CN115851749A - 马凡综合征变异基因fbn1及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因检测技术领域，具体涉及了一种马凡综合征变异基因FBN1，与野生型FBN1基因的参考序列SEQ ID NO:5相比，所述变异基因FBN1第4428位的碱基C突变为碱基A，核苷酸序列为SEQ ID NO:1。本发明还涉及上述马凡综合征变异基因FBN1在制备检测试剂盒中的应用。本发明提供的马凡综合征变异基因FBN1可以作为临床辅助诊断的生物标志物；检测该变异的携带者，为受试者提供优生优育指导和遗传咨询，减少患儿出生，对马凡综合征的早期诊断，或者辅助临床判断具有重要意义。

Description

马凡综合征变异基因FBN1及其应用

技术领域

本发明涉及基因检测技术领域，尤其涉及马凡综合征变异基因FBN1及其应用。

背景技术

马凡综合征(Marfan syndrome,MFS)是一种遗传性结缔组织疾病，患病率0.065‰～0.2‰，病变主要涉及骨骼、眼睛、心血管系统，有时也涉及肺部，皮肤和硬脑脊膜等器官，易引发主动脉夹层和/或主动脉破裂，进而导致死亡。马凡综合征症状呈现广泛的多样性，而且由于马凡综合征的症状是与年龄增长密切相关的，所以许多儿童期的患者并未出现临床症状。此外，还有一些表型与MFS类似但患病率更低的其他综合征，如Loeys-Dietz综合征(LDS)、Shprintzen-Goldberg综合征(SGS)等。因此，马凡综合征的基因诊断对于辅助临床诊断非常重要。

马凡综合征相关致病基因FBN1位于15号染色体，共66个外显子；该基因编码原纤维蛋白(fibrillin)家族的成员。编码的前蛋白经蛋白水解产生2个蛋白，包括纤维蛋白1(fibrillin 1)和一种激素白脂素(asprosin)。纤维蛋白1是一种细胞外基质糖蛋白，该蛋白是细胞外微纤维的主要构成部分。这些微纤维广泛分布于全身的弹性和非弹性结缔组织，提供受力的结构支持，参与弹性组织的形成和稳定、基质细胞的连接等，可能还参与选择性生长因子的调节。

根据患者意愿对疑似病例进行相关基因检测有助于马凡综合征的早期诊断及临床干预，以达到延缓疾病发生或预防疾病的目的。从分子水平揭示与FBN1基因相关的马凡综合征的发病机制，能够马凡综合征的临床治疗提供理论依据，但是目前仍存在大量未知的FBN1基因突变位点，进一步发现新的FBN1基因的突变位点将有助于进一步研究马凡综合征，对马凡综合征的早期诊断，或者辅助临床判断具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于针对上述缺陷，提供马凡综合征变异基因FBN1及其应用。

本发明目的在于提供：马凡综合征变异基因FBN1，与野生型FBN1基因的参考序列SEQ ID NO:5相比，所述变异基因FBN1第4428位的碱基C突变为碱基A，核苷酸序列为SEQ IDNO:1；与野生型FBN1基因编码蛋白的氨基酸序列SEQ ID NO:6相比，所述变异基因FBN1编码蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:2。

本发明经过大量试验、研究和分析成功地筛选出变异基因FBN1，并利用变异基因FBN1开发出能够用于快速、灵敏、有效的检测变异基因FBN1的检测试剂盒。变异基因FBN1具体信息见下表：

表1.变异基因FBN1

本发明还提供上述马凡综合征变异基因FBN1在制备检测试剂盒中的应用，所述检测试剂盒包括用于扩增变异基因FBN1的引物，引物的序列为SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4。

优选地，所述马凡综合征试剂盒还包括PCR预混液、阴性对照试剂和阳性对照试剂。

本发明有益效果在于：本发明公开的变异基因FBN1可以作为临床辅助诊断马凡综合征的生物标志物，对马凡综合征的早期诊断，或者辅助临床判断具有重要意义；基于变异基因FBN1的试剂开发的试剂盒，能够将携带FBN1 c.4428C>A杂合错义突变的患者和正常人群区分开，为受试者提供优生优育指导和遗传咨询，减少患儿出生。

附图说明

图1为实施例1中携带FBN1 c.4428C>A患者的Sanger测序图；

图2为实施例2中马凡综合征先证者家系图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式进一步详细说明，但并不因此而限制本发明。

下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过商业途径获得。

试剂来源：PCR预混液：2×Taq MasterMix(Dye)，购自江苏康为世纪生物科技有限公司，货号：l01037/70335；包含如下成分：Taq DNA Polymerase、PCR Buffer、Mg²⁺、dNTPs、PCR稳定剂和增强剂等常规PCR所需要的组分。Agencourt AMPure XP磁珠：购自贝克曼库尔特商贸(中国)有限公司，货号：311303。扩增用引物均委托生工生物工程(武汉)股份有限公司合成。RNase-Free H₂O：购自北京索莱宝科技有限公司。磁珠法全血基因组DNA提取试剂盒：购自江苏百世诺医疗科技有限公司，批号：20031886-01C。

实施例1：变异基因FBN1 c.4428C>A验证实验

在临床诊断为马凡综合征患者及其家属自愿签署知情同意书的前提下，寄送5-10mL人类全血EDTA抗凝样本，建立病历资料库，详细记录患者病情、家系情况等资料。本研究已得到本单位伦理委员会批准。

S1、提取基因组DNA：对患者的人类全血EDTA抗凝样本进行全基因组DNA的提取，采用江苏百世诺医疗科技有限公司磁珠法全血基因组DNA提取试剂盒，操作步骤按照产品说明书进行。对DNA的浓度和纯度进行检测，作为PCR扩增的模板DNA。

