DE60010478T2

DE60010478T2 - Oral wirksame peptide, die zellschädigung und zelltod verhindern

Info

Publication number: DE60010478T2
Application number: DE60010478T
Authority: DE
Inventors: E. Douglas Brenneman; Illana Gozes; Y. Catherine Spong; Albert Egoz St. Pinhasov; Eliezer Ramat Poleg Giladi
Original assignee: Ramot at Tel Aviv University Ltd; US Department of Health and Human Services
Current assignee: Ramot at Tel Aviv University Ltd; US Government
Priority date: 1999-08-18
Filing date: 2000-08-17
Publication date: 2005-06-09
Anticipated expiration: 2020-08-18
Also published as: EP1206489B1; AU6920100A; CA2381981A1; ES2220522T3; DE60010478D1; ATE266044T1; WO2001012654A2; WO2001012654A3; EP1206489A2; AU761597B2

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf aktivitätsabhängiger neurotrophischer Faktor (ADNF)-Polypeptide mit mindestens einer D-Aminosäure innerhalb der aktiven Kernstellen der ADNF-Polypeptide. Die Erfindung bezieht sich auch auf pharmazeutische Zusammensetzungen mit ADNF-Polypeptiden, die mindestens eine D-Aminosäure innerhalb der aktiven Kernstellen der ADNF-Polypeptide enthalten. Zudem bezieht sich die Erfindung auf die Anwendung der erfindungsgemäßen ADNF-Polypeptide zur Herstellung eines Medikaments für die Reduzierung des neuronalen Zelltodes in vitro und in vivo, sowie auf die Anwendung der erfindungsgemäßen ADNF-Polypeptide zur Herstellung eines Medikaments für die Behandlung oxidativen Stresses bei einem Patienten und auf die Anwendung der erfindungsgemäßen ADNF-Polypeptide zur Herstellung eines Medikaments für die Reduzierung eines mit dem fetalen Alkoholsyndrom assoziierten Zustands.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Das Absterben von Nervenzellen wurde mit diversen klinischen Zuständen und Krankheiten in Verbindung gebracht. Diese Zustände und Krankheiten umfassen zum Beispiel neurodegenerative Krankheiten wie Alzheimersche Erkrankung, Demenz in Verbindung mit einer HIV-Infektion, Huntington-Chorea und Parkinson. Der neuronale Zelltod wurde auch mit Wachstumsretardierung und Lernschwierigkeiten in Verbindung gebracht. Diese Krankheiten und Zustände führen zu schweren Defiziten und haben lebenslange Auswirkungen auf die Personen, bei denen derartige Zustände oder Krankheiten diagnostiziert wurden.
Vorausgehend wurde erwähnt, dass aktivitätsabhängiger neurotrophischer Faktor(ADNF)-Polypeptide zur Verhinderung oder Reduzierung des Absterbens von Nervenzellen eingesetzt werden können. Das aktivitätsabhängiger neurotrophischer Faktor I (ADNF I)-Polypeptid wird in Gegenwart des vasoaktiven intestinalen Peptids (VIP) von den astroglialen Zellen abgesondert. Das ADNF I-Polypeptid weist bei erstaunlich geringen femtomolaren Konzentrationen eine Aktivität auf, die das Überleben von Nervenzellen begünstigt (Brenneman & Gozes, J. Clin. Invest. 97:2299-2307 (1996)). Andere Studien haben ADNF I-Peptidfragmente identifiziert, die die neurotrophischen und neuroprotektiven Eigenschaften des ADNF I reproduzieren. Das kürzeste Peptid (d. h. die aktive Kernstelle), das die überlebensfördernde Aktivität des ADNF I einschloss, war das Peptid SALLRSIPA, das als ADNF-9 bzw. SAL bezeichnet wird (Brenneman et al., J. Pharm. Exp. Therp. 285:619–627 (1998)). Studien über Moleküle, die mit dem ADNF I-Polypeptid verwandt sind, haben zur Entdeckung eines aktivitätsabhängigen neurotrophischen Proteins (sowohl mit ADNP als auch mit ADNF III bezeichnet) geführt. Dieses Protein wurde geklont (Bassan et al., J. Neurochem. 72:1283–1293 (1999)), wobei man herausgefunden hat, dass es ein hinsichtlich der biologischen Aktivität dem Peptid SAL ähnliches aktives Peptid aufwies. Bei diesem Peptid (d. h. die aktive Kernstelle) handelte es sich um NAPVSIPQ, das als NAP bezeichnet wird.
Es hat sich herausgestellt, dass ADNF-Polypeptide den neuronalen Zelltod sowohl in vitro als auch in vivo verhindern. Es hat sich zum Beispiel erwiesen, dass die ADNF-Polypeptide den auf Tetrodotoxin (elektrische Blockade), Beta-Amyloid-Peptid (Neurotoxin der Alzheimerschen Erkrankung), N-Methyl-D-Aspartat (Exzitotoxizität) und das HIV-Mantelprotein zurückzuführenden neuronalen Zelltod verhindern. Außerdem haben tägliche Injektionen von ADNF-Polypeptiden bei neugeborenen Mäusen mit Apolipoprotein-E-Defizienz das Erlernen von Entwicklungsreflexen beschleunigt und Ausfälle des Kurzzeitgedächtnisses verhütet. Siehe z. B. Bassan et al., J. Neurochem. 72:1283–1293 (1999). Zudem hatte sich bereits vorausgehend herausgestellt, dass eine Vorbehandlung mit ADNF-Polypeptiden zahlreiche bzw. verschiedene mit dem fetalen Alkoholsyndrom assoziierte Zustände bei einem Subjekt reduziert. Siehe die am 12. März 1999 angemeldete U.S.S.N. 09/265 511.
Obwohl ADNF-Polypeptide ein unbegrenztes Potenzial als neuroprotektive Wirkstoffe und/oder als Heilmittel haben, wäre es vorteilhaft, zusätzliche ADNF-Polypeptide zur Verfügung zu stellen, die andere Eigenschaften haben als die bekannten ADNF-Polypeptide. Wäre zum Beispiel eine bestimmte Anzahl von ADNF-Polypeptiden mit anderen Rezeptorenaffinitäten verfügbar, könnte man spezifische Rezeptoren in verschiedenen Zellarten ansteuern. Zudem würden zusätzliche ADNF-Polypeptide bei der Entwicklung eines medikamentösen Behandlungsplans helfen, der jedem an einer neurodegenerativen Krankheit leidenden Patienten einzeln angepasst werden kann.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung beruht auf der überraschenden Entdeckung, dass ADNF-Polypeptide mit D-Aminosäuren, die nicht in der Natur vorkommen, auch bei der Reduzierung von neuronalem Zelltod, der Reduzierung von oxidativem Stress, der Reduzierung von mit fetalem Alkoholsyndrom bei einem Subjekt assoziierten Zuständen und anderen Zuständen wirksam sind. Die ADNF-Polypeptide umfassen ADNF I- und ADNF III-Polypeptide sowie Untersequenzen davon, die ihre jeweiligen aktiven Kernstellen enthalten und neuroprotektive sowie wachstumsfördernde Funktionen aufweisen. Die ADNF I-Polypeptide haben eine aktive Kernstelle mit folgender Aminosäurensequenz: Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala (« SALLRSIPA » bzw. « SAL »; SEQ ID NR. 1). Die ADNF 111-Polypeptide haben auch eine aktive Kernstelle mit einigen Aminosäurerückständen, nämlich folgende Aminosäurensequenz: Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln (« NAPVSIPQ » bzw. NAP »; SEQ ID NR. 2). Vorausgehend hatte sich herausgestellt, dass ADNF I-Polypeptide und ADNF III-Polypeptide mit allen L-Aminosäuren ein starkes Potenzial und große Aktivität aufweisen, um das Absterben von Nervenzellen in vitro und in vivo zu reduzieren sowie die mit dem fetalen Alkoholsyndrom bei einem Subjekt assoziierten Zustände zu reduzieren.
So schlägt die vorliegende Erfindung unter einem Aspekt einen aktivitätsabhängigen neurotrophischen Faktor I (ADNF I) mit einer aktiven Kernstelle vor, die folgende Aminosäurensequenz hat: Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala (SEQ ID NR 1) und mindestens eine D-Aminosäure umfasst. In einer Ausführungsform sind die N-Terminal- und/oder C-Terminal-Aminosäuren der aktiven Kernstelle des ADNF I-Polypeptids D-Aminosäuren. In einer anderen Ausführungsform umfasst die aktive Kernstelle des ADNF I-Polypeptids alle D-Aminosäuren. In einer anderen Ausführungsform handelt es sich bei dem ADNF I-Polypeptid um Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala (SEQ ID NR. 1), wobei das ADNF I-Polypeptid mindestens eine D-Aminosäure umfasst. In einer anderen Ausführungsart ist das ADNF I-Polypeptid Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala (SEQ ID NR 1), wobei das ADNF I-Polypeptid alle D-Aminosäuren umfasst.
Unter einem anderen Aspekt schlägt die vorliegende Erfindung einen aktivitätsabhängigen neurotrophischen Faktor III (ADNF III) mit einer aktiven Kernstelle vor, die folgende Aminosäurensequenz hat: Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln (SEQ ID NR.2), wobei die aktive Kernstelle mindestens eine D-Aminosäure umfasst. In einer Ausführungsweise sind die N-terminalen und/oder C-terminalen Aminosäuren der aktiven Kernstelle D-Aminosäuren. In einer anderen Ausführungsweise umfasst die aktive Kernstelle des ADNF III-Polypeptids alle D-Aminosäuren. In einer anderen Ausführungsweise handelt es sich bei dem ADNF III-Polypeptid um Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln (SEQ ID NR. 2), wobei das ADNF III-Polypeptid mindestens eine D-Aminosäure umfasst. In einer anderen Ausführungsweise ist das ADNF III-Polypeptid Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln (SEQ ID NR 2), wobei das ADNF III-Polypeptid alle D-Aminosäuren umfasst.
Unter einem wieder anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung mit einem pharmazeutisch annehmbaren Trägerstoff und einem ADNF-Polypeptid vor, wobei das ADNF-Polypeptid aus folgender Gruppe ausgewählt wird: (a) ein ADNF I-Polypeptid mit einer aktiven Kernstelle mit folgender Aminosäurensequenz: Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala (SEQ ID NR.1); (b) ein ADNF III-Polypeptid mit einer aktiven Kernstelle mit folgender Aminosäurensequenz: Asn-Ala-Pro-Val-Ser-IIe-Pro-Gln (SEQ ID NR. 2); und (c) eine Kombination des ADNF I-Polypeptids aus Punkt (a) und des ADNF III-Polypeptids aus Punkt (b), bei der mindestens eins der ADNF I- und ADNF III-Polypeptide eine aktive Kernstelle mit mindestens einer D-Aminosäure umfasst.
In einer Ausführungsart umfasst die pharmazeutische Zusammensetzung ein ADNF I-Polypeptid, das alle D-Aminosäuren umfasst. In einer anderen Ausführungsart umfasst die pharmazeutische Zusammensetzung ein ADNF III-Polypeptid, das alle D-Aminosäuren umfasst. In einer anderen Ausführungsart umfasst die pharmazeutische Zusammensetzung ein ADNF I-Polypeptid und ein ADNF III-Polypeptid, wobei sowohl das ADNF I- als auch das ADNF III-Polypeptid alle D-Aminosäuren umfassen. In einer anderen Ausführungsart umfasst die pharmazeutische Zusammensetzung ein ADNF I-Polypeptid und ein ADNF III-Polypeptid, wobei das ADNF I-Polypeptid alle D-Aminosäuren und das ADNF III-Polypeptid alle L-Aminosäuren umfasst. In einer anderen Ausführungsweise umfasst die pharmazeutische Zusammensetzung ein ADNF I-Polypeptid und ein ADNF III-Polypeptid, wobei das ADNF I-Polypeptid alle L-Aminosäuren und das ADNF III-Polypeptid alle D-Aminosäuren umfasst.
Unter einem wieder anderen Aspekt schlägt die vorliegende Erfindung die Anwendung der ADNF-Polypeptide der Erfindung zur Herstellung eines Medikaments zur Verhinderung neuronalen Zelltods vor, wobei das Verfahren das Inkontaktbringen der Nervenzellen mit mindestens einem der oben beschriebenen ADNF-Polypeptide umfasst. Bei einer Ausführungsweise kommt es bei einem mit HIV infizierten Patienten zum neuronalen Zelltod. In einer anderen Ausführungsweise ist der neuronale Zelltod mit durch N-Methyl-D-Aspartat induzierter Exzitotoxizität assoziiert. In einer wieder anderen Ausführungsweise wird der neuronale Zelltod durch Beta-Amyloid-Peptid bei einem unter Alzheimer leidenden Patienten induziert. In einer wiederum anderen Ausführungsweise wird der neuronale Zelltod durch cholinergische Blockade bei einem unter Alzheimer leidenden Patienten induziert, was zu Lernschwierigkeiten führt.
Unter einem noch anderen Aspekt schlägt die vorliegende Erfindung die Anwendung der ADNF-Polypeptide der Erfindung zur Herstellung eines Medikaments für die Reduzierung oxidativen Stresses bei einem Patienten vor, wobei das Verfahren die Verabreichung an den Patienten von mindestens einem der oben beschriebenen ADNF-Polypeptide in einer ausreichenden Menge umfasst, um oxidativen Stress zu behandeln.
Unter einem noch anderen Aspekt schlägt die vorliegende Erfindung die Anwendung der ADNF-Polypeptide der Erfindung zur Herstellung eines Medikaments für die Reduzierung des mit dem fetalen Alkoholsyndrom assoziierten Zustands bei einem Subjekt vor, das in utero Alkoholkonsum ausgesetzt ist, wobei das Verfahren die Verabreichung an das Subjekt von mindestens einem der oben beschriebenen ADNF-Polypeptide in einer ausreichenden Menge umfasst, um den mit dem fetalen Alkoholsyndrom assoziierten Zustand zu reduzieren.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
In 1 wird die überlebensfördernde Aktivität der D- und L-Formen von SALLRSIPA in abgetrennten zerebralen Kortexkulturen verglichen, die mit 1 μM Tetrodotoxin – einer Substanz, die die elektrische Aktivität blockiert und zu apoptotischem neuronalen Zelltod führt – behandelt werden. Die Behandlungsdauer lag bei 5 Tagen. Jeder Punkt entspricht dem Durchschnitt t Standardabweichung von 3–4 Ermittlungen. Die Zählungen der Nervenzellen erfolgten ohne Kenntnis der Behandlungsgruppe.
In 2A wird die überlebensfördernde Aktivität der D- und L-Formen von NAPVSIPQ in abgetrennten zerebralen Kortexkulturen verglichen, die mit 1 μM Tetrodotoxin behandelt werden. Es gelten dieselben Versuchsbedingungen wie für 1.
2B stellt die Wirkung einer Mischung aus D- und L-AminosäureD-NA{L-P}VSIPQ auf die überlebensfördernde Aktivität bei einer 5 Tage lang ebenfalls mit Tetrodotoxin behandelten zerebralen Kortexkultur dar. Beim Peptid NAPVSIPQ waren alle Aminosäuren in D-Form, außer dem dritten Prolinrückstand, der in L-Form war.
In 3A wird die überlebensfördernde Aktivität von Kombinationen aus NAPVSIPQ und SALLRSIPA bei D- und L-Formen verglichen. Die Versuchsbedingungen waren dieselben wie bei 1.
In 3B wird die überlebensfördernde Aktivität von Kombinationen aus L-NAPVSIPQ + D-SALLRSIPA mit D-NAPVSIQ und L-SALLRSIPA verglichen. Die Versuchsbedingungen waren dieselben wie bei 1.
4 zeigt, dass Kombinationen aus D-SALLRSIPA + D-NAPVSIPQ vor der Beta-Amyloid-Toxizität in PC12-Zellen schützen können.
5 zeigt, dass eine Vorbehandlung mit D-NAP, D-SAL oder L-NAP + D-SAL eine fetale Sterblichkeit verhindert. Am 18. Entwicklungstag des Embryos (E18) wurde die Anzahl von lebenden und toten Embryonen gezählt und die Sterblichkeitsrate in Prozent ermittelt. Am B. Entwicklungstag hatte man eine Behandlung mit Alkohol durchgeführt und 30 Minuten zuvor eine Vorbehandlung mit Peptiden. Mit einer globalen Varianzanalyse von p<0,001 wurden Vergleiche mit der Alkoholgruppe angestellt. Mit den *Gruppen, die sich deutlich von den Alkoholgruppen unterschieden (Gesamt-Post-hoc p ≤ 0,03), wurden Fishers Post-hoc-Tests durchgeführt. Der Probenumfang war folgender: Kontrollgruppe (36), Alkohol (41), D-NAP (20 μg) + Alkohol (14), D-SAL (20 μg) + Alkohol (19), D-SAL (2 μg) + Alkohol (8), L-NAP (20 μg) + D-SAL (20 μg) + Alkohol (23).
6A zeigt, dass die Vorbehandlung mit L-NAP + D-SAL eine fetale Mikrozephalie verhindert hat. Das Gewicht des fetalen Gehirns wurde bei jedem tragenden Weibchen am E18 gemessen. Es wurden Vergleiche mit der Alkoholgruppe mit einem Varianzanalysewert von p=0,01 durchgeführt. Der Probenumfang entsprach der Anzahl der Würfe. Der Durchschnitt jedes Wurfs wurde für die statistische Analyse verwendet und liegt im Durchschnitt bei 8 bis 10 Föten.
Der Probenumfang war folgender: Kontrollgruppe (34), Alkohol (32), D-NAP (20 μg) + Alkohol (13), D-SAL (20 μg) + Alkohol (19), D-SAL (2 μg) + Alkohol (8), L-NAP (20 μg) + D-SAL (20 μg) + Alkohol (23).
6B zeigt, dass die Vorbehandlung mit L-NAP + D-SAL eine fetale Wachstumseinschränkung verhindert oder reduziert hat. Das Gewicht der Feten wurde bei jedem tragenden Weibchen am E18 ermittelt. Es wurden Vergleiche mit der Alkoholgruppe mit einem Varianzanalysewert von p=0,04 durchgeführt. Der Probenumfang entsprach der Anzahl der Würfe. Der Durchschnitt jedes Wurfs wurde für die statistische Analyse verwendet und liegt im Durchschnitt bei 8 bis 10 Föten. Der Probenumfang war folgender: Kontrollgruppe (34), Alkohol (32), D-NAP (20 μg) + Alkohol (13), D-SAL (20 μg) + Alkohol (19), D-SAL (2 μg) + Alkohol (8), L-NAP (20 μg) + D-SAL (20 μg) + Alkohol (23).
7 zeigt, dass eine Nachbehandlung nach einer Stunde mit L-NAP und L-SAL ein fetales Absterben verhindert hat. Am E8 wurden nach einer und nach drei Stunden nach der Verabreichung von Alkohol L-NAP (20 μg) und L-SAL (20 μg) gegeben. Es wurden Vergleiche mit der Alkoholgruppe mit einem Varianzanalysewert von p=0,001 durchgeführt. Mit den 1-Stunde- und Kontrollgruppen, die sich deutlich von den Alkoholgruppen unterschieden (p jeweils <0,001 und p=0,04), wurden Fishers Post-hoc-Tests durchgeführt. Der Probenumfang war folgender: Kontrollgruppe (36), Alkohol (41), Nachbehandlung nach einer Stunde (18) und Nachbehandlung nach drei Stunden (14).
8 zeigt, dass eine Nachbehandlung nach einer und drei Stunden mit L-NAP und L-SAL eine fetale Mikrozephalie verhindert hat. Eine und drei Stunden nach Verabreichung von Alkohol am E8 (N+S+A) wurde L-NAP und L-SAL verabreicht. Es wurden Vergleiche mit der Alkoholgruppe mit einem Varianzanalysewert von 0,001 durchgeführt. Mit den 1-Stunde-, 3-Stunden- und Kontrollgruppen, die sich deutlich von den Alkoholgruppen unterschieden (p jeweils <0,001, <0,03 und <0,008), wurden Fishers Post-hoc-Tests durchgeführt. Der Probenumfang war folgender: Kontrollgruppe (34), Alkohol (32), Nachbehandlung nach einer Stunde (17) und Nachbehandlung nach drei Stunden (11).
9 zeigt, dass eine orale Behandlung mit D-NAP und D-SAL ein mit dem fetalen Alkoholsyndrom assoziiertes Fetensterben verhindert hat. D-NAP und D-SAL wurden sofort nach der Behandlung mit Alkohol am E8 mit einer Sonde verabreicht. Es wurden Vergleiche mit der Alkoholgruppe mit einem Varianzanalysewert von 0,004 durchgeführt. Mit den Gruppen der oralen Verabreichung und den Kontrollgruppen, die sich deutlich von den Alkoholgruppen unterschieden (p jeweils <0,001 und ≤ 0,04), wurden Fishers Post-hoc-Tests durchgeführt. Der Probenumfang war folgender: Kontrollgruppe (21), Alkohol (18), orales D-NAP + D-SAL und Alkohol (18).
