CN112094867A - 一种高纯度通用型car-t的制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物细胞技术领域，具体涉及一种高纯度通用型CAR‑T的制备方法及应用。一种高纯度通用型CAR‑T的制备方法，所述通用型CAR‑T的CAR的表达率为100％。本发明高纯度通用型CAR‑T的制备方法利用crispr‑cas9技术敲除T细胞TCR的TRAC和HLA‑I的B2M基因，以制备通用型CAR‑T，并且使通用型CAR‑T的CAR的表达率达到100％，减少输注至人体中的CAR(‑)TCR(‑)T细胞量，从而降低不可知的风险。

Description

一种高纯度通用型CAR-T的制备方法及应用
技术领域
本发明涉及生物细胞技术领域，具体涉及一种高纯度通用型CAR-T的制备方法及应用。
背景技术
近几年来，肿瘤免疫疗法发展迅速，尤其是过继性细胞疗法(ACT)，即指从病人体内分离出T细胞、NK细胞等免疫细胞，通过体外修饰扩增培养，随后回输入患者体内进行肿瘤治疗的方法。2013年，肿瘤的免疫疗法被Science杂质评为“十大突破”之首。
CAR-T和TCR-T是过继性细胞疗法重要的组成部分，尤其CAR-T疗法，在血液肿瘤的治疗上取得了显著的成就，取得了较高的缓解率，典型的CAR结构由三部分组成，胞外识别肿瘤抗原的scFv、铰链和跨膜结构域、胞内共刺激信号和激活结构域。第一代的CAR并不包含胞内共刺激信号，CAR-T细胞的杀伤活性较低且生存时间较短。因此，第二代CAR开始加入共刺激信号如CD28和4-1BB，采用不同的共刺激信号的CAR-T细胞的特性也不尽相同，CD28增强了CAR-T细胞的杀伤活性而4-1BB则增强CAR-T细胞杀伤活性的同时延长了CAR-T细胞的生存时间。随后，出现了共同表达两个共刺激信号域的三代CAR，然而其抗肿瘤效果并不如二代CAR-T。因此，现在临床应的主要为二代CAR-T细胞。
CAR-T疗法不仅在血液肿瘤的治疗上成果显著，而且商业化进展顺利，美国FDA于2017年正式批准了两种CAR-T药品上市。尽管CAR-T细胞疗法在血液肿瘤的治疗上大放异彩，然而其制备成本高，需要用患者自己的血，需要患者等的时间久，尤其是对于癌症晚期患者，时间是最宝贵的，并且由于病人体质，病情及之前用药不同，一些病人的T细胞很难在体外扩增。因此，CAR-T在临床上的应用大大受到了限制。临床亟需off-the-shelf产品，是其真正市场化。
通用型CART技术极大程度上解决了以上问题，将是今后的一个方向。利用基因编辑技术ZFN(zinc-finger nucleases)、TALEN(transcription activator-like effectornucleases)和CRISPER-Cas等基因编辑技术，对健康供体来源的T细胞TCR及其他导致不同个体间免疫原性的基因的敲除，减少GvHD和HvGD，将会使CAR-T这一技术真正成为一种活的药物，进而能够广泛而方便的供合适的患者使用，实现CAR-T细胞治疗的产业化，并极大地降低成本。
然而，T细胞的TCR被敲除后，其依赖于TCR的对肿瘤细胞的杀伤能力无法实施，此时只能依靠转入的CAR的激活来达到T细胞的杀伤，所以没有转入CAR的TCR(-)T细胞在体内起到的作用微乎其微，这就意味着输给患者的通用型CAR-T制剂中含有部分无用的CAR(-)TCR(-)T。
公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的在于提供一种高纯度通用型CAR-T的制备方法及应用，其利用crispr-cas9技术敲除T细胞TCR的TRAC和HLA-I的B2M基因，以制备通用型CAR-T，并且使通用型CAR-T的CAR的表达率达到100％，减少输注至人体中的CAR(-)TCR(-)T细胞量，从而降低不可知的风险。
为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：
一种高纯度通用型CAR-T的制备方法，所述通用型CAR-T的CAR的表达率为100％。
作为优选，所述制备方法利用crispr-cas9技术敲除T细胞中会引起移植物抗宿主反应或者宿主抗移植物反应的基因。
作为优选，所述制备方法中敲除的基因为TCR的TRAC和HLA-I的B2M基因。
作为优选，所述制备方法将表达gRNA的基因和表达CAR的基因放在一个载体上共同转入T细胞。
作为优选，所述制备方法中基因转入方式为：慢病毒、逆转录病毒、普通质粒载体、附加体载体、纳米递送系统、电转导、转座子和/或其它递送系统。
作为优选，所述制备方法中cas9蛋白的转入方式为利用AVV病毒、电转导、脂质体和/或转座子的转染方式将cas9蛋白的mRNA或者蛋白或者含cas9基因的质粒转入T细胞，达到瞬时转染，不插入到宿主基因组中。
作为优选，所述制备方法中转入CAR和gRNA的步骤和转入cas9的步骤同时进行或先后进行。
作为优选，所述CAR包含前导序列、识别肿瘤相关抗原的scFv或者肿瘤相关抗原的配体、铰链区和跨膜结构域、胞内共刺激信号和胞内激活信号CD3ζ。
作为优选，所述scFv为EGFR、GPC3和/或Claundin18.2的scFv。
