KR20180136914A - 간에서 목적하는 단백질 발현하기 위한 플랫폼 - Google Patents

간에서 목적하는 단백질 발현하기 위한 플랫폼 Download PDF

Info

Publication number
KR20180136914A
KR20180136914A KR1020180069242A KR20180069242A KR20180136914A KR 20180136914 A KR20180136914 A KR 20180136914A KR 1020180069242 A KR1020180069242 A KR 1020180069242A KR 20180069242 A KR20180069242 A KR 20180069242A KR 20180136914 A KR20180136914 A KR 20180136914A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
gene
sequence
nucleic acid
protein
dna
Prior art date
Application number
KR1020180069242A
Other languages
English (en)
Inventor
김석중
송동우
이규준
이정민
김운기
Original Assignee
주식회사 툴젠
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 주식회사 툴젠 filed Critical 주식회사 툴젠
Publication of KR20180136914A publication Critical patent/KR20180136914A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A61K48/0058—Nucleic acids adapted for tissue specific expression, e.g. having tissue specific promoters as part of a contruct
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/37—Digestive system
    • A61K35/407—Liver; Hepatocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/775—Apolipopeptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/67—General methods for enhancing the expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
    • C12N15/907—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination in mammalian cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/067—Hepatocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/644—Coagulation factor IXa (3.4.21.22)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21022—Coagulation factor IXa (3.4.21.22)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/09—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a nuclear localisation signal
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/40—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation
    • C07K2319/42—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation containing a HA(hemagglutinin)-tag
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/80—Vectors containing sites for inducing double-stranded breaks, e.g. meganuclease restriction sites
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/008—Vector systems having a special element relevant for transcription cell type or tissue specific enhancer/promoter combination
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2840/00—Vectors comprising a special translation-regulating system
    • C12N2840/002—Vectors comprising a special translation-regulating system controllable or inducible

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Marine Sciences & Fisheries (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 명세서는 간을 인위적으로 조작하여 목적하는 단백질을 발현하기 위한 플랫폼으로, 보다 구체적으로 비정상적인 기능 또는 발현 하는 질병 유전자 대신에 정상적인 기능과 발현을 할 수 있는 이식 유전자(예를 들어, 치료유전자)를 고발현 분비 유전자에 삽입하여 발현을 유도함으로써, 유전질환 완화, 치료 또는 기능향상을 위한 플랫폼에 관한 것이다. 상기 고발현 분비 유전자는 HP 또는 APOC3유전자인 것을 포함한다. 상기 이식유전자는 간세포 게놈 내 프로모터를 이용하여 높은 수준으로 발현하여 세포밖으로 분비되는 것을 포함한다.

