DE60107416T2

DE60107416T2 - Adnf mischungen zur verbesserung der lernfähigkeit und der gedächtnisfunktion

Info

Publication number: DE60107416T2
Application number: DE60107416T
Authority: DE
Inventors: Y. Catherine Spong; Douglas Brenneman; Illana Gozes
Original assignee: Ramot at Tel Aviv University Ltd; US Department of Health and Human Services
Current assignee: Ramot at Tel Aviv University Ltd; US Department of Health and Human Services
Priority date: 2000-05-31
Filing date: 2001-05-31
Publication date: 2005-12-01
Anticipated expiration: 2021-06-01
Also published as: WO2001092333A3; MXPA02011923A; AU2001275111B2; JP2003535105A; JP4440536B2; DE60107416D1; HK1054947A1; EP1285000B1; WO2001092333A2; CN1444600A; AU7511101A; US20040048801A1; US20090203615A1; CA2410735A1; NZ522821A; US7427598B2; ATE283286T1; EP1285000A2

Description

ADNF I-Polypeptide haben eine aktive Kernstelle mit der folgenden Aminosäuresequenz: Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala ("SALLRSIPA" oder in Kurzdarstellung "SAL" oder "ADNF-9"). Auch ADNF III-Polypeptide haben eine aktive Kernstelle mit einigen Aminosäureresten, nämlich die folgende Aminosäuresequenz: Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln ('NAPVSIPQ" oder in Kurzdarstellung "NAP"). Bei diesen ADNF-Polypeptiden wurde kürzlich bei jedem einzelnen eine beachtliche Potenz und Aktivität in Tiermodellen in Verbindung mit einer Neurodegeneration festgestellt. [Gozes et al., J. Pharmacology and Experimental Therapeutics, Band 293: 1091 – 1098]
In einer Ausführung der vorliegenden Erfindung wurde entdeckt, dass die postnatale Verabreichung von Mischungen aus ADNF I- und ADNF-III-Polypeptiden auch die Leistungsfähigkeit, wie Lernen und Gedächtnisfunktion bei Tiermodellen verbessert, die z. B. unter einer Neuropathologie, Alzheimerschen Erkrankung, Down-Syndrom, Alter, mentaler Retardierung (z. B. fragiles X-Syndrom) leiden, sowie bei normalen Tieren. Die Polypeptide der Erfindung können auch zur Verbesserung des Kurzzeit- und Referenzgedächtnisses verwendet werden.
So schließen Anwendungen von Mischungen aus ADNF I- und ADNF III-Polypeptiden der vorliegenden Erfindung die Verbesserung der Leistung von Subjekten mit z. B. einer Neuropathologie, sensorisch-motorischen Problemen, die Verbesserung der Leistungen von bei kognitiven Aufgaben geschwächten Subjekten, die Verbesserung der Leistungen von Subjekten mit Gedächtnisschwächen, die Verbesserung der Leistungen von normalen Subjekten und dergleichen ein. Dementsprechend können Ausführungen der Erfindung in geeigneten Rezepturen angewendet werden, um den erforderlichen Zeitraum zum Erlernen von kognitiven, motorischen oder Aufgaben der Wahrnehmung zu reduzieren. Alternativ dazu können erfindungsgemäße Zusammensetzungen in geeigneter Rezeptur zur Erhöhung des Zeitraums angewendet werden, in dem man sich an kognitive, motorische oder Aufgaben der Wahrnehmung erinnert. Als weitere Alternative können Ausführungen der Erfindung in geeigneter Rezeptur dafür verwendet werden, die Menge und/oder Schwere von Fehlern beim Abrufen von kognitiven, motorischen oder Aufgaben der Wahrnehmung zu reduzieren. Eine solche Behandlung kann sich insbesondere bei Individuen als vorteilhaft erweisen, die eine Verletzung des Nervensystems erlitten haben, oder eine Erkrankung des Nervensystems durchgestanden haben. Mischungen aus ADNF I- und ADNF III-Polypeptiden werden erkrankten Individuen verabreicht, und anschließend wird das Individuum einer kognitiven, motorischen oder einer Aufgabe der Wahrnehmung ausgesetzt. Zudem können Mischungen aus ADNF I- und ADNF III-Polypeptiden auch normalen Subjekten verabreicht werden, um ihre Leistungsfähigkeit zu verbessern (z. B. Lernfähigkeit und Gedächtnisfunktion). Die Mischungen aus ADNF I- und ADNF III-Polypeptiden können vor allem für eine ältere Bevölkerung nützlich sein, deren Gedächtnisfunktion (z. B. Kurzzeitgedächtnis) in der Regel nachgelassen hat.
In einer anderen Ausführung basiert die vorliegende Erfindung zum Teil auf der Entdeckung, dass wenn Tiere in utero mit aktivitätsabhängigen neutrotrophischer Faktor (ADNF)-Polypeptiden behandelt werden, die Mischungen aus ADNF I- und ADNF III-Polypeptiden die postnatale Lernfähigkeit und Gedächtnisfunktion und insbesondere räumliches Lernen verbessert hat. Überraschender Weise wird dieser Langzeiteffekt von ADNF I und ADNF III-Polypeptiden selbst dann beobachtet, wenn nur eine Dosis einer Mischung aus ADNF I und ADNF III-Polypeptiden zu Beginn der Trächtigkeit pränatal verabreicht wurde. Ebenfalls überraschend ist, dass dieser erhöhte Lern- und Gedächtniseffekt von Mischungen aus ADNF I – und ADNF III-Polypeptiden auch bei Tieren mit einer normalen geistigen Fähigkeit zu beobachten ist (z. B. bei normalen Mäusen ohne jegliche geistige Schwächung). Daher können Mischungen aus ADNF I- und ADNF III-Polypeptiden normale Tiere über ihre natürliche Lern- und Gedächtnisfähigkeit hinaus bringen und ihre kognitiven Fähigkeiten verbessern.
Wie vorausgehend beschrieben, haben sich diese ADNF Polypeptide mit einer beachtlichen Potenz und Aktivität in Tiermodellen erwiesen, insbesondere in solchen, die mit einer Neurodegeneration in Verbindung stehen. Allerdings wurden die Auswirkungen von ADNF Polypeptiden auch dann beobachtet, wenn sie bei Tieren postnatal verabreicht wurden. Nun wurde zum ersten Mal entdeckt, dass die pränatale Behandlung mit Mischungen aus ADNF I und ADNF III-Polypeptiden die postnatale Lernfähigkeit und Gedächtnisfunktion von Tieren erhöhen kann, was für normale Tiere als auch für geistig geschwächte Tiere gilt. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung sind bei dem Hinweis auf ADNF Polypeptide in der Spezifizierung immer Mischungen aus ADNF I und ADNF III-Polypeptiden gemäß dem unabhängigen Patentanspruch 1 gemeint.
Die vorliegende Entdeckung hat bei menschlichen Subjekten für die Verbesserung ihrer Lernfähigkeit, ihrer Gedächtnisfunktion und bei assoziierten geistigen Prozessen signifikante Anwendungszwecke. Selbst normale menschliche Subjekte können von der pränatalen Behandlung mit Mischungen aus ADNF I – und ADNF III-Polypeptiden einen Nutzen ziehen. Zudem findet die vorliegende Entdeckung bei Subjekten Anwendung, die geistig eingeschränkt sind. Wenn zum Beispiel bei einem Fötus diagnostiziert wird, dass er eine geistige Retardierung oder ein Down-Syndrom hat, kann der Fötus in utero mit Mischungen aus ADNF I und ADNF III-Polypeptiden behandelt werden, so dass seine postnatale Lernfähigkeit und seine Gedächtnisfähigkeiten verbessert werden. Selbst ohne spezifische Diagnose einer geistigen Retardierung oder eines Down-Syndroms können Mischungen aus ADNF I- und ADNF III-Polypeptiden vorbeugend und unter bestimmten Umständen an einen Fötus verabreicht werden. Zum Beispiel bei einer familiären Vorgeschichte einer geistigen Retardierung (z. B. fragiles X-Syndrom) können Mischungen aus ADNF I- und ADNF III-Polypeptiden vorbeugend dem Fötus in utero verabreicht werden. In einem anderen Beispiel, wenn die Mutter z. B. älter als 35 ist und folglich ein höheres Risiko hat, ein Baby mit Down-Syndrom oder anderen genetischen Defekten zu bekommen, können dem Fötus in utero Mischungen aus ADNF I- und ADNF III-Polypeptiden vorbeugend verabreicht werden.
Es können verschiedene Parameter gemessen werden, um festzustellen, ob ein ADNF-Polypeptid oder eine Kombination aus ADNF Polypeptiden in vivo die Leistungsfähigkeit (z. B. Lernfähigkeit und Gedächtnis) verbessert. Zum Beispiel kann der Test der versteckten Plattform nach dem Morris-Wasserlabyrinth angewendet werden, der unter Material und Methoden im nachfolgenden beschrieben wird. In der Regel werden Mäuse, die mit ADNF Polypeptiden behandelt werden und Kontrollmäuse (die nicht mit ADNF Polypeptiden behandelt werden) trainiert, um durch Erlernen der Position einer versteckten Plattform und durch Daraufklettern einer Schwimmaufgabe zu entgehen. Die Zeit, die sie brauchen, um diese Aufgabe zu erfüllen, wird als Fluchtlatenz bezeichnet. Dieser Test kann einmal oder mehrmals täglich eine bestimmte Anzahl von Tagen durchgeführt werden. Ein Aufschluss gebender Parameter für verbesserte Lern- und Gedächtnisfähigkeit liegt in der Reduzierung der Reaktionszeit, innerhalb der durch Klettern auf die versteckte Plattform der Schwimmaufgabe entgangen werden kann. Siehe auch die in Gozes et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 427–432 (1996) beschriebenen Methoden. Tiere, die mit geeigneten ADNF-Polypeptiden behandelt werden, werden in ihrer Lernfähigkeit und Gedächtnisfähigkeit im Vergleich zu den Kontrolltieren, die nicht mit ADNF-Polypeptiden behandelt werden, eine Verbesserung aufweisen. Die Ausführungen der Erfindung sind nicht auf die Testbeispiele beschränkt, die zur Messung der Leistung verwendet werden. Es kann jegliche geeignete Testmethode verwendet werden, um die Leistung wie Lernen und Gedächtnis zu messen.
Es können auch andere in der Technik bekannte Methoden bei menschlichen Subjekten angewendet werden, um festzustellen, ob ADNF-Polypeptide oder eine Kombination von ADNF-Polypeptiden die Leistung (z. B. Lernfähigkeit und Gedächtnis) in vivo verbessern. Zum Beispiel umfassen diese Methoden das Prüfen des Gedächtnisses oder der Lernfähigkeit über einen längeren Zeitabschnitt durch den Randt-Gedächtnis-Test (Randt et al., Clin. Neuropsychol. 2: 184 (1980), Wechsler Memory Scale (J. Psych. 19:87–95 (1945), Forward Digit Span test (Craik, Age Differences in Human Memory, in: Handbook of the Psychology of Aging, Birren and Schaffe (Eds.), New York, Van Nostrand (1977), Mini Mental State Exam (Folstein etal., J of Psych. Res. 12: 189–192 (1975), oder California Verbal Learning Test (CVLT)). Siehe auch das US-Patent Nr. 6,030,968. In diesen Tests werden Faktoren geprüft, die nicht mit den ADNF-Polypeptiden (z. B. Ängstlichkeit, Ermüdung, Ärger, Depression, Verwirrung oder Vitalität) in Verbindung stehen. Siehe das US-Patent Nr. 5,063,206. Methoden zum Testen und Kontrollieren von subjektiven Faktoren sind in der Technik bekannt und werden bei solchen klinischen Standardtests wie BECKs Depressionsskala, Spielbergers mehrdimensionaler Ängstlichkeitstest und POMS-Test (Profile of Mood State) untersucht.
Unter einem Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine Methode zur Leistungsverbesserung (z. B. Lernfähigkeit und/oder Gedächtnisfunktion) vor, wobei die Methode entweder die postnatale oder die pränatale Verabreichung von aktivitätsabhängigen neutrotrophischer Faktor (ADNF)-Polypeptiden in einer ausreichenden Menge an ein Subjekt einschließt, um die postnatale Leistung (z. B. Lernfähigkeit und/oder Gedächtnisfunktion) zu verbessern. Die Methoden der Erfindung können bei allen Subjekten angewendet werden, z. B. bei Subjekten, die an einer Neuropathologie wie Alzheimersche Erkrankung, Down-Syndrom, usw. leiden oder bei normalen jungen oder alten Subjekten, oder bei Subjekten in utero. In einer Ausführungsweise wird die Mischung aus ADNF I- und ADNF III-Polypeptiden pränatal dem Subjekt verabreicht, das normale geistige Fähigkeiten aufweist. In einer anderen Ausführungsweise weist das Subjekt eine geistige Retardierung, (z. B. ein fragiles X-Syndrom), eine familiäre Vorgeschichte geistiger Retardierung, ein Down-Syndrom oder eine Mutter auf, die mindestens 35 Jahre alt ist, wenn sie mit dem Subjekt schwanger ist. Vorzugsweise wird die geistige Retardierung, wenn das Subjekt eine aufweist, nicht durch übermäßigen Alkoholkonsum der Mutter während der Schwangerschaft hervorgerufen (d. h. die geistige Retardierung zählt nicht zum fetalen Alkoholsyndrom).
In einer Ausführung wird die Mischung von ADNF I- und ADNF III-Polypeptiden pränatal, z. B. an eine schwangere Mutter durch intraperitoneale oder orale Verabreichung erteilt. In einer anderen Ausführung wird die Mischung aus ADNF I- und ADNF III-Polypeptiden postnatal, z. B. durch intraperitoneale oder orale Verabreichung erteilt. In einer anderen Ausführung wird die Mischung aus ADNF-I und ADNF III-Polypeptiden zum Zeitpunkt der Bildung und/oder Schließung des Neuralrohrs verabreicht.
In einer ersten Ausführungsart umfasst die Methode die Verabreichung einer Mischung aus ADNF I- und ADNF III-Polypeptiden gemäß Anspruch 1, wobei die ADNF I-Polypeptide eine aktive Kernstelle mit der Aminosäuresequenz Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala (SEQ ID NR: 1) umfassen. In einer anderen Ausführungsart umfasst die Methode das Verabreichen eines ADNF I- Polypeptids ganzer Länge. In einer wieder anderen Ausführungsart umfasst die Methode die Verabreichung eines ADNF I-Polypeptids, das aus der Aminosäuresequenz Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala (SEQ ID NR: 1) besteht. In einer wieder anderen Ausführungsart umfasst die Methode die Verabreichung eines ADNF I-Polypeptides, das aus folgender Gruppe ausgewählt wird: Val-Leu-Gly-Gly-Gly-Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala (SEQ ID NR: 14); Val-Glu-Glu-Gly-Ile-Val-Leu-Gly-Gly-GlSer-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala (SEQ ID NR: 15); Leu-Gly-Gly-Gly-Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala (SEQ ID NR: 16); Gly-Gly-Gly-Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala (SEQ ID NR: 17); Gly-Gly-Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala (SEQ ID NR: 18); und Gly-Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala (SEQ ID NR: 19). In einer wieder anderen Ausführungsform umfasst die Methode die Verabreichung eines ADNF I-Polypeptids mit bis zu ca. 20 Aminosäuren an mindestens einem der N-Termini oder C-Termini der aktiven Kernstelle. In manchen Ausführungsformen hat das ADNF I-Polypeptid bis zu 20 Aminosäuren sowohl am N-Terminus als auch am C-Terminus des ADNF I-Polypeptids.
In der ersten Ausführungsart umfasst die Methode die Verabreichung einer Mischung aus ADNF I und ADNF III-Polypeptiden gemäß dem Patentanspruch 1, wobei das ADNF III-Polypeptid eine aktive Kernstelle umfasst, die die Aminosäuresequenz Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln (SEQ ID NR. 2) aufweist. In einer wieder anderen Ausführungsart umfasst die Methode die Verabreichung eines ADNF III-Polypeptids in ganzer Länge. In wieder einer anderen Ausführungsart umfasst die Methode die Verabreichung eines ADNF I-Polypeptids, das aus der Aminosäuresequenz Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln (SEQ ID NR.: 2) besteht. In einer wieder anderen Ausführungsart umfasst die Methode die Verabreichung eines ADNF III-Polypeptids, wobei das ADNF III-Polypeptid aus folgender Gruppe ausgewählt wird: Gly-Gly-Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln (SEQ ID NR: 20); Leu-Gly-Gly-Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln-Gln-Ser (SEQ ID NR: 21 ); Leu-Gly-Leu-Gly-Gly-Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln-Gln-Ser (SEQ ID NR: 22); und Ser-Val-Arg-Leu-Gly-Leu-Gly-Gly-Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln-Gln-Ser (SEQ ID NR: 23). In einer wiederum anderen Ausführungsart umfasst die Methode die Verabreichung eines ADNF III-Polypeptids mit bis zu ca. 20 Aminosäuren an mindestens einem der N-Termini und C-Termini der aktiven Kernstelle. In manchen Ausführungen hat das ADNF III-Polypeptid bis zu 20 Aminosäuren sowohl am N-Terminus als auch am C-Terminus des ADNF III-Polypeptids.
In einer noch anderen Ausführungsart umfasst die Methode die Verabreichung einer Mischung eines ADNF I-Polypeptids und eines ADNF III-Polypeptids. Ein beliebiges oder mehrere hier beschriebene ADNF I-Polypeptide können mit einem beliebigen oder mehreren hier beschriebenen ADNF III-Polypeptiden in diesem oder anderen Aspekten der Erfindung gemischt werden.
In einer anderen Ausführungsart umfasst die aktive Kernstelle des ADNF-Polypeptids mindestens eine D-Aminosäure. In einer anderen Ausführungsart umfasst die aktive Kernstelle des ADNF-Polypeptids alle D-Aminosäuren.
In einer wieder anderen Ausführungsart werden beide ADNF Polypeptide von einer Nucleinsäure codiert, die an das Subjekt verabreicht wird.
In einer wieder anderen Ausführungsart verbessert das ADNF-Polypeptid ein Kurzzeitgedächtnis. In einer noch anderen Ausführungsart verbessert das ADNF-Polypeptid ein Referenzgedächtnis. In einer wieder anderen Ausführungsart wird das ADNF-Polypeptid intranasal oder oral verabreicht.
Diese und andere Aspekte der vorliegenden Erfindung werden Fachleuten aus der folgenden detaillierten Beschreibung der Erfindung, den begleitenden Zeichnungen und den angehängten Patentansprüchen deutlich werden.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1: AF64A-behandelte Ratten weisen ein geschwächtes Lernverhalten und Gedächtnis auf, das durch intranasale Verabreichung von ADNF-9 verbessert wird. Mit erwachsenen Ratten wurden täglich zwei Wasserlabyrinthtests (jeweils A und B) durchgeführt. Bei den getesteten Gruppen handelte es sich um: 1. Kontrolltiere mit Trägerstoff behandelt (20 Tiere, leere Kreise); 2. AF64A-behandelte Tiere, die intranasal mit Trägerstoff behandelt wurden (27 Tiere, leere Quadrate); 3. Kontrolltiere, die durch intranasale Verabreichung mit ADNF-9 behandelt wurden (volle Kreise, 12 Tiere); 4. AF64A-behandelte Tiere, denen intranasal ADNF-9 verabreicht wurde (19 Tiere, volle Quadrate). (A) Es wird die in Sekunden gemessene Reaktionsdauer (Durchschnitt t Standardfehler des Durchschnitts) dargestellt, um die verborgene Plattform in ihrer täglich neuen Aufstellung zu finden (maßgebend für intaktes Referenzgedächtnis, Gordon et al., Neurosci. Lett. 199: 1–4 (1995)). Die Tests wurden an vier aufeinanderfolgenden Tagen durchgeführt. (B) Die in Sekunden gemessene Reaktionszeit, um die versteckte Plattform innerhalb von 0,5 Min. zu erreichen, nachdem man sich darauf befand (maßgebend für richtiges Arbeiten des Gedächtnisprozesses, Gordon et al., Neurosci. Lett. 199: 1–4 (1995); Gozes et al., J. Neurobiol. 33: 329–342. (1997a)). Diese Tests wurden an vier aufeinanderfolgenden Tagen durchgeführt. Es konnte kein Unterschied zwischen den Tieren festgestellt werden, die mit dem Trägerstoff behandelt wurden und den unbehandelten Tieren (nicht dargestellte Daten). (C) Am 5. Testtag wurde die Plattform entfernt und ein räumlicher Probetest durchgeführt. Die Tiere durften 120 Sek. lang schwimmen und es wurde die Zeit aufgezeichnet, die das Tier im Bereich der Plattform verbrachte.
2: AF64A-behandelte Ratten weisen ein geschwächtes Lernverhalten und eine schwächere Gedächtnisfunktion auf, die durch intranasale Verabreichung von NAP verbessert werden. Es wurde das gleiche Experiment wie in 1 (jeweils A, B, C) wiederholt, mit der Ausnahme, dass das verwendete Peptid NAP war und die Anzahl der Tiere jeder experimentellen Gruppe 10–20 war und 27 bei der AF64A-behandelten Gruppe.
