DE69737293T2 - Nukleotidsequenz, die für eine flavinmonooxygenase kodiert, das korrespondierende protein, sowie deren verwendungen in diagnostik und therapie - Google Patents

Nukleotidsequenz, die für eine flavinmonooxygenase kodiert, das korrespondierende protein, sowie deren verwendungen in diagnostik und therapie Download PDF

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft eine mutierte humane Flavin-Monooxygenase 2 (hFMO2), als auch ihre Nukleotid- und Polypeptidsequenzen. Die vorliegende Erfindung betrifft auch Klonierungs- und/oder Expressionsvektoren, die die Nukleotidsequenzen enthalten, und durch diese Vektoren transformierte Zellen als auch Verfahren zur Herstellung der Polypeptide. Die Erfindung umfasst zudem Verfahren zur Selektion von Zusammensetzungen und zur Diagnostik der Prädisposition für Pathologien und/oder Mängel, die mit diesem mutierten humanem FMO2 assoziiert sind, als auch pharmazeutische Zusammensetzungen, die die vorgesehenen Verbindungen enthalten, zur Behandlung und/oder Verhinderung dieser Pathologien.
  • Die Flavinmonooxygenasen (FMOs) (Lawton et al., 1994) bilden eine Familie von mikrosomalen Enzymen, die die NADPH-abhängige Oxidation einer Vielzahl organischer exogener Verbindungen (Xenobiotika) katalysieren, die ein nukleophiles Heteroatom, wie im Besonderen das Stickstoff-, Schwefel-, Phosphor oder Selenatom, enthalten (Ziegler, D.M., 1988; Ziegler, D.M., 1993), wobei es sich um Medikamente, Pestizide oder andere potentiell toxische Substanzen handelt. Das Cystamin ist das einzige endogene Substrat von FMOs, das derzeit bekannt ist.
  • Die FMOs stellen eine mulitgene Familie dar. Die Expression verschiedener FMO-Formen ist abhängig von der Art des Gewebes und der betrachteten Spezies.
  • Die FMOs sind lokalisiert worden in verschiedenen Gewebetypen, im Besonderen in der Leber, den Lungen und den Nieren.
  • Bisher sind fünf Isoformen von FMOs identifiziert worden in der Referenzspezies, dem Kaninchen. Ihre Homologie ist 50–60 %. Es ist ebenfalls das Dokument Yueh al. zu zitieren. (AC W59453, EMBL Datenbank, Heidelberg) das die Sequenz des FMO2-Proteins von Makak beschreibt.
  • Vier Isoformen, FMO1, FMO3, FMO4 und FMO5, sind für Menschen identifiziert worden (GeneBank-Sequenzen M64082, M83772, Z11737 bzw. L37080). Unter den Säugerspezies ist die Homologie zwischen orthologen FMO über 80%. Das Vorliegen eines FMO, neben anderen Isoformen, kann für Menschen vernünftigerweise postuliert werden.
  • Die FMOs sind assoziiert mit dem endoplasmatischen Retikulum und sind impliziert in der Entgiftung von xenobiotischen Verbindungen, wobei es die Monooxygenierung erlaubt das Xenobiotikum in eine polarere Substanz überzuführen, ein vorausgehender Schritt vor seiner Ausscheidung. Sie können gleichermaßen impliziert sein in der metabolischen Aktivierung verschiedener toxischer Verbindungen und/oder Kanzerogenen, die in der Umwelt vorliegen.
  • Der Mechanismus der Reaktion von FMO ist detailliert beschrieben worden (Poulsen, L.L. et al., 1995). Im Gegensatz zu allen anderen bekannten Oxidasen oder Monooxigenasen haben FMOs die einzigartige Eigenschaft ein stabiles intermediäres Enzym zu bilden, 4α-Hydroperoxyflavin, das NADP(H)- und Sauerstoffabhängig ist, in der Abwesenheit eines oxidierbaren Substrats. Da die Energie der Katalyse in dem FMO-Enzym bereits vor dem Kontakt mit seinem potentiellen Substrat vorliegt, muss die völlige Übereinstimmung nicht so genau sein wie für andere Enzymtypen. Diese spezifische Charakteristik von FMO ist verantwortlich für die große Vielzahl von Substraten, die von den FMOs akzeptiert werden (einschließlich zum Beispiel die tertiären und sekundären Alkyl- und Arylamine, zahlreiche Hydrazine, Thiocarbamide, Thioamide, Sulfide, Disulfide, Thiole).
  • Zahlreiche Moleküle, aktive Verbindungen bzw. Wirkstoffe von Medikamenten, sind als Substrate von FMOs bekannt, entweder für eine N-Oxidation oder eine S-Oxidation (Gasser 1996), unter welchen man insbesondere Antidepressiva, Antipsychotika, Mittel gegen Geschwüre, Vasodilatatoren und blutdrucksenkende Mittel findet.
  • Obwohl bestimmte Substrate von FMO zu weniger aktiven Derivaten oxidiert werden, können zahlreiche nukleophile Verbindungen metabolisiert werden zu Zwischenprodukten, die reaktiver und/oder potentiell toxischer sein können; anstatt ausgeschieden zu werden, könnten solche Produkte toxische Reaktionen induzieren durch kovalente Fixierung an zelluläre Makromoleküle oder durch andere Mechanismen. Zum Beispiel können die Mercaptopyrimidine und die Thiocarbamide vorwiegend aktiviert werden durch eine FMO-Aktivität (Hines et al., 1994). Genauer gesagt, ist gezeigt worden, dass die Nephrotoxizität, die mit der Konjugation von Glutathion an Acrolein assoziiert ist, auf seinem Metabolismus beruht, der durch das renale FMO vermittelt wird; das FMO bildet ein S-Oxid, das danach freigesetzt wird, durch Eliminierungsreaktion, die im basischen Milieu katalysiert wird, unter Bildung von cytotoxischem Acrolein (Park, S.B. et al., 1992). So können die FMOs ebenfalls eine wichtige Rolle spielen in den ersten Schritten der chemischen Toxizität als auch der Entoxifizierung von xenobiotischen Verbindungen.
  • Wie hier nachfolgend beschrieben, enthält eine große Anzahl von Medikamenten, die heute in der klinischen Untersuchungsphase ist oder in großem Ausmaß verschrieben wird, Funktionen mit nukleophiler Charakteristik des Stickstoff-, Schwefel-, Phosphor-Typs oder anderer Typen. Die Rolle von FMO in dem Oxidationsmechanismus von Medikamenten und endogenen chemischen Verbindungen beim Menschen ist dennoch kaum bekannt.
  • Cashman et al. (1996) haben kürzlich die Beiträge von FMO-Enzymen zum physiologischen Mechanismus des Cimetidins und des S-Nikotins in vivo untersucht. Der größte Teil ihrer Ergebnisse bestätigt die Tatsache, dass die FMO3-Aktivität der Leber eines Erwachsenen verantwortlich ist für die Oxidation des Cimetidins und des S-Nikotins, wobei diese Oxidation stereospezifisch ist. Die Autoren zeigten außerdem, dass die Stereochemie der Hauptmetaboliten des Cimetidins und des S-Nikotins für kleine Versuchstiere verschieden von denen sind, die für Menschen beobachtet werden und legten nahe, dass verschiedene Isoformen von FMOs entsprechend den Spezies vorherrschen könnten, wobei dies wichtige Konsequenzen haben könnte bei der Auswahl der Versuchstiere für die Ausarbeitungsprogramme und Entwicklungen von Medikamenten für den Menschen.
  • Es ist bekannt, dass das FMO1 bei Menschen in den Nieren, jedoch nicht in der Leber exprimiert wird. Das FMO2 wird vorherrschend in den Lungen aller getesteten Säugerspezies exprimiert. Das FMO3 ist isoliert worden aus Mensch aus der Leber, wo es bei Erwachsenen überwiegend vorliegt. Das FMO3 ist die hauptsächliche Isoform, die bei der Sulfoxidierung des Methionins und bei der stereospezifischen Oxidation des Cimetidins und des S-Nikotins beteiligt ist. Das FMO3 zeigt eine Spezifität für sein Substrat, die viel größer ist als die des FMO1, das in der Leber in den meisten der untersuchten Tierspezies gefunden wird. Das FMO4 ist eine weniger häufige Isoform, von welcher die Funktion und die Substratspezifität wenig bekannt sind. Es liegt in der humanen Leber vor und wird auch exprimiert im Gehirn, wo es beteiligt sein könnte bei der Oxidation von Antidepressiva wie Imipramin. Das FMO5 wird in der humanen Leber in einem geringeren Ausmaß Weise exprimiert als FMO3. Sein offensichtlicher Effizienzmangel als Enzym, das beteiligt ist am Metabolismus von Medikamenten, legt nahe, dass es beteiligt sein könnte in einer physiologischen Funktion.
  • Die verschiedenen Expressionsprofile von FMO-Isoformen in den Geweben und/oder Spezies bilden folglich möglicherweise einen signifikanten Faktor, der zu Unterschieden von Aktivitäten von FMO beiträgt, die zwischen den Geweben und/oder zwischen Spezies beobachtet werden. So könnte die Vielzahl der Formen von FMO seinen signifikanten Einfluss auf die unterschiedliche Reaktion der Gewebe und/oder Spezies auf die Exposition an eine xenobiotische Verbindungen haben. Tatsächlich beruhen die beobachteten Unterschiede zwischen den Geweben und/oder Spezies in der Reaktion auf xenobiotische Verbindungen und ihrer Toxizität zu einem wichtigen Teil auf Variationen der Aktivität und Spezifität, die impliziert sind im Metabolismus dieser Substrate durch die FMOs. Genetische Faktoren und Gewebespezifität in der Expression der FMOs sind wichtige Faktoren dieser Variationen.
  • Bezüglich der genetischen Faktoren ist zum Beispiel beschrieben worden, dass die Trimethylaminurie, eine Pathologie, die bei 1 % der weißen Briten vorliegt, und die sich manifestiert durch einen starken Geruch nach verdorbenem Fisch in der ausgeatmeten Luft, dem Schweiß oder dem Urin, auf einer Defizienz genetischen Ursprungs der Funktion eines hepatischen FMO beruht.
  • Aus vorstehend genannten Gründen besteht daher heute ein wichtiger Bedarf zum Identifizieren neuer Isoformen von FMO als auch der genetischen Polymorphismen, die eventuell damit verbunden sind, die Spezifitäten betreffend ihrer Substrate und/oder ihres Gewebeexpressionsprofils zeigen, die impliziert sein könnten im Metabolismus von Xenobiotika, als auch dem Metabolismus von Medikamenten oder exogenen Substanzen, die in der Umwelt vorliegen, wie z.B. die Pestizide, oder außerdem die beteiligt sein könnten an einer physiologischen Funktion. Dies ist genau der Gegenstand der vorliegenden Erfindung.
  • Mehrere Gene der Familie der humanen FMOs sind lokalisiert worden in der Region 1g23-25 des Chromosoms 1 durch in situ-Hybridisierung des Chromosoms in der Metaphase.
  • Wenn eine solche Kandidatenregion definiert worden ist, ist es erforderlich Zugriff auf das Fragment des Genoms zu haben, das das Intervall abdeckt wo sich das(die) gesuchte(n) Gen(e) befinden. Dieser Schritt erfolgt durch die Etablierung einer physischen Karte, nämlich die Gewinnung der Region durch mehrere klonierte und geordnete Fragmente. Heute sind dank der Daten integrierten CEPH/Généthon-Karte des humanen Genoms ungefähr 80 % des Genoms durch YAC-Klone abgedeckt, subkloniert in BACS, wobei die Lokalisierung auf den Chromosomen durch den Zwischenraum von polymorphen und geordneten genetischen Markern erfolgt (Chumakov et al., 1995). Diese physiko-genetische Karte erlaubt einen beachtlichen Zeitgewinn, insbesondere durch die Verwendung von umfangreicher Sequenzierung der interessierenden Regionen.
  • So ist gemäß der vorliegenden Erfindung nach Lokalisierung des BAC 123H04M auf dem genetischen Lokus 1q24-25, der zuvor angegeben wurde, etabliert worden, dass die Insertion, die es trägt, die Abschnitte 3' von hFMO3 und 5' von hFMO1 sowie die vollständige Sequenz von hFMO2, und die eines anderen neuen Genmitglieds der FMO-Familie, dem hFMOx, enthält.
