BR112021002231A2 - novo ativador de transcrição - Google Patents

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Tetsuya Yamagata
Yuanbo QIN
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Modalis Therapeutics Corporation
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Abstract

“novo ativador de transcrição” a presente invenção refere-se a um ativador de transcrição que consiste de não mais do que 200 sequências de aminoácidos e contém vp64 e um sítio de ativação de transcrição de rta. a presente invenção também fornece um complexo de um módulo de reconhecimento de sequência de ácido nucleico que se liga especificamente a uma sequência de nucleotídeo alvo em um dna de fita dupla e o ativador de transcrição.

Description

“NOVO ATIVADOR DE TRANSCRIÇÃO” CAMPO DA INVENÇÃO
[001] A presente invenção refere-se a um novo ativador de transcrição compreendendo VP64 e um sítio de ativação de transcrição do ativador R-Trans (RTA). Em adição, a invenção refere-se a um complexo de um módulo de reconhecimento de sequência de ácido nucleico que se liga especificamente a uma sequência de nucleotídeo alvo em um DNA de fita dupla e o ativador de transcrição mencionado acima.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
[002] Nos últimos anos, a edição do genoma está atraindo atenção como uma técnica para modificar o gene objeto e a região do genoma em várias espécies. Por exemplo, um método para realizar recombinação em um lócus de gene alvo no DNA em uma célula de planta ou célula de inseto como um hospedeiro, usando uma nuclease dedo de zinco (ZFN) em que um domínio de ligação de DNA de dedo de zinco e um domínio de clivagem de DNA não específico estão ligados (Literatura Patentária 1), e um método de clivagem ou modificação de um gene alvo em uma sequência de nucleotídeos particular ou um sítio adjacente a ela usando TALEN em que um efetor semelhante a um ativador de transcrição (TAL) que é um módulo de ligação ao DNA que a bactéria patogênica de planta Xanthomonas tem, e uma DNA endonuclease estão ligadas (Literatura de Patentes 2) foram descritos. Além disso, a Cas9 nuclease derivada de Streptococcus pyogenes é amplamente utilizada como uma ferramenta de edição de genoma poderosa em eucariotos tendo uma via de reparo de quebras de DNA de fita dupla (DSB) (por exemplo, Literatura Patentária 3, Literaturas Não Patentárias 1, 2).
[003] As técnicas para a regulação da transcrição sítio-específica também foram desenvolvidas aplicando técnicas de edição genômica. Por exemplo, um método para ativar ou suprimir um gene alvo que foi descrito inclui ligar ZF ou TALE,
ou uma proteína ou complexo em que um domínio de ativação de transcrição ou um domínio de supressão da transcrição (geralmente, VP64 é usado para ativação e KRAB é usado para supressão) é fundido com o sistema Cas9 (dCas9) sem a capacidade de clivar ambas as fitas de um DNA de fita dupla em uma sequência promotora ou intensificadora do gene objeto (por exemplo, Literatura Não Patentária 3).
[004] No entanto, a ativação de transcrição usando VP64 tem problemas, pelo fato de que a capacidade de ativação de transcrição suficiente não é alcançada meramente usando uma molécula de VP64 e é necessário ligar múltiplos complexos TALE-VP64 e dCas9-VP64 / sgRNA a um gene (por exemplo, Literatura Não Patentária 3). Para superar este ponto, por exemplo, foi descrito um método usando um ativador de transcrição no qual outros fatores de ativação de transcrição (p65 e RTA) estão ligados a VP64 (por exemplo, Literatura Não Patentária 4). Lista de Citações Literatura Patentária
[005] PTL 1: WO 03/087341 A2
[006] PTL 2: WO 2011/072246 A2
[007] PTL 3: WO 2013/176772 A1 Literatura Não Patentária
[008] NPL 1: Mali P, e outros, Science 339: 823 a 827 (2013)
[009] NPL 2: Cong L, e outros, Science 339: 819 a 823 (2013)
[010] NPL 3: Hu J, e outros, Nucleic Acids Res, 42: 4375 a 4390 (2014)
[011] NPL 4: Chavez A, e outros, Nat Methods, 12: 326 a 328 (2015)
SUMÁRIO DA INVENÇÃO Problema Técnico
[012] No entanto, quando p65 e RTA são ligados a VP64, o peso molecular total do mesmo torna-se grande. Portanto, ocorre um problema em que o ácido nucleico que codifica o complexo do sistema CRISPR / Cas9 e o ativador de transcrição está sob restrição em termos de tamanho, e não pode ser montado em um vetor de vírus adenoassociado (AAV) como um ácido nucleico ‘tudo em um’. Consequentemente, um dos desafios com a entrega mediada por AAV é fornecer um ativador de transcrição em um tamanho montável em um vetor AAV e capaz de exercer suficientemente a capacidade de ativação de transcrição. Solução para o Problema
[013] Os presentes inventores perceberam que várias proteínas sabiam ter capacidade de ativação de transcrição, e tinham uma ideia inventiva de que os ativadores capazes de resolver o problema mencionado acima podem ser produzidos combinando tais proteínas apropriadamente. Com base nessa ideia, eles conduziram estudos intensivos e descobriram que reduzir o tamanho da proteína e ainda preservar a capacidade de ativação de transcrição suficiente pode ser alcançado combinando VP64 e RTA. Com base nesta descoberta, eles conduziram estudos adicionais e completaram a presente invenção. Portanto, a presente invenção fornece o seguinte.
[1] Um ativador de transcrição que consiste de não mais do que 200 aminoácidos e compreende VP64 e um sítio de ativação de transcrição de RTA.
[2] O ativador de transcrição de [1], em que o dito VP64 compreende (1) a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 1, (2) a sequência de aminoácidos de (1) em que 1 ou vários aminoácidos são deletados, substituídos e / ou adicionados, ou (3) uma sequência de aminoácidos 90% ou mais idêntica à sequência de aminoácidos de (1).
[3] O ativador de transcrição de [1] ou [2], em que o sítio de ativação de transcrição de RTA mencionado acima compreende (4) a sequência mostrada em SEQ ID NO: 2,
(5) a sequência mostrada em SEQ ID NO: 3, (6) a sequência de aminoácidos de (4) ou (5) em que 1 ou vários aminoácidos são deletados, substituídos e / ou adicionados, ou (7) uma sequência de aminoácidos 90% ou mais idêntica à sequência de aminoácidos de (4) ou (5).
[4] Um complexo compreendendo um módulo de reconhecimento de sequência de ácido nucleico que se liga especificamente a uma sequência de nucleotídeo alvo em um DNA de fita dupla e o ativador de transcrição de qualquer um de [1] a [3] ligados entre si, e ativando a transcrição de um gene alvo no DNA.
[5] O complexo de [4], em que o módulo de reconhecimento de sequência de ácido nucleico mencionado acima compreende uma proteína efetora de CRISPR sem a capacidade de clivar pelo menos uma fita do DNA de fita dupla.
[6] O complexo de [5], em que a proteína efetora de CRISPR mencionada acima não tem a capacidade de clivar ambas as fitas do DNA de fita dupla.
[7] O complexo de [5] ou [6], em que a proteína efetora de CRISPR é derivada de Staphylococcus aureus ou Campylobacter jejuni.
[8] Um ácido nucleico que codifica o ativador de transcrição de qualquer um de [1] a [3].
[9] Um ácido nucleico que codifica o complexo de qualquer um de [4] a [7].
[10] Um vetor que compreende o ácido nucleico de [8] ou [9].
[11] O vetor de [10], em que o vetor mencionado acima é um vetor de vírus adenoassociado.
[12] Um método para ativar a transcrição de um gene alvo em uma célula, compreendendo uma etapa de introduzir o complexo de qualquer um de [4] a [7], o ácido nucleico de [8] ou [9], ou o vetor de [10] ou [11] na célula.
[13] O método de [12], em que a célula é uma célula de mamífero.
[14] O método de [13], em que o mamífero mencionado é um ser humano.
EFEITOS VANTAJOSOS DA INVENÇÃO
[014] De acordo com a presente invenção, é fornecido um novo ativador de transcrição tendo um tamanho montável em um vetor AAV e capaz de exercer suficientemente a capacidade de ativação de transcrição. Além disso, um complexo de um módulo de reconhecimento de sequência de ácido nucleico que se liga especificamente a uma sequência de nucleotídeo alvo em um DNA de fita dupla e do ativador de transcrição mencionado acima, e um método para ativar a transcrição de um gene alvo em uma célula usando o complexo são fornecidos.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[015] A Figura 1 mostra a estrutura do vetor AAV e as dez porções de ativação quando dSaCas9 é usado como uma proteína efetora de CRISPR. O número de bases na Figura é indicado pelo comprimento incluindo o códon de terminação.