3: Intranasal verabreichtes [³H]-NAP gelangt in den Körper und das Gehirn. (A) Zu den genannten Zeitpunkten nach der Verabreichung wurden Tiere geopfert und Gewebeproben gewogen und (in zweifacher Ausführung) in einem ß-Zähler auf Radioaktivität untersucht; es wird ein Durchschnitt von vier Tieren dargestellt. (B) Die Gehirne wurden zu den genannten Zeitpunkten seziert und die Radioaktivität untersucht. (C, D) Intaktes [³H]-NAP erreichte das Gehirn nach intranasaler Verabreichung. Radioaktive Gewebeproben (Gehirnkortex) wurden homogenisiert und einer langsamen Zentrifugation unterzogen. Die Überstände (30 Minuten nach der Anwendung, volle Kreise, C, und 60 Mintuen nach der Anwendung, volle Dreiecke, D) wurden durch HPLC-Fraktionierung auf [³H]-NAP Reste (leere Kreise) analysiert. Die Proben wurden auf Radioaktivität (dpm) in einem ß-Zähler untersucht. Alle Ergebnisse wurden berechnet, um die Radioaktivität in femtomol NAP/g Gewebe darzustellen. (E) Das Experiment wurde mit drei zusätzlichen Tieren wiederholt. Hier wogen die Tiere 200 g anstatt 250–300 g bei A–D und kleine sichtbare Blutgefäße wurden unter Anwendung von Uhrmacherzangen (Nr. 5) entfernt.
4: (A) Intranasale Anwendung von NAP verhütet die Verminderung von Cholinacetyltransferaseaktivität bei AF64A-behandelten Ratten. Es wird die Aufnahme von radioaktiv markiertem Cholin in Acetylcholin gezeigt. Die Ergebnisse wurden in Bezug auf die Kontrollgruppe (100%) kalibriert. Es wurden Experimente mit drei Tieren pro Gruppe (jeweils in dreifacher Ausführung) durchgeführt und wie im Text beschrieben analysiert. (B) AF64A-behandelte Ratten weisen eine Schwächung der Lernfähigkeit und des Gedächtnisses auf, d. h. langfristige Wirkungen von NAP, jedoch nicht der ADNF-9 Behandlung. Pro experimentelle Gruppe wurden zehn männliche Ratten verwendet (wie im Abschnitt über die Methoden beschrieben). Es wurden vier Gruppen verwendet, drei davon wurden mit AF64A behandelt und eine Gruppe wurde mit Kochsalz behandelt (Kontrollgruppe). Den Ratten wurde eine Woche lang Erholung erteilt, anschließend wurden zwei AF64A-Gruppen (intranasal) entweder mit ADNF-9 oder NAP behandelt. Nach 5 Behandlungstagen wurde den Tieren eine zweitägige Erholung verordnet und anschließend wurden sie täglichen Wasserlabyrinthtests (wie in 1 und 2 gezeigt) unterzogen. Der Unterschied zwischen diesem Experiment und den Experimenten aus 1 und 2 liegt darin, dass die Tiere keine tägliche intranasale Verabreichung von Peptiden vor ihrem Verhaltenstest erhielten. Die Figur stellt den zweiten täglichen Test dar, der für das Kurzzeitgedächtnis maßgebend ist.
5 zeigt die Auswirkungen einer pränatalen Behandlung von Tieren mit einer Mischung aus L-NAP und L-SAL (intraperitoneale Injektion) auf die durch den Morris-Wasserlabyrinthtest geprüfte Lernfähigkeit.
6 zeigt die Auswirkungen einer pränatalen Behandlung von Tieren mit einer Mischung aus D-NAP und D-SAL (orale Verabreichung) auf die durch den Morris-Wasserlabyrinthtest geprüfte Lernfähigkeit.
7 zeigt die Auswirkungen einer pränatalen Behandlung von Tieren mit D-SAL (orale Verabreichung) auf die durch den Morris-Wasserlabyrinthtest geprüfte Lernfähigkeit.
8 zeigt die Auswirkungen einer pränatalen Behandlung von Tieren mit D-NAP (orale Verabreichung) auf die durch den Morris-Wasserlabyrinthtest geprüfte Lernfähigkeit.
9 zeigt die Auswirkungen einer pränatalen Behandlung von Tieren mit einer doppelten Dosis an D-SAL (orale Verabreichung) auf die durch den Morris-Wasserlabyrinthtest geprüfte Lernfähigkeit.
10 zeigt die Auswirkungen einer pränatalen Behandlung von Tieren mit einer Mischung aus D-NAP und D-SAL (orale Verabreichung) auf die durch einen Probentest geprüfte Lernfähigkeit.
DEFINITIONEN
Der Begriff "ADNF Polypeptid" bezieht sich auf einen oder mehrere aktivitätsabhängige neurotrophische Faktoren (ADNF), die eine aktive Kernstelle mit der Aminosäuresequenz SALLRSIPA (als "SAL" bezeichnet) oder NAPVSIPQ (als "NAP" bezeichnet) oder auf konservative Weise modifizierte Varianten davon haben, die eine neurotrophische/neuroprotektive Aktivität aufweisen, wie sie in einer von z. B. Hill et al., Brain Res. 603,222–233 (1993) beschriebenen In-vitro-Kultur kortikaler Neuronen gemessen wird; Venner & Gupta, Nucleic Acid Res. 18, 5309 (1990); und Peralta etal., Nucleic Acid Res. 18, 7162 (1990); Brenneman et al., Nature 335, 636 (1988); oder Brenneman et al., Dev. Brain Res. 51: 63 (1990); Forsythe & Westbrook, J. Physiol. Lond. 396: 515 (1988). Ein ADNF-Polypeptid kann ein ADNF I-Polypeptid, ein ADNF III-Polypeptid, deren Allele, polymorphische Varianten, Gegenstücke, zwischenartliche Homologe, oder eine beliebige Subsequenz davon sein (z. B. SALLRSIPA oder NAPVSIPQ), die entweder in vitro oder in vivo eine neuroprotektive/neurotrophische Aktion auf z. B. die Neuronenentstehung im zentralen Nervensystem haben. Ein "ADNF Polypeptid" kann sich auch auf eine Mischung aus einem ADNF I Polypeptid und einem ADNF III-Polypeptid beziehen. Zur Erfindung zählen nur Mischungen aus ADNF I und ADNF III-Polypeptiden.
Der Begriff "ADNF I" bezieht sich auf ein aktivitätsabhängiger neurotrophischer Faktor-Polypeptid mit einem Molekulargewicht von ca. 14.000 Dalton mit einer pl von 8,3 ± 0,25. Wie vorausgehend beschrieben, haben die ADNF I-Polypeptide eine aktive Kernstelle mit einer Aminosäuresequenz von Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala (auch als "SALLRSIPA" oder "SAL" oder "ADNF-9" bezeichnet). Siehe Brenneman et al., J. Clin. Invest., 97:2299–2307 (1996), Glazner et al., Anat. Embryol. (In Druck), Brenneman et al., J.Pharm. Exp.Ther., 285: 619–27 (1998), Gozes & Brenneman, J. Mol. Neurosci. 7: 235–244 (1996), und Gozes et al., Dev. Brain Res. 99: 167–175 (1997). Wenn nicht anders angegeben, bezieht sich "SAL" auf ein Peptid mit einer Aminosäuresequenz von Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala und nicht auf ein Peptid mit einer Aminosäuresequenz von Ser-Ala-Leu. Ein ADNF I mit einer vollen Aminosäuresequenz kann in WO 96/11948 gefunden werden.
Die Begriffe "ADNFIII" und "ADNP" beziehen sich auf ein aktivitätsabhängiger neurotrophischer Faktor-Polypeptid mit einem vorhergesehenen Molekulargewicht von ca. 95 kDa (ca. 828 Aminosäurenrückstände) und einem pl von ca. 5,99. Wie vorausgehend beschrieben, haben ADNF III -Polypeptide eine aktive Kernstelle, die eine Aminosäuresequenz von Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln enthält (auch mit "NAPVSIPQ" oder "NAP" bezeichnet). Siehe Bassan et al., J. Neurochem. 72:1283–1293 (1999). Wenn nicht anderweitig angegeben, bezieht sich „NAP" auf ein Peptid, das eine Aminosäuresequenz von Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln enthält, nicht auf ein Peptid mit einer Aminosäuresequenz von Asn-Ala-Pro. Die Sequenzen der ganzen Länge von ADNF III können in WO 98/35042 und WO 00/27875 gefunden werden.
Der Ausdruck "Verbesserung der Lernfähigkeit und/oder Gedächtnisfunktion" bezieht sich auf eine Verbesserung oder eine Steigerung mindestens eines Parameters, der für die Lernfähigkeit und Gedächtnisfunktion maßgebend ist. Verbesserung oder Steigerung bedeutet eine Änderung eines Parameters um mindestens 10%, wahlweise um mindestens ca. 20%, um mindestens ca. 30%, um mindestens ca. 40%, um mindestens ca. 50%, um mindestens ca. 60%, um mindestens ca. 70%, um mindestens ca. 80%, um mindestens ca. 90%, um mindestens ca. 100%, um mindestens ca. 150%, um mindestens ca. 200%, usw. Die Verbesserung der Lernfähigkeit und Gedächtnisfunktion kann durch jegliche in der Technik bekannte Art gemessen werden. Zum Beispiel können ADNF Polypeptide, die die Lernfähigkeit und Gedächtnisfunktion verbessern, durch das Morris-Wasserlabyrinth beurteilt werden (siehe z. B. den Abschnitt über Materialien und Methoden). Siehe auch Gozes et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 427–432 (1996). Die Gedächtnisfunktion und Lernfähigkeit können auch unter Anwendung jeglicher hier beschriebener Methode oder andere dem Fachmann bekannten Methoden wie z. B. dem Randt Gedächtnistest, der Wechsler Gedächtnisskala, dem Zahlenspannentest vorwärts oder dem Kalifornischen Sprachlerntest beurteilt werden.
Der Begriff "Gedächtnis" umfasst alle medizinischen Klassifizierungen von Gedächtnis, z. B. sensorisches, Sofort-, Kurzzeit- und Altgedächtnis, sowie in der Psychologie verwendete Begriffe wie Referenzgedächtnis, das sich auf eine Information bezieht, die aus früherer Erfahrung, entweder aus dem Kurzzeit- oder dem Altgedächtnis gewonnen wurde (siehe z. B. Harrison's Principles of Internal Medicine, Band 1, Seiten 142–150 (Fauci et al., eds., 1988).
Pathologien oder Neuropathologien, die aus den therapeutischen und diagnostischen Anwendungen dieser Erfindung einen Nutzen ziehen, umfassen zum Beispiel folgende Krankheiten:
Erkrankungen von zentralen motorischen Systemen inklusive degenerative Zustände, die die Großhirnganglien angreifen (Morbus Huntington, Wilson, striatonigrale Degeneration, corticobasale ganglionäre Degeneration), Tourette-Syndrom, Morbus Parkinson, progressive supranukleare Lähmung, progressive bulbäre Lähmung, familiäre spastische Paraplegie, Rückenmarkatrophie, ALS und Varianten davon, dentatorubrale Atrophie, olivopontozerebellare Atrophie, paraneoplastische zerebellare Degeneration und dopamine Toxizität;
Krankheiten, die sensorische Neuronen angreifen, wie Friedreichs Ataxie, Diabetes, periphere Neuropathie, retinale neuronale Degeneration;
Erkrankungen des limbischen und kortikalen Systems wie zerebrale Amyloid-Angiopathie, Pick-Atrophie, Rett-Syndrom;
neurodegenerative Pathologien, die multiple neuronale Systeme und/oder den Gehirnstamm betreffen und Alzheimersche Erkrankung, AIDS-bezogene Demenz, Leigh-Erkrankung, diffuse Lewy-Körperchen Erkrankung, Epilepsie, multiple Systematrophie, Guillain-Barre-Syndrom, lysosomale Speicherkrankheiten wie Lipofuszinose, spätdegenerative Stadien des Down-Syndroms, Morbus Alper, Schwindelgefühl als Ergebnis von ZNS-Degeneration;
Pathologien im Zusammenhang mit Entwicklungsretardierung und Lernschwächen, Down-Syndrom und durch oxidativen Stress induzierter Neuronentod;
Pathologien in Zusammenhang mit dem Altern und chronischem Alkohol- und Drogenmissbrauch mit z. B. der Degeneration von Neuronen aufgrund Alkoholismus im Locus coeruleus, Zerebellum, cholinergen basalen Vorderhirn; mit Altersdegeneration von zerebralen und kortikalen Neuronen, die zu kognitiven und motorischen Schwächen führen; und aufgrund chronischem Amphetaminmissbrauch eine Degeneration der basalen ganglionären Neuronen, die zu motorischen Schwächen führt;
pathologische Veränderungen, die auf ein fokales Trauma wie einen Schlaganfall, eine fokale Ischämie, vaskuläre Insuffizienz, hypoxische-ischämische Enzephalopathie, Hyperglykämie, Hypoglykämie, geschlossenes Schädeltrauma oder direktes Trauma zurückzuführen sind;
Pathologien, die auf eine negative Nebenwirkung von therapeutischen Medikamenten und Behandlungen zurückzuführen sind (Degeneration von cingulaten und entorhinalen Kortexneuronen als Reaktion auf Antikonvulsions-Dosen von Antagonisten der NMDA-Glutamatrezeptoren).
Der Begriff "räumliches Lernen" bezieht sich auf das Erlernen seiner Umgebung und erfordert die Kenntnis darüber, wo welche Gegenstände sind. Er bezieht sich auch auf die Aufnahme der Information und deren Anwendung über die Beziehungen zwischen den zahlreichen Dingen der Umwelt. Räumliches Lernen kann bei Tieren dadurch getestet werden, dass man den Tieren erlaubt, die Anordnung von Belohnungen zu erlernen und räumliche Hinweise zu nutzen, um sich an die Anordnungen zu erinnern. Zum Beispiel kann das räumliche Lernen getestet werden, wenn ein radiales Armlabyrinth (z. B. Erlernen, in welchem Arm es Futter gibt) oder ein Morris-Wasserlabyrinth (z. B. Erlernen, wo die Plattform ist) verwendet wird. Um diese Aufgaben zu erfüllen, benutzen die Tiere Hinweise aus dem Testraum (Lage von Objekten, Gerüche usw.). Räumliches Lernen kann auch beim Menschen so getestet werden. Zum Beispiel kann man ein Subjekt bitten, eine Zeichnung zu machen und dann die Zeichnung wegnehmen. Anschließend bittet man das Subjekt, dieselbe Zeichnung aus dem Gedächtnis zu machen. Die letzte Zeichnung des Subjekts gibt den Grad des räumlichen Lernens der Testperson wieder.
Der Begriff "Subjekt" bezieht sich auf alle Säuger, insbesondere auf Menschen und in allen Lebensabschnitten. Zum Beispiel kann sich das Subjekt auf einen Embryo, Fötus, ein Baby, ein Kind, einen Jugendlichen oder einen Erwachsenen beziehen.
Ein „normales" Subjekt oder ein Subjekt mit „normalen geistigen Fähigkeiten" bezieht sich auf ein Subjekt, dessen intellektueller Funktionsgrad um oder über dem Durchschnitt liegt (z. B. mit einem IQ über 75). Ein „normales" Subjekt kann sich auch auf ein Subjekt beziehen, wie z. B. einen Fötus, von dem man nicht meint, dass er irgendwelche geistige Schwächen hat (z. B. gemäß einer Fruchtwasseruntersuchung) und/oder keine Risikofaktoren aufweist (z. B. familiäre Vorgeschichte einer geistigen Retardierung oder eine Mutter, die während der Schwangerschaft übermäßig Alkohol konsumierte und so ein fetales Alkoholsyndrom beim Fötus verursachte).
Bei einem Subjekt erachtet man entsprechend den drei folgenden Kriterien, ob eine „geistige Retardierung" vorliegt: der intellektuelle Funktionsgrad (IQ) liegt unter 70–75; es bestehen signifikante Einschränkungen in zwei oder mehr Lernbereichen; und der Zustand besteht von Kindheit an (als 18 Jahre und darunter definiert) (AAMR, 1992). Unter Lernbereiche fallen die, die täglich zum Leben, Arbeiten und Spielen in der Gemeinschaft erforderlich sind. Sie schließen Kommunikation, Selbstpflege, zuhause leben, soziale Fähigkeiten, Freizeit, Gesundheit und Sicherheit, eigene Lebensführung, zweckmäßige Grundfächer (Lesen, Schreiben, Mathematikgrundkenntnisse) Gemeinschaftssinn und -arbeit ein. Siehe http://www.thearc.org/fags/mrga. html.
Unter dem Begriff „Down-Syndrom" ist eine chromosomale Störung zu verstehen, zu der es kommt, wenn anstatt der normalen Ergänzung von 2 Kopien des Chromosoms 21, es zu einem ganzen oder manchmal einem Teil eines zusätzlichen Chromosoms 21 kommt.
Der Begriff "Kontaktierung" wird hier austauschbar mit folgenden Begriffen verwendet: kombiniert mit, hinzugefügt zu, vermischt mit, gegeben über, inkubiert mit, überströmt von, usw. Zudem können die ADNF Polypeptide oder die sie codierenden Nucleinsäuren der vorliegenden Erfindung auf eine beliebige Art, wie zum Beispiel parenteral, oral, topisch und durch Inhalation „verabreicht" werden. In den hier bevorzugten Ausführungsweisen werden parenterale Verabreichung und nasale Inhalation angewendet.
„Eine ausreichende Menge" oder „eine wirkungsvolle Menge" ist die Menge eines bestimmten ADNF Polypeptids, durch die die Leistung verbessert wird (z. B. Lernfähigkeit und/oder Gedächtnisfunktion). Zum Beispiel ist im Zusammenhang einer verbesserten Lernfähigkeit und Gedächtnisfunktion „eine ausreichende Menge" oder „eine wirkungsvolle Menge" eines bestimmten ADNF Polypeptids die Menge, die die Reaktionszeit zum Finden der Plattform bei einem Wasserlabyrinth-Test reduziert, entweder beim ersten täglichen Test (maßgebend für das Referenzgedächtnis) oder beim zweiten täglichen Test (maßgebend für das Kurzzeitgedächtnis). Der Dosierungsbereich kann abhängig vom verwendeten ADNF-Polypeptid, der Verabreichungsart, und der Fähigkeit des besonderen ADNF-Polypeptids variieren, kann jedoch durch Anwendung der vorhergehenden Tests leicht bestimmt werden.
Die Begriffe "isoliert", "gereinigt" oder "biologisch rein" beziehen sich auf ein Material, das im Wesentlichen oder hauptsächlich frei von Komponenten ist, die ihn normalerweise in seinem Naturzustand begleiten. Reinheit und Homogenität werden herkömmlicher Weise unter Anwendung von analytischen chemischen Techniken wie Polyacrylamidgelelektrophorese oder Hochleistungsflüssigchromatographie bestimmt. Ein Protein, das die vorherrschende, in einer Präparation vorhandene Art ist, ist im Wesentlichen gereinigt. Insbesondere wird eine isolierte ADNF-Nucleinsäure von offenen Leserastern abgetrennt, die das ADNF-Gen flankieren und andere Proteine als ADNF codieren. Der Begriff „gereinigt" weist darauf hin, dass eine Nucleinsäure oder ein Protein im Wesentlichen zu einem Band in einem Elektrophoresegel führt. Insbesondere bedeutet dies, dass die Nucleinsäure oder das Protein zumindest zu 85 % rein ist, vorzugsweise zu mindestens 95% rein ist und am besten zu mindestens 99% rein ist.
Der Begriff „Nucleinsäure" bezieht sich auf Desoxyribonucleotide oder Ribonucleotide und Polymere davon in einfach- oder doppelstrangiger Form. Der Begriff umfasst Nucleinsäuren, die bekannte Nucleotidanaloga oder modifizierte Basisrückstände oder Verbindungen enthalten, die synthetisch sind, in der Natur vorkommen oder nicht vorkommen, die ähnliche Bindungseigenschaften haben als die Referenznucleinsäure und die auf ähnliche Weise als die Referenznucleotide metabolisiert werden. Beispiele solcher Analoga umfassen ohne Einschränkung Phosphorothioate, Phosphoramidate, Methylphosphonate, Chiral-Methyl-Phosphonate, 2-0-Methyl-Ribonucleotide, Peptidnucleinsäuren (PNAs).
Wenn nicht anders angegeben, umfasst eine besondere Nucleinsäuresequenz stillschweigend auch die auf konservative Art modifizierten Varianten davon (z. B. degenerierte Codonsubstitutionen) und ergänzende Sequenzen, sowie die speziell angegebene Sequenz. Der Begriff Nucleinsäure wird austauschbar mit Gen, cDNA, mRNA, Oligonucleotid und Polynucleotid verwendet.
Die Begriffe "Polypeptid", "Peptid" und "Protein" werden hier in austauschbarer Weise verwendet, um sich auf ein Polymer von Aminosäureresten zu beziehen. Die Begriffe beziehen sich auf Aminosäurepolymere, in denen ein oder mehrere Aminosäurerückstände ein Gegenstück oder eine Nachahmung einer entsprechenden in der Natur vorkommenden Aminosäure sind, sowie auch zu natürlich vorkommenden Aminosäurepolymeren.
Der Begriff "Aminosäure" bezieht sich auf natürlich vorkommende Aminosäuren, Gegenstücke von Aminosäuren und Nachbildungen von Aminosäuren, die auf ähnliche Weise funktionieren als die natürlich vorkommenden und Gegenstücke von Aminosäuren. Natürlich vorkommende Aminosäuren sind solche, die vom genetischen Code codiert werden, sowie solche Aminosäuren, die später modifiziert werden, z. B. Hydroxyprolin, γ-Carboxyglutamat und O-Phosphoserin.
