DE202012100019U1

DE202012100019U1 - T-Zellen-Frequenz

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Publication number: DE202012100019U1
Application number: DE201220100019
Authority: DE
Original assignee: Jacobs University gGmbH
Current assignee: Constructor University Bremen Ggmbh De
Priority date: 2012-01-04
Filing date: 2012-01-04
Publication date: 2013-04-09
Anticipated expiration: 2022-01-05

Abstract

Produkt hergestellt nach einem Verfahren zum Herstellen eines Untersuchungsreagens, wobei einem ungefalteten Protein, insbesondere einem ungefalteten MHC-Klasse I-Protein, in einer Ausgangslösung ein Austauschelement zugefügt wird, sodass eine Vorlösung des Untersuchungsreagens mit einem gefalteten Protein vorliegt, wobei das Protein das Austauschelement aufweist.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Herstellen eines Untersuchungsreagens, wobei einem ungefalteten Protein, insbesondere einem ungefalteten MHC-Klasse-I-Protein, in einer Ausgangslösung ein Austauschelement zugefügt wird, ein ungefaltetes Protein, ein Multimer, ein Vorlösungsuntersuchungsreagens, ein Untersuchungsreagens, eine Analyselösung, ein Kit, ein Verfahren zum Erhalt eines Analyseergebnisses und ein Analyseergebnis.
MHC-Klasse I-Moleküle (MHC-Klasse I-Proteine, Major Histocompatibility Complex Class I molecules, Haupt-Histokompatibilitäts-Komplex-Klasse I-Moleküle) sind Transmembranproteine der zellulären Immunantwort, die antigene Peptide aus dem Zellinneren einer antigenpräsentierenden Zelle (APC), wie beispielsweise aus dem Cytosol oder dem Lumen der endocytischen Organellen, binden und an der Zelloberfläche den zytotoxischen T-Zellen (engl. CTL, cytotoxic T lymphocytes, Killer T cells, CD8 positive lymphocytes) präsentieren. Dies ist die sogenannte Klasse I-Antigenpräsentation.
Die Bindung eines T-Zell-Rezeptors (TCR) einer CTL an einen Klasse I-Peptid-Komplex einer APC führt (abhängig vom Ort der Reaktion im Körper, dem Typ der APC (B-Zelle, dendritische Zelle, etc.) und dem Aktivierungszustand der CTL) zur Aktivierung der CTL und/oder zur Induktion des Zelltods (Apoptose) der APC durch die CTL.
Die Spezifität (Reaktionsfähigkeit mit einem bestimmten Klasse I-Peptid-Komplex) einer CTL liegt darin begründet, dass sie an ihrer Oberfläche nur eine Art TCR (d. h., nur TCRs einer einzelnen eindeutigen Sequenz) trägt. Die Immunantwort ist effektiv, weil solche CTL, die mit Selbst-Peptiden (Peptiden, die die aus körpereigenen Proteinen erzeugt werden) reagieren, im Thymus eliminiert werden.
Aus diesem Grund bedeutet die Erkennung eines antigenen Peptids durch den TCR einer CTL, dass die APC fremde Proteine produziert, die von Viren oder intrazellulären Parasiten (Bakterien, Protozoen) stammen könnten. Auch eine Überproduktion endogener Peptide in maligne entarteten Zellen, zum Beispiel in Tumoren, kann zu solchen Erkennungsreaktionen führen.
Nahezu alle in der Zelle vorhandenen Proteine werden in Peptide zersetzt, die dann im Endoplasmatischen Retikulum (einer membranumgrenzten Organelle im Zellinneren) an MHC-Klasse I-Moleküle binden. Anschließend wird der Komplex aus Peptid und MHC-Klasse I-Molekül an die Zelloberfläche transportiert und steht dort für die Erkennung durch CTL zur Verfügung.
Wenn nun aufgrund einer tumorigenen malignen Entartung neuartige oder mutierte Proteine produziert werden oder wenn durch eine virale oder bakterielle Infektion virale oder bakterielle Proteine aus dem genetischen Material des Virus oder Bakteriums produziert werden, werden diese ‚neuartigen’ Proteine ebenfalls in Peptide zersetzt, die dann im Komplex mit MHC-Klasse I-Molekülen auf der Zelloberfläche präsentiert werden. Diese ‚neuartigen’ Peptide sind verschieden von den zelleigenen und lösen eine Erkennung durch die CTL aus.
Die Präsentation durch MHC-Klasse-I-Moleküle spielt ebenfalls eine Rolle in allergischen Reaktionen, der Abstoßung von Transplantaten und einer Anzahl von Autoimmunkrankheiten wie multipler Sklerose und Spondyloarthropathien (z.B. Morbus Bechterew oder rheumatoider Arthritis).
Die Untersuchung der Immunantworten, die durch MHC-Klasse-I-Moleküle vermittelt werden, erfordert oft den Nachweis derjenigen CTL, die mit einem bestimmten Klasse I-Peptid-Komplex (Epitop) reagieren. Reaktionen auf ein einziges immunodominantes Epitop machen oft 10–20% der gesamten T-Zell-Population in einem Organismus aus, und die Verfolgung der T-Zell-Frequenz (d. h. des Anteils derjenigen CTL, die mit einem bestimmten Epitop reagieren, an der Gesamtmenge der CTL im Organismus) erlaubt es daher, die Immunantwort (und z.B. Gelingen oder Fehlschlagen einer Therapie) genau zu verfolgen. Aus diesem Grund sind Reagenzien, die die Epitop-Spezifität von CTL identifizieren können, unabdingbar.
Zum Nachweis solcher Epitop-spezifischen CTL bedient man sich bisher rekombinanter MHC-Klasse I-Moleküle, die in Bakterien hergestellt werden und als unlösliche Einschlusskörper (inclusion bodies) vorliegen, die in einer Lösung eines chaotropen Agens zunächst denaturiert werden. Das Chaotrop wird dann in Gegenwart des gewünschten Peptids entfernt, und der Peptid-Klasse I-Komplex (falls erforderlich) durch Gelfiltrationschromatographie von dem ungefalteten Protein getrennt. Da die niedrige Affinität eines einzelnen Klasse I-Peptid-Komplexes zu einem einzelnen TCR nicht zu einer festen Bindung führt, verwendet man Multimere von Klasse I-Peptid-Komplexen, die aufgrund des Aviditätseffektes fest genug an die TCRn einer CTL binden, um eine dauerhafte Bindung zu ermöglichen.
Solche Multimere werden z.B. durch Streptravidinvermittelte Tetramerisierung von biotinylierten Klasse-I-Peptid-Komplexen (Klasse-I-Tetramere, class I tetramers), durch Pentamerisierung durch selbst-assemblierende Coiled-Coil-Domänen (Klasse-I-Pentamere, class I pentamers), oder durch Multimerisierung an Dextran (Klasse-I-Dextramere) erreicht. Weitere Methoden zur Oligo- oder Multimerisierung von Klasse I-Peptid-Komplexen existieren.
Die Klasse-I-Multimere sind im Allgemeinen mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert, die ihre mikroskopische oder durchfluss-zytometrische Detektion ermöglichen. So können epitop-spezifische CTL zum Zwecke des Nachweises direkt angefärbt werden.
Andere Anwendungen für rekombinante Klasse I-Peptid-Komplexe sind:

– In vitro – Selektion und Expansion monospezifischer T-Zellen zur Re-infusion bei Krebs und Viruskrankheiten. (Die Selektion kann durch Cytofluorimetrie (Durchflusszytometrie, FACS), durch Magnet-aktivierte Zellsortierung (MACS) oder – für erhöhten Durchsatz – in Mikroarrays erfolgen.)
– Ex vivo – Isolierung und Expansion von CTL zur adoptiven Therapie nach allogeneischer Stammzell-Transplantation.
– Ex vivo – Entfernung von alloreaktiven T-Zellen nach Transplantation von peripheren Stammzellen. Ebenso interessant ist die Entfernung von autoreaktiven T-Zellen, die Typ I-Diabetes, Arthritis, und andere Autoimmun-Krankheiten hervorrufen, wie für MHC-Klasse II-Reagenzien bereits beschrieben. Der Gebrauch von isotopmarkierten Multimeren ist in US. Pat. US 2003/0228258 A1 "Suicide tetramers and uses thereof", David Scheinberg et al., beschrieben.

