CN110938658B

CN110938658B - 一种抗体进化方法及其应用

Info

Publication number: CN110938658B
Application number: CN201811110388.5A
Authority: CN
Inventors: 孟飞龙; 刘浏; 黄敏; 刘婷婷; 蔡燕妮
Original assignee: Center for Excellence in Molecular Cell Science of CAS
Current assignee: Center for Excellence in Molecular Cell Science of CAS
Priority date: 2018-09-21
Filing date: 2018-09-21
Publication date: 2023-02-07
Anticipated expiration: 2038-09-21
Also published as: CN110938658A

Abstract

本发明提供一种抗体进化方法，所述抗体进化方法包含以下步骤：1）提供单碱基基因编辑系统，所述单碱基基因编辑系统可形成单碱基基因编辑复合体，所述单碱基基因编辑复合体包括dCas9酶、sgRNA、MS2胞嘧啶脱氨酶融合蛋白，所述sgRNA靶向待进化抗体的可变区基因；2）利用1）中所述的单碱基基因编辑系统对待进化抗体的可变区基因进行碱基突变，表达突变抗体，获得突变抗体库；3）筛选并富集高亲和力抗体。本发明通过对细胞进行基因编辑，真正实现了抗体基因的定范围自主突变。并通过结合后续的流式分选技术，从而定向选择抗体的进化，提高抗体进化效率。

Description

一种抗体进化方法及其应用

技术领域

本发明涉及细胞生物学领域，特别是涉及一种抗体进化方法及其应用。

背景技术

面对复杂的生存环境，人体适应性免疫系统中的免疫细胞可以通过多样化其细胞受体来识别不同的抗原或病原体。例如：多样化的B细胞受体和T细胞受体是B或T细胞介导的免疫反应中各类病原体识别的分子基础。B细胞受体可以分为膜结合型或分泌型，其中分泌型B细胞受体又被称为抗体。抗体是体液免疫的重要分子，它由两条相同的重链和轻链组成，其中N端由于其组成氨基酸具有多样性，也被称为可变区，能够识别并结合抗原分子，决定了抗体的特异性。可变区通过半胱氨酸形成的二硫键连接成三级结构。其中，暴露在可变区结构域外端的高变区的序列多样性最为显著，它们能与抗原表位形成互补结构域，又被称为互补决定区(CDR)。而可变区的其他位置的氨基酸序列相对CDR区域而言更为保守，可被称为框架区(FWR)。CDR1和CDR2位于V_H或V_L元件内部，而CDR3位于V_HD_HJ_H或V_LJ_L的连接区，序列多样性最为明显(Hwang et al.,2015)。抗体分子的C端序列氨基酸组成相对稳定，被称为恒定区。重链的恒定区一般有五种类型，μ、δ、γ、ε以及α，它们通过与不同的下游免疫反应分子相作用，从而介导不同的免疫反应。

据估计，人类一生可以产生多达10⁹种类的抗体，足以识别5×10¹³种抗原。如果每一种抗体分子都对应不同的编码基因，那这将大大超出人类基因组的最大容量。事实上，在我们的机体内，存在着抗体分子多样化的复杂机制，使得我们可以利用少量的基因元件，组成基因序列极为丰富的初级抗体库。在免疫B细胞发育早期，细胞需要经历V(D)J重排，淋巴细胞中特异表达的重排酶RAG(Recombination-Activating Gene)能在V,D,J元件的编码基因附近产生DNA双链断裂(DSB)，并通过招募下游的多种非同源末端连接蛋白对不同的元件进行连接，最终拼接产生抗体可变区。人体和小鼠中，重排过程能形成约10⁵-10⁶不同类型的抗体分子。重排后的细胞成功表达了B细胞受体(BCR)，但此时表面的BCR亲和力较低，对致病菌中和作用较低，且分子多为IgM亚型。当同源B细胞遇到对应抗原后将迅速被激活，细胞快速分裂分化并迁移至生发中心的暗区，成为生发中心母细胞。在生发中心中，B细胞将经历体细胞高频突变(SHM)和抗体类型转换(CSR)两大过程，从而表达高效力抗体。这两个过程均由胞嘧啶脱氨酶(AID)介导，通过对单链DNA上的胞嘧啶N4位的氨基进行脱氨，从而使得胞嘧啶转化成为尿嘧啶，并通过下游的错配修复途径，而在抗体基因簇上形成碱基高频突变，或被处理为DNA双链断裂。相较于正常状态下基因上每分裂一代产生的～10^-9的突变率，抗体可变区基因在高频突变过程中能产生约10^-5-10^-3的突变率。多样化的抗体分子组合成一个次级抗体库，其中表达抗原特异性的高亲和力抗体的B细胞可以在生发中心中被进一步的筛选出来，从而机体可以分泌各种高亲和力抗体。这一过程也被称为抗体的亲和力成熟。

抗体分子的生产可以简单分为免疫动物、构建抗体库、筛选高效抗体、人源化等步骤。目前，有多种方法可被用于构建抗体库，并筛选得到高效抗体。如应用最广泛的单克隆抗体制备的杂交瘤技术，将来自小鼠的骨髓瘤细胞与能分泌高亲和力抗体的浆细胞进行融合，形成杂交瘤细胞。但应用这种方法进行筛选通量小，需要耗费较多人力物力。噬菌体表面展示技术，能在大肠杆菌和噬菌体表面高通量地表达抗体表位分子，通过该方法已获得多种高亲和力抗体，并被成功应用在多种领域。但该方法中，噬菌体不能表达抗体分子在自然配对后产生的重链和轻链，且真核生物中特有的多种氨基酸修饰也无法在该体系中体现。酵母表面展示技术以及真核细胞表面展示技术等部分解决了原核系统表达缺陷、糖基化缺失等问题，但面临通量不够等问题。随着测序技术的不断进步，基于单个B细胞的抗体基因进行克隆得以实现，通过结合流式细胞术，可以有效得到多种高亲和的抗体分子，但这种技术依赖于流式细胞术以及特定的抗原分子。近年来，人源化基因工程小鼠也被广泛应用在抗体分子人源化过程。但这些技术并没有解决抗体多样性产生的问题，因此抗体的生产仍然依赖于免疫动物或大样本的人群样品。

抗体体外亲和力成熟或亲和力提升是人源化抗体制备流程中重要的技术环节。目前主要的手段包括：1.随机突变或易错DNA聚合酶合成，结合表面展示技术的筛选；2.定范围合成DNA短链库，结合表面展示技术的筛选；3.通过过表达脱氨酶AID，结合流式细胞术进行筛选。前两种方法依赖于抗体库的构建，工作量较大而效率低。而第三种方法，利用细胞内源AID的方法，过表达AID虽然在基因上能够造成很多突变，但并不能定点靶向AID活性到特定区域。因此，该方法效率极低。

抗体类药物由于其自身与靶抗原结合具有特异性、有效性和安全性等特点，在自身免疫病、癌症等多种临床疾病治疗过程中发挥了重要作用，是当前生物医药中增长速率最快的一类药物。截止2017年，FDA已累计批准超过70种抗体类药物，自2014年开始，抗体新药批准数量呈爆发式增长。目前仍有26种抗体类药物正在处于临床研究的最终阶段，有望在2018年通过批准。除此之外，抗体也被广泛地运用在生物医学等领域的诊断中。在生物医学的研究中，抗体被用于检测特定蛋白、蛋白的氨基酸修饰、核酸的特殊结构等等，已经成为不可缺少的手段。在疾病和病原体诊断领域，抗体诊断试剂已经成为快速诊断的标准方法。更高亲和力、更稳定的抗体分子是快速并廉价诊断试剂盒的核心成分，也是诊断领域急需的试剂。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种抗体进化方法及其应用，用于解决现有技术中抗体突变效率低的问题。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供一种抗体进化方法，所述抗体进化方法包含以下步骤：

1)提供单碱基基因编辑系统，所述单碱基基因编辑系统可形成单碱基基因编辑复合体，所述单碱基基因编辑复合体包括dCas9酶、sgRNA、MS2胞嘧啶脱氨酶融合蛋白，所述sgRNA靶向待进化抗体的可变区基因；

2)利用1)中所述的单碱基基因编辑系统对待进化抗体的可变区基因进行碱基突变，表达突变抗体，获得突变抗体库；

3)筛选并富集高亲和力抗体。

进一步的，步骤2)还包括：利用1)中所述的单碱基基因编辑系统对获得的突变抗体库进行多轮的碱基突变，获得突变抗体库。一般可以进行1～4轮突变，甚至更多轮的突变。例如，首次利用1)中所述的单碱基基因编辑系统对待进化抗体的可变区基因进行碱基突变获得的突变抗体库为第一轮突变抗体库；利用1)中所述的单碱基基因编辑系统对第一轮突变抗体库进行碱基突变获得的突变抗体库为第二轮突变抗体库；利用1)中所述的单碱基基因编辑系统对第二轮突变抗体库进行碱基突变获得的突变抗体库为第三轮突变抗体库；利用1)中所述的单碱基基因编辑系统对第三轮突变抗体库进行碱基突变获得的突变抗体库为第四轮突变抗体库；利用1)中所述的单碱基基因编辑系统对第四轮突变抗体库进行碱基突变获得的突变抗体库为第五轮突变抗体库。

优选的，步骤2)中，所述突变抗体库进行下一轮碱基突变时，先进行筛选与富集。

进一步的，步骤3)中，所述高亲和力抗体，是指相对于突变之前的抗体，亲和力提升的抗体。

进一步的，所述sgRNA包括靶向待进化抗体的可变区基因的靶向段，以及MS2发夹结构，所述MS2发夹结构用于招募MS2胞嘧啶脱氨酶融合蛋白。

进一步的，所述sgRNA可包括用于结合dCas9酶的发夹结构，所述用于结合dCas9酶的发夹结构与Crispr/Cas9系统中的tracrRNA相同或相似，是由重复序列区转录而成的具有发卡结构的RNA，其编码基因可为如SEQ ID NO：29所示的核苷酸序列。

优选的，所述sgRNA靶向待进化抗体的可变区基因能表达抗体互补决定区(CDR)的位置。

进一步的，所述dCas9酶是指已经丧失剪切活性的cas9酶dCas9酶能特异地结合在靶向位点，将DNA双链打开，而不发生双链切割的，为招募的胞嘧啶脱氨酶提供单链DNA底物，并以此实现在定范围的基因组区域实现高频突变。

进一步的，所述sgRNA包括2个MS2发夹结构。

进一步的，所述MS2胞嘧啶脱氨酶融合蛋白中，胞嘧啶脱氨酶包括AID-mono、AID-crystal、AID-act、人Apobec3a、人Apobec3b、AID-A3c和AID-A3f中的一种或多种。优选的，为AID-mono、人Apobec3a。选用为AID-mono、人Apobec3a时，单碱基基因编辑系统能使抗体的突变在sgRNA靶向的序列的上下游至少50bp。进一步的，达到400bp。

所述MS2是指噬菌体外壳蛋白。

优选的，在对待进化抗体的可变区基因进行碱基突变之前，对所述待进化抗体基因进行密码子优化，使得在不改变所生成的氨基酸序列的情况下，使得序列中保留胞嘧啶脱氨酶容易发生作用的序列，保留所有临近序列中的WRC和AGCT序列模体。密码子的优化根据DNA序列和密码子表，手动进行密码子优化。具体方式可采用分子生物学领域常用技术手段。

