CN115851906A - 用于检测肥厚型心肌病致病基因的试剂及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因检测技术领域，具体涉及了用于检测肥厚型心肌病致病基因的试剂，所述试剂包括SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6；所述致病基因为TPM1；与野生型TPM1基因的参考序列相比，所述致病基因TPM1第170位的碱基T突变为碱基C或碱基A，编码核苷酸序列为SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3。本发明提供的肥厚型心肌病试剂盒能够将携带致病基因TPM1新位点c.170T>C或c.170T>A杂合错义的患者和正常人群区分开，可以作为临床辅助诊断的生物标志物，明确变异致病性，提前干预恶性事件的发生；检测该变异的携带者，为受试者提供优生优育指导和遗传咨询，减少患儿出生，对肥厚型心肌病的早期诊断，或者辅助临床判断具有重要意义。

Description

用于检测肥厚型心肌病致病基因的试剂及其应用

技术领域

本发明涉及基因检测技术领域，尤其涉及用于检测肥厚型心肌病致病基因的试剂及其应用。

背景技术

肥厚型心肌病(Hypertrophic cardiomyopathy,HCM)是最常见的遗传性心肌病，就诊量呈逐年上升趋势，在世界范围内的人群发病率约为0.2％，患者年死亡率约为1％。1958年Teare首先对“肥厚型心肌病”进行了详细描述，随后概念不断演变发展，该病基本特征是心肌肥厚及猝死发生率高，心肌形态学特征和临床表现各不相同，从无症状到猝死、心力衰竭均有发生，是青少年和运动员心源性猝死(Sudden cardiac death,SCD)的最常见原因。其临床表现异质性与基因型、环境因素等相关。

作为遗传性疾病，目前已有8个编码肌丝蛋白的基因被证明为HCM的致病基因，包括编码粗肌丝蛋白的MYBPC3、MYH7、MYL2、MYL3和编码细肌丝蛋白的TNNT2、TNNI3、TPM1和ACTC1。其中原肌球蛋白1α链编码基因TPM1是钙离子依赖的肌肉收缩过程所必须的。该基因突变引起的HCM约占20％(Seidman CE,1998)，与较高的外显率及严重的疾病表型相关(Tran Vu MT,2019)。

基因检测对于患者临床诊断、危险分层、治疗及患者家属的早期预警非常重要，虽然目前已发现TTN基因的许多突变位点，但是在前人的研究基础上，进一步发现新的TTN基因的突变位点将有助于进一步研究扩张型心肌病，对扩张型心肌病的早期诊断，或者辅助临床诊断具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于针对上述缺陷，提供用于检测肥厚型心肌病致病基因的试剂及其应用。

本发明目的之一在于提供：用于检测肥厚型心肌病致病基因的试剂，所述试剂包括SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6；所述致病基因为TPM1；与野生型TPM1基因的参考序列SEQID NO:7相比，所述致病基因TPM1第170位的碱基T突变为碱基C或碱基A，编码核苷酸序列为SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3。

优选地，与野生型TPM1基因编码蛋白的氨基酸序列SEQ ID NO:8相比，所述致病基因TPM1编码蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4。

本发明目的之二在于提供上述用于检测肥厚型心肌病致病基因的试剂在制备检测试剂盒中的应用，所述检测试剂盒包括PCR预混液、阴性对照试剂和阳性对照试剂。

本发明经过大量试验、研究和分析成功地筛选出致病基因TPM1新位点，并利用致病基因TPM1新位点开发出能够用于快速、灵敏、有效的检测致病基因TPM1新位点的检测试剂盒。致病基因TPM1新位点具体信息见下表：

本发明有益效果在于：本发明公开的致病基因TPM1可以作为临床辅助诊断肥厚型心肌病的生物标志物，能够将携带致病基因TPM1c.170T>C或c.170T>A杂合错义突变的患者和正常人群区分开，对肥厚型心肌病的早期诊断，对患者危险分层具有重要意义，有生育需求的受试者提供优生优育指导和遗传咨询，能够有效减少患儿出生。

