TW201920661A - 一種基因編輯t細胞及其用途 - Google Patents

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王飛
于玲玲
董曦
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大陸商博雅輯因（北京）生物科技有限公司
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Abstract

本發明涉及一種新型的通用型T細胞（包括CAR-T和TCR-T細胞）及其製備方法。在一些實施方式中，該通用T細胞通過CRISPR/Cas9基因編輯技術，同時高效、穩定地敲除了T細胞的TCR和/或HLA和/或PD-1蛋白。本發明的通用型CAR-T在體內、體外具有高效持續的殺傷靶細胞的作用。

Description

一種基因編輯T細胞及其用途
[交叉引用]本申請要求享有2017年9月18日提交的中國專利申請201710842264.5和201710841323.7的優先權，該中國專利申請的公開內容以其整體通過引用併入本申請。
本發明涉及T細胞，具體涉及經過基因編輯的單基因、雙基因及三基因敲除的T細胞，包括通用型T細胞、CAR-T細胞和TCR-T細胞，及其製備方法和用途。
惡性腫瘤已成為嚴重威脅身體健康和生命安全的疾病，腫瘤的治癒一直是人類的夢想。近年來，腫瘤免疫療法獲得了廣泛的關注，尤其是CAR-T（Chimeric Antigen Receptor T Cells）技術的出現使得對腫瘤的控制得到了里程碑式的發展。從1989年CAR-T技術首次應用，到2012年賓夕法尼亞大學 Carl June教授帶領團隊治癒的Emily Whitehead，再到2017年FDA腫瘤藥物專家諮詢委員會（ODAC）以10:0的壓倒優勢投票結果一致推薦批准諾華CAR-T藥物CTL019用於青少年晚期B細胞急性淋巴性白血病（r/rAll）治療。
一般地，傳統的CAR-T技術T細胞主要來源於患者自身，在GMP環境下經過體外分離T細胞、啟動、CAR導入、培養擴增，最後經過質控回輸回患者體內。由於患者自身條件的影響導致不適合采血或采血分離T細胞後擴增難的問題會隨之而來。當患者病情危急，從T細胞的分離到CAR-T的回輸，整個流程的等待時間也將是自體回輸要面臨的重大問題。這些問題給CAR-T 技術的廣泛應用帶來了局限性，因此目前CAR-T細胞治療的一個重要研究方向是如何使用一個健康獻血者的T細胞製備大量的CAR-T細胞，滿足患者的臨床使用。這一技術的建立將極大降低CAR-T療法的成本，可以更好的保證統一製備的細胞質量，而且患者在需要時可以馬上得到CAR-T細胞進行治療。
在本說明書的整篇文本中引用了數篇檔。此處的每篇檔(包括任何期刊文章或摘要、公開或未公開的專利申請、授權專利、製造商的說明書、使用說明等)通過題述併入本文。然而，並非認可此處引用的檔事實上是本發明的現有技術。
進行本發明以解決本領域中存在的上述問題。本發明利用CRISPR/Cas9系統對T細胞進行單基因（TRAC、B2M或PD-1）、雙基因（TRAC和B2M）及三基因（TRAC，B2M及PD-1）敲除，其敲除效率分別高達90% (單基因)、81% (雙基因)及67% (三基因)。這些經過基因編輯的T細胞可以為針對不同靶點的CAR或TCR提供通用T細胞，為建立基因編輯技術聯合過繼免疫在腫瘤及病毒感染性疾病（例如HIV/AIDS）的治療提供方法，並為相關疾病治療的研究奠定了堅實的技術基礎。同時使得基因改造的T細胞（包括通用T細胞，CAR-T和TCR-T）可以作為藥物隨時應用于需要的病人。
因此，一個方面，本發明提供了利用利用基因編輯技術，例如CRISPR/Cas9系統對T細胞進行高效的單基因（TRAC、B2M或PD-1）、雙基因（TRAC和B2M）或者三基因（TRAC，B2M及PD-1）敲除，從而獲得不表達TCR，或TCR/HLA，或TCR/HLA/PD-1的通用型T細胞的方法。同時使得通用型T細胞可以隨時結合需要的CAR或TCR，製備成通用型CAR-T或TCR-T，且作為藥物隨時應用于需要的病人。另外還可以為新的有效基因靶點的研究提供支援並及時有效地應用於臨床免疫治療。
一方面，本發明提供一種製備基因改造的T細胞的方法， 包括：通過基因編輯技術破壞所述T細胞中：
(i) 14號染色體第23016448位至第23016490位元的TRAC基因組區域(如SEQ ID NO:23所示);
(ii) 15號染色體第45003745位至第45003788位的B2M基因組區域(如SEQ ID NO:24所示); 和/或
(iii) 2號染色體第242800936位至第242800978位的PD-1基因組區域(如SEQ ID NO:25所示)，或2號染色體第242795009位至第242795051位的PD-1基因組區域(如SEQ ID NO:26所示)。在一些實施方案中，所述TRAC基因組區域、B2M基因組區域和PD-1基因組區域均被編輯。在一些實施方案中，所述基因編輯技術為基於鋅指核酸酶的基因編輯技術、TALEN基因編輯技術或CRISPR/Cas基因編輯技術，例如CRISPR/Cas9基因編輯技術。
在一些實施方案中，本發明提供一種製備基因改造的T細胞的方法， 包括：通過基因編輯技術破壞所述T細胞中：
(i) 與選自SEQ ID NOs：2-5中任一的序列互補的TRAC基因組的靶核苷酸序列;
(ii)與選自SEQ ID NOs：6-13中任一的序列互補的B2M基因組的靶核苷酸序列; 和/或
（iii）與選自SEQ ID NOs：14-22中任一的序列互補的PD-1基因組的靶核苷酸序列。在一些實施方案中，所述TRAC基因組區域、B2M基因組區域和PD-1基因組區域均被編輯。在一些實施方案中，所述基因編輯技術為基於鋅指核酸酶的基因編輯技術、TALEN基因編輯技術或CRISPR/Cas基因編輯技術，例如CRISPR/Cas9基因編輯技術。
在一些實施方案中，本發明提供了一種製備基因改造的T細胞的方法，通過CRISPR/Cas9基因編輯技術破壞所述T細胞中:
(i) 與選自SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3中任一的序列互補的TRAC基因組的靶核苷酸序列;
(ii)與選自SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8中任一的序列互補的B2M基因組的靶核苷酸序列; 和/或
（iii）與選自SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：15中任一的序列互補的PD-1基因組的靶核苷酸序列。
在一些實施方案中，本發明提供了一種製備基因改造的T細胞的方法，通過CRISPR/Cas9基因編輯技術破壞所述T細胞中:
(i) 與SEQ ID NO：2的序列互補的TRAC基因組的靶核苷酸序列;
(ii)與SEQ ID NO：8的序列互補的B2M基因組的靶核苷酸序列; 和/或
（iii）與SEQ ID NO：14的序列互補的PD-1基因組的靶核苷酸序列。
在一些實施方案中，本發明提供了一種製備基因改造的T細胞的方法，通過CRISPR/Cas9基因編輯技術破壞所述T細胞中:
(i) 與SEQ ID NO：2的序列互補的TRAC基因組的靶核苷酸序列;
(ii)與SEQ ID NO：8的序列互補的B2M基因組的靶核苷酸序列; 和/或
（iii）與SEQ ID NO：15的序列互補的PD-1基因組的靶核苷酸序列。
在一些實施方案中，本發明提供了一種製備基因改造的T細胞的方法，通過CRISPR/Cas9基因編輯技術破壞所述T細胞中:
(i) 與SEQ ID NO：3的序列互補的TRAC基因組的靶核苷酸序列;
(ii)與SEQ ID NO：7的序列互補的B2M基因組的靶核苷酸序列; 和/或
（iii）與SEQ ID NO：15的序列互補的PD-1基因組的靶核苷酸序列。
在一些實施方案中，本發明提供了一種通過CRISPR/Cas9基因編輯技術製備基因改造的T細胞的方法，其中:
(i) 將包含選自SEQ ID NOs：2-5中任一序列的sgRNA導入T細胞以實現對 14號染色體第23016448位至第23016490位元的TRAC基因組區域的編輯;
(ii) 將包含選自SEQ ID NOs：6-13中任一序列的sgRNA導入T細胞以實現對 15號染色體第45003745位至第45003788位的B2M基因組區域的編輯; 和/或
(iii) 將包含選自SEQ ID NOs：14-22中任一序列的sgRNA導入T細胞以實現對2號染色體第242800936位至第242800978位的PD-1基因組區域，或2號染色體第242795009位至第242795051位的PD-1基因組區域的編輯。
在一些實施方案中，本發明提供了一種通過CRISPR/Cas9基因編輯技術製備基因改造的T細胞的方法，其中:
(i) 將包含選自SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3中任一序列的sgRNA導入T細胞以實現對 14號染色體第23016448位至第23016490位元的TRAC基因組區域的編輯;
(ii) 將包含選自SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8中任一序列的sgRNA導入T細胞以實現對 15號染色體第45003745位至第45003788位的B2M基因組區域的編輯; 和/或
(iii) 將包含選自SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：15中任一序列的sgRNA導入T細胞以實現對2號染色體第242800936位至第242800978位的PD-1基因組區域，或2號染色體第242795009位至第242795051位的PD-1基因組區域的編輯。
在一些實施方案中，本發明提供了一種通過CRISPR/Cas9基因編輯技術製備基因改造的T細胞的方法，其中:
(i) 將包含SEQ ID NO：2的序列的sgRNA導入T細胞以實現對 14號染色體第23016448位至第23016490位元的TRAC基因組區域的編輯;
(ii) 將包含SEQ ID NO：8的序列的sgRNA導入T細胞以實現對 15號染色體第45003745位至第45003788位的B2M基因組區域的編輯; 和/或
(iii) 將包含SEQ ID NO：15的序列的sgRNA導入T細胞以實現對2號染色體第242800936位至第242800978位的PD-1基因組區域，或2號染色體第242795009位至第242795051位的PD-1基因組區域的編輯。
在一些實施方案中，本發明提供了一種通過CRISPR/Cas9基因編輯技術製備基因改造的T細胞的方法，其中:
(i) 將包含SEQ ID NO：2的序列的sgRNA導入T細胞以實現對 14號染色體第23016448位至第23016490位元的TRAC基因組區域的編輯;
(ii) 將包含SEQ ID NO：8的序列的sgRNA導入T細胞以實現對 15號染色體第45003745位至第45003788位的B2M基因組區域的編輯; 和/或
(iii) 將包含SEQ ID NO：14的序列的sgRNA導入T細胞以實現對2號染色體第242800936位至第242800978位的PD-1基因組區域，或2號染色體第242795009位至第242795051位的PD-1基因組區域的編輯。
在一些實施方案中，本發明提供了一種通過CRISPR/Cas9基因編輯技術製備基因改造的T細胞的方法，其中:
(i) 將包含SEQ ID NO：3的序列的sgRNA導入T細胞以實現對 14號染色體第23016448位至第23016490位元的TRAC基因組區域的編輯;
(ii) 將包含SEQ ID NO：7的序列的sgRNA導入T細胞以實現對 15號染色體第45003745位至第45003788位的B2M基因組區域的編輯; 和/或
(iii) 將包含SEQ ID NO：15的序列的sgRNA導入T細胞以實現對2號染色體第242800936位至第242800978位的PD-1基因組區域，或2號染色體第242795009位至第242795051位的PD-1基因組區域的編輯。
在一些實施方案中，單獨向該T細胞導入所述靶向TRAC的sgRNA。在一些實施方案中，單獨向該T細胞導入所述靶向B2M的sgRNA。在一些實施方案中，單獨向該T細胞導入所述靶向PD-1的sgRNA。在一些實施方案中，同時向該T細胞導入所述靶向TRAC的sgRNA和靶向B2M的sgRNA。在一些實施方案中，同時向該T細胞導入所述靶向TRAC的sgRNA和靶向PD-1的sgRNA。在一些實施方案中，同時向該T細胞導入所述靶向B2M的sgRNA和靶向PD-1的sgRNA。在一些實施方案中，同時向該T細胞導入所述靶向TRAC的sgRNA、靶向B2M的sgRNA和靶向PD-1的sgRNA。
在一些實施方案中，所述sgRNA（包括靶向TRAC的sgRNA、靶向B2M的sgRNA和/或靶向PD-1的sgRNA）是經過2’-O-甲基類似物和/或核苷酸間3’硫代修飾的。在一些實施方案中，所述化學修飾為所述sgRNA（包括靶向TRAC的sgRNA、靶向B2M的sgRNA和/或靶向PD-1的sgRNA）的5’端前一個、二個和/或三個堿基和/或3’端的最後一個堿基的2’-O-甲基類似物修飾。
在一些實施方案中，將上述sgRNA（包括靶向TRAC的sgRNA、靶向B2M的sgRNA和/或靶向PD-1的sgRNA）通過電轉方式導入所述T細胞。在一些實施方案中，上述sgRNA（包括靶向TRAC的sgRNA、靶向B2M的sgRNA和/或靶向PD-1的sgRNA）與Cas9編碼核苷酸（如mRNA）通過電轉方式共同導入該T細胞。在一些實施方案中，所述電轉條件包括選自如下的任一項：150-250V，0.5-2ms；150V，2ms；160V，2ms；170V，2ms；180V，2ms；190V，1ms；200V，1ms；210V，1ms；220V，1ms；230V，1ms；240V，1ms；250V，0.5ms。
在一些實施方案中，還包括從經過基因編輯的T細胞中篩選TRAC、B2M和/或PD-1表達量低的T細胞。例如，所述TRAC、B2M或PD-1在經過基因編輯的Ｔ細胞中的表達量為未經基因編輯的Ｔ細胞的表達量的1/10。
在一些實施方案中，單個基因敲除的效率（TRAC、B2M或PD-1）為80%以上，例如80%-100%、85%-100%、90%-100%、95%-100%、81%以上、82%以上、83%以上、84%以上、85%以上、86%以上、87%以上、88%以上、89%以上、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、或99%以上； 雙基因同時的敲除效率（如TRAC和B2M）在65%以上，例如，65%-100%、70%-100%、75%-100%、80%-100%、85%-100%、90%-100%、95%-100%、70%以上、75%以上、80%以上、85%以上、90%以上、或95%以上；TRAC、B2M和PD-1基因同時的敲除效率在50%以上，例如，55%-100%、60%-100%、65%-100%、70%-100%、75%-100%、80%-100%、85%-100%、90%-100%、95%-100%、55%以上、60%以上、70%以上、75%以上、80%以上、85%以上、90%以上、或95%以上。此處所有數位涵蓋了數位本身和該數位之間的每一整數和小數。此處的敲除效率涵蓋選自TRAC基因、B2M基因和PD-1基因之一敲除、之二同時敲除、之三同時敲除情況下的敲除效率。
在一些實施方案中，所述的T細胞來源於健康受試者、腫瘤或病毒感染患者（例如HIV感染患者）。在一些實施方案中，所述T細胞是處於不同分化階段的幹細胞或前體細胞分化而來的T細胞。
一個方面，本發明涉及通過上述方法製備的基因改造的T細胞。
一個方面，本發明涉及一種基因改造的T細胞， 其中所述T細胞中：
(i) 14號染色體第23016448位至第23016490位元的TRAC基因組區域的一個或多個位點通過基因編輯技術被破壞;
(ii) 15號染色體第45003745位至第45003788位的B2M基因組區域的一個或多個位點通過基因編輯技術被破壞; 和/或
(iii) 2號染色體第242800936位至第242800978位的PD-1基因組區域，或2號染色體第242795009位至第242795051位的PD-1基因組區域的一個或多個位點通過基因編輯技術被破壞。在一些實施方案中，所述T細胞是用本申請所述的任一方法製備的。
一個方面，本發明涉及一種基因改造的T細胞， 其中所述T細胞中：
(i) 14號染色體第23016448位至第23016490位元的TRAC基因組區域具有表D和表E所記載的任一項的基因序列改變；
(ii) 15號染色體第45003745位至第45003788位的B2M基因組區域具有有表B和表C所記載的任一項的基因序列改變; 和/或
(iii) 2號染色體第242800936位至第242800978位的PD-1基因組區域具有表F所記載的任一項的基因序列改變，或2號染色體第242795009位至第242795051位的PD-1基因組區域具有表G所記載的任一項的基因序列改變。在一些實施方案中，所述T細胞是用本申請所述的任一方法製備的。
一個方面，本發明涉及上述基因改造的T細胞用於製備過繼細胞治療的T細胞的用途。在一些實施方案中，所述過繼細胞治療的T細胞為CAR-T細胞或TCR-T細胞。
一個方面，本發明涉及一種製備CAR-T細胞或TCR-T細胞的方法，包括:將嵌合抗原受體（CAR）或其編碼核苷酸、或工程化的T細胞受體（TCR）或其編碼核苷酸導入上述任一基因改造的T細胞。
一方面，本發明涉及一種製備CAR-T或TCR-T細胞的方法，包括:
(i) 將包含靶向14號染色體第23016448位至第23016490位的TRAC基因組的sgRNA導入T細胞以破壞所述TRAC基因組區域；和/或
（ii）將包含靶向15號染色體第45003745位至第45003788位的B2M基因組區域的sgRNA導入該T細胞以破壞所述B2M基因組區域；和/或
（iii）將包含靶向2號染色體第242800936位至第242800978位的PD-1基因組區域，或2號染色體第242795009位至第242795051位的PD-1基因組區域的sgRNA導入該T細胞以破壞所述B2M基因組區域； 和
（iv）將嵌合抗原受體（CAR）或其編碼核苷酸、或工程化的T細胞受體（TCR）或其編碼核苷酸導入該T細胞。在一些實施方案中，所述方法還包含將CAS9或其編碼核苷酸導入該T細胞。
在一些實施方案中，所述製備CAR-T或TCR-T細胞的方法包括:
(i) 將包含選自SEQ ID NOs：2-5中任一的sgRNA導入T細胞以實現對 14號染色體第23016448位至第23016490位元的TRAC基因組區域的編輯;
(ii) 將包含選自SEQ ID NOs：6-13中任一的sgRNA導入T細胞以實現對 15號染色體第45003745位至第45003788位的B2M基因組區域的編輯; 和/或
(iii) 將包含選自SEQ ID NOs：14-22中任一的sgRNA導入T細胞以實現對2號染色體第242800936位至第242800978位的PD-1基因組區域，或2號染色體第242795009位至第242795051位的PD-1基因組區域的編輯；和
（iv）將嵌合抗原受體（CAR）或其編碼核苷酸、或工程化的T細胞受體（TCR）或其編碼核苷酸導入該T細胞。 在一些實施方案中，所述方法還包含將CAS9或其編碼核苷酸導入該T細胞。
在一些實施方案中，所述製備CAR-T或TCR-T細胞的方法包括:
(i) 將包含選自SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3中任一序列的sgRNA導入T細胞以實現對 14號染色體第23016448位至第23016490位元的TRAC基因組區域的編輯;
(ii) 將包含選自SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8中任一序列的sgRNA導入T細胞以實現對 15號染色體第45003745位至第45003788位的B2M基因組區域的編輯; 和/或
(iii) 將包含選自SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：15中任一序列的sgRNA導入T細胞以實現對2號染色體第242800936位至第242800978位的PD-1基因組區域，或2號染色體第242795009位至第242795051位的PD-1基因組區域的編輯；和