进一步的，所述单碱基基因编辑系统包括DNA构建体，所述DNA构建体中，含有sgRNA编码基因、MS2胞嘧啶脱氨酶融合蛋白的编码基因、dCas9酶的编码基因中的一个或多个。例如，可以是含有sgRNA编码基因的DNA构建体；或者是含有MS2胞嘧啶脱氨酶融合蛋白的编码基因的DNA构建体；或者是含有dCas9酶的编码基因的DNA构建体；或者是含有sgRNA编码基因和MS2胞嘧啶脱氨酶融合蛋白的编码基因的DNA构建体；或者是MS2胞嘧啶脱氨酶融合蛋白的编码基因和dCas9酶的编码基因的DNA构建体；或者是含有sgRNA编码基因和dCas9酶的编码基因的DNA构建体；或者是含有sgRNA编码基因、MS2胞嘧啶脱氨酶融合蛋白的编码基因和dCas9酶的编码基因的DNA构建体。

进一步的，所述单碱基基因编辑系统中的sgRNA编码基因可以是一种或多种，优选多种sgRNA编码基因，用以形成靶向sgRNA库。其中，多种sgRNA编码基因是指，sgRNA编码基因编码多条序列不同的sgRNA，且所述各序列不同的sgRNA靶向待进化抗体的可变区中的不同位置。利用多种sgRNA靶向待进化抗体的可变区中的不同位置，可以抗体基因上产生多点、多范围高效突变，提升突变效率。

所述DNA构建体选自含有上述编码基因的质粒或慢病毒载体。

进一步的，所述质粒可以选自pX330、pLL1_sgRNA(MS2)_MS2_AIDmono、pLL4_sgRNA(MS2)_MS2_hA3a。

进一步的，所述慢病毒载体可以选自lenti-dCAS-VP64_Blast、pLL7_lenti_dcas9_3xflag_blast、plenti-universal-CH-cd28-gp41-puro(该载体采用Taube,R.etal.(2008).Lentivirus display:stable expression of human antibodies on thesurface of human cells and virus particles.PLoS One 3,e3181.记载的方法进行构建)。

进一步的，步骤2)中，所述突变抗体经抗体表面展示系统进行展示。

进一步的，所述抗体表面展示系统包括抗体表面展示载体，所述抗体表面展示载体能表达突变抗体基因。

优选的，步骤2)中所用的抗体表面展示载体上，在利用单碱基基因编辑系统进行基因突变之前，在抗体表面展示载体上的抗体的可变区基因与抗生素抗性基因中插入t2A肽段编码序列，将抗体的可变区基因与抗生素抗性基因通过t2A肽段编码序列相连。以提高抗体表面展示的效率。将抗体的可变区基因与抗生素抗性基因相连，使得抗体的可变区基因的移码突变或终止密码子突变可影响抗生素抗性基因或营养缺陷互补基因的编码。通过抗性基因筛选系统的引入，可以排除抗体编码基因编辑过程中发生移码错义突变或终止密码突变的克隆，以提高抗体表面展示的效率。之前报道的系统并没有将可变区基因与抗性基因进行过耦连，而是质粒中分别通过不同的启动子进行表达。

t2A肽段的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。核苷酸序列如SEQ ID NO：30所示。

所述抗体表面展示系统选自噬菌体表面展示系统，大肠杆菌表面展示系统，酵母菌表面展示系统，哺乳动物细胞表面展示系统。优选的，为哺乳动物细胞表面展示系统。

具体的，哺乳动物细胞表面展示系统是指，含有抗体表面展示载体的宿主细胞，所述宿主细胞为哺乳动物细胞。例如为人、鼠或兔子，具体地，可为HEK293T细胞。

进一步的，所述抗体表面展示载体能表达突变抗体基因，并能表达于宿主细胞表面。

进一步的，所述抗体表面展示载体含有抗体的可变区基因、跨膜融合肽段基因与信号肽基因，并能表达于细胞表面。所述跨膜融合肽段可为CD28-gp41或跨膜蛋白PDGFR。

所述跨膜融合蛋白肽段具有如下功能：将融合的目的蛋白展示于细胞外侧。

本发明中，具体的将单碱基基因编辑系统和抗体的可变区基因共转化进入抗体表面展示系统中的方法不作限定，本领域技术人员可以根据实际需要采用本领域公知的技术进行。

进一步的，所述步骤3)中，所述筛选表达高亲和力抗体的细胞的方法为利用流式细胞仪进行筛选。使用APC荧光耦连的anti-IgG抗体对抗体表达情况进行标记，然后用PE荧光耦连的NP检测抗原抗体的结合情况。抗体表达量越高，检测到的抗原抗体结合力就会越强，处于一个线性范围，与抗体能够高亲和力结合的细胞会超出线性染色细胞群。

本发明第二方面，提供一种抗体，所述抗体为采用如本发明第一方面所述的抗体进化方法获得。

如上所述，本发明的抗体进化方法及其应用，具有以下有益效果：本发明是以哺乳动物细胞为研究体系，应用哺乳动物表面展示技术，使得胞嘧啶脱氨酶可以通过sgRNA定位，从而对抗体基因编码序列进行靶向编辑。目前已有的多种抗体生产方法均依赖于机体自身产生突变或外源引入突变。而本发明通过对细胞进行基因编辑，真正实现了抗体基因的定范围自主突变，大大提升了抗体进化效率。并通过结合后续的流式分选技术，从而定向选择抗体的进化。

本发明中所使用的单碱基基因编辑系统，在进行基因编辑时具有显著的底物序列偏好性。本发明所具有的选择性能够大大减少与抗体亲和无关的位点干扰，提高抗体筛选的效率。提高抗体亲和力。

附图说明

图1显示为膜结合型抗体表达系统的建立结果图。(用anti-human IgG1标记抗体分子Fc段的human IgG1，用PE-NP检测其与抗体分子的亲和性)

图2显示为融合蛋白在细胞内对GFP基因进行编辑后产生的突变图谱。图上至下分别是AID多种突变体，以及humanA3a,humanA3b,ratApobec1,AID 3c,AID 3f蛋白。

图3显示为单个sgRNA在单碱基基因编辑系统中造成的突变图谱(突变可达PAM序列上下游数百bp)。

图4显示为单碱基基因编辑系统-AID对VB18编码基因的CDR区域以及FWR区域突变图谱；

图5显示为本发明密码子优化前后突变图谱(图上：优化前；图下：优化后)。

图6显示为本发明VB18抗体基因一轮亲和成熟流式检测图。横坐标为APC荧光信号，纵坐标为PE荧光信号，阴性对照为未转染单碱基基因编辑系统的细胞。

图7显示为单碱基基因编辑系统-hA3a，单碱基基因编辑系统-AID-3c，单碱基基因编辑系统-AID-3f对VB18编码基因突变图谱。

图8显示为利用单碱基基因编辑系统在体外对抗体基因进行筛选后多轮亲和成熟的突变图谱。其中，A组显示为单碱基基因编辑系统-AID三轮亲和突变图谱(A1：分选前，A2：分选后)；B组显示为单碱基基因编辑系统-A3a三轮亲和突变图谱(左：分选前，右：分选后)

图9显示为关键突变位点的确定以及亲和力检测结果图。(体外BLI检测得到的抗原抗体解离常数，分别对应野生型和各突变体。)

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。

应理解，本发明中提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还可以存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以插入其他方法步骤，除非另有说明；还应理解，本发明中提到的一个或多个设备/装置之间的组合连接关系并不排斥在所述组合设备/装置前后还可以存在其他设备/装置或在这些明确提到的两个设备/装置之间还可以插入其他设备/装置，除非另有说明。而且，除非另有说明，各方法步骤的编号仅为鉴别各方法步骤的便利工具，而非为限制各方法步骤的排列次序或限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容的情况下，当亦视为本发明可实施的范畴。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。

实施例1抗体亲和力提升的方法

1.1抗体表面展示系统的构建

先进行密码子优化，列举出VB18基因序列中氨基酸对应的所有碱基组合，手动挑选保留最多的WRC或AGCT序列模体，交给苏州金唯智公司进行合成。优化后的VB18基因核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

用于在293T细胞表面过表达膜结合型抗体分子的载体是lenti dCAS-VP64_Blast进行改造，保留病毒包装骨架，对lenti dCAS-VP64_Blast质粒使用BsiWI，EcoRI进行酶切，信号肽(SEQ ID NO：3)、优化后的VB18基因序列、IgG恒定区序列(CH2-CH3)(SEQ ID NO：4)均合成于苏州金唯智公司。通过PCR扩增和Gibson assembly的方法将重组片段与对应质粒连接，VB18-重链扩增正向引物(SEQ ID NO：5)：

5’-CTGGTGGCAGCGGCCCAGCCGGCCATGCAGGTCCAACTGCAGCAGCCT-3’

VB18-重链扩增反向引物(SEQ ID NO：6)：

5’-CCAGAACCACCACCTCCGGAACCGCCGCCACCTGAGGAGACTGTGAGAGT-3’

VB18-轻链扩增正向引物(SEQ ID NO：7)：

5’-TCCGGAGGTGGTGGTTCTGGCGGTGGTGGCAGCTCCCAG-3’

VB18-轻链扩增反向引物(SEQ ID NO：8)：

5’-GTTTTGTCACAAGATTTGGGCTCTGCGGCCGCCGAGGGGGC-3’

将Cas9蛋白编码基因替换成为信号肽-VB18重链-VB18轻链-CH2-CH3-CD28-gp41融合蛋白编码序列。

Cas9蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示。核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示。

CD28-gp41的核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示。

1.2单碱基基因编辑系统的构建

1.2.1构建dCas9稳转细胞株的质粒：通过分子克隆的方法对张峰实验室(Addgeneplasmid#61425)lenti-dCAS-VP64_Blast进行改造，使用BamHI，BsrGI对lenti-dCAS-VP64_Blast质粒进行酶切，去除VP64基因(SEQ ID NO：12)，并通过连接克隆进3xFlag标签序列(SEQ ID NO：13)，得到lenti-dCAS_3xFlag_Blast质粒。

构建dCas9稳转细胞株的质粒：D10ACas9载体是在前一步得到的lenti-dCAS_3xFlag_Blast质粒基础上将dCas9基因的A863位点突变为N。

dCas9蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：14所示。核苷酸序列如SEQ ID NO：15所示。D10ACas9蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：16所示。核苷酸序列如SEQ ID NO：17所示。

1.2.2.电转以及瞬时转染实验需要用到过表达MS2-胞嘧啶脱氨酶融合蛋白的载体的制备方法：

(1)在张峰实验室(Addgene plasmid#42230)PX330质粒的基础上，对PX330载体使用BbSI，KpnI进行酶切，使用PCR技术将sgRNA基因(SEQ ID NO：18)克隆到PX330载体上，形成含有sgRNA基因的PX330载体。所述sgRNA基因可以形成用于招募MS2胞嘧啶脱氨酶融合蛋白的MS2发夹结构。PCR时所用的包含所述sgRNA序列的模板购自addgene，货号为61426，PCR反应条件为98℃,30s；98℃,10s；60℃,30s；72℃,20s；30个循环；72℃,5min。

sgRNA扩增上游引物(SEQ ID NO：19)：

5’-GGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGGGTCTTCGAGAAGACCTGTTTTAGAGCTAG-3’；

sgRNA扩增下游引物(SEQ ID NO：20)：

5’ATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAACAAAAAAAGCACCGACTCGGTG-3

(2)将上述形成的含有sgRNA基因的PX330载体使用AgeI，EcoRI进行酶切，使用PCR技术将MS2基因序列连接到所述载体上，得到含有sgRNA基因-MS2基因的PX330载体。PCR时所用的包含所述MS2基因序列的模板购自addgene，货号为61426，PCR反应条件为98℃,30s；98℃,10s；60℃,30s；72℃,20s；30个循环；72℃,5min。

