DE69833189T2

DE69833189T2 - Nukleinsäuresequenzen für atp-bindungs cassette-transporter

Info

Publication number: DE69833189T2
Application number: DE69833189T
Authority: DE
Inventors: Rando Frederick ALLIKMETS; L. Kent Houston ANDERSON; Michael Frederick Dean; Mark Salt Lake City LEPPART; A. Richard Houston LEWIS; Yixin Cupertino LI; R. James Houston LUPSKI; Jeremy Baltimore NATHANS; Amir Baltimore RATTNER; F. Noah Houston SHROYER; Nanda Salt Lake City SINGH; M. Philip Woodbine SMALLWOOD; Hui Baltimore SUN
Original assignee: Baylor College of Medicine; US Department of Health and Human Services; University of Utah Research Foundation UURF; Johns Hopkins University
Current assignee: Baylor College of Medicine; US Department of Health and Human Services; University of Utah Research Foundation UURF; Johns Hopkins University
Priority date: 1997-02-27
Filing date: 1998-02-27
Publication date: 2006-08-03
Anticipated expiration: 2018-02-28
Also published as: AU6538698A; JP4290225B2; DE69833189D1; CA2281887C; JP2001516209A; AU742094B2; CA2281887A1; WO1998037764A1; EP0989805B1; ATE315334T1; EP0989805A4; EP0989805A1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Makuladegeneration beeinträchtigt ungefähr 1,7 Millionen Individuen in den Vereinigten Staaten und ist der häufigste Grund für erworbene Sehbeeinträchtigung in jenen, die älter als 65 sind. Stargardt-Krankheit (STGD; McKusick Mendelian Inheritance (MIM) #248200) ist vertretbar die häufigste erbliche rezessive Makuladystrophie und ist gekennzeichnet durch einen Beginn in der Kindheit bis zum jungen Erwachsenen, zentrale-visuelle Beeinträchtigung, progressiver bilateraler Atrophie des Makula-retinalen Pigment-Epithels (RPE) und Neuroepithels und dem häufigen Auftreten von orange-gelben Flecken, die um die Makula und/oder die mittelretinale Peripherie verteilt sind (Stargardt, 1909; Anderson et al., 1995). Eine klinisch ähnliche retinale Störung (Fundus flavimaculatus, FFM, Franceschetti, 1963) zeigt häufig einen späteren Altersbeginn und langsamere Progression (Fishman, 1976, Noble und Carr, 1979). Aus der Verbindungsanalyse wurde geschlossen, dass STGD und FFM wahrscheinlich allelische autosomale rezessive Störungen mit geringfügig verschiedenen klinischen Manifestationen sind, die durch (eine) Mutation(en) eines Gens auf Chromosom 1p13-p21 verursacht wird/werden (Gerber et al., 1995; Anderson et al, 1995). Das STGD Gen wurde auf einer 4 cM Region, die von den rekombinanten Markern D1S435 und D1S236 flankiert wird, lokalisiert, und ein vollständiges artifizielles Hefe Chromosom (YAC) Contig der Region wurde konstruiert (Anderson et al., 1995). Kürzlich wurde die Anordnung des STGD/FFM Locus auf dem humanen Chromosom 1p auf ein 2 cm Intervall zwischen den polymorphen Markern D1S406 und D1S236 durch genetische Verbindungsanalyse in einem unabhängigen Satz von STGD Familien eingegrenzt (Hoyng, et al., 1996). Autosomal dominante Störungen mit in etwa ähnlichen klinischen Phänotypen zu STGD, die in einzelnen großen nordamerikani schen Stammbäumen identifiziert wurden, wurden auf Chromosom 13g34 (STGD2; MIM #153900; Zhang et al., 1994) und auf Chromosom 6q11-q14 (STGD3; MIM #600110; Stone et al., 1994) kartiert, obwohl diese Zustände nicht durch das pathogenomische dunkle Choroid gekennzeichnet sind, das durch Fluoresceinangiograpie beobachtet wurde (Gass, 1987).
Von Mitgliedern der Superfamilie der Säuger-ATP-Bindungs-Cassette (ABC)Transporter wird angenommen, dass sie mögliche Kandidaten für humane Erkrankungsphänotypen sind. Die ABC-Superfamilie schließt Gene ein, deren Produkte Transmembranproteine sind, die in den Energie-abhängigen Transport eines breiten Spektrums von Substraten über Membrane involviert sind (Childs und Ling, 1994; Dean und Allikmets, 1995). Viele Mitglieder dieser Superfamilie, die Erkrankungen verursachen, führen zu Defekten im Transport von spezifischen Substraten (CFTR, Riordan et al., 1989; ALD, Mosser et al, 1993; SUR, Thomas et al., 1995; PMP70, Shimozawa et al., 1992; TAP2, de la Salle et al., 1994). In Eukaryonten kodieren die ABC-Gene typischerweise vier Domänen, die zwei konservierte ATP-Bindungsdomänen (ATP) und zwei Domänen mit multiplen Transmembran (TM) Segmenten einschließen (Hyde et al., 1990). Die ATP-Bindungsdomänen der ABC-Gene enthalten Motive charakteristischer konservierter Reste (Walker A und B Motive), die durch 90 – 120 Aminosäuren voneinander getrennt sind. Sowohl dieser konservierte Abstand als auch das "Signatur" oder "C" Motiv unmittelbar oberhalb der Walker B Stelle unterscheiden Mitglieder der ABC-Superfamilie von anderen ATP-bindenden Proteinen (Hyde et al., 1990; Michaelis und Berkower, 1995). Diese Merkmale haben die Isolierung von neuen ABC-Genen durch Hybridisierung, degenerierte PCR und Untersuchung von DNA-Sequenzdatenbanken ermöglicht (Allikmets et al., 1993, 1995; Dean et al., 1994; Luciani et al., 1994).
Die Charakterisierung von einundzwanzig neuen Mitgliedern der ABC-Superfamilie kann die Charakterisierung und die diesen Genen zugeordnete Funktionen durch Bestimmen ihrer Kartenanordnungen und ihrer Expressionsmuster erlauben (Allikmets et al., 1996). Dass viele bekannte ABC-Gene in erbliche hu mane Erkrankungen involviert sind, liegt nahe, dass einige dieser neuen Loci auch Proteine kodieren, die in spezifischen genetischen Störungen mutiert sind. Trotz dem regionalen Lokalisieren eines Gens durch Kartierung macht es die Bestimmung der genauen Lokalisierung und der Sequenz eines Gens nichts desto trotz notwenig, dass das bestimmte Gen unter ungefähr 250 Genen, vier bis ungefähr fünf Millionen Basenpaare, von innerhalb der regional lokalisierten chromosomalen Stelle ausgewählt wird.
Während Fortschritte wie oben beschrieben gemacht wurden, wurden nach dem Wissen des Anmelders bislang noch keine Mutationen in einem Retinaspezifischen ABC-Transporter (ABCR) in Patienten mit rezessiver Makuladystrophie STGD/FFM identifiziert. Dass die ABCR-Expression auf Fotorezeptoren beschränkt ist, wie in der vorliegenden Erfindung bestimmt wurde, liefert den Beweis, warum ABCR bis jetzt noch nicht sequenziert wurde. Weiterhin ist die ABC1-Superfamilie der ABC-Transporter nicht durch irgendein Homolog in Hefe repräsentiert (Michaelis und Berkower, 1995), was nahe legt, dass sich diese Gene entwickelten, um spezialisierte Funktionen in multizellulären Organismen auszuführen, was auch erklärt, warum das ABCR-Gen schwierig zu identifizieren war. Im Gegensatz zu ABC-Genen in Bakterien sind die homologen Gene in höheren Eukaryonten viel weniger gut untersucht. Die Tatsache, dass Prokaryonten eine große Anzahl von ABC-Genen enthalten, legt nahe, dass viele Säugermitglieder der Superfamilie uncharakterisiert bleiben. Die Aufgabe, eukaryote ABC-Gene zu untersuchen, ist aufgrund der signifikant höheren Komplexität von Eukaryontensystemen und dem offensichtlichen Unterschied in der Funktion von selbst hoch homologen Genen schwierig. Während ABC-Proteine die grundsätzlichen Transporter einer Vielzahl von verschiedenen Verbindungen in bakteriellen Zellen sind, haben Eukaryonten im Gegensatz dazu andere Mechanismen für den Transport von vielen Aminosäuren und Zuckern entwickelt. Eukaryonten besitzen andere Gründe, um die Rolle von ABC-Genen zu diversifizieren, zum Beispiel das Durchführen von Funktionen wie Ionentransport, Toxineliminierung und Sekretion von Signalmolekülen.
Demzufolge verbleibt ein Bedarf für die Identifizierung der Sequenz des Gens, das in mutierten Formen mit retinalen und/oder Makula-degenerativen Erkrankungen, einschließlich zum Beispiel Stargardt-Krankheit und Fundus flavimaculatus assoziiert ist, um gesteigerte Diagnosen und verbesserte Diagnosen und interventionelle Therapien für Individuen, die von solchen Erkrankungen betroffen sind, bereitzustellen.
Die folgenden Dokumente betreffen ein Fotorezeptor-zellspezifisches ATP-Bindungs-Transportergen (ABCR) und Mutationen davon und seine Rolle in Stargardt Makuladystrophie:

Allikmets R. et al., Science, US, Vol. 277, 19. September 1997, Seiten 1805-1807;
Allikmets R. et al., Nature Genetics, Vol. 15, Nr. 3, März 1997 (1997-03), Seiten 236-246;
Gerber S. et al, Genomics, Vol. 48, 1998, Seiten 139-142;
Azarian S. et al., FEBS Letters, Elsevier Science Publishers, Amsterdam, NL, Vol. 409, Nr. 2, 9. Juni 1997, Seiten 247-252;
Nasonkin Igor et al., Human Genetics, Vol. 102, Nr. 1, Januar 1998 (1998-01); und
Sun H. et al., Nature Genetics, 17. September 1997, Vol. 17, Seiten 15-16.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt Sequenzen bereit, die einen ATP-Bindungs-Cassette-Transporter kodieren. Die Erfindung stellt Nukleinsäuresequenzen bereit, die ein ATP-Bindungs-Cassette-Protein gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 kodieren. Nukleinsäuresequenzen, einschließlich SEQ ID NR: 1, die eine genomi sche Sequenz ist, und SEQ ID NRn: 2 und 5, die cDNA Sequenzen sind, sind Sequenzen, auf welche die vorliegende Erfindung gerichtet ist.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt ATP-Bindungs-Cassette-Transporter Polypeptide und/oder Proteine gemäß Anspruch 13 bereit. SEQ ID NRn: 3 und 6 sind neue erfindungsgemäße Polypeptide, die aus Nukleotidsequenzen hergestellt wurden, die für den ATP-Bindungs-Cassette-Transporter kodieren. Ebenfalls innerhalb des Schutzbereichs der vorliegenden Erfindung liegt ein gereinigter ATP-Bindungs-Cassette-Transporter.
Die vorliegende Erfindung stellt auch einen Expressionsvektor umfassend eine Nukleinsäuresequenz, die einen ATP-Bindungs-Cassette-Transporter kodiert, eine transformierte Wirtszelle, die befähigt ist, eine Nukleinsäuresequenz zu exprimieren, die einen ATP-Bindungs-Cassette-Transporter kodiert, eine Zellkultur, die befähigt ist, einen ATP-Bindungs-Cassette-Transporter zu exprimieren und eine Proteinpräparation umfassend einen ATP-Bindungs-Cassette-Transporter, bereit.
Die vorliegende Erfindung ist auch auf ein Verfahren zum Screenen für ein Mittel gerichtet, welches ATP-Bindungs-Cassette-Transporter modifiziert, umfassend das Vereinigen eines gereinigten Retina-spezifischen ATP-Bindungs-Cassette-Transporters mit einem Mittel, welches im Verdacht steht, einen Retinaspezifischen ATP-Bindungs-Cassette-Transporter zu modifizieren, und das Beobachten einer Veränderung in mindestens einer Eigenschaft, die mit dem ATP-Bindungs-Cassette-Transporter assoziiert ist. Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren zum Identifizieren eines Mittels bereit, das Makuladegeneration inhibiert, umfassend das Mischen von gereinigtem ATP-Bindungs-Cassette-Transporter von einem Patienten, der unter dem Verdacht einer Makuladegeneration steht, mit einem Mittel, das unter dem Verdacht steht, mit dem ATP-Bindungs-Cassette-Transporter zu interagieren und das Beobachten einer Inhibierung in mindestens einer der Merkmale der Erkrankungen, die mit dem ATP-Bindungs-Cassette-Transporter assoziiert sind. Zusätzlich stellt die vorliegende Erfindung Verfahren zum Identifizieren eines Mittels bereit, welches den Beginn mindestens eines Merkmals, das mit dem ATP-Bindungs-Cassette-Transporter assoziiert ist, induziert, umfassend das Mischen von gereinigtem Wildtyp-ATP-Bindungs-Cassette-Transporter mit einem Mittel, das unter dem Verdacht steht, eine makuladegenerative Erkrankung zu induzieren, und das Beobachten des Beginns eines Merkmals, das mit Makuladegeneration assoziiert ist.
KURZBESCHREIBUNG DER FIGUREN
1A und 1B zeigt das ABCR-Gen und Amplifikationsprodukte. 1A zeigt eine physikalische Karte des ABCR-Gens. Mega-YAC Klone aus der CEPH Mega-YAC genomischen Bibliothek (Bellane-Chantelot et al., 1992), welche die 4 cM kritische Region für STGD enthalten, sind durch horizontale Balken mit dunklen Ringen dargestellt, die bestätigte Positive für STSs durch Landkartenkartierung zeigen. Die einzelnen STS Marker und ihre physikalische Anordnung sind unter den YACs gezeigt, wobei die Pfeile die centromere (cen) und telomere (1pter) Richtung zeigen (Anderson et al., 1995). Das durch horizontale Pfeile mit zwei Spitzen markierte STGD zeigt das genaue genetische Intervall, das durch historische Rekombinante aufgezeigt ist (Anderson et al., 1995). 1B zeigt die Ergebnisse von Agarosegel Elektrophorese von PCR Amplifikationsprodukten mit Primern von den 5' (GGTCTTCGTGTGTGGTCATT, SEQ ID NR: 114, GGTCCAGTTCTTCCAGAG, SEQ ID NR: 115, markiert 5' ABCR) oder 3' (ATCCTCTGACTCAGCAATCACA, SEQ ID NR: 116, TUCAATTAC-AAATGCAATGG, SEQ ID NR: 117; markiert 3' ABCR) Regionen von ABCR auf den 13 verschiedenen YAC DNA Matrizen, die als Diagonale über dem Gel angegeben sind. Der Stern bezeichnet, dass YAC 680~b~5 für die 5' ABCR PCR positiv, aber für die 3' ABCR PCR negativ war. Diese Daten legen nahe, dass das ABCR-Gen in das Intervall fällt, das durch die Marker D1S3361 – D1S236 beschrieben wird, und das in Richtung des Telomers, wie durch die offene horizontale Box gezeigt ist, transkribiert wird.
