem miševa sa dvostruko humanizovanim IL-4 i IL-4Rα koji su ovde opisani.
[0149] Pod „IL-4 ili IL-4Rα antagonistima“ podrazumevaju se molekuli (npr. antitela) koji blokiraju, potiskuju ili inhibiraju jednu ili više bioloških funkcija posredovanih IL-4 ili IL-4Rα. „Humano specifični IL-4 ili IL-4Rα antagonisti" se odnose na antagoniste koji su specifični za humani IL-4 ili IL-4Rα, i u suštini ne deluju na IL-4 ili IL-4Rα glodara.
[0150] U specifičnim aspektima, postupak skrininga koristi dvostruko humanizovanog miša koji eksprimuje humani IL-4 protein, i humanizovani IL-4Rα protein, pri čemu humanizovani IL-4Rα protein uklјučuje ektodomen humanog IL-4Rα proteina, povezan sa transmembranskim i citoplazmatskim domenom endogenog mišjeg IL-4Rα proteina, pri čemu miš ne eksprimuje mišji IL-4 ili mišji IL-4Rα.
[0151] U nekim aspektima, postupak skrininga za humano specifične IL-4 ili IL-4Rα antagoniste sastoji se u davanju sredstva genetski modifikovanom glodaru koji je dvostruko humanizovan za IL-4 i IL-4Rα, kao što je ovde opisano, određujući efekat sredstva na biološku funkciju posredovanu putanjom IL-4/IL-4Rα signalizacije, i identifikovanje sredstva kao humanog specifičnog IL-4 ili IL-4Rα antagonista ako antagonizira funkciju posredovanu putanjom IL-4/IL-4Rα signalizacije kod genetski modifikovanog glodara.
[0152] U jednom aspektu, sredstvo sadrži varijabilni domen imunoglobulina koji vezuje IL-4 ili IL-4Rα. U jednom aspektu, sredstvo specifično vezuje humani IL-4 ili IL-4Rα, ali ne i IL-4 ili IL-4Rα glodara. U jednom aspektu, sredstvo je antitelo. U specifičnom aspektu, sredstvo je antitelo koje specifično vezuje humani IL-4Rα, ali ne i IL-4Rα glodara.
[0153] U jednom aspektu, postupak skrininga koristi dvostruko humanizovanog miša koji eksprimuje humani IL-4 protein i humanizovani IL-4Rα protein, pri čemu humanizovani IL-4Rα protein uklјučuje ektodomen humanog IL-4Rα proteina, koji je povezan sa transmembranskim i citoplazmatskim domenom endogenog mišjeg IL-4Rα proteina, i pri čemu miš ne eksprimuje mišji IL-4 ili mišji IL-4Rα.
[0154] U nekim aspektima, postupak skrininga uklјučuje korake indukcije kod dvostruko humanizovanog glodara, kao što je ovde opisano, bolesti povezane sa IL-4/IL-4Rα signalizacijom, davanje sredstva glodaru, utvrđivanje da li sredstvo ublažava bolest, i identifikovanje sredstva kao humano specifičnog IL-4 ili IL-4Rα antagonista pogodnog za lečenje bolesti ako sredstvo ublažava bolest.
[0155] Pod „bolešću povezanom sa IL-4/IL-4Rα signalizacijom“ podrazumeva se bolest u kojoj je uključena biološka funkcija posredovana IL-4/IL-4Rα signalizacijom. Primeri bolesti povezanih sa IL-4/IL-4Rα signalizacijom uklјučuju, npr. inflamatorne bolesti ili poremećaje, poput astme, atopijskog dermatitisa, hronične opstruktivne bolesti pluća (KOPB) (koja može nastati barem delimično zbog dima cigareta), inflamatorne bolesti creva, multiple skleroze, artritisa, alergijskog rinitisa, eozinofilnog ezofagitisa i psorijaze. Astma može biti eozinofilna ili neeozinofilna astma, i astma osetlјiva ili rezistentna na steroide.
[0156] U nekim aspektima, bolest povezana sa IL-4/IL-4Rα signalizacijom je upala disajnih puteva, koja se može izazvati kod glodara intranazalnom primenom alergena (npr. ekstrakta grinje iz kućne prašine) u jednoj ili više doza tokom određenog perioda. Efekat sredstva može se odrediti merenjem da li je stepen upale disajnih puteva (odražen, npr. nakuplјanjem sluzi, eozinofilnim infiltracionim ćelijama u tečnosti za ispiranje bronhoalveolarnog sistema, nivoima ukupnog cirkulišućeg IgE i/ili promenom profila ekspresije merlјivim analizom ekspresije mikroniza) se smanjuje kao rezultat primene sredstva. Alergen koji se koristi za izazivanje upale disajnih puteva i sredstvo koje se testira mogu se primenjivati istovremeno ili u različito vreme. U nekim aspektima, alergen se daje glodaru u jednoj ili više doza, a sredstvo koje se testira se daje glodaru nakon što je glodaru data najmanje jedna doza alergena.
[0157] U nekim aspektima, bolest povezana sa IL-4/IL-4Rα signalizacijom je upala kože ili atopijski dermatitis, koji se može izazvati kod glodara stvaranjem povrede kože i izlaganjem povređene kože alergenu (npr. bakterijskom toksinu ili ekstraktu grinje iz kućne prašine) u jednoj ili više doza tokom određenog perioda. Dejstvo sredstva može se odrediti merenjem da li je upala kože smanjena kao posledica primene sredstva.
[0158] U dalјem aspektu, trostruko humanizovane ne-humane životinje, tj. ne-humane životinje čiji su geni IL-4, IL-4Rα i IL-33 humanizovani, koriste se za procenu farmakodinamike (PD) i terapijske efikasnosti jedinjenja kandidata kao što su, npr. humano specifični IL-4 i/ili IL-4Rα antagonisti, i humano specifični IL-33 antagonisti.
[0159] Pod „antagonistima IL-33“ podrazumevaju se molekuli (npr. antitela) koji blokiraju, potiskuju ili inhibiraju jednu ili više bioloških funkcija ili IL-33 posredovanu signalizaciju. „Humano specifični IL-33 antagonisti“ odnose se na antagoniste koji su specifični za humani IL-33 i u suštini ne deluju na IL-33 glodara. Poznato je da IL-33 stimuliše transdukciju signala kroz ST2 i IL-1 RAcP, koja se smanjuje u prisustvu antagonista, kao što je antitelo na IL-33. Inhibicija transdukcije IL-33 signala kroz ST2 i IL-1 RAcP može se odrediti ispitivanjem transdukcije IL-33 signala u in vitro ili in vivo testu, poput onih opisanih u publikaciji US Published Application 2014/0271658 A1. Na primer, test kao što je opisan u US Published Application 2014/0271658 A1 može se koristiti za procenu efekta antitela na IL-33 na upalu pluća kod životinja osetlјivih na alergen koje su homozigotne za ekspresiju humanog IL-33. Antitelo na IL-33 koje je efikasno kao IL-33 antagonist trebalo bi da pokaže trend smanjenja inflamatornih ćelija u plućima, kao i trend smanjenja citokina kao što su IL-4 i IL-5.
[0160] U specifičnim aspektima, ovde se koristi trostruko humanizovana ne-humana životinja za procenu jedinjenja kandidata, pri čemu je trostruko humanizovana životinja trostruko humanizovani miš koji eksprimuje humani IL-4 protein, humanizovani IL-4Rα protein koji uklјučuje ektodomen humanog IL-4Rα proteina vezan za transmembranski i citoplazmatski domen mišjeg IL-4Rα proteina i humani IL-33 protein, pri čemu miš ne eksprimuje mišji IL-4, mišji IL-4Rα ili mišji IL-33.
[0161] U nekim aspektima, trostruko humanizovana ne-humana životinja koristi se za procenu farmakodinamike (PD) i terapijske efikasnosti jedinjenja kandidata, kao što je, npr. humano specifični IL-4 i/ili IL-4Rα antagonist, ili humano specifični IL-33 antagonist. Na primer, humano specifično IL-4 antitelo, humano specifično IL-4Rα antitelo i humano specifično IL-33 antitelo, mogu se pojedinačno testirati na trostruko humanizovanoj životinji (kao što je glodar, npr. miš ili pacov), a njihovi PD profili i terapeutska efikasnost mogu se oceniti i uporediti.
[0162] U drugim aspektima, trostruko humanizovana ne-humana životinja koristi se za procenu efikasnosti kombinacije jedinjenja, npr. kombinacije antitela specifična na humane IL-4 i/ili IL-4Rα antagoniste, sa antitelom specifičnim na humani IL-33 antagonist, u poređenju sa efikasnošću jedinjenja kada se koriste pojedinačno za određivanje, npr. da li kombinacija jedinjenja pokazuje sinergični terapeutski efekat. U specifičnim aspektima, kombinacija humano specifičnog IL-4 antitela i humano specifičnog IL-33 antitela je testirana na trostruko humanizovanoj ne-humanoj životinji. U drugim specifičnim aspektima, kombinacija humano specifičnog IL-4Rα antitela i humano specifičnog IL-33 antitela je testirana na trostruko humanizovanoj ne-humanoj životinji.
[0163] Za procenu jedinjenja kandidata ili kombinacije jedinjenja, bolest povezana sa IL-4/IL-4Rα signalizacijom i IL-33 signalizacijom može se indukovati kod trostruko humanizovane životinje. Primeri bolesti povezanih sa IL-4/IL-4Rα signalizacijom i IL-33 signalizacijom uklјučuju, npr. inflamatorne bolesti ili poremećaje, kao što su astma, atopijski dermatitis, hronična opstruktivna bolest pluća (KOPB) (koja može nastati barem delimično zbog dima cigareta), inflamatorne bolesti creva, multiple skleroze, artritisa, alergijskog rinitisa, eozinofilnog ezofagitisa i psorijaze. Astma može biti eozinofilna ili neeozinofilna astma, i astma osetlјiva ili rezistentna na steroide. Efekat jedinjenja ili kombinacije jedinjenja može se proceniti kao IL-4/IL-4Rα dvostruko humanizovane životinje kako je gore opisano.
[0164] Predmetni pronalazak je dalјe prikazan sledećim neograničavajućim primerima.
