CN116083553A - Sftpa2突变及其应用与检测试剂盒 - Google Patents

Sftpa2突变及其应用与检测试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN116083553A
CN116083553A CN202210978078.5A CN202210978078A CN116083553A CN 116083553 A CN116083553 A CN 116083553A CN 202210978078 A CN202210978078 A CN 202210978078A CN 116083553 A CN116083553 A CN 116083553A
Authority
CN
China
Prior art keywords
sftpa2
mutation
interstitial lung
gene
site
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202210978078.5A
Other languages
English (en)
Inventor
柳律
罗红
覃洁莉
刘一洁
郭婷
范亮亮
彭红
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Second Xiangya Hospital of Central South University
Original Assignee
Second Xiangya Hospital of Central South University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Second Xiangya Hospital of Central South University filed Critical Second Xiangya Hospital of Central South University
Priority to CN202210978078.5A priority Critical patent/CN116083553A/zh
Publication of CN116083553A publication Critical patent/CN116083553A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及分子生物学和医学领域，尤其涉及SFTPA2突变及其应用与检测试剂盒。本发明提供了该变异位点，并提供了检测该突变位点的方法。此外，还提供该突变位点基因在间质性肺疾病的诊断和靶向治疗药物中的应用，并提供了相应的试剂盒，该试剂盒中包括了扩增该突变位点的特异性引物。本发明扩充了SFTPA2基因的突变谱，补充了中国人群间质性肺疾病致病基因信息，有利于该疾病的早期诊断和筛查。本发明中所述检测方法及试剂盒操作简单高效、设计清晰，易于推广，可用于快捷、准确地确定受试者是否患有间质性肺疾病或处于发生间质性肺疾病的风险中，有助于该疾病的预防和治疗，有较好的临床应用前景。

Description

SFTPA2突变及其应用与检测试剂盒
技术领域
本发明涉及分子生物学和医学领域，尤其涉及SFTPA2突变及其应用与检测试剂盒。
背景技术
特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)是间质性肺疾病的常见类型之一，以进行性发展的纤维化性间质性肺炎为主要特点，患者上可无典型临床表现或仅有非特异性的咳嗽、呼吸困难症状。其发病原因尚不十分明确，但目前研究显示其发生及进展与环境因素，如吸烟、粉尘接触等及遗传因素，如基因突变密切相关。目前已被鉴定的与IPF相关的致病基因主要分为两类，一是与表面活性剂蛋白相关基因，包括编码表面活性剂蛋白C基因(SFTPC)、表面活性剂蛋白A2基因(SFTPA2)、表面活性剂蛋白A1基因(SFTPA1)、和ATP结合盒基因3(ABCA3)，另一类是与端粒酶相关基因，主要包括编码端粒酶蛋白质的基因(TERT)、端粒酶RNA组件基因(TERC)、聚腺苷酸特异性核糖核酸酶(PARN)、端粒延长解旋酶调节因子1(RTEL1)，其他端粒相关基因，如假尿苷合成酶1基因(DKCl)、TERF1相互作用核因子2(TINF2)等亦有个案报道可导致IPF的发生。IPF的致病基因变异在各类间质性肺疾病患者中均有检出，在具有家族史的间质性肺疾病患者中，其检出率约30％左右，而在散发患者中，这一比例更低，这就意味着至少有70％的间质性肺疾病患者遗传致病因素不明。
呼吸衰竭定义为各种原因导致的肺通气/换气功能障碍，以致不能进行有效气体交换，导致缺氧伴/不伴二氧化碳潴留，从而引起一系列生理功能和代谢紊乱的临床综合征，造成呼吸衰竭的原因包括：肺部疾病，气道阻塞、肺血管栓塞、胸廓与胸膜疾病、心脏疾病、神经肌肉疾病。呼吸衰竭是一种疾病的终末状态，特发性肺纤维化及其他呼吸系统疾病进展到后期，肺部病变严重可导致呼吸衰竭，目前暂无针对呼吸衰竭的遗传学相关研究，而包括特发性肺纤维化在内的肺部疾患终末期，呼吸衰竭治疗效果差，费用高，需要临床及科研进一步关注。