2 zeigt die Größen- und Gewebeverteilung von ABCR-Transkripten in der adulten Ratte. Ein Blot Gesamt RNA aus den angegebenen Geweben wurde mit einer 1,6 kb Maus Abcr-Sonde (oben) und einer ribosomalen Protein S26 Sonde (unten; Kuwano et al., 1985) hybridisiert. Die ABCR-Sonde zeigte ein vorherrschendes Transkript von ungefähr 8 kb, das nur in der Retina gefunden wird. Die Mobilität der 28S und 18S ribosomalen RNAs sind rechts angegeben. B, Gehirn (brain); H, Herz; K, Niere (kidney); Li Leber (liver); Lu, Lunge; R, Retina, S, Milz (spleen).
3 zeigt die Sequenz der ABCR kodierenden Region innerhalb der genomischen ABCR-Sequenz, SEQ ID NR: 1. Die Sequenz der ABCR cDNA, SEQ ID NR: 2 ist mit der vorhergesagten Proteinsequenz, SEQ ID NR: 3 im Einbuchstaben Aminosäurecode unten gezeigt. Die Lage von Spleiß-Stellen ist durch das Symbol | gezeigt.
4 zeigt die Anordnung des ABCR-Proteins, SEQ ID NR: 3 gegenüber anderen Mitgliedern der ABC1-Superfamilie. Die angenommene Aminosäuresequenz von ABCR ist gegenüber bekannten humanen und Mausproteinen angeordnet gezeigt, die Mitglieder derselben Superfamilie sind. Abc1, Maus Abc1 (SEQ ID NR: 118), Abc2, Maus Abc2 (SEQ ID NR: 119) und ABCC, humanes ABC-Gen (SEQ ID NR: 120). Die Walker A und B Motive und das Signaturmotiv C sind durch Unterstreichen und durch jeweils die Buchstaben A, B und C gekennzeichnet.
5 zeigt die Lage von Abcr aus einer Jackson BSS Rückkreuzung, die einen Anteil des Maus Chromosom 3 zeigt. Die Karte ist mit dem Centromer nach oben gezeigt. Ein 3 cM Maßstabsbalken ist ebenfalls gezeigt. Loci Kartierungen auf dieselbe Position sind in alphabetischer Ordnung aufgezählt.
6 zeigt die Segregation von SSCP-Varianten in Exon 49 des ABCR-Gens in vennrandten AR293. Eine Sequenzanalyse von SSCP-Banden zeigte die Existenz von Wildtyp-Sequenz (Banden 1 und 3) und mutanter Sequenz (Banden 2 und 4). DNA Sequenzierung zeigte eine 15 Basenpaar Deletion, während die betroffenen Kinder (Spuren 2 und 3) homozygot sind. Eine Haplotyp Analyse zeigte Homozygosität am STGD Locus in den zwei betroffenen Individuen.
7A-H zeigt die Lokalisation von ABCR-Tanskripten zu Fotorezeptorzellen. In situ Hybridisierung wurde mit Digoxygenin-markierten Ribosonden durchgeführt und unter Verwendung eines alkalische Phosphatase konjugierten Anti-Digoxygenin Antikörpers sichtbar gemacht. 7A-D zeigt Hybridisierungsergebnisse von Retina und Choroid aus einer pigmentierten Maus (C57/B16); 7E und 7F zeigt Hybridisierungsergebnisse von Retina und Choroid aus einer Albinoratte; und 7G und 7H zeigt Hybridisierungsergebnisse von Retina aus einem Makakenaffen. 7A, 7E und 7G zeigen Ergebnisse aus einer Maus abcr Antisense Sonde; 7B zeigt Ergebnisse aus einer Maus abcr Sense Sonde; 7C zeigt Ergebnisse aus einer Makaken Rhodopsin Antisense Sonde und 7D, 7F und 7H zeigen Ergebnisse aus einer Maus blaues Zapfenpigment Antisense Sonde. ABCR-Transkripte sind in den inneren Segmenten der Fotorezeptorzellschicht angeordnet, ein Muster, das zu der Verteilung von Rhodopsintranskripten passt, aber von der Verteilung von Zapfen visuellem Pigment Transkripten verschieden ist. Hybridisierung wurde nicht in der RPE oder Choroid beobachtet, wie am deutlichsten in dem Albino Rattenauge beobachtet werden kann (Pfeilspitze in 7E). Die retinalen Schichten, die in 7B angegeben sind, sind: OS, äußere Segmente (outer segments); IS, innere Segmente; ONL, äußere Kernschicht (outer nuclear layer); OPL, äußere Plexiformschicht (outer plexiform layer); INL, innere Kernschicht (inner nuclear layer); IPL, innere Plexiformschicht (inner plexiform layer); GCL, Ganglionzellschicht (ganglion cell layer).
8 zeigt eine pGEM^®-T Vektorkarte.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung ist auf die Nukleinsäure- und Proteinsequenzen gerichtet, die einen ATP-Bindungs-Cassette-Transporter kodieren. Der ATP-Bindungs-Cassette-Transporter der vorliegenden Erfindung ist ein Retina-spezifischer ATP- Bindungs-Cassette-Transporter (ABCR); insbesondere kann ABCR aus retinalen Zellen, vorzugsweise Fotorezeptorzellen isoliert werden. Die Erfindung stellt Nukleinsäuresequenzen bereit, die ABCR gemäß den Ansprüchen 1 bis 6 kodieren. Die vorliegende Erfindung stellt Nukleotidsequenzen von ABCR einschließlich genomischer Sequenzen, SEQ ID NR: 1 und cDNA Sequenzen SEQ ID NR: 2 und 5, bereit. Neue Polypeptidsequenzen, SEQ ID NRn: 3 und 6, für ABCR sind jeweils die translatierten Produkte von SEQ ID NRn: 2 und 5, und sie sind ebenfalls in die vorliegende Erfindung eingeschlossen.
SEQ ID NR: 1 stellt die humane genomische cDNA Sequenz von ABCR bereit. SEQ ID NRn: 2 und 5 stellen die Wildtyp cDNA Sequenzen von humanem ABCR bereit, die jeweils zu den translatierten Produkten SEQ ID NRn: 3 und 6 führen. Während nicht beabsichtigt ist, durch irgendeine bestimmte Theorie oder Theorien der Wirkung gebunden zu sein, wird angenommen, dass die SEQ ID NRn: 2 und 5 die Isoformen von ABCR cDNA sind. Dem Unterschied zwischen SEQ ID NRn: 2 und 5 kann durch eine zusätzliche Sequenz in SEQ ID NR: 2 Rechnung getragen werden, die zwischen die Basen 4352 und 4353 von SEQ ID NR: 5 eingefügt ist. Es wird angenommen, dass dieser Unterschied aus alternativem Spleißen des entstehenden Transkripts von ABCR entsteht, in dem ein alternatives Exon 30, SEQ ID NR: 4 ausgeschlossen ist. Dieses alternative Exon kodiert zusätzliche 38 Aminosäuren, SEQ ID NR: 11.
Die Nukleinsäuren innerhalb des Schutzbereichs der vorliegenden Erfindung schließen cDNA, RNA, genomische DNA, Fragmente oder Anteile innerhalb der Sequenzen und Antisense Oligonukleotide ein. Sequenzen, welche die ABCR kodieren, schließen auch Aminosäure-, Polypeptid- und Proteinsequenzen ein. Variationen in den Nukleinsäure- und Polypeptidsequenzen der vorliegenden Erfindung liegen innerhalb des Schutzbereichs der vorliegenden Erfindung und schließen N-terminale und C-terminale Verlängerungen, Transkriptions- und Translationsmodifikationen und Modifikationen in der cDNA Sequenz ein, um die Transkriptions- und Translationseffizienz zu erleichtern und zu verbessern. Zusätzlich behalten Veränderungen innerhalb der Wildtyp-Sequenzen, die hier identifiziert wur den, die eine Sequenz verändern, im Wesentlichen dieselbe Wildtyp-Aktivität, so dass die veränderten Sequenzen im Wesentlichen gleich zu den identifizierten Abcr-Sequenzen sind und auch als in den Schutzbereich der vorliegenden Erfindung fallend erachtet werden. Fehlpaarungen, Insertionen und Deletionen, die eine substantielle Ähnlichkeit zu den Abcr-Sequenzen erlauben, wie Ähnlichkeit in Resten in Hydrophobizität, Hydrophilizität, Basizität und Azidität, sind dem Fachmann bekannt, sobald er mit der vorliegenden Offenbarung ausgestattet ist. Zusätzlich können die isolierten oder gereinigten Sequenzen der vorliegenden Erfindung natürlich, rekombinant, synthetisch oder eine Kombination davon sein. Wildtyp-Aktivität, die mit den Abcr-Sequenzen der vorliegenden Erfindung assoziiert ist, schließt inter alia die gesamte oder einen Teil einer Sequenz oder eine Sequenz im Wesentlichen ähnlich dazu, ein, die für einen ATP-Bindungs-Cassette-Transporter kodiert.
Die genomischen, SEQ ID NR: 1 und cDNA, SEQ ID NRn: 2 und 5 Sequenzen sind in 3A-H gezeigt und kodieren ABCR, bestimmte Mutationen davon sind verantwortlich für die Klasse von retinalen Störungen, die als retinale oder Makuladegenerationen bekannt sind. Makuladegeneration ist gekennzeichnet durch Makuladystrophie, zentral-visuelle Beeinträchtigung, progressive bilaterale Atrophie des Makula-retinalen Pigment-Epithels (RPE) und Neuroepithels, häufiges Auftreten von orange-gelben Flecken, die um die Makula und/oder die mittelretinale Peripherie verteilt sind und subretinale Ablagerung von Lipofuscin ähnlichem Material. Retinale und Makula-degenerative Erkrankungen schließen ein, aber sind nicht beschränkt auf Stargardt-Krankheit, Fundus flavimaculatus, altersbedingte Makuladegeneration, und sie können verschiedene Störungen einschließen, die als Retinitis pigmentosa kombinierte Stäbchen und Zapfendystrophien, Zapfendystrophien und Degenerationen, Musterdystrophien, Ochsenaugen Makulopathien und verschiedene andere retinale degenerative Störungen bezeichnet werden, von denen einige durch Arzneimittel, Toxine, Umwelteinflüsse und ähnliches ausgelöst werden. Die Stargardt-Krankheit ist eine autosomal rezessive retinale Störung, die durch einen Beginn einer makularen und retinalen Dystrophie in der Jugend bis zum erwachsenen Alter gekennzeichnet ist. Fundus flavimaculatus zeigt häufig einen Beginn im späteren Alter und eine langsamere Progression. Einige Umwelteinflüsse und Arzneimitteltoxizitäten können ähnliche retinale Degenerationen verursachen. Die Verbindungsanalyse zeigt, dass Stargardt-Krankheit und Fundus flavimaculatus allelische autosomale rezessive Störungen mit geringfügig verschiedenen klinischen Manifestationen sein können. Die Identifizierung des ABCR-Gens liegt nahe, dass verschiedene Mutationen innerhalb von ABCR für diese klinischen Phänomene verantwortlich sein können.
Die vorliegende Erfindung ist auch auf ein Verfahren zum Screenen für ein Mittel gerichtet, das ATP-Bindungs-Cassette-Transporter modifiziert, umfassend das Mischen von gereinigtem ATP-Bindungs-Cassette-Transporter mit einem Mittel, das unter dem Verdacht steht, den ATP-Bindungs-Cassette-Transporter zu modifizieren, und das Beobachten einer Veränderung in mindestens einem Merkmal, das mit ATP-Bindungs-Cassette-Transporter assoziiert ist.
"Modifizieren" und Variationen davon schließen Änderungen als solche ein und sind nicht beschränkt auf Inhibieren, Unterdrücken, Verlangsamen, Verzögern, Abbremsen, Einstellen, Blockieren und Beschränken, ebenso wie Induzieren, Ermutigen, Provozieren und Verursachen. Modifizieren kann definiert sein als vollständige Inhibierung, so dass die Makuladegeneration arretiert, gestoppt oder blockiert ist. Modifikationen können unter bestimmten Umständen die Makuladegeneration direkt oder indirekt inhibieren oder im Wesentlichen inhibieren oder die Makuladegeneration induzieren oder im Wesentlichen induzieren.
Verfahren zum Identifizieren eines Mittels, das Makuladegeneration inhibiert, sind durch die vorliegende Erfindung verkörpert und umfassen das Mischen von gereinigtem ATP-Bindungs-Cassette-Transporter von einem Patienten, der unter dem Verdacht steht eine Makuladegeneration aufzuweisen, mit einem Mittel, das im Verdacht steht, mit dem ATP-Bindungs-Cassette-Transporter zu interagieren, und das Beobachten einer Inhibierung in mindestens einem der Erkrankungsmerkmale, die mit dem ATP-Bindungs-Cassette-Transporter assoziiert sind. Demzufolge dienen solche Verfahren dazu, Makuladegeneration beispielsweise in menschli chen Patienten zu reduzieren oder zu verhindern. Zusätzlich stellt die vorliegende Erfindung Verfahren zum Identifizieren eines Mittels bereit, das den Beginn mindestens eines Merkmals, das mit ATP-Bindungs-Cassette-Transporter assoziiert ist, induziert, umfassend das Mischen von gereinigtem Wildtyp-ATP-Bindungs-Cassette-Transporter mit einem Mittel, das unter dem Verdacht steht, eine Maku-la-degenerative Erkrankung zu induzieren, und das Beobachten des Beginns eines Merkmals, das mit Makuladegeneration assoziiert ist. Somit stellen solche Verfahren Verfahren zur Verwendung von Versuchstieren bereit, um Mittel zu bestimmen, die Makuladegeneration verursachen. Der ATP-Bindungs-Cassette-Transporter kann in den hier identifizierten Verfahren in der Form von Nukleinsäuren, wie zum Beispiel und nicht beschränkt auf SEQ ID NRn: 1, 2 und 5 oder als Aminosäure, SEQ ID NRn: 3 und 6 bereitgestellt werden. Folglich können Transkriptions- und Translationsinhibitoren getrennt identifiziert werden. Merkmale, die mit Makuladegeneration assoziiert sind, schließen ein und sind nicht beschränkt auf zentral-visuelle Beeinträchtigung, progressive bilaterale Atrophie des Makula-retinalen Pigment-Epithels (RPE) und Neuroeptihels und dem häufigen Auftreten von orange-gelben Flecken, die um die Makula und/oder die mittelretinale Peripherie verteilt sind. Folglich führt das Beobachten von einem oder mehreren der Merkmale, die oben genannt sind, zur Identifizierung eines Mittels, das Makuladegeneration induziert, wohingegen die Verringerung oder Inhibierung mindestens eines der Merkmale zu der Identifizierung eines Mittels, das Makuladegeneration inhibiert, führt.
Die Mutationsanalyse von ABCR in Stargardt-Krankheit Familien zeigte bisher vierundsiebzig Mutationen, einschließlich vierundfünfzig einzelne Aminosäuresubstitionen, fünf Unsinnmutationen, die zu einer frühen Verkürzung des Proteins führen, sechs Leserahmenmutationen, die zu einer frühen Verkürzung des Proteins führen, drei Deletionen innerhalb des Leserahmens, die zu Verlust von Aminosäureresten aus dem Protein führen und sechs Spleiß-Stellen Mutationen, die zu nicht richtigem Prozessieren des neuen RNA Transkripts führen, siehe Tabelle 2. Verbindungsheterozygote für Mutationen in ABCR wurden in zweiundvierzig Familien gefunden. Homozygote Mutationen wurden in drei Familien mit blutsver wandter Herkunft identifiziert. Folglich werden Mutationen in Wildtyp-ABCR, die zu Aktivitäten führen, die nicht mit Wildtyp-ABCR assoziiert sind, hier als Sequenzen bezeichnet, die mit Makuladegeneration assoziiert sind. Solche Mutationen schließen Fehlsinn-Mutationen, Deletionen, Insertionen, wesentliche Unterschiede in Hydrophobizität, Hydrophilizität, Azidität und Basizität ein. Merkmale, die mit retinaler oder Makuladegeneration assoziiert sind, schließen ein und sind nicht beschränkt auf diese Merkmale, die oben genannt sind.
Mutationen in Wildtyp-ABCR stellen ein Verfahren zum Nachweisen von Makuladegeneration bereit. Retinale oder Makuladegeneration kann nachgewiesen werden durch das Erhalten einer Probe, die Nukleinsäuren eines Patienten aus einer Gewebeprobe eines Patienten; das Amplifizieren von Retina-spezifischen ATP-Bindungs-Cassette-Transporter spezifischen Nukleinsäuren aus den Nukleinsäuren eines Patienten, um ein Testfragment herzustellen; das Erhalten einer Probe, die Kontroll Nukleinsäuren aus einer Kontroll Gewebeprobe enthält; das Amplifizieren von Kontroll Nukleinsäuren, die Wildtyp Retina-spezifischen ATP-Bindungs-Cassette-Transporter kodieren, um ein Kontrollfragment herzustellen; das Vergleichen des Testfragments mit dem Kontrollfragment, um die Anwesenheit eines Sequenzunterschieds in dem Testfragment nachzuweisen, umfasst, wobei ein Unterschied in dem Testfragment eine Makuladegeneration anzeigt. Mutationen in dem Testfragment, einschließlich und nicht beschränkt auf jede der Mutationen, die oben angegeben sind, können den Beweis für Makuladegeneration liefern.
Die Erfindung stellt Nukleinsäuresequenzen bereit, die mutante ABCR-Proteine gemäß den Ansprüchen 2 bis 6 kodieren.
Ein gereinigtes ABCR-Protein wird ebenfalls durch die vorliegende Erfindung bereitgestellt. Das gereinigte ABCR-Protein kann eine Aminosäuresequenz wie durch SEQ ID NRn: 3 und 6 bereitgestellt, aufweisen.
Die vorliegende Erfindung ist auf ABCR-Sequenzen gerichtet, die aus Säugern aus der Ordnung Rodentia, einschließlich und nicht beschränkt auf Hamster, Rat ten und Mäuse erhalten werden; Ordnung Logomorpha, wie Kaninchen; insbesondere der Ordnung Carnivora, einschließlich Feline (Katzen) und Canine (Hunde); weiter insbesondere der Ordnung Artiodactyla, Bovine (Kühe) und Suine (Schweine); und der Ordnung Perissodactyla, einschließlich Equine (Pferde); und am meisten insbesondere der Ordnung Primaten, Ceboide und Simoide (Affen) und Anthropoide (Menschen und Menschenaffen). Die Säuger der am meisten bevorzugten Ausführungsformen sind Menschen.
Im Allgemeinen können die erfindungsgemäßen Sequenzen in Wirtszellen hergestellt werden, die mit einem Expressionsvektor, der eine Nukleinsäuresequenz, die für ABCR kodiert, umfasst, transformiert sind. Die transformierten Zellen werden unter Bedingungen kultiviert, wodurch die Nukleinsäuresequenz, die für ABCR kodiert, exprimiert wird. Nach einem ausreichenden Zeitraum, während dem sich das Protein anreichert, wird das Protein aus den transformierten Zellen gereinigt.
Ein Gen, das für ABCR kodiert, kann von einer cDNA Bibliothek erhalten werden. Geeignete Bibliotheken können von kommerziellen Quellen, wie Clontech, Palo Alto, CA erhalten werden. Bibliotheken können auch unter Verwendung der folgenden nicht einschränkenden Beispiele hergestellt werden: Hamsterinsulin sekretierendem Tumor (HIT), Maus αTC-6 und Ratteninsulinoma (RIN) Zellen. Positive Klone werden anschließend einer DNA Sequenzierung unterworfen, um die Anwesenheit einer DNA Sequenz, die für ABCR kodiert, zu bestimmen. Das DNA Sequenzieren wird unter Verwendung des Kettenterminationsverfahrens von Sanger et al., Proc. Nat'I. Acad. Sci. USA, 1977, 74, 5463, durchgeführt. Die DNA-Sequenz, die für ABCR kodiert, wird anschließend in einen Expressionsvektor für die spätere Expression in einer Wirtszelle eingeführt.
Expressionsvektoren und Wirtszellen werden ausgewählt, um ein Expressionssystem zu bilden, das befähigt ist, ABCR zu synthetisieren. In der vorliegenden Erfindung können Vektoren, einschließlich und nicht beschränkt auf Baculovirus Vektoren, verwendet werden. Wirtszellen, die für die Verwendung in der Erfindung geeignet sind, schließen prokaryote und eukaryote Zellen ein, die transformiert wer den können, um ABCR stabil zu enthalten und zu exprimieren. Zum Beispiel können Nukleinsäuren, die für das rekombinante Protein kodieren, in prokaryoten oder eukaryoten Wirtszellen exprimiert werden, einschließlich der am häufigsten verwendeten bakteriellen Wirtszelle für die Herstellung von rekombinanten Proteinen, E. coli. Andere mikrobielle Stämme können jedoch ebenfalls verwendet werden, wie Bacillus subtilis und andere Enterobacteriaceae, wie Salmonella typhimurium oder Serratia marcescens, verschiedene Spezies von Pseudomonas oder andere bakterielle Stämme.
Das bevorzugte eukaryote System ist Hefe, wie Saccharomyces cerevisiae. Systeme mit artifiziellem Hefe Chromosom (YAC) sind in der Lage, die große Größe der ABCR-Gensequenz oder eines genomischen Klons aufzunehmen. Das Prinzip des YAC-Systems ist ähnlich zu jenem, das bei der herkömmlichen Klonierung von DNA verwendet wird. Große Fragmente von cDNA werden in zwei "Arme" eines YAC-Vektors ligiert, und die Ligationsmischung wird anschließend durch Transformation in die Hefe eingeführt. Jeder der Arme des YAC-Vektors trägt einen selektierbaren Marker ebenso wie geeignet orientierte Sequenzen, die als Telomere in Hefe wirken. Zusätzlich trägt einer der zwei Arme zwei kleine Fragmente, die als ein Centromer und als ein Replikationsursprung (auch als ARS Element-autonom replizierende Sequenzen bezeichnet) wirken. Hefetransformanten, die ein artifizielles Chromosom aufgenommen haben und stabil enthalten, werden als Kolonien auf Agarplatten identifiziert, welche die Bestandteile enthalten, die für die Selektion von einem oder beiden YAC-Armen notwendig sind. Die YAC-Vektoren sind derart gestaltet, dass sie die schnelle Identifizierung von Transformanten erlauben, die Inserts von genomischer DNA tragen. Die Insertion von genomischer DNA in die Klonierungsstelle zerstört ein Suppressor tRNA Gen und führt zu der Bildung von roten anstelle von weißen Kolonien durch Hefestämme, die ein Amber ade2 Gen tragen.
Um in YAC-Vektoren zu klonieren, wird genomische DNA von dem Testorganismus unter Bedingungen hergestellt, die zu einem relativ geringen Scheren führen, so dass die durchschnittliche Größe einige Millionen Basenpaare beträgt. Die cDNA wird anschließend in die Arme des YAC-Vektors ligiert, die in geeigneter Weise hergestellt wurden, um die Selbstligation zu verhindern. Als eine Alternative zur teilweisen Spaltung mit EcoRI können YAC-Vektoren verwendet werden, die genomische DNA akzeptieren, die vollständig mit selten schneidenden Restriktionsenzymen wie NotI oder MluI gespalten wurde.
Zusätzlich können Insektenzellen, wie Spodoptera frugiperda; Hühnchenzellen, wie E3C/O und SL-29; Säugerzellen, wie HeLa, chinesische Hamsterovarzellen (CHO), COS-7 oder MDCK Zellen und ähnliche ebenfalls verwendet werden. Die zuvor genannte Liste ist nur beispielhaft, und sie beabsichtigt nicht, die Arten von Wirtszellen, die für die Expression von erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen geeignet sind, in irgendeiner Weise zu beschränken.
So wie hier verwendet, betreffen Expressionsvektoren irgendeine Art von Vektor, der manipuliert werden kann, um eine Nukleinsäuresequenz, die für ABCR kodiert, zu enthalten, wie Plasmid Expressionsvektoren, virale Vektoren und Hefe Expressionsvektoren. Die Auswahl des Expressionsvektors beruht auf der Verträglichkeit mit der gewünschten Wirtszelle, so dass es zur Expression der Nukleinsäure, die für ABCR kodiert, kommt. Plasmid Expressionsvektoren umfassen eine erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz, die operativ mit mindestens einem Expressionskontrollelement, wie einem Promotor, verbunden ist. Im Allgemeinen enthalten Plasmidvektoren Replikon- und Kontrollsequenzen, die von Spezies abgeleitet sind, die mit der Wirtszelle verträglich sind. Um die Selektion von Plasmiden zu erleichtern, welche die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen enthalten, können Plasmidvektoren auch einen selektierbaren Marker, wie ein Gen, das für eine Antibiotikaresistenz kodiert, enthalten. Geeignete Beispiele schließen die Gene ein, die für Ampicillin-, Tetracyclin-, Chloramphenicol- oder Kanamycinresistenz kodieren.
Geeignete Expressionsvektoren, Promotoren, Verstärker und andere Expressionskontrollelemente sind im Stand der Technik bekannt und können in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, zweite Auflage, Cold Spring Har bor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989), das hier durch Bezugnahme in seiner Gesamtheit eingeschlossen ist, gefunden werden.
Transformierte Wirtszellen, die eine DNA-Sequenz enthalten, die für ABCR kodiert, können anschließend in einem für den Wirt geeigneten Medium angezogen werden. Die Zellen werden anschließend angezogen, bis die Produktanhäufung gewünschte Mengen erreicht, zu welcher Zeit die Zellen anschließend geerntet und das Proteinprodukt in Übereinstimmung mit herkömmlichen Techniken gereinigt wird. Geeignete Reinigungsverfahren schließen ein, aber sind nicht beschränkt auf SDS PAGE Elektrophorese, Phenylboronat-Agarose, reaktive grüne 19-Agarose, Concanavalin A Sepharose, Ionenaustauschchromatographie, Affinitätschromatographie, Elektrophorese, Dialyse und andere Reinigungsverfahren, die im Stand der Technik bekannt sind.
Proteinpräparationen von gereinigtem oder nicht gereinigtem ABCR durch Wirtszellen werden folglich hergestellt, die ABCR oder anderes Material, wie Wirtszellbestandteile und/oder Zellmedium, in Abhängigkeit von dem Reinigungsgrad des Proteins, enthalten.
Die Erfindung schließt auch ein transgenes nicht humanes Tier, einschließlich und nicht beschränkt auf Säuger als solche und nicht beschränkt auf Maus, Ratte oder Hamster, ein, das eine Sequenz, die für ABCR kodiert, oder ein Fragment davon, das im Wesentlichen eine ABCR-Aktivität behält, eingeführt in das Tier oder einen Vorfahr des Tieres enthält. Die Sequenz kann Wildtyp oder mutiert sein, und sie kann in das Tier im embryonalen oder adulten Zustand eingeführt werden. Die Sequenz wird in das Genom eines Tieres eingebaut, so dass es chromsomal in einem aktiven Zustand eingebaut ist. Ein transgenes nicht humanes Tier besitzt Keimzellen und somatische Zellen, die eine ABCR-Sequenz enthalten. Embryozellen können mit dem Gen, so wie es natürlicherweise auftritt, transfiziert werden, und transgene Tiere, in denen das Gen in ein Chromosom an einem Locus, der zu einer Aktivierung führt, integriert wurde, werden ausgewählt. Andere Aktivierungsverfahren schließen das Modifizieren des Gens oder seiner Kontrollsequenzen vor dem Einführen in den Embryo ein. Der Embryo kann unter Verwendung eines Vektors, der das Gen enthält, transfiziert werden.
Zusätzlich kann ein transgenes nicht humanes Tier hergestellt werden, in dem ABCR unterdrückt ist. Zum Zweck der Erfindung schließt das Unterdrücken von ABCR ein und ist nicht beschränkt auf Strategien, die bewirken, dass ABCR nicht exprimiert wird. Solche Strategien können einschließen und sind nicht beschränkt auf das Inhibieren von Proteinsynthese, prä-mRNA Verarbeitung oder DNA-Replikation. Jede der oben genannten Strategien kann durch Antisense Inhibierung von ABCR-Genexpression erreicht werden. Viele Techniken zum Einführen von Antisense Sequenzen in Zellen sind dem Fachmann bekannt, einschließlich und nicht beschränkt auf Mikroinjektion, viral vermitteltem Transfer, somatischer Zelltransformation, Transgenintegration und ähnlichem, wie in Pinkert, Carl, Transgenic Animal Technology, 1994, Academic Press, Inc., San Diego, CA, das hier in seiner Gesamtheit durch Bezugnahme eingeschlossen ist, beschrieben sind.
Weiterhin kann ein transgenes nicht humanes Tier hergestellt werden, so dass ABCR ausgeknockt ist. Für die Zwecke der Erfindung schließt ein Knockout ein und ist nicht beschränkt auf die Zerstörung oder das Ruhigstellen des ABCR-Gens. Ein Knockout kann zum Beispiel mit Antisense Sequenzen für ABCR erreicht werden. Das ABCR Gen kann durch Injektion einer Antisense Sequenz für die gesamte oder einen Teil der ABCR-Sequenz, wie eine Antisense Sequenz für die gesamte oder einen Teil von SEQ ID NR: 2, ausgeknockt werden. Sobald ABCR ruhiggestellt wurde, kann die Korrelation von ABCR gegenüber Makuladegeneration untersucht werden. Es können Sequenzen, welche Mutationen kodieren, die das ABCR beeinflussen, eingeführt werden, um Veränderungen in verschiedenen retinalen und Makuladegenerationen zu untersuchen, die durch Veränderungen in den Merkmalen, die mit retinaler und Makuladegeneration assoziiert sind, gezeigt werden.
Ein nicht humaner ABCR Knockout kann durch Einführen von synthetischer DNA in das Tierchromosom durch homologe Rekombination hergestellt werden. In diesem Verfahren sind die Sequenzen, welche die Ziel- und Insert DNA flankieren, identisch, was es erlaubt, dass Strangaustausch und Überkreuzen zwischen der Ziel- und Insert DNA stattfindet. Einzuführende Sequenzen schließen typischerweise ein Gen für einen Selektionsmarker, wie eine Arzneimittelresistenz ein. Sequenzen auf die abgezielt wird, kodieren typischerweise Regionen des Genoms, in diesem Fall einen Teil des ABCR-Gens. In diesem Verfahren der homologen Rekombination werden die Zielsequenzen gegen Insertsequenzen ausgetauscht, wodurch das Zielgen zerstört und es nicht funktionell wird. Dieses nicht funktionelle Gen wird als Nullallel des Gens bezeichnet.
Um eine Knockout Maus herzustellen wird ein DNA Konstrukt hergestellt, das die Insert DNA und flankierende Sequenzen enthält. Dieses DNA-Konstrukt wird in pluripotente embryonale Stammzellen, die rekombinationskompetent sind, transfiziert. Die identischen flankierenden Sequenzen richten sich miteinander aus, und die chromosomale Rekombination findet statt, in der die Zielsequenz durch die Insertsequenz ausgetauscht wird, wie in Bradley, A., Production and Analysis of Chimeric Mice, in Teratocarcinomas and Embrymonic Stem Cells - A Practical Approach, 1987, E. Roberson, Herausgeber, IRP Press, Seiten 113- 151, beschrieben ist. Die Stammzellen werden in einen Embryo injiziert, der anschließend in ein weibliches Tier implantiert und geboren wird. Die Tiere können Keimzellen enthalten, die von den injizierten Stammzellen abgeleitet sind, und anschließendes Verschmelzen kann Tiere bilden, die heterozygot und homozygot hinsichtlich des zerstörten Gens sind.
Transgene nicht humane Tiere können auch nützlich für das Untersuchen von Nukleinsäureveränderungen sein, um zusätzliche Mutationen zu identifizieren, die für Makuladegeneration verantwortlich sind. Ein transgenes nicht humanes Tier kann ein rekombinantes ABCR enthalten.
Der Begriff "gereinigt", wenn er verwendet wird, um den Zustand von erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen zu beschreiben, betrifft Nukleinsäuresequenzen, die im Wesentlichen frei von Nukleinsäure, die nicht für ABCR kodiert oder anderen Materialien, die normalerweise mit Nukleinsäure in nicht rekombinanten Zellen assoziiert sind, d.h. in ihrem "nativen Zustand", sind.
Der Begriff "gereinigt" oder "in gereinigter Form", wenn er verwendet wird, um den Zustand einer/eines ABCR-Nukleinsäure, -Proteins, -Polypeptids oder Aminosäuresequenz zu beschreiben, betrifft die Sequenzen, die im Wesentlichen frei, bis mindestens einem bestimmten Grad, von zellulärem Material oder anderem Material, das normalerweise mit ihm in seinem natürlichen Zustand assoziiert ist, sind. Vorzugsweise besitzt die Sequenz eine Reinheit (Homogenität) von mindestens ungefähr 25 % bis ungefähr 100 %. Weiter bevorzugt ist die Reinheit mindestens ungefähr 50 %, wenn sie in Übereinstimmung mit Standardtechniken, die im Stand der Technik bekannt sind, gereinigt wird.
In Übereinstimmung mit erfindungsgemäßen Verfahren werden Verfahren zum Nachweisen von retinalen oder Makuladegenerationen in einem Patienten bereitgestellt, umfassend das Erhalten einer Gewebeprobe eines Patienten zum Testen. Die Gewebeprobe kann fest oder flüssig sein, eine Körpertlüssigkeitsprobe, wie und nicht beschränkt auf Blut, Haut, Serum, Speichel, Sputum, Schleim, Knochenmark, Urin, Lymphe, und einer Träne, und Stuhl. Zusätzlich kann eine Gewebeprobe aus Fruchtwasser oder Chorion für den Nachweis von retinaler oder Makuladegeneration in utero in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung bereitgestellt werden.
Ein Testfragment ist hier definiert als eine amplifizierte Probe, die ABCR spezifische Nukleinsäuren von einem Patienten enthält, der unter dem Verdacht steht, eine retinale oder Makuladegeneration aufzuweisen. Ein Kontrollfragment ist eine amplifizierte Probe, die normale oder Wildtyp-ABCR spezifische Nukleinsäuren von einem Individuum enthält, das nicht unter dem Verdacht steht, eine retinale oder Makuladegeneration aufzuweisen.
Das Verfahren zum Amplifizieren von Nukleinsäuren kann eine Polymerase-Kettenreaktion unter Verwendung eines Primer-Paares sein, wobei mindestens ein Primer innerhalb des Paares aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus SEQ ID NRn: 40-61, 64, 65, 78, 79, 98-105, 108 und 109 besteht. Wenn die Polymerase-Kettenreaktion das gewählte Amplifikationsverfahren ist, kann ein Primer-Paar verwendet werden, so dass ein Primer des Paares aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus SEQ ID NRn: 40-61, 64, 65, 78, 79, 98-105, 108 und 109 besteht.
Nukleinsäuren, wie DNA (als solche und nicht beschränkt auf genomische DNA und cDNA) und/oder RNA (als solche und nicht beschränkt auf mRNA) werden aus einer Patientenprobe erhalten. Vorzugsweise wird RNA erhalten.
Die Nukleinsäureextraktion wird durch die Amplifikation derselben durch irgendeine Technik, die im Stand der Technik bekannt ist, gefolgt. Der Amplifikationsschritt schließt die Verwendung mindestens einer Primersequenz ein, die komplementär zu einem Teil der ABCR spezifisch exprimierten Nukleinsäuren oder Sequenzen, welche die intronischen genomischen Sequenzen flankieren, ist, um ein Exon oder kodierende Sequenzen zu amplifizieren. Primersequenzen, die in den Amplifikationsverfahren nützlich sind, schließen ein und sind nicht beschränkt auf SEQ ID NRn: 40-61, 64, 65, 78, 79, 98-105, 108 und 109, die in den Amplifikationsverfahren verwendet werden können. Irgendeine Primersequenz von ungefähr 10 Nukleotiden bis ungefähr 35 Nukleotiden, weiter bevorzugt ungefähr 15 Nukleotiden bis ungefähr 30 Nukleotiden, noch weiter bevorzugt ungefähr 17 Nukleotiden bis ungefähr 25 Nukleotiden kann in dem Amplifikationsschritt der erfindungsgemäßen Verfahren nützlich sein. Zusätzlich fallen Fehlpaarungen innerhalb der oben identifizierten Sequenzen, welche durch die erfindungsgemäßen Verfahren erhalten werden, so dass die fehlgepaarten Sequenzen im Wesentlichen komplementär sind und somit an die zu identifizierende Sequenz hybridisieren, auch innerhalb den Schutzbereich der Offenbarung. Fehlpaarungen, die eine im Wesentlichen Ähnlichkeit zu SEQ ID NRn: 40-61, 64, 65, 78, 79, 98-105, 108 und 109 als solche und nicht beschränkt auf die Sequenzen mit ähnlicher Hydrophobizität, Hydrophili zität, Basizität und Azidität erlauben, sind dem Fachmann bekannt, sobald er mit der vorliegenden Offenbarung ausgestattet ist. Die Primer können auch unmodifiziert oder modifiziert sein. Die Primer können durch irgendein Verfahren, das im Stand der Technik bekannt ist, wie Standard Phosphoramidit Chemie hergestellt werden. Siehe Sambrook et al., supra.
Das Verfahren zum Amplifizieren von Nukleinsäuren kann die Polymerase-Kettenreaktion unter Verwendung eines Primer-Paares sein, wobei mindestens ein Primer innerhalb des Paares aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus SEQ ID NRn: 40-61, 64, 65, 78, 79, 98-105, 108 und 109 besteht. Wenn die Polymerase-Kettenreaktion das gewählte Amplifikationsverfahren ist, kann ein Primer-Paar verwendet werden, so dass ein Primer des Paares aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus SEQ ID NRn: 40-61, 64, 65, 78, 79, 98-105, 108 und 109 besteht.
Wenn ein Amplifikationsverfahren die Verwendung von zwei Primern, einem ersten Primer und einem zweiten Primer, wie in der Polymerase-Kettenreaktion einschließt, kann einer des ersten oder des zweiten Primers aus der Gruppe ausgewählt sein, die aus SEQ ID NRn: 40-61, 64, 65, 78, 79, 98-105, 108 und 109 besteht. Jedes Primer-Paar, das Nukleinsäuren zwischen den Paaren, die aufeinander zu gerichtet sind, kopiert und amplifiziert und die spezifisch für ABCR sind, können in Übereinstimmung mit den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden.
Eine Vielzahl von matrizenabhängigen Verfahren stehen zur Verfügung, um die interessierenden Zielsequenzen, die in einer Probe vorhanden sind, zu amplifizieren. Eines der bekanntesten Amplifikationsverfahren ist die Polymerase-Kettenreaktion (PCR), die detailliert in den US Patenten 4,683,195, 4,683,202 und 4,800,159 und in Innis et al., PCR Protocols, Academic Press, Inc., San Diego CA, 1990 beschrieben sind. In kürze werden in der PCR zwei Primersequenzen hergestellt, die komplementär zu Regionen auf gegenüberliegenden komplementären Strängen einer Zielsequenz sind. Ein Überschuss von Desoxinukleosidtriphosphaten wird zu einem Reaktionsgemisch zusammen mit einer DNA Polymerase (z.B., Taq Polymerase) zugegeben. Wenn die Zielsequenz in einer Probe anwesend ist, werden die Primer an das Ziel binden, und die Polymerase wird bewirken, dass die Primer entlang der Zielsequenz durch Zugeben von Nukleotiden verlängert werden. Durch Anheben oder Absenken der Temperatur des Reaktionsgemisches werden die verlängerten Primer von dem Ziel dissoziieren, um Reaktionsprodukte zu bilden, überschüssige Primer werden an das Ziel und die Reaktionsprodukte binden und der Vorgang wird wiederholt. Alternativ kann ein reverse Transkriptase PCR Amplifikationsverfahren durchgeführt werden, um die Menge an amplifizierter mRNA zu quantifizieren. Polymerase-Kettenreaktionsverfahren sind im Stand der Technik gut bekannt.
Ein anderes Verfahren zum Amplifizieren ist die Ligase-Kettenreaktion (als LCR bezeichnet), die in der EPA Nr. 320,308 offenbart ist. In der LCR werden zwei komplementäre Sondenprimer hergestellt, und in der Anwesenheit der Zielsequenz wird jedes Paar an gegenüberliegende komplementäre Stränge des Ziels binden, so dass sie aneinander stoßen. In der Anwesenheit einer Ligase werden sich die zwei Sondenpaare verknüpfen, um eine einzige Einheit zu bilden. Durch Temperaturänderung, wie in der PCR, dissoziieren gebundene ligierte Einheiten von dem Ziel und dienen anschließend als "Zielsequenzen" für die Ligation von überschüssigen Sondenpaaren. Das US Patent 4,883,750 beschreibt ein alternatives Verfahren zum Amplifizieren, ähnlich der LCR, für das Binden von Sondenpaaren an eine Zielsequenz.
Qbeta Replikase, beschrieben in der PCT Anmeldung Nr. PCT/US87/00880 kann ebenfalls als ein noch anderes Amplifikationsverfahren in der vorliegenden Erfindung verwendet werden. In diesem Verfahren wird eine replikative Sequenz von RNA, die eine Region komplementär zu jener des Ziels aufweist, zu einer Probe in der Anwesenheit einer RNA Polymerase zugegeben. Die Polymerase wird die replikative Sequenz kopieren, die anschließend nachgewiesen werden kann.
Ein isothermes Amplifikationsverfahren, in dem Restriktionsendonukleasen und Ligasen verwendet werden, um die Amplifikation von Zielmolekülen zu erreichen, die Nukleotid 5'-[alpha-Thio]triphosphate in einem Strang einer Restriktionsstelle enthalten (Walker, G. T. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 1992, 89:392-396) kann ebenfalls in der Amplifikation von erfindungsgemäßen Nuleinsäuren nützlich sein.
Strangaustausch Amplifikation (Strand Displacement Amplification (SDA)) ist ein anderes Verfahren zum Durchführen von isothermischer Amplifikation von Nukleinsäuren, die mehrfache Runden von Strangaustausch und Synthese, d.h. Nick Translation einschließt. Ein ähnliches Verfahren, das als Reparatur Ketten Reaktion (Repair Chain Reaction (RCR)) bezeichnet wird, ist ein anderes Amplifikationsverfahren, das in der vorliegenden Erfindung nützlich sein kann und das Anlagern einiger Sonden über eine Region, auf die hinsichtlich Amplifikation abgezielt wird, gefolgt von einer Reparaturreaktion, in der nur zwei von vier Basen anwesend sind, einschließt. Die zwei anderen Basen können als biotinylierte Derivate für den einfachen Nachweis zugegeben werden. Ein ähnlicher Ansatz wird in der SDA verwendet.
ABCR spezifische Nukleinsäuren können auch unter Verwendung einer zyklischen Sondenreaktion (cyclic probe reaction (CPR)) nachgewiesen werden. In der CPR wird eine Sonde mit 3' und 5' Sequenzen von nicht-ABCR spezifischer DNA und Mittelsequenzen von ABCR spezifischer RNA an DNA hybridisiert, die in einer Probe anwesend ist. Nach der Hybridisierung wird die Reaktion mit RNaseH behandelt, und die Produkte der Sonde, die als einzelne Produkte identifiziert werden, bilden ein Signal, das nach der Spaltung freigesetzt wird. Die ursprüngliche Matrize wird an eine andere Zyklussonde angelagert, und die Reaktion wird wiederholt. Somit schließt die CPR das Amplifizieren eines Signals ein, das durch Hybridisierung einer Sonde an eine ABCR spezifische exprimierte Nukleinsäure gebildet wird.
Noch andere Amplifikationsverfahren, die in der GB Anmeldung Nr. 2 202 328 und in der PCT Anmeldung Nr. PCT/US89/01025 beschrieben sind, können in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden. In der zuerst ge nannten Anmeldung werden "modifizierte" Primer in einer PCR ähnlichen, matrizen- und enzymabhängigen Synthese verwendet. Diese Primer können durch Markieren mit einem Fängerrest (z.B. Biotin) und/oder einem Nachweisrest (z.B. Enzym) modifiziert sein. In der zuletzt genannten Anmeldung wird ein Überschuss an markierten Sonden zu einer Probe zugegeben. In der Anwesenheit der Zielsequenz bindet die Sonde und wird katalytisch gespalten. Nach der Spaltung wird die Zielsequenz intakt freigesetzt, um durch überschüssige Sonde gebunden zu werden. Die Spaltung der markierten Sonde signalisiert die Anwesenheit der Zielsequenz.
Andere Nukleinsäure Amplifikationsverfahren schließen transkriptionsbasierte Amplifikationssysteme (TAS) (Kwoh, D., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 1989, 86:1173, Gingeras T. R. et al., PCT Anmeldung WO 88/10315), einschließlich Nukleinsäuresequenz basierter Amplifikation (NASBA) und 3SR, ein. In der NASBA können Nukleinsäuren zur Amplifikation durch Standard Phenol/Chloroform Extraktion, Hitzedenaturierung einer klinischen Probe, Behandlung mit Lysepuffer und Minispinsäulen zur Isolierung von DNA und RNA oder Guanidinchlorid Extraktion von RNA hergestellt werden. Diese Amplifikationstechniken schließen das Anlagern eines Primers, der ABCR spezifische Sequenzen enthält, ein. Nach der Polymerisierung werden die DNA/RNA Hybride mit RNase H gespalten, während doppelsträngige DNA-Moleküle erneut hitzedenaturiert werden. In jedem Fall wird die einzelsträngige DNA durch Zugeben eines zweiten ABCR spezifischen Primers, gefolgt von Polymerisierung vollständig doppelsträngig gemacht. Die doppelsträngigen DNA-Moleküle werden anschließend mehrfach durch eine Polymerase, wie T7 oder SP6 transkribiert. In einer isothermen zyklischen Reaktion werden die RNAs in doppelsträngige DNA revers transkribiert, und nochmals mit einer Polymerase, wie T7 oder SP6, transkribiert. Die resultierenden Produkte, entweder verkürzt oder vollständig, zeigen ABCR spezifische Sequenzen an.
Davey, C., et al, europäische Patentanmeldungsveröffentlichung Nr. 329,822 offenbart ein Nukleinsäure Amplifikationsverfahren, welches das zyklische Syntheti sieren einzelsträngiger RNA ("ssRNA"), ssRNA und doppelsträngiger DNA ("dsDNA") einschließt, das in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann. Die ssRNA ist eine erste Matrize für ein erstes Primeroligonukleotid, das durch reverse Transkriptase (RNA abhängige DNA Polymerase) verlängert wird. Die RNA wird anschließend von dem resultierenden DNA:RNA Duplex durch die Wirkung von Ribonuklease H (RNase H, eine RNase, die spezifisch für RNA in einem Duplex mit entweder DNA oder RNA ist) entfernt. Die resultierende ssRNA ist eine zweite Matrize für einen zweiten Primer, die auch die Sequenzen für einen RNA Polymerasepromotor (beispielhaft T7 RNA Polymerase) 5' zu seiner Homologie zu seiner Matrize, einschließt. Dieser Primer wird anschließend durch DNA Polymerase (beispielhaft das große "Klenow" Fragment von E. coli DNA Polymerase I) verlängert, was zu einem doppelsträngigen DNA ("dsDNA") Molekül mit einer Sequenz identisch zu jener der ursprünglichen RNA zwischen den Primern und mit zusätzlich einer Promotorsequenz an einem Ende, führt. Diese Promotorsequenz kann durch die geeignete RNA Polymerase verwendet werden, um viele RNA Kopien der DNA herzustellen. Diese Kopien können anschließend erneut in den Zyklus eintreten, was zu sehr schneller Amplifikation führt. Mit der geeigneten Wahl von Enzymen kann diese Amplifikation isothermisch ohne das Zugeben von Enzymen zu jedem Zyklus durchgeführt werden. Aufgrund der zyklischen Natur dieses Vorgangs kann die Ausgangssequenz in der Form von entweder DNA oder RNA ausgewählt werden.
Miller, H. I., et al., PCT Anmeldung WO 89/06700 offenbart ein Nukleinsäuresequenz Amplifikationsschema, das auf der Hybridisierung einer Promotor/Primersequenz an eine Ziel einzelsträngige DNA ("ssDNA"), gefolgt durch Transkription von vielen RNA Kopien der Sequenz beruht. Dieses Schema ist nicht zyklisch; d.h. neue Matrizen werden nicht aus den resultierenden RNA Transkripten gebildet. Andere Amplifikationsverfahren schließen "race" ein, die von Frohmann, M. A., in: PCR protocols: A Guide to Methods and Applications 1990, Academic Press, N.Y.) und "einseitige PCR" (Ohara, O., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 1989, 86:5673-5677) offenbart wird.
Verfahren, die auf der Ligation von zwei (oder mehr) Oligonukleotiden in der Anwesenheit von Nukleinsäure mit der Sequenz des resultierenden "di-Oligonukleotids", wodurch die di-Oligonukleotide amplifiziert werden, beruhen (Wu, D. Y. et al., Genomics, 1989, 4:560) können auch in dem Amplifikationsschritt der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Das Testfragment und das Kontrollfragment kann durch irgendwelche Amplifikationsverfahren, die dem Fachmann bekannt sind, amplifiziert werden, einschließlich und nicht beschränkt auf die Amplifikationsverfahren, die hier angegeben sind. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung schließt die Amplifikation von Sequenzen, die Patienten- und Wildtyp-ABCR kodiern, die Amplifikation eines Teils einer Sequenz als solche und nicht beschränkt auf einen Teil einer ABCR-Sequenz von SEQ ID NR: 1, wie einer Sequenz einer Länge von ungefähr 10 Nukleotiden bis ungefähr 1.000 Nukleotiden, weiter bevorzugt ungefähr 10 Nukleotiden bis ungefähr 100 Nukleotiden oder mit mindestens 10 Nukleotiden, die irgendwo innerhalb der SEQ ID NR: 1, wo bekannt ist, dass Sequenzunterschiede innerhalb der ABCR Testfragmente auftreten, ein. So können zum Beispiel ein Teil der Sequenz, die ABCR einer Patientenprobe und einer Kontrollprobe kodiert, amplifiziert werden, um Sequenzunterschiede zwischen diesen zwei Sequenzen nachzuweisen.
Nach der Amplifikation des Testfragments und des Kontrollfragments wird ein Vergleich zwischen den Amplifikationsprodukten des Testfragments und des Kontrollfragments durchgeführt. Sequenzänderungen, wie und nicht beschränkt auf Nukleinsäure-Transition, -Transversion und Restriktionsspaltungsmusterveränderungen können durch Vergleich des Testfragments mit dem Kontrollfragment nachgewiesen werden.
Alternativ dazu kann die Anwesenheit oder Abwesenheit des Amplifikationsprodukts nachgewiesen werden. Die Nukleinsäuren werden in verschiedene Größen von einzelnen Fragmenten fragmentiert. Zum Beispiel können DNA-Fragmente nach dem Molekulargewicht durch Verfahren wie, und nicht beschränkt auf, Elektrophorese durch eine Agarosegelmatrix getrennt werden. Die Gele werden anschließend durch Southern Hybridisierung analysiert. In kürze wird die DNA in dem Gel auf ein/eine Hybridisierungssubstrat oder -matrix, wie und nicht beschränkt auf ein Nitrocelluloseblatt und eine Nitrocellulosemembran transferiert. Eine markierte Sonde, die eine ABCR-Mutation kodiert, wird auf die Matrix unter gewählten Hybridisierungsbedingungen aufgebracht, so dass sie mit komplementärer DNA, die auf der Matrix angeordnet ist, hybridisiert. Die Sonde kann eine Länge aufweisen, die befähigt ist, einen stabilen Duplex zu bilden. Die Sonde kann eine Größe im Bereich von ungefähr 200 bis ungefähr 10.000 Nukleotide in der Länge, vorzugsweise ungefähr 500 Nukleotide in der Länge und weiter bevorzugt ungefähr 2.454 Nukleotide in der Länge aufweisen. Fehlpaarungen, die eine wesentliche Ähnlichkeit zu der Sonde erlauben, wie und nicht beschränkt auf Sequenzen mit ähnlicher Hydrophobizität, Hydrophilizität, Basizität und Azidität, sind dem Fachmann bekannt, sobald er mit der vorliegenden Offenbarung ausgestattet ist. Verschiedene Markierungen zur Sichtbarmachung und zum Nachweis sind dem Fachmann bekannt, wie und nicht beschränkt auf Fluoreszenzfärbung, zum Beispiel Ethidiumbromidfärbung, Avidin/Biotin, radioaktive Markierung, wie ³²P Markierung und ähnliches. Vorzugsweise kann das Produkt, wie das PCR Produkt, auf einem Agarosegel laufen gelassen und unter Verwendung einer Färbung, wie Ethidiumbromid sichtbar gemacht werden. Siehe Sambrook et al., supra. Die Matrix kann anschließend durch Autoradiographie analysiert werden, um besondere Fragmente, die mit der Sonde hybridisieren, zu lokalisieren. Noch eine andere Alternative ist das Sequenzieren des Testfragments und des Kontrollfragments, um Sequenzunterschiede zu identifizieren. Verfahren zur Nukleinsäuresequenzierung sind dem Fachmann bekannt, einschließlich und nicht beschränkt auf die Verfahren von Maxam und Gilbert, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1977, 74: 560-564 und Sanger, Proc. Natl. Acad. Sic. USA 1977, 74:5463-5467.
Eine pharmazeutische Zusammensetzung, welche die gesamte oder einen Teil einer Sequenz für ABCR umfasst, kann an einen Patienten verabreicht werden, der unter dem Verdacht steht, eine retinale oder Makuladegeneration aufzuweisen. Die Sequenz kann eine Antisense Sequenz sein. Die erfindungsgemäße Zu sammensetzung kann alleine verabreicht werden oder kann im Allgemeinen in Beimischung mit einem pharmazeutischen Träger verabreicht werden. Der pharmazeutisch verträgliche Träger kann hinsichtlich dem beabsichtigten Verabreichungsweg und der Standard pharmazeutischen Praxis ausgewählt werden. Die Dosierung wird ungefähr jener der Sequenz alleine entsprechen und wird bezüglich des Gewichts und dem klinischen Zustand des Patienten festgesetzt. Das proportionale Verhältnis von aktivem Bestandteil zu Träger wird natürlicherweise, inter alia von der chemischen Natur, Löslichkeit und Stabilität der Sequenz, ebenso wie der verwendeten Dosis, abhängen.
Die erfindungsgemäßen Sequenzen können in dem erfindungsgemäßen Verfahren einzeln oder in Kombination mit anderen Verbindungen verwendet werden, einschließlich und nicht beschränkt auf andere Sequenzen, die in der vorliegenden Erfindung angegeben sind. Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch in Verbindung mit anderen Behandlungen verwendet werden, wie zum Beispiel und nicht beschränkt auf Antikörper. Für in vivo Anwendungen wird die zu verabreichende Menge auch von solchen Faktoren wie dem Alter, Gewicht und klinischen Zustand des Patienten abhängen. Die erfindungsgemäße Zusammensetzung kann über irgendeinen geeigneten Weg, einschließlich einem Augentropfen, Inokulation oder Injektion zum Beispiel intravenös, intraokular, oral, intraperitoneal, intramuskulär, subkutan, topisch und durch Absorption durch epitheliale oder mukokutane Ausgestaltungen, zum Beispiel konjunktival, nasal, oral, vaginal, rektal und gastrointestinal, verabreicht werden.
Die Art und Weise der Verabreichung der Zusammensetzung kann die Stellen in dem Organismus bestimmen, an welche die Verbindung transportiert werden wird. Zum Beispiel kann eine topische Verabreichung durch Cremes, Salben, Gele, Öle, Emulsionen, Pasten, Lotionen und ähnliches verabreicht werden. Für die parenterale Verabreichung kann die Zusammensetzung in der Form von steriler wässriger oder nicht wässriger Lösung verwendet werden, die einen anderen löslichen Stoff, zum Beispiel ausreichend Salze, Glucose oder Dextrose, um die Lösung isotonisch zu machen, enthält. Eine nicht wässrige Lösung kann zum Beispiel ein Öl enthalten. Für die orale Art und Weise der Verabreichung kann die vorliegende Erfindung in der Form von Tabletten, Kapseln, Hustenbonbons, Pastillen, Pulvern, Sirupen, Elexieren, wässrigen Lösungen und Suspensionen und ähnlichem verwendet werden. Verschiedene Zersetzungsmittel, wie Stärke und Gleitmittel können verwendet werden. Für die orale Verabreichung in Kapselform sind nützliche Verdünnungsmittel Lactose und Polyethylenglykole mit hohem Molekulargewicht. Wenn wässrige Suspensionen für die orale Verwendung benötigt werden, können bestimmte Süß- und/oder Geschmacksmittel zugegeben werden.
Ein diagnostischer Kit zum Nachweisen retinaler oder Makuladegeneration, der in einem oder mehreren Behältern mindestens einen Primer, der komplementär zu einer ABCR-Sequenz ist, und ein Mittel zum Sichtbarmachen von amplifizierter DNA umfasst, liegt ebenfalls innerhalb des Schutzbereichs der vorliegenden Erfindung. Alternativ dazu kann der Kit zwei Primer umfassen. In jedem Fall können die Primer aus der Gruppe ausgewählt werden, die zum Beispiel aus den SEQ ID NRn: 40-61, 64, 65, 78, 79, 98-105, 108 und 109 besteht. Der diagnostische Kit kann ein Primer-Paar, wobei ein Primer innerhalb des Paares komplementär zu einer Region des ABCR-Gens ist, wobei einer der Primer des Paares aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus SEQ ID NRn: 40-61, 64, 65, 78, 79, 98-105, 108 und 109 besteht, eine Sonde, die spezifisch für das amplifizierte Produkt ist und ein Mittel zum Sichtbarmachen von amplifizierter DNA und gegebenenfalls einschließlich einem oder mehreren Größenmarkern und positiven und negativen Kontrollen, aufweisen. Der erfindungsgemäße diagnostische Kit kann einen oder mehrere eines Fluoreszenzfarbstoffs, wie Ethidiumbromidfärbung, ³²P und Biotin als ein Mittel zum Sichtbarmachen oder Nachweisen von amplifizierter DNA aufweisen. Gegebenenfalls kann der Kit einen oder mehrere Größenmarker, positive und negative Kontrollen, Restriktionsenzyme und/oder eine Sonde, die spezifisch für das amplifizierte Produkt ist, einschließen.
Die folgenden Beispiele sind beispielhaft, und sie beabsichtigen nicht die Erfindung einzuschränken.
BEISPIELE:
Identifizierung des ABCR als ein Kandidatengen für STGD
Eines der 21 neuen humanen Gene aus der ABC-Superfamilie, hier im Folgenden als ABCR (Retina-spezifischer ABC-Transporter) bezeichnet, wurde identifiziert (Allikmets et al., 1996) unter den exprimierten Sequenztags (ESTs), die aus 5.000 humanen Retina cDNA Klonen erhalten wurden (Wang, Y., Macke, J.P., Abella, B.S., Andreasson, K., Worley, P., Gilbert, D.J., Copeland, N.G., Jenkins, N.A. und Nathans, J. (1996)) und unter ESTs, die aus humanen Retina cDNA Klonen durch das I.M.A.G.E. Konsortium erhalten wurden (Lennon et al., 1996). ABCR ist nahe verwandt zu den zuvor beschriebenen Maus und humanen ABC1 und ABC2 Genen (Luciani et al., 1994; Allikmets et al., 1995). Um zu bestimmen, ob ABCR eine Erkrankung verursachen könnte, wurde das Gen mit einem Gesamtgenom Strahlungshybrid Panel (GeneBridge 4; Research Genetics, Huntsville, AL) kartiert. ABCR wurde auf die humane Chromosom 1p13-p21 Region, nach den Mikrosatellitenmarkern D1S236 und D1S188 kartiert. Um die Lage des Gens weiter zu definieren wurden PCR Primer, 3'UTR-For 5'ATCCTCTGACTCAGCAATCACA, SEQ ID NR: 7 und 3'UTR-Rev 5'TTGCAATTACAAATGCAATGG, SEQ ID NR: 8 für die mögliche 3' nicht translatierte Region verwendet, um YACs aus dem zuvor beschriebenen Contig zwischen diesen unbekannten Markern zu screenen (Anderson et al., 1995). Mindestens 12 YACs enthalten das 3' Ende des ABCR Gens, einschließlich 924_e_9, 759_d _, 775_c_2, 782_b_4, 982_g_5, 775_b_2, 765_a_3, 751_f_2, 848_e_3, 943_h_8, 934_g_7 und 944_b_12 (1). Diese YACs begrenzen eine Region, die das STGD Gen zwischen den Markern D1S3361 und D1S236 enthalten (Anderson et al., 1995).
Expression des ABCR-Gens
Zusätzliche Unterstützung, die nahe legt, dass ABCR ein Kandidaten STGD Gen ist, kam von Expressionsstudien und Inspektion der EST Datenbanken.
Es wurden Recherchen in der dbEST (Boguski et al., 1993) Datenbank mit BLAST auf dem NCBI File Server (Altschul et al., 1990) durchgeführt. Es wurden Aminosäure Anordnungen mit PILEUP (Feng und Doolittle, 1987) hergestellt. Die Sequenzen wurden mit Programmen des Genetics Computer Group Pakets (Devereaux et al., 1984) auf einem VAX Computer durchgeführt.
Es wurden Klone, die dem Mausortholog des humanen ABCR-Gens entsprechen, aus der Mausretina cDNA Bibliothek isoliert und an den Enden sequenziert. Die chromosomale Anordnung des Maus ABCR-Gens wurde auf dem The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) interspezifischen Rückgrat Kartierungspanel (C57BL/6JEi X SPRET/Ei)F1 X SPRET/Ei (Rowe et al., 1994), bekannt als Jackson BSS, bestimmt. Die Kartierung wurde durch SSCP Analyse mit den Primern MABCR1F 5'ATC CAT ACC CTT CCC ACT CC, SEQ ID NR: 9, und MABCR1R 5' GCA GCA GAA GAT AAG CAC ACC, SEQ ID NR: 10, durchgeführt. Das allele Muster des ABCR wurde mit den 250 anderen Loci verglichen, die zuvor in dem Jackson BSS Kreuz (http://www.jax.org) kartiert worden waren.
Die DNA-Fragmente, die als Sonden verwendet wurden, wurden auf einem 1 %, bei niedriger Temperatur schmelzenden Agarosegel gereinigt. Die Sondensequenzen sind innerhalb der genomischen Sequenz von SEQ ID NR: 1 und 3A-H angegeben. Die DNA wurde direkt in Agarose mit dem Random Primed DNA Markierungskit (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) markiert und mit Mehrfachgewebe Northern Blot und einem Master Blot (Clontech, Palo Alto, CA) nach den Anweisungen des Herstellers hybridisiert. Jeder Blot enthielt 2 μg poly A⁺ RNA aus verschiedenen humanen Geweben. Es wurde Gesamt RNA aus adulten Rattengeweben unter Verwendung des Guanidinthiocyanat Verfahrens (Chomczynski und Saachi, 1987) isoliert und durch Agarosegel Elektrophoroese in der Anwesenheit von Formaldehyd (Sambrook et al., 1989) gelöst. Die Hybridisierung mit der Maus ABCR-Sonde wurde in 50 % Formamid, 5X SSC bei 42°C durchgeführt, und die Filter wurden in 0,1X SSC bei 68°C gewaschen.
Die Hybridisierung einer 3' ABCR cDNA Sonde mit einem Mehrfachgewebe Northern Blot und einem Master Blot (Clontech, Palo Alto, CA) zeigte, dass das Gen nicht nachweisbar in irgendeinem der untersuchten 50 nicht retinalen fötalen und adulten Gewebe exprimiert wurde, was mit der Beobachtung übereinstimmt, dass alle 12 der ABCR-Klone in der EST Datenbank von retinalen cDNA Bibliotheken abstammten. Darüber hinaus zeigten das Screenen von cDNA Bibliotheken aus sowohl sich entwickelndem Mausauge und adulater humaner Retina mit ABCR-Sonden eine geschätzte 0,1 % – 1 % Frequenz von ABCR-Klonen von allen cDNA Klonen in der Bibliothek. Die Hybridisierung der ABCR-Sonde an einen Northern Blot, der Gesamt RNA aus Rattenretina und anderen Geweben enthielt, zeigte, dass die Expression dieses Gens einzigartig Retina-spezifisch ist (2). Die Transkriptgröße wird auf 8 kb geschätzt.
Sequenz und Exon/Intron Struktur der ABCR cDNA
Verschiedene ESTs, die von Retina cDNA Bibliotheken abstammen und die eine hohe Ähnlichkeit zu dem Maus Abc1 Gen aufwiesen, wurden verwendet, um den Zusammenbau des größten Teils der ABCR cDNA Sequenz zu ermöglichen. Die Retina cDNA Klone wurden durch RT-PCR verknüpft, und wiederholtes Screenen einer humanen Retina cDNA Bibliothek mit 3' und 5' PCR Sonden zusammen mit 5'RACE wurde verwendet, um die terminalen Sequenzen des Gens zu charakterisieren.
Die cDNA Klone, welche die ABCR-Sequenzen enthalten, wurden aus einer humanen Retina cDNA Bibliothek erhalten (Nathans et al., 1986) und vollständig sequenziert. Es wurden Primer aus den Sequenzen der cDNA Klone von den 5' und 3' Regionen des Gens entworfen und verwendet, um die identifizierten cDNA Klone durch RT-PCR mit Retina QUICK-Clone cDNA (Clontech, Palo Alto, CA) als eine Matrize zu verknüpfen. Die PCR Produkte wurden in pGEM^®-T Vektor kloniert (Promega, Madison, WI). Es wurden Maus ABCR cDNA Klone aus dem Screenen einer sich entwickelnden Mausauge cDNA Bibliothek erhalten (H. Sun, A. Lanahan und J. Nathans, nicht veröffentlicht). Der pGEM^®-T Vektor wird hergestellt durch Schneiden von pGEM^®-5Zf(+) DNA mit EcoR V und Zugeben zu einem 3' terminalen Thymidin zu beiden Enden. Diese einzelnen 3'-T Überhänge an der Insertionsstelle verstärken stark die Effizienz der Ligation von PCR Produkten aufgrund des nicht Matrizen abhängigen Zugebens eines einzelnen Desoxiadenosins (A) zu den 3'-Enden der PCR Produkte durch viele thermostabile Polymerasen. Der pGEM^®-5Zf(+) Vektor enthält den Replikationsursprung des filamentösen Phagen f1 und kann verwendet werden, um ssDNA herzustellen. Das Plasmid enthält auch T7 und SP6 RNA Polymerase Promotoren, die eine multiple Klonierungsregion innerhalb der α-Peptid kodierenden Region für das Enzym β-Galactosidase flankieren. Die Insertionsinaktivierung des α-Peptids erlaubt es, dass rekombinante Klone direkt durch Farbscreenen auf Indikatorplatten identifiziert werden können. Die cDNA Klone aus verschiedenen Regionen des ABCR-Gens wurden als Sonden verwendet, um eine humane genomische Bibliothek in Lambda FIX II (#946203, Stratagene, La Jolla, CA) zu screenen. Überlappende Phagenklone wurden durch EcoRI und BamHl Spaltung kartiert. Insgesamt wurden 6,9 kb der ABCR-Sequenz zusammengesetzt (3A-H), was zu einem 6540 by (2180 Aminosäuren) offenen Leserahmen führte.
Das Screenen einer Bakteriophagen Lambda humanen genomischen Bibliothek mit cDNA Sonden liefert eine Contig, das ungefähr 100 kb umspannt und den Hauptanteil der ABCR kodierenden Region enthält. Die Exon/Intron Struktur aller einundfünfzig Exons des Gens wurde durch direktes Sequenzieren von genomischen und cDNA Klonen charakterisiert. Die Introngrößen wurden aus den Größen der PCR Produkte unter Verwendung von Primern aus angrenzenden Exons mit genomischen Phagenklonen als Matrizen abgeschätzt.
Die Primer für die cDNA Sequenzen des ABCR wurden mit dem PRIMER Programm entworfen (Lincoln et al., 1991). Sowohl ABCR cDNA Klone als auch genomische Klone wurden Matrizen zum Sequenzieren. Das Sequenzieren wurde mit dem Taq DyedesoxyTerminator Cycle Sequencing Kits (Applied Biosystems, Foster City, CA) gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Die Sequenzierreaktionen wurden auf einem ABI 373A automatischen Sequenziergerät aufgelöst. Die Positionen der Introns wurden durch Vergleich zwischen genomischen und cDNA Sequenzen bestimmt. Die Primer für die Amplifikation von einzelnen Exons wurden aus benachbarten Intronsequenzen 20 – 50 bp von der Spleiß-Stelle entworfen und sind in Tabelle angegeben.
Tabelle 1 Exon/Intron Primer für ABCR
Tabelle 1 Exon/Intron Primer für ABCR (Fortsetzung)
Tabelle 1 Exon/Intron Primer für ABCR (Fortsetzung)
Tabelle 1 Exon/Intron Primer für ABCR (Fortsetzung)
Tabelle 1 Exon/Intron Primer für ABCR (Fortsetzung)
Tabelle 1 Exon/Intron Primer für ABCR (Fortsetzung)
In Tabelle 1 bedeutet "F" vorwärts (forward), d.h., 5' nach 3', "R" bedeutet revers, d.h. 3' nach 5'. Die PCR Bedingungen waren 95°C für 8 Minuten; 5 Zyklen bei 62°C für 20 Sekunden, 72°C für 30 Sekunden; 35 Zyklen bei 60°C für 20 Sekunden, 72°C für 30 Sekunden; 72°C für 5 Minuten (mit Ausnahme dass ^a bei 94°C für 5 Minuten durchgeführt wurde); 5 Zyklen bei 94°C für 40 Sekunden; 60°C für 30 Sekunden; 72°C für 20 Sekunden; 35 Zyklen bei 94°C für 40 Sekunden; 56°C für 30 Sekunden; 72°C für 20 Sekunden und 72°C für 5 Minuten.
Die Amplifikation von Exons wurde mit AmpIiTaq Gold Polymerase in einem 25 μl Volumen in 1X PCR Puffer, der durch den Hersteller bereitgestellt wurde, durchgeführt (Perkin Elmer, Foster City, CA). Die Proben wurden auf 95°C für 10 Minuten erhitzt und für 35 – 40 Zyklen bei 96°C für 20 Sekunden; 58°C für 30 Sekunden und 72°C für 30 Sekunden amplifiziert. Die PCR Produkte wurden auf 1 – 1,5 Agarosegelen analysiert und in einigen Fällen mit einem geeigneten Restriktionsenzym gespalten, um ihre Sequenz zu verifizieren. Die Primersequenzen und die spezifischen Reaktionsbedingungen sind in Tabelle 1 angegeben. Die Sequenz der ABCR cDNA wurde bei der GenBank unter der Zugangsnummer # U88667 hinterlegt.
Homologie zu Mitgliedern der ABC-Superfamilie
Eine BLAST Recherche zeigte, dass ABCR am stärksten mit den zuvor charakterisierten Maus Abc1 und Abc2 Genen (Luciani et al., 1994) und zu einem anderen humanen Gen (ABCC) verwandt ist, das auf Chromosom 16p13.3 (Klugbauer und Hofmann, 1996) kartiert wurde. Diese Gene, zusammen mit ABCR und einem Gen aus C. elegans (GenBank #Z29117) bilden eine Superfamilie von Genen, die spezifisch für multizelluläre Organismen ist und nicht in Hefe vorkommt (Michaelis und Berkower, 1995: Allikmets et al., 1996). Die Anordnung der cDNA Sequenz von ABCR mit den Abc1, Abc2 und ABCC Genen zeigte, wie erwartet, dass der höchste Grad der Homologie innerhalb der ATP-Bindungs-Cassetten vorliegt. Die vorhergesagte Aminosäureidentität des ABCR-Gens mit Maus Abc1 betrug 70 % innerhalb der ATP-Bindungsdomänen; selbst innerhalb der hydrophoben Membran durchspannenden Segmente reichte die Homologie von zwischen 55 und 85 % (4A-D). Das mögliche ABCR Initiatormethionin, das in den 3A-H und 4A-D gezeigt ist, entspricht einem Methionincodon am 5' Ende von Abc1 (Luciani et al., 1994).
ABCR zeigt die Zusammensetzung eines typischen Gesamtlängen ABC-Transporters, der aus zwei Transmembrandomänen (TM) besteht, jede mit sechs Membran durchspannenden hydrophoben Segmenten, wie durch einen Hydrophobizitätsblot (Daten nicht gezeigt) vorhergesagt wurde, und zwei hochkonservierte ATP-Bindungsdomänen (3A-H und 4A-D). Zusätzlich zeigte die HH1 hydrophobe Domäne, die zwischen dem ersten ATP und der zweiten TM Domäne angeordnet und spezifisch ist für diese Superfamilie (Luciani et al., 1994), eine vorhergesagte 57 % Aminosäureidentität (24 von 42 Aminosäuren) mit dem Maus Abc1 Gen.
Um das Mausortholog von ABCR zu charakterisieren wurden cDNA Klone aus einer Bibliothek eines sich entwickelnden Mausauges isoliert. Eine teilweise Sequenz der Maus cDNA wurde verwendet, um PCR Primer zu entwerfen, um das Maus ABCR-Gen in einem interspezifischen Rückkreuzungskartierungspanel (Jackon BSS) zu kartieren. Das allele Muster von ABCR wurde mit 2450 anderen Loci verglichen, die zuvor in der Jackson BSS Kreuzung kartiert wurden; eine Verbindung wurde zu dem distalen Ende von Chromosom 3 (5) gefunden. Es wurden keine Rekombinanten zwischen ABCR und D13Mit13 beobachtet. Diese Region des Mausgenoms ist syntenisch zu humanem Chromosom 1p13-p21. Bislang wurde noch kein Augenerkrankungsphänotyp in dieser Region von Maus Chromosom 3 kartiert.
Verbindungsheterozygote und -homozygote Mutationen in STGD Patienten
Einhundertfünfundvierzig nordamerikanische und drei saudiarabische Familien mit STGD/FFM wurden untersucht. Unter diesen waren mindestens vier blutsverwandte Familien, in denen die Eltern Cousins bzw. Cousinen ersten Grades waren. Die Eintrittskriterien für die Charakterisierung der klinischen und angiographischen Diagnose von Stargardt-Krankheit, die Erfassung der Familien und die Methodik für ihre Sammlung, einschließlich der blutsverwandten Familien aus Saudi-Arabien, waren wie in Anderson et al., 1995; und Anderson, 1996 bereitgestellt.
Die Mutationsanalyse des ABCR-Gens wurde in den oben identifizierten einhundertachtundvierzig STGD Familien, die zuvor durch strenge Definitionskriterien festgelegt wurden, betrieben, und es wurde gezeigt, dass sie mit Chromosom 1p verbunden sind (Anderson et al., 1995; Anderson, 1996). Bis heute wurden alle 51 Exons für Mutationsanalyse verwendet.
Die Mutationen wurden durch eine kombinierte SSCP (Orita et al., 1989) und Heteroduplex Analyse (White et al., 1992) unter optimierten Bedingungen (Glavac und Dean, 1993) nachgewiesen. Die genomischen DNA-Proben (50 ng) wurden mit AmpliTaq Gold Polymerase in 1X PCR Puffer, der von dem Hersteller bereitgestellt wurde (Perkin Elmer, Foster City, CA), enthaltend [α-³²P]dCTP, amplifiziert. Die Proben wurden auf 95°C für 10 Minuten erhitzt und für 35 – 40 Zyklen bei 96°C für 20 Sekunden; 58°C für 30 Sekunden; und 72°C für 30 Sekunden amplifiziert. Die Produkte wurden in 1:3 Stopplösung verdünnt, bei 95°C für 5 Minuten denaturiert, für 5 Minuten auf Eis gekühlt und auf Gele geladen. Die Gelformulierungen schließen 6 % Acrylamid:Bis (2,6 % Kreuzvernetzung), 10 % Glycerol bei Raumtemperatur, 12 W; und 10 % Acrylamid:Bis (1,5 % Kreuzvernetzung), bei 4°C, 70 W, ein. Die Gele wurden für 2 – 16 Stunden (3000 Vh/100 bp) gefahren, getrocknet, und einem Röntgenfilm für 2 – 12 Stunden ausgesetzt. Einige Exons wurden durch SSCP mit MDE Acrylamid (FMC Bioproducts, Rockland, ME) mit und ohne 10 % Glycerol für 18 Stunden, 4 Watt bei Raumtemperatur mit α-³²PdCTP markierter DNA analysiert. Die Heteroduplices wurden aus der doppelsträngigen DNA am Boden der Gele identifiziert, und die SSCPs wurden aus der einzelsträngigen Region identifiziert. Die Proben, die Variation zeigten, wurden mit anderen Familienmitgliedern verglichen, um die Segregation der Allele zu bewerten und mit mindestens 40 unabhängigen Kontrollproben von entweder kaukasischen der saudiarabischen Populationen, um Mutationen von Polymorphismen, die nicht mit STGD in Verbindung stehen, zu unterscheiden. Die PCR-Produkte mit SSCP oder Heteroduplex Varianten wurden in einem 25 μl Volumen erhalten, auf einem 1 % Agarosegel aufgetrennt und durch einen DNA-Reinigungskit (PGC Scientific, Frederick, MD) isoliert. Das Sequenzieren wurde auf einem ABI Sequenziergerät mit sowohl Farbstoffprimern als auch Farbstoffterminatorchemie durchgeführt.
Es wurden einige Mutationen mit einem Heteroduplex Analyseprotokoll (Roa et al., 1993) identifiziert. Äquimolare Mengen von Kontroll und Patienten PCR-Produkten wurden in 0,2 ml Gefäßen gemischt. Zwei Volumina PCR-Produkt aus einem normalen Individuum dienten als eine Negativkontrolle, und MPZ Exon 3 aus Patient BAB731 als eine Positivkontrolle (Roa et al., 1996). Die Proben wurden bei 95°C für 2 Minuten denaturiert und auf 35°C bei einer Geschwindigkeit von 1°C/Minute abgekühlt. Die Proben wurden auf 1,0 mm dicke, 40 cm MDE Gele geladen (FMC Bioproducts, Rockland, ME), bei 600 – 800 V für 15 – 20 Stunden elektrophoretisch getrennt und mit Ethidiumbromid sichtbar gemacht. Die Proben, die eine abweichende Bande zeigten, wurden erneut mit biotinylierten forward und reverse Primern amplifiziert und auf Streptavidin-konjugierten Kügelchen immobilisiert (Warner et al., 1996). Die resultierenden einzelnen Stränge wurden durch das Didesoxisequenzierverfahren mit Sequenase 2,0 (Amersham, Arlington Heights, IL) sequenziert.
Es wurden insgesamt fünfundsiebzig Mutationen identifiziert, wobei der Großteil Fehlsinnmutationen in konservierten Aminosäurepositionen darstellte. Jedoch wurden auch einige Insertionen und Deletionen, die Leserahmenverschiebungen darstellen, gefunden (Tabelle 2). Die Sequenz von zwei Mutationen sind in den 6A und 6B gezeigt. Zwei Fehlsinnalterationen (D847H, R943Q) wurden in mindestens einem Kontrollindividuum gefunden, was nahe legt, dass sie neutrale Polymorphismen sind. Die verbleibenden Mutationen wurden in Patienten mit Makuladegeneration gefunden, und sie wurden nicht in mindestens 220 nicht verwandten normalen Kontrollen (440 Chromosomen) gefunden, was mit der Interpretation übereinstimmt, dass diese Alterationen erkrankungsverursachende Mutationen, nicht Polymorphismen, darstellen. Eine der Mutationen, 5892+1 G→T, tritt in Familie AR144 auf, in der eines der betroffenen Kinder rekombinant hinsichtlich des flankierenden Markers D1S236 (Anderson et al., 1995) ist. Diese Mutation ist jedoch im Vater ebenso wie in beiden betroffenen Kindern anwesend. Deshalb ist das ABCR-Gen nicht rekombinant bezüglich des Stargardt-Krankheitslocus.
Die Mutationen sind über die kodierende Sequenz des ABCR Gens (siehe Tabelle 2 und 3A -H) verteilt, obwohl eine Ansammlung innerhalb der konservierten Regionen der ATP-Bindungsdomänen bemerkbar ist. Es wurden homozygote Mutationen in drei ähnlichen blutsverwandten Familien, zwei saudiarabischen und einer nordamerikanischen (Anderson et al., 1995) nachgewiesen, in denen jeweils nur das betroffene Individuum das identische Erkrankungsallel erbte (Tabelle 2; 6C). Zweiundvierzig verbindungsheterozygote Familien wurden identifiziert, in denen zwei Erkrankungsallele von verschiedenen Eltern auf nur den betroffenen Nachkommen übertragen wurden (Tabelle 2).
Tabelle 2. Mutationen in dem ABCR-Gen in STGD Familien
Tabelle 2. Mutationen in dem ABCR-Gen in STGD Familien
Die Mutationen sind gemäß der Standardnomenklatur bezeichnet. Die Spalte, die mit "Exon" überschrieben ist, zeigt, welches der 51 Exons von ABCR die Mutation enthält. Die Spalte, die mit "#Familien" überschrieben ist, zeigt die Zahl der Stargardt-Familien, welche die Mutation zeigen. Die Spalte, die mit "Nukleotid" überschrieben ist, gibt die Basenzahl an, beginnend mit dem A des anfänglichen ATG, gefolgt von der Wildtyp-Sequenz und einem Pfeil, der die Base angibt, in die sie geändert wurde; del bezeichnet eine Deletion von ausgewählten Basen an der angegebenen Position in dem ABCR-Gen; ins bezeichnet eine Insertion von ausgewählten Basen an der angegebenen Position; Spleiß-Donorstellen Mutationen sind durch die Zahl der letzten Base des angegebenen Exons bezeichnet, gefolgt von einem Pluszeichen und der Zahl von Basen in dem Intron, wo die Mutation auftritt. Die Spalte, die mit "Aminosäure" überschrieben ist, bezeichnet den Aminosäureaustausch, den eine gegebene Mutation bewirkt; fs bezeichnet eine Leserahmen Mutation, die zu einem verkürzten Protein führt; Splice bezeichnet eine Spleiß-Donorstellen Mutation; del bezeichnet eine Deletion der angegebenen Aminosäuren innerhalb eines Leserahmens.
Die Mutationen sind gemäß der Standardnomenklatur bezeichnet. Die Exon Nummerierung gemäß der Nukleotidposition beginnt bei dem A in dem anfänglichen ATG.
In situ Hybridisierung
STGD ist histologisch durch eine massive Anreicherung einer Lipofuscin ähnlichen Substanz in dem retinalen Pigment-Epithel (RPE) gekennzeichnet. Dieses Merkmal hat zu dem Vorschlag geführt, dass STGD eine RPE Speicherstörung darstellt (Blacharski et al., 1988). Es war deshalb interessant, dass gefunden wurde, dass ABCR-Transkripte im Überschuss in der Retina vorkommen. Um die Stelle(n) der ABCR-Genexpression bei höherer Auflösung zu identifizieren und zu bestimmen, ob das Gen auch in RPE exprimiert wird, wurde die Verteilung der ABCR-Transkripte durch in situ Hybridisierung in maus-, ratten-, bovinem und makakenokularen Geweben sichtbar gemacht.
In situ Hybridisierung mit Digoxigenin-markierten Ribosonden wurde durchgeführt wie von Schaeren-Wiemers und Gerfin-Moser, 1993 beschrieben. Für Maus und Ratte wurden unfixierte ganze Augen gefroren und geschnitten; Makakenretinas wurden nach Herzperfusion mit Paraformaldehyd, wie beschrieben (Zhou et al., 1996), erhalten. Eine Extrainkubation von 30 min. in 1 % Triton X-100, 1X PBS wurde auf die fixierten Affenretinaschnitte unmittelbar nach dem Acetylierungsschritt aufgebracht. Die Matrizen für die Sondensynthese waren: (1) ein 1,6 kb Fragment, welches das 3' Ende der Maus ABCR kodierenden Region umfasst, (2) ein Gesamtlängen cDNA Klon, der das Maus blaue Zapfenpigment (Chiu et al., 1994) kodiert, und (3) ein Segment einer Makakenrhodopsin kodierenden Region, welches die Reste 133 bis 254 kodiert (Nickells, R.W., Burgoyne, C.F., Quigley, H.A. und Zack, D.J. (1995)).
Diese Analyse zeigte, dass die ABCR-Transkripte exklusiv innerhalb der Fotorezeptorzellen (7) anwesend sind. Die ABCR-Transkripte sind grundsätzlich an den Innensegmenten der Stäbchen angeordnet, eine Verteilung, die gut zu jener der Rhodopsingen Transkripte passt. Interessanterweise wurde die ABCR-Hybridisierung nicht in nachweisbaren Mengen in Zapfen Fotorezeptoren beobachtet, wie durch Vergleichen mit den Hybridisierungsmustern, die mit einer blauen Zapfenpigment Sonde erhalten wurden, bewertet wurde (vgl. 7A und 7D, 7E mit 7F und 7G mit 7H). Weil Melaninkörnchen ein schwaches Hybridisierungssignal in der RPE eines pigmentierten Tieres überlagern könnten, wurde die Verteilung der ABCR-Transkripte auch in sowohl Albinoratten als auch Albinomäusen untersucht. In diesen Experimenten wurde das ABCR-Hybridisierungssignal in den inneren Segmenten des Fotorezeptors beobachtet und war unzweideutig abwesend in dem RPE (7E). Vorausgesetzt, dass die ABCR-Transkripte in jedem dieser Säuger, einschließlich einem Primaten, fotorezeptorspezifisch sind, ist es sehr wahrscheinlich, dass die Verteilung von ABCR-Transkripten dieses Muster ebenso in der humanen Retina bestätigt.
Zahlreiche Modifikationen der Erfindung zusätzlich zu jenen, die hier gezeigt und beschrieben sind, sind für den Fachmann aus der vorhergehenden Beschreibung offensichtlich.
Literaturreferenzen

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SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Nukleinsäuresequenz, welche für einen Retina-spezifischen ATP-Bindungs-Cassette-Transporter kodiert, wobei die Nukleinsäuresequenz SEQ ID NR:4 umfasst.
Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 1, wobei der ATP-Bindungs-Cassette-Transporter eine Aminosäure, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus 818 (G oder E), 863 (G oder A), 931 (V oder M), 1028 (A oder V), 1072 (V oder A), 1087 (E oder K), 2027 (L oder F), 2038 (R oder W), 2050 (V oder L), 2077 (R oder W) und 2106 (R oder C), gemäß der Numerierung der Sequenz in 3, umfasst.
Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 1, umfassend ein Nukleotid, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus 2453 (G oder A), 2588 (G oder C), 2791 (G oder A), 3083 (C oder T), 3215 (T oder C), 3259 (G oder A), 6079 (C oder T), 6112 (C oder T), 6148 (G oder C), 6229 (C oder T) und 6316 (C oder T), gemäß der Numerierung der Sequenz in 3.
Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 3, wobei das Nukleotid zu einer Fehlsinn-Mutation führt.
Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 3, wobei das Nukleotid zu einer Spleiß-Stelle führt.
Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 1, umfassend ein Nukleotid, welches zu einer Rahmenverschiebungsmutation führt.
Vektor, welcher eine Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 1 umfasst.
Zellkultur, erhalten durch Transformieren einer Zelle mit einem Expressionsvektor nach Anspruch 7.
Wirtszelle, welche befähigt ist, eine Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 1 rekombinant zu exprimieren.
Zellkultur, welche befähigt ist, eine Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 1 rekombinant zu exprimieren.
Protein-Präparation, umfassend ein rekombinant exprimiertes Polypeptid, mit einer Aminosäuresequenz, welche durch eine Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 1 kodiert wird.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eine wirksame Menge einer Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 1 und einen pharmazeutisch verträglichen Träger.
Isoliertes Polypeptid, umfassend einen Retina-spezifischen ATP-Bindungs-Cassette-Transporter, wobei die Nukleinsäuresequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 3 für das Polypeptid kodiert.
Isoliertes Polypeptid nach Anspruch 13, wobei das Polypeptid eine mit Makuladegeneration verbundene Mutation umfasst.
Transgener, nicht-humaner Säuger, umfassend eine rekombinante Sequenz, welche eine Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 1 umfasst, die in den Säuger oder einen Vorfahren des Säugers eingeführt wird, oder umfassend ein unterdrücktes Retina-spezifisches ATP-Bindungs-Cassette-Transporter-Gen, welches SEQ ID NR:4 umfasst.
Verfahren zum Screenen für ein Mittel, welches Makuladegeneration moduliert, umfassend das Vereinigen eines gereinigten Retina-spezifischen ATP-Bindungs-Cassette-Transporters, welcher eine Aminosäuresequenz umfasst, die durch eine Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 1 kodiert wird, mit mindestens einem Mittel, welches im Verdacht steht, einen Retina-spezifischen ATP-Bindungs-Cassette-Transporter zu verändern, und die Beobachtung einer Ver änderung der Aktivität des gereinigten Retina-spezifischen ATP-Bindungs-Cassette-Transporters.
Verfahren zum Screenen für ein Mittel nach Anspruch 16, wobei das Verfahren ein Verfahren zum Screenen für ein Mittel ist, das Makuladegeneration hemmt, wobei das Verfahren das Vereinigen des gereinigten Retina-spezifischen ATP-Bindungs-Cassette-Transporters mit mindestens einem Mittel, welches im Verdacht steht, einen Retina-spezifischen ATP-Bindungs-Cassette-Transporter zu aktivieren, und die Beobachtung einer Aktivierung des gereinigten ATP-Bindungs-Cassette-Transporters, umfasst.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei der gereinigte Retina-spezifische ATP-Bindungs-Cassette-Transporter von einem Patienten stammt, welcher unter Verdacht steht, Makuladegeneration aufzuweisen.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei die Aktivierung des gereinigten Retinaspezifischen ATP-Bindungs-Cassette-Transporters durch die Hemmung eines mit Makuladegeneration verbundenen Charakteristikums, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Hemmung der zentral-visuellen Beeinträchtigung, Hemmung fortschreitender bilateraler Atrophie des Makula-retinalen Pigment-Epithels, Hemmung fortschreitender bilateraler Atrophie des Neuroepithels, Hemmung von Makula-Flecken, Hemmung mittelretinaler peripherer Flecken und Hemmung Retina-spezifischer ATP-Bindungs-Cassette-Transporter-Transkripte in Photorezeptorzellen, beobachtet wird.
Verfahren nach Anspruch 19, wobei die Makuladegeneration aus der Gruppe, bestehend aus Stargadt-Krankheit, Fundus flavimaculatus und altersbezogener Makuladegeneration, ausgewählt wird.
Verfahren nach Anspruch 17, weiter umfassend den Schritt des Amplifizierens der Nukleinsäuresequenz, welche für einen Retina-spezifischen ATP-Bindungs-Cassette-Transporter kodiert, unter Verwendung eines Oligonukleotid-Primers, welcher spezifisch mit der Sequenz hybridisiert.
Verfahren nach Anspruch 17, weiter umfassend den Schritt des Amplifizierens der Nukleinsäuresequenz, welche für einen Retina-spezifischen ATP-Bindungs-Cassette-Transporter kodiert, unter Verwendung eines Oligonukleotid-Primers, welcher spezifisch mit 17 bis 25 Nukleotiden der Sequenz hybridisiert.
Verfahren zum Screenen für ein Mittel nach Anspruch 16, wobei das Verfahren ein Verfahren zum Screenen für ein Mittel ist, das Makuladegeneration aktiviert, wobei das Verfahren das Vereinigen des gereinigten Wildtyp-Retinaspezifischen ATP-Bindungs-Cassette-Transporters mit mindestens einem Mittel, welches unter Verdacht steht, einen Retina-spezifischen ATP-Bindungs-Cassette-Transporter zu aktivieren, und die Beobachtung einer Hemmung des gereinigten Wildtyp-ATP-Bindungs-Cassette-Transporters, umfasst.
Verfahren nach Anspruch 23, wobei die Hemmung des gereinigten Retinaspezifischen ATP-Bindungs-Cassette-Transporters durch ein mit Makuladegeneration verbundenes Charakteristikum beobachtet wird, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus zentral-visueller Beeinträchtigung, bilateraler Atrophie des Makula-retinalen Pigment-Epithets, bilateraler Atrophie des Neuroepithels, Makula-Flecken, mittelretinaler peripherer Flecken und Retina-spezifischer ATP-Bindungs-Cassette-Transporter-Transkripte in Photorezeptorzellen.
In vitro -Verfahren zum Diagnostizieren eines Individuums mit Makuladegeneration oder Mangel daran, umfassend das Nachweisen des Vorhandenseins oder der Abwesenheit einer mit Makuladegeneration verbundenen Mutation in einer für Retina-spezifische ATP-Bindungs-Cassette-Transporter kodierenden Nukleinsäure nach Anspruch 1 in einer Gewebeprobe des Individuums.
Verfahren nach Anspruch 25, wobei die Gewebeprobe aus der Gruppe, bestehend aus Blut, Haut, Serum, Speichel, Sputum, Schleim, Knochenmark, Urin, Lymphe, einer Träne, Chorion und Fruchtwasser, ausgewählt wird.
Verfahren nach Anspruch 25, wobei die Mutation aus der Gruppe, bestehend aus 2453 (G→A), 2588 (G→C), 2791 (G→A), 2884 del C, 3083 (C→T), 3259 (G→A), 5041 del 15, 5196 +2(T→C), 6005 +1(G→T), 6079 (C→T), 6112 (C→T), 6148 (G→C), 6229 (C→T) und 6316 (C→T), gemäß der Numerierung der Sequenz in 3, ausgewählt wird.
Verfahren nach Anspruch 25, wobei die Mutation zu einem Aminosäuresequenz-Unterschied, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus G818E, G863A, V931M, A1028V, V1072A, E1087K, VVAIC1681del, L2027F, R2038W, V2050L, R2077W und R2106C, gemäß der Numerierung der Sequenz aus 3, führt.
Verfahren nach Anspruch 25, wobei die Mutation aus der Gruppe, bestehend aus einer Fehlsinn-Mutation, einer, intragenetischer Deletion, einer intragenetischer Insertion, einer Rahmenverschiebungsmutation und einer Spleiß-Stellen-Mutation, ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 29, wobei die Mutation eine Fehlsinn-Mutation ist.
Verfahren nach Anspruch 29, wobei die Mutation eine Rahmenverschiebungsmutation ist.
Verfahren nach Anspruch 29, wobei die Mutation eine Spleißstellenmutation ist.
Verfahren nach Anspruch 25, weiter umfassend das Extrahieren von RNA oder DNA aus der Probe.
Verfahren nach Anspruch 25, weiter umfassend den Schritt des Amplifizierens der Nukleinsäuresequenz, welche für einen Retina-spezifischen ATP-Bindungs-Cassette-Transporter kodiert.
Verfahren nach Anspruch 34, wobei der Amplifizierungsschritt das Ausführen der Polymerase-Kettenreaktion umfasst.
Verfahren nach Anspruch 25, weiter umfassend den Schritt des Amplifizierens der Nukleinsäuresequenz, welche für einen Retina-spezifischen ATP-Bindungs-Cassette-Transporter kodiert, unter Verwendung eines Oligonukleotid-Primers, der spezifisch mit der Nukleinsäuresequenz hybridisiert.
Verfahren nach Anspruch 25, weiter umfassend den Schritt des Amplifizierens der Nukleinsäuresequenz, welche für einen Retina-spezifischen ATP-Bindungs-Cassette-Transporter kodiert, unter Verwendung eines Primers mit einer Nukleinsäuresequenz, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID NRn: 40-61, 64, 65, 78, 79, 98-105, 108 und 109.
Verfahren nach Anspruch 34, weiter umfassend den Schritt des Vergleichens der amplifizierten Nukleinsäuresequenz von dem Individuum mit einer Kontroll-Nukleinsäuresequenz, welche für einen Wildtyp-Retina-spezifischen ATP-Bindungs-Cassette-Transporter kodiert, wobei eine Mutation in der amplifizierten Nukleinsäuresequenz des Individuums, verglichen mit der Nukleinsäuresequenz, welche für einen Wildtyp-Retina-spezifischen ATP-Bindungs-Cassette-Transporter kodiert, Makuladegeneration anzeigt.
In vitro-Verfahren zum Diagnostizieren von Makuladegeneration in einem Individuum, umfassend das Nachweisen des Vorhandenseins einer mutierten Version eines Retina-spezifischen ATP-Bindungs-Cassette-Transporters, für den eine Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 1 kodiert.
Verwendung einer Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 1, oder eines Fragments davon, zur Herstellung eines Medikaments für die Behandlung von Makuladegeneration.
Verwendung nach Anspruch 40, wobei das Nukleotid für einen Wildtyp-ATP-Bindungs-Cassette-Transporter mit einer Aminosäuresequenz kodiert, welche durch SEQ ID NR:4 kodiert wird.
Verwendung nach Anspruch 40, wobei das Medikament zur Behandlung eines Menschen ist.
Verwendung nach Anspruch 40, wobei die Makuladegeneration durch Stargadt-Krankheit, Fundus flavimaculatus, alters-bezogene Makuladegeneration, Retinitis pigmentosa, kombinierte Stäbchen- und Zäpfchen-Dystrophien, Zäpfchen-Dystrophien, Musterdystrophie, Ochsenaugen-Makulopathie, bedingt wird.
Verwendung nach Anspruch 40, wobei die Makuladegeneration durch Stargadt-Krankheit bedingt wird.
Kit zum Nachweis von Makuladegeneration, umfassend einen ersten Behälter, wobei der Behälter einen ersten Primer umfasst, welcher zwischen 15 und 35 Nukleotide aufweist und komplementär zu einem ersten Bereich eines Retinaspezifischen ATP-Bindungs-Cassette-Transporter-Gens ist, welches eine Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 1 umfasst.
Kit nach Anspruch 45, wobei der erste Bereich des Gens ein kodierender Bereich ist.
Kit nach Anspruch 45, wobei der erste Bereich des Gens ein Exon flankiert.
Kit nach Anspruch 45, weiter umfassend einen zweiten Behälter, wobei der zweite Behälter einen zweiten Primer umfasst, welcher zwischen 15 und 35 Nukleotide aufweist und komplementär zu einem zweiten Bereich eines Retinaspezifischen ATP-Bindungs-Cassette-Transporter-Gens ist, welches eine Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 1 umfasst.
Kit nach Anspruch 48, wobei der zweite Bereich des Gens ein kodierender Bereich ist.
Kit nach Anspruch 48, wobei der zweite Bereich des Gens ein Exon flankiert.
Kit nach Anspruch 45, wobei der erste Primer aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID NRn: 40-61, 64, 65, 78, 79, 98-105, 108 und 109, ausgewählt ist.
Kit nach Anspruch 48, wobei der zweite Primer aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID NRn: 40-61, 64, 65, 78, 79, 98-105, 108 und 109, ausgewählt ist, aber nicht mit dem ersten Primer identisch ist.
Kit zum Nachweis von Makuladegeneration, umfassend einen ersten Behälter, wobei der Behälter ein Primer-Paar umfasst, welches komplementär zu einem ersten und einem zweiten Bereich eines Retina-spezifischen ATP-Bindungs-Cassette-Transporter-Gens ist, welches eine Nukleinsäuresequenz nach An sprach 1 umfasst, wobei jeder Primer zwischen 15 und 35 Nukleotide aufweist.
Kit nach Anspruch 53, wobei das Primer-Paar ein Exon flankiert.
Kit nach Anspruch 53, wobei das Primer-Paar einen kodierenden Bereich umspannt.
Kit nach Anspruch 53, wobei das Primer-Paar einen Primer umfasst, welcher eine Sequenz, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID Rn: 40-61, 64, 65, 78, 79, 98-105, 108 und 109, aufweist.
Kit nach Anspruch 45 oder 53, weiter umfassend ein Mittel zur Visualisierung amplifizierter DNA.
Kit nach Anspruch 57, wobei das Mittel ein fluoreszierender Farbstoff, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Ethidiumbromid, ³²P und Biotin, ist.
Kit nach Anspruch 45 oder 53, weiter umfassend einen oder mehrere Größenmarker.
Kit nach Anspruch 45 oder 53, weiter umfassend einen oder mehrere positive oder negative Kontrollen.
Kit nach Anspruch 45 oder 53, weiter umfassend ein oder mehrere Restriktionsenzyme.
Isoliertes Oligonukleotid, umfassend eine Nukleinsäuresequenz, welche komplementär zu einer Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 1 ist.
In vitro-Verwendung eines Oligonukleotids nach Anspruch 62, zur Hemmung der Expression Retina-spezifischen ATP-Bindungs-Cassette-Transporters in einer Zelle.
Isolierte Nukleinsäuresequenz, umfassend eine Nukleinsäuresequenz, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID NRn: 40-61, 64, 65, 78, 79, 98-105, 108 und 109.