KR20200065045A - 코눌린(crnn) 변이체 및 이의 용도 - Google Patents

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KR20200065045A
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nucleic acid
conulin
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클라우디아 곤자가-자우리구이
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리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드
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Abstract

본 기재 내용은 기능-소실 코눌린(CRNN) 단백질을 암호화하는 변이를 포함하는 cDNA를 포함하는 핵산 분자를 제공한다. 본 기재 내용은 또한 위치 79에 상응하는 위치에서 절단부를 포함하는 분리된 및 재조합의 인간 기능-소실 코눌린 단백질 변이체를 제공한다. 절단부 및 이러한 변화를 암호화하는 핵산 분자는, 피부 장애, 예컨대 건선, 습진 또는 아토피성 피부염과 관련된다. 본 기재 내용은 또한 CRNN를 암호화하는 핵산 분자 내의 이러한 변이의 식별에 기초하여, 대상체가 피부 장애를 갖거나, 또는 피부 장애를 발달시킬 위험을 갖는지 여부를 결정하기 위한 방법을 제공한다. 피부 장애에 대한 위험이 있거나 또는 피부 장애를 갖는 대상체는, 피부 장애를 치료하는데 효과적인 제제로 치료될 수 있다.

Description

코눌린(CRNN) 변이체 및 이의 용도
서열 목록에 대한 참고
본 출원은 2018년 10월 14일에 생성된 18923800402SEQ이라는 명칭의 텍스트 파일로서 전자적으로 제출된 서열 목록을 포함하는데, 이는 24 킬로바이트의 크기를 갖는다. 상기 서열 목록은 본원에 참고로 포함된다.
본 발명의 기술 분야
본 기재 내용은 전반적으로 유전학 분야에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 기재 내용은 예를 들어, 피부 장애와 관련된 코눌린(Cornulin, CRNN)의 유전자 변이 및 폴리펩티드 변이체에 관한 것이다.
자가면역 장애는 다양한 장기(organ)에서 상이한 중증도의 정도로 발병할 수 있다. 특정 자가면역 장애는 염증이 있는 피부 발현이 명백하게 나타날 수 있고, 이들 면역-관련 피부 장애, 예컨대 건선(psoriasis), 습진(eczema), 또는 아토피성 피부염(atopic dermatitis)으로 고통받는 환자에게는 다른 이상이 실질적인 물리적 및 생리적 고통을 유발할 수 있다. 건선은 근본적으로 피부과학적 징후를 갖지만, 또한 신체의 관절 및 일부 점막 영역에서도 발병할 수 있는 면역 관련 장애이다. 상기 질병으로 고통받는 환자는 딱지(scale)라고 불리는 피부의 건조한 조각, 또는 다른 병변, 예컨대 농포(pustule) 및 뾰루지(papule)의 출현 이외에도, 염증, 통증 및 가려움을 호소한다. 가계 내에서의 피부 장애, 예컨대 건선의 발생은 논문에 의해 잘 입증되어 있고, 따라서 유전이 이들 질병의 발달에 대한 취약성에 상당한 역할을 한다고 추론된다.
그러나, 주조직 적합성 복합체 이외에, 소수의 유전자들이 질병의 발달, 또는 질병 발생에 대한 취약성 부여에 대한 상당한 기여자로서 확인되었다.
본 발명의 개요
본 기재 내용은 피부 장애, 예컨대 건선, 습진 및 아토피성 피부염과 관련된 것으로 본원에서 입증된, CRNN 변이체 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자(즉, 게놈 DNA, mRNA, 및 cDNA), 및 CRNN 변이체 폴리펩티드를 제공한다.
본 기재 내용은 인간 CRNN 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자, 또는 상기 핵산 서열의 상보체를 제공하는데, 여기에서 상기 단백질은 서열번호: 8에 의한 위치 79에 상응하는 위치에서 절단된 기능-소실 CRNN 단백질 또는 CRNN 단백질이다.
본 기재 내용은 또한 인간 CRNN 단백질의 적어도 일부를 암호화하는 핵산 서열, 또는 상기 핵산 서열의 상보체를 포함하는 게놈 DNA 분자를 제공하는데, 여기에서 상기 단백질은 서열번호: 8에 의한 위치 79에 상응하는 위치에서 절단된 기능-소실 CRNN 단백질 또는 CRNN 단백질이다.
본 기재 내용은 또한 인간 CRNN 단백질의 적어도 일부를 암호화하는 핵산 서열, 또는 상기 핵산 서열의 상보체를 포함하는 cDNA 분자를 제공하는데, 여기에서 상기 단백질은 서열번호: 8에 의한 위치 79에 상응하는 위치에서 절단된 기능-소실 CRNN 단백질 또는 CRNN 단백질이다.
본 기재 내용은 또한 인간 CRNN 단백질의 적어도 일부를 암호화하는 핵산 서열, 또는 상기 핵산 서열의 상보체를 포함하는 mRNA 분자를 제공하는데, 여기에서 상기 단백질은 서열번호: 8에 의한 위치 79에 상응하는 위치에서 절단된 기능-소실 CRNN 단백질 또는 CRNN 단백질이다.
본 기재 내용은 또한 본원에 기재된 임의의 분리된 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제공한다.
본 기재 내용은 또한 본원에 기재된 임의의 분리된 핵산 분자 또는 벡터, 및 담체를 포함하는 조성물을 제공한다.
본 기재 내용은 또한 임의의 분리된 핵산 분자 또는 본원에 기재된 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
본 기재 내용은 또한 인간 CRNN 단백질의 적어도 일부를 포함하는 분리된 또는 재조합 폴리펩티드를 제공하는데, 여기에서 상기 단백질은 서열번호: 8에 의한 위치 79에 상응하는 위치에서 절단된 기능-소실 CRNN 단백질 또는 CRNN 단백질이다.
본 기재 내용은 또한 본원에 기재된 임의의 분리된 또는 재조합 폴리펩티드, 및 담체를 포함하는 조성물을 제공한다.
본 기재 내용은 또한 적어도 약 5개 뉴클레오티드를 포함하는 핵산 서열을 포함하는 프로브 또는 프라이머를 제공하는데, 이는 인간 CRNN 단백질을 암호화하는 핵산 서열과 혼성화하되, 여기에서 상기 단백질은 서열번호: 8에 의한 위치 79에 상응하는 위치에서 절단된 기능-소실 CRNN 단백질 또는 CRNN 단백질이거나, 또는 인간 CRNN 단백질을 암호화하는 상기 핵산 서열의 상보체와 혼성화하되, 여기에서 상기 단백질은 서열번호: 8에 의한 위치 79에 상응하는 위치에서 절단된 기능-소실 CRNN 단백질 또는 CRNN 단백질이다.
본 기재 내용은 또한 본원에 기재된 임의의 프로브와 혼성화하는 기질을 포함하는 지지체를 제공한다.
본 기재 내용은 또한 서열번호: 8에 의한 위치 79에 상응하는 위치에서 절단된 기능-소실 CRNN 단백질 또는 CRNN 단백질을 암호화하는 핵산 서열에 상보적인 핵산 서열을 포함하는 변이-특이적인 프로브 또는 프라이머를 제공하는데, 여기에서 상기 변이-특이적인 프로브 또는 프라이머는 서열번호: 8에 의한 위치 69 내지 76, 78, 또는 79에 상응하는 임의의 복수의 위치들을 암호화하는 핵산 분자의 일부에 상보적인 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 변이-특이적인 프로브 또는 프라이머는 서열번호: 8에 의한 위치 69에 상응하는 위치를 암호화하는 핵산 분자, 또는 이의 상보체의 일부와 특이적으로 혼성화한다. 변이-특이적인 프로브 또는 프라이머는 야생형 CRNN 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 갖는 핵산 분자와는 혼성화하지 않는다.
본 기재 내용은 또한 피부 장애, 또는 피부 장애를 발달시킬 위험이 있는 인간 대상체를 식별하기 위한 방법을 제공하는데, 여기에서 상기 방법은 대상체로부터 얻은 샘플에서, 기능-소실 CRNN 단백질 또는 절단된 CRNN 단백질; 및/또는 상기 기능-소실 CRNN 단백질 또는 절단된 CRNN 단백질을 암호화하는 핵산 분자의 존재 또는 부재를 탐지하는 단계를 포함하되; 여기에서 상기 기능-소실 CRNN 단백질 또는 절단된 CRNN 단백질 및/또는 상기 기능-소실 CRNN 단백질 또는 절단된 CRNN 단백질을 암호화하는 핵산 분자의 존재는, 대상체가 피부 장애, 또는 피부 장애를 발달시킬 위험이 있음을 나타낸다.
본 기재 내용은 또한 피부 장애, 또는 피부 장애를 발달시킬 위험이 있는 인간 대상체를 식별하기 위한 방법을 제공하는데, 여기에서 상기 방법은 대상체로부터 얻은 샘플에서, 번호: 8에 의한 위치 79에 상응하는 위치에서 절단된 기능-소실 CRNN 단백질 또는 CRNN 단백질; 및/또는 서열번호: 8에 의한 위치 79에 상응하는 위치에서 절단된 기능-소실 CRNN 단백질 또는 CRNN 단백질을 암호화하는 핵산 분자의 존재 또는 부재를 탐지하는 단계를 포함하되; 여기에서 상기 기능-소실 CRNN 단백질 또는 CRNN 단백질 및/또는 상기 기능-소실 CRNN 단백질 또는 CRNN 단백질을 암호화하는 핵산 분자의 존재는, 대상체가 피부 장애, 또는 피부 장애를 발달시킬 위험이 있음을 나타낸다.
본 기재 내용은 또한 인간 대상체에서 피부 장애를 진단하거나, 또는 피부 장애를 발달시킬 위험을 탐지하는 방법을 제공하는데, 이는 인간 대상체로부터 얻은 CRNN 단백질을 암호화하는 핵산 분자에서 변이를 탐지하되, 여기에서 상기 변이는 기능-소실 CRNN 단백질 또는 절단된 CRNN 단백질을 암호화하는 단계; 및 대상체가 피부 장애의 하나 이상의 증상을 갖는 경우 상기 인간 대상체가 피부 장애를 갖는 것으로 진단하고, 또는 대상체가 피부 장애의 하나 이상의 증상을 갖지 않는 경우 상기 인간 대상체가 피부 장애를 발달시킬 위험성이 있는 것으로 진단하는 단계를 포함한다.
본 기재 내용은 또한 인간 대상체에서 피부 장애를 진단하거나 또는 피부 장애를 발달시킬 위험을 탐지하기 위한 방법을 제공하는데, 이는 인간 대상체로부터 얻은 CRNN 단백질을 암호화하는 핵산 분자에서 변이를 탐지하되, 여기에서 상기 변이는 서열번호: 8에 의한 위치 79에 상응하는 위치에서 절단된 기능-소실 CRNN 단백질 또는 CRNN 단백질을 암호화하는 단계; 및 대상체가 피부 장애의 하나 이상의 증상을 갖는 경우 상기 인간 대상체가 피부 장애를 갖는 것으로 진단하고, 또는 대상체가 피부 장애의 하나 이상의 증상을 갖지 않는 경우, 인간 대상체가 피부 장애를 발달시킬 위험이 있는 것으로 진단하는 단계를 포함한다.
본 기재 내용은 또한 기능-소실 CRNN 단백질 또는 절단된 CRNN 단백질을 갖는 인간 대상체에서, 피부 장애의 치료에 사용하기 위한 제제를 제공한다.
본 기재 내용은 또한 기능-소실 CRNN 단백질을 갖는 인간 대상체에서, 피부 장애의 치료에 사용하기 위한 제제를 제공한다.
본 기재 내용은 또한 서열번호: 8에 의한 위치 79에 상응하는 위치에서 절단된 CRNN 단백질을 갖는 인간 대상체에서, 피부 장애의 치료에 사용하기 위한 제제를 제공한다.
첨부된 도면은, 본 명세서에 포함되어 이의 일부를 구성하며, 몇 가지 측면들을 예시하고, 상세한 설명과 함께 본 기재 내용의 원칙을 설명하는 역할을 한다.
도 1(패널 A, B, C 및 D)은 건선으로 진단된 피부 장애를 갖는 가계에서, CRNN 단백질의 위치 79에서의 프레임쉬프트(frameshift) 및 하류 절단을 생성하는 CRNN 유전자의 삽입 신규 희소 변이체의 식별 및 분리를 나타낸다.
본 기재 내용의 추가적인 장점은 이하의 상세한 설명에서 부분적으로 제시될 것이고, 부분적으로는 상세한 설명으로부터 명백하거나, 또는 본원에 기재된 구현예를 실행함으로서 배울 수 있다. 본 기재 내용의 장점은 첨부된 청구항에서 특히 지목한 요소들 또는 조합에 의해 실현 및 달성될 것이다. 상기의 일반적인 설명 및 이하의 상세한 설명은 모두 예시적이고, 단지 설명적이며, 청구된 바와 같은 구현예를 제한하는 것이 아닌 것으로 해석될 것이다.
피부 장애, 예컨대 건선, 습진, 또는 아토피성 피부염을 갖는 가계 내에서의 희소한 변이체의 연구는, 보균자 개체가 질병 발현을 유발할 수 있는 환경적인 유해물에 더욱 취약하게 만들 수 있는 면역 조절 또는 상피 분화, 무결성 및 유지에 관여하는 것들을 포함하는, 질병 발달에 역할을 하는 신규한 유전자를 발견할 주요 기회를 제공한다. 본 기재 내용은 CRNN의 생물학을 이해하는데 도움이 되고, 피부 장애를 갖는 대상체의 진단 및 치료를 용이하게 할 CRNN 변이체를 제공한다.
특허, 특허 출원, 수탁 번호, 기술적인 논문 및 학문적인 논문을 포함하는 다양한 참고문헌은 명세서 전체에 걸쳐 인용된다. 각각의 참고문헌은 본원에서 모든 목적을 위해 전체가 참고로 포함된다.
기재 내용의 측면에 관한 다양한 용어는 명세서 및 청구항 전체에서 사용된다. 이러한 용어는 달리 기재되지 않는 한, 당업계에서 이들의 통상의 의미가 되도록 주어진다. 다른 구체적으로 정의된 용어는 본원에서 제공된 정의와 일치하는 식으로 해석될 것이다.
명확히 달리 진술되지 않는 한, 본원에서 제시된 임의의 방법 또는 측면은 이의 단계들이 특정 순서로 실시될 것을 요구하는 것으로 이해되는 것은 아니다. 따라서, 단계들이 특정 순서로 제한되는 방법 청구항이 청구항 또는 상세한 설명에 구체적으로 기재되어 있지 않는 경우, 이는 어떠한 면에서도 순서가 추론되는 것으로 의도되지 않는다. 이것은 단계들 또는 운영 순서도, 문법적인 조직화 또는 구두점, 또는 명세서에 기재된 측면들의 수 또는 유형으로부터 유래된 명백한 의미의 배열에 대한 논리의 문제를 포함하는 해석에 대한 임의의 가능한 비-표현 기초에 대해서도 마찬가지이다.
본원에 사용된 단수 형태 "a", "an" 및 "the"는, 문맥상 명확히 달리 기재된 바 없는 경우, 복수형 언급을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "대상체(subject)" 및 "환자(patient)"는, 상호교환적으로 사용된다. 대상체는 포유류를 포함하는 임의의 동물을 포함할 수 있다. 포유류는 제한 없이, 농장 동물(예를 들어, 말, 소, 돼지), 반려 동물(예를 들어, 개, 고양이), 실험 동물(예를 들어, 마우스, 래트, 토끼), 및 비-인간 영장류를 포함한다. 일부 구현예에서, 대상체는 인간이다.
본원에 사용된 "핵산(nucleic acid)", "핵산 분자(nucleic acid molecule)", "핵산 서열(nucleic acid sequence)", "폴리뉴클레오티드(polynucleotide)", 또는 "올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)"는, 임의의 길이의 뉴클레오티드의 중합체 형태를 포함할 수 있고, DNA 및/또는 RNA를 포함할 수 있고, 단일-가닥, 이중-가닥 또는 다수 가닥일 수 있다. 핵산의 한 가닥은 또한 이의 상보체(complement)라고도 지칭된다.
본원에 사용된 어구 "~에 상응하는(corresponding to)" 또는 이의 문법적인 변이체는, 소정의 아미노산 또는 핵산 서열 또는 위치의 번호매김의 맥락에서 사용될 때, 소정의 아미노산 또는 핵산 서열이 참고 서열[예를 들어, 참고 서열은 본원에서 CRNN의 (야생형 또는 전체 길이의) 핵산 분자 또는 폴리펩티드임]과 비교될 때의, 특정 참고 서열의 번호매김을 지칭한다. 달리 말해, 소정의 중합체의 잔기(예를 들어, 아미노산 또는 뉴클레오티드) 수 또는 잔기(예를 들어, 아미노산 또는 뉴클레오티드) 위치는, 소정의 아미노산 또는 핵산 서열 내에서의 잔기의 실제 숫자 위치보다는 오히려, 참고 서열에 대해 지정된다. 예를 들어, 소정의 아미노산 서열은 두 서열들 간의 잔기 매칭을 최적화하기 위해 갭을 도입함으로서, 참고 서열에 대해 정렬될 수 있다. 이들 경우에, 비록 갭이 존재하기는 하지만, 소정의 아미노산 또는 핵산 서열 내의 잔기의 번호 매김은 정렬되는 참고 서열에 대해 이루어진다.
예를 들어, 어구 "서열번호: 8에 의한 위치 79에 상응하는 위치에서 절단된 CRNN 단백질" (및 유사 어구)는, CRNN 단백질의 아미노산 서열이 서열번호: 8의 서열과 정렬되는 경우, CRNN 단백질은 서열번호: 8의 위치 79에 상응하는 위치에서 절단되는 것을 의미한다(예를 들어, CRNN 단백질의 말단 아미노산은 위치 79의 아미노산임). 또는, 달리 말해, 이들 어구는 서열번호: 8의 위치 79와 일치하는 위치에서 절단을 갖는 CRNN 단백질을 지칭한다. 본원에서, 이러한 단백질은 또한 "절단된 CRNN 단백질(truncated CRNN protein)"로서 지칭된다. "변이체 CRNN 단백질(variant CRNN protein)"은 절단된 CRNN 단백질 및 기능-소실 CRNN 단백질 둘 다를 포함한다.
서열번호: 8에 의한 위치 79에 상응하는 위치에서 절단된 CRNN 단백질은, 소정의 CRNN 단백질과 서열번호: 8의 아미노산 서열 간에 서열 정렬을 실시함으로서 용이하게 식별될 수 있다. 마찬가지로, 서열번호: 8에 의한 위치 69에 상응하는 위치에서 시스테인을 갖는 CRNN 단백질은, 소정의 CRNN 단백질과 서열번호: 8의 아미노산 서열들 간에 서열 정렬을 실시함으로서 용이하게 식별될 수 있다. 서열번호: 8의 위치 79에 상응하는 위치에서 절단을 확인하기 위해, 또는 서열번호: 8에 의한 위치 69에 상응하는 위치에서 시스테인을 확인하기 위해, 서열 정렬을 실시하는데 사용될 수 있는 다양한 컴퓨터 알고리즘이 존재한다. 예를 들어, NCBI BLAST 알고리즘(Altschul 등, 1997, Nucleic acids Res., 25, 3389-3402) 또는 CLUSTALW 소프트웨어(Sievers 등, 2014, Methods Mol. Biol., 1079, 105-116)를 사용함으로서, 서열 정렬을 실시할 수 있다. 그러나, 서열은 또한 수동으로 정렬될 수도 있다.
본 기재 내용에 의하면, CRNN에서의 특정 변이가 피부 장애를 발달시킬 위험과 연관된다고 관찰되었다. CRNN 유전자 또는 단백질의 변이체는 인간에서 피부 장애와의 어떠한 관련성도 알려지지 않았다고 여겨진다. 발병한 가계 구성원에서 피부 장애의 표현형으로 분리하는 CRNN 유전자의 희소한 변이체는, 본 기재 내용에 따라 식별되었다. 예를 들어, 인간 CRNN mRNA 또는 cDNA(예를 들어, 각각 서열번호: 4 및 서열번호: 6)의 위치 205에 티민이 삽입되도록 하는 유전적 변이는, 서열번호: 8에 의한 위치 79에 상응하는 위치에서 절단된 CRNN 단백질(예를 들어, 말단 아미노산은 위치 79에 위치함)을 생성하는 프레임쉬프트를 발생시키는데, 이러한 변이를 갖는 인간은 피부 장애, 예컨대 건선을 발달시킬 수 있다는 것을 나타내는 것으로 관찰되었다. 전체적으로, 본원에 기재된 유전적 분석은 CRNN 유전자, 및 특히 CRNN 유전자의 절단 또는 기능-소실 변이체가, 피부 장애, 예컨대 건선을 발달시킬 취약성의 증가와 관련된다는 것을 암시한다. 따라서, 피부 장애와 관련된 CRNN 변이를 갖는 인간 대상체는 피부 장애가 저해되고, 이의 증상이 감소되고, 및/또는 증상의 발달이 억제되도록 치료될 수 있다. 따라서, 본 기재 내용은 cDNA 및 mRNA를 포함하는 분리된 또는 재조합 CRNN 변이체 유전자, 뿐만 아니라 분리된 또는 재조합 CRNN 변이체 폴리펩티드를 제공한다. 추가적으로, 본 기재 내용은 이러한 대상체에서 피부 장애를 발달시킬 위험을 식별 또는 등급화하거나, 또는 대상체가 피부 장애를 갖는다고 진단하기 위해, 대상체에서 이러한 변이체의 식별에 영향을 줄 수 있는(leveraging) 방법을 제공하여, 위험을 갖는 대상체 또는 활성형 질병을 갖는 대상체가 치료될 수 있다.
야생형 CRNN 단백질에 대한 아미노산 서열은 서열번호: 7에 제시되어 있다. 서열번호: 7을 갖는 야생형 CRNN 단백질은 495개 길이의 아미노산이다. 서열번호: 7을 참고하면, 야생형 CRNN 단백질의 위치 69 내지 79는 이하의 아미노산: Val-Glu-Phe-Lys-Glu-Phe-Leu-Val-Leu-Val-Phe(서열번호:9)을 인용된 순서로 포함한다.
본 기재 내용은 피부 장애, 예컨대 건선, 습진 및 아토피성 피부염과 관련된 것으로 본원에서 입증된 CRNN 변이체 폴리펩티드를 암호하하는 핵산 분자(즉, 게놈 DNA, mRNA, 및 cDNA) 및 CRNN 변이체 폴리펩티드를 제공한다.
본 기재 내용은 인간 CRNN 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자, 또는 상기 핵산 서열의 상보체를 제공하는데, 여기에서 상기 단백질은 서열번호: 8에 의한 위치 79에 상응하는 위치에서 절단된 기능-소실 CRNN 단백질 또는 CRNN 단백질이다.
본 기재 내용은 또한 인간 CRNN 단백질의 적어도 일부를 암호화하는 핵산 서열, 또는 상기 핵산 서열의 상보체를 포함하는 게놈 DNA 분자를 제공하는데, 여기에서 상기 단백질은 서열번호: 8에 의한 위치 79에 상응하는 위치에서 절단된 기능-소실 CRNN 단백질 또는 CRNN 단백질이다.
본 기재 내용은 피부 장애와 관련된 CRNN 변이체 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 제공한다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 기능-소실 CRNN 단백질을 암호화한다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 절단된 CRNN 단백질을 암호화한다. 예를 들어, 본 기재 내용은 인간 CRNN 단백질을 암호화화는 핵산 서열, 또는 상기 핵산 서열의 상보체를 포함하는 분리된 핵산 분자를 제공하는데, 여기에서 상기 단백질은 서열번호: 8에 의한 위치 79에 상응하는 위치에서 절단된다.
일부 구현예에서, 분리된 핵산 분자는 서열번호: 8에 의한 위치 69에 상응하는 위치에서 시스테인을 포함하는 절단된 CRNN 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하거나, 또는 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, 분리된 핵산 분자는 서열번호: 8에 의한 위치 69 내지 79에 상응하는 위치에서 서열번호: 10의 아미노산 서열을 포함하는 절단된 CRNN 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하거나, 또는 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, 핵산 분자는 서열번호: 8에 대한 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 서열 일치성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 인간 CRNN 단백질을 암호화하는 핵산 서열, 또는 상기 핵산의 상보체를 포함하거나, 또는 이로 이루어진다. 본원에서, 퍼센트 서열 일치성에 대한 언급이 있는 경우, 서열 일치성의 백분율이 더 높은 것이 더 낮은 것보다 바람직하다.
일부 구현예에서, 분리된 핵산 분자는 절단된 CRNN 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하거나, 또는 이로 이루어지고, 여기에서 상기 절단된 CRNN 단백질은 서열번호: 8의 아미노산 서열, 또는 서열번호: 8에 대해 적어도 90% 서열 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 서열번호: 8에 의한 위치 69에 상응하는 위치에서 시스테인을 포함한다.
야생형 CRNN 게놈 DNA의 핵산 서열은 서열번호: 1에 제시되어 있다. 서열번호: 1을 포함하는 야생형 CRNN 게놈 DNA는 5,009개 길이의 뉴클레오티드이다. 서열번호: 1을 참고하면, 야생형 CRNN 게놈 DNA의 위치 3375는 구아닌이다.
본 기재 내용은 변이체 CRNN 단백질을 암호화하는 게놈 DNA 분자이다. 일부 구현예에서, 게놈 DNA 분자는 기능-소실 CRNN 단백질을 암호화한다. 일부 구현예에서, 게놈 DNA 분자는 절단된 CRNN 단백질을 암호화한다. 일부 구현예에서, 게놈 DNA는 서열번호: 8에 의한 위치 79에 상응하는 위치에서 절단된 CRNN 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하거나, 또는 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 게놈 DNA는 서열번호: 8에 의한 위치 79에 상응하는 위치에서 절단되고, 서열번호: 8에 의한 위치 69에 상응하는 위치에서 시스테인을 포함하는 CRNN 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하거나, 또는 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 게놈 DNA는 서열번호: 8에 의한 위치 79에 상응하는 위치에서 절단되고, 서열번호: 8에 의한 위치 69 내지 79에 상응하는 위치에서 이하의 아미노산 서열: Cys-Gly-Ile-Gln-Gly-Ile-Pro-Gly-Leu-Ser-Val(서열번호: 10)을 포함하는 CRNN 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하거나, 또는 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 게놈 DNA는 서열번호: 8에 대해 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 서열 일치성을 갖고, 서열번호: 8에 의한 위치 69에 상응하는 위치에서 시스테인을 포함하는 변이체 CRNN 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하거나, 또는 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 게놈 DNA는 서열번호: 8을 갖는 변이체 CRNN 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하거나, 또는 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 게놈 DNA는 절단된 CRNN 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어지고, 여기에서 상기 절단된 CRNN 단백질은 서열번호: 8의 아미노산 서열, 또는 서열번호: 8에 대해 적어도 90% 서열 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 서열번호: 8에 의한 위치 69에 상응하는 위치에서 시스테인을 포함한다.
일부 구현예에서, 게놈 DNA는 서열번호: 2에 의한 위치 3375에 상응하는 위치에서 티민을 포함하는 핵산 서열을 포함하거나, 또는 이로 이루어진다. 반대로, 야생형 CRNN 게놈 DNA는 서열번호: 1에 의한 위치 3375에 상응하는 위치에서 구아닌을 포함한다. 이러한 티민의 변이체 CRNN 게놈 DNA로의 삽입은 하나의 뉴클레오티드 염기 프레임쉬프트를 생성하고, 이로 인해 서열번호: 8에 의한 위치 69에 상응하는 위치에서 시스테인을 갖는 절단된 CRNN 단백질을 생성한다. 일부 구현예에서, 게놈 DNA는 서열번호: 2에 대해 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 서열 일치성을 갖고, 서열번호: 2에 의한 위치 3375에 상응하는 위치에서 티민을 포함하는 핵산 서열을 포함하거나, 또는 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 게놈 DNA는 서열번호: 2에 의한 핵산 서열을 포함하거나, 또는 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, 분리된 핵산 분자는 전체 게놈 DNA 서열보다 적게 포함한다. 일부 구현예에서, 분리된 핵산 분자는 서열번호: 2의 적어도 약 15개, 적어도 약 20개, 적어도 약 25개, 적어도 약 30개, 적어도 약 35개, 적어도 약 40개, 적어도 약 45개, 적어도 약 50개, 적어도 약 60개, 적어도 약 70개, 적어도 약 80개, 적어도 약 90개, 적어도 약 100개, 적어도 약 200개, 적어도 약 300개, 적어도 약 400개, 적어도 약 500개, 적어도 약 600개, 적어도 약 700개, 적어도 약 800개, 적어도 약 900개, 적어도 약 1000개, 적어도 약 2000개, 적어도 약 3000개, 적어도 약 4000개, 또는 적어도 약 5000개의 연속하는 뉴클레오티드를 포함하거나, 또는 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 분리된 핵산 분자는 서열번호: 2의 적어도 약 1000개 내지 적어도 약 2000개의 연속하는 뉴클레오티드를 포함하거나, 또는 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, 분리된 핵산 분자는 서열번호: 2의 적어도 약 15개, 적어도 약 20개, 적어도 약 25개, 적어도 약 30개, 적어도 약 35개, 적어도 약 40개, 적어도 약 45개, 적어도 약 50개, 적어도 약 60개, 적어도 약 70개, 적어도 약 80개, 적어도 약 90개, 적어도 약 100개, 적어도 약 200개, 적어도 약 300개, 적어도 약 400개, 적어도 약 500개, 적어도 약 600개, 적어도 약 700개, 적어도 약 800개, 적어도 약 900개, 적어도 약 1000개, 적어도 약 1000개, 적어도 약 1100개, 적어도 약 1200개, 적어도 약 1300개, 적어도 약 1400개, 적어도 약 1500개, 적어도 약 1600개, 적어도 약 1700개, 적어도 약 1800, 적어도 약 1900개, 적어도 약 2000개, 적어도 약 2100개, 적어도 약 2200개, 적어도 약 2300개, 적어도 약 2400개, 또는 적어도 약 2500개의 연속하는 뉴클레오티드를 포함하거나, 또는 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 이러한 연속하는 뉴클레오티드는 연속하는 뉴클레오티드의 다른 핵산 분자들과 결합되어, 본원에 기재된 cDNA 분자를 생성할 수 있다.
이러한 분리된 핵산 분자는, 예를 들어, 변이체 CRNN mRNA 및 단백질을 발현시키거나, 또는 외인성 공여자 서열로서 사용될 수 있다. 집단 내의 유전자 서열은 다형성, 예컨대 SNP에 기인하여 달라질 수 있다고 이해된다. 본원에서 제공된 예는 단지 예시적인 서열이고, 다른 서열도 또한 가능하다.
일부 구현예에서, 분리된 핵산 분자는 변이체 CRNN 미니유전자를 포함하는데, 여기에서 서열번호: 8을 암호화하는 하나 이상의 비본질적인 단편들은 상응하는 야생형 CRNN 게놈 DNA에 비해 결실되었다. 일부 구현예에서, 결실된 비본질적인 단편(들)은 하나 이상의 인트론 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, CRNN 미니유전자는 서열번호: 2의 일부와 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 100%의 서열 일치성을 갖고, 여기에서 상기 미니유전자는 서열번호: 2에 의한 위치 3375에 상응하는 위치에서 티민을 갖는 핵산 서열을 포함한다.
야생형 CRNN mRNA의 핵산 서열은 서열번호: 3에 제시되어 있다. 서열번호: 3을 포함하는 야생형 CRNN mRNA는 1485개 길이의 뉴클레오티드이다. 서열번호: 3을 참고하면, 야생형 CRNN mRNA의 위치 205는 구아닌이다.
본 기재 내용은 또한 인간 CRNN 단백질의 적어도 일부를 암호화하는 핵산 서열, 또는 상기 핵산 서열의 상보체를 포함하는 mRNA 분자를 제공하는데, 여기에서 상기 단백질은 서열번호: 8에 의한 위치 79에 상응하는 위치에서 절단된 기능-소실 CRNN 단백질 또는 CRNN 단백질이다.
본 기재 내용은 또한 변이체 CRNN 단백질을 암호화하는 mRNA 분자를 제공한다. 일부 구현예에서, mRNA 분자는 기능-소실 CRNN 단백질을 암호화한다. 일부 구현예에서, mRNA 분자는 절단된 CRNN 단백질을 암호화한다. 일부 구현예에서, mRNA는 서열번호: 8에 의한 위치 79에 상응하는 위치에서 절단된 CRNN 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하거나, 또는 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, mRNA는 서열번호: 8에 의한 위치 79에 상응하는 위치에서 절단되고, 서열번호: 8에 의한 위치 69에 상응하는 위치에서 시스테인을 포함하는 CRNN 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하거나, 또는 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, mRNA는 서열번호: 8에 의한 위치 79에 상응하는 위치에서 절단되고, 서열번호: 8에 의한 위치 69 내지 79에 상응하는 위치에서 이하의 아미노산 서열: Cys-Gly-Ile-Gln-Gly-Ile-Pro-Gly-Leu-Ser-Val(서열번호: 10)을 포함하는 CRNN 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하거나, 또는 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, mRNA는 서열번호: 8에 대한 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 서열 일치성을 갖고, 서열번호: 8에 의한 위치 69에 상응하는 위치에서 시스테인을 포함하는 변이체 CRNN 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, mRNA는 서열번호: 8을 갖는 변이체 CRNN 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하거나, 또는 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, mRNA는 절단된 CRNN 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어지고, 여기에서 상기 절단된 CRNN 단백질은 서열번호: 8의 아미노산 서열, 또는 서열번호: 8에 대해 적어도 90% 서열 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 서열번호: 8에 의한 위치 69에 상응하는 위치에서 시스테인을 포함한다.