肺结核：是一类感染性疾病，多由结核分枝杆菌感染肺部引起，其发生与机体免疫力下降相关。其诊断以结核中毒症状，发热、咳嗽、消瘦、盗汗、肺部影像学多形性改变、痰液中检测出结核杆菌抗酸染色阳性、培养出结核分枝杆菌为标准。目前尚无针对该类感染性疾病的遗传致病因素分析，既往有部分基因在肺结核患者中被鉴定出，但多是测序技术早期的实验认定，就目前研究而言，多不考虑遗传因素与肺结核发生相关。
对于包括特发性肺纤维化在内的间质性肺疾病而言，由于其起病隐匿，发现时往往已是疾病中后期，平均中位生存年限约2～5年，且缺乏有效治疗药物，而肺移植治疗费用昂贵且等候时间较长，患者往往在遇到合适的肺源之前就已经进展到严重的呼吸衰竭而无法耐受手术，造成不良的临床预后。如今，运用临床遗传学的方法来辅助早期诊断，已成为该病预防治疗措施的一种优良策略。因此，本领域也迫切需要深入研究包括间质性肺疾病在内的间质性肺疾病的其他遗传发病机制，寻找更多的致病基因及其致病突变位点，开发检测间质性肺疾病致病基因及其突变的方法、试剂盒，以及相关靶向治疗药物等。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供SFTPA2突变及其应用与检测试剂盒。
本发明提供了以SNP位点rs1375597489为标志物，在制备间质性肺疾病的诊断试剂中的应用。
SFTPA2基因转录本NM_001098668第6号外显子c.619位点存在A→T突变，该SNP位点的编号为：rs1375597489。
该基因位点发生A→T错义变异的基因型个体，因此该患者间质性肺疾病发病风险高于普通人群。其中相关研究结果显示，该基因的c.619A＞T位点在正常对照中主要表现为A，而一旦发生该A→T错义变异，可造成该蛋白发生氨基酸替换，造成SFTPA2蛋白结构及分子量改变，并造成SFTPA2蛋白产生异常结构蛋白沉积于内质网，从而导致II型肺泡上皮细胞内内质网应激，II型肺泡细胞凋亡，最终诱导间质性肺疾病的发生。
本发明所述的应用中，所述间质性肺疾病包括表现为弥漫性肺实质疾病、肺泡炎症和/或肺间质纤维化的一类疾病。
本发明提供了间质性肺疾病的诊断试剂盒，其包括能够检测权利要求1所述SNP位点rs1375597489的试剂。
本发明所述的诊断试剂盒中，包括PCR试剂、Southern印迹法试剂、DNA序列分析试剂和/或原位杂交突变方法检测试剂。
本发明所述的诊断试剂盒中，还包括提取核酸的试剂。本发明所述的诊断试剂盒中，包括上游引物和下游引物，所述上游引物具有如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列；所述下游引物具有如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。所述试剂盒还包括dNTP、聚合酶和提取核酸的试剂。
本发明还提供了一种检测SFTPA2基因是否突变的方法，所述方法包括使用所述的诊断试剂盒对待测物进行检测。
本发明提供了一种非诊断目的的检测SNP位点rs1375597489的方法，所述方法包括使用所述的诊断试剂盒对待测物进行检测。
本发明提供了检测样品是否存在SFTPA2基因NM_001098668第6号外显子c.619A＞T位点变异的方法，包括以下步骤：(1)通过特异性引物，扩增获得包含SFTPA2蛋白编码区NM_001098668第6号外显子c.619A＞T位点的区域，所述特异性引物序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示，扩增产物如SEQ ID NO.5所示；(2)扩增产物测序；(3)检测扩增产物中SFTPA2蛋白编码区NM_001098668第6号外显子c.619A＞T位点的基因型。
本发明所述的方法中，所述检测采用PCR法，具体为数字PCR法。其扩增体系包括：Taq DNA聚合酶、PCR Buffer(Tris-HCl，KCl，(NH4)2SO4，Mg SO4，吐温)、dNTP。添加患者DNA样本，扩增引物，ddH2O后构成完整PCR体系。
本发明所述的方法中，PCR的扩增的程序包括四个步骤：
步骤1：循环数1，95℃，10min；95℃，30s；
步骤2：循环数35，56.4℃，30s；72℃，1min；
步骤3：循环数1，72℃，5min；
步骤4：循环数1，4℃，∞。
本发明所述的检测SFTPA2基因是否突变的方法包括以诊断为目的的检测方法，或者非诊断目的的检测方法，其可为对样本本身进行检测，也可为对样本的子代基因型进行预测。本发明对此不做限定。当其为诊断目的的检测时，其待测物为静脉血，该方法可作为间质性肺疾病的辅助诊断方法。当其为非诊断目的的检测时，其待测物为来自实验室的样品或者核酸标准品。
本发明所述的预测基因SFTPA2热点突变间质性肺疾病的方法，即检测SFTPA2编码区NM_001098668第6号外显子c.619A＞T位点的基因型。该基因位点发生A→T错义变异的基因型个体，因此该患者间质性肺疾病发病风险高于普通人群。其中相关研究结果显示，该基因的c.619A＞T位点在正常对照中主要表现为A，而一旦发生该A→T错义变异，可造成该蛋白发生氨基酸替换，造成SFTPA2蛋白结构及分子量改变，并造成SFTPA2蛋白产生异常结构蛋白沉积于内质网，从而导致II型肺泡上皮细胞内内质网应激，II型肺泡细胞凋亡，最终诱导间质性肺疾病的发生。
