CN113584156B - 一种HCN4突变基因及突变体、以及Brugada综合征检测试剂盒 - Google Patents

一种HCN4突变基因及突变体、以及Brugada综合征检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及人类遗传学和内科心血管技术领域，具体涉及了一种HCN4突变基因，在基因组位置chr15:73615687处，碱基G突变为碱基T；参考基因组版本是GRCh37。本发明还涉及了一种HCN4突变体，具有p.Gly916Val突变。本发明还涉及一种Brugada综合征检测试剂盒，包括用于检测HCN4突变基因和/或HCN4突变体的试剂，HCN4突变基因在基因组位置chr15:73615687处，碱基G突变为碱基T；HCN4突变体具有p.Gly916Val突变。本发明提供的人类HCN4突变基因可以将Brugada综合征患者和正常人群区分开，作为临床辅助诊断Brugada综合征的生物标志物；检测该变异的携带者，可以为受试者提供优生优育指导和遗传咨询，减少患儿出生；为人类攻克Brugada综合征提供可能的药物靶点，促进创新药物研发。

Description

一种HCN4突变基因及突变体、以及Brugada综合征检测试剂盒
技术领域
本发明涉及人类遗传学和内科心血管技术领域，尤其涉及一种HCN4突变基因及突变体、以及Brugada综合征检测试剂盒。
背景技术
Brugada综合征属于常染色体显性遗传，临床观察发现该疾病表现有较强的家族遗传性，常因心室颤动(室颤)或多形性室性心动过速(室速)导致晕厥或猝死，心电图右胸导联(V1-3)ST段呈下斜型或马鞍形抬高。自从1992年Brugada兄弟首次将Brugada(Brugadasyndrome，Brs)作为一个新病种报道以来，Brugada综合征受到临床医生和科研工作者的广泛关注。
Brugada综合征是引发特发性室颤猝死的重要疾病之一，在预防上，十分地被动和消极。自1988年Chen(Genetic basis and molecular mechanism for idiopathicventricular fibrillation,Nature,1998,392:293-296)发现了第一个SCN5A基因突变以来，越来越多影响Brugada综合征的突变基因(涉及基因有SCN5A、SCN1B、CACNA1C、GPD1-L等)被发现，基因检测已经成为确诊Brugada综合征的重要手段。但是鉴于Brugada综合征的罕见性，以及基因突变的随机性和不定向性，发现任何一个Brugada综合征的相关基因都是对本领域的重要技术贡献。
发明内容
本发明的目的在于提供一种HCN4突变基因及突变体、以及Brugada综合征检测试剂盒，可以将Brugada综合征患者和正常人群区分开，可以作为临床辅助诊断Brugada综合征的生物标志物；为携带Brugada综合征致病变异的家庭提供遗传阻断，提高优生优育质量。
本发明通过对Brugada综合征的家系成员进行分析，意料不到地发现了，家系中的Brugada综合征患者具有如下突变：
Figure BDA0003201779860000011
HCN4基因编码一个超极化激活的环核苷酸门控钾通道的成员，编码蛋白表现出缓慢的激活和失活动力学，是心脏起搏过程所必需的。这个通道也可能介导对酸性刺激的反应。c.2747G>T表示，在HCN4基因的CDS区，第2747位的碱基G突变为碱基T，HCN4基因编码蛋白的氨基酸由甘氨酸变为缬氨酸。
在基因组chr15:73615650-chr15:73615699上，野生型HCN4基因的序列号为：SEQID NO:3，具体序列为：AGGCGCTGGGTGGCTCCCTGTCCTCCTCCGACTCTCCCCTGCTCACCCCG，其中G为突变前碱基。
在基因组chr15:73615650-chr15:73615699上，HCN4突变基因的序列号为：SEQ IDNO:4，具体序列为：AGGCGCTGGGTGTCTCCCTGTCCTCCTCCGACTCTCCCCTGCTCACCCCG，其中T为突变后碱基。
为了达到上述目的，本发明的技术方案如下：
一、本发明提供一种HCN4突变基因，在基因组位置chr15:73615687处，碱基G突变为碱基T；参考基因组版本是GRCh37。
查询人群频率数据库发现该变异为罕见变异(千人基因组：无，ESP6500：无，ExAC：无)。采用SIFT、PolyPhen-2等生物信息预测软件交叉预测，结果均为有害(SIFT为“D”，Polyphen-2为“B”，MutationTaster_pred为“D”，VEST3评分为“0.287”，其他为“4个D/1个H”)，提示该变异所致的氨基酸改变可能会对蛋白功能产生影响。氨基酸由甘氨酸变为缬氨酸。查询数据库发现该位置的氨基酸在脊椎动物中保守较好。查询ClinVar、HGMD数据库未发现该变异，文献检索未发现该变异与疾病相关的报导。根据现有证据：该变异为罕见变异，软件预测该变异可能会对蛋白功能产生影响，该位置氨基酸在脊椎动物中保守性较好，但缺乏家系连锁及功能学证据支持，所以该变异为可疑致病变异。
二、本发明还提供了上述HCN4突变基因在制备Brugada综合征检测试剂盒中的应用。
三、本发明还提供了一种HCN4突变体，其特征在于，具有p.Gly916Val突变。
四、本发明还提供了上述HCN4突变体在制备Brugada综合征检测试剂盒中的应用。
五、本发明还提供了一种Brugada综合征检测试剂盒，包括用于检测HCN4突变基因和/或HCN4突变体的试剂，HCN4突变基因在基因组位置chr15:73615687处，碱基G突变为碱基T；HCN4突变体具有p.Gly916Val突变。
优选地，还包括正向引物和反向引物，正向引物的序列编号为SEQ ID NO:1，反向引物的序列编号为SEQ ID NO:2。
六、本发明的有益效果在于：
(1)本发明提供的人类HCN4突变基因可以将Brugada综合征患者和正常人群区分开，可以作为临床辅助诊断Brugada综合征的生物标志物。
(2)通过检测受试者是否携带了上述变异，检测该变异的携带者，可以为受试者提供优生优育指导和遗传咨询，减少患儿出生；为人类攻克Brugada综合征提供可能的药物靶点，促进创新药物研发。
附图说明
图1为Brugada综合征家系图；
图2为先证者Sanger测序图；
图3为家系中非患病成员的Sanger测序图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式进一步详细说明：
实施例1-先证者验证实验
样本来源：福建医科大学附属第一医院，在先证者(36岁)及家属自愿签署知情同意书的前提下，寄送5-10mL全血样本，建立病历资料库，详细记录先证者病情、家系情况等资料。本研究已得到本单位伦理委员会批准。
先证者临床概况：
表1先证者的临床概况
Figure BDA0003201779860000031
采用Sanger测序法对先证者及其家属的HCN4基因进行基因检测，具体步骤如下：
S1、制备基因组DNA
使用江苏百世诺医疗科技有限公司的磁珠法全血基因组DNA提取试剂，对先证者和验证样本的人类全血EDTA抗凝样本进行全基因组DNA的提取，对DNA的浓度和纯度进行检测。
S2、对HCN4突变基因进行扩增；
(1)配制PCR扩增试剂，PCR扩增试剂的组成具体参见下表2：
表2 PCR扩增试剂的组成
Figure BDA0003201779860000041
2×Taq MasterMix(Dye)中包含如下成分：Taq DNA Polymerase、PCR Buffer、Mg2 +、dNTPs、PCR稳定剂和增强剂等常规PCR所需要的组份。
扩增所需的引物信息如下表3所示：
表3引物信息
序列编号 引物名称 序列(5’→3’)
SEQ ID NO:1 HCN4-E8-P-F6 GTAGCCGCCACCACCATAGCC
SEQ ID NO:2 HCN4-E8-P-R6 GAGAGTCTGCGCCCCGTCCTG
(2)目的片段扩增
将反应体系混合，在PCR仪上进行目的基因片段的扩增反应，扩增程序如下表3所示。扩增完成后，使用Agencourt AMPure XP磁珠(购自贝克曼库尔特商贸(中国)有限公司)对PCR产物进行纯化。
PCR扩增程序：94℃预变性2min；94℃变性30s，61℃退火30s，72℃延伸30s，共30循环。72℃终延伸2min。
取2μL的PCR产物，使用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物为预期的大小，选用1000bp Marker作为参考。
S3、使用3730XL Genetic Analyzer全自动测序仪对S2获得的PCR产物进行Sanger测序，从NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库获得参考序列和测序结果进行比对。
图1为Brugada综合征家系图；图2为先证者Sanger测序图；图3为家系中非患病成员的Sanger测序图。结果如图1-图3所示：先证者、先证者弟弟、先证者儿子，先证者弟弟的女儿均携带有HCN4突变基因c.2747G>T杂合错义变异。先证者和先证者弟弟的HCN4突变基因均遗传自先证者父亲。
实施例2-一种Brugada综合征检测试剂盒
本实施例提供用于检测人类HCN4突变基因c.2747G>T杂合错义变异的试剂盒，试剂盒组成如下表4所示：
表4试剂盒组成
Figure BDA0003201779860000051
利用本试剂盒筛选Brugada综合征的具体步骤为：按照实施例1的步骤提取待测者DNA，然后使用经设计的引物组合(SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2)对HCN4基因进行扩增，得到PCR产物，最后对PCR产物进行测序。从NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库获得参考序列和测序结果进行比对，判断待测者HCN4基因是否携带c.2747G>T杂合错义变异，协助临床确诊待测者是否患有Brugada综合征。
实施例3-针对家系外的正常人的突变验证
参照实施例1的方法，对200例同种族无关正常人(即家系外正常人)进行HCN4基因c.2747G>T突变位点检测，结果均未能检测到该突变。
综上结果，并基于HCN4基因的c.2747G>T杂合错义变异会导致HCN4基因编码的蛋白质发生p.Gly916Val的改变，而HCN4基因是Brugada综合征的已知致病基因，从而再次证明了HCN4基因的c.2747G>T杂合错义变异为Brugada综合征的致病突变。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
序列表
<110> 百世诺（北京）医疗科技有限公司
<120> 一种HCN4突变基因及突变体、以及Brugada综合征检测试剂盒
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
gtagccgcca ccaccatagc c 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 2
gagagtctgc gccccgtcct g 21
<210> 3
<211> 50
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 3
aggcgctggg tggctccctg tcctcctccg actctcccct gctcaccccg 50
<210> 4
<211> 50
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 4
aggcgctggg tgtctccctg tcctcctccg actctcccct gctcaccccg 50

Claims (4)

1.一种HCN4突变基因，其特征在于，在基因组位置chr15:73615687处，碱基G突变为碱基T；参考基因组版本是GRCh37。
2.权利要求1所述的HCN4突变基因在制备Brugada综合征检测试剂盒中的应用。
3.一种Brugada综合征检测试剂盒，其特征在于，包括用于检测HCN4突变基因的试剂，HCN4突变基因在基因组位置chr15:73615687处，碱基G突变为碱基T；参考基因组版本是GRCh37。
4.根据权利要求3所述的Brugada综合征检测试剂盒，其特征在于，还包括正向引物和反向引物，正向引物的序列编号为SEQ ID NO:1，反向引物的序列编号为SEQ ID NO:2。
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