JP2024501757A - 遺伝子組換え細胞の製造方法 - Google Patents

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Abstract

本発明は、単一の標的部位への複数のエフェクタータンパク質の動員を可能にし、極めて効率的な塩基編集を可能にするＲＮＡ媒介性塩基編集システムに関する。本発明はさらに、細胞を遺伝的に組換えるための方法及びキットに関する。【選択図】なし

Description

本発明は、ＲＮＡ媒介性塩基編集を用いて、植物細胞、動物細胞、哺乳動物細胞、免疫細胞及び幹細胞を含む遺伝子組換え細胞を産生するための方法に関する。
Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔ（ＣＲＩＳＰＲ）－Ｃａｓ技術は、目的の遺伝子を正確に編集する、革新的な核酸ガイド遺伝子編集ツールとして出現した。ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）の指向により、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、目的の遺伝子内で二本鎖切断（ＤＳＢ）を誘導し、それによって、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路を介した高度に可変の修復によって作製される小さな挿入又は欠失（集合的に「インデル」という）を形成する。あるいは、相同組換え修復（ＨＤＲ）による修復のためのＤＮＡ鋳型の同時送達と共にＤＳＢを導入することによって正確なゲノム組換えを達成することができる。このアプローチは、ＮＨＥＪによって単一遺伝子を単純に破壊する場合は効率的かつ信頼できるものの、ＨＤＲによる単一ヌクレオチドの正確な組換えは、極めて効率的でない。さらに、多重化された遺伝子編集手順の間に複数のＤＳＢを誘導すると、望ましくない遺伝毒性及び潜在的に発がん性の肉眼的染色体転座が形成されうる。したがって、当業界では、毒性ＤＳＢの誘導が制限された、細胞、特にヒト細胞の多重遺伝子操作のより制御されたより安全な方法が依然として必要である。
最近、ＲＮＡ媒介性塩基編集システムも開発され、特許文献１（「ヌクレアーゼ非依存的な標的化遺伝子編集プラットフォームおよびその用途」（ラトガース））に記載されている。このシステムは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体のガイドＲＮＡ構成要素を介して塩基編集酵素を標的ＤＮＡ配列に動員する。このシステムは、エフェクター（デアミナーゼエフェクター等）に融合された同族ＲＮＡ結合ドメイン（当業界でＲＮＡアプタマーリガンドともいう）を動員する、３’末端に再プログラム可能なＲＮＡモチーフ（当業界でＲＮＡアプタマーともいう）がある修飾ガイドＲＮＡを含有する。このシステムを用いて、標的ヌクレオチド修飾が、原核細胞及び哺乳動物細胞を含む真核細胞において高精度で達成された；特許文献１及び２を参照されたい。特許文献３に開示されているように、原核細胞において特異性及び効能が亢進した新たな第二世代塩基編集システムが試験され、哺乳動物細胞においてさらに改善された。第二世代システム／プラットフォームは、高い特異性、高い効能、及び低いオフターゲットライアビリティを示す。核酸修飾モジュールを核酸認識モジュールから完全に分離するモジュール設計並びに本明細書に開示される他の利点を用いて、ＲＮＡ媒介性塩基編集プラットフォームは、配列標的化機能を核酸修飾機能から効果的に分離することができなかった、配列標的化タンパク質への融合又は配列標的化タンパク質との直接相互作用を介したエフェクターの動員に対する代替手段を提供する。ＤＮＡ ＤＳＢ及びＨＤＲの要件がないので、新しいシステムは、遺伝子操作及び治療開発のための強力なツールを提供する。
直接的なタンパク質融合（先行技術のＢＥシステム）による動員又はタンパク質成分による他の動員アプローチと比較して、ＲＮＡ足場媒介性エフェクター動員機構には、システム操作及びより良好な機能性の達成の両方にとって潜在的に有利ないくつかの異なる特徴がある。例えば、核酸配列標的化機能及びエフェクター機能が異なる分子に存在するモジュール設計により、機能モジュールを独立して再プログラムすることができる。これにより、個々の機能性Ｃａｓ９融合タンパク質の再操作を必要ない。したがって、異なるモジュールの組み合わせは、動員ＲＮＡモチーフ及び同族ＲＮＡ結合ドメインのヌクレオチド配列を交換することによって達成することができる。一方、配列標的化単位のタンパク質成分との直接融合又は直接相互作用によるエフェクターの動員は、常に、新しい融合タンパク質の再操作が必要であり、これは、しばしば予測できない結果を示し、技術的により困難である。さらに、融合エフェクターはサイズが小さく、機能的エフェクターをより効率的にオリゴマー化することが潜在的に可能であるが、直接融合による立体障害のためにオリゴマーの形成が妨げられる。さらに、ＲＮＡ足場媒介性塩基編集では、Ｃａｓの遺伝子／転写サイズをさらに高めるＣａｓ融合タンパク質が生成しなくてよいため、ＲＮＡ媒介性塩基編集システムが、ウイルスベクターによるパッケージング及び送達のためにより効率的な方法で潜在的に構築され得る。
上記のＲＮＡ媒介性塩基編集システムの利点にもかかわらず、有意な最適化が依然として必要である。デアミナーゼ等の塩基編集酵素の効率は、標的核酸の配列に高度に依存する。したがって、ＲＮＡ媒介性塩基編集システムを用いる場合、エフェクターは、標的配列に基づいて注意深く選択されなければならない。最適なエフェクターを選択し、システムを試験するプロセスは、時間がかかる場合があるため、より効率的な塩基編集システムを開発することが望ましい。
国際公開第二０１７／０１１７２１号パンフレット 国際公開第二０１８／１２９１２９号パンフレット 米国特許出願公開第６２／９０１，５８４号明細書
本発明の発明者らは、単一の標的部位への複数のエフェクターを動員させて、極めて効率的に塩基編集ができる新規のＲＮＡ媒介性塩基編集システムを開発した。
先行している特許文献１に記載されているＲＮＡ－アプタマー媒介性塩基編集システムは、標的ゲノム遺伝子座に正確に組換えをする単一アプタマーリガンドの不可逆的動員を伴うと仮定された。しかしながら、驚くべきことに、本発明者らは、動員機構が実際に可逆的であり、これが塩基編集の効率を改善することに関与することを見出した。この知見に基づいて、本発明者らは、単一のゲノム遺伝子座に複数のエフェクターを動員させて、この領域内での単一又は複数で極めて効率的に編集しうるシステムを注意深く考案した。さらに、当該システムは、複数の異なるゲノム遺伝子座を編集するために同時に適用することができる（多重化塩基編集）。
第一の態様では、本発明は、塩基編集による細胞の遺伝子組換えのための方法であって、以下の：
ｉ）配列標的化タンパク質；
ｉｉ）ａ）ガイドＲＮＡ、及び
ｂ）リガンド結合部分、を含む、ＲＮＡ－リガンド結合複合体；並びに、
ｉｉｉ）ｃ）前記リガンド結合部分に可逆的に結合することができるリガンド、及び
ｄ）エフェクタードメイン、を含む、２つ以上のエフェクタータンパク質、
を、細胞中に導入することを含む、方法をもたらす。
一実施形態では、塩基編集による細胞の遺伝子組換えのための方法であって、前記方法は、以下の：
ｉ）配列標的化タンパク質；
ｉｉ）ｅ）ガイドＲＮＡ、及び
ｆ）リガンド結合部分、を含む、ＲＮＡ－リガンド結合複合体；並びに、
ｉｉｉ）ｇ）前記リガンド結合部分に可逆的に結合することができるリガンド、及び
ｈ）エフェクタードメイン、を含む、２つ以上のエフェクタータンパク質、
を、細胞内にもたらす、例えば、細胞中に導入すること、を含む、方法をもたらす。
一実施形態では、ガイドＲＮＡ（又はｇＲＮＡ）は、標的核酸に相補的な標的化配列を含むｃｒＲＮＡを含む。一実施形態では、ガイドＲＮＡは、さらに、配列標的化タンパク質に結合することができるｔｒａｃｒＲＮＡ又はｓｃｏｕｔＲＮＡを含む。したがって、一実施形態では、ガイドＲＮＡはｃｒＲＮＡのみを含む。他の実施形態では、ガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡを含む。代替的な実施形態では、ガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ及びｓｃｏｕｔＲＮＡを含む。
一実施形態では、前記配列標的化タンパク質はＣａｓタンパク質である。
エフェクターがリガンドに結合している（又はリガンドを含む）場合、システムにはモジュール設計がある。ＲＮＡ－リガンド結合複合体内にリガンド結合部分が存在することにより、この複合体は、エフェクターと会合した（又は含まれた）対応するリガンドと会合することができる。したがって、リガンド結合部分は、リガンドと可逆的に会合することができるような様式及び配向でガイドＲＮＡと会合する。同様に、リガンドは、リガンド結合部分と可逆的に結合することができるような様式で、エフェクターに付着するか、又は結合する。
エフェクター（又は「エフェクタードメイン」）がリガンドに結合している（又はリガンドを含む）場合、システムにはモジュール設計がある。ＲＮＡ－リガンド結合複合体内にリガンド結合部分が存在することにより、この複合体は、エフェクタードメインと会合した（又はエフェクタードメイン内に含有された）対応するリガンドと会合することができる。したがって、リガンド結合部分は、リガンドと可逆的に会合することができるような様式及び配向でガイドＲＮＡと会合する。同様に、リガンドは、リガンド結合部分と可逆的に結合することができるような様式で、エフェクタードメインに付着するか、又は結合する。
リガンド及びリガンド結合部分が互いに会合している場合、リガンドに付着又は会合しているエフェクターは、ＲＮＡ－リガンド結合複合体を含有するいかなる塩基編集複合体の部分となる。塩基編集複合体がＣａｓタンパク質も含有する場合、そのＣａｓタンパク質及びエフェクターは、同じ場所、例えば、目的の標的部位又はその付近に保持され得る。
したがって、特定のエフェクターをＣａｓタンパク質と共に用いるために、エフェクターは、前記Ｃａｓタンパク質を含有する塩基編集複合体の部分であるリガンド結合部分と可逆的に会合することができるリガンドと会合する必要がある。エフェクターを１つのシステムから次のシステムに変えるためには、エフェクター－リガンドのみを変える必要がある。その結果、同じＲＮＡ－リガンド結合複合体及びその関連Ｃａｓタンパク質を、複数の異なるエフェクターと共に用いることができる。複数の異なるエフェクターは、それらのリガンドをリガンド結合部分と会合及び解離させることによって、同じシステムにおいて同時に若しくは逐次的に、又は異なるシステムにおいて同時に若しくは逐次的に用いることができる。
好ましい実施形態では、ＲＮＡ－リガンド結合複合体のリガンド結合部分はＲＮＡモチーフであり、エフェクタータンパク質のリガンドはＲＮＡ結合ドメインである。好ましい実施形態では、ＲＮＡ－リガンド結合複合体のリガンド結合部分はＲＮＡモチーフであり、エフェクタータンパク質のリガンドは、ＲＮＡモチーフを認識し、それに結合することができるＲＮＡ結合ドメインである。ＲＮＡ－リガンド結合複合体がガイドＲＮＡ及びＲＮＡモチーフを含む実施形態では、それはＲＮＡ足場という。
エフェクターがＲＮＡ結合ドメインに結合している（又はそれを含む）場合、システムにはモジュール設計がある。ＲＮＡ－リガンド結合複合体（ＲＮＡ足場）内にＲＮＡモチーフが存在することにより、この複合体は、エフェクターと会合した（又は含有された）対応するＲＮＡ結合ドメインと会合することができる。したがって、ＲＮＡモチーフは、ＲＮＡ結合ドメインと可逆的に会合することができるような様式及び配向でガイドＲＮＡと会合する。同様に、ＲＮＡ結合ドメインは、ＲＮＡモチーフと可逆的に結合することができるような様式で、エフェクターに付着するか、又は結合する。
エフェクター（又は「エフェクタードメイン」）がリガンドに結合している（又はリガンドを含む）場合、システムにはモジュール設計がある。ＲＮＡ－リガンド結合複合体（ＲＮＡ足場）内にＲＮＡモチーフが存在することにより、この複合体は、エフェクタードメインと会合した（又はエフェクタードメイン内に含有された）対応するリガンドと会合することができる。したがって、ＲＮＡモチーフは、ＲＮＡ結合ドメインと可逆的に会合することができるような様式及び配向でガイドＲＮＡと会合する。同様に、ＲＮＡ結合ドメインは、ＲＮＡモチーフと可逆的に結合することができるような様式で、エフェクタードメインに付着するか、又は結合する。
ＲＮＡ結合ドメイン及びＲＮＡモチーフが互いに会合している場合、ＲＮＡ結合ドメインと会合しているエフェクターは、ＲＮＡ－リガンド結合複合体（ＲＮＡ足場）を含有するいかなる塩基編集複合体の部分となる。塩基編集複合体がＣａｓタンパク質も含有する場合、そのＣａｓタンパク質及びエフェクターは、同じ場所、例えば、目的の標的部位又はその付近に保持され得る。
したがって、本発明は、特定のエフェクターをＣａｓタンパク質と共に用いるために、エフェクターは、前記Ｃａｓタンパク質を含有する塩基編集複合体の部分であるＲＮＡモチーフと可逆的に会合することができるＲＮＡ結合ドメインを含む方法を提供する。エフェクターを１つのシステムから次のシステムに変えるためには、エフェクター－ＲＮＡ結合ドメインのみを変える必要がある。その結果、同じＲＮＡ－リガンド結合複合体（ＲＮＡ足場）及びその関連するＣａｓタンパク質を、複数の異なるエフェクターと共に用いることができる。複数の異なるエフェクターは、それらのＲＮＡ結合ドメインをＲＮＡモチーフと会合及び解離させることによって、同じシステムにおいて同時に若しくは逐次的に、又は異なるシステムにおいて同時に若しくは逐次的に用いることができる。
本発明のいかなる実施形態でも、２つ以上のエフェクタータンパク質は各々、ＲＮＡ－リガンド結合複合体中の同じリガンド結合部分に可逆的に結合することができるリガンドを含む。換言すれば、２つ以上のエフェクタータンパク質は、共通のリガンド結合部分と相互作用することができ、したがって、同じＲＮＡ－リガンド結合複合体によって各々動員され得る。通常、２つ以上のエフェクタータンパク質は各々、異なるエフェクタードメインを含み、各々、同じリガンド結合部分に可逆的に結合することができるリガンドを含む。
本発明の一実施形態では、２つ以上のエフェクタータンパク質は各々、ＲＮＡ足場中の同じＲＮＡモチーフに可逆的に結合することができるＲＮＡ結合ドメインを含む。換言すれば、２つ以上のエフェクタータンパク質は、共通のＲＮＡモチーフと相互作用することができ、したがって、同じＲＮＡ足場によって各々動員され得る。通常、２つ以上のエフェクタータンパク質は各々、異なるエフェクタードメインを含み、各々、同じＲＮＡモチーフに可逆的に結合することができるＲＮＡ結合ドメインを含む。
一実施形態では、ＲＮＡ結合ドメインは、単量体、二量体又は多量体であり得る。好ましい実施形態では、ＲＮＡ結合ドメインは、二量体ＲＮＡ結合タンパク質及びその関連するエフェクタードメイン（複数可）が単一のＲＮＡモチーフと可逆的に関連するように、二量体を形成し得る。
ＲＮＡモチーフ及び／又はＲＮＡ結合ドメインの結合親和性は、解離定数（Ｋｄ）が１５０ｎＭ未満である。通常、Ｋｄは、１～１５０ｎＭ、５～１５０ｎＭ、１０～１５０ｎＭ；１５～１５０ｎＭ；２０～１５０ｎＭ、２５～１５０ｎＭ、３０～１５０ｎＭ、４０～１５０ｎＭ、５０～１５０ｎＭ、６０～１５０ｎＭの間であり、より典型的には、Ｋｄは、１～１０ｎＭ：１～２０ｎＭ、１～３０ｎＭ、１～４０ｎＭ、１～５０ｎＭ；１～６０ｎＭ、１～７０ｎＭ；１～８０ｎＭ；１～９０ｎＭの間である。解離定数が１５０ｎＭを超えると、塩基編集の効率が低下する。
本発明の一実施形態では、前記ＲＮＡモチーフ及びＲＮＡ結合ドメインが、以下の：
テロメラーゼＫｕ結合モチーフ及びＫｕタンパク質又はそのＲＮＡ結合セクション；
テロメラーゼＳｍ７結合モチーフ及びＳｍ７タンパク質又はそのＲＮＡ結合セクション；
ＭＳ２ファージオペレーターステムループ及びＭＳ２コートタンパク質（ＭＣＰ）又はそのＲＮＡ結合セクション；
ＰＰ７ファージオペレーターステムループ及びＰＰ７コートタンパク質（ＰＣＰ）又はそのＲＮＡ結合セクション；
ＢｏｘＢ結合モチーフ及びラムダバクテリオファージプロテインＮ（ＬａｍｂｄａＮ－（１－２２））又はそのＲＮＡ結合セクション；
Ｃｓｙ４結合モチーフ及びＣｓｙ４［Ｈ２９Ａ］若しくはそのＲＮＡ結合セクション；又は
Ｑｂｅｔａファージオペレーターステムループ及びＱｂｅｔａコートタンパク質［Ｑ６５Ｈ］又はそのＲＮＡ結合部分セクション；
からなる群から選択される対である方法が提供される。
ある実施形態では、２つ以上のエフェクタータンパク質のエフェクタードメインの機能は、同じか又は異なる。一実施形態では、エフェクタードメインは、酵素又はタンパク質断片である。一実施形態では、エフェクタードメインは、酵素活性がある酵素又はタンパク質断片である。例えば、一実施形態では、エフェクタードメインには、脱アミノ化活性、例えば、一実施形態では、シチジン又はアデニン脱アミノ化活性がある。
一実施形態では、本明細書で提供される方法において、シチジン脱アミノ化活性があるエフェクタードメインは、野生型又は遺伝子操作された、ＡＩＤ、ＣＤＡ、ＡＰＯＢＥＣ１、ＡＰＯＢＥＣ３Ａ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｂ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｃ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｄ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｆ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｈ又は他のＡＰＯＢＥＣファミリー酵素である。一実施形態では、アデニン脱アミノ化活性があるエフェクタードメインは、野生型又は遺伝子操作された、ＡＤＡ、ＡＤＡＲ、ＡＤＡＲ１ファミリー酵素、又はｔＲＮＡアデノシンデアミナーゼＴａｄＡ、ＴＡＴＡ、ＴＡＤ３である。
一実施形態では、エフェクタータンパク質は、さらに、リンカーを含む。有利には、リンカーは、リガンドの三次元空間において、より制御を高めることができ、ひいてはエフェクターを用いることができる。一実施形態では、エフェクタータンパク質は、リガンド及びエフェクタードメインを結合するように構成されたリンカーをさらに含む。
一実施形態では、配列標的化成分及び／又はエフェクタータンパク質は、１つ以上の核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含む。
一実施形態では、標的核酸は、染色体外ＤＮＡ又は染色体上のゲノムＤＮＡである。
本発明の実施形態では、配列標的化タンパク質を含む配列標的化成分が、１つ以上のウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＮＧ）インヒビターペプチド（ＵＧＩ）に融合される方法が提供される。
一実施形態では、前記配列標的化タンパク質は、ＩＩ型Ｃａｓタンパク質又はＶ型Ｃａｓタンパク質である。一実施形態では、前記配列標的化タンパク質は、ヌクレアーゼ欠損であるか、又はニッカーゼ活性がある、ＩＩ型Ｃａｓタンパク質であり、及び／又は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ及びＴｒｅｐｏｎｅｍａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａからなる群より選択される１つの種のｄＣａｓ９又はｎＣａｓ９の配列を含む。一実施形態では、配列標的化タンパク質は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｕｓ ａｕｒｉｃｕｌａｌｉｓのｄＣａｓ９又はｎＣａｓ９の配列を含む、ＩＩ型Ｃａｓタンパク質である。
一実施形態では、配列標的化タンパク質は、Ｖ型Ｃａｓタンパク質である。一実施形態では、前記配列標的化タンパク質は、ヌクレアーゼ欠損であるか、又はニッカーゼ活性がある、Ｖ型Ｃａｓタンパク質であり、及び／又は、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｃｆ．ｎｏｖｉｃｉｄａ Ｆｘ１，Ｄｅｌｔａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ，Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｔｅｒｒｅｓｔｒｉ，Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ，Ｏｌｅｉｐｈｉｌｕｓ ｓｐ．，Ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＣＧ０９＿３９＿２４，Ｕｎｃｕｌｔｕｒｅｄ ａｒｃｈａｅｏｎ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ，Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ ｓｐ．，Ｒｏｔｈｉａ ｄｅｎｔｏｃａｒｉｏｓａ，Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｍｉｃｒａｒｃｈａｅｏｔａ ａｒｃｈａｅｏｎ，Ｇｏｒｄｏｎｉａ ｏｔｉｔｉｄｉｓ，Ｆｒｅｓｈｗａｔｅｒ ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ，Ｈｙｐｅｒｓａｌｉｎｅ ｌａｋｅ ｓｅｄｉｍｅｎｔ ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ ｏｒ Ｈｏｔ ｓｐｒｉｎｇｓ ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅからなる群から選択される種のｄＣａｓ１２又はｎＣａｓ１２の配列を含む。
一実施形態では、配列標的化タンパク質は、ヌクレアーゼ欠損であるか、又はニッカーゼ活性がある、Ｖ型Ｃａｓタンパク質であり、及び／又は、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｃｆ．ｎｏｖｉｃｉｄａ Ｆｘ１，Ｄｅｌｔａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ，Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｔｅｒｒｅｓｔｒｉ，Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ，Ｏｌｅｉｐｈｉｌｕｓ ｓｐ．，Ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＣＧ０９＿３９＿２４，Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ，Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ ｓｐ．，Ｒｏｔｈｉａ ｄｅｎｔｏｃａｒｉｏｓａ，Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｍｉｃｒａｒｃｈａｅｏｔａ ａｒｃｈａｅｏｎ，Ｇｏｒｄｏｎｉａ ｏｔｉｔｉｄｉｓからなる群から選択される種のｄＣａｓ１２又はｎＣａｓ１２の配列を含む。
本発明の一実施形態では、細胞は単一のゲノム遺伝子座で塩基編集を受ける方法が提供される。一実施形態では、細胞は２つ以上のゲノム遺伝子座で塩基編集を受ける。一実施形態では、細胞は真核細胞又は原核細胞である。一実施形態では、細胞は哺乳動物細胞又は植物細胞である。一実施形態では、細胞はヒト細胞である。一実施形態では、細胞は、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ細胞）、ＣＤ３４＋造血幹細胞前駆細胞（ＨＳＰＣ）又はマクロファージ）、幹細胞又はがん細胞である。好ましい実施形態では、細胞はＴ細胞である。
本発明の一実施形態では、遺伝子組換えが同じ遺伝子座内の少なくとも２つの遺伝子組換えを含む方法が提供される。一実施形態では、遺伝子組換えは点変異である。点変異は、未成熟終止コドンを導入するか、開始コドンを破壊するか、スプライス部位を破壊するか、又は遺伝子変異を修正する。
本発明の一実施形態では、ＲＮＡ－リガンド結合複合体は、化学合成されたＲＮＡとして細胞に導入される方法が提供される。一実施形態では、ＲＮＡ－リガンド結合複合体は１つ以上の修飾を含む。一実施形態では、ＲＮＡ－リガンド結合複合体は、本明細書において記載される以下の１つ以上の修飾を含み得る。例えば、ガイドＲＮＡは、ガイドＲＮＡ配列の少なくとも１つの５’ヌクレオチド及び少なくとも１つの３’ヌクレオチド上に２’－（０－メチルホスホロチオエート）修飾を含むように化学的に組換えられる。一実施形態では、ＲＮＡ－リガンド結合複合体は単一成分又は２つの別個の成分として合成される。一実施形態では、ＲＮＡ－リガンド結合複合体が２つの別個の成分として合成され、第一の成分がａ）ｃｒＲＮＡ及び／又はｂ）リガンド結合部分を含み、第二の成分がｃ）ｔｒａｃｒＲＮＡ若しくはｓｃｏｕｔＲＮＡ及び／又はｄ）リガンド結合部分を含む。２つの成分は、細胞に導入される前にハイブリダイズされる。一実施形態では、ＲＮＡ－リガンド結合複合体は合成ＲＮＡ成分である。
本発明の一実施形態では、本明細書の方法で用いられるＲＮＡ足場は、化学合成されたＲＮＡとして細胞に導入される。一実施形態では、ＲＮＡ足場は、１つ以上の修飾を含む。一実施形態では、ＲＮＡ足場は、本明細書において以下に記載される１つ以上の修飾を含む。例えば、ガイドＲＮＡは、ガイドＲＮＡ配列の少なくとも１つの５’ヌクレオチド及び少なくとも１つの３’ヌクレオチド上に２’－（０－メチルホスホロチオエート）修飾を含むように化学的に組換えられる。一実施形態では、ＲＮＡ足場は、単一成分又は２つの別個の成分として合成される。一実施形態では、ＲＮＡ足場は、２つの別個の成分として合成され、第一の成分がａ）ｃｒＲＮＡ及び／又はｂ）リガンド結合部分を含み、第二の成分がｃ）ｔｒａｃｒＲＮＡ若しくはｓｃｏｕｔＲＮＡ及び／又はｄ）リガンド結合部分を含む。２つの成分は、細胞に導入される前にハイブリダイズされる。一実施形態では、ＲＮＡ足場は１又はそれ以上の合成ＲＮＡ成分である。
本発明の一実施形態では、ＲＮＡ－リガンド結合複合体は１つ以上の修飾を含む。本発明の一実施形態では、１つ以上の修飾により、ＲＮＡ－リガンド結合複合体の安定性が高まりうる。一実施形態では、１つ以上の修飾により、ヌクレアーゼ分解に対する複合体の耐性が高まって、ＲＮＡ－リガンド結合複合体の安定性が高まりうる。一実施形態では、ガイドＲＮＡは、少なくとも１つの２’－（０－メチルホスホロチオエート）修飾を含むように化学的に修飾される。
本発明の一実施形態では、１つ以上の前記リガンド結合部分は、ガイドＲＮＡの３’末端、５’末端又はガイドＲＮＡ内に位置する方法が提供される。好ましい実施形態では、ＲＮＡ－リガンド結合複合体（又はＲＮＡ足場）は、１つ以上のエフェクターを動員させうる１つ以上のＲＮＡモチーフを含み得る。好ましい実施形態では、ＲＮＡ－リガンド結合複合体（又はＲＮＡ足場）は、１つ以上のエフェクタータンパク質を動員させうる１つ以上のＲＮＡモチーフを含み得る。一実施形態では、各ＲＮＡモチーフは、単一又は複数のエフェクタータンパク質のいずれかを動員する。ＲＮＡ－リガンド結合複合体（ＲＮＡ足場）が２つ以上のＲＮＡモチーフを含む実施形態では、ＲＮＡモチーフは同じか、又は異なる。２つ以上のＲＮＡモチーフが存在し、それらが異なる実施形態では、各ＲＮＡモチーフは、単一又は複数のエフェクタータンパク質のいずれかを動員する。２つ以上のＲＮＡモチーフが存在し、それらが異なる実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡモチーフが複数のエフェクタータンパク質を動員する。複数のエフェクタータンパク質が動員される実施形態では、これらのタンパク質の機能は、同じか又は異なる。複数のエフェクタータンパク質が動員されるいかなる実施形態でも、エフェクタータンパク質のエフェクタードメインの機能は、同じか又は異なる。
好ましい実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡモチーフはＭＳ２アプタマーであり、場合によっては、前記ＭＳ２アプタマーには伸長ステムがある。一実施形態では、伸長ステムは２～２４ヌクレオチドを含む。一実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡモチーフはＰＰ７アプタマーである。一実施形態では、ＭＳ２アプタマー及びＰＰ７アプタマーは、単一のエフェクタータンパク質又は複数のエフェクタータンパク質を各々動員する。一実施形態では、ＭＳ２アプタマー及びＰＰ７アプタマーは、同じ又は異なるエフェクタータンパク質を動員する。
一実施形態では、前記配列標的化タンパク質は、１つ又は２つのＵＧＩがあるｎＣａｓ９を含み、前記リガンド結合部分は、前記ＲＮＡ－リガンド結合複合体の３’末端に位置する単一のＭＳ２ ＲＮＡモチーフ又はＰＰ７ ＲＮＡモチーフである。
一実施形態では、前記配列標的化タンパク質は、１つ又は２つのＵＧＩがあるｎＣａｓ９を含み、前記リガンド結合部分は、前記ＲＮＡ－リガンド結合複合体の３’末端に位置する単一のＭＳ２ ＲＮＡモチーフ又はＰＰ７ ＲＮＡモチーフである。
本発明の一実施形態では、成分がＲＮＡ又はタンパク質の形態である方法が提供され、例えば、配列標的化成分、前記ＲＮＡ－リガンド結合複合体及びエフェクタータンパク質は、ＲＮＡ又はタンパク質として細胞に導入されうるが、これは、本明細書で提供される方法／システムが、所望であれば、ベクターを含まないシステムで用いられ得ることを意味する。
第二の態様では、本発明は、塩基編集による細胞の遺伝子組換えのための方法により得られた遺伝子組換え細胞の集団を提供し、細胞の少なくとも１０％が１又はそれ以上の遺伝子組換えを含み得る。
第三の態様では、本発明は、塩基編集による細胞の遺伝子組換えのためのキットであって、以下の：
ｉ）配列標的化タンパク質；
ｉｉ）ａ）ガイドＲＮＡ、及び
ｂ）リガンド結合部分、を含む、ＲＮＡ－リガンド結合複合体；並びに、
ｉｉｉ）ｃ）前記リガンド結合部分に可逆的に結合することができるリガンド、及び
ｄ）エフェクタードメイン、を含む、２つ以上のエフェクタータンパク質、
を、含む。
本発明の第三の態様に記載のキットの一実施形態では、エフェクタータンパク質は、さらに、リンカーを含む。
本発明の第三の態様に記載のキットの一実施形態では、リガンド結合部分がＲＮＡモチーフであり、リガンドがＲＮＡ結合ドメインである。
第四の態様では、本発明は、塩基編集による細胞の遺伝子組換えのためのキットであって、以下の：
ｉ）配列標的化タンパク質；
ｉｉ）ａ）ガイドＲＮＡ、及び
ｂ）リガンド結合部分、を含む、ＲＮＡ－リガンド結合複合体；並びに、
ｉｉｉ）ｃ）前記リガンド結合部分に可逆的に結合することができるリガンド、及び
ｄ）エフェクタードメイン、を含む、２つ以上のエフェクタータンパク質、
を、含む。
本発明の第四の態様に記載のキットの一実施形態では、ガイドＲＮＡは、標的核酸に相補的な標的化配列を含むｃｒＲＮＡを含む。本発明の第四の態様に記載のキットの一実施形態では、ガイドＲＮＡは、さらに、配列標的化タンパク質に結合することができるｔｒａｃｒＲＮＡ又はｓｃｏｕｔＲＮＡを含む。
本発明の第四の態様に記載のキットの一実施形態では、リガンド結合部分がＲＮＡモチーフであり、リガンドがＲＮＡ結合ドメインである。
第五の態様では、本発明は、塩基編集による細胞の遺伝子組換えのための方法であって、以下の：
ｉ）ａ）ＳＨ３ドメインを含む配列標的化タンパク質、及び
ｂ）ＳＨ３ドメインを含むエフェクタードメイン、を含む、配列標的化成分であって、ここで、（ａ）及び（ｂ）は、ＳＨ ３媒介性結合によって結合されており；
ｉｉ）ｃ）ガイドＲＮＡ、及び
ｄ）リガンド結合部分、を含む、ＲＮＡ－リガンド結合複合体；並びに、
ｉｉｉ）ｅ）前記リガンド結合部分に可逆的に結合することができるリガンド、及び
ｆ）エフェクタードメイン、を含む、２つ以上のエフェクタータンパク質
を、細胞中に導入すること、及び／又は、細胞中で発現させることを含む。
本発明の第五の態様に記載のキットの一実施形態では、ガイドＲＮＡは、標的核酸に相補的な標的化配列を含むｃｒＲＮＡを含む。本発明の第五の態様に記載のキットの一実施形態では、ガイドＲＮＡは、さらに、配列標的化タンパク質に結合することができるｔｒａｃｒＲＮＡ又はｓｃｏｕｔＲＮＡを含む。
本発明の第五の態様に記載のキットの一実施形態では、前記リガンド結合部分はＲＮＡモチーフであり、リガンドはＲＮＡ結合ドメインである。
第六の態様では、本発明は、塩基編集による細胞の遺伝子組換えのための方法であって、以下の：
ｉ）ａ）配列標的化タンパク質、及び
ｂ）エフェクタードメイン、を含む、配列配列標的化成分；
ｉｉ）ａ）ガイドＲＮＡ、及び
ｂ）リガンド結合部分、を含む、ＲＮＡ－リガンド結合複合体；
ｉｉｉ）ｃ）前記リガンド結合部分に可逆的に結合することができるリガンド、及び
ｄ）エフェクタードメイン、を含む、２つ以上のエフェクタータンパク質、
を、細胞中に導入すること、及び／又は、細胞中で発現させることを含む。
本発明の第六の態様に記載のキットの一実施形態では、ガイドＲＮＡは、標的核酸に相補的な標的化配列を含むｃｒＲＮＡを含む。本発明の第六の態様に記載のキットの一実施形態では、ガイドＲＮＡは、さらに、配列標的化タンパク質に結合することができるｔｒａｃｒＲＮＡ又はｓｃｏｕｔＲＮＡを含む。
本発明の第六の態様に記載のキットの一実施形態では、前記リガンド結合部分はＲＮＡモチーフであり、リガンドはＲＮＡ結合ドメインであるである。
本発明の第七の態様では、本発明は、本明細書に開示される方法により調製された少なくとも１つの細胞に由来する細胞株を提供する。
