CN117642510A - 靶向her2的通用型car-t细胞及其制备方法 - Google Patents
靶向her2的通用型car-t细胞及其制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117642510A CN117642510A CN202280046731.2A CN202280046731A CN117642510A CN 117642510 A CN117642510 A CN 117642510A CN 202280046731 A CN202280046731 A CN 202280046731A CN 117642510 A CN117642510 A CN 117642510A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- hla
- cell
- seq
- gene
- cells
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 22
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 150
- 108010019670 Chimeric Antigen Receptors Proteins 0.000 claims abstract description 139
- 230000008685 targeting Effects 0.000 claims abstract description 134
- 101001012157 Homo sapiens Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Proteins 0.000 claims abstract description 88
- 102100030086 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Human genes 0.000 claims abstract description 87
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 70
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 51
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 51
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 51
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims abstract description 19
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 421
- 101710153660 Nuclear receptor corepressor 2 Proteins 0.000 claims description 176
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 167
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 150
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 144
- 108010075704 HLA-A Antigens Proteins 0.000 claims description 139
- 102100028972 HLA class I histocompatibility antigen, A alpha chain Human genes 0.000 claims description 134
- 108010058607 HLA-B Antigens Proteins 0.000 claims description 120
- 102100028976 HLA class I histocompatibility antigen, B alpha chain Human genes 0.000 claims description 119
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 claims description 119
- 102100029452 T cell receptor alpha chain constant Human genes 0.000 claims description 116
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 91
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 83
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 80
- 239000012642 immune effector Substances 0.000 claims description 74
- 229940121354 immunomodulator Drugs 0.000 claims description 74
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 74
- 101150118346 HLA-A gene Proteins 0.000 claims description 66
- 101100382122 Homo sapiens CIITA gene Proteins 0.000 claims description 64
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 59
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 57
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 57
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 54
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 54
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 54
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 52
- 108091027544 Subgenomic mRNA Proteins 0.000 claims description 48
- 108700002010 MHC class II transactivator Proteins 0.000 claims description 45
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 claims description 44
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 43
- 102100026371 MHC class II transactivator Human genes 0.000 claims description 42
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 claims description 40
- 230000011664 signaling Effects 0.000 claims description 39
- -1 TRBC Proteins 0.000 claims description 38
- 238000003209 gene knockout Methods 0.000 claims description 38
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 36
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 36
- 102100027314 Beta-2-microglobulin Human genes 0.000 claims description 33
- 101000937544 Homo sapiens Beta-2-microglobulin Proteins 0.000 claims description 32
- 230000004068 intracellular signaling Effects 0.000 claims description 30
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 claims description 28
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 claims description 24
- 101000946843 Homo sapiens T-cell surface glycoprotein CD8 alpha chain Proteins 0.000 claims description 24
- 102100034922 T-cell surface glycoprotein CD8 alpha chain Human genes 0.000 claims description 24
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 claims description 24
- 101150076800 B2M gene Proteins 0.000 claims description 22
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 claims description 20
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 19
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 19
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 19
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 claims description 17
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 claims description 16
- 230000020382 suppression by virus of host antigen processing and presentation of peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 claims description 16
- 230000000139 costimulatory effect Effects 0.000 claims description 15
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 15
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 claims description 15
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 15
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 14
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 claims description 14
- 108010092262 T-Cell Antigen Receptors Proteins 0.000 claims description 14
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 claims description 13
- 102100029360 Hematopoietic cell signal transducer Human genes 0.000 claims description 12
- 101000990188 Homo sapiens Hematopoietic cell signal transducer Proteins 0.000 claims description 12
- 101000914514 Homo sapiens T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Proteins 0.000 claims description 12
- 108091027967 Small hairpin RNA Proteins 0.000 claims description 12
- 102100027213 T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Human genes 0.000 claims description 12
- 230000002222 downregulating effect Effects 0.000 claims description 12
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 claims description 12
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 claims description 12
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 claims description 11
- 238000012226 gene silencing method Methods 0.000 claims description 11
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 claims description 10
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 claims description 10
- 102100027207 CD27 antigen Human genes 0.000 claims description 10
- 101000914511 Homo sapiens CD27 antigen Proteins 0.000 claims description 10
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 claims description 10
- 208000007097 Urinary Bladder Neoplasms Diseases 0.000 claims description 10
- 208000005017 glioblastoma Diseases 0.000 claims description 10
- 230000004044 response Effects 0.000 claims description 10
- 102100029822 B- and T-lymphocyte attenuator Human genes 0.000 claims description 9
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 claims description 9
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 claims description 9
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 claims description 9
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 claims description 9
- 206010014733 Endometrial cancer Diseases 0.000 claims description 9
- 206010014759 Endometrial neoplasm Diseases 0.000 claims description 9
- 208000000461 Esophageal Neoplasms Diseases 0.000 claims description 9
- 102100034459 Hepatitis A virus cellular receptor 1 Human genes 0.000 claims description 9
- 101000864344 Homo sapiens B- and T-lymphocyte attenuator Proteins 0.000 claims description 9
- 101001068136 Homo sapiens Hepatitis A virus cellular receptor 1 Proteins 0.000 claims description 9
- 101001109503 Homo sapiens NKG2-C type II integral membrane protein Proteins 0.000 claims description 9
- 101001109501 Homo sapiens NKG2-D type II integral membrane protein Proteins 0.000 claims description 9
- 101000831286 Homo sapiens Protein timeless homolog Proteins 0.000 claims description 9
- 101000752245 Homo sapiens Rho guanine nucleotide exchange factor 5 Proteins 0.000 claims description 9
- 101000914496 Homo sapiens T-cell antigen CD7 Proteins 0.000 claims description 9
- 101000801234 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 18 Proteins 0.000 claims description 9
- 101000851376 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 8 Proteins 0.000 claims description 9
- 208000008839 Kidney Neoplasms Diseases 0.000 claims description 9
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 claims description 9
- 102100022683 NKG2-C type II integral membrane protein Human genes 0.000 claims description 9
- 102100022680 NKG2-D type II integral membrane protein Human genes 0.000 claims description 9
- 206010030155 Oesophageal carcinoma Diseases 0.000 claims description 9
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 claims description 9
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 claims description 9
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 claims description 9
- 101710089372 Programmed cell death protein 1 Proteins 0.000 claims description 9
- 102100040678 Programmed cell death protein 1 Human genes 0.000 claims description 9
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 claims description 9
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 claims description 9
- 206010038389 Renal cancer Diseases 0.000 claims description 9
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 claims description 9
- 108010074687 Signaling Lymphocytic Activation Molecule Family Member 1 Proteins 0.000 claims description 9
- 102100029215 Signaling lymphocytic activation molecule Human genes 0.000 claims description 9
- 102100027208 T-cell antigen CD7 Human genes 0.000 claims description 9
- 208000024770 Thyroid neoplasm Diseases 0.000 claims description 9
- 102100033728 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 18 Human genes 0.000 claims description 9
- 102100036857 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 8 Human genes 0.000 claims description 9
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 claims description 9
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 claims description 9
- 201000004101 esophageal cancer Diseases 0.000 claims description 9
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 claims description 9
- 201000010536 head and neck cancer Diseases 0.000 claims description 9
- 208000014829 head and neck neoplasm Diseases 0.000 claims description 9
- 201000010982 kidney cancer Diseases 0.000 claims description 9
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 claims description 9
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 claims description 9
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 claims description 9
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 claims description 9
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 claims description 9
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 claims description 9
- 201000002510 thyroid cancer Diseases 0.000 claims description 9
- 206010044412 transitional cell carcinoma Diseases 0.000 claims description 9
- 201000005112 urinary bladder cancer Diseases 0.000 claims description 9
- 101100314454 Caenorhabditis elegans tra-1 gene Proteins 0.000 claims description 8
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 8
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 claims description 8
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 8
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 8
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 claims description 7
- 101000851370 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 9 Proteins 0.000 claims description 7
- 102100036856 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 9 Human genes 0.000 claims description 7
- 102100038077 CD226 antigen Human genes 0.000 claims description 6
- 108010029697 CD40 Ligand Proteins 0.000 claims description 6
- 102100032937 CD40 ligand Human genes 0.000 claims description 6
- 101000884298 Homo sapiens CD226 antigen Proteins 0.000 claims description 6
- 101000884270 Homo sapiens Natural killer cell receptor 2B4 Proteins 0.000 claims description 6
- 101000934346 Homo sapiens T-cell surface antigen CD2 Proteins 0.000 claims description 6
- 101000716102 Homo sapiens T-cell surface glycoprotein CD4 Proteins 0.000 claims description 6
- 101000809875 Homo sapiens TYRO protein tyrosine kinase-binding protein Proteins 0.000 claims description 6
- 101000679903 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 25 Proteins 0.000 claims description 6
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 claims description 6
- 108010061593 Member 14 Tumor Necrosis Factor Receptors Proteins 0.000 claims description 6
- 102100038082 Natural killer cell receptor 2B4 Human genes 0.000 claims description 6
- 102100025237 T-cell surface antigen CD2 Human genes 0.000 claims description 6
- 102100036011 T-cell surface glycoprotein CD4 Human genes 0.000 claims description 6
- 102100038717 TYRO protein tyrosine kinase-binding protein Human genes 0.000 claims description 6
- 102100028785 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 14 Human genes 0.000 claims description 6
- 102100022203 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 25 Human genes 0.000 claims description 6
- 102100022153 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 4 Human genes 0.000 claims description 6
- 101710165473 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 4 Proteins 0.000 claims description 6
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 claims description 6
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 claims description 6
- 208000019691 hematopoietic and lymphoid cell neoplasm Diseases 0.000 claims description 6
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 claims description 6
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 claims description 6
- 210000000581 natural killer T-cell Anatomy 0.000 claims description 6
- 239000002924 silencing RNA Substances 0.000 claims description 6
