DE69332041T2

DE69332041T2 - Microsomales Triglyceridtransferprotein

Info

Publication number: DE69332041T2
Application number: DE69332041T
Authority: DE
Inventors: John R. Wetterau Ii; Daru Young Sharp; Richard E. Gregg
Original assignee: ER Squibb and Sons LLC
Current assignee: ER Squibb and Sons LLC
Priority date: 1992-03-06
Filing date: 1993-03-08
Publication date: 2004-04-29
Anticipated expiration: 2013-03-09
Also published as: HU218419B; HU9300627D0; DE69332041D1; ATE219514T1; DE69332041T3; DK0584446T4; ES2178640T3; PT584446E; HUT67962A; CA2091102A1; EP0584446A3; DK0584446T3; AU670930B2; EP0584446B2; JP4298801B2; EP0584446A2; EP0584446B1; JPH0638761A; MX9301269A; ZA931601B

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft das mikrosomale Triglycerid-Transferprotein, Gene für das Protein, Expressionsvektoren, die die Gene enthalten, Wirtszellen, die die Vektoren enthalten, Verfahren zur Herstellung des Proteins, Verfahren zum Nachweis von Inhibitoren des Proteins und Verfahren zur Verwendung des Proteins und/oder seiner Inhibitoren.
Das mikrosomale Triglycerid-Transferprotein (MTP) katalysiert den Transport von Triglycerid (TG), Cholesterinester (CE) und Phosphatidylcholin (PC) zwischen kleinen unilamellaren Vesikeln (SUV). Wetterau und Zilversmit, Chem. Phys. Lipids 38 (1985), 205–222. Wenn man die Transferraten als Prozent des pro Zeit transferierten Donor-Lipids angibt, wird deutlich, dass das MTP den Transport neutraler Lipide (TG und CE) deutlich bevorzugt, im Vergleich zum Transport von Phospholipiden. Das Protein aus Rinderleber wurde isoliert und charakterisiert. Wetterau und Zilversmit, Chem. Phys. Lipids 38 (1985), 205–222. Die Analyse des gereinigten Proteins durch Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese (PAGE) legt nahe, dass das Transferprotein ein Komplex aus zwei Untereinheiten mit offensichtlichen Molekulargewichten von 58000 und 88000 ist, denn wenn das gereinigte MTP einer Elektrophorese unter nicht-denaturierenden Bedingungen unterworfen wurde, lag eine einzelne Bande vor, während zwei Banden mit offensichtlichen Molekulargewichten von 58000 und 88000 identifiziert wurden, wenn die Elektrophorese in Gegenwart von Natriumdodecylsulfat (SDS) durchgeführt wurde. Diese zwei Polypeptide werden nachstehend bezeichnet als: 58-kDa bzw. 88-kDa oder als die 58-kDa- bzw. die 88-kDa-Komponente des MTP oder als die Untereinheit mit niedrigem Molekulargewicht bzw. die Untereinheit mit hohem Molekulargewicht des MTP.
Die Charakterisierung der Komponente mit dem Molekulargewicht von 58000 des Rinder-MTP zeigt, dass es sich hierbei um das schon früher charakterisierte multifunktionale Protein, die Proteindisulfid-Isomerase (PDI) handelt. Wetterau et al., J. Biol. Chem. 265 (1990), 9800–9807. Die Vermutung, dass die PDI in dem Trans ferprotein vorliegt, wird durch die folgenden Beweise bestätigt, die zeigen, dass (1) die aminoterminalen 25 Aminosäuren der 58000-kDa-Komponente des Rinder-MTP mit denen der Rinder-PDI identisch sind, und dass (2) das Rinder-MTP nach Dissoziation des 58-kDa-88-kDa-Proteinkomplexes die Disulfid-Isomerase-Aktivität aufwies. Außerdem waren Antikörper, die gegen die Rinder-PDI, ein Protein, das selbst keine TG-Transferaktivität besitzt, hervorgerufen wurden, in der Lage, die Rinder-TG-Transferaktivität aus einer Lösung Immunzufällen, die gereinigtes Rinder-MTP enthielt.
Die PDI spielt normalerweise bei der Faltung und bei der Zusammenlagerung von neu-synthetisierten Disulfid-gebundenen Proteinen innerhalb des Lumens des endoplasmatischen Retikulums eine Rolle. Bulleid und Freedman, Nature 335 (1988), 649–651. Sie katalysiert die richtige Paarung von Cysteinresten zu Disulfidbindungen, wodurch die richtige Faltung von Disulfid-gebundenen Proteinen katalysiert wird. Außerdem wurde berichtet, dass die PDI identisch ist mit der Beta-Untereinheit der Prolyl-4-Hydroxylase des Menschen. Koivu et al., J. Biol. Chem. 262 (1987), 6447–6449. Bisher konnte nicht geklärt werden, welche Rolle die PDI im Transferprotein des Rindes spielt. Sie scheint eine essentielle Komponente des Transferproteins zu sein, da die Dissoziation der PDI von der 88-kDa-Komponente des Rinder-MTP durch niedrige Konzentrationen eines denaturierenden Mittels (Guanidin-HCl), eines chaotropen Mittels (Natriumperchlorat) oder eines nicht-denaturierenden Detergens (Octylglucosid) zu einem Verlust der Transferaktivität führt. Wetterau et al., Biochemistry 30 (1991), 9728–9735. Die isolierte Rinder-PDI hat keine offensichtliche Lipid-Transferaktivität; dies legt nahe, dass das 88-kDa-Polypeptid entweder das Transferprotein darstellt oder dem Proteinkomplex die Transferaktivität verleiht.
Die Gewebe- und subzelluläre Verteilung der MTP-Aktivität bei Ratten wurde untersucht. Wetterau & Zilversmit, Biochem. Biophys. Acta 875 (1986), 610–617. Die Lipid-Transferaktivität wurde in Leber und Darm gefunden. Eine nur geringe oder keine Transferaktivität lag in Plasma, Gehirn, Herz oder Niere vor. In der Leber war das MTP ein lösliches Protein, das innerhalb des Lumens der mikrosomalen Fraktion vorlag. Etwa gleichwertige Konzentrationen wurden in den glatten und in den rauen Mikrosomen gefunden.
Die Abeta-Lipoproteinämie ist eine autosomal-rezessiv vererbte Erkrankung, die praktisch durch ein Fehlen von Plasma-Lipoproteinen gekennzeichnet ist, die Apolipoprotein B (apoB) enthalten. Kane und Havel, in: „The Metabolic Basis of Inherited Disease", 6. Aufl., 1139–1164, (1989). Die Plasma-TG-Spiegel können sehr niedrig sein, etwa bei nur wenigen mg/dl liegen, und steigen auch nach der Aufnahme von Fett nicht an. Die Plasma-Cholesterinspiegel betragen häufig nur 20 bis 45 mg/dl. Diese Anomalien sind das Ergebnis eines genetischen Defekts bei der Zusammenlagerung und/oder bei der Sekretion von Lipoproteinen sehr niedriger Dichte (VLDL) in der Leber und Chylomikronen im Darm. Die molekulare Grundlage für diesen Defekt wurde bisher noch nicht geklärt. Bei den untersuchten Patienten scheinen die Triglycerid-, Phospholidpid- und Cholesterinsynthese normal zu sein. Bei der Autopsie zeigt sich, dass die Patienten keinerlei Arteriosklerose aufweisen. Schaefer et al., Clin. Chem. 34 (1988), B9-12. Eine Verbindung zwischen dem apoB-Gen und der Abeta-Lipoproteinämie wurde in mehreren Familien ausgeschlossen. Talmud et al., J. Clin. Invest. 82 (1988), 1803–1806; und Huang et al., Am. J. Hum. Genet. 46 (1990), 1141–1148.
Patienten mit Abeta-Lipoproteinämie leiden an zahlreichen Erkrankungen. Kane und Havel, vorstehend. Die Patienten haben eine Fett-Malabsorption und eine TG-Akkumulation in ihren Enterocyten (Darmepithelzellen) und Hepatocyten. Aufgrund des Fehlens von TG-reichen Plasma-Lipoproteinen liegt ein Defekt im Transport von fettlöslichen Vitaminen wie Vitamin E vor. Hierdurch kommt es zu einer Akanthozytose der Erythrocyten, einer spinozerebellären Ataxie mit Degeneration des Fasciculus cuneatus und gracilis, einer peripheren Neuropathie, einer degenerativen Retinopathia pigmentosa und einer Zeroid-Myopathie. Die Patienten mit Abeta-Lipoproteinämie werden u. a. durch eine diätetische Einschränkung der Fettaufnahme und eine diätetische Ergänzung der Vitamine A, E und K behandelt.
Bisher konnte die physiologische Rolle des MTP noch nicht geklärt werden. In vitro katalysiert es den Transport von Lipidmolekülen zwischen Phospholipid-Membranen. Vermutlich spielt es in vivo eine ähnliche Rolle und spielt somit eine gewisse Rolle im Lipidmetabolismus. Aufgrund der subzellulären Verteilung des MTP (Lumen der mikrosomalen Fraktion) und der Verteilung des MTP in bestimmten Geweben (Leber und Darm) kann man davon ausgehen, dass dieses Protein möglicherweise bei der Zusammenlagerung von Plasma-Lipoproteinen eine Rolle spielt, da dies die Orte sind, an denen die Zusammenlagerung von Plasma-Lipoproteinen erfolgt. Wetterau und Zelversmit, Biochem. Biophys. Acta 875 (1986), 610–617. Die Fähigkeit des MTP, den Transport von TG zwischen Membranen zu katalysieren, stimmt mit dieser Hypothese überein und legt nahe, dass das MTP möglicherweise den Transport von TG von seinem Syntheseort in der Membran des endoplasmatischen Retikulums (ER) zu naszierenden Lipoprotein-Partikeln innerhalb des Lumens des ER katalysiert.
Olofsson und Kollegen haben die Lipoprotein-Zusammenlagerung in HepG2-Zellen untersucht. Bostrom et al., J. Biol. Chem. 263 (1988), 4434–4442. Ihre Ergebnisse legen nahe, dass kleine Vorläufer-Lipoproteine mit der Zeit größer werden. Dies würde übereinstimmen mit der Anlagerung oder dem Transfer von Lipidmole külen an/auf naszierende Lipoproteine, während diese zusammengelagert werden. Möglicherweise spielt das MTP in diesem Prozess eine Rolle. Diese Hypothese wird durch Howell und Palade, J. Cell Biol. 92 (1982), 833–845, bestärkt, die naszierende Lipoproteine aus der hepatischen Golgi-Fraktion der Rattenleber isolierten. Dabei wurde ein Spektrum von verschiedenen Größen der Partikel erhalten, die in unterschiedlichen Lipid- und Proteinzusammensetzungen vorlagen. Partikel der Lipoproteine hoher Dichte (HDL) wurden gefunden, die auch noch apoB enthielten. Higgins und Hutson, J. Lipid Res. 25 (1984), 1295–1305, beschrieben, dass die aus Golgi isolierten Lipoproteine durchweg größer waren als die aus dem endoplasmatischen Retikulum; dies legt wiederum nahe, dass die Zusammenlagerung von Lipoproteinen ein fortschreitender Prozess ist. Es gibt jedoch keinen direkten Beweis nach dem Stand der Technik, der zeigen würde, dass das MTP im Lipidmetabolismus oder bei der Zusammenlagerung von Plasma-Lipoproteinen eine Rolle spielt.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein isoliertes Nucleinsäuremolekül, das eine Nucleinsäure umfasst, die die gesamte oder einen Teil der in SEQ ID NO: 1, 2, 5, 7, 8 dargestellten Nucleotidsequenz, die Nucleotidsequenz von SEQ ID NO: 1 zusammen mit SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 2 zusammen mit SEQ ID NO: 7, die ersten 108 Basen von SEQ ID NO: 2 zusammen mit SEQ ID NO: 8 oder die ersten 108 Basen von SEQ ID NO: 2 zusammen mit SEQ ID NO: 7 und 8 aufweist.
Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem ein Nucleinsäuremolekül mit einer Sequenz, die komplementär ist zu den vorstehenden Sequenzen und/oder Intron-, flankierenden 5'- oder 3'-Regionen davon.
Ferner betrifft die vorliegende Erfindung Expressionsvektoren, die eine DNA-Sequenz umfassen, die die gesamte oder einen Teil der Untereinheit mit hohem Molekulargewicht des MTP codiert.
Außerdem betrifft die vorliegende Erfindung prokaryotische oder eukaryotische Wirtszellen, die einen Expressionsvektor enthalten, der eine DNA-Sequenz umfasst, die die gesamte oder einen Teil der Untereinheit mit hohem Molekulargewicht des MTP codiert.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner Verfahren zum Nachweis von Nucleinsäuresequenzen, die die gesamte oder einen Teil der Untereinheit mit hohem Molekulargewicht des MTP codieren, oder verwandten Nucleinsäuresequenzen.
Außerdem betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren zum Nachweis eines Inhibitors des MTP.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein neues Verfahren für die Behandlung von Arteriosklerose oder zum Absenken des Spiegels der Serumlipide wie Serum-Cholesterin, TG, PC oder CE, in einer Säugerart, umfassend die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge eines Mittels, das die Aktivität oder die Menge des MTP senkt. Solche Mittel könnten auch für die Behandlung von Krankheiten verwendet werden, die mit den Serumlipidspiegeln in Zusammenhang stehen oder dadurch beeinflusst werden, wie Pankreatitis, Hyperglykämie, Adipositas und dergleichen.
1 zeigt Rinder-cDNA-Clone. Die fünf Rinder-cDNA-Insertionen sind dargestellt. Die fortlaufende Linie oben in der Figur steht für die gesamte isolierte cDNA-Sequenz. Die kleinen beschrifteten Striche über dieser Linie geben die Lage der Peptid- und Sondensequenzen wieder. Das offene Leseraster ist durch die zweite Linie angegeben, worauf ** folgt, entsprechenden nicht-codierenden 3'-Sequenzen. Die Nummer und die Länge des Clons sind am linken Rand der jeweiligen Linie angegeben, die den entsprechenden Bereich der zusammengesetzten Sequenz darstellt. Die Clone 64 und 76 wurden mit der Sonde 2A isoliert, die Clone 22 und 23 mit der Sonde 37A, und der Clon 2 mit der Sonde 19A. EcoRI-Linker, die während der Konstruktion der cDNA-Bank angefügt wurden, bilden die EcoRI-Restriktionsstellen am 5'- und am 3'-Ende der jeweiligen Insertion. Die innere EcoRI-Stelle in den Insertionen 22 und 76 wird durch die cDNA-Sequenz codiert. Die NheI-Restriktionsstelle wurde zur Herstellung von Sonden zur Isolierung menschlicher cDNA-Clone verwendet (nachstehend). Die Pfeile unter jeder Insertionslinie bezeichnen die einzelnen Sequenzierungsreaktionen.
2 zeigt die TG-Transferaktivität bei normalen Personen. Der Protein stimulierte Transfer von ¹⁴C-TG von Donor-SUV zu Akzeptor-SUV wurde in homogenisierten Darmbiopsien gemessen, die aus fünf normalen Personen erhalten wurden. Die Ergebnisse sind angegeben als Prozentsatz des pro Stunde transferierten Donor-TG als Funktion des Proteins der homogenisierten Darmbiopsie.
3 zeigt die TG-Transferaktivität bei Patienten mit Abeta-Lipoproteinämie. Der Protein stimulierte Transfer von ¹⁴C-TG von Donor-SUV zu Akzeptor-SUV wurde in homogenisierten Darmbiopsien gemessen, die aus vier Patienten mit Abeta-Lipoproteinämie gewonnen wurden. Die Ergebnisse sind angegeben als Prozentsatz des pro Stunde transferierten Donor-TG als Funktion des Proteins der homogenisierten Darmbiopsie.
4 zeigt die TG-Transferaktivität bei Kontrollpersonen. Der Protein-stimulierte Transfer von ¹⁴C-TG von Donor-SUV zu Akzeptor-SUV wurde in homogenisierten Darmbiopsien aus drei Kontrollpersonen erhalten, von denen eine die Chylomikron-Retentionskrankheit hatte (leere Kreise), eine an homozygoter Hypobetalipoproteinämie litt (gefüllte Kreise) und eine nicht fastete (x). Die Ergebnisse sind angegeben als Prozentsatz des pro Stunde transferierten Donor-TG als Funktion des Proteins der homogenisierten Darmbiopsie.
5 zeigt eine Western-Blot-Analyse des MTP bei normalen Personen. Ein Aliquot des gereinigten Rinder-MTP (Bahn 1) oder die post 103000 × g-Proteine nach der Desoxycholat-Behandlung von 23 μg der homogenisierten Darmbiopsien aus drei normalen Personen (Bahnen 2 bis 4) wurden durch SDS-PAGE fraktioniert und dann auf Nitrocellulose überführt. Die Blots wurden mit anti-88-kDa getestet.
6 zeigt eine Western-Blot-Analyse des MTP bei Kontrollpersonen. Ein Aliquot des gereinigten Rinder-MTP (Bahn 1) oder die post 103000 × g-Proteine nach der Desoxycholat-Behandlung von 15 μg, 25 μg und 25 μg der homogenisierten Darmbiopsien aus einem Patienten mit der Chylomikron-Retentionskrankheit (Bahn 2), einem Patienten mit homozygoter Hypobetalipoproteinämie (Bahn 3) bzw. einer Person, die nicht fastete (Bahn 4), wurden durch SDS-PAGE fraktioniert und dann auf Nitrocellulose überführt. Die Blots wurden mit anti-88-kDa getestet.
7 zeigt eine Western-Blot-Analyse des MTP bei normalen Personen mit Affinitäts-gereinigten Antikörpern. Ein Aliquot des gereinigten Rinder-MTP (Bahn 1) oder die post 103000 × g-Proteine nach der Desoxycholat-Behandlung von 34 μg (Bahn 2) oder 25 μg (Bahn 3) der homogenisierten Darmbiopsien aus zwei normalen Personen wurden durch SDS-PAGE fraktioniert und dann auf Nitrocellulose überführt. Die Blots wurden mit Affinitäts-gereinigtem anti-88-kDa getestet.
8 zeigt eine Western-Blot-Analyse des MTP bei Patienten mit Abeta-Lipoproteinämie. Ein Aliquot des gereinigten Rinder-MTP (Bahn 1) oder die post 103000 × g-Proteine nach der Desoxycholat-Behandlung von 18 μg (Bahn 2), 23 μg (Bahn 3), 23 μg (Bahn 4) und 23 μg (Bahn 5) der homogenisierten Darmbiopsien aus vier verschiedenen Patienten mit Abeta-Lipoproteinämie wurden durch SDS-PAGE fraktioniert und dann auf Nitrocellulose überführt. In den Bahnen 6 und 7 wurde das gesamte Darmhomogenisat (Testpersonen entsprechend den Bahnen 4 und 5) durch SDS-PAGE fraktioniert und auf Nitrocellulose überführt. Die Blots wurden mit anti-88-kDa getestet.
9 zeigt eine Southern-Blot-Analyse eines Gendefekts bei einem Patienten mit Abeta-Lipoproteinämie. 10 μg genomische DNA von einer Kontrollperson, von dem Patienten mit Abeta-Lipoproteinämie (Proband) und von der Mutter und dem Vater des Patienten wurden jeweils mit TaqI vollständig gespalten, einer Elektrophorese auf 1% Agarose unterworfen und auf Nitrocellulose überführt. Die Southern-Hybridisierung erfolgte unter Verwendung von Exon-13-cDNA als Sonde. Zwei hybridisierende Banden in der Bahn der normalen Person zeigten, dass im normalen Exon 13 eine TaqI-Stelle vorlag. Eine hybridisierende Bande in der Bahn des Abeta-Lipoproteinämie-Patienten machte deutlich, dass diese Restriktionssequenz in beiden Allelen in Exon 13 fehlte, wodurch eine homozygote Mutation bei diesem Patienten bestätigt wurde. Der heterozygote Zustand bei der Mutter und beim Vater wird durch die drei hybridisierenden Banden verdeutlicht, die zusammen den normalen und den mutierten Restriktionsmustern entsprechen.
10 zeigt die Hemmung des MTP-katalysierten Transports von TG von Donor SUV zu Akzeptor-SUV durch die nachstehend beschriebene Verbindung A. Die Verbindung A wurde in DMSO gelöst und danach in 15/40-Puffer verdünnt. Aliquots davon wurden zu einem Lipid-Transfer-Test so zugegeben, dass die Verbindung in den angegebenen Endkonzentrationen vorlag. Die DMSO-Konzentration in dem Test stieg nie über 2 μl pro 600 μl, eine Konzentration, für die unabhängig bestimmt wurde, dass sie eine nur minimale Wirkung auf den Test hatte. Der MTP-katalysierte Lipidtransport wurde 30 Minuten bei 37°C gemessen. Die TG-Übertragung wurde berechnet und mit einem Kontrolltest ohne Inhibitor verglichen. Die MTP-Hemmung durch die Verbindung A wurde unter Verwendung von drei unabhängigen Testbedingungen gezeigt. Die Testbedingungen waren wie folgt: 8 nMol Donor-PC, 48 nMol Akzeptor-PC und 75 ng MTP (leere Kreise); 24 nMol Donor-PC, 144 nMol Akzeptor-PC und 100 ng MTP (gefüllte Kreise); 72 nMol Donor-PC, 432 nMol Akzeptor-PC und 125 ng MTP (leere Quadrate).
11 zeigt die Dosis-Antwort der Verbindung A auf die ApoB-, ApoAI- und HSA-Sekretion aus HepG2-Zellen. Die HepG2-Zellen wurden mit der Verbindung A in den angegebenen Dosen 16 Stunden behandelt. Die Konzentration in den Zellkulturmedien von apoB, apoAI und HSA wurden nach der Inkubationsperiode mit dem geeigneten ELISA-Test gemessen und auf das Gesamt-Zellprotein bezogen. Die gezeigten Werte sind als Prozentsatz der Kontrolle (nur DMSO) angegeben.
12 zeigt die Wirkung der Verbindung A auf die Sekretion von TG aus HepG2-Zellen. Die HepG2-Zellen wurden mit der Verbindung A in den angegebenen Dosen 18 Stunden inkubiert, wobei die Inkubation in den letzten zwei Stunden davon in Gegenwart von 5 μCi/ml ³H-Glycerin erfolgte. Die Konzentration von radiomarkierten Triglyceriden in den Zellkulturmedien wurde durch eine quantitative Extraktion und danach eine Analyse mittels Dünnschicht-Chromatographie gemessen; die Werte wurden dann auf das gesamte Zellprotein normalisiert. Die dargestellten Werte sind als Prozentsatz der Kontrolle (nur DMSO) angegeben.
13 zeigt die Hemmung des MTP-katalysierten Transports von TG von Donor-SUV zu Akzeptor-SUV durch die nachstehend beschriebene Verbindung B. Die Verbindung B wurde in DMSO gelöst und danach in 15/40 Puffer verdünnt. Aliquots davon wurden zu einem Lipid-Transfer-Test so zugegeben, dass die Verbindung in den angegebenen Endkonzentrationen vorlag. Die DMSO-Konzentration in dem Test stieg nie über 2 μl/600 μl, eine Konzentration, für die unabhängig bestimmt wurde, dass sie eine minimale Wirkung auf den Test hat. Der MTP-katalysierte Lipidtransport wurde 30 Minuten bei 37°C gemessen. Die TG-Übertragung wurde be rechnet und mit einem Kontrolltest ohne Inhibitor verglichen. Die MTP-Hemmung durch die Verbindung B wurde unter Verwendung von zwei unabhängigen Testbedingungen gezeigt. Die Testbedingungen waren wie folgt: 24 nMol Donor-PC, 144 nMol Akzeptor-PC und 100 ng MTP (leere Kreise); 72 nMol Donor-PC, 432 nMol Akzeptor-PC und 125 ng MTP (gefüllte Kreise).
14 zeigt die Dosis-Antwort von Verbindung B auf die ApoB-, ApoAI- und HSA-Sekretion aus HepG2-Zellen. Die HepG2-Zellen wurden mit der Verbindung B in den angegebenen Dosen 16 Stunden behandelt. Die Konzentration in den Zellkulturmedien von apoB, apoAI und HSA nach der Inkubationsperiode wurde mit einem geeigneten ELISA-Test gemessen und auf das gesamte Zellprotein bezogen. Die dargestellten Werte sind als Prozentsatz der Kontrolle (nur DMSO) angegeben.
Definition der Begriffe
Die folgenden Definitionen beziehen sich auf die Begriffe, die in dieser Beschreibung verwendet werden, sofern sie in bestimmten Fällen nicht anders eingegrenzt sind.
Der Begriff „MTP" bezieht sich auf einen Polypeptid- oder Proteinkomplex, der (1), sofern er aus einem Organismus (z. B. Kühen, Menschen usw.) gewonnen wird, aus der mikrosomalen Fraktion eines homogenisierten Gewebes isoliert werden kann; und der (2) den Transport von Triglyceriden, Cholesterinestern oder Phospholipiden von synthetischen Phospholipidvesikeln, Membranen oder Lipoproteinen zu synthetischen Vesikeln, Membranen oder Lipoproteinen stimuliert und der sich von dem Cholesterinester-Transferprotein unterscheidet (Drayna et al., Nature 327 (1987), 632–634), das möglicherweise ähnliche katalytische Eigenschaften hat. Jedoch müssen die MTP-Moleküle der vorliegenden Erfindung nicht notwendigerweise katalytisch aktiv sein. Z. B. können ein katalytisch inaktives MTP oder Fragmente davon eingesetzt werden, um Antikörper gegen das Protein zu induzieren.
Der Begriff „modifiziert" bedeutet, wenn er sich auf eine Nucleotid- oder Polypeptidsequenz bezieht, eine Nucleotid- oder Polypeptidsequenz, die sich von der in der Natur vorkommenden Wildtypsequenz unterscheidet.
Der Begriff „verwandt" bedeutet, wenn er sich auf eine Nucleotidsequenz bezieht, eine Nucleinsäuresequenz, die in der Lage ist, mit einer Oligonucleotid-Sonde zu hybridisieren, die auf der Nucleotidsequenz der Untereinheit mit hohem Molekulargewicht des MTP beruht.
Die Bezeichnung „Kontrollregionen" bezieht sich auf Nucleotidsequenzen, die die Expression des MTP oder einer beliebigen Untereinheit davon regulieren, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf Promotor, Silencerelemente, Enhancerelemente, Spleißstellen, transkriptionale Initiationselemente, transkriptionale Terminationselemente, Polyadenylierungssignale, translationale Kontrollelemente, translatio nale Startstelle, translationale Terminationsstelle und die Information stabilisierende Elemente. Solche Kontrollregionen können in den Sequenzen 5' oder 3' zu der codierenden Region oder in Introns liegen, die die codierende Region unterbrechen.
Die in der vorliegenden Beschreibung verwendete Bezeichnung „Stabilisieren" der Arteriosklerose bezieht sich auf das Verlangsamen der Entwicklung und/oder das Hemmen der Bildung von neuen arteriosklerotischen Läsionen.
Die in der vorliegenden Beschreibung verwendete Bezeichnung „Bewirken einer Regression" der Arteriosklerose bezieht sich auf das Reduzieren und/oder Eliminieren von arteriosklerotischen Läsionen.
Verwendung und Nutzen
Die Nucleinsäuren der vorliegenden Erfindung können erfindungsgemäß auf verschiedene Art und Weise eingesetzt werden. Z. B. können sie als DNA-Sonden verwendet werden, um andere cDNA- oder genomische DNA-Banken abzusuchen, wobei durch Hybridisierung andere DNA-Sequenzen selektiert werden, die Proteine codieren, die mit der Untereinheit mit hohem Molekulargewicht des MTP verwandt sind. Außerdem können die Nucleinsäuren der vorliegenden Erfindung, die die gesamte oder einen Teil der Untereinheit mit hohem Molekulargewicht des menschlichen oder des Rinder-MTP codieren, als DNA-Sonden eingesetzt werden, um andere cDNA- oder genomische DNA-Banken abzusuchen, wobei durch Hybridisierung DNA-Sequenzen selektiert werden, die MTP-Moleküle aus anderen Organismen codieren. Die Nucleinsäuren können auch eingesetzt werden, um Primer herzustellen, mit denen cDNA oder genomische DNA unter Verwendung von Techniken der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) amplifiziert werden können. Die DNA-Sequenzen der vorliegenden Erfindung können auch eingesetzt werden, um angrenzende Sequenzen in der cDNA oder im Genom zu identifizieren; z. B. diejenigen, die das Gen codieren, die flankierenden Sequenzen davon und die regulatorischen Elemente davon.
Die Polypeptide der vorliegenden Erfindung können eingesetzt werden, um die Eigenschaften des MTP zu untersuchen; z. B. seine Struktur, seinen Wirkmechanismus und seine Rolle im Lipidmetabolismus oder bei der Zusammenlagerung von Lipoprotein-Partikeln.
Verschiedene andere Verfahren, bei denen die Nucleinsäuren, Polypeptide, Expressionsvektoren und Wirtszellen verwendet werden, werden nachstehend ausführlich beschrieben.
Wenn die Verfahren der vorliegenden Erfindung durchgeführt werden, können die Mittel, die die Aktivität oder die Menge des MTP senken, an verschiedene Säugerarten verabreicht werden, z. B. an Affen, Hunde, Katzen, Ratten, Menschen usw., die eine solche Behandlung brauchen. Diese Mittel können systemisch wie oral oder parenteral, verabreicht werden.
Die Mittel, die die Aktivität oder die Menge des MTP senken, können in einer herkömmlichen systemischen Dosierungsform enthalten sein, z. B. einer Tablette, einer Kapsel, einem Elixier oder einer injizierbaren Formulierung. Die vorstehenden Dosierungsformen umfassen außerdem ein erforderliches, physiologisch verträgliches Trägermaterial, Excipiens, Gleitmittel, einen Puffer, ein antibakterielles Mittel, einen Füllstoff (z. B. Mannit), Antioxidantien (Ascorbinsäure oder Natriumbisulfit) oder dergleichen. Orale Dosierungsformen sind bevorzugt, wobei jedoch auch parenterale Formen ziemlich zufriedenstellende Ergebnisse zeigen können.
Die verabreichte Dosis muss sorgfältig eingestellt werden, entsprechend dem Alter, Gewicht und Zustand des Patienten, außerdem entsprechend der Verabreichungsroute, Dosierungsform und dem Behandlungsschema sowie dem gewünschten Ergebnis. Im allgemeinen können die vorstehend beschriebenen Dosierungsformen in einzelnen oder geteilten Dosierungen ein bis viermal täglich appliziert werden.
Genaue Beschreibung von spezifischen Ausführungsformen
Nucleinsäuren
Die vorliegende Erfindung betrifft ein isoliertes Nucleinsäuremolekül, das eine Nucleinsäuresequenz umfasst, die die in SEQ ID NO: 1, 2, 5, 7, 8 dargestellte Nucleotidsequenz, die Nucleotidsequenz von SEQ ID NO: 1 zusammen mit SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 2 zusammen mit SEQ ID NO: 7, die ersten 108 Basen von SEQ ID NO: 2 zusammen mit SEQ ID NO: 8 oder die ersten 108 Basen von SEQ ID NO: 2 zusammen mit SEQ ID NO: 7 und 8 oder einen beliebigen Teil davon aufweist, oder eine Nucleinsäuresequenz, die zu einer dieser DNA-Sequenzen komplementär ist. Im Fall einer Nucleotidsequenz (z. B. einer DNA-Sequenz), die einen Teil der Untereinheit mit hohem Molekulargewicht des MTP codiert, ist es bevorzugt, dass die Nucleotidsequenz eine Länge von mindestens etwa 15 aufeinanderfolgenden Nucleotiden, stärker bevorzugt eine Länge von mindestens etwa 20 bis 30 aufeinanderfolgenden Nucleotiden aufweist.
Das Sequenzprotokoll zeigt eine Rinder-cDNA-Nucleotidsequenz (SEQ ID NO: 1), eine menschliche cDNA-Sequenz (SEQ ID NO: 2), einen Vergleich der menschlichen und der Rinder-cDNA-Sequenz, die Rinder-Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 3), die menschliche Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 4) und einen Vergleich der menschlichen und der Rinder-Aminosäuresequenz. Bei den Vergleichen der Sequenzen stellen die mit Kästchen umgebenen Regionen eine perfekte Identität zwischen den zwei Sequenzen dar.
Vergleich der Rinder- und der menschlichen cDNA-Sequenz
Vergleich der Rinder- und der menschlichen cDNA-Sequenz
Vergleich der Rinder- und der menschlichen cDNA-Sequenz
Vergleich der Rinder- und der menschlichen Proteinsequenz
Vergleich der Rinder- und der menschlichen Proteinsequenz
Die Rinder-cDNA ist ein 2900 Basen großes, zusammengesetztes Molekül der cDNA-Sequenzen der Clone 2 und 22 und weist zwischen den Basen 1 und 2580 ein offenes Leseraster auf, das ein Translationsprodukt von 860 Aminosäuren voraussagen lässt, gefolgt von einem TGA-Stopp-Codon, 298 Basen einer nicht-codierenden 3-Strich-Sequenz und einer Poly-A-Region.
In der menschlichen cDNA lassen die 3185 Basen ein aus 894 Aminosäuren bestehendes Translationsprodukt aus den Basen 48 bis 2729 voraussagen, gefolgt von einem TGA-Stopp-Codon, 435 Basen einer nicht-codierenden 3-Strich-Sequenz und einer Poly-A-Region.
Beim Vergleich der cDNA-Sequenzen liegt zwischen den überlappenden Sequenzen in der codierenden Region (Rinder-Basen 1 bis 2583 und menschliche Basen 150 bis 2732) eine Identität von etwa 88% vor. Es ist nicht erforderlich, irgendwelche Lücken einzuführen, um dieses Ausrichten innerhalb der codierenden Region zu erreichen. Die Homologie ist in der nicht-codierenden 3'-Region etwas schwächer, wobei mehrere Lücken eingeführt werden müssen, damit eine optimale Ausrichtung möglich ist.
Die Rinder-Proteinsequenz (SEQ ID NO: 3) ist das aus 860 Aminosäuren bestehende Translationsprodukt der kombinierten Sequenz der Rinder-cDNA-Clone 2 und 22. Die Sequenzen für die Peptidfragmente, die zum Entwerfen von Oligonucleotid-Sonden verwendet wurden, sind wie folgt: Peptid 19A ist zwischen den Resten 37 und 51 zu finden, Peptid 37A zwischen den Resten 539 und 550, und Peptid 2A zwischen den Resten 565 und 572.
Die menschliche Proteinsequenz (SEQ ID NO: 4) ist das 894 Aminosäuren große Translationsprodukt des menschlichen cDNA-Clons 693.
Beim Vergleich der Aminosäuren zeigt das Rinder-Protein eine Identität mit dem menschlichen Translationsprodukt von etwa 86%. Wenn man hoch-konservierte Substitutionen an nicht-identischen Resten in Betracht zieht, sind die zwei Proteine zu etwa 94% homolog.
Die Erfinder haben ihr Wissen noch über das 5'-Ende der vorstehenden Rinder-cDNA-Sequenz hinaus mit der nachstehend 5' zu 3' dargestellten Sequenz erweitert. Die obere Linie zeigt die Nucleotidsequenz (SEQ ID NO: 5) und die unter Linie die Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 6). Die neue Sequenz, die erhalten wurde (83 Basen), ist unterstrichen.
Außerdem haben die Erfinder ihr Wissen noch über das 5'-Ende der vorstehenden menschlichen cDNA-Sequenz hinaus erweitert. Die zusätzliche Sequenz (SEQ ID NO: 7) ist wie folgt:
AGAGTCCACTTCTCA
Diese Sequenz verlängert das 5'-Ende der menschlichen MTP-cDNA-Sequenz um 15 Basen. Diese Sequenzen wurden aus dem menschlichen Leber-cDNA-Clon 754 erzeugt, der während der anfänglichen Clonierung der menschlichen cDNA isoliert wurde (vgl. Beispiel 3); sie wurden jedoch nach dem Clon 693 charakterisiert.
Die Erfinder haben auch eine partielle menschliche genomische DNA-Sequenz (SEQ ID NO: 8) für die Untereinheit mit hohem Molekulargewicht des MTP aufgeklärt. Mit den vertikalen Linien sind die Intron/Exon-Grenzen bezeichnet. Die Exonsequenzen sind mit normalen Buchstaben, die Intronsequenzen mit fetten Buchstaben wiedergegeben. Die Pfeile weisen auf Positionen der Introns hin, für die die Sequenz nicht beschrieben ist (wobei die Längen der Pfeile nicht die Größe der Introns wiedergeben). Die Zahlen in der rechten Spalte geben die erste und die letzte Base von jedem Exon an, bezogen auf die vorstehend dargestellte menschliche cDNA-Sequenz. Diese verlängerte genomische Nucleinsäure und außerdem die verlängerte cDNA sowie Fragmente davon können in der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden.
Die Nucleinsäuren der vorliegenden Erfindung können aus den verschiedensten Quellen isoliert werden, wobei jedoch die zurzeit bevorzugten Sequenzen aus menschlicher und Rinder-cDNA und aus menschlichen genomischen Banken isoliert wurden. Die exakte Aminosäuresequenz des produzierten Polypeptidmoleküls wird entsprechend der ursprünglichen DNA-Sequenz variieren.
Die Nucleinsäuren der vorliegenden Erfindung können unter Verwendung verschiedener Verfahren erhalten werden, die dem Fachmann nach dem Stand der Technik bekannt sind. Mindestens drei alternative Hauptverfahren können eingesetzt werden:

(1) Isolierung einer doppelsträngigen DNA-Sequenz aus einer genomischen DNA oder einer komplementären DNA (cDNA), die die Sequenz enthält;
(2) chemische Synthese der DNA-Sequenz; und
(3) Synthese der DNA-Sequenz durch eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR).

Im ersten Verfahren kann eine genomische oder cDNA-Bank durchmustert werden, um eine DNA-Sequenz zu identifizieren, die die gesamte oder einen Teil der Untereinheit mit hohem Molekulargewicht des MTP codiert. Z. B. können Rinder- oder menschliche cDNA-Banken durchmustert werden, um eine DNA-Sequenz zu identifizieren, die das gesamte oder einen Teil des MTP codiert. Verschiedene cDNA-Banken, z. B. eine Rinder-Dünndarm-Bank in Lambda gt10 (Clontech Laboratories, Inc. Palo Alto, CA), eine menschliche Leber-Bank in Lambda UNI-ZAP^TM XR (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA) oder eine menschliche Darm-Bank in Lambdagt10 (Clontech), können verwendet werden.
Verschiedene Techniken können eingesetzt werden, um genomische DNA- oder cDNA-Banken nach Zielsequenzen zu durchmustern, die die Untereinheit mit hohem Molekulargewicht des MTP codieren. Bei einer solcher Technik kann z. B. eine markierte einzelsträngige DNA-Sonde mit einer Sequenz eingesetzt werden, die zu einer Sequenz komplementär ist, welche die Untereinheit mit hohem Molekulargewicht des MTP codiert. Z. B. können DNA/DNA-Hybridisierungsverfahren eingesetzt werden, um die Sequenz in den clonierten Kopien der genomischen DNA oder cDNA zu identifizieren, die zu einer einzelsträngigen Form denaturiert wurden. Geeignete Sonden umfassen eine cDNA für die Untereinheit mit hohem Molekulargewicht des MTP, die aus der gleichen oder einer verwandten Art gewonnen wurde, synthetische Oligonucleotide und dergleichen.
Eine genomische DNA- oder cDNA-Bank kann auch anhand von Immunblot-Techniken nach einer genomischen DNA oder cDNA durchmustert werden, die die gesamte oder einen Teil der Untereinheit mit hohem Molekulargewicht des MTP codiert.
In einem typischen Durchmusterungsverfahren, das für die Hybridisierungstechniken geeignet ist, wird eine genomische DNA- oder cDNA-Bank zuerst auf Agaroseplatten ausgestrichen, und dann werden die Clone auf Filtermembranen, z. B. Nitrocellulose-Membranen, überführt. Die genomische Bank ist üblicherweise in einem Vektor enthalten, wie z. B. EMBL 3 oder EMBL 4 oder Derivaten davon (z. B. Lambda DASH^TM). Die cDNA-Bank ist normalerweise in einem Vektor enthalten, wie z. B. λgt10, λgt11 oder Lambda-ZAP. Anschließend kann eine DNA-Sonde mit den Clonen hybridisiert werden, so dass diejenigen Clone identifiziert werden, die die genomische DNA oder cDNA enthalten, die die gesamte oder einen Teil der Untereinheit mit hohem Molekulargewicht des MTP codiert. Andererseits können geeignete E. coli-Stämme, die die Vektoren λgt11 oder Lambda-ZAP enthalten, induziert werden, dass sie Fusionsproteine synthetisieren, die Fragmente von Proteinen enthalten, welche der cDNA-Insertion im Vektor entsprechen. Die Fusionsproteine können auf Filtermembranen, z. B. Nitrocellulose, überführt werden. Anschließend kann ein Antikörper an das Fusionsprotein gebunden werden, wodurch die gesamte oder ein Teil der Untereinheit mit hohem Molekulargewicht des MTP identifiziert werden kann.
In dem zweiten Verfahren können die Nucleinsäuren der vorliegenden Erfindung, die die gesamte oder einen Teil des MTP codieren, chemisch synthetisiert werden. Kürzere Oligonucleotide wie solche, die aus 15 bis 50 Nucleotiden bestehen, können direkt synthetisiert werden. Bei längeren Oligonucleotiden kann die DNA-Sequenz, die die Untereinheit mit hohem Molekulargewicht des MTP codiert, als eine Serie von aus 50 bis 100 Basen bestehenden Oligonucleotiden synthetisiert werden, die sodann nacheinander ligiert werden können (über geeignete terminale Restriktionsstellen), so dass die korrekte lineare Nucleotidsequenz gebildet wird.
Im dritten Verfahren können die Nucleinsäuren der vorliegenden Erfindung, die die gesamte oder einen Teil der Untereinheit mit hohem Molekulargewicht des MTP codieren, unter Verwendung einer PCR synthetisiert werden. Kurz gesagt werden Paare von synthetischen DNA-Oligonucleotiden, im allgemeinen mit einer Länge von mindestens 15 Basen (PCR-Primer), die mit gegenüberliegenden Strängen der Ziel-DNA-Sequenz hybridisieren, verwendet, um die dazwischenliegende DNA-Region auf der Zielsequenz enzymatisch zu amplifizieren. Wiederholte Zyklen aus Hitze-Denaturierung der Matrize, Anelierung der Primer und Verlängerung der 3'-Enden der anelierten Primer mit einer DNA-Polymerase führen zur Amplifikation des Segments, das durch die PCR-Primer definiert ist; vgl. White, T. J., et al., Trends Genet. 5 (1989), 185–189.
Die Nucleinsäuren der vorliegenden Erfindung, die das gesamte oder einen Teil des MTP codieren, können auch modifiziert werden (d. h. mutiert), wobei verschiedene Mutationen hergestellt werden können. Durch solche Mutationen wird möglicherweise die Aminosäuresequenz verändert, die durch das mutierte Codon codiert wird, oder es kann sich um stumme Mutationen handeln, die die Aminosäuresequenz nicht verändern. Diese modifizierten Nucleinsäuren können hergestellt wer den, indem z. B. die Nucleinsäure mutiert wird, die die Untereinheit mit hohem Molekulargewicht des MTP codiert, so dass die Mutation zur Deletion, Substitution, Insertion, Inversion oder Addition von einer oder mehreren Aminosäuren in dem codierten Polypeptid führt, wobei verschiedene Verfahren verwendet werden können, die nach dem Stand der Technik bekannt sind. Z. B. können die Verfahren der ortsgerichteten Mutagenese verwendet werden, die von Taylor, J. W., et al., Nucl. Acids Res. 13 (1985), 8749–8764; und Kunkel, J. A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 (1985), 482–492, beschrieben werden. Außerdem können Kits zur ortsgerichteten Mutagenese bei Händlern bezogen werden. Z. B. kann ein Kit zum Durchführen einer ortsgerichteten Mutagenese von Amersham Corp. (Arlington Heights, IL) bezogen werden. Außerdem können auch Verfahren der Disruption, Deletion und Verkürzung eingesetzt werden, die in Sayers, J. R., et al., Nucl. Acids Res. 16 (1988), 791–800, beschrieben sind. Mutationen können für die Herstellung oder Verwendung der erfindungsgemäßen Polypeptide vorteilhaft sein. Z. B. können diese Mutationen die Funktion des Proteins modifizieren (wobei sie z. B. zu einer höheren oder niedrigeren Aktivität führen können), sie können höhere Proteinproduktionsraten oder eine einfachere Reinigung des Proteins möglich machen, oder sie können weitere Restriktionsendonuclease-Erkennungsstellen in der Nucleinsäure bereitstellen. Alle solchen modifizierten Nucleinsäuren und Polypeptidmoleküle sind im Umfang der vorliegenden Erfindung enthalten.
Expressionsvektoren
Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem Expressionsvektoren, die eine DNA-Sequenz enthalten, die die gesamte oder einen Teil der Untereinheit mit hohem Molekulargewicht des MTP oder einen Proteinkomplex codiert, der sowohl die Untereinheit mit hohem als auch die mit niedrigem Molekulargewicht oder Teile davon umfasst. Die Expressionsvektoren enthalten vorzugsweise die gesamte oder einen Teil der DNA-Sequenz, die die in SEQ ID NO: 1, 2, 5, 7, 8 dargestellte Nucleotidsequenz, die Nucleotidsequenz von SEQ ID NO: 1 zusammen mit SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 2 zusammen mit SEQ ID NO: 7, die ersten 108 Basen von SEQ ID NO: 2 zusammen mit SEQ ID NO: 8 oder die ersten 108 Basen von SEQ ID NO: 2 zusammen mit SEQ ID NO: 7 und 8 aufweist. Weiterhin sind Expressionsvektoren bevorzugt, die eine oder mehrere regulatorische DNA-Sequenzen umfassen, die mit der DNA-Sequenz funktionell verbunden sind, die die gesamte oder einen Teil der Untereinheit mit hohem Molekulargewicht des MTP codiert. Der in diesem Zusammenhang verwendete Begriff „funktionell verbunden" bedeutet, dass die regulatorischen DNA-Sequenzen in der Lage sind, die Replikation und/oder die Expression der DNA-Sequenz zu steuern, die die gesamte oder einen Teil der Untereinheit mit hohem Molekulargewicht des MTP codiert.
Expressionsvektoren, die für die vorliegenden Erfindung geeignet sind, liegen häufig in Form von „Plasmiden" vor, die sich auf kreisförmige doppelsträngige DNA-Schleifen beziehen, die in ihrer Vektorform nicht an das Chromosom gebunden sind. Jedoch soll die Erfindung auch andere Formen von Expressionsvektoren enthalten, die gleichwertige Funktionen aufweisen und die nach dem Stand der Technik erst später bekannt werden. Die Expressionsvektoren der vorliegenden Erfindung können auch eingesetzt werden, um die DNA-Sequenz, die die Untereinheit mit hohem Molekulargewicht des MTP codiert, stabil in das Chromosom einer geeigneten Wirtszelle (z. B. COS- oder HepG2-Zellen) zu integrieren.
Expressionsvektoren, die in der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden können, enthalten typischerweise einen Replikationsursprung, einen Promotor, der 5' (d. h. stromaufwärts) zur DNA-Sequenz liegt, gefolgt von der DNA-Sequenz, die die gesamte oder einen Teil der Untereinheit mit hohem Molekulargewicht des MTP codiert, Transkriptions-Terminationssequenzen und den restlichen Vektor. Die Expressionsvektoren können auch andere DNA-Sequenzen umfassen, die nach dem Stand der Technik bekannt sind, z. B. Stabilitäts-Leadersequenzen, die eine Stabilität des Expressionsproduktes bereitstellen, sekretorische Leadersequenzen, die die Sekretion des Expressionsproduktes bewirken, Sequenzen, die es ermöglichen, dass die Expression des Strukturgens moduliert werden kann (z. B. durch das Vorliegen oder die Abwesenheit von Nährstoffen oder anderen Induktoren im Wachstumsmedium), Markierungssequenzen, wodurch man in die Lage versetzt wird, in den transformierten Wirtszellen eine phänotypische Selektion durchzuführen, Sequenzen, die Stellen für die Spaltung durch Restriktionsendonucleasen bereitstellen, sowie Sequenzen, die eine Expression in verschiedenen Wirtstypen ermöglichen, umfassend, jedoch nicht beschränkt auf Prokaryoten, Hefen, Pilze, Pflanzen und höhere Eukaryoten. Die Merkmale des tatsächlich eingesetzten Expressionsvektors müssen mit der Wirtszelle kompatibel sein, die verwendet werden soll. Wenn z. B. DNA-Sequenzen in einem Säugerzellsystem exprimiert werden, sollte der Expressionsvektor Promotoren enthalten, die aus dem Genom von Säugerzellen (z. B. Metallothionein-Promotor der Maus) oder aus Viren isoliert wurden, die in diesen Zellen wachsen (z. B. 7,5 K-Promotor des Vaccinia-Virus). Ein Expressionsvektor wie er von der vorliegenden Erfindung in Erwägung gezogen wird, ist mindestens in der Lage, die Replikation und vorzugsweise die Expression der Nucleinsäuren der vorliegenden Erfindung zu steuern. Geeignete Replikationsursprünge umfassen z. B. die Col E1-, die viralen SV40- und M13-Replikationsursprünge. Geeignete Promotoren umfassen z. B. den Cytomegalievirus-Promotor, den lac Z-Promotor, den gal 10-Promotor und den Polyhedrin-Promotor des Mehrfachkernpolyeder-Virus aus Autographa californica (AcMNPV). Geeignete Terminationssequenzen umfassen z. B. Polyadenylierungs-Signale des Rinder-Wachstumshormons, von SV40, lac Z und des AcMNPV-Polyhedrins. Beispiele von selektierbaren Markern umfassen die Neomycin-, Ampicillin- und Hygromycin-Resistenz und dergleichen. Alle diese Materialien sind dem Fachmann bekannt und im Handel erhältlich.
Geeignete kommerziell verfügbare Expressionsvektoren, in die die DNA-Sequenzen der vorliegenden Erfindung eingefügt werden können, umfassen die Säuger-Expressionsvektoren pcDNAI oder pcDNA/Neo, den Baculovirus-Expressionsvektor pBlueBac, den prokaryotischen Expressionsvektor pcDNAII und den Hefe-Expressionsvektor pYes2, die alle von Invitrogen Corp., San Diego, CA, bezogen werden können.
Geeignete Expressionsvektoren, die die gewünschten codierenden und Kontrollsequenzen enthalten, können unter Verwendung herkömmlicher DNA-Rekombinationstechniken konstruiert werden, die dem Fachmann bekannt sind und von denen viele in Sambrook et al., Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989), beschrieben werden.
Wirtszellen
Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem Wirtszellen, die einen Expressionsvektor enthalten, der eine DNA-Sequenz umfasst, die die gesamte oder einen Teil der Untereinheit mit hohem Molekulargewicht des MTP codiert. Vgl. z. B. die Wirtszellen des nachstehenden Beispiels 4, die bevorzugt sind. Die Wirtszellen enthalten vorzugsweise einen Expressionsvektor, der die gesamte oder einen Teil der DNA-Sequenz umfasst, die die im wesentlichen wie in den SEQ ID NO: 1, 2, 5, 7, 8 dargestellte Nucleotidsequenz, die Nucleotidsequenz von SEQ ID NO: 1 zusammen mit SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 2 zusammen mit SEQ ID NO: 7, die ersten 108 Basen von SEQ ID NO: 2 zusammen mit SEQ ID NO: 8 und die ersten 108 Basen von SEQ ID NO: 2 zusammen mit SEQ ID NO: 7 und 8 aufweist. Vgl. z. B. den im nachstehenden Beispiel 4 beschriebenen Expressionsvektor, der bevorzugt ist. Weiterhin sind Wirtszellen bevorzugt, die einen Expressionsvektor enthalten, der eine oder mehrere regulatorische DNA-Sequenzen enthält, die in der Lage ist/sind, die Replikation und/oder die Expression einer DNA-Sequenz zu steuern, die die gesamte oder einen Teil der Untereinheit mit hohem Molekulargewicht des MTP codiert, und die funktionell mit dieser DNA-Sequenz verbunden sind. Geeignete Wirtszellen umfassen sowohl prokaryotische als auch eukaryotische Zellen. Geeignete prokaryotische Wirtszellen umfassen z. B. die E. coli-Stämme HB101, DH5a, XL1 Blue, Y1090 und JM101. Geeignete eukaryotische Wirtszellen umfassen z. B. Spodoptera frugiperda-Insektenzellen, COS-7-Zellen, menschliche Haut-Fibroblasten und Saccharomyces cerevisiae-Zellen.
Die Expressionsvektoren können durch verschiedene Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, in die Wirtszellen eingeführt werden. Z. B. kann eine Transfektion der Wirtszellen mit Expressionsvektoren anhand eines Calciumphosphat-Fällungsverfahrens durchgeführt werden. Jedoch können auch andere Verfahren zum Einführen von Expressionsvektoren in Wirtszellen verwendet werden, z. B. Elektroporation, Liposomenfusion, Kerninjektion und Virus- oder Phageninfektion.
Sobald ein Expressionsvektor in eine geeignete Wirtszelle eingeführt wurde, kann die Wirtszelle unter Bedingungen gezüchtet werden, die eine Expression von großen Mengen des gewünschten Polypeptids möglich machen, in diesem Fall eines Polypeptidmoleküls, das die gesamte oder einen Teil der Untereinheit mit hohem Molekulargewicht des MTP umfasst.
Wirtszellen, die einen Expressionsvektor enthalten, der eine DNA-Sequenz umfasst, die die gesamte oder einen Teil der Untereinheit mit hohem Molekulargewicht des MTP codiert, können durch eine oder mehrere der folgenden sechs allgemeinen Verfahren identifiziert werden: (a) DNA-DNA-Hybridisierung; (b) Vorliegen oder Abwesenheit von Markergen-Funktionen; (c) Feststellen der Transkriptionsrate, gemessen durch die Produktion von mRNA-Transkripten, die die Untereinheit mit hohem Molekulargewicht des MTP codieren, in den Wirtszellen; (d) immunologischer Nachweis des Genprodukts; (e) enzymatischer Test; und (f) PCR.
Im ersten Verfahren kann das Vorliegen einer DNA-Sequenz, die die gesamte oder einen Teil der Untereinheit mit hohem Molekulargewicht des MTP codiert, durch DNA-DNA- oder RNA-DNA-Hybridisierung unter Verwendung von Sonden nachgewiesen werden, die zu der DNA-Sequenz komplementär sind.
Im zweiten Verfahren kann das rekombinante Expressionsvektor-Wirt-System aufgrund des Vorliegens oder der Abwesenheit bestimmter Markergen-Funktionen (z. B. Thymidinkinase-Aktivität, Resistenz gegen Antibiotika usw.) identifiziert und selektiert werden. Ein Markergen kann im gleichen Plasmid liegen wie die DNA-Sequenz, die die gesamte oder einen Teil der Untereinheit mit hohem Molekulargewicht des MTP codiert, und zwar unter der Regulation des gleichen oder eines anderen Promotors, der zur Regulation der MTP-codierenden Sequenz verwendet wird. Die Expression des Markergens zeigt die Expression der DNA-Sequenz an, Untereinheit mit hohem Molekulargewicht des MTP codiert.
Im dritten Verfahren kann die Produktion von mRNA-Transkripten, die die gesamte oder einen Teil der Untereinheit mit hohem Molekulargewicht des MTP codieren, durch Hybridisierungstests festgestellt werden. Z. B. kann polyadenylierte RNA isoliert und durch Northern-Blotting oder einen Nuclease-Schutz-Test unter Verwendung einer Sonde analysiert werden, die zu der RNA-Sequenz komplementär ist. Andererseits kann die gesamte RNA der Wirtszelle extrahiert und auf Hybridisierung mit solchen Sonden getestet werden.
Im vierten Verfahren kann die Expression der gesamten oder eines Teils der Untereinheit mit hohem Molekulargewicht des MTP immunologisch festgestellt werden, z. B. durch ein Immunblot-Verfahren mit Antikörpern gegen das MTP (Western-Blotting).
Im fünften Verfahren kann die Expression der Untereinheit mit hohem Molekulargewicht des MTP gemessen werden, indem die MTP-Enzymaktivität unter Verwendung bekannter Methoden bestimmt wird. Z. B. kann der hier nachstehend beschriebene Test eingesetzt werden.
Im sechsten Verfahren werden Oligonucleotid-Primer, die zu Sequenzen homolog sind, die im Expressionssystem vorliegen (d. h. Expressionsvektorsequenzen oder MTP-Sequenzen), in einer PCR verwendet, so dass ein DNA-Fragment mit vorausgesagter Länge hergestellt wird, wodurch der Einbau des Expressionssystems in die Wirtszelle gezeigt wird.
Die DNA-Sequenzen von Expressionsvektoren, Plasmiden oder DNA-Molekülen der vorliegenden Erfindung können durch verschiedene Verfahren bestimmt werden, die dem Fachmann bekannt sind. Z. B. kann das Didesoxy-Kettenabbruchverfahren, das in Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977), 5463–5467, beschrieben wird, oder das Maxam-Gilbert-Verfahren, das in Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977), 560–564, beschrieben wird, eingesetzt werden.
Um ein katalytisch aktives MTP zu exprimieren, ist es möglicherweise erforderlich, einen Proteinkomplex herzustellen, der sowohl die Untereinheit mit hohem als auch die mit niedrigem Molekulargewicht des MTP enthält. Die Untereinheit mit niedrigem Molekulargewicht des MTP ist das früher charakterisierte Protein, die Proteindisulfid-Isomerase (PDI). PDI-cDNAs wurden bereits cloniert aus Mensch (Pihlajaniemi et al., EMBO J. 6 (1987), 643–649), Rind (Yamaguchi et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 146 (1987), 1485–1492), Ratte (Edman et al., Nature 317 (1985), 267–270) und Huhn (Kao et al., Connective Tissue Research 18 (1988), 157–174). Verschiedene Verfahren können zum Herstellen eines Proteins verwendet werden, das sowohl die Untereinheit mit hohem als auch die mit niedrigem Molekulargewicht des MTP enthält. Z. B. können cDNA-Sequenzen, die die Untereinheiten codieren, in den gleichen Expressionsvektor oder in verschiedene Expressionsvektoren eingefügt und in einer geeigneten Wirtszelle exprimiert werden, um das Protein herzustellen.
Selbstverständlich ist es so zu verstehen, dass nicht alle Expressionsvektoren und DNA-Regulationssequenzen gleich gut funktionieren, um die DNA-Sequenzen der vorliegenden Erfindung zu exprimieren. Auch werden nicht alle Wirtszellen mit dem gleichen Expressionssystem gleich gut funktionieren. Jedoch kann der Fach mann anhand der hier dargestellten Richtlinien eine Auswahl unter den Expressionsvektoren, DNA-Regulationssequenzen und Wirtszellen treffen, ohne dass ein übermäßiges Experimentieren erforderlich wäre und ohne dass er vom Umfang der Erfindung abweicht.
Polypeptide
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner Polypeptidmoleküle, die die gesamte oder einen Teil der Untereinheit mit hohem Molekulargewicht des MTP umfassen, wobei die Polypeptidmoleküle vorzugsweise die gesamte oder einen Teil der wie in den SEQ ID NO: 3, 4 oder SEQ ID NO: 3 zusammen mit SEQ ID NO: 6 dargestellten Aminosäuresequenz aufweisen. Im Fall von Polypeptidmolekülen, die einen Teil der Untereinheit mit hohem Molekulargewicht des MTP umfassen, ist es bevorzugt, dass die Polypeptidmoleküle eine Länge von mindestens etwa fünf bis acht aufeinanderfolgenden Aminosäuren aufweist, stärker bevorzugt eine Länge von mindestens etwa 15 bis 20 aufeinanderfolgende Aminosäuren. Außerdem sind Polypeptide bevorzugt, die eine Länge von mindestes etwa 180 aufeinanderfolgenden Aminosäuren aufweisen; dies könnte etwa der Größe einer Strukturdomäne in dem Protein entsprechen.
Alle Aminosäuresequenzen sind hier durch Formeln dargestellt, deren links-nach-rechts-Orientierung in der herkömmlichen Richtung vom Aminoterminus zum Carboxyterminus vorliegt.
Die Polypeptide der vorliegenden Erfindung können durch synthetische Verfahren hergestellt werden, d. h. durch chemische Synthese des Polypeptids aus seinen Aminosäuren, und zwar durch Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind. Z. B. kann das Festphasen-Verfahren eingesetzt werden, das von Houghton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 (1985), 5131–5135, beschrieben wird. Es ist bevorzugt, dass die Polypeptide durch Produktion in prokaryotischen oder eukaryotischen Wirtszellen, die eine DNA-Sequenz exprimieren, welche die gesamte oder einen Teil der Untereinheit mit hohem Molekulargewicht des MTP codiert, oder durch in-vitro-Translation der mRNA erhalten werden, die durch eine DNA-Sequenz codiert wird, welche die gesamte oder einen Teil der Untereinheit mit hohem Molekulargewicht des MTP codiert. Z. B. kann/können die DNA-Sequenz von SEQ ID NO: 1, 2, 5, 7, 8, die Sequenz von SEQ ID NO: 1 zusammen mit SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 2 zusammen mit SEQ ID NO: 7, die ersten 108 Basen von SEQ ID NO: 2 zusammen mit SEQ ID NO: 8 oder die ersten 108 Basen von SEQ ID NO: 2 zusammen mit SEQ ID NO: 7 oder 8 oder ein beliebiger Teil davon unter Verwendung einer PCR, wie vorstehend beschrieben, synthetisiert und in einen geeigneten Expressionsvektor eingefügt werden, der seinerseits zur Transformation einer geeigneten Wirtszelle eingesetzt werden kann. Anschließend kann die rekombinante Wirtszelle gezüchtet werden, wobei die Untereinheit mit hohem Molekulargewicht des MTP hergestellt wird. Techniken zur Produktion von Polypeptiden durch diese Verfahren sind dem Fachmann bekannt und werden hier beschrieben.
Die auf diese Weise hergestellten Polypeptide können sodann isoliert und bis zu einem gewissen Grad gereinigt werden, wobei verschiedene Proteinreinigungs-Techniken eingesetzt werden. Z. B. können chromatographische Verfahren wie Ionenaustauch-Chromatographie, Gelfiltrations-Chromatographie und Immunaffinitäts-Chromatographie verwendet werden.
Die Polypeptide der vorliegenden Erfindung können ganz verschieden eingesetzt werden. Z. B. können die Polypeptide verwendet werden, um in bekannter Art und Weise polyclonale oder monoclonale Antikörper herzustellen, die in der Lage sind, die Polypeptide zu binden. Diese Antikörper können dann ihrerseits zum Nachweis der Polypeptide der vorliegenden Erfindung in einer Probe, z. B. einer Zellprobe, anhand von Immuntest-Techniken, z. B. Radioimmuntest, Enzymimmuntest oder Immuncytochemie, verwendet werden. Außerdem können die Antikörper in einer Affinitätschromatographie zur Isolierung oder Reinigung der Polypeptide der vorliegenden Erfindung aus verschiedenen Quellen eingesetzt werden.
Die Polypeptide der vorliegenden Erfindung wurden mit Hilfe einer analysierten DNA und der hergeleiteten Aminosäure-Sequenzierung definiert. Aufgrund der Degeneration des genetischen Codes können zur Herstellung der Polypeptide der vorliegenden Erfindung auch andere DNA-Sequenzen eingesetzt werden, die die gleichen Aminosäuresequenzen codieren, die in den SEQ ID NO: 3, 4, SEQ ID NO: 3 zusammen mit SEQ ID NO: 6 oder einem beliebigen Teil davon beschrieben sind.
Es sollte außerdem so verstanden werden, dass allele Variationen dieser DNA- und Aminosäuresequenzen in der Natur vorkommen oder unter Verwendung von nach dem Stand der Technik bekannten Verfahren gezielt eingeführt werden können. Diese Variationen können anschaulich gemacht werden durch eine oder mehrere Aminosäureänderungen in der Gesamtsequenz wie Deletionen, Substitutionen, Insertionen, Inversionen oder Addition von einer oder mehreren Aminosäuren in der/die Sequenz. Solche Änderungen können für die Herstellung oder die Verwendung der Polypeptide der vorliegenden Erfindung vorteilhaft sein; z. B. bei der Isolierung des MTP oder der Polypeptide durch Affinitätsreinigung. Aminosäuresubstitutionen können durchgeführt werden, z. B. auf der Basis der Ähnlichkeit in der Polarität, der Ladung, Löslichkeit, Hydrophobie, Hydrophilie und/oder der amphipathischen Natur der beteiligten Reste. Z. B. umfassen negativ geladene Aminosäuren Asparaginsäure und Glutaminsäure; positiv geladene Aminosäuren umfassen Lysin und Arginin; Aminosäuren mit ungeladenen polaren Kopfgruppen oder nichtpolaren Kopfgruppen, die ähnliche Hydrophiliewerte haben, umfassend die folgenden: Leucin, Isoleucin, Valin, Glycin, Alanin; Asparagin, Glutamin; Serin, Threonin; Phenylalanin, Tyrosin. Andere in Erwägung gezogene Variationen umfassen Salze und Ester der vorstehend erwähnten Polypeptide, außerdem Vorläufer der vorstehend erwähnten Polypeptide; z. B. Vorläufer, die N-terminale Substituenten aufweisen, wie Methionin, N-Formylmethionin und Leadersequenzen. Alle solchen Variationen sind im Umfang der Erfindung eingeschlossen.
Verfahren zum Nachweis von Nucleinsäuren
Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem ein Verfahren zum Nachweis einer Nucleinsäuresequenz, die die gesamte oder einen Teil der Untereinheit mit hohem Molekulargewicht des MTP codiert, oder einer verwandten Nucleinsäuresequenz, umfassend Inkontaktbringen der Nucleinsäuresequenz mit einem nachweisbaren Marker, der spezifisch an mindestens einen Teil der Nucleinsäuresequenz bindet, und Nachweisen des so gebundenen Markers. Das Vorliegen eines gebundenen Markers zeigt das Vorliegen der Nucleinsäuresequenz an. Vorzugsweise ist die Nucleinsäuresequenz eine DNA-Sequenz, die die gesamte oder einen Teil der in SEQ ID NO: 1, 2, 5, 7, 8 dargestellten Nucleotidsequenz, die Nucleotidsequenz von SEQ ID NO: 1 zusammen mit SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 2 zusammen mit SEQ ID NO: 7, die ersten 108 Basen von 2 zusammen mit SEQ ID NO: 8 oder die ersten 108 Basen von SEQ ID NO: 2 zusammen mit SEQ ID NO: 7 und 8 aufweist, oder sie ist hierzu komplementär.
Eine DNA-Probe, die die DNA-Sequenz enthält, kann unter Verwendung verschiedener Verfahren zur DNA-Isolierung isoliert werden, die dem Fachmann bekannt sind. Z. B. kann eine genomische DNA-Probe aus Gewebe isoliert werden, indem das Gewebe, aus dem die DNA isoliert werden soll, schnell eingefroren wird, sodann das Gewebe zerstoßen wird, so dass einfach verdaubare Teile entstehen, das zerstoßene Gewebe in eine Lösung von Proteinase K und SDS gegeben wird und die resultierende Lösung so lange inkubiert wird, bis der größte Teil des zellulären Proteins abgebaut ist. Anschließend wird die genomische DNA durch aufeinanderfolgende Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol-Extraktionen von Protein getrennt, durch Ethanolfällung gewonnen, getrocknet und in Puffer resuspendiert.