  • Darüber hinaus kann man dank der Verwendung der Banken mit den 5'-Markierungen die Expression von Kandidatengenen, wie zuvor identifiziert, verifizieren: Die Identifizierung einer Markierung, die an eine der Kandidatensequenzen hybridisiert, zeigt, nachdem diese aus einer cDNA-Bank stammt ist, das Vorliegen von mRNA und folglich einer Expression der fraglichen Sequenzen in den betrachteten Geweben.
  • Die vorliegende Erfindung beschreibt insbesondere ein isoliertes Polynukleotid dessen Sequenz SEQ ID Nr. 1 teilweise in 2 dargestellt ist und das codiert für ein Polypeptid mit der Sequenz SEQ ID Nr. 3, die in 1 dargestellt ist.
  • Die vorliegende Erfindung beschreibt auch ein isoliertes Polynukleotid dessen Sequenz SEQ ID Nr. 4 teilweise in 10 dargestellt ist und das codiert für ein Polypeptid mit der Sequenz SEQ ID Nr. 6.
  • Diese beiden Nukleotidsequenzen sind diejenigen von zwei Genen, die für neue Enzyme der Familie der humanen Flavin-Monooxygenasen (FMO), hFMO2 bzw. hFMOx, codieren. Dieses ist festgestellt worden durch Vergleich der identifizierten Sequenzen mit bereits bekannten Sequenzen von FMO: sehr starke strukturelle Homologien zwischen den beiden untersuchten Sequenzen und denen von FMOs, sehr starke Homologien zwischen der ersten Sequenz und den bekannten von FMO2, insbesondere die vom Makaken (FMO2 des Makaken: GeneBank Sequenz U59453), gleichwie eine nicht ausreichende Homologie der zweiten Sequenz mit jeder der bereits für den Menschen veröffentlichten haben eine Schlussfolgerung erlaubt.
  • Die bereits bekannte Exon-Struktur der Gene der FMO-Familie ist vollständig konserviert in der hFMO2-Nukleotidsequenz gemäß der Erfindung. Die Sequenzen von jedem der 9 Exons des Polynukleotids gemäß der Erfindung (3) zeigen Homologiegrade, von 95 % bis 98 % in DNA mit der entsprechenden mRNA-Sequenz des Makaken-FMO2 (4). Die Unterschiede zwischen den beiden Nukleotidsequenzen, gleichwie ihre Bedeutung gegenüber der Peptidsequenz, sind in 5 angegeben. Die Polynukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 gemäß der Erfindung codiert für ein Polypeptid mit der Sequenz SEQ ID Nr. 3 mit 535 Aminosäuren (1); die Sequenz SEQ ID Nr. 2 der vorhergesagten mRNA, gleichwie die Polypeptidsequenz des humanen Proteins, sind zu 97 % homolog mit denen des FMO2 des Makaken (6 und 7), was es erlaubte das Polypeptid gemäß der Erfindung als das humane FMO2 zu identifizieren. Das Polypeptid mit der Sequenz SEQ ID Nr. 3, das in 3 dargestellt ist, stellt gleichfalls einen hohen Homologiegrad mit anderen Flavinmonooxygenasen 2 der Säuger dar; seine Homologiegrade mit anderen Proteinen der Familie der Flavinmonooxygenasen sind weniger stark.
  • Wie zuvor angeführt, hat das Fehlen einer ausreichenden Homologie zwischen den Sequenzen, die hFMOx entsprechen – genomische Sensequenz (SEQ ID Nr. 4), mRNA-Sequenz (SEQ ID Nr. 5) und Peptidaequenz (SEQ ID Nr. 6) – und den Sequenzen der bekannten FMOs es erlaubt zu schlussfolgern, dass es sich um eine neue Isoform von FMO handelt.
  • Die vorliegende Erfindung beschreibt folglich die DNA- oder RNA-Sequenzen, wobei die DNA genomische, komplementäre oder synthetische DNA sein kann, von FMOs, insbesondere von hFMO2 und hFMOx, als auch entsprechender Proteine.
  • Die vorliegende Erfindung beschreibt außerdem Klonierungsvektoren und/oder Expressionsvektoren, die die Nukleotidsequenzen enthalten, durch diese Vektoren transformierte Zellen oder Tiere, die die Zellen enthalten, als auch Verfahren zur Herstellung der Polypeptide in der Form rekombinanter Polypeptide.
  • Die Erfindung beschreibt auch Selektionsverfahren für eine Verbindungen, die in der Lage zum Modulieren der FMO-Aktivität ist.
  • Die Erfindung beschreibt auch Diagnoseverfahren einer Prädisposition für Störungen, die auf mit FMO assoziiert sind, als auch pharmazeutische Zusammensetzungen, die zur Behandlung und/oder Verhinderung solcher Störungen vorgesehen sind.
  • Ein erstes Beispiel solcher Störungen könnte das Weitwinkelprimärglaukom (GPAO). Allerdings haben Sunden et al. (1996), wie auch die Erfinder (Belmunden et al., 1996), einen Zusammenhang zwischen der Chromosomenregion GLC1A, die unter anderen Gensequenzen diejenigen trägt, die von der Familie der FMOs bekannt sind, in 1q23-25, und dem plötzlichen Auftreten von juvenilem GPAO (GPAO-J) identifiziert. Andererseits ist eine mögliche Rolle der Monooxygenasen in der Ethiologie des Glaukoms vorher nahegelegt worden (Schwartzman et al. 1987). Tatsächlich trugen die Metaboliten der Oxidationsreaktionen unter Inhibierung der Aktivität von Na+-, K+-ATPase in der Hornhaut zur Steuerung der Transparenz der Hornhaut und der humoralen Augensekretion bei; folglich sind eine Opazität der Hornhaut und eine Augenüberdruck die beiden Hauptkriterien der Glaukomdiagnose.
  • So ist eine heterozygote Stelle, die eine Segregation in genotypischem Zusammenhang in einer Familie zeigt, die auf Grund ihrer zahlreichen von GPAO- J betroffenen Mitglieder untersucht worden ist, in dem Exon 8 des Polypeptids hFMO2 gemäß der Erfindung durch die Erfinder identifiziert worden.
  • Unter Verfolgung der Untersuchung der Polymorphismen, die in den geeignet ausgewählten Populationen vorliegen, und gelegen sind in den Sequenzen, die denjenigen entsprechen, die von der Insertion von BAC 123H04M getragen werden, oder allgemeiner durch die FMO-Sequenzen, kann man insbesondere die Mutationen identifizieren, die assoziiert sind mit Pathologien oder Störungen, die auf einer FMO-Veränderung beruhen.
  • Die verschiedenen Isoformen der FMOs scheinen sich weniger durch die Gewebespezifität ihrer Expression als durch ihre Substrate, von welchen sie die Transformation katalysieren, zu unterscheiden. Wie zuvor angegeben, ist die Expression der FMOs in der Leber, den Lungen, den Nieren oder dem Gehirn nachgewiesen worden.
  • Die pathogene Wirkung eines funktionellen Mangels einer FMO könnte aus einer verringerten Kapazität der Gewebe resultieren, wo sie sich ausdrückt oxidativer Belastung zu widerstehen.
  • Allgemeiner ausgedrückt, könnten die FMOs durch ihre Rolle im oxidativen Metabolismus und ihrer Enttoxifizierungsfunktion beteiligt sein an der gesamten degenerativen oder toxischen Pathologie, erwiesenermaßen oder noch zu beweisen, insbesondere denjenigen, wo ein programmierter Zelltod nachgewiesen werden kann und den degenerativen Erkrankungen des zentralen Nervensystems.
  • Allgemein ausgedrückt, sind die Pathologien, die mit der Funktion von FMOs assoziiert sind, zusammengefasst unter dem Ausdruck "mit FMO assoziierte Störungen".
  • Unter den mit FMO assoziierten Störungen kann man zum Beispiel, ohne sich darauf zu begrenzen, die Folgenden nennen:
    • – Oxidation von Medikamenten, Substrate von FMO, zu weniger aktiven Derivaten, womit eine Verschlechterung der Wirksamkeit des Medikaments in Verbindung steht;
    • – Nicht-Metabolisierung von Medikamenten, die in der Form von Metaboliten aktiv sind, unter Verlust der Wirksamkeit des Medikaments;
    • – Nicht-Metabolisierung von toxischen und/oder kanzerogenen Xenobiotika von exogenen Substanzen, die natürlich in der Nahrung vorliegen, wie etwa pflanzliche Alkaloide, oder toxischen Substanzen, die in der Umwelt vorkommen, wie etwa die Pestizide oder Herbizide;
    • – Metabolisierung von Medikamenten zu Zwischenprodukten, die reaktiver sein könnten, mit der Folge einer Überdosierung mit einer möglichen Nebenwirkung;
    • – Metabolisierung von Xenobiotika, von Medikamenten oder anderen exogenen Substanzen, zu Zwischenprodukten, die potentiell toxisch sein könnten; und oder
    • – Veränderung der physiologischen Funktion, an welcher FMO beteiligt ist; im Besonderen die Veränderung der Funktion von FMO, die beteiligt sein könnte in der Glaukom-Symptologie.
  • Unter „FMO" wird man die Bezeichnung eines beliebigen der bekannten humanen FMOs, FMO1, FMO3, FMO4 und FMO5, oder neu in der Patentanmeldung beschriebenen, nämlich FMO2 oder FMOx, verstehen.
  • Bestimmte dieser Störungen können eine multigenen Ursprung haben, jedoch vor allem tragen die Modifikationen eines oder mehrerer FMOs zum Fortbestehen einer Störung oder deren Verschlimmerung bei.
  • Die Nukleotidsequenzen
  • Die vorliegende Erfindung betrifft vorallem eine isolierte Nukleotidsequenz, die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie für die humane Variante des Proteins FMO2 der Sequenz SEQ ID Nr. 3 codiert, die einen Lysinrest anstelle eines Glutaminsäurerests in Position 402 der Sequenz SEQ ID Nr. 3 aufweist.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft gleichermaßen eine isolierte Nukleotidsequenz gemäß der Erfindung, dadurch gekennzeichnet, dass sie für die Variante des humanen Proteins FMO2 der Sequenz SEQ ID Nr. 3 codiert, die einen Lysinrest anstelle eines Glutaminsäurerests in Position 402 der Sequenz SEQ ID Nr. 3 aufweist und dass sie eine Sequenz umfasst, ausgewählt aus:
    • a) der Nukleotidsequenz von dem Nukleotid in Position 2001 bis zu dem Nukleotid in Position 2056 der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1,
    • b) der Nukleotidsequenz von dem Nukleotid in Position 2405 bis zu dem Nukleotid in Position 2542 der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1,
    • c) der Nukleotidsequenz von dem Nukleotid in Position 10026 bis zu dem Nukleotid in Position 10214 der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1,
    • d) der Nukleotidsequenz von dem Nukleotid in Position 13341 bis zu dem Nukleotid in Position 13503 der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1,
    • e) der Nukleotidsequenz von dem Nukleotid in Position 16036 bis zu dem Nukleotid in Position 16178 der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1,
    • f) der Nukleotidsequenz von dem Nukleotid in Position 20558 bis zu dem Nukleotid in Position 20757 der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1,
    • g) der Nukleotidsequenz von dem Nukleotid in Position 21972 bis zu dem Nukleotid in Position 22327 der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1,
    • h) der Nukleotidsequenz von dem Nukleotid in Position 24411 bis zu dem Nukleotid in Position 24483 der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1, in welcher das Nukleotid in Position 24431 der SEQ ID Nr. 1 ein Adenosin anstelle eines Guanins ist,
    • i) der Nukleotidsequenz von dem Nukleotid in Position 25487 bis zu dem Nukleotid in Position 25899 der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1,
    • j) der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1, in welcher das Nukleotid in Position 24431 ein Adenosin anstelle eines Guanins ist, und
    • k) der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 2 in welcher das Nukleotid in Position 1266 ein Adenosin anstelle eines Guanins ist.
  • Die Erfindung umfasst darüber hinaus eine isolierte Nukleotidsequenz, die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie ausgewählt ist aus den Sequenzen, die für ein Polypeptid codieren, umfassend das Polypeptid der Sequenz SEQ ID Nr. 3, das einen Lysinrest anstelle eines Glutaminsäurerests in Position 402 aufweist, oder komplementär ist zu einer Sequenz gemäß der vorliegenden Erfindung.
  • Es ist festzuhalten, dass die vorliegende Erfindung nicht die genomischen Nukleotidsequenzen in ihrer natürlichen Chromosomenumgebung betrifft, d.h. im natürlichen Zustand, es handelt sich um Sequenzen, die isoliert worden sind, d.h., dass sie direkt oder indirekt entnommen worden sind, zum Beispiel durch Kopieren (cDNA), wobei ihre Umgebung zumindest teilweise modifiziert worden ist.