[016] A Figura 2 mostra a ativação do gene MYD88 pelas nove porções de ativação. Nos respectivos gRNAs, cada gráfico de barras mostra os resultados de apenas sgRNA, VP64, VP160, VM (VP64-MyoD), VH (VP64-HSF1), V32p65 (VP32- p65), VR (VP64-miniRTA), V64P65 (VP64- p65), VPH e VPR nesta ordem a partir da esquerda. [Tabela 1] MYD88 sgMYD88_1 (n = 3) sgMYD88_2 (n = 3) sgMYD88_3 (n = 3) Média SD Média SD Média SD Apenas 1 NA 1 NA 1 NA sgRNA VP64 1,07 0,04 1,14 0,03 1,80 0,25 VP160 1,42 0,27 1,76 0,15 2,85 0,21 VM 1,21 0,19 1,61 0,21 2,15 0,16 VH 1,04 0,18 1,55 0,24 1,84 0,05 V32p65 1,20 0,26 1,90 0,10 2,31 0,25 VR 3,21 0,39 3,88 0,47 6,03 1,10 V64P65 1,85 0,38 2,61 0,27 3,89 0,57 VPH 4,35 0,63 5,10 0,60 6,72 0,75 VPR 6,18 0,97 7,68 0,89 8,43 1,40
[017] A Figura 3 mostra a ativação do gene FGF21 pelas nove porções de ativação. Nos respectivos gRNAs, cada gráfico de barras mostra os resultados de apenas sgRNA, VP64, VP160, VM (VP64-MyoD), VH (VP64-HSF1), V32p65 (VP32- p65), VR (VP64-miniRTA), V64P65 (VP64- p65), VPH e VPR nesta ordem a partir da esquerda. [Tabela 2] FGF21 sgFGF_1 (n = 3) sgFGF_2 (n = 3) sgFGF_3 (n = 3) Média SD Média SD Média SD Apenas 1 NA 1 NA 1 NA sgRNA VP64 4,05 1,92 3,88 0,88 1,47 0,27 VP160 7,08 0,71 7,56 0,33 3,98 1,03 VM 2,63 0,98 3,20 0,77 1,18 0,75 VH 4,79 0,89 8,21 3,17 1,60 0,42 V32p65 4,61 0,93 6,84 1,80 0,92 0,31 VR 9,13 2,23 11,68 3,51 4,17 0,97 V64P65 12,65 3,65 17,87 2,02 2,37 0,41 VPH 19,19 2,46 31,10 6,50 4,75 1,47 VPR 28,23 3,63 53,28 5,04 7,51 0,96
[018] A Figura 4 mostra a ativação do gene GCG pelas nove porções de ativação. Nos respectivos gRNAs, cada gráfico de barras mostra os resultados de apenas sgRNA, VP64, VP160, VM (VP64-MyoD), VH (VP64-HSF1), V32p65 (VP32- p65), VR (VP64-miniRTA), V64P65 (VP64- p65), VPH e VPR nesta ordem a partir da esquerda. [Tabela 3] GCG sgGCG_1 (n = 3) sgGCG_2 (n = 3) sgGCG_3 (n = 3) Média SD Média SD Média SD Apenas 1 NA 1 NA 1 NA sgRNA VP64 2,40 1,43 3,94 1,00 1,99 0,21 VP160 54,93 3,34 25,97 5,64 6,67 0,51 VM 5,93 0,37 3,75 0,94 1,69 0,70 VH 3,73 1,38 2,82 0,77 1,98 0,63 V32p65 1,99 0,66 1,99 1,37 0,96 0,65 VR 447,92 32,73 109,06 11,81 31,61 8,47 V64P65 83,65 23,05 20,30 4,82 7,99 0,39 VPH 708,07 115,67 101,32 12,27 47,87 7,70 VPR 1274,30 205,93 328,06 88,78 125,96 17,78
[019] A Figura 5 mostra a ativação do gene MyD88 por VP64-miniRTA e VP64-microRTA.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[020] Tal como aqui utilizado, as formas singulares “um”, “uma” e “o”, “a” destinam-se a incluir as formas singular e plural, a menos que a linguagem indique explicitamente o contrário com palavras como “apenas”, “único” e / ou “um”. Será ainda entendido que os termos “compreende”, “compreendendo”, “inclui” e / ou “incluindo” quando usados neste documento, especificam a presença de recursos, etapas, operações, elementos, ideias e / ou componentes declarados, mas não impedem a presença ou adição de um ou mais outros recursos, etapas, operações, elementos, componentes, ideias, e / ou grupos dos mesmos.
[021] A presente invenção fornece um novo ativador de transcrição compreendendo VP64 e um sítio de ativação de transcrição do ativador R-Trans (RTA) do vírus Epstein-Barr (em seguida às vezes descrito como “o ativador da presente invenção”). A transcrição do gene alvo pode ser ativada pelo ativador de transcrição da presente invenção.
[022] Na presente invenção, VP64 significa um peptídeo que consiste de 4 repetições em tandem de um domínio que consiste dos 437º-447º resíduos de aminoácidos de VP16 derivado do vírus Herpes Simplex (DALDDFDLDML; SEQ ID NO: 21) com um ligante peptídico consistindo de glicina e serina (GS) ([DALDDFDLDML]-GS-[DALDDFDLDML]-GS-[DALDDFDLDML]-GS- [DALDDFDLDML]; SEQ ID NO: 1) (Beerli RR, e outros, Proc Natl Acad Sci USA. 95 (25): 14628-33 (1998)) ou uma variante do mesmo tendo uma capacidade de atividade de transcrição. Exemplos de tal variante incluem a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 1 em que 1 ou vários (por exemplo, 2, 3, 4, 5 ou mais) aminoácidos são deletados, substituídos e / ou adicionados. Exemplos específicos dos mesmos incluem, mas não estão limitados a uma variante na qual a parte do ligante é substituída por outro ligante (por exemplo, um ligante peptídico consistindo de G, S, GG, SG, GGG, GSG, GSGS (SEQ ID NO: 22), GSSG (SEQ ID NO: 23), GGGGS (SEQ ID NO: 24), GGGAR (SEQ ID NO: 25), GSGSGS (SEQ ID NO: 26) ou
SGQGGGGSG (SEQ ID NO: 27) e similares). Alternativamente, como a variante mencionada acima, um peptídeo que consiste de uma sequência de aminoácidos não menos do que 90% (por exemplo, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais) idêntica à sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 1 pode ser mencionado. Além disso, um peptídeo que consiste de 10 repetições em tandem do domínio mencionado acima (DALDDFDLDML; SEQ ID NO: 21) ([DALDDFDLDML] -GS-[DALDDFDLDML]-GS-[DALDDFDLDML]-GS-[DALDDFDLDML]-GS- [DALDDFDLDML]-GS-[DALDDFDLDML]-GS-[DALDDFDLDML]-GS- [DALDDFDLDML]-GS-[DALDDFDLDML]-GS-[DALDDFDLDML]; SEQ ID NO: 44) é chamado VP160.
[023] RTA é uma proteína que consiste de 605 resíduos de aminoácidos e tem capacidade de ativação de transcrição (Número de Acesso ao GenBank: CEQ33017) (SEQ ID NO: 4), e sabe-se que seu domínio C-terminal é importante para a ativação de transcrição (Hardwick JM, J Virol, 66 (9): 5500-8, 1992). Como o domínio mencionado acima, uma região que consiste da sequência de aminoácidos 493ª - 605ª de RTA (SEQ ID NO: 2) pode ser mencionada especificamente. Dentre outras, sabe- se que uma região que consiste da sequência de aminoácidos 520ª - 605ª (SEQ ID NO: 3) é importante. Portanto, o RTA contido no ativador da presente invenção é preferencialmente um sítio de ativação de transcrição contendo a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 3, ou uma variante da mesma tendo uma capacidade de ativação de transcrição. Exemplos de tal variante incluem a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 2 ou 3 em que 1 ou vários (por exemplo, 2, 3, 4, 5 ou mais) aminoácidos são deletados, substituídos e / ou adicionados. Especificamente, uma vez que o 564º resíduo de leucina, o 566º resíduo de leucina, o 570º resíduo de leucina, o 578º resíduo de leucina, o 581º resíduo de fenilalanina e o 582º resíduo de leucina em RTA são conhecidos por serem importantes para a capacidade de ativação de transcrição, uma variante na qual os resíduos de aminoácido que não esses resíduos de aminoácido são deletados, substituídos e similares, podem ser mencionados, embora não limitados a essas modificações. Alternativamente, como a variante mencionada acima, um peptídeo que consiste de uma sequência de aminoácidos não menos do que 90% (por exemplo, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais) idêntica à sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 2 ou 3 pode ser mencionado. Na presente especificação, um peptídeo que consiste da sequência mostrada na SEQ ID NO: 2 às vezes é descrito como “miniRTA” e um que consiste da sequência mostrada na SEQ ID NO: 3 é às vezes descrito como “microRTA”.
[024] O ativador da presente invenção contém VP64 e um sítio de ativação de transcrição de RTA. VP64 e RTA podem ser ligados por meio de um ligante (por exemplo, o ligante peptídico mencionado acima) ou ligados diretamente sem um ligante. O VP64 e um sítio de ativação de transcrição de RTA podem ser dispostos nessa ordem do N-terminal ao C-terminal ou podem ser dispostos na ordem inversa. Exemplos específicos do ativador da presente invenção incluem a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 6 ou 8, a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 6 ou 8 em que 1 ou vários (por exemplo, 2, 3, 4, 5 ou mais) aminoácidos são deletados, substituídos e / ou adicionados, e um ativador contendo uma sequência de aminoácidos não menos do que 90% (por exemplo, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96 %, 97%, 98%, 99% ou mais) idêntica à sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 6 ou 8.
[025] A identidade da sequência de aminoácidos pode ser calculada usando o algoritmo de cálculo de homologia NCBI BLAST (National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool) (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) e sob as seguintes condições (expectativa = 10; intervalo permitido; matriz = BLOSUM62; filtragem = OFF). Entende-se que, para determinar a identidade, uma sequência da invenção ao longo de todo o seu comprimento é comparada com outra sequência. Em outras palavras, a identidade de acordo com a invenção exclui a comparação de fragmentos curtos (por exemplo, 1 a 3 aminoácidos) de uma sequência da invenção com outra sequência ou vice-versa.
[026] O ativador da presente invenção não é particularmente limitado, desde que possa ativar a transcrição do gene alvo. Para redução do tamanho, ele consiste preferencialmente de não mais do que 200 (por exemplo, 200, 190, 180, 170, 169, 168, 167 ou mais) aminoácidos e de preferência não menos do que 110 (por exemplo, 110, 120, 130, 135, 136, 137, 138, 139, 140 ou menos) aminoácidos. Em uma modalidade preferencial, um ativador consistindo de cerca de 140 ou cerca de 167 aminoácidos é usado.
[027] Em outra modalidade, é fornecido um complexo no qual um módulo de reconhecimento de sequência de ácido nucleico e o ativador da presente invenção estão ligados (em seguida às vezes descrito como “o complexo da presente invenção”).
[028] Na presente invenção, o “módulo de reconhecimento de sequência de ácido nucleico” significa uma molécula ou complexo de molécula tendo uma capacidade de reconhecer e se ligar especificamente a uma sequência de nucleotídeos particular (isto é, sequência de nucleotídeos alvo) em uma fita de DNA. A ligação do módulo de reconhecimento de sequência de ácido nucleico a uma sequência de nucleotídeo alvo permite que o ativador da presente invenção ligado ao módulo atue especificamente em um sítio dirigido de um DNA de fita dupla.
[029] O complexo da presente invenção abrange não apenas um constituído por várias moléculas, mas também um que tem um módulo de reconhecimento de sequência de ácido nucleico e o ativador da presente invenção em uma única molécula, como uma proteína de fusão.
