CN110484623A - 一种rb1突变基因、引物、检测方法、试剂盒及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种RB1突变基因、引物、检测方法、试剂盒及应用。相较于传统生物标志物，本发明发现的基因突变位点稳定、微创、易于检测，将明显提高疾病诊断的敏感性和特异性。本发明所发现的RB1基因1号外显子c.116位点突变，可用于早期筛查视网膜母细胞瘤基因突变携带者，进而提供遗传咨询和优生优育指导；同时，也可用于开发诊断试剂盒，为视网膜细胞瘤患者提供分子诊断依据。本发明为视网膜母细胞瘤的发病机制研究奠定了重要基础，也为视网膜母细胞瘤患者的治疗提供可能的药物靶点。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学与生物技术领域，尤其涉及一种RB1突变基因、 引物、检测方法、试剂盒及应用。
背景技术
视网膜母细胞瘤(retinoblastoma，RB)起源于视网膜胚胎核层细胞， 是婴幼儿最常见的眼内恶性肿瘤，发病率为1：14000–20000。其临床表现 有白瞳症、知觉性斜视、眼红痛，角膜混浊和无菌性眼眶蜂窝织炎。由于 90％RB患儿在3岁以前发病，早期不易发现。虽然手术及放射疗法、化学 疗法等综合辅助治疗的进步可改善患者的预后，但全球范围内，特别是发 展中国家，RB的死亡率及继发肿瘤发生率仍然较高。有数据显示，中国 RB患儿的生存率仅为63％，远低于发达国家的95％。因此，做好RB的防 治工作具有重要意义。
已有的研究证明，视网膜母细胞瘤基因1(Retinoblastoma1,RB1)是人类 第一个分离克隆的抑癌基因，该基因突变与RB的发生密切相关。RB1基 因位于13号染色体长臂(13q14.1-q14.2)上，全长180kb，包括27个外显 子和26个内含子，编码产物是分子量为110kD的核磷酸蛋白pRb。pRb包 含N-末端结构域、A/B口袋结构域以及C-末端结构域。pRb蛋白可与E2F 家族转录因子结合，抑制G1向S期转换相关基因的转录，从而造成细胞周 期停滞。而且，pRb也可通过调节组织特异性转录因子来调节细胞分化， 维持细胞周期退出。而当RB1基因发生突变，pRb蛋白可出现功能障碍或 缺失，导致E2F的恒定活性和细胞周期的持续激发，促进肿瘤发展。另外， 根据RB1突变的遗传特点，可将RB分为以下三类：60％RB患者因非遗传 性体细胞突变而致病；30％具有新发生殖细胞突变，无家族史，但具有遗传性；其余10％携带家族性生殖细胞突变，存在阳性家族史。生殖细胞突变 者以常染色体显性方式遗传，外显率90％左右，这类患者发病年龄小，多 为双眼发病，RB复发或新发第二肿瘤的风险较高；体细胞突变者发病年龄 大,多为单眼发病，肿瘤复发或新发第二肿瘤的风险与常人一致。
因此，检测RB1基因突变具有重要临床意义。一方面，对可能存在RB 危险的婴幼儿进行基因检测，将有助于判断其危险性：对于携带致病基因 的患儿，应当定期行眼底检查，以期尽早诊断RB，保留眼球和有效视力。 相反，对于无致病基因的婴幼儿，可减少随诊频率，节约医疗资源和医疗 成本；另一方面，RB的基因诊断信息还可以运用于产前诊断和遗传咨询。 对携带或可能携带RB突变基因的妊娠妇女及配偶进行产前诊断，通过选择 性流产避免RB患儿的出生或早期临床诊断RB，进而改善出生人口质量及 提高患儿的生存率和生活质量。另外，检测RB1基因突变，可丰富基因谱， 加深对RB病变及耐药机制的认识，为抗RB个性化药物的研发提供新思路 和实验基础。尽管RB1基因检测对RB的早期诊断及遗传咨询具有重要意 义，但由于RB1基因突变类型各异，分布广泛，没有明确的突变热点，仍 存在着相当一部分未知致病基因位点。
因此，现有技术还有待于改进和发展。
发明内容
鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的是寻找与视网膜母细胞瘤相 关的高特异性的突变位点，并研制出可供临床应用的视网膜母细胞瘤辅助 诊断试剂盒，为视网膜母细胞瘤的筛查和诊断提供支持。
本发明的技术方案如下：
一种用于视网膜母细胞瘤辅助诊断的RB1突变基因，其中，所述RB1 突变基因与RB1正常基因序列相比有1号外显子c.116位点突变。
所述的RB1突变基因，其中，所述RB1突变基因与RB1正常基因序 列相比，1号外显子c.116位点突变为由C碱基变为A碱基。
一种检测RB1基因的突变位点的特异性测序引物，其中，所述特异性 测序引物的上游引物为5′-ccggtttttctcaggggacgttg-3′，所述特异性测序引物的 下游引物为5′-cgcccgccctacgcacac-3′。