일부 구현예에서, mRNA는 서열번호: 4에 의한 위치 205에 상응하는 위치에서 우라실을 포함하는 핵산 서열을 포함하거나, 또는 이로 이루어진다. 반대로, 야생형 CRNN mRNA는 서열번호: 3에 의한 위치 205에 상응하는 위치에서 구아닌을 포함한다. 이러한 우라실의 변이체 CRNN mRNA로의 삽입은 하나의 뉴클레오티드 염기 프레임쉬프트를 생성하고, 이로 인해 서열번호: 8에 의한 위치 69에 상응하는 위치에서 시스테인을 갖는 절단된 CRNN 단백질을 생성한다. 일부 구현예에서, mRNA는 서열번호: 4에 의한 위치 202 내지 204, 및 205 내지 207에 각각 상응하는 위치에 코돈 ACU 및 UGU를 포함하는 핵산 서열을 포함하거나, 또는 이로 이루어진다. 반대로, 야생형 CRNN mRNA는 서열번호: 3에 의한 위치 202 내지 204, 및 205 내지 207에 각각 상응하는 위치에 코돈 ACU 및 GUG를 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA는 서열번호: 4에 대한 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 서열 일치성을 갖는 핵산 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어지고, 서열번호: 4에 의한 위치 205에 상응하는 위치에서 우라실을 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA는 서열번호: 4에 의한 핵산 서열을 포함하거나, 또는 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, 분리된 핵산 분자는 전체 CRNN mRNA 서열보다 적은 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 분리된 핵산 분자는 서열번호: 4의 적어도 약 5개, 적어도 약 8개, 적어도 약 10개, 적어도 약 12개, 적어도 약 15개, 적어도 약 20개, 적어도 약 25개, 적어도 약 30개, 적어도 약 35개, 적어도 약 40개, 적어도 약 45개, 적어도 약 50개, 적어도 약 60개, 적어도 약 70개, 적어도 약 80개, 적어도 약 90개, 적어도 약 100개, 또는 적어도 약 200개의 연속하는 뉴클레오티드를 포함하거나, 또는 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 분리된 핵산 분자는 서열번호: 4의 적어도 약 100개 내지 적어도 약 200개의 연속하는 뉴클레오티드를 포함하거나, 또는 이로 이루어진다. 이에 대하여, 더 긴 mRNA 분자는 더 짧은 것들보다 바람직하다. 일부 구현예에서, 분리된 핵산 분자는 서열번호: 4의 적어도 약 50개, 적어도 약 60개, 적어도 약 70개, 적어도 약 80개, 적어도 약 90개, 적어도 약 100개, 또는 적어도 약 200개의 연속하는 뉴클레오티드를 포함하거나, 또는 이로 이루어진다. 이에 대하여, 더 긴 mRNA 분자는 더 짧은 것들보다 바람직하다. 일부 구현예에서, 이러한 mRNA 분자는 서열번호: 8에 의한 위치 69에 상응하는 위치에서 시스테인을 암호화하는 코돈을 포함한다. 일부 구현예에서, 이러한 mRNA 분자는 서열번호: 4에 의한 위치 205에 상응하는 위치에서 우라실을 포함한다. 일부 구현예에서, 이러한 mRNA 분자는 서열번호: 4에 의한 위치 202 내지 204, 및 205 내지 207에 각각 상응하는 위치에 코돈 ACU 및 UGU를 포함한다.
야생형 CRNN cDNA의 핵산 서열은 서열번호: 5에 제시되어 있다. 서열번호: 5를 포함하는 야생형 CRNN cDNA는 정지 코돈을 제외하고 1485개 길이의 뉴클레오티드이다. 서열번호: 5를 참고하면, 야생형 CRNN cDNA의 위치 205는 구아닌이다.
본 기재 내용은 또한 인간 CRNN 단백질의 적어도 일부를 암호화하는 핵산 서열, 또는 상기 핵산 서열의 상보체를 포함하는 cDNA 분자를 제공하는데, 여기에서 상기 단백질은 서열번호: 8에 의한 위치 79에 상응하는 위치에서 절단된 기능-소실 CRNN 단백질 또는 CRNN 단백질이다.
본 기재 내용은 또한 변이체 CRNN 단백질을 암호화하는 cDNA 분자를 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 cDNA 분자는 기능-소실 CRNN 단백질을 암호화한다. 일부 구현예에서, 상기 cDNA 분자는 절단된 CRNN 단백질을 암호화한다. 일부 구현예에서, 상기 cDNA는 서열번호: 8에 의한 위치 79에 상응하는 위치에서 절단된 CRNN 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하거나, 또는 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, cDNA는 서열번호: 8에 의한 위치 79에 상응하는 위치에서 절단되고, 서열번호: 8에 의한 위치 69에 상응하는 위치에서 시스테인을 포함하는 CRNN 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하거나, 또는 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, cDNA는 서열번호: 8에 의한 위치 79에 상응하는 위치에서 절단되고, 서열번호: 8에 의한 위치 69 내지 79에 상응하는 위치에서 이하의 아미노산 서열: Cys-Gly-Ile-Gln-Gly-Ile-Pro-Gly-Leu-Ser-Val(서열번호: 10)을 포함하는 CRNN 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하거나, 또는 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, cDNA는 서열번호: 8에 대해 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 서열 일치성을 갖고, 서열번호: 8에 의한 위치 69에 상응하는 위치에서 시스테인을 포함하는 변이체 CRNN 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, cDNA는 서열번호: 8을 갖는 변이체 CRNN 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, cDNA는 절단된 CRNN 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어지고, 여기에서 상기 절단된 CRNN 단백질은 서열번호: 8의 아미노산 서열, 또는 서열번호: 8에 대해 적어도 90% 서열 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 서열번호: 8에 의한 위치 79에 상응하는 위치에서 시스테인을 포함한다.
일부 구현예에서, cDNA는 서열번호: 6에 의한 위치 205에 상응하는 위치에서 티민을 포함하는 핵산 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 반대로, 야생형 CRNN cDNA는 서열번호: 5에 의한 위치 205에 상응하는 위치에서 구아닌을 포함한다. 이러한 티민의 변이체 CRNN mRNA로의 삽입은 하나의 뉴클레오티드 염기 프레임쉬프트를 발생시키고, 이로 인해 서열번호: 8에 의한 위치 69에 상응하는 위치에서 시스테인을 갖는 절단된 CRNN 단백질을 생성한다. 일부 구현예에서, cDNA는 서열번호: 6에 의한 위치 202 내지 204, 및 205 내지 207에 각각 상응하는 위치에 코돈 ACT 및 TGT를 포함하는 핵산 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 반대로, 야생형 CRNN cDNA는 서열번호: 5에 의한 위치 202 내지 204, 및 205 내지 207에 각각 상응하는 위치에 코돈 ACT 및 GTG를 포함한다. 일부 구현예에서, cDNA는 서열번호: 6에 대해 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 서열 일치성을 갖는 핵산 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어지고, 서열번호: 6에 의한 위치 205에 상응하는 위치에서 티민을 포함한다. 일부 구현예에서, cDNA는 서열번호: 6에 따른 핵산 서열을 포함하거나, 또는 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, cDNA 분자는 변이체 CRNN cDNA 분자의 전체 서열보다 적게 포함한다. 일부 구현예에서, cDNA 분자는 서열번호: 6의 적어도 약 5개, 적어도 약 8개, 적어도 약 10개, 적어도 약 12개, 적어도 약 15개, 적어도 약 20개, 적어도 약 25개, 적어도 약 30개, 적어도 약 35개, 적어도 약 40개, 적어도 약 45개, 적어도 약 50개, 적어도 약 60개, 적어도 약 70개, 적어도 약 80개, 적어도 약 90개, 적어도 약 100개, 또는 적어도 약 200개의 연속하는 뉴클레오티드를 포함하거나, 또는 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, cDNA 분자는 서열번호: 6의 적어도 약 100개 내지 적어도 약 200개의 연속하는 뉴클레오티드를 포함하거나, 또는 이로 이루어진다. 이에 대하여, 더 긴 cDNA 분자는 더 짧은 것들보다 바람직하다. 일부 구현예에서, cDNA 분자는 서열번호: 6의 적어도 약 50개, 적어도 약 60개, 적어도 약 70개, 적어도 약 80개, 적어도 약 90개, 적어도 약 100개, 또는 적어도 약 200개의 연속하는 뉴클레오티드를 포함하거나, 또는 이로 이루어진다. 이에 대하여, 더 긴 cDNA 분자는 더 짧은 것들보다 바람직하다. 일부 구현예에서, 이러한 cDNA 분자는 서열번호: 8에 의한 위치 69에 상응하는 위치에서 시스테인을 암호화하는 코돈을 포함한다. 일부 구현예에서, 이러한 cDNA 분자는 서열번호: 6에 의한 위치 205에 상응하는 위치에서 티민을 포함한다. 일부 구현예에서, 이러한 cDNA 분자는 서열번호: 6에 의한 위치 202 내지 204, 및 205 내지 207에 각각 상응하는 위치에 코돈 ACT 및 TGT를 포함한다.
본 기재 내용은 또한 변이체 CRNN 게놈 DNA(예컨대 서열번호: 2), 변이체 CRNN 미니유전자, 변이체 CRNN mRNA(예컨대 서열번호: 4), 및/또는 변이체 CRNN cDNA(예컨대 서열번호: 6)에 혼성화하는 분리된 핵산 분자를 제공한다. 일부 구현예에서, 이러한 분리된 핵산 분자는 적어도 약 5개, 적어도 약 8개, 적어도 약 10개, 적어도 약 11개, 적어도 약 12개, 적어도 약 13개, 적어도 약 14개, 적어도 약 15개, 적어도 약 16개, 적어도 약 17개, 적어도 약 18개, 적어도 약 19개, 적어도 약 20개, 적어도 약 21개, 적어도 약 22개, 적어도 약 23개, 적어도 약 24개, 적어도 약 25개, 적어도 약 30개, 적어도 약 35개, 적어도 약 40개, 적어도 약 45개, 적어도 약 50개, 적어도 약 55개, 적어도 약 60개, 적어도 약 65개, 적어도 약 70개, 적어도 약 75개, 적어도 약 80개, 적어도 약 85개, 적어도 약 90개, 적어도 약 95개, 적어도 약 100개, 적어도 약 200개, 적어도 약 300개, 적어도 약 400개, 적어도 약 500개, 적어도 약 600개, 적어도 약 700개, 적어도 약 800개, 적어도 약 900개, 적어도 약 1000개, 적어도 약 2000개, 적어도 약 3000개, 적어도 약 4000개, 또는 적어도 약 5000개의 뉴클레오티드를 포함하거나, 또는 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 분리된 핵산 분자는 적어도 15개의 뉴클레오티드를 포함하거나, 또는 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 분리된 핵산 분자는 적어도 15개의 뉴클레오티드 내지 적어도 약 35개의 뉴클레오티드를 포함하거나, 또는 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 이러한 분리된 핵산 분자는 엄격한 조건 하에서 변이체 CRNN 게놈 DNA(예컨대 서열번호: 2), 변이체 CRNN 미니유전자, 변이체 CRNN mRNA(예컨대 서열번호: 4), 및/또는 변이체 CRNN cDNA(예컨대 서열번호: 6)와 혼성화한다. 이러한 핵산 분자는, 예를 들어, 본원에 기재되거나 또는 예시된 프로브로서, 프라이머로서, 또는 변이-특이적인 프로브 또는 프라이머로서 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 분리된 핵산 분자는 변이체 CRNN 게놈 DNA(예컨대 서열번호: 2), 변이체 CRNN 미니유전자, 변이체 CRNN mRNA(예컨대 서열번호: 4), 및/또는 변이체 CRNN cDNA(예컨대 서열번호: 6)에 대해 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 100% 동일한 핵산 분자의 적어도 약 15개의 연속하는 뉴클레오티드와 혼성화한다. 일부 구현예에서, 분리된 핵산 분자는 약 15개 내지 약 100개 뉴클레오티드, 또는 약 15개 내지 약 35개의 뉴클레오티드를 포함하거나, 또는 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 분리된 핵산 분자는 약 15개 내지 약 100개 뉴클레오티드를 포함하거나, 또는 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 분리된 핵산 분자는 약 15개 내지 약 35개의 뉴클레오티드를 포함하거나, 또는 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 임의의 핵산 분자, 게놈 DNA 분자, cDNA 분자 또는 mRNA 분자는 순수한 것일 수 있는데, 예를 들어, 적어도 약 90% 순수하다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 임의의 핵산 분자, 게놈 DNA 분자, cDNA 분자 또는 mRNA 분자는 순수한 것일 수 있는데, 예를 들어, 적어도 약 95% 순수하다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 임의의 핵산 분자, 게놈 DNA 분자, cDNA 분자, 또는 mRNA 분자는 순수한 것일 수 있는데, 예를 들어, 적어도 약 99% 순수하다. 정제는 인간의 손에 의해, 인간에 의한(human-made) 정제 기술로 실시된다.
본 기재 내용은 또한 본원에 기재된 임의의 분리된 핵산 분자, 게놈 DNA 분자, cDNA 분자 또는 mRNA 분자의 절편을 제공한다. 일부 구현예에서, 절편은 본원에 기재된 임의의 핵산 서열, 또는 이의 임의의 상보체의 적어도 약 5개, 적어도 약 8개, 적어도 약 10개, 적어도 약 11개, 적어도 약 12개, 적어도 약 13개, 적어도 약 14개, 적어도 약 15개, 적어도 약 16개, 적어도 약 17개, 적어도 약 18개, 적어도 약 19개, 적어도 약 20개, 적어도 약 21개, 적어도 약 22개, 적어도 약 23개, 적어도 약 24개, 적어도 약 25개, 적어도 약 30개, 적어도 약 35개, 적어도 약 40개, 적어도 약 45개, 적어도 약 50개, 적어도 약 55개, 적어도 약 60개, 적어도 약 65개, 적어도 약 70개, 적어도 약 75개, 적어도 약 80개, 적어도 약 85개, 적어도 약 90개, 적어도 약 95개, 또는 적어도 약 100개의 연속하는 잔기들을 포함하거나, 또는 이로 이루어진다. 이에 대하여, 더 긴 절편은 더 짧은 것들보다 바람직하다. 일부 구현예에서, 절편은 적어도 약 5개, 적어도 약 8개, 적어도 약 10개, 적어도 약 11개, 적어도 약 12개, 적어도 약 13개, 적어도 약 14개, 적어도 약 15개, 적어도 약 16개, 적어도 약 17개, 적어도 약 18개, 적어도 약 19개, 적어도 약 20개, 적어도 약 21개, 적어도 약 22개, 적어도 약 23개, 적어도 약 24개, 적어도 약 25개, 적어도 약 30개, 적어도 약 35개, 적어도 약 40개, 적어도 약 45개, 또는 적어도 약 50개의 연속하는 잔기들을 포함하거나, 또는 이로 이루어진다. 이에 대하여, 더 긴 절편은 더 짧은 것들보다 바람직하다. 일부 구현예에서, 절편은 적어도 약 20개, 적어도 약 25개, 적어도 약 30개, 또는 적어도 약 35개의 연속하는 잔기들을 포함하거나, 또는 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 절편은 적어도 약 20개의 연속하는 잔기를 포함하거나, 또는 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 절편은 적어도 약 25개의 연속하는 잔기들을 포함하거나, 또는 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 절편은 적어도 약 30개의 연속하는 잔기들을 포함하거나, 또는 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 절편은 적어도 약 35개의 연속하는 잔기들을 포함하거나, 또는 이로 이루어진다. 절편이 서열번호: 8에 의한 위치 69에 상응하는 위치에서 시스테인을 암호화하거나, 또는 서열번호: 8에 의한 위치 69 내지 79에 상응하는 위치를 암호화하는 핵산 분자의 일부를 포함하거나 또는 이로 이루어지는 것이 구상된다. 이러한 절편은 본원에서 기재되고 예시된 바와 같이 예를 들어, 프로브로서, 프라이머로서, 또는 대립형질-특이적인 프라이머로서 사용될 수 있다.
본 기재 내용은 또한 적어도 약 5개의 뉴클레오티드를 포함하는 핵산 서열을 포함하는 프로브 또는 프라이머를 제공하는데, 이는 인간 CRNN 단백질을 암호하하는 핵산 서열과 혼성화하되, 여기에서 상기 단백질은 서열번호: 8에 의한 위치 79에 상응하는 위치에서 절단된 기능-소실 CRNN 단백질 또는 CRNN 단백질이거나, 또는 인간 CRNN 단백질을 암호화하는 상기 핵산 서열의 상보체와 혼성화하되, 여기에서 상기 단백질은 서열번호: 8에 의한 위치 79에 상응하는 위치에서 절단된 기능-소실 CRNN 단백질 또는 CRNN 단백질이다.
본 기재 내용은 또한 프로브 및 프라이머를 제공한다. 본 기재 내용의 프로브 또는 프라이머는 본원에 기재된 임의의 핵산 분자에 특이적으로 혼성화하는 핵산 서열, 또는 이의 상보체를 갖는다. 일부 구현예에서, 프로브 또는 프라이머는 엄격한 조건 하에서 본원에 기재된 임의의 핵산 분자에 특이적으로 혼성화한다. 본 기재 내용은 또한 온화한 조건 하에서 본원에 기재된 임의의 핵산 분자에 혼성화하는 핵산 서열 또는 이의 상보체를 갖는 핵산 분자를 제공한다. 본 기재 내용에 의한 프로브 또는 프라이머는 바람직하게는 서열번호: 8에 의한 위치 69에 상응하는 위치에서 시스테인을 암호화하는 핵산 코돈, 또는 이의 상보체를 포함한다. 따라서, 바람직한 구현예에서, 본 기재 내용은 변이-특이적인 프라이머를 제공하고, 이는 본원에서 상기 및 하기에 더욱 상세히 정의된다.
본 기재 내용에 의한 프로브는, (예를 들어, 서열번호: 8에 의한) 변이체 CRNN 단백질을 암호화하는 변이체 CRNN 핵산 분자(예를 들어, 게놈 DNA, mRNA, 및/또는 cDNA)를 탐지하는데 사용될 수 있다. 추가로, 본 기재 내용에 의한 프라이머는 변이체 CRNN 단백질을 암호화하는 핵산 분자, 또는 이의 절편을 증폭시키는데 사용될 수 있다. 본 기재 내용은 또한 상기 기재된 프라이머들 중 하나를 포함하는 한 쌍의 프라이머를 제공한다. 게놈 중합효소 연쇄 반응(PCR) 증폭을 위하여, 적합한 프라이머 서열은 절단을 유발하는 프레임쉬프트 변이체를 함유하는 CRNN 절편의 일부를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
일부 구현예에서, 변이-특이적인 프라이머를 포함하는 프라이머는, 2세대 시퀀싱 또는 대량 신속처리 시퀀싱에 사용될 수 있다. 일부 경우에, 변이-특이적인 프라이머를 포함하는 프라이머는, 개질될 수 있다. 특히, 프라이머는 예를 들어, 대량 병렬 시그니처 시퀀싱(Massive Parallel Signature Sequencing, MPSS), 폴로니 시퀀싱(Polony sequencing), 및 454 파이로시퀀싱(Pyrosequencing)의 상이한 단계들에 사용되는 다양한 개질을 포함할 수 있다. MPSS는 예를 들어, mRNA의 발현 수준을 결정하는데 사용될 수 있다. mRNA는 먼저 cDNA로 변환되고, 이는 추후에 cDNA가 PCR 증폭되도록 하는 작은 올리고뉴클레오티드 "태그"에 융합된 후, 마이크로비드에 커플링된다. 클로닝 단계의 비오틴화 프라이머, 및 비드 로딩 단계와 탐지 단계에서 사용되는 형광 표지된 프라이머를 포함하는 개질된 프라이머가 공정의 몇 가지 단계들에서 사용된다. 폴로니 시퀀싱은 일반적으로 염기쌍-말단 태그 라이브러리를 사용하여 실시되며, 여기에서 DNA 주형의 각각의 분자는 약 135 bp 길이이다. 비오틴화 프라이머는 비드 로딩 단계 및 에멀젼 PCR에 사용된다. 형광 표지된 축퇴(degenerate) 9량체 올리고뉴클레오티드는 탐지 단계에 사용된다. 454 시퀀싱은 전형적으로 게놈 시퀀서 FLX 상에서 GS FLX 티타늄 시리즈 시약에 의한 10-시간 운영당 대략 400-600 메가베이스의 DNA를 시퀀싱할 수 있는 대규모 병렬 파이로시퀀싱 시스템을 사용한다. 게놈 DNA는 더 작은 절편(예를 들어, 300-800개 염기쌍)으로 절편화되고, 다듬어진다[각각 블런트 말단(blunt end)으로 제조됨]. 짧은 어뎁터는 이후 절편의 말단에 라이게이션될 수 있다. 이들 어뎁터는 샘플-라이브러리 절편의 증폭 및 시퀀싱 둘 다를 위한 프라이머 서열을 제공한다. 어뎁터는 DNA 라이브러리를 스트렙타비딘-코팅된 비드에 고정하기 위한 5'-비오틴 태그를 함유할 수 있다.
본원에 기재된 핵산 분자는 자연발생적 CRNN 게놈 DNA, cDNA, 또는 mRNA 전사체의 핵산 서열을 포함할 수 있거나, 또는 비-자연발생적 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 자연발생적 서열은 암호화된 CRNN 폴리펩티드에 영향을 미치지 않는 동의 돌연변이 또는 돌연변이들에 기인하여, 비-자연발생적 서열과는 상이할 수 있다. 예를 들어, 서열은 암호화된 CRNN 폴리펩티드에 영향을 주지 않는 동의 돌연변이 또는 돌연변이들을 제외하고는 동일할 수 있다. 동의 돌연변이 또는 치환은 단백질을 암호화하는 유전자의 엑손에서 하나의 뉴클레오티드가 다른 것으로 치환되는 것이며, 생성된 아미노산 서열은 달라지지 않는다. 하나 초과의 3개-염기쌍 코돈에 의해 암호화되는 일부 아미노산을 갖는 유전적 암호의 축퇴 때문에, 이것이 가능하다. 동의적 치환은 예를 들어, 코돈 최적화의 과정에서 사용될 수 있다. 본원에 기재된 핵산 분자는 코돈 최적화될 수 있다.
또한, 기재된 핵산 분자와 상호작용할 수 있는 기능성 폴리뉴클레오티드가 본원에서 제공된다. 기능성 폴리뉴클레오티드는, 예컨대 표적 분자와 결합하거나 또는 특정 반응을 촉매화하는 특정 기능을 갖는 핵산 분자이다. 기능성 폴리뉴클레오티드의 예는 안티센스 분자, 압타머(aptamer), 리보자임, 3중체 형성 분자, 및 외부 가이드 서열을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 기능성 폴리뉴클레오티드는 표적 분자가 갖는 특정 활성의 작동자, 저해자, 조절자 및 자극자로서 작용할 수 있거나, 또는 기능성 폴리뉴클레오티드는 임의의 다른 분자와는 독립적인 새로운(de novo) 활성을 가질 수 있다.
안티센스 분자는 정규(canonical) 또는 비-정규 염기쌍 형성을 통해 표적 핵산 분자와 상호작용하도록 디자인된다. 안티센스 분자와 표적 분자의 상호작용은 예를 들어, RNase-H-매개된 RNA-DNA 혼성체 분해를 통해 표적 분자의 파괴를 촉진하도록 디자인된다. 대안적으로, 안티센스 분자는 표적 분자에서 통상 발생하게 될 가공 기능, 예컨대 전사 또는 복제를 방해하도록 디자인된다. 안티센스 분자는 표적 분자의 서열에 기초하여 디자인된다. 표적 분자의 가장 접근가능한 부위를 식별함으로서 안티센스 효율을 최적화하기 위한 다수의 방법이 존재한다. 예시적인 방법은, DMS 및 DEPC를 포함하는 시험관내 선택 실험 및 DNA 개질 연구를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 안티센스 분자는 일반적으로 10-6 이하, 약 10-8 이하, 약 10-10 이하, 또는 내지 약 10-12 이하의 해리 상수(kd)로 표적 분자에 결합한다. 안티센스 분자의 디자인 및 사용을 도와주는 방법 및 기술의 대표적인 샘플은, 이하의 미국 특허: 5,135,917; 5,294,533; 5,627,158; 5,641,754; 5,691,317; 5,780,607; 5,786,138; 5,849,903; 5,856,103; 5,919,772; 5,955,590; 5,990,088; 5,994,320; 5,998,602; 6,005,095; 6,007,995; 6,013,522; 6,017,898; 6,018,042; 6,025,198; 6,033,910; 6,040,296; 6,046,004; 6,046,319; 및 6,057,437의 비-제한적인 목록에서 찾아볼 수 있다. 안티센스 분자의 예는 안티센스 RNA, 작은 간섭 RNA(siRNA), 및 짧은 헤어핀 RNA(shRNA)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본원에 기재된 분리된 핵산 분자는, RNA, DNA, 또는 RNA와 DNA 둘 다를 포함할 수 있다. 분리된 핵산 분자는 또한 벡터에서 이종 핵산 서열, 예컨대 이종 표지에 연결되거나 또는 융합될 수도 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 분리된 핵산 분자는 분리된 핵산 분자 및 이종 핵산 서열을 포함하는 벡터 또는 외인성 공여자 서열에 있을 수 있다. 분리된 핵산 분자는 또한 이종 표지, 예컨대 형광 표지에 연결 또는 융합될 수 있다. 표지의 다른 예는 본원에서 다른 부분에 기술되어 있다.
표지는 직접 탐지가능하거나(예를 들어, 형광단) 또는 간접적으로 탐지가능할 수 있다(예를 들어, 햅텐, 효소, 또는 형광단 퀀처). 이러한 표지는 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적, 또는 화학적 수단에 의해 탐지가능할 수 있다. 이러한 표지는 예를 들어, 방사선-계수 장치에 의해 측정될 수 있는 방사능 표지; 색소, 염료, 또는 분광광도계에서 시각적으로 관찰되거나 또는 측정될 수 있는 다른 발색소; 스핀 표지 분석기에서 측정될 수 있는 스핀 표지; 및 형광 표지(예를 들어, 형광단)를 포함하며, 여기에서 방출 신호는 적합한 분자 부가체의 여기(excitation)에 의해 생성되며, 이는 염료에 의해 흡수되는 광의 여기에 의해 시각화되거나, 또는 표준 형광측정기 또는 화상화 시스템에 의해 측정가능하다. 표지는 또한 예를 들어, 화학 발광 물질일 수 있는데, 여기에서 방출 신호는 신호 화합물; 금속-함유 물질; 또는 효소의 화학적 개질에 의해 생성된다(여기에서, 신호의 효소-의존적인 제2 생성이 일어나며, 예컨대 무색 기질로부터 발색 생성물이 형성됨). 용어 "표지(label)"는 또한 접합된 분자에 선택적으로 결합할 수 있는 "태그" 또는 햅텐을 지칭할 수 있어서, 접합된 분자는, 이후 기질과 함께 첨가될 때, 탐지가능한 신호를 생성하는데 사용된다. 예를 들어, 비오틴을 태그로서 사용한 후 서양고추냉이 페록시데이트(HRP)의 아비딘 또는 스트렙타비딘 접합체를 사용하여 태그에 결합하고, 이후 열량측정 기질[예를 들어, 테트라메틸벤지딘(TMB)] 또는 HRP의 존재를 탐지하기 위한 형광원 기질을 사용할 수 있다. 정제를 용이하게 하기 위한 태그로서 사용될 수 있는 예시적인 표지는, myc, HA, FLAG 또는 3XFLAG, 6XHis 또는 폴리히스티딘, 글루타티온-S-트랜스퍼라제(GST), 말토스 결합 단백질, 에피토프 태그, 또는 이뮤노글루불린의 Fc 부분을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 다수의 표지는, 입자, 형광단, 햅텐, 효소 및 이들의 열량측정성, 형광원성 및 화학 발광성 기질 및 다른 표지를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
기재된 핵산 분자는, 예를 들어 뉴클레오티드 또는 비-자연적 또는 개질된 뉴클레오티드, 예컨대 뉴클레오티드 유사체 또는 뉴클레오티드 치환체를 포함할 수 있다. 이러한 뉴클레오티드는 개질된 염기, 당 또는 포스페이트 기를 함유하거나, 또는 이의 구조에 비-자연적인 모이에티를 포함하는 뉴클레오티드를 포함한다. 비-자연적 뉴클레오티드의 예는, 디데옥시뉴클레오티드, 비오틴화, 아민화, 탈아민화, 알킬화, 벤질화, 및 형광단-표지된 뉴클레오티드를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본원에 기재된 핵산 분자는 또한 하나 이상의 뉴클레오티드 유사체 또는 치환을 포함할 수 있다. 뉴클레오티드 유사체는 염기, 당, 또는 포스페이트 모이에티 중 하나에 대한 개질을 함유하는 뉴클레오티드이다. 염기 모이에티에 대한 개질은, A, C, G, 및 T/U, 뿐만 아니라 상이한 퓨린 또는 피리딘 염기, 예컨대 슈도우리딘, 우라실-5-일, 하이폭산틴-9-일(I), 및 2-아미노아데닌-9-일의 자연적 및 합성적 개질을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 개질된 염기는 5-메틸시토신(5-me-C), 5-히드록시메틸 시토신, 잔틴, 하이폭산틴, 2-아미노아데닌, 아데닌 및 구아닌의 6-메틸 및 다른 알킬 유도체, 아데닌 및 구아닌의 2-프로필 및 다른 알킬 유도체, 2-티오우라실, 2-티오티민 및 2-티오시토신, 5-할로우라실 및 시토신, 5-프로피닐 우라실 및 시토신, 6-아조 우라실, 시토신 및 티민, 5-우라실(슈도우라실), 4-티오우라실, 8-할로, 8-아미노, 8-티올, 8-티오알킬, 8-히드록실 및 다른 8-치환된 아데닌 및 구아닌, 5-할로 특히 5-브로모, 5-트리플루오로메틸 및 다른 5-치환된 우라실 및 시토신, 7-메틸구아닌 및 7-메틸아데닌, 8-아자구아닌 및 8-아자아데닌, 7-데아자구아닌 및 7-데아자아데닌, 및 3-데아자구아닌 및 3-데아자아데닌을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 특정 뉴클레오티드 유사체, 예컨대, 5-치환된 피리미딘, 6-아자피리미딘, 그리고 2-아미노프로필아데닌, 5-프로피닐우라실, 5-프로피닐시토신, 및 5-메틸시토신을 포함하나 이에 제한되지 않는 N-2, N-6 및 O-6 치환된 퓨린은, 이중체 형성의 안정성을 증가시킬 수 있다. 종종, 염기 개질은 예를 들어, 당 개질, 예컨대 2’-O-메톡시에틸과 조합하여, 고유의 성질들, 예컨대 증가된 이중체 안정성을 달성할 수 있다.
뉴클레오티드 유사체는 또한 당 모이에티의 개질을 포함할 수 있다. 당 모이에티에 대한 개질은 리보스 및 데옥시리보스의 자연적인 개질, 뿐만 아니라 합성 개질을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 당 개질은 2' 위치에서의 이하의 개질은: OH; F; O-, S-, 또는 N-알킬; O-, S-, 또는 N-알케닐; O-, S- 또는 N-알키닐; 또는 O-알킬-O-알킬을 포함하나 이에 제한되지 않고, 여기에서 알킬, 알케닐, 및 알키닐은 치환 또는 비치환된 C1- 10알킬 또는 C2- 10알케닐, 및 C2- 10알키닐일 수 있다. 예시적인 2' 당 개질은 또한 -O[(CH2)nO]mCH3, -O(CH2)nOCH3, -O(CH2)nNH2, -O(CH2)nCH3, -O(CH2)n-ONH2, 및 -O(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2을 포함하나, 이에 제한되지 않고, 여기에서 n 및 m은 1 내지 약 10이다.
2' 위치에서의 다른 개질은 C1- 10알킬, 치환된 저급 알킬, 알카릴, 아랄킬, O-알카릴 또는 O-아랄킬, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, 헤테로시클로알킬, 헤테로시클로알카릴, 아미노알킬아미노, 폴리알킬아미노, 치환된 실릴, RNA 분할기, 리포터 기, 인터칼레이터, 올리고뉴클레오티드의 약동학적 성질들을 개선시키기 위한 기, 또는 올리고뉴클레오티드의 약력학적 성질들을 개선시키기 위한 기, 및 유사한 성질들을 갖는 다른 치환체를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 유사한 개질은 또한 당의 다른 위치, 특히 3' 말단 뉴클레오티드의 당 또는 2'-5' 연결된 올리고뉴클레오티드에서의 3' 위치, 및 5' 말단 뉴클레오티드의 5' 위치에서 이루어질 수도 있다. 개질된 당은 또한 브릿지 고리 산소에서의 개질, 예컨대 CH2 및 S를 함유하는 것들을 포함할 수 있다. 뉴클레오티드 당 유사체는 또한 펜토퓨라노실 당 대신에 당 모방체, 예컨대 시클로부틸 모이에티를 가질 수 있다.
뉴클레오티드 유사체는 또한 포스페이트 모이에티에서 개질될 수 있다. 개질된 포스페이트 모이에티는, 개질되어 2개의 뉴클레오티드들 사이의 연결기가 포스포로티오에이트, 비대칭 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포디에스테르, 아미노알킬포스포디에스테르, 3'-알킬렌 포스포네이트 및 비대칭 포스포네이트를 포함하는 메틸 및 다른 알킬 포스포네이트, 포스피네이트, 3'-아미노 포스포라미데이트 및 아미노알킬포스포라미데이트, 티오노포스포라미데이트를 포함하는 포스포라미데이트, 티오노알킬포스포네이트, 티오노알킬포스포디에스테르, 및 보라노포스페이트를 함유할 수 있는 것들을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 2개의 뉴클레오티드들 사이의 이들 포스페이트 또는 개질된 포스페이트 연결기는, 3'-5' 연결기 또는 2'-5' 연결기를 통해 있을 수 있고, 연결기는 반전된 극성, 예컨대 3'-5' 내지 5'-3', 또는 2'-5' 내지 5'-2'를 함유할 수 있다. 다양한 염, 혼합된 염 및 유리산 형태도 또한 포함된다.
뉴클레오티드 치환체는 뉴클레오티드와 유사한 기능성 성질들을 갖는 분자를 포함하나, 포스페이트 모이에티, 예컨대 펩티드 핵산(PNA)를 함유하지 않는다. 뉴클레오티드 치환체는 왓슨-크릭(Watson-Crick) 또는 후그스텐(Hoogsteen) 방식으로 핵산을 인식할 분자를 포함하나, 포스페이트 모이에티가 아닌 모이에티를 통해 연결된다. 뉴클레오티드 치환체는 적절한 표적 핵산과 상호작용하는 경우, 이중 나선 유형의 구조에 순응할 수 있다.
뉴클레오티드 치환체는 또한 포스페이트 모이에티 또는 당 모이에티가 치환된 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체를 포함한다. 일부 구현예에서, 뉴클레오티드 치환체는 표준 인 원자를 함유하지 않을 수 있다. 포스페이트에 대한 치환체는, 예를 들어, 단쇄 알킬 또는 시클로알킬의 뉴클레오시드간의 연결기(internucleoside linkage), 혼합된 헤테로원자 및 알킬 또는 시클로알킬의 뉴클레오시드간의 연결기, 또는 하나 이상의 단쇄 헤테로원자의 또는 헤테로시클릭 뉴클레오시드간의 연결기일 수 있다. 이들은 (부분적으로는 뉴클레오시드의 당 부분으로부터 형성된) 모르폴리노 연결기를 갖는 것들; 실록산 골격; 설파이드, 설폭시드 및 설폰 골격; 포름아세틸 및 티오포름아세틸 골격; 메틸렌 포름아세틸 및 티오포름아세틸 골격; 알켄 함유 골격; 설파메이트 골격; 메틸렌이미노 및 메틸렌히드라지노 골격; 설포네이트 및 설폰아미드 골격; 아미드 골격; 및 혼합된 N, O, S, 및 CH2 요소 부분들을 갖는 다른 것들을 포함한다.
또한, 뉴클레오티드 치환체에서, 뉴클레오티드의 당 및 포스페이트 모이에티 둘 다가 예를 들어, 아미드 유형 연결기(아미노에틸글리신)(PNA)로 치환될 수 있다고 이해된다.