  • So kann es sich ebensogut um cDNA handeln als auch um genomische DNA, die teilweise modifiziert ist oder von Sequenzen getragen wird, die mindestens teilweise verschieden sind von den Sequenzen, die sie natürlich tragen.
  • Diese Sequenzen können ebenfalls als „nicht-natürlich" bezeichnet werden.
  • Unter „Nukleotidsequenz" versteht man ein Fragment einer isolierten natürlichen oder synthetischen DNA und/oder RNA, die eine präzise Aneinanderreihung von Nukleotiden beschreibt, modifiziert oder nicht, womit es möglich ist ein Fragment, ein Segment oder eine Region einer Nukleinsäure zu definieren.
  • Unter „Allelen" versteht man die Bezeichnung der natürlichen mutierten Sequenzen, entsprechend den Polymorphismen, die im Menschen vorliegen können, und insbesondere diejenigen, die zur Entwicklung von Störungen, die mit FMO assoziiert sind, führen können.
  • Unter „Proteinvariante" versteht man die Bezeichnung der Gesamtheit der mutierten Proteine, die im Menschen vorliegen können, die insbesondere Verkürzungen, Substitutionen, Deletionen und/oder Additionen von Aminosäureresten entsprechen, als auch künstliche Varianten, die gleichermaßen „Proteinvarianten" genannt werden. Im vorliegenden Fall sind die Varianten zum Teil mit dem Auftreten von Störungen assoziiert, die mit FMO assoziiert sind.
  • Gemäß der Erfindung können die Fragmente der Nukleotidsequenzen insbesondere für Domänen des Proteins codieren oder auch als Sonde oder Primer in Verfahren zum Nachweis oder zur Identifizierung oder Amplifizierung verwendet werden. Diese Fragmente haben eine Länge von mindestens 10 Basen und man bevorzugt Fragmente mit 20 Basen, bevorzugt 30 Basen.
  • Gemäß der Erfindung ist die Homologie statistisch einzigartig, sie zeigt, dass die Sequenzen minimal 80 % und vorzugsweise 90 % gemeinsame Nukleotide aufweisen.
  • Die 1 zeigt die Sequenz SEQ ID Nr. 3, die 2 zeigt teilweise die Sequenz SEQ ID Nr. 1 von FMO2, die 10 zeigt teilweise die Sequenz SEQ ID Nr. 4 von FMOx, so wie sie sequenziert worden sind im Genom eines Individuums, das keine erkennbaren FMO-Störungen zeigt.
  • Die Struktur des Gens von hFMO2 ist in der 3 identifiziert.
  • Die Sequenz SEQ ID Nr. 4 von FMOx ist teilweise in 10 dargestellt.
  • Die Erfindung beschreibt ebenfalls Fragmente dieser Sequenzen, im Speziellen Sequenzen, die für Polypeptide codieren, die das Gesamte oder einen Teil der Aktivität des FMO-Proteins beibehalten haben.
  • Bestimmte dieser Sequenzen können identifiziert werden indem man sich insbesondere 3 auf bezieht, die die Organisation von hFMO2 schematisch darstellt.
  • Diese partiellen Sequenzen können verwendet werden für zahlreiche Anwendungen, wie nachfolgend hier beschrieben werden wird, insbesondere um Proteinkonstruktionen des FMO-Typs oder verschiedener FMO-Typen auszuführen, jedoch auch zum Realisieren von zum Beispiel FMO-ähnlicher Proteine.
  • Wenn die beschriebenen Proteinsequenzen im Allgemeinen die normalen Sequenzen sind, betrifft die Erfindung somit eine mutierte Sequenz, die eine Punktmutation aufweist.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft somit eine mutierte Nukleotidsequenz, in welcher die Punktmutation nicht still ist, d.h., dass sie zu einer Modifikation der durch die normale Sequenz codierten Aminosäure führt. Die Erfindung beschreibt bestimmte Mutationen, die vorliegen können hinsichtlich der Aminosäuren, die die FMO-Proteine oder die entsprechenden Fragmente davon bilden, insbesondere in den Regionen, die katalytischen Stellen entsprechen, an den Regulationsstellen oder an den Stellen zur Bindung von Cofaktoren; die Mutationen können sich auch auf den am Transport und an der Adressierung beteiligten Sequenzen befinden; sie können auch im Besonderen die Cysteine supprimieren oder, im Gegensatz, sie sichtbar machen, jedoch ebenfalls den Charakter des Proteins ändern, sei es bezogen auf die Ladung, sei es bezogen auf die Hydrophobizität.
  • Diese Mutationen können ebenfalls auftreten in den Promotor- und/oder Regulationssequenzen humaner FMO-Gene, welche Wirkungen auf die Expression des Proteins haben können, insbesondere auf seinen Expressionsgrad.
  • Unter den Nukleotidfragmenten, die interessant sein können, insbesondere für die Diagnose, müssen ebenfalls genomische Intronsequenzen des FMO-Gens genannt werden, zum Beispiel die Verbindungssequenzen zwischen Introns und Exons.
  • Die Erfindung umfasst so die Nukleotidsequenzen gemäß der Erfindung, die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie mindestens die Mutation G.1263mac.A umfasst, diejenige, die hier nachfolgend in den Beispielen definiert wird.
  • Die Erfindung umfasst ebenfalls die Nukleotidsequenzen, wie Nukleotidprimer, die dadurch gekennzeichnet sind, dass die Sequenzen ausgewählt sind aus den Sequenzen SEQ ID Nr. 7, SEQ ID Nr. 8, SEQ ID NR. 9 und SEQ ID Nr. 10.
  • Die Erfindung betrifft außerdem die Nukleotidsequenzen als spezifische Sonde, dadurch gekennzeichnet, das die Sequenzen ausgewählt sind aus den Sequenzen SEQ ID Nr. 11, SEQ ID Nr. 12, SEQ ID Nr. 13 und SEQ ID Nr. 14.
  • Die durch die Nukleotidsequenzen gemäß der Erfindung codierten Polypeptide, insbesondere das Polypeptid mit der Sequenz SEQ ID Nr. 3, das einen Lysinrest anstelle eines Glutaminsäurerests in Position 402 aufweist, sind selbstverständlich Teil der Erfindung.
  • In der vorliegenden Beschreibung sind die Ausdrücke Protein, Polypeptid oder Peptid untereinander austauschbar.
  • Die vorliegende Erfindung benennt ebenfalls die Nukleotidsequenzen, die nicht-natürliche Nukleotide aufweisen können, insbesondere Schwefel-Nukleotide oder mit der α- oder β-Struktur.
  • Es wird in der vorliegenden Erfindung gesagt, dass die Sequenzen selbstverständlich die DNA- als auch RNA-Sequenzen betreffen, sowie Sequenzen, die mit ihnen hybridisieren, als auch die entsprechenden doppelsträngen DNAs.
  • Unter den interessanten Nukleinsäurefragmenten sind im Speziellen die antisense-Oligonukleotide zu nennen, d.h. deren Struktur durch Hybridisierung mit der Zielsequenz für eine Inhibierung der Expression des entsprechenden Produkts sorgt. Ebenfalls müssen die sense-Oligonukleotide genannt werden, die durch Wechselwirkung mit Proteinen an der Regulation der Expression des entsprechenden Produkts beteiligt sind, entweder eine Inhibierung oder eine Aktivierung dieser Expression induzieren.
  • Wie es nachfolgend hier beschrieben wird, kann es für bestimmte Anwendungen erforderlich sein gemischte Konstrukte, Protein/DNA/chemische Verbindung, insbesondere die Verwendung von z.B. Interkalationsmitteln, vorzusehen.
  • Die Proteine, Polypeptide oder Peptide, die den zuvor genannten Sequenzen entsprechen, sind in der nicht-natürlichen Form, d.h., dass sie nicht in ihrer natürlichen Umgebung vorliegen, sie jedoch erhalten werden können durch Reinigung, ausgehend von natürlichen Quellen, oder erhalten werden können durch genetische Rekombination, wie diejenige, die hier nachfolgend beschrieben wird.
  • Die Erfindung zitiert ebenfalls die gleichen Polypeptide oder Proteine, die erhalten werden durch chemische Synthese und nicht-natürliche Aminosäuren aufweisen können.
  • Die vorliegende Erfindung zitiert auch rekombinante Proteine, die ebenfalls gut erhalten werden in glykosilierter Form als auch nicht-glykosilierter Form und die natürliche Tertiärstruktur aufweisen können oder nicht.
  • Die Vektoren und die Zellen
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls Klonierungs- und/oder Expressionsvektoren, die eine Nukleotidsequenz gemäß der Erfindung aufweisen.
  • Diese Klonierungs- und/oder Expressionsvektoren könnten Elemente aufweisen, die die Expression der Sequenz in einer Wirtszelle sicherstellen, insbesondere Promotorsequenzen und Regulationssequenzen, die in der Zelle wirkungsvoll sind.
  • Der fragliche Vektor könnte autonom replizieren oder auch vorgesehen sein, um die Integration der Sequenz in Chromosomen der Wirtszelle sicherzustellen.
  • Im Falle von autonomen Replikationssystemen, in Abhängigkeit von der Wirtszelle, prokariontisch oder eukariontisch, wird man vorzugsweise Systeme des Plasmidtyps oder des viralen Typs verwenden, wobei die Virusvektoren insbesondere Adenoviren (Perricaut et al., 1992), Retroviren, Pockenviren oder Herpesviren (Epstein et al., 1992) sein können. Der Fachman kennt die für jeden dieser Viren verwendbaren Techniken.
  • Ebenso ist es bekannt, als viralen Vektor defekte Viren zu verwenden, deren Kultivierung in komplementierenden Zellen realisiert wird, was die eventuellen Risiken einer Proliferation eines infektiösen viralen Vektors vermeidet.
  • Wenn die Integration der Sequenz in die Chromosomen der Wirtszelle gewünscht sein sollte, wäre es notwendig auf beiden Seiten der zu integrierenden Nukleotidsequenz eine oder mehrere Nukleotidsequenzen, die von der Wirtszelle stammen, vorzusehen, um die Rekombination zu gewährleisten. Es handelt sich hierbei ebenfalls um Verfahren, die weitestgehend im Stand der Technik beschrieben sind. Man könnte zum Beispiel Systeme des Plasmid- oder viralen Typs verwenden; solche Viren können zum Beispiel die Retroviren (Temin 1986) oder die AAV, Adenovirus-assoziierte Viren (Carter 1993), sein.
  • Die Erfindung betrifft ebenfalls prokariontische oder eukariontische Zellen, die transformiert sind durch einen Vektor gemäß der Erfindung und dies, um die Expression eines natürlichen oder varianten FMO-Proteins oder auch beispielsweise einer seiner Domänen sicherzustellen.
  • Die Tiere, die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie eine transformierte Zelle gemäß der Erfindung enthalten, bilden ebenfalls einen Teil der Erfindung.
  • Die Erfindung umfasst weiterhin ein Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids gemäß der Erfindung, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Zelle gemäß der Erfindung kultiviert und dass man das erzeugte Protein gewinnt.
  • Wie es zuvor angegeben wurde, betrifft die vorliegende Erfindung außerdem die Polypeptide, die erhalten werden durch Kultivieren von derart transformierten Zellen und die Gewinnung des exprimierten Polypeptids, wobei die Gewinnung auf intrazelluläre Art als auch extrazelluläre Art im Kulturmilieu erfolgen kann, wenn der Vektor so entwickelt ist, dass er die Ausscheidung des Polypeptids auf einem Umweg, z.B. über eine „Leader-Sequenz, sicherstellt, wobei das Protein exprimiert wird in der Form eines Prä-Proteins oder Prä-Pro-Proteins. Die Konstrukte, die die Sezernierung von Polypeptiden erlauben, sind bekannt, sowohl für prokaryontische als auch eukaryontische Systeme. Bestimmte der FMO-Polypeptide können ihr eigenes Sezernierungs- oder Membraninsertionssystem aufweisen.
  • Unter den für die Herstellung dieser Polypeptide verwendbaren Zellen sind selbstverständlich die Bakterienzellen (Olins und Lee, 1993), als auch die Hefezellen (Buckholz, 1993), als auch die tierischen Zellen, insbesondere die Säugerzellkulturen (Edwards und Aruffo, 1993), aber ebenso die Insektenzellen, in welchen man Verfahren verwenden kann, die zum Beispiel Baculovirus einsetzen (Luckow, 1993), zu nennen.