MS2基因上游引物(SEQ ID NO：21)：

5’-cctgcctgaaatcactttttttcaggttggaccggtccaccatggcttcaaacttt actc-3’；

MS2基因下游引物(SEQ ID NO：22)：

5’-gtcgaggctgatcagcgagctctaggaattaggatccagcggccgccaccttc-3’；

(3)通过Gibson assembly的方法将胞嘧啶脱氨酶基因进行连接到步骤(2)形成的含有sgRNA基因-MS2基因的PX330载体上，形成含有sgRNA基因-MS2基因-胞嘧啶脱氨酶基因的PX330载体，用于表达MS2-胞嘧啶脱氨酶融合蛋白。胞嘧啶脱氨酶基因包括Apobec3a，Apobec3c，Apobec3f，Apobec3g基因，均合成于苏州金唯智公司。

1.3利用单碱基基因编辑系统进行基因编辑

使用lipofectamine 2000脂质体试剂对293T细胞转染单碱基基因编辑系统中的MS2-胞嘧啶脱氨酶蛋白复合体，以及sgRNA库的质粒。提前24h，将293T细胞铺至6孔板中，使得细胞第二天密度约为50-60％。转染前对细胞进行换液，换至2ml新鲜DMEM培养基中。转染时，向250μl Opti-MEM中加入10μl lipofectamine 2000，轻弹混匀后静置5min，同时向250μl Opti-MEM中加入4μl质粒，充分混匀后，与静置完成的脂质体稀释物混合，室温静置20min后，逐滴加入细胞培养基中，轻摇混合均匀，将细胞板置于37℃，5％CO₂培养箱中培养4-6h后更换新鲜培养基。培养两天后进行下一轮转染，三次之后进行分选。

1.4利用流式细胞仪进行筛选

利用流式细胞分选技术，对表达高亲和力抗体细胞进行富集。取适量细胞悬液离心，并用FACS缓冲液(PBS加2.5％FBS)洗一遍。用FACS缓冲液按1：500稀释所需抗体，每个样品用2million/100μl稀释后抗体在室温下染色15分钟，然后用FACS缓冲液洗一遍，用合适体积的FACS缓冲液重悬细胞后立即上机分选，收集表达高亲和力抗体的细胞群。收集后的细胞铺至24孔板中并置于37℃，5％CO₂培养箱中培养。通过流式染色，收集超出线性染色范围的细胞群，并判定其为高亲和力细胞。

1.5碱基突变的检测

对溶解充分的分选富集出来的表达高亲和力抗体的细胞群的突变VB18抗体基因DNA进行浓度测定，取部分DNA稀释至200ng/μl作为PCR模板，反应体系及条件如下：

反应体系：

反应条件：98℃,30s；98℃,10s；60℃,20s；72℃,20s；25个循环；72℃,5min。

一轮PCR完成后，取1μl第一轮产物作为第二轮PCR的模板，进行第二轮PCR反应。

反应体系：

反应条件：98℃,30s；98℃,10s；60℃,20s；72℃,20s；11个循环；72℃,5min。

一轮PCR需要进行两个反应，所用的引物序列如下：

突变VB18基因扩增子一上游引物(SEQ ID NO：23)：

5’-TCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNCAGGAGCCCACTCCCAGGTCC-3’；

突变VB18基因扩增子一下游引物(SEQ ID NO：24)：

5’-AGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTNNNNNNGTAGGCTGTG CTGGAGGGTT-3’；

突变VB18基因扩增子二上游引物(SEQ ID NO：25)：

5’-TTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT CNNNNNNGGCCACACTGACTGTAGACAA-3’；

突变VB18基因扩增子二下游引物(SEQ ID NO：26)：

5’-AGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTNNNNNNCTGAGGAGACTGTGAGAGTGGTG-3

二轮PCR所需要使用的引物序列如下：

二轮上游引物(SEQ ID NO：27)：

5’-TTCCCTACACGACGCTCT TCCGATCTNNNNNNTAGGTGAGTAAGGGTGAGG-3’；

二轮下游引物(SEQ ID NO：28)：

5’-AGTTCAGACG TGTGCTCTTCCGATCTNNNNNNTCATCCACTTCACCACCCTATC-3’。

将反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，切下目的条带，并进行胶回收试验，对纯化后的样品进行二代测序，利用生物信息学方法对突变序列和位点进行分析。

所采用的生物信息学方法是指利用ea-utils工具对双端测序得到的所有源文件进行序列分离，以得到多个单个样品的序列源文件。然后利用Bowtie2工具将源文件与参考基因序列进行比对，最后得到序列的碱基突变，插入和删除信息。

1.6蛋白表达和亲和力验证

对筛选后获得的突变体进行蛋白纯化，将目的质粒转化进入BL21(DE3)感受态中，37℃培养过夜。挑取阳性克隆至6ml 2xTY培养基中，37℃，220rpm，摇7-8h。将培养物转移至含300ml 2xTY培养基的锥形瓶中，37℃，220rpm，待OD600达到0.7-0.8后，16℃，加入1mMIPTG，220rpm过夜。

将过夜培养的细胞于4000rpm离心15min，用事先预冷的20ml裂解(150mM Nacl,20mM HEPES(PH7.5),10％glycerol)重悬细胞，使用时加入终浓度均1mM的TECP.Hcl和PMSF。利用细胞破碎仪对重悬物进行破碎，800Pa压力下破碎10min。将破碎好的菌进行离心，14000rpm离心45min。取500μl

Metal Affinity Resins加入层析柱中，并分别用用水和裂解液对其进行平衡，将用于储存的20％乙醇彻底去除。将离心得到的上清与平衡好的beads进行轻柔混合并置在混合仪上，结合45分钟。

将充分结合后的混合产物加入层析柱中，使得未结合产物匀速流出，先用5倍柱体积的裂解液，再用5倍柱体积的含20mM咪唑的裂解液去除掉层析柱中未结合的多余物质。最后加入含300mM咪唑的裂解液将目的蛋白洗脱下来。将纯化得到的蛋白采用Bradford法进行蛋白浓度测定，同时进行SDS-PAGE胶鉴定，并用考马斯亮蓝法对蛋白条带进行染色，通过蛋白条带大小判断蛋白纯化是否成功。

使用Octet Red 96仪器对抗原抗体的解离常数进行测定，用生物素标记NP_CGG抗原(mole ratio＝3:1),并最终以20g/ml与感应器进行结合，多种抗体突变体稀释至100nM,50nM,25nM,12.5nM,6.25nM。稀释所用缓冲液为常规动力学缓冲液(1xPBS,0.01％BSA,0.002％Tween 20)。实验所使用参数为baseline1,60s,load,300s,baseline2,300s,association,600s,dissociation,600s。

1.7结果分析

1.7.1抗体表面展示系统的构建结果

本发明采用采用荧光标记对应的抗原分子检测抗原抗体亲和情况，以及荧光标记的IgG1检测抗体的表达情况。通过流式检测，证明VB18抗体基因成功表达在HEK293T细胞膜表面(图1)。

1.7.2单碱基基因编辑工具的特性分析

通过对单碱基基因编辑系统中编辑位点进行分析，表明融合了不同胞嘧啶脱氨酶的单碱基基因编辑系统具有突变底物序列的偏好性，这些序列多对应了不同胞嘧啶脱氨酶在体内发挥脱氨作用的底物偏好序列模体(图2)。这表明单碱基基因编辑系统的耦连方式能够在极大程度上保有胞苷脱氨酶在体内发挥活性的特性，从而实现在体外培养的细胞中特异地对一段基因序列进行多样突变。

通过对靶向区域进行高通量测序，表明融合不同胞嘧啶脱氨酶的单碱基基因编辑系统产生的突变均能在PAM序列的上下游50bp被检测到，甚至能产生在数百碱基对的范围之外，这证明耦连了不同工具酶的单碱基基因编辑系统能在一定程度上实现较广范围的碱基编辑(图3)。

抗体序列可分为CDR区域和FWR区域，其中CDR区域可以与抗原表位结合，在抗体亲和中发挥了重要功能。通过对这两个不同的区域设置靶向sgRNA库，分别进行靶向编辑，结果表明对CDR区域进行靶向编辑也能得到很好的效果(图4)。

1.7.3密码子优化结果分析

在自然界中，由于遗传密码子具有简并性，特定氨基酸可对应几种不同的遗传密码子。基于对不同脱氨酶的作用特性的研究，对一段抗体基因编码的核苷酸序列进行密码子优化，在不改变氨基酸序列的情况下，使得序列中更多的出现AID偏好的序列模体，如AGCT序列等。实验结果表明，优化后的序列相较于原有抗体基因序列，编辑后能产生更明显的多样性(图5)。这表明通过密码子优化，可以更好的实现高频广范围多位点的突变。

1.7.4利用单碱基基因编辑系统进行抗体基因突变的结果分析

通过试验持续转染特定工具或不同工具交替转染的方法，发现不同的突变策略都能得到显著的抗体亲和力提高。通过一轮亲和成熟，VB18抗体与NP抗原产生高亲和结合的细胞数量明显增多，由原有的不足1％上升至10％(图6)。

如图7所示，当耦连不同胞嘧啶脱氨酶时，抗体基因的突变图谱具有较大差异，突变的位点也有较大不同。通过扩增三轮分选得到的高亲和细胞群对应的抗体编码序列，使用本发明的方法，应用单碱基基因编辑系统-AID进行突变时，得到以下几个突变频率显著增高的位点：T30,S31,T58,Q82,S84,A97(氨基酸位点)。使用本发明的方法，应用单碱基基因编辑系统-A3a进行突变时，得到以下几个显著增加的点：W33,Q39,S84(氨基酸位点)。其中每个位点每轮突变成的氨基酸序列和比率表1及图8所示。其中W33L的突变，为已知提升该抗体亲和力的重要突变位点。通过本发明的方法，成功富集了这个重要位点，这表明采用本发明所述的抗体进化的方法，在体外培养的细胞中成功进行抗体进化，提升抗体的亲和力，找到影响抗体亲和成熟的重要位点。

表1利用单碱基基因编辑系统在体外对抗体基因进行筛选后多轮亲和成熟

1.7.5亲和力的测定结果分析

根据CDR区域的突变信息，本发明设计了包括S31R,T58I,T58I+A24S,W33L在内的多个突变体，并在体外纯化了这些突变体蛋白。随后通过应用BLI技术，检测这些突变体抗体蛋白和NP_CGG抗原对应的解离常数，结果表明S31R突变和T58I+A24S两个点突变可以提高约2-3倍的亲和力，而T58I单点突变可以提高约10倍亲和力，W33L单点突变也可以提升约10倍亲和力(图9)。这充分说明本发明的方法可在体外通过定范围随机筛选，以实现抗体的亲和成熟。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

序列表

<110> 中国科学院上海生命科学研究院

<120> 一种抗体进化方法及其应用

<160> 30

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro

1 5 10 15

Gly Pro

<210> 2

<211> 738

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

caggtccaac tgcagcagcc tggggctgag cttgtgaagc ctggggcttc agtgaagctg 60

tcctgcaagg cttctggcta caccttcagc agctactgga tgcactgggt gaagcagagg 120

cctggacgag gccttgagtg gattggaagg attgatccta atagtggtgg tactaagtac 180

aatgagaagt tcaagagcaa ggccacactg actgtagaca aaccctccag cacagcctac 240

atgcagctca gcagcctgac atctgaggac tctgcggtct attattgcgc aagatacgat 300

tactacggta gtagctactt tgactactgg ggccaaggca ccactctcac agtctcctca 360

ggtggcggcg gttccggagg tggtggttct ggcggtggtg gcagctccca ggctgttgtg 420

actcaggaat ctgcactcac cacatcacct ggtgaaacag tcacactcac ttgtcgctca 480

agtactgggg ctgttacaac tagtaactat gccaactggg tccaacaaaa accagatcat 540

ttattcactg gtctaatagg tggtaccaac aaccgagctc caggtgttcc tgccagattc 600

tcaggctccc tgattggaaa caaggctgcc ctcaccatca caggggcaca gactgaggat 660

gaggcaatat atttctgtgc tctatggtac agcaaccatt gggtcttcgg gggtggcact 720

aagctaactg tcctaggt 738

<210> 3

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgaaacatc tgtggttctt ccttctcctg gtggcagcgg cccagccg 48