Gegenstücke von Aminosäuren beziehen sich auf synthetische Aminosäuren mit derselben chemischen Grundstruktur als eine natürlich vorkommende Aminosäure, z. B. ein α-Carbon, das an Wasserstoff, eine Carboxylgruppe, eine Aminogruppe und eine R-Gruppe gebunden ist (z. B. Homoserin, Norleucin, Methioninsulfoxid, Methioninmethylsulfonium). Solche Gegenstücke haben modifizierte R-Gruppen (z. B. Norleucin) oder modifizierte Peptidgrundsteine, behalten jedoch die gleiche chemische Grundstruktur als eine natürlich vorkommende Aminosäure. Sowohl die natürlich vorkommende als auch das Gegenstück der Aminosäure können synthetisch hergestellt werden. Nachbildungen von Aminosäuren beziehen sich auf chemische Verbindungen mit einer Struktur, die sich von der allgemeinen chemischen Struktur einer Aminosäure unterscheidet, die jedoch in ähnlicher Weise wie eine natürlich vorkommende Aminosäure funktionieren.
Aminosäuren können hier entweder durch ihre allgemein bekannten Symbole mit drei Buchstaben oder durch die von der IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature empfohlenen Symbole mit einem Buchstaben ausgedrückt werden. Ebenso können Nucleotide durch ihre allgemein angenommenen Codes mit einem Buchstaben ausgedrückt werden.
"Konservativ modifizierte Varianten" bezieht sich sowohl auf Aminosäuren als auch auf Nucleinsäuresequenzen. In Bezug auf besondere Nucleinsäuresequenzen beziehen sich konservativ modifizierte Varianten auf solche Nucleinsäuren, die für identische oder im Wesentlichen identische Aminosäuresequenzen codieren, oder bei denen die Nucleinsäure keine Aminosäuresequenz bis im Wesentlichen identische Sequenzen codiert. Spezifische, degenerierte Codonsubstitutionen können durch Herstellen von Sequenzen erreicht werden, in denen die dritte Position von einem oder mehreren ausgewählten (oder allen) Codonen durch einen Rückstand gemischter Basis und/oder Deoxyinosinrückstände ersetzt wird (Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19: 5081(1991); Ohtsuka et al., J : Biol. Chem. 260: 26052608 (1985); Rossolini et al., MoL Cell. Probes 8: 91–98 (1994)). Aufgrund der Degeneration des genetischen Codes codiert eine große Anzahl von gleich funktionierenden Nucleinsäuren ein beliebiges bestimmtes Protein. Zum Beispiel codieren die Codone GCA, GCC, GCG und GCU alle die Aminosäure Alanin. Daher kann an jeder Stelle, an der durch ein Codon ein Alanin spezifiziert ist, das Codon in ein beliebiges der entsprechenden beschriebenen Codone umgewandelt werden, ohne das codierte Polypeptid zu ändern. Bei solchen Nucleinsäurevariationen handelt es sich um „stille Variationen", die eine Art der konservativ modifizierten Variationen darstellen. Jede hier genannte Nucleinsäuresequenz, die für ein Polypeptid codiert, beschreibt auch jede mögliche stille Variation der Nucleinsäure. Ein Fachmann wird erkennen, dass jedes Codon in einer Nucleinsäure (außer AUG, das normalerweise das einzige Codon für Methionin ist und TGG, das normalerweise das einzige Codon für Tryptophan ist) geändert werden kann, um ein identisches Molekül hinsichtlich der Funktion hervorzubringen. Demgemäß wird jede stille Variation einer Nucleinsäure, die für ein Polypeptid codiert, in jeder beschriebenen Sequenz miteinbezogen.
Wie bei Aminosäuresequenzen wird ein Fachmann erkennen, dass einzelne Substitutionen, Deletionen oder Additionen zu einer Nucleinsäure, einem Peptid, Polypeptid oder einer Proteinsequenz, die eine einzige Aminosäure oder einen geringen Prozentsatz von Aminosäuren in der codierten Sequenz ändert, hinzufügt oder verliert, eine „konservativ modifizierte Variante" bildet, wenn die Änderung zur Substitution einer Aminosäure durch eine chemisch ähnliche Aminosäure führt. Konservative Substitutionstabellen, die zu ähnlich funktionierenden Aminosäuren führen, sind in der Technik gut bekannt. Solche konservativ veränderte Varianten sind zusätzlich zu polymorphen Varianten, zwischenartlichen Homologen und Allelen der Erfindung und schließen diese nicht aus.
Folgende Gruppen umfassen jeweils Aminosäuren, die konservative Substitutionen zueinander darstellen:

1) Alanin (A), Glycin (G);
2) Serin (S), Threonin (T);
3) Asparaginsäure (D), Glutaminsäure (E);
4) Asparagin (N), Glutamin (Q);
5) Cystein (C), Methionin (M);
6) Arginin (R), Lysin (K), Histidin (H);
7) Isoleucin (1), Leucin (L), Valin (V); und
8) Phenylalanin (F), Tyrosin (Y), Tryptophan (W).
(siehe z. B. Creighton, Proteins (1984)).

Die Begriffe "identisch" oder Prozent-"Identität" im Zusammenhang mit zwei oder mehreren Nucleinsäuren oder Polypeptidsequenzen beziehen sich auf zwei oder mehrere Sequenzen oder Subsequenzen, die identisch sind oder einen spezifizierten Prozentsatz von identischen Aminosäurerückständen oder Nucleotiden (d. h. 70% Identität) haben, wenn sie über ein Vergleichsfenster auf maximale Übereinstimmung verglichen und aufgereiht werden, wie sie unter Anwendung der folgenden Sequenzvergleichsalgorithmen oder durch manuellen Abgleich und visuelle Inspektion gemessen werden. Solche Sequenzen werden dann als „im Wesentlichen identisch" bezeichnet. Diese Definition bezieht sich auch auf die Ergänzung einer Testsequenz. Vorzugsweise besteht die prozentuale Übereinstimmung an einer Sequenzregion, die mindestens rund 25 Aminosäuren lang ist, bevorzugter ist eine Region, die zwischen 50 oder 100 Aminosäuren lang ist.
Zum Sequenzvergleich wirkt typischerweise eine Sequenz als Referenzsequenz, mit der Testsequenzen verglichen werden. Bei der Anwendung eines Sequenzvergleichsolgorithmus werden die Test- und Referenzsequenzen in einen Computer eingegeben, es werden Koordinaten von Subsequenzen bestimmt und wenn erforderlich werden Sequenzalgorithmusprogrammparameter bestimmt. Es können vorgegebene Programmparameter verwendet werden oder alternative Parameter bestimmt werden. Der Sequenzvergleichsalgorithmus berechnet dann basierend auf den Programmparametern die prozentuale Sequenzübereinstimmung bei den Testsequenzen in Bezug auf die Referenzsequenz.
Ein wie hier verwendetes "Vergleichsfenster" umschließt die Referenz zu einem Segment einer beliebigen Anzahl von angrenzenden Positionen, die aus der von 20 bis 600 bestehenden Gruppe, üblicherweise zwischen ca. 50 und ca. 200, noch häufiger zwischen ca. 100 und ca. 150 ausgewählt werden, in der eine Sequenz mit einer Referenzsequenz mit der gleichen Anzahl an angrenzenden Positionen verglichen wird, nachdem die beiden Sequenzen optimal abgeglichen werden. Methoden zum Abgleich von Sequenzen zu deren Vergleich sind in der Technik wohl bekannt. Ein optimaler Abgleich von Sequenzen zum Vergleich kann z. B. durch den lokalen homologen Algorithmus von Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981), durch den homologen Abgleichalgorithmus von Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 (1970), durch die Suche nach der Ähnlichkeitsmethode von Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85: 2444 (1988), durch computergesteuerte Ausführungen dieser Algorithmen (GAP, BESTFIT, FASTA, und TFASTA im Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), oder durch manuellen Abgleich und visuelle Inspektion (siehe z. B. Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., zusätzliche Ausgabe 1995)) gemacht werden.
Ein bevorzugtes Algorithmusbeispiel, das sich zum Bestimmen der prozentualen Sequenzidentität und Sequenzähnlichkeit eignet, sind der BLAST- und BLAST 2.0-Algorithmus, die jeweils in Altschul et al., Nuc. Acids Res. 25:3389–3402 (1977) und Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403–410 (1990) beschrieben werden. BLAST und BLAST 2.0 werden mit den hier beschriebenen Parametern verwendet, um die prozentuale Sequenzübereinstimmung von Nucleinsäuren und Proteinen der Erfindung zu bestimmen. Die Software zur Durchführung der BLAST Analysen ist über das National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) der Öffentlichkeit verfügbar. Dieser Algorithmus beinhaltet als erstes das Identifizieren von hohen Sequenzauswertungspaaren (HSP) durch das Identifizieren von kurzen Wörtern der Länge W in der abgefragten Sequenz, die entweder einigen positivwertigen Grenzwerten T entsprechen oder sie zufrieden stellen, wenn sie mit einem Wort derselben Länge in einer Datenbanksequenz abgeglichen werden. T wird als Grenzwert des benachbarten Wortes (Altschul et al., supra) eingestuft. Diese ursprünglichen Nachbarworttreffer dienen als Ausgangspunkt zum Starten von Suchvorgängen nach längeren HSPs, die sie enthalten. Die Worttreffer werden in beide Richtungen entlang jeder Sequenz so weit ausgedehnt, so weit der kumulative Abgleichstand erhöht werden kann. Die kumulativen Stände werden für Nucleotidsequenzen unter Anwendung der Parameter M berechnet (Belohnungsbewertung für ein Paar übereinstimmender Rückstände; immer > 0) und N (Strafbewertung für nicht identische Rückstände; immer < 0). Für Aminosäuresequenzen wird eine Auswertungsmatrix verwendet, um den kumulativen Stand zu berechnen. Die Ausdehnung der Worttreffer in jede Richtung wird angehalten, wenn: der kumulative Abgleichstand um die Menge X von seinem maximal erreichten Wert abfällt; der kumulative Stand auf null oder darunter zurückgeht, aufgrund der Ansammlung eines oder mehrerer negativwertiger Rückstandabgleiche; oder das Ende der einen der zwei Sequenzen erreicht wurde. Die BLAST-Algorithmusparameter W, T, und X bestimmen die Empfindlichkeit und Geschwindigkeit des Abgleichs. Das BLASTN-Programm (für Nucleotidsequenzen) verwendet als Vorgabe eine Wortlänge (W) von 11, eine Erwartung (E) von 10, M=5, N=–4 und einen Vergleich beider Stränge. Bei Aminosäuresequenzen verwendet das BLASTP-Programm als Vorgabe eine Wortlänge von 3, eine Erwartung (E) von 10, und die BLOSUM62 Standmatrix (siehe Henikoff & Henikoff, Proc. Natl.Acad Sci. USA 89: 10915 (1989)) 50 Abgleiche (B), 10 Erwartungen (E) 10, M=5, N=–4 und einen Vergleich von beiden Strängen.
Der BLAST Algorithmus führt auch eine statistische Analyse der Ähnlichkeit zwischen zwei Sequenzen durch (siehe z. B. Karlin & Altschul, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 90: 5873–5787 (1993)). Eine Messung der vom BLAST Algorithmus bereitgestellten Ähnlichkeit ist die kleinste Summenwahrscheinlichkeit (P (N)), die einen Hinweis auf die Wahrscheinlichkeit liefert, mit der es zwischen zwei Nucleotid- oder Aminosäuresequenzen zufällig zu einer Übereinstimmung kommt. Zum Beispiel wird eine Nucleinsäure als ähnlich in Bezug auf eine Referenzsequenz erachtet, wenn die geringste Summenwahrscheinlichkeit im Vergleich der Testnucleinsäure zur Referenznucleinsäure geringer als ca. 0,2 ist, vorzugsweise geringer als ca. 0,01, und noch besser geringer als ca. 0,001.
Ein Hinweis dafür, dass zwei Nucleinsäuresequenzen oder Polypeptide im Wesentlichen identisch sind, liegt darin, dass das von der ersten Nucleinsäure codierte Polypeptid wie nachfolgend beschrieben eine immunologische Kreuzreaktion mit den Antikörpern gegen das von der zweiten Nucleinsäure codierte Polypeptid eingeht. Daher ist ein Polypeptid typischerweise im Wesentlichen mit einem zweiten Polypeptid identisch, z. B., wenn die beiden Peptide sich nur durch konservative Substitutionen unterscheiden. Ein weiterer Hinweis darauf, dass zwei Nucleinsäuresequenzen im Wesentlichen identisch sind, liegt darin, dass die zwei Moleküle oder ihre Ergänzungen, wie nachstehend beschrieben, unter strengen Bedingungen miteinander hybridisieren. Ein wieder anderer Hinweis dafür, dass zwei Nucleinsäuresequenzen im Wesentlichen identisch sind, liegt darin, dass dieselben Primer verwendet werden können, um die Sequenz zu amplifizieren.
Der Begriff "hybridisiert selektiv zu (oder spezifisch zu)" bezieht sich auf das Binden, Verdoppeln oder Hybridisieren eines Moleküls nur zu einer bestimmten Nucleotidsequenz unter strengen Hybridisierungsbedingungen, wenn diese Sequenz in einer komplexen Mischung vorhanden ist (z. B. völlige Zell- oder Bibliothek-DNA oder -RNA).
Der Begriff "strenge Hybridisierungsbedingungen" bezieht sich auf Bedingungen, unter denen eine Probe zu ihrer Zielsubsequenz hybridisiert, typischerweise in einer komplexen Mischung aus Nucleinsäuren, jedoch zu keinen anderen Sequenzen. Strenge Bedingungen sind sequenzabhängig und sind unter unterschiedlichen Umständen verschieden. Längere Sequenzen hybridisieren spezifisch bei höheren Temperaturen. Ein ausführlicher Führer hinsichtlich dem Hybridisieren von Nucleinsäuren ist in Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Probes, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays" (1993) zu finden. In der Regel werden strenge Bedingungen ausgewählt, so dass sie ca. 5–10° C unter dem thermischen Schmelzpunkt (T_m) für die spezifische Sequenz bei einer definierten ionischen pH-Stärke sind. Der T_m ist die Temperatur (bei einer definierten Ionenstärke, einem bestimmten pH und einer Nucleinkonzentration), bei der 50% der Proben, die zum Ziel ergänzend sind, bei Gleichgewicht (da die Zielsequenzen im Überfluss vorhanden sind, sind bei T_m 50 % der Proben bei Gleichgewicht besetzt) zur Zielsequenz hybridisieren. Strenge Bedingungen sind solche, unter denen die Salzkonzentration unter ca. 1,0 M Natriumionen liegt, typischennreise bei einer Natriumionenkonzentration (oder anderen Salzen) von ca. 0,01 bis 1,0 M bei einem pH-Wert von 7,0 bis 8,3 und einer Temperatur von mindestens ca. 30° C bei kurzen Proben (z. B. 10 bis 50 Nucleotide) und mindestens ca. 60° C bei langen Proben (z. B. über 50 Nucleotide). Strenge Bedingungen können auch durch Hinzufügen von destabilisierenden Stoffen wie Formamid erreicht werden. Für eine selektive oder spezifische Hybridisierung beträgt ein positives Signal mindestens zweimal den Hybridisierungshintergrund, vorzugsweise 10 Mal den Hybridisierungshintergrund. Vorbildlich strenge Hybridisierungsbedingungen können wie folgt sein: 50% Formamid, 5 × SSC und 1 % SDS, Inkubieren bei 42° C, oder 5 × SSC, 1 % SDS, Inkubieren bei 65° C, mit Waschen in 0,2 × SSC und 0,1% SDS bei 65° C.
Nucleinsäuren, die unter strengen Bedingungen nicht zueinander hybridisieren, sind noch immer im Wesentlichen identisch, wenn die Polypeptide, für die sie codieren, noch im Wesentlichen identisch sind. Dazu kommt es zum Beispiel, wenn eine Kopie einer Nucleinsäure unter Anwendung der durch den genetischen Code möglichen maximalen Codondegenerenz erzeugt wird. In solchen Fällen hybridisieren die Nucleinsäuren typischerweise unter mäßig strengen Hybridisierungsbedingungen. Vorbildlich „mäßig strenge Hybridisierungsbedingungen" schließen eine Hybridisierung in einem Puffer von 40% Formamid, 1 M NaCl, 1% SDS bei 37° C und einem Waschen in 1X SSC bei 45° C ein. Eine positive Hybridisierung beträgt mindestens zweimal so viel wie die Hintergrundhybridisierung. Fachleute werden einfach erkennen, dass alternative Hybridisierung und Waschbedingungen verwendet werden können, um Bedingungen von ähnlicher Strenge zu erreichen.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG UND BEVORZUGTE AUSFÜHRUNGSWEISEN
VERFAHREN ZUR LEISTUNGSVERBESSERUNG
Die vorliegende Erfindung liefert ein Verfahren zur Verbesserung der Leistungsfähigkeit (z. B. Lernfähigkeit und/oder Gedächtnisfunktion) bei einem Subjekt. Das Verfahren umfasst entweder die pränatale oder postnatale Verabreichung einer Mischung aus ADNF Polypeptiden in einer ausreichenden Menge, um die postnatale Leistung zu verbessern. Insbesondere kann die pränatale Verabreichung das räumliche Lernen bei einem Subjekt verbessern. Testkandidaten, die eine solche post- oder pränatale Behandlung mit zu verabreichenden ADNF-Polypeptiden nutzen können, Zeitplan und Arten der Verabreichung, Tests um die Verbesserung der Lernfähigkeit und des Gedächtnisses zu beurteilen, sowie die Verfahren zur Herstellung von ADNF Polypeptiden werden nachstehend im Einzelnen beschrieben.
Testkandidaten für die Behandlung mit ADNF Polypeptiden
Die pränatale und postnatale Behandlung mit ADNF Polypeptiden findet bei vielen Arten von Subjekten Anwendung. Zum Beispiel können normale Subjekte aus der pränatalen Behandlung mit ADNF Polypeptiden hinsichtlich einer verbesserten Lern- und Gedächtnisfähigkeit einen Nutzen ziehen. Ein normales Subjekt oder ein Subjekt mit normalen geistigen Fähigkeiten bezieht sich auf solche, deren intellektueller Funktionsgrad, selbst ohne pränataler Behandlung mit ADNF Polypeptiden beim oder über dem Durchschnitt liegt (z. B. mit einem IQ über 75). Im Zusammenhang mit einem Fötus kann sich ein normales Subjekt auf ein Subjekt beziehen, von dem man nicht davon ausgeht, dass es irgendwelche geistige Schwächen (z. B. gemäß einem Fruchtwassertest) und/oder Risikofaktoren für eine geistige Retardierung (z. B. familiäre Vorgeschichte mentaler Retardierung oder eine Mutter, die während der Schwangerschaft ausreichend Alkohol konsumierte, um ein fetales Alkoholsyndrom beim Subjekt zu bewirken) aufweist. Eine Mutter, die wünscht, dass ihr ungeborener Embryo oder ihr Fötus eine erhöhte Fähigkeit zum Lernen und eine verbesserte Gedächtnisfunktion hat, kann während der Embryo oder Fötus in utero ist, mit ADNF Polypeptiden behandelt werden.
Zudem können die vorliegenden Verfahren Subjekten zugute kommen, deren geistige Fähigkeiten eingeschränkt sind. Zum Beispiel kann ein Fötus, bei dem eine wahrscheinliche geistige Retardierung oder ein Down-Syndrom diagnostiziert wird, in utero mit ADNF Polypeptiden behandelt werden, sodass die postnatale Lernfähigkeit und Gedächtnisfunktion verbessert werden können. In einer bevorzugten Ausführungsweise wird die geistige Retardierung nicht durch den Alkoholkonsum der Mutter während der Schwangerschaft verursacht. Mit anderen Worten hat ein Testkandidat mit geistiger Retardierung kein fetales Alkoholsyndrom (das einen Zustand von geringer bis mäßiger, gelegentlich jedoch schwerer geistiger Retardierung oder Lernunfähigkeit einschließt).
Einer starken geistigen Retardierung (definiert als ein IQ von 50 oder darunter) liegen oft genetische Störungen zugrunde. Diese umfassen z. B. das Down-Syndrom, fragiles X-Syndrom, Klinefelter-Syndrom, Prader-Willi-Syndrom und das Cri-du-Chat-Syndrom. Viele dieser Zustände können durch einen pränatalen genetischen Test diagnostiziert werden. Zum Beispiel können genetische Störungen durch einen Fruchtwassertest getestet werden, der üblicherweise zwischen der 14. und 18. Schwangerschaftswoche durchgeführt wird, oder durch eine Chorionbiopsie, die zwischen der 9. und 12. Schwangerschaftswoche durchgeführt wird. Eine pränatale Behandlung des Fötus mit ADNF Polypeptiden kann dessen postnataler Lernfähigkeit und Gedächtnisfunktion zugute kommen.