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 claims description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 5
- 238000011129 allogeneic cell therapy Methods 0.000 claims description 4
- 102100038080 B-cell receptor CD22 Human genes 0.000 claims description 3
- 101500007118 Bovine leukemia virus Transmembrane protein Proteins 0.000 claims description 3
- 102100038078 CD276 antigen Human genes 0.000 claims description 3
- 101710185679 CD276 antigen Proteins 0.000 claims description 3
- 101150013553 CD40 gene Proteins 0.000 claims description 3
- 102100037904 CD9 antigen Human genes 0.000 claims description 3
- 108010021064 CTLA-4 Antigen Proteins 0.000 claims description 3
- 229940045513 CTLA4 antagonist Drugs 0.000 claims description 3
- 102100039498 Cytotoxic T-lymphocyte protein 4 Human genes 0.000 claims description 3
- 102100022132 High affinity immunoglobulin epsilon receptor subunit gamma Human genes 0.000 claims description 3
- 108091010847 High affinity immunoglobulin epsilon receptor subunit gamma Proteins 0.000 claims description 3
- 102100026122 High affinity immunoglobulin gamma Fc receptor I Human genes 0.000 claims description 3
- 101000884305 Homo sapiens B-cell receptor CD22 Proteins 0.000 claims description 3
- 101000738354 Homo sapiens CD9 antigen Proteins 0.000 claims description 3
- 101000913074 Homo sapiens High affinity immunoglobulin gamma Fc receptor I Proteins 0.000 claims description 3
- 101001050318 Homo sapiens Junctional adhesion molecule-like Proteins 0.000 claims description 3
- 101000777628 Homo sapiens Leukocyte antigen CD37 Proteins 0.000 claims description 3
- 101000917858 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-A Proteins 0.000 claims description 3
- 101000917839 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-B Proteins 0.000 claims description 3
- 101000934338 Homo sapiens Myeloid cell surface antigen CD33 Proteins 0.000 claims description 3
- 101000738771 Homo sapiens Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Proteins 0.000 claims description 3
- 101000934341 Homo sapiens T-cell surface glycoprotein CD5 Proteins 0.000 claims description 3
- 101000946833 Homo sapiens T-cell surface glycoprotein CD8 beta chain Proteins 0.000 claims description 3
- 101000914484 Homo sapiens T-lymphocyte activation antigen CD80 Proteins 0.000 claims description 3
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 claims description 3
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 claims description 3
- 102100025390 Integrin beta-2 Human genes 0.000 claims description 3
- 108010064593 Intercellular Adhesion Molecule-1 Proteins 0.000 claims description 3
- 102100037877 Intercellular adhesion molecule 1 Human genes 0.000 claims description 3
- 102100023437 Junctional adhesion molecule-like Human genes 0.000 claims description 3
- 102000017578 LAG3 Human genes 0.000 claims description 3
- 101150030213 Lag3 gene Proteins 0.000 claims description 3
- 102100031586 Leukocyte antigen CD37 Human genes 0.000 claims description 3
- 102100029185 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-B Human genes 0.000 claims description 3
- 108010064548 Lymphocyte Function-Associated Antigen-1 Proteins 0.000 claims description 3
- 102000010168 Myeloid Differentiation Factor 88 Human genes 0.000 claims description 3
- 108010077432 Myeloid Differentiation Factor 88 Proteins 0.000 claims description 3
- 102100025243 Myeloid cell surface antigen CD33 Human genes 0.000 claims description 3
- 102100037422 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Human genes 0.000 claims description 3
- 241000713311 Simian immunodeficiency virus Species 0.000 claims description 3
- 102100025244 T-cell surface glycoprotein CD5 Human genes 0.000 claims description 3
- 102100034928 T-cell surface glycoprotein CD8 beta chain Human genes 0.000 claims description 3
- 102100027222 T-lymphocyte activation antigen CD80 Human genes 0.000 claims description 3
- 102100040245 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 5 Human genes 0.000 claims description 3
- 108700010039 chimeric receptor Proteins 0.000 claims description 3
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 abstract description 16
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 abstract description 8
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 abstract description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 2
- 238000003197 gene knockdown Methods 0.000 description 44
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 40
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 31
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 26
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 20
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 20
- 239000000047 product Substances 0.000 description 19
- 102000025171 antigen binding proteins Human genes 0.000 description 18
- 108091000831 antigen binding proteins Proteins 0.000 description 18
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 18
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 18
- 238000007480 sanger sequencing Methods 0.000 description 18
- 108020005004 Guide RNA Proteins 0.000 description 17
- 102000004389 Ribonucleoproteins Human genes 0.000 description 17
- 108010081734 Ribonucleoproteins Proteins 0.000 description 17
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 17
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 17
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 13
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 13
- 230000006870 function Effects 0.000 description 12
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 12
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 12
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 11
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 11
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 11
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 11
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 description 10
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 10
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 10
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 10
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 10
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 10
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 10
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 10
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 10
- 208000009329 Graft vs Host Disease Diseases 0.000 description 9
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 9
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 9
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 9
- 208000024908 graft versus host disease Diseases 0.000 description 9
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 9
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 9
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 9
- NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 1-methylethyl 11-methoxy-3,7,11-trimethyl-2,4-dodecadienoate Chemical compound COC(C)(C)CCCC(C)CC=CC(C)=CC(=O)OC(C)C NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 102100024222 B-lymphocyte antigen CD19 Human genes 0.000 description 8
- 101000980825 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD19 Proteins 0.000 description 8
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 8
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 8
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 7
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 7
- 108010036972 HLA-A11 Antigen Proteins 0.000 description 6
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 6
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 6
- 108091054437 MHC class I family Proteins 0.000 description 6
- 230000008859 change Effects 0.000 description 6
- 238000013461 design Methods 0.000 description 6
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 6
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 6
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 6
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 6
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 6
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 6
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 6
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 6
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 6
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 5
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 5
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 5
- 102000008949 Histocompatibility Antigens Class I Human genes 0.000 description 5
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 5
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 5
- 102000015736 beta 2-Microglobulin Human genes 0.000 description 5
- 108010081355 beta 2-Microglobulin Proteins 0.000 description 5
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 5
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 5
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 5
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 5
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 5
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 5
- 102000054766 genetic haplotypes Human genes 0.000 description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 5
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 5
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 5
- 241000894007 species Species 0.000 description 5
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 5
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 5
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 5
- 238000010453 CRISPR/Cas method Methods 0.000 description 4
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 4
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 4
- 102000043129 MHC class I family Human genes 0.000 description 4
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 4
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 4
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 4
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 4
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 4
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 4
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 4
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 4
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 4
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 4
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 4
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 4
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 4
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 4
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 4
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 3
- RWSOTUBLDIXVET-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen sulfide Chemical compound S RWSOTUBLDIXVET-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102100025137 Early activation antigen CD69 Human genes 0.000 description 3
- 102000006354 HLA-DR Antigens Human genes 0.000 description 3
- 108010058597 HLA-DR Antigens Proteins 0.000 description 3
- 108010088652 Histocompatibility Antigens Class I Proteins 0.000 description 3
- 101000934374 Homo sapiens Early activation antigen CD69 Proteins 0.000 description 3
- 102000003812 Interleukin-15 Human genes 0.000 description 3
- 108090000172 Interleukin-15 Proteins 0.000 description 3
- 102000043131 MHC class II family Human genes 0.000 description 3
- 108091054438 MHC class II family Proteins 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 101100382123 Mus musculus Ciita gene Proteins 0.000 description 3
- 102000000574 RNA-Induced Silencing Complex Human genes 0.000 description 3
- 108010016790 RNA-Induced Silencing Complex Proteins 0.000 description 3
- UDMBCSSLTHHNCD-KQYNXXCUSA-N adenosine 5'-monophosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O UDMBCSSLTHHNCD-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 3
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 3
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 3
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 3
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 3
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 3
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 3
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 3
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 3
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 3
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 3
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 230000031146 intracellular signal transduction Effects 0.000 description 3
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 3
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 3
- 230000032361 posttranscriptional gene silencing Effects 0.000 description 3
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 239000010902 straw Substances 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 3
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 3
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 3
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 3
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 2
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 208000034951 Genetic Translocation Diseases 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100028971 HLA class I histocompatibility antigen, C alpha chain Human genes 0.000 description 2
- 102000012153 HLA-B27 Antigen Human genes 0.000 description 2
- 108010061486 HLA-B27 Antigen Proteins 0.000 description 2
- 108010052199 HLA-C Antigens Proteins 0.000 description 2
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 2
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 description 2
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 2
- 108010025815 Kanamycin Kinase Proteins 0.000 description 2
- 208000031422 Lymphocytic Chronic B-Cell Leukemia Diseases 0.000 description 2
- 208000015914 Non-Hodgkin lymphomas Diseases 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Chemical class 0.000 description 2
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 2
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 2