Primer 1
Zamena engodenog mišjeg IL-4 gena sa humanim IL-4 genom
1
[0165] Humani IL-4 gen od 8.8 kb koji sadrži kodirajući deo egzona 1 počevši od kodona za inicijaciju ATG do egzona 4 (uklјučujući 3’ neprevedeni region) i dela 3’ regiona nishodno od egzona 4 humanog IL-4 gena je zamenio 6.3 kb mišjeg IL-4 lokusa gena koji obuhvata kodirajući deo egzona 1 počevši od kodona za inicijaciju ATG preko egzona 4 (uklјučujući 3’ neprevedeni region) i deo 3’ regiona nishodno od egzona 4. Vidi sliku 2A.
[0166] Ciljajući konstrukt za zamenu mišjeg humanim IL-4 genom u jednom koraku cilјanja konstruisan je korišćenjem tehnologije genetskog inženjeringa VelociGene® (vidi: Valenzuela et al. (2003) High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, Nature Biotech, 21(6):652-659). Mišja i humana IL-4 DNK dobijene su iz klonova bakterijskog veštačkog hromozoma (BAC) bMQ-41A12 i RP11-17K19, tim redosledom. Ukratko, Sbfl linearizovani ciljajući konstrukt generisan kloniranjem popravke praznine koji sadrži mišje IL-4 ushodne i nizvodne homologne krakove koji okružuju sekvencu humanog IL-4 od 8.8 kb koja se proteže od ATG kodona u egzonu 1 do egzona 4 (uklјučujući 3’ neprevedeni region) i deo 3’ regiona nishodno od egzona 4 (genomske koordinate: GRCh37: chr5:132,009,743-132,018,576 (+ soj)) i floksiranu higro selekcionu kasetu, elektroporisan je u F1H4 embrionalne matične ćelije miša (C57BL/6) x 129 F1 hibrid). Pravilno cilјane ES ćelije (MAID 879) su dalјe elektroporisane prolaznim Cre ekspresionim vektorom da bi se uklonila selekciona kaseta za lek. Cilјani klonovi ES ćelija bez kasete sa lekovima (MAID 1553) uvedeni su u embrion miša SW miševa od 8 ćelija pomoću metode VelociMouse® (vidi, U.S. Pat. Nos. 7,294,754, 7,576,259, 7,659,442, i Poueymirou et al. (2007) Miševi generacije F0 koji su u suštini u potpunosti izvedeni iz donorskih gen cilјanih ES ćelija što omogućava neposredne fenotipske analize, Nature Biotech. 25(1):91-99). VelociMice® (miševi F0 u potpunosti izvedeni iz donorske ES ćelije) koji nose humanizovani IL-4 gen identifikovani su genotipizacijom radi gubitka mišjeg alela i dobijanja humanog alela korišćenjem modifikacije alelnog testa (videti, Valenzuela et al. (2003)).
[0167] Pravilno cilјani klonovi ES ćelija identifikovani su testom gubitka nativnog alela (LONA) (Valenzuela et al.
2003) u kojem je broj kopija nativnog, nemodifikovanog IL-4 gena određen pomoću dve TaqMan™ kvantitativne polimerazne lančane reakcije (qPCRs) specifične za sekvence u mišjem IL-4 genu koje su cilјane za brisanje. qPCR testovi su sadržali sledeće skupove prajmer - proba (napisano 5’ do 3’): ushodni forward prajmer CATGCACGGA GATGGATGTG (SEQ ID NO:1); ushodni reverzni prajmer, GACCCCTCAG GTCCACTTAC C (SEQ ID NO:2); ushodna proba, FAM-AACGTCCTCA CAGCAACGA-MGB (SEQ ID NO:3); nishodni forward prajmer, GTGCCCAGGT GTGCTCATG (SEQ ID NO:4); nishodni reverzni prajmer, CGCCTGCCTC CTCACTTTAT C (SEQ ID NO:5); nizvodna proba, FAM-ATCTGCTTCA CCATCCACT-MGB (SEQ ID NO:6); gde se FAM odnosi na 5-karboksifluorescein fluorescentnu probu, a BHQ se odnosi na gašenje fluorescencije tipa gašenja crnih rupa (Biosearch Technologies). DNK prečišćena iz klonova ES ćelija koje je zauzeo ciljajući vektor i ugradio se u njihove genome kombinovana je sa TaqMan™ Gene Expression Master Mix (Life Technologies) prema preporukama proizvođača na PCR ploči sa 384 ležišta (MicroAmp™ Optical 384-Well Reaction Plate, Life Technologies) i ciklira se u Applied Biosystems Prism 7900HT, koja prikuplјa podatke o fluorescenciji tokom PCR-a i određuje prag ciklusa (Ct), frakcioni PCR ciklus u kome akumulirana fluorescencija dostiže unapred podešeni prag. Ushodni i nishodni IL-4 specifični qPCR i dva qPCR za necilјane referentne gene sprovedeni su za svaki DNK uzorak. Izračunate su razlike u vrednostima Ct (ΔCt) između svakog qPCR-a specifičnog za IL-4 i svakog referentnog gena qPCR-a, a zatim je izračunata razlika između svakog ΔCt i medijana ΔCt za sve ispitivane uzorke kako bi se dobile vrednosti ΔΔCt za svaki uzorak. Broj kopije IL-4 gena u svakom uzorku izračunat je prema sledećoj formuli: broj kopije = 2x2-<ΔΔCt>. Pravilno cilјani klon, koji je izgubio jednu od svojih nativnih kopija, imaće broj kopije IL-4 gena jednak jedan. Potvrda da je sekvenca humanog IL-4 gena zamenila izbrisanu sekvencu mišjeg IL-4 gena u humanizovanom alelu potvrđena je TaqMan™ qPCR testom koji sadrži sledeće skupove prajmer -proba (napisano 5’ do 3’): humani forward prajmer, GCCTGGACCA AGACTCTGT (SEQ ID NO:7); humani reverzni prajmer, ACCGTGGGAC GGCTTCTTAC (SEQ ID NO:8); humana ushodna proba, FAM-CACCGAGTTG ACCGTAACAG ACATC-BHQ (SEQ ID NO:9). Potvrda da je higro selekciona kaseta umetnuta sa sekvencom humanog IL-4 gena u humanizovanom alelu potvrđena je TaqMan™ qPCR testom koji sadrži sledeće skupove prajmer - proba (napisano 5’ do 3’): higro forward prajmer, TGCGGCCGAT CTTAGCC (SEQ ID NO:10); higro reverzni prajmer, TTGACCGATT CCTTGCGG (SEQ ID NO:11); higro proba, FAM-ACGAGCGGGT TCGGCCCATT C-BHQ (SEQ ID NO:12).
[0168] Isti LONA test je korišćen za ispitivanje DNK pročišćene iz biopsije repa za miševe izvedene iz cilјanih ES ćelija da bi se odredili njihovi IL-4 genotipovi i potvrdilo da se humanizovani IL-4 alel preneo kroz zametnu liniju. Dva mladunca heterozigotna za zamenu se uzgajaju da bi se dobio miš koji je homozigotan za zamenu endogenog mišjeg IL-4 gena humanim IL-4 genom. Mladunci koji su homozigotni za zamenu koriste se za fenotipizaciju.
[0169] Ushodno spajanje mišjeg IL-4 lokusa i sekvence koja sadrži humani IL-4 gen je dodeljeno da bude unutar 5’-TGCTGATTGG CCCAGAATAA CTGACAATCT GGTGTAATAA AATTTTCCAA TGTAAACTCA TTTTCCCTTG GTTTCAGCAA CTTTAACTCT ATATATAGAG AGACCTCTGC CAGCATTGCA TTGTTAGCAT CTCTTGATAA ACTTAATTGT CTCTCGTCAC TGACGGCACA GAGCTATTG(A TGGGTCTCAC CTCCCAACTG CTTCCCCCTC TGTTCTTCCT GCTAGCATGT GCCGGCAACT TTGTCCACGG ACACAAGTGC GATATCACCT TACAGGAGAT CATCAAAACT TTGAACAGCC TCACAGAGCA GAAG)GTGAGT ACCTATCTGG CACCATCTCT CCAGATGTTC TGGTGATGCT CTCAGTATTT CTAGGCATGA AAACGTTAACAGCTGCTAGA GAAGTTGGAA CTGGTGGTTG GTGGCAGTCCAGGGCACACA GCGAGGCTTC TCCCCTGC (SEQ ID NO:13), pri čemu su humane IL-4 skevence nakošene a sekvence koje kodiraju IL-4 su u zagradama. Nishodni spoj sekvence koja sadrži humani IL-4 gen i floksiranu higro selekcionu kasetu dizajniran je tako da bude unutar 5’-TGTTTATTTT GCAG(AATTCC TGTCCTGTGA AGGAAGCCAA CCAGAGTACG TTGGAAAACT TCTTGGAAAG GCTAAAGACG ATCATGAGAG AGAAATATTC AAAGTGTTCG AGCTGA)ATAT TTTAATTTAT GAGTTTTTGA TAGCTTTATT TTTTAAGTAT TTATATATTTA TAACTCATC ATAAAATAAA GTATATATAG AATCTAACAG CAATGGCATT TAATGTATTG GCTATGTTTA CTTGACAAAT GAAATTATGG TTTGCAACTT TTAGGGAAAT CAATTTAGTT TACCAAGAGA CTATAAATGC TATGGGAGCA AAACAGGAAA GACCACTTCC CCCTCGAGGG GTTCCCTCTC GAGTTAGGGA CATAACACAC AAGATAATTA AAGAACACAA GGCCATACAA GATGCGGCCG CACCGGTATA ACTTCGTATA AGGTATCCTA TACGAAGTTA TATGCATGGC CTCCGCGCCG GGTTTTGGCG CCTCCCGCGG GCGCCCCCCT CCTCACGGCG AGCGCTGCCA CGTCAGACGA AGGGCGCAGC GAGCGTCCTG ATCCT
(SEQ ID NO:14), pri čemu su humane IL-4 sekvence nakošene i IL-4 kodirajuće sekvence su u zagradama. Nishodni spoj sekvence floksirane higro selekcione kasete i mišjeg IL-4 lokusa dizajniran je tako da bude unutar 5’-TGCCAAGTTC TAATTCCATC AGACCTCGAC CTGCAGCCGG CGCGCCATAA CTTCGTATAA GGTATCCTAT ACGAAGTTAT CTCGAGAGGA GTTCCCACCC TTCTCAAGAG CATAATGCGC AGATCATTAA GGGACAGATG CAGGCTGGGG AGACGGTTCA GCAGTTAGGA GTACCTGTTG CTCTTCCAGA GGACCCAGGT TCAATTCCCG GCACTCACAT AGCAGCTTAA AACAATAACT CAAGTTCTGG GGGAGCTGAT GCTCTCCTCT GGCCTCCTGT GGAGGTACAC AGACCACATG CCTGTAGGCA AGACACCCAC ACACATAAAA ACAAAATAAA ATAAGGATAG AAAGGCCAGG GGGATGAATC CAGAGGTAGA AGAAAACTTA TTCCCTGGAA TTGTCCTCTG ACTCCCCTCC CAAAACCTCT AACACGCAT (SEQ ID NO:15), pri čemu su sekvence higro kasete nakošene.