本发明提供了一种检测SFTPA2基因是否突变的方法，所述方法包括使用所述的诊断试剂和所述的试剂盒对待测物进行检测。所述方法包括诊断目的的方法和非诊断目的的方法，本发明对此不做限定。诊断目的的方法包括在医院、诊所、检测机构等对待测物进行检测。若检测结果显示该基因突变，则说明该样品的患者患病；检测结果显示该基因未突变，则说明该样品的患者不患病。
非诊断目的的方法包括在高校、科研院所、研发机构等对待测物进行检测。
本发明提供了检测间质性肺炎的方法，所述方法包括使用所述的诊断试剂和所述的试剂盒对待测物进行检测。
本发明还提供了以所述SNP位点rs1375597489为靶点，在构建特发性肺纤维化模型中的应用。
本发明还提供了所述的突变的SFTPA2基因或所述的载体或所述的宿主细胞在制备间质性肺疾病模型中的应用。
所述间质性肺疾病模型包括细胞模型或动物模型。所述动物模型包括小鼠模型、大鼠模型、兔模型、猫模型、狗模型，黑猩猩模型和/或鸽模型。
本发明还提供了构建间质性肺疾病动物模型的试剂，其包括能够引起SFTPA2基因转录本NM001098668第6号外显子c.619发生A→T突变的试剂。
本发明还提供了构建间质性肺疾病模型的方法。该方法包括但不限于使用诱变或者基因编辑的形式使SFTPA2基因的编码区NM001098668第6号外显子c.619发生A＞T突变。所述诱变的方式包括但不限于物理诱变、化学诱变或生物诱变，本发明对此不做限定。所述基因编辑的方式包括但不限于同源重组技术、锌指核酸酶(ZFN)法、转录激活子样效应因子核酸酶(TALEN)法或者CRISPR技术，本发明对此亦不做限定。
本发明公开了一个与中国人群间质性肺疾病致病相关的SFTPA2基因的热点变异位点，并提供了一个检测上述间质性肺疾病致病基因SFTPA2转录本NM_001098668第6号外显子c.619A＞T/p.Asn207Tyr变异位点的方法。此外，本发明还公开了SFTPA2转录本NM_001098668第6号外显子c.619A＞T/p.Asn207Tyr变异位点基因变异检测在间质性肺疾病的诊断和靶向治疗药物中的应用，并提供了相应的试剂盒，该试剂盒中包括了扩增包含SFTPA2转录本NM_001098668第6号外显子编码区c.619位点的区域的特异性引物。本发明在一定程度上扩充了SFTPA2基因的突变谱，补充了中国人群间质性肺疾病致病基因信息的缺乏，有利于间质性肺疾病的早期诊断和筛查。同时，本发明中关于所述变异位点基因型检测的方法及其试剂盒操作简单高效、设计清晰明了、易于推广、可用于快捷、准确、高效地确定受试者是否患有间质性肺疾病或处于发展间质性肺疾病的风险中，将有助于包括间质性肺疾病在内的肺疾病的预防和治疗，有较好的临床应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图：
图1示利用本发明所述特异性引物进行PCR扩增后所得产物的测序结果截图；其中图1中的A为正常对照组的正向测序图，图1中的B为间质性肺疾病患者组的正向测序图，图1中的C为同一间质性肺疾病患者的相同位点反向测序图，箭头标示为突变位点所在位置；
图2示正常SFTPA2蛋白与发生了所述SFTPA2转录本NM_001098668第6号外显子c.619A＞T突变后的突变体蛋白结构示意图；图中可见突变发生后氨基酸序列改变，该变异位点在各物种间高度保守；CLECT集合体，包含钙离子结合区域1、钙离子结合区域3及碳水化合物识别区域；Normal：野生型SFTPA2蛋白结构，Mutation：SFTPA2转录本NM_001098668第6号外显子c.619A＞T突变后蛋白结构改变预测图，变异后使得SP-A蛋白上氨基酸的替换，形成了一个苯环结构；
图3中的(a)示：SFTPA2(NM_001098668c.619A＞T/p.N207Y)变异导致细胞内SFTPA2蛋白表达差异；图3中的(b)示：qPCR证实SFTPA2(NM_001098668c.619A＞T/p.N207Y)变异导致内质网应激相关蛋白表达增加；图3中的(c)示：Western-blot证实SFTPA2(NM_001098668c.619A＞T/p.N207Y)变异导致内质网应激相关蛋白表达增加；N：正常M：突变(N207Y)；*p＜0.05，**p＜0.01；
图4示间质性肺疾病患者家系图：正方形表示男，圆形表示女，黑色填充表示为特发性肺纤维化确诊患者，灰色填充为有呼吸衰竭病史患者，蓝色填充表示肺结核患者，斜线表示已逝。
具体实施方式
本发明提供了SFTPA2突变及其应用与检测试剂盒。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