主要な特徴；下部ステム、上部ステム、反復、アンチ反復、バルジ、ステムループ１、ステムループ２、ステムループ３を詳述する、ＩＩ型Ｃａｓ酵素と共に用いるための例示的なｇＲＮＡ分子の図である。 星印で示されるアプタマー配列を含む１つ以上の修飾の潜在的な位置を示す、Ｃａｓ１２ｂタンパク質と共に用いるための例示的なｇＲＮＡ配列の描写である。（Ａ）ｔｒａｃｒＲＮＡの５’の位置にアプタマー配列があるｇＲＮＡ。（Ｂ）ｔｒａｃｒＲＮＡの３’の位置にアプタマー配列があるｇＲＮＡ。（Ｃ）ｃｒＲＮＡの５’の位置にアプタマー配列があるｇＲＮＡ。（Ｄ）ｃｒＲＮＡの５’に位置するアプタマー配列と、ｔｒａｃｒＲＮＡの５’の位置に第二のアプタマー配列があるｇＲＮＡ。（Ｅ）ｓｇＲＮＡの５’末端の位置にアプタマー配列があるｓｇＲＮＡ。（Ｆ）テトラループの伸長の位置にアプタマー配列があるｓｇＲＮＡ。（Ｇ）テトラループ上の伸長として配置されたアプタマー配列及びｓｇＲＮＡの５’末端の位置に第二のアプタマー配列があるｓｇＲＮＡ。（Ｈ）ステムループ２への伸長の位置にアプタマー配列があるｓｇＲＮＡ。ｇＲＮＡ（ガイドＲＮＡ）とアプタマー配列（複数可）とを含むＲＮＡ－リガンド結合複合体であって、アプタマー配列（複数可）がＲＮＡモチーフであるＲＮＡ－リガンド結合複合体は、ＲＮＡ足場ともいってよい。 星印で示されるアプタマー配列を含ませるための修飾の潜在的な位置を示す、Ｃａｓ１２ｅ酵素と共に用いるための例示的なｇＲＮＡ配列の描写。（Ａ）ｔｒａｃｒＲＮＡの３’の位置にアプタマー配列があるｇＲＮＡ。（Ｂ）ｔｒａｃｒＲＮＡの５’の位置にアプタマー配列があるｇＲＮＡ。（Ｃ）ｃｒＲＮＡの５’の位置にアプタマー配列があるｇＲＮＡ。（Ｄ）ｃｒＲＮＡの３’の位置にアプタマー配列があるｇＲＮＡ（Ｅ）ｓｇＲＮＡの５’末端の位置にアプタマー配列があるｓｇＲＮＡ。（Ｆ）テトラループの伸長の位置にアプタマー配列があるｓｇＲＮＡ。（Ｇ）ｓｇＲＮＡの３’末端の位置にアプタマー配列があるｓｇＲＮＡ。（Ｈ）ステムループ２への伸長の位置にアプタマー配列があるｓｇＲＮＡ。ｇＲＮＡ（ガイドＲＮＡ）とアプタマー配列（複数可）とを含むＲＮＡ－リガンド結合複合体であって、アプタマー配列（複数可）がＲＮＡモチーフであるＲＮＡ－リガンド結合複合体は、ＲＮＡ足場ともいってよい。 Ｃａｓ１２ｆ酵素と共に用いるための例示的なｇＲＮＡ配列の描写であって、星印で示されるアプタマー配列を含む１つ以上の修飾の潜在的な位置を示す。（Ａ）ｓｇＲＮＡの３’の位置にアプタマー配列があるｓｇＲＮＡ。（Ｂ）テトラループの伸長の位置にアプタマー配列があるｓｇＲＮＡ。（Ｃ）テトラループ上の伸長の位置にアプタマー配列がある、ｓｇＲＮＡの５’末端の位置に第二のアプタマー配列があるｓｇＲＮＡ。（Ｄ）ｔｒａｃｒＲＮＡの５’の位置にアプタマー配列があるｇＲＮＡ。（Ｅ）ｔｒａｃｒＲＮＡの３’末端の位置にアプタマー配列があるｇＲＮＡ。（Ｆ）ｃｒＲＮＡの５’の位置にアプタマー配列があるｇＲＮＡ ｇＲＮＡ（ガイドＲＮＡ）及びアプタマー配列（複数可）を含むＲＮＡ－リガンド結合複合体であって、アプタマー配列（複数可）がＲＮＡモチーフであるＲＮＡ－リガンド結合複合体は、ＲＮＡスキャフォールドともいってよい。 アプタマー配列を含ませるための潜在的な位置を示す、Ｃａｓ１２ａと共に用いるための例示的なｇＲＮＡの図である。アプタマー配列を含ませるための１つ以上の修飾の位置は、星印で示され、直列反復の５’塩基にあり、直列反復のループ又はｇＲＮＡの３’末端に位置する。ｇＲＮＡ（ガイドＲＮＡ）とアプタマー配列（複数可）とを含むＲＮＡ－リガンド結合複合体であって、アプタマー配列（複数可）がＲＮＡモチーフであるＲＮＡ－リガンド結合複合体は、ＲＮＡ足場ともいってよい。 アプタマー配列を含ませるための潜在的な位置を示す、Ｃａｓ１２ｃシステム及びＣａｓ１２ｄシステムと共に用いるための例示的なｇＲＮＡの図である。星印で示されたアプタマー配列を含む１つ以上の修飾の位置：ｓｃｏｕｔＲＮＡの５’、ｓｃｏｕｔＲＮＡの３’、ｓｃｏｕｔＲＮＡのステム。ｇＲＮＡ（ガイドＲＮＡ）とアプタマー配列（複数可）とを含むＲＮＡ－リガンド結合複合体であって、アプタマー配列（複数可）がＲＮＡモチーフであるＲＮＡ－リガンド結合複合体は、ＲＮＡ足場ともいってよい。 単一のアプタマー動員、Ａｐｏｂｅｃのみ、ＡＩＤのみ、並びにＰＣＤ１遺伝子座で組み合わせたＡｐｏｂｅｃ及びＡＩＤを用いるピンポイントシステムの編集効率。単一のリガンド結合部分（ＲＮＡモチーフ）動員、Ａｐｏｂｅｃのみ、ＡＩＤのみ、並びにＡｐｏｂｅｃ及びＡＩＤの組み合わせを用いるピンポイントシステムの編集効率。シトシンからチミンへの核酸塩基遷移の比率を示す。 新規な塩基編集スペーサープロファイルについての複数の遺伝子座での同時の単一アプタマー（リガンド結合部分）マルチデアミナーゼ動員塩基編集。初代ヒト細胞におけるシトシンからチミンへの塩基編集による合成ｓｇＲＮＡ－アプタマー（ＲＮＡ－リガンド結合複合体）を用いたテトラプレックス遺伝子ＫＯ塩基編集。Ａ）Ｂ２Ｍの遺伝子ＫＯの標的ガイド配列内の標的塩基のＣからＴへの変換の定量化。Ｂ）ＣＤ５２の遺伝子ＫＯの標的ガイド配列内の標的塩基のＣからＴへの変換の定量化。Ｃ）ＴＲＡＣの遺伝子ＫＯの標的ガイド配列内の標的塩基のＣからＴへの変換の定量化。Ｄ）ＰＤＣＤ－１の遺伝子ＫＯについての標的ガイド配列内の標的塩基のＣからＴへの変換の定量化。合成ＲＮＡ－リガンド結合複合体及びデアミナーゼベースのエディターｍＲＮＡ（エフェクタータンパク質）を、電気穿孔を介してＣＤ３陽性Ｔ細胞に共送達し、塩基変換を、送達の５～７日後にサンガー配列決定トレースの分析によって決定した。各デアミナーゼ酵素の異なるプロファイルを表示するために、プロトスペーサー全体図面に報告されている。含まれる対照は、３つ全てのデアミナーゼ（ＡｎｏＡｐｏ、ＲａｔＡｐｏ、及びＨｏＡＩＤ）を含有するが、非標的化／スクランブルガイドを含む。ＡｎｏＡｐｏ＝ＮＬＳ－Ａｎｏｌｉｓ（Ｐ１６Ａ－Ｅ１７Ａ）－Ａｐｏｂｅｃ １－リンカー－ＭＣＰ。ＲａｔＡｐｏ＝ＮＬＳ－Ｒａｔｔｕｓ－Ａｐｏｂｅｃ １－リンカー－ＭＣＰ、ＨｏＡＩＤ＝ＮＬＳ－ホモ－ＡＩＤ－リンカー－ＭＣＰ。シトシンからチミンへの核酸塩基遷移の比率を示す。 治療的に関連する免疫細胞モデルにおける新規な塩基編集機能性のための複数の遺伝子座での同時の単一アプタマー（リガンド結合部分）マルチデアミナーゼ動員塩基編集。初代ヒト細胞におけるシトシンからチミンへの塩基編集による合成ｓｇＲＮＡ－アプタマー（ＲＮＡ－リガンド結合複合体）を用いた塩基編集によるテトラプレックス機能的ＫＯ。４つの表面マーカー：Ｂ２Ｍ、ＣＤ５２、ＴＣＲ（ＴＲＡＣ編集の結果としての低減）、及びＰＤ１（ＰＤＣＤ－１編集の結果としての低減）のいずれも含有しない生細胞の比率のフローサイトメトリー定量化；結果は、生細胞集団における成功裏に編集されたテトラプレックス編集細胞を示す。含まれる対照は、３つ全てのデアミナーゼ（ＡｎｏＡｐｏ、ＲａｔＡｐｏ、及びＨｏＡＩＤ）を含有するが、非標的化／スクランブルガイドを含む。ＡｎｏＡｐｏ＝ＮＬＳ－Ａｎｏｌｉｓ（Ｐ１６Ａ－Ｅ１７Ａ）－Ａｐｏｂｅｃ １－リンカー－ＭＣＰ。ＲａｔＡｐｏ＝ＮＬＳ－Ｒａｔｔｕｓ－Ａｐｏｂｅｃ １－リンカー－ＭＣＰ、ＨｏＡＩＤ＝ＮＬＳ－ホモ－ＡＩＤ－リンカー－ＭＣＰ。
本発明は、塩基編集による細胞の遺伝子組換えのための新規な方法に関する。本発明は、２つ以上のエフェクターが標的ゲノム遺伝子座に可逆的に動員されるＲＮＡ媒介性塩基編集システムの使用に基づく。

一態様では、塩基編集による細胞の遺伝子組換えのための方法であって、ｉ）配列標的化タンパク質を含む配列標的化成分（又は配列標的化タンパク質）；ｉｉ）ａ）ガイドＲＮＡ、及びｂ）リガンド結合部分、を含む、ＲＮＡ－リガンド結合複合体；並びに、ｉｉｉ）ｃ）前記リガンド結合部分に可逆的に結合することができるリガンド、及びｄ）エフェクタードメイン、を含む、２つ以上のエフェクタータンパク質、を、細胞中に導入すること、及び／又は、細胞中で発現させることを含むが本明細書で提供される。ＲＮＡ－リガンド結合複合体は、配列標的化タンパク質及びエフェクタータンパク質を標的部位で標的ポリヌクレオチドに誘導し、エフェクタータンパク質のエフェクタードメインは配列を修飾する。本明細書に開示されるように、Ｃａｓ９タンパク質又はＣａｓ１２タンパク質等の配列標的化タンパク質は、その二本鎖切断活性が排除されるように組換えられる。
ＲＮＡ媒介性塩基編集システム
本発明のシステムは、少なくとも部分的に、先行するＲＮＡ媒介性塩基編集システム（特許文献１～３を参照されたい）に関する。
本明細書で提供される方法において用いられるＲＮＡ媒介性塩基編集は、先行技術とは異なるアプローチをとる。より具体的には、先行技術のＲＮＡ媒介性塩基編集では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体のＲＮＡ－リガンド結合複合体では、ＲＮＡモチーフがガイドＲＮＡ分子を含み、単一エフェクターの動員のためのアンカーとして機能する。したがって、ＲＮＡモチーフは、ＲＮＡ結合ドメイン（リガンド）に融合された単一のエフェクター、例えば塩基編集酵素を動員する。
本発明のＲＮＡ媒介性塩基編集複合体では、ＲＮＡ結合ドメイン（リガンド）に融合されたエフェクターの動員は可逆的であり、すなわち、エフェクターは、その同族ＲＮＡモチーフ（リガンド結合部分）と可逆的に会合する機能がある。このシステムの可逆的な性質により、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムが誘導された目的の標的部位への２つ以上のエフェクターを動員することができる。したがって、同じゲノム遺伝子座内で編集する場合、同じＲＮＡ－リガンド結合複合体及びその関連Ｃａｓタンパク質を複数の異なるエフェクターと共に用いることができる。
このシステムを塩基編集の効率を高めるのに用いることができ、それによって、同じＲＮＡ結合ドメイン及び同じ機能を果たす異なるエフェクタードメインがある複数のエフェクタータンパク質が、単一のゲノム遺伝子座に動員される。同族ＲＮＡモチーフ（ＲＮＡ－リガンド結合複合体に存在する）及びその関連配列標的化タンパク質と可逆的に会合することによって、複数のエフェクタータンパク質は、最適な活性があるエフェクタータンパク質が会合して適当な編集を行うまで、塩基編集複合体に一過的に組み込まれ得る。したがって、機能が同じ２、３、４、５又はそれ以上のエフェクターを、本明細書に開示される方法又はキットで用いることができる。
あるいは、同じＲＮＡ結合ドメイン及び機能が異なる異なるエフェクタードメインがある複数のエフェクタータンパク質が、単一のゲノム遺伝子座にガイドされ得る。同族ＲＮＡモチーフ（ＲＮＡ－リガンド結合複合体に存在する）及びその関連する配列標的化タンパク質と可逆的に会合することによって、複数のエフェクタータンパク質は、塩基編集複合体に一過性に組み込まれ、適当な編集を行うことができる。したがって、機能が異なる２、３、４、５又はそれ以上のエフェクターを、本明細書に開示される方法又はキットで用いることができる。
ガイドＲＮＡ配列が異なる複数のＲＮＡ－リガンド結合複合体を用いて、本明細書に開示される方法及びキットを用いて、複数の異なるゲノム遺伝子座で編集を行うこともできる。上記のように複数のエフェクタータンパク質を用いて、各ゲノム遺伝子座において単一編集又は複数編集を行うことができる。
本明細書で実証されるように、本明細書で提供されるＲＮＡ－リガンド結合複合体媒介性塩基編集方法及びシステム、特にＲＮＡスキャフォールド媒介性塩基編集方法及びシステムは、特許文献１及び２（参照によりその全体が本明細書に援用される）に記載される先行の（第一世代）システムと比較して、いくつかの重要な異なる特徴を示す。第一に、本発明の方法及びシステムは、第一世代システムと比較してオンターゲット有効性が実質的に高まるが、検出可能なオフターゲット効果は低いか又は存在しないままである。第二に、本発明の方法及びシステムは、異なる種及び異なるデアミナーゼファミリー由来の多種多様なシチジンデアミナーゼを利用することができる。それらの多くは、先行するいかなる第一世代構築物とは明確に異なる活性ウィンドウ及び優先位置を示す。第三に、編集が行われる全ての部位に複数の異なるエフェクタータンパク質（例えば、デアミナーゼ）を提供する機能は、各ゲノム遺伝子座について最適なデアミナーゼを決定するための時間を浪費せず、編集効率を高めるという利益をもたらす。第４に、シチジンデアミナーゼ及びアデノシンデアミナーゼの両方を同時に同じ部位にもたらすことで、Ｃ－Ｔ編集及びＡ－Ｇ編集の両方が同じゲノム遺伝子座内で同時に行われうる。
本発明のＲＮＡ媒介性塩基編集システムを構成する様々な構成要素を、ここで詳細に考察する。
ｉ）配列標的化成分
本明細書で提供される方法及びシステムの配列標的化成分（配列標的化タンパク質ともいう）は、通常、細菌種由来のＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓシステムのＣａｓタンパク質を配列標的化タンパク質として利用する。ある実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムに由来する。代替的な実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムに由来する。
一般に、Ｃａｓタンパク質は、少なくとも１つのＣａｓ ＲＮＡ結合ドメインを含む。Ｃａｓ ＲＮＡ結合ドメインは、Ｃａｓ会合領域でガイドＲＮＡと相互作用する。Ｃａｓタンパク質は、野生型Ｃａｓタンパク質、又はヌクレアーゼ活性がない組換え型（ｄＣａｓタンパク質）若しくは一本鎖ニッキング活性のみがある組換え型（ｎＣａｓタンパク質）であり得る。Ｃａｓタンパク質は、核酸結合親和性及び／若しくは特異性を高め、酵素活性を組換え、並びに／又はタンパク質の他の特性を変化させるように組換えることができる。例えば、タンパク質のヌクレアーゼ（すなわち、ＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅ）ドメインは、修飾、欠失、又は不活性化され得る。あるいは、タンパク質を切断して、タンパク質の機能に必須でないドメインを除去することができる。タンパク質は、活性を最適化するために切断又は修飾することもできる。
Ｃａｓタンパク質
本発明では様々なＣａｓタンパク質を用いることができる。互換的に用いられるＣａｓタンパク質、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質、又はＣＲＩＳＰＲタンパク質は、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合活性がある、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型又はＶ型システムのタンパク質又はそれに由来するタンパク質をいう。一般に、Ｃａｓタンパク質は、本明細書においてＣａｓ ＲＮＡ結合ドメインという少なくとも１つのＲＮＡ結合ドメインを含む。Ｃａｓ ＲＮＡ結合ドメインは、Ｃａｓ会合領域でガイドＲＮＡと相互作用する。適当な－Ｃａｓタンパク質の非限定的な例としては、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ５ｅ（又はＣａｓＤ）、Ｃａｓ６、Ｃａｓ６ｅ、Ｃａｓ６ｆ、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８ａ１、Ｃａｓ８ａ２、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ８ｃ、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１０ｄ、Ｃａｓ１２ａ（又はＣｐｆ１）、Ｃａｓ１２ｂ（又はＣ２ｃ１）、Ｃａｓ１２ｃ、Ｃａｓ１２ｄ（又はＣａｓＹ）、Ｃａｓ１２ｅ（又はＣａｓＸ）、Ｃａｓ１２ｆ、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｇ１、Ｃａｓ１２ｈ、Ｃａｓ１２ｉ、Ｃａｓ１２ｊ、Ｃａｓ１２ｋ、ＣａｓＦ、ＣａｓＧ、Ｃａｓｈ、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１（又はＣＡＳＡ）、Ｃｓｅ２（又はＣａｓＢ）、Ｃｓｅ３（又はＣａＳｅ）、Ｃｓｅ４（又はＣａｓＣ）、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｚ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、及びＣｕ１９６６があげられる。例えば、Ｋｏｏｎｉｎ ａｎｄ Ｍａｋａｒｏｖａ，２０１９，ｏｒｉｇｉｎｓ ａｎｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｃｒｉｓｐｒ ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｒｅｖｉｅｗ Ｐｈｉｌｏｓ Ｔｒａｎｓ Ｒ Ｓｏｃ Ｌｏｎｄ Ｂ Ｂｉｏｌ Ｓｃｉ．２０１９ Ｍａｙ １３；３７４（１７７２）；Ｔｙｐｅ－Ｖとしては、Ｙａｎ ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３６３ ｐｇ ８８－９２，２０１９；かつ、Ｍｉｎｉａｔｕｒｅ Ｃａｓ１４としては、Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ ｅｔ ａｌ，２０１８，Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｖｏｌ３６２ ｐｇ８３９－８４２を参照されたく、これらの内容はその全体が参照により本明細書に援用される。
Ｃａｓタンパク質（並びに本発明に記載される他のタンパク質成分）は、組換えポリペプチドとして得ることができる。あるいは、タンパク質は、化学的に合成され得るか（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，“Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，”Ｗ．Ｈ． Ｆｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．，ＮＹ，１９８３を参照のこと）、又は本明細書に記載されるような組換えＤＮＡ技術によって産生され得る。さらなるガイダンスのために、当業者は、Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，２００３；及びＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，”Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，２００１）を参照し得る。
本発明に記載のＣａｓタンパク質は、精製若しくは単離された形態で提供されてよく、又は組成物の部分であってよい。好ましくは、組成物中の場合、タンパク質は、最初にある程度まで、より好ましくは高レベルの純度（例えば、約８０％、９０％、９５％、又は９９％以上）まで精製される。本発明による組成物は、所望されるいかなるタイプの組成物であり得るが、通常、ＲＮＡ誘導標的化のための組成物としての使用又はそれへの包含に適した水性組成物である。当業者は、このようなヌクレアーゼ反応組成物に含まれ得る様々な物質を十分に理解する。
本発明に記載されるＣａｓタンパク質は、ＲＮＡ－リガンド結合複合体（又はＲＮＡ足場）を介して塩基編集複合体に可逆的に動員される２つ以上のエフェクタータンパク質に加えて、直接融合されたエフェクタードメインも標的部位でその活性を実行することができるように、エフェクタータンパク質に直接融合することができる。
あるいは、本発明に記載されるＣａｓタンパク質は、Ｓｃｉｅｎｃｅ １６ Ｓｅｐ ２０１６：Ｖｏｌ．３５３，Ｉｓｓｕｅ ６３０５に記載されるように、ＲＮＡ－リガンド結合複合体（又はＲＮＡ足場）を介して塩基編集複合体に可逆的に動員される２つ以上のエフェクタータンパク質に加えて、リガンド結合エフェクタードメインも標的部位でその活性を実行することができるように、リガンドを介してエフェクタードメインに結合することができる。
本明細書中に開示される標的核酸を組換えるための方法を実施するために、ｍＲＮＡ、タンパク質ＲＮＡ複合体（ＲＮＰ）、又はいかなる適当な発現ベクターを介して、標的細胞においてタンパク質を産生し得る。発現ベクターの例には、染色体、非染色体及び合成ＤＮＡ配列、細菌プラスミド、小環状、ファージＤＮＡ、バキュロウイルス、酵母プラスミド、プラスミドとファージＤＮＡの組合せに由来するベクター、ワクシニア、アデノウイルス、ポックスウイルス及び仮性狂犬病等のウイルスＤＮＡが含まれる。さらなる詳細は、以下の発現システム及び方法の節に記載される。
ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムへの適用
ある実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムに由来する。例示的な実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質であるか、又はそれに由来する。Ｃａｓ９タンパク質は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ，Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ，Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．，Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ ｄａｓｓｏｎｖｉｌｌｅｉ，Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｒｉｓｔｉｎａｅｓｐｉｒａｌｉｓ，Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ，Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ，Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ，Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ，Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｓｅｕｄｏｍｙｃｏｉｄｅｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｅｌｅｎｉｔｉｒｅｄｕｃｅｎｓ，Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｉｂｉｒｉｃｕｍ，Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ，Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ，Ｍｉｃｒｏｓｃｉｌｌａ ｍａｒｉｎａ，Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｌｅｓ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ，Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｉｖｏｒａｎｓ，Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ ｓｐ．，Ｃｒｏｃｏｓｐｈａｅｒａ ｗａｔｓｏｎｉｉ，Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ ｓｐ．，Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ，Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．，Ａｃｅｔｏｈａｌｏｂｉｕｍ ａｒａｂａｔｉｃｕｍ，Ａｍｍｏｎｉｆｅｘ ｄｅｇｅｎｓｉｉ，Ｃａｌｄｉｃｅｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ ｂｅｃｓｃｉｉ，Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｄｅｓｕｌｆｏｒｕｄｉｓ，Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ，Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ，Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ ｍａｇｎａ，Ｎａｔｒａｎａｅｒｏｂｉｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ，Ｐｅｌｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ ｔｈｅ ｒｍｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ，Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｄｕｓ，Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ，Ａｌｌｏｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ ｖｉｎｏｓｕｍ，Ｍａｒｉｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．，Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ，Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ ｗａｔｓｏｎｉ，Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ ｈａｌｏｐｌａｎｋｔｉｓ，Ｋｔｅｄｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｒａｃｅｍｉｆｅｒ，Ｍｅｔｈａｎｏｈａｌｏｂｉｕｍ ｅｖｅｓｔｉｇａｔｕｍ，Ａｎａｂａｅｎａ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ，Ｎｏｄｕｌａｒｉａ ｓｐｕｍｉｇｅｎａ，Ｎｏｓｔｏｃ ｓｐ．，Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｍａｘｉｍａ，Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓ，Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｓｐ．，Ｌｙｎｇｂｙａ ｓｐ．，Ｍｉｃｒｏｃｏｌｅｕｓ ｃｈｔｈｏｎｏｐｌａｓｔｅｓ，Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ ｓｐ．，Ｐｅｔｒｏｔｏｇａ ｍｏｂｉｌｉｓ，Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ ａｆｒｉｃａｎｕｓ，又はＡｃａｒｙｏｃｈｌｏｒｉｓ ｍａｒｉｎａ由来でありうる。
ある実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、野生型Ｃａｓ９タンパク質又はその断片の変異体であり得る。他の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、変異体Ｃａｓ９タンパク質に由来し得る。例えば、Ｃａｓ９タンパク質のアミノ酸配列を組換えて、タンパク質の１つ以上の特性（例えば、ヌクレアーゼ活性、親和性、安定性等）を変化させることができる。あるいは、組換えＣａｓ９タンパク質が野生型Ｃａｓ９よりも小さくなるように、ＲＮＡ標的に関与しないＣａｓ９タンパク質のドメインをタンパク質から除去することができる。ある実施形態では、本システムは、細菌においてコードされるか、又は哺乳動物細胞における発現のためにコドン最適化されたいずれかピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９タンパク質を利用する。
変異体Ｃａｓ９タンパク質は、野生型タンパク質のポリペプチド誘導体、例えば、１つ以上の点変異、挿入、欠失、切断があるタンパク質、融合タンパク質、又はそれらの組み合わせをいう。変異体には、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合活性若しくはＲＮＡガイドヌクレアーゼ活性のうちの少なくとも１つ、又はその両方がある。一般に、組換え体は、以下の配列番号４４等の野生型Ｃａｓ９タンパク質と少なくとも５０％（例えば、５０％と１００％の間のいかなる数、例えば、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、及び９９％を含む）同一である。
本明細書に開示されるように、ヌクレアーゼデッドＣａｓ９（ｄＣａｓ９、例えば化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｄ１０Ａ、Ｈ８４０Ａ変異タンパク質由来、配列番号１７）、又はヌクレアーゼ欠損ニッカーゼＣａｓ９（ｎＣａｓ９、例えば化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｄ１０Ａ変異タンパク質由来、配列番号４６）を用いることができる。ｄＣａｓ９又はｎＣａｓ９はまた様々な細菌種に由来し得る。表１は、Ｃａｓ９の例の非消耗リスト及びそれらの対応するＰＡＭ要件を列挙する。Ｒａｕｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ＲＮＡ－Ｇｕｉｄｅｄ ＲＮＡ Ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｂｕｉｌｔ ｆｒｏｍ Ｈｕｍａｎ Ｐａｒｔｓ．Ｃｅｌｌ Ｖｏｌｕｍｅ １７８，Ｉｓｓｕｅ １，２７ Ｊｕｎｅ ２０１９，Ｐａｇｅｓ １２２－１３４．ｅ１２に記載されているもの等の合成Ｃａｓ置換体を用いることもできる。
表１ Ｃａｓ９タンパク質及びそれらの対応するＰＡＭ要件の例の非網羅的リスト
Figure 2024501757000001
 Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムへの適用
ある実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムに由来する（例えば、Ｗａｎｇ，Ｊ．，Ｚｈａｎｇ，Ｃ．，ａｎｄ Ｆｅｎｇ，Ｂ．（２０２０）．Ｔｈｅ ｒａｐｉｄｌｙ ａｄｖａｎｃｉｎｇ Ｃｌａｓｓ ２ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ：ａ ｃｕｓｔｏｍｉｚａｂｌｅ ｔｏｏｌｂｏｘ ｆｏｒ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎｓ．Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．２４，３２５６－３２７０．ｄｏｉ：１０．１１１１／ｊｃｍｍ．１５０３９；及びＭａｋａｒｏｖａ，Ｋ．Ｓ．，Ｗｏｌｆ，Ｙ．Ｉ．，Ｉｒａｎｚｏ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍｓ：ａ ｂｕｒｓｔ ｏｆ ｃｌａｓｓ ２ ａｎｄ ｄｅｒｉｖｅｄ ｖａｒｉａｎｔｓ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １８，６７－８３（２０２０）；及び、Ｔｏｎｇ，Ｂ．ｅｔ ａｌ．（２０２１）Ｔｈｅ ｖｅｒｓａｔｉｌｅ ｔｙｐｅ Ｖ ＣＲＩＳＰＲ ｅｆｆｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ．Ｆｒｏｎｔ．Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．８，１８３５．ｄｏｉ：１０．３３８９／ｆｃｅｌｌ．２０２０．６２２１０３）。Ｃａｓ１２タンパク質は、フランシセラ属（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）（ノビシダ（ｎｏｖｉｃｉｄａ）Ｆｘ１、デルタプロテオバクテリア菌、アリサイクロバチルス属（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）ａｃｉｄｏｔｅｒｒｅｓｔｒｉ、プランクトミセス属（Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓ）菌、Ｏｌｅｉｐｈｉｌｕｓ種、バクテリアＣＧ０９＿３９＿２４、未培養古細菌、バチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）、シアノテッス種、ロチア・デントカリオサ（Ｒｏｔｈｉａ ｄｅｎｔｏｃａｉｏｓａ）、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｍｉｃｒａｒｃｈａｅｏｔａ古細菌、ゴルドニア・オテリティディス（Ｇｏｒｄｏｎｉａ ｏｔｉｔｉｄｉｓ）、淡水メタゲノム、高塩水湖沈殿物メタゲノム、又は温泉メタゲノムに由来し得る。Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ１２ａ（又はＣｐｆ１）、Ｃａｓ１２ｂ（又はＣ２ｃ１）、Ｃａｓ１２ｃ、Ｃａｓ１２ｄ（又はＣａｓＹ）、Ｃａｓ１２ｅ（又はＣａｓＸ）、Ｃａｓ１２ｆ、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｇ１、Ｃａｓ１２ｈ、Ｃａｓ１２ｉ、Ｃａｓ１２ｊ、又はＣａｓ１２ｋであり得る。