一种用于检测RB1基因的突变位点的检测方法，其中，所述检测方法 包括以下步骤：
抽提基因组DNA；
使用PCR扩增特异性测序引物；
采用Sanger测序；
以及根据Sanger测序结果判断RB1基因是否发生突变；
其中，所述特异性测序引物的上游引物为5′-ccggtttttctcaggggacgttg-3′， 所述特异性测序引物的下游引物为5′-cgcccgccctacgcacac-3′。
所述的用于检测RB1基因的突变位点的检测方法，其中，采用通用方 法或试剂盒从外周血白细胞中提取基因组DNA。
所述的用于检测RB1基因的突变位点的检测方法，其中，所述抽提基 因组DNA的步骤还包括：对提取的基因组DNA进行去除蛋白质处理，然 后沉淀及洗涤基因组DNA。
所述的用于检测RB1基因的突变位点的检测方法，其中，所述PCR扩 增包括如下步骤：
预热；
扩增循环阶段；
微反应；
冷却。
一种诊断视网膜母细胞瘤的试剂盒，其中，所述试剂盒组分中含有检 测RB1基因1号外显子c.116位点突变的试剂，所述试剂中包含检测RB1 基因的突变位点的特异性测序引物，所述特异性测序引物的上游引物为 5′-ccggtttttctcaggggacgttg-3′，所述特异性测序引物的下游引物为 5′-cgcccgccctacgcacac-3′。
所述的试剂盒，其中，所述试剂还包括：模板DNA、缓冲液、MgCl2、 dNTP和Taq聚合酶。
一种RB1突变基因在制备视网膜母细胞瘤临床诊断产品中的应用，其 中，所述RB1突变基因具有1号外显子c.116位点突变。
有益效果：1、相较于传统生物标志物，本发明发现的基因突变位点稳 定、微创、易于检测，将明显提高疾病诊断的敏感性和特异性。2、本发明 所发现的RB1基因c.116位点突变，可用于早期筛查视网膜母细胞瘤基因突 变携带者，进而提供遗传咨询和优生优育指导；同时，也可用于开发诊断 试剂盒，为视网膜细胞瘤患者提供分子诊断依据。3、本发明为视网膜母细 胞瘤的发病机制研究奠定了重要基础，也为视网膜母细胞瘤患者的治疗提 供可能的药物靶点。
附图说明
图1为本发明实施例1中患儿母亲1号外显子测序结果图。
图2为本发明实施例1中患儿父亲1号外显子测序结果图。
图3为本发明实施例1中患儿妹妹1号外显子测序结果图。
图4为本发明实施例1中患儿舅舅1号外显子测序结果图。
具体实施方式
本发明提供一种RB1突变基因、引物、检测方法、试剂盒及应用，为 使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步 详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并 不用于限定本发明。
本发明提供一种用于视网膜母细胞瘤辅助诊断的RB1突变基因(即 RB1基因具有一新发突变)，所述RB1突变基因与RB1正常基因 (NM_000321.2)序列相比有1号外显子c.116位点突变。
进一步，所述RB1突变基因与RB1正常基因序列相比，1号外显子c.116 位点突变是C碱基发生颠换，具体由C碱基突变为A碱基，即c.116C>A (p.39Pro>Gln)。所述RB1突变基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示： atgccgccca aaaccccccg aaaaacggcc gccaccgccgccgctgccgc cgcggaaccc ccggcaccgc cgccgccgcc ccctcctgag gaggacccag agcaggacagcggcaggagg acctgcctct cgtcag。相应的RB1基因第39号密码子中间碱基发生突变，氨基酸由脯氨酸(Pro，简写p)突变为谷氨酰胺(Gln，简写q)，具体为：mppktprkta ataaaaaaeppapppppppe edpeq(突变前为p)dsgqe dlplvrlefe eteepdftal，即RB1 基因编码蛋白突变：p.39p(Pro)>q(Gln)。
本发明还提供一种检测RB1基因的突变位点的特异性测序引物，所述 特异性测序引物的上游引物为5′-ccggtttttctcaggggacgttg-3′，所述特异性测序 引物的下游引物为5′-cgcccgccctacgcacac-3′。可采用上述特异性测序引物检 前述的RB1突变基因。
本发明还提供一种用于检测RB1基因的突变位点的检测方法，所述检 测方法包括以下步骤：
抽提基因组DNA；
使用PCR扩增特异性测序引物；
采用Sanger测序；