Primer 2
Zamena endogene mišje IL-4Rα ektodomenske genske sekvence sa humanom IL-4Rα ektodomenskom
genskom sekvencom
[0170] Humani IL-4Rα gen od 15.6 kb koji sadrži egzon 1 koji počinje od kodona za inicijaciju ATG preko egzona 5 i deo introna 5 humanog IL-4Rα gena zamenio je 7.1 kb mišjeg IL-4Rα lokusa gena koji obuhvata kodirajući egzon 1 počevši od kodona za inicijaciju ATG kroz egzon 5 i deo introna 5. Zadržani su mišji egzoni 6 do 9; humanizovani su samo egzoni 1 do 5 (tj. ektodomen). Vidi sliku 2B.
[0171] Ciljajući konstrukt za zamenu mišjeg humanim IL-4Rα genom u jednom koraku cilјanja konstruisan je korišćenjem tehnologije genetskog inženjeringa VelociGene® (vidi: Valenzuela et al. (2003) High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, Nature Biotech, 21(6):652-659). Mišja i humana IL-4Rα DNK dobijene su iz bakterijskih klonova veštačkog hromozoma (BAC) RP23-136G14 i RP11-166E24, tim redosledom. Ukratko, NotI linearizovani ciljajući konstrukt generisan kloniranjem popravke praznine koji sadrži mišji IL-4Rα gen ushodno i nishodno homolognih krakova koji okružuju sekvencu humanog IL-4Rα od 15.6 kb koja se proteže od ATG kodona u egzonu 1 kroz egzon 5 i deo introna 5 (genomske koordinate: GRCh37: chr16:27,351,525-27,367,111 (+ soj)) i floksirana neo selekciona kaseta, elektroporisan je u F1H4 embrionalne matične ćelije miša (C57BL/6 x 129 F1 hybrid). Pravilno cilјane ES ćelije (MAID 803) su dalјe elektroporisane prolaznim Cre eskpresionim vektorom da bi se uklonila selekciona kaseta za lek. Cilјani klonovi ES ćelija bez kasete sa lekovima (MAID 1444) uvedeni su u embrion miša SW miševa u fazi od 8 ćelija pomoću metode VelociMouse® (vidi U.S. Pat. Nos. 7,294,754, 7,576,259, 7,659,442, i Poueymirou et al. (2007) Miševi generacije F0 koji su u suštini u potpunosti izvedeni iz donorskih gen cilјanih ES ćelija što omogućava neposredne fenotipske analize, Nature Biotech. 25(1):91-99). VelociMice® (miševi F0 u potpunosti izvedeni iz donorske ES ćelije) koji nose humanizovani IL-4Rα gen identifikovani su genotipizacijom za gubitak mišjeg alela i dobijanje humanog alela korišćenjem modifikacije alelskog testa (videti, Valenzuela et al. (2003)).
[0172] Pravilno cilјani klonovi ES ćelija identifikovani su testom gubitka nativnog alela (LONA) (Valenzuela et al.
2003) u kojem je broj kopija nativnog, nemodifikovanog IL-4Rα gena određen pomoću dve TaqMan™ kvantitativne polimerazne lančane reakcije (qPCR) specifične za sekvence u mišjem IL-4Rα genu koje su cilјane za brisanje. qPCR testovi su sadržali sledeće skupove prajmer - proba (napisano 5’ do 3’): ushodni forward prajmer, CCGCTGGCAT GTGTATTGTG (SEQ ID NO:16); ushodni reverzni prajmer, TGAGTGTGGG ACCCTCAAGA G (SEQ ID NO:17); ushodna proba, FAM-TGACCCAAGC CCTACATGGC CACT-BHQ (SEQ ID NO:18); nishodni forward prajmer, TGAGGAGAGC TCACGGGAAT C (SEQ ID NO:19); nishodni reverzni prajmer, ACCCATCTCC TGCGTTTCTG (SEQ ID NO:20); nizvodna proba, FAM-TTGACACGCC AGCTACACTG CTCCA-BHQ (SEQ ID NO:21); gde se FAM odnosi na 5-karboksifluorescein fluorescentnu sondu, a BHQ se odnosi na gašenje fluorescencije tipa gašenja crnih rupa (Biosearch Technologies). DNK prečišćena iz klonova ES ćelija koje je zauzeo ciljajući vektor i ugradio se u njihove genome kombinovana je sa TaqMan™ Gene Expression Master Mix (Life Technologies) prema preporukama proizvođača na PCR ploči sa 384 ležišta (MicroAmp™ Optical 384-Well Reaction Plate, Life Technologies) i ciklira se u Applied Biosystems Prism 7900HT, koja prikuplјa podatke o fluorescenciji tokom PCR-a i određuje prag ciklusa (Ct), frakcioni PCR ciklus u kome akumulirana fluorescencija dostiže unapred podešeni prag. Ushodni i nishodni IL-4Rα specifični qPCR i dva qPCR za necilјane referentne gene sprovedeni su za svaki DNK uzorak. Izračunate su razlike u vrednostima Ct (ΔCt) između svakog qPCR-a specifičnog za IL-4Rα i svakog referentnog gena qPCR-a, a zatim je izračunata razlika između svakog ΔCt i medijana ΔCt za sve ispitivane uzorke kako bi se dobile vrednosti ΔΔCt za svaki uzorak. Broj kopije IL-4Rα gena u svakom uzorku izračunat je prema sledećoj formuli: broj kopije = 2x2-<ΔΔCt>. Pravilno cilјani klon, koji je izgubio jednu od svojih nativnih kopija, imaće broj kopije IL-4Rα gena jednak jedan. Potvrda da je sekvenca humanog IL-4Rα gena zamenila izbrisanu sekvencu mišjeg IL-4Rα gena u humanizovanom alelu potvrđena je TaqMan™ qPCR testom koji sadrži sledeće skupove prajmer - proba (napisano 5’ do 3’): humani forward prajmer, ACCTGCGTCT CCGACTACAT G (SEQ ID NO:22); humani reverzni prajmer, GAGCTCGGTG CTGCAATTG (SEQ ID NO:23); humana proba, FAM-TGGGACCATT CATCTTCCAC TCGCA-BHQ (SEQ ID NO:24). Potvrda da je neoselekciona kaseta umetnuta sa sekvencom humanog IL-4Rα gena u humanizovani alel potvrđena je TaqMan™ qPCR testom
1
koji sadrži sledeće skupove prajmer - proba (napisano 5’ do 3’): neo forward prajmer, GGTGGAGAGG CTATTCGGC (SEQ ID NO:25); neo reverzni prajmer, GAACACGGCG GCATCAG (SEQ ID NO:26); neo proba, FAM-TGGGCACAAC AGACAATCGG CTG-BHQ (SEQ ID NO:27).
[0173] Isti LONA test je korišćen za ispitivanje DNK prečišćene iz biopsije repa za miševe izvedene iz cilјanih ES ćelija da bi se odredili njihovi IL-4Rα genotipovi i potvrdilo da se humanizovani IL-4Rα alel preneo kroz zametnu liniju. Dva mladunca heterozigotna za zamenu se uzgajaju da bi se dobio miš koji je homozigotan za zamenu endogenog mišjeg IL-4Rα gena humanim IL-4Rα genom. Mladunci koji su homozigotni za zamenu koriste se za fenotipizaciju.
[0174] Ushodni spoj mišjeg IL-4Rα lokusa i sekvence koja sadrži humani IL-4Rα gen dizajniran je tako da bude unutar 5’-TGGGGGAGGG AGGCCATGAC ACAAATGAAA TGGACCCCGC TGACCCAGGA TCAGCATCTG CCCACTCTTC TTTCTGCAGG CACCTTTTGT GTCCCCA(ATG GGGTGGCTTT GCTCTGGGCT CCTGTTCCCT GTGAGCTGCC TGGTCCTGCT GCAGGTGGCA AGCTCTG)GTA AGTCACCACT TCTCAATCAT TCATTTGTTG GCTATTAATG GCGTGCCAGG GTCCTGCAGTATGTCACCTG GCC (SEQ ID NO:28), gde su humane IL-4Rα sekvence nakošene i IL-4Rα kodirajuće sekvence su podvučene. Nishodni spoj sekvence koja sadrži humani IL-4Rα gen i floksiranu neo selekcionu kasetu dizajniran je tako da bude unutar 5’-GTCAGATCGT GGAGGGTCTC GGACGAGGG TCCTGACCCT GGGTCTCCAG TCCTGGGAAG TGGAGCCCAG GCTGTACCAT GGCTGACCTC AGCTCATGGC Tcccgggctc gataactata acggtcctaa ggtagcgact cgagataact tcgtataatg tatgctatac gaagttatat gcatggcctc cgcgccgggt tttggcgcct cccgcgggcg cccccctcct cacggcgagc gctg (SEQ ID NO:29), pri čemu su sekvence humanog IL-4Rα nakošene a sekvence kasete su malim slovima. Nishodni spoj sekvenci floksirane selekcione neo kasete i mišjeg IL-4Rα lokusa je dizajniran da bude unutar 5’- tattgttttg ccaagttcta attccatcag acctcgacct gcagccccta gataacttcg tataatgtat gctatacgaa gttatcctag gttggagctc TCTGTAGCCA GGTAACCAAG GGTCCCAGGG GAACCCCCAG TGTGGACGCG GACTGCACAT GACACAGGGC GGCCTCCCCA TTCATGACTG TTTTTCTCCT TGCAG(ACTTC CAGCTGCCCC TGATACAGCG CCTTCCACTG GGGGTCACCA TCTCCTGCCT CTGCATCCCG TTGTTTTGCC TGTTCTGTTA CTTCAGCATT ACCAA)GTGAG TTCCTGCTTT GGCTGGTGTC TCTGGCTGGC CCTTCAGCAG TGCTCTCAGA GGTCACAGTC ATTGTGCTGG CTGAGAAAAG (SEQ ID NO: 30), gde su kodirajuće sekvence mišjeg IL-4Rα u zagradi, a sekvence neo kasete malim slovima.