ある実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、野生型Ｃａｓ１２タンパク質（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．由来のＣａｓ１２ａ等）又はその断片の変異体であり得る。他の実施形態では、Ｃａｓ１２タンパク質は、変異体Ｃａｓ１２タンパク質に由来し得る。例えば、Ｃａｓ１２タンパク質のアミノ酸配列を組換えて、タンパク質の１つ以上の特性（例えば、ヌクレアーゼ活性、親和性、安定性等）を変化させることができる。あるいは、組換えＣａｓ１２タンパク質が野生型Ｃａｓ１２タンパク質よりも小さくなるように、ＲＮＡ標的に関与しないＣａｓ１２タンパク質のドメインをタンパク質から除去することができる。ある実施形態では、本システムは、ラクノスピラ科細菌ＮＤ２００６由来のＣａｓ１２ａタンパク質、Ｃａｎｄｉｄａｔｅ Ｐｈｙｌａ Ｒａｄｉａｔｉｏｎ群の細菌由来のＣａｓ１２ｄ、又はＡ．アシドテレストリス（ａｃｉｄｏｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）、細菌においてコードされるか、又は哺乳動物細胞における発現のためにコドン最適化されるかのいずれかである。
変異体Ｃａｓ１２タンパク質は、野生型タンパク質のポリペプチド誘導体、例えば、１つ以上の点変異、挿入、欠失、切断があるタンパク質、融合タンパク質、又はそれらの組み合わせをいう。変異体には、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合活性若しくはＲＮＡガイドヌクレアーゼ活性のうちの少なくとも１つ、又はその両方がある。一般に、組換え型は、以下のＡｓＣａｓ１２ａ（配列番号４８）、ＡａＣａｓ１２ｂ（配列番号４９）又はＣａｓ１２ｄ１５（配列番号５０）等の野生型Ｃａｓ１２と少なくとも５０％（例えば、５０％～１００％の間のいかなる数、例えば、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、及び９９％を含む）同一である。
本明細書に開示される、ヌクレアーゼデッドＡｓＣａｓ１２ａ（例えば、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．Ｄ９０８Ａ変異体タンパク由来のｄＡｓＣａｓ１２ａ）を用いることができ、ｄＣａｓ１２又はｎＣａｓ１２はまた、様々な細菌種に由来し得る。表２は、Ｃａｓ１２タンパク質の例の非消耗リスト、及びそれらの対応するＰＡＭ要件を列挙する。
ｄＣａｓ１２ａ（配列番号５４）、ｄＣａｓ１２ｂ（配列番号５５）及びｄＣａｓ１２ｄ（配列番号５６）のヒト化ヌクレオチド配列並びにｄＡｓＣａｓ１２ａ（配列番号５７）、ｄＡａＣａｓ１２ｂ（配列番号５８）及びｄＣａｓ１２ｄ１５（配列番号５９）のアミノ酸の配列が提供される。
表２
Figure 2024501757000002
 ＰＳ＝プロトスペーサー；Ｎ＝いかなる塩基；Ｒ＝Ａ／Ｇ；Ｖ＝Ａ／Ｃ／Ｇ。
ＵＧＩ
本開示のある実施形態では、上記の配列標的化成分は、（ａ）配列標的化タンパク質と、（ｂ）第一のウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＮＧ）阻害剤ペプチド（ＵＧＩ）との間の融合体を含む。例えば、融合タンパク質は、ＵＧＩに融合されたＣａｓタンパク質、例えばＩＩ型又はＶ型Ｃａｓタンパク質を含むことができる。そのような融合タンパク質は、ＵＧＩドメインを含まない融合タンパク質と比較して、核酸編集効率が高まり得る。ある実施形態では、ＵＧＩには、バチルスファージＰＢＳ２由来の野生型ＵＧＩ配列又は以下のアミノ酸配列（配列番号６０）があるものが含まれる。
ある実施形態では、本明細書において提供されるＵＧＩタンパク質は、ＵＧＩの断片又は変異体、及びＵＧＩ又はＵＧＩ断片に相同なタンパク質を含む。例えば、ある実施形態では、ＵＧＩは、配列番号６０の断片に相同なアミノ酸配列を含む。ある実施形態では、ＵＧＩは、（配列番号６０）に相同なアミノ酸配列、又は（配列番号６０）の断片に相同なアミノ酸配列を含む。ある実施形態では、ＵＧＩ若しくはＵＧＩの断片又はＵＧＩ若しくはＵＧＩ断片のホモログを含むタンパク質は、「ＵＧＩ変異体」という。ＵＧＩ変異体は、ＵＧＩ又はその断片と相同性を共有する。例えば、ＵＧＩ変異体は、野生型ＵＧＩ又はＵＧＩ配列（配列番号６０）に対して少なくとも約７０％（例えば、少なくとも約８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）が同一である。
ある実施形態では、活性又は不活性化Ｃａｓタンパク質は、２つ以上のＵＧＩペプチド又は変異体との融合体を含む。ＵＧＩペプチド又はＵＧＩペプチドの変異体は、他のＵＧＩペプチド若しくはＣａｓタンパク質に直接、又は１～１００アミノ酸残基のリンカーを介して他のＵＧＩペプチド若しくはＣａｓタンパク質に結合することができる。
適当なＵＧＩタンパク質及びヌクレオチド配列は本明細書に提供され、さらなる適当なＵＧＩ配列は当業者に公知であり、例えば、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｕｒａｃｉｌ－ＤＮＡ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｇｅｎｅ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ ＰＢＳ２ ｅｎｃｏｄｅｓ ａ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｆｏｒ ｕｒａｃｉｌ－ＤＮＡ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ．Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１１６３－１１７１（１９８９）；Ｌｕｎｄｑｕｉｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｉｔｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｕｒａｃｉｌ－ＤＮＡ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｒｏｌｅ ｏｆ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｕｒａｃｉｌ－ＤＮＡ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ．Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２１４０８－２１４１９（１９９７）；Ｒａｖｉｓｈａｎｋａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｘ－ｒａｙ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａ ｃｏｍｐｌｅｘ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｕｒａｃｉｌ ＤＮＡ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ（ＥｃＵＤＧ） ｗｉｔｈ ａ ｐｒｏｔｅｉｎａｃｅｏｕｓ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ．Ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｅｌｕｃｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ＵＤＧ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２６：４８８０－４８８７（１９９８）；及びＰｕｔｎａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｉｍｉｃｒｙ ｏｆ ＤＮＡ ｆｒｏｍ ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｕｒａｃｉｌ－ＤＮＡ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｉｔｓ ｃｏｍｐｌｅｘ ｗｉｔｈ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｕｒａｃｉｌ－ＤＮＡ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ．Ｊ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８７：３３１－３４６（１９９９）を参照されたく、これらの内容はその全体が参照により本明細書に援用される。
ｉｉ）ＲＮＡ－リガンド結合複合体
本明細書に開示されるプラットフォームの第二の成分は、ＲＮＡ－リガンド結合複合体であり、これは、配列認識及びエフェクター動員に必須の機能を果たす。ＲＮＡ－リガンド結合複合体は、２つのサブコンポーネント：（ａ）ガイドＲＮＡ及び（ｂ）リガンド結合部分を含む。好ましい実施形態では、リガンド結合部分はＲＮＡモチーフである。
ＲＮＡ鎖内のヌクレオチドは、完全にリボヌクレオチドであってよく、又はリボヌクレオチドとデオキシリボヌクレオチド等の他のヌクレオチドとの組合せであってよい。各ヌクレオチドは、修飾されていなくてもよく、又は全てのヌクレオチドが、例えば、以下の修飾：２’－０－メチル、２’フルオロ又は２’アミノプリンのうちの１つ以上で修飾されていてもよい場合には、１つ以上のヌクレオチドであってよい。ある実施形態では、１～４０個若しくは２～２０個又は２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３５若しくは３６個のヌクレオチドの１又は複数の範囲にわたり、連続的に修飾されたヌクレオチドが存在するか、又は１つおき若しくは２つおき若しくは４つおきのヌクレオチドの修飾パターンがその２’位で修飾され、他のすべてのヌクレオチドが未修飾である。さらに、又はあるいは、連続するヌクレオチドの１つ以上の対又はすべての対の間に、修飾又は非修飾ヌクレオチド間結合が存在し得る。
｛ａ｝プログラム可能なガイドＲＮＡ
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、簡便かつ効率がよいため、様々な生物の細胞においてゲノム編集を行うために用いられてきた。このシステムの特異性は、標的ＤＮＡとカスタム設計されたガイドＲＮＡとの間の塩基対合によって決定される。ガイドＲＮＡの塩基対形成特性を操作及び調整することによって、目的のいかなる配列を標的化することができる。いくつかのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムについて、目的の標的配列は、以下に詳述されるように、塩基編集複合体によって首尾よく標的化されるＰＡＭ配列を含まなければならない。
ガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ及び／又はｓｃｏｕｔＲＮＡのいずれか１つ以上を含み得る。
ＩＩ型Ｃａｓタンパク質が利用される実施形態では、ガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡを含み得る。Ｖ型Ｃａｓが利用される実施形態では、ガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ、又はｃｒＲＮＡ及びｓｃｏｕｔＲＮＡを含み得る。
ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム：ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡガイド
ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡを含むガイドＲＮＡ（ＩＩ型ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡガイド）を利用する。ｃｒＲＮＡは、標的核酸に相補的な配列を含む。ガイドＲＮＡは、少なくとも３つのヌクレオチドの範囲にわたってｃｒＲＮＡと少なくともハイブリダイズすることができ、その領域にわたってハイブリダイズした場合、ＩＩ型Ｃａｓタンパク質との会合を保持することができるｔｒａｃｒＲＮＡをさらに含んでもよい。ガイドＲＮＡは、単一のＲＮＡ分子又は複数のＲＮＡ分子の複合体のいずれかであり得る。
したがって、配列標的化成分がＩＩ型Ｃａｓタンパク質を含む実施形態では、ＲＮＡ－リガンド結合複合体がＩＩ型ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡガイドを含むことが好ましい。
本明細書に開示されるＲＮＡ－リガンド結合複合体（又はＲＮＡ足場）のサブコンポーネントの中で、ｃｒＲＮＡは、標的特異性を提供する。ｃｒＲＮＡは、予め選択された目的の標的部位に相補的であり、ハイブリダイゼーションすることができるプログラム可能なスペーサーを含む。様々な実施形態では、このスペーサーは、約１０ヌクレオチド～約２５ヌクレオチド超を含むことができる。例えば、スペーサーと対応する標的部位配列との間の塩基対合の領域のヌクレオチド長は、約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２２、２３、２４、２５、又は２５を超えてよい。例示的な実施形態では、スペーサーは、約１７～２０ヌクレオチド長、例えば２０ヌクレオチドである。スペーサーは可変であり、Ｃａｓタンパク質及び／又はエフェクターが塩基編集を誘発する目的の標的配列に基づいて選択されてもよい。スペーサーはｔｒａｃｒＲＮＡとハイブリダイズせず、Ｃａｓ会合領域の下流にあってよい。
ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムに適した標的核酸を選択するための１つの要件は、ＰＡＭ部位／配列があることである。各標的配列及びその対応するＰＡＭ部位／配列は、本明細書ではＣａｓ標的部位という。ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓであるＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムには、標的切断に影響を及ぼすために、Ｃａｓ９タンパク質及び標的配列に相補的なガイドＲＮＡのみが必要である。Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓのＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、Ｎ１２－２０ＮＧＧがある標的部位を用いるが、ここで、ＮＧＧは、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＰＡＭ部位を表し、Ｎ１２－２０は、ＰＡＭ部位に対して直接５’側の１２～２０ヌクレオチドを表す。他の種の細菌由来のさらなるＰＡＭ部位配列としては、ＮＧＧＮＧ、ＮＮＮＮＧＡＴＴ、ＮＡＧＡＡＡ、ＮＡＧＡＡＡＷ、及びＮＡＡＡＡＣがあげられる。例えば、米国特許出願第２０１４０２７３２３３号、国際公開２０１３１７６７７２号パンフレット、Ｃｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，（２０１２），Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９（６１２１）：８１９－８２３，Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，（２０１２），Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７（６０９６）：８１６－８２１，Ｍａｌｉ ｅｔ ａｌ，（２０１３），Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９（６１２１）：８２３－８２６，Ｇａｓｉｕｎａｓ ｅｔ ａｌ．，（２０１２），Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１０９（３９）：Ｅ２５７９－Ｅ２５８６，Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ．，（２０１３）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３１，２３０－２３２，Ｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２０１３ Ｓｅｐ ２４；１１０（３９）：１５６４４－９，Ｍｏｊｉｃａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．２００９ Ｍａｒ；１５５（Ｐｔ３）：７３３－４０，及びｗｗｗ．ａｄｄｇｅｎｅ．ｏｒｇ／ＣＲＩＳＰＲ／らの文献の内容は、その全体が参照により本明細書に援用される。ＰＡＭ部位／配列はまた、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲシステムに適した標的核酸を選択するための要件である。
標的核酸鎖は、宿主細胞中のゲノムＤＮＡ上の２つの鎖のいずれかであり得る。このようなゲノムｄｓＤＮＡの例としては、宿主細胞染色体、ミトコンドリアＤＮＡ及び安定に維持されるプラスミドがあげられるが、必ずしもこれらに限定されない。しかしながら、本発明の方法は、宿主細胞ｄｓＤＮＡの性質にかかわらずＣａｓ標的部位が存在する限り、宿主細胞中に存在する他のｄｓＤＮＡ（例えば、不安定なプラスミドＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、及びファージミドＤＮＡ）に対して実施され得ることが理解されるべきである。本方法は、ＲＮＡに対しても実施することができる。
スペーサーに加えて、ｃｒＲＮＡは反復領域も含む。反復領域は、以下に記載されるｔｒａｃｒＲＮＡのアンチ反復領域とハイブリダイズして、反復：アンチ反復二本鎖を形成する。様々な実施形態では、反復領域は、約１０ヌクレオチド～約２５ヌクレオチド超を含み得る。例えば、反復領域のヌクレオチドの長さは、約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２２、２３、２４、２５、又は２５を超えてよい。例示的な実施形態では、反復領域のヌクレオチドの長さは、約２１～２５ヌクレオチド長、例えば２３ヌクレオチドである。
反復：アンチ反復二本鎖は、Ｃａｓ会合領域として作用し、会合することが意図されるＣａｓタンパク質のＣａｓ ＲＮＡ結合ドメイン上に設計される。Ｃａｓ会合領域内のヌクレオチドの全てがＣａｓタンパク質と直接会合しなくてよい。反復：アンチ反復二本鎖内の全てのヌクレオチドがハイブリダイズするわけではない。反復：アンチ反復二本鎖は、下部ステム、バルジ及び上部ステムを含む。バルジは、Ｃａｓタンパク質との相互作用に必須である。非限定的な例では、化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９と相互作用することができるガイドＲＮＡの反復：アンチ反復二本鎖は、約６ヌクレオチド長の下部ステム、約６ヌクレオチド長のバルジ、及び１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１０を超えるヌクレオチド長の上部ステムを含み得る。場合によっては、上部ステムは、反復：抗反復二本鎖に存在しなくてもよい。
ｃｒＲＮＡに加えて、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓシステムのガイドＲＮＡは、トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）をさらに含む。ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、約４０ヌクレオチド～約１００ヌクレオチド超を含んでもよい。例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡのヌクレオチドの長さは、約４０、５０、６０、７０、８０、９０又は１００を超えてよい。例示的な実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡのヌクレオチドの長さは、８９ヌクレオチド等、約８８～９０ヌクレオチド長である。ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、アンチ反復領域、ネクサス、ステムループ２及びステムループ３を含む。ｔｒａｃｒＲＮＡは、ｃｒＲＮＡとハイブリダイズしない遠位領域をさらに含み、それは抗反復領域の上流にあってよい。アンチ反復領域は、少なくとも７個の連続するヌクレオチドにわたってｃｒＲＮＡ反復領域に少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％相補的である。したがって、上記のプログラム可能なｃｒＲＮＡの反復領域及びｔｒａｃｒＲＮＡのアンチ反復領域は、ハイブリダイズしてハイブリダイゼーション領域を形成することができ、本明細書において反復：アンチ反復二本鎖という。
ある実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡは化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来である。
ある実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡ活性及びｃｒＲＮＡ活性は、シングルガイドＲＮＡ（又はｓｇＲＮＡ）として知られるヌクレオチドの単一の連続鎖の部分である。ある実施形態では、ｃｒＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡのすぐ上流にあってよく、又はｔｒａｃｒＲＮＡとｃｒＲＮＡとの間に介在配列若しくはその部分を伴ってｔｒａｃｒＲＮＡの上流にあってよい。本明細書では、ｔｒａｃｒＲＮＡ及びｃｒＲＮＡがヌクレオチドの連続鎖（ｓｇＲＮＡ）の部分である場合はテトラループという、例えば３～６ヌクレオチドのｔｒａｃｒＲＮＡとｃｒＲＮＡとの間のループ領域が存在してもよい。例えば、国際公開２０１４／０９９７５０号パンフレット、米国特許出願第２０１４／０１７９００６号、及び米国特許出願第２０１４／０２７３２２６号を参照されたい。これらの文献の内容は、その全体が参照により本明細書に援用される。ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡガイドＲＮＡ及びｓｇＲＮＡを生成するための方法は、当業界で周知である。
ある実施形態では、ガイドＲＮＡを含むｔｒａｃｒＲＮＡ活性及びｃｒＲＮＡは、機能的ガイドＲＮＡ及びＲＮＡ－リガンド結合複合体（又はＲＮＡ足場）の部分をともに形成する２つの別個のＲＮＡ分子中にある。この場合、ｔｒａｃｒＲＮＡ活性がある分子は、ｃｒＲＮＡ活性がある分子と（通常は塩基対合によって）相互作用して、２部分ガイドｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡを形成することができるはずである。
例示的なハイブリッドＩＩ型ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡガイドＲＮＡ配列（配列番号６１；Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ．２０１３ Ｄｅｃ １９；１５５（７）：１４７９－９１）を以下に示す：
Figure 2024501757000003
 様々なｔｒａｃｒＲＮＡ及びｃｒＲＮＡ配列が当業界で公知であり、本発明に関連して用いられ得るｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡの非限定的な例が以下に提供される（配列番号１、配列番号２）。本明細書で用いられる場合、ｔｒａｃｒＲＮＡの活性部分は、Ｃａｓ９又はｄＣａｓ９又はｎＣａｓ９等のＣａｓタンパク質と複合体を形成する機能を保持する。例えば、国際公開２０１４／１４４５９２パンフレットを参照のこと。
Figure 2024501757000004
 したがって、本発明の配列標的化成分がＩＩ型Ｃａｓタンパク質を含む実施形態では、好ましくは、ＲＮＡ－リガンド結合複合体がＩＩ型ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡガイドＲＮＡを含む。
Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムへの適用
Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、ｃｒＲＮＡ（Ｖ型ｃｒＲＮＡのみのガイド）、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ（Ｖ型ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡガイド）、又はｃｒＲＮＡ及びｓｃｏｕｔＲＮＡ（Ｖ型ｃｒＲＮＡ：ｓｃｏｕｔＲＮＡガイド）を含むガイドＲＮＡを利用し得る。ガイドＲＮＡは、単一のＲＮＡ分子又は複数のＲＮＡ分子の複合体のいずれかであり得る。
したがって、本発明の配列標的化成分がＶ型Ｃａｓタンパクを含む実施形態では、好ましくは、ＲＮＡ－リガンド結合複合体、ｃｒＲＮＡガイドＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡガイドＲＮＡ又はｃｒＲＮＡ：ｓｃｏｕｔＲＮＡガイドＲＮＡを含む。
Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム：ｃｒＲＮＡのみのガイド
配列標的化成分がＡｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＢＶ３Ｌ６由来のＣａｓ１２ａ（ＡｓＣａｓ１２ａ）等のＣａｓタンパク質であるＶ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、ｃｒＲＮＡ分子のみを含むガイドＲＮＡ（Ｖ型ｃｒＲＮＡのみのガイド）が必要である。
ｃｒＲＮＡは、標的化特異性を提供し、目的の予め選択された標的部位に相補的であり、かつ、それにハイブリダイゼーションすることができるヌクレオチド配列があるスペーサーを含む。様々な実施形態では、スペーサーは、約１０ヌクレオチド～約２５ヌクレオチド超を含み得る。例えば、スペーサーと対応する標的部位配列との間の塩基対合の領域のヌクレオチド長は、約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２２、２３、２４、２５、又は２５を超えてよい。例示的な実施形態では、標的化配列は、約１８～２５ヌクレオチド長、例えば、２４ヌクレオチドである。スペーサーは可変であり、Ｃａｓタンパク質及び／又はエフェクターが塩基を編集することが望まれる場所に基づいて選択され得る。
いくつかのＶ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム（表２に詳述される）に適した標的核酸を選択するための１つの要件は、ＰＡＭ部位／配列があることである。いくつかのＶ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム、例えばＣａｓ１２ｇ１は、標的認識にＰＡＭ部位／配列が必要ない。各標的配列及び（必要であれば）その対応するＰＡＭ部位／配列は、本明細書においてＣａｓ標的化部位という。
標的核酸鎖は、宿主細胞中のゲノムＤＮＡ上の２つの鎖のいずれかであり得る。このようなゲノムｄｓＤＮＡの例としては、宿主細胞染色体、ミトコンドリアＤＮＡ及び安定に維持されるプラスミドがあげられるが、必ずしもこれらに限定されない。しかしながら、本発明の方法は、宿主細胞ｄｓＤＮＡの性質にかかわらずＣａｓ標的部位が存在する限り、宿主細胞中に存在する他のｄｓＤＮＡ（例えば、不安定なプラスミドＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、及びファージミドＤＮＡ）に対して実施され得ることが理解されるべきである。本方法は、ＲＮＡに対しても実施することができる
スペーサーに加えて、Ｖ型ｃｒＲＮＡのみのガイドにおけるｃｒＲＮＡは、シュードノット型ヘアピン二次構造を形成するダイレクト反復を含む。二次構造は、Ｃａｓ酵素との重要な接触を形成する。
以下に示すのは、Ｖ型ｃｒＲＮＡのみのガイドの非限定的な例である。
Figure 2024501757000005
 したがって、配列標的化成分がＡｓＣａｓ１２ａ等のＶ型Ｃａｓタンパク質を含む実施形態では、ＲＮＡ－リガンド結合複合体がＶ型ｃｒＲＮＡのみのガイドＲＮＡを含むことが好ましい。
Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム：ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡガイド
Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム（配列標的化成分がＡｌｉｃｙｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ（ＡａＣａｓ１２ｂ）由来のＣａｓ１２ｂ等のＣａｓタンパク質である）は、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡを含むガイドＲＮＡ（Ｖ型ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡガイド）が必要である。
ｃｒＲＮＡは、標的化特異性を提供し、予め選択された目的の標的部位に相補的であり、それにハイブリダイゼーションすることができるヌクレオチド配列があるプログラム可能なスペーサーを含む。様々な実施形態では、このスペーサーは、約１０ヌクレオチド～約２５ヌクレオチド超を含むことができる。例えば、スペーサーと対応する標的部位配列との間の塩基対合の領域のヌクレオチド長は、約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２２、２３、２４、２５、又は２５を超えてよい。例示的な実施形態では、スペーサーは、約１９～２２ヌクレオチド長、例えば２０ヌクレオチドである。スペーサーは可変であり、Ｃａｓタンパク質及び／又はエフェクターが塩基編集を誘発する目的の標的配列に基づいて選択されてよい。スペーサーは、ｔｒａｃｒＲＮＡとハイブリダイズしない。
いくつかのＶ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム（表２に詳述される）に適した標的核酸を選択するための１つの要件は、ＰＡＭ部位／配列があることである。いくつかのＶ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム、例えばＣａｓ１２ｇ１は、標的認識にＰＡＭ部位／配列が必要ない。各標的配列及び（必要であれば）その対応するＰＡＭ部位／配列は、本明細書においてＣａｓ標的化部位という。
標的核酸鎖は、宿主細胞中のゲノムＤＮＡ上の２つの鎖のいずれかであり得る。このようなゲノムｄｓＤＮＡの例としては、宿主細胞染色体、ミトコンドリアＤＮＡ及び安定に維持されるプラスミドがあげられるが、必ずしもこれらに限定されない。しかしながら、本発明の方法は、宿主細胞ｄｓＤＮＡの性質にかかわらずＣａｓ標的部位が存在する限り、宿主細胞中に存在する他のｄｓＤＮＡ（例えば、不安定なプラスミドＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、及びファージミドＤＮＡ）に対して実施され得ることが理解されるべきである。本方法は、ＲＮＡに対しても実施することができる。
スペーサーに加えて、ｃｒＲＮＡは反復領域も含む。反復領域は、以下に記載されるｔｒａｃｒＲＮＡのアンチ反復領域とハイブリダイズして、反復：アンチ反復二本鎖を形成する。様々な実施形態では、反復領域は、約２０ヌクレオチド～約３５ヌクレオチド超を含み得る。例示的な実施形態では、反復領域は、長さが約２８～３３ヌクレオチド、例えば３１ヌクレオチドである。
上記のｃｒＲＮＡに加えて、Ｖ型ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡガイドは、トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含む。ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、約４０ヌクレオチド～約１００ヌクレオチド超を含んでもよい。例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡのヌクレオチド長は、約４０、５０、６０、７０、８０、９０又は１００を超えてよい。例示的な実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡは、約９８～１００ヌクレオチド長、例えば１００ヌクレオチドである。ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、抗反復領域及びステムループを含む。様々なｔｒａｃｒＲＮＡ配列が当業界で公知である。本明細書で用いられる、ｔｒａｃｒＲＮＡの活性部分は、Ｃａｓ１２ｂ又はｄＣａｓ１２ｂ又はｎＣａｓ１２ｂ等のＶ型Ｃａｓタンパク質と複合体を形成する機能を保持する。
ある実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡはＡ．ａｃｉｄｏｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ由来である。