[030] Uma sequência de nucleotídeos alvo em um DNA de fita dupla a ser reconhecida pelo módulo de reconhecimento de sequência de ácido nucleico no complexo da presente invenção não é particularmente limitada, desde que o módulo se ligue especificamente a, e pode ser qualquer sequência no DNA de fita dupla. O comprimento da sequência de nucleotídeos alvo só precisa ser suficiente para a ligação específica do módulo de reconhecimento de sequência de ácido nucleico. Por exemplo, quando um DNA genômico de mamífero é dirigido, a sequência é, de acordo com o tamanho do genoma, de preferência não menos do que 12 nucleotídeos (por exemplo, 12 nucleotídeos, 15 nucleotídeos, 18 nucleotídeos, 19 nucleotídeos, 20 nucleotídeos ou mais) e não mais do que 25 nucleotídeos (por exemplo, 25 nucleotídeos, 24 nucleotídeos, 23 nucleotídeos, 22 nucleotídeos ou menos).
[031] Exemplos do módulo de reconhecimento de sequência de ácido nucleico do complexo da presente invenção incluem, mas não estão limitados a, um sistema CRISPR-GNDM no qual uma proteína efetora de CRISPR não tem a capacidade de clivar pelo menos uma fita (de preferência ambas as fitas) de um DNA de fita dupla, um motivo dedo de zinco, um efetor TAL, motivo PPR e similares, bem como um fragmento contendo um domínio de ligação ao DNA de uma proteína capaz de se ligar especificamente ao DNA, tal como enzima de restrição, fator de transcrição, RNA polimerase e similares. São preferenciais o sistema CRISPR-GNDM, o motivo dedo de zinco, efetor TAL, motivo PPR e similares, dos quais um sistema CRISPR-GNDM no qual uma proteína efetora de CRISPR não tem a capacidade de clivar ambas as fitas de um DNA de fita dupla é particularmente preferencial.
[032] Um motivo dedo de zinco é constituído pela ligação de 3 a 6 unidades diferentes de dedo de zinco do tipo Cys2His2 (1 dedo reconhece cerca de 3 bases), e pode reconhecer uma sequência de nucleotídeos alvo de 9 a 18 bases. Um motivo dedo de zinco pode ser produzido por um método conhecido, tal como método de montagem modular (Nat Biotechnol (2002) 20: 135 a 141), método OPEN (Mol Cell (2008) 31: 294 a 301), método CoDA (métodos Nat (2011) 8: 67 a 69), método de um híbrido de Escherichia coli (Nat Biotechnol (2008) 26: 695 a 701) e similares. A
Literatura Patentária 1 mencionada acima pode ser citada como para o detalhe da produção do motivo dedo de zinco.
[033] Um efetor TAL tem uma estrutura de repetição de módulo com cerca de 34 aminoácidos como uma unidade, e os resíduos de aminoácidos 12º e 13º (chamados RVD) de um módulo determinam a estabilidade de ligação e especificidade de base. Uma vez que cada módulo é altamente independente, o efetor TAL específico para uma sequência de nucleotídeos alvo pode ser produzido simplesmente conectando o módulo. Para o efetor TAL, um método de produção que utiliza um recurso aberto (método REAL (Curr Protoc Mol Biol (2012) Capítulo 12: Unidade 12.15), método FLASH (Nat Biotechnol (2012) 30: 460 a 465) e método Golden Gate (Nucleic Acids Res (2011) 39: e82) etc.) foram estabelecidos, e um efetor TAL para uma sequência de nucleotídeos alvo pode ser projetado de forma comparativamente conveniente. A Literatura Patentária 2 mencionada acima pode ser citada como para o detalhe da produção do efetor TAL.
[034] O motivo PPR é constituído de tal modo que uma sequência de nucleotídeos particular é reconhecida por uma continuação de motivos PPR, cada um consistindo de 35 aminoácidos e reconhecendo uma base de ácido nucleico, e reconhece uma base alvo apenas por 1, 4 e ii(-2) aminoácidos de cada motivo. A constituição do motivo não tem dependência e está livre de interferência de motivos em ambos os lados. Portanto, como o efetor TAL, uma proteína PPR específica para a sequência de nucleotídeos alvo pode ser produzida simplesmente conectando os motivos PPR. WO 2011/111829 A1 pode ser citado como para o detalhe da produção do motivo PPR.
[035] Quando um fragmento de enzima de restrição, fator de transcrição, RNA polimerase e similares é usado, uma vez que os domínios de ligação ao DNA dessas proteínas são bem conhecidos, um fragmento contendo o domínio e livre de capacidade de clivagem de fita dupla de DNA pode ser facilmente projetado e construído.
[036] Quanto ao motivo dedo de zinco, a produção de muitos motivos dedo de zinco realmente funcionais não é fácil, uma vez que a eficiência de produção de um dedo de zinco que se liga especificamente a uma sequência de nucleotídeos alvo não é alta e a seleção de um dedo de zinco com alta especificidade de ligação é complicada. Embora o efetor TAL e o motivo PPR tenham um alto grau de liberdade de reconhecimento da sequência de ácido nucleico alvo em comparação com o motivo dedo de zinco, permanece um problema na eficiência, uma vez que uma grande proteína precisa ser projetada e construída todas as vezes de acordo com a sequência de nucleotídeos alvo. Em contraste, uma vez que o sistema CRISPR-GNDM reconhece a sequência de DNA de fita dupla do objeto por um nucleotídeo guia complementar à sequência de nucleotídeo alvo, qualquer sequência pode ser dirigida simplesmente sintetizando um oligonucleotídeo capaz de formar especificamente um híbrido com a sequência de nucleotídeo alvo. Portanto, em uma modalidade mais preferencial da presente invenção, um sistema CRISPR-GNDM é usado como um módulo de reconhecimento de sequência de ácido nucleico.
[037] Quando o sistema CRISPR-GNDM da presente invenção é usado, a transcrição do gene alvo pode ser suficientemente ativada pelo recrutamento de uma proteína efetora de CRISPR mutante sem a capacidade de clivar pelo menos uma fita (de preferência ambas as fitas) de um DNA de fita dupla em seguida também simplesmente descrita como “proteína efetora de CRISPR”). A região reguladora de transcrição do gene alvo pode ser qualquer região do gene, desde que a transcrição do gene seja ativada pelo recrutamento da proteína efetora de CRISPR e do ativador da presente invenção ligado a ela. Exemplos de tal região incluem uma região de promotor e uma região intensificadora, íntron, éxon, e similares do gene alvo.
[038] Na presente especificação, o “sistema CRISPR-GNDM” significa um sistema que compreende (a) uma proteína efetora de CRISPR classe 2 (por exemplo,
dCas9 ou dCpf1) ou um complexo da dita proteína efetora de CRISPR e do ativador da presente invenção, e (b) um nucleotídeo guia (gN) que é complementar a uma sequência de uma região reguladora da transcrição de um gene alvo, que permite o recrutamento da proteína efetora de CRISPR e do regulador de transcrição ligado a ela à região reguladora da transcrição do gene alvo. Usando o sistema mencionado acima, a ativação de transcrição do gene torna-se possível por meio do ativador da presente invenção ligado à proteína efetora de CRISPR.
[039] A “proteína efetora de CRISPR” a ser usada na presente invenção não está particularmente limitada, desde que forme um complexo com gN, reconheça e se ligue à sequência de nucleotídeos alvo no gene objeto e ao motivo adjacente do protoespaçador (PAM) adjacente a ele. É preferencial Cas9 ou Cpf1 ou uma variante dos mesmos. Exemplos de Cas9 incluem, mas não estão limitados a, Cas9 derivado de Streptococcus pyogene (SpCas9; sequência PAM NGG (N é A, G, T ou C, em seguida o mesmo), Cas9 derivado de Streptococcus thermophilus (StCas9; sequência PAM NNAGAAW), Cas9 derivado de Neisseria meningitidis (NmCas9; sequência PAM NNNNGATT), Cas9 derivado de Staphylococcus aureus (SaCas9; sequência PAM: NNGRRT), Cas9 derivado de Campylobacter jejuni (CjCas9; sequência PAM: NNNVRYM (V é A, G ou C; R é A ou G; Y é T ou C; M é A ou C)). Em vista do tamanho, Cas9 é de preferência SaCas9 ou CjCas9 ou uma variante dos mesmos. Exemplos de Cpf1 incluem, mas não estão limitados a Cpf1 derivado de Francisella novicida (FnCpf1; sequência PAM NTT), Cpf1 derivado de Acidaminococcus sp. (AsCpf1; sequência PAM NTTT), Cpf1 derivado de bactéria Lachnospiraceae (LbCpf1; sequência PAM NTTT) e similares. Como a proteína efetora de CRISPR a ser usada na presente invenção, a proteína na qual a capacidade da proteína efetora de CRISPR de clivar pelo menos uma fita (de preferência ambas as fitas) do DNA de fita dupla está inativada é usada. Por exemplo, no caso de SpCas9, uma variante na qual o 10º resíduo Asp é convertido no resíduo Ala e / ou o 840º resíduo His é convertido no resíduo Ala (variante sem a capacidade de clivar ambas as fitas de um DNA de fita dupla é às vezes descrita como “dSpCas9”) pode ser usada. Alternativamente, no caso de SaCas9, uma variante em que o 10º resíduo Asp é convertido no resíduo Ala e / ou 556º resíduo Asp, o 557º resíduo His e / ou 580º resíduo Asn são convertidos no resíduo Ala (variante sem a capacidade de clivar ambas as fitas de um DNA de fita dupla às vezes é descrita como “dSaCas9”). No caso de CjCas9, uma variante na qual o 8º resíduo Asp é convertido no resíduo Ala e / ou o 559º resíduo His é convertido no resíduo Ala (variante sem a capacidade de clivar ambas as fitas de um DNA de fita dupla às vezes é descrita como “dCjCas9”) pode ser usada. No caso de FnCpf1, uma variante na qual o 917º resíduo Asp é convertido no resíduo Ala e / ou o 1006º resíduo Glu é convertido no resíduo Ala pode ser usada. Além disso, desde que a capacidade de ligação à sequência de nucleotídeos alvo possa ser mantida, uma variante na qual uma parte dos aminoácidos dessas proteínas é modificada também pode ser usada. Exemplos da variante incluem uma variante encurtada em que uma parte da sequência de aminoácidos é deletada. Exemplos de tal variante incluem especificamente dSaCas9 em que os aminoácidos 721º - 745º são deletados (a parte deletada pode ser substituída pelo ligante peptídico descrito acima e similares) e similares.