Description

간에서 목적하는 단백질 발현하기 위한 플랫폼 {Liver biofactory platform}
본 명세서는 간을 인위적으로 조작하여 목적하는 단백질을 발현하기 위한 플랫폼으로, 보다 구체적으로 비정상적인 기능 또는 발현 하는 질병 유전자 대신에 정상적인 기능과 발현을 할 수 있는 이식 유전자(예를 들어, 치료유전자)를 가이드핵산 및/또는 에디터단백질을 이용하여 발현을 유도함으로써 유전질환 완화, 치료 또는 신체 기능향상을 위한 플랫폼에 관한 것이다.
유전자 요법은 인간 공학의 새로운 시대에 막대한 잠재력을 가지고 있다. 유전자 요법은 유전자의 파괴, 수정 또는 이식 유전자에 융합된 특정 외인성 프로모터나 게놈 삽입 부위에서 발견되는 내인성 프로모터에 의해 조절될 수 있는 이식유전자의 삽입과 같은 게놈 편집 기술 등을 포함한다.
현재, 난치성 질환인 혈우병이나 lysosomal storage disease들은 현재 적당한 치료제가 없는 상태로, 효소나 단백질 대체제를 사용하는 대체요법이 주로 치료를 위해 이용되고 있으나 근본적인 치료는 할 수 없는 실정이다. 또한, AAV를 이용한 치료 유전자를 발현시키는 방법들이 임상시험에서 진행되고 있으나 이러한 방법 또한 AAV가 발현되는 동안에만 효과를 기대할 수 있는 것으로, 근본적이고 장기적인 치료방법이라고 할 수는 없다.
따라서, 보다 장기적으로 효과적인 치료를 위해 실제 치료 유전자를 환자의 유전체에 삽입하여 영구적인 발현을 가능하게 하는 치료 플랫폼이 필요한 실정이다. 이러한 치료 플랫폼은 기존의 일시적이고 반복적인 치료제의 투여를 통한 치료 방법과는 차별화 된 방법으로, 환자의 유전체에 치료 유전자를 삽입하기 위한 목적으로 유전자 교정에 효과적인 표적 특이적 인위적으로 조작된 뉴클레아제를 이용한다면 효율적인 치료 플랫폼을 개발할 수 있을 것이다.
이에 본 발명은 표적 특이적 인위적으로 조작된 뉴클레아제를 이용하여 목적하는 유전자가 지속적으로 발현 가능한 치료 플랫폼을 개발하고자 하였다. 특히, 높은 효율을 위해, 장기 또는 조직(예를 들면, 간)에서 고발현되는 유전자 위치를 목적하는 유전자의 삽입 위치로 결정하여 효과적인 플랫폼을 완성하였다.
본 명세서에서 개시된 일 내용은 CRISPR-Cas system을 이용하여 간세포에서 목적하는 단백질을 발현시키는 플랫폼을 제공할 수 있다.
본 명세서에서 개시된 일 내용은, 목적하는 단백질 또는 이를 암호화하는 서열 및 CRISPR-cas system을 포함하는, 목적하는 단백질 발현용 조성물 및 이의 다양한 용도를 제공할 수 있다.
본 명세서에서 개시된 일 내용은 CRISPR-Cas system을 이용하여 목적하는 단백질을 발현하는 세포 및 이의 제조방법을 제공할 수 있다.
본 명세서에서 개시된 일 내용은 CRISPR Cas system을 이용하여 간세포에 목적하는 단백질을 발현시키기 위한 방법을 제공할 수 있다.
본 명세서에서 개시된 일 내용은 간세포에서 목적하는 단백질을 발현시키는 조성물을 치료 대상에 투여하는 단계를 포함하는, 유전질환의 치료 방법을 제공할 수 있다.
본 명세서에서 개시된 일 내용은 목적하는 단백질을 간세포에서 발현시키기 위하여, 해당 표적 유전자의 조작에 사용할 수 있는 가이드 핵산 및 에디터 단백질을 제공할 수 있다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 명세서는 간세포에서 목적하는 단백질을 발현시키기 위한 플랫폼을 제공하고자한다. 보다 구체적으로, CRISPR-Cas시스템을 이용하여 목적하는 단백질을 암호화하는 유전자를 표적 유전자에 삽입하여 높은 수준으로 지속적으로 발현시키고, 더불어 인위적 변형된 세포, 장기 또는 조직을 제공하여, 신체 기능향상 및 유전질환을 치료하기 위한 플랫폼에 관한 것이다.
본 명세서에서 개시된 내용의 "간에서 목적하는 단백질 발현 플랫폼(liver biofactory platform)"은 간세포 내에 특정 이식 유전자를 도입하여 발현시킴으로써 목적하는 단백질을 지속적으로 발현시킬 수 있는 시스템으로서, 직접적으로 또는 간접적으로 관여하는 모든 조성물, 방법 및 용도를 포함한다.
일 예로, 상기 인위적으로 삽입된 이식유전자는 간 세포 내 고발현 분비 유전자 서열 내 위치하고,
상기 고발현 분비 유전자는 간세포 게놈 내에 존재하는 ALB, FTL, FTH1, ACTB, HP, APOC3, SOD2, ORM1, 및 F9 중에서 선택된 하나 이상의 유전자일 수 있다.
상기 인위적으로 삽입된 이식유전자는 삽입 전과 비교하여 세포 내 발현량이 증가하거나 또는 새롭게 발현될 수 있다.
또한, 본 명세서에서 개시되는 내용은 간세포에서 목적하는 단백질 발현을 위해 표적 특이적 인위적으로 조작된 뉴클레아제를 포함한 조성물에 관한 것으로서,
상기 유전자 조작용 조성물은 고발현 분비 유전자 내 이식유전자를 삽입시키기 위한 인위적으로 조작된 뉴클레아제를 포함하고,
상기 고발현 분비 유전자 군 중 선택된 하나 이상의 유전자인 것을 특징으로 하는 유전자 조작용 조성물을 제공한다.
일 예로, 간에서 발현되는 고발현 분비 유전자 군에서 선택된 하나 이상의 유전자의 표적서열에 대한 가이드 핵산;
에디터 단백질 또는 에디터 단백질을 암호화하는 핵산; 및
목적 단백질을 암호화하는 핵산서열을 포함하는 공여체(donor),
를 포함하는 목적하는 단백질 발현을 위한 조성물을 제공하는 것이다.
"고발현 분비 유전자"는 간 세포 내에서 일정수준 이상 발현하는 유전자로, 간 세포 내에서 많이 발현하면서, 상기 발현 산물이 간 세포 밖으로 분비될 수 있는 유전자를 의미한다. 고발현 분비 유전자는 간 세포의 게놈 내에서 지속적으로 높은 수준의 발현이 가능한 위치에 존재하며, safe harbors site 로서 기능을 가질 수 있다.
상기 고발현 분비 유전자는 ALB, FTL, FTH1, ACTB, HP, APOC3, SOD2, ORM1 AAVS1, Rosa, HPRT,또는 CCR5 로 구성된 유전자 군 중에서 선택된 하나 이상의 유전자 일 수 있다.
상기 고발현 분비 유전자 유전자는 바람직하게 HP 또는 APOC3일 수 있다.
상기 인위적으로 조작된 뉴클레아제는 인위적으로 조작된 뉴클레아제 (artificial engineered nuclease, 유전자 가위로 칭하기도 함)를 의미하며, 일 예로 Clustered regularly interspaced short palindromic repets(CRISPR)-CRISPR associated protein(Cas) system, Zinc finger nuclease(ZFN), Transcription activator-like effector nucleases(TALEN) 중 하나일 수 있다.
상기 핵산서열 내 변형은 비제한적으로, CRISPR-Cas 시스템에 의해 인위적으로 조작될 수 있다.
"CRISPR-Cas 시스템"은 관심있는 유전자서열을 인식하고 결합하는 가이드핵산과 표적 유전자를 절단하는 에디터 단백질의 상호작용을 통해 형성된 시스템을 말하며, CRISPR-Cas 시스템은 가이드 핵산과 에디터 단백질을 포함한다.
CRISPR-Caas 시스템은 대상을 변형시킬 수 있다. 상기 대상은 표적 핵산, 유전자, 염색체 또는 단백질일 수 있다.
상기 에디터 단백질 은 스트렙토코커스 피요게네스(Streptococcus pyogenes) 유래의 Cas9 단백질, 캄필로박터 제주니 (Campylobacter jejuni) 유래의 Cas9 단백질, 스트렙토코커스 써모필러스 (Streptococcus thermophiles) 유래의 Cas9 단백질, 스트렙토코커스 아우레우스 (Streptocuccus aureus) 유래의 Cas9 단백질, 네이세리아 메닝기디티스 (Neisseria meningitidis)유래의 Cas9 단백질, 및 Cpf1로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다. 일 예에서, 스트렙토코커스 피요게네스(Streptococcus pyogenes) 유래의 Cas9 단백질 또는 캄필로박터 제주니 (Campylobacter jejuni) 유래의 Cas9 단백질일 수 있다.
상기 표적서열은 고발현 분비 유전자 서열 중 엑손 영역에 위치한 뉴클레오타이드 서열일 수 있다. 예를 들어, 10bp 내지 25bp의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
상기 표적서열은 고발현 분비 유전자 서열 중 인트론 영역에 위치한 뉴클레오타이드 서열일 수 있다. 예를 들어, 10bp 내지 25bp의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
상기 표적서열은 서열번호 1 내지 348번 중 선택된 1이상일 수 있다.
상기 가이드핵산은 고발현 분비 유전자 군에서 선택된 하나 이상의 유전자의 핵산 서열의 일부와 각각 상보적인 결합을 형성할 수 있다. 0 내지 5, 0내지 4, 0 내지 3, 0 내지 2개의 미스매치(mismatching)를 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 본 명세서에서 개시된 내용은 ALB, FTL, FTH1, ACTB, HP, APOC3, SOD2, ORM1 AAVS1, Rosa, HPRT 또는 CCR5 중 선택된 하나 이상의 고발현 분비 유전자의 표적서열에 대한 가이드핵산을 포함한다. 상기 표적서열은 서열번호 1 내지348 번의 뉴클레오타이드일 수 있다.
예를 들어, 이하의 군으로부터 선택되는 1이상의 가이드 핵산을 제공할 수 있다:
HP 유전자의 핵산 서열 중 서열번호 1 내지 153번의 각 표적서열에 대한 가이드 핵산;
APOC3 유전자 핵산 서열 중 서열번호 168 내지 348번의 각 표적서열에 대한 가이드 핵산;
일 구체예에서, 상기 유전자 조작용 조성물은,
서열번호 1 내지 40번 및 서열번호 154 내지 167번 서열 중에 선택된 어느 하나의 표적서열에 대한 가이드핵산, 및
캄필로박터 제주니 (Campylobacter jejuni) 유래의 Cas9을
포함하는 유전자 조작용 조성물을 제공한다.
다른 구체예에서, 상기 유전자 조작용 조성물은,
서열번호 41 내지 134번 및 서열번호 168 내지 332번에 서열 중에 선택된 어느 하나의 표적서열에 대한 가이드핵산, 및
스트렙토코커스 피요게네스(Streptococcus pyogenes) 유래의 Cas9을
포함하는 유전자 조작용 조성물을 제공한다.
상기 가이드 핵산은 비제한적으로, 18 내지 25bp, 18 내지 24bp, 18 내지 23b, 19 내지 23bp, 및 20 내지 23bp의 뉴클레오타이드 중에 어느 하나일 수 있다.
상기 가이드 RNA는 crRNA와 tracrRNA를 포함하는 이중RNA(dual RNA), 또는 단일-사슬 RNA(sgRNA)의 형태로 존재할 수 있다.
본 명세서에서 개시된 일 내용은 목적하는 단백질을 암호화하는 유전자인 이식유전자를 포함한다.
목적하는 단백질의 발현은 기존 단백질의 대체 또는 신규한 단백질을 제공하는 기능을 할 수 있다. 또는 체내 결핍되거나 결여된 단백질을 인위적으로 발현시킴으로써, 결핍 또는 결여로 인한 질병을 치료하거나 해당 단백질의 기능을 향상시킬 수 있다.
예를 들어, 목적하는 단백질은 다른 특성(예, 혈청 반감기 증가)을 갖는 단백질일 수 있다.
예를 들어, 목적하는 단백질은 특정 질환의 치료 유전자일 수 있다. 상기 치료 유전자는 유전질환에 관여하는 질병 유발 유전자의 발현 및 기능에 영향을 미치는 유전자일 수 있다. 상기 치료 유전자는 유전질환에 관여하는 질병 유발 유전자(정상 유전자의 돌연변이 형태)의 정상 형태 유전자의 일부(예, 기능적 도메인)일 수 있다.
상기 질병은 항체에 의해 치료될 수 있는 질병일 수 있다.
상기 질병은 다양한 유전자의 돌연변이에 의해 유발되는 질병일 수 있다. 예를 들어, “유전성 대사 질환"과 관련된 질병일 수 있다. 예를 들어, 혈우병 등일 수 있다.
상기 치료 유전자, 즉 질병 유발 유전자의 정상 형태는 FVII, FVIII, FIX 및 다른 응고인자들로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다.
상기 치료 유전자, 즉 질병 유발 유전자의 정상 형태는 IDUA, I2S, SGSH, NAGLU, HGSNAT, GNS, GALNS, GLB1, ARSB, GUSB, HYAL, NEU, GNPTAB 및 MCOLN1로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다.
상기 치료 유전자, 즉 질병 유발 유전자의 정상 형태는 SAH1, GALC, CTSA, GLA, NAGA, beta-galactosidase, hexosaminidase, GBA, SMPD1, ARSA 및 SUMF로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다.
상기 치료 유전자, 즉 질병 유발 유전자의 정상 형태는 NPC, PPT, TPP1, CLN3, CLN6, PPT1, DNAJC5, CTSF, CLN7, CLN8 및 CTSD로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다.
상기 치료 유전자, 즉 질병 유발 유전자의 정상 형태는 GAA 또는 LAMP2 일 수 있다.
상기 치료 유전자, 즉 질병 유발 유전자의 정상 형태는 CTNS, CTSK 또는 SLC17A5 일 수 있다.
상기 치료 유전자, 즉 질병 유발 유전자의 정상 형태는 MAN2B, MAN2C, MANBA, AGA, FUCA1 및 LAL로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다.
상기 치료 유전자, 즉 즉 질병 유발 유전자의 정상 형태,는 methylmalonic aciduria CbIA Type (MMAA) protein, methylmalonic aciduria CbIB Type (MMAB) protein, methylmalonic aciduria CbIC Type (MMADHC) protein, 5-Methyltetrahydrofolate-Homocysteine Methyltransferase Reductase (MTRR) protein, lysosomal membrane protein domain (LMBRD 1) protein, 5-Methyltetrahydrofolate-Homocysteine Methyltransferase (MTR) protein, propionyl-CoA protein, glucose-6-phosphate transporter (G6PT) protein, glucose-6-phosphatase (G6Pase) protein, low density lipoprotein receptor (LDLR) protein, low density lipoprotein receptor adaptor protein 1 (LDLRAP-1 protein), N-acetylglutamate synthetase (NAGS) protein, carbamoyl phosphate synthetase 1 (CPS1) protein, ornthine transcarbamylase (OTC) protein, argininosuccinic acid synthetase (ASS) protein, argininosuccinase acid lyase (ASL) protein, arginase (ARG1) protein, solute carrier family 25 protein, UDP glucuronosyltransferase 1 family, polypeptide A1 (UGT1A1) protein, fumarylacetoacetate hydrolyase (FAH), alanine-glyoxylate aminotransferase (AGXT) protein, glyoxylate reductase/hydroxypyruvate reductase (GRHPR) protein, APTase Cu(2+) transporting beta (ATP7B) protein, phenylalanine hydroxylase (PAH) protein 및 lipoprotein lyase (LPL) protein로 이루어진 군에서 선택된 단백질은 코딩하는 유전자일 수 있다.
상기 치료 유전자는 항체를 암호화하는 유전자일 수 있다. 즉 질병을 유발하는데 관여하는 특정 인자나 signal pathway를 항체에 의해 차단시키는 단백질 또는 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자일 수 있다.
상기 치료 유전자는 BBB(blood-brain barrier)와 같은 특정한 조직으로의 투과기능이 있는 특정한 펩타이드 또는 치료 유전자의 치료효과를 증대시킬 수 있는 기능성 펩타이드와 fusion 된 형태일 수 있다.
또한, 본 명세서는 상기 가이드핵산 및/또는 에디터 단백질을 이용하여, 이식유전자가 삽입된, 인위적으로 변형된 세포, 조직 또는 장기를 개시한다.
상기 변형된 세포, 조직 또는 장기는, CRISPR-Cas system을 이용하여 관심 있는 게놈 유전자 내의 표적서열에 이식유전자가 삽입되어 목적 단백질이 발현되어 있는 장기 또는 조직인 것을 특징으로 한다. 상기 인위적으로 변형된 세포, 조직 또는 장기에서는 상기 이식 유전자가 간 세포 내 고발현 분비 유전자 위치에 삽입됨으로써, 목적 단백질이 지속적으로 일정량 이상 고발현된다.
본 명세서에서 개시된 내용의 일 구체예는,
간세포의 게놈 내 인위적으로 삽입된 이식유전자를 발현하는 간세포로서,
상기 고발현 분비 유전자는 FTL, FTH1, ACTB, HP, APOC3, SOD2, ORM1, 및 F9 중에서 선택된 하나 이상의 유전자이며,
상기 인위적으로 삽입된 이식유전자는 고발현 분비 유전자 서열 내 위치하고,
상기 이식유전자로부터 발현된 목적하는 단백질을 포함하는 간세포이다.
상기 고발현 분비 유전자는 예를 들어, HP 또는 APOC3일 수 있다.
상기 이식유전자는 고발현 분비 유전자 게놈 내 엑손 또는 인트론 영역에 포함될 수 있다.
상기 인위적으로 삽입된 이식유전자는 간세포 게놈 내 프로모터에 의해 발현될 수 있다.
상기 간세포는 비제한적으로 조작된 좌위 (예를 들어, 고발현 분비 유전자 좌위)를 포함하는 간(hepatic) 줄기세포일 수 있다. 본 명세서의 방법 및 조성물과 함께 사용될 수 있는 구체적인 줄기 세포 형태는 성체 줄기세포, 배아 줄기세포(ESC), 및 유도 만능 줄기 세포(iPSC)를 포함한다.
본 명세서에서 개시된 내용의 다른 구체예는,
간세포 게놈 내 인위적으로 이식유전자를 삽입하여 목적하는 단백질을 발현하기 위하여 간세포를 인위적 조작하는 방법으로서,
상기 방법은
간세포 게놈 내 존재하는 고발현 분비 유전자를 조작하기 위한 인위적으로 조작된 뉴클레아제; 및 이식유전자를 포함하는 공여체서열을 간세포에 도입하는 단계를 포함하고.
상기 이식유전자는 간세포 게놈 내 존재하는 고발현 분비 유전자 내 삽입되고,
상기 고발현 분비유전자는 FTL, FTH1, ACTB, HP, APOC3, SOD2, ORM1, 및 F9에서 선택된 하나 이상의 유전자인, 간세포를 인위적 조작하는 방법이다.
상기 가이드핵산, 에디터단백질 및 공여체를 간세포 내 도입하는 것은 리포좀, 플라스미드, 바이러스 벡터, 나노파티클 (nanoparticles) 또는 PTD (Protein translocation domain) 융합 단백질 방법 중에 선택된 하나이상의 방법으로 수행될 수 있다.
상기 가이드핵산, 에디터단백질 및 공여체는 핵산 서열의 형태로 각각 또는 함께 1이상의 벡터로 제공될 수 있다.
상기 벡터는 바이러스 벡터 시스템으로 형성될 수 있다. 상기 바이러스 벡터는 아데노 바이러스, 아데노-연관 바이러스(AAV), 백시니아바이러스, 폭스바이러스, 단순포진 바이러스 및 렌티 바이러스 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 것을 포함한다.
또한, 상기 인위적으로 조작된 뉴클레아제 및 공여체를 간세포에 도입하는 단계는 생체 내(in vivo)에서 수행될 수 있다.
대상 내 전달방법은 전신투여 또는 국소적용일 수 있다. 상기 전신투여는 정맥 내 투여일 수 있다.
또한, 상기 인위적으로 조작된 뉴클레아제 및 공여체를 간세포에 도입하는 단계는 생체 외(ex vivo)에서 수행될 수 있다. 대상 내 전달방법은 전기천공법(electroporation)일 수 있다.
본 명세서에서 개시된 내용의 일 구체예는,
특정 질환의 치료를 위해 목적하는 단백질을 간세포에서 지속적이고 일정량이상 발현시키기 위한 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 상기 특정 질환의 치료방법에 관한 것이다.
상기 특정 질환은 특정 단백질의 결핍 또는 결여에서 기인하는 질환일 수 있다.
상기 치료 방법은 간세포 게놈 내 인위적으로 삽입된 이식유전자를 발현시키기 위한 유전자 조작용 조성물을 유효성분으로 포함하는 조성물을 치료 대상에 투여하는 단계를 포함하고
상기 유전자 조작용 조성물은 Clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPR)-CRISPR associated protein(Cas) system, Zinc finger nuclease(ZFN), Transcription activator-like effector nuclease(TALEN)의 인위적으로 조작된 뉴클레아제 중 어느 하나를 포함할 수 있다.
예를 들어, 혈우병 치료 방법으로서,
간 세포 내 HP 또는 APOC3 유전자 서열 내 이식유전자 F9을 삽입하기 위한 유전자 조작용 조성물을 투여하는 것을 포함하는 혈우병 치료 방법을 개시한다.
상기 치료 대상은 인간, 원숭이 등의 영장류, 마우스, 래트 등의 설치류 등을 포함하는 포유 동물일 수 있다.
또한, 본 명세서에서 개시된 내용의 다른 구체예는, 상기 특정 질환 치료 용도의 모든 양태를 포함한다.
본 명세서에서 개시된, 간세포에서 목적하는 단백질을 발현시키기 위한 플랫폼에 의해, 목적하는 단백질을 높은 수준으로 지속적 발현시킬 수 있고, 신체 기능향상 및 유전 질환의 근본적인 치료제를 제공할 수 있다.
예를 들어, 본 명세서의 조성물에 의해 결핍되거나 결여된 단백질을 발현하도록 치료용 단백질을 생성하거나, 또는 다른 특성(예를 들어 반감기 증가)을 갖는 신규한 단백질을 제공함으로써, 특정 단백질의 결핍 또는 결여로 인한 유전질환을 예방 또는 치료할 수 있다.
도 1은 고발현 분비 유전자를 선정하기 위한 RNA-sequencing결과를 보여주는 그래프이다.
도 2는 고발현 분비 유전자의 인위적 조작에 의한 liver biofactory 플랫폼에 관하여 도식하여 나타낸 것이다.
도 3은 Haptoglobin(HP)를 타겟하는 가이드 RNA의 활성을 확인하기 위한 T7E1 assay 결과를 보여주는 그래프이다.
도 4는 Digenome-seq를 통한 off-target 사이트를 확인한 그래프이다.
도 5는 인간세포주 HEK293 cell에서 NGS를 통한 targeted deep sequencing을 통한 off-target 활성을 검증한 그래프이다.
도 6은 CRISPR-SpCas9 또는 CRISPR-CjCas9 과 F9유전자를 dual AAV에 packaging 한 것을 도식하여 나타낸 것이다.
도 7은 pAAV-CMV-CjCas9-U6-sgRNA와 pAAV-hF9-donor를 transfection시킨 HEK293 세포주의 genomic DNA에서 F9 치료유전자가 knock-in 되었는지를 sanger sequencing으로 확인한 결과로 hHP 유전자에 F9유전자를 HDR을 이용한 Knock-in을 확인하기 위한 primer design을 도식하여 나타낸 것이다.
도 8은 왼쪽 그래프는 상동성 암 중 left arm과 hHP유전자 사이에 F9의 삽입 결과를 보여주며, 오른쪽 그래프는 상동성 암 중 right arm과 hHP유전자 사이에 F9의 삽입 결과를 보여주는 그래프이다.
도 9은 AV6-EFS-SpCas9 5x10^11 ㎍와 AAV6-hF9-donor-APOC3-Sp 5x10^11 ㎍의 dual AAV를 Human primary hepatocyte에 도입하였을 때, 도 9의 A에서는 genomic DNA를 이용한 on-target 활성을 보여주며, 도 9의 B에서는 supernatant 샘플을 이용한 knock-in결과 hF9의 분비량을 보여주는 그래프이다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 명세서이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 본 명세서에 기재된 것과 유사 또는 동일한 방법 및 물질이 본 명세서의 실행 또는 시험에서 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 물질이 이하에 기재된다. 본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허 및 기타 다른 참고문헌은 전체가 참고로 포함된다. 추가로, 물질 방법 및 실시예는 단지 예시적이며, 제한되는 것으로 의도되지 않는다.
본 명세서에서 개시되는 내용은 간에서 목적하는 단백질을 발현시키기 위한 플랫폼에 관한 것이다.
보다 구체적으로, 본 명세서에서 개시되는 내용은 CRISPR-Cas시스템을 이용하여 고발현 분비유전자를 인위적으로 조작하여 목적하는 단백질을 발현시키는 조성물을 포함하며,
목적하는 단백질 발현을 위해 인위적으로 조작한 세포, 장기 또는 조직을 포함하며,
이를 이용하여 특정 유전질환의 치료, 예방, 경감하거나 신체 기능을 향상시킬 수 있는 용도를 포함한다.
[Liver bio-factory platform]
본 명세서에 의해 개시되는 내용의 일 구현예는 "목적하는 단백질을 발현하기 위한 플랫폼"에 관한 것이다.
목적하는 단백질을 발현하기 위한 플랫폼은 야생형의 게놈 내에 인위적으로 이식유전자를 삽입하여 특정 장기 또는 조직에서 목적하는 단백질을 계속해서 많은 양으로 생산(발현)할 수 있는 시스템을 총칭하는 것으로서, 조성물, 용도, 방법 등의 양태를 포함한다.
또한, 상기 플랫폼은 생산(발현)된 목적 단백질을 세포 밖으로 분비시키는 시스템을 포함한다. 따라서, 상기 생산된 목적 단백질은 이식유전자가 삽입된 장기 또는 조직에서뿐만 아니라, 분비된 다른 장기 또는 조직에서도 기능할 수 있다.
일 구체예에서, 상기 플랫폼은 목적하는 단백질을 일정수준 이상으로 충분히 생산할 수 있어야 한다.
다른 구체예에서, 상기 플랫폼은 다른 장기 또는 조직에서도 생산된 목적 단백질이 작동할 수 있도록 세포 밖으로 충분히 분비될 수 있어야 한다.
본 명세서에서, 목적하는 단백질을 발현하기 위한 플랫폼을 구현하는 특정 장기 또는 조직은 간 또는 간조직이다.
간은 우리 몸에서 일어나는 모든 일에 관여하는 인체의 화학 공장으로 불리어지는 기관으로, 천연 가지의 효소를 통한 영양분의 물질대사 담당, 해독, 면역작용 등의 일을 한다. 특히 인체가 적절한 기능을 하는데 필요한 각종 물질들을 생산, 저장하고, 다시 간정맥을 통해 몸 전체로 내보낼 수 있다.
예를 들어, 간에서 특정 유전자가 고발현됨으로써, 특정 단백질을 많이 생산해 낼 수 있고, 상기 생산된 단백질을 몸 전체로 분비시킴으로써, 필요한 기관에 해당 단백질을 공급할 수 있다.
이하, 간에서 목적하는 단백질을 발현하기 위한 플랫폼 (Liver biofactory platform)에 대해 기술한다.
본 명세서에 의해 개시되는 일 내용으로서, 간에서 목적하는 단백질 발현하기 위한 플랫폼은 간 조직 내에서 목적하는 단백질을 지속적으로 생산하기 위한 시스템이며, 상기 시스템은 또한 생산된 단백질을 세포 밖으로 분비할 수 있는 직적접으로 또는 간접적으로 관여하는 모든 물질, 조성물, 방법 및 용도를 포함한다.
간에서 목적하는 단백질을 발현하기 위한 플랫폼은 간세포, 예를 들어, 상기 간세포 내 게놈을 인위적으로 조작하여 목적하는 단백질을 간세포 내에서 생산하는 시스템을 포함한다.
일 예로, 간세포 게놈 서열을 인위적으로 변형시키는 것을 포함한다.
일 구체예에서, 간세포 게놈 중 특정 유전자의 일부 서열을 절단하는 것을 포함한다.
다른 구체예로, 간세포 게놈 중 절단된 서열 사이에 목적 단백질을 코딩하는 이식유전자를 삽입하는 것을 포함한다.
본 명세서에 의해 개시되는 일 내용으로서, 간에서 목적하는 단백질 발현하기 위한 플랫폼은 다양한 종류의 간 유래 세포를 이용할 수 있다.
예를 들어, 간세포, 유도 만능 줄기 세포(iPSC) 또는 다른 유형의 줄기 세포(배아, 조혈, 또는 중간엽)를 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
간에서 목적하는 단백질을 발현하기 위한 플랫폼은 간에서 목적하는 단백질을 높은 수준으로 발현하기 위한 간세포 게놈 내 특정 영역을 이용할 수 있다.
일 예로, 이식유전자는 간 세포의 게놈 내 세이프 하버 영역(safe harbor site)에 삽입할 수 있다.
상기‘세이프 하버 영역(safe harbor site)’는 외래 유전자가 삽입되어도 심각한 부작용, 예를 들어 암이 유발되지 않는 게놈 내 특정 영역이며, 상기 특정 영역 내 삽입된 외래 유전자는 영구적이고 안전하게 높은 수준의 발현이 가능하다.
다른 예로, 이식 유전자는 간 세포의 게놈 내 유전자 발현 조절영역(expression regulatory region)을 이용할 수 있는 영역에 삽입할 수 있다.
상기 ‘발현 조절영역(gene regulatory region)’는 간세포 게놈에 존재하는 유전자의 발현 조절에 중요한 역할을 하는 영역으로서, 예를 들어 유전정보를 포함하는 서열에 인접한 프로모터 및/또는 조절요소(인핸서, 전사촉진인자 등)을 포함하는 영역을 총칭한다. 상기 프로모터 및/또는 조절요소를 이용하여 삽입된 외래 유전자는 고효율로 높은 수준의 발현이 가능하다.
간에서 목적하는 단백질을 발현하는 플랫폼은, 이러한 간 세포 내 게놈의 특정 위치를 이용하여, 이식유전자를 계속해서 높은 수준으로 발현시킴으로써 목적하는 단백질을 다량으로 생산할 수 있다.
고발현 분비 유전자(highly expressed and secreted gene)
본 명세서에 의해 개시되는 내용으로서,
상기 간세포 게놈 내 이식유전자가 삽입되는 특정 영역은 "고발현 분비 유전자"의 일부 서열에 포함될 수 있다. 본 명세서에서는 상기 고발현 분비 유전자를 간세포 게놈 내 인위적인 조작을 수행하는 표적 유전자(target gene)로 칭하기도 한다.
상기 "고발현 분비 유전자"는 간 세포 내에서 지속적으로 높은 수준의 발현이 가능하고, 상기 발현 산물이 세포 밖으로 분비될 수 있는 유전자를 의미한다.
예를 들어, 상기 고발현 분비 유전자는 간 세포의 게놈 내 세이프 하버 영역 중 어느 하나에 포함될 수 있다.
예를 들어, 상기 고발현 분비 유전자는 간 세포의 게놈 내 지속적으로 높은 유전자 발현을 가능하게 하는 프로모터 및 조절 요소를 포함할 수 있다.
상기 고발현 분비 유전자는 간 세포 게놈 내 존재하는 야생형 유전자일 수 있다.
용어 "야생형"은 자연에서 가장 보편적으로 보이는 유전자 또는 임의의 정상이라고 지정된 대립 유전자를 의미한다. 예를 들어, 특정 질환을 나타내지 않는 정상 상태의 유전자 형태일 수 있다.
또한, 상기 고발현 분비 유전자는 간 세포 게놈 내 존재하는 정상적으로 기능하지 못하는 유전자일 수 있다.
이때, 상기 고발현 분비 유전자는 야생형과 비교하여 하나 이상의 특정 뉴클레오타이드가 변형된 유전자일 수 있다. 예를 들어, 상기 변형은 하나 이상의 뉴클레오타이드의 결실, 치환, 및/또는 삽입을 포함한다. 상기 변형된 고발현 분비 유전자는 전부 또는 일부가 발현되거나, 전혀 발현되지 않을 수 있다.
본 명세서에 의해 개시되는 내용으로서,
목적 단백질을 발현하는 이식유전자(외래유전자)는 상기 고발현 분비 유전자의 서열 내에 삽입할 수 있다.
이 때, 해당 고발현 분비 유전자는 전부 또는 일부가 발현될 수 있다. 즉, 이식유전자 및 고발현 분비 유전자가 함께 발현될 수 있다.
또는 해당 고발현 분비 유전자는 간 세포 내에서 발현하여 혈액으로 분비될 수 있다.
또는 해당 고발현 분비 유전자는 전혀 발현되지 않을 수 있다.
상기 고발현 분비 유전자는 예를 들어, ALB, FTL, FTH1, ACTB, HP, APOC3, SOD2, ORM1 AAVS1, Rosa, 또는 HPRT일 수 있다. 다른 예로, 고발현 분비 유전자는 IDUA, IDS, GLA, 또는 GBA일 수 있다.
일 구체예에서, 고발현 분비 유전자는 HP 일 수 있다.
HP 유전자는 Haptoglobin 을 암호화하는 유전자를 의미한다. 일 예에서, HP유전자는 다음으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다: 인간 HP(e.g., NCBI Accession No. NP_001119574, NP_001305067, NP_005134) 또는 Mous HP(NP_001316894, NP_059066)을 암호화하는 유전자, 예컨대, NCBI Accession No.NM_001126102, NM_005143, NM_001318138 등으로 표현되는 HP 유전자.
다른 구체예에서, 고발현 분비 유전자는 APOC3 일 수 있다.
APOC3 (Apolipoprotein C3) 유전자는 VLDL(very low density lipoprotein)의 구성원인 Apolipoprotein C-III를 암호화는 유전자를 의미한다. APOC3 유전자는 다음으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다: 인간 APOC3(e.g., NCBI Accession No. NP_000031)을 암호화하는 유전자, 예컨대, NCBI Accession No.NM_000040 등으로 표현되는 APOC3 유전자.
본 명세서에 의해 개시되는 내용의 일 예는, 간세포 게놈 내 인위적으로 삽입된 이식유전자를 발현하는 LBP시스템으로서,
상기 인위적으로 삽입된 이식유전자는 고발현 분비 서열 내 위치하고,
상기 고발현 분비 유전자는 ALB, FTL, FTH1, ACTB, HP, APOC3, SOD2, ORM1, 및 F9 중에서 선택된 하나 이상의 유전자이며,
상기 인위적으로 삽입된 이식유전자는 삽입전과 비교하여 발현량이 증가하거나 또는 새롭게 발현되는 LBP 시스템이다.
[목적하는 단백질 발현을 위한 조성물]
본 명세서에 의해 개시되는 내용의 일 구현예는 "목적하는 단백질을 발현하기 위한 플랫폼"을 구현시킬 수 있는 조성물에 관한 것이다.
간세포 게놈 내 인위적으로 삽입된 이식유전자를 발현하는 LBP시스템을 구현할 수 있는 조성물을 포함한다.
일 구체예로서, 고발현 분비 유전자를 인위적으로 조작하기 위한 조성물에 관한 것이다.
상기 고발현 분비 유전자를 인위적으로 조작하기 위한 조성물은 고발현 분비 유전자 내 임의의 영역을 변형 시킬 수 있다.
"인위적으로 조작된(artificially modiified or engineered or artificially engineered)"이라는 용어는 자연상태에서 일어나는 그대로의 상태가 아닌, 인위적으로 변형을 가한 상태를 말한다. 예를 들어 유전자의 일부 뉴클레오타이드가 삭제 또는 치환될 수 있고, 외부 뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드가 삽입하여 변형될 수 있다.
상기 고발현 분비 유전자를 인위적 조작하기 위한 조성물은 인위적으로 조작된 뉴클레아제를 포함한다.
"인위적으로 조작된 뉴클레아제 (programmable nuclease)"는 목적하는 유전체 상의 특정 위치를 인식하여 절단할 수 있는 모든 형태의 뉴클레아제를 포함한다. 이에 제한되는 것은 아니나, 특히 유전체 상의 특정 표적서열을 인식하는 도메인인 Clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPR)- CRISPR associated protein(Cas) system, 식물 병원성 유전자에서 유래한 TAL 작동자 (transcription activator-like effector) 도메인과 절단 도메인이 융합된 TALEN (transcription activator-like effector nuclease), 징크-핑거 뉴클레아제 (zinc-finger nuclease), 메가뉴클레아제 (meganuclease), RGEN (RNA-guided engineered nuclease), Cpf1, FokI -endonuclease 또는 이의 조합일 수 있다.
바람직하게는 CRISPR-Cas system일 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.
[CRISPR-Cas system]
본 명세서에 의해 개시되는 내용의 다른 구현예는 고발현 분비 유전자를 인위적으로 조작하기 위한 CRISPR-Cas system을 포함하는 조성물에 관한 것이다.
상기 CRISPR-Cas systme은 가이드 핵산 및/또는 에디터단백질로 구성될 수 있다.
본 명세서에 의하여 개시되는 내용의 일 구체예에서,
고발현 분비 유전자를 조작하기 위한 조성물은 고발현 분비 유전자를 조작하기 위한 가이드핵산을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 용어 "가이드 핵산"은 표적 핵산, 유전자 또는 염색체를 인지하고, 및 에디터 단백질과 상호작용할 수 있는 뉴클레오티드 서열을 의미한다. 이때, 상기 가이드 핵산은 표적 핵산, 유전자 또는 염색체 내의 일부 뉴클레오티드와 상보적인 결합을 형성할 수 있다.
상기 가이드핵산은 가이드핵산-에디터단백질 복합체를 형성할 수 있으며, 가이드핵산-에디터 복합체가 표적 핵산, 유전자 또는 염색체의 표적 영역에 위치할 수 있도록 유도하는 기능을 수행할 수 있다.
상기 가이드 핵산은 표적 DNA 특이적 가이드 RNA, 상기 가이드 RNA를 코딩하는 DNA, 또는 DNA/RNA 혼합의 형태일 수 있다.
상기 가이드 핵산은 가이드 RNA일 수 있다.
"가이드 RNA"는 생체 외(in vitro) 전사된 것일 수 있고, 특히 올리고 뉴클레오티드 이중가닥, 또는 플라스미드 주형으로부터 전사된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 가이드핵산은 하나의 연속된 핵산서열일 수 있다.
예를 들어, 하나의 연속된 핵산 서열은 (N)m 일 수 있고, 이때 N은 A, T, C 또는 G, 또는 A, U, C 또는 G이며, m은 1 내지 150의 정수를 의미한다.
상기 가이드핵산은 연속된 핵산서열이 두 개 이상일 수 있다.
예를 들어, 두 개 이상의 연속된 핵산서열은 (N)m과 (N)o 일 수 있고, 이때 N은 A, T, C 또는 G, 또는 A, U, C 또는 G이며, m 및 o는 1 내지 150의 정수를 의미하며, m과 o는 서로 같거나 다를 수 있다.
상기 가이드핵산은 하나 이상의 도메인을 포함할 수 있다.
상기 도메인은 가이드 도메인, 제 1 상보적 도메인, 연결 도메인, 제 2 상보적 도메인, 근위 도메인, 꼬리도메인 등의 기능적 도메인일 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
이때, 하나의 가이드핵산은 2 이상의 기능적 도메인을 가질 수 있다. 이때, 상기 2 이상의 기능적 도메인은 서로 상이할 수 있다. 또는 하나의 가이드핵산에 포함된 2 이상의 기능적 도메인은 서로 동일할 수도 있다. 예를 들어, 하나의 가이드핵산은 2 이상의 근위 도메인을 가질 수 있고, 다른 예를 들어, 하나의 가이드핵산은 2 이상의 꼬리도메인을 가질 수 있다. 다만, 하나의 가이드핵산에 포함되어 있는 기능적 도메인이 서로 동일한 도메인이라는 말은 두 기능적 도메인의 시퀀스가 동일하다는 의미는 아니며, 시퀀스가 상이하여도 기능적으로 동일한 기능을 수행하고 있으면 동일한 도메인이라고 할 수 있다.
기능적 도메인에 대해서 이하에서 구체적으로 설명한다.
i) 가이드 도메인
"가이드 도메인"은 표적 유전자 또는 핵산의 이중 가닥 중 어느 하나 가닥의 일부 서열에 상보적인 결합을 할 수 있는 도메인으로, 표적 유전자 또는 핵산과의 특이적인 상호작용을 위해 역할한다. 예를 들어, 가이드 도메인은 표적 유전자 또는 핵산의 특정 뉴클레오타이드서열을 가지는 위치로 가이드핵산-에디터단백질 복합체를 유도하는 기능을 수행할 수 있다.
상기 가이드 도메인은 10 내지 35개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
일 예로, 상기 가이드 도메인은 10 내지 35개의 뉴클레오타이드서열, 15 내지 35개의 뉴클레오타이드서열, 20 내지 35개의 뉴클레오타이드서열, 25 내지 35개의 뉴클레오타이드서열 또는 30 내지 35개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
다른 일 예로, 상기 가이드 도메인은 10 내지 15개의 뉴클레오타이드서열, 15 내지 20개의 뉴클레오타이드서열, 20 내지 25개의 뉴클레오타이드서열, 25 내지 30개의 뉴클레오타이드서열 또는 30 내지 35개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
상기 가이드 도메인은 가이드 서열을 포함할 수 있다.
"가이드 서열"은 표적 유전자 또는 핵산의 이중 가닥 중 어느 하나 가닥의 일부 서열에 상보적인 뉴클레오타이드서열이며, 이때 상기 가이드 서*은 최소한 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 이상의 상보성을 가지거나 또는 완전한 상보성을 가지는 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
상기 가이드 서열은 10 내지 25개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
일 예로, 상기 가이드 서열은 10 내지 25개의 뉴클레오타이드서열, 15 내지 25개의 뉴클레오타이드서열 또는 20 내지 25개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
다른 일 예로, 상기 가이드 서열은 10 내지 15개의 뉴클레오타이드서열, 15 내지 20개의 뉴클레오타이드서열 또는 20 내지 25개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
또한, 상기 가이드 도메인은 추가 뉴클레오타이드서열을 더 포함할 수 있다.
상기 추가 뉴클레오타이드서열은 가이드 도메인의 기능 향상 또는 저하를 위한 것일 수 있다.
상기 추가 뉴클레오타이드서열은 가이드 서열의 기능 향상 또는 저하를 위한 것일 수 있다.
상기 추가 뉴클레오타이드서열은 1 내지 10개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
일 예로, 상기 추가 뉴클레오타이드서열은 2내지 10개의 뉴클레오타이드서열, 4 내지 10개의 뉴클레오타이드서열, 6 내지 10개의 뉴클레오타이드서열 또는 8 내지 10개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
다른 일 예로, 상기 추가 뉴클레오타이드서열은 1 내지 3개의 뉴클레오타이드서열, 3 내지 6개의 뉴클레오타이드서열 또는 7 내지 10개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 추가 뉴클레오타이드서열은 1개의 뉴클레오타이드서열, 2개의 뉴클레오타이드서열, 3개의 뉴클레오타이드서열, 4개의 뉴클레오타이드서열, 5개의 뉴클레오타이드서열, 6개의 뉴클레오타이드서열, 7개의 뉴클레오타이드서열, 8개의 뉴클레오타이드서열, 9개의 뉴클레오타이드서열 또는 10개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
예를 들어, 상기 추가 뉴클레오타이드서열은 1개의 뉴클레오타이드서열 G(구아닌)일 수 있으며, 또는 2개의 뉴클레오타이드서열 GG일 수 있다.
상기 추가 뉴클레오타이드서열은 상기 가이드 서열의 5' 말단에 위치할 수 있다.
상기 추가 뉴클레오타이드서열은 상기 가이드 서열의 3' 말단에 위치할 수 있다.
ii) 제 1 상보적 도메인
"제 1 상보적 도메인"은 이하에서 설명하는 제 2 상보적 도메인에 대해 상보적 뉴클레오타이드서열을 포함하는 도메인으로, 제 2 상보적 도메인과 이중가닥을 형성할 수 있을 정도로 상보성을 가진다. 예를 들어, 제 1 상보적 도메인은 제 2 상보적 도메인에 대해 최소한 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 이상의 상보성을 가지거나 또는 완전한 상보성을 가지는 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
상기 제 1 상보적 도메인은 제 2 상보적 도메인과 상보적 결합을 통해 이중가닥을 형성할 수 있다. 이때, 상기 형성된 이중가닥은 에디터단백질의 일부 아미노산과 상호작용하여 가이드핵산-에디터단백질 복합체를 형성하는 역할을 할 수 있다.
상기 제 1 상보적 도메인은 5 내지 35개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
일 예로, 제 1 상보적 도메인은 5 내지 35개의 뉴클레오타이드서열, 10 내지 35개의 뉴클레오타이드서열, 15 내지 35개의 뉴클레오타이드서열, 20 내지 35개의 뉴클레오타이드서열, 25 내지 35개의 뉴클레오타이드서열 또는 30 내지 35개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
다른 일 예로서, 상기 제 1 상보적 도메인은 1 내지 5개의 뉴클레오타이드서열, 5 내지 10개의 뉴클레오타이드서열, 10 내지 15개의 뉴클레오타이드서열, 15 내지 20개의 뉴클레오타이드서열, 20 내지 25개의 뉴클레오타이드서열, 25 내지 30개의 뉴클레오타이드서열 또는 30 내지 35개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
iii) 연결 도메인
"연결 도메인"은 두 개 이상의 도메인을 연결하는 뉴클레오타이드서열로, 연결 도메인은 동일한 또는 서로 다른 두 개 이상의 도메인을 연결한다. 연결 도메인은 두 개 이상의 도메인과 공유결합 또는 비공유결합을 할 수 있고, 또는 두 개 이상의 도메인을 공유적 또는 비공유적으로 연결할 수 있다.
상기 연결 도메인은 1 내지 30개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
일 예로서, 상기 연결 도메인은 1 내지 5개의 뉴클레오타이드서열, 5 내지 10개의 뉴클레오타이드서열, 10 내지 15개의 뉴클레오타이드서열, 15 내지 20개의 뉴클레오타이드서열, 20 내지 25개의 뉴클레오타이드서열 또는 25 내지 30개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
다른 일 예로서, 상기 연결 도메인은 1 내지 30개의 뉴클레오타이드서열, 5 내지 30개의 뉴클레오타이드서열, 10 내지 30개의 뉴클레오타이드서열, 15 내지 30개의 뉴클레오타이드서열, 20 내지 30개의 뉴클레오타이드서열 또는 25 내지 30개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
iv) 제 2 상보적 도메인
"제 2 상보적 도메인"은 전술한 제 1 상보적 도메인과 상보적 핵산서열을 포함하는 뉴클레오타이드서열을 포함하는 도메인으로, 제 1 상보적 도메인과 이중가닥을 형성할 수 있을 정도로 상보성을 가진다. 예를 들어, 제 2 상보적 도메인은 제 1 상보적 도메인에 대해 최소한 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 이상의 상보성을 가지거나 또는 완전한 상보성을 가지는 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
상기 제 2 상보적 도메인은 제 1 상보적 도메인과 상보적 결합을 통해 이중가닥을 형성할 수 있다. 이때, 상기 형성된 이중가닥은 에디터단백질의 일부 아미노산과 상호작용하여 가이드핵산-에디터단백질 복합체를 형성하는 역할을 할 수 있다.
제 2 상보적 도메인은 제 1 상보적 도메인과 상보적 뉴클레오타이드서열 및 제 1 상보적 도메인과의 상보성이 없는 뉴클레오타이드서열, 예를 들어, 제 1 상보적 도메인과 이중가닥을 형성하지 않는 뉴클레오타이드서열을 포함할 수 있으며, 제 1 상보적 도메인보다 뉴클레오타이드서열의 길이가 길 수 있다.
상기 제 2 상보적 도메인은 5 내지 35개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
일 예로, 상기 제 2 상보적 도메인은 1 내지 35개의 뉴클레오타이드서열, 5 내지 35개의 뉴클레오타이드서열, 10 내지 35개의 뉴클레오타이드서열, 15 내지 35개의 뉴클레오타이드서열, 20 내지 35개의 뉴클레오타이드서열, 25 내지 35개의 뉴클레오타이드서열 또는 30 내지 35 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
다른 일 예로, 상기 제 2 상보적 도메인은 1 내지 5개의 뉴클레오타이드서열, 5 내지 10개의 뉴클레오타이드서열, 10 내지 15개의 뉴클레오타이드서열, 15 내지 20개의 뉴클레오타이드서열, 20 내지 25개의 뉴클레오타이드서열, 25 내지 30개의 뉴클레오타이드서열 또는 30 내지 35개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
v) 근위 도메인(proximal domain)
"근위 도메인"은 제 2 상보적 도메인에 근접하게 위치하는 뉴클레오타이드서열이다.
근위 도메인은 근위 도메인 내의 상보적인 뉴클레오타이드서열을 포함할 수 있으며, 상보적인 뉴클레오타이드서열에 의해 이중가닥을 형성할 수 있다.
상기 근위 도메인은 1 내지 20개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
일 예로서, 상기 근위 도메인은 1 내지 20개의 뉴클레오타이드서열, 5 내지 20개의 뉴클레오타이드서열, 10 내지 20개의 뉴클레오타이드서열 또는 15 내지 20개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
다른 일 예로서, 상기 근위 도메인은 1 내지 5개의 뉴클레오타이드서열, 5 내지 10개의 뉴클레오타이드서열, 10 내지 15개의 뉴클레오타이드서열 또는 15 내지 20개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
vi) 꼬리 도메인
"꼬리 도메인"은 가이드핵산의 양 말단 중 어느 하나 이상의 말단에 위치하는 뉴클레오타이드서열이다.
꼬리 도메인은 꼬리 도메인 내의 상보적인 뉴클레오타이드서열을 포함할 수 있으며, 상보적인 뉴클레오타이드서열에 의해 이중가닥을 형성할 수 있다.
상기 꼬리 도메인은 1 내지 50개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
일 예로, 상기 꼬리 도메인은 5 내지 50개의 뉴클레오타이드서열, 10 내지 50개의 뉴클레오타이드서열, 15 내지 50개의 뉴클레오타이드서열, 20 내지 50개의 뉴클레오타이드서열, 25 내지 50개의 뉴클레오타이드서열, 30 내지 50개의 뉴클레오타이드서열, 35 내지 50개의 뉴클레오타이드서열, 40 내지 50개의 뉴클레오타이드서열 또는 45 내지 50개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
다른 일 예로, 상기 꼬리 도메인은 1 내지 5개의 뉴클레오타이드서열, 5 내지 10개의 뉴클레오타이드서열, 10 내지 15개의 뉴클레오타이드서열, 15 내지 20개의 뉴클레오타이드서열, 20 내지 25개의 뉴클레오타이드서열, 25 내지 30개의 뉴클레오타이드서열, 30 내지 35개의 뉴클레오타이드서열, 35 내지 40개의 뉴클레오타이드서열, 40 내지 45개의 뉴클레오타이드서열 또는 45 내지 50개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
한편, 상기 도메인들, 즉, 가이드 도메인, 제 1 상보적 도메인, 연결 도메인, 제 2 상보적 도메인, 근위 도메인 및 꼬리 도메인이 포함하는 핵산 서열의 일부 또는 전부는 선택적 또는 추가적으로 화학적 변형을 포함할 수 있다.
상기 화학적 변형은 methylation, acetylation, phosphorylation, phosphorothioate linkage, locked nucleic acid(LNA), 2'-O-methyl 3'phosphorothioate(MS) 또는 2'-O-methyl 3'thioPACE(MSP)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
가이드핵산은 하나 이상의 도메인을 포함한다.
상기 가이드핵산은 가이드 도메인을 포함할 수 있다.
상기 가이드핵산은 제 1 상보적 도메인을 포함할 수 있다.
상기 가이드핵산은 연결 도메인을 포함할 수 있다.
상기 가이드핵산은 제 2 상보적 도메인을 포함할 수 있다.
상기 가이드핵산은 근위 도메인을 포함할 수 있다.
상기 가이드핵산은 꼬리 도메인을 포함할 수 있다.
이때, 상기 도메인의 개수는 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 그 이상일 수 있다.
상기 가이드핵산은 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 그 이상의 가이드 도메인을 포함할 수 있다.
상기 가이드핵산은 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 그 이상의 제 1 상보적 도메인을 포함할 수 있다.
상기 가이드핵산은 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 그 이상의 연결 도메인을 포함할 수 있다.
상기 가이드핵산은 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 그 이상의 제 2 상보적 도메인을 포함할 수 있다.
상기 가이드핵산은 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 그 이상의 근위 도메인을 포함할 수 있다.
상기 가이드핵산은 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 그 이상의 꼬리 도메인을 포함할 수 있다.
이때, 상기 가이드핵산은 하나의 도메인이 중복되어 포함될 수 있다.
상기 가이드핵산은 여러 도메인을 중복 또는 중복시키지 않고 포함할 수 있다.
상기 가이드핵산은 같은 종류의 도메인을 포함할 수 있으며, 이때, 같은 종류의 도메인은 동일한 핵산서열을 가지거나 또는 서로 다른 핵산서열을 가질 수 있다.
상기 가이드핵산은 두 종류의 도메인을 포함할 수 있으며, 이때, 다른 두 종류의 도메인은 서로 다른 핵산서열을 가지거나 또는 동일한 핵산서열을 가질 수 있다.
상기 가이드핵산은 세 종류의 도메인을 포함할 수 있으며, 이때, 다른 세 종류의 도메인은 서로 다른 핵산서열을 가지거나 또는 동일한 핵산서열을 가질 수 있다.
상기 가이드핵산은 네 종류의 도메인을 포함할 수 있으며, 이때, 다른 네 종류의 도메인은 서로 다른 핵산서열을 가지거나 또는 동일한 핵산서열을 가질 수 있다.
상기 가이드핵산은 다섯 종류의 도메인을 포함할 수 있으며, 이때, 다른 다섯 종류의 도메인은 서로 다른 핵산서열을 가지거나 또는 동일한 핵산서열을 가질 수 있다.
상기 가이드핵산은 여섯 종류의 도메인을 포함할 수 있으며, 이때, 다른 여섯 종류의 도메인은 서로 다른 핵산서열을 가지거나 또는 동일한 핵산서열을 가질 수 있다.
예를 들면, 가이드핵산은 [가이드 도메인]-[제 1 상보적 도메인]-[연결 도메인]-[제 2 상보적 도메인]-[연결 도메인]-[가이드 도메인]-[제 1 상보적 도메인]-[연결 도메인]-[제 2 상보적 도메인]으로 구성될 수 있으며, 이때, 두 개의 가이드 도메인은 서로 다른 또는 동일한 표적을 위한 가이드 서열을 포함할 수 있으며, 상기 두 개의 제 1 상보적 도메인과 두 개의 제 2 상보적 도메인 동일한 핵산서열을 가지거나 다른 핵산서열을 가질 수 있다. 가이드 도메인이 서로 다른 표적을 위한 가이드 서열을 포함하는 경우, 상기 가이드핵산은 두 개의 표적에 특이적으로 결합할 수 있으며, 이때, 특이적 결합을 동시에 일어나거나 순차적으로 일어날 수 있다. 또한, 상기 연결 도메인은 특정 효소에 의해 절단될 수 있으며, 특정 효소의 존재 하에서 상기 가이드핵산은 두 부분 또는 세 부분으로 나누어질 수 있다.
본 명세서에 의해 개시되는 내용의 일 구체예로서 고발현 분비 유전자를 조작하기 위한 가이드핵산은 고발현 분비 유전자를 조작하기 위한 가이드 RNA일 수 있다.
가이드 RNA는 생체 외 (in vitro) 전사된(transcribed) 것일 수 있고, 특히 올리고뉴클레오티드 이중가닥 또는 플라스미드 주형으로부터 전사된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용된, 용어 "가이드 RNA" 는 표적 DNA에 특이적인 RNA로, Cas 단백질과 복합체를 형성할 수 있고, Cas 단백질을 표적 DNA에 가져오는 RNA를 말한다.
상기 가이드RNA는 다수의 도메인을 포함할 수 있다. 각각의 도메인에 의해 3차원 행태 또는 가이드RNA의 활성 형태의 가닥내 또는 가닥간 상호작용을 할 수 있다.
일 구체예에서, 단일가닥 가이드RNA는 5'으로부터 3' 방향으로 가이드 도메인, 즉 표적 유전자 또는 핵산에 상보적인 결합을 할 수 있는 가이드 서열(guide sequence)를 포함하는 도메인; 제 1 상보적 도메인; 연결 도메인; 제 2 상보적 도메인, 상기 제 1 상보적 도메인 서열에 상보적인 서열을 가지므로 제 1 상보적 도메인과 이중가닥 핵산을 형성할 수 있는 도메인; 근위 도메인(proximal domain); 및 선택적으로 꼬리 도메인을 포함할 수 있다.
다른 일 구체예로서, 이중 가이드RNA는 5'으로부터 3' 방향으로 가이드 도메인, 즉 표적 유전자 또는 핵산에 상보적인 결합을 할 수 있는 가이드 서열(guide sequence)를 포함하는 도메인 및 제 1 상보적 도메인을 포함하는 제 1가닥; 및 제 2 상보적 도메인, 상기 제 1 상보적 도메인 서열에 상보적인 서열을 가지므로 제 1 상보적 도메인과 이중가닥 핵산을 형성할 수 있는 도메인, 근위 도메인(proximal domain); 및 선택적으로 꼬리 도메인을 포함하는 제 2 가닥을 포함할 수 있다.
이때, 상기 제 1가닥은 crRNA라고 지칭될 수 있고, 상기 제 2가닥은 tracrRNA로 지칭될 수 있다. 상기 crRNA는 가이드 도메인과 제 1 상보적 도메인을 포함할 수 있으며, 상기 tracrRNA는 제 2 상보적 도메인, 근위 도메인 및 선택적으로 꼬리 도메인을 포함할 수 있다.
또 다른 일 구체예로서, 단일가닥 가이드RNA는 3'으로부터 5' 방향으로 가이드 도메인, 즉 표적 유전자 또는 핵산에 상보적인 결합을 할 수 있는 가이드 서열(guide sequence)를 포함하는 도메인; 제 1 상보적 도메인; 및 제 2 상보적 도메인, 상기 제 1 상보적 도메인 서열에 상보적인 서열을 가지므로 제 1 상보적 도메인과 이중가닥 핵산을 형성할 수 있는 도메인을 포함할 수 있다.
이때, 상기 제 1 상보적 도메인은 자연유래의 제 1 상보적 도메인과 상동성을 가지거나, 또는 자연유래의 제 1 상보적 도메인으로부터 유래될 수 있다. 또한, 상기 제 1 상보적 도메인은 자연에 존재하는 종에 따라 제 1 상보적 도메인의 뉴클레오타이드서열에 차이가 존재할 수 있으며, 자연에 존재하는 종이 포함하는 제 1 상보적 도메인으로부터 유래될 수 있고, 또는 자연에 존재하는 종이 포함하는 제 1 상보적 도메인과 일부 또는 완전한 상동성을 가질 수 있다.
일 구체예로서, 상기 제 1 상보적 도메인은 스트렙토코커스 피요게네스(Streptococcus pyogenes), 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni), 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophiles), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 또는 네이세리아 메닝기디티스(Neisseria meningitides)의 제 1 상보적 도메인 또는 유래된 제 1 상보적 도메인과 일부, 최소 50%이상, 또는 완전한 상동성을 가질 수 있다.
예를 들어, 상기 제 1 상보적 도메인이 스트렙토코커스 피요게네스의 제 1 상보적 도메인 또는 스트렙토코커스 피요게네스 유래 제 1 상보적 도메인인 경우, 상기 제 1 상보적 도메인은 5'-GUUUUAGAGCUA-3'일 수 있고, 또는 5'-GUUUUAGAGCUA-3'와 일부, 적어도 50% 이상의 상동성을 가지는 뉴클레오타이드서열일 수 있다. 이때, 상기 제 1 상보적 도메인은 추가로 (X)n을 포함, 즉, 5'-GUUUUAGAGCUA(X)n-3', 할 수 있다. 상기 X는 뉴클레오타이드 A, T, U 및 G로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며, 상기 n은 뉴클레오타이드서열의 개수로, 5 내지 15의 정수일 수 있다. 이때, (X)n은 동일한 뉴클레오타이드서열의 정수 n개만큼의 반복일 수 있고, 또는 뉴클레오타이드 A, T, U 및 G가 혼합된 정수 n개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
또 다른 예를 들어, 상기 제 1 상보적 도메인이 캄필로박터 제주니의 제 1 상보적 도메인 또는 캄필로박터 제주니 유래 제 1 상보적 도메인인 경우, 상기 제 1 상보적 도메인은 5'-GUUUUAGUCCCUUUUUAAAUUUCUU-3' 또는 5'-GUUUUAGUCCCUU-3'일 수 있고, 또는 5'-GUUUUAGUCCCUUUUUAAAUUUCUU-3' 또는 5'-GUUUUAGUCCCUU-3'와 일부, 적어도 50% 이상의 상동성을 가지는 뉴클레오타이드서열일 수 있다. 이때, 상기 제 1 상보적 도메인은 추가로 (X)n을 포함, 즉, 5'-GUUUUAGUCCCUUUUUAAAUUUCUU(X)n-3' 또는 5'-GUUUUAGUCCCUU(X)n-3', 할 수 있다. 상기 X는 뉴클레오타이드 A, T, U 및 G로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며, 상기 n은 뉴클레오타이드서열의 개수로, 5 내지 15의 정수일 수 있다. 이때, (X)n은 동일한 뉴클레오타이드서열의 정수 n개만큼의 반복일 수 있고, 또는 뉴클레오타이드 A, T, U 및 G가 혼합된 정수 n개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 상기 제 1 상보적 도메인은 팔쿠박테리아 박테리움(Parcubacteria bacterium (GWC2011_GWC2_44_17)), 라츠노스피라세애 박테리움(Lachnospiraceae bacterium (MC2017)), 부티리비브리오 프로테오클라시커스(Butyrivibrio proteoclasiicus), 페레그리니박테리아 박테리움(Peregrinibacteria bacterium (GW2011_GWA_33_10)), 액시다미노코커스 에스피(Acidaminococcus sp. (BV3L6)), 포르피로모나스 마카캐(Porphyromonas macacae), 라츠노피라세애 박테리움(Lachnospiraceae bacterium (ND2006)), 포르피로모나스 크레비오리카니스(Porphyromonas crevioricanis), 프레보텔라 디이엔스(Prevotella disiens), 모라셀라 보보쿨리(Moraxella bovoculi (237)), 스미이헬라 에스피(Smiihella sp. (SC_KO8D17)), 렙포스피라 이나다이(Leptospira inadai), 라츠노스피라세애 박테리움(Lachnospiraceae bacterium (MA2020)), 프란시셀라 노비시다(Francisella novicida (U112)), 캔디다투스 메타노플라즈마 털미툼(Candidatus Methanoplasma termitum) 또는 에유박테리움 엘리겐스(Eubacterium eligens)의 제 1 상보적 도메인 또는 유래된 제 1 상보적 도메인과 일부, 최소 50%이상, 또는 완전한 상동성을 가질 수 있다.
예를 들어, 상기 제 1 상보적 도메인이 팔쿠박테리아 박테리움의 제 1 상보적 도메인 또는 팔쿠박테리아 박테리움 유래 제 1 상보적 도메인인 경우, 상기 제 1 상보적 도메인은 5'-UUUGUAGAU-3' 일 수 있고, 또는 5'-UUUGUAGAU-3'와 일부, 적어도 50% 이상의 상동성을 가지는 뉴클레오타이드서열일 수 있다. 이때, 상기 제 1 상보적 도메인은 추가로 (X)n을 포함, 즉, 5'-(X)nUUUGUAGAU-3' 할 수 있다. 상기 X는 뉴클레오타이드 A, T, U 및 G로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며, 상기 n은 뉴클레오타이드서열의 개수로, 1 내지 5의 정수일 수 있다. 이때, (X)n은 동일한 뉴클레오타이드서열의 정수 n개만큼의 반복일 수 있고, 또는 뉴클레오타이드 A, T, U 및 G가 혼합된 정수 n개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
이때, 상기 연결 도메인은 제 1 상보적 도메인과 제 2 상보적 도메인을 연결하는 역할을 하는 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