ある実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡ活性及びｃｒＲＮＡ活性は、シングルガイドＲＮＡ（又はｓｇＲＮＡ）として知られるヌクレオチドの単一の連続鎖の部分である。ある実施形態では、ｃｒＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡのすぐ下流にあってよく、又はｔｒａｃｒＲＮＡとｃｒＲＮＡとの間に介在配列若しくは部分を伴ってｔｒａｃｒＲＮＡの下流にあってよい。本明細書では、ｔｒａｃｒＲＮＡ及びｃｒＲＮＡがヌクレオチドの連続鎖（ｓｇＲＮＡ）の部分である場合はテトラループという、例えば３～６ヌクレオチドのｔｒａｃｒＲＮＡとｃｒＲＮＡとの間のループ領域が存在してもよい。Ｖ型ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡガイドＲＮＡ及びｓｇＲＮＡを生成するための方法は、当業界で公知である。非限定的な例示的Ｖ型ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ ｓｇＲＮＡを以下に示す（配列番号４）。
Figure 2024501757000006
 ある実施形態では、ガイドＲＮＡを含むｔｒａｃｒＲＮＡ活性及びｃｒＲＮＡは、機能的ガイドＲＮＡ及びＲＮＡ－リガンド結合複合体（又はＲＮＡ足場）の部分をともに形成する２つの別個のＲＮＡ分子である。この場合、ｔｒａｃｒＲＮＡ活性がある分子は、ｃｒＲＮＡ活性がある分子と（通常は塩基対合によって）相互作用して、２パートＶ型ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡガイドを形成することができるはずである。
したがって、配列標的化成分がＡｌｉｃｙｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ（ＡａＣａｓ１２ｂ）由来のＣａｓ１２ｂ等のＶ型Ｃａｓを含む実施形態では、ＲＮＡ－リガンド結合複合体がＶ型ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡガイドを含むことが好ましい。
Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム：ｃｒＲＮＡ：ｓｃｏｕｔＲＮＡガイド
配列標的化成分がＣａｓ１２ｄ１５等のＣａｓタンパク質であるＶ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、ｃｒＲＮＡ及びｓｃｏｕｔＲＮＡを含むガイドＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ：ｓｃｏｕｔＲＮＡガイドＲＮＡ）が必要である。
ｃｒＲＮＡは、標的化特異性を提供し、予め選択された目的の標的部位に相補的であり、それにハイブリダイゼーションすることができるヌクレオチド配列があるプログラム可能なスペーサーを含む。様々な実施形態では、このスペーサーは、約１０ヌクレオチド～約２５ヌクレオチド超を含むことができる。例えば、スペーサーと対応する標的部位配列との間の塩基対合の領域のヌクレオチド長は、約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２２、２３、２４、２５、又は２５を超えてよい。例示的な実施形態では、スペーサーは、約１９～２２ヌクレオチド長、例えば２０ヌクレオチドである。スペーサーは可変であり、Ｃａｓタンパク質及び／又はエフェクターが塩基編集を誘発する目的の標的配列に基づいて選択されてよい。スペーサーは、ｔｒａｃｒＲＮＡとハイブリダイズしない。
いくつかのＶ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム（表２に詳述される）に適した標的核酸を選択するための１つの要件は、ＰＡＭ部位／配列があることである。いくつかのＶ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム、例えばＣａｓ１２ｇ１は、標的認識にＰＡＭ部位／配列が必要ない。各標的配列及び（必要であれば）その対応するＰＡＭ部位／配列は、本明細書においてＣａｓ標的化部位という。
標的核酸鎖は、宿主細胞中のゲノムＤＮＡ上の２つの鎖のいずれかであり得る。このようなゲノムｄｓＤＮＡの例としては、宿主細胞染色体、ミトコンドリアＤＮＡ及び安定に維持されるプラスミドがあげられるが、必ずしもこれらに限定されない。しかしながら、本発明の方法は、宿主細胞ｄｓＤＮＡの性質にかかわらずＣａｓ標的部位が存在する限り、宿主細胞中に存在する他のｄｓＤＮＡ（例えば、不安定なプラスミドＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、及びファージミドＤＮＡ）に対して実施され得ることが理解されるべきである。本方法は、ＲＮＡに対しても実施することができる。

スペーサーに加えて、ｃｒＲＮＡは、５’ダイレクト反復領域も含む。この領域は、以下に記載されるｓｃｏｕｔＲＮＡの相補的配列にハイブリダイズする保存された５’ｎｔ配列を含む。様々な実施形態では、反復領域は、約２０ヌクレオチド～約３５ヌクレオチド超を含み得る。例示的な実施形態では、反復領域は、長さが約２８～３３ヌクレオチド、例えば３１ヌクレオチドである。
上記のｃｒＲＮＡに加えて、本発明のＶ型ｃｒＲＮＡ：ｓｃｏｕｔＲＮＡガイドは、短鎖相補的非翻訳ＲＮＡ（ｓｃｏｕｔＲＮＡ）を含む。ｃｒＲＮＡとＳｃｏｕｔＲＮＡは、特定のＶ型ＣＲＩＳＰＲシステムの活性、例えばＣａｓ １２ ｄ触媒活性に必要である。ｓｃｏｕｔＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９及びいくつかのＣａｓ１２酵素によって用いられる先行するｔｒａｃｒＲＮＡとは二次構造が異なり、Ｃａｓ１２ ｄ含有システムでは、ｓｃｏｕｔＲＮＡは、ｃｒＲＮＡへのハイブリダイゼーション及びその後の酵素活性に必須である保存された５ヌクレオチド配列を含む。ｃｒＲＮＡ指向性ＤＮＡ認識を支持することに加えて、生化学及びセルベースの実験は、Ｃａｓ １２ ｃ触媒プレｃｒＲＮＡ成熟のための必須補因子としてｓｃｏｕｔＲＮＡを確立する。
ｓｃｏｕｔＲＮＡは、４０～１００ヌクレオチド長であり得る。ｓｃｏｕｔＲＮＡ配列は、ｃｒＲＮＡ相補的領域、ｃｒＲＮＡ相補的領域の上流にある上流領域、及びｃｒＲＮＡ相補的領域の下流にある下流領域を含む。好ましくは、ｃｒＲＮＡ相補的領域は５ヌクレオチド長である。ｃｒＲＮＡ相補的領域は、ｓｃｏｕｔＲＮＡの５’末端に若しくはその近くに、又はｓｃｏｕｔＲＮＡの３’末端に若しくはその近くに、又はｓｃｏｕｔＲＮＡの５’若しくは３’末端のいずれでもないｓｃｏｕｔＲＮＡ内の連続したヌクレオチド間に位置し得る。
いくつかの天然ｓｃｏｕｔＲＮＡｓでは、自己相補的領域は、１つ又は複数の自己ハイブリダイゼーション領域、ループ、及びバルジ、並びに場合によっては、５’ｓｓＲＮＡオーバーハングが可能であり、かつ／又はオーバーハングができない。ある実施形態では、天然に存在するｓｃｏｕｔＲＮＡｓのいかなるバルジ（単数又は複数）は、リガンド結合部分が結合される場合であっても保存される。
ある実施形態では、抗反復領域は、少なくとも５個の連続したヌクレオチドにわたって、Ｃａｓ関連領域に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％相補的である。したがって、上記のプログラム可能なｃｒＲＮＡのＣａｓ会合領域及びｓｃｏｕｔＲＮＡの抗反復領域は、ハイブリダイズしてハイブリダイゼーション領域を形成することができる。ｓｃｏｕｔＲＮＡが自己ハイブリダイズして１つ以上のヘアピン領域を形成する場合、ある実施形態では、そのアンチ反復領域はバルジを形成し得る。
ｓｃｏｕｔＲＮＡの抗反復領域及びｃｒＲＮＡのＣａｓ会合領域がハイブリダイズしてハイブリダイゼーション領域を形成する場合、ｓｃｏｕｔＲＮＡ及びｃｒＲＮＡの両方を含有するＲＮＡは、Ｖ型ＣａｓタンパクのＣａｓ ＲＮＡ結合ドメインとの会合を保持することができる。
ある実施形態では、ｓｃｏｕｔＲＮＡ活性及びｃｒＲＮＡ活性は、ヌクレオチドの単一の連続鎖の部分である。ある実施形態では、ｃｒＲＮＡは、ｓｃｏｕｔＲＮＡのすぐ下流にあってよく、又はｓｃｏｕｔＲＮＡとｃｒＲＮＡとの間に介在配列若しくは部分があるｓｃｏｕｔＲＮＡの下流にあってよい。介在配列又は部分は、リガンド結合部分、又はヌクレオチド若しくは非ヌクレオチドループ領域、又は１８Ｓ、９Ｓ若しくはＣ３等のエチレングリコールスペーサーでてもよい。５’から３’方向に、ｃｒＲＮＡ：ｓｃｏｕｔＲＮＡガイドＲＮＡは、ｓｃｏｕｔＲＮＡの第一の領域、スカウトＲＮＡの抗反復領域、ｓｃｏｕｔＲＮＡの第二の領域、ｓｃｏｕｔＲＮＡ間のループ、Ｃａｓ関連領域及び標的化領域を含むか、本質的にそれらからなるか、又はそれらからなり得る。
ある実施形態では、ｓｃｏｕｔＲＮＡ活性及びガイドＲＮＡを含むｃｒＲＮＡは、機能的ガイドＲＮＡ及びＲＮＡ－リガンド結合複合体（又はＲＮＡ足場）の部分をともに形成する２つの別個のＲＮＡ分子である。この場合、ｓｃｏｕｔＲＮＡ活性がある分子は、標的化配列がある分子（ｃｒＲＮＡ）と（通常は塩基対合によって）相互作用して、２部分ガイドｃｒＲＮＡ：ｓｃｏｕｔＲＮＡを形成することができるはずである。
本発明に関連してＶ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムで用いられ得るｓｃｏｕｔＲＮＡｓ及びｃｒＲＮＡの非限定的な例を以下に示す。
Figure 2024501757000007
 したがって、配列標的化成分がＣａｓ１２ｄ１５等のＶ型Ｃａｓタンパク質を含む実施形態（Ｆｕ，Ｂ．Ｘ．Ｈ．，Ｓｍｉｔｈ，Ｊ．Ｄ．，Ｆｕｃｈｓ，Ｒ．Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ｔａｒｇｅｔ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｎｉｃｋａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ＣＲＩＳＰＲＣａｓ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ Ｃｐｆ１ ａｎｄ Ｃａｓ９． Ｎａｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ４，８８８－８９７（２０１９）。ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｓ４１５６４－０１９－０３８２－０）、ＲＮＡ－リガンド結合複合体は、Ｖ型ｃｒＲＮＡ：ｓｃｏｕｔＲＮＡガイドを含むことが好ましい。
｛ｂ｝リガンド結合部分
いかなる実施形態でも、ＲＮＡ－リガンド結合複合体は、実際に２つ以上のエフェクタータンパク質を標的ＤＮＡに動員する同族リガンドと会合することができるリガンド結合部分をさらに含む。本明細書に開示されるように、ガイドＲＮＡ及びＣａｓタンパク質は共に、配列標的化及び認識のためのＣＲＩＳ ＰＲ／Ｃａｓベースのモジュールを形成する一方で、リガンド結合部分は、１つ以上の遺伝子組換えを行う塩基編集酵素等の１つ以上のエフェクタータンパク質を動員する。この連鎖は、本明細書に開示される塩基編集システム及び方法にとって重要である。
ある実施形態では、リガンド結合部分は、以下の：ＭＳ２コートタンパク質（ＭＣＰ）、Ｋｕ、ＰＰ７コートタンパク質（ＰＣＰ）、ＣｏｍＲＮＡ結合タンパク質又はその結合ドメイン、ＳｆＭｕ、Ｓｍ７、Ｔａｔ、ＣＳＹ４、Ｑｂｅｔａ、ＣＯＭ、ｐｕｍｉｌｉｏ、ラムダＮ２２、リガンドと会合する部分からなる群より選択される。本明細書で提供される方法及びシステムで用いられ得るリガンド結合部分／リガンドの例の非網羅的なリストを表３に要約する。
表３－本発明の様々な実施形態では用いられ得るリガンド結合部分－リガンド対の非網羅的な例。リガンド結合部分及びリガンドの未修飾体及び化学修飾体がともに、本発明の範囲内である。
Figure 2024501757000008
 好ましい実施形態では、リガンド結合部分は、実際にエフェクタータンパク質（塩基編集酵素）を標的ＤＮＡに動員するコグネイトＲＮＡ結合ドメイン（ＲＮＡアプタマーリガンドといってよい）と会合することができるＲＮＡモチーフ（ＲＮＡアプタマーといってよい）である。リガンド結合部分がＲＮＡモチーフである実施形態では、ＲＮＡ－リガンド結合複合体は、ＲＮＡ足場といってよい。本明細書に開示されるように、ガイドＲＮＡ及びＣａｓタンパク質は共に、配列標的化及び認識のためのＣＲＩＳ ＰＲ／Ｃａｓベースのモジュールを形成し、一方、ＲＮＡモチーフは、ＲＮＡ結合ドメインを介して、１つ以上の遺伝子組換えを行う塩基編集酵素等の２つ以上のエフェクタータンパク質を動員する。したがって、ＲＮＡ足場は、エフェクターモジュール（例えば、塩基編集酵素）を配列認識モジュール（例えば、ＩＩ型Ｃａｓタンパク質又はＶ型Ｃａｓタンパク質）に可逆的に接続する。この目的のために、ＲＮＡ足場は、ＲＮＡ結合タンパク質（例えば、ＭＳ２コートタンパク質、ＭＣＰ）に特異的に結合するＲＮＡモチーフ（例えば、ＭＳ２オペレーターモチーフ）がガイドＲＮＡに結合されるように設計される。
その結果、本明細書に開示されるプラットフォームのこのＲＮＡ足場構成要素は、特異的ＤＮＡ／ＲＮＡ配列認識及びＣａｓタンパク質結合のためのガイドＲＮＡだけでなく、エフェクター動員のためのＲＮＡモチーフ（ＲＮＡアプタマーとしても知られる）も含有する、設計されたＲＮＡ分子である。このようにして、エフェクタータンパク質は、会合又は融合されたＲＮＡ結合ドメインを介してＲＮＡモチーフに結合するそれらの機能によって標的部位に動員され得る。ＲＮＡ足場媒介性動員の柔軟性のために、機能的単量体、並びに二量体、三量体、四量体、又はオリゴマーは、標的ＤＮＡ又はＲＮＡ配列の近くで比較的容易に形成され得る。好ましくは、二量体ＲＮＡ結合ドメインは、単一のＲＮＡモチーフに動員される。ＲＮＡモチーフ／結合タンパク質のこれらの対は、天然に存在する供給源（例えば、ＲＮＡファージ、又は酵母テロメラーゼ）に由来し得るか、又は人工的に設計され得る（例えば、ＲＮＡアプタマー及びそれらの対応する結合タンパク質リガンド）。本明細書において提供される方法及びシステムにおいて用いることができる動員ＲＮＡモチーフ／ＲＮＡ結合タンパク質対の例の非網羅的リストを表４に要約する。当業者には明らかであるように、アプタマー及びそれらの結合パートナーの化学修飾体及び／又は配列変異体も利用することができる。
表４ 本発明で用いることができるリクルートＲＮＡモチーフの例、並びにそれらの対形成ＲＮＡ結合タンパク質／タンパク質ドメイン
Figure 2024501757000009
 ＊本発明において、ＲＮＡ結合ドメインは、エフェクタータンパク質に融合される（例えば、表５を参照のこと）。
上記の結合対の配列を以下に列挙する。
１．テロメラーゼＫｕ結合モチーフ／Ｋｕヘテロダイマー
ａ．Ｋｕ結合ヘアピン（配列番号７）
Figure 2024501757000010
 ｂ．Ｋｕヘテロ二量体（配列番号８）
Figure 2024501757000011
 ２．テロメラーゼＳｍ７結合モチーフ／Ｓｍ７ホモ七量体
ａ．Ｓｍコンセンサス部位（一本鎖）（配列番号９）
Figure 2024501757000012
 ｂ．単量体Ｓｍ様タンパク質（古細菌）（配列番号１０）
Figure 2024501757000013
 ３．ＭＳ２ファージオペレーターステムループ／ＭＳ２コートタンパク質
ａ．ＭＳ２ファージオペレーターステムループ（配列番号１１）
Figure 2024501757000014
 ｂ．ＭＳ２コートタンパク質（配列番号１２）
Figure 2024501757000015
 ４．ＰＰ７ファージオペレーターステムループ／ＰＰ７コートタンパク質
ａ．ＰＰ７ファージオペレーターステムループ（配列番号１３）
Figure 2024501757000016
 ｂ．ＰＰ７コートタンパク質（ＰＣＰ）（配列番号１４）
Figure 2024501757000017
 ５．ＳｆＭｕコムステムループ／ＳｆＭｕコム結合タンパク質
ａ．ＳｆＭｕコーンステムループ（配列番号１５）
Figure 2024501757000018
 ｂ．ＳｆＭｕコム結合タンパク質（配列番号１６）
Figure 2024501757000019
 さらなる動員ＲＮＡモチーフ及びそれらのＲＮＡ結合タンパク質／タンパク質ドメインは、Ｑｂｅｔａファージオペレーターステムループ（配列番号６８）及びＱｂｅｔａコートタンパク質［Ｑ６５Ｈ］（配列番号６９）、ＢｏｘＢ（配列番号７０）及びラムダバクテリオファージタンパク質Ｎ（配列番号７１）、Ｃｓｙ４結合モチーフ（配列番号７２）及びＣｓｙ４［Ｈ２９Ａ］（配列番号７３）である。
ＲＮＡ－リガンド結合複合体は、ＲＮＡ－リガンド結合複合体のガイドＲＮＡの３’末端、５’末端、又はガイドＲＮＡ内に位置する１つ以上のリガンド結合部分を含み得る。好ましい実施形態では、ＲＮＡ－リガンド結合複合体は、１つ以上のエフェクターの動員を可能にする１つ以上のＲＮＡモチーフを含み得る。ＲＮＡ－リガンド結合複合体が２つ以上のＲＮＡモチーフを含むいかなる実施形態でも、ＲＮＡモチーフは同じであっても異なっていてもよい。ＲＮＡモチーフが異なる実施形態では、各モチーフは、単一又は複数のエフェクタータンパク質のいずれかを動員し得る。複数のエフェクタータンパク質が動員される実施形態では、これらのタンパク質は、同じ機能又は異なる機能を有し得る。全ての実施形態では、ＲＮＡモチーフの少なくとも１つは、２つ以上のエフェクタータンパク質を動員するために用いられる。
好ましい実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡモチーフはＭＳ２アプタマーであってよく、場合によっては、ＭＳ２アプタマーには伸長ステムがある。伸長ステムは、２～２４ヌクレオチドを含み得る。一実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡモチーフは、ＰＰ７アプタマーであり得る。ＭＳ２アプタマー及びＰＰ７アプタマーは、単一のエフェクタータンパク質又は複数のエフェクタータンパク質を各々動員し得る。ＭＳ２アプタマー及びＰＰ７アプタマーは、同じ又は異なるエフェクタータンパク質を動員することができる。
ＲＮＡリガンド結合複合体（又はＲＮＡ足場）は、単一のＲＮＡ分子又は複数のＲＮＡ分子の複合体のいずれかであり得る。例えば、ガイドＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ、又はｃｒＲＮＡ及びｓｃｏｕｔＲＮＡのいずれかを含む）及びリガンド結合部分（又は動員ＲＮＡモチーフ）は、１つの長い単一ＲＮＡの３つのセグメントであり得る。あるいは、様々な成分が別々の分子上にあってよい。後者の場合、２つ以上の成分は、共有結合若しくは非共有結合又は結合（例えば、ワトソン－クリック塩基対形成を含む）を介してともに結合されて、足場を形成し得る。
一例では、ＲＮＡ足場は、２つの別個のＲＮＡ分子を含むことができる。第一のＲＮＡ分子は、プログラム可能なｃｒＲＮＡ及び相補的領域とステム二本鎖構造を形成することができる領域を含むことができる。第二のＲＮＡ分子は、ｔｒａｃｒＲＮＡ及び１つ以上のＲＮＡモチーフに加えて、相補的領域を含むことができる。このステム二本鎖構造を介して、第一及び第二のＲＮＡ分子は、本発明のＲＮＡ足場を形成する。一実施形態では、第一及び第二のＲＮＡ分子は各々、他の配列と塩基対を形成する（約６～約３０ヌクレオチドの）配列を含む。同様に、ｔｒａｃｒＲＮＡ及びＲＮＡモチーフは、異なるＲＮＡ分子上にあってよく、他のステム二本鎖構造とともにされてもよい。
他の例では、ＲＮＡ足場は、２つの別個のＲＮＡ分子を含むことができる。第一のＲＮＡ分子は、プログラム可能なｃｒＲＮＡ及び相補的領域を含み得る。第二のＲＮＡは、ｓｃｏｕｔＲＮＡ及び１つ又は複数のＲＮＡモチーフに加えて、コグネイト相補的領域を含むことができる。相補的領域のハイブリダイゼーションを介して、第一及び第二のＲＮＡ分子は、本発明のＲＮＡ足場を形成する。一実施形態では、第一及び第二のＲＮＡ分子は各々、他の配列と塩基対を形成する配列（約４～１０ヌクレオチド、好ましくは５ヌクレオチド）を含む。同様に、スカウトＲＮＡ及びＲＮＡモチーフは異なるＲＮＡ分子上にあってよく、他のステム二本鎖構造とともにあってよい。
本発明のＲＮＡ及び関連する足場は、細胞ベースの発現、インビトロ転写、及び化学合成を含む当技術界で公知の様々な方法によって作製することができる。ＴＣ－ＲＮＡ化学（例えば、米国特許第８，２０２，９８３号を参照のこと）を用いて比較的長いＲＮＡ（２００マー以上の長さ）を化学的に合成する機能により、基本的な４つのリボヌクレオチド（Ａ、Ｃ、Ｇ及びＵ）によりも性能が優れている特別な特徴があるＲＮＡを生成することができる。
Ｃａｓタンパク質－ＲＮＡリガンド結合複合体は、当業界で公知の宿主細胞システム又はインビトロ翻訳－転写システムを用いる組換え技術によって作製することができる。そのようなシステム及び技術の詳細は、例えば、国際公開２０１４／１４４７６１パンフレット、国際公開２０１４／１４４５９２パンフレット、国際公開２０１３／１７６７７２パンフレット、米国特許第二０１４０２７３２２６号、及び米国特許第２０１４／０２７３２３３号に見出すことができ、これらの内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に援用される。複合体は、それらが産生される細胞の細胞物質又はインビトロ翻訳－転写システムから、少なくともある程度単離又は精製することができる。
リガンド結合部分の位置決め
リガンド結合部分は、ＲＮＡ－リガンド結合複合体内の様々な位置に配置され得る。リガンド結合部分は、ガイドＲＮＡに直接（例えば、共有結合を介して）、又は１つ以上の共有結合を介してガイドＲＮＡ及びリガンド結合部分の各々と会合しているリンカーを介して結合され得る。リガンド結合部分とガイドＲＮＡとの結合は、共有結合を介して直接であるか、又はリンカーを介してであるかにかかわらず、多数の位置のいずれであってよい。
非限定的な例として、リガンド結合部分は、ガイドＲＮＡの３’末端に、又はガイドＲＮＡが一本鎖である場合にはガイドＲＮＡの５’末端に、直接（例えば、共有結合を介して）又はリンカーを介して結合され得る。あるいは、リガンド結合部分は、ガイドＲＮＡを構成する成分、すなわち、ｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ又はｓｃｏｕｔＲＮＡの３’末端又は５’末端に直接（例えば、共有結合を介して）又はリンカーを介して結合され得る。
リガンド結合部分がヌクレオチド配列、例えばＲＮＡモチーフである場合、それをガイドＲＮＡに挿入することができる。
１つより多くのリガンド結合部分が、以下の非限定的な実施例において概説される位置のいずれか１つにおいて、ＲＮＡ－リガンド結合複合体に組み込まれ得る。複数のリガンド結合部分が援用される場合、それらは互いに隣接していてもよく、又は別個の位置に結合していてもよい。
ＲＮＡ－リガンド結合複合体がＲＮＡ足場である場合、ＲＮＡモチーフは、実施例１に記載されるように、ＲＮＡ足場の様々な位置に配置され得る。ＲＮＡモチーフ、例えばＭＳ２アプタマーは、ｃｒＲＮＡの３’末端に、ｓｇＲＮＡのテトラループに、ｔｒａｃｒＲＮＡのステムループ２に、又はｔｒａｃｒＲＮＡのステムループ３に位置し得る。ＭＳ２アプタマーの位置決めは、嵩高いループから生じ得る立体障害のために重要である。好ましい実施形態では、ＭＳ２アプタマーはｔｒａｃｒＲＮＡの３’末端にある。他の実施形態では、ＭＳ２アプタマーはｓｃｏｕｔＲＮＡの５’末端にある。他の実施形態では、ＭＳ２アプタマーはｔｒａｃｒＲＮＡの５’末端にある。有利には、ｔｒａｃｒＲＮＡの３’末端又はｓｃｏｕｔＲＮＡの５’末端へのＭＳ２アプタマーの配置は空間内であり、したがって、ＲＮＡスキャフォールドの他の嵩高いループとの立体障害を低減する。
リガンド結合部分の位置付け：ＩＩ型ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡガイド
ガイドＲＮＡがＩＩ型ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡガイドである場合、リガンド結合部分は、ガイドＲＮＡの３’末端に、又はガイドＲＮＡが一本鎖（ｓｇＲＮＡにおけるｔｒａｃｒＲＮＡの３’末端及びｃｒＲＮＡの５’末端に対応する）である場合はガイドＲＮＡの５’末端に、又は別々の鎖である場合はｃｒＲＮＡの３’末端に、ｔｒａｃｒＲＮＡの３’末端に、ｔｒａｃｒＲＮＡの５’末端に、又はｃｒＲＮＡの５’末端に、直接又はリンカーを介して結合され得る。したがって、リガンド結合部分は、ｓｇＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ又はｔｒａｃｒＲＮＡ中の最初又は最後のヌクレオチドに結合され得る。あるいは、リガンド結合部分は、ｓｇＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ又はｃｒＲＮＡにおける最初又は最後のヌクレオチドではないヌクレオチドに結合され得る。あるいは、リガンド結合部分とガイドＲＮＡとの会合は、抗反復領域若しくは遠位領域のいずれかにおけるｔｒａｃｒＲＮＡで、又はスペーサーに隣接する若しくは反復領域におけるｃｒＲＮＡで、又は存在する場合、ｔｒａｃｒＲＮＡとｃｒＲＮＡとの間のテトラループであり得る。
リガンド結合部分の位置決め：Ｖ型ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡガイド
ガイドＲＮＡがＶ型ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡガイドである場合、リガンド結合部分は、ガイドＲＮＡの３’末端に、又はガイドＲＮＡが一本鎖（ｓｇＲＮＡにおけるｃｒＲＮＡの３’末端及びｔｒａｃｒＲＮＡの５’末端に対応する）である場合はガイドＲＮＡの５’末端に、又はそれらが別々の鎖である場合はｃｒＲＮＡの３’末端に、ｔｒａｃｒＲＮＡの３’末端に、ｔｒａｃｒＲＮＡの５’末端に、又はｃｒＲＮＡの５’末端に、直接又はリンカーを介して結合され得る。したがって、リガンド結合部分は、ｓｇＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ又はｔｒａｃｒＲＮＡ中の最初又は最後のヌクレオチドに結合され得る。あるいは、リガンド結合部分は、ｓｇＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ又はｃｒＲＮＡにおける最初又は最後のヌクレオチドではないヌクレオチドに結合され得る。あるいは、リガンド結合部分とガイドＲＮＡとの会合は、抗反復領域若しくは遠位領域のいずれかにおけるｔｒａｃｒＲＮＡで、又はスペーサーに隣接する若しくは反復領域におけるｃｒＲＮＡで、又は存在する場合、ｔｒａｃｒＲＮＡとｃｒＲＮＡとの間のテトラループであり得る。リガンド結合部分の非限定的な例示的な位置は、図２、図３及び図４に見ることができる。
リガンド結合部分の配置：Ｖ型ｃｒＲＮＡ：ｓｃｏｕｔＲＮＡガイド
ガイドＲＮＡがｃｒＲＮＡ：ｓｃｏｕｔＲＮＡガイドである場合、リガンド結合部分は、ｃｒＲＮＡの３’末端に、ｓｃｏｕｔＲＮＡの３’末端に、ｓｃｏｕｔＲＮＡの５’末端に、又はｃｒＲＮＡの５’末端に、直接又はリンカーを介して結合され得る。したがって、リガンド結合部分は、ガイドＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ又はｓｃｏｕｔＲＮＡ中の最初又は最後のヌクレオチドに結合され得る。あるいは、リガンド結合部分は、ガイドＲＮＡ、ｓｃｏｕｔＲＮＡ又はｃｒＲＮＡにおける最初又は最後のヌクレオチドではないヌクレオチドに結合され得る。あるいは、リガンド結合部分とガイドＲＮＡとの会合は、抗反復領域若しくは上流領域若しくは下流領域のいずれかのｓｃｏｕｔＲＮＡ、又はスペーサーに隣接するｃｒＲＮＡ若しくは反復領域であってよい。リガンド結合部分の非限定的な例示的位置は、図６に見ることができる。
リガンド結合部分の位置決め：Ｖ型ｃｒＲＮＡのみのガイド
ガイドＲＮＡがＶ型ｃｒＲＮＡのみのガイドである場合、リガンド結合部分は、ガイドＲＮＡの３’末端又はガイドＲＮＡの５’末端に直接又はリンカーを介して結合され得る。したがって、リガンド結合部分は、ガイドＲＮＡ中の最初又は最後のヌクレオチドに結合され得る。あるいは、リガンド結合部分は、５’末端又は３’末端以外の位置でｇＲＮＡに結合していてもよい。リガンド結合部分の非限定的な例示的位置は、図５に見ることができる。
修飾例
本明細書に開示されるＲＮＡ－リガンド結合複合体（又はＲＮＡ足場）は、１つ以上の修飾を含み得る。そのような修飾は、少なくとも１つの天然に存在しないヌクレオチド、又は修飾ヌクレオチド、又はそれらの類似体の包含を含み得る。このような組換えの例としては、配列を伸長するためのヌクレオチドの付加、ヌクレオチドの置換、リンカー配列の付加、及びＲＮＡ－リガンド結合複合体（又はＲＮＡ足場）の様々な成分の配置の組換えがあげられるが、これらに限定されない。
ヌクレオチドは、リボース、リン酸結合、及び／又は塩基部分で修飾されてもよい。修飾ヌクレオチドには、２’－０－メチル類似体、２’－フルオロ類似体又は２’－デオキシ類似体又は２’－リボース類似体が含まれ得る。核酸骨格は修飾されてもよく、例えば、ホスホロチオエート骨格が用いられてもよい。ロックド核酸（ＬＮＡ）又は架橋核酸（ＢＮＡ）を用いることもできる。修飾塩基のさらなる例としては、２－アミノプリン、５－ブロモ－ウリジン、５－メチルシチジン、５－メトキシウリジン、プソイドウリジン、イノシン、７－メチルグアノシンがあげられるが、これらに限定されない。これらの修飾は、ＲＮＡ－リガンド結合複合体（又はＲＮＡ足場）のいかなる成分に適用され得る。これらの組換えは、ＣＲＩＳＰＲシステムのいかなる成分に適用することができる。好ましい実施形態では、これらの組換えは、ＲＮＡ成分（例えば、ガイドＲＮＡ配列）に対して行われる。
ある実施形態、上記のＲＮＡ－リガンド結合複合体（又はＲＮＡ足場）又はそのサブセクションは、１つ又は複数の修飾、例えば、塩基修飾、骨格修飾等を含み、核酸に新しい又は増強された特徴（例えば、改善された安定性）を提供することができる。
修飾された骨格及び修飾されたヌクレオシド間結合
修飾を含有する適当な核酸の例としては、修飾された骨格、塩基、糖、又は非天然ヌクレオシド間結合を含有する核酸があげられる。核酸（修飾された骨格があるものとしては、骨格中にリン原子を保持するもの及び骨格中にリン原子がないものがあげられる）。
その中にリン原子を含む適当な修飾オリゴヌクレオチド骨格としては、例えば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチル及び他のアルキルホスホネート（３’－アルキレンホスホネート、５’－アルキレンホスホネート及びキラルホスホネートを含む）、ホスフィネート、ホスホルアミデート（３’－アミノホスホルアミデート及びアミノアルキルホスホルアミデートを含む）、ホスホロジアミデート、チオノホスホルアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、セレノホスフェート及びボラノホスフェート（通常の３’－５’結合がある）、これらの２’－５’結合アナログ、並びに１つ以上のヌクレオチド間結合が３’→３’、５’→５’又は２’→２’結合である逆極性であるものがあげられる。逆極性である適当なオリゴヌクレオチドは、最も３’側のヌクレオチド間結合に単一の３’から３’への結合、すなわち塩基性であり得る単一の逆ヌクレオシド残基（核酸塩基が欠失しているか、又はその代わりにヒドロキシル基がある）を含む。様々な塩（例えば、カリウム又はナトリウム等）、混合塩及び遊離酸形態も含まれる。
ある実施形態では、対象核酸は、１つ又は複数のホスホロチオエート及び／又はヘテロ原子ヌクレオシド間結合、特に－ＣＨ２－ＮＨ－Ｏ－ＣＨ２－、－ＣＨ２－Ｎ（ＣＨ３）－Ｏ－ＣＨ２－（メチレン（メチルイミノ）又はＭＭＩ骨格として知られる）、－ＣＨ２－Ｏ－Ｎ（ＣＨ３）－ＣＨ２－、－ＣＨ２－Ｎ（ＣＨ３）－Ｎ（ＣＨ３）－ＣＨ２－及び－Ｏ－Ｎ（ＣＨ３）－ＣＨ２－ＣＨ２－を含む（ここで、天然ホスホジエステルヌクレオチド間結合は、－Ｏ－Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－ＣＨ２－として表される）。ＭＭＩ型ヌクレオシド間結合は、上記で参照した米国特許第５，４８９，６７７号に開示されている。適当なアミドヌクレオシド間結合は、米国特許第５，６０２，２４０号に開示されている。
例えば、米国特許第５，０３４，５０６号に記載されるようなモルホリノ骨格構造がある核酸もまた適当である。例えば、ある実施形態では、対象核酸は、リボース環の代わりに６員モルホリノ環を含む。これらの実施形態のいくつかにおいて、ホスホロジアミデート又は他の非ホスホジエステルヌクレオシド間結合は、ホスホジエステル結合を置換する。
その中にリン原子を含まない適当な修飾ポリヌクレオチド骨格は、短鎖アルキル若しくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合ヘテロ原子及びアルキル若しくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、又は１つ以上の短鎖ヘテロ原子若しくは複素環式ヌクレオシド間結合によって形成される骨格がある。これらは、モルホリノ結合（ヌクレオシドの糖部分から部分的に形成される）があるもの；シロキサン骨格；スルフィド、スルホキシド及びスルホン骨格；ホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格；リボアセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファメート骨格；メチレンイミノ及びメチレンヒドラジノ骨格；スルホネート及びスルホンアミド骨格；アミド骨格；並びに混合Ｎ、Ｏ、Ｓ及びＣＨ２成分部分がある他のものを含む。
修飾糖部分