S2、准备PCR反应体系，用于扩增包含目的基因位点在内的一段DNA序列，其组成为：PCR预混液25μL、正向引物(10μM)2μL、反向引物(10μM)2μL、模板DNA＜1000ng，加RNase-Free H2O补至50μL。所用的正、反向引物信息如下：

正向引物(SEQ ID NO:3)：5'ACCTACGAGACTTCACTGTGCAT 3'；反向引物(SEQ IDNO:4)：5'TTGTCTTCTGTGACGGCCCTT 3'。长度：402bp。

S3、扩增目的片段：将反应体系混合，在PCR仪上进行目的基因片段的扩增反应，扩增程序为：95℃预变性2min；94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，共33循环。72℃终延伸2min。

S4、PCR产物的检测：取2μL的PCR产物，使用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，选用1000bp Marker作为参考，检测验证扩增产物为预期的大小。

S5、PCR产物纯化：PCR产物检测后，使用Agencourt AMPure XP磁珠对PCR产物进行纯化，纯化步骤按照产品说明书进行，具体步骤如下：(1)涡旋振荡磁珠30s，使其彻底混匀为均一溶液。(2)向1.5mL的离心管中加入待纯化的PCR产物，然后加入2倍样品体积的磁珠溶液。涡旋振荡混匀后，室温下在1400rpm的Thermomixer上振荡5min。(3)将上一步的离心管放于磁力架上约1min，直至磁珠完全吸附。(4)保持离心管固定于磁力架上，弃去溶液，期间避免接触磁珠。(5)向上一步的离心管中加入500μL Buffer PW后，将离心管从磁力架上取下，涡旋振荡10s后将离心管重新放回磁力架，静置1min，待磁珠完全吸附于离心管侧壁后彻底弃去漂洗液。(6)重复步骤(5)。(7)保持离心管固定于磁力架上静置10min，使乙醇完全挥发干净。(8)将离心管从磁力架上取下，加入20-100μL Buffer EB，涡旋振荡将磁珠重悬于洗脱液中后将离心管放于65℃、1400rpm的Thermomixer上振荡洗脱5min。(9)将离心管放于磁力架上约1min，直至磁珠完全吸附。(10)将洗脱液转移至一个新的1.5mL离心管中，此时，可弃去磁珠。

S6、使用AppliedBiosystems 3500Dx系列基因分析仪对扩增产物进行Sanger测序。

S7、测序结果进行生物信息学分析：将测序结果和在NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中获取的野生型FBN1基因序列(SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6)在软件Chromas中进行序列比对，确定检测位点是否发生变异。

S8、基因变异论证：患者检测到FBN1 c.4428C>A杂合错义变异，即与野生型FBN1基因的参考序列SEQ ID NO:5相比，变异基因FBN1第4428位的碱基C突变为碱基A，核苷酸序列为SEQ IDNO:1；与野生型FBN1基因编码蛋白的氨基酸序列SEQ ID NO:6相比，变异基因FBN1编码蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:2，Sanger测序图如图1所示。

检索千人基因组(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/variation/tools/1000genomes/)：无。ClinVar(https://www.snpedia.com/index.php/ClinVar)：无。ESP6500(https://esp.gs.washington.edu/drupal/)：无。ExAC(http://exac.hms.harvard.edu/)：无。HGMD(http://www.hgmd.c.ac.uk/ac/index.php)：无。百世诺本地人群数据库中的心肌病患者和对照人群均未携带该变异。

根据现有证据：该变异为罕见变异、该变异为马凡综合征的高度可疑致病突变。

实施例2：样本验证实验

招募2500名马凡综合征患者和1000名未患有马凡综合征的健康人群。使用实施例1中的方法扩增该家系每个成员以及健康人群的FBN1 c.4428C>A，扩增完成后进行Sanger测序后进行分析。

基于样本信息保密，现公开部分样本信息。样本可公开信息：(1)马凡综合征家系；国别/地区：中国/武汉；家系成员男女比例：1﹕1；家系成员年龄分布：10-60岁；(2)健康人群国别/地区：中国/武汉；健康人群男女比例：1﹕1；健康人群年龄分布：12-60岁。

仅在招募的马凡综合征家系(家系图如图2所示)中患病成员均携带FBN1 c.4428C>A杂合错义变异；健康人群未见前述任一位点的突变。

实施例3：检测试剂盒

1.组成：

表2组成

2.使用方法：(1)基因组DNA提取：使用DNA提取试剂盒提取外周血液样本基因组DNA。(2)PCR扩增：采用上述的试剂盒进行PCR扩增，反应体系和反应条件参照实施例1。(3)对PCR扩增产物进行纯化。(4)对纯化的PCR扩增产物进行Sanger测序。(5)分析测序结果，比对是否有FBN1 c.4428C>A杂合错义变异。

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

Claims (4)

1.马凡综合征变异基因FBN1，其特征在于，与野生型FBN1基因的参考序列SEQ ID NO:5相比，所述变异基因FBN1第4428位的碱基C突变为碱基A，核苷酸序列为SEQ ID NO:1。

2.根据权利要求1所述的马凡综合征变异基因FBN1，其特征在于，与野生型FBN1基因编码蛋白的氨基酸序列SEQ ID NO:6相比，所述变异基因FBN1编码蛋白的氨基酸序列为SEQID NO:2。

3.根据权利要求2所述的马凡综合征变异基因FBN1在制备检测试剂盒中的应用，其特征在于，所述检测试剂盒包括用于扩增变异基因FBN1的引物，引物的序列为SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4。

4.根据权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还包括PCR预混液、阴性对照试剂和阳性对照试剂。

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