10A zeigt die Auswirkungen einer oralen Verabreichung von ADNF-Polypeptiden auf das Gewicht des Gehirns von Neugeborenen. Trächtigen Mausweibchen hat man als Modell für das fetale Alkoholsyndrom gemäß den Verfahren von Webster et al., Neurobehav. Tox. 2:227–34 (1980) Alkohol injiziert. Den tragenden Mausweibchen wurde 25 %iger Alkohol mit einer Dosierung von 0,030 ml/g Körpergewicht injiziert. Das Peptid wurde in einer mit Phosphaten gepufferten Salzlösung aufgelöst und 30 Minuten vor der Behandlung mit Alkohol über eine Sonde verabreicht. Die Dosierung der jeder Maus verabreichten Peptide NAP und SAL ist in der Zeichnung dargestellt. Die Fehlerbalken entsprechen ± 1 Standardabweichungen; * weist auf eine signifikante Differenz in Bezug auf Alkohol hin; # weist auf eine signifikante Differenz in Bezug auf die Kontrollgruppe hin.
10B zeigt die Auswirkungen der oralen Verabreichung von ADNF-Polypeptiden auf die fetale Sterblichkeit. Die tragenden Mäuse wurden in der in 10A beschriebenen Art behandelt. Die Dosierung der jeder Maus verabreichten Peptide NAP und SAL ist in der Zeichnung dargestellt. Die Fehlerbalken entsprechen ± 1 Standardabweichungen; * weist auf eine signifikante Differenz in Bezug auf Alkohol hin; # weist auf eine signifikante Differenz in Bezug auf die Kontrollgruppe hin.
11 zeigt die Entwicklung des Verhaltens der Klippenvermeidung bei neugeborenen Mäusen. Man vergleicht die Reaktion auf das Peptidmedikament in der Kontrollgruppe in Bezug auf Apo-E-knockout-Mäuse.
Die Versuchstiere wurden entweder durch orale Verabreichung oder durch subkutane Injektion von D-SAL + D-NAP behandelt. Die Peptide jeweils 0,5 mg) wurden in 0,01 M Essigsäure (30 μl) und 470 μl Salzlösung aufgelöst. Anschließend wurden weitere Verdünnungen in einer Salzlösung vorgenommen. Bei beiden Anwendungen wurden 0,5 μg jedes getesteten Medikaments verabreicht; bei der oralen Anwendung (sublingual) in 10 μl Salzlösung und bei der Injektion in 20 μl. Dieses Protokoll wurde während der ersten 4 Lebenstage angewendet. Zwischen dem 5. und 10. Lebenstag wurde die Peptidmenge und das Lösungsvolumen verdoppelt. Zwischen dem 11. und 14. Lebenstag betrug die Peptidmenge jeweils 2 μg in 40 μl (oral verabreicht) und 80 μl (Injektion). Die täglich durchgeführten Tests bezogen sich auf das Vermeiden von Klippen, die negative Geotaxis, Bewegen im Raum und Aufrichten. Es wurden die subkutane und orale Verabreichung von D-NAP und D-SAL verglichen.
12 zeigt die Entwicklung des negativen Geotaxis-Verhaltens bei neugeborenen Mäusen: Man vergleicht die Reaktion auf das Peptidmedikament in der Kontrollgruppe in Bezug auf Apo-E-Knockout-Mäuse. Das Behandlungsmuster entsprach dabei dem aus 11.
13 zeigt die Entwicklung des Verhaltens im Raum bei neugeborenen Mäusen. Man vergleicht die Reaktion auf das Peptidmedikament in der Kontrollgruppe in Bezug auf Apo-E-Knockout-Mäuse. Das Behandlungsmuster entsprach dabei dem aus 11.
Die 14A und B zeigen die Auswirkung einer oralen Verabreichung von D-NAPVSIPQ + D-SALLRSIPA auf das Lernvermögen und Gedächtnis bei mit Cholinotoxin AF-64A behandelten Ratten. Durch die im Morris-Wasserlabyrinth erzielten Ergebnisse wurden Abläufe des Kurzzeitgedächtnisses untersucht. Dabei wurde die Zeit gemessen, die beim zweiten von zwei täglichen Tests zum Finden der versteckten Plattform erforderlich war. Die Anordnung der Plattform und der Ausgangspunkt, an dem das Versuchstier ins Wasser gesetzt wurde, wurden jeweils bei den zwei täglichen Tests gleich gelassen, beide Positionen wurden jedoch täglich gewechselt. Beim ersten Test wurden sowohl die Plattform als auch das Versuchstier in Bezug auf den Pool (unbeweglicher Pool) an einer neuen Position angebracht. Das Experiment wurde wie folgt durchgeführt: Das Versuchstier wurde während 0,5 Minuten auf die Plattform gesetzt und dann ins Wasser versetzt. Wie in 14A gezeigt, wurde die Zeit gemessen, die zum Erreichen der Plattform erforderlich war (Hinweis auf einen Lernprozess und ein funktionierendes Referenzgedächtnis) (erster Test). Nach 0,5 Minuten auf der Plattform wurde das Versuchstier zu einem zweiten zusätzlichen Test (14B) zurück ins Wasser versetzt (in die vorausgehende Position), um die versteckte Plattform (in der vorausgehenden Position gehalten) zu suchen. Die Zeit, die erforderlich war, um die Plattform beim zweiten Test zu erreichen, wurde aufgezeichnet und gibt Aufschluss über das Kurzzeitgedächtnis (Arbeitsspeicher). Alle Messungen wurden mithilfe des computer- und videogestützten HVS-Wasserlabyrinthsystems (HVS Image Ltd. Hampton, UK) durchgeführt. Die Versuchstiere wurden während vier Tage getestet, um die Tiere mit zufälligen Gedächtnisstörungen auszusondern. Der angegebene Wert n entspricht der Anzahl der getesteten Versuchstiere. Jeder Punkt entspricht dem Durchschnitt + Standardabweichung.
14C zeigt die Auswirkung einer oralen Verabreichung von D-SALLRSIPA ausschließlich auf das Lernvermögen und Gedächtnis bei mit Cholinotoxin AF-64A behandelten Ratten.
15 zeigt den Vergleich zwischen sublingualer (oraler) und subkutaner Verabreichung von D-SAL + D-NAP bei der Kontrollgruppe in Bezug auf Apo-E-Knockout-Mäuse, deren Kurzzeitgedächtnis im Morris-Wasserlabyrinth getestet wurde. Eine Woche nach Abschluss der täglichen Behandlung während zwei Wochen mit D-SAL + D-NAP wurden verbesserte kognitive Funktionen festgestellt, d. h. bei 21 Tage alten Mäusen, die einem 5-tägigen Trainingsprogramm unterzogen wurden. Es wurde die Zeit gemessen, die erforderlich war, um beim zweiten der täglich zwei Tests die versteckte Plattform zu finden. Die Position der Plattform und der Ausgangspunkt, an dem das Versuchstier ins Wasser gesetzt wurde, wurden bei den beiden täglichen Tests gleich gehalten, beide Positionen wurden jedoch täglich geändert. Beim zweiten Test des ersten Versuchstags waren die ApoE-defizienten Mäuse deutlich im Nachsehen im Vergleich zur Kontrollgruppe (P<0,04) und verbesserten sich nach einer oralen Verabreichung von D-SAL + D-NAP, wobei die meisten der behandelten Versuchstiere die Plattform nach einer Latenzzeit von ≤20 Sek. fanden.
Die 16A und 16B zeigen jeweils für den ersten und zweiten Test die Ergebnisse des Morris-Wasserlabyrinthtests bei Mäusen mit Apolipoprotein-E-Mangel. Nach Injektionen einer Mischung aus D-NAP + D-SAL gemäß einem Injektionsprotokoll und einem in Gozes et al., J. Pharmacol. Exp. Therap. 293:1091–1098 (2000) beschriebenen Morris-Wasserlabyrinth wurden Experimente durchgeführt. Die Ergebnisse haben signifikante Verbesserungen am 1. und 2. Tag (erster täglicher Test) und am 3. Tag (zweiter täglicher Test) mit P<0,05 gezeigt.
DEFINITIONEN
Der Ausdruck « ADNF-Polypeptid » bezieht sich auf einen oder mehrere aktivitätsabhängige neurotrophische Faktoren (ADNF) mit einer aktiven Kernstelle, die die Aminosäurensequenz von SALLRSIPA oder NAPVSIPQ oder beibehaltend veränderte Varianten davon enthält, welche eine neurotrophische/neuroprotektive Aktivität aufweisen, wie sie z. B. von Brenneman et al., J. Pharmacol. Exp. Therp. 285:629–627 (1998) ; Bassan et al., J. Neurochem. 72:1283–1293 (1999) in vitro mit Kortexnervenzellentestkulturen beschrieben und ermittelt wurde. Bei einem ADNF-Polypeptid kann es sich um ein ADNF I- oder ein ADNF III-Polypeptid handeln. Ein « ADNF-Polypeptid » kann sich auch auf eine Kombination aus ADNF I- und ADNF III-Polypeptiden beziehen.
Der Begriff « ADNF I » bezieht sich auf ein aktivitätsabhängiger neurotrophischer Faktor-Polypeptid mit einem Molekulargewicht von rund 14 000 Dalton und einem pI von 8,3 t 0,25. Wie vorausgehend beschrieben haben ADNF I-Polypeptide eine aktive Kernstelle mit einer Aminosäurensequenz Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala (auch als « SALLRSIPA », « SAL », oder « ADNF 1-9 » bezeichnet; SEQ ID NR 1). Siehe Brenneman et al., J. Clin. Invest. 97:2299–2307 (1996), Glazner et al., Anat. Embryol. 200:65–71 (1999), Brenneman et al., J. Pharm. Exp. Ther. 285:619–27 (1998), Gozes & Brenneman, J. Mol. Neurosci. 7:235–244 (1996) und Gozes et al., Dev. Brain Res. 99:167–175 (1997), wobei all diese Publikationen hier als Referenz mitaufgenommen werden. Außer bei anders lautendem Hinweis bezeichnet « SAL » ein Peptid mit einer Aminosäurensequenz von Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala (SEQ ID NR 1) und kein Peptid mit einer Aminosäurensequenz von Ser-Ala-Leu.
Die Begriffe « ADNF III » und « ADNP » beziehen sich auf ein aktivitätsabhängiger neurotrophischer Faktor-Polypeptid mit einem vorgesehenen Molekulargewicht von ca. 95 kDa (ca. 828 Aminosäurerückstände) und einem pI von rund 5,99. Wie vorausgehend beschrieben, haben die ADNF III-Polypeptide eine aktive Kernstelle mit einer Aminosäurensequenz von Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln (auch als « NAPVSIPQ », « NAP », oder « ADNF III-8 » bezeichnet; SEQ ID NR 2). Siehe Bassan et al., J. Neurochem. 72:1283–1293 (1999), eine hier als Referenz aufgenommene Publikation. Außer bei anders lautendem Hinweis bezeichnet « NAP » ein Peptid mit einer Aminosäurensequenz von Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln (SEQ ID NR 2) und kein Peptid mit einer Aminosäurensequenz von Asn-Ala-Pro.
Der Ausdruck « Reduzieren neuronalen Zelltods» bezieht sich auf die Reduzierung sowie Verhütung des neuronalen Zelltods. Eine Reduzierung entspricht einer Veränderung eines Parameters um ca. 10 % bis ca. 100 %, vorzugsweise um mindestens ca. 50 % und noch besser um mindestens ca. 80 % in Bezug auf die Kontrollgruppe (z. B. ohne Behandlung mit z. B. ADNF-Polypeptiden). Die Reduzierung des neuronalen Zelltods kann durch jegliche im Fachbereich bekannte Art von Verfahren gemessen werden. Z. B. können neuronalen Zelltod reduzierende ADNF-Polypeptide unter Anwendung der unterschiedlichen Techniken untersucht werden, die in der am 27. Februar 1997 angemeldeten Druckschrift U.S.S.N. 60/037 404 (unter der Nr. WO98/35042 veröffentlicht) und in der am 6. November 1998 angemeldeten Druckschrift U.S.S.N. 09/187 330 beschrieben werden.
Der Begriff « oxidativer Stress » in Zellen oder Geweben bezieht sich auf die verstärkte Erzeugung von freien Radikalen oder reaktiven Sauerstoffsubstanzen (ROS) (wie z. B. ein α-Hydroxyethyl-Radikal, ein Superoxid-Radikal, ein Hydroxy-Radikal, ein Peroxy-Radikal und Wasserstoffperoxid) und/oder ein Erschöpfen des Antioxidationsabwehrsystems, was zu einer Unausgeglichenheit zwischen Pro- und Antioxidanzien führt. Das enzymatische Antioxidationssystem umfasst z. B. Superoxid-Dismutase, Katalase, Glutathionperoxidase und Glutathionreduktase, während die nicht-enzymatischen Antioxidanzien z. B. reduziertes Glutathion, Vitamin A, C und E umfassen. Siehe Schlorff et al., Alcohol 17:97–105 (1999).
Der Ausdruck « Reduzieren oxidativen Stresses » bezieht sich auf die Reduzierung sowie Verhütung von oxidativem Stress in Zellen und Geweben. Eine Reduzierung entspricht einer Veränderung eines Parameters um ca. 10 % bis ca. 100 %, vorzugsweise um mindestens ca. 50 % und noch besser um mindestens ca. 80 % in Bezug auf die Kontrollgruppe (z. B. ohne Behandlung mit z. B. ADNF-Polypeptiden). Die Reduzierung des oxidativen Stresses kann durch jegliche im Fachbereich bekannte Art von Verfahren gemessen werden. Zum Beispiel können oxidativen Stress reduzierende ADNF-Polypeptide unter Anwendung von primären Nervenzellen untersucht werden, die wie nachfolgend beschrieben in vitro mit FeSO₄ behandelt werden. Oxidativen Stress reduzierende ADNF-Polypeptide können auch mithilfe von Versuchstieren untersucht werden, denen Äthanol verabreicht wurde, der dafür bekannt ist, in Zellen und Geweben oxidativen Stress hervorzurufen. Zum Beispiel können die Auswirkungen von ADNF-Polypeptiden auf die Fettperoxidation im Plasma und/oder Antioxidationssystem von Ratten herangezogen werden, denen man Äthanol verabreicht hat. Siehe z. B. Schlorff et al., Alcohol 17:97–105 (1999).
Die Ausdrücke « fetales Alkoholsyndrom » und « fetale Alkoholauswirkungen » beziehen sich auf verschiedene physische und geistige Zustände eines Embryos, eines Fötus oder eines Individuums, das in utero in ausreichender Menge Alkohol ausgesetzt ist (z. B. wenn die Mutter während der Schwangerschaft Alkohol konsumiert), so dass die Entwicklung dieser Zustände ausgelöst wird bzw. diese Zustände ohne eine vorbeugende Behandlung, wie z. B. mit ADNF-Polypeptiden, verursacht werden. Manche dieser Zustände umfassen folgende Krankheiten, sind jedoch nicht darauf beschränkt:
Missbildungen des Skeletts: verformte Rippen und Sternum; Skoliose; Hüftendislokation; gekrümmte, zusammengewachsene, Schwimmhaut- oder fehlende Finger oder Zehen; eingeschränkte Gelenkbeweglichkeit; Mikrozephalie; Gesichtsmissbildungen: kleine Augenöffnungen; Schwimmhaut zwischen Augen und Nasenansatz; herunterfallende Augenlider; Kurzsichtigkeit; Unfähigkeit der Augen, sich in der gleichen Richtung zu bewegen; kurze Stupsnase; breiter Nasenrücken; verstrichenes hohes Philtrum und schmales Lippenrot; Gaumenspalte; Mikrognathie, tief ansetzende oder missgebildete Ohren; Missbildung von Organen: angeborene Herzfehler mit anomalen Herzgeräuschen; Genitalanomalien; Harn- und Nierenprobleme; Behinderungen des zentralen Nervensystems: kleines Gehirn; anomale Anordnung der Gehirnzellen und des Bindegewebes; geistige Retardierung – in der Regel leicht bis mäßig, manchmal jedoch schwer; Lernschwierigkeiten; Konzentrationsschwierigkeiten; Reizbarkeit als Kleinkind; Hyperaktivität während der Kindheit; mangelhafte Koordination zwischen Körper, Hand und Finger (siehe z. B. www.well.com/user/woa/fsfas.htm); sowie andere Anomalien: verringertes Gewicht des Gehirns, verringertes Körpergewicht, höhere Sterblichkeitsrate in utero und verringerter VIP-Wert (z. B. VIP mRNA).
Der Ausdruck „Reduzieren eines mit dem fetalen Alkoholsyndrom assoziierten Zustands" bezieht sich auf die Reduzierung sowie Verhütung von Parametern, die mit dem fetalen Alkoholsyndrom in Zusammenhang stehen. Eine Reduzierung entspricht einer Veränderung eines Parameters um ca. 10 % bis ca. 100 %, vorzugsweise um mindestens ca. 50 % und noch besser um mindestens ca. 80 % in Bezug auf die Kontrollgruppe (z. B. ohne Behandlung in utero einem Alkoholkonsum ausgesetzt oder z. B. mit ADNF-Polypeptiden behandelt). Bei den Parametern kann es sich um jeglichen physischen oder geistigen Zustand aus der vorausgehenden Liste handeln. Es kann sich z. B. (1) um den Prozentsatz der fetalen Sterblichkeit, (2) das Fetalgewicht und das Gewicht des Gehirns der Feten, (3) den VIP-Wert (z. B.
VIP mRNA) von Embryos, (4) das Lernvermögen und/oder Gedächtnis und (5) um den Glutathionwert handeln.
Der Ausdruck « ein Subjekt mit fetalem Alkoholsyndrom » betrifft einen Embryo, einen Fetus, ein Subjekt und insbesondere ein menschliches Wesen, das in utero einem Alkoholkonsum ausgesetzt ist und ein fetales Alkoholsyndrom aufweist oder Gefahr läuft aufgrund des Alkoholkonsums der Mutter einen der Zustände in Verbindung mit dem fetalen Alkoholsyndrom zu entwickeln, wie z. B. die vorab aufgeführten Auswirkungen.
Der Begriff « Gedächtnis » umfasst alle medizinischen Klassifizierungen des Gedächtnisses, wie z. B. sensorisches Gedächtnis, Neugedächtnis, Kurzzeit- und Langzeitgedächtnis sowie in der Psychologie verwendete Begriffe wie Referenzgedächtnis, das sich auf aus lang oder kurz zurückliegende Erfahrungen gewonnene Informationen bezieht (siehe z. B. Harrison's Principles of Internal Medicine, volume 1, Seiten 142–150 (Fauci et al., eds, 1988)).
Der Begriff « Inkontaktbringen » wird hier austauschbar mit folgenden Begriffen verwendet: kombiniert mit, hinzugefügt zu, gemischt mit, darüber gebracht, inkubiert mit oder darüber gegossen. Zudem können die ADNF-Polypeptide der vorliegenden Erfindung auf jegliche herkömmliche Art, wie z. B. parenteral, oral, topisch oder durch Inhalieren „verabreicht" werden. In bevorzugten Ausführungsweisen wird eine orale Verabreichung angewendet. Im Zusammenhang mit den Verfahren hinsichtlich des fetalen Alkoholsyndroms können ADNF-Polypeptide einem Embryo, Fetus oder einem Subjekt direkt in utero bzw. indirekt durch die Verabreichung des Polypeptids an die Mutter auf jegliche hier beschriebene Art verabreicht werden.
« Eine ausreichende Menge » bzw. « eine wirksame Menge » ist die Menge eines bestimmten ADNF-Polypeptids, die den neuronalen Zelltod oder das fetale Alkoholsyndrom bzw. den oxidativen Stress wie hier beschrieben reduziert. Zum Beispiel entspricht im Zusammenhang mit dem neuronalen Zelltod « eine ausreichende Menge » bzw. « eine wirksame Menge » der Menge eines bestimmten ADNF-Polypeptids, die den neuronalen Zelltod in den Tests von z. B. Hill et al., Brain Res. 603:222–233 (1993) ; Brenneman et al., Nature 335:639–642 (1988) ; bzw. Brenneman et al., Dev. Brain Res. 51:63–68 (1990); Forsythe & Westbrook, J. Physiol. Lond. 396:515–533 (1988) reduziert. Im Zusammenhang mit der Reduzierung von oxidativem Stress entspricht « eine ausreichende Menge » bzw. « eine wirksame Menge » der Menge an ADNF-Polypeptid, die z. B. Veränderungen bei der Peroxidation von Fetten im Plasma bzw. Veränderungen im Antioxidationssystem entsprechend den in Schlorff of al., Alcohol 17:97–105 (1999) beschriebenen Tests reduziert bzw. verhindert. Im Zusammenhang der Reduzierung des fetalen Alkoholsyndroms entspricht « eine ausreichende Menge » bzw. « eine wirksame Menge » der Menge eines bestimmten ADNF-Polypeptids, die z. B. (1) den Prozentsatz der fetalen Sterblichkeit, (2) das verringerte Körpergewicht des Fetus sowie das verringerte Gewicht des fetalen Gehirns oder (3) eine Reduzierung des Levels an VIP mRNA bei Embryonen reduziert bzw. verhindert. Der Dosierbereich kann je nach angewendetem ADNF-Polypeptid, Verabreichungsart und Potenz des jeweiligen ADNF-Polypeptids variieren, er kann jedoch auf einfache Weise unter Anwendung der vorausgehenden Tests ermittelt werden.