[040] O segundo elemento do sistema CRISPR-GNDM da presente invenção é um nucleotídeo guia (gN) que contém uma sequência de nucleotídeos (em seguida também descrita como “sequência de direcionamento”) complementar à sequência de nucleotídeos adjacente ao PAM da fita dirigida na região reguladora de transcrição do gene alvo. Quando a proteína efetora de CRISPR é dCas9, o gN é fornecido como um nucleotídeo quimérico de crRNA truncado e tracrRNA (isto é, RNA guia único (sgRNA)) ou combinação de crRNA e tracrRNA separados. O gN pode ser fornecido na forma de RNA, DNA ou quimera DNA / RNA. Assim, a seguir, desde que tecnicamente possível, os termos “sgRNA”, “crRNA” e “tracrRNA” são usados para incluir também o DNA e a quimera DNA / RNA correspondente no contexto da presente invenção.
[041] A “fita dirigida” aqui significa uma fita formando um híbrido com crRNA da sequência de nucleotídeos alvo, e uma fita oposta da mesma que se torna de fita simples por hibridização com a fita alvo e crRNA é descrito como uma “fita não dirigida”. Quando a sequência de nucleotídeos alvo é expressa por uma das fitas (por exemplo, quando a sequência PAM é indicada, quando a relação posicional da sequência de nucleotídeos alvo e PAM é mostrada, etc.), ela é representada por uma sequência da fita não dirigida.
[042] A sequência de direcionamento não está limitada, desde que ela possa hibridizar especificamente com a fita dirigida em uma região reguladora de transcrição de um gene alvo e recrutar a proteína efetora de CRISPR e o ativador da presente invenção ligado a ela à região reguladora de transcrição. Por exemplo, quando dSaCas9 é usado como a proteína efetora de CRISPR, as sequências de direcionamento listadas na Tabela 1 são exemplificadas. Na Tabela 1, embora as sequências de direcionamento consistindo de 21 nucleotídeos sejam descritas, o comprimento da sequência de direcionamento é de preferência de não menos do que 12 nucleotídeos (por exemplo, 12 nucleotídeos, 15 nucleotídeos, 18 nucleotídeos, 19 nucleotídeos, 20 nucleotídeos ou mais), e de não mais do que 25 nucleotídeos (por exemplo, 25 nucleotídeos, 24 nucleotídeos, 23 nucleotídeos, 22 nucleotídeos ou menos). Em uma modalidade preferencial, ele é de 21 nucleotídeos.
[043] Quando Cas9 é usado como proteína efetora de CRISPR, a sequência de direcionamento pode ser projetada, por exemplo, usando um site de design de nucleotídeo guia aberto ao público (CRISPR Design Tool, CRISPRdirect etc.) listando sequências de até 21 mer tendo PAM (por exemplo, NNGRRT para SaCas9) adjacente ao lado 3’ das sequências CDS do gene objeto. Uma sequência candidata tendo um pequeno número de sítios fora do alvo no genoma do hospedeiro pode ser usada como uma sequência de direcionamento. Quando o software de design de nucleotídeo guia a ser usado não tem a função de pesquisar o sítio fora do alvo do genoma do hospedeiro, o sítio fora do alvo pode ser pesquisado, por exemplo, submetendo o genoma do hospedeiro à pesquisa Blast em 8 a 12 nucleotídeos (sequência semente com alta capacidade de discriminação da sequência de nucleotídeos alvo) no lado 3’ da sequência candidata. Mesmo quando uma proteína efetora de CRISPR que reconhece um PAM diferente é usada, a sequência de direcionamento pode ser projetada e produzida por um método similar. A menos que especificado de outra forma, na presente especificação, a sequência de direcionamento é mostrada como uma sequência de DNA. Quando um RNA é usado como gN, “T” deve ser lido como “U” em cada sequência. [Tabela 4] SEQ ID NO Gene Alvo Nome de gN Sequência de Direcionamento 35 MYD88 MYD88-1 GGTTCATACGGTCCTGCCCTC 36 MYD88 MYD88-2 GGAGCCACAGTTCTTCCACGG 37 MYD88 MYD88-3 CTCTACCCTTGAGGTCTCGAG 38 FGF21 FDF21-1 TGCCAGATTCCAGTTGTCCAG 39 FGF21 FDF21-2 ACATTCCTGAGTCTCAGAGAG 40 FGF21 FDF21-3 GGCTAATTTCCTGGAGCCCCT 41 GCG GCG-1 CTGTGAGGCTAAACAGAGCTG 42 GCG GCG-2 GTCTCTCCACCCAATATAAGCA 43 GCG GCG-3 AAATCACTTAAGTTCTCTAAA
[044] Qualquer um dos módulos de reconhecimento de sequência de ácido nucleico mencionado acima pode ser fornecido como uma proteína de fusão com o ativador da presente invenção mencionado acima, ou um domínio de ligação de proteína, tal como domínio SH3, domínio PDZ, domínio GK, domínio GB e o similares e um parceiro de ligação do mesmo podem ser fundidos com um módulo de reconhecimento de sequência de ácido nucleico e o ativador da presente invenção, respectivamente, e fornecidos como um complexo de proteína através de uma interação do domínio e de um parceiro de ligação do mesmo. Alternativamente, um módulo de reconhecimento de sequência de ácido nucleico e o ativador da presente invenção podem ser fundidos com inteína, e podem ser ligados por ligação após a síntese de proteínas.
[045] O complexo da presente invenção contendo um complexo (incluindo a proteína de fusão) em que um módulo de reconhecimento de sequência de ácido nucleico e o ativador da presente invenção estão ligados pode ser colocado em contato com um DNA de fita dupla como uma reação enzimática em um sistema livre de células. Tendo em vista o objetivo principal da presente invenção, um ácido nucleico que codifica o dito complexo é desejavelmente introduzido em uma célula tendo o DNA de fita dupla objeto (por exemplo, DNA genômico). Portanto, o módulo de reconhecimento de sequência de ácido nucleico e o ativador da presente invenção são preferencialmente preparados como um ácido nucleico que codifica uma proteína de fusão do mesmo, ou em uma forma capaz de formar um complexo em uma célula hospedeira após a tradução em uma proteína utilizando um domínio de ligação, inteína e similares, ou como um ácido nucleico que codifica cada um deles. O ácido nucleico aqui pode ser um DNA ou um RNA. Quando é um DNA, é preferencialmente um DNA de fita dupla, e fornecido na forma de um vetor de expressão disposto sob a regulação de um promotor funcional em uma célula hospedeira. Quando é um RNA, é preferencialmente um RNA de fita simples.
[046] Uma vez que o complexo da presente invenção em que um módulo de reconhecimento de sequência de ácido nucleico e o ativador da presente invenção estão ligados não acompanha quebras de DNA de fita dupla (DSB), um método usando o complexo da presente invenção pode ser aplicado a uma ampla gama de materiais biológicos. Portanto, as células a serem introduzidas com o módulo de reconhecimento de sequência de ácido nucleico que codifica o ácido nucleico e / ou o ativador da presente invenção podem abranger células de qualquer espécie, de bactérias de Escherichia coli e similares que são procariotos, células de micro- organismos tais como leveduras e similares que são eucariotos inferiores, a células de vertebrados incluindo mamíferos, tal como seres humanos e similares, e células de eucariotos superiores, tal como insetos, plantas e similares.
[047] Um DNA codificando um módulo de reconhecimento de sequência de ácido nucleico, tal como motivo dedo de zinco, efetor TAL, motivo PPR, sistema CRISPR-GNDM e similares, pode ser obtido por qualquer método mencionado acima para cada módulo. Um DNA que codifica um módulo de reconhecimento de sequência de enzima de restrição, fator de transcrição, RNA polimerase e similares pode ser clonado, por exemplo, sintetizando um iniciador oligoDNA cobrindo uma região que codifica uma parte desejada da proteína (parte contendo o domínio de ligação ao DNA) com base na informação da sequência de cDNA da mesma, e amplificando pelo método RT-PCR usando, como um modelo, o RNA total ou fração de mRNA preparada a partir das células produtoras de proteínas.
[048] Uma proteína efetora de CRISPR mutante pode ser obtida introduzindo, no DNA que codifica a proteína efetora de CRISPR clonada, uma mutação que converte o resíduo de aminoácido no sítio importante para a atividade de clivagem de DNA (por exemplo, 10º resíduo Asp e 840º resíduo His para SpCas9, 10º Asp resíduo, 556º resíduo Asp, 557º resíduo His, 580º resíduo Asn para SaCas9, 8º resíduo ASP, 559º resíduo His para CjCas9, 917º resíduo Asp e 1006º resíduo Glu para FnCpf1 e similares, embora não limitado a eles) em outro aminoácido.
[049] O DNA clonado pode ser diretamente, ou após digestão com uma enzima de restrição quando desejado, ou após a adição de um ligante adequado (por exemplo, o ligante peptídico mencionado acima, etc.), etiqueta (por exemplo, etiqueta HA, etiqueta myc, etiqueta MBP, etiqueta FLAG, etc.) e / ou um sinal de localização nuclear (cada sinal de transferência de organela quando o DNA de fita dupla objeto é DNA de mitocôndria ou cloroplasto), ligado a um DNA que codifica um módulo de reconhecimento de sequência de ácido nucleico para preparar um DNA que codifica uma proteína de fusão. Alternativamente, um DNA que codifica um módulo de reconhecimento de sequência de ácido nucleico e um DNA que codifica o ativador da presente invenção podem ser cada um fundido com um DNA que codifica um domínio de ligação ou um parceiro de ligação do mesmo, ou ambos os DNAs podem ser fundidos com um DNA que codifica uma inteína de separação, em que o módulo de reconhecimento de sequência de ácido nucleico e o ativador da presente invenção são traduzidos em uma célula hospedeira para formar um complexo. Nestes casos, um ligante e / ou um sinal de localização nuclear pode ser ligado a uma posição adequada de um ou ambos os DNAs quando desejado. Quando o complexo da presente invenção é expresso como uma proteína de fusão, o ativador da presente invenção pode ser fundido com qualquer um dos N-terminal e C-terminal do módulo de reconhecimento de sequência de ácido nucleico ou um componente constituinte do mesmo (por exemplo, proteína efetora de CRISPR).