Primer 3
Generisanje miševa dvostruko humanizovnih IL-4/IL-4Rα
[0175] Miševi sa dvostruko humanizovanim IL-4/IL-4Ra (Il4<hu/hu>/Il4ra<hu/hu>) generisani su kako sledi. Klon ES ćelije MAID 803, koji sadrži humanizovani IL-4Rα gen i floksiranu neo kasetu, elektroporisan je sa Cre ekspresionim vektorom za uklanjanje floksirane neo kasete da bi se generisao klon ES ćelija MAID 1444, koji sadrži humanizovani IL-4Rα gen bez selekcione kasete za lek (vidi Primer 2). Isti ciljajući konstrukt koji je korišćen za generisanje klona ES ćelije MAID 879, koji sadrži humanizovani IL-4 gen i floksiranu higro kasetu (vidi Primer 1), elektroporisan je u klon ES ćelije MAID 1444 da bi se generisale 879 Het/1444 Het (Il4<+/hu>/Il4ra<+/hu>) ES ćelije, koje su naknadno elektroporisane sa Cre ekspresionim vektorom za uklanjanje floksirane higro kasete za generisanje klona ES ćelije (MAID 1553/1444) koji sadrži humanizovane IL-4 i IL-4Rα gene. Klon ES ćelija MAID 1553/1444 bez kasete sa lekovima uveden je u embrion SW miša od 8 ćelija da bi se generisali miševi dvostruko humanizovanim IL-4/IL-4Rα.
Primer 4
Evaluacija efikasnosti dupilumaba, potpuno humanog IL-4Rα mAb, kod miševa sa humanim IL-4 i IL4Rα genskim zamenama
Postupci
[0176] Genetski modifikovani miševi stvoreni su pomoću tehnologije VelociGene® radi zamene oba mišja IL-4 lokusa cele dužine sa 8.8 kb humanih IL-4 genomskih sekvenci (vidi Primer 1 i sliku 2A) i vanćelijski domen (tj. ektodomen) mišjeg IL-4Rα (CD124) gena sa 15.6 kb fragmentom odgovarajuće humane IL-4Rα genomske DNK (videti Primer 2 i Sliku 2B).
[0177] Miševi sa homozigotnim humanizovanim IL-4 genomRα su validirani na ekspresiju i funkciju humanog gena. Da bi se odredila ekspresija humanog IL-4Rα kod humanizovanih miševa, splenociti iz divljeg tipa i humanizovanih miševa su sakuplјeni i obrađeni za analizu sortiranja fluorescentno aktiviranih ćelija (FACS) sa fluorescentno označenim antitelima na mišji CD3, mišji CD19, humani CD124 i mišji CD124. (Vidi, npr. Blaeser et al. (2003) Targeted inactivation of the IL-4 receptor a chain I4R motif promotes allergic airway inflammation, J Exp Med 198(8):1189-1200).
[0178] Za demonstraciju specifičnosti liganda i funkcionalnosti receptora, korišćene su primarne ćelije izvedene od miševa sa humanizovanim IL-4Rα. Makrofagi dobijeni iz koštane srži uzgajani su korišćenjem ćelija femoralne koštane srži iz divljeg tipa i miševa humanizovanog IL-4Rα u DMEM-u koji je sadržavao 10% fetalnog goveđeg seruma plus 20% medijuma kondicioniranog L-ćelijama tokom 7 dana.
1
[0179] Ćelije su zatim pojedinačno tretirane sa 20 ng/ml mišjeg IL-4, mišjeg IL-13, humanog IL-4, humanog IL-13 ili nosača razblaženog u medijumu za kulturu tokom 20 sati. Četvorostruki uzorci iz svakog stanja su prikuplјeni za analizu ekspresije gena.
[0180] Ukupna RNK iz ovih uzoraka je ekstrahovana i amplifikovana u cRNK uklјučivanjem Cy3-CTP. Cy3 obeležena cRNK iz svakog uzorka je zatim hibridizovana u uobičajeni Agilent niz koji se sastoji od 43,53860-mer oligo koji pokrivaju transkriptome miša. Podaci su dobijeni iz skeniranih slika niza pomoću softvera Agilent Feature Extraction Software 9.5.
[0181] Diferencijalno eksprimovani geni među eksperimentalnim grupama identifikovani su korišćenjem Studentovog t-testa (p <0,05, promena umnožavanja ≥1,5). Ekspresioni klaster ovih gena generisan je korišćenjem Pirsonovog algoritma za korelaciono grupisanje iz GeneSpring GX7.3.
[0182] Neutralizujući efekat dupilumaba protiv IL-4 procenjen je pomoću in vitro testa promene klase IgE sa primarnim B ćelijama izolovanim iz miševa sa humanizovanim IL-4Rα (Il4ra<hu/hu>).
[0183] Divlјi tip (WT) i miševi sa humanizovanim IL-4Rα (Il4ra<hu/hu>) su primili isporuku gena velike zapremine (hidrodinamike) gena golog rastvora plazmidne DNK za ekspresiju mišjeg IL-25 in vivo. (Vidi, npr. Liu et al. (1999) Hydrodynamics-based transfection in animals by systemic administration of plasmid DNA, Gene Therapy 6:1258-1266.) Periferna krv je prikuplјena 8 dana kasnije za merenje serumskih mišjih IgE (mIgE) nivoa korišćenjem komercijalnog ELISA kompleta (R & D systems, MN).
[0184] Prečišćene primarne B ćelije iz humanizovanih mišjih splenocita aktivirane su bakterijskim LPS i pomešane sa rastućim količinama rekombinantnog humanog IL-4 u 7-dnevnoj kulturi da bi se indukovala promena klase imunoglobulina. Za eksperiment blokade antitela, prečišćene B ćelije su inkubirane sa povećanjem doza dupilumaba 30 minuta pre dodavanja 0,167 nM rekombinantnog humanog IL-4 i kultivisane 7 dana. Proizvodnja IgE u odsustvu IL-4 ili sa izotipskim kontrolnim mAb prikazana je u (e) i (n), tim redosledom. Nivoi mišjeg IgE u supernatantima kulture su mereni korišćenjem komercijalnog ELISA seta. (Vidi, npr. Moon et al. (1989) Regulation of IgG1 and IgE synthesis by interleukin 4 in mouse B cells, Scand I Immunol 30:355-361.)
[0185] Interleukin-25 (IL-25) je citokin koji proizvode Th2 ćelije čije su glavne aktivnosti posredovane proizvodnjom IL-4 i IL-13 radi izazivanja tkivno specifičnih patologija, poput povećane proizvodnje plućne sluzi i hiperplazije peharastih ćelija. (Vidi: Fort et al. (2001) IL-25 induces IL-4, IL-5, and IL-13 and Th2-associated pathologies in vivo, Immunity 15(6):985-995.)
[0186] Nedostatak IL-13 štiti životinje od patologija izazvanih IL-25 u cilјnim organima. Stoga je model plućne upale pluća izazvan IL-25 korišćen za procenu farmakodinamičkih (PD) svojstava dupilumaba in vivo kod miševa koji sadrže humanizovane IL-4 i/ili IL-4Rα gene.
[0187] PD odgovori dupilumaba na receptorima tipa II okarakterisani su metodom upale izazvane IL-25 merenjem akumulacije plućne sluzi kod miševa sa humanizovanim IL-4Rα (Il4rahu/hu).
[0188] Na dan 0, WT i miševi sa humanizovanim IL-4Rα (Il4ra<hu/hu>) su primili hidrodinamičku isporuku ekspresionog vektora mišjeg IL-25, nakon čega je usledila injekcija dupilumaba ili izotipskog kontrolnog mAb u navedenim dozama. Dodatne doze antitela su davane svaki drugi dan za ukupno 4 doze. Osmog dana, plućna tkiva su sakuplјena od eutanaziranih miševa i obrađeni plućni delovi su obojeni periodičnim kiselim Schiff-om pre slepog bodovanja za patološke promene.
Rezultati
[0189] Humanizovani IL-4Rα miševi su okarakterisani tako da pokazuju: (a) ekspresiju humanog IL-4Rα na primarnim ćelijama iz miševa sa dvostruko humanizovanim IL-4/IL-4Rα (Il4<hulhu>/Il4ra<hu/hu>) (videti sliku 3); (b) promenu specifičnosti IL-4 liganda kod miševa sa humanizovanim IL-4Rα (Il4ra<hulhu>) (videti sliku 4); i (c) funkcionalnost IL-13 putanje kod miševa sa humanizovanim IL-4Rα (Il4ra<hu/hu>) miševi (vidi sliku 4).
[0190] Kao što je prikazano na Slici 3, na kojoj su prikazani označeni profili IL-4Rα (CD124) na zatvorenoj populaciji ćelija B i T ćelija i distribucija odgovarajuće populacije neobojenih ćelija prikazana je u osenčenom području, miševi divlјeg tipa i sa humanizovanim IL-4Rα (Il4ra<hulhu>) eksprimuju slične količine IL-4Rα proteina na površini B (CD19<+>, CD3-) i T (CD19-, CD3<+>) ćelije.
[0191] Kao što je prikazano na slici 4 (leva strana), divlјi tip (Il4ra<+l+>) miševa reaguju na mišji, ali ne i humani, IL-4, i reaguju i na mišji i na humani IL-13. Kao što je prikazano na Slici 4 (desna strana), miševi sa humanizovanim IL-4Rα (Il4ra<hu/hu>) reaguju na humani, ali ne i mišji, IL-4, i reaguju i na mišji i na humani IL-13.