在本方案进行的特发性肺纤维化致病位点SFTPA2(NM_001098668c.619A＞T/p.N207Y)的鉴定，是通过一个特发性肺纤维化家系的全外显子测序鉴定到，通过软件预测及细胞功能实验确定其致病性。进而通过对中国人群135名特发性肺纤维化患者的测序，鉴定到N207Y位点的检出率为8.2％。该发生率明显高于特发性肺纤维化致病基因罕见致病位点的检出率(＜0.001，通过1000G数据库及Exac数据库查询)，考虑为中国人群特发性肺纤维化的热点变异位点，对开发特发性肺纤维化靶向药物具有特殊意义。
本发明提供了突变的SFTPA2基因，其中SFTPA2基因转录本NM_001098668第6号外显子c.619位点的A→T突变。该SNP位点的rs编号为：1375597489。该变异位点造成的蛋白质改变为p.Asn207Tyr。该基因的c.619A＞T位点在正常对照中主要表现为A，而一旦发生该A→T错义变异，可造成该蛋白发生氨基酸替换，造成SFTPA2蛋白结构及分子量改变，并造成SFTPA2蛋白产生异常结构蛋白沉积于内质网，从而导致II型肺泡上皮细胞内内质网应激，II型肺泡细胞凋亡，最终诱导间质性肺疾病的发生。
本研究中特发性肺纤维化致病位点SFTPA2：(NM_001098668c.619A＞T/p.N207Y)的鉴定，是通过对特发性肺纤维化这一特定疾病患者群体，进行全外显子测序，从特发性肺纤维化家系测序及功能学研究确定该位点的致病性，在通过特发性肺纤维化群体测序确定该位点的发生率。该位点在千人组测序(1000G)、欧洲人群数据(ESP6500)及本地人群数据中未被检出，因此被认定为特发性肺纤维化相关。
与大多数其它SFTPA2基因已公开的错义点突变位点相比，本发明公开的所述SFTPA2基因NM_001098668第6号外显子c.619A＞Tp.Asn207Tyr的变异位点在一项中国人群间质性肺疾病患者的致病因素探寻中被确认为热点变异，其发生频率约为8.2％，这表明在中国人群间质性肺疾病患者中，有SFTPA2c.619A＞T/p.Asn207Tyr突变的比例高于其他罕见突变。该变异通过编码形成分子结构异常的蛋白，导致蛋白异常沉积导致内质网应激，从而介导II型肺泡上皮细胞凋亡，进而导致间质性肺疾病的发生。
该突变位点的确定，是通过全外显子测序的方法，对一个三代特发性肺纤维化患者家系中2名患者及1名正常对照者进行检测后进行关联分析，最终发现SFTPA2(NM_001098668c.619A＞T/p.N207Y)突变是该家系的遗传致病因素并通过Sanger测序进行共分离验证。后续在一项针对中国人群间质性肺疾病患者的研究中显示，在一个家族性肺纤维化家系中，检测出SFTPA2(NM_001098668c.619A＞T/p.N207Y)并通过共分离验证确认。同时，在135名散发IPF患者中进行SFTPA2(NM_001098668c.619A＞T/p.N207Y)突变检测，其检出率约8.2％。同时，该突变位点通过网站致病性预测、分子结构预测及细胞实验证实了其致病性。这一突变位点SFTPA2(NM_001098668c.619A＞T/p.N207Y)突变的检出率明显高于其他罕见突变的检出率(总体间质性肺疾病患者罕见突变检出率：TERT 8％，RTEL1 10％，SFTPC 3％，SFTPA21％，SFTPA1＜1％，单个突变变异位点检出率＜0.001)。这表明在中国人群的间质性肺疾病患者中，SFTPA2(NM_001098668c.619A＞T/p.N207Y)突变位点是一个热点突变位点，即：有较高比例的间质性肺疾病患者是由于发生该突变所造成的。在这11例患者中，3人被诊断为特发性肺纤维化，2人被诊断为特发性间质性肺炎(未分型)，2人被诊断为CTD-ILD(结缔组织疾病相关肺间质病变)，2人被诊断为IPAF(具有自身免疫特性的间质性肺炎)，1人诊断肺间质疾病合并肺部肿瘤，1人被诊断为特发性胸膜肺弹力纤维增生症；1人具有家族史，其肺部影像学表现各不相同，从双肺弥漫分布到局限分布于下肺胸膜下；从磨玻璃样改变(NSIP型)到典型蜂窝影改变(UIP型)。间质性肺疾病在临床上具有诊断困难，鉴别诊断多，治疗方案不同，治疗效果不同等特点。通过全外显子测序的方法，鉴定出不同临床表现的同一类型疾病的共同致病因素，为快捷、简单的诊断疾病提供了有效的手段，同时，以间质性肺疾病热点遗传致病基因位点为基础，设计突变位点特异性靶向药物左右位点，为间质性肺疾病的个体化精准治疗提供分子理论依据，可能是后期间质性肺疾病临床-基础研究要点。
所述全外显子测序的方法的具体步骤包括：(1)提取样本的外周血全基因组DNA；(2)通过特异性引物，扩增获得包含SFTPA2编码区NM_001098668第6号外显子c.619A＞T位点的区域，所述特异性引物序列如SEQ ID NO.3和4所示，扩增产物如SEQ ID NO.5所示；(3)扩增产物测序；(4)对产物中所述变异位点进行基因型分析。
所述方法中涉及的抽提外周血全基因组DNA、扩增、测序等技术均可采用本领域的常规操作方法。
相关性：SFTPA2基因是特发性肺纤维化已知致病基因，于2009年被鉴定(Am J HumGenet.2009Jan；84(1)：52-9)并通过后续一系列的研究证实。前期研究成果中证实SFTPA2(NM_001098668c.619A＞T/p.N207Y)变异会导致SFTPA2蛋白表达下降，细胞内内质网应激相关蛋白表达增加，而内质网应激是SFTPA2变异导致特发性肺纤维化的已知的可能的发病机制。