Selbst ohne pränatale Diagnose von genetischen Störungen, die zu einer geistigen Retardierung führen, können ADNF Polypeptide dem Fötus unter bestimmten Voraussetzungen vorbeugend verabreicht werden. Zum Beispiel kann das Subjekt, wenn es eine familiäre Vorgeschichte von geistiger Retardierung hat, pränatal mit ADNF Polypeptiden behandelt werden. In einem anderen Beispiel kann das Subjekt, wenn es aufgrund von Infektionen wie Röteln, Meningitis, CMV-Infektion usw. ein höheres Risiko hat, mit geistiger Retardierung geboren zu werden, pränatal mit ADNF Polypeptiden behandelt werden. In einem anderen Beispiel hat das Subjekt ein höheres Risiko, mit bestimmten genetischen Störungen wie z. B. einem Down-Syndrom geboren zu werden, wenn die Mutter bereits älter ist (z. B. 35 Jahre und älter). Eine prophylaktische pränatale Behandlung mit ADNF Polypeptiden kann die Kapazitäten des Subjekts zur Lernfähigkeit und Gedächtnisfunktion verbessern.
In anderen Ausführungsformen kann das Subjekt später im Leben behandelt werden, z. B. um die kurzfristige Lernfähigkeit und Gedächtnisfunktion zu verbessern. Zum Beispiel können bestimmte Gedächtnis- und Lernstörungen wie Alzheimersche Erkrankung erst später im Leben auftreten. Andere Zustände, die unter Anwendung einer postnatalen Verabreichung von ADNF-Polypeptiden behandelt werden können, umfassen eine Neuropathologie und sensorischmotorische Probleme, Leistungsverbesserung von Subjekten, die in kognitiven Aufgaben geschwächt sind, Leistungsverbesserung von Subjekten mit Gedächtnisausfällen, Leistungsverbesserung von normalen Subjekten und ähnliches. Dementsprechend können die Ausführungsformen der Erfindung in geeigneter Zusammensetzung zur Herabsetzung der erforderlichen Zeit verwendet werden, um eine kognitive, motorische oder Aufgabe der Wahrnehmung zu erlernen. Wahlweise können die Zusammensetzungen der Erfindung in geeigneter Rezeptur zur Verlängerung des Zeitraums angewendet werden, in dem kognitive, motorische oder wahrnehmerische Aufgaben beibehalten werden. Als andere Alternative können die Ausführungen der Erfindung in geeigneter Rezeptur zur Herabsetzung der Menge und/oder Schwere von Fehlern beim Aufrufen von kognitiven, motorischen oder wahrnehmerischen Aufgaben eingesetzt werden. Eine solche Behandlung kann sich insbesondere bei Personen als sehr vorteilhaft erweisen, die eine Verletzung des Nervensystems erlitten oder eine Erkrankung des Nervensystems durchgemacht haben. Zudem können ADNF Polypeptide an normale Subjekte verabreicht werden, um ihre Leistung zu erhöhen (z. B. Lernfähigkeit und Gedächtnisfunktion). ADNF Polypeptide können bei einer älteren Bevölkerung besonders nützlich sein, bei der die Gedächtnisfunktionen (z. B. Kurzzeitgedächtnis) in der Regel nachgelassen hat.
ADNF Polypeptide
Eine beliebige geeignete Mischung aus ADNF I- und ADNF III-Polypeptiden kann in Ausführungsarten der Erfindung verabreicht werden. In einigen Ausführungsweisen können die ADNF Polypeptide alle L-Aminosäuren, alle D-Aminosäuren oder eine Kombination davon umfassen. Wenn die ADNF Polypeptide oral verabreicht werden sollen, umfasst ein ADNF Polypeptid vorzugsweise mindestens eine D-Aminosäure innerhalb ihrer aktiven Kernstelle, besser am N-Terminus und/oder C-Terminus der aktiven Kernstelle und noch besser an der gesamten aktiven Kernstelle oder an der gesamten Länge des Moleküls. Wahlweise kann sich die D-Aminosäure an einer beliebigen geeigneten Stelle in der Polypeptidsequenz befinden. Da D-Enantiomere von Polypeptiden enzymatisch gesehen stabiler sind als ihre L-Enantiomere, insbesondere im Magen-Darm-Trakt, ist ein ADNF Polypeptid mit D-Aminosäuren besonders für eine orale Verabreichung nützlich.
Unter einem Aspekt umfasst das Verfahren die Verabreichung eines ADNF I-Polypeptids mit einer aktiven Kernstelle mit der folgenden Aminosäuresequenz: Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala. In einer Ausführungsweise besteht das ADNF I-Polypeptid aus einer aktiven Kernstelle mit einer Aminosäuresequenz von Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala. In einer anderen Ausführungsweise kann das ADNF I-Polypeptid am N-Terminus und/oder am C-Terminus der aktiven Kernstelle zusätzliche Aminosäuren umfassen. Zum Beispiel kann das ADNF I-Polypeptid bis zu 40 Aminosäuren am N-Terminus und/oder C-Terminus der aktiven Kernstelle umfassen. In einem anderen Beispiel kann das ADNF I-Polypeptid bis zu 20 Aminosäuren am N-Terminus und/oder am C-Terminus der aktiven Kernstelle umfassen. In einem wieder anderen Beispiel kann das ADNF I-Polypeptid bis zu 10 Aminosäuren am N-Terminus und/oder C-Terminus der aktiven Kernstelle umfassen. In einer wieder anderen Ausführungsart kann das ADNF I-Polypeptid ein ADNF I-Polypeptid der gesamten Länge sein.
Unter einem anderen Aspekt umfasst das Verfahren die Verabreichung an das Subjekt eines ADNF III-Polypeptids mit einer aktiven Kernstelle mit der folgenden Aminosäuresequenz: Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln. In einer Ausführungsart besteht das ADNF I-Polypeptid aus einer aktiven Kernstelle mit einer Aminosäuresequenz von Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln. In einer anderen Ausführungsweise kann das ADNF III-Polypeptid am N-Terminus und/oder am C-Terminus der aktiven Kernstelle zusätzliche Aminosäuren umfassen. Zum Beispiel kann das ADNF III-Polypeptid bis zu 40 Aminosäuren am N-Terminus und/oder C-Terminus der aktiven Kernstelle umfassen. In einem anderen Beispiel kann das ADNF III-Polypeptid bis zu 20 Aminosäuren am N-Terminus und/oder am C-Terminus der aktiven Kernstelle umfassen. In einem wieder anderen Beispiel kann das ADNF III-Polypeptid bis zu 10 Aminosäuren am N-Terminus und/oder C-Terminus der aktiven Kernstelle umfassen. In einer wieder anderen Ausführungsart kann das ADNF III-Polypeptid ein ADNF III-Polypeptid der gesamten Länge sein.
In einer bevorzugten Ausführungsweise umfasst das ADNF I-Polypeptid eine Aminosäuresequenz mit der Formel (R¹)_x-Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala-(R²)_y und das ADNF III-Polypeptid eine Aminosäuresequenz mit der Formel (R³)_w-Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln-(R⁴)_z.
Bei den vorausgehenden Formeln steht jedes Element R¹, R², R³ und gegebenenfalls R⁴ für eine Aminosäuresequenz mit 1 bis ca. 40 Aminosäuren, bei der jede Aminosäure in der Aminosäuresequenz unabhängig voneinander ausgewählt wird. Der Begriff „unabhängig voneinander ausgewählt" bedeutet hier, dass die die Aminosäuresequenz R¹ bildenden Aminosäuren identisch oder verschieden sein können (z. B. können alle Aminosäuren in der Aminosäuresequenz Threonin sein usw.). Darüber hinaus können, wie vorausgehend erklärt, die die Aminosäuresequenz R¹ bildenden Aminosäuren natürlich vorkommende Aminosäuren sein oder als Gegenstücke von natürlichen Aminosäuren bekannt sein, die in einer ähnlichen Weise als die natürlich vorkommenden Aminosäuren funktionieren (d. h. Aminosäurenachahmungen). Die Diskussion hinsichtlich R¹ gilt in vollem Umfang auch für R², R³ und R⁴.
In der vorausgehenden Formel für das ADNF I-Polypeptid werden x und y unabhängig voneinander ausgewählt und sind null oder eins. Der Begriff „unabhängig voneinander ausgewählt" bedeutet hier, dass x und y identisch oder verschieden sein können. Zum Beispiel können x und y beide null sein oder alternativ dazu können beide eins sein. Zudem kann x null und y eins sein oder alternativ dazu kann x eins und y null sein. Darüber hinaus können die Aminosäuresequenzen R¹ und R² identisch oder verschieden sein, wenn sowohl x als auch y eins ist. Auf diese Weise werden die Aminosäuresequenzen R¹ und R² unabhängig voneinander ausgewählt. Wenn R¹ und R² dieselben sind, sind sie sowohl hinsichtlich ihrer Kettenlänge als auch der Aminosäurenzusammensetzung identisch. Zum Beispiel können beide, R¹ und R², Val-Leu-Gly-Gly-Gly sein. Wenn R¹ und R² verschieden sind, können sie sich hinsichtlich der Kettenlänge und/oder der Aminosäurenzusammensetzung und/oder der Reihenfolge der Aminosäuren in den Aminosäuresequenzen unterscheiden. Zum Beispiel kann R¹ Val-Leu-Gly-Gly-Gly sein, während R² Val-Leu-Gly-Gly sein kann. Alternativ dazu kann R¹ Val-Leu-Gly-Gly-Gly sein, während R² Val-Leu-Gly-Gly-Val sein kann. Alternativ dazu kann R¹ Val-Leu-Gly-Gly-Gly sein, während R² Gly-Val-Leu-Gly-Gly sein kann.
Ebenso werden w und z unabhängig voneinander ausgewählt und sind in der vorausgehenden Formel des ADNF III-Polypeptids null oder eins. Der Begriff „unabhängig voneinander ausgewählt" bedeutet hier, dass w und z identisch oder verschieden sein können. Zum Beispiel können w und z beide null sein oder alternativ dazu können beide eins sein. Zudem kann w null und z eins sein oder alternativ dazu kann w eins und z null sein. Darüber hinaus können die Aminosäuresequenzen R³ und R⁴ identisch oder verschieden sein, wenn sowohl w als auch z eins ist. Auf diese Weise werden die Aminosäuresequenzen R³ und R⁴ unabhängig voneinander ausgewählt. Wenn R³ und R⁴ dieselben sind, sind sie sowohl hinsichtlich ihrer Kettenlänge als auch der Aminosäurenzusammensetzung identisch. Zum Beispiel können beide, R³ und R⁴, Leu-Gly-Leu-Gly-Gly sein. Wenn R³ und R⁴ verschieden sind, können sie sich hinsichtlich der Kettenlänge und/oder der Aminosäurenzusammensetzung und/oder der Reihenfolge der Aminosäuren in den Aminosäuresequenzen unterscheiden. Zum Beispiel kann R³ Leu-Gly-Leu-Gly-Gly, während R⁴ Leu-Gly-Leu-Gly sein kann. Alternativ dazu kann R³ Leu-Gly-Leu-Gly-Gly sein, während R⁴ Leu-Gly-Leu-Gly-Leu sein kann.
Unter den verschiedenen Möglichkeiten werden bestimmte ADNF I- und ADNF III-Polypeptide bevorzugt, nämlich die, bei denen x, y, w und z alle null sind (d. h. jeweils SALLRSIPA und NAPVSIPQ). Es werden auch ADNF I-Polypeptide bevorzugt, bei denen x eins ist, R¹ Val-Leu-Gly-Gly-Gly und y null ist. Ebenfalls bevorzugt werden ADNF I-Polypeptide, bei denen x eins ist, R¹ Val-Glu-Glu-Gly-Ile- Val-Leu-GLy-Gly-Gly und y null ist. Genauso bevorzugt man auch ADNF III-Polypeptide, bei denen w eins ist, R³ Gly-Gly und z null ist. Ebenfalls bevorzugt man die ADNF III-Polypeptide, bei denen w eins ist, R³ Leu-Gly-Gly, z eins und R⁴ Gln-Ser ist. Man bevorzugt auch die ADNF III-Polypeptide, bei denen w eins ist, R³ Leu-Gly-Leu-Gly-Gly, z eins und R⁴ Gln-Ser ist. Man bevorzugt auch die ADNF III-Polypeptide, bei denen w eins ist, R³ Ser-Val-Arg-Leu-Gly-Leu-Gly-Gly, z eins und R⁴ Gln-Ser ist. Es können zusätzliche Aminosäuren sowohl zum N-Terminus als auch zum C-Terminus dieser aktiven Kernstellen (SALLRSIPA oder NAPVSIPQ) ohne Verlust der biologischen Aktivität hinzugefügt werden; dies wurde durch die Tatsache nachgewiesen, dass die ADNF I- und ADNF III-Wachstumsfaktoren eine außergewöhnliche biologische Aktivität aufweisen. Siehe das Dokument U.S.S.N. 08/324 297, das am 17. Oktober 1994 (auch unter der Nr. WO96/11948 veröffentlicht) hinsichtlich der Beschreibung der ADNF I-Polypeptide angemeldet wurde; und das am 27. Februar 1997 angemeldete U.S.S.N. 60/037 404 sowie das am 23. September 1997 angemeldete U.S.S.N. 64/059 621 (auch unter der Nr. WO98/35042 publiziert) hinsichtlich der ADNF III-Polypeptide.
In einer pharmazeutischen Zusammensetzung können jedes bzw. mehrere der hier beschriebenen ADNF I-Polypeptide mit jedem bzw. mehreren der hier beschriebenen ADNF III-Polypeptide kombiniert werden. Eine Kombination aus einem ADNF I-Polypeptid und einem ADNF III-Polypeptid kann eine Mischung aus zwei oder mehreren dieser Polypeptide sein. Eine Kombination aus einem ADNF I-Polypeptid und einem ADNF III-Polypeptid kann sich auch auf ein oder mehrere ADNF I-Polypeptide beziehen, die mit einem oder mehreren ADNF III-Polypeptiden gekoppelt (direkt oder indirekt) sind. Zum Beispiel kann ein ADNF I-Polypeptid kovalent mit einem ADNF III-Polypeptid verbunden sein. Eine Kombination aus einem ADNF I-Polypeptid und einem ADNF III-Polypeptid kann als einzelne Zusammensetzung präpariert und einem Subjekt verabreicht werden. Alternativ dazu können ein ADNF I-Polypeptid und ein ADNF III-Polypeptid als separate Zusammensetzungen präpariert werden. Die separaten Zusammensetzungen können dann gleichzeitig oder nacheinander einem Subjekt verabreicht werden. Zudem können unterschiedliche Proportionen eines ADNF I-Polypeptids und eines ADNF III-Polypeptids einem Subjekt verabreicht werden. Zum Beispiel kann in einer Kombination das Verhältnis zwischen einem ADNF I- und einem ADNF III-Polypeptid im Bereich von 1:100 bis 100:1, 1:10 bis 10:1 oder 1:2 bis 2:1 liegen.
Unter wieder einem anderen Aspekt können andere ADNF-Polypeptide (einschließlich ihren Allelen, polymorphischen Varianten, zwischenartlichen Homologen und Subsequenzen davon) im Verfahren der Erfindung eingesetzt werden, um die Leistung zu erhöhen.
Es können verschiedene Parameter gemessen werden, um festzustellen, ob eine Mischung von ADNF Polypeptiden die Leistung eines Subjekts verbessert. Zum Beispiel kann der Grad an Lerndefiziten zwischen der Kontrollgruppe (z. B. nicht mit ADNF Polypeptiden behandelt) und einer Gruppe verglichen werden, die mit ADNF Polypeptiden vorbehandelt wurde. Lerndefizite können zum Beispiel unter Anwendung eines Morris-Wasserlabyrinths beurteilt werden (siehe z. B. Abschnitt der Beispiele). Wenn sich irgendein oder mehrere dieser Parameter bei der mit ADNF Polypeptiden behandelten Gruppe ändern, z. B. um ca. 10%, wahlweise um mindestens ca. 20%, um mindestens ca. 30%, um mindestens ca. 40%, um mindestens ca. 50%, um mindestens ca. 60%, um mindestens ca. 70%, um mindestens ca. 80%, um mindestens ca. 90%, um mindestens ca. 100%, um mindestens ca. 150%, um mindestens ca. 200%, usw. im Vergleich zur Kontrollgruppe, dann können diese ADNF-Polypeptide vorteilhaft in der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden.
Verabreichung und pharmazeutische Zusammensetzungen
ADNF Polypeptide und Nucleinsäuren, die für ADNF Polypeptide codieren, können einem Subjekt unter Anwendung von geeigneten in der Technik bekannten Verfahren pränatal oder postnatal verabreicht werden. Zum Beispiel können ADNF Polypeptide oder Nucleinsäuren als pharmazeutische Zusammensetzungen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Verdünnungsstoff, einem Carrier oder Trägerstoff zubereitet werden. Geeignete Formeln für die Anwendung im Rahmen der vorliegenden Erfindung lassen sich in Remington's Pharmaceufical Sciences (17. Ausgabe 1985)) finden. Eine kurze Zusammenfassung der Verfahren zur Verabreichung von Medikamenten ist z. B. in Langer, Science 249:1527–1533 (1990) beschrieben. Zudem werden die pharmazeutischen Zusammensetzungen mit Peptiden und Proteinen z. B. in Therapeutic Peptides and Proteins Formulations, Processing, and Delivery Systems, von Banga, Technomic Publishing Company, Inc., Lancaster, PA (1995) beschrieben.
In einer Ausführungsweise werden die ADNF-Polypeptide für eine orale Verabreichung gestaltet, z. B. an das Subjekt, oder für eine pränatale Verabreichung an die Mutter des Subjekts. Bei dieser Ausführungsart werden bevorzugt ADNF-Polypeptide mit allen D-Aminosäuren verwendet. Eine pharmazeutisch annehmbare und nicht toxische Zusammensetzung wird durch den Zusatz eines beliebigen, normalerweise angewendeten Trägerstoffes und 10 bis 95 % des aktiven Wirkstoffes bzw. bevorzugter Weise mit einer Konzentration von 25 bis 75 % hergestellt. Um das orale Absorbieren von ADNF-Polypeptiden zu verbessern, werden zudem verschiedene Carrier-Systeme wie Nanopartikel, Mikropartikel, Liposomen, Phospholipide, Emulsionen, Erythrozyten, usw. eingesetzt. Die oralen Wirkstoffe mit den ADNF Polypeptiden der Erfindung können in jeder für eine orale Verabreichung geeigneten Form wie z. B. flüssig, als Tabletten, Kapseln oder dergleichen vorliegen. Die oralen Verabreichungsformen können zudem beschichtet oder behandelt sein, um das Auflösen im Magen zu verhindern bzw. zu reduzieren. Siehe z. B. Therapeutic Peptides and Proteins, Formulation, Processing, and Delivery Systems, von A.K. Banga, Technomic Publishing Company, Inc., 1995.
Zudem werden die ADNF-Polypeptide für eine parenterale, topische, nasale, sublinguale oder lokale Verabreichung bzw. für eine Sonde zubereitet. Zum Beispiel werden die pharmazeutischen Zusammensetzungen parenteral verabreicht, z. B. intravenös, subkutan, intradermal oder intramuskulär bzw. intranasal. Folglich schlägt die Erfindung Zusammensetzungen für eine parenterale Verabreichung vor, welche eine Lösung aus einer Kombination von ADNF-Polypeptiden umfassen, die in einem annehmbaren Carrier, vorzugsweise einem wässrigen Carrier, gelöst oder in Suspension sind. Es können eine Vielzahl von wässrigen Carriern zur Anwendung kommen, darunter z. B. Wasser, gepuffertes Wasser, eine 0,4 %ige Salzlösung, 0,3%ige Glycinlösung, Hyaluronsäure und dergleichen. Diese Zusammensetzungen können durch herkömmliche, gut bekannte Sterilisationsverfahren sterilisiert oder steril gefiltert werden. Die daraus entstehenden wässrigen Lösungen können zur Anwendung unverändert oder lyophilisiert abgepackt werden, wobei das lyophilisierte Präparat vor der Verabreichung mit einer sterilen Lösung kombiniert wird. Die Zusammensetzungen können pharmazeutisch annehmbare Hilfssubstanzen enthalten, die erforderlich sind, um sich den physiologischen Bedingungen anzupassen, inklusive pH-regulierende Substanzen und Puffer, Mittel zur Tonizitätsabstimmung, Netzmittel und dergleichen, wie z. B. Natriumacetat, Natriumlactat, Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Calciumchlorid, Sorbitanmonolaurat, Triethanolaminoleat usw. In einer Ausführungsart wird die Nucleinsäure, die ein ADNF Polypeptid codiert, als bloße DNA verabreicht.
Für eine Aerosol-Verabreichung werden die ADNF-Polypeptide vorzugsweise in fein geteilter Form mit einem oberflächenaktiven Stoff und einem Treibgas bereitgestellt. Der oberflächenaktive Stoff muss selbstverständlich nicht-toxisch und vorzugsweise in Treibgas löslich sein. Repräsentativ für derartige Stoffe sind Ester oder partielle Ester von Fettsäuren mit 6 bis 22 Kohlenstoffatomen, wie z. B. Capronsäure, Octansäure, Laurinsäure, Palmitinsäure, Stearinsäure, Linolsäure, Linolensäure, Olestersäure und Oleinsäure mit einem aliphatischen polyhydriden Alkohol oder dessen zyklisches Anhydrid. Es können gemischte Ester wie gemischte oder natürliche Glyceride angewendet werden. Nach Wunsch kann ein Carrier integriert werden, wie z. B. Lecithin für eine intranasale Verabreichung.