（iv）將嵌合抗原受體（CAR）或其編碼核苷酸、或工程化的T細胞受體（TCR）或其編碼核苷酸導入該T細胞。在一些實施方案中，所述方法還包含將CAS9或其編碼核苷酸導入該T細胞。
在一些實施方案中，所述製備CAR-T或TCR-T細胞的方法包括:
(i) 將包含SEQ ID NO：2的序列的sgRNA導入T細胞以實現對 14號染色體第23016448位至第23016490位元的TRAC基因組區域的編輯;
(ii) 將包含SEQ ID NO：8的序列的sgRNA導入T細胞以實現對 15號染色體第45003745位至第45003788位的B2M基因組區域的編輯; 和/或
(iii) 將包含SEQ ID NO：15的序列的sgRNA導入T細胞以實現對2號染色體第242800936位至第242800978位的PD-1基因組區域，或2號染色體第242795009位至第242795051位的PD-1基因組區域的編輯；和
（iv）將嵌合抗原受體（CAR）或其編碼核苷酸、或工程化的T細胞受體（TCR）或其編碼核苷酸導入該T細胞。在一些實施方案中，所述方法還包含將CAS9或其編碼核苷酸導入該T細胞。
在一些實施方案中，所述製備CAR-T或TCR-T細胞的方法包括:
(i) 將包含SEQ ID NO：2的序列的sgRNA導入T細胞以實現對 14號染色體第23016448位至第23016490位元的TRAC基因組區域的編輯;
(ii) 將包含SEQ ID NO：8的序列的sgRNA導入T細胞以實現對 15號染色體第45003745位至第45003788位的B2M基因組區域的編輯; 和/或
(iii) 將包含SEQ ID NO：14的序列的sgRNA導入T細胞以實現對2號染色體第242800936位至第242800978位的PD-1基因組區域，或2號染色體第242795009位至第242795051位的PD-1基因組區域的編輯；和
（iv）將嵌合抗原受體（CAR）或其編碼核苷酸、或工程化的T細胞受體（TCR）或其編碼核苷酸導入該T細胞。 在一些實施方案中，所述方法還包含將CAS9或其編碼核苷酸導入該T細胞。
在一些實施方案中，所述製備CAR-T或TCR-T細胞的方法包括:
(i) 將包含SEQ ID NO：3的序列的sgRNA導入T細胞以實現對 14號染色體第23016448位至第23016490位元的TRAC基因組區域的編輯;
(ii) 將包含SEQ ID NO：7的序列的sgRNA導入T細胞以實現對 15號染色體第45003745位至第45003788位的B2M基因組區域的編輯; 和/或
(iii) 將包含SEQ ID NO：15的序列的sgRNA導入T細胞以實現對2號染色體第242800936位至第242800978位的PD-1基因組區域，或2號染色體第242795009位至第242795051位的PD-1基因組區域的編輯；和
（iv）將嵌合抗原受體（CAR）或其編碼核苷酸、或工程化的T細胞受體（TCR）或其編碼核苷酸導入該T細胞。 在一些實施方案中，所述方法還包含將CAS9或其編碼核苷酸導入該T細胞。
在一些實施方案中，同時向T細胞導入所述靶向TRAC的sgRNA和靶向B2M的sgRNA。在一些實施方案中，同時向T細胞導入所述靶向TRAC的sgRNA、靶向B2M的sgRNA和靶向PD-1的sgRNA。
在一些實施方案中，所述sgRNA（包括靶向TRAC的sgRNA、靶向B2M的sgRNA和/或靶向PD-1的sgRNA）是經過2’-O-甲基類似物和/或核苷酸間3’硫代修飾的。在一些實施方案中，所述化學修飾為所述sgRNA（包括靶向TRAC的sgRNA、靶向B2M的sgRNA和/或靶向PD-1的sgRNA）的5’端前一個、二個和/或三個堿基和/或3’端的最後一個堿基的2’-O-甲基類似物修飾。
在一些實施方案中，將上述sgRNA（包括靶向TRAC的sgRNA、靶向B2M的sgRNA和/或靶向PD-1的sgRNA）通過電轉方式導入所述T細胞。在一些實施方案中，上述sgRNA（包括靶向TRAC的sgRNA、靶向B2M的sgRNA和/或靶向PD-1的sgRNA）與Cas9編碼核苷酸（如mRNA）通過電轉方式共同導入該T細胞。在一些實施方案中，所述電轉條件包括選自如下的任一項：150-250V，0.5-2ms；180-250V，0.5-2ms；150V，2ms；160V，2ms；170V，2ms；180V，2ms；190V，1ms；200V，1ms；210V，1ms；220V，1ms；230V，1ms；240V，1ms；250V，0.5ms。
在一些實施方案中，所述方法包含將靶向TRAC的sgRNA,靶向B2M的sgRNA和/或靶向PD-1的sgRNA和CAR或其編碼核苷酸、或工程化的T細胞受體（TCR）或其編碼核苷酸同時導入該T細胞。
在一些實施方案中，將CAR或其編碼核苷酸、或工程化的T細胞受體（TCR）或其編碼核苷酸先于靶向TRAC的sgRNA,靶向B2M的sgRNA和/或靶向PD-1的sgRNA導入該T細胞；或將CAR或其編碼核苷酸、或工程化的T細胞受體（TCR）或其編碼核苷酸在導入靶向B2M的sgRNA和/或靶向PD-1的sgRNA後導入該T細胞。
一方面，本發明涉及通過上述方法製備的CAR-T細胞或TCR-T細胞。
一方面，本發明涉及CAR-T細胞,包含表達嵌合抗原受體（CAR）的上述基因改造的T細胞。
一個方面，本發明涉及CAR-T細胞， 其中所述CAR-T細胞中：
(i) 14號染色體第23016448位至第23016490位元的TRAC基因組區域具有表D和表E所記載的任一項的基因序列改變；
(ii) 15號染色體第45003745位至第45003788位的B2M基因組區域具有有表B和表C所記載的任一項的基因序列改變; 和/或
(iii) 2號染色體第242800936位至第242800978位的PD-1基因組區域具有表F所記載的任一項的基因序列改變，或2號染色體第242795009位至第242795051位的PD-1基因組區域具有表G所記載的任一項的基因序列改變。
一方面，本發明涉及一種TCR-T細胞,包含表達工程化TCR的上述基因改造的T細胞。
一個方面，本發明涉及TCR-T細胞， 其中所述TCR-T細胞中：
(i) 14號染色體第23016448位至第23016490位元的TRAC基因組區域具有表D和表E所記載的任一項的基因序列改變；
(ii) 15號染色體第45003745位至第45003788位的B2M基因組區域具有有表B和表C所記載的任一項的基因序列改變; 和/或
(iii) 2號染色體第242800936位至第242800978位的PD-1基因組區域具有表F所記載的任一項的基因序列改變，或2號染色體第242795009位至第242795051位的PD-1基因組區域具有表G所記載的任一項的基因序列改變。
本發明以上所提及的TRAC基因組區域、B2M基因組區域、PD-1基因組區域的位置資訊是以參考資料庫：GRCh37 (hg19)中所述基因的野生序列位置資訊而確定的。本領域技術人員知道如何參照其它資料庫獲得上述基因組區域的相應位置資訊。
在一些具體的實施方案中，14號染色體第23016448位至第23016490位元的TRAC基因組區域的野生核苷酸序列如SEQ ID NO:23(tatccagaaccctgaccctgccgtgtaccagctgagagactct)所示。在一些具體的實施方案中，15號染色體第45003745位至第45003788位的B2M基因組區域的野生核苷酸序列如SEQ ID NO:24(atgtctcgctccgtggccttagctgtgctcgcgctactctctct)所示。在一些具體的實施方案中，2號染色體第242800936位至第242800978位的PD-1基因組區域的野生核苷酸序列如SEQ ID NO:25(agcccagttgtagcaccgcccagacgactggccagggcgcctg)所示。在一些具體的實施方案中，2號染色體第242795009位至第242795051位的PD-1基因組區域的野生核苷酸序列如SEQ ID NO:26(cagtttagcacgaagctctccgatgtgttggagaagctgcagg)所示。
一方面，本發明還涉及包含上述基因改造的T細胞， CAR-T細胞或TCR-T細胞的組合物（如藥物組合）、試劑盒、和醫用製品。
一方面，本發明涉及一種治療受試者疾病的方法，包括給藥受試者有效量的上述CAR-T或TCR-T細胞。在一些實施方案中，所述疾病為腫瘤。在一些實施方案中，所述腫瘤為血液系統腫瘤。在一些實施方案中，所述腫瘤為淋巴瘤或白血病。在一些實施方案中，所述CAR靶向腫瘤特異性抗原（TSA）和/或腫瘤相關抗原（TAA），例如本文表A 所示的抗原（如CD19）。
一方面，本發明涉及包含SEQ ID NOs：2-22任一項的sgRNA或其載體。在一些實施方案中，所述sgRNA是經過化學修飾的，所述化學修飾例如2’-O-甲基類似物和/或核苷酸間3’硫代修飾。在一些實施方案中，化學修飾為所述sgRNA的5’端前一個、二個和/或三個堿基和/或3’端的最後一個堿基的2’-O-甲基類似物的修飾。
定義
如本申請使用的，“CRISPR/Cas”是一種基因編輯技術，包括但不限於各種自然存在或人工設計的CRISPR/Cas系統，如CRISPR/Cas9系統。自然存在的CRISPR/Cas系統(Naturally occurring CRISPR/Cas system)是細菌和古細菌在長期演化過程中形成的一種適應性免疫防禦，可用來對抗入侵的病毒及外源DNA。例如，CRISPR/Cas9的工作原理是 crRNA(CRISPR-derived RNA)通過堿基配對與 tracrRNA(trans-activating RNA)結合形成 tracrRNA/crRNA 複合物，此複合物引導核酸酶 Cas9 蛋白在與 crRNA 配對的序列靶位點剪切雙鏈 DNA。而通過人工設計tracrRNA和crRNA，可以改造形成具有引導作用的sgRNA (single guide RNA )，足以引導 Cas9 對 DNA 的定點切割。作為一種 RNA 導向的 dsDNA 結合蛋白，Cas9 效應物核酸酶能夠共定位 RNA、DNA 和蛋白，從而擁有巨大的改造潛力。CRISPR/Cas系統可使用一類，二類或三類Cas蛋白。本發明的一些實施方式中，所述方法使用Cas9。 其他適用的CRISPR/Cas系統包括但不限於WO2013176772，WO2014065596，WO2014018423，US8,697,359 中所描述的系統和方法。
在本發明中，“sgRNA（single guide RNA）” 和 “gRNA（guide RNA）”或可以是“單指導RNA” 、“合成的指導RNA”或“指導RNA”可互換使用。本發明的sgRNA包含靶向目標序列的指導序列(guide sequence)。
“T細胞受體（TCR）”為所有T細胞表面的特徵性標誌，其與CD3結合，形成TCR-CD3複合物。TCR由α、β兩條肽鏈組成，每條肽鏈又可分為可變區（V區），恒定區（C區），跨膜區和胞質區。TCR分子屬於免疫球蛋白超家族，其抗原特異性存在于V區；V區（Vα、Vβ）又各有三個高變區CDR1、CDR2、CDR3，其中以CDR3變異最大，直接決定了TCR的抗原結合特異性。在TCR識別MHC-抗原肽複合體時，CDR1，CDR2識別和結合MHC分子抗原結合槽的側壁，而CDR3直接與抗原肽相結合。TCR分為兩類：TCR1和TCR2；TCR1由γ和δ兩條鏈組成，TCR2由α和β兩條鏈組成。外周血中，90%-95%的T細胞表達TCR2；而且任一T細胞只表達TCR2和TCR1之一。
“β2微球蛋白（B2M）” 是細胞表面人白細胞抗原（HLA）的β鏈（輕鏈）部分，是分子品質為11800，由99個胺基酸組成的單鏈多肽。
“程式性死亡受體1（PD-1）”，是一個268胺基酸殘基的膜蛋白，最初從凋亡的小鼠T細胞雜交瘤2B4.11克隆出來。PD-1和PD-L1結合啟動T細胞的程式性死亡，使腫瘤細胞獲得免疫逃逸，因此，其是一種重要的免疫抑制分子。
如本申請使用的，“Indel”全稱為插入/缺失，即插入和缺失突變。
“移植物抗宿主反應(GVHD)”是指由於供受體之間存在免疫遺傳學差異，例如，一方面，當供體細胞，例如具有免疫活性的供體的T淋巴細胞，在進入受體病人體內並增殖到一定程度後，將受體病人的正常細胞或組織誤認為靶標進行攻擊從而產生的反應。另一方面，作為異體細胞，受體體內的正常免疫系統也可能會對其進行清除產生“宿主抗移植物反應(HVGR)”。
HVGR與GVHR相關基因包含TCR、HLA分子相關基因，這些基因同時敲除的T淋巴細胞在回輸入同種異體病人時不會引起移植物抗宿主病(GVHD)，因此可以稱為“通用型T細胞”。例如，單個TRAC基因是編碼TCRα鏈的基因與編碼TCRβ的兩個TRBC基因形成完整的有功能的TCR複合物，敲除TRAC是可以致使TCR失活，而B2M為MHCⅠ相關基因。這兩個基因同時敲除的T淋巴細胞在回輸入同種異體病人時不會引起移植物抗宿主病(GVHD)。
“CAR-T”為“嵌合抗原受體T細胞”的簡寫形式，其中，嵌合抗原受體(CAR)是CAR-T的核心部件，賦予T細胞HLA非依賴的方式識別靶細胞（如腫瘤）抗原的能力，這使得經過CAR改造的T細胞相較于天然T細胞表面受體TCR能夠識別更廣泛的目標。在一些實施中，靶向腫瘤的CAR的設計中包括一個腫瘤相關抗原（tumor-associated antigen，TAA）結合區（例如，通常來源於單克隆抗體抗原結合區域的scFV段），一個胞外鉸鏈區，一個跨膜區和一個胞內信號區。目標抗原的選擇對於CAR的特異性、有效性以及基因改造T細胞自身的安全性來講都是關鍵的決定因素。
“通用型CAR-T細胞”指能夠靶向特異的靶細胞（如腫瘤）相關標誌並且細胞表面TCR和MHC功能失活，可以降低同種異體細胞治療引起的免疫排斥反應的CAR-T細胞。
自體細胞的CAR-T治療需要抽取血液分離病人自身T淋巴細胞製備，一方面由於病人自身病情以及T淋巴細胞狀態不同CAR-T生產過程影響因素較多不能標準化生產影響安全性，另一方面有些病人自體T淋巴細胞經過化療後活性和數量不足，或受到腫瘤環境影響導致T淋巴細胞活性和增殖能力受限，這樣的細胞在製備CAR-T時往往難度較大，治療的安全性和有效性受到影響；或者在CAR-T細胞製備過程中若出現突發狀況已準備細胞不能及時回輸給病人也會影響治療效果，甚至於受到自體T淋巴細胞狀態影響有些腫瘤患者不能接受自體的CAR-T細胞過繼治療；可用於同種異體治療的通用型CAR-T或通用型T淋巴細胞在上述情況下便佔有很大的優勢。
TCR-T（T細胞受體（TCR）嵌合型-T 細胞)是指表達有工程化T 細胞受體（engineered TCR）或稱人造T細胞受體（artificial TCR）的T細胞。所述工程化T 細胞受體或人造T細胞受體經過了基因改造，具有靶向目的抗原的結構，同時也保留了TCR信號傳導通路中的結構域和/或輔助分子。在某些實施例中，TCR-T保留了TCR信號傳導通路中的全部輔助分子因此，在少量抗原刺激時，就可以發生全啟動的狀態，引起對靶細胞的殺傷效應。相對於CAR-T而言，這些TCR-T保持並應用了TCR信號傳導通路上的所有輔助分子，因此TCR-T對低濃度，少拷貝數抗原的識別敏感性高於某些CAR-T，治療潛力非常大。
在某些實施例中，TCR-T細胞通過部分基因修改的方法提高了TCR對相應抗原（如TAA）的親和力，因此“基因修改的TCR”技術也因此被稱為“親和力增強的TCR”技術（Affinity-Enhanced TCR）。例如《自然-醫學》雜誌報導的Adaptimmune公司聯合研發的一款“基因修改的TCR”在修改了幾個關鍵胺基酸以後，這些基因修改的TCR大大提高了和一種常見的癌症TAA，NY-ESO-1，的親和力。從而可以用來進攻有NY-ESO-1過量表達的癌症，比如多發性骨髓瘤（Multiple Myeloma）。
過繼細胞療法(Adoptive cellular therapy，ACT) 、過繼免疫療法(adoptive immunotherapy)，例如腫瘤過繼免疫療法（tumor adoptive immunotherapy），是指將免疫細胞在體外處理，例如加入特異性抗原，對免疫細胞表達的分子進行改造或利用細胞因數對其進行刺激等方法，篩選並大量擴增具有高度特異性的靶細胞（如腫瘤）殺傷性免疫效應細胞，然後輸給患者，殺滅靶細胞（如腫瘤）的一種治療方法，是一種被動免疫治療。
高效編輯 T 細胞的方法
本發明的一個方面，提供一種製備基因編輯的T細胞（如通用T細胞）的方法，包括通過基因編輯技術破壞所述T細胞中：(i) 14號染色體第23016448位至第23016490位元的TRAC基因組區域(如SEQ ID NO:23所示）; (ii) 15號染色體第45003745位至第45003788位的B2M基因組區域(如SEQ ID NO:24所示）; 和/或(iii) 2號染色體第242800936位至第242800978位的PD-1基因組區域(如SEQ ID NO:25所示），或2號染色體第242795009位至第242795051位的PD-1基因組區域(如SEQ ID NO:26所示）。在一些實施方案中，該方法所述基因編輯技術為基於鋅指核酸酶的基因編輯技術、TALEN基因編輯技術或CRISPR/Cas基因編輯技術。在一些實施方案中，所述TRAC基因組區域、B2M基因組區域或PD-1基因組區域被編輯。在一些實施方案中，其中所述TRAC基因組區域、和B2M基因組區域均被編輯。在一些實施方案中，其中所述TRAC基因組區域和PD-1基因組區域均被編輯。在一些實施方案中，其中所述B2M基因組區域和PD-1基因組區域均被編輯。在一些實施方案中，其中所述TRAC基因組區域、B2M基因組區域和PD-1基因組區域均被編輯。
在一些實施方案中，提供一種製備基因編輯的T細胞（如通用T細胞）的方法，包括通過基因編輯技術破壞所述T細胞中：(i)與選自SEQ ID NOs：2-5中任一的序列互補的TRAC基因組靶核苷酸序列; (ii)與選自SEQ ID NOs：6-14中任一的序列互補的B2M基因組的靶核苷酸序列; 和/或（iii）與選自SEQ ID NOs：15-22中任一的序列互補的PD-1基因組的靶核苷酸序列。在一些實施方案中，該方法所述基因編輯技術為基於鋅指核酸酶的基因編輯技術、TALEN基因編輯技術或CRISPR/Cas基因編輯技術。在一些實施方案中，所述TRAC基因組區域、B2M基因組區域或PD-1基因組區域被編輯。在一些實施方案中，其中所述TRAC基因組區域、和B2M基因組區域均被編輯。在一些實施方案中，其中所述TRAC基因組區域和PD-1基因組區域均被編輯。在一些實施方案中，其中所述B2M基因組區域和PD-1基因組區域均被編輯。在一些實施方案中，其中所述TRAC基因組區域、B2M基因組區域和PD-1基因組區域均被編輯。
在一些實施方案中，提供一種製備基因編輯的T細胞（如通用T細胞）的方法，包括：將靶向TRAC的sgRNA、靶向B2M的sgRNA和/或PD-1的sgRNA導入T細胞，以破壞T細胞的TRAC、B2M和/或PD-1基因。在一些實施方案中，該方法包括將Cas9或其編碼核苷酸導入T細胞。
在一些實施方案中，sgRNA靶向TCR2的α和/或β鏈的恒定區的編碼基因，從而破壞T細胞表面TCR的結構，使該分子失去功能。
在一些實施方案中，sgRNA靶向β2微球蛋白（B2M）的編碼基因，例如靶向B2M蛋白編碼基因的第一個外顯子區域，從而破壞B2M的結構，使該分子失去功能。
在一些實施方案中，sgRNA靶向PD-1的編碼基因，例如PD-1蛋白編碼基因的第一個外顯子區域，從而破壞PD-1的結構，使該分子失去功能。
在一些實施方案中，提供一種製備基因編輯的T細胞（如通用T細胞）的方法，包括：（i）將包含選自SEQ ID NOs：2-5中任一序列的sgRNA導入T細胞以實現對所述TRAC基因組區域的編輯；（ii）將包含選自SEQ ID NOs：6-14中任一序列的sgRNA導入T細胞以實現對所述B2M基因組區域的編輯； 和/或（iii）將包含選自SEQ ID NOs：15-22中任一序列的sgRNA導入T細胞以實現對所述PD-1基因組區域的編輯。在一些實施方案中，該方法包括將Cas9或其編碼核苷酸導入T細胞。
在一些實施方案中，本發明涉及將靶向TRAC的選自表2所示的任一sgRNA導入T細胞。在本發明的一些實施方案中，本發明涉及將靶向B2M的選自表2所示的任一sgRNA導入T細胞。在本發明的一些實施方案中，本發明涉及將靶向PD-1的選自表2所示的任一sgRNA導入T細胞。在一些實施方案中，該方法包括將Cas9或其編碼核苷酸導入T細胞。