所述SEQ ID NO.1的序列为：AGTCCATCACTTTTGATGCCATTCAGGAGGCATGTGCCAGAGCAGGCGGCCGCATTGCTGTCCCAAGGAATCCAGAGGAAAATGAGGCCATTGCAAGCTTCGTGAAGAAGTACAACACATATGCCTATGTAGGCCTGACTGAGGGTCCCAGCCCTGGAGACTTCCGCTACTCAGATGGGACCCCTGTAAACTACACCAACTGGTACCGAGGGGAGCCTGCAGGTCGGGGAAAAGAGCAGTGTGTGGAGATGTACACAGATGGGCAGTGGAATGACAGGAACTGCCTGTACTCCCGACTGACCATCTGTGAGTTCTGAGAGGCATTTAGGCCATGGGACAGGGAGGATCCTGTCTGGCCTTCAGTTTCCATCCCCAGGATCCACTTGGTCTGTGAGATGCTAGAACTCCCTTTCAACAGAATTCACTTGTGGCTATTAGAGCTGGAGGCACCCTTAGCCACTTCATTCCCCTGATGGGCCCTGACTCTTCCCCATAATCACTGACCAGCCTTGACACTCCCCTTGCAAACCATCCCAGCACTGCACCCCAGGCAGCCACTCCTAGCCTTGGCCTTTGGCATGAGATGGAGGCCTCCTTATTCCCCATCTGGTCCAGTTCCTTCACTTACAGATGGCAGCAGTGAGGCCTTGGGGTAGAAGGATCCTCCAAAGTCACACAGAGTGCCTGCCTCCTGGTCCCCTCAGCTCTGCCTCTGCAGCCCACTGCCTGCCCAGTGCCATCAGGATGAGCAGTACCGGCCAAGCATAATGACAGAGAGAGGCAGATTTCAGGGAAGCCCTGACTGTGTGGAGCTAAGGACACAGTGGAGATTCTCTGGCACTCTGAGGTCTCTGTGGCAGGCCTGGTCAGGCTCTCCAGGTGGTCAGAGGGCCCAGTGGTGCCCCAGCACGGTGGTGCCCAAGCCAACCCTGTGACTGACATGTACGATTCACTCCTTTGAGTCTTTGGATGCCAACTCAGCCCCCTGACCTGGAGGCAGCCGGCCAAGGCCTCTAGGGAAGAGCCCCCCACTGCAGACATGACCCGAGTAACTTTCTGCTGATGAACAAATCTGCACCCCACTTCAGACCTCGGTGGGCATTCACACCACCCCCCATGCCACCGGCTCCACTTTCCCCTTTTATTAATACATTCACCCAGATAATCATTAAAATTAACATGTGCCAGGTCTTAGGATGTGTCTTGGGGTGGGCACAGTACCCGGTGACTCTTGGGGATATTTATTTATTTTCCCTGAGCCTATATCTTCATCTGTGAAATGGGGATAAAAATACTTGTTGCTGTCACAATTATTACCATCTCTCCAGCTAGCAAAATTACTACCAGAGCCGTTACTACACACAAAGGCTATTGACCGAGCACATACCATGTGCCACACACCTTGACAAAATCTTTTAATACAGTTTATTATGTACTATTCAATCTTTACACAATGTCACGGGACCAGTATTGTTTACCCAATTTTTTATAAGGACACTGAAGCTTAGAGGAGTGAAATGTTTTGAGTGTTATTTCAGAGAGCAAATGGCAAAGACTGGATCCAAACCCATCTTCCTGGACCTGAAGTTCATGCTCCCAGCCACCCCACCCCTGAGCTGAATAAAAGATGATTTAAGCATAATAAATCGTTAGTGTGTTCACATGAGTTTCCATA
所述SEQ ID NO.2的序列为：LeuSerLeuGlnGlySerIleMetThrValGlyGluLysValPheSerSerAsnGlyGlnSerIleThrPheAspAlaIleGlnGluAlaCysAlaArgAlaGlyGlyArgIleAlaValProArgAsnProGluGluAsnGluAlaIleAlaSerPheValLysLysTyrAsnThrTyrAlaTyrValGlyLeuThrGluGlyProSerProGlyAspPheArgTyrSerAspGlyThrProValAsnTyrThrAsnTrpTyrArgGlyGluProAlaGlyArgGlyLysGluGlnCysValGluMetTyrThrAspGlyGlnTrpAsnAspArgAsnCysLeuTyrSerArgLeuThtIleCysGluPhe
所述SEQ ID NO.3的序列为：GAGGTGGCTTAGAGACAAAGTG