[050] Um DNA que codifica um módulo de reconhecimento de sequência de ácido nucleico e / ou o ativador da presente invenção pode ser obtido sintetizando quimicamente a fita de DNA, ou conectando fitas curtas de oligoDNA parcialmente sobrepostas utilizando o método de PCR e o método de montagem de Gibson para construir um DNA que codifica todo o seu comprimento. A vantagem de construir um DNA de comprimento total por síntese química ou uma combinação de método de PCR ou método de montagem de Gibson é que o códon a ser usado pode ser projetado em CDS de comprimento total de acordo com o hospedeiro no qual o DNA é introduzido. Na expressão de um DNA heterólogo, espera-se que o nível de expressão da proteína aumente por meio da conversão da sequência de DNA da mesma em um códon usado com alta frequência no organismo hospedeiro. Como os dados de frequência de uso de códon no hospedeiro a serem usados, por exemplo, o banco de dados de frequência de uso de código genético (http://www.kazusa.or.jp/codon/index.html) descrito na página inicial de Kazusa DNA Research Institute pode ser usado, ou os documentos que mostram a frequência de uso de códon em cada hospedeiro podem ser consultados. Com referência aos dados obtidos e à sequência de DNA a ser introduzida, os códons que mostram baixa frequência de uso no hospedeiro dentre aqueles usados para a sequência de DNA, podem ser convertidos em um códon que codifica o mesmo aminoácido e que mostra alta frequência de uso.
[051] O RNA que codifica o módulo de reconhecimento de sequência de ácido nucleico e / ou o ativador da presente invenção pode ser preparado, por exemplo, preparando um vetor contendo um DNA que codifica o módulo e / ou o ativador e transcrevendo o mesmo em mRNA por um sistema de transcrição in vitro conhecido usando o vetor como modelo. Alternativamente, o RNA também pode ser sintetizado quimicamente.
[052] Um vetor de expressão contendo um DNA que codifica o ativador da presente invenção ou o complexo da presente invenção pode ser produzido, por exemplo, ligando o DNA à jusante de um promotor em um vetor de expressão adequado.
[053] Como o vetor de expressão, plasmídeos derivados de Escherichia coli (por exemplo, pBR322, pBR325, pUC12, pUC13); plasmídeos derivados de Bacillus subtilis (por exemplo, pUB110, pTP5, pC194); plasmídeos derivados de levedura (por exemplo, pSH19, pSH15); plasmídeos de expressão de células de inseto (por exemplo, pFast-Bac); plasmídeos de expressão de células animais (por exemplo, pA1- 11, pXT1, pRc / CMV, pRc / RSV, pcDNAI / Neo); bacteriófagos, tais como λphage e similares; vetores de vírus de inseto, tais como baculovírus e similares (por exemplo, BmNPV, AcNPV); vetores de vírus animais, tais como retrovírus, vírus vaccinia, adenovírus, vírus adenoassociado (AAV) e similares são usados. Em consideração ao uso em terapia gênica, o vetor AAV é preferencialmente usado uma vez que pode expressar transgene por um longo prazo e é seguro devido à sua derivação a partir de um vírus não patogênico.
[054] O vetor AAV não é particularmente limitado, desde que a titulação e a eficiência da infecção sejam suficientemente asseguradas. Ele tem, de preferência, não mais do que cerca de 5 kb (por exemplo, cerca de 5 kb, cerca de 4,95 kb, cerca de 4,90 kb, cerca de 4,85 kb, cerca de 4,80 kb, cerca de 4,75 kb, cerca de 4,70 kb ou menos). O comprimento de aminoácidos do ativador da presente invenção é de preferência não mais do que 200 aminoácidos. Assim, os comprimentos de base totais do ácido nucleico que codifica o complexo da presente invenção e do ácido nucleico que codifica o nucleotídeo guia podem ser facilmente projetados para estar abaixo deste limite de tamanho. Portanto, o ativador da presente invenção tem a vantagem de não ser necessária a montagem do ácido nucleico que codifica o complexo da presente invenção e o ácido nucleico que codifica o nucleotídeo guia em vetores AAV separados.
[055] Quando um vetor viral é usado como um vetor de expressão, um vetor derivado de um sorotipo adequado para infecção no tecido ou órgão objeto é preferencialmente usado. Tomando o vetor AAV como exemplo, é preferencial usar um vetor baseado em AAV 1, 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9 ou 10 quando o sistema nervoso central ou retina é o alvo, um vetor baseado em AAV 1, 3, 4, 6 ou 9 quando o coração é o alvo, um vetor baseado em AAV 1, 5, 6, 9 ou 10 quando o pulmão é o alvo, um vetor baseado em AAV 2, 3, 6, 7, 8 ou 9 quando o fígado é o alvo, e um vetor baseado em AAV 1, 2, 6, 7, 8, 9 quando o músculo esquelético é o alvo. Para o tratamento de câncer, AAV 2 é preferencialmente usado. Quanto ao sorotipo de AAV, por exemplo, WO 2005/033321 A2 pode ser citado e similares.
[056] Um RNA que codifica um módulo de reconhecimento de sequência de ácido nucleico e / ou o ativador da presente invenção pode ser introduzido em uma célula hospedeira por método de microinjeção, método de lipofecção e similares. A introdução de RNA pode ser realizada uma vez ou repetida múltiplas vezes (por exemplo, 2 a 5 vezes) em intervalos adequados.
[057] Além disso, várias regiões de DNA em sítios completamente diferentes podem ser o alvo. Portanto, em uma modalidade da presente invenção, dois ou mais tipos de módulos de reconhecimento de sequência de ácido nucleico que se ligam especificamente a diferentes sequências de nucleotídeos alvo (que podem estar presentes em um gene objeto, ou dois ou mais genes objeto diferentes, genes objeto que podem estar presentes no mesmo cromossomo ou cromossomos diferentes) podem ser usados. Neste caso, cada um destes módulos de reconhecimento de sequência de ácido nucleico e do ativador da presente invenção formam um complexo. Aqui, um ativador comum da presente invenção pode ser usado. Por exemplo, quando o sistema CRISPR-GNDM é usado como um módulo de reconhecimento de sequência de ácido nucleico, um complexo comum de uma proteína efetora de CRISPR e do ativador da presente invenção (incluindo a proteína de fusão) é usado, e dois ou mais crRNAs, ou dois ou mais tipos de RNAs quiméricos de tracrRNA e cada um de dois ou mais crRNAs que, respectivamente, formam uma fita complementar com uma sequência de nucleotídeos alvo diferente são produzidos e usados como gNs. Por outro lado, quando o motivo dedo de zinco, efetor TAL e similares são usados como módulos de reconhecimento de sequência de ácido nucleico, por exemplo, o ativador da presente invenção pode ser fundido com um módulo de reconhecimento de sequência de ácido nucleico que se liga especificamente a um nucleotídeo alvo diferente.
[058] Um DNA que codifica um gN pode ser sintetizado quimicamente usando um sintetizador de DNA / RNA com base nas informações de sua sequência. Por exemplo, um DNA que codifica um gN para SaCas9 tem uma sequência de desoxirribonucleotídeo que codifica um crRNA contendo uma sequência de direcionamento complementar a uma região reguladora de transcrição de um gene alvo e pelo menos uma parte da região de “repetição” (por exemplo, GUUUUAGUACUCUG; SEQ ID NO: 31) de SacrRNA nativo, e uma sequência de desoxirribonucleotídeo que codifica tracrRNA tendo pelo menos uma parte da região
“anti-repetição” (por exemplo, CAGAAUCUACUAAAAC; SEQ ID NO: 32) complementar à região de repetição do crRNA e a região haste-alça 1 subsequente, ligante e região haste-alça 2 (AAGGCAAAAUGCCGUGUUUAUCACGUCAACUUGUUGGCGAGAUUUUUUU; SEQ ID NO: 33) de SatracrRNA nativo, opcionalmente ligado através de um tetraloop (por exemplo, GAAA). Por outro lado, um DNA que codifica um gRNA para dCpf1 tem uma sequência de desoxirribonucleotídeo que codifica um crRNA isoladamente, que contém uma sequência de direcionamento complementar a uma região reguladora de transcrição de um gene alvo e a região 5’ anterior (por exemplo, AAUUUCUACUCUUGUAGAU; SEQ ID NO: 34). Quando uma proteína diferente de SaCas9 e Cpf1 é usada como uma proteína efetora de CRISPR, um tracrRNA para a proteína a ser usada pode ser projetado apropriadamente com base em uma sequência conhecida e similares. O DNA que codifica a proteína efetora de CRISPR ligada ao DNA que codifica o ativador da presente invenção pode ser subclonado em um vetor de expressão de modo que os ditos DNAs estejam localizados sob o controle de um promotor que é funcional em uma célula hospedeira de interesse.
[059] Um DNA que codifica gN (por exemplo, crRNA ou quimera crRNA - tracrRNA) pode ser introduzido em uma célula hospedeira por um método similar aos descritos acima, dependendo do hospedeiro.
[060] Alternativamente, um RNA pode ser usado em vez do DNA para entregar a molécula efetora de CRISPR. Em uma modalidade, o sistema CRISPR- GNDM da presente invenção compreendendo (a) o complexo da presente invenção, e (b) um gN contendo uma sequência de direcionamento, pode ser introduzido nas células ou organismos alvo na forma de RNAs codificando (a) e (b) acima.