[0192] Ovi podaci pokazuju da IL-4, ali ne i IL-13, pokazuje specifičnost vrste u divlјem tipu i kod miševa sa humanizovanim IL-4Rα (Il4ra<hu/hu>).
[0193] Kao što je prikazano na Slici 5, uloga IL-4 kao glavnog faktora koji posreduje prebacivanje klase IgE podržan je nedostatkom povišenih nivoa cirkulišućeg IgE nakon isporuke mišjeg IL-25 gena kod miševa sa humanizovanim IL-4Rα (Il4ra<hu/hu>).
[0194] Monoklonalno antitelo dupilumaba je ispitivano in vitro i in vivo.
[0195] Kao što je prikazano na Slici 6, dupilumab sprečava proizvodnju IgE indukovanu humanim IL-4 u kulturama primarnih B ćelija dobijene od miševa sa humanizovanim IL-4Rα (Il4ra<hu/hu>).
[0196] Kao što je prikazano na Slici 7, dupilumaba je zavisno od doze smanjio plućne patologije izazvane IL-25 na 10 mg/kg i više (25 mg/kg smanjilo je patologiju sluzi)
Zaključci
1
[0197] Rezultati pokazuju farmakološku aktivnost dupilumaba, potpuno humanog monoklonalnog antitela na humani IL-4Rα, u genetski modifikovanom modelu miša sa upalom izazvanom citokinima.
[0198] Generisanje genetski modifikovanih miševa sa zamenama humanog IL-4 i/ili IL-4Rα gena pruža moćan alat za procenu funkcije genskih ortologa i in vivo efikasnosti kandidata za antitela sa ograničenom reaktivnošću među vrstama.
Primer 5
Model zapaljenja pluća indukovan ekstraktom grinja iz kućne prašine (HDM)
[0199] Hronična upala disajnih puteva kod miševa sa dvostruko humanizovanim IL-4 i IL-R4α izazvana je intranazalnim izazovom ekstraktom grinje iz kućne prašine (HDM) (Greer laboratories). Ukratko, miševi su prvo senzibilizirani intranazalnim ukapavanjem HDM suspenzije (20 µl u koncentraciji od 2,5 µg/ml) tokom 10 dana. Nakon dvonedelјnog intervala rezolucije, miševi su ponovo izazvani intranazalnom primenom HDM-a 3 puta nedelјno između 5. i 12. nedelјe. Tretman dupilumaba (antitela na IL4Rα) počeo je od 7. nedelјe učestalošću dva puta nedelјno potkožnim injekcijama do kraja eksperimenta u 12. nedelјi. Uzorci tkiva su prikupljeni za dalju analizu. Eksperimentalni dizajn je prikazan na Slici 8.
Pokazivanje terapijske efikasnosti dupilumaba u modelu upale disajnih puteva indukovanom HDM-om korišćenjem miševa sa dvostruko humanizovanim IL-4 i IL-4Rα
[0200] Bolest disajnih puteva je indukovana kod miševa sa dvostruko humanizovanim IL-4 i IL-4Rα (IL-4<hu/hu>/IL-4R<hu/hu>) koristeći gore opisani protokol. Histološka analiza plućnog tkiva pokazala je da je intranazalno ukapavanje HDM uzrokovalo povećanu proizvodnju sluzi u disajnim putevima. Tretman dupilumabom smanjio je nakuplјanje sluzi kod miševa kod kojih je izazvana HDM-om. Analiza ćelija koje se infiltriraju u bronhoalveolarnoj tečnosti za ispiranje (BALF) ukazuje da je broj eozinofila povećan ukapavanjem HDM-a i smanjen tretmanom dupilumabom. Ukupni cirkulišući IgE je povišen tretmanom HDM-a kod humanizovanih miševa, što ukazuje na kompetentnu putanju IL-4 signalizacije. Upotreba dupilumaba je bila sposobna da smanji nivo IgE. Nasuprot tome, uporedni molekul, IL13R2α-Fc, koji antagonizira IL-13 samo bez ometanja transdukcije signala IL-4, imao je uporedne aktivnosti u smanjenju nakuplјanja sluzi i sprečavanju infiltracije eozinofila. Bez obzira na to, otkriven je diferencijalni efekat u cirkulišućem nivou IgE između dupilumaba i IL-13 antagonista, IL13R2α-Fc. Blokada samo IL-13 putanje nije bila dovolјna da smanji nivo IgE indukovan HDM-om; dok je dupilumab smanjio proizvodnju IgE, glavnog patogenog posrednika alergije, blokirajući i IL-4 i IL-13 putanje.
[0201] U odvojenom skupu eksperimenata, bolest disajnih puteva je indukovana kod miševa sa dvostruko humanizovanim IL-4 i IL-4Rα (IL-4<hu/hu>/IL-4R<hu/hu>) korišćenjem istog gore opisanog protokola, osim što je korišćena druga kontrola. Antitelo za kontrolu izotipa istog IgG izotipa kao i dupilumab je korišćeno u ovim eksperimentima. Eksperimentalni dizajn je prikazan na Slici 9. mRNK je prečišćena iz ukupne RNK pomoću Dynabeads mRNK kompleta (Life Tech), a biblioteka specifična za soj RNK-Sekvenci biblioteka je pripremlјena iz mRNK korišćenjem Scriptseq RNA Library Prep kit-a (Illumina). Biblioteka je sekvencirana pomoću HiSeq 2000 (Illumina) pri dužini čitanja od 33 bp i nivoi ekspresije gena su ekstrahovani iz sirovih očitavanja korišćenjem Clcbio (Qiagen) RNA-Seq radnim tokom. Diferencijalno eksprimovani geni među eksperimentalnim grupama identifikovani su korišćenjem Studentovog t-testa (p<0,05, promena povećanja ≥1,5). Ekspresioni klaster ovih gena generisan je korišćenjem Pirsonovog algoritma za korelaciono grupisanje iz GeneSpring GX7.3. Utvrđeno je da HDM indukuje promenu ekspresije plućnih gena kod miševa sa dvostruko humanizovanim IL-4 i IL-4Rα i takvu promenu je blokirao dupilumab. Uzorci seruma su prikuplјeni od eutanaziranih miševa na kraju perioda tretiranja. Nivoi mišjeg IgE u serumu su mereni korišćenjem komercijalnog ELISA kompleta (R & D sistemi). Statistička analiza je izvršena uobičajenom jednosmernom ANOVA metodom.
Primer 6
Model upale kože izazvan antigenom
[0202] Hronična upala kože kod miševa sa dvostruko humanizovanim IL-4 i IL-4Rα može se izazvati sledećom procedurom. Dlaka na leđima humanizovanih miševa obrijana je električnim aparatom za šišanje, a zatim je ogolјena lјeplјivom trakom kako bi se stvorile manje ozlede i probila kožna barijera. Gaza natoplјena rastvorom alergena (kao što je ovalbumin plus bakterijski toksin ili ekstrakt grinje iz kućne prašine) pričvršćuje se na kožu nedelјu dana, nakon čega sledi dve nedelјe perioda rezolucije. Postupak se ponavlјa tri puta ukupno 7 nedelјa kako bi se izazvao atopijski dermatitis poput lezija kože. Tretirani miševi će imati povećan nivo IgE, pruritis, zadeblјanje epidermisa, uobičajene simptome atopijskog dermatitisa.
Primer 7
Karakterizacija PK profila of anti-humanih IL-4Rα antitela kod miševa koji eksprimuju humanizovani IL-4Rα
1
[0203] Ovaj primer opisuje eksperimente sprovedene za procenu PK profila REGN 668 (humano monoklonsko antitelo usmereno na humani IL-4Rα, takođe poznato i kao „dupilumab“) i kontrolnog antitela REGN646 (surogat majmuna, anti-mflL-4R neovezujuće kontrolno antitelo).
[0204] Miševi koji su korišćeni u ovim eksperimentima bili su MAID 1444 (homozigotni za humanizovani IL-4Rα, ili „IL-4Rα HumIn“, u kome je IL-4Rα ektodomen humani, a transmembranski i citoplazmatski region mišji) i upareni sa sojevima (75% C57BL/6/25%129Sv) miševa divlјeg tipa („WT“) od 20-23 nedelјe. Studijska grupa je uklјučivala ukupno 40 miševa, mužjaka i ženki, sa veličinom kohorte po leku/po dozi od 5 homozigotnih i 5 WT usklađenih sojeva. Antitela (u PBS puferu) davana su miševima supkutanim ubrizgavanjem 10 mg/kg. Uzorci krvi uzeti su za analizu na dan ubrizgavanja (vremenska tačka „0“ ili dan 0.), 6 sati nakon ubrizgavanja, i na dan 1, dan 3, dan 7, dan 10, dan 14, dan 21, i dan 30, tim redosledom.
[0205] Nivoi cirkulišućih lekova (tj. REGN668 ili REGN646) određeni su analizom ukupnih humanih antitela pomoću imunološkog testa ELISA. Ukratko, kozje anti-humano IgG poliklonsko antitelo (Jackson ImmunoResearch #109-005-098) naneto je na ploče sa 96 ležišta kako bi se uhvatila testirana humana antitela u serume, a zatim su antitela vezana za ploču detektovana pomoću kozjeg anti-humanog IgG poliklonog antitela konjugovanog sa peroksidazom rena (Jackson ImmunoResearch, #109-035-098) i TMB supstrat (BD Pharmingen). Uzorci seruma bili su u serijskim razređenjima od šest doza po uzorku u rasponu od 1:100-1:243,000, a referentni standardi odgovarajućih antitela u serijskim razblaženjima od 12 doza. Koncentracije antitela na lekove u serumu izračunate su na osnovu referentne standardne krive generisane pomoću softvera Graphpad Prism.
[0206] Utvrđeno je da se poluvreme eliminacije REGN 668 skraćuje kod miševa sa IL-4Rα HumIn u poređenju sa miševima divlјeg tipa sa samo mišjim IL-4Rα proteinom. Ova razlika u PK profilima mogla bi se objasniti cilјano posredovanom interakcijom i klirensom između monoklonskih antitela i humanog IL-4α receptora. Stoga, miševi koji eksprimuju humani ili humanizovani IL-4Rα pružaju odgovarajuću simulaciju za karakterizaciju PK svojstava antitela na humani IL-4Rα (npr. dupilumaba) u predkliničkom modelu miša.