Die Begriffe « isoliert », « gereinigt » bzw. « biologisch rein » beziehen sich auf ein Produkt, das größtenteils oder im Wesentlichen frei von Komponenten ist, die normalerweise im Naturzustand zusammen mit ihm auftreten. Reinheit und Homogenität werden typischerweise unter Anwendung von Techniken der analytischen Chemie wie z. B. Polyacrylamidgel-Elektrophorese oder Hochleistungsflüssigkeitschromatographie ermittelt. Ein Protein, das die vorherrschende Art in dem Präparat ist, gilt als größtenteils gereinigt. Insbesondere wird eine isolierte ADNF-Nukleinsäure von den offenen Leserahmen, die das ADNF-Gen umgeben und andere Proteine als ADNF codieren, abgetrennt. Der Begriff „gereinigt" bedeutet, dass eine Nukleinsäure oder ein Protein im Wesentlichen ein Band in einem Elektrophoresegel ergibt. Insbesondere bedeutet es, dass die Nukleinsäure bzw. das Protein zu mindestens 85 %, bevorzugter Weise zu mindestens 95 % und am besten zu mindestens 99 % rein ist.
Nukleinsäure» bezieht sich auf Deoxyribonucleotide oder Ribonucleotide und Polymere davon in einzel- bzw. doppelsträngiger Form. Der Begriff Nukleinsäure wird auswechselbar mit den Begriffen Gen, cDNA, mRNA, Oligonucleotid und Polynucleotid angewendet.
Der Begriff « Aminosäure » bezieht sich auf natürlich vorkommende Aminosäuren in der L-Form und ihre Enantiomere in der D-Form. Die spiegelbildlichen Formen (Enantiomere) der Aminosäuren werden als L-Isomer und D-Isomer bezeichnet, wobei L linksdrehend bedeutet (Linksdrehung der Polarisierungsebene des Lichts) und D rechtsdrehend (Rechtsdrehung der Polarisierungsebene).
Im vorliegenden Dokument werden Aminosäuren entweder mit ihren aus drei Buchstaben bestehenden und allgemein bekannten Symbolen oder durch ihre Einbuchstabensymbole bezeichnet, die von der IUPAC-IUB Biochemischen Nomenklatur-Kommission empfohlen werden. Ebenso können Nucleotide mit ihren allgemein anerkannten Einbuchstabencodes bezeichnet werden.
Die Begriffe « Polypeptid », « Peptid » und « Protein » werden in dieser Schrift auswechselbar angewendet und bezeichnen ein Polymer von Aminosäurerückständen. Die Begriffe gelten für Aminosäurepolymere, bei denen ein oder mehrere Aminosäurerückstände eine in der Natur vorkommende Aminosäure in L-Form oder deren Enantiomere in D-Form bzw. Kombinationen davon sind.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG UND BEVORZUGTE AUSFÜHRUNGSARTEN
I. EINLEITUNG
Die Chiralität (linke oder rechte Drehrichtung) eines Peptids bezieht sich auf die Tetraeder-Anordnung von vier verschiedenen Gruppen um das α-Kohlenstoffatom der wesentlichen Aminosäuren, das eine optische Aktivität verleiht. Die spiegelbildlichen Formen (Enantiomere) von Aminosäuren werden als L-Isomer und D-Isomer bezeichnet, wobei L linksdrehend (Linksdrehung der Polarisierungsebene des Lichts) und D rechtsdrehend (Rechtsdrehung der Polarisierungsebene) bedeutet. Bei in der Natur vorkommenden Proteinen gehören nur L-Aminosäuren zu den Bestandteilen. Die klassische Rezeptorenpharmakologie lehrt, dass Membranrezeptoren leicht L- und D-Agonisten und Antagonisten unterscheiden können. Die Aktivierung der Rezeptoren erfolgt durch eine stereoselektive Bevorzugung von Wirkstoffen in deren natürlich vorkommenden L-Isomer-Form.
Da ADNF I- und ADNF III-Polypeptide neurotrophische Faktoren sind, ging man davon aus, dass ADNF I- und ADNF III-Polypeptide mit D-Aminosäuren nicht zum Aktivieren ihrer jeweiligen stereoselektiven Membranrezeptoren fähig seien. Überraschenderweise stellte sich heraus, dass ADNF I- und ADNF III-Polypeptide mit D-Aminosäuren bioaktiv sind. Alle D- und alle L-Aminosäureformen des aktiven Kernstellenpeptids in ADNF I-Polypeptiden, d. h. SALLRSIPA (SAL), waren nämlich praktisch identisch hinsichtlich der neuronalen Schutzaktivität in vitro. Ähnlich dazu waren alle D- und alle L-Aminosäureformen des aktiven Kernstellenpeptids in ADNF III-Polypeptiden, d. h. NAPVSIPQ (NAP) praktisch identisch hinsichtlich der neuronalen Schutzaktivität in vitro. Es ist sehr selten, dass alle D-Aminosäurepeptide aktiv sind und noch seltener, dass die D- und L-Isomere eines bestimmten Peptids gleich stark aktiv sind.
Es wurde von einigen Beispielen von Peptiden mit ähnlichen Aktionen ihrer D- und L-Formen berichtet. Ein gut bekanntes Beispiel ist Beta-Amyloid. Es wurde nachgewiesen, dass die Bioaktivität von D-Isomeren von Beta-Amyloid 1-42 der bei der L-Form des Peptids beobachteten entspricht (Cribbs et al., J. Biol. Chem. 272:7431–7436 (1997)). Ein anderes Beispiel sind die immunsuppressiven Auswirkungen von D- und L-Peptiden der HLA-Klasse I der schweren Kette (Woo et al., Transplantation 64:1460–1467 (1997)). Obwohl diese Beispiele zeigen, dass die Bioaktivität von Peptiden nicht-stereoselektiv sein kann, ist dieses Phänomen sehr selten. Dies ist darauf zurückzuführen, dass biologische Makromoleküle aus Monomer-Molekülen gleicher Chiralität bestehen (Mason, Chirality 3:223 (1990)) und dass die biochemischen Wechselwirkungen von Natur aus chiral sind. Bei neurotrophischen Wirkstoffen gibt es in der Tat kein bekanntes Beispiel mit nicht-chiralen Eigenschaften. Daher ist es überraschend, dass die ADNF Polypeptide der vorliegenden Erfindung durch einen nicht-chiralen Mechanismus eine Neuroprotektion gewährleisten.
Die Tatsache, dass ADNF-Polypeptide mit D-Aminosäuren bioaktiv sind, ermöglicht, diese Polypeptide oral zu verabreichen. Im Vergleich zu L-Isomeren weisen die D-Isomere von Peptiden eine erhöhte Stabilität im Magen-/Darmtrakt auf und können unverändert absorbiert werden (He et al., J. Pharmaceutical Sci. 87:626–633 (1998)). Zum Beispiel wurde in He et al. die Bioverfügbarkeit (Messung durch das Vorhandensein von unveränderten markierten D-Peptiden im Urin nach 24–48 Stunden) mit Verbindungen mit einem Molekulargewicht von 900 Dalton – ungefähre Größe der aktiven Kernstelle von ADNF I- und ADNF III-Polypeptiden – auf 13 geschätzt. ADNF-Polypeptide mit D-Aminosäuren weisen eine längere Bioverfügbarkeit auf und eignen sich daher für eine Formel zur oralen Verabreichung.
In diesem Zusammenhang schlägt die vorliegende Erfindung zum ersten Mal ADNF Polypeptide mit mindestens einer D-Aminosäure innerhalb ihrer aktiven Kernstellen vor, vorzugsweise am N-Terminus und/oder am C-Terminus der aktiven Kernstellen. In einer derzeit bevorzugten Ausführungsweise schlägt die Erfindung ADNF-Polypeptide mit allen D-Aminosäuren vor. Die Erfindung schlägt auch eine pharmazeutische Zusammensetzung mit einem pharmazeutisch annehmbaren Trägerstoff und ein ADNF I-Polypeptid sowie ein ADNF III-Polypeptid bzw. eine Kombination davon vor, wobei mindestens eins der ADNF I- oder ADNF III-Polypeptide mindestens eine D-Aminosäure innerhalb seiner aktiven Kernstelle umfasst. Insbesondere schlägt die Erfindung eine oral aktive pharmazeutische Zusammensetzung mit einem ADNF Polypeptid vor, das mindestens eine D-Aminosäure innerhalb seiner aktiven Kernstelle umfasst. Die ADNF Polypeptide und die phamazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können zur Herstellung eines Medikaments zur Reduzierung neuronalen Zelltods, zur Reduzierung oxidativen Stresses bei einem Patienten und zur Reduzierung eines mit dem fetalen Alkoholsyndrom assoziierten Zustands verwendet werden.
II. ADNF-POLYPEPTIDE MIT D-AMINOSÄUREN UND VERFAHREN ZUR HERSTELLUNG DER POLYPEPTIDE
Unter einem Aspekt schlägt die vorliegende Erfindung ein ADNF-Polypeptid mit mindestens einer D-Aminosäure innerhalb seiner aktiven Kernstelle vor, die sich vorzugsweise am N-Terminus und/oder C-Terminus der aktiven Kernstelle befindet. Da die D-Enantiomere von Polypeptiden enzymatisch gesehen stabiler sind als ihre L-Enantiomere bietet ein ADNF-Polypeptid mit D-Aminosäuren eine längere Bioverfügbarkeit im Vergleich zu seinem Gegenstück mit L-Aminosäuren. Insbesondere sind die ADNF-Polypeptide mit D-Aminosäuren im Magen-/Darmtrakt stabil und können ohne Aufspaltung im menschlichen Körper absorbiert werden. Daher sind die ADNF Polypeptide der vorliegenden Erfindung besonders als orale Wirkstoffe nützlich.
In einer Ausführungsweise umfasst das ADNF I-Polypeptid eine aktive Kernstelle mit der folgenden Aminosäurensequenz: Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-IIe-Pro-Ala (SEQ ID NR 1), wobei die aktive Kernstelle mindestens eine D-Aminosäure umfasst. In einer anderen Ausführungsart sind sowohl die N-terminalen und/oder C- terminalen Aminosäuren der aktiven Kernstelle des ADNF I-Polypeptids D-Aminosäuren. In einer wieder anderen Ausführungsart umfasst die aktive Kernstelle des ADNF I-Polypeptids D-Aminosäuren an anderen Stellen als am N-Terminus und/oder C-Terminus der aktiven Kernstelle. Zum Beispiel kann jegliche Aminosäure innerhalb der aktiven Kernstelle eine D-Aminosäure sein. Mit anderen Worten kann eine beliebige Aminosäure oder eine beliebige Kombination aus Serin, Alanin, Leucin, Leucin, Arginin, Serin, Isoleucin, Prolin und Alanin innerhalb der aktiven Kernstelle der ADNF I-Polypeptide eine D-Aminosäure sein. Zum Beispiel kann jede zweite Aminosäure innerhalb der aktiven Kernstelle des ADNF I-Polypeptids eine D-Aminosäure sein. In einer bevorzugten Ausführungsweise umfasst die aktive Kernstelle des ADNF I-Polypeptids alle D-Aminosäuren.
In einer wiederum anderen Ausführungsweise kann das ADNF I-Polypeptid am N-Terminus und/oder am C-Terminus der aktiven Kernstelle zusätzliche Aminosäuren umfassen. Zum Beispiel kann das ADNF I-Polypeptid bis zu 20 Aminosäuren am N-Terminus und/oder C-Terminus der aktiven Kernstelle umfassen. Bei diesen Ausführungsweisen sind vorzugsweise die N-terminale und/oder die C-terminale Aminosäure des ADNF I-Polypeptids D-Aminosäuren. Eine beliebige der zusätzlichen Aminosäuren bzw. alle zusätzlichen Aminosäuren können D-Aminosäuren sein. In einer bevorzugten Ausführungsart umfasst das ADNF I-Polypeptid keine zusätzlichen Aminosäuren und besitzt eine Aminosäurensequenz von Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala (SEQ ID NR 1), wobei das ADNF I-Polypeptid alle D-Aminosäuren umfasst.
In einer anderen Ausführungsweise umfasst das ADNF III-Polypeptid eine aktive Kernstelle mit der folgenden Aminosäurensequenz: Asn-Ala-Pro-Val-Ser-IIe-Pro-Gln (SEQ ID Nr. 2), wobei die aktive Kernstelle mindestens eine D-Aminosäure umfasst. In einer anderen Ausführungsart sind sowohl die N-terminalen und/oder C-terminalen Aminosäuren der aktiven Kernstelle des ADNF III-Polypeptids D-Aminosäuren. In einer anderen Ausführungsart umfasst die aktive Kernstelle des ADNF III-Polypeptids an anderen Stellen als am N- oder C-Terminus der aktiven Kernstelle D-Aminosäuren. Zum Beispiel kann eine beliebige Aminosäure innerhalb der aktiven Kernstelle eine D-Aminosäure sein. Mit anderen Worten kann eine beliebige Aminosäure bzw. eine beliebige Kombination aus Asparagin, Alanin, Prolin, Valin, Serin, Isoleucin, Prolin und Glutamin innerhalb der aktiven Kernstelle der ADNF 111-Polypeptide eine D-Aminosäure sein. Zum Beispiel kann jede zweite Aminosäure innerhalb der aktiven Kernstelle des ADNF III-Polypeptids eine D-Aminosäure sein. In einer bevorzugten Ausführungsart umfasst die aktive Kernstelle des ADNF III-Polypeptids alle D-Aminosäuren.
In einer wiederum anderen Ausführungsweise kann das ADNF III-Polypeptid am N-Terminus und/oder C-Terminus der aktiven Kernstelle zusätzliche Aminosäuren umfassen. Zum Beispiel kann das ADNF III-Polypeptid bis zu 40 Aminosäuren am N-Terminus und/oder C-Terminus der aktiven Kernstelle umfassen. In einem anderen Beispiel kann das ADNF III-Polypeptid bis zu 20 Aminosäuren am N-Terminus und/oder C-Terminus der aktiven Kernstelle umfassen. In einem wieder anderen Beispiel kann das ADNF III-Polypeptid bis zu 10 Aminosäuren am N-Terminus und/oder C-Terminus der aktiven Kernstelle umfassen. Bei diesen Ausführungsarten sind die N-terminale und/oder C-terminale Aminosäure des ADNF I-Polypeptids D-Aminosäuren. Eine beliebige der zusätzlichen Aminosäuren bzw. alle zusätzlichen Aminosäuren können D-Aminosäuren sein. In einer bevorzugten Ausführungsart umfasst das ADNF III-Polypeptid keine zusätzlichen Aminosäuren und hat eine Aminosäurensequenz von Asn-Ala-Pro-Val-Ser-IIe-Pro-Gln (SEQ ID NR 2), wobei das ADNF III-Polypeptid alle D-Aminosäuren umfasst.
In einer bevorzugten Ausführungsweise umfasst das ADNF I-Polypeptid eine Aminosäurensequenz mit der folgenden Formel: (R¹)_x Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-IIe-Pro-Ala-(R²)_y (SEQ ID NR 3), wobei die aktive Kernstelle mindestens eine D-Aminosäure umfasst. In einer anderen bevorzugten Ausführungsweise umfasst das ADNF III-Polypeptid eine Aminosäurensequenz mit der folgenden Formel: (R³)_w-Asn-Ala-Pro-Val-Ser-IIe-Pro-Gln-(R⁴)_z (SEQ ID NR 4), wobei die aktive Kernstelle mindestens eine D-Aminosäure umfasst. Die vorausgehende Diskussion über Position und Anzahl von D-Aminosäuren innerhalb der aktiven Kernstellen der ADNF I und ADNF III-Polypeptiden gilt gänzlich für diese bevorzugten Ausführungsweisen und wird daher hinsichtlich diesen besonderen Ausführungsweisen der Erfindung nicht mehr wiederholt.
Bei den vorausgehenden Formeln steht jedes Element R¹, R², R³ und gegebenenfalls R⁴ für eine Aminosäurensequenz mit 1 bis ca. 40 Aminosäuren, bei der jede Aminosäure in der Aminosäurensequenz unabhängig voneinander ausgewählt wird. Der Begriff „unabhängig voneinander ausgewählt" bedeutet hier, dass die die Aminosäurensequenz R¹ bildenden Aminosäuren identisch oder verschieden sein können (z. B. können alle Aminosäuren in der Aminosäurensequenz Threonin sein). Die Diskussion hinsichtlich R¹ gilt genauso für R², R³ und R⁴. Darüber hinaus kann eine beliebige Aminosäure oder eine Kombination aus den Aminosäuren, die die Aminosäurensequenz R¹ bilden, eine D-Aminosäure oder eine L-Aminosäure sein. In einem Ausführungsbeispiel ist die N-terminale Aminosäure von R¹ eine D-Aminosäure und/oder die C-terminale Aminosäure von R² eine D-Aminosäure. In einem anderen Ausführungsbeispiel ist die N-terminale Aminosäure von R³ eine D-Aminosäure und/oder die C-terminale Aminosäure von R⁴ eine D-Aminosäure. Bei einer anderen Ausführungsweise umfassen alle R¹, R², R³ und R⁴ alle D-Aminosäuren.
In der vorausgehenden Formel für das ADNF I-Polypeptid werden x und y unabhängig voneinander ausgewählt und sind null oder eins. Der Begriff „unabhängig voneinander ausgewählt » bedeutet hier, dass x und y identisch oder verschieden sein können. Zum Beispiel können x und y beide null sein oder alternativ dazu können beide eins sein. Zudem kann x null und y eins sein oder alternativ dazu kann x eins und y null sein. Darüber hinaus können die Aminosäurensequenzen R¹ und R² identisch oder verschieden sein, wenn sowohl x als auch y eins ist. Auf diese Weise werden die Aminosäurensequenzen R¹ und R² unabhängig voneinander ausgewählt. Wenn R¹ und R² dieselben sind, sind sie sowohl hinsichtlich ihrer Kettenlänge als auch der Aminosäurenzusammensetzung identisch. Zum Beispiel können beide, R¹ und R², Val-Leu-Gly-Gly-Gly (SEQ ID NR 5) sein. Wenn R¹ und R² verschieden sind, können sie sich hinsichtlich der Kettenlänge und/oder der Aminosäurenzusammensetzung und/oder der Reihenfolge der Aminosäuren in den Aminosäurensequenzen unterscheiden. Zum Beispiel kann R¹ Val-Leu-Gly-Gly-Gly (SEQ ID NR 5) sein, während R² Val-Leu-Gly-Gly (SEQ ID NR 9) sein kann. Alternativ dazu kann R¹ Val-Leu-Gly-Gly-Gly (SEQ ID NR 5) sein, während R² Val-Leu-Gly-Gly-Val (SEQ ID NR 13) sein kann. Alternativ dazu kann R¹ Val-Leu-Gly-Gly-Gly (SEQ ID NR 5) sein, während R² Gly-Val-Leu-Gly-Gly (SEQ ID NR 11) sein kann.
Ebenso werden w und z unabhängig voneinander ausgewählt und sind in der vorausgehenden Formel des ADNF III-Polypeptids null oder eins. Der Begriff „unabhängig voneinander ausgewählt » bedeutet hier, dass w und z identisch oder verschieden sein können. Zum Beispiel können w und z beide null sein oder alternativ dazu können beide eins sein. Zudem kann w null und z eins sein oder alternativ dazu kann w eins und z null sein. Darüber hinaus können die Aminosäurensequenzen R³ und R⁴ identisch oder verschieden sein, wenn sowohl w als auch z eins ist. Auf diese Weise werden die Aminosäurensequenzen R³ und R⁴ unabhängig voneinander ausgewählt. Wenn R³ und R⁴ dieselben sind, sind sie sowohl hinsichtlich ihrer Kettenlänge als auch der Aminosäurenzusammensetzung identisch. Zum Beispiel können beide, R³ und R⁴, Leu-Gly-Leu-Gly-Gly (SEQ ID NR 7) sein. Wenn R³ und R⁴ verschieden sind, können sie sich hinsichtlich der Kettenlänge und/oder der Aminosäurenzusammensetzung und/oder der Reihenfolge der Aminosäuren in den Aminosäurensequenzen unterscheiden. Zum Beispiel kann R³ Leu-Gly-Leu-Gly-Gly (SEQ ID Nr 7) sein, während R⁴ Leu-Gly-Leu-Gly (SEQ ID NR 12) sein kann. Alternativ dazu kann R³ Leu-Gly-Leu-Gly-Gly (SEQ ID NR 7) sein, während R⁴ Leu-Gly-Leu-Gly-Leu (SEQ ID NR 13) sein kann.