本发明还提供了上述制备方法制备的通用型CAR-T在治疗肿瘤药物中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明双基因敲除效率高，可达70％以上；且敲除后T细胞活率高，可达60％以上。
(2)本发明无需专门进行CAR+T细胞的纯化，gRNA和CAR一起转入，所以只有成功进行敲除的T细胞才会表达CAR，纯化TCR(-)HLA-I(-)T细胞后，CAR阳性率极为100％。
(3)本发明制备的通用型CAR-T中无CAR(-)TCR(-)T细胞的存在，减少不必要的细胞输注到人体内引起的未知风险。
附图说明
图1为UCAR的结构；
图2为CAR的结构；
图3为CAR-T细胞的增殖扩增曲线；
图4为NT细胞第6d的表达情况；
图5为GPC3 UCAR-T细胞第6d的表达情况；
图6为GPC3 CAR-T，细胞第6d的表达情况；
图7为GPC3 UCAR-T细胞纯化前后CD3的表达情况；
图8为GPC3 UCAR-T细胞纯化前后HLA-I的表达；
图9为GPC3 UCAR-T细胞纯化前后CAR的表达；
图10为三种T细胞的体外杀伤效应检测结果；
图11为细胞因子IFN-γ的分泌检测结果；
图12为细胞因子IL-2的分泌检测结果；
图13为与不同来源PBMC共培养72h后CAR-T细胞增殖情况；
图14为INF-GAMMA细胞的分泌释放情况；
图15为与CAR-T和UCAR-T分别共培养72h后PBMC细胞增殖情况；
图16为INF-GAMMA细胞的分泌释放情况；
具体实施方式
下面结合对本发明专利的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域所属的技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例
本实施例通用型CAR-T的制备方法及功能验证包括以下步骤：
步骤一：外周血PBMC的分离和T细胞的扩增
从供体外周血中分离单个核细胞，使用ficol进行密度梯度离心，并用T细胞分选试剂盒富集T细胞(CD3 MicroBeads，human-lyophilized，130-097-043)，使用偶联anti-CD3/anti-CD28的磁珠激活培养和扩增T细胞；
培养基使用TexMACS GMP Medium(Miltenyi Biotec，170-076-309)，含10％FBS，2mM L-glutamine，100IU/ml rhIL2，所有细胞均置于37℃，5％CO2恒温培养箱中培养。
步骤二：细胞系培养
表达GPC3的细胞系：Huh-7(人肝癌细胞)，购自ATCC。
不表达GPC3的细胞系：A549(人非小细胞肺癌细胞)，购自ATCC。
包装用细胞：293T(人胚肾细胞系)，购自ATCC。
培养基培养：Huh-7、A549、293T使用DMEM培养基培养。所有培养基均添加10％(v/v)胎牛血清。
步骤三：CAR结构设计与慢病毒包装
GPC3-CAR结构，即靶向GPC3(磷脂酰肌醇蛋白聚糖3)的CAR结构：
将靶向TRAC和B2M的gRNA分别通过U6启动子驱动，和第二代CAR构建在一个载体上。CAR的核心结构包括分泌信号肽序列；来自anti-GPC3的抗体的scFv(专利号：US 2007/0190599A1)；CD8跨膜区；胞内段刺激信号4-1BB-CD3ζ，命名为UCAR，如图1所示；以只有CAR的表达框作为对照，命名为CAR，如图2所示。
将表达框克隆至PHBLV慢病毒载体骨架中，置于EF1α(EF-1α)的启动子下，形成PHBLV-EF1α-GPC3-CAR和PHBLV-EF1α-PA-GPC3-CAR，将PHBLV-EF1α-GPC3-CAR或者PHBLV-EF1α-PA-GPC3-CAR、慢病毒包膜质粒pMD2.G(Addgene，Plasmid#12259)和慢病毒包装质粒psPAX2(Addgene Plasmid#12260)三个质粒使用Lipofectamine3000转入293T中制备慢病毒完整表达载体；在48h和72h收集病毒上清，超离进行浓缩(Merck Millipore)；浓缩后的病毒即可用于感染T细胞。
步骤四：通用型CAR-T细胞制备
4.1慢病毒感染
分离纯化的原代T细胞在激活1天后，利用步骤三包装的2种慢病毒，按MOI(1-10)进行慢病毒载体感染，转移至细胞培养瓶，置于37℃，5％CO2恒温培养箱中培养。
4.2电转cas9蛋白至CAR-T细胞
慢病毒转染后48h-96h，电转cas9蛋白到CAR-T细胞，置于37℃，5％CO2恒温培养箱中培养。
4.3细胞增殖及CAR阳性率检测
利用2种慢病毒载体，成功构建了2种CAR-T细胞，分别命名为GPC3 CAR T，GPC3UCAR T，以不感染慢病毒的T细胞为对照(NT)；
第6、9、11、13天每天取样检测细胞数量，检测结果如图3所示；
第6天检测T细胞的CAR阳性率。每隔1-2天传代补加培养基，检测结果如图4-6所示。
从图3可以看出，三种T细胞扩增正常，可达约100倍，CAR的转入或者UCAR的转入对与扩增无显著性影响。
从图4-6可以看出，CAR-T细胞表达CAR的百分比不受基因敲除的影响。
4.4TCR(-)HLA-I(-)T细胞的纯化
第13天，利用阳性或者阴选的方式纯化GPC3 UCAR T组的TCR(-)HLA-I(-)T，纯化前和纯化后的T细胞CD3、HLA-I和CAR的表达情况图7-9所示。