  • Die so erhaltenen Zellen können die Herstellung natürlicher oder varianter FMO-Polypeptide erlauben, jedoch auch von Fragmenten dieser Polypeptide, insbesondere von Polypeptiden, die verschiedenen fraglichen Domänen entsprechen können.
  • Die Erfindung betrifft vorzugsweise ebenfalls die mono- oder polyklonalen Antikörper, die gegen die Polypeptide gemäß der Erfindung gerichtet sind, dadurch gekennzeichnet, dass sie erhalten wurden durch Immunreaktion eines humanen oder tierischen Organismus mit einem immunogenen Mittel, bestellend aus einem Polypeptid gemäß der Erfindung, insbesondere einem rekombinanten oder synthetischen Polypeptid gemäß der Erfindung.
  • Die Erfindung betrifft ebenfalls die Antikörper gemäß der Erfindung, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um markierte Antikörper handelt, insbesondere zur Bilddarstellung.
  • Diese markierten monoklonalen oder polyklonalen Antikörper und welche insbesondere dem Gesamten oder einem Teil der mutierten Proteine entsprechen, können zum Beispiel verwendet werden als Bilddarstellungsmittel, in vivo oder ex vivo, auf biologischen Proben (Bilddarstellung mit Hilfe von Antikörpern, gekoppelt an ein nachweisbares Molekül, z.B. mit einer Bilddarstelllung des PET-Abtast-Typs).
  • Die zellulären Modelle
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung können die transformierten oder tierischen, nicht-humanen Zellen gemäß der Erfindung ebenfalls verwendet werden als Modell für die in vitro-Selektion von Produkten, die direkt oder indirekt an der Aktivität von mutiertem FMO2 beteiligt sind, zum Untersuchen der verschiedenen einbezogenen Wechselwirkungen. Sie können ebenfalls verwendet werden zur in vitro-Selektion von mit mutiertem FMO2 wechselwirkenden Produkten, als Agonist, insbesondere enzymatisches Aktivierungsmittel, oder Antagonist, insbesondere enzymatisches Inhibierungsmittel.
  • Eine andere potentielle typische Anwendung dder Charakterisierung dieser Gene ist folglich die Möglichkeit zum Identifizieren von Verbindungen, insbesondere auf Proteinbasis, die mit diesen FMOs wechselwirken. Zum Beispiel kann es sich genausogut um Inhibitoren als auch Aktivatoren, Substrate oder Cofaktoren, handeln. Ihre Identifizierung wird erlauben sie in Abhängigkeit von ihren Wechselwirkungen mit dem normalen Protein oder der Proteinvariante zu verwenden. Im Speziellen wird man versuchen können Mittel zu isolieren, die verschiedene Wirkungen auf normale und variante FMOs haben.
  • Es ist ebenso beschrieben, das man diese zellulären Modelle verwenden können wird zum Untersuchen des Metabolismus von Xenobiotika, Medikamenten oder anderen, mit einem normalen oder varianten FMO. Dies könnte angewendet werden bei der Identifizierung des toxischen Verhaltens bestimmter Verbindungen, bei der Auswahl und Entwicklung von Verbindungen mit erniedrigter Toxizität oder mit verstärkter Aktivität oder bei den modifizierten FMOs, die ein besseres Vermögen zum Metabolisieren der interessierenden Verbindungen aufweisen.
  • Dieser Typ eines zellulären Modells kann realisiert werden durch Anwendung von Gentechniken. Es handelt sich unter Beachtung des Zelltyps, den man zu verwenden beabsichtigt, darum das fragliche Gen in seiner normalen Form oder in seiner mutierten Form in einen Expressionsvektor zu klonieren, wobei es sich um einen autonomen Replikationsvektor oder einen Integrationsvektor handeln kann, wobei der Vektor alle Elemente aufweist, die die Expression des Gens in der fraglichen Zelle ermöglichen, oder diese alle Elemente aufweist, die die Expression der fraglichen Sequenz ermöglichen.
  • Man erhält so eukaryontische oder prokaryontische Zellen, die das oder die FMO-Protein(e), normale oder variant, exprimieren, die dann Modelle bilden können, die es erlauben auf einmal alle Wechselwirkungen verschiedener Produkte mit den FMO-Proteinen oder ihren Varianten zu testen, oder Verbindungen zu testen, insbesondere chemische Synthese-Produkte, die wechselwirken können mit dem Produkt des FMO-Gens, normal oder mutiert, und dies wenn man sie dem Kulturmedium der Zellen zugibt..
  • Es ist insbesondere anzumerken, dass die in Frage stehenden Produkte genauso gut Mittel mit Antagonisten- als auch Agonistenaktivität sein können.
  • Die Verwendung zellulärer Modelle in Hinblick auf das Testen von pharmazeutischen Verbindungen ist allgemein bekannt, sodass es wiederum nicht erforderlich ist diesen Modelltyp detailliert zu beschreiben. Man kann dennoch unter den verwendeten Techniken die „Phage Display"-Technik (Allen et al., 1995), und die Doppelhybrid-Verfahren (Luban und Goff., 1995) zitieren.
  • Diese Modelle können vom in vitro-Typ sein, zum Beispiel Kulturen von humanen Zellen, entweder in normaler Kultur oder möglicherweise in der Form eines isolierten Organs.
  • Die vorliegende Erfindung beschreibt ebenfalls Organismen, wie etwa die tierischen, im Besonderen Mäuse, die den Phänotyp exprimieren, der dem normalen oder varianten FMO humanen Ursprungs entspricht. Hier können wiederum diese Tiere verwendet werden als Tiermodelle zum Testen der Wirksamkeit bestimmter pharmazeutischer Produkte.
  • Diagnoseverfahren
  • Die vorliegende Erfindung betrifft Diagnoseverfahren einer Prädisposition für juveniles Glaukom bei einem Patienten, dadurch gekennzeichnet, dass ausgehend von einer biologischen Probe Patienten das Vorliegen der Mutation G24431A in mindestens einer Sequenz, die für FMO2 codiert, bestimmt durch die Analyse der gesamten oder eines Teils der Nukleinsäuresequenz, die dem Gen entspricht, wobei das Vorliegen mindestens einer solchen Mutation eine Prädisposition des Patienten für juveniles Glaukom anzeigt, die mit FMO2 assoziiert ist.
  • Es ist wichtig klarzustellen, dass die vorliegende Erfindung nur hFMO2 und hFMOx im Detail beschreibt, aber es ist hier angegeben, dass beschriebene Diagnoseverfahren und die für Therapie vorgesehenen Verbindungen, ebenfalls die früheren FMOs betreffen, wie etwa FMO1, FMO3, FMO4 und FMO5. Tatsächlich greifen die FMOs allgemein in den Metabolismus von Xenobiotika und die Störungen, die damit verbunden sind, ein, wie etwa zum Beispiel die vorstehend genannten Xenobiotika und die Störungen, die mit FMO assoziiert sind.
  • Die Mutation, die für die Erfindung untersucht wird, ist die Mutation G.1263mac.A (lokalisiert in 6).
  • Die analysierten Nukleinsäuresequenzen könnten genausogut die genomische DNA, eine cDNA oder eine mRNA sein
  • Wie zuvor angegeben wurde, versteht man unter den Störungen, die mit FMO assoziiert sind, welche nachgewiesen werden können, im Spezielleren die Pathologien, die mit dem xenobiotischen Metabolismus, wie zuvor zitiert, assoziiert sind, oder assoziiert sind mit der biologischen Funktion von FMO, wobei es jedoch andere Störungen geben kann, die mit einer Anomalie der FMOs assoziiert sein können.
  • Die diagnostischen Werkzeuge, die auf der vorliegenden Erfindung basieren, werden, wenngleich sie eine positive und differenzierte Diagnose für einen isolierten Patienten erlauben können, vorzugsweise von Interesse sein für eine Präsymtom-Diagnose für ein gefährdetes Individuum, insbesondere mit familiärer Vorbelastung, und es ist ebenfalls möglich eine pränatale Diagnose vorzusehen.
  • Darüber hinaus kann der Nachweis einer spezifischen Mutation eine fortschreitende Diagnose erlauben, insbesondere betreffend die Stärke der Störung oder den möglichen Zeitpunkt ihres Auftretens.
  • Die Verfahren, die es erlauben die Mutation in einem Gen in Bezug auf ein natürliches Gen nachzuweisen, sind selbstverständlich sehr zahlreich. Man kann sie im Wesentlichen in zwei große Kategorien einteilen, wobei der erste Verfahrenstyp derjenige ist, worin das Vorliegen einer Mutation nachgewiesen wird durch Vergleich der mutierten Sequenz mit der entsprechenden nichtmutierten natürlichen Sequenz und der zweite Typ derjenige ist, in welchem das Vorliegen der Mutation indirekt nachgewiesen wird, zum Beispiel durch Nachweis von Fehlpaarungen, die auf das Vorliegen der Mutation zurückzuführen sind.
  • In den beiden Fällen bevorzugt man im Allgemeinen die Verfahren, in welchen die Gesamte oder ein Teil der FMO entsprechenden Sequenz amplifiziert wird vor dem Nachweis der Mutation, wobei diese Amplifikationsmethoden durch Verfahren realisiert werden können, die als PCR oder PCR-ähnlich bezeichnet werden. Unter PCR-ähnlich wird man die Bezeichnung aller Verfahren verstehen, die direkte oder indirekte Reproduktionen von Nukleinsäuresequenzen verwenden, als auch in welchen die Marker-Systeme amplifiziert worden sind, wobei die Techniken allgemein bekannt sind, wobei es sich im Allgemeinen um die Amplifikation von DNA durch eine Polymerase handelt; wenn die Ursprungs-Probe eine RNAist, wird geeigneterweise vorab eine reverse Transkription durchgeführt. Es gibt derzeit sehr viele Verfahren, die diese Amplifikation erlauben, zum Beispiel die Verfahren, die als NASBA „Nucleic Acid Sequence Based Amplification" (Compton 1991), TAS „Transcription Based Amplification System" (Guatelli et al., 1990), LCR „Ligase Chain Reaction" (Landgren et al., 1988), „Endo Run Amplification" (ERA), „Cycling Probe Reaction" (CPR) und SDA „Strand Displacement Amplification" (Walker et al., 1992), bezeichnet werden, die dem Fachmann allgemein bekannt sind.
  • Tabelle 1 zeigt Primersequenzen, die anwendbar sind zum Amplifizieren der Sequenzen betreffend die Mutation G.1263mac.A.
  • Das Reagens, das verwendet wird zum Nachweisen und oder Identifizieren einer Mutation des FMO-Gens in einer biologischen Probe umfasst eine Sonde, die Einfangsonde oder Nachweissonde genannt wird, wobei mindestens eine dieser Sonden eine Sequenz gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst, die zuvor beschrieben wurde.
  • Suche nach Punktmutationen
  • Allgemein können mehrere Nachweisverfahren angewendet oder gegebenenfalls angepasst werden nach der Amplifikation der interessierenden Sequenzen durch PCR. Als Beispiele kann man nennen:
    • 1) Sequenzierung: Vergleich von Sequenzen mehrerer Individuen und/oder Identifizierung einer heterozygoten Stelle bei einem einzelnen Individuum.
    • 2) „Single nucleotide primer extension" (Syvanen et al., 1990). Beispiele von Primern, die verwendbar sind zum Nachweisen der Mutation G.1263mac.A. Durch das in Tabelle 2 dargestellte Verfahren.
    • 3) RFLP „Restriction Fragment Length Polymorphism". Ein Beispiel eines Restriktionsenzyms, das verwendbar ist zum Nachweisen der G.1263mac.A-Mutation durch RFLP wird in Tabelle 3 gezeigt.
    • 4) Suche nach „Single Strand Conformation Polymorphisms" (SSCP).
    • 5) Verfahren, die auf einer Abspaltung von falsch gepaarten Regionen basieren (enzymatische Abspaltung durch die S1-Nuklease, chemische Abspaltung durch verschiedene Verbindungen, wie etwa Piperidin oder Osmiumtetroxid, etc.
    • 6) Nachweisen eines Heteroduplex durch Elektrophorese.
    • 7) Verfahren, basierend auf der Anwendung der Hybridisierung von spezifischen Oligonukleotidsonden von Allelen: (Allele Specific Oligonucleotide" (ASO) (Stoneking et al., 1991). Beispiele für Sonden, die verwendbar sind für den Nachweis der Mutation G.1263mac.A durch ASO sind in Tabelle 4 dargestellt.
    • 8) OLA-Verfahren (dual color Oligonucleotide Ligation Assay" (Samiotaki et al., 1994).