Außerdem ist das Verfahren bevorzugt, in dem die Nucleinsäuresequenz eine RNA-Sequenz ist. Vorzugsweise ist die RNA-Sequenz eine mRNA-Sequenz. Außerdem ist ein Verfahren bevorzugt, in dem die RNA-Sequenz in den Zellen einer Gewebeprobe liegt. Eine RNA-Probe, die die RNA-Sequenz enthält, kann unter Verwendung verschiedener Verfahren zur RNA-Isolierung isoliert werden, die dem Fachmann bekannt sind. Z. B. kann eine RNA-Probe aus gezüchteten Zellen isoliert werden, indem das Medium von den Zellen abgewaschen wird und die Zellen anschließend durch Einbringen in eine 4 M Guanidiniumlösung lysiert werden. Die Viskosität der resultierenden Lösung wird herabgesetzt, indem das Lysat durch eine 20- Gauge-Nadel gezogen wird. Anschließend wird die RNA durch einen schrittweisen Cäsiumchloridgradienten ausgefällt und die Überstandsflüssigkeit aus dem Gradienten sorgfältig entfernt, wodurch eine vollständige Trennung der im Niederschlag vorliegenden RNA von der DNA und dem Protein, die als Verunreinigung vorliegen, möglich ist.
Der nachweisbare Marker, der eingesetzt werden kann, um eine Nucleinsäuresequenz, die die gesamte oder einen Teil der Untereinheit mit hohem Molekulargewicht des MTP codiert, oder eine verwandte Nucleinsäuresequenz nachzuweisen, kann eine markierte DNA-Sequenz sein, einschließlich einer markierten cDNA-Sequenz, die eine Nucleotidsequenz aufweist, die zu mindestens einem Teil der DNA-Sequenz komplementär ist, die die gesamte oder einen Teil der Untereinheit mit hohem Molekulargewicht des MTP codiert.
Der nachweisbare Marker kann auch eine markierte RNA sein, die eine Sequenz aufweist, die zu mindestens einem Teil der DNA-Sequenz komplementär ist, die die gesamte oder einen Teil der Untereinheit mit hohem Molekulargewicht des MTP codiert.
Die nachweisbaren Marker der vorliegenden Erfindung können mit herkömmlich verwendeten radioaktiven Markierungen markiert sein, wie ³²P und ³⁵S, wobei jedoch auch andere Markierungen wie Biotin oder Quecksilber eingesetzt werden können. Verschiedene Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, können verwendet werden, um die nachweisbaren Marker einzubringen. Z. B. können DNA-Sequenzen und RNA-Sequenzen unter Verwendung der Zufallsprimer verwendenden Methode mit ³²P und ³⁵S markiert werden.
Sobald ein geeigneter nachweisbarer Marker erhalten wurde, können verschiedene Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, eingesetzt werden, um den nachweisbaren Marker mit der Probe von Interesse in Kontakt zu bringen. Z. B. können DNA-DNA-, RNA-RNA- und DNA-RNA-Hybridisierungen durchgeführt werden, wobei herkömmliche Verfahren nach dem Stand der Technik eingesetzt werden. In einem typischen DNA-DNA-Hybridisierungsverfahren zum Nachweis von DNA-Sequenzen, die das gesamte oder einen Teil des MTP codieren, in genomischer DNA wird die genomische DNA zuerst anhand bekannter Verfahren isoliert und anschließend mit einem oder mehreren Restriktionsenzymen gespalten. Die resultierenden DNA-Fragmente werden auf Agarose-Gelen aufgetrennt, in situ denaturiert und auf Membranfilter übertragen. Nach einer Vorhybridisierung zum Verringern der unspezifischen Hybridisierung wird eine radiomarkierte Nucleinsäure-Sonde mit den immobilisierten DNA-Fragmenten hybridisiert. Anschließend wird die Membran gewaschen, um die ungebundenen oder schwach gebundenen Sonden zu entfernen, und danach wird sie autoradiographiert, wodurch die DNA-Fragmente identifiziert werden können, die mit der Sonde hybridisierten.
Das Vorliegen eines gebundenen nachweisbaren Markers kann anhand verschiedener Verfahren nachgewiesen werden, die dem Fachmann bekannt sind. Wenn z. B. der nachweisbare Marker radioaktiv markiert ist, kann eine Autoradiographie eingesetzt werden. Abhängig von der verwendeten Markierung können auch andere Nachweisverfahren, wie Spektrophotometrie, verwendet werden.
Es ist so zu verstehen, dass unter Verwendung der hier beschriebenen Verfahren auch Nucleinsäuresequenzen nachgewiesen werden können, die mit den Nucleinsäuresequenzen verwandt sind, die die gesamte oder einen Teil der Untereinheit mit hohem Molekulargewicht des MTP codieren. Z. B. kann eine DNA-Sonde, die konservierte Regionen des Gens für die Untereinheit mit hohem Molekulargewicht des menschlichen oder des Rinder-MTP aufweist, eingesetzt werden, um verwandte DNA-Sequenzen nachzuweisen und zu isolieren (z. B. eine DNA-Sequenz, die die Untereinheit mit hohem Molekulargewicht des MTP aus Mäusen, Ratten, Hamstern oder Hunden codiert). Alle solche Verfahren sind im Umfang der vorliegenden Erfindung eingeschlossen.
Verfahren zum Nachweis von MTP-Inhibitoren
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner Verfahren zum Nachweis von Inhibitoren des MTP. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Nachweis eines Inhibitors des MTP, umfassend: (a) Inkubation einer Probe, von der angenommen wird, dass sie einen Inhibitor des MTP enthält, mit nachweisbar markierten Lipiden in Donor-Partikeln, Akzeptor-Partikeln und MTP; und (b) Messen des MTP stimulierten Transfers der nachweisbar markierten Lipide von den Donor-Partikeln zu den Akzeptor-Partikeln. In diesem Test würde ein Inhibitor die Rate des MTP stimulierten Transfers des nachweisbar markierten Lipids von Donor- zu Akzeptor-Partikeln senken. Der Nachweis kann durch kernmagnetische Resonanz (NMR), Elektrospin-Resonanz (ESR), Radiomarkierung (die bevorzugt ist), fluoreszierender Markierung und dergleichen erfolgen. Die Donor- und Akzeptor-Partikeln können Membranen, HDL, Lipoproteine mit niedriger Dichte (LDL), SUV, Lipoproteine und dergleichen sein. HDL und SUV sind die bevorzugten Donor-Partikel; LDL und SUV sind die bevorzugten Akzeptor-Partikel.
Anhand des vorstehenden Verfahrens wurde der MTP-Inhibitor A identifiziert,
der den Namen 2-[1-(3,3-Diphenylpropyl)-4-piperidinyl]-2,3-dihydro-3-oxo-1H-isoindol-Hydrochlorid hat (und hier als „Verbindung A" bezeichnet wird). Die Herstellung von Verbindung A ist in dem US-Patent Nr. 3 600 393 beschrieben. Außerdem wurde anhand des vorstehenden Verfahrens der MTP-Inhibitor B identifiziert,
der den Namen 1-[3-(6-Fluor-1-tetralanyl)methyl]-4-O-methoxyphenylpiperazin hat (und hier als „Verbindung B" bezeichnet wird). Diese Verbindungen wurden durch die in den nachstehenden Arbeitsbeispielen beschriebenen Verfahren identifiziert.
Behandlungsverfahren
Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem ein neues Verfahren zum Verhindern, Stabilisieren oder Bewirken einer Regression der Arteriosklerose bei einer Säugerart, umfassend die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge des Mittels, das die Menge oder die Aktivität des MTP herabsetzt.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein neues Verfahren zum Verringern der Serumlipidspiegel, wie der Cholesterin- oder TG-Spiegel, bei einer Säugerart, umfassend die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge eines Mittels, das die Menge oder Aktivität des MTP herabsetzt.
Außerdem betrifft die vorliegende Erfindung die Behandlung verschiedener anderer Zustände oder Krankheiten unter Verwendung von Mitteln, die die Menge oder Aktivität des MTP senken. Z. B. ist es wahrscheinlich, dass Mittel, die die Menge oder die Aktivität des MTP herabsetzen und deshalb die Serumcholesterin- und TG- Spiegel sowie die TG-, Fettsäure- und Cholesterinabsorption senken, zur Behandlung von Hypercholesterinämie, Hypertriglceridämie, Hyperlipidämie, Pankreatitis, Hyperglykämie und Adipositas eingesetzt werden können.
Verschiedene Mittel, die die Menge oder die Aktivität des MTP wirksam senken, können eingesetzt werden, um die Verfahren der vorliegenden Erfindung durchzuführen. MTP-Inhibitoren können anhand der vorstehend sowie nachstehend in Beispiel 5 beschriebenen Durchmusterungsverfahren isoliert werden. Verbindungen wie A und B, die als Inhibitoren des MTP identifiziert sind (vgl. das nachstehende Beispiel 6), können in spezifischen Ausführungsformen der vorstehenden Behandlungsverfahren eingesetzt werden.
Antisense-Moleküle können verwendet werden, um die MTP-Menge zu reduzieren (vgl. Toulme und Helene, Gene 72 (1988), 51–58; Inouye, Gene 72 (1988), 25– 34; und Uhlmann und Peyman, Chemical Reviews 90 (1990), 543–584). MTP-Antisense-Moleküle können entworfen werden, und zwar auf Grundlage der vorstehenden genomischen DNA und cDNA, entsprechenden 5'- und 3'-flankierenden Kontrollregionen, anderen flankierenden Sequenzen oder Intron-Sequenzen. Zu solchen Antisense-Molekülen zählen Antisense-Oligodesoxyribonucleotide, Oligoribonucleotide, Oligonucleotid-Analoga und dergleichen, und sie können etwa 15 bis 25 Basen oder mehr umfassen. Solche Antisense-Moleküle können an die DNA oder RNA für die Untereinheit mit hohem Molekulargewicht des MTP nicht-kovalent oder kovalent binden. Eine solche Bindung könnte z. B. die MTP-DNA oder -RNA spalten oder deren Spaltung erleichtern, den Abbau von Kern- oder cytoplasmatischer mRNA steigern oder die Transkription, Translation, Bindung von transaktivierenden Faktoren oder Prä-mRNA-Spleißung oder Prozessierung hemmen. Alle diese Effekte würden die Expression des MTP herabsetzen, weshalb die Antisense-Moleküle in den vorstehenden Behandlungsverfahren eingesetzt werden könnten.
Mögliche Zielsequenzen für ein Antisense-Verfahren umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf die DNA- oder RNA-Sequenz, die das MTP codiert, ihre 5'- und 3'-flankierenden Kontrollregionen, andere flankierende Sequenzen und nichtklassische Watson und Crick-Basenpaarungs-Sequenzen, die zur Bildung einer Triplex-DNA verwendet werden. Möglicherweise sind Antisense-Moleküle vorteilhaft, die gegen Sequenzen in Tandemanordnung für die Untereinheit mit hohem Molekuargewicht des MTP gerichtet sind.
Antisense-Moleküle können außerdem zusätzliche Funktionalitäten enthalten, die ihre Stabilität, Aktivität, ihren Transport in die Zellen oder aus den Zellen und dergleichen erhöhen. Solche zusätzlichen Funktionalitäten können z. B. an Zielmoleküle binden oder die Bindung daran erleichtern, oder sie können Zielmoleküle spalten oder ihre Spaltung erleichtern.
Vektoren können konstruiert werden, die die Synthese von Antisense-DNA oder RNA steuern. In diesem Fall kann die Länge des Antisense-Moleküls viel länger sein, z. B. 400 bp.
Demonstration des Zusammenhangs zwischen MTP und Serumcholesterin-Spiegeln, TG-Spiegeln und Arteriosklerose
Die Verfahren der vorliegenden Erfindung zum Senken der Serumcholesterin- oder TG-Spiegel oder Verhindern, Stabilisieren oder Bewirken einer Regression der Arteriosklerose beruhen zum Teil auf der Entdeckung durch die Erfinder, dass die genetische Krankheit Abeta-Lipoproteinämie durch das Fehlen eines funktionalen MTP verursacht wird. Die Erfinder haben bei zwei Abeta-Lipoproteinämie-Patienten durch die folgenden Verfahren einen Gendefekt gezeigt.
Test auf TG-Transferaktivität bei Patienten mit Abeta-Lipoproteinämie
A. MTP-Test
Die TG-Transferaktivität wurde als die Protein-stimulierte Rate des TG-Transfers von Donor-SUV zu Akzeptor-SUV gemessen. Die Donor- und Akzeptor-Vesikel wurden hergestellt, indem die geeigneten Lipide in Chloroform in einem 16 × 125 mm-Borsilikat-Glasröhrchen mit Schraubverschluss (Fisher Scientific Co., Pittsburg, PA, Kat.-Nr. 14-933-1A) gemischt und anschließend unter einem Stickstoffstrom getrocknet wurden. 2 ml 15/40-Puffer (15 mM Tris, pH 7,4, 40 mM Natriumchlorid, 1 mM EDTA und 0,02% NaN₃) wurden zu den getrockneten Lipiden zugegeben (oder 100 μl pro Testansatz, was immer das geringste Volumen ist), ein Stickstoffstrom wurde über den Puffer geblasen und danach der Deckel schnell aufgeschraubt, so dass über der Lipidsuspension eine Stickstoffatmosphäre eingefangen wurde. Die Lipide im Puffer wurden in einem speziellen Ultraschall-Reinigungsgerät (Kat.-Nr. G112SP1, Laboratory Supplies Co., Hicksville, NY) in einem Bad beschallt. Das Donor- und das Akzeptor-Phosphatidylcholin (PC) (Ei-L-α-Phosphatidylcholin, Sigma Chem. Co., St. Louis, MO) wurde radiomarkiert, indem Spuren von [³H]-Dipalmitoylphosphatidylcholin (Phosphatidylcholin-L-α-dipalmitoyl-[2-palmitoyl-9, 10, ³H (N)], 33 Ci/mMol, DuPont NEN) bis zu einer spezifischen Aktivität von etwa 100 CpM/nMol zugegeben wurden. Donor-Vesikel, die 40 nMol Ei-PC, 0,2 Mol-% [¹⁴C]-TG [Gemisch aus markiertem (Triolein [Carboxyl-¹⁴C]-, etwa 100 mCi/mMol, DuPont NEN) und unmarkiertem (Triolein, Sigma Chem. Co., St. Louis, MO) Triolein für eine endgültige spezifische Aktivität von etwa 200000 CpM/mMol] und 7,3 Mol-% Cardiolipin (Rinderherz-Cardiolipin, Sigma Chemical Co.) enthielten, und Akzeptor-Vesikel, die 240 nMol Ei-PC und 0,2 Mol-% TG enthielten, wurden mit 5 mg Fettsäure-freiem Rinderserumalbumin (BSA) und einem Aliquot der MTP-Proben in 0,7 bis 0,9 ml 15/40-Puffer gemischt und eine Stunde bei 37°C inkubiert. Die Transferreaktion wurde durch Zugabe von 0,5 ml DEAE-Cellulose-Suspension (1 : 1 Suspension DE-52, vorgequollener Anionenaustauscher-DEAE-Cellulose, Fisher, Kat.-Nr. 05720-5 zu 15 mM Tris, pH 7,4, 1 mM EDTA und 0,02% NaN₃) beendet. Das Reaktionsgemisch wurde fünf Minuten bewegt und sodann die DEAE-Cellulose mit den gebundenen Donor-Membranen (die Donor-Membranen enthielten das negativ geladene Cardiolipin und banden an die DEAE) durch eine Zentrifugation mit geringer Geschwindigkeit sedimentiert.
Das im Überstand verbliebene ¹⁴C-TG und ³H-PC wurde durch Szintillationszählung gemessen. Der TG-Transfer wurde berechnet, indem das Verhältnis von ¹⁴C-TG (transferiert von den Donor-Membranen zu den Akzeptor-Membranen) zu ³H-PC (ein Marker für die Gewinnung der Akzeptor-Vesikel), das im Überstand nach einer Transferreaktion vorlag, mit dem Verhältnis von Gesamt-Donor-¹⁴C-TG zu Akzeptor ³H-PC im Test vor der Transferreaktion verglichen wurde. Der Prozentsatz des ¹⁴C-TG-Transfers wurde wie folgt berechnet:
Die MTP-stimulierte Rate des TG-Transfers wurde berechnet, indem die TG-Transferrate in Abwesenheit von MTP von der TG-Transferrate in Gegenwart von MTP subtrahiert wurde. Kinetiken der ersten Ordnung dienten zur Berechnung des gesamten TG-Transfers.
B. Antikörperproduktion
Anti-88-kDa-Antikörper wurden von der Universität von Cincinnati bereitgestellt. Die Produktion von Anti-88-kDa wurde schon früher beschrieben. Wetterau et al., J. Biol. Chem. 265 (1990), 9800–9807. Um die Spezifität der Antiseren für menschliche Darmhomogenisate zu erhöhen, wurde ein Affinitäts-gereinigter Anti-88-kDa hergestellt. 8 bis 10 mg des gereinigten MTP wurden in 0,1 M MOPS, pH 7,5, dialysiert und dann zu 4 ml Bio Rad Affigel 15 (Bio-Rad, Richmond, CA) zugegeben, das vorher dreimal mit Wasser bei 4°C gewaschen worden war. Das MTP ließ man bei Raumtemperatur zwei Stunden an die Matrix koppeln, und danach wurde es über Nacht bei 4°C gehalten. Die restlichen reaktiven Stellen auf den Affigel wurden durch Zugabe von 0,1 ml 1 M Ethanolamin, pH 8,0, pro ml Gel blockiert. Die optische Dichte des eluierten Proteins wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers gemessen und machte deutlich, dass mehr als 90% des MTP an die Säule gekoppelt waren. Die Säule wurde mit 50 ml 10 mM Tris, pH 7,5, gewaschen, danach mit 50 ml 100 mM Glycin, pH 2,5, danach mit 50 ml 10 mM Tris, pH 8,8, danach mit 50 ml 100 mM Triethylamin, pH 11,5, und schließlich wurde die Säule in 10 mM Tris, pH 7,5, erneut äquilibriert.
Die Antikörper im Antiserum wurden durch Ammoniumsulfat-Fällung partiell gereinigt (226 mg Ammoniumsulfat pro ml Serum). Der Niederschlag wurde resuspendiert und in 15 mM Tris, pH 7,5, 1 mM EDTA, 0,02% Natriumazid und 150 mM Natriumchlorid dialysiert. Die teilweise gereinigten Antikörper wurden innerhalb eines Zeitraums von zwei Stunden langsam auf die MTP-Affigel-Säule aufgetragen (wobei die Antikörper dreimal durch die Säule laufen gelassen wurden). Die Säule wurde gewaschen mit 100 ml 10 mM Tris, pH 7,5, danach mit 100 ml 10 mM Tris, pH, 7,5, 500 mM Natriumchlorid, danach mit 50 ml 100 mM Glycin, pH 2,5 (diese Fraktion wurden in 5 ml 1 M Tris, pH 8,0, gesammelt), danach mit 10 mM Tris, pH 8,8, bis die Säule einen neutralen pH-Wert aufwies, danach mit 50 ml Triethylamin, pH 11,5 (diese Fraktion wurde in 5 ml 1 M Tris, pH 8,0, gesammelt), und schließlich wurde die Säule mit 10 mM Tris, pH 7,5, erneut äquilibriert. Antikörper, die in der sauren Waschlösung eluiert wurden, wurden zurückbehalten und für die Immunblot-Analyse der Proteinfraktionen verwendet.
C. Western-Blot mit anti-88-kDa-Antikörpern
Um die Spezifität der Antikörper zu bestätigen und die 88-kDa-Komponente des MTP in Gewebehomogenisaten nachzuweisen, wurde gereinigtes Rinder-MTP oder die zu testende Fraktion durch SDS-PAGE fraktioniert (im wesentlichen wie von Laemmli, Nature 227 (1970), 680–685, beschrieben), wobei eine 0,75 mm-Hoeffer Scientific-Instrument-Gel-Apparatur (San Francisco, CA) verwendet wurde. Anschließend wurde das Protein auf Nitrocellulose überführt, indem ein Western-Blot-Verfahren unter Verwendung einer BioRad-Trans-blot-Zelle (BioRad, Richmond, CA) durchgeführt wurde. Der Blotting-Puffer (25 mM Tris, 192 mM Glycin, pH 8,3, 20% Methanol) wurde auf 4°C vorgekühlt. Die Proteine wurden 100 Minuten bei 250 Milliampere bei Raumtemperatur übertragen. Die Membranen wurden fünf bis zehn Minuten mit Blockierungspuffer blockiert (400 μl Antischaummittel, etwa 10 mg Thimersal und 200 g fettfreie Trockenmilch in 4 Liter 50 mM Tris, pH 7,7, 150 mM Natriumchlorid). Ein Aliquot des Antiserums (Verdünnung von 1 : 300) oder des Affinitäts-gereinigten Antikörpers (Verdünnung der Affinitäts-gereinigten Antikörper von 1 : 25) wurde zugegeben und die Reaktion über Nacht bei Raumtemperatur zugelassen. Nach Waschen mit Blockierungspuffer wurde der zweite Antikörper, anti-Kaninchen-IgG der Ziege, gekoppelt an Meerrettich-Peroxidase (BioRad), in einer Verdünnung von 1 : 2000 zugegeben und die Reaktion drei Stunden bei Raumtemperatur zugelassen. Nach einem Waschschritt wurde der zweite Antikörper mit dem Entwickler, 50 mg Imidizal, 50 mg 3,3'-Diaminobenzidin-Tetrahydrochlorid und 50 μl H₂O₂ (30% Lösung) in 50 ml Blockierungspuffer sichtbar gemacht.
D. MTP in Darmbiopsien
Darmbiopsien aus fastenden Kontrollpersonen und kranken Patienten wurden eingefroren und auf Trockeneis zu Bristol-Myers Squibb, Princeton, verschickt. Die Biopsien wurden mit einem Polytron (Polytron PT 3000, Brinkmann, Instrument, Inc., Westbury, NY) bei der halben maximalen Einstellung homogenisiert. Typischerweise wurde eine Biopsie in 0,25 ml Homogenisierungspuffer homogenisiert (50 mM Tris, pH 7,4, 50 mM KCl, 5 mM EDTA, 5 μg/ml Leupeptin und 2 mM PMSF). Ein Aliquot des Proteins wurde auf 0,7 ml und 1,4% SDS eingestellt und die Proteinkonzentration durch das Verfahren von Lowry et al. gemessen (J. Biol. Chem. 193 (1951), 265– 275). Das Homogenisat wurde mit Homogenisierungspuffer auf etwa 1,75 mg Protein/ml verdünnt. In einigen Fällen war das Protein bereits stärker verdünnt und wurde direkt verwendet. Um die löslichen Proteine aus der mikrosomalen Fraktion freizusetzen, wurde ein Teil Desoxycholatlösung (0,56%, pH 7,5) zu zehn Teilen verdünntem Homogenisat unter Verwirbelung zugegeben. Die Probe wurde 30 Minuten bei 4°C inkubiert und dann 60 Minuten bei 103000 × g zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt, mit 15/40-Puffer 1 : 1 verdünnt und danach über Nacht in 15/40-Puffer dialysiert. Aliquots der behandelten Biopsien wurden auf TG-Transferaktivität getestet, und das 88-kDa-Protein wurde durch eine Western-Blot-Analyse nachgewiesen. Die TG-Transferaktivität wurde als Prozentsatz des pro Stunde transferierten Donor-TG als Funktion des homogenisierten Darmbiopsie-Proteins angegeben.
E. Ergebnisse mit Abeta-Lipoproteinämie-Patienten
Um zu untersuchen, ob es einen Zusammenhang zwischen defektem MTP und Abeta-Lipoproteinämie gibt, wurde die MTP-Aktivität in Duodenum- und Duodenum-Jejunum-Biopsien von fünf Kontrollpersonen und vier Patienten mit Abeta-Lipoproteinämie gemessen, die die klassische, genetisch rezessive Form der Abeta-Lipoproteinämie aufwiesen. Die Darmbiopsien von den fünf normalen Personen wurden homogenisiert und mit Detergens behandelt, wie vorstehend beschrieben. Die TG-Transferaktivität ließ sich in den Biopsien von allen fünf Personen ohne weiteres nachweisen (2).
Die TG-Transferaktivität in den Biopsien wurde weiter charakterisiert. Um zu bestätigen, dass die TG-Hydrolyse nicht zur Störung der Messungen der Lipid-Transferaktivität führte, wurden die Akzeptor-Vehikel (die das transportierte Lipid enthielten) einer Person nach der Transferreaktion extrahiert, und die Identität des ¹⁴C-TG wurde durch Dünnschicht-Chromatographie bestätigt. Das gesamte ¹⁴C-TG wies eine Mobilität auf, die mit der Mobilität des authentischen TG identisch war; dies bestätigt, dass in dem Test intaktes TG transportiert wurde.
Das menschliche MTP wurde auf seine Hitzestabilität untersucht. Es wurde inaktiviert, wenn es fünf Minuten auf 60°C erhitzt wurde. Der Verlust der Aktivität macht deutlich, dass die gemessene Lipid-Transferaktivität nicht von einer intrazellulären Form des Cholesterylester-Transferproteins (CETP) stammte, das unter diesen Bedingungen hitzestabil ist; Ihm et al., J. Biol. Chem. 257 (1982), 4818–4827.
Darmbiopsien von vier Patienten mit Abeta-Lipoproteinämie wurden gewonnen, homogenisiert und die TG-Transferaktivität, wie hier vorstehend beschrieben, gemessen. Aus den Biopsien von den vier Patienten wurde jeweils keine Transferaktivität gewonnen (3). Das Fehlen einer nachweisbaren TG-Transferaktivität könnte damit im Zusammenhang stehen, dass es nicht möglich ist, MTP aus den Mikrosomen der Abeta-Lipoproteinämie-Biopsien durch die Desoxycholat-Behandlung freizusetzen. Um diese Möglichkeit zu testen, wurden die Mikrosomen aus einem Patienten zusätzlich zur Behandlung mit dem Detergens noch beschallt. Die Bad-Beschallung setzt unabhängig eine TG-Transferaktivität frei, die mit der der Detergensbehandlung vergleichbar ist. Jedoch war auch unter diesen Bedingungen keine TG-Transferaktivität nachweisbar.
Als nächstes wurde die Möglichkeit untersucht, dass das Fehlen einer nachweisbaren TG-Transferaktivität damit in Zusammenhang steht, dass sie nicht in Zellen nachgewiesen werden kann, die große intrazelluläre Fetttröpfchen enthalten, wie sie z. B. bei der Abeta-Lipoproteinämie vorkommen. Um diese Möglichkeit zu testen, wurden drei Kontrollen laufen gelassen. Zuerst wurde die TG-Transferaktivität in einer Biopsie eines Patienten mit Chylomikron-Retentionskrankheit gemessen. Die Patienten mit Chylomikron-Retentionskrankheit haben einen Defekt in der Zusammenlagerung oder in der Sekretion von Chylomikronen und weisen in ihren Enterocyten große Fetttröpfchen auf; dies ist analog zu den Patienten mit Abeta-Lipoproteinämie. Außerdem wurde die TG-Transferaktivität in einer Biopsie gemessen, die aus einer Person, die vor der Biopsie nicht gefastet hatte, und aus einem Patienten mit homozygoter Hypobetalipoproteinämie entnommen wurde. Diese beiden Personen wiesen auch Fett-gefüllte Enterocyten auf. In allen drei Fällen wurde eine TG-Transferaktivität gefunden, die mit der von normalen Personen vergleichbar war (4); dies bestätigt, dass das Vorliegen von intrazellulären Lipidtröpfchen nicht unsere Fähigkeit stört, die TG-Transferaktivität zu gewinnen oder nachzuweisen.
Um den biochemischen Defekt festzustellen, der für die Abwesenheit der Transferaktivität verantwortlich ist, wurden die löslichen Proteine nach der Freisetzung des MTP aus der mikrosomalen Fraktion der homogenisierten Biopsie durch Western-Blot-Analyse mit Antikörpern analysiert, die gegen die 88-kDa-Komponente des Rinder-MTP hergestellt wurden. Wenn normale Personen (5) oder Kontrollpersonen (6) mit einem polyclonalen anti-88-kDa-Antikörper getestet wurden, wurde eine Bande festgestellt, die mit der der 88-kDa-Komponente des Rinder-MTP vergleichbar ist. Außerdem zeigten weitere Proteine mit einer größeren Mobilität auch eine Kreuzreaktion mit diesem Antikörper. Um die Identität der 88-kDa-Komponente des menschlichen MTP zu bestätigen, wurde der Antikörper auf einer MTP-Affinitätssäule affinitätsgereinigt. Nach dieser Behandlung war nur das Protein mit einem Molekulargewicht immunreaktiv, das mit dem der 88-kDa-Komponente des Rinder-MTP vergleichbar war (7).
Die Western-Blot-Analyse der löslichen Proteine nach der Detergensbehandlung der Mikrosomen von allen fünf normalen Personen und den drei Kontrollpersonen zeigte, dass die 88-kDa-Komponente des MTP vorlag (5 bis 7). Im Gegensatz dazu war bei den Patienten mit Abeta-Lipoproteinämie kein Protein zu sehen, das der 88-kDa-Komponente des Rinder-MTP entsprach (8). Außerdem wurde eine ähnliche Analyse mit 100 μg Protein aus Ganz-Darmhomogenisaten von zwei Patienten mit Abeta-Lipoproteinämie durchgeführt. Wieder war keine Bande zu sehen, die der 88-kDa-Komponente des MTP entsprach (8). Als Kontrolle wurde mit der Immunblotanalyse mit anti-PDI-Antikörpern gezeigt, dass die PDI in den zwei letzteren Patienten mit Abeta-Lipoproteinämie vorlag. Diese Ergebnisse machen deutlich, dass die biochemische Grundlage für die Abwesenheit der MTP-Aktivität bei den Patienten mit Abeta-Lipoproteinämie im deutlichen Mangel oder Fehlen der 88-kDa-Komponente des MTP besteht.
Demonstration eines Gendefekts bei einem Patienten mit Abeta-Lipoproteinämie Amplifikation von mRNA und DNA durch PCR
Zwei Darmbiopsien wurden aus der Duodenumschleimhaut eines 39 Jahre alten Patienten mit Abeta-Lipoproteinämie gewonnen. Die frühere Untersuchung zeigte, dass in den aus diesem Patienten entnommenen Darmbiopsien weder die MTP-Aktivität noch die 88-kDa-Komponente des MTP nachweisbar waren. Jede Biopsie wog 5 bis 10 mg und wurde bei –70°C gefroren aufbewahrt. Zur Isolierung der Gesamt-RNA wurde eine gefrorene Biopsie in ein Mikrozentrifugenröhrchen gegeben, das 0,8 ml kaltes RNAzol B (CinnaBiotecx labs, Friendswood, Texas) enthielt. Die Biopsie wurde sofort durch ein Polytron (Brinkmann, Westbury, NY) mit sechs Stößen bei Einstellung 10 homogenisiert. Chloroform (80 μl) wurde zugegeben und das Gemisch vorsichtig 20-mal umgedreht. Nach fünf Minuten Inkubation auf Eis wurde das Gemisch in einer Eppendorf-Mikrofuge 5415 (Brinkmann) bei 14000 UpM 15 Minuten bei 4°C zentrifugiert. Die Gesamt-RNA wurde durch Zugabe von 350 μl Isopropanol zu dem Überstand ausgefällt. Die Ausbeute aus der Biopsie war 20 μg Gesamt-RNA oder etwa 2 μg RNA pro mg Gewebe (0,2%).
Die RNA (50 ng) wurde in die Erst-Strang-cDNA revers transkribiert, wobei 2,5 μM Zufalls-Hexamer-Primer, 5 mM Magnesiumchlorid, 1 mM von jedem Desoxynucleotidtriphosphat (dNTP), 1 U/μl RNAsin, 2,5 U/μl reverse Transkriptase des murinen Moloney Leukämie-Virus (M-MLV-RT) und 1 × PCR-Reaktionspuffer (Perkin- Elmer-Cetus RNA-PCR-Kit Nr. N 808-0017) verwendet wurden. Die Reaktionslösung von 20 μl wurde zehn Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, um die Primer zu anelieren, und dann 30 Minuten bei 42°C, um die RNA revers zu transkribieren. Die Reaktion wurde durch fünf Minuten Erhitzen auf 99°C und Abkühlen auf 5°C beendet. Die Erst-Strang-cDNA wurde zu einer 100-μl-PCR zugegeben, die 0,15 μM Vorwärts- und Rückwärts-Primer, 2 mM Magnesiumchlorid, 0,2 mM von jedem dNTP und 2,5 U Taq-Polymerase in 1,25 × PCR-Puffer enthielt. Die Amplifikation wurde in einem Thermocycler von Perkin-Elmer, GeneAmp PCR-System Modell 9600, 50 Zyklen durchgeführt, die aus 30 Sekunden bei 94°C, 30 Sekunden bei 50°C und einer Minute bei 72°C bestanden. Anschließend wurde das Reaktionsgemisch sieben Minuten bei 72°C inkubiert. Die Vorwärts- und Rückwärts-Primer, die verwendet wurden, um die 5'-Region der RNA, die die 88-kDa-Komponente des MTP codiert, zu amplifizieren, sind nachstehend 5' zu 3' dargestellt.
Nachstehend sind die verwendeten Primer-Kombinationen und die Länge des PCR-Produkts angegeben.