상기 연결 도메인은 제 1 상보적 도메인 및 제 2 상보적 도메인과 각각 공유결합 또는 비공유결합을 할 수 있다.
상기 연결 도메인은 제 1 상보적 도메인과 제 2 상보적 도메인을 공유적 또는 비공유적으로 연결할 수 있다.
상기 연결 도메인은 단일가닥 가이드RNA 분자에 사용하기에 적합하며, 이중 가이드RNA의 제 1 가닥 및 제 2 가닥과 공유결합 또는 비공유결합 하거나, 또는 제 1 가닥 및 제 2 가닥을 공유적 또는 비공유적으로 연결하여 단일가닥 가이드RNA을 생성에 사용될 수 있다.
상기 연결 도메인은 이중 가이드RNA의 crRNA 및 tracrRNA과 공유결합 또는 비공유결합 하거나, 또는 crRNA 및 tracrRNA를 공유적 또는 비공유적으로 연결하여 단일가닥 가이드RNA를 생성에 사용될 수 있다.
이때, 상기 제 2 상보적 도메인은 자연유래의 제 2 상보적 도메인과 상동성을 가지거나, 또는 자연유래의 제 2 상보적 도메인으로부터 유래될 수 있다. 또한, 상기 제 2 상보적 도메인은 자연에 존재하는 종에 따라 제 2 상보적 도메인의 뉴클레오타이드서열에 차이가 존재할 수 있으며, 자연에 존재하는 종이 포함하는 제 2 상보적 도메인으로부터 유래될 수 있고, 또는 자연에 존재하는 종이 포함하는 제 2 상보적 도메인과 일부 또는 완전한 상동성을 가질 수 있다.
일 구체예로서, 상기 제 2 상보적 도메인은 스트렙토코커스 피요게네스(Streptococcus pyogenes), 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni), 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophiles), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 또는 네이세리아 메닝기디티스(Neisseria meningitides)의 제 2 상보적 도메인 또는 유래된 제 2 상보적 도메인과 일부, 최소 50%이상, 또는 완전한 상동성을 가질 수 있다.
예를 들어, 상기 제 2 상보적 도메인이 스트렙토코커스 피요게네스의 제 2 상보적 도메인 또는 스트렙토코커스 피요게네스 유래 제 2 상보적 도메인인 경우, 상기 제 2 상보적 도메인은 5'-UAGCAAGUUAAAAU-3'일 수 있고, 또는 5'-UAGCAAGUUAAAAU-3'와 일부, 적어도 50% 이상의 상동성을 가지는 뉴클레오타이드서열일 수 있다(밑줄 표시는 제 1 상보적 도메인과 이중가닥을 형성하는 뉴클레오타이드서열). 이때, 상기 제 2 상보적 도메인은 추가로 (X)n 또는/및 (X)m을 포함, 즉, 5'-(X)n UAGCAAGUUAAAAU(X)m-3', 할 수 있다. 상기 X는 뉴클레오타이드 A, T, U 및 G로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며, 상기 n 및 m은 뉴클레오타이드서열의 개수로, 상기 n은 1 내지 15의 정수일 수 있고, 상기 m은 1 내지 6일 수 있다. 이때, (X)n은 동일한 뉴클레오타이드서열의 정수 n개만큼의 반복일 수 있고, 또는 뉴클레오타이드 A, T, U 및 G가 혼합된 정수 n개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다. 또한 (X)m은 동일한 뉴클레오타이드서열의 정수 m개만큼의 반복일 수 있고, 또는 뉴클레오타이드 A, T, U 및 G가 혼합된 정수 m개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
또 다른 예를 들어, 상기 제 2 상보적 도메인이 캄필로박터 제주니의 제 2 상보적 도메인 또는 캄필로박터 제주니 유래 제 2 상보적 도메인인 경우, 상기 제 2 상보적 도메인은 5'-AAGAAAUUUAAAAAGGGACUAAAAU-3' 또는 5'-AAGGGACUAAAAU-3'일 수 있고, 또는 5'-AAGAAAUUUAAAAAGGGACUAAAAU-3' 또는 5'-AAGGGACUAAAAU-3'와 일부, 적어도 50% 이상의 상동성을 가지는 뉴클레오타이드서열일 수 있다(밑줄 표시는 제 1 상보적 도메인과 이중가닥을 형성하는 뉴클레오타이드서열). 이때, 상기 제 2 상보적 도메인은 추가로 (X)n 또는/및 (X)m을 포함, 즉, 5'-(X)n AAGAAAUUUAAAAAGGGACUAAAAU(X)m-3' 또는 5'-(X)n AAGGGACUAAAAU(X)m-3', 할 수 있다. 상기 X는 뉴클레오타이드 A, T, U 및 G로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며, 상기 n은 1 내지 15의 정수일 수 있고, 상기 m은 1 내지 6일 수 있다. 이때, (X)n은 동일한 뉴클레오타이드서열의 정수 n개만큼의 반복일 수 있고, 또는 뉴클레오타이드 A, T, U 및 G가 혼합된 정수 n개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다. 또한 (X)m은 동일한 뉴클레오타이드서열의 정수 m개만큼의 반복일 수 있고, 또는 뉴클레오타이드 A, T, U 및 G가 혼합된 정수 m개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 상기 제 2 상보적 도메인은 팔쿠박테리아 박테리움(Parcubacteria bacterium (GWC2011_GWC2_44_17)), 라츠노스피라세애 박테리움(Lachnospiraceae bacterium (MC2017)), 부티리비브리오 프로테오클라시커스(Butyrivibrio proteoclasiicus), 페레그리니박테리아 박테리움(Peregrinibacteria bacterium (GW2011_GWA_33_10)), 액시다미노코커스 에스피(Acidaminococcus sp. (BV3L6)), 포르피로모나스 마카캐(Porphyromonas macacae), 라츠노피라세애 박테리움(Lachnospiraceae bacterium (ND2006)), 포르피로모나스 크레비오리카니스(Porphyromonas crevioricanis), 프레보텔라 디이엔스(Prevotella disiens), 모라셀라 보보쿨리(Moraxella bovoculi (237)), 스미이헬라 에스피(Smiihella sp. (SC_KO8D17)), 렙포스피라 이나다이(Leptospira inadai), 라츠노스피라세애 박테리움(Lachnospiraceae bacterium (MA2020)), 프란시셀라 노비시다(Francisella novicida (U112)), 캔디다투스 메타노플라즈마 털미툼(Candidatus Methanoplasma termitum) 또는 에유박테리움 엘리겐스(Eubacterium eligens)의 제 2 상보적 도메인 또는 유래된 제 2 상보적 도메인과 일부, 최소 50%이상, 또는 완전한 상동성을 가질 수 있다.
예를 들어, 상기 제 2 상보적 도메인이 팔쿠박테리아 박테리움의 제 2 상보적 도메인 또는 팔쿠박테리아 박테리움 유래 제 2 상보적 도메인인 경우, 상기 제 2 상보적 도메인은 5'-AAAUUUCUACU-3' 일 수 있고, 또는 5'-AAAUUUCUACU-3'와 일부, 적어도 50% 이상의 상동성을 가지는 뉴클레오타이드서열일 수 있다(밑줄 표시는 제 1 상보적 도메인과 이중가닥을 형성하는 뉴클레오타이드서열). 이때, 상기 제 2 상보적 도메인은 추가로 (X)n 또는/및 (X)m을 포함, 즉, 5'-(X)nAAAUUUCUACU (X)m-3' 할 수 있다. 상기 X는 뉴클레오타이드 A, T, U 및 G로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며, 상기 n 및 m은 뉴클레오타이드서열의 개수로, 상기 n은 1 내지 10의 정수일 수 있고, 상기 m은 1 내지 6일 수 있다. 이때, (X)n은 동일한 뉴클레오타이드서열의 정수 n개만큼의 반복일 수 있고, 또는 뉴클레오타이드 A, T, U 및 G가 혼합된 정수 n개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다. 또한 (X)m은 동일한 뉴클레오타이드서열의 정수 m개만큼의 반복일 수 있고, 또는 뉴클레오타이드 A, T, U 및 G가 혼합된 정수 m개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
이때, 상기 제 1 상보적 도메인과 상기 제 2 상보적 도메인은 상보적 결합을 할 수 있다.
상기 제 1 상보적 도메인과 상기 제 2 상보적 도메인은 상기 상보적 결합을 통해 이중가닥을 형성할 수 있다.
상기 형성된 이중가닥은 CRISPR 효소와 상호작용할 수 있다.
선택적으로, 상기 제 1 상보적 도메인은 제 2 가닥의 제 2 상보적 도메인과 상보적 결합을 하지않는 추가 뉴클레오타이드서열을 포함할 수 있다.
이때, 상기 추가 뉴클레오타이드서열은 1 내지 15개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다. 예를 들어, 상기 추가 뉴클레오타이드서열은 1 내지 5개의 뉴클레오타이드서열, 5 내지 10개의 뉴클레오타이드서열, 또는 10 내지 15개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
이때, 상기 근위 도메인은 제 2 상보적 도메인의 3' 방향에 위치하는 도메인일 수 있다.
상기 근위 도메인은 자연유래의 근위 도메인과 상동성을 가지거나, 또는 자연유래의 근위 도메인으로부터 유래될 수 있다. 또한, 상기 근위 도메인은 자연에 존재하는 종에 따라 근위 도메인의 뉴클레오타이드서열에 차이가 존재할 수 있으며, 자연에 존재하는 종이 포함하는 근위 도메인으로부터 유래될 수 있고, 또는 자연에 존재하는 종이 포함하는 근위 도메인과 일부 또는 완전한 상동성을 가질 수 있다.
일 구체예로서, 상기 근위 도메인은 스트렙토코커스 피요게네스(Streptococcus pyogenes), 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni), 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophiles), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 또는 네이세리아 메닝기디티스(Neisseria meningitides)의 근위 도메인 또는 유래된 근위 도메인과 일부, 최소 50%이상, 또는 완전한 상동성을 가질 수 있다.
예를 들어, 상기 근위 도메인이 스트렙토코커스 피요게네스의 근위 도메인 또는 스트렙토코커스 피요게네스 유래 근위 도메인인 경우, 상기 근위 도메인은 5'-AAGGCUAGUCCG-3'일 수 있고, 또는 5'-AAGGCUAGUCCG-3'와 일부, 적어도 50% 이상의 상동성을 가지는 뉴클레오타이드서열일 수 있다. 이때, 상기 근위 도메인은 추가로 (X)n을 포함, 즉, 5'-AAGGCUAGUCCG(X)n-3', 할 수 있다. 상기 X는 뉴클레오타이드 A, T, U 및 G로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며, 상기 n은 뉴클레오타이드서열의 개수로, 1 내지 15의 정수일 수 있다. 이때, (X)n은 동일한 뉴클레오타이드서열의 정수 n개만큼의 반복일 수 있고, 또는 뉴클레오타이드 A, T, U 및 G가 혼합된 정수 n개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
또 다른 예를 들어, 상기 근위 도메인이 캄필로박터 제주니의 근위 도메인 또는 캄필로박터 제주니 유래 근위 도메인인 경우, 상기 근위 도메인은 5'-AAAGAGUUUGC-3'일 수 있고, 또는 5'-AAAGAGUUUGC-3'와 일부, 적어도 50% 이상의 상동성을 가지는 뉴클레오타이드서열일 수 있다. 이때, 상기 근위 도메인은 추가로 (X)n을 포함, 즉, 5'-AAAGAGUUUGC(X)n-3', 할 수 있다. 상기 X는 뉴클레오타이드 A, T, U 및 G로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며, 상기 n은 뉴클레오타이드서열의 개수로, 1 내지 40의 정수일 수 있다. 이때, (X)n은 동일한 뉴클레오타이드서열의 정수 n개만큼의 반복일 수 있고, 또는 뉴클레오타이드 A, T, U 및 G가 혼합된 정수 n개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
이때, 상기 꼬리 도메인은 단일가닥 가이드RNA 또는 이중 가이드RNA의 제 1 가닥 또는 제 2 가닥의 3' 말단에 선택적으로 추가될 수 있다.
상기 꼬리 도메인은 자연유래의 꼬리 도메인과 상동성을 가지거나, 또는 자연유래의 꼬리 도메인으로부터 유래될 수 있다. 또한, 상기 꼬리 도메인은 자연에 존재하는 종에 따라 꼬리 도메인의 뉴클레오타이드서열에 차이가 존재할 수 있으며, 자연에 존재하는 종이 포함하는 꼬리 도메인으로부터 유래될 수 있고, 또는 자연에 존재하는 종이 포함하는 꼬리 도메인과 일부 또는 완전한 상동성을 가질 수 있다.
일 구체예로서, 상기 꼬리 도메인은 스트렙토코커스 피요게네스(Streptococcus pyogenes), 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni), 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophiles), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 또는 네이세리아 메닝기디티스(Neisseria meningitides)의 꼬리 도메인 또는 유래된 꼬리 도메인과 일부, 최소 50%이상, 또는 완전한 상동성을 가질 수 있다.
예를 들어, 상기 꼬리 도메인이 스트렙토코커스 피요게네스의 꼬리 도메인 또는 스트렙토코커스 피요게네스 유래 꼬리 도메인인 경우, 상기 꼬리 도메인은 5'-UUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC-3'일 수 있고, 또는 5'-UUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC-3'와 일부, 적어도 50% 이상의 상동성을 가지는 뉴클레오타이드서열일 수 있다. 이때, 상기 꼬리 도메인은 추가로 (X)n을 포함, 즉, 5'-UUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(X)n-3', 할 수 있다. 상기 X는 뉴클레오타이드 A, T, U 및 G로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며, 상기 n은 뉴클레오타이드서열의 개수로, 1 내지 15의 정수일 수 있다. 이때, (X)n은 동일한 뉴클레오타이드서열의 정수 n개만큼의 반복일 수 있고, 또는 뉴클레오타이드 A, T, U 및 G가 혼합된 정수 n개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
또 다른 예를 들어, 상기 꼬리 도메인이 캄필로박터 제주니의 꼬리 도메인 또는 캄필로박터 제주니 유래 꼬리 도메인인 경우, 상기 꼬리 도메인은 5'-GGGACUCUGCGGGGUUACAAUCCCCUAAAACCGCUUUU-3'일 수 있고, 또는 5'-GGGACUCUGCGGGGUUACAAUCCCCUAAAACCGCUUUU-3'와 일부, 적어도 50% 이상의 상동성을 가지는 뉴클레오타이드서열일 수 있다. 이때, 상기 꼬리 도메인은 추가로 (X)n을 포함, 즉, 5'-GGGACUCUGCGGGGUUACAAUCCCCUAAAACCGCUUUU(X)n-3', 할 수 있다. 상기 X는 뉴클레오타이드 A, T, U 및 G로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며, 상기 n은 뉴클레오타이드서열의 개수로, 1 내지 15의 정수일 수 있다. 이때, (X)n은 동일한 뉴클레오타이드서열의 정수 n개만큼의 반복일 수 있고, 또는 뉴클레오타이드 A, T, U 및 G가 혼합된 정수 n개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
다른 일 구체예에서, 상기 꼬리 도메인은 시험관내 또는 생체내 전사 방법과 관련된 3' 말단에 1 내지 10개의 뉴클레오타이드서열을 포함할 수 있다.
예를 들어, T7 프로모터가 가이드RNA의 시험관내 전사를 위해 사용될 때, 상기 꼬리 도메인은 DNA 주형의 3' 말단에 존재하는 임의의 뉴클레오타이드서열일 수 있다. 또한, U6 프로모터가 생체내 전사를 위해 사용되는 경우, 상기 꼬리 도메인은 UUUUUU일 수 있으며, H1 프로모터가 전사를 위해 사용되는 경우, 상기 꼬리 도메인은 UUUU일 수 있고, pol-III 프로모터를 사용하는 경우에는, 상기 꼬리 도메인은 여러 개의 우라실 뉴클레오타이드거나 또는 대안 될 수 있는 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
가이드RNA는 상기에 기재된 바와 같이 다수의 도메인을 포함할 수 있어, 가이드RNA가 포함하는 도메인의 종류 및 개수에 따라 핵산 서열의 길이를 조절할 수 있으며, 각각의 도메인에 의해 3차원 형태 또는 가이드RNA의 활성 형태의 가닥내 또는 가닥간 상호작용을 할 수 있다.
가이드RNA는 단일가닥 가이드RNA(단일 RNA 분자); 또는 이중 가이드RNA(하나 초과의 통상적으로 2개의 별개의 RNA 분자를 포함함)로서 지칭될 수 있다.
이중 가이드RNA
이중 가이드RNA는 제 1 가닥 및 제 2 가닥으로 구성된다.
이때, 상기 제 1 가닥은
5'-[가이드 도메인]-[제 1 상보적 도메인]-3'으로 구성될 수 있고,
상기 제 2 가닥은
5'-[제 2 상보적 도메인]-[근위 도메인(proximal domain)]-3' 또는
5'-[제 2 상보적 도메인]-[근위 도메인(proximal domain)]-[꼬리 도메인]-3'으로 구성될 수 있다.
이때, 상기 제 1가닥은 crRNA라고 지칭될 수 있고, 상기 제 2가닥은 tracrRNA로 지칭될 수 있다.
이때, 상기 제 1가닥 및 제 2가닥은 선택적으로 추가적인 뉴클레오타이드서열을 포함할 수 있다.
일 구체예로서, 상기 제 1 가닥은
5'-(Ntarget)-(Q)m-3'; 또는
5'-(X)a-(Ntarget)-(X)b-(Q)m-(X)c-3'일 수 있다.
이때, 상기 Ntarget은 표적 유전자 또는 핵산의 이중 가닥 중 어느 하나 가닥의 일부 서열에 상보적인 뉴클레오타이드서열로서, 상기 Ntarget은 표적 유전자 또는 핵산 상의 표적서열에 따라 변할 수 있는 뉴클레오타이드서열 부위이다.
이때, 상기 (Q)m은 제 1 상보적 도메인을 포함하는 뉴클레오타이드서열로, 제 2 가닥의 제 2 상보적 도메인과 상보적 결합을 할 수 있는 뉴클레오타이드서열을 포함한다. 상기 (Q)m은 자연에 존재하는 종의 제 1 상보적 도메인과 일부 또는 완전한 상동성을 가지는 서열일 수 있으며, 유래된 종에 따라 상기 제 1 상보적 도메인의 뉴클레오타이드서열은 변경될 수 있다. 상기 Q는 A, U, C 및 G로 이루어진 군에서 각각 독립적으로 선택될 수 있으며, 상기 m은 뉴클레오타이드서열의 개수로, 5 내지 35의 정수일 수 있다.
예를 들어, 상기 제 1 상보적 도메인이 스트렙토코커스 피요게네스의 제 1 상보적 도메인 또는 스트렙토코커스 피요게네스 유래 제 1 상보적 도메인과 일부 또는 완전한 상동성을 가질 경우에, 상기 (Q)m은 5'-GUUUUAGAGCUA-3'일 수 있고, 또는 5'-GUUUUAGAGCUA-3'와 적어도 50% 이상의 상동성을 가지는 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
다른 예로, 상기 제 1 상보적 도메인이 캄필로박터 제주니의 제 1 상보적 도메인 또는 캄필로박터 제주니 유래 제 1 상보적 도메인과 일부 또는 완전한 상동성을 가질 경우에, 상기 (Q)m은 5'-GUUUUAGUCCCUUUUUAAAUUUCUU-3' 또는 5'-GUUUUAGUCCCUU-3'일 수 있고, 또는 5'-GUUUUAGUCCCUUUUUAAAUUUCUU-3' 또는 5'-GUUUUAGUCCCUU-3'와 적어도 50% 이상의 상동성을 가지는 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
또 다른 예로, 상기 제 1 상보적 도메인이 스트렙토코커스 써모필러스의 제 1 상보적 도메인 또는 스트렙토코커스 써모필러스 유래 제 1 상보적 도메인과 일부 또는 완전한 상동성을 가질 경우에, 상기 (Q)m은 5'-GUUUUAGAGCUGUGUUGUUUCG-3'일 수 있고, 또는 5'-GUUUUAGAGCUGUGUUGUUUCG-3'와 적어도 50% 이상의 상동성을 가지는 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
또한, 상기 (X)a, (X)b 및 (X)c는 선택적으로 추가할 수 있는 뉴클레오타이드서열로, 상기 X는 A, U, C 및 G로 이루어진 군에서 각각 독립적으로 선택될 수 있으며, 상기 a, b 및 c는 뉴클레오타이드서열의 개수로, 0 또는 1 내지 20의 정수일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 제 2 가닥은
5'-(Z)h-(P)k-3'; 또는
5'-(X)d-(Z)h-(X)e-(P)k-(X)f-3' 일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 상기 제 2 가닥은
5'-(Z)h-(P)k-(F)i-3'; 또는
5'-(X)d-(Z)h-(X)e-(P)k-(X)f-(F)i-3' 일 수 있다.
이때, 상기 (Z)h는 제 2 상보적 도메인을 포함하는 뉴클레오타이드서열로, 제 1 가닥의 제 1 상보적 도메인과 상보적 결합을 할 수 있는 뉴클레오타이드서열을 포함한다. 상기 (Z)h은 자연에 존재하는 종의 제 2 상보적 도메인과 일부 또는 완전한 상동성을 가지는 서열일 수 있으며, 유래된 종에 따라 상기 제 2 상보적 도메인의 뉴클레오타이드서열은 변경될 수 있다. 상기 Z는 A, U, C 및 G로 이루어진 군에서 각각 독립적으로 선택될 수 있으며, 상기 h은 뉴클레오타이드서열의 개수로, 5 내지 50의 정수일 수 있다.
예를 들어, 상기 제 2 상보적 도메인이 스트렙토코커스 피요게네스의 제 2 상보적 도메인 또는 스트렙토코커스 피요게네스 유래 제 2 상보적 도메인과 일부 또는 완전한 상동성을 가질 경우에, 상기 (Z)h은 5'-UAGCAAGUUAAAAU-3'일 수 있고, 또는 5'-UAGCAAGUUAAAAU-3'와 적어도 50% 이상의 상동성을 가지는 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
다른 예로, 상기 제 2 상보적 도메인이 캄필로박터 제주니의 제 2 상보적 도메인 또는 캄필로박터 제주니 유래 제 2 상보적 도메인과 일부 또는 완전한 상동성을 가질 경우에, 상기 (Z)h은 5'-AAGAAAUUUAAAAAGGGACUAAAAU-3' 또는 5'-AAGGGACUAAAAU-3'일 수 있고, 또는 5'-AAGAAAUUUAAAAAGGGACUAAAAU-3' 또는 5'-AAGGGACUAAAAU-3'와 적어도 50% 이상의 상동성을 가지는 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
또 다른 예로, 상기 제 2 상보적 도메인이 스트렙토코커스 써모필러스의 제 2 상보적 도메인 또는 스트렙토코커스 써모필러스 유래 제 2 상보적 도메인과 일부 또는 완전한 상동성을 가질 경우에, 상기 (Z)h은 5'-CGAAACAACACAGCGAGUUAAAAU-3'일 수 있고, 또는 5'-CGAAACAACACAGCGAGUUAAAAU-3'와 적어도 50% 이상의 상동성을 가지는 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
상기 (P)k는 근위 도메인을 포함하는 뉴클레오타이드서열로, 자연에 존재하는 종의 근위 도메인과 일부 또는 완전한 상동성을 가지는 서열일 수 있으며, 유래된 종에 따라 상기 근위 도메인의 뉴클레오타이드서열은 변경될 수 있다. 상기 P는 A, U, C 및 G로 이루어진 군에서 각각 독립적으로 선택될 수 있으며, 상기 k은 뉴클레오타이드서열의 개수로, 1 내지 20의 정수일 수 있다.
예를 들어, 상기 근위 도메인이 스트렙토코커스 피요게네스의 근위 도메인 또는 스트렙토코커스 피요게네스 유래 근위 도메인과 일부 또는 완전한 상동성을 가질 경우에, 상기 (P)k는 5'-AAGGCUAGUCCG-3'일 수 있고, 또는 5'-AAGGCUAGUCCG-3'와 적어도 50% 이상의 상동성을 가지는 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
다른 예로, 상기 근위 도메인이 캄필로박터 제주니의 근위 도메인 또는 캄필로박터 제주니 유래 근위 도메인과 일부 또는 완전한 상동성을 가질 경우에, 상기 (P)k는 5'-AAAGAGUUUGC-3'일 수 있고, 또는 5'-AAAGAGUUUGC-3'와 적어도 50% 이상의 상동성을 가지는 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
또 다른 예로, 상기 근위 도메인이 스트렙토코커스 써모필러스의 근위 도메인 또는 스트렙토코커스 써모필러스 유래 근위 도메인과 일부 또는 완전한 상동성을 가질 경우에, 상기 (P)k는 5'-AAGGCUUAGUCCG-3'일 수 있고, 또는 5'-AAGGCUUAGUCCG-3'와 적어도 50% 이상의 상동성을 가지는 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
상기 (F)i는 꼬리 도메인을 포함하는 뉴클레오타이드서열로, 자연에 존재하는 종의 꼬리 도메인과 일부 또는 완전한 상동성을 가지는 서열일 수 있으며, 유래된 종에 따라 상기 꼬리 도메인의 뉴클레오타이드서열은 변경될 수 있다. 상기 F는 A, U, C 및 G로 이루어진 군에서 각각 독립적으로 선택될 수 있으며, 상기 i은 뉴클레오타이드서열의 개수로, 1 내지 50의 정수일 수 있다.
예를 들어, 상기 꼬리 도메인이 스트렙토코커스 피요게네스의 꼬리 도메인 또는 스트렙토코커스 피요게네스 유래 꼬리 도메인과 일부 또는 완전한 상동성을 가질 경우에, 상기 (F)i는 5'-UUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC-3'일 수 있고, 또는 5'-UUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC-3'와 적어도 50% 이상의 상동성을 가지는 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
다른 예로, 상기 꼬리 도메인이 캄필로박터 제주니의 꼬리 도메인 또는 캄필로박터 제주니 유래 꼬리 도메인과 일부 또는 완전한 상동성을 가질 경우에, 상기 (F)i는 5'-GGGACUCUGCGGGGUUACAAUCCCCUAAAACCGCUUUU-3'일 수 있고, 또는 5'-GGGACUCUGCGGGGUUACAAUCCCCUAAAACCGCUUUU-3'와 적어도 50% 이상의 상동성을 가지는 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
또 다른 예로, 상기 꼬리 도메인이 스트렙토코커스 써모필러스의 꼬리 도메인 또는 스트렙토코커스 써모필러스 유래 꼬리 도메인과 일부 또는 완전한 상동성을 가질 경우에, 상기 (F)i는 5'-UACUCAACUUGAAAAGGUGGCACCGAUUCGGUGUUUUU-3'일 수 있고, 또는 5'-UACUCAACUUGAAAAGGUGGCACCGAUUCGGUGUUUUU-3'와 적어도 50% 이상의 상동성을 가지는 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
또한, 상기 (F)i는 시험관내 또는 생체내 전사 방법과 관련된 3' 말단에 1 내지 10개의 뉴클레오타이드서열을 포함할 수 있다.
예를 들어, T7 프로모터가 가이드RNA의 시험관내 전사를 위해 사용될 때, 상기 꼬리 도메인은 DNA 주형의 3' 말단에 존재하는 임의의 뉴클레오타이드서열일 수 있다. 또한, U6 프로모터가 생체내 전사를 위해 사용되는 경우, 상기 꼬리 도메인은 UUUUUU일 수 있으며, H1 프로모터가 전사를 위해 사용되는 경우, 상기 꼬리 도메인은 UUUU일 수 있고, pol-III 프로모터를 사용하는 경우에는, 상기 꼬리 도메인은 여러 개의 우라실 뉴클레오타이드거나 또는 대안될 수 있는 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
또한, 상기 (X)d, (X)e 및 (X)f는 선택적으로 추가할 수 있는 뉴클레오타이드서열로, 상기 X는 A, U, C 및 G로 이루어진 군에서 각각 독립적으로 선택될 수 있으며, 상기 d, e 및 f는 뉴클레오타이드서열의 개수로, 0 또는 1 내지 20의 정수일 수 있다.
단일가닥 가이드RNA
단일가닥 가이드RNA는 제 1 단일가닥 가이드RNA 및 제 2 단일가닥 가이드RNA로 나뉠 수 있다.
제 1 단일가닥 가이드RNA
제 1 단일가닥 가이드RNA는 상기 이중 가이드RNA의 제 1 가닥과 제 2 가닥을 연결 도메인으로 연결한 단일가닥 가이드RNA이다.
구체적으로, 상기 단일가닥 가이드RNA는
5'-[가이드 도메인]-[제 1 상보적 도메인]-[연결 도메인]-[제 2 상보적 도메인]-3',
5'-[가이드 도메인]-[제 1 상보적 도메인]-[연결 도메인]-[제 2 상보적 도메인]-[근위 도메인(proximal domain)]-3' 또는
5'-[가이드 도메인]-[제 1 상보적 도메인]-[연결 도메인]-[제 2 상보적 도메인]-[근위 도메인(proximal domain)]-[꼬리 도메인]-3'으로 구성될 수 있다.
상기 제 1 단일가닥 가이드RNA는 선택적으로 추가적인 뉴클레오타이드서열을 포함할 수 있다.
일 구체예로서, 상기 제 1 단일가닥 가이드RNA는
5'-(Ntarget)-(Q)m-(L)j-(Z)h-3';
5'-(Ntarget)-(Q)m-(L)j-(Z)h-(P)k-3'; 또는
5'-(Ntarget)-(Q)m-(L)j-(Z)h-(P)k-(F)i-3'일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 상기 단일가닥 가이드RNA는
5'-(X)a-(Ntarget)-(X)b-(Q)m-(X)c-(L)j-(X)d-(Z)h-(X)e-3';
5'-(X)a-(Ntarget)-(X)b-(Q)m-(X)c-(L)j-(X)d-(Z)h-(X)e-(P)k-(X)f-3'; 또는
5'-(X)a-(Ntarget)-(X)b-(Q)m-(X)c-(L)j-(X)d-(Z)h-(X)e-(P)k-(X)f-(F)i-3'일 수 있다.
이때, 상기 Ntarget은 표적 유전자 또는 핵산의 이중 가닥 중 어느 하나 가닥의 일부 서열에 상보적인 뉴클레오타이드서열로서, 상기 Ntarget은 표적 유전자 또는 핵산 상의 표적서열에 따라 변할 수 있는 뉴클레오타이드서열 부위이다.
상기 (Q)m은 제 1 상보적 도메인을 포함하는 뉴클레오타이드서열로, 제 2 상보적 도메인과 상보적 결합을 할 수 있는 뉴클레오타이드서열을 포함한다. 상기 (Q)m은 자연에 존재하는 종의 제 1 상보적 도메인과 일부 또는 완전한 상동성을 가지는 서열일 수 있으며, 유래된 종에 따라 상기 제 1 상보적 도메인의 뉴클레오타이드서열은 변경될 수 있다. 상기 Q는 A, U, C 및 G로 이루어진 군에서 각각 독립적으로 선택될 수 있으며, 상기 m은 뉴클레오타이드서열의 개수로, 5 내지 35의 정수일 수 있다.
예를 들어, 상기 제 1 상보적 도메인이 스트렙토코커스 피요게네스의 제 1 상보적 도메인 또는 스트렙토코커스 피요게네스 유래 제 1 상보적 도메인과 일부 또는 완전한 상동성을 가질 경우에, 상기 (Q)m은 5'-GUUUUAGAGCUA-3'일 수 있고, 또는 5'-GUUUUAGAGCUA-3'와 적어도 50% 이상의 상동성을 가지는 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
다른 예로, 상기 제 1 상보적 도메인이 캄필로박터 제주니의 제 1 상보적 도메인 또는 캄필로박터 제주니 유래 제 1 상보적 도메인과 일부 또는 완전한 상동성을 가질 경우에, 상기 (Q)m은 5'-GUUUUAGUCCCUUUUUAAAUUUCUU-3' 또는 5'-GUUUUAGUCCCUU-3' 일 수 있고, 또는 5'-GUUUUAGUCCCUUUUUAAAUUUCUU-3' 또는 5'-GUUUUAGUCCCUU-3'와 적어도 50% 이상의 상동성을 가지는 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
또 다른 예로, 상기 제 1 상보적 도메인이 스트렙토코커스 써모필러스의 제 1 상보적 도메인 또는 스트렙토코커스 써모필러스 유래 제 1 상보적 도메인과 일부 또는 완전한 상동성을 가질 경우에, 상기 (Q)m은 5'-GUUUUAGAGCUGUGUUGUUUCG-3'일 수 있고, 또는 5'-GUUUUAGAGCUGUGUUGUUUCG-3'와 적어도 50% 이상의 상동성을 가지는 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
또한, 상기 (L)j는 연결 도메인을 포함하는 뉴클레오타이드서열로, 제 1 상보적 도메인과 제 2 상보적 도메인을 연결하여 단일가닥 가이드RNA을 생성할 수 있도록 하는 뉴클레오타이드서열이다. 이때, 상기 L은 A, U, C 및 G로 이루어진 군에서 각각 독립적으로 선택될 수 있으며, 상기 j은 뉴클레오타이드서열의 개수로, 1 내지 30의 정수일 수 있다.
상기 (Z)h는 제 2 상보적 도메인을 포함하는 뉴클레오타이드서열로, 제 1 상보적 도메인과 상보적 결합을 할 수 있는 뉴클레오타이드서열을 포함한다. 상기 (Z)h은 자연에 존재하는 종의 제 2 상보적 도메인과 일부 또는 완전한 상동성을 가지는 서열일 수 있으며, 유래된 종에 따라 상기 제 2 상보적 도메인의 뉴클레오타이드서열은 변경될 수 있다. 상기 Z는 A, U, C 및 G로 이루어진 군에서 각각 독립적으로 선택될 수 있으며, 상기 h은 뉴클레오타이드서열의 개수로, 5 내지 50의 정수일 수 있다.
예를 들어, 상기 제 2 상보적 도메인이 스트렙토코커스 피요게네스의 제 2 상보적 도메인 또는 스트렙토코커스 피요게네스 유래 제 2 상보적 도메인과 일부 또는 완전한 상동성을 가질 경우에, 상기 (Z)h은 5'-UAGCAAGUUAAAAU-3'일 수 있고, 또는 5'-UAGCAAGUUAAAAU-3'와 적어도 50% 이상의 상동성을 가지는 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
다른 예로, 상기 제 2 상보적 도메인이 캄필로박터 제주니의 제 2 상보적 도메인 또는 캄필로박터 제주니 유래 제 2 상보적 도메인과 일부 또는 완전한 상동성을 가질 경우에, 상기 (Z)h은 5'-AAGAAAUUUAAAAAGGGACUAAAAU-3' 또는 5'-AAGGGACUAAAAU-3'일 수 있고, 또는 5'-AAGAAAUUUAAAAAGGGACUAAAAU-3' 또는 5'-AAGGGACUAAAAU-3'와 적어도 50% 이상의 상동성을 가지는 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
또 다른 예로, 상기 제 2 상보적 도메인이 스트렙토코커스 써모필러스의 제 2 상보적 도메인 또는 스트렙토코커스 써모필러스 유래 제 2 상보적 도메인과 일부 또는 완전한 상동성을 가질 경우에, 상기 (Z)h은 5'-CGAAACAACACAGCGAGUUAAAAU-3'일 수 있고, 또는 5'-CGAAACAACACAGCGAGUUAAAAU-3'와 적어도 50% 이상의 상동성을 가지는 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
상기 (P)k는 근위 도메인을 포함하는 뉴클레오타이드서열로, 자연에 존재하는 종의 근위 도메인과 일부 또는 완전한 상동성을 가지는 서열일 수 있으며, 유래된 종에 따라 상기 근위 도메인의 뉴클레오타이드서열은 변경될 수 있다. 상기 P는 A, U, C 및 G로 이루어진 군에서 각각 독립적으로 선택될 수 있으며, 상기 k은 뉴클레오타이드서열의 개수로, 1 내지 20의 정수일 수 있다.
예를 들어, 상기 근위 도메인이 스트렙토코커스 피요게네스의 근위 도메인 또는 스트렙토코커스 피요게네스 유래 근위 도메인과 일부 또는 완전한 상동성을 가질 경우에, 상기 (P)k는 5'-AAGGCUAGUCCG-3'일 수 있고, 또는 5'-AAGGCUAGUCCG-3'와 적어도 50% 이상의 상동성을 가지는 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
다른 예로, 상기 근위 도메인이 캄필로박터 제주니의 근위 도메인 또는 캄필로박터 제주니 유래 근위 도메인과 일부 또는 완전한 상동성을 가질 경우에, 상기 (P)k는 5'-AAAGAGUUUGC-3'일 수 있고, 또는 5'-AAAGAGUUUGC-3'와 적어도 50% 이상의 상동성을 가지는 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
또 다른 예로, 상기 근위 도메인이 스트렙토코커스 써모필러스의 근위 도메인 또는 스트렙토코커스 써모필러스 유래 근위 도메인과 일부 또는 완전한 상동성을 가질 경우에, 상기 (P)k는 5'-AAGGCUUAGUCCG-3'일 수 있고, 또는 5'-AAGGCUUAGUCCG-3'와 적어도 50% 이상의 상동성을 가지는 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
상기 (F)i는 꼬리 도메인을 포함하는 뉴클레오타이드서열로, 자연에 존재하는 종의 꼬리 도메인과 일부 또는 완전한 상동성을 가지는 서열일 수 있으며, 유래된 종에 따라 상기 꼬리 도메인의 뉴클레오타이드서열은 변경될 수 있다. 상기 F는 A, U, C 및 G로 이루어진 군에서 각각 독립적으로 선택될 수 있으며, 상기 i은 뉴클레오타이드서열의 개수로, 1 내지 50의 정수일 수 있다.
예를 들어, 상기 꼬리 도메인이 스트렙토코커스 피요게네스의 꼬리 도메인 또는 스트렙토코커스 피요게네스 유래 꼬리 도메인과 일부 또는 완전한 상동성을 가질 경우에, 상기 (F)i는 5'-UUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC-3'일 수 있고, 또는 5'-UUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC-3'와 적어도 50% 이상의 상동성을 가지는 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
다른 예로, 상기 꼬리 도메인이 캄필로박터 제주니의 꼬리 도메인 또는 캄필로박터 제주니 유래 꼬리 도메인과 일부 또는 완전한 상동성을 가질 경우에, 상기 (F)i는 5'-GGGACUCUGCGGGGUUACAAUCCCCUAAAACCGCUUUU-3'일 수 있고, 또는 5'-GGGACUCUGCGGGGUUACAAUCCCCUAAAACCGCUUUU-3'와 적어도 50% 이상의 상동성을 가지는 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
또 다른 예로, 상기 꼬리 도메인이 스트렙토코커스 써모필러스의 꼬리 도메인 또는 스트렙토코커스 써모필러스 유래 꼬리 도메인과 일부 또는 완전한 상동성을 가질 경우에, 상기 (F)i는 5'-UACUCAACUUGAAAAGGUGGCACCGAUUCGGUGUUUUU-3'일 수 있고, 또는 5'-UACUCAACUUGAAAAGGUGGCACCGAUUCGGUGUUUUU-3'와 적어도 50% 이상의 상동성을 가지는 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
또한, 상기 (F)i는 시험관내 또는 생체내 전사 방법과 관련된 3' 말단에 1 내지 10개의 뉴클레오타이드서열을 포함할 수 있다.
예를 들어, T7 프로모터가 가이드RNA의 시험관내 전사를 위해 사용될 때, 상기 꼬리 도메인은 DNA 주형의 3' 말단에 존재하는 임의의 뉴클레오타이드서열일 수 있다. 또한, U6 프로모터가 생체내 전사를 위해 사용되는 경우, 상기 꼬리 도메인은 UUUUUU일 수 있으며, H1 프로모터가 전사를 위해 사용되는 경우, 상기 꼬리 도메인은 UUUU일 수 있고, pol-III 프로모터를 사용하는 경우에는, 상기 꼬리 도메인은 여러 개의 우라실 뉴클레오타이드거나 또는 대안될 수 있는 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
또한, 상기 (X)a, (X)b, (X)c, (X)d, (X)e 및 (X)f는 선택적으로 추가할 수 있는 뉴클레오타이드서열로, 상기 X는 A, U, C 및 G로 이루어진 군에서 각각 독립적으로 선택될 수 있으며, 상기 a, b, c, d, e 및 f는 뉴클레오타이드서열의 개수로, 0 또는 1 내지 20의 정수일 수 있다.
제 2 단일가닥 가이드RNA
제 2 단일가닥 가이드RNA는 가이드 도메인, 제 1 상보적 도메인 및 제 2 상보적 도메인으로 구성되는 단일가닥 가이드RNA일 수 있다.
이때, 상기 제 2 단일가닥 가이드RNA는
5'-[제 2 상보적 도메인]-[제 1 상보적 도메인]-[가이드 도메인]-3'; 또는
5'-[제 2 상보적 도메인]-[연결 도메인]-[제 1 상보적 도메인]-[가이드 도메인]-3'으로 구성될 수 있다.
상기 제 2 단일가닥 가이드RNA는 선택적으로 추가적인 뉴클레오타이드서열을 포함할 수 있다.
일 구체예로서, 상기 제 2 단일가닥 가이드RNA는
5'-(Z)h-(Q)m-(Ntarget)-3'; 또는
5'-(X)a-(Z)h-(X)b-(Q)m-(X)c-(Ntarget)-3'일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 상기 단일가닥 가이드RNA는
5'-(Z)h-(L)j-(Q)m-(Ntarget)-3'; 또는
5'-(X)a-(Z)h-(L)j-(Q)m-(X)c-(Ntarget)-3'일 수 있다.
이때, 상기 Ntarget은 표적 유전자 또는 핵산의 이중 가닥 중 어느 하나 가닥의 일부 서열에 상보적인 뉴클레오타이드서열로서, 상기 Ntarget은 표적 유전자 또는 핵산 상의 표적서열에 따라 변할 수 있는 뉴클레오타이드서열 부위이다.
상기 (Q)m은 제 1 상보적 도메인을 포함하는 뉴클레오타이드서열로, 제 2 상보적 도메인과 상보적 결합을 할 수 있는 뉴클레오타이드서열을 포함한다. 상기 (Q)m은 자연에 존재하는 종의 제 1 상보적 도메인과 일부 또는 완전한 상동성을 가지는 서열일 수 있으며, 유래된 종에 따라 상기 제 1 상보적 도메인의 뉴클레오타이드서열은 변경될 수 있다. 상기 Q는 A, U, C 및 G로 이루어진 군에서 각각 독립적으로 선택될 수 있으며, 상기 m은 뉴클레오타이드서열의 개수로, 5 내지 35의 정수일 수 있다.
예를 들어, 상기 제 1 상보적 도메인이 팔쿠박테리아 박테리움의 제 1 상보적 도메인 또는 팔쿠박테리아 박테리움 유래 제 1 상보적 도메인과 일부 또는 완전한 상동성을 가질 경우에, 상기 (Q)m은 5'-UUUGUAGAU-3'일 수 있고, 또는 5'-UUUGUAGAU-3'와 적어도 50% 이상의 상동성을 가지는 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
상기 (Z)h는 제 2 상보적 도메인을 포함하는 뉴클레오타이드서열로, 제 1 상보적 도메인과 상보적 결합을 할 수 있는 뉴클레오타이드서열을 포함한다. 상기 (Z)h은 자연에 존재하는 종의 제 2 상보적 도메인과 일부 또는 완전한 상동성을 가지는 서열일 수 있으며, 유래된 종에 따라 상기 제 2 상보적 도메인의 뉴클레오타이드서열은 변경될 수 있다. 상기 Z는 A, U, C 및 G로 이루어진 군에서 각각 독립적으로 선택될 수 있으며, 상기 h은 뉴클레오타이드서열의 개수로, 5 내지 50의 정수일 수 있다.
예를 들어, 상기 제 2 상보적 도메인이 팔쿠박테리아 박테리움의 제 2 상보적 도메인 또는 팔쿠박테리아 박테리움 유래 제 2 상보적 도메인과 일부 또는 완전한 상동성을 가질 경우에, 상기 (Z)h은 5'-AAAUUUCUACU-3'일 수 있고, 또는 5'-AAAUUUCUACU-3'와 적어도 50% 이상의 상동성을 가지는 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
또한, 상기 (L)j는 연결 도메인을 포함하는 뉴클레오타이드서열로, 제 1 상보적 도메인과 제 2 상보적 도메인을 연결하는 뉴클레오타이드서열이다. 이때, 상기 L은 A, U, C 및 G로 이루어진 군에서 각각 독립적으로 선택될 수 있으며, 상기 j은 뉴클레오타이드서열의 개수로, 1 내지 30의 정수일 수 있다.
또한, 상기 (X)a, (X)b 및 (X)c는 선택적으로 추가할 수 있는 뉴클레오타이드서열로, 상기 X는 A, U, C 및 G로 이루어진 군에서 각각 독립적으로 선택될 수 있으며, 상기 a, b 및 c는 뉴클레오타이드서열의 개수로, 0 또는 1 내지 20의 정수일 수 있다.
본 명세서에 의해 개시되는 내용의 일 태양으로서, 가이드핵산은 고발현 분비 유전자의 표적서열에 상보적으로 결합할 수 있는 가이드 RNA에 관하여 개시한다.
상기 고발현 분비 유전자 관련 설명은 상기 기술한 바와 같다.
상기 가이드 RNA는 분비 세포 내 고발현 분비 유전자에서 선택된 임의의 서열에 결합할 수 있는 가이드 RNA 이다.
상기 고발현 분비 유전자는 가이드핵산에 의해 인지되며, 에디터 단백질에 의해 절단되는 타겟 유전자 또는 표적서열일 수 있다.
"표적서열" 은 표적 유전자 또는 핵산 내에 존재하는 뉴클레오타이드 서열로, 구체적으로는 표적 유전자 또는 핵산 내에 표적 영역의 일부 뉴클레오타이드 서열이며, 이때 "표적 영역"은 표적 유전자 또는 핵산 내에 가이드핵산-에디터단백질에 의해 변형 될 수 있는 부위이다.
이하에서, 표적서열이라 함은 두 가지의 뉴클레오타이드서열 정보 모두를 의미하는 용어로 사용될 수 있다. 예를 들어, 표적 유전자의 경우, 표적서열은 표적 유전자 DNA의 transcribed strand의 서열 정보를 의미하는 것일 수도 있고, 또는 non-transcribed strand의 뉴클레오타이드서열 정보를 의미하는 것일 수도 있다. 본 명세서에서는 두 양태를 포함하는 표적서열에 대하여 '표적서열에 대한 가이드 핵산'이라고 칭하기도 한다.
예를 들어, 표적서열은 표적 유전자 A의 표적 영역 중 일부 뉴클레오타이드서열(transcribed strand)인 5'-ATCATTGGCAGACTAGTTCG-3'을 의미할 수도 있으며, 이에 상보적인 뉴클레오타이드 서열(non-transcribed strand)인 5'-CGAACTAGTCTGCCAATGAT-3' 을 의미할 수도 있다.
표적서열은 5 내지 50개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
일 구체예로서 상기 표적서열은 16개의 뉴클레오타이드서열, 17개의 뉴클레오타이드서열, 18개의 뉴클레오타이드서열, 19개의 뉴클레오타이드서열, 20개의 뉴클레오타이드서열, 21개의 뉴클레오타이드서열, 22개의 뉴클레오타이드서열, 23개의 뉴클레오타이드서열, 24개의 뉴클레오타이드서열 또는 25개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
표적서열은 가이드핵산 결합 서열 혹은 가이드핵산 비결합 서열을 포함한다.
"가이드핵산 결합 서열"은 가이드핵산의 가이드 도메인에 포함되는 가이드 서열과 일부 또는 완전한 상보성을 가지는 뉴클레오타이드서열로, 가이드핵산의 가이드 도메인에 포함되는 가이드 서열과 상보적인 결합을 할 수 있다. 표적서열 및 가이드핵산 결합 서열은 표적 유전자 또는 핵산에 따라, 즉 유전자 조작 또는 교정하고자 하는 대상에 따라 달라질 수 있는 뉴클레오타이드서열로, 표적 유전자 또는 핵산에 따라 다양하게 설계될 수 있다.
"가이드핵산 비결합 서열"은 가이드핵산의 가이드 도메인에 포함되는 가이드 서열과 일부 또는 완전한 상동성을 가지는 뉴클레오타이드서열로, 가이드핵산의 가이드 도메인에 포함되는 가이드 서열과 상보적인 결합을 할 수 없다. 또한, 가이드핵산 비결합 서열은 가이드핵산 결합 서열과 상보성을 가지는 뉴클레오타이드서열로, 가이드핵산 결합 서열과 상보적인 결합을 할 수 있다.
가이드핵산 결합 서열은 표적서열 중 일부 뉴클레오타이드서열로, 표적서열의 두 가지 서로 다른 서열순서를 가지는 뉴클레오타이드서열, 즉, 서로 상보적인 결합을 할 수 있는 두 가지의 뉴클레오타이드서열 중 한 가지 뉴클레오타이드서열일 수 있다. 이때, 가이드핵산 비결합 서열은 표적서열 중 가이드핵산 결합 서열을 제외한 나머지 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
예를 들면, 표적 유전자 A의 표적 영역 중 일부 뉴클레오타이드서열인 5'-ATCATTGGCAGACTAGTTCG-3'과 이에 상보적인 뉴클레오타이드서열인 5'-CGAACTAGTCTGCCAATGAT-3'을 표적서열로 할 때, 가이드핵산 결합 서열은 두 개의 표적서열 중 하나, 즉, 5'-ATCATTGGCAGACTAGTTCG-3' 또는 5'-CGAACTAGTCTGCCAATGAT-3'일 수 있다. 이때, 가이드핵산 비결합 서열은, 가이드핵산 결합 서열이 5'-ATCATTGGCAGACTAGTTCG-3'인 경우, 5'-CGAACTAGTCTGCCAATGAT-3'일 수 있고, 또는 가이드핵산 결합 서열이 5'-CGAACTAGTCTGCCAATGAT-3'인 경우 가이드핵산 비결합 서열은 5'-ATCATTGGCAGACTAGTTCG-3'일 수 있다.
가이드핵산 결합 서열은 표적서열, 즉, transcribed strand와 동일한 뉴클레오타이드서열 및 non-transcribed strand와 동일한 뉴클레오타이드서열 중 선택된 하나의 뉴클레오타이드서열일 수 있다. 이때, 가이드핵산 비결합 서열은 표적서열 중 가이드핵산 결합 서열, 즉, transcribed strand와 동일한 뉴클레오타이드서열 및 non-transcribed strand와 동일한 뉴클레오타이드서열 중 선택된 하나의 뉴클레오타이드서열을 제외한 나머지 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
가이드핵산 결합 서열은 표적서열의 길이와 동일할 수 있다.
가이드핵산 비결합 서열은 표적서열 또는 가이드핵산 결합 서열의 길이와 동일할 수 있다.
가이드핵산 결합 서열은 5 내지 50개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
일 구체예로서 상기 가이드핵산 결합 서열은 16개의 뉴클레오타이드서열, 17개의 뉴클레오타이드서열, 18개의 뉴클레오타이드서열, 19개의 뉴클레오타이드서열, 20개의 뉴클레오타이드서열, 21개의 뉴클레오타이드서열, 22개의 뉴클레오타이드서열, 23개의 뉴클레오타이드서열, 24개의 뉴클레오타이드서열 또는 25개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
가이드핵산 비결합 서열은 5 내지 50개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
일 구체예로서 상기 가이드핵산 비결합 서열은 16개의 뉴클레오타이드서열, 17개의 뉴클레오타이드서열, 18개의 뉴클레오타이드서열, 19개의 뉴클레오타이드서열, 20개의 뉴클레오타이드서열, 21개의 뉴클레오타이드서열, 22개의 뉴클레오타이드서열, 23개의 뉴클레오타이드서열, 24개의 뉴클레오타이드서열 또는 25개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
가이드핵산 결합 서열은 가이드핵산의 가이드 도메인에 포함된 가이드 서열과 일부 또는 완전한상보적인 결합을 할 수 있으며, 상기 가이드핵산 결합 서열의 길이는 가이드 서열의 길이와 동일할 수 있다.
상기 가이드핵산 결합 서열은 가이드핵산의 가이드 도메인에 포함된 가이드 서열에 상보적인 뉴클레오타이드서열일 수 있으며, 예를 들어 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 이상의 상보적이거나 또는 완전하게 상보적인 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
일 예로, 상기 가이드핵산 결합 서열은 가이드핵산의 가이드 도메인에 포함된 가이드 서열에 상보적이지 않은 1 내지 8개의 뉴클레오타이드서열을 가지거나 또는 포함할 수 있다.
가이드핵산 비결합 서열은 가이드핵산의 가이드 도메인에 포함된 가이드 서열과 일부 또는 완전한 상동성을 가질 수 있으며, 상기 가이드핵산 비결합 서열의 길이는 가이드 서열의 길이와 동일할 수 있다.
상기 가이드핵산 비결합 서열은 가이드핵산의 가이드 도메인에 포함된 가이드 서열에 상동성을 가진 뉴클레오타이드서열일 수 있으며, 예를 들어 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 이상의 상동성이거나 또는 완전하게 상동성인 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
일 예로, 상기 가이드핵산 비결합 서열은 가이드핵산의 가이드 도메인에 포함된 가이드 서열에 상동적이 않은 1 내지 8개의 뉴클레오타이드서열을 가지거나 포함할 수 있다.
가이드핵산 비결합 서열은 가이드핵산 결합 서열과 상보적 결합을 할 수 있으며, 상기 가이드핵산 비결합 서열은 가이드핵산 결합 서열의 길이와 동일할 수 있다.
상기 가이드핵산 비결합 서열은 가이드핵산 결합서열에 상보적인 뉴클레오타이드서열일 수 있으며, 예를 들어 최소한 90% 또는 95% 이상의 상보적이거나 또는 완전하게 상보적인 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
일 예로, 상기 가이드핵산 비결합 서열은 가이드핵산 결합 서열에 상보적이지 않은 1 내지 2개의 뉴클레오타이드서열을 가지거나 포함할 수 있다.
또한, 상기 가이드핵산 결합 서열은 에디터단백질이 인식할 수 있는 뉴클레오타이드서열에 근접한 위치에 위치한 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
일 예로, 상기 가이드핵산 결합 서열은 에디터단백질이 인식할 수 있는 뉴클레오타이드서열의 5' 말단 또는/및 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 5 내지 50개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
또한, 상기 가이드핵산 비결합 서열은 에디터단백질이 인식할 수 있는 뉴클레오타이드서열에 근접한 위치에 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
일 예로, 상기 가이드핵산 비결합 서열은 에디터단백질이 인식할 수 있는 뉴클레오타이드서열의 5' 말단 또는/및 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 5 내지 50개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
구현예에서,
본 명세서에 의해 개시되는 표적서열은 고발현 분비 유전자의 프로모터 영역에 위치한 연속하는 10 내지 35개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
이때, 상기 표적서열은 10 내지 35개의 뉴클레오타이드서열, 15 내지 35개의 뉴클레오타이드서열, 20 내지 35개의 뉴클레오타이드서열, 25 내지 35개의 뉴클레오타이드서열 또는 30 내지 35개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
또는 상기 표적서열은 10 내지 15개의 뉴클레오타이드서열, 15 내지 20개의 뉴클레오타이드서열, 20 내지 25개의 뉴클레오타이드서열, 25 내지 30개의 뉴클레오타이드서열 또는 30 내지 35개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
일 예로, 상기 표적서열은 HP 유전자의 프로모터 영역에 위치한 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
다른 예로, 상기 표적서열은 APOC3 유전자의 프로모터 영역에 위치한 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
본 명세서에 의해 개시되는 표적서열은 고발현 분비 유전자의 인트론 영역에 위치한 연속하는 10 내지 35개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
이때, 상기 표적서열은 10 내지 35개의 뉴클레오타이드서열, 15 내지 35개의 뉴클레오타이드서열, 20 내지 35개의 뉴클레오타이드서열, 25 내지 35개의 뉴클레오타이드서열 또는 30 내지 35개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
또는 상기 표적서열은 10 내지 15개의 뉴클레오타이드서열, 15 내지 20개의 뉴클레오타이드서열, 20 내지 25개의 뉴클레오타이드서열, 25 내지 30개의 뉴클레오타이드서열 또는 30 내지 35개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
일 예로, 상기 표적서열은 HP 유전자의 인트론 영역에 위치한 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
다른 예로, 상기 표적서열은 APOC3 유전자의 인트론 영역에 위치한 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
본 명세서에 의해 개시되는 표적서열은 고발현 분비 유전자의 엑손 영역에 위치한 연속하는 10 내지 35개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
이때, 상기 표적서열은 10 내지 35개의 뉴클레오타이드서열, 15 내지 35개의 뉴클레오타이드서열, 20 내지 35개의 뉴클레오타이드서열, 25 내지 35개의 뉴클레오타이드서열 또는 30 내지 35개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
또는 상기 표적서열은 10 내지 15개의 뉴클레오타이드서열, 15 내지 20개의 뉴클레오타이드서열, 20 내지 25개의 뉴클레오타이드서열, 25 내지 30개의 뉴클레오타이드서열 또는 30 내지 35개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
일 예로, 상기 표적서열은 HP 유전자의 엑손 영역에 위치한 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
다른 예로, 상기 표적서열은 APOC3 유전자의 엑손 영역에 위치한 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
본 명세서에 의해 개시되는 표적서열은 고발현 분비 유전자의 인핸서 영역에 위치한 연속하는 10 내지 35개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
이때, 상기 표적서열은 10 내지 35개의 뉴클레오타이드서열, 15 내지 35개의 뉴클레오타이드서열, 20 내지 35개의 뉴클레오타이드서열, 25 내지 35개의 뉴클레오타이드서열 또는 30 내지 35개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
또는 상기 표적서열은 10 내지 15개의 뉴클레오타이드서열, 15 내지 20개의 뉴클레오타이드서열, 20 내지 25개의 뉴클레오타이드서열, 25 내지 30개의 뉴클레오타이드서열 또는 30 내지 35개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
일 예로, 상기 표적서열은 HP 유전자의 인핸서 영역에 위치한 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
다른 예로, 상기 표적서열은 APOC3 유전자의 인핸서 영역에 위치한 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
본 명세서에 의해 개시되는 표적서열은 고발현 분비 유전자의 암호화, 비암호화 또는 이의 혼합 부분의 위치한 연속하는 10 내지 35개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
이때, 상기 표적서열은 10 내지 35개의 뉴클레오타이드서열, 15 내지 35개의 뉴클레오타이드서열, 20 내지 35개의 뉴클레오타이드서열, 25 내지 35개의 뉴클레오타이드서열 또는 30 내지 35개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
또는 상기 표적서열은 10 내지 15개의 뉴클레오타이드서열, 15 내지 20개의 뉴클레오타이드서열, 20 내지 25개의 뉴클레오타이드서열, 25 내지 30개의 뉴클레오타이드서열 또는 30 내지 35개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
일 예로, 상기 표적서열은 HP 유전자의 암호화, 비암호화 또는 이의 혼합 부분의 위치한 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
다른 예로, 상기 표적서열은 APOC3 유전자의 암호화, 비암호화 또는 이의 혼합 부분의 위치한 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
본 명세서에 의해 개시되는 표적서열은 고발현 분비 유전자의 프로모터, 인핸서, 3'UTR, 폴리아데닐(polyA) 또는 이의 혼합 부분의 위치한 연속하는 10 내지 35개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
이때, 상기 표적서열은 10 내지 35개의 뉴클레오타이드서열, 15 내지 35개의 뉴클레오타이드서열, 20 내지 35개의 뉴클레오타이드서열, 25 내지 35개의 뉴클레오타이드서열 또는 30 내지 35개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
또는 상기 표적서열은 10 내지 15개의 뉴클레오타이드서열, 15 내지 20개의 뉴클레오타이드서열, 20 내지 25개의 뉴클레오타이드서열, 25 내지 30개의 뉴클레오타이드서열 또는 30 내지 35개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
일 예로, 상기 표적서열은 HP 유전자의 프로모터, 인핸서, 3'UTR, 폴리아데닐(polyA) 또는 이의 혼합 부분의 위치한 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
다른 예로, 상기 표적서열은 APOC3 유전자의 프로모터, 인핸서, 3'UTR, 폴리아데닐(polyA) 또는 이의 혼합 부분의 위치한 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
본 명세서에 의해 개시되는 표적서열은 고발현 분비 유전자의 엑손, 인트론 또는 이의 혼합 부분의 위치한 연속하는 10 내지 35개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
이때, 상기 표적서열은 10 내지 35개의 뉴클레오타이드서열, 15 내지 35개의 뉴클레오타이드서열, 20 내지 35개의 뉴클레오타이드서열, 25 내지 35개의 뉴클레오타이드서열 또는 30 내지 35개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
또는 상기 표적서열은 10 내지 15개의 뉴클레오타이드서열, 15 내지 20개의 뉴클레오타이드서열, 20 내지 25개의 뉴클레오타이드서열, 25 내지 30개의 뉴클레오타이드서열 또는 30 내지 35개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
일 예로, 상기 표적서열은 HP 유전자의 엑손, 인트론 또는 이의 혼합 부분의 위치한 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
다른 예로, 상기 표적서열은 APOC3 유전자의 엑손, 인트론 또는 이의 혼합 부분의 위치한 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
본 명세서에 의해 개시되는 표적서열은 고발현 분비 유전자의 돌연변이 부분(예를 들면, 야생형 유전자와 다른 부분)을 포함하거나 또는 근접한 연속하는 10 내지 35개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
이때, 상기 표적서열은 10 내지 35개의 뉴클레오타이드서열, 15 내지 35개의 뉴클레오타이드서열, 20 내지 35개의 뉴클레오타이드서열, 25 내지 35개의 뉴클레오타이드서열 또는 30 내지 35개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
또는 상기 표적서열은 10 내지 15개의 뉴클레오타이드서열, 15 내지 20개의 뉴클레오타이드서열, 20 내지 25개의 뉴클레오타이드서열, 25 내지 30개의 뉴클레오타이드서열 또는 30 내지 35개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
일 예로, 상기 표적서열은 HP 유전자의 돌연변이 부분(예를 들면, 야생형 유전자와 다른 부분)을 포함하거나 또는 근접한 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
다른 예로, 상기 표적서열은 APOC3 유전자의 돌연변이 부분(예를 들면, 야생형 유전자와 다른 부분)을 포함하거나 또는 근접한 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