Die Herstellung rekombinanter Klasse I-Peptid-Komplexe ist kompliziert, langwierig und teuer. Zum einen sind mehrere tausend MHC-Klasse-I-Allotypen bekannt (von denen allerdings bereits fünf Allele von HLA-A etwa 50% der Welt-Bevölkerung abdecken). Vor allem aber muss für jedes antigene Peptid, das als Epitop untersucht werden soll, ein neues Multimer hergestellt werden, sodass für jeden Patienten oder für jedes Experiment neue Multimere erforderlich sind, die nach Bedarf spezifisch hergestellt werden müssen.
Es wäre einfacher, die Multimere ohne die antigenen Peptide herzustellen und die jeweils erforderlichen antigenen Peptide dann je nach Bedarf zuzugeben, aber das ist bisher nicht möglich, weil die Faltung der MHC-Klasse I-Moleküle ohne antigenes Peptid für die meisten MHC-Klasse I-Allotypen nicht möglich ist.
In der Vergangenheit ist ein Ausweg beschrieben worden. Dabei wurde Gebrauch von einem lichtempfindlichen Peptid gemacht, welches durch UV-Bestrahlung oder Periodat-Behandlung zerfällt und dann durch ein zugegebenes antigenes Peptid ersetzt werden kann (Publikation: Rodenko et al., Nature Protocols 1 (2006), S. 1120).
Diese Methode ist teuer, kompliziert und funktioniert nicht mit allen antigenen Peptiden oder Klasse I-Allotypen.
Die Aufgabe der Erfindung ist es, die Nachteile des Standes der Technik zu verbessern.
Gelöst wird die Aufgabe durch ein Verfahren zum Herstellen eines Untersuchungsreagens, wobei einem ungefalteten Protein, insbesondere einem ungefalteten MHC-Klasse I-Protein, in einer Ausgangslösung ein Austauschelement zugefügt wird, sodass eine Vorlösung des Untersuchungsreagens mit einem gefalteten MHC-Klasse I-Protein vorliegt, wobei das MHC-Klasse I-Protein das Austauschelement aufweist.
Die Vorteile bei diesem Vorgehen liegen insbesondere darin, dass ein Untersuchungsreagens einfacher, schneller und kostengünstiger hergestellt werden kann.
Das „Protein“ ist insbesondere ein MHC-Klasse I-Protein.
Ein „MHC-Klasse-I-Protein” ist ein Haupt-Histokompatibilitäts-Komplex-Klasse-I-Protein (auch bezeichnet als MHC-Klasse I-Molekül, Haupt-Histokompatibilitäts-Klasse I-Molekül, engl. MHC class I molecule), welches ein Transmembranprotein der zellulären Immunantwort ist. Diese MHC-Klasse I-Proteine binden Peptide aus dem Zellinneren, wie beispielsweise aus dem Cytosol oder dem Lumen der endocytischen Organellen. Zudem präsentieren diese an der Zelloberfläche den zytotoxischen T-Zellen ein Peptid-Antigen (Antigenpräsentation). Menschliche MHC-Klasse I-Moleküle werden auch als HLA(human leukocyte antigen)-Proteine bezeichnet.
Zudem umfasst der Begriff MHC-Klasse I-Protein hier auch die den eigentlichen MHC-Klasse I-Proteinen strukturell und/oder funktionell ähnlichen Moleküle, die ebenfalls im MHC kodiert sind und die ebenfalls Peptide binden, wie beispielsweise HLA-E, HLA-F und HLA-G. Zudem umfasst der Begriff auch Fragmente aller dieser Proteine, insbesondere die extrazelluläre Domäne. Zudem umfasst der Begriff hier sowohl die schweren Ketten ("Heavy chains", großen Untereinheiten) der MHC-Klasse I-Proteine, als auch die in Zellen normalerweise an sie gebundene invariante kleine Untereinheit (leichte Kette, "light chain"), auch bekannt als das Protein "Beta-2 Mikroglobulin" (β2m), als auch den Komplex aus der schweren und der leichten Kette. Zudem umfasst der Begriff auch ein Fusionsprotein, das aus der schweren Kette (oder einem Fragment der schweren Kette), einem Linker (insbesondere der Sequenz Glycin-Glycin-Glycin-Serin-Glycin-Glycin-Glycin-Serin-Glycin-Glycin-Glycin-Serin-) und der leichten Kette besteht.
Unter einem "gefalteten Protein" ist ein Protein von einer solchen Konformation (dreidimensionalen Struktur) zu verstehen, dass seine Konformation stabil (d. h. über eine Zeitspanne von Stunden hinweg nicht wesentlich veränderlich) und gleichzeitig seine biologische Aktivität (beispielsweise die Bindung eines Peptids) intakt ist. Unter einem "ungefalteten Protein" ist im Gegensatz dazu ein Protein von einer solchen Konformation zu verstehen, dass es diese beiden Kriterien nicht erfüllt.
Die hier aufgeführten "Peptide" sind Peptide oder Peptidanaloga, die mit hoher Affinität (mit einer Dissoziationskonstante von K_D = 1 µM oder darunter) an MHC-Klasse I-Proteine binden, insbesondere solche Peptide, die im Komplex mit MHC-Klasse I-Proteinen von CTL erkannt werden, insbesondere käufliche Peptide, die je nach dem Anwendungsfall vorgesehen sind, wie beispielsweise für die speziell zu untersuchende Krankheit oder andere diagnostische Aufgabe.
Das "Austauschelement" ist dahingehend definiert, dass es die Faltung des MHC-Klasse I-Moleküls erlaubt oder unterstützt (d. h., dass in seiner Gegenwart gefaltete Klasse I-Moleküle erhalten werden können), und dass es gleichzeitig durch ein Peptid, das mit größerer Stärke (Affinität) an das MHC-Klasse I-Molekül bindet, ersetzt werden kann.
Das „Ersetzen“ erfolgt insbesondere durch die Zugabe des Untersuchungspeptids zu der Lösung des MHC-Klasse I-Proteins oder Multimers, die Inkubation bei einer Temperatur zwischen 4 ºC und 40 ºC für eine Zeit zwischen 1 Minute und 60 Minuten, und die anschließende Trennung des MHC-Klasse I-Proteins oder Multimers von dem freigesetzten Austauschelement. Diese Trennung kann insbesondere erfolgen durch Flüssigchromatographie, insbesondere Gelfiltrationschromatographie, oder Affinitätschromatograpie.
Das „Austauschelement“ umfasst insbesondere eine Aminosäure und speziell eine modifizierte Aminosäure. Eine Aminosäure ist eine chemische Verbindung, die eine mit einem Kohlenstoff (C)-Atom verbundene Amino- oder Ammoniumgruppe (-NH₂ oder -NH₃ ⁺) und gleichzeitig eine mit demselben oder einem anderen Kohlenstoffatom verbundene Carboxyl- oder Carboxylatgruppe (-COOH oder -COO^–) enthält. Beispiele für eine Aminosäure sind Glycin, Alanin, Homoleucin, Beta-Alanin, und ε-Acetyl-Lysin. Von einer modifizierten Aminosäure wird vorliegend dann ausgegangen, wenn Aminogruppe mit einer anderen chemischen Verbindung (zum Beispiel einer Carbonsäure oder einem ihrer Derivate) derart umgesetzt ist, dass diese andere chemische Verbindung kovalent an die Aminogruppe gebunden ist, zum Beispiel durch eine Amidbindung (Peptidbindung) oder eine einer Amidbindung ähnliche Bindung (zum Beispiel eine Thioamidbindung). Von einer modifizierten Aminosäure wird vorliegend auch dann ausgegangen, wenn die Carboxylgruppe mit einer anderen chemischen Verbindung (zum Beispiel einem Alkohol, einem Amin, oder einem ihrer Derivate) derart umgesetzt ist, dass diese andere chemische Verbindung kovalent an die Carboxylgruppe gebunden ist, zum Beispiel durch eine Esterbindung oder durch eine Amidbindung oder durch eine einer Ester- oder Amidbindung ähnliche Bindung. Von einer modifizierten Aminosäure wird vorliegend auch dann ausgegangen, wenn sowohl die Aminogruppe als auch die Carboxylgruppe in dem in diesem Abschnitt beschriebenen Sinne umgesetzt worden sind. Beispiele von modifizierten Aminosäuren sind Acetyl-methionin, Alanin-amid und N-acetyl-tryptophan-amid.