Unter den verschiedenen Möglichkeiten werden bestimmte ADNF I- und ADNF III-Polypeptide bevorzugt, nämlich die, bei denen x, y, w und z alle null sind (d. h. jeweils SALLRSIPA (SEQ ID NR 1) und NAPVSIPQ (SEQ ID NR 2)). Es werden auch ADNF 1-Polypeptide bevorzugt, bei denen x eins ist, R¹ Val-Leu-Gly-Gly-Gly (SEQ ID NR 5) und y null ist. Ebenfalls bevorzugt werden ADNF 1-Polypeptide, bei denen x eins ist, R¹ Val-Glu-Glu-Gly-IIe-Val-Leu-GLy-Gly-Gly (SEQ ID NR 6) und y null ist. Genauso bevorzugt man auch ADNF III-Polypeptide, bei denen w eins ist, R³ Gly-Gly und z null ist. Ebenfalls bevorzugt man die ADNF III-Polypeptide, bei denen w eins ist, R³ Leu-Glu-Gly, z eins und R⁴ Gln-Ser ist. Man bevorzugt auch die ADNF III-Polypeptide, bei denen w eins ist, R³ Leu-Gly-Leu-Gly-Gly (SEQ ID NR 7), z eins und R⁴ Gln-Ser ist. Man bevorzugt auch die ADNF III-Polypeptide, bei denen w eins ist, R³ Ser-Val-Arg-Leu-Gly-Leu-Gly-Gly (SEQ ID NR 8), z eins und R⁴ Gln-Ser ist. Es können zusätzliche Aminosäuren sowohl zum N-Terminus als auch zum C-Terminus dieser aktiven Kernstellen (SALLRSIPA oder NAPVSIPQ) ohne Verlust der biologischen Aktivität hinzugefügt werden; dies wurde durch die Tatsache nachgewiesen, dass die ADNF I- und ADNF III-Wachstumsfaktoren eine außergewöhnliche biologische Aktivität aufweisen. Siehe das Dokument U.S.S.N. 08/324 297, das am 17. Oktober 1994 (auch unter der Nr. WO96/11948 veröffentlicht) hinsichtlich der Beschreibung der ADNF I-Polypeptide angemeldet wurde; und das am 27. Februar 1997 angemeldete U.S.S.N. 60/037 404 sowie das am 23. September 1997 angemeldete U.S.S.N. 60/059 621 (auch unter der Nr. WO98/35042 publiziert) hinsichtlich der ADNF III-Polypeptide.
Die ADNF-Polypeptide mit mindestens einer D-Aminosäure innerhalb der aktiven Kernstellen der ADNF-Polypeptide können mithilfe einer Vielzahl von gut bekannten Techniken präpariert werden. Relativ kurze Polypeptide werden normalerweise in einer Lösung synthetisch hergestellt oder auf einem festen Trägerstoff gemäß herkömmlichen Techniken (siehe z. B. Merrifield, Am. Chem. Soc. 85:2149–2154 (1963)). Verschiedene Synthese- und Sequenzautomaten sind im Handel erhältlich und können gemäß bekannten Protokollen (siehe z. B. Stewart & Young, Solid Phase Peptide Synthesis (2. Ausg. 1984)) angewendet werden. Das Festphasen-Verfahren, bei dem die C-terminale Aminosäure der Sequenz auf einen unlöslichen Träger fixiert wird und anschließend die verbleibenden Aminosäuren sequenziell in die Sequenz eingefügt werden, ist das bevorzugte Verfahren der chemischen Synthese von Polypeptiden der vorliegenden Erfindung. Unter Anwendung von Festphasen-Verfahren können eine oder mehrere D-Aminosäuren anstelle von L-Aminosäuren in ein ADNF-Polypeptid an einer beliebigen Stelle bzw. Stellen eingefügt werden. Techniken für Festphasen-Verfahren werden beschrieben von Barany & Merrifield, Solid-Phase Peptide Synthesis; Seite 3–284 in The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology. Vol 2 : Special Methods in Peptide Synthesis, Part A.; Merrifield et al., J. Am. Chem. Soc. 85:2149–2156 (1963); und Stewart et al., Solid Phase Peptide Synthesis (2. Ausg. 1984).
Alternativ dazu können ADNF-Polypeptide mit mindestens einer D-Aminosäure innerhalb ihrer aktiven Kernstellen unter Anwendung von rekombinanten DNA-Methoden und chemischer Synthese hergestellt werden. Zum Beispiel können Fragmente eines ADNF-Polypeptids mit D-Aminosäuren unter Anwendung von vorausgehend beschriebenen Festphasen-Verfahren chemisch hergestellt werden und Fragmente eines ADNF-Polypeptids mit L-Aminosäuren auf rekombinante Weise. Das heißt, dass Expressionsvektoren mit einer Nukleinsäure, die für ein Fragment eines ADNF-Polypeptids codiert, in Wirtzellen eingesetzt werden und anschließend die exprimierten ADNF-Polypeptidfragmente gereinigt werden können. Diese ADNF-Polypeptidfragmente mit D-Aminosäuren und ADNF-Polypeptidfragmente mit L-Aminosäuren können chemisch miteinander verbunden werden.
Nach einer chemischen Synthese, biologischen Expression bzw. Reinigung kann/können das/die Polypeptide) eine grundlegend andere Konfiguration als die natürliche Konfiguration der konstitutiven Polypeptide haben. In diesem Fall ist es vorteilhaft das Polypeptid zu denaturieren und zu reduzieren und dieses dann dazu veranlassen, sich wieder in die bevorzugte Konfiguration zu falten. Verfahren zum Reduzieren und Denaturieren von Polypeptiden sowie zum Induzieren eines erneuten Faltens sind dem Fachmann gut bekannt (siehe Debinski et al., J. Biol. Chem. 268:14065–14070 (1993); Kreitman & Pastan, Bioconjug. Chem. 4:581–585 (1993); und Buchner et al., Anal. Biochem. 205:263–270 (1992)). Debinski et al., z. B. beschreiben das Denaturieren und Reduzieren von Inklusionskörperpolypeptiden in Guanidin-DTE. Das Polypeptid wird dann in einem Redox-Puffer mit oxidiertem Glutathion und L-Arginin wieder gefaltet.
III. PHARMAZEUTISCHE ZUSAMMENSETZUNGEN
Unter einem anderem Aspekt schlägt die vorliegende Erfindung pharmazeutische Zusammensetzungen vor, die mindestens eins der vorausgehend beschriebenen ADNF-Polypeptide mit mindestens einer D-Aminosäure innerhalb der aktiven Kernstelle in einer ausreichenden Menge enthalten, um eine neuroprotektive/neurotrophische Aktivität aufzuweisen, sowie einen pharmazeutisch annehmbaren Verdünnen, Trägerstoff oder Carrier. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen mit einem der vorausgehend beschriebenen ADNF-Polypeptiden sind besonders nützlich als orale Wirkstoffe, da sie im Magen/Darmtrakt stabil bleiben und unverändert absorbiert werden können. Darüber hinaus kann man unter Anwendung von Kombinationen aus ADNF-Polypeptiden in L-Form und D-Form zur Herstellung pharmazeutischer Zusammensetzungen pharmazeutische Zusammensetzungen mit variablen Dosis-/Reaktions-Eigenschaften erzielen. Diese pharmazeutischen Zusammensetzungen sind unter anderem nützlich, um gezielt auf verschiedene Rezeptoren einzuwirken, die unterschiedliche Affinitäten gegenüber ADNF-Polypeptide haben können, oder um eine individuell zugeschnittene medikamentöse Behandlungsart für Patienten vorschlagen zu können, die z. B. unter neurodegenerativen Krankheiten leiden.
In einer Ausführungsweise umfasst die pharmazeutische Zusammensetzung einen pharmazeutisch annehmbaren Trägerstoff und ein ADNF-Polypeptid, wobei das ADNF-Polypeptid aus folgender Gruppe ausgewählt wird: (a) ein ADNF I-Polypeptid mit einer aktiven Kernstelle, die folgende Aminosäurensequenz aufweist: Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala (SEQ ID-NR: 1); (b) ein ADNF III-Polypeptid mit einer aktiven Kernstelle, die folgende Aminosäurensequenz aufweist: Asn-Ala-Pro- Val-Ser-Ile-Pro-Gln (SEQ ID-NR: 2); und (c) eine Kombination aus dem ADNF I-Polypeptid aus Punkt (a) und dem ADNF III-Polypeptid aus Punkt (b), wobei mindestens eins der ADNF I und ADNF III-Polypeptide eine aktive Kernstelle mit mindestens einer D-Aminosäure, vorzugsweise am N-Terminus und/oder am C-Terminus der aktiven Kernstelle umfasst.
In einer anderen Ausführungsart umfasst die pharmazeutische Zusammensetzung einen pharmazeutisch annehmbaren Trägerstoff und ein ADNF I-Polypeptid, wobei die aktive Kernstelle des ADNF I-Polypeptids mindestens eine D-Aminosäure, vorzugsweise am N-Terminus und/oder am C-Terminus der aktiven Kernstelle umfasst. Die vorausgehende Diskussion hinsichtlich Position und Anzahl der D-Aminosäuren innerhalb der aktiven Kernstelle des ADNF I sowie die Diskussion über zusätzliche, an der aktiven Stelle des ADNF I-Polypeptids hinzugefügte D-und/oder L-Aminosäuren gilt auch in diesem Fall und wird daher in Bezug auf diese besondere Ausführungsweise der Erfindung nicht wiederholt.
In einer wiederum anderen Ausführungsart umfasst die pharmazeutische Zusammensetzung einen pharmazeutisch annehmbaren Trägerstoff und ein ADNF III-Polypeptid, wobei die aktive Kernstelle des ADNF III-Polypeptids mindestens eine D-Aminosäure umfasst, vorzugsweise am N-Terminus und/oder am C-Terminus der aktiven Kernstelle. Die vorausgehende Diskussion hinsichtlich Position und Anzahl der D-Aminosäuren innerhalb der aktiven Kernstelle des ADNF III sowie die Diskussion über zusätzliche, an der aktiven Stelle des ADNF III-Polypeptids hinzugefügte D-und/oder L-Aminosäuren gilt auch in diesem Fall und wird daher in Bezug auf diese besondere Ausführungsweise der Erfindung nicht wiederholt.
In einer wiederum anderen Ausführungsart umfasst die pharmazeutische Zusammensetzung einen pharmazeutisch annehmbaren Trägerstoff und eine Kombination aus einem ADNF I-Polypeptid und einem ADNF III-Polypeptid, wobei mindestens eins der ADNF I und ADNF III-Polypeptide eine aktive Kernstelle mit mindestens einer D-Aminosäure umfasst. Die vorausgehende Diskussion hinsichtlich Position und Anzahl der D-Aminosäuren innerhalb der aktiven Kernstelle der ADNF I bzw. ADNF III sowie die Diskussion über zusätzliche, an der aktiven Stelle der ADNF I bzw. ADNF III-Polypeptide hinzugefügte D-und/oder L-Aminosäuren gilt auch in diesem Fall und wird daher in Bezug auf diese besondere Ausführungsweise der Erfindung nicht wiederholt. In einer wiederum anderen Ausführungsweise umfasst die pharmazeutische Zusammensetzung ein ADNF I-Polypeptid mit allen D- Aminosäuren und ein ADNF III-Polypeptid mit allen L-Aminosäuren. In einer wieder anderen Ausführungsweise umfasst die pharmazeutische Zusammensetzung ein ADNF I-Polypeptid mit allen L-Aminosäuren und ein ADNF III-Polypeptid mit allen D-Aminosäuren. In einer wieder anderen Ausführungsart umfasst die pharmazeutische Zusammensetzung ein ADNF I-Polypeptid mit allen D-Aminosäuren und ein ADNF III-Polypeptid mit allen D-Aminosäuren.
In einer pharmazeutischen Zusammensetzung können jedes bzw. mehrere der hier beschriebenen ADNF I-Polypeptide mit jedem bzw. mehreren der hier beschriebenen ADNF III-Polypeptide kombiniert werden. Eine Kombination aus einem ADNF I-Polypeptid und einem ADNF III-Polypeptid kann eine Mischung aus zwei oder mehreren dieser Polypeptide sein. Eine Kombination aus einem ADNF I-Polypeptid und einem ADNF III-Polypeptid kann sich auch auf ein oder mehrere ADNF I-Polypeptide beziehen, die mit einem oder mehreren ADNF III-Polypeptiden gekoppelt sind. Zum Beispiel kann ein ADNF I-Polypeptid kovalent mit einem ADNF III-Polypeptid verbunden sein. Eine Kombination aus einem ADNF I-Polypeptid und einem ADNF III-Polypeptid kann als einzelne Zusammensetzung präpariert und einem Subjekt verabreicht werden. Alternativ dazu können ein ADNF I-Polypeptid und ein ADNF III-Polypeptid als separate Zusammensetzungen präpariert und gleichzeitig oder nacheinander einem Subjekt verabreicht werden. Zudem können unterschiedliche Proportionen eines ADNF I-Polypeptids und eines ADNF III-Polypeptids einem Subjekt verabreicht werden. Zum Beispiel kann in einer Kombination das Verhältnis zwischen einem ADNF I- und einem ADNF III-Polypeptid im Bereich von 1:100 bis 100:1, 1:10 bis 10:1 oder 1:2 bis 2:1 liegen.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung eignen sich für die Anwendung bei einer Vielzahl von Systemen zur Verabreichung von Medikamenten. Geeignete Formeln für die Anwendung im Rahmen der vorliegenden Erfindung lassen sich in Remington's Pharmaceutical Sciences (17. Ausgabe 1985)) finden, die als Referenz in dieses Dokument aufgenommen wurde. Eine kurze Zusammenfassung der Verfahren zur Verabreichung von Medikamenten ist z. B. in Langer, Science 249:1527–1533 (1990) beschrieben, die als Referenz in dieses Dokument aufgenommen wurde. Zudem werden die pharmazeutischen Zusammensetzungen mit Peptiden und Proteinen z. B. in Therapeutic Peptides and Proteins Formulations, Processing, and Delivery Systems, von Ajay K. Banga, Technomic Publishing Company, Inc., Lancaster, PA (1995) beschrieben.
In einer bevorzugten Ausführungsweise wird die pharmazeutische Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung für eine orale Verabreichung gestaltet. Bei dieser Ausführungsart werden bevorzugt ADNF-Polypeptide mit allen D-Aminosäuren verwendet. Eine pharmazeutisch annehmbare und nicht toxische Zusammensetzung wird durch den Zusatz eines beliebigen, normalerweise angewendeten Trägerstoffes und 10 bis 95 % des aktiven Wirkstoffes bzw. bevorzugter Weise mit einer Konzentration von 25 bis 75 % hergestellt. Um das orale Absorbieren von ADNF-Polypeptiden zu verbessern, werden zudem verschiedene Carrier-Systeme wie Nanopartikel, Mikropartikel, Liposomen, Phospholipide, Emulsionen, Erythrozyten, usw. eingesetzt. Die oralen Wirkstoffe mit den ADNF Polypeptiden der Erfindung können in jeder für eine orale Verabreichung geeigneten Form wie z. B. flüssig, als Tabletten, Kapseln oder dergleichen vorliegen. Die oralen Verabreichungsformen können zudem beschichtet oder behandelt sein, um das Auflösen im Magen zu verhindern bzw. zu reduzieren. Siehe z. B. Therapeutic Peptides and Proteins, Formulation, Processing, and Delivery Systems, von A.K. Banga, Technomic Publishing Company, Inc., 1995.
Zudem werden die ADNF-Polypeptide mit mindestens einer D-Aminosäure innerhalb der aktiven Kernstellen pharmazeutischen Zusammensetzungen beigemengt, die für eine parenterale, topische, orale, sublinguale oder lokale Verabreichung bzw. für eine Sonde vorgesehen sind. Zum Beispiel werden die pharmazeutischen Zusammensetzungen parenteral verabreicht, z. B. intravenös, subkutan, intradermal, oder intramuskulär bzw. intranasal. Folglich schlägt die Erfindung Zusammensetzungen für eine parenterale Verabreichung vor, welche eine Lösung aus einer Kombination von ADNF-Polypeptiden umfassen, die in einem annehmbaren Carrier, vorzugsweise einem wässrigen Carrier, gelöst oder in Suspension sind. Es können eine Vielzahl von wässrigen Carriern zur Anwendung kommen, darunter z. B. Wasser, gepuffertes Wasser, eine 0,4 %ige Salzlösung, 0,3%ige Glycinlösung, Hyaluronsäure und dergleichen. Diese Zusammensetzungen können durch herkömmliche, gut bekannte Sterilisationsverfahren sterilisiert oder steril gefiltert werden. Die daraus entstehenden wässrigen Lösungen können zur Anwendung unverändert oder lyophilisiert abgepackt werden, wobei das lyophilisierte Präparat vor der Verabreichung mit einer sterilen Lösung kombiniert wird. Die Zusammensetzungen können pharmazeutisch annehmbare Hilfssubstanzen enthalten, die erforderlich sind, um sich den physiologischen Bedingungen anzupassen, inklusive pH-regulierende Substanzen und Puffer, Mittel zur Tonizitätsabstimmung, Netzmittel und dergleichen, wie z. B. Natriumacetat, Natriumlactat, Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Calciumchlorid, Sorbitanmonolaurat, Triethanolaminoleat usw.
Für eine Aerosol-Verabreichung werden die ADNF-Polypeptide mit mindestens einer D-Aminosäure innerhalb der aktiven Kernstellen vorzugsweise in fein geteilter Form mit einem oberflächenaktiven Stoff und einem Treibgas bereitgestellt. Der oberflächenaktive Stoff muss selbstverständlich nicht-toxisch und vorzugsweise in Treibgas löslich sein. Repräsentativ für derartige Stoffe sind Ester und partielle Ester von Fettsäuren mit 6 bis 22 Kohlenstoffatomen, wie z. B. Capronsäure, Octansäure, Laurinsäure, Palmitinsäure, Stearinsäure, Linolsäure, Linolensäure, Olestersäure und Oleinsäure mit einem aliphatischen polyhydriden Alkohol oder dessen zyklisches Anhydrid. Es können gemischte Ester wie gemischte oder natürliche Glyceride angewendet werden. Nach Wunsch kann ein Carrier integriert werden, wie z. B. Lecithin für eine intranasale Verabreichung.
Für feste Zusammensetzungen können herkömmliche nicht-toxische feste Carrier verwendet werden. Feste Carrier umfassen z. B. Mannitol, Lactose, Stärke, Magnesiumstearat, Natriumsaccharin, Talk, Zellulose, Glucose, Saccharose, Magnesiumcarbonat und dergleichen in pharmazeutischer Qualität.
Kleine Polypeptide inklusive SALLRSIPA und NAPVSIPQ passieren die Blut-Hirn-Schranke. Für längere Polypeptide, die die Blut-Hirn-Schranke nicht passieren, sind Verfahren zur Beförderung von Proteinen ins Gehirn gut bekannt. Zum Beispiel können Proteine, Polypeptide, andere Verbindungen und Zellen durch intrazerebroventrikuläre Injektion (IZV) oder über eine Kanüle ins Gehirn eines Säugetiers gebracht werden (siehe z. B. Motta & Martini, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 168:62–64 (1981); Peterson et al., Biochem. Pharmacol. 31:2807–2810 (1982); Rzepczynski et al., Metab. Brain Dis. 3:211–216 (1988); Leibowitz et al., Brain Res. Bull. 21:905–912 (1988); Sramka et al., Stereotact. Funcf. Neurosurg. 58:79–83 (1992); Peng et al., Brain Res. 632:57–67 (1993) ; Chem et al., Exp. Neurol. 125:72–81 (1994); Nikkhah et al., Neuroscience 63:57–72 (1994); Anderson et al., J. Comp. Neurol. 357:296–317 (1995); und Brecknell & Fawcett, Exp. Neurol. 138:338–344 (1996)). Insbesondere können Kanülen zur Verabreichung von neurotrophischen Faktoren an Säuger verwendet werden (siehe z. B. Motta & Martini, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 168:62–64 (1981) (Neurotensin); Peng et al., Brain Res. 632:57–67 (1993) (NGF); Anderson et al., J. Comp. Neurol. 357:296–317 (1995) (BDNF, NGF, Neurotrophin-3).
Alternativ dazu können längere ADNF-Polypeptide, die die Blut-Hirn-Schranke nicht passieren, mit einem Stoff gekoppelt werden, der dem ADNF-Polypeptid hilft, die Blut-Hirn-Schranke zu passieren und die Plasmamembran einer Zelle, oder die Membran eines intrazellulären Teils wie z. B. den Zellkern zu durchqueren. Zellmembrane bestehen aus Fett-Protein-Doppelschichten, die für kleine, nicht ionische lipophile Verbindungen völlig durchlässig sind, für polare Verbindungen, Makromoleküle und Medikamente oder Diagnosestoffe von Natur aus jedoch undurchlässig sind. Es wurden jedoch Proteine und andere Verbindungen wie Liposomen beschrieben, die zum Befördern von Polypeptiden wie z. B. ADNF-Polypeptiden durch die Zellmembran hindurch fähig sind.