Für feste Zusammensetzungen können herkömmliche nicht-toxische feste Carrier verwendet werden. Feste Carrier umfassen z. B. Mannitol, Lactose, Stärke, Magnesiumstearat, Natriumsaccharin, Talk, Zellulose, Glucose, Saccharose, Magnesiumcarbonat und dergleichen in pharmazeutischer Qualität.
Die vorliegende Erfindung stellt auch therapeutische Zusammensetzungen oder Medikamente mit einer Mischung aus einem oder mehreren der hier vorausgehend beschriebenen ADNF I und ADNF III-Polypeptiden in Verbindung mit einem pharmazeutisch annehmbaren Trägerstoff bereit, bei denen die Menge einer Kombination aus ADNF I und ADNF III-Polypeptiden ausreichend ist, um eine gewünschte therapeutische Wirkung zu erzielen.
Kleine Polypeptide, darunter auch SALLRSIPA und NAPVSIPQ, passieren die Bluthirnschranke. Für längere Peptide, die die Bluthirnschranke nicht passieren, sind Methoden zur Verabreichung von Proteinen ins Gehirn wohl bekannt. Zum Beispiel können Proteine, Polypeptide, andere Verbindungen und Zellen über intracerebroventrikuläre Injektion (ICV) bzw. über eine Kanüle in das Säugetierhirn geschleust werden (siehe z. B. Motta & Martini, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 168: 62– 64 (1981); Peterson et al., Biochem. Pharmacol 31: 28072810 (1982); Rzepczynski et al., Metab. Brain Dis. 3: 211–216 (1988); Leibowitz et al., Brain Res. Bull. 21: 905–912 (1988); Sramka et al., Stereotact. Funct. Neurosurg. 58: 7983 (1992); Peng et al., Brain Res. 632: 57–67 (1993); Chem et al., Exp. Neuro. 125: 72–81 (1994); Nikkhah et al., Neuroscience 63: 57–72 (1994); Anderson et al.,J ; Comp. Neurol. 357: 296–317 (1995); und Brecknell & Fawcett, Exp. Neurol.138 : 338–344 (1996)). Kanülen können insbesondere zur Verabreichung neurotrophischer Faktoren an Säugetiere verwendet werden. (Siehe z.B. Motta & Martini, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 168 : 62–64 (1981) (Neurotensin); Peng et al., Brain Res. 632: 57–67 (1993) (NGF); Anderson et al., J.Comp. Neurol. 357: 296–317 (1995) (BDNF, NGF, Neurotrophin-3).
Alternativ dazu können längere ADNF-Polypeptide, die die Bluthirnschranke nicht passieren, an Material gekoppelt werden, das den ADNF-Polypeptiden hilft, die Bluthirnschranke zu passieren oder auch die Plasmamembran einer Zelle bzw. eine intrazelluläre Membran wie z. B. die des Zellkerns zu durchqueren. Zellmembranen bestehen aus einer Lipoprotein-Doppelschicht, die für kleine, nichtionische lipophile Verbindungen frei durchlässig ist und vom Wesen her für polare Stoffe, Makromoleküle und Therapeutika oder Diagnostika undurchlässig ist. Es wurden jedoch Proteine und andere Verbindungen wie Liposomen beschrieben, die die Fähigkeit haben, Polypeptide wie ADNF-Polypeptide durch eine Zellmembran zu schleusen.
Zum Beispiel verfügen "Membran passierende Polypeptide" über amphiphile bzw. hydrophobe Aminosäure-Untersequenzen mit der Fähigkeit, als Membrancarrier zu wirken. In einer Ausführungsart haben Homeodomain-Proteine die Fähigkeit, Zellmembranen zu passieren. Wie festgestellt wurde, war das kürzeste internalisierbare Peptid eines Homeodomain-Proteins, Antennapedia, die dritte Helix des Proteins, von Aminosäureposition 43 bis 58 (siehe z. B. Prochiantz, Current Opinion in Neurobiology 6: 629–634 (1996). Bei einer weiteren Untersequenz, dem hydrophoben Bereich der Signalpeptide, wurden die gleichen Zellmembran passierenden Eigenschaften festgestellt (siehe z. B. Lin et al., J. Biol. Chem. 270:1 4255–14258 (1995)).
Beispiele für Peptidsequenzen, die an ein ADNF-Polypeptid der Erfindung gebunden werden können, um die Aufnahme von ADNF-Polypeptiden in Zellen zu erleichtern, umfassen folgende Peptidsequenzen, sind aber nicht auf diese beschränkt: ein 11 Aminosäurepeptid des HIV Tat-Proteins (siehe Schwarze et al., Science 285: 1569–1572 (1999)); eine 20-Residue-Peptidsequenz, die den Aminosäuren 84–103 des p16-Proteins entspricht (siehe Fahraeus et al., Current Biology 6: 84 (1996)); die dritte Helix des 60 Aminosäuren langen Homeodomains des Antennapedia-Proteins (Derossi et al., J. Biol. Chem. 269: 10444 (1994)); die h-Region eines Signalpeptids wie der Kaposi Fibroblasten Wachstumsfaktor (K-FGF) h-Region (Lin et al., supra); oder die VP22 Transportregion des HSV (Elliot & O'Hare, Cell 88: 223–233 (1997)). Weitere geeignete chemische Fragmente, die eine verbesserte Zellaufnahme ermöglichen, können auch chemisch an ADNF-Polypeptide gebunden werden.
Toxinmoleküle haben auch die Fähigkeit, Polypeptide durch Zellmembranen zu transportieren. Solche Moleküle bestehen oft aus mindestens zwei Teilen ("binäre Toxine" genannt): eine Transport- oder Bindungsregion bzw. Polypeptid und eine separate Toxinregion bzw. Polypeptid. Die Transportregion bzw. das Transportpolypeptid bindet sich an einen Zellrezeptor und dann wird das Toxin in die Zelle transportiert. Verschiedene Bakterientoxine, einschließlich Clostridium perfringens iota toxin, Diphtheria toxin (DT), Pseudomonas exotoxin A (PE), Pertussistoxin (PT), Bacillus anthracis toxin und Pertussis Adenylatcyclase (CYA) wurden bei Versuchen verwendet, Peptide als interne oder animoterminale Fusionen in das Zellcytosol zu schleusen (Arora et al., J.Biol. Chem, 268: 3334–3341 (1993); Perelle et al., Infect. Immun., 61: 5147–5156 (1993); Stenmarketal., J. CellBiol. 113: 1025–1032 (1991); Donnelly et al., Proc.Nat'l Acad. Sci. USA 90: 3530–3534 (1993); Carbonetti et al., Abstr. Annu. Meet. Am. Soc. Microbiol. 95: 295 (1995); Seboet al., Infect. Immun. 63: 3851–3857 (1995); Klimpel et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 89: 10277–10281 (1992); und Novak et al., J.Biol. Chem. 267: 17186–17193 1992)).
Solche Untersequenzen können verwendet werden, um ADNF-Polypeptide über eine Zellmembran zu transportieren. ADNF-Polypeptide können leicht mit solchen Sequenzen verschmolzen oder derivatisiert werden. Vorzugsweise wird die Transportsequenz als Teil eines Fusionsproteins bereitgestellt. Wahlweise kann ein Linker benutzt werden, um das ADNF-Polypeptid mit der Transportsequenz zu verbinden. Jeder geeignete Linker kann eingesetzt werden, z. B. ein Peptidlinker.
ADNF-Polypeptide und Nucleinsäuren, die ADNF-Polypeptide codieren, können auch in eine Tierzelle, vorzugsweise eine Säugetierzelle geschleust werden, und zwar über Liposomen und Liposomenderivate wie Immunoliposomen und Lipid-Nucleinsäurekomplexe. Der Terminus "Liposom" bezieht sich auf Vesikel, die eine oder mehr konzentrisch angeordnete Lipid-Doppelschichten enthalten, die eine wässrige Phase umkapseln. Die wässrige Phase enthält generell die Verbindung, die in die Zelle geschleust werden soll, z. B. ein ADNF-Polypeptid.
Das Liposom verschmilzt mit der Plasmamembran und gibt das ADNF-Polypeptid in das Cytosol frei. Alternativ kann das Liposom auch phagozytiert werden oder über ein Transportvesikel in die Zelle aufgenommen werden. Wenn sich das Liposom im Endosom bzw. im Phagosom befindet, löst sich das Liposom auf oder verschmilzt mit der Membran oder dem Transportvesikel und gibt seinen Inhalt frei.
Bei bekannten Methoden der Einschleusung von Wirksubstanzen mittels Liposomen wird das Liposom letztendlich permeabel und gibt die umkapselte Verbindung (in diesem Fall ein ADNF-Polypeptid) an das Zielgewebe bzw. an die Zielzelle frei. Bei systemischer oder gewebespezifischer Einschleusung kann dies zum Beispiel auf passive Weise erreicht werden, wobei sich die Liposomen-Doppelschicht durch die Wirkung verschiedener Agenzien im Körper auflöst. Alternativ umfasst die aktive Wirkstoffabgabe ein Agens, welches eine Änderung der Permeabilität des Liposomenvesikels bewirkt. Lipsomenmembranen können so konstruiert werden, dass sie sich abbauen, wenn das Umfeld an der Liposomenmembran sauer wird (siehe z. B. Proc.Nat'l Acad. Sci. USA 84 : 7851 (1987); Biochemistry 28:908 (1989)). Werden Liposomen z. B. durch eine Zielzelle endocytosiert, werden sie abgebaut und geben ihren Inhalt frei. Dieser Abbau wird als fusogen bezeichnet. Dioleoylphosphatidyl-Ethanolamin (DOPE) ist die Grundlage vieler „fusogener" Systeme.
Solche Liposomen umfassen herkömmlicher Weise ein ADNF-Polypeptid und eine Lipidkomponente, z. B. ein neutrales und/oder kationisches Lipid, das wahlweise ein Rezeptorerkennungsmolekül wie z. B. einen Antikörper umfasst, welches sich an einen vorbestimmten Zelloberflächenrezeptor oder Ligand (z. B. ein Antigen) bindet. Eine große Auswahl an Methoden stehen zur Vorbereitung von Liposomen in der beschriebenen Art zur Verfügung, dazu gehören: Szoka et al., Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9: 467 (1980), US-Pat. Nr. 4,186,183, 4,217,344, 4,235,871, 4,261,975, 4,485,054, 4,501,728, 4,774,085, 4,837, 028, 4,235,871, 4,261,975, 4,485,054, 4,501,728, 4,774,085, 4,837,028, 4,946,787, PCT-Publikations-Nr. WO 91/17424, Deamer & Bangham, Biochim. Biophys. Acta 443: 629–634 (1976); Fraley, et al., Proc.Nat'l Acad. Sci. USA 76: 3348–3352 (1979); Hope et al., Biochim. Biophys. Acta 812: 55–65 (1985); Mayeret al., Biochim. Biophys. Acta 858:161-168 (1986); Williams et al., Proc.Nat'l Acad. Sci. USA 85: 242–246 (1988); Liposomes (Ostro (ed.), 1983, Chapter 1); Hope et al., Chem. Phys. Lip. 40: 89(1986); Gregoriadis, Liposome Technology (1984) and Lasic, Liposomes: from Physics to Applications (1993)). Geeignete Methoden umfassen z. B. Sonikation, Extrusion, Hochdruckhomogenisierung, Mikroverflüssigung, Detergent-Dialyse, Calciuminduzierte Fusion kleiner Liposomenvesikel und Äther-Fusionsmethoden, die alle unter Fachleuten wohl bekannt sind.
In bestimmten Ausführungsarten der vorliegenden Erfindung ist es wünschenswert, die Liposomen der Erfindung gezielt mit Zielfragmenten zu versehen, die für bestimmte Zelltypen, Gewebetypen u. ä. spezifisch sind. Die Bindung bestimmter Zielfragmente an Liposomen (z. B. Liganden, Rezeptoren und monoklonale Antikörper) wurde bereits beschrieben (siehe z. B. U. S. Patent Nr. 4,957,773 und 4,603,044). Bekannte Standardmethoden zur Bindung von Zielagenzien an Liposomen können eingesetzt werden. Diese Methoden umfassen generell die Inkorporation von Lipidkomponenten in Liposomen, z. B. Phosphatidyl-Ethanolamin, welches für die Bindung mit Zielagenzien aktiviert werden kann, oder auch derivatisierte lipophile Verbindungen, wie durch Lipide derivatisiertes Bleomycin. Gezielt mit Antikörpern versehene Liposomen können konstruiert werden, z. B. unter Verwendung von Liposomen, die Protein A enthalten (siehe Renneisen et al., J. Biol. Chem, 265: 16337–16342 (1990) und Leonetti et al., Proc.Nat'l Acad. Sci. USA 87:2448–2451 (1990).
Alternativ können auch beide ADNF-Arten codierende Nucleinsäuren verwendet werden, um eine therapeutische Dosis von ADNF-Polypeptiden zu erhalten. Diese Nucleinsäuren können in eine beliebige Anzahl von für die Transfektion von Zielzellen und Organismen gut bekannten Vektoren inseriert werden. Zum Beispiel werden Nucleinsäuren als DNA-Plasmide, als nackte Nucleinsäuren und als mit einem Einschleusungscarrier wie z. B. einem Liposom komplexierte Nucleinsäuren eingeschleust. Virale Vektortransportsysteme umfassen DNA- und RNA-Viren, die nach Einschleusung in die Zelle entweder episomale oder integrierte Genome haben. Literaturhinweise zu Gentherapieverfahren: Siehe Anderson, Science 256: 808–813 (1992); Nabel & Felgner, TIBTECH 11: 211–217 (1993); Mitani & Caskey, TIBTECH 11: 162–166 (1993); Dillon, TIBTECH 11 : 167–175 (1993); Miller, Nature 357: 455–460 (1992); Van Brunt, Biotechnology 6 (10): 1149–1154 (1988); Vigne, Restorative Neurology and Neuroscience 8 :35–36 (1995); Kremer & Perricaudet, British Medical Bulletin 51(1) : 31–44 (1995); Haddada et al., in Current Topics in Microbiologyand Immunology, Doerfler and Bohm (eds) (1995); und Yu et al., Gene Therapy 1: 13–26 (1994).
Methoden der nichtviralen Einschleusung von Nucleinsäuren umfassen Lipofektion, Mikroinjektion, Biolistik, Virosomen, Liposomen, Immunoliposomen, Polykation oder Lipid-Nucleinsäureverbindungen, nackte DNA, künstliche Virionen und durch ein Agens verstärkte DNA-Aufnahme. Die Lipofektion wird z. B. in den US Patenten Nr. 5,049,386, Nr. 4,946,787 und Nr. 4,897,355 beschrieben und folgende Lipofektionsreagenzien sind handelsüblich erhältlich (z. B. Transfectam^TM und Lipofectin^TM). Zu den kationischen und neutralen Lipiden, die zur effizienten Rezeptorerkennungs-Lipofektion von Polynucleotiden geeignet sind, gehören die nach Felgner WO 91/17424, WO91/16024. Die Einschleusung kann in Zellen (z. B. ex vivo-Verabreichung) oder in Zielgewebe (in vivo-Verabreichung) erfolgen.
In therapeutischen Anwendungen kann eine Mischung der ADNF I- und ADNF III-Polypeptide der Erfindung in einer für die Leistungsverbesserung des Subjektes ausreichenden Dosis (z. B. für die Lern- und Gedächtnisfähigkeit) an einen Patienten verabreicht werden. Eine zu diesem Zweck ausreichende Dosis wird als „therapeutisch wirksame Dosis" bezeichnet. Die für diesen Zweck wirksame Dosis hängt z. B. von der Art der eingesetzten ADNF I- oder ADNF III-Polypeptide, der Art der Verabreichung, dem Gewicht, dem allgemeinen Gesundheitszustand des Patienten und dem Ermessen des verschreibenden Arztes ab. Zum Beispiel wäre für die Verbesserung der Lern- und Gedächtnisleistung bei einer Maus eine einmal täglich (z. B. abends) intranasal verabreichte Dosis an ADNF I- bzw. ADNF III-Polypeptiden im Bereich von 1 μg bis 50 μg, vorzugsweise 1 μg bis 10 μg, eine therapeutisch wirksame Dosis. Diese Dosis basiert auf dem durchschnittlichen Gewicht einer Maus. Beim Menschen müsste die geeignete Dosis auf einen menschlichen Körper extrapoliert werden.
Pränatal können ADNF-Polypeptide einem Subjekt direkt oder indirekt über seine Mutter verabreicht werden. ADNF-Polypeptide können zu jedem Zeitpunkt der Schwangerschaft verabreicht werden. Vorzugsweise werden ADNF-Polypeptide während des ersten Drittels der Schwangerschaft (d. h. in den ersten 12 Wochen) verabreicht, wenn sich Organe und Nervensystem des Subjekts aktiv entwickeln. Besser noch sollten die ADNF-Polypeptide während der Entwicklungszeit des Neuralrohrs (welche etwa 22 Tage nach der Empfängnis beginnt) und bis vor deren Abschluss verabreicht werden. ADNF-Polypeptide können als Einzeldosis, vorzugsweise während der kritischen Entwicklungszeit des Neuralrohrs oder in mehreren Dosen während der Schwangerschaft verabreicht werden.
Tests für die Messung verbesserter Lern- und Gedächtnisfähigkeit
Verschiedene Parameter können gemessen werden, um zu bestimmen, ob ADNF-Polypeptide die Leistung (z. B. Lern- und Gedächtnisfähigkeit) in vivo verbessern. Zum Beispiel kann der Test mit der versteckten Plattform des Morris-Wasserlabyrinthtests, welches im untenstehenden Beispielteil beschrieben wird, verwendet werden, um räumliches Lernen und Gedächtnis zu testen. In der Regel werden mit ADNF Polypeptiden behandelte Mäuse sowie Kontrollmäuse (nicht mit ADNF Polypeptiden behandelte) trainiert, um durch Erlernen der Position einer versteckten Plattform und durch Daraufklettern einer Schwimmaufgabe zu entgehen. Die Zeit, die sie brauchen, um diese Aufgabe zu erfüllen, wird als Fluchtlatenz bezeichnet. Dieser Test kann einmal oder mehrmals täglich eine bestimmte Anzahl von Tagen durchgeführt werden. Ein Aufschluss gebender Parameter für verbesserte Lern- und Gedächtnisfähigkeit liegt in der Reduzierung der Reaktionszeit, innerhalb der durch Daraufklettern auf die versteckte Plattform der Schwimmaufgabe entgangen werden kann (siehe Beispielteil unten). Dazu sei ebenfalls auf die von Gozes et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 427–432 (1996) beschriebenen Methoden verwiesen, die hier im Sinne der Quellenangabe angegeben werden. Tiere, die mit geeigneten ADNF-Polypeptiden behandelt werden, weisen in ihrer Lern- und Gedächtnisfähigkeit im Vergleich zu den Kontrolltieren, die nicht mit ADNF-Polypeptiden behandelt wurden, eine Verbesserung auf. Die Ausführungen der Erfindung sind nicht auf die Testbeispiele beschränkt, die zur Messung der Leistung herangezogen werden. Sämtliche geeignete Testmethoden können eingesetzt werden, um die Lern- und Gedächtnisleistung zu messen.
Bei menschlichen Subjekten können auch andere unter Fachleuten bekannte Methoden angewendet werden, um festzustellen, ob ein ADNF-Polypeptid oder eine Kombination aus ADNF Polypeptiden in vivo die Lern- und Gedächtnisleistung verbessert. Zum Beispiel umfassen diese Methoden das Prüfen des Gedächtnisses oder der Lernfähigkeit durch den Randt-Gedächtnis-Test über einen längeren Zeitabschnitt (Randt et al., Clin. Neuropsychol., 1980,2: 184), Wechsler-Gedächtnisskala (J. Psych. 19: 87–95 (1945), Forward Digit Span test (Craik, Age Differences in Human Memory, in: Handbook of the Psychology of Aging, Birren, J., und Schaffe, K. (Eds.), New York, Van Nostrand (1977), Mini-Mental State Exam (Folstein et al., J. of Psych. Res. 12: 189–192 (1975), oder California Verbal Learning Test (CVLT). Siehe auch U.S. Patent Nr. 6.030.968. In diesen Tests werden Faktoren geprüft, die zu den Wirkungen von ADNF-Polypeptiden (z. B. Ängstlichkeit, Ermüdung, Ärger, Depression, Verwirrung oder Vitalität) keine Beziehung haben. Siehe U. S. Pat. Nr. 5,063,206. Methoden zum Testen und Kontrollieren subjektiver Faktoren sind in der Fachwelt bekannt und werden aufgrund klinischer Standardtests wie BECKs Depressionsskala, Spielbergers mehrdimensionaler Ängstlichkeitstest und POMS-Test (Profile of Mood State) untersucht.
Räumliches Lernen kann auch an Menschen getestet werden. Zum Beispiel kann ein Subjekt gebeten werden, ein Bild zu malen, das anschließend weggenommen wird. Das Subjekt wird dann gebeten, das gleiche Bild aus dem Gedächtnis noch einmal zu malen. Das von dem Subjekt gemalte zweite Bild gibt ein Maß an räumlicher Lernfähigkeit des Subjekts wieder.