Weiterhin kann das „Austauschelement“ ein Peptid umfassen, welches dadurch charakterisiert ist, dass es aus mehreren Aminosäuren besteht, die wie in einem Protein durch Amidbindungen (Peptidbindungen) miteinander verbunden sind, oder die durch Amidbindungen ähnliche Bindungen, z.B. Thioamidbindungen, miteinander verbunden sind. Von einem Peptid wird vorliegend auch dann ausgegangen, wenn die amino-terminale Aminogruppe oder die carboxy-terminale Carboxylgruppe oder das Stickstoffatom einer zuvor beschriebenen internen Amidbindung mit anderen Verbindungen umgesetzt worden sind.
Weiterhin kann das "Austauschelement" eine peptidähnliche chemische Verbindung umfassen. "Peptidähnliche chemische Verbindungen" sind chemische Verbindungen, die dadurch charakterisiert sind, dass sie mit einer hohen Affinität (Dissoziationskonstante K_D > 1 µM) an die Peptidbindungsstelle von MHC-Klasse I-Molekülen binden. Beispiele von solchen peptidähnlichen chemischen Verbindungen sind Peptide, in denen die internen Peptidbindungen (Amidbindungen) durch Lactame oder Piperazinone ersetzt sind, und auch 7,6-bizyklisches Pyridizin, 9-aminooctahydro-6,10-dioxo-6H-pyridazino[1,2-a][1,2]diazepin-1-carbonsäure, 5-amino-1,2,4,5,6,7-hexahydroazepino[3,2,1-hi]indol-4-on-2-carbonsäure, und methylbutyl-substituierte Lactame, insbesondere 1-(tert-butyloxycarbonyl)-7-[1-(tert-butyloxycarbonyl)-3-methylbutyl]-6-oxo-1,7-diazaspiro[4.5]dekan.
Das Protein mit aufweisendem Austauschelement hat insbesondere folgenden Aufbau: Ein MHC-Klasse I-Protein im gefalteten Zustand, wobei das Austauschelement in die Peptidbindungsstelle des MHC-Klasse I-Proteins gebunden ist.
Um eine effektive und große Ausbeute an ungefalteten MHC-Klasse I-Proteinen zu gewährleisten, kann das ungefaltete MHC-Klasse I-Protein in einem Expressionssystem hergestellt werden.
"Expression" ist die Herstellung eines Proteins, insbesondere eines MHC-Klasse I-Proteins (wie zuvor beschrieben, d. h. sowohl der großen als auch der kleinen Untereinheit, gemeinsam, getrennt, oder miteinander verbunden), in einem Expressionssystem.
In einer diesbezüglichen Ausführungsform kann das Expressionssystem eine Bakterienzelle aufweisen, insbesondere eine Escherichia coli-Zelle, oder eine Hefezelle, insbesondere eine Saccharomyces cerevisiae-Zelle, oder eine Insektenzelle, insbesondere eine Spodoptera frugiperda-Zelle, oder eine Säugerzelle, insbesondere eine CHO-Zelle, wobei CHO für "Chinese Hamster (Cricetulus griseus) Ovary" steht, oder ein zellfreies Expressionssystem, insbesondere als Retikulozyten-Lysat.
Um ein möglichst hohe Ausbeute zu erhalten, weist das Expressionssystem mehrere Zellen auf, insbesondere eine Anzahl von Zellen in einer Größenordnung von mindestens 1.000.000 Zellen.
Unter dem "Untersuchungsreagens" ist zu verstehen eine Substanz oder ein Partikel, das an die TCR einer CTL spezifisch bindet und das für eines der Zwecke, die in der Einleitung beschrieben sind, verwendet wird, insbesondere für den Nachweis einer T-Zellen-Frequenz, für die positive Selektion (Isolierung) von CTL und für die negative Selektion (Entfernung) von CTL. Untersuchungsreagenzien sind insbesondere Multimere wie sie im Weiteren beschrieben werden, Partikel (gemäß der späteren Erläuterung zum Multimerisierungselement) und Membranpräparationen wie sie später beschrieben werden.
"Spezifische Bindung" ist dabei eine Bindung, die deutlich stärker ist als die durchschnittlich beobachtbare ("nichtspezifische") Bindung zwischen einem zufällig ausgewählten TCR und einem zufällig ausgewählten MHC-Klasse I-Molekül, wobei "deutlich" bedeutet, dass die Dissoziationskonstante K_D der spezifischen Bindung mindestens zehnmal niedriger als die einer nichtspezifischen Bindung.
In einer weiteren Ausführungsform wird dem MHC-Klasse I-Protein ein Signalgeber zugeordnet, wobei der Signalgeber insbesondere ein Fluoreszenzfarbstoff ist. Somit kann eine einfache Methode zur Identifizierung des MHC-Klasse I-Proteins bereitgestellt werden.
Weiterhin kann dem MHC-Klasse I-Protein ein Fusionselement zugeordnet werden. Unter einem Fusionselement ist eine Polypeptidsequenz zu verstehen, die in dem MHC-Klasse I-Molekül genetisch kodiert ist und die eine Proteindomäne oder einen Teil davon umfasst. Beispiele für Fusionselemente sind insbesondere die F_c-Domänen von Antikörpern, Staphylococcus aureus Protein A, oder eine Oligohistidin-oder Oligoarginin-Sequenz, wobei eine Oligohistidin-Sequenz aus sechs bis zwölf Histidinen besteht, oder solche Proteindomänen, die stabile coiled coil – Wechselwirkungen miteinander eingehen, insbesondere die helikalen Domänen der Transkriptionsfaktoren jun und fos.
Vorteil des Fusionselements ist, dass es die spezifische Bindung des MHC-Klasse I-Proteins an ein Multimerisierungselement oder an ein Partikel erlaubt. Der Vorteil des Fusionselements liegt außerdem darin, dass es die Reinigung und den Nachweis von MHC-Klasse I-Proteinen mit Hilfe solcher Techniken ermöglicht, bei denen das Fusionselement durch spezifisch daran bindende Reagenzien spezifisch erkannt wird. Ein weiterer Vorteil des Fusionselements liegt darin, dass es die direkte Bindung von MHC-Klasse I-Molekülen aneinander ermöglicht.
Weiterhin kann dem Protein ein Ankerelement zugeordnet werden. Dieses Ankerelement ist insbesondere ein Biotinmolekül, welches entweder durch eine natürliche Biotinylierungssequenz, die in dem Gen für das MHC-Klasse I-Protein genetisch kodiert ist, und ein biotinylierendes Enzym, insbesondere BirA, oder durch chemische Methoden, insbesondere Verwendung eines N-hydroxy-succinimid-Derivats von Biotin, an dem Protein angebracht wird.
Der Vorteil des Ankerelements liegt insbesondere darin, dass es die Zusammenfügung von MHC-Klasse I-Proteinen zu Multimeren und die Bindung an ein Partikel ermöglicht. Der Vorteil des Ankerelements liegt außerdem darin, dass es die Reinigung und den Nachweis von MHC-Klasse I-Proteinen mit Hilfe solcher Techniken ermöglicht, bei denen das Ankerelement durch spezifisch daran bindende Reagenzien spezifisch erkannt wird.
Um den Aviditätseffekt auszunutzen, können mehrere gefaltete MHC-Klasse I-Proteine zu einem Multimer zusammengefügt werden und wenigstens eines der gefalteten MHC-Klasse I-Proteine das Austauschelement aufweisen.
Das Zusammenfügen der MHC-Klasse I-Proteine zu einem Multimer erfolgt in einigen Fällen dadurch, dass die MHC-Klasse I-Proteine mit einem Multimerisierungselement zusammengebracht werden.
Das "Multimerisierungselement" ist dadurch gekennzeichnet, dass die Ankerelemente, die an den MHC-Klasse I-Proteinen vorhanden sind, mit dem Multimerisierungselement eine nicht-kovalente oder kovalente Bindung eingehen.
Ein solches "Multimerisierungselement" ist insbesondere Avidin oder Streptavidin.