Zum Beispiel haben « Transmembranproteine » amphiphile bzw. hydrophobe Aminosäurenuntersequenzen, die als Transmembran-Carrier agieren können. In einer Ausführungsweise können homeodomäne Proteine Zellmembrane überwinden. Es hat sich herausgestellt, dass das kürzeste einbettbare Peptid eines homeodomänen Proteins – Antennapedia – die dritte Spirale des Proteins von der Aminosäurenposition 43 bis 58 ist (siehe z. B. Prochiantz, Current Opinion in Neurobiology 6:629–634 (1996)). Man hat herausgefunden, dass eine andere Untersequenz – die hydrophobe Domäne von Signalpeptiden – ähnliche die Zellmembran überspannende Eigenschaften hat (siehe z. B. Lin et al., J. Biol. Chem. 270:14255–14258 (1995)).
Beispiele von Peptidsequenzen, die mit einem ADNF-Polypeptid der Erfindung verknüpft werden können, um die Aufnahme der ADNF-Polypeptide in den Zellen zu erleichtern, umfassen, ohne sich darauf zu beschränken: ein 11-Aminosäuren-Peptid des Tat-Proteins des HIV (siehe Schwarze of al., Science 285:1569–1572 (1999)); eine Peptidsequenz mit 20 Rückständen, die den Aminosäuren 84 bis 103 des p16-Proteins entspricht (siehe Fahraeus et al., Current Biology 6:84 (1996)); die dritte Spirale der 60 Aminosäuren langen Homeodomäne von Antennapedia (Derossi et al., J. Biol. Chem. 269:10444 (1994)); die h-Region eines Signalpeptids wie dem Kaposi-Fibroblasten-Wachstumsfaktor (K-FGF) (Lin et al., supra); oder die VP22 Translokations-Domäne aus HSV (Elliot & O'Hare, Cell 88:223–233 (1997)). Es können noch andere geeignete chemische Gruppen, die eine verbesserte Aufnahme durch die Zellen ermöglichen, chemisch mit den ADNF-Polypeptiden verknüpft werden.
Auch Toxinmoleküle sind dazu fähig, Polypeptide durch eine Zellmembran zu transportieren. Oft bestehen solche Moleküle aus mindestens zwei Teilen (« binäre Toxine » genannt) und zwar aus einer Translokations- oder Bindungsdomäne bzw. einem Polypeptid und einer separaten Toxindomäne bzw. einem Polypeptid. Typischerweise bindet die Translokationsdomäne bzw. das Polypeptid mit einem Zellrezeptor; anschließend wird das Toxin in die Zelle transportiert. Einige bakterielle Toxine, darunter das Clostridium perfringens Iota-Toxin, das Toxin der Diphterie (DT), das Pseudomonas-Exotoxin A (PE), das Keuchhustentoxin (PT), das Bacillus anthracis-Toxin und die Keuchhustenadenylatcyclase (CYA) wurden eingesetzt, um zu versuchen, Peptide als interne oder aminoterminale Fusionen in das Zellzytosol abzugeben (Arora et al., J. Biol. Chem., 268:3334–3341 (1993); Perelle et al., Infect. Immun., 61:5147–5156 (1993); Stenmark et al., J. Cell. Biol. 113:1025–1032 (1991); Donnelly et al., PNAS 90:3530–3534 (1993); Carbonetti et al., Abstr. Annu. Meet. Am. Soc. Microbiol. 95:295 (1995); Sebo et al., Infect. Immun. 63:3851–3857 (1995); Klimpel et al., PNAS U.S.A. 89:10277–10281 (1992); und Novak et al., J. Biol. Chem. 267:17186–17193 (1992)).
Solche Subsequenzen können dazu verwendet werden, ADNF-Polypeptide durch die Zellmembran zu schleusen. ADNF-Polypeptide können einfach mit derartigen Sequenzen fusionieren oder mit ihnen derivatisieren. Normalerweise liegt die Translokationssequenz als Teil eines Fusionsproteins vor. Ein Verbindungsglied kann gegebenenfalls zum Verbinden der ADNF-Polypeptide und der Translokationssequenz eingesetzt werden. Dabei kann jeder geeignete Linker, z. B. ein Peptidlinker zum Einsatz kommen.
Die ADNF-Polypeptide können über Liposomen und Liposom-Derivate wie Immunoliposomen auch in eine tierische Zelle eingeschleust werden, vorzugsweise in eine Säugetierzelle. Der Begriff « Liposom » bezieht sich auf Tröpfchen, die aus einer oder mehreren konzentrisch angeordneten Fettdoppelschichten bestehen, welche eine wässrige Phase einschließen. Die wässrige Phase enthält normalerweise die an die Zelle zu verabreichende Verbindung, d. h. ein ADNF-Polypeptid.
Das Liposom fusioniert mit der Plasmamembran und setzt dabei die ADNF-Polypeptide im Zytosol frei. Alternativ dazu wird das Liposom phagozytiert oder von der Zelle in einem Transportpartikel aufgenommen. Sobald das Liposom im Endosom bzw. Phagosom aufgenommen wurde, baut es sich ab oder fusioniert mit der Membran des Transportpartikels und setzt seinen Inhalt frei.
Bei den aktuellen Methoden der Freisetzung von Medikamenten durch Liposomen wird das Liposom letztendlich durchlässig und setzt die eingekapselte Verbindung (in diesem Fall ein ADNF-Polypeptid) am angesteuerten Gewebe bzw. an den gewünschten Zellen frei. Bei einer system- oder gewebespezifischen Abgabe kann dies zum Beispiel in einer passiven Art geschehen, indem die Liposom-Doppelschicht sich mit der Zeit durch Einwirkung verschiedener Stoffe im Körper abbaut. Alternativ dazu setzt die aktive Freisetzung von Medikamenten die Anwendung eines Wirkstoffes voraus, der eine Veränderung der Durchlässigkeit im Liposompartikel induziert. Liposommembrane können so aufgebaut sein, dass sie destabilisiert werden, wenn das Umfeld in der Nähe der Liposommembran sauer wird (siehe z. B. PNAS 84:7851 (1987); Biochemistry 28:908 (1989)). Wenn Liposomen von einer Target-Zelle endozytiert werden, werden sie dadurch destabilisiert und setzen ihren Inhalt frei. Diese Destabilisierung wird als „Fusogenese" bezeichnet. Dioleoylphosphatidylethanolamin (DOPE) ist die Grundlage vieler « fusogener » Systeme.
Derartige Liposomen umfassen normalerweise ein ADNF-Polypeptid und eine Fettverbindung, z. B. ein neutrales und/oder kationisches Lipid, darunter eventuell ein Rezeptor-Erkennungs-Molekül wie z. B. einen Antikörper, der mit einem vorbestimmten Rezeptor auf der Zelloberfläche oder mit einem Ligand (z. B. ein Antigen) bindet. Zum Präparieren von Liposomen stehen eine Reihe von Methoden zur Verfügung, die z. B. in Szoka of al., Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9:467 (1980), den US-Patenten 4 186 183, 4 217 344, 4 235 871, 4 261 975, 4 485 054, 4 501 728, 4 774 085, 4 837 028, 4 235 871, 4 261 975, 4 485 054, 4 501 728, 4 774 085, 4 837 028, 4 946 787, der Publikation Nr. WO 91/17424, Deamer & Bangham, Biochim. Biophys. Acta 443:629–634 (1976); Fraley et al., PNAS 76:3348–3352 (1979); Hope et al., Biochim. Biophys. Acta 812:55–65 (1985); Mayer et al., Biochim. Biophys. Acta 858:161–168 (1986); Williams et al., PNAS 85:242–246 (1988); Liposomes (Ostro (ed.), 1983, Chapitre 1) ; Hope et al., Chem. Phys. Lip. 40:89 (1986); Gregoriadis, Liposome Technology (1984) und Lasic, Liposomes: from Physics to Applications (1993)) beschrieben werden. Geeignete Verfahren umfassen z. B. Sonikation, Extrusion, Hochdruckhomogenisierung, Mikrofluidisierung, Detergensdialyse, kalziuminduzierte Fusion oder kleine Liposompartikel und Äther-Fusionsmethoden, die dem Fachmann alle bekannt sind.
Bei manchen Ausführungsarten der vorliegenden Erfindung ist es von Vorteil die Liposomen der Erfindung unter Anwendung von Zielgruppen anzusteuern, die für eine bestimmte Zellart, ein Gewebe und dergleichen spezifisch sind. Das Ansteuern von Liposomen unter Anwendung einer Vielzahl von Zielgruppen (z. B. Liganden, Rezeptoren und monoklonale Antikörper) wurde bereits beschrieben (siehe z. B. die US-Patente 4 957 773 und 4 603 044). Es können Standardmethoden zum Koppeln der Zielwirkstoffe und der Liposomen eingesetzt werden. Diese Methoden setzen in der Regel das Einbetten in Liposom-Fettkomponenten voraus, z. B. in Phosphatidylethanolamin, die zum Anhängen von Zielwirkstoffen oder derivatisierten lipophilen Verbindungen wie lipidderivatisiertes Bleomycin aktiviert werden können. Man kann durch Antikörper angezielte Liposomen herstellen, indem man z. B. Liposomen verwendet, die das Protein A enthalten (siehe Renneisen et al., J. Biol. Chem., 265:16337–16342 (1990) und Leonetti et al., PNAS 87:2448–2451 (1990)).
Alternativ dazu können ADNF-codierende Nukleinsäuren verwendet werden, um eine therapeutische Menge an ADNF-Polypeptiden bereitzustellen. Diese Nukleinsäuren können in einen beliebigen von zahlreichen gut bekannten Vektoren für die Transfektion von Zielzellen und Organismen integriert werden. Zum Beispiel werden Nukleinsäuren als DNA-Plasmide, bloße Nukleinsäuren und mit einem Verabreichungsvektor, wie z. B. einem Liposom, komplexierte Nukleinsäuren abgegeben. Die Freisetzungssysteme durch einen viralen Vektor umfassen DNA- und RNA-Viren, die nach der Freisetzung in der Zelle entweder episomale oder integrierte Genome haben. Bezüglich einer Zusammenfassung der Gentherapieverfahren siehe Anderson, Science 256:808–813 (1992); Nabel & Felgner, TIBTECH 11:211–217 (1993); Mitani & Caskey, TIBTECH 11:162–166 (1993); Dillon, TIBTECH 11:167–175 (1993); Miller, Nature 357:455–460 (1992); Van Brunt, Biotechnology 6(10):1149–1154 (1988); Vigne, Restorative Neurology and Neuroscience 8:35–36 (1995); Kremer & Perricaudet, British Medical Bulletin 51(1):31–44 (1995); Haddada et al., in Current Topics in Microbiology and Immunology Doerfler und Böhm (eds) (1995); und Yu et al., Gene Therapy 1:13–26 (1994).
Die Verfahren der nicht-viralen Abgabe von Nukleinsäuren umfassen Lipofektion, Mikroinjektion, Biolistik, Viosomen, Liposomen, Immunoliposomen, Polykation oder Lipid/Nukleinsäurekonjugate, bloße DNA, künstliche Virionen und eine durch einen Wirkstoff verstärkte DNA-Aufnahme. Die Lipofektion wird z. B. im US-Patent 5 049 386, US-Patent 4 946 787 sowie im US-Patent 4 897 355 beschrieben; die Reagenzien für die Lipofektion sind im Handel erhältlich (z. B. Transfectam^TM und Lipofectin^TM). Kationische und neutrale Lipide, die sich für eine wirksame Rezeptor-Erkennungs-Lipofektion von Polynucleotiden eignen, umfassen die von Felgner, WO 91/17424, WO 91/16024. Die Freisetzung kann an Zellen (ex vivo-Verabreichung) oder an Zielgewebe (in vivo-Verabreichung) erfolgen.
Bei therapeutischen Anwendungen werden die ADNF-Polypeptide der Erfindung einem Patienten in ausreichender Menge verabreicht, um den mit verschiedenen Störungen assoziierten neuronalen Zelltod zu reduzieren, oxidativen Stress bei einem Patienten zu reduzieren oder einen Zustand in Verbindung mit dem fetalen Alkoholsyndrom eines Subjekts in utero zu reduzieren. Eine geeignete Menge, um dieses Ziel zu erreichen, wird als « therapeutisch wirksame Menge bezeichnet. Die wirksamen Mengen für diese Anwendung hängen dabei z. B. vom angewendeten besonderen ADNF-Polypeptid, den zu behandelnden Zuständen, der Art des zu verhütenden neuronalen Zelltods bzw. -schadens, der Verabreichungsart, dem Gewicht und allgemeinen Gesundheitszustand des Patienten und der Einschätzung des verschreibenden Arztes ab. Zum Beispiel wäre zur Verhütung oder Reduzierung neuronalen Zelltods eine Menge an ADNF-Polypeptiden innerhalb des Bereichs von 1 μg bis 50 μg, vorzugsweise eine täglich oral verabreichte Menge (z. B. abends) von 1 μg bis 10 μg pro Maus eine therapeutisch wirksame Menge. Diese Dosis beruht auf dem durchschnittlichen Körpergewicht von Mäusen; eine geeignete Dosis für den Menschen kann basierend auf das durchschnittliche Körpergewicht eines Menschen hochgerechnet werden.
IV. ANWENDUNG DER ADNF-POLYPEPTIDE DER VORLIEGENDEN ERFINDUNG FÜR DIE HERSTELLUNG EINES MEDIKAMENTS ZUR REDUZIERUNG NEURONALEN ZELLTODS
Unter einem anderen Aspekt schlägt die vorliegende Erfindung die Anwendung der ADNF-Polypeptide der vorliegenden Erfindung für die Herstellung eines Medikaments zur Reduzierung neuronalen Zelltods vor; dies umfasst das Inkontaktbringen neuronaler Zellen mit einem ADNF-Polypeptid in einer ausreichenden Menge, um den neuronalen Zelltod zu reduzieren, wobei das ADNF-Polypeptid mindestens eine D-Aminosäure innerhalb seiner aktiven Kernstelle umfasst, vorzugsweise am N-Terminus und/oder C-Terminus der aktiven Kernstelle. Bei dieser Anwendung kann das ADNF-Polypeptid ein ADNF I-Polypeptid, ein ADNF III-Polypeptid oder eine Kombination daraus sein.
Bei einer Ausführungsweise umfasst die Anwendung das Inkontaktbringen von neuronalen Zellen mit einem ADNF-Polypeptid, wobei das ADNF-Polypeptid aus folgender Gruppe ausgewählt wird: (a) ein ADNF I-Polypeptid mit einer aktiven Kernstelle mit folgender Aminosäurensequenz: Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala (SEQ-ID NR. 1); (b) ein ADNF III-Polypeptid mit einer aktiven Kernstelle mit folgender Aminosäurensequenz: Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln (SEQ-ID NR. 2); und (c) eine Kombination aus dem ADNF I-Polypeptid aus Punkt (a) und dem ADNF III-Polypeptid aus Punkt (b); wobei mindestens eins der ADNF I- und ADNF III-Polypeptide eine aktive Kernstelle mit mindestens einer D-Aminosäure umfasst.
Bei einer anderen Ausführungsweise umfasst die Anwendung das Inkontaktbringen neuronaler Zellen mit einem ADNF I-Polypeptid, wobei die aktive Kernstelle des ADNF I-Polypeptids mindestens eine D-Aminosäure umfasst, vorzugsweise am N-Terminus und/oder C-Terminus der aktiven Kernstelle. Die vorausgehende Diskussion über Position und Anzahl der D-Aminosäuren innerhalb der aktiven Kernstelle von ADNF I sowie die Diskussion über zusätzliche, an der aktiven Stelle des ADNF I-Polypeptids hinzugefügte D- und/oder L-Aminosäuren gilt auch hier gänzlich und wird folglich in Bezug auf diese besondere Ausführungsart der Erfindung nicht mehr wiederholt.
In einer wiederum anderen Ausführungsart umfasst die Anwendung das Inkontaktbringen neuronaler Zellen mit einem ADNF III-Polypeptid, wobei die aktive Kernstelle des ADNF III-Polypeptids mindestens eine D-Aminosäure umfasst, vorzugsweise am N-Terminus und/oder am C-Terminus der aktiven Kernstelle. Die vorausgehende Diskussion hinsichtlich Position und Anzahl der D-Aminosäuren innerhalb der aktiven Kernstelle des ADNF III sowie die Diskussion über zusätzliche, an der aktiven Stelle des ADNF III-Polypeptids hinzugefügte D-und/oder L-Aminosäuren gilt auch in diesem Fall und wird daher in Bezug auf diese besondere Ausführungsweise der Erfindung nicht wiederholt.
In einer wiederum anderen Ausführungsart umfasst die Anwendung das Inkontaktbringen neuronaler Zellen mit einer Kombination aus einem ADNF I- Polypeptid und einem ADNF III-Polypeptid, wobei mindestens eins der ADNF I- und ADNF III-Polypeptide eine aktive Kernstelle mit mindestens einer D-Aminosäure umfasst. Die vorausgehende Diskussion hinsichtlich Position und Anzahl der D-Aminosäuren innerhalb der aktiven Kernstelle der ADNF I bzw. ADNF III sowie die Diskussion über zusätzliche, an der aktiven Stelle der ADNF I bzw. ADNF III-Polypeptide hinzugefügte D-und/oder L-Aminosäuren gilt auch in diesem Fall und wird daher in Bezug auf diese besondere Ausführungsweise der Erfindung nicht wiederholt.
Die ADNF-Polypeptide der vorliegenden Erfindung können für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von neurologischen Störungen und zur Verhütung neuronalen Zelltods verwendet werden. Zum Beispiel können die ADNF-Polypeptide der vorliegenden Erfindung zur Verhütung des Absterbens neuronaler Zellen eingesetzt werden, inklusive Rückenmarkzellen, Hippokampuszellen, zerebrale Kortexzellen und cholinergische Nervenzellen, ohne sich darauf zu beschränken. Insbesondere können ADNF-Polypeptide der vorliegenden Erfindung zur Verhütung des Absterbens von Zellen eingesetzt werden, das mit (1) dem gp120-HIV-Mantelprotein; (2) N-Methyl-D-Asparginsäure (Exzitotoxizität); (3) Tetrodotoxin (Blockieren der elektrischen Aktivität); und (4) dem Beta-Amyloid-Peptid (Substanz, die mit der neuronalen Degeneration bei der Alzheimerschen Erkrankung in Verbindung gebracht wird) assoziiert wird.
In diesem Zusammenhang können die ADNF-Polypeptide der vorliegenden Erfindung zur Reduzierung gp120-induzierten neuronalen Zelltods eingesetzt werden, indem einem HIV-infizierten Patienten eine wirksame Menge eines ADNF-Polypeptids der vorliegenden Erfindung verabreicht wird. Die ADNF-Polypeptide der vorliegenden Erfindung können auch zur Reduzierung neuronalen Zelltods eingesetzt werden, der mit einer Exzitotoxizität in Verbindung steht, die durch die Stimulation mit N-Methyl-D-Aspartat induziert wird; die Anwendung umfasst dabei das Inkontaktbringen neuronaler Zellen mit einem ADNF-Polypeptid der vorliegenden Erfindung in einer ausreichenden Menge, um neuronalen Zelltod zu verhüten. Die ADNF Polypeptide der vorliegenden Erfindung können auch zur Reduzierung des Zellsterbens eingesetzt werden, das bei einem unter Alzheimer leidenden oder beeinträchtigten Patienten durch Beta-Amyloid-Peptid induziert wird; die Anwendung umfasst dabei das Verabreichen eines ADNF-Polypeptids der vorliegenden Erfindung in einer ausreichenden Menge an den Patienten, um den neuronalen Zelltod zu verhüten. Die ADNF-Polypeptide können auch eingesetzt werden, um durch cholinergisches Blockieren hervorgerufene Lernschwierigkeiten bei einem unter Alzheimer leidenden oder beeinträchtigten Patienten zu verringern. Die ADNF-Polypeptide können zum Beispiel eingesetzt werden, um das Kurzzeitgedächtnis und/oder Referenzgedächtnis bei Alzheimer-Patienten zu verbessern.
Ebenso wird dem Fachmann schnell klar, dass die ADNF-Polypeptide der vorliegenden Erfindung in ähnlicher Weise eingesetzt werden können, um einen neuronalen Zelltod zu verhüten, der mit einer Reihe von anderen neurologischen Krankheiten und Defiziten in Verbindung steht. Die Pathologien, die sich durch die therapeutischen und diagnostischen Anwendungen dieser Erfindung lindern ließen, umfassen Zustände (Krankheiten und Läsionen), die zu neuronalem Zelltod und/oder subletaler neuronaler Pathologie führen; dazu zählt zum Beispiel folgendes:
Erkrankungen der zentralen motorischen Systeme, darunter degenerative Erscheinungen, die die Basalganglien betreffen (Huntington, Morbus Wilson, striatonigrale Degeneration, kortikobasale Degeneration), Tourette-Syndrom, Parkinson, progressive supranukleäre Blickparesie, progressive bulbäre Blickparesie, familiäre spastische Paraplegie, spinale Atrophie, ALS und Varianten davon, dentatorubrale-pallidolysiale Atrophie, olivo-ponto-zerebelläre Degeneration, paraneoplastische zerebelläre Degeneration und dopamininduzierte Toxizität;
Krankheiten, die die sensorischen Nervenzellen berühren, wie Friedreichs Ataxia, Diabetes, periphere Neuropathie, retinale neuronale Degeneration;
Krankheiten der limbischen und kortikalen Systeme wie zerebrale Amyloidosis, Pick-Atrophie, Rett-Syndrom;
neurodegenerative Pathologien, die multiple neuronale Systeme und/oder den Gehirnstamm betreffen wie Alzheimersche Erkrankung, AIDS-bedingte Demenz, Leigh-Krankheit, Lewy-body-Krankheit, Epilepsie, multiple Systematrophie, Guillain-Barre-Syndrom, lysosomale Speicherkrankheiten wie Lipofuscinosis, spätdegenerative Stadien des Down-Syndroms, Alpers-Krankheit, Schwindelzustände als Folge einer ZNS-Degeneration;
Pathologien in Verbindung mit einer Entwicklungsretardierung, Lernschwierigkeiten und dem Down-Syndrom sowie neuronales Absterben aufgrund oxidativen Stresses;
Pathologien in Verbindung mit erhöhtem Alter und chronischem Alkohol- bzw. Drogenmissbrauch, darunter z. B. bei Alkoholismus die Degeneration der Nervenzellen im Locus coeruleus, Zerebellum, cholinergischen basalen Vorderhirn; bei erhöhtem Alter die Degeneration von zerebellären Neuronen und kortikalen Neuronen, was zu kognitiven und motorischen Störungen führt; und bei chronischem Missbrauch von Amphetaminen die Degeneration von basalen Ganglienneuronen, was zu motorischen Störungen führt;
pathologische Veränderungen, die auf einem fokalen Trauma beruhen, wie z. B. ein Schlaganfall, fokale Ischämie, Durchblutungsinsuffizienz, hypoxische-ischämische Enzephalopathie, Hyperglykämie, Hypoglykämie, geschlossenes Schädeltrauma oder direktes Trauma;
Pathologien, die als unerwünschte Nebenwirkung von therapeutischen Medikamenten und Behandlungen auftreten (z. B. Degeneration von cingularen und entorhinalen Kortexneuronen als Reaktion auf Antikonvulsivum-Dosen von Antagonisten der NMDA-Kategorie von Glutamat-Rezeptoren).
V. ANWENDUNG VON ADNF-POLYPEPTIDEN DER VORLIEGENDEN ERFINDUNG FÜR DIE HERSTELLUNG EINES MEDIKAMENTS ZUR REDUZIERUNG OXIDATIVEN STRESSES
Unter einem wieder anderen Aspekt schlägt die vorliegende Erfindung die Anwendung von ADNF-Polypeptiden der vorliegenden Erfindung zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung oxidativen Stresses bei einem Patienten vor, indem dem Patienten ein ADNF-Polypeptid in ausreichender Menge verabreicht wird, um oxidativen Stress zu verhüten oder reduzieren, wobei das ADNF-Polypeptid mindestens eine D-Aminosäure innerhalb seiner aktiven Kernstelle umfasst, vorzugsweise am N-Terminus und/oder am C-Terminus der aktiven Kernstelle. Oxidativer Stress wurde mit mehreren neurodegenerativen Krankheiten beim Menschen in Verbindung gebracht (Cassarmno & Bennett, Brain Res. Reviews 29:1-25 (1999)). Zudem wurde auf Alkoholkonsum zurückgeführter oxidativen Stress mit fetaler Sterblichkeit und Fehlbildungen in Zusammenhang gebracht (z. B. mit dem fetalen Alkoholsyndrom assoziierte Zustände). Siehe z. B. Henderson et al., Alcoholism: Clinical and Experimental Research 19:714–720 (1995). Bei diesen Anwendungen kann das ADNF-Polypeptid ein ADNF I-Polypeptid, ein ADNF III-Polypeptid oder eine Kombination aus beiden sein. Durch die Anwendung der ADNF- Polypeptide der vorliegenden Erfindung kann oxidativen Stress bei verschiedenen klinischen Zuständen reduziert werden.
Bei einer Ausführungsweise umfasst die Anwendung die Behandlung oxidativen Stresses bei einem Patienten mit einem ADNF-Polypeptid, wobei das ADNF-Polypeptid aus folgender Gruppe ausgewählt wird: (a) ein ADNF I-Polypeptid mit einer aktiven Kernstelle mit folgender Aminosäurensequenz: Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala (SEQ-ID NR.: 1); (b) ein ADNF III-Polypeptid mit einer aktiven Kernstelle mit folgender Aminosäurensequenz: Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln (SEQ-ID NR.: 2); und (c) eine Kombination des ADNF I-Polypeptids aus Punkt (a) und des ADNF III-Polypeptids aus Punkt (b), wobei mindestens eins der ADNF I-und ADNF III-Polypeptide eine aktive Kernstelle mit mindestens einer D-Aminosäure umfasst, vorzugsweise am N-Terminus und/oder C-Terminus der aktiven Kernstelle.
Bei einer anderen Ausführungsweise umfasst die Anwendung die Behandlung oxidativen Stresses bei einem Patienten mit einem ADNF I-Polypeptid, wobei die aktive Kernstelle des ADNF I-Polypeptids mindestens eine D-Aminosäure umfasst, vorzugsweise am N-Terminus und/oder C-Terminus der aktiven Kernstelle. Die vorausgehende Diskussion über Position und Anzahl der D-Aminosäuren innerhalb der aktiven Kernstelle von ADNF I sowie die Diskussion über zusätzliche, an der aktiven Stelle des ADNF I-Polypeptids hinzugefügte D- und/oder L-Aminosäuren gilt auch hier gänzlich und wird folglich in Bezug auf diese besondere Ausführungsart der Erfindung nicht mehr wiederholt.
In einer wiederum anderen Ausführungsart umfasst die Anwendung die Behandlung oxidativen Stresses bei einem Patienten mit einem ADNF III-Polypeptid, wobei die aktive Kernstelle des ADNF III-Polypeptids mindestens eine D-Aminosäure umfasst, vorzugsweise am N-Terminus und/oder am C-Terminus der aktiven Kernstelle. Die vorausgehende Diskussion hinsichtlich Position und Anzahl der D-Aminosäuren innerhalb der aktiven Kernstelle des ADNF III sowie die Diskussion über zusätzliche, an der aktiven Stelle des ADNF III-Polypeptids hinzugefügte D- und/oder L-Aminosäuren gilt auch in diesem Fall und wird daher in Bezug auf diese besondere Ausführungsweise der Erfindung nicht wiederholt.
In einer wiederum anderen Ausführungsart umfasst die Anwendung die Behandlung oxidativen Stresses bei einem Patienten mit einer Kombination aus einem ADNF I-Polypeptid und einem ADNF III-Polypeptid, wobei mindestens eins der ADNF I- und ADNF III-Polypeptide eine aktive Kernstelle mit mindestens einer D- Aminosäure umfasst. Die vorausgehende Diskussion hinsichtlich Position und Anzahl der D-Aminosäuren innerhalb der aktiven Kernstelle der ADNF I bzw. ADNF III sowie die Diskussion über zusätzliche, an der aktiven Stelle der ADNF I bzw. ADNF III-Polypeptide hinzugefügte D-und/oder L-Aminosäuren gilt auch in diesem Fall und wird daher in Bezug auf diese besondere Ausführungsweise der Erfindung nicht wiederholt.
VI. ANWENDUNG DER ADNF-POLYPEPTIDE DER VORLIEGENDEN ERFINDUNG FÜR DIE HERSTELLUNG EINES MEDIKAMENTS ZUR REDUZIERUNG EINES MIT DEM FETALEN ALKOHOLSYNDROM ASSOZIIERTEN ZUSTANDS
Unter einem wiederum anderen Aspekt schlägt die vorliegende Erfindung eine Anwendung der ADNF-Polypeptide der vorliegenden Erfindung für die Herstellung eines Medikaments zur Reduzierung eines mit dem fetalen Alkoholsyndrom assoziierten Zustands bei einem Subjekt vor, das in utero Alkoholkonsum ausgesetzt ist, wobei die Anwendung die Verabreichung an das Subjekt eines ADNF-Polypeptids in ausreichender Menge umfasst, um den mit dem fetalen Alkoholsyndrom assoziierten Zustand zu reduzieren, wobei das ADNF-Polypeptid eine aktive Kernstelle mit mindestens einer D-Aminosäure umfasst, vorzugsweise am N-Terminus und/oder am C-Terminus der aktiven Kernstelle. Bei dieser Anwendung kann das ADNF-Polypeptid ein ADNF I-Polypeptid, ein ADNF III-Polypeptid oder eine Kombination daraus sein.
Die Behandlung eines gut gekennzeichneten Modells für das FAS (z. B. Mausstamm C57B1/6J) mit einem ADNF-Polypeptid mit mindestens einer D-Aminosäure innerhalb einer aktiven Kernstelle reduziert oder- verhütet eine alkoholinduzierte Sterblichkeit des Fetus, verringertes Körpergewicht und verringertes Gewicht des Gehirns sowie eine VIP mRNA-Verringerung. Auf gleiche Art und Weise kann ein menschlicher Embryo, Fetus oder Subjekt durch das Verabreichen eines ADNF-Polypeptids direkt an den Embryo, Fetus oder das Subjekt bzw. durch das indirekte Verabreichen an den Fetus durch eine Verabreichung an die Mutter vor alkoholinduzierten Auswirkungen geschützt werden. Die ADNF-Polypeptide werden dabei vorzugsweise oral verabreicht.
Bei einer Ausführungsweise umfasst die Anwendung die Verabreichung eines ADNF-Polypeptids an ein Subjekt, das in utero Alkoholkonsum ausgesetzt ist, wobei das ADNF-Polypeptid aus folgender Gruppe ausgewählt wird: (a) ein ADNF I-Polypeptid mit einer aktiven Kernstelle mit folgender Aminosäurensequenz: Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala (SEQ-ID NR.: 1); (b) ein ADNF III-Polypeptid mit einer aktiven Kernstelle mit folgender Aminosäurensequenz: Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln (SEQ-ID NR.: 2); und (c) eine Kombination des ADNF I-Polypeptids aus Punkt (a) und des ADNF III-Polypeptids aus Punkt (b), wobei mindestens eins der ADNF I- und ADNF III-Polypeptide eine aktive Kernstelle mit mindestens einer D-Aminosäure umfasst.
Bei einer anderen Ausführungsweise umfasst die Anwendung die Verabreichung eines ADNF I-Polypeptids an ein Subjekt, das in utero Alkoholkonsum ausgesetzt ist, wobei die aktive Kernstelle des ADNF I-Polypeptids mindestens eine D-Aminosäure umfasst, vorzugsweise am N-Terminus und/oder C-Terminus der aktiven Kernstelle. Die vorausgehende Diskussion über Position und Anzahl der D-Aminosäuren innerhalb der aktiven Kernstelle von ADNF I sowie die Diskussion über zusätzliche, an der aktiven Stelle des ADNF I-Polypeptids hinzugefügte D- und/oder L-Aminosäuren gilt auch hier gänzlich und wird folglich in Bezug auf diese besondere Ausführungsart der Erfindung nicht mehr wiederholt.
In einer wiederum anderen Ausführungsart umfasst die Anwendung die Verabreichung eines ADNF III-Polypeptids an ein Subjekt, das in utero Alkoholkonsum ausgesetzt ist, wobei die aktive Kernstelle des ADNF III-Polypeptids mindestens eine D-Aminosäure umfasst, vorzugsweise am N-Terminus und/oder am C-Terminus der aktiven Kernstelle. Die vorausgehende Diskussion hinsichtlich Position und Anzahl der D-Aminosäuren innerhalb der aktiven Kernstelle des ADNF III sowie die Diskussion über zusätzliche, an der aktiven Stelle des ADNF III-Polypeptids hinzugefügte D-und/oder L-Aminosäuren gilt auch in diesem Fall und wird daher in Bezug auf diese besondere Ausführungsweise der Erfindung nicht wiederholt.
In einer wiederum anderen Ausführungsart umfasst die Anwendung die Verabreichung einer Kombination aus einem ADNF I-Polypeptid und einem ADNF III-Polypeptid an ein Subjekt, das in utero Alkoholkonsum ausgesetzt ist, wobei mindestens eins der ADNF I- und ADNF III-Polypeptide eine aktive Kernstelle mit mindestens einer D-Aminosäure umfasst. Die vorausgehende Diskussion hinsichtlich Position und Anzahl der D-Aminosäuren innerhalb der aktiven Kernstelle der ADNF I bzw. ADNF III sowie die Diskussion über zusätzliche, an der aktiven Stelle der ADNF I bzw. ADNF III-Polypeptide hinzugefügte D-und/oder L-Aminosäuren gilt auch in diesem Fall und wird daher in Bezug auf diese besondere Ausführungsweise der Erfindung nicht wiederholt.
BEISPIELE
A. In vitro-Experimente
Es wurden abgetrennte zerebrale Kortexkulturen, die wie in (Brenneman & Gozes, J. Clin. Invest. 97:2299-2307 (1996)) beschriebener Weise vorbereitet wurden, verwendet, um die überlebensfördernden Wirkungen von ADNF I und ADNF III-derivierten Peptiden zu vergleichen. Die Vergleiche wurden mit der D-Form des Peptids und in Kombination mit der L-Form der Peptide durchgeführt. Das Testparadigma bestand darin, das Testpeptid zu Kulturen hinzuzufügen, die auch mit Tetrodotoxin (TTX) behandelt worden sind. TTX verursachte eine Apoptose in diesen Kulturen und wird als eine Modellsubstanz verwendet, um die Wirksamkeit gegen diesen « programmierten Zelltod" und andere Mittel unter Beweis zu stellen, die diese Art von Absterbemechanismus hervorrufen. Die Testdauer betrug 5 Tage; die Neuronen wurden mithilfe ihrer kennzeichnenden Morphologie gezählt und identifiziert, was durch einen immunzytochemischen Marker für Neuronen – neuronenspezifische Enolase – bestätigt wurde.
Wie in 1 gezeigt, waren die D- und L-Formen von SALLRSIPA (SAL) sowohl hinsichtlich ihres Potenzials als auch ihrer Wirksamkeit, neuronalen Zelltod in Verbindung mit einer elektrischen Blockade durch TTX zu verhindern, identisch. Jeder Punkt entspricht dem Durchschnitt von mindestens drei Ermittlungen, wobei die Fehlerbalken den Standardabweichungen entsprechen. Ebenso waren die D- und L-Formen von NAPVSIPQ (NAP) sehr ähnlich, wobei jede eine komplexe Reaktion auf die Dosis mit zwei deutlichen Spitzen aufweist (2A). Außer bei anders lautendem Hinweis beziehen sich L-SAL und D-SAL auf ein Peptid mit einer Aminosäurensequenz von Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala (SEQ-ID NR. 1), das jeweils alle L-Aminosäuren oder alle D-Aminosäuren umfasst. Ebenso beziehen sich L-NAP und D-NAP auf ein Peptid mit einer Aminosäurensequenz von Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln (SEQ-ID NR. 2), das jeweils alle L-Aminosäuren oder alle D-Aminosäuren umfasst.
In 2B wurde die Wirkung eines ADNF-Peptids mit Aminosäurenrückständen sowohl in L- als auch in D-Form, nämlich D-NA{L-P}VSIPQ, getestet. Bei diesem ADNF-Peptid waren alle Aminosäuren von NAPVSIPQ in D-Form, außer der dritte Prolin-Rückstand, der in L-Form vorlag. Man behandelte während 5 Tagen zerebrale Kortexkulturen mit 1 μM TTX, was einem Modell für die bei neurodegenerativen Krankheiten auftretende Apoptose entspricht. Den mit dem Toxin behandelten Kulturen wurden unterschiedliche Konzentrationen D-NA{L-P}VSIPQ hinzugefügt. Wie NAPVSIPQ mit allen L- und allen D-Aminosäuren hat auch dieses kombinierte D-/L-Peptid D-NA{L-P}VSIPQ eine überlebensfördernde Aktivität bewahrt und sich bei der Verhütung neuronalen Zelltods in Zellkulturen im TTX-Modell als wirksam erwiesen.
Wie in den 3A und 3B dargestellt, hat man auch Peptidkombinationen getestet. Bei allen Kombinationsexperimenten lagen die beiden Peptide in äquimolaren Mengen vor. In 3A wird dargestellt, dass mit D-NAP und D-SAL eine andere Reaktion auf die Dosis als mit einem der beiden Wirkstoffe alleine erzielt wird. Noch bedeutender ist, dass es zu keiner sichtbaren Verringerung der überlebensfördernden Aktivität bei einer höheren Konzentration Peptid kam. Dieses offensichtliche Zusammenwirken zwischen den Peptiden ist von Bedeutung, da es darauf hinweist, dass es eine größere therapeutische Bandbreite an wirksamen Konzentrationen geben kann, wenn beide D-Peptide kombiniert angewendet werden. Ähnliche Experimente, die sowohl mit L-SAL und L-NAP durchgeführt wurden, führten zu einem bedeutenden Wirkungsverlust, selbst wenn das Zusammenwirken noch immer deutlich war (3A).
Es wurde eine andere Reihe von Experimenten durchgeführt, um die Auswirkung einer Kombination von D- und L-Formen von NAP und SAL aufzuzeigen. Wie in 3B dargestellt, hat sich die Anwendung von L-NAP und D-SAL als sehr wirksam und mit einem hohen Potenzial zur Verhütung der Apoptose von mit TTX behandelten Neuronen erwiesen. Bei hohen Peptidkonzentrationen (>1 pM) kam es zu keiner deutlichen Verringerung der Schutzwirkung, d. h. dass auch hier ein Zusammenwirken stattfand. Im Gegensatz dazu führte die Behandlung mit D-NAP und L-SAL zu voller Wirksamkeit, jedoch zu einer Verringerung der überlebensfördernden Aktivität bei einer Konzentration von > 0,1 pM. Diese Daten weisen auf eine Spezifität bei den Kombinationen von D- und L-Peptiden hin.
4 zeigt, dass ADNF-Polypeptide in vitro vor der Toxizität von Beta-Amyloid schützen können. Dazu wurden PC12-Zellen (Solomon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4109–4112 (1997) in einem DMEM-Medium (Dulbecco's modified Eagles medium) gehalten, das mit 8 % Pferdeserum, 8 % hitze-inaktiviertem fetalen Kalbsserum, 2 mM L-Glutamin, (alle bei Sigma, Rehovot, Israel erworben), 100 mg/ml Streptomycin und 100 U/l Penizillin (Biological Industries, Beit Haemek, Israel) ergänzt wurde. Die Kulturen wurden bei 37°C / 5 % CO₂ in einzelnen Schichten in 75 cm² Röhrchen aufbewahrt und zweimal wöchentlich in einem Verhältnis von 1:12 geteilt. Zur Behandlung mit Beta-Amyloid (Aminosäuren 25–35) erfolgte das Impfen mit 1,5 × 10⁵ Zellen/ml auf Mikrotiterplatten mit 96 Kavitäten (100 ml/Kavität) in folgendem Medium: DMEM, das mit 1 % Penizillin / Streptomycin und 0,5 M Insulin (Sigma, Rehovot, Israel) ergänzt wurde. 24 Stunden nach der Zugabe von Peptiden 10-9 M (D-SAL und D-NAP in einer 1:1 Mischung, die auf eine Endkonzentration von 1 nM verdünnt wurde) fügte man 2,5 mM Beta-Amyloid hinzu und messte man die Lebensfähigkeit der Zellen (Stoffwechsel) 48 Stunden später. Der Stoffwechsel wurde durch ein kolorimetrisches Verfahren mit einer Tetrazolium-Verbindung (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl-5-(3-Carboxymethoxyphenyl)-2-(4-Sulfophenyl)-2H Tetrazlium (MTS) und dem elektronenkoppelnden Reagens Phenazinmethasulfat gemessen. MTS wird von den lebenden Zellen in die Formazan-Form bioreduziert, welche bei 490 nm detektiert wird (Promega, Medison WI, USA). Die Ergebnisse haben in Gegenwart des Toxins einen signifikanten Aktivitätsverlust und einen Schutz durch die Peptide D-SAL+D-NAP gezeigt.
B. In vivo-Experimente