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 2
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 2
- 102000004022 Protein-Tyrosine Kinases Human genes 0.000 description 2
- 108090000412 Protein-Tyrosine Kinases Proteins 0.000 description 2
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 2
- 108010057163 Ribonuclease III Proteins 0.000 description 2
- 102000003661 Ribonuclease III Human genes 0.000 description 2
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 2
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 2
- 108091081021 Sense strand Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 101710191487 T cell receptor alpha chain constant Proteins 0.000 description 2
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 2
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 2
- 102100023935 Transmembrane glycoprotein NMB Human genes 0.000 description 2
- 206010052779 Transplant rejections Diseases 0.000 description 2
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 2
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 102000005421 acetyltransferase Human genes 0.000 description 2
- 108020002494 acetyltransferase Proteins 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 2
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 2
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 102000006646 aminoglycoside phosphotransferase Human genes 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- IERHLVCPSMICTF-XVFCMESISA-N cytidine 5'-monophosphate Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(O)=O)O1 IERHLVCPSMICTF-XVFCMESISA-N 0.000 description 2
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 2
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 2
- 102000052116 epidermal growth factor receptor activity proteins Human genes 0.000 description 2
- 108700015053 epidermal growth factor receptor activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 2
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 2
- RQFCJASXJCIDSX-UUOKFMHZSA-N guanosine 5'-monophosphate Chemical group C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O RQFCJASXJCIDSX-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 2
- 238000011134 hematopoietic stem cell transplantation Methods 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- PGHMRUGBZOYCAA-UHFFFAOYSA-N ionomycin Natural products O1C(CC(O)C(C)C(O)C(C)C=CCC(C)CC(C)C(O)=CC(=O)C(C)CC(C)CC(CCC(O)=O)C)CCC1(C)C1OC(C)(C(C)O)CC1 PGHMRUGBZOYCAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PGHMRUGBZOYCAA-ADZNBVRBSA-N ionomycin Chemical compound O1[C@H](C[C@H](O)[C@H](C)[C@H](O)[C@H](C)/C=C/C[C@@H](C)C[C@@H](C)C(/O)=C/C(=O)[C@@H](C)C[C@@H](C)C[C@@H](CCC(O)=O)C)CC[C@@]1(C)[C@@H]1O[C@](C)([C@@H](C)O)CC1 PGHMRUGBZOYCAA-ADZNBVRBSA-N 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 2
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 2
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 2
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 2
- 210000004901 leucine-rich repeat Anatomy 0.000 description 2
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 2
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000003071 memory t lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 2
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 2
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 2
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 2
- 230000001502 supplementing effect Effects 0.000 description 2
- MGSRCZKZVOBKFT-UHFFFAOYSA-N thymol Chemical group CC(C)C1=CC=C(C)C=C1O MGSRCZKZVOBKFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012033 transcriptional gene silencing Methods 0.000 description 2
- 108091007466 transmembrane glycoproteins Proteins 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 2
- 238000012070 whole genome sequencing analysis Methods 0.000 description 2
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 2
- 101150028074 2 gene Proteins 0.000 description 1
- BGFTWECWAICPDG-UHFFFAOYSA-N 2-[bis(4-chlorophenyl)methyl]-4-n-[3-[bis(4-chlorophenyl)methyl]-4-(dimethylamino)phenyl]-1-n,1-n-dimethylbenzene-1,4-diamine Chemical compound C1=C(C(C=2C=CC(Cl)=CC=2)C=2C=CC(Cl)=CC=2)C(N(C)C)=CC=C1NC(C=1)=CC=C(N(C)C)C=1C(C=1C=CC(Cl)=CC=1)C1=CC=C(Cl)C=C1 BGFTWECWAICPDG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150094101 3.5 gene Proteins 0.000 description 1
- GOZMBJCYMQQACI-UHFFFAOYSA-N 6,7-dimethyl-3-[[methyl-[2-[methyl-[[1-[3-(trifluoromethyl)phenyl]indol-3-yl]methyl]amino]ethyl]amino]methyl]chromen-4-one;dihydrochloride Chemical compound Cl.Cl.C=1OC2=CC(C)=C(C)C=C2C(=O)C=1CN(C)CCN(C)CC(C1=CC=CC=C11)=CN1C1=CC=CC(C(F)(F)F)=C1 GOZMBJCYMQQACI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000024893 Acute lymphoblastic leukemia Diseases 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000006942 B-Cell Maturation Antigen Human genes 0.000 description 1
- 108010008014 B-Cell Maturation Antigen Proteins 0.000 description 1
- 102100022005 B-lymphocyte antigen CD20 Human genes 0.000 description 1
- 238000011357 CAR T-cell therapy Methods 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 101100007328 Cocos nucifera COS-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- 229930183912 Cytidylic acid Natural products 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 1
- 230000007067 DNA methylation Effects 0.000 description 1
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 1
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 description 1
- 239000004375 Dextrin Substances 0.000 description 1
- 229920001353 Dextrin Polymers 0.000 description 1
- 206010061819 Disease recurrence Diseases 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 1
- 102100023387 Endoribonuclease Dicer Human genes 0.000 description 1
- 101100005249 Escherichia coli (strain K12) ygcB gene Proteins 0.000 description 1
- 102000047351 Exportin-5 Human genes 0.000 description 1
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 1
- 102000018638 GTP binding domains Human genes 0.000 description 1
- 108050007795 GTP binding domains Proteins 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 108010013476 HLA-A24 Antigen Proteins 0.000 description 1
- 101150000578 HLA-B gene Proteins 0.000 description 1
- 108010034791 Heterochromatin Proteins 0.000 description 1
- 108010027412 Histocompatibility Antigens Class II Proteins 0.000 description 1
- 102000018713 Histocompatibility Antigens Class II Human genes 0.000 description 1
- 101000897405 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD20 Proteins 0.000 description 1
- 101000907904 Homo sapiens Endoribonuclease Dicer Proteins 0.000 description 1
- 101000847058 Homo sapiens Exportin-5 Proteins 0.000 description 1
- 101000878605 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin epsilon Fc receptor Proteins 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 102100038007 Low affinity immunoglobulin epsilon Fc receptor Human genes 0.000 description 1
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 108091092724 Noncoding DNA Proteins 0.000 description 1
- 240000007019 Oxalis corniculata Species 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N Pyrimidine Chemical compound C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000014450 RNA Polymerase III Human genes 0.000 description 1
- 108010078067 RNA Polymerase III Proteins 0.000 description 1
- 238000010357 RNA editing Methods 0.000 description 1
- 238000010802 RNA extraction kit Methods 0.000 description 1
- 230000026279 RNA modification Effects 0.000 description 1
- 108091030071 RNAI Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 230000006044 T cell activation Effects 0.000 description 1
- 101100059152 Thermococcus onnurineus (strain NA1) csm1 gene Proteins 0.000 description 1
- OMOVVBIIQSXZSZ-UHFFFAOYSA-N [6-(4-acetyloxy-5,9a-dimethyl-2,7-dioxo-4,5a,6,9-tetrahydro-3h-pyrano[3,4-b]oxepin-5-yl)-5-formyloxy-3-(furan-3-yl)-3a-methyl-7-methylidene-1a,2,3,4,5,6-hexahydroindeno[1,7a-b]oxiren-4-yl] 2-hydroxy-3-methylpentanoate Chemical compound CC12C(OC(=O)C(O)C(C)CC)C(OC=O)C(C3(C)C(CC(=O)OC4(C)COC(=O)CC43)OC(C)=O)C(=C)C32OC3CC1C=1C=COC=1 OMOVVBIIQSXZSZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 239000003070 absorption delaying agent Substances 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 208000009956 adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000000172 allergic effect Effects 0.000 description 1
- 108010087408 alpha-beta T-Cell Antigen Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000006707 alpha-beta T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000009830 antibody antigen interaction Effects 0.000 description 1
- 229940121375 antifungal agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003429 antifungal agent Substances 0.000 description 1
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 208000010668 atopic eczema Diseases 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000007664 blowing Methods 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 101150058049 car gene Proteins 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 101150090505 cas10 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150055191 cas3 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150038500 cas9 gene Proteins 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 1
- 230000033077 cellular process Effects 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 230000019113 chromatin silencing Effects 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- IERHLVCPSMICTF-UHFFFAOYSA-N cytidine monophosphate Natural products O=C1N=C(N)C=CN1C1C(O)C(O)C(COP(O)(O)=O)O1 IERHLVCPSMICTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003568 cytokine secretion assay Methods 0.000 description 1
- 238000002784 cytotoxicity assay Methods 0.000 description 1
- 231100000263 cytotoxicity test Toxicity 0.000 description 1
- GYOZYWVXFNDGLU-XLPZGREQSA-N dTMP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 GYOZYWVXFNDGLU-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 235000019425 dextrin Nutrition 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 239000002612 dispersion medium Substances 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 230000002357 endometrial effect Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000003236 esophagogastric junction Anatomy 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 1
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940093915 gynecological organic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 201000005787 hematologic cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000024200 hematopoietic and lymphoid system neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000004458 heterochromatin Anatomy 0.000 description 1
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 description 1
- 210000003630 histaminocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 102000051957 human ERBB2 Human genes 0.000 description 1
- 210000003917 human chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 229920001477 hydrophilic polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 230000005917 in vivo anti-tumor Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 230000007794 irritation Effects 0.000 description 1
- 239000007951 isotonicity adjuster Substances 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 230000021633 leukocyte mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108091027963 non-coding RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000042567 non-coding RNA Human genes 0.000 description 1
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009437 off-target effect Effects 0.000 description 1
- 230000005868 ontogenesis Effects 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 201000008968 osteosarcoma Diseases 0.000 description 1
- 230000002611 ovarian Effects 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 210000001539 phagocyte Anatomy 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 210000004180 plasmocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229920001983 poloxamer Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000029279 positive regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 230000001124 posttranscriptional effect Effects 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 210000004986 primary T-cell Anatomy 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000000651 prodrug Substances 0.000 description 1
- 229940002612 prodrug Drugs 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000751 protein extraction Methods 0.000 description 1
- 150000003212 purines Chemical class 0.000 description 1
- 239000002510 pyrogen Substances 0.000 description 1
- 230000008844 regulatory mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000009877 rendering Methods 0.000 description 1
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000000630 rising effect Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical group 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000000638 solvent extraction Methods 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 150000005846 sugar alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000003151 transfection method Methods 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 230000009278 visceral effect Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004804 winding Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/463—Cellular immunotherapy characterised by recombinant expression
- A61K39/4631—Chimeric Antigen Receptors [CAR]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
- A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
- A61K39/4643—Vertebrate antigens
- A61K39/4644—Cancer antigens
- A61K39/464402—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- A61K39/464403—Receptors for growth factors
- A61K39/464406—Her-2/neu/ErbB2, Her-3/ErbB3 or Her 4/ ErbB4
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
- A61K39/4643—Vertebrate antigens
- A61K39/4644—Cancer antigens
- A61K39/464402—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- A61K39/464411—Immunoglobulin superfamily
- A61K39/464412—CD19 or B4
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
- C12N15/867—Retroviral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