또한, 다른 유형의 분자(접합체)를 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체에 연결하여, 예를 들어, 세포내 흡수를 개선시키는 것도 가능하다. 접합체는 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체에 화학적으로 연결될 수 있다. 이러한 접합체는, 예를 들어, 지질 모이에티, 예컨대 콜레스테롤 모이에티, 콜산, 티오에테르, 예컨대 헥실-S-트리틸티올, 티오콜레스테롤, 지방족 사슬, 예컨대 도데칸디올 또는 운데실 잔기, 인지질, 예컨대 디-헥사데실-rac-글리세롤 또는 트리에틸암모늄 1,2-디-O-헥사데실-rac-글리세로-3-H-포스포네이트, 폴리아민 또는 폴리에틸렌 글리콜 사슬, 아다만탄 아세트산, 팔미틸 모이에티, 또는 옥타데실아민 또는 헥실아미노-카보닐-옥시콜레스테롤 모이에티를 포함한다.
본 기재 내용은 또한 본원에 기재된 핵산 분자들 중 어느 하나 이상을 포함하는 벡터를 제공한다. 일부 구현예에서, 벡터는 본원에 기재된 핵산 분자 및 이종 핵산 중 어느 하나 이상을 포함한다. 벡터는 핵산 분자를 전달할 수 있는 바이러스 또는 비바이러스 벡터일 수 있다. 일부 구현예에서, 벡터는 플라스미드 또는 코스미드(예를 들어, 추가적인 DNA 단편들이 라이게이션된 환형 이중-가닥 DNA)이다. 일부 구현예에서, 벡터는 바이러스 벡터인데, 여기에서 추가적인 DNA 단편들은 바이러스 게놈으로 라이게이션될 수 있다. 일부 구현예에서, 벡터는 이들이 도입된 숙주 세포에서 자체로 복제할 수 있다(예를 들어, 박테리아 복제 기원을 갖는 박테리아 벡터, 및 에피좀 포유류 벡터). 일부 구현예에서, 벡터(예를 들어, 비-에피좀 포유류 벡터)는 숙주 세포에 도입시 숙주 세포의 게놈에 통합될 수 있고, 이로 인해 숙주 게놈을 따라 복제된다. 나아가, 특정 벡터는 이들이 작동가능하게 연결된 유전자의 발현을 유도할 수 있다. 이러한 벡터는 본원에서 "재조합 발현 벡터(recombinant expression vector)" 또는 "발현 벡터"로 지칭된다. 이러한 벡터는 또한 표적화 벡터(즉, 외인성 공여자 서열)일 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 다양한 유전적 변이체에 의해 암호화되는 단백질은 기재된 유전적 변이체를 암호화하는 핵산 분자를 발현 벡터에 삽입함으로서 발현되어, 유전자가 발현 조절 서열, 예컨대 전사 및 번역 조절 서열에 작동가능하게 연결된다. 발현 벡터는, 플라스미드, 코스미드, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스(AAV), 식물 바이러스, 예컨대 콜리플라워 모자이크 바이러스 및 담배 모자이크 바이러스, 효모 인공 염색체(YAC), 엡스타인-바(EBV)-유래 에피좀, 및 다른 발현 벡터를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 기재된 유전적 변이체를 포함하는 핵산 분자는 벡터에 라이게이션될 수 있어서, 벡터 내의 전사 및 번역 조절 서열은 유전적 변이체의 전사 및 번역을 조절하는 이들의 의도된 기능을 수행한다. 발현 벡터 및 발현 조절 서열은 사용된 발현 숙주 세포와 양립가능하도록 선택된다. 기재된 유전적 변이체를 포함하는 핵산 서열은, 별도의 벡터, 또는 변이체 유전적 정보로서 동일한 발현 벡터에 삽입될 수 있다. 기재된 유전적 변이체를 포함하는 핵산 서열은, 표준 방법에 의해 발현 벡터에 삽입될 수 있다(예를 들어, 기재된 유전적 변이체를 포함하는 핵산과 벡터에 상보적인 제한 부위와의 라이게이션, 또는 제한 부위가 존재하지 않는 경우 블런트 말단 라이게이션).
기재된 유전적 변이체를 포함하는 핵산 서열 이외에도, 재조합 발현 벡터는 숙주 세포에서 유전적 변이체의 발현을 조절하는 조절 서열을 포함할 수 있다. 조절 서열의 선택을 포함하는 발현 벡터의 디자인은, 형질전환될 숙주 세포의 선택, 원하는 단백질의 발현 수준 등과 같은 이러한 인자들에 따라 달라질 수 있다. 포유류 숙주 세포 발현을 위한 원하는 조절 서열은, 예를 들어, 포유류 세포에서 높은 수준의 단백질 발현을 가져오는 바이러스 요소, 예컨대 레트로바이러스 LTR로부터 유래한 프로모터 및/또는 인핸서, 사이토메갈로바이러스(CMV)(예컨대, CMV 프로모터/인핸서), 유인원 바이러스 40(SV40)(예컨대, SV40 프로모터/인핸서), 아데노바이러스(예를 들어, 아데노바이러스 주요 후기 프로모터(AdMLP)), 폴리오마 및 강한 포유류 프로모터, 예컨대 고유의(native) 이뮤노글루불린 및 액틴 프로모터를 포함할 수 있다. 폴리펩티드는 박테리아 세포 또는 진균 세포(예를 들어, 효모 세포)에서 발현될 수 있다.
프로모터는 예를 들어, 항시적으로 활성인 프로모터, 조건성 프로모터, 유도성 프로모터, 일시적으로 제한된 프로모터(예를 들어, 발생적으로 조절된 프로모터), 또는 공간적으로 제한된 프로모터(예를 들어, 세포-특이적인 또는 조직-특이적인 프로모터)일 수 있다. 프로모터의 예는 예를 들어, WO 2013/176772에서 찾아볼 수 있다.
유도성 프로모터의 예는 예를 들어, 화학적으로 조절된 프로모터 및 물리적으로-조절된 프로모터를 포함한다. 화학적으로 조절된 프로모터는, 예를 들어, 알콜-조절된 프로모터[예를 들어, 알콜 데히드로게나제(alcA) 유전자 프로모터], 테트라사이클린-조절된 프로모터[예를 들어, 테트라사이클린-반응성 프로모터, 테트라사이클린 오퍼레이터 서열(tetO), tet-On 프로모터, 또는 tet-Off 프로모터], 스테로이드 조절된 프로모터(예를 들어, 래트 글루코코르티코이드 수용체, 에스트로겐 수용체의 프로모터, 또는 엑디손 수용체의 프로모터), 또는 금속-조절된 프로모터(예를 들어, 메탈로프로테인 프로모터)를 포함한다. 물리적으로 조절된 프로모터는 예를 들어 온도-조절된 프로모터(예를 들어, 열 충격 프로모터) 및 광-조절된 프로모터(예를 들어, 광-유도성 프로모터 또는 광-억제성 프로모터)를 포함한다.
조직-특이적인 프로모터는, 예를 들어, 뉴런-특이적인 프로모터, 신경교-특이적인 프로모터, 근육 세포-특이적인 프로모터, 심장 세포-특이적인 프로모터, 신장 세포-특이적인 프로모터, 뼈 세포-특이적인 프로모터, 내피 세포-특이적인 프로모터, 또는 면역 세포-특이적인 프로모터(예를 들어, B 세포 프로모터 또는 T 세포 프로모터)일 수 있다.
발생적으로 조절된 프로모터는 예를 들어, 발생시의 배아 단계 동안, 또는 단지 성체 세포에서만 활성인 프로모터를 포함한다.
기재된 유전적 변이체 및 조절 서열을 포함하는 핵산 서열 이외에도, 재조합 발현 벡터는 추가적인 서열, 예컨대 숙주 세포에서 벡터의 복제를 조절하는 서열(예를 들어, 복제 기원) 및 선별 마커 유전자를 포함할 수 있다. 선별 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주 세포의 선별을 용이하게 할 수 있다(예를 들어, 미국 특허 4,399,216; 4,634,665; 및 5,179,017을 참고하라). 예를 들어, 선별 마커 유전자는 약물, 예컨대 G418, 하이그로마이신(hygromycin), 또는 메토트렉세이트에 대한 내성을, 벡터가 도입된 숙주 세포에 부여할 수 있다. 예시적인 선별 마커 유전자는 (메토트렉세이트 선별/증폭을 갖는 dhfr-숙주 세포에서 사용하기 위한) 디히드로폴레이트 리덕타제(DHFR) 유전자, (G418 선별을 위한) 네오(neo) 유전자, 및 글루타메이트 신테타제(GS) 유전자를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
추가적인 벡터는, 예를 들어, 2016년 7월 28일자 제출된 미국 가출원 62/367,973에 기재되어 있고, 이는 본원에 전체가 참고로서 포함된다.
본 기재 내용은 또한 본원에 기재된 분리된 핵산 분자, 게놈 DNA 분자, cDNA 분자 또는 mRNA 분자 중 어느 하나 이상을 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 구현예에서, 조성물은 약학적 조성물이다.
본 기재 내용은 또한 인간 CRNN 단백질의 적어도 일부를 포함하는 분리된 또는 재조합 폴리펩티드를 제공하는데, 여기에서 상기 단백질은 서열번호: 8에 의한 위치 79에 상응하는 위치에서 절단된 기능-소실 CRNN 단백질 또는 CRNN 단백질이다.
본 기재 내용은 또한 변이체 CRNN 폴리펩티드를 제공한다. 일부 구현예에서, 변이체 CRNN 폴리펩티드는 기능-소실 단백질이다. 일부 구현예에서, 변이체 CRNN 폴리펩티드는 절단된다. 일부 구현예에서, 변이체 CRNN 폴리펩티드는 서열번호: 8에 의한 위치 79에 상응하는 위치에서 절단된다. 일부 구현예에서, 변이체 CRNN 폴리펩티드는 서열번호: 8에 의한 위치 79에 상응하는 위치에서 절단되고, 서열번호: 8에 의한 위치 69에 상응하는 위치에서 시스테인을 포함한다. 일부 구현예에서, 변이체 CRNN 폴리펩티드는 서열번호: 8에 의한 위치 79에 상응하는 위치에서 절단되고, 서열번호: 8에 의한 위치 69 내지 79에 상응하는 위치에서 복수의 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, 변이체 CRNN 폴리펩티드는 서열번호: 8에 의한 위치 79에 상응하는 위치에서 절단되고, 서열번호: 8에 의한 위치 69 내지 79에 상응하는 위치에서 이하의 아미노산 서열: Cys-Gly-Ile-Gln-Gly-Ile-Pro-Gly-Leu-Ser-Val(서열번호: 10)을 포함한다. 일부 구현예에서, 변이체 CRNN 폴리펩티드는 서열번호: 8에 대한 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 서열 일치성을 갖고, 서열번호: 8에 의한 위치 69에 상응하는 위치에서 시스테인을 포함한다. 일부 구현예에서, 변이체 CRNN 폴리펩티드는 서열번호: 8에 의한 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 절단된 CRNN 단백질은 서열번호: 8에 의한 아미노산 서열, 또는 서열번호: 9에 대해 적어도 90% 서열 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 이로 이루어지고, 서열번호: 8에 의한 위치 69에 상응하는 위치에서 시스테인을 포함한다.
본 기재 내용은 또한 본원에 기재된 임의의 폴리펩티드의 절편을 제공한다. 일부 구현예에서, 절편은 암호화된 폴리펩티드(예컨대, 서열번호: 8의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드)의 적어도 약 10개, 적어도 약 15개, 적어도 약 20개, 적어도 약 25개, 적어도 약 30개, 적어도 약 35개, 적어도 약 40개, 적어도 약 45개, 적어도 약 50개, 적어도 약 55개, 적어도 약 60개, 적어도 약 65개, 적어도 약 70개, 또는 적어도 약 75개의 연속하는 아미노산 잔기를 포함한다. 이에 대하여, 더 긴 절편은 더 짧은 것들보다 바람직하다.
본 기재 내용은 또한 변이체 CRNN 폴리펩티드를 포함하는 분리된 폴리펩티드를 포함하는 이량체를 제공하는데, 여기에서 폴리펩티드는 본원에 기재된 임의의 폴리펩티드로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 분리된 폴리펩티드는 이종 폴리펩티드 또는 이종 분자 또는 표지에 연결되거나 또는 융합되며, 이들의 다수의 예들은 본원에서 다른 곳에 기재되어 있다. 예를 들어, 단백질은 안정성을 증가 또는 감소시키는 이종 폴리펩티드에 융합될 수 있다. 융합된 도메인 또는 이종 폴리펩티드는 폴리펩티드 내에서 N-말단, C-말단 또는 내부에 위치할 수 있다. 융합 파트너는 예를 들어, T 헬퍼 에피토프를 제공하는데 도움을 줄 수 있거나(면역학적 융합 파트너), 또는 고유의 재조합 폴리펩티드보다 더 높은 수율로 단백질을 발현시키는데 도움을 줄 수 있다(발현 인핸서). 특정 융합 파트너는 면역학적 및 발현 개선 융합 파트너 둘 다이다. 다른 융합 파트너는 폴리펩티드의 용해성을 증가시키기 위해, 또는 폴리펩티드를 원하는 세포내 구획으로 표적화하기에 용이하도록 선택될 수 있다. 일부 융합 파트너는 친화성 태그를 포함하는데, 이는 폴리펩티드의 정제를 용이하게 한다.
일부 구현예에서, 융합 단백질은 이종 분자에 직접 융합되거나, 또는 링커, 예컨대 펩티드 링커를 통해 이종 분자에 연결된다. 적합한 펩티드 링커 서열은 예를 들어, 이하의 인자: 1) 유연성이 있는 신장된 입체 구조를 채택하는 능력; 2) 제1 및 제2 폴리펩티드 상의 기능성 에피토프들과 반응할 수 있는 2차 구조를 채택하는데 대한 저항성; 및 3) 폴리펩티드 기능성 에피토프와 상호작용할 수 있는 소수성 또는 전하성 잔기의 결핍에 기초하여 선택될 수 있다. 예를 들어, 펩티드 링커 서열은 Gly, Asn 및 Ser 잔기를 함유할 수 있다. 다른 근처의 중성 아미노산, 예컨대 Thr 및 Ala도 또한 링커 서열에 사용될 수 있다. 링커로서 유용하게 이용될 수 있는 아미노산 서열은, 예를 들어, 문헌[Maratea 등, Gene, 1985, 40, 39-46; Murphy 등, Proc. Natl . Acad . Sci . USA, 1986, 83, 8258-8262]; 및 미국 특허 4,935,233 및 4,751,180에 기재된 것들을 포함한다. 링커 서열은 일반적으로 예를 들어, 1 내지 약 50 개 길이의 아미노산일 수 있다. 제1 및 제2 폴리펩티드가 기능성 도메인들을 분리하고 입체적 간섭을 방지하는데 사용될 수 있는 비-본질적인 N-말단 아미노산 부위를 갖는 경우, 링커 서열은 일반적으로 요구되지 않는다.
일부 구현예에서, 폴리펩티드는 세포-관통 도메인에 작동가능하게 연결된다. 예를 들어, 세포-관통 도메인은 HIV-1 TAT 단백질, 인간 간염 B 바이러스로부터의 TLM 세포-관통 모티프, MPG, Pep-1, VP22, 단순 포진 바이러스로부터의 세포-관통 펩티드, 또는 폴리아르기닌 펩티드 서열으로부터 유래할 수 있다. 예를 들어, WO 2014/089290을 참고하라. 세포-관통 도메인은 N-말단, C-말단, 또는 단백질 내의 어느 부분에도 위치할 수 있다.
일부 구현예에서, 폴리펩티드는 추적 또는 정제의 용이성을 위한 이종 폴리펩티드, 예컨대 형광 단백질, 정제 태그, 또는 에피토프 태그에 작동가능하게 연결된다. 형광 단백질의 예는 녹색 형광 단백질(예를 들어, GFP, GFP-2, tagGFP, turboGFP, eGFP, 에머랄드, 아자미 그린, 단량체 아자미 그린, CopGFP, AceGFP, Zsgreenl), 황색 형광 단백질[예를 들어, YFP, eYFP, 시트린(Citrine), 비너스, YPet, PhiYFP, ZsYellowl], 청색 형광 단백질[예를 들어, eBFP, eBFP2, 아주리트(Azurite), mKalamal, GFPuv, 사파이어, T-사파이어], 청록색 형광 단백질[예를 들어, eCFP, 세룰레안(Cerulean), CyPet, Amcyanl, 미도리시-시안(Midoriishi-cyan)], 적색 형광 단백질(예를 들어, mKate, mKate2, mPlum, DsRed 단량체, mCherry, mRFP1, DsRed-익스프레스, DsRed2, DsRed-단량체, HcRed-탠덤, HcRedl, AsRed2, eqFP611, mRaspberry, mStrawberry, Jred), 오렌지 형광 단백질[예를 들어, mOrange, mKO, 쿠사비라-오렌지(Kusabira-Orange), 단량체 쿠사비라-오렌지, mTangerine, tdTomato], 및 임의의 다른 적합한 형광 단백질을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 태그의 예는, 글루타티온-S-트랜스퍼라제(GST), 키틴 결합 단백질(CBP), 말토스 결합 단백질, 티오레독신(TRX), 폴리(NANP), 일렬의 친화성 정제(TAP) 태그, myc, AcV5, AU1, AU5, E, ECS, E2, FLAG, 헤마글루티닌(HA), nus, Softag 1, Softag 3, Strep, SBP, Glu-Glu, HSV, KT3, S, S1, T7, V5, VSV-G, 히스티딘(His), 비오틴 카르복실 담체 단백질(BCCP), 및 칼모듈린을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 이종 분자는 이뮤노글루불린 Fc 도메인, 펩티드 태그, 형질도입 도메인, 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리살리실산, 또는 글리콜산이다.
일부 구현예에서, 분리된 폴리펩티드는 비-자연적 또는 개질된 아미노산 또는 펩티드 유사체를 포함한다. 예를 들어, 자연발생적 아미노산과는 상이한 기능성 치환체를 갖는 다수의 D-아미노산 또는 아미노산이 있다. 자연발생적 펩티드의 반대 입체 이성질체, 뿐만 아니라 펩티드 유사체의 입체 이성질체도 기재되어 있다. 이들 아미노산은 tRNA 분자에 선택된 아미노산을 충전하고, 예를 들어, 앰버 코돈을 활용하는 유전적 구조체를 조작함으로서 폴리펩티드 사슬에 용이하게 혼입되어, 유사체 아미노산을 부위-특이적인 방식으로 펩티드 사슬에 삽입할 수 있다.
일부 구현예에서, 분리된 폴리펩티드는 펩티드 모방체인데, 이는 펩티드와 닮게 생성될 수 있으나, 자연적인 펩티드 연결기를 통해 연결되지 않는다. 예를 들어, 아미노산 또는 아미노산 유사체를 위한 연결기는 -CH2NH-, -CH2S-, -CH2-, -CH=CH-(시스 및 트랜스), -COCH2-, -CH(OH)CH2- 및 -CHH2SO-를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 펩티드 유사체는 결합 원자들 사이에, 하나 초과의 원자, 예컨대 b-알라닌, 가미노부티르산 등을 가질 수 있다. 아미노산 유사체 및 펩티드 유사체는 종종 개선된 또는 바람직한 성질들, 예컨대 더욱 경제적인 생산성, 더 큰 화학적 안정성, 개선된 약학적 성질들[반감기, 흡수성, 역가(potency), 효능 등], 변화된 특이성(예를 들어, 넓은 범위의 생물학적 활성), 감소된 항원성, 및 다른 바람직한 성질들을 갖는다.
일부 구현예에서, 분리된 폴리펩티드는 D-아미노산을 포함하는데, 이는 D 아미노산이 펩티다제에 의해 인식되지 않으므로 더욱 안정한 펩티드를 생성하는데 사용될 수 있다. 일치되는 서열을 갖는 하나 이상의 아미노산을 동일한 유형의 D-아미노산으로 전체적으로 치환(예를 들어, L-리신 대신 D-리신)하는 것은, 더욱 안정한 펩티드를 생성하는데 사용될 수 있다. 시스테인 잔기는 둘 이상의 펩티드를 함께 환형화하거나, 또는 부착시키는데 사용될 수 있다. 이것은 펩티드를 특정 입체 구조로 제한하는데 유리할 수 있다(예를 들어, 문헌[Rizo and Gierasch, Ann. Rev. Biochem., 1992, 61, 387]를 참고하라).
본 기재 내용은 또한 본원에 기재된 임의의 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자를 제공한다. 이것은 특정 폴리펩티드 서열에 관계된 모든 축퇴 서열(하나의 특정 폴리펩티드 서열을 암호화하는 서열을 갖는 모든 핵산, 뿐만 아니라 단백질 서열의 기재된 변이체 및 유도체를 암호화하는 축퇴 핵산을 포함하는 모든 핵산)을 포함한다. 따라서, 각각의 특정 핵산 서열이 본원에서 다 기재되지 않았을 수 있지만, 각각의 모든 서열은 기재된 폴리펩티드 서열을 통해 본원에서 사실상 기술 및 기재되어 있다.
핵산 내의 핵산 서열 또는 폴리펩티드 내의 아미노산 서열의 특정 신장들 간의 퍼센트 일치성 (또는 퍼센트 상보성)은, BLAST 프로그램(기본적인 국재적 정렬 연구 도구) 및 PowerBLAST 프로그램(Altschul 등, J. Mol. Biol., 1990, 215, 403-410; Zhang and Madden, Genome Res., 1997, 7, 649-656)을 사용함으로서, 또는 Gap 프로그램(위스콘신 서열 분석 패키지, Smith 및 Waterman의 알고리즘(Adv. Appl. Math., 1981, 2, 482-489)을 사용하는 디폴트 세팅을 사용하는 Unix를 위한 버전 8, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison Wis.)을 사용함으로서 결정될 수 있다. 본원에서, 퍼센트 서열 일치성에 대한 언급이 있는 경우, 서열 일치성의 백분율이 더 높은 것은 더 낮은 것보다 바람직하다.
본 기재 내용은 또한 본원에 기재된 임의의 하나 이상의 핵산 분자 및/또는 임의의 하나 이상의 폴리펩티드, 및 담체 및/또는 부형제를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 구현예에서, 담체는 핵산 분자 및/또는 폴리펩티드의 안정성을 증가시킨다[예를 들어, 분해 생성물이 역치 이하, 예컨대 개시 핵산 또는 단백질의 0.5 중량% 미만으로 유지되기 위한 소정의 저장 조건(예를 들어, -20℃, 4℃, 또는 주변 온도) 하에서의 기간 연장; 또는 생체내에서의 안정성 증가]. 담체의 예는 폴리(락트산)(PLA) 미소구체, 폴리(D,L-락틱-글리콜-산)(PLGA) 미소구체, 리포솜, 마이셀, 역상 마이셀, 지질 코클레에이트(cochleate) 및 지질 미세소관을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 담체는 완충된 염 용액, 예컨대 PBS, HBSS 등을 포함할 수 있다.
본 기재 내용은 또한 본원에 기재된 임의의 폴리펩티드 또는 이의 절편을 생성하는 방법을 제공한다. 이러한 폴리펩티드 또는 이의 절편은 임의의 적합한 방법에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드 또는 이의 절편은 이러한 폴리펩티드 또는 이의 절편을 암호화하는 핵산 분자(예를 들어, 재조합 발현 벡터)를 포함하는 숙주 세포로부터 생성될 수 있다. 이러한 방법은 폴리펩티드 또는 이의 절편을 암호화하는 핵산 분자(예를 들어, 재조합 발현 벡터)를 포함하는 숙주 세포를 폴리펩티드 또는 이의 절편을 생성하는데 충분한 조건 하에서 배양함으로서, 폴리펩티드 또는 이의 절편을 생성하는 단계를 포함할 수 있다. 핵산은 숙주 세포에서 활성인 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있고, 배양 단계는 핵산이 발현되는 조건 하에서 실시될 수 있다. 이러한 방법은 발현된 폴리펩티드 또는 이의 절편을 회수하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 회수 단계는 폴리펩티드 또는 이의 절편을 정제하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
단백질 발현에 적합한 시스템의 예는, 숙주 세포, 예를 들어: 박테리아 세포 발현 시스템[예를 들어, 대장균(Escherichia coli ), 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis )], 효모 세포 발현 시스템[예를 들어, 사카로마이세스 세르비시애(Saccharomyces cerevisiae ), 피치아 파스토리스( Pichia pastoris )], 곤충 세포 발현 시스템(예를 들어, 배큘로바이러스-매개된 단백질 발현), 및 포유류 세포 발현 시스템을 포함한다.
폴리펩티드 또는 이의 절편을 암호화하는 핵산 분자의 예는, 본원의 다른 곳에 더욱 상세히 기재되어 있다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 숙주 세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화된다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 숙주 세포에서 활성인 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 프로모터는 이종 프로모터(예를 들어, 자연발생적 프로모터가 아닌 프로모터)일 수 있다. 대장균에 적합한 프로모터의 예는, 아라비노스, lac, tac 및 T7 프로모터를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 락토코커스 락티스에 적합한 프로모터의 예는, P170 및 니신(nisin) 프로모터를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 사카로마이세스 세르비시애에 적합한 프로모터의 예는, 항시성 프로모터, 예컨대 알콜 데히드로게나제(ADHI) 또는 에놀라제(ENO) 프로모터, 또는 유도성 프로모터, 예컨대 PHO, CUP1, GAL1 및 G10을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 피치아 파스토리스에 적합한 프로모터의 예는, 알콜 옥시다제 I(AOX I) 프로모터, 글리세르알데히드 3 포스페이트 데히드로게나제(GAP) 프로모터, 및 글루타티온 의존성 포름알데히드 데히드로게나제(FLDI) 프로모터를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 배큘로바이러스-매개된 시스템에 적합한 프로모터의 예는, 후기 바이러스 강한 폴리헤드린 프로모터이다.
일부 구현예에서, 핵산 분자는 폴리펩티드 또는 이의 절편과 프레임에 맞게 태그를 암호화하여, 단백질 정제를 용이하게 한다. 태그의 예는 본원에서 다른 곳에 기재되어 있다. 이러한 태그는 예를 들어 파트너 리간드에 결합(예를 들어, 합성 수지에 고정)될 수 있어서, 태그가 붙은 단백질은 모든 다른 단백질(예를 들어, 숙주 세포 단백질)로부터 분리될 수 있다. 친화성 크로마토그래피, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 및 크기 배제 크로마토그래피(SEC)는, 발현된 단백질의 순도를 개선시키는데 사용될 수 있는 방법의 예이다.
다른 방법도 또한 폴리펩티드 또는 이의 절편을 생성하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 둘 이상의 펩티드 또는 폴리펩티드는 단백질 화학 기술에 의해 함께 연결될 수 있다. 예를 들어, 펩티드 또는 폴리펩티드는 Fmoc(9-플루오레닐메틸옥시카보닐) 또는 Boc(tert-부틸옥시카보노일) 화학 중 하나를 사용하여 화학적으로 합성될 수 있다. 이러한 펩티드 또는 폴리펩티드는 표준 화학적 반응에 의해 합성될 수 있다. 예를 들어, 펩티드 또는 폴리펩티드는 합성되어 이의 합성 수지로부터 분리되지 않을 수 있는 반면, 펩티드 또는 단백질의 다른 절편은 합성된 후 합성 수지로부터 추후 분리될 수 있고, 이로 인해 다른 절편을 기능적으로 차단하는 말단 기를 노출시킨다. 펩티드 축합 반응에 의해, 이들 2개의 절편은 펩티드 결합을 통해 각각 이들의 카르복실 및 아미노 말단에서 공유적으로 연결될 수 있다. 대안적으로, 펩티드 또는 폴리펩티드는 본원에 기재된 바와 같이, 독립적으로 생체내에서 합성될 수 있다. 일단 분리되면, 이들 독립적인 펩티드 또는 폴리펩티드는 유사한 펩티드 축합 반응을 통해 연결되어, 펩티드 또는 이의 절편을 형성할 수 있다.
일부 구현예에서, 클로닝된 또는 합성 펩티드 단편의 효소적 라이게이션으로 비교적 짧은 펩티드 절편들이 연결되어, 더 큰 펩티드 절편, 폴리펩티드 또는 전체 단백질 도메인을 생성하게 된다(Abrahmsen 등, Biochemistry, 1991, 30, 4151). 대안적으로, 합성 펩티드의 고유의 화학적 라이게이션은 합성에 의해 더 짧은 펩티드 절편으로부터 큰 펩티드 또는 폴리펩티드를 제조하는데 사용될 수 있다. 이러한 방법은 2-단계 화학 반응으로 이루어질 수 있다(Dawson 등, Science, 1994, 266, 776-779). 제1 단계는 비보호된 합성 펩티드-티오에스테르와 아미노-말단 Cys 잔기를 함유하는 또 다른 비보호된 펩티드 단편의 화학선택적인 반응이며, 초기의 공유적인 생성물로서 티오에스테르-연결된 중간생성물을 얻을 수 있다. 반응 조건에서 변화 없이, 이러한 중간생성물은 자발적인, 신속한 분자내 반응을 일으켜, 라이게이션 부위에서 고유의 펩티드 결합을 형성할 수 있다.
일부 구현예에서, 비보호된 펩티드 단편들은 화학적으로 연결될 수 있고, 여기에서 화학적 라이게이션의 결과로서 펩티드 단편들 사이에 형성된 결합은 비자연적인 (비-펩티드) 결합이다(Schnolzer 등, Science, 1992, 256, 221).
일부 구현예에서, 폴리펩티드는 발현-후 개질, 예컨대 당화, 아세틸화 및 인산화, 뿐만 아니라 자연발생적 및 비-자연발생적 둘 다일 수 있는 다른 개질을 포함할 수 있다. 폴리펩티드는 전체 단백질, 또는 이의 하위 서열일 수 있다.
본 기재 내용은 또한 본원에 기재된 임의의 폴리펩티드를 생성하는 방법을 제공하는데, 이는 본원에 기재된 하나 이상의 폴리펩티드를 암호화할 수 있는 폴리뉴클레오티드, 또는 이의 상보체를 포함하는 핵산 분자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 배양함으로서, 폴리펩티드를 생성하는 단계를 포함한다.
본 기재 내용은 또한 임의의 하나 이상의 핵산 분자(핵산 분자들을 포함하는 벡터 포함), 및/또는 임의의 하나 이상의 본원에 기재된 폴리펩티드를 포함하는 세포(예를 들어, 재조합 숙주 세포)를 제공한다. 세포는 시험관내, 시험관외, 또는 생체내에 있을 수 있다. 핵산 분자는 프로모터 및 다른 조절 서열에 연결될 수 있어서, 이들은 발현되어 암호화된 단백질을 생성한다. 이러한 세포의 세포주가 추가로 제공된다.
일부 구현예에서, 세포는 전능성 세포 또는 다능성 세포[예를 들어, 배아 줄기(ES) 세포, 예컨대 설치류 ES 세포, 마우스 ES 세포, 또는 래트 ES 세포]이다. 전능성 세포는 임의의 세포 유형으로 발생할 수 있는 미분화 세포를 포함하고, 다능성 세포는 하나 초과의 분화된 세포 유형으로 발달될 수 있는 능력을 갖는 미분화 세포를 포함한다. 이러한 다능성 및/또는 전능성 세포는 예를 들어, ES 세포 또는 ES-유사 세포, 예컨대 유도된 다능성 줄기(iPS) 세포일 수 있다. ES 세포는 배아에 도입될 때, 발달 중인 배아의 어느 조직에 기여할 수 있는 배아-유래의 전능성 또는 다능성 세포를 포함한다. ES 세포는 배반포의 내부 세포괴로부터 유래될 수 있고, 3개의 척추동물 배엽들(내배엽, 외배엽, 및 중배엽) 중 어느 것의 세포로 분화할 수 있다. 본 기재 내용에 의하면, 배아 줄기 세포는 비-인간 배아 줄기 세포일 수 있다.
일부 구현예에서, 세포는 1차 성체 세포, 또는 1차 성체 세포가 아닌 세포이다. 성체 세포는 배우자(gamete), 생식 세포, 생식모세포(gametocyte), 또는 미분화 줄기 세포가 아닌 임의의 세포를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 세포는 또한 1차 세포일 수도 있다. 1차 세포는 생체, 장기 또는 조직으로부터 직접 분리된 세포 또는 세포의 배양물을 포함한다. 1차 세포는 형질전환되지도 않았고 불멸화되지도 않은 세포를 포함한다. 1차 세포는 조직 배양에서 이전에 계대(passed)되지 않았거나, 또는 이전 조직 배양에서 계대되었으나 조직 배양에서 무한히 계대될 수 없는 생체, 기관 또는 조직으로부터 얻은 임의의 세포를 포함한다. 이러한 세포는 종래의 기술에 의해 분리될 수 있고, 예를 들어 성체 세포, 조혈 세포, 내피 세포, 상피 세포, 근아세포, 간엽 세포, 각질 세포, 멜라닌 세포, 단핵구, 단핵 세포, 지방 세포, 지방전구세포, 뉴런, 교세포, 간세포, 골격 근아세포 및 평활근 세포를 포함한다. 예를 들어, 1차 세포는 연결 조직, 근육 조직, 신경 조직 또는 상피 조직으로부터 유래할 수 있다.
일부 구현예에서, 세포는 정상적으로는 무한정 증식할 수 없으나, 돌연변이 또는 변이에 기인하여, 정상적인 세포 노화를 피하고, 그 대신에 분열을 지속할 수 있다. 이러한 돌연변이 또는 변이는 자연 발생하거나, 또는 의도적으로 유도될 수 있다. 불멸 세포의 예는, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, 인간 배아 신장 세포(예를 들어, HEK 293 세포) 및 마우스 배아 섬유아세포 세포(예를 들어, 3T3 세포)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 다수의 유형의 불멸화된 세포들이 사용될 수 있다. 불멸화된 또는 1차 세포는 전형적으로 재조합 유전자 또는 단백질을 배양 또는 발현시키기 위해 사용되는 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포는 분화된 세포, 예컨대 간 세포(예를 들어, 인간 간 세포)이다.
세포는 어떠한 공급원으로부터도 유래할 수 있다. 예를 들어, 세포는 진핵 세포, 동물 세포, 식물 세포, 또는 진균(예를 들어, 효모) 세포일 수 있다. 이러한 세포는 어류 세포 또는 조류 세포일 수 있거나, 또는 이러한 세포는 포유류 세포, 예컨대 인간 세포, 비-인간 포유류 세포, 설치류 세포, 마우스 세포 또는 래트 세포일 수 있다. 포유류는 인간, 비-인간 영장류, 원숭이, 유인원, 고양이 개, 말, 황소, 사슴, 들소, 양, 설치류(예를 들어, 마우스, 래트, 햄스터, 기니 피그), 가축(예를 들어, 소 종, 예컨대 암소 및 수소 등; 양 종, 예컨대 양, 염소 등; 및 돼지 종, 예컨대 돼지 및 멧돼지)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 조류는 닭, 칠면조, 타조, 거위, 오리 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 가축 동물 및 농업 동물도 또한 포함된다. 용어 "비-인간 동물(non-human animal)"은, 인간을 배제한다.
추가적인 숙주 세포는 예를 들어, 2016년 7월 28일자 제출된 미국 가특허출원 62/367,973에 기재되어 있고, 이는 본원에서 전체가 참고로서 포함된다.