본 명세서에 의해 개시되는 표적서열은 고발현 분비 유전자의 핵산서열 내의 PAM(proto-spacer-adjacent Motif) 서열의 5' 말단 및/또는 3' 말단에 인접한 연속하는 10 내지 35개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
"PAM(proto-spacer-adjacent Motif) 서열"은 에디터단백질이 인식할 수 있는 뉴클레오타이드서열이다. 이때, PAM 서열은 에디터단백질의 종류 및 유래된 종에 따라 뉴클레오타이드서열에 차이가 있을 수 있다.
이때, 상기 PAM 서열은 예를 들어, 하기의 서열 중 1 이상일 수 있다(5'에서 3'방향으로 기재함).
NGG(N은 A, T, C 또는 G임);
NNNNRYAC(N은 각각 독립적으로 A, T, C 또는 G이고, R은 A또는 G이고, Y는 C또는 T임);
NNAGAAW(N은 각각 독립적으로 A, T, C 또는 G이고, W는 A 또는 T임);
NNNNGATT(N은 각각 독립적으로 A, T, C 또는 G임);
NNGRR(T)(N은 각각 독립적으로 A, T, C 또는 G이고, R은 A 또는 G이고, Y는 C 또는 T임); 및
TTN(N은 A, T, C 또는 G임).
이때, 상기 표적서열은 10 내지 35개의 뉴클레오타이드서열, 15 내지 35개의 뉴클레오타이드서열, 20 내지 35개의 뉴클레오타이드서열, 25 내지 35개의 뉴클레오타이드서열 또는 30 내지 35개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
또는 상기 표적서열은 10 내지 15개의 뉴클레오타이드서열, 15 내지 20개의 뉴클레오타이드서열, 20 내지 25개의 뉴클레오타이드서열, 25 내지 30개의 뉴클레오타이드서열 또는 30 내지 35개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
일 예로, 상기 표적서열은 HP 유전자의 핵산서열 내의 PAM 서열의 5' 말단 및/또는 3' 말단에 인접한 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
일 구체예로서, 에디터단백질이 인식하는 PAM 서열이 5'-NGG-3', 5'-NAG-3' 또는/및 5'-NGA-3' (N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C)인 경우, 상기 표적서열은 HP 유전자의 핵산서열 내의 5'-NGG-3', 5'-NAG-3' 또는/및 5'-NGA-3' (N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C) 서열의 5' 말단 또는/및 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 에디터단백질이 인식하는 PAM 서열이 5'-NGGNG-3' 또는/및 5'-NNAGAAW-3' (W = A 또는 T이며, N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C)인 경우, 상기 표적서열은 HP 유전자의 핵산서열 내의 5'-NGGNG-3' 또는/및 5'-NNAGAAW-3' (W = A 또는 T이며, N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C) 서열의 5' 말단 또는/및 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
또 다른 일 구체예로서, 에디터단백질이 인식하는 PAM 서열이 5'-NNNNGATT-3' 또는/및 5'-NNNGCTT-3' (N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C)인 경우, 상기 표적서열은 HP 유전자의 핵산서열 내의 5'-NNNNGATT-3' 또는/및 5'-NNNGCTT-3' (N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C) 서열의 5' 말단 또는/및 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
일 구체예로서, 에디터단백질이 인식하는 PAM 서열이 5'-NNNVRYAC-3' (V = G, C 또는 A; R = A 또는 G 이며, Y = C 또는 T 이고, N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C)인 경우, 상기 표적서열은 HP 유전자의 핵산서열 내의 5'-NNNVRYAC-3' (V = G, C 또는 A; R = A 또는 G 이며, Y = C 또는 T 이고, N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C) 서열의 5' 말단 또는/및 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 에디터단백질이 인식하는 PAM 서열이 5'-NAAR-3'(R = A 또는 G이며, N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C)인 경우, 상기 표적서열은 HP 유전자의 핵산서열 내의 5'-NAAR-3'(R = A 또는 G이며, N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C) 서열의 5' 말단 또는/및 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
또 다른 일 구체예로서, 에디터단백질이 인식하는 PAM 서열이 5'-NNGRR-3', 5'-NNGRRT-3' 또는/및 5'-NNGRRV-3' (R = A 또는 G이며, V = G, C 또는 A이고, N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C)인 경우, 상기 표적서열은 HP 유전자의 핵산서열 내의 5'-NNGRR-3', 5'-NNGRRT-3' 또는/및 5'-NNGRRV-3' (R = A 또는 G이며, V = G, C 또는 A이고, N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C) 서열의 5' 말단 또는/및 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
일 구체예로서, 에디터단백질이 인식하는 PAM 서열이 5'-TTN-3' (N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C)인 경우, 상기 표적서열은 HP유전자의 핵산서열 내의 5'-TTN-3' (N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C) 서열의 5' 말단 또는/및 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
다른 예로, 상기 표적서열은 APOC3 유전자의 핵산서열 내의 PAM 서열의 5' 말단 및/또는 3' 말단에 인접한 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
일 구체예로서, 에디터단백질이 인식하는 PAM 서열이 5'-NGG-3', 5'-NAG-3' 또는/및 5'-NGA-3' (N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C)인 경우, 상기 표적서열은 APOC3 유전자의 핵산서열 내의 5'-NGG-3', 5'-NAG-3' 또는/및 5'-NGA-3' (N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C) 서열의 5' 말단 또는/및 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 에디터단백질이 인식하는 PAM 서열이 5'-NGGNG-3' 또는/및 5'-NNAGAAW-3' (W = A 또는 T이며, N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C)인 경우, 상기 표적서열은 APOC3 유전자의 핵산서열 내의 5'-NGGNG-3' 또는/및 5'-NNAGAAW-3' (W = A 또는 T이며, N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C) 서열의 5' 말단 또는/및 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
또 다른 일 구체예로서, 에디터단백질이 인식하는 PAM 서열이 5'-NNNNGATT-3' 또는/및 5'-NNNGCTT-3' (N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C)인 경우, 상기 표적서열은 APOC3 유전자의 핵산서열 내의 5'-NNNNGATT-3' 또는/및 5'-NNNGCTT-3' (N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C) 서열의 5' 말단 또는/및 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
일 구체예로서, 에디터단백질이 인식하는 PAM 서열이 5'-NNNVRYAC-3' (V = G, C 또는 A; R = A 또는 G 이며, Y = C 또는 T 이고, N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C)인 경우, 상기 표적서열은 APOC3 유전자의 핵산서열 내의 5'-NNNVRYAC-3' (V = G, C 또는 A; R = A 또는 G 이며, Y = C 또는 T 이고, N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C) 서열의 5' 말단 또는/및 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 에디터단백질이 인식하는 PAM 서열이 5'-NAAR-3'(R = A 또는 G이며, N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C)인 경우, 상기 표적서열은 APOC3 유전자의 핵산서열 내의 5'-NAAR-3'(R = A 또는 G이며, N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C) 서열의 5' 말단 또는/및 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
또 다른 일 구체예로서, 에디터단백질이 인식하는 PAM 서열이 5'-NNGRR-3', 5'-NNGRRT-3' 또는/및 5'-NNGRRV-3' (R = A 또는 G이며, V = G, C 또는 A이고, N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C)인 경우, 상기 표적서열은 APOC3 유전자의 핵산서열 내의 5'-NNGRR-3', 5'-NNGRRT-3' 또는/및 5'-NNGRRV-3' (R = A 또는 G이며, V = G, C 또는 A이고, N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C) 서열의 5' 말단 또는/및 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
일 구체예로서, 에디터단백질이 인식하는 PAM 서열이 5'-TTN-3' (N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C)인 경우, 상기 표적서열은 APOC3 유전자의 핵산서열 내의 5'-TTN-3' (N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C) 서열의 5' 말단 또는/및 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드서열일 수 있다.
이하, 본 발명의 일 구체예에서 사용할 수 있는 표적서열들의 일 예들을 표로 정리하였으며, 표에 기재된 표적서열은 가이드핵산 비결합 서열로, 기재한 서열을 통해 상보적인 서열, 즉, 가이드핵산 결합 서열은 예측될 수 있다.
[표 1]. HP 유전자 및 APOC3 유전자의 표적서열
Figure pat00001
Figure pat00002
Figure pat00003
Figure pat00004
Figure pat00005
Figure pat00006
Figure pat00007
Figure pat00008
Figure pat00009
Figure pat00010
본 명세서에 의하여 개시되는 내용의 다른 구체예에서, 고발현 분비 유전자를 조작하기 위한 조성물은 가이드핵산 및 에디터단백질을 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 조성물은
간에서 발현되는 고발현 분비 유전자 군에서 선택된 하나 이상의 유전자의 표적서열에 대한 가이드 핵산; 및
에디터 단백질 또는 에디터 단백질을 암호화하는 핵산;
을 포함할 수 있다.
상기 고발현 분비 유전자 관련 설명은 상기 기술한 바와 같다.
(1) 에디터 단백질
"에디터 단백질"은 핵산과 직접적으로 결합하거나, 또는 직접 결합하지는 않지만 상호작용할 수 있는 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질을 의미한다. 상기 에디터 단백질에 대해서 개념적으로 "인위적으로 조작된 뉴클레아제" 또는 RGEN(RNA-Guided Endonuclease)으로 칭하기도 한다.
상기 에디터 단백질은 효소일 수 있다.
이때, 상기 "효소"는 핵산, 유전자 또는 염색체를 절단할 수 있는 도메인을 포함하는 폴리펩타이드 또는 단백질을 의미한다.
상기 효소는 뉴클레아제 또는 제한효소일 수 있다.
상기 에디터단백질은 완전 활성 효소를 포함할 수 있다.
이때, 상기 "완전 활성 효소"는 야생형(wild type) 효소의 본래의 핵산, 유전자 또는 염색체 절단 기능과 동일한 기능을 가지는 효소를 의미한다. 예를 들면, DNA의 이중 가닥을 절단하는 야생형 효소는 DNA 이중 가닥을 모두 절단하는 완전한 활성 효소일 수 있다. 또 다른 예를 들면, DNA의 이중 가닥을 절단하는 야생형 효소가 인위적인 조작에 의해 아미노산 서열 중 일부 서열이 삭제(deletion) 또는 치환(substitution)된 경우, 인위적으로 조작된 효소 변이체가 야생형 효소와 동일하게 DNA의 이중 가닥을 절단한다면, 상기 인위적으로 조작된 효소 변이체는 완전 활성 효소일 수 있다.
또한, 상기 완전 활성 효소는 야생형의 효소의 기능보다 향상 된 기능을 가지고 있는 효소를 포함할 수 있다. 예를 들면, DNA의 이중 가닥을 절단하는 야생형 효소의 특정 변형 또는 조작된 형태는 야생형 효소보다 증가된 완전한 효소 활성, 즉, 증가된 DNA 이중 가닥을 절단하는 활성을 가질 수 있다.
상기 에디터단백질은 불완전 또는 부분 활성 효소를 포함할 수 있다.
이때, 상기 "불완전 또는 부분 활성 효소"는 야생형 효소의 본래의 핵산, 유전자 또는 염색체 절단 기능의 일부만을 가지는 효소를 의미한다. 예를 들면, DNA의 이중 가닥을 절단하는 야생형 효소의 특정 변형 또는 조작된 형태는 제1 기능을 가지는 형태 또는 제2 기능을 가지는 형태일 수 있다. 이때, 제1 기능은 DNA의 이중 가닥 중 제1 가닥을 절단하는 기능이고, 제2 기능은 DNA의 이중 가닥 중 제2 가닥을 절단하는 기능일 수 있다. 이때, 상기 제1 기능을 가지는 효소 또는 제2 기능을 가지는 효소는 불완전 또는 부분 활성 효소일 수 있다.
상기 에디터단백질은 불활성 효소를 포함할 수 있다.
이때, 상기 "불활성 효소"는 야생형 효소의 본래의 핵산, 유전자 또는 염색체 절단 기능이 모두 불활성화 된 효소를 의미한다. 예를 들면, 야생형 효소의 특정 변형 또는 조작된 형태는 제1 기능 및 제2 기능이 모두 상실된 형태, 즉, DNA의 이중 가닥 중 제1 가닥을 절단하는 제1 기능 및 제2 가닥을 절단하는 제2 기능이 모두 상실된 형태일 수 있다. 이때, 상기 제1 기능 및 제2 기능이 모두 상실된 효소는 불활성 효소일 수 있다.
상기 에디터단백질은 융합단백질일 수 있다.
이때, 상기 "융합 단백질"은 효소에 추가적인 도메인, 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질을 융합하여 생성한 단백질을 의미한다.
상기 추가적인 도메인, 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질은 상기 효소에 포함된 기능적 도메인, 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질과 동일하거나 다른 기능을 가지는 기능적 도메인, 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질일 수 있다.
상기 융합 단백질은 효소의 아미노 말단 또는 그 근처; 카르복시 말단 또는 그 근처; 효소의 중간부; 또는 이들 조합의 하나 이상에 상기 기능적 도메인, 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질이 부가된 형태일 수 있다.
이때, 상기 기능적 도메인, 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질은 메틸라아제(methylase) 활성, 디메틸라아제(demethylase) 활성, 전사촉진(transcription activation) 활성, 전사 저해(transcription repression) 활성, 전사 방출 인자(transcription release factor) 활성, 히스톤 변형(histone modification) 활성, RNA 절단(cleavage) 활성 또는 핵산 결합(nucleic acid binding) 활성을 가지는 도메인, 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질 일 수 있으며, 또는 단백질(펩타이드 포함)의 분리정제를 위한 태그(tag) 또는 리포터 유전자일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 기능적 도메인, 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질은 디아미네이즈(deaminase)일 수 있다.
상기 태그는 히스티딘(His) 태그, V5 태그, FLAG 태그, 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 태그, Myc 태그, VSV-G 태그 및 티오레독신(Trx) 태그 등을 포함하며, 상기 리포터 유전자는 글루타티온-S-트랜스 퍼라제(GST), 호스래디시(horseradish) 과산화효소(HRP), 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(CAT) 베타-갈락토시다제, 베타-글루쿠로니다제, 루시퍼라제, 녹색 형광 단백질(GFP), HcRed, DsRed, 청록색 형광 단백질(CFP), 황색 형광 단백질(YFP) 및 청색 형광 단백질(BFP)을 포함하는 자가형광 단백질을 포함하나, 이들에 한정되지 않는다.
또한, 상기 기능적 도메인, 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질은 NLS(nuclear localization sequence or signal) 또는 NES(nuclear export sequence or signal)일 수 있다.
상기 NLS는 아미노산 서열 PKKKRKV를 갖는 SV40 바이러스 대형 T-항원의 NLS; 뉴클레오플라스민(nucleoplasmin)으로부터의 NLS(예를 들어, 서열 KRPAATKKAGQAKKKK를 갖는 뉴클레오플라스민 이분(bipartite) NLS); 아미노산 서열 PAAKRVKLD 또는 RQRRNELKRSP를 갖는 c-myc NLS; 서열 NQSSNFGPMKGGNFGGRSSGPYGGGGQYFAKPRNQGGY를 갖는 hRNPA1 M9 NLS; 임포틴-알파로부터의 IBB 도메인의 서열 RMRIZFKNKGKDTAELRRRRVEVSVELRKAKKDEQILKRRNV; 마이오마(myoma) T 단백질의 서열 VSRKRPRP 및 PPKKARED; 인간 p53의 서열 POPKKKPL; 마우스 c-abl IV의 서열 SALIKKKKKMAP; 인플루엔자 바이러스 NS1의 서열 DRLRR 및 PKQKKRK; 간염 바이러스 델타 항원의 서열 RKLKKKIKKL; 마우스 Mx1 단백질의 서열 REKKKFLKRR; 인간 폴리(ADP-리보스) 중합효소의 서열 KRKGDEVDGVDEVAKKKSKK; 또는 스테로이드 호르몬 수용체(인간) 글루코코르티코이드의 서열 RKCLQAGMNLEARKTKK로부터 유래된 NLS 서열일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 추가적인 도메인, 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질은 특정 기능을 수행하지 않는 비기능적 도메인, 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질일 수 있다. 이때, 상기 비기능적 도메인, 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질은 상기 효소의 기능에 영향을 주지 않는 도메인, 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질일 수 있다.
상기 융합 단백질은 효소의 아미노 말단 또는 그 근처; 카르복시 말단 또는 그 근처; 효소의 중간부; 또는 이들 조합의 하나 이상에 상기 비기능적 도메인, 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질이 부가된 형태일 수 있다.
상기 에디터단백질은 자연 상태에 존재하는 효소 또는 융합 단백질일 수 있다.
상기 에디터단백질은 자연 상태에 존재하는 효소 또는 융합 단백질의 일부가 변형된 형태일 수 있다.
상기 에디터단백질은 자연 상태에 존재하지 않는 인위적으로 생성된 효소 또는 융합 단백질일 수 있다.
상기 에디터단백질은 자연 상태에 존재하지 않는 인위적으로 생성된 효소 또는 융합 단백질의 일부가 변형된 형태일 수 있다.
이때, 상기 변형은 에디터단백질에 포함된 아미노산의 치환, 제거, 부가 또는 이의 혼합일 수 있다.
또는 상기 변형은 에디터단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드서열 중 일부 뉴클레오타이드의 치환, 제거, 부가 또는 이의 혼합일 수 있다.
상기 가이드핵산과 에디터단백질은 가이드핵산-에디터단백질 복합체를 형성할 수 있다.
상기 가이드핵산-에디터단백질 복합체는 세포 밖에서 형성될 수 있다.
상기 가이드핵산-에디터단백질 복합체는 세포 내의 세포질에서 형성될 수 있다.
상기 가이드핵산-에디터단백질 복합체는 세포 내의 핵 안에서 형성될 수 있다.
상기 가이드핵산-에디터단백질 복합체체에서, 에디터 단백질은 타겟하는 유전자 또는 핵산 서열 내에 존재하는 PAM을 인식할 수 있다.
상기 가이드핵산-에디터단백질 복합체에서 가이드 핵산은 타겟하는 유전자 또는 핵산 서열에 상보적인 결합을 할 수 있다.
상기 가이드핵산-에디터단백질 복합체가 타겟하는 유전자 또는 핵산 서열에 결합하면, 상기 가이드핵산 - 에디터 단백질 복합체의 에디터 단백질에 의해 타겟하는 유전자 또는 핵산 서열은 절단 또는 변형될 수 있다.
본 명세서에 의해 개시되는 내용의 일 태양으로서, 에디터 단백질은 CRISPR 효소일 수 있다.
예를 들어, 상기 조성물은
간에서 발현되는 고발현 분비 유전자 유전자 군에서 선택된 하나 이상의 유전자의 표적서열에 대한 가이드 RNA; 및
CRISPR 효소 또는 CRISPR 효소를 암호화하는 핵산;
을 포함할 수 있다.
상기 가이드RNA 관련 설명은 상기 기술한 바와 같다.
상기 CRISPR 효소는 표적 유전자 또는 핵산의 이중가닥을 절단하는 기능을 가지는 뉴클레아제 또는 제한효소일 수 있다.
"CRISPR 효소"는 CRISPR-Cas 시스템의 주요 단백질 구성 요소로, 가이드RNA와 혼합 또는 복합체를 형성하여 표적서열을 인지하고 DNA를 절단할 수 있는 뉴클레아제를 말한다.
"CRISPR-Cas 시스템"은 박테리아에서 외부로부터 침입한 병원체의 유전정보를 저장하여 후에 재침입시 이를 절단하는 후천적 면역 시스템에서 유래한 것으로서, 이를 인위적으로 조작하여, 원하는 표적서열을 인식할 수 있는 가이드RNA와, DNA를 절단하는 단백질 Cas 단백질로 구성되어 유전자의 기능을 제거, 조절하는 유전체 교정 시템을 말한다.
상기 Cas 단백질은 crRNA(CRISPR RNA) 및 tracrRNA(trans-activating crRNA)와 복합체를 형성하여 이의 활성을 나타낼 수 있다.
상기 Cas 단백질은 천연형 단백질 외에도 가이드 RNA와 협동하여 활성화된 엔도뉴클레아제 또는 Nickase로 작용할 수 있는 변이체를 모두 포함하는 개념으로 본 명세서에서 사용된다. 활성화된 엔도뉴클레아제 또는 니카아제인 경우, 표적 DNA절단을 가져올 수 있고, 이를 이용하여 유전체 교정을 가지고 올 수 있다. 또한, 불활성화된 변이체인 경우, 이를 이용하여 전사 조절 혹은 목적하는 DNA의 분리를 가져올 수 있다.
상기 Cas 단백질은 완전 활성을 가진 CRISPR 효소일 수 있다.
상기 "완전 활성 CRISPR 효소"는 야생형(wild tiype) 효소의 본래의 핵산, 유전자 또는 염색체 절단 기능과 동일한 기능을 가지는 효소를 의미한다. 즉 DNA의 이중 가닥 중 제1가닥을 절단하는 기능 및 DNA의 이중가닥 중 제 2가닥을 절단하는 제2기능을 모두 가지는 상태를 말한다.
인위적으로 조작된 CRISPR 효소 변이체가 야생형 효소와 동일하게 DNA의 이중가닥을 절단하는 효소라면 상기 인위적으로 조작된 CRISPR 효소도 완전 활성 효소에 포함될 수 있다.
상기 인위적으로 조작된 CRISPR 효소는 뉴클레오타이드 서열 중 일부가 제거(deletion), 치환(substitution), 부가된 효소일 수 있다.
상기 인위적으로 조작된 CRISPR 효소는 아미노산 서열에 하나 이상의 아미노산이 제거, 치환 또는 부가된 효소 일수 있다.
상기 아미노산의 부가된 변형은 야생형 효소의 N말단 및/또는 C말단이거나 그 인접한 부분일 수 있다. 또는 이의 혼합된 형태의 변형일 수 있다.
상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소보다 기능이 향상된 완전 활성 효소일 수 있다.
예를 들면, 야생형 CRISPR 효소의 특정 변형 또는 조작된 형태, 즉, CRISPR 효소 변이체는 절단해야 하는 DNA 이중 가닥과 일정 거리이상으로 근접한 상태 또는 특정 결합이 형성된 상태에서 DNA 이중 가닥을 절단할 수 있다. 이때, 특정 결합은, 예를 들어, 효소의 특정 위치의 아미노산과 절단 위치의 DNA 뉴클레오타이드서열과의 결합일 수 있다. 이러한 경우, 상기 변형 또는 조작된 형태는 야생형 CRISPR 효소보다 기능 활성이 감소된 완전 활성 CRISPR 효소일 수 있다.
상기 CRISPR 효소는 불완전 또는 부분 활성 CRISPR 효소일 수 있다.
"불완전 또는 부분 활성"은 야생형 CRISPR 효소의 기능, 즉, DNA의 이중 가닥 중 제1 가닥을 절단하는 제1 기능 및 DNA의 이중 가닥 중 제2 가닥을 절단하는 제2 기능 중 선택된 하나의 기능을 가지는 상태를 의미한다. 이러한 상태의 CRISPR 효소는 불완전 또는 부분 활성 CRISPR 효소로 명칭한다. 또한 상기 불완전 또는 부분 활성 CRISPR 효소는 니카아제(nickase)로 지칭될 수 있다.
"니카아제(nickase)"는 표적 유전자 또는 핵산의 이중가닥 중 한 가닥만 절단되도록 조작 또는 변형된 CRISPR 효소를 의미하며, 상기 니카아제는 단일가닥, 예를 들어, 표적 유전자 또는 핵산의 가이드RNA와 비상보성 가닥 또는 상보성 가닥을 절단하는 뉴클레아제 활성을 가진다. 따라서, 이중가닥을 절단하기 위해서는 2개의 니카아제의 뉴클레아제 활성이 필요하다.
예를 들어, 상기 니카아제는 RuvC 도메인에 의한 뉴클레아제 활성을 가질 수 있다. 즉, 상기 니카아제는 HNH 도메인에 의한 뉴클레아제 활성을 포함하지 않을 수 있으며, 이를 위해 HNH 도메인은 조작 또는 변경될 수 있다.
상기 CRISPR 효소는 상기 기재된 뉴클레아제 활성 외에도 헬리카제 활성, 즉, 이중가닥 핵산의 나선 구조를 푸는 기능을 가질 수 있다.
또한, 상기 CRISPR 효소는 CRISPR 효소의 헬리카제 활성에 대해 완전 활성, 불완전 또는 부분 활성, 또는 불활성이 되도록 CRISPR 효소를 변형시킬 수 있다.
상기 CRISPR 효소는 CRISPR 효소를 암호화하는 서열을 가지는 핵산 또는 폴리펩타이드(또는 단백질)로, 대표적으로 Type II CRISPR 효소 일 수 있다.
Type II CRISPR 효소의 결정 구조는 2종 이상의 자연유래 미생물 Type II CRISPR 효소 분자에 대한 연구(Jinek et al., Science, 343(6176):1247997, 2014) 및 가이드RNA와 함께 복합체를 이루는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9(SpCas9)에 대한 연구(Nishimasu et al., Cell, 156:935-949, 2014; 및 Anders et al., Nature, 2014, doi: 10.1038/nature13579)를 통해 결정되었다.
상기 Type II CRISPR 효소는 Cas9일 수 있다.
"Cas9"은 가이드 RNA와 결합하여 표적 유전자 또는 핵산 상에서 표적서열 또는 위치를 절단 또는 변형시키는 효소로서, 가이드RNA가 상보적인 결합을 하는 핵산 가닥(strand)을 절단할 수 있는 HNH 도메인, 가이드RNA와 비상보적인 결합을 하는 핵산 가닥(strand)을 절단할 수 있는 RuvC 도메인, 표적, 즉, 타겟을 인식하는 REC 도메인 및 PAM 을 인식하는 PI도메인으로 구성될 수 있다. 구체적인 Cas9의 구조적 특성은 Hiroshi Nishimasu et al. (2014) Cell 156:935-949를 참고할 수 있다.
상기 RuvC 도메인은 Type II CRISPR 효소를 포함하는 자연상태에 존재하는 미생물의 구성원에 대해 구조적으로 유사성을 공유하며, 단일가닥, 예를 들어 표적 유전자 또는 핵산의 비상보성 가닥, 즉, 가이드RNA와 상보적인 결합을 하지 않는 가닥을 절단한다. 상기 RuvC 도메인은 종종 당업계에서 RuvCI 도메인, RuvCII 도메인 및 RuvCIII 도메인으로서, 통상적으로 RuvC I, RuvCII 및 RuvCIII로 지칭된다.
상기 HNH 도메인은 HNH 엔도뉴클레아제와 구조적 유사성을 공유하며, 단일 가닥, 예를 들어 표적 핵산 분자의 상보성 가닥, 즉, 가이드 RNA와 상보적인 결합을 하는 가닥을 절단한다. HNH 도메인은 RuvC II와 III 모티프 사이에 위치한다.
상기 Cas9은 완전 활성 Cas9 또는 불활성Cas9일 수 있다.
상기 불활성 Cas9은 완전히 불활성화된 Cas9 및 부분적으로 불활성화된 Cas9 (예, nickase)을 포함할 수 있다.
상기 Cas9은 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes), 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus), 스트렙토코커스 속(Streptococcus sp.), 황색포도상구균(Staphylococcus aureus), 노카르디옵시스 다손빌레이(Nocardiopsis dassonvillei), 스트렙토마이세스 프리스티네스피랄리스(Streptomyces pristinaespiralis), 스트렙토마이세스 비리도크로모게네스(Streptomyces viridochromogenes), 스트렙토마이세스 비리도크로모게네스(Streptomyces viridochromogenes), 스트렙토스포랑기움 로세움(Streptosporangium roseum), 스트렙토스포랑기움 로세움(Streptosporangium roseum), 알리사이클로바클루스 아시도칼다리우스(AlicyclobacHlus acidocaldarius), 바실러스 슈도마이코이데스(Bacillus pseudomycoides), 바실러스 셀레니티레두센스(Bacillus selenitireducens), 엑시구오박테리움 시비리쿰(Exiguobacterium sibiricum), 락토바실러스 델브루에키이(Lactobacillus delbrueckii), 락토바실러스 살리바리우스(Lactobacillus salivarius), 미크로스 킬라 마리나(Microscilla marina), 부르크홀데리아레스 박테리움(Burkholderiales bacterium), 폴라로모나스 나프탈레니보란스(Polaromonas naphthalenivorans), 폴라로모나스 속(Polaromonas sp.), 크로코스파에라 와트소니이(Crocosphaera watsonii), 시아노테세 속(Cyanothece sp.), 마이크로시스티스 아에루기노사(Microcystis aeruginosa), 시네코코커스 속(Synechococcus sp.), 아세토할로비움 아라바티쿰(Acetohalobium arabaticum), 암모니펙스 데겐시이(Ammonifex degensii), 칼디셀룰로시럽토 베시이(Caldicelulosiruptor bescii), 칸디다투스 데술포루디스(Candidatus Desulforudis), 클로스트리듐 보툴리눔(Clostridium botulinum), 클로스트리듐 디피실레(Clostridium difficile), 피네골디아 마그나(Finegoldia magna), 나트라나에로비우스 써모필러스 (Natranaerobius thermophilus), 펠로토마쿨럼 써모프로피오니쿰(Pelotomaculum thermopropionicum), 아시디티오바실러스 칼두스(Acidithiobacillus caldus), 아시디티오바실러스 페로옥시단스(Acidithiobacillus ferrooxidans), 알로크로마티움 비노숨(Allochromatium vinosum), 마리노박터 속(Marinobacter sp.), 니트로소코커스 할로필러스(Nitrosococcus halophilus), 니트로소코커스 와트소니(Nitrosococcus watsoni), 슈도알테로 모나스 할로플란크티스(Pseudoalteromonas haloplanktis), 크테도노박테르 라세미페르(Ktedonobacter racemifer), 메타노할로비움 에베스티가툼(Methanohalobium evestigatum), 아나베나 바리아빌리스(Anabaena variabilis), 노둘라리아 스푸미게나(Nodularia spumigena), 노스톡 속(Nostoc sp.), 아르트로스피라 맥시마(Arthrospira maxima), 아르트로스피라 플라텐시스(Arthrospira platensis), 아르트로스피라 속(Arthrospira sp.), 링비아속(Lyngbya sp.), 마이크로콜레우스 크토노플라스테스(Microcoleus chthonoplastes), 오실라토리아 속(Oscillatoria sp.), 페트로토가 모빌리스(Petrotoga mobilis), 써모시포 아프리카누스(Thermosipho africanus) 또는 아카리오클로리스 마리나(Acaryochloris marina) 등 다양한 미생물 유래의 Cas9일 수 있다.
상기 Cas9은 자연상태에서 존재하는 미생물에서 분리된 것 또는 재조합적 방법 또는 합성적 방법을 통해 비자연적으로 생산된 것일 수 있다.
또한, 상기 CRISPR 효소는 Type V CRISPR 효소일 수 있다.
Type V CRISPR 효소는 Type II CRISPR 효소의 RuvC 도메인에 상응하는 유사한 RuvC 도메인이 있으며, Type II CRISPR 효소의 HNH 도메인은 결핍되어 있고, 대신에 Nuc 도메인을 포함하며, 표적과 상호작용하는 REC 도메인과 WED 도메인 및 PAM을 인식하는 PI 도메인으로 구성될 수 있다. 구체적인 Type V CRISPR 효소의 구조적 특성은 Takashi Yamano et al. (2016) Cell 165:949-962를 참고할 수 있다.
Type V CRISPR 효소는 가이드RNA와 상호작용할 수 있으며, 가이드RNA-CRISPR 효소 복합체, 즉, CRISPR 복합체를 형성할 수 있고, 가이드RNA와 협력하여 가이드 서열을 및 PAM 서열을 포함하는 표적서열로 근접시킬 수 있다. 이때, 표적 유전자 또는 핵산과 상호작용하기 위한 Type V CRISPR 효소의 능력은 PAM 서열에 의존적이다.
상기 PAM 서열은 표적 유전자 또는 핵산 내에 존재하는 서열로, Type V CRISPR 효소의 PI 도메인에 의해 인식될 수 있다. 상기 PAM 서열은 Type V CRISPR 효소의 유래에 따라 그 서열이 다를 수 있다. 즉, 종마다 특이적으로 인식할 수 있는 PAM 서열이 존재한다. 예를 들어, Cpf1이 인식하는 PAM 서열은 5'-TTN-3' (N은 A, T, C 또는 G)일 수 있다. 다만, 전술한 효소의 유래에 따라 PAM이 결정되는 것으로 일반적으로 이해되고 있으나, 해당 유래의 효소의 돌연변이(mutant)에 대한 연구가 진행됨에 따라, 상기 PAM은 달라질 수도 있다.
상기 Type V CRISPR 효소는 Cpf1일 수 있다.
상기 Cpf1은 Streptococcus, Campylobacter, Nitratifractor, Staphylococcus, Parvibaculum, Roseburia, Neisseria, Gluconacetobacter, Azospirillum, Sphaerochaeta, Lactobacillus, Eubacterium, Corynebacter, Carnobacterium, Rhodobacter, Listeria, Paludibacter, Clostridium, Lachnospiraceae, Clostridiaridium, Leptotrichia, Francisella, Legionella, Alicyclobacillus, Methanomethyophilus, Porphyromonas, Prevotella, Bacteroidetes, Helcococcus, Letospira, Desulfovibrio, Desulfonatronum, Opitutaceae, Tuberibacillus, Bacillus, Brevibacilus, Methylobacterium 또는 Acidaminococcus 유래의 Cpf1일 수 있다.
상기 Cpf1은 Cas9의 RuvC 도메인에 상응하는 유사한 RuvC 도메인이 있으며, Cas9의 HNH 도메인은 결핍되어 있고, 대신에 Nuc 도메인을 포함하며, 타겟과 상호작용하는 REC 도메인과 WED 도메인 및 PAM을 인식하는 PI 도메인으로 구성될 수 있다. 구체적인 Cpf1의 구조적 특성은 Takashi Yamano et al. (2016) Cell 165:949-962를 참고할 수 있다.
상기 Cpf1은 완전활성 Cpf1 또는 불활성 Cpf1일 수 있다.
상기 불활성 Cpf1은 완전히 불활성화된 Cpf1 및 부분적으로 불활성화된 Cpf1 (예, nickase)을 포함할 수 있다.
상기 Cpf1 enzyme은 RuvC, Nuc, WED, REC 또는/및 PI 도메인에 존재하는 아미노산 중 하나, 둘 또는 그 이상의 아미노산이 변이될 수 있다.
상기 Cpf1 enzyme은 FnCpf1의 아미노산 중 D917, E1006 또는 D1255; AsCpf1의 아미노산 중 D908, E993 또는 D1263; LbCpf1의 아미노산 중 D832, E925, D947 또는 D1180; 또는 다른 Cpf1 orthologs의 이에 대응되는 아미노산 그룹 중에 하나 또는 둘 이상의 아미노산의 변이를 포함할 수 있다.
상기 Cpf1는 자연상태에서 존재하는 미생물에서 분리된 것 또는 재조합적 방법 또는 합성적 방법을 통해 비자연적으로 생산된 것일 수 있다.
상기 Cas 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산은 Cas 단백질이 핵 내에서 작용할 수 있게 하는 형태일 수 있다.
상기 분리된 Cas 단백질은 또한 세포 내로 도입되기에 용이한 형태일 수 있다. 그 예로 Cas 단백질은 세포 침투 펨타이드 또는 단백질 전달 도메인 (protein transduction domain)과 연결될 수 있다. 상기 단백질 전달 도메인은 폴리-아르기닌 또는 HIV 유래의 TAT 단백질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 세포 침투 펩타이드 또는 단백질 전달 도메인은 상기 기술된 예 외에도 다양한 종류가 당업계에 공지되어 있으므로, 당업자는 상기 예에 제한되지 않고 다양한 예를 본 명세서에 적용할 수 있다.
상기 CRISPR 효소는 야생형 CRISPR 효소를 인위적으로 조작 또는 변형시킨 CRISPR 효소 변이체일 수 있다.
일 예로, 상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소의 아미노산 서열 중 적어도 하나 이상의 아미노산의 치환, 제거 및/또는 부가된 것일 수 있다.
상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소의 기능, 즉, DNA의 이중 가닥 중 제1 가닥을 절단하는 제1 기능 및/또는 DNA의 이중 가닥 중 제2 가닥을 절단하는 제2 기능을 변형시키기 위해 인위적으로 조작 또는 변형된 CRISPR 효소 변이체일 수 있다.
상기 CRISPR 효소 변이체는 선택적으로 기능적(functional) 도메인을 추가로 포함할 수 있다. 이때, 상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소의 원래 기능 이외에 부가적인 기능을 가질 수 있다.
상기 기능적 도메인은 메틸라아제(methylase) 활성, 디메틸라아제(demethylase) 활성, 전사촉진(transcription activation) 활성, 전사 저해(transcription repression) 활성, 전사 방출 인자(transcription release factor) 활성, 히스톤 변형(histone modification) 활성, RNA 절단(cleavage) 활성 또는 핵산 결합(nucleic acid binding) 활성을 가지는 도메인일 수 있으며, 또는 단백질(펩타이드 포함)의 분리정제를 위한 태그(tag) 또는 리포터 유전자일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 태그는 히스티딘(His) 태그, V5 태그, FLAG 태그, 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 태그, Myc 태그, VSV-G 태그 및 티오레독신(Trx) 태그 등을 포함하며, 상기 리포터 유전자는 글루타티온-S-트랜스 퍼라제(GST), 호스라디시(horseradish) 과산화효소(HRP), 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(CAT) 베타-갈락토시다제, 베타-글루쿠로니다제, 루시퍼라제, 녹색 형광 단백질(GFP), HcRed, DsRed, 청록색 형광 단백질(CFP), 황색 형광 단백질(YFP) 및 청색 형광 단백질(BFP)을 포함하는 자가형광 단백질을 포함하나, 이들에 한정되지 않는다.
상기 기능적 도메인은 디아미네이즈(deaminase)일 수 있다.
예를 들어, 불완전 또는 부분 CRISPR 효소에 시티딘 디아미네이즈(cytidine deaminase)를 기능적 도메인으로 추가로 포함할 수 있다. 일 구체예로, SpCas9 니카아제에 시티딘 디아미네이즈, 예를 들면, APOBEC1(apolipoprotein B editing complex 1)를 추가하여 융합 단백질을 생성할 수 있다. 이렇게 형성된 [SpCas9 니카아제]-[APOBEC1]은 뉴클레오타이드 C를 T 또는 U로 뉴클레오타이드 교정 또는 편집에 이용되거나, 또는 뉴클레오타이드 G를 A로 뉴클레오타이드 교정 또는 편집에 이용될 수 있다.
또 다른 예를 들어, 불완전 또는 부분 CRISPR 효소에 아데닌 디아미네이즈(adenine deaminase)를 기능적 도메인으로 추가로 포함할 수 있다. 일 구체예로, SpCas9 니카아제에 아데닌 디아미네이즈, 예를 들면, TadA variants, ADAR2 variants, ADAT2 variants 등을 추가하여 융합 단백질을 생성할 수 있다. 이렇게 형성된 [SpCas9 니카아제]-[TadA variant], [SpCas9 니카아제]-[ADAR2 variant] 또는 [SpCas9 니카아제]-[ADAT2 variant]는 뉴클레오타이드 A를 inosine으로 변형시키며, 변형된 inosine은 polymerase에 의해 뉴클레오타이드 G로 인식되어 실질적으로 뉴클레오타이드 A를 G로 뉴클레오타이드 교정 또는 편집되는 효과를 보이므로, 뉴클레오타이드 A를 G로 뉴클레오타이드 교정 또는 편집에 이용되거나, 또는 뉴클레오타이드 T를 C로 뉴클레오타이드 교정 또는 편집에 이용될 수 있다.
상기 기능적 도메인은 NLS(nuclear localization sequence or signal) 또는 NES(nuclear export sequence or signal)일 수 있다.
일 예로, CRISPR 효소는 하나 이상의 NLS를 포함할 수 있다. 이때, 상기 NLS는 CRISPR 효소의 아미노 말단 또는 그 근처; 카르복시 말단 또는 그 근처; 또는 이들의 조합에 하나 이상의 NLS를 포함할 수 있다. 상기 NLS는 하기로부터 유래된 NLS 서열일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다: 아미노산 서열 PKKKRKV를 갖는 SV40 바이러스 대형 T-항원의 NLS; 뉴클레오플라스민(nucleoplasmin)으로부터의 NLS(예를 들어, 서열 KRPAATKKAGQAKKKK를 갖는 뉴클레오플라스민 이분(bipartite) NLS); 아미노산 서열 PAAKRVKLD 또는 RQRRNELKRSP를 갖는 c-myc NLS; 서열 NQSSNFGPMKGGNFGGRSSGPYGGGGQYFAKPRNQGGY를 갖는 hRNPA1 M9 NLS; 임포틴-알파로부터의 IBB 도메인의 서열 RMRIZFKNKGKDTAELRRRRVEVSVELRKAKKDEQILKRRNV; 마이오마(myoma) T 단백질의 서열 VSRKRPRP 및 PPKKARED; 인간 p53의 서열 POPKKKPL; 마우스 c-abl IV의 서열 SALIKKKKKMAP; 인플루엔자 바이러스 NS1의 서열 DRLRR 및 PKQKKRK; 간염 바이러스 델타 항원의 서열 RKLKKKIKKL; 마우스 Mx1 단백질의 서열 REKKKFLKRR; 인간 폴리(ADP-리보스) 중합효소의 서열 KRKGDEVDGVDEVAKKKSKK; 및 스테로이드 호르몬 수용체(인간) 글루코코르티코이드의 서열 RKCLQAGMNLEARKTKK.
본 명세서에 의해 개시되는 CRISPR 효소 또는 CRISPR 효소 변이체는 폴리펩타이드, 단백질 또는 이를 암호화하는 서열을 가지는 핵산일 수 있으며, 상기 CRISPR 효소 또는 CRISPR 효소 변이체를 도입하고자 하는 대상에 맞추어 코돈 최적화(codon optimization)된 것일 수 있다.
"코돈 최적화"는 고유 서열의 적어도 하나의 코돈을 숙주 세포의 유전자에 더욱 빈번하게 또는 가장 빈번하게 사용되는 코돈으로 대체하면서, 고유 아미노상 서열을 유지함으로써 관심 숙주 세포에서의 발현의 증진을 위해 핵산서열을 변형시키는 과정을 의미한다. 다양한 종은 특정 아미노산의 특정 코돈에 대한 특정 편향을 가지며, 코돈 편향(유기체 간의 코돈 사용의 차이)은 종종 mRNA의 번역의 효율과 상호관련 되며, 이는 번역되는 코돈의 특성 및 특정 tRNA 분자의 이용가능성에 의해 좌우되는 것을 여겨진다. 세포에서 선택된 tRNA의 우세는 일반적으로 펩타이드 합성에 가장 빈번하게 사용되는 코돈을 반영한 것이다. 따라서, 유전자는 코돈 최적화에 기초하여 주어진 유기체에서 최적의 유전자 발현을 위해 맞춤화될 수 있다.
상기 가이드RNA와 CRISPR 효소는 가이드RNA-CIRSPR 효소 복합체를 형성할 수 있다.
"가이드RNA- CRISPR 효소 복합체"는 가이드RNA와 CIRSPR 효소의 상호작용을 통해 형성된 복합체를 의미한다.
상기 가이드RNA- CRISPR 효소 복합체는 세포 밖에서 형성될 수 있다.
상기 가이드RNA-CRISPR 효소 복합체는 세포 내의 세포질에서 형성될 수 있다.
상기 가이드RNA- CRISPR 효소 복합체는 세포 내의 핵 안에서 형성될 수 있다.
상기 가이드RNA- CRISPR 효소 복합체에서, CRISPR 효소는 타겟하는 유전자 또는 핵산 서열 내에 존재하는 PAM을 인식할 수 있다.
상기 가이드RNA- CRISPR 효소 복합체에서 가이드 RNA는 타겟하는 유전자 또는 핵산 서열에 상보적인 결합을 할 수 있다.
상기 가이드RNA- CRISPR 효소 복합체가 타겟하는 유전자 또는 핵산 서열에 결합하면, 상기 가이드RNA- CRISPR 효소 복합체의 CRISPR 효소에 의해 타겟하는 유전자 또는 핵산 서열은 절단 또는 변형될 수 있다.
다른 구체예에서, CRISPR-Cas 시스템은 가이드 RNA 및 CRISPR 효소가 복합체(complex)를 형성하는 RNP(ribonucleoprotein) 형태로 존재할 수 있다.
본 명세서에 의하여 개시되는 내용의 일 구현예에서는 고발현 분비 유전자를 조작하여 목적하는 단백질을 발현시킬 수 있다.
상기 목적하는 단백질을 발현시키기 위해 고발현 분비 유전자 조작용 조성물에는 가이드RNA, CRISPR 효소 외에 공여체가 더 포함될 수 있다.
예를 들어, 상기 조성물은,
간에서 발현되는 고발현 분비 유전자 군에서 선택된 하나 이상의 유전자의 표적서열에 대한 가이드 핵산;
에디터 단백질 또는 에디터 단백질을 암호화하는 핵산; 및
목적 단백질을 암호화하는 핵산서열을 포함하는 공여체(donor),
를 포함할 수 있다.
"공여체(donor)"는 대상에 이식유전자를 삽입하기 위해 필요한 서열을 포함하는 외인성 뉴클레오타이드를 지칭한다. 상기 공여체는 이식 유전자뿐만 아니라 재조합에 필요한 서열, 유전자 전사, 발현에 영향을 주는 서열 등을 모두 포함하는 분자이다.
상기 공여체 분자는 핵산의 형태 즉, DNA 또는 RNA일 수 있다.
상기 공여체 분자는 단일가닥 또는 이중가닥 일수 있다. 일부 경우, 상기 공여체 분자는 단일 가닥 올리고 뉴클레오타이드 DNA 주형(ssODT)일수 있다.
상기 공여체 분자는 폴리 뉴클레오타이드 또는 단백질의 형태일 수 있다.
상기 공여체 분자는 선형, 분자형 또는 환형일 수 있으며, 임의의 길이를 가질수 있다.
이때, 선형의 형태로 공여체 분자가 도입될 경우에는 공여체 서열의 말단은 당업자에게 공지된 방법에 의하여 보호될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 다이데옥시뉴클레오타이드 잔기는 형성 분자의 3'말단에 추가되고 자가 보완적인 올리고 뉴클레오타이드는 하나 또는 양쪽 말단에 결합할 수 있다.
특정 구현 예에서, 상기 공여체 분자를 분해로부터 보호하기 위하여, 추가적으로 말단 아미노기(들)의 첨가 및 예를 들어 포스포로티오에이트, 포스포라미데이트, 및 O-메틸 리보스 또는 데옥시리보스 잔기와 같은 뉴클레오티드간 연결의 사용을 포함할 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 공여체 분자는 이중 복합체(duplex)를 형성할 수 있으며, 뿐만 아니라 삼중복합체(triplex)-형성 핵산을 포함한다.
상기 공여체 서열은 임의의 길이, 예를 들어 10bp 내지 20kb (또는 그 사이의 또는 그 이상의 임의의 정수 값), 바람직하게는 길이 약 100bp 내지 10kb (또는 그 사이의 임의의 정수), 더 바람직하게는 길이로 약 200bp 내지 5kb를 가질 수 있다.
상기 공여체는 도입하고자 하는 대상에 맞추어 코돈 최적화(codon optimization)를 할 수 있다. 예를 들어 대상이 인간인 경우, human codon으로 최적화된 서열을 사용한 공여체일 수 있다.
본 명세서에 의해 개시되는 내용의 일 구현예는, 상기 목적하는 단백질을 발현하기 위하여 고발현 분비 유전자 조작용 조성물에 포함되는 공여체에는 이식 유전자가 포함될 수 있다.
"이식 유전자"는 고발현 분비 유전자 내 삽입되는 외인성 뉴클레오타이드를 말한다. 예를 들어, 에디터 단백질 및 가이드핵산을 이용하여 절단된 간 세포 내 게놈 절단 부위에 상기 이식유전자가 삽입될 수 있다.
상기 이식유전자는 DNA 또는 RNA일 수 있다.
상기 이식유전자는 야생형 간 세포에서 생성되는 단백질을 코딩하는 외인성 뉴클레오타이드일 수 있다.
상기 이식유전자는 야생형 간 세포 외의 세포에서 생성되는 단백질을 코딩하는 외인성 뉴클레오타이드일 수 있다.
상기 이식유전자는 대상체와 상이한 종으로부터 유래한 것일 수 있다.
상기 이식유전자는 야생형(wild type) 유전자일 수 있다. 예를 들어 상기 대상 내 단백질 결핍 또는 부족한 경우, 해당 단백질을 암호화하는 정상 유전자, 즉, 야생형 유전자와 동일한 서열을 가진 이식 유전자를 공여체에 포함시킬 수 있다.
상기 이식유전자는 돌연변이 유전자일 수 있다. 이때, 돌연변이는 상기 야생형 유전자의 하나이상의 뉴클레오타이드가 결실, 치환 또는 부가된 형태일 수 있다.
상기 이식 유전자는 융합 단백질일 수 있다.
일 예로, 상기 이식유전자와 융합되는 단백질은 외인성 유전자일 수 있다.
다른 예로, 상기 이식 유전자와 융합되는 단백질은 내인성 유전자로부터 유래된 것일 수 있다.
예를 들어, 상기 이식 유전자와 융합되는 단백질은 고발현 분비 유전자로부터 유래된 것일 수 있다.
상기 이식 유전자와 융합되는 단백질은 외인성 단백질의 아미노(N)-말단 부분 또는 그 근처에 존재할 수 있다.
상기 이식 유전자와 융합되는 단백질은 외인성 단백질의 카복시(C)-말단 부분 또는 그 근처에 존재할 수 있다.
상기 이식 유전자와 융합되는 단백질은 외인성 단백질의 아미노(N)-말단 및 카복시(C)-말단 또는 그 근처 둘다에 존재하거나, 이의 혼합된 형태로 존재할 수 있다.
상기 이식유전자는 목적하는 특정 기능을 향상시키거나 개선하기 위한 기능성 유전자일 수 있다.
일 예로, 상기 이식 유전자는 간 세포내 내인성 유전자의 기능을 향상시킬 수 있다.
다른 예로, 상기 이식 유전자는 야생형 유전자의 발현을 증가시키는 기능을 할 수 있다. 예를 들어, 이식유전자가 간 세포내 결핍된 단백질을 암호화하는 유전자일 경우, 결핍된 단백질이 간세포 내에서 생산될 수 있고, 해당 단백질의 기능이 정상적으로 작동하거나, 또는 해당 질병을 치료할 수 있다.
일 예로, 상기 이식 유전자는 돌연변이된 유전자를 교정하는 기능을 할 수 있다.
다른 예로, 상기 이식 유전자는 표적 유전자 내 게놈 서열의 발현 조절 기능을 할 수 있다.
일 예로, 상기 이식 유전자는 기존 단백질을 대체하거나 또는 신규한 단백질을 발현시키는 기능을 할 수 있다.
또는, 상기 이식 유전자는 고발현 분비 유전자 내 삽입되어 하나 이상의 표적서열의 일부분 또는 완전한 불활성화시킬 수 있다.
상기 이식유전자는 목적하는 단백질을 암호화하는 유전자일 수 있다.
상기 목적하는 단백질은 신체 내 기능을 향상시키기 위한 단백질일 수 있다. 예를 들어, 대사활동의 기능을 향상할 수 있다.
상기 목적하는 단백질은 질병을 예방하기 위한 단백질 수 있다.
상기 목적하는 단백질은 질병을 경감하기 위한 단백질일 수 있다.
상기 목적하는 단백질은 질병을 치료하기 위한 단백질일 수 있다.
본 명세서에 의해 개시되는 내용의 일 구현예는 간세포를 인위적으로 조작하여 목적하는 단백질을 발현함으로써 질병을 치료하기 위한 것이다.
본 명세서는 질병을 치료하기 위하여 치료 유전자를 고발현 분비 유전자 내에 삽입시켜 해당 유전자를 높은 수준으로 지속적으로 발현시킴으로써, 기존에 수혈 또는 단백질을 일정 기간마다 투여하거나 해당 질병에 관여하는 인자를 억제하는 항체 기반 치료법 등 대체 치료법에서, 영구적, 근본적으로 질병을 치료할 수 있다.
상기 질병은 다음과 같다.
상기 질병은 항체에 의해 예방 또는 치료될 수 있는 질병일 수 있다. 예를 들면 HIV, Alzheimer's disease, Amyotrophic lateral sclerosis 등 질병은 항체를 암호화하는 유전자를 고발현 분비 유전자 내 삽입하여 발현시킴으로써 치료될 수 있다.
상기 질병은 특정 유전자의 발현 감소에 의해 발생하는 질병일 수 있다. 일 예로, 분비되는 유전자 산물의 부족에 의해 야기되는 질병은 부족한 유전자를 고발현 분비 유전자 내 삽입하여 발현시킴으로써 치료될 수 있다.
상기 질병은 특정 유전자의 돌연변이에 의한 정상적인 기능 저해에 의해 발생하는 유전질환일 수 있다. 일 예로, 다양한 단일 유전자상의 돌연변이에 의해 유발되는 질병은 야생형 유전자를 고발현 분비 유전자 내 삽입하여 발현시킴으로써 치료될 수 있다. 예를 들어, 이러한 유전질환은 혈우병 등이 있다.
상기 질병은 유전성 대사 질환과 관련된 질병 일 수 있다.
"유전성 대사질환" 은 우리 몸의 생화학적인 대사 경로를 담당하는 효소나 조효소의 결핍으로 발생하는 질환이다. 정상적으로 꼭 필요한 최종 물질이 생성되지 못하여 결핍 증상이 나타나고 불필요한 전구물질은 다양한 중요 장기(뇌, 심장, 간, 신장 등)에 축적도어 지능 장애와 같은 과잉 증상을 일으키는 것을 말한다.
상기 유전성 대사질환의 일 예는 면역부전증, 고콜레스테롤혈증, Hemophilia , 폐기종, 낭포성 섬유증, 페닐케톤뇨증, 시트룰린혈증(Citrullinemia), 메탈말론산혈증(Methylmalonic Acidemia), 카르니틴팔미토일트란스퍼레이스 결핍증 또는 카르니틴 팔미토일전환효소 결핍증(Carnitine Palmitoyltransferase Deficiency), Hurler syndrome, 오르니틴 트랜스카비미라제 결핍증(Ornithine transcarbamylase deficiency), 또는 테이 삭스 병(Tay-Sachs disease)을 포함한다.
상기 유전성 대사질환의 다른 예는 혈우병A, 혈우병B, 혈우병 C를 포함한다.
예를 들어, 혈우병A는 X염색체에 위치한 F8 유전자의 돌연변이가 일어난 것이고, 혈우병B는 F8 유전자 부근에 위차한 F9 유전자의 돌연변이에 의해 발생한것이며, 혈우병C는 F11 유전자의 돌여변이에 의한 질병이다.
상기 질병은 리소좀 축적병(Lysosomal storage disorders) 일 수 있다.
이때 상기 Lysosomal storage disorders는 Mucopolysaccharidosis, Lysosomal acid lipase deficiency, Glycogen storage diseases, Galactosemia, Sickle cell anaemia, Cystic fibrosis, Tay-Sachs disease, Phenylketonuria, Albinism, Medium-chain acyl-CoA dehydrogenase deficiency, Farber disease, Krabbe disease, Galactosialidosis, Gangliosidosis, Alpha-galactosidase, Fabry disease, Schindler disease, Sandhoff disease, Gaucher Disease, Niemann-Pick disease, Sulfatidosis, Metachromatic Leukodystrophy, Multiple sulfatase deficiency, Hurler Syndrome, Scheie Syndrome, Hurler-Scheie Syndrome, Hunter syndrome, Sanfilippo syndrome, Morquio syndrome, Maroteaux-Lamy syndrome, Sly Syndrome, Hyaluronidase deficiency, Mucolipidosis, Sialidosis, I-cell disease, Pseudo-Hurler Polydystrophy, Mucolipidin 1 deficiency, Lipidosis, Santavuori-Haltia disease, Jansky-Bielschowsky disease, Batten-Spielmeyer-Vogt disease, Kufs disease, Wolman disease, Alpha-mannosidosis, Beta-mannosidosis, Aspartylglucosaminuria, Fucosidosis, Cystinosis, Pycnodysostosis, Salla disease, Infantile Free Sialic Acid Storage Disease, Pompe Disease, Danon disease, 또는 Cholesteryl ester storage disease 일 수 있다.
본 명세서에 의하여 개시되는 내용의 일 구체예로, 상기 공여체에 포함되는 이식유전자는 유전 질환 치료를 위한 치료 유전자일 수 있다.
상기 치료 유전자는 특정 유전 질환의 치료제로 사용될 수 있는 단백질을 암호화할 수 있다.
상기 치료 유전자는 특정 유전질환에 관여하는 질병 유전자(정상 유전자의 돌연변이 형태)의 야생형 유전자(정상 유전자 형태) 또는 야생형 유전자의 일부(예를 들어, 기능적 도메인)를 포함할 수 있다.
구체예로, 상기 치료 유전자는 IDUA, I2S, SGSH, NAGLU, HGSNAT, GNS, GALNS, GLB1, ARSB, GUSB, HYAL, NEU, GNPTAB 및 MCOLN1로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다.
다른 구체예로, 상기 치료 유전자는 SAH1, GALC, CTSA, GLA, NAGA, beta-galactosidase, hexosaminidase, GBA, SMPD1, ARSA 및 SUMF로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다.
다른 예를 들어, 상기 치료 유전자, 즉 질병 유발 유전자의 정상 형태는 NPC, PPT, TPP1, CLN3, CLN6, PPT1, DNAJC5, CTSF, CLN7, CLN8 및 CTSD로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다.
다른 예를 들어, 상기 치료 유전자, 즉 질병 유발 유전자의 정상 형태는 GAA 또는 LAMP2 일 수 있다.
다른 예를 들어, 상기 치료 유전자, 즉 질병 유발 유전자의 정상 형태는 CTNS, CTSK 또는 SLC17A5 일 수 있다.
다른 예를 들어, 상기 치료 유전자, 즉 질병 유발 유전자의 정상 형태는 MAN2B, MAN2C, MANBA, AGA, FUCA1 및 LAL로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다.
다른 예를 들어, 상기 치료 유전자, 즉 즉 질병 유발 유전자의 정상 형태,는 methylmalonic aciduria CbIA Type (MMAA) protein, methylmalonic aciduria CbIB Type (MMAB) protein, methylmalonic aciduria CbIC Type (MMADHC) protein, 5-Methyltetrahydrofolate-Homocysteine Methyltransferase Reductase (MTRR) protein, lysosomal membrane protein domain (LMBRD 1) protein, 5-Methyltetrahydrofolate-Homocysteine Methyltransferase (MTR) protein, propionyl-CoA protein, glucose-6-phosphate transporter (G6PT) protein, glucose-6-phosphatase (G6Pase) protein, low density lipoprotein receptor (LDLR) protein, low density lipoprotein receptor adaptor protein 1 (LDLRAP-1 protein), N-acetylglutamate synthetase (NAGS) protein, carbamoyl phosphate synthetase 1 (CPS1) protein, ornthine transcarbamylase (OTC) protein, argininosuccinic acid synthetase (ASS) protein, argininosuccinase acid lyase (ASL) protein, arginase (ARG1) protein, solute carrier family 25 protein, UDP glucuronosyltransferase 1 family, polypeptide A1 (UGT1A1) protein, fumarylacetoacetate hydrolyase (FAH), alanine-glyoxylate aminotransferase (AGXT) protein, glyoxylate reductase/hydroxypyruvate reductase (GRHPR) protein, APTase Cu(2+) transporting beta (ATP7B) protein, phenylalanine hydroxylase (PAH) protein 및 lipoprotein lyase (LPL) protein로 이루어진 군에서 선택된 단백질을 코딩하는 유전자일 수 있다.
다른 예를 들어, 상기 치료 유전자, 즉 질병 유발 유전자의 정상 형태는 FVII, FVIII, FIX, FX, FXI, FXII 및 다른 응고인자들로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다.
