CN107653248B - 926位点发生突变的RanBP9突变基因及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种发生了c.926delC突变的RanBP9突变基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示，它是人类男性生精障碍的致病基因。本发明还提供了基于多重PCR捕获联合二代DNA测序的RanBP9致病基因外显子突变筛选方法，最后利用Sanger测序对突变进行验证；其中PCR捕获引物组包含扩增引物序列SEQ ID NO:7‑12，用于Sanger测序的RanBP9基因c.926delC突变片段的扩增引物序列如SEQ ID NO:11‑12所示。本发明提供的RanBP9致病基因形式尚未被报道，可以为该病致病机理的解析和检测方法的构建等提供依据和奠定基础。

Description

926位点发生突变的RanBP9突变基因及其应用
技术领域
本发明涉及突变基因及其检测方法，特别涉及人类男性生精障碍致病基因RanBP9及其检测方法。
背景技术
生育年龄的男性中约有5%有不育问题，其中大部分的原因不明。男性生育能力依赖于有功能的精子，精子在睾丸内产生和发育的过程是由数个基因控制，这些基因的表达过程若受到干扰，就会影响精子的形成从而造成男性不育。研究（Jianqiang Bao, et al.,RAN-Binding Protein 9 is Involved in Alternative Splicing and is Critical forMale Germ Cell Development and Male Fertility. PLoS Genetics. 2014，10(12):1-14.）表明，RanBP9基因即RAN binding protein 9编码基因在老鼠睾丸中可以调控生育相关基因的表达，以保证精子的正常生成，因此RanBP9基因是目前精子形成过程中的关键调控因素之一。RanBP9基因编码RanBP9蛋白，RanBP9蛋白是在细胞内多个区域调节不同功能的多种蛋白复合体的关键组成部分，发挥支架蛋白的角色。RanBP9蛋白功能的发挥与多种生物过程相关，例如细胞增殖和凋亡、性腺的生长和发育等。如果RanBP9基因失去功能，精子的生成过程就会受到干扰，从而严重减低男性生育力造成男性出现少精、弱精等生精障碍。然而目前RanBP9基因在人类男性生精障碍中的遗传变异特征尚未得到解析，限制了该基因的研究和应用。
为了系统解析RanBP9基因在人类男性生精障碍中的致病突变，本发明设计和合成了覆盖RanBP9基因全部外显子的PCR捕获引物组，再结合二代DNA测序技术对25个男性生精障碍患者样本进行捕获测序，最终解析出了RanBP9基因的6种候选致病突变形式，所发现的突变均经Sanger测序确证；之后针对这6种致病基因突变，利用Sanger测序分析对应家系中其它成员的样本，发现携带致病基因突变的男性均存在生精障碍从而致病基因突变得到了确证。进一步的，采用同样的方法在另外37个人类男性生精障碍患者和100个生精正常的健康男性样本中进行了验证。本发明提供的男性生精障碍致病基因RanBP9突变均尚未见报道，其对于该病的解析和检测均具有潜在的重要价值。
发明内容
本发明提供了RanBP9基因引起的人类男性生精障碍的6种突变基因形式，同时提供了基于PCR捕获测序的RanBP9致病基因检测方法；这些可以为RanBP9基因引起的男性生精障碍致病机理的解析和药物开发、致病基因筛查和检测等提供依据和奠定基础。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案如下：
本发明提供了RanBP9基因的6种突变基因形式（图1），其序列分别如SEQ ID NO:1-6所示，对应的突变分别为c.126C>T突变、c.133C>T突变、c.702T>G突变、c.912G>T突变、c.921A>G突变和c.926delC突变。RanBP9基因的这6种突变形式经检测和验证，均为人类男性生精障碍致病基因，可以被应用于构建人类男性生精障碍基因检测方法以及制备人类男性生精障碍基因诊断芯片、基因检测试剂盒和治疗药物中。
其中，所述SEQ ID NO:1-6展现的只是发生了突变的RanBP9基因外显子序列，不含内含子序列。参照野生型RanBP9基因序列（NCBI登录号为NM_005493.2），所述c.126C>T突变是指RanBP9基因第126位点的C核苷酸突变成了T核苷酸，该突变发生在外显子1中；所述c.133C>T突变是指RanBP9基因第133位点的C核苷酸突变成了T核苷酸，该突变发生在外显子1中；所述c.702T>G突变是指RanBP9基因第702位点的T核苷酸突变成了G核苷酸，该突变发生在外显子2中；所述c.912G>T突变是指RanBP9基因第912位点的G核苷酸突变成了T核苷酸，该突变发生在外显子4中；所述c.921A>G突变是指RanBP9基因第921位点的A核苷酸突变成了G核苷酸，该突变发生在外显子4中；所述c.926delC突变是指RanBP9基因第926位点发生了C核苷酸的缺失，该突变发生在外显子4中。
此外，本发明还提供了RanBP9基因引起的人类男性生精障碍的致病基因检测方法，该方法包括如下主要步骤：
（1）RanBP9基因的PCR捕获
提取待测患者样本基因组DNA，利用设计合成的PCR捕获引物组进行多重PCR扩增；
（2）二代DNA测序解析基因突变谱
将（1）中的多重PCR扩增产物进行二代DNA测序，并通过信息分析找出突变位点；
（3）突变位点的验证
对于结果是已发现的6种RanBP9基因致病突变的，则直接进行Sanger测序验证；对于结果是新发现的RanBP9基因突变的，则进行Sanger测序验证后，再通过Sanger测序分析患者家系相关成员样本的遗传信息进行验证。
其中，（1）中所述样本为人体正常组织，优选血液或口腔粘膜。
其中，（1）中所述PCR捕获引物组是针对RanBP9基因外显子区设计的，共需要15对引物（其序列如表1所示），在美国Thermo Fisher公司处定制，这15对引物对构成的PCR捕获引物组可以覆盖RanBP9基因所有外显子。SEQ ID NO:7-12也包含在这15对引物对中。
表1 PCR捕获扩增引物组
扩增子编号 引物上游序列（5’-3’） 引物下游序列（5’-3’）