在一些實施方案中，本發明涉及將靶向TRAC的選自表2所示的任一sgRNA、和/或靶向B2M的選自表2所示的任一sgRNA、和/或靶向PD-1的選自表2所示的任一sgRNA與Cas9或其編碼核苷酸導入T細胞。
在一些實施方案中，本發明涉及將靶向TRAC的選自表2所示的任一sgRNA、和靶向B2M的選自表2所示的任一sgRNA、和靶向PD-1的選自表2所示的任一sgRNA導入T細胞。在一些實施方案中，該方法包括將Cas9或其編碼核苷酸導入T細胞。
在本發明的一些實施方案中，提供一種製備通用T細胞的方法，包括：（i）將TRAC-sg3 sgRNA導入T細胞以實現對所述TRAC基因組區域的編輯；（ii）將B2M-sg2 sgRNA導入T細胞以實現對所述B2M基因組區域的編輯； 和（iii）將PD-1-sg2 sgRNA導入T細胞以實現對所述PD-1基因組區域的編輯。在一些實施方案中，該方法包括將Cas9或其編碼核苷酸導入T細胞。
在一些實施方案中，提供一種製備通用T細胞的方法，包括：（i）將包含SEQ ID NO：2或3的序列的sgRNA導入T細胞以實現對所述TRAC基因組區域的編輯；（ii）將包含選自SEQ ID NO：7或11中任一的序列的sgRNA導入T細胞以實現對所述B2M基因組區域的編輯； 和（iii）將包含選自SEQ ID NO：14或15中的序列的sgRNA導入T細胞以實現對所述PD-1基因組區域的編輯。在一些實施方案中，該方法包括將Cas9或其編碼核苷酸導入T細胞。
在一些實施方案中，上述sgRNA是經過化學修飾的。例如是經過2’-O-甲基類似物和/或核苷酸間3’硫代修飾的。在一些實施方案匯總，所述化學修飾為所述sgRNA的5’端前一個、二個和/或三個堿基和/或3’端的最後一個堿基的2’-O-甲基類似物的修飾。
一般而言，sgRNA中的指導序列是與靶多核苷酸序列具有足夠的互補性以與靶序列雜交並指導CRISPR複合物與靶序列的序列特異性結合的任何多核苷酸序列。在一些實施方案中，當使用適當的比對演算法最佳比對時，指導序列及其相應靶序列間的互補程度為約或大於約80%、85%、90%、95%、97.5%、99%或更多。最佳比對可使用用於比對序列的任何適當的演算法確定，其非限制性實例包括Smith-Waterman演算法、Needleman-Wimsch演算法、基於Burrows-Wheeler Transform的演算法(例如Burrows Wheeler Aligner)、ClustalW、Clustai X、BLAT、Novoalign (Novocraft Technologies，ELAND ((Illumina，San Diego，CA)、SOAP (可在soap.genomics.org.cn獲得)和Maq (可在maq.sourceforge.net獲得)。在一些實施方案中，指導序列長度可以為約或大於約10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75或更多個核苷酸。在一些實施方案中，指導序列長度少於約75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、25、20、15、12或更少的核苷酸。指導序列指導CR1SPR複合物與靶序列的序列特異性結合的能力可通過任何適當的測定方法評估。例如，可向具有相應靶序列的宿主細胞提供足以形成CRISPR複合物的CRISPR系統的元件(包括待測試的指導序列)，如可通過使用編碼CRISPR序列元件的載體轉染，隨後評估靶序列內的優先切割來進行。同樣地，靶多核苷酸序列的切割可在測試管中通過提供靶序列、CRISPR複合物(包含待測試的指導序列和不同於指導序列的對照指導序列)的元件，並比較測試和對照指導序列在靶序列的結合或切割率，以此進行評估。也可以使用本領域技術人員知道的其它測定方法進行上述測定和評估。
在一些實施方案中，所述靶向TRAC的sgRNA、靶向B2M的sgRNA和/或靶向PD-1的sgRNA和/或Cas9編碼核苷酸（如mRNA）通過電轉導入該T細胞，例如，通過150-250V，0.5-2ms；180-250V，0.5-2ms；150V，2ms；160V，2ms；170V，2ms；180V，2ms；190V，1ms；200V，1ms；210V，1ms；220V，1ms；230V，1ms；240V，1ms；250V，0.5ms的電轉條件導入T細胞。在一些實施方案中，所述靶向TRAC的sgRNA、靶向B2M的sgRNA和靶向PD-1的sgRNA和Cas9編碼核苷酸通過電轉方式共同導入T細胞。
在一些實施方案中，所述Cas9編碼核苷酸為mRNA，如含有ARCA帽的mRNA。在一些實施方案中，所述Cas9編碼核苷酸在病毒載體中，如慢病毒載體。在一些實施方案中，所述Cas9編碼核苷酸包含如SEQ ID NO：1所述的序列。在一些實施方案中，所述靶向TRAC的sgRNA、靶向B2M的sgRNA和/或靶向PD-1的sgRNA與Cas9編碼核苷酸在同一載體中。
在一些實施方案中，靶向TRAC的sgRNA、靶向B2M的sgRNA和靶向PD-1的sgRNA同時導入T細胞。在具體實施方案中，靶向TRAC的sgRNA、靶向B2M的sgRNA和靶向PD-1的sgRNA同時導入T細胞時，靶向TRAC的sgRNA、靶向B2M的sgRNA和靶向PD-1的sgRNA之間的量可以是近似的或等同的。在一些實施方案中，靶向TRAC的sgRNA、靶向B2M的sgRNA和靶向PD-1的sgRNA以任何合適的順序逐一導入T細胞。在一些實施方案中，靶向TRAC的sgRNA、靶向B2M的sgRNA和/或靶向PD-1的sgRNA與Cas9編碼核苷酸同時導入T細胞。在一些實施方案中， Cas9編碼核苷酸先于靶向TRAC的sgRNA、靶向B2M的sgRNA和/或靶向PD-1的sgRNA導入T細胞。在一些實施方案中，T細胞包含Cas9編碼核苷酸或Cas9蛋白。
在一些實施方案中，T細胞來源於健康人。在一些實施方案中，T細胞來源於患者，如癌症患者，例如化療或放射治療前的癌症患者。在一些實施方案中，T細胞來源如臍帶血，骨髓，或外周血單個核細胞（Peripheral blood mononuclear cell，PBMC)。在一些實施方案中，T細胞來源於幹細胞，例如各個分化階段的造血幹細胞。本申請中所述的製備方法可以用於在例如PBMC或幹細胞中敲除TRAC、B2M 和/或PD-1，並進一步培養，分化，和/或提純出相應的基因改造的T細胞。
與現有技術相比，本發明的T細胞基因敲除方法獲得了高效的基因敲除效率，例如，單基因（TRAC）、雙基因（TRAC和B2M）及三基因（TRAC，B2M及PD-1）敲除，其敲除效率分別高達至少90%、81%及67%。
“敲除效率”可以在基因水準上以產生基因敲除的INDEL的效率來表示，也可以在細胞水準上以所述基因敲除致使該基因表達蛋白消失或顯著降低的細胞的百分比來表示。在本發明中，“敲除效率”是指基於後者計算的敲除效率。本領域技術人員可以理解，高的敲除效率可以提高目的細胞的收穫率，降低生產成本和治療成本。
在一些實施方案中，基因編輯的T細胞（如通用T細胞）被進一步篩選，以得到更高純度的單基因（TRAC）、雙基因（TRAC和B2M）及三基因（TRAC，B2M及PD-1）敲除T細胞。例如，可通過FACS篩選TRAC、B2M和/或 PD-1表達量低的基因編輯的T細胞（如通用T細胞）。
在一些實施方案中，本發明的通用型T細胞的TCR和\或HLA和\或PD-1基因被敲除。
在一些具體的實施方案中，所述TCR的α鏈恒定編碼區(即TRAC)基因被敲除。B2M和\或PD-1的編碼區被敲除。TRAC、B2M和PD-1可以三者均被敲除，也可以敲除三者之一或者敲除其中兩個。
在一些具體的實施方案中，所述TCR的α鏈恒定編碼區(即TRAC)基因被敲除。例如，在具體實施方案中，本發明 TCR α鏈恒定編碼區基因被引入所述細胞的 TRAC-sg 2、3、4、6分子之一(見表2)以及Cas 9分子敲除。優選所述 TCR的α鏈恒定編碼區基因被引入細胞的TRAC-sg 2和Cas9分子或TRAC-sg 3和Cas9分子進行敲除。
在另一些具體的實施方案中，所述HLA的恒定編碼區B2M基因被敲除。例如，在具體實施方案中，本發明B2M恒定編碼區基因被引入所述細胞的B2M-sg 1-8分子之一(見表2) 以及Cas 9分子,優選所述B2M的恒定編碼區基因被引入細胞的B2M-sg 2或B2M-sg 6分子和Cas9分子進行敲除。
在另一些具體的實施方案中，所述PD-1的恒定編碼區基因被敲除。例如，在具體實施方案中，本發明PD-1恒定編碼區基因被引入所述細胞的PD-1-sg1-2，PD-1-sg4-10分子之一(見表2) 以及Cas 9分子,優選所述PD-1的恒定編碼區基因被引入細胞的PD-1-sg1或PD-1-sg2分子和Cas9分子進行敲除。
在另一些具體的實施方案中，所述TCR的α鏈恒定編碼區(即TRAC)基因及B2M基因被敲除。例如，在具體實施方案中，本發明TRAC及B2M基因被引入所述細胞的TRAC-sg3及B2M-sg2分子 (見表2) 以及Cas 9分子進行敲除。
在另一些具體的實施方案中，所述TCR的α鏈恒定編碼區(即TRAC)基因、B2M基因及 PD-1的恒定編碼區基因被敲除。例如，在具體實施方案中，本發明TCR、HLA及PD-1恒定編碼區基因被引入所述細胞的TRAC-sg3、B2M-sg2及PD-1-sg2分子 (見表 2) 以及Cas 9分子進行敲除。在具體實施方案中，本發明TCR、HLA及PD-1恒定編碼區基因被引入所述細胞的TRAC-sg2、B2M-sg6及PD-1-sg1分子 (見表 2) 以及Cas 9分子進行敲除。在具體實施方案中，本發明TCR、HLA及PD-1恒定編碼區基因被引入所述細胞的TRAC-sg2、B2M-sg6及PD-1-sg2分子 (見表 2) 以及Cas 9分子進行敲除。
在一些實施方案中，本發明提供了一種高效編輯T細胞的方法，所述方法包括如下步驟:
在T細胞中引入sgRNA分子和Cas9分子:
在一些實施方案中，所述 sgRNA分子包含與來自 TCR的α鏈恒定編碼區(即TRAC)基因、B2M基因及 PD-1的恒定編碼區基因靶區域互補的靶向結構域。
在一些實施方案中，所述 sgRNA 分子是指一段包含與待敲除的基因的靶區域互補的靶向結構域的核酸序列，其能識別靶標DNA序列並引導Cas9分子剪切靶位點，其可以實現一步高效（敲除效率85%以上）敲除相應位點。
在一些實施方案中，所述sgRNA分子所包含的靶向結構域的序列如表2中之一所示。
在一些優選的實施方案中，所述靶向結構域的序列如T2、B3及P1所示。
在一些優選的實施方案中，通過電轉技術將所述sgRNA 分子和編碼Cas9分子的mRNA 引入所述T細胞中。
在一些具體的實施方案中，上述方法中使用的T細胞來自健康人，例如健康成人外周血，或自然分娩的健康人的臍帶血。
在一些實施方案中，本發明的協力廠商面提供了經過特定修飾後的具有高效編輯效率的sgRNA序列（表2）。
在一些具體的實施方案中，利用化學方法合成並修飾sgRNA，使sgRNA比普通的體外轉錄（IVT）所獲得的sgRNA具有更穩定及更高的編輯效率。優選地，用電轉的方法對T細胞進行一次電轉，化學合成並經過修飾的sgRNA基因編輯效率是普通的IVT所獲得的sgRNA的10倍以上。
在一些實施方案中，提供了本發明所述的通用型T細胞用於製備治療疾病（如腫瘤）的藥物的用途。
在一些具體的實施方案中，所述TCR的α鏈恒定編碼區(即 TRAC)基因，HLA的恒定編碼區B2M基因，PD-1的恒定編碼區基因被敲除。例如，在具體實施方案中，本發明 TCRα鏈恒定編碼區基因被引入所述細胞的 TRAC-sg 2分子，本發明B2M恒定編碼區基因被引入所述細胞的B2M-sg6分子，本發明PD-1恒定編碼區基因被引入所述細胞的PD-1-sg1(見表2)以及Cas 9分子:優選所述 TCR的α鏈恒定編碼區基因被引入細胞的TRAC-sg2、B2M恒定編碼區基因被引入細胞的B2M-sg6、PD-1恒定編碼區基因被引入細胞的PD-1-sg1分子和Cas9分子進行敲除。
高效編輯的 T 細胞或通用型 T 細胞
本發明涉及通過本發明上述方法製備的TRAC單基因敲除T細胞（TRACnegative ），TRAC/B2M雙基因敲除（DKO）T細胞和TRAC/B2M/PD-1三基因敲除（TKO）T細胞。
與現有技術相比，本發明的單基因敲除T細胞（TRACnegative ），TRAC/B2M雙基因敲除（DKO）T細胞和TCR/B2M/PD-1三基因敲除（TKO）T細胞的基因敲除效率大大提高。
本發明製備的單基因敲除T細胞（TRACnegative ），TRAC/B2M雙基因敲除（DKO）T細胞和TCR/B2M/PD-1三基因敲除（TKO）T細胞，可作為T細胞進一步改造的前體細胞，或者作為通用型T細胞，用於製備各種基因修飾的T細胞，例如可用來製備CAR-T細胞或TCR-T細胞。
本發明的一些實施方案中提供一種基因改造的T細胞（如通用T細胞），其中所述T細胞中：(i) 14號染色體第23016448位至第23016490位元的TRAC基因組區域的一個或多個位點通過基因編輯技術被破壞; (ii) 15號染色體第45003745位至第45003788位的B2M基因組區域的一個或多個位點通過基因編輯技術被破壞; 和/或(iii) 2號染色體第242800936位至第242800978位的PD-1基因組區域，或2號染色體第242795009位至第242795051位的PD-1基因組區域的一個或多個位點通過基因編輯技術被破壞. 在一些實施例中，所述T細胞（i）與選自SEQ ID NOs：2-5中任一的序列互補的TRAC基因組靶核苷酸序列通過基因編輯技術被破壞; (ii)與選自SEQ ID NOs：6-14中任一的序列互補的B2M基因組的靶核苷酸序列通過基因編輯技術被破壞; 和/或（iii）與選自SEQ ID NOs：15-22中任一的序列互補的PD-1基因組的靶核苷酸序列通過基因編輯技術被破壞。
本發明的一些實施方案中提供一種基因改造的T細胞（如通用T細胞），其中所述T細胞中：(i) 其TRAC基因組包含表D和表E所記載的任一項的序列；
(ii) 其B2M基因組包含表B和表C所記載的任一項的序列; 和/或
(iii) 其PD-1基因組包含表F或表G所記載的任一項的序列。
本發明一方面提供了包含所述的基因改造的T細胞（如通用T細胞）、CAR-T細胞，或TCR-T細胞組合物，如藥物組合物。
本發明一方面還提供了試劑盒或製品，包含本發明所述的基因改造的T細胞（如通用T細胞）。該試劑盒或製品可用以製備CAR-T、TCR-T或其他過繼細胞治療組合物。
製備 CAR-T 細胞的方法
本發明一方面提供了製備CAR-T細胞（如通用CAR-T細胞）的方法。在一些實施方案中，該方法包括將CAR或其編碼核苷酸或載體導入本發明所描述的任何基因改造的T細胞（如通用T細胞）。
在一些實施方案中，提供了一種製備CAR-T細胞的方法，包括:
(i) 將包含靶向14號染色體第23016448位至第23016490位的TRAC基因組的sgRNA導入T細胞以破壞所述TRAC基因組區域；和/或
（ii）將包含靶向15號染色體第45003745位至第45003788位的B2M基因組區域的sgRNA導入該T細胞以破壞所述B2M基因組區域； 和/或
（iii）將包含靶向2號染色體第242800936位至第242800978位的PD-1基因組區域，或2號染色體第242795009位至第242795051位的PD-1基因組區域的sgRNA導入該T細胞以破壞所述B2M基因組區域； 和
（iv）將嵌合抗原受體（CAR）或其編碼核酸導入該T細胞。
CAR或其編碼核酸以及靶向TRAC的sgRNA,靶向B2M的sgRNA和/或靶向PD-1的sgRNA和CAR或其編碼核苷酸可以以任何適合的順序導入Ｔ細胞。在一些實施方案中，靶向TRAC的sgRNA,靶向B2M的sgRNA和/或靶向PD-1的sgRNA和CAR或其編碼核苷酸同時導入該T細胞。在一些實施方案中，CAR或其編碼核苷酸先于靶向TRAC的sgRNA,靶向B2M的sgRNA和/或靶向PD-1的sgRNA導入該T細胞。在一些實施方案中，ＣＡＲ或其編碼核苷酸導入已經實現基因編輯的Ｔ細胞中，該Ｔ細胞的TRAC,B2M和/或PD-1基因組區域已經通過編輯被破壞。在一些實施方案中，該方法還包括將Cas9或其編碼核苷酸於說所述sgRNA一併導入該Ｔ細胞。
在一些實施方案中，本發明的通用型CAR-T細胞所表達的 CAR可以是本領域己知的任何CAR，只要其能夠使T細胞以人白細胞抗原-非依賴性的方式識別細胞表面抗原，發揮殺傷作用即可。例如，可以使用美國發明專利申請 US20140271635 A1中公開的CAR，本發明的具體實施方案中使用的CAR可參考該發明專利申請公開文本（US20140271635 A1）。在一些實施方案中，本發明CAR-T細胞中的CAR為識別以下腫瘤與相關抗原對應表A中所述抗原的CAR。
表A
在一些實施方案中，本發明的 CAR-T細胞中表達的CAR包含順序連接的信號肽、胞外結合區、鉸鏈區、跨膜區和胞內信號區。本文使用的術語"信號肽"是指引導新合成的蛋白質向分泌通路轉移的短(例如長度5-30個胺基酸)肽鏈。在本發明中，可以使用人體內的各種蛋白質的信號肽，例如體內分泌的細胞因數蛋白、白細胞分化抗原 (CD分子)的信號肽。
在一些實施方案中，所述信號肽為CD8信號肽，例如其胺基酸序列如發明專利申請US20140271635 A1 中所示。
在一些實施方案中，所述絞鏈區可以使用各種不同抗體或抗原受體的鉸鏈區，特別是CD分子的鉸鏈區。在一個具體的實施方案中，所述鉸鏈區可以選自 CD8或CD28等蛋白的鉸鏈區。所述CD8或CD28是T細胞表面的天然標記物。
在本發明中，可以使用各種人體內蛋白的跨膜區，特別是各種不同抗原受體的跨膜區。優選使用的跨膜區是 CD分子的跨膜區。在一個實施方案中，所述跨膜區可以選自CD8或CD28或4-1BB等蛋白的跨膜區。
在一些實施方案中，所述鉸鏈區為CD8α鉸鏈區 (CD8-hinge)，其胺基酸序列如發明專利申請 US20140271635 A1中所示。
所述"胞外結合區"是指包含特異性識別靶抗原的區域。在一些實施方案中，該胞外結合區包含特異性識別靶腫瘤細胞表面抗原的區域。例如這個區域可以是scFv或其他抗體的抗原結合片段。本文使用的術語"scFv"是指通過連接區(linker)連接的重鏈可變區 (variable region of heavy chain ，VH 和輕鏈可變區 (variable region of light chain ，VL) 的重組蛋白，連接區使得這兩個結構域相關聯，最終形成抗原結合位點。scFv通常是由一條核苷酸鏈編碼的胺基酸序列。上述 scFv還可以包括其衍生物。
本發明使用的CAR及其各結構域可通過單獨或聯合使用本領域己知的常規技術，例如胺基酸缺失、插入、取代、增加，和/或重組以及/或其他修飾方法作進一步修飾。根據一種抗體的胺基酸序列在其DNA序列中引入這種修飾的方法對本領域技術人員來說是公知的(參見例如， Sambrook分子克隆:實驗手冊，Cold Spring Harbor Laboratory(1989)N.Y.) 。所述修飾優選在核酸水準上進行。
本文使用的術語"特異性識別"意指本發明的抗原識別區不與或基本上不與目標抗原以外的任意多肽交叉反應。其特異性的程度可以通過免疫學技術來判斷，包括但不限於免疫印跡，免疫親和層析，流式細胞分析等。
在一些實施方案中，所述胞外結合區包含特異性識別 CD19、CEA、EGFR、GD2、CD7或CD138等的抗原結合區域，如scFv。
在一些實施方案中，所述胞外結合區包含經人源化改造的特異性識別CD19的scFv。在一些實施方案中，該特異性識別CD19的scFv的胺基酸序列如發明專利申請 US20140271635 A1中所示。
在本發明中，可以使用各種人體內蛋白的胞內信號區，特別是各種不同抗原受體的胞內信號區。優選使用的胞內信號區是 CD分子的胞內信號區。在具體實施方案中，所述胞內信號區可以選自CD3ζ、FcεRIγ 、CD28 、CD137（4-1BB）、CD134 蛋白的胞內信號區，及其組合。CD3 分子由五個亞單位組成，其中CD3ζ亞單位(又稱CD3zeta，簡稱ζ) 含有3個ITAM基序，該基序是TCR-CD3複合體中重要的信號轉化區。FcεRI y主要分佈在肥大細胞和嗜鹼性粒細胞表面，其含有一個 ITAM基序，在結構、分佈及功能上與CD3ζ類似。此外如前所述，CD28、CD137、CD134是共剌激信號分子，在與各自配體結合後其胞內信號區段產生的共刺激作用引起T細胞的持續增殖，並能夠提高T細胞分泌 IL-2和IFN- γ等細胞因數的水準，同時提高 CAR-T細胞在體內的存活週期和抗腫瘤效果。