본원에 기재된 핵산 분자 및 폴리펩티드는, 임의의 수단에 의해 세포로 도입될 수 있다. 형질감염 프로토콜, 뿐만 아니라 핵산 또는 단백질을 세포로 도입하기 위한 프로토콜은 달라질 수 있다. 비-제한적인 형질감염 방법은 리포솜, 나노입자, 칼슘, 덴드리머, 및 양이온성 중합체, 예컨대 DEAE-덱스트란 또는 폴리에틸렌이민을 사용하는 화학적-기반의 형질감염 방법을 포함한다. 비-화학적 방법은 전기천공, 음파-천공 및 광학적 형질감염을 포함한다. 입자-기반 형질감염은 유전자 총, 또는 자석-보조 형질감염의 사용을 포함한다. 바이러스 방법은 또한 형질감염에 대해서도 사용될 수 있다.
핵산 또는 단백질의 세포에 대한 도입은 또한 전기천공에 의해, 세포질내 감염에 의해, 바이러스 감염에 의해, 아데노바이러스에 의해, 아데노-관련 바이러스에 의해, 렌티바이러스에 의해, 레트로바이러스에 의해, 형질감염에 의해, 지질-매개된 형질감염에 의해, 또는 뉴클레오펙션(nucleofection)에 의해 매개될 수 있다. 뉴클레오펙션은 핵산 기질이 세포질 뿐만 아니라 또한 핵막을 통해 핵으로 전달될 수 있게 하는 개선된 전기 천공 기술이다. 추가로, 본원에 기재된 방법에서의 뉴클레오펙션의 사용은 전형적으로 통상의 전기천공보다 훨씬 적은 세포를 요구한다(예를 들어, 통상의 전기천공에 의한 7백만개에 비해, 단지 약 2 백만개). 일부 구현예에서, 뉴클레오펙션은 LONZA® NUCLEOFECTOR™ 시스템을 사용하여 수행된다.
핵산 또는 단백질의 세포로의 도입은 또한 미세주입에 의해서도 달성될 수 있다. mRNA의 미세주입은 통상 [예를 들어, mRNA를 번역 소기구(translation machinery)들에 직접 전달하기 위해] 세포질에 대해 이루어지는 반면, 단백질 또는 DNA의 미세주입은 통상 핵에 대해 이루어진다. 대안적으로, 미세주입은 핵 및 세포질 둘 다에 대한 주입으로 실시될 수 있는데: 먼저 바늘을 핵에 도입할 수 있고, 제1 양을 주입할 수 있고, 세포로부터 바늘을 제거하면서 제2 양을 세포질에 주입할 수 있다. 뉴클레아제 제제 단백질이 세포질에 주입되는 경우, 단백질은 핵 국재화 신호를 포함하여, 핵/전핵에 대한 전달을 보장할 수 있다.
핵산 또는 단백질을 세포에 도입하기 위한 다른 방법은, 예를 들어, 벡터 전달, 입자-매개된 전달, 엑소솜-매개된 전달, 지질-나노입자-매개된 전달, 세포-관통-펩티드-매개된 전달, 또는 이식-장치-매개된 전달을 포함할 수 있다. 핵산 또는 단백질을 대상체에 투여하여 생체내에서 세포를 개질하기 위한 방법은, 본원에서 다른 곳에 기재되어 있다. 핵산 및 단백질을 세포로 도입하는 것은, 또한 수력학적 전달(HDD)에 의해 달성될 수 있다.
핵산 또는 단백질을 세포로 도입하기 위한 다른 방법은, 예를 들어, 벡터 전달, 입자-매개된 전달, 엑소솜-매개된 전달, 지질-나노입자-매개된 전달, 세포-관통-펩티드-매개된 전달, 또는 이식-장치-매개된 전달을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 핵산 또는 단백질은 담체, 예컨대 폴리(락트산)(PLA) 미소구체, 폴리(D,L-락틱-글리콜-산)(PLGA) 미소구체, 리포솜, 마이셀, 역상 마이셀, 지질 코클레에이트 또는 지질 미세소관 내에서 세포에 도입될 수 있다.
본 기재 내용은 또한 프로브 및 프라이머를 포함한다. 프로브 및 프라이머의 예는 예를 들어 상기 기재되어 있다. 본 기재 내용은 본원에 기재된 임의의 핵산 분자에 특이적으로 혼성화하는 핵산 서열을 포함하는 프로브 및 프라이머를 제공한다. 예를 들어, 프로브 또는 프라이머는 서열번호: 8에 의한 위치 79에 상응하는 위치에서 절단된 변이체 CRNN 단백질을 암호화하는 본원에 기재된 임의의 핵산 분자에 혼성화되거나, 또는 상기 핵산 분자의 상보체에 혼성화하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 프로브 또는 프라이머는 서열번호: 8에 의한 변이체 CRNN 단백질을 암호화하는 핵산 분자에 혼성화하거나, 또는 이러한 핵산 분자의 상보체에 혼성화하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 프로브 또는 프라이머는 서열번호: 8에 의한 위치 79에 상응하는 위치에서 절단되고, 서열번호: 8에 의한 위치 69에 상응하는 위치에서 시스테인을 포함하는 변이체 CRNN 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자에 혼성화되거나, 또는 이러한 핵산 분자의 상보체에 혼성화하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 프로브 또는 프라이머는 서열번호: 8에 의한 위치 79에 상응하는 위치에서 절단되고, 서열번호: 8에 의한 위치 69 내지 79에 상응하는 위치에 복수의 아미노산을 포함하는 변이체 CRNN 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자에 혼성화하거나, 또는 이러한 핵산 분자의 상보체에 혼성화하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 프로브 또는 프라이머는 서열번호: 8에 의한 위치 79에 상응하는 위치에서 절단되고, 서열번호: 8에 의한 위치 69 내지 79에 상응하는 위치에서 이하의 아미노산 서열: Cys-Gly-Ile-Gln-Gly-Ile-Pro-Gly-Leu-Ser-Val(서열번호: 10)을 포함하는 변이체 CRNN 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자에 혼성화하거나, 또는 이러한 핵산 분자의 상보체에 혼성화하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 프로브 또는 프라이머는 서열번호: 8에 의한 아미노산 서열에 대해 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 서열 일치성을 갖고, 서열번호: 8에 의한 위치 69에 상응하는 위치에서 시스테인을 포함하는 변이체 CRNN 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자에 혼성화하거나, 이러한 핵산 분자의 상보체에 혼성화하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 프로브 또는 프라이머는 서열번호: 8에 의한 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어지는 변이체 CRNN 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자에 혼성화하거나, 또는 이러한 핵산 분자의 상보체에 혼성화하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 프로브 또는 프라이머는 서열번호: 8에 의한 위치 69에 상응하는 위치에서 시스테인을 암호화하는 코돈을 포함하는 핵산 분자의 일부에 특이적으로 혼성화한다.
프로브 또는 프라이머는 임의의 적합한 길이를 포함할 수 있는데, 이의 비-제한적인 예는 적어도 약 5개, 적어도 약 8개, 적어도 약 10개, 적어도 약 11개, 적어도 약 12개, 적어도 약 13개, 적어도 약 14개, 적어도 약 15개, 적어도 약 16개, 적어도 약 17개, 적어도 약 18개, 적어도 약 19개, 적어도 약 20개, 적어도 약 21개, 적어도 약 22개, 적어도 약 23개, 적어도 약 24개, 또는 적어도 약 25개 길이의 뉴클레오티드를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 프로브 또는 프라이머는 적어도 약 18개 길이의 뉴클레오티드를 포함한다. 프로브 또는 프라이머는 약 10개 내지 약 35개, 약 10개 내지 약 30개, 약 10개 내지 약 25개, 약 12개 내지 약 30개, 약 12개 내지 약 28개, 약 12개 내지 약 24개, 약 15개 내지 약 30개, 약 15개 내지 약 25개, 약 18개 내지 약 30개, 약 18개 내지 약 25개, 약 18개 내지 약 24개, 또는 약 18개 내지 약 22개 길이의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 프로브 또는 프라이머는 약 18개 내지 약 30개 길이의 뉴클레오티드이다.
본 기재 내용은 또한 서열번호: 8에 의한 위치 79에 상응하는 위치에서 절단된 기능-소실 CRNN 단백질 또는 CRNN 단백질을 암호화하는 핵산 서열에 상보적인 핵산 서열을 포함하는 변이-특이적인 프로브 또는 프라이머를 제공하는데, 여기에서 상기 변이-특이적인 프로브 또는 프라이머는 서열번호: 8, 또는 이의 상보체에 의한 위치 69 내지 76, 78, 또는 79에 상응하는 임의의 복수의 위치들을 암호화하는 핵산 분자의 일부에 상보적인 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 변이-특이적인 프로브 또는 프라이머는 서열번호: 8에 의한 위치 69에 상응하는 위치를 암호화하는 핵산 분자의 일부에 특이적으로 혼성화한다. 변이-특이적인 프로브 또는 프라이머는 야생형 CRNN 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 갖는 핵산 분자와는 혼성화하지 않는다.
본 기재 내용은 또한 변이-특이적인 프로브 및 변이-특이적인 프라이머를 제공한다. 변이-특이적인 프로브 또는 변이-특이적인 프라이머는 서열번호: 8에 의한 위치 79에 상응하는 위치에서 절단된 변이체 CRNN 단백질을 암호화하는 핵산 서열에 상보적인 및/또는 혼성화하거나 또는 특이적으로 혼성화하는 핵산 서열, 또는 이의 상보체를 포함한다.
본 기재 내용의 맥락상, "특이적으로 혼성화하는(specifically hybridize)"은, 프로브 또는 프라이머(예를 들어, 변이-특이적인 프로브 또는 변이-특이적인 프라이머)가 야생형 CRNN 단백질을 암호화하는 핵산 분자에는 혼성화하지 않는 것을 의미한다. 일부 구현예에서, 변이-특이적인 프로브는 서열번호: 8에 의한 위치 69에 상응하는 위치에서 시스테인을 암호화하는 핵산 코돈, 또는 이의 상보체에 특이적으로 혼성화한다. 일부 구현예에서, 변이-특이적인 프라이머, 또는 프라이머 쌍은, 변이체 CRNN 단백질을 암호화하는 핵산 분자의 부위(들)에 특이적으로 혼성화하여, 서열번호: 8에 의한 위치 69에 상응하는 위치에서 시스테인을 암호화하는 코돈이, 이로부터 생성된 임의의 전사체 내에 포함된다. 일부 구현예에서, 프로브 또는 프라이머는 서열번호: 8에 의한 위치 69에 상응하는 위치에서 시스테인을 암호화하는 코돈을 포함하는 핵산 분자의 일부와 특이적으로 혼성화한다.
일부 구현예에서, 변이-특이적인 프로브 또는 변이-특이적인 프라이머는 변이체 CRNN 단백질을 암호화하는 핵산 서열에 상보적인 및/또는 혼성화하거나 또는 특이적으로 혼성화하는 핵산 서열, 또는 이의 상보체를 포함하는데, 여기에서 상기 단백질은 서열번호: 8에 의한 위치 79에 상응하는 위치에 절단을 포함한다.
일부 구현예에서, 변이-특이적인 프로브 또는 변이-특이적인 프라이머는 서열번호: 8에 의한 위치 79에 상응하는 위치에서 절단된 변이체 CRNN 단백질을 암호화하는 게놈 DNA 분자에 상보적인 및/또는 혼성화하거나 또는 특이적으로 혼성화하는 핵산 서열, 또는 이의 상보체를 포함한다. 일부 구현예에서, 변이-특이적인 프로브 또는 변이-특이적인 프라이머는 서열번호: 8에 의한 위치 79에 상응하는 위치에서 절단되고, 서열번호: 8에 의한 위치 69에 상응하는 위치에서 시스테인을 포함하는 변이체 CRNN 단백질을 암호화하는 게놈 DNA 분자에 상보적인 및/또는 혼성화하거나 또는 특이적으로 혼성화하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 변이-특이적인 프로브 또는 변이-특이적인 프라이머는 서열번호: 8에 의한 위치 79에 상응하는 위치에서 절단되고, 서열번호: 8에 의한 위치 69 내지 79에 상응하는 위치에서 이하의 아미노산 서열: Cys-Gly-Ile-Gln-Gly-Ile-Pro-Gly-Leu-Ser-Val(서열번호: 10)을 포함하는 변이체 CRNN 단백질을 암호화하는 게놈 DNA 분자에 상보적인 및/또는 혼성화하거나 또는 특이적으로 혼성화하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 변이-특이적인 프로브 또는 변이-특이적인 프라이머는 서열번호: 8에 대해 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 서열 일치성을 갖고, 서열번호: 8에 의한 위치 69에 상응하는 위치에서 시스테인을 포함하는 변이체 CRNN 단백질을 암호화하는 게놈 DNA 분자에 상보적인 및/또는 혼성화하거나 또는 특이적으로 혼성화하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 변이-특이적인 프로브 또는 변이-특이적인 프라이머는 서열번호: 8을 갖는 변이체 CRNN 단백질을 암호화하는 게놈 DNA 분자에 상보적인 및/또는 혼성화하거나 또는 특이적으로 혼성화하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 프로브 또는 프라이머는 서열번호: 8에 의한 위치 69에 상응하는 위치에서 시스테인을 암호화하는 코돈을 포함하는 게놈 DNA의 일부에 특이적으로 혼성화한다.
일부 구현예에서, 변이-특이적인 프로브 또는 변이-특이적인 프라이머는 서열번호: 2에 의한 위치 3375에 상응하는 위치에서 티민을 포함하는 핵산 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어지는 게놈 DNA 분자에 상보적인 및/또는 혼성화하거나 또는 특이적으로 혼성화하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 변이-특이적인 프로브 또는 변이-특이적인 프라이머는 서열번호: 2에 대해 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 서열 일치성을 갖고, 서열번호: 2에 의한 위치 3375에 상응하는 위치에서 티민을 포함하는 핵산 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어지는 게놈 DNA 분자에 상보적인 및/또는 혼성화하거나 또는 특이적으로 혼성화하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 변이-특이적인 프로브 또는 변이-특이적인 프라이머는 서열번호: 2에 의한 핵산 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어지는 게놈 DNA 분자에 상보적인 및/또는 혼성화하거나 또는 특이적으로 혼성화하는 핵산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 변이-특이적인 프로브 또는 변이-특이적인 프라이머는 서열번호: 8에 의한 위치 79에 상응하는 위치에서 절단된 변이체 CRNN 단백질을 암호화하는 mRNA 분자와 상보적인 및/또는 혼성화되거나 또는 특이적으로 혼성화되는 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 변이-특이적인 프로브 또는 변이-특이적인 프라이머는 서열번호: 8에 의한 위치 79에 상응하는 위치에서 절단되고, 서열번호: 8에 의한 위치 69에 상응하는 위치에서 시스테인을 포함하는 변이체 CRNN 단백질을 암호화하는 mRNA 분자와 상보적인 및/또는 혼성화되거나 또는 특이적으로 혼성화되는 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 변이-특이적인 프로브 또는 변이-특이적인 프라이머는 서열번호: 8에 의한 위치 79에 상응하는 위치에서 절단되고, 서열번호: 8에 의한 위치 69 내지 79에 상응하는 위치에서 이하의 아미노산 서열: Cys-Gly-Ile-Gln-Gly-Ile-Pro-Gly-Leu-Ser-Val(서열번호: 10)을 포함하는 변이체 CRNN 단백질을 암호화하는 mRNA 분자와 상보적인 및/또는 혼성화되거나 또는 특이적으로 혼성화되는 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 변이-특이적인 프로브 또는 변이-특이적인 프라이머는 서열번호: 8에 대해 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 서열 일치성을 갖고, 서열번호: 8에 의한 위치 69에 상응하는 위치에서 시스테인을 포함하는 변이체 CRNN 단백질을 암호화하는 mRNA 분자와 상보적인 및/또는 혼성화되거나 또는 특이적으로 혼성화되는 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 변이-특이적인 프로브 또는 변이-특이적인 프라이머는 서열번호: 8을 갖는, 변이체 CRNN 단백질을 암호화하는 mRNA 분자와 상보적인 및/또는 혼성화되거나 또는 특이적으로 혼성화되는 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 프로브 또는 프라이머는 서열번호: 8에 의한 위치 69에 상응하는 위치에서 시스테인을 암호화하는 코돈을 포함하는 mRNA 분자의 일부에 특이적으로 혼성화한다.
일부 구현예에서, 변이-특이적인 프로브 또는 변이-특이적인 프라이머는 서열번호: 4에 의한 위치 205에 상응하는 위치에서 우라실을 포함하는 핵산 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어지는 mRNA 분자와 상보적인 및/또는 혼성화되거나 또는 특이적으로 혼성화되는 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 변이-특이적인 프로브 또는 변이-특이적인 프라이머는 서열번호: 4에 의한 위치 202 내지 204, 및 205 내지 207에 각각 상응하는 위치에 코돈 ACU 및 UGU를 포함하는 mRNA 분자와 상보적인 및/또는 혼성화되거나 또는 특이적으로 혼성화되는 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 변이-특이적인 프로브 또는 변이-특이적인 프라이머는 서열번호: 4에 대한 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 서열 일치성을 갖고, 서열번호: 4에 의한 위치 205에 상응하는 위치에서 우라실을 포함하는 핵산 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어지는 mRNA 분자와 상보적인 및/또는 혼성화되거나 또는 특이적으로 혼성화되는 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 변이-특이적인 프로브 또는 변이-특이적인 프라이머는 서열번호: 4에 의한 핵산 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어지는 mRNA 분자와 상보적인 및/또는 혼성화되거나 또는 특이적으로 혼성화되는 핵산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 변이-특이적인 프로브 또는 변이-특이적인 프라이머는 서열번호: 8에 의한 위치 79에 상응하는 위치에서 절단된 변이체 CRNN 단백질을 암호화하는 cDNA 분자와 상보적인 및/또는 혼성화되거나 또는 특이적으로 혼성화되는 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 변이-특이적인 프로브 또는 변이-특이적인 프라이머는 서열번호: 8에 의한 위치 79에 상응하는 위치에서 절단되고, 서열번호: 8에 의한 위치 69에 상응하는 위치에서 시스테인을 포함하는 변이체 CRNN 단백질을 암호화하는 cDNA 분자와 상보적인 및/또는 혼성화되거나 또는 특이적으로 혼성화되는 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 변이-특이적인 프로브 또는 변이-특이적인 프라이머는 서열번호: 8에 의한 위치 79에 상응하는 위치에서 절단되고, 서열번호: 8에 의한 위치 69 내지 79에 상응하는 위치에서 이하의 아미노산 서열: Cys-Gly-Ile-Gln-Gly-Ile-Pro-Gly-Leu-Ser-Val(서열번호: 10)을 포함하는 변이체 CRNN 단백질을 암호화하는 cDNA 분자와 상보적인 및/또는 혼성화되거나 또는 특이적으로 혼성화되는 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 변이-특이적인 프로브 또는 변이-특이적인 프라이머는 서열번호: 8에 대해 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 서열 일치성을 갖고, 서열번호: 8에 의한 위치 69에 상응하는 위치에서 시스테인을 포함하는 변이체 CRNN 단백질을 암호화하는 cDNA 분자와 상보적인 및/또는 혼성화되거나 또는 특이적으로 혼성화되는 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 변이-특이적인 프로브 또는 변이-특이적인 프라이머는 서열번호: 8을 갖는 변이체 CRNN 단백질을 암호화하는 cDNA 분자와 상보적인 및/또는 혼성화되거나 또는 특이적으로 혼성화되는 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 프로브 또는 프라이머는 서열번호: 8에 의한 위치 69에 상응하는 위치에서 시스테인을 암호화하는 코돈을 포함하는 cDNA 분자의 일부에 특이적으로 혼성화한다.
일부 구현예에서, 변이-특이적인 프로브 또는 변이-특이적인 프라이머는 서열번호: 6에 의한 위치 205에 상응하는 위치에서 티민을 포함하는 핵산 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어지는 cDNA 분자와 상보적인 및/또는 혼성화되거나 또는 특이적으로 혼성화되는 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 변이-특이적인 프로브 또는 변이-특이적인 프라이머는 서열번호: 6에 의한 위치 202 내지 204, 및 205 내지 207에 각각 상응하는 위치에 코돈 ACT 및 TGT를 포함하는 cDNA 분자와 상보적인 및/또는 혼성화되거나 또는 특이적으로 혼성화되는 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 변이-특이적인 프로브 또는 변이-특이적인 프라이머는 서열번호: 6에 대해 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 서열 일치성을 갖고, 서열번호: 6에 의한 위치 205에 상응하는 위치에서 티민을 포함하는 핵산 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어지는 cDNA 분자와 상보적인 및/또는 혼성화되거나 또는 특이적으로 혼성화되는 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 변이-특이적인 프로브 또는 변이-특이적인 프라이머는, 서열번호: 6에 따른 핵산 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어지는 cDNA 분자와 상보적인 및/또는 혼성화되거나 또는 특이적으로 혼성화되는 핵산 서열을 포함한다.
본 기재 내용의 프로브 또는 프라이머에 대해 상기 기재한 길이는, 필요한 변경을 가하여, 또한 본 기재 내용의 변이-특이적인 프로브 또는 변이-특이적인 프라이머에 적용된다.
본 기재 내용은 또한 상기 기재된 2개의 변이-특이적인 프라이머를 포함하는 한 쌍의 변이-특이적인 프라이머를 제공한다.
일부 구현예에서, 프로브 또는 프라이머(예를 들어, 변이-특이적인 프로브 또는 변이-특이적인 프라이머)는 DNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 프로브 또는 프라이머(예를 들어, 변이-특이적인 프로브 또는 변이-특이적인 프라이머)는 RNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 프로브 또는 프라이머(예를 들어,변이-특이적인 프로브 또는 변이-특이적인 프라이머)는 엄격한 조건, 예컨대 매우 엄격한 조건 하에서 변이체 CRNN 단백질을 암호화하는 핵산 서열에 혼성화된다.
일부 구현예에서, 프로브는 표지를 포함한다. 일부 구현예에서, 표지는 형광 표지, 방사능 표지, 또는 비오틴이다. 일부 구현예에서, 프로브의 길이는 상기에 기재되어 있다. 대안적으로, 일부 구현예에서, 프로브는 적어도 약 20개, 적어도 약 25개, 적어도 약 30개, 적어도 약 35개, 적어도 약 40개, 적어도 약 45개, 적어도 약 50개, 적어도 약 55개, 적어도 약 60개, 적어도 약 65개, 적어도 약 70개, 적어도 약 75개, 적어도 약 80개, 적어도 약 85개, 적어도 약 90개, 적어도 약 95개, 또는 적어도 약 100개 뉴클레오티드를 포함하거나, 또는 이로 이루어진다. 프로브(예를 들어, 대립형질-특이적인 프로브)는, 예를 들어, 본원에 기재된 임의의 핵산 분자를 탐지하는데 사용될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 프로브는 적어도 약 18개 길이의 뉴클레오티드를 포함한다. 프로브는 약 10개 내지 약 35개, 약 10개 내지 약 30개, 약 10개 내지 약 25개, 약 12개 내지 약 30개, 약 12개 내지 약 28개, 약 12개 내지 약 24개, 약 15개 내지 약 30개, 약 15개 내지 약 25개, 약 18개 내지 약 30개, 약 18개 내지 약 25개, 약 18개 내지 약 24개, 또는 약 18개 내지 약 22개 길이의 뉴클레오티드를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 프로브는 약 18개 내지 약 30개 길이의 뉴클레오티드이다.
본 기재 내용은 또한 본원에 기재된 프로브들 중 임의의 하나 이상이 부착된 기질을 포함하는 지지체를 제공한다. 고체 지지체는 분자, 예컨대 본원에 기재된 임의의 프로브가 연결될 수 있는 고체-상 기질 또는 지지체이다. 고체 지지체의 한 형태는 어레이이다. 고체 지지체의 다른 형태는 어레이 탐지기이다. 어레이 탐지기는 다수의 상이한 프로브가 어레이, 그리드, 또는 다른 조직화된 패턴에 커플링될 수 있는 고체 지지체이다.
고체 지지체에 사용하기 위한 고체-상 기질은, 분자가 커플링될 수 있는 임의의 고체 물질을 포함할 수 있다. 이것은 물질, 예컨대 아크릴아미드, 아가로스, 셀룰로스, 니트로셀룰로스, 유리, 폴리스티렌, 폴리에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리프로필렌, 폴리메타크릴레이트, 폴리에틸렌, 폴리에틸렌 옥사이드, 폴리실리케이트, 폴리카보네이트, 테플론, 플루오로카본, 나일론, 실리콘 고무, 다중무수화물, 폴리글리콜산, 폴리락트산, 폴리오쏘에스테르, 폴리프로필퓨머레이트, 콜라겐, 글리코사미노글리칸, 및 폴리아미노산을 포함한다. 고체-상 기질은 박막, 막, 병, 디쉬, 섬유, 직조 섬유, 성형된 중합체, 입자, 비드, 미세입자, 또는 조합을 포함하는 임의의 유용한 형태를 가질 수 있다. 고체-상 기질 및 고체 지지체는 다공성 또는 비-다공성일 수 있다. 고체-상 기질을 위한 형태는 마이크로타이터 디쉬(microtiter dish), 예컨대 표준 96-웰 유형이다. 일부 구현예에서, 통상 웰 당 하나의 어레이를 포함하는 다중 웰 유리 슬라이드가 이용될 수 있다. 이러한 특성은 에세이 재생성, 증가된 대량 처리 및 샘플 취급, 및 자동화의 용이성을 더욱 조절할 수 있게 한다. 일부 구현예에서, 지지체는 마이크로어레이이다.
본원에 기재된 임의의 폴리펩티드는 하나 이상의 치환(예컨대 보존된 아미노산 치환), 삽입, 또는 결실을 추가로 가질 수 있다. 삽입은 예를 들어, 아미노 또는 카르복실 말단 융합, 뿐만 아니라 단일 또는 다수의 아미노산 잔기의 서열내 삽입을 포함한다. 공지된 서열을 갖는 DNA에서 미리 결정된 부위에 치환을 생성하기 위한 기술은, M13 프라이머 돌연변이형성 및 PCR 돌연변이형성을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 아미노산 치환은 전형적으로 단일 잔기에 대한 것이지만, 다수의 상이한 위치에서 한 번에 발생할 수 있고; 삽입은 통상 약 1 내지 10개 아미노산 잔기의 치수로 있을 것이며; 결실은 약 1 내지 30개 잔기의 범위일 것이다. 결실 또는 삽입은 인접한 쌍에서 이루어질 수 있는데, 즉 2개 잔기의 결실 또는 2개 잔기의 삽입이 가능하다. 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 임의의 조합은 결합되어 최종 구조에 이를 수 있다. 일부 구현예에서, 돌연변이는 서열이 해독 틀(reading frame)에서 벗어나게 위치하지 않으며, 2차 mRNA 구조를 생성할 수 있는 상보적인 부위를 형성하지 않는다.
본 기재 내용은 또한 조성물을 제조하고, 본원에 기재된 방법을 활용하기 위한 키트를 제공한다. 본원에 기재된 키트는 대상체의 샘플에서 하나 이상의 유전적 변이체를 탐지하기 위한 에세이 또는 에세이들을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, CRNN 변이체의 인간 식별을 위한 키트는 상기 기재된 조성물 및 방법을 이용한다. 일부 구현예에서, 기본적인 키트는 본원에 기재된 임의의 핵산 분자(예컨대, 예를 들어, 서열번호: 2, 서열번호: 4, 및/또는 서열번호: 6)의 좌위를 위한, 적어도 한 쌍의 올리고뉴클레오티드 프라이머 또는 프로브, 예컨대 변이-특이적인 프로브 또는 변이-특이적인 프라이머를 갖는 용기를 포함할 수 있다. 키트는 또한 선택적으로 사용을 위한 지침을 포함할 수 있다. 키트는 또한 예컨대, 각각의 증폭된 좌위에 대한 하나 이상의 대립형질 래더(ladder), 증폭을 위해 충분한 양의 효소, 증폭을 용이하게 하기 위한 증폭 버퍼, 효소 활성을 용이하게 하기 위한 2가 양이온 용액, 증폭하는 동안 가닥 신장을 위한 dNTP, 전기영동을 위한 증폭된 물질의 제조를 위한 로딩 용액, 주형 조절로서의 게놈 DNA, 물질이 분리 매체에서 예상되는 바와 같이 이동하는지를 확인하기 위한 크기 마커, 사용자를 교육하고 사용시 한계 오차를 제한하기 위한 매뉴얼 및 프로토콜과 같은 다른 선택적인 키트 요소를 포함할 수 있다. 키트 내의 다양한 시약들의 양은 또한 다수의 인자, 예컨대 과정의 최적 감도에 따라서 달라질 수 있다. 수동 적용에서 사용하기 위한 시험 키트, 또는 자동화된 샘플 제조와 함께 사용하기 위한 시험 키트, 반응 셋-업, 탐지기 또는 분석기를 제공하는 것은 이들 기술의 범주 내에 있다.
일부 구현예에서, 키트는 서열번호: 8에 의한 위치 79에 상응하는 위치에서 절단된 변이체 CRNN 단백질을 암호화하는 게놈 DNA 분자 또는 이의 상보체의, 증폭을 위한 적어도 한 쌍의 올리고뉴클레오티드 프라이머(예를 들어, 변이-특이적인 프라이머), 또는 탐지를 위한 적어도 하나의 표지된 올리고뉴클레오티드 프로브(예를 들어, 변이-특이적인 프로브)를 포함한다. 일부 구현예에서, 키트는 서열번호: 8에 의한 위치 79에 상응하는 위치에서 절단되고, 서열번호: 8에 의한 위치 69에 상응하는 위치에서 시스테인을 포함하는 변이체 CRNN 단백질을 암호화하는 게놈 DNA 분자의, 증폭을 위한 적어도 한 쌍의 올리고뉴클레오티드 프라이머(예를 들어, 변이-특이적인 프라이머), 또는 탐지를 위한 적어도 하나의 표지된 올리고뉴클레오티드 프로브(예를 들어, 변이-특이적인 프로브)를 포함한다. 일부 구현예에서, 키트는 서열번호: 8에 의한 위치 79에 상응하는 위치에서 절단되고, 서열번호: 8에 의한 위치 69 내지 79에 상응하는 위치에서 이하의 아미노산 서열: Cys-Gly-Ile-Gln-Gly-Ile-Pro-Gly-Leu-Ser-Val(서열번호: 10)을 포함하는 변이체 CRNN 단백질을 암호화하는 게놈 DNA 분자의, 증폭을 위한 적어도 한 쌍의 올리고뉴클레오티드 프라이머(예를 들어, 변이-특이적인 프라이머), 또는 탐지를 위한 적어도 하나의 표지된 올리고뉴클레오티드 프로브(예를 들어, 변이-특이적인 프로브)를 포함한다. 일부 구현예에서, 키트는 서열번호: 8에 대해 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 서열 일치성을 갖고, 서열번호: 8에 의한 위치 69에 상응하는 위치에서 시스테인을 포함하는 변이체 CRNN 단백질을 암호화하는 게놈 DNA 분자의, 증폭을 위한 적어도 한 쌍의 올리고뉴클레오티드 프라이머(예를 들어, 변이-특이적인 프라이머), 또는 탐지를 위한 적어도 하나의 표지된 올리고뉴클레오티드 프로브(예를 들어, 변이-특이적인 프로브)를 포함한다. 일부 구현예에서, 키트는 서열번호: 8을 갖는 변이체 CRNN 단백질을 암호화하는 게놈 DNA 분자의, 증폭을 위한 적어도 한 쌍의 올리고뉴클레오티드 프라이머(예를 들어, 변이-특이적인 프라이머), 또는 탐지를 위한 적어도 하나의 표지된 올리고뉴클레오티드 프로브(예를 들어, 변이-특이적인 프로브)를 포함한다.
일부 구현예에서, 키트는 서열번호: 2에 의한 위치 3375에 상응하는 위치에서 티민을 포함하는 핵산 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어지는 게놈 DNA 분자의, 증폭을 위한 적어도 한 쌍의 올리고뉴클레오티드 프라이머(예를 들어, 변이-특이적인 프라이머), 또는 탐지를 위한 적어도 하나의 표지된 올리고뉴클레오티드 프로브(예를 들어, 변이-특이적인 프로브)를 포함한다. 일부 구현예에서, 키트는 서열번호: 2에 대해 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 서열 일치성을 갖고, 서열번호: 2에 의한 위치 3375에 상응하는 위치에서 티민을 포함하는 핵산 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어지는 게놈 DNA 분자의, 증폭을 위한 적어도 한 쌍의 올리고뉴클레오티드 프라이머(예를 들어, 변이-특이적인 프라이머), 또는 탐지를 위한 적어도 하나의 표지된 올리고뉴클레오티드 프로브(예를 들어, 변이-특이적인 프로브)를 포함한다. 일부 구현예에서, 키트는 서열번호: 2에 의한 핵산 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어지는 게놈 DNA 분자의, 증폭을 위한 적어도 한 쌍의 올리고뉴클레오티드 프라이머(예를 들어, 변이-특이적인 프라이머), 또는 탐지를 위한 적어도 하나의 표지된 올리고뉴클레오티드 프로브(예를 들어, 변이-특이적인 프로브)를 포함한다.
일부 구현예에서, 키트는 서열번호: 8에 의한 위치 79에 상응하는 위치에서 절단된 변이체 CRNN 단백질을 암호화하는 mRNA 분자의, 증폭을 위한 적어도 한 쌍의 올리고뉴클레오티드 프라이머(예를 들어, 변이-특이적인 프라이머), 또는 탐지를 위한 적어도 하나의 표지된 올리고뉴클레오티드 프로브(예를 들어, 변이-특이적인 프로브)를 포함한다. 일부 구현예에서, 키트는 서열번호: 8에 의한 위치 79에 상응하는 위치에서 절단되고, 서열번호: 8에 의한 위치 69에 상응하는 위치에서 시스테인을 포함하는 변이체 CRNN 단백질을 암호화하는 mRNA 분자의, 증폭을 위한 적어도 한 쌍의 올리고뉴클레오티드 프라이머(예를 들어, 변이-특이적인 프라이머), 또는 탐지를 위한 적어도 하나의 표지된 올리고뉴클레오티드 프로브(예를 들어, 변이-특이적인 프로브)를 포함한다. 일부 구현예에서, 키트는 서열번호: 8에 의한 위치 79에 상응하는 위치에서 절단되고, 서열번호: 8에 의한 위치 69 내지 79에 상응하는 위치에서 이하의 아미노산 서열: Cys-Gly-Ile-Gln-Gly-Ile-Pro-Gly-Leu-Ser-Val(서열번호: 10)을 포함하는 변이체 CRNN 단백질을 암호화하는 mRNA 분자의, 증폭을 위한 적어도 한 쌍의 올리고뉴클레오티드 프라이머(예를 들어, 변이-특이적인 프라이머), 또는 탐지를 위한 적어도 하나의 표지된 올리고뉴클레오티드 프로브(예를 들어, 변이-특이적인 프로브)를 포함한다. 일부 구현예에서, 키트는 서열번호: 8에 대해 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 서열 일치성을 갖고, 서열번호: 8에 의한 위치 69에 상응하는 위치에서 시스테인을 포함하는 변이체 CRNN 단백질을 암호화하는 mRNA 분자의, 증폭을 위한 적어도 한 쌍의 올리고뉴클레오티드 프라이머(예를 들어, 변이-특이적인 프라이머), 또는 탐지를 위한 적어도 하나의 표지된 올리고뉴클레오티드 프로브(예를 들어, 변이-특이적인 프로브)를 포함한다. 일부 구현예에서, 키트는 서열번호: 8을 갖는 변이체 CRNN 단백질을 암호화하는 mRNA 분자의, 증폭을 위한 적어도 한 쌍의 올리고뉴클레오티드 프라이머(예를 들어, 변이-특이적인 프라이머), 또는 탐지를 위한 적어도 하나의 표지된 올리고뉴클레오티드 프로브(예를 들어, 변이-특이적인 프로브)를 포함한다.