所述SEQ ID NO.4的序列为：CTAGCATCTCACAGACCAAGTG
所述SEQ ID NO.5的序列为：GTCAGTGGCCTGACCTGGACTCCTCTGCTCTCAGCCCTCAGTCTGCAGGGCTCCATAATGACAGTAGGAGAGAAGGTCTTCTCCAGCAATGGGCAGTCCATCACTTTTGATGCCATTCAGGAGGCATGTGCCAGAGCAGGCGGCCGCATTGCTGTCCCAAGGAATCCAGAGGAAAATGAGGCCATTGCAAGCTTCGTGAAGAAGTACAACACATATGCCTATGTAGGCCTGACTGAGGGTCCCAGCCCTGGAGACTTCCGCTACTCAGATGGGACCCCTGTAAACTACACCAACTGGTACCGAGGGGAGCCTGCAGGTCGGGGAAAAGAGCAGTGTGTGGAGATGTACACAGATGGGCAGTGGAATGACAGGAACTGCCTGTACTCCCGACTGACCATCTGTG
下列实施例中所用到的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1原发性间质性肺疾病相关基因筛查
研究对象：严格根据临床诊断确诊的一个特发性肺纤维化家系；135例散发间质性肺疾病患者和当地正常对照组200例；收集相应的临床资料及静脉血5mL。
具体实施步骤如下：
(1)操作步骤
当进行实验时，先将采血管上下颠倒摇匀，并从中取出600μL，随后使用QIAGEN公司DNA提取试剂盒(69504)，按照说明书进行如下的操作：
①在1.5mL的离心管中加入20μL的蛋白酶K，随后再加入600μL的外周血，混匀；
②加入200μL的AL Buffer，震荡混匀，随后放入56℃的水浴锅中进行15分钟的水浴；
③结束水浴，往管子中加入400μL的无水乙醇，震荡混匀；
④将混匀后的液体转移到DNeasy Mini吸附柱中，以12,000rpm在离心机中离心1min；
⑤丢弃收集管及其中的废液，换上新的收集管。往吸附柱中加入500λL AW1洗液，再次以12,000rpm在离心机中离心1min；
⑥丢弃收集管及其中的废液，换上新的收集管。往吸附柱中加入500μL AW2洗液，以14,000rpm在离心机中离心3min；
⑦弃掉收集管中的废液，加入100μL DNAAE洗脱液至吸附柱中，静置5min，以12,000rpm在离心机中离心1min；
⑧保存收集管中的液体即为样品的全基因组DNA溶液，并置于-20℃长期保存。
随后使用紫外可见分光光度计NanoDrop ND1000来测定提取后的DNA溶液浓度，步骤如下：①先使用2μL纯净水(ddH2O)清洗分光光度计的探头；②用NanoDrop软件，选择核酸测量(Nucleic acid Measure)模式，同时往探头上滴入2μL AE Buffer，盖上仪器，选择BLANK；③成功将数值调零后，打开探头，用无尘纸擦去探头上的液体，随后滴入2μL已混匀的样品全基因组DNA溶液，点击软件上的Measure按钮，开始进行测量；④关注测量后显示的浓度以及A260/A280的值。浓度表示的是该DNA样品的DNA测量浓度(一般以ng/μL为单位)，A260/A280表示该样品的纯净度，比值大于等于1.8则表明该样品核酸样品较为纯净，杂质较少。
随后运用PCR扩增及Sanger测序法对SFTPA2蛋白编码区NM001098668第6号外显子c.619A＞T位点进行检测，步骤如下：
①建立PCR反应体系(25μL体系)，其中的引物序列为所述特异性引物，序列如SEQID NO.3和SEQ ID NO.4所示：反应体系如下：
试剂 用量
2X Power Taq PCR MasterMix 12.5λl
PCR上游特异性引物 0.5μl
PCR下游特异性引物 0.5μl
gDNA模板 0.5μl
<![CDATA[ddH<sub>2</sub>O]]> 11μl
②建立PCR反应程序：程序如下
步骤 循环数 温度 时间
Step 1 1 95℃ 10min
95℃ 30s
Step 2 35 56.4℃ 30s
72℃ 1min
Step 3 1 72℃ 5min
Step 4 1 4℃ ∞
③将PCR扩增后产物进行Sanger测序，分析所述位点基因型。
结果发现：在一个特发性肺纤维化家系中，临床确诊的间质性肺疾病患者中发现SFTPA2基因转录本NM_001098668第6号外显子编码区c.619位点发生了A→T的杂合错义突变，并通过共分离验证该突变位点的致病性。进一步在135名中国人群散发间质性肺疾病患者中进行检测，发现有11例患者中存在SFTPA2c.619A＞T/p.N207Y变异。与大多数其它SFTPA2基因已公开的错义点突变位点相比，本发明公开的所述SFTPA2基因NM_001098668第6号外显子c.619A＞T/p.N207Y的变异位点的检出率高，该突变存在可造成SFTPA2蛋白的碳水化合物结合区域高度保守性改变，从而导致SFTPA2蛋白结构异常，严重影响该蛋白的功能发挥，异常沉积导致II型肺泡上皮细胞内内质网应激、异常细胞凋亡，进而导致间质性肺疾病的发生。具体结果见图1～2。