在某些實施方案中，由單獨TCR產生的信號不足以完全活化天然T細胞，需要通過TCR起始抗原依賴性初次活化的序列(初級細胞內信號傳導結構域)以及以不依賴於抗原的方式作用以提供共刺激信號的序列(共刺激性結構域)。初級信號傳導結構域以刺激性方式或以抑制性方式調控TCR複合物的初次活化。以刺激性方式作用的初級細胞內信號傳導結構域可以含有信號傳導基序，稱為免疫受體酪氨酸活化基序(ITAM)。適用于本發明中的含有ITAM的初級細胞質信號傳導序列的實例包括CD3ζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b以及CD66d。在一個實施方案中，初級信號傳導結構域包含修飾的ITAM結構域，例如活性相較于天然ITAM結構域有所改變(例如增加或降低)的突變的ITAM結構域，或截短的ITAM的初級細胞內信號傳導結構域。在一個實施方案中，初級信號傳導結構域包含一個或多個ITAM基序。
共刺激信號傳導結構域是指TCR中包含共刺激分子細胞內結構域的部分。共刺激分子是淋巴細胞對抗原高效反應所需的除抗原受體或其配體外的細胞表面分子。這些分子的實例包括CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD1、ICOS、淋巴細胞功能相關抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3，以及與CD83特異性結合的配體等。
在一些實施方案中，本發明提供了一種製備CAR-T細胞，例如通用型CAR-T細胞的方法，所述方法包括如下步驟:
1) 在T細胞中引入 sgRNA分子和Cas9分子:
在一些實施方案中，所述 sgRNA分子包含與來自 TCR的　鏈恒定編碼區(即TRAC)基因、HLA恒定編碼區B2M基因及 PD-1的恒定編碼區基因靶區域互補的靶向結構域。
2) 在所述T細胞中引入CAR分子；
在一些實施方案中，所述 sgRNA 分子是指一段包含與待敲除的基因的靶區域互補的靶向結構域的核酸序列，其能識別靶標DNA序列並引導Cas9分子剪切靶位點，其可以實現一步高效（敲除效率85%以上）敲除相應位點。
在一些實施方案中，所述 Cas9分子是指Cas9 mRNA，其能夠在 sgRNA 的引導下對靶位點進行剪切。
在一些具體的實施方案中，所述sgRNA分子所包含的靶向結構域的序列如表2中之一所示。
在一些優選的實施方案中，所述靶向結構域的序列如T2、B3及P1所示（表2）。
在一些優選的實施方案中，通過電轉技術將所述sgRNA 分子和編碼Cas9分子的mRNA 引入所述T細胞中。
在一些實施方案中，通過例如慢病毒轉染技術將所述CAR分子引入所述T細胞中。
在一些具體的實施方案中，包括分離和/或啟動來自健康人外周血或臍帶血的T細胞的步驟；優選地，所述方法在上述步驟2）之後還包括對通用型CAR-T細胞進行分選的步驟；更優選地，分選之後再對所得的CAR-T細胞，例如通用型CAR-T細胞進行功能性驗證。
在一些實施方案中，本發明提供了上述CAR-T細胞用於製備治療疾病（如腫瘤）的用途。
本發明在一個方面提供了一種治療受試者疾病的方法，包括給藥受試者有效量的本發明所述的CAR-T細胞。本發明所述的治療方法包括但不限於癌症和HIV/AIDS. 在一些實施方案中，該疾病為腫瘤，包括血液系統腫瘤，如淋巴瘤或白血病。在一些實施方案中，所述CAR靶向表A中所示的抗原，該疾病為表Ａ中與該靶抗原相對應的腫瘤。
在一些實施方案中，所述T細胞不是從受試者得到的。例如，所述T細胞可以來源於健康的捐助者。
本發明涉及的CAR－Ｔ細胞可以通過給藥包含細胞成分的醫藥製品常規使用的途徑，例如靜脈輸注途徑，給藥有此需要的受試者。給藥劑量可以基於受試者的病情和一般健康狀況具體確定。
製備 TCR-T 細胞的方法
本發明提供了表達工程化TCR的T細胞，也稱TCR-T細胞。本發明還提供了製備該TCR-T細胞的方法，包括將工程化TCR或其編碼核苷酸或載體導入本發明所描述的任何基因改造的T細胞（如通用T細胞）。
在一些實施方案中，提供了一種製備TCR-T細胞的方法，包括:
(i) 將包含靶向14號染色體第23016448位至第23016490位的TRAC基因組的sgRNA導入T細胞以破壞所述TRAC基因組區域；和/或
（ii）將包含靶向15號染色體第45003745位至第45003788位的B2M基因組區域的sgRNA導入該T細胞以破壞所述B2M基因組區域； 和/或
（iii）將包含靶向2號染色體第242800936位至第242800978位的PD-1基因組區域，或2號染色體第242795009位至第242795051位的PD-1基因組區域的sgRNA導入該T細胞以破壞所述B2M基因組區域；和
（iv）將工程化TCR或其編碼核酸導入該T細胞。
TCR或其編碼核酸以及靶向TRAC的sgRNA，靶向B2M的sgRNA和/或靶向PD-1的sgRNA和TCR或其編碼核苷酸可以以任何適合的順序導入Ｔ細胞。在一些實施方案中，靶向TRAC的sgRNA，靶向B2M的sgRNA和/或靶向PD-1的sgRNA和TCR或其編碼核苷酸同時導入該T細胞。在一些實施方案中，TCR或其編碼核酸先于靶向TRAC的sgRNA,靶向B2M的sgRNA和/或靶向PD-1的sgRNA導入該T細胞。在一些實施方案中，TCR或其編碼核苷酸導入已經實現基因編輯的Ｔ細胞中，該Ｔ細胞的TRAC,B2M和/或PD-1基因組區域已經通過編輯被破壞。在一些實施方案中，該方法還包括將Cas9或其編碼核苷酸於說所述sgRNA一併導入該Ｔ細胞。
在一些實施方案中，本發明的TCR-T細胞所表達的工程化TCR可以是本領域己知的任何工程化TCR，只要其能夠使T細胞以人白細胞抗原-非依賴性的方式識別細胞表面抗原，發揮殺傷作用即可。例如，本發明TCR-T細胞中的工程化的TCR可以是識別表Ａ中所述抗原的工程化的TCR。
如本文所使用，“工程改造的TCR分子”、“工程化TCR分子”或稱“人工TCR分子”包括來源於組成TCR的各種多肽的重組多肽，該重組多肽一般能夠i)結合至靶細胞上的表面抗原；及ii)當共定位於T細胞中或表面上時與完整TCR複合物的其它多肽組分相互作用。
在具體實施方案中，本發明的工程化TCR包含靶特異性結合元件，又稱為抗原結合結構域。可選擇的抗原結合結構域識別例如與特定疾病狀態有關的靶細胞上充當細胞表面標誌物的靶抗原。在具體的實施方案中，所述靶抗原例如上述表Ａ中的抗原。在具體的實施方案中，所述靶抗原例如與病毒感染、身免疫疾自病有關的靶抗原。通過基因工程改造的方式，可以將抗原結合結構域與來源於組成TCR的各種多肽進行組合，從而使TCR介導的T細胞反應針對所關注的抗原。
在具體實施方案中，本發明的工程化TCR包含跨膜結構域。跨膜結構域可以來源於天然來源或重組來源。在該來源是天然來源的情況下，該結構域可以來源於任何膜結合或跨膜蛋白。在一個方面，跨膜結構域能夠向細胞內結構域進行信號傳導，只要工程化TCR結合至靶標。特別適用于本發明中的跨膜結構域可以至少包括例如T細胞受體α、β或ζ鏈、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154的跨膜區域。
在一些情形中，跨膜結構域可以通過鉸鏈，例如來自人蛋白質的鉸鏈連接至工程化TCR的細胞外區域，例如工程化TCR的抗原結合結構域。舉例來說，在一個實施方案中，鉸鏈可以是人免疫球蛋白(Ig)鉸鏈，例如IgG4鉸鏈，或CD8a鉸鏈。
在具體實施方案中，本發明的工程化TCR包含連接跨膜結構域與細胞質區域的連接子。任選地，連接子為長度介於2與50個胺基酸之間的短寡肽或多肽連接子。甘氨酸-絲氨酸對提供特別適合的連接子。
在具體實施方案中，本發明的工程化TCR包含細胞質結構域。細胞內信號傳導結構域一般負責引入了工程化TCR的免疫細胞的至少一種正常效應功能的活化。T細胞的效應功能可以例如是細胞溶解活性或輔助活性，包括細胞因數的分泌。因此，術語“細胞內信號傳導結構域”是指蛋白質中轉導效應功能信號並引導細胞執行專門功能的部分。儘管通常可以採用完整的細胞內信號傳導結構域，但在許多情況中不必使用完整鏈，可以使用此截短部分替代完整鏈，只要該截短部分轉導效應功能信號即可。因此，術語細胞內信號傳導結構域意圖包括足以轉導效應功能信號的細胞內信號傳導結構域的任何截短部分。
在某些實施方案中，所述工程TCR分子包含工程化的TCRα和TCRβ鏈。在某些實施方案中，所述工程化TCR分子與Ｔ細胞中表達的CD3分子和ζ鏈和／或其他共刺激分子所結合。
在一些實施方案中，本發明提供了上述TCR-T細胞用於製備治療疾病（如腫瘤）的用途。
本發明在一個方面提供了一種治療受試者疾病的方法，包括給藥受試者有效量的本發明所述的TCR-T細胞。 本發明所述的治療方法包括但不限於癌症和HIV/AIDS. 在一些實施方案中，該疾病為腫瘤，包括血液系統腫瘤，如淋巴瘤或白血病。在一些實施方案中，所述工程化的TCR靶向表Ａ中所示的靶抗原，該疾病為表Ａ中與該靶抗原相對應的腫瘤。在一些實施方案中，所述T細胞不是從受試者得到的。例如，所述T細胞可以來源於健康的捐助者。
本發明涉及的TCR-T細胞可以通過給藥包含細胞成分的醫藥製品常規使用的途徑，例如靜脈輸注途徑，給藥有此需要的受試者。給藥劑量可以基於受試者的病情和一般健康狀況具體確定。
T 細胞來源
在進行擴增和基因修飾之前，從受試者獲得T細胞來源。術語“受試者”意圖包括能夠引起免疫反應的活生物體(例如哺乳動物)。受試者的實例包括人。T細胞可以從多種來源獲得，包括外周血單核細胞、骨髓、淋巴結組織、臍血、胸腺組織、來自感染部位的組織、腹水、胸膜積液、脾組織及腫瘤。本發明的T細胞還可來源於各個分化階段的造血幹細胞。在定向分化培養條件下，造血幹細胞向T細胞分化。在本發明的某些方面，可以使用本領域中可得到的多種T細胞系。
在本發明的某些方面，T細胞可以使用熟練技術人員已知的多種技術，如FicollTM分離從受試者收集的血液獲得。也可以通過單采血液成分術(apheresis)從個體的迴圈血獲得細胞。單采血液成分術產物典型地含有淋巴細胞，包括T細胞、單核細胞、粒細胞、B細胞、其它有核白細胞、紅細胞及血小板。在一個方面，可以對通過單采血液成分術收集的細胞進行洗滌以去除血漿部分並將細胞放入適當緩衝液或介質中用於後續加工步驟。
可以通過將紅細胞溶解並例如經PERCOLLTM 梯度離心或逆流離心淘選耗盡單核細胞，從外周血淋巴細胞分離出T細胞。特定T細胞亞群，如CD3+、CD28+、CD4+、CD8+、CD45RA+及CD45RO+T細胞可以通過陽性或陰性選擇技術進一步分離。舉例來說，在一個方面，T細胞通過與抗CD3/抗CD28(例如3×28)偶聯珠粒，如DYNABEADSTM M-450CD3/CD28T一起孵育一段足以對所希望的T細胞進行陽性選擇的時間來分離。可以從腫瘤組織分離腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)。
sgRNA
本發明一個方面，提供了靶向TRAC的sgRNA、靶向B2M的sgRNA和靶向PD-1的sgRNA。所述sgRNA含有選自SEQ ID NOs: 2-22的任一核苷酸序列。在一些實施方案中，所述sgRNA是經化學修飾的。
本發明的還包括sgRNA組合物，試劑盒或製品，其包括本發明涉及的sgRNA或其載體。在一些實施方案中，該試劑盒包括：i）包含選自SEQ ID NOs：2-5中任一序列的sgRNA； （ii）包含選自SEQ ID NOs：6-14中任一序列的sgRNA； 和/或（iii）包含選自SEQ ID NOs：15-22中任一序列的sgRNA。在一些實施方案中，該試劑盒包括：（i）包含SEQ ID NO：3序列的的sgRNA；（ii）包含選自SEQ ID NO：16序列的的sgRNA； 和（iii）包含SEQ ID NO：7序列的的sgRNA。在一些實施方案中，該試劑盒還包括Cas6編碼核酸或其載體。在一些實施方案中，所述sgRNA是經化學修飾的。
在一些實施方案中，本發明中的Ｔ細胞基因改造方法使用化學修飾的sgRNA。本發明人採用的經過化學修飾的sgRNA認為具有以下兩個優點。第一、由於sgRNA是單鏈形式的RNA，其半衰期非常短，進入到細胞後，會迅速降解(最長不超過12小時)，而Cas9 蛋白結合sgRNA發揮基因編輯作用則至少需要48hrs。因此，採用經過化學修飾的sgRNA，進入細胞後，穩定表達，與Cas9蛋白結合後，能高效基因編輯基因組，產生Indels。第二、未經修飾的sgRNA穿透細胞膜能力差，無法有效進入細胞或組織發揮相應功能。而經過了化學修飾的sgRNA穿透細胞膜的能力通常是增強的。在本發明中可以採用本領域中常用的化學修飾方法，只要能夠提高sgRNA穩定性(延長半衰期)和提升進入細胞膜能力，均可以使用。除了實施例中使用的具體的化學修飾之外，還包括採用其它的修飾方法，例如，Deleavey GF1，Damha MJ. Designing chemically modified oligonucleotides for targeted gene silencing. Chem Biol. 2012 Aug 24;19(8):937-54，以及Hendel et al. Chemically modified guide RNAs enhance CRISPR-Cas genome editing in human primary cells. Nat Biotechnol. 2015 Sep;33(9):985-989文獻中報導的化學修飾方法。
本發明將經過化學修飾的sgRNA與Cas9 編碼基因共同電轉進入T細胞，產生高效的基因編輯效率(如，以Indels%表示)，其中sgRNA的化學修飾是本發明中的關鍵因素之一。實施例中的資料顯示，如果和Cas9 mRNA一起電轉的是未經化學修飾的sgRNA，其Indels效率遠遠低於電轉經化學修飾的sgRNA時獲得的Indels效率。
以下通過具體實施例來說明本發明的內容。應理解，所述具體實施例僅為說明目的，並不意味著本發明的內容僅限於具體實施例。
在本說明書的整篇文本中引用了數篇檔。此處的每篇檔(包括任何期刊文章或摘要、公開或未公開的專利申請、授權專利、製造商的說明書、使用說明等)通過提述併入本文。然而，並非認可此處引用的檔事實上是本發明的現有技術。
實施例 1: 通用型 T 細胞的製備
1. 健康供者T細胞的分離與啟動
健康供者臍血的採集:從血庫拿到臍血後放到4℃冰箱暫存，24h內，經由配備有恒溫設備的轉運車運至GMP實驗室進行T細胞的分離。
1.1 臍血單個核細胞的製備:用移液管吸取生理鹽水加入到步驟 (1)運輸來的臍血中，臍血與生理鹽水按照 1:1（V/V）稀釋，將血細胞稀釋液緩慢加入淋巴細胞分離管中，以800g離心20分鐘後，吸取淋巴細胞分離液上方的白膜層細胞，轉入一個新的50毫升離心管中，加入T細胞培養基， 400g離心5分鐘後棄上清，保留離心管底部的細胞沉澱，即得到外周血單個核細胞。
1.2 T細胞的分離和啟動:將得到的臍血單個核細胞用細胞計數儀進行計數後進行T細胞分選，具體步驟如下：
1.2.1.將細胞沉澱用Easy buffer（生產商：StemCell，貨號：16F72331）調整密度為5*107 /ml,用5毫升移液管將細胞移至5ml流式管中；
1.2.2.加入T細胞分離試劑，其濃度為50ul/ml，加完後在室溫下孵育5分鐘；
1.2.3.加分選磁珠，30秒內混勻磁珠，加入濃度為40μl/ml；
1.2.4用Easy buffer將細胞液補至2.5毫升，加完後直接放在磁柱上3分鐘，然後將細胞倒入15毫升離心管，得到的即為T細胞；
1.2.5.分選完後，用1000μl移液器混勻取計數，離心（400G，5min）後去上清，即得T細胞沉澱。
將T細胞沉澱重懸到T細胞的培養基中。然後，按照 1 :1的比例加入T細胞啟動因數，此時的 T細胞處於啟動狀態，將T細胞放入到培養箱中繼續擴增培養。
2.電轉條件的優化
將上述培養的T細胞收集到50毫升離心管中，以300g離心7分鐘後棄上清，用DPBS溶液（生產商：Gibco，貨號：1924294）清洗2遍，然後用電轉試劑將細胞密度調至 2.5X107 個細胞/mL。使用HISCRIBETM T7 ARCA mRNA Kit(加尾的)(生產商：NEB,貨號：cat#E2060S)製備的GFP mRNA（具體步驟見3.3）與T細胞均勻混合，使其最終濃度達到每 100μL中含2.5X106 個細胞和6μg GFP mRNA。利用電轉儀BTX Agile pulse MAX（生產商：BTX，型號：47-0200NINT）將GFP mRNA 導入T細胞中。根據電壓與脈衝時間的不同，分別對電轉體系進行了優化，如表1所示，電壓從180伏到400伏依次遞增，脈衝時間從2ms到0.5ms依次遞減。每天觀察細胞的生長狀況，每隔一天對電轉的T細胞進行計數補液，並用流式細胞儀器（生產商：艾森，型號：ACEA NovoCyte）對基因編輯後的T細胞進行表型分析，結果如表1所示，在150-250V，0.5-2ms電轉條件下，其細胞存活率及GFP電轉效率最好。
表1：GFP mRNA在不同電轉條件下的電轉效率及電轉後細胞存活率的比較結果
3. 對T細胞的基因敲除
利用CRISPR/Cas9 基因編輯技術進行敲除經步驟1.2獲得的T細胞中的 TRＡＣ、B2M、PD-1基因，具體操作步驟如下所示:
3.1 針對TCR的α鏈恒定編碼區(即TRAC)基因、HLA恒定編碼區B2M基因及 PD-1的恒定編碼區基因的 sgRNA設計和質粒構建。
針對TRAC、B2M及PD-1編碼區所有編碼序列設計的sgRNA均通過CRISPR RGEN Tools設計，根據最高評分所選取的sgRNA序列見表2。
表2：經過選擇的sgRNA序列
其中T表示針對TRAC的sgRNA序列、P代表針對PD-1編碼區的sgRNA序列、B代表針對B2M的sgRNA序列。
3.2用化學方法對sgRNA進行2’-O-甲基類似物和/或核苷酸間3’硫代的修飾，制得具備高敲除效率及穩定性的sgRNA。
3.3取Ｃas9質粒和GFP質粒，Xba1(生產商：NEB,貨號：cat#R0145S)，cutsmart buffer(生產商：NEB,貨號：cat#B7204s)進行酶切線性化，50μl反應體系：
37℃水浴4小時，取酶2μl酶切產物進行瓊脂糖凝膠電泳，電壓設定110U，電泳30min,凝膠成像儀下觀察為單一條帶，說明酶切完全，所有質粒都線性化。
取上述反應產物並對其進行清潔純化。
取純化後產物，用HISCRIBETM T7 ARCA mRNA Kit (生產商：NEB,貨號：cat#E2060S)進行體外轉錄(即IVT)，20μl體系：
將上述反應體系放在PCR儀上37℃反應4小時。4小時後，在反應體系中加入2μl的DNase 1，37℃反應20min。
取上述反應產物，進行如下操作：
將上述反應體系放置在PCR儀上反應2小時。
將上述反應產物進行清潔純化，放在-80度冰箱備用。
3.4利用電轉技術，將 sgRNA和Cas9　mRNA 導入到T細胞中，利用抗原篩選原理，將TCR和/或B2M和/或PD1 陰性同時CD4及CD8 陽性的T細胞篩選出來，得到通用型T細胞。
取上述細胞，用TIANamp Genomic DNA Kit(生產商：TIAN GEN，貨號：cat#DP304-03)，進行細胞基因組提取。利用合成引物，取上述提取的細胞基因組，用2*Esay Taq Super Mix(+dye)(生產商：TRANS,貨號Code#AS111)，分別PCR擴增TRAC、B2M及PD-1包含對應 sgRNA 的基因組區域，50μl反應體系：
反應條件如下：
3.5取反應後的PCR產物進行Sanger測序從分子水準上驗證 TCR、HLA、PD-1 的敲除效率，結果參見圖2所示，在該體系下，利用CRISPR/Cas9技術可以成功對 TCR 的TRAC基因、HLA的B2M基因、PD-1 的恒定編碼序列進行編輯，包括插入突變和缺失突變，兩者都造成了移碼突變（具體參見下表B-G），從而從基因水準抑制了TCR、HLA、PD-1的表達。
表B：導入B2後在第15號染色體第45003745位至第45003788位內產生的序列變化：
注：該表中的“-”在序列表中標注為“d”
表C：導入B3後在15號染色體第45003745位至第45003788位內產生的序列變化：
注：該表中的“-”在序列表中標注為“d”
表D：導入T3後在14號染色體第23016448位至第23016490位內產生的序列變化：
注：該表中的“-”在序列表中標注為“d”
表E：導入T2後在14號染色體第23016448位至第23016490位內產生的序列變化：
注：該表中的“-”在序列表中標注為“d”