Primerpaar Länge des Produkts (bp)

15F + 678R 664

15F + 839R 825

41F + 1029R 998

578F + 1029R 470

900F + 1588R 689

900F + 2117R 1228
Die Primersequenzen beruhen auf der normalen menschlichen cDNA, die die 88-kDa-Komponente des MTP codiert. Alle Primer sind 5' zu 3' dargestellt. F bezieht sich auf den Vorwärts-Primer und R auf den Rückwärts-Primer. Die unterstrichenen Bereiche sind Restriktionsstellen, die durch EcoRI (Primer 578F) oder BamHI (Primer 1029R und 2117R) erkannt werden; diese wurden in das 5'-Ende der Primer eingebaut.
Die vorliegende genomische DNA wurde aus einer zweiten gefrorenen Darmbiopsie isoliert. Die Biopsie wurde in ein Mikrofugenröhrchen gegeben, das 400 μl Extraktionspuffer (10 mM Tris-Cl, pH 8,0, 0,1 M EDTA, 0,5% SDS, 20 μg/ml RNAse I) enthielt, und sofort homogenisiert. Die Homogenisierung erfolgte mit einem Polytron mit fünf Stößen bei Einstellung 10. Sodann wurde Proteinase K bis zu einer Endkonzentration von 100 μg/ml zugegeben und das Reaktionsgemisch drei Stunden bei 50°C inkubiert. Das Gemisch wurde in bestimmten Abständen aufgewirbelt.
Nach Abkühlen des Reaktionsgemisches auf Raumtemperatur wurden 400 μl Tris-gesättigtes Phenol/Chloroform (pH 8,0) zugegeben. Das Röhrchen wurde vorsichtig für fünf Minuten umgedreht und danach fünf Minuten bei 14000 UpM bei Raumtemperatur zentrifugiert. 2 M Natriumchlorid (35 μl) und Ethanol (0,7 ml) wurden zum Überstand (350 μl) zugegeben, um die DNA auszufällen. Die DNA wurde kurz abzentrifugiert, vorsichtig mit 70% Ethanol gewaschen, kurz getrocknet und in 20 μl entionisiertem Wasser (dH₂O) resuspendiert. Die Ausbeute der DNA betrug 20 μg oder etwa 2 μg DNA pro mg Gewebe (0,2%).
Die genomische DNA (0,5 μg) wurde fünf Minuten auf 95°C erhitzt und unmittelbar zu einem 100-μl-PCR-Reaktionsgemisch zugegeben, das 0,15 μM Vorwärts- und Rückwärts-Primer, 2 mM Magnesiumchlorid, 0,2 mM von jedem dNTP und 2,5 U Taq-Polymerase in 1,25 × PCR-Puffer (Perkin-Elmer-Cetus) enthielt. Die Amplifikation erfolgte in einem Thermocycler von Perkin-Elmer, GeneAmp PCR System Modell 9600, drei Zyklen, die aus 30 Sekunden bei 97°C, 30 Sekunden bei 50°C und einer Minute bei 72°C bestanden. Dann wurden weitere 32 Zyklen durchlaufen, die aus 30 Sekunden bei 94°C, 30 Sekunden bei 50°C und einer Minute bei 72°C bestanden. Danach wurde das Reaktionsgemisch sieben Minuten bei 72°C inkubiert.
Exon 2 des Gens codiert die Basen 109 bis 296 der RNA der 88-kDa-Komponente des MTP. Die Primer (SEQ ID NO: 18 und 19), die zum Amplifizieren von Exon 2 des Gens, das die 88-kDa-Komponente des MTP codiert, aus der genomischen DNA eines Patienten verwendet wurden, sind nachstehend dargestellt.

Primerpaar SEQ ID NO.