예를 들어, 혈우병의 경우, 이식유전자를 암호화하는 유전자는 APOC3 유전자의 발현 제어 요소에 의해 높은 단백질 발현이 일어나도록 내인성 APOC3 유전자 좌위로 삽입될 수 있다. 이때 FVII, FVIII, FIX, FX, FXI, FXII 등이 높은수준으로 발현되거나, 상기 응고인자 발현에 도움을 주는 임의의 펩타이드 또는 단백질이 높은 수준으로 발현될 수 있다.
일 실시예에서, 상기 치료 유전자는 항체를 암호화하는 유전자일 수 있다.
질병을 유발하는데 관여하는 특정 인자나 signal pathway를 항체에 의해 차단시키는 단백질 또는 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자이다.
예를 들어, 알츠하이머(Alzheimer's disease)를 치료하기 위하여 베타 아밀로이드(beta-amyloid)와 결합하는 항체를 암호화하는 유전자일 수 있다.
예를 들어, 에이즈(HIV)를 치료하기 위하여, 뉴클레오시드 유사체(nucleoside analogue reverse transcriptase inhibitors,NRTIs) 중 zidovudine(AZT), Didanosine(ddl), Zalcitabine(ddC), Lamivudine(3TC), Stavudine(d4T), Abacavir(TDF), Emtricitabine(FTC)를 암호화하는 유전자, 또는 비누클레오시드 유사체(non nucleoside analogue reverse transtriptase inhibitors, NNRTIs) 중 Nevirapine(NVP), Efavirenz(EFV)를 암호화하는 유전자, 또는 단백질분해효소 억제제(Protease inhibitors) 중 Sanquinavir(SQV), Ritonavir(RTV), Indinavir(IDV), Nelfinavir(NFV), Lopinavir(LPV), Atazanavir(ATV), Amprenavir(APV)를 암호화하는 유전자일 수 있다.
다른 실시예에서, 상기 치료 유전자는 야생 유전자의 발현을 조절하는 인자를 삽입하여 발현시킴으로써, 야생 유전자의 발현을 증가 또는 감소시킴으로써 유전질환을 치료할 수 있다.
또 다른 실시예에서, 상기 치료유전자는 야생형 유전자의 일부 서열이 삭제, 부가, 또는 치환됨으로써 기능이 향상 또는 새로운 기능을 가진 단백질을 생성함으로써 유전질환을 치료할 수 있을 것이다.
예를 들어, 상기 치료 유전자는 BBB(blood-brain barrier)와 같은 특정한 조직으로의 투과기능이 있는 특정한 펩타이드 또는 치료 유전자의 치료효과를 증대시킬 수 있는 기능성 펩타이드와 fusion 된 형태일 수 있다.
본 명세서에 의해 개시되는 내용의 일 구현예는, 상기 공여체는 이식 유전자의 표적 게놈 내 삽입 및/또는 합성을 위한 유전자를 더 추가로 포함할 수 있다.
상기 표적 게놈 내 이식 유전자의 삽입 및/또는 합성은 상동성 재조합(HDR) 또는 비상동성 재조합(NHEJ)에 의해 일어날 수 있다.
상기 용어 "재조합은", 비상동성 재조합 (NHEJ) 및 상동성 재조합(HDR)에 의한 이식유전자 삽입을 포함하는 두 폴리뉴클레오타이드 간의 유전 정보의 교환 과정을 말한다.
본 명세서 개시하고 있는 "비 상동성 재조합(NHEJ)"은 서열 상동성을 공유하지 않거나 자리-특이적 재조합 서열에서 나타나지 않는 DNA의 서열 사이에 일어나는 교환의 특수화된 형태를 말한다.
이때 이식 유전자는 비 상동성 재조합에 의해 고발현 분비 유전자에 삽입될 수 있다.
예를 들어, 상기 이식유전자의 일부 서열과 표적 유전자의 일부 서열이 동일한 경우 같은 자리 특이적 핵산 분해효소에 의하여 동일한 일부 서열이 절단 될 수 있고, 비상동성 재조합에 의해 이식 유전자는 표적 유전자의 절단된 서열 또는 인접한 부위에 삽입될 수 있다.
본 명세서 개시하고 있는 "상동성 재조합(HDR)"은, 예를 들어 상동성-지향 수선 매커니즘을 통해 세포에서 이중 가닥 절단 수선하는 동안 일어나는 이러한 교환의 특수화된 형태를 말한다.
상기 공여체 서열은 이식 유전자의 상동성 재조합을 위해 상동성 암(homology arm)을 포함할 수 있다.
상기 상동성 암(homology arm)은 표적서열 또는 그와 인접한 서열과 동일하거나 또는 상보적 서열을 함유할 수 있다.
상기 상동성 암은 표적서열 또는 그와 인접한 서열과 상동성이지만 동일하지 않은 서열을 함유 하거나 또는 표적서열과 상보적이지만 완전히 상보적이지 않은 서열을 함유 할 수 있다.
상기 고발현 분비 유전자에 상동성 또는 동일한 서열을 가지는 상동성 암의 핵산 서열에 하나 이상의 mismatch된 염기서열을 포함할 수 있다.
임의의 실시형태에서, 표적서열에 상동성인 공여체 서열의 대부분은 대체되는 게놈 서열에 대하여 약 80 내지 99%(또는 이 사이의 임의의 값) 서열 동일성을 나타낸다.
상기 상동성 암은 상동성 재조합을 가능하도록 하여 표적서열 내 동일하지 않은 서열, 즉, 이식 유전자를 삽입할 수 있다.
예를 들어, 상기 가이드핵산 및 에디터 단백질에 의해 이중가닥이 파괴된 영역에 공여체 서열과 상동성인 서열이 존재한다면, 그 상동성 서열 옆에 이식 유전자 서열은 상동성 재조합에 의해 이식 유전자가 삽입될 수 있다.
상기 공여체 분자는 고발현 분비 유전자와 상동성인 여러 개의 비연속적인 영역을 함유할 수 있다.
상기 공여체 서열에 포함되는 상동성 암은 고발현 분비 유전자의 절단 위치의 일 방향(예를 들어, upstream)의 핵산 서열과 상동성을 가지는 핵산서열을 포함할 수 있다.
상기 공여체 서열에 포함되는 상동성 암은 고발현 분비 유전자의 절단 위치의 다른 방향(예를 들어, downstream)의 핵산서열과 상동성을 가지는 핵산서열을 포함할 수 있다.
상기 공여체 서열에 포함되는 상동성 암은 고발현 분비 유전자의 절단 위치의 upstream 및 downstream 의 핵산서열과 각각 상동성을 가지는 핵산서열을 포함할 수 있다.
예를 들어, 표적서열내 절단위치로부터 양쪽으로 30bp이상 떨어진 자리에 이식유전자를 삽입할 경우, 상기 공여체 서열에서 이식유전자 양 말단은 절단로부터 30bp 각각 떨어진 위치에 존재하는 유전자 서열과 상동성을 가지거나 또는 동일한 서열을 가지는 상동성 암(arm)을 포함한다.
이러한 상동성 암은 최소한 각각 15bp 내지 약 3kB (예를 들어, 약 800, 850, 900, 950, 1000, 1100, 1200b 또는 bp길이 )를 함유할 수 있다.
일 예에서, 상기 상동성 암은 각각 500 내지 1500bp의 길이를 가질 수 있다. 바람직하게, 상기 상동성 암은 각각 800 내지 1200bp의 길이를 가질 수 있다.
일반적으로 상동성 암은 단일 또는 이중 가닥 올리고뉴클레오타이드로 제공될 수 있다. 예시적 단일 또는 이중 가닥 주형 올리고 뉴클레오타이드는 800,850, 900, 950, 1000, 150, 1100, 1150, 1200 b 또는 bp길이, 또는 적어도 약 800, 약850, 약900, 약950, 약1000, 약1050, 약1100, 약1150, 약1200, 약1250 b 또는 bp 길이이다.
또한, 본 명세서에 의해 개시되는 내용의 일 구현예에서, 상기 공여체는 이식 유전자 외 전사, 발현을 조절하는 유전자를 더 포함할 수 있다.
상기 공여체는 하나 이상의 유전자 또는 cDNA 분자를 포함하며, 암호화 또는 비암호화 영역을 포함할 수 있다.
상기 공여체는 유전자 전사, 발현을 제어하는 조절서열, 즉 인핸서, 인슐레이터, 내부 리보솜 유입점, 2A 펩타이드 및/또는 폴리 아데닐화 신포, 프로모터 등을 암호화하는 서열을 포함할 수 있다.
또한 상기 공여체는 리포터 유전자(예를 들어, GFP) 또는 선택마커 (selection marker)등을 추가적으로 포함할 수 있다.
공여체 서열에 의한 이식 유전자의 고발현 분비 유전자 내 삽입은 공여체 내 서열과 고발현 분비 유전자내 표적서열과의 상동성 영역의 유무, 및 이의 사용 여부에 의하여 결정될 것이다.
[전달 및 전달 방법]
본 명세서에 의해 개시되는 내용의 일 구현예서, 가이드 핵산, 에디터 단백질 및/또는 공여체 분자는 이를 암호화하는 서열을 함유하는 벡터, 비벡터 또는 이들의 조합에 의해 대상 내로 전달 또는 도입될 수 있다.
상기 가이드 핵산은 DNA, RNA, 또는 이의 혼합의 형태로 대상 내에 전달 또는 도입될 수 있다.
상기 에디터 단백질은 에디터 단백질을 암호화하는 DNA, RNA, DNA/RNA 혼합, 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질의 형태로 대상 내에 전달 또는 도입 될 수 있다.
상기 공여체는 DNA, RNA 또는 단일가닥 올리고뉴클레오타이드 DNA 주형(ssODT)의 형태로 대상 내에 전달 또는 도입 될 수 있다.
예를 들어, 대상 내로 공여체가 전달 또는 대입될 경우, 재조합에 의해 이식유전자 모두 또는 부분이 표적 유전자로 삽입될 수 있다.
상기 가이드핵산, 에디터 단백질 및/또는 공여체는 다양한 형태로 대상 내에 전달 될 수 있다.
상기 가이드핵산, 에디터 단백질 및/또는 공여체는 벡터로 전달 될 수 있다.
이때 벡터는 바이러스 벡터 또는 비바이러스벡터일 수 있다.
상기 가이드핵산, 에디터 단백질 및/또는 공여체는 비벡터로 전달될 수 있다.
(1) 벡터
상기 벡터는 바이러스 또는 비바이러스 벡터(예를 들어, 플라스미드)일 수 있다.
용어 "벡터"는 세포에 유전자 서열을 전달 할 수 있다. 전형적으로 "벡터 구조체", "발현 벡터", 및 "유전자 전달 벡터"는 관심의 유전자의 발현을 지시할 수 있고 표적 세포에 유전자 서열을 전달할 수 있는 임의의 핵산 구조체를 의미한다. 따라서, 상기 용어는 클로닝, 및 발현 비히클뿐만 아니라 벡터를 통합하는 것을 포함한다.
상기 벡터는 가이드핵산, 에디터단백질 및/또는 공여체를 암호화하는 핵산서열을 포함할 수 있다.
이때 가이드핵산, 에디터단백질 및/또는 공여체는 DNA, RNA 또는 혼합의 형태일 수 있다.
상기 가이드핵산, 에디터단백질 및/또는 공여체는 동일 또는 상이한 벡터를 사용하여 전달될 수 있다. 예를 들어, 공여체는 플라스미드에 의해 운반될 수 있는 한편, 가이드핵산 및/또는 에디터단백질은 하나 이상의 바이러스 벡터에 의해 운반될 수 있다.
상기 가이드핵산, 에디터단백질 및/또는 공여체는 하나 이상의 벡터로 전달 또는 도입될 수 있다.
일 예로, 상기 가이드핵산, 에디터단백질 및/또는 공여체는 동일한 하나의 벡터로 전달 또는 도입될 수 있다.
다른 예로, 상기 가이드핵산과 에디터단백질은 각각 뉴클레오타이드 서열의 형태로 하나의 벡터에 동시에 포함될 수 있으며, 공여체는 상이한 벡터로 전달 또는 도입될 수 있다.
일 예로, 가이드핵산과 공여체 폴리뉴클레오타이드는 하나의 벡터에 동시에 포함될 수 있으며, 에디터단백질은 뉴클레오타이드 서열의 형태로 상이한 벡터로 전달 또는 도입될 수 있다.
다른 예로, 에디터단백질과 공여체는 각각 뉴클레오타이드 서열의 형태로 하나의 벡터에 동시에 포함될 수 있으며, 가이드핵산은 상이한 벡터로 전달 또는 도입될 수 있다.
예를 들어, 가이드핵산, 에디터단백질 및/또는 공여체는 각각 상이한 벡터에 포함될 수 있다.
상기 가이드 핵산에 포함되는 도메인은 하나의 벡터에 모두 포함되거나 또는 각각의 도메인을 나누어 각각의 벡터에 포함시킬 수 있다.
상기 에디터 단백질의 경우, 에디터 단백질을 암호화하는 핵산서열은 하나의 벡터에 포함되거나 또는 에디터단백질을 암호화하는 핵산서열이 분할되어 여러 개의 벡터에 포함될 수 있다.
상기 벡터는 하나 이상의 조절/제어 구성요소를 포함할 수 있다.
이때 상기 조절/제어 구성요소는 프로모터, 인핸서, 인트론, 폴리아데닐화 신호, 코작 공통(Kozak consensus)서열, 내부 리보솜 유입 부위(internal ribosome entry site, IRES), 스플라이스 억셉터 및/또는 2A 서열을 포함할 수 있다.
또한 벡터는 리포터 유전자(예를 들어, GFP) 또는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택마커(selection marker), 복제가능한 벡터의 경우 복제 기원을 추가적으로 포함할 수 있다.
상기 벡터는 이식유전자 왼쪽, 오른쪽 또는 인접한 위치에 Splicing Acceptor (SA)시퀀스를 포함한다.
상기 프로모터는 표적 영역 내 내인성 프로모터 또는 외인성 프로모터 일수 있다.
상기 프로모터는 RNA 중합효소 II 또는 RNA 중합효소 III에 의해 인식되는 프로모터 일 수 있다.
상기 프로모터는 구성적 프로모터일 수 있다.
상기 프로모터는 유도성 프로모터일 수 있다.
상기 프로모터는 대상 특이적 프로모터 일 수 있다.
상기 프로모터는 바이러스 또는 비바이러스 프로모터 일 수 있다.
상기 프로모터는 제어 영역(즉, 가이드핵산, 에디터단백질 또는 이식유전자)에 따라 적합한 프로모터를 이용할 수 있다. 예를 들어, 가이드핵산을 위해 유용한 프로모터는 H1, EF-1a, tRNA 또는 U6 프로모터일 수 있다.
예를 들어, 에디터단백질을 위해 유용한 프로모터는 CMV, EF-1a, EFS, MSCV, PGK 또는 CAG 프로모터일 수 있다. 예를들어, 이식 유전자를 위해 유용한 프로모터는 APOC3 또는 HP 프로모터일 수 있다.
벡터는 바이러스 벡터 또는 재조합 바이러스 벡터일 수 있다.
상기 바이러스는 DNA 바이러스 또는 RNA 바이러스일 수 있다.
이때, 상기 DNA 바이러스는 이중가닥 DNA(dsDNA) 바이러스 또는 단일가닥 DNA(ssDNA)바이러스 일 수 있다.
이때 상기 RNA 바이러스는 단일가닥 RNA(ssRNA)바이러스 일 수 있다.
상기 바이러스 벡터는 레트로 바이러스 벡터, 렌티 바이러스 벡터 아데노 바이러스 벡터, 폭스 바이러스 벡터, 헤르페스 바이러스 벡터, 단순 포진 바이러스, 백시니아바이러스 및 아데노 연관바이러스 벡터(AAV) 등을 포함하지만 이에 제한되는 것은 아니다.
바이러스를 이용하여 가이드핵산, 에디터 단백질 및/또는 공여체 분자를 대상 유기체에 도입할 경우, 대상체 내에서 일시적으로 발현될 수 있다. 또는 장기간 지속적으로 발현될 수 있다. 예를 들어 1주, 2주, 3주, 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 1년, 2년, 또는 영구적으로 발현될 수 있다.
바이러스 패키징 능력은 적어도 2kb 내지 50kb로 바이러스 종류에 따라 다를 수 있다. 이러한 패키징 능력에 따라 가이드핵산 또는 에디터단백질을 단독으로 포함하는 바이러스 벡터를 설계하거나 가이드핵산 및 에디터단백질을 모두 포함하는 바이러스 벡터를 설계할 수 있다. 또는 가이드핵산, 에디터단백질 및 추가 구성요소를 포함하는 바이러스 벡터를 설계할 수 있다.
예를 들어, 레트로바이러스 벡터는 최대 6 내지 10kb의 외래 서열에 대한 패키징 능력을 가지며, 시스(cis)-작용 긴말단반복순서(long terminal repet:LTR)로 구성된다. 레트로바이러스 벡터는 세포 내 치료 유전자를 삽입시키며 영구적인 이식유전자의 발현을 제공한다.
다른 예로, 아데노연관 바이러스 벡터는 세포분열 여부에 상관없이 다양한 세포(근육, 뇌, 간, 폐, 망막, 귀, 심장, 혈관)에 형질도입 효율이 매우 높고, 병원성이 없으며 바이러스 게놈 대부분이 치료유전자에 의해서 대치될 수 있어 면역반응을 유도하지 않아 반복투여가 가능하다. 또한 AAV는 대상세포의 염색체 내로 삽입됨으로써 치료단백질이 장기간 안정적으로 발현된다. 예를 들어 핵산 및 펩타이드의 시험관 내 생성하여 생체내 및 생체외에서 세포의 표적핵산으로 형질 도입하는데 사용하기 유용하다. 다만 AAV는 크기가 작아 4.5kb이하의 패키징 능력을 가진다.
일 예로, 가이드핵산, 에디터 단백질 및/또는 공여체분자를 암호화하는 핵산서열은 재조합 렌티바이러스에 의해 대상 내 전달 또는 도입될 수 있다.
다른 일 예로, 가이드핵산, 에디터 단백질 및/또는 공여체 분자를 암호화하는 핵산서열은 재조합 아데노 바이러스에 의해 전달 또는 도입될 수 있다.
일 예로, 가이드핵산, 에디터 단백질 및/또는 공여체 분자를 암호화하는 핵산서열은 재조합 AAV 에 의해 전달 또는 도입될 수 있다.
상기 벡터는 핵산의 phosphorothioate linkage, locked nucleic acid(LNA), 2'-O-methyl 3'phosphorothioate(MS) 또는 2'-O-methyl 3'thioPACE(MSP) 변형되는 것을 포함할 수 있다.
상기 가이드핵산, 에디터단백질 및/또는 공여체분자를 암호화하는 핵산서열은 비바이러스 벡터에 의해 전달 또는 도입 될 수 있다.
비 바이러스벡터는 가이드핵산, 에디터단백질 및/또는 공여체분자를 암호화하는 핵산서열을 포함할 수 있다.
예를 들어 비바이러스 벡터는 플라스미드가 있으며, 이때, 추가적으로 리포터 유전자(reporter gene), 핵 표적화 서열(nuclear targeting sequence)를 포함할 수 있다. 그 외 기타 몇몇 다른 첨가제를 포함할 수 있다.
(2) 비벡터
상기 가이드핵산, 에디터 단백질 및/또는 공여체 분자는 비벡터 형태로 대상 내 전달 또는 도입될 수 있다.
가이드핵산, 에디터단백질 및/또는 공여체 분자를 암호화하는 핵산서열은 비벡터로 대상 내 전달 또는 도입될 수 있다.
상기 비벡터는 네이키드 DNA, DNA 복합체, mRNA 또는 이의 혼합일 수 있다.
상기 비벡터는 전기천공법(Electroporation), 리포펙션, 미세주입법, 유전자총법, 비로좀, 리포좀(Liposome), 면역리포좀, 지질-매개 형질감염 또는 이의 조합에 의해 대상 내로 전달 또는 도입될 수 있다.
일 예로, 양성 리포좀 방법에 의해 비벡터로 대상 내 전달 될 수 있다. 이는 양성 amphiphile과 중성 helper 지질이 DPOE로 구성되어 안정한 리포좀을 형성한다. 이때 리포좀-DNA복합체는 + 전하를 띠고 있어 - 전하를 띠고 있는 세포표면에 결합하여 세포 흡수작용에 의해 세포내로 유입될 수 있다.
다른 일 예로, DNA를 금입자로 코팅하여 세포내로 주입할 수 있다.
추가적으로, 엔진아씨 전달 비히클(EnGeneIC delivery vehicles: EDV)로 전달될 핵산을 패키징하여 전달 또는 도입할 수 있다. 구체적으로, EDV는 항체의 하나 팔은 표적 조직에 특이성을 가지고, 다른 팔은 EDV에 특이성을 가지는 이중 특이성 항체를 사용하여 표적조직으로 전달한다. 항체는 표적 세포 표면으로 EXV를 가져가고, 그 후 EDV는 엔도시토시스(endocytosis)에 의해 세포 내로 들어가 갈 수 있다.
상기 가이드 핵산 -에디터 단백질 복합체를 형성하여 핵산과 단백질 혼합의 형태로 대상 내 전달 또는 도입될 수 있다.
상기 가이드핵산 및 에디터단백질은 핵산-단백질 혼합의 형태로 대상 내로 전달 또는 도입될 수 있다.
또는 상기 가이드핵산 및 에디터단백질은 가이드핵산-에디터단백질 복합체의 형태로 대상 내로 전달 또는 도입될 수 있다.
상기 가이드핵산은 DNA, RNA 또는 이의 혼합 형태일 수 있다. 또한 상기 에디터 단백질은 폴리뉴클레오티드 또는 단백질 형태일 수 있다.
일 구현예에서, 가이드핵산 및 에디터단백질은 RNA 형태의 가이드핵산과 단백질 형태의 에디터 단백질이 가이드핵산-에디터단백질 복합체, 즉 ribonucleoprotien(RNP)의 형태로 대상 내 전달 또는 도입될 수 있다.
(3) 전달 방법
생체 내 전달 방법
상기 가이드핵산, 에디터단백질은 이를 암호화하는 핵산서열을 함유하는 벡터 또는 비 벡터의 형태, 또는 가이드핵산-에디터 단백질 복합체(ribonucleoprotein(RNP))인 형태로 대상 내에 직접 투여될 수 있다.
또한, 상기 공여체 분자는 가이드핵산 및/또는 에디터단백질과 함께 또는 각각, 이를 암호화하는 핵산서열을 함유하는 벡터 또는 비 벡터의 형태로 대상 내에 직접 투여될 수 있다.
상기 투여는 전신 투여 또는 국소 적용에 의해 대상 내로 전달 또는 도입될 수 있다. 다만 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 전신 투여는 예를 들어 정막 내, 복강 내, 근육 내, 또는 피하 내 주입될 수 있다. 바람직하게 정막 내 전신 투여 일 수 있다.
상기 가이드핵산, 에디터 단백질 및/또는 공여체 분자가 둘 이상의 상이한 벡터에 포함된 경우, 상이한 경로(근육내 주사, 꼬리 정맥주사, 다른 정맥내 주사 및/또는 복강내 주사)에 의해 투여될 수 있다.
또한, 상기 둘 이상의 상이한 벡터에 표함된 경우 동시에 또는 임의의 순차적인 순서로 전달될 수 있다.
생체 외 전달방법
상기 가이드핵산, 에디터단백질 및/또는 공여체 분자는 개별적인 대상으로부터 외식된 세포 또는 보편적인 조혈 줄기세포로 전달 된 다음, 대상에 세포를 재 이식할 수 있다.
상기 전달 방법은 i) 가이드핵산, 에디터단백질 및/또는 공여체 분자를 세포에 접촉하는 단계 ii) 상기 접촉된 세포를 대상 내 직접 투여하는 단계로 나누어 대상 내 전달될 수 있다.
구체 예로, 상기 세포 내 접촉단계는 가이드핵산 및 에디터단백질이 이를 암호화하는 핵산서열을 함유하는 벡터 또는 비벡터의 형태이거나 또는 가이드핵산-에디터 단백질 복합체(ribonucleoprotein(RNP)인 형태로 세포 내 도입될 수 있다. 또한, 상기 공여체 분자는 가이드핵산 및/또는 에디터단백질과 함께 또는 각각, 이를 암호화하는 핵산서열을 함유하는 벡터 또는 비 벡터의 형태로 세포 내에 도입될 수 있다.
예를 들어, 비 벡터의 형태로 세포 내 도입되는경우, 상기 접촉시키는 i) 단계는 전기천공법 (electroporation), 리포좀, 나노파티클(nanoparticles) 및 PTD (Protein translocation domain) 융합 단백질 방법 중 선택되는 1이상의 방법으로 수행될 수 있다.
다른 예로, 벡터의 형태로 세포 내 도입되는 경우, 상기 접촉시키는 i) 단계는 비 바이러스 벡터인 플라스미드 또는 바이러스 벡터 중 선택되는 1이상의 방법으로 수행될 수 있다.
상기 ii) 단계는 i)단계에서 접촉된 세포를 직접 대상 내 투여하는 것으로서, 전신 투여 또는 국소 적용에 의해 대상 내로 전달 또는 도입될 수 있다. 다만 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 전신 투여는 예를 들어 정막 내, 복강 내, 근육 내, 또는 피하 내 주입될 수 있다. 바람직하게 정막 내 전신 투여 일 수 있다.
본 명세서에 의하여 개시되는 내용은 가이드핵산, 에디터단백질 및/또는 공여체의 대상 내 도입 또는 전달함으로써 변형된 대상을 포함한다.
상기 변형된 대상은 간 세포 게놈 내 이식유전자를 삽입시킴으로써 수득할 수 있다.
일 구체예는 인위적으로 조작된 간세포이다.
상기 변형된 간세포는 인위적으로 조작된 고발현 분비 유전자를 포함하는 간세포일 수 있다.
상기 인위적으로 조작된 고발현 분비 유전자는 고발현 분비 유전자 내 이식 유전자가 삽입된 유전자일 수 있다.
상기 인위적으로 조작된 유전자는 고발현 분비 유전자 암호화 영역에 이식유전자가 들어가있는 형태일 수 있다.
일 예로, 상기 이식 유전자는 고발현 분비 유전자의 엑손 영역에 있을 수 있다.
예를 들어, 고발현 분비 유전자 중 APOC3 유전자의 코딩서열에는 exon1, exon2, exon3, exon4가 존재한다.
상기 이식유전자는 APOC3 유전자의 exon1에 있을 수 있다.
상기 이식유전자는 APOC 유전자의 exon2에 있을 수 있다.
상기 이식유전자는 APOC 유전자의 exon3에 있을 수 있다.
상기 이식유전자는 APOC 유전자의 exon4에 있을 수 있다.
다른 예로, 고발현 분비 유전자 중 HP 유전자의 코딩서열에는 exon1, exon2, exon4, exon4, exon5가 있을 수 있다.
이때 상기 이식유전자는 HP 유전자의 exon1에 있을 수 있다.
이때 상기 이식유전자는 HP 유전자의 exon2에 있을 수 있다.
이때 상기 이식유전자는 HP 유전자의 exon3에 있을 수 있다.
이때 상기 이식유전자는 HP 유전자의 exon4에 있을 수 있다.
이때 상기 이식유전자는 HP 유전자의 exon5에 있을 수 있다.
또한, 인위적으로 조작된 유전자는 고발현 분비 유전자 비암호화 영역에 이식유전자가 들어가있는 형태일 수 있다.
상기 이식유전자는 프로모터, 인핸서, 인트론, 3'UTR, 폴리아데닐(polyA) 또는 이의 혼합 부분에 위치하는 영역에 삽입될 수 있다.
일 예로, 상기 이식 유전자는 고발현 분비 유전자의 인트론 영역에 삽입될 수 있다.
예를 들어, 고발현 분비 유전자 중 APOC3 유전자의 코딩서열은 3개의 인트론 intron1, intron2, intron3이 끼어들어 있다.
이때 상기 이식유전자는 APOC3 유전자의 intron1에 있을 수 있다.
이때 상기 이식유전자는 APOC3 유전자의 intron2에 있을 수 있다.
이때 상기 이식유전자는 APOC3 유전자의 intron3에 있을 수 있다.
다른 예로, 고발현 분비 유전자 중 HP 유전자의 코딩서열에는 inron1, intron2, intron3, intron4이 있을 수 있다.
이때 상기 이식유전자는 HP 유전자의 intron1에 있을 수 있다.
이때 상기 이식유전자는 HP 유전자의 intron2에 있을 수 있다.
이때 상기 이식유전자는 HP 유전자의 intron3에 있을 수 있다.
이때 상기 이식유전자는 HP 유전자의 intron4에 있을 수 있다.
상기 이식유전자는 엑손, 인트론 또는 이 두 영역에 동시에 걸쳐서 삽입될 수 있다.
일 예로, 상기 이식유전자는 APOC3 유전자의 exon과 intron 영역 모두 걸쳐서 있을 수 있다.
상기 이식유전자는 APOC3 유전자의 exon1과 intron1 영역 모두 걸쳐서 있을 수 있다.
상기 이식유전자는 APOC3 유전자의 intron1과 exon2 영역 모두 걸쳐서 있을 수 있다.
상기 이식유전자는 APOC3 유전자의 exon2와 intron2 영역 모두 걸쳐서 있을 수 있다.
상기 이식유전자는 APOC3 유전자의 intron2와 exon3 영역 모두 걸쳐서 있을 수 있다.
상기 이식유전자는 APOC3 유전자의 exon3와 intron3 영역 모두 걸쳐서 있을 수 있다.
상기 이식유전자는 APOC3 유전자의 intron3와 exon4 영역 모두 걸쳐서 있을 수 있다.
다른 예로, 상기 이식유전자는 HP 유전자의 exon과 intron영역 모두 걸쳐서 있을 수 있다.
상기 이식유전자는 HP 유전자의 exon1과 intron1 영역 모두 걸쳐서 있을 수 있다.
상기 이식유전자는 HP 유전자의 intron1과 exon2 영역 모두 걸쳐서 있을 수 있다.
상기 이식유전자는 HP 유전자의 exon2 과 intron2영역 모두 걸쳐서 있을 수 있다.
상기 이식유전자는 HP 유전자의 intron2과 exon3 영역 모두 걸쳐서 있을 수 있다.
상기 이식유전자는 HP 유전자의 exon3과 intron3 영역 모두 걸쳐서 있을 수 있다.
상기 이식유전자는 HP 유전자의 intron3과 exon4 영역 모두 걸쳐서 있을 수 있다.
상기 이식유전자는 HP 유전자의 exon4과 intron4 영역 모두 걸쳐서 있을 수 있다.
상기 이식유전자는 HP 유전자의 intro4과 exon5 영역 모두 걸쳐서 있을 수 있다.
또한, 상기 이식유전자는 고발현 분비유전자의 돌연변이 부분(예를 들면, 야생형 유전자와 다른 부분)이 포함되어 있는 영역에 삽입될 수 있다.
또한, 상기 이식유전자는 고발현 분비 유전자의 핵산 서열 내의 PAM(proto-spacer-adjacent Motif) 서열의 5'말단 및/또는 3'말단에 인접한 연석하는 10 내지 35개의 뉴클레오타이드 서열 내에 삽입될 수 있다.
이때, 상기 PAM 서열은 예를 들어, 하기의 서열 중 1 이상일 수 있다(5'에서 3'방향으로 기재함).
NGG(N은 A, T, C 또는 G임);
NNNNRYAC(N은 각각 독립적으로 A, T, C 또는 G이고, R은 A또는 G이고, Y는 C또는 T임);
NNAGAAW(N은 각각 독립적으로 A, T, C 또는 G이고, W는 A 또는 T임);
NNNNGATT(N은 각각 독립적으로 A, T, C 또는 G임);
NNGRR(T)(N은 각각 독립적으로 A, T, C 또는 G이고, R은 A 또는 G이고, Y는 C 또는 T임); 및
TTN(N은 A, T, C 또는 G임).
이때 상기 이식 유전자는 10 내지 35개의 뉴클레오타이드 서열, 15 내지 35개의 뉴클레오타이드 서열, 20 내지 35개의 뉴클레오타이드 서열, 25 내지 35개의 뉴클레오타이드 서열 또는 30 내지 35개의 뉴클레오타이드 서열 내 있을 수 있다.
또는 상기 이식 유전자는 10 내지 15개의 뉴클레오타이드 서열, 15내지 20개의 뉴클레오타이드 서열, 20 내지 25개의 뉴클레오타이드 서열, 25 내지 30개의 뉴클레오타이드 서열, 또는 30 내지 35개의 뉴클레오타이드 서열 내 있을 수 있다.
일 구체예로서, 에디터단백질이 인식하는 PAM 서열이 5'-NGG-3', 5'-NAG-3' 또는/및 5'-NGA-3' (N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C)인 경우, 상기 HP 유전자의 핵산서열 내의 5'-NGG-3', 5'-NAG-3' 또는/및 5'-NGA-3' (N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C) 서열의 5' 말단 또는/및 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드 내에 이식유전자가 있을 수 있다.
다른 일 구체예로서, 에디터단백질이 인식하는 PAM 서열이 5'-NGGNG-3' 또는/및 5'-NNAGAAW-3' (W = A 또는 T이며, N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C)인 경우, 상기 HP 유전자의 핵산서열 내의 5'-NGGNG-3' 또는/및 5'-NNAGAAW-3' (W = A 또는 T이며, N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C) 서열의 5' 말단 또는/및 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드 내에 이식유전자가 있을 수 있다.
또 다른 일 구체예로서, 에디터단백질이 인식하는 PAM 서열이 5'-NNNNGATT-3' 또는/및 5'-NNNGCTT-3' (N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C)인 경우, 상기 HP 유전자의 핵산서열 내의 5'-NNNNGATT-3' 또는/및 5'-NNNGCTT-3' (N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C) 서열의 5' 말단 또는/및 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드 내에 이식유전자가 있을 수 있다.
일 구체예로서, 에디터단백질이 인식하는 PAM 서열이 5'-NNNVRYAC-3' (V = G, C 또는 A; R = A 또는 G 이며, Y = C 또는 T 이고, N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C)인 경우, 상기 HP 유전자의 핵산서열 내의 5'-NNNVRYAC-3' (V = G, C 또는 A; R = A 또는 G 이며, Y = C 또는 T 이고, N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C) 서열의 5' 말단 또는/및 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드 내에 이식유전자가 있을 수 있다.
다른 일 구체예로서, 에디터단백질이 인식하는 PAM 서열이 5'-NAAR-3'(R = A 또는 G이며, N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C)인 경우, 상기 HP 유전자의 핵산서열 내의 5'-NAAR-3'(R = A 또는 G이며, N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C) 서열의 5' 말단 또는/및 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드 내에 이식유전자가 있을 수 있다.
또 다른 일 구체예로서, 에디터단백질이 인식하는 PAM 서열이 5'-NNGRR-3', 5'-NNGRRT-3' 또는/및 5'-NNGRRV-3' (R = A 또는 G이며, V = G, C 또는 A이고, N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C)인 경우, 상기 HP 유전자의 핵산서열 내의 5'-NNGRR-3', 5'-NNGRRT-3' 또는/및 5'-NNGRRV-3' (R = A 또는 G이며, V = G, C 또는 A이고, N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C) 서열의 5' 말단 또는/및 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드 내에 이식유전자가 있을 수 있다.
일 구체예로서, 에디터단백질이 인식하는 PAM 서열이 5'-TTN-3' (N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C)인 경우, 상기 HP 유전자의 핵산서열 내의 5'-TTN-3' (N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C) 서열의 5' 말단 또는/및 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드 내에 이식유전자가 있을 수 있다.
다른 예로, 상기 이식 유전자는 APOC3 유전자의 핵산서열 내의 PAM 서열의 5' 말단 및/또는 3' 말단에 인접한 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드 서열 내 있을 수 있다.
일 구체예로서, 에디터단백질이 인식하는 PAM 서열이 5'-NGG-3', 5'-NAG-3' 또는/및 5'-NGA-3' (N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C)인 경우, 상기 APOC3 유전자의 핵산서열 내의 5'-NGG-3', 5'-NAG-3' 또는/및 5'-NGA-3' (N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C) 서열의 5' 말단 또는/및 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드 내에 이식유전자가 있을 수 있다.
다른 일 구체예로서, 에디터단백질이 인식하는 PAM 서열이 5'-NGGNG-3' 또는/및 5'-NNAGAAW-3' (W = A 또는 T이며, N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C)인 경우, 상기 APOC3 유전자의 핵산서열 내의 5'-NGGNG-3' 또는/및 5'-NNAGAAW-3' (W = A 또는 T이며, N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C) 서열의 5' 말단 또는/및 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드 서열 내에 이식유전자가 있을 수 있다.
또 다른 일 구체예로서, 에디터단백질이 인식하는 PAM 서열이 5'-NNNNGATT-3' 또는/및 5'-NNNGCTT-3' (N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C)인 경우, 상기 APOC3 유전자의 핵산서열 내의 5'-NNNNGATT-3' 또는/및 5'-NNNGCTT-3' (N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C) 서열의 5' 말단 또는/및 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드 내에 이식유전자가 있을 수 있다.
일 구체예로서, 에디터단백질이 인식하는 PAM 서열이 5'-NNNVRYAC-3' (V = G, C 또는 A; R = A 또는 G 이며, Y = C 또는 T 이고, N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C)인 경우, 상기 표적서열은 APOC3 유전자의 핵산서열 내의 5'-NNNVRYAC-3' (V = G, C 또는 A; R = A 또는 G 이며, Y = C 또는 T 이고, N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C) 서열의 5' 말단 또는/및 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드 서열 내에 이식유전자가 있을 수 있다.
다른 일 구체예로서, 에디터단백질이 인식하는 PAM 서열이 5'-NAAR-3'(R = A 또는 G이며, N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C)인 경우, 상기 APOC3 유전자의 핵산서열 내의 5'-NAAR-3'(R = A 또는 G이며, N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C) 서열의 5' 말단 또는/및 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드 서열 내에 이식유전자가 있을 수 있다.
또 다른 일 구체예로서, 에디터단백질이 인식하는 PAM 서열이 5'-NNGRR-3', 5'-NNGRRT-3' 또는/및 5'-NNGRRV-3' (R = A 또는 G이며, V = G, C 또는 A이고, N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C)인 경우, 상기 표적서열은 APOC3 유전자의 핵산서열 내의 5'-NNGRR-3', 5'-NNGRRT-3' 또는/및 5'-NNGRRV-3' (R = A 또는 G이며, V = G, C 또는 A이고, N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C) 서열의 5' 말단 또는/및 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드 내에 이식유전자가 있을 수 있다.
일 구체예로서, 에디터단백질이 인식하는 PAM 서열이 5'-TTN-3' (N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C)인 경우, 상기 표적서열은 APOC3 유전자의 핵산서열 내의 5'-TTN-3' (N= A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C) 서열의 5' 말단 또는/및 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 10 내지 25개의 뉴클레오타이드서열 내에 이식유전자가 있을 수 있다.
상기 변형된 간세포는 인위적으로 조작된 고발현 분비유전자에 의해 발현되는 단백질(이하 "인위적 발현 단백질"이라고 함)을 포함하는 간세포일 수 있다.
상기 인위적 발현 단백질은 고발현 분비 유전자 및/또는 이식 유전자가 발현하는 것을 포함한다.
일 예로, 상기 간세포는 이식유전자가 발현되어 생성된 단백질을 포함할 수 있다.
다른 예로, 상기 간세포는 이식유전자가 발현되어 생성된 단백질 및 인위적으로 조작된 고발현 분비 유전자가 발현되어 생성된 단백질 모두를 포함할 수 있다.
또한, 고발현 분비 유전자는 인위적 조작에 의하여 발현량이 조절될 수 있다.
일 예로, 상기 고발현 분비 유전자는 인위적으로 조작되기 전보다 발현량이 증가할 수 있다.
다른 예로, 상기 고발현 분비 유전자는 인위적으로 조작되기 전보다 발현량이 감소할 수 있다.
또한, 발현된 목적단백질은 간세포 내 존재하는 유전자의 야생형 단백질일 수 있다.
일 예로, 간세포 내 일정 수준 이하로 발현하던 단백질은 목적단백질 발현에 의해 증가된 발현량을 가질 수 있다.
다른 예로, 상기 간세포 내 존재하는 유전자가 돌연변이가 일어난 형태로 정상적 기능을 하지 못하는 경우, 야생형유전자를 발현시킴으로써 정상적인 기능을 가질 수 있다. 이 경우, 간세포 내에 돌연변이형 단백질과 야생형 단백질이 모두 존재할 수 있다. 또는 간세포 내에 돌연변이형 단백질은 발현하지 않고, 야생형단백질만 발현할 수 있다.
또한, 발현된 목적단백질은 간세포에서 발현되지 않는 새로운 단백질일 수 있다.
일 예로, 발현된 목적단백질은 치료용 단백질일 수 있다. 이때 치료용 단백질은 간세포 내에서 자연적으로 발현되지 않는 단백질이며, 유전질환을 포함한 질병을 치료, 경감 또는 예방하는데 사용될 수 있다.
상기 발현된 목적단백질은 돌연변이형 (야생형 단백질이 일부 변형된) 단백질일 수 있다.
일 예로, 상기 발현된 목적단백질은 일부 야생형 유전자의 일부 뉴클레오타이드가 변형되어 발현되는 단백질일 수 있다.
예를 들어 돌연변이형 단백질은 야생형 단백질보다 일부 기능이 향상된 것일 수 있다.
상기 발현된 목적단백질은 융합형태의 단백질일 수 있다.
일 예로, 목적단백질은 외래유전자와 대상 내 내인성 유전자의 결합하여 발현된 융합단백질일 수 있다.
다른 예로, 목적단백질은 외래유전자와 외래유전자의 결합으로 발현된 융합단백질일 수 있다.
예를 들어, 목적단백질은 다른 내인성 유전자끼리 결합하여 발현된 융합단백질일 수 있다.
따라서, 본 명세서에서 개시되는 내용은 인위적으로 조작된 고발현 분비 유전자에 의하여 변형된 간세포를 포함한다..
또한, 본 명세서에서 개시되는 내용은 상기 변형된 간세포에 의하여 변형된 간조직을 포함한다.
또한, 본 명세서에서 개시되는 내용은 상기 변형된 간조직에 의하여 변형된 간을 포함한다.
이때 변형은 일부 또는 전부 변형된 것일 수 있다.
[목적하는 단백질 발현 방법]
본 명세서에 의하여 개시되는 내용의 일 구현예는, 간에서 목적하는 단백질을 발현하기 위한 방법에 관한 것이다.
상기 방법은 생체 내, 생체 외 또는 시험관내에서 이루어질 수 있다.
일부 실시 형태에서, 방법은 i) 인위적으로 조작된 뉴클레아제 및 이식유전자를 장기, 조직 또는 세포에 도입하는 단계를 포함한다.
일 구현예에서, 상기 i) 단계로서
(a) 고발현 분비 유전자 군에서 선택된 하나이상의 유전자의 핵산 서열에 상보적 결합을 형성하거나 동일한 서열을 가진 가이드 핵산;
(b) 에디터 단백질 또는 이를 암호화하는 핵산; 및
(c)이식유전자를 포함하는공여체
를 대상에 도입하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 고발현 분비 유전자 FTL, FTH1, ACTB, HP, APOC3, SOD2, ORM1, 및 F9에서 선택된 하나 이상의 유전자일 수 있다. 바람직하게 APOC3 또는 HP유전자일 수 있다.
상기 (a) 가이드 핵산은 서열번호 1 내지 348번 표적서열과 동일한 서열 또는 상보적 결합을 형성할 수 있는 가이드 핵산을 포함하며,
상기 (b) 에디터 단백질은 스트렙토코커스 피요게네스(Streptococcus pyogenes) 유래의 Cas9 단백질, 캄필로박터 제주니 (Campylobacter jejuni) 유래의 Cas9 단백질, 스트렙토코커스 써모필러스 (Streptococcus thermophiles) 유래의 Cas9 단백질, 스트렙토코커스 아우레우스 (Streptocuccus aureus) 유래의 Cas9 단백질, 네이세리아 메닝기디티스 (Neisseria meningitidis)유래의 Cas9 단백질, 및 Cpf1 단백질로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 에디터단백질을 포함할 수 있다.
상기(c) 이식유전자는 목적하는 단백질을 암호화하는 유전자 일 수 있다. 예를 들어 치료 유전자일 수 있다.
상기 치료 유전자 관련 설명은 상기 기술한 바와 같다.
상기 유전자 조작용 조성물 관련 설명은 상기 기술한 바와 같다.
상기 대상 내 도입하는 단계는 생체내(in vivo)에서 수행되는 것일 수 있다.
이때, 상기 (a), (b), (c)는 벡터 또는 비벡터에 의해 전달 될 수 있다.
상기 벡터, 비벡터 및 전달 방법에 관한 설명은 상기 기재한 설명과 동일하다.
상기 간에서 목적하는 단백질을 발현하기 위한 방법은 상기 i) 단계로 인해 변형된 장기, 조직 또는 세포에서 이식 유전자 발현을 확인하는 단계를 추가로 더 포함할 수 있다.
이때, 상기 ii) 단계에서,
상기 i) 단계로 인해 변형된 장기 또는 조직은 자연 상태에서 존재하는 장기 또는 조직의 게놈 내에 이식유전자가 삽입된 장기 또는 조직일 수 있다.
상기 i) 단계로 인해 변형된 장기 또는 조직은 이식유전자를 포함할 수 있다.
이때 상기 변형된 장기 또는 조직에 포함된 이식유전자는 변형된 장기 또는 조직에서 발현될 수 있다.
상기 변형된 장기 또는 조직에서 이식 유전자의 발현은 이식유전자의 mRNA 또는 단백질의 발현으로 확인할 수 있다.
상기 이식유전자의 mRNA 발현을 확인하는 방법으로 PCR을 이용할 수 있다.
상기 이식 유전자의 단백질 발현을 확인하는 방법으로 웨스턴 블롯, ELISA, IP 등을 이용할 수 있다.
다른 예로, 상기 방법은 생체 외 또는 시험관내에서 이루어질 수 있다. 이때 상기 목적하는 단백질을 발현하기 위한 방법으로 인위적으로 조작된 간세포를 제조하는 방법일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 방법은
(a) 동물세포; 및
(b) 고발현 분비 유전자 ALB, FTL, FTH1, ACTB, HP, APOC3, SOD2, ORM1, 및 F9 중 선택된 하나 이상의 유전자에 인위적으로 이식유전자를 삽입하기 위한 유전자 조작용 조성물
을 접촉시키는 단계를 포함하는 목적하는 단백질을 발현하는 조작된 동물세포 제조 방법일 수 있다.
이때 상기 (a) 동물세포는 인체 유래의 체세포 또는 줄기세포일 수 있다.
구체적으로, 인체 유래의 체세포는 간세포일 수 있다.
상기 (b) 유전자 조작용 조성물은 상기 기술한 바와 같다.
상기 접촉시키는 단계는 (b) 유전자 조작용 조성물을 (a)동물세포로 도입하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
상기 방법에 사용되는 동물세포는 인간, 원숭이 등의 영장류, 마우스, 래트 등의 설치류를 포함하는 포유동물에서 유래한 동물세포일 수 있다.
[용도]
본 명세서에서 개시되는 내용의 일 예는 치료적 용도를 포함한다.
예를 들어, 대상의 간세포 게놈 내 이식유전자를 삽입하기 위한 조성물 또는 이식유전자가 삽입된 간세포의 투여를 포함할 수 있다.
치료 대상은 인간, 원숭이 등의 영장류, 마우스, 래트 등의 설치류 등을 포함하는 포유동물일 수 있다.
1) 약학적 조성물
본 명세서의 일 구현예는 치료 유전자를 고발현시킴으로써 질환 치료에 이용하고자 하는 조성물 및 이의 제조방법을 포함한다.
예를 들어, 간세포 게놈 내 이식유전자를 인위적으로 삽입하기 위한 인위적으로 조작된 뉴클레아제 및 치료 유전자를 함유하는 조성물이다. 치료용 조성물 또는 약학적 조성물로 칭할 수 있다.
구현예에서, 조성물은 인위적으로 조작된 뉴클레아제를 포함할 수 있다.
상기 인위적으로 조작된 뉴클레아제는 Clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPR)-CRISPR associated protein(Cas) system, Zinc finger nuclease(ZFN), Transcription activator-like effector nucleases(TALEN) 중에 하나일 수 있다.
구현예에서, 조성물은 치료용 유전자를 포함할 수 있다.
상기 치료용 유전자는 체내 결핍된 단백질 또는 효소를 암호화하는 유전자 일 수 있다.
예를 들어, 상기 치료용 유전자는 F9일 수 있다. 이 때, 상기 조성물은 혈우병 치료용 조성물일 수 있다.
상기 인위적으로 조작된 뉴클레아제 및 치료 유전자 외에 약제학적으로 허용가능한 부형제 및/또는 당업계에 공지된 다른 화합물을 추가로 함유할 수 있다. 예를 들어 물, 염분, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등 및 이들의 조합물을 포함할 수 있다.
추가적으로, 소량의 보조물질로 습윤제, 유화제, pH완충제, 안정화제 또는 약학 조성물의 유효성을 향상시키는 다른 시약을 함유할 수 있다.
2) 치료방법
본 명세서에서 개시되는 일 구현예는, 상기 설명한 조성물을 이를 필요로 하는 환자에게 유효량으로 투여하는 것을 포함하는, 특정 질환의 치료 방법이다.
예를 들어, 항체에 의해 치료될 수 있는 질병의 치료방법을 포함한다.
예를 들어, 유전자상의 돌연변이에 의해 유발되는 질병의 치료방법을 포함한다.
예를 들어, 유전성 대사질환의 치료방법을 포함한다.
예를 들어, 특정 단백질의 결핍 또는 결여에 의해 유발되는 질병의 치료방법을 포함한다.
예를 들어, 상기 질환은 상기 치료 조성물을 환자의 체내에 주입하여 영구적으로 치료 유전자를 발현함으로써 치료될 수 있는 질병일 수 있다.
상기 치료방법은 치료 조성물을 환자에 전신 투여로 전달하는 방법에 의해 수행될 수 있다.
상기 치료방법은 환자의 특정 신체 부위에 치료 조성물을 주입하는 방법으로 수행될 수 있다. 이때 특정 신체 부위는 치료용 유전자를 높은 수준으로 발현하여 세포 밖으로 분비할 수 있는 세포를 포함하는 장기일 수 있다.
예를 들어, 간세포일 수 있다.
예를 들어, 줄기세포일 수 있다.
상기 치료방법은 인위적으로 조작된 뉴클레아제를 이용하여 유전자를 직접적으로 조작하여 동물세포 유전자 발현에 영향을 주는 치료방법일 수 있다. 이러한 치료방법은 생체의 유전자를 조작하기 위한 인위적으로 조작된 뉴클레아제 및 치료유전자를 포함하는 유전자 조작용 조성물을 체내에 직접 주입하여 이루어 질 수 있다.
상기 인위적으로 조작된 뉴클레아제는 가이드핵산 및/또는 에디터단백질일 수 있다.
상기 치료유전자는 F9일 수 있다.
상기 유전자 조작용 조성물은 상기 기술한 바와 같다.
조성물을 투입 대상은 인간, 원숭이 등의 영장류, 마우스, 래트 등의 설치류 등을 포함하는 포유동물일 수 있다.
조성물의 투여는 주사(injection), 수혈(transfusion), 삽입(implantation) 또는 이식(transplantation)과 같은, 임의의 편리한 방식으로 수행될 수 있다. 투여 경로는 피하(subcutaneously), 피내(intradermaliy), 종양내(intratumorally), 절내(intranodally), 골수내(intramedullary), 근육내(intramuscularly), 정맥내(intravenous), 림프액내(intralymphatic), 복막내(intraperitoneally) 등에서 선택될 수 있다.
바람직하게 정막 내 전신 투여 일 수 있다.
다른 예로서, 상기 투여는 상기 치료 대상의 신장; 위, 췌장, 십이지장, 회장 및/또는 결장을 포함하는 소화계통; 심장; 폐; 뇌, 특히 뉴런, 및/또는 일반적으로 CNS; 망막 조직을 포함하는 눈; 내이를 포함하는 귀; 피부; 근육; 뼈; 및/또는 간; 중 어느 하나 이상의 기관에 투여하는 것일 수 있다.
바람직하게 간일 수 있다.
일 구현예에서
조성물의 1회 투여량(소정의 소망하는 효과를 얻기 위한 약학적 유효량)은 AAV를 이용하여 인간 생체 내 전달 시, 약 1 x 108 내지 약 1 x 1018기능성 AAV/ml을 함유하는 약 0.01 내지 약 10 ml의 염수 용액을 투여 할 수 있다. 본 명세서의 구현예에서, AAV 용량은 일반적으로 약 1 x 105 내지 1 x 1050 개 게놈 AAV, 약 1 x 108개 내지 1 x 1020개 게놈 AAV, 약 1 x 1010 내지 약 1 x 1016 개 게놈 AAV, 또는 약 1 x 1011 내지 약 1 x 1016 개 게놈 AAV의 농도 범위에 있다. 이러한 농도는 약 0.001㎖ 내지 약 100㎖, 약 0.01 내지 약 50㎖, 또는 약 0.05 내지 약 10㎖의 담체 용액으로 전달될 수 있다. 다만 이에 제한되는 것은 아니고, 투여 대상의 연령, 건강 및 체중, 동시에 받는 치료의 종류, 다만 있다면 치료의 빈도, 원하는 효과의 특성을 고려하여 적절히 처방될 수 있다.
일 구현예에서, 본 명세서에 의해 개시되는 내용의 일 구체예는 혈우병 치료 방법일 수 있다.
상기 치료방법은 생체 내에서 이루어질 수 있다.
간세포 게놈 내 인위적으로 삽입된 이식유전자를 발현시키기 위한 유전자 조작용 조성물을 유효성분으로 포함하는 조성물을 치료 대상에 투여하는 단계를 포함하고,
상기 유전자 조작용 조성물은 Clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPR)-CRISPR associated protein(Cas) system, Zinc finger nuclease(ZFN), Transcription activator-like effector nuclease(TALEN)의 인위적으로 조작된 뉴클레아제 중 어느 하나를 포함하며,
상기 인위적으로 삽입된 이식유전자는 HP 유전자 및 APOC3 유전자 중 하나 이상의 유전자 서열 내 위치하고,
상기 이식유전자는 F9일 수 있다.
상기 혈우병은 인위적으로 조작된 뉴클레아제를 이용한 유전자 편집치료에 의해 영구적으로 치료될 수 있다.
본 명세서의 방법, 조성물에 의해 간세포 게놈 내 이식유전자가 삽입되어 고 발현을 함으로써, 결핍 또는 부족한 단백질 발현이 증가 및 생화학적 대사경로의 정상적 작동에 의한 최종적 유전 산물 생성 및 신체 기능이 향상될 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 명세서을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 단지 본 명세서을 예시하기 위한 것으로, 본 명세서의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는다.
실시예1: RNA 시퀀싱
24 well plate에서 Human primacy cell을 William's Medium에 2day동안 culture 후, RNeasy Mini Kit (Qiagen)을 이용하여 RNA를 분리하였다.
Agilent 2100 BioAnalyzer를 통해 RNA Integrity Number (RIN)가 7이상 되는 샘플을 선택하여 1μg의 RNA를 Oligo dT를 포함한 magnetic bead를 이용하여 mRNA를 enrich시키고, 이어 short fragmentation, reverse transcription을 통해 cDNA library를 제작하였다.
이후 TrueSeq RNA sample prep kit (Illumina, CA)을 이용하여 sequencing adaptor를 붙이고, 전기 영동 기법 및 Agilent High Sensitivity DNA kit (Agilent Technology, CA)을 이용하여 cDNA library size (350-450 bp) 및 quality를 check후 Illumina HiSeq2500 (Illumina, CA)을 통해 sequencing하였다.
이후 skipped bases (marked as 'N')가 10% 이상, qualityscore가 20미만인 base가 40%이상 등에 해당하는 low quality read를 filtering한 read들에 대해서 Tophat 프로그램을 이용하여 human reference genome에 mapping하였고, Cufflinks v2.1.1 프로그램을 이용하여 각 transcript의 FPKM value는 계산하였다.
Secreted proteim 을 코딩하는 Haptoglobin, APOC3 과 각 질환별 치료 유전자에 해당하는 F9, IDUA, IDS, GLA, GBA 등의 전사 활성을 FPKM 결과를 통해 확인하였다.
도 1에 나타난바와 같이, Haptoglobin과 APOC3 유전자에서 다른 치료 유전자보다 약 170배 이상의 높은 전사 활성도를 보여준다.
실시예2: sgRNA 설계
CRISPR RGEN Tools (Institute for Basic Science, Korea)을 사용하여 인간의 HP1과 APOC3 유전자의 CRISPR/Cas9 표적 부위 선별하였다. 각각의 유전자의 표적 부위는 CRISPR 효소의 종류에 따라 달라질 수 있으며, CjCas9에 대한 HP와 APOC3 유전자의 표적서열은 표 2, 3에 정리하였고, SpCas9에 대한 HP와 APOC3 유전자의 표적서열은 표 4, 5에 정리하였다.
[표 2]
Figure pat00011
[표 3]
Figure pat00012
[표 4]
Figure pat00013
[표 5]
Figure pat00014
실시예3: 가이드RNA의 활성 검증 및 off-target 분석
3.1 T7E1 assay
HEK293 세포주에 각각의 guide RNA 서열이 cloning된 sgRNA발현용 벡터 250ng과 Cas9 발현용 벡터 750ng을 Lipofectamine 2000 또는 Electroporation을 통해 transfection 하였다. 또는 Jurkat 세포주에 in vitro transcribed sgRNA 1ug과 Cas9 4ug을 RNP complex형태로 mix시켜 Electroporation을 통해 transfection 하였다.
약 2 ~ 3일 후 genomic DNA를 추출하고 PCR로 on-target위치를 증폭시킨 후 T7E1 assay를 통해 activity를 확인하거나, Next-Generation Sequencing을 위한 sequencing primer에 특이적인 adaptor 및 TruSeq HT 이중 지표 프라이머(TruSeq HT Dual Index primers)를 붙이는 추가적인 PCR을 진행하였다. T7E1에 의해 잘리는 band를 통해 guide RNA의 활성을 체크하였다.
도 3에 나타난 바와 같이, HP 유전자를 표2의 1번부터 11번까지의 표적서열에 대해 Cjcas9을 이용하여 가이드 RNA활성을 확인한 결과, 8번, 9번, 10번, 11번 표적서열에서 T7E1의 활성이 나타났으며, 가이드 RNA의 활성을 확인하였다.
3.2 표적서열의 Indel ratio(%) 확인
이후 paired sequencing을 통하여 나온 read들을 분석하여 on-target 유전체 위치에서의 insertion 또는 deletion (Indels) 확인을 통해 guide RNA들의 활성을 평가하여 표 2, 표 3, 표 4, 표 5에 정리하였다.
표 2와 표 4에 나타난 바와 같이, HP 유전자의 해당 표적서열에 대하여 Indel이 모두 발생하는 것을 확인할 수 있고, 최대 86.4%까지 Indel ratio(%)를 나타냄으로서, 높은 유전자 교정 효율을 확인하였다.
또한, 표 3과 표 5에서, APOC3 유전자의 해당 표적서열에 대하여 Indel이 모두 발생하였으며, 최대 96.2%의 Indel ratio(%)를 나타냄으로서, 유전자 교정 효율이 높은 것을 확인하였다.
각각 유전자를 타겟으로 하는 gRNA 중 Cas9종류에 따른 활성이 좋은 것들의 DNA 타겟 부위를 굵은 글씨로 표시해 두었다.
3.3 off-target 분석
선별된 guide RNA의 off-target 분석을 위해서는 첫 번째, CRISPR RGEN Tools의 Cas-Offinder를 사용한 in-silico 방법으로 3-base mismatch가 있는 off-target list들을 선별하고, 각각의 off-target에 해당하는 유전체상의 특정 부분에 대한 돌연변이 여부를 인간 세포주 HEK293에서 targeted-deep sequencing 방법으로 검증하였다.
두 번째 방법으로는, guide RNA와 Cas9 단백질을 37℃에서 overnight로 처리한 인간의 전체 genomic DNA를 Whole Genome Sequencing을 하고, 이후 Digenome-seq 분석을 통해서 잠재적인 list들을 확보하였다. 이후 off-target 후보들 각각의 유전체상의 특정 부분에 대한 돌연변이 여부를 인간세포주 HEK293에서 targeted-deep sequencing 방법으로 검증하였다.
도 4 및 도 5 에서 나타난 바와 같이, Deep sequencing 결과 HP1-Cj에 대한 off- target 10개와 APOC3-Cj에 대한 off-target 6개 검증 결과, 유의미한 off-target은 발견되지 않았으며, 높은 효율로 indel 변이가 일어남을 확인할 수 있었다.
실시예 4: vector 및 Donor 제작
SpCas9 적용을 위해서는 AAV2의 역위 말단 반복(Inverted Tandem Repeat, ITR)사이에 Mammalian 발현용 promoter인 EFS, C- 또는 N-말단에 NLS와 HA태그를 가지는 human codon 최적화된 SpCas9, BGHA를 포함하는 벡터 (pAAV-EFS-SpCas9) 및 U6 promoter, sgRNA서열 및 human codon 최적화된 F9 donor를 포함하는 벡터 (pAAV-hF9-donor-U6-sgRNA)를 각각 합성하여 제작하였다.
CjCas9 적용을 위해서는 AAV2 ITR 사이에 Mammalian 발현용 promoter인 CMV, C- 또는 N-말단에 NLS와 HA태그를 가지는 human codon 최적화된 CjCas9, BGHA를 포함하고 U6 promoter와 sgRNA 서열을 포함하는 벡터 (pAAV-CMV-CjCas9-U6-sgRNA) 및 human codon 최적화된 F9 donor를 포함하는 벡터 (pAAV-hF9-donor)를 각각 합성하여 제작하였다. 즉 CjCas9을 위해서는 AAV packaging capacity를 고려하여 U6와 sgRNA를 Cas9발현 시퀀스과 같이 전달할 수 있다.
각 벡터에 들어가는 donor는 인간 HP1 및 APOC3 유전체상에서 Cas9에 의해 생기는 double strand break를 기준으로 좌우 각각 800bp~1200bp의 Homology arm 사이에 Splicing acceptor(SA) - human codon 최적화된 F9 - bGHA로 구성되어 있다. (도 6)
실시예 5: Human cell line에서의 HDR 확인
HEK293 cell line에 human HP1유전체를 타겟하는 pAAV-CMV-CjCas9-U6-sgRNA 500ng 과 pAAV-hF9-donor 500ng을 lipofectamine 2000을 이용하여 transfection하였다.
3일 후 genomic DNA를 추출하여, HP1 타겟 site의 homology arm 바깥부분과 HDR에 의해 knock-in되는 부분에서 각각 primer를 사용하여 PCR band를 얻고 TA vector에 cloning하였다.
이후 생성된 colony로부터 plasmid를 추출하고 sanger sequencing으로 Knock in되는 양쪽 junction의 sequence를 확인하였다.
도 8은 각각 left arm 과 rigt arm 의 junction 에서 knock-in을 확인한 결과를 보여주며, 정확히 double strand break가 생기는 부분에서 F9의 시퀀스가 변형됨 없이 knock-in된 것을 양쪽 arm에서 확인하였다. guide RNA 서열은 Cj9: 5'- TCCAGGAAAGAGAAACCTCCC-3', Cj10: 5'- CATTCAGGAAAGTACATTGGC-3' 을 각각 사용하였다.
실시예6: AAV 제작
AAV 생산을 위해, AAV capsid의 위형(pseudotype)에 대한 vector, 제작된 pAAV-EFS-SpCas9 또는 pAAV-hF9-donor-U6-sgRNA 또는 pAAV-CMV-CjCas9-U6-sgRNA 또는 pAAV-hF9-donor, pHelper vector를 1:1:1의 몰농도로 HEK293세포에 동시에 transfection하였다.
72시간 후, 세포를 융해한 후 얻은 virus particle을 iodixanol(Sigma-aldrich)을 이용해 step-gradient 초원심분리기로 분리정제하고, AAV의 정량적인 확인은 qPCR을 이용한 titration 방법으로 측정하였다.
실시예7: Hepatocyte에서의 indel 및 KI된 유전자의 대량 발현 확인
6x10^5의 hepatocyte를 24-well plate에서 maintain후 AAV6-EFS-SpCas9 5x10^11 ㎍와 AAV6-hF9-donor-APOC3-Sp 5x10^11 ㎍를 infection하였다.
APOC3-Sp타겟의 서열은 5'-CCTAAGCCTGAAGAATGAGG-3'을 사용하였다. Infection 다음날(2D) medium을 change해주고, 이후 5D, 8D, 최종적으로 10D에 culture supernatant 샘플을 각각 preparation하였고, 최종 10D에는 hepatocyte로부터 genomic DNA를 추출하였다.
Primer set (Forward: 5'- ACGGAAAATATCAAGAAGTA-3', Reverse: 5'- CAGCAAGCCCTGTCCTGCTGG-3')을 이용하여 APOC3-Sp의 on-target에 대한 amplicon을 얻고, primer에 특이적인 adaptor 및 TruSeq HT 이중 지표 프라이머(TruSeq HT Dual Index primers)를 붙이는 추가적인 PCR을 진행하였다.
이후 paired sequencing을 통하여 나온 read들을 분석하여 on-target 유전체 위치에서의 Indels 확인을 통해 CRISPR의 활성을 평가하였다.
Knock-in된 human F9의 대량 발현은 hepatocyte culture supernatant에 secretion된 F9 단백질을 Factor IX Human ELISA Kit(Abcam)을 사용한 ELISA 방법으로 검출하였다.
도 9A에 나타난 바와 같이, AAV를 처리하지 않은 control group과 donor-only group (D-only-hAPOC3-Sp )에 비해서, dual AAV를 사용한 group에서 (hAPOC3-Sp) 평균 9.6%의 indel을 보였다.