<210> 4

<211> 720

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gagcccaaat cttgtgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcctg 60

gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 120

acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 180

aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 240

tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 300

ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 360

atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg 420

gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 480

gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 540

cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc 600

aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 660

tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaatccg gcggctcctc tagaggaggc 720

<210> 5

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ctggtggcag cggcccagcc ggccatgcag gtccaactgc agcagcct 48

<210> 6

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ccagaaccac cacctccgga accgccgcca cctgaggaga ctgtgagagt 50

<210> 7

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tccggaggtg gtggttctgg cggtggtggc agctcccag 39

<210> 8

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gttttgtcac aagatttggg ctctgcggcc gccgaggggg c 41

<210> 9

<211> 1368

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Met Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Asp Ile Gly Thr Asn Ser Val

1 5 10 15

Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe

20 25 30

Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile

35 40 45

Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu

50 55 60

Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg Arg Lys Asn Arg Ile Cys

65 70 75 80

Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met Ala Lys Val Asp Asp Ser

85 90 95

Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu Val Glu Glu Asp Lys Lys

100 105 110

His Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Ile Val Asp Glu Val Ala Tyr

115 120 125

His Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu Arg Lys Lys Leu Val Asp

130 135 140

Ser Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu Ile Tyr Leu Ala Leu Ala His

145 150 155 160

Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro

165 170 175

Asp Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe Ile Gln Leu Val Gln Thr Tyr

180 185 190

Asn Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile Asn Ala Ser Gly Val Asp Ala

195 200 205

Lys Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser Lys Ser Arg Arg Leu Glu Asn

210 215 220

Leu Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu Lys Lys Asn Gly Leu Phe Gly Asn

225 230 235 240

Leu Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr Pro Asn Phe Lys Ser Asn Phe

245 250 255

Asp Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu Gln Leu Ser Lys Asp Thr Tyr Asp

260 265 270

Asp Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln Ile Gly Asp Gln Tyr Ala Asp

275 280 285

Leu Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu Ser Asp Ala Ile Leu Leu Ser Asp

290 295 300

Ile Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile Thr Lys Ala Pro Leu Ser Ala Ser

305 310 315 320

Met Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His Gln Asp Leu Thr Leu Leu Lys

325 330 335

Ala Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro Glu Lys Tyr Lys Glu Ile Phe Phe

340 345 350

Asp Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala Gly Tyr Ile Asp Gly Gly Ala Ser

355 360 365

Gln Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile Lys Pro Ile Leu Glu Lys Met Asp

370 375 380

Gly Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys Leu Asn Arg Glu Asp Leu Leu Arg

385 390 395 400

Lys Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser Ile Pro His Gln Ile His Leu

405 410 415

Gly Glu Leu His Ala Ile Leu Arg Arg Gln Glu Asp Phe Tyr Pro Phe

420 425 430

Leu Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile Glu Lys Ile Leu Thr Phe Arg Ile

435 440 445

Pro Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg Gly Asn Ser Arg Phe Ala Trp

450 455 460

Met Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr Ile Thr Pro Trp Asn Phe Glu Glu

465 470 475 480

Val Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala Gln Ser Phe Ile Glu Arg Met Thr

485 490 495

Asn Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn Glu Lys Val Leu Pro Lys His Ser

500 505 510

Leu Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val Tyr Asn Glu Leu Thr Lys Val Lys

515 520 525

Tyr Val Thr Glu Gly Met Arg Lys Pro Ala Phe Leu Ser Gly Glu Gln

530 535 540

Lys Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu Phe Lys Thr Asn Arg Lys Val Thr

545 550 555 560

Val Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr Phe Lys Lys Ile Glu Cys Phe Asp

565 570 575

Ser Val Glu Ile Ser Gly Val Glu Asp Arg Phe Asn Ala Ser Leu Gly

580 585 590

Thr Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile Ile Lys Asp Lys Asp Phe Leu Asp

595 600 605

Asn Glu Glu Asn Glu Asp Ile Leu Glu Asp Ile Val Leu Thr Leu Thr

610 615 620

Leu Phe Glu Asp Arg Glu Met Ile Glu Glu Arg Leu Lys Thr Tyr Ala

625 630 635 640

His Leu Phe Asp Asp Lys Val Met Lys Gln Leu Lys Arg Arg Arg Tyr

645 650 655

Thr Gly Trp Gly Arg Leu Ser Arg Lys Leu Ile Asn Gly Ile Arg Asp

660 665 670

Lys Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu Asp Phe Leu Lys Ser Asp Gly Phe

675 680 685

Ala Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu Ile His Asp Asp Ser Leu Thr Phe

690 695 700

Lys Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln Val Ser Gly Gln Gly Asp Ser Leu