CCCTTACAATGAAAACTGG 18

GGTACACTTCTCCAAAAACTT 19
Diese Primer wurden auf Grundlage der normalen menschlichen DNA-Sequenz entworfen, die die 88-kDa-Komponente des MTP codiert. Die Primer sind zu den Introns komplementär, die das 188 bp große Exon 2 flankieren, so dass das gesamte Exon in der PCR-Reaktion amplifiziert wird. Die Größe des Amplifikationsprodukts, einschließlich der Primer und flankierenden Intron-Regionen, besitzt eine Länge von 292 bp.
B. Sequenzierung von PCR-Produkten
Die PCR-Produkte, die sowohl aus RNA- als auch aus DNA-PCR erhalten wurden, wurden einer Elektrophorese auf einem 1,4% Agarose-Gel in TAE-Puffer (40 mM Tris-Acetat, 1 mM EDTA, pH 8,0) unterworfen. Das Gel wurde fünf Minuten in 0,5 mg/ml Ethidiumbromid in Wasser gefärbt und zehn Minuten in Wasser entfärbt. Die DNA wurde auf einem UV-Lichtkasten sichtbar gemacht. Die Banden, die das gewünschte PCR-Produkt enthielten, wurden mit einer Rasierklinge ausgeschnitten, und die DNA wurde durch das GeneClean-Verfahren (Bio 101, La Jolla, CA) gereinigt. Die DNA wurde aus der Silica-Matrix in 20 μl destilliertes Wasser eluiert. Jede PCR-Reaktion ergab etwa 1 μg des gewünschten DNA-Fragments. Ein Teil der gereinigten DNA wurde direkt durch eine zyklische Taq-Polymerase-Sequenzierung auf einem automatischen Sequenziergerät, Applied Biosystems, Inc., 373, sequenziert, wie von Tracy und Mulcahy, Biotechniques 11 (1991), 68, beschrieben.
Die restliche DNA wurde für die Clonierung in einen Plasmidvektor zubereitet, indem mit T4-DNA-Polymerase glatte Enden hergestellt und anschließend eine Phosphorylierung mit T4-Polynucleotid-Kinase durchgeführt wurde. Die DNA (500 ng) wurde zu 50 μl Reaktionsgemisch zugegeben, das 20 μM von jedem dNTP, 1 mM ATP, 4,5 Einheiten T4-DNA-Polymerase, 5 Einheiten T4-Polynucleotid-Kinase in 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM Magnesiumchlorid, 1 mM Dithiothreit und 50 μg/ml BSA enthielt. Die Inkubation erfolgte eine Stunde bei 37°C. Anschließend wurde die DNA aus dem Reaktionsgemisch durch GeneClean gereinigt. Die DNA wurde in 10 μl dH₂O eluiert. Die DNA mit glatten Enden wurde in pUC18 ligiert, der vorher mit SamI gespalten und dephosphoryliert worden war (Pharmacia). DH5α-Zellen (100 μl, Gibco-BRL) wurden gemäß den Anweisungen des Herstellers transformiert. Die Plasmid-DNA wurde amplifiziert und durch das alkalische Lyseverfahren isoliert, das in Molecular Cloning (Sambrook, Fritsch und Maniatis, Hrsg.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1.25–1.28, (1989), beschrieben wird. Die Plasmidclone wurden, wie in Beispiel 1 beschrieben, cloniert.
Ergebnisse
Die direkte Sequenz aus drei unabhängigen RNA-PCR-Reaktionen zeigte bei dem Patienten mit Abeta-Lipoproteinämie ein deletiertes Cytosin an Base 262 der cDNA, bezogen auf die Startstelle der Translation. Durch diese eine Basendeletion wird das Leseraster verschoben, wodurch es 21 Basen stromabwärts davon zu einem Stopp-Codon (TGA) kommt. Die Translation der mutierten RNA würde somit beim Aminosäurerest 78 enden. Nachstehend findet sich ein Vergleich der DNA von der normalen Person und von dem Patienten mit Abeta-Lipoproteinämie sowie der hergeleiteten Aminosäuresequenzen.
Die direkte Sequenzanalyse von zwei unabhängigen PCR-Amplifikationen der genomischen DNA zeigte die Deletion. Dies weist darauf hin, dass beide Allele des Gens, das die 88-kDa-Komponente des MTP codiert, bei diesem Patienten die Leserastermutation aufweisen. Außerdem wurden die DNA-Fragmente für die Sequenzierung in pUC18 cloniert. Auch hier ist bei acht Plasmidclonen zu sehen, dass das Cytosin deletiert ist, wodurch die Leserastermutation auf beiden Allelen noch weiter bestätigt wird.
Demonstration eines Gendefekts in einem zweiten Patienten mit Abeta-Lipoproteinämie
A. Verfahren
Die genomische DNA wurde aus dem Blut eines zweiten Patienten mit Abeta-Lipoproteinämie unter Verwendung eines Qiagen-Kits Nr. 13343 (Chatsworth, CA) nach den Anweisungen des Herstellers isoliert. Wie beim ersten Patienten haben wir vorher gezeigt, dass in Darmbiopsien aus diesem Patienten weder eine MTP-Aktivität noch die 88-kDa-Komponente des MTP nachgewiesen werden konnte. 300 μg dieser genomischen DNA wurden an Stratagene (La Jolla, CA) gesendet, wo sie zu einer genomischen DNA-Bank in dem Lambda DASH^TM-Vektor (Stratagene) verarbeitet wurde. Außerdem wurde eine normale genomische Bank im Lambda DASH^TM-Vektor von Stratagene bezogen (Katalog-Nr. 943202).
Zwei Millionen unabhängige rekombinante Phagenplaques aus jeder Bank wurden auf genomische DNA-Insertionen durchmustert, welche Sequenzen enthielten, die zu der cDNA des Rinder-MTP homolog waren. Der Durchmusterungsprozess war ähnlich wie der für die Durchmusterung der cDNA-Bank in Beispiel 1, mit der Ausnahme, dass der E. coli-Wirtsstamm PLK 17 war, die Hybridisierungs- und Waschtemperaturen bei 60°C lagen und der Waschpuffer 1 × SSC, 0,1% SDS, war. Die Sonde für die Durchmusterung der genomischen Bank war das 2,4 kb große EcoRI-Fragment aus dem Rinder-cDNA-Clon Nr. 22, das genau wie in Beispiel 2 mit ³²P markiert wurde. Vermeintliche positive Clone (etwa 30 aus jeder Bank) wurden erneut durchmustert und blieben in zwei weiteren Runden der Hybridisierungsanalyse positiv. Nach der dritten Durchmusterung wurden einzelne isolierte positive Plaques aus den Agarplatten ausgeschnitten und in 1 ml SM-Puffer mit 50 μl Chloroform abgelegt. Der Phagentiter wurde für jedes Phagenstammpräparat amplifiziert, wobei dem Protokoll „Small-scale liquid cultures" von Sambrook et al., vorstehend, S. 2.67, gefolgt wurde. 100 μl der amplifizierten Stammpräparate wurden mit 100 μl der präparierten PLK 17-Plattierungszellen und 100 μl 10 mM Magnesiumchlorid, 10 mM Calciumchlorid gemischt und 15 Minuten bei 37°C inkubiert. Anschließend wurden 50 ml 2 × NZY (Bethesda Research Laboratories) mit 0,2% Casaminosäuren (CAA, Fisher Scientific Nr. DF0288-01-2) mit diesem Gemisch beimpft und über Nacht bei 37°C gezüchtet. Die Lambda-DNA wurde aus den lysierten Kulturen isoliert, wobei der Qiagen-Kit Nr. 12543 mit den Qiagen-Puffern und dem entsprechenden Protokoll eingesetzt wurde.
Die direkte DNA-Sequenzierung der genomischen DNA-Insertionen erfolgte, wie in Beispiel 1 beschrieben, unter Verwendung der Lambda-DNA als Matrize. Oligonucleotide mit etwa 20 Basen, die zu der menschlichen cDNA-Sequenz komplementär waren, wurden als Primer für die Sequenzierung von normalen genomischen Clonen und genomischen Abeta-Lipoproteinämie-Clonen eingesetzt. Die Charakterisierung und Sequenzierung von Abeta-Lipoproteinämie- und normalen genomischen Clonen erfolgten in paralleler Anordnung (vgl. Beispiel 9). Die Intron/Exon-Grenzen wurden durch Vergleich der genomischen und cDNA-Sequenzen identifiziert. Die Sequenzierungs-Primer wurden entsprechend den Intron-Sequenzen 5' und 3' zu jedem Exon entworfen und dazu verwendet, die Intron/Exon-Grenzen durch erneute Sequenzierung der Grenzen zu bestätigen. Außerdem wurde die codierende Se quenz der beiden DNA-Stränge für jedes Exon von mindestens einem genomischen Abeta-Lipoproteinämie-Clon sequenziert. Die Analyse der DNA-Sequenz von Exon 13 des Patienten mit Abeta-Lipoproteinämie zeigte eine C-zu-T-Punktmutation an der Base 1830 der menschlichen cDNA. Diese Basenänderung führt ein Stopp-Codon an einer Stelle ein, die normalerweise den Aminosäurerest Arg₅₉₅ codiert.
Die Nucleotidsequenz um die Base 1830 codiert eine TagI-Endonuclease-Restriktionsstelle (TCGA) in der normalen DNA-Sequenz, nicht jedoch in der DNA-Sequenz des Patienten mit Abeta-Lipoproteinämie (TTGA). Um diese Nucleotidänderung zu bestätigen und die Homozygotie dieses Allels zu untersuchen, wurde die genomische DNA aus einer normalen Kontrolle, aus dem Patienten mit Abeta-Lipoproteinämie und den beiden Eltern des Patienten mit Abeta-Lipoproteinämie mit TaqI gespalten. Die genomische DNA wurde aus dem Blut einer normalen Kontrolle, des Patienten mit Abeta-Lipoproteinämie und der Mutter und dem Vater des Patienten mit Abeta-Lipoproteinämie, wie vorstehend beschrieben, isoliert. 10 μg der genomischen DNA aus jeder Probe wurden mit 100 Einheiten TaqI (Bethesda Research Laboratories) in 100 μl 1 × React-Puffer Nr. 2 (Bethesda Research Laboratories) fünf Stunden bei 65°C gespalten. Jedes Spaltungsreaktionsgemisch wurde bei 2000 UpM in einer Ultrafree-MC 10000 NMWL-Filtereinheit (Nr. UFC3 TGC 00 von Millipore) mit einem Molekuargewichtsausschluss von 10000 30 Minuten abzentrifugiert, wodurch das Reaktionsvolumen auf 50 μl reduziert wurde. Danach wurden die Reaktionsgemische der Restriktionsspaltung einer Agarose-Gel-Elektrophorese durch ein 1 Gel in TEA-Puffer bei 20 Volt 16 Stunden unterworfen. Das Agarose-Gel wurde mit Ethidiumbromid gefärbt, fotografiert und danach durch das Verfahren von Southern auf eine Nitrocellulose-Membran überführt; E. M. Southern, J. Mol. Biol. 98 (1975), 503–517.
Die Sonde für die Southern-Hybridisierung war ein PCR-Produkt, das Exon 13 und einige flankierende Intron-Sequenzen enthielt (vgl. SEQ ID NO: 24, nachstehend). Die PCR wurde unter Verwendung der Komponenten und des Protokolls des GeneAmp-Kits (Perkin-Elmer, Cetus Industries) durchgeführt, indem 0,3 μg normale genomische DNA als Matrize und jeweils 10 pMol des Vorwärts- und des Rückwärts-Primers in einem Reaktionsvolumen von 100 μl verwendet wurden. Das Reaktionsgemisch wurde zwei Minuten bei 97°C inkubiert, dann 30 Zyklen unterworfen, die aus 30 Sekunden bei 94°C, 30 Sekunden bei 45°C und einer Minute bei 72°C bestanden, gefolgt von einer siebenminütigen Inkubation bei 72°C und der Lagerung bei 4°C. Die amplifizierte DNA wurde einer Elektrophorese durch Agarose wie in Beispiel 1 unterworfen und das erwartete 302 bp große Fragment ausgeschnitten und aus dem Gel eluiert. Dieses PCR-Produkt von Exon 13 wurde sodann wie in Beispiel 2 mit ³²P markiert und als Sonde für die Southern-Hybridisierung verwendet. Die Hybridisie rungs- und Waschbedingungen waren wie in Beispiel 2. Der Blot wurde fünf Tage bei –80°C gegen einen Röntgenfilm exponiert.
B. Ergebnisse
Eine menschliche genomische Bank wurde aus DNA erzeugt, die aus einem zweiten Patienten mit Abeta-Lipoproteinämie isoliert wurde. Zwei Millionen Phagen wurden mit einer Rinder-cDNA-Sonde getestet und 30 Phagen mit menschlichen genomischen DNA-Insertionen charakterisiert, die zu der Rinder-MTP-cDNA homolog waren.
Die DNA-Sequenzanalyse der genomischen DNA-Insertionen aus dem Patienten mit Abeta-Lipoproteinämie zeigte eine C-zu-T-Punktmutation an der Base 1830 in Exon 13 des menschlichen MTP-Gens (Exon 13 entspricht den Basen 1817 bis 1914 der menschlichen cDNA). Durch diese C-zu-T-Punktmutation wird das normale CGA-Arginin-Codon am Rest 595 zu einem translationalen Stopp-Signal TGA geändert; dies führt zu einer 300-Aminosäure-Verkürzung dieses Proteins. Diese Nucleotidänderung wurde auf allen vier unabhängigen genomischen DNA-Insertionen gefunden, die aus diesem Individuum charakterisiert wurden.
Nachstehend ist die Position der C-zu-T-Mutation in Exon 13 eines Patienten mit Abeta-Lipoproteinämie dargestellt. Die 302 Basen große DNA-Sequenz des normalen Exons 13 mit flankierender Intron-Sequenz ist dargestellt. Die DNA, die dem Vorwärts- (-->) und dem Rückwärts-(<--) PCR-Primer entspricht, die zum Herstellen der Sonde für die Southern-Hybridisierung verwendet wurden, sind oberhalb der entsprechenden Pfeile angegeben. Die horizontalen Striche stellen die Intron/Exon-Grenzen dar. Die TaqI-Erkennungssequenz ist mit einem Kästchen umrahmt. Ein Sternchen (*) bezeichnet die Base 1830, die Stelle der C-zu-T-Mutation.
Die normale Nucleotidsequenz im Bereich um das C an Base 1830 (TCGA) codiert eine TaqI-Restriktionsstelle. Bei diesem Patienten mit Abeta-Lipoproteinämie ist die Sequenz an dieser Stelle mutiert (TTGA). Aus diesem Grund sollte TaqI das Exon 13 in einer normalen DNA an dieser Stelle spalten, nicht jedoch in einer DNA, die diese Mutation enthält. Im normalen Exon 13 liegt nur eine einzige TaqI-Stelle vor.
Ein Southern-Blot bestätigt diese Nucleotidänderung (9). Die genomische DNA, die aus einer Kontrollperson, dem Patienten mit Abeta-Lipoproteinämie und der Mutter und dem Vater des Patienten isoliert wurde, wurde jeweils mit TaqI vollständig gespalten und mit Sequenzen aus Exon 13 als Sonde getestet. Die normale DNA wird durch TaqI in zwei Stücke gespalten, die mit Exon 13 hybridisieren; die Abeta-Lipoproteinämie-DNA wird durch TaqI nicht gespalten; dies zeigt sich dadurch, dass nur eine einzige hybridisierende Bande vorliegt. Dieses Ergebnis bestätigt das Fehlen einer TaqI-Erkennungsstelle. Die DNA aus beiden Eltern zeigt ein gemischtes Muster, wodurch verdeutlicht wird, dass ein normales Allel und ein mutiertes Alle vorliegen.
C. Analyse
Die vorstehenden Ergebnisse und die daraus gezogenen Schlussfolgerungen können wie folgt zusammengefasst werden.
Die MTP-Aktivität und das MTP-Protein sind in den untersuchten Patienten mit Abeta-Lipoproteinämie nicht nachweisbar. Das Fehlen von Protein und Aktivität lässt sich durch die Mutationen im MTP-Gen vollständig erklären. Frühere Ergebnisse zeigen, dass die Abeta-Lipoproteinämie eine monogenetische Krankheit ist; Kane und Havel, vorstehend. Aus diesen Ergebnissen kann man schließen, dass die Abeta-Lipoproteinämie durch einen Verlust der MTP-Aktivität verursacht wird.
Diese Ergebnisse zeigen, dass die MTP-Aktivität für die wirksame Zusammenlagerung und Sekretion von Lipoprotein-Partikeln, die Apolipoprotein B enthalten, erforderlich ist. Der Verlust der MTP-Aktivität führt zu niedrigeren Serumspiegeln von Cholesterin, Triglyceriden, Phospholipiden und Cholesterinestern. Man kann hieraus folgern, dass eine Abnahme der Menge oder der Aktivität des MTP zu niedrigeren Sperumlipidspiegeln führt.
Außerdem stehen niedrigere Serumlipidspiegel mit der Prophylaxe, Stabilisierung oder Regression der Arteriosklerose in Zusammenhang. Wie vorstehend erläutert führt ein Verlust der Menge oder der Aktivität des MTP zu niedrigeren Serumlipidspiegeln. Außerdem kommt bei Patienten mit Abeta-Lipoproteinämie keine Arteriosklerose vor. Schaefer, vorstehend; Dische und Porro, Am. J. Med. 49 (1970), 568–571; und Sobrevilla et al., Am. J. Med. 37 (1964), 821. Somit kann man hieraus auch folgern, dass die Hemmung des MTP zu einer Prophylaxe, Stabilisierung oder Regression der Arteriosklerose führt.
Die vorliegende Erfindung wird in den folgenden Beispielen noch weiter erläutert. Diese Beispiele sollen in keiner Weise den Umfang der vorliegenden Erfindung einschränken, vielmehr sollen sie dazu dienen, noch weiter zum Verständnis der Erfindung beizutragen.
Beispiel 1
Isolierung und DNA-Seauenzanalyse von cDNA-Clonen, die die 88-kDa-Komponente des Rinder-MTP codieren
Eine kommerziell verfügbare cDNA-Bank des Rinder-Dünndarms im Bakteriophagen Lambda gt10 wurde von Clontech bezogen. 1 × 10⁶ unabhängige rekombinante Phagenplaques wurden nach der cDNA durchmustert, die der 88-kDa-Komponente des Rinder-MTP entsprach.
Ein E. coli-Bakterienwirt, Stamm C600 (Clontech), wurde für die Phageninfektionvorbereitet, indem er in 50 ml Luria-Brühe (LB = 10 g Natriumchlorid, 10 g Bacto-Trypton und 5 g Hefeextrakt pro Liter), angereichert mit 0,2% Maltose und 10 mM Magnesiumsulfat, über Nacht bei 30°C bis zur Sättigung gezüchtet wurde. Die Zellen wurden bei niedriger Geschwindigkeit abzentrifugiert, in 20 ml 10 mM Magnesiumsulfat resuspendiert und bei 4°C gelagert. 20 Aliquots mit jeweils 50000 Phagen und 300 μl der C600-Zellen wurden 15 Minuten bei 37°C inkubiert, dann mit 7 ml LB + 0,7 Agarose gemischt und auf 132-mm-LB-Platten plattiert. Die Platten wurden sieben bis zehn Stunden bei 37°C inkubiert, bis einzelne Phagenplaques zu sehen waren, danach wurden sie auf 4°C überführt.
Die Plaques wurden von jeder Platte in doppelter Ausführung auf Nitrocellulose-Membranen wie folgt übertragen. Eine Nitrocellulose-Membran (Schleicher & Schuell, Keene, NH) wurde direkt auf die Phagen gelegt, und zwar eine Minute (erster Transfer) oder drei Minuten (zweiter Transfer). Die Phagen-DNA, die an der Membran haftete, wurde sodann eine Minute in 0,5 N Natriumhydroxid, 1,5 M Natriumchlorid denaturiert, danach eine Minute in 1 M Tris, pH 8,0, 1,5 M Natriumchlorid neutralisiert und schließlich eine Minute in 2 × SSC gewaschen (1 × SSC = 0,15 M Natriumchlorid, 0,015 M Natriumcitrat, pH 7,0). Danach wurde die DNA auf den Nitrocellulose-Membranen dauerhaft fixiert, indem sie zwei Stunden in einem Vakuumofen bei 80°C gebacken wurden.
Die Isolierung des Rinder-MTP, einschließlich der 88-kDa-Komponente, wurde bereits früher beschrieben. Vgl. Wetterau und Zilversmit, Chem. Phys. Lipids 38 (1985), 205–272; Wetterau et al., J. Biol. Chem. 265 (1990), 9800–9807. Unter Verwendung von Sequenzen von inneren Peptiden der 88-kDa-Komponente wurden Oligonucleotide entworfen, die mit der cDNA hybridisieren können, die das Protein codiert. Vgl. Lathe, R., J. Mol. Biol. 183 (1985), 1–12.
Bei den hier beschriebenen Verfahren wurden Sonden eingesetzt, die die folgenden DNA-Sequenzen aufwiesen (die 5' zu 3' angegeben sind):
Die Sonde 2A ist ein Gemisch aus 32 aus 20 Basen bestehenden Oligonucleotiden, die jeweils die Aminosäuresequenz des Peptids codieren, aus der dieser Sonde entworfen wurde. Die Sonde 37A ist eine einmalige 33-Basen-Sequenz, und die Sonde 19A ist eine einmalige 30-mer-Sequenz. Diese Oligonucleotidsequenzen codieren Aminosäuresequenzen, die inneren Peptiden entsprechen.
Die Oligonucleotide wurden von kommerziellen Lieferanten, wie hier angegeben, bezogen oder auf einem DNA-Synthesegerät, Milligen/Biosearch 8700 (Millipore Corp., Bedford, MA) unter Verwendung der Betacyanoethylphosphoramidit-Chemie synthetisiert. Die Sequenzierungsprimer wurden vor der Verwendung auf NAP-10-Säulen (Pharmacia LKB Biotechnologies, Inc., Piscataway, NJ) entsalzt. Die Sonden wurden auf dem präparativen Harz NENSORB Prep Resin gereinigt (DuPont Company, NEN Research Products, Boston, MA).
Die Sonde 2A wurde von Genosys Biotechnologies, Inc. (The Woodlands, Texas) bezogen und markiert, indem 1 μg des Oligonucleotids in 50 mM Tris-Cl, pH 7,5, 10 mM Magnesiumchlorid, 5 mM Dithiothreit (DTT), 0,1 mM Ethylendiamintetraacetat (EDTA) und 0,1 mM Spermidin mit 10 Einheiten T4-Polynucleotid-Kinase und 120 μCi gamma-markiertem ³²P-ATP in einem Reaktionsvolumen von 50 μl 30 Minuten bei 37°C inkubiert wurde, worauf eine Hitzeinaktivierung der Kinase von fünf Minuten bei 68°C folgte. Das nicht umgesetzte ATP wurde mit Hilfe einer Sephadex G-25-Spin-Säule (Boehringer Mannheim Corp., Indianapolis, IN) gemäß den Anweisungen des Herstellers entfernt. Das markierte Oligonucleotid hatte eine spezifische Aktivität von etwa 2 × 10⁸ DpM/μg.
Die Nitrocellulose-Membranen wurden zwei Stunden bei 37°C in 150 ml Hybridisierungspuffer (6 × SSC, 20 mM NaPO₄, 2 × Denhardt, 0,1% SDS und 100 μg/ml Lachssperma-DNA) vorhybridisiert (vgl. Sambrook et al., vorstehend, für Denhardt S. B15). Der Hybridisierungpuffer wurde ersetzt und die markierte Oligonucleotid-Sonde 2A zugegeben; sodann wurde die Hybridisierung bei 37°C über Nacht zugelassen. Die Membranen wurden in 1 Liter 2 × SSC, 0,1% SDS bei 40°C gewaschen, Luft-getrocknet und fünf Tage bei –80°C gegen einen Kodak XAR-5-Röntgenfilm mit einem Dupont-Blichtungs- plus Verstärkungsschirm (Dupont, NEN) exponiert.
Die vermutlich positiven Clone (40) wurden in zwei anschließenden Hybridisierungsrunden erneut mit der gleichen Sonde durchmustert. Agarstückchen, die den positiven Signalen auf den Röntgenfilmen entsprachen, wurden aus den ursprünglichen Platten ausgeschnitten und in 1 ml SM + 5% CHCl₃ gelegt (SM = 5,8 g Natriumchlorid, 2,0 g Magnesiumsulfat, 50 ml 1 M Tris-Cl, pH 7,5, und 5 ml 2% Gelatine pro Liter). Die Phagen wurden erneut plattiert, indem 0,001 μl des Phagenstammpräparats mit 100 μl C600-Zellen in 10 mM Magnesiumsulfat gemischt wurden, worauf eine Inkubation von 15 Minuten bei 37°C, die Zugabe von 3 ml LB + 0,7% Agarose und die Plattierung auf 82-mm-LB-Platten folgten. Nach der Inkubation über Nacht bei 37°C und einer Stunde bei 4°C wurden die Phagenplaques auf Nitrocellulose überführt und erneut wie vorstehend mit der markierten Oligonucleotid-Sonde 2A abgesucht. Nach der dritten Hybridisierungs-Durchmusterung wurden 16 Phagenplaques isoliert.
Die Insertionen von jedem der 16 rekombinanten Phagen wurden durch PCR amplifiziert, wobei die kommerziell verfügbaren Lambda gt10-Amplimere (Clontech) und der GeneAmp-Kit (Perkin-Elmer, Cetus Industries, Norwalk, CT) genau gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet wurden. Die amplifizierte DNA wurde einer Elektrophorese durch 1,2% Agarose-Gele in Tris-EDTA-Acetat-Puffer (TEA = 40 mM Tris-Acetat, 1 mM EDTA) zwei bis drei Stunden bei 100 Volt unterworfen. Anschließend wurden die Agarose-Gele in Ethidiumbromid (EtBr) gefärbt, mit Wasser gespült und fotografiert. Danach wurde die DNA aus dem Gel durch das Verfahren von Southern auf eine Nitrocellulose-Membran überführt. Eine Southern-Hybridisierung erfolgte unter Verwendung der markierten Oligonucleotid-Sonde 2A in 50 ml Hybridisierungspuffer (vorstehend) bei 40°C über Nacht; hierauf folgten Waschgänge bei 45°C, 48°C und 51°C. Zwei amplifizierte Inserte, die den Phagen Nr. 64 und Nr. 76 entsprachen (1), hybridisierten mit Sonde 2A bei 51°C in 2 × SSC. Die Lambda-DNA dieser zwei Clone wurde nach dem Plattenlysat-Verfahren hergestellt (Sambrook et al., vorstehend, S. 2.118). Ein Zehntel (5 ml von 50 ml) der Phagen-DNA wurde mit 20 Einheiten des Restriktionsenzyms EcoRI (New England Biolabs, Beverly, MA) in dem Puffer des Herstellers zwei Stunden bei 37°C gespalten und danach einer Agarose-Gel-Elektrophorese unterworfen. Bei der Spaltung dieses Phagen Nr. 64 mit EcoRI wurde ein 1,0 kb großes Insertionsfragment erhalten, während die cDNA aus dem Phagen Nr. 76 zwei EcoRI-Stücke mit 0,9 kb und 0,4 kb ergab. Diese Banden wurden aus dem Gel ausgeschnitten.
Die DNA wurde aus den Agarose-Gelscheiben eluiert, indem die Gelscheiben zuerst durch eine 21-Gauge-Nadel in 3 ml T₁₀E₁N₃ gedrückt (10 mM Tris-Cl, pH 7,4, 1 mM EDTA, pH 8,0, und 0,3 M Natriumchlorid) und bei –20°C über Nacht eingefroren wurden. Danach wurden die Proben 30 Minuten bei 37°C aufgetaut, zentrifugiert, um die Agarose zu sedimentieren, 1 : 1 mit Wasser verdünnt und dann nach den Anweisungen des Herstellers durch eine Elu.Tip-Säule (Schleicher & Schnell) laufen gelassen. Danach wurden die DNA-Proben mit Ethanol ausgefällt, mit Ethanol gewaschen und auf eine Konzentration von etwa 0,05 pMol/μl resuspendiert.