일부 구현예에서, 키트는 서열번호: 4에 의한 위치 205에 상응하는 위치에서 우라실을 포함하는 mRNA 분자를 포함하거나 또는 이로 이루어지는 핵산 서열의, 증폭을 위한 적어도 한 쌍의 올리고뉴클레오티드 프라이머(예를 들어, 변이-특이적인 프라이머), 또는 탐지를 위한 적어도 하나의 표지된 올리고뉴클레오티드 프로브(예를 들어, 변이-특이적인 프로브)를 포함한다. 일부 구현예에서, 키트는 서열번호: 4에 의한 위치 202 내지 204, 및 205 내지 207에 각각 상응하는 위치에 코돈 ACU 및 UGU을 포함하는 mRNA 분자의, 증폭을 위한 적어도 한 쌍의 올리고뉴클레오티드 프라이머(예를 들어, 변이-특이적인 프라이머), 또는 탐지를 위한 적어도 하나의 표지된 올리고뉴클레오티드 프로브(예를 들어, 변이-특이적인 프로브)를 포함한다. 일부 구현예에서, 키트는 서열번호: 4에 대해 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 서열 일치성을 갖고, 서열번호: 4에 의한 위치 205에 상응하는 위치에서 우라실을 포함하는 핵산 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어지는 mRNA 분자의, 증폭을 위한 적어도 한 쌍의 올리고뉴클레오티드 프라이머(예를 들어, 변이-특이적인 프라이머), 또는 탐지를 위한 적어도 하나의 표지된 올리고뉴클레오티드 프로브 (예를 들어, 변이-특이적인 프로브)를 제공한다. 일부 구현예에서, 키트는 서열번호: 4에 의한 핵산 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어지는 mRNA 분자의, 증폭을 위한 적어도 한 쌍의 올리고뉴클레오티드 프라이머(예를 들어, 변이-특이적인 프라이머), 또는 탐지를 위한 적어도 하나의 표지된 올리고뉴클레오티드 프로브(예를 들어, 변이-특이적인 프로브)를 포함한다.
일부 구현예에서, 키트는 서열번호: 8에 의한 위치 79에 상응하는 위치에서 절단된 변이체 CRNN 단백질을 암호화하는 cDNA 분자의, 증폭을 위한 적어도 한 쌍의 올리고뉴클레오티드 프라이머(예를 들어, 변이-특이적인 프라이머), 또는 탐지를 위한 적어도 하나의 표지된 올리고뉴클레오티드 프로브(예를 들어, 변이-특이적인 프로브)를 포함한다. 일부 구현예에서, 키트는 서열번호: 8에 의한 위치 79에 상응하는 위치에서 절단되고, 서열번호: 8에 의한 위치 69에 상응하는 위치에서 시스테인을 포함하는 변이체 CRNN 단백질을 암호화하는 cDNA 분자의, 증폭을 위한 적어도 한 쌍의 올리고뉴클레오티드 프라이머(예를 들어, 변이-특이적인 프라이머), 또는 탐지를 위한 적어도 하나의 표지된 올리고뉴클레오티드 프로브(예를 들어, 변이-특이적인 프로브)를 포함한다. 일부 구현예에서, 키트는 서열번호: 8에 의한 위치 79에 상응하는 위치에서 절단되고, 서열번호: 8에 의한 위치 69 내지 79에 상응하는 위치에서 이하의 아미노산 서열: Cys-Gly-Ile-Gln-Gly-Ile-Pro-Gly-Leu-Ser-Val(서열번호: 10)을 포함하는 변이체 CRNN 단백질을 암호화하는 cDNA 분자의, 증폭을 위한 적어도 한 쌍의 올리고뉴클레오티드 프라이머(예를 들어, 변이-특이적인 프라이머), 또는 탐지를 위한 적어도 하나의 표지된 올리고뉴클레오티드 프로브(예를 들어, 변이-특이적인 프로브)를 포함한다. 일부 구현예에서, 키트는 서열번호: 8에 대해 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 서열 일치성을 갖고, 서열번호: 8에 의한 위치 69에 상응하는 위치에서 시스테인을 포함하는 변이체 CRNN 단백질을 암호화하는 cDNA 분자의, 증폭을 위한 적어도 한 쌍의 올리고뉴클레오티드 프라이머(예를 들어, 변이-특이적인 프라이머), 또는 탐지를 위한 적어도 하나의 표지된 올리고뉴클레오티드 프로브(예를 들어, 변이-특이적인 프로브)를 포함한다. 일부 구현예에서, 키트는 서열번호: 8을 갖는 변이체 CRNN 단백질을 암호화하는 cDNA 분자의, 증폭을 위한 적어도 한 쌍의 올리고뉴클레오티드 프라이머(예를 들어, 변이-특이적인 프라이머), 또는 탐지를 위한 적어도 하나의 표지된 올리고뉴클레오티드 프로브(예를 들어, 변이-특이적인 프로브)를 포함한다.
일부 구현예에서, 키트는 서열번호: 6에 의한 위치 205에 상응하는 위치에서 티민을 포함하는 핵산 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어지는 cDNA 분자의, 증폭을 위한 적어도 한 쌍의 올리고뉴클레오티드 프라이머(예를 들어, 변이-특이적인 프라이머), 또는 탐지를 위한 적어도 하나의 표지된 올리고뉴클레오티드 프로브(예를 들어, 변이-특이적인 프로브)를 포함한다. 일부 구현예에서, 키트는 서열번호: 6에 의한 위치 202 내지 204, 및 205 내지 207에 각각 상응하는 위치에 코돈 ACT 및 TGT를 포함하는 cDNA 분자의, 증폭을 위한 적어도 한 쌍의 올리고뉴클레오티드 프라이머(예를 들어, 변이-특이적인 프라이머), 또는 탐지를 위한 적어도 하나의 표지된 올리고뉴클레오티드 프로브(예를 들어, 변이-특이적인 프로브)를 제공한다. 일부 구현예에서, 키트는 서열번호: 6에 대해 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 서열 일치성을 갖고, 서열번호: 6에 의한 위치 205에 상응하는 위치에서 티민을 포함하는 핵산 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어지는 cDNA 분자의, 증폭을 위한 적어도 한 쌍의 올리고뉴클레오티드 프라이머(예를 들어, 변이-특이적인 프라이머), 또는 탐지를 위한 적어도 하나의 표지된 올리고뉴클레오티드 프로브(예를 들어, 변이-특이적인 프로브)를 포함한다. 일부 구현예에서, 키트는 서열번호: 6에 따른 핵산 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어지는 cDNA 분자의, 증폭을 위한 적어도 한 쌍의 올리고뉴클레오티드 프라이머(예를 들어, 변이-특이적인 프라이머), 또는 탐지를 위한 적어도 하나의 표지된 올리고뉴클레오티드 프로브 (예를 들어, 변이-특이적인 프로브)를 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 임의의 키트는: 뉴클레오티드 래더(ladder), 프로토콜, 효소[예컨대, 증폭, 예컨대 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 사용된 효소], dNTP, 버퍼, 염 또는 염들, 및 조절 핵산 샘플 중 어느 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 임의의 키트는: 탐지가능한 표지, 어닐링 반응을 수행하는데 요구되는 생성물 및 시약 및 지침 중 어느 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 키트는 서열번호: 2의 위치 3375에 상응하는 위치, 또는 서열번호: 4 및/또는 서열번호: 6의 위치 205에 상응하는 위치에서 티민과 직접 혼성화하는 3' 말단 뉴클레오티드를 포함하는, 프라이머 또는 프로브 또는 변이-특이적인 프라이머 또는 변이-특이적인 프로브를 포함할 수 있다.
당업계의 숙련자들은, 이용된 탐지 기술이 일반적으로 비제한적인 것으로 이해한다. 오히려, 다양한 탐지 수단은 이들이 앰플리콘의 존재 또는 부재를 결정할 수 있는 경우, 기재된 방법 및 키트의 범주 내에 있다.
일부 측면에서, 키트는 본원에 기재된 하나 이상의 프라이머 또는 프로브를 포함할 수 있다. 예를 들어, 키트는 기재된 하나 이상의 유전적 변이체와 혼성화하는 하나 이상의 프로브를 포함할 수 있다.
일부 측면에서, 키트는 기재된 세포들 또는 세포주들 중 하나를 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 키트는 형질전환 세포 또는 세포주를 생성하는데 필요한 물질을 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 측면에서, 키트는 세포, 및 기재된 하나 이상의 유전적 변이체를 포함하는 핵산 서열을 포함하는 벡터를 포함할 수 있다. 키트는 세포 배양을 위한 배지를 추가로 포함할 수 있다.
본 기재 내용은 또한 대상체 인간으로부터의 생물학적 샘플에서 CRNN 변이체 게놈 DNA, mRNA, cDNA, 및/또는 폴리펩티드의 존재를 탐지하기 위한 방법을 제공한다. 집단 내의 유전자 서열 및 mRNA, 및 이러한 유전자에 의해 암호화된 단백질은, 다형성, 예컨대 단일-뉴클레오티드 다형성에 기인하여 달라질 수 있는 것으로 이해된다. CRNN 게놈 DNA, mRNA, cDNA, 및 폴리펩티드에 대해 본원에서 제공된 서열은 단지 예시적인 서열이다. CRNN 게놈 DNA, mRNA, cDNA 및 폴리펩티드에 대한 다른 서열도 또한 가능하다.
생물학적 샘플은 대상체로부터의 임의의 세포, 조직, 또는 생물학적 유체로부터 유래할 수 있다. 샘플은 임의의 임상적으로 관련된 조직, 예컨대 골수 샘플, 종양 생검, 미세 바늘 흡입물, 또는 체액의 샘플, 예컨대 혈액, 치육구 삼출액(gingival crevicular fluid), 혈장, 혈청, 림프, 복수, 낭액(cystic fluid), 또는 소변을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 샘플은 구강상피세포 채취물(buccal swab)을 포함한다. 본원에 기재된 방법에 사용된 샘플은 에세이 포멧, 탐지 방법의 특성, 및 샘플로서 사용된 조직, 세포, 또는 추출물에 기초하여 달라질 것이다. 생물학적 샘플은 이용될 에세이에 따라서 상이하게 가공될 수 있다. 예를 들어, 변이체 CRNN 핵산 분자를 탐지하는 경우, 게놈 DNA에 대한 샘플을 분리 또는 농축하도록 고안된 예비적인 가공이 이용될 수 있다. 다양한 기술이 이러한 목적을 위해 사용될 수 있다. 변이체 CRNN mRNA의 수준을 탐지하는 경우, mRNA를 갖는 생물학적 샘플을 농축하기 위해 상이한 기술이 사용될 수 있다. mRNA의 존재 또는 수준, 또는 특정 변이체 게놈 DNA 좌위의 존재를 탐지하기 위한 다양한 방법이 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 기재 내용은 변이체 CRNN 단백질의 존재 또는 부재를 탐지하는 방법을 제공하는데, 이는 상기 단백질이 기능-소실 CRNN 단백질 또는 절단된 CRNN 단백질을 암호화하는 아미노산 서열을 포함하는지 여부를 결정하기 위해, 생물학적 샘플 내의 단백질의 적어도 일부를 시퀀싱하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 기재 내용은 기능-소실 CRNN 단백질 또는 변이체 CRNN 단백질의 존재 또는 부재를 탐지하는 방법을 제공하는데, 이는 상기 단백질이 서열번호: 8에 의한 위치 79에 상응하는 위치에서 절단된 CRNN 단백질을 암호화하는 아미노산 서열을 포함하는지 여부를 결정하기 위해, 생물학적 샘플 내의 단백질의 적어도 일부를 시퀀싱하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 기재 내용은 변이체 CRNN 단백질의 존재 또는 부재를 탐지하는 방법을 제공하는데, 이는 단백질이 서열번호: 8에 의한 위치 79에 상응하는 위치에서 절단되고, 서열번호: 8에 의한 위치 69에 상응하는 위치에서 시스테인을 포함하는 CRNN 단백질을 암호화하는 아미노산 서열을 포함하는지 여부를 결정하기 위해, 생물학적 샘플에서 단백질의 적어도 일부를 시퀀싱하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 기재 내용은 변이체 CRNN 핵산 분자의 존재 또는 부재를 탐지하는 방법을 제공하는데, 이는 상기 핵산이 기능-소실 CRNN 단백질 또는 절단된 CRNN 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는지 여부를 결정하기 위해, 생물학적 샘플에서 적어도 일부의 핵산을 시퀀싱하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 기재 내용은 변이체 CRNN 핵산 분자의 존재 또는 부재를 탐지하는 방법을 제공하는데, 이는 상기 핵산이 서열번호: 8에 의한 위치 79에 상응하는 위치에서 절단된 CRNN 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는지 여부를 결정하기 위해, 생물학적 샘플에서 적어도 일부의 핵산을 시퀀싱하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 기재 내용은 변이체 CRNN 핵산 분자의 존재 또는 부재를 탐지하는 방법을 제공하는데, 이는 상기 핵산이 서열번호: 8에 의한 위치 79에 상응하는 위치에서 절단되고, 서열번호: 8에 의한 위치 69에 상응하는 위치에서 시스테인을 포함하는 CRNN 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는지 여부를 결정하기 위해, 생물학적 샘플에서 적어도 일부의 핵산을 시퀀싱하는 단계를 포함한다. 본원에 기재된 임의의 변이체 핵산 분자는 본원에 기재된 임의의 프로브 및 프라이머를 사용하여 탐지될 수 있다.
일부 구현예에서, 대상체에서 피부 장애-관련 변이체 CRNN 핵산 분자(예를 들어, 게놈 DNA, mRNA, 또는 cDNA)의 존재 또는 부재를 탐지하는 방법은: 생물학적 대상체로부터 얻은 샘플에서 에세이를 수행하는 단계로서, 상기 에세이는 생물학적 샘플 내의 핵산 분자가 본원에 기재된 임의의 변이체 CRNN 핵산 서열(예를 들어, 기능-소실 CRNN 단백질을 암호화하는 핵산 분자, 절단된 CRNN 단백질을 암호화하는 핵산 분자, 서열번호: 8에 의한 위치 79에 상응하는 위치에서 절단된 CRNN 단백질을 암호화하는 핵산 분자, 서열번호: 8에 의한 위치 79에 상응하는 위치에서 절단되고, 서열번호: 8에 의한 위치 69에 상응하는 위치에서 시스테인을 포함하는 CRNN 단백질을 암호화하는 핵산 분자)를 포함하는지 여부를 결정하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 생물학적 샘플은 세포 또는 세포 용해물을 포함한다. 이러한 방법은 예를 들어, 대상체로부터 CRNN 게놈 DNA 또는 mRNA를 포함하는 생물학적 샘플을 얻는 단계, 및 만약 mRNA인 경우, 선택적으로 상기 mRNA를 cDNA로 역전사하는 단계, 및 생물학적 샘플에서 CRNN 게놈 DNA, mRNA, 또는 cDNA의 위치가 절단된 CRNN 단백질을 암호화하는지 여부를 결정하는 에세이를 수행하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 방법은 예를 들어, 대상체로부터 CRNN 게놈 DNA 또는 mRNA를 포함하는 생물학적 샘플을 얻는 단계, 및 만약 mRNA의 경우, 선택적으로 상기 mRNA를 cDNA로 역전사하는 단계; 및 생물학적 샘플에서 CRNN 게놈 DNA, mRNA, 또는 cDNA의 위치가 서열번호: 8에 의한 위치 79에 상응하는 위치에서 절단된 CRNN 단백질을 암호화하는지 여부를 결정하기 위한 에세이를 수행하거나, 또는 생물학적 샘플에서 CRNN 게놈 DNA, mRNA, 또는 cDNA의 위치가 서열번호: 8에 의한 위치 79에 상응하는 위치에서 절단되고, 서열번호: 8에 의한 위치 69에 상응하는 위치에서 시스테인을 포함하는 CRNN 단백질을 암호화하는지 여부를 결정하기 위한 에세이를 수행하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어 특정 CRNN 핵산 분자의 이들 위치의 일치성을 결정하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 대상체는 인간이다.
일부 구현예에서, 에세이는: 대상체로부터의 생물학적 샘플에서 핵산 분자의 CRNN 게놈 DNA 서열의 적어도 일부를 시퀀싱하되, 여기에서 상기 시퀀싱된 일부는 서열번호: 8에 의한 CRNN 단백질에서의 위치 69에서 시스테인을 암호화하는 위치에 상응하는 위치를 포함하는 단계; 또는 대상체로부터의 생물학적 샘플에서 핵산 분자의 CRNN mRNA 서열의 적어도 일부를 시퀀싱하되, 여기에서 상기 시퀀싱된 일부는 서열번호: 8에 의한 CRNN 단백질에서의 위치 69에서 시스테인을 암호화하는 위치에 상응하는 위치를 포함하는 단계; 대상체로부터의 생물학적 샘플에서 핵산 분자의 CRNN cRNA 서열의 적어도 일부를 시퀀싱하되, 여기에서 상기 시퀀싱된 일부는 서열번호: 8에 의한 CRNN 단백질에서의 위치 69에서 시스테인을 암호화하는 위치에 상응하는 위치를 포함하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 에세이는: a) 생물학적 샘플을, i) 서열번호: 8에 의한 위치 69에서 시스테인을 암호화하는 위치와 상응하는 위치에 있는 CRNN 게놈 서열의 위치에 가장 근접하는 CRNN 게놈 DNA 서열의 일부; ⅱ) 서열번호: 8에 의한 위치 69에서 시스테인을 암호화하는 위치와 상응하는 위치에 있는 CRNN mRNA 서열의 위치에 가장 근접하는 CRNN mRNA 서열의 일부; 또는 ⅲ) 서열번호: 8에 의한 위치 69에서 시스테인을 암호화하는 위치에 상응하는 위치에 있는 CRNN cDNA 서열의 위치에 가장 근접하는 CRNN cDNA 서열의 일부에 혼성화하는 프라이머와 접촉시키는 단계; b) 상기 프라이머를 적어도: i) 서열번호: 8에 의한 위치 69에 시스테인을 암호화하는 코돈에서 떨어져 있는(beyond) 뉴클레오티드 위치에 상응하는 CRNN 게놈 DNA 서열의 위치; ⅱ) 서열번호: 8에 의한 위치 69에 시스테인을 암호화하는 코돈에서 떨어져 있는 뉴클레오티드 위치에 상응하는 CRNN mRNA 서열의 위치; 또는 ⅲ) 서열번호: 8에 의한 위치 69에 시스테인을 암호화하는 코돈에서 떨어져 있는 뉴클레오티드 위치에 상응하는 CRNN cDNA 서열의 위치를 통하여 신장시키는 단계; 및 c) 상기 프라이머의 신장 산물이 서열번호: 8에 의한 위치 69에 상응하는 위치에서 시스테인을 암호화하는 뉴클레오티드를 포함하는지 여부를 결정하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서는, 단지 CRNN 게놈 DNA만이 분석되었다. 일부 구현예에서는, 단지 CRNN mRNA만이 분석되었다. 일부 구현예에서는, 단지 CRNN mRNA로부터 얻은 CRNN cDNA만이 분석되었다.
일부 구현예에서, 에세이는: a) 생물학적 샘플을, i) 서열번호: 8에 의한 위치 69에 상응하는 위치에서 시스테인을 암호화하는 뉴클레오티드를 포함하는 CRNN 게놈 DNA 서열의 일부; ⅱ) 서열번호: 8에 의한 위치 69에 상응하는 위치에서 시스테인을 암호화하는 뉴클레오티드를 포함하는 CRNN mRNA 서열의 일부; 또는 ⅲ) 서열번호: 8에 의한 위치 69에 상응하는 위치에서 시스테인을 암호화하는 뉴클레오티드를 포함하는 CRNN cDNA 서열의 일부와 혼성화하는 변이-특이적인 프라이머와 접촉시키는 단계; b) 변이-특이적인 중합효소 연쇄 반응 기술을 이용하여 상기 프라이머를 신장시키는 단계; 및 c) 신장이 일어나는지 여부를 결정하는 단계를 포함한다. 변이-특이적인 중합효소 연쇄 반응 기술은, 핵산 서열에서 돌연변이, 예컨대 결실을 탐지하는데 사용될 수 있다. 변이-특이적인 프라이머는, 주형과의 미스매칭이 존재하는 경우 DNA 중합효소가 신장하지 않을 것이기 때문에 사용된다. 기본적인 변이-특이적인 중합효소 연쇄 반응 기술에 대한 다수의 변화는, 당업계의 숙련자들의 재량이다.
변이-특이적인 프라이머는 서열번호: 8에 의한 위치 69에 상응하는 위치에서 시스테인을 포함하는 CRNN 단백질을 암호화하는 핵산 서열에 상보적인 핵산 서열, 또는 상기 핵산 서열에 대한 상보체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 변이-특이적인 프라이머는 서열번호: 8을 암호화하는 핵산 서열에 상보적인 핵산 서열, 또는 이러한 핵산 서열의 상보체를 포함할 수 있다. 변이-특이적인 프라이머는 바람직하게는 핵산 서열이 서열번호: 8에 의한 위치 69에 상응하는 위치에서 시스테인을 암호화하는 경우, 변이체 CRNN 단백질을 암호화하는 핵산 서열에 특이적으로 혼성화한다.
일부 구현예에서, 에세이는 엄격한 조건 하에서 생물학적 샘플을, 변이체 CRNN 게놈 DNA 서열, mRNA 서열, 또는 cDNA 서열에는 특이적으로 혼성화하나, 상응하는 야생형 CRNN 서열에는 그렇지 않은 프라이머 또는 프로브와 접촉시키는 단계, 및 혼성화가 발생했는지 여부를 결정하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 에세이는 RNA 시퀀싱(RNA-Seq)을 포함한다. 일부 구현예에서, 에세이는 또한 역전사효소 중합효소 연쇄 반응(RT-PCR)을 통해 mRNA를 cDNA로 역전사하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 방법은 충분한 뉴클레오티드 길이의 프로브 및 프라이머를 이용하여 표적 핵산 서열에 결합시키고, 변이체 CRNN 게놈 DNA, mRNA, 또는 cDNA를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 특이적으로 탐지 및/또는 식별한다. 혼성화 조건 또는 반응 조건은 운영자(operator)에 의해 결정되어, 이러한 결과를 달성할 수 있다. 이러한 뉴클레오티드 길이는 본원에서 기재되거나 예시된 임의의 에세이를 포함하는 선택의 탐지 방법에 사용하기에 충분한 임의의 길이일 수 있다. 일반적으로, 예를 들어, 약 8개, 약 10개, 약 11개, 약 12개, 약 14개, 약 15개, 약 16개, 약 18개, 약 20개, 약 22개, 약 24개, 약 26개, 약 28개, 약 30개, 약 40개, 약 50개, 약 75개, 약 100개, 약 200개, 약 300개, 약 400개, 약 500개, 약 600개, 또는 약 700개 또는 그 이상의 뉴클레오티드, 또는 약 11개 내지 약 20개, 약 20개 내지 약 30개, 약 30개 내지 약 40개, 약 40개 내지 약 50개, 약 50개 내지 약 100개, 약 100개 내지 약 200개, 약 200개 내지 약 300개, 약 300개 내지 약 400개, 약 400개 내지 약 500개, 약 500개 내지 약 600개, 약 600개 내지 약 700개, 또는 약 700개 내지 약 800개 또는 그 이상의 길이의 뉴클레오티드를 갖는 프라이머 또는 프로브가 사용된다. 바람직한 구현예에서, 프로브 또는 프라이머는 적어도 약 18개 길이의 뉴클레오티드를 포함한다. 프로브 또는 프라이머는 약 10개 내지 약 35개, 약 10개 내지 약 30개, 약 10개 내지 약 25개, 약 12개 내지 약 30개, 약 12개 내지 약 28개, 약 12개 내지 약 24개, 약 15개 내지 약 30개, 약 15개 내지 약 25개, 약 18개 내지 약 30개, 약 18개 내지 약 25개, 약 18개 내지 약 24개, 또는 약 18개 내지 약 22개 길이의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 프로브 또는 프라이머는 약 18개 내지 약 30개 길이의 뉴클레오티드이다.
이러한 프로브 및 프라이머는 매우 엄격한 혼성화 조건 하에서 표적 서열에 특이적으로 혼성화할 수 있다. 프로브 및 프라이머는 표적 서열과 연속하는 뉴클레오티드와의 완전한 핵산 서열 일치성을 가지나, 표적 핵산 서열과 상이하며, 표적 핵산 서열을 특이적으로 탐지 및/또는 식별하는 능력을 유지하는 프로브는 종래의 방법에 의해 디자인될 수 있다. 따라서, 프로브 및 프라이머는 표적 핵산 분자에 대한 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 또는 100%의 서열 일치성 또는 상보성을 공유할 수 있다.
일부 구현예에서, 특정 프라이머는 변이체 CRNN 좌위 및/또는 CRNN 변이체 mRNA 또는 cDNA를 증폭하는데 사용되어 특정 프로브로서 사용될 수 있는 앰플리콘을 생성할 수 있거나, 또는 변이체 CRNN 좌위를 식별하거나 또는 생물학적 샘플에서 특정 CRNN mRNA 또는 cDNA의 수준을 결정하기 위해 자체로 탐지될 수 있다. CRNN 변이체 좌위는 서열번호: 8에 의한 위치 69에 상응하는 위치에서 시스테인을 암호화하는 위치에 상응하는 위치를 포함하는 게놈 핵산 서열을 나타내는데 사용될 수 있다. 프로브가 핵산 분자에 결합하도록 하는 조건 하에서, 프로브가 생물학적 샘플 내의 핵산 분자에 혼성화될 때, 이러한 결합은 생물학적 샘플 내의 변이체 CRNN 좌위의 존재, 또는 변이체 CRNN mRNA 또는 cDNA의 존재 또는 수준을 탐지하고 이를 표시할 수 있다. 결합된 프로브의 식별은 기재되어 있다. 특정 프로브는 변이체 CRNN 유전자의 특정 부위에 대해 적어도 약 80%, 약 80% 내지 약 85%, 약 85% 내지 약 90%, 약 90% 내지 약 95%, 및 약 95% 내지 약 100% 동일한 (또는 상보적인) 서열을 포함할 수 있다. 특정 프로브는 변이체 CRNN mRNA의 특정 부위에 대해 적어도 약 80%, 약 80% 내지 약 85%, 약 85% 내지 약 90%, 약 90% 내지 약 95%, 및 약 95% 내지 약 100% 동일한 (또는 상보적인) 서열을 포함할 수 있다. 특정 프로브는 변이체 CRNN cDNA의 특정 부위에 대해 적어도 약 80%, 약 80% 내지 약 85%, 약 85% 내지 약 90%, 약 90% 내지 약 95%, 및 약 95% 내지 약 100% 동일한 (또는 상보적인) 서열을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 생물학적 샘플의 핵산 상보체가 변이체 CRNN 단백질(예를 들어, 서열번호: 8에 의한 위치 69에 상응하는 위치에서 시스테인을 갖는 기능-소실 CRNN 단백질, 절단된 CRNN 단백질, 변이체 CRNN 단백질)을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는지 여부를 결정하기 위해, 생물학적 샘플은 서열번호: 8에 의한 위치 69에 상응하는 위치에서 세린을 암호화하는 위치에 인접한 5' 측접 서열로부터 유래한 제1 프라이머, 및 서열번호: 8에 의한 위치 69에 상응하는 위치에서 시스테인을 암호화하는 위치에 인접한 3' 측접 서열로부터 유래한 제2 프라이머를 포함하는 프라이머 쌍을 사용하여 핵산 증폭 방법이 실시되어, 서열번호: 8에 의한 위치 69에 상응하는 위치에서 시스테인을 암호화하는 위치에 있는 뉴클레오티드의 존재에 대해 진단하는 앰플리콘을 생성한다. 일부 구현예에서, 앰플리콘은 프라이머 쌍 플러스 하나의 뉴클레오티드 염기쌍의 합쳐진 길이, 내지 DNA 증폭 프로토콜에 의해 생성가능한 앰플리콘의 임의의 길이의 범위일 수 있다. 이러한 거리는 하나의 뉴클레오티드 염기쌍 내지 최대 증폭 반응의 한계, 또는 약 2만 개의 뉴클레오티드 염기쌍의 범위일 수 있다. 선택적으로, 프라이머 쌍은 서열번호: 8에 의한 위치 69에서 시스테인을 암호화하는 위치를 포함하고, 서열번호: 8에 의한 위치 69에서 시스테인을 암호화하는 위치의 각 측면에서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개, 또는 그 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 부위에 측접한다. 유사한 앰플리콘은 mRNA 및/또는 cDNA 서열으로부터 생성될 수 있다.
프로브 및 프라이머를 제조 및 사용하기 위한 대표적인 방법은, 예를 들어, 문헌[Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2판, Vol. 1-3, ed. Sambrook 등, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. 1989 (본원에서 이하, "Sambrook 등, 1989"); Current Protocol in Molecular Biology, ed. Ausubel 등, Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York, 1992(주기적인 업데이트 포함)(본원에서 이하, "Ausubel 등, 1992"); 및 Innis 등, PCR Protocol: A Guide to Method and Applications, Academic Press: San Diego, 1990)]에 기재되어 있다. PCR 프라이머 쌍은 예를 들어, 그 목적을 위해 의도된 컴퓨터 프로그램, 예컨대 벡터 NTI 버전 10의 PCR 프라이머 분석 도구(Informax Inc., Bethesda Md.); PrimerSelect(DNASTAR Inc., Madison, Wis.); 및 프라이머3(버전 0.4.0.COPYRGT., 1991, Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge, Mass.)을 사용하여, 공지의 서열로부터 유래될 수 있다. 추가적으로, 서열은 육안으로 스캐닝되고, 프라이머는 수동으로 식별된다.
임의의 핵산 혼성화 또는 증폭 또는 시퀀싱 방법은, 변이체 CRNN 유전자 좌위의 존재 및/또는 변이체 CRNN mRNA 또는 상기 mRNA로부터 생성된 cDNA의 수준을 특이적으로 탐지하기 위해 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 CRNN 핵산의 부위를 증폭하기 위한 프라이머로서 사용될 수 있거나, 또는 핵산 분자는 예를 들어, 엄격한 조건 하에서, 변이체 CRNN 유전자 좌위를 포함하는 핵산 분자, 또는 변이체 CRNN mRNA, 또는 상기 mRNA로부터의 cDNA를 포함하는 핵산 분자에 특이적으로 혼성화하는 프로브로서 사용될 수 있다.
예를 들어, 핵산 시퀀싱, 핵산 혼성화, 및 핵산 증폭을 포함하는 다양한 기술이 당업계에서 이용가능하다. 핵산 시퀀싱 기술의 설명적인 예는, 체인 터미네이터[생거(Sanger)] 시퀀싱 및 염료 터미네이터 시퀀싱을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
다른 방법은 정제된 DNA, 증폭된 DNA, 및 고정된 세포 제에 대한 표지된 프라이머 또는 프로브를 포함하는, 시퀀싱이 아닌 핵산 혼성화 방법조[형광 제자리 혼성화(FISH))]과 관련된다. 일부 방법에서, 표적 핵산은 탐지에 앞서 또는 이와 동시에 증폭될 수 있다. 핵산 증폭 기술의 설명적인 예는 중합효소 연쇄 반응(PCR), 리가제 연쇄 반응(LCR), 가닥 변위 증폭(SDA), 및 핵산 서열 기반의 증폭(NASBA)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 다른 방법은, 리가제 연쇄 반응, 가닥 변위 증폭, 및 고온성 SDA (tSDA)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
임의의 방법은 예를 들어, 혼성화 보호 에세이(HPA), 실시간 증폭 과정의 정량적 평가를 포함하는 비-증폭된 또는 증폭된 폴리뉴클레오티드를 탐지하고, 샘플에 초기에 존재하는 표적 서열의 양(이는 실-시간 증폭에 기초하지 않음)을 결정하는데 사용될 수 있다.
또한, 서열 증폭이 필수적으로 요구되지 않는 핵산의 식별 방법이 제공되는데, 이는 예를 들어, 염색체 물질의 서던(DNA:DNA) 블롯 혼성화, 제자리 혼성화(ISH), 및 형광 제자리 혼성화(FISH)의 방법에 기초한다. 서던 블롯팅은 특정 핵산 서열을 탐지하는데 사용될 수 있다. 이러한 방법에서, 샘플로부터 추출된 핵산은 절편화되어, 메트릭스 겔 상에서 전기 영동으로 분리되고, 막 필터에 옮겨진다. 필터 결합된 핵산은 관심 서열에 상보적인 표지된 프로브에 혼성화된다. 필터에 결합된 혼성화된 프로브가 탐지된다. 임의의 이러한 방법에서, 과정은 본원에 기재 또는 예시된 임의의 프로브를 사용하는 혼성화를 포함할 수 있다.
혼성화 기술에서, 엄격한 조건은 프로브 또는 프라이머가 이의 표적에 특이적으로 혼성화하도록 하기 위해 이용될 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 프라이머 또는 프로브는 엄격한 조건 하에서 이의 표적 서열(예를 들어, 변이체 CRNN 유전자 좌위, 변이체 CRNN mRNA, 또는 변이체 CRNN cDNA)에 대해, 다른 서열(예를 들어, 상응하는 야생형 CRNN 좌위, 야생형 mRNA, 또는 야생형 cDNA)보다 탐지가능하게 큰 정도로, 예컨대, 백그라운드에 비해 적어도 2-배, 적어도 3-배, 적어도 4-배, 또는 그 이상(백그라운드에 비해 10-배 이상을 포함)으로 혼성화할 것이다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 프라이머 또는 프로브는 엄격한 조건 하에서 다른 서열보다 적어도 2-배 더 큰 탐지가능한 수준으로 이의 표적 서열과 혼성화할 것이다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 프라이머 또는 프로브는 엄격한 조건 하에서 다른 서열보다 적어도 3-배 더 큰 탐지가능한 수준으로 이의 표적 서열과 혼성화할 것이다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 프라이머 또는 프로브는 엄격한 조건 하에서 다른 서열보다 적어도 4-배 더 큰 탐지가능한 수준으로 이의 표적 서열과 혼성화할 것이다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 프라이머 또는 프로브는 엄격한 조건 하에서 다른 서열보다 백그라운드에 비해 10-배 더 큰 탐지가능한 정도로, 이의 표적 서열에 혼성화할 것이다. 엄격한 조건은 서열-의존적이며, 상이한 상황들에서 달라질 것이다. 혼성화 및/또는 세척 조건의 엄격성을 조절함으로서, 프로브에 대해 100% 상보적인 표적 서열은 식별될 수 있다[동종 탐침(homologous probing)]. 대안적으로, 엄격한 조건은 서열에서 일부 미스매칭을 허용하도록 조절될 수 있어서, 더 낮은 정도의 일치성이 탐지된다(이종 탐침).