705 710 715 720

His Glu His Ile Ala Asn Leu Ala Gly Ser Pro Ala Ile Lys Lys Gly

725 730 735

Ile Leu Gln Thr Val Lys Val Val Asp Glu Leu Val Lys Val Met Gly

740 745 750

Arg His Lys Pro Glu Asn Ile Val Ile Glu Met Ala Arg Glu Asn Gln

755 760 765

Thr Thr Gln Lys Gly Gln Lys Asn Ser Arg Glu Arg Met Lys Arg Ile

770 775 780

Glu Glu Gly Ile Lys Glu Leu Gly Ser Gln Ile Leu Lys Glu His Pro

785 790 795 800

Val Glu Asn Thr Gln Leu Gln Asn Glu Lys Leu Tyr Leu Tyr Tyr Leu

805 810 815

Gln Asn Gly Arg Asp Met Tyr Val Asp Gln Glu Leu Asp Ile Asn Arg

820 825 830

Leu Ser Asp Tyr Asp Val Asp His Ile Val Pro Gln Ser Phe Leu Lys

835 840 845

Asp Asp Ser Ile Asp Asn Lys Val Leu Thr Arg Ser Asp Lys Asn Arg

850 855 860

Gly Lys Ser Asp Asn Val Pro Ser Glu Glu Val Val Lys Lys Met Lys

865 870 875 880

Asn Tyr Trp Arg Gln Leu Leu Asn Ala Lys Leu Ile Thr Gln Arg Lys

885 890 895

Phe Asp Asn Leu Thr Lys Ala Glu Arg Gly Gly Leu Ser Glu Leu Asp

900 905 910

Lys Ala Gly Phe Ile Lys Arg Gln Leu Val Glu Thr Arg Gln Ile Thr

915 920 925

Lys His Val Ala Gln Ile Leu Asp Ser Arg Met Asn Thr Lys Tyr Asp

930 935 940

Glu Asn Asp Lys Leu Ile Arg Glu Val Lys Val Ile Thr Leu Lys Ser

945 950 955 960

Lys Leu Val Ser Asp Phe Arg Lys Asp Phe Gln Phe Tyr Lys Val Arg

965 970 975

Glu Ile Asn Asn Tyr His His Ala His Asp Ala Tyr Leu Asn Ala Val

980 985 990

Val Gly Thr Ala Leu Ile Lys Lys Tyr Pro Lys Leu Glu Ser Glu Phe

995 1000 1005

Val Tyr Gly Asp Tyr Lys Val Tyr Asp Val Arg Lys Met Ile Ala Lys

1010 1015 1020

Ser Glu Gln Glu Ile Gly Lys Ala Thr Ala Lys Tyr Phe Phe Tyr Ser

1025 1030 1035 1040

Asn Ile Met Asn Phe Phe Lys Thr Glu Ile Thr Leu Ala Asn Gly Glu

1045 1050 1055

Ile Arg Lys Arg Pro Leu Ile Glu Thr Asn Gly Glu Thr Gly Glu Ile

1060 1065 1070

Val Trp Asp Lys Gly Arg Asp Phe Ala Thr Val Arg Lys Val Leu Ser

1075 1080 1085

Met Pro Gln Val Asn Ile Val Lys Lys Thr Glu Val Gln Thr Gly Gly

1090 1095 1100

Phe Ser Lys Glu Ser Ile Leu Pro Lys Arg Asn Ser Asp Lys Leu Ile

1105 1110 1115 1120

Ala Arg Lys Lys Asp Trp Asp Pro Lys Lys Tyr Gly Gly Phe Asp Ser

1125 1130 1135

Pro Thr Val Ala Tyr Ser Val Leu Val Val Ala Lys Val Glu Lys Gly

1140 1145 1150

Lys Ser Lys Lys Leu Lys Ser Val Lys Glu Leu Leu Gly Ile Thr Ile

1155 1160 1165

Met Glu Arg Ser Ser Phe Glu Lys Asn Pro Ile Asp Phe Leu Glu Ala

1170 1175 1180

Lys Gly Tyr Lys Glu Val Lys Lys Asp Leu Ile Ile Lys Leu Pro Lys

1185 1190 1195 1200

Tyr Ser Leu Phe Glu Leu Glu Asn Gly Arg Lys Arg Met Leu Ala Ser

1205 1210 1215

Ala Gly Glu Leu Gln Lys Gly Asn Glu Leu Ala Leu Pro Ser Lys Tyr

1220 1225 1230

Val Asn Phe Leu Tyr Leu Ala Ser His Tyr Glu Lys Leu Lys Gly Ser

1235 1240 1245

Pro Glu Asp Asn Glu Gln Lys Gln Leu Phe Val Glu Gln His Lys His

1250 1255 1260

Tyr Leu Asp Glu Ile Ile Glu Gln Ile Ser Glu Phe Ser Lys Arg Val

1265 1270 1275 1280

Ile Leu Ala Asp Ala Asn Leu Asp Lys Val Leu Ser Ala Tyr Asn Lys

1285 1290 1295

His Arg Asp Lys Pro Ile Arg Glu Gln Ala Glu Asn Ile Ile His Leu

1300 1305 1310

Phe Thr Leu Thr Asn Leu Gly Ala Pro Ala Ala Phe Lys Tyr Phe Asp

1315 1320 1325

Thr Thr Ile Asp Arg Lys Arg Tyr Thr Ser Thr Lys Glu Val Leu Asp

1330 1335 1340

Ala Thr Leu Ile His Gln Ser Ile Thr Gly Leu Tyr Glu Thr Arg Ile

1345 1350 1355 1360

Asp Leu Ser Gln Leu Gly Gly Asp

1365

<210> 10

<211> 4104

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

atggacaaga agtacagcat cggcctggac atcggcacca actctgtggg ctgggccgtg 60

atcaccgacg agtacaaggt gcccagcaag aaattcaagg tgctgggcaa caccgaccgg 120

cacagcatca agaagaacct gatcggagcc ctgctgttcg acagcggcga aacagccgag 180

gccacccggc tgaagagaac cgccagaaga agatacacca gacggaagaa ccggatctgc 240

tatctgcaag agatcttcag caacgagatg gccaaggtgg acgacagctt cttccacaga 300

ctggaagagt ccttcctggt ggaagaggat aagaagcacg agcggcaccc catcttcggc 360

aacatcgtgg acgaggtggc ctaccacgag aagtacccca ccatctacca cctgagaaag 420

aaactggtgg acagcaccga caaggccgac ctgcggctga tctatctggc cctggcccac 480

atgatcaagt tccggggcca cttcctgatc gagggcgacc tgaaccccga caacagcgac 540

gtggacaagc tgttcatcca gctggtgcag acctacaacc agctgttcga ggaaaacccc 600

atcaacgcca gcggcgtgga cgccaaggcc atcctgtctg ccagactgag caagagcaga 660

cggctggaaa atctgatcgc ccagctgccc ggcgagaaga agaatggcct gttcggaaac 720

ctgattgccc tgagcctggg cctgaccccc aacttcaaga gcaacttcga cctggccgag 780

gatgccaaac tgcagctgag caaggacacc tacgacgacg acctggacaa cctgctggcc 840

cagatcggcg accagtacgc cgacctgttt ctggccgcca agaacctgtc cgacgccatc 900

ctgctgagcg acatcctgag agtgaacacc gagatcacca aggcccccct gagcgcctct 960

atgatcaaga gatacgacga gcaccaccag gacctgaccc tgctgaaagc tctcgtgcgg 1020

cagcagctgc ctgagaagta caaagagatt ttcttcgacc agagcaagaa cggctacgcc 1080

ggctacattg acggcggagc cagccaggaa gagttctaca agttcatcaa gcccatcctg 1140

gaaaagatgg acggcaccga ggaactgctc gtgaagctga acagagagga cctgctgcgg 1200

aagcagcgga ccttcgacaa cggcagcatc ccccaccaga tccacctggg agagctgcac 1260

gccattctgc ggcggcagga agatttttac ccattcctga aggacaaccg ggaaaagatc 1320

gagaagatcc tgaccttccg catcccctac tacgtgggcc ctctggccag gggaaacagc 1380

agattcgcct ggatgaccag aaagagcgag gaaaccatca ccccctggaa cttcgaggaa 1440

gtggtggaca agggcgcttc cgcccagagc ttcatcgagc ggatgaccaa cttcgataag 1500

aacctgccca acgagaaggt gctgcccaag cacagcctgc tgtacgagta cttcaccgtg 1560

tataacgagc tgaccaaagt gaaatacgtg accgagggaa tgagaaagcc cgccttcctg 1620

agcggcgagc agaaaaaggc catcgtggac ctgctgttca agaccaaccg gaaagtgacc 1680

gtgaagcagc tgaaagagga ctacttcaag aaaatcgagt gcttcgactc cgtggaaatc 1740

tccggcgtgg aagatcggtt caacgcctcc ctgggcacat accacgatct gctgaaaatt 1800

atcaaggaca aggacttcct ggacaatgag gaaaacgagg acattctgga agatatcgtg 1860

ctgaccctga cactgtttga ggacagagag atgatcgagg aacggctgaa aacctatgcc 1920

cacctgttcg acgacaaagt gatgaagcag ctgaagcggc ggagatacac cggctggggc 1980

aggctgagcc ggaagctgat caacggcatc cgggacaagc agtccggcaa gacaatcctg 2040

gatttcctga agtccgacgg cttcgccaac agaaacttca tgcagctgat ccacgacgac 2100

agcctgacct ttaaagagga catccagaaa gcccaggtgt ccggccaggg cgatagcctg 2160

cacgagcaca ttgccaatct ggccggcagc cccgccatta agaagggcat cctgcagaca 2220

gtgaaggtgg tggacgagct cgtgaaagtg atgggccggc acaagcccga gaacatcgtg 2280

atcgaaatgg ccagagagaa ccagaccacc cagaagggac agaagaacag ccgcgagaga 2340

atgaagcgga tcgaagaggg catcaaagag ctgggcagcc agatcctgaa agaacacccc 2400

gtggaaaaca cccagctgca gaacgagaag ctgtacctgt actacctgca gaatgggcgg 2460

gatatgtacg tggaccagga actggacatc aaccggctgt ccgactacga tgtggaccat 2520

atcgtgcctc agagctttct gaaggacgac tccatcgaca acaaggtgct gaccagaagc 2580

gacaagaacc ggggcaagag cgacaacgtg ccctccgaag aggtcgtgaa gaagatgaag 2640

aactactggc ggcagctgct gaacgccaag ctgattaccc agagaaagtt cgacaatctg 2700

accaaggccg agagaggcgg cctgagcgaa ctggataagg ccggcttcat caagagacag 2760

ctggtggaaa cccggcagat cacaaagcac gtggcacaga tcctggactc ccggatgaac 2820

actaagtacg acgagaatga caagctgatc cgggaagtga aagtgatcac cctgaagtcc 2880

aagctggtgt ccgatttccg gaaggatttc cagttttaca aagtgcgcga gatcaacaac 2940

taccaccacg cccacgacgc ctacctgaac gccgtcgtgg gaaccgccct gatcaaaaag 3000

taccctaagc tggaaagcga gttcgtgtac ggcgactaca aggtgtacga cgtgcggaag 3060

atgatcgcca agagcgagca ggaaatcggc aaggctaccg ccaagtactt cttctacagc 3120

aacatcatga actttttcaa gaccgagatt accctggcca acggcgagat ccggaagcgg 3180

cctctgatcg agacaaacgg cgaaaccggg gagatcgtgt gggataaggg ccgggatttt 3240

gccaccgtgc ggaaagtgct gagcatgccc caagtgaata tcgtgaaaaa gaccgaggtg 3300

cagacaggcg gcttcagcaa agagtctatc ctgcccaaga ggaacagcga taagctgatc 3360

gccagaaaga aggactggga ccctaagaag tacggcggct tcgacagccc caccgtggcc 3420

tattctgtgc tggtggtggc caaagtggaa aagggcaagt ccaagaaact gaagagtgtg 3480

aaagagctac tggggatcac catcatggaa agaagcagct tcgagaagaa tcccatcgac 3540

tttctggaag ccaagggcta caaagaagtg aaaaaggacc tgatcatcaa gctgcctaag 3600

tactccctgt tcgagctgga aaacggccgg aagagaatgc tggcctctgc cggcgaactg 3660

cagaagggaa acgaactggc cctgccctcc aaatatgtga acttcctgta cctggccagc 3720

cactatgaga agctgaaggg ctcccccgag gataatgagc agaaacagct gtttgtggaa 3780

cagcacaagc actacctgga cgagatcatc gagcagatca gcgagttctc caagagagtg 3840

atcctggccg acgctaatct ggacaaagtg ctgtccgcct acaacaagca ccgggataag 3900

cccatcagag agcaggccga gaatatcatc cacctgttta ccctgaccaa tctgggagcc 3960

cctgccgcct tcaagtactt tgacaccacc atcgaccgga agaggtacac cagcaccaaa 4020

gaggtgctgg acgccaccct gatccaccag agcatcaccg gcctgtacga gacacggatc 4080

gacctgtctc agctgggagg cgac 4104

<210> 11

<211> 291

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ggcaccgaga ccagccaggt ggcgcccgcc attgaagtta tgtatcctcc tccttaccta 60

gacaatgaga agagcaatgg aaccattatc catgtgaaag ggaaacacct ttgtccaagt 120

cccctatttc ccggaccttc taagcccttt tgggtgctgg tggtggttgg tggagtcctg 180

gcttgctata gcttgctagt aacagtggcc tttattattt tctgggtgag gagtaagagg 240

agcaggctcc tgcacagtga ctacatgaat agagttaggc agggatattc a 291

<210> 12

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gacgcattgg acgattttga tctggatatg ctgggaagtg acgccctcga tgattttgac 60

cttgacatgc ttggttcgga tgcccttgat gactttgacc tcgacatgct cggcagtgac 120

gcccttgatg atttcgacct ggacatgctg 150

<210> 13

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gactataagg accacgacgg agactacaag gatcatgata ttgattacaa agacgatgac 60

gataag 66

<210> 14

<211> 1367

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Asp Ile Gly Thr Asn Ser Val Gly

1 5 10 15

Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe Lys

20 25 30

Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile Gly

35 40 45

Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu Lys

50 55 60

Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg Arg Lys Asn Arg Ile Cys Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met Ala Lys Val Asp Asp Ser Phe

85 90 95

Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu Val Glu Glu Asp Lys Lys His

100 105 110

Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Ile Val Asp Glu Val Ala Tyr His

115 120 125

Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu Arg Lys Lys Leu Val Asp Ser

130 135 140

Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu Ile Tyr Leu Ala Leu Ala His Met

145 150 155 160

Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro Asp

165 170 175

Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe Ile Gln Leu Val Gln Thr Tyr Asn

180 185 190

Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile Asn Ala Ser Gly Val Asp Ala Lys

195 200 205

Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser Lys Ser Arg Arg Leu Glu Asn Leu

210 215 220

Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu Lys Lys Asn Gly Leu Phe Gly Asn Leu

225 230 235 240

Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr Pro Asn Phe Lys Ser Asn Phe Asp

245 250 255

Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu Gln Leu Ser Lys Asp Thr Tyr Asp Asp

260 265 270

Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln Ile Gly Asp Gln Tyr Ala Asp Leu

275 280 285

Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu Ser Asp Ala Ile Leu Leu Ser Asp Ile

290 295 300

Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile Thr Lys Ala Pro Leu Ser Ala Ser Met

305 310 315 320

Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His Gln Asp Leu Thr Leu Leu Lys Ala

325 330 335

Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro Glu Lys Tyr Lys Glu Ile Phe Phe Asp

340 345 350

Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala Gly Tyr Ile Asp Gly Gly Ala Ser Gln

355 360 365

Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile Lys Pro Ile Leu Glu Lys Met Asp Gly

370 375 380

Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys Leu Asn Arg Glu Asp Leu Leu Arg Lys

385 390 395 400

Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser Ile Pro His Gln Ile His Leu Gly

405 410 415

Glu Leu His Ala Ile Leu Arg Arg Gln Glu Asp Phe Tyr Pro Phe Leu

420 425 430

Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile Glu Lys Ile Leu Thr Phe Arg Ile Pro

435 440 445

Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg Gly Asn Ser Arg Phe Ala Trp Met

450 455 460

Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr Ile Thr Pro Trp Asn Phe Glu Glu Val

465 470 475 480

Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala Gln Ser Phe Ile Glu Arg Met Thr Asn

485 490 495

Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn Glu Lys Val Leu Pro Lys His Ser Leu

500 505 510

Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val Tyr Asn Glu Leu Thr Lys Val Lys Tyr

515 520 525

Val Thr Glu Gly Met Arg Lys Pro Ala Phe Leu Ser Gly Glu Gln Lys

530 535 540

Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu Phe Lys Thr Asn Arg Lys Val Thr Val

545 550 555 560

Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr Phe Lys Lys Ile Glu Cys Phe Asp Ser

565 570 575

Val Glu Ile Ser Gly Val Glu Asp Arg Phe Asn Ala Ser Leu Gly Thr

580 585 590

Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile Ile Lys Asp Lys Asp Phe Leu Asp Asn

595 600 605

Glu Glu Asn Glu Asp Ile Leu Glu Asp Ile Val Leu Thr Leu Thr Leu

610 615 620

Phe Glu Asp Arg Glu Met Ile Glu Glu Arg Leu Lys Thr Tyr Ala His

625 630 635 640

Leu Phe Asp Asp Lys Val Met Lys Gln Leu Lys Arg Arg Arg Tyr Thr

645 650 655

Gly Trp Gly Arg Leu Ser Arg Lys Leu Ile Asn Gly Ile Arg Asp Lys

660 665 670

Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu Asp Phe Leu Lys Ser Asp Gly Phe Ala

675 680 685

Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu Ile His Asp Asp Ser Leu Thr Phe Lys

690 695 700

Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln Val Ser Gly Gln Gly Asp Ser Leu His