Der Plasmidvektor Bluescript SK+ (Stratagene) wurde für die Aufnahme der cDNA-Insertionen vorbereitet, indem er mit 20 Einheiten der Restriktionsendonuclease EcoRI (New England Biolabs) im Puffer des Herstellers zwei Stunden bei 37°C gespalten wurde, worauf eine Behandlung von 30 Minuten mit einer Einheit alkalischer Phosphatase des Kalbs (Boehringer Mannheim) folgte, die direkt zum EcoRI-Reaktionsgemisch zugegeben wurde. Danach wurde diese DNA einer Elektrophorese durch ein 1,2% Agarose/TEA-Gel zwei Stunden bei 100 Volt unterworfen. Die Bande des linearen Plasmids wurde ausgeschnitten, eluiert und resuspendiert, wie vorstehend beschrieben.
Die cDNA-Insertions-Fragmente wurden in die vorbereiteten Bluescript-Plasmidvektoren ligiert, indem 0,05 pMol des Vektors mit 0,10 pMol der cDNA-Insertion in 50 mM Tris-Cl, pH 7,4, 10 mM Magnesiumchlorid, 1 mM DTT, 1 mM ATP und 40 Einheiten T4-DNA-Ligase (New England Biolabs) gemischt wurden. Das 10-μl-Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei 15°C inkubiert. Danach wurde das Ligierungsreaktionsgemisch mit 100 μl Transformations-kompetenten E. coli-Zellen, Stamm DH5a (Bethesda Research Laboratories), gemischt und die Plasmid-DNA in die E. coli-Zellen transformiert, wie es im Standardprotokoll von Sambrook et al., vorstehend, S. 1.74, beschrieben ist. Die transformierten Zellen wurden auf LB-Agarplatten, die 100 μg/ml Ampicillin enthielten, plattiert und über Nacht bei 37°C gezüchtet.
Die Plasmid-DNA wurde aus den Ampicillin-resistenten Kolonien nach dem alkalischen Lyse-Verfahren von Birnboim und Doly isoliert (Nucleic Acids Res. 7 (1979), 1513–1523). Die gereinigte Plasmid-DNA wurde mit EcoRI wie vorstehend gespalten, einer Agarose-Gel-Elektrophorese unterworfen und daraufhin analysiert, ob das cDNA-Insertions-EcoRI-Fragment mit der korrekten Größe erzeugt worden war. Die Zellen aus einer einzigen Kolonie, die für eine cDNA-Insertion positiv waren, wurden zum Beimpfen von 100 ml LB, enthaltend 100 μg/ml Ampicillin, verwendet und bei 37°C bis zur Sättigung gezüchtet. Die Plasmid-DNA wurde unter Verwendung eines Plasmid-Isolierungskits, Qiagen Nr. 12143 (Qiagen, Inc., Chatsworth, CA), gemäß den Anweisungen des Herstellers extrahiert.
Die Sequenzierung der cDNA-Clone erfolgte mit dem automatischen DNA-Sequenziergerät Nr. 373 von Applied Biosystems, Inc. (ABI, Foster City, CA), wobei entweder mit Farbstoff markierte Primer oder mit Farbstoff markierte Didesoxynucleotide verwendet wurden. Die zyklische Sequenzierung mit Farbstoff markierten Pri mern erfolgte mit Taq Dye Primer Cycle Sequencing-Kits (ABI-Teilenummer 401121 und 401122). Pro Reaktion wurde 1 μg der doppelsträngigen DNA eingesetzt. Die Verfahren zum zyklischen Durchlaufen und zum Konzentrieren der zu sequenzierenden Proben sind im Handbuch Cycle Sequencing of DNA with Dye Primers (ABI-Teilenummer 901482) beschrieben. Andererseits wurde auch eine zyklische Sequenzierung mit Farbstoff-markierten Didesoxynucleotiden durchgeführt, wobei der Taq Dye Deoxy^TM Terminator Cycle Sequencing-Kit (ABI Teilenummer 401113) verwendet wurde. Typischerweise wurden pro Reaktion 1,25 μg Matrize und 4 pMol Primer eingesetzt. Die Matrizen- und Primer-Konzentrationen konnten gegebenenfalls variiert werden, um die Sequenzierungsreaktionen zu optimieren. Die Reaktionen wurden zyklisch durchlaufen, indem ein Thermoczycler von Perkin-Elmer Cetus (Modell 9810) verwendet wurde, wie es im Taq Dye Deoxy^TM Terminator Cycle Sequencing-Protocol (ABI-Teilenummer 901497) beschrieben ist.
Nach den zyklischen Reaktionen wurden Centri-Sep^TM Spin-Säulen (Princeton Separations, Adelphia, NJ) verwendet, um überschüssige Farbstoff-Terminatoren und Primer zu entfernen. Die Eluate der Spin-Säulen wurden sodann ausgefällt und gewaschen, wie es im Taq Dye Deoxy^TM Terminator Cycle Sequencing-Protocol (ABI-Teilenummer 901497) beschrieben ist. Ein denaturierendes 6% Acrylamid-Gel wurde hergestellt, wie im Benutzerhandbuch ABI 373A DNA Sequencing System beschrieben. Direkt vor Laufenlassen des Gels wurden die Proben in 5 μl entionisiertem Formamid/50 mM EDTA (pH 8,0) 5/1 (Vol./Vol.) resuspendiert. Die Proben wurden zwei Minuten bei 90°C denaturiert, schnell auf Eis abgekühlt und danach auf ein vorher laufen gelassenes Gel aufgetragen (das Gel wurde vorher etwa 15 bis 20 Minuten laufen gelassen). Das Gel wurde zwölf Stunden bei den folgenden Einstellungen laufen gelassen: 2500 Volt, 40 Amp, 30 Watt, 40°C. Die Sequenzanalyse erfolgte mit ABI 373A DNA Analysis-Software (Version 1.0.2). Die endgültige Sequenz wurde mit der ABI DNA Sequence-Editor-Software seqEd^TM (Version 1.0), ABI, Inc., erhalten.
Die gesamte 1036-bp-Insertion von Clon Nr. 64 wurde sequenziert. Sie codierte 936 bp des offenen Leserasters, wobei sie sich über das 3-Prime-Ende der Insertion fortsetzte (entsprechend einem Polypeptid mit einem Molekulargewicht von mindestens 34000). Der Vergleich der Sequenz dieses Clons mit verfügbaren Sequenzen in Nucleotidsequenz-Datenbanken zeigte, dass die ersten 91 Basen am 5'-Ende des Clons dem mitochondrischen Rinder-Genom entsprachen. Hieraus kann gefolgert werden, dass die 1036-bp-Insertion von Clon Nr. 64 durch die Ligierung von zwei unabhängigen DNAs während der Konstruktion dieser Bank zustande kam.
Das 400-bp-EcoRI-Fragment von Clon Nr. 76 wurde vollständig sequenziert; dies ergab 81 bp des offenen Leserasters, gefolgt von 298 Basen der untranslatierten 3-Strich-Sequenz und einer Poly-A-Region.
Die cDNA-Bank des Rinder-Dünndarms in Lambda-gt10 wurde erneut durchmustert, und zwar mit der Oligonucleotid-Sonde 37A, die eine exakte 33-bp-Übereinstimmung aufwies mit der am weitesten 5'-gelegenen Peptidsequenz, die durch Clon Nr. 64 codiert wird. Dabei wurden anhand von dreifachen Durchmusterungsverfahren zwei positive Clone, Nr. 22 und Nr. 23 (1), isoliert, subcloniert und sequenziert wie beim Clon Nr. 64.
Die Clone Nr. 22 und 23 enthielten 2,8 kb bzw. 1,7 kb große cDNA-Insertionen. Die 2,8-kb-cDNA-Insertion von Clon Nr. 22 ließ ein fortlaufendes offenes Leseraster mit 835 Aminosäuren zwischen den Basen 2 und 2506 (entsprechend einem 93,2 kDa großen Polypeptid) voraussagen, gefolgt von 298 Basen von untranslatierten 3'-Sequenzen und einer Poly-A-Region.
Die Lambda gt10-Bank wurde erneut durchmustert, und zwar mit der Sonde 19A, die eine exakte Übereinstimmung aufwies mit der Sequenz von Clon Nr. 22, die dem am weitesten 5'-gelegenen Peptid entsprach, das durch diesen Clon codiert wird, und der Clon Nr. 2 wurde wie vorstehend isoliert. Die DNA-Sequenzanalyse der 1-kb-cDNA-Insertion aus Clon Nr. 2 zeigte, dass sie mit dem Clon Nr. 22 überlappte und sich um 100 Basen über das 5'-Ende der Rinder-cDNA hinaus erstreckte. Eine zusammengesetzte Sequenz aus den DNA-Sequenzen der Clone Nr. 2 und Nr. 22 sowie das vorausgesagte Translationsprodukt sind in SEQ ID NO: 1 bzw. SEQ ID NO: 3 dargestellt.
Zusammenfassend kann gesagt werden, dass die Sequenzierung von cDNA-Clonen des Rinder-Dünndarms, die der 88-kDa-Komponente des MTP entsprechen, 2900 bp einer fortlaufenden Sequenz ergaben, die ein offenes Leseraster mit 860 Aminosäuren codiert, gefolgt von einer 298 bp großen nicht-codierenden 3'-Region und einer Poly-A-Region. Das vorausgesagte Proteinprodukt dieser zusammengesetzten Sequenz ist 96,1 kDa groß.
Beispiel 2
DNA-Hybridisierungsanalyse bei verwandten Arten
Die Southern-Hybridisierungsanalyse wurde mit DNAs aus Kuh, Mensch, Maus, Hamster (Eizellen des Chinesischen Hamsters oder CHO-Zellen), Ratte und Hund durchgeführt. 10 μg von jeder genomischen DNA (Clontech) wurden mit 140 Einheiten EcoRI (New England Biolabs) in 100 μl 1 × EcoRI-Puffer (New England Biolabs) bei 37°C über Nacht gespalten. Jedes Spaltungsreaktionsgemisch wurde bei 2000 UpM in einer Ultrafree-MC 10000 NMWL-Filtereinheit (Nr. UFC3 TGC 00 von Millipore) mit einem Molekulargewichts-Ausschluss von 10000 30 Minuten abzentrifugiert, wodurch das Reaktionsvolumen auf 50 μl reduziert wurde. Anschließend wurden die Reaktionsgemische der Restriktionsspaltung einer Agarose-Gel-Elektrophorese auf einem 0,75% Gel in TEA-Puffer drei Stunden bei 80 Volt unter worfen. Das Agarose-Gel wurde mit Ethidiumbromid gefärbt, fotografiert und danach durch das Verfahren von Southern auf eine Nitrocellulose-Membran überführt.
Eine Southern-Hybridisierung wurde durchgeführt, indem das 2,4 kb große EcoRI-Fragment aus dem Rinder-cDNA-Clon Nr. 22 als Sonde verwendet wurde. 25 ng des DNA-Fragments wurden markiert, wobei das Markierungssystem Multiprime DNA Labelling System (Amersham Corp., Arlington Heights, IL) und 50 μCi ³²P-α-dCTP verwendet wurden. Das nicht eingebaute ³²P wurde von der markierten Sonde anhand einer Sephadex G25-Spin-Säule wie vorstehend abgetrennt. Die Nitrocellulose-Membranen wurden in 100 ml Hybridisierungspuffer (vorstehend) zwei Stunden bei 37°C vorhybridisiert. Die Hybridisierung erfolgte über Nacht in 50 ml frischem Hybridisierungspuffer bei 60°C mit 1,2 × 10⁷ DpM denaturierter Sonde. Anschließend wurde die Membran in 500 ml 1 × SSC, 0,1% SDS eine Stunde bei 65°C gewaschen, Luft-getrocknet und bei –80°C vier Tage gegen einen Röntgenfilm plus Verstärkungsschirm exponiert. Das 2,4 kb große EcoRI-Fragment aus dem Rinder-Clon Nr. 22 hybridisiert in jeder getesteten Art spezifisch mit mindestens zwei DNA-Banden. Hieraus wurde gefolgert, dass durch die Hybridisierungsbedingungen, die für die Rinder-cDNA-Sonde eingeführt wurden, auch homologe DNAs aus anderen Arten wie Mensch, Maus, Hamster, Ratte und Hund nachgewiesen werden können.
Beispiel 3
Isolierung und DNA-Sequenzanalyse von cDNA-Clonen, die die 88-kDa-Komponente des menschlichen MTP codieren
A. Clonierung und Sequenzanalyse
Um die vollständige codierende Sequenz der 88-kDa-Komponente des menschlichen MTP zu erhalten, wurde eine cDNA-Bank der menschlichen Leber mit einem vorstehend beschriebenen Rinder-MTP-cDNA-Insertion durchmustert. Die Bank wurde von Stratagene bezogen. Sie enthielt eine Oligo-dT geprimte Leber-cDNA, die in den Lambda-ZAP-Vektor in einer Richtung cloniert war (EcoRI zu XhoI). Die Sonde wurde hergestellt, indem 10 μg des vorstehenden Clons Nr. 22 aus Rinderdarm in Universalpuffer (Stratagene) mit 50 Einheiten EcoRI gespalten wurden und eine Elektrophorese bei 80 bis 150 Volt durch ein Gel durchgeführt wurde, bestehend aus 0,9% Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt (Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, MD), TAE (40 mM Tris-Acetat, 1 mM EDTA) und 0,5 μg/ml Ethidiumbromid. Das resultierende 2,4-kb-Fragment wurde durch Phenolextraktion gereinigt, wie in Sambrook et al., vorstehend, S. 6.30, beschrieben. Anschließend wurde das gereinigte Fragment mit dem Markierungs-Kit Multiprime DNA Labelling Kit und α-³²P-dCTP (Amersham) gemäß den Anweisungen des Herstellers auf 10⁹ CpM/μg radiomarkiert. Das nicht eingebaute ³²P wurde von der markierten Sonde anhand einer Sephadex G25-Spin-Säule wie vorstehend abgetrennt.
10⁶ Plaques aus der Bank wurden wie folgt gemäß den Anweisungen des Herstellers (Stratagene) durchmustert. E. coli-Bakterien, Stamm XL 1 Blue (Stratagene), wurden unter Schütteln über Nacht bei 37°C in 50 ml LB-Brühe (Bethesda Research Laboratories), angereichert mit 0,2% Maltose und 10 mM Magnesiumsulfat, gezüchtet. Die Zellen wurden bei geringer Geschwindigkeit abzentrifugiert und danach in 10 mM Magnesiumsulfat bis zu einer OD₆₀₀ = 0,5 resuspendiert und bei 4°C gelagert. Die Phagen wurden auf eine Konzentration von 50000 Plaquebildenden Einheiten pro 25 μl SM-Puffer verdünnt. Für jede Platte wurden 600 μl Bakterien und 25 μl Phagen gemischt und 15 Minuten bei 37°C inkubiert. Sodann wurde zu dem Gemisch aus Bakterien und Phagen ein Deckagar (6,5 ml) zugefügt, der aus NZY-Brühe (Bethesda Research Laboratories), 0,7% Agarose (Bethesda Research Laboratories) bestand und auf 50°C vorgewärmt war, danach wurde das Ganze auf eine 150-mm-NZY-Platte plattiert. Man ließ den Deckagar fest werden, anschließend wurden die Platten über Nacht bei 37°C inkubiert.
Danach ließ man die Platten zwei Stunden bei 4°C abkühlen, anschließend wurden die Plaques mit Nitrocellulose-Filtern abgenommen. Das Abnehmen wurde in doppelter Ausführung durchgeführt, wobei die Ausrichtung der Membranen in Bezug auf die Platte registriert wurde, indem mit einer Nadel Löcher durch das Filter in die Agarplatte gestochen wurden. Die Filter wurden eine Minute in 0,5 N Natriumhydroxid, 1,5 M Natriumchlorid, eine Minute in 1 M Tris, pH 8,0, 3 M Natriumchlorid, und eine Minute in 2 × SSC inkubiert. Danach wurden die Filter bei 80°C zwei Stunden in einer Vakuumkammer gebacken. Die Filter wurden zwei Stunden bei 60°C in 5 ml Hybridisierungspuffer pro Filter inkubiert (6 × SSC, 20 mM NaPO₄, 2 × Denhardt, 0,1 SDS und 100 μg/ml Lachssperma-DNA). Der Puffer wurde durch ein gleiches Volumen Hybridisierungspuffer ersetzt, der die Sonde in einer Konzentration von 3,5 × 10⁶ CpM pro Filter enthielt, und über Nacht bei 60°C inkubiert. Die Filter wurden in 1 × SSC, 0,1% SDS zuerst bei Raumtemperatur und dann zwei Stunden bei 50°C gewaschen. Die Autoradiographie zeigte 56 Positive.
Ein kleines Stückchen Agarose, das jeweils einen Positiven enthielt, wurde über Nacht bei 4°C mit 1 ml SM-Puffer und einem Tröpfchen Chloroform inkubiert. Die positiven Phagen wurden gereinigt, indem sie mit einer niedrigen Dichte erneut plattiert (etwa 50 bis 500 pro 100-mm-Platte), durchmustert und einzelne positive Plaques, wie vorstehend beschrieben, isoliert wurden.
Wenn die XL1-Blue-Zellen mit dem ZAP-Vektor (Stratagene) infiziert und mit einem Helferphagen co-infiziert werden, wird der Bluescript-Teil des Vektors selektiv repliziert, zirkularisiert und in ein einzelsträniges Phagemid verpackt. Dieses Phagemid wird dann bei der anschließenden Infektion in naive XL1-Blue-Zellen in ein doppelsträngiges Plasmid umgewandelt. Die cDNA-Insertion des resultierenden Plas mids kann direkt sequenziert werden. Plasmide, die die positiven cDNA-Insertionen der menschlichen Leber enthielten, wurden auf diese Weise ausgeschnitten, wobei der von Stratagene bezogene Helferphage gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet wurde.
Die DNA aus diesen Clonen wurde wie folgt gereinigt. Eine Einzelkolonie wurde in 2 ml LB geimpft und über Nacht bei 37°C unter Schütteln inkubiert. 1,5 ml davon wurden zentrifugiert und erneut in 50 μl LB resuspendiert. 300 μl TENS (1 × TE, 0,1 N Natriumhydroxid, 0,5% SDS) wurden zugegeben und fünf Sekunden verwirbelt. 150 μl 3 M Natriumacetat, pH 5,2, wurden zugefügt und fünf Sekunden verwirbelt. Danach wurden die Proben zehn Minuten in einer Mikrofuge abzentrifugiert. Der Überstand wurde gewonnen, 0,9 ml Ethanol wurden zugegeben und die Proben zehn Minuten in einer Mikrofuge abzentrifugiert. Der Rückstand wurde in 70% Ethanol gewaschen, getrocknet und in 20 μl TE (10 mM Tris, pH 7,4, 1 mM EDTA, pH 8) resuspendiert.
Die DNA aus den Clonen wurde wie folgt charakterisiert. 5 μl der DNA aus jedem Clon wurden mit 10 Einheiten EcoRI, 10 Einheiten XhoI und 10 μg RNase gespalten und danach fraktioniert und sichtbar gemacht, und zwar durch eine Elektrophorese durch ein Gel aus 1% Agarose mit TBE (45 mM Tris-Borat, 1 mM EDTA) und 0,5 μg/ml Ethidiumbromid. Ein Southern-Blot des Gels wurde, wie in Sambrook et al., vorstehend, S. 9.41, beschrieben, durchgeführt. Dieser Southern-Blot wurde mit einem Fragment der Rinder-cDNA in der Nähe des 5'-Endes der codierenden Sequenz als Sonde abgesucht. Diese 5'-Sonde wurde hergestellt, indem 25 μg des vorstehenden Rinderdarm-Clons Nr. 2 mit 50 Einheiten EcoRI und 50 Einheiten NheI gespalten wurden, das 376-Basenpaar-Fragment wie vorstehend aus einem Gel mit 2% Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt, TBE und 0,5 μg/ml Ethidiumbromid isoliert und radiomarkiert wurde, wie vorstehend beschrieben. Die Ergebnisse sind wie folgt: Clon Nr. 693, 3,7-kb-Insertion, hybridisiert mit der 5'-Sonde; Clon Nr. 754, 1,2-kb-Insertion, hybridisiert mit der 5'-Sonde; Clon Nr. 681, 1,8-kb-Insertion, hybridisiert nicht mit der 5'-Sonde.
Die Übernacht-Kulturen, die diese drei Clone enthielten, wurden in 200 ml LB mit 100 μg/ml Ampicillin gezüchtet. Große Mengen des Plasmids wurden gereinigt, wobei ein Qiagen Plasmid Maxiprep-Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers eingesetzt wurde. Die Sequenz des Clons Nr. 693 zeigt, dass er zwei Insertionen enthält. Die 500 bp-5'-Insertion war homolog zu Haptoglobin und wird hier nicht weiter besprochen. Hierauf folgte eine mutierte XhoI- und eine EcoRI-Restriktionsstelle (die zwei Stellen, die bei der Clonierung in einer Richtung verwendet wurden). Die 3'-Insertion war die cDNA von Interesse. Sie enthielt eine gewisse untranslatierte 5'-Sequenz, wie durch die Stopp-Codons in allen drei Leserastern gezeigt wird. An den Basen 48 bis 2729 liegt ein ATG-initiiertes offenes Leseraster, das 894 Aminosäuren entspricht. Die hergeleitete Aminosäuresequenz beginnt
M I L L A V L F L C F I
(SEQ ID NO: 28). Das Stopp-Codon liegt an den Basen 2720–2732 vor, hierauf folgt eine untranslatierte 3'-Region von 435 Basen und eine Poly-A-Region. Die Sequenz von Clon Nr. 681 bestätigte die 1768 3'-Basen dieses Clons, und der Clon Nr. 754 bestätigte die Basen 1 bis 442.
B. Gewebelokalisierung der 88-kDa-mRNA
Ein Multi-Tissue-Northern-Blot (Clontech) enthielt pro Bahn 2 μg Poly-A⁺-RNA aus Herz, Gehirn, Plazenta, Lunge, Leber, Skelettmuskel, Niere oder Pankreasdes Menschen. Die Northern-Hybridisierung wurde durchgeführt wie dem genomischen Southern-Blot. Die Vorhybridisierung erfolgte in 50 ml Hybridisierungspuffer zwei Stunden bei 37°C, worauf eine Hybridisierung über Nacht in 20 ml frischem Puffer bei 60°C mit einem mit 5,2 × 10⁷ DpM markierten 2,4 kb großen EcoRI-Fragment aus dem vorstehenden Rinderdarm-Clon Nr. 22 folgte. Der Northern-Blot wurde in 500 ml 0,2 × SSC, 0,1% SDS bei 60°C eine Stunde gewaschen und dann einer Autoradiographie bei –80°C unterworfen. Nach 20 Stunden Exposition gegen einen Röntgenfilm war in der Bahn der Leber-RNA eine vorherrschendes Signal bei etwa 4,4 kb und keine andere nachweisbare Hybridisierung zu sehen. Somit lässt sich mit einer Kreuz-Hybridisierung des 2,4-kb-Fragments der Rinder-cDNA spezifisch eine menschliche Leber-RNA nachweisen. Da die Leber und der Darm die einzigen zwei Gewebe sind, in denen eine signifikante MTP-Aktivität beschrieben wurde, bestätigen die Clonierung und die Northern-Blot-Analyse die biochemische Lokalisierung des MTP. Außerdem machen es die Ergebnisse der Northern-Analyse möglich, dass dieser Nachweis noch auf DNA/RNA-Hybride und auch auf DNA/DNA-Wechselwirkungen ausgedehnt werden kann.
Beispiel 4
Expression des MTP in einer menschlichen Fibroblasten-Zelllinie
I. Verfahren
Alle herkömmlichen Verfahren der Molekularbiologie stammen von Sambrook, vorstehend, Ausnahmen sind nachstehend angegeben. Alle in diesem Beispiel eingesetzten Restriktionsenzyme wurden von Bethesda Research Laboratories (BRL, Gaithersburg, MD) bezogen. Ein 3,2 kb großes Fragment, das sich von Nucleotid -64 bis 3135 erstreckt (bezogen auf die Translations-Startstelle, wobei das A des ATG-Codons der Translations-Startstelle mit +1 bezeichnet wird), wurde aus den Plasmiden p754 (Basen –64 bis 384) und p693 (Basen 385 bis 3135) wie folgt konstruiert. Ein 448 bp großes EcoRI-NcoI-Restriktionsendonuclease-Fragment und ein 2750 bp großes NcoI-XhoI-Restriktionsendonuclease-Fragment wurden aus p754 bzw. p693 ausgeschnitten. Nach der Gelreinigung wurden die Fragmente in das mit EcoRI und XhoI gespaltene Plasmid pBluescript-SK ligiert, wodurch das Plasmid pBS/hMTP erhalten wurde. Das gesamte hMTP-Fragment wurde aus pBS/hMTP durch Restriktionsendonuclease-Spaltung mit HindIII und XhoI isoliert und in das Plasmid pcDNA/Neo (Invitrogen, San Diego, CA) subcloniert, wodurch das Plasmid pcDNA/MTP erhalten wurde. Dieses stellt die hMTP codierende Sequenz der vollen Länge unter die transkriptionale Kontrolle des hochaktiven Cytomegalievirus-Promotors.
Die Plasmide wurden durch das Lipofectin-Reagens (BRL) in die transformierten menschlichen Haut-Fibroblasten 1508T (J. Biol. Chem. 267 (1992), 13229– 13238) transfiziert. Die Zellen wurden 24 Stunden vor der Transfektion in 100-mm-Schalen mit einer Dichte von 25% Konfluenz verteilt. Zum Zeitpunkt der Transfektion wurden 50 mg Plasmid pro 100-mm-Platte in 1,5 ml Serum-freiem Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) gelöst und tropfenweise zu einer Lösung von 120 μl Lipofectin-Reagens in 1,5 ml Serum-freiem DMEM zugegeben. Nach 15 Minuten Inkubation bei Raumtemperatur wurden die Transfektionsgemische zu den 1508T-Kulturen zugegeben, die 7 ml Serum-freies DMEM enthielten. 24 Stunden später wurden die Transfektionsgemische entfernt und 10 ml frisches DMEM, das 10% fetales Rinderserum enthielt, für weitere 24 Stunden zugegeben. Die Zellen wurden von der Schale abgeschabt und zweimal mit eiskalter Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen. Die Zellextrakte, die Messungen der MTP-Aktivität und die Western-Analysen wurden durchgeführt, wie vorstehend im Abschnitt „Test auf TG-Transferaktivität bei Patienten mit Abeta-Lipoproteinämie" beschrieben.
II. Ergebnisse
Die cDNA, die die vollständige codierende Sequenz für MTP enthielt, wurde in den Expressionsvektor pcDNA/Neo subcloniert, wodurch das Konstrukt pcDNA/MTP erhalten wurde. Dieses Plasmid wurde nach einer Liposom-vermittelten Transfektion in den transformierten menschlichen Haut-Fibroblasten 1508T (J. Biol. Chem. 267 (1992), 13229–13238) transient exprimiert. 48 Stunden nach der Transfektion war eine TG-Transferaktivität ohne weiteres nachweisbar, die über den Hintergrundspiegeln lag, die in Extrakten aus mit dem Ausgangsplasmid pcDNA/Neo transfizierten Zellen gemessen wurden. Die Western-Blot-Analyse zeigte das Vorliegen der 88-kDa-Komponente des MTP in Zellen, die mit pcDNA/MTP transfiziert waren, nicht jedoch in Zellen, die mit pcDNA/Neo transfiziert waren. Ein Vergleich der Proteinmasse und -aktivität in den transfizierten Zellen mit der Proteinmasse und -aktivtät in HepG2-Zellen legt nahe, dass das exprimierte MTP effizient in einen aktiven Transferprotein-Komplex zusammen mit PDI eingebaut war.
Beispiel 5
Durchmusterung zum Identifizieren von Inhibitoren des MTP
Mit diesem Durchmusterungsverfahren wird die Rate des Transfers eines nachweisbar markierten Lipids (z. B. NMR, ESR, radioaktiv oder fluoreszierend markiertes TG, CE oder PC) von Donor-Partikeln (z. B. Donor-Membranen, -Vesikeln oder -Lipoproteinen) zu Akzeptor-Partikeln (z. B. Akzeptor-Membranen, -Vesikeln oder -Lipoproteinen) in Gegenwart von MTP gemessen. Ein Absinken der beobachteten Transferrate in Gegenwart eines Inhibitors des MTP (der z. B. in einem Extrakt natürlicher Produkte oder bekannten Verbindungen enthalten ist) kann als Test dienen, um Inhibitoren der MTP-Funktion zu identifizieren und zu isolieren. Für diesen Zweck können die verschiedensten Tests verwendet werden, z. B. die Tests mit synthetischen Vesikeln, die früher von Wetterau und Zilversmit, J. Biol. Chem. 259 (1984), 10863–10866; oder Wetterau et al., J. Biol. Chem. 265 (1990), 9800–9807, beschrieben wurden, oder der hier vorstehend im „Test auf TG-Transferaktivität bei Patienten mit Abeta-Lipoproteinämie" dargestellte Test. Ein Beispiel eines solchen Tests sieht wie folgt aus.