    • 9) ARMS-Verfahren "Amplification Refractory Mutation System" oder ASA-Verfahren "Allele Specific Amplification" oder PASA-Verfahren "PCR Amplification of Specific Allele" (Wu et al., 1989).
  • Diese Liste ist nicht vollständig und andere gut bekannte Verfahren können verwendet werden.
  • Suche nach Veränderungen, zum Beispiel vom Deletionstyp
  • Andere allgemein bekannte Verfahren, die auf Hybridisierungstechniken mit Hilfe genomischer Sonden, cDNA-Sonden, Oligonukleotid-Sonden oder Ribosonden basieren, können verwendet werden zur Untersuchung dieses Typs von Veränderungen.
  • So bilden ebenfalls einen Gegenstand der Erfindung die Diagnoseverfahren einer Prädisposition für juveniles Glaukom eines Patienten die mit mutiertem FMO2 gemäß der Erfindung assoziiert sind, dadurch gekennzeichnet, dass die Analyse durch Hybridisierung realisiert wird, wobei die Hybridisierung vorzugsweise mit Hilfe mindestens einer Allel-spezifischen Oligonukleotidsonde realisiert wird oder dadurch, dass das Vorliegen einer Mutation nachgewiesen wird durch Vergleich mit der entsprechenden nicht-mutierten natürlichen Sequenz, oder dadurch, dass die Analyse durch Sequenzieren oder durch elektrophoretische Migration erfolgt, und im Spezielleren durch SSCP oder DGGE, oder dadurch, dass die Analyse durch eine Methodik erfolgt, die darauf ausgerichtet ist eine Verkürzung des Proteins nachzuweisen.
  • Einen Teil der Erfindung bilden auch die Diagnoseverfahren einer Prädisposition für juveniles Glaukom, das auf mutiertem FMO2 gemäß der Erfindung beruht, bei einem Patienten dadurch gekennzeichnet, dass die gesamte oder ein Teil der Nukleotidsequenz des FMO-Gens zuvor unter Nachweis der mindestens einen Mutation amplifiziert wird, wobei die Amplifikation vorzugsweise durch PCR oder auf PCR-ähnliche Art realisiert wird, wobei die zum Durchführen der Amplifikation ausgewählten Primer vorzugsweise ausgewählt werden aus den Primern gemäß der Erfindung.
  • Die Reagenzien zum Nachweisen und/oder Identifizieren der Gen-Mutation des humanen FMO2-Gens in einer biologischen Probe, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Sonde umfassen, die Einfangsonde und/oder Nachweissonde genannt wird, wobei mindestens eine der Sonden eine Sequenz gemäß der Erfindung aufweist, oder ein Antikörper der Erfindung, bilden ebenfalls einen Teil der Erfindung.
  • Verfahren, die auf dem Nachweis des Genprodukts basieren.
  • Die Mutation des humanen FMO2-Gens ist verantwortlich für eine Modifikation des Genprodukts, wobei die Modifikation verwendbar ist für einen diagnostischen Ansatz. Tatsächlich können die antigenen Modifikationen die Entwicklung spezifischer Antikörper erlauben. Alle diese Modifikationen können verwendet werden als diagnostischer Ansatz, dank zahlreicher allgemein bekannter Verfahren, die auf der Verwendung der monoklonalen oder polyklonalen Antikörper basieren, die das normale Protein oder mutierte Varianten erkennen, zum Beispiel das RIA- oder ELISA-Verfahren.
  • Schließlich wird hier beschrieben, dass es ebenfalls möglich ist eine Prädisposition für die mit FMO assoziierten Störungen eines Patienten zu diagnostizieren, durch Messung der enzymatischen Aktivität des oder der FMO(s), ausgehend von biologischen Proben des Patienten. Die Messung dieser Aktivität(en) durch Vergleich mit einem internen oder externen Standard wird tatsächlich eine Prädisposition für eine der vorstehend zitierten Störungen anzeigen.
  • Therapeutische Zusammensetzungen
  • Die vorliegende Erfindung beschreibt ebenfalls therapeutische, heilende oder präventive Behandlungen von Störungen, die mit FMO assoziiert sind.
  • Man könnte die Verbindungen verwenden, die direkt oder indirekt an der FMO-Aktivität beteiligt sind, und die aus der Verwendung der vorstehend beschriebenen zellulären Modellen hervorgegangen sind.
  • Man könnte im Besonderen die Verbindungen verwenden, die mit den normalen oder varianten FMOs wechselwirken können, insbesondere als Agonist oder Antagonist.
  • Die vorliegende Erfindung beschreibt ebenfalls therapeutische Zusammensetzungen, die als aktives Mittel eine Verbindungen aufweisen, die in die FMO-Aktivität modulieren kann, wobei es sich um Zusammensetzungen mit pro-FMO-Aktivität, insbesondere solche, die zuvor beschrieben sind, oder um Zusammensetzungen mit anti-FMO-Aktivität handeln kann.
  • Allgemein versteht man unter einer Verbindungen mit „pro-FMO-Aktivität" eine Verbindungen, die die Aktivität von FMO induzieren wird, im Gegensatz zu einer anti-FMO-Verbindungen, die die Tendenz zur Verringerung der FMO-Aktivität haben wird. Die tatsächliche Wirkung dieser Aktivitätstypen wird vom Typ des exprimierten Enzyms, normal oder pathogen, abhängen.
  • Bevorzugt könnte man therapeutische Zusammensetzungen verwenden, deren Aktivität verschieden gegenüber den normalen und varianten-FMO-Enzymen ist.
  • Es ist zunächst möglich eine Substitutionsbehandlung vorzusehen, d.h. therapeutische Zusammensetzungen, die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie als aktives Mittel eine Verbindungen mit pro-FMO-Aktivität aufweisen; es könnte sich insbesondere vollständig oder zum Teil um Polypeptide handeln, wie sie vorstehend beschrieben worden sind, oder auch um einen Expressionsvektor derselben Polypeptide, oder auch um chemische oder biologische Verbindungen, die eine pro-FMO-Aktivität, eine FMO-ähnliche Aktivität aufweisen oder die Produktion von FMO induzieren.
  • Es ist ebenfalls möglich therapeutische Zusammensetzungen zu verwenden, in welchen das aktive Mittel eine anti-FMO-Wirkung haben wird, im Speziellen eine anti-FMO-Variante. In diesem Falle handelt es sich um eine supprimierende Behandlung. Es könnte sich zum Beispiel um Verbindungen handeln, die wechselwirken mit den Enzymen, insbesondere Proteinverbindungen, und im Besonderen anti-FMO-Antikörper, insbesondere wenn diese Antikörper die Proteinvarianten erkennen. Es könnte sich ebenfalls um chemische Produkte handeln, die eine anti-FMO-Aktivität aufweisen, insbesondere Antagonisten der FMO-Variante.
  • Unter den zahlreichen verwendbaren pharmazeutischen Zusammensetzungen, sind ganz besonders die anti-Sense-Sequenzen zu zitieren, die mit dem normalen oder mutierten FMO-Gen wechselwirken, als auch die Sense-Sequenzen die auf die Regulation der Expression dieser Gene wirken, wobei die Produkte ebenfalls wechselwirken können stromabwärts der durch die FMOs induzierten Expressionsprodukte,.
  • Ebenfalls zu nennen sind die monoklonalen Antikörper, die die FMOs inhibieren, inbesondere die mutierten FMOs, und/oder die entsprechenden Liganden und/oder die Produkte, die durch FMO-Aktivität induziert werden, inhibieren, die folglich pro- oder anti-Aktivitäten haben können.
  • Es ist ebenfalls möglich die Expression von Proteinen oder ihrer Fragmente in vivo vorzusehen, insbesondere über den Umweg der Gentherapie und unter Verwendung von den Vektoren, die vorausgehend beschrieben worden sind.
  • Im Rahmen der Gentherapie ist es ebenfalls möglich die Verwendung von zuvor beschriebenen „nackten" Gensequenzen oder cDNAs vorzusehen, wobei diese Technik insbesondere entwickelt worden ist durch die Gesellschaft Vical, die gezeigt hat, dass es unter diesen Bedingungen möglich ist das Protein in bestimmten Geweben zu exprimieren, insbesondere ohne auf die Unterstützung eines viralen Vektors zurückgreifen zu müssen.
  • Heute ist es im Rahmen der Gentherapie ebenfalls möglich die Verwendung von ex vivo transformierten Zellen vorzusehen, welche anschließend wieder reimplantiert werden könnten, entweder so wie sie sind oder innerhalb der Systeme des organoiden Typs, so wie dies auch im Stand der Technik bekannt ist (Danos et al., 1993). Man kann ebenfalls die Verwendung von Mitteln vorsehen, die das Abzielen auf einen bestimmten zellulären Typ erleichtern, die Penetration in die Zellen oder den Transport in Richtung des Kerns.
  • So beschreibt die Erfindung ebenfalls eine therapeutische Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, dass sie als aktives Mittel mindestens eine Verbindungen enthält, die in der Lage ist zum Modulieren der FMO-Aktivität, vorzugsweise der Aktivität von FMO2 und/oder FMOx.
  • Die Erfindung beschreibt auch eine therapeutische Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, dass sie als aktives Mittel mindestens eine Verbindungen enthält, die in der Lage ist zum Wechselwirken mit FMO, vorzugsweise in der Lage ist zum Wechselwirken mit FMO2 und/oder FMOx, oder eine therapeutische Zusammensetzung, die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie eine verschiedene Aktivität gegenüber normalem FMO und pathologischem FMO zeigt.
  • Die vorliegende Erfindung umfasst eine therapeutische Zusammensetzung, die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie als aktives Mittel mindestens einen Agonisten des mutierten humanen FMO2 aufweist, ausgewählt aus den folgenden Verbindungen:
    • a) einem Protein oder einem Polypeptid gemäß der Erfindung;
    • b) einem Expressionsvektor gemäß der Erfindung;
    • c) einer Nukleotidsequenz gemäß der Erfindung, dadurch gekennzeichnet, dass die Sequenz eine Sense-Sequenz ist, die die Expression des mutierten FMO2 induziert.
  • Die Erfindung betrifft weiterhin eine therapeutische Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, dass sie als aktives Mittel einen Antagonisten des mutierten humanen FMO2 umfasst, ausgewählt aus den folgenden Verbindungen:
    • a) einem anti-FMO-Antikörper gemäß der Erfindung;
    • b) einer Nukleotidsequenz gemäß der Erfindung, dadurch gekennzeichnet, dass die Sequenz eine Antisense-Sequenz ist, die die Expression des mutierten FMO2 inhibiert,
    • c) einer Nukleotidsequenz gemäß der Erfindung, dadurch gekennzeichnet, dass die Sequenz eine Sense-Sequenz ist, die die Expression des mutierten FMO2 inhibiert.
  • Die Erfindung beschreibt auch eine therapeutische Zusammensetzung gemäß der Erfindung, dadurch gekennzeichnet, dass das aktive Mittel eine lösliche Sequenz ist, die mit FMO wechselwirkt.
  • Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist auch die Verwendung eines aktiven Mittels, das in der Lage ist zum Modulieren der Aktivität des mutierten humanen FMO2, zum Realisieren eines Medikaments, das zur Behandlung und/oder Verhinderung von juvenilem Glaukom vorgesehen ist, dadurch gekennzeichnet, dass das aktive Mittel ausgewählt ist aus den Agonisten- oder Antagonisten-Verbindungen der therapeutischen Zusammensetzungen der Erfindung.
  • Unter einem anderen Aspekt beschreibt die Erfindung auch einen Bioabbau- oder Biosyntheseprozess einer organischen oder anorganischen Verbindung, dadurch gekennzeichnet, dass er ein Polypeptid oder eine Zelle gemäß der Erfindung verwendet.
  • Die Polypeptide mit FMO-Aktivität könnten tatsächlich vorteilhafterweise verwendet werden zum Bioabbau, unter Befolgung von Oxidationsreaktionen, z.B. denjenigen, die von Ziegler (Ziegler et al., 1993) beschrieben sind, der FMO-Substratverbindungen, im Besonderen solcher Verbindungen, die in der vorliegenden Beschreibung genannt sind, oder verwendet werden zur Biosynthese einer interessierenden Verbindung ausgehend von FMO-Substratverbindungen, insbesondere zur Biosynthese eines Medikaments, eines Nahrungsergänzungsmittels, eines Pestizids oder Herbizids.