705 710 715 720

Glu His Ile Ala Asn Leu Ala Gly Ser Pro Ala Ile Lys Lys Gly Ile

725 730 735

Leu Gln Thr Val Lys Val Val Asp Glu Leu Val Lys Val Met Gly Arg

740 745 750

His Lys Pro Glu Asn Ile Val Ile Glu Met Ala Arg Glu Asn Gln Thr

755 760 765

Thr Gln Lys Gly Gln Lys Asn Ser Arg Glu Arg Met Lys Arg Ile Glu

770 775 780

Glu Gly Ile Lys Glu Leu Gly Ser Gln Ile Leu Lys Glu His Pro Val

785 790 795 800

Glu Asn Thr Gln Leu Gln Asn Glu Lys Leu Tyr Leu Tyr Tyr Leu Gln

805 810 815

Asn Gly Arg Asp Met Tyr Val Asp Gln Glu Leu Asp Ile Asn Arg Leu

820 825 830

Ser Asp Tyr Asp Val Asp His Ile Val Pro Gln Ser Phe Leu Lys Asp

835 840 845

Asp Ser Ile Asp Asn Lys Val Leu Thr Arg Ser Asp Lys Asn Arg Gly

850 855 860

Lys Ser Asp Asn Val Pro Ser Glu Glu Val Val Lys Lys Met Lys Asn

865 870 875 880

Tyr Trp Arg Gln Leu Leu Asn Ala Lys Leu Ile Thr Gln Arg Lys Phe

885 890 895

Asp Asn Leu Thr Lys Ala Glu Arg Gly Gly Leu Ser Glu Leu Asp Lys

900 905 910

Ala Gly Phe Ile Lys Arg Gln Leu Val Glu Thr Arg Gln Ile Thr Lys

915 920 925

His Val Ala Gln Ile Leu Asp Ser Arg Met Asn Thr Lys Tyr Asp Glu

930 935 940

Asn Asp Lys Leu Ile Arg Glu Val Lys Val Ile Thr Leu Lys Ser Lys

945 950 955 960

Leu Val Ser Asp Phe Arg Lys Asp Phe Gln Phe Tyr Lys Val Arg Glu

965 970 975

Ile Asn Asn Tyr His His Ala His Asp Ala Tyr Leu Asn Ala Val Val

980 985 990

Gly Thr Ala Leu Ile Lys Lys Tyr Pro Lys Leu Glu Ser Glu Phe Val

995 1000 1005

Tyr Gly Asp Tyr Lys Val Tyr Asp Val Arg Lys Met Ile Ala Lys Ser

1010 1015 1020

Glu Gln Glu Ile Gly Lys Ala Thr Ala Lys Tyr Phe Phe Tyr Ser Asn

1025 1030 1035 1040

Ile Met Asn Phe Phe Lys Thr Glu Ile Thr Leu Ala Asn Gly Glu Ile

1045 1050 1055

Arg Lys Arg Pro Leu Ile Glu Thr Asn Gly Glu Thr Gly Glu Ile Val

1060 1065 1070

Trp Asp Lys Gly Arg Asp Phe Ala Thr Val Arg Lys Val Leu Ser Met

1075 1080 1085

Pro Gln Val Asn Ile Val Lys Lys Thr Glu Val Gln Thr Gly Gly Phe

1090 1095 1100

Ser Lys Glu Ser Ile Leu Pro Lys Arg Asn Ser Asp Lys Leu Ile Ala

1105 1110 1115 1120

Arg Lys Lys Asp Trp Asp Pro Lys Lys Tyr Gly Gly Phe Asp Ser Pro

1125 1130 1135

Thr Val Ala Tyr Ser Val Leu Val Val Ala Lys Val Glu Lys Gly Lys

1140 1145 1150

Ser Lys Lys Leu Lys Ser Val Lys Glu Leu Leu Gly Ile Thr Ile Met

1155 1160 1165

Glu Arg Ser Ser Phe Glu Lys Asn Pro Ile Asp Phe Leu Glu Ala Lys

1170 1175 1180

Gly Tyr Lys Glu Val Lys Lys Asp Leu Ile Ile Lys Leu Pro Lys Tyr

1185 1190 1195 1200

Ser Leu Phe Glu Leu Glu Asn Gly Arg Lys Arg Met Leu Ala Ser Ala

1205 1210 1215

Gly Glu Leu Gln Lys Gly Asn Glu Leu Ala Leu Pro Ser Lys Tyr Val

1220 1225 1230

Asn Phe Leu Tyr Leu Ala Ser His Tyr Glu Lys Leu Lys Gly Ser Pro

1235 1240 1245

Glu Asp Asn Glu Gln Lys Gln Leu Phe Val Glu Gln His Lys His Tyr

1250 1255 1260

Leu Asp Glu Ile Ile Glu Gln Ile Ser Glu Phe Ser Lys Arg Val Ile

1265 1270 1275 1280

Leu Ala Asp Ala Asn Leu Asp Lys Val Leu Ser Ala Tyr Asn Lys His

1285 1290 1295

Arg Asp Lys Pro Ile Arg Glu Gln Ala Glu Asn Ile Ile His Leu Phe

1300 1305 1310

Thr Leu Thr Asn Leu Gly Ala Pro Ala Ala Phe Lys Tyr Phe Asp Thr

1315 1320 1325

Thr Ile Asp Arg Lys Arg Tyr Thr Ser Thr Lys Glu Val Leu Asp Ala

1330 1335 1340

Thr Leu Ile His Gln Ser Ile Thr Gly Leu Tyr Glu Thr Arg Ile Asp

1345 1350 1355 1360

Leu Ser Gln Leu Gly Gly Asp

1365

<210> 15

<211> 4104

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

atggacaaga agtacagcat cggcctggcc atcggcacca actctgtggg ctgggccgtg 60

atcaccgacg agtacaaggt gcccagcaag aaattcaagg tgctgggcaa caccgaccgg 120

cacagcatca agaagaacct gatcggagcc ctgctgttcg acagcggcga aacagccgag 180

gccacccggc tgaagagaac cgccagaaga agatacacca gacggaagaa ccggatctgc 240

tatctgcaag agatcttcag caacgagatg gccaaggtgg acgacagctt cttccacaga 300

ctggaagagt ccttcctggt ggaagaggat aagaagcacg agcggcaccc catcttcggc 360

aacatcgtgg acgaggtggc ctaccacgag aagtacccca ccatctacca cctgagaaag 420

aaactggtgg acagcaccga caaggccgac ctgcggctga tctatctggc cctggcccac 480

atgatcaagt tccggggcca cttcctgatc gagggcgacc tgaaccccga caacagcgac 540

gtggacaagc tgttcatcca gctggtgcag acctacaacc agctgttcga ggaaaacccc 600

atcaacgcca gcggcgtgga cgccaaggcc atcctgtctg ccagactgag caagagcaga 660

cggctggaaa atctgatcgc ccagctgccc ggcgagaaga agaatggcct gttcggcaac 720

ctgattgccc tgagcctggg cctgaccccc aacttcaaga gcaacttcga cctggccgag 780

gatgccaaac tgcagctgag caaggacacc tacgacgacg acctggacaa cctgctggcc 840

cagatcggcg accagtacgc cgacctgttt ctggccgcca agaacctgtc cgacgccatc 900

ctgctgagcg acatcctgag agtgaacacc gagatcacca aggcccccct gagcgcctct 960

atgatcaaga gatacgacga gcaccaccag gacctgaccc tgctgaaagc tctcgtgcgg 1020

cagcagctgc ctgagaagta caaagagatt ttcttcgacc agagcaagaa cggctacgcc 1080

ggctacattg acggcggagc cagccaggaa gagttctaca agttcatcaa gcccatcctg 1140

gaaaagatgg acggcaccga ggaactgctc gtgaagctga acagagagga cctgctgcgg 1200

aagcagcgga ccttcgacaa cggcagcatc ccccaccaga tccacctggg agagctgcac 1260

gccattctgc ggcggcagga agatttttac ccattcctga aggacaaccg ggaaaagatc 1320

gagaagatcc tgaccttccg catcccctac tacgtgggcc ctctggccag gggaaacagc 1380

agattcgcct ggatgaccag aaagagcgag gaaaccatca ccccctggaa cttcgaggaa 1440

gtggtggaca agggcgcttc cgcccagagc ttcatcgagc ggatgaccaa cttcgataag 1500

aacctgccca acgagaaggt gctgcccaag cacagcctgc tgtacgagta cttcaccgtg 1560

tataacgagc tgaccaaagt gaaatacgtg accgagggaa tgagaaagcc cgccttcctg 1620

agcggcgagc agaaaaaggc catcgtggac ctgctgttca agaccaaccg gaaagtgacc 1680

gtgaagcagc tgaaagagga ctacttcaag aaaatcgagt gcttcgactc cgtggaaatc 1740

tccggcgtgg aagatcggtt caacgcctcc ctgggcacat accacgatct gctgaaaatt 1800

atcaaggaca aggacttcct ggacaatgag gaaaacgagg acattctgga agatatcgtg 1860

ctgaccctga cactgtttga ggacagagag atgatcgagg aacggctgaa aacctatgcc 1920

cacctgttcg acgacaaagt gatgaagcag ctgaagcggc ggagatacac cggctggggc 1980

aggctgagcc ggaagctgat caacggcatc cgggacaagc agtccggcaa gacaatcctg 2040

gatttcctga agtccgacgg cttcgccaac agaaacttca tgcagctgat ccacgacgac 2100

agcctgacct ttaaagagga catccagaaa gcccaggtgt ccggccaggg cgatagcctg 2160

cacgagcaca ttgccaatct ggccggcagc cccgccatta agaagggcat cctgcagaca 2220

gtgaaggtgg tggacgagct cgtgaaagtg atgggccggc acaagcccga gaacatcgtg 2280

atcgaaatgg ccagagagaa ccagaccacc cagaagggac agaagaacag ccgcgagaga 2340

atgaagcgga tcgaagaggg catcaaagag ctgggcagcc agatcctgaa agaacacccc 2400

gtggaaaaca cccagctgca gaacgagaag ctgtacctgt actacctgca gaatgggcgg 2460

gatatgtacg tggaccagga actggacatc aaccggctgt ccgactacga tgtggaccac 2520

atcgtgcctc agagctttct gaaggacgac tccatcgaca acaaggtgct gaccagaagc 2580

gacaaggccc ggggcaagag cgacaacgtg ccctccgaag aggtcgtgaa gaagatgaag 2640

aactactggc ggcagctgct gaacgccaag ctgattaccc agagaaagtt cgacaatctg 2700

accaaggccg agagaggcgg cctgagcgaa ctggataagg ccggcttcat caagagacag 2760

ctggtggaaa cccggcagat cacaaagcac gtggcacaga tcctggactc ccggatgaac 2820

actaagtacg acgagaatga caagctgatc cgggaagtga aagtgatcac cctgaagtcc 2880

aagctggtgt ccgatttccg gaaggatttc cagttttaca aagtgcgcga gatcaacaac 2940

taccaccacg cccacgacgc ctacctgaac gccgtcgtgg gaaccgccct gatcaaaaag 3000

taccctaagc tggaaagcga gttcgtgtac ggcgactaca aggtgtacga cgtgcggaag 3060

atgatcgcca agagcgagca ggaaatcggc aaggctaccg ccaagtactt cttctacagc 3120

aacatcatga actttttcaa gaccgagatt accctggcca acggcgagat ccggaagcgg 3180

cctctgatcg agacaaacgg cgaaaccggg gagatcgtgt gggataaggg ccgggatttt 3240

gccaccgtgc ggaaagtgct gagcatgccc caagtgaata tcgtgaaaaa gaccgaggtg 3300

cagacaggcg gcttcagcaa agagtctatc ctgcccaaga ggaacagcga taagctgatc 3360

gccagaaaga aggactggga ccctaagaag tacggcggct tcgacagccc caccgtggcc 3420

tattctgtgc tggtggtggc caaagtggaa aagggcaagt ccaagaaact gaagagtgtg 3480

aaagagctgc tggggatcac catcatggaa agaagcagct tcgagaagaa tcccatcgac 3540

tttctggaag ccaagggcta caaagaagtg aaaaaggacc tgatcatcaa gctgcctaag 3600

tactccctgt tcgagctgga aaacggccgg aagagaatgc tggcctctgc cggcgaactg 3660

cagaagggaa acgaactggc cctgccctcc aaatatgtga acttcctgta cctggccagc 3720

cactatgaga agctgaaggg ctcccccgag gataatgagc agaaacagct gtttgtggaa 3780

cagcacaagc actacctgga cgagatcatc gagcagatca gcgagttctc caagagagtg 3840

atcctggccg acgctaatct ggacaaagtg ctgtccgcct acaacaagca ccgggataag 3900

cccatcagag agcaggccga gaatatcatc cacctgttta ccctgaccaa tctgggagcc 3960

cctgccgcct tcaagtactt tgacaccacc atcgaccgga agaggtacac cagcaccaaa 4020

gaggtgctgg acgccaccct gatccaccag agcatcaccg gcctgtacga gacacggatc 4080

gacctgtctc agctgggagg cgac 4104

<210> 16

<211> 1368

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

Met Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Ala Ile Gly Thr Asn Ser Val