Amplicon1 GAAGCAGAGGAGGAAGGAGA TTGTAGTGCACCCGCAGG
Amplicon2 GTCATGGCAAAACCCCAA CCATCTCTTCCCTTACTGAC
Amplicon3 TTACATGGGAATTGGTCTT CTGGTAGTCTATTCATGTTC
Amplicon4 GTTGGGATAAGCATTCATAT CTAAACTATGTCCATTCTTG
Amplicon5 GTATTGCTTTCACTGACCT GCGCGGTGGCTCACGCC
Amplicon6 CCAAATTTGTATCCTACTGT TTGTATCATGGTCTGCCA
Amplicon7 AATGGTTTCATCTTATTTA TGTCTATTCTTAATGGAA
Amplicon8 GAATTCAGAAATTGGTAT TTTAATGTGAAAAGGAGATT
Amplicon9 AGTGCGTCAGTTTATAGAAA TGAAAAATGTGCGGTGCTT
Amplicon10 GTTTTGAAAGTTGTAGTA CTGGTGAAGTTATTAACTTG
Amplicon11 TAATGATGTAGACATGGAAA CATTTCGGTGTCACAATCT
Amplicon12 AAGTTGATTCAAGTCAGTT CTTCAACATTTTTTTGTTTG
Amplicon13 GATGCATTCAGTCTACTAG CTAATATTGCACTGTTAAGA
Amplicon14 AAACCCACAATCTGCCAAAG TGTGATGATCAATTTGAAC
Amplicon15 ATCCTTTAAAACAATTACC CTGTAGAAGTAAATTTTTAA
其中，（1）中所述的多重PCR扩增其体系（20μL）如表2所示。5×Ion AmpliSeq™HiFi Mix、2×Ion AmpliSeq™ 引物组、20×Ion AmpliSeq™ Sample ID Panel和灭菌的Nuclease-free Water均购置于美国Thermo Fisher公司。
表2 PCR捕获扩增体系
成分 添加量（μL）
5×Ion AmpliSeq™HiFi Mix 4.0
2×Ion AmpliSeq™ 引物组 10.0
20×Ion AmpliSeq™ Sample ID Panel 1.0
样本基因组DNA（>20 ng/μL） 0.5
灭菌的Nuclease-free Water 4.5
总体积 20.0
表2中的2×Ion AmpliSeq™ 引物组是指表1中的15对引物对，每对引物的浓度均为10μM。
其中，（1）中所述的多重PCR扩增其扩增阶段和条件如表3所示：
表3 PCR捕获扩增阶段和条件
其中，（2）中所述的PCR扩增捕获产物进行的二代DNA测序和信息分析，可由商业化的二代DNA测序公司完成，最终需得到所检测样本的RanBP9基因所有外显子的突变信息。
其中，（3）中所述的对已发现的6种RanBP9基因致病突变直接进行Sanger测序验证，是指单独采用特定突变所在扩增子的引物对进行扩增和Sanger测序，以验证是否同二代测序检出的突变结果一致，扩增产物可送商业化的DNA测序公司进行Sanger测序，最终需得到对应的扩增子序列。用于直接Sanger测序的突变片段的扩增引物对具体是：对于RanBP9基因的c.126C>T突变，扩增引物对为SEQ ID NO:7-8；对于c.133C>T突变，扩增引物对为SEQ ID NO:7-8；对于c.702T>G突变，扩增引物对为SEQ ID NO:9-10；对于c.912G>T突变，扩增引物对为SEQ ID NO:11-12；对于c.921A>G突变，扩增引物对为SEQ ID NO:11-12；对于c.926delC突变，扩增引物对为SEQ ID NO:11-12。新发现的RanBP9基因突变则另行设计引物。
本发明提供的人类男性生精障碍相关基因RanBP9的6种致病突变形式，可以为该病致病机理的解析和致病基因检测等提供依据和奠定基础；此外本发明提供的基于PCR捕获联合二代测序的RanBP9致病基因检测方法，覆盖了致病基因的所有外显子，可以高效全面、快速准确地获取突变信息。
附图说明
图1是RanBP9基因6种致病突变形式的位置示意图。黑色方框代表外显子，白色方块代表内含子，独立数字1、2、3和4代表所对应的外显子序号，箭头所指向处为突变位点，对应突变标注于箭头平末端处。
图2是实施例1中的S1号患者其RanBP9基因的c.126C>T突变测序图谱。箭头指向处为突变位点。S1号患者为图8家系的III1，I2、II2、II3和III2的突变测序结果与III1类似，S2号患者的突变测序结果也与III1类似，均可参见图2。
图3是实施例1中的S3号患者其RanBP9基因的c.133C>T突变测序图谱。箭头指向处为突变位点。S3号患者为图9家系的II1，I2的突变测序结果与II1类似，可参见图3。
图4是实施例1中的S4号患者其RanBP9基因的c.702T>G突变测序图谱。箭头指向处为突变位点。S4号患者为图10家系的II1，I2的突变测序结果与II1类似，可参见图4。
图5是实施例1中的S5号患者其RanBP9基因的c.912G>T突变测序图谱。箭头指向处为突变位点。S5号患者为图11家系的III1，II2和II3的突变测序结果都与III1类似，S6号患者的突变测序结果也与III1类似，均可参见图5。
图6是实施例1中的S7号患者其RanBP9基因的c.921A>G突变测序图谱。箭头指向处为突变位点。S7号患者为图12家系的II1，I2和II3的突变测序结果与II1类似，可参见图6。
图7是实施例1中的S8号患者其RanBP9基因的c.926delC突变测序图谱。箭头指向处为缺失突变位点。S8号患者为图13家系的III1，II2的突变测序结果与III1类似，可参见图7。
图8是S1号生精障碍患者所在家系的遗传图谱，S1号患者为图中III1。此图中正方形表示男性，圆形表示女性；黑色填充表示生精障碍，空心表示非生精障碍；“+”表示RanBP9基因检出c.126C>T突变，“-”表示RanBP9基因未检出c.126C>T突变；I、II和III分别代表第1、2和3代，数字为成员编号。