- A61K2239/31—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterized by the route of administration
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
- A61K2239/38—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the dose, timing or administration schedule
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
- A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the cancer treated
- A61K2239/49—Breast
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Oncology (AREA)
- Virology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
一种靶向HER2的通用型CAR‑T细胞及其制备方法,所述通用型CAR‑T细胞包含嵌合抗原受体,所述嵌合抗原受体包含靶向部分,所述靶向部分包含HCDR3,所述HCDR3包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。所述通用型CAR‑T细胞在识别肿瘤抗原的同时,还能降低异体CAR‑T治疗引起的免疫排斥反应,延长细胞存活时间,提高抗肿瘤效果。
Description
本申请涉及生物医药领域,具体的涉及一种靶向HER2的通用型CAR-T细胞及其制备方法和应用。
随着肿瘤免疫理论的发展与技术的进步,细胞免疫治疗肿瘤吸引越来越多的关注。CAR-T细胞技术是一种基于细胞的治疗手段,已经在肿瘤免疫治疗尤其是血液肿瘤的治疗中产生极佳的效果。CAR-T免疫治疗使用基因改造的T细胞,可特异性地识别并杀死表达特定抗原的肿瘤细胞,而不受MHC限制性影响。CAR-T免疫疗法在各种B细胞恶性肿瘤的治疗中取得良好效果,如靶向CD19的CAR-T细胞治疗急性淋巴白血病(ALL),慢性淋巴白血病(CLL)和非霍奇金淋巴瘤(NHL)。同时,CAR-T细胞对多种类型肿瘤的临床应用正在进行中,并显示出令人鼓舞的结果。
HER2受体是一种具有酪氨酸激酶活性的跨膜糖蛋白,属于EGFR受体家族,这些受体对控制上皮细胞生长和分化是必需的。重要的是,HER2蛋白的过表达与一些腺癌相关,如乳腺、卵巢、子宫内膜、宫颈以及肺、食管、胃食管连接部、胃和膀胱癌。HER2蛋白与增长的疾病复发强相关,而且是生存的不良预后因子。因此,HER2是多种癌症治疗的重要预后靶标。
过继回输CAR-T的免疫细胞疗法是一种新颖且有效的治疗肿瘤的方法,已应用于多项临床试验。CAR-T可以特异性识别目标分子HER2并杀死表达HER2的肿瘤细胞,早期临床试验中,靶向HER2的CAR-T细胞成功治疗胶质母细胞瘤和骨肉瘤。然而,病人自体T细胞在体外扩增困难或功能降低,导致制备的CAR-T细胞产品数量不足或质量差。通用型CAR-T细胞是从健康供体分离获得T细胞,制备的CAR-T细胞不但扩增效率高、活力强,而且感染阳性率也有提高,但是通用型CAR-T也面临着移植物抗宿主疾病(GVHD)和免疫排斥的问题。
因此,亟需靶向HER2的通用型CAR-T细胞,在识别肿瘤细胞表面抗原的同时,还能降低异体CAR-T治疗引起的免疫排斥反应,延长细胞存活时间,提高抗肿瘤效果。
发明内容
本发明的目的在于制备一种靶向HER2的通用型CAR-T细胞,识别肿瘤细胞表面抗原的 同时,敲除细胞表达的TCR和HLA-A基因,从而降低异体CAR-T治疗引起的免疫排斥反应,延长细胞存活时间,提高抗肿瘤效果。
本申请的目的之一在于提供一种靶向HER2的嵌合抗原受体。具体如下:以抗HER2 scFv为靶向部分,通过CD8分子铰链区和跨膜区与胞内信号转导结构域相连接,胞内信号转导结构域由4-1BB共刺激信号与CD3ζ胞内信号域组成。
本申请的另一个目的在于提供一种安全性更高的UCAR-T细胞。首先供者来源基于人群中的HLA-B纯合子,患者HLA-B其中一个等位基因和供者纯合子一致即可,来源于这些供者的细胞能覆盖高比例的患者人群。降低HLA-B引起的排异反应。HLA-B主要选择人群中频率较高的B*40纯合子,B*15纯合子,B*46纯合子,B*13纯合子,B*51纯合子,B*58纯合子,B*07纯合子,B*35纯合子,B*44纯合子,B*52纯合子,B*57纯合子,B*54纯合子,B*55纯合子。敲除策略针对TRAC和排异高度相关的HLA-A分子进行敲除,而保留了其他HLA-I类分子,既减少了异体细胞的排异,也避免了HLA分子完全敲除被NK细胞清除的发生,大大延长了同种异体CAR-T细胞在体内的半衰期。同时降低同种异体细胞治疗引起的GVHD反应。TCR基因选择编码TCRα链的基因TRAC,HLA-A选择人群中频率较高的A*02纯合子,A*11纯合子,A*02/A11杂合子及A*24纯合子。
本申请的另一个目的在于提供一种高效率敲除TCR,HLA-A的基因编辑方法。CRISPR/Cas9基因编辑的转染方法主要有质粒法,mRNA法以及RNP法。RNP法指体外将spcas9核糖核蛋白(RNP)和sgRNA组装成RNP复合物,通过电转将复合物导入细胞中,和其他两种方法比,具有spCas9蛋白降解快,脱靶风险低的优势,并且很大程度上提高了电转效率,从而提高目的基因的编辑效率。采用优化后RNP方法双敲TRAC和HLA-A基因,双敲效率可达90%以上。
本申请的另一个目的在于提供一种靶向HER2通用型CAR-T细胞的制备方法。
在某些实施方式中,所述嵌合抗原受体包含靶向部分,所述靶向部分包含HCDR3,所述HCDR3包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中,所述靶向部分包含HCDR2,所述HCDR2包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中,所述靶向部分包含HCDR1,所述HCDR1包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中,所述靶向部分包含SEQ ID NO:1所示的重链可变区中的HCDR1、HCDR2和HCDR3。
在某些实施方式中,所述靶向部分包含HCDR1、HCDR2、HCDR3,所述HCDR3包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列;所述HCDR2包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列;以及所述HCDR1包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中,所述靶向部分包含H-FR1,所述H-FR1的C末端与所述HCDR1的N末端直接或间接地相连,且所述H-FR1包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中,所述靶向部分包含H-FR2,所述H-FR2位于所述HCDR1与所述HCDR2之间,且所述H-FR2包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中,所述靶向部分包含H-FR3,所述H-FR3位于所述HCDR2与所述HCDR3之间,且所述H-FR3包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中,所述靶向部分包含H-FR4,所述H-FR4的N末端与所述HCDR3的C末端直接或间接地相连,且所述H-FR4包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中,所述靶向部分包含H-FR1,H-FR2,H-FR3和H-FR4,所述H-FR1包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列;所述H-FR2包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列;所述H-FR3包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列;以及所述H-FR4包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中,所述靶向部分包含VH,所述VH包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中,所述嵌合抗原受体包含靶向部分,所述靶向部分包含LCDR3,所述LCDR3包含SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中,所述靶向部分包含LCDR2,所述LCDR2包含SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中,所述靶向部分包含LCDR1,所述LCDR1包含SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中,所述靶向部分包含SEQ ID NO:10所示的轻链可变区中的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在某些实施方式中,所述靶向部分包含LCDR1、LCDR2、LCDR3,所述LCDR3包含SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列;所述LCDR2包含SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列;以及所述LCDR1包含SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中,所述靶向部分包含L-FR1,所述L-FR1的C末端与所述LCDR1的N末端直接或间接地相连,且所述L-FR1包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中,所述靶向部分包含L-FR2,所述L-FR2位于所述LCDR1与所述LCDR2之间,且所述L-FR2包含SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中,所述靶向部分包含L-FR3,所述L-FR3位于所述LCDR2与所述LCDR3之间,且所述L-FR3包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中,所述靶向部分包含L-FR4,所述L-FR4的N末端与所述LCDR3的C末端直接或间接地相连,且所述L-FR4包含SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中,所述靶向部分包含L-FR1,L-FR2,L-FR3和L-FR4,所述L-FR1包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列;所述L-FR2包含SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列;所述L-FR3包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列;以及所述L-FR4包含SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中,所述靶向部分包含VL,所述VL包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中,所述靶向部分包括抗体或抗原结合片段。
在某些实施方式中,所述抗原结合片段选自下组:Fab,Fab’,F(ab)2,Fv片段,F(ab’)2,scFv,di-scFv,VHH和/或dAb。
在某些实施方式中,所述靶向部分包括scFv。
在某些实施方式中,所述scFv靶向HER2。
在某些实施方式中,所述靶向部分包含SEQ ID NO:198-199中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中,所述的嵌合抗原受体包括跨膜域,所述跨膜域包含源自选自下述蛋白的跨膜域或其组合:CD8A、CD8B、CD28、CD3e、CD3ε、4-1BB、CD4、CD27、CD7、PD-1、TRAC、TRBC、CD3ζ、CTLA-4、LAG-3、CD5、ICOS、OX40、NKG2D、2B4、CD244、FcεRIγ、BTLA、CD30、GITR、HVEM、DAP10、CD2、NKG2C、LIGHT、DAP12,CD40L、CD154、TIM1、CD226、DR3、CD45、CD80、CD86、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64和SLAM。
在某些实施方式中,所述的嵌合抗原受体中所述跨膜域包含源自CD8A或CD8B的跨膜域。
在某些实施方式中,所述的嵌合抗原受体中所述跨膜域包含SEQ ID NO:21至SEQ ID NO:69中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中,所述的嵌合抗原受体包括共刺激信号传导结构域,所述共刺激信号传导结构域包含源自选自下述蛋白的共刺激信号传导结构域或其组合:CD28、4-1BB、 CD27、CD2、CD7、CD8A、CD8B、OX40、CD226、DR3、SLAM、CDS、ICAM-1、NKG2D、NKG2C、B7-H3、2B4、FcεRIγ、BTLA、GITR、HVEM、DAP10、DAP12、CD30、CD40、CD40L、TIM1、PD-1、LFA-1、LIGHT、JAML、CD244、CD100、ICOS、CD40和MyD88。
在某些实施方式中,所述的嵌合抗原受体中所述共刺激信号传导结构域包括源自4-1BB的共刺激信号传导结构域。
在某些实施方式中,所述的嵌合抗原受体中所述共刺激信号传导结构域包含SEQ ID NO:70至SEQ ID NO:102中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中,所述的嵌合抗原受体中所述共刺激信号传导结构域的N端与所述跨膜域的C端直接或间接地连接。
在某些实施方式中,所述的嵌合抗原受体包括胞内信号转导结构域,所述胞内信号转导结构域包含源自选自下述蛋白的胞内信号转导结构域或其组合:CD3ζ、CD3δ、CD3γ、CD3ε、CD79a、CD79b、FceRIγ、FceRIβ、FcγRIIa、牛白血病病毒gp30、Epstein-Barr病毒(EBV)LMP2A、猿免疫缺陷病毒PBj14 Nef、DAP10、DAP-12和至少包含一个ITAM的结构域。
在某些实施方式中,所述的嵌合抗原受体中所述胞内信号转导结构域包含源自CD3ζ、CD3δ、CD3γ或CD3ε的胞内信号转导结构域。
在某些实施方式中,所述的嵌合抗原受体中所述胞内信号转导结构域包含SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:103至SEQ ID NO:113中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中,所述的嵌合抗原受体中所述胞内信号转导结构域的N端与所述共刺激信号传导结构域的C端直接或间接地连接。
在某些实施方式中,所述的嵌合抗原受体在靶向部分和跨膜域之间包括铰链区,所述铰链区包含源自选自下述蛋白的铰链区或其组合:CD28、IgG1、IgG4、IgD、4-1BB、CD4、CD27、CD7、CD8、PD-1、ICOS、OX40、NKG2D、NKG2C、FcεRIγ、BTLA、GITR、DAP10、TIM1、SLAM、CD30和LIGHT。
在某些实施方式中,所述铰链区包含源自CD8的铰链区。
在某些实施方式中,所述铰链区包含SEQ ID NO:114至SEQ ID NO:135中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中,所述嵌合抗原受体的非靶向部分包含CD8A的跨膜域、CD8的铰链 区、4-1BB的胞内共刺激信号传导结构域和CD3ζ胞内信号转导结构域。
在某些实施方式中,所述的非靶向部分包含SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中,所述的嵌合抗原受体包含SEQ ID NO:200所示的氨基酸序列。
另一方面,本申请提供了一种或多种分离的核酸分子,其编码所述的嵌合抗原受体。
另一方面,本申请提供了一种或多种载体,其包含所述的分离的核酸分子。
在某些实施方式中,所述的载体包括病毒载体。
在某些实施方式中,所述的载体包括慢病毒载体。
另一方面,本申请提供了一种或多种免疫细胞,其包含和/或表达所述的分离的核酸分子或所述的载体,和/或所述的嵌合抗原受体。
在某些实施方式中,所述的免疫细胞来源于人。
在某些实施方式中,所述的免疫细胞包括T细胞、B细胞、天然杀伤细胞(NK细胞)、巨噬细胞、NKT细胞、γδT细胞、单核细胞、树突状细胞、粒细胞、淋巴细胞、白细胞和/或外周血单个核细胞。
在某些实施方式中,所述的免疫细胞包括T细胞。
在某些实施方式中,所述的免疫细胞包括经修饰的免疫细胞。
在某些实施方式中,所述经修饰的免疫细胞包括降低同种异体细胞治疗引起的免疫排斥反应的细胞。
在某些实施方式中,所述经修饰的免疫细胞中的T细胞抗原受体(TCR)和主要组织相容性复合体(MHCI,MHCII)在T细胞中的功能受到抑制。
在某些实施方式中,所述的免疫细胞中所述修饰包括与免疫排斥相关基因中的一个或多个的表达和/或活性被下调。
在某些实施方式中,其中所述与免疫排斥相关基因选自下组中的一种或多种基因:TRAC、TRBC、HLA-A、HLA-B、B2M和CIITA。
在某些实施方式中,所述的免疫细胞中所述经修饰的免疫细胞与未经修饰的相应细胞相比,TRAC基因和HLA-A基因的表达和/或活性被下调。
在某些实施方式中,所述经修饰的免疫细胞与未经所述修饰的相应细胞相比,CIITA基因的表达和/或活性未被下调。
在某些实施方式中,所述经修饰的免疫细胞与未经所述修饰的相应细胞相比,B2M基因的表达和/或活性未被下调。
在某些实施方式中,所述经修饰的免疫细胞与相应的野生型细胞相比,TRAC基因和 HLA-A基因的表达和/或活性被下调。
在某些实施方式中,所述经修饰的免疫细胞与相应的野生型细胞相比,B2M基因的表达和/或活性未被下调。
在某些实施方式中,所述经修饰的免疫细胞与相应的野生型细胞相比,CIITA基因的表达和/或活性未被下调。
在某些实施方式中,所述基因的表达水平和/或活性被下调包括使编码所述基因的核酸分子的表达和/或活性下调;和/或使所述基因编码的蛋白质产物的表达和/或活性被下调。
在某些实施方式中,所述修饰包括:基因敲除、基因突变和/或基因沉默。
在某些实施方式中,所述修饰包括向所述免疫细胞施用一种或多种选自下组的物质:反义RNA、siRNA、shRNA和sgRNA。
在某些实施方式中,所述修饰还包括向所述免疫细胞施用靶向所述TRAC基因外显子部分的sgRNA。
在某些实施方式中,所述靶向所述TRAC基因外显子部分的sgRNA包含SEQ ID NO:138至SEQ ID NO:152中任一项所示的核苷酸序列。
在某些实施方式中,所述修饰包括向所述免疫细胞施用靶向所述HLA-A基因外显子部分的sgRNA。
在某些实施方式中,所述靶向所述HLA-A基因外显子部分的sgRNA包含SEQ ID NO:153至SEQ ID NO:193中任一项所示的核苷酸序列。
在某些实施方式中,所述修饰还包括向所述细胞施用Cas酶。
在某些实施方式中,Cas酶包括Cas9蛋白。
在某些实施方式中,其中所述修饰包括向所述细胞施用反义RNA,所述反义RNA包含SEQ ID NO:194至SEQ ID NO:197中任一项所示的核苷酸序列。
在某些实施方式中,所述免疫细胞为HLA-B纯合子细胞。
在某些实施方式中,所述HLA-B纯合子包括HLA-B*40纯合子,HLA-B*15纯合子,HLA-B*46纯合子,HLA-B*13纯合子,HLA-B*51纯合子,HLA-B*58纯合子,HLA-B*07纯合子,HLA-B*35纯合子,HLA-B*44纯合子,HLA-B*52纯合子,HLA-B*57纯合子,HLA-B*54纯合子或HLA-B*55纯合子。
在某些实施方式中,所述免疫细胞为HLA-A纯合子或杂合子细胞。
在某些实施方式中,所述HLA-A纯合子或杂合子包括HLA-A*02纯合子,HLA-A*11纯合子,HLA-A*02/A*11杂合子或HLA-A*24纯合子。
另一方面,本申请提供了一种制备免疫细胞的方法,其包括向免疫细胞中引入所述的核酸分子和/或所述的载体。
在某些实施方式中,所述的方法还包括:在向免疫效应细胞中引入所述的核酸分子和/或所述的载体之前/之后,修饰所述免疫细胞,所述修饰包括与免疫排斥相关基因中的一个或多个的表达和/或活性被下调。
在某些实施方式中,所述与免疫排斥相关基因选自下组中的一种或多种基因:TRAC、TRBC、HLA-A、HLA-B、B2M和CIITA。
在某些实施方式中,在所述的方法中,与未经所述修饰的免疫细胞相比,使所述免疫细胞中TRAC基因和HLA-A基因的表达和/或活性下调。
在某些实施方式中,在所述的方法中,与未经所述修饰的免疫细胞相比,所述免疫细胞中的CIITA基因的表达和/或活性未被下调。
在某些实施方式中,在所述的方法中,与未经所述修饰的免疫细胞相比,所述免疫细胞中的B2M基因的表达和/或活性未被下调。
在某些实施方式中,在所述的方法中,与野生型细胞相比,使所述免疫细胞中的TRAC基因和HLA-A基因的表达和/或活性被下调。
在某些实施方式中,在所述的方法中,与野生型细胞相比,所述免疫细胞中的CIITA基因的表达和/或活性未被下调。
在某些实施方式中,在所述的方法中,与野生型细胞相比,所述免疫细胞中的B2M基因的表达和/或活性未被下调。
在某些实施方式中,所述的方法中所述基因的表达水平和/或活性被下调包括使编码所述基因的核酸分子的表达和/或活性下调;和/或使所述基因编码的蛋白质产物的表达和/或活性被下调。
在某些实施方式中,所述的方法中所述修饰包括:基因敲除、基因突变和/或基因沉默。
在某些实施方式中,所述的方法中所述修饰包括向所述免疫细胞施用一种或多种选自下组的物质:反义RNA、siRNA、shRNA和sgRNA。
在某些实施方式中,所述的方法中所述修饰包括向所述免疫细胞施用靶向所述TRAC基因外显子部分的sgRNA。
在某些实施方式中,所述的方法中所述靶向所述TRAC基因外显子部分的sgRNA包含SEQ ID NO:138至SEQ ID NO:152中任一项所示的核苷酸序列。
在某些实施方式中,所述的方法中所述修饰包括向所述免疫细胞施用靶向所述HLA-A 基因外显子部分的sgRNA。
在某些实施方式中,所述的方法中所述靶向所述HLA-A基因外显子部分的sgRNA包含SEQ ID NO:153至SEQ ID NO:193中任一项所示的核苷酸序列。
在某些实施方式中,所述的方法中所述修饰还包括向所述细胞施用Cas酶。
在某些实施方式中,所述的方法中Cas酶包括Cas9蛋白。
在某些实施方式中,所述的方法中所述修饰包括向所述细胞施用反义RNA,所述反义RNA包含SEQ ID NO:194至SEQ ID NO:197中任一项所示的核苷酸序列。
在某些实施方式中,所述的方法中所述免疫细胞来源于人。
在某些实施方式中,所述的方法中所述免疫效应细胞包括T细胞、B细胞、天然杀伤细胞(NK细胞)、巨噬细胞、NKT细胞、γδT细胞、单核细胞、树突状细胞、粒细胞、淋巴细胞、白细胞和/或外周血单个核细胞。
在某些实施方式中,所述的方法中所述免疫细胞包括T细胞。
在某些实施方式中,所述的方法中所述免疫细胞为HLA-B纯合子细胞。
在某些实施方式中,所述的方法中所述HLA-B纯合子包括HLA-B*40纯合子,HLA-B*15纯合子,HLA-B*46纯合子,HLA-B*13纯合子,HLA-B*51纯合子,HLA-B*58纯合子,HLA-B*07纯合子,HLA-B*35纯合子,HLA-B*44纯合子,HLA-B*52纯合子,HLA-B*57纯合子,HLA-B*54纯合子或HLA-B*55纯合子。
在某些实施方式中,所述的方法中所述免疫细胞为HLA-A纯合子或杂合子细胞。
在某些实施方式中,所述的方法中所述HLA-A纯合子或杂合子包括HLA-A*02纯合子,HLA-A*11纯合子,HLA-A*02/A*11杂合子或HLA-A*24纯合子。
另一方面,本申请提供了所述的嵌合抗原受体,所述的分离的核酸分子,所述的载体,和/或所述的免疫细胞在制备CAR-T细胞中的应用。
另一方面,本申请提供了一种或多种药物组合物,其包含所述的嵌合抗原受体,所述的分离的核酸分子,所述的载体,和/或所述的免疫细胞,以及任选地药学上可接受的载剂。
另一方面,本申请提供了一种或多种所述的抗原嵌合受体,所述的分离的核酸分子,所述的载体,所述的免疫细胞,和/或所述的药物组合物,其用于治疗与HER2的表达相关的疾病或病症。
在某些实施方式中,所述与HER2的表达相关的疾病或病症包括与HER2的表达上调相关的疾病或病症。
在某些实施方式中,所述与HER2的表达相关的疾病或病症包括肿瘤。
在某些实施方式中,所述肿瘤包括HER2阳性的肿瘤。
在某些实施方式中,所述肿瘤包括实体瘤。
在某些实施方式中,所述肿瘤包括血液瘤。
在某些实施方式中,所述肿瘤包括乳腺癌、胃癌、卵巢癌、宫颈癌、尿路上皮癌、食管癌、膀胱癌、结直肠癌、子宫内膜癌、肾癌、肺癌、胰腺癌、头颈癌、肉瘤、胶质母细胞瘤、前列腺癌和/或甲状腺癌。
另一方面,本申请提供了所述的嵌合抗原受体,所述的分离的核酸分子,所述的载体,所述的免疫细胞,和/或所述的药物组合物在制备药物中的用途,所述药物用于治疗与HER2的表达相关的疾病或病症。
在某些实施方式中,所述与HER2的表达相关的疾病或病症包括与HER2的表达上调相关的疾病或病症。
在某些实施方式中,所述与HER2的表达相关的疾病或病症包括肿瘤。
在某些实施方式中,所述肿瘤包括HER2阳性的肿瘤。
在某些实施方式中,所述肿瘤包括实体瘤。
在某些实施方式中,所述肿瘤包括血液瘤。
在某些实施方式中,所述肿瘤包括乳腺癌、胃癌、卵巢癌、宫颈癌、尿路上皮癌、食管癌、膀胱癌、结直肠癌、子宫内膜癌、肾癌、肺癌、胰腺癌、头颈癌、肉瘤、胶质母细胞瘤、前列腺癌和/或甲状腺癌。
另一方面,本申请提供了一种预防和/或治疗与HER2的表达相关的疾病或病症的方法,其包括向有需要的受试者施用有效量的所述的嵌合抗原受体,所述的分离的核酸分子,所述的载体,所述的免疫细胞,和/或所述的药物组合物。
在某些实施方式中,所述与HER2的表达相关的疾病或病症包括与HER2的表达上调相关的疾病或病症。
在某些实施方式中,所述与HER2的表达相关的疾病或病症包括肿瘤。
在某些实施方式中,所述肿瘤包括HER2阳性的肿瘤。
在某些实施方式中,所述肿瘤包括实体瘤。
在某些实施方式中,所述肿瘤包括血液瘤。
在某些实施方式中,所述肿瘤包括乳腺癌、胃癌、卵巢癌、宫颈癌、尿路上皮癌、食管癌、膀胱癌、结直肠癌、子宫内膜癌、肾癌、肺癌、胰腺癌、头颈癌、肉瘤、胶质母细胞瘤、前列腺癌和/或甲状腺癌。
本申请所涉及的发明的具体特征如所附权利要求书所显示。通过参考下文中详细描述的示例性实施方式和附图能够更好地理解本申请所涉及发明的特点和优势。对附图简要说明如下:
图1显示的是本申请所述示例性的anti-HER2 CAR基因慢病毒表达载体。
图2显示的是本申请所述anti-HER2 UCAR-T细胞的构建策略。
图3A-3D显示的是本申请所述anti-HER2 UCAR-T细胞表型检测结果(敲除效率,转染效率,扩增倍数,记忆T细胞比例)。
图4显示的是本申请所述anti-HER2 UCAR-T细胞对靶细胞的杀伤结果。
图5A-5C显示的是本申请所述anti-HER2 UCAR-T细胞与靶细胞共培养细胞因子分泌检测结果。
图6显示的是本申请所述显示的是本申请所述anti-HER2 UCAR-T细胞体内抗肿瘤效果。
图7显示的是本申请所述anti-HER2 UCAR-T细胞体内半衰期检测结果。
图8A-8B显示的是本申请所述anti-HER2 UCAR-T细胞体内排异反应结果。
图9显示的是本申请所述靶向anti-HER2 UCAR-T细胞脱靶分析。
图10显示的是本申请所述靶向anti-HER2 UCAR-T细胞染色体易位分析。
图11显示的是本申请所述靶向anti-HER2 UCAR-T细胞核型分析。
图12显示的是本申请所述靶向anti-HER2 UCAR-T细胞Cas9残留分析。
图13显示的是本申请中TRAC基因在Sg9RNA编辑后Sanger测序的结果。
图14显示的是本申请中TRAC基因在Sg9RNA编辑后TA克隆检测的结果。
图15显示的是本申请中TRAC基因在Sg9RNA编辑后流式细胞检测的结果。
图16显示的是本申请中HLA-A02基因在Sg2RNA编辑后Sanger测序的结果。
图17显示的是本申请中HLA-A02基因在Sg5RNA编辑后Sanger测序的结果。
图18显示的是本申请中HLA-A11基因在Sg21RNA编辑后Sanger测序的结果。
图19显示的是本申请中HLA-A11基因在Rsg2RNA编辑后Sanger测序的结果。
图20A-20B显示的是本申请的经修饰的免疫效应细胞中同时敲除HLA-A02和TRAC的结果。
图21A-21B显示的是本申请的经修饰的免疫效应细胞中HLA-A02和TRAC的蛋白水平。
图22显示的是本申请的经修饰的免疫效应细胞中TRAC、HLA-A、B2M和CIITA的mRNA水平。
图23A-23B显示的是本申请的经修饰的免疫效应细胞中B2M和CIITA的蛋白水平。
图24A-24D显示的是本申请的经修饰的免疫效应细胞中TRAC、HLA-A、B2M和CIITA的蛋白水平。
图25A-25B显示的是本申请的经修饰的免疫效应细胞中TRAC和HLA-A mRNA水平的敲除情况。
图26A-26B显示的是本申请的经修饰的免疫效应细胞中CD69和CD137的蛋白水平。
图27显示的是本申请的经修饰的免疫效应细胞与NK细胞共培养的情况。
图28显示的是本申请的经修饰的免疫效应细胞表达IFN-γ的水平。
图29A-29D显示的是本申请的经修饰的免疫效应细胞中TRAC、HLA-A、B2M和CIITA的蛋白水平。
图30显示的是本申请的经修饰的免疫效应细胞对CAR的感染效率。
图31显示的是本申请的经修饰的免疫效应细胞的扩增倍数。
图32显示的是本申请的经修饰的免疫效应细胞对CD19阳性靶细胞的杀伤效果。
图33显示的是施用本申请的经修饰的免疫效应细胞的给药方案。
图34显示的是本申请的经修饰的免疫效应细胞对小鼠体内肿瘤的杀伤效果。
以下由特定的具体实施例说明本申请发明的实施方式,本领域技术人员可由本说明书所公开的内容容易地了解本申请发明的其他优点及效果。
术语定义
在本申请中,术语“嵌合抗原受体”或“CAR”通常是指一组多肽,在最简单的实施方案中通常有两种,其当在免疫效应细胞中时,提供细胞对靶细胞(通常为癌细胞)的特异性,并产生细胞内信号。在一些实施方案中,CAR包含至少一个细胞外抗原结合结构域,跨膜域和胞质信号传导结构域(本文中也称为“胞内信号转导结构域”),其包含衍生自如下所定义的刺激分子和/或共刺激分子的功能性信号传导结构域。在一些实施方案中,该组多肽在相同的多肽链中(例如,包含嵌合融合蛋白)。在一些实施方案中,该组多肽彼此不连续,例如在不同的多肽链中。在一些方面,该组多肽包括二聚化开关,其在二聚化分子的存在下可将多肽彼此偶联,例如可将抗原结合结构域偶联至胞内信号转导结构域。一方面,CAR的刺激分子是与T细胞受体复合物相关的ζ链。在一个方面,细胞质信号传导结构域包含一级信号传导结构域(例如,CD3-ζ的一级信号传导结构域)。在一个方面,细胞质信号传导结构域还包 含一个或多个衍生自如下定义的至少一种共刺激分子的功能性信号传导结构域。一方面,共刺激分子可以选自4-1BB(即4-1BB),CD27,ICOS和/或CD28。一方面,CAR包含嵌合融合蛋白,其可以包含细胞外抗原识别结构域,跨膜域和包含衍生自刺激分子的功能性信号传导结构域的细胞内信号转导结构域。一方面,CAR包含嵌合融合蛋白,其可以包含细胞外抗原识别结构域,跨膜域和细胞内信号转导结构域,细胞内信号转导结构域包含衍生自共刺激分子的功能性信号传导结构域和衍生自刺激分子的功能性信号传导结构域。一方面,CAR包含嵌合融合蛋白,其可以包含细胞外抗原识别结构域,跨膜域和细胞内信号转导结构域,细胞内信号转导结构域包含衍生自一个或多个共刺激分子的功能性信号传导结构域和衍生自刺激分子的功能性信号传导结构域。一方面,CAR包括嵌合融合蛋白,其可以包含细胞外抗原识别结构域,跨膜域和细胞内信号转导结构域,细胞内信号转导结构域包含至少两个衍生自一个或多个共刺激分子的功能性信号传导结构域和衍生自刺激分子的功能性信号传导结构域。在一个方面,CAR包含CAR融合蛋白的氨基末端(N-ter)上任选的前导序列。在一个方面,CAR进一步包含在细胞外抗原识别结构域的N末端的前导序列,其中前导序列任选地在细胞加工过程中从抗原识别结构域(例如scFv)切除,并将CAR定位于细胞膜。