1 5 10 15

Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe

20 25 30

Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile

35 40 45

Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu

50 55 60

Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg Arg Lys Asn Arg Ile Cys

65 70 75 80

Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met Ala Lys Val Asp Asp Ser

85 90 95

Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu Val Glu Glu Asp Lys Lys

100 105 110

His Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Ile Val Asp Glu Val Ala Tyr

115 120 125

His Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu Arg Lys Lys Leu Val Asp

130 135 140

Ser Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu Ile Tyr Leu Ala Leu Ala His

145 150 155 160

Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro

165 170 175

Asp Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe Ile Gln Leu Val Gln Thr Tyr

180 185 190

Asn Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile Asn Ala Ser Gly Val Asp Ala

195 200 205

Lys Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser Lys Ser Arg Arg Leu Glu Asn

210 215 220

Leu Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu Lys Lys Asn Gly Leu Phe Gly Asn

225 230 235 240

Leu Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr Pro Asn Phe Lys Ser Asn Phe

245 250 255

Asp Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu Gln Leu Ser Lys Asp Thr Tyr Asp

260 265 270

Asp Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln Ile Gly Asp Gln Tyr Ala Asp

275 280 285

Leu Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu Ser Asp Ala Ile Leu Leu Ser Asp

290 295 300

Ile Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile Thr Lys Ala Pro Leu Ser Ala Ser

305 310 315 320

Met Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His Gln Asp Leu Thr Leu Leu Lys

325 330 335

Ala Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro Glu Lys Tyr Lys Glu Ile Phe Phe

340 345 350

Asp Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala Gly Tyr Ile Asp Gly Gly Ala Ser

355 360 365

Gln Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile Lys Pro Ile Leu Glu Lys Met Asp

370 375 380

Gly Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys Leu Asn Arg Glu Asp Leu Leu Arg

385 390 395 400

Lys Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser Ile Pro His Gln Ile His Leu

405 410 415

Gly Glu Leu His Ala Ile Leu Arg Arg Gln Glu Asp Phe Tyr Pro Phe

420 425 430

Leu Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile Glu Lys Ile Leu Thr Phe Arg Ile

435 440 445

Pro Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg Gly Asn Ser Arg Phe Ala Trp

450 455 460

Met Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr Ile Thr Pro Trp Asn Phe Glu Glu

465 470 475 480

Val Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala Gln Ser Phe Ile Glu Arg Met Thr

485 490 495

Asn Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn Glu Lys Val Leu Pro Lys His Ser

500 505 510

Leu Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val Tyr Asn Glu Leu Thr Lys Val Lys

515 520 525

Tyr Val Thr Glu Gly Met Arg Lys Pro Ala Phe Leu Ser Gly Glu Gln

530 535 540

Lys Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu Phe Lys Thr Asn Arg Lys Val Thr

545 550 555 560

Val Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr Phe Lys Lys Ile Glu Cys Phe Asp

565 570 575

Ser Val Glu Ile Ser Gly Val Glu Asp Arg Phe Asn Ala Ser Leu Gly

580 585 590

Thr Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile Ile Lys Asp Lys Asp Phe Leu Asp

595 600 605

Asn Glu Glu Asn Glu Asp Ile Leu Glu Asp Ile Val Leu Thr Leu Thr

610 615 620

Leu Phe Glu Asp Arg Glu Met Ile Glu Glu Arg Leu Lys Thr Tyr Ala

625 630 635 640

His Leu Phe Asp Asp Lys Val Met Lys Gln Leu Lys Arg Arg Arg Tyr

645 650 655

Thr Gly Trp Gly Arg Leu Ser Arg Lys Leu Ile Asn Gly Ile Arg Asp

660 665 670

Lys Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu Asp Phe Leu Lys Ser Asp Gly Phe

675 680 685

Ala Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu Ile His Asp Asp Ser Leu Thr Phe

690 695 700

Lys Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln Val Ser Gly Gln Gly Asp Ser Leu