In anderen Fällen kann ein solches Multimerisierungselement ein Partikel sein, beispielsweise vom Durchmesser von 1 Mikrometer bis 1 Millimeter, beispielsweise aus Agarose bestehend, welches solcherart chemisch modifiziert ist, dass die Oberfläche des Partikels an die Ankerelemente spezifisch binden kann. Eine solche chemische Modifikation der Oberfläche kann durch die kovalente oder nichtkovalente Bindung von Avidin oder Streptavidin oder durch die Bindung eines Antikörpers, der mit einem Teil des MHC-Klasse I-Moleküls reagiert, an die Oberfläche erfolgen.
Die Zusammenfügung mehrerer MHC-Klasse I-Proteine zu einem Multimer erfolgt in anderen Fällen dadurch, dass die MHC-Klasse I-Proteine miteinander eine Bindung eingehen, ohne dass ein Bindeprotein erforderlich ist.
Das „Multimer“ umfasst insbesondere ein Tetramer und/oder ein Pentamer und weist insbesondere zwei oder mehr MHC-Klasse I-Proteine auf.
Der Vorteil des Multimers liegt unter anderem darin, dass das Multimer durch Filtration oder Chromatographie erhaltbar sein kann und dass mindestens zwei MHC-Klasse I-Proteine an das Multimer angekoppelt sind. Ein weiterer Vorteil des Multimers liegt in dem sogenannten Aviditätseffekt, der darin besteht, dass mehrere MHC-Klasse I-Moleküle fester, d. h., mit geringerer Dissoziationskonstante K_D, an die TCR auf der Oberfläche einer CTL binden. Durch diese festere Bindung wird insbesondere die Detektion und Isolation von CTL erleichtert. Zudem kann durch die festere Bindung eine Aktivierung der CTL herbeigeführt werden.
Unter "Aktivierung" der CTL ist dabei zu verstehen, dass durch die Bindung von Proteinen an die TCR der CTL, insbesondere durch die Bindung von Untersuchungsreagenzien, insbesondere MHC-Klasse I-Proteinen, Multimeren, Partikeln oder Membranpräparationen, Stoffwechselvorgänge im Inneren der CTL verändert werden.
Um eine einfache Methode zur Identifizierung bereitzustellen, kann dem Multimer ein Multimersignalgeber zugeordnet werden, wobei der Multimersignalgeber insbesondere ein Fluoreszenzfarbstoff ist. "Zugeordnet" bedeutet insbesondere die chemische Bindung des Multimersignalgebers an den Multimer.
Weiterhin können die MHC-Klasse I-Moleküle in Membranpräparationen multimerisiert werden. Unter "Membranpräparationen" sind dabei Lipidmembranen zu verstehen, die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie MHC-Klasse I-Moleküle enthalten. Die MHC-Klasse I-Moleküle können dadurch enthalten sein, dass sie teilweise in die Lipidmembran eintauchen und durch hydrophobe Wechselwirkungen in oder an der Lipidmembran festgehalten werden; oder sie können dadurch enthalten sein, dass sie an die Oberfläche der Lipidmembranen kovalent oder nichtkovalent gebunden sind.
Unter "Lipidmembranen" sind solche Membranen zu verstehen, die aus der Zelloberfläche (Plasmamembran) von eukaryotischen Zellen bestehen; dabei ist es unerheblich, ob die Zellen lebendig oder fixiert (tot), intakt (durchlässig für wasserlösliche Substanzen) oder nicht intakt sind. Darunter sind auch solche Membranen zu verstehen, die aus isolierten Bestandteilen, insbesondere Lipiden, im Labor zusammengefügt worden sind.
Die Einsetzung der MHC-Klasse I-Moleküle in die Lipidmembranen kann dadurch erfolgen, dass die MHC-Klasse I-Moleküle in einer Zelle (z.B. in einem Expressionssystem) hergestellt werden und dass die Membranpräparation aus dieser Zelle hergestellt wird. Die Einsetzung der MHC-Klasse I-Moleküle in die Lipidmembranen kann auch dadurch erfolgen, dass die MHC-Klasse I-Moleküle zu einer vorher existierenden Lipidmembran hinzugefügt werden.
Der Vorteil der Membranpräparation liegt unter anderem darin, dass die Membranpräparation aus Expressionssystemen erhaltbar sein kann und dass mindestens zwei MHC-Klasse I-Proteine in der Membranpräparation enthalten sind. Ein weiterer Vorteil der Membranpräparation liegt in dem sogenannten Aviditätseffekt, der darin besteht, dass mehrere MHC-Klasse I-Moleküle fester, d. h., mit geringerer Dissoziationskonstante K_D, an die TCR auf der Oberfläche einer CTL binden. Durch diese festere Bindung wird insbesondere die Detektion und Isolation von CTL erleichtert. Zudem kann durch die festere Bindung eine Aktivierung der CTL herbeigeführt werden.
Weiterhin wird die Aufgabe gelöst durch ein gefaltetes Protein, insbesondere ein gefaltetes MHC-Klasse I-Protein, welches ein Austauschelement aufweist. Dadurch kann vorteilhafter Weise ein MHC-Klasse I-Protein bereitgestellt werden, welches nach Zugabe eines Untersuchungspeptids das zugegebene Untersuchungspeptid bindet und im Anschluss daran das Untersuchungspeptid aufweist.
Ein „Untersuchungspeptid“ umfasst dabei insbesondere ein Peptid, das für eine der Untersuchungen oder therapeutischen Maßnahmen verwendet wird.
Weiterhin wird die Aufgabe gelöst durch ein Multimer, welches gefaltete MHC-Klasse I-Proteine aufweist, welche Austauschelemente aufweisen. Dadurch kann vorteilhafter Weise ein Multimer bereitgestellt werden, das nach Zugabe eines Untersuchungspeptids das zugegebene Untersuchungspeptid bindet und im Anschluss daran zumindest teilweise das Untersuchungspeptid aufweist. Durch die Verwendung eines Multimers kann vorteilhafter Weise der Aviditätseffekt ausgenutzt werden, der es ermöglicht, dass das Multimer an die Oberfläche der CTL bindet.
Weiterhin wird die Aufgabe gelöst durch ein Partikel, welches gefaltete MHC-Klasse I-Proteine aufweist, welche Austauschelemente aufweisen. Dadurch kann vorteilhafter Weise ein Partikel bereitgestellt werden, das nach Zugabe eines Untersuchungspeptids das zugegebene Untersuchungspeptid bindet und im Anschluss daran zumindest teilweise das Untersuchungspeptid aufweist. Durch die Verwendung eines Partikels kann vorteilhafter Weise der Aviditätseffekt ausgenutzt werden, der es ermöglicht, dass das Multimer an die Oberfläche der CTL bindet.
Weiterhin wird die Aufgabe gelöst durch eine Membranpräparation, welche gefaltete MHC-Klasse I-Proteine aufweist, welche Austauschelemente aufweisen. Dadurch kann vorteilhafter Weise eine Membranpräparation bereitgestellt werden, die nach Zugabe eines Untersuchungspeptids das zugegebene Untersuchungspeptid bindet und im Anschluss daran zumindest teilweise das Untersuchungspeptid aufweist. Durch die Verwendung einer Membranpräparation kann vorteilhafter Weise der Aviditätseffekt ausgenutzt werden, der es ermöglicht, dass das Multimer an die Oberfläche der CTL bindet.
Die hier verwendeten Begrifflichkeiten entsprechen dem zuvor erarbeiteten Verständnis.
Um einerseits eine effiziente Faltung des MHC-Klasse I-Proteins und andererseits einen effizienten Austausch des Austauschelements gegen das Untersuchungspeptid zu erreichen, kann das Austauschelement eine modifizierte Aminosäure oder ein Peptid sein, welches einen Bestandteil eines austauschfähigen und gefalteten MHC-Klasse I-Proteinkomplexes darstellt. Insbesondere wird ein gefaltetes MHC-Klasse-I-Protein gebildet, das das Austauschelement aufweist.
Der „austauschfähige MHC-Klasse I-Proteinkomplex“ umfasst ein gefaltetes MHC-Klasse I-Protein, das das Austauschelement aufweist.