本発明の核酸はまた、１つ以上の置換糖部分を含み得る。好適なポリヌクレオチドは、以下から選択される糖置換基を含む。ＯＨ；Ｈ；Ｆ；０－、Ｓ－若しくはＮ－アルキル；０－、Ｓ－若しくはＮ－アルケニル；０－、Ｓ－若しくはＮ－アルキニル；又は０－アルキル－Ｃ０－アルキルであり、ここで、アルキル、アルケニル及びアルキニルは、置換若しくは非置換のＣ１～Ｃ１０アルキル又はＣ２～Ｃ１０アルケニル及びアルキニルであり得る。特に好適なものは、Ｏ（（ＣＨ２）ｎＯ）ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２、及びＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ（（ＣＨ２）ｎＣＨ３）２であり、式中、ｎ及びｍは１～約１０である。他の適当なポリヌクレオチドは、以下から選択される糖置換基を含む：Ｃ１～Ｃ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリール、アラルキル、０－アルカリール又は０－アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、インターカレーター、オリゴヌクレオチドの薬物動態学的特性を改善するための基、又はオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改善するための基、及び類似の特性がある他の置換基があげられる。適当な修飾には、２’－メトキシエトキシ（２’－Ｏ－ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、２’－０－（２－メトキシエチル）又は２’－ＭＯＥとしても知られる）（Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，１９９５，７８，４８６－５０４）、すなわちアルコキシアルコキシ基である。さらなる適当な修飾としては、２’－ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわち、Ｏ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基（２’－ＤＭＡＯＥとしても知られる）（以下の実施例に記載される）、及び２’－ジメチルアミノエトキシエトキシ（２’－０－ジメチル－アミノ－エトキシ－エチル又は２’－ＤＭＡＥＯＥとしても知られる）、すなわち、２’－Ｏ－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２－Ｎ（ＣＨ３）２があげられる。
他の適当な糖置換体基としては、メトキシ（－Ｏ－ＣＨ３）、アミノプロポキシ（－ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）、アリル（－ＣＨ２－ＣＨ＝ＣＨ２）、－０－アリルＣＨ２－ＣＨ＝ＣＨ２）及びフルオロ（Ｆ）があげられる。２’－糖置換基は、アラビノ（上）位又はリボ（下）位にあってよい。適当な２’－アラビノ修飾は２’－Ｆである。同様の修飾は、オリゴマー化合物上の他の位置、特に３’末端ヌクレオシド上又は２’－５’結合オリゴヌクレオチド中の糖の３’位、及び５’末端ヌクレオチドの５’位でも行うことができる。オリゴマー化合物はまた、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部分等の糖模倣体があってよい。
塩基修飾及び置換
対象核酸はまた、核酸塩基（当業界において単に「塩基」ということが多い）修飾又は置換を含んでもよい。本明細書中で用いられる「非組換え」又は「天然」核酸塩基としては、プリン塩基アデニン（Ａ）及びグアニン（Ｇ）、並びにピリミジン塩基チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）及びウラシル（Ｕ）があげられる。修飾核酸塩基としては、５－メチルシトシン（５－ｍｅ－Ｃ）、５－ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２－アミノアデニン、アデニン及びグアニンの６－メチル及び他のアルキル誘導体、アデニン及びグアニンの２－プロピル及び他のアルキル誘導体、２－チオウラシル、２－チオチミン及び２－チオシトシン、５－ハロウラシル及びシトシン、５－プロピニル（－Ｃ＝Ｃ－ＣＨ３）ウラシル及びシトシン及びピリミジン塩基の他のアルキニル誘導体、６－アゾウラシル、シトシン及びチミン、５－ウラシル（プソイドウラシル）、４－チオウラシル、８－ハロ、８－アミノ、８－チオール、８－チオアルキル、８－ヒドロキシル及び他の８－置換アデニン及びグアニン、５－ハロ、特に５－ブロモ、５－トリフルオロメチル及び他の５－置換ウラシル及びシトシン、７－メチルグアニン及び７－メチルアデニン、２－Ｆ－アデニン、２－アミノ－アデニン、８－アザグアニン及び８－アザアデニン、７－デアザグアニン及び７－デアザアデニン並びに３－デアザグアニン及び３－デアザアデニン等の他の合成及び天然核酸塩基があげられる。さらなる修飾核酸塩基としては、三環式ピリミジン、例えばフェノキサジンシチジン（１Ｈ－ピリミド（５，４－ｂ）（１，４）ベンゾオキサジン－２（３Ｈ）－オン）、フェノチアジンシチジン（１Ｈ－ピリミド（５，４－ｂ）（１，４）ベンゾチアジン－２（３Ｈ）－オン）、Ｇ－クランプ、例えば置換フェノキサジンシチジン（例えば９－（２－アミノエトキシ）－Ｈ－ピリミド（５，４－（ｂ）（１，４）ベンゾオキサジン－２（３Ｈ）－オン）、カルバゾールシチジン（２Ｈ－ピリミド（４，５－ｂ）インドール－２－オン）、ピリドインドールシチジン（Ｈ－ピリド（３’，２’：４，５）ピロロ（２，３－ｄ）ピリミジン－２－オン）があげられる。
複素環塩基部分はまた、プリン又はピリミジン塩基が他の複素環（例えば、７－デアザ－アデニン、７－デアザグアノシン、２－アミノピリジン及び２－ピリドン）で置換されているものを含み得る。さらなる核酸塩基としては、米国特許第３６８７，８０８号に開示されるもの、Ｔｈｅ Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ Ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｐａｇｅｓ ８５８－８５９，Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，Ｊ．Ｉ．，ｅｄ．Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９９０に開示されるもの、Ｅｎｇｌｉｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９１，３０，６１３によって開示されるもの、及びＳａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，Ｃｈａｐｔｅｒ １５，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐａｇｅｓ ２８９－３０２，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄ Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．，ｅｄ．，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，１９９３によって開示されるものがあげられる。これらの核酸塩基のあるものは、オリゴマー化合物の結合親和性を高めるのに有用である。これらには、２－アミノプロピルアデニン、５－プロピニルウラシル及び５－プロピニルシトシンを含む、５－置換ピリミジン、６－アザピリミジン及びＮ－２、Ｎ－６及び０－６置換プリンがあげられる。５－メチルシトシン置換は、核酸二本鎖安定性を０．６～１．２℃高めることが示されている。（Ｓａｎｇｈｖｉ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，１９９３，ｐｐ．２７６－２７８）、例えば、２’－０－メトキシエチル糖修飾と組み合わされる場合、適当な塩基置換である。
本明細書に開示される修飾は、ｓｇＲＮＡのテトラループ、ｔｒａｃｒＲＮＡ又はｓｃｏｕｔＲＮＡの３’末端、及びステムループ１、２ループ、ｔｒａｃｒＲＮＡ又はの３’末端、及びステムループ１、２又は３中のＲＮＡモチーフに組み込むことができる。本明細書に開示される修飾は、ｓｇＲＮＡの反復／アンチ反復の伸長、ｔｒａｃｒＲＮＡ又はｓｃｏｕｔＲＮＡの３’末端におけるＲＮＡモチーフの位置決め、ＲＮＡモチーフをｔｒａｃｒＲＮＡ又はｓｃｏｕｔＲＮＡに結合するリンカー配列、ＲＮＡモチーフのヌクレオチドの修飾、及びＲＮＡモチーフの伸長を含む。
ＲＮＡモチーフのヌクレオチドの修飾
ＲＮＡリガンド結合複合体がＲＮＡ足場である場合、修飾は、ＲＮＡモチーフ、例えばアプタマー配列に対してされ得る。例えば、適当な修飾は、Ｃ－５及びＦ－５アプタマー変異体に対する。好ましい実施形態では、アプタマーに対する修飾は、１０位におけるアデニンの２－アミノプリン（２－ＡＰ）への置換である。有利には、置換によりは、より大きな親和性をもたらすような立体構造変化を誘導する。Ｆ－５変異体によるＭＳ２コートタンパク質に対する親和性は、親Ｆ５配列よりも約３倍高かった。いかなる理論にも束縛されることを望まないが、２－ＡＰによって誘導される構造変化は、１０位の２－ＡＰヌクレオチドの環外アミノ基と骨格のＢ５９のカルボニルとの間の水素結合形成を生じると考えられる。ＭＳ２ヘアピン配列をより高い親和性のＭＳ２配列で置換すると、アミノ酸置換がＲＮＡステムループをコートタンパク質によってよりよく認識される立体構造に整えるのに役立つため、ベース編集効率を高めると考えられる。
２’デオキシ－２－アミノプリン、２’リボース－２－アミノプリン、ホスホロチオエート修飾、２’－Ｏメチル修飾、２’－Ｏメチル修飾、２’－Ｆｌｕｒｏ修飾及びＬＮＡ修飾等、上に列挙されている。有利には、修飾により安定性が高まり、所望のヘアピンのより強い結合／折り畳み構造を促進するのに役立つ。
ＲＮＡモチーフの伸長
ＲＮＡリガンド結合複合体がＲＮＡ足場である場合、ＲＮＡモチーフを伸長することができる。ＲＮＡモチーフ伸長の長さは、可変であり得る。ＲＮＡモチーフへの伸長は、２～２４ヌクレオチドの範囲であり得る。ＲＮＡモチーフへの伸長は、２４ヌクレオチド超であり得る。有利には、ＲＮＡモチーフの伸長により、モチーフの柔軟性が高まる。ＲＮＡモチーフへの伸長は、二本鎖伸長又は一本鎖伸長であり得る。二本鎖伸長により、ＲＮＡ足場の安定性がより高まる。
反復の伸長：抗反復上部ステム
ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡを含むガイドＲＮＡは、ｓｇＲＮＡとして提供され得る。２つの成分は、反復：アンチ反復を介して結合される。反復：アンチ反復上部ステムは、ループの柔軟性、適当な折り畳み及び安定性を高めるために伸長され得る。反復：アンチ反復は、テトラループのいずれかの側で、２、３、４、５、６、７ｂｐ又は７ｂｐを超えて伸長され得る。
変形例の組み合わせ
ＲＮＡ足場には、上記修飾のうちの１つ以上があってよい。１つ以上の修飾は、ＲＮＡ骨格の異なる構成要素上にあってよく（例えば、ｓｇＲＮＡの反復：アンチ反復の伸長及びＲＮＡモチーフの伸長）、又はＲＮＡ骨格の同じ構成要素上にあってよい（例えば、ＲＮＡモチーフの伸長及びＲＮＡモチーフのヌクレオチドの置換）。修飾は、２つ以上、３つ以上、４つ以上、又は５つ以上であってよい。一実施形態では、修飾は、ＲＮＡモチーフの伸長であってよく、かつ／又は１つ若しくは複数のヌクレオチドの置換であってよい。
本明細書で用いられるＲＮＡモチーフの例は、ＭＳ２アプタマーである。ＭＳ２モチーフは、ＭＳ２バクテリオファージコートタンパク質（ＭＣＰ）に特異的に結合する。インビトロ選択プロセスを繰り返して、一連のアプタマーファミリーを得た。アプタマーファミリーメンバーのうちの２つは、ＭＳ２ Ｃ－５変異体及びＭＳ２ Ｆ－５変異体を含む。野生型ＭＳ２とＣ－５及びＦ－５変異体との間の有意な差異の１つは、アプタマーループの５位におけるウラシルヌクレオチドのシトシンへの置換である。Ｆ－５変異体は、野生型及びアプタマーファミリーの他のメンバーと比較して、コートタンパク質に対してより高い親和性があることが報告されている。適当には、Ｃ－５変異体及びＦ－５変異体がともに、本発明でアプタマーとして用いられる。一実施形態では、ＭＳ２アプタマーは、野生型ＭＳ２、突然変異体ＭＳ２又はその変異体である。他の実施形態では、ＭＳ２アプタマーは、Ｃ－５及び／又はＦ－５突然変異を含む。ｔｒａｃｒＲＮＡに結合されたＭＳ２タンパク質は、単一コピー（すなわち、１つのＭＳ２ループ）又は二重コピー（すなわち、２つのＭＳ２ループ）であり得る。好ましい実施形態では、ＲＮＡモチーフは単一コピーである。他の実施形態では、ＲＮＡモチーフは２コピー以上である。
リンカー配列
リンカーは、存在する場合、リガンド結合部分をガイドＲＮＡに接続する種であり得る。リガンド結合部分がＲＮＡモチーフである実施形態では、リンカーは、ＲＮＡモチーフをガイドＲＮＡに接続する種であり得る。リンカーは、１つの位置でＲＮＡモチーフ及びガイドＲＮＡの各々に結合してよく、又は複数の位置でＲＮＡモチーフ及びガイドＲＮＡのいずれか又は両方に結合してよい。複数の位置での結合により、ＲＮＡモチーフの三次元空間における制御をより強くでき、次に、エフェクターが用いられる。ＲＮＡモチーフは、リンカー配列を介してｔｒａｃｒＲＮＡに結合され得る。リンカー配列は、２、３、４、５、６、７又は７を超えるヌクレオチドであり得る。有利には、リンカー配列により、ＲＮＡ－リガンド結合複合体（又はＲＮＡ足場）に柔軟性が付与される。リンカー配列は、ＧＣ富化配列であり得る。
ある実施形態では、リンカーは、オリゴヌクレオチド配列を含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなり、場合によっては、リンカーは、少なくとも１つ又は複数の２’修飾を含み、例えば、全てのヌクレオチドは、リンカー内の２’修飾ヌクレオチドである。ヌクレオチド配列は、ランダムであってよく、又はリガンド結合部分、［ＲＮＡ］若しくはＤＮＡの標的部位内の配列に望ましくないほど相補的でないように意図的に設計されてもよい。
ある実施形態では、リンカーは、少なくとも１つのホスホロチオエート結合を含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなる。
ある実施形態では、リンカーは、レブリニル部分を含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなる。
ある実施形態では、リンカーは、エチレングリコール部分を含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなる。
ある実施形態では、リンカーは、１８Ｓ、９Ｓ又はＣ３を含むか、又はそれらからなる群から選択される。
ある実施形態では、リンカー、又は２つ以上のリンカーが存在する場合、各リンカーは、１～６０又は１～２４又は２～２０又は５～１５ヌクレオチド長であるヌクレオチド配列である。さらに、ある実施形態では、リンカーは、ＧＣ富化であり、例えば、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％又は少なくとも９０％のＧＣヌクレオチドがある。リンカーがヌクレオチドを含む場合、それは、例えば、一本鎖若しくは二本鎖、又は部分的に一本鎖及び部分的に二本鎖であり得る。さらに、リンカーがオリゴヌクレオチドである場合、リンカーは、排他的にＲＮＡ、排他的にＤＮＡ、又はそれらの組み合わせであってよい。
ｉｉｉ）エフェクタータンパク質
本発明で開示されるプラットフォームの第三の成分は、リガンドに結合した非ヌクレアーゼエフェクターである。エフェクタータンパク質はまた、「エフェクター成分」といってよい。ＲＮＡ足場が用いられる実施形態では、リガンドはＲＮＡ結合ドメインである。エフェクターはヌクレアーゼではなく、いかなるヌクレアーゼ活性もないが、他のタイプのＤＮＡ修飾酵素、例えば塩基編集の活性があってよい。酵素活性の例としては、脱アミノ化活性、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、ＤＮＡ修復活性、ＤＮＡ損傷活性、ジスムターゼ活性、ニッカーゼ活性、アルキル化活性、脱プリン活性、酸化活性、ピリミジン二量体形成活性、インテグラーゼ活性、トランスポザーゼ活性、リコンビナーゼ活性、ポリメラーゼ活性、リガーゼ活性、ヘリカーゼ活性、フォトリアーゼ活性又はグリコシラーゼ活性があげられるが、これらに限定されない。ある実施形態では、エフェクターには、シチジンデアミナーゼ（例えば、ＡＩＤ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ）、アデノシンデアミナーゼ（例えば、ＡＤＡ）、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、及びＤＮＡデメチラーゼの活性がある。ある実施形態では、エフェクターは、異なる脊椎動物種に由来し、特性が異なるか、又は所望の属性及び活性をまとめるためにインシリコでアセンブルされた新規キメラタンパク質であり得る。
好ましい実施形態では、この第三の成分は、ＲＮＡ結合ドメイン及びエフェクタードメインがある結合体又は融合タンパク質である。これらの２つのドメインは、リンカーを介して結合され得る。
ある実施形態では、エフェクターは、いくつかの細胞型（例えば、デアミナーゼを過剰発現するがん株）では必要ない。その場合、内因性エフェクター（例えば、ＡＰＯＢＥＣ、ＡＩＤ等）は、動員モジュールを含むように遺伝子編集され得るので、外因性エディターは必要ない。これは、目的のエディターを発現する細胞型（例えば、リンパシステム細胞（Ｂ＋Ｔ細胞）及び特定のがん細胞）に適用可能である。
｛ｃ｝リガンド
いかなる実施形態でも、本発明のリガンドは、ＲＮＡリガンド結合複合体のリガンド結合部分と会合することができ、したがって、塩基編集複合体にエフェクターを動員することができるように選択される。適当なリガンド及びそれらの同族リガンド結合部分を表３に示す。代替リガンド及びそれらの同族リガンド結合部分は、当業界において周知である。
ＲＮＡリガンド結合複合体がＲＮＡ足場である場合、リガンドはＲＮＡ結合ドメインである。様々なＲＮＡ結合ドメインを本発明でリガンドとして用いることができるが、Ｃａｓタンパク質（Ｃａｓ９等）又はその変異体（ｄＣａｓ９等）のＲＮＡ結合ドメインを用いるべきでない。上記のように、規定された構造でＤＮＡに固定されるｄＣａｓ９へ直接融合すると、正しい位置での機能的オリゴマー酵素複合体が形成されない。その代わり、本発明は、様々な他のＲＮＡモチーフ－ＲＮＡ結合タンパク質結合対を利用する。例としては、表４に列挙されるものがあげられる。
このようにして、エフェクタータンパク質は、動員ＲＮＡモチーフに結合するＲＮＡ結合ドメインの機能を介して標的部位に動員され得る。ＲＮＡ足場媒介性動員の柔軟性に起因して、機能的モノマー、並びにダイマー、テトラマー、又はオリゴマーは、標的ＤＮＡ又はＲＮＡ配列の近くで比較的容易に形成され得る。各々の場合、単量体、二量体、四量体又はオリゴマーは、単一のＲＮＡモチーフに動員され得る。好ましい実施形態では、二量体ＲＮＡ結合タンパク質を含むエフェクタータンパク質は、単一のＲＮＡモチーフに動員され得る。そのような実施形態では、２つのＲＮＡ結合ドメイン単量体は各々、個々のエフェクタードメインと会合している。エフェクタードメインは、同じであるか又は異なる。代替的な実施形態では、二量体を構成するＲＮＡ結合ドメインのうちの１つのみがエフェクタードメインと会合している。
｛ｄ｝エフェクタードメイン
エフェクター成分は、活性部分、すなわちエフェクタードメインを含む。エフェクタードメインはまた、「エフェクター」といってよい。ある実施形態では、エフェクタードメインは、非ヌクレアーゼタンパク質（例えば、デアミナーゼ）の天然に存在する活性部分を含む。他の実施形態では、エフェクタードメインは、非ヌクレアーゼタンパク質の天然に存在する活性部分の組換えアミノ酸配列（例えば、置換、欠失、挿入）を含む。エフェクタードメインには、酵素活性がある。この活性の例としては、脱アミノ化活性、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、ＤＮＡ修復活性、ＤＮＡ損傷活性、ジスムターゼ活性、アルキル化活性、脱プリン活性、酸化活性、ピリミジン二量体形成活性、インテグラーゼ活性、トランスポザーゼ活性、リコンビナーゼ活性、ポリメラーゼ活性、リガーゼ活性、ヘリカーゼ活性、フォトリアーゼ活性、グリコシラーゼ活性、ＤＮＡメチル化、ヒストンアセチル化活性、又はヒストンメチル化活性があげられる。非ヌクレアーゼタンパク質（例えば、デアミナーゼ）におけるいくつかの修飾により、オフターゲット効果が低減される。例えば、以下に記載されるように、ＡＩＤにおけるＳｅｒ３８をＡｌａ（配列番号２６）に変異させると、オフターゲット部位へのＡＩＤの動員が減少する。エフェクタードメインとして用いることができるＤＮＡ／ＲＮＡ修飾酵素の例の非網羅的リストを表５に詳述する。
表５ 本発明において用いることができるエフェクター（又はエフェクタードメイン）の例
Figure 2024501757000020
 エフェクター（エフェクタードメイン）フルネーム：
ＡＩＤ：活性化誘導シチジンデアミナーゼ、別名ＡＩＣＤＡ
ＡＰＯＢＥＣ１：アポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡ編集酵素、触媒ポリペプチド様１
ＡＰＯＢＥＣ３Ａ：アポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡ編集酵素、触媒ポリペプチド様３Ａ
ＡＰＯＢＥＣ３Ｂ：アポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡ編集酵素、触媒ポリペプチド様３Ｂ
ＡＰＯＢＥＣ３Ｃ：アポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡ編集酵素、触媒ポリペプチド様３Ｃ
ＡＰＯＢＥＣ３Ｄ：アポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡ編集酵素、触媒ポリペプチド様３Ｄ
ＡＰＯＢＥＣ３Ｆ：アポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡ編集酵素、触媒ポリペプチド様３Ｆ
ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ：アポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡ編集酵素、触媒ポリペプチド様３Ｇ
ＡＰＯＢＥＣ３Ｈ：アポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡ編集酵素、触媒ポリペプチド様３Ｈ
ＡＤＡ：アデノシンデアミナーゼ
ＡＤＡＲ１：ＲＮＡ １に作用するアデノシンデアミナーゼ
ＡＤＡＲ２：ＲＮＡ ２に作用するアデノシンデアミナーゼ
ＡＤＡＲ３：ＲＮＡ ３に作用するアデノシンデアミナーゼ
ＣＤＡ：シチジンデアミナーゼ
ＤｎＭｔ１：ＤＮＡ（シトシン－５－）－メチルトランスフェラーゼ１
ＤｎＭｔ３ａ：ＤＮＡ（シトシン－５－）－メチルトランスフェラーゼ３アルファ。
ＤｎＭｔ３ｂ：ＤＮＡ（シトシン－５－）－メチルトランスフェラーゼ３ベータ
Ｔｅｔ１：１０－１１転座１
Ｔｅｔ２：１０－１１転座２
Ｔｄｇ：チミンＤＮＡグリコシラーゼ
代替的な実施形態では、エフェクタードメインは、レポーター、蛍光タグ、活性薬剤又はＨＤＲ増強因子であり得る。
他のドメイン
エフェクタータンパク質は、他のドメインを含むことができる。特定の実施形態では、エフェクタータンパク質は、少なくとも１つの核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含むことができる。一般に、ＮＬＳは塩基性アミノ酸のストレッチを含む。核局在化シグナルは、当業界で公知である（例えば、Ｌａｎｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２００７，２８２：５１０１－５１０５を参照されたい）。ＮＬＳは、融合タンパク質のＮ末端、Ｃ末端、又は内部位置に位置することができる。ＮＬＳは、オンターゲット塩基編集を最適化するのに役立ち、より効率的な塩基編集をもたらす。
ある実施形態では、融合タンパク質が少なくとも１つの細胞透過性ドメインを含むと、タンパク質を標的細胞へ容易に送達できる。一実施形態では、細胞透過性ドメインは、細胞透過性ペプチド配列であり得る。様々な細胞透過性ペプチド配列が当業界で公知であり、例としては、ＨＩＶ－１ ＴＡＴタンパク質、ヒトＨＢＶのＴＬＭ、Ｐｅｐ－１、ＶＰ２２、及びポリアルギニンペプチド配列の配列があげられる。
一実施形態では、ＡＩＤは、システムがどのように動作するかを示すための例として用いられた。ＡＩＤは、ＤＮＡ又はＲＮＡとの関連でシチジンの脱アミノ化反応を触媒することができるシチジンデアミナーゼである。標的部位に運ばれると、ＡＩＤがＣ塩基をＵ塩基に変化させる。分裂細胞において、これは、ＣからＴへの点変異をもたらし得る。あるいは、ＣからＵへの変化により、細胞ＤＮＡ修復経路、主に、ミスマッチＵ－Ｇ塩基対が除去され、Ｔ－Ａ、Ａ－Ｔ、Ｃ－Ｇａ－Ｔ、Ｃ－Ｇ、又はＧ－Ｃ対で置換する。その結果、標的Ｃ－Ｇ部位に点変異が生じる。切除修復経路は、全てではないがほとんどの体細胞に存在するので、標的部位へのＡＩＤの動員により、Ｃ－Ｇ塩基対を他のものに対して修正されうる。その場合、Ｃ－Ｇ塩基対が体細胞組織／細胞における基礎疾患を誘発する遺伝子突然変異である場合、上記のアプローチを用いて突然変異を修正し、それによって疾患を治療することができる。
同様に、基礎疾患を誘発する遺伝子突然変異が特定の部位におけるＡ－Ｔ塩基対である場合、アデノシンデアミナーゼを特定の部位に動員するために同じアプローチを用いることができ、アデノシンデアミナーゼはＡ－Ｔ塩基対を他の塩基対に修正することができる（例えば、Ｄａｖｉｄ ＬｉｕのＵＳ１０１１３１６３を参照）。他のエフェクター酵素は、塩基対形成において他のタイプの変化を生じることが予想される。
リンカー
上記２つのドメイン並びに本明細書に開示される他のドメインは、化学修飾、ペプチドリンカー、化学リンカー、共有結合若しくは非共有結合、又はタンパク質融合等であるがこれらに限定されないリンカーを用いて、又は当業者に公知のいかなる手段によって結合することができる。結合は永久的であっても可逆的であってよい。例えば、米国特許第４６２５０１４号、同第５０５７３０１号及び同第５５１４３６３号、米国特許出願第２０１５０１８２５９６号及び同第２０１０００６３２５８号、並びに国際公開第２０１２／１４２５１５号を参照されたく、これらの内容は参照によりその全体が本明細書に援用される。ある実施形態では、いくつかのリンカーを含めて結合体中の各リンカー及び各タンパク質ドメインの所望の特性を利用することができる。例えば、可撓性リンカー及び結合体の溶解度を高めるリンカーは、単独で又は他のリンカーと共に用いるために企図される。ペプチドリンカーは、リンカーをコードするＤＮＡを発現させることで、結合体中の１つ以上のタンパク質ドメインに結合することができる。リンカーは、酸切断可能リンカー、光切断可能リンカー及び熱感受性リンカーであり得る。結合のための方法は当業者に周知であり、本発明での使用のために包含される。
ある実施形態では、ＲＮＡ結合ドメイン及びエフェクタードメインは、ペプチドリンカーによって結合され得る。ペプチドリンカーは、２つのドメイン及びリンカーをインフレームでコードする核酸を発現させることによって結合することができる。場合によっては、リンカーペプチドは、ドメインのアミノ末端及びカルボキシ末端のいずれか又は両方で結合され得る。いくつかの例では、リンカーは、米国特許第６，１６５，４７６号、同第５，８５６，４５６号、米国出願第２０１５０１８２５９６号及び同第２０１０／００６３２５８号並びに国際出願第２０１２／１４２５１５パンフレットに開示されるような免疫グロブリンヒンジ領域リンカーであり、これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に援用される。
上記の３つの特定の成分（（ｉ）配列標的化成分（又は配列標的化タンパク質）、（ｉｉ）ＲＮＡ－リガンド結合複合体及び（ｉｉｉ）エフェクタータンパク質）は、技術的プラットフォームを構成する。各成分は、特定の治療／有用性目標を達成するために表１～５から選択することができた。当業者であれば、ガイドＲＮＡは、選択されたタンパク質を標的とする配列に適しているにちがいないことを理解するであろう。リガンド結合部分は選択されたリガンドに適しるにちがいなく、逆もまた同様であることも当業者によって理解されるであろう。
（ｉ）配列標的化タンパク質としてのＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のｄＣａｓ９、（ｉｉ）ｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、及びＭＳ２オペレーターモチーフを含むＲＮＡ足場、並びに（ｉｉｉ）ＭＳ２オペレーター結合タンパク質ＭＣＰに融合するヒトＡＩＤを含むエフェクター融合体、及びＭＣＰに融合したＰｍＣＤＡ１を含有するエフェクター融合体を用いて構築されたＲＮＡ足場媒介性動員システムの非限定的な例を以下に示す。成分の配列を以下に列挙する。
ストレプトコッカス・ピオゲネスｄＣａｓ９のアミノ酸配列（Ｄ１０Ａ、Ｈ８４０Ａ活性部位変異体を太字及び下線で示す）（配列番号１７）
Figure 2024501757000021
 （下線を付した残基：Ｄ１０Ａ、Ｈ８４０Ａ活性部位変異体）。
Ｃａｓ９ Ｄ１０Ａアミノ酸配列（下線を付した突然変異残基：Ｄ１０Ａ、配列番号１８）。
Figure 2024501757000022
 ヒト化Ｃａｓ９ Ｄ１０Ａタンパク質ヌクレオチド配列（配列番号１９）
Figure 2024501757000023
Figure 2024501757000024
Figure 2024501757000025
 ２０ヌクレオチドのプログラム可能な配列、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡモチーフ、及びＭＳ２アプタマーモチーフ（配列番号２０）を含有するＲＮＡ足場発現カセット（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）：
Figure 2024501757000026
 （Ｎ２０：プログラム可能な配列。下線：ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡモチーフ；太字：ＭＳ２モチーフ；イタリック体：終端部）。
上記のＲＮＡ足場は、１つのＭＳ２ループ（１ｘＭＳ２）を含有する。以下に示すのは、２つのＭＳ２ループ（２ｘＭＳ２）を含有するＲＮＡ足場であり、ＭＳ２足場には下線が引かれている（配列番号２１）。
Figure 2024501757000027
 エフェクターＡＩＤ－ＭＣＰ融合体（配列番号２２）：
Figure 2024501757000028
 （ＮＨ２）－ＡＩＤ－リンカー－ＭＣＰ－（ＣＯＯＨ）
上記のＣａｓタンパク質と同様に、非ヌクレアーゼエフェクターも組換えポリペプチドとして得ることができる。組換えポリペプチドを作製するための技術は、当業界で公知である。例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，“Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，” Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．，ＮＹ，１９８３）；Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，２００３；及びＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，２００１）を参照されたい。
本明細書に記載される、ＡＩＤにおいてＳｅｒ３８をＡｌａに変異させることによって、オフターゲット部位へのＡＩＤの動員を低減させることができる。野生型ＡＩＤ及びＡＩＤ＿Ｓ３８Ａ（リン酸化ヌル、ｐｎＡＩＤ）の両方の配列を以下に列挙する。
ｗｔＡＩＤ ｃＤＮＡ（太字下線のＳｅｒ３８コドン、配列番号２３）：
Figure 2024501757000029
 ｗｔＡＩＤタンパク（太字下線のＳｅｒ３８、配列番号２４）：
Figure 2024501757000030
 ＡＩＤ＿Ｓ３８Ａ ｃＤＮＡ（太字下線のＳ３８Ａ変異、配列番号２５）
Figure 2024501757000031
 ＡＩＤ＿Ｓ３８Ａタンパク質（太字下線のＳ３８Ａ変異、配列番号２６）
Figure 2024501757000032
 ヒト化ヌクレオチド配列ＰｍＣＤＡ１（Ｐｅｔｒｏｍｙｚｏｎ ｍａｒｉｎｕｓ）（配列番号２７）
Figure 2024501757000033
 アミノ酸配列ＰｍＣＤＡ１（配列番号２８）
Figure 2024501757000034
 ｐＭＣＤＡ １－リンカー－ＭＣＰ（配列番号２９）
Figure 2024501757000035
 Ｋｅｙ：ｐＭＣＤＡ １－リンカー－ＭＣＰ
上記で概説したＩＩ型Ｃａｓタンパク質と共に用いることができるガイドＲＮＡ構築物のいくつかの非限定的な例示的ＲＮＡ配列を以下に示す。各々は、３’末端から５’末端に向かって、カスタマイズ可能な標的、ｇＲＮＡ足場、及びＭＳ２アプタマーの１つ又は２つのコピーを含有する。
ｇＲＮＡ＿ＭＳ２構築物の配列（配列番号３０）：
Figure 2024501757000036
 Ｋｅｙ：カスタマイズ可能な標的－ｇＲＮＡ足場－ＭＳ ２アプタマー
ｇＲＮＡ＿２ｘＭＳ２構築物の配列（配列番号３１）：
Figure 2024501757000037
 Ｋｅｙ：カスタマイズ可能な標的－ｇＲＮＡ足場－ＭＳ ２アプタマー