表F：導入P2後在2號染色體第242800936位至第242800978位內產生的序列變化：
注：該表中的“-”在序列表中標注為“d”
表G：導入P1後在2號染色體第242795009位至第242795051位產生的序列變化
注：該表中的“-”在序列表中標注為“d”
3.6同時對於TRAC-sg3（T2、T3）、B2M-sg2（B2、B3）及PD-1-sg2（P1、P2）潛在的人全基因組上的脫靶位點進行預測，並對預測的可能影響其他基因表達的脫靶位元點區域進行擴增分析，目的是為了從分子水準確認 TRAC、B2M、PD-1 的敲除並沒有引入脫靶（off-target）的非特異基因的敲除，結果如表3和圖 5所示。
表3：TRAC、TRAC/B2M（DKO）以及TRAC/B2M/PD-1（TKO）敲除T細胞的脫靶分析結果
注：上述所有的序列位置資訊是參考資料庫：GRCh37 (hg19)確定的。
從表3可以看出 TRAC、B2M及PD-1的基因並沒有發生任何突變，說明該體系滿足了對基因編輯特異性的需求。
以上結果顯示，利用TRAC-sg2（T2）、TRAC-sg3（T3）；B2M-sg2（B2）、B2M-sg3（B3）、及PD-1-sg1（P1）、PD-1-sg2（P2）作為sgRNA對T細胞進行基因編輯完成後並對其進行篩選而得到的通用型 T細胞中的TRAC、B2M、PD-1基因被完全敲除，同時，沒有發現潛在脫靶位點處的基因突變。
4. 基因編輯T細胞的擴增
利用細胞因數對分選後的T細胞進行啟動，然後T細胞培養基將細胞密度調至 1X 106 個細胞/mL。72h後觀察細胞的狀態，收集細胞懸液，以300g離心7min，棄上清，用DPBS（Gibco）清洗2遍，然後用電轉試劑培養基將細胞密度調至 2.5X 107 個細胞/mL。使用HISCRIBETM T7 ARCA mRNA Kit (生產商：NEB,貨號：cat#E2060S)製備好的Cas9 mRNA 及合成的sgRNA，將T細胞和 RNA 混合，使其最終濃度達到每 100μL中含2.5X106 個細胞和8μg RNA(Cas9 mRNA和sgRNA各4μg) ，然後利用電轉儀BTX Agile pulse MAX將RNA 導入細胞中後進行培養。每天觀察細胞的生長狀況，每隔一天進行細胞計數補液，並對基因編輯後的T細胞進行表型分析，如圖3所示，單獨敲除TCR的效率約為90.42%，敲除TCR及B2M（DKO）的效率約為81.39%，三個基因同時敲除（TKO）的效率高達67.91。細胞培養 8d後，對所得的 T細胞進行品質控制監測。
5. CRISPR/Cas9基因編輯效率的檢測
細胞培養8天時進行取樣，利用人基因組提取試劑盒（生產商：TIAN GEN,貨號：cat#DP304-03）對樣本提取基因組，同時設計對應的測序引物，利用PCR技術製備目的片段，將目的片段連同相對應的引物進行singer測序。利用TIDE軟體，對測序結果分析，所得結果如圖2A， 2C， 2E所示。所優選出的sgRNA能高效地敲除對應的基因。
6. 目的細胞的篩選
通過如下方法對TCR和/或B2M和/或PD-1陰性、CD4和CD8陽性的T細胞進行篩選。
利用免疫磁珠技術篩選出TCR和/或B2M和/或PD-1陰性，同時CD4和CD8陽性的T細胞，並通過T細胞存活率監測被編輯後的T細胞狀態。
第一步，在第12-14天將電轉後的T細胞收集，400G，離心5min,棄上清，用Easy buffer把細胞定溶為1X108 /ml，然後把細胞轉移至5ml流式管中，利用篩選試劑去除掉T細胞中仍表達TCR、B2M、PD-1的細胞，篩選得到終產品即通用型T細胞。
第二步，取少量 T細胞，進行流式檢測，同時針對TCR和/或B2M和/或PD-1細胞表面生物標記物進行染色，如果TCR和/或B2M和/或PD-1陽性率＜1%，即可進行下一步工作。在本實施例中，TCR 陽性率為1%，TCR 和B2M DKO的T細胞陽性率＜0.79%，TCR、B2M 和PD-1 TKO的T細胞陽性率＜1%，如圖4所示。純化後的T細胞存活率並沒有受到明顯影響，均在85％以上，參見表4所示。
表4：對經TCR、TCR/B2M（DKO）以及TCR/B2M/PD-1（TKO）敲除的T細胞進行篩選純化後的存活率
7．脫靶分析
7.1. 收集T細胞1X106 個，提取基因組（生產商：QIAGEN，貨號：Cat#69504）。
7.2. 將提取的基因組進行Cas9體外酶切反應
Cas9體外酶切反應體系如下：
7.3. 用槍頭吹打，輕輕混勻後，37℃溫育15 min；
7.4. 加入1 μl蛋白酶K（生產商：Tiangen,貨號：Cat#RT403），輕輕混勻後，室溫溫育10 min；
7.5. 取5 ul樣本進行凝膠電泳，檢測Cas9體外酶切反應效果；
7.6. 將其餘樣本進行人重基因組檢測。
結果如圖5所示，未發現脫靶現象。
實施例 2: 通用型 T 細胞的製備
通用型CAR-T細胞的製備和擴增
利用細胞因數對分選後的T細胞進行啟動，然後用T細胞培養基將細胞密度調至 1X 106 個細胞/mL。 72h後觀察細胞的狀態，收集細胞懸液，以300g離心7min ，棄上清，用DPBS溶液（生產商：Gibco；貨號：1924294）清洗2遍，然後用電轉試劑培養基將細胞密度調至 2.5X 107 個細胞/mL。使用HISCRIBETM T7 ARCA mRNA Kit(帶尾)(生產商：NEB,貨號：cat#E2060S)製備好的Cas9 mRNA 及合成的sgRNA，將T細胞和 RNA 混合，使其最終濃度達到每 100μL中含2.5X106 個細胞和8μg RNA(Cas9 mRNA和sgRNA各4μg) ，然後利用電轉儀BTX Agile pulse MAX將RNA 導入細胞中後進行培養。每天觀察細胞的生長狀況，每隔一天進行細胞計數補液，在第5天按照MOI=2-10的比例加入包裝有 CAR（包括抗CD19 scFv、連結區（Linker）、CD8 alpha 鉸鏈區（CD8 alpha hinge）、CD8跨膜區（CD8 transmemberane domain）、4-11BB信號區（4-11BB signaling domain）及CD3 zeta，具體結構參見US20140271635A1）的慢病毒。
通用型CAR-T細胞的篩選
通過如下方法對TCR和/或B2M和/或PD-1陰性、CD4和CD8陽性的T細胞進行篩選。
利用免疫磁珠技術篩選出TCR和/或B2M和/或PD-1陰性，同時CD4和CD8陽性的T細胞，並通過T細胞存活率監測被編輯後的T細胞狀態，具體步驟如下：
第一步，在第12-14天將電轉後的T細胞收集，400G，離心5min,棄上清，用Easy buffer把細胞定溶為1X108 /ml，然後把細胞轉移至5ml流式管中，利用篩選磁珠去除掉T細胞中仍表達TCR、B2M、PD-1的細胞，篩選得到終產品即通用型T細胞。
第二步，取少量 T細胞，進行流式檢測，同時染TCR和/或B2M和/或PD-1細胞表面生物標記物，如果TCR和/或B2M和/或PD-1陽性率＜1%，即可進行下一步工作。在本實施例中，TCR 陽性率為1%，TCR 和B2M DKO的T細胞陽性率＜0.79%，TCR、B2M 和PD-1 TKO的T細胞陽性率＜1%，如表5和圖6所示。純化後的T細胞存活率並沒有受到明顯影響，均在85％以上。
表5：
實施例 3: 通用型 CAR-T 功能驗證
觀察實施例2得到的通用型 CAR-T細胞(即效應細胞)對B細胞型急性淋巴細胞白血病細胞的殺傷作用。
一、對特異性腫瘤細胞的體外殺傷作用
本發明實驗步驟如下:
第一步: 靶細胞標記
使用 CELL TRACETM Far Red Cell Proliferation Kit(生產商：Gibco;貨號：1888569)標記靶細胞(人Burkitt’s淋巴瘤細胞Raji、K562,所有細胞來自ATCC)。
1.將Cell TraceTM Far Red Cell Proliferation 用雙蒸水稀釋成 1mmol溶液;
2.取1 X 106 個靶細胞400g離心5分鐘後去上清；
3.加入Cell TraceTM Far Red Cell Proliferation溶液1μl，37℃、避光孵育20min 。
4.將細胞加入T細胞培養基，37℃孵育5min。
5.400g離心5分鐘後去上清，標記完成。
第二步: 效應細胞對靶細胞的殺傷檢測
將標記好的靶細胞用R1640+10%FBS培養液按照 2X105 個細胞/mL的密度重懸，取 500μL加入到 48孔板中。按照適當的效靶比 (2.5:1、1.25:1、0.6:1)，每孔加入 500μL效應細胞，同時以 T細胞和健康人臍血CAR-T細胞（在T細胞培養到第2天時，以MOI=2-10的比例加入包裝有 CAR（具體結構參見US20140271635A1）的慢病毒制得的CAR-T作為對照細胞，每組 3個平行，設計單獨的靶細胞組，檢測其死亡率; 37℃、5% CO2培養12-16h，400g離心5min，取細胞沉澱，用150μl用DPBS（生產商：Gibco；貨號：1924294）重懸。利用PI（生產商：Sigma；貨號：P4170）染色後，用流式細胞儀檢測靶細胞死亡率，結果如圖7所示，通用型 CAR-T相較與其它的CAR-T細胞在對特異性靶細胞的殺傷作用上基本保持一致，效果都優於T細胞。同時對非特異性靶細胞的幾乎無殺傷功能。
第三步: 細胞因數釋放的ELISA檢測
將標記好的靶細胞用RPMI 1640+10%FBS按照 2X105 個/mL的密度重懸，取 500μL加入到 48孔板中。按照適當的效靶比 (10:1)每孔加入 500μL效應細胞，同時以 T細胞和健康人臍血CAR-T作為對照細胞，每組 3個平行，設計單獨的靶細胞組，37℃、5% CO2培養12-16h，每孔取培養上清100μl，400g離心5min去沉澱，取上清後利用 LEGEND MAXTM Human IL-2/IFN-gama（生產商：Biolegend；貨號分別為：431807、430108）試劑盒，根據使用說明檢測因數釋放。
所得結果如圖 8所示，可以看出，通用型 CAR-T對Raji細胞的殺傷能力與普通CAR-T殺傷能力基本一致或稍好于普通CAR-T的殺傷能力，尤其TCRneg CAR-T IFN-r釋放量遠遠高於普通CAR-T且都對K562的殺傷力較低，因此因數釋放相對較少。
二、通用型 CAR-T對特異性腫瘤細胞的體內殺傷作用
1. 細胞系:人淋巴瘤細胞系
Rajitg(luciferase-GFP) /Bcgen細胞是人Burkitt’s淋巴瘤細胞系，其CD19表達為陽性，可以作為CAR-T細胞的靶細胞。Rajiluc-GFP 經過修飾同時表達GFP與luciferase。可以通過尾靜脈注射的方式構建小鼠的人淋巴瘤模型，通過XenoLight D-Luciferin，Potassium Salt（生產商：PerkinElmer；貨號：122799）配合小動物活體成像儀呈現的螢光統計成瘤面積。
2. Rajitg(luciferase-GFP) /Bcgen細胞培養
Rajitg(luciferase-GFP) /Bcgen細胞系為懸浮細胞系，在含有 10%FBS的RPMI 1640培養基中可以快速生長。細胞密為 2-3 X 106 /mL時需要傳代。傳代時取細胞懸液于離心管中，以 300g離心6分鐘，棄上清。將細胞密度調整到1×106 個細胞/ml，繼續培養。正常生長情況，隔天傳代，細胞密度維持在0.8-1 X 106 個細胞/ mL之間即可。
3.小鼠造模
7-10周齡的NPG雌性小鼠 25只，單次尾靜脈注射腫瘤細胞（Rajitg(luciferase-GFP) /Bcgen）5X105 個細胞/只，隔天稱重，每天觀察一次，接種腫瘤細胞3-5天后，通過 XenoLight D-Luciferin，Potassium Salt（生產商：PerkinElmer；貨號：122799）配合小動物活體成像儀呈現的成瘤面積及腫瘤富集度為指標進行隨機分成6組：生理鹽水組、T細胞組、 CAR-T細胞組、TCRneg -CAR-T組、DKO- CAR-T組、TKO- CAR-T組。
4.小鼠淋巴瘤模型給藥。
記錄造模當天為D0。通過尾靜脈注射的方式進行細胞輸生理鹽水200μL、人T細胞200μL（總計2×106 個細胞/只）、 CAR-T細胞200μL(總計2×106 /只) TCRneg -CAR-T 細胞200μL(總計2X 106 / 只)、DKO- CAR-T 細胞200μL(總計2X 106 / 只)、TKO- CAR-T 細胞200μL(總計2X 106 /只) 所有小鼠均單次給藥。結果如圖9A-9B及圖10所示，可以看出，本發明提供的通用型CAR-T前期具有很好的抑制以及殺死腫瘤細胞的效果，與CAR-T細胞幾乎一致；後期較普通CAR-T對腫瘤細胞的抑制效果明顯。
5.小鼠給藥後監測
對給藥後的小鼠每天進行監測，包括小鼠體重，皮膚完整度，毛髮，精神狀態、活動頻率及活動協調度等每2天對小鼠進行體重記錄，連續觀察37天，以腫瘤面積的消除及腫瘤富集的減少為效應細胞功能的評判指標，以皮膚完整度，毛髮，精神狀態、活動頻率及活動協調度評判通用型CAR-T的安全性。如圖11所示小鼠並沒有體重上的下降，皮膚毛髮完整，精神活躍，活動協調，沒有出現GVHD反應。
無。
圖1顯示利用化學修飾過的sgRNA與未經過化學修飾的sgRNA經過1次電轉，對相應位點敲除的效率的比較。
圖2A-2F。圖2A展示了利用修飾的不同sgRNA結合CRISPR/Cas9基因敲除工具敲除HLA中的B2M，敲除後分析各個sgRNA對B2M這一基因的敲除效率。圖2B展示了通過INDEL分析軟體對經過修飾的不同sgRNA對B2M基因敲除後T細胞基因組的INDEL分析，得到T細胞中發生INDEL的效率。圖2C展示了利用修飾的不同sgRNA結合CRISPR/Cas9基因敲除工具敲除TCR中的TRAC，敲除後分析各個sgRNA對TRAC這一基因的敲除效率。圖2D展示了通過INDEL分析軟體對經過修飾的不同sgRNA對TRAC基因敲除後T細胞基因組的INDEL分析，得到T細胞中發生INDEL的效率。圖2E展示了利用修飾的不同sgRNA結合CRISPR/Cas9基因敲除工具敲除PD-1，敲除後分析各個sgRNA對PD-1這一基因的敲除效率。圖2F展示了通過INDEL分析軟體對經過修飾的不同sgRNA對PD-1基因敲除後T細胞基因組的INDEL分析，得到T細胞中發生INDEL的效率。
圖2A展示了利用體外轉錄（IVT）並經過修飾優化的 sgRNA結合CRISPR/Cas9基因敲除工具，在相同的電轉條件下對T細胞中的B2M進行敲除，敲除後分析各個sgRNA對B2M這一基因的敲除效率分別為：B1：27.88%、B2：86.17%、B3：64.69%、B4：1.06%、B5:2.91%、B6：0.17%、B7：41.87%及B8：3.14%。如圖可以挑選出敲除效率較好的sgRNA。經過對挑選的sgRNA進行2’-O-甲基類似物和/或核苷酸間3’硫代的優化修飾，為高效率的雙/三基因敲除（如圖3所示）提供可能。圖2B展示了通過INDEL分析軟體對不同sgRNA對B2M基因敲除後T細胞基因組的INDEL分析，得到T細胞中發生INDEL的效率。圖2C展示了利用體外轉錄（IVT）並經過修飾優化的 sgRNA結合CRISPR/Cas9基因敲除工具，在相同的電轉條件下對T細胞中的TRAC進行敲除，敲除後分析各個sgRNA對TRAC這一基因的敲除效率分別為：T2：77.84%、T3：85.86%、T4：2.59%及T6：34.78%。如圖可以挑選出敲除效率較好的sgRNA。經過對挑選的sgRNA進行上述優化修飾，為高效率的單/雙/三基因敲除（如圖3所示）提供可能。圖2D展示了通過INDEL分析軟體對不同sgRNA對TRAC基因敲除後T細胞基因組的INDEL分析，得到T細胞中發生INDEL的效率。圖2E展示了利用體外轉錄（IVT）並經過上述優化修飾的 sgRNA結合CRISPR/Cas9基因敲除工具，在相同的電轉條件下對T細胞中的PD-1進行敲除，敲除後分析各個sgRNA對PD-1這一基因的敲除效率分別為：P1：21.15%、P2：36.99%、P4：23.03%、P5：25.6%、P6：3.1%、P7：22.49%、P8：23.07%、P9：31.18%及P10：24.48%。如圖可以挑選出敲除效率較好的sgRNA。經過對挑選的sgRNA進行上述優化修飾，為高效率的三基因敲除（如圖3所示）提供可能。圖2F展示了通過INDEL分析軟體對不同sgRNA對PD-1基因敲除後T細胞基因組的INDEL分析，得到T細胞中發生INDEL的效率。
圖3展示了利用經過優化的sgRNA及CRISPR/Cas9基因編輯技術，對T細胞進行TRAC、TRAC/B2M（Double Knock-Out， DKO）以及TRAC/B2M/PD-1（Triple Knock-Out，TKO）的敲除結果分析。對sgRNA進行化學修飾，然後將化學修飾後的sgRNA與Cas9通過進一步優化後的電轉條件遞送到原代T細胞中進行相關基因敲除。結果如圖所示，單基因即TRAC的敲除效率提升至90.42%；雙基因即TRAC和B2M的敲除效率提高至81.39%。三基因即TRAC、B2M和PD-1的敲除效率提高至67.91% (82.70%+15.76%)*68.98%)。
圖4展示了對經TRAC、TRAC/B2M（DKO）以及TRAC/B2M/PD-1（TKO）敲除的T細胞進行篩選純化後的表型分析。通過後期純化條件的優化，即增加純化次數（4~5次)及相應的抗體量(3mg/mL）。結果如圖所示，優化後的雙敲除即TRAC和B2M雙基因敲除純度提高到99.72%。三基因即TRAC、B2M和PD-1敲除純度提高到98.62%。
圖5展示了TRAC-sgRNA3（T2）、B2M-sgRNA2（B3）及PD-1-sgRNA2（P2）的脫靶檢測結果。圖中顯示經過深度測序後結合INDEL分析軟體得到經過T2、B3、P2sgRNA結合CRISPR/Cas9編輯後的T細胞中的INDEL效率。
圖6展示了利用經過優化sgRNA及CRISPR/Cas9基因編輯技術，對T細胞進行TCR和/或B2M和/或PD-1的敲除後表型及對經TCR和/或B2M和/或PD-1敲除的T細胞進行篩選純化後表型分析。橫坐標為CD3，縱坐標為TCR、B2M及PD-1。
圖7展示了T細胞、CAR-T、TCRneg CAR-T、DKO CAR-T及TKO CAR-T細胞殺傷功能的驗證與結果比較。該實驗中，以Raji及K562為靶細胞，T，CAR-T，DKO CAR-T及TKO CAR-T為效應細胞，按照效靶比為10:1、5:1、2.5:1、1.25:1、0.625:1進行體外殺傷實驗。
圖8展示了T細胞、CAR-T、TCRneg CAR-T、DKO CAR-T及TKO CAR-T細胞因數釋放。該實驗中，以Raji及K562為靶細胞，T，CAR-T，DKO CAR-T及TKO CAR-T為效應細胞，按照效靶比為10:1、5:1、2.5:1、1.25:1、0.625:1進行體外共培養後，取上清對其中IL-2及IFN-γ進行檢測。
圖9A-9B展示了注射生理鹽水、CAR-T、TCRneg CAR-T、DKO CAR-T（TCRneg \B2Mneg -CAR-T）及TKO CAR-T（TCRneg \B2Mneg \PD-1neg -CAR-T）細胞後，其在NPG小鼠體內的腫瘤抑制及殺傷效果比較。圖9A顯示向NSG 小鼠通過尾靜脈注射5X10^5個腫瘤細胞/只後，隨機的分為4組，生理鹽水組、T細胞組、TCR/CD3neg CD19-CAR-T細胞組、DKO CD19-CAR-T細胞組及TKO CD19-CAR-T細胞組，隨後分別向四組小鼠通過尾靜脈注射5X10^6個相應的細胞，生理鹽水組作為對照組。通過鉑金埃爾默成像儀得到的圖片分析小鼠體內瘤負荷。圖9B 通過鉑金埃爾默成像儀得到的圖片分析小鼠體內瘤負荷，橫坐標為小鼠細胞飼養天數，縱坐標為單位體表面積每秒放射的輻射信號。
圖10展示了生理鹽水、CAR-T、TCRneg CAR-T、DKO CAR-T（TCRneg \B2Mneg -CAR-T）及TKO CAR-T（TCRneg \B2Mneg \PD-1neg -CAR-T）5組小鼠存活率的比較。橫坐標為注射效應細胞後小鼠飼養天數，縱坐標為小鼠存活率。
圖11展示了注射生理鹽水、CAR-T、TCRneg CAR-T、DKO CAR-T（TCRneg \B2Mneg -CAR-T）及TKO CAR-T（TCRneg \B2Mneg \PD-1neg -CAR-T）細胞後，小鼠體重的變化結果的比較。NPG小鼠體重監測，橫坐標為注射效應細胞後小鼠飼養天數，縱坐標為小鼠體重百分百（n=4）。
 序列表