Ein "Vorlösungsuntersuchungsreagens" umfasst einen austauschfähigen MHC-Klasse I-Proteinkomplex, oder in einer anderen Ausprägung ein Multimer, das gefaltete MHC-Klasse I-Proteine aufweist, die das Austauschelement aufweisen, oder in einer anderen Ausprägung ein Partikel, das gefaltete MHC-Klasse I-Proteine aufweist, die das Austauschelement aufweisen, oder in einer anderen Ausprägung eine Membranpräparation, die gefaltete MHC-Klasse I-Proteine aufweist, die das Austauschelement aufweisen.
Die „gefalteten MHC-Klasse I-Proteine“ sind durch die bereits erfolgte Definition bestimmt.
Ebenfalls kann die Aufgabe gelöst werden durch eine "Vorlösung", welche ein Vorlösungsuntersuchungsreagenz aufweist. Somit kann eine effektive Untersuchungsmethode bereitgestellt werden. Somit kann außerdem ein Kit mit einem Vorlösungsuntersuchungsreagenz nach Vorschriften, die nach dem jetzigen Stand der Technik bereits bekannt sind, hergestellt werden.
In einem weiteren Aspekt der Erfindung wird die Aufgabe gelöst durch ein Untersuchungsreagens, welches wie zuvor beschrieben hergestellt. Somit kann eine effektive Untersuchungsmethode bereitgestellt werden. Somit kann ebenfalls eine effektive Methode bereitgestellt werden, T-Zellen zu isolieren. Somit kann ebenfalls eine effektive Methode bereitgestellt werden, T-Zellen aus einer Population zu entfernen. Somit ist außerdem für die Herstellung eines Untersuchungsreagens aus dem Vorlösungsuntersuchungsreagenz nur ein einfacher, schneller und billiger Arbeitsschritt erforderlich, der auch von einer weniger qualifizierten Person, beispielsweise einem/r Laboranten/in oder einem/r technischen Angestellten leicht durchgeführt werden kann.
Ebenfalls kann die Aufgabe gelöst werden durch eine Analyselösung, welche ein Untersuchungsreagens aufweist. Somit kann eine effektive Untersuchungsmethode bereitgestellt werden. Somit kann ebenfalls ein Kit bereitgestellt werden, der die Analyselösung enthält.
Weiterhin wird die Aufgabe gelöst durch einen Kit, insbesondere zum Analysieren einer T-Zellen-Frequenz, welcher ein Untersuchungspeptid und separat ein Vorlösungsuntersuchungsreagenz enthält, welches einen austauschfähigen MHC-Klasse I-Proteinkomplex aufweist, welcher ein Austauschelement aufweist. Somit kann durch Austausch des Austauschelements für ein Untersuchungspeptid schnell, einfach und günstig ein Untersuchungsreagens hergestellt werden. Somit kann für den Laboralltag einem Laboranten ein Werkzeug zur Verfügung gestellt werden, mit dem eine einfache, schnelle und kostengünstige Herstellung eines Untersuchungsreagenz, d. h. eines MHC-Klasse I-Moleküls, Multimers, Partikels, oder einer Membranpräparation mit gebundenem Untersuchungspeptid, realisierbar ist.
Der „Kit“ ist insbesondere ein System, welches einen Satz Teile aufweist, wodurch eine vollständige Analyse, wie beispielsweise die Analyse einer T-Zellen-Frequenz, ohne weitere zukaufbare Hilfsmittel realisierbar ist.
Unter „T-Zellen-Frequenz“ ist zu verstehen derjenige Prozentsatz der CTL, der ein bestimmtes Peptid im Komplex mit einem bestimmten MHC-Klasse I-Protein erkennt. Unter "CTL" sind dabei die in der Einleitung definierten Zellen zu verstehen. Die T-Zellen-Frequenz für ein Peptid, gegen das eine Immunantwort stattfindet, liegt dabei typischerweise zwischen 0.01% und 20%.
Auch kann die Aufgabe gelöst werden durch ein Verfahren zum Erhalt eines Analyseergebnisses, wobei ein Untersuchungspeptid und ein austauschfähiger Klasse I-Proteinkomplex zusammengegeben werden, sodass sich eine Analyselösung ergibt, die ein Untersuchungsreagens enthält, wobei das Austauschelement durch das Untersuchungspeptid ersetzt ist.
Durch das Analyseergebnis kann beispielsweise ein Arzt eine Diagnose bestätigen oder ausschließen.
In einer weiteren Ausprägung des Verfahrens, kann die Analyselösung mit einer Zellprobe zusammengeführt werden, sodass die Analyselösung mit einem spezifischen Element der Zellprobe komplexiert, sodass ein Komplex vorliegt.
Somit können Zellen spezifisch untersucht werden.
Dabei umfasst der Begriff „Zellprobe“ insbesondere Blutproben von Menschen, Tieren, insbesondere Säuger, bis zum Knorpelfisch, und insbesondere Proben von Lymphozyten, die aus Blutproben isoliert worden sind.
„Komplexieren“ ist dabei insbesondere das spezifische Binden des Reagens durch Wechselwirkungen zwischen den atomaren Elementen von Reagens und Zellprobe, insbesondere ionische Bindungen, hydrophobe Wechselwirkungen und Wasserstoffbrücken. Im einfachsten Falle bedeutet dies die spezifische Bindung eines MHC-Klasse I-Moleküls mit einem Peptid an einen TCR einer CTL. In einem anderen Fall bedeutet dies die gleichzeitige Bindung mehrerer MHC-Klasse I-Moleküle – die auch in einem Multimer enthalten sein können – an mehrere TCR einer CTL, wodurch als besonderer Vorteil der sogenannte "Aviditätseffekt" ausgenutzt wird, der darin besteht, dass die Bindung von mehreren Klasse I-Molekülen an mehrere TCRs zu einer stärkeren Bindung des Multimers an die CTL führt als die Bindung eines einzelnen MHC-Klasse I-Moleküls an einen einzelnen TCR.
Beim „Zusammenführen“ werden die Analyselösung und die Zellprobe dergestalt zusammengebracht, dass eine Reaktion gewährleistet wird. Im einfachsten Fall wird die Zellprobe in die Analyselösung gegeben.
In einer diesbezüglichen Ausführungsform erfolgt nach dem Zusammenführen ein Detektieren des Signalgebers, insbesondere durch eine Durchflusszytometrie. Dabei werden nur diejenigen Signalgeber detektiert, die mit den Zellen komplexiert sind. Somit werden diejenigen Zellen detektiert, die mit dem Signalgeber komplexiert sind.
"Detektieren" umfasst dabei sämtliche messbaren physikalischen Parameter. Insbesondere optische/ spektroskopische Verfahren sind umfasst.
Somit ergeben sich folgende Vorteile: Alle diejenigen Zellen, die mit dem Signalgeber komplexiert sind, werden detektiert. Auf diese Weise kann angegeben werden, welcher Prozentsatz der Zellen mit dem Signalgeber komplexiert sind. Auf diese Weise kann angegeben werden, welcher Prozentsatz der CTL mit einem bestimmten MHC-Klasse I-Molekül, das ein bestimmtes Untersuchungspeptid enthält, reagieren. Auf diese Weise kann die T-Zellen-Frequenz angegeben werden.
Im Weiteren wird die Erfindung anhand von Ausführungsbeispielen erläutert. Es zeigen
1A eine schematische Darstellung des Prinzips der Herstellung eines Multimers (hier: Tetramers) von MHC-Klasse I-Molekülen im Komplex mit einem Peptid (2) nach dem Stand der Technik,
1B eine schematische Darstellung des Prinzips der Herstellung eines Multimers (hier: Tetramers) von MHC-Klasse I-Molekülen wie in Reihe A, aber mit einem anderen Peptid (11) und
1C eine schematische Darstellung des Prinzips der Herstellung zweier Multimere (hier: Tetramere) von MHC-Klasse I-Molekülen, mit verschiedenen Peptiden (17 und 20), mit Hilfe der erfindungsgemäßen Methode.