Verschiedene Parameter können gemessen werden, um zu bestimmen, ob ADNF-Polypeptide die Lern- und Gedächtnisfähigkeit eines Subjektes verbessern. Zum Beispiel kann das Maß an Lern- und Gedächtnisverbesserung zwischen einer Kontrollgruppe (z. B. nicht mit ADNF-Polypeptiden behandelte Gruppe) und einer mit ADNF-Polypeptiden vorbehandelten Gruppe verglichen werden. Die Verbesserung der Lern- und Gedächtnisfähigkeit kann z. B. mittels eines Morris-Wasserlabyrinthttests an Nagetieren (siehe Beispielteil) oder anderen geeigneten Tests wie die oben für Menschen beschriebenen bewertet werden. Werden von diesen Parametern einer oder mehrere für die mit den ADNF-Polypeptiden behandelte Gruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe geändert, z. B. um 10%, oder wahlweise um mindestens etwa 20%, um mindestens etwa 30%, um mindestens etwa 40%, um mindestens etwa 50%, um mindestens etwa 60%, um mindestens etwa 70%, um mindestens etwa 80%, um mindestens etwa 90%, um mindestens etwa 100%, um mindestens etwa 150%, um mindestens etwa 200% usw., dann kann gesagt werden, dass ADNF-Polypeptide die Lern- und Gedächtnisfähigkeit des Subjekts verbessern. Ersatzweise werden statistische Untersuchungen mit ANOVA für kontinuierliche Variablen, Mann-Whitney U für nichtparametrische Daten, Chi-Quadrattest für kategorische Variablen oder Fisher's Exakt-Test mit p < 0,05 als signifikant angesehen.
Produktionsmethoden für ADNF-Polypeptide
Rekombinante Produktionsmethoden für ADNF-Polypeptide
Klonieren und Isolieren von ADNF-Nucleinsäuren
Unterschiedliche spezifische Nucleinsäuren codieren die hier beschriebenen ADNF-Polypeptide. Siehe dazu z. B. auch Brenneman & Gozes, J. Clin. Invest. 97: 2299–2307 (1996), Brenneman, J. Pharm. Exp. Ther. 285: 619–627 (1998), und Bassan et al., J.Neurochem 72: 1283–1293 (1999). Diese Nucleinsäuren können mit Standardmethoden rekombinant oder synthetisch hergestellt werden. Aus den Nucleinsäuren der vorliegenden Erfindung können Fachleute vielfache Klone mit funktionell gleichwertigen Nucleinsäuren herstellen, wie z. B. Nucleinsäuren, die die gleichen ADNF-Polypeptide codieren. Klonungsmethoden, um diese Ziele zu erreichen und Methoden der Sequenzierung, um die Sequenz von Nucleinsäuren zu prüfen, sind unter Fachleuten wohl bekannt. Beispiele geeigneter Methoden zur Klonierung und Sequenzierung, sowie für Fachleute ausreichende Anweisungen zu Klonierungsübungen sind bei Sambrook et al., Molecular Cloning – A Laboratory Manual (2nd ed. 1989) and Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel etal., eds., 1994) zu finden.
Darüber hinaus bieten auch Produktinformationen von Herstellern biologischer Reagenzien und Versuchsgeräte sinnvolle Informationen zu bekannten biologischen Methoden. Zu diesen Herstellern gehören solche wie SIGMA chemical company (Saint Louis, MO), R & D systems (Minneapolis, MN), Pharmacia LKB Biotechnology (Piscataway, NJ), CLONTECH Laboratories, Inc. (Palo Alto, CA), Chem Genes Corp., Aldrich Chemical Company (Milwaukee, WI), Glen Research, Inc., GIBCO BRL Life Technologies, Inc. Schweiz), Invitrogen (San Diego, CA) und Applied Biosystems (Foster City, CA), sowie viele andere in Fachkreisen bekannte Bezugsquellen.
Die Nucleinsäurezusammenstellungen dieser Erfindung, ob RNA, cDNA, Genom-DNA oder ein Hybrid der verschiedenen Mischungen, werden aus biologischen Quellen isoliert, wie z. B. Astrozyten, Neuroblastomzellen, oder Fibroblasten oder in vitro synthetisiert. Die Nucleinsäuren der Erfindung liegen in transformierten oder transfektierten Zellen, in transformierten oder transfektieren Zelllysaten, oder in teilweise gereinigten oder im Wesentlichen reinen Formen vor.
In vitro Amplifizierungstechniken, die geeignet sind, Sequenzen zu amplifizieren, die für Molekularproben oder zur Generierung von Nucleinsäurefragmenten für die anschließende Subklonierung verwendet werden, sind bekannt. Beispiele von Methoden, die für Fachleute als Anleitung für solche in vitro Amplifizierungstechniken ausreichen, sind: Polymerase-Kettenreaktion (PCR), Ligase-Kettenreaktion (LCR), Qβ-Replikase-Amplifizierung sowie andere RNA-Polymerasemethoden (z. B. NASBA). Diese können bei Berger, Sambrook et al. und Ausubel et al., alle supra, im U. S. Patent Nr. 4,683,202, so wie in PCR Protocols A Guide to Methods and Applications (Innis et al., Ausgabe 1990); Arnheim & Levinson (Oktober 1,1990) C & EN 3647; The Journal of NIH Research 3: 81–94 (1991); Kwoh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 1173 (1989); Guatelli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 1874 (1990); Lomell et al., J. Clin. Chem 35: 1826(1989) Landegren et al., Science 241: 1077–1080 (1988); Van Brunt, Biotechnology 8: 291–294 (1990); Wu & Wallace, Gene 4: 560 (1989); Barringer et al., Gene 89: 117 (1990) und Sooknanan & Malek, Biotechnology 13: 563564 (1995) eingesehen werden. Verbesserte Klonierungsmethoden für in vitro-amplifizierte Nucleinsäuren sind US-Patent Nr. 5,426,039 zu entnehmen. Verbesserte Methoden zur Amplifizierung umfangreicher Nucleinsäuren sind in Cheng et al., Nature 369: 684–685 (1994) und den darin enthaltenen Literaturhinweisen zusammengefasst. Fachleuten wird klar sein, dass im Wesentlichen jede RNA in eine Doppelstrang-DNA umgewandelt werden kann, die für das Schneiden der DNA mit Restriktionsenzymen, PCR- Expansion und -Sequenzierung mit Revers-Transkriptase und einer Polymerase geeignet ist.
Oligonucleotide für die Verwendung als Proben, zum Beispiel mit in vitro ADNF Nucleinsäure-Amplifizierungsmethoden oder für die Verwendung als Proben zur Ermittlung von ADNF-Nucleinsäuren, werden vorzugsweise nach der von Beaucage & Caruthers, Tetrahedron Letts 22 (20):1859–1862 (1981) beschriebenen Triestermethode mit Phosphoramidit in der Festphase chemisch synthetisiert, z. B. unter Verwendung eines automatisierten Synthesegerätes, z. B. wie von Needham-Van Devanter et al., Nucleic Acids Res. 12:6159–6168 (1984) beschrieben. Auf den individuellen Bedarf zugeschnittene Oligonucleotide können von verschiedenen Bezugsquellen des Handels angefordert werden, die Fachleuten bekannt sind. Die Reinigung von Nucleotiden wird, wo dies erforderlich ist, vorzugsweise durch native Acrylamid-Gelelektrophorese oder durch HPLC-Anionenaustausch durchgeführt, wie von Pearson & Renier, J. Chrom. 255: 137–149 (1983) beschrieben. Die Sequenz der synthetischen Oligonucleotide kann nach der chemischen Abbaumethode von Maxam & Gilbert, in Methods in Enzymology 65: 499–560 (Grossman & Moldave, eds., 1980) geprüft werden.
Fachleute werden verschiedene Möglichkeiten erkennen, um Alterationen in einer gegebenen Nucleinsäuresequenz zu generieren. Zu solchen wohlbekannten Methoden gehören site-directed Mutagenese, PCR-Amplifikation durch degenerierte Oligonucleotide, Exposition der die Nucleinsäure enthaltenden Zellen mit mutagenen Agenzien oder durch Bestrahlung, chemische Synthese eines gewünschten Oligonucleotids (z. B. zusammen mit Ligierung bzw. Klonierung zur Herstellung langer Nucleinsäureketten) sowie andere wohlbekannte Techniken (siehe Giliman & Smith, Gene 8: 81–97 (1979); Roberts et al., Nature 328: 731–734 (1987); und Sambrook et al., Molecular Cloning-A Laboratory Manual (2. Ausg. 1989)).
Rekombinante Expression von ADNF-Polypeptiden
In einer Ausführung werden die Polypeptide bzw. die Untersequenzen davon mit einer rekombinanten Nucleinsäure-Methode synthetisiert. Generell muss dazu eine Nucleinsäuresequenz geschaffen werden, die das Protein codiert, die Nucleinsäure in eine Expressionskassette unter Kontrolle eines bestimmten Promoters platziert, das Protein in einer Gastzelle exprimiert, das exprimierte Protein isoliert und bei Bedarf renaturiert.
Wurde eine ADNF-Polypeptide codierende Nucleinsäure der Erfindung isoliert und geklont, wird die Nucleinsäure wahlweise in rekombinant konstruierten Zellen exprimiert, die Fachleuten bekannt sind. Beispiele solcher Zellen schließen Bakterien, Hefen, Pflanzen, Fadenpilze, Insekten (insbesondere solche, die baculovirale Vektoren benutzen) und Säugetierzellen ein, sind aber nicht auf diese beschränkt. Die rekombinanten Nucleinsäuren sind zur Expression in dem gewählten Gast aktiv mit geeigneten Kontrollsequenzen verbunden. Bei E. coli gehören zu den beispielhaften Kontrollsequenzen T7, trp oder Lambda Promoter, eine Ribosomen-Bindungsstelle und vorzugsweise ein Transkriptions-Stoppsignal. Bei eukariotischen Zellen umfasst die Kontrollsequenz meist einen Promoter und vorzugsweise einen Enhancer, der von Immunglobulin-Genen, SV40, Cytomegalovirus usw. abgeleitet ist, und eine Polyadenylationssequenz, und kann Splice-Donor- und Akzeptorsequenzen enthalten.
Wenn erwünscht können rekombinante Nucleinsäuren konstruiert werden, um ein Fusionspolypeptid zu codieren, das ein ADNF-Polypeptid enthält. Zum Beispiel kann eine ein ADNF I-Polypeptid codierende Nucleinsäure an eine ein ADNF III-Polypeptid codierende Nucleinsäure gebunden werden, so dass eine Mischung von ADNF-Polypeptiden entsteht. In einem anderen Beispiel kann eine ein ADNF-Polypeptid (z. B. ein ADNF I-Polypeptid, ein ADNF III-Polypeptid oder ein ADNF I-/ADNF III-Fusionspolypeptid) codierende Nucleinsäure an eine andere Nucleinsäure gebunden werden, wie z. B. ein HIV-tat-Nucleinsäurenabschnitt, welche die Abgabe des ADNF III-Polypeptids in das Gewebe vereinfacht. In einem weiteren Beispiel kann eine ein ADNF-Polypeptid codierende Nucleinsäure an Nucleinsäuren gebunden werden, die Affinitäts-Tags codieren, um das Protokoll der Proteinreinigung zu erleichtern. Eine ADNF-Nucleinsäure und eine heterologe Polynucleotidsequenz kann geändert werden, um die Fusion und die anschließende Expression der Fusionspolypeptide zu erleichtern. Zum Beispiel kann der 3'Stoppcodon der ADNF-Polynucleotidsequenz durch eine in-frame Linkersequenz ersetzt werden, die Restriktionsstellen bzw. Cleavage Stellen bieten kann.
Die Plasmide der Erfindung können über wohlbekannte Methoden in die gewünschte Gastzelle übertragen werden. Solche Methoden umfassen z. B. die Methode der Calciumchlorid-Transformation für E. coli und die Calciumphosphatbehandlung bzw. die Elektroporationsmethode für Säugetierzellen. Durch die Plasmide transformierte Zellen können aufgrund ihrer Resistenz gegen Antibiotika ausgewählt werden, die durch in den Plasmiden enthaltene Gene übertragen werden, wie amp, gpt, neo und hyg Gene.
Wurden die rekombinanten ADNF-Polypeptide exprimiert bzw. sind sie natürlich vorkommend, können sie mit Standardverfahren der Gentechnologie gereinigt werden, z. B. durch Ammoniumsulfat-Präziptitation, Affinitätssäulen, Säulenchromatographie, Gelelektrophorese und ähnliche (siehe z. B. Scopes, Polypeptide Purification (1982); Deutscher, Methods in Enzymology Band 182 Guide to Polypeptide Purification (1990)). Wurden die ADNF-Polypeptide teilweise gereinigt bzw. haben sie die gewünschte Homogenität erhalten, können die ADNF-Polypeptide anschließend eingesetzt werden, um die Lern- und Gedächtnisfähigkeit eines Subjektes zu verbessern. Siehe auch z. B. Brenneman & Gozes,J Clin. Invest. 97: 2299–2307 (1996), Brenneman et al., J. Pharm. Exp. Ther. 285: 619–627 (1998), und Bassan et al. J.Neurochem 72: 1283–1293 (1999).
Synthese von ADNF-Polypeptiden
Ergänzend zu den bisher erwähnten Rekombinationstechniken können die ADNF-Polypeptide der Erfindung bei Bedarf auch anhand einer großen Auswahl wohlbekannter Techniken synthetisch bearbeitet werden. Relativ kurze Polypeptide können vorzugsweise in einer Lösung oder mittels konventionellen Verfahren auf einem festen Träger synthetisiert werden (siehe z. B. Merrifield, Am. Chem. Soc. 85: 2149–2154 (1963)). Verschiedene automatische Synthese- und Sequenziergeräte sind im Handel erhältlich und können mit bekannten Verfahren verwendet werden (siehe z. B. Stewart & Young, Solid Phase Peptide Synthesis (2. Ausgabe 1984)). Die Festphasesynthese, bei der die Aminosäure am C-Terminus der Sequenz an einen unlöslichen Träger gebunden ist, gefolgt von sequentieller Addition der verbleibenden Aminosäuren der Sequenz, ist die bevorzugte Methode für die chemische Synthese der Polypeptide dieser Erfindung. Methoden für die Festphasesynthese werden beschrieben von Barany & Merrifield, Solid-Phase Peptide Synthesis; Seite 3–284 in The Peptides : Analysis, Synthesis, Biology. Band 2: Special Methods in Peptide Synthesis, Part A.; Merrifield et al.,J. Am. Chem. Soc. 85: 2149–2156 (1963); und Stewart et al., Solid Phase Peptide Synthesis (2. Ausgabe 1984).
Nach chemischer Synthese, biologischer Expression oder Reinigung kann/können das/die Polypeptide) eine gegenüber der nativen Struktur der enthaltenen Polypeptide substanziell veränderte Struktur besitzen. In diesem Fall ist es hilfreich, die Polypeptide zu denaturieren und zu reduzieren und dann für eine Faltung des Polypeptids in die bevorzugte Struktur zu sorgen. Unter Fachleuten sind die Methoden wohlbekannt, um Polypeptide zu reduzieren, zu denaturieren und anschließend eine Proteinfaltung zu induzieren (siehe Debinski et al., J. Biol. Chem. 268: 14065–14070 (1993); Kreitman & Pastan, Bioconjug. Chem. 4: 581–585 (1993); und Buchner et al., Anal. Biochem. 205: 263–270 (1992)). Debinski et al. zum Beispiel beschreiben die Denaturierung und Reduzierung von Inclusion-body-Polypeptiden in Guanidin-DTE. Das Polypeptid wird anschließend in einem Redox-Puffer mit oxydiertem Glutathion und L-Arginin gefaltet.
Fachleute werden erkennen, dass bei den Polypeptiden Änderungen vorgenommen werden können, ohne dass sich die biologische Aktivität der Proteine vermindert. Einige Änderungen können vorgenommen werden, um die Klonierung, Expression oder Inkorporation des Zielmoleküls in ein Fusionspolypeptid zu erleichtern. Solche Änderungen sind unter Fachleuten wohl bekannt und umfassen zum Beispiel die Hinzufügung eines Methionins am Amino-Terminus, um ein Initiationsstelle zu schaffen, oder zusätzliche Aminosäuren (z. B. Poly His) an einem der Termini, um günstig gelegene Stellen für Restriktionen, Stopp-Codons oder Reinigungssequenzen zu schalten.
Konservative Änderungen der ADNF-Nucleinsäuren und -Polypeptide
Fachleute werden erkennen, dass viele konservative Variationen der hier vorgestellten ADNF-Nucleinsäure- und Polypeptidsequenzen funktional identische Produkte hervorbringen. Zum Beispiel sind "stillschweigende Substitutionen" (d. h. Substitutionen an einer Nucleinsäuresequenz, die nicht zur Veränderung des codierten Polypeptids führen) aufgrund der Degeneration des genetischen Codes ein implizites Merkmal jeder Nucleinsäuresequenz, die eine Aminosäure codiert. In ähnlicher Weise werden "konservative Aminosäuresubstitutionen" bei einer oder wenigen Aminosäuren einer Aminosäuresequenz mit verschiedenen Aminosäuren sehr ähnlicher Eigenschaften substituiert (siehe oben stehender Abschnitt Definitionen) und werden auch meist so identifiziert, dass sie einer offenbarten Aminosäuresequenz oder einer offenbarten Nucleinsäuresequenz, die eine Aminosäure codiert, sehr ähnlich sind. Solche konservativ substituierten Variationen jeder explizit aufgelisteten Nucleinsäure- und Aminosäuresequenz sind ein Merkmal der vorliegenden Erfindung.
Fachleute werden verschiedene Möglichkeiten erkennen, um Alterationen in einer gegebenen Nucleinsäuresequenz zu generieren. Zu solchen wohlbekannten Methoden gehören site-directed Mutagenese, PCR-Amplifikation durch degenerierte Oligonucleotide, durch Exposition der die Nucleinsäure enthaltenden Zellen mit mutagenen Agenzien oder durch Bestrahlung, chemische Synthese eines gewünschten Oligonucleotids (z. B. zusammen mit Ligierung bzw. Klonierung zur Herstellung langer Nucleinsäureketten) sowie andere wohlbekannte Techniken (siehe Giliman & Smith, Gene 8: 81–97 (1979); Roberts et al., Nature 328: 731–734 (1987)). Zum Beispiel kann Alanin-Scanning benutzt werden, um die konservativ veränderten Varianten für SALLRSIPA bzw. NAPVSIPQ zu bestimmen (z. B. durch Substituierung jeder Aminosäure einzeln mit einem Alanin oder einer anderen kleinen neutralen Aminosäure und einer Untersuchung auf Aktivität, wie hier beschrieben).
Polypeptidsequenzen können auch durch Austausch der entsprechenden Nucleinsäuresequenz und Expression des Polypeptids verändert werden. Polypeptidsequenzen können ebenfalls synthetisch mit handelsüblichen Peptidsynthesemitteln generiert werden, mit denen jedes gewünschte Polypeptid produziert werden kann (siehe Merrifield, supra, und Stewart & Young, supra).
Insbesondere wird es für Fachleute sofort ersichtlich sein, dass die ADNF-Polypeptide der vorliegenden Erfindung leicht wegen ihrer leistungssteigernden Wirkung mit verschiedenen Assays ermittelt werden können (z. B. Morris Wasserlabyrinthtest).
Mit Hilfe dieser Assays können Fachleute leicht eine große Anzahl ADNF-Polypeptide nach den Anweisungen der vorliegenden Erfindung herstellen und sie anschließend anhand des vorstehenden Assays ermitteln, um zusätzlich zu den hier beschriebenen ADNF-Polypeptide zu finden, die die neuroprotektiven bzw. neurotrophische Wirkung des intakten ADNF-Wachstumsfaktors besitzen. Zum Beispiel kann durch Verwendung von ADNF III-8, d. h. Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln als Startpunkt, systematisch z. B. Gly-, Gly-Gly-, Leu-Gly-Gly- am N-Terminus des ADNF III-8 hinzugefügt und dann wieder jedes dieser ADNF III-Polypeptide des vorausgehenden Assays ermittelt werden, um zu bestimmen, ob diese eine neuroprotektive bzw. neurotrophische Wirkung zeigen. Dadurch wird erkannt werden, dass der neu entdeckten Aktivstelle sowohl am N-Terminal als auch am C-Terminal zusätzliche Aminosäuren hinzugefügt werden können, d. h. Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln, ohne Verlust der biologischen Aktivität, wie aus der Tatsache hervorgeht, dass der intakte ADNF III-Wachstumsfaktor außergewöhnliche biologische Aktivität zeigt. Diese Diskussion ist auch auf die ADNF I-Polypeptide anwendbar.
BEISPIELE
Beispiel I: Erhöhte Lern- bzw. Gedächtnisfähigkeiten nach postnataler Verabreichung eines ADNF-Polypeptids
Beispiel Ibeschreibt die Eigenschaften von ADNF-Polypeptiden wie SALLRSIPA („ADNF-9"), abgeleitet von ADNF I und NAPVSIPQ („NAP"), abgeleitet von ADNF-III bzw. ADNP bei Kontrolltieren oder Tieren, die dem toxisch auf den Acetylcholinstoffwechsel wirkenden (cholinotoxisch) Ethylcholin-Azridium (AF64A) ausgesetzt wurden, das die Aufnahme von Acetylcholin blockiert (Fisher etal., Neurosci. Lett. 102: 325–331 (1989)). Ein intaktes cholinerges System ist für die normale Gehirnfunktion erforderlich, wobei Alzheimer mit dem Tod cholinerger Zellen assoziiert wird (Brumback und Leech, 1994). Daher bieten mit AF64A behandelte Ratten ein anerkanntes Modell für die Prüfung der in-vivo-Effizienz von Medikamenten, die gegen kognitive Defizite schützen, die sich aus der cholinergen Toxizität ergeben (Fisher et al., Neurosci. Lett. 102: 325–331 (1989); Gozes etal., Proc. Nati.Acad Sci. US. A. 93: 427–432 (1996); Gozeset al., Proc. Nati. Acad. Sci. U. S. A. 96: 4143–4148 (1999)). Die unten beschriebenen Experimente zeigen, dass die postnatale intranasale Verabreichung von ADNF-Polypeptiden wie ADNF-9 und NAP bei durch AF64A induzierter cholinerger Toxizität neuroprotektiv gegen kurzfristigen Gedächtnisverlust wirkt. Die Untersuchungen beschreiben auch, wie ADNF-Polypeptide die Lern- und Gedächtnisfunktion von Kontrolltieren verbessern kann.