또한, 도 9B에 나타난 바와 같이, secretion되는 hF9의 양은 control group은 평균 42.5 ng/ml, donor-only group은 평균 74.1 ng/ml, dual AAV처리 group은 평균 378.2 ng/ml의 값을 보였다.
통계 분석을 위하여, student t-test를 사용하였다. significance는 *는 p<0.05, **는 p<0.01, ***는 p<0.001을 의미한다.
<110> Toolgen <120> Liver biofactory platform <130> OPP17-036-NP-PCT <150> US 62/520,103 <151> 2017-06-15 <150> US 62/662,907 <151> 2018-04-26 <160> 348 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 aaagaggaaa atatctgcta at 22 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 aaggcactta gatcttataa aa 22 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 ttctattaaa atagtttcta gg 22 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 ctcactaaca aatgccaacc at 22 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 ttagtgagat ggtgaactgg ca 22 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 aggtgaatta ttataaaata ct 22 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 ggaaaatatc aagaagtaga gg 22 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 8 ctccaggaaa gagaaacctc cc 22 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 9 gcattcagga aagtacattg gc 22 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 10 gaaattgccc ccacacctgc cc 22 <210> 11 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 11 aagaaattgc ccccacacct gc 22 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 12 tcaaaaatgt aacctgaagg aa 22 <210> 13 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 13 tagcagatat tttcctcttt aa 22 <210> 14 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 14 atgtgttact attagtcttc ct 22 <210> 15 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 15 atgtacaata aggaagacta at 22 <210> 16 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 16 acacaattaa ttgactagta cc 22 <210> 17 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 17 acaattaatt gactagtacc tg 22 <210> 18 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 18 aattaattga ctagtacctg gg 22 <210> 19 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 19 atcccaggta ttagtgtgta tc 22 <210> 20 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 20 ttgactagta cctgggatac ac 22 <210> 21 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 21 acctgggata cacactaata cc 22 <210> 22 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 22 taatacctgg gatacatcta at 22 <210> 23 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 23 atttcctaaa ggtgaattat ta 22 <210> 24 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 24 aaggttcctt aaatatataa tt 22 <210> 25 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 25 tggagggctc ctgtattatt gc 22 <210> 26 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 26 ctcagtttct ggctgcattc ag 22 <210> 27 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 27 catacacact ttagcagctt ct 22 <210> 28 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 28 ccaagaaatt gcccccacac ct 22 <210> 29 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 29 agtgctagga ccaagaaatt gc 22 <210> 30 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 30 ggtgtggggg caatttcttg gt 22 <210> 31 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 31 atccacacac acatgcatgt ac 22 <210> 32 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 32 gcatccacac acacatgcat gt 22 <210> 33 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 33 atgcatccac acacacatgc at 22 <210> 34 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 34 gcatgcatcc acacacacat gc 22 <210> 35 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 35 atgcatgcat ccacacacac at 22 <210> 36 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 36 tggaaagcta gtctccctgc tt 22 <210> 37 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 37 agacccgaga gggtcagagt g 21 <210> 38 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 38 atcccactct gaccctctcg g 21 <210> 39 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 39 tctcgggtct gcactctctc t 21 <210> 40 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 40 agggcactgg ctgaatccac t 21 <210> 41 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 41 ggttacattt ttgactttat 20 <210> 42 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 42 ctgggataca cactaatacc 20 <210> 43 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 43 gcaagtagtg cccgaatggt 20 <210> 44 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 44 ttgttagtga gatggtgaac 20 <210> 45 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 45 gaactggcag acggcacctg 20 <210> 46 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 46 aactggcaga cggcacctgt 20 <210> 47 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 47 ctcagacacc gcaaagatag 20 <210> 48 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 48 cactatcttt gcggtgtctg 20 <210> 49 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 49 actatctttg cggtgtctga 20 <210> 50 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 50 atctttgcgg tgtctgaggg 20 <210> 51 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 51 agaaaggcac ataggtggag 20 <210> 52 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 52 gcagaaatag aacaaagaaa 20 <210> 53 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 53 agaacaaaga aacgggcaaa 20 <210> 54 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 54 gaacaaagaa acgggcaaat 20 <210> 55 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 55 caggagtgtc tttttccttc 20 <210> 56 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 56 aagtcaaaaa tgtaacctga 20 <210> 57 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 57 gttacatttt tgactttata 20 <210> 58 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 58 gatgccagga agcctaccac 20 <210> 59 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 59 ggatgccagg aagcctacca 20 <210> 60 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 60 ataaatatac tcaggatgcc 20 <210> 61 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 61 atctgctaat aaatatactc 20 <210> 62 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 62 cttattgtac atttttaaag 20 <210> 63 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 63 ctctttaaaa atgtacaata 20 <210> 64 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 64 acaattaatt gactagtacc 20 <210> 65 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 65 caattaattg actagtacct 20 <210> 66 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 66 caggtattag tgtgtatccc 20 <210> 67 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 67 tgggatacac actaatacct 20 <210> 68 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 68 gccttaatta gatgtatccc 20 <210> 69 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 69 acctgggata catctaatta 20 <210> 70 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 70 agtttctagg ccagacacgg 20 <210> 71 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 71 aatagtttct aggccagaca 20 <210> 72 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 72 agaagcaagt agtgcccgaa 20 <210> 73 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 73 ctaacaaatg ccaaccattc 20 <210> 74 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 74 actaacaaat gccaaccatt 20 <210> 75 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 75 gttggcattt gttagtgaga 20 <210> 76 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 76 tgagatggtg aactggcaga 20 <210> 77 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 77 ggccatgggc attgacccac 20 <210> 78 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 78 cacctgtggg tcaatgccca 20 <210> 79 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 79 aaaagcagga cggtggccat 20 <210> 80 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 80 caaaagcagg acggtggcca 20 <210> 81 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 81 ggtgtccaaa agcaggacgg 20 <210> 82 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 82 actggtgtcc aaaagcagga 20 <210> 83 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 83 catggccacc gtcctgcttt 20 <210> 84 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 84 gagaactggt gtccaaaagc 20 <210> 85 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 85 ttggacacca gttctcttcc 20 <210> 86 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 86 tgaaacccca aaatgccaga 20 <210> 87 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 87 aataattcac ctttaggaaa 20 <210> 88 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 88 tttcagatac catttcctaa 20 <210> 89 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 89 ttttataata attcaccttt 20 <210> 90 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 90 atatataatt ttaaacacgt 20 <210> 91 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 91 aatatataat tttaaacacg 20 <210> 92 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 92 tgtttaaaat tatatattta 20 <210> 93 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 93 ttgatatttt ccgtaataaa 20 <210> 94 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 94 atttaaggaa ccttttatta 20 <210> 95 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 95 cggaaaatat caagaagtag 20 <210> 96 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 96 aactcagaga tgggaacttt 20 <210> 97 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 97 taactcagag atgggaactt 20 <210> 98 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 98 aatgtagata actcagagat 20 <210> 99 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 99 aaatgtagat aactcagaga 20 <210> 100 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 100 ttttattacc actatctttg 20 <210> 101 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 101 caataataca ggagccctcc 20 <210> 102 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 102 aagtacattg gcaataatac 20 <210> 103 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 103 ctgcattcag gaaagtacat 20 <210> 104 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 104 ctcagtttct ggctgcattc 20 <210> 105 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 105 ggaggggtgg gctcagtttc 20 <210> 106 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 106 aggcacatag gtggaggggt 20 <210> 107 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 107 aaggcacata ggtggagggg 20 <210> 108 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 108 tagaaaggca cataggtgga 20 <210> 109 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 109 atagaaaggc acataggtgg 20 <210> 110 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 110 gggatagaaa ggcacatagg 20 <210> 111 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 111 agagggatag aaaggcacat 20 <210> 112 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 112 gcttctgcag aattcccagc 20 <210> 113 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 113 ccagcaagcc ctgtcctgct 20 <210> 114 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 114 tccagcaagc cctgtcctgc 20 <210> 115 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 115 tgcagaattc ccagcaggac 20 <210> 116 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 116 gcagaattcc cagcaggaca 20 <210> 117 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 117 cccagcagga cagggcttgc 20 <210> 118 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 118 gacagggctt gctggaagct 20 <210> 119 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 119 agaagctgct aaagtgtgta 20 <210> 120 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 120 gaagctgcta aagtgtgtat 20 <210> 121 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 121 ctgctaaagt gtgtatgggc 20 <210> 122 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 122 aaagtgtgta tgggcaggtg 20 <210> 123 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 123 aagtgtgtat gggcaggtgt 20 <210> 124 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 124 agtgtgtatg ggcaggtgtg 20 <210> 125 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 125 gtgtgtatgg gcaggtgtgg 20 <210> 126 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 126 caggtgtggg ggcaatttct 20 <210> 127 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 127 agtcgatata tggaagtgct 20 <210> 128 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 128 cagaaaagaa agtcgatata 20 <210> 129 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 129 catatatcga ctttcttttc 20 <210> 130 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 130 tttcttttct ggctgctaag 20 <210> 131 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 131 ttcttttctg gctgctaagt 20 <210> 132 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 132 ttttctggct gctaagtggg 20 <210> 133 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 133 actgcagaga gaagacaagg 20 <210> 134 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 134 ggcactgcag agagaagaca 20 <210> 135 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 135 tgaaggaaaa agacactcct 20 <210> 136 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 136 aggttacatt tttgacttta 20 <210> 137 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 137 gtggtaggct tcctggcatc 20 <210> 138 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 138 tatctgctaa taaatatact 20 <210> 139 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 139 gaagactaat agtaacacat 20 <210> 140 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 140 acaattaatt gactagtacc 20 <210> 141 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 141 ctgggataca cactaatacc 20 <210> 142 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 142 ttaatagaag caagtagtgc 20 <210> 143 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 143 tgaactggca gacggcacct 20 <210> 144 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 144 tcagatacca tttcctaaag 20 <210> 145 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 145 aaatatataa ttttaaacac 20 <210> 146 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 146 cggaaaatat caagaagtag 20 <210> 147 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 147 taagcccaaa gttcccatct 20 <210> 148 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 148 attattgcca atgtactttc 20 <210> 149 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 149 atagaaaggc acataggtgg 20 <210> 150 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 150 ccagcaagcc ctgtcctgct 20 <210> 151 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 151 ttttctggct gctaagtggg 20 <210> 152 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 152 gtgtgtacat gcatgtgtgt 20 <210> 153 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 153 actgcagaga gaagacaagg 20 <210> 154 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 154 ccagcccagc cagcaagcct gg 22 <210> 155 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 155 cttcaggtta tgatgagggg tg 22 <210> 156 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 156 gggaggggtg tcacttgccc aa 22 <210> 157 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 157 accccctgtg tagctttggg ca 22 <210> 158 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 158 aagcctgaag aatgaggggg ga 22 <210> 159 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 159 tggagagggc cagaaatcac cc 22 <210> 160 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 160 gagagggcca gaaatcaccc aa 22 <210> 161 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 161 gaaaacccac cagactgaac at 22 <210> 162 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 162 aaggagtagg ggccggctcc ct 22 <210> 163 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 163 tggggacctg gggtgcccct ca 22 <210> 164 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 164 tcctgcaagg aagtgtcctg tg 22 <210> 165 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 165 ggaacagagg tgccatgcag cc 22 <210> 166 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 166 caacaaggag tacccggggc tg 22 <210> 167 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 167 gagcgccagg agggcaacaa ca 22 <210> 168 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 168 tctgctcagt tcatccctag 20 <210> 169 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 169 ctgctccagg taatgccctc 20 <210> 170 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 170 agaagcactt gctagagcta 20 <210> 171 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 171 ggggcacccg tccagctccg 20 <210> 172 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 172 cttcaggtta tgatgagggg 20 <210> 173 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 173 gttcttcagg ttatgatgag 20 <210> 174 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 174 cccgggcctc catgttcttc 20 <210> 175 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 175 aggttccccc ctcattcttc 20 <210> 176 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 176 cctaagcctg aagaatgagg 20 <210> 177 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 177 agccctaagc ctgaagaatg 20 <210> 178 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 178 gggtaggact gggctgtcta 20 <210> 179 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 179 agcccagtcc taccccagac 20 <210> 180 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 180 ggtgatttct ggccctctcc 20 <210> 181 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 181 cggagatcag tccagaccgc 20 <210> 182 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 182 gcgagggatc gaggcccaaa 20 <210> 183 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 183 tcctctttcc cctccccaga 20 <210> 184 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 184 ccaggtaatg ccctctgggg 20 <210> 185 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 185 ctcctctttc ccctccccag 20 <210> 186 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 186 caggtaatgc cctctgggga 20 <210> 187 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 187 aggtaatgcc ctctggggag 20 <210> 188 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 188 gccctctggg gaggggaaag 20 <210> 189 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 189 ctctggggag gggaaagagg 20 <210> 190 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 190 tctggggagg ggaaagagga 20 <210> 191 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 191 gggaggggaa agaggagggg 20 <210> 192 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 192 aggggaaaga ggaggggagg 20 <210> 193 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 193 aggaggggag gaggatgaag 20 <210> 194 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 194 ggaggggagg aggatgaaga 20 <210> 195 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 195 gaggggagga ggatgaagag 20 <210> 196 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 196 ggaggatgaa gaggggcaag 20 <210> 197 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 197 cttgctggct gggctgggca 20 <210> 198 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 198 gcttgctggc tgggctgggc 20 <210> 199 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 199 ccaggcttgc tggctgggct 20 <210> 200 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 200 tccaggcttg ctggctgggc 20 <210> 201 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 201 cttctccagg cttgctggct 20 <210> 202 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 202 gcttctccag gcttgctggc 20 <210> 203 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 203 aagtgcttct ccaggcttgc 20 <210> 204 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 204 cccagcccag ccagcaagcc 20 <210> 205 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 205 gctctagcaa gtgcttctcc 20 <210> 206 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 206 cctccccaga gggcattacc 20 <210> 207 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 207 tgctagagct aaggaagcct 20 <210> 208 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 208 agctaaggaa gcctcggagc 20 <210> 209 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 209 tgctccaggt aatgccctct 20 <210> 210 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 210 aaggaagcct cggagctgga 20 <210> 211 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 211 aggaagcctc ggagctggac 20 <210> 212 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 212 aggttatgat gaggggtggg 20 <210> 213 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 213 caggttatga tgaggggtgg 20 <210> 214 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 214 tcaggttatg atgaggggtg 20 <210> 215 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 215 ttcaggttat gatgaggggt 20 <210> 216 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 216 gctccaggta atgccctctg 20 <210> 217 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 217 tgttcttcag gttatgatga 20 <210> 218 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 218 atgttcttca ggttatgatg 20 <210> 219 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 219 tcatcataac ctgaagaaca 20 <210> 220 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 220 tcataacctg aagaacatgg 20 <210> 221 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 221 acctgaagaa catggaggcc 20 <210> 222 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 222 cctgaagaac atggaggccc 20 <210> 223 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 223 gaagaacatg gaggcccggg 20 <210> 224 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 224 aagaacatgg aggcccggga 20 <210> 225 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 225 agaacatgga ggcccgggag 20 <210> 226 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 226 gggcaagtga cacccctccc 20 <210> 227 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 227 tgggcaagtg acacccctcc 20 <210> 228 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 228 cccaccccct gtgtagcttt 20 <210> 229 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 229 ccccaccccc tgtgtagctt 20 <210> 230 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 230 tcacttgccc aaagctacac 20 <210> 231 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 231 cacttgccca aagctacaca 20 <210> 232 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 232 acttgcccaa agctacacag 20 <210> 233 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 233 cttgcccaaa gctacacagg 20 <210> 234 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 234 gcccaaagct acacaggggg 20 <210> 235 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 235 cccaaagcta cacagggggt 20 <210> 236 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 236 ccaaagctac acagggggtg 20 <210> 237 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 237 agctacacag ggggtggggc 20 <210> 238 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 238 acagggggtg gggctggaag 20 <210> 239 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 239 ctggaagtgg ctccaagtgc 20 <210> 240 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 240 atgagggggg aacctgcact 20 <210> 241 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 241 ctaagcctga agaatgaggg 20 <210> 242 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 242 ccctaagcct gaagaatgag 20 <210> 243 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 243 gccctaagcc tgaagaatga 20 <210> 244 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 244 ccccctcatt cttcaggctt 20 <210> 245 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 245 cccctcattc ttcaggctta 20 <210> 246 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 246 tcattcttca ggcttagggc 20 <210> 247 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 247 ttcttcaggc ttagggctgg 20 <210> 248 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 248 tccctgtctg gggtaggact 20 <210> 249 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 249 ttccctgtct ggggtaggac 20 <210> 250 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 250 tcagtttccc tgtctggggt 20 <210> 251 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 251 gcccagtcct accccagaca 20 <210> 252 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 252 aggcctcagt ttccctgtct 20 <210> 253 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 253 caggcctcag tttccctgtc 20 <210> 254 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 254 taccccagac agggaaactg 20 <210> 255 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 255 gtgtgtcttt gggtgatttc 20 <210> 256 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 256 ccaacatgct gtgtgtcttt 20 <210> 257 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 257 gccaacatgc tgtgtgtctt 20 <210> 258 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 258 cccaaagaca cacagcatgt 20 <210> 259 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 259 aagacacaca gcatgttggc 20 <210> 260 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 260 acacagcatg ttggctggac 20 <210> 261 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 261 agcatgttgg ctggactgga 20 <210> 262 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 262 acatcaaggc acctgcggtc 20 <210> 263 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 263 actgaacatc aaggcacctg 20 <210> 264 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 264 acccaccaga ctgaacatca 20 <210> 265 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 265 aggtgccttg atgttcagtc 20 <210> 266 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 266 tgccttgatg ttcagtctgg 20 <210> 267 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 267 gccttgatgt tcagtctggt 20 <210> 268 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 268 ccaaagggag gtgggtggga 20 <210> 269 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 269 aggcccaaag ggaggtgggt 20 <210> 270 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 270 gaggcccaaa gggaggtggg 20 <210> 271 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 271 atcgaggccc aaagggaggt 20 <210> 272 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 272 gatcgaggcc caaagggagg 20 <210> 273 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 273 ccatcccacc cacctccctt 20 <210> 274 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 274 catcccaccc acctcccttt 20 <210> 275 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 275 agggatcgag gcccaaaggg 20 <210> 276 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 276 ggcgagggat cgaggcccaa 20 <210> 277 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 277 tggtgagggg cgagggatcg 20 <210> 278 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 278 gggggactgg tgaggggcga 20 <210> 279 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 279 agggggactg gtgaggggcg 20 <210> 280 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 280 tcagaagggg gactggtgag 20 <210> 281 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 281 ctcagaaggg ggactggtga 20 <210> 282 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 282 tctcagaagg gggactggtg 20 <210> 283 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 283 cgggctctca gaagggggac 20 <210> 284 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 284 taatacgggc tctcagaagg 20 <210> 285 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 285 ctaatacggg ctctcagaag 20 <210> 286 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 286 gctaatacgg gctctcagaa 20 <210> 287 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 287 tgctaatacg ggctctcaga 20 <210> 288 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 288 ggccggctcc ctgctaatac 20 <210> 289 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 289 gggccggctc cctgctaata 20 <210> 290 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 290 ttctgagagc ccgtattagc 20 <210> 291 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 291 tctgagagcc cgtattagca 20 <210> 292 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 292 agcccgtatt agcagggagc 20 <210> 293 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 293 ctgccagaag gagtaggggc 20 <210> 294 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 294 gggtctgcca gaaggagtag 20 <210> 295 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 295 tgggtctgcc agaaggagta 20 <210> 296 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 296 ctgggtctgc cagaaggagt 20 <210> 297 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 297 gagccggccc ctactccttc 20 <210> 298 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 298 ccttagctgg gtctgccaga 20 <210> 299 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 299 ccttctggca gacccagcta 20 <210> 300 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 300 cctaaggtag aaccttagct 20 <210> 301 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 301 ccctaaggta gaaccttagc 20 <210> 302 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 302 cccagctaag gttctacctt 20 <210> 303 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 303 ccagctaagg ttctacctta 20 <210> 304 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 304 cagctaaggt tctaccttag 20 <210> 305 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 305 gggaggtggc gtggccccta 20 <210> 306 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 306 ccctccctgg ggaggtggcg 20 <210> 307 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 307 tggacccctc cctggggagg 20 <210> 308 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 308 aggggccacg ccacctcccc 20 <210> 309 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 309 ggggccacgc cacctcccca 20 <210> 310 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 310 ctctggaccc ctccctgggg 20 <210> 311 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 311 gccacgccac ctccccaggg 20 <210> 312 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 312 ccacgccacc tccccaggga 20 <210> 313 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 313 tgcctctgga cccctccctg 20 <210> 314 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 314 cacgccacct ccccagggag 20 <210> 315 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 315 atgcctctgg acccctccct 20 <210> 316 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 316 catgcctctg gacccctccc 20 <210> 317 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 317 ctccccaggg aggggtccag 20 <210> 318 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 318 cagggagggg tccagaggca 20 <210> 319 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 319 accccaggtc cccatgcctc 20 <210> 320 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 320 agggaggggt ccagaggcat 20 <210> 321 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 321 gggaggggtc cagaggcatg 20 <210> 322 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 322 ggtccagagg catggggacc 20 <210> 323 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 323 gtccagaggc atggggacct 20 <210> 324 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 324 tccagaggca tggggacctg 20 <210> 325 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 325 tgtcctgtga ggggcacccc 20 <210> 326 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 326 ggacctgggg tgcccctcac 20 <210> 327 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 327 gcaaggaagt gtcctgtgag 20 <210> 328 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 328 tgcaaggaag tgtcctgtga 20 <210> 329 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 329 ctgcaaggaa gtgtcctgtg 20 <210> 330 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 330 ctcacaggac acttccttgc 20 <210> 331 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 331 atggcacctc tgttcctgca 20 <210> 332 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 332 acacttcctt gcaggaacag 20 <210> 333 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 333 gaggggaaag aggaggggag 20 <210> 334 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 334 taaggaagcc tcggagctgg 20 <210> 335 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 335 atgttcttca ggttatgatg 20 <210> 336 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 336 gaagaacatg gaggcccggg 20 <210> 337 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 337 cacttgccca aagctacaca 20 <210> 338 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 338 ttcctccagc cctaagcctg 20 <210> 339 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 339 caggcctcag tttccctgtc 20 <210> 340 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 340 agccaacatg ctgtgtgtct 20 <210> 341 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 341 gtgccttgat gttcagtctg 20 <210> 342 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 342 gaggcccaaa gggaggtggg 20 <210> 343 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 343 ggatcgaggc ccaaagggag 20 <210> 344 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 344 agggggactg gtgaggggcg 20 <210> 345 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 345 ccttagctgg gtctgccaga 20 <210> 346 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 346 cccctaaggt agaaccttag 20 <210> 347 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 347 gccacgccac ctccccaggg 20 <210> 348 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 348 ggtccagagg catggggacc 20