  • Die Verarbeitungsverfahren der Verbindung von Interesse, die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie ein Polypeptid oder eine Zelle gemäß der Erfindung verwenden, sind hier zitiert. Die Polypeptide oder Zellen gemäß der Erfindung könnten allerdings vorteilhafterweise in vitro verwendet werden zum Bestimmen der potentiellen Metabolisierung der Verbindung von Interesse und zum Analysieren der möglicherweise erhaltenen Metaboliten, ihrer Toxizität und/oder ihrer Aktivität. Die erhaltenen Ergebnisse werden es erlauben die Verbindung zu bestätigen oder sie wieder zu formulieren, so, dass sie Substrat von FMO wird oder nicht, oder die gebildeten Metaboliten verschieden sind.
  • Schließlich beschreibt die vorliegende Erfindung die Verwendung des Polypeptids oder der Zelle gemäß der Erfindung zur Entgiftung einer xenobiotischen Verbindung, ein Substrat von FMO. Diese xenobiotischen Verbindungen können in der Umwelt vorliegen, wie etwa Pestizide oder Herbizide, natürlich vorliegen in den Pflanzen, wie bestimmte Alkaloide, oder können pharmazeutischen Verbindungen entsprechen.
  • Andere Charakteristika und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden ersichtlich aus den nachfolgenden Beispielen, die unter Bezugnahme auf die nachfolgenden beiliegenden Figuren angegeben werden:
  • 1: Polypeptidsequenz, entsprechend der Sequenz SEQ ID Nr. 3, vorausgesagt von hFMO2, humanes Homologes des FMO2 des Makaken.
  • 2: Nukleotidsequenz, teilweise entsprechend der Sequenz SEQ ID Nr. 1 des Gens, das für hFMO2 codiert, humanes Homologes des FMO2 des Makaken.
  • In Hinblick auf die Homologien der mRNA, die bekannt sind von Genen der Familie der Flavin-Monooxygenasen, teilen diese Gene die gleiche Exon/intron-Struktur:
    Exon 1: nicht übersetzt, variabel in der Größe und der Sequenz,
    Exon 2: Beginn der codierenden Region, Codierung für die Aminosäuren 1–44,
    Exon 3: Aminosäuren 45–107,
    Exon 4: Aminosäuren 108–161,
    Exon 5: Aminosäuren 162–209,
    Exon 6: Aminosäuren 210–275,
    Exon 7: Aminosäuren 276–394,
    Exon 8: Aminosäuren 395–419,
    Exon 9: Aminosäuren 420–535, Ende der codierenden und nichttranslatierten 3'-Region.
  • Die Introns sind in der Größe und Komplexität variabel. Wir haben zunächst die Sequenz von drei Fragmenten von BAC 123H04M isoliert, die die gesamten Exons dieses Homologen enthielten.
    Fragment 1: enthält die Exons 1 und 2,
    Fragment 2: enthält das Exon 3,
    Fragment 3: enthält die Exons 4 bis 9.
  • Die Sequenzen von zwei Introns sind dann vervollständigt worden.
  • 3:
    3A: Beschreibung der Exon/Intron-Struktur des Gens, das für hFMO2 codiert, humanes Homologes von FMO2 des Makaken.
    Angegeben sind die Positionen der Anfänge und Enden der Exons auf den Nukleotidsequenzen SEQ ID Nr. 1 und Nr. 2.
    3b: Beschreibung der Exon/Intron-Struktur des Gens, das für hFMOx codiert. Angegeben sind die Positionen der Anfänge und Enden der Exons auf den Nukleotidsequenzen SEQ ID Nr. 4 und Nr. 5.
  • 4: Homologie zwischen dem FMO2-Gen des Makaken und seinem humanen Homologen, wie in 2 angegeben. Die nichttranslatierte 5'-Region divergiert leicht von der Sequenz von Makak wie in 2 angegeben.
  • 5: Zusammenstellung der varianten Positionen der Sequenz der mRNA von humanem FMO2, unter Bezugnahme auf die homologe Makaksequenz; Einfluss von Variationen auf die Proteinsequenz.
  • 6: Homologien zwischen den Sequenzen der mRNA des FMO2 aus Makak und seinem humanen Homologen.
  • Die Position der Mutation G.1263mac.A ist durch einen vertikalen Pfeil gekennzeichnet.
  • 7: Homologien zwischen den Peptidsequenzen des FMO2 aus Makak und seinem humanen Homologen.
  • 8: Analyse der Segregation des Polymorphismus G.1263 mac.A in der untersuchten Familie.
  • Die genomische DNA der Individuen 3, 4 und 7 bis 14 ist amplifiziert worden durch PCR, und die Sequenz der erhaltenen Fragmente analysiert worden zum Nachweisen von heterozygoten Stellen, die mit der Krankheit segregiert werden.
  • Die ausgefüllten Symbole zeigen die Individuen, die von juvenilem GPAO befallen sind. Die durchgestrichenen Symbole zeigen die nichtgenotypischen Individuen. Die Individuen 11 und 12 sind Zwillinge.
  • G/G = Homozygote für die Base in der Position homolog zur Position 1263 der mRNA des FMO2 aus Makak.
  • G/A = Heterozygote für die Base in der Position homolog zur Position 1263 der mRNA des FMO2 aus Makak.
  • 9: Chromosomenlokalisation von BAC123H04M durch Fluoreszenzhybridisierung in situ.
  • (A) Ein spezifisches Signal wird auf den beiden Chromosomen 1 beobachtet. Auf der Fotografie (B) ist ein einziges der beiden Chromosomen 1 dargestellt. In (C) werden nur die R-Banden dieser Chromosomen beobachtet, wobei gezeigt wird, dass das Signal der Sonde 123H04M auf der Bande 1q23 lokalisiert ist.
  • 10: Nukleotidsequenz, die teilweise der Sequenz SEQ ID Nr. 4 des Gens entspricht, codierend für die humane hFMOx-Isoform.
  • Dieses Gen zeigt einen Homologiegrad von 75 % für DNA und von 70 % für Aminosäuren mit den Messenger-RNAs der Flavon-Monooxygenasen auf BAC 123H04M. Es ist in dieser vorläufigen Figur in vier Fragmenten dargestellt:
    Fragment 1: codiert für Exon 2 (erstes codierendes Exon),
    Fragment 2: Exon 3,
    Fragment 3: Exons 4 bis 8,
    Fragment 4: Exon 9.
  • Beispiele
  • Isolierung von BAC 123H04M
  • Zum Identifizieren eines Gens, das für eine neue FMO codiert, hat man ein BAC („Bacterial Artificial Chromosome") isoliert, das der Kandidatenregion entspricht, die zuvor auf dem Chromosom 1 lokalisiert worden ist. Eine Bank von BACs, die das vollständige humane Genom abdeckt, ist hergestellt worden, ausgehend von DNA einer humanen lymphoblastischen Linie, die von dem Individuum Nr. 8445 der CEPH-Familien stammt. Diese Linie ist verwendet worden als Quelle von DNA mit hohem Molekulargewicht. Die DNA ist partiell durch das Restriktionsenzym BamH1 verdaut worden, danach in die BamH1-Stelle des Plasmids pBeIoBacII kloniert worden. Die so erhaltenen Klone sind „gepoolt" worden und gescreent worden, entsprechend einem dreidimensionalen Analyseverfahren, das beschrieben ist für das Screenung von Banken von YACs („Yeast Artificial Chromosome") (Chumakov et al., 1992). Die erhaltenen dreidimensinalen Pools sind durch PCR gescreent worden mit Hilfe von Primern, die den Marker D1S3423 (WI-10286) einrahmen. Diese STS („Sequence Tagged Site) ist zuvor lokalisiert worden in der Kandidatenregion. Ein Klon von BAC 123H04M ist so isoliert worden.
  • Nach Verdau durch das Restriktionsenzym NotI, ist die Länge des Inserts, das von diesem BAC getragen wird, bestimmt worden auf einem 0,8 % Agarosegel nach Migration durch Elektrophorese im alternierenden Feld (CHEF) (4 Stunden bei 9 Volt/cm, mit einem Winkel von 100°, bei 11 °C in 0,5 × TAE-Puffer). Man hat so nachgewiesen, dass das BAC 123H04 ein Insert mit 180 kb trägt.
  • Chromosomenlokalisation von BAC 123H04M durch in situ-Fluoreszenzhybridisierung (FISH)
  • Die Chromosomenlokalisierung des BAC in der Kandidatenregion 1q23-q25 ist bestätigt worden durch in situ-Fluoreszenzhybridisierung (FISH) auf Metaphase-Chromosomen gemäß dem von Cherif et al., 1990, beschriebenen Verfahren. Das BAC 123H04M ist genauer lokalisiert worden in der Bande 1q23 von Chromosom 1 (9).
  • Sequenzierung des Inserts von BAC 123H04M
  • Zum Sequenzieren des Inserts von BAC 123H04M hat man drei verschiedene Banken von Subklonen hergestellt, ausgehend von beschallter DNA dieses BAC.
  • Nach Inkubation über Nacht sind die Zellen, die aus drei Liter Kulturmedium hervorgehen, durch alkalische Lyse entsprechend klassischer Techniken behandelt worden. Nach Zentrifugation des erhaltenen Produkts in einem Cäsiumchloridgradienten sind 52 μg DNA von BAC 123H04M gereinigt worden. 7 μg DNA sind unter drei verschiedenen Bedingungen beschallt worden, um Fragmente, von welchen sich die Größen gleichförmig von 1 bis 9 kb verteilen, zu erhalten. Die erhaltenen Fragmente sind in einem Volumen von 50 μl mit 2 Einheiten Vent-Polymerase für 20 Minuten bei 70 °C in Gegenwart der 4 Deoxytriphosphate (100 μM)behandelt worden. Die aus diesem Schritt resultierenden Fragmente mit glatten Enden, sind durch Gelelektrophorese mit 1 % Agarosegel mit niedrigem Schmelzpunkt getrennt worden (60 Volt während 3 Stunden). Die gemäß ihren Größen eingeteilten Gruppen sind ausgeschnitten worden und die erhaltenen Banden durch Agarase behandelt worden. Nach Extraktion mit Chloroform und Dialyse auf Microcon 100-Säulen, ist die DNA in Lösung eingestellt worden auf eine Konzentration von 100 ng/μl. Eine Ligation ist bewirkt worden, Inkubation für eine Nacht, durch Vorlegen von 100 ng DNA-Fragment von BAC 123H04M und 20 ng DNA des durch enzymatischen Verdau linearisierten und durch alkalische Phosphatase behandelten Vektors.
  • Diese Reaktion ist realisiert worden in einem Endvolumen von 10 μl in Gegenwart von 40 Einheiten/μl T4-DNA-Ligase (Epizentrum). Die Ligationsprodukte haben dann dazu gedient durch Elektroporation entweder einen XL-Blue-Stamm (für die Plasmide mit mehreren Kopien) oder einen D10HB-Stamm (für die Subklone, die von BAC abstammen) zu transformieren. Die Klone, die lacZ– waren und gegenüber dem Antibiotikum resistent waren sind einzeln auf Mikroplatten plattiert worden zur Aufbewahrung und Sequenzierung.
  • So erhielt man:
    • – 864 Subklone, die aus der Insertion von Fragmenten mit 2 bis 3 kb in die SmaI-Stelle des Plasmids puc18 hervorgehen;
    • – 1728 Subklone, die der Insertion von Fragmenten mit 1,5 bis 2 kb in die BamHI-Stelle (glatt gemacht) des Plasmids BluescriptSK entsprechen;
    • – 288 Subklone, die Fragmente mit 4 bis 7 kb aufweisen, die insertiert sind in die PmII-Stelle eines modifizierten BAC-Vektors.
  • Die Insertionen dieser Subklone sind amplifiziert worden durch PCR von Bakterienkulturen, die eine Nacht unter Verwendung der Primer der Vektoren, die die Insertionen flankieren, inkubiert wurden. Die Sequenzen der Enden dieser Inserts (durchschnittlich 500 Basen an jeder Seite) sind bestimmt worden durch automatische Fluoreszenzsequenzierung auf dem Sequenzierer ABI 377, ausgestattet mit der Software ABI Prism DNA Sequencing Analysis (Version 2.1.2).
  • Die Fragmente der Sequenz, die von Sub-BACs stammen, sind zusammengesetzt worden durch die Software Gap4 von R. Staden (Bonfield et al., 1995). Diese Software erlaubt die Rekonstruktion einer vollständigen Sequenz ausgehend von Sequenzfragmenten. Die aus der Anordnung verschiedener Fragmente deduzierte Sequenz ist die Konsenssequenz.
  • Schließlich hat man gerichtete Sequenzierungstechniken (systematischer Lauf mit Primern) verwendet, um die Sequenzen zu vervollständigen und die Contigs zu verbinden.