DNA 혼성화를 촉진시키는 적절한 엄격한 조건은, 약 45℃에서 6×염화나트륨/소듐 시트레이트(SSC), 및 이후 50℃에서의 2×SSC로의 세척, 및 예를 들어, 문헌[Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6]에 기재된 조건을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 전형적으로, 혼성화 및 탐지를 위한 엄격한 조건은 염 농도가 pH 7.0 내지 8.3에서 약 1.5 M 미만인 Na 이온, 전형적으로 약 0.01 내지 1.0 M Na 이온 농도 (또는 다른 염)이고, 온도는 짧은 프로브(예를 들어, 10 내지 50개 뉴클레오티드)에 대해서는 적어도 약 30℃이고, 더 긴 프로브(예를 들어, 50개 초과의 뉴클레오티드)에 대해서는 적어도 약 60℃인 것들일 것이다. 엄격한 조건은 또한 불안정화제, 예컨대 포름아미드의 첨가에 의해 달성될 수 있다. 예시적인 낮은 엄격한 조건은, 30 내지 35% 포름아미드, 1 M NaCl, 37℃에서 1% SDS (소듐 도데실 설페이트)의 버퍼 용액에 의한 혼성화, 및 50 내지 55℃에서 1× 내지 2×SSC에 의한 세척(20×SSC = 3.0 M NaCl/0.3 M 트리소듐 시트레이트)을 포함한다. 예시적인 중간 정도의 엄격한 조건은, 40 내지 45% 포름아미드, 1.0 M NaCl, 37℃에서 1% SDS에서의 혼성화, 및 55 내지 60℃에서 0.5× 내지 1×SSC로의 세척을 포함한다. 예시적인 높은 엄격한 조건은, 50% 포름아미드, 1 M NaCl, 37℃에서 1% SDS에서의 혼성화, 및 60 내지 65℃에서 0.1×SSC로의 세척을 포함한다. 선택적으로, 세척 버퍼는 약 0.1% 내지 약 1% SDS를 포함할 수 있다. 혼성화의 지속 시간은 일반적으로 약 24 시간 미만, 통상 약 4 내지 약 12 시간이다. 세척 시간의 지속은 적어도 평형 상태에 도달하기에 충분한 시간 길이일 것이다.
혼성화 반응에서, 특이성은 전형적으로 혼성화-이후 세척의 기능이고, 결정적인 인자는 최종 세척 용액의 이온 강도 및 온도이다. DNA-DNA 혼성체에 대해서는, Tm는 문헌[Meinkoth and Wahl, Anal. Biochem., 1984, 138, 267-284]의 수식으로부터 접근될 수 있고: Tm = 81.5℃ + 16.6(log M) + 0.41(% GC) - 0.61(% 포름아미드) - 500/L; 여기에서 M은 1가 양이온의 몰농도이고, %GC는 DNA 내의 구아노신 및 시토신 뉴클레오티드의 백분율이고, % 포름아미드는 혼성화 용액 중의 포름아미드의 백분율이고, L은 염기쌍 내의 혼성체의 길이이다. Tm는 (정해진 이온 강도 및 pH 하에서) 상보적인 표적 서열의 50%가 완벽하게 매칭된 프로브와 혼성화하는 온도이다. Tm는 각각의 1%의 미스매칭에 대하여 약 1℃ 감소된다; 따라서, Tm, 혼성화, 및/또는 세척 조건은 원하는 일치성의 서열에 혼성화하도록 조절될 수 있다. 예를 들어, ≥90% 일치성을 갖는 서열을 찾는 경우, Tm는 10℃ 감소될 수 있다. 일반적으로, 엄격한 조건은 특정 서열 및 이의 상보체에 대해서는 정해진 이온 강도 및 pH에서 열 용융점(Tm)보다 약 5℃ 더 낮도록 선택된다. 그러나, 심하게 엄격한 조건은 열 용융점(Tm)보다 1℃, 2℃, 3℃, 또는 4℃ 더 낮은 온도에서의 혼성화 및/또는 세척을 이용할 수 있고; 중간 정도의 엄격한 조건은 열 용융점(Tm)보다 6℃, 7℃, 8℃, 9℃, 또는 10℃ 더 낮은 온도에서의 혼성화 및/또는 세척을 이용할 수 있고; 낮은 엄격한 조건은 열 용융점(Tm)보다 11℃, 12℃, 13℃, 14℃, 15℃, 또는 20℃ 더 낮은 온도에서의 혼성화 및/또는 세척을 이용할 수 있다. 수식, 혼성화 및 세척 조성물, 및 원하는 Tm을 이용하여, 당업계의 통상의 숙련자는 혼성화 및/또는 세척 용액의 엄격성에서 변화가 본질적으로 기재된 것으로 이해할 것이다. 원하는 정도의 미스매칭이 45℃(수성 용액) 또는 32℃(포름아미드 용액) 미만의 Tm을 발생시키는 경우, SSC 농도를 증가시키는 것이 최적이어서, 더 높은 온도를 사용할 수 있다.
또한, 생물학적 샘플에서 변이체 CRNN 폴리펩티드의 존재를 탐지하거나 또는 그 수준을 정량화하는 방법이 제공되는데, 이는 예를 들어, 단백질 시퀀싱 및 면역에세이를 포함한다. 일부 구현예에서, 인간 대상체에서 변이체 CRNN 단백질(예를 들어, 서열번호: 8)의 존재를 탐지하는 방법은, 인간 대상체로부터의 생물학적 샘플에서, 생물학적 샘플 내의 변이체 CRNN 단백질(예를 들어, 서열번호: 8)의 존재를 탐지하는 에세이를 실시하는 단계를 포함한다.
단백질 시퀀싱 기술의 설명적인 비-제한적인 예는, 질량 분광 측정 및 에드만 분해를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 면역에세이의 설명적인 예는, 면역침강, 웨스턴 블롯, 면역조직화학, ELISA, 면역세포화학, 유세포 분석, 및 면역-PCR을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 다양한 기술(예를 들어, 열량측정, 형광, 화학 발광, 또는 방사능)을 사용하여 탐지가능하게 표지된 다중 클론 또는 단일 클론 항체가, 면역에세이에서 사용하기에 적합하다. 면역에세이에 대해서는, 변이체 CRNN 단백질은 야생형 CRNN 단백질에 비해 상이한 크기를 가지므로, 단백질 겔 상에서 상이한 분자량으로 전개된다. 따라서, 야생형 CRNN 단백질은 동일한 항체를 사용함으로서, 예를 들어, 웨스턴 블롯 에세이에서 변이체 CRNN 단백질과 구별될 수 있다.
본 기재 내용은 또한 인간 대상체에서 피부 장애를 진단하거나, 또는 피부 장애를 발달시킬 위험을 탐지하기 위한 방법을 제공하는데: 이는 인간 대상체로부터 얻은 CRNN 단백질을 암호화하는 핵산 분자에서 변이를 탐지하되, 여기에서 상기 변이는 기능-소실 CRNN 단백질 또는 절단된 CRNN 단백질을 암호화하는 단계; 및 상기 대상체가 피부 장애의 하나 이상의 증상을 갖는 경우 인간 대상체가 피부 장애를 갖는 것으로 진단하거나, 또는 상기 대상체가 피부 장애의 하나 이상의 증상을 갖지 않는 경우, 인간 대상체가 피부 장애를 발달시킬 위험이 있는 것으로 진단하는 단계를 포함한다.
본 기재 내용은 또한 인간 대상체에서 피부 장애를 진단하거나, 또는 피부 장애를 발달시킬 위험을 탐지하기 위한 방법을 제공하는데: 이는 인간 대상체로부터 얻은 CRNN 단백질을 암호화하는 핵산 분자에서 변이를 탐지하되, 여기에서 상기 변이는 서열번호: 8에 의한 위치 79에 상응하는 위치에서 절단된 기능-소실 CRNN 단백질 또는 CRNN 단백질을 암호화하는 단계; 및 상기 대상체가 피부 장애의 하나 이상의 증상을 갖는 경우, 인간 대상체가 피부 장애를 갖는 것으로 진단하거나, 또는 상기 대상체가 피부 장애의 하나 이상의 증상을 갖지 않는 경우, 인간 대상체가 피부 장애를 발달시킬 위험이 있는 것으로 진단하는 단계를 포함한다.
본 기재 내용은 또한 인간 대상체에서 피부 장애를 진단하거나, 또는 피부 장애를 발달시킬 위험을 탐지하기 위한 방법을 제공하는데: 이는 인간 대상체로부터 얻은 핵산 분자에서, 본원에 기재된 임의의 CRNN 핵산 분자 내의 임의의 변이를 탐지하는 단계; 및 대상체가 피부 장애의 하나 이상의 증상을 갖는 경우, 인간 대상체가 피부 장애를 갖는 것으로 진단하거나, 또는 대상체가 피부 장애의 하나 이상의 증상을 갖지 않는 경우, 인간 대상체가 피부 장애를 발달시킬 위험이 있는 것으로 진단하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 인간 대상체는 이러한 진단의 필요가 있다. 일부 구현예에서, 인간 대상체는 피부 장애로 진단받은 친척이 있을 수 있다.
피부 장애의 증상은 건선 발진, 피부에서 가렵고 붉은 건조한 딱지의 형성, 피부에서 가렵고 건조한 비늘의 형성, 은백색 비늘성 피부 딱지의 출현, 피부 딱지의 염증, 피부의 넓은 염증 또는 박리, 염증 피부의 부종 및 통증, 피부에서 농포 또는 뾰루지의 출현, 손발톱의 요흔(pitting), 손발톱의 탈색 또는 백화, 손발톱 밑의 피부 두꺼워짐, 또는 손발톱의 뽑힘(loosening) 또는 부서짐, 관절 및 주변 조직의 염증을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
일부 구현예에서, 방법은 대상체로부터 얻은 생물학적 샘플에서 변이체 CRNN 게놈 DNA, mRNA, 또는 mRNA로부터 얻은 cDNA의 존재를 탐지하는 단계를 포함한다. 집단 내의 유전자 서열 및 이러한 유전자에 의해 암호화되는 mRNA는, 다형성, 예컨대 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP)에 기인하여 달라질 수 있는 것으로 이해된다. 본원에서 CRNN 게놈 DNA, mRNA, cDNA, 및 폴리펩티드에 대해 제공된 서열은, 단지 예시적인 서열이며, 추가적인 CRNN 대립형질을 포함하는 다른 이러한 서열도 또한 가능하다.
일부 구현예에서, 탐지 단계는 기능-소실 CRNN 단백질 또는 절단된 CRNN 단백질을 암호화하는 핵산 분자의 적어도 일부를 시퀀싱하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 탐지 단계는 CRNN 단백질을 암호화하는 핵산 분자의 적어도 일부를 시퀀싱하는 단계를 포함하는데, 여기에서 상기 시퀀싱된 핵산 분자는 서열번호: 8에 의한 위치 69에 상응하는 위치를 포함하는 아미노산 서열을 암호화한다. 본원에 기재된 임의의 핵산 분자(예를 들어, 게놈 DNA, mRNA, 또는 cDNA)는 시퀀싱될 수 있다. 일부 구현예에서, 탐지 단계는 전체 핵산 분자를 시퀀싱하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 탐지 단계는: 기능-소실 CRNN 단백질 또는 절단된 CRNN 단백질을 암호화하는 핵산 분자의 적어도 일부를 증폭하는 단계; 상기 핵산 분자를 탐지가능한 표지로 표지화하는 단계; 상기 표지된 핵산을 프로브를 포함하는 지지체와 접촉시키되, 여기에서 상기 프로브는 엄격한 조건 하에서 기능-소실 CRNN 단백질 또는 절단된 CRNN 단백질을 암호화하는 핵산 서열에 혼성화하는 핵산 서열을 포함하는 단계; 및 상기 탐지가능한 표지를 탐지하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 탐지 단계는 CRNN 단백질을 암호화하는 핵산 분자의 적어도 일부를 증폭시키되, 여기에서 상기 증폭된 핵산 분자는 서열번호: 8에 의한 위치 69에 상응하는 위치를 포함하는 아미노산 서열을 암호화하는 단계; 상기 핵산 분자를 탐지가능한 표지로 표지화하는 단계; 상기 표지된 핵산을 프로브를 포함하는 지지체와 접촉시키되, 여기에서 상기 프로브는 엄격한 조건 하에서 서열번호: 8에 의한 위치 69에 상응하는 위치에서 시스테인을 암호화하는 핵산 서열에 혼성화하는 핵산 서열을 포함하는 단계; 및 상기 탐지가능한 표지를 탐지하는 단계를 포함한다. 본원에 기재된 임의의 핵산 분자는 증폭될 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 임의의 게놈 DNA, cDNA, 또는 mRNA 분자는 증폭될 수 있다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 mRNA이고, 상기 방법은 증폭 단계에 앞서 상기 mRNA를 cDNA로 역전사시키는 단계를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 탐지 단계는: CRNN 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 탐지가능한 표지를 포함하는 프로브와 접촉시키되, 여기에서 상기 프로브는 엄격한 조건 하에서 기능-소실 CRNN 단백질 또는 절단된 CRNN 단백질을 암호화하는 핵산 서열에 혼성화하는 핵산 서열을 포함하는 단계, 및 상기 탐지가능한 표지를 탐지하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 탐지 단계는: CRNN 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 탐지가능한 표지를 포함하는 프로브와 접촉시키는 단계로서, 여기에서 상기 프로브는 엄격한 조건 하에서 서열번호: 8에 의한 위치 69에 상응하는 위치에서 시스테인을 포함하는 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 서열에 혼성화하는 핵산 서열을 포함하는 단계, 및 상기 탐지가능한 표지를 탐지하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 인간 대상체로부터 얻은 세포 내에 존재하여, 탐지는 제자리 혼성화 기술에 의한다.
일부 구현예에서, 탐지 단계는 CRNN 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 변이-특이적인 프라이머와 접촉시키는 단계, 변이-특이적인 PCR 기술을 사용하여 핵산 분자를 증폭하는 단계를 포함한다. 변이-특이적인 프라이머는 본원에 기재한 임의의 이러한 프라이머일 수 있고, 서열번호: 8에 의한 위치 69에 상응하는 위치에서 시스테인을 암호화하는 변이체 CRNN 단백질에 특이적일 수 있다.
본원에 기재된 방법에 사용될 수 있는 다른 에세이는, 예를 들어, 역전사 중합효소 연쇄 반응(RT-PCR) 또는 정량적 RT-PCR(qRT-PCR)을 포함한다. 본원에 기재된 방법에 사용될 수 있는 또 다른 에세이는, 예를 들어, RNA 시퀀싱(RNA-Seq), 및 이후 생물학적 샘플 내의 변이체 mRNA 또는 cDNA의 존재 및 양의 탐지를 포함한다.
본 기재 내용은 또한 피부 장애, 또는 피부 장애를 발달시킬 위험이 있는 인간 대상체를 식별하기 위한 방법을 제공하는데, 여기에서 상기 방법은 대상체로부터 얻은 샘플에서: 기능-소실 CRNN 단백질 또는 절단된 CRNN 단백질; 및/또는 기능-소실 CRNN 단백질 또는 절단된 CRNN 단백질을 암호화하는 핵산 분자의 존재 또는 부재를 탐지하는 단계를 포함하는데; 여기에서 상기 기능-소실 CRNN 단백질 또는 절단된 CRNN 단백질, 및/또는 상기 기능-소실 CRNN 단백질 또는 절단된 CRNN 단백질을 암호화하는 핵산 분자의 존재는, 대상체가 피부 장애, 또는 피부 장애를 발달시킬 위험을 갖는다는 것을 나타낸다.
본 기재 내용은 또한 피부 장애, 또는 피부 장애를 발달시킬 위험이 있는 인간 대상체를 식별하기 위한 방법을 제공하는데, 여기에서 상기 방법은 대상체로부터 얻은 샘플에서: 서열번호: 8에 의한 위치 79에 상응하는 위치에서 절단된 기능-소실 CRNN 단백질 또는 CRNN 단백질; 및/또는 서열번호: 8에 의한 위치 79에 상응하는 위치에서 절단된 기능-소실 CRNN 단백질 또는 CRNN 단백질을 암호화하는 핵산 분자의 존재 또는 부재를 탐지하는 단계를 포함하는데; 여기에서 상기 기능-소실 CRNN 단백질 또는 CRNN 단백질, 및/또는 상기 기능-소실 CRNN 단백질 또는 CRNN 단백질을 암호화하는 핵산 분자의 존재는, 대상체가 피부 장애, 또는 피부 장애를 발달시킬 위험이 있음을 나타낸다.
본 기재 내용은 또한 피부 장애, 또는 피부 장애를 발달시킬 위험이 있는 인간 대상체를 식별하기 위한 방법을 제공한다. 상기 방법은 일반적으로 대상체로부터 얻은 샘플에서, 변이체 CRNN 단백질의 존재 또는 부재; 및/또는 변이체 CRNN 단백질을 암호화하는 본원에 기재된 임의의 핵산 분자의 존재 또는 부재를 탐지하는 단계를 포함한다. 기능-소실 CRNN 단백질 또는 절단된 CRNN 단백질의 존재는, 대상체가 피부 장애, 또는 피부 장애를 발달시킬 위험이 있다는 것을 나타낸다. 서열번호: 2(예를 들어, 게놈 DNA)에 의한 위치 3375에 상응하는 위치의 티민, 또는 서열번호: 4(예를 들어, mRNA)에 의한 위치 205에 상응하는 위치의 우라실, 또는 서열번호: 6(예를 들어, cDNA)에 의한 위치 205에 상응하는 위치의 티민(각각은 서열번호: 8에 의한 위치 79에 상응하는 위치에서 절단되고, 서열번호: 8에 의한 위치 69에 상응하는 위치에서 시스테인을 함유하는 변이체 CRNN 단백질을 생성함)의 존재는, 대상체가 피부 장애, 또는 피부 장애를 발달시킬 위험이 있다는 것을 나타낸다. 상기 방법은 시험관내, 제자리에, 또는 생체내에서 실시될 수 있다.
본 기재 내용은 또한 피부 장애, 또는 피부 장애를 발달시킬 위험이 있는 인간 대상체를 식별하는 방법을 제공하는데, 여기에서 상기 방법은 대상체로부터 얻은 샘플에서: 서열번호: 8에 의한 위치 69에 상응하는 위치에서 시스테인을 갖고, 서열번호: 8에 의한 위치 79에 상응하는 위치에서 절단된 CRNN 단백질; 및/또는 서열번호: 8에 의한 위치 69에 상응하는 위치에서 시스테인을 갖고, 서열번호: 8에 의한 위치 79에 상응하는 위치에서 절단된 CRNN 단백질을 암호화하는 핵산 분자의 존재 또는 부재를 탐지하는 단계를 포함하는데; 여기에서 상기 기능-소실 CRNN 단백질 또는 절단된 CRNN 단백질, 및/또는 상기 기능-소실 CRNN 단백질 또는 절단된 CRNN 단백질을 암호화하는 핵산 분자의 존재는, 대상체가 피부 장애, 또는 피부 장애를 발달시킬 위험을 갖는다는 것을 나타낸다. 일부 구현예에서, 기능-소실 CRNN 단백질 또는 절단된 CRNN 단백질은 야생형 CRNN 단백질에 비해 상이한 아미노산을 서열번호: 8에 의한 위치 69 내지 76, 78, 및 79에 상응하는 위치들 중 어느 하나에서 포함한다. 일부 구현예에서, 기능-소실 CRNN 단백질 또는 절단된 CRNN 단백질은 서열번호: 10의 아미노산 서열을 서열번호: 8에 의한 위치 69 내지 79에 상응하는 위치에서 포함한다.
일부 구현예에서, 샘플 내의 기능-소실 CRNN 단백질 또는 절단된 CRNN 단백질의 존재 또는 부재는, 상기 기능-소실 CRNN 단백질 또는 절단된 CRNN 단백질에 특이적인 항체에 의해 탐지된다. 일부 구현예에서, 기능-소실 CRNN 단백질 또는 절단된 CRNN에 특이적인 항체는: i) 서열번호: 8에 의한 위치 69에 상응하는 위치에서의 시스테인; 또는 ⅱ) 서열번호: 8에 의한 위치 69에 상응하는 위치에서 시스테인을 발생시키는 프레임쉬프트 돌연변이 때문에 CRNN 단백질에 생성되는 에피토프에 대해 특이적이다. 일부 구현예에서, 탐지 단계는 기능-소실 CRNN 단백질 또는 절단된 CRNN에 특이적인 항체의 반응과, 야생형 CRNN에 특이적인 항체의 반응을 비교하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 샘플 중의 기능-소실 CRNN 단백질 또는 절단된 CRNN 단백질의 존재 또는 부재는, 효소-연결된 면역흡착 에세이(ELISA)에 의해 탐지된다. 일부 구현예에서, 샘플 내의 기능-소실 CRNN 단백질 또는 절단된 CRNN 단백질을 암호화하는 핵산 분자의 존재 또는 부재는, 서열번호: 8에 의한 위치 69에 상응하는 위치에서 시스테인을 암호화하는 코돈을 생성하는 핵산 분자에 프레임쉬프트 돌연변이가 있는지 여부를 결정함으로서 탐지된다. 일부 구현예에서, 시퀀싱된 핵산 분자의 일부는 서열번호: 8에 의한 위치 69에 상응하는 위치를 암호화하는 코돈을 포함하는 복수의 위치들을 포함한다.
방법의 일부 구현예에서, 탐지 단계는 CRNN 단백질을 암호화하는 핵산 분자의 적어도 일부를 시퀀싱하는 단계를 포함한다. 방법의 일부 구현예에서, 탐지 단계는 기능-소실 CRNN 단백질 또는 절단된 CRNN 단백질을 암호화하는 핵산 분자의 적어도 일부를 시퀀싱하는 단계를 포함한다. 시퀀싱된 핵산 분자는 서열번호: 8에 의한 위치 69에 상응하는 위치를 포함하는 아미노산 서열을 암호화할 수 있다. 서열번호: 2(예를 들어, 게놈 DNA)에 의한 위치 3375에 상응하는 위치의 티민, 또는 서열번호: 4(예를 들어, mRNA)에 의한 위치 205에 상응하는 위치의 우라실, 또는 서열번호: 6(예를 들어, cDNA)에 의한 위치 205에 상응하는 위치의 티민의 존재는, 각각 서열번호: 8에 의한 위치 79에 상응하는 위치에서 절단되고, 서열번호: 8에 의한 위치 69에 상응하는 위치에서 시스테인을 함유하는 변이체 CRNN 단백질을 생성한다. 탐지 단계는 전체 CRNN 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 시퀀싱하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 방법의 일부 구현예에서, 탐지 단계는 기능-소실 CRNN 단백질 또는 절단된 CRNN 단백질을 암호화하는 핵산 분자의 적어도 일부를 증폭시키는 단계, 상기 증폭된 핵산 분자를 탐지가능한 표지로 표지화하는 단계, 상기 표지된 핵산 분자를 프로브를 포함하는 지지체와 접촉시키되, 여기에서 상기 프로브는 예를 들어, 엄격한 조건 하에서, 기능-소실 CRNN 단백질 또는 절단된 CRNN 단백질을 암호화하는 핵산 서열에 특이적으로 혼성화하는 핵산 서열을 포함하는 단계, 및 상기 탐지가능한 표지를 탐지하는 단계를 포함한다. 상기 방법의 일부 구현예에서, 탐지 단계는 CRNN 단백질을 암호화하는 핵산 분자의 적어도 일부를 증폭시키는 단계, 상기 증폭된 핵산 분자를 탐지가능한 표지로 표지화하는 단계, 상기 표지된 핵산 분자를 프로브를 포함하는 지지체와 접촉시키되, 여기에서 상기 프로브는 예를 들어, 엄격한 조건 하에서, 서열번호: 8에 의한 위치 69에 상응하는 위치에 있는 시스테인을 암호화하는 핵산 서열 [또는 서열번호: 2(예를 들어, 게놈 DNA)에 의한 위치 3375에 상응하는 위치에서의 티민, 또는 서열번호: 4(예를 들어, mRNA)에 의한 위치 205에 상응하는 위치에서의 우라실, 또는 서열번호: 6(예를 들어, cDNA)에 의한 위치 205에 상응하는 위치에서의 티민을 갖는 핵산 서열들(각각은 서열번호: 8에 의한 위치 79에 상응하는 위치에서 절단되고, 서열번호: 8에 의한 위치 69에 상응하는 위치에서 시스테인을 함유하는 변이체 CRNN 단백질을 생성함)]에 대해 특이적으로 혼성화하는 핵산 서열을 포함하는 단계, 및 상기 탐지가능한 표지를 탐지하는 단계를 포함한다. 증폭된 핵산 분자는 바람직하게는 서열번호: 8에 의한 위치 69에 상응하는 위치를 포함하는 아미노산 서열을 암호화한다. 핵산이 mRNA를 포함하는 경우, 상기 방법은 증폭 단계에 앞서 상기 mRNA를 cDNA로 역-전사하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 결정 단계는 CRNN 단백질을 암호화하는 핵산 분자를, 탐지가능한 표지를 포함하는 프로브와 접촉시키는 단계, 및 탐지가능한 표지를 탐지하는 단계를 포함한다. 프로브는 바람직하게는 예를 들어, 엄격한 조건 하에서, 서열번호: 8에 의한 위치 69에 상응하는 위치에서 시스테인을 포함하는 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 서열 [또는 서열번호: 2(예를 들어, 게놈 DNA)에 의한 위치 3375에 상응하는 위치에서의 티민, 또는 서열번호: 4(예를 들어, mRNA)에 의한 위치 205에 상응하는 위치에서의 우라실, 또는 서열번호: 6(예를 들어, cDNA)에 의한 위치 205에 상응하는 위치에서의 티민을 갖는 핵산 서열들(각각은 서열번호: 8에 의한 위치 79에 상응하는 위치에서 절단되고, 서열번호: 8에 의한 위치 79에 상응하는 위치에서 시스테인을 함유하는 변이체 CRNN 단백질을 생성함)]에 특이적으로 혼성화하는 핵산 서열을 포함한다. 핵산 분자는 인간 대상체로부터 얻은 세포 내에 존재할 수 있다.
일부 구현예에서, 탐지 단계는: CRNN 단백질을 암호화하는 핵산 분자의 적어도 일부를 증폭시키되, 여기에서 상기 증폭된 핵산 분자는 서열번호: 8에 의한 위치 69에 상응하는 위치에 아미노산을 암호화하는 코돈을 포함하는 단계; 상기 증폭된 핵산 분자를 탐지가능한 표지로 표지화시키는 단계; 상기 표지된 핵산 분자를, 프로브를 포함하는 지지체와 접촉시키되, 여기에서 상기 프로브는 엄격한 조건 하에서 서열번호: 8에 의한 위치 69에 상응하는 위치에서 시스테인을 암호화하는 코돈을 포함하는 핵산 서열에 특이적으로 혼성화하는 핵산 서열을 포함하는 단계; 및 상기 탐지가능한 표지를 탐지하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 탐지 단계는: CRNN 단백질을 암호화하는 핵산 분자를, 탐지가능한 표지를 포함하는 프로브와 접촉시키되, 여기에서 상기 프로브는 엄격한 조건 하에서 서열번호: 8에 의한 위치 69에 상응하는 위치에서 시스테인을 암호화하는 코돈을 포함하는 핵산 서열에 특이적으로 혼성화하는 핵산 서열을 포함하는 단계; 및 상기 탐지가능한 표지를 탐지하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 인간 대상체는 피부 장애, 또는 피부 장애를 발달시킬 위험을 갖는 것으로 식별된다.
본 기재 내용은 또한 인간 대상체에서 피부 장애를 진단하거나, 또는 피부 장애를 발달시킬 위험을 탐지하기 위한 방법을 제공하는데, 이는 인간 대상체로부터 얻은 기능-소실 CRNN 단백질 또는 절단된 CRNN 단백질을 탐지하는 단계; 및 대상체가 피부 장애의 하나 이상의 증상을 갖는 경우, 인간 대상체가 피부 장애를 갖는 것으로 진단하거나, 또는 대상체가 피부 장애의 하나 이상의 증상을 갖지 않는 경우, 인간 대상체가 피부 장애를 발달시킬 위험이 있는 것으로 진단하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 인간 대상체는 이러한 진단의 필요가 있다. 본 기재 내용은 또한 인간 대상체에서 피부 장애를 진단하거나, 또는 피부 장애를 발달시킬 위험을 탐지하기 위한 방법을 제공하는데: 이는 인간 대상체로부터 얻은 변이체 CRNN 단백질, 예컨대 서열번호: 8을 포함하는 단백질을 탐지하는 단계; 및 대상체가 피부 장애의 하나 이상의 증상을 갖는 경우, 인간 대상체가 피부 장애를 갖는 것으로 진단하거나, 또는 대상체가 피부 장애의 하나 이상의 증상을 갖지 않는 경우, 인간 대상체가 피부 장애를 발달시킬 위험이 있는 것으로 진단하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 인간 대상체는 이러한 진단의 필요가 있다. 일부 구현예에서, 인간 대상체는 피부 장애를 갖는 것으로 진단받은 친척이 있을 수 있다.
본 기재 내용은 또한 인간 대상체에서 피부 장애를 진단하거나, 또는 피부 장애의 위험을 탐지하기 위한 방법을 제공하는데: 이는 인간 대상체로부터 얻은 변이체 CRNN 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 탐지하되, 여기에서 상기 CRNN 단백질은 서열번호: 8에 의한 위치 69에 상응하는 위치에서 시스테인을 갖고, 서열번호: 8에 의한 위치 79에 상응하는 위치에서 절단된 단계; 및/또는 인간 대상체로부터 얻은 CRNN 단백질을 탐지하되, 여기에서 상기 CRNN 단백질은 서열번호: 8에 의한 위치 69에 상응하는 위치에서 시스테인을 갖고, 서열번호: 8에 의한 위치 79에 상응하는 위치에서 절단된 단계; 및 대상체가 피부 장애의 하나 이상의 증상을 갖는 경우 피부 장애를 갖는 인간 대상체로 진단하고, 또는 대상체가 피부 장애의 하나 이상의 증상을 갖지 않는 경우, 인간 대상체가 피부 장애에 대한 위험이 있는 것으로 진단하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 변이체 CRNN 단백질은 기능-소실 CRNN 단백질 또는 절단된 CRNN 단백질이다. 일부 구현예에서, 변이체 CRNN 단백질은 서열번호: 8에 의한 위치 69 내지 76, 78, 및 79에 상응하는 위치들 중 어느 하나에서 야생형 CRNN 단백질에 비해 상이한 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, 기능-소실 CRNN 단백질 또는 절단된 CRNN 단백질은 서열번호: 8에 의한 위치 69 내지 79에 상응하는 위치에서 서열번호: 10의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 기능-소실 CRNN 단백질 또는 절단된 CRNN 단백질은 기능-소실 CRNN 단백질 또는 절단된 CRNN에 특이적인 항체에 의해 탐지된다. 일부 구현예에서, 기능-소실 CRNN 단백질 또는 절단된 CRNN에 특이적인 항체는: i) 서열번호: 8에 의한 위치 69에 상응하는 위치에서의 시스테인; 또는 ⅱ) 서열번호: 8에 의한 위치 69에 상응하는 위치에서 시스테인을 발생시키는 프레임쉬프트 돌연변이 때문에 CRNN 단백질에 생성된 에피토프에 대해 특이적이다. 일부 구현예에서, 탐지 단계는 기능-소실 CRNN 단백질 또는 절단된 CRNN에 특이적인 항체의 반응을, 야생형 CRNN에 특이적인 항체의 반응과 비교하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 기능-소실 CRNN 단백질 또는 절단된 CRNN 단백질은 효소-연결된 면역흡착 에세이(ELISA)에 의해 탐지된다. 일부 구현예에서, 기능-소실 CRNN 단백질 또는 절단된 CRNN 단백질을 암호화하는 핵산 분자는 서열번호: 8에 의한 위치 69에 상응하는 위치에서 시스테인을 암호화하는 코돈을 생성하는 프레임쉬프트 돌연변이를 핵산 분자에서 탐지함으로서 탐지된다. 일부 구현예에서, 시퀀싱된 핵산 분자의 일부는 서열번호: 8에 의한 위치 69에 상응하는 위치를 암호화하는 코돈을 포함하는 복수의 위치들을 포함한다.
일부 구현예에서, 탐지 단계는: CRNN 단백질을 암호화하는 핵산 분자의 적어도 일부를 증폭시키되, 여기에서 상기 증폭된 핵산 분자는 서열번호: 8에 의한 위치 69에 상응하는 위치에서 아미노산을 암호화하는 코돈을 포함하는 단계; 상기 증폭된 핵산 분자를 탐지가능한 표지로 표지화하는 단계; 상기 표지된 핵산 분자를 프로브를 포함하는 지지체와 접촉시키되, 여기에서 상기 프로브는 엄격한 조건 하에서 서열번호: 8에 의한 위치 69에 상응하는 위치에서 시스테인을 암호화하는 코돈을 포함하는 핵산 서열에 특이적으로 혼성화하는 핵산 서열을 포함하는 단계; 및 상기 탐지가능한 표지를 탐지하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 탐지 단계는: CRNN 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 탐지가능한 표지를 포함하는 프로브와 접촉시키는 단계로서, 여기에서 상기 프로브는 엄격한 조건 하에서 서열번호: 8에 의한 위치 69에 상응하는 위치에서 시스테인을 암호화하는 코돈을 포함하는 핵산 서열에 특이적으로 혼성화하는 핵산 서열을 포함하는 단계; 및 상기 탐지가능한 표지를 탐지하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 임의의 방법은 피부 장애를 치료하는데 효과적인 제제로 대상체를 치료하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 방법은 변이가 대상체에서 탐지되고, 대상체가 피부 장애를 갖는 것으로 진단되는 경우, 피부 장애를 치료하는데 효과적인 제제로 상기 대상체를 치료하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 피부 장애는 건선, 습진, 또는 아토피성 피부염이다. 일부 구현예에서, 피부 장애는 건선이다. 일부 구현예에서, 피부 장애는 습진이다. 일부 구현예에서, 피부 장애는 아토피성 피부염이다. 일부 구현예에서, 건선은 심상성 건선(Psoriasis vulgaris), 농포성 건선(Pustular Psoriasis), 또는 건선 관절염(psoriatic arthritis)이다.
일부 구현예에서, 피부 장애를 치료하는데 효과적인 제제는 비타민이거나, 또는 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 비타민은 비타민 A 또는 비타민 D이다. 일부 구현예에서, 피부 장애를 치료하는데 효과적인 제제는 살리실산이다. 일부 구현예에서, 피부 장애를 치료하는데 효과적인 제제는 에이코사펜타엔산(EPA)이다. 일부 구현예에서, 피부 장애를 치료하는데 효과적인 제제는 코르티코스테로이드이다. 일부 구현예에서, 피부 장애를 치료하는데 효과적인 제제는 소랄렌이다. 일부 구현예에서, 피부 장애를 치료하는데 효과적인 제제는 메토트렉세이트이다. 일부 구현예에서, 피부 장애를 치료하는데 효과적인 제제는 사이클로스포린이다. 일부 구현예에서, 피부 장애를 치료하는데 효과적인 제제는 항체, 또는 적어도 이의 항원 결합 도메인이다.