图9是S3号生精障碍患者所在家系的遗传图谱，S3号患者为图中II1。此图中正方形表示男性，圆形表示女性；黑色填充表示生精障碍，空心表示非生精障碍；“+”表示RanBP9基因检出c.133C>T突变，“-”表示RanBP9基因未检出c.133C>T突变；I和II分别代表第1和2代，数字为成员编号。
图10是S4号生精障碍患者所在家系的遗传图谱，S4号患者为图中II1。此图中正方形表示男性，圆形表示女性；黑色填充表示生精障碍，空心表示非生精障碍；“+”表示RanBP9基因检出c.702T>G突变，“-”表示RanBP9基因未检出c.702T>G突变；I和II分别代表第1和2代，数字为成员编号。
图11是S5号生精障碍患者所在家系的遗传图谱，S5号患者为图中III1。此图中正方形表示男性，圆形表示女性；黑色填充表示生精障碍，空心表示非生精障碍；“+”表示RanBP9基因检出c.912G>T突变，“-”表示RanBP9基因未检出c.912G>T突变，“\”表示个体死亡；I、II和III分别代表第1、2和3代，数字为成员编号。
图12是S7号生精障碍患者所在家系的遗传图谱，S7号患者为图中II1。此图中正方形表示男性，圆形表示女性；黑色填充表示生精障碍，空心表示非生精障碍；“+”表示RanBP9基因检出c.921A>G突变，“-”表示RanBP9基因未检出c.921A>G突变；I和II分别代表第1和2代，数字为成员编号。
图13是S8号生精障碍患者所在家系的遗传图谱，S8号患者为图中III1。此图中正方形表示男性，圆形表示女性；黑色填充表示生精障碍，空心表示非生精障碍；“+”表示RanBP9基因检出c.926delC突变，“-”表示RanBP9基因未检出c.926delC突变；I、II和III分别代表第1、2和3代，数字为成员编号。
具体实施方式
以下结合具体实施例，进一步阐述本发明。
实施例1
选择临床检查确诊的25名男性生精障碍患者在其签署了知情同意书的情况下，进行RanBP9基因的检测和分析。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如《分子克隆实验指南》（J.萨姆布鲁克等编著，第三版，科学出版社）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。此外，实施例涉及的生精障碍主要是指少精和弱精，生精障碍患者的诊断依据现有的常规临床标准。
（1）RanBP9基因的PCR捕获
取患者肘静脉血5ml（EDTA抗凝），用中国北京天根公司的血液基因组提取试剂盒进行基因组DNA提取，以其为模板采用表1的PCR捕获引物组按照表2配制多重PCR扩增体系，并在美国ABI公司的2720型PCR仪上按照表3条件进行扩增反应。
（2）二代DNA测序解析基因突变谱
将（1）中的多重PCR扩增产物送深圳华大基因公司进行二代DNA测序，采用的二代DNA测序仪是美国ABI公司的Ion Proton，平均测序深度达到5000×；结果显示有8例患者（编号S1-8）检出RanBP9基因突变，结果如表4所示，共计有6种突变。
表4 8例人类男性生精障碍患者RanBP9基因检测及验证结果
样本编号 突变情况 验证时的扩增引物对 Sanger测序结果 家系遗传 序列
S1 c.126C>T SEQ ID NO:7-8 参见图2，一致 符合 SEQ ID NO:1
S2 c.126C>T SEQ ID NO:7-8 参见图2，一致 符合 SEQ ID NO:1
S3 c.133C>T SEQ ID NO:7-8 参见图3，一致 符合 SEQ ID NO:2
S4 c.702T>G SEQ ID NO:9-10 参见图4，一致 符合 SEQ ID NO:3
S5 c.912G>T SEQ ID NO:11-12 参见图5，一致 符合 SEQ ID NO:4
S6 c.912G>T SEQ ID NO:11-12 参见图5，一致 符合 SEQ ID NO:4
S7 c.921A>G SEQ ID NO:11-12 参见图6，一致 符合 SEQ ID NO:5
S8 c.926delC SEQ ID NO:11-12 参见图7，一致 符合 SEQ ID NO:6
（3）突变位点的验证
根据所检出的突变，利用特定引物对将原样本突变所在扩增子片段扩增后直接进行Sanger测序验证。采用上海生工生物工程有限公司的rTaq聚合酶试剂盒进行扩增，其扩增体系均详见表5，对应扩增引物对详见表4。扩增条件均为：94℃预变性4min；32个循环：94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸45s；72℃终延伸7min。Sanger测序结果发现均与二代DNA测序结果一致（图2-7，表4）。
表5 扩增体系
编号 组份 添加量
1 10×PCR buffer(Mg2+) 2.5μL
2 dNTP Mix 0.5μL
3 Primer(50uM)F 0.25μL
4 Primer(50uM)R 0.25μL
5 rTaq 0.25μL
6 Template DNA(30ng/μL) 1.25μL
7 灭菌去离子水 20.0μL
由于这6种突变均未被报道，因此收集这8例生精障碍患者家系相关成员样本，再通过Sanger测序突变片段确证遗传关系，具体如下：
对于S1号患者，如图8所示其为家系先证者III1，该患者28岁，结婚4年妻子未孕就诊，经精液常规分析显示其连续3次精液检查精子密度每毫升均低于1500万个诊断为少精。根据二代测序数据可知，S1号患者即III1的RanBP9基因发生了c.126C>T突变；利用引物对SEQ ID NO:7-8扩增突变片段，其直接Sanger测序结果（如图2所示），与二代测序结果一致。收集该家系中的其他8名成员资料并做相关检查，还发现III2也为少精个体（如图8中所示），II1和II4并无既往生精障碍史，然而谨慎起见也和III2一起做了相关检查，确诊只有III2为少精个体，而II1和II4生精正常。由于I1和I2为III1的外公外婆年纪大因此只做基因检测而不做生精障碍性状分析。采集这8个家系成员的血液样本提取基因组DNA，利用引物对SEQ ID NO:7-8扩增RanBP9基因c.126C>T突变所在外显子片段，Sanger测序显示I2、II2、II3和III2这4个家系成员均也存在RanBP9基因的c.126C>T突变。由此可知，携带RanBP9基因c.126C>T突变的男性成员即III1和III2均为生精障碍患者，而不携带RanBP9基因c.126C>T突变的男性成员即II1和II4均不存在生精障碍问题；而携带RanBP9基因c.126C>T突变的女性成员即II2和II3，由于是女性不存在生精问题。III1的RanBP9基因c.126C>T突变是由其外婆I2遗传先给其母亲II2再由其母亲II2遗传给他的，而III1的母亲II2和外婆I2由于是女性因此不显示生精障碍。表4中S2号患者，经过同样的分析发现该患者也存在RanBP9基因的c.126C>T突变（参见图2，表4），并且也出现家系中男性成员携带RanBP9基因的c.126C>T突变即出现生精障碍性状。由此证明了RanBP9基因的c.126C>T突变（突变基因序列如SEQ ID NO:1所示）是男性生精障碍患者的致病性突变。
