CN115851750A - 扩张型心肌病变异基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因检测技术领域，具体涉及了一种扩张型心肌病变异基因，与野生型TTN基因的参考序列SEQ ID NO:5相比，所述变异基因第51731至51750位的碱基缺失，核苷酸序列为SEQ ID NO:1。本发明还涉及上述扩张型心肌病变异基因在制备检测试剂盒中的应用。本发明提供的扩张型心肌病变异基因可以作为临床辅助诊断的生物标志物；检测该变异的携带者，为受试者提供优生优育指导和遗传咨询，减少患儿出生，对扩张型心肌病的早期诊断，或者辅助临床判断具有重要意义。

Description

扩张型心肌病变异基因及其应用

技术领域

本发明涉及基因检测技术领域，尤其涉及扩张型心肌病变异基因及其应用。

背景技术

扩张型心肌病(dilated cardiomyopathy,DCM)是引起心力衰竭和心源性猝死的重要原因之一，也是患者进行心脏移植的最常见指征，发病率约为1:2500扩张型心肌病患者起病多隐匿，容易错失治疗良机。出现症状时，往往已到疾病晚期，表现为心力衰竭、心律失常和/或传导系统疾病，或是血栓栓塞性疾病。诊断依据为左心室扩张，同时伴有收缩功能障碍(射血分数＜50％),常通过胸超声心动扫描术的方法进行诊断。扩张型心肌病病因复杂，包括心肌缺血、遗传、感染、炎症、长期严重高血压、辐射、毒素(如蔥环类)等，其中遗传因素占有很重要的地位。现有研究显示，多达40％的扩张型心肌病是由遗传因素所导致。多为常染色体显性遗传，但也有常染色体隐性遗传、X染色体隐性遗传以及线粒体基因突变导致的母系遗传方式。

扩张型心肌病相关致病基因TTN编码肌联蛋白，主要表达于心肌和骨骼肌，该肌联蛋白分子量大，长度跨越肌节的1/2，是一种重要的结构蛋白。

根据患者意愿对疑似病例进行相关基因检测有助于扩张型心肌病的早期诊断及临床干预，以达到延缓疾病发生或预防疾病的目的。从分子水平揭示与TTN基因相关的扩张型心肌病的发病机制，能够扩张型心肌病的临床治疗提供理论依据，但是目前仍存在大量未知的TTN基因突变位点，进一步发现新的TTN基因的突变位点将有助于进一步研究扩张型心肌病，对扩张型心肌病的早期诊断，或者辅助临床判断具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于针对上述缺陷，提供扩张型心肌病变异基因及其应用。

本发明目的在于提供：扩张型心肌病变异基因，与野生型TTN基因的参考序列SEQID NO:5相比，所述变异基因第51731至51750位的碱基缺失，核苷酸序列为SEQ ID NO:1；与野生型TTN基因编码蛋白的氨基酸序列SEQ ID NO:6相比，所述变异基因编码蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:2。

本发明经过大量试验、研究和分析成功地筛选出变异基因，并利用变异基因开发出能够用于快速、灵敏、有效的检测变异基因的检测试剂盒。变异基因具体信息见下表：

表1.变异基因

基因	基因组位置	转录本号	碱基改变	氨基酸改变	参考基因组版本
						TTN	chr2:179431914	NM_003319	c.51731_51750del	p.Ser17244TrpfsTer3	GRCh37/hg19

本发明还提供上述扩张型心肌病变异基因在制备检测试剂盒中的应用，所述检测试剂盒包括用于扩增变异基因的引物，引物的序列为SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4。

优选地，所述扩张型心肌病试剂盒还包括PCR预混液、阴性对照试剂和阳性对照试剂。

本发明有益效果在于：本发明公开的变异基因可以作为临床辅助诊断扩张型心肌病的生物标志物，对扩张型心肌病的早期诊断，或者辅助临床判断具有重要意义；基于变异基因的试剂开发的试剂盒，能够将携带TTN c.51731_51750del杂合错义突变的患者和正常人群区分开，为受试者提供优生优育指导和遗传咨询，减少患儿出生。

附图说明

图1为实施例1中携带TTN c.51731_51750del患者的Sanger测序图；

图2为实施例2中扩张型心肌病先证者家系图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式进一步详细说明，但并不因此而限制本发明。

下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过商业途径获得。

试剂来源：PCR预混液：2×Taq MasterMix(Dye)，购自江苏康为世纪生物科技有限公司，货号：l01037/70335；包含如下成分：Taq DNA Polymerase、PCR Buffer、Mg²⁺、dNTPs、PCR稳定剂和增强剂等常规PCR所需要的组分。Agencourt AMPure XP磁珠：购自贝克曼库尔特商贸(中国)有限公司，货号：311303。扩增用引物均委托生工生物工程(徐州)股份有限公司合成。RNase-Free H₂O：购自北京索莱宝科技有限公司。磁珠法全血基因组DNA提取试剂盒：购自江苏百世诺医疗科技有限公司，批号：20031886-01C。

实施例1：变异基因c.51731_51750del验证实验

在临床诊断为扩张型心肌病患者及其家属自愿签署知情同意书的前提下，寄送5-10mL人类全血EDTA抗凝样本，建立病历资料库，详细记录患者病情、家系情况等资料。本研究已得到本单位伦理委员会批准。

S1、提取基因组DNA：对患者的人类全血EDTA抗凝样本进行全基因组DNA的提取，采用江苏百世诺医疗科技有限公司磁珠法全血基因组DNA提取试剂盒，操作步骤按照产品说明书进行。对DNA的浓度和纯度进行检测，作为PCR扩增的模板DNA。