从图1和图2中可见，原本在正常对照组中的c.619A＞T位点A碱基在间质性肺疾病患者中发生了杂合错义突变，从而导致后续蛋白改变。
图2为正常SFTPA2蛋白与发生了所述SFTPA2转录本NM_001098668第6号外显子c.619A＞T/p.N207Y突变后的突变体蛋白结构示意图。图中可见突变发生后SFTPA2蛋白CLECT集合体区域结构改变，主要表现为其中碳水化合物识别区域改变，该碳水化合物识别区域在各个物种间高度保守。
图4中，家系成员下方字母为利用本发明所述特异性引物进行PCR扩增后所得产物测序得到的SFTPA2基因NM_001098668第6号外显子c.619A＞T位点的基因型，可见该家系的患病成员，所述SFTPA2基因NM_001098668第6号外显子c.619位点均为c.619A＞T/p.N207Y突变。
下表为家系成员的具体信息总结，包括性别、年龄、主要症状及最终诊断。
成员编码 性别 年龄 症状 诊断
I-1 男 62(已故) 咳嗽、呼吸困难 因呼吸衰竭死亡
II-3 男 50(已故) 咳嗽、呼吸困难 因呼吸衰竭死亡
II-4 男 63 咳嗽、呼吸困难 特发性肺纤维化
II-5 男 37(已故) 呼吸困难 特发性肺纤维化
II-6 男 58(已故) 咯血 肺结核
II-7 女 56 咳嗽、呼吸困难 特发性肺纤维化
III-2 男 45 咳嗽 肺部疾患，诊断不明
实施例2
1、步骤举例：
编号9：48岁女性，因“呼吸困难3月”就诊。患者否认粉尘接触史，否认吸烟史及家族史。结缔组织相关检查均正常，肺功能提示中度限制性通气功能障碍。诊断为：特发性肺纤维化。
患者签署知情同意文件，抽取外周血样本2ml，提取DNA(浓度＞30ng/ml，A260/280＞1.80)送全外显子测序(Ilumina，深度大于100％)，将测序结果与目前特发性肺纤维化已知致病基因进行比对，得到可以初步筛查致病变异。
将以上致病变异进行筛查，通过1000G、Exac数据库检出率(＜0.05)；是否发生氨基酸改变(排除silent)；及变异网站致病性预测(Mutationtaster、SIFT、PolyPhen2等)，筛选出致病变异。
dbSNPv151_GRCh37 SIFT Polyphen2 MutationTaster Chr Start End Ref Obs
rs1375597489 0.002(D) 0.996(D) 0.98636，0.98636(D，D) chr10 81317093 81317093 T A
对得到该变异的患者，进行临床资料归纳总结。
下表为对中国人群，135名散发间质性肺疾病进行Sanger测序的患者中，检查出SFTPA2转录本NM_001098668第6号外显子c.619A＞T/p.Asn207Tyr变异位点的11名患者的个人信息资料表：
编码 性别 发病年龄 症状 吸烟史 诊断
1 女 65 咳嗽、呼吸困难 无 干燥综合征继发肺间质病变
2 女 70 咳嗽、呼吸困难 无 自身免疫特征性间质性肺炎
3 女 65 咳嗽、呼吸困难 无 双肺间质性病变
4 女 48 呼吸困难 无 特发性间质性肺炎(未分型)
5 女 63 咳嗽 无 自身免疫特征性间质性肺炎
6 女 67 咳嗽、呼吸困难 无 特发性胸膜肺弹力纤维增生症
7 女 74 咳嗽、呼吸困难 无 干燥综合征继发肺间质病变
8 女 48 呼吸困难 无 特发性肺纤维化
9 男 62 咳嗽 有 特发性肺纤维化
10 男 59 咳嗽、呼吸困难 有 特发性间质性肺炎(未分型)
11 女 80 咳嗽 无 特发性肺纤维化伴感染
中国人群散发间质性肺疾病患者中，检测出SFTPA2(NM_001098668c.619A＞T/p.N207Y)变异位点的11名患者的影像学资料表如下。
目前已被证实SFTPA2是特发性肺纤维化(间质性肺疾病特殊类型)的致病基因，我们通过细胞功能研究证实c.619A＞T/p.Asn207Tyr的致病性，但SFTPA2基因的致病符合常染色体显性遗传但存在不完全外显率，按照现行标准，该变异携带者不一定发生肺间质病变，但如肺间质病变患者中检出该变异，考虑与该变异相关。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (9)

1.以SNP位点rs1375597489为标志物，在制备间质性肺疾病的诊断试剂中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述间质性肺疾病包括影像学表现为弥漫性肺实质疾病、肺泡炎症和/或肺间质纤维化的一类疾病。
3.间质性肺疾病的诊断试剂盒，其特征在于，包括能够检测权利要求1所述SNP位点rs1375597489的试剂。
4.根据权利要求3所述的诊断试剂盒，其特征在于，所述诊断试剂盒包括上游引物和下游引物，所述上游引物具有如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列；所述下游引物具有如SEQ IDNO.4所示的核苷酸序列。