<110> 博雅輯因（北京）生物科技有限公司

<120> 一種基因編輯T細胞及其用途

<130> FB00064PCT

<150> 201710842264.5
<151> 2017-09-18

<150> 201710841323.7
<151> 2017-09-18

<160> 164

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1
<211> 4101
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：Cas9 mRNA

<400> 1
gacaagaagt acagcatcgg cctggacatc ggcaccaact ctgtgggctg ggccgtgatc 60

accgacgagt acaaggtgcc cagcaagaaa ttcaaggtgc tgggcaacac cgaccggcac 120

agcatcaaga agaacctgat cggagccctg ctgttcgaca gcggcgaaac agccgaggcc 180

acccggctga agagaaccgc cagaagaaga tacaccagac ggaagaaccg gatctgctat 240

ctgcaagaga tcttcagcaa cgagatggcc aaggtggacg acagcttctt ccacagactg 300

gaagagtcct tcctggtgga agaggataag aagcacgagc ggcaccccat cttcggcaac 360

atcgtggacg aggtggccta ccacgagaag taccccacca tctaccacct gagaaagaaa 420

ctggtggaca gcaccgacaa ggccgacctg cggctgatct atctggccct ggcccacatg 480

atcaagttcc ggggccactt cctgatcgag ggcgacctga accccgacaa cagcgacgtg 540

gacaagctgt tcatccagct ggtgcagacc tacaaccagc tgttcgagga aaaccccatc 600

aacgccagcg gcgtggacgc caaggccatc ctgtctgcca gactgagcaa gagcagacgg 660

ctggaaaatc tgatcgccca gctgcccggc gagaagaaga atggcctgtt cggcaacctg 720

attgccctga gcctgggcct gacccccaac ttcaagagca acttcgacct ggccgaggat 780

gccaaactgc agctgagcaa ggacacctac gacgacgacc tggacaacct gctggcccag 840

atcggcgacc agtacgccga cctgtttctg gccgccaaga acctgtccga cgccatcctg 900

ctgagcgaca tcctgagagt gaacaccgag atcaccaagg cccccctgag cgcctctatg 960

atcaagagat acgacgagca ccaccaggac ctgaccctgc tgaaagctct cgtgcggcag 1020

cagctgcctg agaagtacaa agagattttc ttcgaccaga gcaagaacgg ctacgccggc 1080

tacattgacg gcggagccag ccaggaagag ttctacaagt tcatcaagcc catcctggaa 1140

aagatggacg gcaccgagga actgctcgtg aagctgaaca gagaggacct gctgcggaag 1200

cagcggacct tcgacaacgg cagcatcccc caccagatcc acctgggaga gctgcacgcc 1260

attctgcggc ggcaggaaga tttttaccca ttcctgaagg acaaccggga aaagatcgag 1320

aagatcctga ccttccgcat cccctactac gtgggccctc tggccagggg aaacagcaga 1380

ttcgcctgga tgaccagaaa gagcgaggaa accatcaccc cctggaactt cgaggaagtg 1440

gtggacaagg gcgcttccgc ccagagcttc atcgagcgga tgaccaactt cgataagaac 1500

ctgcccaacg agaaggtgct gcccaagcac agcctgctgt acgagtactt caccgtgtat 1560

aacgagctga ccaaagtgaa atacgtgacc gagggaatga gaaagcccgc cttcctgagc 1620

ggcgagcaga aaaaggccat cgtggacctg ctgttcaaga ccaaccggaa agtgaccgtg 1680

aagcagctga aagaggacta cttcaagaaa atcgagtgct tcgactccgt ggaaatctcc 1740

ggcgtggaag atcggttcaa cgcctccctg ggcacatacc acgatctgct gaaaattatc 1800

aaggacaagg acttcctgga caatgaggaa aacgaggaca ttctggaaga tatcgtgctg 1860

accctgacac tgtttgagga cagagagatg atcgaggaac ggctgaaaac ctatgcccac 1920

ctgttcgacg acaaagtgat gaagcagctg aagcggcgga gatacaccgg ctggggcagg 1980

ctgagccgga agctgatcaa cggcatccgg gacaagcagt ccggcaagac aatcctggat 2040

ttcctgaagt ccgacggctt cgccaacaga aacttcatgc agctgatcca cgacgacagc 2100

ctgaccttta aagaggacat ccagaaagcc caggtgtccg gccagggcga tagcctgcac 2160

gagcacattg ccaatctggc cggcagcccc gccattaaga agggcatcct gcagacagtg 2220

aaggtggtgg acgagctcgt gaaagtgatg ggccggcaca agcccgagaa catcgtgatc 2280

gaaatggcca gagagaacca gaccacccag aagggacaga agaacagccg cgagagaatg 2340

aagcggatcg aagagggcat caaagagctg ggcagccaga tcctgaaaga acaccccgtg 2400

gaaaacaccc agctgcagaa cgagaagctg tacctgtact acctgcagaa tgggcgggat 2460

atgtacgtgg accaggaact ggacatcaac cggctgtccg actacgatgt ggaccatatc 2520

gtgcctcaga gctttctgaa ggacgactcc atcgacaaca aggtgctgac cagaagcgac 2580

aagaaccggg gcaagagcga caacgtgccc tccgaagagg tcgtgaagaa gatgaagaac 2640

tactggcggc agctgctgaa cgccaagctg attacccaga gaaagttcga caatctgacc 2700

aaggccgaga gaggcggcct gagcgaactg gataaggccg gcttcatcaa gagacagctg 2760

gtggaaaccc ggcagatcac aaagcacgtg gcacagatcc tggactcccg gatgaacact 2820

aagtacgacg agaatgacaa gctgatccgg gaagtgaaag tgatcaccct gaagtccaag 2880

ctggtgtccg atttccggaa ggatttccag ttttacaaag tgcgcgagat caacaactac 2940

caccacgccc acgacgccta cctgaacgcc gtcgtgggaa ccgccctgat caaaaagtac 3000

cctaagctgg aaagcgagtt cgtgtacggc gactacaagg tgtacgacgt gcggaagatg 3060

atcgccaaga gcgagcagga aatcggcaag gctaccgcca agtacttctt ctacagcaac 3120

atcatgaact ttttcaagac cgagattacc ctggccaacg gcgagatccg gaagcggcct 3180

ctgatcgaga caaacggcga aaccggggag atcgtgtggg ataagggccg ggattttgcc 3240

accgtgcgga aagtgctgag catgccccaa gtgaatatcg tgaaaaagac cgaggtgcag 3300

acaggcggct tcagcaaaga gtctatcctg cccaagagga acagcgataa gctgatcgcc 3360

agaaagaagg actgggaccc taagaagtac ggcggcttcg acagccccac cgtggcctat 3420

tctgtgctgg tggtggccaa agtggaaaag ggcaagtcca agaaactgaa gagtgtgaaa 3480

gagctgctgg ggatcaccat catggaaaga agcagcttcg agaagaatcc catcgacttt 3540

ctggaagcca agggctacaa agaagtgaaa aaggacctga tcatcaagct gcctaagtac 3600

tccctgttcg agctggaaaa cggccggaag agaatgctgg cctctgccgg cgaactgcag 3660

aagggaaacg aactggccct gccctccaaa tatgtgaact tcctgtacct ggccagccac 3720

tatgagaagc tgaagggctc ccccgaggat aatgagcaga aacagctgtt tgtggaacag 3780

cacaagcact acctggacga gatcatcgag cagatcagcg agttctccaa gagagtgatc 3840

ctggccgacg ctaatctgga caaagtgctg tccgcctaca acaagcaccg ggataagccc 3900

atcagagagc aggccgagaa tatcatccac ctgtttaccc tgaccaatct gggagcccct 3960

gccgccttca agtactttga caccaccatc gaccggaaga ggtacaccag caccaaagag 4020

gtgctggacg ccaccctgat ccaccagagc atcaccggcc tgtacgagac acggatcgac 4080

ctgtctcagc tgggaggcga c 4101


<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：TRAC-sg 2 (T2)

<400> 2
gctggtacac ggcagggtca 20


<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：TRAC-sg 3 (T3)

<400> 3
ctctcagctg gtacacggca 20


<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：TRAC-sg 4 (T4)

<400> 4
atttgtttga gaatcaaaat 20


<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：TRAC-sg 6 (T6)

<400> 5
tctctcagct ggtacacggc 20


<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：B2M-sg 1(B1)

<400> 6
actctctctt tctggcctgg 20


<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：B2M-sg 2(B2)

<400> 7
gagtagcgcg agcacagcta 20


<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：B2M-sg 3(B3)

<400> 8
cgcgagcaca gctaaggcca 20


<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：B2M-sg 4(B4)

<400> 9
tcacgtcatc cagcagagaa 20


<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：B2M-sg 5(B5)

<400> 10
gctactctct ctttctggcc 20


<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：B2M-sg 6(B6)

<400> 11
tttgactttc cattctctgc 20


<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：B2M-sg 7(B7)

<400> 12
cgtgagtaaa cctgaatctt 20


<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：B2M-sg8(B8)

<400> 13
ctcgcgctac tctctctttc 20


<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：PD-1-sg1(P1)

<400> 14
ctgcagcttc tccaacacat 20


<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：PD-1-sg2(P2)

<400> 15
gccctggcca gtcgtctggg 20


<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：PD-1-sg4(P4)

<400> 16
gccctgctcg tggtgaccga 20


<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：PD-1-sg5(P5)

<400> 17
gagaaggtgg gggggttcca 20


<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：PD-1-sg6(P6)

<400> 18
ccctgctcgt ggtgaccgaa 20


<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：PD-1-sg7(P7)

<400> 19
gaaggtggcg ttgtcccctt 20


<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：PD-1-sg8(P8)

<400> 20
cctgctcgtg gtgaccgaag 20


<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：PD-1-sg9(P9)

<400> 21
gtctgggcgg tgctacaact 20


<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：PD-1-sg10(P10)

<400> 22
cgatgtgttg gagaagctgc 20


<210> 23
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：14號染色體第23016448位至第23016490位的TRAC基因組區
域

<400> 23
tatccagaac cctgaccctg ccgtgtacca gctgagagac tct 43


<210> 24
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：15號染色體第45003745位至第45003788位的B2M基因組區
域

<400> 24
atgtctcgct ccgtggcctt agctgtgctc gcgctactct ctct 44


<210> 25
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：2號染色體第242800936位至第242800978位的PD-1基因組
區域

<400> 25
agcccagttg tagcaccgcc cagacgactg gccagggcgc ctg 43


<210> 26
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：2號染色體第242795009位至第242795051位的PD-1基因組
區域

<400> 26
cagtttagca cgaagctctc cgatgtgttg gagaagctgc agg 43


<210> 27
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：B2作為導向RNA進行編輯後，在15號染色體第45
003745位至第45003788位內產生的序列


<220>
<221> misc_feature
<222> (22)..(22)
<223> 第22位的堿基在編輯後被刪除

<400> 27
atgtctcgct ccgtggcctt adctgtgctc gcgctactct ctct 44


<210> 28
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：B2作為導向RNA進行編輯後，在15號染色體第45
003745位至第45003788位內產生的序列


<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(32)
<223> 第8-32位的堿基在編輯後被刪除

<400> 28
atgtctcddd dddddddddd dddddddddd ddgctactct ctct 44


<210> 29
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：B2作為導向RNA進行編輯後，在15號染色體第45
003745位至第45003788位內產生的序列


<220>
<221> misc_feature
<222> (23)..(23)
<223> 第23位的表示插入任一堿基

<400> 29
atgtctcgct ccgtggcctt agnctgtgct cgcgctactc tctct 45


<210> 30
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：B2作為導向RNA進行編輯後，在15號染色體第45
003745位至第45003788位內產生的序列


<220>
<221> misc_feature
<222> (23)..(25)
<223> 第23-25位的堿基在編輯後被刪除

<400> 30
atgtctcgct ccgtggcctt agdddtgctc gcgctactct ctct 44


<210> 31
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：B2作為導向RNA進行編輯後，在15號染色體第45
003745位至第45003788位內產生的序列


<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(27)
<223> 第17-27位的堿基在編輯後被刪除

<400> 31
atgtctcgct ccgtggdddd dddddddctc gcgctactct ctct 44


<210> 32
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：B2作為導向RNA進行編輯後，在15號染色體第45
003745位至第45003788位內產生的序列


<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(35)
<223> 第17-35位的堿基在編輯後被刪除

<400> 32
atgtctcgct ccgtggdddd dddddddddd dddddactct ctct 44


<210> 33
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：B2作為導向RNA進行編輯後，在15號染色體第45
003745位至第45003788位內產生的序列


<220>
<221> misc_feature
<222> (18)..(22)
<223> 第18-22位的堿基在編輯後被刪除

<400> 33
atgtctcgct ccgtggcddd ddctgtgctc gcgctactct ctct 44


<210> 34
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：B2作為導向RNA進行編輯後，在15號染色體第45
003745位至第45003788位內產生的序列


<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(35)
<223> 第13-35位的堿基在編輯後被刪除

<400> 34
atgtctcgct ccdddddddd dddddddddd dddddactct ctct 44


<210> 35
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：B2作為導向RNA進行編輯後，在15號染色體第45
003745位至第45003788位內產生的序列


<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(31)
<223> 第17-31位的堿基在編輯後被刪除

<400> 35
atgtctcgct ccgtggdddd dddddddddd dcgctactct ctct 44


<210> 36
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：B2作為導向RNA進行編輯後，在15號染色體第45
003745位至第45003788位內產生的序列


<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(32)
<223> 第17-32位的堿基在編輯後被刪除

<400> 36
atgtctcgct ccgtggdddd dddddddddd ddgctactct ctct 44


<210> 37
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：B2作為導向RNA進行編輯後，在15號染色體第45
003745位至第45003788位內產生的序列


<220>
<221> misc_feature
<222> (23)..(24)
<223> n表示插入任一堿基

<400> 37
atgtctcgct ccgtggcctt agnnctgtgc tcgcgctact ctctct 46


<210> 38
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：B2作為導向RNA進行編輯後，在15號染色體第45
003745位至第45003788位內產生的序列


<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(26)
<223> 第17-26位的堿基在編輯後被刪除

<400> 38
atgtctcgct ccgtggdddd ddddddgctc gcgctactct ctct 44


<210> 39
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：B2作為導向RNA進行編輯後，在15號染色體第45
003745位至第45003788位內產生的序列


<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(31)
<223> 第20-31位的堿基在編輯後被刪除

<400> 39
atgtctcgct ccgtggcctd dddddddddd dcgctactct ctct 44


<210> 40
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：B2作為導向RNA進行編輯後，在15號染色體第45
003745位至第45003788位內產生的序列


<220>
<221> misc_feature
<222> (22)..(23)
<223> 第22-23位的堿基在編輯後被刪除

<400> 40
atgtctcgct ccgtggcctt addtgtgctc gcgctactct ctct 44


<210> 41
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：B2作為導向RNA進行編輯後，在15號染色體第45
003745位至第45003788位內產生的序列


<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(37)
<223> 第8-37位的堿基在編輯後被刪除

<400> 41
atgtctcddd dddddddddd dddddddddd dddddddtct ctct 44


<210> 42
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：B2作為導向RNA進行編輯後，在15號染色體第45
003745位至第45003788位內產生的序列


<220>
<221> misc_feature
<222> (19)..(35)
<223> 第19-35位的堿基在編輯後被刪除

<400> 42
atgtctcgct ccgtggccdd dddddddddd dddddactct ctct 44


<210> 43
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：B2作為導向RNA進行編輯後，在15號染色體第45
003745位至第45003788位內產生的序列


<220>
<221> misc_feature
<222> (23)..(26)
<223> 第23-26位的堿基在編輯後被刪除

<400> 43
atgtctcgct ccgtggcctt agddddgctc gcgctactct ctct 44


<210> 44
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：B2作為導向RNA進行編輯後，在15號染色體第45
003745位至第45003788位內產生的序列


<220>
<221> misc_feature
<222> (23)..(24)
<223> 第23-24位的堿基在編輯後被刪除

<400> 44
atgtctcgct ccgtggcctt agddgtgctc gcgctactct ctct 44


<210> 45
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：B2作為導向RNA進行編輯後，在15號染色體第45
003745位至第45003788位內產生的序列


<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(25)
<223> 第9-25位的堿基在編輯後被刪除

<400> 45
atgtctcgdd dddddddddd dddddtgctc gcgctactct ctct 44


<210> 46
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：B2作為導向RNA進行編輯後，在15號染色體第45
003745位至第45003788位內產生的序列


<220>
<221> misc_feature
<222> (18)..(29)
<223> 第18-29位的堿基在編輯後被刪除

<400> 46
atgtctcgct ccgtggcddd dddddddddc gcgctactct ctct 44


<210> 47
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：B2作為導向RNA進行編輯後，在15號染色體第45
003745位至第45003788位內產生的序列


<220>
<221> misc_feature
<222> (23)..(27)
<223> 第23-27位的堿基在編輯後被刪除

<400> 47
atgtctcgct ccgtggcctt agdddddctc gcgctactct ctct 44


<210> 48
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：B2作為導向RNA進行編輯後，在15號染色體第45
003745位至第45003788位內產生的序列


<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(30)
<223> 第8-30位的堿基在編輯後被刪除

<400> 48
atgtctcddd dddddddddd dddddddddd gcgctactct ctct 44


<210> 49
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：B2作為導向RNA進行編輯後，在15號染色體第45
003745位至第45003788位內產生的序列


<220>
<221> misc_feature
<222> (18)..(35)
<223> 第18-35位的堿基在編輯後被刪除

<400> 49
atgtctcgct ccgtggcddd dddddddddd dddddactct ctct 44


<210> 50
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：B2作為導向RNA進行編輯後，在15號染色體第45
003745位至第45003788位內產生的序列


<220>
<221> misc_feature
<222> (18)..(24)
<223> 第18-24位的堿基在編輯後被刪除

<400> 50
atgtctcgct ccgtggcddd ddddgtgctc gcgctactct ctct 44


<210> 51
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：B2作為導向RNA進行編輯後，在15號染色體第45
003745位至第45003788位內產生的序列


<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(35)
<223> 第16-35位的堿基在編輯後被刪除

<400> 51
atgtctcgct ccgtgddddd dddddddddd dddddactct ctct 44


<210> 52
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：B2作為導向RNA進行編輯後，在15號染色體第45
003745位至第45003788位內產生的序列


<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(33)
<223> 第11-33位的堿基在編輯後被刪除

<400> 52
atgtctcgct dddddddddd dddddddddd dddctactct ctct 44


<210> 53
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：B3作為導向RNA進行編輯後，在15號染色體第45
003745位至第45003788位內產生的序列


<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(17)
<223> 第17位的堿基在編輯後被刪除

<400> 53
atgtctcgct ccgtggdctt agctgtgctc gcgctactct ctct 44


<210> 54
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：B3作為導向RNA進行編輯後，在15號染色體第45
003745位至第45003788位內產生的序列