附图说明

图1为实施例1中携带TPM1 c.170T>C患者的Sanger测序图；

图2为实施例2中携带TPM1 c.170T>A患者的Sanger测序图；

图3为实施例3中携带TPM1 c.170T>C先证者的家系图；

图4为实施例3中携带TPM1 c.170T>A先证者的家系图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式进一步详细说明，但并不因此而限制本发明。

下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过商业途径获得。

试剂来源：PCR预混液：2×Taq MasterMix(Dye)，购自江苏康为世纪生物科技有限公司，货号：l01037/70335；包含如下成分：Taq DNA Polymerase、PCR Buffer、Mg²⁺、dNTPs、PCR稳定剂和增强剂等常规PCR所需要的组分。Agencourt AMPure XP磁珠：购自贝克曼库尔特商贸(中国)有限公司，货号：311303。扩增用引物均委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。RNase-Free H₂O：购自北京索莱宝科技有限公司。磁珠法全血基因组DNA提取试剂盒：购自江苏百世诺医疗科技有限公司，批号：20031886-01C。

实施例1：TPM1 c.170T>C验证实验

在临床诊断为肥厚型心肌病患者及其家属自愿签署知情同意书的前提下，寄送5-10mL人类全血EDTA抗凝样本，建立病历资料库，详细记录患者病情、家系情况等资料。本研究已得到本单位伦理委员会批准。

S1、提取基因组DNA：对患者的人类全血EDTA抗凝样本进行全基因组DNA的提取，采用江苏百世诺医疗科技有限公司磁珠法全血基因组DNA提取试剂盒，操作步骤按照产品说明书进行。对DNA的浓度和纯度进行检测，作为PCR扩增的模板DNA。

S2、准备PCR反应体系：该PCR反应体系用于扩增包含目的基因位点在内的一段DNA序列，其组成为：PCR预混液25μL、正向引物(10μM)2μL、反向引物(10μM)2μL、模板DNA＜1000ng，加RNase-Free H₂O补至50μL。所用的正、反向引物信息如下：

正向引物(TPM1-E2F2，SEQ ID NO:5)：5'ACTTGAGCCCGCTGAGACCTCG 3'；反向引物(TPM1-E2R2，SEQ ID NO:6)：5'TAGCAGTCAGAGGCGGCATCCAA 3'。长度847bp。

S3、将反应体系混合，在PCR仪上进行目的基因片段的扩增反应，扩增程序为：95℃预变性2min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共35循环。72℃终延伸2min。

S4、取2μL的PCR产物，使用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，选用1000bpMarker作为参考，检测验证扩增产物为预期的大小。

S5、PCR产物检测后，使用Agencourt AMPure XP磁珠对PCR产物进行纯化，纯化步骤按照产品说明书进行，具体步骤如下：(1)涡旋振荡磁珠30s，使其彻底混匀为均一溶液。(2)向1.5mL的离心管中加入待纯化的PCR产物，然后加入2倍样品体积的磁珠溶液。涡旋振荡混匀后，室温下在1400rpm的Thermomixer上振荡5min。(3)将上一步的离心管放于磁力架上约1min，直至磁珠完全吸附。(4)保持离心管固定于磁力架上，弃去溶液，期间避免接触磁珠。(5)向上一步的离心管中加入500μL Buffer PW后，将离心管从磁力架上取下，涡旋振荡10s后将离心管重新放回磁力架，静置1min，待磁珠完全吸附于离心管侧壁后彻底弃去漂洗液。(6)重复步骤(5)。(7)保持离心管固定于磁力架上静置10min，使乙醇完全挥发干净。(8)将离心管从磁力架上取下，加入20-100μLBuffer EB，涡旋振荡将磁珠重悬于洗脱液中后将离心管放于65℃、1400rpm的Thermomixer上振荡洗脱5min。(9)将离心管放于磁力架上约1min，直至磁珠完全吸附。(10)将洗脱液转移至一个新的1.5mL离心管中，此时，可弃去磁珠。

S6、使用AppliedBiosystems 3500Dx系列基因分析仪对扩增产物进行Sanger测序。

S7、测序结果进行生物信息学分析，将测序结果和在NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中获取的野生型TPM1基因序列(SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8)在软件Chromas中进行序列比对，确定检测位点是否发生变异。