以及根据Sanger测序结果判断RB1基因是否发生突变；
其中，所述特异性测序引物的上游引物为5′-ccggtttttctcaggggacgttg-3′， 所述特异性测序引物的下游引物为5′-cgcccgccctacgcacac-3′。
进一步，采用通用方法或试剂盒从外周血白细胞中提取基因组DNA。
进一步，所述抽提基因组DNA的步骤还包括：对提取的基因组DNA 进行去除蛋白质处理，然后沉淀及洗涤基因组DNA。
进一步，所述PCR扩增包括如下步骤：
预热；
扩增循环阶段；
微反应；
冷却。
需说明的是，本发明中对基因突变位点基因型的检测，可以采用其他 常规方法，如DNA测序、限制性酶切片段长度多态性(RFLP)、单链构象多 态性(SSCP)、等位基因特异的寡聚核苷酸杂交(ASO)等。
基因突变的筛选主要经历核酸提取，PCR扩增，sanger测序三个步骤， 其中从生物样品提取核酸样本和sanger测序的方法和设备，不受特别限制， 可以采用商品化的试剂盒进行。
本发明还提供一种诊断视网膜母细胞瘤的试剂盒，所述试剂盒组分中 含有检测RB1基因第1外显子的c.116C>A(p.39Pro>Gln)位点突变，所 述试剂中包含检测RB1基因的突变位点的特异性测序引物，所述特异性测 序引物的上游引物为5′-ccggtttttctcaggggacgttg-3′，所述特异性测序引物的下 游引物为5′-cgcccgccctacgcacac-3′。
进一步，所述试剂还包括：模板DNA、缓冲液、MgCl2、dNTP和Taq 聚合酶。
进一步，所述缓冲液为10×PCR buffer。
进而，所述试剂盒含有的操作说明书中描述有如下内容：如果RB1基 因第1外显子的c.116C>A(p.39Pro>Gln)位点发生点突变，则提示检测 对象为视网膜母细胞瘤的可能。
实施例1：
抽提制备一例临床诊断为视网膜母细胞瘤的患儿(已去世)父母、妹 妹及母亲哥哥的外周血基因组DNA，PCR扩增并进行Sanger测序检测获得 相关结果，测序过程遵循Sanger测序的标准操作，人工设计Sanger测序引 物，具体步骤为：
1、抽提基因组DNA。采用通用方法或试剂盒从外周血白细胞中提取 基因组DNA。
2、去除蛋白质，沉淀及洗涤DNA。
3、测量DNA的浓度和纯度：通常能得到20-50ng/μL DNA，纯度(紫 外260OD与280OD比值)在1.6-2.0。
4、PCR反应体系如表1所示(单位：μl)。
表1
| ddH<sub>2</sub>O | 4.7 |
| 10×PCR Buffer | 1 |
| MgCl<sub>2</sub> | 0.6 |
| dNTP | 0.8 |
| 上游引物 | 0.4 |
| 下游引物 | 0.4 |
| Taq酶 | 0.1 |
| DNA | 2 |
其中的上游引物和下游引物具体表2所示，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示：
表2
5、PCR反应程序：
预热：96℃热启动5min；
扩增循环阶段：96℃变性20sec，70℃褪火15sec和72℃延伸30sec， 变性、褪火和延伸共进行35个循环；
微反应：72℃反应7min；
冷却：10℃条件下冷却。
6、Sanger测序。
7、结果判定依据的权威数据库：使用UCSC网址(UCSC Genome Browser Homegenome.ucsc.edu)鉴定突变，使用Finch TV或Vector NTI软 件进行序列比较和分析。
8、Sanger测序结果的分析与处理：在患儿的父亲和母亲中均发现RB1 基因第1外显子的c.116位点C碱基发生颠换，由C碱基变为A碱基，患 儿妹妹及舅舅中未见突变。
9、密码子分析发现，患儿父母外显子1上的第39位密码子由CCG突 变为CAG，导致脯氨酸被谷氨酰胺代替，患儿妹妹及舅舅未见类似突变。
如图1所示，患儿母亲的RB1基因第1外显子的部分测序结果为： GACAGCGGCC(C/A)GGAGGACCTG。
如图2所示，患儿父亲的RB1基因第1外显子的部分测序结果为： GACAGCGGCC(C/A)GGAGGACCTG。
如图3所示，患儿妹妹的RB1基因第1外显子的部分测序结果为： GACAGCGGCC(C)GGAGGACCTG。
如图4所示，患儿舅舅的RB1基因第1外显子的部分测序结果为： GACAGCGGCC(C)GGAGGACCTG。
从上述结果可以看出，在患儿的母亲和父亲中均发现RB1基因第1外 显子的c.116位点C碱基发生颠换，由C碱基变为A碱基，患儿妹妹及舅 舅中未见突变。