Es wurden zahlreiche experimentale Modelle eingesetzt, um die Wirksamkeit von D-NAP und D-SAL bei Tieren nachzuweisen. Dabei wurden verschiedene Verabreichungsarten bei Ratten und Mäusen angewendet.
1. Fetales Alkoholsyndrom (FAS) bei Mäusen. Zum Testen der Wirksamkeit der ADNF I- und ADNF III-Peptide bei Mäusen wurde ein gut bekanntes Modell für FAS verwendet (Webster et al., Neurobehav. Tox. 2:227–234 (1980), als Referenz in vorliegendes Dokument integriert). Dieser Test dient zum Prüfen der Wirksamkeit gegen starken oxidativen Stress aufgrund von Alkoholkonsum (Amini et al., Free Radical Biology and Medicine 21:357–365 (1996); Schlorff et al., Alcohol 17:97–105 (1999)). Die fetale Sterblichkeit und Fehlbildungen hängen mit der Entstehung freier Radikale und oxidativen Schäden zusammen (Henderson et al., Alcoholism: Clinical and Experimental Research 19:714–720 (1995)). Das Modell wurde gewählt, weil es eine schnelle und zuverlässige Beurteilung wirksamer Substanzen gegen starken oxidativen Stress ermöglicht. Da oxidativen Stress auch bei verschiedenen neurodegenerativen Krankheiten beim Menschen eine Rolle spielt (Cassarmno & Bennett, Brain Res. Reviews 29:1–25 (1999)), kann die Wirksamkeit bei FAS einen vorhersagenden Wert für die Behandlung einer menschlichen Krankheit haben.
Am achten Tag der Embryonenentwicklung wurde bei tragenden Mäusen eine einzige Injektion mit 25 %igem Äthylalkohol in einer Salzlösung mit einer Dosierung von 0,030 ml/g Körpergewicht intraperitoneal durchgeführt. Bei der ersten Versuchsreihe wurden 30 Minuten vor der Verabreichung von Alkohol Peptide mit einer Dosierung von 2 μg bzw. 20 μg verabreicht. D-NAP bzw. L-NAP (0,5 mg) wurde in 50 μl Dimethylsulfoxid aufgelöst und mit gefilterter (0,22 μ) Dulbeccos Phosphatpuffersalzlösung (DPBS) auf ein Endvolumen von 5 ml verdünnt. Die Injektionsmenge betrug 200 μl. D-SAL bzw. L-SAL wurde vor der Verabreichung in DPBS aufgelöst. Die durchschnittliche Wurfgröße wurde als einzige Messung für die statistische Analyse verwendet. Die durchschnittliche Wurfgröße betrug 8 und wies bei den einzelnen Behandlungsgruppen keine Abweichung auf.
Die überlebenden Feten wurden am 18. Tag der embryonären Entwicklung beurteilt. Die Beurteilung der Wirksamkeit erfolgte in Bezug auf die Anzahl überlebender Feten (5), das Gewicht des Gehirns (6A) und das gesamte Körpergewicht der Feten (6B). Wie in 5 zu sehen ist, führte die Behandlung mit Alkohol zu einer Fetensterblichkeit von 37 % gegenüber 6 % bei der Kontrollgruppe. Eine Vorbehandlung mit 20 μg D-NAP, D-SAL bzw. L-NAP + D-SAL jeweils 20 μg) hat die fetale Sterblichkeitsrate in Bezug auf die Alkoholgruppe (P<0,03) auf signifikante Weise reduziert. Wie in 6A gezeigt, haben von den überlebenden Feten, deren Mütter mit Alkohol behandelt wurden, nur die ein signifikant höheres Gewicht des Gehirns im Vergleich zur Alkoholgruppe, die gleichzeitig mit L-NAP und D-SAL behandelt wurden. Ähnliche Schutzwirkungen von L-NAP und D-SAL waren ersichtlich, die über das Gesamtkörpergewicht der Feten (6B) beurteilt werden konnten.
Um den kritischen Punkt für die Verabreichung der Peptide herauszufinden, an dem noch eine Wirkung erzielt wird, wurde tragenden Mäusen am B. Trächtigkeitstag eine Stunde oder drei Stunden nach der Alkoholbehandlung L-NAP (20 μg) + L-SAL (20 μg) verabreicht. Wie in 7 zu sehen ist, hat eine Nachbehandlung nach 1 Stunde mit NAP + SAL die mit der Alkoholbehandlung zu beobachtende Sterblichkeit verhütet; eine Nachbehandlung nach 3 Stunden hat jedoch zu keiner signifikanten Verhütung der fetalen Sterblichkeit im Vergleich zum Level der Kontrollgruppe geführt. Außerdem verhütete die Nachbehandlung mit NAP+ SAL (1 Stunde und 3 Stunden) die Mikrozephalie (8), jedoch nicht die mit FAS assoziierte Wachstumsverzögerung.
Zum Nachweis, dass D-NAP und D-SAL bei oraler Verabreichung wirksam sind, wurden die Peptide tragenden Mäusen am B. Trächtigkeitstag über eine Sonde verabreicht (d. h. die Peptide wurden über eine Kanüle in den Magen geführt). Wie in 9 zu sehen ist, wurde nach der oralen Behandlung mit jeweils 40 μg D-NAP und D-SAL eine signifikant höhere fetale Überlebensrate festgestellt. Dabei handelt es sich um den ersten Nachweis einer oral aktiven, Embryonen schützenden Wirkung eines Peptids.
Die 10A und 10B stellen die Wirkungen einer oralen Verabreichung von ADNF-Polypeptiden auf das Gewicht des Gehirns von Neugeborenen und auf die fetale Sterblichkeit dar. In einem Modellversuch für das fetale Alkoholsyndrom gemäß den Verfahren von Webster et al., (1980), supra hat man tragenden Mäusen 25 %igen Alkohol mit einer Dosierung von 0,030 ml/g Körpergewicht injiziert. Das Peptid wurde in phosphatgepufferter Salzlösung aufgelöst und über eine Sonde 30 Minuten vor der Alkoholbehandlung oral verabreicht. Dabei stellte sich heraus, dass 40 μg D-SAL (alle D-Aminosäuren von SALLRSIPA) die am 18. Entwicklungstag ermittelte fetale Sterblichkeit verhüteten.
2. Apo-E-knockout-Mäuse
Tests über die Verhaltensentwicklung
Jüngste Studien haben gezeigt, dass die Vererbung des Fettträgers Apolipoprotein E4 (ApoE4) ein wesentlicher Risikofaktor bei der Alzheimerschen Erkrankung ist (Strittmatter & Roses, Proc. Natl. Acad Sci. USA 92:4725–4727 (1995)). Diese Studien sowie die Forschungsarbeiten an ApoE-defizienten Tieren haben darauf hingewiesen, dass ein funktionierendes Apolipoprotein-E-System für eine normale neuronale Entwicklung und Funktion erforderlich ist (Masliah et al., J. Exp. Neurol. 136:107–122 (1995)). Das Erreichen von Entwicklungsstufen im Verhalten erfordert eine entsprechende Synapsenbildung und eine richtige Gehirnaktivität (Altman et al., Anim. Behav. 23:896–920 (1975)). Es hat sich herausgestellt, dass ApoE-defiziente Tiere eine Entwicklungsretardierung aufweisen (Gozes et al., J. Neurobiol. 33:329–342 (1997), als Referenz in das vorliegende Dokument aufgenommen) und ein Testmodell für die In vivo-Auswirkungen von putativen neurotrophischen Substanzen wie z. B. D-SAL oder D-NAP bilden.
Um die Ausgangsstufen der neurologischen Verhaltensentwicklung auf vorausgehend beschriebene Weise (Gozes et al., J. Neurobiol. 33:329–342 (1997); Bassan et al., J. Neurochem. 72:1283–1293 (1999)) zu untersuchen, hat man neugeborene Tiere getestet. Die Tiere wurden bei diesen Experimenten entweder durch eine orale Verabreichung oder durch eine subkutane Injektion von D-SAL+ D-NAP behandelt. Die Peptide (jeweils 0,5 mg) wurden in 0,01 M Essigsäure (30 Mikroliter) aufgelöst. Bei beiden Anwendungen wurden jeweils 0,5 Mikrogramm der Testmedikamente verabreicht: für die orale Anwendung (sublingual) in 10 Mikroliter Salzlösung und für die Injektion in 20 Mikroliter Salzlösung. Dieses Protokoll wurde während der ersten vier Lebenstage angewendet. Zwischen dem 5. und 10. Lebenstag wurden die Peptidmenge und das Lösungsvolumen verdoppelt. Zwischen dem 11. und 14. Lebenstag betrug die Peptidmenge jeweils 2 Mikrogramm in 40 Mikroliter (oral) und 80 Mikroliter (Injektion). Täglich wurden folgende Tests durchgeführt: Vermeiden von Klippen, negative Geotaxis, Positionieren und Aufrichten im Raum. Dabei wurden subkutane und orale Verabreichung von D-NAP und D-SAL verglichen. Wie in 11 gezeigt, waren die ApoE-Knockout-Tiere beim Vermeiden von Klippen am langsamten. Dies bestätigen vorausgehende Studien, die zeigen, dass die Verhaltensentwicklung und das Lernvermögen bei diesen Tieren im Vergleich zu Kontrolltieren retardiert sind (Gozes of al., J. Neurobiol. 33:329–342 (1997); Bassan et al., J. Neurochem. 72:1283–1293 (1999)). Das Verabreichen von D-NAP + D-SAL entweder durch eine subkutane Injektion oder eine orale Verabreichung führte zu signifikanten Verbesserungen im Verhaltensschema, was auf ein schnelleres Erreichen dieser Entwicklungsphase hinweist. Ähnliche Auswirkungen wurden hinsichtlich der negativen Geotaxis (12) und des Raumverhaltens (13) beobachtet.
Eine genauere Beurteilung der Ergebnisse wird nachfolgend aufgeführt. Im Folgenden wurde eine Einfaktorenvarianzanalyse mit mehrfachen Vergleichen der Durchschnitte (Student-Newman-Keuls-Methode) für die statistischen Vergleiche verwendet.
1. 11 (Vermeiden von Klippen): Der Unterschied zwischen ApoE-defizienten Mäusen und Kontrolltieren war nur am fünften Lebenstag (p<0,001) erkennbar. Die Injektion von D-Peptiden bei Kontrolltieren führte zu keiner Wirkung, während die Injektion bei defizienten Mäusen nur am dritten Tag zu einer Wirkung führte. Die orale Verabreichung führte bei defizienten Mäusen nur am ersten Tag zu signifikanten Verbesserungen.
2. 12 (negative Geotaxis): Während am ersten Tag zwischen Kontrolltieren und ApoE-defizienten Mäusen kein Unterschied bestand (mit einem eventuellen Unterschied am 3. Tag, P<0,006), führte die Behandlung der letzteren (Injektion oder oral verabreicht) am 1., 2., 4. und 5. Tag bei Injektion und am 1. und 5. Tag bei oraler Verabreichung (P<0,001) zu signifikanten Verbesserungen.
3. 13 (Positionieren im Raum): Der Unterschied zwischen ApoE-defizienten Mäusen und Kontrolltieren war nur am 1. Lebenstag erkennbar (P<0,001). Eine orale Verabreichung der Peptidmischung war ebenfalls nur am 1. Lebenstag zur Verstärkung der Reaktion wirksam.
3. AF64A-Cholinotoxizität bei adulten Ratten
Ein anderes Ziel der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf die neuroprotektiven Eigenschaften von D-SAL und D-NAP bei Tieren, die dem Cholinotoxin Ethylcholinaziridinium (AF64A), einem Blocker der Cholin-Aufnahme ausgesetzt sind (Fisher et al., Neurosci. Lett. 102:325–331 (1989)). Für eine normale Gehirnfunktion ist ein intaktes cholinerges System erforderlich, während die Alzheimersche Erkrankung mit dem Absterben der cholinergen Zellen in Verbindung gebracht wird (Brumback & Leech, J. Okla. State Med. Assoc. 87:103–111 (1994)). Mit AF64A behandelte Ratten bilden ein akzeptiertes Modell für einen In vivo-Test der Wirksamkeit von Medikamenten, die die cholinerge Funktion verstärken.
Obwohl die Identität der ADNF-abhängigen Neuronen nicht ganz genau ermittelt ist, haben frühere Studien gezeigt, dass bestimmte cholinerge Neuronen zu den betroffenen zählen (Gozes et al., Brain Res. Dev. 99:167–175 (1997)). In diesem Zusammenhang haben ApoE-defiziente Mäuse (vorausgehend beschrieben) eine verringerte Cholin-Acetyltransferase-Aktivität aufgewiesen (Gordon et al., Neurosci. Lett. 199:1–4 (1995) ; Gozes et al., J. Neurobiol. 33:329–342 (1997)), eine Behandlung mit L-NAP hat die cholinerge Funktion bis auf das Level der Kontrollgruppen signifikant verbessert (Bassan et al., J. Neurochem. 72:1283–1293 (1999)), während eine Behandlung mit L-SAL weniger wirksam war.
Zweimal täglich wurden Ratten (männliche Ratten des Wistar-Stamms, 300–350 g) Tests in einem Wasserlabyrinth mit einer versteckten Plattform unterzogen (Morris, J. Neurosci. Methods 11:47–60 (1984) und Gordon et al., J. Neurosci. Lett. 199:1–4 (1995) ; Gozes et al., J. Neurobiol. 33:329–342 (1997)). Beim ersten Test wurden die Plattform und das Tier täglich an einer neuen Stelle in Bezug auf den Swimmingpool (immobil) angeordnet und das Experiment wie folgt durchgeführt: zunächst wurde das Tier für 0,5 Minuten auf die Plattform gesetzt und anschließend in das Wasser. Dann wurde die Zeit gemessen (erster Test), die das Tier brauchte, um die Plattform zu erreichen (aufschlussreich für das Lernvermögen und ein intaktes Referenzgedächtnis). Nach 0,5 Minuten Verweilzeit auf der Plattform wurde das Tier zu einem zweiten zusätzlichen Test zurück ins Wasser versetzt (an die vorausgehende Stelle), um die versteckte Plattform wieder zu suchen (in der vorausgehenden Position beibehalten). Anschließend wurde die Zeit aufgezeichnet, die das Tier brauchte, um die Plattform beim zweiten Test zu erreichen (aufschlussreich für das Kurzzeitgedächtnis/"Arbeitsspeicher"). Alle Messungen wurden mit dem rechner- und videogestützten HVS-Wasserlabyrinthsystem (HVS Image Ltd. Hampton, UK) durchgeführt. Die Tiere wurden vier Tage lang getestet, um die Tiere mit zufälligen Gedächtnisausfällen auszusortieren. Den Ratten mit den besten Leistungen wurde eine intrazerebroventrikuläre Injektion mit einer Dosierung von 0,21 μl/min des Cholinotoxins Ethylcholinaziridinium verabreicht (AF64A, 3 nmoll2 μl/Seite), die Kontrollgruppe erhielt eine Injektion mit Salzlösung (Gozes et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:427–432 (1996)).
Die Tiere konnten sich dann ein Woche lang ausruhen; anschließend wurden ihnen täglich 3 Mikrogramm D-SAL+ 3 Mikrogramm D-NAP in 20 Mikroliter Salzlösung oral auf der Zunge verabreicht. Nach einer Woche mit oraler Verabreichung der Peptide wurden die Tiere täglich zwei Tests im Wasserlabyrinth (wie vorausgehend) unterzogen. Während des Testzeitraums wurden den Tieren eine Stunde vor den täglichen Tests Peptide oder Trägerstoffe (Carrier) oral verabreicht. Vorausgehend hatte sich gezeigt, dass die mit AF64A behandelten Tiere Lernschwierigkeiten und Gedächtnisausfälle im Morris-Wasserlabyrinthtest aufwiesen (Gozes et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:427–432 (1996)). Hier jedoch wiesen die mit AF64A behandelten Ratten, denen auch D-NAP + D-SAL oral verabreicht wurde, eine kürzere Latenzzeit zum Auffinden der versteckten Plattform auf, was auf ein verbessertes Referenzgedächtnis hinweist (14A, erster täglicher Test). Darüber hinaus wiesen dieselben Ratten ein verbessertes Kurzzeitgedächtnis beim zweiten täglichen Test auf (14B). Diese Daten weisen darauf hin, dass die orale Verabreichung von D-SAL und D-NAP bei den Tieren mit einer chemisch induzierten cholinergen Störung zu einer signifikanten Verbesserung der Lernfähigkeit und des Gedächtnisses geführt hat.
14C stellt die Auswirkung der oralen Verabreichung von D-SALLRSIPA allein auf das Lernvermögen und Gedächtnis bei mit dem Cholinotoxin AF-64A behandelten Ratten dar. Die Ratten wurden wie in Gozes et al., J. Pharmacol. Exp. Therap. 293:1091–1098 (2000) beschrieben mit dem Cholinotoxin AF-64A und D-SALLRSIPA behandelt, nur mit dem Unterschied, dass D-SALLRSIPA den mit AF64A behandelten Ratten wie folgt verabreicht wurde: 10 Mikrogramm D-SALLRSIPA (D-SAL) pro Ratte (250–300 g) am Tag in 50 Mikroliter Salzlösung mit einer Mikropipette unter der Zunge verabreicht. Die Peptide wurden eine Woche nach der Läsion durch AF64A einmal täglich drei Tage lang angewendet. Nach einer 2-tägigen Unterbrechung wurden die Peptide weitere 5 Tage einmal täglich angewendet und ab dem dritten Tag getestet. Nach einer weiteren 2-tägigen Unterbrechung wurden die Peptide erneut zwei Tage lang angewendet und die Tiere im Morris-Wasserlabyrinth getestet. Die Grafik zeigt die Ergebnisse des 5-tägigen Tests. Die Tiere wurden jeden Tag zwei aufeinander folgenden Tests unterzogen, die Ergebnisse entsprechen der Summe der beiden täglichen Tests und haben folgende Bedeutung (Einfaktorenvarianzanalyse mit Student-Neuman-Kuels-Mehrfachvergleich der Durchschnitte):
1. Tag: P<0,04 D-SALLRSIPA-AF64A vs. AF64A;
2. Tag: P<0,04 AF64A vs. Kontrollgruppe (Simulationsmodell), die Behandlung mit SALLRSIPA unterschied sich nicht auf signifikante Weise von der anderen mit AF64A behandelten Tieren bzw. der Kontrollgruppe, die eine gewisse Verbesserung nahe liegt;
3. Tag: kein Unterschied;
4. Tag: kein Unterschied; und
5. Tag: t-Test: P<0,04 D-SALLRSIPA-AF64A vs. AF64A.
Diese Ergebnisse legen nahe, dass D-SALLRSIPA (D-SAL) auch alleine wirksam ist.
4. Gedächtnisverbesserungen bei ApoE-defizienten Mäusen
Bei adulten ApoE-defizienten Mäusen wurden Gedächtnisausfälle und cholinerge Störungen beschrieben. Diese Defizite können mit den Zuständen verglichen werden, die bei Menschen anzutreffen sind, die hinsichtlich des Apolipoproteins E4 homozygot sind; dabei handelt es sich um einen Zustand, in dem die Patienten eher Opfer eines frühzeitigen Auftretens der Alzheimerschen Erkrankung sind, im Gegensatz zu Personen mit den Allelen E2 oder E3 (Gordon et al., Neurosci. Lett. 199:1–4 (1995)). Eine Woche nach dem Abbruch der Behandlung wurden die kognitiven Funktionen im Morris-Wasserlabyrinth beurteilt. Eine Woche nach dem Abbruch der zweiwöchigen täglichen Behandlung mit D-SAL-D-NAP, d. h. bei 21 Tage alten Mäusen, die einem 5-tägigen Trainingsprotokoll (15) unterzogen wurden, waren kognitive Funktionsverbesserungen festzustellen. Die Prozesse des Kurzzeitgedächtnisses wurden anhand der im Wasserlabyrinth erzielten Leistungen untersucht; dabei wurde die Zeit gemessen, die beim zweiten der zwei täglichen Tests zum Auffinden der versteckten Plattform erforderlich war. Die Anordnung der Plattform und der Ausgangspunkt, an dem das Tier ins Wasser gesetzt wurde, wurden jeweils bei beiden täglichen Tests beibehalten, die beiden Anordnungen wurden jedoch täglich geändert. Beim zweiten Test des ersten Testtages waren die ApoE-defizienten Mäuse in Bezug auf die Kontrollgruppe (P<0,04) deutlich langsamer und zeigten nach einer oralen Verabreichung von D-SAL+ D-NAP eine Verbesserung, wobei die meisten behandelten Tiere die Plattform nach einer Latenzzeit von ≤20 Sek. wieder fanden.
Die 16A und 16B stellen jeweils die Ergebnisse des Morris-Wasserlabyrinthtests bei Apolipoprotein-E-defizienten Mäusen beim ersten und zweiten Test dar. Die Experimente wurden nach Injektion einer Kombination aus D-NAP-D-SAL gemäß einem Injektionsprotokoll und mit einem wie in Gozes et al., J. Pharmacol. Exp. Therap. 293:1091–1098 (2000)) beschriebenen Morris-Wasserlabyrinth durchgeführt. Die Ergebnisse zeigten signifikante Verbesserungen am ersten und am zweiten Tag (erster Test am Tag und am dritten Tag zweiter Test am Tag) – P<0,05.
1/2A