本明細書に開示されるプラットフォーム／システムの上記の３つの構成要素は、１つ、２つ、又は３つの発現ベクターを用いて発現され得る。このシステムは、実質的にいかなるＤＮＡ配列又はＲＮＡ配列を標的化するようにプログラムされ得る。上記の第二世代ベースエディターに加えて、いかなる適当なＣａｓオルソログ、デアミナーゼオルソログ、及び他のＤＮＡ修飾酵素を含むシステムのモジュール構成要素を変化させて、同様の第二世代ベースエディターを生成することができる。
結合親和性
ＲＮＡ－タンパク質結合親和性について文献で最も広く用いられている値は、平衡解離定数（Ｋｄ）である。それは次のように定義される比である。
Figure 2024501757000038
 Ｋｄは平衡解離定数である。この一定のｒｅｌｆｌｅｃｔｓは、ＲＮＡ－タンパク錯体（例えば、ＲＮＡ．タンパク）の安定度である。一時的複合体の安定性は、Ｋｄを用いて測定することができる。
Figure 2024501757000039
 ｋｏｆｆは解離速度定数である。この定数により、一時的なＲＮＡ－タンパク質複合体が解離しないままである時間を計算することができる。複合体解離は一次プロセスであるため、解離の半減期（ｔ１／２）はｋｏｆｆのみに依存する。
Figure 2024501757000040
 ｋｏｎは、会合速度定数である。この定数により、阻害の遅延時間、すなわち複合体形成に必要な時間を計算することができる。
一実施形態では、解離定数（ＫＤ）が１００ｎＭ未満である結合親和性があるリガンド結合部分及び／又はリガンドが選択される。好ましい実施形態では、解離定数が１０～１００ｎＭであるＲＮＡモチーフ及び／又はＲＮＡ結合ドメインが選択される。好ましい実施形態では、解離定数が１～１０ｎＭであるリガンド結合部分及び／又はリガンドが選択される。最も好ましい実施形態では、解離定数が１ｎＭ未満であるリガンド結合部分及び／又はリガンドが選択される。リガンド結合部分及び／又はリガンドの低い結合親和性は、解離定数が１００ｎＭを超えるため、このシステムには適していない。
一実施形態では、解離定数（ＫＤ）が１５０ｎＭ未満、１４０ｎＭ未満、１３０ｎＭ未満、１２０ｎＭ未満、１１０ｎＭ未満又は１００ｎＭ未満である結合親和性があるＲＮＡモチーフ及び／又はＲＮＡ結合ドメインが選択される。好ましい実施形態では、解離定数が１０～１５０ｎＭであるＲＮＡモチーフ及び／又はＲＮＡ結合ドメインが選択される。好ましい実施形態では、解離定数が１～１０ｎＭであるＲＮＡモチーフ及び／又はＲＮＡ結合ドメインが選択される。一実施形態では、解離定数が１ｎＭ未満であるＲＮＡモチーフ及び／又はＲＮＡ結合ドメインが選択される。ＲＮＡモチーフ及び／又はＲＮＡ結合ドメインの低い結合親和性は、解離定数が１５０ｎＭを超えるため、このシステムには適していない。
平衡状態での解離定数を測定する方法は、当業者に周知である。優先的に、表面プラズモン共鳴が用いられるべきであり、そのような方法の詳細は、Ｊｉｎｇ，Ｍ．＆Ｂｏｗｓｅｒ，Ｍ．Ｔ．（２０１１）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｍｅａｓｕｒｉｎｇ ａｐｔａｍｅｒ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｑｕｉｌｉｂｒｉａ：Ａ ｒｅｖｉｅｗ．Ａｎａｌｙｔｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ．６８６（１－２），９－１８に記載されている。
細胞型及び治療的使用
宿主動物若しくは患者内に天然に存在するか、又は人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に由来する免疫細胞、特に初代免疫細胞は、本明細書で提供される方法及びシステムを用いて遺伝子組換えされ得る。免疫細胞としては、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、Ｂ細胞、骨髄芽球、赤芽球、並びに全ての血液及び免疫細胞に分化することができる造血幹細胞（ＨＳＣ）等の免疫細胞前駆体である多能性細胞があげられる。造血幹細胞（ＨＳＣ）は、ＨＳＣを生じ得る血管芽細胞、血管平滑筋細胞、及び血管内皮細胞に分化する血管芽細胞から生じる。ＨＳＣは、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、Ｂ細胞、骨髄芽球、赤芽球、並びに血液、骨髄、脾臓、リンパ節、及び胸腺の細胞の産生に関与する他の細胞を生じさせる、共通骨髄性及び共通リンパシステム前駆細胞を生じさせることができる。
本明細書では、インビトロ、インビボ、又はエクスビボでの、原核細胞又は真核細胞におけるゲノム操作のための（例えば、１つ若しくは複数の遺伝子又は１つ若しくは複数の遺伝子産物の発現を変更又は操作するための）方法も提供される。特に、本明細書で提供される方法は、初代ヒトＴ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ＣＤ３４＋造血幹細胞及び前駆細胞（ＨＳＰＣ）、例えば、臍帯血又は骨髄から単離されたＨＳＰＣ及びそれらから分化した細胞を含む哺乳動物細胞における標的化塩基編集破壊に有用である。
本明細書に記載の方法により組換えされたＴ細胞等の造血幹細胞から生じる遺伝子操作された細胞も本明細書において提供される。
ある場合、本方法は、治療的適用のための「普遍的に許容される」細胞として適しているＨＳＣ又はｉＰＳＣから生じる遺伝子操作されたＴ細胞を産生するように構成される。このような方法はまた、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ＣＤ３４＋造血幹細胞及び前駆細胞（ＨＳＰＣ）、例えば臍帯血又は骨髄から単離されたＨＳＰＣ、並びにそれらから分化した細胞に適用することができる。
他の態様では、塩基編集修正のために疾患を標的化する方法が本明細書で提供される。標的配列は、当業界で確立されているいかなる疾患関連ポリヌクレオチド又は遺伝子であり得る。内因性遺伝子配列の変異又は「修正」の有用な適用の例としては、疾患関連遺伝子変異の組換え、スプライス部位をコードする配列の組換え、調節配列の組換え、機能獲得型変異を誘発する配列の組換え、及び／又は機能喪失型変異を誘発する配列の組換え、並びにタンパク質の構造的特徴をコードする配列の標的組換えがあげられる。
ある場合、細胞がキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）及び／又はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するように、本明細書に記載の方法を用いて細胞を遺伝子組換えることが有利であろう。キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）」は、「キメラ受容体」、「Ｔボディ」、「キメラ免疫受容体（ＣＩＲ）」と呼ばれることもある。本明細書で用いられる用語「キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）」は、膜貫通ドメイン及び少なくとも１つの細胞内ドメインに作動可能に結合された抗体の細胞外抗原結合ドメイン（例えば、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ））を含む、人工的に構築されたハイブリッドタンパク質又はポリペプチドをいう。一般に、ＣＡＲの抗原結合ドメインには、目的の標的細胞の表面上に発現される特定の抗原に対する特異性がある。例えば、Ｔ細胞は、Ｂ細胞リンパ腫上のＣＤ１９に特異的なＣＡＲを発現するように操作することができる。ドナーマッチングによって限定されない同種異システム抗腫瘍細胞治療のために、細胞は、ＣＡＲをコードする核酸をノックインするが、ドナーマッチングに関与する遺伝子（ＴＣＲ及びＨＬＡマーカー）もノックアウトするように操作され得る。
本明細書中で用いられる用語「遺伝子組換えされた」及び「遺伝子操作された」は、交換可能に用いられ、挿入のために用いられる方法にかかわらず、外因性ポリヌクレオチドを含む原核生物細胞又は真核生物細胞をいう。ある場合、エフェクター細胞は、ヒトの手によって（例えば、組換えＤＮＡ技術を用いて）作製若しくは組換えされた、又はそのような分子に由来する（例えば、転写、翻訳等によって）、天然に存在しない核酸分子を含むように組換えられる。外因性、組換え、合成、及び／又は別様に修飾されたポリヌクレオチドを含有するエフェクター細胞は、操作された細胞であると見なされる。
他の態様では、本開示は、上記のシステムを含む宿主細胞若しくは細胞株又はその子孫を提供する。他の態様では、細胞株は、本明細書で提供される方法に従って調製された少なくとも１つの細胞に由来し得る。細胞株を調製するための方法は、当業界で周知である。
細胞療法及びエクスビボ療法
本発明の様々な実施形態はまた、治療で用いるために、本発明の他の実施形態のいずれかにより産生又は用いられる細胞を提供する。一実施形態では、本発明は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ－Ｔ）又はＴ細胞受容体（ＴＣＲ－Ｔ）を発現するように組換えられたＴ細胞等の治療用細胞を生成するための方法を対象とする。ＣＡＲ－Ｔ／ＴＣＲ－Ｔ細胞は、初代Ｔ細胞に由来してよく、幹細胞から分化してもよい。適当な幹細胞としては、造血、神経、胚、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、間葉、中胚葉、肝臓、膵臓、筋肉、及び網膜幹細胞や、これらに限定されないヒト幹細胞等の哺乳動物幹細胞があげられるが、これらに限定されない。他の幹細胞としては、マウス幹細胞、例えばマウス胚性幹細胞等の哺乳動物幹細胞があげられるが、これらに限定されない。
様々な実施形態では、本発明は、様々な細胞又は細胞株（哺乳動物由来の細胞があげられるが、これらに限定されない）における単一の遺伝子又は複数の遺伝子の発現をノックアウト、組換え又は高めるために用いられ得る。本システム及び方法は、多重遺伝子組換えに適用することができ、これは、当業界で公知であるように、複数の遺伝子又は同じ遺伝子内の複数の標的を遺伝子組換えすることを含む。この技術としては、非宿主細胞を宿主に対して非免疫原性にすることで移植片対宿主病を予防するための遺伝子のノックアウト、又は非宿主細胞を宿主による攻撃に対して耐性にすることで宿主対移植片病を予防するための遺伝子のノックアウトがあげられるが、これらに限定されない多くの用途に用いることができる。当該アプローチはまた、同種異システム（既製）又は自己（患者特異的）細胞ベースの治療薬を生成することに関連する。このような遺伝子としては、Ｔ細胞レセプター（ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、ＴＲＤＣ、ＴＲＧＣ１、ＴＲＧＣ２）、例えば、Ｂ２Ｍを含む主要組織適合遺伝子（ＭＨＣクラスＩ及びクラスＩＩ）遺伝子、コレセプター（ＨＬＡ－Ｆ、ＨＬＡ－Ｇ）、以下の：自然免疫応答（ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＨＣＰ５、ＳＴＩＮＧ、ＤＤＸ４１、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ））、炎症（ＮＫＢＢｉＬ、ＬＴＡ、ＴＮＦ、ＬＴＢ、ＬＳＴ１、ＮＣＲ３、ＡＩＦ１）、熱ショックタンパク質（ＨＳＰＡ１Ｌ、ＨＳＰＡ１Ａ、ＨＳＰＡ１Ｂ）、補体カスケード、制御受容体（ＮＯＴＣＨファミリーメンバー）、に関与する遺伝子、抗原プロセシング（ＴＡＰ、ＨＬＡ－ＤＭ、ＨＬＡ－ＤＯ）、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、確認ポイントタンパク質のＢ７ファミリーの他のメンバー等）、に関与する遺伝子、免疫抑制性免疫細胞に関与する遺伝子（ＦＯＸＰ３やインターロイキン（ＩＬ）－１０等）、Ｔ細胞と腫瘍微小環境との相互作用に関与する遺伝子（ＴＧＦＢ、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、ＩＦＮγ等のサイトカインのレセプターを含むがこれらに限定されない）、サイトカイン放出症候群に関与する遺伝子（ＩＬ－６、ＩＦＮγ、ＩＬ－８（ＣＸＣＬ８）、ＩＬ－１０、ＧＭ－ＣＳＦ、ＭＩＰ－１α／β、ＭＣＰ－１（ＣＣＬ２）、ＣＸＣＬ９、およびＣＸＣＬ１０（ＩＰ－１０）を含むがこれらに限定されない）、ＣＡＲ／ＴＣＲが標的とする抗原をコードする遺伝子（例えば、ＣＡＲがＣＳ１に対して設計されている場合、内因性ＣＳ１）、又はＣＡＲ－Ｔ／ＴＣＲ－Ｔ（ＴＥＴ２等）、又はＣＡＲ－ＮＫ、ＣＡＲ－Ｂ等を含むがこれらに限定されない他の細胞ベースの治療薬に有益であることが見出された他の遺伝子、があげられるが、これらに限定されない。例えば、ＤｅＲｅｎｚｏ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｔｏ Ｅｎｈａｎｃｅ ＣＡＲ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅ ｆｏｒ Ｐａｔｉｅｎｔｓ Ｗｉｔｈ Ｓｏｌｉｄ Ｔｕｍｏｒｓ．Ｆｒｏｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５ Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２０１９を参照されたい。
この技術はまた、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞及びＮＫ細胞）の破壊に関与する遺伝子、又は外来細胞、粒子若しくは分子が患者若しくは動物に侵入したことを患者若しくは動物の免疫システムに警告する遺伝子、又は免疫応答を低下させるか若しくはブーストするために用いられる現在の治療標的であるタンパク質（例えば、各々ＣＤ５２及びＰＤ１）をコードする遺伝子をノックダウン又は組換えるために用いられ得る。
本明細書で提供される方法及びシステムの１つの適用は、骨髄細胞又はｉＰＳ細胞から分化した骨髄細胞のＨＬＡ対立遺伝子を組換えて、ハプロタイプｈｌａ対立遺伝子を組換えることである。組換え細胞は、白血病を治療するための骨髄移植に用いることができる。他の適用は、鎌状赤血球貧血及びβ－サラセミアを治療するために、造血幹細胞における胎児ヘモグロビン遺伝子の負の調節エレメントを組換えることである。負の調節エレメントが変異されると、胎児ヘモグロビン遺伝子の発現が造血幹細胞において再活性化され、成人アルファ又はベータヘモグロビン遺伝子の変異による機能喪失が補償される。さらなる適用は、パーキンソン病（ニューロン細胞喪失）、１型糖尿病（膵臓β細胞喪失）を含む様々な変性疾患のための同種異システム治療用細胞を生成するためにｉＰＳ細胞を組換えることである。他の例示的な用途としては、ＣＣＲ５遺伝子及びＨＩＶ侵入細胞に必要な受容体をコードする他の遺伝子を不活性化することによるＨＩＶ感染耐性Ｔ細胞の操作；ジストロフィンの発現を再確立するためのＤＭＤ遺伝子中の未成熟終止コドンの除去；並びにｐ５３ Ｙ１６３Ｃ等のがんドライバー突然変異の修正があげられる。
遺伝子組換えのタイプ
したがって、本明細書では、標的遺伝子の転写又は翻訳の標的破壊のための方法が提供される。特に、本方法としては、開始コドンの破壊による標的遺伝子の転写又は翻訳の標的破壊、未成熟終止コドンの導入、及び／又はイントロン／エクソンスプライス部位の標的破壊があげられる。
本明細書に記載される方法を用いて、改善された効率及びオフターゲットインデル形成の低減された速度で、初代細胞において１つ以上の目的の遺伝子をノックイン及び／又はノックアウトすることができる。好ましい実施形態では、本方法は、遺伝子ノックイン、遺伝子ノックアウト、及びミスセンス変異を含む多重化塩基編集のために用いられる。
以下の段落及び実施例に記載されるように、ゲノム操作に対する本発明者らの合理化されたアプローチは、ノックアウト及びミスセンス変異による標的化された遺伝子破壊並びに遺伝子修正を含む適用のために基本エディタを用いる。本明細書に記載される方法は、免疫細胞生物学及び遺伝子機能の研究、原発性免疫不全症等の疾患のモデル化、並びに疾患を誘発する点変異の修正、及び治療用途のための新規細胞産物（例えば、Ｔ細胞産物）の生成によく適している。
スプライスアクセプター－スプライスドナー（ＳＡ－ＳＤ）部位での破壊もまた、終止コドンリードスルーを伴わずにコード配列及び非コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）をノックアウトし得るので、有用である。
成分の細胞への送達
塩基編集構成要素を造血細胞等の免疫細胞に送達するための好適な方法は、本明細書の以下の実施例に提供される。
本明細書で提供される実施形態では、ガイドＲＮＡ分子は、以下に列挙されるがこれらに限定されない様々な方法を介して標的細胞に送達され得る。第一に、電気穿孔、ヌクレオフェクション、トランスフェクション、ナノ粒子経由、ウイルス媒介ＲＮＡ送達経由、非ウイルス媒介送達経由による、目的の細胞への合成ＲＮＡ分子（ｓｇＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、及びそれらの修飾体のいずれか）の直接導入、細胞外小胞（例えば、エキソソーム及び微小胞）による、真核細胞移入（例えば、組換え酵母）等、ＲＮＡ分子をパッケージングすることができ、ゲノムランドスケープを変化させずに標的生細胞に送達することができる他の方法による。ガイドＲＮＡの導入のための他の方法としては、標的ガイドＲＮＡに転写され得るように、タンパク動員のための関連配列を含むポリヌクレオチドの非組込み一過性導入があげられるが、これには限定されず、ＤＮＡのみのビヒクル（例えば、プラスミド、ＭｉｎｉＣｉｒｃｌｅｓ、ＭｉｎｉＶｅｃｔｏｒｓ、ＭｉｎｉＳｔｒｉｎｇｓ、プロテロメラーゼ生成ＤＮＡ分子（例えばＤｏｇｇｙｂｏｎｅｓ）、人工染色体（例えばＨＡＣ）、コスミド）、ナノ粒子によるＤＮＡビヒクル、細胞外小胞（エクソソームやマイクロベシクル等）、真核細胞移入（組み換え酵母等）、ＡＡＶによる一過性のウイルス移入、非組込み型ウイルス粒子（レンチウイルスやレトロウイルスに基づくシステム等）、細胞貫通ペプチド等、ゲノムランドスケープに直接組み込まずにＤＮＡを細胞内に導入することができる技術があげられる。
ガイドＲＮＡの導入のための他の方法としては、ガイドＲＮＡ転写のための機械を標的細胞のゲノムに安定的に導入するための組込み遺伝子導入技術の使用があげられ、これにより、ガイドＲＮＡの発現を減弱させるための構成的又はプロモーター誘導性システムを介して制御することができ、また、また、実用性を満たした後にシステムを除去できるように設計することもでき（例えば、Ｃｒｅ－Ｌｏｘ組換えシステムを導入する）このような安定した遺伝子導入のための技術としては、ウイルス粒子（例えば、レンチウイルス、アデノウイルス、レトロウイルスに基づくシステム）の統合、トランスポザーゼを介した導入（例えば、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ ＢｅａｕｔｙやＰｉｇｇｙｂａｃ）、ＤＮＡ切断によって導入される非相同修復経路の利用（例えば、ＣＲＩＳＰＲやＴＡＬＥＮの利用）、サロゲートＤＮＡ分子、標的ＤＮＡの目的の細胞への組込みを促進するその他の技術があげられるが、これらに限定されない。
デアミナーゼエフェクター融合タンパク質を送達する方法とＣＲＩＳＰＲシークエンシング標的成分は、多くの場合、同じ技術によって媒介されるが、状況によっては、異なる方法によって送達を媒介する利点がある。第一に、電気穿孔、ヌクレオフェクション、トランスフェクション、ナノ粒子経由、ウイルス媒介パッケージ化送達、細胞外小胞（例えばエクソソームやマイクロベシクル）経由、真核細胞移入（例えば組換え酵母による）、及び高分子をパッケージ化でき、ゲノムランドスケープに組み込まずに標的生細胞に送達できる他の方法によって、ｍＲＮＡおよびタンパク質分子を目的の細胞に直接導入する。分子を導入するための他の方法としては、分子又は分子が標的タンパク質分子に転写および翻訳され得るように、タンパク動員のための関連配列を含むポリヌクレオチドの非組込み一過性導入があげられるが、これには限定されず、ＤＮＡのみのビヒクル（例えば、プラスミド、ＭｉｎｉＣｉｒｃｌｅｓ、ＭｉｎｉＶｅｃｔｏｒｓ、ＭｉｎｉＳｔｒｉｎｇｓ、プロテロメラーゼ生成ＤＮＡ分子（例えば、Ｄｏｇｇｙｂｏｎｅｓ）、人工染色体（例えばＨＡＣ）、コスミド）、ナノ粒子によるＤＮＡビヒクル、細胞外小胞（例えばエクソソームやマイクロベシクル）、真核細胞移入（例えば組換え酵母による）、ＡＡＶによる一過性ウイルス移入、非組込み型ウイルス粒子（例えばレンチウイルスやレトロウイルスに基づくシステム）、かつ、ゲノムランドスケープに直接組み込まずに細胞へのＤＮＡ導入を仲介することができる他の技術を介する。
デアミナーゼエフェクター融合タンパク質およびＣＲＩＳＰＲシークエンシング標的コンポーネントを導入するための別の方法としては、標的細胞のゲノムに転写および翻訳のための機構を安定的に導入するための組込み型遺伝子導入技術の使用があげられ、これは、分子または分子の発現を減弱させるために構成的または誘導可能なプロモーターシステムを介して制御することができ、これはまた、有用性が満たされた後にシステムを除去することができるように設計することができる（例えば、 安定した遺伝子導入のためのこのような技術には、ウイルス粒子（例えば、レンチウイルス、アデノウイルス、レトロウイルスに基づくシステム）の統合、トランスポザーゼを介した導入（例えば、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ ＢｅａｕｔｙやＰｉｇｇｙｂａｃ）、ＤＮＡ切断によって導入される非相同修復経路の利用（例えば、ＣＲＩＳＰＲやＴＡＬＥＮの利用）技術やサロゲートＤＮＡ分子、標的ＤＮＡの目的の細胞への統合を促すその他の技術が含まれるが、これらに限定されるものではない。
発現システム
上記のプラットフォームを用いるために、タンパク質及びＲＮＡ成分の１つ又は複数をコードする核酸から発現させることが望ましい場合がある。これは、様々な方法で行うことができる。例えば、ＲＮＡ足場又はタンパク質をコードする核酸を、複製及び／又は転写のために原核細胞又は真核細胞に導入するための１つ又は複数の中間ベクターにクローニングすることができる。中間ベクターは、通常、ＲＮＡ足場又はタンパク質の産生のためのＲＮＡ足場又はタンパク質をコードする核酸の保存又は組換えのための原核生物ベクター、例えば、プラスミド、又はシャトルベクター、又は昆虫ベクターである。核酸はまた、植物細胞、動物細胞、好ましくは哺乳動物細胞若しくはヒト細胞、真菌細胞、細菌細胞、又は原生動物細胞への投与のために、１つ以上の発現ベクターにクローニングすることができる。したがって、本発明は、上記のＲＮＡ足場又はタンパク質のいずれかをコードする核酸を提供する。好ましくは、核酸は単離及び／又は精製される。
本発明はまた、上記のＲＮＡ骨格又はタンパク質の１つ以上をコードする配列がある組換え構築物又はベクターを提供する。構築物の例としては、本発明の核酸配列が順方向又は逆方向に挿入されているベクター（例えば、プラスミド又はウイルスベクター）があげられる。好ましい実施形態では、この構築物は、この配列に作動可能に結合された調節配列（プロモーターを含む）をさらに含む。多数の適当なベクター及びプロモーターが当業者に公知であり、市販されている。原核生物宿主及び真核生物宿主とともに用いるための適当なクローニングベクター及び発現ベクターはまた、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ）に記載される。
ベクターは、それが結合されている他の核酸を輸送することができる核酸分子をいう。ベクターは、自律複製又は宿主ＤＮＡへ組み込みしうる。ベクターとしては、プラスミド、コスミド、又はウイルスベクターがあげられる。本発明のベクターは、宿主細胞における核酸の発現に適した形態の核酸を含む。好ましくは、ベクターは、発現されるべき核酸配列に作動可能に結合された１つ以上の調節配列を含む。「調節配列」は、プロモーター、エンハンサー、及び他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含む。調節配列には、ヌクレオチド配列の構成的発現を指示するもの、並びに誘導性調節配列が含まれる。発現ベクターの設計は、形質転換、トランスフェクト、又は形質導入される宿主細胞の選択、所望のＲＮＡ又はタンパク質の発現レベル等の因子によってよい。
発現ベクターの例としては、染色体、非染色体及び合成ＤＮＡ配列、細菌プラスミド、ファージＤＮＡ、バキュロウイルス、酵母プラスミド、プラスミドとファージＤＮＡとの組合せに由来するベクター、ワクシニア、アデノウイルス、ポックスウイルス及び仮性狂犬病等のウイルスＤＮＡがあげられる。しかし、宿主中で複製可能かつ生存可能であるならば、いかなる他のベクターを用いてよい。適当な核酸配列は、様々な手順によってベクターに挿入され得る。一般的に、上記のＲＮＡ又はタンパク質の１つをコードする核酸配列は、当業界で公知の手順によって適当な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入され得る。このような手順及び関連するサブクローニング手順は、当業者の範囲内である。
ベクターは、発現を増幅するための適当な配列を含み得る。さらに、発現ベクターは、好ましくは、形質転換された宿主細胞の選択のための表現型形質を提供する１つ以上の選択マーカー遺伝子（例えば、真核生物細胞培養物についてはジヒドロ葉酸レダクターゼ又はネオマイシン耐性、あるいはＥ．ｃｏｌｉにおけるテトラサイクリン耐性又はアンピシリン耐性）を含む。
ＲＮＡを発現させるためのベクターとしては、ＲＮＡの発現を駆動するためのＲＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター、例えば、Ｈ１、Ｕ６又は７ＳＫプロモーターであってよい。これらのヒトプロモーターにより、プラスミドトランスフェクション後に哺乳動物細胞でＲＮＡが発現されうる。あるいは、Ｔ７プロモーターは、例えば、インビトロ転写のために用いられてよく、そしてＲＮＡは、インビトロで転写され、そして精製されてよい。
上記のような適当な核酸配列、並びに適当なプロモーター又は制御配列を含むベクターにより、適当な宿主を形質転換、トランスフェクト、又は感染させて、宿主が上記のＲＮＡ又はタンパク質を発現しうる。適当な発現宿主の例としては、細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、真菌細胞（酵母）、昆虫細胞（例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ及びＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ９））、動物細胞（例えば、ＣＨＯ、ＣＯＳ、及びＨＥＫ ２９３）、アデノウイルス、及び植物細胞があげられる。適当な宿主の選択は、当業者の範囲内である。ある実施形態では、本発明は、ＲＮＡ、又はポリペプチド、又はタンパク質のうちの１つをコードするヌクレオチド配列がある発現ベクターで宿主細胞を形質転換、トランスフェクト、又は感染させて、上記のＲＮＡ又はタンパク質を産生するための方法を提供する。その後、宿主細胞は、ＲＮＡ又はタンパク質の発現を可能にする適当な条件下で培養される。
外来ヌクレオチド配列を宿主細胞に導入するための当業界で公知のいかなる手順が用いられ得る。例としては、リン酸カルシウムトランスフェクション、ポリブレン、プロトプラスト融合、電気穿孔、ヌクレオフェクション、リポソーム、マイクロインジェクション、裸のＤＮＡ、プラスミドベクター、ウイルスベクター（エピソーム及び組込みの両方）、並びにクローニングされたゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ又は他の外来遺伝物質を宿主細胞に導入するための他の周知の方法のいずれかを用いてよい。
細胞の培養
本方法は、ガイドＲＮＡがエフェクタータンパク質を標的配列中の標的部位にガイドし、エフェクタードメインが標的配列を修飾するような適当な条件下で細胞を維持することをさらに含む。
一般に、細胞は、細胞増殖及び／又は維持に適した条件下で維持することができる。適当な細胞培養条件は、当業界で周知であり、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ“Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２００３又は“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”Ｓａｍｂｒｏｏｋ＆Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１），Ｓａｎｔｉａｇｏ ｅｔ ａｌ．（２００８）ＰＮＡＳ １０５：５８０９－５８１４；Ｍｏｅｈｌｅ ｅｔ ａｌ．（２００７）ＰＮＡＳ １０４：３０５５－３０６０；Ｕｒｎｏｖ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｎａｔｕｒｅ ４３５：６４６－６５１；及びＬｏｍｂａｒｄｏ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２５：１２９８－１３０６に記載されている。細胞を培養するための方法が当業界で公知であり、当業者は、細胞型に依存して変化してよく、そして変化することを理解する。全ての場合、ルーチン最適化を用いて、特定の細胞型に対する最良の技術を決定することができる。
本明細書において提供される方法に有用な細胞は、新たに単離された初代細胞であり得るか、又は初代細胞培養物の凍結アリコートから得ることができる。ある場合、細胞は、ｇＲＮＡ及び塩基編集融合タンパク質の取り込みのために電気穿孔される。以下の実施例に記載されるように、いくつかのアッセイ（例えば、Ｔ細胞）のための電気穿孔条件は、１６００ボルト、１０ミリ秒のパルス幅、３パルスをであってよい。電気穿孔後、電気穿孔されたＴ細胞を細胞培養培地中で回復させ、その後、Ｔ細胞増殖培地中で培養する。ある場合、電気穿孔された細胞は、細胞培養培地中で約５～約３０分間（例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０分間）回復される。好ましくは、回収細胞培養培地は、抗生物質又は他の選択剤を含まない。ある場合、Ｔ細胞増殖培地は、Ｉｍｍｕｎｏｃｕｌｔ ＸＴ Ｔ細胞増殖培地である。
キット
本明細書に記載される技術の他の態様は、遺伝子組換え細胞を生成するために用いるためのキットに関する。本明細書に記載されるのは、キットの１つ以上に含まれ得るキット構成要素である。
ある実施形態では、本明細書に記載される構成要素は、単独で、又はキットとしてのいかなる組み合わせで提供され得る。キットは、本明細書に記載される構成要素、例えば、配列標的化タンパク質、ＲＮＡ－リガンド結合複合体（又はＲＮＡ足場）、及び２つ以上のエフェクタータンパク質を含む。
ある実施形態では、キットの構成要素は、ｍＲＮＡ、プラスミド、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）、又はこれらの形式のうちの２つ以上の組み合わせとして提供され得る。例えば、一実施形態では、配列標的化成分及びエフェクタータンパク質は、別個のｍＲＮＡ分子として提供されてもよく、一方、部分合成ｓｇＲＮＡ及び関連するＲＮＡモチーフ（ＲＮＡ足場）は、ＲＮＡとして提供される。あるいは、他の実施形態では、配列標的化成分及びエフェクタータンパク質は、別個のｍＲＮＡ分子として提供されてよく、一方、ＲＮＡ骨格は、ハイブリダイズして単一のＲＮＡ－リガンド結合複合体を形成し得る１つ以上の別個の成分として提供される。他の実施形態では、配列標的化成分及びエフェクタータンパク質は、別個のＲＮＰとして提供されてよく、一方、部分合成ｓｇＲＮＡ及び関連するＲＮＡモチーフ（ＲＮＡ足場）は、ＲＮＡとして提供される。あるいは、他の実施形態では、配列標的化成分及びエフェクタータンパク質は、別個のＲＮＰとして提供され得るが、ＲＮＡ足場は、ハイブリダイズして単一のＲＮＡ－リガンド結合複合体を形成することができる１つ又は複数の別個の成分として提供される。
ある実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、安定的に発現する細胞株を用いて提供され得る。
ある実施形態では、キット中の化合物は、ある実施形態ではキットの他の成分を実質的に含まない水密又は気密容器中で提供することができる。ある実施形態では、成分は、単一の容器で提供され得る。本明細書に記載の成分（複数可）は、実質的に純粋及び／又は無菌であることが好ましい。
キットは、通常、その様々な要素が１つのパッケージ、例えば、繊維系、例えば、ボール紙、又はポリマーの、例えば、スタイロフォーム（登録商標）（Ｓｔｙｒｏｆｏａｍ）の箱に含まれて提供される。エンクロージャは、内部と外部との間の温度差を維持するように構成することができ、例えば、予め選択された時間にわたって予め選択された温度で試薬を保持するための絶縁特性を提供することができる。
定義
核酸又はポリヌクレオチドとしては、ＤＮＡ分子（例えば、限定されないが、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ）又はＲＮＡ分子（例えば、限定されないが、ｍＲＮＡ）をいい、ＤＮＡ又はＲＮＡ類似体があげられる。ＤＮＡアナログ又はＲＮＡアナログは、ヌクレオチドアナログから合成され得る。ＤＮＡ又はＲＮＡ分子は、天然に存在しない部分、例えば、修飾塩基、修飾骨格、ＲＮＡ中のデオキシリボヌクレオチド等を含み得る。核酸分子は、一本鎖又は二本鎖であり得る。
核酸分子又はポリペプチドに言及する場合の用語「単離された」は、核酸分子又はポリペプチドが、それが天然で会合しているか又はともに見出される少なくとも１つの他の成分を実質的に含まないことを意味する。