Ein mit einem Peptid komplexiertes Multimer von MHC-Klasse I-Molekülen wird nach dem Stand der Technik wie folgt hergestellt. Das entfaltetete MHC-Klasse I-Molekül (1, Nr. 1) wird mit dem Peptid (2, 11) versehen, und in einem Faltungsprozess (3) entsteht das gefaltete MHC-Klasse I-Molekül mit gebundenem Peptid (4). Hiernach findet ein Reinigungsschritt, insbesondere eine Gelfiltrationschromatographie, statt. Eine Vorstufe des Ankerelements (5) wird zugegeben und an das Klasse I-Molekül gebunden (6), so dass ein Klasse I-Molekül mit gebundenem Peptid und Ankerelement (7) erhalten wird. Hiernach findet ein Reinigungsschritt, insbesondere eine Gelfiltrationschromatographie, statt. Im nächsten Schritt wird ein Multimerisierungselement (8) zugegeben, so dass ein Multimer (10, 12) erhalten wird. Hiernach findet ein Reinigungsschritt, insbesondere eine Gelfiltrationschromatographie, statt.
Der Stand der Technik ist dadurch gekennzeichnet, dass, um Multimere mit verschiedenen Peptiden (z.B. 10, 12) zu erhalten, man die im vorherigen Abschnitt [84] beschriebene Prozedur für jedes Multimer getrennt, von Anfang bis Ende, durchführen muss.
In Ergänzung dazu ist die Erfindung wie folgt beschrieben (1C):
Das Austauschelement (13) wird in die Faltungsreaktion (14) eingebracht und ermöglicht die Faltung eines Klasse I-Moleküls (15) aus dem denaturierten Zustand ohne Gegenwart eines Peptids. Die Vorgänge der Anbringung des Ankerelements (16) und der Herstellung des Multimers (18), inklusive der dabei erforderlichen Reinigungen (siehe oben). Es wird dadurch ein Multimer erhalten, das MHC-Klasse I-Moleküle aufweist, die das Austauschelement aufweisen (19). Dieses Multimer kann dann weiterverarbeitet oder als Bestandteil eines Kits vertrieben werden.
Um ein Multimer mit einem gewünschten Untersuchungspeptid zu erhalten, wird das Untersuchungspeptid (20, 23) zu dem Multimer, das das Austauschelement enthält, zugegeben. Dadurch wird eine Austauschreaktion (21, 24) eingeleitet, zu deren Ende das Multimer teilweise oder vollständig mit dem Untersuchungspeptid versehen ist (22, 25).
Durch dieses Verfahren können Klasse I-Multimere ohne Untersuchungspeptid hergestellt und vertrieben werden. Wenn die Multimere dann verwendet werden sollen, kann das antigene Peptid direkt zugegeben werden, und man erhält ein gebrauchsfertiges Klasse I-Multimer-Reagenz mit entsprechendem antigenen Peptid. Die Spezifität dieser Disulfid-Multimere für die T-Zell-Rezeptoren ist identisch der Spezifität der Wildtyp-Multimere.
Die Erfindung erstreckt sich auf die MHC-Klasse I-Allotypen, die in den menschlichen Genloci für HLA-A, HLA-B und HLA-C kodiert sind. Sie erstreckt sich auch auf die Klasse I - ähnlichen Moleküle, die im menschlichen MHC kodiert sind und ebenfalls Peptide binden, d. h. HLA-E und HLA-G. Fernerhin erstreckt sich die Erfindung auf die MHC-Klasse I-Allotypen, die in den murinen Genloci für H-2K, H-2D und H-2L kodiert sind, sowie für die Klasse I-ähnlichen Moleküle, die im murinen MHC kodiert sind und ebenfalls Peptide binden, d. h. Qa-1 und Qa-2.
Folgende Anwendungen sind mit der Erfindung realisierbar: Detektion von spezifischen T-Zellen und ihren Frequenzen mit Hilfe von Untersuchungsreagenzien; Isolierung von CTL bestimmter Spezifitäten mit Hilfe von Untersuchungsreagenzien; Aktivation von CTL bestimmter Spezifitäten mit Hilfe von Untersuchungsreagenzien. Untersuchungsreagenzien sind hierbei insbesondere MHC-Klasse I-Moleküle, Multimere, Partikel und Membranpräparationen, die MHC-Klasse I-Moleküle enthalten, die Untersuchungspeptide enthalten, die gegen Austauschelemente ausgetauscht worden sind.
Beschreibung der Herstellung eines MHC-Klasse I-Tetramers:
Klonierung. Zur Einbringung der Gensequenz eines Klasse I-Moleküls in einen Expressionsvektor wird eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR) durchgeführt. Der Vorwärtsprimer hat die Sequenz 5' x-y 3', wobei x die Schnittsequenz eines Restriktionsenzyms und y den Beginn des Genes des Klasse I-Moleküls (20 Basenpaare) darstellt. Der Rückwärtsprimer hat die Sequenz 5' e-f 3', wobei e die Schnittsequenz eines Restriktionsenzyms und f eine Sequenz darstellt, die komplementär zum Ende des Gens des Klasse I-Moleküls ist und auch das Stopp-Codon beinhalten kann.
Das PCR-Produkt wird in einen Expressionsvektor kloniert, der einen T7-Promoter enthält, insbesondere durch Zuschneiden der Enden des PCR-Produkts mit Restriktionsenzymen und Zuschneiden der Enden des Expressionsvektors mit Restriktionsenzymen, die zu den Enden des PCR-Produkts passende Überhangsequenzen erzeugen, und anschließende Ligation des PCR-Produkts in den Expressionsvektor mit Hilfe des Enyzms Ligase; oder durch Klonierung des PCR-Produkts in einen Expressionsvektor mit Hilfe eines handelsüblichen PCR-Klonierungskits, insbesondere einen TOPO TA Kit der Firma Invitrogen, oder einen CloneJet Kit der Firma Fermentas. Die Sequenz des Produkts wird dann durch Sequenzieren verifiziert.
Herstellung des Expressionsstamms.
Das Expressionsplasmid wird in einen E.coli-Expressionsstamm (z.B. BL21DE3(pLysS)) transformiert, insbesondere durch Herstellung kompetenter Zellen durch Behandlung von E.coli – Zellen mit Dimethylsulfoxid oder mit Calciumchlorid, Inkubation der behandelten Zellen mit dem Expressionsplasmid, und Selektion der so transformierten Zellen auf Agarplatten, denen das Antibiotikum beigegeben ist, das durch das Enzym, das durch das auf dem Expressionsplasmid vorhandene Resistenzgen kodiert ist, abgebaut wird.
Der Expressionsstamm wird als Flüssigkultur mit 20% Glycerol eingefroren und ist bei –80 ºC für mehrere Jahre lagerbar.
Produktion des MHC-Klasse I-Proteins.
20 ml LB-Medium mit entsprechendem Antibiotikum (z.B. 100 µg/ml Ampicillin) werden mit 100 µl einer Vorkultur eines Expressionsstamms von Escherichia coli, der ein Plasmid mit einem MHC-Klasse I-Gen trägt, inokuliert und bei 37 ºC in einem Schüttelinkubator über Nacht bis zur stationären Phase angezogen.
Die Kultur wird zentrifugiert (3000 × g, 10 Minuten, 25 ºC), der Überstand verworfen, und das Sediment (Zellen) zur Inokulation einer 1-Liter-Kultur desselben Mediums verwendet. Die Kultur wird in einem Schüttelinkubator bei 37 ºC bis zu einer Extinktion von 0.4–0.5 bei 600 nm Wellenlänge und 1 cm Küvettendurchmesser, die mit einem Spektrophotometer (ThermoSpectronic Genesys 10 UV) gemessen wird, gezogen.
Die Kultur wird mit Isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG) zu einer finalen Konzentration von 0.5 mM versetzt und dann unter den gleichen Bedingungen bis zu einer Extinktion von 1.0 bei 600 nm Wellenlänge und 1 cm Küvettendurchmesser, die mit einem Spektrophotometer (ThermoSpectronic Genesys 10UV) gemessen wird, gezogen.
Die Kultur wird zentrifugiert (13000 × g, 10 Minuten, 25 ºC), der Überstand verworfen, und das Sediment in 20 ml Saccharoselösung resuspendiert (25 Gew.-% Saccharose, 1 mM Ethylendiamin¬tetra¬essig¬säure (EDTA), 1 mM Phenylmethyl¬sulfonyl¬fluorid (PMSF), 10 mM Dithiothreitol (DTT), 10 mM Tris(hydroxymethyl)aminomethan (Tris), pH 8.0). Dis Suspension wird in ein 50 ml-Zentrifugenröhrchen transferiert und im Gefrierschrank eingefroren.