[061] Por exemplo, o RNA mencionado acima codificando as moléculas efetoras acima pode ser gerado por meio de transcrição in vitro, e o mRNA gerado pode ser purificado para entrega in vivo. Resumidamente, um fragmento de DNA contendo a região CDS das moléculas efetoras pode ser clonado à jusante de um promotor artificial a partir de um bacteriófago que conduz a transcrição in vitro (por exemplo, promotor T7 T3 ou SP6). O RNA pode ser transcrito a partir do promotor adicionando componentes necessários para a transcrição in vitro, tais como T7 polimerase, NTPs e tampões IVT. Se necessário, o RNA pode ser modificado para reduzir a estimulação imunológica, aumentar a tradução e a estabilidade da nuclease (por exemplo, 5mCAP (capeamento m7G(5’)ppp(5’)G, ARCA; Análogos de quepe antirreverso (modificações 3’ O-Me- M7G (5’)ppp(5’)G), 5-metilcitidina e pseudouridina, cauda 3’ poli A).
[062] Alternativamente, um complexo de uma proteína efetora e um gN, em seguida denominado nucleoproteína (NP) (por exemplo, desoxirribonucleoproteína (DNP), ribonucleoproteína (RNP)), pode ser usado para entregar a molécula efetora de CRISPR e gN. Resumidamente, a proteína efetora de CRISPR gerada in vitro e a gN transcrita ou sintetizada quimicamente in vitro são misturadas em relações apropriadas e, em seguida, encapsuladas em nanopartículas lipídicas (LNPs). As LNPs encapsuladas podem ser entregues a um animal que sofre de uma doença ou paciente, e o complexo NP pode ser entregue diretamente nas células ou órgãos alvo.
[063] Uma proteína efetora de CRISPR pode ser expressa em bactérias e pode ser purificada por meio de coluna de afinidade. A sequência de cDNA códon- otimizada de bactérias da proteína efetora de CRISPR pode ser clonada em plasmídeos de expressão de bactérias tal como o vetor pE-SUMO a partir de LifeSensors. O fragmento de cDNA pode ser marcado com uma pequena sequência de peptídeo, tal como HA, 6xHis, Myc ou peptídeos FLAG, tanto no N-terminal quanto no C-terminal. Os plasmídeos podem ser introduzidos em cepas bacterianas que expressam proteínas, tais como E. coli B834 (DE3). Após a indução, a proteína pode ser purificada usando a ligação de coluna de afinidade às pequenas sequências de marcação de peptídeo, tais como coluna Ni-NTA ou coluna de afinidade anti-FLAG. O peptídeo marcador anexado pode ser removido por tratamento com TEV protease. A proteína pode ser posteriormente purificada por cromatografia em uma coluna HiLoad Superdex 200 16/60 (GE Healthcare).
[064] Alternativamente, a proteína efetora de CRISPR pode ser expressa em linhagens de células de mamíferos, tal como células CHO, COS, HEK293 e células Hela. Por exemplo, a sequência de cDNA códon-otimizada humana da proteína CRISPR pode ser clonada em plasmídeos de expressão de mamífero (por exemplo, pA1-11, pXT1, pRc / CMV, pRc / RSV, pcDNAI / Neo, pSRa); vetores derivados de vírus animais, tais como retrovírus, vírus vaccinia, adenovírus, vírus adenoassociado, etc., e similares podem ser usados. Os fragmentos de cDNA podem ser marcados com uma pequena sequência de peptídeo, tal como HA, 6xHis, Myc ou peptídeo FLAG, tanto no N-terminal quanto no C-terminal. Os plasmídeos podem ser introduzidos nas linhagens de células de mamíferos que expressam proteínas. Dois a três dias após a transfecção, as células transfectadas podem ser colhidas e a proteína CRISPR expressa pode ser purificada utilizando a ligação em coluna de afinidade às pequenas sequências de marcadores de peptídeos mencionadas acima.
[065] O ativador da presente invenção também pode ser obtido por um método similar ao método mencionado acima. Exemplos
[066] A invenção será mais completamente entendida com referência aos exemplos a seguir, que fornecem modalidades ilustrativas não limitantes da invenção.
[067] Foram projetadas e construídas novas porções de ativação que são pequenas o suficiente para se fundir com dSaCas9 e se encaixam no limite de tamanho do vetor AAV de 5 kb, ao mesmo tempo que abrigam potência de ativação de transcrição comparável ou até melhor do que as porções de ativação existentes (Figura 1). As porções de ativação existentes incluem VP64 (50 a.a.), VP160 (130 a.a.), VPR (520 a.a.) e P300 (617 a.a.) (descrito em PMID:27214048/25730490).
Destas porções de ativação, apenas VP64 e VP160 satisfazem o limite de tamanho do vetor AAV quando fundido com dSaCas9.
[068] Portanto, foram projetadas, construídas e testadas as seguintes sete novas porções de ativação fundidas com dSaCas9 e comparada a sua potência de transativação com as três porções existentes (VP64, VP160 e VPR).
[069] Sequência de aminoácidos e nucleotídeos das porções de ativação geradas
[070] 1. VP64-miniMYOD (154 a.a.) consiste de VP64 (itálico) e 1 - 100 a.a. de MYOD1 humano (negrito, PMID: 9710631) que estão conectados por um ligante G-S-G-S (sublinhado);
[071] gatgctttagacgattttgacttagatatgcttggttcagacgcgttagacgacttcgacctagacatg ttaggctcagatgcattggacgacttcgatttagatatgttgggctccgatgccctagatgactttgatttggatatgctagg atctggtagcatggagctactgtcgccaccgctccgcgacgtagacctgacggcccccgacggctctctctgctccttt gccacaacggacgacttctatgacgacccgtgtttcgactccccggacctgcgcttcttcgaggacctggacccgcgc ctgatgcacgtgggcgcgctcctgaaacccgaagagcactcgcacttccctgcggctgttcacccggcaccggggg cacgcgaggacgaacatgtcagggctcccagcggtcatcaccaggctggtcggtgtctgttgtgggcctgcaaggcg (SEQ ID NO: 9).
[072] 2. VP64-miniHSF1 (154 a.a.) consiste de VP64 (itálico) e 430 - 529 a.a. de HSF1 humano (negrito, PMID: 7760831) que estão conectados por um ligante G- S-S-G (sublinhado);
[073] gatgctttagacgattttgacttagatatgcttggttcagacgcgttagacgacttcgacctagacatg ttaggctcagatgcattggacgacttcgatttagatatgttgggctccgatgccctagatgactttgatttggatatgctagg tagcagtgggcctgaccttgacagcagcctggccagtatccaagagctcctgtctccccaggagccccccaggcctc ccgaggcagagaacagcagcccggattcagggaagcagctggtgcactacacagcgcagccgctgttcctgctgg accccggctccgtggacaccgggagcaacgacctgccggtgctgtttgagctgggagagggctcctacttctccgaa ggggacggcttcgccgaggaccccaccatctccctgctgacaggctcggagcctcccaaagccaaggaccccact gtctcc (SEQ ID NO: 11).
[074] 3. VP32-miniP65 (160 a.a.) consiste de VP32 (itálico) e 415 - 546 a.a. de P65 humano (negrito, PMID: 1732726) que estão conectados por um ligante G-S- G-S (sublinhado);
[075] gatgcattggacgacttcgatttagatatgttgggctccgatgccctagatgactttgatttggatatgc taggatctggtagccctggacctccacaggctgtggctccaccagcccctaaacctacacaggccggcgagggcac actgtctgaagctctgctgcagctgcagttcgacgacgaggatctgggagccctgctgggaaacagcaccgatcctg ccgtgttcaccgacctggccagcgtggacaacagcgagttccagcagctgctgaaccagggcatccctgtggcccct cacaccaccgagcccatgctgatggaataccccgaggccatcacccggctcgtgacaggcgctcagaggcctcct gatccagctcctgcccctctgggagcaccaggcctgcctaatggactgctgtctggcgacgaggacttcagctctatcg ccgatatggatttctcagccttgctg (SEQ ID NO: 13).
[076] 4. VP64-miniRTA (167 a.a.) consiste de VP64 (itálico) e 493 - 605 a.a. do ativador de replicação e transcrição do vírus Epstein-Barr (negrito, RTA; PMID: 1323708) que são conectados por um ligante G-S-G-S (sublinhado);
[077] gatgctttagacgattttgacttagatatgcttggttcagacgcgttagacgacttcgacctagacatg ttaggctcagatgcattggacgacttcgatttagatatgttgggctccgatgccctagatgactttgatttggatatgctagg atctggtagcccagcgcccgcagtgactcccgaggccagtcacctgttggaagatcccgatgaagagaccagcca ggctgtcaaagcccttcgggagatggccgatactgtgattccccagaaggaagaggctgcaatctgtggccaaatgg acctttcccatccgcccccaaggggccatctggatgagctgacaaccacacttgagtccatgaccgaggatctgaac ctggactcacccctgaccccggaattgaacgagattctggataccttcctgaacgacgagtgcctcttgcatgccatgc atatcagcacaggactgtccatcttcgacacatctctgttt (SEQ ID NO: 5).
[078] 5. VP64-miniP65 (186 a.a.) consiste de VP64 (itálico) e 415 - 546 a.a. de P65 humano (negrito, PMID: 1732726) que estão conectados por um ligante G-S- G-S (sublinhado);
[079] gatgctttagacgattttgacttagatatgcttggttcagacgcgttagacgacttcgacctagacatg ttaggctcagatgcattggacgacttcgatttagatatgttgggctccgatgccctagatgactttgatttggatatgctagg atctggtagccctggacctccacaggctgtggctccaccagcccctaaacctacacaggccggcgagggcacactg tctgaagctctgctgcagctgcagttcgacgacgaggatctgggagccctgctgggaaacagcaccgatcctgccgt gttcaccgacctggccagcgtggacaacagcgagttccagcagctgctgaaccagggcatccctgtggcccctcac accaccgagcccatgctgatggaataccccgaggccatcacccggctcgtgacaggcgctcagaggcctcctgatc cagctcctgcccctctgggagcaccaggcctgcctaatggactgctgtctggcgacgaggacttcagctctatcgccg atatggatttctcagccttgctg (SEQ ID NO: 15).