S2、准备PCR反应体系，用于扩增包含目的基因位点在内的一段DNA序列，其组成为：PCR预混液25μL、正向引物(10μM)2μL、反向引物(10μM)2μL、模板DNA＜1000ng，加RNase-Free H2O补至50μL。所用的正、反向引物信息如下：

正向引物(SEQ ID NO:3)：5'AGCTGGTGCAATAAGTAAACCC 3'；反向引物(SEQ ID NO:4)：5'AACAACAGTCCAGGCAAGTCG 3'。长度：508bp。

S3、扩增目的片段：将反应体系混合，在PCR仪上进行目的基因片段的扩增反应，扩增程序为：95℃预变性60s；92℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，共33循环。72℃终延伸2min。

S4、PCR产物的检测：取2μL的PCR产物，使用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，选用1000bp Marker作为参考，检测验证扩增产物为预期的大小。

S5、PCR产物纯化：PCR产物检测后，使用Agencourt AMPure XP磁珠对PCR产物进行纯化，纯化步骤按照产品说明书进行，具体步骤如下：(1)涡旋振荡磁珠30s，使其彻底混匀为均一溶液。(2)向1.5mL的离心管中加入待纯化的PCR产物，然后加入2倍样品体积的磁珠溶液。涡旋振荡混匀后，室温下在1400rpm的Thermomixer上振荡5min。(3)将上一步的离心管放于磁力架上约1min，直至磁珠完全吸附。(4)保持离心管固定于磁力架上，弃去溶液，期间避免接触磁珠。(5)向上一步的离心管中加入500μL Buffer PW后，将离心管从磁力架上取下，涡旋振荡10s后将离心管重新放回磁力架，静置1min，待磁珠完全吸附于离心管侧壁后彻底弃去漂洗液。(6)重复步骤(5)。(7)保持离心管固定于磁力架上静置10min，使乙醇完全挥发干净。(8)将离心管从磁力架上取下，加入20-100μL Buffer EB，涡旋振荡将磁珠重悬于洗脱液中后将离心管放于65℃、1400rpm的Thermomixer上振荡洗脱5min。(9)将离心管放于磁力架上约1min，直至磁珠完全吸附。(10)将洗脱液转移至一个新的1.5mL离心管中，此时，可弃去磁珠。

S6、使用AppliedBiosystems 3500Dx系列基因分析仪对扩增产物进行Sanger测序。

S7、测序结果进行生物信息学分析：将测序结果和在NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中获取的野生型TTN基因序列(SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6)在软件Chromas中进行序列比对，确定检测位点是否发生变异。

S8、基因变异论证：患者检测到TTN c.51731_51750del杂合错义变异，即与野生型TTN基因的参考序列SEQ ID NO:5相比，变异基因第51731至51750位的碱基缺失，核苷酸序列为SEQ ID NO:1；与野生型TTN基因编码蛋白的氨基酸序列SEQ ID NO:6相比，变异基因编码蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:2，Sanger测序图如图1所示。

检索千人基因组(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/variation/tools/1000genomes/)：无。ClinVar(https://www.snpedia.com/index.php/ClinVar)：无。ESP6500(https://esp.gs.washington.edu/drupal/)：无。ExAC(http://exac.hms.harvard.edu/)：无。HGMD(http://www.hgmd.c.ac.uk/ac/index.php)：无。百世诺本地人群数据库中的心肌病患者和对照人群均未携带该变异。

根据现有证据：该变异为罕见变异、该变异为扩张型心肌病的可疑致病突变。

实施例2：样本验证实验

招募2500名扩张型心肌病患者和1000名未患有扩张型心肌病的健康人群。使用实施例1中的方法扩增该家系每个成员以及健康人群的TTN c.51731_51750del，扩增完成后进行Sanger测序后进行分析。

基于样本信息保密，现公开部分样本信息。样本可公开信息：(1)扩张型心肌病家系；国别/地区：中国/徐州；家系成员男女比例：1﹕1；家系成员年龄分布：10-60岁；(2)健康人群国别/地区：中国/徐州；健康人群男女比例：1﹕1；健康人群年龄分布：12-60岁。

仅在招募的扩张型心肌病家系(家系图如图2所示)中患病成员均携带TTNc.51731_51750del杂合错义变异，家系中的先证者父亲携带TTN c.51731_51750del杂合错义变异，但还未表现出临床症状，要注意后续的随访；健康人群未见前述任一位点的突变。

实施例3：检测试剂盒

1.组成：

表2.组成

2.使用方法：(1)基因组DNA提取：使用DNA提取试剂盒提取外周血液样本基因组DNA。(2)PCR扩增：采用上述的试剂盒进行PCR扩增，反应体系和反应条件参照实施例1。(3)对PCR扩增产物进行纯化。(4)对纯化的PCR扩增产物进行Sanger测序。(5)分析测序结果，比对是否有TTN c.51731_51750del杂合错义变异。

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

Claims (4)

1.扩张型心肌病变异基因，其特征在于，变异基因为TTN，与野生型TTN基因的参考序列SEQ ID NO:5相比，所述变异基因第51731至51750位的碱基缺失，核苷酸序列为SEQ ID NO:1。

2.根据权利要求1所述的扩张型心肌病变异基因，其特征在于，与野生型TTN基因编码蛋白的氨基酸序列SEQ ID NO:6相比，所述变异基因编码蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:2。

3.根据权利要求2所述的扩张型心肌病变异基因在制备检测试剂盒中的应用，其特征在于，所述检测试剂盒包括用于扩增变异基因的引物，引物的序列为SEQ ID NO:3和SEQ IDNO:4。

4.根据权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还包括PCR预混液、阴性对照试剂和阳性对照试剂。

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