从图7-9可以看出，纯化后CD3表达率不到1％，HLA-I表达率不到百分之2％，CAR阳性率为100％。
步骤五：细胞体外杀伤实验
对步骤4获得的3种T细胞进行体外杀伤实验：靶细胞与效应细胞共孵育6h后，LDH法(promega：G1780)检测CAR-T细胞的杀伤效应，检测结果图10所示。
从图10可以看出，CAR-T细胞的杀伤效率明显，且敲除TCR、HLA-I基因对CAR-T的杀伤活性无显著性影响。
步骤六：细胞因子释放检测
将步骤四获得的CAR-T细胞与靶细胞(A549、Huh-7)分别以1：1效靶比混合，置于RPMI培养基中，共培养24h，收集上清，离心后取上清检测细胞因子IFN-γ与IL2的释放水平，采用Elisa试剂盒(abbkine，KET6011、KET6014)进行检测，检测结果图11和图12所示。
从图11和图12可以看出，与GPC3+靶细胞共培养后，CAR-T细胞会释放大量IFN-γ与IL-2；与GPC3-靶细胞共培养后，CAR-T细胞只少量分泌IFN-γ与IL-2。表明CAR-T和UCAR-T均能被肿瘤表面GPC3抗原有效且特异性的激活。
步骤7：体外模拟CAR-T的GvHD反应和HvGD反应实验。
取donor A和donor B的PBMC，及与此次实验制备的CAR-T相同来源的donor-C的PBMC，将其用gamma射线照射，使其不增殖，分别和GPC3UCAR-T、GPC3 CAR-T共培养，CFSE检测CAR-T的增殖情况，Elispot检测细胞分泌INF-gamma的情况，检测结果分别如图13和图14所示。
从图13可以看出，donor A和donor B的PBMC会刺激CAR-T细胞的增殖，但是不会刺激UCAR-T的增殖。
从图14可以看出，donor A和donor B的PBMC和CAR-T共培养时，可检测到分泌INF-gamma的细胞显著增高，可见敲除TCR，不引起GvHD。
将GPC3 UCAR-T、GPC3 CAR-T用gamma射线照射，使其不增值，分别和donor A和donor B、donor-C的PBMC共培养，CFSE检测PBMC的增殖情况，Elispot检测细胞分泌INF-gamma的情况，检测结果分别如图15和图16所示。
从图15可以看出，GPC3 CAR-T会刺激donor A和donor B的PBMC增殖，但是不会刺激donor-C的PBMC的增殖，UGPC3 CAR-T不会刺激donor A和donor B、donor-C的PBMC增殖。
从图16可以看出，donor A和donor B的PBMC和CAR-T共培养时，可检测到分泌INF-gamma的细胞显著增高，可见敲除HLA-I，不引起HvGD，延长CAR-T在体内的存活时间。
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。

Claims (10)

1.一种高纯度通用型CAR-T的制备方法，其特征在于，所述通用型CAR-T的CAR的表达率为100％。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法利用crispr-cas9技术敲除T细胞中会引起引起移植物抗宿主反应或者宿主抗移植物反应的基因。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法将表达gRNA的基因和表达CAR的基因放在一个载体上共同转入T细胞。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法中基因转入方式为：慢病毒、逆转录病毒、普通质粒载体、附加体载体、纳米递送系统、电转导、转座子和/或其它递送系统。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法中cas9蛋白的转入方式为利用AVV病毒、电转导、脂质体和/或转座子的转染方式将cas9蛋白的mRNA或者蛋白或者含cas9基因的质粒转入T细胞，达到瞬时转染，不插入到宿主基因组中。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法中转入CAR和gRNA的步骤和转入cas9的步骤同时进行或先后进行。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述CAR包含前导序列、识别肿瘤相关抗原的scFv或者肿瘤相关抗原的配体、铰链区和跨膜结构域、胞内共刺激信号和胞内激活信号CD3ζ。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述scFv为EGFR、GPC3和/或Claundin18.2的scFv。
9.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法中敲除的基因为T细胞TCR的TRAC和HLA-I的B2M基因。
10.一种上述任一项权利要求所述制备方法的应用，其特征在于，上述任一项权利要求所述制备方法制备的通用型CAR-T在治疗肿瘤药物中的应用。
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