일부 구현예에서, 피부 장애를 치료하는데 효과적인 제제는 아달리무맙(adalimumab)[Humira®], 또는 적어도 이의 항원 결합 도메인이다. 일부 구현예에서, 피부 장애를 치료하는데 효과적인 제제는 브로달루맙(brodalumab)[Siliq®], 또는 적어도 이의 항원 결합 도메인이다. 일부 구현예에서, 피부 장애를 치료하는데 효과적인 제제는 에타너셉트(etanercept)[Enbrel®], 또는 적어도 이의 항원 결합 도메인이다. 일부 구현예에서, 피부 장애를 치료하는데 효과적인 제제는 이세키주맙(ixekizumab)[Taltz®], 또는 적어도 이의 항원 결합 도메인이다. 일부 구현예에서, 피부 장애를 치료하는데 효과적인 제제는 세쿠키누맙(secukinumab)[Cosentyx®], 또는 적어도 이의 항원 결합 도메인이다. 일부 구현예에서, 피부 장애를 치료하는데 효과적인 제제는 우스테키누맙(ustekinumab)[Stelara®], 또는 적어도 이의 항원 결합 도메인이다.
치료제의 투여는 비경구, 정맥내, 경구, 피하, 동맥-내, 두개내, 척추강내, 복강내, 국소, 비강내, 또는 근육내를 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 적합한 경로에 의할 수 있다. 투여를 위한 약학적 조성물은 바람직하게는 멸균되고, 실질적으로 등장성이며, GMP 조건 하에서 제조된다. 약학적 조성물은 단위 제형(즉, 단일 투여를 위한 투여량)으로 제공될 수 있다. 약학적 조성물은 하나 이상의 생리적 및 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제, 부형제 또는 보조제를 사용하여 제제화될 수 있다. 제제는 선택된 투여의 경로에 따라 달라진다. 용어 "약학적으로 허용가능한(pharmaceutically acceptable)"은, 담체, 희석제, 부형제, 또는 보조제가 제제의 다른 성분과 양립가능하고, 이의 수여자에 실질적으로 해롭지 않는 것을 의미한다.
본 기재 내용은 또한 피부 장애로 고통받는 환자를 피부 장애 치료제로 치료하는 방법을 제공한다. 방법은 대상체로부터의 샘플이 본원에 기재된 임의의 변이체 CRNN 핵산 분자[예를 들어, 기능-소실 CRNN 단백질 또는 절단된 CRNN 단백질을 암호화하는 핵산 분자, 서열번호: 2(예를 들어, 게놈 DNA)에 의한 위치 3375에 상응하는 위치에서의 티민, 또는 서열번호: 4(예를 들어, mRNA)에 의한 위치 205에 상응하는 위치에서의 우라실, 또는 서열번호: 6(예를 들어, cDNA)에 의한 위치 205에 상응하는 위치에서의 티민을 갖는 핵산 서열들(각각은 서열번호: 8에 의한 위치 79에 상응하는 위치에서 절단되고 서열번호: 8에 의한 위치 69에 상응하는 위치에서 시스테인을 함유하는 변이체 CRNN 단백질을 생성함)을 포함하는 핵산 분자], 또는 서열번호: 8에 의한 위치 79에 상응하는 위치에서 절단되고, 서열번호: 8에 의한 위치 69에 상응하는 위치에서 시스테인을 함유하는 변이체 CRNN 단백질을 포함하는지 여부를 결정하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 대상체로부터의 샘플이 기능-소실 CRNN 단백질 또는 절단된 CRNN 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 포함하는지 여부를 결정하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 대상체로부터의 샘플이 서열번호: 2에 의한 위치 3375에 상응하는 위치에서 티민을 갖는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함하는지 여부를 결정하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 대상체로부터의 샘플이 서열번호: 4에 의한 위치 205에 상응하는 위치에서 우라실을 갖는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함하는지 여부를 결정하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 대상체로부터의 샘플이 서열번호: 6에 의한 위치 205에 상응하는 위치에서 티민을 갖는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함하는지 여부를 결정하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 서열번호: 8에 의한 위치 79에 상응하는 위치에서 절단되고, 서열번호: 8에 의한 위치 69에 상응하는 위치에서 시스테인을 함유하는 변이체 CRNN 단백질을 포함하는지 여부를 결정하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 이러한 결정은 환자로부터 생물학적 샘플을 얻거나 또는 얻었음에 의해 수행된다. 일부 구현예에서, 방법은 환자가 본원에 기재된 임의의 변이체 CRNN 핵산 분자[예를 들어, 기능-소실 CRNN 단백질 또는 절단된 CRNN 단백질을 암호화하는 핵산 분자, 서열번호: 2(예를 들어, 게놈 DNA)에 의한 위치 3375에 상응하는 위치에서의 티민, 또는 서열번호: 4(예를 들어, mRNA)에 의한 위치 205에 상응하는 위치에서의 우라실, 또는 서열번호: 6(예를 들어, cDNA)에 의한 위치 205에 상응하는 위치에서의 티민을 갖는 핵산 서열들(각각은 서열번호: 8에 의한 위치 79에 상응하는 위치에서 절단되고, 서열번호: 8에 의한 위치 69에 상응하는 위치에서 시스테인을 함유한 변이체 CRNN 단백질을 생성함)을 포함하는 핵산 분자]을 갖는지 여부를 결정하기 위해, 생물학적 샘플에 유전형질분석(genotyping) 에세이를 실시하거나 또는 실시했던 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 환자가 기능-소실 CRNN 단백질 또는 절단된 CRNN 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 갖는지 여부를 결정하기 위해, 생물학적 샘플에 대해 유전형질분석 에세이를 실시하거나 또는 실시했던 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 환자가 서열번호: 2에 의한 위치 3375에 상응하는 위치에서 티민을 갖는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자를 갖는지 여부를 결정하기 위해, 생물학적 샘플에 대해 유전형질분석 에세이를 실시하거나 또는 실시했던 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 환자가 서열번호: 4에 의한 위치 205에 상응하는 위치에서 우라실을 갖는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함하는지 여부를 결정하기 위해, 생물학적 샘플에 대해 유전형질분석 에세이를 실시하거나 또는 실시했던 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 환자가 서열번호: 6에 의한 위치 205에 상응하는 위치에서 티민을 갖는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함하는지 여부를 결정하기 위해, 생물학적 샘플에 대해 유전형질분석 에세이를 실시하거나 또는 실시했던 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 환자가 서열번호: 8에 의한 위치 79에 상응하는 위치에서 절단되고, 서열번호: 8에 의한 위치 69에 상응하는 위치에서 시스테인을 함유하는 변이체 CRNN 단백질을 갖는지 여부를 결정하기 위해, 생물학적 샘플에 대해 에세이를 실시하거나 또는 실시했던 단계를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 환자가 본원에 기재된 임의의 변이체 CRNN 핵산 분자들[예를 들어, 기능-소실 CRNN 단백질 또는 절단된 CRNN 단백질을 암호화하는 핵산 분자, 서열번호: 2(예를 들어, 게놈 DNA)에 의한 위치 3375에 상응하는 위치에서의 티민, 또는 서열번호: 4(예를 들어, mRNA)에 의한 위치 205에 상응하는 위치에서의 우라실, 또는 서열번호: 6(예를 들어, cDNA)에 의한 위치 205에 상응하는 위치에서의 티민을 갖는 핵산 서열들(각각은 서열번호: 8에 의한 위치 79에 상응하는 위치에서 절단되고, 서열번호: 8에 의한 위치 69에 상응하는 위치에서 시스테인을 함유하는 변이체 CRNN 단백질을 생성함)을 포함하는 핵산 분자]를 갖는 경우, 이후 상기 방법은 피부 장애를 치료하는데 효과적인 제제를 환자에 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 환자가 기능-소실 CRNN 단백질 또는 절단된 CRNN 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 갖는 경우, 이후 상기 방법은 피부 장애를 치료하는데 효과적인 제제를 환자에 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 환자가 서열번호: 2에 의한 위치 3375에 상응하는 위치에서 티민을 갖는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자를 갖는 경우, 이후 상기 방법은 피부 장애를 치료하는데 효과적인 제제를 환자에 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 환자가 서열번호: 4에 의한 위치 205에 상응하는 위치에서 우라실을 갖는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자를 갖는 경우, 이후 상기 방법은 피부 장애를 치료하는데 효과적인 제제를 환자에 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 환자가 서열번호: 6에 의한 위치 205에 상응하는 위치에서 티민을 갖는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자를 갖는 경우, 이후 상기 방법은 피부 장애를 치료하는데 효과적인 제제를 환자에 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 환자가 서열번호: 8에 의한 위치 79에 상응하는 위치에서 절단되고, 서열번호: 8에 의한 위치 69에 상응하는 위치에서 시스테인을 함유하는 변이체 CRNN 단백질을 갖는 경우, 이후 상기 방법은 피부 장애를 치료하는데 효과적인 제제를 환자에 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
본 기재 내용은 또한 본원에 기재된 임의의 변이체 CRNN 핵산 분자들[예를 들어, 기능-소실 CRNN 단백질 또는 절단된 CRNN 단백질을 암호화하는 핵산 분자, 서열번호: 2(예를 들어, 게놈 DNA)에 의한 위치 3375에 상응하는 위치에서의 티민, 또는 서열번호: 4(예를 들어, mRNA)에 의한 위치 205에 상응하는 위치에서의 우라실, 또는 서열번호: 6(예를 들어, cDNA)에 의한 위치 205에 상응하는 위치에서의 티민을 갖는 핵산 서열들(각각은 각각 서열번호: 8에 의한 위치 79에 상응하는 위치에서 절단되고, 서열번호: 8에 의한 위치 69에 상응하는 위치에서 시스테인을 함유하는 변이체 CRNN 단백질을 생성함)을 포함하는 핵산 분자], 또는 서열번호: 8에 의한 위치 79에 상응하는 위치에서 절단되고, 서열번호: 8에 의한 위치 69에 상응하는 위치에서 시스테인을 함유하는 변이체 CRNN 단백질을 갖는 인간 대상체에서 피부 장애 치료용 약제의 제조에 사용하기 위한 치료제(예컨대, 본원에 기재된 임의의 것들)를 제공한다. 일부 구현예에서, 인간 대상체는 기능-소실 CRNN 단백질 또는 절단된 CRNN 단백질, 및/또는 기능-소실 CRNN 단백질 또는 절단된 CRNN 단백질을 암호화하는 핵산 분자에 대해 양성으로 시험되었다. 일부 구현예에서, 치료는 인간 대상체가 기능-소실 CRNN 단백질 또는 절단된 CRNN 단백질 및/또는 기능-소실 CRNN 단백질 또는 절단된 CRNN 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 갖는지 여부를 결정하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 인간 대상체는 본원에 기재된 임의의 방법을 사용함으로서, 피부 장애를 갖거나 또는 피부 장애를 발달시킬 위험을 갖는다고 식별되었다. 일부 구현예에서, 기능-소실 CRNN 단백질 또는 절단된 CRNN 단백질은 서열번호: 8에 의한 위치 69 내지 76, 78, 및 79에 상응하는 위치들 중 어느 것에서 야생형 CRNN 단백질에 비해 상이한 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, 기능-소실 CRNN 단백질 또는 절단된 CRNN 단백질은 서열번호: 8에 의한 위치 69에 상응하는 위치에서 시스테인을 포함한다. 일부 구현예에서, 기능-소실 CRNN 단백질 또는 절단된 CRNN 단백질은 서열번호: 8의 아미노산 서열, 또는 서열번호: 8에 대해 적어도 90% 서열 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 서열번호: 8에 의한 위치 69에 상응하는 위치에서 시스테인을 포함한다. 일부 구현예에서, 피부 장애를 치료하는데 효과적인 제제는 비타민이거나, 또는 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 비타민은 비타민 A 또는 비타민 D이다. 일부 구현예에서, 피부 장애를 치료하는데 효과적인 제제는 살리실산이다. 일부 구현예에서, 피부 장애를 치료하는데 효과적인 제제는 에이코사펜타엔산(EPA)이다. 일부 구현예에서, 피부 장애를 치료하는데 효과적인 제제는 코르티코스테로이드이다. 일부 구현예에서, 피부 장애를 치료하는데 효과적인 제제는 소랄렌이다. 일부 구현예에서, 피부 장애를 치료하는데 효과적인 제제는 메토트렉세이트이다. 일부 구현예에서, 피부 장애를 치료하는데 효과적인 제제는 사이클로스포린이다. 일부 구현예에서, 피부 장애를 치료하는데 효과적인 제제는 항체, 또는 적어도 이의 항원 결합 도메인이다. 일부 구현예에서, 피부 장애를 치료하는데 효과적인 제제는 아달리무맙(휴미라®), 또는 적어도 이의 항원 결합 도메인이다. 일부 구현예에서, 피부 장애를 치료하는데 효과적인 제제는 브로달루맙(Siliq®), 또는 적어도 이의 항원 결합 도메인이다. 일부 구현예에서, 피부 장애를 치료하는데 효과적인 제제는 에타너셉트(Enbrel®), 또는 적어도 이의 항원 결합 도메인이다. 일부 구현예에서, 피부 장애를 치료하는데 효과적인 제제는 이세키주맙(Taltz®), 또는 적어도 이의 항원 결합 도메인이다. 일부 구현예에서, 피부 장애를 치료하는데 효과적인 제제는 세쿠키누맙(Cosentyx®), 또는 적어도 이의 항원 결합 도메인이다. 일부 구현예에서, 피부 장애를 치료하는데 효과적인 제제는 우스테키누맙(Stelara®), 또는 적어도 이의 항원 결합 도메인이다.
본 기재 내용은 또한 서열번호: 8에 의한 위치 79에 상응하는 위치에서 절단된 기능-소실 CRNN 단백질 또는 CRNN 단백질을 갖는 인간 대상체에서, 피부 장애의 치료에 사용하기 위한 피부 장애 치료제를 제공한다. 일부 구현예에서, 인간 대상체는 기능-소실 CRNN 단백질 또는 절단된 CRNN 단백질, 및/또는 기능-소실 CRNN 단백질 또는 절단된 CRNN 단백질을 암호화하는 핵산 분자에 대해 양성으로 시험되었다. 일부 구현예에서, 치료는 인간 대상체가 기능-소실 CRNN 단백질 또는 절단된 CRNN 단백질 및/또는 기능-소실 CRNN 단백질 또는 절단된 CRNN 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 갖는지 여부를 결정하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 인간 대상체는 본원에서 정의된 바와 같은 방법들 중 어느 것을 사용함으로서, 피부 장애를 갖거나 또는 피부 장애를 발달시킬 위험을 갖는다고 식별되었다. 일부 구현예에서, 기능-소실 CRNN 단백질 또는 절단된 CRNN 단백질은 서열번호: 8에 의한 위치 69 내지 76, 78, 및 79에 상응하는 위치들 중 어느 하나에서, 야생형 CRNN 단백질에 비해 상이한 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, 기능-소실 CRNN 단백질 또는 절단된 CRNN 단백질은 서열번호: 8에 의한 위치 69에 상응하는 위치에서 시스테인을 포함한다. 일부 구현예에서, 기능-소실 CRNN 단백질 또는 절단된 CRNN 단백질은 서열번호: 8에 의한 위치 69 내지 79에 상응하는 위치에서, 서열번호: 10의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 기능-소실 CRNN 단백질 또는 절단된 CRNN 단백질은 서열번호: 8의 아미노산 서열, 또는 서열번호: 8에 대해 적어도 90% 서열 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 서열번호: 8에 의한 위치 69에 상응하는 위치에서 시스테인을 포함한다. 일부 구현예에서, 피부 장애를 치료하는데 효과적인 제제는 비타민이거나, 또는 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 비타민은 비타민 A 또는 비타민 D이다. 일부 구현예에서, 피부 장애를 치료하는데 효과적인 제제는 살리실산이다. 일부 구현예에서, 피부 장애를 치료하는데 효과적인 제제는 에이코사펜타엔산(EPA)이다. 일부 구현예에서, 피부 장애를 치료하는데 효과적인 제제는 코르티코스테로이드이다. 일부 구현예에서, 피부 장애를 치료하는데 효과적인 제제는 소랄렌이다. 일부 구현예에서, 피부 장애를 치료하는데 효과적인 제제는 메토트렉세이트이다. 일부 구현예에서, 피부 장애를 치료하는데 효과적인 제제는 사이클로스포린이다. 일부 구현예에서, 피부 장애를 치료하는데 효과적인 제제는 항체, 또는 적어도 이의 항원 결합 도메인이다. 일부 구현예에서, 피부 장애를 치료하는데 효과적인 제제는 아달리무맙(휴미라®), 또는 적어도 이의 항원 결합 도메인이다. 일부 구현예에서, 피부 장애를 치료하는데 효과적인 제제는 브로달루맙(Siliq®), 또는 적어도 이의 항원 결합 도메인이다. 일부 구현예에서, 피부 장애를 치료하는데 효과적인 제제는 에타너셉트(Enbrel®), 또는 적어도 이의 항원 결합 도메인이다. 일부 구현예에서, 피부 장애를 치료하는데 효과적인 제제는 이세키주맙(Taltz®), 또는 적어도 이의 항원 결합 도메인이다. 일부 구현예에서, 피부 장애를 치료하는데 효과적인 제제는 세쿠키누맙(Cosentyx®), 또는 적어도 이의 항원 결합 도메인이다. 일부 구현예에서, 피부 장애를 치료하는데 효과적인 제제는 우스테키누맙(Stelara®), 또는 적어도 이의 항원 결합 도메인이다.
본 기재 내용은 또한 변이체 CRNN 게놈 DNA, mRNA, cDNA, 폴리펩티드 중 어느 것의 용도를 제공하며, 이는 피부 장애의 진단 또는 피부 장애를 발달시킬 위험을 진단할 때 본원에 기재된 핵산 분자에 혼성화된다.
상기 또는 하기에 인용된 모든 특허 문헌, 웹사이트, 다른 간행물, 수탁 번호 등은, 각각의 개별 항목이 구체적이고 개별적으로 참고로 포함된 것으로 기재된 것과 동일한 정도로, 모든 목적을 위해 이들 전체가 참고로 포함된다. 서열의 상이한 버전이 상이한 횟수로 수탁 번호와 관련되는 경우, 본 출원의 유효 출원일자에서 상기 수탁 번호와 관련된 버전을 의미한다. 유효 출원 일자는 실제 출원 일자, 또는 적용가능한 경우, 수탁 번호로 지칭되는 우선권 출원의 출원 일자 중 이른 것을 의미한다. 마찬가지로, 간행물, 웹사이트 등의 상이한 버전이 상이한 횟수로 공개된 경우, 달리 특정된 바 없는 한, 출원의 유효 출원 일자에 공개된 가장 최근에 공개된 버전을 의미한다. 본 기재 내용의 임의의 특성, 단계, 요소, 구현예, 또는 측면은. 달리 특정된 바 없는 경우, 임의의 다른 특성, 단계, 요소, 구현예, 또는 이의 측면과 조합하여 사용될 수 있다. 비록 본 기재 내용이 명확함 및 이해의 목적으로 도해 및 예시의 방식으로 일부 자세히 기재되어 있기는 하지만, 특정 변화예 및 변형예가 첨부된 청구항의 범주 내에서 실시될 수 있다는 것은 명백한 할 것이다.
본원에서 인용된 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은, 뉴클레오티드 염기에 대해서는 표준 글자 약어, 그리고 아미노산에 대해서는 한-글자 코드를 사용하여 나타나 있다. 뉴클레오티드 서열은 서열의 5' 말단에서 시작하여 3' 말단으로(즉, 각 라인의 좌측에서 우측으로) 진행하는 표준 관행을 따른다. 각각의 뉴클레오티드 서열의 단지 한 가닥만 나타나 있지만, 상보 서열은 제시된 서열을 임의로 참고하여 포함된 것으로 이해된다. 아미노산 서열은 서열의 아미노 말단에서 시작하여 카르복시 말단으로(즉, 각 라인의 좌측에서 우측으로) 진행하는 표준 관행을 따른다.
이하의 실시예는 구현예를 더욱 상세히 설명하기 위해 제공된다. 이들은 청구된 구현예를 제한하지 않고 설명하기 위해 의도되었다.
실시예
이하의 실시예는 당업계의 숙련자에게 본원에서 청구된 화합물, 조성물, 물품, 장치 및/또는 방법이 어떻게 만들어지고 평가되는지에 대한 완전한 기재 및 설명을 제공하기 위해 제시되었고, 순수하게 예시적인 것으로 의도되며, 본 발명자가 본 발명으로서 고려한 것의 범주를 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 숫자(예를 들어, 양, 온도 등)에 대한 정확성을 보장하도록 노력을 들였지만, 일부 잘못 및 오차는 설명되어야 할 것이다. 달리 지정되지 않는 한, 부(part)는 중량부이고, 온도는 ℃이거나, 또는 주변 온도이고, 압력은 대기압 또는 그 부근이다.
실시예 1: 환자 모집 및 표현형 분석
전체 엑솜 시퀀싱 및 트리오-기반 변이체 분석은, 레게네론 유전학 센터(RGC)와 유타 대학 간의 협력으로부터, 6명의 감염 개체와 2명의 비감염 개체에서 우성 유전 패턴으로 건선을 분리한 8명-구성원 가계에서 실시하였다(도 1 참고). 신규한, 이전에 관찰되지 않은 삽입 돌연변이(c.203_204insT; p.V69Cfs*12)는, 건선을 갖는 가계에서 분리된 CRNN(코눌린) 유전자에서 확인되었다.
실시예 2: 게놈 샘플
게놈 DNA를 말초혈 샘플로부터 추출하여, 이를 전체 엑솜 시퀀싱을 위해 레게네론 유전학 센터(RGC)로 전달하고, -80℃에서 자동화된 바이오뱅크에 저장하였다. 형광-기반 정량화를 실시하여, 시퀀싱 목적을 위한 적절한 DNA 양 및 품질을 보장하였다.
1㎍의 DNA를 150개 염기쌍의 평균 절편 길이로 전단하고(Covaris LE220), Kapa BioSystems 사의 맞춤형 시약 키트에 의한 엑솜 포획을 위해 준비하였다. 샘플을 NimbleGen SeqCap VCRome 2.1 또는 Integrated DNA Technologies xGen 엑솜 표적 디자인을 사용하여 포획하였다. 샘플에 바코드를 붙이고 풀(pool)을 만들고, 여러 개로 나누어(multiplexed), v4 화학에 의한 Illumina HiSeq 2500에서의 75 bp 쌍-말단 시퀀싱을 사용하여 시퀀싱하였다. 포획된 절편은 시퀀싱되어, 20× 이상의 범위(coverage)로 커버된 표적 염기의 최소 85%를 달성한다. 시퀀싱 이후, 데이터는 샘플-수준 데이터 생성 및 분석을 위한 표준 툴을 운영하기 위해 DNAnexus 및 AWS을 사용하는, RGC에서 개발된 클라우드-기반 파이프라인을 사용하여 가공되었다. 간단히, 서열 데이터는 Illumina 사의 CASAVA 소프트웨어를 사용하여 생성 및 역-다중화(de-multiplex)하였다. 서열 판독은 BWA-mem을 사용하여 GRCh37/hg19 인간 게놈 참고 어셈블리에 맴핑하고, 정렬하였다. 정렬 이후, 이중 판독을 표시하고, Picard 툴을 사용하여 플리깅하고(flagged), 인델(indel)은 GATK을 사용하여 재정렬하여, 변이체 소집(calling) 품질을 개선하였다. SNP 및 INDEL 변이체 및 유전자형을 GATK 사의 HaplotypeCaller를 사용하여 불러오고(call), GATK 사로부터의 변이체 품질 점수 재측정(VQSR)을 적용하여 총 변이체 품질 점수를 주석화하였다. 시퀀싱 및 데이터 품질 측정(metric) 통계를 각각의 샘플에 대하여 포착하여, 캡쳐 성능, 정렬 성능, 및 변이체 소집을 평가하였다.
실시예 3: 게놈 데이터 분석
최소 판독 깊이(>10), 유전자형 품질(>30), 및 대립 형질 밸런스(>20%)를 위한 표준 품질-제어 필터를 적용하여, 변이체를 소집하였다. 통과 변이체는 RGC 개발된 주석 및 분석 파이프라인을 사용하여, 이들의 잠재적인 기능적 효과(동의적, 비동의적, 스플라이싱, 프레임쉬프트, 또는 비프레임쉬프트 변이체이든 간에 무관함)에 기초하여 분류 및 주해되었다. 가계 관계는 PRIMUS(Staples 등, Amer. J. Human Genet., 2014, 95, 553-564) 및 이 가계에 대한 보고된 계통의 교차-참고를 사용하여, 코호트 내의 관련성 및 관계를 추론하기 위한 유전적인 데이터로부터의 하향 유래 메트릭스(descent derived metrics)에 의한 일치성을 통해 입증되었다.
계통-기반 변이체 분석 및 분리를 수행하여, 상염색체 우성 유전 패턴 하에 보고된 가족력을 고려하여 후보 질병 유전자를 식별하였다. 모든 발병된 개체들 간에 공유된 변이체는 이후 주석화되고, 집단 조절 데이터베이스, 예컨대 dbSNP, 1000 게놈 프로젝트, NHLBI 엑솜 시퀀싱 프로젝트, Aggregation Consortium Database(ExAc), 및 내부 RGC 데이터베이스에서 이들의 관찰된 빈도로 필터링되어, 공통된 다형성 및 높은 빈도의 가능성 높은 양성 변이체를 걸러내었다. 변이체의 기능 효과의 생물정보학적 분석을 위한 알고리즘, 예컨대 LRT, Poly-phen2, SIFT, CADD, 및 Mutation Taster은, 다수의 종 정렬(즉, GERP, PhastCons, PhyloP)에 기초한 보존 점수와 함께 변이체의 주석 과정의 일부로서 포함되고, 식별된 후보 변이체의 잠재적인 유해성을 알리기 위해 사용되었다.
하류 절단을 생성하는 것으로 예측된 희소한, 프레임쉬프트된 1 염기쌍 삽입 변이체는 건선 질병 표현형으로 분리하여 CRNN 유전자(CRNN: c.203_204insT; p.V69Cfs*12)에서 식별되었고, 가계의 2명의 비발병 개체에는 존재하지 않았다. 도 1(패널 A, B, 및 C)을 참고하면, 건선을 갖는 가계에서 우성 분리를 갖는 CRNN 유전자의 절단 변이체의 식별이 나타나 있다. 패널 A는 상염색체 우성 유전을 갖는, CRNN에서 c.203_204insT; p.V69Cfs*12에서의 절단 변이체를 설명하는 표를 나타내고; 변형 부위는 영향을 미치고, 위치 69의 보존된 발린 잔기를 시스테인으로 변화시키고, 단백질의 조기 절단을 생성하며, 단백질 기능에 손상을 줄 것으로 예측되어, CRNN의 기능 소실을 가져올 가능성이 높다. 이 가계에서 식별되는 변이체는 희소하며, Thousand Genomes Project(TGP), 엑솜 서열 Project(ESP), 또는 엑솜 Aggregation Consortium(ExAC) 데이터베이스를 포함하는 공개적으로 이용가능한 데이터베이스에서는 이전에 관찰되지 않았다. 패널 B는 연구된 가계의 계통을 나타내고; 속이 채워진 기호는 건선-발병된 개체를 나타내고, 속이 빈 기호는 비발병된 개체를 나타내고; 원은 여성을 나타내고, 사각형은 남성을 나타낸다. 패널 C는 단백질의 조기 절단을 생성하는 희소한 변이체의 위치를 나타내며, 이는 CRNN의 한 카피의 난센스 매개 붕괴(nonsense mediated decay) 및 기능 소실을 유도할 가능성이 크다. 패널 D는 다수의 종에서의 CRNN 단백질의 위치 69에서 발린 잔기의 보존을 나타낸다.
실시예 4: 탐지
대상체에서 특정 유전적 변이체의 존재는, 대상체가 피부 장애, 예컨대 건선, 습진 또는 아토피성 피부염을 갖거나 또는 발달시킬 위험성이 크다는 것을 나타낼 수 있다. 샘플, 예컨대 혈액 샘플은, 대상체로부터 얻을 수 있다. 핵산은 통상의 핵산 추출 키트를 사용하여 샘플로부터 분리될 수 있다. 대상체로부터 얻은 샘플에서 핵산을 분리한 후, 유전적 변이체가 존재하는지 여부를 결정하기 위해 핵산을 시퀀싱한다. 핵산의 서열은 조절 서열(야생형 서열)과 비교될 수 있다. 대상체로부터 얻은 샘플로부터 얻은 핵산과 조절 서열 사이에 차이점이 있음을 발견한 것은, 유전적 변이체의 존재가 있음을 가리킨다. 이들 단계들은 상기 실시예 및 본 기재 내용의 전반에 기재한 바와 같이 실시될 수 있다. 하나 이상의 유전적 변이체의 존재는, 대상체가 피부 장애, 예컨대 건선, 습진 또는 아토피성 피부염을 갖거나 또는 발달시킬 위험성이 크다는 것을 나타낸다.
SEQUENCE LISTING <110> Regeneron Pharmaceuticals Inc. <120> Cornulin (CRNN) Variants And Uses Thereof <130> 189238.00402 (3052) (10385WO01) <150> 62/572,958 <151> 2017-10-16 <160> 10 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5009 <212> DNA <213> homo sapien wild type CRNN genomic DNA <400> 1 cacttaacag ccacttgttt catcccacct gggcattagg taagtcccct cataagaaac 60 ctctttctca ttctcagtgt cttggtgatc tgagctcata aaactggggc agtcaggtat 120 ggactatgca tccttcagag ctagctgtga gcactgggca aaccaacgct accgttggga 180 aacatgctct cctgaagcaa tcaggctttc tcctcctccc tgaggctggc ctgggagcag 240 ctcctctcac tgggaaactg tgtgggcagc ggctatgggg ccacccatgt gccttcctgg 300 atcagcaaag gtttcttttt tctaaggctc tggaagcttc tttgcagtgc tgagagtcta 360 tgggatcaga atcagtttac ttatgccaac ctagacaata agatcaaact gtgtcatgga 420 tgaaggggtt tacatgattc ccctctccta caccagggtg atatttaggc aaaatatgtg 480 tagatttttc taaggaatct aaaatgtaac taaaaggtca tcttattatt ttattatcta 540 aaggtcagtg gttaaagtct gctacatggt tttaaaaaaa agaaagatat ttttcatcta 600 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420 cagcagggtt ccagagggca gaacaggcct ggggttcaga cccagggtca ggccactggc 480 tctgcgtggg tcagcagcta tgacaggcaa gctgagtccc agagccagga aagaataagc 540 ccgcagatac aactctctgg gcagacagag cagacccaga aagctggaga aggcaagagg 600 aatcagacaa cagagatgag gccagagaga cagccacaga ccagggaaca ggacagagcc 660 caccagacag gtgagactgt gactggatct ggaactcaga cccaggcagg tgccacccag 720 actgtggagc aggacagcag ccaccagaca ggaagaacca gcaagcagac acaggaggcc 780 accaatgacc agaacagagg gactgagacc cacggtcaag gcaggagcca gaccagccag 840 gctgtgacag gaggacatgc tcagatacag gcagggacac acacccagac acccacccag 900 accgtggagc aggacagcag ccaccagaca ggaagcacca gcacccagac acaggagtcc 960 accaatggcc agaacagagg gactgagatc cacggtcaag gcaggagcca gaccagccag 1020 gctgtgacag gaggacacac tcagatacag gcagggtcac acaccgagac tgtggagcag 1080 gacagaagcc aaactgtaag ccacggaggg gctagagaac agggacagac ccagacgcag 1140 ccaggcagtg gtcaaagatg gatgcaagtg agcaaccctg aggcaggaga gacagtaccg 1200 ggaggacagg cccagactgg ggcaagcact gagccaggaa ggcaggagtg gagcagcact 1260 cacccaaggc gctgtgtgac agaagggcag ggagacagac agcccacagt ggttggtgag 1320 gaatgggttg atgaccactc aagggagaca gtgatcctca ggctggacca gggcaacttg 1380 cataccagtg tttcctcagc acagggccag gatgcagccc agtcagaaga gaagcgaggc 1440 atcacagcta gagagctgta ttcctacttg agaagcacca agcca 1485 <210> 6 <211> 240 <212> DNA <213> homo sapien variant CRNN cDNA <400> 6 atgcctcagt tactgcaaaa cattaatggg atcatcgagg ccttcaggcg ctatgcaagg 60 acggagggca actgcacagc gctcacccga ggggagctga aaagactctt ggagcaagag 120 tttgccgatg tgattgtgaa accccacgat ccagcaactg tggatgaggt cctgcgtctg 180 ctggatgaag accacacagg gacttgtgga attcaaggaa ttcctggtct tagtgtttaa 240 <210> 7 <211> 495 <212> PRT <213> homo sapien wild type CRNN protein <220> <221> misc_feature <222> (27)..(27) <223> Xaa can be Ala or Val <220> <221> misc_feature <222> (374)..(374) <223> Xaa can be Gln or His <220> <221> misc_feature <222> (480)..(480) <223> Xaa can be Gly or Ser <400> 7 Met Pro Gln Leu Leu Gln Asn Ile Asn Gly Ile Ile Glu Ala Phe Arg 1 5 10 15 Arg Tyr Ala Arg Thr Glu Gly Asn Cys Thr Xaa Leu Thr Arg Gly Glu 20 25 30 Leu Lys Arg Leu Leu Glu Gln Glu Phe Ala Asp Val Ile Val Lys Pro 35 40 45 His Asp Pro Ala Thr Val Asp Glu Val Leu Arg Leu Leu Asp Glu Asp 50 55 60 His Thr Gly Thr Val Glu Phe Lys Glu Phe Leu Val Leu Val Phe Lys 65 70 75 80 Val Ala Gln Ala Cys Phe Lys Thr Leu Ser Glu Ser Ala Glu Gly Ala 85 90 95 Cys Gly Ser Gln Glu Ser Gly Ser Leu His Ser Gly Ala Ser Gln Glu 100 105 110 Leu Gly Glu Gly Gln Arg Ser Gly Thr Glu Val Gly Arg Ala Gly Lys 115 120 125 Gly Gln His Tyr Glu Gly Ser Ser His Arg Gln Ser Gln Gln Gly Ser 130 135 140 Arg Gly Gln Asn Arg Pro Gly Val Gln Thr Gln Gly Gln Ala Thr Gly 145 150 155 160 Ser Ala Trp Val Ser Ser Tyr Asp Arg Gln Ala Glu Ser Gln Ser Gln 165 170 175 Glu Arg Ile Ser Pro Gln Ile Gln Leu Ser Gly Gln Thr Glu Gln Thr 180 185 190 Gln Lys Ala Gly Glu Gly Lys Arg Asn Gln Thr Thr Glu Met Arg Pro 195 200 205 Glu Arg Gln Pro Gln Thr Arg Glu Gln Asp Arg Ala His Gln Thr Gly 210 215 220 Glu Thr Val Thr Gly Ser Gly Thr Gln Thr Gln Ala Gly Ala Thr Gln 225 230 235 240 Thr Val Glu Gln Asp Ser Ser His Gln Thr Gly Arg Thr Ser Lys Gln 245 250 255 Thr Gln Glu Ala Thr Asn Asp Gln Asn Arg Gly Thr Glu Thr His Gly 260 265 270 Gln Gly Arg Ser Gln Thr Ser Gln Ala Val Thr Gly Gly His Ala Gln 275 280 285 Ile Gln Ala Gly Thr His Thr Gln Thr Pro Thr Gln Thr Val Glu Gln 290 295 300 Asp Ser Ser His Gln Thr Gly Ser Thr Ser Thr Gln Thr Gln Glu Ser 305 310 315 320 Thr Asn Gly Gln Asn Arg Gly Thr Glu Ile His Gly Gln Gly Arg Ser 325 330 335 Gln Thr Ser Gln Ala Val Thr Gly Gly His Thr Gln Ile Gln Ala Gly 340 345 350 Ser His Thr Glu Thr Val Glu Gln Asp Arg Ser Gln Thr Val Ser His 355 360 365 Gly Gly Ala Arg Glu Xaa Gly Gln Thr Gln Thr Gln Pro Gly Ser Gly 370 375 380 Gln Arg Trp Met Gln Val Ser Asn Pro Glu Ala Gly Glu Thr Val Pro 385 390 395 400 Gly Gly Gln Ala Gln Thr Gly Ala Ser Thr Glu Ser Gly Arg Gln Glu 405 410 415 Trp Ser Ser Thr His Pro Arg Arg Cys Val Thr Glu Gly Gln Gly Asp 420 425 430 Arg Gln Pro Thr Val Val Gly Glu Glu Trp Val Asp Asp His Ser Arg 435 440 445 Glu Thr Val Ile Leu Arg Leu Asp Gln Gly Asn Leu His Thr Ser Val 450 455 460 Ser Ser Ala Gln Gly Gln Asp Ala Ala Gln Ser Glu Glu Lys Arg Xaa 465 470 475 480 Ile Thr Ala Arg Glu Leu Tyr Ser Tyr Leu Arg Ser Thr Lys Pro 485 490 495 <210> 8 <211> 79 <212> PRT <213> homo sapien variant CRNN protein <220> <221> misc_feature <222> (27)..(27) <223> Xaa can be Ala or Val <400> 8 Met Pro Gln Leu Leu Gln Asn Ile Asn Gly Ile Ile Glu Ala Phe Arg 1 5 10 15 Arg Tyr Ala Arg Thr Glu Gly Asn Cys Thr Xaa Leu Thr Arg Gly Glu 20 25 30 Leu Lys Arg Leu Leu Glu Gln Glu Phe Ala Asp Val Ile Val Lys Pro 35 40 45 His Asp Pro Ala Thr Val Asp Glu Val Leu Arg Leu Leu Asp Glu Asp 50 55 60 His Thr Gly Thr Cys Gly Ile Gln Gly Ile Pro Gly Leu Ser Val 65 70 75 <210> 9 <211> 11 <212> PRT <213> homo sapien wild type CRNN protein positions 69-79 <400> 9 Val Glu Phe Lys Glu Phe Leu Val Leu Val Phe 1 5 10 <210> 10 <211> 11 <212> PRT <213> homo sapien variant CRNN protein positions 69-79 <400> 10 Cys Gly Ile Gln Gly Ile Pro Gly Leu Ser Val 1 5 10

Claims (170)

  1. 서열번호: 8에 의한 위치 79에 상응하는 위치에서 절단된 코눌린 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는, cDNA.