Zell-Lyse
Das Zentrifugenröhrchen mit der Zellsuspension wird im 30 ºC-Wasserbad unter Schütteln aufgetaut. Nach dem Auftauen wird auf Eis oder im Kühlraum weitergearbeitet.
Fragmentierung der DNA: Die Suspension wird mit der Sonde eines Ultraschallgeräts beschallt, solange bis sie nach Anschauung nicht mehr viskos ist.
Die Suspension wird zentrifugiert (40000 × g, 15 Minuten, 4 ºC), der Überstand verworfen, und das Sediment durch Beschallung in 20 ml Detergens-Puffer resuspendiert (25 Gew.-% Saccharose, 1 Vol.-% Triton X-100, 5 mM EDTA, 2 mM DTT, 50 mM Tris, pH 8.0).
Die Suspension wird zentrifugiert (40000 × g, 15 Minuten, 4 ºC), der Überstand verworfen, und das Sediment durch Beschallung in 20 ml Harnstoffpuffer resuspendiert (2 M NaCl, 2 M Harnstoff, 2 mM DTT, 25 mM Tris pH 8.4).
Die Suspension wird zentrifugiert (40000 × g, 15 Minuten, 4 ºC), der Überstand verworfen, und das Sediment durch Beschallung in 20 ml TBS resuspendiert (150 mM NaCl, 0.5 mM PMSF, 20 mM Tris pH 7.5).
Die Suspension wird zentrifugiert (40000 × g, 15 Minuten, 4 ºC), der Überstand verworfen, und das Sediment durch Beschallung in 10 ml Denaturierungslösung resuspendiert (8 M Harnstoff, 50 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazin-ethansulfonsäure (HEPES), 100 µM β-mercaptoethanol, pH 6.5), und die Suspension für 48 Stunden bei 4 ºC unter leichtem Schütteln inkubiert.
Die Suspension wird zentrifugiert (40000 × g, 15 Minuten, 4 ºC). Das Sediment wird verworfen und die Zentrifugation wiederholt. Das Sediment wird wiederum verworfen und die klare Lösung durch einen 0.22 µm – Filter filtriert, aliquotiert und bei –20 ºC bis zur weiteren Verwendung aufbewahrt. Die Proteinkonzentration wird duch Messung der Extinktion bei 280 nm gegen Wasser bestimmt. Der Extinktionskoeffizient ε eines Klasse-I-Moleküls unter diesen Bedingungen beträgt etwa 85000 M-1cm-1.
Auf die hier beschriebene Weise werden entweder die schwere Untereinheit von MHC Klasse I und die leichte Untereinheit (beta-2 microglobulin, β₂m) getrennt in zwei verschiedenen Ansätzen hergestellt (um später bei der Faltung gemischt zu werden), oder ein Fusionsprotein aus der schweren und der leichten Kette wird entsprechend als einziges Protein hergestellt.
Faltung des Klasse-I-Proteins.
Ein Liter Faltungspuffer (100 mM Tris-Cl pH 8.0, 0.5 M Arginin, 2 mM EDTA, 0.5 mM oxidiertes Glutathion, 5 mM reduziertes Glutathion) wird unter Rühren bei 4 ºC tropfenweise mit entweder 10 mg denaturiertem β2m und 30 mg denaturierter schwerer Untereinheit oder mit 20 mg eines Fusionsproteins aus der schweren und der leichten Kette in Denaturierungslösung versetzt. Die Lösung wird 12 Stunden weiter gerührt.
Die Lösung wird in einem Druckfiltrationsgerät auf etwa 100 ml und dann in einem zentrifugalen Konzentrationsgerät (Trenngrenze: 30000 Da) auf etwa 1 ml konzentriert und dann zentrifugiert (16000 × g, 4 ºC, 15 min); das Sediment wird verworfen.
Der Überstand wird filtriert (0.22 µm) und auf eine in TBS (150 mM NaCl, 25 mM Tris-Cl pH 7.5) äquilibrierte Gelfiltrationssäule (z.B. GE Healthcare HiLoad 16/60 Superdex 75 prep grade) aufgetragen. Der Peak des rückgefalteten Klasse I-Moleküls wird durch Analyse der Proben mit SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese identifiziert: er enthält sowohl schwere als auch leichte Kette und weist ein apparentes Molekulargewicht von etwa 60000 Da auf.
Die entsprechenden Fraktionen werden vereinigt. Die Proteinkonzentration wird wie oben bestimmt.
Herstellung eines Klasse I-Tetramers.
Rückgefaltete Klasse I-Proteine werden in einer Konzentration von 5 µM in Biotinylierungspuffer (50 mM Tris-Cl pH 7.4; 150 mM NaCl; 1 mM Biotin; 5 mM Adenosintriphosphat; 5 mM MgCl2) aufgenommen und mit 0.1 µM rekombinanten BirA-Biotinylierungsenzym versetzt. Die Reaktion wird für 12 Stunden bei 25 ºC inkubiert.
Die Tetramerisierung wird durch Zugabe von 20 µM fluoreszenzmarkiertem Avidin oder Streptavidin (z.B. phycoerythrin-UltraAvidin, Leinco) induziert, und die Reaktion wird für 15 Minuten bei 4 ºC inkubiert.
Die Tetramer-Komplexe werden durch Gelfiltration mit einer Superdex S-200 Säule (in TBS (25 mM Tris-Cl pH 7.4; 150 mM NaCl) äquilibriert) gereinigt.
Die entsprechenden Fraktionen werden vereinigt. Die Proteinkonzentration wird wie oben bestimmt.
Zugabe des Peptids.
Um ein peptidgebundenes Tetramer zu erhalten, wird eine Lösung des Tetramers in TBS mit 10 µM des entsprechenden Peptids versetzt. Die Reaktion wird bei 25 ºC für 15 Minuten inkubiert.
Falls erforderlich, werden die Peptid-Tetramer-Komplexe durch Gelfiltration mit einer Superdex S-200 Säule (in TBS äquilibriert) gereinigt. Die entsprechenden Fraktionen werden vereinigt. Die Proteinkonzentration wird wie oben bestimmt.
Reaktion des Tetramers mit T-Zellen und Durchflusszytometrie.
200 000 isolierte T-Zellen (die Zahl wird mit Hilfe einer Neugebauer-Zählkammer unter dem Mikroskop bestimmt) werden in 1 ml FACS-Puffer (TBS plus 2% fötalem Kälberserum und 5 mM NaN₃) mit gereinigtem Peptid-Tetramer-Komplex zu einer finalen Konzentration von 0.5 mg/ml versetzt. Die Reaktion wird bei 4 ºC für eine Stunde inkubiert.
Die Zellen werden zentrifugiert (800 × g, 5 Minuten, 4 ºC) und der Überstand entfernt. Die Zellen werden zweimal mit FACS-Puffer gewaschen und dann in Fixierungspuffer (PBS, 2% Paraformaldehyd) resuspendiert.
c) Durchflusszytometrie erfolgt mit einem handelsüblichen Gerät (z.B. BectonDickinson FACSAria oder Partec CyFlow Space).
Im Folgenden wird die Verwendung des Kits beschrieben. Ein Kit, der ein Vorlösungsuntersuchungsreagens enthält, wird bereitgestellt.
Um ein Untersuchungsreagens zu erhalten, wird die Vorlösung des Vorlösungsuntersuchungsreagens mit 10 µM des entsprechenden Peptids versetzt. Die Reaktion wird bei 25 ºC für 15 Minuten inkubiert.
Falls erforderlich, wird das Untersuchungsreagens durch Gelfiltration mit einer Superdex S-200 Säule (in TBS äquilibriert) gereinigt. Die entsprechenden Fraktionen werden vereinigt. Die Proteinkonzentration wird wie oben bestimmt.
Die Reaktion des Untersuchungsreagens mit T-Zellen und Detektion der Komplexe erfolgt wie zuvor beschrieben.