本明細書で用いられる用語「ガイドＲＮＡ」は、一般に、ＣＲＩＳＰＲタンパク質に結合し、標的ＤＮＡ内の特定の位置にＣＲＩＳＰＲタンパク質を標的化することができるＲＮＡ分子（又は集合的にＲＮＡ分子の群）をいう。ガイドＲＮＡは、２つのセグメント：ＤＮＡ標的化ガイドセグメント及びタンパク質結合セグメントを含み得る。ＤＮＡ標的化セグメントは、標的配列に相補的である（又は少なくともストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる）ヌクレオチド配列を含む。タンパク質結合セグメントは、Ｃａｓ９若しくはＣａｓ９関連ポリペプチド、又はＣａｓ１２若しくはＣａｓ１２関連ポリペプチド等のＣＲＩＳＰＲタンパク質と相互作用する。これらの２つのセグメントは、同じＲＮＡ分子又は２つ以上の別個のＲＮＡ分子に位置し得る。ガイドＲＮＡを含む成分は、ガイドＲＮＡが用いられることが意図されるタンパク質を標的とする配列に基づいて適当に選択及び／又は設計される。例えば、配列標的化タンパク質がＣａｓ９又はＣａｓ９関連ポリペプチドである場合、ガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡを含む。配列標的化タンパク質がＶ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムに由来する場合、ガイドＲＮＡは、ｃｒ－ｏｎｌｙガイドＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡガイドＲＮＡ又はｃｒＲＮＡ：ｓｃｏｕｔＲＮＡガイドＲＮＡであってよい。
本明細書で用いられる用語「標的核酸」又は「標的」は、標的核酸配列を含有する核酸をいう。標的核酸は、一本鎖又は二本鎖であり得、多くの場合、二本鎖ＤＮＡである。本明細書で用いられる「標的核酸配列」、「標的配列」又は「標的領域」は、ＣＲＩＳＰＲシステムを用いて結合又は修飾することが望まれる特定の配列又はその相補体を意味する。標的配列は、一本鎖又は二本鎖核酸のいかなる形態であり得る、細胞のゲノム内のインビトロ又はインビボの核酸内にあり得る。
「標的核酸鎖」は、本明細書に開示されるガイドＲＮＡとの塩基対合に供される標的核酸の鎖をいう。すなわち、ｃｒＲＮＡ及び標的配列とハイブリダイズする標的核酸の鎖は、「標的核酸鎖」という。標的配列と相補的でない標的核酸のもう一方の鎖は、「非相補鎖」という。二本鎖標的核酸（例えば、ＤＮＡ）の場合、各鎖は、ｃｒＲＮＡ及びガイドＲＮＡを設計するための「標的核酸鎖」であってよく、適当なＰＡＭ部位が存在する限り、本発明の方法を実施するために用いられ得る。いくつかのＶ型Ｃａｓタンパク質は、ＰＡＭ部位が必要なく標的核酸鎖と塩基対合することができることに留意すべきである。
本明細書で用いられる用語「ＲＮＡ足場」は、リガンド結合部分がＲＮＡモチーフ（又はＲＮＡアプタマー）であるＲＮＡリガンド結合複合体をいう。
本明細書で用いられる用語「由来」は、第一の成分（例えば、第一の分子）、又はその第一の成分からの情報を用いて、異なる第二の成分（例えば、第一の成分とは異なる第二の分子）を単離、誘導又は作製するプロセスをいう。例えば、哺乳動物コドン最適化Ｃａｓ９ポリヌクレオチドは、野生型Ｃａｓ９タンパク質アミノ酸配列に由来する。また、Ｃａｓ９単一突然変異ニッカーゼ（ｎＣａｓ９、例えばｎＣａｓ９Ｄ１０Ａ）及びＣａｓ９二重突然変異ヌルヌクレアーゼ（ｄＣａｓ９、例えばｄＣａｓ９ Ｄ１０Ａ Ｈ８４０Ａ）を含む変異体哺乳動物コドン最適化Ｃａｓ９ポリヌクレオチドは、野生型哺乳動物コドン最適化Ｃａｓ９タンパク質をコードするポリヌクレオチドに由来する。
本明細書中で用いられる用語「野生型」は、当業者によって理解される当業界の用語であり、変異体形態又は組換え体形態と区別され、天然に存在する生物、株、遺伝子又は特徴の通常の形態を意味する。
本明細書中で用いられる用語「変異体」は、第二の組成物（例えば、「親」分子ともいう第二の分子）に関連する第一の組成物（例えば、第一の分子）をいう。変異体分子は、親分子に由来し得るか、親分子から単離され得るか、親分子に基づき得るか、又は親分子と相同であり得る。例えば、Ｃａｓ９単一突然変異ニッカーゼ及びＣａｓ９二重突然変異ヌルヌクレアーゼを含む哺乳動物コドン最適化Ｃａｓ９（ｈｓｐＣａｓ９）の突然変異体は、哺乳動物コドン最適化野生型Ｃａｓ９（ｈｓｐＣａｓ９）の変異体である。用語「変異体」は、ポリヌクレオチドポリヌクレオチド又はポリペプチドのいずれかを記載するために用いられ得る。
ポリヌクレオチドに適用される、組換え体分子は、元の親分子のヌクレオチド配列との同一性が完全であるか、あるいは、親分子のヌクレオチド配列との同一性が１００％未満であり得る。例えば、遺伝子ヌクレオチド配列の変異体は、元のヌクレオチド配列と比較して、ヌクレオチド配列において少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％又はそれ以上同一である第二のヌクレオチド配列であり得る。ポリヌクレオチド変異体はまた、親ポリヌクレオチド全体を含み、そしてさらなる融合ヌクレオチド配列をさらに含むポリヌクレオチドを含む。ポリヌクレオチド組換え体はまた、親ポリヌクレオチドの部分配列又はサブ配列であるポリヌクレオチドを含み、例えば、本明細書中に開示されるポリヌクレオチドの独特のサブ配列（例えば、標準的な配列比較及び整列技術によって決定されるような）もまた、本発明に含まれる。
他の態様では、ポリヌクレオチド組換え体は、親ヌクレオチド配列に対するマイナーな変化、些細な変化、又は取るに足らない変化を含むヌクレオチド配列を含む。例えば、軽微な、些細な、又は取るに足らない変化は、（ｉ）対応するポリペプチドのアミノ酸配列を変化させない、（ｉｉ）ポリヌクレオチドのタンパク質コードオープンリーディングフレームの外側に生じる、（ｉｉｉ）対応するアミノ酸配列に影響を及ぼし得るが、ポリペプチドの生物学的活性にほとんど又は全く影響を及ぼさない欠失又は挿入をもたらす、（ｉｖ）ヌクレオチド変化は、アミノ酸の化学的に類似のアミノ酸による置換をもたらす、ヌクレオチド配列に対する変化を含む。ポリヌクレオチドがタンパク質（例えば、ｔＲＮＡ又はｃｒＲＮＡ又はｔｒａｃｒＲＮＡ）をコードしない場合、そのポリヌクレオチドの変異体は、ポリヌクレオチドの機能の喪失をもたらさないヌクレオチド変化を含み得る。他の態様では、機能的に同一のヌクレオチド配列を生じる開示されたヌクレオチド配列の保存的組換え体は、本発明に含まれる。当業者は、開示されたヌクレオチド配列の多くの組換え体が本発明に含まれることを理解する。
タンパク質に適用される場合、組換え体ポリペプチドは、元の親ポリペプチドのアミノ酸配列との同一性が完全であるか、あるいは、親タンパク質のアミノ酸配列との同一性が１００％未満であり得る。例えば、アミノ酸配列の変異体は、元のアミノ酸配列と比較してアミノ酸配列が少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上同一である第二のアミノ酸配列であり得る。
ポリペプチド変異体には、親ポリペプチド全体を含み、さらなる融合アミノ酸配列をさらに含むポリペプチドが含まれる。ポリペプチド組換え体はまた、親ポリペプチドの部分又はサブ配列であるポリペプチドを含み、例えば、本明細書中に開示されるポリペプチドの独特のサブ配列（例えば、標準的な配列比較及び整列技術によって決定されるような）もまた、本発明に含まれる。
他の態様では、ポリペプチド変異体は、親アミノ酸配列に対して軽微な、些細な、又は取るに足らない変化を含有するポリペプチドを含む。例えば、軽微な、些細な又は重要でない変化には、ポリペプチドの生物学的活性にほとんど又は全く影響を及ぼさず、機能的に同一のポリペプチドを生じるアミノ酸変化（置換、欠失及び挿入を含む）が含まれ、非機能的ペプチド配列の付加を含む。他の態様では、本発明の変異体ポリペプチドは、親分子の生物学的活性を変化させ、例えば、ヌクレアーゼ活性を組換え又は喪失したＣａｓ９ポリペプチドの突然変異体変異体である。当業者は、開示されたポリペプチドの多くの組換え体が本発明に含まれることを理解する。
ある態様では、本発明のポリヌクレオチド又はポリペプチド組換え体は、ヌクレオチド又はアミノ酸位置を低比率（例えば、代表的には、約１０％未満、約５％未満、４％未満、２％未満又は１％未満）で組換え、付加又は欠失する組換え体分子を含み得る。
ヌクレオチド配列又はアミノ酸配列において本明細書中で用いられる用語「保存的置換」は、（ｉ）トリプレットコドンコードの重複性に起因するアミノ酸配列におけるいかなる対応する変化を生じないか、又は（ｉｉ）元の親アミノ酸の化学的に類似の構造があるアミノ酸での置換を生じるかのいずれかである、ヌクレオチド配列における変化をいう。機能的に類似のアミノ酸を提供する保存的置換表は、当業界で周知であり、ここで、１つのアミノ酸残基は、類似の化学的特性（例えば、芳香族側鎖又は正に荷電した側鎖）がある他のアミノ酸残基に置換され、従って、得られるポリペプチド分子の機能的特性を実質的に変化させない。
以下は、類似の化学的特性を含む天然アミノ酸のグループ分けであり、ここで、グループ内の置換は、「保存的」アミノ酸置換である。異なる機能的特性が考慮される場合、これらの天然アミノ酸は異なる群に配置され得るので、以下に示されるこの群は固定されていない。非極性側鎖及び／又は脂肪族側鎖があるアミノ酸には、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン及びプロリンがあげられる。極性非荷電側鎖があるアミノ酸としては、セリン、トレオニン、システイン、メチオニン、アスパラギン及びグルタミンがあげられる。芳香族側鎖があるアミノ酸としては、フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファンがあげられる。正に荷電した側鎖があるアミノ酸としては、リジン、アルギニン及びヒスチジンがあげられる。負に荷電した側鎖があるアミノ酸としては、アスパラギン酸及びグルタミン酸があげられる。
「Ｃａｓ９突然変異体」又は「Ｃａｓ９変異体」は、化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９タンパク質（配列番号４４）等の野生型Ｃａｓ９タンパク質のタンパク質又はポリペプチド誘導体、例えば、１つ又は複数の点変異、挿入、欠失、切断があるタンパク質、融合タンパク質、又はそれらの組み合わせをいう。それは、Ｃａｓ９タンパク質のＲＮＡ標的化活性を実質的に保持する。タンパク質又はポリペプチドは、配列番号４４の断片を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になることができる。一般に、突然変異体／変異体は、配列番号４４と少なくとも５０％（例えば、５０％～１００％の間のいかなる数を含む）同一である。変異体／変異体は、ＲＮＡ分子に結合し、ＲＮＡ分子を介して特定のＤＮＡ配列を標的とすることができ、さらにヌクレアーゼ活性があってよい。これらのドメインの例としては、ＲｕｖＣ様モチーフ（ａａ．７～２２、７５９～７６６及び９８２～９８９）及びＨＮＨモチーフ（ａａ８３７～８６３）があげられる。Ｇａｓｉｕｎａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２０１２ Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２５；１０９（３９）：Ｅ２５７９ Ｅ２５８６及び国際公開２０１３／１７６７７２パンフレットを参照されたい。
「Ｃａｓ１２突然変異体」又は「Ｃａｓ１２変異体」は、Ａｌｉｃｙｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ Ｃａｓ１２ｂ（配列番号４９）等のＶ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム由来の野生型Ｃａｓタンパク質のタンパク質又はポリペプチド誘導体、例えば、１つ以上の点変異、挿入、欠失、切断があるタンパク質、融合タンパク質、又はそれらの組み合わせをいう。「Ｃａｓ１２突然変異体」又は「Ｃａｓ１２変異体」は、それが由来するＣａｓ１２タンパク質のＲＮＡ標的化活性を実質的に保持する。非限定的な例として、タンパク質又はポリペプチドは、配列番号４８、４９又は５０の断片を含むか、それからなるか、又は本質的にそれからなることができる。変異体／変異体は、ＲＮＡ分子に結合し、ＲＮＡ分子を介して特定のＤＮＡ配列を標的とすることができ、さらにヌクレアーゼ活性があってよい。
「相補性」は、従来のワトソン－クリック塩基対合又は他の非従来型のいずれかによって他の核酸配列と水素結合（複数可）を形成する核酸の機能をいう。比率相補性は、第二の核酸配列と水素結合（例えば、ワトソン－クリック塩基対形成）を形成することができる核酸分子中の残基の比率を示す（例えば、１０のうち５、６、７、８、９、１０は、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、及び１００％相補的である）。「完全に相補的」とは、核酸配列の全ての連続する残基が、第二の核酸配列中の同数の連続する残基と水素結合することを意味する。本明細書中で用いられる用語「実質的に相補的な」は、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、又はそれ以上のヌクレオチドの領域にわたって少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、又は１００％である相補性の程度をいうか、又はストリンジェントな条件下でハイブリダイズする２つの核酸をいう。
ハイブリダイゼーションについての本明細書中で用いられる用語「ストリンジェントな条件」とは、標的配列に対して相補性がある核酸が、標的配列と優勢にハイブリダイズし、そして非標的配列と実質的にハイブリダイズしない条件をいう。ストリンジェントな条件は、一般に配列依存性であり、多くの因子に依存して変化する。一般に、配列が長いほど、その配列がその標的配列に特異的にハイブリダイズする温度は高くなる。ストリンジェントな条件の非限定的な例は、Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３），Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ－Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ Ｐａｒｔ Ｉ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｃｈａｐｔｅｒ“Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｂｅ ａｓｓａｙ”，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．に詳細に記載されている。「ハイブリダイゼーション」又は「ハイブリダイズする」とは、完全に又は部分的に相補的な核酸鎖が特定のハイブリダイゼーション条件下でともになって、２つの構成鎖が水素結合によって結合される二本鎖構造又は領域を形成するプロセスをいう。水素結合は通常、アデニンとチミン又はウラシル（ＡとＴ又はＵ）又はシチジンとグアニン（ＣとＧ）の間で形成されるが、他の塩基対が形成されてもよい（例えば、Ａｄａｍｓ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ，１１ ｔｈ ｅｄ．，１９９２）。
本明細書中で用いられる用語「発現」とは、ポリヌクレオチドがＤＮＡテンプレートから（例えば、ｍＲＮＡ又は他のＲＮＡ転写物に）転写されるプロセス、及び／又は転写されたｍＲＮＡが続いてペプチド、ポリペプチド又はタンパク質に翻訳されるプロセスをいう。転写物及びコードされたポリペプチドは、集合的に「遺伝子産物」とともいってよい。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来する場合、発現は、真核細胞におけるｍＲＮＡのスプライシングを含み得る。
本明細書中で用いられる用語「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」は、本明細書において互換的に用いられ、いかなる長さのアミノ酸のポリマーをいう。ポリマーは、直鎖状又は分枝状であってよく、修飾アミノ酸を含んでもよく、非アミノ酸によって中断されていてもよい。この用語はまた、組換えされたアミノ酸ポリマーを包含する；例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、ペグ化、又はいかなる他の操作（例えば、標識成分との結合体化）。本明細書中で用いられる用語「アミノ酸」は、グリシン及びＤ光学異性体又はＬ光学異性体の両方、並びにアミノ酸アナログ及びペプチド模倣物を含む、天然アミノ酸及び／又は非天然アミノ酸又は合成アミノ酸を含む。
本明細書中で用いられる用語「融合ポリペプチド」又は「融合タンパク質」は、２つ以上のポリペプチド配列をともに結合することによって作製されるタンパク質を意味する。本発明に包含される融合ポリペプチドは、第一のポリペプチド（例えば、ＲＮＡ結合ドメイン）をコードする核酸配列を、第二のポリペプチド（例えば、エフェクタードメイン）をコードする核酸配列と結合して単一のオープンリーディングフレームを形成するキメラ遺伝子構築物の翻訳産物を含む。換言すれば、「融合ポリペプチド」又は「融合タンパク質」は、ペプチド結合によって、又はいくつかのペプチドを介して結合された２つ以上のタンパク質の組換えタンパク質である。融合タンパク質はまた、２つのドメイン間にペプチドリンカーを含んでもよい。
用語「リンカー」は、２つ以上の実体を結合するために用いられるいかなる手段、実体又は部分をいう。リンカーは、共有結合リンカー又は非共有結合リンカーであり得る。共有結合リンカーの例としては、結合されるタンパク質又はドメインの１つ以上に共有結合した共有結合又はリンカー部分があげられる。リンカーはまた、非共有結合（例えば、白金原子のような金属中心を介する有機金属結合）であり得る。共有結合のために、様々な官能基（例えば、カルボン酸誘導体を含むアミド基、エーテル、有機エステル及び無機エステルを含むエステル、アミノ、ウレタン、尿素等）が用いられ得る。結合を提供するために、ドメインを酸化、ヒドロキシル化、置換、還元等によって組換えして、カップリングのための部位を提供することができる。結合のための方法は当業者に周知であり、本発明における使用のために包含される。リンカー部分としては、化学的リンカー部分、又は例えばペプチドリンカー部分（リンカー配列）があげられるが、これらに限定されない。ＲＮＡ結合ドメイン及びエフェクタードメインの機能を有意に減少させない組換えが好ましいことが理解される。
本明細書で用いられる用語「結合体（コンジュゲート）」又は「結合（コンジュゲーション）」又は「結合された」は、１つの実体を形成するための２つ以上の実体の結合をいう。結合体は、ペプチド－小分子結合体並びにペプチド－タンパク質／ペプチド結合体の両方を包含する。
本明細書における用語「対象」及び「患者」は、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトをいうために、互換的に用いられる。哺乳動物には、マウス、サル、ヒト、家畜、競技用動物、及びペットがあげられるが、これらに限定されない。インビボで得られた、又はインビトロで培養された生物学的実体の組織、細胞及びそれらの子孫も包含される。ある実施形態では、対象は、無脊椎動物、例えば、昆虫又は線虫であってよく、他の実施形態では、対象は、植物又は真菌であってよい。
本明細書中で用いられる用語「治療」又は「治療すること」又は「緩和すること」又は「改善すること」は、互換的に用いられる。これらの用語は、治療的利益及び／又は予防的利益を含むがこれらに限定されない有益な又は所望の結果を得るためのアプローチをいう。治療的利益とは、治療中の１つ以上の疾患、状態、又は症状におけるいかなる治療的に関連する改善又はそれらに対する効果を意味する。予防的利益のために、組成物は、特定の疾患、状態、若しくは症状を発症するリスクがある対象に、又は疾患、状態、若しくは症状がまだ現れていなくても、疾患の生理学的症状のうちの１つ以上を報告する対象に投与され得る。
本明細書中で用いられる用語「接触させる」は、成分のいかなるセットに関して用いられる場合、接触される成分が同じ混合物に混合される（例えば、同じ区画又は溶液に添加される）いかなるプロセスを含み、列挙された成分間の実際の物理的接触を必ずしも必要としない。列挙された成分は、いかなる順序又はいかなる組合せ（又はサブ組合せ）で接触させることができ、列挙された成分の１つ又はいくつかが、場合によっては、他の列挙された成分の添加の前に、混合物からその後除去される状況を含むことができる。例えば、「ＡをＢ及びＣと接触させること」は、以下の状況のいずれか及び全てを含む：（ｉ）ＡをＣと混合し、その後Ｂを混合物に添加する；（ｉｉ）Ａ及びＢを混合して混合物にする；Ｂを混合物から除去し、その後Ｃを混合物に添加する；及び（ｉｉｉ）ＡをＢ及びＣの混合物に添加する。標的核酸又は細胞を、Ｃａｓタンパク質又はガイドＲＮＡ等の１つ又は複数の反応成分と「接触させること」には、以下の状況のいずれか又は全てが含まれる：（ｉ）標的又は細胞を反応混合物の第一の成分と接触させて混合物を作製する；その後、反応混合物の他の成分をいかなる順序又は組み合わせで混合物に添加する；及び（ｉｉ）標的又は細胞と混合する前に反応混合物を完全に形成する。
本明細書中で用いられる用語「混合物」は、いかなる特定の順序ではなく散在している要素の組合せをいう。混合物は不均質であり、その異なる構成要素は空間的に分離できない。元素の混合物の例としては、同じ水溶液に溶解された多数の異なる元素、又はランダムに若しくは異なる元素が空間的に区別されない特定の順序でなく固体支持体に結合された多数の異なる元素があげられる。換言すれば、混合物はアドレス可能ではない。
本明細書に開示されるように、いくつかの値の範囲が提供される。その範囲の上限と下限との間の、下限の単位の１０分の１までの各介在値もまた、文脈が別途明確に指示しない限り、具体的に開示されることが理解される。記載された範囲内のいかなる記載された値又は介在値と、その記載された範囲内のいかなる他の記載された値又は介在値との間の各々のより小さい範囲は、本発明内に包含される。これらのより小さい範囲の上限及び下限は、独立して、範囲内に含まれても除外されてもよく、いずれかの限界がより小さい範囲内に含まれるか、いずれも含まれないか、又は両方の限界がより小さい範囲内に含まれる各範囲もまた、本発明内に包含され、述べられた範囲内のいかなる具体的に除外された限界に従う。記載された範囲が限界の一方又は両方を含む場合、それらの含まれる限界のいずれか又は両方を除外する範囲も本発明に含まれる。用語「約」は、一般に、示された数のプラス又はマイナス１０％をいう。例えば、「約１０％」は９％～１１％の範囲を示してもよく、「約２０」は１８～２２を意味してもよい。「約」の他の意味は、四捨五入等、文脈から明らかであり得るので、例えば、「約１」は、０．５～１．４も意味し得る。
次に、本発明による組成物および方法の種々の例示的な実施形態を、以下の非限定的な例によって説明する。
［実施例］
以下の実施例では、真核細胞を用いて、複数の戦略を用いて複数のエフェクターを同じゲノム遺伝子座に能動的に動員して、驚くべき効率及び転帰がある新規の機能性を得ることができることを証明した。驚くべき観察は、結合したＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムにより、単一の遺伝子座で多機能活性が提供されるエフェクターのプールと共に提示された場合、単一のアプタマーがエフェクターを一過的に動員することができるということである。
実施例１及び８は非限定的な実施例である。実施例２～７は予言的実施例である。
ヒト細胞における新規塩基編集用途のための単一アプタマー動員システムを介した遺伝子座指向性マルチエフェクター
本実施例では、初代ヒトリンパ球を用いた場合、単一のアプタマー動員システムを用いてても複数の酵素を同じ遺伝子座に能動的に動員することができることを証明した。複数のデアミナーゼ（Ａｐｏｂｅｃ１及びＡＩＤ）が、ｓｇＲＮＡ上の単一のアプタマー（ＲＮＡモチーフ）を介して部位に動員される。
Ｐａｎ Ｔ細胞を、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８を利用して活性化し、その後、細胞を、Ａｐｏｂｅｃ１－ＭＣＰ、ＡＩＤ－ＭＣＰ又は両方のデアミナーゼのいずれかについてのｍＲＮＡ成分、ｎＣａｓ９－ＵＧＩ－ＵＧＩ成分、ｔｒａｃｒＲＮＡ－ＭＳ２アプタマー及びｃｒＲＮＡを用いて電気穿孔した。その後、細胞をさらに２４時間インキュベートし、その後、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８で４８時間刺激し、その後、標的化ＰＣＲ増幅及びサンガー配列決定によって塩基編集を確認した。
材料及び方法
ＰＡＭモチーフ（ＮＧＧ）からの設定距離で計算された特定の塩基編集ウィンドウのために、ガイドを設計した。ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡは、Ｈｏｒｉｚｏｎ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（以前はＤｈａｒｍａｃｏｎ）で合成した。
合成ｃｒＲＮＡ配列（配列番号３２）：
Figure 2024501757000041
 ２’ＯＭｅ（ｍ）及びホスホロチオエート（＊）修飾残基
合成ｔｒａｃｒＲＮＡ－ＭＳ２アプタマー配列（配列番号３３）：
Figure 2024501757000042
 ２’ＯＭｅ（ｍ）及びホスホロチオエート（＊）修飾残基
ｍＲＮＡ成分の生成：メッセンジャーＲＮＡ分子は、修飾ヌクレオチドを利用してＴｒｉｌｉｎｋによってカスタム生成された。プソイドウリジン及び５－メチル－シトシン。ｍＲＮＡ成分は以下のタンパク質に翻訳された：デアミナーゼＡＩＤ－ＭＣＰ＝ＮＬＳ－ｈＡＩＤ－リンカー－ＭＣＰ、デアミナーゼＡｐｏｂｅｃ１－ＭＣＰ＝ＮＬＳ－ｒＡｐｏｂｅｃ １－リンカー－ＭＣＰ、及びＣａｓ９－ＵＧＩ－ＵＧＩ＝ＮＬＳ－ｎＣａｓ９－ＵＧＩ－ＵＧＩ－ＮＬＳ。
Ｔ細胞の培養：Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）勾配遠心分離を用いて新鮮な血液供給源からＰＢＭＣを単離し、その後陰性選択（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を介して全Ｔ細胞を単離した。Ｔ細胞を、１×ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を含むＩｍｍｕｎｏｃｕｌｔ ＸＴ培地（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で培養した。
Ｔ細胞電気穿孔： ４８～７２回の活性化後、Ｎｅｏｎ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｏｒ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）又は４Ｄ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（Ｌｏｎｚａ）を用いてＴ細胞を電気穿孔した。Ｎｅｏｎ電気穿孔条件は、２５０ｋ細胞がある１０μｌチップで１６００ｖ／１０ｍｓ／３パルス、デアミナーゼ－ＭＣＰ及びｎＣａｓ９－ＵＧＩ－ＵＧＩの両方について合計１～５μｇのｍＲＮＡ量、及び適用可能な場合、０．２～１．８μｍｏｌの複合体化ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ又はｓｇＲＮＡであった。４Ｄ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ条件は、単一又は二重デアミナーゼ－ＭＣＰ及びｎＣａｓ９－ＵＧＩ－ＵＧＩ（Ｔｒｉｌｉｎｋによって合成された）の両方について１～５ ｕｇのｍＲＮＡ量の５００ｋを合わせた合計がある２０ ｕｌキュベットがあるＥＯ－１１５、並びに０．２～１．８ ｕｍｏｌの複合体化ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ又はｓｇＲＮＡ（Ｈｏｒｉｚｏｎ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）であった。電気穿孔後の細胞を、１００Ｕ ＩＬ－２、１００Ｕ ＩＬ－７及び１００Ｕ ＩＬ－１５（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含むＩｍｍｕｎｏｃｕｌｔ ＸＴ培地に移し、３７℃及び５％ＣＯ２で２４～７２時間培養した。
ＣＤ３＋Ｔ細胞活性化：Ｔ細胞を、１００Ｕ／ｍｌのＩＬ－２（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及び１×ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）の存在下、３７℃及び５％ＣＯ２で４８時間、Ｉｍｍｕｎｏｃｕｌｔ ＸＴ培地（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で培養した１：１のビーズ：細胞比のＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｈｕｍａｎ Ｔ Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を用いることによって活性化した。活性化後、磁石上に置くことによってビーズを除去し、細胞を培養に戻した。
ゲノムＤＮＡ分析：ゲノムＤＮＡは、電気穿孔の４８～７２時間後に溶解細胞から放出された。目的の遺伝子座をＰＣＲによって増幅し、その後、産物をサンガー配列決定（Ｇｅｎｅｗｉｚ）に送った。独自の社内ソフトウェアによってデータを分析した。
データは、複数の酵素が、ガイダンスタンパク質の標的酵素活性（ニッカーゼ）に加えて、同じガイド上の同じアプタマー（ＲＮＡモチーフ）を介して動員され得ることを証明する。図７は、両方の酵素を含むことによって、２つの酵素による相補的相乗作用が存在し、標的遺伝子座において両方の酵素の最良のものが得られることを実証する。
この驚くべき結果は、動員戦略が、同じアプタマー（ＲＮＡモチーフ）を介した同じ遺伝子座への複数のエフェクターのオンサイト動員を可能にする動的プロセスであることを示し、これは、多くの実用的な治療的利点を提供し、ゲノム編集の分野において開発されている新しい技術への機会を開く。
ヒト細胞における新規塩基編集適用のための遺伝子座指向性多タンパク質マルチアプタマー動員システム
本実施例では、初代ヒトリンパ球を用いて、ガイダンスシステム（例えば、ＤＮＡを開いて切断するｎＣａｓ９－ＵＧＩ－ＵＧＩ）に対するタンパク質の利益を送達する同じ単一ｓｇＲＮＡ上の複数のアプタマー（ＲＮＡモチーフ）及び同じガイド上の異なるアプタマーを介して部位に特異的に動員される複数のデアミナーゼ（ラットＡｐｏｂｅｃ１及びヒトＡＩＤ）を用いて、複数のエフェクタータンパク質が同じ遺伝子座に能動的に動員され得ることを示す。
Ｐａｎ Ｔ細胞は、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８を利用して活性化され、その後細胞は、Ａｐｏｂｅｃ１－ＭＣＰ、ＡＩＤ－ＰＣＰ又は両方のデアミナーゼのいずれかのｍＲＮＡ成分、ｎＣａｓ９－ＵＧＩ－ＵＧＩ成分、ｓｇＲＮＡ－ＭＳ２－Ｐ７アプタマーを用いて電気穿孔される。その後、細胞をさらに２４時間インキュベートし、その後抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８で４８時間刺激し、その後フローサイトメトリーによって表面ＫＯについて確認し、塩基編集を標的化ＰＣＲ増幅及びサンガー配列決定によって確認する。
データは、ガイダンスタンパク質の標的酵素活性（ニッカーゼ）に加えて、同じｓｇＲＮＡ上の複数の異なるアプタマーを用いて、複数の異なる酵素が同じ遺伝子座に動員され得ることを示す。
ニッカーゼへの複数のエフェクターの単一アプタマー動員を介した、ヒト細胞における新規塩基編集適用のための遺伝子座指向性システム
本実施例では、初代ヒトリンパ球を用いて、アプタマーに基づく動員（例えば、ＡＩＤ－ＭＣＰ及びＡｐｏｂｅｃ１－ＭＣＰを介して）を用いて複数の酵素を同じ遺伝子座に能動的に動員することができ、アプタマーがニッカーゼ誘導システム（例えば、ＭＳ２－ｎＣａｓ９－ＵＧＩ－ＵＧＩ）のＣ末端に結合されて、誘導システムの利益（ニッカーゼ活性）及び同じ遺伝子座において同じアプタマーによって動員される複数のエフェクターがあることを示す。これは、単一部位特異的多重遺伝子エフェクター作用の利点がある。
Ｐａｎ Ｔ細胞は、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８を利用して活性化され、その後、細胞は、ＡＩＤ－ＭＣＰのためのｍＲＮＡ成分、ＭＳ２－ｎＣａｓ９－ＵＧＩ－ＵＧＩ成分、ｓｇＲＮＡを用いて電気穿孔される。その後、細胞をさらに２４時間インキュベートし、その後、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８で４８時間刺激し、その後、フローサイトメトリーによって表面ＫＯについて確認し、標的化ＰＣＲ増幅及びサンガー配列決定によって塩基編集を確認する。
データは、複数の塩基編集技術が、向上した機能性のために組み合わせられ得、融合及びアプタマー動員戦略の両方が、改善された機能性があるように相補的であることを示す。エフェクターを単一遺伝子座に送達する２つ以上のシステムを最適化する必要なく、編集効率が改善された。
ニッカーゼへの複数のエフェクターの複数のアプタマー動員を介した、ヒト細胞における新規塩基編集適用のための遺伝子座指向性システム
本実施例では、初代ヒトリンパ球を用いて、複数のアプタマーがニッカーゼ誘導システム（例えば、ＭＳ２－ＭＳ２－ｎＣａｓ９－ＵＧＩ－ＵＧＩ）に結合されているアプタマー系の動員を用いて（例えば、ＡＩＤ－ＭＣＰ及びＡｐｏｂｅｃ１－ＭＣＰを介して）複数の酵素を同じ遺伝子座に能動的に動員することができ、誘導システム（ニッカーゼ活性）の利点及び同じ遺伝子座において様々な配向で同じアプタマーによって動員される複数のエフェクターがあることを示す。これは、単一部位特異的多重遺伝子エフェクター作用の利点がある。