Anzahl der neuronalen Zellen Peptid-Konzentrations-Log (M)

2B

E1066: Auswirkung von D-NA{L-P} auf SPF in mit TTX behandelten gemischten zerebralen Kortexkulturen Anzahl der neuronalen Zellen Peptid-Konzentrations-Log (M)

3A/3B

Anzahl der neuronalen Zellen Peptid-Konzentrations-Log (M)

4

OD 490 nm Kontrollgruppe Beta-Amyloid Beta-Amyloid+ D-SAL+ D-NAP

5

L-NAP+ D-SAL+ Alkohol D-SAL+ Alkohol D-SAL+ Alkohol D-NAP+ Alkohol Kontrollgruppe Alkohol % fetale Sterblichkeit

6A

Fetales Hirngewicht (Gramm)

6B

Fetalgewicht (Gramm)

7

N+S+A nach 3 Stunden N+S+A nach 1 Stunde Kontrollgruppe Alkohol % fetale Sterblichkeit

8

N+S+A nach 3 Stunden N+S+A nach 1 Stunde Kontrollgruppe Alkohol Fetales Hirngewicht (Gramm)

9

oral verabreichtes D-NAP + D-SAL + Alkohol Kontrollgruppe Alkohol % fetale Sterblichkeit

10A

Varianzanalyse, globales P = 0,02 oral verabreichtes L-NAP, L-SAL + Alkohol oral verabreichtes D-SAL + Alkohol oral verabreichtes D-NAP, D-SAL ohne Alkohol oral verabreichtes D-NAP, D-SAL + Alkohol oral verabreichtes D-NAP + Alkohol Kontrollgruppe Alkohol Hirngewicht von Neugeborenen (Gramm)

10B

Oral verabreichtes D-SAL, D-NAP+ D-SAL (40 oder 100μg) verhütet alkoholinduzierte fetale Sterblichkeit fetale Sterblichkeit

11

Vermeiden von Klippen AUSWERTUNG TAGE Kontrollgruppe + Salzlösung Kontrollgruppe + D-SAL + D-NAP ApoE + Salzlösung ApoE + D-SAL + D-NAP ApoE + D-SAL + D-NAP (orale Behandlung)

12

Negative Geotaxis Auswertung Tage Kontrollgruppe + Salzlösung Kontrollgruppe + D-SAL + D-NAP ApoE + Salzlösung ApoE + D-SAL + D-NAP ApoE + D-SAL + D-NAP (p/ orale Behandlung)

13

Positionieren im Raum

14A

Erster Test Latenzzeit (Sekunden) Tag

14B

Zweiter Test Latenzzeit (Sekunden) Tag

14C

Erster und zweiter Test im Wasser Latenzzeit Tage

15

Zweiter Test Latenzzeit Tage

Claims

Aktivitätsabhängiger neurotrophischer Faktor I -Polypeptid (ADNF I), bei dem das ADNF I-Polypeptid eine aktive Kernstelle mit folgender Aminosäurensequenz umfasst: Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala (SEQ ID NR: 1), bei dem die aktive Kernstelle mindestens eine D-Aminosäure umfasst.
ADNF I-Polypeptid nach Anspruch 1, bei dem entweder eine N-terminale Aminosäure oder eine C-terminale Aminosäure der aktiven Kernstelle eine D-Aminosäure ist.
ADNF I-Polypeptid nach Anspruch 1, bei dem sowohl die N-terminalen als auch die C-terminalen Aminosäuren der aktiven Kernstelle D-Aminosäuren sind.
ADNF I-Polypeptid nach Anspruch 1, bei dem die aktive Kernstelle alle D-Aminosäuren umfasst.
ADNF I-Polypeptid nach Anspruch 1, bei dem das ADNF I-Polypeptid Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala (SEQ ID NR: 1) ist.
ADNF I-Polypeptid nach Anspruch 5, bei dem das ADNF I-Polypeptid alle D-Aminosäuren umfasst.
ADNF I-Polypeptid nach Anspruch 1, bei dem das ADNF I-Polypeptid aus wie folgt zusammengesetzter Gruppe ausgewählt wird: Val-Leu-Gly-Gly-Gly-Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala (SEQ ID NR. 14); Val-Glu-Glu-Gly-Ile-Val-Leu-Gly-Gly-Gly-Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala (SEQ ID NR. 15); Leu-Gly-Gly-Gly-Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala (SEQ ID NR: 16); Gly-Gly-Gly-Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala (SEQ ID NR: 17); Gly-Gly-Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala (SEQ ID NR: 18); und Gly-Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala (SEQ ID NR: 19).
ADNF I-Polypeptid nach Anspruch 1, bei dem das ADNF I-Polypeptid bis zu 20 Aminosäuren an jedem eines N-Terminus und C-Terminus der aktiven Kernstelle umfasst.
ADNF I-Polypeptid nach Anspruch 8, bei dem sowohl N-terminale als auch C-terminale Aminosäuren des ADNF I-Polypeptids D-Aminosäuren sind.
Aktivitätsabhängiger neurotrophischer Faktor III-Polypeptid (ADNF III), bei dem das ADNF III-Polypeptid eine aktive Kernstelle mit folgender Aminosäurensequenz umfasst: Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln (SEQ ID NR: 2), bei dem die aktive Kernstelle mindestens eine D-Aminosäure umfasst.
ADNF III-Polypeptid nach Anspruch 10, bei dem entweder eine N-terminale oder eine C-terminale Aminosäure der aktiven Kernstelle eine D-Aminosäure ist.
ADNF III-Polypeptid nach Anspruch 10, bei dem sowohl die N-terminalen als auch die C-terminalen Aminosäuren der aktiven Kernstelle D-Aminosäuren sind.
ADNF III-Polypeptid nach Anspruch 10, bei dem die aktive Kernstelle alle D-Aminosäuren umfasst.
ADNF III-Polypeptid nach Anspruch 10, bei dem das ADNF III-Polypeptid Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln (SEQ ID NR:2) ist.
ADNF III-Polypeptid nach Anspruch 14, bei dem das ADNF III-Polypeptid alle D-Aminosäuren umfasst.
ADNF III-Polypeptid nach Anspruch 10, bei dem das ADNF III-Polypeptid aus wie folgt zusammengesetzter Gruppe ausgewählt wird: Gly-Gly-Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln (SEQ ID NR: 20); Leu-Gly-Gly-Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln-Gln-Ser (SEQ ID NR: 21); Leu-Gly-Leu-Gly-Gly-Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln-Gln-Ser (SEQ ID NR: 22); und Ser-Val-Arg-Leu-Gly-Leu-Gly-Gly-Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln-Gln-Ser (SEQ ID NR: 23).
ADNF III-Polypeptid nach Anspruch 10, bei dem das ADNF III-Polypeptid bis zu 20 Aminosäuren an jedem eines N-Terminus und C-Terminus der aktiven Kernstelle umfasst.
ADNF III-Polypeptid nach Anspruch 17, bei dem sowohl die N-terminalen als auch die C-terminalen Aminosäuren des ADNF III-Polypeptids D-Aminosäuren sind.
Pharmazeutische Zusammensetzung mit einem pharmazeutisch annehmbaren Trägerstoff und einem aktivitätsabhängiger neurotrophischer Faktor (ADNF)-Polypeptid, bei der das ADNF-Polypeptid aus wie folgt zusammengesetzter Gruppe ausgewählt wird: (a) ADNF I-Polypeptid mit einer aktiven Kernstelle, die folgende Aminosäurensequenz aufweist: Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala (SEQ ID NR: 1); (b) ADNF III-Polypeptid mit einer aktiven Kernstelle, die folgende Aminosäurensequenz aufweist: Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln (SEQ ID NR. 2); und (c) Mischung des ADNF I-Polypeptids aus Punkt (a) und des ADNF III-Polypeptids aus Punkt (b); bei der mindestens eins der ADNF I- und ADNF III-Polypeptide eine aktive Kernstelle mit mindestens einer D-Aminosäure umfasst.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 19, bei der das ADNF-Polypeptid ein ADNF I-Polypeptid ist und die aktive Kernstelle des ADNF I-Polypeptids mindestens eine D-Aminosäure umfasst.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 20, bei der sowohl die N-terminalen als auch die C-terminalen Aminosäuren der aktiven Kernstelle des ADNF I-Polypeptids D-Aminosäuren sind.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 20, bei der die aktive Kernstelle des ADNF I-Polypeptids alle D-Aminosäuren umfasst.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 20, bei der das ADNF I-Polypeptid Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala (SEQ ID NR: 1) ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 23, bei der das ADNF I-Polypeptid alle D-Aminosäuren umfasst.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 19, bei der das ADNF-Polypeptid ein ADNF III-Polypeptid ist und die aktive Kernstelle des ADNF III-Polypeptids mindestens eine D-Aminosäure umfasst.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 25, bei der sowohl die N-terminalen als auch die C-terminalen Aminosäuren der aktiven Kernstelle des ADNF III-Polypeptids D-Aminosäuren sind.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 25, bei der die aktive Kernstelle des ADNF III-Polypeptids alle D-Aminosäuren umfasst.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 25, bei der das ADNF III-Polypeptid Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln (SEQ ID NR: 2) ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 28, bei der das ADNF III-Polypeptid alle D-Aminosäuren umfasst.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 19, bei der das ADNF-Polypeptid eine Mischung eines ADNF I-Polypeptids aus Punkt (a) und eines ADNF III-Polypeptids aus Punkt (b) ist und mindestens eins der ADNF I und ADNF III-Polypeptide eine aktive Kernstelle mit mindestens einer D-Aminosäure umfasst.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 30, bei der sowohl die N-terminalen als auch die C-terminalen Aminosäuren der aktiven Kernstelle des ADNF I-Polypeptids D-Aminosäuren sind und sowohl die N-terminalen als auch die C-terminalen Aminosäuren der aktiven Kernstelle des ADNF III-Polypeptids D-Aminosäuren sind.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 30, bei der die aktive Kernstelle des ADNF I-Polypeptids alle D-Aminosäuren umfasst und die aktive Kernstelle des ADNF III-Polypeptids alle D-Aminosäuren umfasst.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 30, bei der das ADNF I-Polypeptid Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala (SEQ ID NR1) ist und das ADNF III-Polypeptid Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln (SEQ ID NR: 2) ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 33, bei der das ADNF I-Polypeptid alle D-Aminosäuren umfasst und das ADNF III-Polypeptid alle D-Aminosäuren umfasst.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 30, bei der das ADNF I-Polypeptid alle D-Aminosäuren umfasst und das ADNF III-Polypeptid alle L-Aminosäuren umfasst.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 30, bei der das ADNF I-Polypeptid alle L-Aminosäuren umfasst und das ADNF III-Polypeptid alle D-Aminosäuren umfasst.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 19, wobei die Zusammensetzung für eine intranasale, intraperitoneale, subkutane, sublinguale, intravenöse, orale bzw. für eine Verabreichung über eine Sonde zubereitet wird.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 19, 22, 27 oder 32, wobei die Zusammensetzung für eine orale Verabreichung zubereitet wird.
Pharmazeutische Zusammensetzung, insbesondere wie durch mindestens einen der Ansprüche 19 bis 38 definiert, zur Anwendung als Medikament bei einer Behandlung zur Reduzierung neuronalen Zelltods, die das Inkontaktbringen der Nervenzellen mit einem aktivitätsabhängiger neurotrophischer Faktor (ADNF) Polypeptid in ausreichender Menge einschließt, um neuronalen Zelltod zu verhindern, bei der das ADNF-Polypeptid aus wie folgt zusammengesetzter Gruppe ausgewählt wird: (a) ADNF I-Polypeptid mit einer aktiven Kernstelle, die folgende Aminosäurensequenz aufweist: Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala (SEQ ID NR: 1); (b) ADNF III-Polypeptid mit folgender Aminosäurensequenz: Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln (SEQ ID NR: 2); und (c) Mischung des ADNF I-Polypeptids aus Punkt (a) und des ADNF III-Polypeptids aus Punkt (b); bei der mindestens eins der ADNF I- und ADNF III-Polypeptide eine aktive Kernstelle mit mindestens einer D-Aminosäure umfasst.
Pharmazeutische Zusammensetzung zur Anwendung als Medikament bei einer Behandlung nach Anspruch 39, wobei die Nervenzellen aus der aus Rückenmark-, Hippokampus-, Großhirnrinden- und cholinergischen Nervenzellen bestehenden Gruppe ausgewählt werden.
Pharmazeutische Zusammensetzung zur Anwendung als Medikament bei einer Behandlung nach Anspruch 39, wobei der neuronale Zelltod bei einem mit Immundefizienz hervorrufenden Virus infizierten Patienten auftritt, insbesondere wenn das Immundefizienz hervorrufende Virus das HIV-Virus ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung zur Anwendung als Medikament bei einer Behandlung nach Anspruch 39, wobei der neuronale Zelltod mit einer Exzitotoxizität in Verbindung steht, die durch die Stimulation mit N-Methyl-D-Aspartat induziert wird.
Pharmazeutische Zusammensetzung zur Anwendung als Medikament bei einer Behandlung nach Anspruch 39, wobei der neuronale Zelltod bei einem unter Alzheimer leidenden Patienten durch das Beta-Amyloid-Peptid induziert wird.
Pharmazeutische Zusammensetzung zur Anwendung als Medikament bei einer Behandlung nach Anspruch 39, wobei der neuronale Zelltod bei einem unter Alzheimer leidenden Patienten durch cholinergische Blockade induziert wird und diese zu Lernschwierigkeiten führt.
Pharmazeutische Zusammensetzung, insbesondere wie durch mindestens einen der Ansprüche 19 bis 38 definiert, zur Anwendung als Medikament bei einer Behandlung oxidativen Stresses bei einem Patienten, die das Verabreichen eines aktivitätsabhängiger neurotrophischer Faktor (ADNF)-Polypeptids in ausreichender Menge umfasst, um oxidativen Stress zu reduzieren, bei der das ADNF-Polypeptid aus wie folgt zusammengesetzter Gruppe ausgewählt wird: (a) ADNF I-Polypeptid mit einer aktiven Kernstelle, die folgende Aminosäurensequenz aufweist: Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala (SEQ ID NR: 1); (b) ADNF III-Polypeptid mit folgender Aminosäurensequenz: Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln (SEQ ID NR: 2); und (c) Mischung des ADNF I-Polypeptids aus Punkt (a) und des ADNF III-Polypeptids aus Punkt (b); bei der mindestens eins der ADNF I- und ADNF III-Polypeptide eine aktive Kernstelle mit mindestens einer D-Aminosäure umfasst.
Pharmazeutische Zusammensetzung, insbesondere wie durch mindestens einen der Ansprüche 19 bis 38 definiert, zur Anwendung als Medikament bei einer Behandlung eines mit dem fetalen Alkoholsyndrom assoziierten Zustands bei einem Subjekt, das in utero Alkohol ausgesetzt ist, wobei die Behandlung das Verabreichen eines aktivitätsabhängiger neurotrophischer Faktor (ADNF)-Polypeptids an das Subjekt in ausreichender Menge umfasst, um den mit dem fetalen Alkoholsyndrom assoziierten Zustand zu reduzieren, wobei das ADNF-Polypeptid aus wie folgt zusammengesetzter Gruppe ausgewählt wird: (a) ADNF I-Polypeptid mit einer aktiven Kernstelle, die folgende Aminosäurensequenz aufweist: Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala (SEQ ID NR: 1); (b) ADNF III-Polypeptid mit folgender Aminosäurensequenz: Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln (SEQ ID NR: 2); und (c) Mischung des ADNF I-Polypeptids aus Punkt (a) und des ADNF III-Polypeptids aus Punkt (b); bei der mindestens eins der ADNF I- und ADNF III-Polypeptide eine aktive Kernstelle mit mindestens einer D-Aminosäure umfasst.
Pharmazeutische Zusammensetzung zur Anwendung als Medikament bei einer Behandlung nach Anspruch 46, bei der der Zustand aus wie folgt zusammengesetzter Gruppe ausgewählt wird: verringertes Körpergewicht eines Subjekts, verringertes Gewicht des Gehirns des Subjekts, ein verringertes VIP mRNA-Level eines Subjekts und Tod eines Subjekts in utero.
Anwendung der pharmazeutischen Zusammensetzung, insbesondere wie durch mindestens einen der Ansprüche 19 bis 38 definiert, zur Herstellung eines Medikaments zur Reduzierung neuronalen Zelltods nach mindestens einem der Ansprüche 39 bis 44.
Anwendung der pharmazeutischen Zusammensetzung, insbesondere wie durch mindestens einen der Ansprüche 19 bis 38 definiert, zur Herstellung eines Medikaments für die Behandlung oxidativen Stresses bei einem Patienten nach Anspruch 45.
Anwendung der pharmazeutischen Zusammensetzung, insbesondere wie durch mindestens einen der Ansprüche 19 bis 38 definiert, zur Herstellung eines Medikaments zur Reduzierung eines mit dem fetalen Alkoholsyndrom assoziierten Zustands bei einem in utero Alkohol ausgesetzten Subjekt nach mindestens einem der Ansprüche 46 bis 47.