  • Sequenzanalyse
  • Die potentiellen Exons von BAC 123H04M sind ausfindig gemacht worden durch Homologierecherche in allgemein zugänglichen Banken für Proteine, Nukleinsäuren und EST (Exprimierte Sequenz-Tags).
  • Datenbanken:
  • Man verwendete lokale Überarbeitungen allgemein zugänglicher Hauptbanken. Die verwendete Proteinbank ist gebildet durch nichtredundante Fusion der Banken Genpept (Automatische Translation von GenBank, NCBI; Benson et al., 1996); Swissprot, (George et al., 1996); und PIR/NBRF (Bairoch et al., 1996). Die Verdopplungen sind eliminiert worden durch die Software „nrdb" (gemeinfreie Software); NCBI; Benson et al., 1996). Die internen Wiederholungen sind dann maskiert worden durch die Software „xnu" (gemeinfreie Software; NCBI; Benson et al., 1996). Die resultierende Bank, die als NRPU (Non-Redundant-Protein-Unique) bezeichnet wird, diente als Referenz für Recherchen von Proteinhomologien. Die mit dieser Bank gefundenen Homologien haben die Lokalisierung von Regionen erlaubt, die potentiell für ein Proteinfragment codieren, das zumindest einem bekannten Protein (codierend Exons) ähnlich ist. Die verwendete EST-Bank besteht aus Unterabschnitten „gbest" (1–9) der Genbank (NCBI; Benson et al., 1996). Sie enthält alle Fragmente öffentlich zugänglicher Transkripte.
  • Die gefundenen Homologien mit dieser Bank haben die Lokalisierung von potentiell transkribierten Regionen erlaubt (vorhanden auf mRNA).
  • Die verwendete Bank von Nukleinsäuren (andere als die EST) enthielt alle anderen Unterabschnitte von Genbank und EMBL (Rodriguez-Tome et al., 1996) wovon die Verdopplungen wie zuvor eliminiert wurden.
  • Software:
  • Man verwendete die komplette Blast-Software (gemeinfreie Software, Altschul et al., 1990) zur Suche nach Homologien zwischen einer Sequenz und Protein- oder Nukleinsäure-Datenbanken. Die Signifikanzschwellen hingen von der Länge und der Komplexizität der getesteten Region als auch der Größe der Referenzbank ab. Sie sind eingestellt worden auf und angepasst worden an jede Analyse.
  • Identifizierung genetischer Polymorphismen, die assoziiert sind mit FMO in Verbindung mit einem phänotypischen Polymorphismus, der assoziiert ist mit dem plötzlichen juvenilen GPAO-J-Glaukom, eine Krankheit mit autosomaler dominanter Vererbung (Locus GLC1A)
  • Nachweis von Polymorphismen/Mutationen
  • 1) Extraktion der DNA
  • Die DNA wird extrahiert aus venösem peripherem Blut nach Zelllyse, Proteinverdau, Abtrennung von organischem Material und schließlich alkoholischer Präzipitation.
  • Das Blut (20 ml) wird durch periphäre venöse Punktion entnommen mit einem Röhrchen, das EDTA enthält.
  • Es wird verdünnt mit einem Volumen bidestilliertem Wasser. Nach zehn Minuten werden die Zellen durch Zentrifugation gesammelt bei 1600 g für 10 Minuten. Dieses Verfahren wird wiederholt.
  • Die weißen Blutkörperchen werden in Gegenwart von 20 ml CLB-Puffer (Tris 10 mM, pH-Wert 7,6, 5 mM MgCl2, 0,32 M Sucrose, 1 % V/V Trition X-100) lysiert. Die Zellkerne werden durch Zentrifugation bei 1600 g für 10 Minuten gesammelt. Dieses Verfahren wird wiederholt.
  • Die Zellkerne werden einmal in dem RSB-Puffer gewaschen (Tris 10 mM, pH-Wert 8, NaCl 10 mM, EDTA 10 mM). Der Bodensatz wird in 2 ml RSB-Puffer, dem Natriumlaurylsulfat (1 %) und die Proteinase K (200 mg/ml) zugegeben wurden, resuspendiert. Die Mischung wird bei 55 °C mindestens drei Stunden inkubiert und regelmäßig bewegt.
  • Die so erhaltene DNA-Lösung wird dann mit einem Volumen Phenol, äquilibriert mit einem 50 mM Tris-Puffer, pH-Wert 8, extrahiert. Dieser Vorgang wird wiederholt und abgeschlossen durch eine Extraktion mit einem Volumen Chloroform/Isoamylalkohol (24:1 V/V).
  • Die DNA wird mit einem Volumen Isopropanol präzipitiert, mit Ethanol (70 %) gespült, getrocknet und schließlich in einem ml TE-Puffer (Tris 10 mM, pH-Wert 8, EDTA 0,5 mM) resuspendiert. Die DNA-Konzentration wird beurteilt durch Messen der Absorption bei 260 nm unter Verwendung der Äquivalenz von 50 μg/ml DNA für eine Absorptionseinheit. Die DNA-Konzentration wird dann auf 200 μg/ml eingestellt.
  • 2) Amplifikation der genomischen DNA
  • Die zur genomischen Amplifikation der von BAC 123H04M stammenden Exon-Sequenzen verwendeten Oligonukleotidprimer, wie durch Computeranalyse vorhergesagt, sind definiert worden mit Hilfe der Software OSP (Hillier et al., 1991).
  • Alle diese Primer enthielten stromaufwärts der Basen, die für die Amplifikation vorgesehen waren, einen gemeinsamen Oligonukleotidstrang, der vorsieht die Sequenzierung der amplifizierten Fragmente zu erlauben (PU für die stromaufwärtigen Primer und RP für die stromabwärtigen Primer; die Sequenzen sind in Tabelle 5 angegeben).
  • Die Oligonukleotidprimer sind entsprechend dem Phosphoramiditverfahren synthetisiert worden auf einem Genset UFPS 24.1-Synthesizer.
  • Die Amplifikation jeder vorhergesagten Exon-Sequenz wurde durch Polmerasekettenreaktion-Amplifikation (PCR) durchgeführt unter den folgenden Bedingungen:
    Endvolumen 50 μl
    genomische DNA 100 ng
    MgCl2 2 mM
    dNTP (jeweils) 200 μm
    Primer (jeweils) 7,5 pmol
    AmpliTaq Gold DNA-Polymerase (Perkin) 1 Einheit
    *PCR-Puffer 1X
    • *: (10X = 0,1 M Tris HCl, pH-Wert 8,3, 0,5 M KCl)
  • Die Amplifikation wird in einem Perkin Elmer 9600- oder MJ Research PTC200-Thermocycler mit Heizhaube durchgeführt. Nach Erhitzen auf 94°C für 10 Minuten wurden 35 Zyclen durchgeführt. Jeder Zyklus umfasst: 30 Sekunden bei 94 °C, 1 Minute bei 55 °C und 30 Sekunden bei 72 °C. Ein abschließender Abschnitt von 7 Minuten bei 72 °C beendet die Amplfikation.
  • Die Menge der erhaltenen Amplifikationsprodukte wird auf Mikroplatten mit 96 Vertiefungen durch Fluorometrie unter Verwendung des Picogreen-Intercalationsmittels (Molecular Probes) bestimmt.
  • 3) Bestimmung der Polymorphismen/Mutationen
    • – Sequenz
  • Die Produkte der genomischen Amplifikation durch PCR wurden sequenziert auf einem automatischen Sequenzierer ABI 377, unter Verwendung fluoreszierender Primer, die markiert waren mit den Fluorochromen ABI (Joe, Fam, Rox und Tamra) und der DNA-Polymerase Thermosequanase (Amersham) Die Reaktionen sind realisiert worden auf Mikroplatten mit 96 Vertiefungen auf dem Perkin Elmer Thermocycler 9600, unter den klassischen Temperaturzyklusbedingungen:
    • – 8 Zyklen: Denaturierung: 5 sec bei 94 °C; Hybridisierung: 10 sec; Elongation: 30 sec bei 72 °C, dann
    • – 13 Zyklen: Denaturierung: 5 sec bei 94 °C; Elongation: 30 sec bei 72 °C.
  • 6 Einheiten Thermosequanase und 5–25 ng Amplifikationsprodukt wurden pro Sequenzierungsreaktion verwendet.
  • Ausgehend von den Amplifikationszyklen werden die Produkte der Sequenzierungsreaktionen in Ethanol präzipitiert, resuspendiert in Aufgabepuffer, der Formamid enthält, denaturiert und auf 4 % Acrylamidgele gegeben; die Elektrophoresen (2 Stunden 30 bei 3000 Volt) werden auf ABI 377-Sequenzierern, die ausgestattet sind mit der Aufnahme- und Analyse-Software ABI (ABI Prism DNA Sequencing Analyses Software, Version 2.1.2) durchgeführt.
    • – Sequenzanalyse
  • Da GPAO-J ist eine autosomal dominante Krankheit ist, wurden die erhaltenen Sequenzdaten analysiert, um das Vorliegen von heterozygoten Stellen unter Patienten, die an juvenilem Glaukom erkrankt waren, nachzuweisen. Die heterozygoten Stellen wurden bestätigt nach Vergleich der Sequenzen der zwei genomischen DNA-Stränge von jedem betroffenen Individuum. Eine heterozygote Stelle wird als Mutationskandidat beibehalten, der verantwortlich ist für das plötzliche Auftreten von Problemen, die mit FMO verbunden sind, wenn sie in einer Population von Mitgliedern der gleichen Familie vorliegt, während sie im Allgemeinen nicht vorliegt bei Kontrollen, die nicht mit der Familie verwandt sind.
  • Ergebnisse
  • Unter allen untersuchten Amplifikationsfragmenten, die von BAC 123H04M abgeleitet sind, stellt eines unter diesen eine heterozygote Stelle dar, die mit dem plötzlichen Auftreten von juvenilem Glaukom in einem Stammbaum, dargestellt in 8, sezerniert wird.
  • Diese heterozygote Stelle (G/A) liegt bei 7 Patienten vor, die an GPAO-J erkrankt sind, während sie bei 3 gesunden homozygoten Patienten (G/G) nicht vorliegt, wobei alle von der gleichen Familie stammen. Weiterhin sind 99 nichtverwandte Kontrollen ebenso homozygot (G/G) für diese Stelle, wodurch angezeigt wird, dass die Häufigkeit des Allels A in der allgemeinen Population kleiner als 0,005 ist.
  • Die Stelle ist enthalten im Exon 8 des Gens, das für das Protein hFMO2 gemäß der Erfindung codiert; die beschriebene Mutation verändert Glutaminsäure in Position 402 der Sequenz SEQ ID Nr. 1 des hFMO2 zu Lysin (1).
  • Es ist überraschend festzustellen, dass die LOD-Score-Berechnung, die die vorhergehenden Daten für verschiedene Häufigkeitshypothesen für jedes Allel in der allgemeinen Population integriert, eine Wahrscheinlichkeit von mehr als 100 zu eins angibt, dass die beschriebene Heterozygotie (G/A) mit GPAO-J verbunden ist (Tabelle 6). Diese Wahrscheinlichkeit ist signifikant für die Tatsache, dass die Analyse von einer einzigen Familie getragen wird.
  • Die Primer, die die Amplifikation des DNA-Fragments erlaubt haben, das die heterozygote Stelle enthält, sind in Tabelle 1 beschrieben.
  • Tabelle 1: Primersequenzen, die verwendet werden zum Amplifizieren der Exon-Region, die von BAC 123H04M abgeleitet ist und eine heterozygote Stelle enthält, die mit juvenilem GPAO verbunden ist.
    • Locus des Fragments: FMO2/Exon 8
    • Größe des amplifizierten Fragments: 420
    • Primer: PU stromaufwärts (SEQ ID Nr. 7): 5'TCACATAGAGTGCTATGGGGG RP stromabwärts (SEQ ID Nr. 8): 5'CTTAGGAAGAAGATAAAAATGCAAC
  • Tabelle 2: Beispiele der Primer zum Nachweisen der Mutation G.1263mac.A durch „Single Nucleotide Primer Extension"
    • a) SEQ ID Nr. 9: 5' AATGTCCATCATCATAGTTCTCT 3' (Antisense) und/oder
    • b) SEQ ID Nr. 10: 5' TAGGCTTGTGTAGCCTGCCCTCA 3'(Sense)
  • Tabelle 3: Identifizierung der Mutation G.1263mac.A durch RFLP
    Figure 00420001
  • Tabelle 4: Beispiel von Sonden für den Nachweis der Mutation G.1263mac.A durch die ASO-Technik
    Figure 00430001
  • Tabelle 5: Sequenz der Primer, die verwendet wurden zur Sequenzierung der Amplifikationsfragmente, ausgehend von genomischer DNA
    • PU 5'TGTAAAACGACGGCCAGT
    • RP 5'CAGGAAACAGCTATGACC
  • Tabelle 6: Lod-Score zwischen dem Polymorphismus G.1263mac.A und dem juvenilen GPAO in der untersuchten Familie als Funktion der Häufigkeit der beiden Allele in der allgemeinen Population.