  2. 제1항에 있어서, 상기 코눌린 단백질은 서열번호: 8에 의한 위치 69에 상응하는 위치에서 시스테인을 포함하는, cDNA.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 코눌린 단백질은 서열번호: 8에 의한 위치 69 내지 76, 78, 및 79에 상응하는 위치들 중 어느 하나에서, 야생형 코눌린 단백질에 비해 상이한 아미노산을 포함하는, cDNA.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 코눌린 단백질은 서열번호: 8에 의한 위치 69 내지 79에 상응하는 위치들에서, 서열번호: 10의 아미노산 서열을 포함하는, cDNA.
  5. 제1항에 있어서, 상기 코눌린 단백질은 서열번호: 8에 의한 아미노산 서열, 또는 서열번호: 8에 대해 적어도 90% 서열 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 서열번호: 8에 의한 위치 69에 상응하는 위치에서 시스테인을 포함하는, cDNA.
  6. 제1항에 있어서, 상기 코눌린 단백질은 서열번호: 10에 의한 아미노산 서열을 포함하는, cDNA.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 cDNA는 서열번호: 6에 의한 위치 205에 상응하는 위치에서 티민을 포함하는, cDNA.
  8. 제7항에 있어서, 상기 cDNA는 서열번호: 6에 의한 위치 202 내지 204, 및 205 내지 207에 각각 상응하는 위치들에서 코돈 ACT 및 TGT를 포함하는, cDNA.
  9. 제7항에 있어서, 상기 cDNA는 서열번호: 6을 포함하는, cDNA.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 cDNA를 포함하는, 벡터.
  11. 제10항에 있어서, 상기 벡터는 플라스미드인, 벡터.
  12. 제10항에 있어서, 상기 벡터는 바이러스인, 벡터.
  13. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 의한 cDNA를 포함하는, 숙주 세포.
  14. 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 의한 벡터를 포함하는, 숙주 세포.
  15. 제13항 또는 제14항에 있어서, 상기 cDNA는 숙주 세포에서 활성인 프로모터에 작동가능하게 연결된, 숙주 세포.
  16. 제15항에 있어서, 상기 프로모터는 외인성 프로모터인, 숙주 세포.
  17. 제15항 또는 제16항에 있어서, 상기 프로모터는 유도성 프로모터인, 숙주 세포.
  18. 제13항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 숙주 세포는 포유류 세포인, 숙주 세포.
  19. 피부 장애, 또는 피부 장애를 발달시킬 위험이 있는 인간 대상체를 식별하는 방법으로서, 상기 방법은 대상체로부터 얻은 샘플에서:
    기능-소실 코눌린 단백질; 및/또는
    기능-소실 코눌린 단백질을 암호화하는 핵산 분자
    의 존재 또는 부재를 탐지하는 단계를 포함하되;
    상기 기능-소실 코눌린 단백질 및/또는 상기 기능-소실 코눌린 단백질을 암호화하는 핵산 분자의 존재는, 상기 대상체가 피부 장애, 또는 피부 장애를 발달시킬 위험을 갖는다는 것을 나타내는, 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 피부 장애는 건선, 습진 또는 아토피성 피부염인, 방법.
  21. 제19항에 있어서, 상기 피부 장애는 건선인, 방법.
  22. 제19항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기능-소실 코눌린 단백질은 절단된 코눌린 단백질인, 방법.
  23. 제19항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기능-소실 코눌린 단백질은 서열번호: 8에 의한 위치 69에 상응하는 위치에서 시스테인을 포함하는, 방법.
  24. 제19항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기능-소실 코눌린 단백질은 서열번호: 8에 의한 위치 69에 상응하는 위치에서 시스테인을 포함하고, 서열번호: 8에 의한 위치 79에 상응하는 위치에서 절단되는, 방법.
  25. 제24항에 있어서, 상기 절단된 코눌린 단백질은 서열번호: 8에 의한 위치 69 내지 76, 78, 및 79에 상응하는 위치들 중 어느 하나에서, 상기 야생형 코눌린 단백질에 비해 상이한 아미노산을 포함하는, 방법.
  26. 제24항 또는 제25항에 있어서, 상기 절단된 코눌린 단백질은 서열번호: 8에 의한 위치 69 내지 79에 상응하는 위치에서, 서열번호: 10의 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  27. 제19항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 시험관내 방법인, 방법.
  28. 제19항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플 내의 기능-소실 코눌린 단백질의 존재 또는 부재는 기능-소실 코눌린 단백질에 특이적인 항체에 의해 탐지되는, 방법.
  29. 제28항에 있어서, 상기 기능-소실 코눌린 단백질에 특이적인 항체는:
    i) 서열번호: 8에 의한 위치 69에 상응하는 위치의 시스테인; 또는
    ⅱ) 서열번호: 8에 의한 위치 69에 상응하는 위치에서 시스테인을 발생시키는 프레임쉬프트 돌연변이 때문에 기능-소실 코눌린 단백질에 생성된 에피토프에 대해 특이적인, 방법.
  30. 제28항 또는 제29항에 있어서, 상기 탐지 단계는 상기 기능-소실 코눌린 단백질에 대해 특이적인 항체의 반응을, 야생형 코눌린에 특이적인 항체의 반응과 비교하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  31. 제19항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플 내의 기능-소실 코눌린 단백질의 존재 또는 부재는 효소-연결된 면역흡착 에세이(ELISA)에 의해 탐지되는, 방법.
  32. 제19항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기능-소실 코눌린 단백질은 서열번호: 8을 포함하는, 방법.
  33. 제19항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플 내의 상기 기능-소실 코눌린 단백질을 암호화하는 핵산 분자의 존재 또는 부재는, 서열번호: 8에 의한 위치 69에 상응하는 위치에서 시스테인을 암호화하는 코돈을 생성하는 프레임쉬프트 돌연변이가 핵산 분자 내에 있는지 여부를 결정함으로서 탐지되는, 방법.
  34. 제19항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 탐지 단계는 상기 기능-소실 코눌린 단백질을 암호화하는 핵산 분자의 적어도 일부를 시퀀싱하는 단계를 포함하되, 여기에서 상기 시퀀싱된 핵산 분자는 서열번호: 8에 의한 위치 79에 상응하는 위치에서 절단된 코눌린 단백질을 암호화하는, 방법.
  35. 제34항에 있어서, 상기 시퀀싱된 핵산 분자의 일부는 서열번호: 8에 의한 위치 69에 상응하는 위치를 암호화하는 코돈을 포함하는 복수의 위치들을 포함하는, 방법.
  36. 제34항 또는 제35항에 있어서, 상기 탐지 단계는 상기 기능-소실 코눌린 단백질을 암호화하는 전체 핵산 분자를 시퀀싱하는 단계를 포함하는, 방법.
  37. 제19항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 탐지 단계는:
    코눌린 단백질을 암호화하는 핵산 분자의 적어도 일부를 증폭하되, 여기에서 상기 증폭된 핵산 분자는 서열번호: 8에 의한 위치 69에 상응하는 위치에서 아미노산을 암호화하는 코돈을 포함하는 단계;
    상기 증폭된 핵산 분자를 탐지가능한 표지로 표지화하는 단계;
    상기 표지화된 핵산 분자를 프로브를 포함하는 지지체와 접촉시키되, 여기에서 상기 프로브는 엄격한 조건 하에서, 서열번호: 8에 의한 위치 69에 상응하는 위치에서 시스테인을 암호화하는 코돈을 포함하는 핵산 서열에 특이적으로 혼성화하는 핵산 서열을 포함하는 단계; 및
    상기 탐지가능한 표지를 탐지하는 단계를 포함하는, 방법.
  38. 제37항에 있어서, 상기 샘플 내의 상기 핵산 분자는 mRNA이고, 상기 탐지 단계는 증폭 단계에 앞서 상기 mRNA를 cDNA로 역-전사하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  39. 제19항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 탐지 단계는:
    코눌린 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 탐지가능한 표지를 포함하는 프로브와 접촉시키되, 상기 프로브는 엄격한 조건 하에서, 서열번호: 8에 의한 위치 69에 상응하는 위치에서 시스테인을 암호화하는 코돈을 포함하는 핵산 서열에 특이적으로 혼성화하는 핵산 서열을 포함하는 단계; 및
    상기 탐지가능한 표지를 탐지하는 단계를 포함하는, 방법.
  40. 제39항에 있어서, 상기 핵산 분자는 인간 대상체로부터 얻은 세포 내에 존재하는, 방법.
  41. 제19항 내지 제26항, 및 제33항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기능-소실 코눌린 단백질을 암호화하는 핵산 분자는 게놈 DNA인, 방법.
  42. 제41항에 있어서, 상기 게놈 DNA는 서열번호: 2를 포함하는, 방법.
  43. 제19항 내지 제26항, 및 제33항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기능-소실 코눌린 단백질을 암호화하는 핵산 분자는 mRNA인, 방법.
  44. 제43항에 있어서, 상기 mRNA는 서열번호: 4를 포함하는, 방법.
  45. 제19항 내지 제26항, 및 제33항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기능-소실 코눌린 단백질을 암호화하는 핵산 분자는 cDNA인, 방법.
  46. 제45항에 있어서, 상기 cDNA는 서열번호: 6을 포함하는, 방법.
  47. 인간 대상체에서 피부 장애를 진단하거나 또는 피부 장애를 발달시킬 위험을 탐지하는 방법으로서:
    상기 인간 대상체로부터 얻은 기능-소실 코눌린 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 탐지하는 단계; 및/또는
    상기 인간 대상체로부터 얻은 기능-소실 코눌린 단백질을 탐지하는 단계; 및
    상기 대상체가 피부 장애의 하나 이상의 증상을 갖는 경우, 상기 인간 대상체가 피부 장애를 갖는 것으로 진단하고, 또는 대상체가 피부 장애의 하나 이상의 증상을 갖지 않는 경우, 상기 인간 대상체가 피부 장애를 발달시킬 위험이 있는 것으로 진단하는 단계를 포함하는, 방법.
  48. 제47항에 있어서, 상기 피부 장애는 건선, 습진 또는 아토피성 피부염인, 방법.
  49. 제47항에 있어서, 상기 피부 장애는 건선인, 방법.
  50. 제47항 내지 제49항에 있어서, 상기 기능-소실 코눌린 단백질은 절단된 코눌린 단백질인, 방법.
  51. 제47항 내지 제50항에 있어서, 상기 기능-소실 코눌린 단백질이 서열번호: 8에 의한 위치 69에 상응하는 위치에서 시스테인을 포함하는, 방법.
  52. 제47항 내지 제51항에 있어서, 상기 기능-소실 코눌린 단백질이 서열번호: 8에 의한 위치 69에 상응하는 위치에서 시스테인을 포함하고, 서열번호: 8에 의한 위치 79에 상응하는 위치에서 절단된, 방법.
  53. 제52항에 있어서, 상기 절단된 코눌린 단백질은 서열번호: 8에 의한 위치 69 내지 76, 78, 및 79에 상응하는 위치들 중 어느 하나에서, 야생형 코눌린 단백질에 비해 상이한 아미노산을 포함하는, 방법.
  54. 제52항 또는 제53항에 있어서, 상기 절단된 코눌린 단백질은 서열번호: 8에 의한 위치 69 내지 79에 상응하는 위치에서, 서열번호: 10의 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  55. 제47항 내지 제54항에 있어서, 상기 기능-소실 코눌린 단백질은 기능-소실 코눌린 단백질에 특이적인 항체에 의해 탐지되는, 방법.
  56. 제55항에 있어서, 상기 기능-소실 코눌린 단백질에 특이적인 항체는:
    i) 서열번호: 8에 의한 위치 69에 상응하는 위치에서의 시스테인; 또는
    ⅱ) 서열번호: 8에 의한 위치 69에 상응하는 위치에서 시스테인을 발생시키는 프레임쉬프트 돌연변이 때문에 코눌린 단백질에서 생성된 에피토프에 특이적인, 방법.
  57. 제55항 또는 제56항에 있어서, 상기 탐지 단계는 기능-소실 코눌린 단백질에 특이적인 항체의 반응과 야생형 코눌린에 특이적인 항체의 반응을 비교하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  58. 제52항 내지 제57항에 있어서, 상기 기능-소실 코눌린 단백질은 효소-연결된 면역흡착 에세이(ELISA)에 의해 탐지되는, 방법.
  59. 제47항 내지 제58항에 있어서, 상기 기능-소실 코눌린 단백질은 서열번호: 8을 포함하는, 방법.
  60. 제47항 내지 제54항에 있어서, 상기 기능-소실 코눌린 단백질을 암호화하는 핵산 분자는 서열번호: 8에 의한 위치 69에 상응하는 위치에서 시스테인을 암호화하는 코돈을 생성하는 프레임쉬프트 돌연변이를 핵산 분자 내에서 탐지함으로서 탐지되는, 방법.
  61. 제47항 내지 제54항, 및 제60항에 있어서, 상기 탐지 단계는 상기 기능-소실 코눌린 단백질을 암호화하는 핵산 분자의 적어도 일부를 시퀀싱하는 것을 포함하는, 방법.
  62. 제61항에 있어서, 상기 시퀀싱된 핵산 분자 서열들 중 일부는 서열번호: 8에 의한 위치 69에 상응하는 위치를 암호화하는 코돈을 포함하는 복수의 위치들을 포함하는, 방법.
  63. 제47항 내지 제54항, 및 제60항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 탐지 단계는 상기 기능-소실 코눌린 단백질을 암호화하는 전체 핵산 분자를 시퀀싱하는 단계를 포함하는, 방법.
  64. 제47항 내지 제54항, 및 제60항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 탐지 단계는:
    상기 기능-소실 코눌린 단백질을 암호화하는 핵산 분자의 적어도 일부를 증폭시키되, 여기에서 상기 증폭된 핵산 분자는 서열번호: 8에 의한 위치 69에 상응하는 위치에서 아미노산을 암호화하는 코돈을 포함하는 단계;
    상기 증폭된 핵산 분자를 탐지가능한 표지로 표지화하는 단계;
    상기 표지화된 핵산 분자를 프로브를 포함하는 지지체와 접촉시키되, 여기에서 상기 프로브는 엄격한 조건 하에서, 서열번호: 8에 의한 위치 69에 상응하는 위치에서 시스테인을 암호화하는 코돈을 포함하는 핵산 서열과 특이적으로 혼성화하는 핵산 서열을 포함하는 단계; 및
    상기 탐지가능한 표지를 탐지하는 단계를 포함하는, 방법.
  65. 제64항에 있어서, 상기 핵산 분자는 mRNA이고, 상기 방법은 증폭 단계에 앞서 상기 mRNA를 cDNA로 역-전사하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  66. 제47항 내지 제54항, 및 제60항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 탐지 단계는:
    상기 기능-소실 코눌린 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 탐지가능한 표지를 포함하는 프로브와 접촉시키되, 여기에서 상기 프로브는 엄격한 조건 하에서, 서열번호: 8에 의한 위치 69에 상응하는 위치에서 시스테인을 암호화하는 코돈을 포함하는 핵산 서열과 특이적으로 혼성화하는 핵산 서열을 포함하는 단계; 및
    상기 탐지가능한 표지를 탐지하는 단계를 포함하는, 방법.
  67. 제66항에 있어서, 상기 핵산 분자는 인간 대상체로부터 얻은 세포 내에 존재하는, 방법.
  68. 제47항 내지 제54항, 및 제60항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기능-소실 코눌린 단백질을 암호화하는 핵산 분자는 게놈 DNA인, 방법.
  69. 제68항에 있어서, 상기 게놈 DNA는 서열번호: 2를 포함하는, 방법.
  70. 제47항 내지 제54항, 및 제60항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기능-소실 코눌린 단백질을 암호화하는 핵산 분자는 mRNA인, 방법.
  71. 제70항에 있어서, 상기 mRNA는 서열번호: 4를 포함하는, 방법.
  72. 제47항 내지 제54항, 및 제60항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기능-소실 코눌린 단백질을 암호화하는 핵산 분자는 cDNA인, 방법.
  73. 제72항에 있어서, 상기 cDNA는 서열번호: 6을 포함하는, 방법.
  74. 제47항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 상기 기능-소실 코눌린 단백질이 대상체에서 탐지되고, 상기 대상체가 피부 장애를 갖는 것으로 진단되는 경우, 상기 대상체를 피부 장애를 치료하는데 효과적인 제제로 치료하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  75. 제73항에 있어서, 상기 피부 장애를 치료하는데 효과적인 제제는 비타민을 포함하는, 방법.
  76. 제75항에 있어서, 상기 비타민은 비타민 A 또는 비타민 D인, 방법.
  77. 제74항에 있어서, 상기 제제는 살리실산인, 방법.
  78. 제74항에 있어서, 상기 제제는 에이코사펜타엔산(EPA)인, 방법.
  79. 제74항에 있어서, 상기 제제는 코르티코스테로이드인, 방법.
  80. 제74항에 있어서, 상기 제제는 소랄렌(psoralen)인, 방법.
  81. 제74항에 있어서, 상기 제제는 메토트렉세이트인, 방법.
  82. 제74항에 있어서, 상기 제제는 사이클로스포린인, 방법.
  83. 제74항에 있어서, 상기 제제는 항체인, 방법.
  84. 제83항에 있어서, 상기 항체는 아달리무맙(Humira®)인, 방법.
  85. 제83항에 있어서, 상기 항체는 브로달루맙(Siliq®)인, 방법.
  86. 제83항에 있어서, 상기 항체는 에타너셉트(Enbrel®)인, 방법.
  87. 제83항에 있어서, 상기 항체는 이세키주맙(Taltz®)인, 방법.
  88. 제83항에 있어서, 상기 항체는 세쿠키누맙(Cosentyx®)인, 방법.
  89. 제83항에 있어서, 상기 항체는 우스테키누맙(Stelara®)인, 방법.
  90. 기능-소실 코눌린 단백질을 암호화하는 핵산 서열, 또는 상기 핵산 서열의 상보체 서열을 포함하는, 분리된 핵산 분자.
  91. 제90항에 있어서, 상기 기능-소실 코눌린 단백질은 절단된 코눌린 단백질인, 분리된 핵산 분자.
  92. 제90항 또는 제91항에 있어서, 상기 기능-소실 코눌린 단백질은 서열번호: 8에 의한 위치 69에 상응하는 위치에서 시스테인을 포함하는, 분리된 핵산 분자.
  93. 제90항 내지 제92항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기능-소실 코눌린 단백질은 서열번호: 8에 의한 위치 69에 상응하는 위치에서 시스테인을 포함하고, 서열번호: 8에 의한 위치 79에 상응하는 위치에서 절단된, 분리된 핵산 분자.
  94. 제93항에 있어서, 상기 기능-소실 코눌린 단백질은 서열번호: 8에 의한 위치 69 내지 76, 78, 및 79에 상응하는 위치들 중 어느 하나에서, 야생형 코눌린 단백질에 비해 상이한 아미노산을 포함하는, 분리된 핵산 분자.
  95. 제93항 또는 제94항에 있어서, 상기 기능-소실 코눌린 단백질은 서열번호: 8에 의한 위치 69 내지 79에 상응하는 위치에서 서열번호: 10의 아미노산 서열을 포함하는, 분리된 핵산 분자.
  96. 제90항 내지 제95항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기능-소실 코눌린 단백질은 서열번호: 8에 의한 아미노산 서열, 또는 서열번호: 8에 대해 적어도 90% 서열 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 서열번호: 8에 의한 위치 69에 상응하는 위치에서 시스테인을 포함하는, 분리된 핵산 분자.
  97. 제90항 내지 제96항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기능-소실 코눌린 단백질은 서열번호: 10에 의한 아미노산 서열을 포함하는, 분리된 핵산 분자.
  98. 제90항 내지 제97항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 분자 DNA를 포함하는, 분리된 핵산 분자.
  99. 제98항에 있어서, 상기 핵산 분자는 게놈 DNA이고, 서열번호: 2에 의한 위치 3375에 상응하는 위치에서 티민을 포함하는, 분리된 핵산 분자.
  100. 제99항에 있어서, 상기 게놈 DNA는 서열번호: 2를 포함하는, 분리된 핵산 분자.
  101. 제98항에 있어서, 상기 핵산 분자는 cDNA이고, 서열번호: 6에 의한 위치 205에 상응하는 위치에서 티민을 포함하는, 분리된 핵산 분자.
  102. 제101항에 있어서, 상기 cDNA는 서열번호: 6을 포함하는, 분리된 핵산 분자.
  103. 제90항 내지 제97항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 분자는 RNA를 포함하는, 분리된 핵산 분자.
  104. 제103항에 있어서, 상기 핵산 분자는 mRNA이고, 서열번호: 4에 의한 위치 205에 상응하는 위치에서 우라실을 포함하는, 분리된 핵산 분자.
  105. 제103항 또는 제104항에 있어서, 상기 핵산 분자는 mRNA이고, 서열번호: 4에 의한 위치 202 내지 204, 및 205 내지 207에 각각 상응하는 위치에서, 코돈 ACU 및 UGU를 포함하는, 분리된 핵산 분자.
  106. 제103항 내지 제105항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 분자는 서열번호: 4를 포함하는, 분리된 핵산 분자.
  107. 제90항 내지 제106항 중 어느 한 항의 분리된 핵산 분자를 포함하는, 벡터.
  108. 제107항에 있어서, 상기 벡터는 플라스미드인, 벡터.
  109. 제107항에 있어서, 상기 벡터는 바이러스인, 벡터.
  110. 제90항 내지 제106항 중 어느 한 항에 의한 분리된 핵산 분자를 포함하는, 숙주 세포.
  111. 제107항 내지 제109항 중 어느 한 항에 의한 벡터를 포함하는, 숙주 세포.
  112. 제110항 또는 제111항에 있어서, 상기 핵산 서열은 숙주 세포에서 활성인 프로모터에 작동가능하게 연결된, 숙주 세포.
  113. 제112항에 있어서, 상기 프로모터는 외인성 프로모터인, 숙주 세포.
  114. 제112항 또는 제113항에 있어서, 상기 프로모터는 유도성 프로모터인, 숙주 세포.
  115. 제110항 내지 제114항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 숙주 세포는 포유류 세포인, 숙주 세포.
  116. 기능-소실 코눌린 단백질을 포함하는, 분리된 또는 재조합 폴리펩티드.
  117. 제116항에 있어서, 상기 기능-소실 코눌린 단백질은 절단된 코눌린 단백질인, 분리된 또는 재조합 폴리펩티드.
  118. 제116항 또는 제117항에 있어서, 상기 기능-소실 코눌린 단백질은 서열번호: 8에 의한 위치 69에 상응하는 위치에서 시스테인을 포함하는, 분리된 또는 재조합 폴리펩티드.
  119. 제116항 내지 제118항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기능-소실 코눌린 단백질은 서열번호: 8에 의한 위치 69에 상응하는 위치에서 시스테인을 포함하고, 서열번호: 8에 의한 위치 79에 상응하는 위치에서 절단된, 분리된 또는 재조합 폴리펩티드.
  120. 제119항에 있어서, 상기 기능-소실 코눌린 단백질은 서열번호: 8에 의한 위치 69 내지 76, 78, 및 79에 상응하는 위치들 중 어느 하나에서, 야생형 코눌린 단백질에 비해 상이한 아미노산을 포함하는, 분리된 또는 재조합 폴리펩티드.
  121. 제119항 또는 제120항에 있어서, 상기 기능-소실 코눌린 단백질은 서열번호: 8에 의한 위치 69 내지 79에 상응하는 위치에서 서열번호: 10의 아미노산 서열을 포함하는, 분리된 또는 재조합 폴리펩티드.
  122. 제116항 내지 제121항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기능-소실 코눌린 단백질은 서열번호: 8에 의한 아미노산 서열, 또는 서열번호: 8에 대해 적어도 90% 서열 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 서열번호: 8에 의한 위치 69에 상응하는 위치에서 시스테인을 포함하는, 분리된 또는 재조합 폴리펩티드.
  123. 제116항 내지 제122항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기능-소실 코눌린 단백질은 서열번호: 10에 의한 아미노산 서열을 포함하는, 분리된 또는 재조합 폴리펩티드.
  124. 제116항 내지 제123항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 이종 폴리펩티드에 융합되는, 분리된 또는 재조합 폴리펩티드.
  125. 제124항에 있어서, 상기 이종 폴리펩티드는 펩티드 정제 태그, 형광 단백질, 또는 펩티드 정제 태그와 형광 단백질 둘 다를 포함하는, 분리된 또는 재조합 폴리펩티드.
  126. 제116항 내지 제123항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 탐지가능한 표지에 연결된, 분리된 또는 재조합 폴리펩티드.
  127. 제126항에 있어서, 상기 탐지가능한 표지는 형광 표지 또는 방사능 표지인, 분리된 또는 재조합 폴리펩티드.
  128. 제116항 내지 제127항 중 어느 한 항에 의한 분리된 또는 재조합 폴리펩티드, 및 담체를 포함하는, 조성물.
  129. 적어도 약 15개 뉴클레오티드를 포함하는 핵산 서열을 포함하는 프로브 또는 프라이머로서, 서열번호: 8에 의한 위치 69에 상응하는 위치에서 시스테인을 갖고, 서열번호: 8에 의한 위치 79에 상응하는 위치에서 절단된, 기능-소실 코눌린 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 갖는 핵산 분자에 특이적으로 혼성화하거나, 또는 상기 기능-소실 코눌린 단백질을 암호화하는 상기 핵산 서열의 상보체에 특이적으로 혼성화하는, 프로브 또는 프라이머.
  130. 제129항에 있어서, 상기 프로브 또는 프라이머는 DNA를 포함하는, 프로브 또는 프라이머.
  131. 제129항에 있어서, 상기 프로브 또는 프라이머는 RNA를 포함하는, 프로브 또는 프라이머.
  132. 제129항 내지 제131항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로브 또는 프라이머는 서열번호: 8에 의한 위치 69에 상응하는 위치에서 시스테인을 암호화하는 코돈을 포함하는 핵산 분자의 일부에 특이적으로 혼성화하는, 프로브 또는 프라이머.
  133. 제129항 내지 제132항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로브 또는 프라이머는 엄격한 조건 하에서 기능-소실 코눌린 단백질을 암호화하는 핵산 서열, 또는 이의 상보체에 특이적으로 혼성화하는, 프로브 또는 프라이머.
  134. 제129항 내지 제133항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로브 또는 프라이머 표지를 포함하는, 프로브 또는 프라이머.
  135. 제134항에 있어서, 상기 표지는 형광 표지, 방사능 표지 또는 비오틴인, 프로브 또는 프라이머.
  136. 제129항 내지 제133항 중 어느 한 항에 의한 프로브가 부착되는 기질을 포함하는, 지지체.
  137. 제136항에 있어서, 상기 지지체는 마이크로어레이인, 지지체.
  138. 서열번호: 8에 의한 위치 79에 상응하는 위치에서 절단된 기능-소실 코눌린 단백질을 암호화하는 핵산 분자의 핵산 서열에 상보적인 핵산 서열을 포함하는 변이-특이적인 프로브 또는 프라이머로서, 상기 변이-특이적인 프로브 또는 프라이머는 서열번호: 8에 의한 위치 69에 상응하는 위치에서 시스테인을 암호화하는 코돈을 포함하는 핵산 분자의 일부에 상보적인 핵산 서열을 포함하는, 변이-특이적인 프로브 또는 프라이머.
  139. 제138항에 있어서, 상기 변이-특이적인 프로브 또는 프라이머는 적어도 약 15개의 뉴클레오티드를 포함하는, 변이-특이적인 프로브 또는 프라이머.
  140. 기능-소실 코눌린 단백질을 갖는 인간 대상체에서 피부 장애의 치료에 사용하기 위한 제제.
  141. 제140항에 있어서, 상기 기능-소실 코눌린 단백질은 절단된 코눌린 단백질인, 제제.
  142. 제140항 또는 제141항에 있어서, 상기 기능-소실 코눌린 단백질은 서열번호: 8에 의한 위치 69에 상응하는 위치에서 시스테인을 포함하는, 제제.
  143. 제140항 내지 제142항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기능-소실 코눌린 단백질은 서열번호: 8에 의한 위치 69에 상응하는 위치에서 시스테인을 포함하고, 서열번호: 8에 의한 위치 79에 상응하는 위치에서 절단된, 제제.
  144. 제143항에 있어서, 상기 기능-소실 코눌린 단백질은 서열번호: 8에 의한 위치 69 내지 76, 78, 및 79에 상응하는 위치들 중 어느 하나에서, 야생형 코눌린 단백질에 비해 상이한 아미노산을 포함하는, 제제.
  145. 제143항 또는 제144항에 있어서, 상기 기능-소실 코눌린 단백질은 서열번호: 8에 의한 위치 69 내지 79에 상응하는 위치에서, 서열번호: 10의 아미노산 서열을 포함하는, 제제.
  146. 제140항 내지 제145항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기능-소실 코눌린 단백질은 서열번호: 8에 의한 아미노산 서열, 또는 서열번호: 8에 대해 적어도 90% 서열 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 서열번호: 8에 의한 위치 69에 상응하는 위치에서 시스테인을 포함하는, 제제.
  147. 제140항 내지 제146항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기능-소실 코눌린 단백질은 서열번호: 10에 상응하는 아미노산 서열을 포함하는, 제제.
  148. 제140항 내지 제147항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간 대상체는 기능-소실 코눌린 단백질 및/또는 기능-소실 코눌린 단백질을 암호화하는 핵산 분자에 대해 양성으로 시험된, 제제.
  149. 제140항 내지 제148항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료는 인간 대상체가 기능-소실 코눌린 단백질 및/또는 기능-소실 코눌린 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 갖는지 여부를 결정하는 단계를 포함하는, 제제.
  150. 제140항 내지 제149항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간 대상체는 제1항 내지 제69항 중 어느 한 항에서 정의된 방법을 사용함으로서, 피부 장애를 갖거나, 또는 피부 장애를 발달시킬 위험을 갖는 것으로 식별된, 제제.
  151. 제140항 내지 제150항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간 대상체는 건선, 또는 건선을 발달시킬 위험이 있는 것으로 식별된, 제제.
  152. 제140항 내지 제151항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기능-소실 코눌린 단백질은 서열번호: 8에 의한 위치 69 내지 76, 78, 및 79에 상응하는 위치들 중 어느 하나에서, 야생형 코눌린 단백질에 비해 상이한 아미노산을 포함하는, 제제.
  153. 제140항 내지 제152항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기능-소실 코눌린 단백질은 서열번호: 8에 의한 위치 69에 상응하는 위치에서 시스테인을 포함하는, 제제.
  154. 제140항 내지 제153항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기능-소실 코눌린 단백질은 서열번호: 8에 의한 위치 69 내지 79에 상응하는 위치에서, 서열번호: 10의 아미노산 서열을 포함하는, 제제.
  155. 제140항 내지 제154항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기능-소실 코눌린 단백질은 서열번호: 8의 아미노산 서열, 또는 서열번호: 8에 대해 적어도 90% 서열 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 서열번호: 8에 의한 위치 69에 상응하는 위치에서 시스테인을 포함하는, 제제.
  156. 제140항 내지 제155항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제제는 비타민을 포함하는, 제제.
  157. 제156항에 있어서, 상기 비타민은 비타민 A 또는 비타민 D인, 제제.
  158. 제140항 내지 제155항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제제는 살리실산인, 제제.
  159. 제140항 내지 제155항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제제는 에이코사펜타엔산(EPA)인, 제제.
  160. 제140항 내지 제155항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제제는 코르티코스테로이드인, 제제.
  161. 제140항 내지 제155항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제제는 소랄렌인, 제제.
  162. 제140항 내지 제155항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제제는 메토트렉세이트인, 제제.
  163. 제140항 내지 제155항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제제는 사이클로스포린인, 제제.
  164. 제140항 내지 제155항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제제는 항체인, 제제.
  165. 제140항 내지 제155항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 아달리무맙(Humira®)인, 제제.
  166. 제140항 내지 제155항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 브로달루맙(Siliq®)인, 제제.
  167. 제140항 내지 제155항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 에타너셉트(Enbrel®)인, 제제.
  168. 제140항 내지 제155항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 이세키주맙(Taltz®)인, 제제.
  169. 제140항 내지 제155항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 세쿠키누맙(Cosentyx®)인, 제제.
  170. 제140항 내지 제155항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 우스테키누맙(Stelara®)인, 제제.
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