Upotreba miševa sa humanizovanim IL-4 i/ili IL-4Rα
[0207] Humanizovani IL-4 i/ili IL-4Rα su korisni za procenu farmakodinamike (PD) humano specifičnih IL-4 i/ili IL-4Rα antagonista, npr. neutrališući anti-IL-4 i/ili anti-IL-4Rα antitela, npr. dupilumaba.
[0208] Farmakokinetički (PK) i PD testovi kod miševa sa humanizovanim IL-4 i/ili IL-4Rα izvode se prema standardnim procedurama poznatim u tehnici.
[0209] Miševi sa humanizovanim IL-4 i/ili IL-4Rα korisni su za ispitivanje in vivo terapeutske efikasnosti humano specifičnih IL-4 i/ili IL-4Rα antagonista, npr. neutrališućih antitela na IL-4 i/ili IL-4Rα, npr. dupilumaba, u različitim modelima bolesti poznatim u tehnici, npr. kao što je prikazano gore.
Primer 8
Zamena endogenog mišjeg IL-33 gena humanim IL-33 genom
[0210] Mišji IL-33 gen (NCBI Genski ID: 77125, Primarni izvor: MGI:1924375; RefSeq transkript: NM_001164724.1; UniProt ID: Q8BVZ5; Genomski sklop: NCBI37/mm9; Lokacija: chr19:29,999,604-30,035,205 soj) ima 8 egzona i kodira protein od 266 amino-kiselina (GenBank Accession No. NP_001158196.1).
[0211] Humani IL-33 gen (NCBI Genski ID: 90865, Primarni izvor: HGNC:16028; RefSeq transkript: NM_033439.3; UniProt ID: 095760; Genomski sklop: GRCh37/hg19; Lokacija: chr9:6,215,149-6,257,983 soj) takođe ima 8 egzona i kodira protein od 270 amino-kiselina (GenBank Accession No. NP_254274.1).
[0212] Humani genomski segment od 16333 bp koji sadrži egzon 2 koji počinje od kodona za inicijaciju ATG do egzona 8 (uklјučujući 3’ neprevedeni region) humanog IL-33 gena zamenio je 9381 bp mišjeg IL-33 lokusa gena koji se proteže preko egzona 2 počevši od kodona za inicijaciju ATG kroz kodirajući deo egzona 8 uklјučujući stop kodon. Vidi sliku 10A.
[0213] Ciljajući konstrukt za zamenu mišjeg IL-33 gena genomskim segmentom humanog IL-33 u jednom koraku cilјanja konstruisan je korišćenjem tehnologije genetskog inženjeringa VelociGene® (vidi Valenzuela et al. (2003) High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, Nature Biotech, 21(6):652-659), slično postupku opisanom u Primeru 1 gore za zamenu mišjeg IL-4 gena genomskim segmentom humanog IL-4, osim što su mišja i humana IL-33 DNK dobijene iz klonova bakterijskog veštačkog hromozoma (BAC) bMQ-350I18 i CTD-3015M15, respektivno, i da ciljajući vektor sadrži selekcionu kasetu za neomicin loxP (slika 10B).
[0214] Pravilno cilјani klonovi ES ćelija (MAID 7060) identifikovani su testom gubitka nativnog alela (LONA) (Valenzuela et al. 2003) u kome je broj kopija nativnog, nemodifikovanog IL-33 gena određen pomoću dva TaqMan™ kvantitativne polimerazne lančane reakcije (qPCRs) specifične za sekvence u mišjem IL-33 genu koje su cilјane za brisanje. qPCR testovi obuhvatali su sledeće skupove prajmer - proba (napisanih 5’ do 3’):
ushodno ("mTU"):
forward prajmer, TTGGACTAGTAACAAGAAGGGTAGCA (SEQ ID NO: 31);
reverzni prajmer, CCTTTCCCATCACCCTCTAACTT (SEQ ID NO: 32);
proba (MGB), AGCTCTGGTGGACAGA (SEQ ID NO: 33);
1
nishodno ("mTD"):
forward prajmer, TCTCTGCCAAGCTGCTTATCC (SEQ ID NO: 34);
reverzni prajmer, GGCTGCATGGAAGAGGTGAA (SEQ ID NO: 35);
proba (MGB), CTCTCCACAAATCG (SEQ ID NO: 36)
[0215] Potvrda da je sekvenca humanog IL-33 gena zamenila sekvencu IL-33 gena miša u humanizovanom alelu potvrđena je TaqMan™ qPCR testom koji sadrži sledeće skupove prajmer - proba (napisano 5’ do 3’):
ushodno ("hTU")
forward prajmer, CAGGCAGGAATAGCTGAGATAATCT (SEQ ID NO: 37);
reverzni prajmer, TGTGGAGCAAAAAGTGGTTGAT (SEQ ID NO: 38);
proba (MGB), CCTGTGAATAGTGATAAAC (SEQ ID NO: 39);
nishodno ("hTD"):
forward prajmer, CAGTTCCAAACGATAGGCTCAA (SEQ ID NO: 40);
reverzni prajmer, ATAATTCTGTGAAGCATCTGGTCTTC (SEQ ID NO: 41);
proba (MGB), CTAGAGCTGCTAGTAAAA (SEQ ID NO: 42).
[0216] Ushodni spoj mišjeg IL-33 lokusa i sekvence koja sadrži humani IL-33 gen (prikazan kao „I“ na slici 10B) dizajniran je tako da bude unutar 5’- ATAGCCAAGG TTGCTTCTGA TGACTTCAGG TCCATATAGT
TGGATTAATG TTATATTTCA ATCCCACAGA AACCTGAAAA ATGAAGCCTA AAATGAAGTA TTCAACCAAC
AAAATTTCCA CAGCAAAGTG GAAGAACACA GCAAGCAAAG CCTTGTGTTT -3’ (SEQ ID NO: 43), pri čemu je sekvenca humanog IL-33 nakošena i humani ATG startni kodon podvučen. Nishodni spoj sekvence koja sadrži genomsku sekvencu humanog IL-33 i selekcione kasete za neomicin loxP (prikazana kao „II“ na slici 10B) dizajniran je tako da bude unutar 5’- TTTATATTAT TGAATAAAGT ATATTTTCCA AATGTATGTG AGACTATAAT
GATTTTATCA TATGATGACT CAATATTCTG/CTCGAGATAA CTTCGTATAA TGTATGCTAT ACGAAGTTAT
ATGCATGGCC TCCGCGCCGG GTTTTGGCGC CTCCCGCGGG -3’ (SEQ ID NO: 44), pri čemu je sekvenca humanog IL -33 ispisana nakošeno i mesto spoja je označeno simbolom „/“, a mesto lox P je podvučeno. Nishodni spoj sekvence loxP neo selekcione kasete i mišjeg IL-33 lokusa (prikazan kao „III“ na slici 10C) dizajniran je tako da bude unutar 5’- AGCCCCTAGA TAACTTCGTA TAATGTATGC TATACGAAGT TATGCTAGTA ACTATAACGG
TCCTAAGGTA GCGAGCTAGC/CGCCTGTGCG TTCTGGGTTG AATGACTTAA TGCTTCCAAC TGAAGAAAGG
GTAACAGAGA GAAAGAAAGC CATTCTTGGC-3’ (SEQ ID NO: 45), pri čemu je spoj prikazan „/“ simbolom a loxP mesto je podvučeno.
[0217] Pravilno cilјane ES ćelije (MAID 7060) su dalјe elektroporisane prolaznim Cre ekspresionim vektorom da bi se uklonila selekcion kaseta za lek i dobili klonovi ES ćelija bez kasete za lekove (MAID 7061). Ushodni spoj u ovim ćelijama MAID 7061 ES (prikazan kao „I“ na slici 18C) je isti kao u ćelijama MAID 7060 ES. Nishodni spoj (prikazan kao „II“ na slici 18C) dizajniran je tako da bude unutar 5’-TTTATATTAT TGAATAAAGT ATATTTTCCA
AATGTATGTG AGACTATAAT GATTTTATCA TATGATGACT CAATATTCTG/CTCGAGATAA CTTCGTATAA
TGTATGCTAT ACGAAGTTAT GCTAGTAACT ATAACGGTCC TAAGGTAGCG AGCTAGC/CGCCTGTGCG
TTCTGGGTTG AATGACTTAA TGCTTCCAAC TGAAGAAAGG GTAACAGAGA GAAAGAAAGC CATTCTTGGC-
3’ (SEQ ID NO: 46), pri čemu je 3’ humana IL-33 sekvenca nakošeno ispisana pre prvog simbola „/“, a 3’ mišja IL-333’ sekvenca je nakošeno ispisana iza drugog simbola „/“ i loxP mesto je podvučeno.
[0218] Pravilno cilјane ES ćelije (MAID 7060 ili MAID 7061) uvedene su u embrion SW miševa u fazi od 8 ćelija pomoću metode VelociMouse® (vidi, U.S. Pat. Nos.7,294,754, 7,576,259, 7,659,442, i Poueymirou et al. (2007) Miševi generacije F0 koji su u suštini u potpunosti izvedeni iz donorskih gen cilјanih ES ćelija što omogućava neposredne fenotipske analize, Nature Biotech. 25(1):91-99). VelociMice® (F0 miševi potpuno izvedeni iz donorske ES ćelije) koji nose humanizovani IL-33 gen identifikovani su genotipizacijom na gubitak alela miša i dobijanje humanog alela korišćenjem modifikacije alelnog testa (videti, Valenzuela et al. (2003)). Isti LONA test je korišćen za ispitivanje DNK pročišćene iz biopsije repa za miševe izvedene iz cilјanih ES ćelija kako bi se odredili njihovi IL-33 genotipovi i potvrdilo da se humanizovani IL-33 alel preneo kroz zametnu liniju. Dva mladunca heterozigotna za zamenu su uzgajana da bi se dobio miš koji je homozigotan za zamenu endogenog mišjeg IL-33 gena humanim IL-33 genom.