Material und Methoden
Tiere
Für die Versuche der cholinergen Toxizität wurden männliche Wistar-Ratten (300 bis 350 g, Harlan Laboratories, Jerusalem, Israel) verwendet.
Peptidsynthese
Peptide wurden mit Festphasentechnologie synthetisiert und durch Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie bis zur Homogenität gereinigt (HPLC; Gozes et al., Proc. Nati. Acad. Sci. U. S. A. 96: 4143–4148 (1999)). Reinheit und Identität wurden durch Aminosäureanalyse und Elektrospray-Ionisierung Massenspektroskopie (Micromass, Manchester, U.K.) gesichert. Zusätzliche Peptide wurden von Peptide Technologies, Bethesda, MD, USA gekauft.
Cholinerge Toxizität bei Ratten und Untersuchung des Kurzzeitgedächtnisses in einem Wasserlabyrinth
Ratten wurden täglich zwei Tests in einem Wasserlabyrinth mit versteckter Plattform unterzogen (Morris, R., J. Neurosci. Methods 11: 47–60 (1984); Gordon et al., Neurosci. Lett. 199: 1–4 (1995); Gozes et al., JNeurobiol. 33: 329–342. (1997a)). Jeden Tag wurde zum ersten Test die Position der Plattform und des Tieres im Vergleich zum Pool geändert (der Pool veränderte nicht die Position).
Das Experiment wurde folgendermaßen durchgeführt: Das Tier wurde 0,5 Min. auf die Plattform gestellt, dann ins Wasser gesetzt. Gemessen wurde die zum Erreichen der Plattform (erster Test) benötigte Zeit (gibt Aufschluss über die Lernfähigkeit und das intakte Referenzgedächtnis). Nach 0,5 Min. auf der Plattform wurde das Tier ins Wasser gesetzt (in der vorigen Position), wo es in einem zweiten Test die Plattform suchen sollte (Plattform in der gleichen Position). Die zum Erreichen der Plattform im zweiten Test benötigte Zeit gibt Aufschluss über das Kurzzeit- (Arbeits-)gedächtnis. Die Tiere wurden vier Tage lang getestet, um Tiere mit zufälliger Gedächtnisschwäche auszuschließen.
Den Besten wurde AF64A (Sigma RBI, Saint Louis, Missouri, USA, 3 nmol/2μl/ side) in einer Menge von 0,21 μ/min i.c.v. injiziert; Kontrolltiere erhielten eine Injektion einer Salzlösung (Gozes et al., Proc. Nati.Acad Sci. US. A. 93: 427–432 (1996)). Die Tiere durften eine Woche lang ruhen und erhielten dann täglich eine intranasale Verabreichung von 40 μl 5%iges Sefsol (Sigma, Rehovot, Israel) und 20%iges Isopropanol (Kontrollgruppe) bzw. 1 μg Peptid (experimentell) (Gozes et al., Proc. Nati. AcadSci. US. A. 93: 427–432 (1996)).
Nach einer Woche Peptidbehandlung wurden die Tiere zwei täglichen Tests im Wasserlabyrinth unterzogen (wie oben). Während des Testzeitraums erhielten die Tiere auch eine intranasale Verabreichung mit Peptiden oder mit dem Trägerstoff (Carrier) eine Stunde vor den täglichen Tests. Um Voreingenommenheit wegen Änderungen in der Motorik der verschiedenen Behandlungsgruppen auszuschalten, wurde zur Prüfung des räumlichen Gedächtnisses ein Probentest folgendermaßen durchgeführt. Nach vier Tagen Training und Tests wurde die Plattform entfernt und am Tag 5 mussten die Tiere ohne die Plattform im Pool schwimmen (120 s.); in diesen Versuchen wurde die Zeit aufgenommen, die das Tier sich in dem Poolquadranten aufhielt, wo sich sonst die Plattform befand.
Die Messungen wurden mit Hilfe des computer- und videogestützten HVS-Wasserlabyrinthsystems (HVS Image Ltd. Hampton, UK) durchgeführt.
Biodistribution anhand der intranasalen Verabreichung
NAP (M. W. 824.9) wurde synthetisiert, so dass es Hydroproline enthielt, und diese wurden ausgetauscht, um ein mit [³H] markiertes Peptid zu produzieren (NAP, propyl 3-3,4- [³H], American Radiolabeled Chemicals Inc. St. Louis, MO, USA). Die spezifische Aktivität lag bei 50 Ci/mmol. Die Reinheit und Identität von NAP wurde mit Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC), Zorbax SB-C18 (250 × 4.6 mm) 5 μm, getestet, gefolgt von 20-minütiger Elution mit einem 5–25% Methanolgradienten in 0,1% Trifluoracetylsäure und UV-Bestimmung bei 220 nm und [³H] β-Ram-Detektor. Zweieinhalb Mikroliter einer 1 mCi/ml-Lösung wurden einer (200–300g) männlichen Wistarratte in jedes Nasenloch verabreicht. Zu gegebenen Zeitpunkten wurden Ratten geopfert und die Gewebe bei 55°C für 12 Stunden aufgelöst (100 mg in 1 ml Luma Solve, Lumac bv., Landgraaf, Netherlands). Die Radioaktivität wurde nach Zugabe von Optiflour (10 ml/100 mg, Packard, Groningen, Netherlands) in einem Beta-Szintillationszähler bestimmt.
Zur Bestimmung des intakten NAP im Gehirn wurde Kortexgewebe mit Phosphat gepufferter Salzlösung (PBS) bei 4°C (100 mg/l ml) homogenisiert und das Homogenat wurde einer 10.000 g Zentrifugation bei 4°C (10 min.) unterzogen. Der resultierende Überstand wurde bei –80°C gefroren und dann einer HPLC (RP-18, Merck, 250 × 4 mm, 5 μm) unter Verwendung eines linearen Gradienten zwischen 35% Acetonitril und 75% Acetonitril in mit 0,1% Trifluoracetylsäure versetztem Wasser unterzogen (Gozes et al., Proc. Nati. Acad. Sci. U. S. A. 96:4143–4148 (1999)).
Messungen der cholinergen Aktivität
Die Cholin-Acetyltransferase (ChAT)-Aktivität wurde nach dem veröffentlichten Verfahren (Fonnum, 1975) wie oben gemessen (Gozes et al., J Neurobiol. 33: 329–342. (1997a)). Nach Beendigung des Verhaltenstests wurden die Tiere geopfert und die Gehirne (Hirnrinde) seziert und wie oben weiterverarbeitet (Gozes et al., J Neurobiol. 33: 329–342. (1997a)). Unter den Kontrolltieren, den mit AF64A behandelten und den mit AF64A + Peptid behandelten Tieren wurden Vergleiche gezogen.
Statistische Auswertung
Die statistische Auswertung erfolgte mit der ANOVA Einwegvarianzanalyse mit (immer paarweise) multiplen Vergleichsverfahren (Student-Newman-Keuls Method).
Ergebnisse
Intranasale Verabreichung von ADNF-9 schützt gegen Verlust des Kurzzeitgedächtnisses bei gleichzeitiger AF64A-Behandlung in vivo.
Da ADNF-9 ein kurzkettiges hydrophobes Peptid ist, wurde getestet, ob es durch intranasale Verabreichung die Gehirnfunktionen beeinflusst. Die Bewertung der räumlichen Lern- und Gedächtnisfähigkeit wurde in einem Wasserlabyrinth durchgeführt, durch Messung der Zeit, die erforderlich war, um eine versteckte Plattform zu finden. Pro Tag wurden zwei Tests durchgeführt. Die Position der Plattform und der Ausgangspunkt des Tieres blieb für den täglichen Doppeltest gleich, aber an den darauf folgenden Tagen wurden die Position der Plattform und der Ausgangspunkt des Tieres jeweils geändert.
Am ersten täglichen Test, der für das Referenzgedächtnis maßgebend ist, waren die mit AF64A behandelten Tiere im Vergleich zu den Kontrolltieren langsamer, wie sich am zweiten Testtag herausstellte (p < 0,016). Die Behandlung mit ADNF-9 resultierte in einer scheinbar nicht signifikanten Verbesserung (1A). Im Gegensatz dazu waren die mit AF64A behandelten am zweiten Testtag (maßgebend für das intakte Kurzzeitgedächtnis (Gordon etal., 1995)) erheblich langsamer (p < 0,001 an allen Versuchstagen) und die mit ADNF-9 behandelten Tiere zeigten während des gesamten Versuchs signifikante Verbesserungen und verminderte Reaktionszeiten (1B, p < 0,001).
1C zeigt das Ergebnis des Probentests, das das räumliche Gedächtnis bewerten sollte. Nach 4 Tagen Training und Tests wurde die Plattform entfernt und am Tag 5 mussten die Tiere in einem Pool ohne die Plattform schwimmen. Aus dem Probentest ging hervor, dass die Aufenthaltszeit in dem Poolquadranten, in dem sonst die Plattform stand, bei den mit AF64A behandelten Tieren, die ADNF-9 erhielten, signifikant erhöht war (p < 0,001).
Intranasale Verabreichung von NAP schützt gegen Verlust des Kurzzeitgedächtnisses bei gleichzeitiger AF64A-Behandlung in vivo.
Ein ähnlicher Versuch wie der mit dem für ADNF-9 beschriebenen wurde mit NAP bei Kontrolltieren und mit AF64A behandelten Tieren durchgeführt. Auch hier wurden die Peptide intranasal verabreicht. Am ersten Testtag beim ersten Test, sofort nach Platzierung auf der versteckten Plattform (Testen des Referenzgedächtnisses) waren die mit NAP behandelten Tiere den mit dem Trägerstoff behandelten Tieren signifikant überlegen (2A, p < 0,001). Wie oben angegeben resultierte die AF64A-Behandlung in einer verminderten Leistung im Wasserlabyrinth-Test, und hier verhielten sich die mit NAP behandelten, durch AF64A beeinträchtigten Tiere am vierten Testtag signifikant anders als die mit dem Trägerstoff behandelten, durch AF64A beeinträchtigten Tiere (2A, p < 0,041). Beim zweiten Tagestest, der für das Kurzzeitgedächtnis maßgebend ist, verbesserten sich die mit NAP behandelten, durch AF64A beeinträchtigten Tiere während des Versuchsverlaufs und erreichten bereits am zweiten Testtag das Niveau der Kontrollgruppe (2B, p < 0,001). Nach 4 Tagen Training und Tests wurde die Plattform entfernt und am Tag 5 mussten die Tiere in einem Pool ohne die Plattform schwimmen (wie oben). Die Ergebnisse zeigten, dass die Aufenthaltszeit in dem Poolquadranten, wo sich vorher die Plattform befand, bei den mit AF64A behandelten Tieren, denen NAP verabreicht wurde, gegenüber den mit dem AF64A-Trägerstoff behandelten Tieren signifikant erhöht war (2C, p < 0,001). Außerdem unterschieden sich die mit Peptid behandelten Gruppen (control-sham lesion, bzw. AF64A-lesion) nicht signifikant von den Kontrolltieren (sham-lesion) und eine scheinbar nicht signifikante Verbesserung wurde bei den mit NAP behandelten Gruppen im Vergleich zu den Kontrolltieren (sham-lesion) bemerkt (2C).
Intranasale Verabreichung von NAP schützt das Gedächtnis bei Kontrolltieren in vivo
Ein dem beschriebenen ähnlicher Versuch wurde mit NAP an Kontrolltieren durchgeführt. Auch hier wurden die Peptide intranasal verabreicht. Wie in 2A gezeigt, zeigten die mit NAP behandelten Kontrolltiere beim ersten Tagestest sofort nach Platzierung auf der versteckten Plattform (Test für Referenzgedächtnis) signifikant verbesserte Leistungen im Vergleich zu nicht mit NAP behandelten Kontrolltieren (2A).
Bioverfügbarkeit und Stabilität von NAP
Im oben genannten Wasserlabyrinthtest resultierte die Verabreichung von NAP in einer sichtbaren Verhaltensverbesserung im Vergleich zu einer Anwendung von ADNF-9 (1 gegenüber 2). Vorausgehend war ADNF-9 weniger wirkungsvoll als NAP bei der Verbesserung von Gedächtnisdefiziten bei Apolipoprotein-E defizienten Mäusen (Bassan et al., J. Neurochem. 72:1283–1293 (1999)) und PBS-Lösungen von ADNF-9 verloren ihre biologische Aktivität bei Lagerung bei Temperaturen unter 4°C (Brenneman et al., J. Pharmacol. Exp.Therap. 285: 619–627 (1998)). Daher wurde beschlossen, die Bioverfügbarkeit und Stabilität von NAP im Sinne der Eignung für ein zukünftiges Therapeutikum zu untersuchen.
Die Verteilung von intranasal verabreichtem [³H]-NAP wurde im Zeitverlauf in verschiedenen Körperorganen gemessen. Die Ergebnisse (3A) zeigten 30 Minuten nach Verabreichung eine hohe Gesamtradioaktivität (berechnet in femtomol NAP/g Gewebe) in Darm und Leber, mit Höchstwerten im Darm. Die Gesamtradioaktivität im Gehirn (Großhirnrinde) war 60 Minuten nach Verabreichung am höchsten (3B). Jedes Tier erhielt fünf Mikroliter [³H]-NAP, das 2,5 Millionen dpm (22,75 pmole) enthielt. Wäre der Wirkstoff in einer 250g schweren Ratte gleichmäßig verteilt, würde dies 91 femtomol/g Gewebe entsprechen (bei 300g schweren Ratten 75,5 femtomol/g Gewebe). Diese Ergebnisse zeigen 45 femtomol/g Gewebe. Tests mit Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (RP-HPLC) weisen darauf hin, dass das Peptid 30 Minuten nach Verabreichung im Hirn intakt vorlag (3C). Von den 807,8 femtomol/g Gewebe, die aus der Säule eluiert wurden, migrierte 98 femtomol/g Gewebe mit dem intakten NAP. Dies weist darauf hin, dass im Gehirn 30 Minuten nach Verabreichung mindestens 12% des Materials intakt waren. Sechzig Minuten nach Verabreichung eluierten von den von der Säule eluierten 1198,9 femtomol/g Gewebe nur 2% mit dem intakten radioaktiven NAP (3D).
Diese Ergebnisse zeigten an, dass die Halbwertszeit des NAP im Kortex etwa 15 Minuten beträgt. Eine genauere Untersuchung von 3A und 3B zeigte höhere Werte des radioaktiven NAP im Blut als im Kortex, insbesondere 3 Stunden nach Verabreichung, eine Zeit, nach der das Peptid wahrscheinlich völlig abgebaut war (3D). Die erhöhten Radioaktivitätswerte im Blut zu späterer Zeit nach der Peptidanwendung können auf den Abbau und die Verstreuung des Peptids hinweisen.
Um der Frage nachzugehen, ob das Peptid sich im Gehirngewebe oder in den Blutgefäßen des Gehirns befindet, wurde eine zusätzliche Untersuchung durchgeführt. Dazu wurden 200 g schwere männliche Ratten wie vorausgehend behandelt und 30 Minuten nach Peptidgabe (nach 30 Minuten ist das Peptid noch intakt, 3C) wurden die Gehirne seziert und kleine Blutgefäße sorgfältig entfernt. Die Ergebnisse zeigen, dass, obwohl ein Teil der Radioaktivität von kleinen sichtbaren Blutgefäßen herrührte, sich das meiste davon im sichtbaren Gehirngewebe befand, wobei der Beitrag der sichtbaren Blutgefäße unwesentlich war (3E). Außerdem befand sich im Kleinhirn (frei von kleinen sichtbaren Blutgefäßen), welches weiter vom Riechzentrum entfernt ist als die Großhirnrinde, anscheinend weniger radioaktives Peptid. Der Unterschied zwischen Großhirnrinde und Kleinhirn war jedoch nicht signifikant, was auf eine schnelle Peptidverteilung hinweist (3B und 3E).
Mit AF64A behandelte Tiere zeigen eine Verminderung der Cholinacetyl-Transferaseaktivität auf, Schutz durch NAP
Enzymatische Versuche an Gehirnextrakten abgeleitet von mit AF64A behandelten Tieren und sham-behandelten Kontrolltieren (drei Tiere pro Gruppe, jeder Versuch dreifach) zeigten am Ende des Versuchs (4A) eine geringfügige Verminderung (11 + 2,6%) bei der Cholinacetyl-Transferaseaktivität. Die Behandlung der AF64A-Tiere mit NAP ergab eine erhöhte cholinerge Aktivität, die sich von den Werten der Kontrollgruppen (sham-behandelt) nicht unterschied (4A, 100% Cholinacetyl-Transferaseaktivität zeigte 130 pmol/mg Protein/Minute an).
Von vier Tiergruppen wurden drei mit AF64A behandelt, erhielten eine Woche Ruhe, und dann wurden zwei Gruppen intranasal mit entweder ADNF-9 oder NAP behandelt. Nach 5 Behandlungstagen wurde den Tieren eine zweitägige Erholung verordnet und anschließend wurden sie täglichen Wasserlabyrinthtests (wie in 1 und 2 gezeigt) unterzogen. Der Unterschied zwischen diesem Experiment und den obigen Experimenten (1 und 2) liegt darin, dass die Tiere vor dem Verhaltenstest keine tägliche intranasale Verabreichung von Peptiden erhielten. Die mit NAP behandelten AF64A-Tiere unterschieden sich nicht signifikant von den Kontrollratten und waren signifikant schneller beim Finden der versteckten Plattform im Wasserlabyrinth als die mit ADNF-9 behandelten AD64A-Ratten (p < 0,022).
Diskussion
Die vorliegende Studie hat die in-vivo-Effizienz der neuroprotektiven Wirkung von ADNF aufgezeigt. Die intranasale Verabreichung von ADNF-9 bzw. NAP schützte gegen den Verlust des Kurzzeitgedächtnisses, das mit der AF64A-Behandlung assoziiert wird. Die Verabreichung von NAP verbesserte ebenfalls das Referenzgedächtnis bei Kontrolltieren. Darüber hinaus schützte NAP gegen die Verminderung der Cholinacetyl-Transferaseaktivität, wie vorausgehend ebenfalls für Apolipoprotein E-defiziente Mäuse gezeigt wurde (Bassan et al., J. Neurochem. 72: 1283-1293 (1999)). Die Verteilung von NAP im Gehirn und im Körper erfolgte schnell. Die berechnete Halbwertszeit von NAP im Gehirn nach intranasaler Verabreichung lag bei etwa 15 Minuten. Die HPLC-Analyse zeigte, dass NAP in vivo zu unterschiedlichen Fragmenten metabolisiert wird. Dies gibt einen Hinweis auf aktive Metaboliten.
Die Auswirkungen von ADNF-9 und NAP auf die cholinerge Aktivität (4A) und in den Verhaltenstests (4A) weisen auf die Möglichkeit hin, dass die beiden Peptide bei der Verbesserung der kognitiven Funktionen über verschiedene Mechanismen wirken, wobei ADNF-9 eine sofortige Kurzzeitwirkung entfaltet. Darüber hinaus zeigten die mit NAP durch intranasale Verabreichung behandelten Tiere erhöhte Lern- und Gedächtnisfähigkeiten im Wasserlabyrinth im Vergleich zu den mit ADNF-9 behandelten Tieren (1 und 2). In ähnlicher Weise verhinderte die Injektion von NAP (und nicht von ADNF-9) bei neugeborenen Apolipoprotein E-defizienten Mäusen die Defizite im Kurzzeitgedächtnis bei drei Wochen alten Mäusejungen (Bassan etal., J.Neurochem. 72: 1283–1293 (1999)).
Diese Studien weisen auf ein breites neuroprotektives Wirkungsspektrum von NAP hin. In der Tat bot NAP (über einen großen Konzentrationsbereich) Schutz gegen die durch Buthionin-Sulfoximin induzierte Abnahme (70–90%) der Lebensfähigkeit von Neuroblastomzellen (Offen et al., Brain Research 854: 257–262 (2000)). Buthionin-Sulfoximin, ein selektiver Hemmstoff der Glutathionsynthese, bewirkt eine merkliche Abnahme des reduzierten Glutathions in Neuronzellmodellen, die zu verringerter Lebensfähigkeit führen (Offen et al., Brain Research 854: 257–262 (2000)). Daher könnte der neuroprotektive Mechanismus des NAP durch die Erhöhung des Zellwiderstands gegen oxidativen Stress bewirkt werden, ein allgemeiner Mechanismus, der das Überleben einer Zelle beeinflusst. Außerdem haben toxikologische Vorstudien bei diesem Peptid keine toxischen Effekte gezeigt.