Claims (57)

  1. 간세포의 게놈 내 인위적으로 삽입된 이식유전자를 발현하는 LBP(liver bio-factory platform) 시스템으로서,
    상기 인위적으로 삽입된 이식유전자는 고발현 분비 유전자 서열 내 위치하고,
    상기 고발현 분비 유전자는 간세포 게놈 내에 존재하는 ALB 유전자, FTL 유전자, FTH1 유전자, ACT 유전자, HP 유전자, APOC3 유전자, SOD2 유전자, ORM1 유전자, 및 F9 유전자 중에서 선택된 하나 이상의 유전자이며,
    상기 인위적으로 삽입된 이식유전자는 삽입 전과 비교하여 발현량이 증가하거나 또는 새롭게 발현되는 LBP 시스템.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 고발현 분비 유전자는 HP 유전자 및 APOC3 유전자 중 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 LBP시스템.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 이식유전자는 고발현 분비 유전자 서열 중 엑손 및 인트론 영역 중 어느 하나 이상에 삽입되는 것을 특징으로 하는 LBP시스템.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 이식유전자는 간세포의 게놈 내 프로모터에 의해 발현되는 것을 특징으로 하는 LBP시스템.
  5. 제1항에 있어서,
    싱기 이식유전자는 F9 유전자인 것을 특징으로 하는 LBP시스템.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 이식유전자 발현에 의해 생성된 단백질은 간세포 밖으로 분비되는 것을 포함하는 LBP시스템.
  7. 간세포 게놈 내 인위적으로 삽입된 이식유전자를 발현시키기 위한 유전자 조작용 조성물로서,
    상기 유전자 조작용 조성물은 고발현 분비 유전자 내 이식유전자를 삽입시키기 위한 인위적으로 조작된 뉴클레아제를 포함하고,
    상기 고발현 분비 유전자는 FTL 유전자, FTH1 유전자, ACTB 유전자, HP 유전자, APOC3 유전자, SOD2 유전자, ORM1 유전자 및 F9 유전자 중 선택된 하나 이상의 유전자인 것을 특징으로 하는
    유전자 조작용 조성물.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 인위적으로 조작된 뉴클레아제는 Clustered regularly interspaced short palindromic repets(CRISPR)-CRISPR associated protein(Cas) system, Zinc finger nuclease(ZFN), Transcription activator-like effector nucleases(TALEN) 중 하나인 것을 특징으로 하는 유전자 조작용 조성물.
  9. 제7항에 있어서
    상기 고발현 분비 유전자는 HP 유전자 및 APOC3 유전자 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는 유전자 조작용 조성물.
  10. 제7항에 있어서,
    상기 이식유전자는 F9 유전자인 것을 특징으로 하는 유전자 조작용 조성물.
  11. 간세포 게놈 내 인위적으로 삽입된 이식유전자를 발현시키기 위한 유전자 조작용 조성물로서,
    상기 유전자 조작용 조성물은 간세포 게놈 내 존재하는 고발현 분비 유전자 군에서 선택된 하나 이상의 유전자의 표적서열에 대한 가이드 핵산;
    에디터 단백질 또는 에디터 단백질을 암호화하는 핵산; 및
    이식유전자를 포함하는 공여체를 포함하는
    유전자 조작용 조성물.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 에디터 단백질은 스트렙토코커스 피요게네스(Streptococcus pyogenes) 유래의 Cas9 단백질, 캄필로박터 제주니 (Campylobacter jejuni) 유래의 Cas9 단백질, 스트렙토코커스 써모필러스 (Streptococcus thermophiles) 유래의 Cas9 단백질, 스트렙토코커스 아우레우스 (Streptocuccus aureus) 유래의 Cas9 단백질, 네이세리아 메닝기디티스 (Neisseria meningitidis)유래의 Cas9 단백질, 및 Cpf1로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 유전자 조작용 조성물.
  13. 제11항에 있어서,
    상기 표적서열은 고발현 분비 유전자 서열 중
    엑손;
    인트론;
    5'-UTR(untranslation region);
    3'-UTR; 및
    인핸서; 중 어느 하나 이상의 영역에 포함되는 것
    을 특징으로 하는 유전자 조작용 조성물.
  14. 제11항에 있어서,
    상기 표적서열은 고발현 분비 유전자 서열 중
    엑손; 및
    인트론; 중 어느 하나 이상 영역에 포함되는 것
    을 특징으로 하는 유전자 조작용 조성물.
  15. 제11항에 있어서,
    상기 표적서열은 서열번호 1 내지 348번 중 선택된 1이상인 것을 특징으로 하는 유전자 조작용 조성물.
  16. 제11항에 있어서,
    상기 고발현 분비 유전자는 HP 유전자 및 APOC3 유전자 중 선택된 어느 하나 이상의 유전자인 것을 특징으로 하는 유전자 조작용 조성물.
  17. 제11항에 있어서,
    상기 가이드 핵산은 고발현 분비 유전자의 표적서열에 대한 가이드 도메인을 포함하며, 이때, 상기 가이드 도메인은 0 내지 5개 중 어느 하나의 미스매칭(mismatching)결합을 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자 조작용 조성물.
  18. 제11항에 있어서,
    상기 가이드 핵산은 HP 또는 APOC3의 핵산 서열 중 서열번호 1 내지 348번의 표적서열에 대한 가이드핵산인 것을 특징으로 하는 유전자 조작용 조성물.
  19. 제11항에 있어서,
    상기 가이드핵산은 서열번호 1 내지 11, 서열번호 37 내지 51, 서열번호 154 내지 167 및 서열번호 168 내지 182번 중 어느 하나 이상의 표적서열에 대한 가이드 핵산인 것을 특징으로 하는 유전자 조작용 조성물.
  20. 제11항에 있어서,
    상기 유전자 조작용 조성물은,
    서열번호 1 내지 40번 및 서열번호 154 내지 167번 중 어느 하나 이상의 표적서열에 대한 가이드핵산; 및
    캄필로박터 제주니 (Campylobacter jejuni) 유래의 Cas9단백질 또는 이를 암호화하는 핵산;
    을 포함하는 유전자 조작용 조성물.
  21. 제11항에 있어서,
    상기 유전자 조작용 조성물은,
    서열번호 41 내지 134번 및 서열번호 168 내지 332번 중 어느 하나 이상의 표적서열에 대한 가이드핵산; 및
    스트렙토코커스 피요게네스(Streptococcus pyogenes) 유래의 Cas9단백질 또는 이를 암호화하는 핵산;
    을 포함하는 유전자 조작용 조성물.
  22. 제11항에 있어서,
    상기 유전자 조작용 조성물은,
    서열번호 135 내지 153번 및 서열번호 333 내지 348번 중 어느 하나 이상의 표적서열에 대한 가이드핵산; 및
    스트렙토코커스 아우레우스 (Streptocuccus aureus) 유래의 Cas9단백질 또는 이를 암호화하는 핵산;
    을 포함하는 유전자 조작용 조성물.
  23. 제11항에 있어서,
    상기 이식유전자는 F9 유전자인 것을 특징으로 하는 유전자 조작용 조성물.
  24. 제11항에 있어서,
    상기 가이드핵산, 에디터 단백질 및 공여체는 각각 핵산 서열의 형태로 1이상의 벡터에 암호화되어 있는 것을 특징으로 하는 유전자 조작용 조성물.
  25. 제11항에 있어서,
    상기 벡터는 바이러스 벡터 시스템으로 형성되어있는 것을 특징으로 하는 유전자 조작용 조성물.
  26. 제25항에 있어서,
    상기 바이러스 벡터는 아데노 바이러스, 아데노-연관 바이러스(AAV), 백시니아바이러스, 폭스바이러스, 단순포진 바이러스 및 렌티 바이러스로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 것을 특징으로 하는 유전자 조작용 조성물.
  27. 간에 존재하는 고발현 분비 유전자의 핵산 서열 중 서열번호 1 내지 348번의 표적서열에 대한 가이드 핵산.
  28. 제27항에 있어서,
    상기 가이드 핵산은 상기 가이드핵산은 서열번호 1 내지 12, 서열번호 37 내지 51, 서열번호 154 내지 167 및 서열번호 168 내지 182 중 어느 하나 이상의 표적서열에 대한 가이드 핵산.
  29. 제27항에 있어서,
    상기 가이드 핵산은 18 내지 25bp의 뉴클레오타이드인 가이드 핵산.
  30. 간세포의 게놈 내 인위적으로 삽입된 이식유전자를 발현하는 간세포로서,
    상기 인위적으로 삽입된 이식유전자는 고발현 분비 유전자 서열 내 위치하고,
    상기 고발현 분비 유전자는 FTL 유전자, FTH1 유전자, ACTB 유전자, HP 유전자, APOC3 유전자, SOD2 유전자, ORM1 유전자, 및 F9 유전자 중에서 선택된 하나 이상의 유전자이며,
    상기 이식유전자로부터 발현된 목적하는 단백질을 포함하는 간세포.
  31. 제30항에 있어서,
    상기 고발현 분비 유전자는 HP 유전자 및 APOC3 유전자 중 선택된 어느 하나 이상의 유전자인 것을 특징으로 하는 간세포.
  32. 제30항에 있어서,
    상기 이식유전자가 포함되어 있는 고발현 분비 유전자 게놈 내 위치는 엑손 또는 인트론인 것을 특징으로 하는 간세포.
  33. 제30항에 있어서,
    상기 인위적으로 삽입된 이식유전자는 간세포 게놈 내 프로모터에 의해 발현되는 것을 특징으로 하는 간세포.
  34. 제30항에 있어서,
    상기 이식유전자는 F9 유전자인 것을 특징으로 하는 간세포.
  35. 간세포 게놈에 존재하는 고발현 분비 유전자 내 인위적으로 이식유전자를 삽입하여 목적하는 단백질을 발현하기 위한 유전자 조작 방법으로서,
    상기 고발현 분비 유전자인 FTL 유전자, FTH1 유전자, ACTB 유전자, HP 유전자, APOC3 유전자, SOD2 유전자, ORM1 유전자, 및 F9 유전자에서 선택된 하나 이상의 유전자를 인위적으로 조작하기 위한 인위적으로 조작된 뉴클레아제; 및
    이식유전자를 포함하는 공여체서열을 간세포에 도입하는 단계를 포함하는
    유전자 조작 방법.
  36. 제35항에 있어서,
    상기 고발현 분비 유전자는 HP유전자 및 APOC3유전자 중 선택된 어느 하나 이상의 유전자인 것을 특징으로 하는 목적하는 단백질 발현하기 위한 유전자 조작 방법.
  37. 제35항에 있어서,
    상기 이식유전자는 F9 유전자인 것을 특징으로 하는 유전자 조작 방법.
  38. 제35항에 있어서,
    상기 인위적으로 조작된 뉴클레아제는 CRISPR/Cas 시스템이고, 상기 CRISPR/Cas 시스템은 간세포 게놈 내 존재하는 고발현 분비 유전자 군에서 선택된 하나 이상의 유전자의 표적서열에 대한 가이드핵산 및 에디터단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자 조작 방법.
  39. 제38항에 있어서,
    상기 표적서열은 고발현 분비 유전자 서열 중
    엑손;
    인트론;
    5’(region);
    3’; 및
    인핸서; 중 어느 하나 이상의 영역에 포함되는 것
    을 특징으로 하는 유전자 조작 방법.
  40. 제38항에 있어서,
    상기 표적서열은 고발현 분비 유전자 서열 중
    엑손; 및
    인트론; 중 어느 하나 이상 영역에 포함되는 것
    을 특징으로 하는 유전자 조작 방법.
  41. 제38항에 있어서,
    상기 가이드 핵산은 고발현 분비 유전자 군에서 선택된 하나 이상의 유전자의 핵산 서열 중 서열번호 1 내지 348번 중 하나 이상의 표적서열에 대한 가이드핵산인 것을 특징으로 하는 유전자 조작 방법.
  42. 제38항에 있어서,
    상기 가이드핵산은 서열번호 1 내지 15, 서열번호 37 내지 51, 서열번호 154 내지 167 및 서열번호 168 내지 182번 중 하나 이상의 표적서열에 대한 가이드 핵산인 것을 특징으로 하는 유전자 조작 방법.
  43. 제38항에 있어서,
    상기 에디터 단백질은 스트렙토코커스 피요게네스(Streptococcus pyogenes) 유래의 Cas9 단백질, 캄필로박터 제주니 (Campylobacter jejuni) 유래의 Cas9 단백질, 스트렙토코커스 써모필러스 (Streptococcus thermophiles) 유래의 Cas9 단백질, 스트렙토코커스 아우레우스 (Streptocuccus aureus) 유래의 Cas9 단백질, 네이세리아 메닝기디티스 (Neisseria meningitidis)유래의 Cas9 단백질, 및 Cpf1 단백질로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 유전자 조작 방법.
  44. 제35항 또는 제38항에 있어서,
    상기 가이드핵산, 에디터단백질 및 공여체는 각각 핵산 서열의 형태로 1이상의 벡터의 형태로 제공되는 것을 특징으로 유전자 조작 방법.
  45. 제44항에 있어서
    상기 벡터는 바이러스 벡터 시스템으로 형성되어 있는 것을 특징으로 하는 유전자 조작 방법.
  46. 제45항에 있어서.
    상기 바이러스 벡터는 아데노 바이러스, 아데노-연관 바이러스(AAV), 백시니아바이러스, 폭스바이러스, 단순포진 바이러스 및 렌티 바이러스 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 것을 특징으로 하는 유전자 조작 방법.
  47. 제44항에 있어서,
    상기 벡터는 전신투여 또는 국소적용의 방법으로 도입되는 것을 특징으로 하는 유전자 조작 방법.
  48. 제47항에 있어서,
    상기 전신투여는 정맥 내 투여인 것을 특징으로 하는 유전자 조작 방법.
  49. 제35항에 있어서,
    상기 인위적으로 조작된 뉴클레아제 및 공여체를 간세포에 도입하는 단계는 생체 내(in vivo) 또는 생체 외(ex vivo)에서 수행되는 것을 포함하는 유전자 조작 방법.
  50. 혈우병 치료 방법으로서,
    간세포 게놈 내 인위적으로 삽입된 이식유전자를 발현시키기 위한 유전자 조작용 조성물을 치료 대상에 투여하는 단계를 포함하고,
    상기 유전자 조작용 조성물은 Clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPR)-CRISPR associated protein(Cas) system, Zinc finger nuclease(ZFN), Transcription activator-like effector nuclease(TALEN)의 인위적으로 조작된 뉴클레아제 중 어느 하나를 포함하며,
    상기 공여체 서열에 포함되는 이식유전자는 HP 유전자 및 APOC3 유전자 중 하나 이상의 유전자 서열 내 인위적으로 삽입되고,
    상기 이식유전자는 F9인 것을 특징으로 하는
    혈우병 치료 방법.
  51. 제50항에 있어서,
    상기 인위적으로 조작된 뉴클레아제는 간세포 게놈 내 존재하는 고발현 분비 유전자 군에서 선택된 하나 이상의 유전자의 표적서열에 대한 가이드핵산; 및
    스트렙토코커스 피요게네스(Streptococcus pyogenes) 유래의 Cas9 단백질, 캄필로박터 제주니 (Campylobacter jejuni) 유래의 Cas9 단백질, 스트렙토코커스 써모필러스 (Streptococcus thermophiles) 유래의 Cas9 단백질, 스트렙토코커스 아우레우스 (Streptocuccus aureus) 유래의 Cas9 단백질, 네이세리아 메닝기디티스 (Neisseria meningitidis)유래의 Cas9 단백질, 및 Cpf1 단백질로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 에디터단백질 또는 에디터단백질을 암호화하는 핵산;
    으로 구성된 CRISPR/Cas 시스템인 것을 포함하는 혈우병 치료 방법.
  52. 제51항에 있어서,
    상기 가이드핵산은 HP 유전자 또는 APOC3 유전자의 핵산 서열 중 서열번호 1 내지 348번 중 하나 이상의 표적서열에 대한 가이드 핵산인 것을 특징으로 하는 혈우병 치료 방법.
  53. 제51항에 있어서,
    상기 가이드핵산은 서열번호 1 내지 15, 서열번호 37 내지 51, 서열번호 154 내지 167 및 서열번호 168 내지 182번 중 하나 이상의 표적서열에 대한 가이드핵산인 것을 특징으로 하는 혈우병 치료 방법.
  54. 제50항 또는 51항에 있어서,
    상기 가이드핵산, 에디터단백질 및 공여체는 각각 핵산 서열의 형태로 1이상의 벡터에 암호화되어 있는 것을 특징으로 혈우병 치료 방법.
  55. 제54항에 있어서,
    상기 벡터는 바이러스벡터인 것을 특징으로 하는 혈우병 치료 방법.
  56. 제50항에 있어서,
    상기 조성물을 치료 대상에 투여하는 단계는 전신투여인 것을 특징으로 하는 혈우병 치료 방법.
  57. 제56항에 있어서,
    상기 전신투여는 정맥 내 투여인 것을 특징으로 하는 혈우병 치료 방법.