2
2
2
2
2
2
2
1
2

Claims (12)

PATENTNI ZAHTEVI
1. Glodar, koji sadrži zamenu genomskog fragmenta IL-4 gena glodara na endogenom IL-4 lokusu glodara sa genomskim fragmentom humanog IL-4 gena da bi se formirao modifikovani IL-4 gen, naznačen time što modifikovani IL-4 gen kodira humani IL-4 protein i sadrži egzon 1 počevši od kodona za inicijaciju ATG preko egzona 4 humanog IL-4 gena, i naznačen time što je eksprimovanje modifikovanog IL-4 gena pod kontrolom regulatornih elemenata glodara na endogenom IL-4 lokusu glodara.
2. Glodar iz zahteva 1, naznačen time što je glodar miš ili pacov.
3. Glodar iz zahteva 1 ili 2, naznačen time što glodar nije sposoban da eksprimuje IL-4 protein glodara.
4. Glodar iz zahteva 1 ili 3, naznačen time što je glodar miš, i time što je data zamena, zamena genomskog fragmenta koji sadrži egzon 1 počevši od kodona za inicijaciju ATG preko egzona 4 mišjeg IL-4 gena sa genomskim fragmentom koji sadrži egzon 1 počevši od kodona za inicijaciju ATG preko egzona 4 humanog IL-4 gena.
5. Glodar iz bilo kojeg od zahteva 1-4, naznačen time što glodar eksprimuje humanizovani IL-4Rα protein koji sadrži ektodomen humanog IL-4Rα proteina.
6. Glodar iz zahteva 5, naznačen time što humanizovani IL-4Rα protein sadrži transmembranski domen i citoplazmatski domen endogenog IL-4Rα proteina glodara.
7. Matična ćelija embriona (ES) glodara, koja sadrži zamenu genomskog fragmenta IL-4 gena glodara na endogenom IL-4 lokusu glodara sa genomskim fragmentom humanog IL-4 gena da bi se formirao modifikovani IL-4 gen, naznačena time što modifikovani IL-4 gen kodira humani IL-4 protein i sadrži egzon 1 počevši od kodona za inicijaciju ATG preko egzona 4 humanog IL-4 gena, naznačena time što je eksprimovanje modifikovanog IL-4 gena pod kontrolom regulatornih elemenata glodara na endogenom IL-4 lokusu glodara.
8. ES ćelija glodara iz zahteva 7, naznačena time što je glodar miš ili pacov.
9. ES ćelija glodara iz zahteva 7, naznačena time što je glodar miš, i time što data zamena je zamena genomskog fragmenta koji sadrži egzon 1 počevši od kodona za inicijaciju ATG preko egzona 4 mišjeg IL-4 gena sa genomskim fragmentom koji sadrži egzon 1 počevši od kodona za inicijaciju ATG preko egzona 4 humanog IL-4 gena.
10. Postupak stvaranja glodara, koji uključuje:
(a) zamenu genomskog fragmenta IL-4 gena glodara na endogenom IL-4 lokusu glodara u ES ćeliji glodara genomskim fragmentom humanog IL-4 gena da bi se formirao humanizovani IL-4 gen, naznačen time što humanizovani IL-4 gen kodira humani IL-4 protein i sadrži egzon 1 počevši od kodona za inicijaciju ATG preko egzona 4 humanog IL-4 gena, naznačen time što je eksprimovanje modifikovanog IL-4 gena pod kontrolom regulatornih elemenata glodara na endogenom IL-4 lokusu glodara; i
(b) generisanje glodara iz ES ćelije iz koraka (a).
11. Postupak prema zahtevu 10, naznačen time što je glodar miš ili pacov.
12. Postupak prema zahtevu 10, naznačen time što je glodar miš, i što data zamena je zamena genomskog fragmenta koji sadrži egzon 1 počevši od kodona za inicijaciju ATG preko egzona 4 mišjeg IL-4 gena sa genomskim fragmentom koji sadrži egzon 1 počevši od kodona za inicijaciju ATG preko egzona 4 humanog IL-4 gena.
RS20211141A 2014-05-07 2015-05-07 Životinje sa humanizovanim il-4 i il-4r alfa RS62345B1 (sr)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201461989757P 2014-05-07 2014-05-07
EP17193855.8A EP3281521B1 (en) 2014-05-07 2015-05-07 Humanized il-4 and il-4r alpha animals

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS62345B1 true RS62345B1 (sr) 2021-10-29

Family

ID=53284509

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20211141A RS62345B1 (sr) 2014-05-07 2015-05-07 Životinje sa humanizovanim il-4 i il-4r alfa
RS20180131A RS57073B1 (sr) 2014-05-07 2015-05-07 Životinje sa humanizovanom il-4 i il-4r alfa

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20180131A RS57073B1 (sr) 2014-05-07 2015-05-07 Životinje sa humanizovanom il-4 i il-4r alfa

Country Status (26)

Country Link
US (7) US9565841B2 (sr)
EP (3) EP3906781A1 (sr)
JP (5) JP6640740B2 (sr)
KR (2) KR102473565B1 (sr)
CN (2) CN106470545B (sr)
AU (3) AU2015255977B2 (sr)
BR (1) BR112016025745A2 (sr)
CA (2) CA2947307C (sr)
CY (2) CY1119773T1 (sr)
DK (2) DK3281521T3 (sr)
ES (2) ES2656529T3 (sr)
HR (2) HRP20211455T1 (sr)
HU (2) HUE038028T2 (sr)
IL (3) IL304841B2 (sr)
LT (2) LT3027015T (sr)
MX (1) MX370672B (sr)
NO (1) NO2785538T3 (sr)
PH (1) PH12016502058A1 (sr)
PL (2) PL3281521T3 (sr)
PT (2) PT3027015T (sr)
RS (2) RS62345B1 (sr)
RU (1) RU2703139C2 (sr)
SG (2) SG10201912354PA (sr)
SI (2) SI3027015T1 (sr)
SM (2) SMT201800018T1 (sr)
WO (1) WO2015171861A1 (sr)

Families Citing this family (38)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NO2785538T3 (sr) 2014-05-07 2018-08-04
HUE048677T2 (hu) 2014-06-19 2020-07-28 Regeneron Pharma Humanizált programozott sejthalál 1 génnel rendelkezõ nem-humán állatok
WO2016042072A1 (en) * 2014-09-17 2016-03-24 Oerlikon Surface Solutions Ag, Trübbach Method for producing a double-layer coated cutting tool with improved wear resistance
KR20240055876A (ko) 2014-11-24 2024-04-29 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 인간화 cd3 복합체를 발현하는 비인간 동물
KR102617691B1 (ko) 2014-12-05 2023-12-27 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 인간화 분화 클러스터 47 유전자를 가진 비인간 동물
NZ731954A (en) 2014-12-09 2024-11-29 Regeneron Pharma Non-human animals having a humanized cluster of differentiation 274 gene
AU2016358101B2 (en) 2015-11-20 2022-12-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals having a humanized Lymphocyte-activation gene 3
CN108779159B (zh) 2016-02-04 2022-12-30 瑞泽恩制药公司 具有经改造的angptl8基因的非人动物
JP6980674B2 (ja) * 2016-02-29 2021-12-15 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッドRegeneron Pharmaceuticals, Inc. ヒト化ｔｍｐｒｓｓ遺伝子を有する齧歯類
TWI857389B (zh) * 2016-12-01 2024-10-01 美商再生元醫藥公司 治療發炎症狀的方法
MX2019012171A (es) 2017-04-13 2019-11-25 Regeneron Pharma Tratamiento e inhibicion de enfermedades pulmonares inflamatorias en pacientes que tienen alelos de riesgo en los genes que codifican la il33 e il1rl1.