Bezugszeichenliste

1: Entfaltetes MHC-Klasse I-Molekül
2: Untersuchungspeptid
3: Prozedur der Faltung des MHC-Klasse I-Moleküls mit dem Untersuchungspeptid
4: MHC-Klasse I-Molekül gefaltet mit gebundenem Untersuchungspeptid
5: Vorstufe des Ankerelements, hier: Reagenz zur Biotinylierung
6: Prozedur der Biotinylierung
7: MHC-Klasse I-Molekül gefaltet mit gebundenem Untersuchungspeptid und biotinyliert
8: Multimerisierungselement, hier: Streptavidin
9: Prozedur der Bindung von (7) an (8)
10: Multimer, hier: Tetramer mit Untersuchungspeptid (2)
11: Untersuchungspeptid (chemisch verschieden von (2))
12: Multimer, hier: Tetramer mit Untersuchungspeptid (11)
13: Austauschelement
14: Prozedur der Faltung des MHC-Klasse I-Moleküls mit dem Austauschelement
15: MHC-Klasse I-Molekül gefaltet mit gebundenem Austauschelement
16: Prozedur der Biotinylierung
17: MHC-Klasse I-Molekül gefaltet mit gebundenem Austauschelement und biotinyliert
18: Prozedur der Bindung von (17) an Streptavidin
19: Multimer mit MHC-Klasse I-Molekülen mit gebundenem Austauschelement
20: Untersuchungspeptid
21: Prozedur des Austauschs des Austauschelements gegen das Untersuchungspeptid (20)
22: Tetramer mit Untersuchungspeptid (20)
23: Untersuchungspeptid (chemisch verschieden von (20))
24: Prozedur des Austauschs des Austauschelements gegen das Untersuchungspeptid (23)
25: Tetramer mit Untersuchungspeptid (22)

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
Zitierte Patentliteratur

US 2003/0228258 A1 [0013]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

“Suicide tetramers and uses thereof”, David Scheinberg et al., beschrieben [0013]
Rodenko et al., Nature Protocols 1 (2006), S. 1120 [0016]

Claims

Produkt hergestellt nach einem Verfahren zum Herstellen eines Untersuchungsreagens, wobei einem ungefalteten Protein, insbesondere einem ungefalteten MHC-Klasse I-Protein, in einer Ausgangslösung ein Austauschelement zugefügt wird, sodass eine Vorlösung des Untersuchungsreagens mit einem gefalteten Protein vorliegt, wobei das Protein das Austauschelement aufweist.
Produkt nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei das ungefaltete Protein in einem Expressionssystem hergestellt wird.
Produkt nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei dem Protein ein Signalgeber zugeordnet wird, wobei der Signalgeber insbesondere ein Fluoreszenzfarbstoff ist.
Produkt nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei dem Protein ein Ankerelement zugeordnet wird, wobei das Ankerelement insbesondere ein Biotinmolekül ist.
Produkt nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei mehrere gefaltete Proteine zu einem Multimer zusammengefügt werden und wenigstens eines der gefalteten Proteine das Austauschelement aufweist.
Produkt nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei dem Multimer ein Multimersignalgeber zugeordnet wird, wobei der Multimersignalgeber insbesondere ein Fluoreszenzfarbstoff ist.
Gefaltetes Protein, insbesondere gefaltetes MHC-Klasse I-Protein, gekennzeichnet durch ein Austauschelement.
Gefaltetes Protein nach Anspruch 7, wobei das Austauschelement eine Verbindung ist, welche ein austauschfähiges und gefaltetes MHC-Klasse-I-Protein bildet.
Gefaltetes Protein nach einem der Ansprüche 7 oder 8, wobei das ungefaltete Protein einen Signalgeber, insbesondere einen Fluoreszenzfarbstoff, und/oder ein Ankerelement, insbesondere ein Biotinmolekül, aufweist.
Multimer, welches ein gefaltetes Protein nach einem der Ansprüche 7 bis 9 aufweist.
Multimer nach Anspruch 10, wobei das Multimer einen Multimersignalgeber, insbesondere einen Fluoreszenzfarbstoff, und/oder ein Multimerankerelement, insbesondere ein Biotinmolekül, aufweist.
Partikel, welches ein gefaltetes Protein nach einem der Ansprüche 7 bis 9 aufweist.
Partikel nach Anspruch 12, wobei das Multimer einen Signalgeber, insbesondere einen Fluoreszenzfarbstoff, aufweist.
Membranpräparation, welche ein gefaltetes Protein nach einem der Ansprüche 7 bis 9 aufweist.
Membranpräparation nach Anspruch 14, wobei die Membranpräparation einen Signalgeber, insbesondere einen Fluoreszenzfarbstoff, aufweist.
Vorlösung, welche ein gefaltetes Protein nach einem der Ansprüche 7 bis 9 oder ein Multimer nach einem der Ansprüche 10 oder 11 oder ein Partikel nach den Ansprüchen 12 oder 13 oder eine Mebranpräparation nach den Ansprüchen 14 oder 15 aufweist.
Vorlösungsuntersuchungsreagens, welches durch ein Aufreinigen aus der Vorlösung nach Anspruch 16 erhaltbar ist.
Analyselösung, welche ein gefaltetes MHC-Klasse I-Protein nach einem der Ansprüche 7 bis 9 oder ein Multimer nach einem der Ansprüche 10 oder 11 oder ein Partikel nach den Ansprüchen 12 oder 13 oder eine Mebranpräparation nach den Ansprüchen 14 oder 15 oder ein Vorlösungsuntersuchungsreagens nach Anspruch 17 aufweist, wobei das Austauschelement durch das Untersuchungspeptid ersetzt ist.
Kit, insbesondere zum Analysieren einer T-Zellen-Frequenz, welcher ein Untersuchungspeptid und separat ein Analysereagens aufweist, wobei das Analysereagens ein gefaltetes MHC-Klasse I-Protein nach einem der Ansprüche 7 bis 9 oder ein Multimer nach einem der Ansprüche 10 oder 11 oder ein Partikel nach den Ansprüchen 12 oder 13 oder eine Mebranpräparation nach den Ansprüchen 14 oder 15 oder ein Vorlösungsuntersuchungsreagens nach Anspruch 17 aufweist.
Ergebnis erhalten nach einem Verfahren zum Erhalt eines Analyseergebnisses, wobei ein Untersuchungspeptid und ein Vorlösungsuntersuchungsreagens zusammen gegeben werden, sodass sich eine Analyselösung ergibt, und das Analysereagens ein gefaltetes MHC-Klasse I-Protein nach einem der Ansprüche 7 bis 9 oder ein Multimer nach einem der Ansprüche 10 oder 11 oder ein Partikel nach den Ansprüchen 12 oder 13 oder eine Mebranpräparation nach den Ansprüchen 14 oder 15 oder ein Vorlösungsuntersuchungsreagens nach Anspruch 17 ist, wobei das Austauschelement durch das Untersuchungspeptid ersetzt ist.
Ergebnis nach Anspruch 20, wobei die Analyselösung mit einer Zellprobe zusammengeführt wird, sodass das Untersuchungsreagens mit einem spezifischen Element der Zellprobe komplexiert, sodass ein Komplex vorliegt.
Ergebnis nach Anspruch 21, wobei nach dem Zusammenführen ein Detektieren des Signalgebers erfolgt, insbesondere durch eine Durchflusszytometrie.
Ergebnis nach einem der Ansprüche 20 bis 22, wobei die Bildung des Komplexes aus Zellprobe und Untersuchungsreagens dazu führt, dass bestimmte CTL aus der Gesamemenge abgetrennt werden und das Abtrennen insbesondere mittels durchflusszytometrischer oder chromatographischer Verfahren erfolgt, sodass ein Trennergebnis und ein Rest vorliegen.
Analyseergebnis erhalten nach einem Ergebnis nach einem der Ansprüche 20 bis 23, wobei das Analyseergebnis den Rest und/oder das Trennergebnis umfasst.
Ergebnis nach einem der Ansprüche 20 bis 22, wobei die Bildung des Komplexes aus Zellprobe und Untersuchungsreagens dazu führt, dass bestimmte CTL aktiviert werden.
Ergebnis nach einem der Ansprüche 20 bis 22, wobei die Bildung des Komplexes aus Zellprobe und Untersuchungsreagens dazu führt, dass bestimmte CTL aus einer Zellprobe aussortiert werden.