KR1020180069242A 2017-06-15 2018-06-15 간에서 목적하는 단백질 발현하기 위한 플랫폼 KR20180136914A (ko)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201762520103P 2017-06-15 2017-06-15
US62/520,103 2017-06-15
US201862662907P 2018-04-26 2018-04-26
US62/662,907 2018-04-26

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20180136914A true KR20180136914A (ko) 2018-12-26

Family

ID=64660524

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020180069242A KR20180136914A (ko) 2017-06-15 2018-06-15 간에서 목적하는 단백질 발현하기 위한 플랫폼

Country Status (9)

Country Link
US (2) US11667934B2 (ko)
EP (1) EP3640335A4 (ko)
JP (2) JP7123982B2 (ko)
KR (1) KR20180136914A (ko)
CN (1) CN110997924A (ko)
AU (1) AU2018283686A1 (ko)
CA (1) CA3067316A1 (ko)
SG (1) SG11201911623WA (ko)
WO (1) WO2018231018A2 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023140694A1 (ko) * 2022-01-24 2023-07-27 주식회사 툴젠 스트렙토코커스 피오게네스 유래 cas9 변이체

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SG11202111256XA (en) 2019-06-07 2021-11-29 Regeneron Pharma Non-human animals comprising a humanized albumin locus
CN113058041B (zh) * 2020-08-27 2022-04-05 华东师范大学 一种用于治疗庞贝氏病的产品
CA3167681A1 (en) 2020-01-14 2021-07-22 Toolgen Incorporated Cells having high adaptability under hypoxic conditions, and use thereof
WO2022026606A2 (en) * 2020-07-28 2022-02-03 Sigilon Therapeutics, Inc. Genetically modified cell lines expressing an exogenous substance and uses thereof
KR20230107750A (ko) 2022-01-07 2023-07-18 주식회사 툴젠 유전자 편집 과정에서 발생 가능한 오프 타겟을 예측하는 방법
WO2023153811A1 (ko) 2022-02-08 2023-08-17 주식회사 툴젠 프라임 에디팅 시스템을 이용한 게놈 편집의 과정에서 발생 가능한 오프 타겟을 예측하는 방법

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0460056A4 (en) * 1989-02-24 1992-06-24 Southwest Foundation For Biomedical Research Non-a, non-b hepatitis hepatocyte cell culture
WO2012051343A1 (en) * 2010-10-12 2012-04-19 The Children's Hospital Of Philadelphia Methods and compositions for treating hemophilia b
ES2961613T3 (es) 2011-09-21 2024-03-12 Sangamo Therapeutics Inc Métodos y composiciones para la regulación de la expresión transgénica
CN116083487A (zh) 2013-05-15 2023-05-09 桑格摩生物治疗股份有限公司 用于治疗遗传病状的方法和组合物
EP3757116A1 (en) 2013-12-09 2020-12-30 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for genome engineering
KR20160089527A (ko) 2013-12-12 2016-07-27 더 브로드 인스티튜트, 인코퍼레이티드 게놈 편집을 위한 ｃｒｉｓｐｒ-ｃａｓ 시스템 및 조성물의 전달, 용도 및 치료적 응용
US10612041B2 (en) * 2014-03-21 2020-04-07 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Genome editing without nucleases
CN105316530A (zh) * 2014-07-10 2016-02-10 中国科学院金属研究所 一种用于制备氢气的铝基合金
CN107295802B (zh) 2014-09-24 2021-06-29 希望之城 用于高效基因组编辑的腺相关病毒载体变异体和其方法
CN109328231A (zh) 2015-11-06 2019-02-12 克里斯普治疗股份公司 用于治疗1a型糖原贮积病的材料和方法
WO2017093804A2 (en) * 2015-12-01 2017-06-08 Crispr Therapeutics Ag Materials and methods for treatment of alpha-1 antitrypsin deficiency
CN105462968B (zh) * 2015-12-07 2018-10-16 北京信生元生物医学科技有限公司 一种靶向apoCⅢ的CRISPR-Cas9系统及其应用

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023140694A1 (ko) * 2022-01-24 2023-07-27 주식회사 툴젠 스트렙토코커스 피오게네스 유래 cas9 변이체

Also Published As

Publication number Publication date
US20230287461A1 (en) 2023-09-14
SG11201911623WA (en) 2020-01-30
JP2020527030A (ja) 2020-09-03
AU2018283686A1 (en) 2020-01-30
JP2022166155A (ja) 2022-11-01
US11667934B2 (en) 2023-06-06
WO2018231018A3 (ko) 2019-02-07
EP3640335A4 (en) 2021-03-31
CA3067316A1 (en) 2018-12-20
JP7123982B2 (ja) 2022-08-23
EP3640335A2 (en) 2020-04-22
US20210095316A1 (en) 2021-04-01
WO2018231018A2 (ko) 2018-12-20
AU2018283686A2 (en) 2020-02-13
CN110997924A (zh) 2020-04-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20230340456A1 (en) Use of exonucleases to improve crispr/cas-mediated genome editing
US20220135970A1 (en) Crispr/cas-related methods and compositions for treating usher syndrome and retinitis pigmentosa
US11268086B2 (en) CRISPR/CAS-related methods and compositions for treating Leber&#39;s Congenital Amaurosis 10 (LCA10)
US20210139872A1 (en) Crispr having or associated with destabilization domains
US20230287461A1 (en) Platform for expressing protein of interest in liver
KR102523466B1 (ko) 지배적인 gRNA를 이용하는 CRISPR-관련 방법 및 조성물
KR20210023832A (ko) 프로그래밍가능한 염기 편집기 시스템을 이용하여 단일염기다형성을 편집하는 방법
KR20160044457A (ko) 서열 조작을 위한 탠덤 안내 시스템, 방법 및 조성물의 전달, 조작 및 최적화
KR102621539B1 (ko) 인위적으로 조작된 sc 기능 조절 시스템
JP2024050582A (ja) 新規のｏｍｎｉ－５０ｃｒｉｓｐｒヌクレアーゼ
US20200101173A1 (en) Genome Editing System For Repeat Expansion Mutation
KR20200012786A (ko) 항응고 인자들의 유전자 에디팅
US20230190889A1 (en) Gene editing of anticoagulant factors
JP2024532784A (ja) 新規なｏｍｎｉ－１１５、１２４、１２７、１４４～１４９、１５９、２１８、２３７、２４８、２５１～２５３及び２５９ｃｒｉｓｐｒヌクレアーゼ
WO2023081070A1 (en) Nme2Cas9 INLAID DOMAIN FUSION PROTEINS

Legal Events

Date Code Title Description
E902 Notification of reason for refusal
X701 Decision to grant (after re-examination)