JP7657440B2 (ja) 2017-06-12 2025-04-07 ブルーフィン バイオメディシン， インコーポレイテッド 抗－ｉｌ１ｒａｐ抗体および抗体薬物コンジュゲート
ES2962277T3 (es) 2017-09-29 2024-03-18 Regeneron Pharma Roedores que comprenden un locus Ttr humanizado y métodos de uso
IL274740B2 (en) 2017-11-30 2024-06-01 Regeneron Pharma Non-human animals comprising a humanized trkb locus
JP7328243B2 (ja) 2018-03-26 2023-08-16 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド 治療薬を試験するためのヒト化げっ歯類
IL307286B1 (en) 2018-04-11 2025-11-01 Regeneron Pharma Methods and compositions for quantifying il-33
JP7048051B2 (ja) 2018-07-11 2022-04-05 正徳 染井 痒みを軽減するアトピー性皮膚炎治療剤
HRP20240999T1 (hr) * 2018-07-16 2024-10-25 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Glodavački modeli bolesti ditra i njihova upotreba
WO2020074005A1 (en) * 2018-10-12 2020-04-16 Beijing Biocytogen Co., Ltd Genetically modified non-human animal with human or chimeric genes
CN114164177A (zh) * 2019-01-17 2022-03-11 百奥赛图(北京)医药科技股份有限公司 人源化转基因动物
WO2020206139A1 (en) 2019-04-04 2020-10-08 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals comprising a humanized coagulation factor 12 locus
EP3801011A1 (en) 2019-06-04 2021-04-14 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals comprising a humanized ttr locus with a beta-slip mutation and methods of use
AU2020289581B2 (en) 2019-06-07 2024-11-21 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals comprising a humanized albumin locus
US20220272953A1 (en) * 2019-07-29 2022-09-01 Biocytogen Pharmaceuticals (Beijing) Co., Ltd. Genetically modified non-human animal with human or chimeric il33
CN112430621B (zh) * 2019-08-09 2022-09-27 百奥赛图(北京)医药科技股份有限公司 Il2ra基因人源化的非人动物的构建方法及应用
US20220378025A1 (en) * 2019-11-11 2022-12-01 Biocytogen Pharmaceuticals (Beijing) Co., Ltd. Genetically modified non-human animal with human or chimeric genes
CN114786479B (zh) * 2019-12-25 2023-12-15 江苏集萃药康生物科技股份有限公司 一种il-15人源化小鼠模型及其用途
US12250931B2 (en) * 2020-01-28 2025-03-18 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Genetically modified mouse with a humanized PNPLA3 gene and methods of use
CN111149767B (zh) * 2020-02-24 2021-07-20 中南大学湘雅二医院 一种人源化皮肤型红斑狼疮小鼠模型的构建方法和应用
CN113527485B (zh) 2020-04-17 2024-11-15 湖南麦济生物技术股份有限公司 抗人白细胞介素-4受体α抗体及其制备方法和应用
CN111808882B (zh) * 2020-09-01 2020-12-29 北京百奥赛图基因生物技术有限公司 Il7r基因人源化改造的动物模型的构建方法及其应用
CN111793646B (zh) * 2020-09-08 2021-01-15 北京百奥赛图基因生物技术有限公司 Il1r1基因人源化改造的非人动物的构建方法及其应用
CN111926039B (zh) * 2020-09-23 2021-03-16 百奥赛图(北京)医药科技股份有限公司 Il-13基因人源化的非人动物的构建方法和应用
JP2024500153A (ja) * 2020-12-21 2024-01-04 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド ヒト化ｔｓｌｐ遺伝子、ヒト化ｔｓｌｐ受容体遺伝子、及び／又はヒト化ｉｌ７ｒａ遺伝子を有する非ヒト動物
WO2022247936A1 (en) * 2021-05-28 2022-12-01 Biocytogen Pharmaceuticals (Beijing) Co., Ltd. Genetically modified non-human animal with human or chimeric cd36
WO2024067796A1 (zh) * 2022-09-28 2024-04-04 百奥赛图(北京)医药科技股份有限公司 一种il5和/或il5ra基因人源化修饰的非人动物
WO2024151707A1 (en) * 2023-01-11 2024-07-18 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Systems and methods for a regulatory-compliant automated assay
WO2025175099A1 (en) 2024-02-16 2025-08-21 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. A rodent copd model

Family Cites Families (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU643427B2 (en) * 1988-10-31 1993-11-18 Immunex Corporation Interleukin-4 receptors
US6596541B2 (en) * 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
AU2005295269B2 (en) 2004-10-19 2010-05-13 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Method for generating an animal homozygous for a genetic modification
JP2007252370A (ja) * 2006-02-22 2007-10-04 Institute Of Physical & Chemical Research Ｉｌ−４初期発現系トランスジェニック非ヒト動物およびその利用
US7608693B2 (en) * 2006-10-02 2009-10-27 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. High affinity human antibodies to human IL-4 receptor
US20110016543A1 (en) * 2008-12-04 2011-01-20 Sigma-Aldrich Co. Genomic editing of genes involved in inflammation
WO2011002727A1 (en) * 2009-06-29 2011-01-06 Qingfeng Chen Methods of producing humanized non-human mammals
AU2010275432A1 (en) * 2009-07-24 2012-02-02 Sigma-Aldrich Co. Llc. Method for genome editing
RU2425880C2 (ru) * 2009-07-30 2011-08-10 Учреждение Российской академии наук Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН Способ получения трансгенных мышей
CA3040377C (en) 2009-10-06 2025-12-30 Yale University Genetically modified mice and engraftment comprising the knock-in of a human thrombopoietin (tpo) gene
ES3040596T3 (en) 2011-02-15 2025-11-03 Regeneron Pharma Humanized m-csf mice and uses thereof
RS56656B1 (sr) 2011-10-28 2018-03-30 Regeneron Pharma Miševi sa genetski modifikovanim glavnim kompleksom gena tkivne podudarnosti
RS56330B1 (sr) 2011-10-28 2017-12-29 Regeneron Pharma Genetski modifikovani miševi sa ekspresijom himernih molekula klase ii glavnog kompleksa histokompatibilnosti (mhc)
MY186903A (en) * 2011-10-28 2021-08-26 Regeneron Pharma Humanized il-6 and il-6 receptor
US8962913B2 (en) * 2012-06-18 2015-02-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Humanized IL-7 rodents
WO2014031610A1 (en) * 2012-08-21 2014-02-27 Sanofi Methods for treating or preventing asthma by administering an il-4r antagonist
KR102287541B1 (ko) 2012-09-07 2021-08-10 예일 유니버시티 유전적으로 변형된 비-인간 동물 및 이것들의 사용 방법
EP4389764B1 (en) 2012-11-05 2026-03-18 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Genetically modified rodents and methods of use thereof
KR20240147707A (ko) 2013-02-20 2024-10-08 리제너론 파아마슈티컬스, 인크. 사람화된 ｔ-세포 보조-수용체를 발현하는 마우스
CN110192541B (zh) 2013-02-22 2022-02-18 瑞泽恩制药公司 表达人源化主要组织相容性复合物的小鼠
JO3532B1 (ar) 2013-03-13 2020-07-05 Regeneron Pharma الأجسام المضادة لمضاد انترلوكين-33 واستعمالاتها
DK3175706T3 (en) 2013-09-23 2019-03-04 Regeneron Pharma Non-human animals with a humanized signal regulatory protein gene
SMT201900177T1 (it) 2013-10-15 2019-05-10 Regeneron Pharma Animali con il-15 umanizzata
SG10201811701YA (en) 2013-11-19 2019-01-30 Regeneron Pharma Non-human animals having a humanized a proliferation-inducing ligand gene
CN105792646B (zh) 2013-11-19 2018-03-02 瑞泽恩制药公司 具有人源化的b细胞活化因子基因的非人动物
ES2794942T3 (es) 2014-04-08 2020-11-19 Regeneron Pharma Animales no humanos que tienen receptores Fc-gamma humanizados
JP6598798B2 (ja) 2014-05-05 2019-10-30 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド ヒト化ｃ５およびｃ３動物
NO2785538T3 (sr) 2014-05-07 2018-08-04

Also Published As

Publication number Publication date
NO2785538T3 (sr) 2018-08-04
KR102517112B1 (ko) 2023-04-03
JP6838131B2 (ja) 2021-03-03
IL248358A0 (en) 2016-11-30
US20170311580A1 (en) 2017-11-02
ES2887852T3 (es) 2021-12-28
PH12016502058A1 (en) 2017-01-09
DK3027015T3 (en) 2018-01-22
IL304841B1 (en) 2025-09-01
JP2024159985A (ja) 2024-11-08
JP2017514501A (ja) 2017-06-08
JP2021087434A (ja) 2021-06-10
AU2021218060B2 (en) 2024-04-11
EP3027015B1 (en) 2017-11-08
IL297105B2 (en) 2024-01-01
SG11201608570YA (en) 2016-11-29
JP6640740B2 (ja) 2020-02-05
MX370672B (es) 2019-12-19
JP7145250B2 (ja) 2022-09-30
HRP20211455T1 (hr) 2022-01-07
JP2020058379A (ja) 2020-04-16
RU2019131253A (ru) 2019-12-06
US10477842B2 (en) 2019-11-19
US11109578B2 (en) 2021-09-07
CA2947307C (en) 2023-09-26
LT3281521T (lt) 2021-09-27
PT3281521T (pt) 2021-09-16
BR112016025745A2 (pt) 2018-01-16
SMT202100560T1 (it) 2021-11-12
AU2021218060A1 (en) 2021-09-09
US20230027494A1 (en) 2023-01-26
US20180000056A1 (en) 2018-01-04
IL304841A (en) 2023-09-01
CN106470545A (zh) 2017-03-01
KR102473565B1 (ko) 2022-12-02
PT3027015T (pt) 2018-02-09
SI3027015T1 (en) 2018-02-28
AU2015255977B2 (en) 2021-09-02
RU2016143376A (ru) 2018-06-09
MX2016014563A (es) 2017-02-23
CA3207834C (en) 2025-10-14
AU2024204694A1 (en) 2024-09-05
IL297105A (en) 2022-12-01
US12310340B2 (en) 2025-05-27
CY1124605T1 (el) 2022-07-22
AU2015255977A1 (en) 2016-11-17
US11963521B2 (en) 2024-04-23
CN106470545B (zh) 2019-08-20
RU2703139C2 (ru) 2019-10-15
EP3281521B1 (en) 2021-06-30
RU2016143376A3 (sr) 2018-11-22
US20200022344A1 (en) 2020-01-23
NZ725615A (en) 2024-05-31
JP7755699B2 (ja) 2025-10-16
IL304841B2 (en) 2026-01-01
JP2022171841A (ja) 2022-11-11
US9565841B2 (en) 2017-02-14
CY1119773T1 (el) 2018-06-27
SG10201912354PA (en) 2020-02-27
PL3281521T3 (pl) 2022-01-03
US20150320021A1 (en) 2015-11-12
CN110269047A (zh) 2019-09-24
DK3281521T3 (da) 2021-09-20
IL297105B1 (en) 2023-09-01
US10588298B2 (en) 2020-03-17
EP3906781A1 (en) 2021-11-10
US9743647B2 (en) 2017-08-29
EP3281521A1 (en) 2018-02-14
NZ763861A (en) 2024-05-31
WO2015171861A1 (en) 2015-11-12
SI3281521T1 (sl) 2021-11-30
US20150320022A1 (en) 2015-11-12
ES2656529T3 (es) 2018-02-27
IL248358B (en) 2022-11-01
US20210368753A1 (en) 2021-12-02
HUE055860T2 (hu) 2021-12-28
CA2947307A1 (en) 2015-11-12
PL3027015T3 (pl) 2018-04-30
KR20160150637A (ko) 2016-12-30
EP3027015A1 (en) 2016-06-08
KR20220165814A (ko) 2022-12-15
IL248358B2 (en) 2023-03-01
CN110269047B (zh) 2021-11-02
SMT201800018T1 (it) 2018-03-08
HRP20180242T1 (hr) 2018-03-09
HUE038028T2 (hu) 2018-09-28
CA3207834A1 (en) 2015-11-12
LT3027015T (lt) 2018-01-25
RS57073B1 (sr) 2018-06-29
AU2021218060C1 (en) 2024-11-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2021218060B2 (en) Humanized il-4 and il-4r alpha animals
RU2788523C2 (ru) ЖИВОТНЫЕ С ГУМАНИЗИРОВАННЫМИ IL-4 И IL-4Rα
HK40053187A (en) Humanized il-4 and il-4r alpha animals
HK1245011B (en) Humanized il-4 and il-4r alpha animals
HK1245011A1 (en) Humanized il-4 and il-4r alpha animals
HK1225575A1 (en) Humanized il-4 and il-4r alpha animals
HK1225575B (en) Humanized il-4 and il-4r alpha animals