在本申请中,术语“HER2蛋白”通常是指具有酪氨酸激酶活性的跨膜糖蛋白,属于EGFR受体家族。“HER2蛋白”也可以称为ERBB2。人HER2蛋白的氨基酸序列可以见于UniProt/Swiss-Prot登录号P04626。本申请中,所述分离的抗原结合片段可以结合HER2蛋白。本申请中,术语“HER2蛋白”、“HER2抗原”和“HER2-Fc重组蛋白”可以互换使用,并且包括由细胞天然表达的其任何变体或同种型。
在本申请中,术语“互补决定区”(CDR)通常是指在抗原结合片段可变区内的互补性决定区。在本申请中,所述重链可变区存在3个CDRs,所述CDRs对于每个可变区命名为HCDR1、HCDR2和HCDR3。这些CDRs的确切边界已根据不同系统不同地限定。由Kabat(Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1987)和(1991))描述的系统,不仅提供了可应用于抗原结合片段的任何可变区的明确残基编号系统,还提供了限定3个CDRs的精确残基边界。这些CDRs可以被称为Kabat CDRs。Chothia和同事(Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987)以及Chothia等人,Nature 342:877-883(1989))发现尽管在氨基酸序列水平上具有大的多样性,但是Kabat CDRs内的某些亚部分采取几乎相同的肽主链构象。这些亚部分命名为L1、L2和L3或H1、H2和H3,其中“L”和“H”分别指轻链和重链区域。这些区域可以被称为Chothia CDRs,所述Chothia CDRs具有与Kabat CDRs重叠的边界。与Kabat CDRs重叠的限定CDRs的其他边界 已由Padlan(FASEB J.9:133-139(1995))和MacCallum(J Mol Biol 262(5):732-45(1996))描述。另外,其他的CDR边界定义可能不严格地遵循上述系统之一,但仍将与Kabat CDRs重叠,尽管按照特定残基或残基组或甚至整个CDRs并不显著影响抗原结合的预测或实验发现,它们可以缩短或加长。在本申请中,使用的是IMGT编号系统。
在本申请中,术语“FR”通常是指抗体可变结构域的更高度保守的部分,其被称为框架区。例如,天然重链和轻链的可变结构域各自可以包含四个FR区,即在VH中四个(H-FR1,H-FR2,H-FR3和H-FR4),和在VL中四个(L-FR1,L-FR2,L-FR3和L-FR4)。“框架区”通常是指本领域识别的抗体可变区中存在于分歧性更高的(即高变)CDR之间的部分。此类框架区典型地称为框架1至4(FR1、FR2、FR3和FR4)且提供用于在三维空间中呈现六个CDR(三个来自重链且三个来自轻链)的骨架,以形成抗原结合表面。
在本申请中,术语“单链抗体”或“scFv”通常是指包含通过连接体连接的抗体重链可变区(VH)和抗体轻链可变区(VL)的分子。尽管2个结构域VL和VH由分隔的基因编码,可使用重组方法将它们连接,通过合成的接头使它们成为单个蛋白质链,其中VL和VH区配对形成被称为单链Fv(scFv)的单价分子。见,例如Bird等人,Science 242:423-426(1988);和Huston等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85:5879-5883(1988)。当涉及术语“抗体”片段时包括所述单链抗体,通过重组技术或完整抗体的酶促或化学切割可制备所述单链抗体。
在本申请中,术语“同源性”通常可以等同于序列“同一性”。同源序列可以包括可以与主题序列是至少80%、85%、90%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%或99.9%相同的氨基酸序列。通常,同源物将包含与主题氨基酸序列相同的活性位点等。同源性可以根据相似性(即具有相似化学性质/功能的氨基酸残基)来考虑,也可以在序列同一性方面表达同源性。在本申请中,提及的氨基酸序列或核苷酸序列的SEQ ID NO中的任一项具有百分比同一性的序列是指在所提及的SEQ ID NO的整个长度上具有所述百分比同一性的序列。
为了确定序列同一性,可进行序列比对,其可通过本领域技术人员了解的各种方式进行,例如,使用BLAST、BLAST-2、ALIGN、NEEDLE或Megalign(DNASTAR)软件等。本领域技术人员能够确定用于比对的适当参数,包括在所比较的全长序列中实现最优比对所需要的任何算法。
在本申请中,术语“KD”可与“KD”互换使用,通常是指特定的抗体-抗原相互作用的解离平衡常数,单位为M(mol/L)。KD可通过物质AB和其解离得到的物质A和物质B的浓度来计算:KD=c(A)*c(B)/c(AB)。由该公式可知,KD值越大,说明解离越多,代表物 质A、B之间的亲和力越弱;反之,KD值越小,说明解离越少,代表物质A、B之间的亲和力越强。
在本申请中,术语“分离的核酸分子”通常是指从其天然环境中分离的或人工合成的任何长度的分离形式的核苷酸、脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物。
在本申请中,术语“载体”通常是指能够在合适的宿主中自我复制的核酸分子,其将插入的核酸分子转移到宿主细胞中和/或宿主细胞之间。所述载体可包括主要用于将DNA或RNA插入细胞中的载体、主要用于复制DNA或RNA的载体,以及主要用于DNA或RNA的转录和/或翻译的表达的载体。所述载体还包括具有多种上述功能的载体。所述载体可以是当引入合适的宿主细胞时能够转录并翻译成多肽的多核苷酸。通常,通过培养包含所述载体的合适的宿主细胞,所述载体可以产生期望的表达产物。
在本申请中,术语“宿主细胞”通常是指可以或已经含有包括本申请所述分离的核酸分子的载体,或者能够表达本申请所述分离的抗原结合片段的个体细胞,细胞系或细胞培养物。所述宿主细胞可以包括单个宿主细胞的子代。由于天然的,意外的或故意的突变,子代细胞与原始亲本细胞在形态上或在基因组上可能不一定完全相同,但能够表达本申请所述分离的抗原结合片段即可。所述宿主细胞可以通过使用本申请所述的载体体外转染细胞而得到。所述宿主细胞可以是原核细胞(例如大肠杆菌),也可以是真核细胞(例如酵母细胞,例如COS细胞,中国仓鼠卵巢(CHO)细胞,HeLa细胞,HEK293细胞,COS-1细胞,NS0细胞或骨髓瘤细胞)。例如,所述的宿主细胞可以是大肠杆菌细胞。例如,所述的宿主细胞可以是酵母细胞。例如,所述的宿主细胞可以是哺乳动物细胞。例如,所述哺乳动物细胞可以是CHO-K1细胞。
在本申请中,术语“免疫效应细胞”通常是指参与免疫应答,行使效应功能的免疫细胞。例如所述行使效应功能可以包括清除异物抗原或促进免疫效应子应答等。免疫效应细胞可以包括浆细胞、T细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T(NKT)细胞、肥大细胞和骨髓源性吞噬细胞。
本申请的免疫效应细胞可以是自体/自身的(autologous/autogeneic)(“自己的”)或非自体的(“非自己的”,例如同种异体的、同基因的或异基因的)。在本申请中,术语“自体的”通常是指来自相同受试者的细胞。“同种异体的”通常是指与相比较的为相同物种但在遗传上不同的细胞。“同基因的”通常是指在遗传上与相比较的细胞相同的不同受试者的细胞。“异基因的”通常是指物种与相比较的细胞不同的细胞。在一些实施方式中,本申请的细胞是自体的或同种异体的。
在本申请中,术语“修饰”通常是指改变细胞的状态或结构和/或细胞的状态或结构的改变。所述改变通常是与相应未经所述修饰的细胞的状态或结构相比,所述改变可以包括内源基因表达水平或功能的变化,例如通过基因工程手段使得细胞内源基因表达水平下调、上调或不表达,所述基因工程手段可以包括同源重组、CRISPR/Cas9系统基因编辑等;所述改变还可以包括细胞蛋白质表达、结构或功能的变化,例如通过所述内源基因表达水平或功能的变化而实现的相应蛋白质表达的变化、结构或功能的变化,例如通过调节蛋白质翻译、翻译后修饰而实现的蛋白质表达的变化、结构或功能的变化;所述改变还可以包括引入外源基因、表达外源蛋白质等。
在本申请中,术语“TRAC”通常是指T细胞受体α链恒定区(T cell receptor alpha con-stant)。T细胞受体(TCR)通常是指位于T细胞表面的特异性受体,能够识别与主要组织相容性复合物(MHC)分子结合的抗原。TCR通常由两条不同的蛋白质链组成(即异源二聚体)。在人类中,多数T细胞中的TCR由一条α链和一个β链(分别由TRA和TRB编码)组成,这一类T细胞被称为αβT细胞,少数的的T细胞中,TCR由γ链和δ链(分别由TRG和TRD编码)组成,这一类T细胞被称为γδT细胞。通常情况下,αβT细胞约占T细胞总数的95%,γδT细胞约占T细胞总数的5%,该比率在个体发育过程中和患病状态(例如白血病)中发生变化,物种之间也有所不同。组成TCR的每一条链都含有可变区与恒定区,在人类中,编码α链的基因(TRA,例如HGNC:12027所示的信息)位于14号染色体,由多基因片段构成,包括可变段(V)、连接段(J)以及恒定区(C),TRAC基因通常是指编码T细胞受体α链恒定区(C)的基因序列(例如HGNC:12029所示的信息),其位于14号染色体(14q11.2;14:22,547,505-22,552,131)。通常编码N段抗原识别域的可变段(V)基因中的1个与连接段(J)中的一个重排产生一个功能性V区外显子,该外显子被转录并通过剪接与恒定区(C)连接,从而形成T细胞受体α链编码序列。
在本申请中,术语“主要组织相容性复合物抗原”(“MHC”,在人类的情况下也称为“人类白细胞抗原”(“HLA”))通常是指在细胞表面上表达的赋予细胞独特抗原身份的蛋白质。MHC/HLA抗原是被T细胞和NK细胞识别为源自于与免疫效应细胞相同的造血干细胞来源(“自身”)或识别为源自于另一种造血重建细胞来源(“非自身”)的靶分子。识别了两种主要类别的HLA抗原:HLA I类和HLA II类。HLA I类抗原(人类中的A、B、C)使每个细胞都可被识别为“自身”,而HLA II类抗原(人类中的DR、DP和DQ)参与淋巴细胞和抗原呈递细胞之间的反应。两者都已经与移植器官的排斥有牵涉。HLA基因系统的一个重要方面是其多态性。每个基因,MHC I类(A、B和C)和MHC II类(DP、DQ和DR)存在着不同的等位基因。HLA 等位基因由数字和下标表示。例如,两个不相关的个体可能分别携带I类HLA-B基因B5和Bw41。等位基因产物在α和/或β结构域的一个或更多个氨基酸中有差异。大量的特异性抗体或核酸试剂被用于使用表达I类和II类分子的白细胞对个体的HLA单倍型进行分型。通常用于HLA分型的基因是六种MHC I类和II类蛋白,即HLA-A;HLA-B和HLA-DR各自有两个等位基因。HLA基因簇集在存在于染色体位置6p21上的“超级基因座”中,所述“超级基因座”编码在免疫系统以及一些其他的基本分子和细胞过程的调控中具有重要作用的6个经典的移植HLA基因和至少132个蛋白质编码基因。完整的基因座粗略度量为3.6Mb,具有至少224个基因座。这种簇集的一个效果是“单倍型”,即存在于单条染色体上的一组等位基因,是从一个亲本遗传来的,倾向于作为一组进行遗传。从每个亲本遗传来的一组等位基因形成一个单倍型,其中一些等位基因倾向于关联在一起。鉴定患者的单倍型可以帮助预测找到匹配供体的概率,并且帮助制定搜索策略,因为一些等位基因和单倍型比其他等位基因和单倍型更常见,而且它们在不同种族和民族中分布的频率不同。
在本申请中,“HLA-A”通常是指一类人类白细胞抗原(human leukocyte antigens)多肽链,由位于人类染色体6p21.3的HLA-A基因(例如HGNC:4931所示的信息)编码。HLA-A是构成人类细胞表面I类MHC分子的三种主要多肽类型之一,其他还包括HLA-B和HLA-C。由HLA-A基因编码的α链和B2M基因编码的β链(β2-微球蛋白)组成的异二聚体即为HLA-A类MHC I分子。所述由HLA-A基因编码的α链可以包含α1结构域、α2结构域域、α3结构域、跨膜区以及胞质区,其中α1结构域、α2结构域可以与肽段结合从而由MHC I分子(例如HLA-A类)将所述肽段呈递给免疫系细胞。在人类中,与大多数哺乳动物相似,MHC I分子的α链为多态性的,其一级结构有较多变化,截至2013年12月,共有2432个已知的HLA-A等位基因,编码1740个活性蛋白和117个无效蛋白。在本申请中,HLA-A等位基因可以包括IMGT/HLA数据库3.38.0版(https://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/)收录的由WHO HLA因子命名委员会命名的不同HLA-A等位基因的序列信息。
在本申请中,术语“HLA-B”通常是指人类白细胞抗原(HLA)复合物的基因家族的一部分。HLA是主要组织相容性复合体(MHC)的人类版本,MHC是一个存在于许多物种中的基因家族。在这个复杂的基因被分为三个基本组:I类,II类和III类。在人类中,HLA-B基因和两个相关基因HLA-A和HLA-C是MHC I类的主要基因。HLA-B基因位于6号染色体短(p)臂的细胞带21.3,从碱基对31,353,871到31,357,211。HLA-B是供者和受者之间应匹配的三个主要HLA之一。它们是HLA-A、HLA-B(均为I类MHC)和HLA-DR(II类MHC)。如果这两种组织具有编码这三种HLA的相同基因,那么排斥的可能性和严重程度就会降到最低。 HLA-B的数百个版本(等位基因)是已知的,每个版本都有一个特定的编号(例如HLA-B27)。密切相关的等位基因被归类在一起;例如,至少有28个非常相似的等位基因是HLA-B27的亚型。这些亚型被指定为HLA-B*2701至HLA-B*2728。
在本申请中,术语“HLA匹配的”是指其中供体和受体之间HLA抗原没有不匹配的供体-受体对,所述供体诸如向需要造血干细胞移植疗法的受体提供造血干细胞移植物的供体。HLA匹配的(即其中所有6个等位基因都是匹配的)供体-受体对具有降低的移植物排斥的风险,原因是内源性T细胞和NK细胞不太可能将进入的移植物识别为外来的,并且因此不太可能产生针对移植物的免疫应答。
在本申请中,术语“HLA不匹配的”是指其中供体和受体之间至少一种HLA抗原(特别是对于HLA-A、HLA-B和HLA-DR)是不匹配的供体-受体对,所述供体诸如向需要造血干细胞移植疗法的受体提供造血干细胞移植物的供体。在一些实施方案中,一个单倍型是匹配的,而另一个是不匹配的。HLA不匹配的供体-受体对相对于HLA匹配的供体-受体对可能具有增加的移植物排斥的风险,原因是在HLA不匹配的供体-受体对的情况下,内源性T细胞和NK细胞更可能将进入的移植物识别为外来的,并且这样的T细胞和NK细胞因此更可能产生针对移植物的免疫应答。
在本申请中,术语“B2M”通常是指是β2微球蛋白(β2-microglobulin),是MHC I类分子的组成部分之一。β2微球蛋白(也称为β链)可以与HLA编码的α链组成MHC I类的分子。B2M通常在所有有核的细胞中都有表达。在人类中,β2微球蛋白由位于15q21.1的B2M基因(例如HGNC:914所示的信息)所编码。
在本申请中,术语“CIITA”通常是指Ⅱ类主要组织相容性复合体(MHCⅡ)的反式激活因子。所述反式激活因子可以是具有酸性转录激活结构域、4个LRR(富含亮氨酸的重复序列)和GTP结合结构域的蛋白质。所述蛋白质可位于细胞核中,作为II类主要组织相容性复合体(MHCⅡ)基因转录的正向调节剂,被称为表达这些基因的“主控制因子”。该蛋白质还可结合GTP,并利用与GTP结合来使其自身转运到细胞核中,在细胞核中,其通常使通过乙酰转移酶(AT)活性以类似共激活剂的方式起作用。在人类中,所述蛋白质由位于16p13.13的基因(例如HGNC:7067所示的信息)编码,能够产生几种编码不同同工型的转录物变体。
在本申请中,术语“野生型细胞”通常是指自然存在的或者自然来源的细胞。
在本申请中,术语“T细胞”通常是指胸腺衍生的细胞,其参与各种细胞介导的免疫反应。
在本申请中,术语“核酸”或“多核苷酸”或“核酸分子”通常时指脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)及其单链形式或双链形式的聚合物。除非特别限定,否则该术语可以包括含天 然核苷酸的类似物的核酸,所述核酸具有与参考核酸(例如示出了序列信息)相似的结合特性并且按照与天然存在核苷酸相似的方式代谢。除非另外说明,核酸的序列可以包括其保守方式修饰的变体,例如简并密码子置换、等位基因、直向同源物、SNP和互补序列,以及明确指出的序列。
在本申请中,术语“表达”通常是指特定核苷酸序列的转录和/或翻译。
在本申请中,术语“基因突变”通常是指基因在结构上发生的碱基对组成或排列顺序的改变。例如单个碱基改变所引起的点突变,或多个碱基的缺失、重复和插入等。
在本申请中,术语“基因沉默”通常是指通过调节机制阻止某些基因的表达。主要可以包括两种:一种是由于DNA甲基化、异染色质化以及位置效应等因素引起的转录水平上的基因沉默(transcriptional gene silencing,TGS),另一种是转录后基因沉默(post-transcriptional gene silencing,PTGS),即在基因转录后的水平上通过对靶标RNA进行特异性干预而影响基因的表达。通常情况下当基因沉默时,相应基因表达下调/减少。而当基因被敲除时则通常表现为不表达,例如在细胞中,某种特定基因的所有等位基因均被敲除后则表现为该基因的表达消失。基因沉默通常被认为是一种基因敲低机制,通用于沉默基因的方法可以如RNAi等。
在本申请中,术语“内源”指来自生物、细胞、组织或系统或在其内部产生的任何物质。
在本申请中,术语“外源”指从生物、细胞、组织或系统外部引入或在其外部产生的任何物质。
在本申请中,术语“反义RNA”通常是指一种与转录产物mRNA(信使RNA)互补的单链RNA。反义RNA可通过与mRNA的结合抑制基因的表达。例如,反义RNA与靶mRNA结合后引起该双链RNA分子对RNA酶Ⅲ的敏感性增加,使其降解;例如,反义RNA与mRNA的上游非编码区结合,从而直接抑制靶mRNA的翻译。
在本申请中,术语“siRNA”通常是指Small interfering RNA(小干扰RNA)或short in-terfering RNA(短干扰RNA)的缩写。siRNA是一类双链非编码RNA分子,长度约为18-28个碱基对,可通过与mRNA的互补结合引起mRNA的降解从而干扰特定基因的表达。在某些实施方式中,siRNA可以是长双链RNA或shRNA经Dicer酶处理得到的产物。在某些实施方式中,siRNA进入细胞与其他蛋白质形成RNA诱导沉默复合体(RISC),有义链发生降解,反义链可与互补的靶向序列结合,从而实现基因沉默。
在本申请中,术语“shRNA”通常是指short hairpin RNA的缩写,即“短发夹RNA”。shRNA通常包括两个短反向重复序列,中间由一茎环(loop)序列分隔,组成发夹结构。通 常还可以包括5-6个T碱基作为RNA聚合酶Ⅲ的转录终止子。在某些实施方式中,shRNA可经由病毒载体或质粒进入细胞中,在聚合酶Ⅱ或聚合酶Ⅲ的作用下进行转录,转录产物自细胞核输出(通常可经由Exportin 5)后经Dicer处理后输送至RISC,有义链发生降解,反义链可与互补的靶向序列结合,从而实现基因沉默。
在本申请中,术语“CRISPR/Cas系统”通常是指包含RNA引导的核酸酶或其他效应分子和gRNA分子的一组分子,所述分子能够指引和实现由RNA引导的核酸酶或其他效应分子在靶序列处修饰核酸,例如引起靶序列降解。在某些实施方式中,CRISPR系统包含gRNA和Cas蛋白,例如,Cas9蛋白。包含Cas9或其功能性突变体的系统在本申请中称作“Cas9系统”或“CRISPR/Cas9系统”。在某些实施方式中,gRNA分子和Cas分子可以复合,以形成核糖核蛋白(RNP)复合体。
在本申请中,术语“gRNA分子”或“向导RNA”、“指导RNA”、“指引RNA”、“向导RNA分子”、“gRNA”可互换使用,通常是指能够促进特异性指引RNA引导的核酸酶或其他效应分子(一般与gRNA分子复合)至靶序列上的核酸分子。在某些实施方案中,通过gRNA的一部分与DNA(例如,通过gRNA导引结构域)杂交并且通过gRNA分子的一部分与RNA指导的核酸酶或其他效应分子结合(例如,至少通过gRNAtracr)实现所述引导。在某些实施方案中,gRNA分子由单一的连续多核苷酸分子组成,在本文中称作“单一向导RNA”或“sgRNA”等。在其他实施方案中,gRNA分子由本身能够缔合(一般通过杂交)的多个(例如二个)多核苷酸分子组成,在本文中称作“双重向导RNA”或“dgRNA”等。
在本申请中,术语“Cas蛋白”通常是指CRISPR/Cas系统中负责剪切DNA的酶。可以包括来自Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型CRISPR/Cas系统的酶。例如,Cas3、Cas9、Cas10。
在本申请中,术语“Cas9蛋白”通常是指负责剪切DNA的来自细菌II型CRISPR/Cas系统的酶。Cas9可以包括野生型蛋白及其有功能性突变体。
在本申请中,“等位基因”通常是指基因座上的基因序列可能具有的不同变化的形式。基因座也称作基因位点或位点,是指染色体上的固定位置,例如某个基因所在。基因座在基因组中的排列位置称为基因图谱(genetic map)。
在本申请中,术语“纯合子”通常是指同源染色体在同一基因座上的两个等位基因相同的基因型个体。一对相对基因可以有AA和aa两种基因型的个体。
在本申请中,术语“杂合子”通常是指二倍体中同源染色体同一位点上的两个等位基因不相同的基因型个体,如Aa。杂合基因型一般比纯合显性或纯合隐性基因型的适应性都要高,这种现象被称为杂合子优势。
在本申请中,术语“药学上可接受的”通常是指代与合理的益处/风险比相称、在合理医学判断范围内适合用于与人类和动物的组织接触而不具有过度毒性、刺激、过敏应答或其它问题或并发症的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。
在本申请中,术语“药学上可接受的载剂”通常是指常规使用的那些载剂中的任一种,并且仅受到物理-化学考虑因素(如溶解性和与活性结合剂的反应性的缺乏)限制,并且受给药途径限制。本文所描述的药学上可接受的载剂,例如媒剂、佐剂、赋形剂和稀释剂为所属领域的技术人员所熟知并且公众可容易获得。在一个方面中,药学上可接受的载剂是对医药组合物的活性成分具有化学惰性的载剂,并且是在使用条件下不具有不利的副作用或毒性的载剂。在一些实施例中,当向动物或人类给予时,载剂不产生不良、过敏或其它不适当的反应。在一些方面中,医药组合物不含热原质以及会对人类或动物有害的其它杂质。药学上可接受的载剂包括任何和所有溶剂、分散介质、涂料、抗细菌剂和抗真菌剂、等张剂和吸收延迟剂等等;其用途在所属领域中是众所周知。
可接受的载剂、赋形剂或稳定剂对接受者无毒性并且优选在所采用的剂量和浓度下是惰性的,并且包括缓冲夜,如磷酸盐、柠檬酸盐或其它有机酸;抗氧化剂,如抗坏血酸;低分子量多肽;蛋白质,如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白;亲水性聚合物,如聚乙烯吡咯烷酮;氨基酸,如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸;单糖、双糖和其它碳水化合物,包括葡萄糖、甘露糖或糊精;螯合剂,如EDTA;糖醇,如甘露糖醇或山梨糖醇;盐形成抗衡离子,如钠;和/或非离子表面活性剂,如Tween、Pluronics或聚乙二醇(PEG)。
在本申请中,术语“包括”通常是指包含、总括、含有或包涵的含义。在某些情况下,也表示“为”、“由……组成”的含义。
在本申请中,术语“约”通常是指在指定数值以上或以下0.5%-10%的范围内变动,例如在指定数值以上或以下0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%、4.5%、5%、5.5%、6%、6.5%、7%、7.5%、8%、8.5%、9%、9.5%、或10%的范围内变动。
发明详述
嵌合抗原受体
一方面,本申请提供了一种嵌合抗原受体(CAR),其可包含靶向部分,所述靶向部分可包含重链可变区VH中的至少一个CDR。例如,所述VH可以包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。在本申请中,所述分离的抗原结合蛋白的HCDR可以通过任何形式划分,只要VH与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列相同,以任何形式划分得到的HCDR都可落入本申请 的保护范围内。
抗体的CDR又称互补决定区,是可变区的一部分。该区域的氨基酸残基可以与抗原或抗原表位接触。抗体CDR可以通过多种编码系统来确定,如CCG、Kabat、Chothia、IMGT、AbM、综合考虑Kabat/Chothia等。这些编码系统为本领域内已知,具体可参见,例如,http://www.bioinf.org.uk/abs/index.html#kabatnum。本领域技术人员可以根据抗体的序列和结构,用不同的编码系统确定出CDR区。使用不同的编码系统,CDR区可能存在差别。在本申请中,所述CDR涵盖根据任何CDR划分方式划分得到的CDR序列;也涵盖其变体,所述变体包括所述CDR的氨基酸序列经过取代、缺失和/或添加一个或多个氨基酸。例如1-30个、1-20个或1-10个,又例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或9个氨基酸取代、缺失和/或插入;也涵盖其同源物,所述同源物可以为与所述CDR的氨基酸序列具有至少约85%(例如,具有至少约85%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%、约99%或更高的)序列同源性的氨基酸序列。在某些实施方式中,本申请所述分离的抗原结合蛋白通过IMGT编码系统定义。
在本申请中,所述靶向部分可包含HCDR3,所述HCDR3可包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。例如,所述靶向部分的HCDR3可通过IMGT编码系统定义。
在本申请中,所述靶向部分可包含HCDR2,所述HCDR2可包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。例如,所述靶向部分的HCDR2可通过IMGT编码系统定义。
在本申请中,所述靶向部分可包含HCDR1,所述HCDR1可包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。例如,所述靶向部分的HCDR1可通过IMGT编码系统定义。
在本申请中,所述靶向部分可包含SEQ ID NO:1所示的重链可变区中的HCDR1、HCDR2和HCDR3。
在本申请中,所述靶向部分可包含HCDR1、HCDR2、HCDR3,所述HCDR3可包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列;所述HCDR2可包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列;以及所述HCDR1可包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。例如,所述抗原结合蛋白可包括抗体A0或与其具有相同HCDR3(例如,与其具有相同的HCDR1-3)的抗原结合片段(例如,scFv)。
在本申请中,所述靶向部分可包含H-FR1,所述H-FR1的C末端与所述HCDR1的N末端直接或间接地相连,且所述H-FR1可包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。
在本申请中,所述靶向部分可包含H-FR2,所述H-FR2位于所述HCDR1与所述HCDR2之间,且所述H-FR2可包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。
在本申请中,所述靶向部分可包含H-FR3,所述H-FR3位于所述HCDR2与所述HCDR3之间,且所述H-FR3可包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列。
在本申请中,所述靶向部分可包含H-FR4,所述H-FR4的N末端与所述HCDR3的C末端直接或间接地相连,且所述H-FR4可包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列。
在本申请中,所述靶向部分可包含H-FR1,H-FR2,H-FR3和H-FR4,所述H-FR1可包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列;所述H-FR2可包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列;所述H-FR3可包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列;以及所述H-FR4可包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列。例如,所述抗原结合蛋白可包括抗体A0或与其具有相同H-FR1-4的抗原结合片段(例如,scFv)。
在本申请中,所述嵌合抗原受体中所述靶向部分可包含重链可变区VH,所述VH可包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。例如,编码所述VH的核苷酸序列可为SEQ ID NO:2。
在本申请中,所述抗原结合蛋白可包含轻链可变区VL,所述VL可包含LCDR1、LCDR2和LCDR3中的至少一个、两个或三个。
在本申请中,所述VL可以包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列。在本申请中,所述分离的抗原结合蛋白的LCDR可以通过任何形式划分,只要VL与SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列相同,以任何形式划分得到的LCDR都可落入本申请的保护范围内。
在本申请中,所述嵌合抗原受体中所述靶向部分可包含LCDR3,所述LCDR3可包含SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列。例如,所述靶向部分的LCDR3可通过IMGT编码系统定义。
在本申请中,所述嵌合抗原受体中所述靶向部分可包含LCDR2,所述LCDR2可包含SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列。例如,所述靶向部分的LCDR2可通过IMGT编码系统定义。
在本申请中,所述的嵌合抗原受体中所述靶向部分可包含LCDR1,所述LCDR1可包含SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列。例如,所述靶向部分的LCDR1可通过IMGT编码系统定义。
在本申请中,所述的嵌合抗原受体中所述靶向部分可包含SEQ ID NO:10所示的轻链可变区中的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在本申请中,所述的嵌合抗原受体中所述靶向部分可包含LCDR1、LCDR2、LCDR3,所述LCDR3可包含SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列;所述LCDR2可包含SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列;以及所述LCDR1可包含SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列。例如,所 述抗原结合蛋白可包括抗体A0或与其具有相同LCDR3(例如,与其具有相同LCDR1-3)的抗原结合片段(例如,scFv)。
在本申请中,所述的嵌合抗原受体中所述靶向部分可包含L-FR1,所述L-FR1的C末端与所述LCDR1的N末端直接或间接地相连,且所述L-FR1可包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列。