对于S3号患者，如图9所示其为家系先证者II1，该患者30岁，结婚5年妻子未孕就诊，经精液常规分析显示其连续3次精液检查精子密度每毫升均低于1500万个诊断为少精。根据二代测序数据可知，S3号患者即II1的RanBP9基因发生了c.133C>T突变；利用引物对SEQ ID NO:7-8扩增突变片段，其直接Sanger测序结果（如图3所示），与二代测序结果一致。收集该家系中的其他2名成员资料并做相关检查，获知男性成员中I1并无既往生精障碍史，I1经检查也确诊不存在生精障碍（如图9中所示）。采集这2个家系成员的血液样本提取基因组DNA，利用引物对SEQ ID NO:7-8扩增RanBP9基因c.133C>T突变所在外显子片段，Sanger测序显示只有I2存在RanBP9基因的c.133C>T突变。由此可知，携带RanBP9基因c.133C>T突变的男性成员即II1为生精障碍患者，而不携带RanBP9基因c.133C>T突变的男性成员即I1不存在生精障碍，II1的RanBP9基因c.133C>T突变是遗传自其母亲I2，而II1的母亲I2由于是女性不显示生精障碍，由此证明了RanBP9基因c.133C>T突变（突变基因序列如SEQ IDNO:2所示）是男性生精障碍患者的致病性突变。
对于S4号患者，如图10所示其为家系先证者II1，该患者29岁，结婚3年妻子未孕就诊，经精液常规分析显示其连续3次精液检查精子密度每毫升均低于1500万个诊断为少精。根据二代测序数据可知，S4号患者即II1的RanBP9基因发生了c.702T>G突变；利用引物对SEQ ID NO:9-10扩增突变片段，其直接Sanger测序结果（如图4所示），与二代测序结果一致。收集该家系中的其他3名成员资料并做相关检查，获知男性成员中I1未有既往生精障碍史，进一步做精液常规分析也确定了I1不存在生精障碍，II2经检查也不存在生精障碍（如图10中所示）。采集这3个家系成员的血液样本提取基因组DNA，利用引物对SEQ ID NO:9-10扩增RanBP9基因c.702T>G突变所在外显子片段，Sanger测序显示I2存在RanBP9基因的c.702T>G突变。由此可知，携带RanBP9基因c.702T>G突变的男性成员即II1为生精障碍患者，而不携带RanBP9基因c.702T>G突变的男性成员即I1和II2均不存在生精障碍，II1的RanBP9基因c.702T>G突变遗传自其母亲I2，而II1的母亲I2由于是女性不显示生精障碍，由此证明了RanBP9基因c.702T>G突变（突变基因序列如SEQ ID NO:3所示）是男性生精障碍患者的致病性突变。
对于S5号患者，如图11所示其为家系先证者III1，该患者32岁，结婚3年妻子未孕就诊，经精液常规分析显示其连续3次精液检查精子密度每毫升均低于1500万个诊断为少精。根据二代测序数据可知，S5号患者即III1的RanBP9基因发生了c.912G>T突变；利用引物对SEQ ID NO:11-12扩增c.912G>T突变所在外显子片段，其直接Sanger测序结果（如图5所示），与二代测序结果一致。收集该家系中的其他4名在世成员资料并做相关检查（I1和I2已离世），获知男性成员中II3结婚21年未生育既往检查诊断为少精，此次再做精液常规分析也确定了II3存在生精障碍（如图11中所示），而II1经检查生精正常。采集这4个家系成员的血液样本提取基因组DNA，利用引物对SEQ ID NO:11-12扩增RanBP9基因c.912G>T突变所在外显子片段，Sanger测序显示II2和II3均也存在RanBP9基因的c.912G>T突变。由此可知，携带RanBP9基因c.912G>T突变的男性成员即II3和III1均为生精障碍患者，而不携带RanBP9基因c.912G>T突变的男性成员即II1不存在生精障碍，III1的RanBP9基因c.912G>T突变是由其母亲II2遗传给他的，而III1的母亲II2由于是女性不显示生精障碍。表4中S6号患者，经过同样的分析发现该患者也存在RanBP9基因的c.912G>T突变（参见图5，表4），并且也出现家系中男性成员携带RanBP9基因的c.912G>T突变即出现生精障碍性状。由此证明了RanBP9基因c.912G>T突变（突变基因序列如SEQ ID NO:4所示）是男性生精障碍患者的致病性突变。
对于S7号患者，如图12所示其为家系先证者II1，该患者30岁，结婚4年妻子未孕就诊，经精液常规分析显示其连续3次精液检查精子密度每毫升均低于1500万个诊断为少精。根据二代测序数据可知，S7号患者即II1的RanBP9基因发生了c.921A>G突变；利用引物对SEQ ID NO:11-12扩增c.921A>G突变所在外显子片段，其直接Sanger测序结果（如图6所示），与二代测序结果一致。收集该家系中的其他4名成员资料并做相关检查，获知男性成员中I1未有既往生精障碍史，此次再做精液常规分析也确定了I1不存在生精障碍（如图12中所示）。采集这4个家系成员的血液样本提取基因组DNA，利用引物对SEQ ID NO:11-12扩增RanBP9基因c.921A>G突变所在外显子片段，Sanger测序显示I2和II3均也存在RanBP9基因的c.921A>G突变。由此可知，携带RanBP9基因c.921A>G突变的男性成员即II1为生精障碍患者，而不携带RanBP9基因c.921A>G突变的男性成员即I1不存在生精障碍，II1的RanBP9基因c.921A>G突变是由其母亲I2遗传给他的，同时也遗传给其妹妹之一II3，而II1的母亲I2和妹妹II3由于是女性不显示生精障碍，由此证明了RanBP9基因c.921A>G突变（突变基因序列如SEQ ID NO:5所示）是男性生精障碍患者的致病性突变。