Ｐａｎ Ｔ細胞は、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８を利用して活性化され、その後、細胞は、ＡＩＤ－ＭＣＰのためのｍＲＮＡ成分、ＭＳ２－ＭＳ２－ｎＣａｓ９－ＵＧＩ－ＵＧＩ成分、ｓｇＲＮＡを用いて電気穿孔される。その後、細胞をさらに２４時間インキュベートし、その後抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８で４８時間刺激し、その後フローサイトメトリーによって表面ＫＯについて確認し、塩基編集を標的化ＰＣＲ増幅及びサンガー配列決定によって確認する。
データは、複数の塩基編集技術が、向上した機能性のために組み合わせられ得、融合及びアプタマー動員戦略の両方が、改善された機能性があるために相補的であることを例示する。
ヒト細胞における新規な塩基編集適用のための遺伝子座指向性タンパク質アプタマー及び直接融合動員システム
本実施例では、初代ヒトリンパ球を用いて、アプタマー系の動員を用いて（例えば、ＡＩＤ－ＭＣＰ及びｓｇＲＮＡ－ＭＳ２アプタマーを介して）、及びガイダンスシステム（例えば、Ａｐｏｂｅｃ１－ｎＣａｓ９－ＵＧＩ－ＵＧＩ）への直接酵素融合を介して、複数の酵素を同じ遺伝子座に能動的に動員して、ガイダンスシステム（例えば、ガイダンス及びニッカーゼ活性）、直接融合パートナー（例えば、Ａｐｏｂｅｃ１）の利益を得ることができ、アプタマー（例えば、ＡＩＤ－ＭＣＰ）によって動員されるタンパク質分子を介して、複数塩基編集技術及び改善された編集効率から利益を得ることができることを示す。
Ｐａｎ Ｔ細胞は、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８を利用して活性化され、その後、細胞は、ＡＩＤ－ＭＣＰのためのｍＲＮＡ成分、Ａｐｏｂｅｃ１－ｎＣａｓ９－ＵＧＩ－ＵＧＩ成分、ｓｇＲＮＡを用いて電気穿孔される。その後、細胞をさらに２４時間インキュベートし、その後抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８で４８時間刺激し、その後フローサイトメトリーによって表面ＫＯについて確認し、塩基編集を標的化ＰＣＲ増幅及びサンガー配列決定によって確認する。
データは、複数の塩基編集技術が、向上した機能性のために組み合わせられ得、融合及びアプタマー動員戦略の両方が、改善された機能性があるために相補的であることを例示する。
ヒト細胞における新規塩基編集適用のための単一アプタマー及び直接融合動員システムを介した遺伝子座指向性多タンパク質
本実施例では、初代ヒトリンパ球を用いて、複数の酵素が、同じアプタマーがある複数のタンパク質のアプタマー系の動員（例えば、Ａｐｏｂｅｃ－ＭＣＰ、ＡＩＤ－ＭＣＰ、及びｓｇＲＮＡ－ＭＳ２アプタマー）を用いて同じ遺伝子座に能動的に動員され得ること、及び同時に誘導システム（例えば、ＴａｄＡ－ＴａｄＡ＊－ｎＣａｓ９）への直接的な酵素融合を介して動員され得ることを証明する。ガイダンスシステム（例えば、ガイダンス及びニッカーゼ活性）の利益を得るために、直接融合パートナー（例えば、Ａｐｏｂｅｃ１）、並びに複数の塩基編集技術から利益を同時に得るアプタマー（例えば、ＡＩＤ－ＭＣＰ及びＡｐｏｂｅｃ１－ＭＣＰ）によって動員される複数のタンパク質分子を介して、増強体のために組み合わせる。
Ｐａｎ Ｔ細胞を、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８を利用して活性化し、その後、細胞を、Ａｐｏｂｅｃ１－ＭＣＰ、ＡＩＤ－ＭＣＰ、Ａｐｏｂｅｃ１－ＭＣＰ、ＴａｄＡ－ＴａｄＡ＊－ｎＣａｓ９－ＵＧＩ－ＵＧＩ成分、及びｓｇＲＮＡについてのｍＲＮＡ成分を用いて電気穿孔する。その後、細胞をさらに２４時間インキュベートし、その後抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８で４８時間刺激し、その後フローサイトメトリーによって表面ＫＯについて確認し、塩基編集を標的化ＰＣＲ増幅及びサンガー配列決定によって確認する。
データは、複数の塩基編集技術が、向上した機能性のために組み合わせられ得、融合及びアプタマー動員戦略の両方が、改善された機能性があるために相補的であることを例示する。
ヒト細胞における新規な塩基編集適用のための複数のアプタマー及び直接融合動員システムを介した遺伝子座指向性多タンパク質
本実施例では、初代ヒトリンパ球を用いて、複数の異なるアプタマーがある複数のタンパク質の、アプタマーに基づく動員（例えば、Ａｐｏｂｅｃ－ＭＣＰ、ＡＩＤ－ＰＣＰ、及びｓｇＲＮＡ－ＭＳ２－Ｐ７アプタマー）を用いて、ガイダンスシステム（例えば、ＴａｄＡ－ＴａｄＡ＊－ｎＣａｓ９）への直接酵素融合を介して、複数の酵素を同じ遺伝子座に能動的に動員して、ガイダンスシステムの利益（例えば、ガイダンス及びニッカーゼ活性）、直接融合パートナー（例えば、ＴａｄＡ－ＴａｄＡ＊）を得ることができ、アプタマー（例えば、ＡＩＤ－ＭＣＰ及びＡｐｏｂｅｃ１－ＰＣＰ）によって動員された複数のタンパク質分子を介して、複数の塩基編集技術から利益を得て、強化体に組み合わせることができることを例示する。
Ｐａｎ Ｔ細胞は、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８を利用して活性化され、その後、細胞は、Ａｐｏｂｅｃ１－ＭＣＰ、ＡＩＤ－ＭＣＰ、Ａｐｏｂｅｃ１－ＭＣＰ、ＴａｄＡ－ＴａｄＡ＊－ｎＣａｓ９－ＵＧＩ－ＵＧＩ成分、及びｓｇＲＮＡについてのｍＲＮＡ成分で電気穿孔される。その後、細胞をさらに２４時間インキュベートし、その後抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８で４８時間刺激し、その後フローサイトメトリーによって表面ＫＯについて確認し、塩基編集を標的化ＰＣＲ増幅及びサンガー配列決定によって確認する。
データは、複数の塩基編集技術により、組み合わせで機能性が向上し、融合及びアプタマー動員戦略がともに機能性の改善に寄与するために相補的であることを例示する。
ヒト細胞における新規多重化塩基編集適用のための単一アプタマー動員システムを介した遺伝子座指向性多タンパク質
この実施例では、初代ヒトリンパ球を用いて、複数の異なるエフェクタータンパク質が、単一アプタマー動員システム（ＲＮＡ－リガンド結合複合体）を用いて同じ遺伝子座に能動的に動員され得ることを実証した。この実施例において、３つのエフェクタータンパク質の各々は、デアミナーゼ活性があるエフェクタードメイン、及びリガンド、ＭＣＰを含んだ。共通のリガンド結合部分を共有することによって、３つのエフェクタータンパク質は、ガイドＲＮＡ及びＭＳ２ ＲＮＡモチーフを含む同じＲＮＡ－リガンド結合複合体によって動員されることができた。それにより、標的部位に動員され、ｓｇＲＮＡ（ＲＮＡ－リガンド結合複合体）上の単一のリガンド結合部分を介して、誘導システム上の配列標的化成分（例えば、ＤＮＡを開いて切断するｎＣａｓ９－ＵＧＩ－ＵＧＩ）及び複数のエフェクタータンパク質（異なるエフェクタータンパク質、例えば、Ｌｉｚａｒｄ Ａｐｏｂｅｃ１（Ａｎｏｌｉｓ）、Ｒａｔ Ａｐｏｂｅｃ１（Ｒａｔｔｕｓ）、及び／又はヒトＡＩＤ（Ｈｏｍｏ）に融合又は結合されたリガンド）の両方の利益を送達する。さらに、各々異なるガイドＲＮＡを含むが同じリガンド結合部分（ＭＳ２ ＲＮＡモチーフ）を含む複数のＲＮＡ－リガンド結合複合体を提供することによって、本発明に記載されるシステムがゲノム中の複数の遺伝子座を標的化するために適用され得、同時多重化塩基編集を可能にすることがさらに実証された。
Ｐａｎ Ｔ細胞を、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８を利用して活性化し、その後、細胞を、Ａｎｏｌｉｓ Ａｐｏｂｅｃ１－ＭＣＰ、Ｒａｔｔｕｓ Ａｐｏｂｅｃ１－ＭＣＰ、Ｈｏｍｏ ＡＩＤ－ＭＣＰ又は両方のデアミナーゼのいずれかについてのｍＲＮＡ成分、ｎＣａｓ９－ＵＧＩ－ＵＧＩ成分、及びｓｇＲＮＡを用いて電気穿孔した。その後、細胞をさらに９６～１２０時間インキュベートした後、フローサイトメトリーのための刺激Ｔ細胞集団及びｇＤＮＡ収集のための非刺激集団を作製し、その後、これをさらに２４～４８時間インキュベートした。標的化ＰＣＲ増幅及びサンガー配列決定によって塩基編集を確認し（図８）、フローサイトメトリーによって（Ｂ２Ｍ、ＣＤ５２、ＴＲＡＣ、及びＰＤ－１）を含む多重染色パネルによって表面ＫＯを確認し、これを用いて集団における多重ＫＯを確認した（図９）。
データは、１つだけではない複数のエフェクタータンパク質が、同じＲＮＡ－リガンド結合複合体を介して動員され得、ゲノム中の多くの遺伝子座にわたって同時に利用され得ることを実証する。データはまた、デアミナーゼの異なる組み合わせが異なる機能的結果をもたらし得ることを示し、特定の混合物は、単一のデアミナーゼを用いる場合と比較して、優先的な編集プロファイル及び機能的結果をもたらす。図９は、治療的に関連する免疫細胞システムにおいて、単一のデアミナーゼと比較して、機能的テトラプレックス編集について驚くべき改善を示している。
これは、アプタマー動員塩基編集のモジュール性が、新規かつ実用的な治療用途並びに非治療用途（例えば、スクリーニング）を容易にすることができ、ゲノム編集の分野における新規方法論の可能性を開くという点で、他のデータを支持する。
材料及び方法
ＰＡＭモチーフ（ＮＧＧ）からの設定距離で計算された特定の塩基編集ウィンドウのために、ガイドを設計した。ｓｇＲＮＡはＡｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによって合成された。
合成ｓｇＲＮＡ配列：
Ｂ２Ｍ ｓｇＲＮＡ（配列番号３４）
Figure 2024501757000043
 ＣＤ５２ ｓｇＲＮＡ（配列番号３５）：
Figure 2024501757000044
 ＴＲＡＣ ｓｇＲＮＡ（配列番号３６）：
Figure 2024501757000045
 ＰＤＣＤ－１ ｓｇＲＮＡ（配列番号３７）：
Figure 2024501757000046
 スクランブルｓｇＲＮＡ（配列番号３８）：
Figure 2024501757000047
 ２’ＯＭｅ（ｍ）及びホスホロチオエート（＊）修飾残基
ｍＲＮＡ成分の生成：メッセンジャーＲＮＡ分子のほとんどは、修飾ヌクレオチドを利用してＴｒｉｌｉｎｋによってカスタム生成された。プソイドウリジン及び５－メチル－シトシン。ｍＲＮＡ成分は、以下のタンパク質に翻訳された：デアミナーゼＡＩＤ－ＭＣＰ＝ＮＬＳ－ホモ－ＡＩＤ－リンカー－ＭＣＰ（配列番号４１）、デアミナーゼＡｐｏｂｅｃ１－ＭＣＰ＝ＮＬＳ－Ｒａｔｔｕｓ－Ａｐｏｂｅｃ １－リンカー－ＭＣＰ（配列番号４０）、及びＣａｓ９－ＵＧＩ－ＵＧＩ＝ＮＬＳ－ｎＣａｓ９－ＵＧＩ－ＵＧＩ－ＮＬＳ（配列番号４２）。
１つのｍＲＮＡ成分は、非修飾リボヌクレオチドを利用して社内で合成した。ｍＲＮＡ成分は、以下のタンパク質に翻訳された：ＮＬＳ－Ａｎｏｌｉｓ（Ｐ１６Ａ－Ｅ１７Ａ）－Ａｐｏｂｅｃ １－リンカー－ＭＣＰ（配列番号３９）。
ＮＬＳ－Ａｎｏｌｉｓ（Ｐ１６Ａ－Ｅ１７Ａ）－Ａｐｏｂｅｃ １－リンカー－ＭＣＰ（配列番号３９）：
Figure 2024501757000048
 ＮＬＳ－Ｒａｔｔｕｓ－Ａｐｏｂｅｃ １－リンカー－ＭＣＰ（配列番号４０）：
Figure 2024501757000049
 ＮＬＳ－Ｈｏｍｏ－ＡＩＤ－Ｌ ２５－ＭＣＰ（配列番号４１）：
Figure 2024501757000050
 ＮＬＳ－ｎＣａｓ９（Ｄ１０Ａ）－ＵＧＩ－ＵＧＩ－ＮＬＳ（配列番号４２）：
Figure 2024501757000051
 Ｔ細胞の培養：Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）勾配遠心分離を用いて新鮮な血液供給源からＰＢＭＣを単離し、その後陰性選択（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を介して全Ｔ細胞を単離した。Ｔ細胞を、１×ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を含むＩｍｍｕｎｏｃｕｌｔ ＸＴ培地（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で培養した。
ＣＤ３＋Ｔ細胞活性化：Ｔ細胞を、１００Ｕ／ｍｌのＩＬ－２（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及び１×ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）の存在下、３７℃及び５％ＣＯ２で４８時間、Ｉｍｍｕｎｏｃｕｌｔ ＸＴ培地（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で培養した１：１のビーズ：細胞比のＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｈｕｍａｎ Ｔ Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を用いることによって活性化した。活性化後、磁石上に置くことによってビーズを除去し、細胞を培養に戻した。
Ｔ細胞電気穿孔： ４８～７２回の活性化後、Ｎｅｏｎ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｏｒ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）又は４Ｄ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（Ｌｏｎｚａ）を用いてＴ細胞を電気穿孔した。Ｎｅｏｎ電気穿孔条件は、２５０ｋ細胞、デアミナーゼ－ＭＣＰ及びｎＣａｓ９－ＵＧＩ－ＵＧＩの両方について１～２μｇの合計ｍＲＮＡ量、並びに０．２～１．８μｍｏｌの各ｓｇＲＮＡを含む１０μｌチップを用いた１６００ｖ／１０ｍｓ／３パルスであった。電気穿孔後の細胞を、１００Ｕ ＩＬ－２、１００Ｕ ＩＬ－７及び１００Ｕ ＩＬ－１５（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含むＩｍｍｕｎｏｃｕｌｔ ＸＴ培地に移し、３７℃及び５％ＣＯ２で９６～１２０時間培養した。その後、細胞培養ウェルを２つに分け、半分は刺激せず、もう一方を５０ ｎｇ／ｍｌホルボールミリステートアセテート及び２５０ ｎｇ／ｍｌイオノマイシンで刺激し、これをさらに２４～４８時間インキュベートした。
ゲノムＤＮＡ分析：ゲノムＤＮＡは、電気穿孔の４８～７２時間後に溶解細胞から放出された。目的の遺伝子座をＰＣＲによって増幅し、その後、産物をサンガー配列決定（Ｇｅｎｅｗｉｚ）に送った。独自の社内ソフトウェアによってデータを分析した。
配列
ヒト化ヌクレオチド配列ＷＴストレプトコッカス・ピオゲネスＣａｓ９（配列番号４３）
Figure 2024501757000052
Figure 2024501757000053
 ヒト化アミノ酸配列ＷＴストレプトコッカス・ピオゲネスＣａｓ９（配列番号４４）
Figure 2024501757000054
 ヒト化ヌクレオチド配列ストレプトコッカス・ピオゲネスｎＣａｓ９（太字及び下線のＡ２９Ｃ変異）（配列番号４５）
Figure 2024501757000055
Figure 2024501757000056
Figure 2024501757000057
 ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ｎＣａｓ９のヒト化アミノ酸配列（太字及び下線のＤ１０Ａ残基変化）（配列番号４６）
Figure 2024501757000058
 ストレプトコッカス・ピオゲネスｄＣａｓ９のヒト化ヌクレオチド配列（Ａ２９Ｃ、Ｃ２５１８Ｇ、及びＡ２５１９Ｃ塩基変化を太字及び下線で示す）（配列番号４７）
Figure 2024501757000059
Figure 2024501757000060
Figure 2024501757000061
 アミノ酸配列ＷＴ ＡｓＣａｓ１２ａ（配列番号４８）
Figure 2024501757000062
 アミノ酸ＷＴ ＡａＣａｓ１２ｂ（配列番号４９）
Figure 2024501757000063
 アミノ酸配列ＷＴ Ｃａｓ１２ｄ１５（配列番号５０）
Figure 2024501757000064
 ヒト化ヌクレオチド配列ＷＴ ＡｓＣａｓ１２ａ（配列番号５１）
Figure 2024501757000065
Figure 2024501757000066
 ヒト化ヌクレオチド配列ＷＴ ＡａＣａｓ１２ｂ（配列番号５２）Ｎｏ．５２）
Figure 2024501757000067
Figure 2024501757000068
 ヒト化ヌクレオチド配列ＷＴ Ｃａｓ１２ｄ１５（配列番号５３）
Figure 2024501757000069
Figure 2024501757000070
 置換されたアミノ酸を太字＋下線で示す。
ヒト化ヌクレオチド配列ｄＣａｓ１２ａ（太字及び下線のＡ２７２３Ｃ／Ｔ２７２４Ｃ変異）（配列番号５４）
Figure 2024501757000071
Figure 2024501757000072
 ヒト化ヌクレオチド配列ｄＣａｓ１２ｂ（太字下線のＡ１７０９Ｃ変異）（配列番号５５）
Figure 2024501757000073
Figure 2024501757000074
 ヒト化ヌクレオチド配列ｄＣａｓ１２ｄ（太字及び下線のＡ２６２４Ｃ／Ａ２９１２Ｃ／Ｇ２９１３Ｃ／Ａ３５９３Ｃ変異）（配列番号５６）
Figure 2024501757000075
Figure 2024501757000076
 アミノ酸ｄＡｓＣａｓ１２ａ配列（太字下線のＤ９０８Ａ変異）（配列番号５７）
Figure 2024501757000077
 触媒活性がないＡｓＣａｓ１２ａは Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２０２０，５６，２１２３－２１２６に記載されている。
アミノ酸ｄＡａＣａｓ１２ｂ（太字及び下線のＤ５７０Ａ変異）（配列番号５８）
Figure 2024501757000078
 ＣＲＩＳＰＲＣａｓ １２ ｂに記載される触媒死ＡａＣａｓ１２ｂにより、植物ゲノム操作を効率的なに行うことができる。Ｍｉｎｇ Ｍ、Ｒｅｎ Ｑ、Ｐａｎ Ｃ、Ｈｅ Ｙ、Ｚｈａｎｇ Ｙ、Ｌｉｕ Ｓ、Ｚｈｏｎｇ Ｚ、Ｗａｎｇ Ｊ、マルツァンＡＡ、Ｗｕ Ｊ、Ｚｈｅｎｇ Ｘ、Ｚｈａｎｇ Ｙ、及びＱｉ Ｙ． Ｎａｔｕｒｅ Ｐｌａｎｔｓ（２０２０）１０．１０３８／ｓ４１４７７－０２０－０６１４－６を参照のこと。
アミノ酸配列ｄＣａｓ１２ｄ１５（太字及び下線のＤ８７５Ａ／Ｅ９７１Ａ／Ｄ１１９８Ａ変異）（配列番号５９）
Figure 2024501757000079
 注：これは、推定上の触媒的に死んだＣａｓ１２ｄであり、まだ実験的に検証されていない。
バチルスファージＰＢＳ２ウラシル－ＤＮＡグリコシラーゼ阻害剤（配列番号６０）
Figure 2024501757000080
 ハイブリッドＩＩ型ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡガイドＲＮＡ配列：５’－（２０ ｎｔガイド）（配列番号６１）
Figure 2024501757000081
 ２０ヌクレオチドのプログラム可能な配列、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡモチーフ、及びＭＳ２オペレーターモチーフを含有するＲＮＡ足場発現カセット（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）（配列番号６２）：
Figure 2024501757000082
 （Ｎ２０：プログラム可能なシーケンス。下線：ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡモチーフ；太字：ＭＳ２モチーフ；イタリック体：ターミネータ）。
上記のＲＮＡ足場は、１つのＭＳ２ループ（１ｘＭＳ２）を含有する。２つのＭＳ２ループ２つのＭＳ２ループ（２ｘＭＳ２）を含有するＲＮＡ足場であり、ＭＳ２足場に下線が引かれている（配列番号６３）
Figure 2024501757000083
 ＮＬＳ－Ａｎｏｌｉｓ（Ｐ１６Ａ－Ｅ１７Ａ）－Ａｐｏｂｅｃ １－リンカー－ＭＣＰ（配列番号６４）
Figure 2024501757000084
 ＮＬＳ－Ｒａｔｔｕｓ－Ａｐｏｂｅｃ １－リンカー－ＭＣＰ（配列番号６５）
Figure 2024501757000085
 ＮＬＳ－Ｈｏｍｏ－ＡＩＤ－Ｌ ２５－ＭＣＰ（配列番号６６）
Figure 2024501757000086
Figure 2024501757000087
 ＮＬＳ－ｎＣａｓ９（Ｄ１０Ａ）－ＵＧＩ－ＵＧＩ－ＮＬＳ（配列番号６７）
Figure 2024501757000088
Figure 2024501757000089
 Ｑベータファージオペレーターステムループ（配列番号６８）
Figure 2024501757000090
 Ｑベータコートタンパク質［Ｑ６５Ｈ］（配列番号６９）
Figure 2024501757000091
 ＢｏｘＢ（配列番号７０）
Figure 2024501757000092
 λバクテリオファージプロテインＮ（ＬａｍｂｄａＮ－（１－２２）（配列番号７１）
Figure 2024501757000093
 Ｃｓｙ４結合モチーフ（配列番号７２）
Figure 2024501757000094
 Ｃｓｙ４［Ｈ２９Ａ］（配列番号７３）
Figure 2024501757000095

Claims (52)

  1. 塩基編集による細胞の遺伝子組換えのための方法であって、以下の：
    ｉ）配列標的化タンパク質；
    ｉｉ）ａ）ガイドＲＮＡ、及び
    ｂ）リガンド結合部分、を含む、ＲＮＡ－リガンド結合複合体；並びに、
    ｉｉｉ）ｃ）前記リガンド結合部分に可逆的に結合することができるリガンド、及び
    ｄ）エフェクタードメイン、を含む、２つ以上のエフェクタータンパク質、
    を、細胞中に導入すること、及び／又は、細胞中で発現させることを含む、方法。
  2. ガイドＲＮＡは、標的核酸に相補的な標的化配列を含むｃｒＲＮＡを含む、請求項１に記載の方法。
  3. ガイドＲＮＡは、さらに、配列標的化タンパク質に結合することができるｔｒａｃｒＲＮＡ又はｓｃｏｕｔＲＮＡを含む、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 前記配列標的化タンパク質はＣａｓタンパク質である、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 前記リガンド結合部分はＲＮＡモチーフであり、リガンドは前記ＲＮＡモチーフを認識するＲＮＡ結合ドメインである、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
  6. エフェクタータンパク質は、さらに、リガンドとエフェクタードメインとを結合するように構成されたリンカーを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 細胞は単一のゲノム遺伝子座で塩基編集を受ける、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 細胞は２つ以上のゲノム遺伝子座で塩基編集を受ける、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 細胞は真核細胞又は原核細胞である、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 細胞はヒト細胞である、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 前記配列標的化タンパク質は、１つ以上のウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＮＧ）インヒビターペプチド（ＵＧＩ）に融合される、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. 前記配列標的化タンパク質は、ＩＩ型Ｃａｓタンパク質又はＶ型Ｃａｓタンパク質である、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
  13. 前記配列標的化タンパク質は、ヌクレアーゼ欠損であるか、又はニッカーゼ活性がある、ＩＩ型Ｃａｓタンパク質である、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
  14. 前記配列標的化タンパク質は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ及びＴｒｅｐｏｎｅｍａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａからなる群より選択される１つの種のｄＣａｓ９又はｎＣａｓ９の配列を含む、請求項１３に記載の方法。
  15. 前記配列標的化タンパク質は、ヌクレアーゼ欠損であるか、又はニッカーゼ活性がある、Ｖ型Ｃａｓタンパク質である、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
  16. 配列標的化成分及び／又はエフェクター融合タンパク質が、１つ以上の核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
  17. 前記ＲＮＡモチーフ及びＲＮＡ結合ドメインが、以下の：
    テロメラーゼＫｕ結合モチーフ及びＫｕタンパク質又はそのＲＮＡ結合セクション；
    テロメラーゼＳｍ７結合モチーフ及びＳｍ７タンパク質又はそのＲＮＡ結合セクション；
    ＭＳ２ファージオペレーターステムループ及びＭＳ２コートタンパク質（ＭＣＰ）又はそのＲＮＡ結合セクション；
    ＰＰ７ファージオペレーターステムループ及びＰＰ７コートタンパク質（ＰＣＰ）又はそのＲＮＡ結合セクション；
    ＢｏｘＢ結合モチーフ及びラムダバクテリオファージプロテインＮ（ＬａｍｂｄａＮ－（１－２２））又はそのＲＮＡ結合セクション；
    Ｃｓｙ４結合モチーフ及びＣｓｙ４［Ｈ２９Ａ］若しくはそのＲＮＡ結合セクション；又は
    Ｑｂｅｔａファージオペレーターステムループ及びＱｂｅｔａコートタンパク質［Ｑ６５Ｈ］又はそのＲＮＡ結合部分セクション；
    からなる群から選択される対である、請求項５～１６のいずれか一項に記載の方法。
  18. ２つ以上のエフェクタータンパク質のエフェクタードメインの機能は、同じか又は異なる、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。
  19. エフェクタードメインは、酵素又はタンパク質断片である、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。
  20. エフェクタードメインは、酵素活性がある酵素又はタンパク質断片である、請求項１９に記載の方法。
  21. エフェクタードメインにはシチジン又はアデニン脱アミノ化活性がある、請求項２０に記載の方法。
  22. シチジン脱アミノ化活性があるエフェクタードメインは、野生型又は遺伝子操作された、ＡＩＤ、ＣＤＡ、ＡＰＯＢＥＣ１、ＡＰＯＢＥＣ３Ａ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｂ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｃ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｄ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｆ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｈ又は他のＡＰＯＢＥＣファミリー酵素である、請求項２１に記載の方法。
  23. アデニン脱アミノ化活性があるエフェクタードメインは、野生型又は遺伝子操作された、ＡＤＡ、ＡＤＡＲ、ＡＤＡＲ１ファミリー酵素、又はｔＲＮＡアデノシンデアミナーゼＴａｄＡ、ＴＡＴＡ、ＴＡＤ３である、請求項２１に記載の方法。
  24. 標的核酸は、染色体外ＤＮＡ又は染色体上のゲノムＤＮＡである、請求項１～２３のいずれか一項に記載の方法。
  25. 遺伝子組換えは、同じ遺伝子座内の少なくとも２つの遺伝子変異を含む、請求項１～２４のいずれか一項に記載の方法。
  26. 遺伝子組換えは点変異である、請求項１～２５のいずれか一項に記載の方法。
  27. 点変異は、未成熟終止コドンを導入するか、開始コドンを破壊するか、スプライス部位を破壊するか、又は遺伝子変異を修正する、請求項２６に記載の方法。
  28. ＲＮＡ－リガンド結合複合体は、化学合成されたＲＮＡとして細胞に導入される、請求項１～２７のいずれか一項に記載の方法。
  29. ＲＮＡ－リガンド結合複合体は１つ以上の修飾を含む、請求項１～２８のいずれか一項に記載の方法。
  30. ガイドＲＮＡは、ガイドＲＮＡ配列の少なくとも１つの５’ヌクレオチド及び少なくとも１つの３’ヌクレオチド上に２’－（０－メチルホスホロチオエート）修飾を含むように化学的に組換えられる、請求項１～２９のいずれか一項に記載の方法。
  31. ＲＮＡ－リガンド結合複合体は単一成分又は２つの別個の成分として合成される、請求項１～３０のいずれか一項に記載の方法。
  32. ＲＮＡ－リガンド結合複合体が２つの別個の成分として合成され、
    第一の成分がａ）ｃｒＲＮＡ及び／又はｂ）リガンド結合部分を含み、
    第二の成分がｃ）ｔｒａｃｒＲＮＡ若しくはｓｃｏｕｔＲＮＡ及び／又はｄ）リガンド結合部分を含む、請求項３１に記載の方法。
  33. ２つの成分は、細胞に導入される前にハイブリダイズされる、請求項３２に記載の方法。
  34. ＲＮＡ－リガンド結合複合体は合成ＲＮＡ成分である、請求項１～３３のいずれか一項に記載の方法。
  35. 前記リガンド結合部分は、ガイドＲＮＡの３’末端、５’末端又はガイドＲＮＡ内に位置する、請求項１～３４のいずれか一項に記載の方法。
  36. ＲＮＡ－リガンド結合複合体が１つ以上のリガンド結合部分を含み、前記１つ以上のリガンド結合部分がＲＮＡモチーフである、請求項１～３５のいずれか一項に記載の方法。
  37. 少なくとも１つのＲＮＡモチーフはＭＳ２アプタマーであり、場合によっては、前記ＭＳ２アプタマーには伸長ステムがある、請求項５～３６のいずれか一項に記載の方法。
  38. 伸長ステムは２～２４ヌクレオチドを含む、請求項３７に記載の方法。
  39. 少なくとも１つのＲＮＡモチーフはＰＰ７アプタマーである、請求項５～３８のいずれか１項に記載の方法。
  40. 前記配列標的化タンパク質は、１つ又は２つのＵＧＩがあるｎＣａｓ９を含み、前記リガンド結合部分は、前記ＲＮＡ－リガンド結合複合体の３’末端に位置する単一のＭＳ２ ＲＮＡモチーフ又はＰＰ７ ＲＮＡモチーフである、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
  41. 配列標的化成分、前記ＲＮＡ－リガンド結合複合体及びエフェクタータンパク質は、ＲＮＡ又はタンパク質として細胞に導入される、請求項１～４０のいずれか一項に記載の方法。
  42. 細胞の少なくとも１０％が１又はそれ以上の遺伝子組換えを含む、請求項１～４１のいずれか一項に記載の方法により得られる、遺伝子組換え細胞の集団。
  43. 請求項１～４１のいずれか一項に記載の方法により調製された少なくとも１つの細胞に由来する細胞株。
  44. 塩基編集による細胞の遺伝子組換えのためのキットであって、以下の：
    ｉ）配列標的化タンパク質；
    ｉｉ）ａ）ガイドＲＮＡ、及び
    ｂ）リガンド結合部分、を含む、ＲＮＡ－リガンド結合複合体；並びに、
    ｉｉｉ）ｃ）前記リガンド結合部分に可逆的に結合することができるリガンド、及び
    ｄ）エフェクタードメイン、を含む、２つ以上のエフェクタータンパク質、
    を、含む、キット。
  45. リガンド結合部分がＲＮＡモチーフであり、リガンドがＲＮＡ結合ドメインである、請求項４４に記載のキット。
  46. ガイドＲＮＡは、標的核酸に相補的な標的化配列を含むｃｒＲＮＡを含む、請求項４４又は４５に記載のキット。
  47. ガイドＲＮＡは、さらに、配列標的化タンパク質に結合することができるｔｒａｃｒＲＮＡ又はｓｃｏｕｔＲＮＡを含む、請求項４６に記載のキット。
  48. エフェクタータンパク質は、さらに、リンカーを含む、請求項４４～４７のいずれか一項に記載のキット。
  49. 塩基編集による細胞の遺伝子組換えのための方法であって、以下の：
    ｉ）ａ）ＳＨ３ドメインを含む配列標的化タンパク質、及び
    ｂ）ＳＨ３ドメインを含むエフェクタードメイン、を含む、配列標的化成分であって、ここで、（ａ）及び（ｂ）は、ＳＨ ３媒介性結合によって結合されており；
    ｉｉ）ｃ）ガイドＲＮＡ、及び
    ｄ）リガンド結合部分、を含む、ＲＮＡ－リガンド結合複合体；並びに、
    ｉｉｉ）ｅ）前記リガンド結合部分に可逆的に結合することができるリガンド、及び
    ｆ）エフェクタードメイン、を含む、２つ以上のエフェクタータンパク質
    を、細胞中に導入すること、及び／又は、細胞中で発現させることを含む、方法。
  50. ガイドＲＮＡは、標的核酸に相補的な標的化配列を含むｃｒＲＮＡを含む、請求項４９に記載の方法。
  51. ガイドＲＮＡは、さらに、配列標的化タンパク質に結合することができるｔｒａｃｒＲＮＡ又はｓｃｏｕｔＲＮＡを含む、請求項４９又は５０に記載の方法。
  52. 前記リガンド結合部分はＲＮＡモチーフであり、リガンドはＲＮＡ結合ドメインである、請求項４９～５１のいずれか一項に記載の方法。
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