在本申请中,所述的嵌合抗原受体中所述靶向部分可包含L-FR2,所述L-FR2位于所述LCDR1与所述LCDR2之间,且所述L-FR2可包含SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列。
在本申请中,所述的嵌合抗原受体中所述靶向部分可包含L-FR3,所述L-FR3位于所述LCDR2与所述LCDR3之间,且所述L-FR3可包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列。
在本申请中,所述的嵌合抗原受体中所述靶向部分可包含L-FR4,所述L-FR4的N末端与所述LCDR3的C末端直接或间接地相连,且所述L-FR4可包含SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列。
在本申请中,所述靶向部分可包含L-FR1,L-FR2,L-FR3和L-FR4,所述L-FR1可包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列;所述L-FR2可包含SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列;所述L-FR3可包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列;以及所述L-FR4可包含SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列。例如,所述抗原结合蛋白可包括抗体A0或与其具有相同L-FR1-4的抗原结合片段(例如,scFv)。
在本申请中,所述嵌合抗原受体中所述靶向部分可包含轻链可变区VL,所述VL可包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列。例如,编码所述VL的核苷酸序列为SEQ ID NO:11。
在本申请中,所述嵌合抗原受体中所述靶向部分可包含HCDR1-3以及LCDR1-3。所述HCDR3可包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列;所述HCDR2可包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列;以及所述HCDR1可包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列;所述LCDR3可包含SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列;所述LCDR2可包含SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列;以及所述LCDR1可包含SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列。例如,所述抗原结合蛋白可包括抗体A0或与其具有相同LCDR3及HCDR3(例如,与其具有相同LCDR1-3及HCDR1-3)的抗原结合片段(例如,scFv)。
在本申请中,所述抗原结合蛋白可包含重链可变区和轻链可变区。所述抗原结合蛋白的重链可变区可包含HCDR1-3以及H-FR1-4。所述抗原结合蛋白的轻链可变区可包含LCDR1-3以及L-FR1-4。例如,所述HCDR1可包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列;所述HCDR2可包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列;所述HCDR3可包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸 序列;所述LCDR1可包括SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列;所述LCDR2可包含SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列;所述LCDR3可包含SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列。例如,所述H-FR1可包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列;所述H-FR2可包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列;所述H-FR3可包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列;所述H-FR4可包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列;所述L-FR1可包括SEQ ID NO:12的氨基酸序列;所述L-FR2可包含SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列;所述L-FR3可包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列;所述L-FR4可包含SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列。例如,所述抗原结合蛋白的重链可变区可包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。例如,所述抗原结合蛋白可包括抗体A0或与其具有相同重链可变区的抗原结合蛋白。例如,所述抗原结合蛋白的轻链可变区可包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列。例如,所述抗原结合蛋白可包括抗体A0或与其具有相同轻链可变区的抗原结合蛋白。
在本申请中,所述的嵌合抗原受体中所述靶向部分可包括抗体或抗原结合片段。
在本申请中,所述的嵌合抗原受体中所述抗原结合片段可选自下组:Fab,Fab’,F(ab)2,Fv片段,F(ab’)2,scFv,di-scFv,VHH和/或dAb。
在本申请中,所述的嵌合抗原受体中所述靶向部分可包括scFv。例如,所述scFv可靶向HER2。例如,在所述scFv中,所述VH的C端可与所述VL的N端直接或间接地连接。例如,在所述scFv中,所述VL的C端可与所述VH的N端直接或间接地连接。
在本申请中,在所述scFv中,所述VH的C端可通过连接子与所述VL的N端直接或间接地连接。例如,所述scFv可包含SEQ ID NO:198-199中任一项所示的氨基酸序列。
在本申请中,其可包括跨膜域,所述跨膜域可包含源自选自下组中的一种或多种蛋白的跨膜域:CD8A、CD8B、CD28、CD3e、CD3ε、4-1BB、CD4、CD27、CD7、PD-1、TRAC、TRBC、CD3ζ、CTLA-4、LAG-3、CD5、ICOS、OX40、NKG2D、2B4、CD244、FcεRIγ、BTLA、CD30、GITR、HVEM、DAP10、CD2、NKG2C、LIGHT、DAP12,CD40L、CD154、TIM1、CD226、DR3、CD45、CD80、CD86、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64和SLAM。
在本申请中,其中所述跨膜域可包含源自CD8A或CD8B的跨膜域。
在本申请中,其中所述跨膜域可包含SEQ ID NO:21至SEQ ID NO:69中任一项所示的氨基酸序列。
在本申请中,其可包括胞内共刺激信号传导结构域,所述胞内共刺激信号传导结构域可包含源自选自下组中的一种或多种蛋白的胞内共刺激信号传导结构域:CD28、4-1BB、 CD27、CD2、CD7、CD8A、CD8B、OX40、CD226、DR3、SLAM、CDS、ICAM-1、NKG2D、NKG2C、B7-H3、2B4、FcεRIγ、BTLA、GITR、HVEM、DAP10、DAP12、CD30、CD40、CD40L、TIM1、PD-1、LFA-1、LIGHT、JAML、CD244、CD100、ICOS、CD40和MyD88。
在本申请中,其中所述胞内共刺激信号传导结构域可包括源自4-1BB的共刺激信号传导结构域。
在本申请中,其中所述胞内共刺激信号传导结构域可包含SEQ ID NO:70至SEQ ID NO:102中任一项所示的氨基酸序列。
在本申请中,其可包括胞内信号转导结构域,所述胞内信号转导结构域可包含源自选自下组中的一种或多种蛋白的胞内信号转导结构域:CD3ζ、CD3δ、CD3γ、CD3ε、CD79a、CD79b、FceRIγ、FceRIβ、FcγRIIa、牛白血病病毒gp30、Epstein-Barr病毒(EBV)LMP2A、猿免疫缺陷病毒PBj14Nef、DAP10、DAP-12和至少包含一个ITAM的结构域。
在本申请中,其中所述胞内信号转导结构域可包含源自CD3ζ、CD3δ、CD3γ或CD3ε的信号传导结构域。
在本申请中,其中所述胞内信号转导结构域可包含SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:103至SEQ ID NO:113中任一项所示的氨基酸序列。
在本申请中,其在靶向部分和跨膜域之间可包括铰链区,所述铰链区可包含源自选自下组中的一种或多种蛋白的铰链区:CD28、IgG1、IgG4、IgD、4-1BB、CD4、CD27、CD7、CD8、PD-1、ICOS、OX40、NKG2D、NKG2C、FcεRIγ、BTLA、GITR、DAP10、TIM1、SLAM、CD30和LIGHT。
在本申请中,所述铰链区可包含源自CD8的铰链区。
在本申请中,所述铰链区可包含SEQ ID NO:114至SEQ ID NO:135中任一项所示的氨基酸序列。
在本申请中,所述嵌合抗原受体还可包含信号肽,所述信号肽可包含SEQ ID NO:136所示的氨基酸序列。例如,所述编码信号肽的核酸可包含SEQ ID NO:137所示的核苷酸序列。
在本申请中,所述嵌合抗原受体的非靶向部分可包括铰链区,跨膜域,胞内共刺激信号传导结构域与胞内信号转导结构域。
例如,所述嵌合抗原受体以抗HER2单链抗体(scFv)为靶向部分,通过铰链区和跨膜域与胞内信号转导结构域相连接,胞内信号转导结构域由胞内共刺激信号传导结构域与胞内信号转导结构域组成。
在某些实施方式中,所述嵌合抗原受体的非靶向部分可包含CD8A分子跨膜域、CD8的铰链区、4-1BB的胞内共刺激信号传导结构域和CD3ζ胞内信号转导结构域。
又例如,所述嵌合抗原受体以抗HER2单链抗体(scFv)为靶向部分,通过CD8分子铰链区和跨膜域与胞内信号转导结构域相连接,胞内信号转导结构域由4-1BB胞内共刺激信号传导结构域与CD3ζ胞内信号转导结构域组成。
在某些实施方式中,所述嵌合抗原受体的非靶向部分包含SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中,所述的嵌合抗原受体包含SEQ ID NO:200所示的氨基酸序列。
核酸分子、载体、细胞
另一方面,本申请提供一种或多种分离的核酸分子,其可编码前述的嵌合抗原受体。
在本申请中,所述的分离的核酸分子可包含SEQ ID NO:201所示的核苷酸序列。
另一方面,本申请提供一种载体,其可包含前述的分离的核酸分子。
在本申请中,所述的载体可包括病毒载体或非病毒载体。
在本申请中,所述非病毒载体可包括睡美人系统或piggybac系统。
在本申请中,所述的载体可包括慢病毒载体。
另一方面,本申请提供一种细胞,其可包含前述的嵌合抗原受体,前述的分离的核酸分子,和/或前述的载体。
另一方面,本申请提供前述的嵌合抗原受体,前述的分离的核酸分子,前述的载体,前述的细胞,或前述的免疫效应细胞在制备CAR-T细胞中的应用。
免疫效应细胞
另一方面,本申请提供一种免疫效应细胞,其可包含前述的所述的核酸分子或前述的载体,和/或表达前述的CAR。
在本申请中,所述的免疫效应细胞可包括人细胞。
在本申请中,所述免疫效应细胞可包括T细胞、B细胞、天然杀伤细胞(NK细胞)、巨噬细胞、NKT细胞、单核细胞、树突状细胞、粒细胞、淋巴细胞、白细胞和/或外周血单个核细胞。
在本申请中,述的免疫效应细胞可包括T细胞。
在本申请中,所述的免疫效应细胞可包括经修饰的免疫效应细胞。
在本申请中,其中所述经修饰的免疫效应细胞可包括降低同种异体细胞治疗引起的免疫排斥反应的细胞。
在本申请中,其中所述经修饰的免疫效应细胞中的T细胞抗原受体(TCR)和主要组织相容性复合体(MHCI,MHCII)在T细胞中的功能受到抑制。
在本申请中,其中所述修饰可包括与免疫排斥相关基因中的一个或多个的表达和/或活性被下调。
在本申请中,其中所述与免疫排斥相关基因可选自下组中的一种或多种基因:TRAC、TRBC、HLA-A、HLA-B、B2M和CIITA。
在本申请中,其中所述与免疫排斥相关基因可选自下组中的一种或多种基因:TRAC、TRBC、HLA-A和HLA-B。
在本申请中,其中所述与免疫排斥相关基因可选自下组中的一种或多种基因:TRAC、TRBC和HLA-A。
在本申请中,其中所述与免疫排斥相关基因可选自下组中的一种或多种基因:TRAC和HLA-A。
在本申请中,所述经修饰的免疫效应细胞与未经修饰的相应细胞相比,TRAC基因和HLA-A基因的表达和/或活性可被下调。
在本申请中,其中所述经修饰的免疫效应细胞与未经所述修饰的相应细胞相比,CIITA基因的表达和/或活性未被下调。
在本申请中,其中所述经修饰的免疫效应细胞与未经所述修饰的相应细胞相比,B2M基因的表达和/或活性未被下调。
在本申请中,其中所述经修饰的免疫效应细胞与相应的野生型细胞相比,TRAC基因和HLA-A基因的表达和/或活性被下调。
在本申请中,其中所述经修饰的免疫效应细胞与相应的野生型细胞相比,B2M基因的表达和/或活性未被下调。
在本申请中,其中所述经修饰的免疫效应细胞与相应的野生型细胞相比,CIITA基因的表达和/或活性未被下调。
在本申请中,其中所述基因的表达水平和/或活性被下调包括使编码所述基因的核酸分子的表达和/或活性下调;和/或使所述基因编码的蛋白质产物的表达和/或活性被下调。
在本申请中,其中所述修饰可包括:基因敲除、基因突变和/或基因沉默。
在本申请中,所述修饰可包括所述免疫效应细胞中两个TRAC等位基因中的任意一个被敲除并且两个HLA-A等位基因中的任意一个被敲除。
在本申请中,所述修饰可包括所述免疫细胞中两个TRAC等位基因被敲除并且两个 HLA-A等位基因中的任意一个被敲除。
在本申请中,所述修饰可包括所述免疫细胞中TRAC基因外显子被敲除并且HLA-A基因外显子被敲除。
在本申请中,其中所述修饰可包括向所述免疫效应细胞施用一种或多种选自下组的物质:反义RNA、siRNA、shRNA和CRISPR/Cas9系统。
在本申请中,其中所述修饰可包括向所述免疫效应细胞施用CRISPR/Cas9系统。
在本申请中,其中所述修饰还可包括向所述免疫效应细胞施用靶向所述TRAC基因外显子部分的sgRNA。
在本申请中,其中所述靶向所述TRAC基因外显子部分的sgRNA可包含SEQ ID NO:138至SEQ ID NO:152中任一项所示的核苷酸序列。
在本申请中,其中所述修饰可包括向所述免疫效应细胞施用靶向所述HLA-A基因外显子部分的sgRNA。
在本申请中,其中所述靶向所述HLA-A基因外显子部分的sgRNA可包含SEQ ID NO:153至SEQ ID NO:193中任一项所示的核苷酸序列。
在本申请中,其中所述修饰还可包括向所述细胞施用Cas酶。
在本申请中,其中Cas酶可包括Cas9蛋白。
在本申请中,其中所述修饰包括向所述细胞施用反义RNA,所述反义RNA可包含SEQ ID NO:194至SEQ ID NO:197中任一项所示的核苷酸序列。
在本申请中,其中所述免疫效应细胞可为HLA-B纯合子细胞。
在本申请中,其中所述HLA-B纯合子可包括HLA-B*40纯合子,HLA-B*15纯合子,HLA-B*46纯合子,HLA-B*13纯合子,HLA-B*51纯合子,HLA-B*58纯合子,HLA-B*07纯合子,HLA-B*35纯合子,HLA-B*44纯合子,HLA-B*52纯合子,HLA-B*57纯合子,HLA-B*54纯合子,HLA-B*55纯合子。
在本申请中,其中所述免疫效应细胞可为HLA-A纯合子或杂合子细胞。
在本申请中,其中所述HLA-A纯合子或杂合子可包括HLA-A*02纯合子,HLA-A*11纯合子,HLA-A*02/A*11杂合子或HLA-A*24纯合子。
另一方面,本申请提供一种制备免疫效应细胞的方法,其可包括向免疫效应细胞中引入前述的核酸分子或前述的载体。
在本申请中,所述的方法还可包括:在向免疫效应细胞中引入前述的核酸分子或前述的载体之前/之后,修饰所述免疫效应细胞,所述修饰包括与免疫排斥相关基因中的一个或多 个的表达和/或活性被下调。
在本申请中,所述的方法可包括:在向免疫效应细胞中引入前述的核酸分子或前述的载体之后,修饰所述免疫效应细胞,所述修饰包括与免疫排斥相关基因中的一个或多个的表达和/或活性被下调。
例如,所述制备免疫效应细胞的方法可以包括:
(1)向免疫效应细胞中引入前述的核酸分子或前述的载体;
(2)修饰所述免疫效应细胞,所述修饰包括与免疫排斥相关基因中的一个或多个的表达和/或活性被下调。
例如,所述制备免疫效应细胞的方法可以包括:
(1)采集健康人的外周血,进行PBMC的分离,按照比例加入CD3磁珠孵育,进行CD3+T细胞分选;将CD3/CD28抗体偶联磁珠混匀,按计算的量取出适量磁珠悬液加入到T细胞培养体系中,激活T细胞,过夜培养;
(2)根据HER2 CAR病毒的滴度感染T细胞;
(3)同时敲除TRAC和HLA-A基因;
(4)CD3阴性T细胞分选:按照比例加入CD3磁珠,收集CD3-T细胞(磁珠未结合的细胞)。
在本申请中,其中所述与免疫排斥相关基因选自下组中的一种或多种基因:TRAC、TRBC、HLA-A、HLA-B、B2M和CIITA。
在本申请中,与未经所述修饰的相应细胞中相应基因的表达和/或活性相比,下调所述免疫效应细胞中TRAC基因和HLA-A基因的表达和/或活性。
在本申请中,与未经所述修饰的相应细胞中相应基因的表达和/或活性相比,CIITA基因的表达和/或活性未被下调。
在本申请中,与未经所述修饰的相应细胞中相应基因的表达和/或活性相比,B2M基因的表达和/或活性未被下调。
在本申请中,与相应的野生型细胞相比,所述免疫效应细胞的TRAC基因和HLA-A基因的表达和/或活性被下调。
在本申请中,与相应的野生型细胞相比,CIITA基因的表达和/或活性未被下调。
在本申请中,与相应的野生型细胞相比,B2M基因的表达和/或活性未被下调。
在本申请中,其中所述基因的表达水平和/或活性被下调可包括使编码所述基因的核酸分子的表达和/或活性下调;和/或使所述基因编码的蛋白质产物的表达和/或活性被下调。
在本申请中,其中所述修饰包括:基因敲除、基因突变和/或基因沉默。
在本申请中,所述修饰可包括所述免疫效应细胞中两个TRAC等位基因中的任意一个被敲除并且两个HLA-A等位基因中的任意一个被敲除。
在本申请中,所述修饰可包括所述免疫细胞中两个TRAC等位基因被敲除并且两个HLA-A等位基因中的任意一个被敲除。
在本申请中,所述修饰可包括所述免疫细胞中TRAC基因外显子被敲除并且HLA-A基因外显子被敲除。
在本申请中,其中所述修饰可包括向所述免疫效应细胞施用一种或多种选自下组的物质:反义RNA、siRNA、shRNA和CRISPR/Cas9系统。
在本申请中,其中所述修饰可包括向所述免疫效应细胞施用CRISPR/Cas9系统。
在本申请中,其中所述修饰可包括向所述免疫效应细胞施用靶向所述TRAC基因外显子部分的sgRNA。
在本申请中,其中所述靶向所述TRAC基因外显子部分的sgRNA可包含SEQ ID NO:138至SEQ ID NO:152中任一项所示的核苷酸序列。
在本申请中,其中所述修饰可包括向所述免疫效应细胞施用靶向所述HLA-A基因外显子部分的sgRNA。
在本申请中,其中所述靶向所述HLA-A基因外显子部分的sgRNA可包含SEQ ID NO:153至SEQ ID NO:193中任一项所示的核苷酸序列。
在本申请中,其中所述修饰还可包括向所述细胞施用Cas酶。
在本申请中,其中Cas酶可包括Cas9蛋白。
在本申请中,其中所述修饰包括向所述细胞施用反义RNA,所述反义RNA可包含SEQ ID NO:194至SEQ ID NO:197中任一项所示的核苷酸序列。
在本申请中,其中所述免疫效应细胞可包括人细胞。
在本申请中,所述免疫效应细胞可包括T细胞、B细胞、天然杀伤细胞(NK细胞)、巨噬细胞、NKT细胞、单核细胞、树突状细胞、粒细胞、淋巴细胞、白细胞和/或外周血单个核细胞。
在本申请中,所述免疫效应细胞可包括T细胞。
在本申请中,其中所述细胞可为HLA-B纯合子细胞。
在本申请中,其中所述HLA-B纯合子可包括HLA-B*40纯合子,HLA-B*15纯合子,HLA-B*46纯合子,HLA-B*13纯合子,HLA-B*51纯合子,HLA-B*58纯合子,HLA-B*07 纯合子,HLA-B*35纯合子,HLA-B*44纯合子,HLA-B*52纯合子,HLA-B*57纯合子,HLA-B*54纯合子,HLA-B*55纯合子。
在本申请中,其中所述细胞可为HLA-A纯合子或杂合子细胞。
在本申请中,其中所述HLA-A纯合子或杂合子可包括HLA-A*02纯合子,HLA-A*11纯合子,HLA-A*02/A*11杂合子或HLA-A*24纯合子。
例如,所述制备免疫效应细胞的方法可以包括:
(1)采集健康人的外周血,进行HLA分型检测,选取符合我们需要的分型,进行PBMC的分离,按照比例加入CD3磁珠孵育,进行CD3+T细胞分选;将CD3/CD28抗体偶联磁珠混匀,按计算的量取出适量磁珠悬液加入到T细胞培养体系中,激活T细胞,过夜培养;
(2)根据HER2 CAR病毒的滴度感染T细胞;
(3)同时敲除TRAC和HLA-A基因;
(4)CD3阴性T细胞分选:按照比例加入CD3磁珠,收集CD3-T细胞(磁珠未结合的细胞)。
用途、药物组合物与治疗方法
另一方面,本申请提供一种药物组合物,其可包含前述的嵌合抗原受体,前述的分离的核酸分子,前述的载体,前述的细胞,和/或前述的免疫效应细胞,以及任选地药学上可接受的载剂。
例如,所述药物组合物可包括前述的免疫效应细胞以及任选地药学上可接受的载剂。
另一方面,本申请提供前述的抗原嵌合受体,前述的分离的核酸分子,前述的载体,前述的细胞,前述的免疫效应细胞,和/或前述的药物组合物,其可用于治疗与HER2的表达相关的疾病或病症。
在本申请中,其中所述与HER2的表达相关的疾病或病症可包括与HER2的表达上调相关的疾病或病症。
在本申请中,其中所述与HER2的表达相关的疾病或病症可包括HER2阳性的肿瘤。在HER2阳性的肿瘤中,与正常细胞相比,肿瘤细胞表面或肿瘤微环境中的HER2的蛋白表达量高约1%,5%,10%,15%,20%,25%,30%,35%,40%,50%,60%,70%,80%或更高。例如,所述肿瘤可包括乳腺癌、胃癌、卵巢癌、宫颈癌、尿路上皮癌、食管癌、膀胱癌、结直肠癌、子宫内膜癌、肾癌、肺癌、胰腺癌、头颈癌、肉瘤、胶质母细胞瘤、前列腺癌和/或甲状腺癌。
另一方面,本申请提供前述的嵌合抗原受体,前述的分离的核酸分子,前述的载体,前述的细胞,前述的免疫效应细胞,和/或前述的药物组合物在制备药物中的用途,所述药物可用于治疗与HER2的表达相关的疾病或病症。
在本申请中,其中所述与HER2的表达相关的疾病或病症可包括与HER2的表达上调相关的疾病或病症。
在本申请中,其中所述与HER2的表达相关的疾病或病症可包括与HER2的表达上调相关的疾病或病症。
在本申请中,其中所述与HER2的表达相关的疾病或病症可包括HER2阳性的肿瘤。在HER2阳性的肿瘤中,与正常细胞相比,肿瘤细胞表面或肿瘤微环境中的HER2的蛋白表达量高约1%,5%,10%,15%,20%,25%,30%,35%,40%,50%,60%,70%,80%或更高。例如,所述肿瘤可包括乳腺癌、胃癌、卵巢癌、宫颈癌、尿路上皮癌、食管癌、膀胱癌、结直肠癌、子宫内膜癌、肾癌、肺癌、胰腺癌、头颈癌、肉瘤、胶质母细胞瘤、前列腺癌和/或甲状腺癌。
另一方面,本申请提供预防或治疗与HER2的表达相关的疾病或病症的方法,其可包括向有需要的受试者施用有效量的前述的嵌合抗原受体,前述的分离的核酸分子,前述的载体,前述的细胞,前述的免疫效应细胞,和/或前的药物组合物。
在某些实施方式中,其中所述与HER2的表达相关的疾病或病症可包括与HER2的表达上调相关的疾病或病症。
在本申请中,其中所述与HER2的表达相关的疾病或病症可包括与HER2的表达上调相关的疾病或病症。
在本申请中,其中所述与HER2的表达相关的疾病或病症可包括HER2阳性的肿瘤。在HER2阳性的肿瘤中,与正常细胞相比,肿瘤细胞表面或肿瘤微环境中的HER2的蛋白表达量高约1%,5%,10%,15%,20%,25%,30%,35%,40%,50%,60%,70%,80%或更高。例如,所述肿瘤可包括乳腺癌、胃癌、卵巢癌、宫颈癌、尿路上皮癌、食管癌、膀胱癌、结直肠癌、子宫内膜癌、肾癌、肺癌、胰腺癌、头颈癌、肉瘤、胶质母细胞瘤、前列腺癌和/或甲状腺癌。
不欲被任何理论所限,下文中的实施例仅仅是为了阐释本申请的经修饰的免疫细胞、制备方法和用途等,而不用于限制本申请发明的范围。
实施例
实施例1
1.1抗HER2嵌合抗原受体(CAR)的设计
抗HER2 CAR结构包括:一个HER2抗原结合区(来源于抗HER2的scFv,其氨基酸序列如SEQ ID NO:198-199中任一项所示),一个CD8A胞外铰链区,一个CD8A跨膜区,一个4-1BB胞内共刺激域和一个CD3ζ激活信号域。HER2 CAR的非抗原结合域的氨基酸序列如SEQ ID NO:19所示,核苷酸序列如SEQ ID NO:20所示。
1.2 HER2 CAR的慢病毒载体构建
根据HER2序列信息及CAR载体结构,构建HER2 CAR慢病毒表达载体,载体示意图(见图1)。进行优化:选择商业化慢病毒表达载体pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP为骨架,在此载体基础上进行元件改造。首先,将载体的氨苄抗性基因β-内酰胺酶替换为源自Tn5的氨基糖苷磷酸转移酶,使载体具有卡那霉素抗性。其次,我们删除了在体内应用中具有潜在威胁性的CMV启动子及其临近的下游多克隆位点。最后,将原载体中由EF1启动子启动表达的copGFP基因删除,保留SalI酶切位点,并在SalI 5’端加入SmaI酶切位点供载体构建用,形成最终目的载体。加入的SmaI酶切位点是最终目的载体的单一酶切位点,载体的其他序列部分不具有该酶切位点。优化后构建嵌合抗原受体慢病毒表达载体,经sanger测序确证序列无误后,进行慢病毒包装。
1.3设计导向RNA
通过网站https://www.ncbi.nlm.nih.gov/,查找并下载相应基因序列,使用SnapGene软件打开基因序列,可在目的基因的不同外显子上设计sgRNA。在本实施例中采用的CRISPR/Cas9系统的sgRNA非限制性的设计原则为:5’-NNN(20)-NGG-3’,NGG被称为原间隔子相邻基序(PAM),其中,N表示A、T、C或G。由于在同一外显子上可以设计出较多sgRNA,并且由20个核苷酸序列组成的sgRNA可能会在基因组中重复出现,所以利用网站http://crispr.cos.uni-heidelberg.de来进行sgRNA的设计与评估,将外显子序列粘贴至该网站,网站设计出sgRNA并进行预测评估,在评估中得分越高,则说明可能存在较高的编辑效率和较低的脱靶风险,从中选择得分较高的sgRNA进行试验。靶向TRAC基因的 sgRNA如SEQ ID NO:138至SEQ ID NO:152所示,靶向HLA-A02基因的sgRNA如SEQ ID NO:153至SEQ ID NO:174所示,靶向HLA-A11基因的sgRNA如SEQ ID NO:175至185所示,靶向HLA-A24基因的sgRNA如SEQ ID NO:186至SEQ ID NO:193所示,由金斯瑞生物科技公司合成。
实施例2
2.1供体筛选
根据受体的HLA-B分型,选择与受体HLA-B分型匹配的HLA-B纯合子。
首先供者来源基于人群中的HLA-B纯合子,患者HLA-B的其中一个等位基因和供者HLA-B纯合子一致即可,来源于这些供者的细胞能覆盖高数量的患者人群。降低HLA-B亚型不一致引起的排异反应。HLA-B主要选择人群中频率较高的B*40纯合子,B*15纯合子,B*46纯合子,B*13纯合子,B*51纯合子,B*58纯合子,B*07纯合子,B*35纯合子,B*44纯合子,B*52纯合子,B*57纯合子,B*54纯合子,B*55纯合子。HLA-A选择人群中频率较高的A*02纯合子,A*11纯合子及A*02/A11杂合子。
2.2 CD3+T细胞制备
(1)从外周血中分离PBMC
从健康捐献者中采集外周血,用PBS缓冲液按照1:1进行外周血稀释。在新的50mL离心管中先加入稀释后血量1/3的细胞分离液(Ficoll),然后沿着管壁非常缓慢加入血细胞稀释液,800g常温离心20min(离心机设置升速1、降速0)。离心后离心管中的液体自上而下分为PBS与血清层、白细胞层、淋巴细胞分离液、红细胞层。去除PBS与血清层,将白细胞层移至新的50ml离心管中,加入PBS至40ml清洗细胞,450g离心10min。离心后弃上清,即得到外周血单个核细胞。细胞重悬后进行细胞计数。
(2)复苏冻存的健康人PBMC
将冻存的健康人PBMC细胞在37℃水浴锅中进行复苏,完全融化后将细胞吸到含有10ml含10%FBS的X-VIVO15培养基(购自LONZA)的15ml离心管中,400g离心8min;去上清,加入2ml X-VIVO15培养基(含10%FBS和终浓度100μg/ml的DNase I)室温孵育15min,孵育的过程中不断振荡;将孵育结束后的溶液用40μm的滤网进行过滤,并吸取10ml PBS缓冲液重悬底部的细胞再加到滤网上,过虑后400g离心8min,离心后弃上清,细 胞重悬后进行细胞计数。
(3)CD3
+T细胞分选
使用EasySep
TM人T细胞分选试剂盒(购自StemCell Technologies,货号:17951)提取外周血单个核细胞(PBMC)中的T细胞。将PBMC密度调整至5×10
7细胞/ml,PBS缓冲液的添加范围在0.25-2ml;先加cocktail混匀再按照50μl/ml加入isolation cocktail,混匀后室温放置5min;将RapidSpheres用旋涡振荡仪涡旋30s后加按照40μl/ml加入至细胞中混匀;补加缓冲液至2.5ml的倍数,上下轻轻吹打2-3次;按照每管2.5ml分别加到冻存管中,将冻存管置于磁力架上,室温放置3min;轻轻打开冻存管盖,小心持两边拿起磁力架,倒置保持2-3s,将细胞液一次性倒入新的离心管中;用10-20ml缓冲液(视细胞量)重悬细胞后,300g离心10min,弃掉上清,得到CD3
+T细胞。
(4)T细胞激活
激活试剂按培养基:Transact=99:1体积比进行配置,培养基为X-VIVO15培养基(含5%FBS、200U/ml IL2、10ng/ml IL7和5ng/ml IL15)、Transact购自美天旎。T细胞按每1×106个细胞用1ml激活试剂(含有10μl Transact)充分重悬后,放置于37℃、5%CO
2培养箱中孵育1天。
实施例3
3.1转病毒
按照实施例2的方式获得CD3+T细胞(D0天),并用CD3/CD28抗体磁珠激活,激活后于D1天进行慢病毒载体(实施例1制备的HER2 CAR慢病毒表达载体)转染,D2天洗去慢病毒载体,D3天进行电转。
3.2基因敲除
使用电转试剂盒(购自LONZA,货号V4XXP-3024)通过电转方式将RNP复合体转入3.1制备的激活后T细胞(取D3天的CAR-T细胞为初始细胞)。取样计数后收集细胞离心,用PBS重悬细胞沉淀。提前30min在孔板中预热培养基(X-VIVO15培养基+10%FBS+IL2(200U/ml)+IL7(10n g/ml)+IL15(5ng/ml))。准备电转缓冲液:Nucleofector Solution:Supplement按照82:18进行配置;根据每个电转体系使用1x10
7的细胞进行分配RNP复合物(Cas9:sgRNA=2:1),先将10μg sgRNA加入到PCR管(无RNA酶)中,再加 入20μg Cas9蛋白(购自thermo,货号A36499),轻轻混匀后,室温孵育12min。将上述细胞进行计数,300g离心8min弃上清,加入PBS重悬细胞,吸取1E7个细胞重新300g离心8min,弃上清后用100μl配置好的电转缓冲液重悬细胞。将孵育好的RNP复合体加入上述细胞悬液中,轻柔混匀,然后将混合物轻轻地转移到电转杯中。将电转杯放在Lonza-4D电转仪上,选用EO-115电转程序进行电转。往电转杯中加入预热的培养基,然后用配套吸管将细胞转入孔板中预热的培养基中,然后放置于37℃、5%CO
2培养箱中培养48小时后收细胞,sanger测序检测编辑效率,同时收细胞FACS检测敲除效率。