<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(17)
<223> 第16-17位的堿基在編輯後被刪除

<400> 54
atgtctcgct ccgtgddctt agctgtgctc gcgctactct ctct 44


<210> 55
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：B3作為導向RNA進行編輯後，在15號染色體第45
003745位至第45003788位內產生的序列


<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(21)
<223> 第16-21位的堿基在編輯後被刪除

<400> 55
atgtctcgct ccgtgddddd dgctgtgctc gcgctactct ctct 44


<210> 56
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：B3作為導向RNA進行編輯後，在15號染色體第45
003745位至第45003788位內產生的序列


<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(18)
<223> 第17-18位的堿基在編輯後被刪除

<400> 56
atgtctcgct ccgtggddtt agctgtgctc gcgctactct ctct 44


<210> 57
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：B3作為導向RNA進行編輯後，在15號染色體第45
003745位至第45003788位內產生的序列


<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(29)
<223> 第7-29位的堿基在編輯後被刪除

<400> 57
atgtctdddd dddddddddd dddddddddc gcgctactct ctct 44


<210> 58
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：B3作為導向RNA進行編輯後，在15號染色體第45
003745位至第45003788位內產生的序列


<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(18)
<223> 第13-18位的堿基在編輯後被刪除

<400> 58
atgtctcgct ccddddddtt agctgtgctc gcgctactct ctct 44


<210> 59
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：B3作為導向RNA進行編輯後，在15號染色體第45
003745位至第45003788位內產生的序列


<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(18)
<223> 第16-18位的堿基在編輯後被刪除

<400> 59
atgtctcgct ccgtgdddtt agctgtgctc gcgctactct ctct 44


<210> 60
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：B3作為導向RNA進行編輯後，在15號染色體第45
003745位至第45003788位內產生的序列


<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(23)
<223> 第2-23位的堿基在編輯後被刪除

<400> 60
addddddddd dddddddddd dddtgtgctc gcgctactct ctct 44


<210> 61
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：B3作為導向RNA進行編輯後，在15號染色體第45
003745位至第45003788位內產生的序列


<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(29)
<223> 第16-29位的堿基在編輯後被刪除

<400> 61
atgtctcgct ccgtgddddd dddddddddc gcgctactct ctct 44


<210> 62
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：B3作為導向RNA進行編輯後，在15號染色體第45
003745位至第45003788位內產生的序列


<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(16)
<223> 第8-16位的堿基在編輯後被刪除

<400> 62
atgtctcddd ddddddcctt agctgtgctc gcgctactct ctct 44


<210> 63
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：B3作為導向RNA進行編輯後，在15號染色體第45
003745位至第45003788位內產生的序列


<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(17)
<223> 第6-17位的堿基在編輯後被刪除

<400> 63
atgtcddddd dddddddctt agctgtgctc gcgctactct ctct 44


<210> 64
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：B3作為導向RNA進行編輯後，在15號染色體第45
003745位至第45003788位內產生的序列


<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(26)
<223> 第2-26位的堿基在編輯後被刪除

<400> 64
addddddddd dddddddddd ddddddgctc gcgctactct ctct 44


<210> 65
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：B3作為導向RNA進行編輯後，在15號染色體第45
003745位至第45003788位內產生的序列如下表所示


<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(20)
<223> 第16-20位的堿基在編輯後被刪除

<400> 65
atgtctcgct ccgtgddddd agctgtgctc gcgctactct ctct 44


<210> 66
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：B3作為導向RNA進行編輯後，在15號染色體第45
003745位至第45003788位內產生的序列


<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(24)
<223> 第2-24位的堿基在編輯後被刪除

<400> 66
addddddddd dddddddddd ddddgtgctc gcgctactct ctct 44


<210> 67
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：B3作為導向RNA進行編輯後，在15號染色體第45
003745位至第45003788位內產生的序列


<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(25)
<223> 第14-25位的堿基在編輯後被刪除

<400> 67
atgtctcgct ccgddddddd dddddtgctc gcgctactct ctct 44


<210> 68
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：B3作為導向RNA進行編輯後，在15號染色體第45
003745位至第45003788位內產生的序列


<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(17)
<223> n表示插入任一堿基

<400> 68
atgtctcgct ccgtggncct tagctgtgct cgcgctactc tctct 45


<210> 69
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：B3作為導向RNA進行編輯後，在15號染色體第45
003745位至第45003788位內產生的序列


<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(19)
<223> 第16-19位的堿基在編輯後被刪除

<400> 69
atgtctcgct ccgtgddddt agctgtgctc gcgctactct ctct 44


<210> 70
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：B3作為導向RNA進行編輯後，在15號染色體第45
003745位至第45003788位內產生的序列


<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(20)
<223> 第2-20位的堿基在編輯後被刪除

<400> 70
addddddddd dddddddddd agctgtgctc gcgctactct ctct 44


<210> 71
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：B3作為導向RNA進行編輯後，在15號染色體第45
003745位至第45003788位內產生的序列


<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(16)
<223> 第13-16位的堿基在編輯後被刪除

<400> 71
atgtctcgct ccddddcctt agctgtgctc gcgctactct ctct 44


<210> 72
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：B3作為導向RNA進行編輯後，在15號染色體第45
003745位至第45003788位內產生的序列


<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(31)
<223> 第12-31位的堿基在編輯後被刪除

<400> 72
atgtctcgct cddddddddd dddddddddd dcgctactct ctct 44


<210> 73
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：B3作為導向RNA進行編輯後，在15號染色體第45
003745位至第45003788位內產生的序列


<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(19)
<223> 第13-19位的堿基在編輯後被刪除

<400> 73
atgtctcgct ccdddddddt agctgtgctc gcgctactct ctct 44


<210> 74
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：B3作為導向RNA進行編輯後，在15號染色體第45
003745位至第45003788位內產生的序列


<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(28)
<223> 第11-28位的堿基在編輯後被刪除

<400> 74
atgtctcgct dddddddddd ddddddddtc gcgctactct ctct 44


<210> 75
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：B3作為導向RNA進行編輯後，在15號染色體第45
003745位至第45003788位內產生的序列


<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(25)
<223> 第7-25位的堿基在編輯後被刪除

<400> 75
atgtctdddd dddddddddd dddddtgctc gcgctactct ctct 44


<210> 76
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：T3作為導向RNA進行編輯後，在14號染色體第23
016448位至第23016490位內產生的序列


<220>
<221> misc_feature
<222> (22)..(22)
<223> n表示插入任一堿基

<400> 76
tatccagaac cctgaccctg cncgtgtacc agctgagaga ctct 44


<210> 77
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：T3作為導向RNA進行編輯後，在14號染色體第23
016448位至第23016490位內產生的序列


<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(30)
<223> 第20-30位的堿基在編輯後被刪除

<400> 77
tatccagaac cctgaccctd dddddddddd gctgagagac tct 43


<210> 78
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：T3作為導向RNA進行編輯後，在14號染色體第23
016448位至第23016490位內產生的序列


<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(25)
<223> 第21-25位的堿基在編輯後被刪除

<400> 78
tatccagaac cctgaccctg dddddtacca gctgagagac tct 43


<210> 79
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：T3作為導向RNA進行編輯後，在14號染色體第23
016448位至第23016490位內產生的序列


<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(32)
<223> 第9-32位的堿基在編輯後被刪除

<400> 79
tatccagadd dddddddddd dddddddddd ddtgagagac tct 43


<210> 80
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：T3作為導向RNA進行編輯後，在14號染色體第23
016448位至第23016490位內產生的序列


<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(21)
<223> 第22位的堿基在編輯後被刪除

<400> 80
tatccagaac cctgaccctg dcgtgtacca gctgagagac tct 43


<210> 81
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：T3作為導向RNA進行編輯後，在14號染色體第23
016448位至第23016490位內產生的序列


<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(28)
<223> 第17-28位的堿基在編輯後被刪除

<400> 81
tatccagaac cctgacdddd ddddddddca gctgagagac tct 43


<210> 82
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：T3作為導向RNA進行編輯後，在14號染色體第23
016448位至第23016490位內產生的序列


<220>
<221> misc_feature
<222> (22)..(23)
<223> n表示插入任一堿基

<400> 82
tatccagaac cctgaccctg cnncgtgtac cagctgagag actct 45


<210> 83
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：T3作為導向RNA進行編輯後，在14號染色體第23
016448位至第23016490位內產生的序列


<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(26)
<223> 第16-26位的堿基在編輯後被刪除

<400> 83
tatccagaac cctgaddddd ddddddacca gctgagagac tct 43


<210> 84
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：T3作為導向RNA進行編輯後，在14號染色體第23
016448位至第23016490位內產生的序列


<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(32)
<223> 第22位的堿基在編輯後被刪除

<400> 84
tatccagaac cctgaccctg dddddddddd ddtgagagac tct 43


<210> 85
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：T3作為導向RNA進行編輯後，在14號染色體第23
016448位至第23016490位內產生的序列


<220>
<221> misc_feature
<222> (18)..(23)
<223> 第18-23位的堿基在編輯後被刪除

<400> 85
tatccagaac cctgaccddd dddtgtacca gctgagagac tct 43


<210> 86
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：T3作為導向RNA進行編輯後，在14號染色體第23
016448位至第23016490位內產生的序列


<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(23)
<223> 第7-23位的堿基在編輯後被刪除

<400> 86
tatccadddd dddddddddd dddtgtacca gctgagagac tct 43


<210> 87
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：T3作為導向RNA進行編輯後，在14號染色體第23
016448位至第23016490位內產生的序列


<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(24)
<223> 第7-24位的堿基在編輯後被刪除

<400> 87
tatccadddd dddddddddd ddddgtacca gctgagagac tct 43


<210> 88
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：T3作為導向RNA進行編輯後，在14號染色體第23
016448位至第23016490位內產生的序列


<220>
<221> misc_feature
<222> (22)..(23)
<223> 第22-23位的堿基在編輯後被刪除

<400> 88
tatccagaac cctgaccctg cddtgtacca gctgagagac tct 43


<210> 89
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：T3作為導向RNA進行編輯後，在14號染色體第23
016448位至第23016490位內產生的序列


<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(22)
<223> 第9-22位的堿基在編輯後被刪除

<400> 89
tatccagadd dddddddddd ddgtgtacca gctgagagac tct 43


<210> 90
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：T3作為導向RNA進行編輯後，在14號染色體第23
016448位至第23016490位內產生的序列


<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(22)
<223> 第21-22位的堿基在編輯後被刪除

<400> 90
tatccagaac cctgaccctg ddgtgtacca gctgagagac tct 43


<210> 91
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：T3作為導向RNA進行編輯後，在14號染色體第23
016448位至第23016490位內產生的序列


<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(29)
<223> 第16-29位的堿基在編輯後被刪除

<400> 91
tatccagaac cctgaddddd ddddddddda gctgagagac tct 43


<210> 92
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：T3作為導向RNA進行編輯後，在14號染色體第23
016448位至第23016490位內產生的序列


<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(35)
<223> 第16-35位的堿基在編輯後被刪除

<400> 92
tatccagaac cctgaddddd dddddddddd dddddgagac tct 43


<210> 93
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：T3作為導向RNA進行編輯後，在14號染色體第23
016448位至第23016490位內產生的序列


<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(26)
<223> 第7-26位的堿基在編輯後被刪除

<400> 93
tatccadddd dddddddddd ddddddacca gctgagagac tct 43


<210> 94
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：T3作為導向RNA進行編輯後，在14號染色體第23
016448位至第23016490位內產生的序列


<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(23)
<223> 第12-23位的堿基在編輯後被刪除

<400> 94
tatccagaac cddddddddd dddtgtacca gctgagagac tct 43


<210> 95
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：T3作為導向RNA進行編輯後，在14號染色體第23
016448位至第23016490位內產生的序列


<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(23)
<223> 第21-23位的堿基在編輯後被刪除

<400> 95
tatccagaac cctgaccctg dddtgtacca gctgagagac tct 43


<210> 96
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：T3作為導向RNA進行編輯後，在14號染色體第23
016448位至第23016490位內產生的序列


<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(22)
<223> 第16-22位的堿基在編輯後被刪除

<400> 96
tatccagaac cctgaddddd ddgtgtacca gctgagagac tct 43


<210> 97
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：T3作為導向RNA進行編輯後，在14號染色體第23
016448位至第23016490位內產生的序列


<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(26)
<223> 第9-26位的堿基在編輯後被刪除

<400> 97
tatccagadd dddddddddd ddddddacca gctgagagac tct 43


<210> 98
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：T3作為導向RNA進行編輯後，在14號染色體第23
016448位至第23016490位內產生的序列


<220>
<221> misc_feature
<222> (18)..(22)
<223> 第18-22位的堿基在編輯後被刪除

<400> 98
tatccagaac cctgaccddd ddgtgtacca gctgagagac tct 43


<210> 99
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：T3作為導向RNA進行編輯後，在14號染色體第23
016448位至第23016490位內產生的序列


<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(34)
<223> 第21-34位的堿基在編輯後被刪除

<400> 99
tatccagaac cctgaccctg dddddddddd ddddagagac tct 43


<210> 100
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：T3作為導向RNA進行編輯後，在14號染色體第23
016448位至第23016490位內產生的序列


<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(32)
<223> 第15-32位的堿基在編輯後被刪除

<400> 100
tatccagaac cctgdddddd dddddddddd ddtgagagac tct 43


<210> 101
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：T3作為導向RNA進行編輯後，在14號染色體第23
016448位至第23016490位內產生的序列


<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(25)
<223> 第15-25位的堿基在編輯後被刪除

<400> 101
tatccagaac cctgdddddd dddddtacca gctgagagac tct 43


<210> 102
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：T3作為導向RNA進行編輯後，在14號染色體第23
016448位至第23016490位內產生的序列


<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(29)
<223> 第17-29位的堿基在編輯後被刪除

<400> 102
tatccagaac cctgacdddd ddddddddda gctgagagac tct 43


<210> 103
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：T2作為導向RNA進行編輯後，在14號染色體第23
016448位至第23016490位內產生的序列


<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(20)
<223> 第15-20位的堿基在編輯後被刪除

<400> 103
tatccagaac cctgdddddd ccgtgtacca gctgagagac tct 43


<210> 104
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：T2作為導向RNA進行編輯後，在14號染色體第23
016448位至第23016490位內產生的序列


<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(21)
<223> 第16-21位的堿基在編輯後被刪除

<400> 104
tatccagaac cctgaddddd dcgtgtacca gctgagagac tct 43


<210> 105
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：T2作為導向RNA進行編輯後，在14號染色體第23
016448位至第23016490位內產生的序列


<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> 第15位的堿基在編輯後被刪除

<400> 105
tatccagaac cctgdccctg ccgtgtacca gctgagagac tct 43


<210> 106
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：T2作為導向RNA進行編輯後，在14號染色體第23
016448位至第23016490位內產生的序列


<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(16)
<223> n表示插入任一堿基

<400> 106
tatccagaac cctganccct gccgtgtacc agctgagaga ctct 44


<210> 107
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：T2作為導向RNA進行編輯後，在14號染色體第23
016448位至第23016490位內產生的序列


<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(16)
<223> 第15-16位的堿基在編輯後被刪除

<400> 107
tatccagaac cctgddcctg ccgtgtacca gctgagagac tct 43


<210> 108
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：T2作為導向RNA進行編輯後，在14號染色體第23
016448位至第23016490位內產生的序列


<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(25)
<223> 第2-25位的堿基在編輯後被刪除

<400> 108
tddddddddd dddddddddd dddddtacca gctgagagac tct 43


<210> 109
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：T2作為導向RNA進行編輯後，在14號染色體第23
016448位至第23016490位內產生的序列


<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(18)
<223> 第15-18位的堿基在編輯後被刪除

<400> 109
tatccagaac cctgddddtg ccgtgtacca gctgagagac tct 43


<210> 110
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：T2作為導向RNA進行編輯後，在14號染色體第23
016448位至第23016490位內產生的序列


<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(23)
<223> 第7-23位的堿基在編輯後被刪除

<400> 110
tatccadddd dddddddddd dddtgtacca gctgagagac tct 43


<210> 111
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：T2作為導向RNA進行編輯後，在14號染色體第23
016448位至第23016490位內產生的序列


<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(15)
<223> 第5-15位的堿基在編輯後被刪除

<400> 111
tatcdddddd dddddccctg ccgtgtacca gctgagagac tct 43


<210> 112
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：T2作為導向RNA進行編輯後，在14號染色體第23
016448位至第23016490位內產生的序列


<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(26)
<223> 第9-26位的堿基在編輯後被刪除

<400> 112
tatccagadd dddddddddd ddddddacca gctgagagac tct 43


<210> 113
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：T2作為導向RNA進行編輯後，在14號染色體第23
016448位至第23016490位內產生的序列


<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(17)
<223> 第6-17位的堿基在編輯後被刪除

<400> 113
tatccddddd dddddddctg ccgtgtacca gctgagagac tct 43


<210> 114
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：T2作為導向RNA進行編輯後，在14號染色體第23
016448位至第23016490位內產生的序列


<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(29)
<223> 第5-29位的堿基在編輯後被刪除

<400> 114
tatcdddddd dddddddddd ddddddddda gctgagagac tct 43


<210> 115
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：T2作為導向RNA進行編輯後，在14號染色體第23
016448位至第23016490位內產生的序列


<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(15)
<223> 第9-15位的堿基在編輯後被刪除

<400> 115
tatccagadd dddddccctg ccgtgtacca gctgagagac tct 43


<210> 116
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：T2作為導向RNA進行編輯後，在14號染色體第23
016448位至第23016490位內產生的序列


<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(21)
<223> 第15-21位的堿基在編輯後被刪除

<400> 116
tatccagaac cctgdddddd dcgtgtacca gctgagagac tct 43


<210> 117
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：T2作為導向RNA進行編輯後，在14號染色體第23
016448位至第23016490位內產生的序列


<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(25)
<223> 第21-25位的堿基在編輯後被刪除

<400> 117
tatccagaac dddddccctg ccgtgtacca gctgagagac tct 43


<210> 118
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：T2作為導向RNA進行編輯後，在14號染色體第23
016448位至第23016490位內產生的序列


<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(24)
<223> 第2-24位的堿基在編輯後被刪除

<400> 118
tddddddddd dddddddddd ddddgtacca gctgagagac tct 43


<210> 119
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：T2作為導向RNA進行編輯後，在14號染色體第23
016448位至第23016490位內產生的序列


<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(15)
<223> 第1-15位的堿基在編輯後被刪除

<400> 119
dddddddddd dddddccctg ccgtgtacca gctgagagac tct 43


<210> 120
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：T2作為導向RNA進行編輯後，在14號染色體第23
016448位至第23016490位內產生的序列


<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(30)
<223> 第15-30位的堿基在編輯後被刪除

<400> 120
tatccagaac cctgannnnn nnnnnnnnnn ccctgccgtg taccagctga gagactct 58


<210> 121
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：T2作為導向RNA進行編輯後，在14號染色體第23
016448位至第23016490位內產生的序列


<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(21)
<223> 第9-21位的堿基在編輯後被刪除

<400> 121
tatccagadd dddddddddd dcgtgtacca gctgagagac tct 43


<210> 122
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：T2作為導向RNA進行編輯後，在14號染色體第23
016448位至第23016490位內產生的序列


<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(18)
<223> 第9-18位的堿基在編輯後被刪除

<400> 122
tatccagadd ddddddddtg ccgtgtacca gctgagagac tct 43


<210> 123
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：T2作為導向RNA進行編輯後，在14號染色體第23
016448位至第23016490位內產生的序列


<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(15)
<223> 第6-15位的堿基在編輯後被刪除

<400> 123
tatccddddd dddddccctg ccgtgtacca gctgagagac tct 43


<210> 124
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：P2作為導向RNA進行編輯後，在2號染色體第242
800936位至第242800978位內產生的序列


<220>
<221> misc_feature
<222> (22)..(22)
<223> n表示插入任一堿基

<400> 124
agcccagttg tagcaccgcc cnagacgact ggccagggcg cctg 44


<210> 125
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：P2作為導向RNA進行編輯後，在2號染色體第242
800936位至第242800978位內產生的序列


<220>
<221> misc_feature
<222> (22)..(23)
<223> n表示插入任一堿基

<400> 125
agcccagttg tagcaccgcc cnnagacgac tggccagggc gcctg 45


<210> 126
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：P2作為導向RNA進行編輯後，在2號染色體第242
800936位至第242800978位內產生的序列


<220>
<221> misc_feature
<222> (29)..(33)
<223> 第29-33位的堿基在編輯後被刪除

<400> 126
agcccagttg tagcaccgdd dddacgactg gccagggcgc ctg 43


<210> 127
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：P2作為導向RNA進行編輯後，在2號染色體第242
800936位至第242800978位內產生的序列