    Figure 00430002
  • Sequenzprotokoll
    • SEQ ID Nr. 1
    • SEQ ID Nr. 2
    • SEQ ID Nr. 3
    • SEQ ID Nr. 4
    • SEQ ID Nr. 5
    • SEQ ID Nr. 6
    • SEQ ID Nr. 7
    • SEQ ID Nr. 8
    • SEQ ID Nr. 9
    • SEQ ID Nr. 10
    • SEQ ID Nr. 11
    • SEQ ID Nr. 12
    • SEQ ID Nr. 13
    • SEQ ID Nr. 14
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Claims (40)

  1. Isolierte Nukleotidsequenz, dadurch gekennzeichnet, dass sie für die humane Variante des Proteins FMO2 der Sequenz SEQ ID Nr. 3 codiert, die einen Lysinrest anstelle eines Glutaminsäurerests in Position 402 der Sequenz SEQ ID Nr. 3 aufweist.
  2. Isolierte Nukleotidsequenz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sie für die Variante des humanen Proteins FMO2 der Sequenz SEQ ID Nr. 3 codiert, die einen Lysinrest anstelle eines Glutaminsäurerests in Position 402 der Sequenz SEQ ID Nr. 3 aufweist und dass sie eine Sequenz umfasst, ausgewählt aus: a) der Nukleotidsequenz von dem Nukleotid in Position 2001 bis zu dem Nukleotid in Position 2056 der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1, b) der Nukleotidsequenz von dem Nukleotid in Position 2405 bis zu dem Nukleotid in Position 2542 der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1, c) der Nukleotidsequenz von dem Nukleotid in Position 10026 bis zu dem Nukleotid in Position 10214 der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1, d) der Nukleotidsequenz von dem Nukleotid in Position 13341 bis zu dem Nukleotid in Position 13503 der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1, e) der Nukleotidsequenz von dem Nukleotid in Position 16036 bis zu dem Nukleotid in Position 16178 der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1, f) der Nukleotidsequenz von dem Nukleotid in Position 20558 bis zu dem Nukleotid in Position 20757 der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1, g) der Nukleotidsequenz von dem Nukleotid in Position 21972 bis zu dem Nukleotid in Position 22327 der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1, h) der Nukleotidsequenz von dem Nukleotid in Position 24411 bis zu dem Nukleotid in Position 24483 der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1, in welcher das Nukleotid in Position 24431 der SEQ ID Nr. 1 ein Adenosin anstelle eines Guanins ist, i) der Nukleotidsequenz von dem Nukleotid in Position 25487 bis zu dem Nukleotid in Position 25899 der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1, j) der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1, in welcher das Nukleotid in Position 24431 ein Adenosin anstelle eines Guanins ist, und k) der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 2 in welcher das Nukleotid in Position 1266 ein Adenosin anstelle eines Guanins ist.
  3. Isolierte Nukleotidsequenz, dadurch gekennzeichnet, dass sie ausgewählt ist aus den Sequenzen, die für ein Polypeptid codieren, umfassend das Polypeptid der Sequenz SEQ ID Nr. 3, das einen Lysinrest anstelle eines Glutaminsäurerests in Position 402 aufweist, oder komplementär ist zu einer Sequenz nach Anspruch 1 oder 2.
  4. Nukleotidprimer, dadurch gekennzeichnet, dass seine Sequenz ausgewählt ist aus den Sequenzen SEQ ID Nr. 7, SEQ ID Nr. 8, SEQ ID Nr. 9 und SEQ ID NR. 10.
  5. Nukleotidsonde, dadurch gekennzeichnet, dass ihre Sequenz ausgewählt ist aus den Sequenzen SEQ ID Nr. 11, SEQ ID Nr. 12, SEQ ID Nr. 13 und SEQ ID NR. 14.
  6. Polypeptid, codiert durch eine Nukleotidsequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 3.
  7. Polypeptid nach Anspruch 6 mit der Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 3, das einen Lysinrest anstelle eines Glutaminsäurerests in Position 402 aufweist.
  8. Klonierungsvektor und/oder Expressionsvektor in einer geeigneten Wirtszelle mit einer Nukleotidsequenz, die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie eine Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 3 aufweist.
  9. Vektor nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass er die Elemente umfasst, die die Expression und/oder Sezernierung der Sequenzen in die Wirtszelle zulassen.
  10. Vektor nach einem der Ansprüche 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um einen Vektor zur autonomen Replikation handelt.
  11. Vektor nach einem der Ansprüche 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um einen Chromosomenintegrationsvektor handelt.
  12. Vektor nach einem der Ansprüche 8 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um einen viralen Vektor handelt.
  13. Vektor nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass der Vektor realisiert wird auf Basis eines Adenovirus, eines AAV, eines Retrovirus, eines Pockenvirus oder eines Herpesvirus.
  14. Zelle, transformiert durch einen Vektor nach einem der Ansprüche 8 bis 13.
  15. Zelle nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um eine prokaryontische Zelle handelt.
  16. Zelle nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um eine eukaryontische Zelle handelt.
  17. Nichthumanes Lebewesen, dadurch gekennzeichnet, dass es eine Zelle nach einem der Ansprüche 14 bis 16 aufweist.
  18. Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Polypeptids nach den Ansprüchen 6 und 7, dadurch gekennzeichnet, dass eine Zelle nach einem der Ansprüche 14 bis 16 kultiviert wird und das produzierte Protein gewonnen wird.
  19. Polyklonale oder monoklonale Antikörper gegen mutiertes humanes FMO2, die spezifisch gegen ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 6 oder 7 gerichtet sind, das die Lysin-Mutation in Position 402 der Sequenz SEQ ID Nr. 3 aufweist.
  20. Polyklonale oder monoklonale Antikörper nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass sie erhalten wurden durch Immunreaktion eines humanen oder tierischen Organismus mit einem immunogenen Mittel, bestehend aus einem Polypeptid nach einem der Ansprüche 6 oder 7, das die Lysin-Mutation in Position 402 der Sequenz SEQ ID Nr. 3 aufweist.
  21. Antikörper nach einem der Ansprüche 19 oder 20, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um einen markierten Antikörper handelt.
  22. Verwendung eines Antikörpers nach Anspruch 21 zur Herstellung einer Zusammensetzung, die zur Bilddarstellung vorgesehen ist.
  23. Verwendung von Zellen nach einem der Ansprüche 14 bis 16 oder von einem Lebewesen nach Anspruch 17 zur in vitro-Selektion von direkt oder indirekt mit der Aktivität von mutiertem FMO2 in Zusammenhang stehenden Produkten.
  24. Verwendung von Zellen nach einem der Ansprüche 14 bis 16 oder von einem Lebewesen nach Anspruch 17 zur in vitro-Selektion von Produkten, die mit mutiertem FMO2 wechselwirken.
  25. Diagnoseverfahren einer Prädisposition für juveniles Glaukom bei einem Patienten, dadurch gekennzeichnet, dass man zu Beginn einer biologischen Voruntersuchung des Patienten das Vorliegen der Mutation G24431A im Gen FMO2 durch die Analyse der gesamten oder eines Teils einer Nukleinsäuresequenz, die dem Gen entspricht, bestimmt, wobei das Vorliegen mindestens einer solchen Mutation kennzeichnend für eine Prädisposition des Patienten für juveniles Glaukom ist.
  26. Verfahren nach Anspruch 25, worin die analysierte Nukleinsäuresequenz eine genomische DNA, eine cDNA oder mRNA ist.
  27. Verfahren nach einem der Ansprüche 25 oder 26, dadurch gekennzeichnet, dass die Analyse durch Hybridisierung realisiert wird.
  28. Verfahren nach einem der Ansprüche 25 bis 27, dadurch gekennzeichnet, dass das Vorliegen einer Mutation nachgewiesen wird durch Vergleich mit der entsprechenden natürlichen, nichtmutierten Sequenz.
  29. Verfahren nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, dass die Hybridisierung realisiert wird mit Hilfe mindestens einer Oligonukleotidsonde, die spezifisch für das Allel ist.
  30. Verfahren nach einem der Ansprüche 25 oder 26, dadurch gekennzeichnet, dass die Analyse durch Sequenzieren realisiert wird.
  31. Verfahren nach einem der Ansprüche 25 oder 26, dadurch gekennzeichnet, dass die Analyse durch elektrophoretische Migration und im Spezielleren durch SSCP oder DGGE realisiert wird.
  32. Verfahren nach einem der Ansprüche 25 bis 31, dadurch gekennzeichnet, dass die gesamte oder ein Teil der Nukleinsäuresequenz des mutierten FMO-Gens vorab amplifiziert wird, wie durch Mutation gezeigt wird.
  33. Verfahren nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, dass die Amplifikation realisiert wird durch PCR oder durch ein Verfahren, ausgewählt aus dem NASBA-(Nucleic Acid Sequence based Amplification), TAS-(Transcription based Amplification System), LCR-(Ligase Chain Reaction), ERA-(Endo Run Amplification), CPR-(Cycling Probe Reaction) und SDA-(Strand Displacement Amplification) Verfahren.
  34. Verfahren nach einem der Ansprüche 32 oder 33, dadurch gekennzeichnet, dass die zur Realisierung der Amplifikation ausgewählten Primer ausgewählt werden aus den Primern nach Anspruch 4.
  35. Reaktives Mittel zum Nachweisen und/oder Identifizieren der Mutation G24431A der Sequenz SEQ ID Nr. 1 des humanen FMO2-Gens in einer biologischen Probe, gekennzeichnet dadurch, dass es eine Einfangsonde und/oder eine Nachweissonde umfasst, wobei die mindestens eine dieser Sonden eine Sequenz nach Anspruch 5 umfasst, oder dadurch, dass es einen Antikörper nach einem der Ansprüche 19 bis 21 aufweist.
  36. Diagnoseverfahren für eine Prädisposition für juveniles Glaukom eines Patienten, dadurch gekennzeichnet, dass man zu Beginn einer biologischen Voruntersuchung des Patienten das Vorliegen des mutierten FMO2 entsprechend der Mutation G24431A der Sequenz SEQ ID Nr. 1 des FMO2-Gens mit Hilfe eines mono- oder polyklonalen Antikörpers nach einem der Ansprüche 19 bis 21 bestimmt.
  37. Verfahren nach Anspruch 36, dadurch gekennzeichnet, dass der Nachweis durch ein ELISA- oder RIA-Verfahren erfolgt.
  38. Therapeutische Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, dass sie als aktives Mittel mindestens einen Agonisten des mutierten humanen FMO2, entsprechend der Mutation G24431A der Sequenz SEQ ID Nr. 1, aufweist, wobei der Agonist ausgewählt ist aus den folgenden Zusammensetzungen: a) einem Polypeptid nach Anspruch 6 oder 7, b) einem Expressionsvektor nach einem der Ansprüche 8 bis 13, c) einer Nukleotidsequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Sequenz eine Sense-Sequenz ist, die die Induktion der Expression des mutierten FMO2 induziert.
  39. Therapeutische Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, dass sie als aktives Mittel einen Antagonisten des mutierten humanen FMO2, entsprechend der Mutation G24431A der Sequenz SEQ ID Nr. 1, aufweist, wobei der Antagonist ausgewählt ist aus den folgenden Zusammensetzungen: a) einem Antikörper gegen mutieres FMO2 nach einem der Ansprüche 19 bis 22, b) einer Nukleotidsequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Sequenz eine Antisense-Sequenz ist, die die Expression des mutierten FMO2 inhibiert, c) einer Nukleotidsequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Sequenz eine Sense-Sequenz ist, die die Expression des mutierten FMO2 inhibiert.
  40. Verwendung eines aktiven Mittels, das in der Lage ist zum Modulieren der Aktivität von mutiertem humanem FMO2, entsprechend der Mutation G24431A der Sequenz SEQ ID Nr. 1, zum Realisieren eines Medikaments, das vorgesehenen ist zur Behandlung und/oder Verhinderung von juvenilem Glaukom, dadurch gekennzeichnet, dass das aktive Mittel ausgewählt ist aus einem Agonisten oder Antagonisten nach einem der Ansprüche 38 und 39.
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