A. Herstellung des Substrats
In einem typischen Durchmusterungsverfahren, bei dem markierte Lipoproteine eingesetzt werden, erfolgt die Markierung der Lipoproteine mit ³H-TG durch das von Morton und Zilversmit (Morton, R. E., et al., J. Biol. Chem. 256 (1981), 1992– 1995) beschriebene Lipiddispersions-Verfahren unter Verwendung von kommerziell erhältlichen Stoffen. Bei dieser Herstellung werden 375 μCi ³H-Triolein (Triolein, [9, 10-³H-(N)]-, NEN Research Products, Kat.-Nr. NET-431), 1,5 mg Ei-Phosphatidylcholin und 160 μg unmarkiertes Triolein in Chloroform gemischt und unter einem Stickstoffstrom bis zur vollständigen Trockne eingedampft. 2 ml 50 mM Tris-HCl, 0,01% Na₂EDTA, 1 mM Dithiothreit, pH 7,4, werden zugegeben, und das Röhrchen wird sodann mit Stickstoff ausgespült. Die Lipide werden durch Verwirbelung resuspendiert, und die Suspension wird anschließend mit zwei 20-Minuten-Intervallen in einem Bad-Beschalleungsgerät beschallt. Die beschallten Lipide werden zu 75 ml Kaninchen-Plasma (Pel-Freez Biologicals, Rogers, AR) mit 5,8 ml 8,2 mM Diethyl-p-nitrophenylphosphat (Sigma, Kat.-Nr. D9286) und 0,5 ml 0,4 M Na₂EDTA und 4 NaN₃ zugegeben. Anschließend wird das Plasma unter Stickstoff 16 bis 24 Stunden bei 37°C inkubiert. Lipoproteine geringer Dichte (LDL) und Lipoproteine hoher Dichte (HDL) werden aus dem Inkubationsgemisch und aus dem nicht markierten Kontrollplasma durch sequentielle Ultrazentrifugation isoliert (Schumaker und Puppion, Methods Enzymology 128 (1986), 155–170). Die isolierten Lipoproteine werden bei 4°C gegen 0,9% Natriumchlorid, 0,01% Na₂EDTA und 0,02% NaN₃ dialysiert und bei 4°C gelagert.
B. Transfertest
In einem typischen Test wird die Transferaktivität bestimmt, indem der Transfer von radiomarkiertem TG von ³H-HDL (5 μg Cholesterin)-Donor-Partikeln auf LDL (50 μg Cholesterin)-Akzeptor-Partikel bei 37°C drei Stunden in 15 mM Tris, pH 7,4, 125 mM MOPS, 30 mM Natriumacetat, 160 mM NaCl, 2,5 mM Na₂EDTA, 0,02 NaN₃, 0,5% BSA ermittelt wird, wobei etwa 50 bis 200 ng gereinigtes MTP pro Vertiefung einer Platte mit 96 Vertiefungen vorliegen. Das zu testende Material (z. B. Extrakte natürlicher Produkte) in einem mit dem Test kompatiblen Lösungsmittel, z. B. Ethanol, Methanol oder DMSO (typischerweise werden 5 μl des Materials in 10 DMSO zugegeben), kann durchmustert werden, indem es vor der Inkubation zu einer Vertiefung zugegeben wird. Der Transfer wird durch die Zugabe von 10 μl frisch hergestellter, 4°C kalter Heparin/MnCl₂-Lösung beendet (1,0 g Heparin, Sigma, Kat.-Nr. H3393 187 U/mg, zu 13,9 ml 1,5 M MnCl₂, 0,4% Heparin (187 I.U.)/0,1 M MnCl₂), wodurch die ³H-TG-LDL-Akzeptor-Partikel ausgefällt werden; sodann wird die Platte bei 800 × g zentrifugiert. Ein Aliquot des Überstands aus jeder Vertiefung, enthaltend die ³H-TG-HDL-Donor-Partikel wird in einen Szintillationscocktail überführt und die Radioaktivität quantitativ bestimmt. Die Enzymaktivität beruht auf dem Prozentsatz des TG-Transfers und wird durch die folgende Gleichung berechnet:
In einem solchen Test wird der prozentuale TG-Transfer mit steigender MTP-Konzentration zunehmen. Ein möglicher Kandidat für einen Inhibitor wird den prozentualen TG-Transfer senken. Ein ähnlicher Test könnte mit markiertem CE oder PC durchgeführt werden.
Beispiel 6
Identifizierung und Demonstration der Aktivität von MTP-Inhibitoren
1. Verfahren
A. Identifizierung von MTP-Inhibitoren
Unter Verwendung des in Beispiel 5 beschriebenen Verfahrens wurden die MTP-Inhibitorverbindungen A und B identifiziert. In dem Test wurde die durch Rinder-MTP katalysierte Transportrate von radiomarkiertem TG von Donor-HDL auf Akzeptor-LDL gemessen. In diesem Verfahren senkt ein Inhibitor die Transferrate des radiomarkierten TG.
Die MTP hemmende Aktivität dieser Verbindungen wurde in einem unabhängigen Test bestätigt, wobei die Verfahren verwendet wurden, die im vorstehenden „Test auf TG-Transferaktivität bei Patienten mit Abeta-Lipoproteinämie" beschrieben sind. In diesem Test wurde der durch Rinder-MTP katalysierte Transport von radiomarkiertem TG von Donor- zu Akzeptor-SUV gemessen.
B. Zellkultur
Die menschliche Hepatoblastom-Zelllinie HepG2 wurde von der American Type Culture Collection bezogen (Rockville, MD; ATCC Hinterlegungsnummer 8065). Die Kulturen wurden bei 37°C in einer 5% CO₂-Atmosphäre in T-75-Kulturflaschen mit 12 ml RPMI 1640-Medium gehalten, das 10% fetales Rinderserum enthielt (alle Zellkulturmedien und Puffer wurden von GIBCO Life Technologies, Gaithersurg, MD, bezogen). Die Zellen wurden einmal pro Woche 1 : 4 subkultiviert und dreimal pro Woche mit frischem Medium versorgt.
Experimente, mit denen die Wirkungen der Verbindungen A und B auf die Proteinsekretion gemessen wurden, wurden in Platten mit 48 Vertiefungen durchgeführt. Die HepG2-Zellen wurden 1 : 2 subkultiviert und vor der Arzneistoffbehandlung mindestens 24 Stunden bis zur Konfluenz wachsen gelassen. Vor Beginn der Arzneistoff-behandlung wurde das Kulturmedium entfernt, die Zellen einmal mit PBS gewaschen und 1 ml frisches Medium quantitativ zugegeben. Die Verbindung A wurde zu Vertiefungen in doppelter Ausführung in 10 μl Dimethylsulfoxid (DMSO) zugegeben, so dass verschiedene Konzentrationen der Verbindung erhalten wurden. DMSO alleine (10 μl) wurde als negative Kontrolle verwendet. (Anmerkung: Die Wirkung von DMSO in dieser Konzentration auf die HepG2-Zellen ist vernachlässigbar.) Nach 16 Stunden Inkubation unter herkömmlichen Zellkulturbedingungen wurden die Platten fünf Minuten bei 2500 UpM bei 4°C zentrifugiert, um die frei vorliegenden Zellen zu sedimentieren. Für die Tests auf Apolipoprotein B (apoB) und menschliches Serumalbumin (HSA) wurden die Medien mit Zellkulturmedium zehnmal verdünnt, und für die Tests auf Apolipoprotein AI (apoAI) wurden sie 20-mal verdünnt. Die Zellen wurden zweimal mit kalter PBS gewaschen und danach mit 0,5 ml Homogenisierungspuffer versetzt (0,1 M Natriumphosphat, pH 8,0; 0,1% Triton X-100). Die Zellen wurden durch Digerieren mit einer 1-ml-Mikropipette homogenisiert, und das Protein wurde unter Verwendung des Coomassie-Reagens (Pierce Chemical Co., Rockford, IL), wie vom Hersteller beschrieben, gemessen.
C. ELISA-Tests auf ApoB, ApoAI und HSA
Die ELISA-Tests zum Messen der Proteinmasse wurden als „Sandwich"-Tests durchgeführt. Die Mikrotiterplatten wurden mit einem monoclonalen Antikörper (primärer Antikörper) beschichtet, der für das Protein von Interesse spezifisch war (Biodesigns International, Kennebunkport, ME); hierauf folgten das Antigen oder die Probe, ein polyclonaler Antikörper (sekundärer Antikörper), der gegen das Protein von Interesse gerichtet war (Biodesigns International) und ein an alkalische Phosphatase gebundener dritter Antikörper, der gegen den sekundären Antikörper gerichtet war (Sigma Biochemical, St. Louis, MO). Die Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen (Corning Nr. 25801) wurden über Nacht bei Raumtemperatur mit 100 μl des verdünnten monoclonalen Antikörpers beschichtet (wobei die Endkonzentrationen 1 μg/ml, 2 μg/ml und 4 μg/ml für anti-apoB, -apoAI bzw. -HSA in 0,1 M Natriumcarbonat-Natriumbicarbonat, pH 9,6, und 0,2 mg/ml Natriumazid betrugen). Die Beschichtung erfolgte über Nacht bei Raumtemperatur. Nach der Beschichtung und jeweils zwischen den anschließenden Inkubationsschritten wurden die Platten fünfmal mit 0,9 Natriumchlorid mit 0,05% Tween 20 gewaschen. Aliquots in doppelter Ausführung (100 μl) der verdünnten Kulturmedien oder Standard (gereinigtes apoB, apoAI oder HSA, verdünnt auf 0,3125 bis 320 ng/ml mit Zellkulturmedium) wurden zu den mit dem monoclonalen Antikörper beschichteten Vertiefungen zugefügt. Nach 1,5 Stunden Inkubation bei Raumtemperatur wurde das Antigen oder die Probe entfernt, und die Vertiefungen wurden gewaschen. Die sekundären Antikörper wurden 1 : 500 in PBS + 0,05% Tween 20 (Puffer III) verdünnt, anschließend wurden 100 μl zu jeder Vertiefung zugegeben und eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Der Antikörper wurde entfernt, und die Vertiefungen wurden gewaschen. Alle sekundären Antikörper waren polyclonale Antiseren, die in einer Ziege gegen die menschlichen Proteine hervorgerufen wurden. Ein anti-Ziegen-IgG des Kaninchens, konjugiert an alkalische Phosphatase, wurde 1 : 1000 mit Puffer III verdünnt, und 100 μl davon wurden zu jeder Vertiefung zugegeben. Nach einer Stunde Inkubation bei Raumtemperatur wurde der Antikörper entfernt, und die Vertiefungen wurden achtmal gewaschen. Das Substrat p-Nitrophenylphosphat (Sigma Biochemical, St. Louis, MO) wurde mit 1 mg/ml in 0,05 M Natriumcarbonat-Natriumbicarbonat, pH 9,8, plus 1 mM Magnesiumchlorid zugegeben. Nach einer Umsetzung von 45 Minuten bei Raumtemperatur wurde der Test gestoppt und die Farbe durch Zugabe von 100 μl 0,1 M Tris, pH 8,0, und 0,1 M EDTA stabilisiert. Die Mikrotiterplatten wurden bei 405 nm in einem V-Max-Lesegerät für Platten mit 96 Vertiefungen abgelesen (Molecular Devices, Menlo Park, CA).
Nach Subtraktion des Hintergrunds wurden die Standards als halblogarithmische Darstellung aufgetragen, und eine logarithmische Regression wurde durchgeführt. Anhand der Gleichung für die Kurve wurde die Konzentration von apoB, apoAI und HSA berechnet. Die Proteinkonzentration wurde auf das gesamte Zellprotein normalisiert, wodurch Konzentrationen mit den Einheiten ng/ml/mg Zellprotein erhalten wurden. Jede Arzneistoffbehandlung wurde in doppelter Ausführung durchgeführt, wobei aus den Ergebnissen der Durchschnitt gebildet wurde. Die apoB-, apoAI- und HSA-Konzentrationen für jede Arzneistoffbehandlung wurden durch die entsprechende Proteinkonzentration in der DMSO-Kontrolle geteilt. Die Ergebnisse wurden als Prozentsatz der Kontrolle gegen die Arzneistoffkonzentration aufgetragen.
D. Lipidanalyse
Die HepG2-Zellen wurden in Platten mit 6 Vertiefungen subkultiviert und vor der Arzneistoffbehandlung mindestens 24 Stunden bis zur Konfluenz gezüchtet. Vor Zugabe des Arzneistoffs wurden die Kulturmedien entfernt, die Zellen einmal mit PBS gewaschen und mit 1 ml frischem Medium (RPMI 1640 + 10% FBS) quantitativ versetzt. Die Verbindung A wurde zu den Vertiefungen in doppelter Ausführung in 10 μl DMSO zugegeben, so dass verschiedene Konzentrationen der Verbindung erhalten wurden. DMSO alleine (10 μl) wurde als negative Kontrolle verwendet. Nach 16 Stunden Inkubation unter herkömmlichen Zellkulturbedingungen wurden die Medien entfernt, und 1 ml Markierungsmedium (RPMI 1640; 16,5 mg/ml Fettsäure-freies BSA; 1 mM Natriumoleat; 1 mM Glycerin; 5 μCi/ml ³H-Glycerin (Amersham Arlington Heights, IL, Kat.-Nr. TRA.244) wurde zusammen mit einer zweiten Zugabe der Verbindung A zugefügt. Die Kulturen wurden zwei Stunden unter herkömmlichen Zellkulturbedingungen inkubiert. Die Medien (1 ml) wurden entnommen, in 15-ml-Glasröhrchen gegeben und sofort mit 2 ml eiskaltem Methanol und 1 ml dH₂O verdünnt. Die Zellen wurden einmal mit PBS gewaschen und für die Messungen des Gesamtproteins zubereitet, wie in Abschnitt I-B beschrieben.
Die Gesamtlipide wurden aus den Medien extrahiert und wie folgt analysiert. Nach Zugabe von 5,0 ml Chloroform und 0,2 ml 2% Essigsäure wurden die Röhrchen nach einer Minute Verwirbelung fünf Minuten bei 2000 UpM zentrifugiert, wodurch die wässrige Phase und die organische Phase voneinander getrennt wurden. Die obere wässrige Phase wurde entfernt, und 3,6 ml Methanol : Wasser (1 : 1), enthaltend 0,1% Essigsäure, wurden zugegeben. Nach kurzem Verwirbeln wurden die Röhrchen wie vorstehend zentrifugiert, und erneut wurde die wässrige Phase entfernt. Die organische Phase wurde quantitativ in saubere 15-ml-Glasröhrchen überführt und das Lösungsmittel unter Stickstoff abgedampft. Die getrockneten Lipide wurden in 0,1 ml Chloroform gelöst, und 30 μl von jeder Probe wurden auf Dünnschicht-Chromatographieplatten mit 19 Bahnen aus Kieselgel 60A (Whatman) getüpfelt. 5 bis 10 μg TG in 10 μl Chloroform wurden als Träger zugegeben und die Platten in Hexan : Diisopropylether : Essigsäure (130 : 70 : 4, Vol./Vol./Vol.) entwickelt. Nach dem Trocknen wurde das Lipid gefärbt, indem die Platten mit Iod in Kontakt gebracht wurden. Die Banden, die dem TG entsprachen, wurden in Szintillationsgläschen geschabt. 0,5 ml dH₂O und 10 ml EcoLite (ICN Biomedical) Szintillationsflüssigkeit wurden zugegeben und die Proben kräftig verwirbelt. Die Rohdaten wurden auf das Zellprotein normalisiert und als Prozent der DMSO-Kontrolle angegeben.
II. Ergebnisse
A. Identifizierung von MTP-Inhibitoren
Die erste Durchmusterung legte nahe, dass die Verbindung A den MTP-katalysierten Transport von ³H-TG von HDL zu LDL hemmt. Die Fähigkeit der Verbindung A, den MTP-katalysierten Lipidtransport zu hemmen, wurde in einem zweiten Test bestätigt, in dem der MTP-katalysierte Transport von ³H-TG von Donor-SUV zu Akzeptor-SUV gemessen wurde. Der IC₅₀-Wert für Verbindung A beträgt etwa 1 μM (10).
B. Hemmung der apoB- und der TG-Sekretion
Die Verbindung A wurde in einer zweifachen Verdünnungsserie im Bereich von 0,156 bis 20 μM an HepG2-Zellen verabreicht. Nach 16 Stunden Inkubation unter herkömmlichen Zellkulturbedingungen wurden Aliquots der konditionierten Medien durch einen ELISA auf apoB, apoAI und HSA getestet. Die ApoB-Sekretion wurde in dosisabhängiger Art und Weise mit einem IC₅₀-Wert von 5 μM gehemmt (11). Die Sekretion von apoAI und HSA blieb bis zur maximalen Dosis von 20 μM unbeeinflusst; dies bestätigt, dass die Hemmung für apoB spezifisch war. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Zugabe eines MTP-Inhibitors zu einer menschlichen Leberzelllinie die Sekretion von apo B enthaltenden Lipoproteinen hemmt.
HepG2-Zellen wurden mit Dosen der Verbindung A im Bereich von 1,25 μM bis 20 μM unter Bedingungen behandelt, die identisch waren mit den im apoB-, apoAI- und HSA-Sekretionsexperiment verwendeten Bedingungen. Der interazelluläre PooI von TG wurde zwei Stunden mit ³H-Glycerin markiert, und zwar in Gegenwart eines Trägers oder von verschiedenen Dosen der Verbindung A. Die Ansammlung von radiomarkiertem TG im Medium wurde gemessen, indem eine quantitative Extraktion und danach Dünnschicht-Chromatographie-Analysen durchgeführt wurden und die Ergebnisse sodann auf das gesamte Zellprotein normlisiert wurden. Als Kontrolle diente DMSO alleine. Die TG-Sekretion wurde durch die Verbindung A in dosisabhängiger Art und Weise gehemmt. Der IC₅₀-Wert lag bei etwa 2,0 μM und ist damit ähnlich wie der IC₅₀-Wert für die Hemmung der Sekretion von apoB (12). Die Ergebnisse bestätigen, dass die Verbindung A die Sekretion von TG-reichen Lipoproteinen, die apoB enthalten, hemmt.
Die vorstehenden Verfahren wurden mit der Verbindung B wiederholt. Die Verbindung B hemmt den MTP-katalysierten ³H-TG-Transport von Donor-SUV zu Akzeptor-SUV. Der IC₅₀-Wert beträgt etwa 4 bis 6 μM (13). Die Sekretion von Lipoproteinen, die apoB enthalten, wird in HepG2-Zellen auch durch die Verbindung B gehemmt (14).
Beispiel 7
Hemmung des MTP-katalysierten CE- und PC-Transports
I. Verfahren
Um die Wirkung der Verbindung A auf den durch Rinder-MTP katalysierten Transport von CE oder PC zwischen Membranen zu messen, wurde der Lipid-Transfertest, der den TG-Transfer zwischen SUV misst, modifiziert. Die Zusammensetzung der Donor-Vesikel war die gleiche, mit der Ausnahme, dass anstelle des markierten TG 0,25 Mol-% ¹⁴C-CE oder ¹⁴C-PC verwendet wurden. Die Zusammensetzung der Akzeptor-Vesikel war die gleiche, mit der Ausnahme, dass markiertes PC und unmarkiertes TG nicht enthalten waren. Nach der Fällung der Donor-Vesikel wurde der Prozentsatz des Lipid-Transfers berechnet, indem ¹⁴C-CE oder -PC in den Akzeptor-Vesikeln im Überstand nach einer Transferreaktion mit dem gesamten ¹⁴C-CE oder -PC im Test verglichen wurde. Das markierte Lipid im Überstand in Abwesenheit von MTP wurde von dem markierten Lipid in Gegenwart von MTP abgezogen, wodurch der MTP-katalysierte Lipid-Transfer von Donor-SUV zu Akzeptor-SUV berechnet wurde. Im übrigen wurde der Test im wesentlichen wie vorstehend beschrieben durchgeführt.
II. Ergebnisse
Die Fähigkeit der Verbindung A wurde ebenfalls untersucht, den MTPkatalysierten Transport von radiomarkiertem CE und PC zwischen den Membranen zu hemmen. Die Verbindung A hemmte den CE-Transfer in einer Art und Weise, die mit ihrer Hemmung des TG-Transfers vergleichbar war. Die Verbindung A hemmte den PC-Transfer, wobei sie jedoch beim Hemmen des PC-Transfers weniger wirksam war als beim CE- und TG-Transfer. Etwa 40% des PC-Transfers wurde bei Konzentrationen des Inhibitors gehemmt, die den TG- und CE-Transfer um mehr als 80% senkten.
Beispiel 8
Clonierung von Rinder-MTP-5'-Ende
Eine cDNA-Bank des Rinder-Dünndarms, verpackt in Lambda gt10, wurde von Clontech bezogen (Nr. BL1010A). Die Bank wurde in SM verdünnt, so dass 50000 Phagen pro 100 μl enthalten waren (eine Verdünnung von 1 : 100000). Das verdünnte Phagenpräparat (100 μl) wurde mit 300 μl E. coli C 600-Zellen (Clontech) gemischt und 15 Minuten bei 37°C inkubiert. Nach Zugabe von 7 ml Deck-Agarose wurde das Gemisch auf eine 150-mm-Platte gegossen, die 75 ml LB-Agarose enthielt. Insgesamt wurden auf diese Weise 25 Platten hergestellt, die jeweils etwa 5 × 10⁴ Phagen enthielten. Die Platten wurden über Nacht bei 37°C inkubiert.
Um die Phagen-DNA zu isolieren, wurden zu jeder Platte 10 ml SM (keine Gelatine) zugegeben. Danach wurden die Platten vorsichtig zwei Stunden bei Raum temperatur geschwenkt. Die eluierten Phagen (etwa 8 ml/Platte) wurden gewonnen und vereinigt. Die E. coli-Zellen wurden zehn Minuten bei 12000 × g abzentrifugiert.
Die Lambda-DNA wurde aus dem Überstand unter Verwendung des QIAGEN Tip-100 (midi)-Präparats gemäß den Anweisungen des Herstellers isoliert. Die gereinigte DNA wurde in einem Gesamtvolumen von 200 μl TE (10 mM Tris-Cl, pH 8,0, 1 mM EDTA) resuspendiert.
1 μg Lambda-Phagen-DNA (etwa 3 × 10⁷ Moleküle) wurde zu einem PCR-Reaktionsgemisch von 100-μl zugegeben, das 2 mM Magnesiumchlorid, 0,2 mM von jedem Desoxynucleotid-Triphosphat, 1,25 × Puffer und 2,5 Einheiten Taq-Polymerase enthielt (Perkin-Elmer Cetus, Kit Nr. N801-0555). Die Konzentration jedes Primers betrug 0,15 mM. Die Sequenz des Vorwärts-Primers (SEQ ID NO: 29) war wie folgt:
Die Sequenz des Vorwärts-Primers beruhte auf der menschlichen cDNA-Sequenz, die die Basen 41 bis 66 der 88-kDa-Komponente des MTP codiert. Der Rückwärts-Primer (SEQ ID NO: 30) hatte die folgende Sequenz:
Die Sequenz des Rückwärts-Primers beruhte auf der bekannten Rinder-cDNA-Sequenz, die die 88-kDa-Komponente des MTP codiert und mit den Basen 658 bis 636 der Rinder-cDNA hybridisiert, welche den Basen 807 bis 785 der menschlichen cDNA entspricht.
Die PCR-Amplifikation wurde in einem Thermocycler von Perkin-Elmer, Modell 9600, durchgeführt. Nach zwei Minuten Inkubation bei 97°C wurde die Reaktion 35 Zyklen unterworfen, die jeweils aus 30 Sekunden bei 94°C, 30 Sekunden bei 50°C und einer Minute bei 72°C bestanden. Eine letzte Inkubation wurde sieben Minuten bei 72°C durchgeführt.
Das PCR-Produkt wurde einer Elektrophorese auf einem 1% Agarose-Gel in TAE-Puffer, wie vorstehend beschrieben, unterworfen. Die Ausbeute des gewünschten 766-Basenpaar-Fragments betrug etwa 2 μg. Die DNA wurde aus dem Gel ausgeschnitten, unter Verwendung von GeneClean (Bio101, La Jolla, CA) gereinigt, mit glatten Enden versehen, in pUC-18-Sma1 (Pharmacia) cloniert und, wie früher beschrieben, sequenziert.
Die neue Sequenz, die aus der Rinder-cDNA erhalten wurde, welche die 5'-Region der 88-kDa-Komponente des MTP codiert, ist in SEQ ID NO: 5 dargestellt.
Durch die Sequenz werden 83 Basen an das 5'-Ende der früher beschriebenen Rinder-cDNA angefügt.
Beispiel 9
Sequenzierung der menschlichen genomischen DNA für die 88-kDa-Komponente des MTP
Die Sequenzierung der menschlichen genomischen DNA erfolgte durch die Verfahren, die in „Demonstration eines Gendefekts bei einem zweiten Patienten mit Abeta-Lipoproteinämie" und in Beispiel 1 beschrieben sind. Als Ergebnis dieses Verfahrens wurde die menschliche genomische Sequenz SEQ ID NO: 8 erhalten.
Mikrosomales Triglycerid-Transferprotein
Zusammenfassung
Nucleinsäuresequenzen, insbesondere DNA-Sequenzen, die die gesamte oder einen Teil der Untereinheit mit hohem Molekulargewicht des mikrosomalen Triglycerid-Transferproteins codieren, Expressionsvektoren, die die DNA-Sequenzen enthalten, Wirtszellen, die die Expressionsvektoren enthalten, und Verfahren zur Verwendung dieser Materialien. Die Erfindung betrifft außerdem Polypeptidmoleküle, die die gesamte oder einen Teil der Untereinheit mit hohem Molekulargewicht des mikrosomalen Triglycerid-Transferproteins umfassen, und Verfahren zur Herstellung dieser Polypeptidmoleküle. Außerdem betrifft die Erfindung neue Verfahren zum Verhindern, Stabilisieren oder Bewirken einer Regression der Arteriosklerose sowie Arzneimittel, die eine solche Aktivität besitzen. Ferner betrifft die Erfindung neue Verfahren zum Senken der Serumlipidspiegel und Arzneimittel, die eine solche Aktivität besitzen.
Rinder-cDNA-Sequenz (SEQ ID NO: 1) 2900 Nucleotide
Rinder-cDNA-Sequenz (SEQ ID NO: 1, Fortsetzung)
Rinder-cDNA-Sequenz (SEQ ID NO: 1, Fortsetzung)
Rinder-cDNA-Sequenz (SEQ ID NO: 1, Fortsetzung)
Menschliche cDNA-Sequenz (SEQ ID NO: 2); 3185 Nucleotide
Menschliche cDNA-Sequenz (SEQ ID NO: 2, Fortsetzung)
Menschliche cDNA-Sequenz (SEQ ID NO: 2, Fortsetzung)
Menschliche cDNA-Sequenz (SEQ ID NO: 2, Fortsetzung)
Rinder-Proteinsequenz (SEQ ID NO: 3); 860 Aminosäuren
Menschliche Proteinsequenz (SEQ ID NO: 4); 894 Aminosäuren
(SEQ ID NO: 8)
(SEQ ID NO: 8, Fortsetzung)
(SEQ ID NO: 8, Fortsetzung)
(SEQ ID NO: 8, Fortsetzung)
(SEQ ID NO: 8, Fortsetzung)
(SEQ ID NO: 8, Fortsetzung)
(SEQ ID NO: 8, Fortsetzung)
(SEQ ID NO: 8, Fortsetzung)
Mikrosomales Triglycerid-Transferprotein
Inhaltsangabe
Nucleinsäuresequenzen, insbesondere DNA-Sequenzen, die die gesamte oder einen Teil der Untereinheit mit hohem Molekulargewicht des mikrosomalen Triglycerid-Transferproteins codieren, Expressionsvektoren, die die DNA-Sequenzen enthalten, Wirtszellen, die die Expressionsvektoren enthalten, und Verfahren zur Verwendung dieser Materialien. Die Erfindung betrifft außerdem Polypeptidmoleküle, die die gesamte oder einen Teil der Untereinheit mit hohem Molekulargewicht des mikrosomalen Triglycerid-Transferproteins umfassen, und Verfahren zur Herstellung dieser Polypeptidmoleküle. Außerdem betrifft die Erfindung neue Verfahren zum Verhindern, Stabilisieren oder Bewirken einer Regression der Arteriosklerose sowie Arzneimittel, die eine solche Aktivität besitzen. Ferner betrifft die Erfindung neue Verfahren zum Senken der Serumlipidspiegel und Arzneimittel, die eine solche Aktivität besitzen.