<220>
<221> misc_feature
<222> (22)..(35)
<223> n表示插入任一堿基

<400> 127
agcccagttg tagcaccgcc cnnnnnnnnn nnnnnagacg actggccagg 50


<210> 128
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：P2作為導向RNA進行編輯後，在2號染色體第242
800936位至第242800978位內產生的序列


<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(29)
<223> 第13-29位的堿基在編輯後被刪除

<400> 128
agcccagttg tadddddddd dddddddddg gccagggcgc ctg 43


<210> 129
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：P2作為導向RNA進行編輯後，在2號染色體第242
800936位至第242800978位內產生的序列


<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(33)
<223> 第10-33位的堿基在編輯後被刪除

<400> 129
agcccagttd dddddddddd dddddddddd dddagggcgc ctg 43


<210> 130
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：P2作為導向RNA進行編輯後，在2號染色體第242
800936位至第242800978位內產生的序列


<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(28)
<223> 第7-28位的堿基在編輯後被刪除

<400> 130
agcccadddd dddddddddd ddddddddtg gccagggcgc ctg 43


<210> 131
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：P2作為導向RNA進行編輯後，在2號染色體第242
800936位至第242800978位內產生的序列


<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(21)
<223> 第21位的堿基在編輯後被刪除

<400> 131
agcccagttg tagcaccgcc dagacgactg gccagggcgc ctg 43


<210> 132
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：P2作為導向RNA進行編輯後，在2號染色體第242
800936位至第242800978位內產生的序列


<220>
<221> misc_feature
<222> (22)..(26)
<223> 第22-26位的堿基在編輯後被刪除

<400> 132
agcccagttg tagcaccgcc cdddddactg gccagggcgc ctg 43


<210> 133
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：P2作為導向RNA進行編輯後，在2號染色體第242
800936位至第242800978位內產生的序列


<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(24)
<223> 第10-24位的堿基在編輯後被刪除

<400> 133
agcccagttd dddddddddd ddddcgactg gccagggcgc ctg 43


<210> 134
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：P2作為導向RNA進行編輯後，在2號染色體第242
800936位至第242800978位內產生的序列


<220>
<221> misc_feature
<222> (22)..(23)
<223> 第22-23位的堿基在編輯後被刪除

<400> 134
agcccagttg tagcaccgcc cddacgactg gccagggcgc ctg 43


<210> 135
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：P2作為導向RNA進行編輯後，在2號染色體第242
800936位至第242800978位內產生的序列


<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(21)
<223> 第20-21位的堿基在編輯後被刪除

<400> 135
agcccagttg tagcaccgcd dagacgactg gccagggcgc ctg 43


<210> 136
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：P2作為導向RNA進行編輯後，在2號染色體第242
800936位至第242800978位內產生的序列


<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(22)
<223> 第14-22位的堿基在編輯後被刪除

<400> 136
agcccagttg tagddddddd ddgacgactg gccagggcgc ctg 43


<210> 137
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：P2作為導向RNA進行編輯後，在2號染色體第242
800936位至第242800978位內產生的序列


<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(23)
<223> 第14-23位的堿基在編輯後被刪除

<400> 137
agcccagttg tagddddddd dddacgactg gccagggcgc ctg 43


<210> 138
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：P2作為導向RNA進行編輯後，在2號染色體第242
800936位至第242800978位內產生的序列


<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(32)
<223> 第9-32位的堿基在編輯後被刪除

<400> 138
agcccagtdd dddddddddd dddddddddd ddcagggcgc ctg 43


<210> 139
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：P2作為導向RNA進行編輯後，在2號染色體第242
800936位至第242800978位內產生的序列


<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(36)
<223> 第7-36位的堿基在編輯後被刪除

<400> 139
agcccadddd dddddddddd dddddddddd ddddddgcgc ctg 43


<210> 140
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：P2作為導向RNA進行編輯後，在2號染色體第242
800936位至第242800978位內產生的序列


<220>
<221> misc_feature
<222> (19)..(22)
<223> 第19-22位的堿基在編輯後被刪除

<400> 140
agcccagttg tagcaccgdd ddgacgactg gccagggcgc ctg 43


<210> 141
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：P2作為導向RNA進行編輯後，在2號染色體第242
800936位至第242800978位內產生的序列


<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(22)
<223> 第21-22位的堿基在編輯後被刪除

<400> 141
agcccagttg tagcaccgcc ddgacgactg gccagggcgc ctg 43


<210> 142
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：P2作為導向RNA進行編輯後，在2號染色體第242
800936位至第242800978位內產生的序列


<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(25)
<223> 第11-25位的堿基在編輯後被刪除

<400> 142
agcccagttg dddddddddd dddddgactg gccagggcgc ctg 43


<210> 143
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：P2作為導向RNA進行編輯後，在2號染色體第242
800936位至第242800978位內產生的序列


<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(34)
<223> 第12-34位的堿基在編輯後被刪除

<400> 143
agcccagttg tddddddddd dddddddddd ddddgggcgc ctg 43


<210> 144
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：P2作為導向RNA進行編輯後，在2號染色體第242
800936位至第242800978位內產生的序列


<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(21)
<223> 第7-21位的堿基在編輯後被刪除

<400> 144
agcccadddd dddddddddd dagacgactg gccagggcgc ctg 43


<210> 145
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：P2作為導向RNA進行編輯後，在2號染色體第242
800936位至第242800978位內產生的序列


<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(26)
<223> 第12-36位的堿基在編輯後被刪除

<400> 145
agcccagttg tddddddddd ddddddactg gccagggcgc ctg 43


<210> 146
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：P2作為導向RNA進行編輯後，在2號染色體第242
800936位至第242800978位內產生的序列


<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(27)
<223> 第7-27位的堿基在編輯後被刪除

<400> 146
agcccadddd dddddddddd dddddddctg gccagggcgc ctg 43


<210> 147
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：P1作為導向RNA進行編輯後，在2號染色體第242
800936位至第242800978位內產生的序列


<220>
<221> misc_feature
<222> (26)..(26)
<223> n表示插入任一堿基

<400> 147
cagtttagca cgaagctctc cgatgntgtt ggagaagctg cagg 44


<210> 148
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：P1作為導向RNA進行編輯後，在2號染色體第242
800936位至第242800978位內產生的序列


<220>
<221> misc_feature
<222> (26)..(27)
<223> 第26-27位的堿基在編輯後被刪除

<400> 148
cagtttagca cgaagctctc cgatgddttg gagaagctgc agg 43


<210> 149
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：P1作為導向RNA進行編輯後，在2號染色體第242
800936位至第242800978位內產生的序列


<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(25)
<223> 第25位的堿基在編輯後被刪除

<400> 149
cagtttagca cgaagctctc cgatdtgttg gagaagctgc agg 43


<210> 150
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：P1作為導向RNA進行編輯後，在2號染色體第242
800936位至第242800978位內產生的序列


<220>
<221> misc_feature
<222> (23)..(25)
<223> 第23-25位的堿基在編輯後被刪除

<400> 150
cagtttagca cgaagctctc cgdddtgttg gagaagctgc agg 43


<210> 151
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：P1作為導向RNA進行編輯後，在2號染色體第242
800936位至第242800978位內產生的序列


<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(25)
<223> 第12-25位的堿基在編輯後被刪除

<400> 151
cagtttagca cddddddddd dddddtgttg gagaagctgc agg 43


<210> 152
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：P1作為導向RNA進行編輯後，在2號染色體第242
800936位至第242800978位內產生的序列


<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(25)
<223> 第21-25位的堿基在編輯後被刪除

<400> 152
cagtttagca cgaagctctc dddddtgttg gagaagctgc agg 43


<210> 153
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：P1作為導向RNA進行編輯後，在2號染色體第242
800936位至第242800978位內產生的序列


<220>
<221> misc_feature
<222> (22)..(25)
<223> 第22-25位的堿基在編輯後被刪除

<400> 153
cagtttagca cgaagctctc cddddtgttg gagaagctgc agg 43


<210> 154
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：P1作為導向RNA進行編輯後，在2號染色體第242
800936位至第242800978位內產生的序列


<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(31)
<223> 第11-31位的堿基在編輯後被刪除

<400> 154
cagtttagca dddddddddd dddddddddd dagaagctgc agg 43


<210> 155
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：P1作為導向RNA進行編輯後，在2號染色體第242
800936位至第242800978位內產生的序列


<220>
<221> misc_feature
<222> (28)..(35)
<223> 第28-35位的堿基在編輯後被刪除

<400> 155
cagtttagca cgaagctddd dddddtgttg gagaagctgc agg 43


<210> 156
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：P1作為導向RNA進行編輯後，在2號染色體第242
800936位至第242800978位內產生的序列


<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(25)
<223> 第20-25位的堿基在編輯後被刪除

<400> 156
cagtttagca cgaagctctd dddddtgttg gagaagctgc agg 43


<210> 157
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：P1作為導向RNA進行編輯後，在2號染色體第242
800936位至第242800978位內產生的序列


<220>
<221> misc_feature
<222> (26)..(38)
<223> 第26-38位的堿基在編輯後被刪除

<400> 157
cagtttagca cgaagctctc cgatgnnnnn nnnnnnnntg ttggagaagc tgcagg 56


<210> 158
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：P1作為導向RNA進行編輯後，在2號染色體第242
800936位至第242800978位內產生的序列


<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(36)
<223> 第21-36位的堿基在編輯後被刪除

<400> 158
cagtttagca dddddddddd ddddddgttg gagaagctgc agg 43


<210> 159
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：P1作為導向RNA進行編輯後，在2號染色體第242
800936位至第242800978位內產生的序列


<220>
<221> misc_feature
<222> (26)..(27)
<223> n表示插入任一堿基

<400> 159
cagtttagca cgaagctctc cgatgnntgt tggagaagct gcagg 45


<210> 160
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：P1作為導向RNA進行編輯後，在2號染色體第242
800936位至第242800978位內產生的序列


<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(27)
<223> 第11-27位的堿基在編輯後被刪除

<400> 160
cagtttagca dddddddddd dddddddttg gagaagctgc agg 43


<210> 161
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：P1作為導向RNA進行編輯後，在2號染色體第242
800936位至第242800978位內產生的序列


<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(25)
<223> 第13-25位的堿基在編輯後被刪除

<400> 161
cagtttagca cgdddddddd dddddtgttg gagaagctgc agg 43


<210> 162
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：P1作為導向RNA進行編輯後，在2號染色體第242
800936位至第242800978位內產生的序列


<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(26)
<223> 第20-26位的堿基在編輯後被刪除

<400> 162
cagtttagca cgaagctctd ddddddgttg gagaagctgc agg 43


<210> 163
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：P1作為導向RNA進行編輯後，在2號染色體第242
800936位至第242800978位內產生的序列


<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(25)
<223> 第11-25位的堿基在編輯後被刪除

<400> 163
cagtttagca dddddddddd dddddtgttg gagaagctgc agg 43


<210> 164
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> 人工序列的描述：P1作為導向RNA進行編輯後，在2號染色體第242
800936位至第242800978位內產生的序列


<220>
<221> misc_feature
<222> (26)..(33)
<223> 第26-33位的堿基在編輯後被刪除

<400> 164
cagtttagca cgaagctctc cgatgnnnnn nnntgttgga gaagctgcag g 51

Claims (43)

  1. 一種製備基因改造的T細胞的方法，包括：通過基因編輯技術破壞所述T細胞中： (i) 14號染色體第23016448位至第23016490位元的TRAC基因組區域； (ii) 15號染色體第45003745位至第45003788位的B2M基因組區域；及/或 (iii) 2號染色體第242800936位至第242800978位的PD-1基因組區域，或2號染色體第242795009位至第242795051位的PD-1基因組區域。
  2. 如申請專利範圍第1項所述的方法，其中所述TRAC基因組區域、所述B2M基因組區域和所述PD-1基因組區域均被編輯。
  3. 如申請專利範圍第1項所述的方法，其中： (i) 所述TRAC基因組的靶核苷酸序列與選自SEQ ID NOs：2-5中任一的序列互補； (ii) 所述B2M基因組的靶核苷酸序列與選自SEQ ID NOs：6-13中任一的序列互補；及/或 （iii）所述PD-1基因組的靶核苷酸序列與選自SEQ ID NOs：14-22中任一的序列互補。
  4. 如申請專利範圍第1項或第2項所述的方法，其中所述基因編輯技術為基於鋅指核酸酶的基因編輯技術、TALEN基因編輯技術或CRISPR/Cas基因編輯技術。
  5. 如申請專利範圍第4項所述的方法，其中所述基因編輯技術為CRISPR/Cas9基因編輯技術。
  6. 如申請專利範圍第5項所述的方法，其中： （i）將包含靶向所述TRAC基因組的sgRNA導入所述T細胞以實現對所述TRAC基因組區域的編輯； （ii）將包含靶向所述B2M基因組的sgRNA導入所述T細胞以實現對所述B2M基因組區域的編輯；及/或 （iii）將包含靶向所述PD-1基因組的sgRNA導入所述T細胞以實現對所述PD-1基因組區域的編輯。
  7. 如申請專利範圍第6項所述的方法，包含： （i）將包含選自SEQ ID NOs：2-5中任一序列的sgRNA導入所述T細胞以實現對所述TRAC基因組區域的編輯； （ii）將包含選自SEQ ID NOs：6-14中任一序列的sgRNA導入所述T細胞以實現對所述B2M基因組區域的編輯；及/或 （iii）將包含選自SEQ ID NOs：15-22中任一序列的sgRNA導入所述T細胞以實現對所述PD-1基因組區域的編輯。
  8. 如申請專利範圍第7項所述的方法，包含同時向所述T細胞導入靶向TRAC的sgRNA、靶向B2M的sgRNA和靶向PD-1的sgRNA.
  9. 如申請專利範圍第6項所述的方法，其中所述sgRNA是經過修飾的，且所述修飾包括2’-O-甲基類似物及/或核苷酸間3’硫代修飾。
  10. 如申請專利範圍第9項所述的方法，其中所述修飾為所述sgRNA的5’端前一個、二個及/或三個鹼基和/或3’端的最後一個鹼基的2’-O-甲基類似物修飾。
  11. 如申請專利範圍第6項所述的方法，其中將所述sgRNA與Cas9編碼核苷酸序列共同導入所述T細胞。
  12. 如申請專利範圍第11項所述的方法，將所述sgRNA與所述Cas9編碼核苷酸序列通過電轉方式共同導入所述T細胞，所述電轉的條件包括選自如下的任一項：150-250V，0.5-2ms；150V，2ms；160V，2ms；170V，2ms；180V，2ms；190V，1ms；200V，1ms；210V，1ms；220V，1ms；230V，1ms；240V，1ms；及250V，0.5ms。
  13. 如申請專利範圍第1項所述的方法，還包括從經過基因編輯的T細胞中篩選TRAC、B2M及/或PD-1表達量低的T細胞。
  14. 如申請專利範圍第1項所述的方法，其中所述TRAC、所述B2M或所述PD-1基因敲除的效率為90%以上；所述TRAC與所述B2M基因的同時敲除效率在75%以上；或所述TRAC、所述B2M和所述PD-1基因的同時敲除效率在65%以上。
  15. 如申請專利範圍第1項所述的方法，其中所述T細胞來源於健康受試者。
  16. 一種基因改造的T細胞，透過如申請專利範圍第1項所述的方法所製備。
  17. 一種基因改造的T細胞，其中所述T細胞中： (i) 14號染色體第23016448位至第23016490位元的TRAC基因組區域的一個或多個位點通過基因編輯技術被破壞； (ii) 15號染色體第45003745位至第45003788位的B2M基因組區域的一個或多個位點通過基因編輯技術被破壞；及/或 (iii) 2號染色體第242800936位至第242800978位的PD-1基因組區域，或2號染色體第242795009位至第242795051位的PD-1基因組區域的一個或多個位點通過基因編輯技術被破壞。
  18. 一種用於製備過繼細胞治療的T細胞的用途，透過如申請專利範圍第16項或第17項所述的基因改造的T細胞。
  19. 如申請專利範圍第18項所述的用途，其中所述過繼細胞治療的T細胞為CAR-T細胞或TCR-T細胞。
  20. 一種製備CAR-T細胞或TCR-T細胞的方法，包括：將嵌合抗原受體（CAR）或其編碼核苷酸、或工程化的T細胞受體（TCR）或其編碼核苷酸導入如申請專利範圍第16項或第17項所述的基因改造的T細胞。
  21. 一種製備CAR-T或TCR-T細胞的方法，包括： (i) 將包含靶向14號染色體第23016448位至第23016490位的TRAC基因組的sgRNA導入T細胞以破壞所述TRAC基因組區域； （ii）將包含靶向15號染色體第45003745位至第45003788位的B2M基因組區域的sgRNA導入所述T細胞以破壞所述B2M基因組區域； （iii）將包含靶向2號染色體第242800936位至第242800978位的PD-1基因組區域，或2號染色體第242795009位至第242795051位的PD-1基因組區域的sgRNA導入所述T細胞以破壞所述B2M基因組區域；及/或 （iv）將嵌合抗原受體（CAR）或其編碼核苷酸、或工程化的T細胞受體（TCR）或其編碼核苷酸導入所述T細胞。
  22. 如申請專利範圍第21項所述的方法，其中靶向TRAC的sgRNA、靶向B2M的sgRNA、靶向PD-1的sgRNA及/或CAR或其編碼核苷酸或工程化的T細胞受體（TCR）或其編碼核苷酸同時導入所述T細胞。
  23. 如申請專利範圍第21項所述的方法，其中將CAR或其編碼核苷酸、或工程化的T細胞受體（TCR）或其編碼核苷酸先于靶向TRAC的sgRNA、靶向B2M的sgRNA及/或靶向PD-1的sgRNA導入所述T細胞；或將所述CAR或其編碼核苷酸、或所述工程化的T細胞受體（TCR）或其編碼核苷酸在導入所述靶向TRAC的sgRNA、所述靶向B2M的sgRNA及/或所述靶向PD-1的sgRNA後導入所述T細胞。
  24. 如申請專利範圍第20項至第23項中任一項所述的方法，其中所述CAR-T為通用型CAR-T；或所述TCR-T為通用型TCR-T。
  25. 一種CAR-T細胞或TCR-T細胞，透過如申請專利範圍第20項至第23項中任一項所述的方法所製備。
  26. 一種CAR-T細胞，包含表達嵌合抗原受體（CAR）的如申請專利範圍第16項或第17項所述的基因改造的T細胞。
  27. 一種TCR-T細胞，包含表達工程化TCR的如申請專利範圍第16項或第17項所述的基因改造的T細胞。
  28. 一種包含如申請專利範圍第16項或第17項所述的基因改造的T細胞、如申請專利範圍第25項所述的CAR-T細胞或如申請專利範圍第25項所述的TCR-T細胞的組合物。
  29. 一種包含如申請專利範圍第16項或第17項所述的基因改造的T細胞、如申請專利範圍第25項所述的CAR-T細胞或如申請專利範圍第27項所述的TCR-T細胞的組合物。
  30. 一種包含如申請專利範圍第16項或第17項所述的基因改造的T細胞、如申請專利範圍第26項所述的CAR-T細胞或如申請專利範圍第25項所述的TCR-T細胞的組合物。
  31. 一種包含如申請專利範圍第16項或第17項所述的基因改造的T細胞、如申請專利範圍第26項所述的CAR-T細胞或如申請專利範圍第27項所述的TCR-T細胞的組合物。
  32. 一種治療受試者疾病的方法，包括給藥受試者有效量的如申請專利範圍第25項所述的CAR-T細胞，或如申請專利範圍第25項所述的TCR-T細胞。
  33. 如申請專利範圍第32項所述的方法，其中所述疾病為腫瘤。
  34. 如申請專利範圍第33項所述的方法，其中所述腫瘤為血液系統腫瘤。
  35. 如申請專利範圍第34項所述的方法，其中所述腫瘤為淋巴瘤或白血病。
  36. 如申請專利範圍第32項所述的方法，其中所述CAR靶向CD19。
  37. 如申請專利範圍第32項所述的方法，其中所述T細胞不是從受試者得到的。
  38. 一種包含SEQ ID NOs：2-22中任一項所述的sgRNA。
  39. 如申請專利範圍第38項所述的sgRNA，其中化學修飾是2’-O-甲基類似物及/或核苷酸間3’硫代修飾。
  40. 如申請專利範圍第39項所述的sgRNA，其中所述化學修飾為所述sgRNA的5’端前一個、二個及/或三個堿基及/或3’端的最後一個堿基的2’-O-甲基類似物的修飾。
  41. 一種治療受試者疾病的方法，包括給藥受試者有效量的如申請專利範圍第25項所述的CAR-T細胞，或如申請專利範圍第27項所述的TCR-T細胞。
  42. 一種治療受試者疾病的方法，包括給藥受試者有效量的如申請專利範圍第26項所述的CAR-T細胞，或如申請專利範圍第25項所述的TCR-T細胞。
  43. 一種治療受試者疾病的方法，包括給藥受試者有效量的如申請專利範圍第26項所述的CAR-T細胞，或如申請專利範圍第27項所述的TCR-T細胞。
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