对于S8号患者，如图13所示其为家系先证者III1，该患者29岁，结婚3年妻子未孕就诊，经精液常规分析显示其a级和b级这两级精子数量比例大于30%但小于50%诊断为中度弱精子症。根据二代测序数据可知，S8号患者即III1的RanBP9基因发生了c.926delC突变；利用引物对SEQ ID NO:11-12扩增c.926delC突变所在外显子片段，其直接Sanger测序结果（如图7所示），与二代测序结果一致。收集到了该家系中的其他5名成员II1、II2、II3、II4和III2的资料（I1和II2未收集到）并做相关检查，获知男性成员中II2有生精障碍史既往检查诊断为轻度弱精子症，进一步做精液常规分析也确定了II2存在弱精症状供此次参考；而II3和III2经检查生精正常（如图13中所示）。采集这5个家系成员的血液样本提取基因组DNA，利用引物对SEQ ID NO:11-12扩增RanBP9基因c.926delC突变所在外显子片段，Sanger测序显示只有II2存在RanBP9基因的c.926delC突变。由此可知，携带RanBP9基因c.926delC突变的男性成员即II2和III1均为生精障碍患者，而不携带RanBP9基因c.926delC突变的男性成员即II3和III2均不存在生精障碍，III1的RanBP9基因c.926delC突变是由其父亲II2遗传给他的，由此证明了RanBP9基因c.926delC突变（突变基因序列如SEQ ID NO:6所示）是男性生精障碍患者的致病性突变。
综上可知，通过本实施例获得了RanBP9基因的6种致病突变均满足家系遗传规律，实施例2将在人群样本中做进一步验证。
实施例2
另取与实施例1中不同的人类男性生精障碍临床确诊患者37例以及100例临床确诊无生精障碍的健康男性血样进行分析，方法同实施例1，结果11例患者样本检出RanBP9基因突变，相关数据如表6所示。
表6 11例人类男性生精障碍患者RanBP9基因检测及验证结果
样本编号 突变情况 Sanger测序 家系分离 序列
s1 c.912G>T 一致 是 SEQ ID NO:4
s2 c.133C>T 一致 是 SEQ ID NO:2
s3 c.126C>T 一致 是 SEQ ID NO:1
s4 c.912G>T 一致 是 SEQ ID NO:4
s5 c.126C>T 一致 是 SEQ ID NO:1
s6 c.702T>G 一致 是 SEQ ID NO:3
s7 c.126C>T 一致 是 SEQ ID NO:1
s8 c.702T>G 一致 是 SEQ ID NO:3
s9 c.133C>T 一致 是 SEQ ID NO:2
s10 c.921A>G 一致 是 SEQ ID NO:5
s11 c.926delC 一致 是 SEQ ID NO:6
对于表6中生精障碍患者的突变均经过Sanger测序验证了，所有突变基因均属于所述6种基因突变形式，对此11个患者进一步做家系遗传分析也确证了这6中基因突变形式符合家系遗传规律；而在100例健康男性中，均不存在所述的突变，从而从正反两方面再次验证了本发明提供的RanBP9基因突变形式的致男性生精障碍性，以及本发明提供的检测方法具有良好的可靠性和准确性。
基于本发明新鉴定的RanBP9基因的6种致病突变基因形式，申请人将突变所在的扩增子进行纯化，将其克隆到商业化质粒等载体中，之后将其导入大肠杆菌等宿主菌中，置于-80℃冰箱中保存。另一方面，由于本发明对于致病基因序列的公布，可以采用定点突变的方式由野生型基因制备得到，或通过序列合成的方式获取。
序列表
<110> 黄志清
<120> 926位点发生突变的RanBP9突变基因及其应用
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 3132
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 1
gaagcagagg aggaaggaga gaagaggtgg aggtggccgc aggctgagtc gcggccggga 60
tgtccgggca gccgccgccg ccgccgccgc agcagcagca acagcagcag cagctgtcgc 120
cgccatcgcc ggcggccttg gccccagtct ccggagtcgt cctgccggcg cccccggccg 180
tcagcgccgg ctcttctccg gccggctcgc ccggcggcgg tgcgggcggc gaaggcttag 240
gggccgcggc ggccgccctg ctcctccacc ctccgccgcc gccgcccccg gccaccgcgg 300
ccccgccgcc cccgccgccg cccccgcctc cccctgcctc agcggctgcc cccgccagcg 360
ggccgcccgc tcccccgggc cttgcagcgg gccccggccc ggctggagga gccccgaccc 420
cagctctggt ggcgggcagc agcgccgcgg cccccttccc tcacggggac tcggccctga 480
acgagcagga gaaggagttg cagcggcggc tgaagcgtct ctacccggcc gtggacgaac 540
aagagacgcc gctgcctcgg tcctggagcc cgaaggacaa gttcagctac atcggcctct 600
ctcagaacaa cctgcgggtg cactacaaag gtcatggcaa aaccccaaaa gatgccgcgt 660
cagttcgagc cacgcatcca ataccagcag cctgtgggat ttattatttt gaagtaaaaa 720
ttgtcagtaa gggaagagat ggttacatgg gaattggtct ttctgctcaa ggtgtgaaca 780
tgaatagact accaggttgg gataagcatt catatggtta ccatggggat gatggacatt 840