Claims

Nucleinsäuremolekül, umfassend eine Nucleinsäuresequenz, die die gesamte oder einen Teil der Untereinheit mit hohem Molekulargewicht des mikrosomalen Triglyceridtransferproteins codiert und die in SEQ ID NO. 1, 2, 5, 7, 8 dargestellte Nucleotidsequenz, die Nucleotidsequenz von SEQ ID NO. 1 zusammen mit SEQ ID NO. 5, SEQ ID NO. 2 zusammen mit SEQ ID NO. 7, die ersten 108 Basen von SEQ ID NO. 2 zusammen mit SEQ ID NO. 8 oder die ersten 108 Basen von SEQ ID NO. 2 zusammen mit SEQ ID NO. 7 und 8 oder einen Teil davon besitzt, wobei die einen Teil der Untereinheit mit hohem Molekulargewicht des mikrosomalen Triglyceridtransferproteins codierende Nucleinsäuresequenz wenigstens ungefähr 15 aufeinanderfolgende Nucleotide lang ist.
Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 1, das ein DNA-Molekül ist, und wobei die Nucleinsäuresequenz eine DNA-Sequenz ist.
DNA-Molekül, umfassend eine DNA-Sequenz, die (a) zu der DNA-Sequenz nach Anspruch 2 komplementär ist; oder (b) mit der DNA-Sequenz nach Anspruch 2 hybridisiert und ein Protein codiert, das die biologische Aktivität oder antigene Aktivität der Untereinheit mit hohem Molekulargewicht des mikrosomalen Triglyceridtransferproteins besitzt; oder (c) ein allelisches Derivat von einer der Sequenzen nach Anspruch 2 oder (b) oder einem Fragment davon ist; oder (d) degeneriert ist im Vergleich zu einer der Sequenzen nach Anspruch 2, (b) oder (c) oder einem Fragment davon, wobei das Fragment von (c) oder (d) einen Teil der Untereinheit mit hohem Molekulargewicht des mikrosomalen Triglyceridtransferproteins codiert und wenigstens 15 aufeinanderfolgende Nucleotide lang ist.
Expressionsvektor, umfassend die DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die DNA-Sequenz unter der Kontrolle eines regulatorischen Elements steht, das geeignet ist, die Expression in einer geeigneten Wirtszelle zu vermitteln.
Prokaryontische oder eukaryontische Wirtszelle, umfassend den Expressionsvektor nach Anspruch 4.
Verfahren zur Herstellung eines Polypeptidmoleküls, das die gesamte oder einen Teil der Untereinheit mit hohem Molekulargewicht des mikrosomalen Triglyceridtransferproteins besitzt, wobei das Verfahren das Kultivieren einer Wirtszelle nach Anspruch 5 unter Bedingungen, die die Expression des Polypeptids erlauben, umfasst.
Verfahren zum Nachweis einer Nucleinsäuresequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 3, die die gesamte oder einen Teil der Untereinheit mit hohem Molekulargewicht des Triglyceridtransferproteins codiert, oder einer verwandten Nucleinsäuresequenz, umfassend: (a) Inkontaktbringen der Nucleinsäuresequenz mit einem nachweisbaren Marker, der spezifisch an wenigstens einen Teil der Nucleinsäuresequenz bindet, und (b) Nachweis des derart gebundenen Markers; wobei die Anwesenheit des gebundenen Markers die Anwesenheit der Nucleinsäuresequenz anzeigt.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei der nachweisbare Marker eine Nucleotidsequenz mit einer Länge von mindestens 15 Nucleotiden ist, die zu mindestens einem Teil der die Untereinheit mit hohem Molekulargewicht des mikrosomalen Triglyceridtransferproteins codierenden Nucleinsäuresequenz komplementär ist.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Nucleotidsequenz eine genomische DNA-Sequenz, eine cDNA-Sequenz, eine RNA-Sequenz, eine Sense-RNA-Sequenz oder eine Antisense-RNA-Sequenz ist.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei der nachweisbare Marker mit einem Radioisotop markiert ist und der Nachweisschritt durch Autoradiographie erfolgt.
Nucleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 3 oder die Untereinheit mit hohem Molekulargewicht des mikrosomalen Triglyceridtransferproteins zur Verwendung in der Therapie oder Diagnose.
Arzneimittel, umfassend das Nucleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 3 oder die Untereinheit mit hohem Molekulargewicht des mikrosomalen Triglyceridtransferproteins, gegebenenfalls zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger.
Verwendung einer therapeutisch wirksamen Menge eines Inhibitors des mikrosomalen Triglyceridtransferproteins oder des DNA-Moleküls nach Anspruch 3(a), der (das) die Menge oder Aktivität des mikrosomalen Triglyceridtransferproteins vermindert, oder eines Nucleinsäuremoleküls nach einem der Ansprüche 1 bis 3 oder der Untereinheit mit hohem Molekulargewicht des mikrosomalen Triglyceridtransferproteins zur Herstellung eines Arzneimittels zur Verhinderung, Stabilisierung oder Regression von Atheriosklerose in einer Säugerspezies.
Verwendung einer therapeutisch wirksamen Menge eines Inhibitors des mikrosomalen Triglyceridtransferproteins oder des DNA-Moleküls nach Anspruch 3(a), der (das) die Menge oder Aktivität des mikrosomalen Triglyceridtransferproteins vermindert, oder eines Nucleinsäuremoleküls nach einem der Ansprüche 1 bis 3 oder der Untereinheit mit hohem Molekulargewicht des mikrosomalen Triglyceridtransferproteins zur Herstellung eines Arzneimittels zur Verringerung von Serumlipidspiegeln in einer Säugerspezies.
Verwendung nach Anspruch 14, wobei das Lipid Cholesterol, Triglycerid, Cholesterylester oder Phosphatidylcholin ist.
Verwendung einer therapeutisch wirksamen Menge eines Inhibitors des mikrosomalen Triglyceridtransferproteins oder des DNA-Moleküls nach Anspruch 3(a), der (das) die Menge oder Aktivität des mikrosomalen Triglyceridtransferproteins vermindert, oder eines Nucleinsäuremoleküls nach einem der Ansprüche 1 bis 3 oder der Untereinheit mit hohem Molekulargewicht des mikrosomalen Triglyceridtransferproteins zur Herstellung eines Arzneimittels zur Verhinderung oder Behandlung von Pancreatitis in einer Säugerspezies.
Verwendung einer therapeutisch wirksamen Menge eines Inhibitors des mikrosomalen Triglyceridtransferproteins oder des DNA-Moleküls nach Anspruch 3(a), der (das) die Menge oder Aktivität des mikrosomalen Triglyceridtransferproteins vermindert, oder eines Nucleinsäuremoleküls nach einem der Ansprüche 1 bis 3 oder der Untereinheit mit hohem Molekulargewicht des mikrosomalen Triglyceridtransferproteins zur Herstellung eines Arzneimittels zur Verhinderung oder Behandlung von Obesität in einer Säugerspezies.
Verfahren zur Herstellung eines Nucleinsäuremoleküls oder eines DNA-Moleküls nach einem der Ansprüche 1 bis 3 oder 11, umfassend die Verwendung einer der folgenden im Stand der Technik bekannten Methoden: (a) Durchmustern einer genomischen oder cDNA-Bibliothek nach der betreffenden DNA-Sequenz und Isolieren dieser DNA-Sequenz; oder (b) chemische Synthese der DNA-Sequenz; oder (c) Synthese der DNA-Sequenz durch die Polymerasekettenreaktion (PCR).
Verfahren zur Herstellung des Arzneimittels nach Anspruch 12, umfassend die Kombination des Nucleinsäuremoleküls oder des Proteins mit dem pharmazeutisch verträglichen Träger.