其中sgRNA序列TRAC sgRNA:AGAGTCTCTCAGCTGGTACA(SEQ ID NO:138),A02 sgRNA:CTGACCATGAAGCCACCCTG(SEQ ID NO:155),A11sgRNA:GGCCCCTCCTGCTCTATCCA(SEQ ID NO:185)。
3.3 CD3阴性T细胞分选
进行CD3阴性T细胞分选,细胞计数后离心,弃上清;用buffer重悬细胞并混匀,按20ul CD3磁珠/10
7的细胞加CD3磁珠,混合均匀后放4度冰箱孵育,加buffer洗涤细胞离心后进行磁珠分离,首先将column放在磁极上,下面对应放离心管,用buffer浸润column(LD),将细胞加到column上,不要产生气泡,用buffer清洗column 2次,收集清洗下来的液体(CD3-T)于15ml离心管中,取部分细胞进行细胞计数。
3.4细胞培养
镜下观察细胞状态,取细胞进行稀释计数,补充全培养基维持细胞密度在3x10^5-1x10^6个/ml,中间补/换液,放入37℃、5%CO
2培养。细胞收获:收集到细胞离心管中离心后弃上,用生理盐水再次洗涤细胞,离心,配制冻存液,冻存液重悬离心后的细胞,用注射器吸取细胞悬液至终制品用细胞冻存袋中,在细胞冻存袋上贴好标签,进行下一步冻存。
3.5基因敲除效率检测
(1)Sanger测序检测
细胞计数,取3~5×10
4细胞,2000r/min离心5min,尽量去干净上清,然后每管加20μl DE裂解液,细胞裂解后加到PCR管中,瞬时离心后上PCR仪,上机条件:65℃30min,4℃3 0s、95℃2min、16℃无限。使用引物对TRAC-For/TRAC-Rev,或HLA-A For/HLA-A Rev,将裂解产物作为模板进行PCR,将PCR产物交送金唯智进行Sanger测序。得到sanger 测序结果后,使用网站:https://moriaritylab.shinyapps.io/editr_v10/中的EditR编辑器预测编辑发生的位置以及编辑效率。
(2)流式检测细胞计数
取10E5至10E8细胞,2000rpm离心5min,去上清,然后每管加100μl的PBS缓冲液重悬细胞,再加入anti-human AB TCR-APC(购自eBioscience)抗体5μl,HLA-A02 Monoclonal Antibody(BB7.2),APC,eBioscince
TM(购自invitrogen)抗体5μl,混合均匀后于室温孵育10min。2000rpm离心5min后再以PBS缓冲液洗2遍,重悬细胞并通过BD FACSAria流式细胞仪进行检测,可得细胞表面TCR、HLA-A02表达阳性率。敲除效率=(A-B)/A×100%;A为对照组表达阳性率;B为敲除组表达阳性率。
结果如图3A-3D所示,anti-HER2 UCAR-T细胞CAR阳性率可达34%以上(图3A),anti-HER2 UCAR-T细胞中心记忆比例达45%左右(图3B),anti-HER2 UCAR-T细胞双敲效率高达95%以上(图3C),平均扩增倍数100X以上(图3D)。
实施例4靶向HER2 UCAR-T细胞体外细胞毒性分析
4.1 HER2 UCAR-T细胞对靶细胞的杀伤
(1)HER2靶细胞:SK-BR-3-Luciferase-GFP;调整靶细胞状态至对数生长期,在进行实验前需连续传代2次;
(2)制备HER2 UCAR-T细胞及对照组HER2 CAR-T,T细胞,流式检测敲除效率,转染效率,CD3-T分选效率及记忆T细胞的比例,统计扩增倍数;
(3)离心收集制备的几组细胞,每组6x10^6的细胞;
(4)将靶细胞重悬于1640+10%FBS中,每个靶点取3块24孔板,按照2x10^5/孔的量接种靶细胞。(靶细胞和效应细胞都是2x10^6/ml的密度接种)。然后按照E/T(效靶比,效应细胞:靶细胞)比例,加入效应细胞。每孔补液到最大体积(如600ul)。对照接种同样数量的靶细胞,不加效应细胞(600ul)。将孔板置于5%CO
2、37℃培养箱中,培养24小时。E/T:1:2,1:1,2:1,5:1,10:1铺板,重复三次。
(5)培养24小时,将孔板从培养箱中取出,收集200ul上清。然后通过检测Luciferase活性反映重组CAR-T细胞对靶细胞的裂解能力。
靶细胞裂解百分数计算公式:
结果分析:HER2 UCAR-T对SK-BR-3-Luciferase-GFP细胞有显著的杀伤作用,在效靶比1:2时即可达到90%以上的杀伤效率(见图4)。
4.2 HER2 UCAR-T细胞与靶细胞共培养细胞因子分泌检测
收集上述共培养体系的上清,检测细胞因子分泌水平。结果分析(图5A-5C):HER2 UCAR-T显著激活,大量分泌IL-2,IFN-γ和TNF-α细胞因子。
实施例5靶向HER2 UCAR-T细胞体内抗肿瘤效果
8-10周大的NSG小鼠皮下注射肿瘤细胞SK-BR-3-Luciferase-GFP(5x10
^6),小鼠分成三组,每组5只,成瘤时间一般2-4周。分别向每组小鼠瘤内注射HER2 UCAR-T细胞,HER2 CAR-T细胞,无基因敲除的T细胞5E6,单点注射,注射体积50ul。通过荧光素酶监测小鼠肿瘤消退情况。
结果分析(图6):回输anti-HER2 UCAR-T细胞的小鼠,肿瘤生长速度明显减缓,anti-HER2 UCAR-T细胞表现出卓越的抗肿瘤效果。
实施例6靶向HER2 UCAR细胞体内半衰期检测
准备人源化免疫系统小鼠(hHSC-NCG)15只。分成3组。制备细胞,实验组anti-HER2 UCAR-T细胞(敲除TRAC+HLA-A02);对照组1:anti-HER2 CAR-T;对照组2:anti-HER2 UCAR-T细胞(敲除TRAC+B2M);每只小鼠注射1x10^7细胞,不同的时间点采血D0,2h,D3,D7,D14,D21,D28,D35,D42,D49,D56,D60。提取不同时间点血样中基因组,用QPCR绝对定量的方法计算copy/ng genome DNA,阳性对照用第14天收获的UCAR-T细胞,阴性对照用DEPC水。
结果分析:anti-HER2 UCAR-T细胞(敲除TRAC+HLA-A02)在小鼠体内存活时间超过9周,并在week7进行二次扩增(见图7)。
实施例7通用型T细胞的体外安全性验证
(1)GVHD反应:制备TRAC,HLA-A双敲T细胞,无基因敲除的T细胞,辐照同种异体PBMC,分别刺激制备的2组细胞,检测IFN-r的水平。
结果分析:TRAC,HLA-A双敲T细胞组IFN-γ分泌水平很低,表明TRAC敲除降低了GVHD反应。
(2)同种异体反应:同种异体PBMC刺激辐照后的2组细胞,检测IFN-r的水平。
结果分析:TRAC,HLA-A双敲T细胞组IFN-γ分泌水平很低,表明HLA-A的敲除降低了同种异体反应。
实施例8通用型T细胞的体内安全性验证
(1)GVHD反应:制备TRAC,HLA-A双敲T细胞,无基因敲除的T细胞。取8-10周NSG小鼠分别注射1x10^7,通过临床指标:存活率,皮毛纹理和皮肤完整性等,观察移植物抗宿主反应。细胞因子检测:取外周血血清,检测IL6、IL-2、TNF-α、IFN-γ等细胞因子的水平。取血时间点:回输前,24h,D3,D7,D14,D28,2M。脏器病变检测:观察期结束时(2个月左右),取小鼠的脾脏,肝脏,皮肤、胃肠道,肺,肾脏进行HE切片染色分析。
结果分析:注射未经处理的T细胞的5只小鼠中,有4只在注入后2个月内发生了致死性异种移植物抗宿主病(GVHD)。而接受TRAC,HLA-A双敲细胞的小鼠中没有一个出现GVHD;TRAC,HLA-A双敲T细胞组细胞因子IL6、IL-2、TNF-α、IFN-γ分泌水平很低;并且小鼠不同器官形态正常。说明TRAC,HLA-A双敲T细胞组很大程度上降低了GVHD反应。
(2)同种异体反应:制备TRAC,HLA-A双敲CAR-T细胞,共同注射1x10^7TCR-HLA-A-双敲CAR-T细胞和2x10^6同种异型T细胞到NSG小鼠体内。对照组:注射1x10^7TCR-CAR-T细胞到NSG小鼠体内。
不同时间点取血测CAR拷贝数。比较两组CAR的拷贝数变化。时间点:D1,D5,D7,D10,D14。
结论:D24天,对照组小鼠排异反应明显,基本检测不到拷贝数;而实验组拷贝数仍处在相对稳定水平,说明排异反应明显减弱,实验组细胞在小鼠体内存活时间延长说明TRAC,HLA-A双敲CAR-T细胞组很大程度上降低了排异反应(见图8A-8B)。
实施例9基因编辑的安全性分析
制备TRAC,HLA-A双敲T细胞,无基因敲除的T细胞,检测敲除效率后,进行以下分析:
(1)脱靶:
对照组:转CAS9+ODN标签
实验组:转CAS9+sgRNA(TRAC+HLA-A)+ODN标签
On-target and off-target-WGS:(Whole genome sequencing):分别取无基因敲除的T细胞、TRAC,HLA-A双敲的T细胞各1×10^6送苏州金维智生物科技有限公司检测。
结果分析:实验组脱靶率很低,而且脱靶主要集中在基因之间和内含子上,对基因功能的影响不大(见图9)。
(2)染色体易位:采用qPCR方法对同时编辑TRAC和HLA基因座时可能发生的重排进行了定量。两个易位被标记为TRAC:HLA,HLA:TRAC。合成的模板质粒中的阳性参考样品作为检测对照进行评估。以HLA基因组靶区两侧的扩增片段作为内对照。提取基因组DNA进行实时定量PCR,根据标准曲线和Cq值计算基因组DNA的基因拷贝数。
结果分析:双敲T细胞(TRAC+HLA-A)在D14(收获)检测是否发生染色体易位,检测结果:两种易位方式检测值都接近零检值,提示基因座没有发生重排(见图10)。
(3)核型分型:分别取铺满度在70-80%的无基因敲除的T细胞、TRAC,HLA-A双敲的T细胞各1×10^6装于2个T25瓶中,加满培养液,盖上全密封盖子,缠上封口膜,寄送至浙江如耀生物科技有限公司检测。
结果分析:和对照组比,实验组核型正常(见11)。
(4)Cas9蛋白残留:细胞制备时,取敲除前、敲除后以及收获前三个时间点的细胞各1×10^6进行裂解,随后用蛋白定量试剂盒(NOVATEINBIO,货号NB-E1372PR)进行定量,将各组样品调整至相同上样量2μg,根据说明书用CRISPR/Cas9蛋白ELISA试剂盒进行检测。样品中的Cas9蛋白被牢固稳定地点在试纸孔上。然后使用检测抗体识别被绑定的Cas9蛋白,然后显影剂进行显影。Cas9比值与吸光度成正比,通过与Cas9对照品比较来定量Cas9蛋白的绝对量。
结果分析:双敲T细胞(TRAC+HLA-A)分别在电转前(D3)、电转后换液前(D5)、D9、D14(收获)四个时间点检测spCas9的残留,除了电转后换液前(D5)检测到微量残留,其余三个时间点均未检出。(见图12)。
实施例10制备单基因敲除的T细胞
使用电转试剂盒(购自LONZA,货号V4XXP-3024)通过电转方式将RNP复合体转入实施例2制备的激活后T细胞。提前30min在孔板中预热培养基(X-VIVO15培养基+10%FBS+IL2(200U/ml)+IL7(10n g/ml)+IL15(5ng/ml))。电转缓冲液按照Nucleofector Solution:Supplement=82:18进行配置。准备RNP复合体:TRAC的sgRNA序列为sg9(如SEQ ID NO:138所示),HLA-A的sgRNA序列为HLA-A02 Sg2(如SEQ ID NO:154所示)或HLA-A02 Sg5(如SEQ ID NO:155所示)或HLA-A11 sg21(如SEQ ID NO:185所示)或HLA-A11 Rsg2(如SEQ ID NO:184所示),先将20μg sgRNA加入到PCR管(无RNA酶)中,再加入10μg Cas9蛋白(购自thermo,货号A36499),轻轻混匀后,室温孵育12min。将实 施例2培养的激活后T细胞进行计数,300g离心8min弃上清,加入PBS重悬细胞,吸取1E7个细胞重新300g离心8min,弃上清后用100μl配置好的电转缓冲液重悬细胞。将孵育好的RNP复合体加入上述细胞悬液中,轻柔混匀,然后将混合物轻轻地转移到电转杯中。将电转杯放在Lonza-4D电转仪上,选用EO-115电转程序进行电转。往电转杯中加入预热的培养基,然后用配套吸管将细胞转入孔板中预热的培养基中,然后放置于37℃、5%CO
2培养箱中培养。
实施例11基因敲除效率检测方法的比较
(1)Sanger测序检测
细胞计数,取3~5×104细胞,2000r/min离心5min,尽量去干净上清,然后每管加20μl DE裂解液,细胞裂解后加到PCR管中,瞬时离心后上PCR仪,上机条件:65℃ 30min,4℃3 0s、95℃ 2min、16℃无限。使用引物对TRAC-For/TRAC-Rev,或HLA-A For/HLA-A Rev,将裂解产物作为模板进行PCR,将PCR产物交送金唯智进行Sanger测序。得到sanger测序结果后,使用网站:https://moriaritylab.shinyapps.io/editr_v10/中的EditR编辑器预测编辑发生的位置以及编辑效率。
(2)TA克隆测序检测
利用AxyPrepTM PCR产物清洁试剂盒(购自AXYGEN),将PCR产物纯化,随后用试剂盒(DNA A-Tailing Kit,购自TaKaRa)将纯化后的PCR产物加粘性末端,通过DNA Ligation Kit Ver2.1(购自TaKaRa)将产物连接至T载体(pMDTM19-T Vector Cloning Kit购自TaKaRa),连接产物转化感受态细胞(DH5alpha),然后涂布于含氨苄抗性的LB板,在37℃培养箱培养约12小时后挑单菌落,并将单菌落菌液交由金维智进行测序。敲除效率=突变克隆数/总克隆数。
(3)流式检测细胞计数
取10E5至10E8细胞,2000rpm离心5min,去上清,然后每管加100μl的PBS缓冲液重悬细胞,再加入anti-human AB TCR-APC(购自eBioscience)抗体5μl,HLA-A02 Monoclonal Antibody(BB7.2),APC,eBioscince
TM(购自invitrogen)抗体5μl,混合均匀后于室温孵育10min。2000rpm离心5min后再以PBS缓冲液洗2遍,重悬细胞并通过BD FACSAria流式细胞仪进行检测,可得细胞表面TCR、HLA-A02表达阳性率。敲除效率=(A-B)/A×100%;A为对照组表达阳性率;B为敲除组表达阳性率。
TRAC单基因敲除的三种检测结果如图13至图15所示,敲除效率计算结果如表1所示,三种检测方法基本相同,后续试验仅采用Sanger测序方法检测编辑效率。
表1基因敲除效率检测方法结果
针对HLA-A02基因编辑的Sanger测序方法结果如图16-17所示,编辑效率均为90%;针对HLA-A11基因编辑的Sanger测序方法结果如图18-19所示。
实施例12制备TRAC基因和HLA-A基因双基因敲除的T细胞
使用电转试剂盒(购自LONZA,货号:V4XXP-3024)通过电转方式将RNP复合体转入实施例2制备的激活后T细胞。提前30min在孔板中预热培养基(X-VIVO15培养基+10%FBS+IL2(200U/ml)+IL7(10ng/ml)+IL15(5ng/ml))。电转缓冲液按照Nucleofector Solution:Supplement=82:18进行配置。准备RNP复合体:分别将20μg TRAC sgRNA(TRAC Sg9),20μg HLA-A sgRNA(HLA-A02 Sg2或HLA-A02 Sg5或HLA-A11sg21或者靶向HLA-A*24:02:01、HLA-A*30:01:01:01、HLA-A*33:01:01:01、HLA-A*03:01:01:01、HLA-A*01:01:01:01或HLA-A*26:01:01:01的sgRNA)加入到PCR管(无RNA)中,再各自加入10μg Cas9蛋白(购自thermo,货号A36499),轻轻混匀后,室温孵育12min。将实施例2培养的激活后T细胞进行计数,300g离心8min弃上清,加入PBS重悬细胞,吸取1E7个细胞重新300g离心8min,弃上清后用100μl配置好的电转缓冲液重悬细胞。将孵育好的TRAC与HLA-A的RNP复合体加入上述细胞悬液中,轻柔混匀,然后将混合物轻轻地转移到电转杯中。将电转杯放在Lonza-4D电转仪上,选用EO-115电转程序进行电转。往电转杯中加入预热的培养基,然后用配套吸管将细胞转入孔板中预热的培养基中,然后放置于37℃、5%CO
2培养箱中培养。
通过测序检测双基因敲除效率,可得到双基因敲除效率均不低于80%的TRAC阴性、HLA-A阴性的T细胞。结果如图20-21所示。其中图20A显示的是利用HLA-A02 Sg5敲除HLA-A02的结果,其中上一行显示的是对照组结果(即没有使用HLA-A02 Sg5进行敲除);下一行显示的是同时敲除HLA-A02和TRAC的结果;其中图20B显示的是利用TRAC Sg9敲除TRAC的结果,其中上一行显示的是对照组结果(即没有使用TRAC Sg9进行敲除);下一行显示的是同时敲除HLA-A02和TRAC的结果。图21A-21B显示了敲除HLA- A02和TRAC蛋白水平的敲除情况,其中NEG指阴性对照,WT指没有经任何敲除处理的情况,TRAC+HLA-A双敲指同时敲除HLA-A02和TRAC的结果。
实施例13双基因敲除的T细胞中TRAC基因,HLA-A基因,B2M基因和CIITA基因与相应细胞中的相应基因的表达区别
(1)利用实施例2制备的激活后T细胞,分为两组,一组作为对照,另一组按照实施例5的方法制备TRAC基因和HLA-A基因双基因敲除的T细胞,按照实施例4步骤(1)的方式进行Sanger测序。依据测序结果获得TRAC和HLA-A双基因敲除的细胞。将制备的双基因敲除T细胞与相应TRAC和HLA-A抗体孵育,通过流式分选或磁珠分选,可以得到双基因敲除的细胞株。
(2)检测双基因敲除的T细胞与对照组相比mRNA表达水平的变化。使用RNA提取试剂盒(购自QIAGEN,货号:74004)提取RNA,使用逆转录试剂盒(购自Applied Biosystems,货号:4368814)对RNA进行逆转录得到cDNA,以cDNA为模板进行定量PCR检测。
(3)检测双基因敲除的T细胞与对照组相比蛋白表达水平的变化。使用全蛋白提取试剂(购自Thermo Scientific,货号:87787)提取蛋白,通过Western Blot方法或流式方法检测蛋白表达水平,使用的抗体分别为TRAC抗体(购自eBioscience货号:17-9986-42)、HLA-A抗体(购自Merck货号:17-9876-41)、B2M抗体(购自Invitrogen货号:A15770)和CIITA抗体(购自OriGene货号:CF812200)。
Sanger测序检测双基因敲除的T细胞中TRAC和/或HLA-A基因的核苷酸序列相对于对照组发生了变化;定量PCR显示双基因敲除的T细胞中TRAC和/或HLA-A基因mRNA表达量下调,而B2M和/或CIITA基因的mRNA表达量没有下调。FACS和Western Blot结果显示双基因敲除的T细胞中蛋白表量下调,B2M和/或CIITA蛋白表达量没有下调。
结果如图22-23所示。其中,图22显示的是基因表达的mRNA水平测定,其中图22显示了TRAC、HLA-A、B2M和CIITA的mRNA水平;其中WT指没有经任何敲除处理的情况,双敲组指TRAC基因和HLA-A基因双基因敲除的T细胞的结果。图23显示的是基因表达的蛋白水平测定,其中图23A-23B分别显示了B2M和CIITA的蛋白表达水平;其中NEG指阴性对照,WT指没有经任何敲除处理的情况,TRAC+HLA-A双敲指TRAC基因和HLA-A基因双基因敲除的T细胞的结果。
实施例14制备TRAC基因、HLA-A/B2M基因和CIITA基因三基因敲除的T细胞并验证其中相应三种基因的表达变化
(1)按照实施例13步骤(1)的方式准备对照组和TRAC基因、HLA-A基因和CIITA基因三基因敲除的细胞,以及TRAC基因、B2M基因和CIITA基因三基因敲除的细胞。
(2)按照实施例13步骤(3)的方式通过FACS和Western Blot方法检测蛋白表达水平变化。
相对于对照组细胞,TRAC、HLA-A和CIITA三基因敲除的T细胞中TRAC、HLA-A和CIITA基因的蛋白表达量下调;相对于对照组细胞,TRAC、B2M和CIITA三基因敲除的T细胞中TRAC、HLA-A和CIITA基因的蛋白表达量下调。
(3)使用TRAC(购自eBioscience,货号:17-9986-42)、HLA-A(购自Merck,货号:17-9876-41)、B2M(购自:Invitrogen,货号:A15770)抗体通过流式细胞术检测实施例13中的双基因敲除细胞和本实施例中的两种三基因敲除细胞的敲除效率,结果显示在单细胞水平同时实现多基因敲除的效率,双基因敲除明显高于三基因敲除。
结果如图24A-24D所示。其中图24A-24C依次为TRAC、HLA-A和B2M蛋白质水平的敲除情况。其中,WT指没有经任何敲除处理的情况,TRAC+HLA-A双敲指TRAC基因和HLA-A基因双基因敲除的T细胞的结果;TRAC+HLA-A+CIITA三敲指TRAC、HLA-A和CIITA三基因敲除的T细胞的结果;其中TRAC+B2M+CIITA三敲指B2M、CIITA和TRAC三基因敲除的T细胞的结果;TRAC+HLA-A敲低指实施例16制备的TRAC基因和HLA-A基因敲低的T细胞的结果。图24D显示了CIITA蛋白质水平的敲除情况。
图24的结果显示,和WT对照组相比,TRAC、HLA-A、CIITA和B2M的蛋白质水平下调。同时,与TRAC+HLA-A+CIITA三敲或TRAC+B2M+CIITA三敲相比,TRAC+HLA-A双敲的敲除效率更高。
实施例15设计反义RNA序列
通过数据库https://www.ncbi.nlm.nih.gov/或www.ensembl.org/,获得相应基因(TRAC基因和HLA-A基因)的转录RNA序列,参考如下原则设计siRNA:
尽量避免起始密码子下游50-100个核苷酸与终止密码子上游100个核苷酸的序列;选择长度小于30个核苷酸的序列;避免4个或以上的连续相同碱基;避免内含子区域;避免重复序列;避免单核苷酸多态性(SNP)位点;序列GC含量30%-60%之间,优先选择序列模式AA(N<sub>19)、NA(N<sub>21)或NAR(N<sub>17)YNN,A为腺苷酸;T为胸腺苷酸;R 为腺苷酸或鸟苷酸(嘌呤类);Y为胸腺苷酸或胞苷酸(嘧啶类);N为腺苷酸、胸腺苷酸、鸟苷酸或胞苷酸;对选择的序列进行同源性比较分析,避免反义RNA与其他基因或序列具有显著的同源性,由此造成脱靶效应。同源性分析利用NCBI Blast tool:Nucleotide-nucleotide BLAST(blastn),UCSC Blat tool或Ensembl Blast进行。
设计获得的反义RNA序列包括HLA-A-homo-551(其包含SEQ ID NO:194所示的核苷酸序列);HLA-A-homo-NEG(其包含SEQ ID NO:195所示的核苷酸序列);TRAC-homo-375(其包含SEQ ID NO:196所示的核苷酸序列);TRAC-homo-NEG(其包含SEQ ID NO:197所示的核苷酸序列)。
实施例16制备TRAC基因和HLA-A基因敲低的T细胞
利用通过实施例15设计的反义RNA进行双基因敲低。公司制备TRAC基因和HLA-A基因反义RNA序列的慢病毒(吉玛)。按照实施例2的方式制备CD3
+T细胞(D0天),并用CD3/CD28抗体磁珠激活,将携带TRAC基因和HLA-A基因的反义RNA序列的慢病毒转染激活的T细胞(D1天),D2天洗去慢病毒载体,继续培养至D5天。收集培养至D5天的T细胞,通过定量PCR或Western Blot等方法对基因敲低效率进行检测。对获得的T细胞进行相应TRAC和HLA-A抗体标记,通过流式分选或磁珠分选的方式可以得到TRAC基因和HLA-A基因敲低的T细胞。结果显示,TRAC和HLA-A基因敲低组中TRAC和HLA-A的mRNA和蛋白表达水平均下调。其中,图25A-25B依次为TRAC和HLA-A mRNA水平的敲除情况。其中,WT指没有经任何敲除处理的情况,TRAC+HLA-A双敲指TRAC基因和HLA-A基因双基因敲除的T细胞的结果。其中,为TRAC和HLA-A蛋白质水平的敲除水平可以参见图24的结果。
实施例17不同T细胞活性的区别
制备实施例2、12、14和16中的无基因敲除、双基因敲除、三种基因敲除和双基因敲低的T细胞,比较几种T细胞活性各组细胞计数并分别各取1*10
6细胞接种24孔板中,每孔加入PHA(0.3μg/ml)(离子霉素+)或5ng/ml的PMA和50ng/ml的ionomycin于细胞中,继续培养5小时后,使用CD69(早期活化)(购自BD Biosciences,货号:FN50)、CD137(偏晚期)(购自BD Biosciences,货号:4B4-1)抗体,流式检测细胞的活化状态。结果表明,双基因敲除、双基因敲低的T细胞活性优于三基因敲除的T细胞。
CD69和CD137的蛋白质水平表达情况分别参见图26A-26B。其中,WT指没有经任何敲除处理的情况,TRAC+HLA-A双敲指TRAC基因和HLA-A基因双基因敲除的T细胞的结 果;TRAC+HLA-A+CIITA三敲指TRAC、HLA-A和CIITA三基因敲除的T细胞的结果;其中TRAC+B2M+CIITA三敲指B2M、CIITA和TRAC三基因敲除的T细胞的结果;TRAC+HLA-A敲低指实施例16制备的TRAC基因和HLA-A基因敲低的T细胞的结果。
实施例18不同T细胞对异体NK细胞反应性的区别
对实施例2、12、14和16中的无基因敲除、双基因敲除、三种基因敲除和双基因敲低的T细胞进行CFSE(invitrogen,C34554)标记,细胞计数,分别取1*10
6细胞并以1:1比例与NK细胞(NK92MI)进行共培养,24小时后收集共培养的各组细胞,流式细胞检测混合细胞中CFSE阳性细胞的比率。
结果表明,NK细胞对双基因敲除、双基因敲低的T细胞的杀伤毒性低于三基因敲除的T细胞。结果如图27所示。其中,NK+T指将NK细胞与没有经任何敲除处理的T细胞共培养的情况;NK+TRAC+HLA-A敲低指将NK细胞与实施例16制备的TRAC基因和HLA-A基因敲低的T细胞的结果共培养的情况;NK+TRAC+HLA-A双敲指将NK细胞与TRAC基因和HLA-A基因双基因敲除的T细胞共培养的情况;NK+TRAC+HLA-A+CIITA三敲指将NK细胞与TRAC、HLA-A和CIITA三基因敲除的T细胞共培养的情况;NK+TRAC+B2M+CIITA三敲指将NK细胞与B2M、CIITA和TRAC三基因敲除的T细胞共培养的情况。
实施例19不同的T细胞异体免疫排斥反应的区别
供者1来源的外周血制备实施例2、12、14和16中的无基因敲除、双基因敲除、三种基因敲除和双基因敲低的T细胞。供者2来源的外周血制备CD3
+T细胞。将供者1外周血制备的各组细胞分别与供者2外周血按照实施例2制备的CD3
+T细胞等比例混合,24小时后检测细胞混合体系中的IFN-γ的表达水平。结果显示,双基因敲除的T细胞组IFN-γ的表达水平低于三基因敲除的T细胞组。
结果如图28所示,WT指没有经任何敲除处理的情况,TRAC+HLA-A双敲指TRAC基因和HLA-A基因双基因敲除的T细胞的结果;TRAC+HLA-A+CIITA三敲指TRAC、HLA-A和CIITA三基因敲除的T细胞的结果;其中TRAC+B2M+CIITA三敲指B2M、CIITA和TRAC三基因敲除的T细胞的结果;TRAC+HLA-A敲低指实施例16制备的TRAC基因和HLA-A基因敲低的T细胞的结果。
实施例20制备TRAC基因和HLA-A基因双基因敲除的CAR-T细胞,TRAC基因,HLA-A基因和CIITA基因三基因敲除的CAR-T细胞以及TRAC基因,B2M基因和CIITA基因敲除的CAR-T细胞
(1)按照实施例2的方式获得CD3
+T细胞(D0天),并用CD3/CD28抗体磁珠激活,激活后于D1天进行慢病毒载体(包含CD19-CAR、CD20-CAR或BCMA-CAR等的慢病毒)转染,D2天洗去慢病毒载体,D3天对CAR阳性的T细胞进行分选并继续培养至D5天。
(2)取D5天的CAR-T细胞为初始细胞,分别按照实施例12和实施例14中的方式制备TRAC基因和HLA-A基因双基因基因敲除的细胞,TRAC基因、HLA-A基因和CIITA基因以及TRAC基因、B2M基因和CIITA基因三基因敲除的CAR-T细胞。
(3)通过流式细胞技术检测可得到上述双基因敲除和三基因敲除的CAR-T细胞,其中双基因敲除CAR-T细胞的得率高于三基因敲除CAR-T细胞。
结果如图29A-29D所示。其中,图17A-17C依次为TRAC、HLA-A和B2M蛋白质水平的敲除情况。图29D显示了CIITA蛋白质水平的敲除情况。其中,WT指没有经任何敲除处理的情况,TRAC+HLA-A双敲指TRAC基因和HLA-A基因双基因敲除的CAR-T细胞的结果;TRAC+HLA-A+CIITA三敲指TRAC、HLA-A和CIITA三基因敲除的CAR-T细胞的结果;其中TRAC+B2M+CIITA三敲指B2M、CIITA和TRAC三基因敲除的CAR-T细胞的结果。
其中,CD19CAR的转染效率如图30A-30B所示。其中,CAR30%+即代表CD19 CAR的转染效率。
图31显示了不同细胞的扩增倍数。其中,TRAC基因和HLA-A基因双基因基因敲除的CAR-T细胞扩增倍数最高。
实施例21 TRAC基因和HLA-A基因双基因敲除的CAR-T细胞抗肿瘤效果
制备实施例21中的TRAC基因和HLA-A基因双敲除的CAR-T细胞(靶向CD19、CD20或BCMA),接种表达荧光素酶基因的靶细胞(靶基因阳性的白血病或淋巴瘤细胞系,如Raji、Jurkat、MM1S等)至孔板中,再分别以不同效靶比(1∶2.5,1∶1,5:1,10:1)加入双基因敲除的CAR-T细胞、三基因敲除的CAR-T细胞或无基因敲除的T细胞,共培养24小时后将细胞转移至检测孔板中,加入荧光素酶底物,酶标仪检测荧光值。杀伤效率=1-靶细胞T细胞共培养荧光值/单独培养的靶细胞荧光值。
结果显示TRAC基因和HLA-A基因双敲除的CAR-T细胞对肿瘤细胞有显著的杀伤效 果。
图32显示了对CD19靶细胞Raji-Luciferase的杀伤效果,其中TRAC基因和HLA-A基因双敲除的CAR-T细胞的杀伤效果最为显著。其中每个E/T比下从左到右依次是A-D的图注所对应的结果。
实施例22 TRAC基因和HLA-A基因双基因敲除的CAR-T细胞抗肿瘤效果
NSG小鼠静脉注射肿瘤细胞,肿瘤成功建立后向小鼠体内回输TRAC基因和HLA-A基因双基因敲除的CAR-T细胞、三基因敲除的CAR-T细胞或无基因敲除的T细胞,监测小鼠肿瘤体积。
回输双基因敲除CAR-T细胞的小鼠,肿瘤生长速度明显减缓。
结果如图33-34所示。其中,图33显示了对小鼠的给药方式,i.v.表示静脉注射,CAR-T细胞代表表达CD19 CAR的双基因敲除的CAR-T细胞、三基因敲除的CAR-T细胞。图32显示了小鼠在施用CAR-T细胞后体内肿瘤的体积情况。其中,图32从左至右列依次显示了分别施用生理盐水、未改造的T细胞、TRAC基因和HLA-A基因双基因敲除的CD19 CAR-T细胞、TRAC、HLA-A和CIITA三基因敲除的CD19 CAR-T细胞、B2M、CIITA和TRAC三基因敲除的CD19 CAR-T细胞后,小鼠体内肿瘤的体积情况。结果发现回输TRAC基因和HLA-A基因双基因敲除的CAR-T细胞的小鼠,肿瘤生长的速度明显减缓。
综上,
1.本申请制备了一种靶向HER2的嵌合抗原受体,该重组受体的抗原结合域(靶向部分)来自scFv,具有结构稳定的特点。
2.本申请提供了一种慢病毒表达载体。以pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP为骨架,将载体的氨苄抗性基因β-内酰胺酶替换为源自Tn5的氨基糖苷磷酸转移酶,使载体具有卡那霉素抗性;删除了在体内应用中具有潜在威胁性的CMV启动子及其临近的下游多克隆位点;将原载体中由EF1启动子启动表达的copGFP基因删除,保留SalI酶切位点,并在SalI 5’端加入SmaI酶切位点供载体构建用,形成最终目的载体。加入的SmaI酶切位点是最终目的载体的单一酶切位点,载体的其他序列部分不具有该酶切位点。
3.本申请优化了蛋白质RNA复合体电转染技术。获得了原代T细胞中90%以上的双基因敲除效率。
4.本申请供者来源基于人群中高频出现的HLA-B纯合子,患者HLA-B其中一个等位基因和供者纯合子一致即可,来源于这些供者的细胞能覆盖高数量的患者人群,且能够降低HLA-B引起的排异反应。
5.本申请筛选出了与排异高度相关的HLA-A分子进行敲除,而保留了其他HLA-I类分子,既减少了异体细胞的排异,也避免了HLA分子完全敲除被NK细胞清除的发生,大大延长了同种异体CAR-T细胞在体内的半衰期。
6.本申请首次构建了高效率双敲除TCR,HLA-A的HER2-UCAR-T细胞,做到一种安全型货架式即用型治疗剂,提高抗肿瘤效果,用于乳腺癌等疾病的治疗。