S8、基因变异论证：患者检测到TPM1 c.170T>C杂合错义变异，即与野生型TPM1基因的参考序列SEQ ID NO:7相比，致病基因TPM1第170位的碱基T突变为碱基C，与野生型TPM1基因的编码蛋白的氨基酸序列SEQ ID NO:8相比，致病基因TPM1编码蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:2，Sanger测序结果如图1所示。

检索千人基因组(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/variation/tools/1000genomes/)：无。ClinVar(https://www.snpedia.com/index.php/ClinVar)：无。ESP6500(https://esp.gs.washington.edu/drupal/)：无。ExAC(http://exac.hms.harvard.edu/)：无。HGMD(http://www.hgmd.c.ac.uk/ac/index.php)：无。

根据现有证据：该变异为罕见变异、该变异为扩张型心肌病的高度可疑致病突变。

实施例2：TPM1 c.170T>A验证实验

在临床诊断为肥厚型心肌病患者及其家属自愿签署知情同意书的前提下，寄送5-10mL人类全血EDTA抗凝样本，建立病历资料库，详细记录病情、家系情况等资料。本研究已得到本单位伦理委员会批准。

采用实施例1的方法提取基因组DNA进行Sanger测序，PCR扩增时，采用正向引物SEQ ID NO:5和反向引物SEQ ID NO:6。

测序结果发现患者携带TPM1 c.170T>A杂合错义变异，即与野生型TPM1基因参考序列SEQ IDNO:7相比，致病基因TPM1第170位的碱基T突变为碱基A，编码核苷酸序列为SEQID NO:3，与野生型TPM1基因编码蛋白的氨基酸序列SEQ ID NO:8相比，致病基因TPM1编码蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:4。测序结果如图2所示。

检索千人基因组(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/variation/tools/1000genomes/)：无。ClinVar(https://www.snpedia.com/index.php/ClinVar)：无。ESP6500(https://esp.gs.washington.edu/drupal/)：无。ExAC(http://exac.hms.harvard.edu/)：无。HGMD(http://www.hgmd.c.ac.uk/ac/index.php)：无。

根据现有证据：该变异为罕见变异、该变异为肥厚型心肌病的高度可疑致病突变。

实施例3：样本验证实验

招募3000名肥厚型心肌病患者和1100名未患有肥厚型心肌病的健康人群。使用实施例1中的方法扩增TPM1 c.170T>C和TPM1 c.170T>A，扩增完成后进行Sanger测序后进行分析。基于样本信息保密，现公开部分样本信息。样本可公开信息：(1)肥厚型心肌病家系；国别/地区：中国/上海；家系成员男女比例：1﹕1；家系成员年龄分布：20-50岁；(2)健康人群国别/地区：中国/上海；健康人群男女比例：1﹕1；健康人群年龄分布：20-50岁。

仅在肥厚型心肌病的家系(家系图如图3所示)的患病成员中检测到TPM1 c.170T>C杂合错义变异；仅在肥厚型心肌病的家系(家系图如图4所示)的患病成员中检测到TPM1c.170T>A杂合错义变异；正常健康人群未见TPM1 c.170T>C和TPM1 c.170T>A突变。

实施例4：检测试剂盒

1.组成：

表2组成

2.使用方法：(1)基因组DNA提取：使用DNA提取试剂盒提取外周血液样本基因组DNA。(2)PCR扩增：采用上述的试剂盒进行PCR扩增，反应体系和反应条件参照实施例1。(3)对PCR扩增产物进行纯化。(4)对纯化的PCR扩增产物进行Sanger测序。(5)分析测序结果，比对是否有TPM1c.170T>C或c.170T>A杂合错义变异。

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

Claims (3)

1.用于检测肥厚型心肌病致病基因的试剂，其特征在于，所述试剂包括SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6；所述致病基因为TPM1；与野生型TPM1基因的参考序列相比，所述致病基因TPM1第170位的碱基T突变为碱基C或碱基A，编码核苷酸序列为SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3。

2.根据权利要求1所述的用于检测肥厚型心肌病致病基因的试剂，其特征在于，所述致病基因TPM1编码蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4。

3.根据权利要求1或2所述的用于检测肥厚型心肌病致病基因的试剂在制备检测试剂盒中的应用，其特征在于，所述检测试剂盒包括PCR预混液、阴性对照试剂和阳性对照试剂。

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