cgttttgttc ttctggaact ggacaacctt atggaccaac tttcactact ggtgatgtca 900
ttggctgttg tgttaatctt atcaacaata cctgctttta caccaagaat ggacatagtt 960
taggtattgc tttcactgac ctaccgccaa atttgtatcc tactgtgggg cttcaaacac1020
caggagaagt ggtcgatgcc aattttgggc aacatccttt cgtgtttgat atagaagact1080
atatgcggga gtggagaacc aaaatccagg cacagataga tcgatttcct atcggagatc1140
gagaaggaga atggcagacc atgatacaaa aaatggtttc atcttattta gtccaccatg1200
ggtactgtgc cacagcagag gcctttgcca gatctacaga ccagaccgtt ctagaagaat1260
tagcttccat taagaataga caaagaattc agaaattggt attagcagga agaatgggag1320
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aagcacatca atcatattgc catagtaata aacaccagtc atccaacttg aatgtaccag1680
aactaaacag tataaatatg tcaagatcac agcaagttaa taacttcacc agtaatgatg1740
tagacatgga aacagatcac tactccaatg gagttggaga aacttcatcc aatggtttcc1800
taaatggtag ctctaaacat gaccacgaaa tggaagattg tgacaccgaa atggaagttg1860
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tccactttgg acgagagctg caagcaatga gtgaacagct aaggagagac tgtggcaaga1980
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attatgtact ggggacaggt ttttgtcgct ttacattgct tcctagttta cagcatgatg2400
caaatgattt tctaacttag tgttaggaga aattattttc catctttaac ctcttagttg2460
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caataaaatg tagtgatata attaaccagc cattaaaaat ttacttctac agaaaaaaaa3120
aaaaaaaaaa aa 3132
<210> 2
<211> 3132
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 2
gaagcagagg aggaaggaga gaagaggtgg aggtggccgc aggctgagtc gcggccggga 60
tgtccgggca gccgccgccg ccgccgccgc agcagcagca acagcagcag cagctgtcgc 120
cgccaccgcc ggtggccttg gccccagtct ccggagtcgt cctgccggcg cccccggccg 180
tcagcgccgg ctcttctccg gccggctcgc ccggcggcgg tgcgggcggc gaaggcttag 240
gggccgcggc ggccgccctg ctcctccacc ctccgccgcc gccgcccccg gccaccgcgg 300
ccccgccgcc cccgccgccg cccccgcctc cccctgcctc agcggctgcc cccgccagcg 360
ggccgcccgc tcccccgggc cttgcagcgg gccccggccc ggctggagga gccccgaccc 420
cagctctggt ggcgggcagc agcgccgcgg cccccttccc tcacggggac tcggccctga 480
acgagcagga gaaggagttg cagcggcggc tgaagcgtct ctacccggcc gtggacgaac 540
aagagacgcc gctgcctcgg tcctggagcc cgaaggacaa gttcagctac atcggcctct 600
ctcagaacaa cctgcgggtg cactacaaag gtcatggcaa aaccccaaaa gatgccgcgt 660
cagttcgagc cacgcatcca ataccagcag cctgtgggat ttattatttt gaagtaaaaa 720
ttgtcagtaa gggaagagat ggttacatgg gaattggtct ttctgctcaa ggtgtgaaca 780
tgaatagact accaggttgg gataagcatt catatggtta ccatggggat gatggacatt 840
cgttttgttc ttctggaact ggacaacctt atggaccaac tttcactact ggtgatgtca 900
ttggctgttg tgttaatctt atcaacaata cctgctttta caccaagaat ggacatagtt 960
taggtattgc tttcactgac ctaccgccaa atttgtatcc tactgtgggg cttcaaacac1020
caggagaagt ggtcgatgcc aattttgggc aacatccttt cgtgtttgat atagaagact1080
atatgcggga gtggagaacc aaaatccagg cacagataga tcgatttcct atcggagatc1140