705 710 715 720

His Glu His Ile Ala Asn Leu Ala Gly Ser Pro Ala Ile Lys Lys Gly

725 730 735

Ile Leu Gln Thr Val Lys Val Val Asp Glu Leu Val Lys Val Met Gly

740 745 750

Arg His Lys Pro Glu Asn Ile Val Ile Glu Met Ala Arg Glu Asn Gln

755 760 765

Thr Thr Gln Lys Gly Gln Lys Asn Ser Arg Glu Arg Met Lys Arg Ile

770 775 780

Glu Glu Gly Ile Lys Glu Leu Gly Ser Gln Ile Leu Lys Glu His Pro

785 790 795 800

Val Glu Asn Thr Gln Leu Gln Asn Glu Lys Leu Tyr Leu Tyr Tyr Leu

805 810 815

Gln Asn Gly Arg Asp Met Tyr Val Asp Gln Glu Leu Asp Ile Asn Arg

820 825 830

Leu Ser Asp Tyr Asp Val Asp His Ile Val Pro Gln Ser Phe Leu Lys

835 840 845

Asp Asp Ser Ile Asp Asn Lys Val Leu Thr Arg Ser Asp Lys Asn Arg

850 855 860

Gly Lys Ser Asp Asn Val Pro Ser Glu Glu Val Val Lys Lys Met Lys

865 870 875 880

Asn Tyr Trp Arg Gln Leu Leu Asn Ala Lys Leu Ile Thr Gln Arg Lys

885 890 895

Phe Asp Asn Leu Thr Lys Ala Glu Arg Gly Gly Leu Ser Glu Leu Asp

900 905 910

Lys Ala Gly Phe Ile Lys Arg Gln Leu Val Glu Thr Arg Gln Ile Thr

915 920 925

Lys His Val Ala Gln Ile Leu Asp Ser Arg Met Asn Thr Lys Tyr Asp

930 935 940

Glu Asn Asp Lys Leu Ile Arg Glu Val Lys Val Ile Thr Leu Lys Ser

945 950 955 960

Lys Leu Val Ser Asp Phe Arg Lys Asp Phe Gln Phe Tyr Lys Val Arg

965 970 975

Glu Ile Asn Asn Tyr His His Ala His Asp Ala Tyr Leu Asn Ala Val

980 985 990

Val Gly Thr Ala Leu Ile Lys Lys Tyr Pro Lys Leu Glu Ser Glu Phe

995 1000 1005

Val Tyr Gly Asp Tyr Lys Val Tyr Asp Val Arg Lys Met Ile Ala Lys

1010 1015 1020

Ser Glu Gln Glu Ile Gly Lys Ala Thr Ala Lys Tyr Phe Phe Tyr Ser

1025 1030 1035 1040

Asn Ile Met Asn Phe Phe Lys Thr Glu Ile Thr Leu Ala Asn Gly Glu

1045 1050 1055

Ile Arg Lys Arg Pro Leu Ile Glu Thr Asn Gly Glu Thr Gly Glu Ile

1060 1065 1070

Val Trp Asp Lys Gly Arg Asp Phe Ala Thr Val Arg Lys Val Leu Ser

1075 1080 1085

Met Pro Gln Val Asn Ile Val Lys Lys Thr Glu Val Gln Thr Gly Gly

1090 1095 1100

Phe Ser Lys Glu Ser Ile Leu Pro Lys Arg Asn Ser Asp Lys Leu Ile

1105 1110 1115 1120

Ala Arg Lys Lys Asp Trp Asp Pro Lys Lys Tyr Gly Gly Phe Asp Ser

1125 1130 1135

Pro Thr Val Ala Tyr Ser Val Leu Val Val Ala Lys Val Glu Lys Gly

1140 1145 1150

Lys Ser Lys Lys Leu Lys Ser Val Lys Glu Leu Leu Gly Ile Thr Ile

1155 1160 1165

Met Glu Arg Ser Ser Phe Glu Lys Asn Pro Ile Asp Phe Leu Glu Ala

1170 1175 1180

Lys Gly Tyr Lys Glu Val Lys Lys Asp Leu Ile Ile Lys Leu Pro Lys

1185 1190 1195 1200

Tyr Ser Leu Phe Glu Leu Glu Asn Gly Arg Lys Arg Met Leu Ala Ser

1205 1210 1215

Ala Gly Glu Leu Gln Lys Gly Asn Glu Leu Ala Leu Pro Ser Lys Tyr

1220 1225 1230

Val Asn Phe Leu Tyr Leu Ala Ser His Tyr Glu Lys Leu Lys Gly Ser

1235 1240 1245

Pro Glu Asp Asn Glu Gln Lys Gln Leu Phe Val Glu Gln His Lys His

1250 1255 1260

Tyr Leu Asp Glu Ile Ile Glu Gln Ile Ser Glu Phe Ser Lys Arg Val

1265 1270 1275 1280

Ile Leu Ala Asp Ala Asn Leu Asp Lys Val Leu Ser Ala Tyr Asn Lys

1285 1290 1295

His Arg Asp Lys Pro Ile Arg Glu Gln Ala Glu Asn Ile Ile His Leu

1300 1305 1310

Phe Thr Leu Thr Asn Leu Gly Ala Pro Ala Ala Phe Lys Tyr Phe Asp

1315 1320 1325

Thr Thr Ile Asp Arg Lys Arg Tyr Thr Ser Thr Lys Glu Val Leu Asp

1330 1335 1340

Ala Thr Leu Ile His Gln Ser Ile Thr Gly Leu Tyr Glu Thr Arg Ile

1345 1350 1355 1360

Asp Leu Ser Gln Leu Gly Gly Asp

1365

<210> 17

<211> 4104

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

atggacaaga agtacagcat cggcctggcc atcggcacca actctgtggg ctgggccgtg 60

atcaccgacg agtacaaggt gcccagcaag aaattcaagg tgctgggcaa caccgaccgg 120

cacagcatca agaagaacct gatcggagcc ctgctgttcg acagcggcga aacagccgag 180

gccacccggc tgaagagaac cgccagaaga agatacacca gacggaagaa ccggatctgc 240

tatctgcaag agatcttcag caacgagatg gccaaggtgg acgacagctt cttccacaga 300

ctggaagagt ccttcctggt ggaagaggat aagaagcacg agcggcaccc catcttcggc 360

aacatcgtgg acgaggtggc ctaccacgag aagtacccca ccatctacca cctgagaaag 420

aaactggtgg acagcaccga caaggccgac ctgcggctga tctatctggc cctggcccac 480

atgatcaagt tccggggcca cttcctgatc gagggcgacc tgaaccccga caacagcgac 540

gtggacaagc tgttcatcca gctggtgcag acctacaacc agctgttcga ggaaaacccc 600

atcaacgcca gcggcgtgga cgccaaggcc atcctgtctg ccagactgag caagagcaga 660

cggctggaaa atctgatcgc ccagctgccc ggcgagaaga agaatggcct gttcggaaac 720

ctgattgccc tgagcctggg cctgaccccc aacttcaaga gcaacttcga cctggccgag 780

gatgccaaac tgcagctgag caaggacacc tacgacgacg acctggacaa cctgctggcc 840

cagatcggcg accagtacgc cgacctgttt ctggccgcca agaacctgtc cgacgccatc 900

ctgctgagcg acatcctgag agtgaacacc gagatcacca aggcccccct gagcgcctct 960

atgatcaaga gatacgacga gcaccaccag gacctgaccc tgctgaaagc tctcgtgcgg 1020

cagcagctgc ctgagaagta caaagagatt ttcttcgacc agagcaagaa cggctacgcc 1080

ggctacattg acggcggagc cagccaggaa gagttctaca agttcatcaa gcccatcctg 1140

gaaaagatgg acggcaccga ggaactgctc gtgaagctga acagagagga cctgctgcgg 1200

aagcagcgga ccttcgacaa cggcagcatc ccccaccaga tccacctggg agagctgcac 1260

gccattctgc ggcggcagga agatttttac ccattcctga aggacaaccg ggaaaagatc 1320

gagaagatcc tgaccttccg catcccctac tacgtgggcc ctctggccag gggaaacagc 1380

agattcgcct ggatgaccag aaagagcgag gaaaccatca ccccctggaa cttcgaggaa 1440

gtggtggaca agggcgcttc cgcccagagc ttcatcgagc ggatgaccaa cttcgataag 1500

aacctgccca acgagaaggt gctgcccaag cacagcctgc tgtacgagta cttcaccgtg 1560

tataacgagc tgaccaaagt gaaatacgtg accgagggaa tgagaaagcc cgccttcctg 1620

agcggcgagc agaaaaaggc catcgtggac ctgctgttca agaccaaccg gaaagtgacc 1680

gtgaagcagc tgaaagagga ctacttcaag aaaatcgagt gcttcgactc cgtggaaatc 1740

tccggcgtgg aagatcggtt caacgcctcc ctgggcacat accacgatct gctgaaaatt 1800

atcaaggaca aggacttcct ggacaatgag gaaaacgagg acattctgga agatatcgtg 1860

ctgaccctga cactgtttga ggacagagag atgatcgagg aacggctgaa aacctatgcc 1920

cacctgttcg acgacaaagt gatgaagcag ctgaagcggc ggagatacac cggctggggc 1980

aggctgagcc ggaagctgat caacggcatc cgggacaagc agtccggcaa gacaatcctg 2040

gatttcctga agtccgacgg cttcgccaac agaaacttca tgcagctgat ccacgacgac 2100

agcctgacct ttaaagagga catccagaaa gcccaggtgt ccggccaggg cgatagcctg 2160

cacgagcaca ttgccaatct ggccggcagc cccgccatta agaagggcat cctgcagaca 2220

gtgaaggtgg tggacgagct cgtgaaagtg atgggccggc acaagcccga gaacatcgtg 2280

atcgaaatgg ccagagagaa ccagaccacc cagaagggac agaagaacag ccgcgagaga 2340

atgaagcgga tcgaagaggg catcaaagag ctgggcagcc agatcctgaa agaacacccc 2400

gtggaaaaca cccagctgca gaacgagaag ctgtacctgt actacctgca gaatgggcgg 2460

gatatgtacg tggaccagga actggacatc aaccggctgt ccgactacga tgtggaccat 2520

atcgtgcctc agagctttct gaaggacgac tccatcgaca acaaggtgct gaccagaagc 2580

gacaagaacc ggggcaagag cgacaacgtg ccctccgaag aggtcgtgaa gaagatgaag 2640

aactactggc ggcagctgct gaacgccaag ctgattaccc agagaaagtt cgacaatctg 2700

accaaggccg agagaggcgg cctgagcgaa ctggataagg ccggcttcat caagagacag 2760

ctggtggaaa cccggcagat cacaaagcac gtggcacaga tcctggactc ccggatgaac 2820

actaagtacg acgagaatga caagctgatc cgggaagtga aagtgatcac cctgaagtcc 2880

aagctggtgt ccgatttccg gaaggatttc cagttttaca aagtgcgcga gatcaacaac 2940

taccaccacg cccacgacgc ctacctgaac gccgtcgtgg gaaccgccct gatcaaaaag 3000

taccctaagc tggaaagcga gttcgtgtac ggcgactaca aggtgtacga cgtgcggaag 3060

atgatcgcca agagcgagca ggaaatcggc aaggctaccg ccaagtactt cttctacagc 3120

aacatcatga actttttcaa gaccgagatt accctggcca acggcgagat ccggaagcgg 3180

cctctgatcg agacaaacgg cgaaaccggg gagatcgtgt gggataaggg ccgggatttt 3240

gccaccgtgc ggaaagtgct gagcatgccc caagtgaata tcgtgaaaaa gaccgaggtg 3300

cagacaggcg gcttcagcaa agagtctatc ctgcccaaga ggaacagcga taagctgatc 3360

gccagaaaga aggactggga ccctaagaag tacggcggct tcgacagccc caccgtggcc 3420

tattctgtgc tggtggtggc caaagtggaa aagggcaagt ccaagaaact gaagagtgtg 3480

aaagagctac tggggatcac catcatggaa agaagcagct tcgagaagaa tcccatcgac 3540

tttctggaag ccaagggcta caaagaagtg aaaaaggacc tgatcatcaa gctgcctaag 3600

tactccctgt tcgagctgga aaacggccgg aagagaatgc tggcctctgc cggcgaactg 3660

cagaagggaa acgaactggc cctgccctcc aaatatgtga acttcctgta cctggccagc 3720

cactatgaga agctgaaggg ctcccccgag gataatgagc agaaacagct gtttgtggaa 3780

cagcacaagc actacctgga cgagatcatc gagcagatca gcgagttctc caagagagtg 3840

atcctggccg acgctaatct ggacaaagtg ctgtccgcct acaacaagca ccgggataag 3900

cccatcagag agcaggccga gaatatcatc cacctgttta ccctgaccaa tctgggagcc 3960

cctgccgcct tcaagtactt tgacaccacc atcgaccgga agaggtacac cagcaccaaa 4020

gaggtgctgg acgccaccct gatccaccag agcatcaccg gcctgtacga gacacggatc 4080

gacctgtctc agctgggagg cgac 4104

<210> 18

<211> 212

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

caccgggtct tcgagaagac ctgttttaga gctaggccaa catgaggatc acccatgtct 60

gcagggccta gcaagttaaa ataaggctag tccgttatca acttggccaa catgaggatc 120

acccatgtct gcagggccaa gtggcaccga gtcggtgctt tttttgtttt agagctagaa 180

atagcaagtt aaaataaggc tagtccgttt tt 212

<210> 19

<211> 65

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

ggctttatat atcttgtgga aaggacgaaa caccgggtct tcgagaagac ctgttttaga 60

gctag 65

<210> 20

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

attttaactt gctatttcta gctctaaaac aaaaaaagca ccgactcggt g 51

<210> 21

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

cctgcctgaa atcacttttt ttcaggttgg accggtccac catggcttca aactttactc 60

<210> 22

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

gtcgaggctg atcagcgagc tctaggaatt aggatccagc ggccgccacc ttc 53

<210> 23

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

tccctacacg acgctcttcc gatctnnnnn ncaggagccc actcccaggt cc 52

<210> 24

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

agttcagacg tgtgctcttc cgatctnnnn nngtaggctg tgctggaggg tt 52

<210> 25

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

ttccctacac gacgctcttc cgatctcnnn nnnggccaca ctgactgtag acaa 54

<210> 26

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

agttcagacg tgtgctcttc cgatctnnnn nnctgaggag actgtgagag tggtg 55

<210> 27

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

ttccctacac gacgctcttc cgatctnnnn nntaggtgag taagggtgag g 51

<210> 28

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

agttcagacg tgtgctcttc cgatctnnnn nntcatccac ttcaccaccc tatc 54

<210> 29

<211> 102

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc cgttatcaac ttgaaaaagt 60

ggcaccgagt cggtgctttt ttgttttaga gctagaaata gc 102

<210> 30

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

gagggcagag gaagtctgct aacatgcggt gacgtcgagg agaatcctgg ccca 54

Claims

1.一种抗体进化方法，所述抗体进化方法包含以下步骤：

1）提供单碱基基因编辑系统，所述单碱基基因编辑系统可形成单碱基基因编辑复合体，所述单碱基基因编辑复合体包括dCas9酶、sgRNA、MS2胞嘧啶脱氨酶融合蛋白，所述sgRNA 靶向待进化抗体的可变区基因；

2）利用1）中所述的单碱基基因编辑系统对待进化抗体的可变区基因进行碱基突变，表达突变抗体，获得突变抗体库；所述突变抗体经表面展示系统进行展示；所述表面展示系统包括抗体表面展示载体，所述抗体表面展示载体能用于表达突变抗体基因；将抗体的可变区基因与抗生素抗性基因相连，使得抗体的可变区基因的移码突变或终止密码子突变可影响抗生素抗性基因或营养缺陷互补基因的编码；

3）筛选并富集高亲和力抗体；

所述MS2胞嘧啶脱氨酶融合蛋白中，胞嘧啶脱氨酶选自AID-mono、AID-crystal、AID-act、人Apobec3a、人Apobec3b 、AID-A3c和AID-A3f中的多种；

所述步骤2）还包括：利用1）中所述的单碱基基因编辑系统对获得的突变抗体库进行多轮的碱基突变，获得突变抗体库。

2.如权利要求1所述的抗体进化方法，其特征在于，步骤2）中，所述突变抗体库进行下一轮碱基突变时，先进行筛选与富集。

3.如权利要求1所述的抗体进化方法，其特征在于，所述sgRNA包括靶向待进化抗体的可变区基因的靶向段，以及MS2发夹结构，所述MS2发夹结构用于招募MS2胞嘧啶脱氨酶融合蛋白。

4.如权利要求3所述的抗体进化方法，其特征在于，所述sgRNA包括2个MS2发夹结构。

5.如权利要求1所述的抗体进化方法，其特征在于，所述单碱基基因编辑系统包括DNA构建体，所述DNA构建体中，含有sgRNA编码基因、MS2胞嘧啶脱氨酶融合蛋白的编码基因，dCas9酶的编码基因中的一个或多个。

6.如权利要求5所述的抗体进化方法，其特征在于，所述单碱基基因编辑系统的DNA构建体中，sgRNA编码基因有一种或多种。

7.如权利要求1所述的抗体进化方法，其特征在于，步骤2）中所用的抗体表面展示载体上，在利用单碱基基因编辑系统进行基因突变之前，在抗体表面展示载体上的抗体的可变区基因与抗生素抗性基因中插入t2A肽段编码序列，将抗体的可变区基因与抗生素抗性基因通过t2A肽段编码序列相连。

8.如权利要求1所述的抗体进化方法，其特征在于，所述步骤3）中，筛选并富集高亲和力抗体的方法为利用流式细胞仪进行筛选。