[080] 6. VPH (376 a.a.) consiste de VP64 (itálico), 369 - 549 a.a. de P65 de murino (negrito) e 407-529 a.a. de HSF1 humano (sublinhado em negrito), PMID: 25494202) que estão conectados por NLS (PKKKRKV) (SEQ ID NO: 45) e / ou ligante S-G-Q-G-G-G-G-S-G (sublinhado);
[081] gatgctttagacgattttgacttagatatgcttggttcagacgcgttagacgacttcgacctagacatg ttaggctcagatgcattggacgacttcgatttagatatgttgggctccgatgccctagatgactttgatttggatatgctaag ttccggatctccgaaaaagaaacgcaaagttggtagcccttcagggcagatcagcaaccaggccctggctctggcc cctagctccgctccagtgctggcccagactatggtgccctctagtgctatggtgcctctggcccagccacctgctccagc ccctgtgctgaccccaggaccaccccagtcactgagcgctccagtgcccaagtctacacaggccggcgaggggac tctgagtgaagctctgctgcacctgcagttcgacgctgatgaggacctgggagctctgctggggaacagcaccgatcc cggagtgttcacagacctggcctccgtggacaactctgagtttcagcagctgctgaatcagggcgtgtccatgtctcata gtacagccgaaccaatgctgatggagtaccccgaagccattacccggctggtgaccggcagccagcggccccccg accccgctccaactcccctgggaaccagcggcctgcctaatgggctgtccggagatgaagacttctcaagcatcgct gatatggactttagtgccctgctgtcacagatttcctctagtgggcagggaggaggtggaagcggcttcagcgtggaca ccagtgccctgctggacctgttcagcccctcggtgaccgtgcccgacatgagcctgcctgaccttgacagcagcctgg ccagtatccaagagctcctgtctccccaggagccccccaggcctcccgaggcagagaacagcagcccggattcag ggaagcagctggtgcactacacagcgcagccgctgttcctgctggaccccggctccgtggacaccgggagcaacg acctgccggtgctgtttgagctgggagagggctcctacttctccgaaggggacggcttcgccgaggaccccaccatct ccctgctgacaggctcggagcctcccaaagccaaggaccccactgtctcc (SEQ ID NO: 17).
[082] 7. VPR (510 a.a.) consiste de VP64 (itálico), 284-543 a.a. de P65 humano (negrito, PMID: 5970) e 416-605 a.a. do ativador de replicação e transcrição do vírus Epstein-Barr (sublinhado em negrito, RTA; PMID: 1323708) que estão conectados por NLS (PKKKRKV) e / ou ligante G-S-G-S-G-S (sublinhado)
[083] gacgccctcgatgattttgaccttgacatgcttggttcggatgcccttgatgactttgacctcgacatgc tcggcagtgacgcccttgatgatttcgacctggacatgctgattaactctAgaagttccggatctccgaaaaagaaacg caaagttggtagccagtacctgcccgacaccgacgaccggcaccggatcgaggaaaagcggaagcggacctac gagacattcaagagCatcatgaagaagtcccccttcagcggccccaccgaccctagacctccacctagaagaatc gccgtgcccagcagatccagcgccagcgtgccaaaacctgccccccagccttaCcccttcaccagcagcctgagc accatcaactacgacgagttccctaccatggtgttccccagcggccagatctctcaggcctctgctctggctccagccc ctcctcaggtgctgcctcaggctcctgctcctgcaccagctccagccatggtgtctgcactggctcaggcaccagcacc cgtgcctgtgctggctcctggacctccacaggctgtggctccaccagcccctaaacctacacaggccggcgagggc acactgtctgaagctctgctgcagctgcagttcgacgacgaggatctgggagccctgctgggaaacagcaccgatcc tgccgtgttcaccgacctggccagcgtggacaacagcgagttccagcagctgctgaaccagggcatccctgtggccc ctcacaccaccgagcccatgctgatggaataccccgaggccatcacccggctcgtgacaggcgctcagaggcctcc tgatccagctcctgcccctctgggagcaccaggcctgcctaatggactgctgtctggcgacgaggacttcagctctatc gccgatatggatttctcagccttgctgggctctggcagcggcagccgggattccagggaagggatgtttttgccgaagc ctgaggccggctccgctattagtgacgtgtttgagggccgcgaggtgtgccagccaaaacgaatccggccatttcatc ctccaggaagtccatgggccaaccgcccactccccgccagcctcgcaccaacaccaaccggtccagtacatgagc cagtcgggtcactgaccccggcaccagtccctcagccactggatccagcgcccgcagtgactcccgaggccagtca cctgttggaggatcccgatgaagagacgagccaggctgtcaaagcccttcgggagatggccgatactgtgattcccc agaaggaagaggctgcaatctgtggccaaatggacctttcccatccgcccccaaggggccatctggatgagctgac aaccacacttgagtccatgaccgaggatctgaacctggactcacccctgaccccggaattgaacgagattctggata ccttcctgaacgacgagtgcctcttgcatgccatgcatatcagcacaggactgtccatcttcgacacatctctgttt (SEQ ID NO: 19).
[084] 8. VP64-microRTA (140 a.a.) consiste de VP64 (itálico) e 520 - 605 a.a. do ativador de replicação e transcrição do vírus Epstein-Barr (negrito, RTA; PMID: 1323708) que são conectados por um ligante G-S-G-S (sublinhado);
[085] gatgcactcgatgattttgacctcgatatgcttgggagtgatgcgctcgatgacttcgatttggatatg cttggatctgatgccctcgacgatttcgaccttgatatgctcgggtcagacgctttggatgactttgaccttgacatgctgg ggagcggctcccgggagatggctgacacagtaataccccaaaaagaggaggctgcgatttgtgggcagatggattt gtcccaccctccaccgagaggtcatcttgacgaattgacaacgacgctcgaatccatgaccgaggacctgaacctcg atagcccgctcacccccgagttgaatgagatcctggatacatttcttaatgatgagtgtttgcttcacgcaatgcatatttct acgggtcttagtattttcgacacgagcctgttt (SEQ ID NO: 7).
[086] As novas porções de ativação (AMs) foram sintetizadas por IDT e clonadas no vetor NUC9-dSaCas9. As proteínas de fusão foram expressas a partir do promotor EFS. Sequência de sgRNA usada: MYD88-1; GGTTCATACGGTCCTGCCCTC (SEQ ID NO: 35) MYD88-2; GGAGCCACAGTTCTTCCACGG (SEQ ID NO: 36) MYD88-3; CTCTACCCTTGAGGTCTCGAG (SEQ ID NO: 37) FGF21-1; TGCCAGATTCCAGTTGTCCAG (SEQ ID NO: 38) FGF21-2; ACATTCCTGAGTCTCAGAGAG (SEQ ID NO: 39) FGF21-3; GGCTAATTTCCTGGAGCCCCT (SEQ ID NO: 40) GCG-1; CTGTGAGGCTAAACAGAGCTG (SEQ ID NO: 41) GCG-2; GTCTCTCACCCAATATAAGCA (SEQ ID NO: 42) GCG-3; AAATCACTTAAGTTCTCTAAA (SEQ ID NO: 43) Transfecção Celular
[087] As células HEK293FT foram semeadas em placas de 24 poços a 75.000 células por poço. 250 ng de proteína de fusão expressando plasmídeos NUC9- dsaCas9-AM foram co-transfectados com sgRNA expressando plasmídeos LvSG03 usando Lipofectamina 2000 de acordo com as instruções do fabricante. Após 24 horas, as células transfectadas foram submetidas à seleção com puromicina e colhidas no dia seguinte. Sequência de nucleotídeos de dSaCas9;
[088] atgaagcggaactacatcctgggcctggccatcggcatcaccagcgtgggctacggcatcatcg actacgagacacgggacgtgatcgatgccggcgtgcggctgttcaaagaggccaacgtggaaaacaacgagggc aggcggagcaagagaggcgccagaaggctgaagcggcggaggcggcatagaatccagagagtgaagaagct gctgttcgactacaacctgctgaccgaccacagcgagctgagcggcatcaacccctacgaggccagagtgaaggg cctgagccagaagctgagcgaggaagagttctctgccgccctgctgcacctggccaagagaagaggcgtgcacaa cgtgaacgaggtggaagaggacaccggcaacgagctgtccaccaaagagcagatcagccggaacagcaaggc cctggaagagaaatacgtggccgaactgcagctggaacggctgaagaaagacggcgaagtgcggggcagcatc aacagattcaagaccagcgactacgtgaaagaagccaaacagctgctgaaggtgcagaaggcctaccaccagct ggaccagagcttcatcgacacctacatcgacctgctggaaacccggcggacctactatgagggacctggcgaggg cagccccttcggctggaaggacatcaaagaatggtacgagatgctgatgggccactgcacctacttccccgaggaa ctgcggagcgtgaagtacgcctacaacgccgacctgtacaacgccctgaacgacctgaacaatctcgtgatcacca gggacgagaacgagaagctggaatattacgagaagttccagatcatcgagaacgtgttcaagcagaagaagaag cccaccctgaagcagatcgccaaagaaatcctcgtgaacgaagaggatattaagggctacagagtgaccagcacc ggcaagcccgagttcaccaacctgaaggtgtaccacgacatcaaggacattaccgcccggaaagagattattgag aacgccgagctgctggatcagattgccaagatcctgaccatctaccagagcagcgaggacatccaggaagaactg accaatctgaactccgagctgacccaggaagagatcgagcagatctctaatctgaagggctataccggcacccaca acctgagcctgaaggccatcaacctgatcctggacgagctgtggcacaccaacgacaaccagatcgctatcttcaac cggctgaagctggtgcccaagaaggtggacctgtcccagcagaaagagatccccaccaccctggtggacgacttc atcctgagccccgtcgtgaagagaagcttcatccagagcatcaaagtgatcaacgccatcatcaagaagtacggcct gcccaacgacatcattatcgagctggcccgcgagaagaactccaaggacgcccagaaaatgatcaacgagatgc agaagcggaaccggcagaccaacgagcggatcgaggaaatcatccggaccaccggcaaagagaacgccaag tacctgatcgagaagatcaagctgcacgacatgcaggaaggcaagtgcctgtacagcctggaagccatccctctgg aagatctgctgaacaaccccttcaactatgaggtggaccacatcatccccagaagcgtgtccttcgacaacagcttca acaacaaggtgctcgtgaagcaggaagaagccagcaagaagggcaaccggaccccattccagtacctgagcag cagcgacagcaagatcagctacgaaaccttcaagaagcacatcctgaatctggccaagggcaagggcagaatca gcaagaccaagaaagagtatctgctggaagaacgggacatcaacaggttctccgtgcagaaagacttcatcaacc ggaacctggtggataccagatacgccaccagaggcctgatgaacctgctgcggagctacttcagagtgaacaacct ggacgtgaaagtgaagtccatcaatggcggcttcaccagctttctgcggcggaagtggaagtttaagaaagagcgg aacaaggggtacaagcaccacgccgaggacgccctgatcattgccaacgccgatttcatcttcaaagagtggaaga aactggacaaggccaaaaaagtgatggaaaaccagatgttcgaggaaaagcaggccgagagcatgcccgagat cgaaaccgagcaggagtacaaagagatcttcatcaccccccaccagatcaagcacattaaggacttcaaggacta caagtacagccaccgggtggacaagaagcctaatagagagctgattaacgacaccctgtactccacccggaagga cgacaagggcaacaccctgatcgtgaacaatctgaacggcctgtacgacaaggacaatgacaagctgaaaaagc tgatcaacaagagccccgaaaagctgctgatgtaccaccacgacccccagacctaccagaaactgaagctgattat ggaacagtacggcgacgagaagaatcccctgtacaagtactacgaggaaaccgggaactacctgaccaagtact ccaaaaaggacaacggccccgtgatcaagaagattaagtattacggcaacaaactgaacgcccatctggacatca ccgacgactaccccaacagcagaaacaaggtcgtgaagctgtccctgaagccctacagattcgacgtgtacctgga caatggcgtgtacaagttcgtgaccgtgaagaatctggatgtgatcaaaaaagaaaactactacgaagtgaatagca agtgctatgaggaagctaagaagctgaagaagatcagcaaccaggccgagtttatcgcctccttctacaacaacgat ctgatcaagatcaacggcgagctgtatagagtgatcggcgtgaacaacgacctgctgaaccggatcgaagtgaaca tgatcgacatcacctaccgcgagtacctggaaaacatgaacgacaagaggccccccaggatcattaagacaatcg cctccaagacccagagcattaagaagtacagcacagacattctgggcaacctgtatgaagtgaaatctaagaagca ccctcagatcatcaaaaagggctaa (SEQ ID NO: 28). Sequência de tracrRNA;
[089] guuuuaguacucuggaaacagaaucuacuaaaacaaggcaaaaugccguguuuaucac gucaacuuguuggcgagauuuuuuu (SEQ ID NO: 30)
[090] Isolamento de RNA e análise de expressão gênica
[091] Para a análise da expressão gênica, as células transfectadas foram colhidas 48 a 72h após a transfecção e lisadas em tampão RLT para extrair o RNA total usando o kit RNeasy (Qiagen).