Als Schlussfolgerung identifiziert die demonstrierte in-vivo-Wirksamkeit des NAP, gekoppelt an seine Bioverfügbarkeit und anscheinende Stabilität, dieses als einen attraktiven Leitwirkstoff für die Entwicklung von Therapeutika gegen neurodegenerative Erkrankungen. Die derzeit verfügbaren Medikamente für die symptomatische Behandlung der Alzheimer Erkrankung zielen direkt auf die Funktionsfähigkeit des cholinergen Systems ab. Ein Beispiel ist Takrin, das inhibierend auf Acetylchlorinesterase wirkt (van Reekum et al., Can.J. Psychiatry 42 suppi.1 :35S–50S (1997)). Die Behandlung mit Wachstumsfaktoren könnte jedoch ein breiteres neuroprotektives Wirkungsspektrum abdecken, folglich können Studien über die in vivo Auswirkungen der neurotrophischen Faktoren eine bedeutende Grundinformation und neue Horizonte für die Schaffung von Medikamenten bieten.
Beispiel II: Die pränatale Verabreichung von ADNF-Polypeptiden liefert postnatal eine erhöhte Lern- und/oder Gedächtnisfähigkeit
Material und Methoden
Tiere und Behandlung
Weibliche C57-B16J Mäuse (Jackson Labs) wurden bei 12 h Licht /12h Dunkelheit mit Futter und Wasser ad libitum gehalten. Die Mäuse wurden von Menschen nach der Richtlinie "Guideline for Care and Use of Experimental Animals" gepflegt. Die sechs Wochen alten weiblichen Mäuse (21 bis 24 g) wurden mit männlichen C57-B16J Mäusen 4 Stunden gepaart. Das Vorhandensein eines Vaginal-Plugs wurde als Tag 0 der Trächtigkeit angesehen.
Die Tiere erhielten am B. Trächtigkeitstag eine intraperitoneale Injektion, oder wurden am B. Trächtigkeitstag nach 1 Stunde Fasten über eine Sonde mit einer Dosis ADNF-Polypeptiden behandelt. Das NAP wurde mit 50 μl DMSO verdünnt und in gefilterter, mit Phosphat gepufferter Salzlösung nach Dulbecco (DPBS) verdünnt. SAL wurde aufgelöst und in gefilterter DPBS verdünnt. Die Kontrolltiere wurden mit einem Trägerstoff behandelt (z. B. DPBS). Alle Behandlungen wurden codiert.
Der Wurf erfolgte am 20. Tag, die Entwöhnung am 20. Lebenstag. Die männlichen Nachkommen erhielten einen Ohrknopf, alle Markierungen zur Identifikation codierter Behandlungen wurden entfernt.
Morris Wasserlabyrinth Test
Nur die männlichen Nachkommen wurden für die Wasserlabyrinth-Versuche herangezogen. Die Versuche an den Mäusen begannen am 35. bis 50. Lebenstag, meist am 38. Tag, und zwar zweimal täglich (zwei Tests) an 7 aufeinanderfolgenden Tagen.
Der verwendete Morris Wasserlabyrinth-Test wurde angepasst von: "Repeated acquisition of a spatial navigation task in mice: Effects of spacing of trials and of unilateral middle cerebral artery occlusion" Klapdor & Van der Staay, Physiology & Behav. 63 (5): 903–909(1998). Ein Test besteht darin, die versteckte Plattform von 4 festgelegten Punkten aus zu finden. Die Tests an den Mäusen begannen meist morgens, vorzugsweise zwischen 9 und 9:30 Uhr. Konsequente Zeitmessung ist bei allen Verhaltensstudien wichtig. Das Testen der Mäuse erfolgte in einer zufälligen Reihenfolge, um die Voreingenommenheit des Forschers bei einem chronologischen Ablauf zu vermeiden. Das Labyrinth wurde am Vortag eingerichtet, damit das Wasser Raumtemperatur erlangen konnte. 100 bis 150 ml nicht-toxische weiße Tempurafarbe wird zugesetzt und verrührt. Vor Testbeginn wird an jedem Tag das Wasser zur gleichmäßigen Verteilung der Farbe gerührt, und zusätzliches Wasser wird zugefügt, damit trotz Verdunstung eine gleich bleibende Wasserhöhe von 7 bis 10 ml über der Plattform sichergestellt werden kann. Die Software wird aufgestellt, so dass die Maskierung optimal ist und jeder der beiden Tests wird auf 60 Sekunden eingestellt. Die aktive Plattform wird in Quadrant Nummer 1 gesetzt.
Die Mäuse dürfen am Tag 1 während einer Minute auf der Plattform sitzen, um sich an ihre Umgebung zu gewöhnen und einen ersten Sinn dafür zu entwickeln, wo sich die rettende Plattform befindet. Es ist in diesem ersten Stadium normal, dass die Mäuse von der Plattform springen und schwimmend die Umgebung erkunden. Dies sollte kurz erlaubt werden, aber nach ein paar Sekunden Schwimmen sollten die Mäuse wieder auf die Plattform gesetzt werden.
Die Mäuse werden an der Mittellinie, die die Quadranten 2 und 3 (Westen) voneinander trennt, zur Außenseite des Labyrinths gerichtet, losgelassen. Sie dürfen 60 Sekunden schwimmen bzw. bis sie die Plattform eigenständig erreichen. Finden sie die Plattform nicht selbst, wurden sie manuell dorthin gesetzt. Alle Mäuse dürfen dann nach dem ersten Versuch 15 Sekunden auf der Plattform sitzen.
Der zweite Versuch verläuft auf die gleiche Art wie der erste (gleiche Ausgangsposition, gleiche Plattformposition usw.), die Mäuse dürfen auch wieder 15 Sekunden lang auf der Plattform sitzen, bevor sie zu den Trockenkäfigen gebracht werden (ausgestattet mit Tüchern, um das überschüssige Wasser aufzusaugen).
An den Tagen 2 bis 7 wird den Mäusen vor dem ersten Test nur 15 Sekunden auf der Plattform erlaubt. Dies reicht, damit sie sich an die Wassertemperatur gewöhnen. Die Tendenz, die Plattform zu verlassen, hat an diesem Stadium gegenüber Tag 1 in bemerkenswertem Ausmaß nachgelassen, die meisten Mäuse bleiben still sitzen, ohne zu versuchen, die Plattform zu verlassen. Die tägliche durchschnittliche Fluchtlatenz wird an den 7 Tagen aus Gründen der Testverwaltung berechnet und dokumentiert. Viele Mäuse mit verringerter räumlicher Lernfähigkeit und Gedächtnis zeigen Verhaltensstörungen, einschließlich Kontaktinhibition und Treiben. Dies wurde von Minichiello et al., Neuron 24 (2): 401–414 (1999) dokumentiert.
Der durchschnittliche Wert der beiden Tests wurde aufgezeichnet und für die statistische Auswertung verwendet. Die statistische Analyse wurde mit ANOVA und nachfolgender Bonferroni Korrektur bei multiplen Analysen (Gesamtwert P < 0,007 gilt als signifikant) und Fisher's Post-hoc-Test zur Bestimmung signifikant unterschiedlicher Paare durchgeführt.
Statistische Auswertung
Die statistischen Untersuchungen umfassten ANOVA für kontinuierliche Variablen, Mann-Whitney U für nichtparametrische Daten, Chi-Quadrattest für kategorische Variablen oder Fisher's Exakt-Test (Statview 4.5 (Abacus Concepts, Inc., Berkeley, CA)), die an geeigneten Fällen eingesetzt wurden, wobei p < 0,05 als signifikant galt. Die Ergebnisse wurden als Durchschnitt t Standardabweichung angegeben, außer wenn anders spezifiziert.
Ergebnisse
Auswirkungen der pränatalen Behandlung mit L-NAP + L-SAL
Tragende weibliche Tiere wurden am B. Trächtigkeitstag mit einer intraperitonealen Injektion von L-NAP (NAPVSIPQ, aus ADNF III) (0,2 ml; 20 μg) und L-SAL (SALLRSIPA, aus ADNF1) (0,2 ml, 20 μg) (n=8) oder nur mit Trägerstoff (n=50) behandelt.
Die Bewertung der Lernfähigkeit wurde anhand des im Abschnitt Material und Methoden beschriebenen Morris Wasserlabyrinths durchgeführt. Ab dem 38. Lebenstag wurden zwei aufeinander folgende Tests pro Tag über einen Zeitraum von 7 Tagen im Morris Wasserlabyrinth durchgeführt. Aufgezeichnet wurde die benötigte Reaktionszeit, um die versteckte Plattform zu finden. Alle Tiere wurden täglich in einer zufällig bestimmten Reihenfolge getestet. Der Durchschnittswert beider Versuche wurde analysiert.
Wie in 5 gezeigt, setzte bei den Tierjungen, die pränatal mit L-NAP + L-SAL behandelt wurden, die Lernfähigkeit früher ein als bei den Tierjungen aus Kontrollwürfen (P < 0,03).
Auswirkungen oraler D-NAP + D-SAL-Verabreichung
Tragenden weiblichen Tieren wurde am B. Trächtigkeitstag nach 1 Stunde Fasten mit einer Sonde eine Dosis (0.2 ml) D-NAP (40 μg) und D-SAL (40 μg) (n=27) bzw. nur der Trägerstoff (n=34) verabreicht. Die Bewertung der Lernfähigkeit wurde anhand des im Abschnitt Material und Methoden beschriebenen Morris Wasserlabyrinths durchgeführt. Ab dem 38. Lebenstag wurden zwei aufeinander folgende Tests pro Tag über einen Zeitraum von 7 Tagen im Morris Wasserlabyrinth durchgeführt. Aufgezeichnet wurde die benötigte Reaktionszeit, um die versteckte Plattform zu finden. Konnte das Tier die Plattform innerhalb von 60 Sekunden nicht finden, wurde es manuell auf die Plattform gesetzt. Alle Tiere wurden täglich in einer zufällig bestimmten Reihenfolge getestet. Der Durchschnittswert beider Versuche wurde analysiert. Wie in 6 gezeigt, lernten die während der Trächtigkeit einer oralen D-NAP + D-SAL-Gabe ausgesetzten Tiere signifikant schneller als die Kontrolltiere, auch setzte ihre Lernfähigkeit früher ein und es wurde zum Ende der Studie eine insgesamt verringerte Reaktionszeit beobachtet.
Auswirkungen oraler D-SAL-Verabreichung
Tragenden weiblichen Tieren wurde am 8. Trächtigkeitstag nach 1 Stunde Fasten mit einer Sonde eine Dosis (0,2 ml) D-SAL (40 μg) (n=14) bzw. nur der Trägerstoff (n=16) verabreicht. Die Bewertung der Lernfähigkeit wurde anhand des im Abschnitt Material und Methoden beschriebenen Morris Wasserlabyrinths durchgeführt. Zwei aufeinander folgende Tests wurden pro Tag über einen Zeitraum von 7 Tagen im Morris Wasserlabyrinth durchgeführt. Aufgezeichnet wurde die benötigte Reaktionszeit, um die versteckte Plattform zu finden. Konnte das Tier die Plattform innerhalb von 60 Sekunden nicht finden, wurde es manuell auf die Plattform gesetzt. Alle Tiere wurden täglich in einer zufällig bestimmten Reihenfolge getestet. Der Durchschnittswert beider Versuche wurde analysiert. Wie in 7 gezeigt schienen die Tiere, die eine orale D-SAL-Gabe erhielten, einen Trend zu geringeren Reaktionszeiten zu zeigen.
Auswirkungen oraler D-NAP-Verabreichung
Tragenden weiblichen Tieren wurde am B. Trächtigkeitstag nach 1 Stunde Fasten mit einer Sonde eine Dosis (0,2 ml) D-NAP (40 μg) (n=13) bzw. nur der Trägerstoff (n=14) verabreicht. Die Bewertung der Lernfähigkeit wurde anhand des im Abschnitt Material und Methoden beschriebenen Morris Wasserlabyrinths durchgeführt. Zwei aufeinander folgende Tests wurden pro Tag über einen Zeitraum von 7 Tagen im Morris Wasserlabyrinth durchgeführt. Aufgezeichnet wurde die benötigte Reaktionszeit, um die versteckte Plattform zu finden. Konnte das Tier die Plattform innerhalb von 60 Sekunden nicht finden, wurde es manuell auf die Plattform gesetzt. Alle Tiere wurden täglich in einer zufällig bestimmten Reihenfolge getestet. Der Durchschnittswert beider Versuche wurde analysiert. Wie in 8 gezeigt schienen die Tiere, die eine orale D-NAP-Gabe erhielten, einen Trend zu geringeren Reaktionszeiten zu zeigen.
Auswirkungen einer oralen D-SAL-Gabe (Doppelfe Dosis, 80 μg)
Tragenden weiblichen Tieren wurde am B. Trächtigkeitstag nach 1 Stunde Fasten mit einer Sonde eine Dosis (0,2 ml) D-SAL (80 μg) (n=19) bzw. nur der Trägerstoff (n=19) verabreicht. Die Bewertung der Lernfähigkeit wurde anhand des im Abschnitt Material und Methoden beschriebenen Morris Wasserlabyrinths durchgeführt. Zwei aufeinander folgende Tests wurden pro Tag über einen Zeitraum von 7 Tagen im Morris Wasserlabyrinth durchgeführt. Aufgezeichnet wurde die benötigte Reaktionszeit, um die versteckte Plattform zu finden. Konnte das Tier die Plattform innerhalb von 60 Sekunden nicht finden, wurde es manuell auf die Plattform gesetzt. Alle Tiere wurden täglich in einer zufällig bestimmten Reihenfolge getestet. Der Durchschnittswert beider Versuche wurde analysiert. Wie in 9 gezeigt, schienen die Tiere, die die doppelte Dosis orales D-SAL verabreicht bekommen hatten, den Kontrolltieren sehr ähnliche Leistungen zu zeigen.
Auswirkungen oraler D-NAP + D-SAL-Verabreichung bei Probentest
Tragenden weiblichen Tieren wurde am 8. Trächtigkeitstag nach 1 Stunde Fasten mit einer Sonde eine Dosis (0,2 ml) D-NAP (40 μg) und D-SAL (40 μg) (n=27) bzw. nur der Trägerstoff (n=34) verabreicht. Bei den Tieren, die im Wasserlabyrinth getestet wurden, wurde die Lernfähigkeit der Mäuse weiter in einem Probentest bewertet. In einem Probentest wurde das oben beschriebene Wasserlabyrinth verändert, indem die Plattform herausgenommen wurde. Gemessen wurde die Zeit, die die Tiere sich in dem Poolquadranten aufhielten, wo sonst die Plattform stand. Wie in 10 gezeigt hielten sich die Tiere, die einer D-NAP + D-SAL-Gabe unterzogen wurden, gegenüber der Kontrollgruppe eine signifikant längere Zeit in dem Quadranten auf (in dem die Plattform sonst stand).

Claims

Zusammensetzung zur Verbesserung der Lernfähigkeit und/oder Gedächtnisfunktion bei einem Subjekt, wobei die Zusammensetzung in einer ausreichenden Menge ein aktivitätsabhängiger neurotrophischer Faktor (ADNF)-Polypeptid enthält, um die postnatale Lernfähigkeit und/oder Gedächtnisfunktion des Subjekts zu verbessern, bei der das ADNF-Polypeptid eine Mischung ist aus: (a) einem ADNF I-Polypeptid mit einer aktiven Kernstelle mit folgender Aminosäurensequenz: Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala (SEQ ID NR : 1); und (b) einem ADNF III-Polypeptid mit einer aktiven Kernstelle mit folgender Aminosäurensequenz: Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln (SEQ ID NR : 2).
Zusammensetzung nach Anspruch 1, bei der das ADNF-Polypeptid eine Mischung aus einem ADNF I-Polypeptid ganzer Länge und einem ADNF III-Polypeptid ganzer Länge ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, bei der die aktive Kernstelle des ADNF I-Polypeptids mindestens eine D-Aminosäure umfasst.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, bei der die aktive Kernstelle des ADNF I-Polypeptids alle D-Aminosäuren umfasst.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, bei der das ADNF I-Polypeptid Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala (SEQ ID NR : 1) ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, bei der das ADNF I-Polypeptid aus der wie folgt zusammengesetzten Gruppe ausgewählt ist: – Val-Leu-Gly-Gly-Gly-Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala (SEQ ID NR : 14); – Val-Glu-Glu-Gly-Ile-Val-Leu-Gly-Gly-Gly-Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala (SEQ ID NR : 15); – Leu-Gly-Gly-Gly-Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala (SEQ ID NR : 16); – Gly-Gly-Gly-Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala (SEQ ID NR : 17); – Gly-Gly-Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala (SEQ ID NR : 18); – Gly-Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala (SEQ ID NR : 19); und – Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala (SEQ ID NR : 1).
Zusammensetzung nach Anspruch 1, bei der das ADNF I-Polypeptid an mindestens einem des N-Terminus und C-Terminus der aktiven Kernstelle bis zu 20 Aminosäuren umfasst.
Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 5, bei der das ADNF III-Polypeptid Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln (SEQ ID NR : 2) ist.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, bei der die aktive Kernstelle des ADNF III-Polypeptids mindestens eine D-Aminosäure umfasst.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, bei der die aktive Kernstelle des ADNF III-Polypeptids alle D-Aminosäuren umfasst.
Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 6, bei der das ADNF III-Polypeptid ein Element ist, das aus der wie folgt zusammengesetzten Gruppe ausgewählt ist: – Gly-Gly-Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln (SEQ ID NR : 20); – Leu-Gly-Gly-Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln-Gln-Ser (SEQ ID NR : 21); – Leu-Gly-Leu-Gly-Gly-Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln-Gln-Ser (SEQ ID NR : 22); – Ser-Val-Arg-Leu-Gly-Leu-Gly-Gly-Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln-Gln-Ser (SEQ ID NR : 23); und – Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln (SEQ ID NR : 2).
Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 7, bei der das ADNF III-Polypeptid an mindestens einem des N-Terminus und C-Terminus der aktiven Kernstelle bis zu 20 Aminosäuren umfasst.
Zusammensetzung nach Anspruch 5 und 8, bei der eines der ADNF I- und ADNF III-Polypeptide oder beide alle D-Aminosäuren umfassen.
Nukleinsäure, die für beide ADNF-Polypeptide einer Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 13 codiert.
Medikament zur Verbesserung der Lernfähigkeit und/oder der Gedächtnisfunktion bei einem Subjekt, wobei das Medikament in ausreichender Menge eine Zusammensetzung gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 13 oder eine Nukleinsäure gemäß Anspruch 14 enthält, um die postnatale Lernfähigkeit und/oder Gedächtnisfunktion des Subjekts zu verbessern, wobei das Medikament für eine pränatale oder postnatale Verabreichung an das Subjekt anwendungsbereit ist.
Medikament gemäß Anspruch 15 zur postnatalen Verabreichung an ein Subjekt, das an einer Krankheit leidet bzw. davon betroffen ist, welche aus der aus einer Neuropathologie, Alzheimerschen Erkrankung und dem Down-Syndrom bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Medikament gemäß Anspruch 15 zur postnatalen Verabreichung an ein normales oder altes Subjekt, bzw. an ein Subjekt, das ein besseres Kurzzeitgedächtnis oder ein besseres Referenzgedächtnis braucht.
Medikament gemäß einem der Ansprüche 16 oder 17 zur intranasalen oder oralen Verabreichung.
Medikament gemäß Anspruch 15 zur pränatalen Verabreichung an ein Subjekt mit normalen geistigen Fähigkeiten.
Medikament gemäß Anspruch 15 zur pränatalen Verabreichung an ein Subjekt, das eine geistige Retardierung, eine familiäre Vorgeschichte geistiger Retardierung oder ein Down-Syndrom aufweist bzw. eine Mutter hat, die während es mit dem Subjekt schwanger ist, mindestens 35 Jahre alt ist.
Medikament gemäß Anspruch 15 zur pränatalen Verabreichung an ein Subjekt, bei dem das ADNF-Polypeptid in der Zeit der Bildung des Neuralrohres und/oder der Schließung des Neuralrohres verabreicht werden muss.
Medikament gemäß einem der Ansprüche 15 oder 19 bis 21 zur pränatalen Verabreichung an ein Subjekt, bei dem das ADNF-Polypeptid während der Schwangerschaft intraperitoneal oder oral an die Mutter verabreicht werden muss.
Verwendung einer Zusammensetzung, welche ein aktivitätsabhängiger neurotrophischer Faktor (ADNF)-Polypeptid in einer ausreichenden Menge enthält, um die postnatale Lernfähigkeit und/oder Gedächtnisfunktion bei einem Subjekt zu verbessern, gemäß einem der Ansprüche 1 bis 13, für die Herstellung eines Medikaments zur Verbesserung der Lernfähigkeit und/oder der Gedächtnisfunktion des Subjekts.
Verwendung einer Nukleinsäure, die für beide aktivitätsabhängiger neurotrophischer Faktor (ADNF)-Polypeptide einer Zusammensetzung zur Verbesserung der postnatalen Lernfähigkeit und/oder Gedächtnisfunktion bei einem Subjekt codiert, gemäß einem der Ansprüche 1 bis 13, für die Herstellung eines Medikaments zur Verbesserung der postnatalen Lernfähigkeit und/oder Gedächtnisfunktion des Subjekts.
Verwendung einer Zusammensetzung oder einer Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 23 oder 24 für die Herstellung eines Medikaments gemäß einem der Ansprüche 15 bis 22.