gagaaggaga atggcagacc atgatacaaa aaatggtttc atcttattta gtccaccatg1200
ggtactgtgc cacagcagag gcctttgcca gatctacaga ccagaccgtt ctagaagaat1260
tagcttccat taagaataga caaagaattc agaaattggt attagcagga agaatgggag1320
aagccattga aacaacacaa cagttatacc caagtttact tgaaagaaat cctaatctcc1380
ttttcacatt aaaagtgcgt cagtttatag aaatggtgaa tggtacagat agtgaagtac1440
gatgtttggg aggccgaagt ccaaagtctc aagacagtta tcctgttagt cctcgacctt1500
ttagtagtcc aagtatgagc cccagccatg gaatgaatat ccacaattta gcatcaggca1560
aaggaagcac cgcacatttt tcaggttttg aaagttgtag taatggtgta atatcaaata1620
aagcacatca atcatattgc catagtaata aacaccagtc atccaacttg aatgtaccag1680
aactaaacag tataaatatg tcaagatcac agcaagttaa taacttcacc agtaatgatg1740
tagacatgga aacagatcac tactccaatg gagttggaga aacttcatcc aatggtttcc1800
taaatggtag ctctaaacat gaccacgaaa tggaagattg tgacaccgaa atggaagttg1860
attcaagtca gttgagacgc cagttgtgtg gaggaagtca ggccgccata gaaagaatga1920
tccactttgg acgagagctg caagcaatga gtgaacagct aaggagagac tgtggcaaga1980
acactgcaaa caaaaaaatg ttgaaggatg cattcagtct actagcatat tcagatccct2040
ggaacagccc agttggaaat cagcttgacc cgattcagag agaacctgtg tgctcagctc2100
ttaacagtgc aatattagaa acccacaatc tgccaaagca acctccactt gccctagcaa2160
tgggacaggc cacacaatgt ctaggactga tggctcgatc aggaattgga tcctgcgcat2220
ttgccacagt ggaagactac ctacattagc tatgcatttc aagagctcac acttatattg2280
tggcatatag tcaacatgga agtagaccag ctctgctgat ttgaaattta gattttttaa2340
attatgtact ggggacaggt ttttgtcgct ttacattgct tcctagttta cagcatgatg2400
caaatgattt tctaacttag tgttaggaga aattattttc catctttaac ctcttagttg2460
tctaagagtt aaatattact gaatttcaga cgttcaaatt gatcatcaca aatcctttaa2520
aacaattacc taaaagaaac caaaaatcct gccttctttg tgggggaggg gggagagagg2580
ggaaggaaat ggaacaagtt gtgtttgtgt tagcatgtgg gtgatgtaaa cttcaaattg2640
ggagatgttc cgacccccac tcccatataa gcattcaatc agtgtaactt gcaaaatgca2700
taaacatccg acagtttgaa tttatagtgt tgatggaaga aatcattttt aatgtgtact2760
gtaaaacttg aaatactcag gagctgagtg aatatgtttg ttgctactta caatcccgac2820
ctgttagtcc cagtagtttt gttttaacat ggtctttttc aactttgttt cctgtttaac2880
tacagatgac ttctgttgta gactcacaag tttaactgtt gtattataac agtattacat2940
gtcaacggtg tggttatgac ctttatttat ataaaaacca aatatttagt caatttaccg3000
tgtcttaatt taatctttgt acaccttcca tttttaagtg cttaaatgag tactatattg3060
caataaaatg tagtgatata attaaccagc cattaaaaat ttacttctac agaaaaaaaa3120
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<210> 3
<211> 3132
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 3
gaagcagagg aggaaggaga gaagaggtgg aggtggccgc aggctgagtc gcggccggga 60
tgtccgggca gccgccgccg ccgccgccgc agcagcagca acagcagcag cagctgtcgc 120
cgccaccgcc ggcggccttg gccccagtct ccggagtcgt cctgccggcg cccccggccg 180
tcagcgccgg ctcttctccg gccggctcgc ccggcggcgg tgcgggcggc gaaggcttag 240