[092] Para a análise Taqman, 1 μg de RNA total foi usado para gerar cDNA usando o kit de RNA para cDNA de Alta Capacidade TaqManTM (Applied Biosystems) em um volume de 10 μl. O cDNA gerado foi diluído 10 vezes e 3,33 μl foram usados por reação Taqman (10 μL de volume total por reação). A reação Taqman foi corrida usando a mistura principal de expressão gênica Taqman (ThermoFisher) no Roche LightCycler 96 ou LightCycler 480 e analisada usando o software de análise LightCycler 96.
[093] IDs de produto de sonda Taqman: MYD88; Hs01573837_g1 (FAM) FGF21: Hs00173927_m1
GCG: Hs01031536_m1 HPRT: Hs99999909_m1 (VIC PL) Condição de QPCR Taqman: Etapa 1; 95° C por 10 min Etapa 2; 95° C por 15 s Etapa 3; 60° C por 30 s Repetir as etapas 2 e 3; 40 vezes Resultado
[094] Figura 1. A estrutura do vetor AAV e as dez porções de ativação
[095] Este vetor AAV contém dSaCas9 fundido com porções de ativação mostradas no diagrama abaixo. As proteínas de fusão são expressas pelo promotor EFS, e o sgRNA é expresso a partir do promotor U6. Sete novas porções de ativação foram criadas; VP64-MyoD, VP64-HSF1, VP32-p65, VP64-miniRTA, VP64-microRTA, VP64-p65 e VPH. As porções de ativação relatadas (VP64, VP160 e VPR) também foram testadas para comparação. O limite de tamanho do vetor AAV é de 5 kb, e os componentes somam 4,45 kb, o que deixa espaço para as porções de ativação fundidas em torno de 550 bps. Assim, as seguintes sete porções de ativação se encaixam no limite de tamanho do vetor; VP64, Vp160, VP64-MyoD, VP64-HSF1, VP32-p65, VP64-miniRTA e VP64-microRTA.
[096] Figura 2. Ativação do gene MYD88 pelas nove porções de ativação
[097] A função de ativação das seis novas porções de ativação foi testada com três diferentes sgRNAs (MYD88-1, -2 e -3) dirigidos à região de promotor MYD88 humano. As três porções de ativação, VP64, VP160 e VPR também foram testadas para comparação. Em todos os três sgRNAs testados, o VP64-RTA mostrou a melhor ativação do gene das seis porções que se encaixam no limite de tamanho do vetor AAV.
[098] Figura 3. Ativação do gene FGF21 pelas nove porções de ativação
[099] A função de ativação das seis novas porções de ativação foi testada com três diferentes sgRNAs (FGF-1, -2 e -3) visando a região de promotor FGF21 humano. As três porções de ativação, VP64, VP160 e VPR também foram testadas para comparação. Em todos os três sgRNAs testados, o VP64-RTA mostrou a melhor ativação do gene das seis porções que se encaixam no limite de tamanho do vetor AAV.
[0100] Figura 4. Ativação do gene GCG pelas nove porções de ativação
[0101] A função de ativação das seis novas porções de ativação foi testada com três diferentes sgRNAs (GCG-1, -2 e -3) visando a região de promotor GCG humano. As três porções de ativação, VP64, VP160 e VPR também foram testadas para comparação. Em todos os três sgRNAs testados, o VP64-RTA mostrou a melhor ativação do gene das seis porções que se encaixam no limite de tamanho do vetor AAV.
[0102] Figura 5. Ativação do gene MyD88 por VP64-miniRTA e VP64- microRTA
[0103] As funções de ativação de VP64-miniRTA (164 a.a.) e VP64-microRTA (140 a.a.) foram comparadas no promotor MYD88 humano. VP64-microRTA mostrou nível de ativação similar ao VP64-miniRTA. gMYD88_2 foi usado. Conclusão
[0104] VP64-miniRTA (miniVR; 167 aa, 501 bps) e VP64-microRTA (microVR; 140 aa, 420 bps) da presente invenção são pequenos o suficiente para caber dentro do limite de tamanho do vetor AAV (5kb) na presença de outros elementos, tal como Cas9, sgRNA e promotores.
[0105] Assim, VP64-miniRTA e VP64-microRTA são porções poderosas para usar com a tecnologia CRISPR e sistema de entrega AAV.
[0106] Este pedido é baseado no pedido de patente provisório U.S. No. 62/715.432 (data de depósito: 7 de agosto de 2018), cujo conteúdo é incorporado na íntegra neste documento por referência.

Claims (14)

REIVINDICAÇÕES
1. Ativador de transcrição, CARACTERIZADO pelo fato de que consiste de não mais do que 200 aminoácidos e compreende VP64 e um sítio de ativação de transcrição de RTA.
2. Ativador de transcrição, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito VP64 compreende: (1) a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 1, (2) a sequência de aminoácidos de (1) em que 1 ou vários aminoácidos são deletados, substituídos e / ou adicionados, ou (3) uma sequência de aminoácidos 90% ou mais idêntica à sequência de aminoácidos de (1).
3. Ativador de transcrição, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito sítio de ativação de transcrição de RTA compreende: (4) a sequência mostrada em SEQ ID NO: 2, (5) a sequência mostrada em SEQ ID NO: 3, (6) a sequência de aminoácidos de (4) ou (5) em que 1 ou vários aminoácidos são deletados, substituídos e / ou adicionados, ou (7) uma sequência de aminoácidos 90% ou mais idêntica à sequência de aminoácidos de (4) ou (5).
4. Complexo, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende um módulo de reconhecimento de sequência de ácido nucleico que se liga especificamente a uma sequência de nucleotídeo alvo em um DNA de fita dupla e o ativador de transcrição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3 ligados entre si, e ativando a transcrição de um gene alvo no DNA.
5. Complexo, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito módulo de reconhecimento de sequência de ácido nucleico compreende uma proteína efetora de CRISPR sem a capacidade de clivar pelo menos uma fita do DNA de fita dupla.
6. Complexo, de acordo com a reivindicação 5, CARACTERIZADO pelo fato de que a dita proteína efetora de CRISPR não tem a capacidade de clivar ambas as fitas do DNA de fita dupla.
7. Complexo, de acordo com a reivindicação 5 ou 6, CARACTERIZADO pelo fato de que a proteína efetora de CRISPR é derivada de Staphylococcus aureus ou Campylobacter jejuni.
8. Ácido nucleico, CARACTERIZADO pelo fato de que codifica o ativador de transcrição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3.
9. Ácido nucleico, CARACTERIZADO pelo fato de que codifica o complexo de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 7.
10. Vetor, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende o ácido nucleico de acordo com a reivindicação 8 ou 9.
11. Vetor, de acordo com a reivindicação 10, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito vetor é um vetor de vírus adenoassociado.
12. Método para ativar a transcrição de um gene alvo em uma célula, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende uma etapa de introduzir o complexo de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 7, o ácido nucleico de acordo com a reivindicação 8 ou 9, ou o vetor de acordo com a reivindicação 10 ou 11 na célula.
13. Método, de acordo com a reivindicação 12, CARACTERIZADO pelo fato de que a célula é uma célula de mamífero.
14. Método de acordo com a reivindicação 13, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito mamífero é um ser humano.
Modulação de Ativação A estrutura do cassete de expressão GNDM e porções de ativação
Petição 870210012521, de 05/02/2021, pág. 51/55 Figura 1
Figura 2 (capacidade de empacotamento de 5 kb)
sgRNA Apenas Cassete de expressão
Genoma de rAAV de fita dupla
Porção 1/3
Encaixa dentro do limite de tamanho do vetor
Figura 3 Modulação de Ativação
Apenas sgRNA
Figura 4 Modulação de Ativação
Apenas sgRNA
Figura 5 Modulação de Ativação
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