本发明还提供一种RB1突变基因在制备视网膜母细胞瘤临床诊断产品 中的应用，其中，所述RB1突变基因具有1号外显子c.116C>A(p.39 Pro>Gln)位点突变。其中的临床诊断产品可以是试剂盒等。
本发明分离出了视网膜母细胞瘤患者直系亲属外周血DNA并研究了 其中的突变，并与正常DNA序列相对比(参照野生型RB1基因序列，NCBI 登录号为NM_000321.2)，寻找出了与视网膜母细胞瘤相关的高特异性的突 变位点，并研制出可供临床应用的视网膜母细胞瘤辅助诊断试剂盒，为视 网膜母细胞瘤的筛查和诊断提供了支持。
应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术 人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应 属于本发明所附权利要求的保护范围。
序列表
<110> 深圳市宝安区妇幼保健院
<120> 一种RB1突变基因、引物、检测方法、试剂盒及应用
<130> 无
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ccggtttttc tcaggggacg ttg 23
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cgcccgccct acgcacac 18
<210> 3
<211> 136
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atgccgccca aaaccccccg aaaaacggcc gccaccgccg ccgctgccgc cgcggaaccc 60
ccggcaccgc cgccgccgcc ccctcctgag gaggacccag agcaggacag cggcaggagg 120
acctgcctct cgtcag 136
Claims (10)
1.一种用于视网膜母细胞瘤辅助诊断的RB1突变基因，其特征在于，所述RB1突变基因与RB1正常基因序列相比有1号外显子c.116位点突变。
2.根据权利要求1所述的RB1突变基因，其特征在于，所述RB1突变基因与RB1正常基因序列相比，1号外显子c.116位点突变为由C碱基变为A碱基。
3.一种检测RB1基因的突变位点的特异性测序引物，其特征在于，所述特异性测序引物的上游引物为5′-ccggtttttctcaggggacgttg-3′，所述特异性测序引物的下游引物为5′-cgcccgccctacgcacac-3′。
4.一种用于检测RB1基因的突变位点的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括以下步骤：
抽提基因组DNA；
使用PCR扩增特异性测序引物；
采用Sanger测序；
以及根据Sanger测序结果判断RB1基因是否发生突变；
其中，所述特异性测序引物的上游引物为5′-ccggtttttctcaggggacgttg-3′，所述特异性测序引物的下游引物为5′-cgcccgccctacgcacac-3′。
5.根据权利要求4所述的用于检测RB1基因的突变位点的检测方法，其特征在于，采用通用方法或试剂盒从外周血白细胞中提取基因组DNA。
6.根据权利要求5所述的用于检测RB1基因的突变位点的检测方法，其特征在于，所述抽提基因组DNA的步骤还包括：对提取的基因组DNA进行去除蛋白质处理，然后沉淀及洗涤基因组DNA。
7.根据权利要求4所述的用于检测RB1基因的突变位点的检测方法，其特征在于，所述PCR扩增包括如下步骤：
预热；
扩增循环阶段；
微反应；
冷却。
8.一种诊断视网膜母细胞瘤的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒组分中含有检测RB1基因1号外显子c.116位点突变的试剂，所述试剂中包含检测RB1基因的突变位点的特异性测序引物，所述特异性测序引物的上游引物为5′-ccggtttttctcaggggacgttg-3′，所述特异性测序引物的下游引物为5′-cgcccgccctacgcacac-3′。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂还包括：模板DNA、缓冲液、MgCl2、dNTP和Taq聚合酶。
10.一种RB1突变基因在制备视网膜母细胞瘤临床诊断产品中的应用，其特征在于，所述RB1突变基因具有1号外显子c.116位点突变。
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