前述详细说明是以解释和举例的方式提供的,并非要限制所附权利要求的范围。目前本申请所列举的实施方式的多种变化对本领域普通技术人员来说是显而易见的,且保留在所附的权利要求和其等同方式的范围内。
Claims (126)
- 嵌合抗原受体(CAR),其包含靶向部分,所述靶向部分包含HCDR3,所述HCDR3包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求1所述的嵌合抗原受体,其中所述靶向部分包含HCDR2,所述HCDR2包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求1-2中任一项所述的嵌合抗原受体,其中所述靶向部分包含HCDR1,所述HCDR1包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求1-3中任一项所述的嵌合抗原受体,其中所述靶向部分包含SEQ ID NO:1所示的重链可变区中的HCDR1、HCDR2和HCDR3。
- 根据权利要求1-4中任一项所述的嵌合抗原受体,其中所述靶向部分包含HCDR1、HCDR2、HCDR3,所述HCDR3包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列;所述HCDR2包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列;以及所述HCDR1包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求1-5中任一项所述的嵌合抗原受体,其中所述靶向部分包含H-FR1,所述H-FR1的C末端与所述HCDR1的N末端直接或间接地相连,且所述H-FR1包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求1-6中任一项所述的嵌合抗原受体,其中所述靶向部分包含H-FR2,所述H-FR2位于所述HCDR1与所述HCDR2之间,且所述H-FR2包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求1-7中任一项所述的嵌合抗原受体,其中所述靶向部分包含H-FR3,所述H-FR3位于所述HCDR2与所述HCDR3之间,且所述H-FR3包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求1-8中任一项所述的嵌合抗原受体,其中所述靶向部分包含H-FR4,所述H-FR4的N末端与所述HCDR3的C末端直接或间接地相连,且所述H-FR4包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求1-9中任一项所述的嵌合抗原受体,其中所述靶向部分包含H-FR1,H-FR2,H-FR3和H-FR4,所述H-FR1包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列;所述H-FR2包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列;所述H-FR3包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列;以及所述H-FR4包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求1-10中任一项所述的嵌合抗原受体,其中所述靶向部分包含VH,所述VH包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求1-11中任一项所述的嵌合抗原受体,其中所述靶向部分包含LCDR3,所述LCDR3包含SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求1-12中任一项所述的嵌合抗原受体,其中所述靶向部分包含LCDR2,所述LCDR2包含SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求1-13中任一项所述的嵌合抗原受体,其中所述靶向部分包含LCDR1,所述LCDR1包含SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求1-14中任一项所述的嵌合抗原受体,其中所述靶向部分包含SEQ ID NO:10所示的轻链可变区中的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
- 根据权利要求1-15中任一项所述的嵌合抗原受体,其中所述靶向部分包含LCDR1、LCDR2、LCDR3,所述LCDR3包含SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列;所述LCDR2包含SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列;以及所述LCDR1包含SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求1-16中任一项所述的嵌合抗原受体,其中所述靶向部分包含L-FR1,所述L-FR1的C末端与所述LCDR1的N末端直接或间接地相连,且所述L-FR1包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求1-17中任一项所述的嵌合抗原受体,其中所述靶向部分包含L-FR2,所述L-FR2位于所述LCDR1与所述LCDR2之间,且所述L-FR2包含SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求1-18中任一项所述的嵌合抗原受体,其中所述靶向部分包含L-FR3,所述L-FR3位于所述LCDR2与所述LCDR3之间,且所述L-FR3包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求1-19中任一项所述的嵌合抗原受体,其中所述靶向部分包含L-FR4,所述L-FR4的N末端与所述LCDR3的C末端直接或间接地相连,且所述L-FR4包含SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求1-20中任一项所述的嵌合抗原受体,其中所述靶向部分包含L-FR1,L-FR2,L-FR3和L-FR4,所述L-FR1包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列;所述L-FR2包含SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列;所述L-FR3包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列;以及所述L-FR4包含SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求1-21中任一项所述的嵌合抗原受体,其中所述靶向部分包含VL,所述VL包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求1-22中任一项所述的嵌合抗原受体,其中所述靶向部分包括抗体或抗原结合片段。
- 根据权利要求23所述的嵌合抗原受体,其中所述抗原结合片段选自下组:Fab,Fab’,F(ab)2,Fv片段,F(ab’)2,scFv,di-scFv,VHH和/或dAb。
- 根据权利要求1-24中任一项所述的嵌合抗原受体,其中所述靶向部分包括scFv。
- 根据权利要求25所述的嵌合抗原受体,其中所述scFv靶向HER2。
- 根据权利要求1-26中任一项所述的嵌合抗原受体,其中所述靶向部分包含SEQ ID NO:198-199中任一项所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求1-27中任一项所述的嵌合抗原受体,其包括跨膜域,所述跨膜域包含源自选自下述蛋白的跨膜域或其组合:CD8A、CD8B、CD28、CD3e、CD3ε、4-1BB、CD4、CD27、CD7、PD-1、TRAC、TRBC、CD3ζ、CTLA-4、LAG-3、CD5、ICOS、OX40、NKG2D、2B4、CD244、FcεRIγ、BTLA、CD30、GITR、HVEM、DAP10、CD2、NKG2C、LIGHT、DAP12,CD40L、CD154、TIM1、CD226、DR3、CD45、CD80、CD86、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64和SLAM。
- 根据权利要求28所述的嵌合抗原受体,其中所述跨膜域包含源自CD8A或CD8B的跨膜域。
- 根据权利要求28-29中任一项所述的嵌合抗原受体,其中所述跨膜域包含SEQ ID NO:21至SEQ ID NO:69中任一项所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求1-30中任一项所述的嵌合抗原受体,其包括共刺激信号传导结构域,所述共刺激信号传导结构域包含源自选自下述蛋白的共刺激信号传导结构域或其组合:CD28、4-1BB、CD27、CD2、CD7、CD8A、CD8B、OX40、CD226、DR3、SLAM、CDS、ICAM-1、NKG2D、NKG2C、B7-H3、2B4、FcεRIγ、BTLA、GITR、HVEM、DAP10、DAP12、CD30、CD40、CD40L、TIM1、PD-1、LFA-1、LIGHT、JAML、CD244、CD100、ICOS、CD40和MyD88。
- 根据权利要求31所述的嵌合抗原受体,其中所述共刺激信号传导结构域包括源自4-1BB的共刺激信号传导结构域。
- 根据权利要求31-32中任一项所述的嵌合抗原受体,其中所述共刺激信号传导结构域包含SEQ ID NO:70至SEQ ID NO:102中任一项所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求31-33中任一项所述的嵌合抗原受体,其中所述共刺激信号传导结构域的N端与所述跨膜域的C端直接或间接地连接。
- 根据权利要求1-34中任一项所述的嵌合抗原受体,其包括胞内信号转导结构域,所述胞内信号转导结构域包含源自选自下述蛋白的胞内信号转导结构域或其组合:CD3ζ、CD3δ、CD3γ、CD3ε、CD79a、CD79b、FceRIγ、FceRIβ、FcγRIIa、牛白血病病毒gp30、Epstein-Barr病毒(EBV)LMP2A、猿免疫缺陷病毒PBj14 Nef、DAP10、DAP-12和至少包含一个ITAM的结构域。
- 根据权利要求35所述的嵌合抗原受体,其中所述胞内信号转导结构域包含源自CD3ζ、CD3δ、CD3γ或CD3ε的胞内信号转导结构域。
- 根据权利要求35-36中任一项所述的嵌合抗原受体,其中所述胞内信号转导结构域包含SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:103至SEQ ID NO:113中任一项所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求35-37中任一项所述的嵌合抗原受体,其中所述胞内信号转导结构域的N端与所述共刺激信号传导结构域的C端直接或间接地连接。
- 根据权利要求1-38中任一项所述的嵌合抗原受体,其在靶向部分和跨膜域之间包括铰链区,所述铰链区包含源自选自下述蛋白的铰链区或其组合:CD28、IgG1、IgG4、IgD、4-1BB、CD4、CD27、CD7、CD8、PD-1、ICOS、OX40、NKG2D、NKG2C、FcεRIγ、BTLA、GITR、DAP10、TIM1、SLAM、CD30和LIGHT。
- 根据权利要求39所述的嵌合抗原受体,所述铰链区包含源自CD8的铰链区。
- 根据权利要求39-40中任一项所述的嵌合抗原受体,所述铰链区包含SEQ ID NO:114至SEQ ID NO:135中任一项所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求1-41中任一项所述的嵌合抗原受体,所述嵌合抗原受体包括非靶向部分,所述非靶向部分包含CD8A的跨膜域、CD8的铰链区、4-1BB的胞内共刺激信号传导结构域和CD3ζ胞内信号转导结构域。
- 根据权利要求42所述的嵌合抗原受体,所述嵌合抗原受体的非靶向部分包含SEQ ID NO:19中任一项所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求1-43中任一项所述的嵌合抗原受体,其包含SEQ ID NO:200所示的氨基酸序列。
- 分离的核酸分子,其编码权利要求1-44中任一项所述的嵌合抗原受体。
- 载体,其包含权利要求45所述的分离的核酸分子。
- 根据权利要求46所述的载体,其包括病毒载体。
- 根据权利要求46-47中任一项所述的载体,其包括慢病毒载体。
- 免疫细胞,其包含和/或表达权利要求45所述的分离的核酸分子或权利要求46-48中任一项所述的载体,和/或权利要求1-44中任一项所述的嵌合抗原受体。
- 根据权利要求49所述的免疫细胞,其中所述的免疫细胞来源于人。
- 根据权利要求49-50中任一项所述的免疫细胞,其中所述的免疫细胞包括T细胞、B细胞、天然杀伤细胞(NK细胞)、巨噬细胞、NKT细胞、γδT细胞、单核细胞、树突状细胞、粒细胞、淋巴细胞、白细胞和/或外周血单个核细胞。
- 根据权利要求49-51中任一项所述的免疫细胞,其包括T细胞。
- 根据权利要求49-52中任一项所述的免疫细胞,其中所述的免疫细胞包括经修饰的免疫细胞。
- 根据权利要求53所述的免疫细胞,其中所述经修饰的免疫细胞包括降低同种异体细胞治疗引起的免疫排斥反应的细胞。
- 根据权利要求53-54中任一项所述的免疫细胞,其中所述经修饰的免疫细胞中的T细胞抗原受体(TCR)和主要组织相容性复合体(MHCI,MHCII)在T细胞中的功能受到抑制。
- 根据权利要求53-55中任一项所述的免疫细胞,其中所述修饰包括与免疫排斥相关基因中的一个或多个的表达和/或活性被下调。
- 根据权利要求56所述的免疫细胞,其中所述与免疫排斥相关基因选自下组中的一种或多种基因:TRAC、TRBC、HLA-A、HLA-B、B2M和CIITA。
- 根据权利要求53-57中任一项所述的免疫细胞,其中所述经修饰的免疫细胞与未经修饰的相应细胞相比,TRAC基因和HLA-A基因的表达和/或活性被下调。
- 根据权利要求53-58中任一项所述的免疫细胞,其中所述经修饰的免疫细胞与未经所述修饰的相应细胞相比,CIITA基因的表达和/或活性未被下调。
- 根据权利要求53-59中任一项所述的免疫细胞,其中所述经修饰的免疫细胞与未经所述修饰的相应细胞相比,B2M基因的表达和/或活性未被下调。
- 根据权利要求53-60中任一项所述的免疫细胞,其中所述经修饰的免疫细胞与相应的野生型细胞相比,TRAC基因和HLA-A基因的表达和/或活性被下调。
- 根据权利要求53-61中任一项所述的免疫细胞,其中所述经修饰的免疫细胞与相应的野生型细胞相比,B2M基因的表达和/或活性未被下调。
- 根据权利要求53-62中任一项所述的免疫细胞,其中所述经修饰的免疫细胞与相应的野生型细胞相比,CIITA基因的表达和/或活性未被下调。
- 根据权利要求56-63中任一项所述的免疫细胞,其中所述基因的表达水平和/或活性被下 调包括使编码所述基因的核酸分子的表达和/或活性下调;和/或使所述基因编码的蛋白质产物的表达和/或活性被下调。
- 根据权利要求53-64中任一项所述的免疫细胞,其中所述修饰包括:基因敲除、基因突变和/或基因沉默。
- 根据权利要求53-65中任一项所述的免疫细胞,其中所述修饰包括向所述免疫细胞施用一种或多种选自下组的物质:反义RNA、siRNA、shRNA和sgRNA。
- 根据权利要求53-66中任一项所述的免疫细胞,其中所述修饰还包括向所述免疫细胞施用靶向所述TRAC基因外显子部分的sgRNA。
- 根据权利要求67所述的免疫细胞,其中所述靶向所述TRAC基因外显子部分的sgRNA包含SEQ ID NO:138至SEQ ID NO:152中任一项所示的核苷酸序列。
- 根据权利要求53-68中任一项所述的免疫细胞,其中所述修饰包括向所述免疫细胞施用靶向所述HLA-A基因外显子部分的sgRNA。
- 根据权利要求69所述的免疫效应细胞,其中所述靶向所述HLA-A基因外显子部分的sgRNA包含SEQ ID NO:153至SEQ ID NO:193中任一项所示的核苷酸序列。
- 根据权利要求53-70中任一项所述的免疫细胞,其中所述修饰还包括向所述细胞施用Cas酶。
- 根据权利要求71所述的免疫细胞,其中Cas酶包括Cas9蛋白。
- 根据权利要求53-72中任一项所述的免疫细胞,其中所述修饰包括向所述细胞施用反义RNA,所述反义RNA包含SEQ ID NO:194至SEQ ID NO:197中任一项所示的核苷酸序列。
- 根据权利要求49-73中任一项所述的免疫细胞,其中所述免疫细胞为HLA-B纯合子细胞。
- 根据权利要求74所述的免疫细胞,其中所述HLA-B纯合子包括HLA-B*40纯合子,HLA-B*15纯合子,HLA-B*46纯合子,HLA-B*13纯合子,HLA-B*51纯合子,HLA-B*58纯合子,HLA-B*07纯合子,HLA-B*35纯合子,HLA-B*44纯合子,HLA-B*52纯合子,HLA-B*57纯合子,HLA-B*54纯合子或HLA-B*55纯合子。
- 根据权利要求49-75中任一项所述的免疫细胞,其中所述免疫细胞为HLA-A纯合子或杂合子细胞。
- 根据权利要求76所述的免疫细胞,其中所述HLA-A纯合子或杂合子包括HLA-A*02纯合子,HLA-A*11纯合子,HLA-A*02/A*11杂合子或HLA-A*24纯合子。
- 一种制备免疫细胞的方法,其包括向免疫细胞中引入权利要求45所述的核酸分子和/或权利要求46-48中任一项所述的载体。
- 根据权利要求78所述的方法,其还包括:在向免疫效应细胞中引入权利要求45所述的核酸分子和/或权利要求46-48中任一项所述的载体之前/之后,修饰所述免疫细胞,所述修饰包括与免疫排斥相关基因中的一个或多个的表达和/或活性被下调。
- 根据权利要求79所述的方法,其中所述与免疫排斥相关基因选自下组中的一种或多种基因:TRAC、TRBC、HLA-A、HLA-B、B2M和CIITA。
- 根据权利要求78-80中任一项所述的方法,与未经所述修饰的免疫细胞相比,使所述免疫细胞中TRAC基因和HLA-A基因的表达和/或活性下调。
- 根据权利要求78-81中任一项所述的方法,与未经所述修饰的免疫细胞相比,所述免疫细胞中的CIITA基因的表达和/或活性未被下调。
- 根据权利要求78-82中任一项所述的方法,与未经所述修饰的免疫细胞相比,所述免疫细胞中的B2M基因的表达和/或活性未被下调。
- 根据权利要求78-83中任一项所述的方法,与野生型细胞相比,使所述免疫细胞中的TRAC基因和HLA-A基因的表达和/或活性被下调。
- 根据权利要求78-84中任一项所述的方法,与野生型细胞相比,所述免疫细胞中的CIITA基因的表达和/或活性未被下调。
- 根据权利要求78-85中任一项所述的方法,与野生型细胞相比,所述免疫细胞中的B2M基因的表达和/或活性未被下调。
- 根据权利要求79-86中任一项所述的方法,其中所述基因的表达水平和/或活性被下调包括使编码所述基因的核酸分子的表达和/或活性下调;和/或使所述基因编码的蛋白质产物的表达和/或活性被下调。
- 根据权利要求79-87中任一项所述的方法,其中所述修饰包括:基因敲除、基因突变和/或基因沉默。
- 根据权利要求79-88中任一项所述的方法,其中所述修饰包括向所述免疫细胞施用一种或多种选自下组的物质:反义RNA、siRNA、shRNA和sgRNA。
- 根据权利要求79-89中任一项所述的方法,其中所述修饰包括向所述免疫细胞施用靶向所述TRAC基因外显子部分的sgRNA。
- 根据权利要求90所述的方法,其中所述靶向所述TRAC基因外显子部分的sgRNA包含SEQ ID NO:138至SEQ ID NO:152中任一项所示的核苷酸序列。
- 根据权利要求79-91中任一项所述的方法,其中所述修饰包括向所述免疫细胞施用靶向所述HLA-A基因外显子部分的sgRNA。
- 根据权利要求92所述的方法,其中所述靶向所述HLA-A基因外显子部分的sgRNA包含SEQ ID NO:153至SEQ ID NO:193中任一项所示的核苷酸序列。
- 根据权利要求79-93任一项所述的方法,其中所述修饰还包括向所述细胞施用Cas酶。
- 根据权利要求94所述的方法,其中Cas酶包括Cas9蛋白。
- 根据权利要求79-95中任一项所述的方法,其中所述修饰包括向所述细胞施用反义RNA,所述反义RNA包含SEQ ID NO:194至SEQ ID NO:197中任一项所示的核苷酸序列。
- 根据权利要求78-96中任一项所述的方法,其中所述免疫细胞来源于人。
- 根据权利要求78-97中任一项所述的方法,所述免疫细胞包括T细胞、B细胞、天然杀伤细胞(NK细胞)、巨噬细胞、NKT细胞、γδT细胞、单核细胞、树突状细胞、粒细胞、淋巴细胞、白细胞和/或外周血单个核细胞。
- 根据权利要求78-98中任一项所述的方法,其中所述免疫细胞包括T细胞。
- 根据权利要求78-99中任一项所述的方法,其中所述免疫细胞为HLA-B纯合子细胞。
- 根据权利要求100所述的方法,其中所述HLA-B纯合子包括HLA-B*40纯合子,HLA-B*15纯合子,HLA-B*46纯合子,HLA-B*13纯合子,HLA-B*51纯合子,HLA-B*58纯合子,HLA-B*07纯合子,HLA-B*35纯合子,HLA-B*44纯合子,HLA-B*52纯合子,HLA-B*57纯合子,HLA-B*54纯合子或HLA-B*55纯合子。
- 根据权利要求78-101中任一项所述的方法,其中所述免疫细胞为HLA-A纯合子或杂合子细胞。
- 根据权利要求102所述的方法,其中所述HLA-A纯合子或杂合子包括HLA-A*02纯合子,HLA-A*11纯合子,HLA-A*02/A*11杂合子或HLA-A*24纯合子。
- 权利要求1-44中任一项所述的嵌合抗原受体,权利要求45所述的分离的核酸分子,权利要求46-48中任一项所述的载体,和/或权利要求49-77中任一项所述的免疫细胞在制备CAR-T细胞中的应用。
- 药物组合物,其包含权利要求1-44中任一项所述的嵌合抗原受体,权利要求45所述的分离的核酸分子,权利要求46-48中任一项所述的载体,和/或权利要求49-77中任一项所述的免疫细胞,以及任选地药学上可接受的载剂。
- 权利要求1-44中任一项所述的抗原嵌合受体,权利要求45所述的分离的核酸分子,权 利要求46-48中任一项所述的载体,权利要求49-77中任一项所述的免疫细胞,和/或权利要求105所述的药物组合物,其用于治疗与HER2的表达相关的疾病或病症。
- 根据权利要求106所述的用途,其中所述与HER2的表达相关的疾病或病症包括与HER2的表达上调相关的疾病或病症。
- 根据权利要求106-107中任一项所述的用途,其中所述与HER2的表达相关的疾病或病症包括肿瘤。
- 根据权利要求108所述的用途,其中所述肿瘤包括HER2阳性的肿瘤。
- 根据权利要求108-109中任一项所述的用途,其中所述肿瘤包括实体瘤。
- 根据权利要求108-110中任一项所述的用途,其中所述肿瘤包括血液瘤。
- 根据权利要求108-111中任一项所述的用途,其中所述肿瘤包括乳腺癌、胃癌、卵巢癌、宫颈癌、尿路上皮癌、食管癌、膀胱癌、结直肠癌、子宫内膜癌、肾癌、肺癌、胰腺癌、头颈癌、肉瘤、胶质母细胞瘤、前列腺癌和/或甲状腺癌。
- 权利要求1-44中任一项所述的嵌合抗原受体,权利要求45所述的分离的核酸分子,权利要求46-48中任一项所述的载体,权利要求49-77中任一项所述的免疫细胞,和/或权利要求105所述的药物组合物在制备药物中的用途,所述药物用于治疗与HER2的表达相关的疾病或病症。
- 根据权利要求113所述的用途,其中所述与HER2的表达相关的疾病或病症包括与HER2的表达上调相关的疾病或病症。
- 根据权利要求113-114中任一项所述的用途,其中所述与HER2的表达相关的疾病或病症包括肿瘤。
- 根据权利要求115所述的用途,其中所述肿瘤包括HER2阳性的肿瘤。
- 根据权利要求115-116中任一项所述的用途,其中所述肿瘤包括实体瘤。
- 根据权利要求115-117中任一项所述的用途,其中所述肿瘤包括血液瘤。
- 根据权利要求115-118中任一项所述的用途,其中所述肿瘤包括乳腺癌、胃癌、卵巢癌、宫颈癌、尿路上皮癌、食管癌、膀胱癌、结直肠癌、子宫内膜癌、肾癌、肺癌、胰腺癌、头颈癌、肉瘤、胶质母细胞瘤、前列腺癌和/或甲状腺癌。
- 预防和/或治疗与HER2的表达相关的疾病或病症的方法,其包括向有需要的受试者施用有效量的权利要求1-44中任一项所述的嵌合抗原受体,权利要求45所述的分离的核酸分子,权利要求46-48中任一项所述的载体,权利要求49-77中任一项所述的免疫细胞,和/或权利要求105所述的药物组合物。
- 根据权利要求120所述的方法,其中所述与HER2的表达相关的疾病或病症包括与HER2的表达上调相关的疾病或病症。
- 根据权利要求120-121中任一项所述的方法,其中所述与HER2的表达相关的疾病或病症包括肿瘤。
- 根据权利要求122所述的方法,其中所述肿瘤包括HER2阳性的肿瘤。
- 根据权利要求122-123中任一项所述的方法,其中所述肿瘤包括实体瘤。
- 根据权利要求122-124中任一项所述的方法,其中所述肿瘤包括血液瘤。
- 根据权利要求122-125中任一项所述的方法,其中所述肿瘤包括乳腺癌、胃癌、卵巢癌、宫颈癌、尿路上皮癌、食管癌、膀胱癌、结直肠癌、子宫内膜癌、肾癌、肺癌、胰腺癌、头颈癌、肉瘤、胶质母细胞瘤、前列腺癌和/或甲状腺癌。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202110749397 | 2021-07-01 | ||
CN2021107493974 | 2021-07-01 | ||
PCT/CN2022/103085 WO2023274385A1 (zh) | 2021-07-01 | 2022-06-30 | 靶向her2的通用型car-t细胞及其制备方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN117642510A true CN117642510A (zh) | 2024-03-01 |
Family
ID=84690455
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202280046731.2A Pending CN117642510A (zh) | 2021-07-01 | 2022-06-30 | 靶向her2的通用型car-t细胞及其制备方法 |
Country Status (2)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN117642510A (zh) |
WO (1) | WO2023274385A1 (zh) |
Family Cites Families (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP3294342A4 (en) * | 2015-05-08 | 2018-11-07 | President and Fellows of Harvard College | Universal donor stem cells and related methods |
US9574014B2 (en) * | 2015-05-15 | 2017-02-21 | City Of Hope | Chimeric antigen receptor compositions |
US11197919B2 (en) * | 2015-11-04 | 2021-12-14 | City Of Hope | Chimeric antigen receptors targeting HER2 |
EP4353319A3 (en) * | 2016-09-28 | 2024-06-05 | Atossa Therapeutics, Inc. | Methods of adoptive cell therapy |
CN106543286A (zh) * | 2016-12-07 | 2017-03-29 | 上海邦耀生物科技有限公司 | 一种去岩藻糖抗her2抗体及其应用 |
CN107723275B (zh) * | 2017-10-20 | 2020-09-04 | 重庆精准生物技术有限公司 | 通用型car-t细胞及其制备方法和应用 |
WO2020065406A2 (en) * | 2018-09-28 | 2020-04-02 | Immpact-Bio Ltd. | Methods for identifying activating antigen receptor (acar)/inhibitory chimeric antigen receptor (icar) pairs for use in cancer therapies |
CN112391414A (zh) * | 2020-11-17 | 2021-02-23 | 中国医学科学院基础医学研究所 | 一种靶向her2的car-t表达载体及其构建和应用 |
-
2022
- 2022-06-30 CN CN202280046731.2A patent/CN117642510A/zh active Pending
- 2022-06-30 WO PCT/CN2022/103085 patent/WO2023274385A1/zh active Application Filing
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2023274385A1 (zh) | 2023-01-05 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN112639083A (zh) | 制备表达嵌合抗原受体的细胞的方法 | |
CN111566124A (zh) | 制备表达嵌合抗原受体的细胞的方法 | |
JP7190096B2 (ja) | 遺伝子編集t細胞及びその使用 | |
WO2021136263A1 (zh) | 一种经修饰的免疫效应细胞及其制备方法 | |
US20230256017A1 (en) | Methods of making chimeric antigen receptor-expressing cells | |
CN113840912A (zh) | 包含识别分子的工程化免疫细胞 | |
CN115397460A (zh) | 制备表达嵌合抗原受体的细胞的方法 | |
CN113122503A (zh) | 一种靶向t细胞淋巴瘤细胞的通用型car-t及其制备方法和应用 | |
CN115916833B (zh) | 靶向b7h3的抗原结合多肽及其应用 | |
WO2023274385A1 (zh) | 靶向her2的通用型car-t细胞及其制备方法 | |
WO2023274386A1 (zh) | 靶向egfr的通用型car-t细胞及其制备方法 | |
WO2023274387A1 (zh) | 靶向gd2的通用型car-t细胞及其制备方法和应用 | |
WO2023274380A1 (zh) | 靶向IL13Rα2的通用型CAR-T细胞及其制备方法和应用 | |
US20240109978A1 (en) | Chimeric antigen receptor (car) spacer modifications enhance car t cell functionality | |
WO2024094165A1 (zh) | 靶向b7h3的通用型car-t细胞及其制备方法和应用 | |
TW202323521A (zh) | 製備表現嵌合抗原受體的細胞之方法 | |
JP2023509058A (ja) | T細胞リンパ腫細胞を標的とするユニバーサルcar-tならびにその調製方法及び使用 | |
WO2023199069A1 (en) | Chimeric antigen receptor that binds mesothelin | |
CN114929867A (zh) | 一种经修饰的免疫效应细胞及其用途 | |
CN117165529A (zh) | 一种经过基因修饰的t细胞及其制备方法和应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication |