HU218419B - Mikroszomális triglicerid transzfer protein (MTP) nagy molekulatömegű alegységének rekombináns úton történő előállítására és a protein és inhibitorainak kimutatására szolgáló eljárások - Google Patents

Abstract

A találmány mikroszomális triglicerid transzferprotein (MTP) nagymolekulatömegű alegységének teljes vagy részleges szekvenciáját kódolónukleinsavmolekulákra, főként DNS-molekulákra, ezeket tartalmazóexpreszsziós vektorokra, ezekkel transzformált gazdasejtekre és azizolált, valamint expresszált polipeptidekre vonatkozik. A találmánytárgyát képezik továbbá a fenti termékek előállítására szolgálórekombináns eljárások. A találmány továbbá mikroszomálistranszferprotein (MTP) nagy molekulatömegű alegységét kódolónukleinsavak kimutatására és protein inhibitorok kimutatására szolgálóeljárásokra is vonatkozik. ŕ

Description

A találmány mikroszomális transzferprotein nagy molekulatömegű alegységére, ezt meghatározó génekre, a géneket tartalmazó expressziós vektorokra és a vektorokat tartalmazó gazdasejtekre vonatkozik.

A találmány tárgyát képezik az említett protein előállítására szolgáló eljárások, valamint a protein és inhibitorainak kimutatására szolgáló eljárások.

A mikroszomális trigiicerid transzferprotein (MTP) a trigliceridnek (TG), koleszterin-észternek (CE=cholesteryl ester) és foszfatidil-kolinnak (PC=phosphatidylcholine) a kis, egylamellás vezikulák (SUV=small unilamellar vesicle) közötti transzportját katalizálja [Wetterau & Zilversmit, Chem. Phys. Lipids, 38, 205-222 (1985)]. Ha a transzfer sebességét az átvitt donor lipid/idő százalékában fejezzük ki, akkor az MTP határozottan előnybe helyezi a neutrális lipidek transzportját (TG és CE) a foszfolipidek transzportjával szemben. A proteint marhamájból izolálták, és meghatározták jellemzőit [Wetterau & Zilversmit, Chem. Phys. Lipids, 38, 205-222 (1985)]. A tisztított protein poliakrilamid-gélelektroforézises (PAGE) vizsgálata arra enged következtetni, hogy a transzferprotein két alegységből álló molekula, melyek molekulatömege 58 000 és 88 000, mivel egyetlen sávot kapunk, ha a tisztított MTP-t nem denaturáló feltételek mellett elektroforetizáljuk, és két sávot kapunk - melyek molekulatömege 58 000-88 000 -, ha az elektroforézist nátrium-dodecil-szulfát (SDS=sodium dodecyl sulphate) jelenlétében végezzük el. E két polipeptidet a továbbiakban 58 kD, illetve 88 kD néven nevezzük, vagy pedig 58 kD, illetve 88 kD MTP komponensnek, vagy az MTP kis molekulatömegű, illetve nagy molekulatömegű alegységének.

A marha (bovin)-MTP 58 000 molekulatömegű komponensének a vizsgálatakor kiderült, hogy ez egy előzőleg leírt multifunkcionális protein, a protein diszulfíd izomeráz (PDI) [Wetterau et al., J. Bioi. Chem., 265, 9800-9807 (1990)]. A PDI-nek a transzferproteinben való jelenlétét az támasztotta alá, hogy 1) a marha-MTP 58 kD komponensének 25 aminoterminális aminosava azonos a marha-PDI ugyanezen aminosavaival, és 2) a marha-MTP - az 58 kD-88 kD proteinkomplex disszociációja után - diszulfíd izomerázaktivitást fejtett ki. Ezenkívül a marha-PDI - e proteinnek önmagában nincs TG transzferaktivitása - ellen termelt antitestek egy tisztított marha-MTP-t tartalmazó oldatból a marha-TG transzferaktivítást immunprecipitálni tudták.

A PDI rendes körülmények között az endoplazmatikus retikulum lumenén belül az újonnan szintetizált, diszulfidhíd-tartalmú proteinek felgombolyításában és öszszeszerelésében játszik szerepet [Bulleid & Freedman, Natúré, 335, 649-651 (1988)]. A ciszteincsoportok diszulfidkötésekké való helyes párosítását katalizálja, katalizálván ezáltal a diszulfidkötéses protein helyes felgombolyodását. Közölték ezenkívül, hogy a PDI azonos a humán prolil-4-hidroxiláz béta-alegységével [Koivu et al., J. Bioi. Chem., 262, 6447-6449 (1987)]. A marha-transzferproteinben a PDI szerepe nem világos. Úgy tűnik mégis, hogy a transzferproteinnek lényeges részét alkotja, mivel ha a PDI ledisszociál a marha-MTP 88 kD komponenséről, akár egy alacsony koncentrációjú denaturálószer (guanidin-hidroklorid), akár egy kaotrop szer (nátriumperklorát), akár egy nem denaturáló detergens (oktil-glükozid) hatására, ez a transzferaktivitás megszűnéséhez vezet [Wetterau et al., Biochemistry, 30, 9728-9735 (1991)]. Az izolált marha-PDI-nek nincs megnyilvánuló lipid transzferaktivitása, amiből arra lehet következtetni, hogy vagy a 88 kD polipeptid a transzferprotein, vagy ez kölcsönöz transzferaktivitást a proteinkomplexnek.

Vizsgálták patkányokban az MTP szöveti és szubcelluláris eloszlását [Wetterau és Zilversmit, Biochem, Biophys. Acta, 875, 610-617 (1986)]. A májban és a belekben találtak lipid transzferaktivitást. A plazmában, agyban, szívben vagy vesében alacsony volt, vagy nem volt transzferaktivitás. A májban az MTP a mikroszomális frakció lumenében mint szolubilis protein volt jelen. Megközelítőleg azonos koncentrációban volt jelen a sima felszínű és durva felszínű mikroszómaffakcióban.

Az abétalipoproteinémia egy autoszomális receszszív betegség, amelyet az apolipoprotein B-t (apoB) tartalmazó plazmalipoproteinek hiánya jellemez [Kané és Havel, The Metabolic Basis of Inherited Disease, 6. kiadás, 1139-1164. old. (1989)]. A plazma-TG-szintek alacsonyak, mennyiségük néhány mg/dl, és nem emelkednek fel zsírfogyasztás után. A plazma-koleszterinszintek értéke gyakran mindössze 20-45 mg/dl. Ezeket a rendellenességeket a májban a nagyon kis sűrűségű lipoproteinek (VLDL=very low density lipoprotein) és a bélben a kilomikronok összeszerelésének és/vagy szekréciójának egy genetikai hibája okozza. Ennek a hibának a molekuláris alapjait eddig még nem derítették fel. A vizsgált betegekben a trigiicerid-, foszfolipid- és koleszterinszintézis normálisnak mutatkozik. A betegek boncolásakor nem találtak ateroszklerózist [Schaefer et al., Clin. Chem., 34, B9-12 (1988)]. Számos család esetében kizárták az apoB gén és az abétalipoproteinémia közti kapcsolatot [Talmud et al., J. Clin. Invest., 82, 1803-1806 (1988) és Huang et al., Am. J. Hűm. Génét., 46, 1141-1148 (1990)].

Az abétalipoproteinémiás betegeket több betegség sújtja (Kané és Havel, lásd fentebb). A betegeknél zsírfelszívódási zavar áll fenn, és TG-felszaporodás észlelhető a bélsejtekben és májsejtekben. A TG-ben gazdag plazmalipoproteinek hiánya miatt zavar van a zsírban oldódó vitaminok, így az E-vitamin transzportjában. Ennek következményei : a vörösvérsejtek akantocitózisa, spinocerebrális ataxia, mely a fasciculus cuneatus és gracilis degenerációjával jár együtt, perifériás neuropathia, degeneratív pigmentáló retinopathia és ceroid myopathia. Az abétalipoproteinémiás betegek kezelése magában foglalja a zsírfogyasztás étrendi csökkentését és a napi élelemadag Α-, E- és K-vitaminnal való kiegészítését.

Mostanáig nem mutatták ki az MTP fiziológiai szerepét. Az MTP in vitro katalizálja a lipidmolekulák foszfolipidmembránok közötti transzportját. Feltehetően hasonló szerepet játszik in vivő is, és így bizonyos szerepe van a lipidanyagcserében. Az MTP szubcelluláris (a mikroszomális frakció lumene) és szöveti (máj és bél) eloszlása olyan feltevéshez vezetett, hogy szerepet játszhat a plazmalipoproteinek összeszerelésében, minthogy ezeken a helyeken megy végbe a plazmalipoproteinek

HU 218 419 Β összeszerelése [Wetterau & Zilversmit, Biochem. Biophys. Acta, 875, 610-617 (1986)]. Az MTP-nek azon képessége, hogy a TG membránok közötti transzportját katalizálja, egybeesik ezzel a hipotézissel, és ahhoz a következtetéshez vezet, hogy az MTP katalizálhatja a TG transzportját az endoplazmatikus retikulum (ER) membránban történő szintézise helyéről az ER lumenén belüli nascens lipoproteinpartikulákhoz.

Olofsson és munkatársai tanulmányozták a lipoprotein összeszerelődését HepG2 sejtekben [Bostrom et al., J. Bioi. Chem., 263, 4434-4442 (1988)]. Eredményeikből kitűnik, hogy a kis prekurzor lipoproteinek idővel nagyobbak lesznek. Ez egyezik azzal a felfogással, miszerint a lipidmolekulák nascens lipoproteinekké addicionálódnak, vagy a nascens lipoproteinekhez szállítódnak, ahol összeszerelődnek. Az MTP-nek ebben a folyamatban lehet szerepe. Hogy ezt a hipotézist alátámasszák, Howel és Palade [J. Cell. Bioi., 92, 833-845 (1982)] nascens lipoproteineket izoláltak patkánymáj Golgi-frakcióból. Különböző nagyságú partikulák spektrumát kapták, változó lipid- és proteinösszetétellel. Találtak olyan nagy sűrűségű lipoproteint (HDL=high density lipoprotein), mely apoB-t még tartalmazott. Higgins és Hutson [J. Lipid Rés., 25, 1295-1305 (1984)] közölték, hogy a Golgi-készülékből izolált lipoproteinek rendszeresen nagyobbak, mint azok, amelyeket az endoplazmatikus retikulumból izoláltak, s ez megint azt sugallja, hogy a lipoproteinek összeszerelése egy előrehaladó történés. Mindazonáltal a technika jelenlegi állása szerint nincs olyan bizonyíték, amely bemutatná, hogy az MTP szerepet játszik a lipidmetabolizmusban vagy a plazmalipoprotein összeszerelésében.

A találmány egy olyan izolált nukleinsavmolekulára vonatkozik, amelyben egy nukleinsavszekvencia az MTP nagy molekulatömegű teljes alegységét vagy ennek egy részét és/vagy ennek intron és 5’ vagy 3’ határos szakaszait kódolja. Előnyös, ha a nukleinsavmolekula egy DNS (dezoxiribonukleinsav)-molekula, és ha a nukleinsavszekvencia egy DNS-szekvencia. Előnyben részesítünk továbbá egy olyan nukleinsavat, amely a szekvencialistában megadott alábbi nukleotidszekvenciák egészét vagy részét tartalmazza: 1., 2., 5., 7. vagy 8. számú szekvencia, az 1-es és az 5-ös szekvencia együtt, a 2-es és a 7-es szekvencia együtt, a 2-es szekvencia első 108 bázisa a 8-as szekvenciával, vagy a 2es szekvencia első 108 bázisa a 7-es és 8-as szekvenciával együtt.

A találmány egy olyan nukleinsavmolekulára is vonatkozik, amelynek a szekvenciája a fenti szekvenciákkal és/vagy intronnal vagy ezek 5’- és 3’-végével szomszédos szekvenciákkal komplementer.

Vonatkozik a találmány az MTP nagy molekulatömegű alegységének egészét vagy részét kódoló DNSszekvenciát tartalmazó expressziós vektorokra is.

A találmány ezenkívül olyan expressziós vektort tartalmazó prokarióta vagy eukarióta gazdasejtekre is vonatkozik, amelyek az MTP teljes nagy molekulatömegű alegységét vagy ennek részét kódoló DNS-szekvenciát tartalmaznak.

Vonatkozik még a találmány az MTP teljes nagy molekulatömegű alegységét vagy ennek részét tartalmazó polipeptidmolekulákra. Előnyös, ha a polipeptid a humán vagy szarvasmarha-MTP nagy molekulatömegű alegysége.

A találmány olyan nukleinsavszekvenciák vagy rokon nukleinsavszekvenciák kimutatására szolgáló módszerekre is vonatkozik, melyek az MTP nagy molekulatömegű alegységének egészét vagy részét kódolják.

A találmány további tárgyát képezik az MTP inhibitorokat kimutató módszerek.

A találmány egy új eljárásra is vonatkozik, amely az ateroszklerózis kezelésére vagy emlősökben a szérumlipidek - ilyen a szérumkoleszterin, TG, PC vagy CE - csökkentésére szolgál, és amely magában foglalja egy olyan szer terápiásán hatásos mennyiségének az alkalmazását, amely az MTP aktivitását vagy mennyiségét csökkenti. Az ilyen szerek olyan betegségek kezelésére is használhatók, amelyek kapcsolatban vannak vagy amelyekre kihatnak a szérumlipidszintek, ilyenek a pancreatitis, hiperglikémia, kóros elhízás (obesitas) és hasonlók.

Az alábbiakban az ábrák magyarázata következik.

Az 1. ábrán marha (bovin) cDNS-klónokat mutatunk be. Ábrázoltunk öt marha cDNS-inszeitumot. Az ábrán felül lévő összefüggő vonal az izolált teljes cDNS-szekvenciát jelenti. E vonal feletti kis jelzett keretek peptid- és szondaszekvenciákat ábrázolnak. A nyílt leolvasási keretet a második vonal képviseli, amely csillagokkal folytatódik, és a 3’ nem kódoló szekvenciáknak felel meg. A klón számát és hosszát a vonalaktól balra jeleztük. Ezek a vonalak a teljes szekvencia megfelelő szakaszait képviselik. A 64-es és 76-os kiónt a 2A szondával, a 22-es és 23-as kiónt a 37A szondával és a 2-es kiónt a 19A szondával izoláltuk. A cDNS-tár készítése során hozzáadott EcoRI linkerek az inszertum 5’és 3’-végein EcoRI restrikciós helyeket létesítenek. A 22-es és 76-os inszertumban lévő belső EcoRI helyet a cDNS-szekvencia kódolja. Az Nhel restrikciós helyet a humán cDNS-klónok (lásd alább) izolálására szánt szondák készítésénél használtuk. Az inszertumot ábrázoló vonalak alatt lévő nyilak az egyes szekvenálási reakciókat jelzik.

A 2. ábra a TG transzferaktivitást mutatja normál egyénekben. A ¹⁴C-TG proteinstimulált transzferjét a donor SUV-tól az akceptor SUV-hoz, öt normál egyénből vett homogenizált bélbiopsziás mintákban mértük. Az eredményeket a homogenizált bélbiopsziás protein függvényében óránként átvitt donor TG százalékában fejeztük ki.

A 3. ábra abétalipoproteinémiás betegekben mutatja be a TG transzferaktivitást. A ¹⁴C-TG proteinstimulált transzferjét, a donor SUV-tól az akceptor SUV-hoz, négy abétalipoproteinémiás betegtől vett homogenizált bélbiopsziás mintákban mértük. Az eredményeket a homogenizált bélbiopsziás protein függvényében óránként átvitt donor TG százalékában fejeztük ki.

A 4. ábra kontrollbetegekben mutatja be a TG transzferaktivitást. A ¹⁴C-TG proteinstimulált transzferjét, a donor SUV-tól az akceptor SUV-hoz, három

HU 218 419 Β kontrollbetegtől vett homogenizált bélbiopsziás mintában mértük. Egyikük kilomikron retenciós betegségben (üres körök), a másik beteg homozigóta hipobétalipoproteinémiában (betöltött körök) szenvedett, és egy beteg nem koplalt (x). Az eredményeket a homogenizált bélbiopsziás protein függvényében óránként átvitt donor TG százalékában fejeztük ki.

Az 5. ábra normál egyedekből származó MTP-k Western blot-analízisét mutatja be. Nitro-cellulóz-membránra felvittük a tisztított marha-MTP alikvot mennyiségét (1-es nyomsáv), és három normál egyénből (2-4 nyomsáv) származó homogenizált bélbiopsziás minta 23 pg-ja dezoxikolátos kezelését követően kapott post 103 000 xg proteinek alikvotjait - SDS-PAGE ffakcionálás után - szintén nitro-cellulóz-membránra vittük át. A biotokat anti-88 kD antitesttel szondáztuk.

A 6. ábra kontrollegyénekből származó MTP-k Western blot-analízisét ábrázolja. Nitro-cellulóz-membránra vittük a tisztított marha-MTP alikvot mennyiségét (1-es nyomsáv). Kilomikron retenciós betegségben szenvedő beteg (2-es nyomsáv), homozigóta hipobétalipoproteinémiás beteg (3-as nyomsáv) és egy nem koplaló beteg (4-es nyomsáv) bélbiopsziás mintáinak 15-25-25 pg-jának dezoxikolátos kezelése után a kapott post 103 000 χ g proteineket - SDS-PAGE frakcionálás után - szintén nitro-cellulóz-membránra vittük át. A biotokat anti-88 kD antitesttel szondáztuk.

A 7. ábra normál egyének MTP-jének Western blotanalízisét mutatja, amelyben affinitáskromatográfiával tisztított antitesteket használtunk. Nitro-cellulóz-membránra vittük a tisztított marha-MTP alikvot mennyiségét (1-es nyomsáv). Két normál egyénből származó homogenizált bélbiopsziás minta 34 pg-ja (2-es nyomsáv), illetve 25 pg-ja (3-as nyomsáv) dezoxikolátos kezelése után a kapott post 103 000xg proteineket - SDS-PAGE frakcionálás után - szintén nitro-cellulóz-membránra vittünk át. A biotokat affinitáskromatográfiával tisztított anti-88 kD antitesttel szondáztuk.

A 8. ábra abétalipoproteinémiás betegek MTP-je Western blot-analízisét mutatja be. Nitro-cellulózmembránra vittük a tisztított marha-MTP alikvot menynyiségét (1-es nyomsáv). Négy különböző abétalipoproteinémiás betegből származó homogenizált bélbiopsziás mintákból 18 pg-ot (2-es nyomsáv), 23 pg-ot (3-as nyomsáv), 23 pg-ot (4-es nyomsáv), illetve 23 pg-ot (5-ös nyomsáv) dezoxikoláttal kezeltünk, s a kapott post 103 000 χ g proteineket - SDS-PAGE frakcionálás után - nitro-cellulóz-membránra vittünk át. A 6-os és 7-es nyomsáv tartalma: a teljes bélhomogenizátum (a 4-es és 5-ös sávnak megfelelő betegekből) 100 pgját frakcionáltuk SDS-PAGE segítségével, és nitrocellulóz-membránra vittük át. A biotokat anti-88 kD antitesttel szondáztuk.

A 9. ábrán egy abétalipoproteinémiás beteg hibás génjének Southern blot-analízise látható. Egy kontroliegyénből és az abétalipoproteinémiás betegtől, valamint a beteg anyjától és apjától származó genomiális DNS 10 pg-ját teljesen elhasítottuk Taql-gyel, 1%-os agarózban elektroforetizáltuk, és átvittük nitro-cellulózra.

A Southern hibridizálásnál az exon 13 cDNS-t használtuk szondaként. A normál nyomsávban két hibridizálósáv mutatja a Taql helyet a normál exon 13-ban. Az abétalipoproteinémiás betegnél egy hibridizálósáv jelzi, hogy az exon 13-ban mindkét allélben hiányzik ez a restrikciós szekvencia, s ez alátámasztja a homozigótamutációt ebben a betegben. Az apában és anyában a heterozigóta állapotot a három hibridizálósáv mutatja, s ez megfelel mind a normál, mind a mutáns restrikciós képnek.

A 10. ábra a TG MTP-katalizált transzportjának - a donor SUV-tól az akceptor SUV-hoz - gátlását mutatja be, amelyet a később ismertetett A vegyület okozott. Az A vegyületet dimetil-szulfoxidban (DMSO) oldottuk, majd 15/40 pufferben hígítottuk. Ebből olyan mennyiségeket adtunk egy lipidtranszfer-vizsgálathoz, hogy a vegyület a jelzett végső koncentrációkat érje el. A vizsgálatban a DMSO koncentrációja soha nem haladta meg a 2 pl/600 pl-t. Ennek a koncentrációnak minimális a hatása a vizsgálatra, amelyet külön vizsgálatban határoztunk meg. Az MTP-katalizált lipidtranszportot 37 °C-on 30 percig mértük. A TG transzfert kiszámítottuk, és egy inhibitor nélküli kontrollvizsgálathoz hasonlítottuk. Három egymástól független vizsgálatban, különböző feltételek mellett mutattuk ki az A vegyület MTP-gátló hatását. A vizsgálati feltételek a következők voltak: 8 nM donor PC, 48 nM akceptor PC és 75 ng MTP (üres körök); 24 nM donor PC, 144 nM akceptor PC, 100 ng MTP (betöltött körök); 72 nM donor PC, 432 nM akceptor PC és 125 ng MTP (üres négyszögek).

All. ábra az A vegyület dózisválaszát ábrázolja a HepG2 sejtek apoB, apoAl és HSA szekréciójára. A HepG2 sejteket 16 órán át az A vegyület jelzett dózisaival kezeltük. Az inkubációs idő után a megfelelő ELISA-vizsgálattal mértük a sejttenyészetben az apoB, apoAl és HSA koncentrációját, majd az összsejtproteinhez normalizáltuk. Az eredményeket a kontroll (csak DMSO) százalékában fejeztük ki.

A 12. ábra az A vegyületnek a HepG2 sejtek TGszekréciójára gyakorolt hatását mutatja be. A HepG2 sejteket 18 órán át az A vegyület jelzett dózisaival kezeltük, az utolsó két órában 5 pCi/ ml ³H-glicerin jelenlétében. A radiojelzett triglicerideket a sejttenyészetben kvantitatív extrakció segítségével mértük, majd vékonyréteg-kromatográfiás vizsgálatot végeztünk, és a méréseket az összsejtproteinhez normalizáltuk. A kapott eredményeket a kontroll (csak DMSO) százalékában fejeztük ki.

A 13. ábra a TG MTP-katalizált transzportjának - a donor SUV-tól az akceptor SUV-hoz - a későbbiekben ismertetett B vegyülettel történő gátlását mutatja be. A B vegyületet DMSO-ban oldottuk, majd 15/40 pufferrel hígítottuk. Ebből annyit adtunk egy lipidtranszfervizsgálathoz, hogy a vegyület a jelzett végső koncentrációkat érje el. A vizsgálatban a DMSO koncentrációja soha nem lépte túl a 2 pl/600 μΐ-t. Ez egy olyan koncentráció, amelyről egy független vizsgálatban megállapítottuk, hogy minimális hatása van a vizsgálatra. Az MTP-katalizált lipidtranszportot 37 °C-on 30 percig

HU 218 419 Β mértük. Kiszámítottuk a TG transzfert, és egy inhibitor nélküli kontrollvizsgálattal hasonlítottuk össze. Két egymástól független vizsgálatban különböző feltételek mellett mutattuk ki a B vegyület gátló hatását. A vizsgálati körülmények a következők voltak: 24 nM donor PC, 144 nM akceptor PC és 100 ng MTP (üres körök); 72 nM donor PC, 432 nM akceptor PC és 125 ng MTP (betöltött körök).

A 14. ábra a B vegyület dózisválaszát mutatja be a HepG2 sejtek apoB, apoAI és HSA szekréciójára. A HepG2 sejteket 16 órán át a B vegyület jelzett dózisaival kezeltük. Az inkubációs idő után megfelelő ELISAvizsgálattal mértük a sejttenyészetben az apoB, apoAI és HSA koncentrációit, majd az összsejtproteinhez normalizáltuk. Az eredményeket a kontroll (csak DMSO) százalékában fejeztük ki.

A leírásban használt kifejezések jelentését az alábbiakban ismertetjük, hacsak speciális esetekben ezeket másként nem határozzuk meg.

Az „MTP” rövidítés egy olyan polipeptidre vagy proteinkomplexre vonatkozik, amely 1) ha egy szervezetből (például marha, ember stb.) származik, homogenizált szövet mikroszomális frakciójából izolálható; és 2) trigliceridek, koleszterin-észterek vagy foszfolipidek transzportját stimulálja szintetikus foszfolipidvezikuláktól, membránoktól vagy lipoproteinektől szintetikus vezikulákhoz, membránokhoz vagy lipoproteinekhez, különbözik a koleszterin-észter transzferproteintől [Drayna et al., natúré, 327, 632-634 (1987)], amely hasonló katalitikus tulajdonságokkal rendelkezik. Nem feltétlenül szükséges azonban, hogy a találmány szerinti MTP-molekulák katalitikusán aktívak legyenek. Például a katalitikusán inaktív MTP-t vagy ennek fragmentumát a proteinnel szembeni antitestek termelésére használhatjuk.

A „módosított” kifejezés, ha egy nukleotid- vagy polipeptidszekvenciára vonatkozik, egy olyan nukleotid- vagy polipeptidszekvenciát jelent, amely a vad típusú, természetben előforduló szekvenciától különbözik.

A „rokon” kifejezés, ha egy nukleotidszekvenciára vonatkozik, egy olyan nukleinsavszekvenciát jelent, amely az MTP nagy molekulatömegű alegysége nukleotidszekvenciáján alapuló oligonukleotidszondával képes hibridizálni.

A „szabályozószakaszok” kifejezés olyan nukleotidszekvenciákra vonatkozik, amelyek az MTP-nek vagy bármelyik alegységének kifejeződését szabályozzák, beleértve - de nem kizárólag - bármely promotert, csendes szakaszt, erősítőelemeket, összetoldó helyeket, transzkripciót indító elemeket, transzkripciót leállító elemeket, poliadenilációs szignálokat, transzlációt szabályozó elemeket, transzlációstarthelyet, transzlációt leállító helyet és message-stabilitás elemeket. Ezek a szabályozószakaszok a kódolószakasztól 5’ vagy 3’ felé eső szekvenciákban vagy a kódolószakaszt megszakító intronokban helyezkedhetnek el.

E bejelentésben az „ateroszklerózisstabilizáló” kifejezés az új ateroszklerotikus léziók előrehaladtának lelassulását és/vagy kialakulásának gátlását jelenti.

A bejelentésben az „ateroszklerózis regresszióját okozó” kifejezés az ateroszklerotikus léziók csökkenését és/vagy megszüntetését jelenti.

A találmány szerinti nukleinsavak változatos módon használhatók a találmánnyal összhangban. Például felhasználhatók mint DNS-szondák és cDNS- és genomiális DNS-tárak szűrésére oly módon, hogy hibridizálással szelektáljuk azokat a DNS-szekvenciákat, amelyek az MTP nagy molekulatömegű alegységével rokon proteineket kódolják. Ezenkívül a humán vagy marhaMTP nagy molekulatömegű alegységeinek egészét vagy részét kódoló, találmány szerinti nukleinsavakat mint DNS-szondákat használhatjuk más cDNS- és genomiális DNS-tárak szűrésére, amikor hibridizálás segítségével szelektáljuk az olyan DNS-szekvenciákat, amelyek más szervezetekből származó MTP-molekulákat kódolnak. A nukleinsavakat felhasználhatjuk primerek készítéséhez is, cDNS- vagy genomiális DNS-polimeráz láncreakció (PCR) technikákkal való sokszorozásra. A találmány szerinti DNS-szekvenciák a cDNS-ben vagy genomban a szomszédos szekvenciák meghatározására is felhasználhatók; például azok, amelyek a gént, ennek határolószekvenciáit és szabályozóelemeit kódolják.

A találmány szerinti polipeptidek az MTP jellemző tulajdonságainak a tanulmányozására is használhatók; például: szerkezete, hatásmechanizmusa, a lipidanyagcserében vagy a lipoproteinrészecskék összeszerelésében betöltött szerepe tanulmányozására.

Az alábbiakban részletesen ismertetünk különböző olyan eljárásokat, amelyekben a nukleinsavakat, polipeptideket, expressziós vektorokat és gazdasejteket használjuk.

A találmány szerinti eljárásokban az MTP hatását vagy mennyiségét csökkentő szereket különböző olyan emlősfajoknál - például majmoknál, kutyáknál, macskáknál, patkányoknál, embereknél stb. - alkalmazhatjuk, ahol erre a kezelésre szükség van. Ezek a szerek rendszeresen, orálisan vagy parenterálisan alkalmazhatók.

Az MTP hatását vagy mennyiségét csökkentő szerek a hagyományos, rendszeresen alkalmazott gyógyszerformában, tabletta, kapszula, elixír vagy injekciós készítmény formában formázhatok. Az említett gyógyszerformák, adott esetben fiziológiai szempontból elfogadott hordozóanyagot, kötőanyagot, síkosítóanyagot, puffért, antibakteriális szert, töltőanyagot (ilyen a mannit), antioxidánst (aszkorbinsav vagy nátrium-biszulfit) vagy hasonlókat tartalmazhatnak. Előnyösek az orális gyógyszerformák, jóllehet a parenterális gyógyszerformák szintén kielégítő módon használhatók.

Az adagolást gondosan, a korhoz, súlyhoz és a beteg állapotához, valamint a beadás módjához, rendszerességéhez, a dózis formájához és a kívánt eredményhez kell igazítani. Általánosságban a fent említett gyógyszerformákat egy adagban vagy több adagban - a napi egyszeri alkalmazástól a négyszeri alkalmazásig - adhatjuk be.

Nukleinsavak

A találmány egy olyan nukleinsavszekvenciát tartalmazó, izolált nukleinsavmolekulára vonatkozik, amely

HU 218 419 Β az MTP teljes nagy molekulatömegű alegységét van ennek részét kódolja. Előnyös, ha a nukleinsavmolekula egy DNS-molekula és a nukleinsavszekvencia egy DNS-szekvencia. Előnyösek továbbá az 1., 2., 5., 7. és 8. számú szekvenciavázlat szerinti nukleinsavszekvenciák, valamint az 1. és 5. számú szekvencia együtt, a 2. és 7. számú szekvencia együtt, a 2. számú szekvencia első 108 bázisa a 8. számú szekvenciával együtt, vagy a 2. számú szekvencia első 108 bázisa a 7. és 8. számú szekvenciával együtt, vagy ezek bármely része, vagy egy olyan nukleinsavszekvencia, amely e DNS-szekvenciák valamelyikével komplementer. Egy olyan nukleotidszekvencia (például egy DNS-szekvencia) esetében, amely az MTP nagy molekulatömegű hegységének egy részét kódolja, előnyös, ha a nukleotidszekvencia hossza legalább körülbelül 15 egymást követő nukleotidból áll, még előnyösebb, ha legalább körülbelül 20-30 egymást követő nukleotidból áll.

A következőkben egy marha-cDNS-nukleotidszekvenciát (1. számú szekvencia) és egy humán cDNSszekvenciát (2. számú szekvencia) mutatunk be, összehasonlítjuk továbbá a humán és a marha-cDNS-szekvenciákat, bemutatjuk a bovin aminosavszekvenciát (3. számú szekvencia), a humán aminosavszekvenciát (4. számú szekvencia), és összehasonlítjuk a humán és a marha-aminosavszekvenciákat. A szekvencia-összehasonlításokban a bekeretezett szakaszok a két szekvencia közötti teljes azonosságot jelentik.

A marha-DNS-szekvenciát (1. számú szekvencia; lásd 9-12. ábraoldal), a humán cDNS-szekvenciát (2. számú szekvencia; 12-16. ábraoldal), a marha/humán cDNS-szekvenciák összehasonlítását (17-19. ábraoldal), a marha-proteinszekvenciát (3. számú szekvencia;

20. ábraoldal), a humán proteinszekvenciát (4. számú szekvencia; 21. ábraoldal) és a marha/humán proteinszekvenciák összehasonlítását a 22-23. ábraoldalakon mutatjuk be.

A marha-cDNS a 2-es és 22-es klón cDNS-szekvenciából kombinált 2900 bázisból álló egység. A szekvencia nyílt leolvasási keretet tartalmaz az 1-2580. bázis között - amelyből egy 860 aminosavból álló transzlációs termék várható -, ezt követi a TGA stopkodon, a prime nem kódoló szekvencia 298 bázisa és egy poliA szakasz.

A 3185 bázisból álló humán cDNS-ben a 48. bázistól a 2729. bázisig terjedő szakaszból egy 860 aminosav hosszú transzlációs termék keletkezik. Ezt a cDNSszakaszt egy TGA stopkodon követi, továbbá a 3 prime nem kódoló szekvencia 435 bázisa és egy poliA szakasz.

A cDNS-ek összehasonlítása a kódoló szakaszokban lévő átfedő szekvenciák között körülbelül 88%-os azonosságot mutat (1-2583. marhabázis és 150-2732. humán bázis). Nem szükséges hézagot beiktatni, hogy megvalósítsuk a kódolószakaszok egymáshoz illesztését. A homológia valamelyest gyengébb a 3’ nem kódoló szakaszban, azzal együtt, hogy számos hézagot kell beiktatni, hogy optimális illeszkedést kapjunk.

A marha-proteinszekvencia (3. számú szekvencia) a 2-es és 22-es bovin-cDNS-klónok kombinált szekvenciájának 860 aminosavból álló transzlációs terméke. Az oligonukleotidszondák szerkesztéséhez használt peptidfragmentumok szekvenciái következők: a 19A peptid a 37-51 csoport között helyezkedik el, a 37A peptid az 539-550 csoport között és a 2A peptid az 565-572 csoport között található.

A humán proteinszekvencia (4. számú szekvencia) a 693-as humán cDNS-klón 894 aminosavat tartalmazó transzlációs terméke.

Az aminosavak összehasonlítása azt mutatja, hogy a marhaprotein körülbelül 86%-ban azonos a humán transzlációs termékkel. Ha tekintetbe vesszük a nem azonos csoportok nagyon állandó szubsztitúcióit, a két protein körülbelül 94%-ban homológ.

A feltalálók az említett marha-cDNS-szekvencia 5’-végét az alább bemutatott 5’-3’ szekvenciával kibővítették. A felső sor a nukleotidszekvenciát (5. számú szekvencia) és az alsó sor az aminosavszekvenciát (6. számú szekvencia) mutatja. A kapott új szekvenciát (83 bázis) aláhúztuk.

TT TTT CTC TGC TTC ATT TCC TCA TAT TCA GCT TCT

FLCFISSYSAS

GTT AAA GGT CAC ACA ACT GGT CTC TCA TTA AAT AAT

VKGHTTGLSLNN

GAC CGA CTA TAC AAA CTC ACA TAC TCC ACT GAA GTT

D R L Y K L

A feltalálók a fentebb bemutatott humán cDNSszekvencia 5’-végét is kiegészítették. A hozzákapcsolt szekvencia (7. számú szekvencia) a következő:

AGAGTCCACTTCTCA

Ez a szekvencia a humán MTP cDNS-szekvencia 5’-végét 15 bázissal hosszabbítja meg. Ezek a szekvenciák a kezdeti humán cDNS-klónozás (lásd a 3. példát) folyamán izolált 754-es humán máj cDNS-klónT Y S T Ε V ból keletkeztek, de a 693-as klón után történt a vizsgálatuk.

A feltalálók ugyancsak értelmeztek egy, az MTP nagy molekulatömegű alegységét meghatározó részleges humán genomális szekvenciát (8. számú szekvencia), amelyet a 24-31. ábraoldalakon mutatunk be. A függőleges vonalak az intron/exon határokat jelzik.

Az exonszekvenciákat vékony betűk, az intronszekven6

HU 218 419 Β ciákat vastag betűk jelzik. A nyilak az intronok azon részleteit jelzik, melyek szekvenciáit nem ismertetjük (a nyilak hossza nem az intronok méretét jelzi). A jobb oldalon lévő számok az exonok első és utolsó bázisát jelölik a fent bemutatott humán cDNS-szekvenciához viszonyítva. A kibővített genomiális nukleinsavat, valamint a meghosszabbított cDNS-t és ezek fragmentumait a találmányban felhasználjuk.

A találmány szerinti nukleinsavak számos forrásból izolálhatok, jóllehet a jelenleg előnyösnek tekintett szekvenciákat humán és marha-cDNS-ből és humán genomiális gyűjteményekből izoláltuk. Az előállított polipeptidmolekula aminosavszekvenciája a kiindulási DNS-szekvencia szerint változik.

A találmány szerinti nukleinsavakat különböző olyan eljárások felhasználásával állíthatjuk elő, amelyeket a gyakorlott szakemberek jól ismernek. Lényegében három alternatív eljárás alkalmazható:

(1) Kétszálú DNS-szekvenciát izolálunk olyan genomiális DNS-ből vagy komplementer DNS-ből (cDNSből), amely a szekvenciát tartalmazza.

(2) A DNS-szekvenciát kémiai szintézissel állítjuk elő.

(3) A DNS-szekvenciát polimeráz láncreakcióval (PCR-rel) szintetizáljuk.

Az első eljárás szerint egy genomiális vagy cDNStárat szűrünk abból a célból, hogy meghatározzuk az MTP nagy molekulatömegű alegységének egészét vagy részét kódoló DNS-szekvenciát. Például a marha- vagy humán cDNS-tárakat az iránt szűrjük, hogy az egész MTP-t vagy részét kódoló egy DNS-szekvenciát azonosítsuk.

Különböző cDNS-tárakat használhatunk, például egy marhavékonybél lambda-gtlO tárat (Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA, USA), vagy egy humán máj lambda UNI-ZAP™XR tárat (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA, USA) vagy egy humán él lambda-gtlO tárat (Clontech).

Különböző módszereket használhatunk arra, hogy a genomiális DNS- vagy cDNS-tárakból az MTP nagy molekulatömegű alegységét kódoló célszekvenciát kiszűrjük. Ez a technika például olyan jelzett, egyszálú DNS-szondát alkalmaz, amelynek a szekvenciája az MTP nagy molekulatömegű alegységét kódoló szekvenciával komplementer. Alkalmazhatunk például DNS/DNS hibridizációs módszert a genomiális DNS vagy cDNS klónozott másolataiban - amelyeket egyszálú formává denaturáltunk - a szekvencia azonosítására. Alkalmas szonda például az MTP nagy molekulatömegű alegységét meghatározó cDNS, amelyet azonos vagy rokon fajból nyertünk, vagy a szintetikus oligonukleotidok vagy az ezekhez hasonló szekvenciák.

A genomiális DNS- vagy cDNS-tárat immunoblotting technikák alkalmazásával szűrhetjük az MTP nagy molekulatömegű alegységének egészét vagy részét kódoló genomiális DNS-re vagy cDNS-re.

Egy tipikus, a hibridizációs technikákhoz alkalmas szűrési módszer szerint a genomiális DNS- vagy cDNStárat először agarózlemezekre szélesztjük, és ezután a kiónokat szűrőmembránokra - például nitro-cellulózmembránokra - visszük át. A genomiális gyűjteményt rendszerint egy vektor tartalmazza, ilyen az EMBL 3 vagy az EMBL 4 vagy ezek származékai (például a lambda DASH™). A cDNS-gyűjteményt rendszerint például a XgtlO, Ágtl 1 vagy a lambda-ZAP vektor tartalmazza. A DNS-szondát ezután a kiónokhoz hibridizáljuk, hogy meghatározzuk azokat a kiónokat, amelyek az MTP nagy molekulatömegű alegysége egészét vagy részét kódoló genomiális DNS-t vagy cDNS-t tartalmazzák. Egy másik módszer szerint Zgtll vagy lambdaZAP vektort tartalmazó megfelelő E. coli törzseket olyan fúziós proteinek szintetizálására késztethetünk, amelyek a vektorban lévő cDNS-inszertumnak megfelelő proteinek fragmentumait tartalmazzák. A fuziósproteineket szűrőmembránokra - például nitro-cellulózra vihetjük. Ezután antitesteket köthetünk a fúziós proteinhez az MTP nagy molekulatömegű teljes alegységének vagy részének az azonosítása céljából.

A második eljárás szerint a teljes MTP-t vagy ennek egy részét kódoló, találmány szerinti nukleinsavakat kémiai úton szintetizáljuk. A rövidebb, 15-20 nukleotidból álló oligonukleotidok közvetlenül szintetizálhatok. Ami a hosszabb oligonukleotidokat illeti, az MTP nagy molekulatömegű alegységét kódoló DNSszekvenciát úgy szintetizáljuk, hogy 50-100 bázis méretű oligonukleotidok sorát szintetizáljuk, amelyeket ezután sorban úgy ligálunk egymáshoz (megfelelő terminális restrikciós helyek révén), hogy megkapjuk a helyes, lineáris nukleotidszekvenciát.

A harmadik eljárás szerint az MTP nagy molekulatömegű alegységének egészét vagy egy részét kódoló, találmány szerinti nukleinsavakat PCR segítségével szintetizáljuk. Röviden kifejtve általában legalább 15 bázis hosszú szintetikus DNS-oligonukleotidpárokat - amelyek a cél DNS-szekvencia ellenkező szálával hibridizálnak - használunk ahhoz, hogy a célszekvencián a közbülső szakaszt enzim segítségével sokszorozzuk. A templát hődenaturálásából, a primerek illesztéséből és a rá illesztett primerek 3’-végeinek egy DNSpolimerázzal való meghosszabbításából álló ismételt ciklusok a PCR-primerek által meghatározott szegmentumok sokszorozását eredményezik. [Lásd: T. J. White et al., Trends Génét., 5, 185-189 (1989)].

A teljes MTP-t vagy részét kódoló, találmány szerinti nukleinsavakat módosíthatjuk is (azaz mutagenizálhatjuk) különböző mutánsok előállítása céljából. Ilyen mutációk megváltoztathatják a mutált kodon által kódolt aminosavszekvenciát, de lehetnek csendesek is, és ez nem változtatja meg az aminosavszekvenciát. E módosított nukleinsavakat úgy állítjuk elő, hogy például az MTP nagy molekulatömegű alegységét kódoló nukleinsavak mutagenizálása a kódolt polipeptidben egy vagy több aminosav delécióját, szubsztitúcióját, inszercióját, inverzióját vagy addícióját eredményezze. Az eljárást a szakterületen jól ismert módszerek használatával végezhetjük. Alkalmazhatunk például helyre irányuló mutagenezist a következő közlemények alapján: J. W. Taylor et al., Nucl., Acids Rés., 13, 8749-8764 (1985) és J. A. Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci., 82, 482-492 (1985). Ezenkívül a kereskedelemből is beszerezhetők a helyre

HU 218 419 Β irányuló mutegenezishez szolgáló készletek (kitek). Például az Amersham Corp.-től (Arlington Heights, IL, USA) is beszerezhetők helyre irányuló mutagenezis elvégzéséhez alkalmas kitek. Ezenkívül tördelő, törlő és csonkító módszereket is alkalmazhatunk J. R. Sayers és munkatársai [Nucl. Acids. Rés., 16, 791-800 (1988)] leírása szerint. A mutációk előnyösek lehetnek a találmány szerinti polipeptidek előállításában és felhasználásában. Ezek a mutációk például módosítják a protein funkcióját (például magasabb vagy alacsonyabb aktivitást eredményeznek), megnövelhetik a proteintermelés szintjét, vagy megkönnyíthetik a protein tisztítását, vagy további restrikciós endonukleáz-felismerő helyeket létesíthetnek a nukleinsavban. Minden ilyen módosított nukleinsav- és polipeptidmolekula a találmány oltalmi körébe tartozik.

Expressziós vektorok

A találmány olyan DNS-szekvenciát tartalmazó expressziós vektorokra is vonatkozik, amely szekvencia az MTP teljes nagy molekulatömegű alegységét vagy ennek részét, vagy egy olyan proteinkomplexet kódol, amely mind a nagy molekulatömegű, mind a kis molekulatömegű alegységet vagy ezek részét tartalmazza. Előnyös, ha az expressziós vektorok az alábbi nukleinsavszekvenciákat tartalmazó teljes DNS-szekvenciát vagy ennek részét foglalják magukban, ilyenek az 1., 2., 5., 7., 8. számú szekvenciavázlat szerinti szekvenciák, az 1. és az 5. szekvencia együtt, a 2. szekvencia a 7. szekvenciával együtt, a 2. szekvencia első 108 bázisa a 8. szekvenciával együtt, vagy a 2. szekvencia első 108 bázisa a 7. és 8. szekvenciával együtt. A további előnyös expressziós vektorok egy vagy több szabályozó DNS-szekvenciát tartalmaznak, amelyek működőképesen kapcsolódnak a MTP nagy molekulatömegű alegységének egészét vagy részét kódoló DNS-szekvenciához. A szövegben használt „működőképesen kapcsolódik” („operatively linked”) kifejezés azt jelenti, hogy a szabályozószekvenciák az MTP nagy molekulatömegű alegysége egészét vagy részét kódoldó DNSszekvencia replikációját és/vagy expresszióját képesek vezérelni.

A találmányban használatos expressziós vektorok gyakran „plazmid” formájúak, amelyek kör alakú, kettős szálú DNS-hurkoknak felelnek meg, és vektor formájúkban nincsenek a kromoszómához kötve. A találmány azonban az expressziós vektorok más olyan formáit is oltalmi körébe óhajtja vonni, amelyek azonos funkciókat látnak el, és amelyek majd ezután válnak ismertté e szakterületen. A találmány szerinti expressziós vektorokat arra is felhasználhatjuk, hogy az MTP nagy molekulatömegű alegységét kódoló DNS-szekvenciát stabilan integrálják egy megfelelő gazdasejt (például COS vagy HepG2) kromoszómájába.

A találmány szerinti eljárásban használt expressziós vektorok általában egy replikációs origót tartalmaznak, továbbá egy promotert, amely a DNS-től 5’-irányban (azaz upstream) helyezkedik el, ezt követi az MTP nagy molekulatömegű alegységének egészét vagy részét kódoló DNS-szekvencia, a transzkripciót leállító szekvenciák és a vektor maradéka. Az expressziós vektorok más ismert DNS-szekvenciákat is tartalmazhatnak, például stabilizációs vezérszekvenciákat, amelyek az expressziós termék stabilitását biztosítják, szekréciós vezérszekvenciákat, amelyek az expressziós termék szekréciójáról gondoskodnak, olyan szekvenciákat, amelyek lehetővé teszik, hogy a strukturális gén expresszióját modulálhassuk (például a táptalajban a tápanyagok vagy más indukciós anyagok jelenléte vagy hiánya révén), markerszekvenciákat, amelyek a transzformált gazdasejtekben a fenotípusos szelekciót segítik elő, olyan szekvenciákat, amelyek a restrikciós endonukleázok számára hasítási helyeket szolgáltatnak, és olyan szekvenciákat, amelyek különböző gazdasejttípusokban, így prokariótákban, élesztőkben, gombákban, növényekben és magasabb rendű eukariótákban teszik lehetővé az expressziót. (A gazdasejteket nem korlátozzuk az említett típusokra.) A ténylegesen használt expreszsziós vektor jellemző tulajdonságainak kompatibilisnek kell lenniük az alkalmazott gazdasejttel. Például, ha emlőssejtrendszerben fejezünk ki DNS-szekvenciákat, az expressziós vektornak emlőssejtek genomjából izolált promotereket kell tartalmaznia (például egér metallotionein promotert), vagy olyan vírusokból izolált promotereket, amelyek ezekben a sejtekben szaporodnak (például a vakcinia-vírus 7,5 K promotert). Egy találmány szerint tervezett expressziós vektor képes arra, hogy legalább a találmány szerinti nukleinsav replikációját és előnyösen az expresszióját vezérelje. A megfelelő replikációs origók közé tartozik például a Col El, a virális SV40 és az M13 replikációs origó. Alkalmas promoterek például a következők: citomegalovírus promoter, lacZ promoter, gal IC promoter és az Autographa califomica multiple nuclear polihedrózis vírus (AcMNPV) polihedrális promotere. Alkalmas terminációs szekvenciák például a következők: marha növekedési hormon, SV40, lacZ, AcMNPV polihedrális poliadenilációs szignálok. Példák a szelekciós markerekre: neomicin-, ampicillin- és higromicinrezisztencia stb. A felsorolt anyagok ismertek a szakterületen, és a kereskedelemben hozzáférhetők.

A kereskedelemből beszerezhető alkalmas expressziós vektorok - amelyekbe a találmány szerinti DNS-szekvenciákat beépíthetjük - a következők: a pcDNAI vagy pcDNA/Nco emlős expressziós vektor, a pBlueBac baculovírus expressziós vektor, a pcDNAII prokarióta expressziós vektor és a pYes2 élesztő expressziós vektor. Mindezek beszerezhetők az Invitrogen Corp. (San Diego, CA., USA) cégtől.

A kívánt kódoló- és szabályozószekvenciákat tartalmazó megfelelő expressziós vektorokat a szakterületen ismert standard rekombináns DNS-technikák segítségével szerkeszthetjük meg. Több ilyen technika leírását tartalmazza a következő kézikönyv: Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. kiadás, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY. (1989).

Gazdasejtek

A találmány tárgyát képezik továbbá olyan gazdasejtek is, amelyek az MTP nagy molekulatömegű alegységének egészét vagy részét kódoló DNS-szekvenciát

HU 218 419 Β tartalmazó expressziós vektort foglalnak magukban. Lásd például alább a 4. példában említett előnyös gazdasejteket. Előnyös, ha a gazdasejtek egy olyan expressziós vektort tartalmaznak, amely az alábbi nukleotidszekvenciával rendelkező teljes DNS-szekvenciát vagy ennek részét foglalja magában: az L, 2., 5., 7., 8. számú szekvenciavázlat szerinti szekvenciák, az 1., az 5. szekvenciával együtt, a 2. a 7. szekvenciával együtt, vagy a 2. szekvencia első 108 bázisa a 8. szekvenciával együtt és a 2. szekvencia első 108 bázisa a 7. és 8. szekvenciával együtt. Lásd például az alábbi 4. példában említett előnyös expressziós vektort. Előnyösek ezenkívül azok a gazdasejtek, amelyekben az expressziós vektor egy vagy több olyan szabályozó DNS-szekvenciát tartalmaz, amely az MTP nagy molekulatömegű alegységének egészét vagy egy részét kódoló DNS-szekvencia replikációját és/vagy expresszióját képes vezérelni, és amely működőképesen kapcsolódik e kódoló DNSszekvenciához. A megfelelő gazdasejtek mind prokarióta, mind eukarióta sejtek lehetnek. Alkalmas prokarióta gazdasejtek például a következő E. coli sejtek: HB101, DHSa, XL1, Blue, Y1090 és JM101. Alkalmas eukarióta gazdasejtek közé tartoznak például a Spodoptera frugiperda rovarsejtek, a COS-7 sejtek, a humán bőrfibroblasztok és a humán bőrfibroblasztok és a Saccharomyces cerevisiae sejtek.

Az expressziós vektorokat különböző ismert módszerek segítségével vihetjük be a gazdasejtekbe. Például : a gazdasejtek expressziós vektorokkal való transzfekcióját kivitelezhetjük a kalcium-foszfátos precipitációs módszerrel. Az expressziós vektorokat azonban más módszerekkel is bevihetjük a gazdasejtekbe, alkalmazhatunk például elektroporációt, liposzomális fúziót, maginjekciót és vírus- vagy fágfertőzést.

Mihelyt az expressziós vektort bevittük egy megfelelő gazdasejtbe, a gazdasejtet olyan körülmények között tenyésztjük, amelyek a kívánt polipeptid nagy mennyiségben való expresszióját teszik lehetővé, és ez esetben a polipeptidmolekula tartalmazza az MTP nagy molekulatömegű teljes alegységét vagy ennek egy részét.

Az MTP nagy molekulatömegű teljes alegységét vagy ennek részét kódoló DNS-szekvenciával rendelkező expressziós vektort tartalmazó gazdasejtek az alábbi hat általános módszer egyikének vagy ezek közül többnek a használatával azonosíthatók: (a) DNS-DNS hibridizáció; (b) markergénfunkciók jelenléte vagy hiánya; (c) transzkripciós szint meghatározása: a gazdasejtben az MTP nagy molekulatömegű alegységét kódoló mRNS-átiratok termelődését mérjük; (d) a géntermék immunológiai kimutatása; (e) enzimassay; és (f) PCR.

Az első megoldás szerint az MTP nagy molekulatömegű teljes alegységét vagy ennek egy részét kódoló DNS-szekvencia jelenlétét DNS-DNS vagy RNS-DNS hibridizálással mutatjuk ki, a DNS-szekvenciával komplementer szondák alkalmazásával.

A második eljárásban bizonyos markergénfunkciók (például timidinkináz-aktivitás, antibiotikumokkal szembeni rezisztencia stb.) jelenlétének vagy hiányának az alapján azonosítjuk és szelektáljuk a rekombináns expressziós vektor-gazda rendszert. A markergént ugyanabba a plazmidba építhetjük be, mint amelyben az MTP nagy molekulatömegű alegységének egészét vagy egy részét kódoló DNS-szekvencia helyezkedik el, és ugyanazon promoter szabályozása alá, mint amelyet az MTP-t kódoló szekvencia szabályozásához használunk, vagy egy más protomoter szabályozása alá. A markergén expressziója jelzi az MTP nagy molekulatömegű teljes alegységét vagy ennek egy részét kódoló DNS-szekvencia expresszióját.

A harmadik megközelítésben az MTP nagy molekulatömegű alegységét kódoló mRNS-átiratok termelését hibridizációs vizsgálatokkal mutathatjuk ki. Például: poliadenilált RNS-t izolálunk, és vagy Northern blotting segítségével vagy nukleázvédő (nuclease protection assay) vizsgálattal analizálunk egy, az RNS-szekvenciával komplementer szonda használatával. Egy másikféle megoldás szerint a gazdasejtből kivonjuk az össz-RNS-t, és vizsgáljuk, hogy ilyen szondákkal hibridizálnak-e.

A negyedik eljárásban az MTP nagy molekulatömegű egész alegységének vagy egy részének az expresszióját immunológiai módszerrel vizsgáljuk, például immunoblotting (Western blotting) alkalmazásával, MTP elleni antitestet használva.

Az ötödik megoldás szerint az MTP nagy molakulatömegű alegységének expresszióját úgy mérhetjük, hogy az MTP enzim aktivitását vizsgáljuk ismert módszerekkel. Használhatjuk például az alábbiakban leírt vizsgáló módszert.

A hatodik megoldás szerint az expressziós rendszerben jelen lévő szekvenciákkal (azaz expressziós vektor szekvenciákkal vagy MTP-szekvenciákkal) homológ oligonukleotid primereket használunk egy PCR-elj árasban, hogy egy várható hosszúságú olyan DNS-fragmentumot kapjunk, amely jelzi, hogy a gazdasejt befogadja az expressziós rendszert.

A találmány szerinti expressziós vektorok, plazmidok vagy DNS-molekulák DNS-szekvenciáit e szakterület különböző módszereivel analizálhatjuk. Használhatjuk például a didezoxilánc-terminációs módszert (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 74, 5463-5467 (1977)] vagy a Maxam-Gilbert-módszert (Proc. Natl. Acad. Sci., 74, 560-564 (1977)].

Annak érdekében, hogy katalitikusán aktív MTP fejeződjék ki, olyan protein komplex termelésére van szükség, amely mind a nagy, mind a kis molekulatömegű MTP-alegységeket tartalmazza. Az MTP kis molekulatömegű alegysége a már előzőleg jellemzett protein, a protein diszulfíd izomeráz (PDI). Eddig több kutató klónozott PDI cDNS-t emberből [Pihlajaniemi et al., EMBO J., 6, 643-649 (1987)], marhából (Yamaguchi et al., Biochem. Biophys. Rés. Comm., 146, 1485-1492 (1987)], patkányból [Edinán et al., Natúré, 317, 267-270 (1985)] és csirkéből (Kao et al., Connective Tissue Research, 18, 157-174 (1988)]. Különböző módszerekkel termelhetünk olyan proteint, mely az MTP nagy és kis molekulatömegű alegységeit egyaránt tartalmazza. Például: az alegységeket kódoló DNS9

HU 218 419 Β szekvenciákat ugyanabba az expressziós vektorokba is beépíthetjük. E DNS-szekvenciák megfelelő gazdasejtekben kifejeződnek, és így termeljük a proteint.

Magától értetődik azonban, hogy nem minden expressziós vektor és DNS-szabályozó szekvencia működik egyformán jól a találmány szerinti DNS-szekvenciák kifejezését illetőleg. A különböző gazdasejtek sem működnek egyformán jól ugyanazon expressziós rendszerben. Azonban a szakterületen átlagos gyakorlattal rendelkező szakemberek az itt rendelkezésre bocsátott irányelvek alapján, túlzottan sok kísérletezés nélkül is ki tudják választani az expressziós vektorok, DNS-szabályozó szekvenciák és gazdasejtek közül azokat, melyek megfelelők, anélkül hogy a találmány elveitől eltérnének.

Polipeptidek

A találmány tárgyát képezik az MTP nagy molekulatömegű teljes alegységéből és ennek egy részéből álló polipeptidmolekulák. Az említett polipeptidmolekulák előnyösen a következő teljes aminosavszekvenciákat vagy ezek egy részét tartalmazhatják: a 3. vagy 4. számú szekvenciavázlat szerinti szekvenciát vagy a 3. és 6. szekvenciát együtt. Az MTP nagy molekulatömegű alegységének részét tartalmazó polipeptidmolekulák esetében az az előnyös, ha azok legalább körülbelül 5-8 egymás után következő aminosav hosszúságúak, előnyösebben legalább 15-20 egymás után következő aminosav hosszúságúak. Ugyancsak előnyösek azok a polipeptidek, amelyek legalább körülbelül 180 egymásután következő aminosav hosszúságúak, és ez megközelítheti a protein strukturális doménjének méretét.

Minden aminosavszekvenciát, amelyet ebben a leírásban bemutatunk, a képletekben a szokásos módon, balról jobbra, azaz az aminoterminális végtől a karboxiterminális vég irányában írunk le.

A találmány szerinti polipeptideket szintetikus úton is előállíthatjuk, azaz a polipeptidet aminosavkomponenseiből kémiailag szintetizálhatjuk olyan módszerekkel, melyeket a szakemberek jól ismernek. Alkalmazható például a szilárd fázisú eljárás, amelyet Houghton és munkatársai írták le [Proc. Natl. Acad. Sci., 82, 5131-5135 (1985)]. Előnyös, ha a polipeptideket prokarióta vagy eukarióta gazdasejtekben termeljük, amikor is a gazdasejtek az MTP nagy molekulatömegű teljes alegységét vagy ennek egy részét kódoló DNSszekvenciát fejezik ki. Megkaphatjuk a polipeptideket egy olyan mRNS in vitro transzlációja révén, amelyet az MTP nagy molekulatömegű alegységének egészét vagy részét kódoló DNS-szekvencia kódol. Például az 1., 2., 5., 7., 8. számú szekvenciavázlat szerinti DNSszekvencia vagy az 1. és az 5. szekvencia együtt, vagy a 2. és 7. szekvencia együtt, vagy a 2. első 108 bázisa a 8. szekvenciával együtt, vagy a 2. első 108 bázisa a 7. és 8. szekvenciával együtt, vagy ezek bármely része PCR-rel szintetizálható - mint fentebb leírtuk -, és beépíthető megfelelő expressziós vektorba, amelyet ezután megfelelő gazdasejt transzformálására használhatunk. A rekombináns gazdasejtet ezután tenyésztjük az MTP nagy molekulatömegű alegysége termelése céljából. A polipeptideknek ilyen módon való termelésére szolgáló eljárások jól ismertek a szakterületen, és itt le is írjuk ezeket.

Az ilyen módon előállított proteineket ezután izoláljuk, és bizonyos szintig tisztítjuk különböző proteintisztítási technikákkal. Alkalmazhatunk például kromatográfiás eljárásokat, mint az ioncserélő kromatográfia, gélszűréses kromatográfia és az immunaffinitás-kromatográfia.

A találmány szerinti polipeptideket különbözőképpen használhatjuk fel. Például: felhasználhatjuk a polipeptideket - ismert módon - olyan poliklonális vagy monoklonális antitestek termelésére, amelyek a polipeptidek megkötésére képesek. Ezeket az antitesteket ezután felhasználhatjuk arra, hogy a találmány szerinti polipeptideket kimutassuk egy mintában, például egy sejtmintában. A kimutatást például immunassay technikák használatával, mint a radioimmunassay, enzimimmunassay vagy immuncitokémia végezhetjük. Az antitesteket az affinitáskromatográfiában is használhatjuk, például a találmány szerinti polipeptidek különböző forrásokból való izolálására vagy tisztítására.

A találmány szerinti polipeptideket pontos DNSszekvenálással és az ebből levezetett aminosavszekvenciával határoztuk meg. A genetikai kód degeneráltsága következtében más DNS-szekvenciákat is használhatunk a találmány szerinti polipeptidek termelésére, ha ezek ugyanazokat az aminosavszekvenciákat kódolják, mint amilyeneket a 3. és a 4. számú szekvenciavázlat vagy a 3. és 6. szekvenciavázlat vagy ezek bármely része leír.

Magától értetődik továbbá, hogy ezen DNS- és aminosavszekvenciák allélváltozatai természetesen léteznek, vagy pedig - ismert módszerek alkalmazásával - szándékosan is bevezetjük ezeket. Ezeket a változatokat az jellemezi, hogy a szekvencia egész hosszában egy vagy több aminosav megváltozik a szóban forgó szekvenciában, például egy vagy több aminosav deléciója, szubsztitúciója, inszerciója, inverziója vagy addíciója révén. Az ilyen változtatások előnyösek lehetnek a találmány szerinti polipeptidek termelésében vagy felhasználásában; például az MTP vagy a polipeptidek affinitáskromatográfiás izolálásában. Az aminosavszubsztitúciókat például a polaritás, töltés, oldhatóság hasonlósága alapján, vagy az illető csoport hidrofób, hidrofil és/vagy amfipátiás természete alapján lehet kivitelezni. Például: negatív töltésű aminosav az aszparaginsav és a glutaminsav; pozitív töltésű aminosav a lizin és az arginin; a töltetlen apoláros főcsoportokat vagy nem poláros főcsoportokat tartalmazó aminosavak, amelyeknél hasonlóak a hidrofilícitási paraméterek, a következők: leucin, izoleucin, valin, glicin, alanin; aszparagin, glutamin; szerin, treonin; fenilalanin, tirozin. A további elképzelt változatok a következők lehetnek: az előbb említett polipeptideknek, valamint a már említett polipeptidek prekurzorainak a sói és észterei, például olyan prekurzorok, amelyek N-terminális szubsztituenssel rendelkeznek, ilyen a metionin, az Nformil-metionin és a vezérszekvenciák. Minden ilyen változat a találmány oltalmi körébe tartozik.

HU 218 419 Β

Módszer nukleinsavak kimutatására

A találmány tárgyát képezi az MTP nagy molekulatömegű alegysége egészének vagy részének vagy egy rokon nukleinsavnak a kimutatására szolgáló olyan módszer is, amikor a nukleinsavszekvenciát egy detektálható markerrel hozzuk össze, amely specifikusan kötődik a nukleinsavszekvencia legalább egy részéhez, és az így megkötött markert mutatjuk ki. A megkötött marker jelenléte jelzi a nukleinsavszekvencia jelenlétét. Előnyös, ha a nukleinsavszekvencia egy olyan DNS-szekvencia, mely lényegében az 1., 2., 5., 7. vagy 8. számú szekvencia szerinti teljes szekvenciát vagy részét tartalmazza, vagy az 1. szekvenciát az 5. szekvenciával együtt, vagy a 2. és 7. szekvenciát együtt, vagy a 2. szekvencia első 108 bázisát a 8. szekvenciával együtt, vagy a 2. szekvencia első 108 bázisát a 7. és 8. szekvenciával együtt, vagy egy ezekkel komplementer szekvenciát.

DNS-szekvenciát tartalmazó DNS-mintát különböző, DNS-izolálásra szolgáló módszerekkel izolálhatunk. Ezeket a módszereket a szakterületen jártas szakemberek jól ismerik. Például egy genomiális DNSmintát úgy izolálhatunk szövetből, hogy a szövetet, amelyből a DNS-t izolálni fogjuk, gyorsan lefagyasztjuk, összezúzzuk, hogy könnyen emészthető darabkákat nyerjünk, az összezúzott szövetet proteináz K. és SDS oldatába helyezzük, s a kapott oldatot addig inkubáljuk, amíg a sejtproteinek nagy része elbomlik. A genomiális DNS-t ezután proteinmentesítjük úgy, hogy egymás után fenol/kloroform/izoamil-alkoholos extrakciót végzünk. A DNS-t etanollal kicsapjuk, szárítjuk, és pufferben reszuszpendáljuk.

Előnyös az a módszer is, amelyben a nukleinsavszekvencia egy RNS-szekvencia. Előnyös, ha az RNSszekvencia egy mRNS-szekvencia. Ugyancsak előnyös az a módszer, melyben az RNS-szekvencia a szövetminta sejtjeiben helyezkedik el. Az RNS-szekvenciát tartalmazó RNS-mintát különböző, a szakemberek által jól ismert RNS-izoláló módszerekkel izolálhatjuk. Egy RNS-mintát sejttenyészetből például úgy izolálunk, hogy a sejteket táptalajmentesre mossuk, majd a sejteket 4 M guanidiniumoldatba helyezve lizáljuk, A kapott oldat viszkozitását úgy csökkentjük, hogy a lizátumot egy 20-as tűn keresztül átszívogatjuk. Az RNS-t ezután cézium-klorid gradiensben ülepítjük, és a felülúszó folyadékot a gradiensről gondosan eltávolítjuk, hogy az üledékben lévő RNS-t a szennyező DNS-től és proteintől elválasszuk.

A detektálható marker, mely az MTP nagy molekulatömegű alegységének egészét vagy egy részét kódoló nukleinsavszekvencia vagy egy rokon nukleinsavszekvencia kimutatására szolgál, jelzett DNS-szekvencia lehet, beleértve egy olyan jelzett cDNS-szekvenciát, melynek a nukleotidszekvenciája az MTP nagy molekulatömegű alegységének egészét vagy részét kódoló DNS-szekvenciának legalább egy részével komplementer.

A detektálható marker egy olyan jelzett RNS is lehet, amelynek egy szekvenciája az MTP teljes nagy molekulatömegű alegységét vagy egy részét kódoló DNSszekvencia legalább egy részével komplementer.

A találmány szerinti detektálható markereket az általárosan alkalmazott radioaktív jelzőkkel jelölhetjük, ilyen a ³²P és a ³⁵S, de más jelzők is, mint a biotin vagy higany szintén használhatók. A szakterület gyakorlott szakemberei jól ismerik azokat a módszereket, amelyek markerek jelölésére használhatók. Például: DNSszekvenciák és RNS-szekvenciák ³²P-vel vagy ³⁵S-sel random primer módszerrel jelölhetők.

Mihelyt megkapunk egy alkalmas, detektálható markért, különböző, a szakemberek által jól ismert módszerek alkalmazhatók arra, hogy a detektálható markert a szóban forgó mintával összehozzuk. Például: DNSDNS, RNS-RNS és DNS-RNS hibridizációkat végezhetünk ismert standard módszerekkel. Egy tipikus DNSDNS hibridizációs eljárásban, mely genomiális DNSben a teljes MTP-t vagy részét kódoló DNS-szekvenciák detektálására szolgál, először a genomiális DNS-t izoláljuk ismert módszerekkel, majd egy vagy több restrikciós enzimmel emésztjük. A kapott DNS-ffagmentumokat elválasztjuk agarózgélben, in situ denaturáljuk, és átvisszük membránszűrőkre. A nem specifikus hibridizáció csökkentése céljából végzett előhibridizálás után radioaktív jelzett nukelinsavszondát hibridzálunk az immobilizált DNS-fragmentumokhoz. A membránt mossuk, hogy eltávolítsuk a kötetlen vagy gyengén megkötött szondát, és ezután autoradiografáljuk, hogy a szondával hibridizálódott DNS-fragmentumokat azonosítsuk.

A megkötött, detektálható marker jelenlétét számos olyan módszerrel mutathatjuk ki, melyeket jól ismernek az ezen a szakterületen jártas szakemberek. Például, ha a detektálható marker radioaktívan jelzett, úgy autoradiográfíát használunk. Az alkalmazott jelzőtől függően más kimutatási módszerek is használhatók, például a spektrofotometria.

Magától értetődik, hogy azokat a nukleinsavszekvenciákat, amelyek az MTP nagy molekulatömegű alegysége egészét vagy részét kódoló nukleinsavszekvenciákkal vannak rokonságban, az itt leírt módszerekkel szintén kimutathatjuk. Például, azt a DNS-szondát, mely a humán vagy marha-MTP nagy molekulatömegű alegységét meghatározó gén állandó szakaszait tartalmazza, rokon DNS-szekvenciák (például: egerekből, patkányokból, hörcsögökből vagy kutyákból származó MTP nagy molekulatömegű kódoló DNS-szekvencia) kimutatására és izolálására is használhatjuk. Minden ilyen módszer a találmány oltalmi körébe tartozik.

MTP-inhibitorok kimutatására szolgáló módszerek

A találmány tárgyát képezi az MTP inhibitorainak kimutatása is. Részletesen kifejtve, a találmány az MTP egy inhibitorának kimutatására szolgáló olyan eljárásra is vonatkozik, amely a következő lépésekből áll: (a) egy mintát, amelyről gyanítjuk, hogy az MTP egy inhibitorát tartalmazza, a donorpartikulákban, akceptorpartikulákban lévő, detektálható jelzéssel ellátott lipidekkel és MTP-vel inkubálunk, és (b) mérjük a detektálható jelzéssel ellátott lipidek MTP-stimulált transzferjét a donorpartikulák és akceptorpartikulák között. Ebben a vizsgálatban egy inhibitor csökkenteni fogja a kimutatható jelzéssel ellátott lipidek MTP-sti11

HU 218 419 Β mulált transzferje sebességét a donor- és az akceptorpartikulák között. A kimutatást magmágneses rezonancia (NMR), elektronspin rezonancia (ESR) mérésekkel, radioaktív jelöléssel (ez az előnyös), fluoreszcens jelöléssel és hasonló módszerekkel végezhetjük. A donorés az akceptorpartikulák membránok, HDL, kis sűrűségű lipoprotein (LDL), SUV, lipoproteinek és hasonlók lehetnek. A HDL és SUV az előnyös donorpartikula, az LDL és a SUV előnyös akceptorpartikula.

Az előbb említett eljárást az MTP egyik inhibitorának azonosítására használjuk, amelynek neve 2-[l(3,3-difenil-propil)-4-piperidinil]-2,3-dihidro-3-oxo1,4-izoindol hidroklorid (a leírásban a továbbiakban „A vegyület” elnevezést használunk. Az „A vegyület” előállításának leírását a 3,600,393 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírás tartalmazza. A fenti eljárás ugyancsak alkalmas egy másik MTP-inhibitor azonosítására, amelynek neve l-[(6-fluor-l-oxo-3-tetralinil)metil]-4-(2-metoxi-fenil)-piperazin (a leírásban a továbbiakban „B vegyület”). Ezeket a vegyületeket az alábbi példákban leírt eljárások szerint azonosítjuk.

Kezelési módszerek

A találmány a továbbiakban egy új módszerre is vonatkozik, mely emlősfajoknál az ateroszklerózis megelőzésére, stabilizálására szolgál, vagy az ateroszklerózis regresszióját idézi elő, és abból áll, hogy egy szerből terápiásán hatásos mennyiséget alkalmazunk, amely csökkenti az MTP mennyiségét vagy aktivitását.

A találmány szerinti módszerrel emlősfajokban a szérumlipidszinteket - például a koleszterin- és TGszintet - csökkenthetjük azáltal, hogy egy szerből, amely az MTP mennyiségét vagy aktivitását csökkenti, terápiásán hatásos mennyiséget alkalmazunk.

Más egyéb állapotok vagy betegségek kezelésénél, amikor olyan szerkezetet használunk, amelyek az MTP mennyiségét vagy aktivitását csökkenti, ugyancsak e találmány elveinek megfelelően járunk el. Például azok a szerek, amelyek csökkentik az MTP mennyiségét vagy aktivitását, és ezáltal csökkentik a szérumkoleszterinés TG-szintet és a TG-, zsírsav- és koleszterinfelszívódást, hasonlóan alkalmasak a hiperkoleszterinémia, hipertrigliceridémia, hiperlipidémia, pankreatitisz, hiperglikémia és az obesitas kezelésére.

Az MTP mennyiségének vagy aktivitásának a hatásos csökkentésére különböző szerek használhatók a találmány szerinti módszerek kivitelezésében. MTP-inhibitorok a fentebb leírt és az alábbi 5. példában leírt szűrési módszerekkel izolálhatok. Az „A” és „B” vegyület, melyeket mint MTP-inhibitorokat azonosítottunk (lásd a 6. példát), a fent említett kezelési módszerek speciális kiviteli formáiban használhatók.

Az MTP mennyiségének a csökkentésére antiszensz molekulák használhatók. [Lásd: Toulme és Helene, Gene, 72, 51-58 (1988); Inouye, Gene, 72, 25-34 (1988); Uhlmann és Peyman, Chemical Reviews, 90, 543-584 (1990)].

MTP antiszenszmolekulák az előzőekben említett genomiális DNS- és cDNS-szekvenciák a megfelelő 5’ és 3’ határoló szabályozószakaszok, más határolószekvenciák vagy intronszekvenciák alapján szerkeszthetők. Az ilyen antiszenszmolekulák közé tartoznak az antiszensz oligodezoxiribonukleotidok, oligoribonukleotidok, oligonukleotidanalógok és hasonló molekulák, és körülbelül 15-25 vagy több bázisból állnak. Ezeket az antiszenszmolekulákat nem kovalens vagy kovalens kötéssel köthetjük az MTP nagy molekulatömegű alegységét kódoló DNS-hez vagy RNS-hez. Az ilyen kötés az MTP DNS-t vagy RNS-t el tudja például hasítani, vagy megkönnyíti a hasításukat, gyorsítja a mag-mRNS vagy citoplazma-mRNS elbomlását, vagy gátolja a transzkripciót, transzlációt, a transzaktiváló faktorokhoz való kötődését vagy a pre-mRNS összetoldását (splicing) vagy feldolgozását (processing). Mindezek a hatások csökkentik az MTP expresszióját, azaz az antiszenszmolekula használható lesz az előbbiekben említett kezelési módszerekben.

Az antiszenszmegoldás számára potenciális célszekvenciák közé tartoznak - nem kizárólag - az MTP-t kódoló DNS- vagy RNS-szekvenciák, ezek 5’ és 3’ határolószakaszai, más határolószekvenciák és a triplex DNS-formációban használt, nem klasszikus Watson- és Crick-féle bázispárosodással keletkező szekvenciák. Előnyösek lehetnek az MTP nagy molekulatömegű alegységét meghatározó tandem szekvenciák ellen ható antiszenszmolekulák.

Az antiszenszmolekuláknak további funkcióik is lehetnek, melyek megnövelik a stabilitásukat és aktivitásukat, elősegítik a sejtekbe befelé és a sejtekből kifelé irányuló transzportjukat és így tovább. Az ilyen egyéb funkciók például megkönnyíthetik a célmolekulákhoz való kötődést vagy megkönnyíthetik a célmolekulák hasítását.

Olyan vektorok is szerkeszthetők, amelyek az antiszensz DNS- vagy RNS-szintézisét vezérlik. Ebben az esetben az antiszenszmolekula sokkal hosszabb lehet, például 400 bp hosszúságú.

Az MTP és a szérumkoleszterin-szintek, TG-szintek és ateroszklerózis közötti összefüggés bemutatása A szérumkoleszterin- vagy TG-szintek csökkentésére vagy az ateroszklerózis megelőzésére, stabilizálására vagy regressziójának előidézésére szolgáló, találmány szerinti eljárások a feltalálóknak részben azon a felfedezésén alapul, hogy az abetalipoproteinémia nevű genetikai betegséget a funkcionális MTP hiánya okozza.

TG transzferaktivitás-vizsgálat abetalipoproteinémiás betegekben

A. MTP-vizsgálat

A TG transzferaktivitást úgy kapjuk meg, hogy a donor SUV-tól az akceptor SUV-ig mérjük a TG transzferproteinstimulált sebességét. A donor- és akceptorvezikulák készítéséhez megfelelő lipideket kloroformmal keverünk össze 16x125 mm-es, csavaros kupakkal ellátott kémcsövekben (Fisher Scientific Co., Pittsburg, PA., USA, Kát. szám: 14-933-1A), majd nitrogénáram alatt szárítjuk. A szárított lipidekhez 2 ml 15/40 puffért [15 mM trisz (pH=7,4), 40 mM nátriumklorid, 1 mM EDTA és 0,02% nátrium-azid] adunk (vagy vizsgálatonként 100 μΐ-t, ami egyáltalán a legkisebb térfogat), nitrogénáramot fújunk a puffer fölé, ezután a kupakot gyorsan rácsavatjuk, hogy nitrogénat12

HU 218 419 Β moszféra maradjon a lipidszuszpenzió felett. A pufferben lévő lipideket ultrahangos fürdőben kezeljük, Special Ultrasonic Cleanerben (Laboratory Supplies Co., Hicksville, NY, USA; Kát. szám: G112SP1). A donor és akceptor foszfatidil-kolint (PC) (tojás Lalfa-foszfatidil-kolin, Sigma Chem. Co., St. Louis, MO., USA) radioaktív jelezzük olyan módon, hogy hozzáadunk nyomnyi ³[H]-dipalmitoil-foszfatidil-kolint (L-alfa-dipalmitol-foszfatidil; [2-palmitoil-9,10, ³H (N)]; 33 Ci/mM; DuPont NEN), hogy a specifikus aktivitás közel 100 cpm/nM legyen. A 40 nM tojás-PC-t, 0,2 mol% ¹⁴[C]TG-t [jelzett trióiéin, (triolein-karboxil¹⁴C]; körülbelül 100 mCi/mM, DuPont NEN] és nem jelzett triolefint (trióiéin, Sigma Chem. Co., St. Louis, MO.) tartalmazó donorvezikulákat, és a 240 nM tojás PC-t és 0,2 mol% TG-t tartalmazó akceptorvezikulákat összekeverjük 5 mg zsirsavmentes marha-szérumalbuminnal (BSA) és MTP-minták alikvot mennyiségeivel 0,7-0,9 ml 15/40 pufferben. Az elegyet 1 órán át 37 °C-on inkubáljuk. A transzferreakciót 0,5 ml DEAEcellulóz szuszpenzió [15 mM triszben (pH=7,4) előduzzasztott DE-52 DEAE-cellulóz anioncserélők (Fisher, Kát.szám: 05720-5) és 1 mM EDTA 1:1 szuszpenziójára +0,02% nátrium-azid] hozzáadásával állítjuk le. A reakcióelegyet 5 percig rázzuk, majd a DEAEcellulózra kötött donormembránokat (a donormembránok tartalmazzák a negatív töltésű kardiolipint, és a DEAE-hez kötődnek) kis sebességű centrifügálással ülepítjük.

A felülúszóban maradt ¹⁴C-TG-t és ³H-PC-t szcintillációs számolással mérjük. A TG transzfert úgy számítjuk ki, hogy összehasonlítjuk a transzferreakció után a felülúszóban lévő ¹⁴C-TG (a donormembránról az akceptormembránra átvitt ¹⁴C-TG) és a ³H-PC (az akceptorvezikula nyereségének markere) arányát a transzferreakció előtt a vizsgálandó elegyben lévő teljes donor ¹⁴C-TG és az akceptor [³H]PC arányával. A ¹⁴C-TG transzfer százalékát a következőképpen számítjuk ki:

(¹⁴C-TG/³H-PC) felülúszóxlOO

Az MTP-stimulált TG transzfer sebességének a kiszámításánál az elsőrendű reakciókinetikát alkalmaztuk.

B. Antitesttermelés

Anti-88kD antitesteket a Cincinnati Egyetemtől kaptunk. Az anti-88 kD antitestek termelését előzőleg Watterau és munkatársai [J. Bioi. Chem. 265, 9800-9807 (1990)] ismertették. Hogy megismerjük az antiszérum specificitását humán bélhomogenizátumban, affinitáskromatográfiával tisztított anti-88 kD antitestet készítetünk: 8-10 mg tisztított MTP-t 0,1 M MOPS (pH=7,5) pufferben dializálunk, majd ezután hozzáadjuk 4 ml BioRad Affígel 15-höz (BioRad, Richmond, CA., USA), melyet előzőleg háromszor mostunk vízzel 4 °C-on. Szobahőmérsékleten 2 órán át hagyjuk, hogy az MTP kötődjön a mátrixhoz, majd egy éjszakán át 4 °C-on tartjuk. Az Affígel fennmaradó reaktív helyeit 0,1 ml 1 M etanol-amin (pH=8,0)/l ml gél hozzáadásával blokkoljuk. A leoldódó protein optikai sűrűségének mérései, melyet a gyártó cég előírásai szerint végeztünk, azt mutatták, hogy az MTP-nek több mint 90%-a kötődött az oszlopra. Az oszlopot sorban 50 ml 10 mM triszpufferrel (pH=7,5), 50 ml 100 mM glicinnel (pH=2,5), 50 ml 100 mM trietil-aminnal (pH=ll,5) mossuk, végül az oszlopot 10 mM triszpufferrel (pH=7,5) újra egyensúlyba hozzuk.

Az antiszérumban lévő antitesteket ammónium-szulfátos kicsapással (226 mg ammónium-szulfát ml szérum) részlegesen tisztítjuk. A csapadékot reszuszpendáljuk, és 15 mM trisz (pH=7,5), 1 mM EDTA, 0,02% nátrium-azid és 150 mM nátrium-klorid-tartalmú oldatban dializáljuk. A részlegesen tisztított antitesteket lassan - 2 óra alatt - felvisszük az MTP-Affigel oszlopra (az antitesteket háromszor cirkuláltatjuk át az oszlopon). Az oszlopot sorban 100 ml 10 mM triszpufferrel (pH = 7,5), 500 mM nátrium-klorid-oldattal, 50 ml 100 mM glicinnel (pH=2,5) [ezt a frakciót 5 ml 1 M triszbe (pH = 8,0) vesszük le] és 10 mM trisszel (pH = 8,8) mossuk, míg az oszlop el nem éri a semleges pH-t, majd 50 ml trietil-aminnal (pH=ll,5) [ezt a frakciót 5 ml 1 M triszben (pH = 8,0) vesszük le], és végül az oszlopot 10 mM triszpufferrel (pH=7,5) hozzuk újra egyensúlyba. A savanyú mosással kioldódó antitesteket használtuk a proteinfrakciók immunoblot-analíziséhez.

C. Western blotting anti-88 kD antitestekkel

Annak érdekében, hogy bebizonyítsuk az antitestek specificitását, és hogy szövethomogenizátumokban kimutassuk az MTP 88 kD komponensét, tisztított bovin MTP-t vagy a vizsgálandó frakciót SDS-PAGE rendszerben frakcionáljuk [lényegében Laemmli szerint: Natúré, 277, 680-685 (1970)] 0,75 mm Hoeffer Scientific Instrument Gél Apparátus (San Francisco, CA., USA) használatával. A proteint ezután nitro-cellulózra visszük át Western blotting révén, BioRad Trans-blot cellával (BioRad, Richmond, CA., USA). A blotting puffért (25 mM trisz, 192 mM glicin, pH 8,3,20% metanol) 4 °C-ra előhűtjük. A proteinek átvitelét szobahőmérsékleten, 100 percig 250 milliamper mellett végezzük. A membránokat 5-10 percig blokkolópufferrel [400 pl habzásgátló, körülbelül 10 mg tiomerzál és 200 g zsírtalan tejpor 4 liter 50 mM íriszt (pH=7,7) és 150 mM nátrium-kloridot tartalmazó oldatban] blokkoljuk. Az antiszérumot (1:300-as hígításban) vagy az affinitáskromatográfiával tisztított antitestet (affinitással tisztított antitestek 1:25 hígításban) hozzáadjuk a membránhoz, és egy éjszakán át szobahőmérsékleten reagáltatunk. A blokkolópufferrel való mosás után hozzáadjuk a második antitestet, a torma-peroxidázzal konjugált kecske anti-nyúl IgG-t 1:2000 hígításban, és 3 órán át reagáltatjuk szobahőmérsékleten. Egy második mosási lépés után a második antitestet a következő oldattal hívjuk elő: 50 mg imidazol, 50 mg 3,3’-diamino-benzidin-tetrahidroklorid és 50 μΐ hidrogén-peroxid (30%-os oldat) 50 μΐ blokkolópufferben.

D. MTP a bélbiopsziás mintákban

A koplaltatott kontroll és beteg egyénekből vett bélbiopsziás mintákat lefagyasztva, szárazjégen szállítottuk a Bristol-Myers Squibb (Princeton) laboratóriumába. A biopsziás mintákat politronnal (Polytron PT3000, Brinkmann Instrument, Inc., Westbury, NY., USA) ho13

HU 218 419 Β mogenizáltuk 1/2 maximális beállítással. Egy-egy biopsziás mintát 0,25 ml homogenizálópufferben [50 mM trisz (pH=7,4), 50 mM kálium-klorid, 5 mM EDTA, 5 pg/ml leupeptin és 2 mM PMSF] homogenizáltunk. A proteinoldatot 0,7 ml-re egészítettük ki 1,4%-os SDS-sel, és a proteinkoncentrációt Lowry et al., J. Bioi. Chem. 193, 265-275 (1951)] mértük. A homogenizátumot körülbelül 1,75 mg protein/ml-re hígítottuk a homogenizálópufferrel. Bizonyos esetekben a protein már hígabb volt, és ekkor közvetlenül használtuk fel. Hogy a mikroszomális frakcióból kinyerhessük a szolubilis proteint, egy rész dezoxikolátoldatot (0,56%; pH=7,5) adtunk 10 rész homogenizátumhoz Vortex-keverést alkalmazva. A mintát 4 °C-on 30 percig inkubáltuk, majd 103 000 χ g-vel centirugáltuk 60 percig. A felülúszót eltávolítottuk, 1:1 hígítást készítettünk 15/40 pufferrel, és 15/40 pufferben dializáltuk egy éjszakán át. A kezelt biopsziás mintákat TG transzferaktivitásra vizsgáltuk, és Western blot-analízist használtunk a 88 kD protein kimutatására. A TG transzferaktivitást a homogenizált bélbiopsziás protein függvényében óránként átvitt donor TG százalékában fejeztük ki.

E. Eredmények a bétalipoproteinémiás betegekkel

Annak kiderítése érdekében, hogy van-e összefüggés a csökkent MTP és az abétalipoproteinémia között, öt kontroliegyénből és négy olyan abétalipoproteinémiás betegből - akiknél az abétalipoproteinémia klasszikus genetikai recesszív formája állt fenn - duodenális vagy duodenális-jejunális biopsziás mintákat vettünk, és ezekben mértük az MTP-aktivitást. A normál egyénekből származó bélbiopsziás mintákat homogenizáltuk, és detergenssel kezeltük, ahogyan ezt fentebb leírtuk. A TG transzferaktivitást mind az öt egyén biopsziás mintájából könnyen ki tudtuk mutatni (2. ábra).

A biopsziás mintákban a TG transzferaktivitást tovább vizsgáltuk. Annak bizonyítására, hogy a TG hidrolízise nem befolyásolja a lipidtranszferaktivitás-méréseket, az egyik egyénből a transzferreakció után az akceptorvezikulákat (amelyek a szállított lipidet tartalmazták) kivontuk, és a ¹⁴C-TG azonosságát vékonyrétegkromatográfiával bizonyítottuk. Mindegyik ¹⁴C-TG mobilitása azonos volt az autentikus TG mobilitásával, s ez azt bizonyította, hogy a vizsgálatban érintetlen TG szállítódott.

A humán MTP-t hőstabilitásra vizsgáltuk. Ha 5 percig 60 °C-on melegítettük, inaktiválódott. Az aktivitás elvesztése bizonyította, hogy a mért lipidtranszfer-aktivitás nem a koleszterin-észter transzferprotein (CETP=cholesteryl ester trasfer protein) egy intracelluláris formája volt, mivel az ilyen körülmények között hőstabil [Ihm et al., J. Bioi. Chem., 257, 4818-4827(1982)].

A négy abétalipoproteinémiás betegtől származó bélbiopsziás mintákat homogenizáltuk, és a TG transzferaktivitást a fent leírtak szerint mértük. A négy beteg közül egyetlen bélbiopsziás mintában sem kaptunk transzferaktivitást (3. ábra). A kimutatható TG transzferaktivitás hiánya összefügghetett azzal, hogy az abétalipoproteinémiás biopsziás minták mikroszómáiból a dezoxikolátos kezelés nem tudja felszabadítani az

MTP-t. Ennek a lehetőségnek a vizsgálatára az egyik egyén mikroszómáit ultrahanggal kezeltük a detergenssel való kezelésen kívül. Az ultrahangos fiirdőben való kezelés függetlenül is hasonló TG transzferaktivitást hozott ki, mint a detergenses kezelés. Még ilyen körülmények között sem volt észlelhető TG transzferaktivitás.

A következő elképzelt lehetőség szerint a kimutatható TG transzferaktivitás hiánya azzal lehet kapcsolatban, hogy ezt azokban a sejtekben nem lehet kimutatni, amelyekben olyan nagy intracelluláris zsírcseppek vannak, mint amilyenek az abétalipoproteinémiában előfordulnak. Ennek a lehetőségnek a vizsgálatára három kontrollvizsgálatot végeztünk. Az elsőben kilomikron retenciós betegségben szenvedő beteg biopsziás mintájában mértük a TG transzferaktivitást. A kilomikron retenciós betegségben szenvedő betegeknél a kilomikronok összeszerelése vagy szekréciója hibás, és nagy zsírcseppek jelennek meg az enterocitákban, ugyanúgy, mint az abétalipoproteinémiás betegeknél. Ezenkívül megmértük a TG transzferaktivitást olyan egyéntől vett biopsziás mintában, aki a biopszia előtt nem koplalt, továbbá egy homozigóta hiopbétalipoproteinémiás betegtől vett mintában is. Mindkét betegnél szintén zsírral telt enterocitákat találtunk. A TG transzferaktivitás mind a három esetben a normál egyénekben talált aktivitáshoz volt hasonló (4. ábra), és ezzel bizonyítottuk, hogy az intracelluláris lipidcseppek nem befolyásolják a TG transzferaktivitást és ennek kimutatását.

Hogy megállapítsuk azt a biokémiai hibás funkciót, amely a transzferaktivitás hiányáért felelős, a homogenizált biopsziás minta mikroszomális frakciójában az MTP-felszabadulást követően, a szolubilis proteineket Western blot-analízissel vizsgáltuk, bovin-MTP 88 kD komponense ellen termelt antitestek használatával. Normál (5. ábra) és kontroll (6. ábra) egyének esetén az anti-88 kD poliklonális antitesttel végzett vizsgálatban egy olyan sávot figyeltünk meg, mely a bovin-MTP 88 kD komponenshez volt hasonló. Ezenkívül a további nagyobb mobilitású proteinek szintén keresztreakciót adtak ezzel az antitesttel. A humán MTP 88 kD komponense azonosságának a bizonyítása érdekében az antitestet affinitáskromatográfiával tisztítottuk MTP affinitásoszlopon. Ez után a kezelés után csak az a protein volt immunreaktív, amelynek a molekulatömege a bovin-MTP 88 kD komponensének a molekulatömegéhez volt hasonlítható (7. ábra).

Az öt normál egyén és a három kontrollegyén mikroszómáinak detergenssel való kezelése után kapott szolubilis proteinek Western blot-analízise az MTP 88 kD komponensének jelenlétét mutatta ki (5-7. ábrák). Ezzel szemben az abétalipoproteinémiás betegekben a bovin-MTP 88 kD komponensének megfelelő protein nem volt jelen (8. ábra). Ezenkívül hasonló analízist végeztünk a két abétalipoproteinémiás betegből származó teljes bélhomogenizátumokból előállított 100 pg proteinnel. Itt ugyancsak nem jelent meg az MTP 88 kD komponensének megfelelő sáv. Kontrollként anti-PDI antitestekkel végeztünk immunoblot-analízist, amely e két utóbbi abétalipoproteinémiás betegben a PDI jelen14

HU 218 419 Β létét kimutatta. Ezek az eredmények mutatják, hogy abétalipoproteinémiás betegekben az MTP-aktivitás hiányának a biokémiai bázisát az MTP 88 kD komponensének a kifejezett hiánya vagy távolléte képezi.

Hibás funkciójú gén kimutatása a második abétalipoproteinémiás betegben mRNS- és DNS-sokszorozás PCR-rel Két bélbiopsziás mintát vettünk egy 39 éves abétalipoproteinémiás beteg duodeniális nyálkájából. Előzetes analízissel megállapítottuk, hogy sem MTP-aktivitás, sem a 88 kD MTP-komponens nem mutatható ki a beteg bélbiopsziás mintájában. A minták 5-10 mgosak voltak, melyeket -70 °C-on lefagyasztva tároltunk. Az össz-RNS izolálása céljából az egyik lefagyasztott mintát mikrocentrifugacsőbe helyeztük, amely 0,8 ml hideg RNáz B-t (Cinnabiotexc Labs., Friendswood, TX., USA) tartalmazott. A biopsziás mintát politronnal (Brinkmann, Westbury, NY., USA) azonnal homogenizáltuk, 6 ütemben, 10-es beállítással. A homogenizátumhoz 80 pl kloroformot adtuk, és az elegyet hússzor óvatosan felkavartuk. Ezután jégen 5 percig inkubáltuk, majd 14 000 fordulat/perc mellett, Eppendorf-mikrocentrifugában (5415 Brinkmann) 15 percig 4 °C-on centrifugáltuk. Az össz-RNS-t úgy csaptuk ki, hogy a felülúszóhoz 350 pl izopropil-alkoholt adtunk. A biopsziás mintából 20 pg össz-RNS-t, vagyis szövet mg-onként 2 pg RNS-t (2%) nyertünk.

Az RNS (50 ng) átírását egyszálú cDNS-sé a következő elegyben végeztük: 2,5 μΜ random hexamer primerek, 5 mM magnézium-klorid, 1-1 mM a dezoxinukleotid-trifoszfátokból (dNTP), 1 E/μΙ RNAzin, 2,5 Ε/μ1 Moloney Murine Leukémia Vírus reverz transzkriptáz (MMLV-RT) és 1 χ PCR-reakciópuffer (Perkin-Elmer Cetus RNA-PCR kit No. N808-0017). A 20 μΐ-nyi reakcióelegyet 10 percig szobahőmérsékleten inkubáltuk a primerek illesztése céljából, majd 30 percig 42 °C-on az RNS reverz átírása céljából. A reakció leállítása úgy történt, hogy az elegyet 5 percig 99 °C-on melegítettük, majd 5 °C-ra hűtöttük. Az egyszálú cDNS-t hozzáadtuk 100 pl PCR-elegyhez, amely 0,15 μΜ forward és reverz prímért, 2 mM magnézium-kloridot, 0,2-0,2 mM-t a dNTP-kből és 2,5 E Taq polimerázt tartalmazott 1,25 χ PCR-pufferben. A sokszorozási egy Perkin-Elmer-féle GeneAmp PCR System Thermal Cycler (9600 model) készülékben végeztük, 50 ciklusban, ciklusonként 94 °C 30 másodperc, 50 °C 30 másodperc és 72 °C 1 perc alkalmazásával. A reakcióelegyet ezután 7 percig 72 °C-on inkubáltuk. A 88 kD MTP- komponenst kódoló RNS 5'-szakaszának sokszorozásához használt forward és reverz primerek (5’-től 3’-ig) a 32. ábraoldalon láthatók (9-17. Szekvencia).

Primer kombinációk és a PCR-termékek hossza: Primer pár A termék hossza (bp)

15F+678R	664
15F+839R	825
41F+1029R	998
578F+1029R	470
900F+1588R	689
900F+2117R	1228

A primer szekvenciák alapjául az MTP 88 kD komponensét kódoló normál humán cDNS szolgált. A primerek leírása 5’-től 3’-ig haladt. Az F betű a forward prímért, az R betű a reverz prímért jelenti. Az aláhúzás a primerek 5’-fágába bevitt EcoRI (578F primer) vagy BamHl (1029R és 2117R primerek) restrikciós felismerőhelyeket jelzi.

A beteg második lefagyasztott bélbiopsziás mintájából genomiális DNS-t izoláltunk. A biopsziás mintát 400 μΐ extrakciós puffért (10 mM trisz, pH=8,0, 0,1 M EDTA, 0,5% SDS, 20 pg/ml RNázI) tartalmazó mikrocentrifugacsőbe helyeztük, és azonnal homogenizáltuk. A homogenizálást politronnal végeztük, 5 ütemben, 10es beállítással. A homogenizátumhoz annyi proteináz K-t adtunk, hogy végső koncentrációja 100 pg/ml legyen, és az elegyet 50 °C-on 3 óra hosszat inkubáltuk. Az elegyet időnként felkavartuk.

A reakcióelegyet szobahőmérsékletre hűtöttük, ezután hozzáadtunk 400 pl írisszel telített fenol/kloroform elegyet (pH=80). A csövet 5 percig óvatosan forgattuk, majd 5 percig 14 000 fordulat/perc mellett, szobahőmérsékleten centrifugáltuk. A felülúszóhoz (350 pl) 35 μΐ 2 M nátrium-kloridot és 0,7 ml etanolt adtunk a DNS kicsapása céljából. A DNS-t rövid ideig centrifugáltuk, óvatosan mostuk 70%-os etanollal, gyorsan megszárítottuk, és 20 pl ionmentesített vízben (dH₂O) reszuszpendáltuk. A kihozatal 20 pg DNS volt, mely körülbelül 2 pg DNS/mg szövetnek (0,2%) felelt meg.

A genomiális DNS-t (0,5 pg) 95 °C-on melegítettük 5 percig, majd azonnal hozzáadtuk 100 pl-nyi PCRreakcióelegyhez, mely 0,15 pM forward és reverz prímért, 2 mM magnézium-kloridot, 0,2-0,2 mM-t a dNPT-kből és 2,5 E Taq polimerázt tartalmazott 1,25 χ PCR-pufferben (Perkin-Elmer Cetus). A sokszorozási Perkin-Elmer CeneAmp PCR System Thermal Cycler (9600 model) készülékben végeztük 3 ciklusban, ciklusonként 97 °C 30 másodperc, 50 °C 30 másodperc és 72 °C 1 perc alkalmazásával. További 32 ciklust futtattunk, ciklusonként 94 °C 30 másodperc, 50 °C 30 másodperc és 72 °C 1 perc alkalmazásával. A reakcióelegyet ezután 72 °C-on 7 percig inkubáltuk.

Az exon 2 génszekvencia a 88 kD MTP komponenst meghatározó RNS 109-296 bázisait kódolja. A beteg genomiális DNS-éből származó MTP 88 kD komponensét kódoló gén exon 2 szakaszának sokszorozásához a 18-as és 19-es számú primereket használtuk. Szekvenciájuk a 32. ábraoldalon látható (18. és 19. számú szekvencia).

Ezeket a primereket az MTP 88 kD komponensét kódoló normál humán DNS-szekvencia alapján terveztük meg. A primerek a 188 bp méretű exon 2-t határoló intronokkal komplementerek, így a teljes exon sokszorozódik a PCR-reakcióban. A sokszorozott termék mérete, beleértve a primereket és a határos intronszakaszokat, 292 bp-t tesz ki.

B. A PCR-termékek szekvenálása

Az RNS- és DNS-PCR-rel kapott PCR-termékeket 1,4%-os agarózgélben - TAE pufferben (40 mM triszacetát, 1 mM EDTA, pH = 8,0) - elektroforetizáltuk. A gélt 5 percig 0,5 mg/ml etidium-bromid vizes oldatá15

HU 218 419 Β val festettük meg, és 10 percig színtelenítettük vízben. A DNS-t ultraibolya fény alatt tettük láthatóvá. A kívánt PCR-terméket tartalmazó sávokat borotvapengével metszettük ki, és a DNS-t GeneClean (Bio 101, La Jolla, CA., USA) módszerrel tisztítottuk. A DNS-t a szilikagélmátrixból 20 μΐ desztillált vízzel oldottuk ki. Minden PCR-reakció körülbelül 1 pg kívánt DNS-fragmentumot eredményezett. A tisztított DNS egy részletét közvetlenül szekvenáltuk Taq polimeráz ciklizáló szekvenálással az Applied Biosystems, Inc., 373 Automatic Sequencer készülékén, Tracy és Mulcahy [Biotechniques, 11, 68 (1991)] leírása szerint.

A maradék DNS-t plazmidvektorba való klónozáshoz úgy készítettük elő, hogy T4 DNS-polimerázzal tompa végeket alakítottunk ki, majd T4 polinukleotid kinázzal foszforiláltuk. A DNS-t (500 ng) 50 μΐ olyan reakcióelegyhez adtuk, mely 20-20 μΜ-t tartalmazott a dNTP-kből, továbbá 4,5 Ε T4 DNS-polimerázt, 5 Ε T4 polinukleotid kinázt 50 mM trisz-HCl-ben (pH=7,5), 10 mM magnézium-kloridot, 1 mM DTT-t és 50 pg/ml BSA-t. Az elegyet 1 órán át 37 °C-on inkubáltuk. A DNS-t a reakcióelegyből GeneClean segítségével tisztítottuk. A DNS-t 10 pl ionmentes vízzel oldottuk ki. A tompa végű DNS-t pUC18-ba ligáltuk, melyet előzőleg Smal-gyel hasítottunk és defoszforiláltunk (Pharmacia). Dh5a sejteket (100 pl, GibcoBRL) transzformáltunk a gyártó cég által rendelkezésre bocsátott leírat szerint. A plazmid DNS-t elszaporítottuk, és alkalikus lizálómódszerrel izoláltuk Sambrook és munkatársai „Molecular Cloning” (Sambrook, Fritsch és Maniatis) című kézikönyvében leírt eljárás szerint. A plazmidklónokat az 1. példában leírtak szerint szekvenáltuk.

Eredmények

Három egymástól független RNS-PCR reakcióból kapott direkt szekvenciánál kimutattuk, hogy az abétalipoproteinémiás betegben a transzlációs starthelyhez viszonyítva a cDNS 262. bázisánál egy citozin kiesett. Az egyetlen bázist érintő törlés eltolja a leolvasási keretet, és egy stopkodonhoz (TGA) vezet 21 bázissal 3’irányban. A mutáns RNS transzlációja a 78. aminosav csoportnál be fog fejeződni. A 23/a. ábrán összehasonlítjuk egy normál és egy abétalipoproteinémiás egyén DNS-eit és a levezetett aminosavszekvenciákat (AS). (A szekvenciák száma: 20., 21., 22., illetve 23.)

A genomiális DNS két egymástól független PCRreakciójának direkt szekvenciaanalízise is kimutatta a deléciót. Ez azt jelenti, hogy az MTP 88 kD komponensét kódoló gén mindkét allélje ebben a betegben kereteltolódásos mutációt tartalmaz. Ezenkívül a DNS-fragmentumokat pUC18-ba klónoztuk szekvenálás végett. Nyolc plazmidklónban szintén deletált volt a citozin, ami megerősíti a két alléi kereteltolódásos mutációját.

A hibás funkciójú gén kimutatása egy második abétalipoproteinémiás betegben A. Módszerek

Genomiális DNS-t izoláltunk a második abétalipoproteinémiás betegből Qiagen kit (No. 13343; Chatsworth, CA., USA) segítségével a gyártó cég előirata szerint. Mint az első betegnél, előzőleg itt is megállapítottuk, hogy sem MTP-aktivitást, sem az MTP 88 kD komponensét nem tudjuk kimutatni a beteg bélbiopsziás mintáiból. A genomiális DNS 300 pg-ját elküldtük a Stratagene (La Jolla, CA., USA) céghez, hogy a lambda-DASH™ Vectorban (Stratagene) genomiális DNS-gyűjteményt készítsenek. Ezenkívül a Stratagene cégtől lambda-DASH™ vektorban fenntartott normál genomiális tárat (Kát. szám: 943202) is vásároltunk.

Mindegyik gyűjteményből kétmillió független rekombináns fágplakkot szűrtünk olyan genomiális DNS-inszertumokra, amelyek a bovin-MTP cDNS-sel homológok. A szűrést hasonló módon végeztük, mint az 1. példában leírt cDNS-tár szűrését, kivéve, hogy PLK 17 E. coli gazdasejtet használtunk, és a hibridizálást és mosást 60 °C hőmérsékleten végeztük, és a mosópuffer összetétele lxSSC, 0,1% SDS volt. A genomiális gyűjtemény szűréséhez szolgáló szondaként a 22-es számú bovin-cDNS-klónból származó 2,4 kb méretű ³²P-jelzett EcoRI fragmentumot használtuk pontosan úgy, mint a 2. példában. A valószínűen pozitív kiónokat (gyűjteményként körülbelül 30) újból kiszűrjük, és ezek pozitívaknak bizonyultak a két további hibridizációs analízis folyamán. A harmadik szűrést követően, egyedi, izolált pozitív plakkokat metszettünk ki az agarlemezekből, melyeket 50 pl kloroformot tartalmazó 1 ml SM pufferbe helyeztünk. A Sambrook és munkatársai által (lásd fentebb, 2. 67 oldal) a „Smallscale liquid cultures”, azaz a „Kis mennyiségű folyékony tenyészetek” című fejezetben leírtak szerint mindegyik fágtörzs fágtiterét megnöveltük. A felszaporított fágtörzsek 100 μΐ-ét összekevertük a lemezrevitelhez elkészített PLK 17 sejtek 100 μΐ-ével és 100 pl 10 mM magnézium-klorid és 10 mM kalcium-klorid-oldattal, majd a szuszpenziót 37 °C-on 15 percig inkubáltuk. Ezzel a szuszpenzióval 50 ml 0,2% Casamino Acids (CAA, Fisher Scientific, No. DF0288-01-2) tartalmú 2xNZY (Bethesda Research Laboratories) tápoldatot oltottunk be, és 37 °C-on egy éjszakán át tenyészettük. A lambda-DNS-t Qiagen-kittel (No. 12543) izoláltuk a lizált tenyészetekből Qiagen-pufferek és Quiagen-előirat használatával.

A genomiális DNS-inszertumok direkt szekvenálását az 1. példában leírt módon végeztük, a lambdaDNS-t templátként használva. A normál és az abétalipoproteinémiás kiónok szekvenálásához a humán cDNS-szekvenciával komplementer, körülbelül 20 bázisból álló oligonukleotidokat használtuk primerek gyanánt. Párhuzamos vizsgálatban analizáltuk és szekvenáltuk az abétalipoproteinémiás és normál genomiális kiónokat (lásd a 9. példát). Az intron-exon határok azonosítását a genomiális és cDNS-szekvenciák összehasonlításával végeztük. A szekvenáló 5’ prímért az intronszekvenciákkal szemben és a 3’ prímért exonokhoz terveztük. A primereket az intron/exon határok megállapítására használtuk oly módon, hogy a határszakaszokat újból szekvenáltuk. Ezenkívül legalább egy abétalipoproteinémiás genomiális kiónban az összes exonhoz tartozó két DNS-szál kódolószekvenciáját szekvenáltuk. Az abétalipoproteinémiás betegből származó exon

HU 218 419 Β

DNS-szekvencia analízise egy C—>T pontmutációt fedett fel a humán cDNS 1830. bázisánál. Ez a bázisváltozás egy stopkodont vezetett be egy olyan helyen, amely normál körülmények között az Arg₅₉₅ aminosavcsoportot kódolja.

A normál DNS-szekvenciában az 1830. bázis körüli nukleotidszekvencia egy Taql endonukleáz restrikciós helyet (TCGA) kódol, de az abétalipoproteinémiás beteg DNS-szekvenciájában (TTGA) nem. E nukleotidváltozás bizonyítására és ezen alléi homozigóta voltának az alátámasztására egy normál kontrollegyén, az abétalipoproteinémiás beteg és az abétalipoproteinémiás beteg mindkét szülője genomiális DNS-ét Taqlgyel emésztettük. A genomiális DNS-t a normál kontroll, az abétalipoproteinémiás beteg és az abétalipoproteinémiás beteg anyjának és apjának a véréből izoláltuk. Mindegyik mintából 10 pg genomiális DNS-t emésztettünk 5 órán át 100 E Taql-gyel (Bethesda Research Laboratories) 100 pl 1 xREact No. 2. pufferben 65 °C-on. Az emésztett mintákat 2000 fordulat/perc mellett 30 percig centrifugáltuk egy UltraffeeMC 10. 000 NMWL szűrőegységben (No. UFC3 TGC; Millipore) - molekulatömeg-kizárási határ: 10 000 abból a célból, hogy a reakcióelegy térfogatát 50 pl-re csökkentsük. A restrikciós emésztés termékét 1%-os agarózgélben - TEA pufferben - elektroforetizáltuk 20 volt mellett, 16 órán át. Az agarózgélt etidium-bromiddal festettük meg, fotografáltuk, majd nitro-cellulóz-membránra vittük Southern módszerével [Ε. M. Southern, J. Mól. Biok, 98, 503-517 (1975)].

A Southern hibridizációhoz szondaként egy olyan PCR-terméket használtunk, mely az exon 13-at és bizonyos határos intronszekvenciákat (24-es számú szekvencia: lásd alább) tartalmazott. A PCR-t GeneAmp Kit (Perkin-Elmer Cetus Industries) komponensekkel és a gyártó cég előírása szerint végeztük, 100 pl reakcióelegyben, templátként 0,3 pg normál genomiális DNS-t használva, valamint 10-10 pM forward és reverz prímért. A reakcióelegyet 97 °C-on 2 percig inkubáltuk, majd 30 ciklusban végeztük a PCR-t, ciklusonként 94 °C 30 másodperc, 45 °C 30 másodperc és 72 °C 1 perc alkalmazásával. Ezután egy 7 perces inkubálás következett 72 °C-on, végül a terméket 4 °C-on tároltuk. A sokszorozott DNS-t agarózban elektroforetizáltuk, mint az 1. példában, a várt 302 bp méretű fragmentumot kimetszettük, és kioldottuk a gélből. Az exon 13 PCR-terméket ezután ³²P-vel jeleztük - a 2. példa szerint - és szondaként használtuk a Southern hibridizáláshoz. A hibridizálási és mosási körülményeket a 2. példában írtuk le. A blotot -80 °C-on 5 napon át röntgenfilmre exponáltuk.

B. Eredmények

Genomiális gyűjteményt készítettünk a második abétalipoproteinémiás betegből izolált DNS-ből. Kétmillió fágot vizsgáltunk egy bovin-cDNS-szondával és harminc fágot vizsgáltunk bovin-MTP cDNS-sel homológ humán genomiális DNS-inszertumokkal.

Az abétalipoproteinémiás betegből származó genomiális DNS-inszertumok DNS-szekvencia-analízise egy C-T pontmutációt mutatott ki a humán MTP génben lévő exon 13-ban, az 1830. bázisnál (az exon 13 a humán cDNS-ben az 1817. bázistól az 1914. bázisig terjedő szekvenciának felel meg). Ez a C—»T pontmutáció a normál CGA argininkodont egy TGA transzlációs stopkodonná változtatja az 595. csoportnál, és ennek eredményeként a protein 300 aminosavval lesz rövidebb. Az ebből az egyénből származó mind a négy vizsgált, egymástól független genomiális DNS-inszertumban ezt a nukleotidváltozást találtuk meg.

A 23/b. ábrán bemutatjuk egy abétalipoproteinémiás beteg exon 13 szekvenciájában a C—>T mutáció pozícióját. Bemutatjuk a 302 bázisból álló exon 13 DNS-szekvenciát a határoló intronszekvenciával együtt. A forward (—>) és reverz (<-) PCR-primereknek megfelelő DNS-t, melyeket a Southem-hibridizáció szondái készítéséhez használtuk, a megfelelő nyilak jelzik. A függőleges vonalak az intron/exon határokat jelzik. A Taql-felismerő helyet bekereteztük. Csillag (*) jelzi az 1830. bázist, a C -> T mutáció helyét. (Lásd a

24. számú szekvenciavázlatot).

A normál nukleotidszekvenciában az 1830. bázisnál a C körüli szekvencia (TCGA) egy Taql restrikciós helyet kódol. Az abétalipoproteinémiás betegben ezen a helyen a szekvenciamutációt szenved (TTGA). A normál DNS-ben ezen a helyen a Taql-nek el kell hasítania az exon 13-at, de a mutációt tartalmazó DNS-ben ez nem történik meg. A normál exon 13-ban csak egy Taql hely van.

A Southern biot alátámasztja ezt a nukleotidváltozást (9. ábra). Egy kontroliegyénből, az abétalipoproteinémiás betegből és a beteg anyjából és apjából izolált genomiális DNS-t Taql-gyel teljesen megemésztettünk, és az exon 13-ból származó szekvenciákkal szondáztuk. A normál DNS-t a Taql két részre hasította, amelyek hibridizáltak az exon 13-mal, az abétalipoproteinémiás DNS-t nem hasította a Taql, s ezt bizonyította a csak egyetlen hibridizálósáv. Az eredmények a Taql-felismerő hely hiányát bizonyították. A két szülőből származó DNS kevert képet mutat, és ez egy normál alléi és egy mutáns alléi jelenlétét bizonyította.

C. Analízis

Az előbbi eredményeket és az ezekből levont következtetéseket a következőképpen foglalhatjuk össze.

MTP-aktivitás és MTP-protein nem volt kimutatható a tanulmányozott abétalipoproteinémiás betegekben. Az MTP-génben lévő mutációk kielégítően magyarázzák a protein és az aktivitás hinyát. Az előzetes eredmények jelezték, hogy az abétalipoproteinémia egy monogenetikus betegség (Kané és Havel, lásd fentebb). A fenti eredményekből arra lehet következtetni, hogy az abétalipoproteinémiát az MTP-aktivitás hiánya okozza.

Az eredmények alátámasztják, hogy MTP-aktivitás szükséges az apolipoprotein B-t tartalmazó lipoproteinpartikulák hatékony összeszereléséhez és szekréciójához. Az MTP-aktivitás hiánya abban nyilvánul meg, hogy a koleszterin, trigliceridek, foszfolipidek és koleszterin-észterek szérumszintje alacsonyabb. Ebből arra lehet következtetni, hogy az MTP mennyiségének és aktivitásának a csökkentése alacsonyabb szérumlipidszinteket eredményez.

HU 218 419 Β

Ezenkívül az alacsonyabb szérumlipidszint kapcsolatban van az ateroszklerózis prevenciójával, stabilizálásával vagy regressziójával. Mint fent tárgyaltuk, az MTP mennyiségének és aktivitásának a csökkenése alacsonyabb szérumlipidszinteket eredményez. Ezenkívül, az abétalipoproteinémiás betegeknél nincs ateroszklerózis [Schaefer, lásd fentebb, Dische és Porro, Am. J. Med., 49, 568-571 (1970); Sobrevilla et al., Am. J. Med., 37, 821 (1964)]. Ebből az is következhet, hogy az MTP gátlása az ateroszklerózis prevencióját, stabilizálását vagy regresszióját fogja eredményezni.

Az alábbi példákkal részletesebben szemléltetjük a találmányt. A példákkal nem óhajtjuk korlátozni a találmány oltalmi körét, de a példák hozzájárulhatnak a találmány jobb megértéséhez.

7. példa

A bovin-MTP 88 kD komponensét kódoló cDNSklónok izolálása és DNS-szekvencia analízise Egy kereskedelemben kapható bakteriofág lambda-gtl 0/bovinvékonybél cDNS-gyűjteményt vásároltunk a Clontech-től. 1 χ 10⁶ egymástól független rekombináns fágplakkot szűrtünk a bovin-MTP 88 kD komponensének megfelelő cDNS-re.

A C600 E. coli baktérium gazdasejteket (Clontech) fágfertőzéshez úgy készítjük elő, hogy 50 ml 2% maltózzal és 10 mM magnézium-szulfáttal kiegészített Luria-levesben (LB=Luria Broth; literenként 10 g nátrium-klorid, 10 g Bacto Trypton és 5 g élesztőkivonat) egy éjszakán át 30 °C-on telítésig tenyésztjük a sejteket. A sejteket kis sebességű centrifügálással ülepítjük, 20 ml 10 mM magnézium-szulfát-oldatban reszuszpendáljuk, és 4 °C-on tároljuk. Húsz egyenlő mennyiségű, egyenként 50 000 fágot tartalmazó anyagot 300 μΐ C600 sejttel inkubálunk 37 °C-on 15 percig, hozzákeverünk 7 ml 0,7% agaróztartalmú LB táptalajt, és 132 mm-es LB lemezekre öntjük ki. A lemezeket 7-10 órán át 37 °C-on addig inkubáljuk, míg elkülönülő fágplakkok nem jelennek meg, s utána 4 °C-on tároljuk.

A plakkokat minden lemezről két nitro-cellulózmembránra visszük át a következőképpen: nitro-cellulóz-membránt (Schleicher és Schuell, Keene, NH.,) helyezünk közvetlenül a fágra 1 percig (első transzfer), majd 3 percig (második transzfer). A membránra tapadt fág DNS-t 1 percig 0,5 n nátrium-hidroxid-, 1,5 M nátrium-klorid-tartalmú oldatban denaturáljuk, 1 percig 1 M trisz (pH=8,0), 1,5 M nátrium-klorid-oldatban semlegesítjük, végül 1 percig 2xSSC pufferben (lxSSC=0,15 M nátrium-klorid, 0,015 M nátrium-citrát; pH=7,0) mossuk. A DNS-t ezután véglegesen a nitro-cellulóz-membránra fixáljuk 2 órán át 80 °C-on tartva vákuum-szárítószekrényban.

Az MTP izolálását, beleértve a 88 kD komponensét is, előzőleg leírtuk. [Lásd: Wetterau és Zilversmit, Chem. Phys. Lipid, 38, 207-272 (1985); Wetterau et al., J. Bioi. Chem., 265, 9800-9807 (1990)].

A 88 kD komponens belső peptidszekvenciáit használjuk azon oligonukleotidok tervezéséhez, amelyekkel a proteint kódoló cDNS-t hibridizáljuk. [Lásd: R. Lathe, J. Mól. Bioi., 183, 1-12 (1985)].

Az itt leírt eljárásokban a 23/c. ábrákon bemutatott

DNS-szekvenciákat (5’-tői 3’-ig) tartalmazó szondákat alkalmaztuk.

A 2A szonda harminckét és húsz bázisból álló oligonukleotid keveréke. Mindkettő ugyanazon peptid aminosavszekvenciáját kódolja, amelynek alapján a szondát terveztük. A 37A szonda egy egyedi 33 bázisból álló szekvencia és a 19A szonda egy egyedi harmincmer. Ezek az oligonukleotidszekvenciák a belső peptideknek megfelelő aminosavszekvenciákat kódolják.

Az oligonukleotidokat a kereskedelemből szereztük be, vagy egy Milligen/Biosearch 8700 DNS-Synthesizer (Millipore Corp., Bedford, MA., USA) készülékben szintetizáltuk, (ciano-etil)-foszforamidites módszerrel. A szekvenálóprimereket NAP-10 oszlopokon (Pharmacia LKB Biotechnologies, Inc., Piscataway, NJ., USA) sótalanítjuk használat előtt. A szondákat NENSORB Prep Resin (DuPont Co., NEN Research Products, Boston, MA, USA) gyantán tisztítjuk.

A 2A szondát a Genosys Biotechnologies, Inc. (The Woodlands, TX., USA) cégtől vásároltuk és a következőképpen jeleztük; az oligonukleotid 1 pg-ját 50 pl 50 mM trisz-HCl- (pH=7,5) 10 mM magnézium-klorid-, 5 mM DTT-, 0,1 mM EDTA-, 0,1 mM spermidin-, 10 E T4 polinukleotid kináz- és 120 pCi ³²P-ATP(σ-jelzett) tartalmú reakcióelegyben inkubáltuk 37 °Con 30 percig. Ezután a kinázt 5 percig 68 °C-on hőinaktiváltuk. Az elreagálatlan ATP-t G-25 Sephadex forgatható oszlopon (spin column) távolitottuk el (Boehringer Mannheim Corp., Indianapolis, IN., USA) a gyártó cég ajánlásai szerint. A jelzett oligonukleotid specifikus aktivitása körülbelül 2 χ 10⁸ dpm/pg volt.

A nitro-cellulóz-membránokat 2 órán át 37 °C-on 150 ml hibridizálópufferben (6xSSC, 20 mM nátriumfoszfát, 2xDenhardt-oldat, 0,1% SDS és 100 pg/ml lazacsperma DNS) előhibridizáljuk (a Denhardt-oldatra vonatkozóan lásd: Sambrook et al., B15 old.). A hibridizálópuffert eltávolítjuk, és a jelzett 2A oligonukleotid szondát visszük a lemezekre, ahol egy éjszakán át 37 °C-on hagyjuk hibridizálni. A membránokat 1 liter 2xSSC, 0,1% SDS-oldattal mossuk 40 °C-on, levegőn szárítjuk, majd Kodak XAR-5 röntgenfilmre exponáljuk 5 napon át -80 °C-on, DuPont megvilágítással plusz erősítő szűrővel (DuPont NEN).

A valószínűen pozitív kiónokat (40) újból szűrtük ugyanazon szondával, két egymást követő hibridizációs menetben. A röntgenfilmen pozitív szignálnak megfelelő agardarabokat kivágjuk az eredeti lemezekből, és 1 ml 5% kloroformot tartalmazó SM-oldatba helyezzük [SM=5,8 g nátrium-klorid, 20 g magnéziumszulfát, 50 ml 1 M trisz-HCl (pH=7,5) és 5 ml 2%-os zselatin literenként]. A fágtörzs 0,001 μΐ-ét 100 pl C600 sejtszuszpenzióval - 10 mM magnézium-szulfátoldatban - keveijük el, a keveréket lemezre öntjük és 15 percig 37 °C-on inkubáljuk, majd hozzáadunk 3 ml 0,7% agaróztartalmú LB táptalajt, és 82 mm-es LB lemezekre öntjük. A lemezeket egy éjszakán át 37 °C-on majd 1 óra hosszat 4 °C-on inkubáljuk. Ezután a fágplakkokat nitro-cellulóz-membránra visszük át, ahol újra szondázzuk jelzett 2A oligonukleotidszondával.

HU 218 419 Β

A harmadik hibridizációs szűrés után 16 fágplakkot izoláltunk.

A 16 rekombináns fág inszertumait PCR-rel sokszoroztuk a kereskedelemben kapható lambda-gtlO amplimer (Clontech) és a GeneAmp Kit (Parkin-Elmer Cetus Industries, Norwalk, CT.) használatával, pontosan az előállító cégek előiratai szerint. A sokszorozott DNS-t 1,2%-os agarózgélben - trisz-EDTA-acetát pufferben [TEA=40 mM trisz-acetát, 1 mM EDTA] - 23 óra hosszat 100 volt mellett elektroforetizáltuk. Az agarózgéleket etidium-bromiddal (EtBr) festettük meg, vízzel öblítettük és fotóztuk. A DNS-t ezután a gélről nitro-cellulóz-membránra vittük át Southern módszerével. Southern-hibridizációt végeztünk a jelzett 2A oligonukleotid szondával 50 ml hibridizálópufferben (lásd fent) 40 °C-on egy éjszakán át, majd 45 °C-on, 48 °C-on és 51 °C-on végeztük a mosást. Két sokszorozott inszertum - melyek a 64-es és 76-os számú fágoknak feleltek meg (1. ábra) - hibridizált a 2A szondával 51 °C-on 2xSSC-ben. A két klón lambda-DNS-ét lemezlizátum módszerrel (Sambrook et al., 2-118. old., lásd fenti) izoláltuk. A fág-DNS egytized részét (50 miből 5 ml-t) 20 E EcoRl restrikciós enzimmel (New England Biolabs, Beverley, MA., USA) emésztettük a gyártók által megadott pufferben 37 °C-on 2 órán át, és agarózgélben elektroforetizáltuk. EcoRI-gyel való hasítás után a 64-es fág 1,0 kb méretű inszert fragmentumot és a 76-os fág cDNS-e két 0,9 kb és 0,4 kb méretű EcoRI-darabot eredményezett. Ezeket a sávokat kivágtuk a gélből.

Az agarózgélszeletekből úgy oldjuk ki a DNS-t, hogy a gélszeleteket először átnyomjuk egy 21-es tűn 3 ml T₁₀E,N₃ oldatba [10 mM trisz-HCl (pH=7,4), 1 mM EDTA (pH=8,0), 0,3 M nátrium-klorid], majd -20 °C-ra lefagyasztjuk éjszakára. A mintákat ezután 37 °C-on 30 perc alatt felolvasztjuk, lecentrifugáljuk, hogy az agaróz leülepedjék, 1:1 arányban hígítjuk vízzel, és áteresztjük egy Elu.Tip oszlopon (Schleicher és Schuell) a gyártó cég előírása szerint. A DNS-mintákat ezután etanollal kicsapjuk, etanollal mossuk, majd úgy reszuszpendáljuk, hogy koncentrációja körülbelül 0,05 pmol/μΐ legyen.

A cDNS-inszertumok beviteléhez előkészítjük a Bluescript SK+plazmid vektort (Stratagens). A vektort 20 egység EcoRl restrikciós endonukleázzal (New England Biolabs) emésztjük 37 °C-on 2 órán át az előállító által javasolt pufferben, ezután 30 percig kezeljük 1 egység borjú alkalikus foszfatázzal (Boehringer-Mannheim), amelyet közvetlenül az EcoRl reakcióhoz adunk. A kapott DNS-t 1,2% agaróz/TEA gélben, 100 volt mellett, 2 órán át elektroforetizáljuk. A lineáris plazmidsávot kimetsszük, eluáljuk és reszuszpendáljuk, mint fent.

A cDNS-inszert fragmentumot az előkészített Bluescript plazmidvektorba ligáljuk oly módon, hogy 0,05 pM vektort 0,10 pM cDNS-inszertummal keverünk össze 50 mM trisz-HCl (pH = 7,4), 10 mM magnézium-klorid, 1 mM DTT, 1 mM ATP és 40 E T4 DNS-ligáz (New England Biolabs) tartalmú oldatban. A 10 μΐ-nyi reakcióelegyet 15 °C-on egy éjszakán át inkubáljuk. A ligáz reakcióelegyet ezután 100 μΐ transzformáció kompetens E. coli sejtekhez - DH5a törzs (Bethesda Research Laboratories) - keveijük, és így transzformáljuk az E. coli sejteket a plazmid DNSsel a Sambrook és munkatársai szerinti (lásd fentebb, 1-74 old.) standard eljárárással. A transzformált sejteket 100 pg/ml ampicillintartalmú LB-agar lemezekre öntjük, és 37 °C-on egy éjszakán át tenyésztjük.

A plazmid DNS-t az ampicillinrezisztens telepekből Bimbóim és Doly [Nucleic Acids Rés., 7, 1513-1523 (1979)] alkalikus lizálómódszerével izoláljuk. A tisztított plazmid DNS-t EcoRI-gyel emésztjük, mint fent, agarózgélben elektroforetizáljuk, és a helyes méretű EcoRl cDNS-inszert fragmentum jelenlétére vizsgálunk. Egyetlen cDNS-inszertum-pozitív telep sejtjeit használtuk 100 ml 100 pg/ml ampicillint tartalmazó LB táptalaj beoltásához. A sejteket 37 °C-on telítésig tenyésztettük. A plazmid DNS-t az Qiagen plazmidizoláló kittel (No. 12143, Qiagen, Inc., Chatsworth, CA., USA) extraháltuk a gyártó cég előirata szerint.

A cDNS-klónt az Applied Biosystems, Inc. (ABI, Foster City, CA., USA) 373 Automated DNA Sequencer készülékével szekvenáltuk, színezékkel jelzett primerek vagy színezékkel jelzett didezoxinukleotidok használatával. A ciklizáló szekvenálást színezékkel jelzett primerekkel végeztük a Taq Dye Primer Cycle Sequencing Kiteket (ABINo. 401121 és 401122) használva. Reakciónként 1 pg kétszálú DNS-t használtunk. A szekvenálandó minták ciklizálására és koncentrálására a „Cycle Sequencing of DNA with Dye Primers” című kézikönyvben (ABI No. 901482) leírt módszereket használtuk. Vagy másként, a színezékkel jelzett didezoxinukleotidokkal való ciklizáló szekvenálást a Taq Dye-DeoxyTM Terminátor Cycle Sequencing Kittel (ABI No. 401113) végeztük. Reakciónként rendszerint 1,25 pg templáthoz 4 pM prímért használtunk. A templát és primer koncentrációkat szükség szerint változtattuk a szekvenálási reakció optimalizálása érdekében. A ciklizálóreakciókat Perkin-Elmer Cetus Thermal Cycler (model 9810) készülékkel végeztük, ahogyan ezt a Taq Dye Deoxy™ Terminátor Cycle Sequencing Protocol (ABI No. 901497) című műveleti utasítás leírja.

A ciklizálóreakciók után Centri-Sep™ centrifugálható oszlopokat (spin columns) (Princeton Separation. Adelphia, NJ., USA) használtunk a színezék, a terminátorok és primerek eltávolítására. A centrifugálható oszlopok (spin column) eluátumait ezután kicsaptuk, és mostuk a Taq Dye Deoxy™ Terminátor Cycle Sequencing Protocol (ABI No. 901497) előirata szerint. Egy 6%-os akrilamid denaturáló gélt készítettünk az ABI 373A DNA Sequencing System User’s Manual, azaz az ABI 373A DNS-szekvenáló rendszer felhasználói kézikönyvében leírtak szerint. Közvetlenül a gélben való futtatás előtt a mintákat (5 pl ionmentes formamid) 50 mM EDTA (pH=8,0) 5/1 (térfogat/térfogat) oldatban reszuszpendáltuk. A mintákat 2 percig 90 °C-on denaturáltuk, jégen hirtelen lehűtöttük, majd egy előre futtatott gélre vittük fel (a gélt körülbelül 15-20 percig előre futtattuk). A gélt 12 óra hosszat futtattuk a következő beállí19 i

HU 218 419 Β tással: 2500 volt, 40 amper, 30 watt, 40 °C. A szekvenciaanalízist az ABI 373A DNA Analysis software (version 1.0.20) segítségével végeztük. A végső szekvenciát az ABI DNA Sequence Editor software seqEd™ (version 1. 0) ABI, Inc., használatával kaptuk.

A 64-es klón teljes 1036 bp hosszú inszertumát szekvenáltuk. Ez az inszertum a nyílt leolvasási keret 936 bp-ját kódolja, amely az inszertum 3 prime végén keresztül folytatódik (ez egy olyan polipeptidnek felel meg, melynek a molekulatömege legalább 34 000). Összehasonlítva ennek a kiónnak a szekvenciáját a nukleotidszekvencia adatbankokban fellelhető szekvenciával, kiderült, hogy a klón 5’-végén a első 91 bázis a bovin mitokondriális genomnak felel meg. Tehát a 64es klón 1036 bp hosszú inszertuma két független cDNS kapcsolódásának eredménye, amely a gyűjtemény készítése folyamán jött létre.

A 76-os klón teljes 400 bp méretű EcoRI-fragmentumát szekvenáltuk. Az analízis 81 bp hosszú nyílt leolvasási keretet mutatott ki, melyet 3 prime nem transzlatált szekvencia 298 bázisa és egy poliA-szakasz követ.

A lambda-gtlO bovinvékonybél cDNS-gyűjteményt újra szűrtük a 37A oligonukleotidszondával, mely pontos 33 bp mása a 64-es klón által kódolt 5’-legvégi peptidszekvenciának. A harmadik szűrés révén két pozitív kiónt - 22-es és 23-as klón - izoláltunk, ezeket szubklónoztuk, és ugyanúgy szekvenáltuk, mint a 64-es kiónt.

A 22-es és a 23-as klón 2,8 kb, illetve 1,7 kg méretű cDNS-inszertumot tartalmazott. A 22-es klón 2,8 kb méretű cDNS-inszertuma egy 835 aminosavat meghatározó, folytonos nyílt leolvasási keretet jelent a 2-es és 2566-os bázis között (ez egy 93,2 kD polipeptidnek felel meg), ezt követi a 3’ nem transziáit szekvenciák 298 bázisa és egy poliA-szakasz.

A lambda-gtlO gyűjteményt újból szűrtük a 19A szondával, ami pontos mása a 22-es klón szekvenciájának, és megfelel e klón által kódolt 5’-legvégi pepiidnek, és a 2-es kiónt úgy izoláltuk, mint fent. A 2-es ki ónból származó 1 kb méretű cDNS-inszertum DNSszekvencia-analízise kimutatta, hogy ez a 22-es kiónt átfedi, és 100 bázissal kibővíti a bovin-cDNS 5’-végét. A 2-es és 22-es kiónok egyesített DNS-szekvenciáját és az előre látható transzlációs terméket az 1., illetve 3. számú szekvenciavázlatok ábrázolják.

Összefoglalva, az MTP 88 kD komponensének megfelelő bovinvékonybél cDNS-klónok szekvenálása egy 2900 bp méretű folyamatos szekvenciát eredményezett, amely egy 860 aminosavat kódoló nyílt leolvasási keretet tartalmaz, ezt követi egy 298 bp méretű nem kódoló szakasz és egy poliA-szakasz. Ezen egyesített szekvencia előre látható proteintermékének molekulatömege 96,1 kD.

2. példa

Rokon fajok DNS-hibridizációs analízise

Southern hibridizációs analízist végeztünk tehén, ember, egér, hörcsög (kinaihörcsög-petefészek vagy CHOsejtek), patkány- és kutya-DNS-ekkel. Mindegyik genomiális DNS-ből (Clontech) 10 pg-ot emésztettünk 140 E EcoRI-gyel (New England Biolabs) 100 pl 1 χ EcoRI pufferben (New England Biolabs) 37 °C-on, egy éjszakán át. Az emészteteket 2000 fordulat/perc mellett 30 percig forgattuk egy Ultrafree-MC 10 000 NMWL szűrőegységben (No. UFC3 TGC 00; Millipore; kizárási molekulatömeg-határ: 10 000), hogy a reakcióelegy térfogatát 50 pl-re csökkentsük. A restrikciós enzimes reakcióelegyet 0,75%-os agarózgélben, TEA pufferben, 80 volt mellett 3 órán át elektroforetizáltuk. Az agarózgélt etidium-bromiddal festettük meg, fotóztuk, majd nitro-cellulóz-membránra vittük Southern módszerével.

A Southem-hibridizációhoz a 22-es bovin-cDNSklónból származó 2,4 kb méretű EcoRI-ffagmentumot használtuk szondaként. A DNS-fragmentum 25 ng-ját Multiprime DNA Labelling System (Amersham Corp., Arlington Heights, IL., USA) és 50 pCi ³²P-a-dCTP használatával jeleztük. A be nem épült ³²P-t Sephadex G25 oszlopon (spin column) választottuk el a jelzett szondától. A nitro-cellulóz-membránokat 100 ml hibridizálópufferben (lásd fent) prehibridizáltuk 37 °C-on 2 óra hosszat. A hibridizálást egy éjszakán át végeztük 50 ml friss hibridzálópufferben, 60 °C-on, 1,2xlO⁷ dpm denaturált szondával. A membránt 500 ml 1 χ SSC, 0,1% SDS oldatban mostuk 1 órán keresztül, levegőn szárítottuk és ezután röntgenfilmre exponáltuk -80 °C-on erősítő szűrővel, 4 napon át. A 22es bovinklónból származó 2,4 kb méretű EcoRI-ffagmentum specifikusan hibridizált minden vizsgált fajnál legalább két DNS-sávval. Ennélfogva arra a következtetésre jutottunk, hogy a bovin-cDNS-szondára megállapított hibridizációs feltételek lehetővé teszik más fajoknál, így embernél, egérnél, hörcsögnél, patkánynál és kutyánál a homológ DNS-ek kimutatását.

3. példa

A humán MTP 88 kD komponensét kódoló cDNSklónok izolálása és DNS-szekvencia analízise

A. Klónozás és szekvencia analízise Annak érdekében, hogy megkapjuk a humán MTP kD komponensének teljes kódolószekvenciáját, egy humán máj cDNS-tárat szűrtünk a fent leírt bovin MTP cDNS-inszertummal. A cDNS-tárat a Stratagene cégtől kaptuk. Ez oligodT-vel indított máj cDNS-t tartalmazott, melyet közvetlenül klónoztak (EcoRI-XhoI) lambda ZAP vektorba. A szondát úgy készítettük, hogy a fenti 22-es bovinbél eredetű klón 10 pg-ját 50 E EcoRI-gyel emésztettük univerzál pufferben (Stratagene), majd agaróz gélben 80-150 volt mellett elektroforetizáltuk. A gél 0,9% alacsony olvadáspontú agarózt (Bethesda Research Laboratory, Gaithersburg, MD., USA), TAE puffért (40 mM trisz-acetát, 1 mM EDTA) és 0,5 pg/ml etidium-bromidot tartalmazott. A kapott 2,4 kb méretű fragmentumot fenolos extrahálással tisztítottuk (lásd fent: Sambrook, 6. 30. old.). A tisztított fragmentumot radioaktív jelzéssel láttuk el egy multiprime DNS-jelző kitet és alfa-³²P-dCTP-t (Amersham) használva. A be nem épült ³²P-t Sephadex G25 oszlopon (spin column) választottuk el a jelzett szondától, mint fent.

HU 218 419 Β

A gyűjteményből 10⁶ plakkot szűrtünk a gyártó (Stratagene) előírásai szerint, a következőképpen: E. coli baktériumokat - XL 1 Blue törzs (Stratagene) - rázott tenyészetben tenyésztettünk egy éjszakán át 37 °C-on, 50 ml 0,2% maltózzal és 10 mM magnézium-szulfáttal kiegészített LB levesben (Bethesda Research Laboratories). A sejteket kis sebességű centrifugálással ülepítettük, majd 10 mM magnézium-szulfát-oldatban reszuszpendáltuk úgy, hogy sűrűsége OD₆₀₀ = 0,5 legyen. A szuszpenziót 4 °C-on tároltuk. A fágot úgy hígítottuk, hogy koncentrációja 50 000 plakk-képző egység/25 μΐ SM puffer legyen. Minden lemezen 600 μΐ baktériumszuszpenziót és 25 μΐ fágot kevertünk el, és a lemezeket 37 °C-on 15 percig inkubáltuk. A baktériumfág keverékre 6,5 ml NZY levest (Bethesda Research Laboratories) és 0,7% agarózt (Bethesda Research Laboratories) tartalmazó, 50 °C-ra melegített fedő agart öntöttünk, majd egy 150 mm-es NZY lemezre vittük. Hagytuk, hogy a fedő agar megdermedjen, és a lemezeket egy éjszakán át 37 °C-on inkubáltuk.

A lemezeket ezután 2 óra alatt 4 °C-ra hűtöttük, és a plakkokat nitro-cellulóz-szűrőkre vittük át. Kétszeri átvitelt végeztünk, és a membránok és a lemezek egymáshoz illeszkedését tűszúrásokkal jelöltük úgy, hogy tűt szúrtunk az agarlemezbe a szűrőn keresztül. A szűrőket 1 percig 0,5 M nátrium-hidroxid, 1,5 M nátrium-klorid, 1 percig 1 M trisz (pH = 8,0), 3 M nátrium-klorid és percig 2xSSC oldatban inkubáltuk. A szűrőket ezután óra hosszat vákuumszekrényben 80 °C-on melegítettük. A szűrőket ezután 2 órán át 60 °C-on, szűrőnként 5 ml hibridizációs pufferben (6xSSC, 20 mM nátriumfoszfát, 2x Denhardt, 0,1% SDS és 100 pg/ml lazacsperma-DNS) inkubáltuk. A puffért ezután azonos mennyiségű olyan hibridizációs pufferrel helyettesítettük, amelyben a szonda koncentrációja szűrőnként

3,5 χ 10⁶ cpm volt, és a szűrőket egy éjszakán át 60 °Con inkubáltuk. A szűrőket 1 xSSC, 0,1% SDS tartalmú oldatban mostuk, először szobahőmérsékleten és utána 50 °C-on 2 óra hosszat. Az autoradiográfia 56 pozitív fágot mutatott ki.

A pozitív fágokat tartalmazó kis agarózdarabkákat egy éjszakán át 4 °C-on 1 ml SM pufferrel és egy csepp kloroformmal inkubáltuk. A pozitív fágot úgy tisztítottuk, hogy kis sűrűséggel (körülbelül 50-500/100 mmes lemez) újból lemezre vittük, szűrtük és egyedi pozitív plakkokat izoláltunk, mint fent.

Ha XL 1 Blue sejteket fertőzünk a ZAP vektorral (Stratagene) és koinficiáljuk egy helperfággal, úgy a vektor Bluescript-részét szelektíven replikáljuk, cirkularizáljuk, és egy egyszálú fágmidba pakoljuk. Ez a fágmid kettős szálú plazmiddá konvertálódik, ha ismételten natív XL 1 Blue sejteket fertőzünk vele. A kapott plazmid cDNS-inszertumát közvetlenül szekvenálhatjuk. A pozitív humán máj cDNS-inszertumokat tartalmazó plazmidokat ilyen módon kimetsszük a Stratagene által rendelkezésre bocsátott helperfágot használva, az előállító előírásai szerint.

A klónokból a következőképpen tisztítjuk a DNS-t. Egy egyedi teleppel beoltunk 2 ml LB táptalajt, és rázva inkubáljuk 37 °C-on egy éjszakán át. A tenyészetből

1,5 ml-t lecentrifugálunk, és 50 pl LB-ben reszuszpendáljuk. Ezután hozzáadunk 300 pl TENS oldatot (1 xTE, 0,1 M nátrium-hidroxid, 0,5% SDS), és 5 másodpercig vortexeljük. A mintákat ezután mikrocentrifugában 10 percig centrifugáljuk. A felülúszót levesszük, hozzáadunk 0,9 ml etanolt, és a mintákat 10 percig mikrocentrifugában centrifugáljuk. Az üledéket 70%-os etanollal mossuk, szárítjuk, és 20 μΐ TE pufferben [10 mM trisz (pH=7,4), 1 mM EDTA (pH=8)] reszuszpendáljuk.

A klónokból nyert DNS-t a következőképpen vizsgáljuk. Minden klónból 5 pl-t emésztünk 10 E EcoRIgyel, 10 E Xhol-gyel és 10 pg RNáz-zal, majd a mintákat 1% agaróz, TBE puffer (45 mM trisz-borát, 1 mM EDTA) és 0,5 pg/ml etidium-bromid-tartalmú gélben elektroforetizáljuk, majd láthatóvá tesszük. A gél Southern blot-analízisét Sambrook és munkatársai (lásd fent, 9. 14. old.) szerint végezzük. A Southern biotokat egy, a kódolószekvencia 5’-végéhez közeli bovin cDNS-fragmentummal szondázzuk. Ezt az 5’szondát úgy készítjük, hogy a 2-es számú bovinbél eredetű klón 25 pg-ját 50 E EcoRI-gyel és 50 E Nhel-gyel emésztjük, és a 376 bp méretű fragmentumot - mint fent 2%-os alacsony olvadáspontú agarózt, TBE-t, 0,5 pg/ml etidium-bromidot tartalmazó gélből izoláljuk, és radioaktíve jelezzük, mint fent. Az eredmények a következők voltak: 693-as klón: 3,7 kb hosszú inszertum hibridizált az 5’ szondával; 754-es klón; 1,2 kb hosszú inszertum hibridizált az 5’-szondával; 681-es klón: 1,8 kb hosszú inszertum hibridizált az 5’ szondával.

E három klón egyéj szakás tenyészetét 100 pg/ml ampicillint tartalmazó 200 ml LB táptalajban tenyésztjük. Nagy mennyiségű plazmidot tisztítottunk egy Qiagen plasmid maxi prep kit használatával, az előállító cég előírása szerint. Megállapítottuk, hogy a 693-as klón szekvenciája két inszertumot tartalmaz. Az 5’ 500 bp méretű inszertum homológ volt a haptoglobinnal, így ezt tovább nem tárgyaljuk. Ezt követte egy mutáns Xhol és egy EcoRl restrikciós hely (e két helyet használtuk az irányított klónozásnál).

A 3’-inszertum volt a minket érdeklő cDNS. Ez néhány 5 ’ nem transzlatált szekvenciát tartalmazott, amelyet stopkodonok jeleztek mindhárom leolvasási keretben. A 4-től 2729-ig terjedő bázisok ATG-vel indított nyílt leolvasási keretet képviselnek, amely 894 aminosavnak felel meg. A levezetett aminosavszekvencia eleje a következő (28. számú szekvencia):

MILLAVLFLCFI

A stopkodon a 2730-2732 bázisoknál található, ezt követi egy 435 bázisból álló 3’ nem transzlatált szakasz és egy poliA-szakasz. A 681-es klón szekvenciája megerősíti e klón 3’ 1768 bázisát, a 754-es klón pedig az 1-től 442-ig terjedő bázisokat bizonyítja.

B. A 88 kD mRNS szöveti elhelyezkedése

Egy MultiTissue Northern Biot (Clontech) sávonként 2 pg poliA⁺ RNS-t tartalmaz a következő szövetekből: humán szív, agy, placenta, tüdő, máj, vázizom, vese, pankreász. A Northem-hibridizálásnál úgy jártunk el, mint a genomiális Southern blotnál. A prehibridizá21

HU 218 419 Β lást 50 ml hibridizációs pufferben végeztük 37 °C-on 2 órán át, majd egy éjszakán át hibridizáltunk 60 °C-on, a 22-es bovinbél eredetű kiónból származó

5,2 χ 10⁷ dpm jelzett 2,4 kb hosszú EcoRI fragmentummal. A Northern blotot 500 ml 0,2 χ SSC, 0,1% SDS tartalmú oldatban mostuk 60 °C-on 1 órán át, majd -80 °C-on autoradiografáltuk. A blotot 24 órán át exponáltuk röntgenfilmre, és ekkor egy uralkodó szignált észleltünk a máj-RNS-sávban, körülbelül 4,4 kb-nál. Egyéb észlelhető hibridizációt nem észleltünk. Ekkor a bovincDNS 2,4 kb méretű fragmentumával végzett kereszthibridizálás speciális humán máj RNS-t mutatott ki. Az eddigi közlések szerint két szövetféleségben, a máj- és bélszövetekben észleltek szignifikáns MTP-aktivitást, s a klónozás és a Northern blot-analízis alátámasztja az MTP biokémiai lokalizációját. A Northem-analízis eredményei ezt a megfigyelést még azzal egészítették ki, hogy beleértendők a DNS:RNS hibridek, valamint a DNS: DNS kölcsönhatások.

4. példa

MTP kifejeződése humán fibroblaszt sejtvonalban

1. Módszerek

Minden standard molekuláris biológiai előírást Sambrooktól (lásd fent) vettünk, kivéve, ahol ezt később jelezzük. Az ebben a példában használt restrikciós enzimeket a Bethesda Research Laboratories cégtől (BRL, Gaithersburg, MD., USA) szereztük be. A -64től a 3135. nukleotidig tartó (a transzlációs starthelyhez viszonyítva, ahol a transzlációs starthely ATG kodonjában az A-t +l-gyel számoztuk) 3,2 kb méretű fragmentumot a p754 (-64-től a 384. bázisig) és p693 (a 385-től a 3135. bázisig) plazmidból szerkesztettük a következőképpen. A p754, illetve a p693 plazmidból egy 448 bp EcoRI-Xeol restrikciós endonukleáz fragmentumot, illetve egy 275 bp Ncol-Xhol restrikciós endonukleáz fragmentumot metszettünk ki. Géltisztítás után a fragmentumokat az EcoRI-Xhol-gyel hasított pBluescript-SK plazmidba ligáltuk, s így kaptuk a pBS/hMTP plazmidot. A teljes hMTP fragmentumot a pBS/hMTP-ből HindlII és Xhol restrikciós endonukleázzal való emésztéssel izoláltuk, majd a pcDNA/Neo plazmidba (Invitrogen, San Diego, CA., USA) szubklónoztuk, melynek eredménye a pcDNA/MTP plazmid lett. Ez tartalmazza a teljes hosszúságú hMTP kódolószekvenciát a nagy aktivitású citomegalovírus promoter transzkripciós szabályozása alatt.

A plazmidokkal 1508T [J. Bioi. Chem., 267, 13 229-13 238 (1992)] transzformált humán bőr fibroblasztokat transzficiáltunk, lipofektinreagenst (BRL) használva. A sejteket 24 órával a transzfekció előtt 100 mm-es csészékre szélesztettük 25%-os összefolyáshoz szükséges sűrűségben. A transzfekcióval egy időben 100 mm-es lemezenként 50 mg plazmidot oldottunk 1,5 ml szérummentes Dulbecco-féle módosított Eagle táptalajban (DMEM = Dulbecco’s Modified Eagle Médium), és cseppenként hozzáadtuk 1,5 ml 120 μΐ lipofektinreagenst tartalmazó szérummentes DMEM-hez. Szobahőmérsékleten 15 perces inkubálás után a transzfekciós elegyeket hozzáadtuk a 7 ml szérummentes DMEM-et tartalmazó 1508T tenyészetekhez. Huszonnégy órával később a transzfekciós elegyeket eltávolítottuk, és 10 ml 10%-os fetális bovinszérum-tartalmú friss DMEM-et adtunk a csészékhez további 24 órára. A sejteket lekapartuk a csészékről, és kétszer mostuk jéghideg foszfáttal pufferolt konyhasóoldattal (PBS). A sejtkivonatok készítését, az MTP-aktivitás méréseket és a Eastem blot-analíziseket a „TG transzferaktivitás vizsgálata abétalipoproeinémiás betegekben” című fejezetben leírtak szerint végeztük.

II. Eredmények

Az MTP-t kódoló teljes szekvenciát tartalmazó cDNS-t a pcDNA/Neo expressziós vektorba szubklónoztuk, s így kaptuk a pcDNA/MTP szerkezetet. Ez a plazmid tranziensen fejeződik ki az 1508T transzformált humán bőr fibroblasztokban (J. Bioi. Chem., 267, 13 229-13 238 (1992)] liposzóma közvetített transzfekció révén. A transzfekció után 48 óra múlva a pcDNA/Neo szülőplazmiddal transzficiált sejtek kivonatában TG transzferaktivitás világosan észlelhető a háttérszintek felett. A Western blot-analízis az MTP 88 kD komponensének jelenlétét mutatta ki a pcDNA/MTP-vei transzficiált sejtekben, de a pcDNA/Neo-val transzficiált sejtekben nem. A transzficiált sejtekben lévő protein mennyiségét és a protein aktivitását összehasonlítottuk a HepG2 sejtekben talált protein mennyiségével és aktivitásával. Az összehasonlítás alapján arra lehet következtetni, hogy a kifejezett MTP hatékonyan beépült egy aktív, PDI-t tartalmazó transzferprotein komplexbe.

5. példa

Szűrés MTP-inhibitorok azonosítására

Ebben a szűrővizsgálatban az észlelhetően jelzett lipidek (például: NMR, ESR, radioaktív vagy fluoreszcein jelzett TG, CE vagy PC) transzferjeinek sebességét mérjük MTP jelenlétében a donorpartikuláktól (például : donormembránok, vezikulák vagy lipoproteinek) az akceptorpartikulákhoz (például: akceptormembránok, vezikulák vagy lipoproteinek). Egy MTP inhibitor (melyet például egy természetes termék-kivonat tartalmazhat vagy lehetnek ismert vegyületek) jelenlétében a megfigyelt transzfer sebességében bekövetkező csökkenést használhatjuk vizsgálómódszer gyanánt az MTPfunkció inhibitorainak azonosításánál és izolálásánál. Erre a célra számos vizsgálómódszer használható, például a Wetterau és Zilversmit (J. Bioi. Chem., 259, 10 863-10 866 (1984)] vagy a Wetterau és munkatársai [J. Bioi. Chem., 265, 9800-9807 (1990)] által előzőleg közölt szintetikus vezikulum assay vagy a fentiekben itt ismertetett vizsgálat. A fejezet címe: „TG transzferaktivitási vizsgálat abétalipoproteinémiás betegekben”. Egy ilyen vizsgálatot ismertetünk az alábbi példában.

A. Szubsztrátumkészltés

Egy jellemző szűrővizsgálatban, melyben jelzett lipoproteineket használunk, a lipoproteinek [³H]-TGvel való jelzését a Morton és Zilversmit által leírt [R. E. Morton et al., J. Bioi. Chem., 256, 1992-1995 (1981)] lipiddiszperziós módszerrel végeztük, kereskedelemben

HU 218 419 Β kapható anyagok felhasználásával. Ebben a készítményben 375 pCi [³H]-trioleint [Trióiéin, 9,10-³H(N)]-, NEN Research Products, katalógusszám: NET-431],

1.5 mg tojás-foszfatidil-kolint és 160 pg jelzetlen trioleint (kloroformban) kevertünk össze. Az elegyet nitrogénáram alatt pároltuk be, egészen szárazra. A száraz anyaghoz 2 ml 50 mM trisz-HCl, 0,01% Na₂EDTA és 1 mM DTT (pH=7,4) tartalmú oldatot adtunk, és a csövet nitrogénnel öblítettük át. A lipideket vortexelve reszuszpendáltuk, majd a szuszpenziót 20 perces időközönként ultrahanggal kezeltük, ultrahangos fürdőben. Az ultrahangozott lipideket 75 ml nyúlplazmához (Pel-Freez Biologicals, Rogers, ARG.) adtuk. Az elegy ezenkívül 5,8 ml 8,2 mM dietil-p-nitro-fenil-foszfátot (Sigma, kát. szám: D9286), 0,5 ml 0,4 M Na₂EDTA-t és 4% nátrium-azidot tartalmazott. A plazmát ezután nitrogén alatt inkubáltuk 16-24 órán át 37 °C-on. Az inkubált elegyből és nem jelzett kontrollplazmából kis sűrűségű lipoproteineket (LDL) és nagy sűrűségű lipoproteineket (HDL) izoláltunk szekvenciális ultracentrifúgálással [Schumaker és Puppion, Methods Enzymology, 128, 155-170 (1986)]. Az izolált lipoproteineket 4 °C-on 0,9% nátrium-klorid-, 0,01% Na₂EDTA- és 0,02% nátrium-azid-tartalmú oldattal szemben idazoláltuk, majd 4 °C-on tároltuk.

B. Transzfervizsgálat

Egy szokásos, 150 pl térfogatban végzett vizsgálatban a transzferaktivitást úgy határozzuk meg, hogy a radioaktív jelzett TG transzferjét mérjük a [³H]-HDL (5 pg koleszterin) donorpartikuláktól az LDL (50 pg koleszterin) partikulákhoz, 37 °C-on 3 órán át, a következő összetételű pufferben: 15 mM trisz, pH=7,4, 125 mM MOPS, 30 mM nátrium-acetát, 160 mM nátrium-klorid,

2.5 mM Na₂EDTA, 0,02% nátrium-azid, 0,5% BSA és körülbelül 50-200 ng tisztított MTP. A vizsgálatot 96 tartályos lemezen végezzük. A vizsgálandó anyagot (például természetes anyag kivonata a vizsgálattal kompatibilis oldószerben, mint az etanol, metanol vagy a DMSO; általában 5 pl anyag 10%-os DMSO-ban) úgy szűrhetjük, hogy bemérjük egy tartályba inkubálás előtt. A transzferreakciót 10 pl frissen készített 4 °C-os heparin/mangán(II)-klorid oldat [1,0 g heparin (Sigma kát. szám: H3393; 187 U/mg) 13,9 ml-ben+1,5 M mangán-klorid; 0,4% heparin (187 IU)/0,1 M MnCl₂] hozzáadásával állítjuk le, mely kicsapja a [³H]-TG-LDL akceptorpartikulákat. A lemezeket 800 χ g mellett centrifugáljuk. A tartályokból egyenlő mennyiségű felülúszókat - a felülúszó tartalmazza a [³H]-TG-HDL donorpartikulákat - viszünk át szcintillációs elegybe, és mérjük a radioaktivitást. Az enzimaktivitást a TG transzfer százalékában fejezzük ki és a következő egyenlettel számítjuk ki:

[³H]-TG mért (-MTP)

Egy ilyen vizsgálatban a TG transzfer százaléka növekedni fog, ha növekszik az MTP koncentrációja. Egy feltételezett inhibitor csökkenteni fogja a TG transzfert. Hasonló vizsgálatot lehet végezni jelzett CE vagy PC használatával.

6. példa

MTP-inhibitorok azonosítása és bemutatása

I. Módszerek

A. MTP-inhibitorok azonosítása

Az 5. példában vázolt módszert használva azonosítottuk az A és B vegyületet. A módszer szerint a radioaktív jelzett TG transzportjának bovin MTP-katalizált sebességét mértük a donor HDL-től az akceptor LDLig. Ebben a módszerben egy inhibitor csökkenti a radioaktív TG transzfer sebességét.

E vegyületek MTP-gátló aktivitását ettől függetlenül a fenti „TG transzferaktivitási vizsgálat abétalipoproteinémiás betegekben” című fejezetben leírt módszerrel bizonyítottuk. Ezzel a vizsgálattal a radioaktív jelzett TG-nek a donor SUV-tól az akceptor SUV-hoz való bovin MTP-katalizált transzferjét mértük.

B. Sejttenyésztés

A HepG2 humán heptaoblasztóma sejtvonalat az American Type Culture Collection (Rockville, MD; ATCC letéti szám: 8065) intézménytől kaptuk. A tenyészeteket 37 °C-on 5% szén-dioxid-atmoszférában, T-75 tenyésztőpalackokban, 10% fetális bovinszérumtartalmú RPMI 1640 táptalajban tartottuk fenn (minden sejttenyésztő táptalajt a GIBCO Life Technologies cégtől, Gaithersburg, MD., USA szereztünk be). A sejtekből egyszer egy héten 1:4 szubkultúrát készíthettünk, és hetenként háromszor friss táptalajt adagoltunk hozzájuk.

Az A és B vegyületeknek a proteinszekrécióra gyakorolt hatása mérésére 48 tartályos lemezeken végeztük a kísérleteket. A HepG2 sejtekből 1:2 szubkultúrát készítettünk, és a szerrel való kezelés előtt legalább 24 órát hagytuk, hogy a tenyészet összefolyjon. A szerrel való kezelés megkezdése előtt a táptalajt eltávolítottuk, a sejteket egyszer mostuk PBS-sel, majd 1 ml friss táptalajt adtunk hozzájuk. Az A vegyületet 10 pl dimetil-szulfoxidban (DMSO) adagoltuk két-két tartályonként változtatott koncentrációban. A DMSO (10 pl) negatív kontrollként szolgált. (Megjegyzés: a DMSO ebben a koncentrációban elhanyagolható hatással van a HepG2 sejtekre). Ezután a lemezeket 16 órán át inkubáltuk standard sejttenyésztési feltételek mellett, majd centrifugálás következett 5 percig 2500 fordulat/perc mellett 4 °C-on, hogy a laza sejteket leülepítsük. A táptalajt a sejttenyésztő táptalajjal 10-szeresére hígítottuk az apolipoprotein B (apoB) és a humán szérumalbumin (HSA) vizsgálatokhoz és 20-szorosára az apolipoprotein AI (apoAI) vizsgálatokhoz. A sejteket kétszer mostuk hideg PBS-ben, és ezután homogenizálópuffert [0,1 M nátrium-foszfát (pH = 8,0), 0,1% Triton X-100] adtunk a sejtekhez. A sejteket triturációval, 1 ml-es mikropipettorral homogenizáltuk, és a proteint Coomassie-reagenssel (Pierce Chemical Co., Rockford, IL., USA) mértük az előállító cég leírása szerint.

C. ELISA-vizsgálat apoB-re és ApoAI és HSA-ra

A protein mennyiségi mérésére „szendvics” ELISA-t használtunk. A mikrotitrálólemezeket a szóban forgó proteinre specifikus monoklonális antitesttel (első antitest) fedtük (Biodesigns International, Kennebunkport, ME., USA). A lemezekhez ezután hozzáad23

HU 218 419 Β tűk az antigént vagy mintát, majd a szóban forgó proteinre specifikus poliklonális antitestet (második antitest) és egy harmadik, a második antitest elleni, alkalikus foszfatázzal konjugált antitestet (Sigma Biochemicals, St. Louis, MO., USA.

A 96 tartályos mikrotitrálólemezeket (Corning, no. 25801) egy éjszakán át szobahőmérsékleten 100 μΐ hígított monoklonális antitesttel [végső koncentrációk: 1 pg/ml, 2 pg/ml, 4 pg/ml anti-apoB, anti-apoAI, illetve anti-HSA, 0,1 M nátrium-karbonát-nátrium-hidrogén-karbonát (pH=9,6), 0,2 mg/ml nátrium-azid-tartalmú oldatban] fedtük. Ezután és mindegyik egymást követő inkubációs lépés után a lemezeket ötször mostuk 0,05% Tween 20-at tartalmazó 0,9%-os nátrium-klorid-oldattal. A hígított táptalajból vagy standardból (tisztított apoB, apoAI vagy HSA 0,3125-320 ng/mlre hígítva sejttenyésztő táptalajjal) kétszer 100 pl-eket adtunk a monoklonális antitesttel fedett lemezekhez. Szobahőmérsékleten másfél órás inkubálás után az antigént vagy mintát eltávolítottuk, és a tartályokat mostuk. A második antitestet 1:500-ra hígítottuk 0,05% Tween 20-at tartalmazó PBS-sel (puffer III), és ebből 100 pl-t mértünk be minden tartályba. A lemezeket 1 órán át szobahőmérsékleten inkubáltuk. Az antitestet eltávolítottuk, és a tartályokat mostuk. A második antitestek poliklonális antiszérumok voltak, melyeket kecskében termeltek a humán proteinek ellen. Egy alkalikus foszfatázzal konjugált, nyúlban termelt anti-kecske IgG-t l:1000-re hígítottunk puffer III-mal, és ebből 100 pleket mértünk minden tartályba. Szobahőmérsékleten 1 órás inkubálás után az antitestet eltávolítottuk, és a tartályokat nyolcszor mostuk. Ezután hozzáadtuk a szubsztrátum p-nitro-fenil-foszfátot (Sigma Biochemical, St. Louis, MO., USA). A szubsztrátum koncentrációja 1 mg/ml, 0,05 M nátrium-karbonát-nátrium-hidrogén-karbonát (pH=9,8)+l mM magnézium-kloridtartalmú oldatban. A reagáltatás 45 percig szobahőmérsékleten történt, majd a reakciót leállítottuk, és a színt 100 pl 0,1 M trisz, pH=8,0 és 0,1 EDTA hozzáadásával stabilizáltuk. A mikrotitrálólemezeket 405 nm-en, egy V-Max 96 tartályos lemezleolvasón (Molecular Devices, Menlo Park, CA., USA) olvastuk le.

A háttér levonása után a standardokat féllogaritmusos papíron ábrázoltuk, és logaritmikus regressziót alkalmaztunk. A görbe egyenletét használtuk az apoB, apoAI és HSA koncentrációinak kiszámítására. A proteinkoncentrációt az összsejtproteinhez normalizáltuk, és így a koncentrációkat ng/ml/mg sejtproteinegységben kaptuk meg. A szerekkel való kezeléseket párhuzamos kísérletekben végeztük el, és az eredmények középértékét vettük. A szerekkel való minden egyes kezelésre kapott apoB-, apoAI- és HSA-koncentrációkat a DMSO-kontrollban kapott megfelelő koncentrációval osztottuk el. Az eredményeket a szerkoncentrációval szembeni kontroll százalékában ábrázoltuk.

D. Lipidanalízis

HepG2 sejteket oltunk le 6 tartályos csészékre, és szerrel való kezelés előtt legalább 24 órán át hagyjuk, hogy a sejtek összefolyjanak. A szer hozzáadása előtt a táptalajt eltávolítjuk, a sejteket egyszer mossuk PBSsel, és 1 ml friss táptalajt (RPMI 1640+10 FBS) mérünk be. Két-két tartályba, változó koncentrációkban, 10 pl DMSO-ban A vegyületet mérünk be. Negatív kontrollként DMSO-t használunk. A csészéket 16 órán át inkubáljuk standard sejttenyésztési feltételek mellett, majd a táptalajt eltávolítjuk és 1 ml jelző reakcióelegyet [RPMI 1640; 16,6 mg/ml zsírsavmentes BSA; 1 mM nátrium-oleát; 1 mM glicerin; 5 pCi/ml ³H-glicerin (Amersham Arlington Heights, IL.,), kát. szám: TRA 244] adunk hozzá egy másodszori A vegyület beméréssel együtt. A tenyészetet 2 óra hosszat inkubáljuk standard sejttenyésztési feltételek mellett. Az elegyeket (1 ml) 15 ml-es üveg kémcsövekbe visszük át, és azonnal felhígítjuk 2 ml jéghideg etanollal és 1 ml ionmentes vízzel. A sejteket egyszer mossuk PBS-sel, és előkészítjük proteinméréshez, mint ahogyan az I. B. fejezetben leírtuk.

A reakcióelegyekből extraháljuk az összlipidet, és a következőképpen analizáljuk. A csövekhez hozzáadunk 0,5 ml kloroformot és 0,2 ml 2%-os ecetsavat. A csöveket 1 percig vortexeljük, ezután 2000 fordulat/perc mellett 5 percig centrifugáljuk, hogy elválasszuk a vizes és az organikus fázist. A felső vizes fázist eltávolítjuk, és hozzáadunk 3,6 ml 0,1% ecetsavtartalmú metanokvíz (1:1) elegyet. Rövid ideig vortexelünk, majd a csöveket centrifugáljuk, mint előbb, és a vizes fázist újból eltávolítjuk. Az organikus fázist kvantitatíve átvisszük 15 mles tiszta kémcsövekbe, és a folyadékot nitrogén alatt eldesztilláljuk. A szárított lipideket 0,1 ml kloroformban oldjuk fel, és mindegyik mintából 30 pl-t cseppentünk 60A szilikagéles 19 csatornás vékonyréteg-kromatográfiás lemezre (Whatman). Vivőanyagként 5-10 pg TG (10 pl kloroformban) hozzáadása után a lemezeket hexán: diizopropil-éter: ecetsav (130:70:4; térfogat/térfogat) elegyében fejlesztjük ki. Szárítás után a lipideket jódgőzbe helyezve festjük meg. A TG-nek megfelelő sávokat szcintillációs fiolákba kaparjuk. 0,5 ml ionmentes vizet és 10 ml EcoLit (ICN Biochemical) szcintillációs folyadékot adunk a fiolákhoz, és a mintákat erősen vortexeljük. A nyers adatokat a sejtproteinhez normalizáljuk, és a DMSO-kontroll százalékában fejezzük ki.

II. Eredmények

A. MTP-inhibitorok azonosítása

Az első szűrés alapján valószínűsítettük, hogy az A vegyület gátolja a ³H-TG MTP-katalizált transzportját a HDL-től az LDL-hez. Hogy az A vegyület valóban képes gátolni az MTP-katalizált lipidtranszportot, azt egy második vizsgálattal bizonyítottuk, amelyben a ³H-TG MTP-katalizált transzportját mértük a donor SUV-tól az akceptor SUV-hoz. Az A vegyület IC₅₀-értéke körülbelül 1 pM (10. ábra).

B. Az apoB és a TG szekréciógátlása

A vegyületet adagoltunk a HepG2 sejtekhez kétszeres hígítási sorban, 0,156-tól 20 pM-ig. A sejteket 16 órán át inkubáltuk standard sejttenyésztési feltételek mellett, ezután a kondicionált táptalajokat ELISA-val vizsgáltuk apoB-re, apoAI-re és HSA-ra. Megállapítottuk, hogy az apoB szekréciógátlása dózisfuggő és az IC₅₀-értéke 5 pM (11. ábra). Az apoAI és a HSA szekrécióját a maximális 20 pM-os dózis sem befolyásolta, s

HU 218 419 Β ez megerősítette, hogy a gátlás specifikus volt apoB-re. Ezek az adatok azt mutatták, hogy ha MTP-inhibitort adunk egy humán máj sejtvonalhoz, ez gátolni fogja az apoB-t tartalmazó lipoproteinek szekrécióját.

A HepG2 sejteket az A vegyület 1,25 μΜ-tói 20 μΜ-ig terjedő mennyiségével kezeltük az apoB, apoAI és HSA szekréciójával kapcsolatos kísérletekben használt körülményekkel azonos módon. A TG intracelluláris poolját radioaktíve jeleztük 2 órán át ³Hglicerinnel, hordozóanyag vagy különböző dózisú A vegyület jelenlétében. A táptalajban a radioaktív jelzett TG akkumulációját kvantitatív extrakcióval mértük, ezután vékonyréteg-kromatográfiás analízist végeztünk, majd az eredményeket az össz-sejtproteinhez normalizáltuk. DMSO-t használtunk kontrollként. Az A vegyület a TG-szekréciót dózisfuggő módon gátolta. Az IC₅o-értékre 2,0 μΜ-t kaptunk, mely hasonlít az apoB szekréció gátlásánál észlelt gátláshoz (12. ábra). Az adatok megerősítették, hogy az A vegyület gátolja az apoB-t tartalmazó TG-gazdag lipoproteinek szekrécióját.

Az előbbi eljárásokat megismételtük a B vegyülettel is. A B vegyület gátolta a ³H-TG MTP-katalizált transzportját a donor SUV-tól az akceptor SUV-hoz, az IC₅₀-érték körülbelül 4-6 μΜ volt (13. ábra). Az apoB-t tartalmazó lipoproteinek szekrécióját a B vegyület szintén gátolta HepG2 sejtekben (14. ábra).

7. példa

Az MTP-katalizált CE és PC transzport gátlása

I. Módszerek

Hogy mérhessük az A vegyület hatását a CE vagy PC bovin MTP-katalizált transzportjára a membránok között, a lipidtranszfer-vizsgálatot, mely a TG transzfert a SUV között méri, megváltoztattuk. A donorvezikulák összetétele azonos volt, kivéve hogy 0,25 mol% ^l4CCE-vel vagy ¹⁴C-PC-vel helyettesítettük a jelzett TG-t. Az akceptorvezikulák összetétele azonos volt, kivéve hogy nem tartalmaztak jelzett TG-t és jelzetlen TG-t. A donorvezikulák kicsapása után a lipidtranszfer százalékát úgy számítottuk ki, hogy összehasonlítottuk egy transzferreakció után a felülúszóban az akceptorvezikulákban lévő ¹⁴C-CE-t vagy ¹⁴C-PC-t a vizsgálatba bevitt összes ¹⁴C-CE-vel vagy ¹⁴C-PC-vel. Az MTPkatalizált lipidtranszfert a donor SUV-tól az akceptor SUV-hoz úgy számítottuk ki, hogy az MTP nélküli felülúszó jelzett lipidtartalmát levontuk az MTP jelenlétében mért jelzett lipidtartalomból. A vizsgálat további részét lényegében az előzőekben leírt módon végeztük el.

II. Eredmények

Az A vegyületet arra vonatkozóan is vizsgáltuk, hogy képes-e gátolni a radioaktív jelzett CE és PC membránok között végbemenő MTP-katalizált transzportját. Az A vegyület olyan módon gátolta a CE transzfert, hogy az összehasonlítható volt a TG transzfergátlással. Az A vegyület gátolta a PC transzfert is, de a PC transzfernél kevésbé volt hatékony, mint a CE és TG transzfernél. A PC transzfernek körülbelül 40%-a volt gátolt olyan inhibitorkoncentrációknál, amelyek a TG és CE transzfer több mint 80%-át gátolták.

8. példa

Bovin-MTP-5 ’-vég klónozása

Egy lambda-gtl0-be pakolt bovinvékonybél cDNStárat szereztünk be a Contech-től (BL1010A). A tárat SM oldattal úgy hígítottuk, hogy 100 μΐ-ben 50 000 fágot tartalmazzon (1:100 000 hígítás). A hígított fágot (100 μΐ) 300 μΐ E. coli C600 sejtekkel (Clontech) kevertük össze, és a keveréket 15 percig 37 °C-on inkubáltuk. Ezután hozzáadtunk 7 ml fedő agarózt, és az elegyet 75 ml LB agarózt tartalmazó 150 mm-es lemezre öntöttük. Ilyen módon összesen 25 lemezt készítettünk, mindegyik körülbelül 5 χ 10⁴ fágot tartalmazott. A lemezeket egy éjszakán át 37 °C-on inkubáltuk.

A fág-DNS izolálása céljából 10 ml SM (zselatin nélkül) oldatot adtunk minden lemezhez. A lemezeket ezután óvatosan rázogattuk 2 órán át szobahőmérsékleten. A kioldott fágot (körülbelül 8 ml lemezenként) összegyűjtöttük, és egyesítettük. Az E. coli sejteket centrifugálással — 10 perc, 12 000 xg - ülepítettük.

A lambda-DNS-t a felülúszóból izoláltuk Qiagen tip-100 (midi) használatával, a gyártó által rendelkezésre bocsátott előirat szerint. A tisztított DNS-t 200 μΐ összmennyiségben, TE oldatban (10 mM trisz-HCl (pH = 8,0), 1 mM EDTA] reszuszpendáltuk.

pg lambda-fág-DNS-t (körülbelül 3 χ 10⁷ molekula) adunk 100 pl PCR reakcióelegyhez, mely 2 mM magnézium-kloridot, 0,2-0,2 mM-t a dezoxinukleotid-trifoszfátokból, 1,25X puffért és 2,5 egység Taq polimerázt (Perkin-Elmer Cetus kit, no. N801-0555) tartalmazott. A primerek koncentrációja 0,15 mM volt. A forward primer szekvenciája (29. számú szekvencia) a következő:

66

GGTCAATATGATTCTTCTTGCTGTGC

A forward primer szekvenciát az MTP 88 kD komponensét kódoló humán cDNS-szekvenciára alapoztuk. A reverz primer szekvenciája (30. számú szekvencia) a következő:

8 6 36 (bovin)

07 7 8 5 (humán)

GCCTCGATACTATTTTGCCTGCT

A reverz primer szekvenciát az MTP 88 kD kompenensét kódoló ismert bovin-cDNS-szekvenciára alapoztuk. Ez a szekvencia a bovin-cDNS 658-785 bázisaival - megfelelnek a humán cDNS 807-785 bázisainak - hibridizál.

A PCR-amplifikációt egy Perkin-Elmer Thermal Cycler (Model 9600) készülékben végeztük. Kétperces 97 °C-on való inkubálás után 35 ciklusban végeztük a reakciót, ciklusonként: 94 °C 30 másodperc, 50 °C 30 másodperc és 72 °C 1 perc alkalmazásával. Az utolsó inkubáció 72 °C-on 7 percig tartott.

A PCR-terméket 1%-os agarózgélben - TAE pufferben - elektroforetizáltuk, mint előbb. A kívánt 766 bp hosszú fragmentum kihozatala körülbelül 2 pg volt. A DNS-t kimetszettük a gélből, GeneClean (Bio 101, La Jolla, Ca, USA) segítségével tisztítottuk, tompa végűvé alakítottuk, pUC18-SmaI-be (Pharmacia) klónoztuk és szekvenáltuk, ahogyan előzőleg leírtuk.

Az MTP 88 kD komponensének 5’-szakaszát kódoló bovin-cDNS-ből származó új szekvenciát az 5. szá25

HU 218 419 Β mű szekvencia (lásd a Nukleinsavak című fejezetben) mutatja be. Ez a szekvencia az előzőleg ismertetett bovin-cDNS-szekvencia 5’-végéhez 83 bázist ad hozzá.

9. példa

Az MTP 88 kD komponensét meghatározó humán genomiális DNS szekvenálása A humán genomiális DNS szekvenálását az „Egy hibás funkciójú gén kimutatása a második abétalipoproteinémiás betegben” című fejezetben és az 1. példában leírtak szerint végeztük. Ennek az eljárásnak az eredménye a 8. számú szekvencia szerinti humán genomiális szekvencia (lásd a 24-31. ábraoldalakon).

Claims (23)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Izolált nukleinsavmolekula, azzal jellemezve, hogy egy mikroszomális triglicerid transzferprotein (MTP) nukleotidszekvenciából áll, amely MTP nukleotidszekvencia a mikroszomális triglicerid transzferprotein nagy molekulatömegű alegységét kódolja.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti nukleinsavmolekula, azzal jellemezve, hogy egy DNS-molekula.
3. 3. A 2. igénypont szerinti DNS-molekula, azzal jellemezve, hogy egy teljes vagy részleges MTP nukleotidszekvenciából áll, amely megfelel a szekvencialistában megadott 1., 2., 5., 7. vagy 8. számú szekvenciának, vagy az 1. számú szekvenciának az 5. számú szekvenciával együtt, vagy a 2. számú szekvenciának a

   7. számú szekvenciával együtt, vagy a 2. számú szekvencia első 108 bázisának a 8. számú szekvenciával együtt, vagy a 2. számú szekvencia első 108 bázisának a 7. és 8. számú szekvenciával együtt.
4. 4. DNS-molekula, azzal jellemezve, hogy az 1. igénypont szerinti MTP nukleotidszekvenciával teljes mértékben komplementer.
5. 5. A 4. igénypont szerinti DNS-molekula, azzal jellemezve, hogy DNS-szekvenciája a 3. igénypont szerinti teljes vagy részleges MTP nukleotidszekvenciával teljes mértékben komplementer.
6. 6. Expressziós vektor, azzal jellemezve, hogy egy 1. igénypont szerinti, a mikroszomális triglicerid transzferprotein nagy molekulatömegű alegységét vagy ennek egy részét kódoló MTP nukleotidszekvenciát tartalmaz.
7. 7. A 6. igénypont szerinti expressziós vektor, azzal jellemezve, hogy egy 3. igénypont szerinti MTP nukleotidszekvenciát tartalmaz.
8. 8. Prokarióta vagy eukarióta gazdasejt, azzal jellemezve, hogy egy 6. igénypont szerinti expressziós vektort tartalmaz.
9. 9. A 8. igénypont szerinti gazdasejt, azzal jellemezve, hogy egy 7. igénypont szerinti expressziós vektort tartalmaz.
10. 10. Izolált polipeptidmolekula, azzal jellemezve, hogy egy mikroszomális triglicerid transzferprotein (MTP) nagy molekulatömegű alegysége, melyet a szekvencialistában megadott 11. számú vagy 2. számú nukleotidszekvencia vagy ennek egy része kódol.
11. 11. A 10. igénypont szerinti izolált polipeptidmolekula, azzal jellemezve, hogy aminosavszekvenciája a szekvencialistában megadott 3. számú vagy 4. számú, vagy a 3. és 6. számú együttes aminosavszekvenciának felel meg.
12. 12. Eljárás nukleinsavmolekula előállítására, amely a mikroszomális triglicerid transzferprotein (MTP) nagy molekulatömegű alegységét kódoló nukleotidszekvenciából áll, azzal jellemezve, hogy önmagában ismert módon az említett nukleinsavmolekulát izoláljuk, vagy szintetikus vagy rekombináns módszerekkel előállítjuk.
13. 13. A 12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy DNS-molekulát állítunk elő.
14. 14. A 13. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a DNS-molekula nukleotidszekvenciája a szekvencialistában megadott 1., 2., 5., 7. vagy 8. számú szekvencia, vagy az 1. és 5. számú vagy a 2. és 7. számú szekvencia együtt, vagy a 2. számú szekvencia első 108 bázisa a 8. számú szekvenciával együtt, vagy a 2. számú szekvencia első 108 bázisa a 7. és 8. számú szekvenciával együtt.
15. 15. Eljárás expressziós vektor előállítására, azzal jellemezve, hogy egy alkalmas expressziós vektorba egy, a 12-14. igénypontok bármelyike szerint előállított MTP nukleotidszekvenciát a megfelelő szabályozószekvenciákkal együtt működőképesen beépítünk.
16. 16. Eljárás gazdasejt előállítására, azzal jellemezve, egy alkalmas prokarióta vagy eukarióta gazdasejtbe egy, a 15. igénypont szerint előállított expressziós vektort ismert módon bejuttatunk.
17. 17. Eljárás mikroszomális triglicerid transzferprotein nagy molekulatömegű alegységének teljes vagy részleges szekvenciáját tartalmazó polipeptid kifejezésére, azzal jellemezve, hogy egy, a 16. igénypont szerint előállított gazdasejtet a polipeptid kifejeződését biztosító körülmények között tenyésztünk, és a kifejeződött polipeptidet izoláljuk.
18. 18. Eljárás mikroszomális triglicerid transzferprotein (MTP) nagy molekulatömegű alegységét kódoló nukleotidszekvenciával bíró nukleinsav vagy egy rokon nukleinsav kimutatására, azzal jellemezve, hogy (i) érintkezésbe hozzuk az említett nukleinsavat egy olyan kimutatható markerrel, amely egy jelzett nukleotidszekvencia, amely specifikusan kötődik a kimutatandó nukleinsav legalább egy részéhez; és (ii) detektáljuk a megkötött markért; amikor is a megkötött marker jelenléte egy MTP nukleotidszekvencia jelenlétét jelzi.
19. 19. A 18. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy detektálható marker nukleotidszekvenciaként a szekvencialistában megadott 1., 2., 5., 7. vagy 8. számú, vagy 1. és 5. számú vagy 2. és 7. számú szekvenciákat együtt, vagy a 2. számú szekvencia első 108 bázisát a 8. szekvenciával együtt, vagy a 2. szekvencia első 108 bázisát a 7. és 8. szekvenciával együtt tartalmazó nukleotidszekvencia 15-33 egymást követő nukleotidját alkalmazzuk.
20. 20. A 18. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy detektálható marker nukleotidszekvenciaként a szekvencialistában megadott 1., 2., 5., 7. vagy 8. számú,

    HU 218 419 Β vagy 1. és 5. számú vagy 2. és 7. számú szekvenciákat együtt, vagy a 2. számú szekvencia első 108 bázisát és a

    8. szekvenciát együtt, vagy a 2. szekvencia első 108 bázisát és a 7. és 8. szekvenciát együtt tartalmazó nukleotidszekvenciával teljes mértékben komplementerszek- 5 vencia 15-33 egymást követő nukleotidját alkalmazzuk.
21. 21. A 18. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az MTP nukleotidszekvenciával bíró nukleinsav egy genomiális DNS, cDNS vagy RNS.
22. 22. A 18. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemez- 10 ve, hogy a detektálható markert radioizotóppal jelöljük, és a detektálólépést autoradiográfiával végezzük.
23. 23. Eljárás mikroszomális triglicerid transzferprotein (MTP) inhibitor kimutatására, azzal jellemezve, hogy (i) az inhibitorhatásra vizsgálandó mintát a donorpartikulákban, akceptorpartikulákban lévő, detektálható jelzéssel ellátott lipidekkel és mikroszomális triglicerid transzferproteinnel inkubáljuk; és (ii) mérjük a detektálható jelzéssel ellátott lipidnek a mikroszomális triglicerid transzferprotein által katalizált transzferjét a donorpartikuláktól az akceptorpartikuIákig, amikor is az inhibitor gátolni fogja a detektálhatóan jelzett lipidek említett transzferjét.