5.一种非诊断目的的检测SNP位点rs1375597489的方法，其特征在于，所述方法包括使用权利要求3或4所述的诊断试剂盒对待测物进行检测。
6.以权利要求1所述SNP位点rs1375597489为靶点，在构建特发性肺纤维化模型中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述特发性肺纤维化模型包括细胞模型和动物模型。
8.构建间质性肺疾病动物模型的试剂，其特征在于，包括能够引起rs1375597489位点突变的试剂，所述rs1375597489位点突变包括使SFTPA2基因转录本NM_001098668第6号外显子c.619位点发生A→T突变。
9.间质性肺疾病模型的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括使动物和/或细胞的SFTPA2基因转录本NM_001098668第6号外显子c.619位点发生A→T突变。
CN202210978078.5A 2022-08-15 2022-08-15 Sftpa2突变及其应用与检测试剂盒 Pending CN116083553A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210978078.5A CN116083553A (zh) 2022-08-15 2022-08-15 Sftpa2突变及其应用与检测试剂盒

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210978078.5A CN116083553A (zh) 2022-08-15 2022-08-15 Sftpa2突变及其应用与检测试剂盒

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116083553A true CN116083553A (zh) 2023-05-09

Family

ID=86210851

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210978078.5A Pending CN116083553A (zh) 2022-08-15 2022-08-15 Sftpa2突变及其应用与检测试剂盒

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN116083553A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2023142619A1 (zh) 一种扩张型心肌病基因检测标志物及其应用
CN107557461B (zh) 一种用于肝癌易感基因早筛的核酸质谱的检测方法
CN114703278A (zh) 一种肌萎缩侧索硬化致病基因、检测试剂盒及引物组
WO2017107545A1 (zh) Scap基因突变体及其应用
CN104745592B (zh) Cyp4v2基因突变体及其应用
CN115786356B (zh) 致心律失常右室发育不良心肌病变异基因cdh2及其应用
CN109457031B (zh) BRCA2基因g.32338309A＞G突变体及其在乳腺癌辅助诊断中的应用
CN113584156B (zh) 一种HCN4突变基因及突变体、以及Brugada综合征检测试剂盒
CN116004642A (zh) 长qt综合征变异基因kcnh2及其应用
CN116083553A (zh) Sftpa2突变及其应用与检测试剂盒
CN110511992B (zh) 一种tardbp突变基因、检测引物和试剂盒
CN108342404A (zh) Inpp5e基因突变体及其应用
CN115948533B (zh) 一种用于检测mybpc3突变基因的试剂及其应用
CN115927354B (zh) 一种sh3tc2基因致病突变体及其在制备腓骨肌萎缩症4c型诊断试剂盒中的应用
CN113637739B (zh) 一种SCN5A突变基因、应用以及Brugada综合征检测试剂盒
CN108251519B (zh) 轴前多指病的致病基因及其用途
CN110205322B (zh) 一种乳腺癌致病基因sec63的突变snp位点及其应用
CN116200395A (zh) 长qt综合征kcnq1变异基因及其应用
CN116410983A (zh) 扩张型心肌病变异基因rbm20及其应用
CN115851750A (zh) 扩张型心肌病变异基因及其应用
CN116023465A (zh) 致心律失常右室发育不良心肌病变异基因dsp及其应用
CN117867097A (zh) 检测THRβ基因突变情况的引物及其试剂盒
CN115725715A (zh) 用于检测mybpc3突变基因的试剂在制备肥厚型心肌病试剂盒的应用
CN115806997A (zh) 扩张型心肌病变异基因lama4及其应用
CN115976034A (zh) 致心律失常右室发育不良心肌病dsp变异基因及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination