CN108410889B - 一种用于癫痫辅助诊断的atp1a2突变基因及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因工程及神经生物学领域，公开了ATP1A2基因c.2426T>C突变及其在癫痫辅助诊断中的应用。该ATP1A2基因突变与ATP1A2正常基因序列相比具有c.2426T>C位点突变。本发明提供了癫痫易感的新的突变位点，可用于早期预测诊断癫痫的发生。

Description

一种用于癫痫辅助诊断的ATP1A2突变基因及应用

发明领域

本发明属于基因工程及神经生物学领域，涉及ATP1A2基因c.2426T>C突变及其在癫痫辅助诊断中的应用。

背景技术：

癫痫是最常见的神经系统疾病之一，在美国大约有二百万人发病。其特征是易发生反复的癫痫发作，可表现为发作性运动、感觉、自主神经、意识及精神障碍。它的电生理特征是异常高的兴奋性，与神经活动同步。然而，对癫痫发展或致痫的细胞和分子机制仍然知道的很少，一般认为遗传因素是引起青少年癫痫的病因。尽管研究发现一些致病基因位点，但仍有许多相关基因有待鉴定。因此，寻找有效的基因突变位点有助于进一步认识癫痫发生发展的机制，提高癫痫诊断和治疗水平。

目前可以通过癫痫家系的全外显子测序有效的鉴定青少年癫痫相关致病基因，克服传统的基因定位克隆策略难以筛选出所有的候选基因的缺陷，全基因组外显子测序技术迅速提高了人类疾病相关基因的识别水平。

突变位点的存在是个体不同表型存在的重要原因，也是对药物不同反应的重要原因之一。将疾病的突变位点用于临床的辅助诊断具有广阔的前景。近年来已有多种突变位点用于临床的诊断及作为靶药治疗的分子基础。

ATP1A2编码P型阳离子转运Na⁺/K⁺ATP酶α2亚基，是一种完整的膜蛋白，负责建立和维持细胞膜上Na和K离子的电化学梯度。这些梯度对于渗透调节、各种有机和无机分子的钠耦合运输以及神经和肌肉的电兴奋性都是必不可少的。该酶由一个大的催化亚基(α)和一个较小的糖蛋白亚基(β)组成。Na⁺/K⁺ATP酶的催化亚基由多个基因编码。该基因编码一个α2亚基，由10个跨膜螺旋组成，并含有Na⁺和K⁺结合位点。

ATP1A2基因c.2426T>C突变在癫痫中未被报道。

发明内容

本发明第一个目的是提供一种具有新的突变位点的ATP1A2突变基因，ATP1A2正常基因的Gene ID:477。

本发明第二个目的是提供检测上述突变位点的特异性引物对。

本发明第三个目的是提供上述ATP1A2突变基因及特异性引物对在制备癫痫辅助诊断试剂盒中的应用。

本发明第四个目的是提供一种癫痫辅助诊断试剂盒。

发明人通过分离和研究癫痫患者及与健康对照外周血DNA中的突变,寻找与癫痫相关的高特异性的突变位点,并研制出可临床或人群应用的癫痫辅助诊断试剂盒,为癫痫的筛查和诊断提供支持。

本发明的目的是通过下列技术方案实现的:

所述用于癫痫辅助诊断的ATP1A2突变基因，与ATP1A2正常基因序列相比具有c.2426T>C位点突变。

用于检测上述ATP1A2基因的突变位点的特异性引物对,其上游引物的序列如为SEQ ID NO.3所示,下游引物的序列如SEQ ID NO.4所示。

用于检测上述ATP1A2基因的检测方法,该方法采用Sanger测序方法,使用上述引物对(PCR扩增引物对),对ATP1A2基因进行突变检测。

上述的ATP1A2突变基因可用于制备癫痫辅助诊断试剂盒。

上述的引物对可用于制备癫痫辅助诊断试剂盒。

所述癫痫辅助诊断试剂盒含有上述引物对(上游引物的序列如SEQ ID NO.3所示，下游引物的序列如SEQ ID NO.4所示)，还可以含有PCR技术所需的常用技术。

本发明采用全基因组外显子测序结合癫痫相关基因分析，对同一家族非同胞两癫痫患者及其父母、祖母进行测序(脑电图见附图1，家族系谱图见附图2)，筛选与癫痫相关的突变位点，我们发现两患者均存在ATP1A2基因c.2426位置发生T碱基到C碱基的突变，而其父母、祖母均未见突变(测序结果见附图3)；随后从两患者和200名健康对照外周血中提取DNA，扩增出含有c.2426T的ATP1A2基因片段，并将其连接到质粒环上，进行Sanger测序，发现两患者存在突变，健康对照均无突变。结果表明，两例患者的ATP 1A2基因均为杂合子，提示c.2426T>C突变可能是常染色体显性突变；此外，该突变位点在dbSNP and 1000基因组数据库中未被提及，提示该突变位点是一个全新的突变位点，且可能在癫痫的发生发展中发挥重要角色。

以上研究所发现的与癫痫发生发展及辅助诊断相关的突变位点为c.2426T>C，该变位点发生于第1号染色体位置，ATP1A2基因在NCBI参考数据库GRCh38.p7中的编号为NC_000001.11(160115730-160143591)，这里列出在该数据库中本突变位点前后100bp的碱基序列供参考，如SEQ ID NO:1所示，ATP1A2基因突变序列对应的序列如SEQ ID NO:2所示，其中突变位点为SEQ ID NO:1序列的第101位由碱基T到碱基C的突变。

ACCCTGACCAGCAACATCCCCGAGATCACCCCCTTCCTGCTGTTCATCATTGCCAACATCCCCCTACCTCTGGGCACTGTGACCATCCTTTGCATTGACCTGGGCACAGATATGGTGAGCGCAGGAGGTGGAGGAGGGGACAGGCAAGGCAATCGTGATGGCACAGTGGCAGGGAGGAGAGGTGCACTGGGGCAGTGGCCC(SEQ ID NO:1)；

ACCCTGACCAGCAACATCCCCGAGATCACCCCCTTCCTGCTGTTCATCATTGCCAACATCCCCCTACCTCTGGGCACTGTGACCATCCTTTGCATTGACCCGGGCACAGATATGGTGAGCGCAGGAGGTGGAGGAGGGGACAGGCAAGGCAATCGTGATGGCACAGTGGCAGGGAGGAGAGGTGCACTGGGGCAGTGGCCC(SEQ ID NO:2)。

本发明解决问题的技术方案包括：(1)突变筛选：采用全基因组外显子测序技术对同一家族非同胞两癫痫患者及其非患病父母、祖母进行测序，筛选与癫痫相关的突变位点，发现两患者均存在ATP1A2基因c.2426位置发生T碱基到C碱基的突变，父母、祖父母均未见突变；(2)筛选出与癫痫发生相关的突变位点，提供位点的突变后碱基序列。(3)对筛选出的突变位点，满足在正常人群中无频率：从两患者及200名健康对照外周血中提取DNA，扩增出含有c.2426T的ATP1A2基因片段，并将其连接到质粒环上，进行Sanger测序，发现两患者存在突变，而健康对照均无突变。(4)癫痫辅助诊断试剂盒的研制：根据癫痫病例所独有的突变位点开发突变位点辅助诊断试剂盒。

本发明人以标准操作程序(SOP)采集符合标准的血液样本,系统收集完整的人口学资料、临床资料等,并采用了全外显子测序分析癫痫相关致病基因，发现ATP1A2基因的c.2426T新生突变有可能是引起癫痫的重要遗传因素。

具体来说研究的实验方法主要包括以下几个部分：

1、研究样本的选择:经临床确诊的同一家族非同胞两癫痫患者及其非患病父母、祖母。

2、酚-氯仿法提取外周血基因组DNA，得到100ng/μl DNA，纯度(紫外260OD与280OD比值)在1.8-2.0。

3、全基因组外显子测序技术筛选突变位点

(1)取同一家族非同胞两癫痫患者及其父母、祖母全基因组DNA样本；

(2)采用全基因组外显子测序技术测序。

4、单个突变位点Sanger测序

(1)取同一家族非同胞两癫痫患者及200名健康对照DNA样本；

(2)采用Primer 3软件在线设计引物SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4；

(3)采用Sanger测序对ATP1A2基因测序。

5、诊断试剂盒制备方法

采用全基因组外显子测序技术筛选癫痫相关突变基因，通过Sanger测序确定单个突变位点，作为癫痫诊断的指标。最后利用筛选出的突变位点组成辅助诊断试剂盒。该诊断试剂盒可以包括该突变位点的特异性引物及Taq酶、dNTP等试剂。

以下是本发明进一步的说明：

在上述2例同一家族的非同胞癫痫病例中我们采用全基因组外显子测序筛选得到相关结果。检测到两例患者均有ATP1A2基因c.2426T>C突变。并进一步对这两例患者及200名健康对照进行单个突变位点的Sanger测序，发现两患者存在该突变位点，而其健康对照均未见该突变位点。

根据上述实验结果，本发明人发现了一个能用于进一步研究癫痫发生发展机制及辅助癫痫诊断的突变位点。

具体而言，该突变位点的碱基序列的改变有助于癫痫的辅助诊断，为临床医生快速准确掌握患者的疾病状态和病情严重程度，及时采取更具个体化的防治方案提供支持。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)突变位点是一种新型基因生物标记物，区别于传统标志物，稳定、微创、易于检测，将大大提高诊断的敏感性及特异性，该类标志物的成功开发将为癫痫的诊断和治疗提供帮助。同时为其他疾病生物标志物的研制提供了借鉴。

(2)该突变位点有利于癫痫发生发展机制的进一步明确，有助于癫痫的辅助诊断更加方便易行，为临床医生快速准确掌握患者的疾病状态和病情严重程度，及时采取更具个体化的防治方案提供支持。

附图说明

图1为脑电图；上图为异常儿童脑电图，浅睡期右额区中量棘波发放；下图为正常儿童脑电图；

图2为家族系谱图；

图3为测序结果图。

具体实施方式

实施例1外周血DNA全基因组外显子测序。

收集同一家族非同胞两癫痫患者及其父母、祖母的血液标本，并进行全基因组外显子测序。

具体步骤为：

1、向2ml冻存的全血中加入溶血试剂(即裂解液，40份量配置方法如下：蔗糖219.72g、氯化镁2.02g和曲拉通X-100(amresco 0694)20ml混合后，用TrisHcl溶液定容至2000ml，下同)，颠倒混匀后完全转入。

2、去除红细胞：用溶血试剂将5ml离心管补至4ml，颠倒混匀，4000rpm离心10分钟，弃上清。向沉淀中加入4ml溶血试剂，再次颠倒混匀清洗一次，4000rpm离心10分钟，弃上清。

3、抽提DNA：向沉淀中加1ml抽提液(每300ml中含有122.5ml0.2M氯化钠，14.4ml0.5M乙二胺四乙酸，15ml 10％十二烷基硫酸钠，148.1ml双蒸水，下同)和8μl蛋白酶K，震荡器上充分震荡混匀，37℃水浴过夜。

4、去除蛋白质：加1ml饱和酚充分混匀(手轻摇15分钟)，4000rpm离心10分钟,取上清转入新的5ml离心管中在上清液中加入等体积氯仿与异戊醇混合液(氯仿:异戊醇＝24:1,v/v,下同)，充分混匀后(手摇15分钟)，4000rpm离心10分钟，取上清(分入两个1.5ml的离心管)。

5、DNA沉淀：在上清液中加入3M的醋酸钠60μl，再加入与上清液等体积的冰无水乙醇，上下轻摇，可见白色絮状沉淀物，再以12000rpm离心10min。

6、DNA洗涤：在沉淀中加入冰无水乙醇1ml，12000rpm离心10min，弃上清后真空抽干或置于清洁干燥环境中蒸干。

7、测量浓度：得到100ng/μl DNA，纯度(紫外260OD与280OD比值)在1.8-2.0。

8、利用Agilent液体捕集系统(Agilent Sure Select Human All Exon V5)，从1.0μg基因组DNA中富集外显子序列。

9、进行全基因组外显子测序。

10、结果发现，两癫痫患者存在ATP1A2基因c.2426T>C的新生突变，患者的父母、祖母均未检测到该突变位点。

实施例2外周血DNA中突变位点的测序鉴定。

在上述2例癫痫患者及200名健康对照中，采用Sanger测序检测获得相关结果，测序过程遵循Sanger测序的标准操作，人工设计Sanger测序引物，引物序列为F:5’-CGGGATCCGGGGAAGAGTCCCTCTGACCTCCCTGATGCC-3’(SEQ ID NO:3)和R:5’-CGCTCGAGAGGGACCTGTGTGGGGTAGGAAATGGGGCAG-3’(SEQ ID NO:4)，引物序列由北京六合华大基因科技有限公司合成(详见表1)。具体步骤为：

1、向2ml冻存全血中加入溶血试剂(即裂解液，40份量配置方法如下：蔗糖219.72g、氯化镁2.02g和曲拉通X-100(amresco 0694)20ml混合后，用TrisHcl溶液定容至2000ml，下同)，颠倒混匀后完全转入。

2、去除红细胞：用溶血试剂将5ml离心管补至4ml，颠倒混匀，4000rpm离心10分钟，弃上清。向沉淀中加入4ml溶血试剂，再次颠倒混匀清洗一次，4000rpm离心10分钟，弃上清。

3、抽提DNA：向沉淀中加1ml抽提液(每300ml中含有122.5ml0.2M氯化钠，14.4ml0.5M乙二胺四乙酸，15ml 10％十二烷基硫酸钠，148.1ml双蒸水，下同)和8μl蛋白酶K，震荡器上充分震荡混匀，37℃水浴过夜。

4、去除蛋白质：加1ml饱和酚充分混匀(手轻摇15分钟)，4000rpm离心10分钟,取上清转入新的5ml离心管中在上清液中加入等体积氯仿与异戊醇混合液(氯仿:异戊醇＝24:1,v/v,下同)，充分混匀后(手摇15分钟)，4000rpm离心10分钟，取上清(分入两个1.5ml的离心管)。

5、DNA沉淀：在上清液中加入3M的醋酸钠60μl，再加入与上清液等体积的冰无水乙醇，上下轻摇，可见白色絮状沉淀物，再以12000rpm离心10min。

6、DNA洗涤：在沉淀中加入冰无水乙醇1ml，12000rpm离心10min，弃上清后真空抽干或置于清洁干燥环境中蒸干。

7、测量浓度：得到100ng/μl DNA，纯度(紫外260OD与280OD比值)在1.8-2.0。

8、PCR反应体系30μl，包括：模板50ng；引物F(SEQ ID No:3)：1μl和引物R(SEQ IDNo:4)：1μl；2×MIX：15μl；H2O补足至30μl。

9、PCR反应程序：95℃5min；(95℃30s；56℃30s；72℃30s)×40个循环；72℃6min；4℃保存。

10、通过

-Blunt Cloning Kit，0.5-4μl PCR产物、1μl Vector室温反应5min，连接得到含有c.2426T的ATP1A2基因片段质粒环。

11、进行Sanger测序。

12、使用NTI软件进行序列比较和分析。

13、发现两癫痫患者存在ATP1A2基因c.2426T>C突变，与全基因组外显子测序结果一致，而其健康对照均未发现该突变。

因此，本发明人证明了ATP1A2基因c.2426T>C突变能够很好地将健康人和癫痫患者区分。

实施例3用于癫痫辅助诊断突变位点试剂盒的制作

突变位点试剂盒的制作和操作流程是基于Sanger测序扫描检测分型技术。试剂盒含有一批突变位点特异性引物(包括下列引物：c.2426T>C突变位点的引物序列为SEQ IDNo:3和SEQ ID No:4)，该试剂盒还可以包括PCR反应常用的试剂，如Taq酶、dNTP混合液、MgCl₂溶液、去离子水等；这些常用试剂都是本领域技术人员熟知的，另外还可以含有标准品和/或对照品(如确定基因型的标准品和空白对照等)。此试剂盒的价值在于只需要外周血而不需要其它组织样品，通过最精简和特异的引物对检测突变位点，再通过突变位点谱辅助判断癫痫，不仅稳定，检测方便，且精确，大大提高疾病诊断的敏感性和特异性，因此将此试剂盒投入实践，可以帮助指导诊断和更有效的个体化治疗。

表1.相关突变位点引物信息

SEQUENCE LISTING

<110> 湘雅医院

<120> 一种用于癫痫辅助诊断的ATP1A2 突变基因及应用

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 201

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

accctgacca gcaacatccc cgagatcacc cccttcctgc tgttcatcat tgccaacatc 60

cccctacctc tgggcactgt gaccatcctt tgcattgacc tgggcacaga tatggtgagc 120

gcaggaggtg gaggagggga caggcaaggc aatcgtgatg gcacagtggc agggaggaga 180

ggtgcactgg ggcagtggcc c 201

<210> 2

<211> 201

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

accctgacca gcaacatccc cgagatcacc cccttcctgc tgttcatcat tgccaacatc 60

cccctacctc tgggcactgt gaccatcctt tgcattgacc cgggcacaga tatggtgagc 120

gcaggaggtg gaggagggga caggcaaggc aatcgtgatg gcacagtggc agggaggaga 180

ggtgcactgg ggcagtggcc c 201

<210> 3

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cgggatccgg ggaagagtcc ctctgacctc cctgatgcc 39

<210> 4

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cgctcgagag ggacctgtgt ggggtaggaa atggggcag 39

Claims (2)

1.一种用于癫痫辅助诊断的ATP1A2突变基因，其特征在于，所述ATP1A2突变基因与ATP1A2正常基因序列相比具有c.2426T>C位点突变。

2.如权利要求1所述的ATP1A2突变基因在制备癫痫辅助诊断试剂盒中的应用。

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