gggccgcggc ggccgccctg ctcctccacc ctccgccgcc gccgcccccg gccaccgcgg 300
ccccgccgcc cccgccgccg cccccgcctc cccctgcctc agcggctgcc cccgccagcg 360
ggccgcccgc tcccccgggc cttgcagcgg gccccggccc ggctggagga gccccgaccc 420
cagctctggt ggcgggcagc agcgccgcgg cccccttccc tcacggggac tcggccctga 480
acgagcagga gaaggagttg cagcggcggc tgaagcgtct ctacccggcc gtggacgaac 540
aagagacgcc gctgcctcgg tcctggagcc cgaaggacaa gttcagctac atcggcctct 600
ctcagaacaa cctgcgggtg cactacaaag gtcatggcaa aaccccaaaa gatgccgcgt 660
cagttcgagc cacgcatcca ataccagcag cctgtgggat tgattatttt gaagtaaaaa 720
ttgtcagtaa gggaagagat ggttacatgg gaattggtct ttctgctcaa ggtgtgaaca 780
tgaatagact accaggttgg gataagcatt catatggtta ccatggggat gatggacatt 840
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ttggctgttg tgttaatctt atcaacaata cctgctttta caccaagaat ggacatagtt 960
taggtattgc tttcactgac ctaccgccaa atttgtatcc tactgtgggg cttcaaacac1020
caggagaagt ggtcgatgcc aattttgggc aacatccttt cgtgtttgat atagaagact1080
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gatgtttggg aggccgaagt ccaaagtctc aagacagtta tcctgttagt cctcgacctt1500
ttagtagtcc aagtatgagc cccagccatg gaatgaatat ccacaattta gcatcaggca1560
aaggaagcac cgcacatttt tcaggttttg aaagttgtag taatggtgta atatcaaata1620
aagcacatca atcatattgc catagtaata aacaccagtc atccaacttg aatgtaccag1680
aactaaacag tataaatatg tcaagatcac agcaagttaa taacttcacc agtaatgatg1740
tagacatgga aacagatcac tactccaatg gagttggaga aacttcatcc aatggtttcc1800
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Claims (1)

1.一种RanBP9突变基因，其特征在于RanBP9基因第926位点的C核苷酸缺失即发生了c.926delC缺失突变，其核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。
CN201711177392.9A 2017-11-23 2017-11-23 926位点发生突变的RanBP9突变基因及其应用 Active CN107653248B (zh)

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Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105368840A (zh) * 2015-12-12 2016-03-02 西南大学 山羊RanBP9基因克隆及在精子中的定位检测方法

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Homo sapiens RAN binding protein 9 (RANBP9), mRNA;佚名;《GeneBank》;20171016;序列 *
Mouse RanBPM is a partner gene to a germline specific RNA helicase, mouse vasa homolog protein;N Shibata等;《Molecular Reproduction & Development》;20041231;第67卷(第1期);第1-7页 *
RAN-binding protein 9 is involved in alternative splicing and is critical for male germ cell development and male fertility;J Bao等;《Plos Genetics》;20141204;第10卷(第12期);e1004825 *
RanBPM protein acts as a negative regulator of BLT2 receptor to attenuate BLT2-mediated cell motility;JD Wei等;《Journal of Biological Chemistry》;20131231;第288卷(第37期);第26753-63页 *
山羊CD320和RanBP9分子遗传分析及功能鉴定;沈彦花;《中国优秀硕士学位论文全文数据库（电子期刊）》;20170215;D050-428 *
山羊RanBP9和CD320基因克隆、组织表达与多态性分析;赵博渊;《中国优秀硕士学位论文全文数据库（电子期刊）》;20140915;D050-47 *

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